®Iff ■§. p. pti pbrar^ Jforth (üarolitta State (üoikat QHÖ2.4 pt.l NORTH CAROLINA STATE UNIVERSITY LIBRARIES i [l ' I1IIIIIIIIIIII S01 949925 $ ^ V Date Dtie '''^f^O^ VA \ i ! [ ^ i _! ._i QH3^4 v.5,Dt.l 1840^> _arbjei-t£^e±Ji^4öe: HANDBUCH DER BIOCHEMISCHEN ARBEITSMETHODEN. V.BAND. I. TEIL. HANDBUCH DER iMISCHEN km BEARBEITET VON Prof. Dr. E. Abderhalden, Berlin — Prof. Dr. W. Autenrieth, Freiburg i. Br. — Prof. Dr. H. Bech- hold, Frankfurt a. M. - M. T. Burrows, New-Tork — Prof. Dr. A. Carrell, New-Tork — Dr. phil. Edelstein, Berlin — Exz. Geh. Rat Prof. Dr. Emil Fischer, Berliu — Prof, Dr. Otto Polin, Boston — Prof. Dr. Sigmund Fränkel, Wien — Priv.-Doz. Dr. Fühner, Freiburg i. Br. — Priv.Doz. Dr. Fuhrmann, Graz — Geh. Rat Prof. Dr. V. Hensen, Kiel — Prof. Dr. M. Kumagawa, Tokio — Priv.-Doz. Dr. E. Letsche, Tübingen — Dr. phil. P. A. Levene, New- York — Prof. Dr. Lockemann, Berlin — Dr. med. H. Loh- risch, Chemnitz — Prof. Dr. E. S. London, St. Petersburg — Prof. Dr. Macallum, Toronto — Prof. Dr. Leonor Michaelis, Berlin — Prof. Dr. Morawitz, Freibnrg i. B. — Prof. I)r Franz Müller, Berlin — Prof. Dr. Hermann Pfeiffer, Graz — Prof. Dr. Pohl, Prag — Prof. Dr. Pregl, Innsbruck — Priv.-Doz. Dr. Ernst G.Pringsheim, Halle a. S. — Priv.-Doz. Dr. H.Pringsheim, Berlin — l'riv.-Doz. Dr. Rohde, Heidelberg — Dr. med. und phil. P. Rona, Berlin — Dr. phil. van Slyke, New-York — Hofrat Prof. Di. J. Stoklasa, Prag — Prof. Dr. J. Traube, Berlin — Priv.-Doz. Dr. Völtz, Berlin. HERAUSGEGEBEN VON PROF. DR. EMIL ABDERHALDEN, DIREKTOR. DES PHYSIOL. INSTITUTES DER TIERÄRZTL. HOCHSCHULE, BERLIN. FÜNFTER BAND. ERSTER TEIL. MIT 168 TEILS MEHRFAEBIGEN TEXTABBILDUNGEN. URBAN & SCHWARZENBERG BERLIN WIEN N., FRIEDRICHSTRASSE 105b I., M AXIMILI ANST R ASSE 4 1911. Vorwort. In Band 1 — 4 des Handbuchs der biochemischen Arbeitsmethoden sind die einzelnen Methoden nach den einzelnen Operationen und den einzelnen Stoffen geordnet. So finden sich zum Beispiel die Methoden zur Isolierung der Verbindungen, die im Harn vor- kommen, einzeln nach diesen geordnet. Diese Art der Wiedergabe der Methoden genügt nicht für alle Fälle. Sehr oft kommt man in die Lage, mehrere Stoffe nebeneinander bestimmen zu müssen. Oft bringt auch im Einzelfalle die Art des Ausgangsmateriales, aus dem man einen bestimmten Stoff gewinnen möchte, Besonder- heiten mit sich. Der vorliegende Band soll derartige Lücken aus- füllen. Er gibt Anweisung, wie man Gesamtblut, Harn, Milch etc. auf die einzelnen Bestandteile verarbeitet. Bei der Wiedergabe der einzelnen Methoden ist Rücksicht auf das in den bereits erschie- nenen Bänden Enthaltene genommen worden, doch nur dann, wenn ein Hinweis ohne Störung des Zusammenhangs möglich war. Die einzelnen Methoden sind auch hier wiederum so geschildert, daß direkt nach den Vorschriften gearbeitet werden kann. Der vorliegende Band bringt ferner neben manchen Ergän- zungen zu den bereits erschienenen Bänden des Werkes noch zahl- reiche neue Kapitel. Es sind speziell die Grenzgebiete der Biochemie berücksichtigt worden. Weitere Ergänzungsbände sollen in größeren Zeitabschnitten fortlaufend über Verbesserungen alter Methoden und Ausarbeitung neuer berichten. 'ö Berlin, den 15. August 191L Emil Abderhalden. 1R40f) InhaltsYerzeiclinis. Sc-itc Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. \'on Priv.-Doz. Dr. Hermanu Fühner, Freiburg i. Br 1 Methoden zur Bestimmung des Blutdrucks. Von Priv.-Doz. Dr. Erwin Roh de, Heidelberg 125 Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. Von Priv.-Doz. Dr. E. Letsche, Tübingen 139 Die Blutgerinnung. Von Prof. Dr. P. Morawitz, Freiburg i. B 223 Die vollständige Analyse eines 24stündigen Urins. Von Prof. Dr. Otto Fol in, Boston 281 Nachweis und Bestimmung der Eiweißabbauprodukte im Harn. Von Dr. med. und phil. P. Rona, Berlin ... • .... 295 Bestimmung der Reaktion mittelst Indikatoren. Von Dr. med. und phil. P. Rona, Berlin 317 Nachtrag zur Gefrierpunktsbestimmung. Von Dr. med. und phil. P. Rona, Berlin 328 Methoden zur Untersuchung der menschlichen Fäzes. Von Dr. med. H. Lohrisch, Chemnitz 331 Methodik der Milchuntersuchung. Von Dr. phil. E. F. Edelstein, Berlin . . .421 Fettbestimmung nach Kumagawa-Suto. Von Prof. Dr. M. Kumagawa, Tokio . 477 Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. Von Dr. phil. P. A. Levene, New- York . 489 Die Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration durch Gasketten. Von Prof. Dr. Leonor Michaelis, Berlin 500 Die Arbeitsmethoden bei Versuchen über Anaphylaxie. Von Prof. Dr. Herrn. Pfeiffer, Graz . .' 525 Der Nachweis photodynamischer Wirkungen fluoreszierender Stoffe am lebenden Warmblüter. Von Prof. Dr. Herrn. Pfeiffer, Graz 563 Über Mikropolarisation. Von Exz. Geh. ßat Prof. Dr. Emil Fischer, Berlin . . . 572 Die optische Methode und ihre Verwendung bei biologischen Fragestellungen. Von Prof. Dr. E. Abderhalden, Berlin 575 Die wichtigsten Methoden beim Arbeiten mit Pilzen und Bakterien. Von Priv.-Doz. Dr. Franz Fuhrmann, Graz 584 Darstellung von Lipoiden aus Gehirn und anderen Geweben. Von Prof. Dr. Sigm. Fränkel, Wien . . . . ■ 613 Die Methodik der Plankton-Untersuchung. Von Geh. Rat Prof. Dr. Viktor Hansen, Kiel 637 Das Arbeiten mit Organeiweiß. Von Prof. Dr. J. Pohl, Prag 659 Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologiseliem Wege. Von Hermaini Füliuer, Freiburg i. Br. Einleitung. Bioloii'ische Methoden finden einmal zum qualitativen Nach- weis von Giften Verwendung- und besitzen hier namentlich forensisch- toxikologische Bedeutung; sie können aber auch zu quantitativen Be- stimmungen von Giften, in erster Linie zur Gehalts- und Wertbestim- mung von Chemikahen und Drogen herangezogen werden und haben dann hauptsächlich pharmazeutisch-medizinisches Interesse. Die wichtigsten bisher in beiden Richtungen bekannt gewordenen Methoden sind nachstehend zusammengestellt. Zum Nachw^eis der meisten anorganischen Gifte sind biologische Proben überflüssig. Die vielgenannte biologische Methode zum Nachweis von Arsenik ist wohl rasch und bequem ausführbar und in forensischen Fällen wenigstens als Vorprobe verwendbar; aber angesichts der scharfen und sichereren chemischen Proben tritt ihre P)edeutung hier zurück. Anders bei organischen Giften.. Selbst bei Substanzen, die sich chemisch und mikro- chemisch gut charakterisieren lassen, wie das Strychnin, wird in forensi- schen Fällen doch kein Sachverständiger neben dem chemischen Nachweis auf den charakteristischen Tierversuch am Frosche oder der hier empfind- licheren weißen Maus verzichten wollen. Erst der positive Ausfall von charakteristischen chemischen und biologischen Proben bietet bei derartigen Pflanzengiften die Gewähr für die Richtigkeit der Diagnose. Gilt dies schon für Substanzen wie das Strychnin, welche leicht in reiner kristallinischer Form aus Leichenmaterial gewonnen worden können, so ist solches in noch höherem Malie der Fall bei Produkten, die nicht kristallinisch und auch kaum in reiner Form aus forensischem Material zu isoheren sind. Hier wird in vielen Fällen der biologische Nachweis wich- tiger sein als der chemische, z. B. bei Aconitin, Nicotin und Veratrin. 15ei noch komplizierter gebauten Giften vollends, wie bei den sogenannten Toxalbuminen Abrin, Ricin u. a. oder den tierischen Giften, versagen die Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. 1 N. C. Stau Ctütm 2 H. Füll 11 er. chemischen Nachweismethoden durchaus und wir sind zum Nachweis dieser Substanzen ausschheßlich auf biologische Proben angewiesen. Die chemischen Identitätsreaktionen der organischen Gifte bestehen zumeist nur in rasch vergänglichen Farbenreaktionen, welche überdies mit einer Zerstörung des Giftes verbunden sind. Bei den meisten biologischen Proben dieser Gifte wird die betreffende Substanz nicht zerstört, sondern kann aus dem Versuchsobjekt wiedergewonnen werden. Außerdem lassen sich die Yergiftungserscheinungen am lebenden Objekt häufig in Form einer Kurve oder einer Photographie aufnehmen und so dauernd fixieren, was für forensische Fälle besonders wertvoll erscheint. Erwähnt sei noch, daß viele biologische Proben auch mit den nicht völlig rein dargestellten Giften einwandfreie Resultate ergeben, während eine große Anzahl der chemischen Identitätsreaktionen, an unreinem Material angesteUt, unsicher werden oder völlig versagen. Im übrigen ist es durchaus nicht die Aufgabe biologischer Pieak- tionen, die chemischen Proben zu ersetzen oder überflüssig zu machen. Es wird in den meisten Fällen durch den biologischen Nachweis lediglich die Sicherheit des chemischen Befundes erhöht werden. Im Prinzip empfiehlt es sich, irgend ein unbekanntes Gemenge nicht einfach einem Tiere beizubringen, um seine Giftigkeit zu erweisen, sondern man wird dasselbe nach dem bewährten Gange der toxikologisch-chemischen Analyse erst in verschiedene schon weitgehend gereinigte Bestandteile zerlegen und erst mit diesen etwaige chemische und biologische Pteaktionen anstellen. Alle biologischen Prüfungen sind mit neutral reagierenden Lösungen auszuführen. Quantitative biologische Bestimmungen finden heute Verwen- dung zur Prüfung von Desinfektionsmitteln, von Digitalisblättern, Fieber- mitteln, Nebennierenpräparaten u.a.m., Methoden, welche sich, wie auch die qualitativen Proben, leicht noch vermehren lassen. ') Unter ..biologischem Nachweis" von Giften verstehen wir den Nachweis derselben unter Verwendung lebender pflanzlicher oder tierischer Objekte. Es kann sich dabei um vollständige Organismen oder deren Teile handeln. Ausschlaggebend ist, daß die Objekte leben, denn wir woUen aus den veränderten Funktionen eines Lebewesens oder seiner Teile oder dadurch, daß wir das Leben vernichten, auf die An- wesenheit von Gift schließen. Das biologische Objekt dient uns als „lebendes Reagens". Demnach ist z.B. der Nachweis von Kohlenoxyd unter Verwendung von Blut kein biologischer Nachweis, denn hierbei ist nur der Blutfarbstoff, nicht aber die lebende rote Blutzelle erforderhch. Zum Nachweis von Saponinen hingegen bedarf man lebender Blutkörper- chen, welche durch diese Gifte zerstört, hämolysiert werden. Die Gliederung des Stoffes erfolgt nachstehend nach biologischen Objekten; diese sind in folgender Anordnung behandelt: *) Vgl. W. Strauh, Physiologische Wertbestimmung von Drogen, speziell der Folia Digitalis. Münchener med. Wocheuschr., 1910, Nr. 37, S. 1941. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 3 Schimmelpilze, Bakterien, Protozoen, Blut, der Frosch und seine Teile (Skelettmuskel, Nervmuskelpräparat, Herz, Gefäßpräparat, Auge), Maus, Kaninchen, Mensch. Möglichst ausgiebig- zur Charakterisierung der Gifte ist der Frosch und seine isolierten Organe herangezogen worden, während von einer Ver- wendung von Objekten, welche operative Eingriffe am Warmblüter er- fordern, abgesehen wurde. Es käme hier auch einzig die isolierte Gebär- mutter zur Wertbestimmung von Mutterkornpräparaten nach Kehrer in Betracht. Schimmelpilze. Zahlreiche Prüfungen über die Empfindlichkeit von Schimmelpilzen, Giften gegenüber, sind schon angestellt worden. Hier soll aus den Ergeb- nissen derselben nur erwähnt werden, daß Schimmelpilze wie auch Hefen im allgemeinen Giften gegenüber recht widerstandsfähig sind, und zwar in viel höherem Maße, als Algen und Blütenpflanzen. Diese Eigenschaft der Schimmelpilze ist von Bedeutung für den hier zu besprechenden Nachweis von Arsenik mit Hilfe gewisser Schimmelpilze, welche noch bei hohem Arsengehalt ihres Nährbodens gedeihen können. Die in Betracht kommenden Pilze entwickeln beim Wachsen auf arsenhaltigem Substrat charakteristischen Knoblauchgeruch und diese Geruchsreaktion ist eine derart intensive, daß sie zum Nachweis selbst kleinster Mengen von Arsenik Verwendung finden kann. Die Tatsache, daß in feuchten Zimmern mit arsenhaltigen Tapeten Knoblauchgeruch unter Umständen auftritt, war seit langer Zeit bekannt und ist schon 18:')9 von L. Gmelin und später von anderen P'orschern näher untersucht worden. Daß dieses Auftreten flüchtiger Arsenverbindungen aber auf die Einwirkung von Schimmelpilzen zurückzuführen ist. wurde erst 1892 von B. Gosio i) erkannt und wurde von ihm auch zu einer Me- thode des Arsennachweises ausgearbeitet. Der Nachweis von Arsen und seinen Verbindungen. Nicht alle, als Verunreinigung der Luft sich findenden Schimmelpilze . (Mucor-, Aspergillus-, Penicilliumarten) besitzen die Eigenschaft, feste Arsenverbindungen in flüchtige, nach Knoblauch riechende Verbindungen zu verwandeln. Diese Eigenschaft ist auf einige, von Gosio ..Arsenschimmel- ^) B. Gosio, Azione di alcune muffe sui composti fissi d'arsenico. Rivista d'igiene e sanitä pubblica. 1892. p. 201. — Derselbe. Action de quelques moisissures sur les compos^s fixes d'arsenic. Arch. italiennes de Biologie. T. 18. p. 253 (1893). — Der- selbe, Zur Frage wodurch die Giftigkeit arsenhaltiger Tapeten bedingt wird. Bcr. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. 30. S. 1024 (1897). — Die Entdeckung von Gosio wurde von 0. EmmerJing [Bcr. d. Deutsch, ehem. Gesellsch. 30. S. 1025 (1897)] angezweifelt, aber von zahlreichen Untersuchern, wie Cli. R. Sanger, Morpurgo und Brunner, Baumert, Abel und Buttenberg vollauf bestätigt. 1* 4 H. F ü h u e r. pilze" genannte Arten beschränkt und findet sich sehr gut ausgeprägt bei dem von diesem Forscher zum Arsennachweis empfohlenen Penicillium brevicaule.i) Man kultiviert den Pilz auf Kartoffelkeilen, hält die Kulturen bei Zimmertemperatur und impft 1 — 2mal im Jahre um. Die Kulturen sind mindestens 1 Jahr lang lebensfähig. Die alten mit einem Überzug von hell- braunen Sporen bedeckten Kulturen sind zum Überimpfen auf frische Kartoff el- stücke und auf Xährsubstrate, welche auf Arsen geprüft werden sollen, geeignet. Zur Herstellung frischer Kartoffelkulturen sticht man mit einem weiten Korkbohrer aus rohen, gewaschenen und geschälten Kartoffeln Zy- hnder aus. spaltet diese durch einen Schrägschnitt in zwei Keile, die man in Reagenzgläser bringt, auf deren Boden sich etwas Watte befindet. Die Reagenzgläser werden mit einem Wattepfropf verschlossen und entweder im Autoklaven bei l'Ö — 2 Atmosphären 20 — 30 Minuten oder im Dampf- kochtopf 1 Stunde sterilisiert. Man kann die Reagenzgläser auch, in ein Becherglas gestellt, in das kochende Wasserbad einhängen. . Über die Re- agenzgläser stülpt man ein weiteres Becherglas, läßt 1 Stunde im Wasser- bad stehen und dann, nach Abdrehen der Heizung, in demselben erkalten. Dieses Erhitzen und Abkühlenlassen wiederholt man an drei aufeinander- folgenden Tagen. Es hat den Zweck, die resistenten Kartoffelsporen zum Auskeimen zu bringen und die Keime nachher abzutöten. Hat sich am Boden der Reagenzgläser Kondenswasser angesammelt, so gießt man dieses ab und ersetzt die naß gewordenen Wattepfropfe durch neue in der Flamme abgebrannte. Auf die sterilen Keile impft man dann etwas braunes Sporen- material mit einem Platindraht in bekannter Weise, unter Vermeidung von Infektion durch Luftkeime, und bringt die Reagenzgläser in den Brut- schrank (Temperatur oO — 32"). Sind die Kartoffelstücke sehr naß, so wachsen die Pilze bis zur oberflächlichen Austrocknung, derselben langsam. Bei richtigem Feuchtigkeitsgehalt der Kartoffelstücke ist nach 24stün- digem Wachstum die Pilzkolonie schon gut sichtbar. Nach 2 Tagen hat sich ein weißer Pilzrasen gebildet. Nunmehr läßt man bei Zimmertemperatur weiter wachsen. Fig. 1 zeigt in einem Reagenzglase einen Kartoffelkeil und in dem daneben befindlichen einen solchen mit einer Schimmelpilzkultur nach drei- tägigem Wachstum. Die Kultur bildet einen rein weißen Rasen vom Aus- sehen eines Wattebausches. Etwa nach 2 Wochen beginnt die Bildung brauner Sporen. Als Nährboden für Penicillium brevicaule kommt zum Zwecke des Arsennachweises Kartoffelbrei und Brotbrei in Betracht. Kartoffel ist für manche Untersuchungen weniger geeignet als Brot, da ihre Wasserauf- nahmefähigkeit eine begrenzte ist. xlußerdem haben manche Kartoffelsorten einen eigentümlichen Geruch, welcher bei der Geruchsdiagnose des Arsens ^) Der Pilz kann von Dr. G. Grübler d- Co., Leipzig imd von VroL Kral, Prag, bezogen werden. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. Fig.l. störend sein kann. Darum ist nach Abel und Buttenherg i) Brot der Kar- toffel vorzuziehen, und zwar möglichst geruchloses Grau- oder Weilibrot nach Entfernung der Rinde. Bei richtigem Feuchtigkeitsgehalt wächst auf Brot und Kartoffeln Penicillium brevicaule rasch, auch wenn dieselben zur Arsendiagnose mit zerhackten Leichenteilen , Kot, Harn etc. vermengt sind. Penicillium brevicaule zeigt in Rein- kulturen, im Gegensatz zu anderen Schimmelpilzen, keinen muffigen Geruch, so daß der Knoblauchgeruch in Arsenkulturen rein zur Geltung kommt. Die wertvollste Eigenschaft des Penicillium brevicaule ist aber, daß der Knoblauchgeruch noch bei sehr geringen Arsenmengen auftritt. Nach Abel und Buttenherg ist die äußerste Grenze der Reaktion für die arsenige Säure 1/100 — 1/1000 ui^, für die wasserunlöslichen Produkte /S't7iee/6'sches Grün , Schweinf urter Grün, Realgar und Auripigment etwa 1/100 121^, während metalli- sches Arsen nur in Mengen von 1/10^ m^ an nachzuweisen ist. Auch die modernen organischen, als Arzneimittel dienenden Arsenver- bindungen, wie kakodylsaures Natron, Atoxyl, Arsazetin und Salvarsan, werden von Penicillium brevicaule unter Auftreten von Knoblauchgeruch zersetzt. Da die Empfindlichkeit der Reaktion mit der Empfindlichkeit des Geruchsorgans des Untersuchers schwankt, so kann die Methode nur zum qualitativen Arsennachweis dienen. Die flüchtigen, durch Einwirkung der Schimmelpilze entstehenden Verbindungen bestehen zum kleinen Teil aus Arsenwasserstoff, AsHs, zum Eeinkultur von Pünicilliura biuvicaulo. größeren, wie BigUielli"-) (1900) nachgewiesen hat, aus Diäthvlarsin, ^) R. Abel und P. Buttenherg, Über die Einwirkung von Schimmelpilzen auf Arsen und seine Verbindungen. Der Nachweis von Arsen auf biologischem Wege. Zeitschr. f. Hygiene u. Infektionskrankh. 32. S. 449 (1899). -) P. Biginelli, Zusammensetzung und chemische Konstitution des arsenikhaltigen Gases der Tapeten. (1. Mitteilung.) Atti R. Accad. dei Lincei Roma. (5.) 9. II. p. 210 und 6 H. Fübner. AsH(C2H5)2. Die Gegenwart von Arsenwasserstoff in den Gasen läßt sich objektiv durch die Bettendorf sehe Silbernitratprobe erweisen, wozu aller- dings bemerkt werden muß, daß in den Untersuchungsflaschen neben Arsenwasserstoff noch andere Silberlösung schwärzende Gase (Schwefel- wasserstoff) auftreten können. Wichtig ist, daß die Antimouverbindungen unter der Einwirkung von Schimmelpilzen keine riechende Verbindung geben. Hingegen erzeugen die Pilze bei Gegenwart fester Selen- und Tellurverbindungen, nach Maassen i), flüchtige riechende Verbindungen. Die Selenverbindungen liefern ein merkaptanähnlich riechendes Gas; die Tellurverbindungen aber ein solches, dessen Geruch von dem Arsenknoblauchgeruch nicht zu unterscheiden ist. Alle von Maassen untersuchten Schimmelpilze liefern mit Tellurver- bindungen diesen Geruch, dabei auch solche, welche Arsenverbindungen nicht vergasen, ein Unterschied, welcher sich differentialdiagnostisch verwerten läßt. Der Hauptvorzug der biologischen Methode des Arsennachweises gegenüber den chemischen Methoden besteht darin, daß organisches Ma- terial, z. B. von Leichen, direkt, ohne vorherige Zerstörung der organi- schen Substanz, zum Arsennachweis Verwendung finden kann. In einem Versuche an einem Kaninchen, welches mit bOmg arseniger Säure (in Form des offizinellen Liquor Kali arsenicosi [5^] in oOcm^ Wasser mit der Schlundsonde beigebracht) vergiftet worden war, konnte im Harn, der vor dem Tode des Tieres ausgeschieden wurde, in solchem, der aus der Blase des toten Tieres entnommen wurde, dann im Magen- und Darm- inhalt , in Xiere, Leber und Herz Arsenik durch die Pilzreaktion festgestellt werden, nicht hingegen im Gehirn des Tieres. Bei Abwesenheit von Tellur (Selen) hat sich die Methode nament- lich beim Vorhandensein viel organischen Materials mit geringem Arsengehalt oder in Fällen, wo zahlreiche Arsenproben neben- einander vorzunehmen sind, nützlich erwiesen. Sehr geeignet ist sie auch zur Verfolgung der A r s e n a u s s c h e i d u n g in den Exkreten bei therapeu- tischer Verwendung von Arsenpräparaten. Li forensischen Fällen kann sie nicht als ausschließliche Methode verwandt werden. Doch bei ihrer, der Marshschen Probe nahezu gleichkommenden Empfindlichkeit, wird sie als Vorprobe, welche mit einem nur äußerst geringen Arsen- verlust durch Vergasung verbunden ist und deren Material, wenn nötig, nachträglich zur weiteren chemischen Prüfung gebraucht werden kann, wertvolle Dienste leisten können. Ausführung der Prüfung.'-) Gekrümeltes, möglichst geruchloses Weiß- oder Graubrot (ohne Ptinde) wird mit dem zu untersuchenden, fein Gaz. chim. ital. 31. I. p. 58; refer. Chem. Zentralbl. 1900. II. S. 1067. (II. Mitteilung.) Ibidem. S. 1100. M A. Maassen, Die biologische Methode Gosios zum Nachweis des Arsens und die Bildung organischer Arsen-, Selen- und Telhirverbindungen durch Schimmelpilze und Bakterien. Arb. a. d. Kaiserl. Gesuudbeitsamte. 18. S. 475 (1902). -) Nach Abel und Butfenberg, 1. c. S. 464. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 7 zerkleinerten Material innig- gemischt und mit so viel Wasser versetzt, daß ein fester, nicht zu nasser Brei entsteht. Bei Flüssigkeiten wird so viel trockenes Brot zugesetzt, als zur vollständigen Aufsaugung nötig ist. Re- agiert das Untersuchungsmaterial alkalisch, so muß es mit Weinsäure neu- tral oder bequemer sauer gemacht werden. Der Säureüberschuß wird durch Zusatz von reinem Calciumcarbonat beseitigt. Desgleichen wird saures Ma- terial durch Calciumcarbonat, von welchem ein Überschuß vorhanden sein kann, neutrahsiert. In schwach saurem Material gedeihen die Pilze am besten. Die dicke Masse bringt man in Erlenmeyerkolben von mindestens 100 cm^ und gibt auf die Oberfläche noch Inseln von reinem feuchten Brot, damit sich auf diesen die Schimmelpilze erst ansiedeln und von ihnen aus das als Nährsubstrat oft weniger günstige Untersuchungsmaterial allmäh- lich durchwuchern können. Enthält das Untersuchungsmaterial anorganische Desinfektionsmittel, wie Quecksilberchlorid, Silber- oder Kupfersalze, so muß dasselbe erst mit Schwefelwasserstoff behandelt werden, da die Metalle das Pilzwachstum hemmen könnten. Flüchtige, desinfizierende Zusätze, wie Chloroform, Toluol, Formaldehyd. Phenole wird man zum Teil durch Erhitzen auf dem Wasser- bade entfernen, zum Teil durch reichliche Verdünnung des Materials mit Brot unschädlich machen können. Neben den Kulturen mit dem zu untersuchenden Material wird man stets eine Kontrollkultur anlegen, um festzustellen, ob das verwandte Brot und Wasser arsenfrei sind und die Pilzkultur entwicklungsfähig ist. Die mit Wattebausch verschlossenen Kolben werden nunmehr im Dampfkochtopf oder Autoklaven sterihsiert und nach dem Erkalten mit sporenhaltigen Kulturen beschickt. Hat man alte vertrocknete Pieagenzglas- kulturen, so kann man sie mit sterilem Brunnenwasser oder Nährbouillon durchschütteln und mit der Sporenaufschwemmung den Brei im Erlen- meyerkolben übergießen. Jüngere Kulturen auf Kartoffelkeilen läßt man am besten in toto in die Erlenmeyerkolben gleiten, natürlich mit der nötigen Vorsicht, um Luftinfektion zu vermeiden. Den Erlenmeyerkolben verschließt man gut mit abgebranntem Wattepfropf, darüber mit dichter Gummikappe und setzt ihn in den Brutschrank in eine Temperatur von oO bis 32«. Bei Gegenwart von Arsenik kann man in günstigen Fällen schon nach 24 Stunden und früher i) Knol)lauchgeruch wahrnehmen, der dann zunimmt, je mehr die Pilzrasen wachsen. Bei geringer Entwicklung muß man den Wattepfropf bei der Geruchsprüfung abnehmen. Hat man an einer kräftig riechenden Kultur gerochen, so muß man erst geraume Zeit zuwarten, bis man die Diagnose an einer schwach riechenden Kultur stellen kann. Der Geruch hält sich in den Kulturen, auch ohne (iummikappe und selbst bei kleinen Arsenmengen, mehrere Monate lang. M Beim Zusammenbringen einer frischen kräftig gewachsenen Pilzkultur mit arsenhaltigem Material in Pulverform, mit dem mau die Kultur einfach bestreuen kann, läßt sich Knoblaucligeruch oft schon nach 3 — 4 Stunden wahrnehmen. (Morpurgo und Brunner.) 8 H. Fühner. Bakterien. Die Bakterien (Scliizomyzeten , Spaltpilze) gehören morphologisch zu den niedrigsten Pflanzen und haben verwandtschaftliche Beziehungen zu den Algen und den Schlauchpilzen (Askoniyzeten). Sie sind einzeUig, fast immer chlorophyllfrei und besitzen meist Stäbchen- oder Kugelform. Man unterscheidet vegetative Formen, die sich durch einfache Querteilung vermehren, und Dauerformen, Sporen, welche auf geeignetem Nährboden ..auskeimen" und sich biologisch von den vegetativen Formen durch viel größere Besistenz gegenüber physikaUschen und chemischen Schädigungen auszeichnen. Yon den Bakterien leben manche als Saprophyten. Medizinische Be- deutung besitzen aber vor allem die parasitären Formen, die als Krank- heitserreger in Betracht kommen und zu deren Vertilgung — Desinfek- tion — man teils auf physikaUschem , teils auf chemischem Wege gelangt. An dieser Stelle können nur die chemischen Desinfektions- mittel und ihre Wertbestimmung an Bakterien als Testobjekten besprochen werden, Methoden, welche auf den grundlegenden Arbeiten über Desinfektion von Robert Koch'^) basieren. Bei der Prüfung von Desinfektionsmitteln an Bakterien müssen zwei Punkte streng unterschieden werden: Die entwicklungshemmende und die b a k t e r i e n t ö t e n d e Wirkung derselben. -) Bei Substanzen, welche z. B. als innere Desinfizientien an Menschen und Tieren angewandt werden, wird es zumeist genügen, wenn sie imstande sind, die Entwicklung der Bakterien zu hindern, ohne dieselben abzutöten. Die Entwicklungshemmung von Bakterien zu erreichen gelingt relativ leicht und durch viele, auch für den Tierkörper wenig giftige Stoffe. Zur iVbtötung derselben, sofern sie mit einem zu prüfenden Desinfektionsmittel überhaupt möglich ist, ist viel intensivere Einwirkung nötig. Alle bisher bekannten bakterientötenden Mittel sind auch für den Tierkörper giftig und es ist bis heute kein brauchbares Mittel gefunden, Bakterien im Tierkörper abzutöten, wie dies bei krankheitserregenden Protozoen möglich ist. Verbringt man Bakterien in einen Nährboden, der eine bestimmte Menge eines Desinfektionsmittels enthält, so wachsen sie darin nicht weiter; sie sind in ihrer Entwicklung gehemmt. Impft man sie aber auf einen ge- eigneten neuen Nährboden über, so wachsen sie normal. Zur Entwicklungs- hemmung der Milzbrandbazillen genügt nach B. Koch der Gehalt einer Nährgelatine von 1 : 1 Million an Quecksilberchlorid. In dieser entwicklungs- hemmenden Konzentration werden die Bakterien nicht primär abgetötet, sondern sie sterben erst sekundär an Degeneration nach langem Ver- weilen in dem gifthaltigen Nährboden. Bei der Entwicklungshemmung *) B. Koch, Über Desinfektion. Mitteilungen a. d. kaiserl. Gesundheitsamte. 1881. ^) Th. Faul, Entwurf zur einheitlichen Wertbestimmung chemischer Desinfektions- mittel. Berlin 1901. S. 5. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 9 kommt lediglich die Konzentration der giftigen Stoffe in Frage. Diese Konzentration ist für dasselbe Desinfiziens bei verschiedenen Hakterien- arten sehr verschieden und schwankt auch bei denselben Individuen sehr bedeutend je nach der Zusammensetzung des Nährbodens, der Temperatur, dem Feuchtigkeitsgrad, dem Alter der Kulturen usw. i) Verbringt man Ikkterien hingegen in starke Sublimatlösungen und läßt sie eine be- stimmte Zeit darin verweilen, so werden sie abgetötet und wachsen auch nach völliger Entfernung des an ihnen haftenden Giftes auf einem neuen Nährboden nicht weiter. Bei Abtötung- kommt neben der Konzentra- tion der Giftlösung noch ihre Einwirkungsdauer in Betracht, die im allgemeinen desto kürzer sein kann, je stärker die Lösung ist. Von ausschlaggebender Bedeutung für die desinfizierende Wirkung chemischer Produkte ist das Medium, in welchem sich die I)akterien be- finden. Gelingt es in feuchter Luft leicht, z. B. durch Chlor, Bakterien ab- zutöten, so ist dessen Wirkung in organischem Material sehr vermindert, da es zur Oxydation desselben verbraucht und für die IJakterien dadurch unwirk- sam wird. Auch Metallsalze, z. B. Sublimat, verlieren in eiweißhaltigen Lösungen, mit denen die Metallsalze Fällungen geben, viel von der Litensität ihrer Wirkung. Weniger ist diese Abnahme der Wirkung in Eiweißlösungen fest- zustellen bei aromatischen Desinfektionsmitteln (Phenol, Lysol usav.). Bei der Prüfung der Desinfektionsmittel erhält man, wie bei allen biologischen Wertbestimmungen keine absoluten, sondern nur relative Werte, die auf irgend eine Vergleichseinheit zurückgeführt werden müssen. Vergleichbar sind die Resultate verschiedener Versuche nur dann, wenn sie unter genau denselben Bedingungen ausgeführt sind. Die zu prüfenden Desinfektionsmittel werden, je nach dem Zwecke, dem sie dienen sollen, mit Substanzen von bekannter Wirksamkeit verglichen: so für die Luft- desinfektion mit Formalin, für Flüssigkeitsdesinfektion mit Subhmat oder Phenol, für Wunddesinfektionsmittel mit Jodoform. Da, wie gesagt, die entwicklungshemmende Wirkung chemischer Des- infektionsmittel unter sonst gleichen Bedingungen lediglich von der Kon- zentration der Lösung abhängt, während der bakterizide Wert gleichzeitig eine Funktion der Einwirkungszeit darstellt {Krönuj und Paul), so müssen auch die Methoden, welche dazu dienen, genannte Werte zu bestimmen, wesentlich von einander verschieden sein. Nachstehend sind die wichtigsten • heute gebrauchten Methoden wiedergegeben. 2) 1. Methoden zur Bestimmung der entwicklungshemmenden Kraft chemischer DesinfektionsmitteL Bei der Anstellung von Versuchen über Entwicklungshemmung ist es nötig, daß außer der Konzentration des zu prüfenden Desinfektion.s- ') Th. Paul, ]. c. S. 6. -) Ich folge in meinen Ausfüliriuigcii hier hauptsächlich der Darstellung von K. Laitlicnheimer in seiner Publikation: Phenol und seine Derivate als Desinfektions- mittel. Berlin 1909. 10 H. Fühuer. mittels alle anderen Bedingungen durchaus gleich sind, damit wirklich ver- gleichbare Resultate erzielt werden. Von solchen Bedingungen, die geeignet sind, das Resultat der Unter- suchung zu beeinflussen, ist in erster Linie die verschiedene Resistenz der benutzten Testbakterien zu nennen. Verschiedene Stämme derselben Bak- terienart können sich gegen schädigende äußere Einflüsse wesentlich ver- schieden verhalten. Auch die Zahl der dem Desinfiziens ausgesetzten Keime scheint das Ergebnis zu beeinflussen, und zwar in dem Sinne, daß vollständige Ent- wicklungshemmung bei größerer Einsaat schwieriger zu erreichen ist, wie wenn nur wenige Bakterien dem Nährboden zugesetzt werden. Ferner wird das Resultat wesenthch durch die Wahl des zur An- wendung kommenden Nährsubstrates beeinflußt. Je eiweißreicher ein Me- dium ist, in dem die entwicklungshemmende Kraft eines Desinfiziens ge- prüft wird , desto mehr wird letzteres in seiner Wirkung, den Bakterien gegenüber, beeinträchtigt werden. Dies gilt, wie schon oben bemerkt, in höherem Maße für die eiweißfällenden Metalle, wie Quecksilber und Silber, als für die Phenole und ihre Derivate. Wichtig ist dann auch, daß die Versuche bei bestimmter, sich gleich- bleibender Temperatur ausgeführt werden. Die Entwicklungshemmung, die ein Desinfiziens auszuüben vermag, wird am geringsten bei dem Tempe- raturoptimum des zur Prüfung verwandten Mikroorganismus sein. Je mehr die Temperatur sich von dem Optimum nach oben oder unten hin ent- fernt, desto mehr wird die Entwicklungshemmung in Erscheinung treten, was bemerkenswert ist insofern, als bei Bestimmung der keimtötenden Kraft eines Desinfiziens die Verhältnisse umgekehrt liegen. Da die Entwicklungshemmung bedeutend einfacher festzusteUen ist als die abtötende Wirkung einer Substanz, letztere aber viel wichtiger er- scheint, so wird die Prüfung der Entwicklungshemmung zumeist als Vorprobe in Betracht kommen. Substanzen, welche sich bei dieser Prüfung als sehr wirksam erweisen, werden mit größerer Wahrscheinhch- keit abtötende Kraft besitzen, als solche, die schon im ersten Falle ver- sagen. Als Testbakterien werden, je nach den Zwecken, welchen ein Desin- fektionsmittel dienen soll, verschiedene Arten in Betracht kommen. Viel gebraucht werden Diphtherie-, Typhus- und Kolil)azillen, dann aber nament- lich Staphylo- und Streptokokken. Die Bakterien verwendet man in 1 oder 2 Tage alter Bouillonkultur. Ausführung der Prüfung.^) In einer Reihe steriler Reagenz- röhren werden mit sterilem destillierten Wasser Verdünnungen des Des- infiziens hergestellt in steigender Konzentration, z. I). im Verhältnis 1 : 100, 1 :200, 1 : :-iOO, 1 : 400 usf. Von diesen Verdünnungen wird je 1 cm" mit steriler Pipette entnommen und in Röhrchen gegeben, die genau *) Nach K. Lanbenheimer, 1. c. S. 4. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. W 9 cni^ Bouillon enthalten. Es entsteht also eine weitere, lOfache Verdün- nung- des Antisepticums, das demnach in der Bouillon in einem Verhält- nis 1:1000, 1:2000 usw. enthalten ist. Nachdem auf die geschilderte Weise die Reihe vorbereitet ist. wird in jedes Iiöhrchen ein Tropfen der P>ouillonkultur der als Testobjekte dienenden Bakterien mittelst steriler Pipette eingebracht. Es wird so erreicht, daß eine annähernd gleiche Zahl von Keimen in der gleichen Menge desselben Xährmediums sich be- findet. Als Versuchstemperatur wird die für die betreffenden Bakterien optimale gewählt. Die Röhrchen w^erden jeden Tag auf Wachstum untersucht und Ent- wicklungshemmung dann angenommen, wenn die Bouillon während der Dauer der Beobachtung, Avelche 8 Tage beträgt, steril, d. h. klar bleibt. Zur Kontrolle dient ein Röhrchen , das nur 10 cm^ Bouillon plus einem Tropfen Bakterienkultur enthält. Diese Methode ist dann gut verwendbar, wenn die zu untersuchenden Desinfektionsmittel mit der Bouillon gemischt keine Trübungen und Nieder- schläge geben. Ist letzteres der Fall, so können die Resultate hierdurch unrichtig ausfallen und man wird statt Bouillon besser Agar verwenden, der dann zwar voraussichtlich auch durch das betreffende Desinfektions- mittel getrübt werden wird, aber die Trübung wird hier nicht so störend sein, wie in der Bouillon, weil der Nährboden, zu dünner Schicht erstarrt, genügend durchsichtig bleibt, um das Aufgehen der Bakterienkolonien er- kennen zu lassen, welche sich in voller Deutlichkeit von dem diffus ge- trül^ten Agar abheben.. Die Versuchsanordnung bei dieser Methode ist ähnlich wie die vor- stehend beschriebene , nur werden die von dem Desinfiziens hergestellten Verdünnungen in der Menge von 1 cin'^ nicht in Bouillon, sondern in 9 vin^ verflüssigten und auf 42« abgekühlten Agar gegeben. Eine gleichmäßige Verteilung des Antiseptikums im Nährsubstrat wird durch Umrühren mit einer Platinspirale erreicht. Nun erfolgt wieder die Beimpf ung der Röhr- chen mit je einem Tropfen der Bakterienbouillonkultur und nach noch- maUgem gründlichen \'ermischen mit der Platinspirale Ausgießen des Agars in Petrischalen. Entwicklungshemmung ist auch hier nur dann anzunehmen, wenn jegliches Bakterienwachstum ausbleibt, d. h. keine Kolonien, auch bei Beobachtung mit der Lupe, sichtbar werden. Das Arbeiten mit Agar ist zwar etwas umständUcher Avie mit Bouillon, aber die Beurteilung der Re- sultate ist leichter. 2. Methoden zur Bestimmung der keimtötenden Kraft chemischer Desinfektionsmittel. Zur Bestimmung der abtötenden Wirkung von Desinfektionsmitteln sind zahlreiche Methoden ausgearbeitet worden, als deren erste die von Bobert Koch angegebene ,,Seidenfadenmethode" zu nennen ist, welche auch heute noch vielfach Verwendung findet. Das Prinzip dieser Methode 12 H. Fühuer. besteht darin, daß sterile, etwa 1 cm lange Seidenfäden mit einer Bakterien- bouillonkultnr getränkt, im Brutschrank getrocknet und dann eine be- stimmte Zeit in das zu prüfende Desinfektionsmittel getaucht werden. Verbringt man die Fäden hernach, nach mögUchster Entfernung des Des- infektionsmittels, in sterile Bouillon, so läßt sich nach Verlauf eines Tages erkennen, ob die Bakterien abgetötet wurden oder nicht. Die Verwendung von Seidenfäden hat den großen Nachteil, daß es sehr schwierig ist, die Desinfektionsmittel wieder aus denselben zu ent- fernen. Die Substanzen werden zum Teil in die Bouillon mit übertragen und können hier Entwicklungshemmung hervorrufen und dadurch Abtötung vortäuschen. Dieser Übelstand wird vermieden, wenn statt der Seidenfäden mit ihrer porösen Oberfläche z. B. Gummistückchen (Johnston) oder Glasfäden (Buttersack) verwendet werden, oder, wie in dem Verfahren von Krönig und Paul, die böhmischen Tariergranaten. Die Methode von Krönig und Paul gilt als die exakteste aller bekannten Methoden und soll hier in der von K Lauhenheimer etwas ver- einfachten Form wiedergegeben werden. Prinzip der Methode. Schon M. Gruber ^) hatte eine Pteihe von Leitsätzen aufgestellt, die bei der Wertbestimmung von Desinfektionsmitteln zu berücksichtigen sind. Nach Krönig und Paul -) müssen hierbei folgende Bedingungen eingehalten werden. 1. Die für eine vergleichende A'ersuchsreihe benutzten Bakterien müssen gleiche Widerstandsfähigkeit haben. 2. Die Anzahl der zu den einzelnen Versuchen verwendeten Bakterien muß annähernd die gleiche sein. 3. Die Bakterien müssen in die desinfizierenden Lösungen gebracht werden, ohne daß etwas von dem Nährsubstrat, auf dem sie gezüchtet wurden, mit übertragen wird. 4. Die Desinfektionslösungen müssen während der Einwirkung stets die gleiche Temperatur haben. 5. Nach der Einwirkung der desinfizierenden Mittel müssen die Bak- terien wieder möglichst vollständig von diesen befreit werden. 6. Die Bakterien müssen , nachdem sie der Einwirkung der desinfi- zierenden Lösungen ausgesetzt wurden, auf gleichen Mengen desselben günstigen Nährbodens bei gleicher Temperatur, wenn möglich beim Opti- mum, zum Wachstum gebracht werden. 7. Die Zahl der noch entwicklungsfähig gebliebenen Bakterien muß nach Ablauf derselben Zeit festgestellt werden. Aus diesem Grunde können nur feste Nährböden benutzt Averden. 8. Handelt es sich um wissenschaftliche Untersuchungen, dürfen die Konzentrationen der Lösungen nicht nach Gewichtsprozenten verglichen ') M. Gruber, Über die Methoden zur Prüfung von Desinfektionsmitteln. Zentralbl. f. Bakteriologie und Parasitenkunde. Bd. 11. S. 115. (1892.) 2) Th. Paul, 1. c. S. 9. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 13 werden, sondern es müssen äquimolekulare Menj^en der betreffenden Stoffe zur Anwendung- kommen. Diesen Postulaten suchten Krönig und Paul durch folgende \' er- such sauordnung gerecht zu werden, i) Von den Bakterien wird eine wässerige Aufschwemmung bereitet und diese nach dem Filtrieren, durch das gröbere Teile entfernt werden, an sorgfältig gereinigte Tariergranaten gleicher Größe angetrocknet. Eine gewisse Menge dieser mit Bakterien beschickten Granaten bringt man in die auf einer bestimmten Temperatur gehaltene Desinfektionslösung, nimmt eine bestimmte Anzahl dei'selben nach verschiedenen passend gewählten Zeitabschnitten heraus und befreit sie durch Behandeln mit geeigneten Chemikalien, die ihrerseits wiederum durch Wasser abgespült werden, vom anhängenden Desinfiziens. Die Gra- naten werden darauf in Reagenzgläschen mit etwas Wasser geschüttelt, wobei die Bakterien von den Granaten losgesprengt werden. Hierauf mischt man die so erhaltene wässerige Bakterienaufschwemmung mit einem geeigneten, festwerdenden Nährboden, gießt in Petrischalen aus und stellt nach gewissen Zeitabschnitten die Zahl der bei einer bestimmten Tempe- ratur entwickelten Kolonien fest. Als Testbakterien werden von Dauerformen die durch B. Koch in die Desinfektionstechnik eingeführten Milz br and sporen und von vegetativen Formen Staphylokokken zumeist verwandt, und zwar am besten der resistente Staphylococcus pyogenes aureus. Ausführung der Prüfung. Böhmische Tariergranaten v.erden durch einen Satz von zwei Sieben sortiert, und solche ausgesucht, die einen Durchmesser von' 1'5 — 2 nun haben. Auf die absolute Größe der Granaten kommt es hierbei nicht an, sondern nur darauf, dal5 alle Gra- naten von gleicher Größe sind. Diese werden sorgfältig von anderweitigen Beimengungen befreit und dann dreimal mit auf 1 : .'J verdünnter roher Salzsäure gekocht. Die Säure wird durch gründliches Spülen zuerst mit gewöhnlichem , dann mit destilliertem Wasser entfernt. Es folgt eine Waschung mit absolutem Alkohol, mit Äther und wieder mit absolutem Alkohol und zum Schlüsse ein nochmahges Abspülen mit destilliertem Wasser. Die so gereinigten Granaten werden, vor Staub geschützt, ge- trocknet und schließlich im Heißluftschrank steriUsiert. Sie sind nunmehr zur Aufnahme der Keime bereit. Die Staphylokokkenkulturen verwendet man, nachdem sie 1 — 2 Tage im Brutschrank bei zirka ST-ö" gestanden haben. Die Milzbrandkulturen, zu deren Anlegung man am besten eine frische, aus der Milz einer un- mittelbar vorher an Milzbrand gestorbenen Maus gewonnene Reinkultur benutzt, hält man drei Tage lang bei zirka 1^4" C, um die IMldung von Sporen zu veranlassen. Die Zubereitung der Bakterienemulsion geschieht in folgender Weise. Von einer gut gewachsenen Schrägagarkultur wird der Bakterienbelag in IQcni,^ sterile physiologische Kochsalzlösung aufgenommen 1) Th. Faul, 1. c. S. 10. 14 H. Füll 11 er. und diese Aufschwemmung durch ein steriles doppeltes Faltenfilter filtriert, um gröbere Partikelchen zurückzuhalten und die Keime möglichst zu iso- lieren. Diese Suspension kommt mit 20 g der gereinigten Granaten in ein Erlenmeyerkölbchen und wird mit denselben gründlich geschüttelt. Die übrige Flüssigkeit wird abgegossen und die Granaten in einen Trichter gebracht, dessen Hals mit einem kleinen, losen Wattepfropf verschlossen ist. Man läßt gut abtropfen. Die vollständige Trocknung erfolgt in dem von Kröniy und Paul angegebenen sterilisierbaren Trockenkasten 0 (Fig. 2). Dieser Kasten besteht aus einem inneren rechteckigen flachen Kasten aus Nickelblech von 28 ('^^^ Länge, 11cm Breite und ^cm Tiefe, der mit einem Siebboden Fig. 2. Trockenkasten von Krönifj und Paul. (Nach Paul.) aus Nickeldrahtnetz versehen ist und zur Aufnahme der Granaten dient. Um gleichzeitig zwei verschiedene Sorten von Granaten trocknen zu können, ist der Kasten der Länge nach in zwei Abteilungen geteilt. Dieser Kasten steht innerhalb eines geräumigen, mit gut schließendem Überfangdeckel versehenen Blechgefäßes aus Zink in einer flachen Schale mit gekörntem, entwässertem Chlorcalcium. Zum Trocknen der Granaten, was etwa 12 Stunden in Anspruch nimmt, wird der Kasten in den Eisschrank ge- stellt. Bei der niederen Temperatur und vor Licht geschützt l)ehalten die Milzbrandsporen ziemUch lange ihre Widerstandsfähigkeit gegen Desinfi- 0 Trockenkasten (M. 55), Thermostat (M. 65), Platinsiebe (zirka M. 12) etc. sind von der Firma Dr. B. Bohrheck Nachfolger, Berlin NW., Karlstraße 20a zu be- ziehen. Nachweis und Bestimmung von Giften auf liiologischem Wege. 15 zientien; erst allniälilich geht diese zurück und nach Ablauf mehrerer Monate beträgt sie nur noch einen Bruchteil der ursprünghcheii. Die mit Staphylokokken beschickten Granaten müssen, trotz der Aufbewahrung im Eisschrank, innerhalb woniger l'age aufgebraucht werden. Die in dieser AVeise hergestellten Granaten können jetzt den Desin- fektionsmitteln ausgesetzt werden. Die Desinfektionsmittel selbst befinden sich in der Menge von 20 cm^ in kleinen Glasdosen mit über- Fig.s. greifendem Deckel, die zur Er- langung einer gleichmäßigen Temperatur der Lösungen auf das Drahtnetz eines Ostirahl- schen Thermostaten (Fig.3) gestellt werden. Wie schon früher er- wähnt, wird die Wirkung von Desinfektionsmitteln sehr we- sentUch durch die Temperatur beeinflußt, bei welcher die Ver- suche ausgeführt werden, und man wird nur dann unter sich vergleichbare Resultate erhal- ten, wenn bei allen Untersu- chungen gleiche Temperaturen eingehalten werden. Da die meisten Desinfektionsprozesse bei Zimmertemperatur vor sich gehen, wählt man zweckmäßig 18" als Temperatur der Des- infektionslösungen. Um auch im Sommer, wenn die Tem- peratur in den Laboratorien höher steigt, unter gleichen Bedingungen arbeiten zu kön- nen, befindet sich unter dem Drahtnetz des Thermostaten, das die Schälchen mit den Des- infektionsmitteln trägt , eine Kühlschlange aus Bleirohr, die an die Wasserleitung angeschlossen werden kann, so daß in ihr ständig kühles Wasser zirkuliert. Ein durch eine Gasflamme getriebenes Rührwerk sorgt für eine gleichmäßige \'erteilung der Wärme in dem Wasserbade. Nach etwa einer halben Stunde haben die Desinfizientien in dem Thermostaten die Temperatur von 18*^ angenommen und werden nunmehr mit den Testobjekten beschickt. Thorraostat nach Tr»7/(. Ostwald. ^Xach Paul.) 16 H. Fühner. Fig. 4. Man entnimmt zu diesem Zwecke dem Trockenkasten eine Anzahl der Granaten mit einer vorher ausgeglühten Pinzette mit P latinarmen und bringt sie auf ein kleines Platinsiebchen (Fig. 4), von dem sie alle gleichzeitig in die Desinfektionslösung geschüttet werden. Für jede zu gießende Agarschale Averden 5 Granaten benötigt. In dem Desinfiziens steht ein zweites Platinsiebchen, auf das die Granaten einzeln unter der Flüssigkeit mit steriler Pinzette aufgelegt werden. "Wollte man die Granaten auf dem ersten Platinsiebchen Hegend direkt in die Lösungen bringen, so würden sich kleine Luftbläschen, die den Granaten anhaften, nicht ver- meiden lassen. Eine gleichmäßige Benetzung der angetrockneten Keime mit den Desinfizientien würde aber dadurch verhindert. Nach bestimmten Zeiten werden die Platinsiebchen mit den Granaten herausgenommen und in ein Schälchen mit sterilem Wasser gebracht, um so den größten Teil des anhaftenden Desinfiziens zu entfernen. Die eigent- liche Unschädlichmachung des Desinfektionsmittels erfolgt in einer zweiten Ifeihe von Schalen, welche das zu diesem Zwecke geeignete Reagens enthalten, das seinerseits durch nochmaliges 10 Minuten dauerndes Waschen mit de- stilhertem Wasser zu entfernen ist. Der vorstehend geschilderte Waschprozeß muß mit ganz besonderer Sorgfalt ausgeführt werden, da bei allen Desinfek- tionsvorsuchen eine Hauptschwierigkeit darin be- steht, nach Ablauf der gewünschten Zeit die weitere Einwirkung des Desinfiziens möglichst schnell aufzu- heben und zu verhindern, daß Spuren des Mittels auf die Nährböden mit übertragen werden , wo sie entwicklungshemmend wirken können. Während es Geppert^) gelang, Subhmat durch Schwefelammon zu fällen und es so in eine für Mikroorganismen unschädliche Verbindung überzuführen, ist gerade für die in der Praxis wichtigsten Substanzen, Phenole und Kresole, kein Mittel bekannt, das sie in ihrer Wirkung zu neutralisieren vermöchte. Am meisten eignen sich zur Entfernung des Phenols und seiner Derivate verdünnte Alkahen, wie Ammoniak, Natron- oder Kalilauge, eine Methode, die auch von Krönirj und Paul empfohlen wird. Nach Laubenheimer aber gelingt es schon durch einfaches Wässern der Granaten, sowohl Desinfektions- mittel aus der Phenolreihe, wie auch Sublimat vollständig zu entfernen, und so ein besonderes Reagens zu ihrer Neutralisation entbehrlich zu machen. Das Wässern gestaltet sich nach genanntem Autor folgender- maßen : Die Granaten werden auf dem Platinsiebchen aus der Desinfektions- lösung nach der beabsichtigten Zeit herausgenommen und auf dem Sieb liegend für etwa eine halbe Minute in einer 2 cm hohen Petrischale durch Platinsiebchen. Nat. Größe. fNach Paul.) \) Geppert, Zur Lehre von den Antisepticis. Berliner klin. Wochenschr. 1889. S. 789. Nachweis und Bestimmung von Giften auf liiologischem Wege. {~^ Hin- und Herbewegen mit etwa bOcm^ sterilem destillierten Wasser ober- flächlich abgespült. Darauf kommen sie in eine zweite Schale mit 50 cm^ Waschwasser, worin sie 5 Minuten verweilen. Schliclilich werden sie ein- zeln mit steriler Pinzette in eine dritte Schale, die ebenfalls 50 f'y/<3 steriles Wasser enthält, eingelegt; hier bleiben sie nochmals 10 Minuten. Damit ist der Waschprozeß , der ungefähr 15 Minuten dauert, beendet. In der ersten Schale wird schon die Hauptmenge des Desinfiziens entfernt. Hier lälit man die Granaten aber nur ganz kurz, um eine Nachwirkung der wenn auch schon stark verdünnten Substanzen nicht aufkommen zu lassen. Die letzten Reste werden durch die zweite und dritte Waschung entfernt, wobei Sorge zu tragen ist, daß die Granaten in den Schalen möglichst isoliert hegen und daß sie ferner stets von frischem Wasser umspült werden, was durch vorsichtiges Bewegen der Schalen leicht zu erreichen ist. Nachdem die Granaten so behandelt, werden sie mit steriler Pinzette zu je 5 Stück in Reagenzröhrchen übertragen, die Pycni^ steriles Wasser enthalten. Die so mit Granaten beschickten Röhrchen werden serien- weise, zu je 6—9 Stück, in der Hand kräftig geschüttelt, um die an- haftenden Keime abzulösen und in das Schüttelwasser überzuführen. L)abei ist darauf zu achten, daß nicht etwa Wassertröpfchen an den Watte- pfropf gelangen , wodurch viele Keime der Untersuchung entzogen werden könnten. Die in dem Wasser suspendierten Keime können nunmehr auf das Nährsubstrat übertragen werden, um die noch lebensfähigen Individuen zur Entwicklung zu bringen. Um aber den Vorgang der Abtötung von Bakterien durch ein Desinfiziens quantitativ verfolgen zu können, müssen die noch vermehrungsfähigen Keime gezählt werden, was nur mit Hilfe fester Nährböden möglich ist. Hierbei kommt in erster Linie Nähragar in Betracht, da nach Einwirkung der Desinfektionsmittel die Mikroorganismen bei optimalen Temperaturen, also meist bei oT"^, gehalten werden sollen. Zu empfehlen ist ein 2°/oiger Agarnährboden, aus bestem Rindfleisch hergestellt. \'on dem verflüssigten und auf 42** abgekühlten Agar werden l'2c)n^ in die Röhrchen gegeben, welche die von den Granaten abgeschüttelten Keime enthalten. Dabei müssen die Röhrchen während des Zugießens des Agars ständig um ihre Längsachse gedreht werden, damit von dem herabfließenden Nährboden die Innenwände vollständig bespült und alle keimhaltigen Wassertröpfchen aufgenommen werden. Mit einer Platinspirale wird dann der xA.gar und das Schüttelwasser mit den abgelösten Keimen vermischt und in Petrischalen ausgegossen. Es ist notwendig, von den nach den ein- zelnen Einwirkungszeiten hergestellten Proben mehrere Kulturen anzulegen und aus der oft schwankenden Zahl der aufgegangenen Kolonien das Mittel zu ziehen. Drei Proben genügen nach Lauhenheimer. Nach einer dreitägigen Bebrütungszeit der Platten erfolgt die Aus- zählung der zur Entwicklung gelangten Kolonien, d. h. es wird festgestellt, wie viele Keime nach bestimmter Einwirkungszeit des Desinfiziens noch vermehrungsfähig geblieben sind. Die Platten länger wio :'. Tage im Brut- schrank zu lassen ist nicht nötig. •• Abderhalden. Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. ') 18 H. Fühner. Will man an Stelle von Staphylokokken und Milzbrand andere patho- gene Bakterien, z. B. Diplitheriebazillen oder Streptokokken, zu den Prü- fungen verwenden, so ist die Granatenmethode nach H. Bechhold^) nicht brauchbar, da diese Bakterien durch das Austrocknen stark geschädigt werden. Über eine Methode , welche in diesem Falle benutzt werden kann, vgl. H. BechJwld und P. Ehrlich^-) und H. Bechhold.^) Zur Prüfung von Wundstreupulvern als Ersatzmittel für das Jodoform kann eine von B. Heile*) angegebene Methode Verwendung finden. Protozoen. Die, wie die Bakterien, einzelligen Protozoen werden von der zoologischen Systematik an den Anfang der Tierreihe gestellt. Als para- sitäre Erreger zahlreicher Krankheiten, darunter der Malaria, der tro- pischen Schlafkrankheit und der Syphilis, besitzen sie hohe medizinische Bedeutung. Die pathogenen Protozoen unterscheiden sich von den pathogenen Bakterien biologisch vor allem dadurch, daß sie eine viel geringere Resistenz äußeren Faktoren gegenüber als letztere besitzen. Dies bedingt, dal^ eine Kultur derselben außerhalb des Tierkörpers bisher nicht gelungen ist, da- mit hängt aber auch zusammen , daß Wertbestimmungen chemischer Büttel zu ihrer Abtötung außerhalb des Tierkörpers nicht die praktische Be- deutung zukommt, wie bei den Bakterien, da Übertragung der Para- siten durch Wasser, Gebrauchsgegenstände etc. kaum vorkommt. j\Iit der geringen Widerstandsfähigkeit der pathogenen Protozoen gegenüber Ver- änderungen ihres chemischen MiUeus hängt auch zusammen, daß bei ihnen, im Gegensatz zu den Bakterien, eine Abtötung im tierischen Or- ganismus durch Arzneimittel unter günstigen Bedingungen gelingt, wie dies seit langer Zeit von der Malaria durch Chinin, von der Syphilis durch Quecksilber bekannt ist. Gifte, denen sich die Arsenpräparate in ihren Wirkungen anreihen. Auf die bekannten ..chemotherapeutischen" Untersuchungen von Ehrlich und seinen Schülern zur Auffindung praktisch brauchbarer orga- nischer Arsenverbindungen für die Bekämpfung der Schlafkrankheit, der Syphilis und anderer Protozoenerkrankungen von Mensch und Tieren kann hier nicht eingegangen werden. Hinsichtlich der Methodik der Wert- M H. Bechhohl, Desinfektionsmittel niul ihre Prüfung. Zeitschr. f. angewandte Chemie. Bd. 22. S. 2033 (1909). -) H. BechhoJd und P. Ehrlich, Beziehungen zwischen chemischer Konstitution und Desinfektionswirkung. Zeitschr. f. phjsiol. Chemie. Bd. 47. S. 177 (1906). ^) H. Bechhohl, Halbspezifische chemische Desinfektionsmittel. Zeitschr. f. Hygiene u. Infektionskrankh. Bd. 64. S. 113 (1909). *) B. Heile, Experimentelle Prüfung neuer Antiseptica. Sammlung klin. Vorträge (Volkmann). N. F. Xr. 388. Leipzig 1905. Nachweis und Bestimmung von Giften auf liinlogischem Wege. I9 bestimmung' derartiger Substanzen im Tierversuch sei auf die einschlägige Literatur \) verwiesen. An dieser Stelle sollen lediglich die einfach auszuführenden Prüfungen an leicht zugänglichen und kultivierbaren Protozoen besprochen worden. Als solche kommen Süß wasserin fusorien und von diesen in erster Linie ..Paramäcien'" in Betracht. Derartige an Infusorien angestellte Versuche besitzen wenigstens als Vor proben für die Prüfung an pathogenen Formen einige Bedeutung, insofern viele Gifte, wie das Chinin, die arsenige Säure und die Quecksilbersalze, sich auch hier als sehr wirksam erweisen. Die Herstellung einer „Paramäcienkultur" kann nach R. Hertivifj-) in folgender Weise geschehen. Teilstücke der Kiemen und des Fußes der Teichmuschel (Anodonta) werden ins Wasser gelegt, worauf sich nach einigen Tagen Paramäcien am Wasserrande oben ansammeln. Diese über- trägt man mit gut gereinigter Pipette in etwa 10 1 haltende Flaschen, die als Zuchtgefäße mit stark geschütteltem, altem, ausgefaultem Teich- wasser gefüllt sind und hängt darein an einer Schnur ein Gazebeutelchen mit zerkleinerten Salatblättern. Das Gazebeutelchen mit den Blättern verbringt man vor dem Einhängen für einige Zeit in kochendes Wasser. Bald entwickeln sich in der Flasche zahlreiche Fäulnisbakterien, die den Paramäcien zur Nahrung dienen. Die Salatblätter muß man etwa alle 4 — 6 Wochen wechseln. Namentlich in den Wintermonaten gelingt das Anlegen einer solchen Kultur schlecht. Man verschafft sich dann am besten Impfmaterial aus einem zoologischen LTniversitätsinstitut. Eine gute Kultur kann sich jahre- lang halten. Man entnimmt die Tiere von der Oberfläche der Flüssigkeit. Aus Heuaufgüssen (Heu . das man mit Leitungswasser übergießt und vor Staub geschützt faulen läßt) bekommt man gewöhnlich nicht die großen Paramäcien, sondern kleinere Formen, meist Colpidien. Die häufig vorkommenden Paramäcienformen sind Paramaecium Aurelia und P. caudatum. Fig. 5 zeigt, einer Arbeit von H. Koreiit- schewshy^) entnommen, Paramaecium caudatum, und zwar A und B in normalem Zustande, C — F nach Vergiftung. Die Länge des Tieres be- trägt 0*1 — 0'^6mui. Eine Vertiefung in dem Tiere, die den Zugang zur jNIundöffnung (b) darstellt, heißt Peristomum (p). Vom Munde (h) aus führt das Schlundrohr (f) zu einer Nahrungsvakuole (d), w^ohin die aufgenommene Nahrung (Bakterien) gelangt. Nachdem diese Nahrungsvakuole eine gewisse ') Kisskalf uml Harfmann , Traktikum der Bakteriologie und Protozoologie. T. II. Jena 1910. — 0. Neven, Über die Wirkungsweise der Arzneimittel bei Trypanosomiasis. Dissertat. Gießen 1009. — ./. Morgenroth und L. Halb) rstaedfer , Über die Beoin- flussung der experimentellen Trypanosomeninfektion durch Chinin. Sitzungsber. d. K. preuß. Akademie d. Wissensch. l'hysikal.-mathemat. Klasse, 1910. S. 732. — P. Ehrlich und 6'. Hata, Die experimentelle Chemotlierapic der Spirillosen. Berlin 1910. ■-) Zitiert nach S. r. l'rowacek, Taschenbuch der mikroskopischen Technik der Protistenuntersuchung. Leipzig 1909. S. 70. 2. Aufl. ') W. Korentschewskij, Vergleichende pharmakologische Untersuchungen über die Wirkung von (Üften auf einzellige Organismen. Arcliiv f. oxporim. Pathol. u. l'harmakid. Bd. 49. S. 7 (1903). 9* 20 H. Fühner. Fig. 5. Größe erreicht hat, löst sie sich vom Schlund ab und vollführt ihren Kreis- lauf im Körper der Infusorie (d^ — dg), wobei die Nahrung allmählich ver- daut und aufgesogen wird. An Stelle der abgegangenen Vakuole bildet sich eine neue. Das Fortführen des Wassers, der löslichen Extraktivstoffe etc. wird mittelst zweier pulsierender Vakuolen (a) bewerkstelligt. Die Flüssig- keit sammelt sich in denselben durch Vermittlung von 8 Bildungsvakuolcn an. Das Pulsieren geschieht rhythmisch , in regelmäßigen Zeitzwischen- räumen und ist abhängig von der Temperatur, vom Sauerstoff des Wassers und von vielen anderen Einflüssen auf die Infusorie. Das ganze Tier ist von einer festeren Ecto- plasmaschicht l)edeckt. Unter dieser befinden sich nadelartige Bil- dungen , Trichozysten (x) genannt, die auf Reizung hervorge- streckt werden. Im Protoplasma liegt außerdem der INIacro- nucleus (e) und der Micronucleus (i). Fig. 5 C zeigt ein Tier nach der Einwir- kung einer verdünn- ten Natronlauge (1:5000-1:7000), welche nicht mehr töd- lich wirkt, sondern nur Quellung und Klärung des Protoplasmas zur Folge hat. Fig. D—F zeigt die Einwirkung von freiem Coffein. Durch das Coffein wird Paramaeciuni caudatum. A Normal, Vergr. 230. B Normal ; halbschematisch. Vergr. 130. C — F in gleicher Vergr. mit JB vergleichbar. C Nach Alkaliwirkung. D — F Nach Coffein- wirknng. (Nach Kortnt seh ewsky.) (am besten in einer Konzentration 1:1400) vor allem eine Veränderung der pulsierenden Va- kuolen hervorgebracht. Das Pulsieren wird langsamer und hört schließlich ganz auf. Die Vakuolen vergrößern sich zugleich mehr und mehr, vereinigen sich schließlich und das Tier nimmt Kugelform an. Trotz dieser starken anatomischen Veränderung können sich solche Tiere noch lebhaft bewegen und werden durch die genannte Konzentration nicht getötet. Das Coffein ist überhaupt für Paramäcien auffallend wenig giftig. Meist wird man in quantitativen Versuchen an Protozoen davon ab- sehen, die genaueren anatomischen Veränderuiigen der Tiere zu verfolgen, sondern sich damit begnügen, die tödlichen Grenzdosen der Gifte Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 21 festzustellen. Dies geschieht am besten durch Prüfung auf dem (Mtjekt- träger „im hängenden Tropfen" (in einer kleinen feuchten Kammer), wo- bei man je einen Tropfen Protozoenkultur und zu prüfende Lösung ver- mischt. Genaue wirksame Grenzdosen festzustellen ist häufig nicht mög- lich, da einzelne Individuen in einer Probe sich als viel widerstandsfähiger erweisen, wie andere. Beim Tode der Infusorien beobachtet man unter dem Mikroskop ein Zerfließen und Platzen derselben und als totes Tier bleibt nur noch ein leeres Gebilde zurück, das von JS'euhaus^) als ..Schatten" bezeichnet wird, da es an die lUutkörperchenschatten erinnert. Wie durch derartige Versuche an Infusorien Ilesultate erhalten wer- den können, die den Verhältnissen bei pathogenen Protozoen entsprechen, zeigen die bekannten Untersuchungen von Binz^) über die Wirkung des Chinins. Noch Lösungen 1:50000 des salzsauren Salzes lähmen Para- mäcien nach einigen Stunden, während Lösungen von 1:5000 innerhalb 25 — 30 Minuten den Tod der Tiere herbeiführen. Salzsaures Cinchonin und Cinchonidin erweisen sich dagegen mehrfach schwächer wirksam. was auch ihrer geringeren antipyretischen Kraft entspricht. . Daß aber derartige \'ersuche auch andere Resultate ergeben koinien als die Prüfungen am kranken Tier und Menschen , lehren die Unter- suchungen von Tappeiner ^) und seinen Schülern. Von diesen Untersuchern waren Derivate des Chinolins und Acridins aufgefunden worden, die im Paramäcienversuch bedeutend stärker als Chinin wirkten, sich aber bei der Behandlung von Malariafällen als unwirksam erwiesen. Blut Frisches (..lebendfrisches'') lUut verschiedener Tiere findet sowohl zum qualitativen Nachweis von Giften, wie auch zur (piantitativen P)estimmung derselben Verwendung auf Grund mehrerer ihm zukommender Eigen- schaften. Das aus dem Pdutgefäße ausfließende I>lut gerinnt je nach der Tier- art mehr oder weniger rasch meist schon nach einigen ^Minuten. Äußere ITmstände können die Gerinnung beschleunigen oder hemmen. Bei der Gerinnung, welche unter chemischer Beteiligung von Kalksalzen erfolgt, verwandelt sich das im Blutplasma gelöste Fibrinogen in Fibrin- *) H. Neuhans, Versuche über Gewöhnung an Arsen, Antimon, Quecksillier und Kupfer bei Infusorien. Arch. internation. de Pharmacodyn. et de Thörap. '1". 20. p. 35)8 (1910). '-) Vgl. C.Binz, Vorlesungen über Pharmakologie. 2. Aufl. S. 552 und ferner G. Grethc, Über die Wirkung verschiedener Chininderivate auf Infusorien. Deutsch. Arch. f. klin. Med. Bd. 5(5. S. 18mal. Von anderen Blutarten kommt hier noch das von Kaninchen und Meerschweinchen in Betracht. Kaninchenblut entnimmt man ohne Schädigung des Tieres in Giengen bis zu 5 und lOciii^ aus einer Ohrvene. Dazu eignen sich lang- ohrige Tiere besser als kurzohrige. Etwas unterhalb der Mitte des einen Ohres klemmt man am äußeren Rande eine Arterienklemme fest, um venöse Stauung herbeizuführen. Ein Gehilfe hält dann das Tier mit beiden Händen am Kopf, eine Hand über die Augen legend, die andere am Hinterkopf. Mit dem Arm dieser zweiten Hand hält er das Tier gegen seinen Körper angedrückt fest. Man entfernt mit einer Schere die Haare an einer Stelle der gestauten und stark hervortretenden Vene und wäscht diese Ohrgegend mit einem in 2''/oige Natriumcitratlösung getränkten Wattebausch ab. Das Blut entnimmt man mit einer Injektionsspritze (Rekordspritze) von 2 oder 5 cm^ (Fig. 6), welche man mit 2Voi8er Natriumcitratlösung ausgespritzt hat (um Gerinnung bei der Blutentnahme zu vermeiden). Man sticht mit der scharfen und nicht zu engen Nadel in die gestaute Vene parallel zu dieser und gegen den Blutstrom (also nach der Ohrspitze zu) (Fig. 7) die Nadel der leeren Spritze ein und zieht den Stempel derselben langsam zurück. Ist man im Lumen der Vene, so füllt sich dabei die Spritze mit Nachweis imd Bestimmung von Giften auf biologischem Wcfre. 28 Blut. Ist dies geschoheii, so entleert man den Spritzeninhalt in einen mit physiologischer Kochsal/lösung- ausoespiilten Mellzylindcr mit Stöpsel und schüttelt hier mit einigen Glasperlen, um Gerinnung herbeizuführen, durch. Man verdünnt dann mit physiologischer Kochsalzlösung bis auf das ge- wünschte Volumen und filtriert durch einen losen Wattebausch vom Fibrin ab. Nach Herausnahme der Spritzennadel aus der Ohrvene kann man die Klemme, welche zur Stauung der Vene diente, nunmehr an der Einstich- stelle für einige Zeit anbringen, um weitere Blutung zu Fig. ß. verhindern. Stärkere Blutfüllung am Kaninchenohr und besseres Flielien des Blutes erzielt man durch Abwaschen des (Jhres mit einem mit Toluol oder Xylol getränkten Wattebausch. Braucht man größere Blutmengen, so entnimmt man diese am besten aus einer in Äther- oder Urethannarkose des Tieres freigeleg- ten 1) Halsarterie (Ca- rotis). Man präpa- riert diese in mög- • liebster Ausdehnung frei, legt dann zw^ei Ligaturen möglichst weit oben ( köpf wärts) Fig. 7. 1,0 — Rekordspritze. massage kann \'on mittelgroljen Kaninchen 1 M e e r s c h w e i n c h e n 1 ) 1 u t in ^jo cni Entfeniung voneinander an und schneidet zwischen beiden Ligaturen das Gefäß durch. Man legt dann das frei- l)ewegliche Gefäß- ende in einen Zy- linder mit Glasstöp- sel und schneidet es nahe der Ligatur an. Das Blut spritzt in starkem Strahl in das Gefäß. Durch Kompression des Bauches und Herz- man die ausfließende assen sich SO kann man , Blutentnabroe aus dem Kaninchenohr. Blutmenge noch etwas vermehren -100 c^//'' Blut gewinnen, ohne das Tier zu schädio:on ent- in Mengen von 2 — h cm^ direkt aus dem Herzen mit der Spritze nehmen. Hierzu spannt man ein großes Tier auf einem Brette auf, durch ^) Präparation siehe hei /.'. /•'. Fuchs, Physiologisclies rraktikum für Mediziner. Wiesbaden 1906. S. 62. 24 H. Fübner. Festbinden an den Beinen und Fixieren des Kopfes. Dann wird der Tliorax zur Orientierung über den Herzschlag abgetastet und auf der linken Seite geschoren. Nach Entfernung der Haare kann die Haut etwas gewaschen werden. Mit einer Pvekordspritze mit weiter scharfer Xadel sticht man in der Herzgegend auf der linken Seite des Brust])eins zwischen den Rippen ein und zieht den Stempel an. Kommt kein Pdut, so zieht man die Spritze wieder heraus und macht an anderer Stelle einen neuen Einstich. Bei gutem Gehngen der Blutentnahme erholt sich das Tier rasch nach dem Losbinden von dem Brett und kann nach längerer Zeit von neuem punktiert werden. AVill man das Tier ganz entbluten, so geschieht dies durch Ein- schnitt in den Hals und Abwärtshalten. Ein großes Tier hat bis zu 14 cni'^ Blut. Zur biologischen Charakterisierung von Giften finden zwei Eigen- schaften des Blutes Verwendung: 1, diejenige, daß die roten Blutkörperchen durch viele Agenzien derart geschädigt werden, daß die den roten Inhalt bildende Hämoglobin- lösung austritt, ein Vorgang, welcher Hämolyse (Hcuiihurger) ge- nannt wird, 2. diejenige, daß die roten Blutkörperchen durch manche Gifte zu- sammengeballt, verklebt werden, eine Erscheinung, die man als Aggluti- nation oder Konglutination bezeichnet. 'ö 1, Hämolyse. Das normale Blut ist auch in dünner Schicht undurchsichtig, ..deck- farben"; durch die Auflösung der Blutkörperchen wird es vollkommen klar und durchsichtig, ..lackfarben". Die Aufhellung der undurchsichtigen Blut- schicht, das Durchsichtigwerden, ist das Kennzeichen der eingetretenen Hämolyse. Abgesehen von mechanischen Einwirkungen (Zerreiben mit Sand) oder Temperaturwechsel (Gefrieren und Wiederauftauen, Erwärmen auf 60 — 70*') kann Hämolyse herbeigeführt werden durch folgende Substanzen: 1. Wasser. 2. Säuren und Basen. B. Fettlösende Substanzen. 4. Spezifische Blutgifte. Die roten Blutkörperchen sind kleine mit Flüssigkeit gefüllte Säck- chen. Sie besitzen eine semipermeable Hülle, welche zum Teil eiweiß-, zum Teil fettartiger Natur (Lipoide: Cholesterin, Lecithin) ist. Der Inhalt der Blutkörperchen ist beim höheren Wirbeltiere mit einer Lösung von etwa 0-9"/o Kochsalz oder einer solchen von 8*5 Vo Bohrzucker ,, isotonisch". In derartiger Lösung werden Blutkörperchen, z. B. des Rindes, weder schrumpfen (durch Austritt von W^asser durch die semipermeable Hülle), noch an ^'o- lumen zunehmen (durch Wasseraufnahme). Schrumpfung der Blutkörper- chen, welche hierbei sogenannte StechapfeLform annehmen, findet statt in mehrprozentigen .,hyperisotonischen'' Salzlösungen, N'olumzunahme in ..hy- poisotonischen" Lösungen, z. B. von OßVo NaCl. Wird die Salzlösung, in welche die Rinderblutkörperchen gebracht werden, noch weiter ver- IflWfEKTT UKItAKT M C. SiaU Colltie Nachweis uiiil Bestiminiuifj' von (üitoii auf liiologisclioni Wcjre. •>;"■) dünnt, so ist ihre ^'oll^Hznllahme eine derartig starke, daß die Hülle gesprengt ^Yird, also lliimolyse eintritt. Manelie lUutarten. z. B. Hundeblnt. sind gegen- über Verniinderunii' des osnioti.schen Druckes vielenipfindliciier als llindcrltlut. Mit Frosehblutkörperclien ist eine 0"6Voige Lösiniii von Na("l im osmotischen Gleichgewicht. Die Ilämolyse dm'ch Alkalien und Säuren ist in erster Linie auf das Vorhandensein freier OH- und H-Ionen zurückzuführen. Doch nicht aus- schließlich. Lösungen organischer Säuren und Alkalien wirken stärker hämolytisch, als man nach ihrer lonenkonzentration erwarten sollte {Fiilnier und Ncuhmur'^). Hämolyse durch Kaliumhydroxyd wird herbeigeführt bei einer Konzentration von ü"04o/o im Blute, durch Ammoniak von 0"4" o und durch Trimethylamin von 0-5«/o. Ebenso von 0-002Vo Salzsäure. OOOTVo Ameisensäure und 002Vo Essigsäure. Bei der Plämolyse durch Säuren, z. T. auch durch Alkalien, findet Braunfärbung des gelösten Blutes statt, infolge von Hämatinbildung. Eine große Gruppe hämolytischer Agenzien bilden die Lipoide (Cho- lesterin, Lecithin) lösenden Substanzen. Diese Gruppe fällt größtenteils mit der pharmakologischen Gruppe der indifferenten Nai'cotica zusammen. Hierher gehören Chloroform, Chloralhydrat , Äther, Alkohole, L^rethane. Ester. Um eine Vorstellung von der Wirkungsstärke dieser Substanzen zu geben, sei erwähnt, daß (nach Fähner und Neuhauer) die hämolytische Wirkung auftritt beim Äthylalkohol in Konzentration von 15°/„, Athyl- urethan 9Vo und Äthylacetat (Essigester) 4o/o- Chloralhydrat ist etwas wirksamer als Äthylacetat. Die hier angegebenen Werte sind nur relative, unter sich vergleich- bare, keine absoluten. Unter anderen Versuchsbedingungen (z. B. anderer Zeitdauer der Einwirkung, anderer Temperatur) erhält man andere Werte. In einem in Fig. 8 wiedergegebenen Versuche ist die hämolytische Grenze für den Äthylalkohol bei etwa 137o gelegen. In diesem \'ersuche wurden zu je 5 crn^ Alkohollösung ö cin^ ö^/oiger Blutaufschwemmung gegeben. Die Alkoholkonzentration der 10«»^ Flüssigkeit betrug 11 — 16%. Der Versuch wurde bei Zimmertemperatur ausgeführt. Eine Stunde nach dem Ansetzen des Versuches lag die hämolytische (irenze bei 16Vo- ^-^^i^'h drei Stunden bei lö^/o. Die photographische Aufnahme wurde erst 20 Stunden nach dem Ansetzen der Proben gemacht. Die Hämolyse durch die bisher genannten Substanzen besitzt zum Nachweis von Giften keine nennenswerte praktische Bedeutung. Man könnte sie aber z. B. verwerten zur ([uantitativen Bestimmung von Fusel- öl (Gärungsamylalkohol) im Äthylalkohol, da die höheren Alkohole hämolvtisch wirksamer sind, als die niederen. =) Praktisch wichtig ist die ') Jf. Fiihner und E. Nettbauer , Hämolyse durch Substanzen homologer Reihen. Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 56. S. 344 (l'JOT). ^) A. J. ./. VainJeveldc, Üher die Anwendung liiohigischor Methoden zur Analyse von Nahruugsstoffen. Biochem. Zcitschr. Bd. 1. S. 1 llitOG) uiul II. nUnur und K. Neu- bauer, 1. c. 2^ H. Fühiier. Hämolyse aber hauptsächlich zum Nachweis der spezifischen Blut- gifte, welche sich vor den bisher genannten Substanzen durch eine hämo- lytisch außerordentlich viel größere Wirksamkeit auszeichnen. Zu den spezifischen Blutgiften gehören in erster Linie artfremde Sera. Normales Blutserum einer Tierart kann die Blutkörperchen einer anderen auflösen. Starke Hämolysine finden sich dann in giftigen tieri- schen Sekreten, wie dem Gifte von Schlangen, Kröten, Spinnen, Bienen. Ferner gehören, als toxikologisch wichtig, namentlich zahlreiche Pflanzen- produkte hierher. Schon manche Bakterien produzieren hämolytisch wirk- Fig. S. Hämolyse durch Äthylalkohol. same Stoffe; auch finden sich solche in höheren Pilzen, nach Kohert z. B. in dem sehr giftigen Knollenblätterschwamm, Amanita phalloides und nach Boehm in der Lorchel, Helvella esculenta. Vor allem aber gehört hierher die Gruppe der Saponine und ihnen nahestehender Pflanzengifte, welche in zahlreichen Pflanzen vorkommen. Aus einer größeren Tabelle von B. Koherf^) sei hier die Wirkungs- stärke der wichtigsten Saponine wiedergegeben, verglichen mit Chloral- liydrat und Solanin. 1) R. Kohert, Beiträge zur Kenntnis der Saponinsubstanzen. Stuttgart 1904. S.18. — Vgl. ferner ./. Gadamer, Lehrlnich der chemischen Toxikologie. Göttingen 190V). S.444. Niicliweis iiiul Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. U I) Cliloralhydrat Solanin Guajaksaponin Quillajasapotoxin (Juillajasaui'c {als Xa-Salz) . . . Saponin. puriss. Merck Roßkastanicnsaponiii Senegin Agrostommasapotoxia Agrostemmasaponin Levant. Seifenwurzclsapotoxin Molanthin des Sclnvnrzkümmels Digitonin des Fiugerliuts . . . Cyclamin des Alpenveilchens Sarasaponin der Sarsaparille . . Dioscin der Dioscorea Tok. Mak. Völlipu Häinolyse erfolgt noch bei 1:20 1 :«:3(J0 löst kaum 1 : 1(1000 1 : 101)00 1:10000 1:12000 1:12000 1:15000 1 : 50000 1 : 20000 1 : 75000 l:8OU00 1 : lOOüOO 1:125000 1:400000 Autor Kruskftl Kohert Frlehoes Koh/rf IIojIdkoiu l'achoriikoiv Weil. Kohert Atlas Kriiskal H ran dl Kruskal Robert Kriishal Tufanow c. Schtih Honda Die hier angegebenen Werte beziehen sich auf Bestimmungen, welche an IVoigen Rinderblutkochsalzaufschwemraungen ausgeführt wurden. Wichtig ist, daß die gewaschenen Bhitkörperchen gegen Saponine viel empfind- licher sind als ungewaschene bei Gegenwart des Serums. So fand Kruskal^) als Wert für die hämolytische Wirkung am Agrostemmasapotoxin. wie in der Tabelle angegeben, am normalen l%igen Blut den Wert J : 15.000. An gewaschenen Blutkörperchen zu P/o in ^aCl 1 : 38.000. Dieser Unterschied dürfte auf den Lipoidgehalt des Serums zurückzuführen sein , denn , wie Ransom -) entdeckte, kann Saponin durch Cholesterin entgiftet werden. Die hämolvtische Methode eignet sich vor allem zum Nachweis dieser Pflanzengifte speziell der Saponine und ist von A'. Brunurr^) und .7. Rühle^) zum Nachweis von Saponin in schilumenden Getränken (Limonaden) verwandt worden. Ausführung der hämolytischen Versuche. Eine auf Sapt)iiin zu prüfende Substanz löst man in 0*9"/oiser Kochsalzlösung auf. Von de- fibrinierten und gewaschenen Rinderblutkörperchen stellt man eine P/oigc Aufschwemmung gleichfalls in physiologischer Kochsalzlösung her. Hat man nur sehr geringe Saponinmengen, so führt man die Untersuchung unter dem Mikroskop aus. Man gibt einen Tropfen der Blutaufschwemmung auf einen Objektträger, bedeckt ihn mit einem Deckglase und stellt etwa ;)00fache \>rgrößerung des Mikroskopes ein. Labt mau dann seitlich einen Tropfen Saponinlösung zufheßen, so kann man die allmähliche .\uf- ') N. Kruskal, Über Agrostemma Githago L. Dorpater pharmakol. Inst.-Arb. Bd. 0. S. 126 (1891). -) /-'. liausoni, Saponin und sein Gegi.Migift. Deutsdie med. Wochenschr. 1901. S. 194. — Vgl. auch .1. Windaus, Über die Entgiftung der Saponine durch Cholesterin. Ber. d. D. ehem. Ges. Bd. 42. S. 238 (1909). '■') K. lirunncr und J. Rä/ilc, zitiert nacli ./. Cadamn-, Lehrbuch d. ehem. i'cxi- kologie. Göttingen 1909. S. 446. 2B H. Fühner. hellung des Präparates durch dieselbe gut verfolgen. Die Blutkörperchen quellen erst und werden stark lichtbrechend, um darauf gewissermaßen zu verlöschen.!) Hat sich die Substanz als hämolytisch wirksam erwiesen, so ist zu ihrer weiteren Charakterisierung als Saponin noch ihre Entgiftung durch Cholesterin festzustellen. Das Cholesterin löst man zu P/q in Äther und gibt von dieser Lösung soviel zu der Lösung des Saponins in physiolo- gischer Kochsalzlösung, daß auf 20 Teile Saponin 1 Teil Cholesterin kommt. Man schüttelt tüchtig durch und erwärmt im offenen Becherglase einige Stunden auf 40". Diese Lösung wird dann, wenn sie ein typisches Saponin enthielt, nicht mehr hämolytisch wirken. Bei genügenden Mengen Material untersucht man in kleinen oder größeren Pieagenzgläsern. Immer sind Kontrollproben gleichzeitig anzu- setzen und zu beobachten. Hat man eine Reihe lleagenzgläser mit ver- schiedenen Mengen hämolytischer Substanz angesetzt, so kann man die fortschreitende Aufhellung von der am stärksten wirksamen Konzentration bis zu der schwächsten gut verfolgen. In den Gläsern, in welchen sich die Blutkörperchen nicht lösen, setzen sie sich am Boden derselben ab. Man muß zu den Proben immer gut durchgemischte Blutkörperchcnaufschwem- mung verwenden. Auch verfährt man derart, daß man das Blut zur lösen- den Flüssigkeit zusetzt und nicht umgekehrt. Nach dem Zusatz muß sofort gut umgeschüttelt werden, um P)indung der lösenden Substanz nur etwa an die unterste Schicht der Blutkörperchen zu vermeiden. Für die meisten toxikologischen Versuche am Blute wird, wie bei dem Saponinnachweis, die Ausführung bei Zimmertemperatur geschehen. Bei vergleichender Prüfung wird man nach 3 — 4 Stunden die hämolytische Grenze ablesen. Über die Natur und Herkunft eines hämolytisch wirksamen Saponins kann man aus der Intensität der Wirkung bei Vergieichung mit der Kobertschen Tabelle einige Anhaltspunkte gewinnen. 2. Agglutination, Die Tatsache, daß es Pflanzenstoffe gibt, welche an roten Blutkörper- chen deren Zusammenkleben, Agglutination, neuerdings auch Kongluti- nation genannt, herbeiführen können, wurde 1887 von B. Kohert und seinem Schüler Stülmark'"-) an dem wichtigsten hierhergehörigen Produkte, dem Piicin, entdeckt und ist seither häufig zu toxikologischer Charakteri- sierung dieser Substanzen gebraucht worden, für welche beweisende che- mische Reaktionen nicht bekannt sind. Derartige giftige Pflanzen produkte („Toxalbumine"), wie das Ricin der Ricinussamen, das Abrin der Paternostererbsen, das Crotin der Crotonsamen und das Robin der Rinde der falschen Akazie, besitzen die gemeinsame Eigenschaft, daß sie bisher 1) J. Gadamer, 1. c. S. 447. 2) //. Sfilhnark, Über Ricin. Dorpater pharmakol. Inst.-Arb. Bd. 3. S. 59. Stutt- gart 1889. Nachweis uiul Bestimmung von Giften auf liiologischem AVege. •>i\ in einwandfreier Weise von ihrem Jiegieiteiweili nieht hctivit werden konnten und daß Versuchstiere gegen steigende Dosen derselhen wie gegen Bakterientoxine immunisiert werden können (KhrUchJ. Toxikologische Bedeutung besitzt in erster Linie das Ricin, das aus Preltrückständon der Kicinussamen gewonnen wird. Solche Ricinusprel»- rückstände haben bei ihrem geringen Werte schon zur X'erfiilschung von Preßkuchen anderer ölhaltiger Samen, die als Futtermittel Vei-\veiidinig finden, gedient, und Erkrankung der damit gefütterten Tiere herl)eigeführt. Ausführung der Agglutinationsprüfung. Handelt es sich darum, eine Substanz auf den Gehalt an Klein zu untersuchen, so kann man nach Koherf^) in folgender Weise vorgehen: Man zerreibt den trockenen Rückstand innig mit mindestens der lOfachen Menge physiolo- gischer Kochsalzlösung und filtriert nach 24 Stunden. Das Filtrat hält das vorhandene Ivicin in Lösung. Die Prüfung des Filtrates geschieht in der Weise, daß man einen Teil davon einem Kaninchen (s. d.) unter die Haut spritzt, einen anderen Teil mit etwa demselben Volumen oder mehr einer 2''/oigen Mischung von defibriniertem Rinderl)lut mit physiologischer Koch- salzlösung (2 cm^ Blut + 98 cm^ 0-9Voiger Na Cl-Lösung) vermengt. Bei grö- ßerem Ricingehalt des Auszuges tritt rasch Agglutination ein. Bei geringem Gehalt kann die Blutprobe unsicher oder negativ ausfallen, während das injizierte Kaninchen nach mehreren Tagen doch noch erkrankt und stirbt. Eine verdünnte wässerige Ricinlösung läßt sich nach Cushnij'-) da- durch anreichern, daß man in dieselbe gewaschene Fibrinflocken einträgt, auf welche sich das Gift niederschlägt. Die mit Wasser gewaschenen Flocken werden mit verdünnter Sodalösung behandelt, in welcher sich das Ricin löst. Die Sodalösung neutralisiert man mit Salzsäure und stellt nun mit dieser Lösung den Agglutinations versuch an. Die Agglutinationsprobe kann dadurch empfindlicher gestaltet werden, daß man mit Kochsalzlösung gewaschene Blntköi-perchen verwendet, da das Serum nach Kohert die Piicinwirkung hemmend beeinflußt. Aul'ierdem empfiehlt sich die Verwendung des empfindlicheren Mecrschweinchcnblutes an Stelle von Rinder- oder Kaninchenblut zu der Aggiutinationsprobe. Stillmarl- fand, dal.) bei 2''/oiger Blutkochsalzmischung Piicin in Kon- zentration 1:40.000 Kaninchenblut vollständig, bei einer Verdünnung 1:160.000 nur noch spurenweise aggiutiniert , während Meerschweindien- blut in Kmizentration 1:160.000 vollständig, in solcher von 1 : (JOO.OOO immerhin noch schwach zusammengeballt wii'd. Von der Vollständigkeit der Agglutination üi)rrzengt mau sich iliiich Filtration des aggiutinierten Blutes durch Filtrierpapier, durch das die nichtagglutinierte Blutkörperchenaufschwemmung ungehindert himlurch- ') /t". Kohcrf, Einige Notizen über die Bedeiitiini: mul den liiologisclien Narliweis von vegetabilischen Agghitininen und Hämolysinen. Landwirtsch. \'ersuclisstalionen. Bd. 71. S. 258. Berlin 1909. -) A. R. Cushnijf über das Ricinusgift. Arch. f. exp. Patliol. u. Pharmakol. Bd. 41. S. 446 (1898). 30 H. Fühner. geht. Ist das Filtrat nach der Agglutiuationsprobe noch rot gefärbt, so ist die Agglutination unvollständig. Bei geringen Blutmengen stellt man die Probe statt im Pieagenzglas in einem kleinen Uhrglase an und verfolgt die Erscheinung unter dem Mikroskop. Kontrollproben sind auch hier dringend nötig, da ebenso wie spontane Hämolyse auch spontane Agglu- tination der Blutkörperchenaufschwemmung vorkommen kann. ^'om Ricin unterscheidet sich das Abrin, der Giftstoff der Pater- nostererbsen fJequiritisamen) in seiner Blutwirkung nur sehr wenig. Nach Hellin ^) wirkt im Gegensatz zum Ricin das Abrin stärker auf Hunde- als auf Kaninchenblut ein. Leichter als Abrin ist vom Ricin das Crotin, der Giftstoff der Crotonsamen zu unterscheiden. Nach Elf Strand^) agglutiniert dieses das defibrinierte Rinderblut, hingegen nicht das Blut von Meerschweinchen. Kaninchenblutkörperchen aber werden durch dasselbe hämolysiert. Hierbei erweist sich das Blut verschiedener Kaninchen als verschieden empfindlich. Auf Grund verschieden starker Blutwirkung lassen sich vom Ricin noch andere hierhergehörige Substanzen unterscheiden, so nach Robert und Lau^) das aus der Rinde der falschen Akazie gewonnene Robin. Neuerdings wurde von Wienhaus *) und Assmann ^) unter Kohert aus Schminkbohnen ein Phasin und aus Sojabohnen ein Sojaphasin genanntes eiweißhaltiges Produkt hergestellt, von denen namentlich das letztere eine der Ricinagglutination täuschend ähnliche Agglutination von Kaninchenblutkörperchen herbeiführt. Doch auch dieses Produkt läßt sich vom Ricin dadurch unterscheiden, daß es auf Blutarten, die vom Ricin agglu- tiniert werden, nicht einwirkt; besser aber lassen sich diese Phasine von dem giftigen Ricin durch ihre geringe Giftigkeit für Kaninchen (s. d.) unter- .scheiden. ^) Der Frosch und seine isolierten Organe. Im mittleren Europa sind hauptsächhch zwei Froscharten') leicht und in größerer Menge zu erhalten 0): Der Wasserfrosch, Rana escu- M H. Hellin, Der giftige Eiweißkörper Abrin und seine Wirkung auf das Blut. Dissert. Rostock 1901. ■-) M. Elfstrand, Über blutkörperchenagglutinierende Eiweiße. Görbersdorfer Ver- öffentlichungen, heraiisgeg. v. B. Kohert. Bd. 1. S. 11. Stuttgart 1898. ^) Lau, Über vegetabilische ßlutagglutinine. Dissert. Rostock 1901. *) 0. Wienhaus, Zur Biochemie des Phasins. Biochem. Zeitschr. Bd. 18. 8.228(1909). ^) F. Assmann , Beiträge zur Kenntnis pflanzlicher Agglutinine. Fjiiigers Arch. Bd. 137. S. 489 (1911). ^) Über den Nach weis von Ricin vgl. auch Miessner, Über die Giftigkeit der Ricinussamen. Mitteil. d. Kaiser Wilhelms-Instituts für Landwirtschaft in Bromberg. Bd. 1. S. 217. Berlin 1909. "') Zur Biologie des Frosches vgl. Fr. K. Knauer, Das Leben unserer heimischen Lurche und Kriechtiere. Dresden 1905. — Fr. Hempelmann, Der Frosch. Leipzig 1908. — Die Anatomie des Frosches ist ausführlich dargestellt in F. Gaupp, A. Eckers und B. Wiedersheims Anatomie des Frosches. 3. Aufl. 3. Bände. Braunschweig 1896 — 1904. *) Wasserfrösche liefert Fischer Fritz Norak, Köpenik bei Berlin. Die Varietät Ridi- bunda in Größen von 40— 150.9' A.v. Kordes, Zoolog. Handlung, N.-Becskerek (Un- Nacliweis uiul Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. ;-i] lenta mit seiner für I)iologische \'ersuche gleichwertigen ^'carietät. dem Seefrosche, R. esc. Var. ridibunda nml der Gras- oder Taufrosch. Rana fusca (temporaria). Beide Arten sind zum biologischen Tüftnach- weis erforderlich, denn sie reagieren manchen Giften gegeniil)er verschieden. Da die Frösche sich im Winter verkriechen, so ist deren Beschaffimii- in den kalten Wintermonaten oft schwierig. .Man versieht sich für den Winter am besten im Herbst mit einer genügenden Anzahl dersellien und bewahrt sie in kühlem Räume in Rehältern mit langsam fliebendem oder öfters erneuertem Wasser auf. Die Sterblichkeit namentlich größerer Wasser- frösche ist in der Gefangenschaft häufig eine recht beträchtliche. Die Tiere erliegen parasitären Infektionen. Als häufige Krankheitserscheinung beob- achtet man das Auftreten von Hautdefekten, vorzugsweise an der Schnauze. Die Grasfrösche halten sich meist besser in der Gefangenschaft. Fütte- rung der Frösche ist unnötig. In den Frühjahrs- und Sommermonaten Fig. 9. Links: Kanu fiisca. 4:^ (/. Rechts: Kana es cu lenta. tß 7. Heide männlich. Aufnahme vom r2. November 1909. wird man zu den biologischen Prüfungen immer möglichst frisch gefangene Tiere verwenden. Der Wasserfrosch ist auf dem Rücken meist grün, der (Jrasfrosch braun gefärbt. Doch ist die grüne Färbung des Wasserfrosches durch- aus unbeständig. Abgesehen davon, daß die Eigenfarbe der Tiere zwischen hell und dunkel je nach der R)eliclitung etc. wechselt, findet man häufig braun gefärbte Wasserfrösche. Konstanter erscheint die P'ärbung der Raucli- haut, welche beim \Vasserfrosch weiß, beim (irasfrosch gelb ist. Da.< sicherste Unterscheidungsmerkmal für beide Arten iuetet die Kopff(»rni und hier namentlich die verschiedene Länge der Sclniauzc. von den Augen an gerechnet. Die Schnauze ist. wie Fig. 9 zeigt, bei l!ana fusca kurz und stumpf, bei Rana esculenta länger und mehr zugespitzt. garn). Durch Vormitthimr der Diener an physiologisclien und piiarmakologischen L ui- vorsitätsinstitutcn können Wasserfnisciie und aucii (Irasfrosclie liezotron werden. 32 H. Füll n er. Auf der Photographie sind zwei fast gleichschwere männUche Tiere dargestellt. Die Aufnahme ist Anfang November gemacht. Zu dieser Zeit sind bei Rana fusca die Daumenschwielen beim männlichen Tiere schon deutlich hervortretend, bei Rana esculenta noch wenig. Die stark ausge- prägten Daumenballen mit den vor der Brunstzeit auftretenden schwieligen Verdickungen sind neben den Schallblasen (diese nur bei R. esculenta!) die besten äußeren Kennzeichen für männliche Frösche. Erwähnt sei noch, daß die männlichen Tiere meist kleiner als die weiblichen sind. Bei Rana esculenta schwellen die Daumenballen erst später an, damit zusammen- hängend, daß die Paarungszeit der Wasserfrösche später als die der Gras- frösche eintritt. Die Paarungszeit der Grasfrösche fällt in das erste Früh- jahr, die der Wasserfrösche erst in die Monate Mai und Juni. Frosch- laich und Kaulquappen, welche man im Frühjahr findet, stammen darum meist von Grasfröschen, im Sommer von Wasserfröschen. Dieser Hinweis mag genügen zur Identifizierung der zu toxikologischen Versuchen dienen- den Kaulquappen. 1) Kaulquappen haben häufig \'erwendung gefunden zu vergleichenden Bestimmungen des Wirkungsgrades von Giften, ^'on solchen seien hier lediglich Overtons-) bekannte Untersuchungen über die Wir- kungsstärke der Narcotica genannt. A. Beschreibung der Instrumente und Apparate.^) Zur Herstellung der bei der Prüfung von Giften nötigen physiologi- schen Präparate, wie isolierte Skelettmuskeln. Herz, Auge, bedient man sich ausschließlich anatomischer Scheren und Pinzetten. Messer sind nicht nötig. Von Pinzetten braucht man eine sogenannte Hakenpinzette, geeignet zum Erfassen der glatten Haut des Frosches, außerdem zwei ') über genauere anatomische Unterscheidungsmerkmale der verschiedenen Kaul- quappenarten vgl. F. Werner, Die Reptilien und Amphiliien Österreich-Ungarns und der Okkupationsländer. Wien 1897. S. 113. -) E.ÖDerton, Studien über die ^Narkose. Jena 19U1. — Vgl. auch l.Bany und E.Overton, Studien über die Wirkung des Kobragiftes. Biochem. Zeitschr. Bd. 31. S. 243 (11)11). '*) Die im Texte beschriebenen Apparate etc sind die im Pharmakologischen Institut der Universität Freiburg i. Br. gebräuchlichen. Sie können, sofern keine andere Bezugsquelle angegeben ist, durch den Mechaniker des genannten Institutes, Herrn Lantzsch, zu nachstehenden Preisen bezogen werden: Froschbrett mit beweg- lichem Stab und Klammern (Fig. 11) 5 M. — Kymographion (Registrierapparat) von E. Ziinmeriiiaiin, Berlin N. 4, Chausseestraße 6 (Fig. 12, 13) 140 M. — Stativ mit drei Muffen und Aluminiumschreibhebel (Fig. 15) 35 M. — Stativ mit Zahnstange und Trieb, dazu ein Stab, 2 Muffen, 2 offene Muffen, 1 Stab mit Brettchen (Fig. 15) 45 M. — Zeitmarkicruhr (Fig. 18) 90 M. — Markierhebel (Fig. 19) 8 M. — Jaqitetsche Zeit- markieruhr von E. Zimmermann, Berlin X. 4. Chausseestraße 6 (Fig. 52) 125 M. — Akkumulatoren (Gülcher) (Fig. 20) pro Zelle 16 M. — Induktorium (Fig. 20) 30 M. — Reizelektrode (Fig. 20) 10 M. — (^uecksilberschlüssel (Fig. 20) 10 M. — Abblender nach O.Frank von Mechaniker W. Schmidt, Inhaber C. Schunk, Gießen (Fig. 21) 40 M. — AVippe (Fig. 22) 7 M. — Feuchte Kammer (Fig. 39) 22 M. — Herzkammer mit 4 Ka- nülen und 3 Herzklammern (Fig. 52) 5^50 M. — Muskelklemme (Fig. 56 und 57 /v) 12 M. — Mausbrett (Fig. 61) — '80 M. — Kaninchentrichter (Fig. 64) 17 M. Nachweis imd Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. ;-i3 größere und zwei feine Pinzetten. Von Scheren genügt eine grödere mit spitzem und stumpfem lilatt und eine ebensolche feine. Die Scheren sind der lleinigung wegen auseinandernehmbar. Als Unterhige zum Herstellen der Froschpräparate dienen flache Eßteller neben dicken einseitig matten (ilasplatton in der (Irölie 24 : '24 cm. Zur Freilegung des Herzens am nichtnarkotisierton Frosche muli das Tier gefesselt werden. Dies geschieht vermittelst starker liaumwollfiidcn. welche in Form von Schlingen (Fig. 10) dem Frosche um die Peine gelegt werden, worauf man das Tier auf einem Prettchen der Größe 20: 10 cm {Focke verwendet für die Digitalisprüfung (s.d.] längere Froschbretter) da- durch befestigt, daß die Fäden durch in das Prettchen eingesägte Spalte ge- zogen werden (vgl. Fig. ;)4). Die Spalte können in schräger Pichtuiig in das Prettchen gesägt werden, damit Zurückgleiten der durchgezogenen Fäden bei Bewegungen des Tieres weniger leicht möglich ist. Für viele Versuche verwendbar ist ein gestieltes Froschbrett (Fig. 11), auf Fig. 10. Fig. 11. Froschbrett mit Fußschlinge. Gestieltes Froschbrett mit FnOklammern. welchem der Frosch mit vier Drahtklammern in vorhandenen ("Öffnungen befestigt wird und das den Vorteil besitzt, mit einem daran beweglich an- gebrachten eisernen Stabe in den Muffen der Stative befestigt werden zu können. Will man den auf dem Froschbrette befestigten Frosch elektrisch reizen, etwa zum Nachweis von Veratrin, und die Muskelzuckungen gra- phisch registrieren, so kann dies, wie aus Fig. 26 ersichtlich ist, auf dem vorliegenden Froschbrett geschehen. Ein besonders zu diesem Zweck ge- bautes Froschbrett ist vor kurzem von Boehm ') beschrieben worden. Zur graphischen Aufzeichnung der Muskelzuckungen, der Herzbewe- gung etc. ist ein Kegistrierapparat , ein sogenanntes Kymographion erforderlich. Zur Aufnahme der im Texte wiedergegebenen Kurven diente ein Instrument von K. Zinniicriuann, Perlin, welches bei billigem Preise den Vorzug besitzt, für raschen und sehr langsamen Gang verwendbar zu sein. Der in Fig. 12 und \?> abgebildete Api>arat kann sowohl mit ver- tikal-, als auch horizontal rotierender Trommel l)enutzt werden. Zin- Aus- M /'. Boehm, Zwei kleine Apparate für Froschversucho. .\rch. f. exp. Tathol. ». Phurmakol. Bd. 63. S. 159 (1910). Abderhalden. Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. 3 34 H. Füll 11 er. ^'°-^-- lotuDg der Höhenlage dient Schraube.?; zur Ver- änderung der Geschwin- digkeit der Trommel, Friktiousscheibe und -rolle F, mittelst welcher die jeweilige Geschwin- digkeit des Uhrwerkes im Verhältnis 1 :6 verändert und der Trommel über- mittelt werden kann. Die größte Geschwindigkeit erhält die Trommel bei Stellung der Eolle am Zentrum der Scheibe. Durch Verstellung der liolle gegen die Peripherie wird die Umdrehungszeit bis auf etwa das öfache verlangsamt. Um die Ver- schiebung bequem bewir- ken zu können, muß die Achse und die mit ihr verbundene Scheibe außer Kontakt mit der Eolle gebracht werden. Dies ge- schieht durch Hoch- drehen der unter der Grundplatte be- findlichen Schrau- be S. Das Uhrwerk wird mittelst Schlüs- sel t aufgezogen und durch den Hebel B arretiert bzw. in Gang gesetzt. Bei W lassen sich verschieden große Windflügel aufstecken und kann durch den größten derselben die Ge- schwindigkeit bis auf ca. 1 Stunde pro Umdrehung ( = 500 mm) redu- ziert werden. Hierbei muß die Friktionsrolle an der Peripherie der Scheibe Kymographion. Fig. 1; Kymographion. Nachweis imd Bestimmung vdii (iiftcn auf liinlotrisclicin W rge. 35 stehen. Eine weitere Ixeduktion der Unidrehungsj>esch\vindij^keit wird erreicht durch Einschaltung- des Ankerganges u und i*rh;Ut liiei-hei die Trommel eine Umdrehungsgeschwindigkeit von etwa 4 — 24 Stunden pro Umdrehung. Das lunsclialten des Ankerganges wird nach Lösen der Schraube x, durch ruckweises Hochdrücken des vorstehenden Kästchens u bewirkt. Es ist erforderhch, den Ankergang mögUchst momentan aus- oder einzuschalten. Die größte Umdrehungsgeschwindigkeit des Instrumentes beträgt (bei Verwendung ohne die AVindt'lügel und Stellung der Friktionsrollc im Zen- trum) 10 — 15 Sekunden pro Umdrehung. Doch kann das Instrument für besondere Zwecke von der Firma mit noch größerer Umdrehungsge- schwindigkeit geliefert werden. Die Trommel des Kymographions wird mit (ilanzpapicr M über- zogen. Zu dem Zwecke wird das Instrument horizontal gestellt und die Trommel durch Hochdrehen der Schraube S leicht beweglich gemacht. Dann wird die rauhe Papier- fläche mit einem Schwämme leicht angefeuchtet und die gummierten Ränder des Papieres über- einander geklebt. Das Papier darf keine Falten machen und muß überall gleich gut an der Trommelfläche anUegen. Nun wird das Papier unter schnellem Drehen der Trommel in horizontaler Lage berußt. Dies geschieht im Saume einer rußenden Gasflamme. Um die Gasflamme stark rußend zu machen, leitet man das Gas durch eine Flasche (Fig. 14), welche eine Mischung gleicher Teile Benzin und Benzol (Benzol allein rußt zu stark, Benzin zu schwach! ) enthält. Das Gas entströmt einem rechtwinkelig gebogenen Glasrohr, dessen Spitze ausgezogen ist. Zum Berußen rückt man langsam Trommelbewegung mit der Spitze der Gasflaiiunc Fig. U. Berussnngsflasche. bei möglichst rascher über der Papierfläche hin und her. Für feine Aufzeichnungen auf der Papierflächc darf die Be- rußung keine zu starke sein. Nach Fertigstellung einer Kurve wird die Trommel nach Hochschrauben des oberen Lagers M aus dem K\ niogra- phion genommen, das berußte Papier, unter Festhalten an seiiu-m oberen llande mit einem Finger, in der Nähe der zusammengeklebten IJäiider durch einen Messerschnitt gespalten und die Kurve dann lackiert. Zum Lackieren verwendet man eine Lösung von gebleichtem Schellack in OeVoiS^'n» Alkohol. Da der gebleichte Schellack unter AVasser aufbewahrt Avird, so muß er erst gepulvert und das Pulver «.•etrocknet wc>rdeu. be\(ir man es im Weingeist auflöst. Das \erhältnis ist l:10(\'ol.). Die Kurven werden an beiden Enden mit Pinzetten erfaßt und durch dif in einer ])hotograi)hischen Schale befindliche Lacklösung gezogen, dann getrockuet. ') Durch die das Ivymograpbioii liefernde Firma zu hezielien. 36 H. Fühner. Am besten werden die Kurven nach dem Trocknen noch ein zweites Mal lackiert, um sie besser vor Beschädigung zu schützen. Widerstands- fähiger wird die Lacklösung noch durch Zusatz von l^/o venezianischem Terpentin. Zur Ausführung der angegebenen Versuche sind mindestens drei Stative nötig , wie sie in Fig. 15 wiedergegeben sind. Davon zwei ein- fache, wie das in der Figur vorn befindliche, und eines mit Zahnstange und Trieb (in der Figur hinten) , welche vertikale Verstellung der an der Stativstange befestigten Apparate ermöglichen „Muffen'- und kleinere Stativteile, hebeln , Herzkammer , Froschbrett Fig. 15. <^^$i Zu den Stativen gehören welche der Befestigung von Schreib- etc. am Stativ dienen. Oberhalb des Fußes der Stative befindet sich eine endlose Schraube, deren Drehung die Drehung der Stativstange um die senk- rechte Achse bewirkt, eine Vorrichtung, welche zum Anlegen des Schreibhebels an eine berußte Papierfläche nützlich ist. Zu den Stativen werden außerdem winkelförmige, mit Stab in den Muffen zu befestigende Stücke geliefert, welche eine dünne Achse tragen, an der ein Schreibhebel befestigt werden kann. Dieser findet zur Aufzeichnung von Herz- und Skelettmuskelbewegung auf der berußten Papierfläche des Kymo- graphions Verwendung. Das beste Material zur Herstellung von Schreibhebeln sind Strohhalme, in einer Qualität, wie sie in Kaffeehäusern gebraucht werden. Die Länge solcher Strohhalm Schreibhebel beträgt durch- schnittlich 20 — 2b cm. Zur Herstellung des Schreibhebels wird der Strohhalm in der Nähe des einen Endes in seiner Mitte ein Stück weit gespalten und durch den Spalt die aus ihren Lagern in dem Winkel genommene Schreibhebelachse eingeführt, nachdem die eine der beiden zum Festklemmen des Schreibhebels bestimmten kleinen Scheiben von ihr abgeschraubt ist. Diese wird dann wieder aufgesetzt und der Strohhalm festgeklemmt. Xahe der einen kleinen Scheibe, welche mit einer Piinne versehen ist, befindet sich eine kleine Schraube an der Achse, an der ein Faden angebracht und von hier aus über die Scheibe gelegt wird. Derselbe trägt an seinem freien Ende ein Gewicht oder einen kleinen mit Schroten zu füllenden Becher. Für die Aufzeich- nung der Herzbewegung wird der längere Arm des Schreibhebels an der Achse entlastet (Fig. 16). Zur Aufnahme von Skelettmuskel- stative. Nachweis und Bestimmung von Giften auf liiolu^jischeni W etfo. 37 Fig. 16. zuckuiiiren wird er hingegen mit Gewicht von r)0— lOOy i)elastet (Fig. 17). In den Strohhahn.schreihhehel werden in der Weise, wie die.s Fig. 17 zeigt, beiderseits von der .Vch.se mit glühendem Draht eine Anzahl Löcher eingebohrt. Die Schreibfaline des Helyels kann aus Sclireibpapier hergestellt werden. Der Strohhalm wird zur Befestigung der Papier- fahne an seinem vorderen Ende gespalten und in den Spalt das Papier eingeklemmt. Zur Fixierung dient Radfahrkitt (Kautschuk- lüsung). Die Papieii'ahne am Aluminium- schreibhebel kann mit Siegellack befestigt werden. Die Schreibfahne wird an ihrem Ende fein zugeschnitten und nach der Kymographionfläche hin gebogen. Auf der berußten Fläche der Kymo- graphiontrommel wird unter die Herz- oder Skelettmuskelkurve die Zeit aufgezeichnet, je nach der Umdrehungsgeschwindigkeit des Instrumentes in Sekunden oder 10, oO, 60 Se- kunden. Zur Zeitmarkierung verwendet man einen mit Schreibhebel versehenen Elektromagneten und eine Kontaktuhr nach Bowditch. Die gewöhnlich gebrauchte Bowditchsche lihr hat den Nachteil, daß Elektromagnet und Uhr beständig unter Strom stehen, welcher nur im Moment der Zeitmarkierung unterbrochen wird. Dies bedingt eine starke Aliiminiamschreibhebel. l-'ig. 17. Strohhalmschreibhebel. Inanspruchnahme der den Strom liefernden Kiemente. Eine verbesserte der- artige Zeitmarkieridn- wurde nach Angaben von Herrn Prof. Stniuh. vom Mechaniker des Pharmakologischen Institutes. Freiburu i. IJ.. Herrn Lotitcftrh, hergestellt. Diese besitzt statt der Melallscheibe des alten Modells eine 38 H. Fühner. Fig. 18. rotierende Hartgummischeibe^) (Fig. 18). Auf der Scheibe befinden sich acht an verschiedenen Stellen unterbrochene konzentrische Ringe, auf welchen ein auf jeden Kreis einstellbarer Hebel schleift. Beim (xang der Uhr fällt der Hel)el in die Lücken der Kreise und schließt hierbei für kurze Zeit den elektrischen Strom. Dabei wird der mit Uhr und Element verbundene Markiermagnet (Fig. 19) gleichzeitig durchströmt und der Schreibhebel an- gezogen und wieder entfernt, was auf dem Kymographion verzeichnet wird. In den Stromkreis schaltet man zweck- mäljig einen Quecksilberschlüssel ein, um völlige Unterbrechung des Stromes zu ermöglichen. Als Stromquelle verwendet man Akkumulatoren (2 — 4 Volt). Die Zeitmarkieruhr ist verwendbar zur Aufzeichnung von 1, 2, 3, 4, 5, 10, 30 und 60 Sekunden. Zur Aufzeichnung von Vö Sekunden und Sekunden existiert eine kleine von Jaquet konstruierte Uhr (vgl. Fig. 52), welche recht brauch- bar, aber teuer ist. Der Markierhebel kann am glei- chen Stativ wie der die Muskelkurve aufzeichnende Schreibhebel angebracht werden , wie z. B. aus Fig. 36 ersichtlich. Besser ist derselbe an einem zweiten Stative unterzubringen, wobei man ihn am bequemsten entgegen der Trommelbewegung des Kymographions aufstellt. Zeitraarkieruhr. Fig. 19. Markiermagnet. Ob ein Muskel oder Nerv eines üntersuchungstieres gelähmt oder tot ist, läßt sich dem Organ nicht ohneweiteres ansehen. Es läßt sich dies 1) Diese ist dem Mechaniker des Pharmakologischen Institutes in Freibarg, Herrn Lantzsch geschützt. Nachweis und Bestimmuug von (litten auf biologischem Wege. 39 aber feststellen durch Reizung des hetroffenden Orf^nines. und hierzu dient am besten diejeniiie durch den elektrischen Strom. Zur AusführunL; der- artiger Prüfung dient das folgende Instrumentarium: Als StrouKiuelle ein Akkumulator. lU'i Benutzung solcher muli man ein kleines (Taschen-)Voltmeter besitzen, um das Element von Zeit zu Zeit zu prüfen. Ein frisch geladener Akkumulator zeigt auf dem \'olt- meter eine Spannung von 2*1 — 2'S Volt an. Dieselbe geht beim (Jcbrauch allmählich zurück. Sobald sie sich r8 Volt nähert, muß das Element frisch aufgeladen werden. Die Art und Weise, wie dies geschieht, ist aus der dem Akkumulator beigegebenen Gebrauchsanweisung zu ersehen. Zur elektrischen Heizung-, welche für die Zwecke des biologischen (iift- nachweises ausschließlich mit Induktionsströmen (faradischen Strömen) Fig -20. K E Anordnung zur elektrischen Reizung. geschieht, ist die in Fig. 20 wiedergegebene \'ersuchsanordnung empfeh- lenswert. Sie besteht aus Akkumulator f.-l), Quecksilberschlüssel (' Sa liidiiktorium und Elektrode (E), untereinander verbunden durch isolierte Kupferdrjthte. Der Quecksilberschlüssel (S) dient zur öffnmig und Schlielimi^' des Stromes. Ist das Quecksilber in dem Porzellannapfe nach längerem Gebrauche mit einer Oxydschicht bedeckt . so muH rs erneuert werden. Die Oxydation wird verzögert, wenn man das (^)uecksill)er beim (Gebrauch des Schlüssels mit liOVoig^m Alkohol überschichtet. Die Reizelektrode (E) endigt gabelförmig in zwei Drähten, die zur Berührung des Muskels oder zum Darüberlegen des Nerven dienen imd 40 H. Fühner. durch Verschiebung- des Knopfes (K) in ihrer gegenseitigen Entfernung verstellt werden können. Das kleine abgebildete Induktorium ist für vorliegende Zwecke ausreichend. Es besteht in der Hauptsache aus der primären Rolle (1 1), der sekundären Rolle (1 2) und dem mit der Schraube (Sc) verstellbaren Hammer (Ha). Die sekundäre Rolle des Apparates ist um eine horizontale Achse drehbar. Je mehr die sekundäre Rolle in ihrer Stellung zur primären dem rechten Winkel sich nähert, desto schwächer wird der induzierte Strom. Der Hebel (H) ermöglicht Kurzschluß, so daß kein Strom in die Elektrode gelangt. Man kann mit dem Apparat sowohl mit Einzelinduktions- schlägen wie tetanisierend reizen. Ist der Hammer (Hd) durch die Schraube (Sc) fest an den weichen Eisenkern der primären Rolle angedrückt, so er- hält ein von der Elektrode berührter Muskel bei Schließung des Schlüssels (S) einen Schließungs-, beim Wiederöffnen einen Öffnungsinduktions- schlag und wird in beiden Fällen mit einer Einzelzuckung antworten, stärker hierbei bei der Öffnung als bei der Schließung des Stromes. Dreht man die Schraube (Sc) aber etwa 1 mm weit zurück , so daß der Hammer zwischen ihr und dem Eisenkern hin- und herschwingen kann, so bekommt man so lange andauernde Reizung des Muskels, als der Schlüssel ge- schlossen ist. Man nennt diese fortwährend durch die Hammerbewegung unterbrochene Reizung des Muskels eine tetanisierende, weil der Muskel durch sie in den Zustand einer Dauerkontraktion (Tetanus) versetzt wird. Wie erwähnt, zuckt der Muskel stärker bei der Reizung mit Öffnungs- ais mit Schließungsinduktionsschlägen. Will man einen Muskel oder ein Nervmuskelpräparat wiederholt rhythmisch mit gleichstarken Schlägen reizen, so muß man entweder den Öffnungs- oder den Schließungsinduk- tionsschlag unwirksam machen, ihn ..abblenden-'. Dies kann geschehen durch Anwendung des Kurzschlußhebels (H) oder bequemer durch Ver- wendung von zwei Quecksilberschlüsseln, wie dies beim Nachweis von Veratrin (vgl. Fig. 27) angegeben ist. Für länger fortzusetzende rhyth- mische Reizung ist die manuelle Abbiendung besser durch mechanische zu ersetzen. Ein einfacher gut funktionierender rotierender „Abblender" ist von 0. Frank i) angegeben worden. Derselbe findet hier zum Nachweis von Curarin am Nervmuskelpräparat Verwendung und besteht aus folgenden Teilen (Fig. 21): Auf einem Hartgummistück, dessen Form aus Fig. 21 zu ersehen ist, sind, um eine Walze drehbar, drei in ihrer Lage zueinander verstell- bare Messingstücke (Kreissektoren), Flügel, befestigt. Die Unterbrechung ge- schieht durch zwei Hebel, Messingbügel, die mit zwei Quecksilberschlüsseln (vgl. Fig. 27) vergleichbar sind. Der eine Schlüssel ist in den primären, der andere, der Kurzschlußschlüssel, in den sekundären Leitungskreis ein- geschaltet. Jeder Hebel wird durch ein Gummiband an die Platin spitze einer mit den Polschrau])en leitend verbundenen Schraube angedrückt und *) Beschrieben in der Dissertation von K. Seitz: Der periodische Wechsel der Erregbarkeit des Herzmuskels. Gießen 1906. S. 17. Nacliwcis uiicl Bestininuiiiijr vnn Giften auf Mologischcm Wei^e. 41 ist an der Boriihiungsseite mit einem Platinstroifen versehen. I)er kleine Flüiiel hebt hei seiner Drehung- den in dei- /cichiuing links hclindliclicn lUitiel , die beiden grolien Fliiacl den reehts lielindlichen von ihrem An- schlag ab und öffnen so den Stromkreis. I)ie l)rehunü- der lliigel erl'olj^t im Sinne eines Uhrzeigers. Wenn wie in Fig. 4:-) die beiden Pole des Ab- blenders rechts (wovon einer auf der Kiickseite der Ilartgumniiplatte) in Fiff. 21. Fiff. 22. Rotierender Abblender nach O. Frnnk. den primären, die beiden links in den sekun- dären Stromkreis eingeschaltet sind, in welch letzterem auch das Xervmuskelpr;ij)arat in Nebenschlieljung sich l)efindet,so erhält man bei der gezeichneten Stellung' der Flügel (Fig. 21 ) rhythmische Schheßungszuckung. Wird bei geschlossenem Kurzschlußschlüssel des sekun- dären Stromkreises der primäre Stromkreis geöffnet (die in der Figur gezeichnete Stel- lung!), so bleibt dies ohne Finwirkung auf das Xervmuskelpräparat. P)ei weitei-er Drehung der Flügel wird, solange der primäre Hebel noch geöffnet ist. der sekundäre, gleiclifalls ohne Wirkung, geöffnet. Solange er aber offen, erfolgt Schließung des primären Kreises, die eine Muskelzuckung auslöst, während die darauf folgende Schließung des sekundären Kreises wieder wir- kungslos bleibt. Wechselt man die Pole um, so erhält man (H'fnnngs.schläge. Der Apparat wird in die Muffe eines Stativs i'ingespannt und mit ge- wünschter Geschwindigkeit durch einen Flektronu)tor in rnnirehung versetzt. Zum Nachweis von Curarin am Xervmuskelpräparat ist. wie aus Fig. 4;3 ersichtlich ist, noch ein Strojnwender. eine sogenannte Wippe nötig (Fig. 22). Dieselbe besteht aus einem Ibdzblock mit i\ Quecksilber- wippe. 42 H. Fühner. näpfen, die leitend mit 6 Klemmschrauben in Verbindung stehen. Zu dem Curarinversuch wird die kreuzförmige Drahtverbindung zwischen Napf 4, 5 und 3, G entfernt. Wird die ^Yippe so in die Stromkreise eingeschaltet, wie dies aus Fig. 43 hervorgeht, so kann durch Umlegen des Drahtgestells abwechslungsweise die Stromzuführung zum Muskel direkt oder zum Nerven erfolgen. B. Nachweis und Bestimmung von Giften am ganzen Frosch. Eine Anzahl forensisch wichtiger organischer Gifte läßt sich durch das Vergiftungsbild, welches sie nach subkutaner Injektion an Fröschen hervorrufen, gut charakterisieren. Die Beobachtungen am Frosch können dann im Verein mit chemischen Identitätsreaktionen häufig zur sicheren Diagnose solcher Gifte führen. Die ^\^chtigsten, auf diese Weise am Frosch erkennbaren Gifte sind die folgenden : Die zentral (Gehirn, Rückenmark) erregenden: Strychnin, Pikro- toxin, Cicutoxin, Nico'tin.' Das zentral lähmende Colchicin. Die peripher (Muskel, Nervenende) erregenden: Guanidin und Veratrin, die peripher lähmenden: Curarin und Coniin. Die Skelettmuskelgifte: Coffein und Theobromin und die Herzmuskelgifte: Digi talin, Digitoxin, Strophanthin, Helleborein, Aconitin und Muscarin. Mit der hier vorgenommenen Einteilung soll nur angezeigt werden, welches die hervor- stechendsten und zum biologischen Nachweis dienenden Wirkungen der betreffenden Gifte sind. Auf andere Wirkungen derselben , z. B. zentrale Lähmung im Anschluß an die zentrale Erregung, wird bei der Beschreibung der Hauptwirkung hingewiesen werden. Nur wenn der Verdacht auf das Vorhandensein eines der genann- ten oder ähnlich wirkender Gifte vorhegt, hat es Sinn, eine zu prüfende Lösung Fröschen zu injizieren, und auch hier ist bei den Substanzen Aconitin, Coffein, Guanidin, Muscarin, Theobromin, Veratrin, sobald nur geringe Giftmengen für die Untersuchung zur Verfügung stehen, nicht der ganze Frosch, sondern das für die Diagnose besonders in Betracht kommende isolierte Organ, wie Herz- oder Skelettmuskel, zu der Prüfung zu verwenden. Handelt es sich darum, die Giftigkeit einer Substanz überhaupt darzutun, so injiziert man mit den zu prüfenden Lösungen nicht Frösche, sondern die dem Menschen näherstehenden Warmblüter. Bei kleinen Substanzmengen verwendet man weiße Mäuse, bei größeren Katzen oder Hunde. Zur Injektion von Fröschen sowohl, wie von Warmblütern, wie zu allen andern biologischen Versuchen, dürfen nur neutrale Lösungen Verwendung finden. Zur Neutralisation von Alkalien verwendet man Salz- säure oder Weinsäure. Zur Neutrahsation von Säuren Natronlauge oder NatriumkarlDonat. Geringer Natriumkarbonatüberschuß schadet zur sub- kutanen Injektion nichts, während jeder Säureüberschuß reizt. Lösungen, Nachweis und IJestimmmig von Giften auf biologischem Wege. 4;», welche Tieren subkutan injiziert werden, müssen frei sein von anor{iaiii- schen Salzen in nennenswerten Mengen, namentlich von Kalium- und Ammnniumsalzen. Subkutane Injektion au Fröschen. Zur Prüfung auf Gifte dürfen nur gesunde Frösche gebraucht werden. Tiere, welche aufge.stoUcne Schnauzen oder sonstige, namentlich an der P.auchseite auftretende Haut- defekte (Decubitus) zeigen, sind hierzu ungeeignet. I)ie Dosierung der (Jifte bei allen Tierversuchen erfolgt nach dem Körpergewicht der Tiere.') Kleinere Frösche von etwa .'iO g sind größeren Tieren, wegen der geringe- ren zur Vergiftung nötigen Mengen, vorzuziehen. Zur \'('rgiftung bestimmte Tiere werden in geeigneten Töpfen mit l)rahtdeckel bei Zimmertemperatur gehalten und tiiglich mit frischem Wasser abgespült. Frösche, welche im Winter aus kaltem Itaume entnom- men werden, reagieren langsamer und zum Teil anders als Tiere, die bei Zimmertemperatur erst mehrere Tage gehalten wurden. Man prüft den Frosch vor der Injektion einer zu untersuchenden Lösung erst, ob er sich normal rasch aus der Kückenlage umdreht und normal springt. Zu beobachten ist auch die meist unregelmiiliig erfolgende Lungenatmung, erkennbar an der Bewegung der Flanken, und die regel- mälJiger erfolgende Kehlbewegung. Ferner wird man eine Zühlung der Herzschläge vor Beginn des Versuches anstellen. ]Man kann bei richtiger Haltung des Frosches gegen das Licht -) die Herzschläge meist deutlich an Hebungen und Senkungen der Brustwand auf beiden Seiten des Brust- beins erkennen. L'nter dem Mikroskop ist endlich an einer ausgespannten Schwimmhaut '^) die normale Blutzirkulation festzustellen. Die Injektion von riiftUisungen an Fröschen wird meist subkutan vor- genommen. Die Haut (\q<. Frosches läßt sich in großen Falten von der darunter- liegenden Körpermuskulatur, an welcher sie nur an einzelnen Stellen fest- geheftet ist, abheben. In die Zwischenräume zwischen Haut und Muskulatur, in die sogenannten Lymphsäcke, injiziert man die zu prüfenden (üfte. Man kann, je nach dem Zwecke, welchen man mit der Injektion verfolgt. ') Zu genaueren Dosierungen sind nur männliche Frösche brauchbar, da das (ie- vvicht der weiblichen Tiere durch das wechselnde Gewicht der Eierstöcke großen Schwaiikuntren unterworfen ist. -) Man erfaßt hierzu den Frosch fest mit einer ILiiid. wie zur subkutanen In- jektion (s. d.) und hält mit dem Daumen der anderen Hand den Kopf des P'rosches durcli Druck auf die Kehle nach hinten. Hierdurch wird die Haut glatt gespannt und werden die störenden Atembeweguntren wälirend der Hrrzlieoliaclitung unterdrückt. '') Alan hält den Frosch mit der Holilhand, streckt ein Bein aus und legt dessen Fuß auf einer Glasplatte (9; 12) auf, welche auf dem objekttische des .Mikroskopes liegt. Mit 2 Fingern derselben Hnnd liält man zwei /elien auseinander und entfaltet so die Schwimniliaut , auf deron äußeren Kand das Mikroskop eingestellt wird. Es darf auf den Fuß kein starker Druck ausgeübt werden, sonst unterdrückt man die Zir- kulation in den (iefäßen. Auch darf der Druck kein w »«ch sei nd e r sein: Bei -' " stehender Zirkulation kann durch solchen aktive Bewegung der Blut-.inb" voi'/it;iii ■werden. 44 H. Fühner. in den Päickenlymphsack (unter die Rückenhaut) oder in den (Jberschenkel- lymphsack oder in den Brust- und Bauchlymphsack injizieren. Am meisten ist für den Giftnachweis die Injektion in den Brustlymphsack zu emp- fehlen, da bei dieser die injizierte Flüssigkeit nicht wieder ausfließen kann, was bei Injektion in Schenkel- und Rückenlymphsack selten ganz ver- mieden wird. Zur Injektion in den Brustlymphsack erfaßt man den mit einem Handtuch eventuell erst abgetrockneten Frosch mit der Hohlhand über seinem Rücken , hält mit 4. und 5. Finger den Leib und die ausge- streckten Hinterbeine und zwischen 2. und '6. Finger das eine Vorderbein, während das andere durch Zurückdrücken mit dem Daumen fixiert wird. Mit der anderen Hand führt man die Nadel der gefüllten Injektions- spritze seitlich in die Mundhöhle ein und schiebt dann, die unter der Haut liegende Nadelspitze mit dem Auge verfolgend, diese seitUch vom Brust- bein vorsichtig vor, bis etwa in die Herzgegend. Hier angekommen, ent- leert man den Inhalt und zieht die Nadel zurück. Die Nadel muß dicht unter der Haut vorgeschoben werden, was leicht ohne Durchstechen der- selben nach außen hin gehngt, wenn der Frosch gut festgehalten wird. Macht die Brusthaut hierbei Falten, so durchsticht man namentlich die dünne Haut des Grasfrosches leicht. Als Injektionsspritze für Frösche ist eine Rekordspritze (vgl. S. 23) von 2 oii^ mit genügend langer Nadel empfehlenswert. Die Mengen, welche man Fröschen auf einmal injiziert, bewegen sich in den Grenzen von 1/2—3 cm\ Nach der Injektion setzt man das Versuchstier auf einen Teller unter eine Glasglocke, notiert das vorher festgestehte Gewicht des Tieres, die Zeit der Injektion und die Menge der injizierten Flüssigkeit. Zweckmäßig wird man, um den Frosch dauernd feucht zu erhalten, einige Kubikzenti- meter Wasser auf den Teller gießen. Vom Zeitpunkt der Injektion an ist das Tier genau zu beobachten und vom Normalen abweichendes A'erhalten zu notieren. Hat man eine alkoholische oder saure Flüssigkeit, die reizend wirken, injiziert, so springt das Tier gleich nach der Injektion lebhaft unter der Glasglocke. Allmählich tritt Beruhigung ein und erst jetzt kann man etwa vorhandene Wirkungen der genannten Gifte beobachten. 1. Der Nachw^eis von Strychnin. Die durch Strychnin am Frosch hervorgerufenen Krämpfe sind im Gegensatz zu den durch Pikrotoxin bedingten charakterisiert durch vor- wiegende StreckstelluQg der Hinterbeine, so daß das in Fig. 23 wiedergegebene Vergiftungsbild zustande kommt. Diese Streckkrämpfe, der sogenannte Tetanus, treten an Wasser- fröschen und Grasfröschen nach kleinen Strychnindosen in gleicher Weise auf. Der Wasserfrosch ist gegen Strychnin etwas empfindlicher als der Grasfrosch. Bei kleinen Fröschen von 25— oO^j' Gewicht, welche in Zimmertempe- ratur gehalten wurden, beginnen die ersten Zeichen einer Strychninwirkung Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 45 bei Dosen von 5/1000 mg des Nitrats. Dieselben bestehen in einer leichten „Steig-erung der Reflexe" beim Wasserfroseh , dadnrch nachzuweisen, dal.) man den Frosch leise auf dem Rücken i)erührt, wobei er, oft blitz- schnell, manchmal unter schwachem (,)uaken, zusammenzuckt. Ilci dieser Dose ist beim Grasfrosch meist noch keine Wir- kung zu sehen. Pi«. 23. Bei Dosen von 1/100 mg des Nitrats wird bei l)eid('n Froscharten die Reflexsteigerung deut- lich und hält, namentlich beim Wasserfrosch, mehrere Stunden an. /wischen 2 100 und 5/100 «7^^ des Nitrats liegen für mittelürolje Frösche die niedersten Te- ^-j '6: \V tanus hervorrufenden Dosen. Rei 5/100 mg zeigen die Tiere nach etwa 10 Minuten Reflexsteigerung, nach 20 — oO Minuten erfolgen auf äuljeren Reiz, z. B. beim Beklopfen des Tellers, die ersten tetani- schen Anfälle. Anfangs sind dieselben noch von kurzer Dauer, und die Tiere ziehen nach dem Streckkrampf die Hinterbeine wieder an. Später werden diese dauernd gestreckt gehalten und die Krämpfe erfolgen scheinljar ohne äußeren Anstoß. Die Vorderbeine werden während der Krämpfe übereinander gekreuzt. Zur Anfertigung der Zeichnung wurde ein Grasfrosch gewählt , da bei diesen die Starrheit der Beine, verbunden mit Dehnung der Schwimmhäute, liesser ausgeprägt ist als bei Wasserfröschen. Bei Dosen von etwa 1 mg Strychninnitrat be- ginnt neben der Erregung schon eine daiauffolgende Lähmung 1) sich geltend zu machen. Die Lähmung tritt in auffälliger Weise nur an Wasserfröschen zu- //||'\^ M, tage und betrifft bei diesen sowohl das Zentral- //' \( //,, nervensystem, wie die motorischen Nervenenden im [[ [/^ ^1 Muskel (Curarinwirkung). Sie tritt leichter bei Warmfröschen (im Sommer) als I)ei Kaltfröschen auf. Dosen von mehreren Milligrammen be- Rana fuBca. strvchninu.t«nD». wirken beim Wasserfrosch fast keinen Tetanus mehr, sondern nur Lähmung. Solange die Herztätigkeit der Frösche nach den Strychningaben eine ausreichende ist, erholen sich dieseli)en selbst nach großen Dosen wieder, wenn man sie in öfter gewechseltem Wasser liegen läßt. In dieses wird, oft erst nach \ Crlauf mehrerer Tjure, alles Strvchnin wieder ausueschieden. a: ') Vgl. E. PokIssoii , Ülier die lälinionilo Wirliiing des Stiychnins. Arch. f. exp. I'athol. u. Pharmakol. Bd. 26. S. •>> (181)0). 46 H. Fühiier. Kohert^) und nach ihm Focke-) empfehlen als empfindhcher zum Strychninnachweis sog. ..Reflexfrösche", d. h. geköpf te Tiere oder solche, denen das Gehirn, wie beim Veratrinnachweis angegeben ist, zerstört wurde. Reflex- frösche sitzen noch normal, zeigen aber keine spontanen Bewegungen mehr. Erwähnung verdient, daß von anderen toxikologisch wichtigen Alka- loiden noch das Brucin, Thebain, Morphin und Coffein Tetanus an Fröschen hervorrufen, aber erst in viel größeren Dosen als das Strychnin, von welchem diese Alkaloide außerdem leicht durch chemische Identitäts- reaktionen unterschieden werden können. Zum Nachweis von Strychninraengen , welche kleiner sind als etwa 2/100 mg, sind Versuche an der weißen Maus (s. d.) anzustellen. 2. Der Nachweis von Pikrotoxin und Cicutoxin. Ein ganz anderes Vergiftungsbild als das Strychnin ruft das zweite toxikologisch wichtige Krampf gif t, das Pikrotoxin, hervor, welches mit Strychnin, Brucin, Chinin und Pikrinsäure den bitteren Geschmack teilt. In Fig. "24 sind Frösche in mehreren Stellungen abgebildet, me sie für die Pikrotoxinvergiftung typisch sind. Im Gegensatz zur Streckstellung Fig. 24. Kana esciilenta. Pikrotoxinstellungen. im Strychninkrampf beobachtet man hier Überwiegen der Innervation der Beuger an den Hinterbeinen. 1) R. Robert, Lehrbuch der latoxikationen. Bd. 1. Stuttgart 1902. S. 191. — Der- selbe, Über die Bedeutung des biologischeu Giftuachweises für die gerichtliche Mediziu. Ber. d. Deutsch, pharmazeut. Gesellsch. Bd. 13. S. 330 (1903). -) C. Pocke, Die Heranziehung physiologischer Versuche zum qualitativen und quantitativen Nachweis krimineller Strychninvergiftung. Vierteljahrsschr. f. gerichtl. Medizin. 3. Folge. Bd. 37. S. 28 (1909). Nachweis und Bestimmung von (iifteu auf hiologischem Wclto. 47 All iiiittolyroCicn AVasserfröschen (etwa öO g) hat eine Dose von 1/10 m^ l'ikrotoxin keine Wirkung. 2, 10 mg zeiii't eine erst nacli mehreren Stunden deutlich werdend«* AVirkunii, welche (hirin bestellt, dal) das Tier sich nicht mehr auf seine Vorderl)eine stützt und die Hinterbeine schon vorwiegend in Ijeugcstdlung hält. Zugleich beobachtet man Dehnung der Schwimmhäute. Die Stellung ■wird auf Reizung des Tieres mehr ausgeprägt. Der Thorax ist gebläht. Spontane Bewegungen werden kaum ausgeführt. Kii'impfe treten bei dieser Dose noch nicht auf. Noch nach 24 Stunden besteht bei den Tieren Steifigkeit und Disposition zur Einnahme der charakteristischen ..Pikro- toxinstelluii g". 5 10 mg. Etwa V4 Stunden nach der Injektion tritt der erste Krampfanfall auf, nachdem vorher schon die charakteristische Stellung ein- genommen wurde. Im Krampfanfall können die Tiere auf den Iiücken ge- schleudert werden und von hier wieder in die Bauchlage. Plötzliche Ent- leerung der Luft aus dem geblähten Thorax unter starkem Schrei wird bei dieser Pikrotoxindose meist noch nicht beobachtet. Die Krämpfe halten mehrere Stunden an und nehmen allmählich an Intensität ab. Auch die Pikrotoxinstellung ist weniger ausgesprochen wie zu Anfang. Werden die Frösche mit Wasser abgespült und in solchem aufbewahrt, so können sie am anderen Tag noch leben, sind aber meist noch gelälimt. •• 10 nxj l'ikro- toxin ist für mittelgroße Frösche etwa die tödliche Grenzdose. 1 mg. Nach einer halben bis einer Stunde stellen sich nach dem Prodromalstadium Krämpfe ein, die anfangs tetanischen Charakter haben können. Meist noch später kommen spontan oder häufig noch besser auf Heizung sehr starke Krampfanfälle zur Beobachtung, die durch starke Blähung des Thorax und dessen plötzHch erfolgende Entleerung ver- bunden mit starkem Schrei (namentlich bei männlichen Fröschen) aus- gezeichnet sind. Krämpfe mit und ohne Schrei können sich noch mehrere Stunden lang wiederholen. Sie werden allmählich schwächer und schließ- lich stirbt das völlig gelähmte Tier. Erholung nach so starker Pikro- toxinvergiftung der Frösche ist selten. Bemerkenswert an der Pikrotoxin- vergiftung des Frosches ist der langsame Verlauf selbst iiei tödlichen Dosen. Bei Vorhandensein von genügend Material kann neben dem \'ersnch am Frosche ein solcher an kleinen Fischen ausgeführt werden. Nach JJraf/endor//"^) steri)eii kleine Karpfen von Oö — 07 Minuten erfol- gende Eniporziehen der Hinterbeine über den Iiücken. Man kann die typische Stellung noch deutlicher zur (Geltung l)ringen, Avenn man die Beine des Frosches über seinem Bücken in die Höhe schiebt. Sie wer- den dann hier festge- halten. Weniger cha- rakteristisch für die Nicotinwirkung als die Beeinflussung der Stel- lung der Hinterbeine in der angegel)enen Weise ist eine solche der Vor- derbeine. Diese werden meist nach unten an den Bauch angelegt. Allmäh- lich sinken die in ab- normer Haltung befind- lichen Hinterbeine in die Kormalhaltung zurück. Nach 2 bis o Stunden kehren Atmung und spontane Bewegungen wieder. 5/10 mg. Hier sind die geschilderten Erscheinungen noch ausgeprägter und die Erholung erfolgt später. 1 mg. Schon nach 1 — 2 Minuten tritt Atmungsstillstand und Flimmern der Flanken auf. Nach :'> .Minuten beginnt das Emporziehen der Hinter- beine über den Kücken, während die Vorderbeine noch in normaler Stel- lung sich befinden. Nach etwa 5 Minuten erträgt der Frosch Rückenlage und die Vorderbeine sind nunmehr an den Leib nach unten angelegt. Nach 10 Minuten ist das Flimmern dei- Flankenmuskulatnr vorüber und die Beine werden weniger kräftig über dem Kücken emporgezogen. Die typische Haltung der Hinterbeine ist bei dieser Dose in etwa ;>() Minuten vorüber Abderhalden. Hundbach der biochemischen ArbcitsmctbodcD. V. 4 Bana escnlenta. NicotiusteUungcu. 50 H. Fühner. und die Hinterbeine erschlaffen. Die Muskulatur des Tieres nimmt bei dieser und größeren Nicotingaben einen eigeutümliclien Zustand der Steif- heit an , so daß man den Frosch in Körperstellungen , wie sie Fig. 25 C wiedergegeben, bringen kann, welche lange Zeit beibehalten werden. Ton genannter Dose erholen sich die Frösche regelmäßig wieder. Auch an Grasfröschen ruft das Nicotin die typische Beinstellung hervor, sogar schon in Dosen von 1/10 mg. Doch ist die Erscheinung bei den etwas weniger empfindlichen Wasserfröschen besser zu beob- achten. Wichtig ist, daß namentlich dem Co nun, welches bei dem Gang der toxikologischen Analyse gleichzeitig mit dem Nicotin ausgeschüttelt wird, die hier beschriebene Wirkung- auf den Frosch vollständig fehlt. Ebenso fehlt sie dem Pilocarpin und dem synthetischen Muscarin. Dies ist insofern beachtenswert, als am isoherten Muskel das Muscarin und in schwächerem Maße auch das Coniin tonische Kontraktion wie das Nicotin hervorrufen. 4. Der Nachweis von Colchicin. Die biologischen Reaktionen, welche für das Colchicin bekannt sind, genügen allein nicht, das Gift mit Sicherheit nachzuweisen. i\.ber die kombinierte Verwendung chemischer und biologischer Reaktionen er- möglicht dieses. Die Frösche sind, wie Jahohj^y gezeigt hat, gegen reines Colchicin auffallend wenig empfindlich. 10 mg mittelgroßen Wasserfröschen in den Brustlymphsack injiziert, bleiben ohne jede Wirkung. 20 mg. Nach einigen Stunden zeigen sich schwache zentrale Wir- kungen. Legt man den Frosch auf den Rücken, so dreht er sich wieder- holt um, ermüdet dann aber und erträgt längere Zeit Rückenlage. Bei männhchen Tieren ist beim Streichen über den Rücken leicht der soge- nannte ..Quakreflex'' auszulösen. Spontan bewegt sich der Frosch nicht, verhält sich also wie ein Tier, dem das Großhirn zerstört wurde. Bei regelmäßigem Abspülen erholt sich der Frosch in 2—3 Tagen wieder völlig. 40 Wig. Etwa eine Stunde nach der Injektion erträgt das Tier zeit- weise Rückenlage und befindet sich in einem Zustand leichter Narkose. Nach 2 Stunden erscheint die Bauchhaut gerötet. 24 Stunden nach der Injektion erträgt der Frosch lange Zeit hindurch Rückenlage. Thorax- atmuug fehlt und Kehlbewegung ist selten. Bei Berührung der Flanken tritt Thoraxblähung und Exspiration unter Quaken ein. Spontan bewegt sich der Frosch nicht. Nach 2 — 3 Tagen bemerkt man wieder bessere Be- weglichkeit und auch die Atmung wird wieder sichtbar. Trotz dieser an- fänglichen Remission erfolgt keine völlige Erholung. Fortschreitende zentrale ^) C. JakobJ, Pharmakologische Untersuchung über das Colchicuingift. Arch. f. €xp. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 27. S. 125 (1890). Nachweis und Bestimmung von (jit'tcii auf liiologischem Woge. 5^ Lähmung- macht sich mehr und mehr geltend. Nach etwa einer Woche kann das Tier sich nicht mehr ans der llückenhige umwenden, die Keflexe (Anziehen der Heine auf Kneifen (h'r Zehen) sind aber noch erhalten. Später kann der Frosch nicht mehr normal sitzen. l)ie JIcinc ^[leiten aus und das Tier liegt auf dem IJauche. Nach et\\a 2 Wochen hat die Haut, wehdie schon längere Zeit hindurch dunkel war, wachsartigen (Jlanz angenommen (,, Wachshaut"). Die Reflexe verschwinden dann immer mehr und mehr, meist zuletzt der Kornealreflex. Öffnet man bei dem völlig reflexlosen Tier den Thorax, so findet man das Herz noch ki-äftig schlagend. Diese Angaben über die Wirkung des Colchicins sind nach F.eobach- tungen an gesunden Was.serfröschen gemacht, und zwar wurden 2° mehrere Wochen im Thermo- staten halten, wenn man sie täglich mit Wasser, welches bei derselben Temperatur gehalten wird, abspült. Injiziert man Fröschc^n. welche ö bis 6 Tage bei dieser Temperatur gehalten wurden und hier sich normal be- fanden — die Tiere fidiren bei diesen Temperaturen sehr lebhafte Bewe- gungen aus — Colchicindosen von Ol — 1 mg, so sterben sie im \erlauf von 2 — 5 Tagen unter den Erscheiimngen fortschreitender zentraler Läh- mung, wie sie bei großen Colchicindosen in der Kälte auftreten und hier sich sehr langsam entwickeln. Die Giftigkeit des Colchicins ist bei dieser Temperatur für die Frösche annähernd öOOmal höher als bei Zimmertem- peratur. Zum Nachweis von Colchicin unter Verwendung von Fröschen kann man in der Weise vorgehen, daß man das verdächtige, die chemische l'ol- chicinprobe gebende, möglichst gereinigte Material einem bei Zimmertem- peratur gehaltenen Wasserfrosche von 25 — HO g injiziert und diesen in etwas W'asser, das täglich öfters gewechselt wird, 2 Tage sitzen lälit. Das Wasser, in welches der Frosch Harn und Kot entleerte, wird filtriert und eingedampft und kann wieder zu chemischen und biologischen Frohen (\'er- such an der weißen Maus) dienen, da das Colchicin vom Frosche in wirk- samer Form wieder im Harn ausgeschieden wii-d. Hat der Frosch 2 Tage hindurch l)ei Zimmertemperatur keine \'ergiftungserscheinungen gezeigt — Mengen, bei denen der Frosch schon in der Kälte Wirkungen zeigt, werden in forensisch-toxikologischen Fällen wohl nie vorhanden sein — so verbringt man ihn zugleich mit mehreren Kontrollfröschen derselben (Jröße in den Thermostaten von HO — i\2°. Sind Colchicinmengen von liiifi und darüber dem Tiere injiziert worden, so stirbt es im TiuMinostaten im Ver- lauf von 2 — H Tagen, bei geringeren Mengen tritt der Tod häufig erst nach 4 Tagen und später ein. Die Kontrollfrösche müssen in 'b-r-rlben ') H. Fühncr, l ber den tu.xikologischen Nachweis des Colchii-ins. Arcli. f. rxp. Pathul. u. Pharmakol. Bd. 63. S. 3(55 (1910). 4» 52 H. Fühner. Zeit durchaus normal bleiben. Bei Vorhandensein von genügend Material wird man zweckmäßig zur Bestätigung der ersten Probe noch einen Frosch injizieren, welcher schon einige Zeit im Thermostaten gehalten wurde. Als charakteristisch für das Colchicin und für den biologischen Nach- weis am Frosche verwertbar ist demnach seine geringe Giftigkeit bei nie- derer Temperatur und seine außerordentlich gesteigerte Giftigkeit bei höheren Temperaturen. Andere Gifte, welche beim Gange der toxikologischen Analyse zugleich mit dem Colchicin in die Ausschüttelungsflüssigkeiten übergehen können, wie Pikrinsäure, Pikrotoxin, Strophanthin, Digi- toxin und Veratrin, zeigen derartige Differenzen nicht. Bei Zimmer- temperatur unwirksame Mengen dieser Gifte sind auch bei 30 — 320 nicht imstande, den Tod von Fröschen herbeizuführen. Zur weiteren biologischen Charakterisierung des Colchicins können Versuche an der weißen Maus (s. d.) oder Katze angestellt werden. 5. Der Nachweis von Guanidin und Methylguanidin. Das Guanidin selbst besitzt keine forensisch-toxikoloo-ische Bedeu- tung, hingegen kommt solche dem Methylguanidin zu, welches nach Achelis'^) als normaler Bestandteil des Harns vorkommt und nach Brieger-) bei der Fäulnis von Fleisch sich bildet. Injiziert man Fröschen Auszüge von Leichenteilen, so können demnach Wirkungen des Methylguanidins oder Guanidins, welche bei beiden Substanzen die gleichen sind, auftreten. Die Kenntnis derselben ist darum für den Gerichtsarzt und Gerichts- chemiker wichtig. Zur Prüfung sind kleine lebhafte, möglichst frisch gefangene Wasser- frösche (oder auch Grasfrösche) von 20 — 30 g geeignet. Vom salzsauren Guanidin ist für kleine Wasserfrösche 1mg die unterste Grenze, bei welcher noch charakteristische Wirkungen am ganzen Tier beobachtet werden können. Doch meist undeutlich. 2 mg sind am normalen Frosche im allgemeinen deutlich wirksam. Etwa 20 jNlinuten nach der Injektion in den Brustlymphsack beobachtet man bei der Atmung des Tieres eine eigentümlich wogende Bewegung der Flanken. Nach dieser Zeit und oft schon früher treten sogenannte fibril- läre (faszikuläre) Zuckungen in der Nähe der Injektionsstelle auf, also zu- nächst an den Vorderbeinen und der Bauch- und Seitenmuskulatur, später auch in der Muskulatur des Kückens. Sehr auffällig sind auch die sich unter der Einwirkung des Guanidins einstellenden Bewegungen des Aug- apfels. Zuckungen in der Muskulatur des Oberschenkels erfolgen erst später, etwa nach »/^ — 1 Stunde. Bei diesen kleinen in den Brustlymphsack injizierten Dosen beobachtet man meist kein Fortschreiten derselben bis zu den Füßen. Erst bei größeren Dosen. *) W. Achelis, Über das Vorkommen von Methylguanidin im Harn. Zeitsclir. f. physiol. Chemie. Bd. 50. S. 10 (1906/1907). *) L. Brieger, Untersuchungen über Ptomainc. 3. Teil. Berlin 1886. S. 34. Nachweis und Bestimmung von Giften auf bioloirischem Woue. 53 Diese eigentümliche Wirkuii'^ des (Juanidiiis ist eine rein lokale '\Virknn<>' auf den mit der Substanz in P>eriihrun{jr kommenden Muskel bzw. die motorischen Nervenenden in dem Muskel, welche durch das (luanidin erreiit werden. Das progressive X'ordriiiiien des Guanidins liilU sich am besten bei Injektion in den Lymphsack des Oljerschenkels verfoliren, wobei die Guanidinzuckuni^en längere Zeit auf die injizierte Korperseite be- schränkt bleiben. Die Erscheinuniien nach 2 mri Guanidiniumchlorid bleiben mehrere Stunden lang ungeschwächt l)estehen. Nachdem sie schon nachgelassen, treten sie beim Abspülen des Frosches wieder verstärkt auf. Zu erwähnen ist noch die bei dieser Dose schon zur Beobachtung gelaiiüende I'.lähung des Thorax. Rückenlage erträgt der Frosch nicht. 24 Stunden nach der Injektion ist das Tier wieder völlig normal. Während solch kleine Guanidindosen nur die motorischen Nerven- enden in den Skelettmuskeln erregen, besitzen große Dosen auch zentral erregende AVirkung, die sich in krampfhaften Zuckungen der Deine äußert. Auf die zentrale Erregung folgt zentrale Lähmung, bei welcher der Frosch reflexlos wird. In diesem Stadium sind anfimglich vom freigelegten Nervus ischiadicus (über dessen I'räparation und Reizung vgl. beim Nachweis von Curarin) aus durch elektrische Reizung noch Zuckungen der zugeliöi'ii;en I:)einmuskeln auszulosen. Endlich werden aber auch die durch das (iuani- din zuerst erregten motorischen Nervenenden nach Art des Curarins ge- lähmt (Fi(Ji)ier^), so daß elektrische Reizung des N. ischiadicus ohne Er- folg bleibt, während direkte Muskelrei/ung noch wirksam ist. Durch Guanidin zentral und peripher gelähmte Frösche erholen sich meist nicht mehr. Zum Nachweis des Guanidins und Methylguanidins dient lediiilich die erregende Wirkung auf das motorische Nervenende. Diese Wirkung kann am isolierten Muskel (s. d.) auch graphisch registriert werden. Zuckungen von ähnlicher Intensität, wie sie (iuanidin und >h'thyl- guanidin am Frosche hervorbringen, verursacht auch das toxikologisch nicht in Betracht kommende Tetraäthylammoniumchlorid, dami aber von Alkaloiden namentlich auch das Nicotin. Bei diesem treten die Zuckungen schnell nach der Injektion auf und gehen sehr rasch vorüiier. In gerin- gerem Malie kommt diese Wirkung auch l)ei Injektion von Aconitinlösungen zur Beobachtung. Rhysostigmin, welches eine ähnliche Erscheinung am Warmblüter hervorruft, ist in dieser Hinsicht am Frosche unwirksam. Eine Verwechslung des Guanidins oder Methylguanidins mit den tertiären Alkaloiden Aconitin und Nicotin auf (Jrund dieser Muskelwirkimg ist da- durch ausgeschlossen, daß bei Ausschüttelunii mit Chloroform und .\ther letztere aufgenommen werden, das (iuanidin aber, wie das Curarin. Mus- carin und andere (luartärc Ammoniumverliindinigen. zurückltleibt. ') //. Fiihncr, Cnrarestudion. I. Die peiipliore Wirkuntr J zu dem Drahte ireschehen , welcher Bana esculenta. Verpucheaiiordniinp zur Pleklrischen Reizung; des Musculus ^'astrocniTnius. 56 H. Fi'ihner. Sehne und Schreibhebel verbindet. Die zweite Zuleitung erfolgt durch einen Draht (Fig. 21 D), welcher zu einer Klemmschraube führt, die von einer starken, das Knie des Frosches durchbohrenden Nadel getragen wird. Die Nadel dient zugleich zur Fixierung des Froschbeines auf dem Frosch- brett. Viel bequemer für diesen Reizungsversuch ist die Verwendung des früher (S. 33) erwähnten Froschbrettes nach Boehm. Der Froschmuskel soll nun rhythmisch alle 4 oder 5 Sekunden mit von gleicher Stärke gereizt werden. Da die Öff- nung des Stromes wirk- Einzelinduktionsschlägen Fig. 27. samer ist als dessen Schlie- ßung, so kann nur mit Öffnungs- oder mitScliIie- ßungsschlägeu gereizt werden. Zur ,, Abbiendung" der einen oder anderen Art von Schlägen existieren mechanische Vorrichtun- gen, wie eine solche S. 40 angegeben ist. Für den Veratrinnachweis ist diese Appai'atur überflüssig. Man kann hier manuell nach der Uhr rhythmisch reizen unter Verwendung von 2 (^)uecksilberschlüsseln zur Abbiendung , welche , wie aus P^ig. 27 ersichtlich, in den primären und se- kundären Stromkreis ein- geschaltet werden. Will man den Frosch mit Schließuugsschlä- gen reizen, so schließt man von den anfänglich offen- stehenden Schlüsseln erst Si. Hierbei zuckt der Gastrocnemius. Dann schUeßt man S^, öffnet S^ und dann wieder Ä,, was alles keine Zuckung auslöst. Um mit Öffnungs seh lägen zu reizen, schließt man zuerst Ä,, was wirkungslos bleibt, dann S-^ , gleichfalls ohne Wirkung. Öffnet dann S.2, wieder ohne Wirkung und endlich S^, wobei der Muskel zuckt. Dieses Spiel der Schlüsselhebel wird weis ist es gleichgültig, ob verwendet. Reizt man einen normalen Versuchsanordnung zur Abbiendung der Öffnungs- oder Schließungsinduktionsschläge. regelmäßig man Öffnuugs- wiederholt. Für den Veratrinnach- oder Schheßungsschläge zur Reizung Froschffastrocnemius mit einem wirk- samen Induktionsschlag, so führt dieser eine Zuckung aus. Bei graphischer Nacliweis und Bestimmung von (üften auf biologischem Wc/c 57 Registrierung- unter Verwendung einer rnidrehnngsgeschwindigkeit des Kyniographions von etwa Tö cm in der Sekunde erhiilt ni.-ui Kurven mit einem (lipfelpunkt. wie solche in Fig. 40 r< wiedergegeben sind. Unter diesen Kurven ist die Zuckung eines Muskels nach \eratrinvergiftung auf- gezeichnet (Fig. 40/0, dadurch auffallend, daß die Kurve hier iMIipfel- punkte besitzt. Ahnlich wie diese am isolierten Froschmuskel aufgenom- menen Kurven sehen diejenigen aus, welche man vom ganzen Frosch nach Veratrinvergiftung erhält. Reizt man den Frosch regelmäbig- alle 4 — 5 Se- kunden, so verschwindet allmählich der zweite Gipfel der Zuckunti und nach 10 — 20maliger Reizung zeichnet der Muskel normale Zuckungen auf. Nach einer Pause von mehreren Minuten labt sich eine neue Serie charak- teristischer Kurven aufnehmen. Fig. 38 zeigt eine derartige, ebenfalls am isolierten Muskel gewonnene Kurvenreihe, bei langsamei'em Trommel- gang (1 )n})i pro Sekunde) und unter Reizung mit 4-Sekundenüffnungs- schlägen aufgenommen. Gibt eine Substanz oder ein bei der toxikologisch-chemischen Analyse erhaltener Rückstand die chemischen Reaktionen des Veratrins, so ist von vornherein vorzuziehen, die luologische Prüfung: auf das Gift nicht am ganzen Frosch, sondern am isolierten Froschmuskel vorzunehmen, in der Weise, wie weiter unten angegeben. Erwähnung verdient, daß ein von Jdcohj^) durch Oxydation von Colchicin erhaltenes, von ihm Oxydicolchicin genanntes Produkt, an Fröschen veratrinähnliche Wirkung hat, und daß solche Wirkung nach Santesson-) auch durch größere Dosen von Glyzerin hervorgerufen werden kann. 7. Der Nachv^reis von Curarin, Coniin und von anderen Substanzen mit Curarinwirkung. Wenn auch die toxikologische Bedeutung des reinen Curarins. von welchem gutes Kalebassencurare etwa lO^o enthält, eine nur geringe ist, so muß doch der biologische Nachweis desselben hier besprochen wer- den, da Curarinwirkung einer großen (Jruppe von Substanzen zukommt. Während sich bei Vergiftungen von Fröschen mit Sui)stanzen, die zentral oder peripher erregend wirken, oft ein charakteristisches Ver- giftungsbild entwickelt, ist dies bei Substanzen, welche von Anfang au zen- tral oder peripher lähmend wirken, nicht der Fall. Injiziert man einem Frosche ein Gift, welches zentral lähmt, z. 15. ein Narcoticum wie Urethan in Menge von 02 ,7 'u\ 2 cin^ in den lirust- lymphsack, so beobachtet man nichts weiter, als daß das Tier sich nach ') C. JacohJ , riiarmakolotrische Untcrsuchunsr über das ( ololiicumirift. Aroli. f. exp. Pathol. u. Pliarmak..!. Bd. 27. S. 141 (18iKJ). *) C. G. Santesson , Einiges über die Wirkung des Glyzerins und des Veratrins auf die (juergestreifte Muskelsubstanz (Frosch). Skandinav. .\rch. f. Pliysiol. Bd 14. S. 1 (l'JÜ3). 58 H. Fiihner. 5 — 10 Minuten nicht mehr aus der Rückenlage umzudrehen vermag, daß auch die Aterabewegungen des Thorax meist eingestellt sind, während der Herzschlag noch deutlich an rhythmischen Bewegungen der Brustwand zu erkennen ist. Reflexbewegungen sind am Anfang auf Kneifen der Beine noch auszulösen, bald ist aber völlige Reflexlosigkeit eingetreten. Denselben nur etwas langsameren Verlauf nimmt die Vergiftung bei einem Frosche, welchem man eine genügende Dose Curarin (Vioo mg oder Vio mg gutes Kalebassencurare) injiziert hat, welches im Gegensatz zum Urethan den Frosch nur peripher lähmt, und zwar hier die motori- schen Nervenenden in den '^' ■ ■ Skelettmuskehi. Beide Frösche sind ohne eingehendere Prüfung nicht voneinander zu unterscheiden. Der durchgreifende Unter- schied beider Vergiftungen läi)t sich aber leicht unter Zuhilfenahme von elektri- scher Reizung feststellen. Zu dem Zwecke präpariert man den Nervus ischiadi- cus, den Hauptnerv des Froschbeines. Man l)ringt dazu den bewegungslosen Frosch in Bauchlage und legt mit einem Scherenschnitt in der Mitte eines Oberschenkels (vgl. Fig. 28 ) dessen Muskulatur frei. Beim Auseinanderziehen der Haut treten, zum Teil noch von einer feinen Haut (Faszie) bedeckt, o Muskeln hervor: Der Mus- culus glutaeus magnus (a), der Musculus semimembranosus (b) und zwischen beiden der Musculus ileofibularis (c). Der Nerv liegt in der Tiefe zwischen M. semimembranosus und M. ileofibularis. Spaltet man die zwischen beiden Muskeln liegende Faszie vorsichtig, so lassen sich die Muskeln mit einer Pinzette leicht auseinanderschieben und der Nerv er- scheint als glänzender weißer Strang (e), begleitet von der schwarzen Ar- terie (d), welche ihn zum Teil überbrückt. Bei weiterem Auseinander- ziehen der Muskulatur kommt seitUch noch die Hauptvene des Beines (f) zum Vorschein. Unter den Nerven schiebt man schonend eine feine Pinzette, wobei man sucht, dieselbe zwischen Arterie und Nerv durchzuführen. Ist dies ge- lungen, so kann man durch Verschieben der Pinzette nach rechts und links den Nerven in einer Ausdehnung von 1 cui und mehr frei über der Freilegung des Nervns'iscliiadicus. Niichweis uiul Bestimmung von Giften auf l)i<»lofrisch('m Wege. 59 Pinzotto liegend erhalten. \on hier aus legt man ihn über die umgebogenen Knden der Reizelektrode (Fig. 20 A'), was alles ohne Zerrung des emi»fiiid- lichen Nerven geschehen mnl». Hei dem Urethanfrosch wird man bei größtem Uollcnabstand des Induktionsapparates bei tetanisiorender Reizung Zuckung im rntorschenkel und FulJe auslösen können. Rei dem mit Curarin vergifteten Frosche, so- bald die Wirkung des (iiftes eine vollständige ist, wird man auch l)ei völlig übereinandergeschobenen Rollen des Apparates, zwar durch Strom- schleifen vielleicht Zuckungen der Muskulatur in der Nähe der gereizten Stelle, aber nicht im Unterschenkel und Ful) erhalten können. Dali es sich hier bei völlig oder nahezu übereinandergeschobenen Kollen um Strom- schleifen handelt, durch welche die Muskulatur direkt gereizt werden, lälit sich dadurch zeigen, daß die Muskelzuckungen nicht mehr auftreten, wenn man den Nerven möglichst weit nach ol)cn (zentralwärtsj freilegt und hier abschneidet. Wird nun das äußerste Nervenende bei der Reizung über die Elektrode gebrückt, so werden die früheren durch Stromschi -ifen her- vorgerufenen Zuckungen ausbleiben. AVährend bei völliger Curarinlähmung die Muskulatur vom Nerven aus nicht erregbar ist, können Muskel- zuckungen beim direkten Aufsetzen der Elektrode auf einen Reinmuskel in normaler Weise schon bei einem Rollenabstande von 8 — lö ciit der ge- bräuchlichen Induktionsapparate ausgelöst werden. Es ist charakteristisch für die Substanzen mit typischer Cur arin Wirkung, daß sie in Dosen, welche ausreichend sind, die Reizübertragung vom Nerven auf den Muskel zu blockieren, den Muskel selbst intakt lassen und diese Eigenschaft läßt sich zum biologischen Nachweis derartiger Produkte verwerten. Rei Vorhandensein von genügend Untersuchungsmaterial kann zur weiteren Charakterisierung vorhandener Curarinwirkung ein bekannter \'er- sucli von Claude Beniard^) dienen. Man setzt einen normalen kleinen Wasserfrosch in eine (ilasschale mit übergreifendem Deckel (Petrischale) und gibt dazu einen Wattebausch, der mit Äther getränkt ist. Nachdem der Frosch Rückenlage erträgt, wird er herausgenommen und wie oben lieschrieben , unter \'ermeidung von Rlutungen aus den leicht verletzbaren (iefäßen. der Nervus ischiadicus in möglichster Ausdehnung präpariert. Unter diesem zieht man einen starken RaumwoU- oder Seidenfaden durch, schiebt zwischen Faden und Nerv einen dünnen, mit Ringerlösung getränkten Watteliausch (Fig. '1\^) und schnürt dann durch Anlegen eines Knotens den ( )bersclienkel unter dem Nerven fest ab. Die Ligatur muß so fest liegen, daß bei der Reob- achtung der Schwimmhaut unter dem Mikroskop (s. S. 4:D keine Zirkula- tion mehr wahrgenommen werden kann. Der Wattebausch wird dann über dem Nerven zu dessen Schutz vor Vertrocknung zusannnengelogt und von Zeit zu Zeit mit Ringerlö.sung befeuchtet. Der Nerv darf von der Haut. *) Cl. Brrnard, Lerons sur les effets des stibsfances toxitjues et mt-dieainentcuscs. Paris 1857. p. 320. Nnuveau tirage. Taris 1883. p. 320. 60 H. Füll u er. Fig. 29. des schädlichen Sekretes wegen, nicht berührt werden. Nachdem sich der Frosch von der Narkose erholt hat, Avird ihm die auf Curarinwirkung zu prüfende Lösung injiziert. Ist Curarinwirkung vorhanden, so ist Lähmung des Tieres nach i/., — 1 Stunde eingetreten. Die Lösung hat sich überall im Körper des Frosches verbreitet, mit Ausnahme des umschnürten Beines, in welchem die Zirkulation ausgeschaltet wurde. Taucht man nunmehr den Fuß des nicht ligierten Beines in verdünnte Essigsäure, so zuckt, wenn die Curarinlähmung voUständig ist. nur das hgierte Bein, während in dem anderen vergifteten Beine Zuckungen ausgeschlossen sind. Der Versuch zeigt zugleich, daß die Empfindung des Frosches noch vorhanden ist, daß also die in der Haut liegenden sensibeln Nervenenden durch das Gift nicht gelähmt werden. Die Leitung erfolgt noch normal von der Haut zum Eückenmark und von hier zurück auf das abgebundene Bein. Dieser soge- nannte Reflexbogen ist also für das abgebundene Bein intakt, welches natürhch auch reagiert, wenn es selbst durch Säure oder anderweitig gereizt wird. Das Vorhanden- sein schwächerer Grade von Curarinwirkung läßt sich noch durch den Versuch am isoherten Nervmuskelpräpa- rat (s.d.) nachweisen. Gesunde Frösche ertragen große Curarin- dosen und scheiden das Gift im Harn wieder aus. Mit dem Harn können von neuem andere Frösche vergiftet werden. Nach der Untersuchung von Tillie^) hat an Wasserfröschen mittlerer Größe (etwa 50 g) 1/1000 mg Curarin (Boehin) keine Wirkung. 1/100 mg lähmt noch nicht vollständig, hingegen genügen 1-5/100—2/100 mg zur Herbeiführung völliger Pteflexlosigkeit im Verlauf von V2 — 1 Stunde. Nach diesen Dosen erholen sich die in etwas Wasser gehaltenen Frösche nach 1 — 3 Tagen wieder. Nach größeren Dosen dauert die Erholung entsprechend länger. Das Curarin ist eine quartäre Ammoniumverbindung. Führt man die tertiären Alkaloidbasen durch Methyherung in quartäre Verbindungen über, so bekommen sie fast alle mehr oder weniger stark ausgeprägte Curarin- wirkung. Allerdings wird hierbei von keinem methylierten x\lkaloid die Wirkunesstärke des Curarins erreicht. Zu den am stärksten wirksamen Fropchpräparation nach Cl. Bernard. ^) J. Tillie, Über die Wirkungen des Curare und seiner Alkaloide. Arcb. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 27. S. 1 (1890). Nachweis iiiiil Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. gl Produkten f>ehüren inethvliertes Strychnin und Atropin uiul diese sind etwa hundertnial wenii^er wirksam am Frosch als das Curarin.M Diese niethylierten Produkte könueu toxikolo^nsche P>edeutuuü;' gewiuuen, da sie ueuerdiniis zum Teil in den Arzueischatz eingeführt wurden (z. B. Atroi)iuuietlivluitrat als Eumydrin und Apomorphinbrommethylat als Euporphiii). Auch die ali- phatischen quartären Ammoniumverhinduui'en , wie Tetramethvlamuio- niumchlorid und synthetisches Muscarin haben Curariuwirkuug. Die erwähnten quartären Ammoniumverhiuduuucu hahcu als P»asen das (Jemeiusame, daü sie sich mit Äther und Chloroform aus ihreu Lö- sungen nicht ausschütteln lassen. Hierdurch kann eiue Verwcchsluug mit tertiären Alkaloidbasen, welche Curarinwirkung besitzen, vermieden werden. Von tertiären Basen mit Curarinwirkuug ist am bemerkenswertesten das Coniin^), da bei ihm Lähmung zustande kommt ohne vorheriges Er- regungsstadium. Die C'urarinwirkung kann neben chemischen Reaktionen eventuell zur Charakterisierung des Coniins dienen. Allerdings tritt die- selbe erst bei größeren Mengen deutlich in Erscheinung. Co nun, als salzsaures Salz fi/trcZ;) kleinen Wasserfröschen in den Brustlymphsack injiziert, hat folgende Wirkung: 1 mg. Bleil)t ohne Wirkung. 5 mg. Nach V, — 1 Stunde wird das Tier schlaff und erträgt Piücken- lage. Die Reflexe erlöschen aber bei dieser Dose nicht völlig und nach einigen Stunden ist das Tier wieder erholt. 10 mg. Nach 15 Minuten erträgt das Tier Riickeidage und ist bald völlig reflexlos. Der Herzschlag bleibt gut äußerlich sichtbar. Legt man 1 — 2 Stunden nach der Injektion den Nervus ischiadicus eines Beines frei, so erhält man keine Zuckung des Fußes bei elektrischer Reizung, während die Muskulatur direkt gut erregbar ist. Legt man den l-'rosch, bei welchem der Herzschlag äußerlich gut sichtbar bleil)t, in etwas Wasser, so hat er sich bis zum nächsten Tage völlig erholt und auf Pieizung des Nerven er- folgen die Zuckungen des Beines wieder in normaler Weise. 20 mg. Wirkt wie 10 nie/. Hier ist nach mehreren Stunden der Herz- schlag äußerlich kaum mehr sichtl)ar, trotzdem man das Herz liei Eröff- nung des Thorax noch schlagend finden kann. Diese Menge kann als töd- hche Grenzdose angesehen werden. Jedenfalls ist das Coniin für P'rösche verhältnismäßig schädlicher als Curarin und Erholung erfolgt nach der mehrfachen Dose der peripher wirksamen Menge seltener. Curarinwirkuug besitzt dann von tertiären Alkaloiden noch das Cytisin»), dann vor allem das Strychnin (vgl. dessen Nachweis S. 44) M tlber den Wiikuugsgrail methylierter Alkaloidc vgl. //. Hihhlirandt , Zur Pharmakologie der Animoniuml»asen. Arcli. f. exp. I'atiiol. u. Pharniakol. Hd. 53. S. 84 (ino:>). -') (iirariiiwiikuiig licsit/t (his Coniin. hydroi-hhn-. Merck. Ks kommen aber nach Borhm [Arch. f. exp. l'athol. u. Pharmakol. Hd. 15. S. 432 (1882)] und an.icren Unter- sucIktm ancli Coniiiisorten ohiip ausgesprocliene Curarinwirkuiiir an Fnisclien vor. ') /.'. liadziivilloiricz. Über Cytisin. /.'. Kobcrtu Arbeiten a. d. pbarniak.)!. Institut Dorpat. Bd. 2. S. 73 (1888). 62 H. Fühner. und ausgeprägter das Brucin. Die beiden letztgenannten Alkaloide haben in großen Dosen namentlich für Wasserfrösche ausgesprochen peripher lähmende Wirkung, die beim Brucin ohne vorausgehendes Krampfstadium sich ausbildet. Bei Grasfröschen beobachtet man selbst bei großen Brucin- dosen tetanische Krämpfe vor dem Eintritt der Lähmung, während solche beim Curariu niemals auftreten. 8. Der Nachweis von Coffein und Theobromin. • Die Purinderivate lassen sich biologisch am Frosche durch eine eigentümliche Muskelwirkung charakterisieren, die namentlich am iso- lierten Muskel (s. d.) noch in großer Verdünnung nachzuweisen ist. Gibt irgend eine zu prüfende Substanz die chemischen Reaktionen der Purin- derivate, so ist von vornherein die biologische Prüfung nicht am ganzen Frosche, sondern am Muskelpräparat anzustellen. Die Muskelwirkung ist auch am ganzen Tier zu beobachten und hier viel ausgeprägter an Gras- fröschen als an Wasserfröschen. An Wasserfröschen treten aber nach Schniiedcherr/'^) neben der Muskelwirkung noch tetanische Anfälle, wie nach Strychninvergiftung, auf, und diese Tatsache verlangt ein näheres Eingehen auf die Wirkung vor allem des Coffeins am ganzen Frosch, um einer etwaigen Verwechslung mit den früher erwähnten Krampf giften vorzu- beugen. Injiziert man Wasserfröschen mittlerer Größe (bis zu 50 (?') wässerige Lösungen reinen Coffeins subkutan in den Brustlymphsack, so beobachtet man folgendes: 1 mg. Diese Dose hat keine deutliche Einwirkung. 5 mg. Eine Stunde nach der Injektion zeigt der Frosch gesteigerte Reflexerregbarkeit und quakt bei leichter Berührung des Rückens. Der Thorax ist gebläht. Beim Springen werden die Zehen (Schwimmhäute) gespreizt. Die Wirkung dieser Menge geht nach einigen Stunden vorüber. 10 mg. (1 ciu^ einer lo/oigen Lösung). Bald nach der Injektion wer- den die Vorderbeine starr und nach innen verdreht gehalten. Später wer- den auch die Hinterbeine steif, so daß alle Bewegungen, namentlich das Umdrehen aus der Rückenlage sehr schwerfällig und steif geschehen. Der Thorax ist gebläht. Allmählich tritt Reflexsteigerung auf. Beim Sprung ist prononzierte Streckstellung der Hinterbeine auffällig, aber kein Tetanus. Die Steifheit geht nach mehreren Stunden vorüber und die Reflexsteige- rung tritt stärker hervor. Beim Sprung werden die Beuger aber stärker innerviert als die Strecker, so daß Pikrotoxinstellung der Hinterbeine auf- tritt. Es dauert mehrere Tage, bis sich der Frosch von dieser Dose er- holt hat. *) 0. Schmiedeher g, Über die Verschiedenheit der Coffeinwirkung an Rana tem- poraria L. und Rana esculenta L. Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 2. S. 02 (1874). Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Weirc. gj) 2i)ing i-2('m^ oinor 1" ßig^'n Lösiinc-). P.akl nach diT Injektion l»e- ginnt (las .Steihvonlen der Vorder- und Hinterheine. Die Vorderheine werden gekreuzt , die Hinterheine stark an den Körper angezogen. Naeh cint-r Stunde ist die Steifheit der lieine geringer und Keflexsteigerung deuthch geworden. Bei Berührung des Körpers erfolgt reflektorisch Streckung der Hinterheine. Auch tetanische Anfälle können auftreten, wie sie die Strvchnin- wirkung charakterisieren Nach dieser Dose erholen sich die Frösche meist nicht mehr. An (irasfröschen tritt durch Coffein kein Tetanus auf. sondern nur die Muskelwirkung. Theobroinin ist nach Filehnc^) für Frösche etwas giftiger :\\< Coffein und ruft auch am Wasserfrosch keinen Tetanus hervor. Zum Nachweis der Turinderivate sind in jedem Falle Grasfrösche zu verwenden, da sie die Muskelwirkung besser zeigen als Wasserfrösche. 9. Der Nachweis von Giften mit Digitalinwirkung. „Eine Anzahl zum größten Teile stickstofffreier Pflanzenhestandteile, von denen die meisten zu den Glykosiden oder Pentosiden gehören, wirkt, abgesehen von quantitativen Unterscliieden, in so gleichartiger Weise auf das Herz der verschiedensten Tierarten, daß jede dieser Substanzen in bezug auf den Charakter dieser Wirkung wie eine getreue Kopie der anderen' erscheint. Sie werden schlechtweg als ..11 erzgifte" i)ezeichnet. Direkte Wirkungen auf das Nervensystem lassen sich mit Sicherheit weder an Menschen noch an Tieren nachweisen." „Zu dieser Gruppe, die durch die praktisch wichtigen wirksamen Be- standteile der Digitahs purpurea, das Digitalin und Digitoxin, charakte- risiert wird, gehören die nachstehend aufgeführten Stoffe "^j; Digitalin, Digitoxin. Strophanthin, Antiarin, Oleandrin, Scillain, Adonidin, Helleborein, Convallamarin , Cheiranthin u. a. Als Beispiel der Wirkung dieser Produkte sei hier auf diejenige von g- Strophanthin eingegangen, welches als kristallinisches Produkt mit dem Vorzug kon- stanter Zusammensetzung den guter Wasserlöslichkeit verbindet und darum namentlich als Testsubstanz zu vergleichenden quantitativen Bestimmungen zu empfehlen ist. Injiziert man mittelgroßen, in Zimmertemperatur gehaltenen (iras- fröschen 3) {oOg) von kristallisiertem Strophanthin (M< rck) die stark wirksame Menge von 1 lOnig in einem Kubikzentimeter Wasser gelöst in den Brustlymphsack, so tritt Herzstillstand nach Vi — ' ., Stunde ein. An der Brustwaud sind äußerlich keine Bewegungen des Herzens mehr ') W. Filehnc, i'ber einige Wirkungen desXanthins, des Caffeins und mehrerer mit ihnen verwandter Körper. Archiv f. (Anat. u.) Physiol. 188G. S. 77. -) 0. Schmicdt'bcnj , Grundriß der rhurmaknlogie. (5. Aufl. Leipzig l'JÜO. S. i88. *) Wegen ihrer größereu Emp f indliclikei t gegenülier Sulistanzen mit Digi- talinwirkung sind für Prüfungen am ganzen Tier ürasfrösche vorzuziehen. 64 H. Fübiier. wahrzunehmen und die Zirkulation in den Schwimmhäuten stockt. Nach- dem der Herzstillstand eingetreten, wird der Frosch unruhig und springt und bewegt sich häufig. Aus der Rückenlage dreht er sich, trotz des ein- getretenen Herzstillstandes, noch gut um und springt normal. Nach und nach wird die Atmung seltener und es macht sich allgemeine Erstickung bemerkbar. Die Pupillen werden eng und das noch normal sitzende Tier öffnet wiederholt weit das Maul. Allmählich, nach etw a einer Stunde, wird der Frosch schlaff und beginnt Rückenlage zu ertragen. Die Lähmung schreitet langsam weiter bis zur völligen Reflexlosigkeit. Etwa 1/100222^ ist die tödliche Grenzdose für mittelgroße Frösche. Es kann mehrere Stunden währen, bis durch diese Dose Herzstillstand sich ausbildet und daran anschließend Erstickung des Tieres zustande kommt. Öffnet man den Thorax des Frosches nach eingetretenem Herzstill- stand, so findet man das Herz blutleer (blaß) und maximal kontrahiert. Es hat sich der für die Digitalissubstanzen charakteristische systolische Stillstand des Herzens ausgebildet. Das Zustandekommen des systolischen Herzstillstandes läßt sich graphisch registrieren. Um eine gute Aufzeichnung der Herzbewegungen zu erhalten, muß der Frosch vollkommen unbeweglich sein. Zerstört man nur das Gehirn des Tieres, so ist dies nicht der Fall. Zerstört man aber auch das Rückenmark, so werden Herzschlag und Resorption sehr beein- trächtigt. Man wird darum den Frosch am besten narkotisieren. Zur Herbeiführung einer tiefen Narkose sind für mittelgroße Frösche 2cm^ einer 10"/oigen Lösung von Urethan nötig, welche man den Tieren in den Brustlymphsack (ohne Verletzung der Brustmuskulatur : Blutungen vermeiden!) injiziert. Nach 5 bis 10 Minuten erträgt der Frosch Rücken- lage, in welcher man ihn 1/2 — 1 Stunde lang vor Anstellung des Versuches beläßt. Die Reflexlosigkeit dauert 12 — 24 Stunden an. Der Frosch wird, auf dem Teller mit dem Kopfe gegen den Ope- rierenden liegend, in folgender Weise präpariert: Mit einer Hakenpinzette erfaßt man in der Mitte des Unterkiefers die glatte Haut und schneidet eine kleine Lücke in dieselbe ein. Durch diese wird das stumpfe Blatt der Schere eingeschoben, der Hautzipfel mit der Pinzette erfaßt und ein mittlerer Hautlappen bis in die Bauchgegend präpariert, der am besten nicht breiter als 2 cm ist. Jedenfalls muß man sich hüten, zu weit seithch die Haut einzuschneiden, da hier Gefäße liegen, deren Verletzung starke Blutung zur Folge hat, und Blutungen müssen, um die Herztätigkeit intakt zu erhalten, möglichst vermieden werden. Nachdem der Haut- lappen (Fig. 45 d) über den Bauch gelegt ist , wird mit der Pinzette der oberste knorpelige Teil des Brustbeins (a) erfaßt, genau in der Mitte ge- spalten und dieser Schnitt durch Eingehen mit dem stumpfen Scheren- blatt, welches dicht unter dem Knochen (um einer Herz Verletzung vorzu- beugen) vorgeführt wird, durch die Mitte des knöchernen Brustbeinteiles (h) verlängert. Der sich an diesen weiter unten anschließende knorpehge Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. Of) Teil (c) Nvird nicht median, sondern nacli links herüber dnrchtrennt , um eine Verletzuiiii' der mittleren IJauchveiR' zu vermeiden. Ili.s an da.s Kndc des knorpeligen Brustheinteiles Avird der Schnitt i-eführt und der Krosch jetzt auf dem gestielten Froschbrett mit Klammern (Fig. HO) befestigt. Das linke Hinterbein, in welches die zu prüfende Flüssigkeit injiziert wird, kann l)ei dem tief narkotisierten Tiere frei gelassen werden , zur be- quemeren N'ornahme der Injektion. I)ie \orderbeine werden so befestigt, daß dabei der Thoraxschnitt weit klafft und das Herz freiliegt. I)as Herz ist noch in dem Herzbeutel eingeschlossen, w^elcher mit feiner Pinzette am Fig. 30. Graphische Registrierung der Herztätigkeit, a Uerzklammer. unteren Ende erfaßt und nach oben hin bis zur Teilung der Aorta er- öffnet wird. Die Herzspitze wird mit einer feinen, aus Federdraht ge- bogenen Herzklammer (Fig. 80a) erfaßt. An dieser ist mit einem Faden ein Haken befestigt, der in eines der Löcher am Schreibhcbel eingehängt wird. Das Froschbrett wird in ein vertikal verstellbares Stativ eingespannt, (""her demselben wird der durch Achsenbelastung in seinem lungeren «lie Papierfahne tragenden Arme fast völlig entlastete Schreibhebel befestigt. Zum Einhängen des Hackens in den Schreibhebel wird das Froschbrett schräg gestellt. Nach dem Einhängen kann durch Drehen des Hrettes, Abderhalden, llandbnch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. 5 66 H. Fühner. nach der Horizontaleil zu , der Schreibhebel richtig eingestellt werden. Vor dem Eintrocknen schützt man das Herz durch einen um dasselbe aufge- bauten hohen Wall aus Watte, welche mit Ringerlösung getränkt ist. (In der Figur nicht gezeichnet.) Die rhythmischen Bewegungen des Schreibhebels werden auf der be- rußten Papierfläche des Kymographions aufgezeichnet. Unt^r diese Kurve werden Zeitmarken geschrieben. Der Markiermagnet wird in einem zweiten Stative befestigt und unter dem Herzhebel zeichnet eine Zeitlang dem Frosche die Hierzu sticht man an am bequemsten entgegen aufgestellt. (In der Figur die normale Herztätigkeit ftlösung in den linken dem nicht fixierten Beine der Troramelbewegung nicht gezeichnet.) Man auf und injiziert dann Ober schenkelly mph sack, die mit feiner scharfer Nadel versehene gefilUte Injektionsspritze etwa 1 cm unterhalb des Knie- Fig. 31. Fig. 32. Raua fusca. öö g. Weiblich. Narkose. Herzfreilegung. Strophanth. cristall. 1 mg bei (+). Herzstillstand nach 14 Minuten. (3/i Größe der Originalkurven.) Rana fusca. 45 g. Weiblich. Narkose. Herzfreilegung. Strophanth. cristall. ^/^o mg bei (+). Herzstillstand nach 30 Minuten. gelenkes in die Haut des Unterschenkels ein und führt von hier die Nadel unter Streckung des Beines vorsichtig unter der Haut vor bis unter die Oberschenkelhaut. Man injiziert und zieht die Nadel zurück; dann wird das Bein im Kniegelenk gebeugt. Diese Maßnahmen sollen einem Ausfließen der Injektionsflüssigkeit aus der Injektionsstelle vorbeugen. Ist die Injektion vor- sichtig ausgeführt, so wird man (bei völlig reflexlosem Tier) in der Aufzeich- nung des Schreibhebels keine Verschiebung oder Veränderung wahrnehmen. Man bezeichnet den Moment der Injektion auf der berußten Fläche des Kymographions. Drei beigegebene Kurven, welche unter den oben ge- schilderten Bedingungen aufgenommen wurden, zeigen die Wirkung von verschieden großen Dosen Strophanthin. cristall. Merck {1 mg, ^U^yng, Vioo«^^), das drei narkotisierten Grasfröschen in den Oberschenkellymph- :sack injiziert wurde Kurve Fig. 31 und 32 wurden in ^/^ Größe des Nachweis und Bestimmung von (üften auf biologischem Wege. 67 Originals, Kurvo Fi^-. ';);) in hullter Ori^iinal^irölic wiodoriicnciion. Da hei Aufzoichiiunii- der (Jiftwirkuni;' hier nicht die Form der Kinzelkurvo der Herzpulse, sondern das Gesamtbild der Kurvenschar von Interesse ist. so wurde nach dem Vorgange von M. Straub^) bei so langsamem Trommel- gange registriert, daß vom iSchreibhebel auf dem bei'uliten Papier nur eine einzige ununterbrochene Silhouette ausgewischt wurde. Wie beim isolierten Herzen ist auch hier der Anstieg der „Silhouettenkurve- bis zum end- gültigen systolischen Stillstand des Herzens um so steiler, je rascher die Vergiftung verläuft. Uei Aufnahme der ersten und zugleich steilsten Kurve trat der Stillstand nach 14 .Minuten, bei der zweiten nach ;iU und l)ei der dritten nach 105 Minuten ein. Obgleich diese Kurven an sich das Vorhandensein einer Substanz mit Digitalinwirkung in der Injektionsflüssigkeit hinreichend klar beweisen, so kann man doch zur weiteren Charakterisierung des vorhandenen Still- Fig. 33. Kana fusca. 50 j. Weiblich. Urethannarkose (2 cm^ 10°l„So\.). Herzfrei legnng. ff^t^Vf .Ji Strophanthin. cristall. */io<> '"JS bei ( + ) im Oberschenkellymphsack. Herzstillstand nach 150 Minnten. Zeit in Minuten. (Halbe Größe der Originalkurve.) Standes noch einen Tropfen einer ^V/oinPi^ Atropinlösung auf das still- stehende Herz auftropfen. Tritt hier nicht bald wieder regelmäßige Herz- tätigkeit ein, so ist die in der injizierten Lösung vorhandene, den Herz- stillstand herbeiführende Substanz jedenfalls kein Muscarin. Obgleich Muscarin keinen systolischen, sondern diastolischen Stillstand des Herzens am Frosche hervorruft, so kann unter Umständen bei der graphischen Kegi- strierung der Tätigkeit des Herzens am ganzen Frosche doch .systolischer Stillstand, wenigstens solcher in halber Höhe der systolischen Kontraktion, vorgetäuscht werden. Auch ist nach dem Stillstand des Herzens dieses auf seinen Kontraktionszustand zu untersuchen. Tritt der Herzstillstand innerhalb 1 — 2 Stunden ein. so ist das Herz des (irasfrosches immer M W. Straub, Quantitative Untersuchungen über den Chemismus der Strophanthin- virkuiig. Biochem. Zeitschr. Bd. 28. S. 392 (1910). 5» 68 H. F (ihn er. stark kontrahiert und blutleer. Kommt aber der Stillstand des Herzens erst sehr spät zustande, nach 12 — 24 Stunden, so ist derselbe kein rein systolischer mehr, sondern er ist ein mehr oder weniger diastolischer. Zu bemerken ist, daß für den qualitativen Nachweis der Digitalis- substanzen der Versuch am ganzen Frosch , namenthch unter Injektion in den Oberschenkellymphsack wichtiger ist, als der allerdings empfind- lichere Versuch am isolierten Herzen (s. d.). An isoherten Herzen sind die Substanzen mit Digitalin Wirkung von den ihnen nahestehenden Sapo- ninen nicht einfach zu unterscheiden, da auch diese Produkte am iso- lierten Organe systolischen Stillstand hervorrufen. Hingegen ist dies nicht der Fall bei Injektion in den Oberschenkellymphsack, aus welchem sie nicht genügend resorbiert werden, um Herzstillstand herbeizuführen. Sie bringen hier nur lokal die Muskulatur in der Nähe der Injektionsstelle zum Ab- sterben. 1) 10. Die Wertbestimmung von Digitalisblättern und -präparaten. Als wirksame Glykoside sind nach Schmiedeberg f) in den Digitalis- blättern Digitoxin, Digitalin und Digitalein enthalten, unter welchen dem Digitoxin die stärkste Wirkung zukommt. Das Digitoxin ist in reiner Form 3) in Wasser nur spurenweise lösUch. Es findet sich aber in der Pflanze in löslicher Form, und zwar nach B. Gottlieb *) als Glykotannoid, als Verbindung mit Gerbsäure, welche in reinem Wasser zwar auch wenig, aber in verdünnten Alkalien leicht löslich ist. Der Gehalt der Blätter an den drei wirksamen Bestandteilen ist ein mit dem Standort der Pflanze und dem Jahrgang derselben wechselnder. Um dem verordnenden Arzte ein immer gleichwirksames Arzneimittel zu liefern, werden die Digitalisblätter, wie auch die daraus hergestellten Präparate neuerdings auf einen bestimmten Wirkungswert eingestellt und dies ge- schieht ausschließUch auf biologischem Wege durch Dosierung am Frosche. Zur Wertbestimmung der Digitalisblätter und -präparate sind bereits zahlreiche Methoden ausgearbeitet worden. Hier soll in erster Linie das am eingehendsten geprüfte Verfahren von Focke^) besprochen werden, 0 B. Kobert, Beiträge zur Kenntnis der Sapouinsubstanzen. Stuttgart 1904. S. 16. ^) 0. Schmiedeherg , Untersuchungen über die pharmakologisch -wirksamen Be- standteile der Digitalis purpurea L. Archiv f. experim. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 3. S. 16 (1875). 3) H. Kiliani, Über ß-Digitoxin. Archiv d. Pharmazie. Bd. 233. S. 315 (1895). — Derselbe, Über Digitoxin. Ibid. Bd. 234. 483 (1896). *) B. Gottlieh und R. Tambach, Über Digipuratum. Münchener med. Wochenschr. Jahrg. 58. S. 10 (1911). ^) C. Focke , Die physiologische Wertbestimmung der Digitalisblätter. Archiv d. Pharmazie. Bd. 241. S. 128 und 669 (1903). — Derselbe, Weiteres zur physiologischen Prüfung der Digitalisblätter. Ibid. Bd. 245. S. 646 (1907). — Derselbe, Der jetzige Stand der physiologischen Digitalisprüf uug, ihr Wert für die Praxis und für die Forschung. Ibid. Bd. 247. 8.544(1909). — Derselbe, Die kurzzeitige Injektious- methode der physiologischen Digitalis- und Strophanthusprüfung. Ibid. Bd. 248. S. 345 (1910). Nachweis und n<'stimmuntr vmi fiifton auf liinlügisclicm W ego. [^\) welches sich an ein durch Hans Mcycr aniiere^^es ^'el•fahl•on von /uiin)- hein ^ ) anschließt. Das Prinzip der Methode von Fockc ist foli^endcs: Von einem wässerigen Auszug der Diiiitalisl)lätt('r wird einem ( irasfrosche , dessen Herz freigelegt ist, eine bestimmte Menge injiziert und es wird heohachtct. in welcher Zeit Herzstillstand eintritt. Injiziert man (I rast' röschen von 20 — ?)0 fj von einem 10'V(,igen Ijifuse den vierzigsten Teil ihi-es Gewichtes in zwei Hiilften verteilt in die ()l)erschenkellymi)hsäcke, so soll der Herz- stillstand durchschnittlich, bei Anstellung von mindestens vier Versuchen, zwischen 9 und 11 .Minuten eintreten. Blätter, welche dieser Forderung entspi-echen . haben nach Focke einen „Valor" von 4*0 — 4:*5. Dieser Wert wird berechnet aus der Glei- chung: \' = , worin p das Gewicht des Frosches, d die injizierte Dose und t die 'Zeit bezeichnet, welche von der Injektion des Tieres bis zum Herzstillstand vergeht. Hat man z. B. einen Frosch von 24 (/ (Gewicht, so erhält er 0-^ cm^ des 10" oigt'" Infuses. Vergehen 10 Minuten bis zum Stillstand, so ergibt sich der Wert 4"0. Dieser Wert der Blätter kann auch in .schlechten Jahren erhalten und darum als Xormalwert-) ange- nommen werden. Auf ihn wird die Droge in Jahren mit stärker wirkender Ernte eingestellt. Ausführung der Prüfung. Zu der Prüfung eignen sich am besten möglichst gleichgrolte Grasfrösche im Gewichte von 20 — l-i.") //. Im Sommer sollen dieselben frisch gefangen, aber immerhin einige Tage in (Jefangen- schaft vor x\nstellung der Versuche gehalten sein. Für den Winter werden die Tiere im September gefangen und in nicht zu kaltem liaume (Kellen aufbewahrt. Von Mai bis Oktober sind beide Geschlechter gleich brauch- bar. Von November an nur männliche Tiere. Die Tiere werden aus dem kühlen Ivaume 2 — )i Tage vor Anstellung der Versuche in Töpfen oder Gläsern in den rntersuchungsraum gestellt, dessen Temperatur auf 18 — 20'^ (auch im Sommer nicht höher!) ge- halten wird. Zur Prüfung ist ein Blechkasten nötig, welcher eine (Grundfläche von 28:55 c»/ und 12 cw Höhe hat. \\\ einer Seitenwand ist oben und unten je eine mit Kork verschlielibare Öffnung angebracht. Die erste ist zum Eingießen von heißem Wasser bestimmt, die untere dient zum Ab- lassen desselben. Zur eventuellen Abkühlung kann dinch lien Scharnier- deckel des Kastens Eis eingebracht werden. Auf diesen Kasten werden die dünnen und etwa lO: 27 c/y/messenden Froschbretter gelegt lU'ltst dem halb so breiten, scmst aber ganz gleichartigen Thermometerbrett. Auf letz- terem ist dauernd ein gutes Thermometer so befestigt, daß der Queck- ^) H. Ziegenbein, AVertltestininiuiig der I)iL'italisl)l;ittcr. An-liiv d. Pharinazio. Bd. 240. S. 454 "(1902). -) Vgl. ..Fol. Digital, titrat." der Firma i'aisar .( Lm-ti:, Halle a. S. 70 H. Fühner. silberbeliälter dem Holz flach aufliegt; zum Abschluß gegen die Außenluft ist das untere Thermometerende von einem, mit Heftzwecken befestigten hellen Flanellappen bedeckt. Diejenigen Untersuchungsbrettchen, die gerade zum Versuch dienen, müssen vorher ebenso trocken sein wie das Thermo- meterbrett. Durch Erwärmen der Frösche ist es in der kalten Jahreszeit immer möglich, die Empfindlichkeit derselben so weit zu erhöhen, daß sie in nor- maler Weise reagieren. Abkühlung in der heißen Jahreszeit erweist sich seltener als nötig. Soll eine Wertbestimmung von Digitalisblättern vorgenommen w'erden, so vergleicht man die zu untersuchende Probe am besten mit den „Fol. Digital, titrat." des Handels, die einen Valor von 4'0 besitzen. Unter Verwendung dieses Testpräparates prüft man zunächst die Reak- tionsfähigkeit der Frösche. Man muß an den Tieren bestimmen, ob die Normalprobe den angegebenen Xormalwert besitzt. Ist dies der Fall, so kann die zu prüfende Blätterprobe in gleicher Weise untersucht wer- den. Ergibt die Normalprobe zu hohe oder zu niedere Werte, so muß ent- sprechend abgekühlt oder erwärmt werden. Die Feststellung der Normal- werte wird erleichtert durch die Beobachtung der Pulsfrequenz der Tiere. Etwa 40 — 60 Pulsschläge pro Minute sind das Pdchtige. Bei 30 bis 40 Schlägen ist es erheblich zu kühl; bei höherer Frequenz als 60 ist es zu warm. Bei einiger Übung reichen 4 — 5 Frösche aus zur Feststellung der richtigen Temperatur. So lange dann die gleiche Witterung andauert, braucht man nur jeden Tag dasselbe Temperaturoptimum im Zimmer her- stellen und wird dann gleichmäßige Resultate erhalten können. Sobald sich aber die Witterung ändert, muß zur ^'ermeidung von Fehlern an der Nor- malprobe aufs neue das Temperaturoptimum bestimmt werden. Damit stehen die Wertprüfungen immer auf festem Boden. Hat sich bei der Vorprobe mit dem Testpräparat eine Temperatur- reguherung durch den Kasten als notwendig erwiesen, so wird dieser eine halbe Stunde vor der Untersuchung auf die gewünschte Temperatur ge- bracht. Auf ihm befinden sich dann neben dem Thermometerbrett schon vier leere Froschbretter und das Glas mit der Injektionsflüssigkeit. Der Frosch wird an den Beinen mit vier Schlingen aus dicken Baum- wollfäden versehen, welche dann durch Einschnitte des Froschbrettes gezogen werden (Fig. 10 und Fig. 34. Hier ist ein kleineres Froschbrett, als im Texte angegeben, aufgezeichnet). Zwischen den Armen beginnend, schneidet man einen kleinen Hautlappen nach unten hin ab (Fig. 34), erfaßt dann von der Seite her den unteren knorpeligen Teil des Brustbeins (Fig. 45 c) mit der Pinzette, geht mit stumpfem Scherenblatt hier ein und schneidet dann nach oben hin eine kleine viereckige Öffnung. Man erblickt das pulsierende Herz nur zum kleinen Teil. Namentlich der Herzventrikel liegt tiefer unten. Man schneidet nunmehr den feinen Herzbeutel der Länge nach auf und drückt dann leicht auf den Unterleib in der Ventrikelgegend. Der \'entrikel wird dadurch herausgepreßt und liegt nun frei, wie in Nachweis und Bestimmung von Giften auf biolofrischem Wege. 71 Fig. 34 (largostellt. Die Lücke darf nur so groß sein , dal) gerade der Ventrikel herausgedrückt \verden kann. Ist die (')ffninig «rrölier, so wird leicht hei Bewegungen des Tieres die Leber herausgedrängt, was verniied«'n werden muli In der angegebenen Weise werden zuniichst zwei Frösche präpariert. Da man zur Bemessung der Dosis das Frosch^n'wicht kennen muß, so >Yird das Froschbiett samt dem Tier gewogen und das vorher bekannte Gewicht des Brettes abgezogen. Das Froschgewicht Fig. 34. wird notiert. Nach dem AViegen wird das Brett mit dem Tier sofort wieder auf den Kasten gelegt, damit es im ganzen etwa V4 Stunde lang von unten die- jenige Temperatur erhält, die das Brettchenthermometer zeigt. Dabei wird das Herz nach Rhyth- mus und Schlagzahl beobachtet. Ein Tier, welches (z.B. im Fe- bruar, März) ein schlaff de- generiertes, auch nach einigem Warten allzu träge arbeitendes Herz besitzt, wird durch ein neues ersetzt. Wenn aber die Herztätigkeit, wie doch meistens der Fall, gut ist, so erhalten die beiden ersten Tiere ihi-e Injektion. Die Spritze wird mit der zu untersuchenden Lösung einmal durchgespritzt; dann wird das bestimmte Quantum so ver- teilt, daß der eine Oberschenkel rasch ungefähr die Hälfte , der andere den Rest erhält. Hierzu wird die möglichst fein zuge- schliffene Spitze der dünnen Nadel der Injektionsspritze etwas unterhalb des Knies in den L'n- terschenkellymphsack eingesto- chen und von da aus vorsichtig, dicht unter der Haut, nach dem Oberschenkellymphsack vorgeführt bis etwa in seine Mitte. Die Injektion darf nicht in die Muskulatur, sondern nur in den Lymphsack vorgenommen werden. Bei \'erwen(hmg einer l'einin Nadel und Einführung vom rnterschenkeliyniphsack aus ist ein Austheln-n der Flüssigkeit aus der Einstichstelle so gut wie ausireschlossen. Nach der Injektion wiid die Nadel rasch zurückgezogen und sofort auf der (lanel)en Rana fusrn. I'reilegung des HvrzpDR. rl H. Fühner. liegenden Uhr die Zeit der Injektion festgestellt. Focke empfiehlt, dann aus einer kleinen, in einem Glase Wasser stehenden Pipette, je einen Tropfen auf die Kehle, das Herz und den Oberschenkel des Tieres zu träufeln und jeden Oberschenkel sogleich zwischen zwei Fingerkuppen einige Male sanft nach der Leistengegend hin zu massieren. Nunmehr kommt das Brett mit dem Frosche wieder an seinen Platz und die Injek- tionszeit wird notiert. Während man auf die Wirkung bei den ersten Tieren wartet, präpariert man die beiden folgenden. Sobald bei einem Tiere der Kamm ers tillstand eingetreten und notiert ist, wird wieder ein trockenes Brettchen auf den Kasten gelegt, das Tier aber durch Zerstörung von Ge- hirn und Piückenmark getötet und zur eventeUen Berichtigung des ersten Gewichtes ohne das Froschbrett gewogen. (Dabei wird natürlich die inji- zierte Dosis mitgewogen und abgezogen. Die aufgeträufelten Wassertropfen bleiben außer Betracht; mindestens ebensoviel Flüssigkeit hat das Brett- chen aufgenommen.) Nr. Temperatur g ü " S 3 B eö ,■ 'S X a e » s des Brett- chens Kana fusca. Quelle und Datum des Bezuges Ge- schlecht Gewicht Präparat Injizierte Flüssigkeits- nienge relativ zum Froschgewicht Dosis d Injektion Uhr C o r Stillstand Uhr also Zeit Durch- schnitt ^'^1°^- (= d^) Bemerkungen Ein übersichtliches Protokoll ist durchaus nötig. Focke verwendet das vorstehende Formular. In die Kolumne „Cor" trägt man die Schlag- zahlen kurz vor der Injektion ein. auch nach Belieben z. B. den Beginn der ,,Herzperistaltik". Die übrigen Pveihen verstehen sich nach dem bisher Gesagten von selbst. Die zu prüfenden Lösungen werden nach Focke in folgender Weise hergestellt : a) Das Blatt er infus. Wenn man nicht sicher weiß, daß das Blätter- pulver scharf getrocknet war, so wird es zuerst bei 60 — 80" mäßig aus- gebreitet eine halbe Stunde lang nachgetrocknet. Darauf gibt man 2 g in Nachweis und Bestiinuiuug von (Jiften auf liiolopischom Wo'jp. "j;^ einen kleinen rorzellansallientopf. der in rin ) Tinct. Digitalis und andere alkoholhaltige Digitalis- präparate. Hier wird der Alkohol durch vorsichtiges Einengen auf dem Wasserbade zum größten Teile entfernt und der Rückstand mit Was.ser aufgenommen. Bei Tiuct. St lopli.nithi ist ein Entfernen des Alkohols nicht nötig; an dessen Stelle tritt die Wasserverdüunimg. auf deren (Jrad viel ankommt. Wenn man mit der normalen Tinct. Stroplianthi (Komln^) den Valor 100 erzielen will, wie ihn durchschnittlich diese Tinktur besitzt, .so verdünnt man l mt^ mit 19 c/^/MVasser. Der(M-ad der Verdünnung ist in diesem Falle nach Fockc von beträchtlichem Einfluß auf das Kesultat. c) Trockene Präparate der Digitalisgrup|)e werden zu ihrei- Prü- fung zuerst in demjenigen Stärkeverhältnis wässerig gelöst, das vermutlich ihrem Vorhandensein im lOo/oiri'«"'» Atifguß der Mutterdroge entspricht: bei der Prüfimg wird die Lösung nach Bedarf konzentrierter genonnnen. Ist das Pulver nur (oder fast nini alkohollöslich, .so wird zuerst eine starke alkoholische Lösung hergestellt, dann diese allmählich unter langsamem Bührcn. damit das (ielöste nicht ausfällt, mit Wa.s.ser !)is zur gewün.'^chten Verdünnung gemischt. .Mehr als 10<>/o Alkohol sollte darin nicht verbleiben. 74 H- Fühner. Neben der beschriebenen, von Focke sehr genau ausgearbeiteten Me- thode, welche bei genügender Vertrautheit mit derselben sicher brauchbare Werte bei der Prüfung der Digitalisprodukte ergibt, existieren noch andere Prüfungsmethoden am Frosche, von denen einige hier kurz beschrieben seien. Eine Zusammenstellung und Kritik derselben findet sich bei Ch. W. Edmunds and Worth Haie \) und bei Focke. 2) Während bei Focke den Hauptfaktor für die Wertbestimmung der Digitalispräparate die Zeit darstellt, welche von der Injektion bis zum Herzstillstand vergeht, bestimmt Gottiieh^) die kleinste Menge, welche innerhalb 30 bis höchstens 45 Minuten den Stillstand in der Mehrzahl der Fälle bei Verwendung gleichgroßer Grasfrösche (von etwa oO g) herbei- führt. Man kann diese kleinste Dose als „Einheit^' bezeichnen und die Wertigkeit nach der Zahl solcher Einheiten pro Gramm Präparat aus- drücken. Das frisch bereitete Infus eines gut wirksamen Digitalispulvers muß demnach mindestens 40 — 50 Einheiten auf 1 g der angewandten Blätter enthalten. Bei den stärksten Blättersorten entspricht das frisch be- reitete Infus von 1 g aber mitunter bis 120 Einheiten. x\bweichend hiervon bestimmt E. M. Houghton *) am Frosche die minimal tödliche Dose der Digitalispräparate, d.h. die Menge, welche im Verlaufe von 12 Stunden bei Injektion in den Brustlvmphsack des nicht operierten Frosches den Tod des Tieres herbeiführt. Die Ausführung er- folgt in der Weise, daß von zwei Gruppen von Fröschen, welche alle möglichst dasselbe Gewicht haben, die eine mit einer Testlösung, die andere mit der zu prüfenden Lösung in gleichen Konzentrationen injiziert wird. Die Dosen bilden eine Reihe von geringerer bis zu größerer Stärke, aber bei der einen Froschgruppe genau ebenso wie bei der anderen. Nach 12 Stunden wird bei jeder Gruppe die Zahl der Toten notiert. Zu jeder Prüfung ist natürlich eine mehrfache Wiederholung mit enger werdenden Dosengrenzen erforderlich, so daß gewöhnlich vier Tage für eine Prüfung nötig sind. Allerdings können mehrere Proben gleichzeitig untersucht wer- den. Diese Methode ist von allen sicher die einfachste und be(|uemste, hat aber den Nachteil, daß man zu ihrer Ausführung viel mehr Frösche braucht, als bei den erstgenannten. Die Wertbestimmung der Digitalisprodukte unter Verwendung des isolierten Froschherzens, welche Schmiedeherg '">) der Prüfung am ') Ch. W. Edmunds and W. Haie, Tlie physiological Standartizatioii of Digitalis. Washington. Hygienic Laboiatory. Bulletin Nr. 48. December 1908. '^) C. Focke, Betrachtung der neuen in- und ausländischen Arbeiten über die Digitalisprüfung. Arch. d. Pharmazie. Bd. 248. S. 365 (1010). ^) R. Goftlieb, tfber die physiologische Wertbestimmuug von Arzneimitteln. Mün- chener med. Wocheuschr., 1908. Xr. 24. — R. Gottlieh und R. Tambach, Über Digi- puratum. Ibid. 1911. Nr. 1. S.U. ^) E. M. Houghton zitiert nach Focke, 1. c. ^) 0. Schmiedehercj , Untersuchungen über die Bestimmung des pharmakologischen Wirkungswertes der getrockneten Blätter von Digitalis purpurea. Archiv f. experim Pathol. u. Pharmakol. Bd. 62. S. 305 (1910). Nachweis iiinl Bestimmung von (iiften auf liiologiscliem Wctre. 75 ganzen Frosche vorzieht und von welcher Straub^) vermutet, dal» sie leistungsfähiger sein wird, namentlich zur Bestimmung absoluter Werte, ist auf ihre Brauchbarkeit bisher noch nicht geniigcnd untersucht worden. 11. Der Nachweis von Aconitin. \'on den verschiedenen in Aconitum- und Delphiniumarten sich findenden Alkaloiden besitzt namentlich das Aconit in aus Aconitum Napellus toxikologische Bedeutung. In dieser Pflanze ist neben einem kristallinischen ein amorphes ,.Aconitin- enthalten. Ersteres ist giftiger und für den toxikologischen Nachweis wichtiger als das amorphe Produkt, das aber dieselbe charakteristische Wirkung wie das kristallinische Produkt aufweist. Wie für den Menschen und die höheren Wirbeltiere ist auch für 76 H. Fühner. Fig. 35. Inhalt so gut wie gar nicht, sondern derselbe wird unter wurmförmigen Bewegungen der Herzwand im Herzen hin und her geschoben. Der Ventrikel bekommt hierbei ein eigentümlich fleckiges Aussehen: Dunkle vorgewölbte Stellen wechseln mit hellen kontrahierten ab, so daß ein Bild entsteht, das festzuhalten in Fig. 35 versucht worden ist. Kohert i) spricht nicht unpassend von einer „Maulbeerform" des Herzens. Je nach der Aconitindose und dem Zustande der Frösche geht diese Erscheinung rascher oder langsamer wieder in eine regelmäßige Herztätigkeit über, welche aber bedeutend ver- langsamt ist und bei welcher der Vorhof viel häufiger als der Ventrikel pulsiert. Auf das Stadium der langsamen Pulse folgt, wenigstens bei größeren Dosen als Vioo^'^^/i Stillstand des Herzens in Diastole. Bei dieser Dose von Vioo i^W salzsaurem kristallinischen Aconitin beobachtet man an den Fröschen, namenthch in der Nähe der Injektionsstelle, ausgeprägte fibrilläre Zuckungen, wie nach Guanidininjektion. Die Erschei- nung geht in etwa einer Stunde vorüber. Nach dieser Zeit erträgt der Frosch dauernd Rückenlage und wird schließlich völlig reflexlos. Hält man das Tier in etwas Wasser, so erholt es sich von der curarin- artigen Lähmung in einigen Tagen wieder. 1/10 222^. Hier ist der Ver- lauf der Vergiftung ein rascherer. Die Peristaltik dauert meist nur kurze Zeit an und nach etwa einer Stunde steht das Herz dauernd in Diastole still. Der Frosch erholt sich nicht wieder. Bemerkenswert ist noch als Erscheinung an Fröschen nach Injektion wirksamer Aconitindosen eine starke Sekretion der Haut und im Zusammen- hang mit der schlechten Herztätigkeit häufiges Aufsperren des Maules. Von Lahorde und Duquesnel^) ist zum biologischen Nachweis des Aconitins die graphische Registrierung der Herzkurve, welche sie am ganzen Frosch aufnahmen, empfohlen worden. Demgegenüber ist zu be- merken, daß nicht gerade selten die charakteristische Herzperistaltik nach Injektion von Aconitin oder aconitinhaltigen Extrakten am ganzen Frosche vermißt wird, und daß dieser Nachweis darum ein unzuverlässiger ist. Hingegen lassen sich am isolierten Herzen (s. d.) noch kleinste Mengen Aconitin mit Sicherheit nachweisen (Fühner). Das dem Aconitin nahestehende Delphinin bringt ähnliche Erschei- Aconitinwirkimg am Herzen. nungen am Herzen hervor wie ersteres, hat aber toxikologisch nur ge- ^) (Kohert) Kako/rski^ Über den direkten Einfluß verschiedener Substanzen auf das Herz. Arch. internation. de Pharmacodyn. et de Therapie. T. 15. p. lOG (1905). ^) J.V.Laborde et H.Dtiquesnel, Des Aconits et de l'Aconitine. Paris 1883. p. 267. Nachweis und Bestimmung von (iiften auf biologischem Wege. I I ringe Hcdciitung. \'oii den Digitalisprodnkton , wcldie g'h'ichfulls iVri- staltik iW<, Froschherzens hervorrufen, unterscheidet sich die Aconitin- peristcaltik durch viel längere Dauer und den Ihergang in diastoHschen Stillstand des Herzens im Gegensatz zum systolischen Stillstand hei den Digitalisprodukten. 12. Der Nachweis von Muscarin. Das reine Muscarin, der wirksame Bestandteil des Fliegenpilzes, besitzt keine forensisch-toxikologische Iledeutung. Bei Vergiftungen mit Fliegenpilzen wird die Diagnose immer am leichtesten auf botanisch- mikroskopischem Wege zu stellen sein. Wichtig ist aber die Kenntnis der charakteristischen Herzwirkung des Muscarins am Froschherzen, da beim Faulen von Eiweilistoffen Produkte mit Muscarinwirkung entstehen können (Brieger^), da solche im normalen Harn vorkommen iHarnisen^), Fühncr^) und durch Oxydation von Cholin erhalten werden (= künstliches Mus- carin von Schmiedeherg und Haniack*). Das Muscarin ruft, wie z. B. die Kalisalze, am Froschherzen dia- stolischen Stillstand hervor, welcher aber nach Schtnicdchcrg^') da- durch ausgezeichnet ist, daß er durch A tropin aufgehoben wird, wie er auch am atropinisierten Herzen nicht mehr auftritt. Zur Verfolgung der Erscheinung am Frosche ist Freilegung des Herzens erforderlich (vgl. darüber die Angaben beim Nachweis von Sub- stanzen mit Digitalinwirkung). Man injiziert dem auf dem Froschbrett auf- gebundenen Tiere die zu prüfende Lösung in den Oberschenkellymphsack und beobachtet die Herztätigkeit. Während beim systolischen Stillstand, hervorgerufen durch Substanzen mit Digitalinwirkung, der Ventrikel des Herzens infolge maximaler Kontraktion blaß erscheint, ist er hier, im diastolischen Stillstand, bei maximaler Füllung dunkel. Mechanische Reizung löst noch Einzelpulse aus. Gibt man auf den stillstehenden Ventrikel einen Tropfen einer halbprozentigen oder auch schwächeren Lösung von Atropin- sulfat, so treten schon sehr rasch wieder regelmäßige Herzpulse auf und bald erscheint die Herztätigkeit normal wie zuvor. Bei graphischer Regi- strierung der Herztätigkeit des narkotisierten Frosches kann man nach Muscarinvergiftung beobachten, daß beim Schwächerwerden der l'ulse die Kurve, welche der Schreibhebel aufzeichnet, nicht mehr vollständig zur Abszisse absinkt, so daß systolische Wirkung, wie bei Digitaliskörpern. ») L. Brieger, tlber Ptomaine. Berlin 1885. S. 48. -) E. Harmsen, Zur Toxikologie des Fliegenschwamraes. Archiv f. experim. l'athol. u. Pharmakol. Bd. 50. S. 449 (1903). ') //. Kühner, Cher chis Verhalten des synthetischen Muscarins im Tierkurper. Archiv f. experim. Pathol. u. Pharmakol. Bd. (>1. S. L'Sf) (19Ü9). *) 0. Schmiedcbet-g und K. Harnack, t)her die Synthese des Muscarins und über muscarinartiu' wirkende Amniniiiund>;is(Mi. Archiv f. experim. l'athid. u. IMiarmakol. Bd. 6. S. 101 (1«77). •') 0. Schmiedeberg und /.'. Koppe, Das Muscarin , das giftige Alkahdd de8 Fliegenpilzes. Leipzig 1869. S. 29. 78 H. Fühner. vorgetäuscht wird. Jedenfalls gelingt es am isolierten Herzen (s. d.) viel besser, den charakteristischen diastolischen Herzstillstand durch Muscarin aufzuzeichnen als am Herzen in situ, ^Yenn auch hier durch Atropin die Muscarinwirkung als solche gekennzeichnet werden kann. Bei der schwierigen Zugänglichkeit des reinen natürlichen Muscarins haben Angaben über dessen Wirkungsstärke am Frosche keine praktische Bedeutung. Vom künstlichen durch Oxydation von Cholin hergestellten Produkte ist 05 — liiig für kleine Wasserfrösche die mittlere tödUche Dose, Der Tod erfolgt nach vorausgehendem Herzstillstand durch allmäh- liche Erstickung des Tieres. Doch können sich Tiere auch von größeren Muscarindosen wieder erholen. Bemerkenswert ist die außerordentlich wechselnde Resistenz der Frösche nach Jahreszeit und Individuum gegenüber der Muscarinherzwirkung. Genaueres über diese Differenzen ist bei der Prüfung am isolierten Herzen angegeben. C. Nachweis und Bestimmung von Giften an isolierten Organen. a) Prüfungen am Skelettmuskel. r)er isolierte Skelettmuskel des Frosches läßt sich zur Charakteri- sierung mehrerer Gifte verwenden, deren Nachweis hier zu besprechen ist. Herstellung des Präparates. Als Muskel wird am besten der leicht zu präparierende Wadenmuskel, Musculus gastrocnemius, des Frosches gebraucht. Zu dessen Gewinnung wird der Frosch mit einem Scherenschlag geköpft und dem Tier darauf durch Einführung einer stumpfen Nadel (Stricknadel) in den Wirbelkanal das Rückenmark zer- stört. Hierbei bekommt der Frosch einen Streckkrampf (Tetanus) und entleert den Inhalt der Harnblase. Bei Kaltfröschen hält der Streck- krampf längere Zeit an. Neben diesem Krampf beobachtet man häufig Zuckungen einzelner Muskelpartien. Man erfaßt den Frosch an den Hinter- beinen, eröffnet mit einem breiten Scherenschnitt die Bauchhöhle, ent- fernt deren Inhalt und schneidet dann das Tier in der Mitte quer durch über die Wirbelsäule. Von der zurückbleibenden hinteren Körperhälfte erfaßt man die über dem Rücken abstehende Haut zwischen Daumen und Zeigefinger der einen , die Wirbelsäule ebenso mit der anderen Hand und zieht die Haut über Hinterkörper und Schenkel ab. Beim Erfassen von Haut und Wirbelsäule zwischen Daumen und Zeigefinger nimmt man zweckmäßig ein Handtuch zu Hilfe. Das abgehäutete Froschhinterteil spaltet man oben im Becken in zwei Hälften. Die eine bewahrt man bis zur Ver- wendung in einer feuchten Kammer (Petrischale mit einigen Tropfen Ringer- lösung) auf, von der anderen wird der Musculus gastrocnemius präpariert. Die Muskelpräparation geschieht am besten auf einer dicken Glasplatte. Zur Präparation müssen die Instrumente sowie die Glasplatte rein sein (kein Hautsekret !). Der Musculus gastrocnemius geht unten in eine starke weiße Sehne, die Achillessehne, über. Zur Isolierung des Muskels schneidet man die Sehne unterhalb der Ferse durch , erfaßt sie mit einer Nachweis und IJestimimmg von Gifteu auf liiologisclicm Wege. 79 Pinzette und präpariert den Muskel bis an seinen Ansatz in der Knie- gegend frei. Den Muskel mit der einen Hand iniiner veiinittcist der l'in- zette an der Achillessehne haltend und hochzichcnd . durchschneidet man zunächst unterhall) des Knicizelcnks den Unterschenkel und dann olicrhalh den Oberschenkel und hat nunmehr ein Präparat des isolierten Muskels, wie aus Fig. 36 -B ersichtlich ist. Fig. 30. Versnchsanordnung zara Einhängen des Muskels in Li^songen. Will man lediglich feststellen, oh irgend eine zu untei-suchendc Lö- sung den Muskel chemisch reizt, so dall Kontraktionen desselben ausgelöst werden, so kann er ohne die Knochenteile präpariert und direkt an seiner Insertionsstelle am Oberschenkelknochen abgeschnitten werden. .Man legt ihn dann zunächst in eine Schale mit etwa ;}0 cm' ..I! ingerlösung'M und ') Die froschisotonische nach S. liittqer hergestellt«' Losung hat foI»?enile Zu- sammensetzung: Natriumhicarl>oiiat Ol //. trockenes talciunichloiid Ol y. KaliMmchlori«! 0075 r/, Natriumchlorid ()0//. destilliertes NVasser 1/. Das NatriuuihicarlM.nat muß im destillierten Wasser erst vollständig gelöst sein, bevor das C'alciumchlorid zugesetzt wird. 80 H. Fühner. beobachtet, ob derselbe hier ruhig bleibt. (In O'TVoig^i' sogenannter ..phy- siologischer Kochsalzlösung'' können Zuckungen auftreten, welche durch Zusatz von Calciumchlorid unterdrückt werden.) Ist dies der Fall, so verbringt man den Muskel nach etwa 1/2 Stunde in die zu prüfende Lösung. Zur graphischen Kegistrierung der hier auftretenden Zuckungen dient die in Fig. 36 wiedergegebene \'ersuchsanordnung. Zur Fixierung am Schreibhebel wird der Muskel nach Durchbohrung der an seinem oberen Ende noch vorhandenen Sehnen- und Knochenteile (mit der Scherenspitze oder einer Ahle) mit einem etwa 10 cm langen Draht versehen, dessen freies Ende umgebogen wird, zum Einhängen in eines der Löcher des Schreibhebels. In die Achillessehne wird ein kleiner Haken eingebohrt, was am besten gelingt beim Auflegen der Sehne auf ein Korkstückchen. Dieser Haken wird an einem starken mehrfach ge- bogenen Draht (Fig. 36 A und B) befestigt , der oben ein Stück Hart- gummi trägt, zum Einklemmen im Stativ. Die den Schreibhebel tragende Muffe wird in der Höhe so eingestellt, daß der Schreibhebel horizontal steht. Bis zur Yerbringung in die zu prüfende Giftlösung wird der Muskel in Ringerlösung eingesenkt, und zwar so tief, daß er völlig von Flüssigkeit bedeckt ist. Zum Einsenken dient ein zweites Stativ mit Zahn- stange und Trieb, welches eine kleine horizontale Holzplatte trägt, auf die ein die Ringerlösung enthaltender Zylinder gestellt wird. Je nach der Weite des Zyhnders sind 10 — 20 cni^ Flüssigkeit nötig, um den Muskel völlig in die Lösung untertauchen zu können. Bei richtiger Aufstellung des Zylin- ders kann der Muskel ohne Erschütterung in die Flüssigkeit verbracht und wieder daraus entfernt werden. Unter dem Schreibhebel oder bequemer an einem dritten Stativ kann ein Markiermagnet zur Aufzeichnung der Zeit angebracht werden. 1. Der Nachw^eis von Guanidin. Zum Nachweis kleiner Guanidin mengen verwendet man am besten kleine lebhafte Grasfrösche (20 — 30 p'), deren Gastrocnemien sehr emp- findlich gegenüber Guanidinlösungen sind. Die Muskeln, in mit Ringerlösung hergestellte Guanidinlösungen (salzsaures Salz) eingelegt, zeigen nach 5 bis 15 Minuten anfangs schwache, später stärker werdende Zuckungen, welche durch große Unregelmäßigkeit ausgezeichnet sind: Bald zuckt das Kopf- ende des Muskels, bald das Sehnenende, bald erfolgen die Zuckungen rasch, bald langsam ; oft sind sie auf einzelne kleine Muskelbündel lokalisiert, dann zuckt wieder der ganze Muskel auf einmal. Sehr auffallend ist die Erscheinung an den abgehäuteten in Guanidinlösung eingelegten Füßen zu sehen. Die Guanidinempfindlichkeit der Frösche ist sehr verschieden. Ab- gesehen davon, daß die Grasfrösche meist empfindUcher sind als die Wasserfrösche, zeigen sich auch Unterschiede an den Tieren derselben Art. In der Kälte treten die Zuckungen verspätet auf. Am besten geeignet sind in Zimmertemperatur gehaltene Frösche und Prüfimg der Lösungen in Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. Hl Zimmertemperatur. Durch Guanidiiilüsunscn 1: 10.000 hekoinmt man nahezu immer charakteristische Zuckungen an (Jastrocneniicn. l)ie aulicrst«' (Ircn/e, bei (Um- /uckunficn im alli^cincincii auftreten, sind L()suii}.Tn 1:15.000 bis 1 : 20.000. Die Guanidinzuckuniien lassen sich, wenn sie in genii^en sich biologisch durch eine Heaktion am Skelett- *) C. G. Saittcüson, Kiniirfs iilicr die Wiikuiis: des (ily/erins und des V'onitrins auf die quergestreifte Muskelsubstanz (Frosch). Skandiauv. Arch. f. i'li\si.d. IM. 14. S. 20 (19Ü3). 86 H. Füll n er. muskel des Frosches charakterisieren, welche zwar nicht sehr empfindlich ist, aber dennoch unter Umständen zum Nachweis dieser Substanzen Ver- wendung finden kann, da dieselben, sobald sie toxikologische Bedeutung gewinnen, auch schon in größeren Mengen vorhanden sein müssen. Die Reaktion besteht darin, daß die Purinderivate, voran das Coffein, den Skelettmuskel in einen Zustand der Verkürzung und Starre ver- setzen, eine Erscheinung, welche derjenigen der Totenstarre oder der Er- starrung durch Wärme an die Seite zu stellen ist. Wie hier, so findet auch bei der Ausbildung der ,,Coffeinstarre" ein Gerinnungsvorgang im Innern der Muskelfibrille statt, wobei der erst durchsichtige Inhalt unter Wasseraustritt undurchsichtig wird. Legt man einen ganzen Musculus gastrocnemius eines Grasfrosches in eine starke, etwa l^/oige Coffeinlösung (in Ringerlösung) ein. so beob- achtet man maximale Kontraktion, Hart- und Undurchsichtigwerden des Fig. 41. Rana temporaria. Muskelzupfpräparat. A normal. B nach Coffeineinwirkung. Vergr. SOfach. Muskels. Auch noch beim Einlegen des Muskels in eine Lösung 1 : 1000 findet allmählich Kontraktion desselben statt. Doch ist der Gerinnungsvor- gang unter diesen Bedingungen schlecht zu beobachten. Gut verfolgen läßt sich derselbe nur an den isolierten Muskelfasern, an einem „Zupfprä- parat" des Muskels. Zum Nachweis der Purinderivate sind Muskeln des Grasfrosches zu verwenden, da an ihnen die Erscheinung noch in größerer Verdünnung ausgelöst wird als an Muskeln des Wasserfrosches. Ausführung der Prüfung. Von einem kleinen munteren Gras- frosche stellt man ein von der Haut befreites Präparat der Hinterbeine her und verbringt dasselbe in eine feuchte Kammer (Petrischale mit wenig Ringerlösung). Entsprechend der Längsrichtung der Muskulatur des Ober- oder Unterschenkels schneidet man ein etwa ^2 c"^ langes Stückchen aus irgend einem Muskel aus, verbringt es auf ein Uhrglas und zerfasert es in einem Tropfen Ringerlösung mittelst zweier Präpariernadeln. Fig. 41^ Naclnveis uiul Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. g7 zeigt bei etwa 80f:\rhor Voroninonino- einen Ausschnitt aus einem so ge- wonnenen Zupf Präparat. (Jiltt man liier/u einen Tropfon Coffcinlösunti:, so beüi)achtet man unter dem Mikroskop rasclu's /usaninH'nkriimiiK'n und sofortiges Undurchsichtigwerden der anfänglich geraden und durchscheinen- den Muskelfasern. Das Präparat nimmt die Form an, wie dies inKig. 41i^ dargestellt ist. Nach SchiuiedcOerf/^) genügt eine Coffeinkonzentration 1 : 4000 zur Auslösung des (ierinnungsvorganges. Nach P)estimmungen von JacobJ und GoIoirhisJd") an den Doppelsalzen mit Natriumsalicvlat ist das Theobromin etwa halb, das Theophyllin etwa ein Viertel so wirksam als das Coffein an den Muskelfibrillen von (Trasfröschen. b) Prüfungen am Nervmuskelpräparat. Der Nachweis von Curarin. Das Nervmuskelpräparat des Frosches, bestehend aus dem Musculus gastroenemius und dem diesen innervierenden Nervus ischiadicus, soll hier lediglich in seiner Verwendung zur Charakterisierung von Sub- stanzen mit Curarin Wirkung besprochen werden. Das Nervmuskelprä- parat besitzt hierzu dem ganzen Frosche gegenüber den \'orzug, dali man die Curarinwirkung graphisch registrieren kann und daß sich hierbei noch geringe Grade der Curarinwirkung, welche nicht /.nv völligen peripheren Lähmung des Tieres führen, als solche kennzeichnen lassen. Reizt man den mit seinem Nerven in Zusammenhang präparierten Musculus gastroenemius eines gesunden kräftigen Frosches rhythmisch in- direkt (d. h. vom Nerven aus) alle 2 — )') Sekunden mit Einzel-(()ffnungs- oder Schließungs-llnduktionsschlägen, so bekommt man bei graphischer Registrierung eine nur äußerst langsam absinkende Reihe von Zuckungen. Der Anfang einer solchen Reihe nahezu gleichhoher Zuckungen ist in Fig. 42 a wiedergegeben. Eine ähnliche Reihe erhält man auch bei direkter Reizung des Muskels (Fig. 42 c). Anders beim Frosche nach Curarinver- giftung. Stellt man hier ein Nervmuskelpräparat her zu einer Zeit, in welcher der Frosch noch nicht vollständig perii)her gelähmt ist, und reizt rhythmisch vom Nerven aus, so erhält man statt der langgestreckten, oft erst nach mehrstündiger Reizung langsam absinkenden Reihe stark ver- kürzte sogenannte ..Ermüdungsreihen". Der vollständigen Lähmung der motorischen Nervenenden geht nach Boehm ^) ein Stadium leichter Ermüd- barkeit derselben voraus und dieses kann zum Nachweis von Substanzen mit Curarinwirkung verwertet werden. *) 0. Schmiedeherg, Grundriß der Pliarmakologie. Ij. Aufl. Leipzig löUD. S. i)5. *) C. Jacobj und Golowinsk-i, Ein Beitrag zur Frage der vcrscliiedenen Wirkung des Coffeins auf Rana esculenta und Rana temporaria. Aroli.f. exp. I'atliol.u. riiaruiakol. Supplement. 1908. S. 293. •') Ji. liorhni, Einige Beoliaclitungon über die Nerveueudwirkungen des Curarin. Arch. f. oxp. Patliol. u. riiarmakol. Bd. 35. S. H; (IS'.I.')). 88 H. F (ihn er. Fie. Will man derartige Ermüdungsreihen 42 6 wiedergegeben ist, so muß man erhalten , wie eine solche m das Nervmuskelpräparat des FiR. 42. Frosches herstellen, solange das Tier noch nicht reflexlos ist, also Reiz- übertragung vom Nerven auf den Muskel noch erfolgt. Bei Injektion läh- mender Giftmengen muß weitere Giftzufuhr zum Nervenende durch Unter- brechung der Zirkulation, etwa 20 — oO Minuten nach Injektion der Lösung in den Brustlymphsack, verhindert werden, zu einer Zeit, wo das Tier noch vermag, sich aus der Rückenlage umzuwenden. Ist der Frosch hierzu nicht mehr imstande , so bekommt man bei Applikation von Ein- zelinduktionsschlä- gen am isolierten Nervmuskelprä parat vom Nerven aus meist keine Zuckun- gen mehr. Zu dem Ver- suche bedarf man einer gut funktionie- renden Abblendungs- vorrichtung, um den Muskel teils direkt, teils indirekt rhyth- misch alle 2 — o Se- kunden durch Öff- nungs- oder SchUe- ßungsinduktions- schläge reizen zu können. Neben dem Abblender ist ein Stromwender (Wip- pe), eine feuchte Kammer, Induktions- apparat, Quecksilberschlüssel und Akkumulator erforderlich. Die Versuchsanordnung ist in Fig. 43 dargestellt. Der primäre Stromkreis verbindet den Akkumulator (Ä) mit Quecksilberschlüssel (S), primärer Rolle (1,) und zwei Polen des Frankschen Abblenders (Ab); der sekundäre Stromkreis verbindet die sekundäre Rolle des Induktions- apparates (L) mit den beiden anderen Polen des Abblenders. Von diesen Polen führen außerdem zwei Drähte zu der Wippe ( W), und zwar zu den Quecksilbernäpfen 1 und 2. Von der Wippe gehen von den Quecksilber- 'Kana esculenta. 65 g. Weiblich. 2 Nervmuskelpräparate nach Curarinvergiftung. a Nervenreizung am normalen, 6 am vergifteten Präparat, c Direkte Mnskel- reizung am vergifteten Präparat, 3 Sekunden-Öffnungsschläge. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 89 Kig. 43. Ky H -rm ■,Ö ,''■ näpfen 3—6 vier Drähte zu den Klemmschrauben der feuchten Kammer (A7/ und Fiii'. ;59). Davon führen (in der Fiy-.4;3) die Drähte von Napf 3 uml 4 zum kleinen Stativ in der Kammci-. \velches den Nerven (Xj träp:t. wäh- rend die Drähte, welche von Napf '> und G ah^'ehen, der Stromzufüliruiig zum .Muskel (M) dienen. Diese geschieht einerseits durch das kleine, den Muskel tragende Stativ, andrerseits durch einen, Klemmschraube und Muskel verbindenden, ausgeglühten Lamettafaden (L). Der Abblendcr. welcher in der Muffe eines Stativs befestigt ist, wird am besten mit einem langsam gehenden Elektromotor in Umdrehung versetzt, und zwar für den Curarinnachweis so, daß eine Umdrehung in 2 oder 3 Sekunden erfolgt. Herstellungdes Nervmuskelpräpa- rates. Nachdem der in den Brustlymphsack in- jizierte Frosch begin- nende Lähmung zeigt, wird der Kopf abge- schnitten und das Rü- ckenmark zerstört. Dann schneidet man das Tier, nach Eröffnung der Bauchhöhle und Ent- fernung der Eingeweide. unter den Armen durch, zieht die Haut von dem Hinterkörper ab und legt zur weiteren Prä- paration auf eine reine Glasplatte. Hier entfernt man noch etwa vorhan- dene Eingeweidereste (Niere, Blase) und legt dadurch die beiden aus der ^Yirbelsäule austre- tenden und nach den Hinterbeinen ziehenden glänzenden Nervenstränge frei (vgl. Fig.öl)). Mit oinem Scherenschnitt halbiert man nun die Wirbelsäule unter Schonung der Nerven- stränge und verlängert diesen Schnitt genau median durch das Becken des Frosches hindurch. Bei der Schnittfühning durch das I5ecken werden die Hinter- beine zweckmäßig in der Schenkelbeiige maximal nach oben gebeugt. Wird der Schnitt nicht genau durch die Mitte des Beckens geführt, so wird leicht das Nervenbündel der einen Seite verletzt. Das eine Bein wird nun in eine Petrischale mit etwas Bingerlösung gebracht, während von dem Yersncheanordnung zur rhythmischen elektrischen Keizunir de« Nervmuskelpräparatos mit Öffnungs- oder .Schlii-Uunnsinduktious- schlagen. 90 H. Fühner. anderen das Nervmuskelpräparat hergestellt wird. Das Aussehen des fertigen Präparates ist aus Fig. 44 B zu entnehmen. Zur Präparation schiebt man die Schere an der AustrittssteUe der Nerven aus der Wirbel- säule platt unter denselben durch und schneidet die Wirbelsäule quer ab, so daß ein Stück derselben (a) mit dem Nervenstrang in Zusammenhang bleibt. Dieses Stück erfaßt man mit der Pinzette und präpariert den Nerven- strang frei, soweit er im Becken verläuft. Dann dreht man das Präparat auf die Bauchseite um, damit man den Nervus ischiadicus am Oberschenkel isoüeren kann. Zu dem Zwecke zieht man die Muskulatur des Oberschenkels auseinander (vgl. Fig. 44 Ä) , geht mit dem stumpfen Scherenblatt unter dem Nerven durch und durchschneidet die Muskulatur des Oberschenkels und den Oberschenkelknochen fc)^ dessen halbe Länge mit dem Knie in Ver- Fig. 44. Herstellung des Nervmnskelpräparates. bindung bleiben muß. Der Nerv wird durch kräftiges Auseinauderziehen der Muskulatur nach obenhin weiter verfolgt und freigelegt und die Ver- bindung mit dem Beckenstücke durch Entfernung der noch vorhandenen Muskel- und Knochenteile hergestellt. Die kleineren Seitenäste des Nerven- bündels werden abgeschnitten (Fig. 44 5 in der Nähe von b) und schließ- lich auch die den Nerven begleitende schwarz aussehende Arterie entfernt. Am Oberschenkel wird der Nerv dann bis zu seiner Gabelung und diese weiter- hin bis zum Knie verfolgt. Während der ganzen Präparation darf der Nerv niemals mit der Pinzette erfaßt werden. Als Handhabe dienen immer entweder das Stück noch vorhandener Wirbelsäule oder Ober- und Unter- schenkel. Der Nerv wird jetzt auf ein mit Piingerlösung getränktes Watte- stück gelegt und der Oberschenkelknochen von den ihn noch umgebenden Muskelstücken bis zum Knie befreit. Dann wird der Musculus gastro- cnemius (d) in früher (S. TSj angegebener Weise im Zusammenhang mit Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 91 der Achillessohne (e) präpariert und der Unterschenkel untcrlialh des Knies abfjeschnitten. Das fertifie Xervmuskelpräparat wird vermittelst des Ober- schenkelknochens in der Stativkhunnier der fenchten Kammer l)efesti<:t, nachdem vorher noch ein Ilaken in der Achillessehne angebracht wurde. Der Nerv wird über die P'dektroden des für ihn bestimmten Ilartiiummitroges gelegt und in seiner ganzen Länge bis zum Beginn des Versuches mit in liingerlösnng getränkter Watte bedeckt. Der Muskel ( Fig. 4;> M) wird durch ein Stück Draht mit dem unterhalb der feuchten Kammer befindlichen Schreibhebel (H). der in der Nähe der Achse (H) mit öO— TO.r/ (di belastet ist, verl)un(len, außerdem in der Kammer mit dem zweiten Pol durch einen Lamettafaden (L). Zu Beginn des Versuches stellt man die Wippe erst so ein, daß der Muskel elektrisch gereizt wird. Man stellt die sekundäre Rolle des Induktionsapparates zunächst möglichst weit entfernt von der j)rimären und nähert dann so lange, bis der Muskel auf der berußten Fläche des Kymo- graphions ^/Ty; maximale Zuckungen aufzeichnet. Maximal sind die Zuckungen z. B. bei Rollenabstand 12 oder 10 on, wenn diesell)en auch bei wei- terer Annäherung, z. B. bei 6 oder 7 cm, nicht mehr höher werden. Die Reizung des Muskels darf nur so stark sein, daß sich keine Kontraktur desselben ausbildet. Diese Erscheinung besteht darin, daß der Muskel sich bei übermaximalen Reizen nicht mehr auf seine ursprüngliche Länge aus- dehnt. Nachdem man festgestellt hat, daß die N'ersnchsanordnung keine Störungen aufweist und der Muskel bei etw^a 10 cm Rollenabstand bei direkter Reizung maximale Zuckungen gibt, schaltet man die Wippe um auf die Nervenreizung. Bei unvergiftetem Nerven bekommt man von diesem aus Zuckungen des Muskels bei viel größerem Rollenabstand als bei di- rekter Muskelreizung. Beim mit Curarin teilweise vergifteten Präparat wird man erst vielleicht bei 10 oder 15 cm Rollenabstand maximale Zuckungen vom Nerven aus erhalten. Nachdem man diese Grenze mög- lichst rasch festgestellt hat, läßt man bei ihr eine erste ..P>müdungsreihe"' aufzeichnen. Zeigt der Muskel nur noch schwache Zuckungen , so öffnet man den Quecksilberschlüssel und läßt das Präparat 10 Minuten lang sich erholen. Dann wird eine zweite und nach abermaligen Pausen eine dritte und vierte Reihe aufgezeichnet. Die Reihen werden jedesmal kürzer. Schließlich bekommt man selbst bei völlig übereinandergeschobenen Rollen des Induktionsapparates keine Zuckungen mehr. Man reizt dann den Muskel statt mit Finzelinduktionsschlägen mit kurz dauernden tetanisierenden Strömen anfangs bei etwa 10 cm Rollenabstand. Scbließlich werden auch diese Reize unwirksam und das Nervmuskeli)räparat ist indirekt völlJLr un- erregbar geworden. Jetzt zeichnet man wieder mit Kinzelinduktionsschbigeii bei direkter Muskeheizung eine längere Reihe auf. um sich von der In- taktheit des Muskels zu überzeugen. Ist die Vergiftung des Frosches zur Zeit seiner Präparation schon zu weit vorgeschritten, so bekommt man bei Einzehnduktionsschlägen selbst bei völlig übereinandergeschobenen KolifU des Induktionsapparates keine Zuckungen mehr. Meist ist aber dann wenig- stens die tetanisierende Reizung noch wirksam. 92 H. Fühner. Hat man niu' Giftmengen zur ^^erfügung, welche nicht zur völligen Lähmung des Frosches führen, so wird man am besten bei dem zur Prü- fung dienenden Frosche erst das eine Bein nach Cl. Bernard (vgl. S. 59, 60) präparieren, dann den Frosch vergiften und nach etwa 1 Stunde die Nerv- muskelpräparate herstellen. Man prüft erst das vergiftete, dann das durch die Ligatur vor der Gifteinwirkung geschützte Bein. Auf diese Weise wer- den auch noch geringe Grade von Curarinwirkung festgestellt werden können. Die in Fig. 42 wiedergegebenen Kurven sind in dieser Weise, allerdings unter Verwendung lähmender Curarinmengen, von demselben Wasserfrosche gewonnen. c) Prüfungen am Herzmuskel. Das isolierte Herz des Frosches soll hier in seiner Verwendung zum Nachweis von Digitalisprodukten, von Aconitin und Muscarin und zur quantitativen Bestim- FiR. 45. mung des letzteren bespro- chen werden. Zur Herstellung des Prä- parates verwendet man am besten große Wasserfrösche (60 — 100 g). Bei einiger Übung gelingt die Einführung einer Kanüle in das pulsie- rende Herz aber auch an kleineren Tieren. AnfertigungdesPrä- parates. Zur Isoüerung des Herzens braucht man neben einer Hakenpinzette und einer größeren Schere zwei feine Pinzetten und eine feine Schere. Dann ist starker Leinenfaden, Herzkanüle und Herzklammer weiterhin nötig. Das isoKerte Herz wird in einer Glaskammer (Fig. 52) befestigt, an deren Boden Eingerlösung sich befindet, durch welche Sauerstoff perlt. Die Herzbewegung wird auf einen leichten Schreibhebel übertragen, welcher sie auf der berußten Papierfläche des Kymographions in gewünschter Vergrößerung aufschreibt. Unter der Herzkurve wird die Zeit aufgezeichnet. Vor Beginn der Präparation füllt man eine kleine Kristalüsierschale mit Ptingerlösung und legt in dieselbe die der Größe des Frosches ent- Präparation des Froschherzens. I. Nachweis uiitl Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 9a sprechende Herzkanüle (Fiii. 49), damit sie sich iu ihrem unteren Drittel mit liiniierlösuiit'- füllt. Aulienloin le^t man zwei je etwa 20 cm lange Leinent'ädeii zurecht zum Al)binden des Herzens. Dann ergreift man den Frosch mit der einen Hand, führt die Schere in das Maul ein und schneidet den Kopf ab, wobei der Unterkiefer stehen bleibt. Nach Zer- störung des Rückenmarks wird der Frosch auf einen gewöhidichen Teller gelegt, wobei der l'nterkiefer zweckmäßig auf dem Tellerrand aufliegt. Das Tier ist mit der Kopfseite zunächst dem Operierenden zugekehrt. Mit einer Hakenpinzette erfaßt man die Haut am Unterkiefer und präpariert mit der Fig. in. Schere einen großen und breiten Haut- lappen (Fig. 45 d), welcher über den Bauch umgelegt wird. Zur Entfer- nung des für das Herz schädhchen Hautsekretes wird die Schere nunmehr abgewaschen. Dann wird das obere knor- pehgeEnde des Brust- beins fa^ mit gewöhn- licher Pinzette erfaßt und in der Mitte gespalten. Dieser Schnitt wird weiter nach unten hin durch das Brustbein (b, c) vei'längert, wobei der stumpfe Ast der Schere dicht unter dem Knochen vor- geschoben wird. Der Schnitt wird in die Bauchmuskulatur fortgesetzt, in welche dann zwei seit- liche Einschnitte zur Erweiterung der Lücke gemacht werden. Dem gleichen Zwecke dient das hierauf folgende Abtragen des Brustbeins auf beiden Seiten bis zu den Knochen der oberen Extremität (Fig. 4(j./'). Hierbei ist darauf zu achten, daß die Leber und namentlich die daransitzende (iallenblase nicht verletzt wird. Nunmehr wird der Teller umgedreht, so dali die Kopfseite des Frosches vom Operierenden abgekehrt ist. ri)er dem pulsiereniien ller/en sieht man als dünne durchsichtige Haut den Herzbeutel, der manchmal bei der Durchtrennung des Brustbeins schon angeschnitten wird. Diesen erfaßt man an irgend einer Stelle mit feiner Pinzette, .schneidet, sofern er nech unverletzt, eine Öffnung in (lenseli)en, die man dann nach oben hin er- Präparation des FroschherzeuB. IT. 94 H. Fühner. weitert, so daß der Herzbeutel bis oben an seine Anheftungsstellen an den Aorten vollständig gespalten ist und das Herz (ö? = Vorliof, e =; \'entrikel) frei daliegt. Bemerkt sei noch, daß manchmal die Lungen prall gefüllt sind und die weitere Präparation des Herzens stören. Nach einem kleinen Ein- schnitt fallen dieselben zusammen. Die beiden Aortenbögen (Fig. 46 a und b) kommen aus einem gemein- samen Stamme, der seinerseits aus dem Bulbus cordis (c) hervorgeht. Unter der Verzweigungsstelle der Aorta schiebt man eine feine Pinzette vorsichtig durch, erfaßt mit derselben den einen bereitliegenden Faden und zieht ihn unter dem Gefäße hindurch. Die beiden Fadenenden schlingt man schon, wie in der Figur sichtbar, übereinander, um später die Ligatur rascher anlegen zu können. Man erfaßt dann eine kleine Stelle der Wand des linken Aorten- ^'^ *^- bogens mit feiner Pinzette und schneidet mit feiner Schere das Gefäß an. Die Öffnung muß so groß sein, daß man mit der Kanüle be- quem eingehen kann. Hierzu hält man mit der linken Hand den Zipfel der blutenden Aorta, mit der rechten Hand führt man die zum Teil mit Ringerlcsung gefüllte und durch einen Finger oben ver- schlossene Kanüle in den Spalt ein (vgl. Fig. 47). Sobald man mit der Kanüle bis in den Bulbus ein- gedrungen ist, ist der Ver- schluß derselben nicht mehr nötig. Man erfaßt nunmehr mit der Pinzette der linken Hand den Herz- beutel an der Stelle der Vereinigung beider Aorten und versucht mit der rechten die Kanüle vom Bulbus in den Ventrikel vorzuschieben (in der Richtung des Pfeiles !). Dies gelingt dem Ungeübten nicht leicht. Man muß hierbei den Widerstand der Herzklappe über\\inden. Doch nicht mit Gewalt bohrend, sondern durch vorsichtiges Vor- und Zurückschieben der Kanüle. Man dringt in das Herz leicht und ohne Beschädigung desselben ein im Mo- ment der Systole, d. h. wenn der Ventrikel seineu Inhalt auspreßt und die Klappe geöffnet ist. Man muß suchen, die Kanüle nach hinten und zugleich nach der linken Seite (des Frosches) vorzuschieben. Am besten übt man sich erst an toten Fröschen, bevor man die IsoUerung am lebenden Tier versucht. Das Eindringen der Kanüle in den Ventrikel gehugt mit einem Schlag. Man muß dann darauf achten, daß dieselbe nicht wieder herausgleitet, was beim nunmehr vorzunehmenden Zuziehen der Fadenschlinge um die Aorta Präparation des Froschherzens. III. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 95 leicht vorkommen kann, namentlich wenn der ausgezogene Teil der Kanüle für das vorhegende Froschherz zu kurz ist. Hevor man die Li- gatur fest zuzieht, überzeugt man sich davon, dal'» die Kanülenspitze tat- sächlich in den Ventrikel hineinragt, durch vorsichtiües Betasten (W^ Ven- trikels mit einem Finger. Man kann die harte Kanüle durch die Ilcrzwand hindurch leicht fühlen. Über dem ersten Knoten der Ligatur schlingt man einen zweiten, zieht fest an und schneidet die Fäden ab. Das Herz pulsiert an der Kanüle, in ^velche zum Teil Blut eingedrungen ist. das bei richtiger Lage der Kanüle sich auf und ab bewegt. Man entleert das Blut aus der Kanüle mit einer in dieselbe passenden Pipette (Fig. 51) und ersetzt es 5 — 6maUger Blutentnahnie und Ersatz durch Fig. 48. durch Ringerlösung. Nach Ringerlösung gelangt nur noch wenig Blut in die Kanüle aus dem Herzen. Man schneidet dann, indem man die Kanüle hochhebt . zu- nächst die beiden Aorten ab. dann ein feines Ge- fäül)ändchen , welches von hinten her an den Ventrikel geht, das Fre- ^ nulum, und endlich die in den Sinus venosus (Fig. 48 c) einmündende Hohlvene (d). Hierbei mul'i man die Kanüle • in horizontaler Lage möglichst hoch halten und dann die Vene mög- lichst tief nach unten abschneiden. Vorzuzie- hen ist die Anlegung einer zweiten Ligatur um die Hohlvene, bevor man sie abschneidet, da bei länger dauernden \'er- suchen ein Undichtwerden der anfänglich gut schließenden \'()rhofklai)pen vorkommt. Der Ungeübte läßt sich zur Anlegung dieser Ligatur am besten die Herzkanüle durch einen Assistenten in die Höhe halten, legt erst eine weite Fadenschlinge um die Vorhöfe (bj und schiebt diese Schhnge, sie mit zwei Pinzetten allmählich zuziehend, immer mehr nach hinten, .^o daß der Venensinus möglichst vollständig am Herzpräparat verbleibt. Ist die Ligatur gelegt und mit zweitem Knoten versehen . so werden die Fäden abgetrennt und unter der Ligatur das (Jeweite durchschnitten. Bei einiger Cbung kann man die Ligatur auch allein anlegen. Zu dem Zwecke spannt man Hohlvenensinus und Hohlvene bei Anlegung der Ligatur mög- Präparation des Froschherzens. IV. 96 H. Fühner. Fig. 49. Fig. 50. liehst dadurch an, daß man die Kanüle, wie in der Figur ersichtlich ist, quer über die Kehle legt. Durch wiederholtes Aussaugen mit der Pipette und Einfüllen von Ringerlösung ersetzt man das noch vorhandene Blut durch die Salzlösung, welche bei gelungener Präparation des Herzens , bei der allmählich regel- mäßig wiedereinsetzenden Herztätigkeit, in der Kanüle auf und absteigt. Man entfernt die vorhandene Lösung in der Kanüle solange sie noch rötlich gefärbt erscheint, da selbst geringe Blutreste Anlaß zu Gerinnsel- bildung geben und die Kanüle zum Teil verstopfen können. Bewegt sich bei kräftiger Herztätigkeit die Flüssigkeit in der Kanüle nicht entsprechend mit, so ist die Kanüle in ihrem engen Teile ver- legt. Dies kann geschehen durch Blutgerinnsel oder durch Luft- blasen, oder dadurch, daß die Kanüle zu tief in dem Ventrikel steckt, so daß die Herzwand das Kanülenende klappenartig verschließt. Luftblasen kann man durch Aussaueen mit der Pipette entfernen, oft auch Blutgerinnsel. Steckt die Kanüle zu tief im Herzen, so sucht man das Herz etwas mehr an der Kanüle herabzu- schieben. Ungenügendes Pulsieren in der Kanüle wird natürlich auch dann beobachtet werden, wenn die Kanülenspitze nicht bis in den Ven- trikel hineinreicht. Nach Abnahme der ersten Ligatur gehngt es dann noch manchmal, die Kanüle tiefer in den Ventrikel vorzuschieben. An der Herzspitze wird nunmehr die aus Federdraht gebogene Herzklammer (Fig. 30«), die mit einem Faden versehen ist, festgeklemmt. Die Herzklammer muß genügend breite Enden haben, die den Herzmuskel beim Festklemmen nicht verletzen. Kanüle, daneben Kanülenende mit daran festgebundenem Herzen mit Herz- klammer sind in Fig. 49 und 50 in natürlicher Größe wiedergegeben. Zur Herstellung der Herz- kanülen ist hier zu bemerken, daß dieselben Herzkanüle. , . . . -ui-i i (Nat. Größe.) am bcstcu m emem Mikrobrenner ausgezogen und mit einer kleinen Verdickung versehen Isoliertes Herz. werden, welche aber auch fehlen kann. Nach dem Ausziehen wird das Ende der Kanüle auf feinem Schmirgelpapier schräg abgeschliffen. Um das Abgleiten des Herzens von der Kanüle zu verhindern, wird das Ende derselben mit Glasätztinte etwas rauh gemacht. Die in Fig. 51 ver- kleinert wiedergegebene Pipette wird aus einem weiteren Glasrohr aus- gezogen, mit einem Stück Gummischlauch und kleinem Kork versehen. Das kapillare Ende der Pipette wird so lang gelassen, daß beim maxi- malen Einführen der Pipette in die Herzkanüle das Pipettenende bis in das Kanülenende reicht, aber nicht darüber hinau.s, weil sonst das Herz Nacliwcis und Bestimmung,' von (üftcn auf biologischem Wege. f»? leicht durchstochen wird. Je weiter die Pipette aber in das Kaniilenende vorreicht, desto hesser laut sich mit derselhon der llcrzinhalt ciitlecrfn. Die llerzkanüle mit dem pulsierenden Heizen wird in dem Kork der Herzkammer (Fig. 52) befestigt, der Fach-n durch die untere (')ttiiung der Herzkammer gezogen und durch einen Drahthaken mit (h-m mogHchst entlasteten Schreibhebel verbunden. Sauerstoffzufuhr durch die am Boden der Herzkammer befindliche Kingerlösung erweist sich namentheh am Anfang des \'ersuches als nützlich, um das Herz in geordnete Tiitigkeit zu bringen. Im späteren Verlauf des \'ersuches kann dieselbe sehr FiR. 51 . Fig. 62. U Pipette für Herzkandle. (Verkleinert.) Isoliertes Froschherz in Herzkammer tiber Kinp.Tl.'SUDK. SauerstofTdurohleituni;. Jiiquelsche Zeitmarkieruhr. eingeschränkt werden. Je höher die Aulientemperatur bei Anstelhiiig th's \er- suches ist, desto nötiger erweist sich die Zufuhr von Sauerstoff zum Herzen. Hat die Präparation des Herzens im Sommer längere Zeit in Anspruch ge- nommen, so ist der Herzmu.skel erstickt. Hier lälit sich dann eklatant der belebende Einfluli des Sauerstoffs beobachten, den man in diesem Falle so rasch durch die liingerUisung streichen läl'.t, dali diese zerstäubt wird und das Herz Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmothoden. V. ( 98 H. Fühner. besprüht. Ist das Herz nicht wiederzubeleben, so kann dies eventuell daran liegen, daß der Venensinus zu kurz abgebunden ist, wodurch die Herz- tätigkeit gehemmt wird (Staun ins). Unregelmäßige Herztätigkeit kann mechanisch bedingt sein durch zu weites Hineinragen der Herzkanüle in den Ventrikel. Sie kommt aber auch als pathologische Erscheinung bei kranken Fröschen vor. Solche Herzen sind zu verwerfen. Unbrauchbar ist auch das Herzpräparat zu Vergiftungs- versuchen, wenn dasselbe rinnt. Dies kann bedingt sein durch schlechtes Abbinden der Aorta oder der Hohlvene, häufiger aber durch eine Ver- letzung des Vorhofs bei der Präparation oder durch Verletzung des Ven- trikels mit der Herzklammer. Zur graphischen Registrierung der Herztätigkeit verwendet man einen möglichst entlasteten einarmigen Schreibhebel aus Aluminium oder Stroh. Auch ist darauf zu achten , daß die Schreibfahne eine feine Spitze hat und die auf der berußten Papierfläche zu ül)erwindende Pteibung eine geringe (Papier nicht zu dick berußen!) ist. Das isolierte Froschherz hält sich in feuchter Kammer im winter- kalten Räume, selbst ohne Sauerstoffzufuhr, mehrere Tag lang, ebenso im Sommer bei Sauerstoffzufuhr. 1. Der Nachweis von Giften mit Digitalinwirkung. Wie beim Nachweis von Giften mit Digitalinwirkung am ganzen Frosche erwähnt wurde, ist das Auftreten eines systolischen Herzstillstandes nach Injektion der Giftlösung in einen Lymphsack beweisender für das Vorhandensein eines Produktes mit typischer Digitalinwirkung, als der Versuch am isoUerten Herzen. Hier verursachen auch die den Digitahs- glykosiden chemisch und pharmakologisch nahestehenden Saponine systo- hschen Herzstillstand, während sie am ganzen Tier zu schlecht resorbiert werden, um diese Wirkung zu entfalten. Hingegen ist das isolierte Frosch- herz geeignet, das Vorhandensein noch sehr geringer Mengen von Produkten mit Digitalinwirkung nachzuweisen, welche am ganzen Tier keinen Herzstillstand mehr hervorrufen. Zu bemerken ist , daß nach Straub ^) für Versuche am isoherten Herzen der Wasserfrosch ebensogut brauchbar ist wie der Grasfrosch, während bei Versuchen am ganzen Tier der Grasfrosch, Avegen seiner größeren Empfindhchkeit gegenüber Produkten mit Digitalinwirkung, zur Prüfung derselben vorzuziehen ist. Injiziert man einem Wasserfrosche (50^) 1 — 2cm^ einer Lösung von Strophanthin Boehringer (das annähernd ebenso wirksam ist wie das kristallisierte Produkt von Merck) 1:10.000 (=1/10— 2/10 m^) in den Brustlymphsack, so geht das Tier im Verlauf eines Tages zugrunde und es zeigt sich bei demselben am freigelegten Herzen systohscher Stillstand. ') W. Strauh , Quantitative Untersuchungen über den Chemismus der Strophan- thinwirkung. Biochem. Zeitschr. Bd. 28. S. 395 (1910) Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 99 l cm^ einer Lösun^^ dcssclheii rr;ii)ar;ites ] : 1(H).(H)0 (= lldi) nifit bleibt am ganzen Wasserfrosche ohne sichtbare Wiiküii;^'. Am isolieiteu Herzen des Wasserfrosches hinbiegen brin«^t nach F. Trmdrhnhurg'^) die Menge von Icrn^ einer Lösung- 1 :5(M».(K)0 ( = 2 l(MM>//ixf) im N'erhmf einer Stunde systolischen Stillstand hervor. Die Substanz muti natürlich in IJinger- lösung gelöst sein und wird nach Entleerung des isoliert<'n Herzens von der darin befindlichen IMngerlösnng in die Kanüle eingebracht, nachdem erst die normale llerztiitigkeit registriert ist. Man markiert auf der Kurve den Zeitpunkt des Einbringens der Lösung. Charakteristisch für die Hauptvertreter der Produkte mit higitalin- wirkung ist die relativ langsame Wirkung. Der Stillstand tritt auch bei starker Stroplianthinlösung niemals sofort auf, sondern erst nach ö bis 15 Minuten und darül)er. Hierdurch unterscheiden sich diese Substanzen mehr oder weniger von den Saponinen, bei welchen in stärkeren Lö.sungen fast sofortiger systolischer Stillstand des Herzens zustande kommen kann (P. Trendelenhurcj). Auch in noch anderer Weise lassen sich die Saponine von den Digitalissul)stanzeu unterscheiden. Eine Saponinlüsung wird durch Digerieren mit Cholesterin für das Froschherz entgiftet, während dies beim Strophanthiu etc. nicht der Fall ist {Karnülow 2). Quantitative Anhaltspunkte über die Konzentration einer Lösung an Digitalisprodukten lassen sich nach Straub ^) am isolierten Herzen aus der Form der Gesamtkurve, welche im Verlaufe der Vergiftung aufgezeichnet wird, gewinnen, sofern man sich erst, wie dies Straub für das Strophanthiu getan hat. an einer Anzahl isolierter Herzen die Wirkungsstufen ver- schieden starker Lösungen aufgezeichnet hat. Man verwendet hierzu wieder, wie bei der Prüfung am ganzen Frosch angegeben wurde, sehr langsamen Oang des Kymographions, um ..Silhouettenkurven- aufzuzeichnen. Wie am ganzen Tier, so fällt auch am isolierten Herzen der Anstieg der Kurve um so steiler aus , je größer die Konzentration der Lösung an wirksamer Substanz ist. Es ist zu erwarten, daß zur ([uantitativen Bestimmung das ausgeschnittene Herz leistungsfähiger ist als der ganze Frosch, da bei letzterem, wie aus den ^■ersuchen von Focke hervorgeht, die Uesorptions- geschwindigkeit nur schwer zu beherrschen ist. 2. Der Nachweis von Aconitin. Wenn der Versuch am ganzen Frosche (s. d.) die Anwesenheit von Aconitin auch meist einwandfrei durch die Herzwirkung (Peristaltik) erkennen läßt, so sind dazu doch von dem kristallisierten Produkt in Form des salzsauren Salzes Mengen bis 1, 100 m.Q nötig. Tberdies versagt die *) P. Trendelenburg, Vergleichende Untersuchung über den WirkungsmeclKinismus und die Wirkungsintensität glykosidischer Herzgiftc. Arch. f. e.xperim. l'atliol. u. l'hariua- kologic. Bd. 61. S. 25fi (1909). -) Karaiiloir, tlii.T Kut-iiftung glykosidischor Herzgiftc durch Cholesterin in Ver- suchen am ausgeschnittenen Froschherzen. Biochem. Ztschr. Bd. l\'2. S. 14n (1911). 3) W. Straub, 1. c. 100 H- Fühner. Reaktion in nicht zu seltenen Fällen vollständig. Hingegen lassen sich am isolierten Herzen noch Mengen von 1/1000 mg des Salzes mit Sicher- heit nachweisen (Fühner), was darum besonders wichtig ist, weil für das Aconitin keine empfindlichen und beweisenden chemischen Identitäts- reaktionen bekannt sind. Um eine die charakteristische Peristaltik zeigende Kurve vom isolierten Herzen zu bekommen, wird man in folgender Weise vorgehen: Man verdünnt das auf Aconitin zu prüfende Material mit Ringer- lösung im Verhältnis 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10.000 und 1 : 100.000. Von jeder Verdünnung genügen einige Kubikzentimeter. In das normal pulsierende isolierte Herz eines gesunden Wasserfrosches, das bis dahin mit einem Inhalt von etwa i/, cm^ Ringerlösung gearbeitet hat und von dem man eine Zeitlang die Herztätigkeit aufzeichnete, verbringt man, nach Entleerung der Ringerlösung mit der Pipette, V2 c^><^ der auf Aconitin zu prüfenden Flüssigkeit in Verdünnung 1 : 100.000. Enthält die Lösung im Kubikzentimeter etwa 1/1000 mg Aconitin, so wird man an dem Herzen folgende Beobachtungen machen können. Ist die Herzaktion im Anfange des Versuches eine langsame , z. B. bei Kaltfröschen, so wird sie im Verlaufe von etwa 10 Minuten beschleu- nigt und die anfänglich hohen Pulse werden niedriger. Zweckmäßig saugt man die in der Kanüle enthaltene Lösung im Verlaufe des Versuches etwa alle 10 Minuten mit der Pipette zurück und gibt sie von neuem in das Herz. Man erreicht auf diese Weise bessere Durchmischung der Flüssig- keit. Nach etwa 20 Minuten kann sogenannte Halbierung am Herzen auftreten, d. h. auf zwei Vorhofpulse kommt nur ein Ventrikelpuls, was in der Aufzeichnung auf der berußten Fläche durch seltenere und meist wieder höhere Pulse zum Ausdruck kommt. Es kann dann vorübergehend ein Stadium der Periodenbildung beobachtet werden, wobei auf regelmäßige Serien von 2 — 6 Pulsen ein Puls ausfällt. Die Herzaktion kann hierauf, bei dieser geringen Giftmenge, wieder eine nahezu normale werden. Ist im Verlaufe einer halben Stunde von Beginn der Vergiftung an keine weitere Wirkung, wie etwa unregelmäßige Herztätigkeit oder die durch fast vollständige vorübergehende Stillstände und auffallend unregelmäßige, abwechselnd große und kleine Pulse im Kardiogramm gekennzeichnete Peristaltik (Fig. öo^) aufgetreten, so entleert man den Herzinhalt und gibt wieder V2 ^»^^ derselben Verdünnung 1 : 100.000 in das Herz. Ist die Menge von 1/1000 mg kristaUisiertem Aconitin im Kubikzentimeter der Lösung enthalten, so wird sich 20 — 30 Minuten nach Zugabe der neuen Menge, also jedenfalls im Verlaufe der ersten Stunde der Vergiftung mit ziemlicher Sicherheit Peristaltik einstehen, am Herzen selbst kenntlich durch wurmförmige, hin- und herwogende Bewegungen der Herzmuskulatur. Auf ein Stadium kleiner Pulse folgt meist ein solches mit großen Pulsen. Oder das Herz kommt nach 1 — 2 Stunden zum völligen diastolischen Stillstand des Ventrikels, während der Vorhof noch eine Zeitlang weiter pulsiert. Dieser Stillstand läßt sich beseitigen. Man entleert dazu den Herz- Nachweis ui.d Btstimmung von Giften auf biologischem ^Vege \{ji Inhalt und ersetzt ihn durch Kinj^erlösung. Durch wiederholtes Ansaugen und Zurückpressen der Kingerlösuu^- in den Ventrikel mit der Pipette wird das Herz rhythmisch gedehnt und allmählich nimmt es wieder seine geordnete Tätigkeit auf. Die Pulse werden nach und nach grüßer. aber die Fi«. B3. Rana escnlenta. 86 g. Männlich. Isoliertes Herz. VerRiftanR durch Aconitin. crisUll. HCl 1 : 100.000. n normale HerzthtiKkeit. /) Peristaltik. <• fin.ile rulgverlangsamung. Zeit = Sekunden. Herzaktion ist gegenüber früher stark verlangsamt. Man kann den Herzinhalt noch 1 — 2mal entleeren und durch Pingerlösung ersetzen. Meh- rere Stunden nach der Vergiftun«;- ist die Herztätiirkeit wieder vollkommen regelmäüig. Aber der Ventrikel pulsiert langsam bei normaler Vorhoft;itii:- keit (Fig. 5a c). 8— 16 Vorhofpul.se können auf eine Vcntrikelkoutraktion 102 H. Fühner. kommeü. Dieses ist das letzte charakteristische Stadium der Aco- nitinwirkung am Froschherzen, das mau aber bei so kleiueu Giftmeugen nicht immer erhält. Unter den angegebenen Bedingungen kann das mit Eingerlösung pulsierende Herz von kleinen wirksamen Aconitinmengen sick wieder völlig erholen. Hat die zu prüfende Lösung im Verlaufe einer Stunde keine Peri- staltik und keinen diastolischen Herzstillstand hervorgerufen, so entfernt man sie aus dem Herzen und prüft die nächst höhere Konzentration (1 : 10.000) in der angegebenen Weise. Es kommt, wenn auch selten, vor, daß diastolischer Stillstand des Herzens im ^^erlauf der ersten Stunde der Einwirkung von schwachen Aconitinlösungen eintritt ohne voraufgehende deutliche Peristaltik. Man wird dann das Herz in der oben angegebenen Weise mit Piingerlösung be- handeln, nach Entleerung der Giftlösung. In solchen Fällen kann Peristaltik beim Auswaschen eintreten. Geht aber auch hier die Herzaktion ohne Peri- staltik und Pulsverlangsamung in normale Herztätigkeit über, so gibt man von neuem die erste Giftlösung zu. Es kann jetzt immer noch Peristaltik auftreten. Ist dies nicht der Fall, so entfernt man die Lösung und prüft das ausgewaschene Herz auf normale Pieaktionsfähigkeit durch Einbringen einer Lösung von salzsaurera Aconitin 1:100.000. Zeigt durch diese Lösung das Herz im Verlauf der ersten halben Stunde deutlich ausgeprägte Peristaltik, so ist es unwahrscheinlich, daß die erste zu prüfende Lösung Aconitin enthielt oder sie enthielt neben Aconitin ^'erunreinigungen, welche das Zustandekommen der typischen Aconitinwirkung verhindern. Die beigegebenen Kurven sind einem Versuche entnommen, bei welchem das Herz eines großen Wasserfi'osches mit einer Lösung von Aconitin HCl 1 : 100.000 (d. h. 1/100 mg im Kubikzentimeter) vergiftet wurde. Nach Einbringung des ersten 1/2 cm^ der Lösung zeigte das Herz^ dessen normale Tätigkeit aus Fig. 53 a zu ersehen ist , schon nach 5 Mi- nuten die in Fig. 53 b aufgezeichnete Peristaltik. Nachdem diese vorüber war, wurden die Pulse wieder größer und langsamer. Die in Fig. 53c wiedergegel)enen langsamen Pulse wurden eine Stunde nach Beginn der Vergiftung aufgezeichnet, nachdem noch dreimal von neuem i/, cnt^ der Lösung 1 : lOOClOO in das Herz gegeben worden war. Auf dieses Stadium folgt scliließhch, bei immer seltener werdenden Pulsen, der diastolische Stillstand. Es ist zu bemerken, daß das Stadium der langsamen Pulse selbst bei der Konzentration der Aconitinlösung 1 : 10.000 (1/10 mg im Kubik- zentimeter) fast nie vor V2 — V4 Stunden eintritt. Bei dieser starken Aconitinlösung ist die Peristaltik schlecht ausgeprägt. Deshalb ist es bei Prüfung einer unbekannten Lösung angebracht, erst mit weitgehenden Ver- dünnungen zu beginnen. Optimale, lang andauernde Peristaltik erhält man bei Lösungen des kristallisierten Aconitins in Konzentration 1 : 200.000 bis 1 : 500.000, wobei die Menge von 1/0 cm^ meist ausreicht. Ganz denselben Verlauf der Vergiftung kann man mit amorphem salzsauren Aconitin (Merck) bekommen, nur ist dasselbe schwächer Nachweis und Bestimmung vun (iiften auf biolo(,'ischein Wege. iQjj wirksam als das kristallisiorte Produkt. Auch mit einer durch Iliu^M-rlösunf? verdünuten Tinct. Acouiti lassen sich die j^^deichen Erschcinnn^'en er- halten. Bei der Tinktur namentlich wird öfters erst beim Auswaschen des vergifteten Herzens mit Ringerlösung die Peristaltik in typischei- Weise beobachtet. Unter den angegebenen Bedingungen dürfte es an jedem normalen Froschherzen (Wasserfrosch; Grasfrösche sind in dieser Ilichtung bisiier nicht geprüft!) gelingen, geringste Aconitinmengen nachzuweisen. 3. Der Nachweis von Muscarin. Wie DigitaHsprodukte und Aconitin ist auch das Muscarin in geringerer Menge am isolierten Herzen nachzuweisen als anj ganzen P'rosche. - Bemerkenswert bei der Muscarinwirkung ist vor allem, wie schon bei der Besprechung des Giftes in seiner Wirkung am ganzen Tiere (s. d.) hervorgehoben wurde, die wechselnde Resistenz der P" rösche ihr gegen- über. Diese findet sich nicht nur am ganzen Tiere ausgeprägt, etwa ab- hängig von verschiedener Piesorptionsgeschwindigkeit von den Lymphsäcken aus, sondern auch am isolierten Herzen. Bei Verwendung von künstlichem, durch Oxydation von C'holin her- gestelltem salzsauren Muscarin in Ringerlösung gelöst, ist am isolierten Herzen von empfindlichen Wasserfröschen durch eine Lösung 1 : 100.000 (in Menge von Va om^ in die Herzkanüle gebracht) noch deutliche Ver- minderung der Pulshöhe und durch Lösung 1 : 50.000^1 : 75.000 noch dia- stolischer Stillstand zu erzeugen. An unempfindlichen Herzen wird der Stillstand oft erst durch Lösungen 1 : 10.000. manchmal nur durch 1:5(MM> hervorgerufen {Fühner und Bosenoiv ^ ). Fig. 54a zeigt die Wirkung von '^Ucm^ einer Lösung von salz- saurem Muscarin 1 : 50.000 an einem wenig empfindlichen Froschherzen. Beim Entfernen der Ringerlösung aus dem Herzen steigt die Höhe der Herzpulse etw^as an. Sie nehmen aber sofort nach Einbringen der Muscarin- lösung stark ab. Diese Verringerung der l'ulshöhe (..negativ-inotrojte Wirkung") ist die einzige Wirkung dieser Lösung. Nach EntfernuuLf der Giftlösung und Ersatz durch Pingerlösung steigen die Pulse wieder au und bei wiederholtem Auswaschen kehrt die Herztätigkeit bald zur Norm zurück. Fig. 54 i zeigt die Wirkung einer Muscarinlösung 1 : 10.000 an dem- selben Herzen. Nachdem die Pulse kleiner geworden sind, tritt rasch dia- stoHscher Stillstand auf, nur noch einmal unterbrochen durch eine Ven- trikelkontraktion. Dem vollständigen Stillstand kann eine Serie verlang- samter Pulse (..negativ-chronotiope Wirkung") vorausgehen . wie /.. B. in *) H. Fühner (und A'. Roticumr), I'lior das \orhalti'n tlos s\ ntlu-tisclicn Muscarin» im Tierkörper. Arch. f. cxi.. I'atlml. n. l'liarmakol. BdOl. S. 284 (1909). 104 H. Füll 11 er. Fig. 55. Dieser diastolische Herzstillstand läßt sich durch gründliches und häufig wiederholtes Auswaschen mit Ringerlösung vollständig beseitigen. Fig. 54. Bana esculenta. 65 3. Männlich. Isoliertes Herz, n Vergiftung durch Muscarin HCl 1:50.000 (bei M). h Vergiftung durch Muscarin HCl 1 : 10.000 (bei 3/). Bei ( | ) Kingerlösung entleert oder Herz aus- gewaschen. Zeit =: 10 Sekunden. Am längsten dauert es, bis auch der Vorhof wieder normal pulsiert, der durch das Muscarin im Gegensatz zum Aconitin und den Substanzen mit Digitaliswirkung früher in seiner Tätigkeit beeinträchtigt wird als der Ven- Nachweis und Bestimmung von Giften auf liiologischem Wejfe. lOf) trikel. Erst wenn die Voiiiofpulse wieder kräftii^ und normal erfolgen, ist das Muscarin völlif,^ aus dem Herzen ausgewaschen, was nach stiirkcrer Vergiftung etwa 20 Minuten in Anspruch nimmt. Das Herz reagiert dann, einer neuen Muscarinvergiftung gegenüber, wieder wie ein normales Herz. Man kann an demselben Herzen bis zu 20 Muscarinvcrgiftungen verschie- dener (irade vornehmen, ein Umstand, welcher die genaue (|uant itative Bestimmung des Muscarins, und zwar nicht nur des synthetischen, sondern auch des natürlichen Produktes, am isolierten Froschherzen er- möglicht {Fiihncr^). Dieselben Wirkungen, wie sie hier beschrieben sind, lassen <\r\\ am isolierten Herzen auch durch Lösungen von Kaliumchlorid hervorbringen. Doch unterscheidet sich der diastolische Stillstand durch Fig.bb. eine Kalilösung prinzipiell vom Muscarinstillstand dadurch, daß er durch Atropin nicht beseitigt werden kann. Fig. 55 zeigt Muscarin- stillstand wieder an demselben Herzen wie oben und durch dieselbe Lösung 1:10.000. Während des Stillstandes wur- de zu der Muscarinlösung in der Herzkanüle etwas einer schwachen Lösung von Atro- pinsulfat zugesetzt und der Kanüleninhalt durch leichtes Ansaugen durchmischt. Dald schon traten schwache, allmäh- lich stärker werdende Pulse auf und nach einiger Zeit war die Herztätigkeit wieder eine normale. Das Atropin läßt sich durch Auswaschen aus dem Herzen nicht mehr derart beseitigen, dal'» das .Muscarin von neuem wirksam wird. Noch geringste Spuren von Atrojjin hindern das Zustande- kommen des Muscarinstillstandes. Nach Hdninck-) genügt schon am ganzen Frosch die Menge von 1 400 wi/? Atropin. um die Muscarin- wirkung aufzuheben. Die am isolierten Herzen wirksamen Atropinmengen dürften noch bedeutend geringere sein und ist hiermit zugleich eine Methode zum Nachweis kleiner Atropinmengen gegeben. *) H. Fühner, Die (luantitative Bestimmung des synthetischen .Muscarins auf phy- siologischem Wege. Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol, Hd. 59. S. 17".l (IDOH). ") K. Hariiark, ÜhoT die Wirkung ties .Vtropin und Thysostigniin auf Pupille und Herz. Arch. f. e.\p. Pathol. u. riuumakol. Bd. 2. S. 331 (1874). - Noch wirksamer in Baaa escalenta. öbg. Mäonlirh. Igoliortrs Herz. ViTSiftunfT durch Muscarin (M). Stillstand hescititft durch .Atropin- 7.ugahe>(A>. Bei ( | ) Kinj^erlosung rntferiit oder Horz »uü- gewascht'n. Zeit =: 10 Sekunden. 106 H. Fühner. d) Prüfungen am Gefäßpräparat. Wertbestimmung von Nebennierenpräparaten und Adrenalin- lösungen, Zur Prüfung- der Wirkung von Substcanzen, ^Yelche yne das Adre- nalin (Suprarenin) die Gefäßweite beeinflussen, findet nach einem Vorschlage von Straub ein Gefäßpräparat des Frosches Verwendung, welches nach A. Läwen i) und P. Trendelenhurg 2) in folgender Weise her- gestellt wird. Einem möglichst großen Wasserfrosche (100 f/ und darüber) wird der Kopf abgeschnitten und das Rückenmark sorgfältig ausgebohrt. Der Frosch wird, auf einem Teller auf dem Rücken liegend, mit dem Kopfe nach dem Präparierenden gewendet. Mit Schere und Pinzette wird die Haut in etwa 2 an breitem Lappen von der Brust bis in die Schenkelgegend abpräpariert und über die Oberschenkel gelegt (Fig. 56). Hierauf folgt die Entfernung des Brustbeins, das von den Oberarmknochen abgeschnitten und in die Höhe gehalten wird. Man sieht an seinem unteren Ende, von der vorderen Bauchwand zum Herzen ziehend, genau in der Mittellinie, die große Bauchvene, welche man durch einen Scherenschnitt abtrennt. Dann wird die Bauchdecke unterhalb des Brustbeins quer durch- schnitten, ein Lappen von 2 cm Breite (je 1cm zu beiden Seiten der Vene) nach unten zu präpariert und ül)er den Hautlappen gelegt. Nunmehr wird der Teller umgedreht. Man präpariert die Blase des Frosches vorsichtig (unter Schonung der Bauchvene) und möglichst tief nach unten von der vorderen Bauchwand ab und schneidet sie zusammen mit dem Mastdarm heraus. Eine Ligatur um Mastdarm und Blase, wie sie die Abbildung (Fig. 56c) zeigt, ist überflüssig. Hingegen müssen beiderseits die von den Schenkelvenen aufwärts zur Xierengegend ziehenden Venae renales ad- vehentes mit feiner Pinzette unterstochen und mit Ligaturen (d) abgebunden werden. Xun werden unter Schonung der schwarz aussehenden über der Wirbelsäule herabziehenden Aorta (a) sämtliche Bauchorgane entfernt, l)is herauf zum Herzen, welches gleichfalls entfernt oder mit der Aorta in Verbindung gelassen wird. Der Frosch wird auf das Froschbrett horizontal gelagert und kann an den Armen mit zwei Klammern fixiert werden. Darauf wird eine möglichst fein ausgezogene Kanüle (AoK) in die Aorta etwa 1 cm oberhalb ihrer Gabelung über der Wirbelsäule dm'ch eine mit einem Scheren- dieser Richtung als das Atropin ist nach E. Harnack und H. Mei/er [Untersuchungen über die Jaborandialkaloide. Ibid. Bd. 12. S. 369 (Anmerk.) (1880)] das dem Atropin nahestehende Duboisin. *) A. Läicen , Quantitative Untersuchungen über die Gefäßwirkung von Suprarenin. Archiv f. experim. Pathol. u. Pharraakol. Bd. 51. S. 415 (1904). -) F. TrenddeHbiirg, Bestimmung des Adrenalingehaltes im normalen Blut sowie beim Abklingen der Wirkung einer einmaligen intravenösen Adrenalininjektiou mittelst phYsiologischer Meßmethode. Archiv f. experim. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 63. S. 161 (1910). Nachweis uiitl Bcstimmiin;,' vuii Giftoii .inf liiulugischem Wege. 107 Fi^. 6U. AoK schnitte hergestellte Öffnung eingeführt. Die Kanüle wird, etwa Vyriit lang, ans einem dickwandigen Kapil- larrohr ausgezogen (die in der Figur gezeichnete längere Kanüle ist unnötig). Die Kanüle wird in die Aorta, unter wel- che vorher ein Faden gelegt wurde , bis dicht oberhalb der Gabelung derselben vorgeschoben, festge- bunden und mit einer Klammer am Stativ in richtiger Lage be- festigt. Zur Einbin- dung ist die Kanüle schon mit Ringer- lösung gefüllt von einer 2Ianotte?,chen 'Flasche (250 cm^) aus, welche durch einen etwa 40 an lan- gen (nimmischlauch mit der Kanüle ver- bunden ist. Der ClUmmischlauc li wird mit einem Quetsch- halin versehen , der während der Einfidi- rung der Kanüle in die Aorta soweit ge- öffnet ist, dali die Ringerlösung lang- sam aus der Kanüle tropft. (Junimi- schlaucli und Kanüle müssen frei von Luft- blasen sein. Lut'tl)la- sen, in dieiiefiHJc gelangt, kiiiincii diese verstojjfi-n (Luftembolie) und das l'r.i- parat unbrauchbar machen. Sitzt die Aortenkanüle hchtiu:, so fliel'it bei geöff- Frogcbgcniliprapnrnt. 108 H. Fühner. Fig. 57. netem Quetschhahn schon Flüssigkeit durch die hintere Extremität und aus der Bauch vene(/jj, in welche jetzt die Venenkanüle (VK) eingeführt wird. Man lagert hierzu zweckmäßig den Haut- und Muskellappen auf einen Kork (e), auf welchem er mit Nadeln angeheftet werden kann. Durch eine mit der Schere hergestellte Schnittöffnung wird die Kanüle in das Gefäß geschoben. Die Venen- kanüle muß dünnwandig und innen möglichst weit sein. Man zieht sie am besten aus einem Reagenzglase in Länge von 10 — 12 ««aus. Sie kann an der Einführungsstelle einen äußeren Durchmesser von Imm, an der um- gebogenen Ausflußstelle einen solchen von 2 mm haben. Ein Festbinden der Kanüle in der Bauchvene ist überflüssig. Zur Unterstützung der Venen- kanüle, welche derart gelagert werden muß, daß das Gefäß keine Knickung er- leidet, dient ein zweiter Kork (f). — Die Mariottesche Flasche (Fig. 57 MF), durch deren Heben und Senken die Ausflußgeschwindigkeit der Tropfen aus der Venenkanüle reguliert werden kann, wird so eingestellt, daß in der Minute 30 — 40 Tropfen ausfließen. Dazu genügt am Anfang des Versuches eine Ein- stellung der Flasche 10 — 15 cm über dem Präparat. Die zu prüfende Flüssigkeit wird jeweils in Menge von 1 cm^ mit einer mit feiner Nadel versehenen Spritze in das Innere des Gummischlauches ein- gespritzt. Dies geschieht nahe der An- satzstelle des Gummischlauches an die Aortenkanüle (Stelle J). Letztere muß so fest durch die Klammer (Fig. 56 u. 57 A') am Stativ gehalten werden, daß eine Verschiebung während der Injektion nicht vorkommt. Die Flüssigkeit wird langsam eingespritzt (Dauer etwa 15 Sekunden), wobei man darauf achtet, daß während der Injektion in dem Glasrohr der Mariotteschen Flasche die Ringerlösung jedesmal gleichhoch (etwa 1 cm) steigt, der Druck in dem Apparat also jedesmal in gleicher Weise gesteigert wird. Ein Größerwerden der Tropfenzahl ist bei dieser geringen Drucksteigerung kaum wahrzunehmen. Die Zahl der fallenden Tropfen wird graphisch registriert. Zu solchem Zwecke existieren verschiedene elektrische Registrierapparate, die aber alle ab und zu versagen. Als viel brauchbarer und niemals versagend hat sich eine von Herrn Prof. Straub angegebene Vorrichtung erwiesen, die man sich leicht selbst herstellen kann (Fig. 58). Es wird dazu ein 20 cm langer Strohhalm (vgl. die Angabe S. 36) aufgespalten und an der Achse eines Schreibhebelwinkels in der Mitte seiner Länge fixiert. An seinem vorderen Gefäßpräparat mit Bnrchströmnngsvorrichtung. Nachweis uud Bestimmung von Giften auf biologischem We^'e. \W Ende wird mit Siefjellack ein etwa lOnu horausnifjcnder diinnoror Stroh- halm eingekittet, welcher die Papierfahne zur Auf/.eicimnnj; auf dt-r be- rußten Trommel trügt. In das zweite Ende wird ein doppelt recht winkelig,' gebogenes Glasröhrchen (Fig. 58) eingekittet, an dessen freiem Ende ein „Deckglas" (D) aufgeschmolzen ist. Dieser Arm des Schrcibhebels wird durch einen in der Mitte mit einem Ann langen Schiit/ ver.sehenen rJumuii- streifen (G) federnd getragen, welcher seinerseits oben von einem Stativ- stück gehalten wird. Zur Anspannung des Ciummisti-eifciis ist an dem Hebelarm, verstellbar, ein kleines (iewicht (Boj augebracht. Ein zweites Gegengewicht (BJ kann an der Achse des Schreii)hel)els angehängt werden. Die (lewichtsstellung wird nach den Ausschlägen , die der Schr('il)hel»cl auf der berußten Trommel gibt, reguliert. Man stellt das Froschbrett so hoch Fig. 58. Schreibbebel zur Tropfenregistriernng nach Stniuh. ein. daß die Tropfen aus einer Höhe von 10 -JOrm auf das Deckglas des Sclu'eibhebels und von da in eine Glasschale fallen. Über der Kurve, welche der Schreii)hebel auf dem Kvmographiou verzeichnet, wird durch einen Markiermagneten die Zeit in Minuten auf- genommen. Nach Abschluß des Versuches wird auf den lackierten Kurven ausgezählt, wie viele Tropfen in der Minute auf den Schreibhebel fielen. Injiziert man Adrenalinlösuiigen in angegebener Weise in den (Jummi- schlauch, so erfolgt durch Verengerung der (iefäßc sehr rasch eine \Crmin- derung der Zahl der Tropfen, wi'lche aus der Vencnkaniilc ausfließen. Fig. ')l> zeigt zwei Kurven, welche nacheinander an demselben Pr;ii)arate nach Ein- spritzung verschieden starker Adrenalinlösungen aufgenommen wurden. Die injizierten Adrenalinlösungen hatten die Konzentration 1 : H» .Millionen (kurve a) und Irö .Millionen ( Kurve />). Diese Injektionen wurden an einem 110 H. Füliner. Froschpräparate bald nach seiner Herstellung vorgenommen. Es muß be- merkt werden, daß nach P. Trendelenhurg die Empfindlichkeit des Prä- parates anfangs eine Adel geringere ist als später, nachdem erst einige Stunden lang Ringerlösung durch dasselbe geleitet wurde, eine Erschei- nung, welche an die allmählich zunehmende EmpfindUchkeit des isoherten Fig. ng. Bana esculeuta. 85 (1909). *) 0. B. Meyer, Über einige Eigenschaften der Gefäßmuskulatiir mit bosondorcr Berücksichtigung der Adrenalinwirkung. Dissertat. Würzburg 1906. ^) r. Trendehnhurfi , 1. c. *) E. lirükiny und /'. Trcndelenhiirtj , Ül)er den Adrenalinnachweis unil den Adrc- nalingelialt im menschlichen Blute. Deutsciies Arch. f. klhi. Medizin (1911). — Eine Zu- sammenstellung der gesamten bis heute vorliegenden Li teratnr (ib er das Ad re na liu findet sich in der Abhandlung von G. Iku/ir. Die normale und pathologische Physio- logie des chromaffinen Gewebes der Nebennieren. Lubarach-Ustcrtags Ergebnisse der pathologischen Anatomie. Jahrg. 14 (1910). j^|2 H. Fühiier. derselben angezeif^t werden. Zum Nachweis dient aber in der Praxis nicht das Auge des Frosches hierfür, sondern das viel empfindhchere Auge der Katze oder noch besser, speziell für Atropin und ihm verwandte Gifte, dasjenige des Menschen (s. d.). Pupillen er Weiterung (Mydriasis) auch am Froschauge bewirken neben Atropin die diesem nahestehenden Alkaloide Hom atropin, Scopolamin, Duboisiu, Tropacocain, Cocain, dann vor allem auch das Adrenalin (Suprarenin). Pupillenverengerung (Miosis) wird hervorgerufen durch Physo- stigmin, Muscarin, Nicotin, Pilocarpin. In der Pupillenwirkung dieser Substanzen bestehen zum Teil Unter- schiede: Legt man ein isoliertes Froschauge, welches erst im Dunkeln ge- halten wurde und dessen Pupille dabei weit geworden ist, in eine iVoige Lösung von Pilocarpin- oder Physostigminsalz , so verengert sich die Pu- pille. Bringt man ein Froschauge erst in V2''/oige Atropinlösung , so wird es hier weit. Nach der Atropinwirkung erweist sich nur noch das Physo- stigmin als wirksam, Pilokarpin nicht mehr. Legt man hingegen ein Auge erst in Curarin (oder Curare), so hat zwar noch das Pilocarpin verengende Wirkung, aber nicht mehr das Physostigmin. >) Zur toxikologischen Charakte- risierung von Pilocarpin und Physostigmin dürfte die Keaktion nicht empfindlich genug sein. Die hauptscächliche Verwendung, welche das enukleierte Froschauge gefunden hat, ist diejenige zur quantitativen Bestimmung des Adrenalins (Ehrmann^). Herstellung des Präparates. Man geht mit starker Schere in das Maul eines Frosches (Wasser- oder Grasfrosch) ein und schneidet mit einem Schlage den die Augen enthaltenden Kopfteil möglichst weit nach hinten ab. Der Kopf wird in der MitteUinie halbiert. Mit Schere und Pin- zette lassen sich die Augen nach Abtrennung der Kopfhaut leicht und ohne Verletzung (ohne daß der Augapfel seinen Inhalt entleert) aus der Augenhöhle herauspräparieren. Wertbestimmung von Adrenalinlösungen. Die isolierten Augen werden nach Ehrmann in kleine, unten ge- schlossene Glastrichterchen von O'ö cm^ Inhalt, welche in ein Reagenzglas- gestell hineingesetzt werden können, die Pupille nach oben gekehrt, ver- bracht und zu dem einen Auge die mit physiologischer (d. h. O-T^/oiger) Kochsalzlösung verdünnte Adrenalinlösung, zu dem anderen Auge desselben Tieres nur physiologische Kochsalzlösung zugefügt. Das zweite Auge dient zur Kontrolle. Die Pupille des ersteren erweitert sich, und zwar ist die ^) Vgl. W. E. DLron, Colchicine with special reference to its mode of actiou on bone-marrow. .Joiini. of Physiol. Vol. 37. p. 53 (1908). ■-) R. Ehrmann, über eine physiologische Wertbestimmung des Adrenalins und seinen Nachweis im Blut. Archiv f. experim. Pathol. u. Pharmakol. Bd. 53. S. 97 (1905). Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischoin Wege. li:^ GescliAvindi^keit der Erweiteruiio' und der (Ji-iid dersclhen ahhilnfri^r von der vorhandenen AdrenaIiimien«,^eJ) Zweckmäßig verwendet man durch vor- heriiie intensive Beliclitun;^' verengte rnpillcn für (Umi N'crsucli. \on Adrenalin (Siipraicnin. hydrochlor. Höchst) Ix-wirken Verdün- nungen von 1 : 1 Million noch maximale Erweiterung der Pupille, 1:10 Millionen hat noch deutliche, 1:20 .Millionen keine Wirkung mehr. Die Methode ist zu orientierenden quantitativen \'ersuchen sehr bequem und brauchbar. Für größere Versuchsreihen erfordert sie zuviel Froschmaterial. Für solche ist die zugleich genauere Methode am Gefiiß- präparat (s. d.) nach Läwen-Trendelenhurg vorzuziehen. Weiße Maus. Weiße Mäuse sind zu Versuchen leicht zu beschaffen, da sie in vielen wissenschaftlichen I>aboratorieu, namentlich in pharmakologischen und hygienischen Universitätsinstitu- ten, ausgedehnte ^'erwendung Fig. ci. finden und darum von den Dienern derselben gezüchtet werden. Cber Mäusezucht vgl. F. Fuhrmann, Die wichtigsten Methoden beim Arbeiten mit Pilzen und J Bakterien, in F.Ab- derhaldens Handbuch der l)ioche- mischen Arbeitsmethoden. Bd. 3. 2. Teil. Berlin 1910. S. 1269. Gefüttert werden die Mäuse mit Brot oder Weizenkörnern und Wasser. Zu Versuchen, welche mehrere Tage andauern, nimmt man die Tiere aus dem Käfig, verbringt sie in I^>echergläser mit etwas Watte und verschließt mit beschwertem Drahtnetz. Man ergreift die Mäuse am besten am Schwanz mit einer Tiegelzange. Zu prüfende Substanzen werden den Mäusen entweder i)er os oder subkutan beigebracht. Man kann die zu untersuchende Substanz mit Siil'i- holzpulver innig vermengen und mit Sirui» daraus l'illen herstellen, welche man nach dem Trocknen zum Fressen gibt oder man kann nach FJtrIirh die Substanz auf ..Cakes" verteilt-) verfüttern. Will man die Maus subkutan injizieren, so geschieht dies am besten unter die liückenhaut. Beiiuem zur Injektion ist ein kleines Mausbrett (Fig. 61), i)estehend aus einer auf einem Brettchen befestigten Draht- ') Gute plidtoiriapliische Wio(lor!.'al)(Mi iiornialor und (lincli .Vdrcnalin erwoitorter Froschpupilleu finden sich hei /•;. Alnhrluthtcii und F. Thies, Weitere Stmlicn üher das physiologische Verhalten von 1-. d- und dl-Siii)rarenin. Zeitsclir. f. phvsiol. C'hem. Bd. 59. S. 25 (llKni). -) Albert-Cakes werden mit der Lösunir getrankt, sodann ijetrooknet. zerrielicn und mit Hilfe von Wasser oder Milcli nach Zusatz von UO // Giidin pro Cakc zu i!i über- ragenden feinen Draht, legt das Tier, das, sobald der erste Streckkrampf aufgetreten war, leicht Seitenlage erträgt . in solcher auf ein gestieltes Froschbrett und befestigt dieses in dem durch Trieb und Zahn vertikal verstellbaren Stativ. Zur llegistrierung bringt man das Kymographion mit herunter Papierfläche in horizontaler Lage unter das Froschbrett, wel- ches man durch Drehen am Stativ bis ganz nahe über die Trommel herab- senkt. Man legt die Maus an den unteren Rand des Froschbrettes und läßt den dasselbe überragenden Schwanz lose auf der Papierfläche schleifen. Durch beständig regulierendes Heben und Senken des Froschbrettes über der Trommel gelingt es leicht, die Schwanzbewegung vom Aufti'eten der anfänglichen schwachen Zitterbewegungen bis zu den sjjäteren starken Au.*^- schlägen kontinuierlich, in mehreren Heihen untereinander, auf der be- rubten Papierfläche zur Aufzeichnung zu bringen. .Man verfolii:t die Kr- scheinung etwa eine Stunde lang. I)ie Zeitmarkierung in Sekunden kann nachträglich, bei gleicher Geschwindigkeit der Tronnnel wie während des Versuches, auf dieser aufgezeichnet werden. Wie Fig. «»H zeigt, sind die Zitterbewegungen des Schwanzes etwa 1<) .Minuten nach der Injektion, al.>. \ uitcljaiir^sciir. 1. gcrniiu. Med. N. F. Bd. 41. S. 345 (1^84). 116 H. Fühner. und rasch (a), steigern sich aber bei der genannten Dose bis zu starken und zugleich viel langsameren Bewegungen (d) im Verlaufe von Vi Stunden. Dieser Versuch an der weißen Maus hat ungefähr dieselbe Empfind- lichkeitsgrenze wie die chemische Probe mit Kaliumbichromat und Schwefel- Fig. 63. ^^,l^/,^»»wA»>^^n/,%«(?/;j^,||j^ ■■^r^mUmiMiii ■^mifk$iMlßlll00 .^^,■i^llli^^wr'<0^«tlifmß^^ Weiße Maus. 4-5 j/. ',10011 '"!/ Strychuiunilrat. ZitterbeweRung des Schwanzes, a 10, ü 15, c d 40 Minuten nach der Injektion. Zeit := Sekunden. säure und kann, mit dieser vereint, bei positivem Ausfall als beweisend für die Gegenwart von Strychnin angesehen werden. Zur Herbeiführung der Strvchninkrämpfe an jungen weißen Mäusen genügen geringere Giftmengen als bei Fröschen (s. d.). Nach Fcdclx sind Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. I17 zwar hei sehr kleinoii Fröschen (Wasserfrüsche von i'y) auch schon Mengen des Nitrats von 5/1000 //i.t> hierzu ausreichend. Doch sind sohli kleine Frösche, im Gef?ensatz zu kk'inen Mäusen, nicht immer zu heschaft'en und dann sollen namentlich hei kleinen Fröschen schon gerinn:fü}iige Ver- letzungen, ohne Vergiftung. Tetanus, wenn auch nur ausnahmsweise, her- beiführen können, was jedenfalls an der weißen Maus nicht der Fall ist. Der Versuch an der weißen Maus erscheint darum nicht nur empfind- licher, sondern auch beweiskräftiger als derjenige am P'roscli. 3. Wertbestimmimg von Schilddrüsenpräparaten. Eine interessante Methode zur Wert bestimm ung von Schild- drüsenpräparaten ist von BeklHunt^) ausgearbeitet worden. Sie ba- siert auf der Beobachtung, daß weiße Mäuse, die mit wirksamer Schild- drüsensubstanz einige Zeit gefüttert wurden, gegenüber der \'ergiftung mit Acetonitril eine außerordentlich gesteigerte Resistenz bekommen. Bezüglich der Ausführung der Methode muß auf die Originalarbeiten des genannten Autors und die Nachprüfung derselben durch F. Trendeleubunj -) verwiesen werden. Kaninchen. . Kaninchen ^) sollen hier in ihrer \'erwendung zum Nachweis des Ki- cins und zur Wertbestimmung von Fiebermitteln besprochen werden. Man hält die Tiere während der Versuche in trichterförmigen Blechkästen (Fig. 64) mit doppeltem Siebboden, unter die ein (JefiU) zum Auffangen des Harns gestellt wird. 1. Der Nachweis von Ricin. Will man die Lösung einer Substanz, welche im \'ersuch am Blute (s.d.) Agghitinationswirkung gezeigt hat, als llicin charakterisieren, so muß ihre (Giftigkeit durch subkutane Injektion am Kaninchen erwiesen werden, da auch ungiftige auf gleiche Weise wie das Hicin, und zwar aus Bohnen dargestellte Träparate, die sogenannten l'hasine, auf rote Blut- körperchen stark agglutinierend wirken, sich aber vom Kicin, Abrin etc. durch geringe Giftigkeit am Kaninchen unterscheiden. IJicin tötet Kanin- chen noch in Mengen von Ol 712^" pro Kilo Tier und darunter [Kobert*), während von Phasiu selbst Dosen von 10 /jj.ij unwirksam sind. *) li'rid Hunt and Atherthon Seidel!, Studios on Thyroiii. HyLnciiic Laboratory Bulletin Nr. 47. Washington 1909. ^) /'. Tretulelcnhurfi, ülior (Ion Xiicliwcis toxischer Stoffe im Hliitc thyreoidekto- mierter Tiere. Biochem. /eitsciir. Bd. 29. 8. H9() (l'.lloi. ^) U.Gerhardt, Das Kauinciien. Leipzig 1910. — A. Srhumaun, Das Kaninchen. Stuttgart (s. a.). *) R. Kohert, Kini^e Notizen iilu r die Bcdoutunv' und ih'U Idologischen Nachweis von veufotahilischen Agirlutininen und Hiimolysinen. Die Landwirtschaft!. Versuchs- stationen. Berlin. Bd. 71. S. 258 (1909). 118 H. Füll 11 er. Zur Prüfung auf Ricin wird die Lösung einem Kaninchen subkutan Prüfung der Fig. 64. unter die Ptückenhaut injiziert, in der weiter unten, bei der Fiebermittel, beschriebenen Weise. Bei Injektion größerer Ricinmengen (etwa 1 mg pro Kilo Tier) beobachtet man nach Fr. Müller'^) folgende Erscheinungen: In den ersten 12 — 14 Stunden verhält sich das Tier durchaus normal, nimmt Nahrung zu sich und scheidet Harn in gewohnter Menge aus. Nach 24 bis oO Stunden tritt die tödliche Giftwirkung plötzlich hervor. Das Tier fällt um, kann allgemeine Krämpfe zeigen, liegt dann bald schlaff auf Bauch oder Seite und kann sich nicht mehr aufrichten. Krämpfe können noch wiederholt auftreten, werden aber allmählich schwächer und etwa I/o Stunde nach dem ersten Anfall tritt der Tod ein. Doch kann auch der Tod ohne Krämpfe nach vorausgehender kurzer Atemnot und bald einsetzender schlaffer Lähmung des Tieres eintreten. In den letzten Lebensstunden zeigen sich häufig profuse Diarrhöen. Erhö- hung oder Verminderung der wirk- samen Dose des Ricins ist nur von Einflul) auf das Stadium der Inku- bation, d. h. das Stadium vor dem Einsetzen der akuten Erscheinungen. Dieses kann bei geringen Dosen mehrere Tage andauern. Bei der Sektion des verendeten Tieres ist als charakteristisch für die Ricinvergiftung besonders der Befund von selten des Darmes anzusprechen. Hier finden sich viele Blutungen, dann besonders auffallend Schwellung und Rötung der Pei/erschen Pla(i[ues. Da- neben findet man Schwellung und Rö- tung der retroperitonealen Lymphdrüsen. Für die lokale Wirkung des Ricins ist dann noch typisch die sulzige Nekrose des Gewebes, welche sich an der Injektionsstelle unter der Rückenhaut ausbildet. Kaninchen trichter. 2. Wertbestimmung von Fiebermitteln. Nach der von 21. Kiliani -) ausgearbeiteten ^lethode verfährt man in der Weise, daß man am Kaninchen durch subkutane Injektion steriUsierter Kulturen von Bacterium coli Fieber erzeugt und dieses Fieber durch *) Fr. Müller, Beiträge zur Toxikologie des Ricins. Arch. f. exp. Pathol. u. Phar- makologie. Bd. 42. S. .30.5 (1899). '-) M. Kiliani, Piiarmakologische Wertliestimmimg der technischen Fiebermittel. Arch. internatiou. de pharmacodyn. et de therapie. T. 20. p. 333 (1910). Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. 119 Fig. 66. Eingabe dor zu prüfondou Substanz h('ial)zuilriick(Mi .sucht wobei die Wir- kung derselben mit derjenigen von in ihrer Wirkung bekannten Ki<-bfM- mitteln, wie Antipyrin oder I'vramidon. vergHchen wird. Herstellung der Bakterienkultur. Eine niindesten.s 3 — 4 Wochen in einem auf SO—))!" (nicht höher!) eingestellten Thermostaten gewachsene ('oli-Iiouillonkultur filtriert man durch ein Ton-(Pukal-)fiiter. L)er Uiickstand der Filtration >Yird vom Filter abgeschal)t, in der zu feiner \erteilung eben genügenden Glyzerinmenge im Achatmörser gut verrieben und eine Viertelstunde bei etwa 100" erhitzt, was einmal Sterilisierung und zweitens AufschlieÜung der liakterienleiber, welche die Hauptmenge des Fiebergiftes enthalten, bezweckt. Die Fieber er Zeugung am Kaninchen geschieht durch sui)kutane Injektion dieser Bakteriensuspension, und zwar erhalten davon Tiere unter 1500 rieusaspeiision im 40 cm^ Kolibouillonfiltrat. Injektion bei +. (Nach Kiliani.) Antipvretika können unter den angegebenen Bedingungen dauenuk' Ent- fieberung der Tiere bewirken. /n" f2 Fig. CS. « G S fO 4/^ 6*0 39' + + x 1 ^-^ k--' \ /• , + ^^\ ^ y w 'tO' 39° Kaninchen von IÖ5O3. I-ieber durcb Injektion wie oben ( + 1. liei -j — f- üubkntaue Injektion von 0'05<7 Pyramidon. Wirkung: Vorübergehende TeinporatursenkuDg. (Nach Kilinni.) Auf die voraussichtliehe Wirkung einer am Kaninchen gcjjrüften Substanz beim fiebernden Menschen ist vor allem ans dem N'cr^ucli bei innei'licher Darreichung ein lliickschluC» möglich. Mensch. Auf die (legenwart einer Anzahl von (üften kann der rnter>ucher im Verlaufe einer toxikologischen Analyse, nanu'ntlich bei N'ornahnie von l)e>tillati()nen. schon durch eigentümliche (;eruciis(|ualitäten mancher Gifte aufmerksam werden. Hierher gehören Substanzen, wie Chlor. Drom. Jod. Phosphor, P)lausiiure. Alkohol, .\tlier. Chloroform, Jodo- 122 H. Füll n er. form, Phenol und Kresole, Nitrobenzol, Anilin, Pyridin, Piperidin, Chinolin und von Alkaloiden namentlich Coniin und Nicotin. Sehr wichtig zur Erkennung vieler Substanzen ist ihre Prüfung auf der Zungenspitze. Durch bitteren Geschmack machen sich Strychnin, Brucin, Chinin, Colchicin, Pikrotoxin, Pikrinsäure bemerkbar, während Cocain und ihm in der Wirkung nahestehende Produkte durch Lähmung der sensiblen Nervenenden Gefühllosigkeit hervorrufen, Aconit in und Veratrin dagegen durch deren Erregung ein Gefühl des i3rennens erzeugen. Der Nachweis hautreizender und namentUch blasenziehender Sub- stanzen, wie in erster Linie des Cantharidins, geschieht am besten am eigenen Körper. Man löst dazu den zu prüfenden Piückstand in Avenig heißem Mandelöl, tränkt damit ein Stückchen Watte und befestigt dies an einer empfindlichen Stelle der Brusthaut oder des Arms mit etwas Heftpflaster. Noch durch 1/10 mg Cantharidin kann Blasenbildung, durch geringere Mengen Hautrötung hervorgerufen werden. Gleichzeitige Anbringung eines zur Kontrolle nur mit Öl getränkten Wattebausches ist empfehlenswert. Versuche am Menschen kommen weiterhin vor allem dann in Frage, wenn es sich um den Nachweis kleiner Mengen von Giften handelt, die, wie Physostigmin und A tropin, durch ihre Beeinflussung der Pupillen- weite (vgl. die Angaben beim Froschauge) charakterisiert werden können. Am wichtigsten und zugleich am empfindlichsten ist der Nachweis des A tropin s und der ihm nahestehenden Alkaloide Scopol am in, Duboi- sin etc., welche das Atropin zum Teil noch an Wirksamkeit übertreffen. Zur Prüfung am Menschenauge muß der aus organischem Material gewonnene Piückstand weitgehend gereinigt sein, namentlich darf derselbe nicht sauer, eher etwas alkalisch, gegen Lackmus reagieren. Zur Prüfung werden 2 — ?> Tropfen einer wässerigen Lösung mit Pipette oder Glasstab in den Bindehautsack des einen Auges gebracht, während das zweite Auge der Kontrolle dient. Natürlich muß man sich vor Anstellung des Versuches von der Pupillengleichheit bei der Versuchsperson, am besten durch Mes- sung, überzeugt haben. Nach ein und zwei Stunden untersucht man, ob Pupillendifferenz vorhanden ist. Schwache Grade können nur durch Mes- sung festgestellt werden. Nach Feddersen ') tritt am gesunden Menschen- auge noch durch 1 — 2 zebiitauseiulstel Millis;T}Uiim Atropin erkennbare Pupillenerweiterung auf. Von quantitativen Bestimmungen des Wirkungswertes von Arzneimitteln, die in Selbstversuchen vorgenommen werden können, sei hier eine von H. Braun u. a. 2) ausgearbeitete Methode der vergleichenden ') Zitiert nach J. Krattcr, Beiträge zur Lelire von den Vergiftungen. Leipzig 1905. S. 120. '^) Vgl. F. M. Recke, Vergleichende experimentelle Untersuchungen lokalanästheti- scher Mittel. Dissertat. Leipzig 1903. Nachweis unil Bestiiniming von Giften auf hiologiscliem Wege. 123 Wertbestimmunii- lokalanästhesierender Mittel, welche als Ersatz für das Cocain in Betracht kommen, fi:enannt. Übersicht der im Texte erwähnten Gifte in alphabetischer Reihenfolge. Abrin: Nachweis am Blut. Aconitin: Nachweis am pan/en Frosch, am isolierten Frosch- herzen, an der menschlichen Zunge. Adrenalin: Wertbestimmung- der Lösungen am Froschauge, am Gefäßpräparat. Arsenik: Nachweis durch Schimmel- pilze. Atropin: Nachweis am isolierten Herzen, am Froschauge, am Menschenauge. Cantharidin: Nachweis an der menschlichen Haut. Chinin: Wirkung auf Protozoen, Nachweis an der menschlichen Zunge. Cicutoxin: Nachweis am ganzen Frosch. Cocain: Nachweis an der mensch- lichen Zunge. Coffein: Wirkung auf Protozoen, Nachweis am ganzen Frosch, am Froschmuskel. Colchicin: Nachweis am ganzen P'rosch, an der Maus. Coniin : Nachweis am Frosch. Crotin: Nachweis am Blut. ganzen Curarin: Nachweis am ganzen Frosch, am Nervmuskelpräparat. Desinfektionsmittel : Wertbe- stimmung an Bakterien. Digitalinwirkung, Produkte mit solcher: Nachweis am ganzen Frosch, am Froschherzen. Digitalisblätter und -i>räpa- rate: Wertbestimmung am ganzen Frosch. Fiebermittel: Wertbesti am Kaninchen. mmung Guanidin: Nachweis am ganzen Frosch, am Froschmuskel. Lokal an äst he tica : Wertbestiin- mung an der menschlichen Haut. Methyl guani diu vgl. (iuanidin. Muscarin: Nachweis am ganzen Frosch, Nachweis und Bestim- mung am isolierten Herzen. Nicotin : Nachweis Frosch. am tran/en Physostigmin : Nachweis am Froschauge, am .Menschenauge. Pikrotoxin: Nachweis am ganzen Frosch. Pilocarpin: Nachweis am Frosch- auge. 124 H. Fühner. Nachweis und Bestimmung von Giften auf biologischem Wege. Ricin: Nachweis am Blut, am Ka- ninchen. Saponin: Nachweis am Blut. Schilddrüsenpräparate : Wert- bestimmung an der Maus. Scopol am in: Nachweis am Frosch- auge, am Menschenauge. Solanin: Nachweis am Blut. Strophanthin vgl. Produkte mit Digitalinwirkung. Strychnin: Nachweis am ganzen Frosch, an der Maus. Theobrom in vgl. Coffein. Tierische Gifte: Nachweis am Blut. Veratrin : Nachweis am ganzen Frosch, am isolierten Skelettmus- kel, an der menschlichen Zunge. Methoden zur Bestiiiimniii»- des lUiitdrucks. \'oii ErwiiJ Rohde, lleidulberg. Wenn wir von Blutdruckmessung schlechtweg sprechen, so meinen wir die Messung des arteriellen Drucks, und zwar des Seitendrucks in den großen Arterien des Körpers. Auch bei der unblutigen Blutdruckmessung am Menschen , für die derzeit eine Reihe von Methoden ausgebildet sind, sucht man den Druck in einer möglichst grol'ien Arterie, und zwar am Oberarm zu i)estimmen. Der Biochemiker dürfte kaum in die Lage kommen, diese kUnischen Methoden am Menschen anzuwenden : hingegen fällt es noch in das Grenzgebiet l)iochemischer Untersuchungen, sich im Tier- experiment gegebenenfalls selbst über die Wirkung chemischer Substanzen auf die Kreislaufsverhältnisse orientieren zu können. Alle gröberen Kin- wirkungen auf den Kreislauf führen zu Veränderungen des Aortendrucks, Wir erschUeßen deshalb Kreislaufswirkungen der Substanzen zunächst aus dem Blutdruckversuch, in welchem man eine Messung des Aortendrucks mit einer exakten Schreil)ung der rulsfre(iuenz verbindet unti zugleich ein Urteil über die Qualität des Herzschlages gewinnt; duich Keizung der Herz- und Gefäßnerven und durch andere experimentelle Kingriffe während des lUutdruckversuchs ergibt sich eine nähere Analyse der Kreislauf.s- änderung. Eine kurze Darstellung der Methoden , die sich den /wecken des Biochemikers entsprechend auf eine erste Orientierung beschränkt, mag deshalb auch in diesem Handbuch am Platze sein. Sie soll dem Bio- chemiker praktische Winke für die Anstellung eines Blutilruckvcrsuches geben und durch eine Besprechung der gei)räuchlichsten Itegistiicrapparate und ihrer Leistungen die Wahl des für den betreffenden Fall geeigneten Apparates erleichtern. Verbindet man mit dem blutdruckregistrierenden Apparate eine vmU ständig in die Karotis eingeführte Kanüle, so mißt man. da dieses Gefäß fast rechtwinklig aus der Aorta entspringt, den Seitendruck in diesem Haupt- stamm des Gefälibaumes. Der Aortendruck hängt bekanntlich von der in der Zeiteinheit vom Herzen in das (iefäß.^^ystem beförderten Blutmenge, dem Zufluß der Aorta, und andererseits vom Abfluß, d. h. von den Wider- ständen der kleinen Arterien ab. Die bei der Tätigkeit der Organe stets 126 E. Roh de. wechselnden, durch lokale Gefäßerweiterung oder Gefäßverengerung ver- änderlichen AViderstände in den einzelnen Gefäßprovinzen werden durch kompensatorische Verengung oder Erweiterung anderer Gefäßprovinzen leicht ausgeglichen , solange sie sich in physiologischen Grenzen halten. Aber auch darüber hinausgehende Veränderungen vermag der Organismus auszugleichen, wenn sie nicht allzu große Gefäßgebiete betreffen, so daß lokale Kreislaufstörungen noch keineswegs auf den Blutdruck in der Aorta zurückzuwirken brauchen. Sie müssen durch Pleth3'smographie und andere Methoden festgestellt werden. Auch Änderungen des Gesamtwiderstandes im Gefäßbaum werden zunächst durch Änderungen der Herztätigkeit. Änderungen der Herztätigkeit durch Veränderungen der Vasomotion kom- pensiert. Erst wenn diese Regulationseinrichtungen des Kreislaufes nicht mehr hinreichen, kommt es zu Veränderungen des mittleren Druckes in der Aorta. Abweichungen von dem normalen Mitteldruck in der Aorta weisen sonach schon auf weitgehende Störungen des Kreislaufes hin. Es ist begreiflich , daß die richtige Deutung aller für den Zustand des Kreis- laufes im Blutdruckversuch gewonnenen Anzeichen eigentlich die gesamte Kreislaufsphysiologie zur Voraussetzung hat. Zur Vorbereitung des Blutdruckversuches gehören die Instandsetzung des Apparates . die Narkose und Präparation des Tieres und die Ver- bindung der Karotis mit dem Blutdruckapparat. Heftige Muskelbewegungen des Tieres verändern den Blutdruck ; des- halb erleichtert die Immobilisierung den Versuch. Auch hiervon abgesehen wird man aber die Versuchstiere , wenn es der Versuch irgendwie erlaubt, zu narkotisieren wünschen. Hierfür sind aber nur solche Mittel verwendbar, die die Kreislaufsverhältnisse nicht selbst wesentlich verändern. Für die Kaninchen entspricht das Urethan dieser Anforderung. Es wird am besten etwa V2 Stunde vor i\.nstellung des Versuchs in der Dosis von 1 — V/29 pro Kilogramm in lO^'oiger Lösung mit der Schlundsonde in den Magen der Tiere injiziert. Auch andere, für den Kreislauf unschädliche Substanzen der Alkoholgruppe, wie der Bromisovalerianylharnstoff (Bromural) oder das Bromdyäthylazetamid (Neuronal), können Verwendung finden. Hingegen beeinflussen narkotisierende (xaben von Chloralhydrat den Kreislauf in allzu störender Weise. Für Katzen ist die Äthernarkose wohl das brauchbarste Verfahren. Für Hunde wird meist die Kombination von Morphin mit nach- folgender Äthernarkose benützt ; Chloroform ist wegen seiner starken Kreis- laufwirkung ausgeschlossen. Das Morphin muß dabei in einer Gabe von etwa 7 — Hmg pro Kilogramm einige Zeit vor Anstellung des Versuchs sub- kutan injiziert werden. Die so vorbereiteten Tiere sind dann der Äther- narkose leicht zugänglich, doch hat das Morphin den Nachteil, das Vagus- zentrum zu erregen und eine bedeutende Pulsverlangsamung besonders am Hund hervorzurufen; schon dies beweist, daß der Kreislauf nach solchen Morphingaben keineswegs normal ist. Keines der üblichen Narkotika ist demnach völlig einwandfrei. Dies gilt insbesondere für die Versuche an Hunden und Katzen. Feinere Pteak- Methoden zur Bestimmung des Blutdrucks. 1 «>~ tionen der Herz- und Gefäßnerven, z. B. die Wirkung' des Nerv, depressor. Averden mehr oder weniger durch alle Narkotika i^estört. Es l)leil)t sonach nichts ül)riii-. als die am narkotisierten Tier beobachteten P'.rsclu'inun^M'n auch an dem knrarisierten Tiere zn kontrollieren. Die l)ei den enfjUscht-n Physiologen übliche Dezerebriernng (Abtreiniung des (irollhirns vom Hirnstanim) setzt erst recht pathologische Verhältnisse für den Kn'i>laiif. so gut diese Methode für andere Zwecke brauchbar sein mag. Auch die Kurarisierung nml> vorsichtig und nur mit den eben wirksamen Gaben durchgeführt werden. Schlechte Kuraresorten, welche neben den auf die motorischen Nerven wirksamen Kurarinen auch sogenannte Kurine ent- halten, schädigen gleichfalls den Kreislauf. Das sogenannte ("urarilM. die Lösung eines guten und auf gleichmäbige Wirksamkeit eingvstcllten. wenn auch noch unreinen Kurareextraktes wird deshalb den Experimentatoren ein erwünschtes Hilfsmittel sein. Man injiziert das Kurarepräparat intra- venös, bis die Reizung des bloßgelegten Ischiadikus unwirksam wird, respek- tive bis die spontane x\tmung aufhört. Nach Einleitung künstlicher Re- spiration durch eine Trachealkanüle ist der Blutdruck sehr regelmäßig. Die Kurarisierung hat aber den Nachteil, daß das Verhalten der Respiration und. des Bewegungsapparates während des I'lutdruckversuches nicht gleich- zeitig beobachtet werden kann. Ist das Versuchstier durch ein Narkotikum oder Kurare immobilisiert und aufgebunden, so wird die Karotis freigelegt, ihr peripheres Ende ligiert. das zentrale mittelst einer Klemmpinzette abgeklemmt und in das so isolierte Stück eine passende Glaskanüle in der Richtung nach dem Herzen eingeführt. ]\Ieist werden auch die Gefäß- und Herznerven zum Zweck ihrer Funktionsprüfung im Versuche isoliert und auf Fäden gelegt. Die Kanüle und ihre Verbindung zu dem blutdruckschreibenden Apparate muß mit einer gerinnungshemmenden Flüssigkeit gefüllt werden. Als solche sind verschiedene Flüssigkeiten empfohlen. Für Hunde und Kaninchen ist eine ca. 25%ige Magnesiumsulfatlösung sehr geeignet. Für Katzen ist dieses Salz aber besonders giftig, so daß schon der Übertritt geringer Mengen der MagnesiuraKisung bei fallendem Blutdruck zu schwerer Kreislaufschädigunu^ führt. Für Katzen, alier auch sonst für alle Versuche, in denen größere Blut- druckschwankungeu zu erwarten sind, sind deshalb gesättigte Natriumkar- bonatlösungen respektive Bikarbonatlösungen, die nach langem Stehen wahr- scheinlich IVofach kohlensaures Natron enthalten, vorzuziehen. Ein (iemisch des einfach und doppelt kohlensauren Salzes: auf 4 / Wasst'r lS6_f/ Natrium- bikarbonat und 286y Natriumkarbonat ist geeignet. Will man mit Sicher- heit die Störung des Blutdruckversuches durch Gerinnung verhindern, so ist es noch zweckmäßig, etwas Blutegelextrakt in die Karotiskanüle zu bringen. Hierfür steht derzeit der durch Jacobj-') in eine relativ reine und konzen- *) Curaril I und II. Chemische Werke vorm. Dr. Heiurioh Hvk. Berlin. -) Franz, tJber den die Blutirerinnunir aufhebenden Bestandteil des niediziii'«-'"" Blutegels. Archiv f. exp. Path. u. Pharm. IL. S. 342. VMS. 128 E. Rohde. trierte Form gebrachte Bestandteil des gerinnungshemmenden Blutegel- extraktes , das Hirudin , zur Verfügung. 1 mg des Präparates verhindert die Gerinnung von l-bcm^ Blut. Zur Messung und graphischen Registrierung des Blutdruckes dienen das Manometer und das Kymographion. Während über die Kymographien wenig zu sagen sein wird, weil ihre Konstruktionen im wesentlichen den praktischen Anforderungen genügen, müssen wir der Besprechung der Manometer einen größeren Platz einräumen, da bei der sehr verschiedenen Güte der einzelnen Instrumente nur eine richtige Handhabung und Kritik brauchbare Piesultate ergeben kann. Zunächst sollen die Kymographien, dann erst die Manometer be- sprochen ^Yerden. weil zum Verständnis der Kurvenbilder im Kapitel über Manometer die Kenntnis der Schreibflächen gehört. Das Kymographion. Die Aufzeichnung der vom Manometer wiedergegebenen Blutdruck- schwankungen geschieht an einer bewegten Fläche, und zwar entweder durch Ptuß- oder Tintenschreibung auf Papier oder durch photographische Fixierung eines Lichtpunktes. ]\Ian erhält so Kurven, deren Abscissen die Zeit, deren Ordinaten die Druckwerte darstellen. Nur die Papierregistrierung soll hier besprochen werden; über die photographische Registrierung siehe die ausführhche Darstellung in Tiger- stedts Handbuch der physiologischen Methodik. Bd. I. 1. (Leipzig. Verlag von S. Hirzel. 1910.) Das gebräuchhchste Kymographion ist das Ludivig-BaUzarsdie Kymo- graphion; seine Schreibfläche befindet sich auf einer mit Papier umklebten Trommel, die durch ein Uhrwerk in Rotation gesetzt wird. Die Umdre- hungsgeschwindigkeit kann durch Wechselräder beliebig verändert werden; sie variiert etwas nach der Federspannung und muß deshalb stets durch eine gleichzeitige Zeitschreibung kontrolliert werden. Das Papier wird nach dem Aufkleben auf die Trommel gleichmäßig und nicht zu dicht über einer leuchtenden Gasflamme berußt, nach dem Versuch abgeschnitten und die Kurve in verdünntem Spirituslack (V'3 des käuflichen Präparates in 2/3 ab- solutem Alkohol) fixiert. Für vertikale Schreibung , z. B. für den Schwimmer des Hg-Mano- meters ist diese Trommelschreibung ohne weiteres brauchbar , für Bogen- schreibung dagegen, wie sie sich bei den meisten elastischen Manometern findet, stellt die zylindrisch gekrümmte Trommeloberfläche, zumal bei größereu Exkursionen, eine Fehlerquelle dar wegen der wechselnden Stärke der Anlagerung. Für manche Versuche ist deshalb eine der neueren Kon- struktionen vorzuziehen, bei denen ein längerer berußter Papierstreifeu um 2 Trommeln läuft und eine ebene Fläche zur Schreibung besitzt (Schleif en-Kym ographi on ) . Für die großen und trägen Exkursionen des Quecksilber-Manometers haben sich Kymographien mit endlosem Papier und Tintenschreibung gut Methoden zur Bestiminiiii'' des Blutdrucks. 129 bewährt. Das weiße Tapior wickelt sich von einer Trommel ab, zieht in ebener Fläche am Schreiber vorbei und wird von einer zweiten Trommel aufgewickelt: der Schreibei- ist an der Spitze des Schwimmers befestigt und wird mit roter Tinte Cmit 2/3 Wasser verdünnt) beschickt. ff 11 Fig. 69. \ PaB Kymoffr:iphioii. nach Lutiwiij »ind Paltzar. ' ,. Zur Zeitschreibun«^' benutzt man ciifweder ein käufliches ,t:raplii- sches Chronometer nach Ja([uet '), welches 1 und ' V, Sekunde zu mar- kieren erlaubt oder aber ein elektrisches Si'*) und neuerdint^s namentlich (h'n eiiifiolicnden theoretisch-experinu'ntdU'n Arbeiten 0. Franks. •') Frank- kam bei seiner Analyse zu dem Resultat, dall bei den schnollen I)riicksch\vai)knnp:on des Kreislaufes neben einer \iq- nüj^enden ilmpfindlichkeit dos Instrumentes vor allem eine hohe Zahl der Eigensclnvinj^ungen für die Güte eines Manometers mal,')!i;ebend ist. und zwar aus folgenden Gründen: das Schädigende für die Druckregistrierung sind die Trägheitskräfte des Manometersystems; sie sind abhängig von der Größe der ..wirksamen Masse". Diese Größe läßt sich — nach Frank — nun nicht nur berechnen, sondern auch experimentell messen durch He- stimmung der Schnelligkeit der Eigenschwingung: je größer die Zahl der Schwingungen in der Zeiteinheit ist. desto kleiner ist die wirksame Masse, desto kleiner die zur Geltung kommenden Trägheitskräfte, um so genauer folgt also das Manometer' den zu messenden Druckschwankungen und um- gekehrt kann man aus einer kleinen Schwingungszahl auf eine geringe Güte des Manometers schließen. Die Verbesserungsbestrebungen Franks gingen deshalb in erster Linie darauf hinaus, die wirksame Masse soweit zu verkleinern, daß bei möglichst hoher Schwingung.szahl eine möglichst geringe dynamische Entstellung der Kurve resultierte.*) Im folgenden soll der historischen Entwicklung gemäli zuerst das Quecksilbermanometer und dann das (iummi- und Federmanometer be- handelt werden, zuletzt sollen an Kurvenbildern, die gleichzeitig mit beiden Manometern aufgenommen sind, die theoretisch entwickelten Leistungs- differenzen auch experimentell veranschaulicht werden. Quecksilber-Manometer. Das älteste und auch heute noch gebräuchlichste Blutdruckmanometer ist das Ludwigsche Quecksilbermanometer; es besteht aus einer l'-förmig gebogenen Ilöhre von (Yö cm Durchmesser, das zur Hälfte mit Hg gefüllt 1) Fick, Ein neuer Wollenzeicliner. Ges. Schriften. III. S. 593 und 608. 1877. -) Hürthlc, Beiträge zur Hämodynauiik. Pffii;/rrs Arciiiv. 43. S. :i99. 1888: 47. S. 1. 1890: 49. S. 29. 1891: 55. S. 319. 1893. — VWr die Leistung des Tonograplien. Ibid. 82. S. .j15 1900. ^) (). Frank, Kritik der elastischen Manometer. Zeitschr. f. Biologie. 44. S. 44''>. 1904. — Theorie des Kolln'iimanometors. Iliid. 45. S. 40.'). 19U4. — Der l'uls in den Arterien. Il)i(l. 46. S. 441. 1905. — Statik der .Menilirannianonieter untl der Lufttrans- raissiou. lliid. 48. S. 489. 190(). —Dynamik der Mcmliranmannmeter und der Lnftfrans- mission. Il)id. 50. S. 309. 1908. 'l .\nf die experimoutpllcu und theoretischen Kiuwaudc, die neuerdiiii:s \un Ilin-tliU und Sciuifer {lliirthlv, Betrachtungen über die tlK'orctisciien und praktisolien Bestrebungen, Instrumente zur Registrierung der im Kreislauf auftretenden Dnick- schwankungen lierzustellen etc.; /'//»Vr/<'/-.s Archiv. 137. S. 145 ff.; VI. Schaf, r. Kritische Randglossen zu den theoretischen Untersuchungen von <>. Frank über Manometer. Ibid. 137. S. 250, 1910) gegen die /V«/enähert richtii^e Wiederi>abc des mittleren I>lutdruckes betrachtet werden darf. Aber auf die Messung dieses mittleren Blutdrucks kommt es ja bei biochemiscluMi Arbeiten hauptsächlich an . wenn von einer Substanz ein Eintiuij auf die Höhe des lllutdrucks festgestellt werden soll. Der für die praktische Verwendung nicht zu unterschiitzende \ (»rteil dieses Manometers ist der, daß seine Empfindlichkeit, wenn man fürKcin- heit des Quecksilbers sorgt, fast unverändert ») l)leil)t, dall es keiner Aichung bedarf, daß man vielmehr von der Abszissenlinie aus die Druckhöhe direkt mit dem Zentimetermaß abmessen kann'-), endlich daß bei zwei iil)er- einander geschriebenen Kurven die Punkte gleicher /eitmomente stets in derselben Ordinate liegen. Die Leistungsfähigkeit des Quecksilbermanometers ist nach dem be- sagten nur eine recht beschränkte, sie versagt ganz, wo schnellere Druck- schwankungen aufgeschrieben werden sollen, so daß es nur zu einer An- deutung der einzelnen Pulse kommt : al)er auch bei langsameren Druck- schwankungen können durch Interferenz beträchtliche Entstellungen selbst des mittleren Blutdrucks entstehen. Schon Mare// hat deshalb durch Dämp- fung, d. h. durch Einschaltung eines Ileibungswiderstandes an irgend einer Stelle zwischen Arterie und Manometer eine Verbesserung des Hg-Mauo- meters versucht; in der Tat gelingt es durch vorsichtige Ik-nutzung dieses Hilfsmittels, die Wirkung der Eigenschwingung fast ganz zu beseitigen. Die erhaltenen Kurven entsprechen nach der heutigen Anschauung ziem- lich genau dem mittleren Blutdruck. =^) Man bringt zu diesem Zwecke. z.B. an der Schlauchverbindung zwischen Arterienkanüle und Verbindungsrohr, eine Schraubklemme an und zieht sie vorsichtig so weit an. daß die Atem- schwankungen fast verschwinden und die rulsschwankungen noch eben notiert werden. Zieht man die Schraube noch stärker au. so verschwinden auch diese und die Notierung des mittleren Blutdrucks ist natürlich noch etwas genauei" doch dürfte dies kein Vorteil gegenüber dem \'erlust der Pulsaufzeichnung sein. Ein Nachteil dieser Dämpfung macht sich aber bei größeren Schwankungen des mittleren Blutdrucks geltend: durch die schmale Dämpfungsöffnung gleicht sich nämlich der Druck durch Flüssigkeitsver- schiebung nur so langsam aus. daß die Kurve zeitlich immer etwas hinter der wahren Druckschwankung zurückbleiben und die wahre (rröße einer Schwankung um so kleiner angeben wird . je schneller diese zur Norm zurückkehrt (vgl. Kurve III, S. loS). ^) FfiirfJih', Sficlis' und lÜetncnin, Vorfjloich des mittleren Blutdrucks in K.ip'ii>. und Krurulis. l'ßiUjers Archiv. CX. S. 421. 1*JÜ5. -) Natürlich unter \'erdopplung der erhaltenen Werte. ^) Frank, loc. cit. — r. Kriis, Cher die BestimnuniL' de> Mitteldrucks durch das (^uecksilbernianonieter. I)>t liois-hcytuoiids Arciiiv f. riiysinl. 1878. S. 41'.>. 134 E. Rohde. Elastische Manometer. Wie man sieht, verzichtet man bei Benutziinsi- des Quecksilbermano- meters auf eine genaue Schreil)ung von Form und Verlauf jedes einzelnen Pulsdruckes wie der Atemschwankungen ; stellt man die Forderung, auch diese richtig darzustellen, so muß man ein Manometer mit kleinerer wirk- samer Masse benutzen, deren Trägheit so gering ist, daß ihre Eigenbewe- gungen den wahren Druckablauf nur unmerklich entstellen. Eine solche Leistungsfähigkeit besitzen die elastischen Manometer; bei ihnen wird die Elastizität von Gummi, von Metall oder einer kleinen Luftblase als Gegenkräfte benutzt. Fick^) war (1877) der erste, der im Federmanometer ein solches Instrument konstruierte; auf seinen genaueren Bau wollen wir hier nicht eingehen, da es in der alten Form verlassen ist und in seinen Prinzipien weiter unten beim Fra«Ä:schen Federmanometer be- schrieben werden wird. Zuvor sollen vielmehr die in den meisten Labora- Fig. 71. Elastisches Manometer, nach Härthle-Gad. c die elastische Membran, n die Schi-eibfeder. b Schreiber der Nullinie, l Leitungsrohr zu dem Blutgefäß. torien heute gebrauchten Manometer von Hürthle-) (Tonometer 1888) und Gad-Coivl^^ *) (1890) besprochen werden. Beim Hürthlescheiü Tonometer ist eine kleine mit Wasser gefüllte Manometerkapsel verschlossen durch eine straff gespannte Gummimembran von nur 7 nun Durchmesser (oder noch weniger); die Manometerkapsel ist durch eine möghchst kurze wasserge- füllte Piöhre mit der Arterie verbunden. Die auch bei hohen Drucken nur sehr geringen Ausbuchtungen der Gummimembran werden mittels eines Hebels vergrößert aufgeschrieben; im Gad-Coivlsdieji Apparat ist an die Stelle der Gummimembran eine kleine, kreisförmig gewellte Blechplatte ') Fick, Ein neuer Wellenzeichner. Ges. Schriften. III. 593. 1877. ^) Hürthle, Beiträge zur Hämodynamik. Pflngers Archiv. 43. S. 399. ^) Gud, Zentralbl. f. Physiol. 1889. S. 318.' ^) Coicl, Ül)er Blutwellenzeichner. Arch. f. Anat. u. Physiol. 1890. S. 564. Methoden zur Bestimmuiifj des Blutdrucks. ];-»fj gesetzt. Gegenüber doni Quecksilhornianometcr hodouteten diese Instru- mente einen großen Fortscliritt ; konnte iiinii doch mit ihnen die jjrrolien Dnickschwanknngen feststellen, die diii-ch jede Ilerzkoiitraktion im (lefiUi- system liervorgeriit'en werden, den soi^enaniiten Pulsdnick, den man nach den Erfahrungen am Hg-Manometer nur für relativ unbedeutend gelialteu hafte. Neuerdings sind nun diese Verbesserungsbestrebuugen weiterhin ganz bedeutend gefördert worden durcli die Arbeiten Franks. Zur weiteren Ver- ringerung der wirksamen Masse setzte er im (»pti.schen .Manometer') an Stelle der Hebelschreibung eine Spiegelvorrichtuiig, welche die Exkursionen einer Gummimembran durch Ablenkung eines Lichtstrahls photograi»hisch zu registrieren erlaubt. Da diese Spiegelschreii)ung als fast masselos zu betrachten ist und auch eine weitere Verkleinerung der wirksamen .Masse durch geeignetere Konstruktion der llühren und der Manometerkapsel erzielt wurde, so konnte eine Schwingungszahl des Instrumentes von 18()/Sek. erreicht werden ; mit einer so geringen Trägheit dürfte dies Manometer allen pruckschwankungen des Kreislaufes gerecht werden ; seine Güte ist etwa ISOOmal größer als die des Hg-Manometers. Vorzügliche Resultate scheinen auch BnyUss und Star/in;/'^) mit der Photographie der \'oIumschwankungen einer kleinen in einer Glaskapillare eingeschlossenen Luftblase gehabt zu haben; die Kapillare ist auf der einen Seite geschlossen, auf der anderen Seite mit der Arterie durch wasser- gefüllte Piöhren verbunden. Die Benutzung dieser letzteren Modelle ist jedoch zu umständlich, als dali sie für den praktischen Gebrauch in Betracht käme; unter \'erzicht auf eine solche extreme Güte hat deshalb Frank neuerdings ein Federmauo- meter^i) konstruiert, dessen Schwinuungszahl 50/Sek. beträgt und das bei einer Empfindlichkeit von 1 cm Hebelausschlag pro 100 nun Hg-Druck noch immer öOOuial besser ist als das Quecksilbernianometer. Es hat prak- tisch den großen Vorteil der Hebelschreibung auf berußtem Papier, so dali seine Handhabung eine relativ sehr einfache ist. Seine Güte reicht, wie Ver- gleiche mit dem weit besseren optischen Manometer ergeben haben, durchaus hin, um die Pulsschwankungen mit genügender Treue aufzuzeichnen. Als Typus eines elastischen Manometers sei es hier ausführlicher besprochen. In der Konstruktion schließt es sich an das von A. Firk*) (ISTT) augegebene. von Hiirt/ile-') modifizierte Federmanometer an, seine einzelnen Teile sind jedoch auf Grund der theoretischen fberlegungen von Frank so gebaut, daß wohl eine für diese Konstruktion maximale Güte erreicht ist. Die Anordnung ist folgende (vergl. Fig. 72): Von der Arterie führt eine Metallkanüle, die durch einen Hahn ver.schließbar ist. vermittelst eines fest anschraubbaren Metallkonus an eine F."» <-ih weite, winklig gebogene (Mas- ') Frank, Ein neues Spiegclmanomoter von liöchster tülte. Zoitsclir. f. Hiol. ").'l. 545, 1910. -) Bai/liss und S/aiiiuf/, Internat. Monatssclir. f. .Vnat. n. ^ll_\^i^ll. 11. S. 420. ^) Frank und Fetter, Ein neues Federmanometer. Zeitsehr. f. Bi• Archiv. 4:i. S 300 1SR8. 136 E. Rohde. Fig. 72. röhre, au deren Ende sich die Manometerkapsel befindet; ihre 0"9 r^^Mveite Öffnung ist von einer Gummimembran mittlerer Spannung- verschlossen; die Köhre selbst ist luftfrei mit ausgekochtem Wasser gefüllt. Auf der Gummimembran liegt von außen eine Pelotte auf, die durch eine Stahl- feder fest angedrückt wird; die Feder ist an ihrem anderen Ende festge- klemmt und kann durch eine Schraube (a) in ihrer Spannung verändert werden. Die Bewegungen der Feder werden durch einen kleinen besonders konstruierten Schreibhebel auf berußtes Papier aufgeschrieben. Die Druckschwankungen im Arterienrohr pflanzen sich also durch die inkompressible Flüssigkeit fort und bewirken durch geringfügige Ver- schiebung der Flüssigkeit (pro 100 ww Hg = 0"6 )iim^) eine Ausbuchtung der Gummimembran und damit eine geringe Durchbiegung der Feder, deren Wert von dem Hebel aufgeschrieben wird ; man gibt der Feder von An- fang an eine solche Spannung, daß der iVusschlag des Hebels für 100)111)1 Hg = 1 ci)t ist. Die elastische Gegenkraft wird bei dieser Konstruktion im wesentlichen (bis 90Vo) durch die Fe- der geleistet , nur zum geringen Teil von der Gummimem- bran, die hauptsäch- lich abdichtende Funktion hat. Vor dem einfachen Gum- mimanometer (Tono- graph,i?//r^A/el888) hat dieses Federma- nometer deshalb den Vorzug der gleich- mäßigen Empfind- lichkeit, so daß man nicht gezwungen ist, vor und nach jedem Versuch eine Aichung vorzunehmen. Die Aichung des Instrumentes geschieht so, daß man zunächst die Abszisse feststellt durch Lösen der Arterienkanüle; dann verbindet man diese Kanüle mit einem Gummischlauch, der sich gabelnd zu einem gra- duierten Hg-Manometer und einer genügend großen luftdichten Spritze oder einem mit Luft gefüllten Gummiballon führt. Durch Einpressen von Luft erhöht man sukzessive den Druck und markiert die Hebelstellung bei verschiedenen Drucken. Ist die Empfindlichkeit des Federmanometers rich- tig eingestellt, so entspricht 1 mm Höhe = 10 ))U)i Hg-Druck. Daß für den praktischen Gebrauch den Vorteilen einer genauen Re- gistrierung Nachteile einer gewissen Umständlichkeit der Handhabung gegenüber stehen, kann nicht weiter wundernehmen. Ganz besonders peinlich ist auf die Fernhaltung von Luftblasen Wert zu legen; sie setzen die Güte des Manometers stark herab. Kopf des Federraanoraeters (nach Frank und Fetter). Methoden zur Bestiminung des Blutdrucks. I37 Dio Benrtcilunii' der Dnicksclnvankmi^cii auf den Kurven ist ferner- hin nicht so leiciit wie hei denen des Hg-Manonieters, (hi kleine Druck- differenzen we^en des jieriniien Ausmaßes nicht so sinnfidh^^ iiervortrcten. Zur genauen Ausmessunj^' (h'r Kurven wird man eines Kurvenanalysa- tors-) nicht enthehren können: es ist dies ein j)iiltfürniif,^er Apparat, auf dem die Kurve hefestijit wird. An ilnn sind hcwe-ilich zwei Malistähe an- gehracht, die mit einer Lupe und Sclirauhen scharf auf die Kurve einj^^cstcllt werden ; auf diese Weise können alle Dimensionen genau ausgemessen werden. Zum Schlüsse seien zum \'ergleich der L('istun;4>l;ihigk('it des Queck- silher- und Federmanometers noch einige Kurven besprochen, die mit beiden Instrumenten gleichzeitig geschrieben sind: besser als Worte werden diese l^ihler die wesentlichsten Untei'schiede ihrer Güte zeigen können. Die Kurven sind in der Weise gewonnen, daß die Karotis eines Kaninchens (T rethannarkose) durch eine T-förmige Arterienkanüle einerseits mit einem Hg-]\Ianometer. andererseits mit einem T^n/^/Aschen Fedennano- meter .verbunden wurde und die Schreiber beider Instrumente möglichst genau üb<'i"einan(ler an ein Kvmographion angelegt wurden ; beide Mano- meter schreiben also von derselben ..Verkoppelungsstelle". Alle Kurven sind von links nach rechts zu lesen; Zeit in '5 Sekunde. Fig. 73. /VVV V •»••«»«Ä»^ Kurve I (F\ix.l3). Normale Blutdruckkurve: 11 g- .Manometer (oben): ii. Nach der Dänipfiniir versclnvindeu die .\tiMn- schwaiikuugen fast ganz. Auch die l'iilse ;w#.^^^NWJ\^^KW^^:^w^^^^ f,j\ni\M\f\K*NWN^' ,sl^^I#W'^^^^^N^'''"^w^^J#Am iiiiM niii iiini I IUI II n Uli L lim w II i i 1 1 1 1 1 1 1 u i u 1 1 1 MI I u 11 11 1 1 1 1 n I 1 1 ' u 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 n 11 1 1 m I m 1 1 n I Kurve III (Fig. 75). Vagusreizung (X); oben: gedämpftes Quecksilbermano- meter; unten: Federmanometer. Kleinen und langsamen Druckschwankungen folgt das ge- dämpfte Hg-Manometer mit genügender Treue, bei großen Schwankungen dagegen bleibt die Kurve infolge der starken Reibung in der engen Dämpfungsstelle hinter dem wahren Druckablauf zurück: sie erreicht den tiefsten Punkt später als das Federmanometer und steigt langsamer an als dieses. Die Größe der Blutdruckschwankung wird zu- dem ganz falsch wiedergegeben : nach der Quecksilberkurve scheint sie nur ca. Ys des Wertes zu betragen, den sie nach der Aufschreibung durch das Federmanometer tat- sächlich erreicht hat. Methoden zur Aufarbeitung des lUutes in seine einzelnen Bestandteile. Von E. Letsclie, Tiihinnon. Die äußere Beschaffenheit des Blutes und die Beohachtunji-. daß es bei ruhigem Stehen und nicht eintretender Gerinnung sich trennt in einf klare, schwachgelb gefärbte Lösung und ein gefärbtes Sediment, lassen es für viele Zwecke geraten erscheinen, diese beiden Teile getrennt für sich zu untersuchen. Da al)er das Blut ja je nach den rmständon — Tierart, Temperatur, Sauerstoff- und Kohlensäuregehalt usf. — nach dem \'erlassen der Gefäße rascher oder langsamer gerinnt, so ist die Aufgabe, die lieiden Teile getrennt für sich zu erhalten, keine ganz einfache. Als Einleitung gewissermaßen ist deshalb zu l)ehandeln : I. Beschreibung der Methoden zur Gewinnung von Plasma, Serum und Formelementen. Hieran schließen sich : II. Methoden zur Bestimmung des relativen \'olumens bzw. Gewichts von Formelemeuteu und Plasma bzw. Serum. III. Trockensubstanzbestimmung; Nachweis und Bestimmung von Ammoniak, Kohlensäure und Aschenbestandteilen. I\'. Methoden zur Untersuchung des Plasmas und Serums') auf einzelne Bestandteile. V. I'ntorsuchung der Formelemente auf einzelne Bestandteile. VI. Verfahren zur Bestimmung verschiedener Bestandteile in einer Bhit- portion. VII. I)estimmung der \'erteilung einzelner Bestandteile auf Serum uml Formelemente. I. Gewinnung von Plasma, Serum und Fonnelementen. 1. Plasma. Reines Plasma von Säugetierblut ohne irgend welchen Zusatz zu er- halten, gelingt nur l)ei Blutarten, die, wie z. B. Pferdeblut, selir langsam gerinnen und deren Formelemente genügenil rasch sich absetzen. ^) Es sind in diesem Absclinitto auch Methoden mit aufgenommeu , die dazu dienen, das Blut als Ganzes auf gewisse Bestandteile, für deren Isolierung, Nachweis und BcstimmuniT im Plasma bzw. Serum besondere Methoden nicht austrearbeitet sind, zu untersuchen. 140 E. Letsche. Man läßt in diesem Falle das Blut direkt aus einem Gefäß in einen nicht zu weiten, stark abgekühlten Glaszylinder einfließen und füllt den Zylinder möaiichst vollständig mit Blut an, um zu verhüten, daß Wasser an den oberen Teilen des Zylinders sieh kondensiert, die gebildeten Tropfen in das Blut zurückfließen und dadurch die Auflösung geringer jNIengen Blutkörperchen bewirken. An einem kühlen ( )rt, möglichst bei 0^ läßt man den Zylinder ruhig stehen; dabei setzen die Blutkörperchen sich zu Boden und das Plasma steht als klare, leicht abhebbare Schicht über dem Sediment. Das l>lut der meisten übrigen Wirbeltiere gerinnt, soweit darüber Untersuchungen angestellt worden sind, selbst beim Abkühlen und bei Einhaltung gleich nachher zu erwähnender Vorkehrungen zu rasch, als daß es gelingen könnte, Plasma und Formelemente zu trennen. Wohl aber gelingt dies bei dem Blut von Vögeln, Reptilien, Amphibien und Fischen, wie Delezenne^) gezeigt hat. Sein Verfahren ist folgendes 2): Eine peinlich saubere Kanüle (ausgekocht) führt man in die Karotis eines Vogels (Truthenne, Gans, Ente verwendete Delezenne) ein; mit ihrer Hilfe fängt man das Blut, das man peinlich vor der Berührung mit der Wunde schützen muß, direkt in einem Zentrifugenglas auf. Die gereinigten Zentrifugengläser werden mit destilliertem Wasser ausgekocht und vor Staub geschützt aufbewahrt. Mit Hilfe der Zentrifuge {Delezenne verwendet eine solche von Fr. Bunne, Heidelberg, die 2400 — 2600 Touren in der Minute macht) trennt man Plasma und Formelemente. In der Regel ge- nügt 10 Minuten langes Ausschleudern, doch läßt man die Zentrifuge zweckmäßig jedesmal ^U Stunde gehen. Man hebt das Plasma vorsichtig ab und zentrifugiert nochmals 7, Stunde; Abheben und Zentrifugieren wieder- holt man mindestens zweimal. Nur auf diese Weise erhält man etwa im Laufe von 2 Stunden ein Plasma, das vollkommen frei von zelligen Ele- menten (vor allem Blutplättchen) ist. Schützt man das zuletzt abgehobene Plasma durch mehrere Papier- schichten vor Staubteilchen und Keimen aus der Luft, so bleibt das Plas- ma bei einer Temperatur von 7 — 16" über einen Monat flüssig. Bei allen übrigen Blutarten muß man sich damit begnügen, ein Plasma zu erhalten, das durch bestimmte Zusätze un gerinnbar gemacht worden ist. Die gerinnungshemmende Wirkung von Peptonlösungen^), die in die Blutbahn injiziert wurden, ist zur Gewinnung größerer Plasmaquanti- ^) C. Delezenne, Aper^-u general sur la coagulation du sang cbez les vertdbr^s. Compt. Reud. de la Soc. de Biol. 49. 507 (1897). °) C. Delezenne, Recherches sur la coagulation du saug chez les oiseaux. Archiv de Physiol. V. 9. 347/52 (1897). ^) A. SV/;»;/f7i'-Miihlheim, Beiträge zur Kenntnis des Peptons und seiner physiolo- gischen Bedeutung. Arch. f. Anat. u. Physiol., 1880. (Physiol. Abt.) 33/56. Fano, Ver- halten des Peptons und Tryptous gegen Blut und Lymphe. Arch. f. Anat. u. Physiol. 1881. (Physiol. Abt.) 277/96. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. 141 täten für chemische I'ntersiichiingen bis jetzt nur wenig verwendet worden. Ebenso hat man bis jetzt die von H(i;/cn(f't^) beobachtete Wirkiiii«,' von lUutegelextrakt für diese /wecke, soweit ich sehe, nur weui;,^ an^'u- wandt, trotzdem es auf (irund der Arbeiten von Fr. Fninz-) und von A. Bodong'^) möglich ist, Hirudin in reiner und leicht dosierbarer Form zu gewinnen.*) Schuf enhebii und Bodong"^) verfahren zur Gewinnung von Iliru- dinplasma folgendermaßen : Man stellt eine Lösung von beispielsweise 40 uig Hirudin in physio- logischer Kochsalzlösung (5 — 10 aii'^) her und läßt in diese das Iliut z.H. aus der Karotis eines Hundes einfiieljon. Man läßt soviel \\\\\\ zufließen, daß auf 1 on^ Blut etwa O'l mg Hirudin kommt — in unserem Falle also 400 cw3 Blut. Dieses Blut bleibt tagelang ungeronnen, und es wird mit Hilfe dieses Verfahrens wohl auch möglich sein, noch größere (^)uantitäten Ülut. als Schittenhchn und Bodong sie verwendeten, ungerinnbar zu machen und in der üblichen Weise zur Gewinnung von Plasma zu verwerten. Die Mittel, die gegenwärtig beinahe ausschließlich Verwendung finden, wenn es sich darum handelt, größere Plasmamengen zu gewinnen, sind Oxalate und Fluoride. Daneben finden in ganz untergeordneter Weise auch noch andere Substanzen, z. B. Natriumzitrat, Xatriummetaphosphat, MgSOi, und andere Neutralsalze Verwendung. \'on Magnesiumsulfat z. B. wendet man auf ein Volumen gesättigter Lösung am besten 3 Volumina Blut an und mischt möglichst gut und rasch. Durch die große Magnesiumsulfatmenge wird natürlich der osmotische Druck des Plasmas gegenüber den Blutkörperchen enorm erhöht: die Folge ist zumindest ein reichlicher Austritt von Wasser aus den Formelementen und man wird demzufolge ein solches Plasma für ((uantitative Unter- suchungen an Plasma oder F'ormelementen der Änderung der Konzen- trationsverhältnisse wegen kaum anwenden können. Die Anwendung von Oxalaten und Fluoriden der Alkalimetalle und des Ammoniums begegnet, abgesehen von ihrer kalkfällenden Wirkung, keinen prinzipiellen Bedenken und bringt auch nicht die bei Anwendung von Xeutralsalzen, wie Magnesiumsulfat, oft recht störenden rnannelunlich- keiten der Verarbeitung außerordentlich stark salzhaltiger Lösungen mit sich. ') ./. 7>. Jhn/crnff, Vhev die Einwirkunsr eines Sekretes des offizinellen Bluti-irt-is auf die Gerinnbarkeit des IJlutes. Arcb. f. oxperini. Patli. u. Pharm. 18. 2US 17 USS4). '-) Fr. Franz, Über den die Blutgerinnung' aufhebenden Bestandteil des uiedizini- scluMi Blutegels. Areh. f. experini. Patii. u. Pharm. 49. 342 (Ui (I')Ü3). ■') A. Bodo IUI, tWv Hirudin. Arch. f. experini. Path. u. Pliarm. 52. 242 lil (UHl.'i). ^) Das Hirudin wird von der Firma F. Sachsse <(• Comp, in Leipzig fabriknuilüif hergestellt. ^) A. Schitioihchn u. A. lioiloiuj. Beiträge zur Frage der Bhiiirfriniiung mit im- sonderer Berücksichtigung der Ilirudinwirkung. Arcli. f i>\prrim. Patli. u. Pliarm. <>4. 217/44. S. 241 (PJUG). 142 E. Letsche. Nach Arfhus und Fages^) verwendet man von Oxalaten soviel daß die Mischung von Blut und Oxalatlösung schließlich auf 1000 Teile 1 Teil Oxalat enthält. Man fängt z. B. in 25 cni^ Oxalatlösung von O'OVo 225 crn^ Blut direkt aus einem Gefäß (ob Arterie oder Vene ist gleichgültig) auf, mischt gut und trennt durch Zentrifugieren. Anstatt eine etwa l%ige Lösung zum Auffangen des Blutes zu ver- wenden, kann man auch konzentriertere Lösungen oder direkt auch festes Salz benutzen. \oy allem in letzterem Falle sorgt man durch gutes Rühren des Gemisches für rasche und vollständige Mischung. Bei Anwen- dung von festem Salz kann man, um rasch eine vollständige Mischung von Blut und Oxalat zu erreichen, zweckmäßig sich folgenden Kunstgriffes bedienen : Man bringt die für das zu erwartende Blut(|uantum — z. B. 500 cm^ Blut — nötige Menge Kaliumoxalat — in diesem Falle 0*5 g — in einen Meßzylinder, gibt die zur Lösung eben nötige Menge warmen Wassers zu und verteilt die Lösung durch Neigen und Drehen des Gefäßes über seine innere Wandung bis zu der Höhe, welche das Blut erreichen wird. Beim Verdunsten des Wassers wird das Oxalat als dünne Schicht die W^andung des Gefäßes gleichmäßig bedecken und es ist dadurch eine raschere Mischung gesichert. Für die Verwendung von Fluoriden gilt genau das gleiche, nur empfiehlt es sich nach den Angaben von Arthus und Pages ^% auf 1000 Teile Mischung etwa Vb g Fluorid anzuwenden. Eine etwas höhere Konzentration des Oxalats oder Fluorids — im ersteren Fall bis zu etwa O'250/o, im letzteren bis zu etwa 0"3Vo — ist in vielen Fällen ganz zweckmäßig. 2. Serumgewinnung. Leichter als Plasma ist Serum zu erhalten; frei von Beimengungen, die aus den Formelementen stammen, vor allem frei von Blutfarbstoff er- hält man Serum nach folgendem allgemein bekannten und geübten Ver- fahren: Man fängt das Blut in einem vollkommen trockenen Gefäß, das möglichst auf Körpertemperatur erwärmt ist, auf und läßt das Gefäß samt Inhalt ruhig stehen. Nach einiger Zeit beginnt das Blut zu gerinnen und es bildet sich auf der Oberfläche eine dicke Haut. Diese klebt meist ziemlich fest an der Gefäßwand ; mit Hilfe eines Messers löst man sie vorsichtig ab und erreicht auf diese Weise, daß der Blutkuchen sich ganz gleichmäßig zusammenzieht und das Serum vollkommen klar ausgepreßt wird. Ganz frei von Blutfarbstoff erhält man das Serum nur, wenn man während und nach dem Auffangen des Blutes die Bildung von Konden- sationswasser unmöglich macht. Dies erreicht man während des Auffangens, wie oben erwähnt, am besten dadurch, daß man das Auffanggefäß auf Körper- *) M. Arthus und C. Pages, Nouvelle thöorie chimique de la coagulatiou du sang. Arcli. de PhysioL (Y.) 2. 739/46 (1890). Methoden zur Aufarbeitung des Hinten in seine einzelnen Bcstandt<'Uo ] \-' tempei-Mtur vorwärmt und es möglichst bis zum Rando mit Ulut nul'üllt. Ist letzteres nicht möglich, so sorge man dafür, dal» der nicht mit Ulut ^^v- füllte Teil des Gefälles sich nicht rascher als das Blut ahkidilt. Am hestcu erreicht man dies dadurch, dal» man das Oefiili in eiiicni mäliig warmen Raum ruhig stehen lälU. Das eben geschilderte Verfahren hat neben dein \urzug. bei sorg- fältiger Ausführung ein vollkommen hänu)globinfreies Serum zu liefern, den einen Nachteil, für die Gewinnung größerer Serummengen ziendich zeitraubend zu sein. Rascher kommt man zum Ziel, wenn man das Rlut sofort, nachdem es den Körper verlassen hat, mit einem Holzstab ..schlägt" (kräftig rührt); das Fibrin, das sich an dem Stab als elastisch-faserige zusammenhängende Masse abscheidet, heraushei)t und das defibrinierte Blut, nachdem man es zuvor kolliert hat, zentrifugiert. Das über dem Blutkörix-rchensediment stehende, meist etwas gefärbte Serum hebt man dann mit Hilfe eines Hebers ab, den man an seinem längeren Schenkel zweckmäbig mit einem Kautschuk- schlauck und einem Quetschhahn versieht, um die Ausflußgeschwindigkeit regulieren und das Abfließen nach Belieben unterbrechen zu können. Statt durch Schlagen mit einem Holzstab kann man vor allem kleinere Blutmengen auch defibrinieren durch kriiftiges Schütteln mit reinem (^)ueck- silber, das Fibrin durch Kollieren abtrennen und dann die Trennung von Serum und Formelementen in üblicher Weise vornehmen. 3. Gewinnung der Formelemente. a) Rote Blutkörperchen. Rote Blutkörperchen, denen jedenfalls nur geringe Mengen von Leuko- zyten und Blutplättchen beigemengt sind, erhält man am besten in folgen- der Weise'): Frisches Pferdeblut 2), das mit OTVo Ammonoxalat ungerinnbar ge- macht worden ist, wird bei etwa 3000 Umdrehungen in der Minute etwa 15 Minuten lang zentrifugiert. Das Plasma und die oberste Schicht des Sediments werden abgehoben und die untere feste Blutkörperchenschicht mit 0"9o,oiger Kochsalzlösung vermischt. Nach erneutem 1.') Mimiten langem Zentrifugieren wird die abgeschiedene Kochsalzlösung abgeholfen und der ganze Prozeß noch 2mal wiederholt. Für Zwecke, bei denen es darauf ankommt, rote Blutkörperchen voll- kommen frei von Leukozyten und Blutplättchen zu erhalten, verfahren Abd er ha hl eil und Deetjeu in folgender Weise-''): ^) E. Abderhalden, Abbau einitrer Polypeptide diircli dir rdutkörperchen dos Pferdes. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 51. 3:U (il>()7). ^) Ebenso verfäbrt man natürlich bei jeder anderen Hlutart: auch k.tun mau für die Gewinnung von Erythrozyten von dcfibrinierteni lilut ausgehen. '■') E. Abderhalden und Deetjen, Weitere Studien über den Altl)au einiger Poly- peptide durch die roten lUutkörjierchen und die Blutplättchen des Pferdeblutes. Zeit- schrift f. physiol. Chemie. 53. 28U d'.lüTj. 144 E. Letsche. Pfercleblut wird durch Zusatz von 0"15Vo Ammonoxalat ungerinnbar gemacht und zentrifugiert: das Plasma wird abgegossen und die oberste an Leukozyten reiche Schicht des Sediments abgehoben. Das übrige Sedi- ment vermischt man mit einer Lösung von 0-9''/o Kochsalz und Ol^/o Ammonoxalat, zentrifugiert Avieder und filtriert nach dem Abheben der Flüssigkeitsschicht das Gemisch der roten Blutkörperchen, Blutplättchen und noch vorhandenen Leukozyten durch eine mehrfache Lage von Filzi) auf einer Nutsche. Die Filzschicht durchtränkt man vorher mit Plasma, das man durch Zusatz einiger Tropfen Chlorkalziumlösung zur Gerinnung gebracht hat. Blutplättchen und Leukozyten werden vollständig zurückge- halten. Die Erythrozyten werden nach dem Filtrieren noch omal mit Koch- salzlösung verrührt und zentrifugiert. b) Leukozyten. Zentrifugiert man ungerinnbar gemachtes P)lut, so setzen sich die Leukozyten, als die spezifisch leichteren Formelemente, auf den Erythro- zyten ab. Über den Leukozyten findet man bei genügend langem Zentri- fugieren eine Schicht von Blutplättchen. Während es nun, wie wir nachher sehen werden, ohne allzu große Schwierigkeiten gelingt, Blutplättchen frei von anderen Beimengungen zu erhalten, bereitet die Gewinnung von Leuko- zyten aus Blut bis jetzt unüberwindUche Schwierigkeiten, wenigstens so- weit es sich um Mengen handelt, die für chemische Untersuchungen aus- reichen. Untersuchungen, die sich mit der Zusammensetzung der Leuko- zyten beschäftigen, sind angestellt worden an Leukozyten aus Eiter und aus lymphatischen Organen. c) Blutplättchen. Zur Gewinnung dieser Elemente verfährt il/osm -) folgendermaßen: Man läßt das Blut direkt aus der Karotis oder Jugularis in einen Maßzylinder fließen, der je nach der zu erwartenden Biutmenge ein ge- wisses Quantum einer 2''/oigen Ammonoxalatlösung in O'TVoiger Kochsalz- lösung enthält. Sobald die Mischung das lOfache des angewandten Volums Ammonoxalatlösung erreicht (also 0"2Vo Ammonoxalat enthält), bringt man sie auf die Zentrifuge und schleudert aus, bis eine Trennung der verschiedenen Bestandteile des Blutes nach ihrem spezifischen Gewicht erreicht ist (2 bis 7 Stunden). Das Blut zeigt dann in der Kegel eine 4fache Schichtung. Über den roten Blutkörperchen findet man eine je nach der Blutmenge bis 5 mm dicke graurötliche Lage, die neben vorwiegend Leukozyten reich- ') Noch besser erreicht man den gewünschten Zweck durch Filtrieren durch eine längere nicht zu fest gepreßte Watteschicht; Abderhalden und Mcuucaring , Über den Abbau einiger Polypeptide durch die roten Blutkörperchen und die Blutplättchen des Rindes. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 55. 377 (1908) verwenden eine 2b cm hohe Watte- schicht. '-) R. Mosett, Die Herstellung wägbarer Mengen von Blutplättchen. Arch. f. Anat. u. Phys. 1893. (Phys. Abteil.) 352. Methodeu zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. ij;, lieh Erytlirozyten und ehvas IJliitplättchon enthiilt. Darüber folf,'t, wie eine zarte Decke, eine weißliche Schicht, die von Krytiirozyton und Leukozyten vollkoiiinicn frei ist und aus den gewünschten Plättchon besteht. .Mit Hilfe einer kleinen Saugpipette kann man diese Schicht leicht ahhehen. Morawitz^) wendet zu einer vollständigen .Vhtreiinung der Dliitpliitt- chen fraktioniertes Zentrifugieren an. Aus der Karotis eines Tieres entHiinint man Dliit und fängt es in Fluornatrium oder Natriummetaphosphatlösnng auf. so dal« die Konzen- tration an diesen Zusätzen 0-2 I)zw. 2% beträgt. Die Mischung hat sofort und recht ausgiebig zu geschehen, am besten durch l'mstülpen des mit einem Olasstopfen versehenen Gefäßes. (Man wählt für diesen Zweck bes.ser verschiedene kleine (Jefäße zu je 1 00 ny/^ statt eines größeren.) Dann zen- trifugiert man; die Dauer läßt sich nicht von vornherein bestimmen. .Mit einiger Übung erkennt man bald den richtigen Zeitpunkt zum Luter- brechen. '-) Trifft man den richtigen .Moment, so haben sich die Erythrozyten vollständig abgesetzt; darüber findet sich eine Schicht, die Leukozyten und wenig riättchen enthält. Das Plasma ist mehr oder weniger weililich ge- trübt— von der Hauptmenge eben der Plättchen. ^Lan hebt das Plasma ab, läßt aber eine etwa 2 cm hohe Schicht über dem Sediment stehen und zen- trifugiert das Plasma o — 4 Stunden mit einer (ieschwindigkeit von etwa 2000 Touren. Die Plättchen haften dann als grauweißer Pelag am lioden des Gefäßes und lassen sich durch Abspülen mit physiologischer Kochsalz- lösung von dem anhängenden Plasma befreien. Das von Morawitz angegebene Verfahren haben auch Ahdrrhihlen und Deetjen^) und Schittenhehn und Bodong^) benutzt. Die beiden letz- teren benutzten eine Zentrifuge '')■ deren Geschwindigkeit beliebig geändert und jederzeit genau festgestellt werden kann und verfahi'en folgender- maßen: Das Blut wird wie üblich in Oxalatlösung aufgefangen. Nach 3- bis 4stündigem Stehen haben sich bei Pferdeblut der größte Teil der Erythro- zyten und Leukozyten zu Doden gesetzt. Das blutkörperchenarme, aber plättchenreiche Plasma wird vor.sichtig abgehebert und auf die elektrisch betriebene Zentrifuge •'"') gebracht. Man schleudert das Plasma zunächst 15 Minuten bei 1600 Umdrehungen aus. Dabei .setzen Erythrozyten und Leukozyten sich vollkommen ab. Die vorsichtig von den Körperchen abge- M Morawitz, Beiträge zur Kenntnis der Bhitgerinnung. Deutsches Arch. f. klin. Med. 79. 21 .ö/:« (1904). -) Fluoridphisma scheidet sich rascher ah als Salzplasnia. ') Abderhalden und Deetjen, Weitere Studien ülier ihn Aldiau einiger I'oly- peptide usf. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 5^^ 28ö (l'.)07). ■*) A. Schittitihclm und Jiodniif/, Beitrage zur Krage der BlutuHMiiiiuniL' u-f \"'li f. c.xperim. Path. u. Pharm. 54. 220 (1S)0()). •') Solche Zentrifugen werden von der Firma S/jindlcr «c llaor in dottjugen nach der Aiigahe von ('. Jacob i/ gehaut und inaclieu his zu .'lälH) Imdrehungen iu ilcr .Minute. A bdur h ul den , Handbuch der biochemischen Arbeitemethodun. V. 10 146 E. Letsche. gossene leicht getrübte Flüssigkeit zentrifugiert man jetzt 15 Minuten bei 3200 Umdrehungen. Die Flüssigkeit ist dann vollkommen klar und die Plättchen haften als zäher weißgrauer Belag am Boden des Gefäßes. Bei Blutarten, deren Formelemente sich nicht so leicht absetzen wie die des Pferdebluts, hält man folgende Bedingungen ein: Man fängt das Blut, z. B. Hundeblut, in Fluornatriumlösung auf, so daß die Fluoridkon- zentration schließhch O'o7o beträgt. Man schleudert sofort 40 Minuten bei 1600 Umdrehungen aus zur Abscheidung von Erythrozyten und Leukozyten. Dann schleudert man nochmals 10 ^linuten bei 1600 und nach erneutem Abheben o Minuten bei 2100 Umdrehungen aus, um schheßUch das milchige Plasma noch 30 — 40 Minuten bei 3200 Umdrehungen zu zentrifugieren zur Abscheidung der Blutplättchen, die dann, wie oben schon angedeutet wurde, mit O^Q^/oiger NaCl-Lösung abgespült werden können. Es ist nicht zweckmäßig — jedenfalls für manche Zwecke nicht — , die Plättchen in NaCl-Lösung aufzuschwemmen und dann wieder auszuschleudern. Die vor- her schon mit recht großen ^'erlusten arbeitende Methode wird dadurch noch verlustreicher. (1) Stroma. Im Anschluß an die Methoden zur Isolierung der Formelemente seien hier noch die Methoden zur Isolierung des Stroma aufgeführt. Als erster hat wohl Wooldridge i) das Stroma, und zwar nach folgen- dem Verfahren, zu isolieren versucht. Frisch geschlagenes Blut wird mit einem mehrfachen Volum 2<'/oiger Kochsalzlösung versetzt und zentrifugiert. Der nach dieser ersten Be- handlung bleibende Bodensatz wird noch mehrere Male mit Kochsalz- lösung auf der Zentrifuge ausgewaschen, bis das anhaftende Serum ent- fernt ist. Der aus einem Gemenge verschiedener Formelemente bestehende Brei wird in das h — 6fache Volumen Wasser eingetragen und das Ganze kräftig durchgeschüttelt. Dann fügt man vorsichtig so lange Äther zu, bis die Flüssigkeit vollkommen durchsichtig ist. Jetzt kommt sie von neuem auf die Zentrifuge, um die Leukozyten, die wenig verändert in der Feuchtigkeit schwimmen, abzuscheiden; das Zentrifugieren muß man eventuell so oft wiederholen, bis ein Bodensatz sich nicht mehr bildet. Der nun erst vollkommen klaren Flüssigkeit setzt man eine P/oige Lösung von Natriumbisulfat -) tropfenweise zu; ist eine genügende Menge von dieser Salzlösung zugegeben, so trübt sich die klare Flüssigkeit bis zu einem ähnUchen Grade wie unverändertes Blut; alsbald ballen sich die ausgefällten Stromata zusammen und setzen sich zu Boden. Ist das Stroma einmal geschrumpft, so quillt es auch nach langem Waschen mit destilliertem Wasser nicht wieder auf. Da es in verdichtetem ^) L. Wooldridge, Zur Chemie der Blutkörperchen. Arch. f. Anat. u. Phys. 1881. Phys. Abteil. 389. ^) Das saure Salz ist der prinzipiell auch brauchbaren Säure vorzuziehen , weil .sich dadurch eine Zersetzung des Hämoglobins vermeiden läßt. Mothodon zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzoliii'u liesiandteile. 147 Zustand leicht filtrierbar ist, so kann man alle lU'imenj^'un^M'ii ausziehen rait Ausnahme einer Spur zersetzten Hämoi>lol)ins. Die gesamten im Obigen beschriebenen OjK-rationen lassen sich bei niedriger Temperatur in wenigen Tagen ausführen. Ein einfacheres und wie mir scheint besseres \' erfahren hat J'ar- stellung auf diesem Wege gelingt nicht immer und die Ausbeute ist meist eine unvoU- Jiommeue. *) IHcttre et Vila, Le stroma des gloluiles rouges. L'ompt. Kend. 14."). 787/ '.KJ (1906). 10* 148 E. Letsche. eine konzentrierte Hämoglobinlösung darstellt, und eine obere flockig ge- trübte, welche die Gesamtheit der freien Stromata und der noch nicht hämolysierten Körperchen enthält. Die untere Schicht läßt man ausfließen, ersetzt sie durch ein kleineres Volum physiologischer Kochsalzlösung und schüttelt von neuem, um die Hämolyse zu vervollständigen. Man läßt die untere Schicht wieder ab und wäscht die Ätherschicht so lange mit salz- haltigem Wasser, bis dieses keine färbende Substanz mehr aufnimmt. Die Stromaflocken sammelt man dann auf einem Filter. II. Bestimmung des relativen Volums beziehungsweise Gewichts von Formelementen und Plasma oder Serum. 1. Methoden, welche die Beobachtung benutzen, daß gewisse Be- standteile des Blutes entweder nur im Plasma (oder Serum) oder nur in den Formelementen sich befinden oder daß dem Blut zu- gesetzte fremde Stoffe nicht in die Blutkörperchen eindringen. Die älteste hierher gehörige Methode ist die von Hoppe- Seyler ange- gebene ^) , bei welcher man die Mengen Fibrin, die einerseits in einer ge- wogenen Menge Blut, andrerseits in einer gewogenen Menge Plasma sich finden, bestimmt. Man bestimmt in einer Portion Blut (10 — -iOcm^) den Fibriugehalt nach der an anderer Stelle beschriebenen Methode. -) Eine zweite größere Blutportion fängt man in einem in Eis stehenden Standzylinder auf, läßt die Blutkörperchen sich senken, entnimmt mit einer ebenfalls gekühlten Pipette, die der zur ersten Bestimmung angewandten Bkitmenge gleiche Plasmamenge und bestimmt in ihr das Fibrin genau ebenso wie im Blut. Bedeutet a den Prozentgehalt des Blutes an Fibrin, b „ „ „ Plasmas an Fibrin, ferner X den Prozentgehalt des Blutes an Plasma, y ,; „ „ „ ;, Körperchen, z „ „ „ „ „ Serum, so gelten die Beziehungen: x = — ; y— 100 — x; z = x — a. b Diese Methode wird wegen ihrer nicht allzu hohen Genauigkeit nur wenig angewandt. Methode von Bunge. C. Schmidt^) hat festgestellt, daß in der Zwischenflüssigkeit des Blutes das Natron vorherrscht, in den Körperchen dagegen das Kali. ^) Hoppe- Seyler -Thierf eider, Handbuch der physiol.- u. pathologisch-chemischen Analyse. 8. Aufl. Berlin 1909. S. 682. 2) Dieses Handbuch. Bd. 2. 8.376(1910). ä) C. Schmidt, Charakteristik der epidemischen Cholera. Leipzig und Mitau 1850. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestantitoile. I4f^ G. Sacharjin i) hat die Vermutung ausfresprochon, dali in gewissen lilutarten das Natron nur im Serum , nicht in den Körperchen sich fin(h'. Dieser Vermutung ist G. Bumje-) nachgegangen und hat darauf folgende Methode gegründet: Man bestimmt in einer gewogenen Menge defibrinierten Blutes nach einem der später zu besprechenden ^'erfahren das Natron und in gleicher Weise das Natron des Serums. Bezeichnet dann a den Prozentgehalt des Blutes an Natron, b „ „ „ Serums an Natron, X „ „ ., Blutes an Serum, so gilt wie bei der Methode von Hoppe-Seyler die Bezielmng a.lOO " = -¥— Die Methode liefert Werte, die mit den Zahlen, die nach anderen Methoden gew^onnen worden sind, recht gut übereinstimmen. Sie ist aber natürlich nur anwendbar bei Blutarten, für welche die von Sacharjin aus- gesprochene Vermutung zutrifft, und zwar ist dies nach Ahderhalden ») das Blut vom Pferd, Schwein und Kaninchen. Für dieses Verfahren ist natürlich prinzipiell jede Substanz hrau(lil)ar, die entweder nur im Serum oder nur in den Fonnelementen sich findet, wie z. B. Fett und Kalk, welche beiden nach Abderhalden *) in den Form- elementen fehlen. Schlielilich steht auch wohl nichts im Wege, diese Methode auch auf nicht geronnenes oder ungerinnbar gemachtes Blut anzuwenden. Methode von Stewart.^) Das Prinzip der Methode ist folgendes: Ein Farbstoff, der im Serum löslich ist und weder in die Körperchen eindringt noch in merklicher Weise den osmotischen Druck des Serums beeinflulit, wird in bestimmter Menge einem bestimmten \'olum oder Gewicht von defibriniertem Blut zu- gefügt. Das i^dut wird geschüttelt, bis der Farbstoff gleichmäbig verteilt ist und wird dann zentrifugiert. Aus der Menge des Farbstoffs, der in einer gegebenen JMengo des gefärbten Serums enthalten ist. kann die Menge des Serums im Blut leicht errechnet werden. Als Farbstoff verwendet man Hämogloblin, das man nach dem Verfahren von Hoppc-Scyler^) oder 1) G. Sacharjin, Zur Blutanalyse. Virchows Arcli. Bd. 21. :-i37 (18(51). ^) O.Jhoiqe, Zur quantitativen Analvse des Blutes. Zeitsrlir. f. Bioloirie. 12. 191 (187()). ^) E. Ahderhalden, Zur (juantitativen vergleichenden .\nalyse des Blutes. Zeitschr. f. physiol. Chomic. 25. Go/115 (18i)8). *) E.Abderhalden, Zur quantitativen vergleichenden Analyse 'lc> lUnfes. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 25. 109 (1898). ') B. N. Stewart, The relative volume of corpuscles and plasuia in blood. Joum. of l'hysiol. 24. 35G/93 (1899). «) Iloppe-Seyler-Thicrf eider, Handbuch etc. 8. Aufl. 1909. S. 408. 150 E. Letsche. sonst einem anderen brauchbaren Verfahren herstellt, wiederholt um- kristallisiert und schließhch trocknet. Das Verfahren ist folgendes : Ein genau gewogenes oder gemessenes Quantum Blut mrA zentri- fugiert, bis eine große Quantität klaren Serums sich abscheidet ; möglichst viel von diesem vollkommen körperchenfreien Serum wird genau gemessen oder gewogen. 5 — Ibcm^ (genau zu bestimmen!) werden in einer Reib- schale sorgsam mit einer gewogenen Quantität Hämoglobin zerrieben. Man nimmt gewöhnlich soviel Hämoglobin, daß eine 1 — 2''/oige Lösung von Hämoglobin im Serum entsteht. Von dieser Lösung gibt man eine bestimmte Menge dem Blutkörperchensediment zu, mischt das Sediment gut mit der Lösung und zentrifugiert wieder, bis eine rötliche oder schwärzlich rötliche Serum schiebt sich abgetrennt hat, die als „gefärbtes Serum" bezeichnet sei. Auch diese Schicht muß vollkommen frei von Blutkörperchen sein. Man hebt von diesem Serum wieder einen Teil ab und vergleicht ihn mit der Lösung von Hämoglobin in Serum, und zwar in der Weise, daß man die Hämoglobinlösung mit frischem Serum oder mit Wasser verdünnt, bis sie die Farbe des „gefärbten Serums" zeigt, was man mit Hilfe eines Kolori- meters feststellt. Aus der Menge Serum oder Wasser, die man der ursprünglichen Hämoglobinlösung hinzufügen muß, kann man die Menge Serum, mit welcher jedes Gramm oder jeder Kubikzentimeter der Hämoglobinlösung, die man dem Sediment zugefügt hat, vermischt worden sein muß, und deshalb auch die Menge Serum, die im Sediment nach der Entfernung der ersten Serumportion zurückgeblieben ist, unmittelbar entnehmen. Das spezifische Gewicht des defibrinierten Blutes und Serums wird immer be- stimmt, so daß die Menge Serum im Blut sowohl in Kubikzentimeter auf 100 cw^ als auch in Gramm auf 100^ Blut angegeben werden kann. Bedeutet V das angewandte Blutvolum, V „ Volum der ersten Serumportion, v' „ „ „ Hämoglobinlösung, die man dem Sediment zugefügt hat, a „ „ Serum oder Wasser, das jedem Kubikzentimeter von v' zu- gefügt werden mußte, um seine Färbung der des gefärbten Serums gleich zu machen , dann gilt die Beziehung ^-^^ — '-— = Volum des Serums in 100 cm^ Blut. Die Hämoglobinbestimmung ist die einzige Messung, die nicht mit gleich großer (xenauigkeit wie die anderen ausgeführt werden kann, aber die Entfernung und Bestimmung der größeren Serumportion vor dem Zu- fügen der Hämoglobinlösung reduziert den Fehler aus dieser Quelle. Beispiel : Ibcm^ Blut zentrifugiert, 43"5cm3 klares Serum abgehoben; 0"384r/ Hämoglobin werden in 35 «w^ Serum gelöst und Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandtcilo. ]",| Ibcm^ der klaren Lösunji: dem Blutkörperchensedinient zugefügt. Man mischt gut und zentrifugiert wieder; 21-bcin^ Serum (..gefärbtes Serum") werden abgehoben: 20)1^ der Iliimoglobinlösung geben mit IM) cm^ Serum vom lihit dessell)en Tieres genau die gleiche Färi)ung, wie sie das ..gefärbte Serun»- aufweist. Also wurden Q-San^ Serum in dem Sediment gemischt mit je einem Kubikzentimeter der Hiimoglobinlüsung, die dem Sediment zugefügt worden ist, und es müssen somit nach der Entfernung von 43'5cm3 Serum noch 15 X O'S = 12 c»i^ Serum im Sediment enthalten gewesen sein. Dies gibt 4;Vö + 12 = 55-5nM=» Serniii in Ibnn^ IWut, somit 74'Ucw* Serum in 100 cni^ Blut. Zum Vergleich sei noch angeführt, daß bei einem anderen lllut ergeben haben die Methode von Hoppe-Seyler b'6'11 cm^ , die Methode von Stewart b9'2'dcm^, die Leitfähigkeitsmethode 59'39cw3 Serum in lOOcm^Blut; so- mit gibt die Methode recht befriedigende Resultate. 2. Methoden, welche Bestandteile, die in Formelementen und Zwischenflüssigkeit sich finden, im Blute, Serum (Plasma) und Körperchen gesondert bestimmen und hieraus das Verhältnis von Formelementen zu Serum (Plasma) ermitteln. Methode von Hoppe-Seyler.'^) Die Methode beruht auf der experimentell begründeten Annahme, daß bei Trennung von Plasma (Serum) und Formelementen durch verdünnte Kochsalzlösung (0"9VoiS) keine Proteinstoffe aus den Körperchen aus- treten. Sie verwendet zur Berechnung folgende experimentell zu ermittelnden Größen : 1. Gehalt des P>lutes an Proteinstoffen; 2. Gehalt der Formelemente an Protein Stoffen : 3. Gehalt des Serums an rroteinstoffen. Die.>^e Daten braucht man für defibriuiertes Blut; wünscht man die entsprechenden Verhältnisse an Bhit. wie es aus dem Körper strömt, kennen zu lernen, so hat man 4. den Gehalt des Blutes an Fibrin noch zu bestimmen. Die Ausführung gestaltet sich folgendermaßen: Man fängt, wenn es sich um defibriuiertes Blut handelt, ;'. , im anderen Falle 4 einzelne Blut- portionen auf. In der 1. Portion — 5 — \Octn^ — , die man in einem mit l'hrglas versehenen, tarierten Becherglas auffängt und nach dem Krkalten wägt, bestimmt man den Gesamteiweißgehalt nach der Methode, die sich an anderer Stelle-') beschrieben findet. *) Hoppe- Serjler-Thin-felder , Handbuch ilor physiologisch- und pathologisch- chemischen Analyse. 8. Aufl. 19Ü9. S. (582. •-) Dieses Ilandbuch. Bd. 2. S. 373 (lyiU). 152 E. Letsche. Als 2. Portion fängt man wieder etwa 5 — 10 cni^ Blut in einem Fibrinbestimmungsapparat 1), den man gewogen und dann auf Körper- temperatur erwärmt hat, auf, bringt das Blut durch Schlagen zur Ge- rinnung 2), wägt nach dem Erkalten und mischt die Flüssigkeit in einem größeren Becherglas mit dem zehnfachen Volumen einer Mischung von 1 Teil gesättigter Chlornatriumlöung und 9 Teilen Wasser. Man bringt jetzt die Flüssigkeit quantitativ in die Gläser einer Zentrifuge, schleudert 1 — 2 Stunden aus, gießt die überstehende Flüssigkeit völlig klar ab, mischt den zurückbleibenden Blutkörperchenbrei mit derselben Salzlösung, zentri- fugiert wieder, gießt von neuem ab und verfährt nochmals in der gleichen "Weise. Sind auf diese Weise alle Serumbestandteile entfernt dann werden die in den Zentrifugengläsern sich findenden Eückstände mit möglichst wenig Wasser in ein Becherglas gebracht, durch Alkohol gefällt und zur Bestimmung der Proteinstoffe in der gleichen Weise wie oben das Gesamt- blut weiter behandelt. Eine 3. Portion Blut fängt man in einer auf Körpertemperatur er- wärmten Schale auf, bedeckt die Schale und läßt ruhig stehen. Von dem nach eingetretener Gerinnung allmählich aus dem Blutkuchen austretenden Serum wägt man b—lOcm^ in einem Becherglas ab und bestimmt in dieser Portion die Serumeiweißkörper. Geht man von defibriniertem Blut aus, so wird man dieses ausschleudern und das abgehobene Serum in gleicher Weise wie oben beschrieben weiter behandeln. Schließlich benützt man die 4. Portion noch zu der Bestimmung des Fibringehaltes des Blutes nach dem an anderer Stelle 1) beschriebenen Verfahren. Die in 1, 2 und 4 erhaltenen Zahlen rechnet man auf 100 g Blut um; die in 3 erhaltenen Zahlen auf 100«/ Serum, Bezeichnet dann a den Prozentgehalt des Blutes an Eiweißstoffen: b „ „ von Fibrin + Eiweißstoffen in den Formelementen; c „ „ des Serums an Eiweißstoffen; d „ „ „ Blutes an Fibrin; ferner X den Prozentgehalt des Blutes an Serum; y „ „ „ ■„ ,; P^rmelementen; z „ „ „ ,j „ 1 lasma; so ist x = ^^100; y = 100— (x-t-d); z=rx-hd. Schließlich stammt von Hoppe- Seyler noch ein weiteres Verfahren^), das im wesentUchen mit dem eben beschriebenen übereinstimmt. Wegen 1) Siehe dieses Handbuch. Bd. 2. S. 376 (1910). ~) Bei defibriniertem Blut vereinfacht sich das Verfahren in leicht ersichtlicher Weise. 3) Hoiype-Seißer-Thierfelder, Handbuch etc. 8. Aufl. 1909. S. 683. Methoden zur Aufarbeitung des ßlutos in seine einzelnen Bestancitfilc 1 ");> der bei diesem Verfahren notwendi^^en kolorimetrischfii liestiiniiiuiiy; ist dieses \'erfalireu vielleicht etwas wenif^er «;enau, bietet aber bei lUutartcn. deren Formeleniente nicht oder nur schwer sich absetzen (aucli mit Hilfe der Zentrifuge nicht), den Vorteil, dali ein Verlust an Formelementen ohne P^influli auf das liesultat der IJestimmunti- ist. In einer ersten Blutportion bestimmt man den (iesamteiweillgehalt des Blutes genau so wie auf S. ir»! angedeutet. Die zweite Blutportion wird zunächst genau entsprechend dem. was bei dem vorhergehenden Verfahren für ihre Bearl)eitung angegeben wurde, behandelt . wobei es nichts zu bedeuten hat . wenn beim Waschen des Formelementesediments von diesem etwas verloren geht. In einem genau allzumessenden Quantum des von Serumbestandteilen freien ühit- körperchenbreis bestimmt man das Gesamteiweili, in einem zweiten die Menge des Blutfarbstoffes auf kolorimetrischem Wege.i) Die dritte Portion verwendet man zur (luantitativen Bestimmung des Fibrins-), wobei die abgegossenen und abfiltrierten Waschflüssigkeiten sorgfältig gesammelt und zur Blutfarbstoffbestimmung verwendet werden. Eine vierte Portion dient schließlich zur P>estimmung der Serum- eiweißkörper, wobei man wie bei der vorhergehenden Methode verfährt. Die in 1, 8 und 4 erhaltenen Werte rechnet man auf 100^ Blut bzw. Serum um. die in 2 erhaltenen auf ein bestimmtes Volumen der Flüssigkeit. Bezeichnet a den Prozentgehalt des Blutes an Proteinstoffen; b ,, „ „ „ r Fibrin: c „ „ „ „ „ Blutfarbstoff: j; V « n » n n ^» V d „ ,. „ Serums an i^roteinstoffen: e das Yerhiiltnis von Proteinstoffen zu Blutfarbstoff in den Kfirpei-chon und ferner w den Prozentgehalt des Blutes an Proteinstoffen der Ivürpercheii; X „ „ „ „ „ Serum: y ;, ;, „ „ „ l'lasma: z „ „ „ „ „ Körperchen: so ist [a-(.- + bn 100_. ^,^^^^. ,=ioO-(x + b). w = c . e ; X _ , d Methode von M. und L. Bleibtreu. Eine Methode, die ebenfalls die im lUut enthaltt-nen Fiweibkörper zum Ausgangspunkt der Bestimmung des Verhältnisses von Serum ') Franz Miilhr, dieses Handbuch. Bd. 2. S. 705 ff. (1910). •-) Dieses Ilandbucli. Bd. 2. S. 376. Die Fibrinbestimnuing fällt in defibriniortom Blute luitürlich weg. und es bniuclit dann nur die Blutfarbstoffltestimmun!.' in I'ortiou :3 ausgeführt zu werden. 154 E. Letsche. (Plasma) und Forraelementen macht, haben M. und L. Bleibtreu ausge- arbeitet.^) Das Prinzip der Methode ist folgendes : Mischt man Blut mit phy- siologischer Kochsalzlösung und läßt man die Formelemente sich zu Boden senken, so ist in der Flüssigkeit der Prozentgehalt an Eiweiß bzw. Stickstoff in dem Maße vermindert, als der Flüssigkeit Salzlösung zugefügt worden ist. Ist die zu der Mischung angewandte Blutmenge = a , das zugefügte Volumen Kochsalzlösung := b und bezeichnet x den echten Bruch , mit welchem man das Blutvolum a multiplizieren muß, um das darin enthal- tene Flüssigkeitsvolum zu erfahren, so beträgt die Gesamtmenge der in der Mischung enthaltenen Plüssigkeit ax + b. Verwendet man ein bestimmtes Volum dieser Salzlösung-Serum- mischung zur Analyse, so muß man dieses Volum mit — — l multiplizie- * -^ ax-l-b ren, um das darin enthaltene Volum Serum zu bekommen. Z. B. sind in 5 cm^ des Gemisches 5 . — —,- cm^ Serum enthalten. ax+b Ergibt dann die Stickstoffbestimmung , daß in diesem Volum e g Eiweiß (Stickstoff auf Eiweiß umgerechnet) enthalten sind, so erhält man: in 5 r cm^ Serum e q Eiweiß; ax + b -^ eine zweite Verdünnung ergibt: in 5 ^—^ cm ^ Serum e, g Eiweiß. a^x + bi ' -^ Somit sind in 5 cm^ Serum enthalten: ^iX + bi , ax + b . Ci -^^ bzw. e g Eiweiß. ajX ax Diese beiden Mengen müssen aber gleich sein; also a^x + bi ax + b ajX ax Hieraus ergibt sich dann : . , bi b x(e— Ci) — ei e aj a Aus dieser Gleichung läßt sich x berechnen und damit kennt man auch das Volum der körperlichen Elemente 1 — x. Macht man statt 2 Mischungen deren drei, so hat man eine 2fache KontroUe, indem man x aus der 1. und 2., der 1. und 3. und aus der 2. und 3. Mischung berechnen kann. Natürlich kann man auch das unvermischte Serum bei dieser Me- thode mitbenutzen; das zugehörige b ist dann eben = o; in diesem Falle vereinfacht sich die obige Gleichung für x auf *) Max Bleibtreu und Leopold Bleibtreu, Eine Methode zur Bestimmung des Volums der körperlichen Elemente im Blut. Pflügers Archiv. 51. 151/228 (1892). Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. löf» (e— e,) x = e, a, wobei e den Eiweißwert für das unvoi-diinnte Serum bedeutet. Die ganze Arbeit bei dieser Metliodc l)estelit also darin - im ein- fachsten Fall — den EiweiÜgehalt des Serums und den Kiweiligchalt des Gemisches von Serum + Kochsalzlösung, die man nach dem Zentrifiigieren des mit 0"9Voiger Kochsalzlösung verdünnten liiutes erhält, zu bestimmen. Neben den im Vorhergehenden aufgeführten [Methoden, die sich che- mischer Verfahren zur Ermittlung des Verhältnisses von Formelementen zu Zwischenflüssigkeit bedienen, gibt es noch Methoden, die bestimmte physikalische Eigenschaften von lUut und Seruin (Plasma) für den ange- gebenen Zweck benützen, auf die hier nur verwiesen sei. Es gehören hierher die von Schrott enhach'^) angegebene .Methode, welche das spezifische Gewicht von Blutkörperchen, Plasma und Blut ver- wertet und. ferner die Leitfähigkeitsmethoden, die ziendich gleichzeitig von Roth, Tancjl-Biigarszhj und Stewart^) angegeben worden sind. III. Bestimmung des Trockenrückstandes, des Ammoniaks, der Kohlensäure und der Asclienbestandteile. 1. Trockenrückstand. Die Bestimmung der Trockensubstanz im Blut , Plasma und Serum geschieht am einfachsten in der allgemein geübten Weise, daü man in einem mit gut schliei'iendem Deckel versehenen Wägegläschen mit möglichst breitem Boden ein bestimmtes Quantum abwägt, den Inhalt bis zum Ver- dunsten der Hauptmenge Wassers auf zirka 1>0» hält und schließlich liei 115 — 120° bis zur (iewichtskonstanz trocknet. Vor kurzer Frist hat Shackell'^) ein Verfahren angegeben, das eine bei höh(!rer Temperatur möglicherweise eintretende \'erän(lernng vollkom- men ausschließt. Ausgehend von der Tatsache, daß im hohen \'akuum Eis verdampfen kann, ohne zuvor in die flüssige Phase überzugehen, läßt Shackell beson- ders stark wasserhaltige Substanzen in einer Eis-Kochsalzmischung ge- frieren. Dann bringt er die gefrorene [Masse in einen mit Schwefelsäure (konzentriert) beschickten Exsikkator und evakuiert diesen möglichst rasch mit einer Quecksilberpumpe auf einen Druck von wenigen Bruchteilen eines .Millimeters. Besondere Rücksicht muß genommen werden I. darant. daß der Ex- sikkator gut geari)eitet ist, und 2. daß er ein hohes \'aknuni dauernd hält ') II. Schrottenhach , Kino Mctliodo vaw Bpstinimnnj,' dos Volum- und (iowiclits- verlulltuisscs von rotcti Blutkorperchon und IMasma im Hlut durch Wagung. Pjltlycrs Archiv. 123. 312 22 (1908). -) Siehe Zentrallil. f. Thys. 11. S. 271, 2<)7. 332 (1S97). ») L. F. Shackell, .\n improved method of Ucsiccation witli some applications to biological problcms. Am. Journ. of Phys. 24. 324 40 (1905M. 156 E. Letsche. (als Dichtungsmittel dient eine Mischung von 5 Teilen Vaselin und o Teilen Paraffin); 3. muß die Masse durch und durch gefroren sein; 4. muß die H2SO4 von Zeit zu Zeit bewegt werden, damit eine raschere Aufnahme der Wasserdämpfe möglich ist.^) In 4mal 24 Stunden sind nach den Angaben von Shackell Flüssig- keiten wie Milch oder Blut vollkommen eingetrocknet und der Rückstand gewichtskonstant. Wie wenig Veränderungen sich dabei abspielen, dafür spricht die von Shackell angeführte Tatsache, daß nach dem ..Eindampfen" von Blut der Rückstand — bis auf die Körperchenelemente, die natürlich zerstört sind — in physiologischer Kochsalzlösung sich leicht löst und das Eiweiß dieser Lösung in gewohnter Weise koaguliert werden kann. 2. Ammoniakbestimmun^. Zur Bestimmung des Ammoniaks in Blut, Plasma und Serum kommen im wesentlichen folgende Methoden in Betracht: a) Methode von Folin.-) Das Prinzip der Methode besteht darin, das durch bestimmte Zusätze in Freiheit gesetzte Ammoniak bei niederer Temperatur durch einen star- ken Luftstrom abzusaugen und in titrierter Säure aufzufangen. Die hierzu nötige Apparatur findet sich an einer früheren Stelle be- schrieben. 3) Die Ausführung für Blut ist folgende: 50 cm^ Blut werden in einem Aräometerzyhnder abgemessen und der Zylinder in Eis eingepackt. Man gibt dann zu dem Blut etwa 16 (7 Koch- salz, 25 crn^ Methylalkohol und zuletzt 2 g getrocknete oder 5 g kristalli- sierte Soda und leitet 5 Stunden lang einen kräftigen Luftstrom (600 bis 700 l Luft pro Stunde) durch die Mischung. Nach den ersten 2 Stunden ist es wegen des Schäumens notwendig, nochmals 25 cm^ Methylalkohol zuzugeben. Die Vorlage soll nur etwa 10 c/w» — Schwefelsäure neben Was- ser enthalten. Während der letzten 15 ^linuten der Luftstrombehandlung oder besser nach Beendigung derselben muß die Vorlage in Wasser von 30 — 350 eingetaucht werden, damit die in der Flüssigkeit zurückgehaltene Kohlensäure mit dem Luftstrom vor der Titrierung entweicht. Das Blut muß möglichst frisch sein, weil man sonst zu hohe und auch in anderer Weise unzuverlässige Resultate erhält. Ebenso gute Resultate gibt auch die Methode von Krüger und Beich^) in der Modifikation von Schittenhelm.^) *) Dies erreicht mau eiafach durch vorsichtiges Hiu- uud Herbewegeu des Ex- sikkators. ^) Otto Folin, Eine neue Methode zur Bestimmung des Ammoniaks im Harn und anderen tierischen Flüssigkeiten. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 37. 161/76 (1902/03). «) Dieses Handbuch. Bd. 3. S. 765 (1910). *) M. Krüger und 0. Reich, Zur Methodik der Bestimmung des Ammoniaks im Harn. Zeitschr. f. physiol. Chom. 39. 165 (1903). ^) A. Schittenhehn, Zur Methodik der Ammoniakbestimmung. Zeitschr. f. physiol. Chem. 39. 73/80 (1903). Methodeu zur Aufarbeitung des Blutes iu seine einzelnen Bestandteile. 157 Sie beruht darauf, das durch NaoCOa frei gemachte Ammoniak im Vakuum ahzudestillieren. Sie ist vor allem da aui Tlatz, wo es nicht möglich ist, die für die /o/i«sche Methode notwendige hohe (Jeschwindig- keit des Luftstroms zu erreichen und führt viel i-ascher zum Ziel als die Folinsche Methode. Man führt die Bestimmung in folgender Weise aus: 25 — 50 cwi3 ]]i,it versetzt man im Destillierkolben') mit 10 dieses Handbuchs beschrieben sind. Wir behandeln hier nur die B)estimmung der Gesamtkohlensäure, also die Summe der beiden oben erwähnten Formen. *) Die für die Bestimmung nötige Apparatur ist in Bd. 3 dieses Ilandliuclios auf S. 768 abjreliildct uml lu'scbriehen. -) M. Xoicki und ./. Zahski. Cb(M- die Bestimmuutr dos .\iiimoniaks m iniix mu Flüssigkeiten und Geweben. Zeitsdir. f. pliysiol. Clieiii. ;W. l'.Ki 2tl'.HliK)ll. *) O. Foliu, Eine neue Methode zur Bestimmung des Ammoniaks usf. Zeitschr. f. physiol. Cbcm. 37. 161 7() (VMl ;i). ■■) E. Gni/i, Metbodiscbes zur Amnuiniakbostinimungin tieriscbfii Cfwi'licn. Zoitst^lir. f. physiol. Cbem". 48. 30U 14 (1906). 158 E. Letsche. Für diesen Zweck sind verschiedene Apparate und Methoden ange- geben 1) worden, deren einfachste und zugleich auch recht genaue mir fol- gende 2) zu sein scheint. Das Prinzip der Methode ist folgendes: Durch Oxalsäurezugabe verdrängt man aus dem Blut die Kohlen- säure und fängt sie in titrierter Baryumhydroxydlösung auf. Den hierzu nötigen Apparat zeigt nebenstehende Figur. Er besteht aus 2 etwa 100 cm^ fassenden Glasflaschen Ä und B mit weitem Hals, die durch ein gebogenes Glasrohr C miteinander verbunden sind; das Glasrohr muß an seinen Enden sehr sorgfältig in die Flaschenhälse eingeschUffen sein. Am Fla- schenhals und Glasrohr findet sich jederseits je ein kleiner gläserner Stachel, der zur Aufnahme eines Gummiringes dient, welcher Glasrohr und Flaschen fest zu einem Ganzen verbindet. Die Flasche Ä besitzt ein ebenfalls genau eingeschliffenes Ansatzstück, ^'^' "■ das durch einen Glashahn luftdicht verschlossen werden kann. Die Bestimmung geschieht in folgender Weise. Die Flasche A wird mit doppelt soviel konzentrierter wässeriger Oxalsäurelösung be- schickt, als man Blut anzuwenden gedenkt; es genügen 3 — 5 cm^ Blut für eine Bestimmung. Man setzt dann das Ansatzstück D, dessen Schliff leicht eingefettet ist, ein, setzt die Glasröhre C auf und be- festigt sie beiderseits mit Gummi- ^ bändchen. Schließlich füllt man in die Flasche B möglichst rasch 80 ciii^ Barytlösung (im Liter 3"5^ Baryumhydroxyd und 0"25(/Chlor- baryum enthaltend), verbindet so- fort mit dem anderen Ende von C und saugt durch den Ansatz D rasch die Luft ab. Man schließt den Hahn E und prüft, ob der Apparat luftdicht schließt in der Weise, daß man durch vorsichtiges Schwen- ken die Verbindungsteile im Innern benetzt und zusieht, ob das Ein- treten kleiner Luftbläschen zu erkennen ist. Ist dies der Fall, so muß der Apparat neu hergerichtet und gefüllt werden. Der Apparat wird, Avenn er gut schließt, gewogen und dann in folgender Weise mit Blut beschickt. Man saugt das Blut durch ein Stückchen Kautschukschlauch durchs* in yl langsam hinein — wobei man sorgsam darauf achtet, keine Luft mit ein- ') Siehe Fr. Kratis, Über die Alkaleszenz des Blutes und ihre Änderung durch den Zerfall der roten Blutkörperchen. Arch. f. exp. Path. u. Pharm. 26. 186 (1890). *) W. Dibbelt, Zur Methodik der Kohlensäurehestimmung im Blut. Arbeiten aus dem pathol. Institut zu Tübingen fP. v. Bmmigarten). 6. 228 (1908). Methoileu zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. ] r>(i treten zu lassen. Da.s IJhit kann etweder vorher aus einem GefiUi mit einer gut schlieljenden Spritze entnommen sein oder al)er kann man es mit Hilfe von Hohlnadel und Kautsehukschlaueh ans dem Illutg:efäri direkt in den Apparat überleiten. Mau entfernt dann alles lilut außerhalb des Hahns und .schliebt dauu den Apparat wieder. Jetzt braucht man den Apparat, den man bei :;7" stehen lälit. nur ab und zu umzuschüttein. um die auf der liarvtlösung- sich bildende Haut von BaCOg zu entfernen, llildet sich keine Haut mehr, dies ist nach 2 — 3mal 24 Stunden ») der Fall, dann öffnet man Hahn A' lan;isam, ent- fernt B vom Apparat, entnimmt von der vollkommen klaren Flüssitrkeit, die üiier dem Niederschlag- von ISaCOg steht, ■JOnH-' und titriert mit Oxal- säurelösung von bestimmtem (iehalt. Hat man einen Teil der IJarytlösung vor dem Versuch titriert , so sind alle Daten zur Berechnung der CO»- Menge vorhanden. Verwendet man zur Titration eine Oxalsäure, die im Liter V4(X) fj Oxalsäure enthält, so entspricht l cm'^ dieser Lösung Q'2hcm^ CO, bei no und TGO nun Druck. Wurde für 20 crn^ Darvtlösung vor dem Versuch verbraucht . . 172 on'^ Oxalsäure nach „ „ „ . . 1-2 .. lO'O cni^ Oxalsäure so entspricht diese Differenz bei Anwendung von 80 c/»^ Barvtlosuug 4 X 10-0 X 0-25 cm3 COg = 10 an^ CO.,. 4. Bestimmunii: der Asclienbestandteile. Die Veraschung von Blut, Plasma oder Serum geschieht nach den schon an früherer Stelle eingehend behandelten Grundsätzen.-) Ebenso er- folgt die qualitative L'ntersuchung der Asche und die Bestimmung ein- zelner Bestandteile nach den an jener Stelle ausführlich angegebenen Regeln. Nur für die Bestimmung von Fluor und von Jod seien einige neuere Methoden angeführt. Zur Piestimmung des Fluors im Blut vorfährt /jhirek '^) folgen- dermaßen: Das Blut wird zur Trockene verdampft und das Gewicht des Trockenrückstandes bestimmt; der Rückstand wird auf dem Wasserbad mit soviel reinstem Natriumhydroxyd (e natrio) erwärmt, dali sicher alle Phosphorsäure als tertiäres Phosphat in Lösung geht und noch ein Fber- ') Die Menge der angewandten O.xalsäure verl)ürgt oin Storill)loihon auch bei längerem Stehen im Brutschrank. =*) Hans Aron, Aschenanalyse. Dieses Handl)uch. Bd. 1. S. 372 428 (litO'.t». ') E. Zdarek, t'lior die Verteiluntr des Fluni-s in den Ortrancu des Menschen. Zeitschr. f. phys. Chem. 69. 127,39 (,1910). 160 E. Letsche. schuß an Na OH vorhanden ist. Diese Masse wird in der Porzellanschale wieder eingedampft und verkohlt. Die Kohle wird mit Wasser ausgezogen und bei mäßiger Hitze verbrannt. Die Asche wird mit HjO ausgezogen und diese Lösung mit dem ersten Auszug vereinigt. Der H2O unlösliche Teil der Asche wird mit verdünnter Salzsäure längere Zeit behandelt, dann wird filtriert und das Ungelöste auf dem Filter gut ausgewaschen und der Filter verascht, der Glührückstand mit kohlen- saurem Xatronkali innig gemengt und bei eben ausreichender Hitze auf- geschlossen. Die erkaltete Schmelze wird in Wasser gelöst, die Lösung filtriert und im Filtrat die Fluorbestimmung gewichtsanalytisch durch- geführt. Im wasserlösUchen Teil der Organasche wird zunächst die über- schüssige Soda mit Salzsäure bis zu schwach alkalischer Reaktion abge- stumpft, hierauf mit FeClg in der Wärme die Phosphorsäure gefällt, die sehr voluminösen Niederschläge gut absitzen gelassen, auf einem Saugfilter gut abgesaugt und gewaschen. Eventuell wurde der Niederschlag nochmals gelöst und Avieder gefällt. Beim Eindampfen der großen Flüssigkeitsmengen scheidet sich manchmal noch eine kleine Menge von Eisenphosphat aus, die durch Filtrieren entfernt wird. Dann wird die Analyse in der üblichen Weise weitergeführt und das Fluor als Kalziumfluorid bestimmt. Den qualitativen Nachweis führt man in der in diesem Handbuch, Bd. 1, S. 401 angegebenen Weise. Zum Nachweis und zur Bestimmung von Jod verfährt BourceP) folgendermaßen: Man versetzt das Serum, in welchem allein das Jod in nicht dialy- sierbarer Form sich findet 2), mit jodfreier Kalilauge, dampft die Mischung ein (bei stets alkaüscher Pieaktion) und trocknet den Rückstand bei 100". Die trockene Masse wird pulverisiert und dann mit reinem Kaliumhydro- xyd in einer Nickelschale geschmolzen. Man läßt abkühlen, erschöpft die Schmelze mit heißem Wasser, bis dieses nicht mehr alkalisch reagiert. Die vereinigten Flüssigkeiten dampft man etwa auf die Hälfte ein und fügt der kalten Lösung allmählich verdünnte HjSO^ (auf 1 Gewichtsteil reiner konzentrierter Hg SO4 5 Gewichtsteile Wasser) zu, wobei man. um eine Er- wärmung zu verhüten, von Zeit zu Zeit kühlt. Ist die Lösung neutral, dann fügt man einige Tropfen KOH zu, um wieder deutüch alkalisch zu machen und fügt unter Umschütteln langsam V2 Volum 95°/oigen Alkohol zu. Der größere Teil des KoSO^ fällt als feines Pulver aus. Man saugt an der Pumpe ab und wäscht mit Alkohol (30 auf 100). Das Filtrat engt man auf Vs ein und fällt A^ieder mit Alkohol, saugt den Niederschlag von K2 SO4 ab, wäscht ihn und engt das Filtrat wieder ein. Dui'ch mehrmalige Wieder- holung dieser Operation kann man beinahe alles K2SO4 entfernen, wobei ^) P, Botircet, Recherches et dosage colorimetrkiue de petites quantit^s de Tiode dans les matieres organiques. Compt. Rend. 128. 1120 (1899). -) Gley et Bourcet, Pr^sence de Tiode dans le sang. Compt. Rend. 130. 1721/24 (1900). Methoden zur Aiifarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. ]{\\ das Jod, wenn welches vorhanden ist, sich in den alkalischen in Alkohol löslichen Teilen ansammelt. Die letzte Flüssigkeit wird in einer Nickel- schale eingedampft und der Kiickstand h'icht ge<,diiht, wobei die letzten Anteile organischen Materials zerstört werden. Den abgekühlten Kilckstand nimmt man in einem Minimum Wasser auf, filtriert und macht das .lod hei Gegenwart von CS« durch nitrose (Jase frei. Die Jiestimmung erfolgt kolorimetrisch nach den Angaben an anderer IS teile, ij IV. Untersuchung des Plasmas und Serums-^ auf einzelne Bestandteile. 1. Eiweißstoffe. Von Kiweil^körpern finden sich im Serum d'lasma) Serumalliumin, Serumglobulin, Fibrinogen, Fibrinoglobulin, Serumnukleoproteid und Serum- mukoid. Ihre Darstellung aus dem Plasma bzw. Serum sowie* ihre (luan- titative Bestimmung ist schon von Fr. Samuely im VA. -J die.ses Hand- buches in erschöpfender Weise i)ehandelt worden und es dürfte genügen hier auf die dort'') gegebene Darstellung zu verweisen. 2. Fette und fettartige Substanzen. a) IJestandteile der echten Fette. Zum Nachweis und zur Destimmnng von ..J^ett" aus Organen und Körperflüssigkeiten sind im Laufe der Zeit eine Iieihe von Methoden aus- gearbeitet worden, die alle im wesentlichen darauf ausgehen, mit Hilfe verschiedener Lösungsmittel die in den Organen usw. enthaltene Summe von Fett und fettartigeu Substanzen zu isolieren und dieses (iemenge in geeigneter Weise in seine verschiedenen Bestandteile — Neutralfett. Lezi- thin, Jecorin, Protagon usw\ — zu zerlegen. Die verschiedenen Methoden liefern bei Anwendung auf eine und dieselbe Substanz keine übereinstim- menden Resultate, und zwar hängt dies, wie KunuKjaiia und Suto *) in einer umfangreichen Arbeit gezeigt haben, jedenfalls zum Teil von der .\rt des Extraktionsmittels ab, das je nach den Umstanden mehr oder wenii^er von nichtfettartigen Substanzen mitlöst. 1) Dieses Ilaudlmcli. Bd. 1. S. 428 (1909). '-) Eine reinliche Scheidung der .Methoden zur UntersucluniL' von riasnia, von Serum und von Blut habe ich nicht durchführen zu müssen geplauht. Denn einmal wäre dadurch manche überflüssige Wiederholung nötig geworden, da ja die Aufarbeitung dieser drei Flüssiirkeitou im wesentlichen die gleiche ist und dann sind für manche Be- standteile nur .Mt'thodfii zum Nachweis etc. im Serum, für andere nur Methoden zur Isolierung aus dem Blut ausgearbeitet worden. Es erschien mir deshalb zweck maüiger, auch Methoden zur Isolierung einzelner Bestandteile aus dem lllut in diesem Abschnitt mit aufzuführen. ■') Dieses Handbuch. Bd. 2. S. 357 77 (1910). *) Kutuagawa und Suto, Ein neues Verfahren zur (|uantitativen Bestimmung des Fettes und der unverseifbaren Substanz in tierischem Material nelist Kritik einiger go- bräuclilichcr Methoden. Biochem. Zeitschr. 8. IVdWAl ( 19US|. Abderhalden, Handbuch der biochemischeo Arbeitsmethoden. V. 11 162 E. Letsche. „Was von den Bestandteilen des Ätherextraktes für das Fett charak- teristisch ist, das sind nur hohe, d. h. nicht flüchtige wasserunlösliche Fett- säuren.-' 1) Da sich deren Menge verhältnismäßig leicht feststellen läßt, arbei- teten KuDiagawa und Suto hierfür eine genaue Methode aus. Über die Be- gründung und Berechtigung dieses Verfahrens ist das Original nachzusehen.-) Das für pulverförniiges Material von Kumayaiva und Suto ange- gebene Verfahren hat Shimidzu^) zur Anwendung auf Blut (defibriniert), Blutplasma, Blutserum und Blutkörperchenbrei etwas modifiziert. Man ver- wendet zur Bestimmung der Fettsäuren in den angeführten Flüssigkeiten etc. folgende ..kombinierte Alkoholextraktion''.*) 10 on^ Blut (bei Blutkörperchen wohl ein entsprechendes Gewicht) werden mit der 4fachen Menge Qö^/oigen kalten Alkohols versetzt und der Niederschlag nach einiger Zeit abgenutscht. Der Rückstand wird im Heiß- extraktor^) mit absolutem Alkohol kochend extrahiert. Die vereinigten Alkoholfiltrate werden verseift (für 10 cm^ Blut verwendet Shimidzu 2 g Na OH), verdunstet, der Rückstand in wenig heißem Wasser aufgelöst und in folgender Weise nach Kuntagaira-Sufo^) w^iterbehandelt. ^) Man bringt die Lösung in einen hermetisch schließenden Scheide- trichter von ca. 250 cm^ Rauminhalt. Das Becherglas, in dem die Versei- fungsflüssigkeit verdunstet w^urde, wird 2 — Hmal mit ein wenig warmem Wasser (etwa 5 cm^) ausgespült. Nun wird die Mischung mit 30 cm^ 20Voigei* Salzsäure (11 D) tiberneutralisiert. Zu dem Zweck werden am besten nach dem Erkalten des Trichterinhaltes bis auf etwa 40 — 50« C zunächst 20 cdi'^ der Säure auf einmal hineingegossen, der Trichter dann tüchtig geschüttelt und mittelst Leitungswassers gut abgekühlt. Alsdann werden die übrigen 10 cm^ der Säure gegeben und ganz ebenso wie vorher behandelt. Es tritt dabei eine reichhche Ausscheidung auf. Nach guter Kühlung werden nun 1) Kumagaira und Suto, Ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Fettes und der unverseif baren Substanz in tierischem Material nebst Kritik einiger ge- bräuchlicher Methoden. Biochem. Zeitschr. 8. 250 (1908). ^) Kmnagaica und Suto, Ein neues ^'erfahren zur quantitativen Bestimmung des Fettes und der unverseifbaren Substanz in tierischem Material nebst Kritik einiger ge- bräuchlicher Methoden. Biochem. Zeitschr. 8. 340/46 (1908). ^) Shimidzu, Ein Beitrag zur Kumac/awa-Sutoschen Fettbestimmungsmethode. Biochem. Zeitschr. 28. 237/73 (1910). *) Shimidzu, Ein Beitrag zur Ku7nagawa-SutoschGn Fettbestimmungsmethode. Biochem. Zeitschr. 28. 261 (1910). 5) Dieser Heißcxtraktor ist ähnlich dem Bd. 1. S. 183. Fig. 363 beschriebenen Stockschen Apparat so eingerichtet, daß die heißen Dämpfe durch das Extraktionsgut treten und das Kondensat ebenfalls seinen Weg durch die zu extrahierende Substanz nehmen muß. ^)Ktiiu(i(iau-a und Suto, Ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Fettes und der unverseifbaren Substanz in tierischem Material nebst Kritik einiger ge- bräuchlicher Methoden. Biochem. Zeitschr. 8. 338 (1908). ') Im Rückstande des Blutes verblieben die Restfettsäuren in ganz minimaler Menge. Will man auch diese noch gewinnen, so wird man diesen Rückstand mit einigen Kubikzentimetern Na OH (20 5- in 100 cw") verseifen und jxd,ch. Ktimagmva-Suto mit dem obigen zusammen behandeln. Methoden zur Aiifarlieitung des lilutes in seine einzelnen Bestandteile. iHä 70 — 100 fm* Äthyliither hinziigef^eben und das (Jcinenge tüchti«^ goschiittolt. Trennung erfolgt meist sofort. Der Niederschlag verdichtet sich hierhei zu einer dünnen Schicht in der Mitte. Die klare wässerige Schicht wird nach einigen Minuten abgelassen. Der briiunlich gefärbte Äther wird vorsichtig in ein Beclierglas umgegossen und der Trichter mit Niederschlag 2nial mit ein wenig Äther (.') 40f>/r^) ausgespült. Der Niederschlag wird alsdann mit etwa 5 ctn^ Normalnatronlauge unter Schütteln nochmals aufgelöst und diese alkalische Lösung von neuem mit 30 — öOcw^ Äther tüchtig geschüttelt. Daim wird jene stark saure wässerige Lösung der ersten Schüttelung hineinge- bracht und nochmals gut geschüttelt. Die Reaktion wird hierbei sauer und die restierende Fettsäure geht hierdurch (|uantitativ in den Äther über. (Durch wiederholte Prüfung wurde festgestellt, dali sowohl in dem neu aus- geschiedenen, ganz geringen Niederschlage, wie auch in dem Spülwasser keine Spur Fettsäure mehr zurückbleibt.) Die vereinigten Ätheranszüge werden verdunstet, der lUickstand dann nochmals mit absolutem Äther aufgenommen, die Lösung durch Asbest filtriert und verdunstet. Dieses Ätherextrakt, welches auüer Fettsäuren, Farbstoff. Milchsäure noch andere Beimengungen enthält, wird jetzt bei 50" einige Stunden gut getrocknet und erst dann mit Tetroläther extrahiert. Zu dem Zwecke gielit man am besten auf den noch warmen Ätherrückstand sofort etwa 20 — ;»0 cni^ Petrol- äther unter sanftem Umschwenken des Becherglases allmählich auf. Es tritt hierbei in der Regel eine milchige Trübung auf. Das Becherglas wird jetzt mit einem Uhrglas bedeckt und V2 — 1 Stunde stehen gelassen, wo- bei der größte Teil der emulsionsartigen Ausscheidung sich als Harz am Boden niederschlägt. Hierauf wird der Petroläther durch Asbest abfilti-iert. das farblose Filtrat verdunstet und der Rückstand bei 50» bis zur Gewichts- konstanz, welche nunmehr in kurzer Zeit erreicht wird, getrocknet. Line genügende Trocknung des Ätherextraktes vor der Aufnahme desselben in Petroläther ist ganz besonders wichtig, will man die Fettsäuren in reiner farbloser Form erhalten. Die Ausführung der Methode ist äuüerst einfach. Hervorzuheben ist der Umstand, dali man mittelst dieser .Methode in einem Tage mehrere Bestimmungen mit Leichtigkeit ausführen kann. Die nach dei- Verseifungsmethode dargestellten Fettsäuren werden in einem Scheidetrichter mit etwa 50 — 70 cm^ Petroläther aufgelöst , hierzu wird " absolut alkoholische Kalilauge in einer solchen Menge zugesetzt, dali dieselbe etwa das :')0 — 40fache Volum des betreffenden l'etrolätherextraktes beträgt. Die Mischung wird einige Male tüchtig geschüttelt. Fs entsteht hier- bei stets eine absolut klare Auflösung. Hierzu wird genau ebensoviel Wasser aeKeben w'w die zugesetzte Menü-e der . -Kalilauge beträgt und das Ganze ein paar Mal geschüttelt. Indem hieidtinli die Konzentration des Alkohols auf ungefähr 50 Volumprozent sinkt, erlolirt jetzt sofort eine 11» jß4 E- Letsche. glatte Trennung der oberen Petroläther- und der unteren Alkoliolschicht. Dabei gehen die unverseifbaren Substanzen in den Petroläther über, wäh- rend die Seife in der unteren Alkoholschicht aufgelöst zurückbleibt. Die abgetrennte alkohoUsche Seifenlösung wird noch einmal mit 30 bis 40 cm^ reinem Petroläther geschüttelt. Die vereinigten Petrolätherauszüge werden verdunstet und der Rückstand dui-ch eine Nachbehandlung von geringen Mengen beigemengter Fettsäure vollkommen befreit. Zu diesem Zwecke wird das Petrolätherextrakt nochmals in wenig Alkohol aufgelöst, mit 0-5 bis 1*0 cm^ ^ alkoholischer Natronlauge versetzt , wiederum auf dem Wasser- bade verdunstet und 15 — 30 Minuten bei 100" getrocknet. Der Rückstand wird noch heiß mit Petroläther extrahiert, durch Asbest abfiltriert, ver- dunstet und nunmehr bei 100° C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der so isolierte Anteil stellt ein Gemenge von Cholesterin und noch un- bekannter unver seif barer Substanz dar. (Die Bestimmung des Cholesterins, am besten nach der Digitonin- methode von Windaus erfolgend, ist später beschrieben.) 1)) Jekorinartige Substanzen und Lezithin. Nach dem eben beschriebenen Verfahren wird nur die Summe der höheren Fettsäuren — gleichviel in welcher Form auch sie im Blut sich finden — bestimmt. Für viele Zwecke ist es nun aber von Interesse, einzelne dieser Kom- ponenten zu isoUeren; hierzu können folgende Verfahren dienen. Das von Drechsel zuerst aus Pferdeleber isolierte ., Je kor in" gewann Baldi^) nach folgendem Verfahren aus Blut. Das Blut wird aus der Karotis des Tieres (Pferd) in einem Gefäß aufgefangen und sofort mit absolutem Alkohol gut durchgeschüttelt. (Es ist hierzu mindestens das 3 — 4fache \'olumen des angewandten Blutes nötig.) Der feinflockige Niederschlag (aus etwa 7 / Blut) wird bei Zimmer- temperatur wiederholt mit Alkohol ausgezogen, so lange bis dieser nichts mehr aufnimmt. Die vereinigten Alkoholauszüge werden bei 70 — 80" ver- dampft und der dickflüssige Rückstand mit Äther, der die Hauptmenge des Rückstandes leicht löst, behandelt. Die Ätherlösung läßt man absitzen, fil- triert und fällt das Filtrat mit Alkohol. Der Niederschlag wird wieder in Äther gelöst, nochmals mit Alkohol gefällt und dieses Verfahren so lange wiederholt, bis in der Alkoholmutterlauge durch Ho PtClg kein Niederschlag mehr hervorgerufen wird — das Lezithin also entfernt ist. Der Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, getrocknet und steht dann ein gelb bis braun gefärbtes, sehr hygroskopisches Pulver dar, das beim Kochen mit Lauge Fehlingsche Lösung reduziert unter gleich- zeitiger Bildung von Seife. ^) Dario Baldi, Einige Beobachtungen über die Verbreitung des Jekorins im tierischen Organismus. Arch. f. Anat. u. Phys. 1887. Physiol. Abteil. Suppl. S. 100/108. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. J^ßf) Nach Mayer'^) stellt man Blutjekorin nach der Methode von Drrchfiel in foljxonder Weise her. l'/.^ — '2 1 frisches lilut werden mit der f>leiclien Men;.ie Alkohol liino^ere Zeit ^^eschüttelt (5 X Stniidcni. Mit dem Kückstand wird diese Prozedur noch ;»mal wiederholt und die vereini^^tcn Alkoliülauszüf^e werden sukzessive im Vakuumapparat bei einer Temperatur zwischen ;}8 und 40" abdestilliert. Der Al)dami)tunfisriickstand wird erst zur Entfernung von Lezithin und Fett mehrere Male mit absolutem Alkohol behandelt, bis dieser sich nicht mehr fiirhte und dann in wasserhaltigem Äther aufgenommen (1 Teil Wasser, 'A Teile Athen. Nach iM StunckMi — nicht früher, damit der Äther sich vollkommen klar absetzt wird fil- triert und die völlig klare Ätherlösung vorsichtig mit absolutem Alkohol versetzt. Das Jekorin fällt als weilUich gelber Niederschlag aus . der sich schnell absetzt, so dab die darüber stehende Flüssigkeit sich leicht abgieben läßt. Die Substanz wird dann sofort wieder in Äther gelöst und nach dem Filtrieren mit absolutem Alkohol gefällt. Nachdem diese Prozedur noch 4— 6mal wiederholt worden ist. wird das Jekorin mehrere Male mit absolutem Alkohol gewaschen und dekan- tiert und schlieblich im üecherglas mit den letzten Kcsten der anhaften- den Flüssigkeit in einen gut vakuumhaltenden Exsikkator gebracht und tagelang über Phosphorpentoxyd getrocknet. Wenn man besonders darauf achtet, dab die Atherlösungen vor dem Zusatz des absoluten Alkohols völlig klar sind, erhält man ein fast weißes Präparat, das in einem möglichst gut schliebenden (iefäli sich nur ganz wenig gelb färbt. Nach diesem Verfahren erhielt Mayer aus Rinder- und Pferdeblut N-, P-, S- und Na-haltige Substanzen, die auch nach dem Kochen mit Säuren kein Reduktionsvennögen zeigten. Die Substanz ist nicht hvgroskojjisch und löst sich in Wasser vollkommen klar mit schwach alkalischer Reaktion. Das Jekorin aus Hundeblut reduziert dagegen sehr stark, ist außer- ordentlich hygroskopisch und gibt alle für Leberjekorin charakteristischen Reaktionen. Beim Kochen mit NaüH entweichen ül)elriechende Dämpfe, die Flüssigkeit erstarrt nach längerem Kochen zu einer seifenartigen Gallerte — beides Reaktionen, welche — nach Mayer — das Pferde- und Rinderl)lut jekorin nicht zeigen. Um diese (oder ähnliche?) N-, P- und S-haltigen, reduzierenden Sub- stanzen in größerer zu eingehender rntersuchung ausreichender Menge zu erhalten, empfiehlt es sich, .sehr große IJlutmengen anfzuariieiten. Dabei ist man aber gezwungen, das Serum nach dem Knteiweißen im X'akuum zur Trockene einzudampfen.-) Dies gelingt in später zu beschreibender Weise ohne allzu großen Schwierigkeiten. ') F. Mayer, Über Blutjekorin und über das physikalisch-chemische Verhalten des Zuckers im I?lut. Bioch. Zeitschr. 4. .'i4n (1007). *) E. Lctschc, Beiträge zur Kenntnis d(>r (irganischen Bestandteile des Serums. Zeitschr. f. phys. Chem. 53. 31 (1907). iQß E. Letsche. Den vollkommen trockenen Rückstand extrahiert man zur Isolierung der Lipoide im Soxhlet mit Äther. Die etwas eingeengte Ätherlösung fällt man mit Azeton vollständig aus, löst den Niederschlag ^Yieder in Äther und fällt nochmals; dieses Lösen und Wiederausfällen wiederholt man im ganzen etwa 5mal. Dann löst man nochmals in Äther und fällt jetzt mit absolutem Alkohol. Niederschlag und Lösung trennt man mit Hilfe der Zentrifuge. Der Niederschlag ist in Äther auch feucht nicht mehr löslich; man löst ihn in wenig Wasser, fügt Alkohol zu, bis die sich einstellende Trübung zu einem Niederschlag sich verdichtet hat und trennt Nieder- schlag und Lösung wie oben mit Hilfe der Zentrifuge. Löst man den Niederschlag nochmals in HgO und sucht mit Alkohol zu fällen, so bleibt eine Fällung meist aus. entsteht aber sofort auf Zusatz von Äther zu der alkoholisch wässerigen Lösung. Man filtriert diesen Niederschlag auf einem gehärteten Filter ab, wäscht mit Äther gut aus und trocknet über H, SO4. Der graue bis gelbbraune Niederschlag zeigt alle Eigenschaften des Drechsel- schen Jekorins. Die vereinigten Mutterlaugen dieses ...Jekorins'' werden verdunstet, der Rückstand in Alkohol aufgenommen und diese Lösung mit HsPtClg versetzt. Der reichliche Niederschlag wird in Äther gelöst und durch Al- kohol aus dieser Lösung wieder gefällt; er stellt die Platinchloriddoppel- verbindung eines Lezithins dar. Handelt es sich darum festzustellen, ob in dem aus dem Serum oder Blut mit Hilfe von Äther oder einem ähnlichen Extraktionsmittel ausge- zogenen Gemenge auch der zweite wesentliche Bestandteil der echten Fette sich findet, so benutzt man für diesen Zweck am besten die von Tangl und Weiser^) ausgearbeitete Methode, die wir später beim Glyzerin noch auf- führen werden. c) Cholesterin, Cholesterinester und Oxycholesterine. Zur Prüfung auf freies Cholesterin und dessen Isolierung aus dem Serum verfuhr ich folgendermaßen'-): Das eiweißfreie Serum wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand so lange mit Äther extrahiert, bis nichts mehr auf- genommen wird. Diese Ätherlösung engt man etwas ein und versetzt sie mit Azeton, so lange noch ein Niederschlag entsteht. Man trennt den Niederschlag ab, löst ihn nochmals in Äther und wiederholt die Fällung mit Azeton; dieses Lösen in Äther und Wiederfällen mit Azeton wiederholt man zweckmäßig 3 — 4mal. Die Äther-Azetonmutterlaugen werden vereinigt und im Vakuum ein- geengt. Der Rückstand wird durch Schütteln mit Wasser von eventuell *) F. Tangl und St. Weiser, Über den Glyzeringehalt des Blutes. Pßügers Arch. 115. S. 155 (1906). ^) E. Letsche, Beiträge zur Kenntnis der organischen Bestandteile des Serums. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 53. S. 65 (1907). Methoden zur Aufarboitnng des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. 1(^7 vorhandenen wasserlöslichen Substanzen befreit. Sollten (lalx'i (ijc jn Wasser iiiilöslic'hen Bestandteile sich nur schwer und hin^'sam abscheiden, so kann man die Abscheidnn«^- durch Kochsalz/.usatz erleichtern und beschleunif^en. Man trennt die wässerige Flüssigkeit im Scheidetrichter ab ; sie reagiert in der Regel schwach sauer und kann somit Seifen, die Cholesterin in Lösung halten würden, nicht enthalten. Man wäscht die wasserunlöslichen Bestandteile wiederholt mit Wasser (oder eventuell Kochsalzlösunjji und nimmt sie in Äther auf. Diese Lösung trocknet man über Na-^SO, und läßt sie teilweise verdunsten ; durch vorsichtigen Zusatz von Alkohol zu der stark eingeengten Lösung erreicht man die Abscheidung fester Stoffe, die man auf Ton über konzentrierter H2SO4 trocknet. Die vollkommen wasserfreie, gelb gefärl)te Masse behandelt man in der Wärme mit wenig Alkohol ; dabei bleibt eine ohne weiteres Umkristallisieren reine, bei TG" schmelzende Verbindung zurück, die den nachher zu beschreibenden Pal- mitinsäurecholesterinester darstellt. Reim teilweisen Verdunsten der alkoholischeu Lösung fällt Cholcstcriu in den charakteristischen Tafeln aus; nach 2maligem Umkristallisiereu aus Alkohol ist es rein und schmilzt bei 144 — 145°. Aus etwa 30^ Serum (Pferdeblut) erhält man auf diese Weise etwa O30 g reines Cholesterin. Für die quantitative Restimmung ist das später beschriebene Verfahren von Windaus zu empfehlen. Zur Isolierung der im Serum vorkommenden Cholesterinester verfährt man nach Hürthle^) am besten in folgender Weise: Zur Darstellung des Öl sä urecholesteri nesters wird das Serum mit dem Hfachen ^'olum Alkohol von 96% gefällt (Alkohol I), gut durchgeschüttelt und über Nacht stehen gelassen. Dann wird die Flüssig- keit auf einer Nutsche abgesaugt und das Filtrat in die Kälte gestellt, wobei meist bis zum nächsten Tage einige Nadeln ausfallen, die aus Cho- lesterinoleat bestehen; ihre Menge ist jedoch sehr gering, so dad man das erste Filtrat füglich weggießen kann. Der von Flüssigkeit möglichst befreite Serumrückstand wird weiter mit Alkohol zerrieben, und zwar wieder mit der ;'>fachen Menge des ur- spriniglich verwendeten Serums (Alkohol II). Der Brei wird in eine Fla*?che gebracht und mindestens über einen, besser über "J — t) Tage bei ;14 — 40** extrahiert, wobei die Flasche häufig umzuschüttein ist.-) Nach dieser Zeit wird der Alkohol wieder abgesaugt und enthält nun fast die ganze Menge des im Serum vorhandenen Ölsäureesters in Lösung. Die Flüssigkeit wird nun in die Kälte gestellt, wo sie bahl trüb wird und bis zum nächsten Tage mit nadeiförmigen Kristallen erfüllt ist. die den Fster darsti'llen. War er in reichlicher Menge im Serum enthalten, so fällt ein Teil schcm bei Zimmertemperatur aus; um ihn vollständig zu gewinnen, ist es nötig, ') Jliirfhle, riiordie Fettsäurecliolesteiinester des Blntsoriims. Zoitsclir f. pliysiol. Chemie. 21. 331 (ISOö/ÜG). *) E. W. liroirn, A note du tlit- Cliolesterinesters of Hiids bloiui. Am. Joiirn. of Physiol. 2. 306 9 (1899) empfiehlt, einen langsamen Lnftstrom durchzuleiton. 168 E. Letsche. den Alkohol mit Wasser zu verdünnen und in der Kälte stehen zu lassen; die letzten Reste lassen sich aber nur durch Verdampfen des Alkohols gewinnen. ') Die aus dem Alkohol II gewonnenen Kristalle zeigen häufig wie der Alkohol selbst eine gelbliche Färbung und schmelzen zwischen o7 und 40". Zur Reindarstelluug werden sie ein oder mehrere Male bis zur Konstanz des Schmelzproduktes umkristallisiert, am besten wiederum aus Alkohol; man stellt die Kristalle mit Alkohol in den Wärmeschrank (40") und schüttelt öfters um; zweckmäßig ist es ferner, nicht gleich die ganze zur Lösung nötige Alkoholmenge zuzusetzen, sondern fraktioniert zu lösen, da der höher schmelzende Palmitinsäureester . falls er dem Präparat beige- mengt ist, als der schwerer lösliche erst in den 2. oder o. Alkoholauszug übergeht. Hat man zum Umkristallisieren nicht soviel Zeit zur ^'erfügung, so kann man die Kristalle auch in Äther lösen, filtrieren und das Filtrat unter beständigem Umrühren in heißen Alkohol, dem etwas Äther zugesetzt ist, einfheßen lassen. In diesem Falle ist aber darauf zu achten, daß der Ester nicht schon direkt ausfällt, denn dann kristallisiert er nicht mehr, sondern bleibt ölig. Die Kristallbildung geht sehr langsam vor sich und der Alkohol darf daher nicht zu rasch er- kalten und der Äther nicht zu rasch verdunsten. Niemals kristalhsiert der Ester auch in reinem Zustande so schneU wie z. B. das Cholesterin. Läßt man das 2. Alkoholextrakt des Blutserums (siehe Ölsäureester) stehen, so sieht man in manchen Fällen zuerst kleine Plättchen auftreten, welche auf der Oberfläche ein Häutchen bilden. Werden diese auf dem Filter gesammelt, so zeigen sie beim Trocknen starken Seidenglanz und einen Schmelzpunkt, der in verschiedenen Versuchen zwischen 70 und 80" C liegt. Dieser Körper stellt den Palmitinsäureester des Cholesterins dar: um ihn vollständig aus dem Serum zu gewinnen, muß man dasselbe, nachdem es schon zweimal mit Alkohol behandelt worden ist, mit einer Mischung von Alkohol und Äther mehrere Tage bei etwa 40« C extrahieren, so lange, als diese Mischung aus dem Serum noch etwas aufnimmt. Läßt man die ver- einigten Extrakte stehen, so kristallisiert zuerst der Palmitinsäureester aus und nachher häufig noch eine gewisse Menge des Ölsäureesters. Um den Zeitpunkt nicht zu verpassen, in welchem der Palmitinsäureester ausge- fallen ist und der Ölsäureester auszufallen beginnt, tut man gut, die ge- bildeten Kristalle zu wiederholten Malen zu sammeln und ihren Schmelz- punkt zu bestimmen. Zur Pieindarstellung werden die Kristalle in Äther gelöst und filtriert, das Filtrat bis zur leichten Trübung mit absolutem Alkohol versetzt und zur KristaUisation in die Kälte gestellt. Auch heißes Azeton eignet sich zum Umkristalüsieren des Palmitinsäureesters. ^) In manchen Fällen treten im Alkohol II vor der Bildung der langen Nadeln des ölsäureesters sehr kleine Nadeln oder Plättchen auf. welche zuerst ein Häutchen an der Oberfläche der Flüssigkeit bilden; sie müssen auf einem Filter gesammelt und getrennt aufbewahrt werden, da sie nicht den Ölsäure-, sondern den Palmitinsäureester des Cholesterins darstellen. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. ](',(] Handelt es sich um die quantitative Isolierunf,»- dieser Cho- lesterinester, so wird das Serum in der oben f^^'sciiildcrten Weise mit Alkoiiol und Äther vollständig extrahiert. Des weiteren verfährt man ^n-nan wie oben und dampft die alkoholisch-wässerif^en liösunj^cii d.inn ein. wobei man die letzten Keste Cholesteryloleat erhält, allerdin'::s auf Kosten schöner Kristallbildung'. '/.UV (juantitativen Bestimmung des Cholesterins wird man den Ätherextrakt erst verseifen und zur weiteren liehandlung zweckmäßig das \>rfahren von Bitter^) benützen, das so wie es für Fett verwendet wird, hier wiedergegeben sei.-) Etwa r)0 ,r/ Fett werden abgewogen, in eine etwa 1',,/ fassende I'or- zellanschale gebracht und hier mit lOO cw/r' Alkohol auf dem Wasserbad gekocht. Zu der Lösung- gibt man dann eine Natriumalkoholatlüsung . die man so herstellt. daU man 8^ Natrium ^j in 160 cm^ 99<'/oioCiii Alkohol ohne zu kühlen auflöst. Diese Alkoholatlösung gießt man unter beständigem Umrühren noch warm in die alkoholische Fettlösung. Man erwärmt dann noch einige Zeit auf dem Wasserbad, bis der Alkohol entwichen ist; hierauf fügt man das zirka 1' flache Gewicht des verwendeten Fettes an Kochsalz und so viel Wasser zu, daß der Inhalt sich ganz oder doch zum größten Teile autlöst. Dies ist wünschenswert, um eine innige Mischung der Seife mit dem Salz zu erzielen. (Das Salz muß natürlich so gereinigt sein, daß der Äther keine Stoffe aus demselben extrahieren kann.) Es wird iiiiii unter häufigem Um- rühren zur Trockene verdampft. Dies kann im Anfang direkt über einer kleinen Ga.sflamme geschehen; sobald aber ein ]>rei sich zu bilden beginnt, muß die Verdampfung auf dem Wasserbad fortgesetzt werden. Um die Masse ganz trocken zu erhalten, erwärmt man schließlich noch im Trocken- schrank bei zirka SO". Man beginnt dann mit dem Pulverisieren direkt in der Schale, sobald der Trockenheitszustand es erlaubt. Nachher wird die Masse noch weiter im Trockenschrank belassen und schlielilich zu einem feinen Pulver verarbeitet, das dann noch wann in einen Kxsikkator über konzentrierte Schwefelsäure gestellt wird. Alsdann schreitet man zur Ex- traktion in einem geräumigen Soxhictschvn Extraktionsai)])arat. Mit \orteil verwendet man die käuflichen, schon entfetteten Papierhülsen aus dichtem Filtrierpapier. Das in die Hülse gebrachte Seifenpulver bedeckt man mit einem entfetteten Wattebausch, um das Hinübertreten von Teilen des feinen Pulvers in die Flüssigkeit zu verhindern. Die Extraktion, welche mit gewöhnlichem Äther vorgenommen werden kann, soll ca. 0 Stunden dauern. Unten im Gefäß trübt sich der .\ther anfangs gewöhnlich ein ') Riffer, Clior die .Mctliodcn, die zur Alisclioidunir dor Cliolostoriii.- ;iii> den Fetten und ihrer quantitativen Bestimmung vcrwenditar sind, /eitsclir. f. idivsiol. Chemie. 34. 430 (1901/2). -) Ätherextrakt aus Serum liißt sieh in entspreciicnder NVeise verarhiiten. ') Die vom Petroleum herrüliremlen, dem Natrium anliaftenden oru'anisi luii IJesto müssen abgeschaht werden. 170 E. Letsche. wenig. Das rührt davon her, daß sich Glyzerin in fein verteiltem Zustande ausscheidet. In kurzer Zeit schlägt sich aber dieses Glyzerin am Boden und an den Wandungen des Gefäßes nieder, so daß die Lösung klar wird. Zur Entfernung noch vorhandener Spuren von Seife und Glyzerin gießt man den ätherischen Extrakt in einen ^/^ — 1 1 haltenden Erlenmeyer- kolben und wäscht mit frischem Äther einige Male nach. Durch dieses Umgießen hat man das in das Extraktionskölbchen übergegangene Glyzerin zum allergrößten Teile entfernt, indem es an den Wandungen des ersten Gefäßes festhaften bleibt. Der Äther wird dann abdestilliert und der Destillationsrückstand auf dem Wasserbad in ganz wenig Alkohol gelöst. Alsdann gießt man unter Umschwenken nach und nach so \iel Wasser zu, bis der Erlenmeyerkolben annähernd gefüllt ist. Man bringt die gefällte Substanz auf ein Papierfilter und wäscht mit reinem Wasser etwas nach. Nun wird der so gereinigte Körper im Filter getrocknet, indem man das- selbe in einem Trichter in einen Trockenschrank bringt und hier bei zirka 60" beläßt. Mit einem kleinen Spatel wird nun sorgfältig so viel als möglich von dem getrockneten Produkt in ein gewogenes Erlenmeyerkölb- chen gebracht. Die letzten Pieste des Cholesterins auf dem Filter spült man mit Äther in das gewogene Gefäß. Der Äther wird dann wieder ab- destilliert oder direkt verdunstet und der Piückstand im Trockenschrank bei 100 — 120" vollständig getrocknet und dann gewogen. Da diesem Ätherrückstand wohl immer noch andere Substanzen bei- gemengt sind '). empfiehlt es sich für gewisse Zwecke, auf den Rückstand eines der von Obermüller '^) oder Lewko witsch ^) angegebenen Verfahren anzuwenden oder das Cholesterin mit Hilfe der von Windaus *) aufge- fundenen Komplexverbindung von Cholesterin mit Digitonin zu isolieren und quantitativ zu bestimmen. Obcrmüller verfuhr so, daß er den beim \'erdunsten des Äthers bleibenden Ptückstand in Schwefelkohlenstoff löste, und so lange von einer bromhaltigen Schwefelkohlenstofflösung von bestimmtem Gehalt zusetzte, bis eine ins Gelbrot stechende Farbenerscheinung auftrat. Leivkowitsch gil)t folgende zwei Methoden an : Cholesterin wird mit der U/ofachen Menge Azetanhydrid am Rück- flußkühler gekocht, das Reaktionsprodukt auf dem Filter mit warmem Wasser gewaschen, bis die saure Reaktion verschwunden ist und das *) Das ergibt sich unter anderem aus den Angaben von Obermüller, Weitere Bei- träge zur quantitativen Bestimmung des Cholesterins. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 16. 143 (1892), der ein ganz ähnliches Verfahren zur Isolierung des Cholesterins anwendet wie Bitter und dabei durchschnittlich 11% mehr Cholesterin findet, als er zuvor zugesetzt hatte. -) Siehe bei 1. ^) Lewkowifsch, Zur quantitativen Bestimmung des Cholesterins. Berichte d. Deutsch. Chem. Gesellsch. 25. 65 (1892). ■*) Windaus, Über die Entgiftung der Saponine durch Cholesterin. Berichte d. Deutsch. Chem. Gesellsch. 42. 245 (1909). Siehe auch Windaus, Über die quantitative Bestimmung des Cholesterins und der Cholesterinester in einigen normalen und patho- logischen Nieren. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 65. 110 (1910). Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelneu Bestandteile. 1 7 1 Filter samt Niederschlag in einem Kolben mit einer genau gemessenen Menge titrierter alkoholischer KaHlösung gekocht. Das verbrauchte Alkali wird durch Zurücktitrieren des Überschusses bestiiiiuit. Für die Hercch- nuug ist zu berücksichtigen, daß 1 Molekül Cholesterin I .Vzetylgruppe bindet. Das Cholesterin wird in Chloroform gelöst (für o")// etwa oOcm^CHClj) und mit 25 c;»^ einer nach v. Hübl bereiteten Lösung von Jod und Sublimat in Alkohol versetzt. Der Cberschuli an Jod wird mit Thiosulfat znrück- titriert. da 1 MolekiU Cholesterin 2 Atome Jod addiert, ist die Berechnung eine einfache Sache. Diese Methode ist genauer und führt rascher zum Ziele, als die vor- her beschriebene Azetatmethode. Das genaueste Verfahren ist zweifellos das von W'uulaus'^) ausge- arbeitete, das darauf beruht, daß freies Cholesterin mit Digitouiu ein recht beständiges Additionsprodukt liefert. Es gestattet freies Cholesterin und Ester nacheinander in einer Portion zu bestimmen. Man verfährt folgendermaßen : Das zu untersuchende .Material löst man in der öOfachen Menge kochenden 95" „igen Alkohols und versetzt mit einer lo/oigen Lösung von Digitonin in Alkohol ('.'O"/,,), so lange noch ein Niederschlag entsteht. Nach mehreren Stunden wird auf dem Gooch- tiegel abgesaugt, mit Alkohol und Äther gewaschen, bei 100° getrocknet und gewogen. Aus der Menge A des Additionsproduktes läßt sich die Menge C des Cholesterins berechnen : A : C = 1539-06 : 38ß-35 2) oder C = A x 0-243 1 . Das Filtrat des Digitonincholesterids wird konzentriert, nach Zusatz von Wasser mit Petroläther oder Äther ausgeschüttelt ; das überschüssige Digitonin bleibt in der wässerig-alkoholischen Flüssigkeit . wähn-nd Chole- sterinäther. Fette und andere Lipoide in den Petroläther übergehen. .Man destilliert den Petroläther ab, verseift den Rückstand mit Natriumäthylat in der Hitze, isoliert das gebildete Cholesterin durch Ausschütteln mit Petroläther und bestimmt das Cholesterin nach der Digitoninmethode. ») Neben Cholesterin finden sich, wie Lifschütz*) gezeigt hat, auch noch sogenannte O.xycholesterine im Plut. Ihr Nachweis wird in folgender Weise geführt : ') A. Windaus, Über die ([uantitative BestimnuniL' des Cholesterins und der (holestcriiicster in oinitrfMi normalen und pathologischen Nieren. Zeitschr. f. i)hysiol. Chemie. 65. llU/117 (1910). -) M.-G. des Additionsproduktes beziehungsweise von Cholesterin. ^) Da das Digitonin recht wertvoll ist, cnipfielilt es sich, es jeweils wiederzu- gewinnen. Dies ist leicht möglich dadurch, daü man das Addifionsprodukt etwa 10 Stunden mit Xylol extrahiert (im Apparat von Stock, siebe Belichte d. Deutsch. Chem. Gesellsch. 39. 15)76 (1906), eine Abliildung findet sich dieses Handbuch. Bd. 1. S. 183. Fig. 363). wobei das Digitonin i|uantitativ in das .\ylol ülierL'cht. ^j Lifschütz, Die Oxydationsprodukte des ( holestcrins in den tierischen Organeu. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 53. 140 (1907). 172 E. Letsche. Frisches, noch lebenswarmes Rinderblut wird auf dem Wasserbad gut eingetrocknet. Die bräunlich schwarze, fast steinfeste Masse wird möglichst fein zermahlen und mit Benzin 6 — 8 Stunden lang extrahiert. Nach der Beseitigung des Benzins bleibt eine dunkelbraune, weiche, sehr dickflüssige und ziemlich klebrige Fettmasse zurück, die selbst über 100"' C zwar völlig klar durchsichtig ist, aber doch schwer beweglich und dick- flüssig bleibt. Sie betrug l'o — l'SVo vom Trockenblut. Die rohe Fettmasse wird nun mit alkoholischem Kali verseift. Nach dem Erkalten des Ver- seifungsgemisches scheidet sich eine erhebliche Menge kristaUinischer Sub- stanz aus. Das Gemisch wird, ohne vorheriges Filtrieren, mit etwa dem gleichen Volum Wasser vermengt, dreimal mit Äther tüchtig ausgeschüttelt und die vereinigten ätherischen Lösungen mit Wasser wiederholt gewaschen, bis sie gegen Phenolphtalein neutral reagieren. Nach dem Verdunsten des Äthers und Verjagen des Wassers mit absolutem Alkohol auf dem Wasserbade scheidet sich zunächst eine erhebliche Menge weißer, glänzender Plättchen aus, die unter dem Mila-oskop die bekannten Cholesterintafeln erkennen lassen und die nach dem völligen Eintrocknen der Substanz in einer wesentlich überwiegenden Menge hellgelber, fetter, amorpher Masse ein- gebettet sind. Den Nachweis, daß es sich bei dem Bückstand um ein Gemenge von Cholesterin und Oxycholesterinen handelt, führt man nach Lif schütz mit Hilfe der LiehemiannscheJi Cholestolreaktion und mit Hilfe der von Lifschütz angegebenen Essigschwefelsäurereaktion, die reines Cholesterin nicht gibt. Man stellt sie in folgender Weise an^): Man löst wenige Milligramme des Rückstandes in Eisessig (etwa 2 — 3 crn^) und setzt zur kalten Lösung 4 bis 5 Tropfen konzentrierter H.. SO^ zu. Dabei färbt sich die Lösung ohne Selbst- erwärmung schwach rotgelb, wird beim Stehen intensiv grün und zeigt alsdann ein sehr charakteristisches Absorptionsspektrum in Gestalt eines schmalen tiefdunklen Streifens im Bot zwischen C und d und eines ebenso schmalen, aber viel schwächeren Streifens auf D. Die Farbe hält sich 10 bis 15 Stunden und geht dann durch Grüngelb in Braungelb über. Das Spektrum aber ist selbst nach 24 Stunden noch scharf sichtbar. 3. Kohlehydrate. Zum Nachweis und zur Bestimmung des im Blut (Gesamtblut, Plasma oder Serum) sich findenden Zuckers sind eine Reihe von Methoden aus- gearbeitet worden, deren Unterschiede zur Hauptsache in der Art der Vor- bereitung der Lösung für die eigentliche Zuckerbestimmung liegen. Im folgenden ist auf diesen Punkt besonders Rücksicht genommen ; der Nach- weis und die Bestimmung des Zuckers erfolgt in jedem Falle nach Regeln, die schon an früherer Stelle -) beschrieben sind. *) Lifschütz, Beiträge zur Kenntnis der Zusammensetzung des Wollfetts. Berichte d. Deutsch. "Cbem. Gesellsch. 31. 1133 (1898). ^) Dieses Handbuch. Bd. 2. S. 85/183 ; speziell der Beitrag von B. Tollens und der von K. Grube. Metboilen zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. {~^■J Hat man die Aufnabo, den /uckor;,''ohalt des Blutes so wie es im Körper strömt, festzustellen, so ist es von wesentlicher Bedeutung, das Blut so aufzufangen, dali (ilykolvse nicht eintreten kann. I>ies erreicht man dadurch, dall man das Itlut direkt aus der Arterie oder Vene in Alkohol oder in einer heilien Salzlösung auffängt ; di(\so beiden Wege sin?schen Methode durch Wägung des ausgeschiedenen Knprooxyds. Alkohol zum Enteiweißen von Serum oder Blut verwendett'u Dastrc, Pavy und Siau u. a. Das Verfahren von Dastre'^) ist folgendes: Man läßt das Blut direkt aus\'ene oder Arterie in etwa die lifache Menge Alkohol einfließen. Man trennt den Niederschlag ab, preßt ihn aus. trocknet *) Wai/iiioufh heid , A method for the estimation of sugar in blood. .lourn. of Physiol. 20. BIG 21 (18%). '-) Ch. II. VosJ)uryh and A. X. h'icliards , On oxporimental study of tlie suirar content and extravascular coai/ulation of the blood after adniinistration of adfenalin. Amer. Journ. of Physiol. 9. 34 01 (l'.HK^I. *) J. F. B. Mac Liod, A comparison of tlie niethods of JUid and Sclinik for quantitative estimation of the reducing substance in blood. Journ. of biolog. Cliein. 5. 443'52 (1908,09). ••) Fr. Schenk, Über Bestimmunfr und rmsetznng des Blutzurkcrs. I'iiioitrg Archiv. 55. 203/11 (1894). Findet sich in diesem IIandl)uch Bd. 2. S. 184 beschriobon. ^) Die Masse schäumt l)eim Kochen unter l'mständen ziemlich stark. «) 70.9 Phosphorwolframsäure und 20 chc' Salzsäure von der Dichte 1. 12 ver- dünnt mau auf 1000 cw/'. ') Ä. Dastrc, Lanalyse do Sucre dans le sang. Arch. de lMi\ s \" 1 Ser. IM ). 1891 .'i33 46. 176 E. Letsche. ihn bei etwa 80" und zieht ihn wiederholt mit Alkohol aus, nachdem man ihn vorher fein zerrieben hat. Man verdampft die Lösung (am besten im Vakuum), sollte sie noch etwas gefärbt sein, so entfärbt man sie mit Tier- kohle, die zw'ar aus wässeriger, nicht aber aus alkoholischer Lösung Zucker adsorbiert. Den beim Eindampfen bleibenden Rückstand nimmt man mit Wasser auf, bringt diese Lösung bei Anwendung von 25 — 50 cni^ Blut auf 80 — 100 cm^ und führt in dieser Lösung die Zuckerbestimmung aus. Das an derselben Stelle von Dastre noch angegebene 2. Verfahren scheint mir keine Vorteile zu bieten. Es besteht darin , daß man mit Oxalat ungerinnbar gemachtes Blut tropfenweise in eine kochende, etwa lOVoige Nag S04-Lösung (4 — 6faches Volum des anzuwendenden Blutes), die man vorher mit Essigsäure angesäuert hat, einfließen läßt und dann Nieder- schlag und Lösung in gleicher Weise wie oben weiter behandelt. Das im folgenden zu beschreibende Verfahren von Pavi/ und Siau^) entspricht im wesentlichen dem von Ban(/ (siehe oben) angegebenen. Man läßt das Blut - etwa 30 c/y^^ — in die lOfache Menge Alkohol einfließen und läßt 24 Stunden stehen; nach dieser Zeit rührt man den Niederschlag auf und kocht den Inhalt des Becherglases im Wasserbad auf. Man kolliert, nimmt den Eiweißniederschlag vom Tuch ab und zerreibt ihn in der Reibschale zu einem feinen Pulver; das Pulver wird mit 100 bis 150 cm^ Alkohol nochmals aufgekocht, der Niederschlag abfiltriert und die ganze Manipulation nochmals wiederholt. Die vereinigten Filtrate engt man auf dem Wasserbad bei einer 60*^ nicht übersteigenden Temperatur unter vermindertem Druck ein bis zur Trockene. Zum Rückstand gibt man 10 c;;^^ Aluminiumhydroxydpaste 2) und 20 cm^ Wasser, kocht das Ganze auf dem Sandbad lebhaft auf, filtriert, bringt Filtrat und Wasch- wasser auf 100 cni^ und bestimmt den Zucker nach Pav>/s oder einer anderen ^lethode. Virtueller Zucker. Alle die bis jetzt beschriebenen Methoden verfolgen den Zweck, die Glukose, soweit sie im Blut frei oder nur in ganz loser Bindung sich findet, in möglichst reiner, vor allem eiweißfreier Lösung zu erhalten und dann zu bestimmen. Nach den Untersuchungen von Lepine vor allem findet sich im Blut noch sogenannter „virtueller" Zucker, der einer direkten Bestimmung nicht zugänglich ist. Man muß ihn vielmehr zuvor durch Hydrolyse in Freiheit setzen. Das Verfahren, das Lupine und Boulud ^) zum Nachweis und zur ^) F. W. Pavy and R. L. Statt, An experimental enquiry upon Glykolysis in drawn blood. Journ. of Physiol. 27. 451/56 (1901/02). ") Die Aluminiumhydroxydpaste stellt man aus Kalium- oder Ammoniumalaun durch Zugabe von Ammoniak her; man wäscht den Niederschlag alkalifrei und bewahrt den Niederschlag feucht bis zur Verwendung auf. Durch diese Paste werden die letzten Eiweißreste und auch Farbstoffe sicher entfernt. ") Lepine et Boulud, Sur le Sucre total du sang. Conipt. Rend. 147. 226/28 (1908); ferner: Sur le Sucre total du plasma et des globules du sang. Compt. Rend. 149. 583/86 (1909). Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandtoüp. ]77 Bestimmung dieses virtuellen Zuckers verwenden, ist im wesentliclu'n tol- lendes. In einem Teile des enteiwcitUen Hlutes bestimmt man den in freiem Zustande vorgebildeten Zucker nadi einem der erprobten Verfahren, in einer zweiten I'robe spaltet man den gebundenen Zucker ab, indem man das wie vorher erhaltene Extrakt unter Druck im Wasserbad erhitzt. Die Lösung enthiilt dabei Fluorwasserstoffsäure, und zwar geben Lupine und Boulud auf 500 an^ Flüssigkeit 5 cni'^ einer oOVoif^en Fluorwasserstoff- säure. Das Erhitzen dauert in der Regel 28 — 32 Stunden; dabei empfiehlt es sich aber, einige in gleicher Weise angesetzte Proben verschieden lang zu erhitzen. Die Probe, in der der Zuckerwert die höchste Höhe erreicht, ist die richtige. Erhitzt man zu kurz, so ist es möglich, daß noch nicht aUer Zucker frei gemacht wurde, und erhitzt man zu lange, so besteht die (iefalir, daß ein Teil des Zuckers wieder zerstört wird. Nach älteren Angaben von Lepine und Boiihul handelt es sich bei diesem virtuellen Zucker zum mindesten teilweise um (Uukuronsäure, denn sie sagend): ..Es kommt vor, daß der aus P)lut hergestellte Auszug, ohne daß er mit Säure in lierührung kam, bei der polarimeti-ischen Prüfung keinen Zucker anzeigt und höchstens eine ganz schwache Peduktionskraft auf- weist. Nach dem Kochen mit Säuren findet man eine deutliche Rechts- drehung und eine hohe Reduktionskraft. Unterwirft man den Auszug der Vergärung mit Bierhefe, so beobachtet man nach der \'ergärung eine Linksdrehung, die nach dem Kochen in eine Pvechtsdrehuug übergeht, wo- bei gleichzeitig eine wesentlich stärkere Ileduktionskraft zu beobachten ist. Ferner gelingt es aus dem Auszug mit Hilfe von p-Ih'omphenyihydrazin die für (ilukuronsäure charakteristische \erbindung zu erhalten." '» Glukuronsäure. Daß Glukuronsäure. die wohl auch Pavi/ und Siau als Phenyl- hydrazinverbindung in Händen gehabt haben'-), im Blut sich findet, ist durch P. Mayer sichergestellt. Er führt den Nachweis der Glukuronsäure in folgender Weise ^) : 2 / Ochsenblut läßt man möglichst frisch sofort nach dem Schlachten in die n(\ch Abeles *) vorbereitete Zinkazetatlösung einfließen (die Zinkazetat- lösung stellt man her aus einem dem anzuwendenden Plut gleichen \olum absoluten Alkohols und ^^/p vom Gewichte des Blutes an Zinkazetat. Die *) Lepine et Boulud, Sur l'acide glycuronique dans le sang du chien. Compt. Rend. 135. 139 40 (1902). -') F. W. l'anj and JL L. Siau, On tho nature of tho suir.ir prosont in niirraal blood, urine and niusele. Joiirn. of Phys. 26. 282 90 (1900 01). ^) P. Malier, t'ber eine bisher iiiil)pkanute reduzierende Substanz des liiiitos. Zeitschr. f. physiol. Chem. 32. öl 8/3(1 (1901). *) Äbfics, Über ein Verfaliren zum Entei weißen des Blutes für die Zuokerl'estim- mung. Zeitsclir. f. physiol. (heni. 15. 495 504 (1891». Abderh,-ildeii . llandhuch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. 12 178 ^- Letsche. trübe Lösung wird mit dem darin suspendierten ziemlich reichlichen Nieder- schlag direkt verwendet). Wenn die Mischung eine gleichmäßige schwarz- graue Masse bildet, in der sich keine roten Blutklümpchen mehr finden, verarbeitet man sie in folgender Weise weiter: Man filtriert durch ein mit Alkohol angefeuchtetes Filter, wäscht mit 90 — 95o/oigem Alkohol nach, bringt den Rückstand auf ein mit Alkohol angefeuchtetes Stück Leinwand und preßt mit der Handpresse scharf aus. Der Preßrückstand wird mit Alkohol zu einem feinen Schlamm zerrieben, filtriert und der Rückstand wieder ausgepreßt. Die gewöhnhch etwas trüben Filtrate werden zur Ent- fernung des überschüssigen Zinks mit einer konzentrierten Lösung von Na, GO3 (1:5) unter Umrühren bis zu schwach alkalischer Reaktion versetzt. Das ausfallende ZnCOä sowie das überschüssige ausfallende Nag CO3 klären die Lösung, die vollkommen klar und beinahe farblos filtriert. Eine im Filtrat manchmal nachträglich noch auftretende Trübung von ZnCOj wird durch Filtrieren entfernt und dieses Filtrat schließlich mit verdünnter Essigsäure bis zu schwach saurer Reaktion versetzt. Durch die wiederholte Behandlung der Rückstände mit Alkohol wächst die Flüssigkeit schließlich auf etwa 6^ an, die im Vakuum bei 40 — 50'' bis auf etwa 500 cm'^ eingeengt werden. Diese Lösung fällt man mit Bleiessig und Ammoniak, um alle störenden Körper möglichst zu entfernen. Der in H2O suspendierte Niederschlag, in dem der größte Teil des Zuckers und die zu isolierende Glakuronsäure in gepaarter Form übergehen, wird mit HgS zerlegt. Nach der Abtrennung des ausgeschiedenen Bleisulfids und der Ent- fernung des überschüssigen HoS durch einen Luftstrom engt man die Lösung wieder im Vakuum bis auf etwa Vs des Volums vor dem Zusatz von Bleiessig und Ammoniak ein. Diese Lösung erhitzt man unter Zusatz von so viel konzentrierter H2SO4, daß eine etwa l%ige Lösung entsteht, etwa 1 Stunde im Autoklaven, um die Glukuronsäure aus ihren gepaarten Verbindungen in Freiheit zu setzen. Man neutralisiert alsdann genau mit NaaCOg, versetzt mit einem Überschuß von p-Bromphenylhydrazinazetat (in unserem Falle etwa 3 g) und erwärmt im kochenden Wasserbad unter möglichster Vermeidung von Luftzutritt, i) Dies erreicht man am ein- fachsten dadurch, daß man über das in das Wasserbad gehängte Becher- glas eine Glasschale stülpt, so daß der über der Flüssigkeit befindliche Raum hauptsächlich von Wasserdämpfen erfüllt ist. Nach etwa 10 Minuten langem Erwärmen beginnt die Ausscheidung von Kristallen, die man nach dem Erkalten der Lösung an der Pumpe ab- saugt und mit absolutem Alkohol so lange wäscht, bis dieser farblos ab- ') Es ist dies notwendig, weil die p-Bromphenylh\ drazinverbindung der Glukuron- säure bei Wasserbadtemperatur gegen Sauerstoff empfindlich ist. Weiter ist zu beachten, daß die freie Glukuronsäure namentlich in warmer Lösung gegen Säuren sehr emp- findlich ist und man muß deshalb einen Überschuß an freier Essigsäure vermeiden. Das erreicht man am besten durch Anwendung von p-Bromphenylhydrazinchlorhydrat und der eben erforderlichen Menge Natriumazetat. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. 1 79 läuft. Die auf dem Filter bleibende, prachtvoll li(lit^''('lhe Verbindun^^ cha- rakterisiert .sich durch ihren Sclnnei/punkt (227 22!)'') und ihre l'idös- lichkeit in Alkohol als j^lukuronsaures p-Uroniphenyliiydrazin. Fruktose. Von Monosacchariden scheint auller (ilukosc nur noch I-iiiktosc im IJlut enthalten zu sein. Zum Nachweis von Fruktose im IJlut verfuhren Seuhery und Strauss^) folj^endermaßen: Das ülut wird sofort nach dem Austritt aus dem Körper mit Essifj- säure bis zur deutlich sauren Reaktion versetzt und auf^M-kocht. I)abei koaguHert die Hauptmenge des vorhandenen Kiweilles. man filtriert die Koagula ab und engt das klare Filtrat, das deutlich sauer reagieren nuilV im Vakuum bei einer 400 nicht übersteigenden Temperatur bis zum dünnen Sirup ein: die Iveaktion muH auch während (\e^ Kindampfens sauer bleiben. Der dünnflüssige Verdampfungsrückstand wird dann, unbekümmert um feste Ausscheidungen, die aus Salzen oder Albumin bestehen, mit halb so- viel Alkohol von 98" o^ wie das ursprüngliche Flüssigkeitsvolum betrug, auf dem Was.serbade ausgekocht. In etwa ö Minuten wird die Haujjtmenge der vorhandenen Fruktose ausgezogen; die erkaltete Lösung wird filtriert und das Auskochen mit Alkohol nacli F)efeuchten des Kückstaufles mit wenig Wasser wiederholt. Die vereinigten alkoholischen Auszüge werden nach eventuellem iioch- maUgen Filtrieren mit Tierkohle entfärbt. In einem ah(iuoten Teil be- stimmt man die Menge reduzierender Substanz und berechnet sie auf Lävulose. Den Hauptteil der alkoholischen Flüssigkeit engt man ein, setzt die für Lävulose berechneten ;> Moleküle Methyl])henylhydrazin zu, lälit einige Stunden stehen und filtriert, wenn sich ein Niederschlag gebildet hat. Dann fügt man dem Filtrat bzw. der ursprünglichen I>üsung die der angewandten Methylphenylhydrazinmenge gleiche Gewichtsmenge öC/oige Essigsäure zu und eventuell noch so viel Alkohol, bis die F'lüssigkeit ganz klar ist. Die.se wird schlielilich ;i — 5 Minuten auf kochendem Wasserbad oder besser 24 Stunden auf 40° erwärmt. Hei größeren Mengen Fruktose erhält man das Osazon direkt kri- stallinisch, eventuell nach Zusatz weniger Tropfen Wasser. Jiei geringen Mengen erhält man zunächst ein (')1, das beim Reiben fest wird. Am sichersten kommt man durch starke Abkühlung ( Kälte- mischung aus festem C().> und Äther) zum Ziel. Zu diesem Zweck trennt man das öl von der Mutterlauge, dekantiert es mit Wasser und trocknet es im Vakuum über H-^SOi. Dann löst man es in absolutem Alkohol, fil- triert und stellt die Lösung in die Kältemischung, wobei sofort die Aus- scheidung von Kristallen beginnt. Man saugt ab, wä.scht mit kaltem (Kfllte- ') C. Neuherfi und Strauss, Tber Vorkommen und Nachweis von Fruchtzucker in 4en menschlichen Körpersäften. Zeitschr. f. physiol. Cheni. 36. 232 (1902). 10* 180 E. Letsche. mischung!) Alkohol und kiüstallisiert aus heißem Wasser unter Zusatz von etwas Pyridin um. Beim Einengen erhält man das Osazon in sehr feinen gelblichen Nadeln von F. P. 158— 160°. Tierisches Gummi. Von Polysacchariden ist von Freund'^) sogenanntes tierisches Gummi aus Blut in folgender Weise erhalten worden: 4 l Ochsenblut werden unter Benutzung von Zn C O3 enteiweißt , der Niederschlag abfiltriert, mehrmals mit heißem Wasser aufgekocht, gewaschen und das Filtrat samt Waschwasser bei möghchst niederer Temperatur auf 1 l eingedampft. Man fällt dann nach den Angaben von Landwehr^) mit CuSO^ und Na OH das tierische Gummi aus, filtriert die Fällung ab, wäscht sie gut aus, löst sie in verdünnter Salzsäure und versetzt diese Lösung so lauge mit NH3 , als der Niederschlag von CuiOH)., sich noch löst; dann fügt man 3 Volumina 95Voig"en Alkohol zu und erwärmt auf 60". Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Alkohol gewaschen, in leicht mit Salzsäure angesäuertem Wasser gelöst, nochmals mit Alkohol gefällt und dann mit Alkohol und Äther gewaschen. Man erhält so ein gelblichweißes Pulver, das sich in HgO vollkommen klar löst, Pieduktionsfähigkeit aber erst nach dem Kochen mit Säuren zeigt. 'ö' 4. Extraktivstoffe. a) N-haltige Extraktivsnbstanzen. Harnstoff. Zur IsoUerung von Harnstoff aus Serum oder Blut verfährt man nach Hoppe-Seyler^) folgendermaßen: Frisches Blut wird mit dem 3 — 4fachen Volum starken Alkohols gut gemischt und diese Mischung 24 Stunden stehen gelassen. Man filtriert nach dieser Zeit, wäscht den Rückstand mehrere Male mit Alkohol und engt Filtrat und Waschalkohol bei mäßig hoher Temperatur, am besten im Vakuum, ein. Die erkaltete Lösung säuert man dann mit Essigsäure stark an, schüttelt sie mit Chloroform zur Entfernung von Fett, Phospha- tiden, Cholesterinestern, Seifen etc. aus, wäscht die Chloroformlösung mit Wasser und engt Hauptflüssigkeit und Waschwasser zur Entfernung von *) Freund, tJber das Vorkommeu von tierischem Gummi im normalen Blut. Zentralbl. f. Physiol. 6. 345 (1892). -) E. Lcindirehr, Ein neues Kohlehydrat im menschlichen Körper. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 8. 122/128 (1883/84). Man fügt zu der alkalischen Lösung CuSO^, so lange als das gebildete Cu(OH), sich noch löst ; beim Kochen dieser Lösung scheidet sich die basische Cu-Verbindung in bläulichweißen Flocken aus. ^) Hoppe-Seyler-Thierfelder, Handbuch der physiol. u. pathol. -ehem. Analyse. 8. Aufl. 1909. S. 651. Methoden zur Aufarbeitunir des Blutes in soino eiiizolneii licsuiadttile. lr- perflüssiixkeiten und Organen. Arbeiten aus dem path. Institut zu Boiiiii. FJorlin. IIirf Physiol. 12. 444 56 (1905). 186 ^- Letsche. Die Ausführung ist folgende: Das Blut wird direkt aus einem Blut- gefäß in einem Zentrifugenglas von 12 — 16 cm^ Faßraum aufgefangen. Man gibt etwas Quecksilber in das Glas , verstopft gut und defibriniert durch kräftiges Schütteln. Während man das defibrinierte Blut zentrifu- giert, beschickt man 2 Wägegläschen — J und B — von etwa 25 cm^ Faßraum mit je 1 crn^ klarer Ba(0H)2 -Lösung, 2 c/y^^ ausgekochtem Wasser und O'b cm^ einer l^/oigen Chlorbaryumlösung. In jedes Gefäß gibt man dann 1 crn^ Blutserum und in das Gefäß A noch o'ö cm^ einer lOVoigen Ammoniaklösung. Beide Gefäße w-erden gut zugestopft , das Gefäß A in einem Schüttelapparat geschüttelt und Glas 5 15 Minuten lang in einem Wasserbad auf 60" erwärmt. Dadurch wird alles Karbamat in Karbonat übergeführt. Dann kühlt man das Gefaßt ab, fügt seinem Inhalt noch S'bcm^ lOVoiges NH3 zu und schüttelt ebenfalls. Nach je ^^stündigem Schütteln bringt man den Inhalt jeden Glases in ein Zentrifugengläschen, verstopft gut und zentrifugiert 15 — 20 Minuten auf einer Zentrifuge mit hoher Tourenzahl. Von jedem Zentrifugenglas bringt man dann 7 ci>^3 (=:0-5 cm^ Serum) je in ein Gefäß des Barcroff-Hah/anescheu Apparats, gibt eine zur Neu- tralisierung beinahe hinreichende Menge gesättigter wässeriger Weinsäure- lösung hinzu — diese Menge muß durch eine vorherige Titration festge- stellt werden — und bringt je 0"25 tm^ Weinsäure in die Schälchen H des Apparates.^) Die Gefäße werden mit den Manometern verbunden und die Tem- peratur an einem Vio" angebenden Thermometer abgelesen. Ist die Tem- peratur in den Gefäßen konstant geworden, was durch die Manometer an- gezeigt wird, dann läßt man die Säure aus den Schälchen in die Flüssig- keit in A und B einfheßen und schüttelt die Gefäße kräftig. Ist alles Gas ausgetrieben, dann senkt man die Gefäße wieder in das Wasserbad, in dem sie vor dem Zugeben der Weinsäure aus den Schälchen sich befan- den und läßt sie auf die frühere Temperatur abkühlen. Man liest die Flüssigkeitsmenisken in den Manometern ab und macht die Berechnung folgendermaßen: Die Ablesung an dem Manometer B wird abgezogen von der an A (da die Gefäße A und B praktisch den gleichen Faßraum haben, so ist diese Subtraktion statthaft). Die Differenz multipliziert man mit dem Inhalt von Gasgefäßen und Meßröhren. Dieser letztere Wert dividiert durch 10.000 ^) gibt die Anzahl Kubikzentimeter CO2, die aus Karbamat stammen. 1 cin'^ COo (0°, 760 jinii) entspricht 0-0036 g Kalziumkarbamat (siehe auch Bd. 3 dieses Handbuches. S. 685/88.) *) Siehe Fig. 228, Bd. 3. S. 685. Die eingehende Beschreibung des Apparates und seiner Benutzung ist dort einzusehen. ^) Die Flüssigkeit in den Barometerröhren ist eine Lösung von Chromsäure in Wasser von der Dichte 1030. Wäre Wasser in den Manometerröhren, so wäre der Faktor mit dem zu dividieren, wäre der Barometerdruck in Millimeter Wasserdruck, d. h. die Zahl 10.300. Hat man aber eine Flüssigkeit von oben angegebenem spezifischen Ge- wicht, so ist nur eine Regulierung der Dezimalen erforderlich. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteil.-. ift,^ Kreatin. Den Nachweis von Kreatin im Blut zu führen ist nicht {,'anz leicht. Bei Anwendung von viel Serum habe ich mit folgendem Verfahren Erfolg gehabt.») Das Serum wird durch das ;ifache N'olum lM;%igen Al- kohol gefällt; nach etwa 'M] Stunden wird filtriert und der Niederschlag ausgewaschen. Die vereinigten alkoholischen Filtrate werden im Vakuum bei einer Temperatur von etwa 40 — 4i)° zur Trockene ('ingedami)ft. Der Trockenrückstand wird erst mit Äther, dann mit absolutem Alkohol er- schöpfend behandelt und das hierbei ungelöst Bleil)ende mit Wasser ge- schüttelt, bis dieses nach wiederholtem Erneuern nichts mehr aufnimmt (als Bückstand bleiben Eiweißreste). Die wässerige Lösung wird auf dem Wasserbad bis zur Bildung einer Kristallhaut an der Oberfläche eingeengt; durch Einleiten von gasförmiger Salzsäure in das Filtrat von dieser kri- stallinischen Ausscheidung bis zur Sättigung erreicht man die Abschei- dung einer groben Quantität anorganischen Materials (vor allem von NaCl-). Aus dem Filtrat entfernt man mit Hilfe von Kuprooxyd die Salz- säure und eventuell in Lösung gehendes. Cu durch H<,S und engt die Lö- sung möglichst weit ein, fällt mit Bleiessig und engt das durch H, S blei- frei gemachte Filtrat nach der Entfernung des PbS zum Verjagen der Essig- säure bis zur Trockene ein. Den Rückstand nimmt man mit Wasser (wenig) auf, versetzt mit Chlorzinklösung und erhält dabei die bekannten warzen- förmigen Kristalle von Kreatininchlorzink. Der Weg ist recht mühsam und führt nicht immer zum gewünschten Ziel. C.Voit gibt an 3): ..Ich habe im Kälberblut kein Kreatinin nach- weisen können, doch gelang es nach Neubauers Methode, das Kreatin quan- titativ zu bestimmen." Nähere Angaben finden sich nicht. Zur (juantitativen Bestimmung des Kreatins verfährt man nach MeUanhy^) folgendermaßen: Man fällt das Serum mit der etwa ;'.facheii Menge Alkohol, filtriert die Lösung nach einigem Stehen, wäscht den Niederschlag mit etwa OOVoifeP'ii Alkohol aus und engt die Filtrate bei einer 57" nicht überstei- genden Temperatur bis zur Trockene ein. Den Rückstand nimmt man mit Wasser auf und bestimmt in einem Teil dieser Lösung das eventuell vor- handene Kreatinin nach dem Verfahren von Folin. ■■) Einen anderen Teil bringt man nach dem Vorgange von Gottlieb und StaiK/assim/ir'') auf •) Letsche, Beitrai^e zur IveiiatiHS der organischcMi Hestandteilo des Serums. Zeitschr. f. physiol. Chem. 53. 107 (15)07). ■-') Dabei wird allerdings das Kreatin jedenfalls zum Teil, wenn nicht vollständig, in Kreatinin übergeführt. ^) ('. Voit, l'bor das Verhalten des Kreatins, Kreatinins uml Harnstoffs im Tier- körpcr. Zeitschr. f. Biol. 4. 77/162 (1868). *) E. Mrlinn/»/. Croatin and Croatinin. .Tourn. of l'hysiol. 3«. 447 87 ( l'.»()7 OS). *) Eine eingehende Beschreibung dieser Methode siehe tlieses Handbuch. IM. 3. S. 787. *) B. Gottlieb und Stau (jastiiii r/er. Über das Verhalten des Kreatins boi der Auto- lyse. Zeitschr. f. physi(d. Chem. 52. 1/41 (ll»07). 188 E. Letsche. einen Gehalt von etwa 2"2''/o HCl und erwärmt diese Lösung auf einem lebhaft kochenden Wasserbad etwa o Stunden. Dann bringt man die Lö- sung aus dem Erlenmeyerkölbchen , in dem sie erwärmt wurde, in eine Schale und dampft sie zur Trockene ein. Der Trockenrückstand wird in H2 0 gelöst, die Lösung mit natronalkalischer Pikrinsäurelösung versetzt, nach 5 Minuten in einen MelJkolben filtriert und auf das erforderliche Volum verdünnt. Von etwa ausgeschiedenen kohligen Zersetzungsprodukten filtriert man erst vor der Bestimmung ab und führt diese selbst nach den Angaben von Folin (siehe oben) aus. Harnsäure. Harnsäure scheint als normaler Bestandteil zwar im Blut der Vögel regelmäßig vorzukommen, im Blut der Säugetiere, auch des Menschen, aber zu fehlen. Dagegen tritt sie unter bestimmten pathologischen Um- ständen bei diesen auf und man führt ihren Nachweis dann in folgen- der Weisel): Blut — Serum oder Plasma werden genau entsprechend behandelt — wird auf das 3 — öfache mit Wasser verdünnt; die Mischung wird mit einigen Tropfen verdünnter Essigsäure (D = l'OoSö) eben angesäuert und im kochenden Wasserbad 2) koaguliert. Man läßt die Mischung etwa 15 bis 20 Minuten im kochenden Wasserbad, bis das Eiweiß in braunen Flocken sich zu Boden setzt, filtriert heiß und kocht den Rückstand wiederholt mit Wasser aus. Die vereinigten Filtrate engt man auf dem Wasserbad ein, filtriert einige neuerlich sich ausscheidende Eiweißflocken ab und fällt aus dieser Lösung die Harnsäure nach dem Verfahren von Salkowski- Ludwig. '^) Hat man von vornherein unter Beobachtung quantitativer Kautelen gearbeitet, so kann das Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Harnsäure dienen. Die in Arbeit zu nehmende Blutquantität richtet sich natürüch nach der zu erwartenden Harnsäuremenge. Schröder hat aus Blut von Gänsen bei Anwendung von nur etwa 60 cw3 Blut noch 6 mg Harnsäure erhalten. Fetren hat bei Verwendung von etwa 200 cm,^ Menschenblut (von Kranken) noch Harnsäure sicher nachweisen können, während v.Jaksch selbst in 300 cm^ normalem Menschen- *) Das Verfahren ist mit kleinen Abänderungen benutzt worden unter anderen von Schröder, Über den Harnsäuregehalt des Blutes und der Leber der Vögel. Beiträge zur Physiol. C.Ludwig gewidmet. Leipzig 1887. S. 93. — K. Pefren, Über das Vorkommen von Harnsäure im Blut bei Menschen und Säugetieren. Arch. f. exp. Path. u. Pharm. 41. 267/69 (1898). — v. Jaksch, Über die klinische Bedeutung des Vorkommens von Harn- säure und Xanthinbasen im Blut, den Exsudaten und Transsudaten. Zeitschr. f. Heilk. Bd. 11. 415 42 (1890). ^) Andere verdünnen stärker (bis zum lOfachen Volum) oder koagulieren durch Kochen auf dem Drahtnetz und fügen die Essigsäure erst der zum Kochen erhitzten Lösung zu. ^) Das Verfahren findet sich genau beschrieben: Dieses Handbuch. Bd. 3. S. 888. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. 1h9 blut keine Spur von Harnsäure mit Hilfe des angegebenen Verf.ilirciis nai finden können. Brugsch und Schittcnhdm'^) bereiten das Blut zur l'ntersuchung auf Harnsäure und ihrer quantitativen Bestimmung nach dem N'erfahren von Ludtvicj-SalkoH'ski oder nach dem Verfahren von Krihjir- Sihnid-) in folgender Weise vor: Das aus einer Vene (oder Arterie) strömende Blut wird mit Ammon- oxalat (O'o (j auf '200 cni^ Blut) aufgefangen. Durch Tnirühren mit ein<'m Glasstab sorgt man für innige Mischung des Salzes mit dem Blut und verhindert so die (Jerinnung. Man zentrifugiert und hel)t das riasma dann ab. (Will man auch die Blutkörperchen auf Harnsäure untersuchen, .so werden sie mit 0"9%igPr Kochsalzlösung, der etwas Ammonoxalat zuge- setzt ist, gewaschen.) Die Knteiweißung geschieht in der W\'ise, dal» man das Plasma (Serum oder Gesamthlut, auch P>lutkörperchen) in das mehr- fache Volum kochender ' oVo^ger KH.J'O^-Lösung einflieiien liilit; das Koaguhim wird nach dem Abfiltrieren mit heißem Wasser ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate werden auf dem Wasserbad stark eingeengt und diese Lösung zur Bestimmung der Harnsäure verwendet. Die zweite Ai't der Enteiweißung, das P)lut in etwa öVoige niit Essig- säure angesäuerte siedende NaCl-Lösung einfließen zu lassen, scheint mir besonders bei Verwendung der Luduig Salkoivskischon Methode dci- Ilarii- säurebestimmung der großen NaCl-Quantitäten wegen nicht besonders empfehlenswert zu sein. Für große Blutmengen — mehrere Liter — ist nach Brugsrh und Schittenhelm^) folgendes Verfahren zur EnteiweiTiung zu empfehlen: Man läßt das Blut in etwa 2 — oVoige Koli-Lösung - ein dem an- zuwendenden Blut mindestens gleiches Volum — einfließen , erhitzt die Mischung auf dem Drahtnetz zum Kochen und koaguliert durch tropfen- weisen Zusatz von verdünnter Essigsäure; will man ganz sicher sein, alle Harnsäure aus dem Koagulum zu entfernen, so trägt man dieses nochmals in etwa öVoig"^ Kalilauge ein und verfährt nochmals in gleicher Weise wie anfangs. Die Filtrate engt man dann ein und führt den Nachweis oder eventuell die quantitative Bestimmung nach einer der oben angegebenen Methoden zu Ende. Hypoxanthin. \'on Verbindungen, die der Harnsäure nahestehen, hat Salkuirski in leukämischem P)lut Hypoxanthin nach folgendem Verfahren nachgewiesen.*) *) Th. Bnnjsck und A. Schittinlulni, Zur Stoffwechselpathologio der (liclit. Zeit- schrift f. exp. Path. u. Ther. 4. 4;}8/45 (1007). -) Beschreibung tler Methode siehe dieses Handbuch. Bd. 3. S. 88.i. Itruijsch und SchittetihcJin geben dieser Metliode den Vorzug. ^) Brugsch w. Schittetihclm , Zur Stoffwechsclpatlrologif der (iirbt. Zeitsfhr, f. experim. Path. u. Ther. 4. 438 45 (1907). ■•) Sftlkoirslci ,'*i'Rc\{Yi\]iQ zur Kenntnis diT I.i'ukaniic. \irr/i(> <>:ewaschen. nach Zusatz von weni},^ Wasser alidcstil- liert und der gelbe ölige Rückstand mit NII3 bis zur schwach alkalischen Reaktion versetzt. Ungelöst bleibt das Amid der [i-Naphtalinsiilfosaure, das man durch 2 — omaliges Ausschütteln mit Äther entfernt. Aus der schwach ammoniakalischen wässerigen Lösung scheidet man durch HCl die Naphtalinsulfoverbindungen ab, schüttelt sie mit Äther aus, wäscht die Ätherlösung mit Wasser und destilliert schließlich den Äther nach Zugabe von wenig Wasser ab. Der Rückstand wird mit Wasser auf etwa .'>(.» cm'^ gebracht, auf dem Wasserbad erwärmt und das VuLrelöste abfiltriert. Das erkaltende Filtrat wird mit [i-NaphtalinsulfogiykokoU geimpft: die Ausschei- dung erfolgt dann rasch und wird im Eisschrank vervollständigt. Der bei der ersten Rehandlung mit Wasser ungelöst bleibende Rück- stand wird ein zweites und eventuell noch ein drittes Mal mit wenig Wasser erwärmt und heiü filtriert. Durch wiederholtes Umkristallisieren ist das [i-Naphtalinsulfogiyzin zu reinigen. Bemerkenswert ist. daß das von Amid befreite IJohjjrodukt in alko- hohsch-ammoniakalischer Lösung die Ebene des polarisierten Lichtes nach rechts dreht. Es enthält also das Rohprodukt zweifellos die Naphtalin- sulfo Verbindung entweder einer höheren Aminosäure oder einer poly- peptidartigeu Substanz. Weniger glücklich als Bingel war Hotvell^), der ebenfalls die ^i-Naph- talinsulfochloridmethode anwandte, zur Enteiweißung aber ein \"crfahren benutzte, das in anderen Fällen vielleicht gute Dienste leisten kann. Er trennt die Aminosäuren durch Dialyse ab und verwendet dazu Kollodium- membranen, die er in folgender Weise herstellt: Man stellt sich eine etwa 5 — 67oi^e Lösung von Schießbaumwolle in einem Gemisch von gleichen Teilen absolutem Alkohol und .Vthcr her und gießt die Lösung in einen Erlenmeyerkolben von dem Faßraum, den die Membran etwa haben soll (Houell wandte solche mit 2öü cm^ Inhalt an). Unter gleichmäßigem Rotieren des Kolbens verteilt man die Lösung über die innere Oberfläche des Kolbens und läßt unter beständigem gleich- mäßigem Drehen den Überschuß wieder ausfließen. Das Drchcu muß einige Minuten fortgesetzt werden, bis die Schicht, welche die (ilaswandung be- deckt, oberflächlich trocken geworden ist. Die Flasche wird jetzt mit Wasser gefüllt, die Membran am Kolbenhalsrand mit Hilfe eines Messers abgelöst und mit Hilfe eines Glasstabes oder eines Spatels vorsichtig auch ein Stück weit von der Wandung des Halses losgelöst. Man entleert jetzt die Flasche und kann die ganze Membran be(iuem 1os1ös(mi. dadurch, daß man einen Wasserstrom zwischen (ilaswand und Membiau fließen läßt. M W. H. Jlowell , Note upon the presence of aniido aoids in the Mood and lymphe as detcrmiued bv the ß-Naphtalinsulfochloride reaotion. Am. Journ. u£ rbjsiol. 17. 273 79 (1906,07). 192 E. Letsche. Ist die Membran auf diese Weise losgelöst, so läßt sie sich, ohne Schaden zu nehmen, aus dem Kolben herausziehen; bis zum Gebrauch bewahrt man sie unter Wasser auf. Für die Dialyse kittet man in die Öffnung dieser „Kollodiumflasche" mit Hilfe von Kollodium eine Glasröhre von 30 bis 40 cDi Länge und sichert diese Verbindung durch Umwickeln mit Bind- faden. (Das Rohr hat den Zweck, zu verhindern, daß beim Zunehmen der Flüssigkeitsmenge in der „Flasche" infolge des osmotischen Druckes der Inhalt überfließt.) Die „Flasche" beschickt man mit Blut oder Serum, hängt sie in ein Gefäß mit 2 — 4 l Wasser und dialysiert 5 — 24 Stunden. Das Dialysat, in dem die Aminosäuren sich finden müssen, engt man auf 50 — 100 cm^ ein und benutzt die eingeengte Flüssigkeit direkt für die Reaktion mit ß-Naphtalinsulfochlorid. i) Zur Entfernung der Aminosäuren aus dem Serum (Blut) genügt es, 5 — 6 Stunden zu dialysieren ; dialysiert man länger, so trübt sich die sonst klare Flüssigkeit infolge des Durchtrittes von etwas Globulin. Aus Serum von einem Fall von akuter Leberatrophie haben Neu- berg und Richter Leucin und Tyrosin in folgender Weise isoliert. 2) Das abgehobene Serum heß beim Stehen im Eisschrank über Nacht Tyrosin in beinahe vollkommen reinem Zustande ausfallen. Das Filtrat dieser spontanen Kristallisation wird mit Essigsäure bis zu eben wahr- nehmbarer saurer Reaktion versetzt und diese Flüssigkeit in etwa das öfache Volumen kochend heißen Wassers einfließen gelassen, und zwar nur so rasch, daß das Kochen nicht unterbrochen wird. Man filtriert, wäscht das Koagulum mit heißem Wasser aus und engt die vereinigten Filtrate auf etwa 20 cm^ ein. Dieser vollkommen eiweißfreie Sirup ist nach 48 Stunden zu einem Kristallbrei von vorwiegend Leucin und wenig Tyro- sin erstarrt. Man rührt den Brei mit 10 cm'^ Eiswasser an und saugt die Kristalle ab. Tyrosin und Leuzin werden durch kochenden Alkohol ge- trennt, wobei Leuzin in den Alkohol geht und beim Verdunsten des Al- kohols in reinem Zustande zu erhalten ist. Das Filtrat von Leuzin und Tyrosin wird nach dem Verfahren von Kossei und Kutscher^) auf Lysin, Arginin und Histidin untersucht, wobei sich das Vorhandensein von Lysin in ziemhch reichlicher ]\Ienge und das Fehlen von Arginin und Histidin ergab. Proteinsäuren.*) Zu den N-haltigen Extraktivsubstanzen sind schließlich auch noch die Proteinsäuren, deren Nachweis und Isolierung aus dem Blut in folgender Weise gelungen ist, zu rechnen. ^) Die weitere Verarbeitung ist die gleiche ^Yie bei Bingel. -) Neuler g und Richter, t)ber das Vorkommen von freien Aminosäuren im Blut bei akuter Leberatropbie. Deutsche med. Wocheuschr. 1904. S. 499. ^) A. Kossei und Fr. Kutscher, Beiträge zur Kenntnis der Eiweißkörper. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 31. 165 (1900). Eine genaue Beschreil)ung der Methode samt ihren Verbesserungen findet sich in diesem Handbuch. Bd. 2. S. 498 ff. •*) Broirinski, Über die Gegenwart von Proteiusäuren im Blut. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 58. 134/46 (1908). Metlioden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzclnon Ik-strind».!!.. Dcfihriniertes Pferdeblut wird /iir Ahtreiimui^' der Fonneleiiicnte ausgeschleudert. Das abgchohene Serum verdünnt man mit dem gleichen Volum Wasser, säuert mit Kssii^säure an und entfernt durch Ilitzekoagu- lation die Kiweilikörper. Der Kiweiliniedcrschlag- wird kollicrt, ansgeprellt und mit Wasser nochmals aufgekocht. Ihc. \ ereinigten l'iltratc werden im Vakuum eingeengt, die eingeengte Flüssigkeit nochmals unter Zusatz von etwas Essigsäure aufgekocht und wieder filtriert. Sind dir eben erwähnten Manipulationen richtig ausgeführt, so enthält die Flüssigkeit nnr noch Si)uren von Fiweiß. Die aus etwa 100 1 Serum erhaltene Flüssigkeit wird bei essigsaurer Ileaktion solange mit Quecksilberazetat versetzt, als noch ein Niederschlag entsteht. Dieser Niederschlag (I) enthält Crochrom iiml Antoxyproteinsäure. Das Filtrat dieses Niederschlags wird mit Soda und Quecksilber- azetat bis zum Auftreten von gelbem (.»uecksilbero.xvd versetzt: Nieder- schlag II enthaltend Oxy- und Alloxyproteinsäure. Niederschlag I wird durch H.,S zerlegt, das HgS abfiltriert und d3 wiid im \'akuum ein- geengt und aus dieser Lösung das Baryumsalz der Antoxyproteinsäure durch Zusatz von Alkohol gefällt. Zu weiterer Beinignng löst man das I'>aryumsalz in HoO, versetzt die Lösung mit der zur Ausfidlung des Baryums eben notwendigen Menge von Na. SO4. fällt mitAgN(>3 vorsichtig das in der Lösung sich findende Chlor aus und fügt dann zur AnsfiUlunR der Antoxyproteinsäure als Silbersalz AgNOj zu. Abderli aldon , Handbuch der biochemischen Arboitsmothodpo. V. 13 194 E. Letsche. Zur Untersuchung auf Oxy- und Alloxyp rotein säure wird der wie oben beschrieben erhaltene Niederschlag II verwendet. Durch H2 S entfernt man das Quecksilber; aus dem Filtrat vom HgS verjagt man den Schwefelwasserstoff durch einen Luftstrom und gibt zu der Lösung Ba (ÜH)2 ; den Überschuß entfernt man durch Kohlensäure und fügt zum Filtrat vom BaCOs Bleiessig, wodurch AUoxyproteinsäure gefällt und von Uxyproteinsäure getrennt wird. Der Bleiniederschlag wird mit Oxalsäure (soviel bis Kongopapier blau wird) zersetzt; dem Filtrat fügt man Ba(0H)2 zu, entfernt den Überschuß an letzterem durch Kohlensäure und engt das Filtrat vom BaCOg auf wenige Kubikzentimeter ein. Durch Eintragen dieser Lösung in starken Alkohol wird alloxyproteinsaures Baryum gefällt, das man wie oben bei der Antoxyproteinsäure beschrieben in das Silbersalz überführt. Aus dem Filtrat vom Bleiniederschlag der Alloxyproteinsäure , das die Oxyproteinsäure enthalten muß, fällt man durch Nag CO3 das Blei; zum Filtrat vom basischen Bleikarbonat fügt man Quecksilberazetat bis zum Gelbwerden (von Hg 0) der Fällung. Dieser Niederschlag wird in der bei der Antoxyproteinsäure beschriebenen Weise in das Baryumsalz und dieses in das Silbersalz übergeführt. Über die Charakterisierung dieser Säuren ist die von Bona ^) in diesem Handbuch gegebene Darstellung nachzusehen. Dort findet sich auch eine Methode beschrieben zur quantitativen Bestimmung der Proteinsäuren im Blute. 2) b) N-freie Extraktivsubstanzen. Milchsäure. Zur IsoUerung und gleichzeitigen quantitativen Bestimmung von Milchsäure im Blut verfahren Saito und Katsuyama^) folgendermaßen: Das gewogene Blut wird mit dem 6fachen Volumen 96Voigen Alkohols versetzt und nach 12stündigem Stehenlassen unter zeitweisem LTmrühren abfiltriert. Der Rückstand wird noch 4— 5mal mit Alkohol (96 Vo) aus- gezogen und ausgepreßt. Aus den vereinigten Alkoholauszügen wird der Alkohol abdestilliert, der Rückstand in wenig Wasser aufgenommen, mit einigen Tropfen Soda- lösung schwach alkalisch gemacht und zur Entfernung der Fette etwa 5mal mit Äther geschüttelt. Die entfettete Flüssigkeit wrd mit dem gleichen Volum mäßig verdünnter Phosphorsäure angesäuert und 6mal mit dem öfachen ^'olum Äther geschüttelt. Der nach dem Abdestillieren des Äthers zurückbleibende Sirup wird mit Barytwasser neutralisiert, ein ») Dieses Handbuch. Bd. 3. S. 819 (1910). *) Dieses Handbuch. Bd. 3. S. 823 (1910). *) Saito und Katsuyama, Beiträge zur Kenntnis der Milchsäurebildung im tierischen Organismus bei Sauerstoffmangel. Zeitschr. f. physiol.' Chem. 32. 214/30 (S. 217) (1901). I Methoden zur Aufarl)citun),f dos Blutes in seine einzelnen Bestandteile'. nj^j hierbei entstehender Niederschlafj:' abfiltiicrt und aiisf^e waschen. I)ie {ge- samten Filtrate werden nach dem Ausfällen des Baryts mit verdünnter H2SÜ4 auf dem Wasserbad konzentriert und mit Äther erschöpft. Von den klar abgegossenen Atherextrakten wurde der Äther al)destilliert. der liück- stand mit Wasser und überschüssigem /inkoxyd gekocht, heili filtriert und gut ausgewaschen. Die filtrierte Losung wurde in einem gewogenen Schillchcn auf dem Wasserbade auf ein kleines A'olumen verdunstet und unter /usat/. von einigen Tropfen Alkohol zur Kristallisation stehen gelassen. Ganz ähnlich verfahren auch andere Untersucher bei der Isolierung; eine kleine Abänderung, die vielleicht eine kleine Abkürzung der Arbeit bedeutet, hat Loekemann^) getroffen. Er verfährt bis zum Verdunsten des die Milchsäure enthaltenden Äthers genau wie Salto und Kdtsuyanut. I>ann aber ist sein Verfahren folgendes : Der beim Abdestillieren des Äthers bleibende Kückstand wird mit HgÜ aufgenommen und diese Lösung mit PbCüa (das frei von löslichen Bleisalzen sein soll) einige Zeit erwärmt. Man läßt abkühlen, filtriert, entbleit 2) das Filtrat mit H., S, entfernt aus dem neuen Filtrat vom l'bS den H, S durch Erwärmen der Lösung auf dem Wasserbad und entfärbt das Filtrat, falls es noch gefärbt sein sollte, mit 'J'ierkohle. Dann kocht man die Lösung längere Zeit mit ZnCOj, filtriert heiß und läßt das Filtrat im Vakuum über H, SO4 verdunsten, wobei das /inklaktat in Kristallen sich ausscheidet. Äthylalkohol. Äthylalkohol hal)en Jolli/ und Food in normalem Blut nachweisen können. JoUy ^j wendet zum Nachweis folgendes Verfahren an : 500 .r/ Rinderblut werden mit dem doppelten Gewicht einer gesättigten Nag SOi-Lösung versetzt, das Ganze gut gemischt und sofort einer lang- samen Destillation unterworfen. Man läßt etwa öOcy/zMibergehen und i)rüft in diesem Destillat auf Alkohol durch vorsichtigen Zusatz einer verdüuiiten Chromsäurelösung, die gestattet, Alkohol noch in einer Verdünnung von 1 : 5000 nachzuweisen. Ein Teil des Destillats dient zur Herstellung von Jodoform und schließhch verwendet man eine Probe zur Herstellung des nach Ananas duftenden Athylbutyrats. Food*) läßt das Blut ohne Zusatz und sucht durch wiederholte Fraktionierung möglichst reinen Alkohol zu erhalten. Kr erhitzt Blut so ') Locl-cmann, Nachweis von Fleischniilrhsäure im Blut, T'rin und Zendirospinal- flüssigkeit eklauiptisclier Frauen. Deutsche med. Wochensclir. 53. 2W (ISKM")). *) In manchen Fallen soll nach Angahen von Locktmaiin mit H, S kein Nieder- schlag entstehen. Die Intersuchung mulJ aber trotzdem in der angegebenen Weise weitergeführt werden. ^) JoUi/, Sur l'oxydation du glucose dans le sang. Compt. Rend. 137. 771/72 (1903). *) W. Hutson Food, Note on thc presence of alcohol in nnrinal blood and tissiies and its rolation to calorifaction. Journ. of l'hysiol. 34. 430/43 (IDOG). 13* 196 E. Letsche. rasch als möglich auf 100" und destilliert dann aus einem Kochsalzbad so lange, bis eine genügend scheinende Menge übergegangen ist. Dieses erste Destillat wird durch mehrmaliges — bis zu 12 Mal — Fraktionieren ge- reinigt, bis man schließlich 1 — 'dcm^ eines neutralen farblosen Destillats erhält, das durch seine Brennbarkeit, sein Verhalten gegen verdünnte Chromsäurelösung, durch die Bildung von Jodoform- und Äthylbutyrat als Äthylalkohol sich charakterisiert. * Glyzerin. Neben freiem Äthylalkohol findet sich auch der biologisch wichtigste dreiwertige Alkohol, das Glyzerin, in freiem Zustande im Blut. Die Bestimmung geschieht am besten nach dem Zeisehah&w Jodid- verfahren i) unter Einhaltung der zur Vorbereitung des Blutes für diesen Zw'eck von Tangl und Weiser -) angegebenen Vorschriften : 1 kg Blut (ganz ebenso gestaltet sich natürlich das Verfahren auch bei Verwendung von Plasma oder Serum) wird in 2 — o l 967oigen Alkohols unter beständigem Umschütteln aufgefangen. Zur Ermittlung des Gewichtes des angewandten Blutes ist die Flasche mit Alkohol vorher und nachher zu wägen. Nach etwa 24stündigem Stehen wird der Niederschlag abgesaugt, in einer Schale mit Alkohol zerrieben und nochmals auf das Filter gebracht. Diese Prozedur wiederholt man zweimal und preßt den Niederschlag in einer Buchnerpresse (300 Atmosphären) aus. Aus den vereinigten Filtraten wird der Alkohol al)destilliert ; schäumt die im Kolben bleibende Flüssigkeit zu stark; so geschieht das Eindampfen in Porzellanschalen auf dem Wasser- bad, bis die letzten Spuren des Alkohols verschwunden sind, was in 5 bis 6 Stunden der Fall ist. Besondere Vorsicht ist darauf zu verwenden, daß keine Eindampfungsringe an der Wand der Schale sich bilden, weil sonst Glyzerin Verluste unvermeidlich sind. Man verhütet ihre Bildung dadurch, daß man jede halbe Stunde mit Wasser die Schalenränder nachspült. Die zurückbleibende, schmutzig-grünUchgelbe Flüssigkeit versetzt man nach dem Ansäuern mit Essigsäure mit Phosphorwolframsäure, solange noch ein Niederschlag entsteht 3) (Essigsäure verwendet man statt HaSO^, um die Zahl der Substanzen, die man entfernen muß, nicht noch zu erhöhen). Der Niederschlag wird mit Hilfe der Zentrifuge entfernt und mit schwach essigsaurem Wasser wiederholt gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit wird zur Entfernung von Fett, Phosphatiden, Cholesterin mit unter 60*^ siedendem Petroläther ausgeschüttelt, bis eine Probe beim Verdunsten keinen Rückstand mehr hinterläßt. Die jetzt vollständig von Eiweiß, Fett, Lezithin und Cholesterin befreite wässerige Flüssigkeit wird auf dem *) S. Zeisel und R. Fanto, Über ein neues ^"erfahren zur Bestimmung des Glyzerins. Zeitschr. f. d. landwirtschaftliche Versuchswesen in Österreich. Bd. 5. 729 (1902). -) Fr. Tangl und St. Weiser, Üher den Glyzeringehalt des Blutes nach Unter- suchungen mit dem ZeisehQh&n Jodidverfahreu. Pßüyers Archiv. 115. 152 (190G). '■^) Zur Entfernung von Eiweiß. Methoden zur Aufarhcituiif^ des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. 19? Wasserbad einpreenfft. mit überschüssiger konzcntrierti'r llarytldsmi^r (um Sulfate, Phosphate uiid rhosphorwolfranisäure zu entfenien) versetzt umi der Barytüberschuit durch CO., entfernt. Das Filtrat vom liaCO, wird mitsamt den Waschwässern auf dem Wasserl)ad bis auf etwa läOrm' ein«ieengt. Auch hier düifen sich keine Eindampfungsringe bilden. Zur Knt- fernung von Chloriden hißt man die eingeeni^te Lösung in die 4- bis r)fache Menge 96Voiti'en Alkohols einflielien, wuscht den Niederschlag mit absolutem Alkohol und engt Filtrat und Waschalkohol ein. Zur Entfernung der letzten Reste von Chloriden i)ehandelt man die Lösung mit frisch gefälltem Ag. (J und engt das Filtrat vom AgCl-Niederschlag. den man mit IMV'oigeni Alkohol wäscht, unter allmählichem Zusatz von Wasser — um sicher allen Alkohol zu entfernen — auf etwas weniger als öOcw^ ein. Man bringt die gelbliche Flüssigkeit in ein Meßkrtlbchen zu öOcni^, füllt mit Wasser zur Marke auf und unterwirft 20 cm^ — bei Anwendung von Ihr/ Blu-t 400// Blut entsprechend — dem Jodidverfahren. Diese '20 cm^ engt man in dem Siedekiilijchen des Jodidapparates in einem starken Luftstrom, den man durch das Kölbchen oberhalb der J'lüssigkeit streichen läßt, auf einem schwach geheizten Wasserbad auf die vorgeschriebenen bcm^ ein. Wegen der Ausführung der Bestimmung sei auf die in Band 2 dieses Handbuches auf Seite 2 IC) 18 von Röhmunn gegebene Darstellung verwiesen. Azeton. Der Nachweis und die l>estimmung von Azeton im Blut kann in folgender Weise ausgeführt werden. ^) 100 ciii'-'^ VAwi verdünnt man mit der 4 — 5fachen Menge einer 1- bis 27oigen Lösung von primärem Kaliumphosphat : von diesem Gemisch werden unter guter Kühlung etwa 100 ctn^ abdestilliert; das Destillat wird mit H., S()^ angesäuert und nochmals der Destillation unterworfen, wobei man wieder etwa Vi — \4 überdestillieren läßt. In diesem neuen Destillat, das man natürlich auch zur Anstellung der Azetonreaktionen verwenden kann, bestimmt man das Azeton nach Mcsnui/cr-Hupjxrf.-) Statt das Blut zu verdünnen und das Azeton al)destillieren. ohne die Eiweißkörper zu entfernen, ist es manchmal zweckmäßig, das Blut zu enteiweißen. Emhden und Kalhcrhih verwenden das Verfahren von Schenk^) für diesen Zweck und destillieren dann 400- 500r///3 des eiweili- freien Filtrats. Will man in normalem Blut Azeton in der Form von l)il)enzal;i/eton nachweisen, so werden mindestens öOO (•///=' Blut — noch besser aber w-esentlich größere Quantitäten einem der oben skizzierten ^'erfahren untor- ') G. Emhdeu uiul /•'. Kalberlah, Über Azetonbildunir in der Leber. Ilof'meüters Beiträge. 8. 122 (1908). -) Über die Ausführung dieser Bestimniiuiir siehe dieses Handbuch. Bd. 3. S. 912 (191Ü). ») Siehe dieses Handbuch. Bd. 2. S. 1H4 (.1910). ]gg E. Letsche. worfen; durch wiederholtes Destillieren sucht man ein möglichst azeton- reiches Destillat zu erhalten und fängt das letzte Destillat schUeßUch in Reagenzgläsern zu je 15 — 20 cni^ auf. Der Inhalt jeden Glases wird mit 2cni^ 10^/oiger Natronlauge und 2 Tropfen Benzaldehyd versetzt, die Flüssigkeit zur Lösung des Benzaldehyds umgeschüttelt und der Inhalt der gut zu verschUeßenden Gläser bei Zimmertemperatur sich selbst überlassen. Im Verlauf mehrerer Tage geht die anfängliche Trübung in einen Nieder- schlag über; man saugt ihn ab, wäscht ihn alkalifrei und löst ihn in wenig heißem Alkohol; dieser Lösung fügt man bis zur beginnenden Trübung Wasser zu und läßt sie langsam abkühlen. Der Schmelzpunkt des Kondensationsproduktes ist schon nach einmaligem Umkristallisieren — sicher aber nach zweimaUgem ■ — der richtige, nämlich 112°. Hat man die Aufgabe, im Blut vorgebildetes Azeton neben Ge- samtazeton (vorgebildetes -f- Azeton aus Azetessigsäure) zu bestimmen, so führt folgendes Verfahren von Emhden und Engel'^) ziemUch rasch und sicher zum Ziel. In 500 fw« 3 des nach der Methode von Schenk-) gewonnenen Blut- filtrats bestimmt man in der oben angegebenen Weise das Gesamtazeton nach Messinfier-Huppert. Eine ebenfalls 500 cm^ betragende Filtratmenge wird genau neutrali- siert. Durch eine Vakuumdestillation, deren Geschwindigkeit man so regu- liert, daß in 50—60 Minuten etwa 100 rm^ Destillat übergehen, entfernt man das vorgebildete Azeton und bestimmt es in bekannter Weise. Nach Beendigung der Vakuumdestillation säuert man die im Destillationskolben zurückgebhebene Flüssigkeit an und destilliert das ..Azeton aus Azetessig- säure'" bei Atmosphärendruck ab. Während die vorerwähnten Methoden zum Nachweis und zur Be- stimmung des Azetons im Blut, die Verarbeitung recht erheblicher Blut- mengen nötig machen, genügen bei der von Oppenheimer ^) angege- benen Methode, die auf Versuchen von Deuiges*) beruht, ganz kleine Blutmengen (etwa 3 — 5 crn^). Das Prinzip der Methode ist folgendes: Azeton gibt beim Erhitzen mit saurem Quecksilbersulfat einen in H-.O unlöslichen Niederschlag von der Zusammensetzung: (2 Hg SO, 3 Hg 0)3 . 4 CO (CH3), (?). ') G. Emhden und H. Engel, Über Azetefsigsäurebilduug in der Leber. Hofmeisters Beitr. 11. 323 (1908). *) Fr. Schenk, Über Bestimmung und Umsetzung des Blutzuckers. Pflüyers Arch. 55. 203 11 (1894). Das Verfahren besteht darin, daß man Blut (Serum) auf das Doppelte verdünnt, dieser Lösung auf 1 Volumen Blut erst 2 Volumina 2*'/oiger Salzsaure, dann 2 Volumina ö'/oiges Sublimat zufügt. Also kommen auf 100 cm^ Blut (Serum) erst 100 Wasser, dann 200 cm^ Salzsäure und 200 cm^ Sublimatlösung. ') C. Oppenheimer, Über einen bequemen Nachweis von Azeton in Harn und an- deren Körperflüssigkeiten. Berliner klin. "NVochenschr. 36. 828/29 (1899). *) Deniges, Sur les fonctions organiques pouvant se combiner au sulfate mer- curique. Compt. Rend. 126. 1868 (1898). — Idem. Combinaison, recherche et dosage de l'ac^tone ordinaire avec le sulfate mercurique. Compt. Rend. 127. 963 (1898). Methoden zur Aufarbcituug des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. ^99 Man versetzt etwa '6 cni^ Blut mit so viel Reagens, bis kein Nieder- schlag mehr entsteht. (Das Reagens stellt man sich her, indem man äO^/ Quecksilberoxyd (via humid, parat.) in einer Lösung von 200 (7/<» kon- zentrierter H-^SOi und 100 an» Wasser löst.) Man braucht zu dem ange- gebenen Zweck etwa das lOfache Volumen Reagens. Das Illut gerinnt zu einer tiefbraunen Masse; man liißt den Niederschlag sich absetzen imd prüft, ob die überstehende Flüssigkeit auf Zusatz von noch mein- Reagens nicht noch einen Niederschlag gibt. Wenn nicht, dann setzt mau noch etwa 2 — o cin'^ Reagens zu, filtriert, fügt noch etwas Schwefelsaure zu (die Lö- sung muß stark sauer sein) und erwärmt. Ein weiDer Niederschlag, der in einem Überschul) von HCl sich löst, zeigt Azeton (bzw. Azetessigsäurei an. Zur quantitativen Bestimmung fällt man das Blut erst mit dem Reagens, überzeugt sich in einer anderen (|ualitativen Probe, ob viel oder wenig Azeton vorhanden ist und fügt dann je nach Umständen einen Überschuß von 25 — .•')0 ciii^ Reagens zu , nachdem man aber zuerst den Eiweißniederschlag abfiltriert hat. ^lan bringt die Lösung in ein Stöpsel- glas (gut eingeschliffener Stopfen I), verschnürt und erhitzt die Flasche eine halbe Stunde im Wasserbad. Nach dem Abkühlen sammelt man den Niederschlag auf einem Gooch-Tiegel, wäscht ihn erst mit Wasser säure- frei, schließlich dann noch mit Alkohol und Äther und wägt nach dem Trocknen. Das Gewicht des Niederschlages wird zur Berechnung der Azetonmenge mit O'Or);") multipliziert. Der Faktor 005;') entspricht einer Formel: 5 Hg SO, . 7 Hg ü . 3 CO (CHj),. Oxybuttersäure. Außer Azeton und Azetessigsäure kann — vor allem bei Diai)etikern — auch noch der .-i. Azetonkörper , die ,i-Oxybuttersäure. mauchnial im Blut sich finden. Zu ihrem Nachweis hat Geelinui/den folgenden Weg einge- schlagen. M 100 — 200 (■>)/=* Blut werden mit 600 c^^/^ Wasser verdünnt: hierzu gibt man 12^ KOH in Substanz, digeriert erst 24 Stunden bei Zimmer- temperatur und dann auf kochendem Wasserbad bis zur Lösung des Nie- derschlages. Nach dem Erkalten säuert man mit verdünnter ILSO^ an {[00 cut'^ genügen in der Regel; die Säure entli;ilt in llioOc^//^ 70 cm» kon- zentrierter H-.SO,). füllt auf 1000 cm3 mit Wasser auf und filtriert in einem 2 l fassenden Meßkolben. Zum Filtrat gibt man ' .. XOlumen einer 10" eigen Phosphorwolframsäurelösung (100// Phosphorwolframsäure + loo <•///» kon- zentrierte IL SO, auf 1000 ««3 gebracht), filtriert den voluminö.sen Nieder- schlag ab, mißt das Filtrat genau, versetzt mit NH;, bis zu alkalischer Reaktion, dampft ein und bestiiiiiiit in dieser Lösung die .'i-Oxybuttersäure nach Maynus-Lcvij. -) ') n.Chr. Gecliiiiinilcu, t'lior den AzctoiikuriKTirfliult «ier (»rn;iiio :ui ( onia dia- beticum Verstorhcncr. Zeitschr. f. pliysifd. Clioni. 58. l'M\ (l'.KiH()*.M. •-) Die Methode ist ausfiihrlicii in diesem Handbuch beschrielien. Bd. 8. S. 5)29 (1910). 200 E. Letsche. Indoxyl, Indol und Skatol. In ganz geringer Menge finden sich im Serum schließlich noch In- doxyl, Indol und Skatol, zu deren Nachweis Hervieux folgende Verfahren ausgearbeitet hat. Zum Indoxylnachweis ') wird Serum, mit dem gleichen Volum Wasser verdünnt, durch Erwärmen auf dem Wasserbad unter Zusatz von basischem Bleiazetat enteiweißt; entsteht auf Zusatz von basischem Blei- azetat kein Niederschlag mehr, dann entfernt man den Niederschlag, wäscht ihn aus und fällt aus dem Filtrat den Bleiüberschuß mit Hilfe einer konzentrierten Nag SO^-Lösung; man filtriert von neuem, macht das Filtrat mit Soda schwach alkahsch und engt es auf dem Wasserbad auf etwa 20 cm^ eiu. Die anfänglich farblose Flüssigkeit dunkelt mehr und mehr nach. Man fügt ihr ein gleiches Volum Isatinchlorhydratlösung (0"05 g Chlorhydrat im Liter) zu und bringt dann 7 Minuten auf das kochende Wasserbad. Man kühlt ab und schüttelt die Lösung mit CHCI3 aus, das hierbei eine leicht gelbhche Farbe annimmt. Wäscht man das CHCI3 mehr- mals mit verdünnter Kalilauge (2:1000), so wird die Lösung in CHCI3 rosafarben. Verdunstet man den Hauptteil des Lösungsmittels, so wird die Probe sehr deutlich. Dampft man die Lösung schließlich im Platintiegel zur Trockene ein und erhitzt man den Piückstand vorsichtig, so verflüch- tigt sich die Substanz unter Bildung violetter Dämpfe von Indirubin. Die Menge Indoxyl, die im Blut sich findet, ist außerordentlich klein. Zum Nachweis von Indol und Skatol-) wird das Serum mit dem gleichen \'olum Wasser verdünnt und wiederholt mit Benzol aus- geschüttelt. Die hierbei sich bildende Emulsion bringt man auf ein mit Wasser angefeuchtetes Filter; das Wasser und eventuell noch vorhandene Blutkörperchen gehen durchs Filter; die Emulsion bleibt oben. Hat sich die Emulsion getrennt, so hebt man das Benzol ab und weist das Indol und Skatol mit Hilfe der p-Dimethylaminobenzaldehydreaktion 3) nach. Man bringt zu diesem Zweck 10 cm^ der verdünnten Benzollösung von Indol und Skatol in eine Ileagierröhre, fügt 2 cm^ einer alkoholischen Dimethylaminobenzaldehydlösung (1 g in 25 cm'^ 90Voig) E. Fischer, Über das Methylketol. Anualeu d. Cliem. 242, 372 (1887). Methoden zur Aufarl)eitung des Blutes in seine einzelnen Bcstiimitnile. 201 Da bei der Verbrennung^- von Eiweii» Schwefelsäure unU l'ho>iihor- säure «•ebildet werden, so ist zum mindesten ein Teil dieser Substanzen, müiilieherweise aber auch noeh andere Aschenbestandleile (Alkalien), auf diese (Quelle zurückzuführen. Weiter ninl) man mit der Mö|j[lichkeit rechnen, daß die neu gebildete H,S()^ und Hsl'Oi Salzsäure und Kohlensäure ver- dränjit haben könnten. Es ist darum ohne weiteres klar, dall die Ver- aschuui;' uns kein klares P.ild von der Art und der Menj^e der anorfz-anischen Salze, die vori>el)ildet im Serum sich finden, «leben kann. Eine direkte Restimmnngsmethode einzelner anoriianisrher Uestand- tt'ile im Hlut oder Serum ist, so viel ich sehe, kaum je anifegcben worden. Nur über die IJestimmung' von CINa, das nach Bwjarszkij und Tau;/!^) den Hauptbestandteil der anorganischen Bestandteile des Serums bildet, macht V. Hösslin 2) folgende Angaben : Die Bestimmung- des CINa wird mit h cm'^ Serum vorgenommen, das verdünnt und mit lIXOa versetzt, stets ziemlich klar durchs Filter g-eht. Kontrollversuche bei Veraschung- bzw. Enteiweiliung und nachfoliren- der Bestimmung ergaben höchstens einen Unterschied von o-OUöST bis O'Olll-i y XaCl auf \i}0 crn^ Serum. Angaben über die zur Chlorbestim- mung angewandte Methode fehlen. Die bei direkter Veraschung unvermeidlichen l'jisicherheiten über die Deutung der erhaltenen Resultate vermindern sich, ohne sich übrigens ganz ausschalten zu lassen, bei Einhaltung folgenden \'erfahrens »): Man fällt das Blut (Serum oder Plasma) mit der mehrfachen (min- destens öfachen) ]\Ienge 96Voig('n Alkohols, filtriert durch ein aschefreies Filter und wäscht den Niederschlag erst mit heiliem Alkohol, dann mit Wasser (heiß) aus. Den alkoholischen Auszug verdunstet man bei mäßiger Wärme (nicht über 60"), zieht den lUickstand mit absolutem Alkohol aus, verdunstet diese Lösung wieder und zieht den neuen Kückstand mit vollkommen trockenem, alkoholfreiem Äther aus; dieser Äther nimmt die I'hosi)hatide auf; die in absolutem Alkohol und in Äther unlöslichen Rückstände löst man in Wasser und vereinigt diese Lösung mit dem wässerigen Auszug. Die wässerige Lösung wird ebenfalls eingedunstet, der Rückstand ire- trocknet. verascht und die Asche nach bekannten Kegeln der (lualitativen Analyse unter.sucht oder zur (luantitativen Bestimmung einzelner Uestand- teile verwendet. Der bei der Fällung des Blutes mit Alkohol entstehende Niederschlag wird, nachdem man ihn, wie oben angegei)en, gewaschen hat, getrocknet ') 67. Duriarszkn und F. TaiKjl, rhysikaliscii-chemisciio rntorsucliunsren liluT die molekularen I\onz(>ntratinnsverli;iltnisse des Blutserums. l'jlii(/ci:f Arcluv. 71» '<"n (1898). ■-) /•. Iliiss-Iin, Beitrag zur Frage der chemischen Veränderung des Blutes uiicb Aderlässen. Hofmeisters Beitr. 8. 4:^,38 (lOnC). ^) Sicho JIopjJc-S>!/lcr-Tlüer/i lii, r. Ilandl.. d. phvs. u. path.-chem. Anahse. 8. Aufl. Berlin, Hirsch wald, VMJ. S. C45. 202 E. Letsche. und für sich verascht. Er enthält die Phosphate der alkahschen Erden neben Proteinen. Die Asche wird mit Salzsäure ausgezogen und dann die Lösung in bekannter Weise weiterverarbeitet. V. Untersuchung der Formelemente auf einzelne Bestandteile. Die Methoden, die für den in der Überschrift angegebenen Zweck Verwendung finden, sind in der Hauptsache die gleichen wie bei der Unter- suchung von Blut, Plasma oder Serum. Dieser Umstand sowie die weiteren, dali die Zahl der in den Formelementen nachgewiesenen Bestandteile wesent- lich kleiner ist als im Serum, und daß die Formelemente weniger oft Gegenstand einer eingehenden chemischen Untersuchung gewesen sind, lassen es verständlich erscheinen, daß die Zahl der speziell für die Untersuchung der Formelemente ausgearbeiteten Methoden eine recht beschränkte ist. Von den 3 verschiedenen Arten geformter Elemente hat man die Blutplättchen und die Leukozyten bis jetzt nicht in Mengen gewinnen können, die für eine eingehende chemische Untersuchung ausgereicht hätten. Über die Zusammensetzung und die Bestandteile der Blutplättchen weiß man deshalb so gut wie nichts; das wenige, was man über die Be- standteile der Leukozyten weiß, ist festgestellt worden bei der Untersuchung von Eiterkörperchen. ^) Ich darf daher diese beiden Arten von geformten Elementen füglich übergehen und werde mich auf die Beschreibung einiger Methoden zur Untersuchung der Erythrozyten beschränken. 1. Emeißstoffe. Unter den Eiweißstoffen der Erythrozyten nimmt der Blutfarbstoff sowohl seiner Menge als auch seiner biologischen Bedeutung nach die erste Stelle ein. Auf diesen Bestandteil näher einzugehen, muß ich mir versagen, weil in diesem Handbuch sowohl seine Darstellung 2) als auch seine ({uantitative Bestimmung 3) schon eingehend beschrieben worden sind. Außerdem ist ') Die Isolierung des nach Hupperf in den Leukozyten des Blutes sich finden- den Glykogens ist bei den Methoden zur Untersuchung der Erythrozyten an geeigneter Stelle beschrieben. '') Fr. N. Schulz, Darstellung von Blutfarbstoffkristallen. Dieses Handbuch. Bd. 2. S. 339 (1910). ■■') Franz Müller, Die Blutkörperchenzähluug und Hämoglobinbestimmung. Bd. 3. S. 707/41 (1910). Bezüglich der auf S. 741 sich findenden, recht absprechenden Beurteilung des iZV(/werschen Spektrophotometers verweise ich auf meine Notiz: Zur Spektrophotometrie des Blutes. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 63. 313/14 (1909). Ich habe dort hervorgehoben, daß in der unter meiner Leitung ausgeführten Arbeit von E. E. Butterficld, Über die Lichtextinktion des Blutfarbstoffs [Zeitschr. für physiol. Chemie. 62. 173 (1909)] alle spektrophotometrischen Resultate mit Hilfe des ifw/werschen Spektrophotometers gewonnen worden sind, und ich kann heute, auf Grund weiterer 1 '/„jähriger Erfahrung den Schlußsatz jener Notiz über die Brauchbarkeit des Instruments in geübten Händen nur vollauf bestätigen. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Hestaniiteile. 203 erst vor kurzem an anderer Stelle ') eine einziehende l);ir.stellun[r der (iewin- nung. (|ualitativen nnd (|uantitativen liestiinnuin^^ {los Iliiniogloltins erschienen. Ininieriiin aber mitten hier einiüc Worte über die (iewinnun;.' von Hämoglohinkristallen nach der Aikoholniethodc; aus Pferde- und liindfr- blut auf Grund von Erfahrun. Mal umkristallisierten Pferdehänn>globin spektrophotometrisch nachweisbare (^)uantitäten von Met-Hb sich nicht finden. Neben Hämoglobin findet sich nach Wooldr'idije^) Paraglobulin, das man am besten aus dem Stroma, nach dem oben^i beschriebenen ') K. Bürker, Gewinnung, (lualitative und «itiantitative Hestiinmunjr des Hämo- globins. Tigerstedt, Handbuch der physiolog. Methodik. Leipzig bei Hirzel (lUlO). =) li. Woolrlriihfc. Zur Kenntnis der Blutkörperchen. .\rch. f. .\nat. u. Phys. 18H1. (Physiol. Abteilung) S. 38U. ") Siehe S. 146. 204 E. Letsche. Verfahren gewonnen, isoliert, indem man das Stroma mit melirprozentiger (etwa 5Vo) NaCl-Lösung schüttelt, wobei Paraglobulin in Lösung geht. Durch Sättigen der Lösung mit Kochsalz fällt das Paraglobulin aus und kann eventuell durch Lösen und Wiederausfällen gereinigt werden. In den Kernen der Yogelblutkörperchen findet sich Histon. Die Iso- lierung der Kerne sowohl, als auch die Darstellung des Histons findet sich an früherer Stelle i) schon beschrieben. Zur quantitativen Bestimmung des G-esamteiweißes in den Blutkörperchen sind die gebräuchlichsten Methoden folgende beiden: Man trägt die gewogene Blutkörperchenmasse quantitativ (mit Hilfe von etwas Wasser) in die 4 — öfache Menge kochenden Wassers; dann fügt man tropfenweise Essigsäure zu der kochenden Lösung, bis der Niederschlag gut ausflockt und die Lösung vollkommen klar ist. Man fil- triert auf ein gewogenes aschefreies Filter, wäscht erst mit Wasser, dann mit Alkohol und schließlich mit Äther, trocknet den Rückstand bei 110", wägt, verascht und zieht die Asche von dem zuerst ermittelten Ge- wicht ab. Der 2. Weg besteht darin, daß man den Blutkörperchenbrei erst mit wenigen Tropfen verdünnter Essigsäure versetzt und dann das 4 — ofache Volum Alkohol zuaibt. Man läßt dann einitie Stunden stehen, besser ist es, noch einige Zeit auf dem Wasserbad zu kochen, Avobei man den ver- dunstenden Alkohol ersetzt, filtriert den Niederschlag ab, wäscht ihn erst mit Alkohol, dann mit Wasser, wieder mit Alkohol und zum Schluß mit Äther, trocknet und wägt. Das erste alkoholisch-wässerige Filtrat dampft man zur Trockene ein, zieht den Piückstand erst mit Alkohol, dann mit Äther aus und bringt das Ungelöste auf ein gewogenes Filter; man wäscht gut aus, trocknet und wägt und verascht mit dem zuerst erhaltenen Niederschlag. Dieses Verfahren ist unbedingt notwendig, weil der ersten Fällung mit Alkohol meist geringe Eiweißmengen entgehen. 2. Fett und fettartige Bestandteile. Nach den Untersuchungen von Abderhalden 2) finden sich echtes Fett und Fettsäuren (bzw. natürlich fettsaure Alkaüen) in den Blutkörperchen nicht. Dagegen findet sich Lezithin, das man nach Wooldridge^) in fol- gender Weise aus dem Stroma isolieren kann: Isolierung von Lezithin. Man zieht das frische Stroma bei etwa 45" mit 80 — QO^/oigem Alko- hol aus. Beim Erkalten fällt Cholesterin aus; das Filtrat von dieser Aus- 0 H. Steudel, Histone und Protamine. Dieses Handbuch. Bd. 2. 4-42/43 (1910). ^j E. Abderhalden, Zur vergleichenden quantitativen Analyse des Blutes. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 25. 65 (1898). ^) L. Wooldridqe, Zur Chemie der Blutkörperchen. Arch. f. Anat. u. Physiol. 1881. (Physiol. Abt.) 389. Methoden zur Aufarbeitung des Blutes ia seine einzelnen Bostandfcilc. 205 Scheidung- wird bei 40— 45o einged;unpft und der Kiickstand mit abso- lutem Alkohol aufgenommen. Dabei bleibt etwas Humatin unj^elöst. Ver- setzt man diese Lösung mit einer Lösung von Platinchlorid in absolutem Alkohol, der man zuvor ein paar Tropfen konzentrierter HCl zugefügt hat, so erhiilt man einen kristallinisciu'n gelblichwciben Niederschlag, der sich in Chloroform bis auf einen kleinen liest löst. Der beim \('rdunsten des Chloroforms bleibende Kiickstand gibt bei der Analyse auf eine Formel (C42Hs2NP08)2H2PtCl6, dls von Strecker aufgestellt wurde"), stimmende Zahlen. Cholesterinisolierung. Cholesterin hat ebenfalls Wooldriclrjc-) aus dem Stroma gewonnen, und zwar dadurch, daß er das Stroma wiederholt mit kaltem Petroliither auszog, der beim Verdunsten Cholesterin frei von Fett und phosphorhalti- gen Beimengungen hinterließ. Direkt aus den Blutkörperchen erhielt Hepner^) Cholesterin nach folgendem Verfahren, das er auch zur annähernden quantitativen Bestimmung benutzte. Blutkörperchen werden aus Oxalatblut durch Zentrifugieren gewonnen, mit etwa dem 6fachen Volumen ii^/^^/nigQi' NaCl-Lösung durchgerührt und wieder zentrifugiert. (Ein anderer Weg ist der, daß man Blut gerinnen läßt und den Blutkuchen nach 24stündigem Stehen durch Mull preßt, um das Fibrin abzutrennen, und die durchgepreßte Masse dann zentrifugiert.) Für ([uantitative Zwecke trocknet man eine kleine Probe der Blut- körperchen bei 110 — 115", um durch Vergleich des Gewichtes der feuchten und trockenen Probe den Trockensubstanzgehalt der untersuchten Blut- körperchenniasse zu erfahren. Die gewogene Hauptmenge der Blutkörper- chen wird mit dem 4fachen Volum Alkohol verrührt und die Mischung 48 Stunden in den Wärmeschrank gestellt; nach dieser Zeit saugt man den Niederschlag ab, zerreibt ihn mit -/;^ der ursprünglich angewandten Alkoholmenge und bringt die Masse wieder auf einige Zeit in den Wärme- schrank. Schließlich erhitzt man die Mischung zum deutlichen Kochen auf dem Wasserbad, saugt den Niederschlag ab und zerreibt ihn nochmals mit Alkohol. Die alkoholischen Auszüge werden eingeengt und die letzten Beste Alkohol durch Abdampfen nach Zusatz von Wasser verjagt. Die wäs- serige Flüssigkeit bringt man zusammen mit etwaigen festen Ausscheidun- gen mit Hilfe von Äther in einen Scheidetrichter und schüttelt sie wieder- holt mit Äther aus (mindestens 5mal je etwa 10 Minuten lang). Der Äther ') Es würde also ein Palmitinsäure und Ölsäure enthaltendes Lezithin vorliege», wobei zu beacbtcu bleibt, daß die Aualyse allein keine bestimmten Seldüssc auf das Vorluindeiiseiu oder ^"elilen bestimmter Säuren zuläßt. ^) L. Wooldriclf/c, Zur Chemie der Blutkörperchen. Areh. f. .\nat. u. Phys. 1881 (Phys. Abteil.) 389. ') E. llepiur, Über den C'li(>b-;tcrin;.'elialt der Hlntktirpertlini l'i!r,„. r.i Andiiv. 73. 595/GU6 (1S'J8). 206 E. Letsche. wird abdestilliert; den Rückstand, der beim Verdunsten des Äthers bleibt, kocht man mit Essigäther aus, läßt abkühlen und filtriert die Essigäther- lösung vom Ungelösten ab. Dieses letztere spült man mit kaltem Essig- äther so lange nach, bis der Essigäther nichts mehr aufnimmt (Probe auf Uhrglas verdunsten lassen!). Der Essigätherextrakt wird mit Tierkohle gekocht und in einem tarierten Kolben filtriert. Nach dem Abdestillieren des Essigäthers hinterbleibt Cholesterin neben einer ganz minimalen Ver- unreinigung (unwägbar). Nach einmaligem Umkristallisieren zeigt das Cholesterin den richtigen Schmelzpunkt von 144 — 145*'. An Stelle der etwas zeitraubenden Behandlung des Ätherrückstandes mit Essigäther wird es sich zweifellos empfehlen, die von Windaus angegebene und oben be- schriebene Digitoninmethode zur Isolierung und quantitativen Bestimmung anzuwenden. 3. Kohlehydrate, Glukose. Daß entgegen älteren Angaben nicht bloß im Serum, sondern auch in den Formelementen Zucker sich findet, haben Bona und Michaelis'^) gezeigt. Zur ([uantitativen Bestimmung^) des Zuckers haben sie die Blutkörperchen in folgender Weise verarbeitet: Die Blutkörperchen werden ^/^ Stunden mit 3000 Touren pro Minute abzentrifugiert , mit ClNa-Lösung wiederholt gewaschen und möglichst weitgehend zusammen zentrif ugiert , mit bekannten Mengen von destil- liertem Wasser in einem vorher tarierten Kolben gespült und ihre Menge durch Wägung festgestellt. Dann werden je 50^ Blutkörperchen auf 2000 cw'^ mit Wasser aufgefüllt. Zu der lackfarbenen Flüssigkeit wird eine auszuprobierende Menge Eisenhydroxydlösung zugegeben, dann noch eine geringe Menge (zirka 10 g) eines Elektrolyten, wozu man am besten ein Sulfat wählt, weil die zweiwertigen Anionen gegen das kathodische Eisenhydroxyd viel wirksamer sind als die einwertigen. Am besten ver- wendet man MgSO^; unangebracht ist dieses, wenn der Zucker nachher vergoren werden soll; in diesem Falle wählt man K.2SO4, NagSO^ oder ZnS04. Der Zusatz von Eisenlösung soll soweit getrieben werden, daß eine abfil- trierte Probe nur noch ganz wenig Hämoglobin enthält. Dann wird die Flüs- sigkeit durch mehrere sehr große Faltenfilter abfiltriert und ein großer, aliquoter Teil weiter verarbeitet. Jetzt wird die Entfernung des Hämo- globins durch nochmaligen Zusatz von kleineren Mengen Eisenlösung ohne Schwierigkeit beendet, wieder ein möglichst großer aUquoter Teil ab- filtriert, das nun wasserklare, eiweißfreie Filtrat bei leicht essigsaurer Reaktion auf ein mögUchst kleines Volumen eingeengt, derart, daß der zugegebene Elektrolyt gerade ganz in Lösung bleibt und polarisiert. ^) P. Bona und L. Michaelis, Uiitersucliungeu über den Blutzucker. Bloch. Zeitschr. 16. 61 (1909). '■') Ebenso wird man auch zum qualitativen Nachwels des Zuckers verfahren. Methodoii zur Aufaibeituiig des Blutog iii seine ciiizelaou Bestandteile. 207 Beispiel: f>9(')f\ VI. Verfahren zur Bestimmung verschiedener Bhitbestandteile in einer Blutportion. (fiesamtl)liitanalvso. ') Mail \v;i und filtriert durch das eben schon benutzte Filter, fängt dieses wässerige Filtrat aber getrennt von dem alkoholisch- ätherischen auf. Man bringt das Ungelöste (juantitativ auf das Filter und wäscht es mit Wasser aus. Der auf dem Filter bleibende Rückstand wird getrocknet, gewogen und zusammen mit dem ersten Filterrückstand verascht. Das Gewicht der beiden getrockneten Filterrückständo, vermindeit um die Summe der Asche, gibt das Gewicht der in dem angewandten Serum (P.lut etc.) enthaltenen Proteinstoffe. Der wässerige Auszug (ursprünglich Filtrat ;'>) wird auf dem Wasser- bad verdunstet (in gewogener Schale), der Rückstand bei llU" getrocknet, gewogen, verascht und die Asche wieder gewogen. Der alkoholisch-ätherische Auszug (ursprünglich Filtrat 2) enthält die Hauptmenge der Fette, Phos- phatide etc. und Extraktivstoffe. Er wird bei einer (iO" nicht übersteigen- den Temperatur auf dem Wasserbad verdunstet und schließlich über H.^S(>^ ') Hoppe-Sei/Ier-Thifr/rh/er, Ilandl.ueli. S. Aull. 6t'.2ff. (VMM -) Bei Verwendung von Blut wird man den Blutkuclien erst mecbaniscii zer- kleinern und dann die Masse in der oben zu beschreibenden Weise weitcrvenirbeiten. ') Das 3— 4faclie Volum wird meist geniitren, doch hat man schon bis zu lö Vo- lumina Alkoliol angewandt, z. B. Erben, Chemische /usammensetziuig des Blutes bei Tuberculosis pulmonum. Zeitschr. f. Heilkunde. 26. 24ö (1895). A btl p r li a I den . Handbuch der biochemischen Arbeifsmethodon. V. 14 25^0 ^- Letsche. getrocknet. Der Rückstand wird mit Äther ausgezogen, das Äther unlösliche abfiltriert und wiederholt mit Äther gewaschen. 1. Der Rückstand — das ÄtherunlösUche wird mit Wasser in eine tarierte Schale gespült, die Aufschwemmung auf dem Wasserbad zur Trockene gebracht, der Rückstand bei 110" getrocknet und gewogen. Das Gewicht gibt die Summe der in Alkohol löslichen Extraktivstoffe. Das Ge- wicht der Asche, vermehrt um das Gewicht der Asche des wässerigen Auszugs (siehe oben), gibt die Summe der löslichen Salze. Viel genauer ist es freilicii, die beiden Aschen zu vereinigen, mit Wasser auszukochen und das wasserlösliche von eventuell wasserunlöslichen zu trennen. Das letztere wäre dann dem Rückstand zuzuzählen, den man beim Veraschen der Pro- teinstoffe bekommt. 2. Das ätherische Filtrat wird bis auf ein kleines Volumen abde- stilliert, in ein gewogenes Becherglas übergeführt und der Kolben mit Äther und Alkohol nachgespült. Bei mäßiger Wärme verdunstet man die Lösung auf dem Wasserbad und trocknet den Rückstand vor der Wägung im Va- kuum über Ha SO4. Dann löst man den Rückstand in Alkohol, fügt alkoho- lische Kalilauge zu, kocht die Mischung etwa 1 Stunde auf dem Wasser- bad, verdunstet nach dem Verseifen den Alkohol und löst den Rückstand im Wasser. Diese Lösung wird mehrmals mit Äther ausgeschüttelt. Die vereinigten Ätherlösungen werden verdunstet, der Rückstand mit Petroläther aufgenommen, wobei das eventuell vorhandene Cholesterin in Lösung geht. Nach dem Verdunsten des Petroläthers bestimmt man das Cholesterin nach Windaus. Vermutet man in dem Petrolätherrückstand neben Cholesterin noch andere Substanzen, so schüttelt man das Filtrat vom Digitonincholesterid nach dem Ansäuern mit Salzsäure, mit Äther oder Petroläther aus und vereinigt den Rückstand dieses Auszugs mit der von der \'erseifung herrührenden wässerigen alkalischen Lösung und unter- sucht sie in früher geschilderter Weise (S. 162 ff.). In diesem Teil findet sich der Phosphor der Phosphatide, den man am besten nach der Neuman7tscheTi Methode bestimmt. Berechnungen über die Menge des Fetts aus der Differenz des Ge- wichtes des Ätherauszugrückstandes und dem Resultat der Phosphorsäure- bestimmung berechnet auf ein beliebiges Lezithin, z.B. Distearyllezithin 1), sind natürlich sehr willkürUch, mögen aber trotzdem für manche Zwecke ganz wertvoll sein. Zur Bestimmung von Erythrozyteneiweiß und Fibrin in einer Blutportion verfährt Erben ^) folgendermaßen: In einem Wägegläschen von etwa oO cm^ Inhalt werden zuerst 0"025 bis O'O:-) rj wasserfreies Ammonoxalat abgewogen , dann läßt man unter dauerndem Umrühren das Blut hineinfließen und wägt nach dem Erkalten. ') Welchem Gewicht natürlich noch das Cholesterin zuzuaddieren ist. -) Erben, Chemische Zusammensetzung des Blutes usf. Zeitschr. f. Heilkunde. 26. 245 (1895). Methoden zur Aufarbeitung des Blutes in seine einzelnen Bestandteile. 211 Hierauf wird das flüssig' iiebliebene Blut in 2 Zfutrifu^ioi-nilirchen ausge- schleudert und das klare I'lasnia in einem Wä«iej^l;iscl)en gewogen. Dann spült mau das Plasma mit etwas ^Vasser in ein IJechergläsclien unrf eider, Handbuch der physiol. u. pathol.-chem. Analyse. 8. Aufl. Berlin 1909. S. 685." 3) Dieses Handbuch. Bd. 2. S. 373 (1910). *) Dieses Handbucb. Bd. 3. S. 705 ff. (1910). Methoden zur Aufarbeitung der Lynipho in iliro einzelnen licstandtcile. 21;") von lOOy lUut sich findet, so erfährt man die Mcn^r^ der Protoinstoffe. die neben dem ISkitfarbstoff in den inutkörperchcn von lOOy lUiit ent- halten ist. Weiterhin bestimmt man in etwa HD — iSOmi^ Jilnt Cholesterin, I'hos- phatide, lösliche und unlösliche Salze ^). rechnet die Resultate auf lOOy Blut um und führt die ji^leichen Bestimmunjien in einer entsprechenden Menge Serum aus. Die im Serum erhaltenen Werte sind dann auf die Menge Serum, die WOg Blut enthalten, umzurechnen. Zieht man diese Zahl ab von der ersten fiii- das Bhit hestimmten, so erfährt mau die Mengen der bestimmten Stoffe, wie sie in den Blutkörperchen von 100 9 Blut sich finden. Genau das gleiche Verfahren ist anzuwenden für Zucker, für Harn- stoffe, Milchsäure usw., für Trockensubstanz und Aschenliestandtcilc. Untersuchung der Lymphe. Die Bestandteile der Lymphe (und des Chylus) sind ([ualitativ die gleichen wie die des Blutes. Die geformten Elemente Leukozyten und unter Umständen auch Erythrozyten hat man bis jetzt der Schwierigkeit ihrer Gewimiung wegen noch nicht zum Gegenstand chemischer Untersuchungen gemacht. Zur Untersuchung der Lymphe, des Lymphplasmas und Lyrnj)!!- serums finden die gleichen Methoden wie beim Blut Anwendung-, irgend welche Besonderheiten sind nicht zu beachten. Methoden zur Aufarbeitung der Zerebrospinalflüssigkeit. Untersuchungen über die Zusammensetzung normaler menschlicher Zerebrosi)inalflüssigkeit sind bis jetzt kaum gemacht worden. Die unter- suchten Hüssigkeiten stammten vielmehr entweder von Kranken, bei welchen eine Entziehung dieser Flüssigkeit duich Punktion vom ärztlichen Stamlpunkte aus geboten schien oder aus Leichen. Dagegen ist von gesunden Kälbern stammende Zerebrospinalflüssigkeit von Xaivnitzki eingehend untersucht worden. Ob die zu untersuchende Flüssigkeit von gesunden oder kranken Individuen stammt, ist für die zu befolgende Methodik nebensächlich, wenn auch pathologische Zerebrospinalflüssigkeit in ihrer Zusammensetzung so- wohl nach der (|ualitativen als auch nach der t|nantitativen Seite Ab- weichungen von normaler Flüssigkeit zeigen wird. Bei der Untersuchung der Zerebrospinalflüssigkeit sowie l)ei der Be- stimmung einzelner ihrer Bestandteile hat man sich im grol'.en und ganzen an die für das Serum gebräuchliche und im Vorhergehenden ausführlicli be- schriebene Methodik zu halten. Für die Isolierung und ÜestinniinuL'- (MuiL'er ') Die Bestimmung kann im Ansoliluli an das im Abschnitt \ 1 wipilerjfcgcbene Verfahren crfoliri'n : oder abpr iianii man joden einzelnen Bestandteil nach den früher beschrioboiicn Methoden in einer Itesonderen Blut])orfion uml einer Itesondercn iSeruiu- portion bcstimiuen. 216 E. Letsche. Bestandteile sind im Folgenden eine Anzahl Methoden beschrieben, die sich gegenüber den entsprechenden Methoden, die für das Serum in An- wendung kommen, meist durch größere Einfachheit auszeichnen. Die Einteilung entspricht der beim Blutserum eingehaltenen ; es finden sich nebeneinander Methoden zur Isolierung und zur quantitativen Be- stimmung , da zur Isolierung und zum Nachweis der einzelnen Bestandteile in der Piegel Methoden Anwendung finden, die ohne weiteres auch für quantitative Zwecke brauchbar sind. 1. Eiweißstoffe. Zur quantitativen Bestimmung von Serumglobulin verfährt Panzer^) folgendermaßen: 50 on^ Flüssigkeit werden durch einige Tröpfchen verdünnter Essig- säure neutralisiert und die Lösung bei 40" mit MgS04 gesättigt. Der Niederschlag wird auf gewogenem Glaswollfilter abfiltriert, mit gesättigter MgSO^-Lösung gewaschen und auf dem Trichter bei 110*^ getrocknet, um das Eiweiß zu koagulieren. Alsdann wäscht man mit Wasser aus, trocknet wieder und wägt. Das Filtrat dieser Fällung, durch Dialyse von der Hauptmenge Salze befreit, scheidet beim Kochen und nachherigen Ansäuern mit ver- dünnter Essigsäure eine beträchtliche Menge koaguherbares Eiweiß — Serumalbumin — aus. Das gleiche Verfahren benutzte auch Halliburton. -) Zur Bestimmung des in der Zerebrospinalflüssigkeit enthaltenen Ge- samteiweiß verfährt FrenJcel-Heiden^) folgendermaßen: Die Flüssigkeit (3 — 10 cm^) wird mit der 10 — lofachen Menge Al- kohol gefällt, der Niederschlag nach 24stündigem Stehen auf einem kleinen Filter gesammelt, sorgfältig ausgewaschen und zur N-Bestimmung nach Kjeldahl verwendet. Nauratzki*) dagegen fällt die Eiweißstoffe durch Hitzekoagulation bei ganz schwach essigsaurer Reaktion. Den Eiweißniederschlag sammelt er auf gewogenem Filter, wäscht ihn gründlich aus (mit Wasser, Alkohol und Äther), trocknet ihn bei 100" und wägt. 2. Kohlehydrate. Zum Nachweis von Glukose in Z.-Flüssigkeit von Gesunden hat Nawratzki^) folgenden Weg eingeschlagen: ') Th. Panzer, Zur Kenntnis der Zerebrospinalflüssigkeit. Wiener klin.Wochenschr. 1899. 805 7. -) }V. D. Halliburton, On cerebrospinal fluid. Journ. of Physiol. 10.232 58(1889). ') Frenkel-Heiden, Zur Chemie der Zerebrospinalflüssigkeit. Biochem. Zeitschr. 2. 188'89 (1907). *) Xawratzki, Zur Kenntnis der Zerebrospinalflüssigkeit. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 23. 532 (1897). *) Nawratzki, Zur Kenntnis der Zerebrospinalflüssigkeit. Zeitschr. f. phvsiol. Chemie. 23. 532 (1897). Methodeu zur Aufarbeitiuig der Zerebrospinalfliissigkeit in ilire einz. Bestandteile. 2 1 7 Zur Fällung von Eiweiß wird die Lösunj;^ mit dorn nichrfaclicii Volum Alkohol versetzt, das Filtrat bei etwa 40" (am besten im Vakuum) einge- dampft und der Rückstand mit Wasser aufgenommeu. Diese Lösung wird mit neutralem Bleiazetat versetzt, der Niederschlag ausgewaschen und das Filtrat (samt Waschwasser) entbleit mit H., S. Das Filtrat von I'l>8 wird stark eingeengt und zwar etwa auf '/oi des ursprünglicheu \'oluniens. In dieser Lösung läßt sich Glukose nachweisen mit Hilfe des l'ola- risationsapparates , mit Hilfe der Reduktionsproben von Fchlhuj und Sy- lander und mit Hilfe der Gärprobe. Weiter gelingt auch die Darstellung von Glukosazon nach dem üblichen \erfahren. Panzer'^] weist mit Hilfe der gleichen Reaktionen die Gegenwart von Glukose nach, nachdem er für diesen Zweck die Zerebrospinalflüssigkeit in folgender Weise vorbereitet hat : Etwa 100 cm"^ Z.-Flüssigkeit werden mit Essigsäure schwach ange- säuert. Zu dieser Lösung fügt man Bleizucker, solange noch eine FiUlung entsteht. Das Filtrat macht man mit NH3 alkahsch, filtriert wieder und wiederholt die Fällung mit NH;, und Bleizucker so lange, als noch eine P^ällung auftritt. Die verschiedenen durch NH3 und Bleizucker erhaltenen Niederschläge werden in gelinder Wärme mit Hilfe von HaSO^ zersetzt, das Filtrat genau neutralisiert und diese Lösung zur Isolierung von Phenyl- glukosazon verwendet. Diese beiden Methoden eignen sich bei Einhaltung (luantitativer Kautelen natürlich auch zur quantitativen Bestimmung der Glukose, dabei verdient die erstere Methode m. E. den Vorzug. Statt die Flüssigkeit mit Hilfe von Alkohol vom Eiweiß zu befreien, kann man natürlich auch Hitzekoagulation hierzu verwenden oder eine der von Rona und Michaelis angegebenen, bei der Blutzuckerbestimmung beschriebenen Methoden. 3. Fett und fettiihnliche Substanzen. Geringe Mengen Fett, Fettsäuren und Cholesterin hat J'diuer in der Z.-Flüssigkeit eines Falles von Hydrokephalus (jualitativ nachweisen können, indem er die eiweißfreie Flüssigkeit sowohl l)ei alkalischer wie bei saurer Reaktion ausschüttelte und die Ätherauszüge ..in der gewohn- ten" Weise aufarbeitete. Zum Nachweis und zur Isolierung von Cholesterin, das in normaler Flüssigkeit nicht zu finden ist, hat Piginni-) Lumbaiflüssigkeit von Geisteskranken in unten zu beschreibender Weise aufgearbeitet. 25 cjii'-^ I^umbalflüssigkeit werden im Scheidetrichter wiederholt mit Äther ausgeschüttelt. Der nach dem \'erdunsten des Äthers bleibende ^) J'h. Panzer, Zur Keiuituis drr Zerebrospinalfliissigkeit. Wiener klin. WocIionscLr. 1899. 80.Ö. -) G. Pifihini, Über den Cbolesterinsrelialt der I.umlialflüssigkeit einiger Geistes- krankbeiten. Zcitschr. f. pbysioi. Cbemie. 61. 508,11") (19Ü9). 218 E. Letsche. Rückstand wird in siedendem absoluten Alkohol gelöst und nach dem Ver- fahren von Ritter'^) verseift. Die Verseifung gelingt ebensogut in Benzol, wenn man kleine Stücke Natrium und soAdel absoluten Alkohol hinzufügt, bis das Natrium ganz ge- löst ist. Nach 3 — 4stündigem Sieden am Rückflußkühler filtriert man und wäscht die Benzollösung so oft mit destilliertem Wasser, bis dieses nicht mehr alkalisch reagiert. Die Benzollösung wird dann langsam verdunstet, der Rückstand in Alkohol gelöst, und die Lösung zum Sieden erhitzt, während man ihr soviel Wasser zugießt, bis sie eben trüb wird. Man klärt die Lösung dann wieder durch ein paar Tropfen Alkohol, filtriert sie warm, engt sie auf ein kleines Volumen ein und läßt sie langsam abkühlen. Die Rückstände , die man beim Verdunsten des Alkoholauszuges er- hält, den man nach Bitters oder dem oben beschriebenen Verfahren ge- wonnen hat, enthalten oft außer dem gesuchten Cholesterin auch noch an- dere Substanzen, welche die Kristallisation und die Abscheiduug des Cho- lesterins hindern. Um diese Substanzen zu entfernen, fällt man nach Fiyhini die alkoholische Lösung mit Bleizucker, der diese Substanzen zum großen Teil niederschlügt. Das Filtrat wird entbleit, auf ein kleines Volum eingeengt und das auskristallisierende Cholesterin durch Umkristal- lisieren aus Alkohol gereinigt. Sollte es nicht mögUch sein, Kristalle zu erhalten, so löst man den beim Verdunsten des Alkohols bleibenden Rück- stand in Chloroform und versucht, mit dieser Lösung die Cholesterin- reaktion zu erhalten. -j 4. Extraktivstoffe. a) N-haltige Substanzen. Harnstoff hat Cuvazzani^) einfach in der Weise nachgewiesen, daß er die neutrale Lösung einengte — SOan^ auf zirka 18 cm'^ — und in dieser Lösung nach Hü/ners Methode den Harnstoff mittels Bromlauge zersetzte. Gumprecht*) weist den Harnstoff ebenfalls mit Hilfe der eben er- wähnten Methode nach, sucht aber den Harnstoff zuerst durch Behandlung der Z.-Flüssigkeit in folgender AVeise in möglichst reiner Lösung zu er- halten: 42 cm 3 Flüssigkeit werden mit 120 c;;^^ Alkohol versetzt, der Niederschlag nach etwa 24stündigem Stehen abfiltriert und mit Alkohol M Riffer, Über die Methoden, die zur Abscheidung des Cholesterins aus den Fetten und ihrer quantitativen Bestimmung verwendbar sind. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 34. 430 (1901/02). Vgl. auch S. 169 dieser Arbeit. =) Zweifellos wird auch hier statt der beschriebenen Reiniguugsmethode das Ver- fahren von Windaus zur Isolierung des Cholesterins gute Dienste leisten. — Ferner wird man die vereinigten alkalischen wässerigen Lösungen zur Bestimmung der Fett- säuren — vielleicht nach dem Verfahren \on Kumagawa-Suto — verwenden können. =*) E. Cavazzani, Weiteres über die Zerebrospinalflüssiffkeit. Zentralbl. f. Phvsiol. 10. 145 147 (1896). ■•) Gumprecht, Cholin in der normalen und pathologischen Spinalflüssigkeit etc. Verhandlungen des Kongresses für innere Medizin. Wiesbaden 1900. S. 326/48. Methoden zur Aufarbeitung der Zerebrospinalflüssigkeit in ihn« ciii/, Ri-standteile. 2l!l ausgewaschen. Das Filtrat engt man bei einem Druck von weniger als 200 mm und bei möglichst niederer Badtemperatur (zirka 35 — 40") auf etwa 10 cm^ ein und läßt diesen Rest im Vakuum über HoSO^ bei Zimmer- temperatur verdunsten. Der Hückstand wird in Alkohol aufgenonnnen, die Lösung filtriert und zur Harnstoffbestimmung verwendet. Wie Cavazzani^), so hat auch Panzer llydrokephalusfliissigkeit auf Harnstoff untersucht; während, wie oben angedeutet, Cavazzdni Harnstoff nachweisen konnte mit Hilfe eines recht einfachen Verfahrens, \?>t Panzer^) der Nachweis auf folgendem Wege nicht geglückt. Die Z.-Flüssigkeit wird mit dem ofachen Volum Alkohol versetzt; der Eiweißniederschlag wird abfiltriert und mit Alkohol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit dampft man znr Trockene ein; den lUickstand zieht man mit Alkohol aus, verdunstet diese Lösung wieder und löst den Kück- stand in Wasser (möglichst wenig). Auf Zusatz von konzentrierter reiner HNO3 waren Kristalle von salpetersaurem Harnstoff nicht zu erhalten; auch Merkurini trat gab nur eine ganz unbedeutende Trübung. Die Angaben über den Cholingehalt der Zerebrospinalflüssigkeit sind sehr widersprechend. Die differenten Hesultate hegen sicher nicht an kleinen Verschiedenheiten der Methodik, sondern sind zweifellos dadurch zu erklären, daß Cholin bei gewissen Krankheiten auftritt, bei anderen da- gegen nicht. In normaler Zerebrospinalflüssigkeit scheint es zu fehlen, wenigstens macht Nmvratzki über seinen Nachweis in der Z.-Flüssigkeit von Kälbern keine Angaben. Donath verfährt zum Nachweis von Cholin in der Z.-Flüssigkeit von Epileptischen in folgender Weise ^) : 20 — 'i)0 cm'^ der Flüssigkeit werden mit O'ö — 1 cni^ einer ö" oig^"» reinen Lösung von NaaCOs versetzt, um Kalzium, Magnesium und Eisen zu entfernen. Das Filtrat von diesem Niederschlag wird im Wasserbad znr Trockene verdampft und der Rückstand mit absolutem Alkohol aufgenom- men. Diese Lösung wird mit einigen Tropfen HCl eben angesäuert und wieder zur Trockene verdunstet. Den Piückstand. der neben Cholinehl(U-- hydrat auch noch anorganische Chloride enthält, löst man zur Abtrennung eben dieser anorganischen Chloride wieder in absolutem Alkohol und ver- setzt diese Lösung mit einer alkoholischen Lösung von riatinchloridehlor- wasserstoff. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Alkohol uewasclien, ge- trocknet und gewogen. Donath löst dann die Kristalle in Wasser, läßt die Lösung laui^sam verdunsten und sucht die Kristalle noch auf Grund ihres Lichtbrechungs- *) Siehe Anni. 3, S. 218. -) 7'/i. Panzer, Zur Kenntnis der Zerebrospinalflüssigkeit. Wiener klin. Wochenschr. 1899. 80.-) 7. ■') J. Donath, Detection of thc ( holiiu' in tlie cprebrospinal fluid by means of tlie Polarisation niicroscope. Jouni. of Physiol. 33. 21119 (1905/06). — Siehe auch ./. Donath, Yorkomnion und Boiioutung des Cholins in der Zerebrospinalflüssigkeit etc. Zeit.-chr. f. physin], ( hrmie. 39. .Ö2() 44 (1903). 220 E. Letsche. Vermögens (Doppelbrechung) und ihrer chromatischen Polarisation zu cha- rakterisieren. Gumprechf^) verfährt in ganz ähnlicher Weise, begnügt sich aber nicht mit der Isoüerung der Platindoppelverbindung, sondern zerlegt diese mit H.,S. filtriert den Niederschlag ab und prüft noch mit Hilfe einiger weiterer Reaktionen auf Cholin. (JK gibt Nadeln und lichtkaffeebraune Prismen, AuCIg gibt Kristalle, Phosphormolybdänsäure gibt Fällung usf.) Rosenheiiii^) unterläßt die etwas mühsame Isoherung und Pieinigung der Platinverbindung und gibt zu einer Probe des Rückstandes von der AlkohoUösung, wie sie zur Isolierung der Platinverbindung gewonnen wird, eine starke Lösung von Jod in Jodkalium. Dabei bilden sich die charak- teristischen Kristalle von Cholinperjodid. h) N-freie Extraktivstoffe. Guniprecht^) isoliert Milchsäure aus Z.-Flüssigkeit , indem er diese mit Schwefelsäure ansäuert, mit Äther die saure Lösung wieder- holt ausschüttelt, den Äther verdunstet und den Rückstand in wenig Wasser aufnimmt. Mit dieser Lösung sollen dann die Milchsäurereaktionen angestellt werden. Lehndorf und Batiingarien*) schütteln die angesäuerte Zere- brospinalflüssigkeit ebenfalls mit Äther aus; sie verdunsten dann den Äther und nehmen den Rückstand in Wasser auf. Sie machen dann weiter folgende Angabe: ..Ferner suchten wir die Identität der Milchsäure durch die Abspaltung des Aldehyds und Überführung desselben in Jodoform fest- zustellen. Den sicheren Nachweis aber erbrachten wir durch die Darstel- lung der charakteristischen Zinklaktatkristalle und durch deren Analyse." Nähere Angaben über die Methodik fehlen. Eine eingehende Beschreibung zur Isolierung von Milchsäure aus Zerebrospinalflüssigkeit gibt Lockemann^), dessen Verfahren bei den Me- thoden zur Untersuchung des Serums beschrieben ist. 5. Anorganische Bestandteile. Zur Bestimmung der Asche der Zerebrospinalflüssigkeit dampft man eine gemessene (oder gewogene) Quantität der Flüssigkeit in gewogener Schale ein. Handelt es sich zugleich um eine Trockensubstanzbestim- *) Gumpt-echf, Cholin in der normalen u. pathol. Spinalflüssigkeit etc. Verhandl. d. Kongr. f. innere Med. ^Viesbaden 1900. S. 326/48. -) 0. Kosenheim, Choline on the cerebrospinal fluid. Journ. of Phvsiol. 35. 465/72 (1906/07). ^) Gumprecht, siehe oben bei 1. *) H. Lehndorf und Ä. Baumgarten, Zur Chemie der Zerebrospinalflüssigkeit. Zeitschr. f. exp. Path. u. Ther. 4. 330/55 (1907). ^) Lockemann, Über den Kachweis von Fleischmilchsäure im Blut, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit eklamptischer Frauen. Deutsche med. Wochenschr. 53. 299 (1906). Siehe auch S. 195. ö Methoden zur Aufarbeitung der Zercbrospiualf lüssigkcit in ihre einz. Bestandteile. 22 1 mun^-, SO wird man zunächst bei llU" trocknen und wiipfon. Danach ver- ascht man und wägt wieder. Dai)ei empfiehlt es sich, bei nicht allzu hoher Temperatur die Veraschung auszuführen und eine Spirituslampe statt der Gasflamme anzuwenden, da das Gas infolge seines S-Gehaltes vielfach die Ursache ist, daß der HaSO^-Gehalt /u hoch gefunden wird. Handelt es sich um die Bestimmung einzelner anorganischer Bestand- teile, so kann man zur Bestimmung der Hg 1*0 1 nach Donath^) in fol- gender Weise verfahren: Man kocht nach dem Ansäuern mit verdünnter Essigsäure die Flüssigkeit auf, filtriert von dem Niederschlag ab und fällt die Phosphorsäure mit molybdänsaurem Ammonium. Die weitere Behand- lung des Niederschlages geschieht in der von Neumami angegebenen Weise auf titrimetrischem Wege. '•^) Den Gehalt an Chloriden bestimmten Lanc/aw und Hulpeni^) mit Hilfe der Methode von Volhard-Salkowski zweifellos in der einfach nur verdünnten Zerebrospinalflüssigkeit, wie dies auch v. Hösslin*) am Serum ausführte. Die Alkalimetalle bestimmt man entweder nach den Angaben von Nawratzli oder nach dem Verfahren von Halliburton. Nawratzki ^) verascht die eingedampfte Zerebrospinalflüssigkeit und löst den Bückstand in einigen Tropfen HCl; diese Lösung wird mit XH^ alkalisch gemacht und ein hierbei auftretender Niederschlag von Phos- phaten abfiltriert: das Filtrat wird mit Ammonoxalat versetzt, der Nieder- schlag durch Filtrieren entfernt, das neue Filtrat mit IJafOH). im Cber- schuß versetzt , der Niederschlag von Barvumoxalat ai)filtriert , aus dem Filtrat der Baryt durch H0SO4 entfernt und nach der Entfernung des BaSO^ dieses Filtrat unter Zusatz von (NH4)2C03 eingedampft, gelinde geglüht und gewogen. Der Bückstand, der aus einem Gemenge von KsSO^ + NaoSOi besteht, wird in wenig HoO gelöst, diese Lösung mit HCl angesäuert und aus ihr, nachdem man zum Kochen erhitzt hat, die H2SO4 durch vorsichtigen Zusatz von BaCL entfernt. Einen etwaigen Überschuß von BaCU entfernt man durch wenige Tropfen sehr verdünnter H2 SU4. Das Filtrat wird nach dem Einengen mit Platinchloridlösuug versetzt, die Lösung unter Zusatz von konzentrierter HCl bis fast zur Trockene abgedampft und mit starkem Alkohol übergössen. Das auf diese Weise isoUerte KoPtClß wird auf gewogenem Asbestfilter gesammelt, getrocknet und im Ho-Strom reduziert. Nach dem Ausziehen des KCl wägt man das *) J. Donath, Der Phosphorsäuregehalt der Zerebrospinalflüssigkeit. Zoitschr. f. physiol. Chem. 42. 141 48 (10U4). ^) Das Nähere siehe dieses Handbuch. Bd. 1. 419 (1909). ^) Landau und Ualpern, Beitrag zur Chemie der Zerebrospinalflüssigkeit. Bioch. Zeitschr. 9. 72 (1908). •■) Siehe den Artikel über Blut. S. 201. 5) Nawratzki, Zur Kenntnis der Zerebrospinalflüssigkeit. Zeitsoiir. f. physiol. Chem. 23. 5:J2 (1897). 222 E. Letsche. Methoden zur Aufarbeitung der Zerebrospinalflüssigkeit etc. Platin, berechnet hieraus den Kaliumgehalt und hat damit die Möglich- keit, aus dem Gewicht des Gemenges A'on Na., SO4 + K, SO4 auch das Na- trium zu errechnen. Das Verfahren von Halliburton'^) ist etwas einfacher und kürzer : Etwa 300 cm^ Z.-Flüssigkeit werden in einer Platinschale im H., 0- Bad eingetrocknet; der Rückstand wird auf dem Wasserbad 2 — Smal mit rauchender Salpetersäure zur Trockene eingedampft — um die organische Substanz zu zerstören — und der Rückstand ebenfalls 2 — 3mal mit kon- zentrierter HCl eingedampft, um die Nitrate in Chloride überzuführen. Zur Lösung dieser Chloride fügt man Ba(0H)2 bis zu eben alkaUscher Reak- tion, um Kalk, Magnesia und Phosphorsäure zu entfernen. Man filtriert, wäscht den Niederschlag gut aus (mit heißem Wasser), engt Filtrat und Waschwasser auf dem Wasserbad ein und entfernt geringe Mengen Ba(OH)o mit Hilfe von (NH4)2C03. Ist das BaCOj durch Filtrieren entfernt, dann dampft man das Filtrat in einer Platinschale zur Trockene ein, erhitzt den Rückstand auf Dunkelrotglut, um eventuell noch vorhandene Spuren organischer Substanz und die Ammonsalze zu entfernen. Der Rückstand wird gewogen und dann in HoO gelöst; aus dieser Lösung fällt man in bekannter Weise das KaUum als luPtClo und wägt dieses entweder direkt oder nachdem man wie oben Pt aus dem KaPtClg hergestellt hat. Hat man nur die Aufgabe, Kalium allein zu bestimmen, so mag man die von Myers 2) angegebene Methode anwenden, die darauf beruht, daß Kaliumsalze mit Na3Co(N02)6 schwer lösUches K3Co(N02)6 geben, daß man mit Kaliumpermanganat diese Verbindung oxydiert und mit Hilfe von Oxalsäure den hierzu nötigen Verbrauch an Permanganat feststellt. *) W. D. Hallibtirton, On the cerebrospiual fluid. Journ. of Phvs. 10. 232 58 (1889). ^) F. C. Mijers, The cerebrospinal fluid in certain forms of iusanitv, with special reference to the content of potassium. Journ. of biol. Chemistry. 6. 115/31 (1909). Die ßlutgeriiiiiung. Von P. 3Iorjnvitz, Freiburg' i. B. I. Einleitung. Eine Besprechung der Methoden , die zum Studium und zur Auf- klärung des Vorganges der Blutgerinnung dienen, ist insofern keine ganz leichte Aufgabe, als die theoretischen Vorstellungen über das Wesen dieses Prozesses auch heute noch — trotz zalilreicher Fortschritte — recht weit auseinandergehen. Dieser Umstand bi-ingt es mit sich, dalj auch das methodische Vorgehen der einzelnen Autoren sehr verschieden ist. Es iril)t auf diesem Gebiete nur wenige Verfahren, die allgemeine Anerkennung finden. Vielfach schafft sich jeder l'ntersucher seine eigene Arbeitsmethode oder er paßt sie seinem Gedankengange au, indem er das \'orgehen älterer Beobachter modifiziert. A. Neuere Anschauungen über Blutgerinnung, Es erscheint mir notwendig, dem methodologischen, rein technischen Teil eine kurze theoretische Erörterung der modernen Vorstellungen über das Wesen des Gerinnungsvorganges vorauszuschicken. Sonst müssen die späteren Ausführungen vielfach unverständlich bleit)en. Eingehend ist die Theorie der Blutgerinnung bei Leo Loch^) und Monurit::-) besprochen. Man kann den Gerinnunusvorgang zweckmäüig in zwei Phasen ein- teilen : Die erste Phase umgreift alle \'eränderungen, welche die eigentliche GerinnuniT, den Übergang des Fibrinogens in Fibrin, vorbereiten. Über die einzelnen Vorgänge während dieser ersten Phase ist man sich noch durchaus nicht einig. Alexander ScJnnidt^) betrachtet die Ge- rinnung als einen fermentativen Vorgang. Nach seiner Ansicht besteht die erste Phase des Prozesses in allen Veränderungen, die im Blute die *) L. Loch, Neuere Arbeiten über die BlutgeriiiimniLr etc. Ridclimu. /.Mifr:illil \ I. SA. (1907). ^) Moraivitz, Die Geriunnng des Blutes. Oppenheimers Haiidb. d. Binoiieiuie. Hd. 2. 2 (1908). *) Alexander Schmidt, Zur Blutlehre. Leipzig 1892 niid W oitori' Beiträge zur Blutlchre. Wiesbaden 1895. 224 P- Morawitz. Entstehung von Fibriiifermeiit veranlassen. Das strömende Blut (inner- halb der Gefälle) ist frei oder doch nahezu frei von Fibrinferment. Aus diesem (irunde bleibt es auch im lebenden Organismus flüssig. Erst wenn Blut in vitro oder in vivo in Kontakt mit benetzbaren Fremdkörpern kommt — auch die tote oder veränderte GefälUvand kann als Fremdkörper wirken — . werden die Veränderungen eingeleitet, deren Folge die Bildung von Fibrinferment (Thrombin, Thrombase)' ist. Welches sind nun diese ^'orgäng(' V Alexander Schmidt hat seine eigenen Ansichten über diese Frage im Laufe seiner Untersuchungen mehrfach verändert. Es wird ge- nügen, hier die von ihm in seinen letzten Arbeiten niedergelegte Theorie wiederzugeben. Diese gipfelt darin, daß die Bildung von Fibrinferment ein zellulärer Vorgang ist, respektive daß die zelligen Elemente des Blutes wie auch der übrigen Körperflüssigkeiten sich an der Gerinnung beteihgen. Nur durch ein Zusammenwirken von Zellen — Schmidt denkt in erster Linie an Leukozyten — und Plasma kann Fibrinferment entstehen. Im Plasma findet sich nämlich eine unwirksame Vorstufe des Thrombius, ein Prothrombin. Aus den Blutzellen treten unter geeigneten Bedingungen (Berührung mit Fremdkörpern!), vielleicht auch nach Zerfall von weißen Blutkörperchen, zymoplastische Substanzen in das Plasma aus, die das Prothrombin in den aktiven Zustand überführen. Geringe Giengen zymoplastischer Substanzen sollen allerdings auch schon im zirkulierenden Plasma gelöst vorhanden sein , doch ist ihre Wirkung durch einen noch unbekannten Mechanismus gehemmt. Das Fibrinferment oder Thrombin entsteht demnach durch das Zusammen- oder Aufeinanderwirken zweier Körper, von denen der eine ursprünglich dem Plasma angehört (Pro- thrombin), der andere (zymoplastische Substanz) vorwiegend den Blutzellen entstammt. In ähnlicher Weise wie zymoplastische Substanzen soll auch eine vorübergehende Erhöhung der Alkaleszenz des Plasma (durch Zusatz von —Na OH) die LImwandlung von Prothrombin in wirksames Thrombin befördern. Nach dieser von Schmidt entwickelten, hier nur in groben Zügen skizzierten Anschauung ist also die Schnelligkeit der Fermententwicklung im wesentlichen abhängig von dem Umfange der Schädigungen, denen die zeUigen P^lemente des Blutes unterworfen sind. Je größer die Be- rührungsfläche des Blutes mit Fremdkörpern ist, je rauher und unebener diese selbst sind, um so schneller und ausgiebiger wird sich die Abgabe zymoplastischer Substanzen, mithin also die Bildung der Thrombase, voll- ziehen müssen. Dieser Auffassung von der ersten Phase des Gerinnungsvorganges wurde durch Arthus^) alsbald eine andere gegenübergestellt. Arthns und Pages-) entdeckten die Bedeutung der Kalksalze für den Gerinnungsvor- •) Arthns, Recherches sur la coagulation du sang. These de doct. Paris 1890. ■-) Arfliiis und Paffes, Nouvelle tlieoiie chimique de la coagulation du sang. Arch. de Physiol. T. 22. 739—746 (1890). Die Blutgeriniunig. 095 gang. Ohne Kcalksalze keine Gerinnung I Dieser Satz wurde bald von vielen Seiten bestätigt. Während al)er Art/ms und I'chtlharlmj'^) im Zweifel waren, an welcher Stelle die Kalkwirkiing einsetzt — sie dachten speziell auch an die Bedeutung der Ca-lenen für die fbcrfiihrung des Fibrinoi^cns in Fibrin — . ergibt sich aus den Arbeiten Haiiini(iysff)is-) mit Sicherheit Folgendes: Ionisierte Kalksalze sind während der ersten l'liase des (Je- rinnungsvorganges notwendig, sie ermöglichen die Umwandlung der unwirk- samen Vorstufe des Fibrinfermentes, des Prothrombins, in aktives Thrombin. Dagegen kann die zweite Phase der Gerinnung, die Reaktion zwischen fertigem Thrombin und Fibrinogen, auch bei Abwesenheit ionisierter Kalk- salze ablaufen. In dieser Lehre, die sich aus den Arl)eiten von Artlius, l'ckdharhKj und besonders H(t)iin(arsfen ergibt, haben die zymoplastischen Substanzen Schmidts keinen Platz mehr gefunden. Die beiden Vorstelluni:sr(!ihen standen sich bis vor wenigen Jahren ziemlich unvermittelt gegenüber. (Nebenbei mag hier erwähnt werden, dalj die Lehre von den zymoplastischen Sub- stanzen im ganzen recht wenig bekannt war und demgemäß auch wenig diskutiert wurde.) Nach Schmidt, der übrigens die liedeutung der Kalk- salze überhaupt bestreitet, wäre das Prothrombin im Plasma enthalten, die zymoplastischen Substanzen hingegen stammten vornehndich aus den P>lut- zellen. I)emgegenül)er wird nach Arthu.s und Hammarsten gerade das Prothrombin von den Zellen geliefert und trifft im Plasma auf Kalksalze, die dann die w^eitere Umwandlung in wirksames Thrombin übernehmen. Versuche, die hier vorliegenden Widersprüche aufzuklären, sind von Fuld und Spiro^) und Moraicitz*) unternommen worden. Ihre Arbeiten führten etwa zu folgenden Ergebnissen : Sicher sind Kalksalze für die Ent- stehung des Thrombins erforderlich. Insofern behält Arflius recht. Aber die Anschauungen A. Schmidts sind hiermit nicht unvereinbar. Zahlreiche Erfahrungen weisen darauf hin . dab aulier den Kalksalzen mindestens zwei fermentähidiche Körper zur Entstehung des Thrombins beitragen : Die eine findet sich bereits im zirkulierenden Plasma und entspricht dem Prothrombin Schmidts. Es ist von Morawitz und Nolf'>) Thromboi^en genannt worden. Der andere Körper stammt nach Fuld-Spiro und Mora- witz vornehmlich aus den zelligen Elementen des Blutes. Wahrscheiidich ist er in erster Linie ein Derivat der IMutpliittchen, vielleicht auch der Leukozyten. Er tritt erst extravaskulär auf gewisse Reize hin aus ilen ^) Pekelharing, Über die Bedeutung der Kalksalze für die Gerinnung des Bhites. Internat. Beiträge f. Bud. l'trclioics- Festsclirift. I (1891 1. ^) Hammarsten , Über die Bedeutung der bislicben Kalksalzc für die Faserstoff- gerinnung. Zeitschr. f. physiol. Chem. Bd. 22. 8.333(1896). — Derselbe: Weitere Beiträge zur Kenntnis der Fibrinbildung. Zeitschr. pliysiol. Cheni. Bd. 28. S. 98 (1899). ') Fuld und Spiro, Der Einfluß einiffer irerinnungslioniinemlen Agentien auf das Vogelplasma. Jlofmcis-tcrs Beiträge. Bd. 5. S. 171 (1904). ■•) Morawitz, Die Chemie der Blutgerinnung. Ergebnisse d. Physiol. IV. S. 307 (19(t.'»). ^) Xolf, Coiitributidii h IV-tudc de la cohlmiI. du sang. 3"' memoire. .\rrh. inti-rnut. do rhysiologie. VI. IL 1 (1908). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmotbnden. V. 15 226 P- Morawitz. Zellen in das Plasma über. Wie man sieht, entspricht Herkunft und Wirkungsweise dieses Körpers durchaus dem der Schmidtschen zymo- plastischen Substanzen. Man könnte ihn unbedenklich mit diesen identi- fizieren, wenn nicht die gerinnungsbef ordernden Stoffe der Zellen nach Fuld und Moraicitz ganz andere chemische Eigenschaften hätten, als sie Schwidt seinen zymoplastischen Substanzen zuschreibt. Letztere sollen alkohollöslich und hitzebeständig sein, während die Thrombokiuase ferment- ähnlich ist, also sehr labil gegen chemische Einflüsse verschiedener Art, besonders gegen hohe Temperaturen. Es erscheint daher berechtigt, die Thrombokinase nicht kurzerhand den zymoplastischen Substanzen gleich- zusetzen. Hiernach hätte man sich die erste Phase der Gerinnung folgender- maßen zu denken: Verläßt Blut das Gefäßsystem, treten seine geformten Elemente in Kontakt mit benetzbaren Fremdkörpern, so erfolgt eine Ab- gabe von Thrombokinase in das Plasma. Dieses enthält bereits Throm- bogen und ionisierte Kalksalze, nach Nolf^) auch schon eine gewisse Menge Thrombokinase (Thrombozym). Durch ein Zusammenwirken der drei Faktoren entsteht Thrombin. Wahrscheinlich ist der Ablauf der Erscheinungen aber noch kompli- zierter, als das nach den eben gegebenen Ausführungen scheinen mag. Zunächst dürften nach Loeh -) und Murasdww 3) u. a. gerinnungshemmende Körper eine, einstweilen allerdings noch Avenig geklärte PioUe spielen. Vielleicht sind sie für den flüssigen Zustand des Blutes von Bedeutung. Hiernach wäre das strömende Blut in erster Linie deshalb flüssig, weil Thrombokinase entweder gar nicht oder doch in zu geringer Menge in das Plasma übertritt, so lange das Blut innerhalb lebender Gefäße weilt. Aber auch bei der Gerinnung in vitro scheint in der Regel nur ein Teil des gesamten Thrombogenvorrates in Thrombin übergeführt zu werden. Durch Zusatz von Thrombokinase zu Blutserum (also nach vollendeter Gerinnung) kann man die Bildung neuer, oft sehr beträchtlicher Thrombin- mengen hervorrufen. Indessen scheinen auch diese zuletzt wiedergegebenen Untersuchungen und Theorien noch nicht allen bisher beobachteten Tatsachen gerecht zu werden. Auch heute noch bestehen Meinungsverschiedenheiten über die wichtigsten Fragen der Gerinnungslehre. Zunächst werden die beiden wichtigsten Tatsachen, die man Alexander Schmidt verdankt, neuerdings energischer als früher bestritten. Das ist die fermentative Natur des Gerinnungsvorganges auf der einen, die Beteili- gung und ausschlaggebende Piolle der Blutzellen auf der anderen Seite. ') liolf, 1. c. ^) Loeb, Versuche über einige Bedingungen der Blutgerinnung etc. Virchou-s Arch. Bd. 170. S. A. (1904). ') Murascheir , Über die Spezifizität des Fibriufermentes und seiner Vorstufen. Deutsches Arch. f. klin. Med. Bd. 80. S. 187 (1904). Dio Blutgerinnung. 227 Schon vor langer Zeit hat Wooldridge^) auf (irund von Vorsuchon an Peptonplasma behauptet, die Geriiuiunf? sei ül»erhaupt kein fernwu- tativer Prozeß, sondern Ausdruck der NCrhindunir zweier Fihrin()ü:eno, also der fjegenseitiL^en Fälhin;;' zweier Kolloide. l)i('se, das A- und B-l'ihrinogen. finden sich schon im strömenden Pdute. Das Plasma selbst enthalt also schon von vornherein alles, was zur (lerinnun«.^' erforderlich ist. Inner- halb lebender Gefäße bleibt es aber trotzdem flüssig, da gewisse, unbe- kannte Faktoren die Vereinigung der beiden Fibrinogene hindern. Nolf^) hat neuerdings diese Theorie in stark veränderter l'orm wieder aufgenommen und den neugewonnenen P)efunden angopalU. In vielen F'ragen nähert er sich den Anschauungen von Fuld-Spiro und Mormritz. Indessen bestreitet er die Fermentnatur des Gerinnungsvorganges, (ierinnung entsteht vielmehr durch gegenseitige Fällung mindestens dreier Kolloide, die in zwei Phasen vor sich geht: Zunächst vereinigen sich bei gleichzeitiger Anwesenheit ionisierter Kalksalze Thrombogen und Thrombozym (letzteres entspricht ungefähr der Thrombokinase anderer Autoren). Dann erfolgt die Fällung des Fibrinogens. Alle zur CJerinninig notwendigen Substanzen finden sich schon im zirkulierenden Plasma. Allerdings enthalten auch die Zellen des Blutes und der Gefäßwände Throml)ozym, das wahrscheinlich ebenfalls in das Plasma übertritt. Sc/uin'dfs Fibrinferment ist nach Nol/ nicht Vr- Sache, sondern Produkt der Gerinnung. Innerhalb lebender Gefäße bleibt Blut nicht deswegen flüssig, weil ihm ein für die Gerinnung notwendiger Faktor (etwa Thrombozym) fehlt, sondern vornehmlich deswegen, weil die drei Kolloide an sich nur geringe Neigung haben miteinander zu reagieren. Ihre Vereinigung erfolgt erst unter dem Einfluß gewisser thrombo- plastischer Substanzen mit größerer Geschwindigkeit. Die Zahl solcher Substanzen , die für die Gerinnung nicht absolut erforderlich sind . sie aber doch in hohem Grade befördern, ist sehr groß. Alle Gewebe, jedes Protoplasma enthält sie. Dagegen ist das Thrombozym nur den Zellen des l>lutes und der Gefäßwände eigen. Auch Berührung mit Fremdkörpern verschiedener Art wirkt thromboplastisch. Gewebsextrakte enthalten meist ein Gemisch von Thrombozym (Thrombokinase) und thromboplastischen Substanzen, die etwa den zymoplastischen Substanzen A. Schmidts ent- sprechen. Gelingt es, Gewebszellen ganz frei von Blut und Gefäi'en zu ge- winnen (z.B. Sperma), so kann man in ihnen nur thromboplastLsehe Sub- stanzen, nicht aber Thrombozym nachweisen. Die Bedeutung thromboplastischer Wirkungen energisch betont zu haben, ist iVo//5 Verdienst. Indessen kannte man solche Wirkungen schon früher: Bordcf und Gengou'^) fingen Blut in paraffinierten Gefälk'u auf. ') Wooldridye, Die Geiiiinun': des liliitcs. l»outscli von J/. r. Frei/, l.cipziir IHKl. ^) Xolf, Contribution ä lY'tude de la coagulation du sang. 3* ni«?moire. Arcli. internat. de riiysiol. VI. II. 1 (l'JOS). ^) Bordi't-dctuioK , Recherclies sur la coagulation du sanir. Ann. Instit. /'(/-'"»■ Bd. 17. S. 822. (H)03). 15* 228 P- Morawitz. entfernton die zelligen Elemente durch die Zentrifuge und gewannen ein völlig zellfreies Plasma. Dieses blieb flüssig, so lange es in paraffinierten Gefaijen verweilte. Füllte man es aber in ein Glasgefäß mit benetzbaren AVänden. so erfolgte schon in kurzem Gerinnung. Hier hatte also das Plasma sicher .schon alles zur Gerinnung Notwendige enthalten. Aber die gerinnungserzeugenden Substanzen konnten erst dann miteinander reagieren, als durch Einführung einer benetzbaren Fläche ein thromboplastisch wirkender Faktor gegeben war. In dieselbe Kategorie gehören auch vermutlich einige Beobachtungen am ..Peptonplasma" ; dieses gerinnt spontan gar nicht oder doch nur sehr langsam. Dagegen läßt es sich meist durch Verdünnen mit destilliertem ^Vasser oder durch leichtes Ansäuern zur Gerinnung bringen. Zu wesentlich anderen Vorstellungen als die übrigen Beobachter ist Leo Loeh^) gekommen. Er ging von der Untersuchung der Blutgerinnung bei Wirbellosen aus, bei denen die Verhältnisse viel einfacher liegen. Bei ^ielen Wirbellosen beobachtet man überhaupt keine eigentliche Ge- rinnung sensu strictiori. Die Blutstillung geschieht lediglich durch Agglu- tination der amöboiden Zellen des Blutes, die sich zusammenballen, ver- filzen und hierdurch einen Verschluß des blutenden Gefäßes bewirken. (Übrigens läßt sich ein analoger Vorgang auch bei Wirbeltieren überall nachweisen. Kurz vor der Gerinnung tritt eine auch schon makroskopisch sichtbare Agglutination von Leukozyten und Blutplättchen ein.) Meist be- schränkt sich bei Wirbellosen der Gerinnungsvorgang auf diese Aggluti- nation. Ein fibrinogenähnlicher Eiweißkörper existiert nicht. Einige Deka- poden zeigen aber Verhältnisse, die der Wirbeltiergerinnung an die Seite zu stellen sind. Es tritt bei ihnen nämUch eine Art von zweiter Gerinnung ein, die durch Unlöslichwerden eines Fibrinogens entsteht. Zwei Gruppen von Substanzen veranlassen diese zweite Gerinnung: erstens das Thrombin und zweitens in den Geweben enthaltene Koaguline. Loeb ist nicht der Ansicht, daß die Koaguhne als Kinasen Avirken, er denkt daran, daß sie auch bei Wirbeltieren direkt am Fibrinogen angreifen. Die Gewebskoaguline würden also prinzipiell ähnlich wirken wie Thrombin. Immerhin darf man beide Körper nicht identifizieren, denn das Thrombin ist auch bei Abwesen- heit von Ca-Salzen wirksam, es bedarf ihrer nur zu seiner Entstehung. Die Koaguline wirken dagegen nur bei Gegenwart von Ca-Ionen. Das Thrombin ist ferner in der Wirbeltierreihe nicht spezifisch adaptiert, die Gewebs- koaguline zeigen ausgesprochene Spezifität. Verschiedenartige Substanzen besitzen also hiernach die Fähigkeit, Fibrinogen in Fibrin umzuwandeln. Im übrigen hebt Loeb mit Recht hervor, daß heute jeder Theorie der Blut- gerinnung bei der außerordentlichen Komplikation der Erscheinungen und der Unmöglichkeit, mit reinen Körpern zu arbeiten, eine gewisse Un- sicherheit anhaften muß. ') L. Loeb, siehe die zusammenfassende Darstellung im Biochemischen Zentralbl. VI. S. A. (1907). Die Blutgerinnung. 229 Kndlicli maff!; not'li bemerkt werden, daß neuerdiniis Houell^\ und Bettcjer-) den gerinnunf^shefürdernden Substanzen der Zellen und Oewebe überhaupt jede gröl5ere liedeutunj^' für die Entstehung des Thronibins ab- sprechen. Zusatz von Gewebsextrakten soll nicht anders wirken , als der irgend welcher indifferenter Substanzen mit großer Oberfliiche (Kohle, Glaspulver etcj. Wie sich hiermit die von Loch u. a. nachgewiesene Spezifität der Extrakte in Einklang bringen lälit, scheint mir unverstiindlich. Es gehen also die Anschauungen noch recht weit auseinander. Zum \'er- ständnis der hier gegebenen methodologischen Darstellung mag aber Folgendes betont werden : P^in hoher Grad von Wahrscheinlichkeit spricht dafür, daß das Thrombin durch Zusammenwirken mindestens dreier Fak- toren entsteht. Zwei, nämlich Thrombogen und Kalksalze, finden sich sicher schon im zirkuliei'enden Plasma, die Thrombokinase (oder das Thrombozym Xolfs) wird wohl vorwiegend erst extravaskulär von den ge- formten Elementen an das Plasma abgegeben. Verschiedene Einflüsse, be- sonders Berührung mit Fremdkörpern, sind im Stande, die Entstehung des Throml)ins zu beschleunigen. Diese Erscheinung wird nur zum Teil da- durch erklärt, daß die Zellen bei ausgedehnter Bezeichnung mit Fremd- körpern schneller zerfallen, respektive zur Abgabe der ihnen entstammenden gerinnungsbefördernden Stoffe veranlaßt werden. Sicher ist der Einfluß der Berührung mit Fremdkörpern auch noch ein anderer: nach Erfahrungen von Bordet-Gengou und Xolf befördert sie auch die (ioriimnng des zell- freieu Plasma. Sehr wenig ist über die zweite Phase der (ierinimng. die Cber- führung des Fibrinogens in Fibrin, bekannt. Möglicherweise handelt es sich um eine Spaltung des Fibrinogenmoleküls, wie Heuhner^) vermutet. Das Fibrinogen soll dabei in Fibrin und das von Hammarsün*) entdeckte Fibi-inglobuliu gespalten werden. Letzteres ist löslich und im Serum nach vollendeter Gerinnung nachweisbar. 'SRch Huiskainj)^) ist es aber gar nicht erforderlich, das Fibringlobulin als eine für die (lerinnung wichtige Sub- stanz anzusehen. I)<'nn es gelingt durch Fällung mit Fluornatiium Fibrinogen- lösungen zu erhalten, die frei von Fibringlobulin sind. Dieses entsteht daher wahrscheinlich nicht erst während der Gerinnung, sondern ist schon von vorneherein in den Fibrinogenlösungen enthalten, entweder als ein- fache Beimengung oder in lockerer Verbindung mit dem Fii)rinogen. Kurz nach vollendeter Gerinnung beginnt der Blutkuchen sich zu- sammenzuziehen und läßt Serum austreten. Fiü- diese Retraktion des *) Howell, The coagulatioii nt lilood. l'lic Clovclanil medic. Journ. Januar und Februar (1910). S. A. ^) Kettger, The coagulation of hlood. Araeric. .):enü{^ende Mentre des ThromI)ot!:ens im zirkulicrouden Plasma. Mangel an ionisierten KalksalzfMi. ferner unzureichende Ilildung, respektive Alt^Mhe von Thromho- kinase ('rhromhozym von Xolf) seitens der «ieformten Elemente. Knlutstropfen der "Wunde schnell entquellen. "Wunden, in denen sich bereits Gerinnsel gebildet haben, scillen nicht noch einmal zur Blutentnahme für Gerinuungsbestimmungen benutzt werden; denn die Blutstropfen, die mau dann erhält, gerinnen meist sehr rasch. Dieselbe Vorsichtsmaßregel sollte auch im Tierversuch beobachtet werden. Hat man in irgend ein Blutgefäß eine Kanüle eingebunden, so sollte man diese nur einmal, nicht aber mehrfach zur Blutentnahme be- nutzen, besonders wenn zwischen der ersten und zweiten Entnahme längere Zeit verstrichen ist. Sonst wird man oft bei der zweiten Blutentnahme — selbst wenn man die Kanüle inzwischen mit Kochsalzlösung ausgespritzt hat — eine starke Beschleunigung der (lerinnung feststellen können, die rein lokal bedingt ist und mit einer allgemeinen Änderung der (Jerinn- barkeit gar nichts zu tun hat. Manche Versuche, besonders die älteren Beobachtungen über die gerinnungsbefördernde Wirkung der (ielatine. ') KottiiKDui, Der Koagiilnviskosimeter etc. Zeitschr. f. kliii. Med. Bil. 69. S. 415 (1910). -) Bortht-Gengou , Rech, snr la coagiilatioii du saiii;. 4önic niöin. .Sur lo pouvoir coagulaiit du serum. Anu. de l'instit. Pasfcur. T. 18 (11)04). S. 98— 115. 234 ^- Morawitz. leiden an diesem Mangel der Methodik. Man tut daher gut, im Tierver- such die Blutentnalime an verschiedenen Stellen und stets mit unge- brauchten, sorgfaltig gereinigten Kanülen auszuführen. Die durch Ein- binden der Glaskanüle geschädigten Gefäßwandzellen können möglicher- weise auch schon eine schnellere Blutgerinnung veranlassen. 4. Der Gasgehalt des Blutes ist nicht ohne Einfluß auf die Ge- rinnungszeit. Kohlensäurereiches Blut gerinnt nach A. Schmidt u. a. lang- samer als C0.2-armes. Auch das verdient Beachtung. Ein wechselnder Gas- gehalt des Blutes kommt als Fehlerquelle besonders für die Methoden in Betracht, die mit gestautem Armvenenblut arbeiten. Wie groß die prak- tische Bedeutung der vermehrten C0.2-Spannung ist, scheint noch nicht genauer untersucht zu sein. Jedenfalls geht Deetjen'^) zu weit, wenn er eine wesentliche Ursache der Gerinnung des Blutes in einer Abnahme seiner COo-Spannung (bedingt durch Entweichen von CO.. in die Atmosphäre) erblickt. Werden alle diese Fehlerquellen berücksichtigt, arbeitet man stets mit gleicher Methodik, so findet man eine ziemlich weitgehende Konstanz der Gerinnungszeit. Das gilt für ein und dasselbe Individuum, aber auch für verschiedene Individuen derselben Spezies. Ein Einfluß von Tageszeit und Nahrungsaufnahme ist nicht deutlich zu erkennen. Bürker-) nimmt ein Minimum der Gerinnungszeit gegen 2 Uhr nachmittags an. Andere {Addis '^), Hartmann ^) fanden keine Gesetzmäßigkeit nach dieser Richtung. Da die meisten Methoden zur Bestimmung der Gerinnungszeit nicht ganz einfach sind, sollte man sich erst dann an die Untersuchung wissen- schaftlicher Fragen machen, wenn man am Normalen zuverlässige Werte zu gewinnen vermag. Eine praktisch bedeutsame Frage bleibt noch zu erörtern : Gibt die Bestimmung der Gerinnungszeit in vitro wirklich ein zuverlässiges Bild von den Vorgängen, die sich beim Verschluß blutender Wunden im Orga- nismus abspielen? Liegen dort nicht vielleicht ganz andere Verhältnisse vor, die eine Übertragung der bei Versuchen in vitro gewonnenen Vor- stellungen gar nicht gestatten? Wahrscheiidich sind nun allerdings die Vorgänge beim Verschluß blutender Gefäße der Gerinnung in vitro nicht ohne weiteres an die Seite zu setzen. Im ersten Falle spielt sicher die Agglutination der Blutplättchen und Leukocyten und die dadurch bedingte Pfropfbildung eine vielleicht ebenso bedeutende Rolle, wie die eigentliche Fibringerinnung. Trotzdem zeigen doch fast alle Individuen, die schwer stillbaren Blutungen unter- worfen sind, die Erscheinung einer verminderten Gerinnbarkeit in vitro. ^) Deetjen, Zerfall und Leben der Blutplättchen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 63. Heft 1 (1909). -) Biirker, 1. c. ^) Addis, The coagulatiou Time of the blood etc. Edinb. med. Journ. July 1910. S. A. ■*) Hartmann, Zur Frage der Blutgerinnungszeit. Münchener med. Wochenschr. Kr. IG (1909). Die Bhitgcriiiniini,'. t)q?^ Insofern besteht also ein /usanimoiilianti. I)ag('j,^'n darf man den Satz nicht umkehren : Eine verzögerte Gerinnung hrauclit nicht notwendigcr- ^Yeise mit einer starken Neigung zu I^hitungen einherzugehen {Hbwmn und Skidcn^). Im Folgenden können nicht alle .Methoden zur Bestimmung der Tle- rinnungszcit beschrieiien werden. Ihre Zahl ist Legion. Ich heschriinke mich auf die ^'erfahren, deren Brauchbarkeit durch zuverliissiy-e Beobachtun«: feststeht. B. Methoden zur Bestimmung der Gerinnungszeit. 1. Methode von Vierordt.-) Sie ist das älteste aller brauchltaren Verfahren zur Bestimmung der Gerinnungszeit. Auch heute noch findet sie hier und da N'erwendung. Vierordt saugt Blut in sorgfältig gereinigte und getrocknete, beider- seits offene kapillare Glasröhren von 1 mm Durchmesser und 5 cm Länge. Ein durch Einstich in die Haut gewonnener Blutstropfen wird mit dem Ende einer der Glasröhren berührt. Das P)lut tritt sofort durch Kapillar- attraktion in das Glasröhrchen ein. Man sorgt dafür, dali die Blutsäule stets gleich lang ausfällt, etwa i^mm. In die Röhre wird nun von der anderen Seite ein weilles, durch Alkohol und Äther entfettetes und ge- trocknetes Pferdehaar eingeführt. Die Länge des Haares beträgt \{)cm. Es wird durch die Blutsäule hindurchgeführt und von Zeit zu Zeit, etwa alle ^/a Minute, um ein kleines Stück weiter vorgezogen. So lange das Blut noch nicht geronnen ist, bleiben die durch das Blut durchgeführten Partien des Haares ungefärbt. Mit Beginn der Gerinnung bedeckt sich das Haar mit rötlichen Niederschlägen. Das Ende der Koagulation wird dadinch be- zeichnet, daß keine neuen Niederschläge entstehen und das Haar bei weiterem ^■orziehen wieder weiß erscheint. Als Geriimungszeit gilt der Zeitraum vom Einströmen des Blutes in die Ginsröhre bis zur Vollendung der Fibrinabscheiduug. Er beträgt nach Vierordt bei einem gesunden Menschen im Durchschnitt 9V4'' mit Schwankungen von 7 bis 11' (Zimmertemperatur). Diese Zeit ist recht lang, wenn man die ausgedehnte Berührung des Blutes mit der Glaswan»l berücksichtigt. Vierordt sucht nicht den Beginn, sondern das Ende der Gerinnung zu bestimmen. Bestimmung des Gerinnungsbeginnes soll weniger e.xakt sein. Nach Sahli''-) kann man mit l'icmn/ts Methode, auch in ursprüng- licher (iestalt, brauchbare Resultate erhalten. Doch sind verschiedene Fehlermöglichkeiten zu berücksichtigen, z. B. Temperaturschwankuiigen. •) Ilinmau und Sladen , Mcasurcmciit of tlie Coairnlatio Time of tlio hiood. aiiil its Application. Johns Ifojikins H<»s|). Bull. \'nl. 18. .Tuiii-.Iuli 1907. S. A. -) Vierordt, Aldi. f. lh'iiiFr^y/A^sche Verfahren gestaltete sich im ein/einen folgendermaßen: Ein halbes bis ein Dutzend Glaskapillareu von 0 2'^ mm Durchmesser werden so graduiert, daß sie eine Blut- säule von 5 cm Länge aufzunehmen vermögen. Ein durch Einstich in die Eingerbeere gewonnener Bluts- tropfen wird mit einer der Glasröhren aufgesogen. Nach Füllung des Röhrchens notiert man die Zeit der Blutentnahme. Dann wird die Wunde al)gewischt und ein neuer Blutstropfen in einem zweiten Glasröhrchen aufgefangen usw. Die Füllung immer neuer Kapillaren geschieht in Zwischenräumen von V4 bis \ a'i ebenso auch später das Ausblasen des Blutes. Pressen der Wuudränder zum Zwecke eines besseren Blutzuflusses ist verboten. Zur Herstellung konstanter Temperaturbedin- gungen empfiehlt Wright sein Koagulometer. Es ist das ein mit Wasser von bestimmter Temperatur gefüllter Metallzylinder, der von einer eng anlii'genden Flanelltasche umgeben ist. In diese Tasche werden die Glasröhrchen nebst einem Thermometer schon vor Beginn des \'er- suches eingeschoben und vorgewärmt. Am besten füllt man den .Metall- zylinder mit Wasser von 18r)". Bei dieser Temperatur wird eine im Laufe des ^'ersuches eintretende Ai)kühlung des Wassers keine nennenswerte Fehlenjuelle abgeben können (Fig. 80). ') Wrif/ht, An a motliod uf detcrmining tlic condition of blood ooagulability etc. Brit. med. Journ. II. [). 223 (18Ü3). — Dersell)e, Un souie new procedures for the examiuation of the blood etc. Lancet. London 1*J02. II. S. M. Koaguloinotor von Wriijhl. (.Viis lieznnfon-Lnbli , Trait(5 d'Hi'iiiatoIogio, l'iiris 1904.) 238 P- Morawitz. Wright nahm dann noch weitere Modifikationen vor. Die eine be- trifft die Herstellung der Glaskapillaren von dem erwünschten Durch- messer. Die Methode ist einfach und elegant: Ein Glasrohr wird in eine Kapillare ausgezogen und mit bmm^ Quecksilber geeicht. Man wird beim Verschieben des Quecksilberfadens eine Stelle finden, in der die Queck- silbersäule in der Glaskapillare gerade eine Länge von 5 cm hat. Die obere und untere Grenze dieser Partie wird markiert und die Kapillare in der Weise abgeschnitten, daß das eine ihrer Enden mit einer der Marken zu- sammenfällt, das andere sich etwa 1—2 cm über der anderen Marke be- findet. In dieser Weise stellt man sich eine größere Zahl Kapillaren her, die man beim ^'ersuch bis zur oberen Marke mit Blut füllt. In letzter Zeit hat Wright Temperaturkonstanz nicht mehr mit Hilfe des Koagiilometers , sondern durch ein Wasserbad von l&b° hergestellt. Die einzelnen Kapillaren werden aufrecht hineingestellt, das obere Ende überragt den Wasserspiegel. Eine Mischung von Wasser und Blut wird durch die zwischen Wasser und Blut eingeschlossene Luftsäule verhindert. Will man die Kapillaren in Wasser vorwärmen, so muß man ihr unteres Ende durch eine Gummikappe verschließen. Die Wrightsche Methode dürfte manchen anderen, besonders neueren \'erfahren gegenüber kaum A'orteile bieten. Da das Lumen der Kapillaren nur 0"2rv?»m weit ist, sind die Gerinnungszeiten sehr kurz. Bei 37" ist die Gerinnungszeit z. B. normalerweise weniger als 2'. Das ist nicht er- wünscht, da Differenzen im allgemeinen um so besser zum Ausdrucke kommen und um so sicherer sind, je länger die normale Gerinnungszeit ist. Außerdem ist es nicht ganz einfach, die für die Füllung so vieler Kapillaren nötigen Blutmengen zu bekommen. Wright empfiehlt im Notfalle zahlreiche Stiche oberhalb des Nagelbettes anzulegen. Dadurch vermeidet er allerdings den Fehler, den eine beginnende Gerinnung in der Wunde mit sich bringt; aber die ^Methode wird für den Untersuchten recht lästig. 3. Andere Kapillarmethoden. a) Methode von Sahrazks.'^) Das in großen Tropfen aus dem vorher mit Alkohol gereinigten und getrockneten Ohrläppchen hervor- quellende Blut wird in Glaskapillaren aufgesogen. Diese sollen einen Durch- messer von 1 mm bei einer Länge von 10 cm haben. Sie bestehen aus möglichst dünnem Glase und werden sorgfältig mit Salzsäure, Soda, Wasser, xVlkohol, Äther gereinigt und trocken unter aseptischen Kautelen, vor Staub geschützt, aufbewahrt. Es ist nach Sahrazes ziemlich schwierig, stets Kapillaren von genau 1 mm Durchmesser zu beschaffen. Kleinere Ab- weichungen (von Vio— 'Vlo'>*w^) sollen aber das Resultat nicht wesenthch trüben. Eventuell könnte man sich auch des oben (S. 238) erwähnten Ver- fahrens von Wright zur Herstellung gleichmäßiger Glaskapillaren be- dienen. *) Sahrazks, Procede de determinatioii du debut de la coagulatiou du sang. Fol. haematol. III. p. 432 (1906). Die Blutgerinnung. 239 j Vor Beginn des Versuches werden die Kapillären an mehreren Stellen mit der Feile eingeschnitten, um das später iiiiti^'e /erl)reclien zu er- leichtern. Zur Herstellung konstanter Temperatur dient eine (ila.sglocke mit doppeltem Boden, der mit Wasser gefüllt wird. Man wählt die Temperatur des Wassers so, daß in der Kammer, respektive oberhalb des inneren Bodens, eine Temperatur von 185" herrscht. Im Sommer, bei hoher Zimmertemperatur, soll man einige P^isstücke statt Wasser zwischen den I)op])elboden brin- gen (Fig. 81). ^''*■^^• Zwei Kapil- larrohre und das Thermometer lie- gen horizontal auf einem kleinen (ie- stell in der ge- schlossenen Kam- mer. Der \'ersuch kann begonnen werden, wenn sich das Thermometer auf 18"5'' einge- stellt hat. Dann wird der Einstich in das Ohrläpp- chen gemacht, der erste Tropfen fort- gewischt, der zwei- te und dritte aspi- riert und die Zeit der Füllung genau notiert. Die Kai)il- laren legt man dann sogleich mit der Pinzette an den alten Platz in der Kammer (Anfassen mit den Fingern soll möglichst vermieden werden). Die Glasglocke wird ge.>lutes beim Neigen der Kammer eintritt, wird auch das zweite Röhrchen zerbrochen. Sollte man das zu früh ausgeführt haben (kein Fibrinfädchen beim Bruche sichtbar), so wird der Versuch wiederholt. Dann ist aber die Gerinnungszeit schon durch den ersten Versuch appro- ximativ festgelegt. Nach der Methode von Sahrazes beträgt sie für den Normalen zirka 9 — 10'. Das entspricht recht gut den von Vier or dt mit gleichkahbrigen Kapillaren bestimmten Werten. Mängel der /SViftro^esschen Methode sind : Unbequeme Herstellung der konstant temperierten Kammer. Ungenügende Verschiebung der Blutsäule beim Neigen der Kapillare schon längere Zeit vor beginnender Gerinnung. h) Methode von Schultz.'^) Blut wird in einer Hohlperlenkapillare aufgefangen (Fig. 82). Die einzelnen Glieder der Kapillare werden in bestimmten Zeitab- schnitten abgebrochen und in abgemessenen Quanten physiologischer Koch- salzlösung ausgeschüttelt. Man kann hierdurch den Gerinnungsvorgang in Stadien zerlegen und sukzessive Fortgang und Abschluß der Gerinnung feststellen. Die Gerinnungsröhre besteht aus einem Teilstück mit 12 eng an- einanderliegenden kugeligen Auftreibungen, die in einen kurzen Stiel aus- laufen. Die Auf- ^'^' ^^' blasungen sollen möglichst kongru- ent sein, die Inter- vallstücke kurz und von dem ur- Methode Yon Schultz. sprünglichen Durchmesser der Kapillare. Sind sie zu weit, so kann die Beobachtung dadurch gestört werden, daß bei Abbrechen einer Hohlperle Gerinnsel aus der nächsten Perle mit hinausgerissen werden. Man muß dann sofort noch eine Kugel abbrechen. Die Intervallstücke sind einseitig geritzt und werden der Mar- kierung entsprechend gebrochen. Die Füllung eines Röhrchens erfordert ein bis zwei Tropfen P)lut. Der Gerinnungsversuch gestaltet sich folgendermaßen : Das Röhrchen ist sorgfältig mit Wasser, Alkohol und Äther gesäubert und getrocknet. Man läßt von seinem Ende, an dem sich die Perlen befinden, Blut ein- treten, trocknet nach vollendeter Füllung etwa außen anhaftendes Blut ab und legt die Kapillare auf eine Unterlage, den Stiel etwas höher gerichtet, um ein Zurückfließen von Blut aus den Hohlperlen in den Stiel zu ver- *) Schnitz, Eine neue Methode zur Bestimmung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Berliner klin. Wochenschr. Nr. 12 (1910). Die lilutgeriniuiiig. ■J41 c.'il^'en/- Fig. 83. A /l ^ I [y B meiden. Inzwischen wird ein Keafienzglas^estell mit li^ odci- l'4 K gläsern aufgestellt und jedes (ilas mit 1 cm'' physiologischer Kochsalz- lösung beschickt. In gemessenen Zeitabständen bricht man nunmehr eine Ilohlperle nach der anderen ab und wirft sie in das numcrici-te (ilas. -Man i)eol)achtet dabei Entleerung und Aufschwemmung des IJJutes in der Kochsalzlösung. Anfangs ist nichts von geronnenen Teilchen wahrneinnbar, in einem der folgenden Gläser zeigen sich dann zum ersten Male kleine Gerinnsel (Sp.). Ein größeres Gerinnsel, dessen Umfang kleiner als die Hiilfte der Hohlperle ist. wird mit f bezeichnet. Als iMidstadium ist der Punkt anzusehen, bei dem die Hohlperle ganz von Gerinnseln erfüllt ist und beim Schütteln nur geringe Mengen roter lilutscheiben in der Salzlösung aufgeschwemmt wei'den (ftt)- Fehlermöglichkeiten liegen haupt- sächlich in einer etwaigen ungleich- mäßigen Qualität der Gerinnungsröhr- chen. 1) Für Temperaturkonstanz ist in irgend welcher Weise Sorge zu tragen, lierührung der Kapillare mit den Fingern müßte W'ohl vermieden werden, wenn man den Versuch bei einer niedrigeren Temperatur als 37° anstellt. Durch Venenpunktion gewonnenes Illut gerinnt nach Schultz in 11 — 15', ülut aus dem Ohrläppchen in 2 — 5'. 4. Methode von Milian'^), ver- bessert \on Binman und Sladen^) lObjektträgermethode). MiJkm läßt Blutstropfen auf eine lleihe sorgfältig gereinigter Objektträger fallen und notiert die Zeit des Ein- stiches sowie des Auffangens der ein- zelnen Tropfen. Die Gerinnung ist voll- endet, wenn man den Objektträger senkrecht aufrichten kann, ohne Ände- i'ung der Konturen des Tropfenprofils. » 1/ Mi-thodf von Milian. Konturen des Bliittropfcns vor(.l) iiud'nach^/l^ der Gerinnung. (Aus Ilintiinn und Slmltii.) Im anderen Falle sti-ömt das Hluf natürlich an die tieferen Partien. Der Tropfen nimmt die Gestalt einer Träne an (Fig. 83). Auf möglichst gleiche Temperaturverhältnisse ist Rücksicht /u nehmen. Hinman und Sladen empfehlen besonders auch die Gröl'ie der Tropfen zu beachten und ausschließlich solche von 4 — i'tnini Durchmesser zu vei- ^) Erhältlich bei der Firma Eberhardt vonii. Nippe, Herliii. -) Milian, Techniqiie poiir retiulc rliui(i;!f (h' hi coagulatioii du sang. Soc. med. des hop. Paris 1901. ^) llinman und Sladen , 1. c. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmetbodeu. V. 10 242 P. Morawilz. wenden. Eine größere Zahl Objektträger wird mit Alkoliol und Äther sorg- fältig gereinigt und getrocknet. Dann macht man den Stich in das Ohr- läppchen des zu Untersuchenden. Der erste Tropfen wird fortgewischt. Er l)ildet sich nämlich relativ langsam und ist aus diesem Grunde (Bei- mischung von Gewebssaft) nicht verwertbar. Erst die folgenden sind brauchbar. Die Gerinnungszeit wird von dem Augenblicke der Tropfen- bildung in der Wunde ab gerechnet, nicht von dem AugenbUcke des Auf- fangens mittels Objektträger. Die Aufnahme des Tropfens durch den Objektträger gestaltet sich etwas anders als bei Milian. Der Tropfen fällt nicht auf die Glasplatte. sondern wird bei Fig. 84. horizontaler Hal- tung des Ohrläpp- chens durch leichte Berührung mit dem Objektträger auf diesen über- tragen. Der Ob- jektträger wird dann schnell um- gedreht und auf eine Skala gelegt. Alle Tropfen, die mehr als 6 und weniger als 4: mm im Durchmesser haben, wischt man fort, der Rest dient zur Gerinnungs- bestimmung nach Milian (s. oben). Recht gut läßt sich der Ge- Methode von Milinn bei durchfullendem Lichte. A vor, B nach der Gerinnung. rinnUngSaDiaUl 061 (Aus Hin.:an und Sladen.) SeukreCht geSteU- tem Objektträger auch im durchfallenden Lichte verfolgen. Solange noch (Fig. 84) keine Gerin- nung erfolgt ist, sammelt sich das Blut vornehmüch in den abhängigen Partien des Tropfens. Diese sind dann weniger lichtdurchlässig. Nach Ge- rinnung des Tropfens erscheint das Zentrum dunlder. Hinman und Sladen finden zwischen ihrer und der Brodie-Busselschen Methode gute Übereinstimmung, vorausgesetzt, daß die Größe der Tropfen sich zwischen 4 und 6 mm bewegt. Bei Zimmertemperatur beträgt die Ge- rinnungszeit 7—8'. Bei kleineren Tropfen ist sie kürzer. Die Methode ist sehr einfach und bequem. Der Haupteinwand liegt darin, daß die Ver- Die Blutgerinnung'. .>^;^ dunstung' zuweilen eine erheMiche Kollo spielen kann, besonders bei stark verlangsamter (Jerinnung. Hhtman und Sladvn konnten in iler Tat bei Kontrollversiiclien in der feuchten Kammer eine Verzögerung gegenüber der gewöhidicben Olijektträgerniethode feststellen. Indessen glaul)en sie. dal) dieser Fehler praktisch nur von geringer l'.edeutung ist. Über Herstellung konstanter Teniperaturbedingungen finden sich in den bisherigen Mitteilungen keine Angaben. Falls man keine Möglichkeit hat, bei konstanter Temperatur zu arbeiten, wird man auf absolute Werte ver- zichten und immer Kontrollversuche an normalen Personen unter gleichen Bedingungen ausführen. 5. Methode von Bürker.^) Ein Tropfen lUut wird in den Hohl- schliff eines Objekttriigers gebracht. Dessen obere Seite ist matt . der ganze Objektträger quadratisch zugeschnitten. Er kommt auf einen Konus von Kupferblech zu liegen, der in einem Hartgummiring steckt. Der Hartgummiring ist soweit viereckig ausgesägt, daü das quadratische Giasstück auf den Kupferkonus gelegt werden kann. Ein viereckiges Hart- gummistück kann weiterhin so auf den Objektträger aufgelegt werden, dab es ihn mit Ausnahme des Hohlschliffes selber zudeckt. Dort ist die kleine Hartgummischeibe rund durchlocht, fber das ganze System kommt dann noch ein Hartgummideckel mit Handgriff. Auf diese Weise ist das Glasstück oben und seitlich von einem schlechten Wärmeleiter umgeben, sitzt aber mit der XJnterfläche dem guten Wärmeleiter Kupfer auf. Der Kupferkonus taucht in Wasser ein, was dadurch erreicht wird, daß die Hartguramischeibe auf den oberen Rand eines mit Wasser ge- füllten, zylindrischen (iefäßes aus Messing aufgesetzt ist. Der obere Hand des Gefäßes paßt in eine Rinne auf der l^nterfläche der Hartgummi- scheibe. Letztere kann mit Hilfe des Griffes um eine vertikale Achse ge- dreht werden. Bei der Drehung rühren einige unten an der Gummischeibe befestigte Schaufeln das Wasser um. Das auf drei Füßen ruhende, mit einem Halm und einer Steigröhre versehene Messinggefäß ist also nach oben durch die Hartgummischeibe und seitlich durch eine ringsum befestigte Filzplatte vor nicht gewünschter Wärmcab- und -Zufuhr geschützt. Das Gefäß kann von unten her mit Hilfe einer kleinen Gasflamme erwärmt und dadurch das Wasser samt Kupferkonus und (Jlasstück genau auf derselben Temjjeratur erhalten werden. Ein Thermometer, durch eine Bohrung der Hartgummischeiltf durchgesteckt, mißt die Tempei-atur des Wassers. So ist dafür Sorge getragen, daß das im Hohlschliff des (ilasstückes befindliche Blut möglichst genau die Temperatur des Wassers annimmt. Ausführung eines Versuches: Wasser wird zunächst im zylin- drischen Gefäß auf 2')" gebracht und mit Ililfe eines kleinen regulierbaren ') Biirkcr, Kiu Apparat zur Knnittlung^ tlor Gerinnungsztit. iJiUgcm .^n-li Bd. 118. S. 452 (1907). lÜ* 94.4 P- Morawitz. Gasbrenners auf dieser Temperatur erhalten. Die Wassermenge beträgt zirka 1 Liter. Dann wird das Glasstück, besonders der Hohlschliff, mit Wasser ausgespült und mit einem feinen leinenen Tuche, das schon öfter ge- waschen wurde, mit Äther- Alkohol abgerieben und getrocknet. Etwaige Stäubchen und Fäserchen, die noch zurückgeblieben sind, beseitigt man mit einem feinsten Haarpinsel. Darauf kommt in die Mitte des Hohlschliffes ein Tropfen ausge- kochten, destillierten Wassers. Dieses befindet sich in einer Bürette, die mit der Mariotteschen Anordnung für konstanten Ausfluß versehen ist. Der Druck , unter dem das Wasser austritt , beträgt 10 cm Wassersäule. Zur Fernhaltung von CO, ist ein Natronkalkröhrchen vorgelegt. Glasstück + Wassertropfen wird dann auf den erwärmten Kupfer- konus gelegt und einige Zeit gewartet, bis es die gewünschte Temperatur angenommen hat. Dann wird mit Hilfe der Franckeschen Nadel ein Blutstropfen aus der Fingerbeere entnommen und in den vorgewärmten Wassertropfen fallen gelassen. Sofort setzt man den Deckel wieder auf und bringt ein zeitmessendes Instrument in Gang. Nunmehr reinigt man die Spitze eines fein ausgezogenen Glasstabes. Der zirka Q-bcm dicke Stab ist 18 cm lang und von 13 — IScut zu einem feinen (ilasfaden ausgezogen, der an der Spitze zirka 0*2 — 0-3;^«» dick ist. Um ihn an der Spitze abzurunden, wird er einen Augenblick in eine leuchtende Gasflamme gehalten. Man muß stets eine Reihe solcher Glas- stäbe vorrätig halten. Die Reinigung geschieht durch Eintauchen in Äther-Alkohol, dann wird der Glasstab vorsichtig mit dem Leinentuch getrocknet. Nach der ersten V2 Minute des Versuches dreht man die Hart- gummischeibe mit Hilfe des Handgriffes um 90", hebt den Deckel ab, geht mit dem Glasstab in die Mitte des Blutwassertropfens und beschreibt bis zur Peripherie des Tropfens fünf Spiraltouren, um Blut und Wasser zu mischen, ohne aber die Basis des Blutwassertropfens zu vergrößern. Darauf wird der Deckel wieder aufgesetzt, der Glasfaden von anhaftenden Spuren Blut und Wasser gereinigt. Nach der zweiten V2 Minute wird wieder gedreht (um 90°) und mit der Spitze des Glasfadens in einem Durchmesser durchgefahren oder ent- lang eines Halbkreises und so fort, alle V2 Minute, bis man den ersten Fibrinfaden ziehen kann. Die Bestimmungen sind bis auf V2 Minute genau. Auf thermoelektrischem Wege bestimmte Bürker die Differenz zwischen Temperatur des Wassers und des Tropfens als sehr gering, zirka O'ö". Die Bürkersche Methode ist in den letzten Jahren am Krankenbette viel verwendet worden. Die Resultate sollen bei größerer Übung zuver- lässig sein. (Der Apparat ist bei Universitäts-Mechaniker Albrecht-Tühhv^en zu haben. ) Die Bliitgerinnmiif. 24: Fig. 85. 7) B 1 ^ C. ^ 6. Methode von Brodle und Bussel. ') Du-^r Methode enthält ein neues, originelles Prinzip: Ein Blutstropfen wird in einer feuchten Kammer durch einen tangential gerichteten Luftstrom in Ilewegung ge- setzt und diese Bewegung durch das Mikroskop bei schwacher VergröDerung beobachtet. Ist das Blut geronnen, so hört die Bewegung auf. Im einzelnen sieht man dabei Folgendes: Im Beginn des \ersuches genügen sehr schwache Luftstöße schon, den Tropfen in rotierende Be- wegung- zu setzen. Die Blutkörperchen bewegen sich einzeln, ohne Hiiufchen zu bilden. Allmählich fangen sie an zu verklumpen, wobei hellere Zwischen- räume auftreten. Sehr bald hört dann jede stärkere Bjeweglichkeit auf. I)ie Blutzellen geben zw-ar einem Luftstrom noch ein wenig nach, federn aber sofort in ihre alte Lage zurück. Dieser Zeitpunkt, in dem also der Bluts- tropfen zwar noch durch den Luftstrom ein wenig von der Peripherie nach dem Zentrum hin zusammengedrückt werden kann, seine Form aber sofort wieder an- nimmt und alle sonstigen Bewegungen zirkulärer Art im Tropfen aufgehört haben, ist der Augenblick der Gerinnung. Der Zeitpunkt ist nach einiger Dbung ziemlich leicht zu bestimmen. Das zur Ausführung der Methode von Brodle und Bussel angegebene In- strument besteht aus einer runden, . , , , 1 .) 1 -x Schema dos Bro(/(>-ii'«sse/scben Koaguloraeters im zirka 1 cm hohen und O cm nreiten Querschnitt. Modifikation von Boggs. (Nach Boggs.) Luftkammer Ä, die nach unten durch eine Glasplatte, nach oben durch einen leicht abnehmbaren, ebenfalls mit Glaseinlage versehenen Metalldeckel D-K abgeschlossen wird (Fig. 8.")). Die seitlichen Wände bestehen bei dem ursprünglichen .\pparat aus einem Metallhohlring, in dem behebig temperiertes Wasser zirkulieren kann. Ein Ein- und ein Ausflußrohr dienen der Wasserzirkulation. Außer- dem ist in den durchbrochenen Deckel D-E ein Glaskonus B eingelassen, dessen abgestun)pftes unteres Ende zur Aufnahme des Blutstropfens dient. Die seitliche Wand der Kammer ist nun weiterhin noch von dem Bohre C durchsetzt. Dieses steht nach außen mit einem kleinen Gebläse in \'er- bindung und ist an seiner Einmündung in die Kammer zu einer feinen Spitze ausgezogen, die so angeordnet ist, daß bei geschlossener Kammer der durch C eintretende Luftstrom gerade die Oberfläche des Konus />' tangential berührt. Die eingeblasene Luft entweicht durch eine oder zwei kleine Öffnungen, die man beliebig anbringen kann. Boggs-) hat den /?roc??>-i^MSs 7 — 8'. Hinman und Sladen finden als Durchschnitt von 214 Beob- achtungen 6' 40". Auch bei ihnen sind die Schwankungen, selbst l)ei ein- und derselben Versuchsperson, recht bedeutend. Auch finden sie starke Tagesschwankungen. Das widerspricht den Erfahrungen von Addis ^) und Hartmann. *) Die Differenzen erklären sich zum Teile wohl auch durch die ver- schiedene Größe der glatt geschliffenen Glasfläche des Konus B. Je größer diese ist, um so größer fällt auch der Tropfen aus. Hierdurch verändert sich natürlich die Gerinnungszeit. Man wird also stets die Fläche des Konus messen und nur solche Befunde miteinander vergleichen dürfen, die mit ganz gleichen Instrumenten gewonnen wurden. Auch die Art des Anblasens ist von Belang. Je häufiger man den Tropfen durch den Luftstrom in Bewegung setzt, um so schneller gerinnt er. Auch sieht man dann nicht selten am Rande des Tropfens Ein- trocknungserscheinungen, die natürlich ebenfalls die Gerinnung beeinflussen M Pratt, Observations upon tbe coagiilation time of blood, and blood plates. Journ. Med. Research. V. p. 120 (1903). -) Murphji and Gould, Coagulation time of tbe blood, a comparison between the Wright and the Br odie- Rüssel m^irnm^nis etc. Boston. Med. and Surg. Journ. p. 45 (1!)04). ^) Addis 1. c. *) Hartmann 1. c. Die Blutgorinmiiif,'. .^i- (S. 24o). Man soll also nicht zu liiiufi^- und nicht zu stark hlason. Voll- ständige Konstanz lälit sich wohl schwer erreichen, ein Faktor, der ent- schieden am allermeisten der Zuverlässigkeit dieser Methode Ahhruch tut. Natürlich ist der Glaskonus nach jedem Versuche Sorgfalt i«.;; zu reinigen und ahzutrocknen. Am hesten arheitet man in einem koii>tant temperierten Räume. Den Wassermantel von Brodie-Bussel halte auch ich mit Bof/gs für unnötig. Mit dem Gebläse bringt man ja doch von /cit zu Zeit andere temperierte Luft in die Kammer. Nach eigenen Erfahrungen scheint es mir, dal'i die so geistreich er- sonnene Methode im ganzen mehr Fehlenjuellen bietet als die meisten anderen. Jedenfalls erhält man nur bei sehr großer fbung einigermalten zuverlässige Resultate. 7. Methode von Morawitz und Bicrirh.^) Das Hlut wiid nicht durch Hautschnitt, sondern beim Menschen durch Venenpunkti(»ii . lici Tieren aus einer Arterie entnommen. Dadurch vermeidet man r>eimi>(hung gerinnungsbefördernder Substanzen aus Haut und Geweben. Die zweite Abweichung den vorher erwähnten Methoden gegenüber besteht darin. daU nicht mit einem einzigen Blutstropfen, sondern mit gröl'ieren lilutmengen gearbeitet wird. Die Gerinnungszeit ist natürlich viel länger als bei anderen Methoden. Das erscheint vorteilhaft, insofern als Unterschiede der (xerinnungszeit sich dann deutlicher und schärfer mai-kicrou. Ausführung eines Versuches: Die leicht gestaute Armvene wird mit einer sauberen, trockenen oder auch mit Kochsalzlösung ausgespritzten, 10 cm^ fassenden Spritze punktiert. Alkali (etwa von der zum Auskochen verwandten Sodalösung) darf der Spritze nicht anhaften. Je bcm^ lllut kommen in sorgfältig gereinigte (Wasser, Alkohol, Äther) Wiegegläschen, die von gleicher Größe und Gestalt sind. Sie werden in eine mit Thermo- meter versehene feuchte Kammer gestellt. Annähernde Temperaturkonstanz läßt sich durch P'iillen eines Teiles der Kammer mit Wasser von wechselnder Temperatur herstellen. GewöhnHch habe ich bei 20^ gearbeitet. Die Wiege- gläschen sollen schon einige Zeit vor Beginn des X'ersuches verschlossen in die temperierte Kammer gestellt werden, damit sie die gewünschte Temperatur annehmen. Ist der Versuch im (lange, so lüftet man von Zeit zu Zeit den Deckel der Kammer und überzeugt sich durch leichtes Neigen der (iläschen von dem Zustande des Blutes. Den Gerinnungsbeginn erkennt man au einem leichten rötlichen Belag an den (ilaswänden. Vollendet ist die Ge- rinnung, wenn die Oberfläche des Blutes erstarrt ist und der Neigung des (iläschens nicht mehr folgt. Der Deckel soll nicht häufiger als alle 2' gelüftet werden. Möglichst gleichmäßiges Vorgehen beim Herausnehmen und Neigen der Gläschen ist anzustreben. Die (ierinnung erfordert unter ') Morawitz und liicrich , Ül)er die Pathogenese der dioliimisrhen Bhitiingen Arcli. f. experim. l^vtliol. u. Pharm. Bd. 56. S. ll.'i (I'.IOC)). 248 P- Morawitz. diesen Bedinnungen lö— 20'. Eine Differenz von 'iO^/o kann noch in den Bereicli der Fehler fallen. Nur größere Differenzen dürfen berücksichtigt werden. Fehler(|H('llen sind : 1. Der wechselnde Gasgehalt des Blutes. Es muß sich das hei starker Stauung besonders bemerkbar machen. Blut, das viel CO2 enthält, gerinnt langsamer. 2. Ungenügende Übereinstimmung beim Verfahren zur Kontrolle der Gerinnung. In dem einen Falle wird das Wiegegläschen samt Inhalt stärker bewegt als in dem anderen. 3. Ungleich- mäßige Bestimmung des Endpunktes der Gerinnung. Diese zieht sich über eine Zeit von mehreren Minuten hin. Man muß also daher durchaus einen bestimmten Punkt als Endpunkt fixieren. Am meisten schien mir hierfür das Erstai-ren der Oberfläche des Blutes geeignet zu sein. Die Methode soll möghchst in Kombination mit einer der anderen angewendet werden, die nur kleine Blutmengen erfordert. Findet man mit beiden Verfahren Gerinnungsänderungen im gleichen Sinne , so ist damit Gewähr für die Richtigkeit der Beobachtung gegeben. 8. Methode von Buckmaster. '^) Ein Blutstropfen wird in einer Drahtschlinge aufgefangen und in einer feuchten Kammer bei beliebiger Temperatur beobachtet. Von Zeit zu Zeit wird die Drahtschlinge um ihre Achse gedreht. Man kann dann leicht mit einer Linse das Hinabsinken »^ der roten Blutkörperchen im Tropfen beobachten. Es geschieht ziemlich schnell. Gerinnung ist dann eingetreten, wenn sich so viel Fibrin gebildet hat , daß die Blutkörperchen bei Drehung der Schlinge nicht mehr schnell nach unten sinken. Die Vorteile dieser Versuchsanordnung sind nach Buchvastcr folgende: 1. Die Einfachheit der Methode; 2. die geringen Blutmengen, die man braucht: ;>. der Kontakt mit Fremdkörpern ist auf das geringste Maß beschränkt: 4. das Blut wird nicht geschüttelt oder umgerührt; 5. die Bestimmung des Endpunktes ist scharf und bis auf zirka V2 Minute genau. Als Durch- schnittszeiten für menschliches Blut gibt Buckmaster folgende Werte an: 20» C 8' 45'', 31° C .5' 45", 38« C 5' 56", 390 C 2' 56' j'/ Wichtig für die Ausführung des Versuches ist vor allem gleichmäßige Ge- stalt und Größe der Platinöse, respektive Drahtschlinge. Natürlich muß sie vor Beginn des Versuches sorgfältig gereinigt und getrocknet werden. Für die Blutentnahme selbst kommen die auch sonst üblichen Kautelen in Be- tracht. Der Apparat läßt sich leicht improvisieren: Man nimmt einen schmalen, rechteckigen Holzkasten, der an seinen beiden Längswänden Fenster hat. Die Platinöse wird mittelst ihres Stieles so durch eine Öffnuni>- *) Buchmaster, Model of a new form of coagulometer. 7. internationaler Physio- logenkongreß. Heidollierg 1907. Die IJllltge^illllllll;L^ 9it) in eiiKU' dor SchnialseitxMi des Kastens dui-cliiiesteckt. dall die liliitstropfon gerade zwischen den beiden Olasscbeiben erseiieint. Die Distanz zwischen Glasscheibe und Drahtschiinge muß so gewählt sein, daß man den Tropfen von außen mit einer guten Stativlupe genau einstellen kaim. Auch die l'm- drehung der Drahtschlinge kann von außen mit Hilfe des Stieles besorgt werden. Zur Herstellung konstanter Temperatur und einer feuchten Atmo- sphäre dient eine kleine Wasserwanne am lioden des Apparates. Der Deckel Nvird von einem Thermometer durchsetzt. Eigene Erfahrungen mit dieser Methode l)esitze ich nicht. 9. Der Koaguloviskosimeter von Kottmann. •) Neu und originell ist der Weg, den Kottnutnn kürzlich mit der Konstruktion des Koagulovis- kosimeters beschrieben hat. Sein Prinzip ist folgendes: IjälJt man ein mit Flüssigkeit gefülltes Gefäß um eine senkrechte Achse rotieren, so werden die der (iefäßwand benachbarten, periphersten Flüssigkeitsschichten in die- selbe Rotation geraten. In Abhängigkeit von dem Viskositätsgrade der Flüssigkeit überträgt sich die Rotation in nach dem /entrum abnehmender Weise auch auf die anderen Schichten. Ein genau in die Mitte der Flüssig- keit eintauchendes Schäufelchen, das nicht direkt mit in Rotation versetzt ^Yird. muß also, falls es beweglich anuebracht ist, eine Ablenkung erfahren. Diese ist um so stärker, je schneller das mit Flüssigkeit gefüllte Gefäß rotiert und je viskoser die Flüssigkeit ist. Da nun Blut während der Ge- rinnung durch Ausscheidung des Fibrins seine Viskosität ändert, seil, viskoser wird, muß sich der Gerinnungseintritt durch eine stärkere Ab- lenkung des Schäufelchens dokumentieren. Durch eine geeignete \'orrichtung wird verhindert, daß die Schaufel selbst in rotierende Bewegungen gerät. Die genauere Beschreibung des Apparates ist an der Hand der neben- stehenden Zeichnungen (Fig. 86, 1—6) verständlich. ..Das Nickelgefäß .-1 mit dem inneren Durchmesser von \ciii wird, nachdem es mit der zu unter- suchenden Flüssigkeit gefüllt ist, mit einer vertikalen Metallhülse // wasser- dicht verbunden, damit es während der Untersuchung in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur getaucht werden kann. Die vertikale Hülse 7) wird, wie in Fig. 1 und 5 ersichtlich, auf ein inneres Metallrohr geschoben, das durch einen uhrwerkartigen Motor in rotierende Bewegung versetzt wird. Dadurch überträgt sich die gleiche Botation auch auf die Metall- hüLse B und durch diese auf das Gefäß mit der rntersuclinngsflüssigkeit (Blut, Milch, Fibrinogenlösung). Das Gefäl'i mit Flüssigkeit macht also eine konstante Tourenzahl pro Minute. Für Bestimmungen des KoagiilationsverlautVs von Blut erwies sich eine Tourenzahl von 12 — 15 pro Minute am günstigsten. Hält man in allen Versuchen die gleiche Tourenzahl ein. so erhält man gut vergh'ichbare Resultate. M Kottmaitii, Dor Koagiiloviskosimctor mit speziolliM- Borürksii-htiirmi!,' ^^iMiicr klinischen Venveiull.arkcit etc. Zoitschr. f. kliii. Md. Bd. G<>. S. 41.'» (ÜMO). 250 P. Morawitz. Fig. 86. ^Ü/IÜL-L orri. 'im- •^ lu Sll'-liiLii. 1 -/jj© ^1 ! a *S S^'u-^tit -f. ■y" i, ^^,,^-^ M l«j 1 i'"\cim'i 5. r ä, ! i 1 ;3- i" -/ Die Bhitgeiiiiuiing. '2:>i KrI iiu ter u II K (1 tj r Ki(f. 80, 1-0. Figur 1. LängsBchnItt. Kipur 2. Ansicht von oben. Figur ;>. AuBicht von oben eines Querschnittes oberhulb dar Spiralfedi'r ./. Figur 4. Ansicht von oben eines Quorschuittus obf-rhalb der Dn-hscheibt* G. Figur S. GofiilJ, Metallhülse, MotuUrohr, Scbilut'elchen und Achse. Vergrößerung der i>iit)itii>-rli.'n- den J'artie der Figur 1. Figur 6. Quersclinitt von 5 durch da.s Schilufelchen. A = GefülJ. J3 — rotierende MetallhiilHe. C = Schäufelchen. /) = Achse. E = BUgol. F = Tragarm mit Lagerung, (j — Drehscheibe, an der Peripherie gc^.ahnt. // --. gezahntes Handrad für Drehscheibe. ■/ = Spiralfeder. A' = Zeiger. L— Korkzapfen zum VorschluU der Tliermoflasohe. ^f = Zifferblatt. A' = Achsenführung. O == Zapfensteinlagor. In das Gefäß A taucht mm senkrecht und lionauestons zentriert die feststehende, aber äulJerst leicht in Rotation versctzharc stählerne Achse I) ein, die durch das Zapfe n- Fig. 87. M SS gO TS 70 es 60 SS so «/ 3S 30 2S 20 fS ■fO s f 2 3 * s e 7 s s -fo -ff /z f3 »^ fS re -f? 1^ fS 20 zi sz ;s lager 0 mit dem Bügel E ver- bunden ist. Sie träfi:t an ihrem unteren Ende das Schäufel- chen C, an ihrem oberen einen Zeiger und ist aulterdem mit einer feinen Spiralfeder ./ ver- bunden. Die Spiralfeder, die außerdem noch (s. Fif?. ^lU) an einem festen Punkt befesti,ü:t ist, verhindert eine freie Mit- rotation des Schäufelchens mit der Flüssigkeit und ge- stattet diesem nur einen ge- wissen Ausschlag, liieser Aus- n ^ 30 52 r. Morawitz. Für die Gerinniingsbestimmung des IJlutes genügt ein Zeigerausschlag bis 90**, also eine nur einmalige Umdrehung der Schaufel vollständig. Bei Viskositätsbestimnmngen anderer Flüssigkeiten läßt sich durch eine in der Originalarbeit näher beschriebene Vorrichtung durch Verschieben des Flügels F auch eine mehrfache Umdrehung des Zeigers möglich machen. An Stelle des Schäufelchens kann man auch einen Zylinderansatz an die Achse D anbringen. Dadurch gestalten sich die Ausschläge größer, die Gerinnungszeit wird abgekürzt und die Methode noch weiter verfeinert. Das Blut wird durch Venaepunctio entnommen. Es soll nicht erst mit einer Spritze aspiriert werden, sondern direkt aus der Vene durch einen kleinen Metallansatz in das Nickelgefäß A eintreten. Für Temperatur- konstanz ist durch \'ersenkung des Nickelgefäßes in ein Wasserbad gesorgt, das sich in einer Thermosflasche befindet. Fig. 1 gibt diese Verhältnisse klar wieder. Die beiden nebenstehenden Kurven (Fig. 87) erläutern die mit dieser Methode gewonnenen Resultate. Bei 20° ist die Gerinnung in etwa 20' vollendet, der Beginn scheint etwas weniger konstant zu sein. Bei 40" ge- rinnt das l)lut schon in 6'. Für das Studium der Gerinnungsverhältnisse Haemophiler und Kropf kranker hat sich der Apparat in den Händen Kott- DKums bewährt. Von allen hier aufgeführten Methoden scheint die zuletzt erwähnte den ^'orzug zu verdienen. Eigene Erfahrungen stehen mir leider nicht zu Gebote, iberlegt man aber die mannigfaltigen Fehlerquellen, denen die meisten übrigen Verfahren unterworfen sind, so wird man die Vorteile des Kottmcrnnschen x\pparates anerkennen. Einer ausgedehnteren Verwen- dung steht leider der hohe Preis (475 Frcs.) im Wege. (Der Apparat wird in dem Sanitätsgeschäft 31. Schaerer, A.-G, Bern, Bubenbergplatz, hergestellt.) Viel gerühmt, besonders von klinischer Seite, wird auch die Bürkersche M(^thode. Immerhin scheint sie mir viel mehr Fehlermöglichkeiten zu bieten als der Koaguioviskosimeter. Für letzteren fällt ganz besonders die Tatsache ins Gewicht, daß keine größere Übung erforderlich ist, da alle Bewegungen durch maschinelle Kräfte besorgt werden. Endlich mag noch darauf hingewiesen werden, daß quantitative Throm- binbestimmungen im Blutserum, wie sie z. B. von Birnbaum und Osten^) versucht worden sind, selbstverständlich nicht dasselbe bedeuten, wie die direkte Bestimmung der Gerinnungszeit. Ich möchte diesen Punkt nach- drücklich hervorheben, da immer wieder Bestrebungen sich geltend machen, beide Begriffe zu konfundieren und eine Methode der Gerinnungsbestimmung auf die Untersuchung des Fermentgehaltes im Blutserum zu gründen. Das ist nicht zulässig; denn ein großer Teil des bei der Gerinnung gebildeten Thrombins wird mit den Fibringerinnseln entfernt, eine weitere, sehr *) Birnbaum und Osten, Untersuchungen über die Gerinnung des Blutes während der Menstruation. Arch. f. Gynäkol. Bd. 80. H. 2. S. 373 (19Üö). Die Blutgerinnung. Of,;.^ f^Tolio Menge geht bald nach vollendeter Gerinnnng in die imwirksanie Modifikation des Metathronihins üixjr (S. 274). Anlierdeni ist die (le- rinnungszeit ja nicht allein von der Menge des Thronibins , sondern auch sehr wesentlich von der SchneUigkeit der Ferniententwicklnng alihiin^ng. 111. Methoden zur Gewinnung fibrinogenhaltiger Flüssigkeiten. Die hier erwähnten Methoden dienen ziii- (Jewinnnng von Lösungen, die das Reagenz auf Fihrinferment und seine Vorstufen darstellen. Diese Lösungen sollen daher 1. nicht von selbst gerinnen und 2. trotzdem Fibri- nogen in gerinnungsfähigem Zustande enthalten. Es gii)t viele .Möglich- keiten zur Herstellung solcher Lösungen. Am idealsten entspricht eine reine Fibrinogenlösung dieser Aufgabe. Sie soll nur Fibrinogen enthalten, dagegen keine anderen Eiweißkörper und vor allem keine Vorstufen de.s Thrombins. Für gewisse Zwecke kommen auch noch andere Plasmaarten in Betracht. Allerdings sind sie als Indikatoren für Thrombin nicht gleich- wertig. Die Ursachen für die Stabilität, also die mangelhafte (Jerinnbarkeit dieser Plasmaarten, können eben sehr verschiedenartig sein. Manche werden nicht allein durch Thromben, sondern auch schon durch eine der Thrombin- vorstufen zur (rerinnung gebracht, ein Zeichen dafür, daß alles, was sonst zur Thrombinbildung nötig ist, bereits in diesen Lösungen präe.xistiert. So gerinnt z. B. das an sich stabile Gansplasma sehr schnell auf Zusatz von Muskelextrakt. Man darf nun aber keineswegs daraus schließen : dei' .Muskel- extrakt enthält Thrombin. De facto enthält er auch nur eine Vorstufe des Thrombins. Alles , was sonst zur Gerinnung erforderlich ist , findet er im Plasma. Auf diesen Punkt ist längere Zeit nicht ausreichend geachtet worden. Gerade der Umstand, daß der eine Untersucher dieses, der andere jenes stabile Plasma als Pieagenz für Thrombin wählte, hat zu manchen Unklarheiten geführt. Manche stabile Plasmaarten verdanken ihre Beständigkeit ausschließlich dem Mangel löslicher Kalksalze. Hier wird natürlich schon Zusatz von Kalk- salzen allein Gerinnung hervorrufen können. Stets muß man sich also über- legen, ob das Reagenz auf Thrombin. das man anwendet, außer dem Fibrinogen auch noch andere Substanzen enthält, die den Geriiuiiingsvoi-- gang zu beeinflussen , respektive auszulösen vermögen. A. Fibrinogenlösungen. 1. Fibrinogenlösung nach IJ((iii unirsfrii.^) Prinzip der Methode: Das Fibrinogen wird aus Blutplasma xhon bei halber Sättigung mit Kochsalz ausgefällt, die antleren Eiweilikörper erst bei höheren Konzentrationen. Das durch Kociisalz niedergeschlagene Fiitri- nogen wird durch mehrfache Wiederholung von Fällung und Lösung gereinigt. ') Hammarsten , t*bcr die BcilputunL' tior lösliolion Kulksalze für die Fasorstoff- gerinnuDg. Zeitschr. f. pliysiol. Clicmio. Bd. 22. 8. 33."i (ISilC)). 254 P- Morawitz. Man geht ain besten vom Pferdeblut aus. Dieses wird im Schlacht- hause in einem großen Gefäße aufgefangen, das etwas Kalium- oder Natrium- oxalat in Lösung enthält. Die Menge der Natriumoxalatlösung ist so zu bemessen, daß die Konzentration des Salzes nach Auffangen des aus der Wunde strömenden Blutes etwa 0*2 — 0"5<'/o beträgt. Will man ungefähr 5 Liter Pferdeblut auffangen, so kann man in das zum Auffangen be- stimmte Gefäß zuvor bOOcm^ 2 — 3Voi^er Natriumoxalatlösung bringen. Das so gewonnene „Oxalatblut" gerinnt nicht, da es keine ionisierten Kalk- salze enthält. Ich folge nun der von Nolf^) angegebenen Methodik, die einige Ver- besserungen des ursprüngUchen Hammarstenschen Verfahrens enthält: Das Oxalatblut wird gleich nach seiner Ankunft aus dem Schlachthause scharf abzentrifugiert, das abgehobene, vollständig zellfreie Plasma (800 bis ^00 cni^) auf 0" abgekühlt und bei niedriger Temperatur filtriert. Schon Hammarsten hat empfohlen, das Plasma längere Zeit, etwa eine Nacht, bei niederer Temperatur stehen zu lassen. Es fällt dabei ein nukleoproteid- haltiger Niederschlag aus, der Proferment enthält, also wohl Thrombogen und Thrombokinase. Erst nach Entfernung dieses Niederschlages kann man mit einiger Sicherheit darauf rechnen, wirklich brauchbare Fibrinogen- lösungen zu erhalten, d. h. also Lösungen, die nur auf Zusatz von Thrombin gerinnen. Das eiskalte, filtrierte Plasma wird mit wenig verdünnter Essigsäure gegen Lackmuspapier neutralisiert und reines , kalkfreies Kochsalz zuge- setzt, bis die Flüssigkeit ein spezifisches Gewicht von lllO angenommen hat. Das Fibrinogen fällt nun in großen, sich zusammenballenden Flocken aus. Diese können leicht mit einem Hornlöffel oder einem siebartigen In- strument aus dem Plasma in 800 — 900 cm^ destillierten Wassers übertragen werden. Das destillierte Wasser soll eine Spur Natriumoxalat, etwas Koch- salz und f}cm^ einer gesättigten Sodalösung enthalten. Man nimmt also die Fällung des Fibrinogens stets bei neutraler, die Lösung bei leicht alkahscher Reaktion vor (Heubner^). Arbeitet man mit Pferdeplasma, so ist allerdings dieser Kunstgriff nicht so wichtig. Auch ohne ihn gewinnt man brauchbare Fibrinogenlösungen. Anders bei Rinderplasma. Ohne Neutrahsation gehngt es meist überhaupt nicht, durch Halbsättigung mit Kochsalz das Fibrinogen zur Ausflockung zu bringen. Ebenso löst sich das aus Rinderplasma niedergeschlagene Fibrinogen nur bei leicht alkalischer Reaktion. Die erste Fällung des Pferdefibrinogens löst sich meist schnell und vollständig. Die Lösung kann durch Umrühren der Flüssigkeit befördert werden. \'om Ungelösten filtriert man ab. Nun wird die klare, leicht alkalische Flüssigkeit durch vorsichtigen Zusatz dünner Essigsäure wieder *) ^olf, Contril). ä. l'ötude de la coagulation du sang. 3^ memoire. Arch. internat. de Physiol. VI. H. 1. SA. p. 3 (1908). ^) Heubner, Die Spaltung des Fibrinogens bei der Fibringerinnung. Arch. f. «xperimen. Pathol. und Pbarm. Bd. 49. S. 229 (1903). Die Blntjjcrinniiiig. _ , , gej^en Lackiims neutralisiert. Bildet sich dabei ein leiehter. firohilockijrer Niederschlag, so ist er durch Gaze ahzufiltrieren. Das I-iltrat wird ab- gekühlt und in derselben Weise mit Kochsalz gefüllt wie das l'lasnia. Der zweite Niederschlag kann, wenn er an Masse gegen den ersten zurücksteht, in etwas weniger Wasser (400— '->()() cm'^) übertragen werden. Man l'iihrt nun in dieser Weise mit Fällen und Lösen des Fibrinogens fort. Doch soll das Wasser , in dem man den ;». Niederschlag auflöst, keinen ( )xalatzusatz mehr erhalten. Der 4. Niederschlag wird in etwa 150 — 300 cw^ Wasser übertragen. Dem Wasser hat man vorher ein wenig Soda (5 — 0 Tropfen auf ;')00cw?3) zugesetzt. Man fügt nun noch so viel Koehsalz hinzu, dali die Salzkonzentration ungefähr P,„ beträgt. Die Fibrinogenlösung bleibt bis zum nächsten Tage bei 0° stehen und wird durch Leinen kollert. 1 Liter Plasma gibt ungefähr LöO — iiOOcnt'-^ Fibi-inogenlösuug. Trotz großer Verluste bei der Reinigung ist diese Lösung zu konzentriert. Sie wird zum Versuch mit der 5- bis lOfachen Menge l^/oiger Kochsalzlösung verdünnt. Zuw^eileu erlebt man trotz aller Vorsieht Spontangerinnungen der Fibrinogenlösung. Es müssen also Vorstufen des Thrombins auch noch in die letzte Fibrinogenfällung übergegangen sein. In anderen Fällen gerinnt die Fibrinogenlösung zwar nicht von selbst , wohl aber auf Zusatz von Kalk oder Gewebsextrakt + Kalk. Auch solche Lösungen sind keine zuverlässigen Indikatoren für Thrombin. Eine gute Fibrinogenlösung soll nur auf Zusatz von Thrombin gerinnen. Durch Morawitz^), Noif-), Schittmhehu und Bodouff^), Rettger*) ist jetzt oft genug festgestellt worden, dab man solche Lösungen gewinnen kann. Gegenteilige Angaben von Pckdbariwj^) und Mellanhy ^') kann ich nicht anerkennen. Nolf weist allerdings darauf hin , daß auch die sogenannten reinen Fibrinogenlösungen sicher nicht im strengen Sinne des Wortes ..rein" sind. d. h. nur Fibrinogen enthalten. Häufig führen sie auch noch etwas Thrombogen. Durch stärkere \'er- dünnung läßt sich der störende Einfluß des Thrombogens beseitigen. .Vo//' arbeitet meist mit Fibrinogenlösungen, die so stark verdünnt sind, daß sich eben noch ein dünnes, gallertiges Fibrinogengerinnsel bilden kann. Am leichtesten und sichersten gelingt die Darstellung von Fibrinogen aus Pferdeplasma. Rinderplasraa ist weniger geeignet : denn erstens fällt ') Morauitz, Zur Kenntnis der Vorstufen des Fibrinferments. Ho/tucistfrs Bei- trage. IV. S. 381 (1903). -') Noif I. c. ^) Schittenhelm und Bodong, Beitrug zur Frage der Blutgerinnung etc. Arcli. f. experim. Pathol. u. Pharm. Bd. 54. S. 217 (1Ü05 0(5). ••) Rettgir, The coagulation of hlond. Anier. .lourn. of rii\siol. Noi. 24. 1. Juli, p. 406 (1909). '") l'ekelharing, Ein paar Bemerkungen über Fihrinferment. Biochem. Zoitschr. Bd. 11. 1 (1908). «) Mellanby, Coagulation of hlood. Journ. of Pliysiol. Vol. 38. p. 28 (HH)8()9). •256 P. Morawitz. das l'ihrinoiion mir hei sehr sorgfältiger Neutralisation des Plasma (s. oben) aus und zweitens zeigt das Präzipitat oft eine feiuflockige Konsistenz und wenig- Neigung, sich zusammenzuballen. Es ist daher oft schwierig, den Niederschlag in destilliertes Wasser zu übertragen. Zuweilen läßt sich das Zusammenballen durch Zusatz von ein wenig Alkali, z. B. Soda, befördern. Die Flocken steigen dann nach oben, so daß man dekantieren kann. Auch die Lösung des Fibrinogens in destilliertem Wasser gelingt bei Rinder- plasma schlecht. Man hat große Verluste. Die Gewinnung einwandfreier Fibrinogenlüsungen aus Piinderblut erfordert Übung und Geduld. Immerhin ist es mir, als mir kein Pferdeplasma zu Gebote stand, gelungen, gute Fibrinogenlüsungen aus Rinderblut herzustellen. Hattger empfiehlt Katzenblut. Zur Entfernung jeder Spur von Oxalaten dialysiert er zum Schluß seine Fibrinogenlösung gegen 0'97oige kalkfreie Kochsalzlösung. 2. Fibrinogenlösung nach A. Schmidt und Mellanhij (I.e.). Von verschiedenen Seiten ist mit Unrecht) der Vorwurf gemacht der Hammarstenschen Methode (wohl worden , sie sei zu eingreifend. Das Fibrinogen sollte bei mehrfacher Kochsalzfällung andere Eigenschaften an- nehmen, speziell an Gerinnungsfähigkeit einbüßen. A. Schmidt hatte daher einen anderen Weg der Fibrinogendarstellung beschritten. Das Prinzip der Methode ist folgendes : Aus stark verdünntem Plasma (O.xalatplasma, Vogelplasma etc.) wird das Fibrinogen durch ge- linden Essigsäurezusatz ausgefällt, abzentrifugiert und in Wasser gelöst. Mdlanhij verfährt in folgender Weise: Vogelplasma (über dessen Ge- winnung s. S. 264) wird mit 20 Volumina destillierten Wassers verdünnt. Es entsteht kein Niederschlag. Nun fügt man vorsichtig und tropfenweise O-p/o Essigsäure hinzu. Schnell bildet sich ein massiger Niederschlag. Er wird abzentrifugiert und in destiUiertem Wasser gelöst. Die Menge destillierten Wassers entspricht der ursprünglichen Plasmamenge. Diese Fibrinogenlüsungen gerinnen bereits langsam auf Zusatz Kalksalzen, schnell mit verschiedenen Gewebssäften. Sie enthalten — der Art der Herstellung ist das ja auch nicht anders zu erwarten — neben Fibrinogen offenbar auch noch alle Thrombinvorstufen. Daher sind sie den Hammurstensdhen Fibrinogenlösungen nicht gleichwertig. Als zuverlässige Indikatoren für Thrombin dürfen sie nicht gelten. des von bei 3. Seröse Körperflüssigkeiten. (Natürliche Fibrinogenlösungen.) Seit Buchanan und A. Schmidt werden seröse Trans- und Exsudate häufig zu Gerinnungsversuchen verwandt. Sie sind nun keineswegs immer ..reine- Fibrinogenlösungen, sondern enthalten häufig auch noch einen Teil oder gar die Gesamtheit der zur Gerinnung erforderlichen Substanzen. Die meisten entzündlichen Exsudate gerinnen entweder bereits in den serösen Höhlen des Körpers oder bald nach ihrer Entleeruns'. Doch verläuft die Die Blutgerinuiiiig. 957 Gerinnunf;' meist zöiicrnd und verschleppt, verglichen mit der des lilutes. Offenbar findet sich in den meisten Exsudaten ziemlich wi'uij^^ Thi-omim- kinaso. Dementsprechend beschleuniget Zusatz von Oewebssaft die (icrinnunji: in hohem (hade. Spontan scheiden die Exsudate um so schneller Filirin aus, je zellreicher sie sind. Es gibt aber auch seröse Flüssigkeiten, die überhaupt nicht sjjontan gerinnen, sich auch auf Zusatz von Kalksalzen und Gewebssaft nicht ver- ändern, sondern nur durch Thrombin zur Koagulation gebracht werden. vSolche Transsudate sind nicht gerade häufig. Das perikardiale Transsudat des Pferdes zeigt diese P^igentümlichkeit {A. Schmidt ^), Arthus-). Auch der menschlichen Hydrokeleflüssigkeit können , allerdings nicht in allen Fällen, alle Fermentvorstufen fehlen. Sie gerinnt also mn- noch auf Throm- binzusatz und entspricht in ihren Eigenschaften am meisten einer guti-ii, nach Hamniarsfett dargestellten Fibrinogenlösung. Der Angabe Mcllanhi/s, daß jede Flydrokeleflüssigkeit durch Gewebssaft zur (ierinnung gebracht werden kann, möchte ich die Befunde A. Sclnnidts sowie einzelne eigene Beobachtungen gegenüberstellen. Will man einen zuverlässigen Indikator für Thrombin haben, so kann man sich solcher Transsudate bedienen. Immerhin scheint eine Fibrinogen- lösung dem Zweck besser zu entsprechen. Denn kleine Tlirombinmengen sind bisweilen in Transsudaten wirkungslos. Diese enthalten offenbar un- bekannte gerinnungshemmende Körper, die die Wirkung kleiner Thrombin- mengen (z. B. einiger Tropfen Blutserum) zu paralysieren vermögen. B. Plasmata, deren Stabilität durch Neutralsalze bedingt ist. Alle Neutralsalze können in genügender Konzentration die Blut- gerinnung hemmen oder verzögern. Man bedient sich dieser Tatsache viel- fach zur Gewinnung von Fibrinogenlösungen, die zum Nachweis gei'innungs- beförderuder Substanzen geeignet sind. Nach BiKjlia ^) ist die gerinnungs- hemmende Wirkung von der lonenkonzentration abhängig. Wenig ionisierte Salze sind schwach wirksam. Für praktische Zwecke kommen nur Salze der Alkalien und alkalischen Erden in Frage. Salze der Schwermetalle sind zwar auch wirksam . aber der Vorgang ist irreversibel. Echte Fibringerinming läßt sich in diesen Lösungen nicht mehr erzielen. 1. Die kalkfällenden Salze. (Jxalate, Fluoride und Zitrate hemmen schon in sehr geringer Kon- zentration die Gerinnung. Das ist verständlich, da ionisierte Kalksalze für die Bildung des Thrombins unerläßlich sind (s. S. 224). Durch die kalk- *) A. Schmidt, Zur Blutleluc. Leipzig 1892. *) Arthus, Le tiaiissucliit peritoneal du chcval coutient-il uii Profibriiifcrniout? C. r. Soc. Biol. T. 56. S. 388 (1904). ") BiKjJia, Azioni anticoagulantc dci cationi etc. Areli. di fisiol. \()1.3. fit. n. L. Loch, Bloch. Cbl. VI. 19U7. S. A. Abderhuldou, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. 17 258 P, Morawitz. fällenden Salze ^Yird also vor allem die Entstehung des Throrabins. erst in zweiter Linie die Wirkung des fertigen Fibrinfermentes gehemmt. Zitronensaures Natron wirkt zwar nicht kalkfällend {Ä. Schmidt i), Pekel- haHng 2) , hebt aber nach Sahhatani 3) die Ionisierung der Kalksalze auf. Damit ist aber die Bedingung für das Flüssigbleiben des Blutes gegeben. Ein Znsatz von P/00 Natriumoxalat genügt. Blut ungerinnbar zu maclien {Art lins und Pages ^). Man fängt also das aus den Gefäßen striimeude Blut in i/,o Volumen 1— 2Vo Natriumoxalatlösung auf. Das auf diese Weise gewonnene Oxalatblut, respektive -plasma gerinnt nicht spontan, wohl aber auf Zusatz genügender Thrombinmengen sowie bei Kalk- zusatz. Gewebssäfte können im ( )xalatplasma keine Gerinnung be^^^rken. Immerhin ist Oxalatplasma kein sehr gutes Reagenz auf Thrombin. Geringe Thrombinmengen bleiben häufig überhaupt ohne Wirkung. Bisweilen bilden sich aber, ähnlich wie im Fluoridplasma . auf Serumzusatz nur partielle Gerinnungen. Nur zum geringsten Teil dürfte diese Erscheinung auf eine direkte gerinnungshemmende Wirkung der Oxalate zu beziehen sein. Wahrscheinlich liegen auch noch andere Momente vor, denen man auch in Ilydrokeleflüssigkeiten (s. S. 257) begegnet. Ob es sich hier um echte Anti'körperwirkungen oder um Adsorptionserscheinungen handelt, ist noch nicht sicher bekannt. Oxalatplasma gerinnt regelmäbig auf Zusatz löslicher Kalksalze, z. B. Kalziumchlorid, wenn man deren Menge so wählt, daß nur ein geringer flierschui) von Kalziumchlorid im Plasma entsteht. Stärkere Kalzium- konzentrationen wirken hemmend (0-6— P/o CaCU). Aber selbst wenn man den Kalkzusatz richtig berechnet, verläuft die Gerinnung doch oft ziemlich zögernd. Das liegt daran, daß ein Teil der Fermentvorstufen von dem oft voluminösen Ca-Oxalatniederschlag zu Boden gerissen wird. Nach Rettger (1. c.) kann man das dadurch vermeiden, daß man Oxalatplasma längere Zeit gegen eine kalkfreie, 0'9Voig'P Kochsalzlösung dialysiert. Das Plasma bleil)t füssig. Geringe Spuren von Kalksalzen rufen aber eine schnell verlaufende, typische Gerinnung hervor. Das Prothrombin, respek- tive die Fermentvorstufen bleiben im Oxalatplasma mehrere Tage erhalten. Das Fluoridplasma wird nach Arthus durch Auffangen von Blut in einer Lösung von Natriumfluorid gewonnen. Die Konzentration des Salzes muß etwa 2°/oo betragen. Sonst wird die Jaerinnung nicht vöUig unterdrückt. Natriumfluorid besitzt also trotz erheblich niedrigeren Mole- kulargewichts (42j schwächere gerinnungshemmende Eigenschaften als Natriumoxalat (152). Nach Sabbatani ist die Ca-fällende Kraft eines Gram- moleküls Na Fl \iermal schwächer, als die eines Grammoleküls Natrium- oxalat. ^) Schmidt^ Weitere Beiträge zur Blntlehre. Wiesbaden 1895. '-) Fekelharing , Untersuchiingeu über das Fibriiifermeut. Amsterdam 1892. ^) Sabhatini, Fouction biologique du calcium. Arch. ital. de Biologie. T. p.341 (1903). *) Arthus uud Pages 1. c. 39. Die Blutgeriunung. or^O Fluornatriumplasma bleibt ebenso wie ()\alati)la.sina flii.ssit,^ weil es keine Ca-Ionen enthält. Immerhin unterscheidet es sich von uni'' mit Kochsalz, aus Fluornatriumplasma eine Fil)rinogenl()sung her und läßt diese gegen kalkfreie ()-'.)"/oig(' K(»cli- salzlösung dialysieren, so tritt in der Fibrinogcnlüsung alsbald (Jerinnuu},^ ein (Rettger^). Mit Oxalatplasma geHngt der Versuch nicht. Natriumfluorid beeinflußt daher wahrscheinlich die Kalksalze des Plasma in anderer Wei.se als das Oxalat. Offenbar wird der Kalk nicht vollständig gefiUlt. sondern bleibt zum Teil in nicht ionisierter Form in Lösung, nach licWjer in loser F5indung mit den Fluoriden. Dialyse kann diese Bindung, an der sich vielleicht auch Eiweillkörper beteihgen, sprengen; es tritt dann ])romj)te Gerinnung ein, ohne daß man Kalk zusetzen muß. Fügt man dem Fluoridplasma Chlorkalzium in solcher Menge hinzu, daß alles Fluornatrium ausgefüllt wird und ein leichter Kalküberschuß im Plasma entsteht, so erfolgt, ganz im Gegensatz zum \erlialten des (Jxalat- plasma, meist doch keine Gerinnung. Diese Beobachtung ist verschieden gedeutet worden. r)ie von Arthus gegebene Erklärung lautet folgender- maßen : Fluorsalze hemmen die Gerinnung auf zweierlei Weise. Erstens analog den Oxalaten durch Bindung der Kalksalze, zweitens aber auch durch Beeinflussung der geformten Elemente des Blutes. Diese sollen durch die toxische Wirkung des XaFl verhindert werden , gerinnungsbefördernde Substanzen an das Plasma abzugeben. Das Fluoridplasma soll also kein oder nur wenig Prothrombin, speziell Thrombokinase enthalten. Anders deuten Bordct und Gemjou -) diese Erscheinung. Setzt man die berechnete Menge Ca OL zu Fluoridplasma, so entsteht ein massiger Niederschlag, der nicht allein aus Ca FL besteht, sondern auch Fiweil». speziell Fibri- nogen, sowie Thronibokinase zu Boden reißt. Dadurch soll sich die Fnge- rinubarkeit des Plasma erklären. Nach Nolf (1. c.) ist das mit Kalk versetzte, an sich ungerinnbare Fluornatriumplasma (le plasma fluore recalcifie) das beste Reagenz auf Thrombozym (Thrombokinase). Es enthält Fibrinogen und Thrombogen und unterscheidet sich durch seinen reichlichen Thrombogengehalt von einer nach Hain mattsten bereiteten Fil)rinogenlösung. Der richtige CaCU-Zusatz wird am besten durch Berechnung ermittelt. ( )der man setzt so lange Ca Clj-Lösung tropfenweise hinzu, als sich noch Niederschlag bildet. Dieser wird abgeschleudert. Neuerdings hält lictfr/er diese P^eobachtungen am Fluoridplasma für unzutreffend. Bei sorgfältiger \ermeidung jedes Ca-Cberschusses soll es ganz gut gelingen, auch Fluoridplasma durch Kalkzusatz zur (Jerinnung *) Rettger, The coapiilatiou of blood. .Vmcr. Joiirn. of riiysiol. XXIW 1. .Iiili. p. 40ß (1909).' -) Bordct et (icttyou, Kecli. sur la coaLriilaiiuii du sauj,'. 3" möm., Contrilnition A rdtiule du plasma fluore. Aunal. de l'Instit. I'asfeur. T. 18 p. 26—40 (1904). 17* 260 P. Morawitz. ZU Ijiiugen. Also muß das Fluoridplasma erstens alle zur Gerinnung nötigen Faktoren enthalten. Zweitens kann aber der Fluoridnied erschlag diese Sub- stanzen offenbar auch nicht vollständig zu Boden reißen respektive immo- bilisieren. Die Eigenschaften des Natriumfluoridplasma sind also noch nicht vollständig geklärt. Seine Stabilität verdankt es jedenfalls in erster Linie dein Kalkmangel. Gegen die \'erwendung des Fluornatriumplasma als quahtatives und (juantitatives Reagenz auf Thrombin {Arthus^) sprechen früher erörterte Gründe (vgl. S. 258). Das Zitratplasma wird durch Auffangen von Dlut in einer Lösung von Xatriumzitrat gewonnen. Die Konzentration dieses Salzes muß 4^00 betragen, damit das Blut sicher flüssig bleibt. Es erfolgt kein Nieder- schlag von Ca-Zitrat. Trotzdem ist das Ca gebunden und für die Ferment- bildung nicht verfügbar. Das Zitratplasma findet neuerdings oft bei Immunitätsuutersuchungen Verwendung. 2. Andere Neutralsalze. Die gerinnungshemmende Wirkung der meisten nicht kalkbindenden Salze beruht, wie schon A. Schutidt feststellte, auf der Fähigkeit der Neutralsalze in genügender Konzentration die Fermentbildung zu unter- drücken. Die Wirkung fertigen Thrombins wird erst bei sehr starker Salz- konzentration paralysiert. Das Magnesiumsulfatplasma (A. Schmidt). 2V2 — 3 Volumina Blut werden in 1 Volumen schwefelsaurer Magnesialösung von 28^/0 aufgefangen. Die Mischung wird sofort tüchtig durchgeschüttelt und zentrifugiert. Das zellfreie Magnesiumsulfatplasma kann entweder in dieser Form wochenlang im Eisschrank aufgehoben werden ( Wohlgemuth -) , oder man kann es nach A. Schnidt schnell über Schwefelsäure trocknen und pulverisieren. Das Pulver behält seine Brauchbarkeit beliebig lange. Zum Versuch wird die erforderliche Menge Pulver in einem lleagenzglase mit dem siebenfachen Gewicht Wasser durchgeschüttelt und nach einigen Stunden vom Ungelösten abzentrifugicrt respektive abfiltriert. Das auf die eine oder andere Weise gew^onnene Magnesiumsulfat- plasma gerinnt aus sich selbst heraus nicht mehr, obwohl es alle zur Ge- rinnung nötigen Faktoren enthält. In der angegebenen Konzentration unter- drückt das Salz meist auch die Wirkung zugesetzten freien Thrombins. Erst wenn man das Salzplasma hinreichend verdünnt, kommt zugesetztes Thronibin zur Wirkung. Nach Wohlgemuth (1. c.) genügt schon eine geringe Verdünnung {Icmi Wasser auf 2cm^ Salzplasma), um durch Zusatz von ') Arthus, Un r^actif quantitatif du Fibrinferment. Journ. de Physiol. T. 4. p. 1. (1902). '-') Wohlfjemuth , Eine neue Methode zur quantitativen Bestimmung des Fibrin- ferments etc. Biochem. Zeitschr. Bd. 27. S. 79 (1910). Die Blutgerinnung. 9^^j Fibrinfermont respektive Serum (lorinuung' zu erhalten. \'on selb.st ge- rinnt das verdünnte Magnesiumsulfatplasnia nicht. Bisweilen bleibt es sopar bei einer Verdünnuni? mit dei- zehnfachen Wassernienfi:e flüssig. Nach A. Schmidt ist man nicht imstande, lianz bestimmte (|Uantitative An^^aben über die jeweils zweckmäßige ^'erdünnung des Salzplasma zu machen. Sie hängt sehr von der Tierspezies ab. Schmidt, der meist mit Pferdeblut arbeitete, vei'dünnte das Plasma auf das achtfache, um «'inen brauchbaren Indikator für Thromltin zu gewinnen. In ]\'ohl(jcmuths Versuchen (Blut von Kaninchen und Hund) genügten schon viel geringere Zusätze. In jedem Falle wii'd man also den optimalen (irad der Verdünnung festzustellen haben, d. h. den (Jrad, bei dem das Plasma auf Fermentzusatz schnell gerinnt, spontan aber flüssig bleibt. Mäliig verdünntes Salzplasma kann auber durch Thrombin auch noch durch zymoplastische Substanzen zur ist keine deutliche Verzögerung mehr nachweisl)ar. Stärker gerinnungshemmend wirken chol- saure Salze (z. B. die Matnersvhe Galle). Bei einem Zusatz von I^q bleibt die Gerinnung oft ganz aus, ist aber immer stark verzögert. ') Borrief ot Gengou, Rccli. siir la cnau'iil. ilii san-:. Annal. iK' Tlnstit. /'asfiur. T. 17. p. 822 (lyuüj. 262 P- Morawitz. Ungerinnbares Gallensalzplasma enthält kein fertiges Throrabin, wohl aber dessen Vorstufen. Schon bei mäßiger Verdünnung mit Wasser erlangt es die Fähigkeit der Koagulation wieder. Nach Ausfällung der Kalksalze durch Natriumoxalat ist die nachfolgende Verdünnung unwirksam , das Plasma bleibt flüssig. Galleusalze wirken stark hämolytisch. Doch ist ihre gerinnungs- hemmende Eigenschaft nicht auf Hämolyse zu beziehen ; denn sie läßt sich auch in blutkörperchenfreien Fibrinogenlösuungen demonstrieren. Für die Erklärung cholämischer Blutungen im Organismus, die oft mit einer erhebhchen Verminderung der Gerinnbarkeit einhergehen, kommt sicher nicht eine direkte gerinnungshemmende Wirkung der im Blute Leberkranker kreisenden Gallenbestandteile in Frage {Morawitz und Bierich \). Gallensalzplasma ist im ganzen kein guter Indikator für Thrombin oder dessen Vorstufen, da es gar zu leicht schon bei mäßiger Verdünnung spontan zu gerinnen pflegt, ganz im Gegensatz zum MagnesiumsuKatplasma. C. Methoden zur Gewinnung möglichst unveränderten, stabilen Blutplasmas. Da Blutplasma in vitro meist starke Neigung zur Gerinnung zeigt, sind besondere Vorsichtsmaßregeln zur Gewinnung möglichst unveränderten Plasmas erforderlich, eines Plasmas, das keinen gerinnungshemmenden Zusatz erhält. Besonders geeignet erweist sich hier Blutplasma von Vögeln und niederen AVirbeltieren. Dieses ist, wie Delezenne ^) zuerst zeigte, unter gewissen Bedingungen viel stabiler als Säugerblut. Aber auch aus diesem kann man ziemlich stabile Plasmata herstellen, die besonders früher viel- fach für Geriunungsversuche Anwendung fanden. 1. Zellfreies Pferdeblutplasma nach A. Schmidt.^) Das Plasma wird durch Abkühlung und Filtration gewonnen. Nur Pferdeblut ist geeignet. Das Blut anderer Tiere hat einmal eine zu starke Gerinnungstendenz. Dann sedimentieren aber auch alle anderen Blutarten zu langsam und unvollständig, während sich die Blutzellen gerade im Pferdeblut besonders schnell und vollständig absetzen. Pferdeblut wird in hohen, vorher sorgfältig gekühlten Glaszylindern aufgefangen. Sie stehen in Eis oder in einer Kältemischung. Das Blut kühlt sich rasch ab und bleibt flüssig. Sobald seine Temperatur auf etwa 0" gesunken ist und die geformten Elemente sich abgesetzt haben, wird das Plasma vorsichtig dekantiert und auf ein Filter aus einer dreifachen Lage Filtrierpapier gebracht (Papier von Schleicher & Schüll, Nr. 598). Das *) Morawitz und Jiicrich, Über die Pathogenese der choliimischen Blutungen. Arch. f. experim. Pathol. u. Pbarmakol. Bd. 56. S. 115 (1906). ^) Delezenne, Rech, sur la coagulation du sang chez les oiseaux. Arch. de Physiol. T. 9. p. .333-;352 (1897). ■') A. Schmidt, Zur Blutlehre. Leipzig 1892. S. 7. Die Blulgerinimng. 9g3 Filter befindet sich in einem Doppeltrichter, der mit einer Killtemischunf? gefüllt ist. Man hat nun die Aufgabe, auch ^väh^'nd des Fiitrationspni/' die Temperatur des Plasmas nicht über + ()•;')" steijj^en und andniM-n- nicht viel unter den Gefrierpunkt sinken zu lassen. Im erstei'en Fall«' ^'ehen zu viele Blutzellen (hauptsächlich Blutplättchen und Leukozyten), die sich noch nicht abgesetzt hatten, durch das Filter, im anderen Falle gerät die Filtration ins Stocken. Aullerdem löst sich ein Teil der Blutzellen während des Gefrierens auf; es gelangen dann /elli)estandteile in das Plasma und wii-ken gerinnungserzeugend. Hat man solche Zwischenfälle vermieden, so bleibt das zellfieie Plasniafiltrat selbst bei einer Temperatur von 1.")" oft viele Stunden lang, ausnahmsweise sogar 24 Stunden flüssig und kann zu Gerinnungsversuchen verwandt werden. Niemals erhiilt man aber Plasma, das spontan gar keine Neigung zur (ierinnung zeigt. Je intensiver die Ge- frierung im Filter war, je mehr Zellen durch das Filter durchgegangen sind, um so größer ist die Gerinnungstendenz. Es ist gut. die Filtration in einem kühlen Baume vorzunehmen. Im Laufe einer Stunde erhält man bis öOcm^ Filtrat, oft aber nur viel weniger. Hoher Filtrationsdruck ist erforderlich. Daher geht man zweckmäCiig von grollen Plasmamengen aus. Auf jeden Fall bleibt die Gewinnung (ki^ abgekühlten, zellfreien Plasma schwierig. Auch kann ich nicht glauben, dalJ es als Indikator für Throml)in und seine Vorstufen viel leistet. Die Stabilität ist ja keine absolute , aulierdem ist sie großen Schwankungen unterworfen. 2. Stabiles Säugerplasma in paraffinierten (Jefäßen (Uordrf- Gengon ^). Da die Berührung mit benetzbaren Fremdkörpern den ersten Anstoß zur Gerinnung gil)t, kann Auffangen von Blut unter Ol {Freund-) oder noch besser in paraffinierten Gefäßen, in denen jede Möglichkeit der lU-netzung ausgeschlossen ist, die Gerinnung erhel)lich behindern oder hintanhalten. Man versieht zunächst eine Anzahl sorgfältig gereinigter Zentii- fugengläser innen mit einem Überzug sauberen und sterilen Paraffins. Paraffin von niedrigem Schmelzpunkte ist vorzuziehen. Sonst macht man die Erfahrung, daß eine sehr spröde Paraffinschiebt doch einer gewissen Benetznng mit Blut zugänglich ist. P^ine Mischung von festem Paraffin mit Paraff. li(iuidum ist am meisten zu empfehlen. Der Schmelzpunkt liege nur wenig über 40^'. Vaseline oder Ol ist nicht recht brauchbai', da es während des Zentrifugierens leicht von den Wänden des Glasgefäßes ab- gleitet. Die Zentrifugiergiäschen sind .sorgfältig voi- dem Eindringen von Staub zu schützen, am besten durch P.edecken mit Stanniol, das man auch beim Zentrifucieren als Deckel auf don Gläsern beläßt. Auch die zur P>lut- ') Bordet-GfUf/oii , 1. c. S. 2(51. -) Freund, Ein Beitrag zur Keiiiitnis der Blutgerinnung. NViiMitr med. .lalirb. 46-48 (1886). 264 P. Morawitz. entnähme dienende Glaskanüle sowie die sich anschließenden Glas- und Gummirohre müssen mit einem Paraffinüberzug versehen werden. Man i)efestigt nun die Kanüle auf die gewöhnliche Weise in einer der Arterien des Versuchstieres , läßt die zuerst ausfließenden Blutmengen abtropfen und füllt dann schnell die Ghäser, die sofort wieder zugedeckt und zentrifugiert werden. Ist kein Fehler passiert, hat man speziell jedes Eindringen von Staub u. dgl. zu vermeiden gewußt, so tritt keine Ge- rinnung ein. ^lan kann nach kurzer Zeit das zellfreie Plasma mit einer paraffinierten Pipette abheben. Dieses Plasma hält sich nur so lange flüssig, als es in paraffinierten Gefäßen verweilt. In gewöhnlichen Glasgefäßen wird es regelmäßig mit größerer oder geringerer Geschwindigkeit fest. Es enthält also alles, was zur Gerinnung erforderlich ist. Trotzdem entsteht in ihm doch erst dann Thronihin. wenn eine Kontaktwirkung benetzbarer Fremdkörper gegeben ist. Zur Ausführung von Gerinnungsversuchen ist dieses Plasma seiner geringen Stabilität wegen wenig geeignet. Größere Übung und sorgfältige Technik ist außerdem Vorbedingung für die Gewinnung des Plasma in Paraffin röhrchen. n. Vogelplasma nach Delezenne.^) Vogelblut und Blut niederer Wirbeltiere zeichnet sich durch größere Stabilität in vitro vor dem Säugerblute aus. Es gelingt ^^ogelblut nach einem von Delezenne angegebenen Ver- fahren ohne jeden gerinnungshemmenden Zusatz lange Zeit außerhalb des Körpers flüssig zu erhalten und durch die Zentrifuge ein zellfreies Vogel- plasma zu gewinnen, das nur wenig oder überhaupt keine Neigung zur Koagulation aufweist. Am l)esten macht man den Versuch mit Gänsen oder Truthähnen. Hühner sind wegen der kleineren Verhältnisse weniger geeignet. Auch habe ich einige Male die Beobachtung gemacht, daß Hühner schon beim Aufbinden auf das Operationsbrett oder beim ersten Haut- schnitt plötzlich starben (Shokwirkung?). Nach Fuld 2) verfährt man zur Gewinnung von Vogelplasma in folgender Weise: Das Blut wird aus der Karotis entnommen, von der mau ein längeres Stück freilegen kann als von der Brachialis. Das Tier wii-d ohne Narkose — der Eingriff ist kaum schmerzhaft — aufgebunden und durch einige untergeschobene Keile gestützt. Der Hals soll möglichst gerade und unverdreht liegen. Nun reinigt man das Operationsfeld von Federn (am besten durch Rupfen) und durchtrennt die Haut in der Mittel- linie, wobei es meist zu kleinen Blutungen aus Hautvenen kommt. Diese werden gestillt, bevor man weiter geht. Nun geht man möglichst stumpf, scharf in der Mittellinie, zwischen den Muskeln in die Tiefe, ohne den Puls zu suchen. Ist man bis auf die ziemlich tief gelegene linke Arterie 1) Delezenne, 1. c. S. 262. -) FuJd , Ül)ei' das Zeitgesetz des Fibrinferments. Hofmeisters Beitr. Bd. 2. S. 514 (1902). Die Blutf'erinuunff. '15 265 gekommen, so tritt diese deutlich aus der Wunde hervor. I)as rechte Ge- fäß lie^t unmittelbar dahinter. Man legt das (iefäli nun auf einen Streifen Flic'lipapior und bindet in gewühnliclier Weise eine absolut sauborc - freien Gegenständen in Berührung kommen. Fuhl rät, die Zentrifugen- gläschen und besonders auch die Pipetten, die zum Abheben des Plasmas dienen, vorher auszudampfen. Ich habe mich mehrfach mit gutem Erfolge paraffinierter Gläser und Kanülen bedient. Das zellfreie Plasma ist viel weniger zur Gerinnung geneigt und kann — auch in nicht paraffinieiten Glasgefäßen — unter Umständen wochenlang gehalten werden . ohne zu gerinnen. Sehr hiiufig erlebt man es aber doch, daß schon während des Zentrifugierens oder kurz danach eines oder das andere der Köhrchen partielle Gerinnung zeigt. Der noch nicht geronnene Plasmaanteil aus diesen Gefäßen darf nicht weiter verwendet werden, (iewöhnlich liegt hierbei ein Fehler der Technik vor, besonders Unsauberkeit eines der Glasgefäße, mit denen das noch zelleuhaltige Plasma in Berührung kommt. Außer der Karotis kommt für die Blutentnahme noch die Art. brachialis (im Sulcus bicipitalis internus des Flügels) oder die Vena ju- gularis respektive brachialis in Betracht. Die Blutentnahme aus der Vene — technisch einfacher als die aus der Karotis — ist vielleicht weniger zu empfehlen, da das Blut sich nur tropfenweise entleert und hierdurch die Möglichkeit der Verunreinigung durch Staubpartikel in hölieroin (irade gegeben ist. Das ungerinnbare, zellfreie \ogelplasma ist kein guter Indikator für Thrombin. Ebenso wie die meisten anderen ..natürlichen" Plasmaarten (Hydrokeleflüssigkeit , Oxalatplasma etc.) enthält es gerinnungshemmende Körper (L. Locb^), Murascheiv-). Zusatz von wenig Tlirombin. /. 15. Blut- serum, ruft häufig nur langsam verlaufende oder unvollständige (ierinnungen hervor. Dagegen ist Gansplasma ein sehr gutes Reagenz auf Thrombokinase *) L. Loch, Versuche üher einige Bedingungen der Blutgerinnung etc. Virchotrs Arch. Bd. 176. S. A. (1'.IÜ4). -) Murascluir, tlicr die Spezifizität des Fibrinferments uiul seiner Vorstufen. Deutsches Arch. f. klin. Med. Bd. 80. S. 187. 0^04). 266 P. Morawitz. respektive zymoplastische Substanzen. Eine Spur Gewebssaft genügt schon, das Plasma in wenigen Minuten zu vollständiger Gerinnung zu bringen. Das Gansplasma enthält also Thrombogen, Fibrinogen und Kalksalze. Es fehlt ihm an Thrombokinase oder diese ist doch nur in geringen Mengen vorhanden. Gansplasma, das längere Zeit hindurch im Eisschrank aufbewahrt wurde, bleibt bisweilen auch auf Zusatz von Gewebssaft flüssig, obwohl es noch mit Thrombin gerinnen kann. Nach HewleW^) handelt es sich möglicherweise um Unwirksamwerden des Thrombogens. Aus sich selbst heraus (etwa durch Verdünnen mit Wasser, Durch- leiten von CO2 oder Neutralisieren) ist sorgfältig bereitetes Gansplasma nur schwer oder gar nicht zur Gerinnung zu bringen (im Gegensatz zu Peptonplasma). -t. Plasma niederer Tiere (Fische, Krustazeen). Das Blut der Batrachier und Fische weist nach Delezenne (1. c.) ähn- liche Eigentümlichkeiten auf, wie Vogelplasma, d. h. eine gewisse StabiUtät in vitro, falls es unter Vermeidung jeden Kontaktes mit Geweben, Staub etc. entnommen wird. Ich gebe die Technik der Gewinnung von Fischplasma nach Nolf.^) Ein Katzenhai (Scyllium catulus) wird vertikal aufgehängt, mit dem Kopf nach unten. Man schneidet den Schwanz des Tieres in der Höhe der letzten Dorsalflosse ab. Es erfolgt trotz Eröffnung der Kaudalarterie keine Blutung, da der arterielle Druck, der sehr niedrig ist, durch die Körperlage ungefähr auf 0 reduziert wird. Nun führt man in die Arterie eine ganz saubere Glaskanüle ein. Sie wird tief in das Lumen des Gefäßes hineingestoßen und soll durch seithche Kompression auch die darunter- begende, ebenfalls eröffnete Vene schließen. Die Umgebung der Arterien- kanüle wird durch Wattetampons gut abgedeckt, um jede Beimischung von Gewebssaft zu vermeiden. Dann wird das Tier nach sorgfältiger Fixa- tion der Kanüle in horizontale Körperhaltung gebracht und unter Ein- leitung künstlicher Pvespiration entblutet. Die ersten Blutstropfen läßt man ablaufen, die folgenden werden in paraffinierten Gefäßen aufgefangen und sofort zentrifugiert. Das dekantierte Plasma behält in paraffinierten Ge- fäßen seinen flüssigen Zustand unbegrenzt lange bei. In Glasgefäßen ge- rinnt es meist langsam im Gegensatze zu Gansplasma, das auch hier flüssig bleibt. Verdünnung mit Wasser befördert die Gerinnung des Fisch- plasnia. Im übrigen verhält sich letzteres — besonders gegenüber Gewebs- saft — ähnlich wie Gansplasma. Bei Teleostiern ist die Tendenz zur spontanen Gerinnung größer, die Gewinnung eines stabilen Plasma weniger leicht. *) Hewlett, Über die Einwirkung des Peptonblutes auf Hämolyse und Bakteri- zidie etc. Arch. f. experim. Pathol. u. Pharm. Bd. 49. S. 307 (1903). -) Xolf, La coagulation du sang des poissons. Arch. internat. de Physiol. Vol. 4. S.A. (,1906). Die Blutgeriuuuiii?. 0p,7 Blutplasma Wirbelloser. Eini^^e der ^rölieren Krustazeenartt-n liefern f2:enün:ende lUiitinont-on. Es läßt sich bei ihnen ein Plasma ohne oder doch nur mit i'orin^er (ierinnuufrstendenz gewinnen. \'ei-fahren zur Gewinnuni^- von Krustazeenplasma sind von L. Loch i) uml P. S'olf-) an- gegeben worden. Es mag hier erwähnt werden, daü manciic Krustazeen zwar auch eine echte Eibrinogengerinnung haben wie Wirbeltiere, dalJ aber außerdem eine dieser (ierinnung vorhergehende Agglutination und Verklumpung der Amöbozyten des Blutes eine Art vdii erster Gerinnung darstellt, die für die spontane Blutstillung bei diesen Tieren bedeutung.s- voU ist. Bei anderen Wirliellosen ist eine echte Fibringerinnnng überhaupt nicht nachweisbar, z. B. bei Limulus. Dagegen ist die Agglutiiiati(ui der Amöbozyten ganz allgemein verbreitet. Bei der Languste iralinurus vulgaris) und dem Hummer (Ilomarus vulgaris) tritt zu der Agglutination eine nachträgliche zweite Gerinnung, die viel Ähnlichkeit mit der Fil)rin- gerinnung der Wirbeltiere hat. Blutentnahme bei der Languste (Palinurus vulgaris) nach AW. Man wählt große Tiere und entnimmt ihnen oO — GOcm^ Blut durch Ampu- tation eines Beines. Die Tiere vertragen den Eingriff gut und bleiben am Leben, ^'or der Blutentnahme wird das dazu gewählte Bein (gewöhnlich das vorletzte) sorgfältig gereinigt und in Höhe des letzten Gelenkes ab- geschnitten. Zuweilen tritt danach Autotomie ein. Das Blut entleert sich ziemlich schnell, falls keine stärkeren Muskelbänder in der rmgebung des Gefäßes liegen. Sonst kann es vorkommen, daß es sich durch Aggluti- nation der Amöbozyten wieder schließt. Beim Hummer gewinnt man das Blut nach L. Loch am besten durch Inzision ins Al)domen. Da das Blut der Krustazeen in vitro meist ziemlich schnell nach der sogenannten ersten Gerinnung, der Agglutination der Amöbozyten. durch Ausscheidung des Fibrinogens ganz fest wird, so ist es notwendig, sich durch bestimmte Methoden ein stabiles, für (lerinnungsversuche brauch- bares Plasma zu verschaffen. Nach L. Loch kann man zu diesem Zwecke in folgender Weise ver- fahren : 1. Ilummerblut wird in destilliertem Was.ser aufgefangen. Man wählt 1 N'olumen Wasser für 2 — 4 Volumina Blut. Die Flüssigkeit wird filtriert. Das Plasma gerinnt aus sich selbst heraus nicht mehr, oder doch nur langsam. '2. Hummerblut wird während der Blutentnahme geschüttelt, um die Agglutination der Amöbozyten zu befördern, dann sogleich filtriert, has Filtrat versetzt man mit Wasser im Verhältnis von 20 Teilen Blut zu 14 Teilen Wasser. Diese Mischung wird sofort eine hallte Stunde lang auf *) L. Loeb, über die Koafrulatiou des Blutes eiüiiL'er Arthropudeii. Boitr. z. ehem. Physiol. u. Pathol. V. S. 191 (19U4). — Derselbe, Untersiichuneen über BUitgeriunung. Ebenda. VI. S. 2(iO (1905). ■-') F.Xolf, La i'oagulatiuii chcz les tTUstacüs. Arch. intcniat. .If I'b\siol. \ol. 7. II. VI. S.A. (1909)- 268 P. Morawitz. 52" erwärmt. Die Lösung gerinnt aus sich selbst heraus nicht mehr, wohl aber auf Zusatz gerinnungsbefördernder Substanzen, z. B. Gewebssaft oder Extrakten aus Amöbozyten. 3. Endlich kann man aus Hummerblut auch eine Fibrinogenlösung herstellen. Das Blut wird wieder wie oben durch Schütteln von den Amöbo- zyten befreit — man erkennt die vöUige Ausscheidung dieser Zellen an der Flockenbildung in der sonst klaren Flüssigkeit — , dann mit einem größeren Volumen gesättigter Kochsalzlösung versetzt. Man fügt dem Ge- misch Kochsalz in Substanz bis zur Sättigung hinzu (Berechnen der Menge!). Der nach 4 — 9 Stunden abfiltrierte Niederschlag wird in destil- liertem Wasser gelöst. Diese Fibrinogenlösung ist haltbar, sie gerinnt nur auf Zusatz gerinnungsbefördernder Stoffe. 4. Nach Nolf gelingt es auch, Langustenplasma ohne jeden Zusatz in der Weise zu erhalten, daß man Blut aus einem Hinterbein des Tieres (die ersten Tropfen soll man nicht verwenden!) in paraffinierten Gläsern auffängt, sofort zentrifugiert und das abgehobene zellfreie Plasma bei 0" aufhebt. Es bleibt unter diesen Bedingungen lange flüssig und gerinnt auch bei gewöhnhcher Temperatur erst in mehreren Stunden. Die in verschiedener Weise gewonnenen Plasmata der Krustazeen gerinnen auf Zusatz von Gewebsextrakten oder Extrakten von Amöbozyten. Anwesenheit von Kalksalzen ist dabei erforderUch. Thrombin und Gewebs- saft von Wirbeltieren sind in einer von Krustazeenplasma hergestellten Fibrinogenlösung unwirksam und vice versa. Weitere technische Einzelheiten finden sich bei L. Loeh. D. Plasmata, deren Stabilität vornehmlich durch gerinnungs- hemmende Substanzen bedingt ist. 1. Das Peptonplasma. Wittepepton verhindert zwar nicht in vitro, wohl aber bei intra- venöser Injektion unter gewissen Bedingungen die Gerinnung (Schmidt- Mühlheim'^) ^ Fano^). Die Gerinnungsunfähigkeit dauert mehrere Stunden. Man wählt für den Versuch am besten Hunde oder Katzen. Die Tiere müssen zuvor 12 — 24 Stunden gehungert haben. Die Injektion der Pepton- lösung erfolgt durch eine in die Vena iugularis eingeliundene Kanüle (herzwärts!). Das Pepton wird in kochender Kochsalzlösung gelöst. Man stellt sich eine etwa 3 — 5<»/oige Peptonlösung her. Diese ist nach Ab- kühlung und Filtration zur Injektion verwendbar. Will man das Blut völlig ungerinnbar machen, so empfiehlt es sich, mindestens 0*3 g Pepton pro Kilogramm Tier zu injizieren. Lieber wilhlt man noch etwas höhere Dosen, doch nicht über 0"6 (/. Sonst sind Todesfälle während oder kurz ^) Schmidt-Miihlheim, Zur Kenntnis des Peptons und seiner physiologischen Be- deutung. Arch. f. Anal u. Physiol. Physiol. Abt. S. 33—56 (1880). -) Fano, Über das Verhalten des Peptons und Tryptons zu Blut und Lymphe. Arch. f. Anat. u. Physiol. Physiol. Abt. S. 277—297 (1881). Die Blutgerinnung. o^jq nach (lor Infusion zu befürchten. Ferner geschehe die Injektion müghchst schnell. Spritzt man die «bleiche Dosis langsam ein. so wird das lilut häufig nicht ganz ungerinnbar. \uu der Peritonealhöhle ans sind sehr starke Gaben erforderlich, um überhaupt eine Änderung der (ierinnbarkeit zu bewirken. Kaninchen und Meerschweinchen sind für Peptonversuche ungeeignet. Zuweilen bekommt man bei ihnen überhaupt keine Änderung der (Jerin- nungsfähigkeit, bisweilen sogar eine Beschleunigung. Eine sichere Pcpton- wirkung liilit sich hingegen wieder bei Vögeln beobachten. Auch die.se lälit man am besten tags zuvor hungern. Inniittelbar nach der Injektion werden die Tiere, falls sie nicht narkotisiert waren, somnolent, der IHutdruck sinkt stark, zuweilen .setzen die Atembewegungen aus. Man mub dann zur künstlichen liespiration greifen. Todesfälle sind selten, falls man nicht sehr große Peptonmengcn verwendet. Das zirkulierende Blut wird schon kurz nach der Injektion unge- rinnbar. Erst nach mehreren Stunden geht dieser Zustand allmählich vor- über. Gleichzeitig wird das Tier gegen die gerinnungshemmende Wii-kung einer zweiten Peptoninjektion immun. (Pepton- oder Peptozymimmunität.) Die Immunität dauert nur wenig über 24 Stunden. Ungerinnbares Blut, kurz nach der Injektion der Karotis entnommen, bleibt in vitro oft lange Zeit, zuweilen unbegrenzt lange flüssig. Ebenso verhält sich das Peptonplasma. Es laut sich leicht durch Zentrifugieren gewinnen. Das Peptonplasma hat zu vielen Untersuchungen über das Wesen der (Jerinnung gedient {Wooldridye^), Xolf 1. c). Es enthält einen gerin- nungshemmenden Körper, ein Antithromlnn. Dieser wird unter dem Ein- flüsse der Peptoninjektion in der Leber gebildet. Er kann zugesetztes Thrombin unwirksam machen. Daher gerinnt Peptonplasma nur schwer und langsam auf Zusatz fermenthaltigen Serums. Sonst finden sich im Peptonplasma alle zur Gerinnung nötigen Faktoren, also Fibrinogen. Kalk- salze, Thrombogen und Kinase. Trotzdem reagieren sie aus noch unbe- kannten (iriinden nur schwer oder doch nur auf bestimmte Beize mit- einander. Berührung mit benetzbaren Fremdkürperu genügt nicht, es müssen andere zymoplastische Faktoren eingreifen. In diesem Sinne wirkt Verdünnen des Plasma mit destilliertem Wasser, Einleiten von C'0.j, Neu- tralisation mit Essigsäure. Besonders wirksam ist Zusatz von (iewebssaft. Nach Nolf ist das Peptonplasma das beste Beagenz auf ..throml>o- plastische'' Substanzen. Indessen sollte es doch nur mit \orsicht \'er- wendnng finden ; seine P^igenschaften sind nicht konstant, auch liegen die Verhältnisse gerade hier sehr verwickelt. Nicht jedes Pepton .schlechthin, sondern nur bestimmte Sorten, be- sonders gerade das Pepton y\'ltte, löst diese eigenartige Beaktion im ') WooJdridge, Die (ieriiuiung des Blutes. Deutsch von M. r. Frey. Leipzig If'Ol 270 ?■ Morawitz. Organismus aus. Andere Albumosengemische sind vielfach wenig oder gar nicht wirksam. Ähnlich wie Pepton wirkt eine Reihe anderer, scheinbar gar nicht zusammengehöriger Substanzen, die Delezenne'^) unter dem Namen ..Körper der Peptongruppe" umschreibt. Dazu gehören: Aalserum, Krebsmuskel- und Schneckenextrakte und mannigfaltige Auszüge aus den Geweben nie- derer Tiere. 2. Hirudinplasma. Durch Blutegelextrakt oder Hirudin läßt sich die Gerinnung aufheben resp. verzögern. Wirksame Extrakte erhält man durch Trocknen der in Alkohol konservierten Blutegelköpfe. Die Köpfe werden dann möglichst fein gepulvert und mehrere Stunden mit Wasser extrahiert (Dickinson^-). Das von JakobJ und Franzi) aus Blutegelköpfen hergestellte Hiru- din (Firma Sachse da Cie., Leipzig) ist ein sehr stark gerinnungshemmend wirkender Körper. Hirudin ist zurzeit sicher das beste Mittel, die Blut- gerinnung im Organismus zum Zwecke physiologischer Versuche für län- gere Zeit aufzuheben. Denn es ist die einzige gerinnungshemmende Sub- stanz, die relativ wenig toxisch ist. 1 mg Hirudin genügt in vitro und in vivo, um die Gerinnung von 5 crn^ Blut zu verhindern. Einer ausgedehn- teren Anwendung, speziell auch bei größeren Tieren, steht nur der hohe Preis des Hirudins im Wege. (Ebenso , wie das Krogh [Skandin. Arch. f. Physiol, Bd. 20, 190SJ getan hat, möchte auch ich an dieser Stelle darauf hinweisen, daß der Preis des Hirudins , einer Substanz , die ausschUeßlich wissenschafthchen Zwecken dient, ganz unverhältnismäßig hoch ist. Hier sohten doch nicht allein rein kaufmännische Gesichtspunkte maßgebend sein !) Auch in vitro ist Hirudin wirksam, sogar im trockenen Zustande als Pulver. Es ist also nicht erforderlich. Blut, dessen Gerinnung man hemmen will, in einer Hirudinlösung aufzufangen. Einige Körnchen trockenen Hirudins sind auch schon genügend. Hirudin ist ein Antithrombin. Es neutralisiert eine bestimmte Menge Fibrinferment. Demgemäß gelingt es nur schwer, Hirudinplasma durch Fermentzusatz zur Gerinnung zu bringen. Ob das überhaupt möglich ist, hängt von der Menge des vorhandenen Hirudins ab, auch von der Stärke der Fermentlösung. Gewebsextrakte können, falls der Hirudinzusatz nicht gar zu groß ist, ebenfalls das Plasma zur Gerinnung bringen. Offenbar erfolgt hierbei im Hirudinplasma eine massenhafte Thrombinbildung. *) Delezenne, AVirkung des Aalserums und der Organextrakte auf die Blutgerin- nung. Arch. de Physiol. p. 646 (1897). -) Dickinson , Notiz über den Blutegelextrakt und seine Wirkung auf das Blut. Journ. of Physiol. 11. p. 566 (1890). ^) Franz, Über den die Blutgerinnung aufhebenden Bestandteil des medizinischen Blutegels. Arch. f. experim. Path. u. Pharm. Bd. 49. S. 342 (1903). Die Blutgerinnung. 071 E. Quantitative Bestimmung des Fibrinogens. Die Sfhwiorifikeit einer exakten quantitativen liestininuing des Fi- brinof>en.s liei>t in der Trennung dieses Eiweilikörpers von den anderen Glol)ulineii . die ähnliche Eigenschaften hahcn. Folgende Methoden sind heute im ( iebrauch : 1. Bestimmung des Fibrinogens durch Wägen des daraus gebildeten Fibrins. Die Resultate dieser Methode sind wahrschcinlicli recht unsicher. Denn abgesehen davon, daß der Übergang von Fibrinogen in Fibrin wohl kein quantitativer ist (vgl Hanunarstm^) , Herihnn-'^), Huiskamp^ dürfte es schwer sein, das Fibrin von all seinen Einschlüssen, von allen mitgerissenen Substanzen nachträglich zu befreien. Auch die Fibrinolyse kann bei längerem AYaschen mit Salzlösungen Fehler bedingen. 2. Die Methode der fraktionierten Ilitzekoagulation wurde zuerst von FrHeriaj*) geübt. Die Koagulationstemperatur liegt unter der anderer Globuline. Fredericq schlägt vor, Bittersalzplasma IT) Minuten lang auf 60" zu erwärmen und die ausgeschiedenen Gerinnsel zu wiegen. Leider ist die Gerinnung bei der genannten Temperatur nach Hainmarsten un- vollständig. Die Methode gibt zu niedrige Werte. 3. Bestimmung des Fibrinogens durch Fällung mit Essig- säure {Doijon, Morel, Peju^). Als Material dient Natriumfluoridi)lasma. Dieses wird mit verdünnter Essigsäure versetzt, und zwar auf 12 rn/^ Plasma 1 ciii'-^ der Essigsäurelösung. Der Niederschlag wird abfiltriert, koaguliert, gew^aschen, getrocknet und gewogen. Die Werte sollen denen entsprechen, die man durch Hitzekoagulation oder nach der später zu beschrei- benden Bei/escheji Methode erhält. Mir erscheint es wenig vorteilhaft, an ganz unverdünntem Plasma zu arbeiten. Denn die mitgerissenen Anteile, die den anderen Globulinen entstammen, sind um so größer, je stärker die Konzentration der Eiweißlösung ist. 4. Salzfällungsmethode nach Bet/e^) (resp. nach Pon/Cf^ und Spiro''). Die ^Methode geht von der Tatsache aus, daß Fibrinogen durch Neutralsalze leichter ausgesalzen wird als die anderen Globuline. Blut wird in B^/^iger Lösung von Na Fl aufgefangen. Man wählt Menge der Lösung und des Blutes so, daß in diesem eine Fluornatriumkonzen- ') Hammarsfen, Ülior den Faserstoff und seine Entstehung aus dem Filirinogen. Pflügers Arch. Bd. 30. S. 437 (1883). -) Heubner, Die Spaltung des Fibrinogens bei der Fibringerinnung. Arch. f. experim. Path. u. rharm. Bd. 49. S. 229 (1903). ^) Hiiiskainp, Zur Fibringlobulinfrage. Zeitschr. f. phvsiol Chemie. Bd. 44. S. A. (1905). *) Fredericq, Untersuchungen über die Konstitution des Blutplasmas, (.laml. i'ans, Leipzig 1S78. ^) J)oi/o>i , Morel, Peju, Proc6d(5s de dosage du fibrinogeue. C. rend. soc. biol. T. 58. p. 657 (19Ü5). *) Beye, über Nachweis und Bestimmung des Fibrinogens. I.-D. Straßburg 1898. ') Porges u. Spiro, Die Gloiniline des Blutserums. Hofmeisters Beitrau'e. Bd. 3. S. 277 (1903). 272 P- Morawitz. tration von 0'56— O'ßo/o besteht. Zu 2 c^^^^ dieses Plasma setzt man aus einer Bürette gesättigte neutrale Ammonsulfatlösung, deren Dichtigkeit bei 19" 1-240 betragen soll. Nach Zusatz der Salzlösung füllt man die Plasma- Salzmischung mit destilhortem Wasser auf 10 cm^ auf und läßt einige Stunden stehen. Das Fibrinogen beginnt bei Zusatz von l'ö — 1*7 cm^ Am- moniumsulfat auszufallen. Die P'ällung ist bei 2*5 — 2'7 cm^ beendet, falls man 2 citt^ Plasma nimmt und immer auf 10 cui" auffüllt. Bei 2*8 cm^ Ammoniumsulfatzusatz beginnt schon die Fällung der Globuline. Daher ist bei Verwendung der Methode zur (quantitativen Fibrinogenbestimmung vor allem eine Kollision mit der Globulinfällung zu vermeiden. Das geschieht am besten, ^venn man das Plasma, wie oben angegeben, auf das öfache verdünnt. Im unverdünnten Plasma geht die obere Grenze der Fil)rinogen- fällung in die untere der Globulinfraktion ohne Grenze über. Im Serum finden sich sehr geringe Mengen eines Eiweißkörpers mit den Salzfällungsgrenzen des Fibrinogens. 2 cm'^ Serum geben nämlich bei Zusatz von 22 — 2*9 cm^ Ammonsulfat und nachfolgender Auffüllung auf 10 cm'i Gesamtflüssigkeit Trübung und feine flockige Ausscheidung. "Wahrscheinlich handelt es sich hier um das Hammarsten^che Fibrin- g 1 0 b u 1 i n. Beije empfiehlt schließlich folgendes einfachere \'erfahren: Je 12 cm^ klaren Fluornatriumplasmas werden mit je P)0 cm^ destillierten Wassers verdünnt, mit je 16 cm,^ Ammonsulfatlösung gefällt und bis zum Absetzen des Niederschlages stehen gelassen. Man bringt dann die flockigen Aus- scheidungen auf ein gewogenes Filter, wäscht mit entsprechend verdünnter Ammonsulfatlösung so lange nach, als das Filtrat noch Eiweißreaktion gibt. Dann wird der Niederschlag an der Luft getrocknet und bei 80" im Trockenofen koaguüert. Der jetzt unlöslich gewordene Niederschlag wird mit heißem W^asser schwefelsäurefrei gewaschen, dann mit Alkohol und Äther behandelt, zuletzt bei 100" getrocknet und gewogen. In 12 ciii^ Ptinderplasma findet Eet/e 0-042 — 00424 r/ Fibrinogen, was einem mittleren Prozentgehalt des Plasma von 0-3479 entspricht. Das Ausw^aschen des Ammonsulfats aus dem Niederschlag ist zeit- raubend. Porges und Sjjiro haben die Methode dadurch sehr vereinfacht, daß sie N-Bestimmungen vor und nach Ausfällung des Fibrinogens im Plasma vornehmen. Das Fibrinogen wird also überhaupt nicht gew^ogen, sondern aus der Differenz berechnet. Natürlich ist kein Ammonsulfat ver- wendbar. Porges und Sjnro empfehlen Natriumsulfat. 4fach verdünntes Plasma wird mit Y^ Volumen warmer gesättigter Natrium Sulfatlösung versetzt. Man läßt den Niederschlag sich absetzen. Wegen der Eigenschaften des Natriumsulfats muß die ganze Prozedur bei zirka 32" vorgenommen werden, und zwar sowohl die Sättigung der Na- triumsulfatlösung, als auch die Fällung des Plasma. Man läßt die Plasma- salzmischung mehrere Stunden lang — unter Vermeidung jeder Ver- dunstung — bei dieser Temperatur im Brutschrank stehen , z. B. in zu- gekorkten Meßzylindern. Danach wird bei derselben Temperatur filtriert. Die Bliitgerinming. i;«?-» Die N-Bestiinmung geschieht nach Kiddald. Xatüilicii sind nsalz«'n. Das V'erfaliren von Heye, besonders in der ihm von Spiro und Porgf'S gegebenen Form, dürfte zurzeit die beste und be(|U('inste Methode zum Nachweis wie zur quantitativen r)estimnniug des Filtrinogeiis sein. Ganz zuverhissige Werte gibt sie aber wohl schon deshali» nicht, weil der Niederschlag wahrscheinlich stets geringe Anteile der anderen cm^ frisch der Ader entciuellen- den Blutes werden mit 1 oir^ 20"/üiger Magnesium sulfatlösung gemischt, die Mischung zentrifugiert und das Salzplasma abgehoben. Eine Keihe von Reagenzgläsern wird nun mit absteigenden Mengen des Salzplasma beschickt, die Volumdifferenzen mit 1" „iger kalkfreier Kochsalzlösung ausgeglichen und nun in jedem (Häschen je 1 cm'^ der lOfach verdünnten Fibrinfermentlösung hinzugefügt (Serum). Dann kommen alle Gläschen nach i;^mschütteln 24 Stunden in den Eisschrank. Danach kontrolliert man, ob Gerinnung eingetreten ist. Die ersten beiden (Wäs- chen, die viel Plasma und daher auch viel Magnesiumsulfat enthalten, sind in der Kegel flüssig geblieben. Die folgenden zeigen komplette, die mit sehr stark verdünntem Plasma partielle oder überhaupt keine (rerin- nung. So zeigen z. !>. in einer Serie die Uöhrchen mit lo und ()") i-m^ Plasma keine Gerinnung, zwischen ü'25 und OOIG etn^ Plasma ist überall ein mehr oder weniger ausgedehntes Gerinnsel zu sehen, die Proben mit 0-008 und 0-004 cm^ Plasma sind flüssig geblieben. Als Fibrinogeneinheit setzt Wohlj/emuth diejenige Menge Plasma, die noch gerade ausreicht, um in Gegenwart eines Überschusses an Thrombin ein deutlich erkennbares Gerinnsel zu bilden. Man erhält also keine abso- luten, sondern nur Vergleichswerte. Vielleicht wären gerade bei dieser Methode Störungen durch Fibrino- lyse noch genauer zu berücksichtigen. Geringe resp. mällige Fibrinolyse kann auch bei niedriger Temperatur erfolgen. IV. Gerinnungsbefördernde Substanzen. Gerinnungsauslösende und -befördernde Substanzen kann man zweck- mäßig in solche einteilen, die fertiges Thrombin enthalten — die Uein- darstellung dieses Körpers ist bisher nicht geglückt — und in solche, in denen sicli zwar kein fertiges Throndtin, wohl aber Throndiinvorstufen (Thrombogen und Thrombokinase) finden. Auch kalksalze, z. R Kalzium- chlorid, können als gerinnungsbefördernde Substanzen gelten, endlich auch noch eine dritte Gruppe von Körpern, die zwar zur Fennentltildimg nicht >) Wohhiemiilh, Eine neue Metlioilc zur ([luuititativiii Hcstimmmi>r dos Kiliriii- fermeuts etc. JBiochom. Zeitschr. Bd. 27. S. Yd (^lülU). Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden. V. 18 274 P. Morawitz. erforderlich sind, wohl aber in noch unbekannter, unspezifischer Weise die Entstehuno-, vielleicht auch die Wirkung des Fibrinferments begünstigen. Das wären die zymoplastischen Substanzen Schmidts, die thromboplastischen Substanzen Xolfs. Aber die Anschauungen über die Wirkung solcher Körper sind noch wenig geklärt. Durch genügenden Thrombinzusatz kann man jede überhaupt ge- rinnungsfähige Flüssigkeit zur Koagulation bringen. Die inaktiven Vor- stufen des Thrombins sind aber natürlich nur dort wirksam, wo die son- stigen Vorl)edingungen der Fermentbildung gegeben sind. Flüssigkeiten, die nur Kalksalze sowie Thrombokinase enthalten, werden zwar imstande sein, Vogelplasma oder Peptonblut zur Gerinnung zu bringen, in den pro- plastischen Flüssigkeiten A. Schmidts, in Fibrinogenlösungen, sind sie aber ohne Wirkung. A. Thrombinlösungen. 1. Die am einfachsten zu gewinnende Thrombinlösung ist Blutserum. Sein Thrombingehalt ist recht schwankend, im ganzen gering, d.h. also, daß selbst ziemlich große Serummengen nur langsam Fibrinogenlösungen und andere fibrinogenhaltige Flüssigkeiten zur Gerinnung zu bringen ver- mögen. lUutserum , das längere Zeit, etwa mehrere Tage gestanden hat, ist weniger wirksam als ganz frisches. Die Fermentarmut des Blutserums erklärt sich durch 2 Momente: Erstens wird ein Teil des bei der Gerin- nung gebildeten Thrombins auf dem Fibrinnetz adsorbiert und mit diesem entfernt und zweitens geht ein erheblicher Teil des einmal entwickelten Thrombins bald nach vollendeter Gerinnung in eine unwirksame Modifi- kation, das Meta thrombin über, aus der es, wie schon A. Schmidt fand, wieder in Freiheit gesetzt werden kann. Auffallend arm an Thrombin ist das Blutserum des Pferdes. Nachweis von Metathrombin im Serum. Das Verfahren — es ist bereits von A. Schmidt verwendet worden — gestattet es, in einfacher Weise aus fermentarmem Serum stark wirksame Lösungen herzustellen. Das kann unter Umständen zweckmäßig sein, besonders dann, wenn man die Dauer von Gerinnungsversuchen abkürzen oder sich schnell überzeugen will, ob eine Flüssigkeit fibrinogenhaltig ist. Pferdeserum wird mit dem gleichen Volumen ~ Na OH versetzt und nach Vi — V2 Stunde mit ^ H, SO4 neutralisiert. Die fermentative Kraft des Serums hat dann sehr stark zugenommen, gemessen an der Gerinnungszeit einer Fibrinogenlösung. Folgender, von mir früher ausgeführter Versuch mag das illustrieren : Pferdeserum frisch Fibrinogen Temperatur Aktiviert Geronnen nach 5 Tropfen 5 crn^ 5 « 350 350 nicht ja 3V2 Stunden 8 Minuten Die Bliitgeriiiuung. Otä Die Wirkungen, die man durch Zusatz des frleichen Voluniciis -NaOH erhält, sind übrigens nocii niclit maximal. Noch g:röljere Fermentmen'^'cii kann man in Freiheit setzen, wenn man auf je 10cm» Serum '«Stunde lang 2 — 4 c;m» Normalnatronlauge einwirken lätit. Zu lange Wirkung der Na OH kann aber das Ferment wieder zerstören. Ebenso verliert das mit Alkali aktivierte Serum bei längerem Stehen ziendich rasch wieder seinen Fermentreichtum. Auch Zusatz nicht aktivierten, thrombinhaltigen Serums setzt den Fermentgelialt herab. Noch besser und mit noch kleineren Alkalizusätzen gelingt die Ak- tivierung des Metathrondjins in dialysiertem Pferdeserum (A. Sfliitiidf '). Hier genügt schon Zusatz von 0*1 — 0'2 rm^ ^/lo-Normalnatroidauge pro Kubikzentimeter Serum. Stärkere Alkalikonzentrationen zerstören das Thrombin leicht. Auch durch Säurezusatz — etwa in entsprechender Menge — und nachfolgende Neutralisation wird die fermentative Kraft wesentlich ver- stärkt, aber doch nicht in dem Maße wie durch Alkali. Rinder-, Hunde-, Katzenserum zeigen diesell)e Erscheinung. Doch sind die in Freiheit gesetzten Fermentmengen geringer. Daß das Metathrombin Kinase sei, wie Mellanbif-) meint, ist ganz unwahrscheinlich. 2. Thrombin nach A. Schmidt. Die Methode geht darauf aus. eine möglichst eiweißai'me, dabei doch wirksame Thrombinlösung zu ge- winnen. Man läßt eine bestimmte, nicht zu kleine ISlutmenge spontan ge- rinnen. Sobald Serum abgepreCjt ist, wird dieses mit dem 20facheii \'olu- men Alkohol (Oö^/o) gefällt. Der Alkohol bleibt einige Tage bis mehrere .Monate über dem Niederschlage stehen. Die Dauer der Alkoholwirkung scheint nur von geringer Bedeutung für die Wirksamkeit der später zu gewinnenden Thrombinlösung zu sein. Will man diese aus dem Nieder- schlage herstellen, so wird der Alkohol al)filtriert, das Präzipitat getrocknet und mit Wasser extrahiert. Wirklich eiweißarme Thrombinlösungen erhidt man nur bei kurz- dauernder Wasserextraktion. Sonst geht auch ziemlich viel Eiweiß in Lösung. Das scheint übrigens der Tlirombinwirkung nicht hinderlicii zu sein. Die Thrombinlösung ist natürlich reich an Salzen. Der Salzgehalt läßt sich durch Dialyse gegen 0"9Voige Salzlösung vermindern. .Metathrombin fehlt in diesen Thrombinlösungen. Wahrscheiidich bewirkt .Mkohol schon eine Cberführung in Thi-ombin. Nach Rdtger^) werden möglichst eiweißfreie Thrombinlösungen durch kurzes Aufkochen nicht vollständig inaktiviert, wohl aber eiweißreiche. Diese Tatsache soll gegen die Fermentnatur des Tlirond)ins sprechen. ') Ä. Schmidt, Zur Bliitlehro. Leipzig 1892. S. 209. ■') Mellanby, The coagulation of blood. Joiini. of IMiysiol. Vol. 38. i).2S (li)US DD) *) Rettger, Tlic coagulation of lilood. Americ. Jouni. of IMiysiol. \'«il. 24 ^r 4. p. 406 (1909). 18* 276 P- Moraw itz. Fängt man Blut direkt, ohne es vorher gerinnen zu lassen, unter Al- kohol auf, so läßt sich aus dem Niederschlage später kein Thrombin ex- trahieren, ein Zeichen dafür, daß das Thrombin nicht schon im zirkulieren- den Blute vorgebildet war. Alkohol scheint die Thrombinvorstufen zu zerstören. o. Thrombin nach HowelU) Eine größere, durch Schlagen von Schweinsblut gewonnene Fibrinmenge wird in fließendem Wasser bis zu völliger Hämoglobinfreiheit gewaschen. Das erfordert mehrere Stunden und muß von Zeit zu Zeit durch Kneten mit der Hand unterstützt werden. Die weiße Fibrinmasse wird dann möglichst fein verteilt und für 2 — 3 Tage im Eiskasten mit S^/oiger Kochsalzlösung extrahiert, dann filtriert, zuerst durch Gaze, später durch Filtrierpapier. Das etwas trübe, stark thrombin- haltige Filtrat Avird zur Entfernung der Eiweißkörper mehrfach tüchtig mit dem halben Volumen Chloroform durchgeschüttelt und filtriert, wobei der Chloroformniederschlag auf dem Filter bleibt. Diese Prozedur, die man mit der Schüttelmaschine vornehmen kann, ist so lange fortzusetzen, als das Filtrat noch trübe ist oder beim Kochen noch eine deutliche Fällung gibt. Endlich gewinnt man eine wasserklare, nahezu eiweißfreie Lösung, die immer noch ziemlich viel Thrombin enthält. (Geprüft an einer Fibri- nogenlösung.) Die Methode ist umständlich, liefert aber nach üowell sehr wirksame Thrombinpräparate. Das zum Ausschütteln benutzte Chloroform kann durch Destillation wieder gewonnen werden. Um dieses Thrombin in einen haltbaren Zustand überzuführen, läßt man geringe Mengen (5 — 10 cm^) der Thrombinbildung bei 35 — 40" mög- hchst schnell in Uhrschälchen eintrocknen. In diesem Zustande hält es sich unbeschränkt, während es in wässeriger Lösung, auch bei Chloroform- zusatz, ziemlich schnell an Wirkung einimßt. Will man aus dem einge- trockneten Thrombin wieder eine Lösung herstellen, so verreibt man den im Uhrgläschen befindlichen, leicht gelben Belag mit etwas Wasser, dem man einige Kochsalzkristalle zusetzt. Das Thrombin wird aus diesen Lösungen durch Halbsättigung mit Ammonsulfat niedergeschlagen. B. Andere gerinnungsbefördernde Substanzen. 1. Thrombogen {Morawitz, No^f, 1. c.) findet sich im Blutplasma und Blutserum, vielleicht auch noch in den Blutplättchen. Es ist gegen Erwärmen empfindlich und wird bei einer Temperatur von 56 — 60" inak- tiviert. Auch unter gewissen natürlichen und experimentellen Bedingungen scheint es zerstört zu werden. Es fehlt z. B. in den proplastischen Flüssig- keiten, die auf Zusatz von Thrombokinase und Kalksalzen nicht gerinnen, ebenso in den nach Hanunarsten bereiteten Fibrinogenlösungen , falls sie stärker verdünnt sind. Endlich kann man auf experimentellem Wege durch ^) Howell, The preparation and properties of Thrombin etc. Amer. Joarn. of Physiol. Vol. 26. Nr. 7. S. A. (1910). Die liluttreriniiung. ^t-j subakuto Phosphorintoxikation das Thrombosen (und Fibrinoj/on) hei Hunden zum X'erschwindcn bringen. Aus<^e\vachsene Hundo erhalten na<-h L.Loeb^) innerlialb ^ — 10 Taf::en 7— ^i I'hosj)li(»röl. hoch roafjieren einzelne Hunde J4'ef^f*u die Intoxikation recht verschieden: daher gelinj^t der Versuch nicht in jedem Falle. Kaninchen scheinen nach ei^n-nen Beobachtungen ungeeignet zu sein. IJeim Hunde verliert aber das I5lut gegen F]nde des Lebens meist sukzessive mehr und mehr seine (;erinid»ar- keit. Schließlich bleibt es ganz flüssig. Hs enthält dann kein Fibrinogen mehr, aber auch kein Thrombogen. Das lälit sich durch geeignete Kom- binationsversuche zeigen. Auch im lUutserum findet sich nach vollendeter Gerinnung noch Thrombogen. Durch Zusatz von Throml)okiiiase lassen sich im iJlutserum neue, oft sehr große Fermentmengen in Freiheit setzen, die man durch Zufügen einer Fibrinogenlösung nachweisen kann. Thrombogen wird nur im I)lute bzw. in der Lymphe gefunden. Die Gewebe enthalten, falls man für Entfernung aller Dlutspuren sorgt . kein Thrombogen. 2. Gerinnungsbefördernde Substanzen der Zellen (Zymopla- stische Substanzen, Thrombokinase). Zynioplastische Substanzen nach A. Schmidt.') Zellen verschiedener Organe werden auf dem Wasserbade mit Kückflußkühler mit siedendem Alkohol mehrfach extrahiert, die alkoholi- schen Auszüge vereinigt und eingedampft. Man erhält einen gelblichen, vornehmlich aus Lipoiden bestehenden Rückstand, der in Was.^er aufge- schwemmt und fein verteilt die Geriniuing des verdünnten Magnesium- sulfat-, Gallensalzplasma und mancher Transsudate stark beschleunigt. A. Schmidt nahm an, die zymoplastischen Substanzen spalteten Thrombin aus seinem Proferment (Thromi)ogen) ab. Xolf denkt an thromboplastische Wirkungen unspezifischer Natur. Die Substanzen sollen nur ilen Keaktions- ablauf verkürzen. Die Wirkung der zymoplastischen Substanzen mülUe wohl noch ge- nauer untersucht werden. Ich habe bei Versuchen mit ÜlutM'rum . zymo- plastischen Substanzen und Fibrinogenlösungen deutliche Uesultate über- haupt nicht gesehen. Thrombokinase (Throndiozym von Solf). Diese soll bei Gegen- wart von Kalksalzen mit dem Thi'ombogen des Plasma wirksames Thi-om- bin bilden resp. die Gerinnung veranlassen. Nach Morauitz ist die Tlirom- bokinase ein allgemeines Protoplasuia])rodukt. nach Xolf findet sie sich indessen nur in den Zellen des JMutes und der(iefäße. In Organextrakten hat man nach yolf zwar stets Thrombokinase, daneben aber noch unspe- zifische, thromboplastisch wirkende Substanzen. In i.solierten /elh'u . z. H. ') L. Loch, Weitere Unteisuchuiigen über BliitgeriiimuiL'. Hofmeisters Boiträje. Bd. 5. S. 534 (1904). 2) Ä. Schmidt, Zur Blutlolire. Leipzig 1892. 278 P. Morawitz. Spermatozoen, soll Thromboki nase fehlen, ebenso bei niederen Tieren, Bak- terien etc. Diese Fragen müßten wohl noch genauer als bisher untersucht werden. Man gewinnt die Thrombokinase durch Extraktion sorgfältig ent- bluteter und gereinigter Organe mit Kochsalzlösung. Gewöhnlich habe ich gleiche Mengen Organbrei und Kochsalzlösung genommen, ca. V* — V2 Stunde mit der Maschine geschüttelt (manuelles Schütteln genügt auch), dann die ^Mischung mehrere Stunden lang in den Eisschrank gestellt. Danach wird dekantiert und die trübe aussehende Kochsalzlösung zu Gerinnungsver- suchen verwendet. Es hat nach meiner Erfahrung keinen Wert, danach zu streben, möglichst klare Lösungen herzustellen. Je klarer eine Lösung ist, um so geringer ist die Intensität ihrer Wirkung. Preßsäfte von Geweben, die mit der Buchnerpresse hergestellt waren, zeigten sich weniger wirksam, als die mit der oben beschriebenen Methode gewonnenen Extrakte. Besonders wirksame Gewebsextrakte erhält man aus Thymus, Lymph- knoten, Leber. Die gerinnungsbefördernde Wirkung ist bis zu einem ge- wissen Grade spezifisch für die einzelnen Tierarten (L.Loe^M, -Mw-sascÄew' 2). Wenige Tropfen Thrombokinase kürzen die Gerinnung des Blutes in toto ungemein ab. Sie bringen ferner Gansplasma, Peptonplasma und abgekühltes Pferdeplasma schnell zur Gerinnung, während sie in den echten proplastischen Plüssigkeiten Schmidts unwirksam bleiben, ebenso in Fibrinogenlösungen. Die Kinase bedarf zu ihrer Wirkung der Ca-Ionen. Daher vermag sie im Oxalat- und Fluoridplasma keine Wirkung zu entfalten. Da die Thrombokinase sehr labil ist, gelingt es nur schwer und un- vollkommen, sie zu konservieren. Gewebsextrakte werden trotz Zusatz von Toluol oder Chloroform in wenigen Tagen fermentativ unwirksam, ja es treten während der Autolyse sogar gerinnungshemmende, hitzebeständige Körper auf (Conradi^). Alkohol- und Azetonfällung vernichtet ebenfalls die gerinnungsbeschleunigende Wirkung, ebenso höhere Temperaturen (ca. 70 bis 80"). Durch Eintrocknen bei niederer Temperatur (ca. 35 — 40") im Vakuum gehngt es hingegen, ein trockenes Gewebepulver herzusteUen, das wenig- stens in gewissem Maße sich die gerinnungsbefördernden Eigenschaften bewahren kann. Die Thrombokinase beschleunigt nicht allein die Gerinnung des Blutes in vitro, sondern vermag auch bei intravenöser Injektion durch intravas- kuläre Gerinnungen (vornehmlich im Pfortadergebiet und rechten Herzen) tödlich zu wirken, während Injektionen von Fibrinferment selbst nur ') L. Loeh, Versuche über einige Bedingungen der Blutgerinnung etc. Virchows Arch. Bd. 176. S. A. (1904). -') Muraschew, Über die Spezifizität des Fibrinferments und seiner Vorstufen. Deutsch. Arch. f. klin. Med. Bd. 80. S. 187 (1904). ^) Conradi, Über die Beziehungen der Autolyse zur Blutgerinnung. Hofmeisters Beiträge. Bd. 2. S. 136 (1901/02). Die ßlutgerinimiig. 971) selten deletär vorlaiifon (Wooldr'uhje^), Bo(/f/s -\, Conradi^), A. KüiiUr'}, Edelherrj '''). Bei niederen Tieren, spezieil Krustazeen, sciieiiien die (iewehssäfto einen Körper zu enthalten, der nicht wie eine Kinase, sondern wie Thronihin wirkt. Er bedarf aber zu seiner \Virkun^- der Kalksalze (L. Loeh^), Xolf''). C. Quantitative Bestimmung des Thrombingehaltes. Der \ersuch einer quantitativen Bestinimunj:; des Thronibinj^'ehaltcs kann folgendes bezwecken: 1. Messung- des Thronibingehaltes in fjncr Lösung, z. B. im Serum und 1\ Bestimm ung der bei der (lerinniing über- haupt gebildeten Thromljinnienge. Diese l)eiden Dinge sind nicht ich'iitisch; denn ein erheblicher Teil des Thrombins wird ja nach vollendeter (Gerin- nung schnell unwirksam. Der Thrombingehalt des Serums kann also nie einen brauchi)aren Indikator weder für die Gerinnungszeit, noch für die während der (ierinnung gebildeten Thrombinmengen abgeben. Man mißt den Thrombingehalt in der Art, daü man die Zeit be- stimmt, die eine fibrinogenhaltige Flüssigkeit bis zur vollendeten (Jerinnung braucht. Starke Thrombinmengen wirken natürlich schneller als geringe. Ob aber eine direkte Abhängigkeit der Gerinnungszeit von der Ferment- menge in Form einer einfachen Proportion vorliegt, ist noch unsicher, fber das Zeitgesetz des Fibrinferments herrscht nämlich noch keine völlige Übereinstimmung (vgl. Fuld% Martin% L. Locb^^). 1. Quantitative Bestimmung des Thrombins im Serum (nach WohlgciHuth^^). Eine Reihe von Reagenzgläsern wird mit absteigenden Mengen Serum beschickt, die Volumdifferenzen mit den entsprechenden Quantitäten 1" oiger kalkfreier Kochsaklösung ausgegUchen und nun zu jeder Portion 2 -i"lnL'\. V<>I. 9 p. 265. 1903. 284 Otto Fol in. ferner wird der schädliche Einfluß der Ammoniaksalze auf ein Minimum vermindert. Der letztere Effekt wird zum Teil durch Erniedrigung der Temperatur der Lösung hervorgerufen. Durch den Zusatz scheint die Hydro- lyse der Ammonsalze fast gänzlich verhindert zu sein. Es ist wenigstens eine Tatsache, daß eine Ammoniumsalzlösung, welche mit Kaliumoxalat in beschriebener Weise gesättigt ist, sich Phenolphtalein gegenüber fast neutral verhält, mehr als eine ähnliche Lösung, welche nur abgekühlt ist. Außer der Gesamtazidität des Urins ist es manchmal wünschenswert, die Mineralazidität zu bestimmen oder das Verhältnis zwischen an- organischen Säuren und anorganischen Basen, welche sich im Urin finden. Diese Bilanz könnte natürlich einerseits durch Bestimmung des gesamten Chlors, Phosphors und Schwefels und andrerseits durch Feststellung des gesamten Natriums, Kaliums, Calciums und Magnesiums ermittelt werden. Einfacher wird sie direkt nach folgender Methode bestimmt (FoUn).'^) In einer Platinschale wird nicht weniger als 0"o g und nicht mehr als 0*6 g reines, trockenes , gekörntes Kaliumkarbonat genau abgewogen. Nachdem man 25 cm^ Urin zugefügt hat, wird die so erhaltene alkalische Lösung auf einem Sandbad oder einem elektrischen Ofen zur Trockene ver- dampft. Wenn der Inhalt der Schale völlig trocken ist, wird unter Rot- glut über einem Radialbrenner, welcher breit genug ist, um die ganze Grundfläche der Schale zugleich zu erhitzen, geglüht. Das Erhitzen sollte ungefähr noch eine halbe Stunde unterhalten werden, nachdem bereits alle sichtbaren Ammoniakdämpfe ausgetrieben worden sind. Am Ende dieses Zeitpunktes ist immer noch Ammoniak im Rückstand vorhanden. Der Rück- stand wird jetzt erkalten gelassen und nun durch Zusatz von ungefähr 10 cm^ Wasser gänzlich durchfeuchtet. Früher benutzte man Wasserstoffsuperoxyd; jedoch erfüllt Wasser denselben Zweck. Das Wasser löst die alkalische Schicht, welche die organische Substanz bedeckt, und bewirkt dadurch daß gewisse Stickstoffverbindungen, die bei trockener Hitze beständig sind, entbunden werden. Die resultierende Lösung wird jetzt wieder zur Trockene verdampft und dann wieder eine Stunde lang unter Rotglut mittelst des Radialbrenners erhitzt. Danach ist der Rückstand noch mehr oder weniger durch unverbrannte Kohle schwarz gefärbt, aber er ist jetzt frei von Am- moniakverbindungen. Die rückständige Masse wird nun sogleich gelöst und mit Wasser und 75 — 100 cm^ Zehntelnormal-Salzsäure in einen Erlenmeyer- kolben gespült. Diese Säuremenge sollte genügend sein, um die Lösung sauer zu machen. Zu der sauren Lösung, die ein wenig Kohle suspen- diert enthält, setzt man zwei Tropfen Phenolphtaleinlösung zu und kocht dann fünf Minuten lang, um die Kohlensäure zu vertreiben. Nach Abküh- lung und Zusatz einer geringen Menge (ungefähr 1 g) neutralen Kalium- oxalates wird die Lösung mit Zehntelnormal-Natronlauge bis zu einer schwachen, aber unverkennbaren Rosafärbung titriert. Bis auf eine (gering- ^) 0. Folin, The acidity of uriue. American Journal of Physiology, Vol. 9. p. 265. 1903. Die vollständige Analyse eines 24stiuuligen Urins. i)^5 fügige) Menge von suspendierter Kohle in der Lösung nmli der Endpunkt der Titration klar und unverkennbai- sein. Wenn erwünscht, kann die Kohl<- durch Filtration entfernt werden. Ehe man die Resultate der Bestimmung in /ehntclnormal-Säure um- rechnet, ist es natürlich erforderlich, den Wert des zu Beginn der Ojicra- tion zugesetzten Kaliumkarbonates festzustellen. Dies wird so ausgeführt, daß man eine geringe bekannte Menge des Salzes mit einem fbcisdiuli von Normalsäurc erhitzt, dann abkühlt und titriert. Der Wert des Kalium- karbonats plus dem des Natriumhydrates, das bei der Kndtitration verbraucht wird, subtrahiert von dem Wert, welcher der zugefügten Xor- malsalzsäure entspricht, repräsentiert das zwischen anorganischen Säuren und anorganischen Basen (Metallen im Urin) bestehende \'erhältnis. Die so bestimmte Miueralazidität stellt nicht den l'berschub an freier Mineral- azidität dar, welche tatsächlich in dem Harn enthalten ist. Kin Teil dieser Azidität ist nämlich durch organische Verbindungen neutralisiert, wie sie in den organischen Sulfaten vorkommen. Ein anderer und beträchtlicherer Teil ist durch Ammoniak neutrahsiert. Unter Berücksichtigung dieser für Ammoniak und für die organischen Sulfate in Betracht kommenden Werte wird die freie Mineralazidität des Urins bestimmt. Zur Berichtigung des Wertes für die organischen Sulfate macht Folln die empirische An- nahme, daß sowohl die ..ätherischen" Sulfate als auch der ..neutrale Schwefel" als Schwefelsäure anwesend sind, in der eine Hälfte der Azidität durch organische Verbindungen neutralisiert ist. Da luni diese organischen Verbindungen während des Glühens zerstört werden, würde eine Hälfte der Azidität frei gemacht, die sich aus der Schwefelsäure des neutralen Schwefels und der ätherischen Sulfate, wie sie gewöhnlich bestimmt werden, berechnet. Ammoniak. Im Zusammenhang mit systematischen, vollständigen Harnanalysen ist es wichtig, nur Methoden zu gebrauchen, welche ein Minimum an Zeit erfordern. Die Folin?>c\iQ Luftstrom methode zur Bestimmung des Ammo- niaks entspricht dieser Anforderung (vgl. Bd. HI dieses Werkes, 2. S. T«Ui) und ist außerdem im ganzen zuverlässiger als irgend eine andere Methode, wenn man einmal mit dem in dem betreffenden Laimratorium zur \'erfügung stehenden Luftstrom genau vertraut geworden ist. Über den Gebrauch dieser Methode sind die folgenden Mitteilungen beachtenswert. Es ist erforderlich, daß die Genauigkeit der Methode für einen bestimmten Apparat und Luftstrom gründlich ausgeprüft ist. Dies sollte so ausgeführt werden, daß man das Ammoniak in dem erhältlichen, reinsten Ammoniumsulfat bestimmt und die Kesultate durch Destillation nach der gewöhnlichen Kjeldahl-Methode nachprüft. Andere Ammoniuinsal/e. wie zum Beispiel die Chloride, sollten für diesen Zweck nicht benutzt werden, ilenn sie enthalten fast immer Pyridinbaseu, welche bei der Destillation mit über- 286 Otto Folin. gehen wüi-den und als Ammoniak zur Titration kämen. Je geringer das Volumen ist, welches man braucht, je schneller und leichter wird das Am- moniak durch den Luftstrom übergetrieben. Bei einem Fig. 88. ziemlich schwachen Strom sind 20 cm^ Urin 25 cm ^ vor- zuziehen. Es ist kaum nötig, die Luft mit Schwefelsäure zu waschen , wie es Klercker empfiehlt (vgl. 1. c. S. 766), da die gebrauchte Luft meistens Außenluft ist oder mit Wasser gewaschen wird, indem sie die Luftpumpe passiert. Für das früher angegebene Absorptionsrohr (vgl. 1. c. S. 766, Fig. 259) sollte man die im Folgenden angeführte, verbesserte Form benutzen. Harnstoff. Folins Methode (Bd. III dieses Werkes, 2, S. 778). Wenn diese Methode richtig ausgeführt wird, gibt sie sehr zuverlässige Resultate. Die beiden Hauptfaktoren, welche beachtet werden müssen, sind: erstens, daß das Erhitzen so lange fortgesetzt wird, bis aller Harnstoff zer- setzt ist: zweitens, daß die Destillation so reguliert wird, daß sie eine volle Stunde durchgeführt werden kann, ohne daü der Inhalt des Destil- lationskolbens trocken wird. Die im Folgenden angegebene, bis jetzt noch nicht veröffentlichte Modifikation der ursprünglichen Methode erleichtert die Bestimmung. Für die Zersetzung ist eine Temperatur von ungefähr 150" erfor- derhch. Bei dieser Operation bedient man sich vorteilhaft etwas Chlorjod- quecksilbers, HgClJ. Diese Substanz ist deshalb außerordentlich empfehlens- wert, da sie ein Indikator für die Temperatur in Verbindung mit der Zersetzung des Harnstoffes ist. Chlorjodquecksilber, HgClJ, ist ein hellrotes Pulver, welches bei 1250 gelb wird und bei 153" schmilzt. Es wird dar- gestellt, indem man in einem geschlossenen Rohr molekulare Mengen reinen Chlorquecksilbers und Jodquecksilbers 6 — 8 Stunden lang auf ungefähr 160° erhitzt. 1) Das pulverisierte Produkt wird dann in kleinen Glaskolben (Jena-Glas) von ungefähr 0'5 cm^ Inhalt verschlossen aufbewahrt. Wenn richtig ausgeführt, kann man solche Gefäße unbegrenzt lange benutzen, um die Temperatur 153" anzeigen zu lassen. In einem Kjeldahlkolben (von 500 cm'i Inhalt) werden nun 5 cin^ Urin eingemessen und 20 g Magnesiumchlorid, 2 — 5 cm^ konzentrierte Salz- säure, ein kleines Stück Paraffin und einige Tropfen roter Alizarinlösung zu- gesetzt. Der Mischung wird schließlich in das oben beschriebene Glaskölbchen, das als Temperaturanzeiger dient, zugefügt. Der Kolben wird nun in auf- rechter Stellung über eine passende Flamme gebracht. Das überschüssige Wasser wird abgedampft. Die Mischung wird nach und nach heißer, bis der 1) Köhler, Über Quecksilberclilorjodid. Ber. Chem. Ges., Bd. 12, S. 1187, 1879. Die vollständige Analyse eines 248tüniligcn Urins. 287 Indikator im Glaskölltclien zunächst gelb wird und schliflllicli schmil/t. Dieses Stadium sollte in ungefiihr IT) Minuten erreicht werden, und zwar so, daß die Mischung dann noch sauer reagiert. Von diesem Punkte an handelt es sich nur noch um die Art und AVeise des Erhitzens, damit — während ein und einer halhen Stunde laut; — kein Wasser mehr entweicht und die noch vorhandene Salzsäure zurück- bleibt. Ein gewöhnlicher Kühler wird natürlich am besten diesem Zwecke dienen. Wenn ein solcher Kühler benutzt wird, ist es vorteilhaft, das Er- hitzen vorher einige Minuten länger fortzusetzen, damit das Wasser ent- weicht, welches im oberen Teil des Kjeldahlkolbens zurückgelilieben ist. Ehe man die Verbindung mit dem Kühler herstelllt, fügt man noch zwei oder drei Tropfen konzentrierter Salzsäure zu. An Stelle eines gewöhnlichen Kühlers kann man sich eines Keagenz- rohres von 20 cm Länge, das mit kaltem Wasser gefüllt ist, bedienen. Indem man dieses Reagenzglas am Halse des Kolbens mittelst eines Korkes befestigt, so daß eine Hälfte davon sich außerhalb des Halses des Kjeldahlkolbens befindet, kann man die Operation ohne Mühe beenden, vorausgesetzt, daß die Flamme so reguliert wird, daß die Mischung nicht zu stark siedet. Sollte das Produkt in dem Kolben rot werden, so müßte mnn tropfenweise Salzsäure hinzufügen, bis die Lösung wieder gelb ist. Nach Verlauf von anderthall) Stunden wird das Erhitzen unterbrochen und der Kolben etwas abgekühlt. Hiernach ^Yerden 350 — 400 cni^ Wasser (am besten heißes Wasser) und L5 — 20 cm^ lOVoigt'i' Natronlauge zuge- fügt. Nachdem darauf das Ammoniak überdestilliert worden ist , wird ge- kocht, dann abgekühlt und titriert. Die Destillation sollte mindestens eine Stunde unterhalten werden, da das Ammoniak selten in kürzerer Zeit völlig übergetrieben wird. Die erhaltene Menge des Harnstoffstickstoffs sollte zunächst in Prozent des gesamten Stickstoffs ausgerechnet werden. Wenn die 24stün- dige Menge des Gesamtstickstoffs mehr als 12 (j beträgt, sollte der Prozent- gehalt des Harnstoffstickstoffs nicht weniger als 87Vo betragen. Wenn der Stickstoff viel mehr als 12 (j ausmacht, sollte der Prozentgehalt desselben als Harnstoff noch höher sein. Andrerseits, wenn der Gesamtstickstoff sehr niedrig ist (4 — 7 (/), kann der Prozentsatz des Harnstoffstickstoffs bis auf GO"/o oder weniger sinken. ^) Gesanitstickstoff. Vgl. Bd. III dieses Werkes, S. 2:10. Kreatin und Kreatinin. \'ul. Dd. HI dieses Werkes, 2, S. 7S7. ') 0. FoHh, Approximativ complote analyses of tliirty , normal' nrines. Amoricaa Journal of Physiology. Vol. 13, S. CC, l'.IUö. 288 Otto Fol in. Harnsäure. (Vgl. Fol ins xMethode: Dieses Handbuch, Bd. III, 2, S. 889.) Die Harnsäurebestimniuno- sollte an dem Tage beginnen, an dem der Harn gesammelt ist. Wenn aber einmal mit Ammoniumsulfat und Ammoniak beiseite gesetzt ist, schadet es nicht, wenn die Bestimmung erst nach einigen Tagen beendet wird. Zweitägiges Stehenlassen ist übrigens empfehlenswert. Wenn mehrere aufeinanderfolgende 24stiindige Harn- mengen zu analysieren sind, kann der letzte Teil der Bestimmung, das ist die Ultration und Titration, vorteilhaft verschoben werdeu, bis wenigstens fünf oder sechs Bestimmungen zusammen vorgenommen werdeu können. Purinbasen. Die beste zu Gebote stehende Methode für die Bestimmung der Purinbasen im Urin ist wahrscheinlich diejenige von Krüger und Schuld (Bd. III, 2, S. 886). Selbst diese Methode ist aber nicht so zuverlässig, wie es wünschenswert wlire. Ein befriedigender Beweis dafür, daß die Stickstoffkolloide des Harns nicht zum Teil als Purinbasen bestimmt werden, ist noch nicht geliefert worden. Es ist auch möglich, daß unter Umständen die Summe der Harnsäure und der Purinbasen, die durch diese Methode erhalten wird, geringer ist als der W^ert, welcher sich für die Harnsäure allein nach der oben angegebenen Ammoniumsulfatmethode ergibt. Da ferner die Bestimmung mehr als ein Viertel der gesamten 24stündigen Urinmenge verlangt, paßt diese Methode nicht sehr gut in den Plan der vollständigen Harnanalyse, den wir in diesem Kapitel verfolgen. Weitere Modifikationen der Methode zwecks einer allgemeineren Anwendung sind sehr nötig. Anorganische Sulfate, ätherische Sulfate und „neutraler" Schwefel. Bei der Bestimmung der Sulfate im Urin werden die zuverlässigsten Resultate erhalten, wenn man die anorganischen Sulfate direkt nach der i^o^mschen Methode ermittelt (Bd. III, 2, S. 799). Die gesamten Sulfate sind vielleicht am leichtesten zu bestimmen nach der zweiten FoUn^ohQYi Methode, welche in demselben Band (S. 799) beschrieben ist. Die Sal- kouskische Methode (S. 797) ist auch gebrauchsfähig, aber es sollten bei Anwendung dieser Methode folgende Vorsichtsmaßregeln beobachtet w^erden: Erstens ist es besser, den Urin nicht auf dem Wasserbade zu erhitzen, ehe man vom Baryumsulfat abfiltriert ; zweitens ist es nicht ratsam, das Baryum Sulfat feucht mit Alkohol zu waschen, da sonst etwas von dem Niederschlag durch das Filter geht; drittens sollten immer Gooch-Tiegel für Sulfatbestimmungen benutzt werden, und viertens geben 25 cm^ Urin ebenso genaue Resultate für Sulfate als 100 cm^ Die vollständige Aualyse eines 24stnndigeii Urins. o^f) Die Men^e der Totalsulfato iiiiiiiis derjeiiii,^en der aiiorf^anischen Sul- fate ergibt die ätherischen Sulfate. Der Oesanitschwefel niiiiiis desjenigen der (iesanitsulfate izua . 4>qi man noch mit otwas riiosphorsiUire (1 — 8 cm^), diimit siclior ein t^oriiiL"!- Überschuß an Säure vorhanden ist. An der wurmen liösun;,»- füj?t man huu- sam unt(M- Umrühren ungefalir 100 cm^ Alkohol hiii/u. kühlt einige Minuti-u lang unter tlieliendem Wasser und filtriert dann dnrch einen Üüchner- trichter ab. Man wäscht nun mit Alkohol 4- oder ömal nach und trocknet zwischen Filtrierpapier. Ausbeute 110—120^. Das so erhaltene kristalli- nische Salz ist reines Kilo ro^ und enthält kein Kristallwasser. I)ie daraus bereiteten Standard-l'hosphatlösungen bleiben fast unbeschränkt unverändert. Eine Lösung, welche 2 mg Phosphor (P) auf 1 cm^ enth.dt. wird ge- wonnen, indem man 8-78^ KH2PO4 in Wasser löst und dann zum Liter auffüllt. Die Standard-Uranlüsung wird am besten aus reinem l'ranazetat dargestellt. Mau löse 30 g in ungefähr 1 / Wasser, füge öO cm^ Eis- essig hinzu und lasse die Lösung einige Tage lang stehen, so daß sich die ungelöste Substanz zu Boden setzt. Man ziehe nun die klare, oben auf- schwimmende Lösung so vollständig wie möglich ab. Diese Lösung muli jetzt so eingestellt werden, daß 25 cm^ der.selben genau gleich 2örw<3 der obigen Phosphatlösung entsprechen, so daß 1 cm^ 2 nifj/ P entspricht. I )ie erforderliche Titration wird, wie folgt, ausgeführt: Man mißt 2ö cm^ Phosphatlösung in einen 200 cw^-Erlenmeyerkolben und setzt 25 cni^ einer Lösung hinzu, welche ungefähr 6^ Natriumchlorid, 4 f/ Kaliumchlorid. lg x\mmoniumchlorid und 10g Natriumazetat pro Liter enthält. Nun wird die verdünnte Phosphatlösung zum Sieden erhitzt und während sie noch heiß ist, in die Uranlösung aus einer Püirette zufließen gelassen, bis zwei Tropfen der heißen Mischung, die man mittelst eines in eine Spitze ausgezogenen Glasrohres entnommen hat, auf einer Porzellanplatte mit ein wenig pulverisiertem Ferrocyankalium eine schwache, aber deutlich rötliche Farbe hervorrufen. I'nter Zugrundelegung der Titrationswerte wird die Uranlösung verdünnt, so daß sie genau der Phosphatlösung entspricht. Zur Bestimmung der Phosphate im Urin mißt man 50 cm^ in einen Erlenmeyerkolben, erhitzt zum Sieden und titriert wie vorher bei der Phosphatlösung, d. h. bis zwei Tropfen der Mischung mit etwas pulveri- siertem Ferrocyankalium die Anwesenheit einer Spur unverbrauchten Uran- azetates anzeigen. Wenn bereits zuviel Uranazetat vorhanden ist, kann die Titration noch so durchgeführt werden, daß man 2 r//r' der Standard- Phosphatlösung zufügt und nach dem Erhitzen bis zum Sieden wieder mit der Uranlösung titriert. Chlor. Volhardsche Methode. Diese ausgezeichnete und genaue, allgemein gebräuchliche Methode ist jeder anderen für die Bestimmung des Chlors im Urin überlegen. Erforderliche Lösungen: 1. "^-Silbernitrat (K*)'.)*»^ im Liter). 19» ö 292 Otto Fol in. 2. ^-x\mmoniiimthiocyanat. Es werden 8 — 9(/ des reinen Salzes in 1000 — llOOcms Wasser gelöst. Diese Lösung wird dann unter Zuhilfe- nahme der Titration mit der Silbernitratlösung und durch Hinzufügen der erforderlichen Menge Wasser zehntelnormal gemacht. '6. Eisenalaun (gesättigte Lösung). 4. Salpetersäure (1 Teil konzentrierter HNO3 und 3 Teile Wasser). Mau muß aufkochen, um die Stickstoffoxyde zu entfernen und dann vor Licht geschützt aufbewahren. Die Titration wird, wie folgt, ausgeführt: Man mißt 10 cm^ Urin in einen 100 cy>^ 3. Stöpselkolben (Glas) und fügt 20 — 30 cm 3 Wasser, 20 cw^^ Salpetersäure, 2 cm» Alaunlösung und 20 a» 3 Silbernitratlösung in genannter Reihenfolge hinzu. Man schüttelt nun ein wenig, damit sich der Chlorsilberniederschlag zusammenballt. Jetzt füllt man den Meßkolben bis zur Marke mit Wasser. Dann wird zuge- stöpselt, und der Kolben einige Male umgedreht, damit sich die Flüssigkeit vollständig mischt. Man gießt darauf durch ein trockenes Filter und ent- nimmt mit einer Pipette 50 cni^ für die Titration. Der Überschuß des Silbernitrates wird mit der ^-Thiocyanatlösung titriert. Der Endpunkt, eine rötliche Färbung, ist sehr scharf. Dieses Verfahren schließt eine kleine üngenauigkeit ein wegen des Volumens, welches der Chlorsilberniederschlag in dem Meßkolben ein- nimmt, aber sie ist so gering, daß sie vernachlässigt werden kann. Anstatt den Überschuß des Silbernitrates in einer filtrierten Portion der Mischung zu titrieren, kann man auch das Ganze in Gegenwart des Silberchlorids titrieren. Dieses Verfahren erfordert keinen Meßkolben und erspart auch die Filtration. Diese vereinfachte Methode ist aber weniger genau und gibt Werte, welche 1 — 5Vo zu niedrig sind. Natrium und Kalium. Lehmann, Bunge, Salkowski, Munk und Neumann haben Zusatz verschiedener Reagenzien zum Urin empfohlen, ehe Verdampfung und Oxydation, die für die Bestimmung des Natriums und Kahums erforder- lich sind, vorgenommen werden. Das einfache Verfahren, den Urin zu ver- dampfen und zu veraschen ohne irgend einen Zusatz, ergibt aber auch durchaus befriedigende Resultate. Man verdampfe 50 cm^ Urin in einer Platinschale (von ungefähr 250 cw?3 Inhalt) zur Trockene , erhitze den Rückstand eine Stunde lang, anfangs sehr vorsichtig, bis zur schwachen Rotglut über einem Radialbrenner (wie es bei der Mineralazidität-Bestimmung beschrieben ist, vgl. S. 284). Man kühlt nun ab, setzt 20 c/h^ Wasser hinzu, verdunstet und erhitzt wieder eine Stunde lang über dem Radialbrenner bis zur schwachen Rotglut. Es bleibt dann nur eine geringe Menge Kohle zurück. Jetzt löse man die Salze in heißem Wasser und einigen Tropfen Salzsäure. Dann füge man einen Überschuß von gesättigter Baryumhydratlösung hinzu und erhitze Die vollständige Analyse eines 24standifreM Urins. - der Eiweil)al)bau- produkte im Harn. Von P. Koiia, Berlin. Bestimmung des Gesamtstickstoffs. Bestimmung- nach Kjeldahl vgl. Band I, S. ;540. Nach Untersuchungen von C. C.Erdmann^) können stick.stoffhaltige Verbindungen, die die Gruppen ^N.CH.,, — NH.CH;, oder ^rNfCM^ij enthalten, bei der Digestion mit HaSO^ nach Kjehhihl Mono-, l»i- oder Trimethvlamin liefern. Die Bestimmung von Alkvlamin neben Ammoniak läßt sich in der Weise bewirken, dal'i man nach dem Aufschlull mit H. So, und Katalysator zunächst die Gesamt-X-Meuüe durch Titration des in — n- >" Kl Säure überdestillierten Gemisches mit —-n-Na 011 ermittelt. Dann fügt man zu der neutralen Flüssigkeit 5^10 c;//^ einer Mischung von i'O" oiger NaOll und 30"/oiger Sodalösung hinzu, füllt l)is zur Marke auf •_';">() oder .")(>(» »w^ auf, fügt für jeden Kubikzentimeter ttt-u-NH:; 0-1 y gelbes HgO hinzn. schüttelt eine Stunde bei Lichtabschluli, liißt \-l Stunden lang absitzen, filtriert durch Watte und bestimmt in 200 oder i^')!) (W^ des Filtrates das Alkvlamin durch Destillation und Titration. Die Menge (V'^^ dnrch IlgO absorbierten Ammoniaks ergibt sich aus der Differenz. Bei der Bestimmung des Stickstoffs nach KjildnJil in fetten Sub- stanzen empfiehlt J. A. Broun-), um das lästige Schäumen zu vermeiden, die Substanz nach der Behandlung mit H.^SO^ auf 100 cm ^ mit Wasser zu verdünnen, auf -iOciH^ einzudampfen und dann mit Alkab /ii destilbereii. C.Beger'^) empfiehlt den AufsclduÜ von fettreicher .Milch in einem langhalsigen Bundkoll)en mit 30 c/»^ Phosphorschwefelsiiure und einem Tropfen Hg vorzunehmen. Den Hals des Kolbens und einen Teil des I\oi- *) C. C. Erdmann, Ül)er Alkylamiiio ;ils Tioduktp der A7< /'/«/»/-Boliainllimir. Joiii-n. Biolog. Chem. 8. 41 (1910); Chem. Zcntralbl. 1'.»1U. II. 7(50. Vgl. auch Joiirii. Biol. Chora. 9. 85 (1911). -) J. Ä. Broun, Notiz über die Hostimimiiiir dos X nach KUI'lahl in f<'ttrn Sub- stanzen. Chem. News. 102. 51 (1910). •') C. Beyer, Aus der analytischen Praxis. Zeitschr. f. aualw. Lh«'niH'. 4i». iJT (1910). 96 P. Rona. benbauches umgebe man mit einem Belag von Bleiblech. Der Aufschluß- kolben steht auf einem Stativ unter einem Winkel von 45» geneigt und die Mündung rage in einen mit Blei röhren versehenen Abzug. Die KJeldahhche Methode ist wohl in ihrer ursprünglichen Form, wie auch speziell in Gw«M«?^s Modifikation (Anwendung von K2SO4) mit einem Fehler behaftet, so daß die Stickstoffwerte ein wenig zu niedrig ausfallen {R. Koefoed^). Der Grund hierfür ist, daß während der Zersetzung mit Säure durch Verdampfung oder noch wahrscheinlicher infolge Zersetzung des Ammoniumsulfats ein \'erlust an Stickstoff entsteht. Man soll, um diese Verluste zu vermeiden, die Stickstoff bestimmung womöglich nach der ursprünglich von Kjddahl angegebenen Form ausführen und die Dauer der Erwärmung (3 — 5 Stunden) nicht unnötig verlängern. Wo das von Kjeläahl angegebene Verfahren nicht genügt, wo aber die Zersetzung nach Gunning vorgenommen werden kann, soll nach Koefoed die Dauer der Erwärmung möglichst abgekürzt werden. Nach A. C. Andersen-) ist Platinchlorid als Katalysator zu verwerfen, da es erhebliche Stickstoffverluste verursacht. Bei Bestimmungen nach KJeldahl wird nach der Beschreibung von Koefoed der zu untersuchende Stoff mit 10 cm^ konzentrierter Ha SO4 und 0"2h g CuO 3 — 5 Stunden erwärmt, die Flüssigkeit mit fein gepulvertem KMn04 oxydiert und in den von Kjeldahl angegebenen Kupferkolben 3) mit ca. 2Q0 cm'^ Wasser gebracht. Mit 50 cm^ ca. 33%igei' Natronlauge wird soviel abdestilliert, daß sich in der Vorlage 100 cm^ sammeln. Bei Bestimmungen nach Kjeldahl- Gmming wird nach der im Carlsberg-Labo- ratorium geübten Weise die Substanz Y, Stunde mit 20 cm- H2SO4, ti g K2SO4 und O'ö g CuO erwärmt; dann werden noch 15^ K2SO4 hinzugefügt und die Zersetzung ohne Oxydation mit Kaliumpermanganat durchgeführt. Bei der Destillation werden 10 cni^ Natronlauge verwendet. Erfolgt der Säureaufschluß bei der Kjeldahl-^iethode in Gegenwart einer Quecksilberverlnnduug , so muß für eine Zerlegung des gebildeten Amidomerkurisulfats Hg(NH3)2 SO4 gesorgt werden, was vorteilhaft mit dem von C. Neuberg empfohlenen Natriumthiosulfat geschehen kann. Wird jedoch zu der noch schwefelsauren Flüssigkeit das Natriumthiosulfat hin- zugefügt, so kann ein Teil der flüchtigen schwefeligen Säure in die Vor- lage gelangen und so deren Säuretiter erhöhen. Um von vornherein diesem Fehler vorzubeugen, empfiehlt C. Neuberg*) neuerdings an Stelle des ^) R. Koefoed, Einige Bemerkungen über die jodometrische Säuretitrierung und ül»er KjHdahls Stickstoffbestimmung. Zeitschr. f. physiol. Chom. 69. 421 (1910). -) Ä. C. Andersen, Einige Bemerkungen über N-Bestimmung nach Kjeldalil. Skand. Arch. f. Phys. 25. 96 (1911). ^) tiber den Einfluß des Glases bei dem AjeZc?aÄ?-Verfahren vgl. E. Jalowetz, Wocbenschr. f. Brauerei. 21. 393 (1904). — //. T.liroini, Ebenda. 21. 165 (1904). — K. Bartelf und IL Schönewuld, Ebenda. 21. 523 und 793 (1904). *) C. Nctibery, Zur Ausführung der Ä7cW«/»?-Bestimmung. Biochem. Zeitschr. 24. 435 (1910). Nachweis und Bestimmung der Eiwoißaldiauprndukf.' im Harn. 297 Natriunithiosiilfats das gleichfalls festeKaliinnxantho^'i'iiat (C,Hi( ».('SSKi anzinveruien, und zwar etwa 10 .9 für 0'4 r/ HfjO. Das xaiitli(j<,M'nsaun. Kaliiiin liefert selbst bei saurer Reaktion niehts ins Destillat, was den Titer verändert. In alkalischer Lösung- zerlegt es das Aniidoiiicrkurisulfat glatt wie Alkalisulfid. Die von Kjeldahl ausgearbeitete jodometrische Säuretitrierung wird im Carlsberg-Laboratorium folgendermaßen ausgeführt'): Das Titrieren wird immer in dem.selben Flüssigkeitsvolumen (lüO cm^) vorgenommen, und zwar so, dal) man bei der Ammoniakdestillation so viel in die in einem Erlenmeyerkolben vorgelegte Säure {ih cm-^ ca. —-n-HaSOj) überdestilliert, daß die totale Flüssigkeitsmenge KJOr///^' beträgt: wird Destillation nicht vorgenommen, so wird mit ausgekochtem, destilliertem Wasser bis 100 rw/s aufgefüllt. Man gibt dann 10 c^x^ öo/^iggi^ j^^j^limi^jodidiösung, 2n//3 2"„igor Stärkelösung (mit NaCl gesättigt) und endlich 2cm^ 47oiger Kaliumjodat- lösung und beendet das Titrieren immer biimen derselben Zeit. Zweck- mäßig verwendet man, um die genaue Zeit zu bestimmen, ein Minntenglas für zwei Minuten, welches gleichzeitig mit dem Kalium jodatzusatz in l!e- trieb gesetzt wird; im Anfang kann die Thiosulfatlüsung ziemlich schnell in den Kolben laufen, wenn man durch Schütteln für gute .Mischung sorgt; wenn aber die Farbe rein dunkelblau geworden ist, setzt man nur tropfen- weise zu. Es ist unnötig, die genaue Stärke der verwendeten ca. — -n-Säure zu kennen, dagegen muß die Stärke der Thiosulfatlösung mit möglichst großer Genauigkeit bestimmt werden. Als l'rtitersubstanz verwemlet man mit großem Vorteil Natriumoxalat (S. P. L. Sörensen). Eine abgewogene Menge dieses im Vakuum über H2 SO4 getrockneten Salzes wird nach Sörensen über eine Spiritusflasche dekomponiert, in eine bestimmte Säure- menge aufgelöst und die Kohlensäure durch Kochen verjagt. Der Minder- verbrauch an Thiosulfat, den das in dieser Weise teilweise gesättigte \'o- lumen Säure gegen den Thiosulfatverbrauch derselben Sänremenge zeigt, gibt den Titer der 'J'hiosulfatlösung. Verwendet man ayNa.^C'sO* und beträgt der Minderverbrauch i) cm'^ Thiosulfatlösung, so ist diese 100 X 28-02 X a normal 134-00 X b ■ "14-01 ' Nach Lunge kann man auch wasserfreies Natriumkarbonat verwen- den. Eine abgewogene Menge entwässertes Salz wird zur teilweisen Sätti- gung einer bestimmten Säuremenge benutzt; wenn man ayNa, CO, ver- wendet und der Minderverbrauch an Thiosulfat l)f^//' beträgt, so wird die Thiosulfatlüsung 100 X 28-02 X a normal iÖiv[>Ö~x'b • 14-01 ■ Was den bei der azidimetrischen Titrierung angewandten Indikator betrifft, so bestätigt de Jäger die gute Anwendbarkeit des von Spaeth •) Vgl. /.'. Koefoed, 1. c. 298 P. Rona. Fig. 89. empfohlenen Luteols (0-2o/oige alkoholische Lösung. Zu 50 cm^ Flüssigkeit setzt man 4 — 5 Tropfen). Hat man den Ammoniakgehalt durch Sättigung der überschüssigen Hg SO4 bestimmt unter Anwendung von Luteol, so kann man nach Zusatz von Phenolphtalein , das auch sofort zugesetzt werden kann, den Gehalt an Am- moniak auch noch nach der Formolmethode be- stimmen. 1) A. W. Bosworth und W. Eissing-) em- pfehlen die Titration mit Vi4-04 n-Lauge vorzu- nehmen. Einem Kubikzentimeter Lauge entsprechen 1 mg N ; die Berechnung wird daher sehr ver- einfacht. Hinsichtlich der Appai^atur sind verschiedene Vorschläge gemacht worden. 3) Einen praktischen Destillationsaufsatz zur Ammoniakbestimmung em- pfiehlt A. Berthold *) (vgl. Fig. 89). Die Lauge wird dabei in den Laugentrichter eingefüllt und durch geringes Anheben des Schluß- stiftes nur so viel Lauge in den Kolben gelassen, daß noch ein Flüssigkeitsverschluß bestehen bleibt. Zur Bestimmung des X in Substanzen, die den Stickstoff in Form von Nitraten, Nitriten, Nitro-, Nitroso-, Azo-, Diazo-, Hydrazin-, Zyan-Ver- bindungen enthalten, verfährt man nach den S. 356 (Band I) beschrie- benen Verfahren. Als Ergänzung mögen noch folgende Methoden hier erwähnt werden: Zur Bestimmung des Stickstoffs in Phenylhydrazin, Hydrazonen und Osazonen verfährt J. Milhauer wie folgt. ■^) 0*2 g Substanz werden in einem Kolben in 50 011^ Wasser gelöst, mit ?>g in l^/oiger Schwefelsäure gewaschenem Zinkpulver versetzt und hierauf werden durch einen Glastrichter langsam 50 fw^ konzentrierter Schwefelsäure zugegeben. Die Flüssigkeit wird vorsichtig auf dem Drahtnetze erhitzt, so daß eine zu heftige Wasserstoffent^^^cklung vermieden wird. Nach been- deter Reduktion wird ein Tropfen Quecksilber hinzugegeben und bis zur vollständigen Entfärbung zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen der Flüssigkeit auf 100« werden 2 g Kaliumpersulfat hinzugesetzt: darauf wird weiter erhitzt, nach etwa V, Stunde, wenn die Flüssigkeit vollkommen klar ^) L. de Jager, Über Luteol. Zeitschr. f. physiol. Chem. 67. 115 (1910). ^) A. W. Bosicorth und W. Eissing, Eine Bürette und Xormallösungen für die N-Bestimmung nach Kjeldahl. Zeitschr. f. analyt. Chem. 42. 711 (1903). ^) Vgl. hierzu auch „Ammoniak". — Einen neuen Aufsatz zur Ammoniakdestil- lation beschreiben Hciibner und Wiegner. Journ. f. Landw. 57. 385 (1910). *) A. Berthold, Neuer Destillationsaufsatz zur Ammoniakbestimmung. Chem.-Ztff. 33. 1292 (1910). *) J. Milhauer, Über die quantitative Bestimmung des N in Hydrazonen und Osazonen nach Kjeldahl. Zeitschr. f. analyt. Chem. 42. 725 (1903). Nachweis und Bestimmung der Eiweißaliltaupmdukte im Harn. 900 geworden ist, wird das gebildete Ammoniak wie heim KjclduhUchcn Ver- fahren bestimmt. Die Bestimmung des Stickstoffes in Nitraten, Nitro- iiiid Nititj.-o- verbindungen ist nach .1/. Kriü/cr folgendermaßen auszuführen: 0"1 — 0"3 // Substanz werden in einem Uundkolben mit etwa 20 «m^ Wasser oder bei in Wasser schwer löslichen Körpern mit 2U cin^ Alkohol, darauf mit 10 ciu^ /inkchlorürlösung und \\) (/ /innschwamm versetzt. Alsdann erwärmt man über kleiner Flamme bis zur vollständigen Entfiir- ])ung des Gemisches und bis zur Lösung des Zinns. Ist diese erfolgt, so fügt man vorsichtig nach dem Erkalten der Flüssigkeit und. wenn .Mkohol angewendet war, nach seiner \'erdunstung 20 n» ' konzentrierter Schwefel- säure hinzu, dampft bis zur Entwicklung reichlicher Schwefelsäuredämpfe ein und verbrennt weiter wie beim Kjeldahhchen \'erfahren. Die Reduktion von Nitrat-N zum Ammoniak-N vollzieht sich sehr glatt, wenn man als Reduktionsmittel Aluminiumschnitzel verwendet, vor allem in Gegenwart von Quecksilber als Katalysator. Man bringt die i)e- treffende Substanz in einen Destillationskolben, setzt 5 — 6/7 Aluminium und 2 ciit^ einer gesättigten HgCL-Lösung, darauf 150 — 200 Wasser zu. läßt nach beendigter Reaktion Lauge zu und fängt das Ammoniak in der mit der n-Säure beschickten Vorlage auf. Gegen Ende der Destillation zer- stört man die eventuell gebildete geringe Menge Merkuriammoniumverbin- dung durch einige Kubikzentimeter Natriumhypophos[)hitlösung. 1 rm^ n-Säure entspricht 0'085 mittelst der Fonnol- methode durchführen. Man wird allerdings kaum in die Lage kommen, die ohnehin einfache Al)destilIation des Ammoniaks durch eine andereMethode zu ersetzen. F. Rona und Ii. Ottenhcrg-) geben hierzu folgende Vorschrift: b cm'^ Harn werden mit \0 cm^ konzentrierter Schwefelsäure und 5 — 8 Tropfen einer P oigen Platinchloridlösung als Katalysator aufge- schlossen 3) . mit ca. 100 nw'^ destiUiertem Wasser (luantitativ in einem ') Pozzi-Escot, Reduktion der Salpetersäure zur Stufe des Anunoniakstiekstnffs und ein neues Verfahren zur Bestinmuuii: der Nitrate. Ann. (hini. anal. appl. 14. 445 (1910); C. r. Acad. sc. 149. 1380 (1910). — Vgl. auch Sa/h; Allgemciuc Moth<.de zur Bestinimunsf des Nitratstickstoffs. Ann. Cliim. analyt. appl. 15. lO:? (lOKt). — Ferner E. Cahoi, The Analyst. 35. 307. — C. Frahof, Ann. Chini. anal. appl. 15. 219. — Vor- züglich geeignet zur Reduktion zu Ammoniak in alkalischer Lösung ist die Dcrardaschc Legierung, die aus 50 Teilen Kupfer, 5 Teilen Zink und 45 Teilen .Muniinium besteht. Noch energischer wirkt eine Legierung, die aus 59" 0 AI, 397,, ^'" "'"• -"/o -i^» hesteht. Vgl. Zeitschr. f. analvt. Ciieni. 33. 11:5; 3«. 50. — Bezüglich des Verfahrens der Stirk- stoffbestimmung in Bodenauszügen von /•;. A. Mitsein rficli vgl. 77». Zeller, Lantlw. Ver- suchsstation. 71. 4:^7 (1910). Drusch. (Iieni.-Zti:. 33. 1249 (1910). — l'niktische Be- merkungen über die A/V /(/«/(/-Methode findet man noch C. //. J»ius, .Tourn. of Iiul. .ind Engin. Chem. 2. 546 uiid /'. L. Hihhanl, Ebenda. 4G3 (1910). '-) r. Roua und I\. Ottinhcrfi, Zur Methodik der Stickstoffbestiuimung im ll.un. Biociiem. Zeitschr. 24. 354 (1910). ^) Vgl. hierzu jedoch A. C. Andersen, 1. c. S. 29G. 300 P. Rona. ca. dbOcm-^ fassenden Erlenmeyerkolben gespült, mit 6—7 Tropfen einer Lackmuslösung (Lackmus von Kuhel-Tiemann , von Kahlhaum bezogen) versetzt, ca. 20 crn^ SSVoige Na OH hinzugefügt, dann an der Wasserleitung abgekühlt und nach dem Erkalten der Flüssigkeit weiter 33o/oige Natronlauge zuerst kubikzentimeterweise, dann, wenn die blaue Farbe nicht mehr so schnell verschwindet (wenn nötig, unter Kühlung) tropfenweise hinzuge- geben, bis die Farbe eben blau geworden ist. Dann macht man die Flüssigkeit mit -J-Säure wieder schwach sauer oder neutral und fügt nun 5 wieder bis zur deutlich blauen Farbe -^-Lauge hinzu. Dann wird tropfen- weise ^-Säure hinzugefügt, bis eben die erste deutliche x\bweichung nach dem Violett auftritt, l^m diesen Punkt deutlich zu erkennen, muß man eine Vergleichslösung von rein blauer Farbe benutzen, die folgendermaßen hergestellt wird: 150 c»?^ destilliertes Wasser werden mit 1 cm^ —-Natron- lauge und 10 Tropfen Lackmus versetzt. Bei der Verwendung dieser Lö- sung ist der Umschlag stets mit Leichtigkeit erkennbar. Nun fügt man zu der so neutralisierten Lösung 30 cm^ Formaldehyd, das vorher unter Anwendung von Phenolphtalein gerade bis zur beginnenden llosafärbung neutralisiert worden ist, titriert mit —Lauge, fügt noch, sobald die Farbe beginnt blau zu werden, 1 cm^ einer V2Voigen alkohoUschen Phenolphtalein- lösung hinzu und titriert weiter bis zum ersten Auftreten der violetten Farbe, die als Mischfarbe von Lackmus und Phenolphtalein entsteht. Die Anzahl der verbrauchten Kubikzentimeter Na OH gibt direkt die entspre- chende NH3- bzw. Stickstoffmenge an. Die ganze Prozedur des Titrierens nimmt etwa 10 Minuten in Anspruch. Die Methode läßt die Phosphate des Harnes unberücksichtigt. — Nach der Vorschrift von de Jager ^) werden diese aus dem Harn zuerst entfernt. 40 cm^ Harn, 5 (/Natrium azetat werden mit lO^/oiger Eisenchlorid- lösung bis zur rotbraunen Färbung versetzt, auf 50 cm^ mit Wasser auf- gefüllt, durchgeschüttelt, die Flüssigkeit annähernd gewogen und nach dem Kochen bis zur völligen Ausflockung das verdampfte Wasser auf der Wage ersetzt. 10 cm^ Filtrat (=8cw?3 Harn) w'erden wie üblich unter Zugabe von Kupfersulfat und Kaliumsulfat mit 5 cm^ konzentrierter H2SO4 zerstört. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser verdünnt und mit 10 cm^ lO^/oiger Natriumsulfidlösung zur Abscheidung des Kupfers so lange gekocht, bis der gesamte Schwefelwasserstoff entfernt ist. Hierauf wird auf 100 cm^ mit Wasser verdünnt und 50 cm^ Filtrat unter Anwendung von Phenolphtalein neutralisiert. Man macht zuerst schwach alkalisch und setzt dann tropfenweise —-n- Säure bis zur Entfärbung und — -n-Lauge bis zum ersten schwachen Rot zu. Nach ^) de Javier, Die Formoltitration zur Bestimmung des Gesamtstickstoffs. Zeitschr. f. physiol. Chem. 67. 1 (1910). Nachweis und Bcstiinimintr der Eiwpißahbatiproduktf im Harn. oUl Zugabe von 6 cm* neutralisiertem Fornialdehyd wird wieder bis zun» ersten schwachen Rot mit Lau^e titriert. Die jetzt verbrauchten Kubikzentimeter Lauge geben die Ammoniakmenge direkt in T^-n-lviii)ikzentimeter. ._./■ Bestimmung des Kohlenstoffs organischer Substanzen auf nassem Wege. (Vgl. Band I, S.351I.) Als Nachtrag zu den im ersten P>and beschriebenen \ erfahren sei die Methode, wie sie in der tierphvsiologischen Versuchsstation in Buda- pest (Fr. Tamjl) angewendet wird , genau be- schrieben, i) Der aus Jenenser Glas geblasene, gut ge- kühlte Aufschließkolben (Fig. 90) ist ganz glatt, hat keinen angeschmolzenen Ansatz. Im Kolben- hals ist eine Schliff stelle, die ein luftdichtes p]in- setzen des Kühlers ermöglicht. Zur Sicherung der Dichtung ist der obere Rand des Kolbens umge- krämpt, wodurch um den Kühler eine kreis- förmige Rinne gebildet wird, die man mit einigen Tropfen konzentrierter HaSO^ anfüllt. In den Kolben paßt luftdicht ein Kühleinsatz, der, wie die Figur zeigt, bis zur kugelförmigen Erweiterung des Kolbens herabreicht und silmt- liche Ansätze trägt. Die Ansätze a und }> dienen zum Zu- und Ableiten des strömenden Kühlwassers. Die mittlere Röhre (c), die bis 10 bis 12 mm über den Boden des Kolbens reicht, setzt sich nach oben in eine kugelförmige Erweiterung fort, die in Längsschnitt in Fig. UO abgebildet ist. Der seit- liche Ansatz rr/) dient zur Zuleitung der COj-freien Luft während der Verbrennung, die Schliffstelle im Halse (ej zum luftdichten Einsetzen des Glas- stöpseis (f)\ in den Trichter (g) wird die nötige Menge Ho SO4 gegossen und durch leichtes Lüften des Glasstöpsels (f) in kleinen Portionen in den Kolben gelassen. Die überschüssige HoSO^, die im Trichter bleibt, dient zur Dichtung. Durch den Kühler geht auch die llöhre ilü. die seitlich miten ') Fr. 7'anf/l und (i. i\ Kcresz/i/, Zur MctliodiU dor Bi'stiiuniuu;: des Kolilciist«>ffs organischer Sulistauzeu auf nassem Wege. Bioeliem. Zeitsclir. 32. 2t)ü (lUll). Herr Prof. laiiffl hatte die Güte gehaht, das Manuskript dieser Mitteilung für die „Arbeitsn zur Verfiiguni: zu stellen, wofiir ihm aucli an dieser Stelle gedankt sei. Die i. Beschreibung ist ein wörtlicher Alulruck der wesentlichen Teile dos Manuskrii • 302 P. Rona. mündet und oben in einen Ansatz (h) ausläuft. Sie dient zum Ableiten der durch d — c zugeleiteten Luft. Der PFw^^sche Kühler ist nur insofern mo- difiziert, als die Röhre (h) in den Kühler versetzt wurde, wodurch die chromhaltigen, flüchtigen Produkte besser zurückgehalten werden. Die Zusammenstellung des ganzen Apparates zeigt Fig. 91. Die mit 25Voi&er KOH-Lösung gefüllte \Yaschf lasche (1) und der Natronkalkturm (2) reinigen die in den Apparat gesaugte Luft von CO2, die H2SU4 in der AVaschflasche (^5^ entwässert sie. Der Auf schließkolben (^^^ ist an einem Stativ über einen mit einer Asbestplatte bedeckten Dreifuß befestigt; unter dem Dreifuß befindet sich ein Bunsenbrenner, der in der Zeichnung nicht abgebildet ist. Die Waschflasche (5) enthält wenig kon- zentrierte H2SO4. Dann folgt ein Verbrennungsrohr in einem Verbrennungs- ofen, wie es zu Elementaranalysen verwendet wird. Die Verbrenn nngsröhre ist nur in einer Länge von 30 — 40 cm mit Cu(3-Asbest gefüllt. Dieser Fig. 91. Wasser -i:::T Lz/Ti A VerbrennuJiffS- d o/en Petten?[o/fer 'sehe Ai/ire Teil der Röhre ward wie bei der Elementaranalyse bis zum Glühen des CuO angeheizt. Hinter der angeheizten Strecke folgt eine etwa 6 — 8 cm lange Strecke, die mit körnigem PbO, gefüUt ist, das sich zwischen 2 Asbest- pfropfen befindet. Dieser Teil der Röhre ist von einer mit einem Thermo- meter versehenen Metallkapsel umgeben, die von unten mit einem kleinen Bunsenbrenner angeheizt wird. (Der Verbrennungsofen ist in der Zeichnung nicht angegeben.) Tamjl benutzt einen elektrischen Ofen, doch kann natürhch ebenso gut ein mit Gasflammen geheizter verwendet werden. Neuerdings benutzt Tangl den /Ve_(7?schen i) Doppelofen, in dem 2 Verbrennungen gleichzeitig ausgeführt w^erden können. Er leistet in derselben Zusammenstellung mit derselben Röhrenfüllung, wie sie Fregl für die Elementaranalyse angibt, ausgezeichnete Dienste. Nach der Verbrennungsröhre folgt eine Waschflasche (8), die etwas mit H2SU4 angesäuertes Wasser enthält, damit die durchgesaugte Luft 1) Ber. d. doutsch. ehem. Ges. XXXVIII. II. 1905. Nachweis und Bostiramuiig der Eiweißabbaupiodukte im Harn. ;i();l mit Wasserdampf gesättigt in die liarytrölire (9) tritt. Harytröhren sind zwei hintereinander geschaltet: die erste dJj fallt :'.0() c/// ' I'.arytwasser, die zweite (lOj kleinere lOO ciu-K Letztere dient nur zui' Kontrolle und ver- mittelt die Verbindung mit der Saugieitung resj). Wasserstraldpunipt'. Die einzelnen Teile des Apparates sind mittelst m(igli«-hst knrzi-r Kautschnkschlauchstückc miteinander luftdicht vcrl Minden. Vor allem ül)erzeugt man sich davon, ob alle Teile des Apparates luft- dicht schheßen. Dann bringt man 8 — 10 .y vorher bis zum Schmelzen erhitztes Kaliumbichromat in den Aufschlielikolben , setzt den Kiihh'r ein und saugt noch vor der Einschaltung der Barytröhreu in langsamem Strom Luft durch den Apparat, um ihn vollstäudig mit C().,-freier Luft zu füllen. Gleichzeitig wird der C'uO enthaltende Teil der N'erbrennuuüsrühre bis zur Rotglut, der PbOa enthaltende Teil auf 150— ISO" C erhitzt. Nachdem der Apparat genügend durchventiliert ist (V* — V2 Stunde), werden die Barytröhren eingeschaltet und die zu verbrennende Substanz in den AufschlulJkolben gebracht. Soll eine feste Substanz verbrannt werdeu, so werden genau gewogene CT— O'of/ derselben eventuell in Stanniol gewickelt, nach Herausheben des Kühlers in den Kolben geworfen. Soll eine flüssii!;e Substanz verbrannt werden, z. B. Harn, so kann man sie mittelst einer geeichten Pipette nach Entfernung des Stöpsels durch die Röhre c in den Kolben fließen lassen. Was an der Röhrenwand haftet, wird später durch die zufließende IL SOi in den Kolben gespült. \'om Harn nimmt man ge- wöhnlich f) ciN'\ Dann wird der Stöpsel (fj eingesetzt und in den Trichter (yy die H2SO4 gegossen. Man erhitzt jedesmal die zur \'ei brennung benutzte reine konzen- trierte H.2SO4 vorher längere Zeit, damit jede Spur eventuell darin vor- handener C-haltiger Substanzen zerstört werde. Aus demselben (Jruude wird das Kalibichromat geschmolzen. Nachdem der Wasserstrom durch den Kühler in (iang gesetzt ist, setzt man mit dem Durchsaugen von Luft ein. Den Luftsti'om regelt man so, daß pro Sekunde 2 — o Bläschen durch das P>arytwasser streichen. Dann beginnt man mit der äußerst vorsichtigen Zuführung der RjSO^, indem man den Stöpsel/ sehr w'enig und langsam lüftet, so daß nur einige Tropfen HoSO^ durch die Röhre c in den Kolben fließen. Die Keaktion ist, besonders wenn kohlenhydrathaltige Substanzen verbrannt werden, eine sehr heftige, die Gasentwicklung besonders anfangs eine sehr stürmische, so daß man die H2SÜ4 nur in sehr kleinen Portionen und langsam zu- fließen lassen kann. Man bringt so allmählich die ganze, zu einer \erbren- nung nötige H.2SO4 (\:'>0 — 140 cm ^) in den Kolben. Sobakl die ganze H, SO4 im Kolben ist und die (iaseutwicklung auf- gehört hat, beginnt man mit dem vorsichtigen Erhitzen des Kolbens, das man so lange erhöht, i)is der Kolbeninhalt in leidiaftes Sieden gerät, und erhitzt so lange, bis die Zersetzung vollkommen beendet ist. Das erkennt man daran, daß die Gasentwicklung — feine Bläschenbildung — aufhört 304 P. Roua. und der Kolbeninhalt eine dunkelgrüne Färbung annimmt, was nach 2- bis 2V2Stiindigem Sieden immer eintritt. Nach Abstellen der Flamme wird noch /*' 1/2 Stunde lang Luft Fig. 92. durchgesaugt, um alle CO2 in die Barytröhren zu schaffen. Während der ganzen Zeit muß das CuO in der Verbrennungsröhre in Kotglut erhalten und sorgfältig darauf geachtet werden, daß die Tempe- ratur der PbO.. nicht über 180 — 200" C steigt. So werden einerseits die flüchtigen unvollständigen Oxydationsprodukte in der CuO-Schichte voll- ständig verbrannt und andrerseits die flüchtigen S- und Cl-haltigen Verbindungen im PbOg sicher zurückgehalten. Wird das PbOg stärker erhitzt, so gehen sehr leicht Halo- genverbindungen in das Barytwasser über und machen die C-Bestimmung unbrauchbar. \Verden die oben angegebenen Versuchsbedingungen genau eingehalten, so kann man selbst bei viel N-, Cl- und S-haltigen Substanzen im Barytwasser weder Nitrat-, noch Sulfat-, noch Cl-Ionen nachweisen. Das Titrieren des Barytwassers erfolgt dann in der be- kannten Weise. Gewöhnhchwird eine 0*06 — 0-09 n-Ba[0H]2- Lösung benutzt, die mit 005 n-HCl und Phenolphtalein als Indikator titriert wird. Hat man einen Doppelverbrennungsofen, so kann man, wie schon erwähnt, 2 Verbrennungen zu gleicher Zeit in ca. 3 Stunden ausführen. Als Ergänzung zu Band I, S. 360, sei hier der von Spiro bei den nassen Kohlenstoffbestimmungen empfohlene Aufschlußkolben noch einmal abgebildet^), da die Fig. Nr. 491 mit einem Fehler behaftet ist (Fig. 92). Ammoniak (vgl. Band HI, S. 765). Die verschiedenen Methoden der Ammoniakbestim- mung beruhen entweder auf der Austreibung des Am- moniaks im Vakuum oder durch einen Luftstrom (Folin, vgl. S. 765). Nach dem ersten Prinzip arbeiten V. Henriqties und S. P. L. Sörensen ^) folgender- maßen : Der Apparat ist nach demselben Prinzip wie der von Krüger und Beich konstruiert, nur ist der Destillationskolben mit einem Scheidetrichter versehen *) Nach Neiihauer-Hinjpert, Analj'se des Harns. 11. Aufl. S. 514. *) V.Henriques und S.P.L. Sörensen, t)ber die quantitative Bestimmung der Amino- säuren etc. durch Formoltitration. 2. Mitteilung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 64. 136 (1910). — An dieser Stelle sei erwähnt, daß E.J. Slagle neuerdings zur Aufbewahrung großer Mengen Harn für die (juantitative Analyse empfiehlt, zu je 1 ? Harn 5 «n* kon^ zentrierter HjSO^ zuzufügen und einzudampfen. Man erhält so einen festen, pulverisier- baren, in Wasser leicht löslichen Rückstand. Journ. of Biol. Chem. 8. 77 (1910). Nachweis und Bcstimuuiiig der Eiweißabbauprodukte im Harn. ;'rr, und als Kühlcapparat dient ein verzinnter Mctallkülilcr, der älter dem (Msti-n Schenkel der als Vorla.ue dienenden /VV/V/o/schen iJöhre antjebracht ist. l)i(' Vorlage, die während der Destillation nicht fickühlt wird, wird mit ca. nornialcr SehwetVlsäine beschickt und der auf dem zweiten Schenkel der /V/jr/o/scheii Ilöhre angebrachte Destillieraufsatz wird mit der tileichen Siinre i^espült. Nach- dem die zu destillierende Lösung- in den Koliien gebracht wurden ist. wird durch den Scheidetrichter eine ca. halbnormale Lösung von Bariiimhvdr- oxyd in Methylalkohol zugesetzt (bei sehr ammoniakreicher Lösinig eine gesättigte Lösnng von liariumhydroxyd in Methylalkohol), und zwar s<» viel, dal.) nach der Abdestillation des Ammoniaks die Flüssigkeit noch einen deutlichen Überschul» an Uarinmhydroxyd enthält (mindestens \Orw^). "Während der Destillation bei ca IT) nn» Druck wird der Kolben in Wasser von 40*' erwärmt und ein schwacher Strom von kohlensäiirefreier Lnl'f wird durch den Kolben geleitet. Eine einmalige Destillation genügt, wenn der Kolbeninhalt in leibhaftem Sieden gehalten und fast bis zur Trockene abdestilliert wird. Bei größeren Ammoniakmengen (z. 1!. in mit Salz.säure gekochtem Harn) ist es notwendig, den Destillationsrückstand in ein wenig' Salzsäure zu lösen und nach Zusatz vom Überschul) an methylalkoholischer Barytlösung noch einmal beinahe bis zur Trockene zu destillieren. Sollte das abgetriebene Ammoniak quantitativ bestimmt werden, so wurde das Destillat quantitativ in einen Kupferkolben für Kjeldahldestillation gespült, das Ammoniak in ül)liclier Weise abdestilliert und jodometrisch bestimmt (vgl. hierzu S. 297). Die Austreibung des Ammoniaks mittelst Luftstroms nach dem Prin- zip von FoUn benutzt Fh.A. Kobfr^): die Methode kann auch beim Kjeldahl- prozeß angewendet werden. Nach dem Säureaufschluli in üblicher \Veiso verdünnt man die erkaltete ]\Iasse mit Wasser, und zwar mit Itö cw^ bei Anwendung von 2b on^ konzentrierter H., S<)^, mit 40 n/^"' bei einer von lOcnt^. Dann läßt man auf Zimmei'temperatur abkühlen und stellt den Apparat zusammen. Die eingestellte Säure befindet sich in dem mit einem Fnlin- schen Rohr versehenen Zylinder A (Fig. UH). die zu untersuchende Lösung im Kolben B und in C so viel Natronlauge, die genügt, vs;ittii;t('r Koclisalzliisung versetzt, unter (iaiicrnileni KühnMi werden 2i)0 cm'-^ Methylalkohol /uiicfügt ; man filtriert und hcstiimnt in 100 cni'^ das Ammoniak nach Znsatz von \0 rm'-^ 2 n-Sodalösuug indem man es im Vakuum (vor dem Evakuiei-en werden einige rdmstcinstüeke zugesetzt) in zwei Vrechsehche Hascia'U mit je 2ö cm^ ^ n-ll.X), iiher- destilliert, was bei 40 — 50° 40 Minuten in Anspruch nimmt. Der Iidialt beider Vorlagen wird vereint, zur Austieibung der Kohlcusäinc einige Minuten im Sieden erhalten und mit Natronlauge mit alizariusulfosaurem Natrium als Indikator titriert. Im lUickstand wird der Harnstoff nach Folin bestimmt. Schwefel (vgl. Band III, S. 794 und dieser Band. S. 2H8). Bei schwerer oxydierbaren biologischen Produkten schlagen ('. C L. Wolf und E. Österherg -) in Anlehnung an die von bencdict angegebene Methode folgendes Verfahren vor: Man bringt die zu analysierende Sub- stanz in einen birnenförmigen, ;)()0 r;»'* fassenden Kolben mit einem langen Hals. Dazu fügt man 20 cm^ rauchende Salpetersiiure . erhitzt zuerst auf einer kleinen Flamme und läßt dann schlieblich so lange sieden, bis die Flüssigkeit frei von festen Bestandteilen ist. Das Kochen wird so lange fortgesetzt, bis keine Salpetrigsäuredämpfe mehr aufsteigen. Die so zer- setzte Substanz wird dann (piantitativ mit destilliertem Wasser in eine 150 cm'^ große l'orzellanschale oder -Tiegel mit abnehmbarem Deckel über- tragen und 20 c»r^ 7ye^?(T/i('/sche Lösung (kristallisiertes Kui)fernitrat 2<>()y. Natrium- oder Kaliumchlorat öO^/, destiUiertes Was.ser \{)00 im^) hinzu- gefügt. Man läßt die Mischung in einem Sandbade verdampfen . bis sie ganz trocken ist. Darauf wird die Schale auf freier Flamme erhitzt und die Hitze allmählich gesteigert, bis der Boden des GefälJes rotglühend ist. Auf dieser Temperatur wird sie 20 Minuten gehalten. Dann läßt man die Schale abkühlen, fügt 2b cm^ Salzsäure (1:4) hinzu und erwärmt den In- halt der Schale, bis der ganze schwarze Bodensatz in derselben aufgelöst ist. Die Lösung wird dann in einen öoo on^ grolVn Krlennieyerkolbeii übertragen, ungefähr ir)0 cmMV asser zugefügt und die Lösung 1.') Minuten lang gekocht. Dann läßt man sie abkühlen und ein paar Stunden stehen, am besten über Nacht. Zum Schluß filtriert man sie dinrh einen kleinen Trichter. Alsdann wird Bariumchlorid tropfenweise so lange zugesetzt, bis *) C. G. Wolf und Mr Kim Marriot, Bestimmung von Ammoniiik- und Harnstoff im Blut. Biochem. Zeitschr. 26. 16.0 (1910). -) C. G. L. Wolf und Kiuil ös/< rlicrg, Die «luantitativo Bestimmung von Scliwi'fel und Phosphor. Biochom. Z. 29. 429(1910). Zur Scliwofcdbestimmumr vtrl. noch: Sf'i-J" Rifson, A C(nnparison i)f the metliods for the (dimination i)f total snli)iiur in i;: The biochem. Journ. 4. 337 (1909) und Tho use of harium pero.xyd in tlie elimiuation of total sulphur in urine. Ehoiula. 4. 34.^ (1909): >'/. A'. lUiicdict , Tho dotemiination of total sulphur in urine. Journ. of liiid. Cheni. 8. 499 (.1910). 20* 308 P. Rona. kein Niederschlag mehr entsteht, einige Stunden stehen gelassen und durch einen Goochtiegel filtriert. Das schwefelsaure Barium wird mit heißem Wasser gewaschen, bis die Spülflüssigkeit bariumfrei ist. Dann wird geglüht und gewogen. Das Schäumen fetthaltiger Substanzen verhin- dert man durch Hinzufügen von 5 cin^ 5 n-Salpetersäure, wenn die Lösung zur Trockenheit vcrclampft ist. Als Nachtrag zur Bestimmung der Sulfatschwefelsäure (Band III, S. 797) sei noch die von B. v. Lengyel vorgeschlagene Fällung mittelst alkohoUscher Strontiumchloridlösung erwähnt. \) 2bcm^ des vorher filtrierten Harnes werden auf das dreifache verdünnt, mit bcm'^ verdünnter Salzsäure angesäuert, bis nahe zum Sieden erhitzt und mit 50 cw^ Strontiumchlorid- lösung (gesättigte Lösung von SrCls in 99o/nigem Alkohol: 100,9' der Lösung enthalten 0-817(7 wasserfreies SrCl^) tropfenweise gefällt. Dann werden noch \hOcm^ 95Voiger Alkohol zugefügt, der Flüssigkeitsstand markiert, einige Stunden mit aufgelegtem L'hrglas auf dem Wasserbade stehen ge- lassen, dann noch Avarm bis zur Marke aufgefüllt und in der Kälte stehen gelassen, bis der Niederschlag sich absetzt. Nach dem vollständigen Er- kalten \äv& die überstehende Lösung durch ein Filter gegossen, der Nieder- schlag dreimal dekantiert, mit Alkohol auf ein Filter gespritzt und mit wässerigem xVlkohol bis zum Verschwinden der Chlorreaktion gewaschen. Man äschert das Filter mit dem Niederschlag ein, glüht das Sr SO4 einige- mal unter Zufügen von einigen Tropfen verdünnter Hg SO4 schwach. Ist eine Reinigung des Bariumsulfatniederschlages nötig (vgl. Band III, S. 798), so verfährt man nach Briif/chiumn^) so, daß man den Nieder- schlag im Platintiegel mit ?> — 4 Troi)fen konzentrierter HCl und mit einigen Kubikzentimetern Wasser versetzt , die Klümpchen mit einem Glasstab zer- teilt und die Flüssigkeit etwa 2 Minuten lang, ohne da[i diese ins Sieden kommt, über der Flamme erwärmt. Die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit wird durch ein kleines Filter gegossen, das angegebene Ver- fahren fünfmal wiederholt. Nun erst wäscht man aus und prüft das Wasch- wasser mit H2 SO4 auf lösliches Barytsalz. Ist das Filtrat ganz oder bis auf Spuren frei von Baryt, so sammelt man den Niederschlag auf dem Filter, trocknet ihn und schüttet in einen gewogenen Platintiegel. Dieses Filter, wie auch das erste, auf dem der Barytniederschlag gesammelt wurde, verbrennt man in der Platinspirale und glüht nun die Asche mit dem Niederschlag im Tiegel. Man befeuchtet den Niederschlag mit verdünnter Schwefelsäure, verdunstet die Flüssigkeit vorsichtig, glüht den Tiegel wieder und wägt dann. 3) Nach M. J. Van't Kruijs*) kann man statt konzen- ') B. c. Lcngijel, Pßügers Archiv. 104. 514 (1904). -) G. BrügelntariH, Zeitschr. f. analyt. Chemie. 16. 22. •') In Bd. III, S. 798, 6. Zelle von oben ist der Satz : „Man dampft das in den Platintiegel etc." zu streichen. *) M. D. Van't Kruijs, Die quantitative Bestimmung von Ba SO^ neben Substanzen, welche das Resultat beeinflussen. Zeitschr. f. analyt. Chemie. 49. 393 (1910) ; vgl. auch Chem. Weekblad. 6. 73.0 (1909). Nachweis und ßestiininiiii!,' iler Eiwclüaliliaiiprixlulcto im H;ini. ,,,(F/7/e-Peptons (mit einem N-liehalt von bT2bmg in bcm'^) werden in einem Melikolben bis auf 200cm^ verdünnt, nach vorheriger genauer Neutralisierung mit Lackmuspapier. \'ou dieser Lösung werden 40 c/y/^' zur Formoltitrierung genommen, andere 40 <•//<' zur Ammoniakbestimmung. Die Formoltitrierung ergab i;>-44/>'// forniol- titrierbaren Stickstoff, die NHa-Bestimmung OSO///// N als NH,. Mithin beträgt die Menge des Aminosäure-N 1204 >//S'. A. GammeUoft '•^) in einer Mitteilung, in der auch andere Harnstoffbestimmungsmethoden kritisch beleuchtet werden, folgendes Verfahren zur Bestimmung des Harnstoffes im Harn an. In 5 cm^ Harn wird zuerst bestimmt, wieviel einer lOVoigen Phosphorwolframsäurelösung (in V/.n-HoSOi) nötig ist, um gerade eine vollständige Fällung hervorzurufen. Sodann mißt man in einem 100 (-//^ä. Kolben 10(vy«3Harn, setzt die vorher bestimmte Menge der Phosphorwolfram- säurelösung hinzu und füllt den Kollien bis zur Marke mit V2 n-H2 SO4. Die Flüssigkeit bleibt nun — nach Mischung — so lange stehen , bis der Bodensatz sich gerade gesetzt hat, und wird dann filtriert. Von dem Filtrate bringt man 2mal 10 c^^^^ jn Reagenzgläser aus Jenaglas, welche sodann — mit Zinnfolie bedeckt — IV2 Stunden bei 150» autoklaviert werden. Der Inhalt der Gläser wird nun in entsprechende Kolben gebracht *") V. Hcnriques und L. A. GammeUoft, Einige Bemerkungen über Harustoff- bestimmung im Harn. Skandin. Arch. f. Physiologie. 25. 153(1911). ^) Vgl. .s'. P. L. Sörcnscn und //. Jessen Hansen, Über die Ausführung der Formol- titrierung in stark farbigen Flüssigkeiten. Biochem. Zeitschr. 7. 407 (1908). Nachweis und Bestimmung der Eiweißaliliaiiproiliiktc im Harn. :',i ] und die Ammoniakmenge entweder durch I)iircldiiftung (nach /iisat/ von kohlensaurem Natrium) oder durch Destilhition im Vaknnm (nach Zusatz von Ilariumhvdroxvd in Methylalkohol gelöst) bestimmt. Kreatinin (vgl. I')and III, S. 788). Zur Darstellung des Kreatinins aus dem Harn geben Folln und ß/un< /: neuerdings folgende Methode an ^) : In ungefähr 8 l frischen Harns wird unter lÜUircn cinr licil'ie alko- holische Lösung, die ungefähr 125^ Pikrinsäure enthält, zugefügt, hie Mischung bleibt über Nacht, stehen, es wird dann die überstehende Flüssig- keit abgegossen, das Sediment auf der Nutsche mit verdimnter rikrinsäure und kaltem Wasser gut ausgewaschen, dann in zirka 400 cm^ lauwarmem Wasser suspendiert und zirka 60^ gepulvertes KaliundDikarbonat hinzu- gefügt. Der Kolben wird in warmes Wasser von 55 — 60*^ getaucht und sorgfältig geschwenkt, bis die Entwicklung von CO, aufhört. Die Temi)e- ratur muß dabei auf 45 — 50° gehalten werden. Beim Einspritzen von Alkohol in den Kolben hört das Schäumen auf. Sobald sich keine Kohlen- säure mehr entwickelt, wird der Kolben in kaltes Wasser gestellt und nach einigen Stunden die Ileaktionsflüssigkeit filtriert und mit 50''/oiger Essigsäure bis zur bleibenden sauren Reaktion vorsichtig angesäuert. Wenn sich keine Kohlensäure mehr entwickelt, wird die Lösung durch einen Tberschuß von alkoholischer Chlorzinklösung gefällt und so das Chlorzink- doppel.salz erhalten. Die Fällung ist gewöhnlich in 1—2 Tagen beendet. Der Niederschlag wird auf einem Duchnerfilter gesammelt und gründlich gewaschen. Durch Lösung des Chlorzinkdoppelsalzes in 10"/oigci" Schwefel- säure und Fällen der Lösung mit Azeton, Alkohol oder Äther erhält man ein neues Salz von der Formel: Kreatinin 2 SO4, ZnSOi, 8H.M>. Kreatinin- zinkalaun. das als Ausgangsmaterial für die Darstellung reinen Kreatinins dienen kann. Es wird zunächst durch Umkristallisieren aus Wasser nach Behandlung mit Tierkohle gereinigt. Zu einer 10" oigen Lösung des reinen Produktes in heißem Wasser wird die zur Bildung der Schwefelsäure be- rechnete Menge Bariumazetat in Lösung zugidugt und in die Mischung zur Fällung des Zinks Schwefelwasserstoff eingeleitet. Das Filtrat. das nur noch Kreatinin und Essigsäure enthält , wird bei 50" im \akuum zur Trockene eingedampft, der Ilückstand zur Entfernung des Restes Essig- säure mit wenig kaltem Alkohol gewaschen. Die Ausbeute an Kreatinin ist fast quantitativ. Zur Überführung trockenen Kreatins in kristallisiertes Kreatinin'-) wird das Kreatin in eine Fla.^^che mit (ilasstöp.^^el gebracht untl zugestöpselt in ein gewöhnliches irdenes Gefäß gestellt, dessen Deckel fest verschlossen ') Folin and BJanck, Tlic preparation of Creatinine from urine. Joiirii. l'iol. Chem. 8. 39ö (1910). -) O. Folin and W. Denis, Tlie propnration «f Creatinine from creatiiu«. .li>iiin. biol. Chem. 8. 399 (1910). 312 P- Rona. ist. Dieses wird in Wasser im Autoklaven auf 41/2 Atmospliüren drei Stunden lang- erhitzt, dann abgekühlt. Zur Reinigung wird es mit kaltem Alkohol gewaschen oder mit sehr wenig absolutem Alkohol gekocht. Ein neues billiges Kolorimeter, das außer zur Bestimmung von Blut- farbstoff, Eisen und Indikan auch zu der von Kreatinin nach der Folin- schen Methode geeignet ist, geben H^. Authenrieth und ,7. Koenigs- herger an. ^) An dieser Stelle sei auch darauf hingewiesen, daß bei der Angabe der nötigen Reagenzien bei der Fo/iwschen Methode in Band III, S. 787 zwei störende Druckfehler stehen gebUeben sind. Es sollen daher die erforder- lichen Reagenzien hier wieder aufgezählt werden: 1. Eine— -n-Kaliuml)ichromatlösung ( 24-54 ^ pro Liter). 2. Eine annähernd gesättigte (l-2''/oige) Pikriusäurelösung. lO^/oige Natronlauge. o i). Zur Isolierung des Kreatinins aus Suppenwürzen sowie aus ge- ringen Mengen Fleischextrakt schlägt Micko-) folgendes Verfahren vor: Eine wässerige Lösung von 10 g Liehigschem Fleischextrakt wird mit Bleiessig bei Zimmertemperatur ausgefällt, auf 1 / mit Wasser ver- dünnt, nach mehrstündigem Stehen filtriert, das Filtrat nach Zusatz von HCl auf dem Wasserbade eingedampft, vom Chlorblei abfiltriert, das ein- geengte Filtrat mit mehrfachem Volumen heißen Alkohols vermischt, nach dem Abkühlen filtriert, das Filtrat ganz eingedampft, der Rückstand mit 80 — 100 ('»^3 Wasser aufgenommen, die mit Na OH neutralisierte Flüssig- keit mit 10 r»/ 3 einer Lösung von '200 g pulverigem Natriumbisulfit in 1 / Wasser und mit ebensoviel einer Lösung von 130 cm^ CuSOi in 1 1 Wasser versetzt, aufgekocht, nach dem Abkühlen filtriert. Aus dem von Xanthin- basen befreiten Filtrat wird die schwefelige Säure durch Zusatz von HCl und Eindampfen auf dem Wasserbad vertrieben, dann das Kupfer mit H.2S gefäUt. Das Filtrat wird eingedampft, mit heißem Alkohol ausgezogen, dieser Vorgang (zur Entfernung der Chloralkalien) wiederholt, bis die Salz- rückstände keine oder nur geringe Reaktion nach Jafe geben. Der erhal- tene Sirup wird mit ca. 50 cm^ verdünnter H, SO4 (1 : 3) und mit 30VoigPi' Phosphorwolframsäurelösung gefällt, der Niederschlag nach zweitägigem Stehen gefällt, der Niederschlag mit stark verdünnter, mit Hg SO4 ange- säuerter Phosphorwolframsäurelösung gewaschen, dann abgesaugt, in heißem Wasser aufgeschwemmt, mit Baryumhydroxyd versetzt, bis zur alkalischen Reaktion. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit heißem Wasser ge- ') ir. Authenrieth und J. Koenigsherger, t)ber ein neues Kolorimeter und dessen Verwendung zur Bestimmung von Blutfarbstoff, Eisen, Indikan und Kreatinin. Münchener med. AVochenschr. 57. 998 (1910). ^) K. Mirko, Über Isolierung des Kreatinins aus Extrakten. Zeitscbr. f. Unters. Nahrangs- u. Genußm. 19. 426 (1910). Nachweis unil HostiminmiLr der Kiweißahbaiiprodiikto im Harn. ;;j;j waschen, das Filtrat mit verdünnter Ho SO, neutralisiert, die neutrale Flüssigkeit bis zum Sirup eingedamjjft. Zur Ihcrt'ührun;^ des unter der Einwirkung des Baryumhydroxyds gebildeten Kreatins löst man den Sirup in etwa 10 — 15 n>i3_-n-H2 SO4 und 50 tw^ Wasser auf, dampft ein, nimmt den Küekstand in 50«»-' Wasser auf und dampft die Flüssigkeit noch- mals ein. Der Sirup wird mit wenig Wasser in einen Kolben gebracht, die konzentrierte Lösung mit heibem Alkohol vermischt, bis zum nächsten Tag stehen gelassen, die klare Flüssigkeit vom ungelösten abgegossen, der Alkohol durch Destillation verjagt, wieder mit hciliem Alkohol vermischt und wieder der Alkohol verjagt. Die in saurem Alkohol unlöslidu'u An- teile des Sirups werden zur Gewinnung der darin enthaltenen kleinen Mengen Kreatinin in sehr wenig Wasser gelöst, mit siedendem Alkohol vermengt und wie oben verfahren. Die alkoholischen Auszüge werden durch Destination vom Alkohol befreit, der Pdickstand wird in 25 — 30 cm ^ Wasser aufgenommen, die zum Sieden erhitzte Lösung wird mit P)leihydro.\yd ver- setzt bis zur alkalischen Reaktion und die Mischung mit dem mehrfachen Volumen absoluten Alkohols verdünnt. Die nach mehrstündigem Stehen filtrierte Flüssigkeit wird nach Abdestillieren des Alkohols mit ll.jS be- handelt, zum Sirup eingedampft, das Kreatinin ins l'ikrat übergeführt, dies in das salzsaure Kreatinin übergeführt. Zu diesem Zwecke wird das l'ikrat mit verdünnter HCl erwärmt, die freigewordene Pikrinsäure durch Schütteln der noch heißen Flüssigkeit mit Toluol beseitigt, die wässerige Lösung des salzsauren Kreatinins eingedampft. Die feuchte Kristallmasse wird mit einem Gemisch von 1/3 Azeton und -J^ absolutem .Vlkohol gewaschen (Schm. 243—2440). Phenole (vgl. Band III, S. 823). C. Xeuberf/ und A. Hildesheini er ^) zeigen, dab die Angalien Moosrrs (vgl. Band III, S. 82G) über die Brauchbarkeit der Phosphorsäure für die direkte jodometrische Phenol- bzw. Kresolbestimmung bei Herbivorenharnen unzutreffend sind. Für Pflanzenfresser und Diabetikerurinen ist die von Neuherg angegebene Modifikation des Kossk'r-Pcnni/si:\\on ^■erfahrens an- zuwenden. Eine Methode zur getrennten Bestimmung von Phenol und Parakresol im Harn geben J7. Siegfried und li. Ziwincrniann'-) an. Die (irundidee der Methode ist die folgende: Bei der ersten Bestimmung wird diejenige Menge Br(6,) ermittelt, die das Phenol und das Kresol zusanunen verbrauchen, indem aus ersterem Tribromphenol, aus letzterem rril)romkresol entsteht. bei einer zweiten diejenige Menge Br(/>2), die bei der ri)erführung des Phenols in Tribromphenol und des Krcsols in Dibromkresol verbraucht wird. ') C. Xruhfrc/ und A. llildcsheimer, Die Bc-^tiininiinL' -('biet der verschiedenen Indikatoren bei verschiedener Wasserstoffionenkonzentration liegt ; aus der Beobachtung der Farbennuance der mit dem Indikator ver- setzten Flüssigkeit kann man daher direkt auf die Wasserstoffionenkon- zentration schließen. Die Farbennuancen beziehungsweise Umschlagspunkte einiger wichtiger Indikatoren gibt die folgende Tabelle 1 . die aus Band I übernommen ist, an. Umschlagspunkte der gebriiuchlichsten Indikatoren in dem für den Physiologen wichtigen Gebiet um den Neutralit:its])nnkt herum zeigt die Tabelle IL Um die genaue Ausarbeitung der Indikatorenmethode hat sich -S'. P. L. Sürensen die größten Verdienste erworben, i) Wir benutzen bei der Beschreibung dieses Verfahrens möglichst getreu die Ausführungen dieses Forschers. Zuerst prüfe man die zu untersuchende Flüssigkeit Lackmus- papier gegenüber; ist sie alkalisch, prüft man ihr Verhalten weiter gegen Phenolphtalein, ist sie sauer, gegen Methylorange. Nun kann der Bereich, innerhalb dessen die AVasserstoffionenkonzentration der Lösung zu suchen ist, weiter eingeengt werden. Ist z. B. die Lösung gegen Lackmus sauer, gegen Methylorange alkalisch, so nimmt man einen Indikator, des.>^eu Umschlagspunkt zwischen dem des Lackmus und dem des Mt-thylorange liegt, z. B. das p-Xitrophenol. Nun mißt man in möglichst gleich großen, farblosen Probiergläsern folgende Phosphatgemische ab : I II 111 IV V VI VII VIII i II K 11 lii U z c II t i 111 0 t (' r ii Primäres Phosphat . . 10 O-Tö ii-f) !>() S-0 7-0 f.<> .VO sekundäres Phosphat . 0 U-i^") o-f) ro 2-(> :".n 1»» .V(» *) S. F. L. Sürensen, Enzymstudieu. Biocliem. Zcitsclir. 21. 201 (litUO). 318 P. Roua. Tabelle Indikator Mauvein Koügorot 2nH- InH- 1-10-1 nH- 110-2 nH- 1-10-3 nH- 110-4 nH- 110-5 nH- 1-10-6 nH- gelb g-ruu blau blau VI olett blau bla u Alizarinsulf 0- gelb- saures Natrium I grün Rosolsäure Phenolpbtalein violett Schar- lach braun rot gelb hell- bräun- lich hell- bräun- lich farblos a-Naphtolben- ,. , ^''''' ' gelb Tropäoliu 0 Trinitrobenzol gelb grün- gelb I farblos Benzopurpurin Safranin blau blau- violett violett rot- violett I gelb, rosa I Stich : rot blau lila rosen- rot ^^ A'i. Tabelle Indikator 10 nH-^ 4-4 10 nH- — 5-4 10 nH- — 6-2 10 nH- — 6-5 10 nH- Methylorange rotgelb gelb (maximal) gelb (maximal) gelb , Alizarinrot gelb gelb orangerosa rot rot Rosolsäure — blaßgelb blaßgelb blaßgelb gelb, Stich rosa Lackmus — — rot rot rotviolett Neutralrot — — — — — Phenolphtalein — — — / - 7 Bestimmuu'^ der Reaktion mittelst Indikatoren. :uo T. 1-10-7 1-10-8 iiH- nH- 110-9 nH- 1-10-10 nH- 110-11 nH- 1-10-12 nH- 1-10-13 nH- 110-1* nH- 110-15! iill- — _ ! _ — — — • — violett- rot gelb- rot — — ! — — 1 — — — 1 1 lila 1 violett . — — rosa rot — — — — — '3 ^-^-e» 1 — farblos rosa rot — — — rot, schnell farblos rot einfal- lend, gleich darauf farblos — — 1 — ' grün grün- blau — — — — -:- — — 1 — grün- gelb rot- orange ° orange — — — — — — — farblos orange ^«*- /f* " orange farblos — — — — — gelb, Stich- rot rosa — ! ~~ — - - r°ro;"-|-'^"i II. —6-8 _ -7-1 10 nH- 10 nH- 10 nH^ 10 nH- — S ^— 8'3 10 nH- ! 10 nH- 1 —9 2 10 „H- — — — — — — - rot — — — — — röter maxim. rotimaxim. rot ( — — — — rotviolett violett . , , . ' blau- ^'^«1^" violett blau- violett _ fast reinblau maxim. rot rot, Stich 1 orange- orange rot orange orange- gelb gelber maxim. gelb — — farblos farblos farblos. rosa rot (nicht maximal) 1 320 P- Rona. Das sind Gemische, die dem Konzentrationsbereiche der Wasserstoff- ionen entsprechen, das p-Nitrophenol umfaßt. In I (Ph = 4'53) ist p-Nitro- phenol so gut wie farblos i), in VIII (Ph = 6*81) griinüchgelb z^Yischen diesen zwei Grenzpunkten lassen sich die übrigen Gemische nach den Wasserstoff- ionenkonzentrationen scharf einreihen. Von der zu untersuchenden Lösung werden nun auch 10 cm- in ein entsprechendes Reagenzglas abgemessen, in jedes Glas eine passende Menge der Indikatorlösung eingetröpfelt, wonach die Farbe der Lösungen nach gutem, aber vorsichtigem Umschütteln ver- glichen wird. Sörensen empfiehlt Reagenzglasgestelle zu verwenden, deren am zweckmäßigsten 35 bis 40*' gegen den horizontalen geneigten Boden mit einem P)latt reines Papier bedeckt ist und die so eingerichtet ist, daß eine Drehung des Gestelles von 35 bis 40" um dessen Längsachse es er- möglicht, quer durch die gesamten vorliegenden Reagenzgläser gegen das w^eiße Papier als Hintergrund unbehindert zu sehen. Sollten die Anzahl Tropfen des angewendeten Indikators nicht ge- nügen , eine deutliche Färbung hervorzurufen , so muß man zu allen Reagenzgläsern noch mehr Indikatorlösung (3, 6 bis 12 Tropfen je nach Bedarf) zufügen. Durch Einschaltung neuer Vergleichsmischungen kann die Methode noch verschärft werden. Äußerst ausführliche und genaue Untersuchungen über die Fehler- quellen der kolorimetrischen Methode der Reaktionsbestimmung verdanken wir S. P. L. Sörensen. Auf Grund seiner Untersuchungen müssen dabei folgende Punkte berücksichtigt werden : 1. Eigenfarbe der Versuchsflüssigkeit. FaUs die zu unter- suchende Lösung nicht farblos ist, ist es vorteilhaft, um die Unterschiede des Farbentons zu verdecken, die Vergleichsflüssigkeiten mit verdünnten Lösungen passender Farbstoffe bis zum gleichen Farbentone zu versetzen. Die Färbungsmittel müssen natürlich denselben Farbenton geben innerhalb des ganzen in Frage kommenden Bereichs der AVasserstoffionenkonzen- trationen. Als angemessene Färbungsmittel der Vergleichsflüssigkeiten bei der Messung solcher Lösungen, die bei den enzj^natischen Spaltungen in Frage kommen, schlägt Sörensen folgende vor: a) Bismarckbraun {0*2^ in 1/ Wasser), b) Helianthin II (0-1^ in 800 cm^ 93 Voigem Alkohol + 20007^3 Wasser), c) Tropäolin 0 (0-2 (/ in 1/ Wasser), d) Tropäohn 00 (0-2^ in 1 1 Wasser), e) Curcumein {0'2g in 600 cm^ 93ö/oigem x\lkohol + 400 cm^ Wasser), f) Methylviolett {6-02(/ in 11 Wasser), g) Baum\volll)lau (Ol^ in H Wasser). ') Wird der Normalitätsfaktor einer Lösung in bezug auf Wasserstoffioneu durch die Größe 10— i' angegeben, so schlägt .S'öre^se« für den numerischen ^Yert des Potenz- exponenteu den Namen Wasserstoffionenexponent und die Schreibweise Ph vor. Unter dem Wasserstoff ionenexponenten einer Lösung wird demnach der Briggsche Logarithmus des reziproken Wertes des ■ auf Wasserstoffioneu bezogenen Normalitätsfaktors der Lösung verstanden. Bestimmuuf,' dor Reaktion mittol-t Imlikatuicii. ;;•>! Vm (1er Verglcichsflüssiiikeit fi'cgehonen Falls eine passende Trühunvr zu verleihen (ohne wesentliche Änderung der lonenkonzentration), kann eine wässerige Aufschweninmng von frisch gefiilltem r.ai'iuinsnlfat /u^ri'geben werden. Die Anschweminung wird bereitet durch \eriiiischen von 2 rm^ einer O'I n-Bariunichloridlösung und 2 ein'' einer oi n-KaHiiinsuHatliisuii'r. 2. Einflul» der Neutralsalze. Der l'nischlagspunkt der Indikatoren wird in verschiedenem Maße durch die Gegenwart der Neutralsalze beein- flußt. L. Michaelis und P. Bona ') wiesen eindringlich auf diese Fehleniuelle hin. So ist z.B. Methylviolett in einer ;•; Messung erhält man daher, wenn man nicht mit dem wahren Was-erstoff- ionenexponenten der Veriilcichstliissi^kcit (y'J4. sondern mit dem int(»l;:i' dt die erwähnte Fehler(|uelle. ö. Von sehr großem Einfluß sind die Eiweißstoffe und deren Abbauprodukte, die als amphotere. kolloidale Körper sich mit sauren oder basischen Farbstoffen zu verbinden i)efäliigt sind. Diese VerbinduiiL'en fallen aus oder bleiben in (kolloidaler) Lösung und hindern so die koloii- metrische Messung merkhch oder vereiteln diese ganz. Die l'ntersuchungen von Sörenscn zeigen, daß Methylviolett und verwandte Indikatoren auch durch genuine Eiweißkörper nur wenig beeinflußt werden, während die zahlreichen Indikatoren der Azogruppe sämtlich .^o liut wie uid)rauchbar sind, wenn einigermaßen bedeutemle Mengen l'roteinstoffe von kolloidaler Natur gegenwärtig sind. Von Bedeutung ist in dieser Hinsicht die Zusammen- setzung der Indikatoren. In solchen Fällen, in welchen dieselbe nicht genuine, sondern irgendwie abgebaute Proteine enthält, können die einfacher /'i- sammengesetzten Indikatoren der Azogrujjpe oft vollkommen zuverlä>- Werte geben, während die komplizierter zusammenge.setzten Vertreter der -Gruppe, vor allem das Kongorot, ganz unbrauchbar sind. Sehr instruktiv 21* 324 P. Rona. zeigt die vorliegenden Verhältnisse folgender Versuch von Sörensen'^) über den Einfluß der Proteinstoffe auf die Indikatoren. Folgende drei Lösungen wurden untersucht : a) eine schwach salzsaure , etwa 2°/oige Leimlösung, h) eine schwach schwefelsaure, etwa 2" o^ge Lösung von Wittepepton, c) eine schwach salzsaure, etwa 2Voige Lösung von genuinem Hühnereiweiß. Wert vou Ph in ah c Angewandte Meßmethode : Elektrometrisch 2*56 2-59 2-49 Kolorimetrisch : mit Methylviolett 2-61 2-55 2-53 „ Mauvein 2-58 2-52 2-50 „ Benzol- azo-anilin 2-65 2-61 2*81 „ p-Benzolsulfonsäure-azo-anilin .... 2"61 2"68 3'07 „ Benzol-azo-benzylanilin 2*53 2-57 ^3"34 ,, p-Benzolsulfonsäure-azo-benzylanilin . 2-69 2*83 ^3*68 „ Kongorot 3-50 3-99 55-30 Da der Einfluß auf die Farbenänderung der Indikatoren bei dem genuinen Eiweiß sich zuweilen anders als bei den Abljauprodukten äußert, ist die Farbenänderung gelegenthch ein gutes Zeichen für den fortschreitenden Abbau. Vermischt man z. B. 2) 4:0 on^ einer 0"57oigen genuinen Hühnereiweißlösung mit 10 cti/^ 1-n-Salzsäure und versetzt das Gemisch sofort mit Tropäolin 00, so nimmt die Lösung eine rote Farbe an, die im Laufe von etwa einer Stunde in Gelb übergeht. Dies rührt davon her, daß das gebildete Azidalbumin den Indikator in noch höherem Maße bindet , als es genuines Eiweiß tut : so kann die vorschreitende Azidalbuminbildung leicht verfolgt werden. — Gibt man zu der salzsauren Eiweißlösung wirksame Pepsinlösung, so wird das gebildete Azidalbumin in weniger kompUzierte Körper gespaltet ; die das TropäoHn nur in ge- ringem Maße binden. Infolgedessen wird der Farbenwechsel von Piot zu Gelb langsamer vor sich gehen und zuletzt, wenn der Pepsinabbau die Oberhand gewinnt, Halt machen, wonach die Flüssigkeit nach und nach wieder rot wird. ^) Auf Grund seiner Untersuchungen empfiehlt Sörensen folgende Indi- katoren, die den Bereich der Wasserstoffionenkonzentrationen Ph von 0"1 bis 12'7 beherrschen, zu denen noch das neuerdings empfohlene a-Naphtholphtalein*) (mit einem guten Umschlag zwischen Ph = 7-26 und Ph = 8*58) hinzukommt. *) Sörensen, 1. c. S. 217. ^) Sörensen, 1. c. S. 219. ^) Vgl. auch L. Michaelis und H. Davidsohn, Die isoelektrische Konstante des Pepsins. Biochem. Zeitschr. 28. 1 (1910). *) S. P. L. Sörensen und S.Palitzsch, Über einen neuen Indikator, a-Xaphthol- phtaleiu , mit Umschlag in der Nähe des Neutralpunktes. Biochem. Zeitschr. 24. 381 (1910). I Bcstimniiiii'.'^ dor Reaktion mittelst Intlikatorrn. uor^ Nr. 1. Methvlviolott l'u ~ 0"1 3-2 „ 2. Mauveiii — O'l — 2-9 „ 3. Benzol-azo-diphonvlainiii — \-2 — 2*1 „ 4. p-Beiizolsulfonsäiire-azo-(li|)Ii(Miylainiii . .. \A~ l'-C» 5. m-Heiizolsiilfoiisäuro-azo-diplioiivlaiiiin . .. - \-> — 2-;i „ (■). P)('iiz()l-nzn-l)('iizylanilin - 2-3— 3-;i ,, 7. p-Jl('iiZ()lsulloii.^;iiire-azo-l)('ii/ylaiiiliii . . „ — 1-9 — S'H „ 8. p-15enz()lsulfoiisäure-azo-metaclilui(lialliyl- anilin r= 20 - 4() „ '.1. Denzol-azo-diinethylaiiilin = 21i — 4U „ 10. p-Benzol.sulfünsäure-azo-dimethylaiiilin . .. — 31 — 44 „ 11. Benzol-azo-a-naphthylamin — ."'.•T - .'>() „ 12. p-Benzolsiilf()iisäure-azo-'/-iiaphtliylamiii .. = ;Vi) .'>" .. 13. p-Nitro])lu'iiol — 5-Ü— TU „ 14. Neutralrut = IrS- S-Q „ 15. Rosolsaure rz: 6-9 H-0 „ 16. p-BenzoIsuIfonsäure-azo-a-naphthol . . .. = 7'6 — H"9 „ 17. Phenolphtaleiii = 8-3— 10-() „ 18. Thyiiiolphtalein = 9-3— lO-ö „ 19. p-Xitrobonzol-azo-salizylsäure = lOl — 12'1 .. 20. p-Benzolsiilfonsiiure-azo-re.sorzin = IM- 12-7 Die Messung- der normalen Ilarnazidität auf kolorimctriscliom Wege hat L. J. Hcnderson^) in folgender Weise ausgeführt: Eine lleilie von Lösungen mit bekannter Wasserstoffionenkonzentration wurde durch Mischen verschiedener Mengen einer schwachen Säure mit ihrem Natrium- salz hergestellt. Die Zusammensetzung und annähernde Wasserstoffionen- konzentration der benutzten Lösungen zeigt folgende Tabelle: Na H, PO4 Na„ HPU, (H) Iiiilikator 00010 II 00010 11 OOOfiOn 0-0023 u 4. 10-« II l.lO 7ll 2.10-7 II ' 5 . 10-7 II 1 .10 on 2 . 10-« II ."1.10-0 11 1 .1(1—^ u 2.10 ftu Xeutralrot ■ p-Nitniiilicinil CH3 ■ COOH CHj-COONa 00009 II 00023 II 00046 11 00092 11 0-02:-^0 II 0()4(;o II OU920 II 0-0920 n 00920 n 00920 II 0-0920 ü 00920 II 0-0920 II 00920 u Diese Lösungen in Flaschen von 250 cw^ wurden mit dein erforder- lichen Indikator versetzt (Konzentration des Neutralrots om M M )5<'/o , des p-Nitrophenols 008**/o) und dienten als \'ergleichslösung hei der Bestim- ') L. J. Hinderson, Zur Keuntuis der Ioiieiii,'lcicliiiiii:ou im Orirauismus. II. Mes- sungen der normalen Ilarnazidität. Biochem. Zeitschr. 24. 40 (19101 326 P. Rona. mung der Harnazidität. Bei jeder Bestimmung wurden 10 cm ^ ganz frischen Harns in eine 2:^0 ciu^ fassende Flasche gebracht, mit Wasser verdünnt und mit p-Nitrophenol versetzt. Die Konzentration der Wasserstoffionen wurde nun abgeschätzt entweder durch Feststellung der Standardfarbe, mit der die Farbe der Harnprobe übereinstimmte, oder, wenn diese zwischen zwei der Standardlösungen lag, Avurde aus den Unterschieden der Farben- nuancen durch rohe Abschätzung die Konzentration der Wasserstoffionen, bestimmt. War die Azidität geringer als die Konzentration der Wasser- stoffionen von 2.10"', so wurde eine andere Probe mit Xeutralrot ver- setzt und die Farbe mit der Xeutralrotseite verglichen. Die infolge der Verdünnung eingetretene Verminderung der Konzentration der Wasser- stoffionen betrug in den Versuchen durchschnittlich ungefähr ein Viertel. Um die Indikatorenmethode zur Messung der Azidität des Magen- saftes brauchbar zu machen, hatten L. Michaelis und H. Davidsohn^) die Aichung der Umschlagspunkte der entsprechenden Indikatoren im Magen- saft selbst vorgenommen, indem gleichzeitig in einer Gaskette die Wasser- stoffionenkonzentration des Magensaftes festgestellt wurde. Die folgende Tabelle zeigt, welche Wasserstoffionenkonzentration des Magensaftes den verschiedenen Nuancen der einzelnen Indikatoren entspricht. Die Zahlen bedeuten die Anzahl Wasserstoffgrammionen im Liter. Ol 1 . 10- 0-032 1 . lu-'-' 001 = 1 . 10- 00032 = 1 . 10-' = Methylviolett . Tropäolin . . Kongorot . . Methylorange Lackmus . . p-Nitrophcnol Xeutralrot . . grün burgunderrot blau , Nieder- schlag rot rot farblos himbeerrot grün burgunderrot blau, Nieder- schlag rot rot farblos himbeerrot grün orange blau, Nieder- schlag rot rot farblos himbeerrot grünblau orange blauviolett, Niederschlag rot rot farblos himbeerrot 0-001 = 1 . 10- 0-0001 : 1 . 10- 000001 = 1 . 10 0000001 = 1 . 10-" 00000001 = 1 . 10-' blau gelb blauviolett, Niederschlag rot rot farblos himberrot violettblau gelb schmutzig- rot orange rot farblos himbeerrot blauviolett gelb rot violett gelb rot gelb gelb gelb Sticli violett violett violett Stich gelb gelb gelb himbeerrot himbeerrot orange Anmerkung: Bei Mischfarben ist die dominierende zuletzt, die modifizierende zuerst genannt. Wenn bei Methylviolett die Farbennuance schwierig zu beurteilen ist, ■was mitunter vorkommt, so orientiere man sieb an einer Kontrolle von 1 Tropfen Indi- kator auf 1 c;«" destillierten Wassers. violett gelb rot *) L. Michaelis und H. Davidsohn, Die Bedeutung und die Messung der Magen- saftazidität. Zeitschr. f. experim. Pathol. u. Therapie. 8. 1 (1910). Bestimm II II'' der Koiiktimi mittelst Indikatoren. 'o Bei der Anwciidunii der bescliriel)eiieii Methode ist es ausreirh vier Keagenz^läsehen mit je einem Kiiliik/.ciitiiiietcr des filtrierten Ma^^'f-ii- inhalts zu versetzen und als Indii'jniaknia!.'nosia (Sargdeckelkristalle). Einwandfrei kann die Anwesenheit lieigemischten L'rins gezeigt werden durch den Nachweis reichlichen Chlors, das sich normalerweise nur sehr spür- lich im Kote findet. Dazu stellt man sich nach Hecht *) ein ziemlich konzentriertes wässeriges Stuhlextrakt her, filtriert und versetzt das Filtrat mit Saliietersäure; dann tropft man so lange lOVois^' Argentum nitricum-Losiing dazu, als noch ein Nieder- schlag entsteht. Bei urinfreien Stühlen kommt höchstens eine leichte Opaleszenz vor. Starker Chlorgehalt wird durch reichliche Trübung oder käsigen Niederschlag nach- gewiesen. Bestimmung der feuchten Kotmenge. a) Wägung. Zur Bestimmung der .Menge des feuchten Kotes wird der Kot in den el)en beschricl)enen verschliel.ibaren (dasgefälien. deren (ie- wicht bekannt und am besten in das Glas eingeritzt ist, aufgefangen. Kommt es auf ganz exakte AVägungen an. so muß der Peckel eingeschlit'fen und luftdicht schliebend sein. Sehr harfer und trockener Kot kann auch 1) Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglings und des Kindes. Die Bedeutung und Technik ihrer Untersuchung. S. 3. Berlin und Wien 1910. 332 H. Lohrisch. Fig. 95. Fig. 94. Fig. CD iL L im offenen Glas oder auf offener flacher Schale aufgefangen und gewogen werden, da der Wasserverlust hierbei in der zur Wägung nötigen Zeit unbedeutend ist. Soll der Gesamtkot einer längeren Versuchsperiode bestimmt Averden, so wird jede einzelne Kotportion in ein gewogenes Glas für sich entleert, einzeln gewogen und das Gesamtgewicht aus den Einzelportionen berechnet. h) Volumetrische Messung. Hierzu dient ein von Strashurger \) angegebenes zylin- drisches Gefäß mit aufgeschliffenem Deckel, welches ein Steigrohr trägt (Fig. 94). Das Gefäß ist entweder auf 200 oder 400 cm^ geaicht. Der Kot wird in das Glas hineingebracht und das Gefäß mit Wasser aus einem Meßzylinder ge- füllt. Eingeschlossene Luft wird durch Umrühren mit einem Holz- spatel vertrieben. Es wird bis zur obersten Marke des Steigrohrs auf- gefüllt. Das Volumen der Fäzes entspricht der Aichungszahl des Ge- fäßes, vermindert um die Menge des gebrauchten Wassers. Um kleine Mengen Kot ab- zumessen, dient der in Fig. 95 ab- gebildete kleine Strasburg er^ohOi Apparat-): Dieser stellt eine Bürette dar. die bei der Marke 0 abge- schnitten ist. In derselben befindet ^ !__-+_ 11 ,,|„|. sich ein kleiner verschiebbarer ^^^^1^^^^ Kork, der in der Mitte mit einer ^^^ ~ ^^^^ glühenden Nadel durchlocht ist und der durch einen Glasstab vorge- schoben werden kann. Zur Abmessung wird zunächst der Kork bis über die gewünschte Marke hinaus in das Rohr hineingeschoben. Mit Hilfe eines Holzspatels wird der Kot in das Rohr gedrückt, ohne daß sich Luft da- zwischen ansammelt. Dann schiebt man mittelst des Glasstabes den Kork bis zur geA\1inschten Marke vor, streicht den überschüssigen Kot vorn am Rohr mit dem Hokspatel ab und kann nun das gewünschte Kotquantum in Form einer Kotsäule aus dem Rohre herausdrücken. O 0 J- Strashtirc/er , Untersuchungen über die Bakterienmenge in menschlichen Fäzes. Zeitschr. f. klin. Med. Bd. 46. H. 5 u. 6. S. 7 des Sep.-Abdr. ^) J. Strasimrger, 1. c. S. 8 des Sep.-Abdr. m Methoden zur Untersuchung der mensclilichen Fiizcs. -^•y} Einen ganz ähnlichen Apparat hat neucnlings auch Sato^) an'M-rohcn (Fig. 96). Dünnflüssige Stühle werden am besten in graduierten Stand/vlindtTii gemessen. Konservierung des Kotes. Um den feuchten Kot für einige Zeit auf/uhewahren , d. Ii. um die im Kote stattfindenden Fäulnis- und Gärungsprozesse auf einige Zeit zu unterbrechen, empfiehlt es sich, den feuchten Kot mit einer gemessenen Menge dünner Karbollösung ((>25Vo) oder mit Chloroform wasser zu über- gießen oder zu verrühren und in luftdicht schlieiJendcu (iläsern aufzube- wahren. Stützer-) empfiehlt für Tierkot, 100^ frischen verriebenen Kot mit 1 cnt^ Schwefelkohlenstoff zu versetzen und das Gemisch in einem Glasgefäß luftdicht abzuschließen. I)al)ei tritt i)esonders in den Löslichkeits- verhältnissen der N-haltigen Substanzen keine Veränderung ein. hir Me- thode ist auch für menschlichen Kot geeignet. Im allgemeinen empfiehlt es sich, für Analysenzwecke den Kot mög- lichst schnell zu trocknen, um Zersetzungsvorgänge und die Tätigkeit im Kote vorhandener Fermente möglichst rasch zu uiiferlneclien. Abgrenzung des Kotes. Wenn es sich darum handelt, den gesamten Kot von einer bestimmten Ernährungsperiode zu sammeln (bei Ausnutzungsversuchen usw.), so ist eine genaue Abgrenzung desselben erforderlich. Benutzt wird hierzu nach dem Vorgang von Ad. Schmidt ^) am besten pulverisiertes Karmin. Soll beispielsweise der Kot von 3 Tagen gesammelt werden, so gibt man ,iin Morgen des ersten \'ersuchstages mit Beginn der Versuchsnahrung ()-;i Karmin in einer Oblate (oder in einem anderen Vehikel, falls ilie \erab- reichung der (Jblate den Versuchszwecken zuwidei-läuft). ebenso am Ende des dritten Tages mit der letzten Mahlzeit wiederum ()•;'. Kai-min. Bei der Aufsammlung des Kotes muß nun Beginn und Ende der Ausscheidung roten Karminstuhles genau beobachtet werden. Im vorstehend angegebenen Falle würde der am Beginn und Ende der Versuchsperiode rotgefärbte Kot und der zwischen den roten Portionen liegende Kot zu sammeln sein. W^ürde man das zweite Karminpulver erst am Beginn des vierten Tages mit der ersten Nahrungsaufnahme geben, so würde der zu Ende des \'er- suches entleerte Karminkot natürlich nicht mit zu sammeln sein. Die Tren- nung des Karminkotes von dem vorhergehenden und dem am Knde des *) Ts. Sato, Üher die Bestimmungen der Bakterienmenge in den Fäzes des Men- schen. Zcitschr. f. e.xp. l'uthol. u. Ther. Bd. 7. II. 1. S. 431. r.dd. -) A.Stutzer (Berichterstatter), K.Merrcs und L.Selilhr, Die Uutei-suchunp ties Kotes auf (behalt an Stickstoff, der in Form von Stoffwechselprodiditen darin entlialten ist. Biochcm. Zeitschr. Bd. 9. S. 313—317. lOON. ') All. Srhniidt, Die Funklionspnifun^f des Darmes mittelst der rruliek'>>t. 2. Aufl. Wiesbaden 1908. 334 H. Lohrisch. Versuches nachfolgenden, nicht zum Versuche gehörigen Kot muß sehr sorgfältig geschehen. Es empfielilt sich hierzu das Aufsammeln jeder Kot- portion in einem Glase für sich. Im Glasgefäß kann man zu Anfang und zu Ende des Versuches besonders sehen, ob der Karminkot die unterste oder oberste Schicht bildet, was zur Orientierung bezüglich der Abgren- zung oft wichtig ist. Am besten gelingt die Abgrenzung bei sehr hartem, geformten und dickbreiigen Kote. Schwierig kann es oft sein, bei diar- rhoischen Stühlen eine richtige Trennung vorzunehmen. Zur Abtrennung benutzt man 18 — 20 6m lange und IV2 — 2 cm breite flache Holzspatel. Die nicht zum gewünschten Kote gehörigen Teile werden mit dem Spatel aus den Gläsern entfernt. Kommt es nicht auf exakte Wägung der feuchten Kotmenge an, so kann man den Kot auch in flache Porzellanschüsseln ent- leeren lassen, in denen die Abgrenzung mittelst des Spatels mitunter noch leichter und übersichtlicher vor sich geht. Trocknung und Pulverisierung des Kotes. Zunächst ist der gesammelte Kot lufttrocken zu machen. Zu diesem Zweck wird entweder der gesamte feuchte Kot in einer gewogenen großen Porzellanschale vereinigt (in den Sammelgläsern haftende Reste werden mit dem Spatel und mit Wasser entfernt und mit dem Gesamtkot ver- einigt) und auf dem Wasserbade bei 50 — 60" eingedampft, oder es wird nur eine kleine Menge (10 — 15 g) des gut durchrührten feuchten Kotes in einer kleinen gewogenen Porzellanschale abgewogen und hierin auf dem Wasserbade getrocknet. Nach dem Eintrocknen wird gewogen und der Wasserverlust festgestellt. Der lufttrockene Kot wird nun sorgfältig und ohne Verluste aus der Porzellanschale entfernt; der an der Wand der Schüssel oft sehr adhärente Kot muß mit Hilfe eines scharfen zum Schaben geeigneten Instrumentes (schmales scharfes Stemmeisen oder dergleichen) abgekratzt werden, so daß die Schüssel nach Möglichkeit gesäubert ist. Dann wird der Kot ent- weder in einer Porzellanreibeschale oder im Mörser grob zerstampft oder in einer Handmühle grob geschroten. Der grob zerkleinerte Kot ist nun noch nach Möglichkeit zu pulverisieren. Dies geschieht, indem man die gesamte Kotmenge portionsweise in einer Porzellan- oder Glasreibe- schale mittelst eines Pistills zu Pulver verreibt, oder indem man eine der gebräuchlichen Futtermittelmühlen benutzt, von denen Scheunert^) beson- ders die Märkersche Mühle empfiehlt und abbildet: diese erfordert aber das Vorhandensein maschineUer Einrichtungen. Sehr wichtig ist es, bei der Pulverung ohne Verluste zu arbeiten. Da der Kot während des Pulverisierens in seinem Feuchtigkeitsge- halt Änderungen erfahren haben könnte, ist es ratsam, die gesamte pul- ^) Ä. Schcwrert, Methoden zur Untersuchung des Speichels und des Inhaltes des Verdauungsschlauches und der Fäzes der Pflanzenfresser. Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden, herausgegeben von E. Abderhalden. Bd. 3. S. 269. Berlin und Wien 1910. Methoden zur Untersuchung der menschlichen Fäzes. , , , vorisierte Kotmonpni;iclit wurde und in der vielleicht noch ein/eine kleine Kot- partikelchen hatten, /ur(ickzui)rin^('n . noch einmal zu wiejicn und dieses Gewicht als das des lufttrockenen Kotes füi- die IJerechnuiij.'' einzustellen. Die Aufbewahrung des lufttrockenen Kotpulvers erfolgt in Flaschen und Gläsern mit eingeschliffenem (dasstöpsel oder dicht schlieJiciHlem Kork in Räumen, deren Feuchtigkeitsgrad nicht zu sehr schwaidvt. Hecht ^) empfiehlt, um das F'.indami»fen abzukürzen, folgende Methoijc von Poda: Sic beiuht darauf, dalJ der Siedepunkt der zu verdampfenden Hüssigkeit durch wiederholten Alkoholzusatz erniedrigt wird. .Man l;il>t zu- nächst den Kot in der rorzellanschale 4 Stunden auf schwachsiedendem Wasserbade trocknen. Dann versetzt man ihn mit 50 crn^ Alkohol und verrührt ihn mit einem Glasstab oder Holzspatel. Nach einer Stunde noch- mals Zusatz von 25 cm^ Alkohol, eventuell noch ein drittes Mal dieselbe Menge. Auf diese Weise hat der Kot dann noch 2— 5Vo Wasser und lälit sich schnell l)ei 100'' zur Gewichtskonstanz bringen. Vorsichtsmaßregeln beim Eindampfen und Trocknen. Beim Eindampfen können Fehler entstehen dadurch, dali sich aulier dem Wasser noch andere Substanzen (Fettsäuren, aromatische Substanzen, Ammoniak) verflüchtigen. Deshalb dampft man von vornherein, um diese Verluste möglichst niedrig zu gestalten, bei nicht zu liohen Tempei-aturcn ein. Um NHs-Verluste, die spätere N-Bestimmungeu fehlerhaft machen könnten, zu vermeiden, verrührt man die feuchten Fäzes vor dem Kin- dampfen mit einer geringen Menge stark verdünnter Schwefelsäure oder Weinsäure (P/o) oder gibt ein paar Oxalsäurekristalle zu. Kleine Mengen feuchten Kotes können zur möglichsten Vermeidung aller Fehlei'quellen im Exsikkator getrocknet werden. Die Luft im F'xsikkator kann dabei duich Wasserstoff, Methan und Stickstoff ersetzt werden, auch kann im \akuum getrocknet werden. Besondere Vorsicht erfordert die Behandlung stark fetthaltiger Stühle. Hier erfolge schon das Eindampfen bei niederer Temperatur. Da der lufttrockene, stark fettige Kot oft grobe Klumpen bildet und sich sehr schwer pulverisieren läßt, ist es zweckmälüg, den Kot vor dem Eindami'fen mit einer genau gewogenen, etwa lOfachen Menge gewaschenen und ge- glühten Seesandes zu vermischen. Hierdurch wird beim Trocknen das Zu- sammenballen zu großen Klumpen verhindert und das l'ulverisieren des lufttrockenen Kotes erleichtert. Der Sandzusatz kann auch erst vor der Pulverung erfolgen. Immerhin läßt sich auch der mit Sand versetzte Fett- stuhl häufig nicht zu einem Pulver verari)eiten, und man inuli sich e löst sie. Biuret- und Xantho- proteinreaktion liehen sie ebenso wie das l}indef?ewebe. Mit Millons Reagens (= salpetersaures Quecksilberoxydul; Quecksilber wird in dem gleichen Gewicht Salpetersäure gelöst und mit gleichen Teilen Wasser ver- dünnt; das Reagons muß stets frisch sein, alte Lösungen kann man durch Zusatz einiger Tropfen Kaliumnitritlösung auffrischen) erwärmt, findet Verlust der Struktur und liotfärbung statt. Die Muskelfasern geben nach Hecht ^) die Eiweißreaktion besonders schön dann, wenn ihnen der Gallen- farbstoff entzogen worden ist (Hydrobilirubin durch Alkohol, Bilirubin durch Chloroform). Die von Nothnagel sogenannten gelben Körner, mohnkorn- große gelblichbraune Gebilde, bestehen mikroskopisch aus kleinen gelben Schollen, die zuweilen von Schleim umhüllt sind. Nach Ad. Schmidt-) i^'md auch diese gelben Körner Reste von Muskelstückchen. Kerne sind in den Fleischresten nur bei Störung der Pankreasfunktion zu finden. Sie sind sichtbar zu machen durch Färbung mit dünner Methylenblaulösung unter Essigsäurezusatz. Die Kaseingerinnsel bestehen mikroskopisch aus netzartig struktu- rierten Milchresten, in denen sich Schleim-, Fett- und sonstige Kot- partikelchen finden. Sie geben die genannten Eiweißreaktionen und färben sich leicht mit Jod und Eosin. Auch die gelben Körner können Kasein enthalten. Makroskopisch erkennbare, von der Darmwand stammende eiweiß- haltige Produkte sind Schleim, Eiter und Blut. Schleim ist makroskopisch ohne weiteres sichtbar, wenn er in flüssigen Stuhlgängen in groben Fetzen schwimmt oder (wie bei der Enteritis membra- nacea) in großen Mengen und groben Bändern und Stücken entleert wird. Sonst ist zur Sichtbarmachung kleiner Schleimmengen der Kot wie oben sorgfältig mit Wasser zu verreiben. Auf dunklem Untergrunde sieht man dann leicht die durchsichtigen, glasigen, größeren und kleineren Schlcim- flocken. Eventuell muß zur Untersclieidung das Mikroskoj) herangezogen werden. Hierbei stellt sich der Schleim dar als eine strukturlose oder ganz schwachstreifige durchsichtige Masse mit Einlagerung von Detritus und Zellen (Darmepithelien). Auf Zusatz von HO'Voiger Essigsäure wird der Schleim dichter, undurchsichtig und zeigt eine ausgesprochen streifig- fädige Struktur, wodurch er sich vom Bindegewebe unterscheidet. Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal des Schleimes gegenüber Bindegewebe ') Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglinjjrs und des Kindes. S. 65. Berlin und Wien 1910. -) Ad. Schmidf und .7. Strafthurf/rr, Die Fäzes des Menschen im normalen «nd krankhaften Zustande. S. G4. 2. Aufl. Berlin l'JO.'i. 9'i* 340 H.L ohrisch. ist seine Widerstandsfühigkeit gegen Pepsin — H Cl ; Bindegewebe löst sich in Pepsin — H CI in wenigen Stunden. In zweifelhaften Fällen kann durch die makroskopische Färbung entschieden werden, ob es sich um Schleim oder Bindegewebe handelt. Ad. Schmidt^) verfährt dazu folgendermaßen: Einige Flocken des Schleimes werden in Wasser gut gereinigt und in einem Pieagenzglase mit 2^j.2''/'oVj^em Sublimatalkohol geschüttelt, um den Schleim zu härten und größere Flocken zu zerkleinern. Dann läßt man sedimen- tieren, gießt den Sublimatalkohol ab und füllt destilliertes Wasser auf, das man mit einigen Tropfen Biondischen Dreifarbengemisches ( Grübler- Dresden), lg auf oOon^ Wasser, versetzt. Damit Avird umgeschüttelt, sedimentiert , abgegossen und das Sediment mit destilHertem Wasser ge- waschen. Schleimflocken färben sich dabei, wenn sie nicht zu zahlreich oder fetthaltig sind , grün- oder blaugrün, alle anderen tierischen Gewebs- bestandteile rot. Bei Anstellung der Probe darf die Reaktion des Stuhles nicht zu weit vom Neutralen abweichen. Hecht-) hat folgende Färbung zur Differentialdiagnose des Schleims gegenüber anderen Gebilden als brauchbar gefunden: 2<'/oiges wässeriges Brillantgrün und P/o^ge Neutralrotlösung werden zu gleichen Teilen ge- mischt, so daß die Flüssigkeit in der Farbe der Ehrlichschen Triazid- lösung gleicht. Setzt man nun einen Tropfen dieser Lösung einem Klümpchen Stuhl auf dem 01)jektträger zu und mischt den Kot mit der Farbe innig, so färlit sich alsbald die gesamte Stuhlmasse spinatgrün, während die Flüssigkeit rot wird. Es wird nun ein Filtrierpapierstreifen aufgelegt und darüber gestrichen, um die überschüssige Flüssigkeit zwischen Deck- glas und Objektträger auszupressen und abzusaugen. Schon bei schwacher Vergrößerung sieht man, daß in der grün gefärbten Stuhlmenge der Scheim fädig ausgefällt und leuchtend rot gefärbt ist. Bindegewebe färbt sich blau- grün. Zellprotoplasma färbt sich dunkelgrün. Rot färben sich außer dem Schleim nur noch die Zellkerne und Bakterienleiber, rotviolett die Pflan- zenzellmembranen. Die Reaktion beruht auf dem sauren Charakter des Schleimes. Bei stark alkahscher Reaktion des Stuhlganges gelingt sie nicht. Im allgemeinen ist der Schleim, der aus dem Dickdarm stammt, grobflockig und enthält viele Epithelien und Rundzellen, welche den Schleim oft so dicht durchsetzen, daß er direkt weiß aussieht und undurchsichtig wird. Schleim, der aus dem Dünndarm stammt, tritt in kleinen und kleinsten Flöckchen auf, enthält wenig Zellen, meist nur spärliche Zell- kerne und viel Bakterien und ist nicht selten durch Gallenfarbstoff gelb ge- färbt respektive enthält bei mikroskopischer Betrachtung Bilirubinkristalle. Die von Nothnagel sogenannten hyalinen Schleiminseln sind homogene, matt durchscheinende Klümpchen von etwa Askarideneigröße und meist rundlicher Form. Woraus diese Gebilde* bestehen, ist noch nicht ') Ad. Schmidt und J. Sfrashurc/er, Die Fäzes des Menschen im normalen und krank- haften Zustande. S. 35. 2. Aufl. Berlin 1905. -) Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglings und des Kindes. S. 53. Berlin uiul \Vien 1910. Methoden zur Uutersucbiui!; der inonscliliclicii I'a/cv ;• ii bekannt. Sie lassen sicli in lOVnJJ^'C'i' HCl anflüscii. werden durch Essi"- säure nicht .ucfällt und enthalten nie irj^-endwelche Kinschlüsse. Nach Äd. Schmidt^) bestehen sie nicht aus Schleim. Eiter kann dem Stuhi.üaiii:- aul'ien in j^rolier Menp' anhaften. Kleine Menden sind makroskopisch sichtbar zu machen durch sorfj^fiilti^^'s \'erreiben des Kotes und Ausbreiten auf schwarzem Teljei-. Hierbei erscheint reiner Eiter in Form kleiner linsenförmii^ier ^raugelhhcher Häufehen und Trü]ifehen, die mikroskopisch aus Eiter bestehen. Blut ist in frischem Zustande makroskopisch und inikroskopi.sch leicht zu erkennen, schwerer zersetztes Blut. Reichliche Beimengung zersetzten Blutes macht die bekannte Teerfarbe des Kotes. In zweifelhaften Fällen sind die chemischen Blutproben heranzuziehen. Die mikroskopische Untersuchung der Fäzes zeigt Muskelbi-uch- stticke auch dann, wenn makroskopisch keine Fleischreste zu sehen sind. Es handelt sich dabei um kleine weißliche und gelbe Stückchen mit rund- lichen Ecken oder gröbere zusammenhängende gut erhaltene Fasern, die mit (,)uerstreifung versehen und mikroskopisch wie oben zu identifizieren sind. Auch Bindegewebsstückchen und elastische Fasern sind mikroskopisch zu sehen, auch wenn sie makroskopisch nicht sichtbar sind. Pflanzliche Ei\veißreste sind mikroskopisch erkennbar in Form der unverdaulichen Kleberzellen des Brotes, die ihren eiweißhaltigen Inhalt behalten haben. Die Zellwände sind dabei so fest und undurchgängig, daß es mikrochemisch nicht gelingt, den Zelliuhalt als Eiweiß nachzuweisen. Abbildungen zu dem \'orstehenden sind bei Ad. Schniidf-) einzuseiien. ( heniischer Naclnveis der N-lialtiiten Substanzen. liestinimunjJT des Gesamt-N im Kote. Der Gesamt-N-(iehalt der Fäzes wird nach Kjtldnhl bestimmt. Das Prinzip dieses Verfahrens ist, sämtlichen N durch Kochen mit konzen- trierter Schwefelsäure in schwefelsaures Ammoniak überzuführen. Aus diesem wird das Ammoniak nach Übersättigung mit Lauge durch Destillation au.*;- getrieben und in Xormalschwefelsäure aufgefangen. Fm die Zerstörung der organischen Substanzen l)eim Kochen mit Schwefelsäure möglichst zu fördern, wird Quecksilber oder ein Schwermetalloxyd zugefügt. Bei diesem Vorfahren wird iiulier tlcni onrnnisclion N auch der als Auiniouiak schon vorhandene X niitbestimnit. Nicht mitl)esfiinrat wird der N etwa vorliandener Nitrate, da die Salpetersäure der Nitrate durcli die Schwefelsäure frei wird und heim Kochen entweicht. Der hierdurch entstellende Fehler ist belanglos, da die MeuL'e etwa vor- handener Nitrate in den menschlichen Fäzes minimal ist. Zusatz von Benztiesaure neben der Schwefelsäure ermötrlicht alier ain-li die MitbestimmunL' «lieses N. ') Ad. Schmidt und .7. Strashurcier, Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. S. 88. 2. Aufl. Berlin l'.lOri. *) Ad. Üchmidt und J. StrasOiiri/cr, 1. c. Taf. I — \ I. 342 H. Lobrisch. Benötii^t werden an Reagentien: Ein Schwofelsiiureffemisch, das aus 3 Teilen reiner konzentrierter und 1 Teil rauchender H„ SO4 besteht, oder aus 800 reiner, 200 rauchender H„SO^ und 100 Phos- phorsäureanhydrit. Natronlauge, eine Lösung von 500 r/ Ätznatron in 500 c«*^ Wasser- Schwefelkaliumlösung 4'0:]00-0. die nach mehrtägigem Stehen zu filtrieren ist. Talk. Quecksilber. -. -Normal-H^ SO^ und -^ -Normal-NaOH. Cochenilletinktur. Zur Ausführung werden langhalsige A7e?c^«7i7-Kolben aus hartem Glas und der für 6—8 gleichzeitige Bestimmungen eingerichtete /ye ?(?«/; ?-Destillierapparat mit Kühler be- nutzt. Das aus dem Destillationskolben abgehende Destillationsrohr muß einen Kugel- ansatz haben, um das Überspritzen von Lauge zu verhindern. Ebenso muß das in die Vorlage tauchende Glasrohr eine kugelige Ausbuchtung besitzen, um ein Zurücksaugen der vorgelegten ILSO4 zu verhüten. Zur Bestimmung wird der lufttrockene pulverisierte Kot benutzt, dessen Trockensubstanz bestimmt ist. Von diesem werden zirka 2 g im Wiegegläschen gewogen und in einen der langhalsigen Zye?c?aÄ/-Kochkolben gebracht. Das Hineinschütten des pulverförmigen Kotes in den Kolben muß sehr vorsichtig geschehen , um Verluste und Haften des Kotes im Kolben- hals zu vermeiden. Man benutzt dazu am besten einen langen, Aveiten, ab- solut trockenen Glastrichter, der möglichst nahe bis an den Boden des Kolbens reicht. In diesen schüttet man vorsichtig den Kot hinein und be- fördert die im Trichter anhaftenden Kotpartikelchen mit Hilfe eines trockenen Haarpinsels mit langem Stiele bis in den Kolben hinein und achtet darauf, daß an dem Pinsel nichts hängen bleibt. Man kann den Kot auch in Stanniolpapier eingewickelt in den Kolben bringen. Nun übergießt man den Kot mit 20 cni^ des Ho SOi-Gemischs und fügt dazu einen Tropfen Hg, etwa Olc/»^ am besten mit einer Kapillarpipette ab- gemessen. Zweckmäßig ist es nun, das Kölbchen zugestöpselt 12 bis 24 Stunden stehen zu lassen, nachdem man vorher gut durchgeschüttelt hat. Man vermeidet dadurch zu starkes Schäumen beim Kochen. Zum Kochen setzt man den Kolben schräg geneigt auf ein Sandbad unter den Abzug, erhitzt erst langsam, um Schäumen und Spritzen zu vermeiden, dann mit voller Flamme. In einigen Stunden wird der Kolbeninhalt wasser- hell, A\orauf der Kochprozeß beendet ist. Etwaige beim Kochen durch Spritzen im Kolbenhalse haftende schwarze Partikelchen spült man durch vorsichtiges Schütteln und Schwenken der Lösung in den Kolben zurück und kocht nochmals auf. Die wasserklare Lösung ist nun verlustlos in den Destillationskolben, einen zirka V2 ^ fassenden Kochkolben, zu Iningen. Zu diesem Zwecke füllt man nach Erkalten der Lösung in den Ä^e^t/o /«/-Kolben langsam bOcm^ Aq. dest. zu, schwenkt um und gießt die wieder heißgewordene, jetzt ver- dünnte Lösung in den Destillationskolben über. Es scheidet sich dabei etwas Quecksilbersulfat aus, welches bei mehrmaligem Nachspülen in Lösung geht. Man spült 2 — 3mal nach, so daß man zum Pvcinspülen des Kjeldahl- Kolbens im ganzen nicht mehr als 200 c;;«!^ Wasser braucht. Hierauf kühlt man den Kolben unter der Wasserleitung, setzt rasch nacheinander 50 om* Natronlauge (vorsichtig wegen eventuellen starken Schäumens), iOan^ Methoden zur Uiitersuchuii'' di-r iiunschlicheu Fäzes. . > 1 •> Schwefelkaliumlösuni;', einen reicliliclicii Kaffeelöffel Talk und iiochinals öOcm^ Lauge zu. verschließt sofort, ehe NH3 entweichen kann, mit dem Destillationsrohr, bringt den Kolben auf das schon vorgewärmte Sand- bad und lallt nun die Destillation in eine X'orlagc (/•>/<•// ///«"//rr-Kolbeni, welche mit öOtw»— -Normal-H., SO4 beschickt ist, vor sich gehen. Der Zusatz von Schwefelkalium hat den Zweck, etwa vorhandenes Qiiecksillter- amid zu zerlegen und das (^)uecksill)er zu fällen. Durch den Talkzusatz wini starkes Stoüou der Fliissiirkeit heim Kochen verhindert. Wichti',' ist auch, daU der Destillier- kolben auf ein vorher schon erhitztes Sandbad gebracht wird. Geschieht die Erwärmung der Mischung zu laugsam, so erfolgt zuweilen ein rasches Ansaugen der^:— Normal- HjSO^ aus der Vorlage in den Destillationskolben. Erfolirt während der Destillation gelegent- lich ein derartiges stärkeres Ansaugen, so ist die Erhitzung eventuell noch durch eine zweite Gasflamme zu verstärken. Nach 20 Minuten Koch/eit kann man darauf rechnen, dali die Destillation vollendet ist. Soll dann der Kochprozeli unterbrochen werden, so öffnet man zunächst den Yerschlull des Destillierkolbens und löscht dann erst die Flamme. Das in die Vorlage tauchende Rohr wird mit Wasser in die Vorlage hinein ab- und durchgespült. Hierauf wird mit — -Normal-Na < »H austitriert, wieviel Kubikzentimeter der vorgelegten H, SO4 durch Ammoniak gesättigt worden sind. Indikator ist Cochenilletinktur, von der etwa lUcw^ zugegeben werden. Die Menge der gesättigten H., 81)4 = der Zahl der vorge- legten Kubikzentimeter H, SO^, minus der Zahl der zum Titrieren gebrauchten Kubikzentimeter Normallauge. Die Zahl der in der verwendeten KotnnMige enthaltenen Milligramme N erhält man, wenn man die Zahl der durch NH3 gesättigten Kubikzentimeter —-Normal-Ho SO4 mit 2-s multipliziert (1 cm^ — -Xormal-NaOH enthält ^Vs "'^ Na OH und entspricht IT-öm// N H3 0 oder 1^5 = 2-8 mg N). Bei jeder N-Bestimmung ist mindestens eine Kontrollanalyse auszu- führen. Die N-PJestimmungen können auch mit feuchtem Kote ausireführt werden. Man vermeidet dabei etwaige beim Trocknen entstehende N 11 .- ^'erluste. NiU'Jnveis lösHcher und kosigulabler Eiweilikörper in «len Fäzes. Der Nachweis geschieht im witsserigen Fäzesextrakt. In jedem Stuhlgang findet sich dabei ein mit Essigsäure in der Ivälte fällbarer Eiweißkörper, das Nuklen- proteid der Fäzes. Dieses ist, wie alle Nukleine, eine Verbindung von Eiweißk()" Jgt'r Essigsäure Ausfällen der Nukleoproteide im Ileagenzglase. Die hierltei entstehende Trübung wird durch doppeltes Filter ein- beziehentlich mehrmals ab- filtriert. a) Erhält man dadurch wasserklare Filtrate, so überzeugt man sich durch Zusatz von wenigen Tropfen 3— ö^/oiger Essigsäure, ob alles Nu- kleoproteid ausgefällt ist und stellt dann die Eiweißprobe an. h) Bleiben die Filtrate trüb, so läßt man sie jetzt nochmals durch ein kleines mit wenig Kieseiguhr bestreutes Filter hindurchgehen und untersucht in den nunmehr stets klaren Lösungen auf Eiweiß, nachdem man zuvor die Kontrollprobe auf vollständige Entfernung der Nukleine gemacht hat. Die Prüfung des klaren und nnkleoproteidfreien Filtrats auf YA- weiß wird vorgenommen als Essigsäurekochjjrobe unter Na Cl-Zusatz (bei zu geringem Salzgehalt der Fäzes wird die Reaktion undeutlich), als Salpeter- säure-IJingprobe und als Ferrozyankalium])robe. Die Menge des vorhan- denen Eiweißes kann entweder mit dem /.W^^ttV/schen Beagens oder, wie neuerdings TsncJtii/a^) vorschlägt, mit einer l%iii:(^» alkoholischen IMios- phorwolframsäurelösung(Fhosphorwolframsäure FO, Salzsäure frO, OßO/oi^'t^i' ') H. SchlocssDianii, Über Nachweis und Auftreten gelösten EiwiiLies m li.-n 1- ,i/.> Erwachsener. Zeitschr. f. kliu. Med. Bd. GO. II. 3 u. 4. VXÄ). S. 7 des Scii.-Abdr. 2) //. Schlocsswann, 1. c. S. 9 des Sep.-Alulr. ^) J. Tsuchii/a, Die volumetrische Eiweißl)estimmuuir mittelst der l'iiospbor\\. IVtOS. 346 H. Lohrisch. Alkohol lOO-O) bestimmt werden. Diese Lösung soll vor allen Dingen für geringe Eiweißmengen genauer arbeiten als das Esbachsche Eeageus. TsucUya hat dafür besonders geaichte Meßgläschen angegeben. Um zu unterscheiden, ob der Eiweißniederschlag aus Albumin be- steht oder ob daneben noch Albumosen vorhanden sind, gibt es folgende quahtative ünterscheidungsmöghchkeiten (Schloessmann i): Vorsichtiges und langsames Erwärmen des bei der Ferrozyankaliumprobe ent- standenen Xiederschlages. Sind Albumosen in der Fällung, so lösen sich dieselben bei ca. 70° wieder auf und die Trübung schwindet mehr oder weniger. AVeun man nun, ohne -weiter zu erhitzen, das Reagenzglas rasch abkühlt, so fallen die Albumosen wieder aus und die Trübung nimmt zu. Setzt man zu dem vom XukleoiDroteid befreiten klaren Filtrate Salpetersäure im Überschuß zu, so bleibt ein Eiweißniederschlag bestehen, ein Albumoseniederschlag löst sich im Überschuß von Salpetersäure wieder. Die mit Essigsäure stark angesäuerten Lösungen werden zu Ve ilres Yolumens mit konzentrierter Kochsalzlösung versetzt. Hierbei gibt es schon in der Kälte bei starkem Eiweißgehalt einen Niederschlag. Löst sich dieser beim Erwärmen, so besteht er nur aus Albumosen. Sind Alliumin und Albumosen vorhanden, so scheiden sich die Albumosen aus dem warmen Filtrate der gekochten Mischung beim Erkalten wieder aus, während Eliweiß auf dem Filter zurückbleibt. Wie Schloessmann -) bemerkt, werden durch diese :\lbumosenproben immer nur erheblichere xllbumosenmengen nachgewiesen, so daß also selbst spurweise Trübungen berücksichtigt werden können. Erinnert sei hierliei daran, daß das im Filtrat nachweisbare Eiweiß mit dem unverdauten Nahrungseiweiß in keinem Zusammenhange steht. Simon^) hat vorgeschlagen, wenn sich beim Abfiltrieren des Xukleoproteids durch Papierfilter keine klare Lösung erhalten läßt, die Trübung im Überschusse der Essig- säure wieder zu lösen und dann die Eiweißproben anzustellen. SchJoessrnann*) hat aber gezeigt, daß sich das wieder gelöste Nukleoproteid durch Ferrozyankalium zum Teil ausfällen läßt. Mau ist also bei diesem Verfahren Täuschungen ausgesetzt, und der Ferrozyankaliumniederschlag darf nur dann als Eiweißniederschlag gelten, wenn er deutlich stärker ist, als es der Nukleoproteidniederschlag war. Vereinfachtes Verfahren zum gemeinsamen Nachweise von Albumin und Albumosen mit Hilfe der Biuretreaktion von Tsuchiya. ») Das Prinzip der Methode besteht darin, daß man zunächst im wäs- serigen Fäzesextrakt die Nukleoproteide sich vollkommen niederschlagen läßt und das Hvdrobilirubin möulichst entfernt. Wenn man alsdann in das *) E. Schloessmann, Über Nachweis und Auftreten gelösten Eiweißes in den Fäzes Erwachsener. Zeitschr. f. klin. Med. Bd. 60. H. 3 u. 4. 1906. S. 16 u. 17 des Sep.-Abdr. ^) H. Schloessmann, 1. c. S. 20 des Sep.-Abdr. ^) 0. Simon, Über das Vorkommen und den Nachweis gelöster Eiweißkörper in den Fäzes. Arch. f. Verdauungskrankheiteu. Bd. 10. H. 3. 1904^^ S. 197—203. '') H. Schloessmann, 1. c. S. 8 des Sep.-Abdr. ^) J. Tst(chi>/a, Über das Auftreten des gelösten Eiweißes in den Fäzes Erwach- sener und sein Nachweis mittelst der Biuretreaktion. Zeitschr. f. exp. Pathol. u. Thcr. Bd. 5. 1908. Methoden zur Untersuchung der nicnschlirlion Fäzes. J5^7 SO behaiulelte Fäzesoxtrakt ein kleines Stück Kui)fei-snlfata*,''jir hineinwirft, quillt dieses nach einiger Zeit auf und saugt die nukleoproteid- und hvw, der des unteren Ansatzes O'o cm. Dieser Ansatz trägt eine von unten ausgehende Millimeterskala (im ganzen 20 mm) und faßt somit etwa 0-4 cm\ d. h. pro Teilstrich 002 cm^ Flüssigkeit. Das ganze Röhrchen faßt 8 — 9cm-^ In diesem Meßgläschen wird jetzt nochmals, und zwar besonders sorgfältig zentrifugiert und die Höhe des Boden- satzes an der Skala des verdünnten Endes abgelesen. Sollte dessen Höhe über 20 mm hinausgehen, so verteilt man die auf- geschüttelte Flüssigkeit auf 2 Gläschen. Nach erneutem gründ- lichen Aufschütteln wird das Gläschen mit einem gutsitzenden Stöpsel verschlossen und in den Brutschrank gelegt. Nach 24 Stunden wird es herausgenommen und von neuem zentri- fugiert. Die Differenz der Bodensatzhöhen vor und nach der Verdauung gibt den Maßstab für die Menge der verdauten Eiweißreste (Muskelfasern, Bindegewebe) ab. Der Magensaft wird am besteio so hergestellt, daß die Schleimliaut eines Schweine- magens abpräpariert, gehackt und mit bl 0-27oigei' Salzsäure versetzt, kollert, filtriert und mit 2-5.(/ Thymol versetzt wird. Dieser Magensaft bleibt lange wirksam {Hecht'-). Qualitativer Nacliweis des Kaseins. Für den Kaseinnachweis kommen nur Säuglings- und Kiuderfäzes in Frage. Es wird dabei nach Biedert^) in folgender Weise verfahren: Die frischen Fäzes Averden zunächst mit destilliertem Wasser und dünnem Salzwasser, sodann mit sehr verdünnter Salzsäurelösung ausgezogen. Darauf wird gewöhnliche Natronlauge zugesetzt und filtriert. Im Filtrat fällt diu-ch Essigsäure ein starker Niederschlag aus. Was sich davon im Überschuß von Essigsäure löst , ist Kasein (Paranuklein). Die quantitativen Methoden zum Nachweis des Kaseins sind alle höchst ungenau. Biologische Differeuzieruiig der Eiweißkörper im Fäzesextrakt. In neuerer Zeit hat man versucht, den Nachweis der Abstammung des Fäzeseiweißes, ob Nahrungseiweiß oder Körpereiweiß, auf biologischem ^) Ad. Schmidt und J. Strasburger, Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. S. 55. 2. Aufl. Berlin 1905. -) Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglings und des Kindes. S. 66. Berlin und Wien 1910. ^) Zit. nach Ad. Schmidt und J. Strashurger , Die Fäzes des Menschen im nor- malen und krankhaften Zustande. S. 134. 2. Aufl. Berlin 1905. Metlioili'ii zur rntorsucliuiig der iihiivc1,1;,'1i,.ii t'Uzes. 'V',! Wege zu erbringen. Sc/iloessmann^) benutzte hier/u Menschen- nnd HühniT- antiserum vom Fällungsverniöiien 1:25 000. Die lleaktion wiinle in tlen vom Nukleoproteid befreiten essigsauren Fäzesfiltratcn angestellt, und zwar wurden Olc//?^ Immunsernm auf 2 nn-^ Fiizesextrakt zugesetzt. Die Priizi- pitinreaktion mit dem ^lenschenantiserum war immer prompt positiv. Svhloessmann liomcrkt, daß man mit der praktisclicii Vcrwortuui^ der Ucsultute dieser biologischen Eiweißproheii in den Fäzes seiir vorsirlitig sein muß. Nach Ihcht^) hat es keinen Wert, im Stuhl auf biologischem Wege nach Nahrungseiweiß zu faluiden, denn Hamburger hat gefunden . daß das Eiweiß bereits im Magen seine Arteigenheit verliert. Nacliweis der Abbau- uiid Zersetzuiigsproilukte des FiweiUes und der Nukleinsäuren. Purinbasen und Harnsäure (Alloxnrkörper|. Der Nachweis der Nukleiue in den Fäzes und ihrer Abbauprodukte, der Purinbasen (Xanthin, Hypoxanthin, Guanin, Adenin und der Harn- säure) erfolgt nach Krüger und Schittenhclm'-^- *) in folgender Weise : Die ganze frische Tagesmeuge der Fäzes wird mit 1 — 2 /Wasser, dem 1.") bis 20 cm^ konzentrierter H., SO^ zugesetzt sind, zirka o Stunden über freier Flamme am Rückfluükühler erhitzt. Diese Fäzesabkochung wird mit Na- tronlauge alkalisch und dann mit 10 — 20 0)1"^ Eisessig sauer gemacht und auf dem Wasserbad während kurzer Zeit erhitzt, wobei man lOg Oxal- säure zusetzt, um den Kalk auszufällen. Nach dem Erkalten füllt mau auf 1500— 3000 cw^ auf und filtriert durch ein trockenes Faltenfilter. Ist der Niederschlag sehr massig, so muß man ihn mit heijjem Wasser vom Filter spritzen, in einer essigsauren Lösung von Natriumazetat aus- schwemmen, erwärmen, filtrieren und die Filtrate vereinigen. Ein Teil des Filtrats , etwa ')QOciit^, wird in einem Kollieu mit Natronlauge alkalisch gemacht, Natriumbisulfitlösung (auf 100 cy;^^ Filtrat lOcni'^) hinzugefügt nnd zum Kochen erhitzt. Dann fügt man ebensoviel 10" „ige Kupfersulfatlösung hinzu und hält die Flüssigkeit noch durch einige Minuten im Sieden. Der entstehende flockige Niederschlag, der die Kupferoxydulverbiuduugen der Purinkörper (Harnsäure und Purinbasen) enthält, wird auf ein Falten- filter gebracht, ausgewaschen und mit dem Filter in einen l-'ällungskolbeu zurückgebracht. Man fügt zirka 200cm» Wasser hinzu, schüttelt kräftig durch, erhitzt zum Sieden und fügt eine Na.^ S-Lösung hinzu (die man durch Einleiten von Ho S in eine l"/oige Natronlauge hergestellt Imti so Inn-e. bi< ') IL Schloessmann , Über Nachweis und Auftreten gelösten Eiweißes iu den Fäzes Erwachsener. Zeitschr. f. Iclin. Medizin. Bd. (»0. 11. 'i uud 4. 19()(;. S. l'.t und 20 des Sep.-Abdr. '-) Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglings uiul des Kindes. S. 70. Rorli» und Wien 1910. ') Zit. nacli Ad. Hecht , lUe Fäzes des Säuglings und drs i\iiii v -.47—48. Berlin uud Wieu 1910. *) A. Schittenhelm, Die Purinkörper der Fäzes uebst Untersuchungon nber die Purinbasen der Darmwand, der Gallo und des Pankreassaftes. Deutsches Archiv f. klio. Medizin. Bd. 81. H. 5 und 0. S. 427-429. 1904. 352 H. Lohrisch. Bleiazetatpapier deutlich gebräunt wird. Man kocht noch einige Minuten, säuert mit lOVoig^^' Essigsäure an und erhitzt noch weiter, bis das Schwefelkupfer sich zusammenballt. Tritt dies nicht ein und klärt sich die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit nicht genügend, so ge- nügt stets die Zugabe von 5 — 10 cm^ gesättigter Aluminiumazetat- lösung, um nach kurzem Aufkochen eine absolute Klärung zu er- zielen. Der Niederschlag wird nun abfiltriert. Er muß jedoch, um Verluste zu vermeiden, nach dem ersten Abfiltrieren nochmals mit Wasser aus- gekocht und abgesaugt werden. Die vereinigten Filtrate werden unter Zu- satz von 10 cm^ 10"/oiger Salzsäure zur Trockne gebracht und der die Purinbasen enthaltende Trockenrückstand mit öcm^ Salzsäure und etwas Wasser in der Wärme versetzt. Nach dem Erkalten filtriert man von dem geringen Rückstande, der sich in braunen Flocken ausgeschieden hat, ab, wäscht mehrmals mit Wasser und kann nun die Purinbasen nach der Kupfer- oder Silberfällungsmethode bestimmen. Kupferfällungsmethode: Man erhitzt das Filtrat zum Sieden, macht es mit Ammoniak schwach alkalisch, fügt 10 cni^ Natriumbisulfitlösung und 10cm3 Kupfersulfat hinzu, erhält o Minuten im Sieden, filtriert durch ein Faltenfilter aus schwedischem Papier, wäscht mit heißem Wasser nach und bestimmt den Stickstoff nach Kjeldahl. Silberfällungsmethode: Das Filtrat wird mit Ammoniak schwach alkahsch gemacht und mit l{)cm'^ ammoniakalischer Silberlösung und 20 cm^ lOVoigem^'Ha versetzt. Nun fügt man 10 c^/^» ßVoigf'r Dinatriumphosphat- lösung und 5 cm- einer Magnesiaraischung hinzu, wodurch sich ein Nieder- schlag von phosphorsaurer Ammoniakmagnesia bildet. Hierdurch wird das Absetzen des Niederschlages begünstigt und die Filtration des Silbernieder- schlages beschleunigt. Nach zweistündigem Stehen filtriert man den Nieder- schlag ab, wäscht ihn ammoniakfrei, spritzt ihn mit heißem Wasser in einen runden Kolben, vertreibt das Ammoniak durch Magnesia usta-Zusatz, kocht und bestimmt den Stickstoff der zurückbleibenden Silberverbindungen der Purinbasen nach Kjeldahl. Der geringe bräunliche Filterrückstand enthält die etwa in den Fäzes enthaltene Harnsäure und dient zum Nachweis derselben (typische Kri- stalle, Murexidprobe). Ist das Vorhandensein von Harnsäure erwiesen, so kann die Menge derselben durch direkte Wägung oder durch Berechnung aus dem Stickstoffgehalt l)estimnit werden. Reindarstellung der Nukleinsubstanzen nach Micko.^) 10 (/ pulverisierter Trockenkot werden mit 200 cm^ 2-5Voi8em Salz- säurealkohol 20 Stunden stehen gelassen, dann filtriert. Das salzsaure Filtrat enthält keine nennenswerten Mengen organisch gebundenen Phos- phors. Der Filterrückstand wird mit 100 cm^ 2-5o/oigem Salzsäurealkohol, ') Zit. nach H. Ury, Zur Methodik der Fäkaluntersuchuiigen. Deutsche med. Wochenschr. Nr. 41. S. 722. 1901. Methoden zur T'iitorsiicluinir der iiicusclilichcn Filzes. ;.jr,u sodann mit Alkohol bis zur pjitfärhun^- dv^^ Filtr.itos f?ew,ischon. l>;imi wird er mit 2-r)Voiger wässeriger Salzsäure nochmals r' '.•(;" jir<-m Alkohol. Mäßig reichlicher flockiger Niederschlag. Filtration, Trocknung. AVägung. Bestimmung des Nukleinphosphors. Zur Bestimmung des Nukleinphosphors im Kote empfiehlt Hirlit ') nach Kossei zu verfahren: 2 — ög fein gepulverten Kotes werden in einer Porzellanschale 3— 4mal mit 100 cni/^ Alkohol auf dem Wasserbade ge- kocht, vom Alkohol wird abfiltriert. Der Kot wird dann im Soxhietapparat mit Äther extrahiert und trocken mit 10 — 20 rm^ 20%is:t'r Salzsäure ver- rieben. Hierauf werden bis SOcnt^ 20Voi."'Pi' Sabcsäure und nach 12 l»is 20 Stunden locm^ lO'Yoig^i' Tanninlösung zugefügt. Es wird umgerührt und durch ein aschefreies Filter abfiltriert. Sodann erfolgt Waschen des Rückstandes mit Salzsäure und tanninhaltigem Wasser, bis größere Filtrat- mengen keine IM^iCaktion mehr geben. Nun wird das Filter getrocknet, mit Alkohol und Äther gewaschen, getrocknet und sodann die feuchte P-Bestimmung nach Neutnann ausgeführt. Dazu werden 20c)n^ Kjeldahl- schwefelsäure mit 15 — 20^ Ammoniumnitrat allmählich eingetragen. Dann wird mit molybdänsaurem Ammonium und Magnesiamixtur gefällt und aus der pyrophosphorsauren Magnesia der P berechnet. Nach TJry '-) läßt sich der Nukleinphosphor durch Extraktion der Fäzes mit V2VoiS'6r Natronlauge erhalten. Die Tagesmenge Kot wird mit V2%ig6r Natronlauge gründlich extrahiert, auf das \'olumen 1000 c/»' ge- bracht und filtriert. \00 cm^ des Filtrats werden zur Sirupskonsistenz ein- gedickt, alsdann unter Zusatz von 20 g Salpetermischung geschmolzen, die Schmelze in Wasser gelöst und darin in der üiilichcn Weise der 1' bi»- stimmt. Es läßt sich dabei allerdings nicht vermeiden, dal» auch kleine Mengen anorganischen Phosphors mit ins Filtrat übergehen. Indol, Skatol, Phenole, Oxysäureii. Der qualitative Nachweis dieser Fäulnisprodukte wird in folgender Weise ausgeführt (zitiert nach Ad. Schmidt^): ') Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglings und des Kindes. S. 31— 32. Berlin und Wien 1910. '-) H. Urij, Zur Methodik der Fäkaluutersuchuugcn. Unit^clir iiumI Worhenschr. Xr. 41. S. 722. 1901. ^) Ad. Schmidt und J. Slrashurfjn-, Die Fäzes des iMniselien im noriDiilon und kraukhaften Zustande. S. 143-144. 2. Aufl. Berlin lUÜö. Abderhaldon , Handbuch d«M- liinibi'niischon Arbeitsiiu'tlmdi'n. V. 23 354 H. Lobrisch. Die Fäzes werden mit Wasser zu dünnem Brei verrieben und der dritte Teil des Volumens abdestilliert. Dieses Destillat I enthält Indol. Skatol, Phenole und freie Fettsäuren. Destillat I wird mit Natriumkarbonat übersättigt und zum zweiten Male destilliert, wobei die Fettsäuren an Natrium gebunden zurückbleiben. Dieses neue Destillat II enthält Indol, Skatol und Phenole, wird mit Ätzkali stark alkahsch gemacht und wiederum destilliert, wobei die Phenole zurückbleiben. Das neue Destillat III enthält Indol und Skatol. Die im DestiUat II zurückgebliebenen Phenole werden nach Ansäuern des Rückstandes mit Schwefelsäure abdestilliert und im Destillat IV nachgewiesen. Der von der 1. Destillation zurückgebliebene Fäzesrückstand wird mit Schwefelsäure angesäuert , eventuell eingeengt und mit mehreren Por- tionen Äther ausgeschüttelt , das ätherische Extrakt Avird abgedampft, der Rückstand mit etwas Wasser aufgenommen und darin mit Millons Reagens auf die Anwesenheit von Oxy säuren geprüft. Der Nachweis von Oxysäuren ist erbracht, wenn nach Zusatz von Millons Reagens unter Erwärmung Rotfärbung auftritt. Nachweis der Phenole (Destillat IV): Rotfärbung oder roter Nieder- schlag beim Kochen mit Millons Reagens. Violette bis blauschwarze Färbung einer vollkommen neutralen Lösung durch einige Tropfen verdünnter Eisenchloridlösung. Bromwasserzusatz gibt milchige Trübung und dann einen Niederschlag von gelbweißen seideglänzenden Nadeln oder Flocken von Tribromphenol. Nachweis von Indol und Skatol im Destillat III. Indol: Auf Zusatz einiger Tropfen Salpetersäure, die etwas salpetrige Säure enthält, Rotfärbung. Auf Zusatz von Nitroprussidnatriumlösung und Natronlauge tiefe violettblaue Färbung, die auf Zusatz von Eisessig rein blau wird. Ein mit starker Salzsäure befeuchteter Fichtenspahn wird durch al- koholische Indollösung kirschrot gefärbt. Skatol: Auf Zusatz von salpetrige Säure enthaltender Salpetersäure weißUche Trübung. Auf Zusatz von Nitroprussidnatriumlösung intensive Gelbfärbung, auf Zusatz von 1/2 Volumen Eisessig nach Kochen allmählich eintretende Violett- färbung. In konzentrierter Salzsäure löst sich Skatol mit Violettfärbmm-. ^&* Quantitativer Indol nach weis. In den Fäzes ist vorwiegend Indol vorhanden, weniger Skatol. Zum quantitativen (und auch qualitativen) Nachweis des Indols dient das Ehr- lichsche Dimethvlamidobenzaldehvd. Nach ^Id Schmidt^) und Bnuin- *) Ad. Schmidt, Über den Nacbweis uud die Bestimmimg des Indols in den Fäzes mittelst der Ehrlichscheu Dimethylamidobenzaldehydreaktion. Müncbeuer med. Wochen- scbrift. 190:3. Nr. 17. S. 721—722. I Methoden zur L'ntersuchuug der iiieiisclili rm^ absoluten Alkohol zur Verdünnung braucht, um den Absorptionsstreifen gerade noch sichtbar zu lassen. Diese Testlösung benutzt Baumstark -) zu folij-endt-r schatzungsweisegenauenquantitativenBestimmungdesIndolgehaltesderFiiy.es: Je nach der Konsistenz der Stühle werden 2'5 — 8 g oder bei flüssigen Stühlen 10 g Fäzes abgewogen und mit 40 cm^ absolutem .\lkohol so lange verrieben, bis keine gröberen Fäzespartikelchen mehr erkennbai* sind. Nach kurzem Stehenlassen wird durch ein nasses Filter filtriert. Dei- Filterrück- stand gibt nun keinen positiven Ausfall der Reaktion mehr, ein Reweis, daß alles Ridol extrahiert ist. Zu 10 cm^ des Filtrats werden 1 cm'^ Khrlich- sches Reagens und 1 cm^ konzentrierte Salzsäure tropfenweise zugeführt und 10 Minuten laug tüchtig geschüttelt. Von dieser je nach Ausfall der Reaktion rosaroten bis dunkelroten Lösung wird 1 cm^ so lange verdünnt, bis der Absorptionsstreifen gerade noch sichtbar ist (Taschenspektroskop). Alle Verdünnungen müssen inReagenzgiäschen von derselben Weite geschehen. Je 1 an^ der oben erwähnten Testlösung und der zu untersuchenden Stuhlreaktion sind nun mittelst des Extinktionsverfahrens auf dieselbe Konzentration gebracht und können deshalb in einer (ileichung zusammen- gestellt werden. In derselben ist Menge und Indolgehalt der Testlösung und Menge der verdünnten Stuhlprobe bekannt. Berechnung: Ist x— der gesuchten ludoluienge der zur Roaktiim heuutzton 10 nii^ des Stuhlfiltrats und y = der Summe aus dem zur Verdüunuug benutzten 1 cm* der Reaktion + der nötigen Verdünnungsflüssigkeit, so lautet die für jede Ber.'cli- nuug gültige P\)rmel x — OÜUOUlö X y. Diese Berechnung ergibt sich aus folgendem: In 1(X)0 c//i ' der Testlösung ist O005 Indol enthalten, in 1 cm^ demnach 0(X)OOO.J Indol. Dieser eine Kubikzentimeter ist mit 3 c;«' verdünnt, so daÜ die Mentre von 0000005 Indol in 4 cw' aufgelost ist. Dies ist die Testlösung. In 1 cm' derselben ist , 0000005 , , , üann - — -. Indol. \) R. Baumstark, Bestimmungen der Fäulnisprodukte im Urin und in den Fäzes mit Benutzung der EhrlichschQn Aldeiiydreaktion. Münchener med. Wochcnschr. 1903. Nr. 17. S. 722-72:5. '-) Ji. ßauni.stark, \er\vcrtung der A7ii7/r/»schen I)imetiiylamidol>enzaldchydro.ik- tion für eine quantitative Indolprobe in den Fäzes nebst Untersucbuiigen über die Eiweißfäulnis im Darme. Archiv für Verdauungskrankheiten. Rd. 9 II. li. S. iü4— 2f»ö. 1903. 23» 356 H. Lohrisch. Ist nuu X = der gesuchten Indolmenge der 10 cm^ Stuhlfiltrat, die zur Her- stellung der Probe benutzt \Yurden. und v = der Menge der verdünnten Probe, in der 1 c»i^ der 10 zur Reaktion benutzten Kubikzentimeter des Stuhlfiltrats enthalten ist, j- r. 1 0000005 X 12 X y , ,^ , ., t t. , so lautet die Formel x = ;; . und zwar 12mal, weil die Probe von 10 cm^, von der 1 cm^ verdünnt wurde, nach der Ausführung der Reaktion auf 12 cm^ 12 angewachsen ist. Nach Ausrechnung der Division —— und der Multiplikation 0"000005x 3 resultiert die Formel x = 0000015 X y. Es erübrigt dann noch die ■weitere Ausrechnung des Indolgehaltes der täglichen Stuhlmeuge. Bei der Extraktion der Fäzes mit Alkoliol geht Urobilin mit über. Der Absorptionsstreifen desselben stört bei der oben genannten Verdün- nung nicht. Da das Urobilinogen (Hydrobilirubinogen) die gleiche Reaktion wie Indol gibt, so ist vor Anstellung der Probe darauf zu achten, daß dieser Körper entfernt wird. Das kann durch Überführung in Hydrobili- rubin mittelst Jodtinktur oder Chlorzink oder durch Ausschütteln mit Petroläther geschehen {Äd. Schmidt ^). V. Moraczewski 2) hält die quantitative Indolbestimnmng mit Hilfe einer Xitroverl)indung des Indols für exakter als die BaumstarJcsche Me- thode. Er verfährt folgendermaßen: 30 — 40 g Kot bei fester Konsistenz (entsprechend mehr bei flüssiger, jedoch nie mehr als 100 g) werden in einem IbOO c»i^ fassenden Kolben mit 700 cwi^ Wasser versetzt und daraus unter Anwendung eines Deflegmators für stark schäumende Flüssigkeiten 500 cm^ abdestiUiert. Da die Fäzes meist schwach alkalisch reagieren, so ist kein Zusatz von Alkalien erforderhch. Ein Zusatz von Säuren führt zu Verlusten, obgleich das Kochen dabei entschieden ruhiger verläuft. Das Schäumen der Flüssigkeit kann durch sorgfältiges Überwachen der Flamme, besonders beim Beginn des Kochens, in Grenzen gehalten werden. Von den 500 cvi,^ des Destillates werden nach gutem Umschütteln 150 cni^ genommen, mit 10 Tropfen konzentrierter Schwefelsäure und 1 g Kieseiguhr versetzt, kräftig geschüttelt und klar filtriert. In dem Filtrat erzeugen 2 — 8 Tropfen einer 27ooi§'en Xatriumnitritlösung eine Rosafär- bung, welche nach 2 — 3 Stunden ihren Höhepunkt erreicht hat. Die so gewonnene Lösung wird mit einer Stammlösung im Kolori- meter von Woljf^) verglichen. Die Stammlösung wird folgendermaßen be- reitet: 1 cm3 lo/oiger IndoUösung (ir«A/6aM7/?-Berlin) wird in 500 cm^ Wasser genau gelöst, davon 5 cm^ abpipettiert und in einen Meßkolben mit zehn Tropfen Schwefelsäure und 2 — 5 Tropfen Xatriumnitritlösung versetzt und auf 100 cm^^ aufgefüllt. Jeder Kubikzentimeter enthält 0-000002 Indol. Mit der Stammlösung werden die 100 cm.'^ des Destillates verglichen und von ^) Ad. Schmidt und J. Strasburger, Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 145. Berlin 1905. -) W. i\ Moraczewski, Über den Mangel von Relation zwischen Harnindikan und Kotindol. Archiv für Yerdauungskrankheiten. Bd. 14. S. 375—381. 1908. ^) G. und //. Kriiss, Spektralanalyse und Kolorimetrie. S. 17. Leipzig und Ham- burg 1891. Methoden zur Untersuchung der menschlichen Fäzes. J\r^"7 der zu prüfeiKlon Lösiin"- so laiifre abi:ie u. IMicniiuc. IM 7. M '2. S. 438-440. 1910. •') M. FJirenpfordt , Kritik der Strasliitri/irscUvu \ViiLniui:sinetli(»il«' dti Kotluk- terien hinsiclitlich ilirer absoluten Werte. Zeitsrlir. f. e.xp. l'atliol. u. 'llu-r. IM 7 M '' S. 4.J5— 4Gü. I'JIO. 360 H. Lohrisch. festgestellt worden ist, mit der Hälfte ihres Volumens, sehr harte Stühle mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt und zu einer breiartigen Beschaffen- heit verrieben. Das Volumen dünnbreiiger und flüssiger Stühle kann direkt in weiten Glasmeßzylindern gemessen werden. Auch sie werden sorgfältig verrieben, um eine gleichmäßige Verteilung aller Bestandteile zu erhalten. Ein kleiner für die Untersuchung speziell bestimmter Teil der so vorbe- reiteten Stuhlmasse wird nun in einem kleinen Porzellanmörser noch ein- mal aufs feinste verrieben. Von dieser Masse werden alsdann im Meß- zylinder bestimmte Mengen, welche 2 cm^ der ursprünglichen Stühle ent- sprechen müssen (von normal konsistenten Stuhlgängen gewöhnlich 3 cm^; von Stühlen, die sehr hart waren und infolgedessen, wie oben erwähnt, mit dem gleichen Volumen Wasser verrieben wurden, 4cm^: von dünn- flüssigen Stühlen dagegen mehr, bis zu 10 cm^), abgemessen und zur Be- stimmung der Trockensubstanz, eine zweite ebenso abgemessene Portion zur Bestimmung der Bakterienmenge verwendet. Zur Trockensubstanzbe- stimmung wird die abgewogene Kotmenge in einem Abdampfschälchen mit der gleichen oder doppelten Menge Alkohol verrührt, auf dem Wasserbade lufttrocken gemacht und im Trockenschrank oder Exsikkator bis zur Ge- wichtskonstanz getrocknet. Die zur Bakterienwägung abgemessene Kotmenge, die also 2 cm^ des ursprünglichen Kotes enthält, wird nun mit 40 cm^ O'öVfliger HCl gut verrieben und mit geringer Kraft 5 Minuten lang mittelst elektrischer Zentrifuge bei 1500 Umdrehungen pro Minute aus- geschleudert. Die über dem Bodensatz befindliche trübe bakterienhaltige Flüssigkeit wird abgesaugt und in einen Meßzylinder gegossen, der Boden- satz erneut mit Salzsäurelösung verrieben resp. im Zentrifugenglas mit Salzsäure vermischt und ausgiebig durchgeschüttelt, wieder in derselben Weise wie oben zentrifugiert (5 Minuten, 1500 Umdrehungen) und dieses Verfahren etwa 5 — 6mal, selten noch ein 7. Mal wiederholt, bis die Flüssig- keit nach dem Zentrifugieren fast klar ist. Um eine möglichst gute und gleichmäßig verteilte Bakterienaufschwemmung zu erhalten und das Zu- sammenbacken von Bakterienhäufchen tunlichst zu vermeiden, raten Berger und Tsuchiya, möglichst große Flüssigkeitsmengen zu verwenden, so daß am Schlüsse der wiederholten Ausschleuderungen mindestens 200, meist sogar 250 — 3U0 cm^ salzsaurer bakterienhaltiger Flüssigkeit im ZyUnder enthalten sind. Nun wird die ganze Flüssigkeit nochmals, und zwar kräftig (5 Minuten, 2000 Umdrehungen) in einzelnen Portionen ausgeschleudert. Der hierbei erhaltene, manchmal noch recht beträchtliche Bodensatz zeigt mikroskopisch neben sonstigen Fäzesbestandteilen noch ziemlich reichliche Bakterienhäufchen. Der Bodensatz wird deshalb nochmals mit Salzsäure- lösung versetzt, durchgeschüttelt und ausgeschleudert (5 Minuten, 1500 Um- drehungen pro Minute). In dem nunmehr sich ergebenden Bodensatze sind kaum noch Bakterien nachzuweisen. Die gesamte Bakterienaufschwemmung wird jetzt mit 96"/oigem Alkohol in gleicher Menge versetzt, über 24 Stun- den auf dem Wasserbade bei 40^ C unter mehrmals erneutem Alkoholzu- satz auf etwa bQ cm'^ eingeengt, alsdann nochmals mit 96°/ui8'em Alkohol Methoilcu zur Untersiicliun;.' di-r moiiscliliclinn Filzes. ;j»;i versetzt und mit i>Toijor (Jeschwindinkcit ö Minuten lan;.,' aus^'cschlcudort. Die nun den Bodensatz bildenden IJakterien werden schließlich mit aliso- lutem Alkohol auspewasehen. Hierauf wiril mit Atlicr entfettet. Zu diesem Zwecke wird das Zentrifujieniilas mit einem Oiimmikork verschlossen. Strasburr/cT^) empfiehlt, da der Kork leicht al»si)rin frischem Kot und das Trockengewicht der Bakterien (b) in einer ebenso großen Portion. Wird der Prozentgehalt des trockenen Kotes an trockenen Bakterien mit x bezeichnet, so ist x = . Um die Gesamtmenge der a Bakterien in 24 Stunden zu finden, wird das \'olumen des frischen Tages- kotes (c) (Durchschnitt aus 3 Tagen) bestimmt. Das Gewicht der trockenen, in einem Tage entleerten Bakterien ist dann — . c. Ehrenpfordt*) empfiehlt, daß der Untersucher in allen EinzeUiestiminunuren pein- lichst genau die obige Methodik einhält, besonders immer gleiche AnsschlciidiTungszcit und Umdrehungszahl beilieliiilt. um vergleichbare Resultate zu erhalten. Kiirentlich müßte nach Ehrenpfordt zunächst jcd(>r Untorsucher einiire NormalstiUilc venirlteitfu und seine übrigen Werte dann in Beziehung zu den gefundenen Normalwerton setzen. denn die Werte, die die einzelnen Autoren mit der niclit oder weniir modifizierten Strasbiir (/ersehen Methode erzielt hal)cn, gehen noch sehr auseinander. Zum Absaugen der bakterienhaltigen salzsauren Flüssigkeit und zu- letzt des Alkohols über dem Bodensatz hat Stnishurcjer '>) eine gut funk- tionierende Saugvorrichtung angegeben (Fig. 98). Erforderlich sind zwei Spritzflaschen, deren Gummipfropfen jeder 3 Durch- bohrungen aufweist. Durch das erste Loch geht ein Glasrohr bis beinahe auf den (inind eines jeden Gefäßes und ist außen scliräg abgebogen. Das zweite Loch trägt ein kurzes Piöhrclien. Durch einen (nnnmischlauch von etwa 2.5 c»« Länge siml difse Hnlircheu beider Flaschen miteinander verbunden. In einem Stativ ist die eine Flasche mit der Mündung nach unten befestigt, die andere Flasche stellt unter ihr. Das dritte Loch *) Ad. Schmidt und J. Strashnrger, Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 2;38. Anmerkunir 3. Berlin 190."). -) 7'5. Sato, Über die Bestimmuniren der BakterienmenL'e in den Fäzes des Men- schen. Zeitsclir. f. exp. Pathol. u. Ther. B.l. 7. 11. 1. S. 4H2. l'.tlU. «) Ad. Schmidt und J. Strasburger, 1. c. S. 258-259. *) M. Ehrenpfordt. Kritik der Sfrasbiiri/i r^chou \Väguii<:smetlniiien dor Kotliak- terien hinsichtlich ihrer absoluten Werte. Zeitsclir. f. e.xp. raflinl. u. 'I'lior. Bd. 7. 11 2. S. 465. 1910. ^) J. Strashnrger, UntersucliuiiL'en über die Bakteriiiimenu'e in den menscblKlicu Fäzes. Zeitschr. f. klin. Medizin. Bil. W. H. ;'> und t». S. 9 des Sep.-Al'dr. 362 H. Lohrisch. der oberen Flasche ist durch einen Glasstab verschlossen, das der unteren Flasche bleibt offen. Das obere Gefäß wird mit Wasser gefüllt. Öffnet man jetzt die bei a angebrachte Schlauchklemme, so läuft Wasser in das untere Gefäß, dessen Luft durch das offene Loch im Stopfen entweicht. Durch das Rohr h wird Luft eingesaugt. Dieses Rohr bringt man nun noch in Verbindung mit einem Gefäß, in welches die bakterienhaltige Flüssig- keit hineingesaugt werden soll. Letzteres trägt einen mit zugespitztem Glasrohre und Klemme versehenen Schlauch c. Bei Benutzung des Apparates wird erst die Klemme a geöffnet, dann das Eöhrchen bei c zum Absaugen benutzt, wobei die dort befindliche Klemme eine genaue Regulierung der Geschwindigkeit erlaubt. Ist die obere Flasche leer gelaufen, so wird der Schlauch h abgenommen, an das entsprechende Rohr Fig- 98- Fig. 99. der unteren Flasche befestigt, desgleichen das Glasstäbchen, welches das dritte Loch im Pfropfen verschließt, ausgetauscht und man braucht nur noch die beiden Flaschen umzuwechseln , um von neuem ansaugen zu können. Einfacher und ebenso zweck- mäßig scheint die von Sato'^) an- gegebene mit Gummiballon armierte Absaugpipette (Fig. 99) zu sein. Um die Bakterien aus stark fetthaltigen Stühlen zu isoheren, setzt Strasburger '-) der ersten Stuhl- emulsion Alkohol und Äther zu gleichen Teilen zu und bringt dieses Gemisch, nachdem es gründUch verrieben worden ist, in das Zentrifugenglas. Beim Ausschleudern bilden sich drei Schichten , zu oberst die alkoholisch-ätherische Fettlösung , dann folgt die bakterienhaltige Mittelschicht und endlich ein Bodensatz. Die Mittelschicht wird abgesaugt; zu dem Rückstände kann man noch etwas Alkohol und Äther zusetzen, ihn verreiben und nochmals zentrif ugieren , worauf man die gesamte alkoholisch-ätherische Fettlösung absaugt und weggießt. Der *) Ts. Sato, Über die Bestimmungen der Bakterienmenge in den Fäzes des Menschen. Zeitschr. f. experim. Pathol. u. Therapie. B. 7. H. 2. S. 431. 1910. ^) J. Strasbtirf/er , Untersuchungen über die Baktorienmenge in den menschlichen Fäzes. Zeitschr. f. klin. Medizin. Bd. 46. H. 5 u. 6. S. 21 des Sep.-Abdr. Methoden zur Unteisiicluiiig der ineiisclilic-heii Fäzes. ;^»j;.» Bodensatz wird (hmn wie oben weiter verarbeitet. Die ;ihf,'esauj,'t»' Mittel- schicht muß natürlich den später ahj;o<,^ossenen baktericidialti^r,.,, nussig- keiten zuiiefügt werden. Gefärbte Bakterien p r ä parate. Die Mikrooriianismon müssen von den üliritron Kothestandteilcti >:ctrciint wfrd.-n. Hierzu wird ähnlich verfahren, wie bei der i>/ra>ihiir;/(r>c\n'\i Baktoricnwa^rnnt:. .Mau verreibt eine kleine E'äzesmenge, etwa von der Größe einer halben Erbse, mit einigen Kubikzentimetern Wasser, zentrifuiriert und gießt dann vom IJodensatze die trübe Flüssig- keit ab, verdünnt einen Teil derselben mit 2 Teilen Ü6" „igem Alkohol und zentrifugiert von neuem. Von dem jetzt erhaltenen bakterienhaltigen Bodensatze bringt man eine kleine Menge auf den Objektträger, läßt die Flüssigkeit ablaufen und verfeilt die Bakterien in gleichmäßiger Sehicht auf den Objektträger, indem man einen zweiten 0])jcktträger aufdeckt und von dem ersten abzieht. Es entsteht so eine sehr feine gleich- mäßige Schicht, welche über der Flamme fixiert wird. Zur Färbung kommen iu Be- tracht Lö/Jicrs Methylenl)lau. zehnfach verdünnte wässerige Li'achweise von Tuberkelbazillen, starke Lu(/»l>c\\e Lösung (Jod l'O, Jodkali 2'0, Aqua dest. SO'O) zur Färbung granulosebaltiger Pilze. Um ein tjbersichtsbild über die Kotflora zu bekommen, eignet sich sehr gut die Färbung nach Weigert-Escheridi,^), eine modifizierte GramfürliuiiLr. Hierzu benötigt man: Gentianaviolettlösung (2 g Gentianaviolett werden mit 2CMJ r;//' A(|ua dest. eine halbe Stunde gekocht und filtriert; die Lösung ist lange haltbar); Anilinalkohol (11 cm* Alk. absol. werden mit Sc/«' Anilimil gemischt); Lxf/ohcho Lösung; Anilinölxybd zu gleichen Teilen; reines Xylol. Man mischt die Gentianaviolettlösung mit dem Anilinöl- alkohol im Verhältnis vonSVo^tVo) färbt damit eine halbe Minute und tupft mit Fließ- papier ab. Dann bringt man LugolschQ Lösung auf den Objektträger und tupft gleich wieder ab. Dann läßt man Anilincilxylol auftropfen und wieder aliflieüen so lansre, bis keine blaue Farbe mehr abgegeben wird, spült zum Schluß einmal mit reinem Xybd ab und trocknet. Zur Nachfärbung dient schwache wässerige Fuchsinlösung oder eine mit gleichen Teilen Alkohol aI)solut. versetzte konzentrierte alknh) Zitiert nach .7. Strashurgcr: Äd. Schmidt und ./. Straxliurgrr, Die Fii7.cs dos Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 2(il. IJerlin 191).'». -) Ad. Schmidt und .7. Strashurgcr, Die Fäzes de^ Mcnsclim im norni;ilen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 265-279. *) A. Combe, Die intestinale Autointoxikation und ilire Hchandlunir. CltorseUtt von C. WegeJe. S. 145—147. Stuttgart 1909. 364 H. Lohrisch. stuhl ; flüssiges an der Luft erstarrendes Neutralfett). Geringere Grade von Fettstühlen erkennt man an der lehm artigen salbigen Konsistenz der Fäzes und der helleren Farbe. In seltenen Fällen (bei starken Diarrhöen) kommen nach Ad. Schmidt^) kleine weißgelbliche weiche Fettklümpchen vor, die im Mikroskop als Fett zu identifizieren sind. Neutralfett erscheint im mikroskopischen Präparat in Form matt- glänzender, unregelmäßig begrenzter Schollen und Platten und in Form von meist gelbhch gefärbten Tropfen. Die Tropfen sind ohne weiteres als Neutralfett anzusprechen. Die Schollen können durch Erhitzen zum Schmelzen und Zusammenfließen gebracht werden und erstarren beim Abkühlen wieder zu undurchsichtigen Schollen. Das Neutralfett ist unlöslich in Wasser, wenig löslich in kaltem Alkohol, leicht löshch in Äther, Chloroform und heißem Alkohol. Mit Uberosmium säure färbt sich Neutralfett gelbbraun bis schwarz, mit alkoholischer Lösung von Sudan III rot. Die freien höheren Fettsäuren erscheinen im Stuhl zum Teil als unregelmäßige Schollen , die meist kleiner und kompakter sind als die NeutraUettschollen, oder in Form der bekannten langen, dünn geschwungenen, spitz auslaufenden, ungefärbten Fettsäurenadeln. Mikrochemisch unterscheiden sie sich vom Neutralfette dadurch, daß sie in kaltem Alkohol leicht löslich sind. Osmium und Sudan färben die Nadeln nicht, wohl aber die Schollen. Seifen kommen ebenfalls als Schollen und als Kristalle vor. Die Schollen sind undurchsichtig, meist eckig begrenzt, größer und kleiner, leicht zerbrechlich, von kristallinischem Bruch. Zum Teil sind sie hellgelb bis gelbbraun gefärbt (Nothnagels gelbe Kalksalze = fettsaurer Kalk). Zum Teil sind die Kalkseifen ungefärbt . weiß. Eine andere Form der Seifen sind die Yon Ad. Schmidt'^) beschriebenen ..Kringelformen", ..runde Gebilde mit erhabenem Kande und vertieftem Zentrum. Sie haben bei oberfläch- licher Betrachtung große Ähnlichkeit mit Bandwurmeiern, die noch dadurch erhöht wird, daß der Ptand manchmal eine feine radiäre Strichelung zeigt, auch im Zentrum findet sich bei einigen kristallinische Zeichnung. Sie sind nicht immer wohlausgebildet, sondern häufig zerbröckelt und kommen farblos oder gelb gefärbt vor". Die Seifenkristalle sind ungefärbte Nadeln, die kürzer, plumper, dicker und weniger spitz sind als die Fettsäurenadeln und oft in Form von Drusen und Büscheln auftreten. Die meisten der Schollen, Kringel und Nadeln sind Kalkseifen. Nach- weis : Erwärmung des mit H, SO4 versetzten mikroskopischen Präparates. Die Seifen sind dann verschwunden ; nach dem Erkalten treten Gipskristalle in Form feiner Spieße und langgezogener Rhomben auf. Einfaches Erwärmen löst die Seifen nicht. Beim Erhitzen eines mit 30°/oiger Essigsäure innig vermischten Fäzespartikelchens auf dem Objekt- M Ad. Schmidt, Die Fuuktionsprüfung des Darmes mittelst der Probekost. 2. Aufl. S. 16. Wiesbaden 1908. -) Ad. Schmidt und J. Strasburg/er , Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 67. Berlin 1905. Mothoileii zur Untcrsuchiuig der nienschliclicii Filzes. ;-jg5 träger bei aufgelegtem Deckglas schinelzen die Seifen zu FeHsaun-tropfon, die mikroskopisch gut zu sehen sind und heim Krkaltcn rasch mit einem Kuck zu undurchsichtigen Schollen erstarren. Siiurcn, Alkalien und .Vmmoniak ^virken auf die Seifen in der Kälte nicht ein. Ebensowenig wirken lösend heißes Wasser, Äther und Alkohol. Durch Osmiumsäure und Sudan findet keine Färbung statt. Um alle ,') Formen des Fettes durch Färbung gleichzeitig differen- zieren zu können, soll ein hei Hecht '^) zitiertes, von Jakohson angegebenes Verfahren geeignet sein: Das Stuhlpriiparat wird auf dem Oiijektträger mit einer verdünnten Karholfuchsinlösung (4—0 Tropfen Karbolfnchsin auf ein Reagenzglas xV([ua dest.) behandelt. Mit dieser Lösung färben sich die Neutralfetttröpfchen nicht, die Seifen färben sich rosa, die freien Fett- säuren aber leuchtend rot. Auf diese Weise gelingt es, Tröpfchen, die ätherlöslich sind und die Färbung mit Osmium annehmen , die man also für Neutralfett gehalten hätte, als freie Fettsäuren zu erkennen. Jakobson fand diese lleaktion besonders in pathologischen Säuglingskoten. Halit hält die Reaktion nich<: für beweisend zur Diagnose eines ausschlielilich aus freier Säure bestehenden Tröpfchens. Der chemisclie Nac.lnveis des Fettes. Der chemische Nachweis des Fettes ergibt sich zum Teil aus den vorstehenden mikrochemischen Reaktionen. Ganz grob ist die Anwesenheit von Fett zu demonstrieren, wenn man die Fäzes mit Äther verreibt und einige Tropfen des abgehobenen Äthers auf Fließpapier verdunsten läßt; es hinterbleibt ein mit Wasser nicht zu ent- fernender Fettfleck. P'erner ist zum einfachen chemischen Nachweis des Fettes im Stuhl das oben beschriebene mikroskopische Kssigsäurepräparat (Kochen mit Essigsäure) geeignet, in dem man nach dem Erhitzen die Fettsäuretröpfchen sehr schön sehen kann. Bestimmung der Gesamtfettmenge als Gesaratätherextrakt. Die Fette Averden mit Äther im Soxhletapparat extrahiert, lin alles Fett zu bekommen, ist es nötig, vorher die mit Äther nicht extra- hierbaren Seifen zu spalten. Dies geschieht folgendermaben : Eine größere Quantität der in der früher geschilderten Weise lufttrocken gemachten pulverisierten Fäzes wird in einem PorzellanschiUchen mit Poigen» H^'l- Alkohol Übergossen und verrührt und auf dem Wasserbade zur Trockne eingedampft. Hierbei ist öfter umzurühren und gut zu mischen, da sich bei sehr fetthaltigen Stühlen das Fett gern an der Oberfläche und an der Wand der Schale ansammelt. Darauf wird wieder pulverisiert und luft- trocken gemacht. Zur Extraktion werden Proben von 2~:^<| des gespaltenen Kotes im Wiegegläschen abgewogen und in die zur Extraktion nötige l'ajiier- patrone gebracht. F^xtrahiert wird drei Tage lang mit wasserfreiem Äther ^) Ad. Hecht, Die Fiizos des Säuglings und dos Kindes. S. ll'.i. Uerliii und AVieii 1910. ;^gg H. Lohrisch. auf dem Wasserbade, welches zweckmäßiger Weise durch GKihlampen er- wärmt wird. Das in dem untersten Kolben des Apparates angesammelte Ätherextrakt wird eingedampft, wieder mit Äther aufgenommen und in ein kleines gewogenes Becherglas filtriert, woliei das Filter sorgfältig mit Äther auszuwaschen ist. Das Filtrat wird eingedampft. Etwa im (xlase noch vorhandene Ätherdämpfe werden durch P^inblasen von Luft mittelst eines Glasrohres in das mit der Öffnung nach unten gehaltene Glas entfernt. Dann wird im Exsikkator über Hg SO4 getrocknet und gewogen. Stets sind 1 — 2 Kontrollanalysen auszuführen. Man erhält auf diese Weise das Gesamtätherextrakt. Rosenfeld ^) empfiehlt zur Bestimmung des Gesamtätherextraktes folgende kürzere Methode: Die wie oben mit HCl-Alkohol gespaltenen Fäzes werden in der Papierpatrone eine halbe Stunde lang in Alkohol in einem Becherglase auf dem Wasserbade ausgekocht. Nach Trocknen der Patrone ^1rd sie oben zugebunden und 6 Stunden im Soxhletapparat mit Chloro- form extrahiert. Alkoholextrakt und Chloroformextrakt werden jedes für sich zur Trockene eingedampft, mit Äther wieder aufgenommen, wie oben filtriert und die Filtrate vereinigt. In dem Gesamtätherextrakt sind auch die flüchtigen Fettsäuren (deren Nachweis s. S. 386 und 387) und die Lipoide enthalten. Für die Zwecke der gewöhnlichen Fäzesanalyse sind diese geringfügigen Bei- mengungen unwesenthch. Wenn Wert darauf gelegt wird, diese Substanzen zu vermeiden, können sie entfernt v;erden. Die Entfernung der flüchtigen Fettsäuren aus dem Ge- samtätherextrakt geschieht durch Auswaschen des Extraktes mit heißem Wasser. Man gießt etwas heißes Wasser auf das trockene Extrakt, schwenkt öfters um und filtriert durch ein kleines glattes Filter, auf welchem etwaige von dem Wasser mit aufgenommene Fetttropfen zurückbleiben. Diese Pro- zedur wird häufig wiederholt. Hierauf werden das Bechergläschen mit dem Reste des Ätherextraktes und das Filter im Trockenschrank und Exsikkator getrocknet, das Fett des Filters mit Äther in das Becherglas mit dem Rest des Ätherexiraktes zurückgespült. Dann wird eingedampft und wie oben getrocknet und gewogen. Lipoide. Die Entfernung des Cholestearins 2) geschieht unter Benutzung der Tatsache, daß Cholestearin nicht verseifbar ist. Wenn also das Ge- samtätherextrakt verseift und dann mit Äther extrahiert wird, so geht nur das Cholestearin in den Äther über. Die Ausführung ist so, daß das trockene Gesamtätherextrakt mit alkoholischer Normal-Kalilauge (auf etwa lg Extrakt zirka 20 g Lauge) zirka V2 Stunde auf dem Wasserbade ge- 1) Zitiert nach Ad. Schmidt uud J. Straslurger , Die Fäzes des Mensclien im normaleu und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 151. Berlin 1905. 2) Zitiert nach Ad. Schmidt und ./. Strasbiirger , 1. c. S. 153. Mctlioilcu zur liitorsucliiiiig der niciischliclHMi Käze>^. -jk-? kocht wird. I)anii wird eingedanii)ft und dci- lliicksland mit Atlicr ans{?e- zogcii. In doni ätherisfiion Auszuj^o ist das Cholcstoariii cntlialtcn. I>r»r Ixiickstaml wird mit ivichlich Wasser f^olüst. mit vcrdiimitcr H., SO^ aiif^e- säuert. Die dadurch wieder gewomieiieii Fettsäuren wenh-n durch Schütteln mit Äther oder durch Filtration und Auswaschen des das Fett enthaltenden Filters mit Äther i^ewonnen. Kassel^) empfiehlt folgendes Verfahren: Nerseifunir ^V^y^ in reichlich Äther wieder gelösten Gesamtätherextraktes mit einigen Kuhik/entimetern Xatriumalkoholat (durch Auflösen von Oiör/ Natrium in einer möglichst geringen Menge 99''/oigc^n Alkohols in der Wärme hergestellt;, l'mschütteln und dreistündiges Stehenlassen hei Zimmertemperatur. Alifiltrieicn der Seifen, welche durch Waschen mit Äther vom Cholestearin hefreit werden. Beide Methoden hal)t'n den unvermeidlichen Chelstand, dal'i ganz kleine Mengen Seifen in den Ätherauszug des verseiften Fettes mit iiher- gehen können. Der qualitative Nachweis des Cholestearins in dem ätherischen Auszug des verseiften Gesamtätherextraktes geschieht so. dai'i der ätherische Auszug eingedampft und der Rückstand mit heillem Alkohol aufgenommen wird. Läßt man auf dem Objektträger einen Tropfen der alkoholischen Lösung verdampfen, so bleibt das Cholestearin in Form der bekannten rhombischen Tafeln, im Mikroskop gut sichtbar, zurück. Oder man versetzt eine Lösung des Cholestearins in Chloroform mit H2 SO4 : man erhält bei Anwesenheit von Cholestearin eine blutrote, später purpurrote Färbung. Die quantitative Bestimmung des Cholestearins ge.schieht durch Eindampfen des ätherischen Auszuges aus dem verseiften Gesanit- ätherextrakt und Wägung des Rückstandes. Dabei ist zu bedenken, daß leicht etwas Seife mit in das Extrakt gegangen sein könnte. Tm sie zu entfernen, behandelt man das eingetrocknete Cholestearinextrakt mit mehreren kleinen Portionen Alkohol und 1 — 2 Tropfen Salzsäure, wobei Cholestearin ungelöst bleil)t, während die Seifen gelöst werden. Neben dem Cholestearin kommt das ihm nahe verwandte Koprostear in vor. Dieses ist ebenso in Äther löslich wie Cholestearin, labt sich incht verseifen, wird also ebenso gewonnen wie Cholestearin. Es ist abt-r in heibem und kaltem Alkohol löslich und kristallisiert aus der alkoholichcii un normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 1j3. Berlin liKJ."). 368 H. Lohrisch. in den Fäzes vor und gellt mit in das Ätherextrakt über. Bei der Ver- seilung des Gesamtätherextraktes wird es gespalten. Sein Fettsäureanteil bleibt bei den Seifen. Sein Glyzerinphosphorsäureanteil geht bei der Ent- fernung der Cholalsäure (vgl. ..Nachweis der Gallensäuren", S, 389) als giyzeriuphosphorsaurer Baryt mit ins Waschwasser über. Eventuell kann das Lezithin als ganzes bestimmt werden aus dem Phosphorgehalte des verseiften Gesamtätherextraktes, w^obei Hoppe- Seyler^) folgendermaßen ver- fährt: Die wässerige, durch Äther vom Cholestearin befreite Seifenlösung wird mit einem Überschuß von Salpeter versetzt, in der Platinschale zur Trockne verdunstet , der Rückstand bis zur Entfernung der Kohle , aber nicht länger, geschmolzen, die Schmelze nach dem Erkalten in heißem Wasser gelöst , im Becherglase mit starker Salpetersäure unter Bedeckung des Glases stark sauer gemacht, einige Zeit im offenen Glase zur Ent- fernung der Untersalpetersäure auf dem Wasserbade digeriert, dann mit einer Lösung von molybdänsaurem Ammoniak in Salpetersäure gefällt und 12 Stunden stehen gelassen. Der hierauf abzufiltrierende , nicht w^eiter zu waschende Niederschlag von phosphormolybdänsaurem Ammoniak wird in verdünntem Ätzammoniak gelöst, die Lösung mit klarer ammoniakalischer Magnesialösung gefällt, 12 Stunden kalt stehen gelassen, der Niederschlag auf kleinem Filter gesammelt, mit verdünntem Ammoniak gewaschen, ge- trocknet, stark geglüht bis zur Entfernung der Kohle, im Exsikkator er- kalten gelassen und gewogen. Man findet das Gewicht der pyrophosphor- sauren Magnesia; dieses mit 7"27 multipUziert, ergibt das Lezithin des Ätherauszuges als Distearyllecithin. Quantitative Bestimmung des Neutralfettes, der Seifen und Fettsäuren nach Fr. Müller.-) Zunächst werden die lufttrocken pulverisierten Fäzes, die ohne Schwefelsäurezusatz getrocknet sein müssen, mit Äther im Soxhletapparat extrahiert. Das hierbei gewonnene Extrakt enthält die Neutralfette und Fettsäuren. Die in der Patrone zurückgebliebene Substanz wird hierauf mit Salzsäurealkohol gespalten und nochmals mit Äther extrahiert. Dieses zweite Extrakt enthält die aus den Seifen abgespaltenen Fettsäuren. Aus dem ersten Extrakte werden die flüchtigen Fettsäuren, wie oben beschrieben, mit heißem Wasser entfernt, der Ptückstand getrocknet, gewogen und nach erneuter Lösung in Ätheralkohol mit alkoholischer KaUlauge zur Be- stimmung des Säuregrades titriert. Hierzu verwendet man eine alkoholische -^--j--- Norm alkalilauge, als Indikator Phenolphtalein. Fr. Müller legte der Berechnung das Molekulargewicht der Stearinsäure zugrunde (1 cm^ —-Normalkalilauge — 0*0284: Stearinsäure) ; es werden also die Anzahl der I ') Zitiert nach Ad. Schmidt und ,7. Strashurger , Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 167. Berlin 1905. -) Zitiert nach Ad. Schmidt und J. Stra<^burger , 1. c. S. 153 Methoiloii zur riitorstichiinir der iiiciiscliliclipn Fäzes. verbrauchten Kuhik/.ciitiiuetcr — -Xoniialkalihuif^p mit O-o'is-} luuliiiiii/.urt und das Produkt als Fettsäuren von dem (iewiclitc des Extraktes al»|,'o- zogen. Der liest entspricht (h'm Xeutralfett (+ Cholesterin -|- Lezithin i. Zur Entfernung' (\g> Cholcsfenns ist nach der Titration einzu- dampfen und wie oben mit alkoholischer Kalilau^^e vollends zu verseifen. Nachweis der Kohlehydrate. Stärke. Stärke koinnit in den Fäzes vor entweikr in Form isolierter freier oder in Zellii- losehüllen eingeschlossener Stärkekörner. Freie SUlrkekörner finden sich bei gemischter Kost mit reichlicher Stärkeliei^'ahe in geringer Zahl in jedem Stnlile. noch reichliclier. weun die Stärke in ZelluluschiUlon eingeschlossen genossen wird. Mikrochemischer Nachweis. Der Nachweis der Stärke in den Fäzes kann mikroskopisch so er- folgen, daß man nach Ad. Schmidt ^) ein Fäzespartikelchen mit einem Tropfen starker Z?/r/o/scher Lösung (FO Jod, 2-0 Jodkali. öUO A(pia destj auf dem Objektträger mit Hilfe einer Präpariernadel innig vermischt, unter dem Deckglase in dünner Schicht ausbreitet und bei volleni Licht umt schwacher Vergrößerung betrachtet. Man sieht dann die Stärkekörner wohl erhalten oder fragmentiert, tief dunkelblau gefärbt, frei oder in Zellulose- hüllen eingeschlossen. Fällt das Jodpräparat negativ aus, so ist damit noch nicht bewiesen, dal) keine Stärke im Kote vorhanden ist. Es läßt sich dann mitunter chemisch Stärke nachweisen. Chemischer Nachweis. L)er Nachweis von Stärke kann gelingen, wenn man den Kot mit Wasser aufkocht , filtriert, das Filtrat einengt und mit L^/y^/scher Lösung auf P)laufärbung fahndet. Exakter wird der chemische Nachweis von Stärke so ausgeführt, daß die Stärke durch halbstündiges Kochen des pulverisierten trockenen Kotes mit 27oiger HCl am llückflußkühler zu Zucker invertiert wird. Man neutralisiert bis zur schwachsauren Ileaktion, filtriert etwa vorhandenes Eiweiß ab imd prüft nach Trommer oder mit l'henylhydrazin. Nimmt man 10" «ige IUI. so braucht man nur einige Minuten ohne liückflnlikühler zu kochen. Hei sehr geringen Zucker- respektive Stärkemengen, wo die Tromm erprobe zuweilen versagt, empfiehlt Strashurger -) folgende Phenylhydrazinprobe: Man gibt in ein Peagenzglas ö Trojtfeu iciiies Phenylhydra/in, V2 cm^ Eisessig oder 1 cni^ oOVoige Essigsäure. 4 c///' der zu untersuchenden ^) Ad. Schniiilt , Die FunktionsprüfnnL' des Darmes mittelst der IVnheknst. 2. .\iifl. S. 18. Wieshaden 1908. ") Ad. Schmuif und ./. Strashiinjcr, l»if l-azes drs .Menschen im »urmaicu uuii krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 173." Berlin 1«H.)5. Abderhalden , Ilaudbuch der biochcmiccbcn Arboilsmethoden. V. 24 370 H. Lobrisc h. Flüssigkeit und kocht l Minute über kleiner Flamme. Dann setzt man 4 — 5 Tropfen Natronlauge vom spezifischen Gewichte V16 zu, so dali die Flüssigkeit sauer bleibt, kocht noch etwas und läljt erkalten. Man weist dann in der Flüssigkeit die Phenylglukosazonkristalle nach, deren Bildung in einigen Minuten bis zu einer halben Stunde erfolgt. Fig. 100. Nachweis der Stärke durch die Ad. SchDtidt&Qhe Gärungs- probe. ^'-) Die Probe bezweckt, etwa vorhandene Stärke im Kote bei Brut- schranktemperatur zur Vergärung zu bringen. Sie zeigt nur die Stärke an, welche in einer für die Verdauungssäfte leicht an- greifbaren Form mit den Fäzes ausgeschieden wird, d. h. also die freiliegende und eventuell die in dünne zarte Zellulosehüllen eingeschlossene Stärke. Diejenige Stärke, die von dickwandigen, für die Verdauungs- säfte undurchdringlichen /ellwänden umschlossen ist, wird durch die Brutschrankprobe nicht gefunden. Die Brutschrankprobe bestimmt also im Gegensatz zu den sonstigen quantitativen Stärkebestimmungsmethoden nur die Stärke, welche eigentlich hätte verdaut werden müssen. Das Prinzip der Methode ist das der Nachverdauung. Die Stärke wird durch die im Kote vorhandene Diastase verzuckert und der Zucker durch die Darmbakterien unter Vergärung gebracht. Man berück- in den ersten 24 Stunden ent- stehenden Gasmengen. Die Ausführung erfolgt mit Hilfe des von Stras- burger ^) angegebenen Gärungsröhrchens (Fig. 100): Von dem gut durchrührten Kote, dessen Reaktion geprüft ist, werden mittelst Holzspatels zirka bg abgeteilt, von harten Stühlen weniger, von dünnen Stühlen mehr, so daß stets annähernd dieselbe Menge Trockensubstanz ver- arbeitet wird. Das Gärungsröhrchen besteht aus einem Grundgefäß a, in welches der Kot hineingegeben und dem Das Ende eine kleine Öffnung. Das Köhrchen b Gasentwicklung zur sichtigt dabei nur die mit Wasser gut verrührt wird. leeren Ptöhrchen c unter Röhrchen c trägt am oberen ^.,^^ ^.„v. ^.^,i^^ ^^^^^^.^ wird bis zum Rande mit Wasser gefüllt und muß nun unter in Dann wird der Gummipfropfen mit von Luftblasen aufgesetzt. Vermeidung Vermeidung ') Ad. Schmidt und J. Straslmrger , Die Fäzes des Menschen im normalen und krankiiaften Zustande. 2. Aufl. S. 178—180. Berlin 1905. ^) Ad. Sclimidt, Die Fuuktionsprüfuug des Darmes mittelst der Probekost. 2. Aufl. S. 20—21. Wiesbaden 1908. ^) J. Sfrasburger , Experimentelle und klinische Untersuchungen über Funktions- prüfung des Darmes. III. Mitteilung. Die Grenzen physiologischer und pathologischer Nachgärung menschlicher Fäzes. Deutsches Archiv f. klin. Medizin. Bd. 61. H. 5 und 6. S. 596. 1898. Methoden zur Untersuchung der niensclilichcn Filzes. Fig. 101. von Luftzutritt auf den mit dem (Jruiidgpfiil.je und dem ItiiluThcn '■ direkt in Vorl)indung' stehenden doppolt durcliholirtcii r;ummili)iU(h iiiniun. ii.i.s auf 200 cnt'^ gel)raflite Fiitrat ist meist noch nicht ^^•^nz i()0 cm^ fassendes BecheiL in welchem sich 60 cm^ FcIiIw(/9,chor Lösung und ;-i5c;;<3 destilliertes Wasser befinden. Das l)echerglas wird, mit einem UJirglas oder mit einer Petrischale zugedeckt, in einen an einem Stativ befestigten Metallring ein- g'ehängt und in ein heftig sieriendes Wasserbad so tief eingetaucht, dal» das Wasser etwa 1 rm über dem Uande der Flüssigkeit steht. I)as Wasser- bad darf nicht aus dem Kochen kommen. Nach genau .'»() Minuten ist das Glas herauszunehmen und zu der Flüssigkeit ca. i;-^0 cw^ kaltes destilliertes Wasser zuzufügen. Darauf wird mittelst Saugi)umpe durch ein .\sbestfilter- rcihrchen, wie es von Strasburr/er ') angegeben ist, die Flüssigkeit abge- saugt, das Kupferoxydul, welches der Wand und dem Boden des (ilases anhaftet, mit Hilfe destillierten Wassers und eines am Ende mit «lummi üi)erzogenen Glasstabes in das Filterröhrchen gebracht und mit Wasser ausgewaschen. Dabei mub immer Flüssigkeit über dem Asbest stehen, da- mit kein Kupferoxydul mit durchgerissen werden kann. Statt des Filter- röhrchens kann man nach meinen Erfahrungen auch sehr gut einen l'or- zellantiegel mit siebartig durchlöchertem Doden (6r'ooc//tiegel). der ge- nügend mit x\sbest belegt ist, zum Absaugen benutzen, ohne Kupferoxydul- verluste befürchten zu müssen. Nunmehr setzt man das Filterröhrchen oder den 6^oocAtiegel mit dem Kupferoxydul auf eine reine Saugflasche auf, löst das Oxydul in nicht zuviel Salpetersäure vom spezifischen (ie- wichte r2, wobei ein Fhrglas auf den Trichter gelegt wird, damit die beim Lösen aufschäumende Flüssigkeit nicht verspritzt. Man wartet nun. bis das salpetersaure Kupfer ohne Anwendung der l'umpe in die Flasche getropft ist und wäscht dann das Filter mit reichlich Wasser unter Anwendung der Pumpe aus. Die nunmehr grünlich gefärbte gesamte Flüssigkeit wird aus der Saugflasche in eine Porzellanschale ohne \'erluste gebra<-ht. mit 72 — 1 cm^ konzentrierter Schwefelsäure versetzt und im Abzug auf dem Wasserbad abgedampft, bis alle Salpetersäure abgeraucht ist. Es bleiben Kristalle von schwefelsaurem Kupfer zurück, die in Wasser gelöst und in ein geaichtes ;300 n«Muilbchen gespült werden. Dann fügt man zur Hin- dung der überschüssigen Hg SO4 konzentrierte Sodalösung zu. bis eben ein bleibender Niederschlag entsteht. Dieser wird von äOc»/' kaltgesättigter schwefliger Säure, die nun zugesetzt wird, wieder gelöst. Man kocht die Flüssigkeit auf und fügt sogleich aus der Bürette y^- Normal - llhodanam- moniumlösung zu. bis die blaugrüne Farbe verschwunden ist. Es bildet sich bei Gegenwart von schwefliger Säure ein reichlicher Niederschlag von weil'.eni Kupferrhodanüi-. Der Zeitimnkt des \erschwindens der i^riineii Farbe ist 1) Ad. Schmidt und ./. Slmsbiirger, Die Fäzes des Menschen im nonnaleu und krankhaften Znstande. 2. Anfl. S. 175." Berlin liKi."^. 374 H. Lohrisch. in der Flüssigkeit nicht immer leicht zu erkennen. Nach meinen Erfah- rungen ist es zweckmäßig, bei Benutzung von 2 g menschlicher Fäzes etwa 50 cm3 — Xormal-Rhodanammoniumlösung zuzusetzen, womit also Rhodan- ammonium im Überschuß zugesetzt ist. Das überschüssige Rhodanammonium muß mit —-Normallösung von salpetersaurem Silber zurücktitriert werden, um die Menge des zur Kupferrhodanürl)ilduug verbrauchten Rhodans zu erfahren. Zu diesem Zwecke läßt man die Flüssigkeit erkalten, füllt bis zur Marke 300 mit Wasser auf und schüttelt energisch um. Nun filtriert man durch ein trockenes doppeltes Filter so lange, bis die Flüssigkeit wasserklar ist und mißt zur Titration 100 cm'' in einem geaichten Kolben ab, bringt sie in ein Becherglas, setzt bO cm'^ mit Harnstoff versetzter Salpetersäure vom spezifischen Gewicht r2 und 10 an^ einer kalt gesät- tigten Eisenammoniakalaunlösung zu, worauf die Flüssigkeit eine tiefrote Farbe annimmt. Dann läßt man so lange -T:-Normal-Silberlösung aus der Bürette zufließen, bis ein schwach gelb-rötlicher Farbenton das Ende der Titration anzeigt; oder man setzt etwas Silberlösung im Überschuß zu und titriert mit Rhodanlösung zurück, wobei sich die Endreaktion (Übergang in Gelbbraun) besonders gut markiert. Da nur der dritte Teil der Flüssigkeit zur Titration mit der Silber- lösung benutzt wird, so ist die Menge der verbrauchten Silberlösung mit 0 zu multiplizieren. Nach Abzug derselben von dem Volumen der angewen- deten Rhodanlösung wissen wir, ^\ieviel Rhodan an Kupfer gebunden ist. 1 c;«3 — -Normal-Rhodanammoniumlösung zeigt 6'?» 2 /y«// Kupfer an. Der zu- gehörige Wert für Zucker ist in der folgenden von Pflüger aufgestellten Tabelle aufzusuchen. Tabelle der zusammengehörigen Werte für Zucker und Kupfer (die Zahlen bedeuten Milligri imme '). Zucker Kupfer Zucker Kupfer Zucker Kupfer 6-25 18-94 28 66-2 45 100-7 12 32-8 29 68-2 46 102-7 13 34-9 30 70-2 47 104-7 14 370 31 72-3 48 106-7 15 391 32 74-3 49 108-8 16 41-2 33 76-3 50 110-8 17 43-3 34 78-4 51 112-8 18 45-4 35 80-4 52 114-9 19 47-5 36 82-4 53 116-9 20 49-6 37 84-4 54 1190 21 51-7 38 86-5 55 1210 22 53-8 39 88-5 56 123-0 23 55-9 40 90-5 57 125-1 24 580 41 92-6 58 127-1 25 601 42 94-6 59 1292 26 621 43 96-6 60 131 2 27 64-2 44 98-6 ') Nach Ad. Schmidt und .7. Strashurger, Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 176. Berlin 1905. Methoden zur l'ntersnchung der menschlichen Filzes«. j^-rsy Die für Zucker gefundene Zahl ist mit dem von Soxhlrt und Lintner und Diill gefundenen Faktor U-04 zu multipli/icren . um den Wort für Stärke zu bekommen. Die Methode ist trotz ihrer Feinheit, hinsichtlich deren sie andere Methnd.n übertrifft, nicht ganz fehlerfrei. Wie Strashurgcr^) gezeigt hat, wird mit der .Motlidde immer etwas zu wenig Zucker (ca. 6 mg) gefunden. Weiter entstehen zuweilen Feliler, wenn es sich um die Bestimmung sehr kleiner Zuckermengen hanilelt. Ks wird dahei. wie schon PjUiger zeigte, so wenig Kupferoxydul und in so feiner Stauhfurm alige- schieden, daß es leicht dtircli das Asbestfilter mit iiindurciitreht. Um diesen TbeUtand zu vermeiden, empfieidt I'Jliujer. wo es sich um selir geringe Mentren Zucker handelt, ein bekanntes Quantum Zucker zuzufügen, welcher nachtraglicii bei der Berechnung in Abzug gebracht wird. Man kann sich zu diesem Zwecke eine mit 2-27oit'er HCl ver- setzte und dadurch lialtbar gemachte Traubcnzuckerlösunf,' von bekanntem Zuckerge- halte vorrätig lialteu und mit einer Bürette abmessen. Die datiei vorwendete Säure ist durch entsprechenden Alkalizusatz zu neutralisieren. Weiterhin können unter Umständen Fehler entstehen, wenn der Stuhl pathid«i- gischcrwcise stark sclileinilialtig ist, da Muzin beim Kochen einen reduzierenden Korjter abspaltet. Man muß deshalb, wenn es sich um gndjere öchleimlieimengungen handelt, den Schleim mechanisch mit der Pinzette zu entfernen versuchen. Bei feineren Schleim- beimengungen, die sich mechanisch nicht entfernen lassen, empfiehlt Slrashurger^) die K.xtraktion der Fäzes mit Kalkwasser. Doch fülirt auch diese nicht zum Zi(de. da nach Ad. Schmidt der Darmschleini durch diiniu' alkalische Lösungen nur schwer gelöst winl. Hier läuft also eventuell ein kleiner Fehler mit unter. Auch der l'rozeß der Invertierung mit verdünnter Säure ist kein iranz einwand- freier. Es wird nämlich nicht alle Stärke in Zucker umgewandelt, sondern neben der Inversion findet eine gei'ingfügige Reversion statt, welche einsetzt, wenn die Verzucke- rung etwa bis zur Hälfte vorgeschritten ist. Die oben an^'egebene Kochzeit von lYj Stunden ist nach dem Vorgange AUihns von Sirafthurgcr beibehalten worden, weil es damit gelingt, ca. 'JoVo ''^i' Stärke zu invertieren. Deshallt ist es auch richtiger, zur Berechnung der Stärkemengo die gefundene Zuckermenge mii OiU zu multiplizieren. Die Multiplikation mit O'ü, die sonst srebräuchlich ist, würde nur richtig sein, wenn mau auf die Inversion sämtlicher Stärke rechnen könnte. Fehler können bei der Inversion auch entstehen, wenn in den Fäzes sehr viide pflanzliche Reste (Gemüse usw.) enthalten sind. Die in den l'flanzen immer vorhandenen Hemizclhiloscn (Hexosane, Pentosane) werden beim Kochen mit dünnen Säuren eben- falls in ihre Zucker (Ilexosen, Pentosen) umgewanstreiluk- tion zu prüfen. Die gewichtsanalytischen Kupfernietlmden (Heduktinn des Oxyduls zu Kupl.r nach Allihn, Wägung des Kupferoxyduls nach lyHign) leiden an dem l'.-l.I.i .l.iü 1h i ') J. Strasburger, Über den (luantitativen Nachweis der leicht angroilbarcn Kohle- hvdrate (Stärke und ihrer Abkömmlinge) in menschlichen Fäzes. Arch. f. d. ge». l'hyi*. Bd. 84. S. 184. 1001. '-) J. Strashurgcr, 1. c. S. 180. 376 H. Lohriscli. ihnen Veruureinigungeu, die mit dem Kupferoxydul aus den Fäzes niedergeschlagen werden, mitgewogen werden. Zucker. Die menschlichen Fäzes enthalten bei normaler Verdauung keinen Zucker. Bei schweren Störungen der Darmverdauung kann Zucker in geringen Mengen vorkommen. Zum qnalitativen Nachweis extrahiert man den Zucker mit Wasser, indem frische oder trockene pulverisierte Fäzes mit Wasser ausgekocht werden. Im Filtrat. wekdies am besten auf dem Wasserbade noch einge- engt wird, wird mit Hilfe der Trommer-, Ni/lander- oder Phenylhydrazin- probe auf Zucker untersucht. Diese Zuckerreaktionen können aber gestört werden, wenn gleichzeitig mit dem Zucker All)umosen oder Peptone extra- hiert worden sind; diese Eiweißsubstanzen können unter Umständen Kupfer- lösungen reduzieren. Sicherer ist es daher nach JJffelmann i), den Kot mit Alkohol zu extrahieren, den filtrierten Alkohol zu verjagen, den Rückstand mit Wasser aufzunehmen und hierin die Zuckerprobe anzustellen. Nach Blau- herg~) ist es zweckmäßig, ca. ?>g der Trockensubstanz mit Thymolwasser zu extrahieren, wobei die im Becherglas befindliche Substanz einige Stunden im W^asserbade leicht erwärmt wird. Nach Filtration und Nachwaschen mit Thy- molwasser werden die Eiweißkörper durch Bleiazetat und basischessigsaures Blei abgeschieden. Der Überschuß des Bleis wird durch Einleiten von CO2 und Abfiltrieren entfernt, das Filtrat abgedampft und auf Zucker untersucht. Die Schniidtsche Gärungsprobe ist zum qualitativen Nachweis von Zucker dann geeignet, wenn die Nahrung völlig frei von Stärke und an- deren leicht aufschließbaren Kohlehydraten war. Zum (luantitativen Nachweis ist es nötig, das mit Wasser oder nach Ijff'elmann oder Blauberg von einer gewogenen Fäzesmenge gewonnene Filtrat bis zu einem gewissen Quantum (200 — ?)00 cm ^') aufzufüllen. Von dieser Zuckerlösung wird dann ein bestimmter Anteil (50 — 100 crn^) nach Strasburger mit Fehlingscher Lösung gekocht und der Zucker mittelst der Kupferrhodanürmethode bestimmt. Diese Bestimmung mißlingt aber leicht dann, wenn der Zuckergehalt zu gering ist. Strasburger macht darauf auf- merksam, daß schon ein Zuckergehalt der Fäzestrockensubstanz von 72^05 der dem Nachweis von V/^ mg Zucker und 2V2 w?^ Cu entsprechen würde, sich nicht mehr mit Sicherheit quantitativ bestimmen läßt. Befreiung- eines Fäzesextraktes von allen Kolileliydraten und von Eiweiß. Um ein Fäzesextrakt mit Sicherheit von allen Kohlehydraten zu befreien, ver- fährt Strashiirger^) in folgender Weise: Ca. 3.9 der getrockneten fein pulverisierten *) Zit. nach Äd. Schmidt und J. Sfrasburger, Die Fäzes des Menschen im nor- malen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 169. Berlin 1905. -) M. Blauberg, Experimentelle und kritische Studien über Säuglingsfäzes. S. 39. Berlin 1897. *) J. Strashurger, Über den quantitativen Nachweis der leicht angreifbaren Kohle- hydrate (Stärke und ihrer Abkömmlinge) in menschlichen Fäzes. Arch. f. d. ges. Phys. Bd. 84. S. 183. 1901. Methoden zur Untersuchung der menschlichen FäzcB. 3' I I Fäzos werden, um die Stärke zur Quolhuifj zu bringen, mit ICH) cm* \V:i .de am Riickflußkühlor gekoclit, dann mit Pankroasdiastase versetzt und imi n 1 IJrutschrank gelassen. Dann liilit man die Kliissigkeit nacli Zusatz von Hit-rl ■ 22" C 2 Tage gären. Die Reaktion ist danach schwach sauer. Um alles Eiweiß zu ent- fernen, wird nach Zusatz von etwas Kssiirsäure gekocht und sorgfältig filtriert. I>a8 Fil- trat zeigt mit Kalilauge nnd Kupfersullat keine Spur von Karlii-iinaktinii. Tleniizclliiloscn. Schon oben wurde erwähnt, daß bei der Hydrolyse der im Kot enthaltenen Stärke die erhaltene Dextrosemenge zu groß ausfallen kann, wenn Ilemizellulosen im Kote vor- banden sind. Der Xamc ..Ilemizellulose" stammt von E. Schuhe'), der damit diejenigen Zell- wandbestandteile bezeichnete, die weder zur Stärke noch zur Zellulose gehören nnd mit verdünnten Mineralsäurcn hydrolysierl)ar sind. In den Tflanzcn kommen vorwiou'end vor Hexosaue (tJalaktan) und noch häufiger Pentosane (Araiian, Xylan); ihre Zucker sind Galaktose, Arabinose und Xylose. Ist bei einer Stärkebestimmung im K»* abdestilliert sind, ?>0 cin^ derseli)en Säure in den Destillationskolben naeh- gießt und im ganzen 400 rm^ überdestillier<'n läßt. Das dabei gebildete Furfurol wird im Destillat durch Phlorogluzin ausgefällt. Den Niederschhig, das Furfurolphlorogluzid , sammelt man in mit Asbest beschickten Por- zellan-ÖoocÄ-Tiegeln niul wäscht ilin mit löOcw« Wasser aus. Die Tiegel werden dann 4 Stunden im Wassertrockenschranke bi-i ;i7 — 98'^ C ge- trocknet, in Wiegegläser, welche sofort verschlossen werden, gegebm. in diesen in den Exsikkator gebracht und nach dem Erkalten im Kxsikkator mit den Wiegegläsern gewogen. Auf diese Wei.^^e vermeidet man Papier- filter und den Einfluß der hygroskopischen Eigenschaften tles PhloroLrlu- zids, und die Resultate werden sicherer und konstanter als es früher mög- lich war. Für Pidorogluzidmengen von ;]0—'dOi) mg kann man die entspre- *) E.Schulze, Zur Chemie der pflanzliclien Zellmembranen. II. Abhandlunir. Zeit- schrift f. phys. Chem. Bd. 39. l'.)U3. '-) B. Tollcns, Ül)er die Bestimmung der Pentosen und Pentosaue Zeif#cbr. f. phys. Chem. Bd. 36. S. 239-243. 1902. 378 H- Lohrisch. chenden Werte an Furfurol, Arabinose, Araban, Xylose, Xylan, Pentose und Pentosan aus einer bei Tollens^) mitgeteilten ausführlichen Tabelle, Avelche von Kröher stammt, ablesen. Die Zahlen für Pentose und Pentosan sind in dieser Tabelle die Mittelzahlen aus Arabinose und Xylose und Araban und Xylan, die man anwendet, wenn man mit Gemengen von Arabinose und Xylose zu tun hat oder wenn man nicht weiß, welche Pentose in der untersuchten Substanz sich befindet. Ebendaselbst finden sich auch Formeln zur Berechnung von Furfurol, Pentosan und Pentose, wenn das Phlorogluzid weniger als 30 mri oder mehr als .-KX) mg wiegt. Es darf nicht übersehen werden, daß den Pentosen- und Pentosan- bestimmungen noch immer zahlreiche Mängel anhaften, die ihre Genauig- keit beeinträchtigen. Sie gehören in die Pteihe der konventionellen Me- thoden, bei denen es auf peinlichstes Innehalten der Bedingungen sehr ankommt. Hexosane. Der Nachweis des Galaktans würde so zu führen sein, daß das HCl-saure zuckerhaltige Filtrat der Fäzes eingedampft und der syrupose Rückstand mit Salpetersäure vom spezifischen Gewichte 1-15 auf dem Wasser- bade erwärmt wird. Bei Anwesenheit von Galaktose entsteht Schleimsäure. Im allgemeinen kommen, wie gesagt, die Bestimmungen im mensch- lichen Kote kaum in Frage. Will man speziell die Ausnutzung einer Hemizellulose im mensch- lichen Darme feststellen, so ist darauf zu achten, daß außer der Hemi- zellulose weder Zucker noch Stärke in der Versuchszeit genommen werden. Es genügt dann, im Fütterungsmaterial und im Kote den Zuckergehalt nach Strashiirger festzustellen und miteinander zu vergleichen, wie ich 2) dies bei Versuchen über die Ausnutzung der Hemizellulose des Agars ge- tan habe. Um vergleichbare Ptesultate zu erhalten, ist bei jeder einzelnen Untersuchung peinlichst genau nach den Strasburg er?,chQ\\ Vorschriften (Kochzeit!) zu verfahren. Nachweis der Rohfaser und Zellulose. Uuter Rohfaser versteht mau alles das, das nach Behandlung von Pflanzen- teilen mit Wasser, verdünnten Säuren und Alkalien. Alkohol und Äther ungelöst zurück- bleibt. Der Hauptanteil der Rohfaser besteht aus Zellulose, daneben sind noch ent- halten Lignin, Eutin und Ascheubestandteile, welche mit zunehmendem Alter der Pflanze die ursprünglich reine Zellulose innig durchdringen und inkrustieren. Die Zellulose gehört nach der heutigen Auffassung zu den Polysacchariden, und zwar ist sie ein Anhydrid der Dextrose von der Formel n (CgHi^Oj). *) B. ToUens, Über die Bestimmung der Pentosen und Pentosane. Zeitschrift f. phys. Chemie. Bd. 36. S. 239—243. 1902. Die Tabelle (TabeUe zur Umwandlung von Phlo- rogluzid in Furfurol, Pentosan usw. von E. Kröher) befindet sich am Ende des Bandes. -) //. Lohrisch, Der Vorgang der Zellulose- und Hemizellulosenverdauung beim Menschen und der Nährwert dieser Substanzen für den menschlichen Organismus. Zeit- schrift f. exp. Pathol. u. Ther. Bd. 5. S. 14 — 16 des Separatabdruckes. 1908. (Daselbst ausführliche Literatur über Hemizellulosen.) Methoden zur Untersuchung der menschlichen Fäzes. 3-0 Makroskopischer, inikroskopiscliri- imkI niikroclicmlsrlicr Nachweis. Abgesehen von sehr ji^robon I'flanzonresten, die ohne weiteres in dio Aufien fallen, kann man sieh einen niaki-oskopi sehen I'!ini)liek in den Gehalt der Fäzes an pflanzlichen Bestandteilen nur verschafti-n, wenn man eine größere gut durchmischte Fäzesmenge nach Ad. Sc/nnidt aufs feinste mit Wasser verreibt und auf dem Makroskopierteller ausbreitet Man sieht dann die gelblich-bri'uiidich oder grünlich gefärbten /ellulose- reste, die sich schon durch ihre harte Beschaffenheit als pflanzliche (le- bilde ausweisen. In zweifelhaften Fällen ist mikroskopisch zu untersuchen. Jeder .Stuhl, der von einer Vegetabilien enthaltenden Kost stammt, enthält mi- kroskopisch sichtbare Partikel von Rohfaser und Zellulose, die in den ver- schiedensten Formen auftreten können (l'arenchymzehen, verholzte und un- verholzte Membranen. P^pidermis, spiralige Gefälje, Pflanzenhaare, liräun- liche Spelzenreste, Kakaoreste, Bruchstücke der Kleberzellenschicht. Cotyle- donen, Kartoffelzellen. Steinzellen aus Birnen u.v.a.). (Jute Abbildungen hierzu sind bei ScJimidt und Strashurger^] einzusehen. Mikrochemisch wird Zellulose nachgewiesen durch ihre Figen- schaft, sich mit Jodchlorzinklösung violett zu färben. Die Färbung beruht darauf, daß die Zellulose durch Jodchlorzink in einen amyloidartigen Körper überführt wird. Dabei ist immer zu bedenken, daß es natürlich nur die reine, nicht mit inkru- stierenden Substanzen (Liirnin. Kutin) durchsetzte Zelbilose ist. die diese Rcaktiiui deut- lich gibt. \'erhoIzte und verkorkte Zellulose (= Rohfaser) gibt die Reaktion nicht oder nur undeutlich, weil die inkrustierenden Substanzen dem Reagens das Kindringen in die Zellulose sehr erschweren. Finden sich also reinviolett gefärbte Teilchen, so sind diese als Roinzolhiloso anzusehen. Reine Zellulose ist. wie ich-,"') nachwies, für den Menschen verdaulich, waiirsclieiiilich durcli eine Zytase. Verdaut werden vom normalen Darm ca. 60% 'ler eingeführten Zellulose. Immerhin setzt die Zellulose den Verdauungs- säften einen viel größeren Widerstand entgegen, als die sonstigen Nalirunirsliestandteile, woraus sich der relativ große Teil unverdauter, an sich aber verdaulicher Zellulose in den Fäzes erklärt. Ein gewisser Anteil der Zellulose unterliegt im Darm einer bak- teriellen Zersetzung, wobei Essigsäure, Buttersäure, Wasserstoff und ('11^ gebildet wer- den. Die rein violett gefärbten Partikel im Kot stellen also immer verdauliche Zellulose dar, weil eben reine Zellulose an sich verdaulicli ist. Zellulose, die mit Ihdz- und Kutinstoffen, den inkrustierenden Substanzen, verunreinigt ist, also Rohfaser, färbt sich mit Jodchlorzink gelblich-lträunlicb oder L'ar nidit. Derartige Ridifaserteilclien sinti natürlich unvcrdaulicii. Amaiin*} unterscheidet neuerdings verdaulidie und unverdauliche M Ad. Schmidt und J. Sfrushurgrr, Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. Taf. VI mid VII. Berlin \\)()h. -) H. Lohrisch, Über die Bedeutung der Zellulose im Haushalte des Menschen. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 47. II. 2 und 3. S. 2t)0— 252. I'IUC) (Literatur). ^) II. Lohrisch, Der Vorgang der Zellulose- und llemizeUulosenverdauung beim Menschen und der Nährwert dieser Substanzen für den menschlichen Organismus. Zeit- schrift f. exp. Pathol. u. Ther. Bd. 5. MIOS. •*) J. Ämattn, La reclierclie microciiimiciue de la cellnlose digerable tlans les nia- tieres f^cales. Revue medicale de la Suisse Romande. XXX'n^ Annt5e. Nr. 2. 2<1 fi'vrier 1909. Sep.-Abdr. 3gO H. Lohrisch. Zellulose. Mit letzterer bezeichnet er die gelblich gefärbten unverdaulichen Rohfaser- teilchen. Das ist nach dem Vorstehenden insofern zu beanstanden, als hierbei der prin- zipielle Unterschied, der zwischen Rohfaser und Zellulose besteht, nicht genügend be- tont wird. Man sollte doch, worin es besonders die ältere Literatur sehr fehlen läßt, stets scharf zwischen Rohfaser und Zellulose unterscheiden. Wenn man dies tut, kann man auch nicht von verdaulicher und unverdaulicher Zellulose reden, denn es gibt eigent- lich keine unverdauliche Reinzellulose. Um die Jodchlorzinkreaktion recht deutlich zu bekommen, ist es zweckmäßig, das Reagens nicht zu konzentriert zu nehmen, worauf auch Amann^) hinweist und folgende Zusammensetzung vorschlägt: Reines Zink- chlorid 10-0, Jodkali 2-5, Jod 0-25, Aqua dest. 10-0. Zur Technik empfiehlt er Zentrifugieren des mit Wasser verriebenen Kotes und Untersuchung des Sediments, von dem ein Tropfen auf dem Objektträger mit einem Tropfen der obigen Lösung vermischt wird. Die Zellulose färbt sich ferner blau, wenn man einem vorher mit Liigohdier Lösung vermischten Präparat Schwefelsäure ( 2 H2 SO^ : 1 H._j 0) oder Phosphorsäure zufheßen läßt. Ferner wird Zellulose durch frisch be- reitete Kupferoxydammoniaklösung gelöst. Lignin färbt sich nach Vorbehandlung mit Phlorogluzinalkohol in Salzsäure violett rot. Kutin nimmt bei Zusatz von Kalilauge einen gelben Farbenton an (Ad. Schmidt -). Der quantitative Nachweis der Rohfaser und Zellulose. Rohfaser. Die Rohfaser ist ihrer Zusammensetzung nach naturgemäß chemisch niemals exakt zu definieren, sondern ist je nach Art und Alter der Pflanzen ganz verschieden zusammengesetzt. Deshalb liefern auch die gebräuchlichen Methoden zur Darstellung der Rohfaser niemals ein gleichmäßig zusammengesetztes Produkt, sondern die erhaltene Rohfaser wird stets nach der Beschaffenheit des pfhxnzlichen Materials und der Art der angewendeten chemischen Ageutien eine andere Zusammensetzung haben. Darum ist es auch schwierig, bei quantitativen Rohfaserbestimmuugen in den Kontrollaualjsen genau übereinstimmende Resultate zu erhalten. Häufig ist eine größere Anzahl Analysen nötig, um brauchbare Resultate zu erzielen. Es sei daher gleich von vornherein darauf hinge- wiesen, daß es bei den Rohfaserbestimmungen dringend nötig ist, bei der Verarbeitung eines bestimmten Materials bei den erforderlichen mehrfachen Analysen peinlichst darauf zu achten, daß in bezug auf Kochzeiten. Zusammensetzung der Reagentien, Hitzegrade usw. ganz gleichmäßige Verhältnissse herrschen. Zur Ausführung der quantitativen Rohfaserbestimmung benutzt man am besten das alte Weender Verfahren von Henneberg und Stoh- mann^) mit einigen von Wattenberg^) und v. Knicrieni^) angegebenen Ver- besserungen. Dasselbe wird folgendermaßen ausgeführt: 1) ./. Ämannf La recherche microchimique de la cellulose digerable dans les matieres fecales. Revue mödicale de la Suisse Romande. XXX™«» Annee. Nr. 2. 20 fevrier 1909. S. 4 des Sep.-Abdr. -) Äd. Schmidt und ■/. Strashurger, Die Fäzes des Mensclien im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 78. Berlin 1905. •■'j Literatur vgl. bei H. Lohrisch, Über die Bedeutung der Zellulose im Haus- halte des Menschen. Zeitschr. f. phys. Chem. Bd. 47. H. 2 und 3. S. 203-207. 1906. Methodeu zur Untersuchuii),' der iiienscliliclicii Filzes. -i Ca. l\ (j lufttrockene pulverisierte Filzes (sehr fettreiche werden vor- her mit Äther extrahiert) werden mit r)0 cm» öVoiger Schwefel.säure und 150 cm^ Wasser unter Ersatz des verdampfenden Wassers •/, Stunde lang in einer Porzellanschale p:ekocht, zum .Vhsetzen stehen j^elassen, die Flüs.sig- keit mit einem kleinen (Uashcher abgehoben, der Rückstand zweimal mit Wasser ausgekocht, die jedesmal abgeholiene Flüssiiikeit mit der ersten vereinigt. Der Rückstand wird danach ganz in dersellien Weise mit einer Mischung von 50 cm^ 50/oiger Kalilauge und 150c///3 Wasser, dann mit Weisser behandelt und zuletzt auf ein gewogenes Filter gebracht. Die kali- haltige Flüssigkeit wird soweit als möglich mit dem Heber abgehoben, der Absatz mit dem Inhalt des Filters vereinigt, letzteres bis zum Verschwin- den der alkalischen Reaktion ausgewaschen, dann das Sediment aus den schwefelsaurehaltigen Flüssigkeiten dai'auf gegeben, darauf sukzessive mit Wasser, Alkohol und Äther voUstiindig ausgewaschen, getrocknet und ge- wogen. Der Wert für Asche und Proteinsubstanz (N x 6"25) wird von der Rohfaser in Abzug gebracht. Der Nachteil des Verfahrens liegt in der viel zu langen Dauer, da man gezwungen ist, vor dem Abhei)ern zu warten, bis Sedimentierung ein- getreten ist, was oft lange Zeit in Anspruch nimmt. Wattruhcrg hat daher vorgeschlagen, sich statt des lästigen Al)heberns eines mit Gaze und FlielJ- papier überzogenen Trichters, der mit einem Saugapparat in \'erbin(iung steht, zu bedienen. Auf diese Weise kann man die sauren und alkalischen Flüssigkeiten schnell und so vollständig von dem Rückstände absaugen, daß kaum einige Kubikzentimeter bleiben. Es empfiehlt sich daliei. die ge- kochten Flüssigkeiten möglichst heiß abzusaugen. \'orteilhaft ist es auch, zum Kochen Porzellanschalen zu benutzen, welchen nach Wattenhery genau im Niveau von 200 c^y^^ unter der Glasur ein blauer Ring eingebrannt ist. Dadurch läßt sich der Flüssigkeitsstand während des Kochens durch Nach- füllen bis zum Ring stets regulieren, v. Knkricnt empfiehlt als wesent- lich zeitsparend die Anwendung der Zentrifuge zum Absetzen der Rück- stände. Ein neueres Verfahren, welches bessere Resultate geben soll , ist das Glyzerin-Schwefelsäure verfahren von Könige): 3 g lufttrockene pulverisierte Fäzes werden mit 200 g Glyzerin vom spezifischen Gewichte l'2o, welches 20 g konzentrierte Schwefelsäure im Liter enthält, bei lo.H— 137" 1 Stunde am Rückflußkidder gekocht. Man läßt erkalten, verdünnt die gekochte Masse auf ca. ;')(.)(» r»/^ kocht noch- mals auf und filtriert heiß durch einen mit Asbest ausgelegten (VoocZ/schen Tiegel mit Hilfe der Saugpumpe. Der Rückstand im Tieirid wird mit reich- lich heißem Wasser, erwärmtem Alkohol. Alkoholäther inid Äther ausgt»- waschen, bis das Filtrat farblos abläuft. Tritt beim Filtrieren \erstoplimg ein, so kaini man den Nieder.schlag im Tiegel mit einem Spatel vorsichtig von der Mitte tler Asbestfläche nach den Seiten schieben. !'•" '' ■'■-''"• ') ./. König, Die Zolliiicniliniu und ilin- liostaudtoilo iii »'lifiiiisc-iit r uuu logischer Hinsicht. Luiulwirtschattlichc Versuchsstatioinu IM (m S .L') 110. 1'.' 382 H. Lohriscb. Tiegel wird dann getrocknet (105») und gewogen, der Inhalt im Tiegel verascht und der Tiegel mit der Asche gewogen. Die Differenz zwischen beiden Gewichten gibt das Gewicht der aschefreien Rohfaser. Nochmals sei darauf hingewiesen, daß die Kö>iigsche Rohfaser in ihrer Zusam- mensetzung mit der durch andere Verfahren gewonnenen Rohfaser keineswegs identisch ist. Sicherlich werden auch durch die Einwirkung von Säuren, Alkalien und Glyzerin- schwefelsäure Rohfaserbestandteile in verschiedenstem Umfange gelöst und gehen beim Abheben und Filtrieren verloren. Für die Weender Methode hat man darauf aufmerk- sam gemacht, daß speziell elastisches Gewebe nicht gelöst wird und als Rohfaser mit bestimmt wird, worauf bei der Untersuchung von Fäzes, die von einer reichlich Fleisch enthaltenden Nahrung stammen, zu achten ist. Zellulose. Alles, was bezüglich der Ungenauigkeit der Rohfasermethoden gesagt wurde, gilt in gleichem Sinne für die Bestimmung der Zellulose. Zur Reindarstellung und quan- titativen Bestimmung der Zellulose sind wir wie bei der Rohfaserbestiramuug gezwungen, die Zellulose aus einem Gemisch von Eiweißsubstanzen, Fett, Kohlehydraten, inkrustie- renden Substanzen und Hemizellulosen möglichst rein herauszuschälen. Keine der bis- herigen Methoden ist so beschaffen, daß es dabei nachweislich ohne Zelluloseverluste abginge. Denn die angewendeten chemischen Mittel wirken bei den verschiedenen Me- thoden entweder zu schwach, und wir erhalten dann keine Reinzellulose, oder sie wirken zu energisch, und dann gibt es eben Zelluloseverluste. Den richtigen Mittelweg inne zu halten besteht vorläufig noch keine Möglichkeit. Wir wissen nicht, bis zu welchem Grade der Konzentration bei der Untersuchung zellulosehaltigen Materials auf Rein- zellulose wir chemische Mittel einwirken lassen dürfen, wenn sie in ihrer lösenden resp. oxydierenden Wirkung eben vor der Zellulose Halt machen sollen. Dazu reichen unsere Kenntnisse von der chemischen Beschaffenheit reiner Zellulose noch nicht aus. Wissen wir doch, daß schon verdünnte Säuren und Alkalien Zellulose lösen können. Es herrschen also auch hier unkontrollierbare Verhältnisse, und deshalb kann an die Zellulosemethoden im allgemeinen nicht der strenge Maßstab bezüglich peinlichster Übereinstimmung der Kontrollaualysen angelegt werden, der bei anderen quantitativen chemischen Methoden selbstverständlich unerläßlich ist. Man muß sich also bei Be- nutzung jeder Zellulosemethode von vornherein darüber klar sein, daß jede Methode eine anders beschaffene Zellulose liefert. Ferner leiden fast alle Zellulosemethodeu an dem Fehler, daß sie viel zu lange Zeit in Anspruch nehmen, was ihrer Verwendung sehr im Wege steht. Die beste Zellulosemethode wird immer die sein, die es ermög- licht, die Bestimmungen in möglichst kurzer Zeit auszuführen und möglichst reine, d.h. von den sonstigen Rohfaserbestandteilen befreite Zellulose zu gewinnen. Dieser Forderung scheint mir noch am meisten trotz mancher unten zu erwähnender Einwände die von Simon und Lohrisch'^- -) angegebene Methode zur Reindarstellung und quantitativen Bestimmung der Zellulose zu entsprechen. Die Methode knüpft an an eine von G. Lange angegebene, immerhin noch sehr umständliche Methode, bei der die Zerstörung der der Zellulose beigemischten Substanzen durch schmelzendes Alkali erfolgt, ohne daß dabei die eigentliche Zellulose zerstört wird. Dieser Vorgang wird auch ^) 0. Simon und H. Lohriscli , Eine neue Methode der quantitativen Zellulose- bestimmung in Nahrungsmitteln und Fäzes. Zeitschr. f. phvsiol. Chemie. Bd. 42. H. 1 u. 2. S. 55-58. 1904. ^) H. Lohrisch, Über die Bedeutung der Zellulose im Haushalte des Menschen. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 47. H. 2 u. 3. S. 215—219. 1906. Methoden zur Untersuchung der menschlichen Fäzes. 3f^jj bei der Mctliode SiD/oii-Lo/iriscIi Itcimtzt, die W iikiiiiii des Atzkiilis ;il>or uoch durch Zusatz von ILO., unterstützt und srlilirClich otwaii^e in Lösuiifjr gegangene Zellulose durch Alkohol wieder ausgefällt, im einzelnen wird wie folgt verfahren: Zirka o— 5 (/ feinst pulverisierte lufttrockene Fäzes werden in ein zirka 500 cin^ fassendes Kecherglas gebracht mid zunächst mit 100 — 150 cm^ heii'ieni Wasser übergössen. .Mit dem (Jlasstabe wird die Substanz in dem Wasser möglichst fein verrührt, so dal') von dem Fäzes- pulver keine gröberen Bröckel mehr sichtbar sind. Zu dieser Anfschweni- mung setzt man nun soviel (Tramm Atzkali in Stangen, daß eine 50" oig»^ Lauge entsteht. Es erfolgt beim Schmelzen des Alkalis starke Erhitzung und lebhaftes Aufschäumen, weshalb der Alkalizusatz nur portionsweise er- folgen darf. So wird erreicht, daß das Ätzkali bereits im schmelzenden Zustande bei starker Hitze auf die inkrustierenden Substanzen und son- stigen Fäzesbestandteile einwirken kann. Nachdem sich alles Kali gelöst hat, kocht man eine Stunde im Wasserbade. Nach dieser Zeit ist ein großer Teil der Substanz gelöst. Man läßt die Flüssigkeit ziemlich erkalten und setzt dann 3 — b cm^ SOVoiges HA),, (Merck j zu. l)er Zusatz muß vor- sichtig tropfenweise, am besten aus einer Meßpipette erfolgen, da die Flüs- sigkeit stark aufschäumt. Sollte das Aufschäumen so intensiv sein, daß der Inhalt des Bechergiases den Rand desselben zu überschreiten droiit. so genügt es, aus der Spritzflasche eine kleine Menge 960 o'gen Alkolnds auf- zuspritzen, um das Überschäumen zu verhindern. Unter dem H.,().,-Zusatz tritt eine neuerliche starke Erhitzung ein, bei der noch die letzten Ueste organischer Substanzen außer der Zellulose zerstört und zersprengt werden, (ileichzeitig entfärbt sich die Flüssigkeit. Selbst anfangs tiefschwarz au.s- sehende Flüssigkeit erscheint jetzt hellgelb oder hellbraim. Das bietet den Vorteil, das man etwa noch ungelöste Brocken erkennen kann, in welchem Falle man noch ^/j — V4 Stunde im Wasserbade kocht. Nachdem die helle Flüssigkeit etwas abgekühlt ist, setzt man das halbe \'olumen 96%igen Alkohols zu. Oft mischen sich die Flüssigkeiten nicht sofort. Der Alkohol schwimmt oben auf wie Öl auf Wasser. Es genügt dann ein tropfenweiser Zusatz von 6 7 nn^ konzentrierter Essigsäure, welche Zellulose nicht angreift, um eine gleichmiißige Mischung zu erzielen. Die etwa gelöst gewesene Zel- lulose fällt als feiner Niederschlag aus. Die FUissigkeit ist dabei natürlich noch so stark alkalisch, daß alle Eiweißstoffe in Lösung bleibt'U. Nun wiid möglichst heiß duich ein gehärtetes Filter (Schhic/icr und Schul/ Nr. 575, 24 cm Durchmesser) abfiltriert. Das Filtrieren geht meist so schnell von- statten, daß man eine Saug])unipe nicht nötig hat. Der Ilückst.-md im Filter ist unlösliche 4- lösliche Zellulose -|- Asche. Lm aus dem Bückstand schon den größten Teil des Alkalis zu entfernen und sich dadurch das spätere Filtrieren zu erleichtern, ist es zweckmäßig, noch 1 2nial mit heißem Wasser nachzuwaschen, was eiienfalls sehr schnell vor sich geht. Nunmehr wird der Bückstand vom Filter ins Becherglas zurückgespritzt, mit reichlich warmem Wasser aufgenommen, auf einem gewogenen Filter {Schlächer und Schüll Nr. 5,^!i . 12^ ., cm Durchmesser) filtriert und mit 334 H. L ohrisch. heißem Wasser ausgewaschen, bis das Spülwasser keine alkalische Reaktion mehr gibt. Dieses Filtrieren geht ebenfalls rasch vor sich, zumal wenn man darauf achtet, daß zunächst die im Becherglase überstehende Flüs- sigkeit getrennt vom Sediment auf das Filter gebracht wird. Dann wird mit verdünnter warmer Essigsäure zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen, die Essigsäure ward mit Wasser ausgewaschen, zuletzt wird mit heißem Alkohol und Äther gewaschen, getrocknet und gewogen. Der Aschegehalt muß von dem Gewicht in Abzug gebracht werden. Ein etwaiger N-Gehalt ist so geringfügig, daß er vernachlässigt werden kann. Vorherige Extraktion sehr fettreicher Fäzes mit Äther ist nicht nötig. Die Methode ist, wie ich mich durch reichliches und laugjähriges Arbeiteu da- mit überzeugt habe, durchaus brauchbar, weuu es sich darum handelt, Ausuutzungs- versuche anzustellen, bei denen es auf einen Vergleich zwischen der eingeführten und ausgeschiedenen Zellulose ankommt. AVenn man hierbei im Fütterungsmaterial und im Kot die Zellulose mit der Methode bestimmt und dabei größten Wert darauf legt, daß die Kochzeiten in allen Analysen peinlichst genau eingehalten werden, daß immer die gleichen Mengen Lauge und B^O^ bei gleicher Hitze angewendet werden, so erhält man Analysenresultate, die sich sehr wohl verwerten lassen und vor allen Dingen genügen, um die zugeii'ihrte mit der ausgeschiedeneu Zellulose zu vergleichen. Scheunert ^> ^) fand die Differenzen in den Kontrollanalyseu größer als bei anderen Methoden und führt dies zurück vor allem auf die Verwendung des HjO,, welches Zellulose, zumal bei Gegen- wart von Alkali, in der Tat stärker anzugreifen scheint als andere Chemikalien. Läßt man aber das llfi^ weg, so begibt man sich damit des Vorteils, reine Zellulose zu bekommen. Ich würde deshalb lieber eine etwas größere Differenz in den Resultaten der Koutrollanalysen vorziehen, zumal diese Differenzen bei sorgfältigster Herstellung ganz gleichmäßiger Verliältnisse bei Ausführung der Analysen meiner Erfahrung nach nie so groß werden können, um das Resultat erheblich zu trüben. Ich^) habe erst in neuerer Zeit gelegentlich eines Hundeversuchs wieder gezeigt, daß sich damit doch recht brauchbare Analysen ausführen lassen. Gelegentlich allerdings trifft man wohl einmal Fälle an, in denen auch in zahlreichen Analysen keine rechte Übereinstimmung zu er- zielen ist. Hier spielt offenbar die Beschaffenheit des Untersuchungsmaterials eine Rolle. In solchen Fällen muß man sich eben mit einem Mittelwerte aus den am meisten über- einstimmenden Analysen zufrieden geben. Führt man aber dabei eine genügend große Anzahl Analysen aus, so ist die Fehlerbreite dann auch keine allzu große. Es sind also die Scheunertschen Bedenken nicht unberechtigt. Die Mängel der Methode sind aber in den geschilderten eigenartigen ^'erhältnissen begründet und werden sich vorläufig noch nicht vermeiden lassen. Die Einwände Scheunerts treffen übrigens jede andere Methode eben- so, auch z. B. die weiter unten erwähnte Zellulosemethode von Kö)iig. Auf den Alkohol- zusatz logt Scheunert keinen Wert. Dies ist für viele Fälle wohl richtig, wenn keine Zellulose in Lösung gegangen ist. Wo aber Zellulose gelöst ist, muß sie durch Alkohol- zusatz gefällt werden, sonst würde sie mit dem Filtrate zu Verlust gehen, was die Fehler der Methode noch mehr vergrößern würde. Es ist deshalb, da man nie wissen kann, ob Zellulose in Lösung geht, in jedem Falle angebracht, den Alkoholzusatz zu verwenden. *) Ä. Scheunert und E. Lötsch, Vermag der Hund Zellulose oder Rohfaser zu ver- dauen? Biochem. Zeitschr. Bd. 20. H. 1 u. 2. S. 10— 2L 1909. -) A. Scheunert und E. Lötsch, Über die quantitative Zellulosebestimmung mit Hilfe der Methoden von „Lange" und „Simon und Lohrisch". Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 65. H. 3. S. 219-231. 1910. ^) H. Lohrisch, Bemerkungen zur Frage der Zelluloseverdauung beim Hunde und iiber die Methoden der quantitativen Zellulosebestimmung. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 09. H. 2. S. 113—151. 1910. Methoden zur Untersuchiiug der inensrhlichon FMzos. •)m', Schcunert und Latsch^) füluTu unsere Methode in foljronder W» ■- modifiziert und vereinfacht aus : 1—2 (/ fein gemahlene Substanz wird in einem Hec lier^,'lase mit 100 rw 3 kaltem Wasser verrührt, in weiches nach und nach 1()(» y Kali- staniien einj^etrai^en werden. Nach Lösuul;- (h's Kalis wird auf (h-m sie- denden AVasserhade eine Stunde lan^' erhitzt, dann tlier.en des Filtrats mit heiliem Wasser nachirewaschen. hann spritzt iii.ni (h-n Kück- stand vom Filter in das Becherf^las zurück, filtriert durch ein ;,'ewo<^enes Filter und wäscht mit heißem Wasser nach bis zum Verschwinden di-r al- kalischen Reaktion des Filtrats. Hierauf wä.scht man mit :y\oV^i-r heiücr Essitisäure dreimal, spült abermals mit heij'.em Wasser nach bis zum Ver- schwinden der saureu Keaktion, wäscht mit Alkohol und Äther und trocknet. Der Aschegehalt ist vom Gewichte abzuziehen. Bei diesem N'fifalircu wird die Zellulose natürlich iiiciit so rein erhalten wie lici Sinion-Lohrifich. Iiiimerhiii wird mau auch hei gleichmäßiger Anwendung dieses Verfahrens vergleicliliaro Resultate erzielen können. Erwähnt sei noch das Königsche^) Verfahren der Zellulosedarstellunir, welches ebenfalls, trotz Anwendung- von H.^O,, gute Resultate geben soll, aber sehr umständlich und langwierig ist. Das Verfahren gestaltet sich zunächst genau so wie das oben ange- gebene Könif/ache Rohfaserverfahren. Es wird mit (dyzerinschwefelsäure gekocht, durch den Goor//-Tiegel filtriert und der Rückstand mit warmem Alkohol und Äther gewaschen. Nun wird der Rückstand mit dem Asl»e>t aus dem Tiegel in ein etwa 800 cin'^ fassendes llecherglas gebracht und mit ca. 150 cin'^ chemisch reinem dreigewichtsprozentigen H.J)., und 10 cm^ 24''/oigem Ammoniak versetzt und ca. 12 Stunden stehen gelassen. Dann werden 10 ciu'-^ liOVoiges Wasserstoffsupero.xyd zugesetzt, der Zusatz noch einige Male wiederholt und auch noch einige Male 5 cni^ 24:Voiger Am- moniak zugegeben, bis die Masse weili geworden ist. Dann erwärmt man 2 Stunden im Wasserbade und filtriert wieder durch Asbest. Der gewaschene Rückstand wird samt dem Asbest mit 7.") cnt^ Kupfero.xydammtmiak er- wärmt und dann durch einen G^oocÄ-Tiegel filtriert. Das Filtrat wird mit 300 cms SOVoigem Alkohol versetzt und stark gerührt. Hierdurch scheidet sich die Zellulose in großen Flocken (piantitativ wieder aus. Sie winl auf dem Filter gesammelt, gewogen und verascht. Von größter Wichtitrkeit ist es, hei der Ausführung Vdii .\ us n ut zu ngs vor- suchen, hei denen es darauf ankommt, die Menge iler eingeführten mit der wieder ausgeschiedenen Zellulose zu vergleichen, darauf zu achten, daß zur FOtteriinjf nicht reine Zellulosepräparate henutzt worden, die mit einer »ler ge- nannten Zellulosemethodon hergestellt worden sinii. Srli, um rt") neigt*: luim- ') A. Schcunrrf und I'J. JJifsrh, \ermag der Hund Ztdluhtse oder Hohfaser zu verdauen? Biochem. Zeitschr. Bd. 20. H. 1 u. 2. S. 18-10. lUit'.». 2) .7. Könifi, Die Ztdlmemhran und ilire Bestandteile in cIk iiiiM-lier und piivhio- logischer Hinsicht. Landwirtschaftliche Versuchsstationen. Bil. <)."> S .'-."i lld l'.H>fi. «) A. Sciuumrt und E. LiU.srh, I. c. S. 10—21. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arlii«itpi((n- säure erkannt. Der Rest der Kalksalzlösung wird mit Kupfernitrat versetzt, worauf die Kupfersalze der Propionsäure, der Buttersäure und der Valerian- säure in meist sehr charakteristischen Formen (besonders die Valeriaii- säurekristalle) auskristallisieren. Die Buttersäurekristalle sind an der cli.i- rakteristischen Schwalbenschwanzzwillingsform zu erkennen. Milclisäiire. Der nach der Entfernung der flüclitigeu Fettsäuren zni-iickbli-ibende Destillationsrückstand kann nach Sfrasl'Utyer^) in folgemier Weise ztn- quantitativen Bestimmung von Müchsäure verwendet werden: Der Destil- lationsrückstand wird mit Wasser verdünnt, mit Baryt ausgefällt, filtriert und nachgewaschen. Das Filtrat wird durch CO.^ von überschüssigem Baryt befreit, bei mäßiger Temperatur (nicht über 70" C') eingeenirt und dreimal mit der lOfachen Menge Alcohol absol. ausgezogen. Nach \'erdnn- sten des Alkohols versetzt man den Rückstand mit der gleichen MenL'e Phosphorsäure und schüttelt mit der iDfachen Menge Äther ca. fünfmal aus. Da etwas Phosphorsäure mitgerissen resp. gelöst wird, so sucht man durch Dekantieren sowie Verdunsten des Äthers und nochmaliges LöstMi in diesem die Phosphorsäure zu entfernen. Nunmehr wird der Äther ver- trieben, der Rückstand — Milchsäure in Wasser gelöst nnd die .Menge durch Titration bestimmt. Der (jualitative Na(diweis der Milchsäure in dem zur .Vusschütteluni: benutzten Äther geschieht so, dall man im Reagenzglase zu .') <-;//^ des Äthers 2 Tropfen einer 10"/oi&e'> Eisenchloridlösung zu.setzt . worauf die bekannte gelbgrüne bis intensiv grüne Färbung des Äthers din-ch Bildung von milchsaurem Eisen eintritt. Statt der Fisenchloridlösuni: kann auch das Uffelmaniische Reagens (H Tropfen Kisenchloridlösung: ÜO cm» l^/oiper Karbolsäurelösung) genommen werden. Die amethystblaue Farbe des Re- agens wird durch Milchsäure in /eisiggelb oder (ielbtrriin verwandelt. *) A(L Schmidt und .7. Slruahutyir, Die Fäzes des M.i,x,1i,mi im iionnil.'ii und Jiraukhaften Zustande. 2. Auflage. S. 202. Berlin llHJö. 9ji» 388 H. Lohrisch, Nachweis von Gallenbestandteilen. Galleiisäuren. Die Gallensiiurcn (Glykochol- uiul Taurocholsäure) erscheinen unverändert nur unter pathologischen Verhältnissen (starke Durchfälle, mangelhafte Reduktionsprozesse) in den menschlichen Fäzes "wieder. Unter normalen Umständen wird der größere Teil der Säuren im unteren Dickdarm resorbiert, der kleinere Teil im Dickdarm unter dem f^influsse der Fäulnis gespalten in Glykochol, Taurin und Cholalsäure. Es ist also, um Gallensäure nachzuweisen, unter normalen Verhältnissen insbesondere auf Cholalsäure zu fahnden. Um die Cholalsäure rein darzustellen, ist es nötig, sie zu isolieren durch Extraktion der P'äzes mit Alkohol und Entfernung der Fettkörper aus dem alkoholischen Extrakte durch Fällung mit Barvtlösung. Hoppc- Seijler'^) verfährt in folgender Weise: Man extrahiert die J'äzes mit Alkohol, filtriert, dampft unter Zusatz von etwas Essigsäure auf dem Wasserbade zum Syrup ein und zieht den Rückstand mit kaltem W^asser aus. Das Un- gelöste wird mit Barytwasser übergössen und nach Zufügen von etwas Wasser erwärmt. Man leitet jetzt Kohlensäure bis zur neutralen Reaktion ein, erhitzt zum Sieden, filtriert heiß, erschöpft den Rückstand durch Auskochen mit heißem Wasser und dampft die vereinigten heiß filtrierten Auszüge auf ein kleines Volumen ein. Nach dem Erkalten wird etwas Äther und dann Salzsäure zugefügt, gut umgerührt und eine Zeitlang stehen gelassen, wobei der Äther verdunsten kann. Man filtriert die ausgeschiedene Cholalsäure ab, wäscht mit Wasser, löst in Alkohol, dampft die alkoholische, nötigenfalls mit Tierkohle entfärbte Lösung auf ein kleines Volumen ein und läßt zur Kristallisation stehen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden mit Hilfe der Pettenkoferschen Reaktion auf Cholalsäure geprüft. Pettenko/ersche Probe. Fügt man zu einer etwas Cholalsäure ent- haltenden wässerigen Flüssigkeit im Reagenzglas etwas Rohrzucker und dann allmählich tropfenweise unter Umschütteln konzentrierte H., SO^ , indem man durch Erwärmen oder Abkühlen in kaltem Wasser die Temperatur auf etwa 70" erhält, so tritt, wenn die zunächst gefällte Cholalsäure durch den w^eiteren Zusatz der Schwefelsäure wieder gelöst ist und noch weitere Schwefelsäure zugesetzt wird, eine zuerst kirschrote, dann prachtvoll purpurrote Färbung der Flüssigkeit ein, die sich im Verlaufe von 8 Tagen unter allmählichem Dunklerwerden in eine blaurote Farbe umwandelt. Diese Reaktion beruht auf der Einwirkung des Furfurols, welches aus dem Zucker durch Schwefelsäure gebildet wird. Die purpurrote Lösung zeigt, hierzu am besten mit Alkohol verdünnt, einen Absorptionsstreifen rechts von />, einen zweiten bei E. Anwesenheit von Eiweißstoffen, viel Farb- stoffen oder oxydierenden Substanzen kann die Reaktion beeinträchtigen. Der Xachweis der gepaarten Gallensäuren und der Cholal- säure geschieht nach Hoppe-Sei/ler folgendermaßen: Man extrahiert die Fäzes mit Alkohol, filtriert, entfernt den größten Teil des Alkohols durch ') Zitiert nach Äd. Schmidt und J. Strctfthuryer , Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 218. Berlin 1905. Methodeu zur Untersucliung der incusi-liliclieii Filzes. h«ij Kindanipfen, macht mit Salzsäure sauer, dann mit Barvtwasser stark alkalisch, leitet CO., ein, erhitzt zum Kochen, filtriert heil', nml kocht den Ivückstand noch mehrmals mit Wasser aus. Die vereini.^tcn Kiltrate werden auf ein kleines Volumen ei uticd, impft. Reim Krkaltcn scheidet sich cholal- saurer Baryt ah, während .iilykocholsaurer und taurochdlsaurer I'>ar>t in Lösung bleiben. Der cliolalsaure l'.aryt wird durch Deliandeln mit Salz- säure, wie oben ano-egeben, in Cholalsäure überfidirf. Zur weiteren Tren- nung der Glykocholsäure von der Taurocholsäure dient das verschiedene Verhalten dieser Säuren gegen Bleizuckerlösung, (llykocholsäure und Cholal- säure werden durch Bleizucker gefällt, während dabei nur sehr geringe Mengen Taurocholsäure mitgerissen werden, wenn die Flüssigkeit nicht stark alkalisch ist. Nach der Ausfällung dieser Säuren kann die Taurochol- säure durch Bleiessig und etwas Ammoniak gefällt werden. Cber die ver- schiedenen Methoden zur Identifizierung der S;iui-en außer der Pcttcn- kof ersehen Reaktion vgl. Hoppe- Sc f/1 er. ' ) Die Cholalsäure geht auch in das Ätherextrakt der Fäzes mit über. Wenn man den vom Cholestearin befreiten getrockneten Kückstand des Gesamtätherextraktes (vgl. S. o68)mit Barytwasser unter Erwärmen schüttelt, so kommt es zur Bildung von Pjarytseifen und cholalsaurem Baryt. Die Seife wird abfiltriert und mit heißem Wasser gewaschen. Der cholalsäure Baryt geht ins Waschwasser über und kann wie oben weiter verarbeitet werden. Nach Uri/ 2) werden die gepaarten Gallensäuren und die Cholalsäure in folgender Weise nachgewiesen : Mau extrahiert die Fäzes mit Alkohol, filtriert, engt auf ein geringes Flüssigkeitsquautum ein, säuert mit HCl an, macht mit Barytwasser stark alkali.sch, leitet CO., ein und erhitzt zum Kochen. Es wird heiß filtriert und der Bückstaud mehrere Male mit Wasser ausgekocht. Hierauf werden die Filtrate vereinigt, eingedampft und der Kückstand, um etwa gepaart anwesende (i aliensäuren zu veiseifen, mit 2b cm^ 3H%iger Natronlauge 8 Stunden gekocht, indem das Wasser immer wieder durch heißes ersetzt wird. Dann säuert man mit Schwefel- säure an, schüttelt mit Äther aus und löst den Ätherrückstand in wenig verdünnter Natronlauge und prüft auf Cholalsäure mittelst der I'rftrn- ^q/erschen Probe. Die Botfärbung allein genügt nicht ; man gießt daher die Lösung in Eisessig und sieht nun, ob die Fliissiirkeit rot gefärbt ist und das charakteristische Spektrum zeigt. Gallenrarljstoft'e. Die Farbstoffe der Galle, die in den Darm crjrosspii wird, werden ziim größeren Teil im Urin und in den Fäzps ausgeschieden. lU>r Ilauptantoil der ausgeschiediMioii Gallenfarbstoffc kommt auf die Fäzes. Drr normale Fazesfarlistoff ist Hvdroliili- *) F. Hoppe-Sci/ler und //. Thirrfeldcr, Hainllnicli der pliysiologiscli- und paflio- logisch-chemischen Analyse. VII. Aufl. Berlin l'.)03. *) Zitiert nach Ad. ffrchf. Die Fäzes des Sänglintfs und des Kimlis .'^. HJj liciini und Wien lUlÜ. 390 ^- Lohrisch. ruliin, entstanden durch Reduktion des Bilirubins, die im Blinddarm und oberen Teile des Dickdarms staltfindet. Früher nahm man an. daß das Hydrobilir ubin der Fäzes und das Uro bil in des Harns identisch seien. Jetzt wissen wir, daß das nicht der Fall ist, denn Hydrobilirubin enthält nach Mahf 9-45Vo N, das Urobiliu \\Vic\\ Garrod und HopUns 4117o N. Neuer- dings hat Fromholdt >) noch ein hydrobilirubinartiges Pigment dargestellt mit ö'OSVo ^• Nach Fromholdt ist es nicht unwahrscheinlich, daß die Zahl dieser Körper sich noch vermehren läßt, und er hält es deshalb für richtiger, von einer Hydrobilirubiugruppe zu sprechen, in die die genannten Pigmente und eventuell auch noch andere hineingehören, die in ihren spektralen Eigenschaften gleich, in ihrem N-Gehalte aber verschieden sind. Hydrobilirubin. Qualitativer Xach weis. Die einfachste Methode ist die Sublimat- probe von Äd. Schmidt.^) Diese wird so ausgeführt, daß man von den möglichst frischen Fäzes ein etwa hasel- bis walnußgroßes Stück im Morser mit einer nicht zu kleinen Menge konzentrierter wässeriger Sublimatlösung (Sublimat 25-0, Na Cl 2*5, Aqua dest. 500-0) fein verreibt und das Gemisch in einem zugedeckten Petrischälchen bis 24 Stunden stehen läßt. Es färben sich dann sehr schnell alle hvdrobilirubinhaltigen Teilchen intensiv ziegel- rot infolge von Bildung des leuchtend roten, gelb fluoreszierenden Queck- silberchlorid-Hydrobilirubins , so daß die ganze Stuhlmenge diese Farbe an- nimmt. Am schönsten kommt die Farbe an ganz frischen Fäzes heraus. Kot, der längere Zeit gestanden hat, gibt rotbraune bis schmutzigbraune Farbe. Eine weitere qualitative Probe besteht im Nachweis der Fluores- zenz des Hydrobilirubins: 10cm3 wässerigen geklärten (Kieseiguhr) Fäzesextraktes werden mit 10 cm 3 alkoholischer Zinkazetatlösung (lOVoige Zinkazetatlösung in abso- lutem Alkohol) im Reagenzglas vermischt und umgeschwenkt. Ein etwa entstehender Niederschlag wird abfiltriert. Im Filtrat Fluoreszenz. Oder 3): Eine kleine ^lenge Kot wird im Reagenzglas mit saurem xVlkohol Übergossen und eine Zeitlang stehen gelassen. Wenn Gelb- oder Braun- färbung des Alkohols aufgetreten ist, wird derselbe abgegossen und mit ein paar Tropfen Ammoniak und Chlorzinklösung versetzt. Oder man ver- setzt ein mit ammoniakhaltigem Wasser hergestelltes und filtriertes Fäzes- extrakt mit Chlorzink. Es entsteht ein dunkelroter Niederschlag, welcher auf ein Filter gebracht und mit ammoniakhaltigem Alkohol ausgezogen wird. Es tritt dann sehr schön die Fluoreszenz auf. ferner kann man das Hydrobilirubin in dieser Lösung an seinem charakteristischen Spektrum erkennen: das alkalische Hydrobilirubin hat zwischen h und F, näher an h gelegen , einen Absorptionsstreifen ; beim Ansäuern der Lösung rückt der Streifen nach F zu. 1) G. Fromholdt , Beiträge zur Urobilinfrage. Zeitschr. f. exp. Path. u. Therapie 7. Bd. H. 3. S. 717. 1910. -) Ad. Schmidt und .7. Strashurger , Die Fäzes dos Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 220—221. Berlin 1905. "j Zitiert nach Ad. Schmidt und J. Strashurger , 1. c. S. 221. Mcthndpii zur UiitorsiiclmiiL'' der iiioii — 4<7 Stuhl werden mit :\Ovni'^ Amvlalkohol verrieben nnd im Filtrat das charakteristische Spektrum das Ilydrobilirubins anf^rcsnciif. Zu diesen rroben können auch getrocknete Fiizcs verwendet werden. Die i)ekannten tont'arbiiien Fett stuhle kommen beim .Menschen im allgemeinen dann zur Ucobachtuny, wenn der (Jallezuthib zinn I»arm abgeschnitten ist. Hier ist der Mangel an iiydrobilirnbin mittelst (h-r Sublimatprobe ohne weiteres zu erkennen. Es gibt in seltenen Fähen aber auch acholische Stühle bei erhaltenem (iaileznnuli in den I>arm. liei denen die weiße Farbe lediglich durch den Fettgehalt bedingt ist. Solche Stühle werden, wenn man sie mit Äther entfettet, wieder iu-aun : lerner klärt die SubUmatprobe auf. Weiter können diese acholischen Sfühle aber auch dadurch bedingt sein, daß das Bilirubin durch eine zu weit geheii(h' Reduktion zu Leukohydrobilirubin umgewandelt worden ist. In diesem Falle wird der Stuhl, wenn man ihn an der Luft stehen lidit. an der Ober- fläche durch Oxydation wieder braun. Die Sublimatprobe gibt mit Leuko- hydrobilirubin ebenfalls schöne llotfärbung. Quantitativer Nachweis. Die Methoden zum ([uantitativen Nach- weis des Hydrobilirubins sind schwierig ausznführen und sind nicht als ganz exakt zu bezeichnen, da das Hydrobilirubin ein leicht veränderlicher Körper ist. Sie liefern, wie schon oben (Fromholdt) erwähnt, nicht imnu'r gleichmäßig zusammengesetzte Pigmente (N), während die optischen pjgen- schaften der Pigmente übereinstimmen. Es ist deshalb eigentlich nöti^^ in den dargestellten Pigmenten immer den N-Gehalt zu bestinnnen. Alle .Me- thoden stützen sich auf die von Friedrich Midier ursprün^dich angege- bene Methode zur Darstellung des Uroliilins aus dem Hai-n. Das Ver- fahren von Müller-) wird in folgender Weise ausgeführt, wobei einiire kleine Modifikationen von Tsuchiija-BriKjsrh^) berücksitditiüt sind: Eine gewogene Menge des frischen oder trockenen pulverisierten Kotes wird mit Wasser verdünnt und mit heißer Barytmischung (1 Vol. gesättigte Chlorbaryumlösung -j- r^Vol. gesättigte BarythydratlösuuLr) ver- rieben, aufgekocht, filtriert und der Filterrückstand noch mehrmals mit heißer Barytmischung und Wasser gewaschen, wodurch das Ilydrobiliinlün dem Niederschlag bis auf einen kleinen Best entzogen wird. Dann wird im Filtrat das überschüssige Baryt durch konzentrierte Natriumsidt'atlösiini; entfernt, mit Schwefelsäure nahezu neutralisiert, filtriert uud das Filtrat mit feingepulvertem Ammoniumsulfat (etwa »/j — V, \ ol. der Lösunu-) ver- ') Zitiert nach Äd. Hecht, Die Ftizes des Süngliniufs und lics Kindes. S. \ÜA). Berlin und Wien 1910. ^) Zitiert nacli Ad. Scluuidf nnd ./. S/nislnirt/cr, Die Füzos dos Mensrlion im normalen und krankhaften Zustande. 2. Aufl. S. 222—223. Berlin IWO'o. ■') ./. 'J'f!iirhii/a (mitLreteilt von 77i. lirtnisrh). IJcitriiire zin- Krasro der I r- scheidnmr. Zeitsriir. f. oxperini. I'atind. n. TiuMapii". Bd. 7. H. 1 S. X^I :^<'.) l'iin 392 H. Lohrisch. setzt und unter häufigem Umrühren und Schütteln 24 Stunden stehen ge- lassen. Enthält die Lösung dann bei der spektroskopischen Untersuchung noch Hydrobilirubin, so wird das Aussalzen mit Ammoniumsulfat wieder- holt. Andernfalls wird filtriert. Durch Schwenken des Gefäßes mit dem rückständigen Salze läßt sich an der Wand haftender Farbstoff leicht ab- lösen. Dann spült man Salz und Gefäß mit dem Filtrat auch auf das Filter aus und wäscht das Filter zuletzt mit gesättigter Ammoniumsulfat- lösung. Wenn das Filter mit dem Niederschlage oberflächlich lufttrocken geworden ist, wird es in einem Kolben mit aufgesetztem Kühlrohr nach Zusatz von verdünnter Schwefelsäure mit einer Mischung von 1 Teil Äther und 2 Teilen Alkohol in der Wärme ausgezogen. Das Hydrobilirubin löst sich in dem schwefelsauren Ätheralkohol. Ein dreimaliges Extrahieren ist gewöhnlich genügend. Die Lösung wird nun klar abfiltriert und der Rück- stand wiederholt mit schwefelsäurehaltigem Alkohol ausgewaschen. Wenn die ätherisch-alkohohsche Lösung stark verdünnt ist, so wird sie auf dem heißen Wasserbade mittelst des Luftgebläses eingeengt, um ihr eine gewisse Konzentration zu geben. Das Volumen der Lösung wird dann genau ge- messen und auf seinen P^arbstoffgehalt untersucht. Tsuchiya-Brugsch empfehlen zur quantitativen Bestimmung des Hy- drobilirubins in der Lösung als exakteste Methode die spektrophoto- metrische Bestimmung mit dem /vöm^-3far^ew5schen Spektralphoto- meter. Eine genaue Beschreibung dieser Methodik siehe bei Tsuchiya- Brugsch. 1 ) Es kann auch gewichtsanalytisch bestimmt werden so, daß man in der Farbstofflösuug Chloroform auflöst und die Mischung in einem Scheide- trichter mit etwa dem doppelten Volumen Wasser schüttelt. Das Chloro- form nimmt den Farbstoff auf, setzt sich nach einiger Zeit ab und kann abgelassen werden. Nach dem Verdunsten desselben bleibt der Farbstoff zurück, welcher getrocknet und gewogen wird. Will man aus der ätherisch-alkoholischen Lösung das Hydrobilirubin in wässeriger Lösung haben, so führt man nach Tsuchiya-Brugsch'^) das Hydrobihrubin wie vorstehend in Chloroform über, läßt das Chloroform aus dem Scheidetrichter ab und wäscht es in dem doppelten Volumen Wasser. Dem Chloroform läßt sich das Urobilin durch langsames Schütteln mit schwach Ammoniak enthaltendem Wasser entziehen, wobei zu beobachten ist, daß bei Gegenwart von viel Ammoniak leicht eine sich nur sehr lang- sam in ihre Bestandteile scheidende Emulsion entsteht. Fromholdt ^) macht darauf aufmerksam, daß bei der Hydrobilirubin- darstellung möglichste Schonung des leicht veränderlichen Farbstoffes ge- M J- Tsiichiija (mitgeteilt von Th. Brugsch), Beiträge zur Frage der Urobilinaus- scheidung. Zeitschr. f. experim. Pathol. u. Therapie. Bd. 7. H. 1. S. 353—357. 1910. -) J. Tsuchii/a (mitgeteilt von Th. Bnigsch), 1. c. S. 359. ') G. Fromholdt, Beiträge zur Urobilinfrage, Zeitschr. f. experim. Pathol. u. The- rapie. Bd. 7, H. 3. S. 716-717. 1910. Methotlen zur riitcrsucliuiiL^ dor in«Mi.srhlii*h(Mi Fiizps -'»r; boten erscheint, ^veshall) besonders starkes Erwärmen vermieden werden soll. Nach seinen Ani^al)en, die für das Urobilin des Urins ;.n'macht sind, würde man für die Fäzes so vorzugehen haben, dati man eine bestimmte Menge Fäzes mit salzsaiirem Wasser fein verreibt und extrahiert und das Extrahieren solange fortsetzt, bis man sicher ist, dali alles Ilydroliilirubin aus den Fäzes entfernt ist. Das klar filtrierte P'äzesextrakt. welches even- tuell eingeengt wird, wird dann zum Aussalzen des Hydrobilirubins mit Ammoniumsulfat versetzt. Hierauf Filtrieren. Lösen des Niederschlags mit mögüchst wenig Natronlauge in Wasser. Filtrieren, behandeln des Filtrats mit der obigen Barytmischung, solange noch ein Niederschlag entsteht. Filtrieren. Befreiung des Filtrats vom überschüssigen Baryt mit Natriiun- phosphat und etwas Natriumsulfat. Filtrieren (Abnutschen). Ansäuern des Filtrats mit Salzsäure und Aussalzen mit Ammoniumsulfat. Filtrieren. Trocknen des abfiltrierten Niederschlags im Vakuum über Kal/iumchlorid. Extraktion des trockenen Niederschlages mit Chloroformalkohol (:)0:1). Filtrieren. Fällen des Hydrobilirubins aus dem im \'akuum eingeengten Extrakt mit Petroläther. V. Moraczewshi^) verfährt zum ([uantitativen Ilydrobilirubiniiachwels einfacher so, daß er einen sauren alkoholischen Fäzesauszug im Spektro- photometer untersucht. Die Absorptionsstreifen für saures Hydrobilirubin sind so charakteristisch, und es braucht der alkoholische Auszug eine so große Verdünnung, daß dal)ei die anderen Kotfarbstoffe nicht in Frage kommen. Außer dem schon erwähnten Apparat von KönKj-Martem können be- nutzt werden die Spektrophotometer von Vierordt, Hiifnrr oder GUni. -) Bilirubin. Qualitativer Nachweis: Hierzu wird die Ad. Schinidt^^che^) Sub- limatprobe benutzt, die in derselben Weise wie oben angestellt wird. Da- bei färben sich alle bilirubinhaltigen Teilchen durch Oxydation des Bili- rubins zu Biliverdin grün. Die Probe kann also gelegentlich Hydi-obilirnbin und Bilirubin gleichzeitig anzeigen. Auch kann darin der Nachweis kleinster bilirubinhaltiger Teile mikroskopisch geführt werden. Die GmelimchQ Probe: Zusatz von salpetrige Säure enthaltender Salpetersäure zu den Fäzes bewirkt schnellen Farbenumschlag der gold- gelben Bilirubinfarbe in Grün, Blau, Violett. Bot und (ielb. Die Probe wird am besten so ausgeführt, daß man auf die in einer flachen (Jlasschale befind- liche Salpetersäure kleine Tropfen der mit Wasser fein verriebenen Fäzes fallen läßt. Sie gelingt nur bei reichlichem P.ilinibingelialt. *) W. r. Morarzcwski, Über den Maiiird v«mi Holatioii zwischoii lianiiiulikaii und Kotindol. Arcli. f. Yerdamingskrankh. Bd. 14. S. 378. li)U8. 2) Netibauer-IIiippcrf, Analyse des Harns. 11. Aufl. S. 48-Ü4. ^Viesl.adcn l'.MO. ^) Ad. Schmidt und J. S/rashiirijcr, Die Fäzes des .McnscluMi im iionualeii und krankhaften Zustand. 2. Aufl. S. 220-221. Berlin 11)05. 394 H. Lolirisch. Empfindlicher ist die Probe von Nahnyama.'^) Hierzu wird benötigt eine lOo/oige BaClo-Lösung und eine Mischung von 99 Teilen 95o/oigem Alkohol und 1 Teil rauchender Salzsäure , in der auf 1 ? 4 ^ Eisenchlorid aufgelöst sind. Man mischt nun eine Stuhlaufschwemmung, der man nötigen- falls eine Spur Xa^SOi zusetzt, mit der Chlorbaryumlösung zu gleichen Teilen, zentrifugiert und gießt die über dem Barytniederschlag stehende Flüssigkeit ab. Der Xiederschlag wird sodann mit 2 crn^ des an zweiter Stelle genannten Reagens übergössen und zum Sieden erhitzt. Die über dem Niederschlag stehende Hüssigkeit färbt sich bei Anwesenheit von Bilirubin grün oder blaugrün. Quantitativer Nachweis. 2) Die frischen Fäzes werden mit der Fr. MüUerschen Barytmischung verrieben, filtriert, der Rückstand mit wenig Essigsäure angesäuert und mit Chloroform ausgeschüttelt. Aus der Chloroformlösung wird das essigsaure Salz durch Schütteln mit mehreren Portionen Wasser entfernt; dann AAird die Chloroformlösung durch Zusatz von Alkohol filtrierbar gemacht und aus dem Filtrate der Alkohol durch erneutes Schütteln mit Wasser wieder entfernt. Die im Scheidetrichter abgeschiedene Chloroformlösung, die den Farbstoff enthält, wird verdunstet, der Rückstand getrocknet und gewogen. Der Nachweis von Blut in den Fäzes. Blut, welches aus dem Magen oder aus den oberen Darmabschuitten stammt, wird als Hämatin ausgeschieden. Hierauf beruht der chemische Nachweis des Blutes. Der Nachweis des Hämatins kann nach verschiedenen Methoden erfolgen: Teiclimannsche Häminprobe: Ein kleines auf Blut verdächtiges Kotpartikelchen wird mit nicht zu wenig Eisessig auf dem vorher erwärm- ten Objektträger verrieben und nach Zusatz einer Spur Kochsalz oder auch eines Tropfens gewöhnlichen Wassers langsam über einer kleinen Flamme erwärmt. Der Eisessig soll dabei nicht ins Sieden kommen und muß, wenn er sehr schnell verdunstet, eventuell noch einmal ersetzt werden. Nach dem Eintrocknen und Abkühlen wird ein Tropfen Wasser oder Gly- zerin zugesetzt, das Deckglas aufgelegt und das Präparat im Mikroskop auf die Anwesenheit von braunen . in rhombischen Prismen auftretenden Hä minkristallen untersucht. Die Kristalle sind unlöslich in Wasser, Alko- hol, Äther, Essigsäure und kalter Salpetersäure, lösUch in kochender Sal- petersäure, in konzentrierter Schwefelsäure, verdünnter Kalilauge und Am- moniak. Exakter sind die folgenden Proben: Weber-vau Deenscbe Probe: 5 — 10 r/ der gut mit dem Holzspatel durchrührten Fäzes werden in einer Reibeschale mit Wasser, dem 1/3 Vol. *) Zitiert nach Ad. Hecht, Die Fäzes des Säuglings und des Kindes. S. 161. Berlin und AVien 1910. -) Zitiert nacii Ad. Schmidt und J. Strashurger , Die Fäzes des Menschen im normalen und krankhaften Zustande. 2. Auflage. S. 223. Berlin 1905. Metliddon zur rntorsuolimi|? der menscblicheu i'iues. uqr^ Eisessig zugesetzt ist, bis zur flüssigen Konsistenz vorrielicii. Jliorvon nininit man eine größere Portion in ein weites Reagenzglas und schwenkt vorsichtig (nicht zu stark, um Emulsionsbildung zu vermeiden) mit Äther um. Dann läßt man den Äther absetzen und klären. Falls dies sehr langsam geschieht, setzt man einige Tropfen .\lkohol zu. Man kann nun entweder nach Wchir in dem hei Anwesenheit von Hämatin bräunlich gefärbten Äther das Spektrum des saui-en liämatins nachweisen. Dieses zeigt einen intensiven schmalen Streifen in Kot zwischen CundD und, gegen diesen an Stärke bedeutend zurücktretend, drei weitere Streifen in Gelb, auf der Grenze zwischen Gelb und (Jrün und auf der Grenze zwischen Grün und Blau; der letztere ist meist nur schwer erkennbar. Oder man verfährt nach vcm Dcen: Dem abgehobenen Äther setzt man lOTropfen frisch bereiteterGuajaktinkturund20— :;OTropfen altes ozonisiertes Terpentinöl zu. Bei Anwesenheit von Hämatin fäil)t sich der Äther blau. In neuerer Zeit ersetzt man die Guajaktinktnr durch einige Körn- chen pulverisierten Guajakharzes und das Terpentinöl durch 20 — .•'.() Trojjfen iWerc/tsches Perhydrol. Man kann die Guajaktinktnr auch durch frisch be- reitete Aloinlösung (ü-a Aloin. pulv. auf lO'O TüVoigen Alkohol) ersetzen. Einigermaßen fetthaltige Stühle werden vorher am besten mit Äther entfettet. Die Uenzidinprobe. Eiue noch feinere Methode ist die von Schlesinger und Holst ^i anffesrelteiic, bei der Benzidin verwendet wird. Die Bcnzidiureaktion üliertrifft nacii Walthtr-) die mittelst Guajaktinktnr und Ah)in angestellten Blutproben an Scbärfe ganz wesentlich, so daß beim negativen Ausfall der Benzidinreaktion das Vorhandensein von Blut mit der größten Sicherheit ausgeschlossen werden kann. Der positive Ausfall der Benzidin- reaktion ist nur unter gewissen Vorsichtsmaßregeln zu verwerten. Walther stellte fest, daß noch Verdünnungen von frischem Blut im Verhältnis 1 : 250000 l)ei Anwendung der Bcnzidiniaktion deutliche Grünfilrbung hervorrufen. Es werden sdion minimale Mengen von Fleisch oder sonstigem mit der Nahrung eingeführten Blut damit naclige- wiesen. Deshalb ist, wenn man auf okkulte, aus den Verduuungsorgani'ii sdlist stam- mende Blutungen fahndet, streng darauf zu halten, daß der Kot von einer absolut fleisch- und blutfreieu Kost stammt (was übrigens auch für die oben genannten Proben gilt). Ferner kann auch bei vrdliger Abwesenheit von Blut durch oxydierende Fer- mente tierischer oder pflanzlicher Herkunft, wie sie häufig im Stuhle vorkommen, ein positiver Ausfall der Benzidinreaktion liervorgerufen werden, was .sV/i/<. vi/Ji/cr und llolat dadurch zu verhindern suchen, daß sie sehr kleine Mengen Fäzes benutzen und die Fenneute vor Anstellung der Probe durcli KocIkmi zerstören. Krst unter diesen Vor- sichtsmaßregeln gestattet der positive Ausfall der Benzidinreaktion. auf die Anwe-i-n- heit von Blut, das dem Magen oder Darm entstammt, zu sehließen. Ausführung: Man stellt sich zunächst eine annähernd konzentrierte Lösung von Benzidin (Merck) in Eisessig dadurch her. dal'i man eine 0 E. SchJesiiu/cr und /'. Holst, Vergleichentle Untersuchungen über den Nachweis von Minimalblutungen in den Fäzes nel)st einer neuen Modifikation der Benzidinprobo. Deutsche med. Wocbenschr. Nr. 36. S. 1444—1447. lUOC). -) E. Walther, Über die \'erwendung des Benzidins für den lUutnacbweis, im be- sonderen über seine Anwendungsweise in der gerichtsärztlichen Pra.xis. Deutsche med. Wochenschr. Nr. 7. S. 309. 1910. 396 H. Lohriseh. Messerspitze Benzidiu in einem sauberen Reagenzglä sehen mit etwas Eis- essig (etwa 2cm^, wenn mehrere Proben auszuführen sind, entsprechend melir) übergießt, einige Male umschüttelt und dann beiseite stellt. Das Benzidin löst sich leicht. Um eine konzentrierte Lösung zu erhalten, tut man jedoch gut, während der weiteren Handhabungen diese Benzidineis- essiglösung noch einmal durchzuschütteln. Eine kleine etwa erbsengroße Menge der zu untersuchenden Fäzes wird mit einem Glasstabe in ein sauberes, etwa zu ein Fünftel mit Wasser gefülltes Reagenzglas gebracht und durch rührende Bewegungen mit dem Glasstabe in dem Wasser aufgeschwemmt. Dann wird das Gläschen durch einen Wattepfropfen verschlossen und die Aufschwemmung über der Flamme einmal zum Aufkochen ge- bracht, was beim ruhigen Hineinhalten in die Flamme in wenigen Minuten geschieht. Jetzt gießt man in ein reines Reagenzgläschen etwa 10 — 12 Tropfen der konzentrierten Eisessigbenzidinlösung und fügt etwa 2\/o — 3 cm^ 37oig6S Wasserstoffsuperoxyd hinzu. Damit ist das Reagens fertig, dessen Inhalt, wenn er seine Farl)e unverändert behält, zugleich eine Kontrolle der Re- agentien und des Reagenzglases ist. Hierzu fügt man 1 — 3 Tropfen der gekochten Fäzeslösung durch ein- faches Ausgießen aus dem geneigten Reagenzgläschen nach vorherigem leichten Durchschütteln. Bei Anwesenheit von Blut färbt sich die durch die wenigen Tropfen der dünnen Fäzeslösung nur in geringem Gi-ade getrübte hellgelb-bräun- liche Lösung schön grün, blaugrün oder blau. Je stärker der Blutgehalt ist, desto mehr herrscht das Blau vor. Folgende Modifikation der Probe von Schlesinger und Holst schlägt Messersckmidf^) vor und bezweckt damit die Zerstörung etwa anwesender reduzierender Stoffe und Fermente durch Verreiben des Extraktes mit Essigsäure und Neutralisation alkalischer Fäzes. Eine Messerspitze Benzidin wird in 2 cm'^ Eisessig gelöst. Diese Mi- schung muß jedesmal frisch gemacht werden, da sie nicht lange haltbar ist. In 2 m<3 Wasser, dem man einige Tropfen Eisessig zugesetzt hat, ver- reibt man mittelst Glasstabes in einem Reagenzglas ein erbsengroßes Stück Kot (von flüssigen Fäzes Va crn^)- Zu 3 Tropfen dieser Fäzeslösung wer- den 1 — 11/2 «>^3 (nicht mehr!) 3''/oiges H., 0« zugefügt. Hierzu setzt man 1 — 2 cni^ der Benzidineisessiglösung. Es empfiehlt sich nicht, zur Anstellung der Probe Fließpapiere, die mit den Reagentien getränkt sind, zu verwenden, z. B. Benzidinpapier, da dabei leicht Täuschungen unterlaufen {Walther ■^. *) Th. Messerschmidt , Zum klinischen Nachweis von Blut in den Fäzes. Münchener med. Wochenschr. Nr. 8. S. 389. 1909. 2) E. Walther, Über die Verwendung des Benzidins für den Blutnachweis, im be- sonderen über seine Anwendungsweise in der gerichtsärztlichen Praxis. Deutsche med. Wochenschr. Nr. 7. S. 310. 1910. Methoden zur Untcrsuchuiij,' der nieiiscliliclicii Fa/.es. 397 Die Phcnolplitaliiiprohe iiiicli IJoas.') Das Phonolphtalin ist als Uliitreagens zuerst von Iraiizüsischer Seite empfohlen worden. Boas benutzt es in folf^endcr Weise: Das Reagens ist eine alkalische Lösung von I'henolphtalein. das durch Zink zu Phenolphtalin reduziert und nach Boas in folgender Weise herge- stellt wird: 1 c/ I'henolphtalein und 25// Kalium hydr. fus. werden in l(M)j/ Wasser gelöst und 10 (/ Zinkpulver hinzugegeben. Die anfiinirlich rote Mi- schung wird unter beständigem lUihren und Schütteln so lange bei kleiner Flamme gekocht, bis vollständige Entfärbung eingetreten ist. Dann wird heiß filtriert. Zum Zwecke der besseren Haltbarkeit tut man gut. der Lösung etwas überschüssiges Zinkpulver zuzusetzen. Die Haltbarkeit ist unbegrenzt. Der feste Kot wird mit Wasser bis zur Dünnflüssigkeit verrieben, etwas Eisessig zugesetzt, verrührt, Äther zugefügt, langsam im Reagenz- glas geschwenkt, der Äther in ein reines Reagenzglas abgegossen, zum Äther 20 Troi)fen des Reagens zugegeben (da das Reagens sich bei Be- rührung mit dem Sauerstoff der Luft leicht oxydiert, so ist es zweck- mäßig, bevor man es zu dem Ätherextrakt zufügt, einige Tropfen ablaufen zu lassen), leicht geschüttelt und schließlich '^ — 4 Tropfen H^ ( )., zugesetzt. Hierbei wird bei Anwesenheit von Blutfarbstoff das Phenolphtalin zu Phenol- phtalein oxydiert und, da es sich in alkalischer Löstmg befindet, je nach dem stärkeren oder schwächeren Blutgehalt mehr oder weniger rosa bis intensiv rosarot gefärbt. Bei starkem Blutgehalt l)leibt die Rotfärbung län- gere Zeit bestehen, l)ei schwächerem l)laßt sie bereits nach einigen Mi- nuten ab. Bei hohem Blutgehalt der Fäzes ist der Zusatz von 11., ()o nicht nötig. Bei geringem Blutgehalt dagegen ist der HaOj-Zusatz immer nötig. Das ist praktisch insofern von Bedeutung, als bei einer schon ohne Zusatz von E-oOi auftretenden Rotfärbung unbedingt ein starker Blutgehalt angenom- men werden kann und umgekehrt. Ferner ist bei Ausfühiung der Probe zu beachten, daß das Ätherextrakt nicht zu sauer .sein darf. Im Notfalle kann man nachträglich tropfenweise lOVoi^ie Kalilauge zufügen. Ihrer Schärfe nach steht die Phenolphtalinprobe zwischen der Fr«'6frschcn tiuajak- probe und der Benzidinprobe. Auch bei der Plienolphtalinprobe ist die Einhahung meh- rerer fleischfreier 'J'age unerläßlich. Der Nachweis von Fermenten in den Fäzes. Trypsiii. Hierzu eignen sich klare Fäzesextrakte, die nach Frank und Schitfrn- helm') in folgender "Wei.se hergestellt werden: Die Fäzes werden in einem *) J. Boa.s, Die riicnoliiiitalinpriilK' als Reagens auf okkulte Hlutuniron <1<'S M:igon- darmkanales. Deutsche med. Wochenschr. Nr. 2. S. 62— 64. l'.Ml. -) Fr. Frank und A. Schitteuhcliii, Wnkinxwww und Nacliwi'is von 'li\]i.'-iii wnu Eropsin im Magen-Darmkanal. Zeitsdir. f. e.\p. ratli..|, u. 'I'li.r. Ud.8. Hl. S.2I6 l'.iK). 398 H. Lohrisch. Verhältnisse von 1:2 bis 1:4 mit Wasser angerülirt und durch gehärtetes Filtrierpapier auf der Nutsche mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe abfiltriert. Das so erhaltene Extrakt läßt man noch durch ein Beichel-Filter passieren. Die auf diese Weise erhaltene bakterienfreie Fäzeslösung stellt eine zu- meist der Farbe der Fäzes entsprechend gefärbte klare Flüssigkeit dar, welche meist neutral oder schwach alkahsch, in seltenen Fähen schwach sauer reagiert. Man kann natürlich auch Extrakte herstellen in der Art, wie es früher (S. 345) beschrieben worden ist. Diese sind aber nicht bak- terienfrei und müssen bei ihrer Verwendung mit Chloroform resp. Thymol versetzt werden. Das Extrakt wird mit konzentrierter Natriumbikarbonat- lösung, wenn nötig, leicht alkalisch gemacht. Am einfachsten gestaltet sich der Nachweis des Trypsins. wenn man zu kleinen Quantitäten des Extraktes im Reagenzglase eine Fibriuflocke oder ein mit Eiereiweiß oder Hammelserum {Frank und Schittenhelm i) gefülltes i¥e^/sches Röhrchen gibt und für 24 — 36 Stunden bei 37" in den Brutofen steht. Trypsinnachweis durch das Plattenverfahren von Müller- Schlecht^-) Das Prinzip des Verfahrens ist folgendes: Bringt man zur Prüfung auf proteolytische Fermente kleine Tröpfchen des zu untersuchenden Ma- terials auf die Oberfläche einer sogenannten Lö/f7er-Serum platte (Petri- schale mit einer dicken Schicht erstarrten Blutserums) und hält die so beschickte Platte bei 50 — 60" im Brutschrank, so zeigt sich an Stelle jedes Tröpfchens bei Anwesenheit von Ferment eine nach und nach sich ver- größernde dellen- oder muldenförmige Einsenkung. Ist kein Ferment vor- handen, so bleibt die Dellenbildung aus. Müller- Schi echt fanden, ^^•enn sie mit Hilfe der Serumplatte den normalen Darm- inhalt prüften, eine bis zum untersten Dünndarm fortschreitende Zunahme der proteo- lytischen Fermentwirkung. Im Dickdarmstuhle finden sich mir noch Reste von Trypsin oder gar keines. Es ist also nötig, wenn man im menschlichen Kote Trypsin nach- weisen will, einen Dünndarmstuhl zu erhalten. Dieser Dünndarmstuhl ist durch Abführ- mittel zu erzielen. Täuschungen können bei positivem Ausfalle der Plattenprobe dann vorkommen, wenn der Stuhl Eiter enthält, da man dann die Wirkung von proteolyti- schem Leukozytonferment nicht ausschließen kann. Um sich hierüber zu orientieren, genügt meist der makroskopische resp. mikroskopische Nachweis von Eiter. Eine hin- reichend sichere Differenzierung gelingt durch eine einfache biologische Methode. Das Pankreastrypsin läßt sich nämlich von proteolytischem Leukozytenfermeut durch Zusatz des Blutserums von Kaltblütern oder Vögeln unterscheiden, insofern geringe Mengen des Kaltblüter- resp. Vogelserums durch ihren Gehalt an Antitrypsin die Dellenbildung durch den trypsinhaltigen Stuhl verhindern können. Gegenüber dem Leukozytenferment besitzt das Kaltblüterserum aber keine gröbere Hemmungskraft. ^Mrd also eine ausge- sprochene Dellenbildung schon bei Zusatz geringer Mengen von Kaltblüter- bzw. Vogel- blutserum gehemmt, so handelt es sich um Pankreastrypsin. Blutbeimengungen zum *) Fr. Frank und A. Schittenhelm , Vorkommen und Nachweis von Trypsin und ■ Erepsin im Magen-Darmkanal. Zeitschr. f. exp. Pathol. u. Ther. Bd. 8. H. 1. S. 242. 1910. ■■*) Ed. Müller und H. Schlecht , Über die Prüfung der Pankreasfunktion durch Trypsinbestimmungen in den Eäzes. Med. Klinik. Nr. 16. S. 573— 575 u. Nr. 17. S. 616— 618. 1909. Methoden zur Untersucluui'r il<'r meiischliclicn I-azi 399 Darminhalt können durch den Gehalt des Blutserums an Antitrypsin die Wirkung des Fäzestrypsins auf die Platte nur dann lu-nuncn. wenn das Bhit in s(» (,Toüen Monifcn vorhanden ist, daß es schon makroskopiscli ulnic weiteres t'rkcnnliar ist. Die Seruiuplutte wird nach Müller iiiid Schlexht aus KindorMut- serum mit Zusatz von Traubenzuckerbouillon hergestellt. Herstellung der 'rrauhcnz uck erlxi iiill on : \ ky mageres Rindfleisch, gewicht und von Fett und Sehnen l)efreit, wird mit 2 / destilliertem Wasser im Emailletopf ver- setzt und mit einem starken Glasstab gut umgerührt und unter stetigem rmrühreii V4 Stunde auf dem Gasbrenner kochen gelassen. Der Topf mit Inlialt wird vi»r und nach dem Kochen gewogen und der Gewichtsverlust durch Zusatz von destilliertem Wasser ergänzt. Das Fleischwasser wird durch ein ausgespanntes Leinwimdtucli in einen vorher abgewogenen Emailletopf koliert und der Rest dun-iigepreßt. Dann werden 1% Pepton, sicc. und Ü"5Vo Kochsalz zugefügt und unter fleißigem Umrühren wiederum 10 Minuten gekocht. Der Topf wird durch Deckel verschlossen und im Kaltwasserbad abgekühlt. Dann wird durcli Filtriertuch filtriert (ganz klar!), in gesäuberten Bierflaschen mit Patentverschluß abgefüllt und 2 Stunden im Danipftopf sterilisiert. Aus der P'leisch- wasservorratslösung wird neutrale Bouillon bereitet. Dazu wird das Fleisch wasser neu- tralisiert (auf 1 l etwa 20 cm^ Xormalnatronlauge), im Wasserbade gründlich aufire- kocht und durcli ein doppeltes Filter filtriert. Zu lUO cm^ dieser neutralen B(niillon kommen 10 cni^ 107oi?er Trauhenzuckerlösung. Die Mischung wird im ^\'asserl)ade ge- kocht und mit Xormalnatronlauge sorgfältig neutralisiert. Herstellung der Platte: 2 Teile Riuderblutserum werden mit ITeil Trauben- zuckerl)ouillon versetzt und sorgfältig geschüttelt. Man erhält auf diese Weise das „Lö/f7er-Serum", mit dem man die „Lö/^7er- Platten" derart gießt, daß in den zuvor ste- rilisierten Petrischalen eine dicke Schicht möglichst undurchsichtigen weißgelblichen Serums in dem auf 85 — 90" eingestellten Sterilisator erstarrt. Nach 3— 4stündigem Ver- weilen im Sterilisator läßt mau das erstarrte Serum langsam abkühlen. Nacii Abnahme des Glasdeckels wird das Koudenswasser durch Umdrehen der Platten entfernt. Wieder- holte Sterilisation ist nicht nötig. Die Serumplatte ist dann gelungen, wenn sie von er- hel)licher Dicke und vollkommen glatter trockener Oberfläche ist. so daß die ausge- säten Tröpfchen nicht auslaufen können. Mau läßt deshalb die sterilisierten Platten einige Tage ablagern oder nach Wegnahme des Glasdeckels bei 55 — 60" einige Zeit nachtrocknen. Der Trypsinuachweis mittelst des Platteuvert'ahrens ge- staltet sich nun folgendermaßen: Die zu untersucliende Person erhält früh nüchtern einen hohen Kin- lauf oder eine Glyzerinspritze zur Iveinigung der untersten Darmabschnitte. Nach erfolgtem Stuhlgang wird eine Probemahlzeit (löO g Fleisch und 150^ Kartoffelbrei) verabreicht. Eine halbe Stunde danach Darreichung eines Abführmittels (0'2 — 0*3 Kalomel oder 0%') Purgen, eventuell t)-J Ka- lomel mit 0"i — 0".'> Purgen zusammen). Der damit erzielte meist dünn- flüssige Dünndarmstuhl wird zum (lualitativen Nachweis des Trypsins so verwendet, daü man kleine Stuhltröpfchen mit einer Platinöse oder einem Glasstäbchen auf eine abgeteilte Fläche der Serumplatte bringt und dieselbe 24 Stunden bei 50— 60" im Brutschrank hält. Die Anwesenheit von Trypsin zeigt sich durch Bildung deutlicher Dellen. Die Dellenbildung tritt bei nor- malem Fermentgehalt meist sehr rasch in kaum einer halben Stunde ein. Fehlt nach 24 Stunden jede Dellenbildung, so ist kein wirksames Tryjtsin vorhanden. Ist der Stuhl zu dickl)reiig. so verreibt man ihn mit Glyzerinwas.ser. AVenn nötig, wird mit Sodalösung alkalisiert. bis Lackmus|)apier eben eine 400 H- Lohrisch. alkalische Reaktion zeigt. Scheut man sich vor der Verabreichung von Ab- führmitteln, so kann man auch den spontan entleerten Stuhlgang nach der Verreibung mit Glyzerinwasser und Alkalisierung in der beschriebe- nen Weise verwenden. Allerdings ist dann die Dellenbildung: meist eine recht geringe. Zur genaueren quantitativen Bestimmung des Trypsins sind dünn- flüssige Stühle nötig. Diese werden in einem Porzellanmörser aufs sorg- fältigste verrieben. Alsdann werden mit einer Meßpipette Verdünnungen des verriebenen unfiltrierten Stuhles mit Glyzerinwasser hergestellt. Man macht diese Verdünnungen am zweckmäßigsten in Porzellanschälchen oder Uhrgläschen oder auf Porzellanplatten, in denen eine Anzahl Vertiefungen enthalten sind. Müller und Schlecht empfehlen, was den Grad der Ver- dünnungen betrifft, die Stuhlverreibung 5-, 10-, 20-, 50-, 100- und 200fach mit Glyzerinwasser zu verdünnen. Die Serumplatte wird in 8 numerierte Abschnitte durch Tintenstriche eingeteilt und die einzelnen Abschnitte mit Tinte numeriert. In das erste Feld kommt dann in Gestalt von 4 bis 6 Tröpfchen die unverdünnte Stuhlverreibung, in die nächsten 6 Felder nacheinander die obenerwähnten Verdünnungen mit Glyzerinwasser. Vor der Aussaat wird jede Verdünnung nochmals sorgfältig verrieben. Ist man der tadellosen Herstellung einer Serumplatte nicht sicher, so kommen in das 8. Feld Tröpfchen einer wirksamen künstlichen Trypsinlösung. Die so beschickte Platte wird auf 24 Stunden bei 50—60° in den Brutschrank gestellt. Ist ein solcher nicht zur Verfügung, so kann man die Platte nach Zusatz von Chloroform oder ThymoUösung zu der Stuhlverreibung bei 87" halten. Das letzte Ablesen der Resultate erfolgt erst nach 24 Stunden. Kniaskof^) empfiehlt neuerdings, da das Serum ein immerhin ziemlich teures Material und nicht immer zu beschaffen ist und da die Serumplatten leicht verderben, zur Trypsinprobe Platten zu gießen mit Gelatine, welche mit Formaliu vorbehandelt ist. Eine derartig behandelte Gelatine verflüssigt sicli bei höheren Temperaturen nicht. Ihre Empfindlichkeit gegen Trypsin bleibt aber erhalten. Diese Platten werden folgen- dermaßen hergestellt: 10— loVoige Gelatine wird auf einem Wasserbade in destilliertem Wasser aufge- löst, neutralisiert, filtriert, dann in Petrischalen bis zur Bildung einer gleichmäßigen Schicht in ca Vg cm Höhe ausgegossen. Man läßt die Gelatine erstarren und gießt auf ihre Oberfläche eine 107oige Formalinlösung. Nach 12—24 Stunden wird das Formalin entfernt; darauf werden die Schalen mit der erstarrten Gelatineschicht während V2 bis 1 Stunde mit fließendem Wasser abgespült, bis der Formalingeruch verschwunden ist. Die Gelatineoberfläehe wird dann vorsichtig mittelst Fließpapieres abgetrocknet, worauf die Platten fertig sind. Sie müssen vor Austrocknen geschützt werden. Bei diesen Platten sind ganz unbedeutende Vertiefungen bei Einwirkung schwacher Trypsinlösungen infolge der Durchsichtigkeit der Gelatine nicht ganz deutlich erkenn- bar. Sie werdei\ aber deutlicher, wenn die Gelatine mit einem Farbstoff versetzt wird. Zu diesem Zwecke empfiehlt Kniaskof die i^^rr/sche Tusche. Man setzt der flüssigen Gelatine vor Füllung der Petrischalen soviel Tropfen Tusche zu, bis die Gelatine rauch- grau aussieht. Nach der Einwirkung der Trypsinlösung wird die Gelatineoberfläche mit Wasser abgespült. Es treten dann die kleinen Vertiefungen auf dem dunklen Grunde der gefärbten Gelatine deutlich hervor. 1) Kniaskof, Platten für die Trypsinprobe. Med. Klinik. Xr. 3. S. 108. 1911. Methoden zur l'iitorsiichuiijj der mouschlichcn Fdzes. AQt Die Kapsolmethodc von Müller iiiul Schlcrltt.^) Die Kapselmethode ist eine ModifikatiDii (k-r Sahlii^dieu (ilutoid- kapselprobe, bei der die Kapseln bekaiintlidi mit Jodoform ^cUWU sind. Mülle?- und Schlecht benutzen iiicrzu die nach Anf^alx'ii von Iiuniprl lior- gestellten Capsulae f^eloduratae. Es sind dies (ielatinekajisehi, die in alkoholischer Forinalinlösun^' so j^'-ehärtet sind, dali sie nur durch das Pankreastrypsin rasch gelöst werden. Sie sind mit tVin pulverisiertem Holzkohlenstaub gefüllt und sind als Capsulae geloduratae c. carb. Viiin. 0-:-J von der Firma G. Pohl in Schöid)aum bei Danzig zu beziehen. Für die Kapselprohe mnli in der oben geschilderten Wei.se ein Diinn- darmstuhl geschaffen w(!rden. Etwa 10—1;') cw^ der möglichst dünnfliis- sigen 8tuhlprobe werden unter Zusatz von Chloroform oder einigen Thymol- ki'istallen in ein kleines Glasgefäü gefüllt, welches so weit .sein mul), daU die Kapsel darin frei schwimmen kann. Der Stuhl darf nicht filtriert werden. Es genügt, etwaige gröbere Brocken sorgfältig zu verreiben. Wenn nötig, wird mit Sodalösung alkalisiert. Die in das Glasgefäß gefüllte Stulil- probe wird nun mit einer (ieloduratkapsel beschickt und l)ei .-iT" im lirut- ofen gehalten. Die Temperatur von ;>7" darf nicht erheblich überschritten werden, weil sonst die Kapsel sich spontan lösen kann. Der Moment der Kapsellösung zeigt sich dadurch an, daß der austretende Kohlenstaub die Flüssigkeit schwarz färbt. Ist innerhalb 24 Stunden die Kapsel ungelöst, so ist kein Trypsin im Stuhl enthalten. Bei normalem Trypsintiehalt ist die Kapsel in '/g — 1 Stunde gelöst. Je weniger Trypsingehalt vtuiiandcn ist, desto länger dauert die Lösung. Es läßt sich also schon durch Fest- stellung der Lösungszeit eine annähernde quantitative Abschätzung des Trypsingehaltes ermöglichen. Um genauere quantitative Angaben zu machen, verfährt man wie beim Plattenverfahren, indem man in der.sellten Weise, wie oben geschildert, mit lOVoi&e"^ Glyzerinwasser verdünnt und in jede der Verdünnungen eine Kapsel legt. Die Kaseinmethode von Gross")-Koslowsky.^) Das Prinzip der ^lethode besteht darin, daß das Kasein, in Alkali leicht löslich, im Gegensatz zu seinen Verdauungsprodukten bei Essigsäure- zusatz leicht ausfällt. Zur Stuhluntersuchung stellt man sich am besten eine V2Vooige Lösung des Kaseins her, indem man Uö ^ des Caseinum purissimum Grübler in 1 / einer P/oo'^Pn Sodalösung unter Erhitzen löst. Die Fäzes werden in einer Reibeschale mit der dreifachen Menge Po.jger Sodalösung zu einer ganz gleichmäßigen Masse aufgeschwemmt und so *) Ed. Müller und 11. Schlecht, Über die Prüfung der r:inkrea.sfiinktion durch Trypsiubestimmungen in den Fäzes. Med. Klinik. Nr. 17. S. 617. 190*.». *) 0. Gross, Zur Funktionsprüfung des Pankreas. Houtsche med. W ochenschr. Nr. 1(5. S. 706—708. 1909. ^) S. Kosloic^ky, Der Nachweis des Trypsins in den P'äzes und seine diajfuostisclic Bedeutung (Untersuchung mit der Kaseinmethode von Gross). I.-D. Greifswahi iy09. Abd e rh .il den , Handbuch der biochemischen Arbeitamethoden. V. JA) 402 H. Lohrisch. lange filtriert, bis man ein klares g-elbgefärbtes Filtrat erhält, was gewöhn- lich rasch der Fall ist. Bekommt man kein ganz klares Filtrat, so läßt man die Trübung absetzen und benutzt die darüberstehende klare Flüssig- keit. In ein kleines Kölbchen bringt man 100 crn^ der Kaseinlösung und setzt 10 cm^ der Kotaufschwemmung zu, bringt die Mischung in den Thermostaten bei 38 — 40° C und sieht an kleinen , von Zeit zu Zeit ent- nommenen Proben nach, wenn auf Zusatz von P/oiger Essigsäure eine Trübung nicht mehr auftritt, d. h. wenn alles Kasein verdaut ist. Es hat sich gezeigt, daß in allen Fällen, bei denen es sich nicht um eine Er- krankung des Pankreas oder einen Verschluß der Pankreasausführungsgänge handelt, Trypsin in den Fäzes nachzuweisen ist. Um einen möglichst starken Trj-p singehalt der Fäzes zu erzielen, ist eine stark eiweißhaltige Nahrung zu verabreichen, eventuell kann auch ein mildes Abführmittel gegeben werden. Die Verdauungszeit des Kaseins schwankt zwischen 8 und 15 Stunden, gewöhnlich beträgt sie 12 — 14 Stunden. Durch geeignete Verdünnungen der Fäzes kann man auch annähernd quantitative Schlüsse ziehen. Die Seidenpeptonmethode. Dieselbe ist von Abderhalden^) für den Nachweis peptolyti- scher Fermente im Darmkanal eingeführt worden. Man löst V2 9 des Seidenpeptons -) in 1 011^ des nach Frank und Schittenhehn ^) hergestellten Fäzesextraktes auf, wobei sofort zu alkalisieren ist. Das Gemisch wird im Brutofen bei 37 — 40° 1^ — 3 Tage gehalten. Dabei fällt', wenn reichlich Ferment vorhanden ist , Tyrosin in kristallinischer Form aus , erkennbar makroskopisch oder nach Sedimentieren im Sediment mikroskopisch als schöne in Büschelform angeordnete Nadeln. Ist nichts ausgefallen, so kommt die Lösung für einige Tage in den Eisschrank, wobei dann zuweilen das Tyrosin erst ausfällt. Bleibt die Lösung dauernd klar, so ist kein Ferment vorhanden. Die Seidenpeptonmethode kann auch bei Anwesenheit von Erepsin positiv ausfallen. Die Kernprobe von Ad. Schmidt.^) Schmidt fand, daß die Kerne der Zellen im Gegensatz zum Binde- gewebe nur vom Pankreassekret, nicht aber vom Magensaft verdaut werden. *) E. Abderhalden und Fl. Medigreceanu, Über das Vorkommen von peptolytischen Fermenten im Mageninhalte und ihr Nachweis. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 57. S. 317. 1908, ferner E. Abderhalden und A. ScJntfenhelm, Über den Nachweis peptoly- tischer Fermente. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 61. S. 421. 1909. ^) Über die Darstellung des Seidenpeptons vergl. E. Abderhalden und Eugen Steinheck, Beitrag zur Kenntnis der Wirkung des Pepsins und der Salzsäure. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 68. S. 293. 1910. ^) Fr. Frank und A. Schittenhehn , Vorkommen und Nachweis von Trj'psin und Erepsin im Magendarmkanal. Zeitschr. f. experim. Pathol. u. Therapie. Bd. 8. H. 1. S. 242 und 246. 1910. *) Ad. Schmidt, Die Funktionsprüfung des Darmes mittelst der Probekost. 2. Aufl. S. 35—36. 1908. Methoden zur l utersiicliuiig ilcr inciischiichcn Fäzes. "Wenn also unverdaute Gewebskerne in entelchen von S»'iden;;;ize befindet, versehlueken läßt, und zwar mehrere 'raj^n' hintereinander mittajxs. Die Peutelchen werden im Kote leieht wiederjrefundcn , besonders wenn man den zusehnürenden Seidenfaden recht lanj^ liilit, und es wird dann in dem in dem Säekchen enthaltenen Fleischreste entweder frisch mit Essigsäure oder Methylenblaulösung oder nach vorausgegangener Härtung in gefärbten Schnitten auf die Anwesenheit von Kernen gesucht. Die Fleischwürfel werden so hergestellt, daü fi-isches Fleisch in Wür- fel von ca. ^/o cm Seitenlänge geschnitten und in Alkohol aufbewahrt wii-d. Nach der Härtung werden die Würfel in kleine (iazebeutelchen getan und wieder in Alkohol aufbewahrt. Vor dem Gebrauche sind die gefüllten lieutel mehrere Stunden zu entwässern. Gegenüber mehreren Einwänden, die in neuerer Zeit gegen diese Probe gemarht \vorden sind (i>rar/5cA'), Hesse'-) und die sich darauf gründen, daß die Kerne schon im ^Magensaft gelöst werden, hat Sfrauch'^) neuerdings bei Verwendung natürlicher Ver- dauungssäfte gezeigt, daß die Zellkerne nur vom Pankreassaft gelöst werden, daß also die Grundlagen der Sehmidtschen Probe richtig sind und daß die Probe mit Recht zum Kachwcis von Pankreasferment verwendet wird. Zu dem gleichen Kesidtat ist nach einer Mitteilung von Ad. Sclimidf*) vor kurzem Kashiirado gelaugt, der fand, daß weder Magensaft noch Darmsaft die Kerne in einem für den Ausfall der Probe wesentlichen Grade angreifen. Dagegen löst reiner Pankreassaft — und zwar auch der nicht akti- vierte — die Kerne schnell. Kashiwado hat die Schiiiidtsche Kernprobe in folgender Weise ver- einfacht: Die Kerne der Thymusdrüse lassen sich durch ^■erdauung des Thymusgewebes im Magensaft leicht isolieren. Die isolierten Kerne werden mit Alkohol und Äther gewaschen, mit Alaun-Hämatoxylin gefärbt, getrocknet und mit Lykopodium vermischt in einer Oblate gereicht. Im nächsten oder übernächsten Stuhl werden die Stellen, an denen Lykopodium vorhanden ist, mikroskopiert, und man erkennt dann die gefäibten Kerne, wenn sie unverdaut geblieben sind, leicht wieder. Sind sie verdaut, so bieilit nur das auffällige Lykopodium zurück. Diese Modifikation gibt nach Ad. Sc/imidfs bisherigen Krfahrungen dieselben Pvesultate wie die ursprüngliche Kernprobe. ') Th. Brugsch, Experimentelle Beiträge zur funktionellen Darn^liagno-^tik. Zeitschr. f. expcrim. Path. u. Therapie. Bd. 6. H. 2. S. 361-362. 1901». '') A. Hesse, Zur Bewertung der Schiiiidt^vhcn Kernpridte. Zcitsclir. 1. ixju mn. Pathol. u. Therapie. Bd. 7. H. 1. S. 01-93. Vgl. ferner .V. ru/i !»',*/< ;irvA-, Die K.-rn- prohe von Prof. Ad. Srlmn'df. Zeitsriir. f. experini. Pathol. u. Thnrapio. Bd. 8. H. 2. S. 353-357. 1910. •') /'/v/r. Strtiuch, liii' Grundhige der Ail. .•x-iniifif^ctwu Imi m'i-diC. Deutsches Areh. f. kliu. Med. Bd. 101. S. 128-136. 1910. ^) Ad. Schmidt, Diskussionsbemerkung zu dem Vortrag von Wintcmitz, Über eine neue Methode zur Fuuktionsprüfung des Pankreas. 28. deutscher Kongreß für innere Medizin. Wiesbaden. 21. April 191L 26« 404 H. Lohrisch. Erepsin. Erepsin ist im menschlichen Dünndarminhalt und in den Fäzes mit Sicherheit nachgxnviesen worden. Zum Nachweis in den Fäzes werden die Eigenschaften des Erepsins benutzt, durch die es sich vom Trypsin unterscheidet, daß es nämlich, wie Abderhalden'^) und seine Mitarbeiter nachgewiesen haben, gewisse Poly- peptide, z. B. Glyzyl-glyzin spaltet, was Trypsin nicht tut, und daß es ferner natives Eiweiß (Fibrinflocken, i¥e^/sches Röhrchen) nicht angreift. Störend wirkt aber bei der Differenzierung zwischen Trypsin und Erepsin der Um- stand, daß beide Kasein spalten und die Seidenpeptonreaktion geben. Peptone werden vom Erepsin schnell gespalten. Die zu zweit genannte Eigenschaft des Erepsins, natives Eiweiß nicht anzugreifen, ist zum Nachweis des Erepsins so zu verwerten, daß auf An- wesenheit von Erepsin geschlossen werden kann, wenn Fibrinflocke und Mettsche Röhrchen unangegriffen bleiben bei gleichzeitiger Lösung von Kasein und bei positiver Seidenpeptonprobe. Nach Brugsch^) empfiehlt es sich, zu bciii'^ einer P/ooig^n Witte- Peptonlösung 1 cm^ Fäzesextrakt zuzusetzen und das Reagenzglas mit dem Gemisch 40 — 72 Stunden bei 37*^ zu halten. Ist dann die vorher positive Biuretreaktion negativ geworden, so spricht dies für das Vorhandensein von Erepsin, wenn es nicht gelingt, Trypsin nachzuweisen. Frank und Schittenhelm^) raten wegen der dem Trypsin und Erepsin gemeinsamen Eigenschaft, Kasein zu verdauen, die Kaseinmethode von Gross zum Nachweis des Trypsins in den Fäzes nicht zu verwerten oder nur in Kombination mit anderen Me- thoden. Indessen scheint es nach den neuesten Untersuchungen von Brugsch und Masuda*}, als ob die kaseolytische Wirkung der Fäzesextrakte in der Hauptsache auf das Trypsin zu beziehen ist. Die geringere kaseolytische Wirkung des Erepsins und Bacterium coli- Extraktes kann bei der doch immerhin großen Verdünnung der Fäzesextrakte unbe- rücksichtigt bleiben. Diastase. Der Nachweis der Diastase geschieht so, daß der verzuckernde Ein- fluß der vorhandenen Diastase auf eine Stärkelösung geprüft wird, wobei Jodlösung als Indikator dient. *) Vgl. hierzu Emil Abderhalden und Y. Teruuchi, Studien über die proteolytische Wirkung der Preßsäfte einiger tierischer Organe sowie des Darmsaftes. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 49. S. 1. 1906. ^) Th. Bruc/schf Experimentelle Beiträge zur funktionellen Darmdiagnostik. Zeit- schrift f. exper. Path. u. Therapie. Bd. 6. H. 2. S. 359. 1909. ^) Fr. Frattk und A. Schiftenhelm , Vorkommen und Nachweis von Trypsin und Erepsin im Magendarmkanal. Zeitschr. f. exper. Path. u. Therapie. Bd. 8. H. 1. S. 253. 1910. *) Th. Brugsch und N. Mastida, Über das Verhalten des Dünndarmsaftes und -Extraktes, ferner des Extraktes einiger Bazillen (Koli, Streptokokken) gegenüber Kasein, Lezithin, Amylum. Ein Beitrag zur fanktionell-diagnostischeu Prüfung der Fäzes auf Fermente des Pankreas. Zeitschr. f. exper. Path. u. Therapie. Bd. 8. H. 3. S. 617-623. 1911. Metlindon zur Untersucliuiii.' der ineiisclilichcn Fäzes. mj^, Die Methode wird nach Wohlyenmth ' -) in foi'rcndcr Weise ausgo- fiihrt: Eine auf der IIand\vap:e abiiewo^ene Men^^e von öy frischem Kot wird in einer Keiheschale mit 20 rm» einer l<'/oi&('n Kochsalzlösung; verrieben, und zwar in der Weise, dal» man von dem abf,^emessenen (Quantum Koch- salzlösung- erst ein paar Kubikzentimeter zufüp:t, so lanf,'e verreibt, bis man einen vollkommen homo<^enen Brei hat , wieder etwas Kochsalzlösun}; zu- füj.5t und verreibt und .<;o weiter verfahrt, bis man die •.'csamte i-'liissi^;- keitsmenge mit dem Kote verrieben hat. Dann liiüt man noch :K) Minuten bei Zimmertemperatur stehen, rührt in der Zwischenzeit hiiufiji: um und verteilt nun den dünnen flüssigen Brei in gleichmäßiger Weise (je 10 rm') auf 2 Zentrifugierröhrchen , die genau gegeneinander tariert sind und eine Graduierung tragen. Dann wird so lange zentrifugiert , bis die festen Be- standteile sich abgesetzt haben, was innerhalb ö— 10 Minuten erreicht ist. und nun die Plöhe des festen Rückstandes und der Flüssigkeitsmcuge an der Graduierung der beiden Röhrchen abgelesen und notiert. Hat man vor der Übertragung des Breies auf die Zentrifugierröhrchen noch einmal gründlichst durchgerührt, so wird man nach Beendigung des Zentrifugierens finden, daß der Rückstand in beiden Röhrchen die gleiche Höhe einnimmt. Glaubt man. daß der Rückstand bei weiterem Zentrifugieren noch mehr zusammensinken würde, so läßt man die Zentrifuge noch weitere 5 Minuten laufen. Bei einer elektri.schen Zentrifuge genügt es. die (Jläschen höchstens 15 Minuten lang in Betrieb zu halten. Alsdann gießt man das überstehende fermenthaltige Fäzesextrakt ab und bestimmt die Diastase mittelst eines Iieihenversuchs. Zu diesem Zwecke benutzt man 9 Reagenzgläschen, auf die man das Ferment verteilt. Die Fermentverteilung nimmt man so vor, daß man die ersten drei Gläschen mit 10, 0"5 und O-'lbcin^ des unverdünnten Fäzesextraktes i)eschickt und weiterhin so fortfährt, daß jedes Gläschen die Hälfte von dem vorher- gehenden erhält. Das erreicht man am beiiuemsten. wenn man mit der 8- respektive 64fachen Verdünnung des ursprünglichen Fäzesextraktes arbeitet. Glas 4, 5 und 6 erhalten dann DO, O'ö und 0-2öcm3 der Hfachen Extraktverdünnung, Glas 7, 8 und '.' erhalten 10. (»"ö und o-2ö<7»3 der 64fachen Extraktverdünnung, so daß die einzelneu Gläser folgende Ferment- mengen enthalten : Glas 1 Glas 2 Glas H DO 0-5 0-25 Glas 4 Glas 5 (Jlas 6 0-125 00625 oo:U2 Glas 7 Glas 8 Glas 9 0-0156 0-0078 0-0():i9. •) J. Wohlgemuth, (M»er eine iieiio Metlimle zur (iiiaiititativeu Bestimmunir dw diastatischen Fermentes. Biocliem. Zeitscbr. H»l. !>. H. 1 u. 2. S. 1— 9. 11KJ8. ') .7. Wohlficmuth , Beitra-r zur funktionellen Diairiiostik des Pankreas. Beiuii' r klin. Wochenschr! Nr. 3. S. 92-95. 191U. 406 H. Lohrisch. Die VerdünDung macht mau sämtlich mit P/oiger Kochsalzlösung und ergänzt die fehlende Menge in den einzelnen Gläschen mit derselben Lösung, um überall gleichmäßige Kochsalzkonzentration zu erhalten. Dann kommen zu jeder Fermentprobe bcm^ IVoiger Stärkelösung. Die Gläschen werden sodann mit einem Kork oder Wattestopfen fest geschlossen und auf 24 Stunden in den Brutschrank bei 38" gestellt. Nach x\blauf der Frist werden sie herausgenommen, mit kaltem Leitungswasser bis etwa 1 Finger breit vom Rande aufgefüllt, mit je 1 Tropfen —-Normaljod- lösung versetzt und nun die unterste Grenze der Wirksamkeit (limes) be- stimmt, d. h. dasjenige Gläschen, in dem zum ersten Male ein blauer Farbenton auftritt. Angenommen, Glas 7 sei als Hmes zu bezeichnen, so würde Glas 6 mit 0-0312 Extrakt dasjenige Glas sein, in dem sämtliche Stärke mindestens bis zum Dextrin abgebaut ist. Aus diesem Glase berechnet sich die Größe des Fermentes in der Weise, daß die Anzahl Kubikzentimeter einer iVoigen Stärkelösung bestimmt werden, die durch lau"- der Fermentlösung in der für den Versuch angewandten Zeit bis zum Dextrin total abgebaut wird. Es ergibt sich folgende rechnerische Überlegung: 0-0312 Extrakt bauen in 24 Stunden bei 38» bcrn^ IVoiger Stärke- lösung ab. 1-0 Extrakt baut in 24 Stunden bei 38" 160-3 c;«^ lo/^iger Stärke- lösung ab. Die diastatische Kraft eines Kubikzentimeters Extrakt aus Fäzes be- zeichnet Wohlgemuth mit Df. Im angenommenen Beispiele würde also Df = 160-3) sein , d. h. die diastatische Kraft beträgt 160-3 Diastaseein- heiten. Nun muß man weiter in Rechnung setzen die Menge des Rückstandes, die in bg Kot enthalten ist. Angenommen, es wären beim Zentrifugieren für den Rückstand 2-bcm'^ und für die Menge des Extraktes 7-5 cm^ ge- funden worden, so würde 1 cm^ Rückstand entsprechen — ^ c^m^ Extrakt — ?>cm^ Extrakt. Da nun 1 cm^ Extrakt = 160-3 Fermenteinheiten ist, so entspricht 1 cm» Rückstand 3 x 160-3 = 480-9 Fermenteinheiten. Dem- nach würde sich aus diesem Beispiel für die Diastasemenge im Kot der Wert ergeben : Df f' = 480-9 , wobei Df f ' bedeuten würde die Diastase- konzentration in 1 cm^ Kotrückstand unter gleichzeitiger Angabe der Zeit und der Temperatur, die bei Ausführung des Versuches zur Ver- wendung kamen. Will man nun noch die Diastasemenge für den Gesamtkot berechnen, so braucht man nur das Gewicht in Beziehung zu setzen zu der Menge des Ausgangsmaterials und zu dem Werte, den man für Df g^j^ gefunden hat. In dünnen Fäzes ist die Diastasemenge viel größer als in festen Fäzes, dabei so gleichmäßig verteilt, daß Kontrollbestimmiingen sich erübrigen. Diastasewerte von 470 Methoden zur Untcrsuchiiiif,' der ineiischlichon Fäzes. 4.(j7 bis 5U0 sind luuli Wuhltiemuth und \l'i/itliuuseii ') l)uridischnitts\viTi. . . ,,, ,,1 große Diastasemengeu im Stuhle zu erhalten, niuli eine jreeifrnete Diät (fcifehcii Die Diät muß bewirken, daß das Pankreas möglichst viel Sekret liefert und dui; dir Stuhl möglichst homogen und alkalisch ist, da die Diastase in saurem .Mr ' sam ist. Es soll dcslialb eine gemischte Kost mit wesentlicher Kin-. Kohlehydrate gegeben werden (Milch mit Tee und Kaffee, Bouillon, Schubefleis« Kalb und Rind, Eier, weißer Käse. Weißbrot. Butter). Diese Diät wird 2 Tag" l.iut gegeben und erst am zweiten und dritten Tage der Stuiil auf Diastase untersucht. Am Tage vor der Diät und an den beiden nächsten Tagen wird abends ein mildes LaxanK (Rhabarber, Sagrada, Kurella) gcgelien. Die zum Versuche nötige Stärkelösung wird aus der löslichen Stärk«- von Kahl- baum hergestellt. Die Bereitung der P/oigen Lösung geschieht so, d:iß man die genau abgewogene Menge Stärke in das entsprechende Quantum kalten destillierten Wassers einträgt und so lauge rührt, bis sich eine gleichniäßigi' Suspensiim (.'eliildct hat. Dann wird die Mischung in einer Porzellanschalc auf dem Wasserbade unter stetem Cmrüiiren erwärmt, bis sie sich aufhellt, was innerhalb 8 — 10 Minuten erreicht ist. Auf diese Weise erhält man eine ganz homogene. leicht opake Lösung. Dieselbe muß natürlich erst stark gekühlt werden, bevor sie zum \'ersuch verwendet wird. Sie hält sich zwar mehrere Tage, doch ist es zweckmäßig, möglichst frische Lösungen zu verwenden. Zuweilen ist es schwierig, dasjenige Gläschen zu bestimmen, in dem man den ersten blauen Farbenton deutlich wahrnimmt. Man beiregnet manchmal Röhrchen, in denen neben einem starken Rot (Erythrodextrin) ein leichter Idauer Farbenton vurhan- den ist. Wenn man schwankt, ob dieses Röhrchen schon als unterste Grenze aufzu- fassen ist, so gibt man zweckmäßig noch einen Tropfen Jodlösung in dieses Gläschen und beobachtet beim Umschütteln, ob der blaue Farltenton Itestehen bleibt oder durcii eine rotbraune Färbung verdrängt wird. Gleichzeitige Ausführuiii,^ der KaspininetlKMle ((irossl uinl der Diastjisenu'thode ( Wolili;eimitli ). Wenn es darauf ankommt, beide Fermente jik'it'hzeiti','- zu bostimnien. so verfährt Wi/uhausen-) praktischerweise folgendermalien: Er licnutzt ein Fäzesfiltrat und führt zwei Reihenversuche mit je 12 Glaschen, die in zwei kleinen Regalen untergebracht sind, aus. Die Gläschen beschickt er in fol- gender Weise: Je 2 Gläschen mit 0-25 und O'! cm^ unverdünntem Filtrat: je 5 Gläschen mit O'ö, 0-4, 0-25, O'IB und Ol n,i^ des lofach ver- dünnten Filtrats; je a Gläschen mit OOn, 0-25 und 0-1 nn-' des lUOfadi verdünnten Filtrats; je 2 Gläschen mit 05 und 0-25 cw» des lOOOfach verdünnti-n Filtrat.^. Die 12 Gläschen der einen Reihe werden mit je bcm^ IVoig«*!' Stilrke- lösung, die 12 der anderen Reihe mit je öcm^' lVooip:Pr l^^i^^^i"'*'^""!-' '^*'- schickt und die Proben in der obigen Weise weitergeführt. Die l'msetaung von l cni^ lo/ooiger Kaseinlösung durch 1 cm^ Filtrat = tryptische Fer- menteinheit, wovon sich normalerweise immer mehr als 2(Hl Fiidteiten finden. ') O.J.Wi/nhause», Zur ([uantitativeii FunktionsprUfuuL' de-^ Pankreas. Berliner klin. Wochenschr. Nr. 30. S. 1401J-1407. PJOU. 2) (). ./. WijuhauKvii, 1. c. S. 1407. 408 H. Lohrisch. Der Nachweis anorganischer Bestandteile. Der Nachweis erfolgt durch Analyse der Fäzesasche. Quantitative Bestimmung der Fäzesasche. Zur Veraschung wird ganz trockener und fein pulverisierter Kot ver- wendet. Ein abgewogenes Quantum davon wird im Platin- oder Porzellan- tiegel vorsichtig erhitzt, zunächst bei Rotglut verkohlt und schließlich bis zum völligen Weißwerden der Asche geglüht. Der Tiegel wird zur Abküh- lung im Exsikkator aufbewahrt und dann gewogen. Analyse der Fäzesasche. Hoppe- Sei/ler ^ ) hat darauf aufmerksam gemacht, daß bei der obigen Veraschung ein Teil der hierbei nachweisbaren Schwefelsäure und Phos- phorsäure nicht als anorganisches Salz im Untersuchungsmaterial enthalten zu sein braucht, sondern erst während der Veraschung aus dem organisch gebundenen Schwefel der Protein Stoffe entstanden bzw. aus den Phosphor- säure enthaltenden Lezithinen und phosphorhaltigen Proteiden abgespalten werden kann; ferner, daß Kohlensäure und Salzsäure während der Ver- aschung durch Schwefelsäure und Phosphorsäure ausgetrieben werden können. Um diese Fehlerquellen nach Möglichkeit zu vermeiden, verrührt man die Fäzes nach Hoppe-Seyler 2) mit einem großen Überschuß von Alkohol, filtriert und zieht den Rückstand zunächst mit verdünnter Essig- säure und darauf mit verdünnter Salzsäure aus. Man erhält auf diese Weise eine alkoholische, eine essigsaure und eine salzsaure Lösung. Die alkoholische und essigsaure Lösung werden vereinigt, ein- gedampft und verascht. 3) Hierzu bringt man den beim Eindampfen ver- bleibenden Rückstand in eine IMatinschale, welche mindestens das sechs- fache Volumen der zu veraschenden Substanz faßt. Ist diese Substanz spröde, knistert und zerspringt sie beim Erhitzen, so bedeckt man zunächst die Schale und erhitzt bedeckt so lange, als man noch Knistern hört. Dann entfernt man den Deckel. Das Erhitzen ist nur langsam zu steigern, um dem Wasser und gasförmigen Destillationsprodukten hinreichend Zeit zum ruhigen Entweichen zu lassen, denn bei zu rapidem Entweichen der Gase können Substanzpartikelchen mit fortgerissen werden und Verluste an Asche bedingen. Man erhitzt in dieser Weise höchstens bis zu beginnender Rot- glut und erhält bei dieser Temperatur, bis keine Dämpfe oder Nebel mehr entweichen und die Kohle fest und unbeweglich geworden ist. Man läßt dann erkalten, übergießt die erkaltete Kohle mit ein wenig Wasser, ver- reibt sie unter demselben möghchst fein, erhitzt nach Zusatz von noch mehr Wasser zum Sieden und filtriert durch ein aschefreies Filter, wel- 1 ^) F. Hoppe-Seyler und H. Thierfelder, Handbuch der physiologisch- und pathologisch- chemischen Analyse. 7. Aufl. Berlin 1903. i^ 541. S. 471. 2) Hoppe-Sei/Jer-Thierfelder, 1. c. § 687. S. 553. ») Hoppe-Scyhr-Thierfelder, 1. c. § 426. S. 391. Methoden zur Untersuchiiiig der menschlichen Fitzes inq ches mit heißem Wasser senüj^ciid aus^^ewaschen wird, riatinscliale, Filu-r und Kohle werden j>ut im Lufthade jj^etrocknet, die trockenen Substanzen mit dem Filter in der Schale aljermals hei schwacher Kotj/hit erhitzt, nach dem Plrkalten wieder mit Wasser verriehen und in der ohij,'en Weise he- handelt. Das Filtrat wird mit dem ersten vereini^^t. Nnn werden Schale. Filter und Kohle wieder getrocknet, allmählich his zum hefti;,'en (iliihen erhitzt und so lange im Glühen erhalten, bis die Kohle völlig oder bis auf geringe Spuren verschwunden ist. Da die Kohle stets noch Sjjuren lüs- licher Salze zurückhält, so ist auch diese Asche noch mit Wasser zu ex- trahieren, das Filtrat mit den vorherigen zu vereiniiicn und die ganze Flüssigkeitsmenge auf dem Wasserbade einzuengen. ])ie im Wasser un- löslichen Aschebestandteile werden nun mit verdünnter Salzsäure erwärmt. und wenn hierbei Eisenoxyd zurückbleiben sollte, bis zur völligen Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf dem Wasserbade digeriert. Man erhält auf diese Weise einen wässerigen iiiid eim-n Salz- säuren Auszug der Asche. In dem wässerigen Auszuge können nach Hoj>pr- Sei/Urs'^) Vor- schriften nachgewiesen werden: Kohlensaure und phosithorsaure .\lkalien. Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Kalk. Kali, Natron, Kieselsäure. In dem salzsauren Auszuge wird geprüft auf Kalk, Magnesia, Thos- phorsäure und Eisen.-) Die direkt aus den Fäzes extrahierte salzsaure Lösung wiid eben- falls verdampft und verascht, die Asche mit Salzsäure aufgenommen und auf Phosphor und Eisen untersucht, s) Veraschung auf nassem Wege. Die von A. Neumann *) angegebene ^'eraschung auf nassem Wege ist sehr zweckmäßig deshalb, weil das zu veraschende Material nicht ge- trocknet werden muß. weil die Veraschung .sehr befiuem vor sich geht und Verluste durch Erhitzen und Fortfließen ausgeschlossen sind. Mit der- selben kann man nur die Metalle und die nicht flüchtigen Säuren be- stimmen. Salzsäure und Kohlensäure entweichen. Das Prinzip der feuchten Veraschung ist Oxydation der Substanz mittelst eines Gemisches von Sal- peter- und Schwefelsäure und Vermeidung der Verkohlung durch langsames beständiges Hinzufügen des Säuregemisches. Die feuchte Veraschung mit dem Säuregemisch wird in einem gut funktionierenden Abzug ausgefiüirt. Die Fäzes können feucht oder ge- trocknet verwendet werden. Eine Portion derselben wird in einem Kund- kolben mit 5 — 10 cmr^ Säuregemisch (gleiche Vohnnenteile konzentrierter Schwefel- und Salpetersäure) übergössen und mit mäßiger Flamme erwärmt. Es steigen dann braune Dämpfe auf. Wenn die Entwicklung dieser Dämpfe V) F. Hopj)c-Sei/ler und //. TUicrj'tltUr, Ilandlnu'h der physicdoiri-''''- und pitli logisch-chomisehcn Analyse. 7. Aufl. Berlin 11MJ3. S 431. S. 394—390. 2) Hoppe-Sojler-fhierfrlihr, 1. c. ?5 432. S. 398-307. ■') Ifo/>pr-Sn/hr-T/iifrfrl(fn: I.e. § (587. S. 553: 5? 432. S. 3%- 31)7. ^j Zit. inu-h Hoppr-Sriffer-T/iifrfr/dcr, I.e. $5 428—430. S. .393—394. 410 H. Lohrisch. geringer ^^1rd, gibt man aus einem Halmtrichter tropfenweise weiteres Ge- misch zu und fährt damit fort, bis ein Nachlassen der Reaktion eintritt und die Intensität der braunen Dämpfe abgeschwächt erscheint. Um zu entscheiden, ob die Substanzzerstörung beendet ist, unterbricht man das Hinzufließen des Gemisches für kurze Zeit , erhitzt aber weiter , bis die braunen Dämpfe verschwunden sind, und beobachtet, ob sich die Flüssig- keit im Kolben dunkler färbt oder noch schwärzt. Ist das der Fall, so läßt man Mieder Säuregemisch zufließen und wiederholt nach einigen Mi- nuten obige Probe. Färbt sich die hellgelbe oder farblose Flüssigkeit bei weiterem Erhitzen nicht mehr, dann ist die Veraschung beendet. Die Flüssigkeit wird beim Erkalten völlig wasserhell. Man fügt nun etwa 3mal so viel Wasser hinzu als Säuregemisch verbraucht wurde , erhitzt und kocht etwa 5 — ^10 Minuten, wobei braune Dämpfe, welche von der Zer- setzung der entstandenen ISitrosylschwefelsäure herrühren, entweichen. Die so erhaltene Lösung der Aschebestandteile kann zur qualitativen und quan- titativen Untersuchung auf alle Basen, mit Ausnahme von Ammoniak, und auf nichtflüchtige Säuren benutzt werden. Es lassen sich vor allen Dingen darin nachweisen und quantitativ bestimmen Kalium, Natrium, Kalzium und Magnesium. Bezüglich Einzelheiten in der Darstellung und Bestimmung der einzelnen Elemente ist bei Hopi^e-Seyler^) nachzulesen. Kalorimetrische Fäzesuntersuchung. Die kalorimetrische Fäzesuutersucliuno- ist dann anzuwenden, wenn es darauf an- kommt, Vergleiche anzustellen zwischen der Energiemenge der eingeführten Nahrung und der Energiemenge, die den Organismus im Kote verläßt, vorausgesetzt, daß dabei nicht Wert gelegt wird auf die Einzelbestimmung von N, Fett, Kohlehydraten, Zellu- lose usw. Derartige Bestimmungen sind an Säuglingsfäzes von SchJosfmami -), an den Fäzes Erwachsener von Lohrisch '■') ausgeführt worden. Die Bestimmungen werden am besten mit Hilfe des Hempelscluen^) Kalorimeters ausgeführt, welches nach folgendem Prinzip arbeitet: Die zu untersuchende Substanz wird unter einem Überdruck und Überschuß von Sauerstoff im luftleeren Raum verbrannt. Es wird dadurch erreicht, daß alle Elemente so hoch wie möglich oxydiert werden, so daß die gesamte latente Energie des betreffenden Stoffes in Wärme überführt wird. Damit die entwickelte Wärme sich nicht im Räume verliert, wird sie gezwungen, sich in einem bestimmten Medium, nämlich in Wasser, auszubreiten. Die Erwärmung des Wassers wird direkt thermometrisch gemessen und daraus die der Wärmeentwicklung entsprechende Kalorienmenge berechnet. Das Hempehche Kalorimeter enthält folgende Teile (Abbildungen der verschiedenen Teile siehe bei Hempel'^). M F. Hoppe-Seijler und H. Thierf eider, Handbuch der physiologisch- und patho- logisch-chemischen Analyse. 7. Aufl. Berlin 1903. §433-451. S. 397— 410. -j A. Schlossmann, t)ber die Bedeutung kalorimetrischer Untersuchungen für klinische Zwecke. Berliner klin. Wochenschr. Nr. 12. S. 264—265. 1903. ^) H. Lohrisch, Kalorimetrische Fäzesuntersuchungen. Zeitschr. f. phys. Chemie. Bd. 41. H. 4. S. 308-320. 1904. ■*) W.Hempel, Gasanalytische Methoden. S. 375— 396. 3. Aufl. Braunschweig 1900. 5) W. Hempel, 1. c. S. 379-389. Methoilon zur l'utersucliung der mcnscliliclion 1- . j j ] 1. Kincn l'icüapparnt. in dein ilii' zu iintersuchciulcu fein pulvtMini.'i ■ zu Blockclien gepreßt worden. 2. Eine Autoklave aus FhiUcisen von ca. 200 cm' Inhalt. Der Vorschluü di-r Autoklave wird durch ein aufschraubbares Kopfstück -^fehihlet. Dieses trägt ein Schrau- benventil, oiiipu Flanschonrolirausatz und zwei KlektnxbMi. Am unteren l'i ' ' ' :.f- stückes sind zwei Eisenstahe aniire'bracht, welche an ihren Enden je eine IM n und in die Autoklave hineinragen. 3. Eine Sauerstoffbombe mit Manometer, welche an den Flanschenrohransatz an- zuschrauben ist. 4. Das eigentliche Kalnriineter. Dieses besteht ans einem Metallgefüß, welches das Kalorimeterwasser enthält und in einem Abstände von ca. 2 cm in einem Molzj^e- fäßo aufL'eliängt ist. In das Metallgofäß wird die Autoklave eingesetzt, ferner ein feines Thorinonieter und eine Rührvoniclitung. Das Ganze wird durch einen Deckel abge- schlossen, welcher Öffnungen für das Thermometer, das Rührwerk und die Elektro- den hat. Eine Brennwertbestimmung mit diesem Kalorimeter gestaltet sich nun folgendermajjen: Ca. 1 y des lufttrockenen Fäzespulvers wird mit Hilfe des l'reliappa- rates zu einem IJlückchen gepreßt. Gleichzeitig wird ein 1 1 on Junger Zwirnsfaden, dessen Brennwert bekannt ist, mit in die Sul)stanz Iuikmu- gedrückt. Das FJlöckchen wird gewogen. Nun wird es an einem Ol nim dicken Platindraht, der zwischen den im Kopfstücke der Autoklave befind- lichen beiden Platinösen ausgespannt wird, mit dem einen Ende des Zwirns- fadens aufgehängt , so dab der Block jetzt in einem kleinen Platintiegel schwebt, der in ein an den beiden Platinüsen aufgehängtes Tonschälcht-n eingesetzt ist. Durch den Tiegel werden etwa abbröckelnde Teilchen des Blockes aufgesammelt und so der Verbrennung zugänglich gemacht. Die Autoklave wird hierauf fest verschlossen, der Sauerstoffbehälter an den Flanschenrohransatz angeschraubt, durch einströmenden Sauerstoff die in der Autoklave vorhandene Luft verdrängt und dann die Autoklave bei einem Druck von 20 — 21 Atmosphären unter Kontrolle des Manometers mit Sauerstoff gefüllt und durch das Schraubenventil abgeschlossen. Dann wird die Autoklave in das .Metallgefäß des Kalorimeters eingesetzt, wel- ches genau 1/ destillierten Wassers enthält. Die Temperatur dieses Wassers muß um ca. lö» C kälter als die umgebende Luft .<;ein. Mau erreicht dies durch vorherige Mischung des Wassers. Nachdem man noch das Wühr- werk in das Metallgefäß gebracht hat, wird der Apparat durch den Deckel, welcher das Thermometer und die zwei Elektroden trägt, geschIoss(M». Die Elektroden werden mit einem kleinen zweizeiligen Akkumulator verbunden. Nun beginnt die eigentliche Verbrennung. Mittelst der lltdirvorrichtung wird so lange gerührt, bis das Wasser eine konstante Temiieratur ange- nommen hat. Darauf wird gezündet und unter beständiL-^em Imrühren mit einer Lupe an einem in V/öo''C eingeteilten Thermometei- die Erwär- mung des Wassers abgelesen. Mit dem Thermometer, desst-n Fehler genau bekannt sind, kann man auf V '.,50 Orad genau ablesen. Ist z.B. der Kalorien- faktor (der Kalorienfaktor des Kalorimeters ist diejenige WännemenKe. welche nötig ist, um den im Kalorimeter vorhandenen einen Liter ^^ asser 412 H. Lohrisch. um 1"C ZU erwärmen; er muß für jeden Apparat besonders bestimmt werden) des betreffenden Kalorimeters r3583, die Menge des verbrannten Kotes 1*1058^ und betrug die Erwärmung des Wassers 3'925*', so ist der Brennwert für lg des betreffenden Kotes , .^^,'. — ^Kalorien. Da- -^ 1-1058 von ist der Brennwert des Zwirnsfadens in Abzug zu bringen. Jede Brenn- wertbestimmung mulj doppelt ausgeführt werden. Ich fand die direkt kalorimetrisch hestimmteii Brennwerte der Fäzes immer etwas höher als die aus den Analysen herechneten, was wohl an kleinen Ungenauig- keiten, die bei den Analysen unvermeidlich sind, liegt. So werden beispielsweise bei der Analyse Lezithin und Cholestcarin durch Äther mit extrahiert und als Fett be- rechnet, während ihre eigentlichen Brennwerte höher sind. Die Methoden der Kohle- hydratbestimmuug leiden au den früher geschilderten Ungenauigkeiteu. Meist wird bei den üblichen Analysen auch die Zellulose vernachlässigt, ebenso die Gallenfarbstoffe, Gallensäuren und sonstige organische Säuren, die im Kote vorkommen und die bei den Brennwertsbestimmungen mitbestimmt werden. Getrennte Bestimmung von Sekreten und Nahrungsresten in normalen Fäzes nach Ury. ' -) Es kann als sicher angenommen werden, daß der normale Darm des Erwach- senen mit großer Exaktheit diejenigen Xahrungssubstanzen, die durch den Verdauungs- prozeß in Lösung gebracht worden sind, auch völlig resorbiert, so daß normale Darm- entleerungen keine wasserlöslichen kristalloiden Substanzen (Zucker) und wasserlösliche Eiweißkörper (Albumosen, Albumine) enthalten. Von dieser Tatsache ausgehend gelangt Ury zu einer annähernden Feststellung des vom Darm selbst gelieferten Kotanteiles, indem er die normalen Fäzes mit destilliertem Wasser gilindlichst verreibt und filtriert. Man kann dann annehmen, daß unter nonnalen Verhältnissen nur die von der Darm- wand selbst gelieferten Sekrete in das wässerige Extrakt üliergehen, während die Nah- rungsreste auf dem Filter zurückbleiben. Naturgemäß ist diese Trennung der Sekrete von den Nahrungsresten keine exakte; es kann sich dabei immer nur um eine an- nähernde Bestimmung handeln. Wenn auch als sicher anzunehmen ist, daß erhebliche wasserlösliche Reste per es eingeführter Nahrungsmittel nicht in das wässerige Extrakt übergehen, so kann andrerseits die Frage nicht unbedingt bejaht werden, ob in der Tat das gesamte Sekret in das w ässerige Extrakt übergeht. Dies tun z. B. nicht wasser- unlösliche Stoffe (Fette), die im Dickdarm ausgeschieden werden, ebenso nicht abge- stoßene Darmepithelien, ebensowenig in den Darmkanal ausgeschiedenes, aber mit den Fettsäuren zu fettsaurem Kalk umgesetztes Kalziumpliosphat. Unter Berücksichtigung dieser Fehlerquellen ist aber die Methode annähernd richtig. Es wird so verfahren, daß die feuchte Tageskotmenge oder der von einer größeren Zeitperiode gesammelte feuchte Stuhl frisch gewogen wird. Der größere genau abgewogene Teil des frischen Kotes wird mit destil- liertem Wasser aufs feinste verrieben, auf ein Volumen von ca. 1000 bis 1500 crn^ gebracht und durch mehrere Faltenfilter filtriert. Das Filtrat wird auf ein bestimmtes Volumen mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Darin konnte Ury nachweisen: HCl, geringe Mengen Ho SO4. P-Säure (öOcm.^ *) H. Vry, Zur Methodik der Fäkaluntersuchungen. Deutsche med. "Wochenschr. Nr. 41. S. 718—723. 1901. 2) H. Ury, Zur Lehre von den Abführmitteln. I. Archiv für Verdauungskrank- heiten. Bd. 14. S. 411-423. 1908. Methoden zur Untersuchung der nieusehliclMn Fiizos. Filtrat mit Essig'säuro versetzen; filtrieren; mit I ranlösunj; reichl. Niederschlag), Kalk. Maf:;nesia, Kaliniii, Xatriuin, Ammoniak, ^'erin^,'<' Men- gen Eisen. Vom (iesamtstickstoff jiini^cn ins Filtrat ühcr ca. 247o, von clor Trockensnhstan/ ca. 21" o- vom Ca ca. 7%. Der kleinere znriickf,'el)liebene Teil des frischen Kotes wird ^.- trocknet, die Trockensubstanz bestimmt und in der iil»lichen Weise ana- lysiert. Der Gang der Fäzesuntersuchung zum Zwecke der Funktions- prüfung des Darmes nach Ad. Schmidt. ') Unbedingtes Erfordernis für diese Fäzesuntersnchiing ist die \'er- abreichung der Ad. Schmidtscheu Probediät. Dieselbe besteht aus folgendem : Morgens: ^ o ^ Milch oder Tee oder Kakao, wenn möglich mit viel .MiNli. Dazu 1 Semmel mit Dutter und 1 weiches Ei. Frühstück: 1 Teller Ilaferschleimsuppe. mit Milch gekocht, durchgeseiht (Salz- oder Zuckerzusatz erlaubt), eventuell kann auch Mehlsuppe oder Porridge gereicht werden. Mittags: 1/4 Pfund gut gehacktes mageres liindfleisch , mit Dutter leicht übergebraten (inwendig roh), dazu eine nicht zu kleine Portion Kar- toffelbrei (durchgesiebt). Nachmittags: wie morgens, aber kein Ei. Abends: ^ o / Milch oder 1 Teller Suppe (wie zum Frühstück). Dazu eine Semmel mit Butter und 1 — 2 weiche Eier (oder lUdirei). Eventuell ist hierzu noch etwas Wein, dünner Kaffee zur Milch. Douillon und etwas gewiegter kalter Kalbsbraten zu gestatten. Für exakte klinische Untersuchungen und quantitative Analysen eignet sich die folgende detaillierte Prohediät von Ad. Schmidt : Morgens: Ob l Milch (oder, wenn Milch schlecht vertragen wird, Ü.') / Kakao, aus 20 clilii-iicii i'.i/js. losehüllen eiiiiieschlossene Stärke, l)lun,uefarl)te .lodpil/e, trell);r< ; Zellen, Milchsiiurebazillcn inul Sarcine). III. Chemische Untersuchnn^': Tniinni^- der Keakti(»n Sublimatprobe (S. ;)'.)() lunl H93). llrutschrankprobe (S. 84H und ;Mtt .'.7 j). Untersuchuni^- auf gelöstes Eiweiß (S. :i44 :546). Gewinnung und Analyse der Darmgase. Bei den Darmgasen können wir unterscheiden zwischen den direkt im Darm gebildeten und als solche entleerten Gasen (l)ickdarnigase) und denen, die bei der Nachgärung des Kotes im Brutschrank ( Ürutschrank- probe von Ad. Schmidt vgl; S. ;U8 und 570 — 372) entstehen (Nach- gärungsgase). Die Üic-lvLlarm- und XachgärungSfraso sind Gemische von C0„ (entsteht liesmi- ders aus den Kohlehydraten und der Zellulose, in geringem Grade aus Eiweiß). 11, (ent- steht aus Zellulose, Kohlehydraten und Eiweiß), CH^ (entsteht l)ei der Vergiirung der Zellulose und der Kohlehydrate und hei der Zersetzung des Eiweißes), N^ und (),. N,- und 0.,-Beiinengungeu zu den (jasen sind stets künstliche. Sie stammen zum Teile von verschluckter Luft her. Der N2 kann auch aus dem Blut ins Darmlumen diffundieren. Ammoniak. H^S und Methylmerkaptnn sind nur in uaiiz irerini/cn MenL'en in den Darmgasen enthalten. Ammoniak entsteht bei der Eiweißfäulnis. H.jS kommt nielit re- gelmäßig vor, sondern meist nur bei Genuß bestimmter schwefelhaltiger Nahrungsmittel (Zwiebel, Knoblauch. Rettich). Sie können im allgemeinen vernachlässigt werden. Es werden untersuclit entweder die dem Darm direkt entnommenen Dickdann- gase oder die Nachgärungsgase. Wenn es darauf ankommt, sich über die Zusammen- setzung der im Darme selbst entstehenden Gase zu orientieren, so ist natürlich die direkte Untersuchung der Dickdarmgase der sicherste Weg. Es ist nach .!en von Luft ist bei tlicscni Verfalireii nicht immer y.u vcrmi-iden. Es ist aber, wie schon erwiilint. für die Analyscnresuitate oline Bedentun^'. I,iift und restierender N, werden auch liier von vornherein in Abrechnung gebracht, da N. im Darm selbst nicht gebihlet wird. Die Analyse der Hase. Die Gasanalyse wird mit Hilfe der Apparate und .Methodik von Hempel^) ausgeführt. Nach Ad. Schmidts*) Erfahrungen kann von vorn- herein auf Bestimmung von Ammoniak und IL, S verzichtet werden, da deren Mengen noch geringer als die Fehlergrenzen der Methode sind. Alle absorbierbaren Gase werden durch absorbierende Mittel bestimmt, die nichtabsorbierbaren durch Verpuffung. Zunächst seien ganz kurz die hierzu nötigen Hcinpchchvw Apjiarair geschildert : Zur Entnahme des Gases aus dem Gasometer dient die //cwyjf/sche Gas- bürette^) (Fig. 103). Sie besteht aus zwei Glasröhren, welche in eiserne Fiiße ciugesptzt sind und durch einen ca. 120 on laniren dünnen (Junimischlaiicli miteinander vorbuiideii sind. In den Gunimischlauch ist in der JNIitte ein Stück Glasrohr eingesclialtct. Die eine der Röhren, die Meßröhre, läuft in ihrem oberen Ende in ein 3 n« langosf ', — 1 mm weites starkwandiges Röhrcheu aus, an welches mittelst Draht ein kurzes Stück schwarzer dichter Gunimischlauch l)efestigt ist. der mit einem (^hietscliliahn versehen ist. Die Meß- röhre ist in 100 cw' eingeteilt. Die andere Röhn«. die Niveau röhre, dient, wenn beide Röhren und der Gummischlauch vollständig mit Wasser gefüllt sind, zum FüUen ikUt Entleeren der Meßröiire und zum Ansaugen des Gases in die Meürolire. l'm (ias aus der Gasomcterglocke zu entnehmen, wird die vollständig mit Wasser gefüllte MeÜröhrc durch ein feines, gebogenes, mit Wasser gefülltes Glasrohr mit dem am oberen Enile der Gasometerglocke befindlichen nnd ebenfalls mit Ciummischlaucii armierten Glasrohr ver- bunden. Der tibertritt von Gas aus der Gasometerglocke in die Mollröhre erfolgt dann beim Senken der Niveauröhre. Auf diese Weise kiinnen das gesamte (iastjuantiini luid auch einzelne Portionen desselben genau gemessen werden. ') W. llempel, Gasanalytischo Methoden. 3. Aufl. S. 25. Braunschweig l'.K)0. *) W. Hempcl, 1. c. S. 22-2(5. ») W. Hewinh 1. c. S. 27-221. *) Ad. Schmidt , Experimentelle und klinische Untersuchungen über Funkti«»iis- prüfung des Darmes. I. Mitteilung. Über Fäzesgürungen. Deutsches Arcli. f. klin. Med. Bd. 61. H. 3 und 4. S. 317. 1898. " ') W. Hempcl, 1. c. S. 20-33. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arboittmothodm. V. 27 418 H. Lohrisch. Fig. 103. Fig. 104. Zur Absorption absorbierharer Gase dient die Henqiehcha Absorptiouspipette') für feste und flüssige Reageutien. Deren Konstruktion ist aus Fig. 104 ersichtlich. Sie besteht aus zwei großen miteinander kommunizierenden Kugeln und einem doppelt ge- bogenen starkwandigen Kapillarrohr. Die größere und länglich geformte Kugel Trird durch den an ihrem unteren Ende befindlichen, durch Gummistopfen verschließbaren halsförmigen Ansatz mit dem absorbierenden Mittel gefüllt. Diese Kugel faßt etwa 150««^; die zweite kleinere Kugel faßt etwa 100 cw^. Das in der Meßröhre abgemessene Gasquantum wird in die Absorptionspipette überführt dadurch, daß die Meßröhre mit dem oberen Ende des Kapillarrohres der Absorptionspipette mit Hilfe des daselbst be- festigten Gummischlauchstückes und eines gebogenen dünnen Glasrohres verbunden wird. Das Kapillarrohr der Absorptionspipette muß dabei mit dem Absorptiousmittel gefüllt sein. Wenn jetzt die Klemme am oberen Ende der Meßröhre geöffnet und die mit Wasser gefüllte Niveauröhre gehoben wird, so strömt das in der Meßröhre be- findliche Gas in die Absorptionspipette über. Dabei wird die Absorptionsflüssigkeit in die kleinere Kugel zum Teil verdrängt. Es bleibt aber noch genügend Absorptionsmittel in der großen Kugel zurück, um auf das Gas einwirken zu können. Wenn das Gas einige Minuten in der Absorptionspipette gelassen worden ist, wird es in derselben Weise in die Meß- röhre bei gesenkter Niveauröhre zurückgeleitet. Man kann dann die Menge des absorbier- ten Gases unmittelbar ablesen. DieExplosion s- p i p e 1 1 e ') von Hempel (Fig. 105) besteht aus einer dickwandigen Ex- plosionskugel und einer Niveaukugel , welche durch einen überspon- neuen Gummischlauch miteinander verbanden sind. Die Explosions- kugel hat an ihrem oberen Ende zwei dünne Platindrähte (p) einge- schmolzen, welche mit einer Tauchbatterie in Verbindung stehen und dienen. Das untere Ende der Explosionskugel ist Am oberen Ende der Explosionskugel ist , wie dickwandiges Kapillarrohr angeschlossen , von dem aus die Füllung der Absorptiouskugel durch Verl)indung mit der Meßlnirette unter Heben und Senken der Niveaukugel erfolgt. Die Explosionen werden immer unter Anwendung von Quecksilber als Sperrflüssigkeit angewendet. Das Quecksilber er- möglicht es nämlich, nachträglich die durch die Verbrennung gebildete Kohlensäure zu bestimmen, was bei Explosion über Wasser wegen der Absorption der Kohlensäure durch das Wasser nicht möalich ist. zur Entzündung brennbarer Gase mit einem Glashahn geschlossen. bei der Absorptionspipette, ein ») W. Hempel, Gasanalytische Methoden. 3. Aufl. S. 38. Braunschweig 1900. 2) W. Hempel, 1. c. S. 114—115. Metliodcii zur üiitorsucluiii(T der menschliclicii Fiizos. 419 Zur Analyse des aus CO, , O., , H,,, CH, und N, hestehendi-ii Itann- gasgemisches wird nun fojgendernialjen vorfaliron: Ks wird zunilchst das gesamte Quantum der gesammelten Gase in dii Mcllröhre bestimmt. Das gesamte in der Meßröhre ixifindlicho (Jas(|uantum wird sodann zur Ab- sorption der CO, 0 in eine AI)sorpti(msi)ip('(t(' j^^olcitet, deren ^n-olic KuizpI gefüllt ist mit kloinen, 1 — 2cm lanji:('n und zirka ')i>i»i dicken Ilöllclien von eisernem feinmaschigen Drahtnetz und einer Ant'lüsung von 1 (icwjchts- teil käuflichem Ätzkali in 2 Gewichtsteilen Wasser. Die Drahtnetznillchen haben den Zweck, die absorbierende Fläche nach Möglichkeit zu vergröüern. Nach 1 — 2 Minuten ist die CO2 vollständig absorbiert. Hierauf wird «las Gas aus der Absorptionspipette wieder in die Mebröhre zurückgeleitet und die Menge der absorbierten CO. notiert. Fig. 10.5. Nun folgt die Bestimmung des Oo-Gehaltes. -) Dazu wird die gesamte, nunmehr CC^-freie Gasmenge aus der MeUröhre in eine zweite Absorp- tionspipette überführt, deren Absorptionskugel gefüllt ist mit kleiiu-n Köll- chen von Kupferdrahtnetz nnd einer Lösung, bestehend aus gleichen Teilen einer gesättigten Lösung des in Stücken käuflichen anderthalbfach kohlen- sauren Ammoniaks und einer einfach verdünnten Lösung V(ui Ammoniak von 0"9;-i spezifischem Gewicht. Da das metallische Kupfer oft oberflächlich mit etwas Fett überzogen ist, so kann man dies zweckmälligerweise «lurch Anätzen mit etwas Salpetersäure vor der P.enutzung entfernen. Mit die.-. 1«1— l.S2. HrauiisrhwcJi; 1'J(hk 2) W. Ilrniiicl, 1. c. S. 142—144. 420 H. Lohrisch. Methoden zur Untersuchung der menschlichen Fäzes. Zur Bestimmung des Hg in diesem Gasreste, der nunmehr ein Ge- misch von H, , CH^ und Nj darstellt , verf cährt man nach Hempel i) in folgender Weise: Hempel zeigte, daß der Wasserstoff aus einem derartigen Gasgemisch durch Palladiumschwamm bei zirka 100" glatt absorbiert wird. Zu diesem Zwecke verbindet man die Meßröhre mit dem einen Schenkel einer U-förmig gebogenen Röhre von -imm lichter Weite und 20 cw Ge- samtlänge, welche mit Ag Palladiumschwamm gefüllt ist. Der andere Schenkel des U-förmigen Rohres wird mit einer gewöhnlichen Gaspipette verbunden , d. h. mit einer analog der iVbsorptionspipette gebauten Pipette, welche mit Wasser gefüllt ist und lediglich als Sperrvorrichtung dient. Das U-förmige Rohr steht in einem großen Becherglas mit warmem Wasser von 90 — 100". Man treibt nun das Gasgemisch aus der Meßröhre durch Heben und Senken der Niveauröhre dreimal durch das Palladiumrohr hin und her. Hierauf ersetzt man das heiße Wasser durch solches von Zimmer- temperatur und führt den Gasrest noch zweimal hin und her, um den- selben vollständig abzukühlen. Es gelingt so mit Sicherheit, den Wasser- stoff bis auf die letzte Spur zu absorbieren. Das Gas wird dann wieder in die Meßröhre überführt. Die nach der Absorption eingetretene Differenz entspricht dem Wasserstoffgehalt + der Menge Sauerstoff, welche in der in dem U-förmigen Rohre eingeschlossenen Luft enthalten war. Diese Luft- menge läßt sich aber ein für allemal als Konstante ermitteln. Der jetzt noch bleibende Gasrest enthält CH4 und N«. Hierin wird CH^ durch Verpuff ung in der Explosionspipette l)estimmt. Dazu werden etwa 15 cm^ des Gasrestes in der Meßröhre abgemessen. Zu diesen Ibcui^ wird durch Senken des Mveaurohres zunächst eine beUebige Quantität Luft zugeführt und das Gesamtquantum abgelesen. Das so entstandene Gemisch wird in die Explosionspipette gebracht und dann noch so viel Luft in der Meß- röhre abgemessen, als voraussichtlich zur vollständigen Verbrennung des Gasrestes notwendig ist, und diese ebenfalls in die Explosionspipette über- führt. Ein Volumen CH4 braucht zwei Volumen O2 und bildet ein Volumen CO2 bei der Verbrennung. "-) Das Gasluftgemisch wird in der Pipette durch tüchtiges Schütteln gemischt und explodiert. Nach der Explosion wird der Gasrest zur Absorption der gebildeten COo in die Ätzkalipipette überführt. Dann wird in der Meßröhre gemessen. Bekannt ist das Gesamtvolumen des in die Explosionspipette überführten Geraisches von Gasrest und Luft. Von diesem wird das Gesamtvolumen, welches nach der Explosion abge- lesen wird, abgezogen. Der dritte Teil des verschwundenen Volumens ent- spricht der CH^-Menge. Bei der Prozentberechnung des CH^ muß noch das Volumen des Palladiumrohres mit berechnet werden. Der nunmehr noch vorhandene Gasrest ist N,. 1). W. Hempel, Gasanalytische Methoden. 3. Aufl. S. 162—174. Braunschweig 1900. -) W. Hempel, 1. c. S. 203. Methodik der Milcliuiitersucliiiiii;. ^'on K. F. Edelstein, Charloftcnltiir^'. Die Methodik der lYIilchuntersuchiing. Diese Methodik soll in knapper Darstellunii- Ansahen enthalten, wie man die Milch vom wissenschaftlichen Standpunkte ans untersucht. l)ie Untersuchung der Milch vom Standpunkte des .Milchpraktikers, der Milcii- hygiene und der polizeilichen Milchkontrolle kann hier nur ganz kurz, so- weit sie in den Rahmen der verschiedenen Methoden hineinpal'.t. behan- delt werden. Die Milch als Sammelbegriff, gleich ob sie Menschen- oder Tiermilch ist, stellt eine bläulich- oder gelblich-weiße, undurchsichtige Flüssigkeit dar. Im Speziellen hat die Kuhmilch folgende Kigenschaften : Sie ist gegen Lackmus amphoter; ihr spezifisches (Gewicht hidt sich in den Grenzen zwischen 1028 — 103. Der Gefrierpunkt betragt im Mittel — 0"555". Der Siedepunkt ist etwas höher als beim Wasser (-f-0-2"). Beim Kochen nimmt die Milch einen geli)lichen Farbenton an. Läßt man sie bei gewöhnlicher Temperatur stehen, so sammelt sich das spezi- fisch leichtere Fett in Form von Fettkügelchen an. Erhitzt man frische Milch zum Sieden, so bleibt sie unverändert. Heim längereji Erhitzen bildet sich an der Oberfläche ein Häutchen. welches wesentlich aus eingedanijjfter Milch besteht. Beim längeren Stehen gerinnt die Milch freiwilli^^ initer dem Einfluß der bakteriellen Zersetzung des Milchzuckers zu Milchsäure, welche das Kasein ausfiUlt. Versetzt man Milch mit Lab. so scheidet sich in dicker Masse der Käsestoff und eine gelltliche Flüssigkeit aus: die sülie Molke. Die Undurchsichtigkeit der Milch wird durch das in derselben in gequollenem Zustande suspendierte Kasein hervorgerufen. Setzt man zur Milch Alkali oder am besten Ammoniak zu, so löst sich darin (la< Kast-in und es entsteht eine fast klare Flüssigkeit. Die gelbhche Färltung rührt von dein im Milchfett enthaltenen Farb- stoff her. Je fettärmer eine Milch ist. desto weißer ist ihr Aussehen. Die Wärmekapazität der Kuhmilch ist geringer als die des Wassers, d. h. man braucht zur Temperaturerhöhung von 1° für Milch weniger Ka- lorien als für dieselbe MeuL^e Wasser. Die W.irmekai)azit;if beträgt nach 422 E. F. Edelstein. Fleischmann^) 0'847 ; nach neueren Untersuchungen 2) desselben Forschers 0-935 (Vollmilch). Läßt man die Milch gefrieren, so entmischt sie sich unter Erstarren des größten Teils; nur ein ganz kleiner Teil bleibt flüssig. Dabei ändert sich anscheinend der phvsikahsche Zustand des Kaseins. Fuld und Wohl- gemuth ^) haben gezeigt, daß die Frauenmilch durch Gefrieren soweit ge- ändert wird, daß beim nachträglichen Auftauen das Kasein direkt mit Säuren fällbar ist. Sie führen diesen Umstand auf die physikahsche Än- derung des Lösungszustandes zurück, in Avelchem sich das Kasein befindet. Die Viskosität der warmen Milch ist geringer als die der kalten. Die Milch setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: Wasser, Eiweiß, Milchzucker, Fett, Salzen und einigen organischen Stoffen wie Harnstoff, Purinbasen (Xanthin, Hypoxanthin) und Kreatin und Kreatinin. Ferner Zitronensäure, in geringen Spuren Milchsäure, Orotsäure, Sulfo- cyannatrium, Lezithin und Cholesterin. Außerdem enthält die Milch noch Fermente und ( iase, und zwar : Kohlensäure, Stickstoff und Sauerstoff. Die durchschnittliche Zusammensetzung der Kuhmilch ist folgende {Faudnitz^) : Wasser 88"/o Trockensubstanz 12''/o Fett 4-8Vo Kasein 3Vo Albumin und Globulin O'SVo Gesamtstickstoff O'550/o Extraktivstoff OOöVo Eiweißstickstoff 0-57o Kaseinstickstoff 0"45''/o Milchzuckeranhydrit 4'4''/o Zitronensäure 0-12— 0-2o/o Harnstoff O-P/o Asche O-T^/o Gase 4-2— 8-6 Vol.-o/o Der Gehalt der Kuhmilch an Salzen ist folgender (Söldner &) : *) Fleischmann, Beiträge zur Physik der Milch, Betrachtungen über das sogenannte schwedische .Abralim verfahren. Sitzungsberichte der bayr. Akad. d. Wiss. Bd. 4. 1874. ^) Fleischmann, Spezifische Wärme der Milch. Journ. f. Landw. Bd. 50. 33. 1902. ^) Fuld und WohJgemuth, Eine neue Methode zur Ausfällung des reinen Kaseins aus der Frauenmilch durch Säure und Lab, sowie über die Natur der labhemmenden Wirkung der Frauenmilch. Biochem. Zeitschr. 5. 118. 1907. ^) Baudnitz, „Die Milch", im Handbuch d. Kinderheilk. von Pfaundler-Schloss- maun. Leipzig. €. W. Vogel. S. 133. 1910. ^) Söldner, Die Salze der Milch und ihre Beziehungen zu dem Verhältnis des Kaseins. Landwirtsch. Versuchsstationen. Bd. 35. 351. 1889. — Hammarsten, Lehrbuch d. physiol. Chem. Wiesbaden. 623. 1910. Methodik der MilchunterBuchung. ^23 Asche 0-7ö._0-8o/o CaO 1-98 im Mtor Milch PaOß 1H2 Cl ()-9W .. KoO 1-72 NaaO O-.")! MgO 0-20 FeaOg nOOar) im Liter Milch (nach /;M»7t'>) Die Frauenmilch ist auch amphoter, sie ist aber nach den l'nter- suchungen von Coumuf-) etwas stiirker alkalisch als die Kuhmilch. l)as spezifische Gewicht der Frauenmilch ist dasselbe wie das der Kuhmilch. Ganz abnesehen davon, daß das Kasein der Frauenmilch andere Eigenschaften aufweist als das der Kuhmilch, dab ferner das Frauenmilch- fett im Gegensatz zum Kuhmilchfett nur Spuren von flüchtigen Sjluren enthält, unterscheiden sich die beiden besonders im Gehalt an Albumin und Kasein und auch im Milchzuckergehalt. Die Kuhmilch enthiilt Albumin und Kasein im Verhältnis von 1:6, die Frauenmilch dagegen nur im Ver- hältnis von 1:1. Die Zusammensetzung der Fraueninilch ist im hurch- schnitt nach J. König ^) folgende : Wasser 87-58"/o Kasein 0-80Vo Albumin 1-21 "/o Stickstoffsubstanz 2-01 «/o Fett :VT4'Vo Milchzucker 6";) 7% Asche 0-:iVo Wie man daraus ersieht, ist der Aschegehalt viel geringer als iu der Kuhmilch. Nach Blauberg ^) enthalten 100 Teile Frauenmilch: KjO OOC.'.IO Na.O 00041) Gab oo:; und 30.'). 1874. -) Courant, Über die Keaktion der Kuh- und Frauenmilch und ihre Beziehnnjfeii zur Reaktion des Kaseins und der I'hospliate. Pßügers Arch. f. Physiol. 50. 109. 1H9L ') J. Küniff, Chemie der menschlichen Nahrunps- und (JenuOmittel. Berlin, J. Springer. Bd. 2. öOS. 1U()4. *) Zitiert nach Enf/el, „Die Frauenmilch", in Sommerfelds Hamlhuch der Milch- kunde. S. 800. 1909. 424 E. F. Edelstein. Nach Bahrdt und Edelstein i) enthält die Frauenmilch in 1000 Teilen im Durchschnitt 1-93 m^ Eisenoxyd und 0"42 ^ CaO. Nach einer neuerdings von Schloss'^) genau durchgeführten Analyse der Frauenmilch hat diese folgende Zusammensetzung (Durchschnitt aus 8 Analysen) : Im Liter Milch Fett 37-88 N 1-847 Asche 1-839 CaO 0-3758 MgO 0-0857 K2O 0-5291 NaaO 0-1886 P^Ob 0-4045 Ci 0-5232 In folgender Tabelle (nach J. König ^) sei noch zum Vergleich die Zusammensetzung der Frauen-, Kuh-, Ziegen-, Schaf-, Eselinnen- und Stutenmilch in Prozenten angegeben: Frau Kuh Esel Schaf (Milchsehaf) Ziege Stute Spez. Gewicht . Wasser .... Kasein .... Albumin .... Stickstoff Substanz Fett Milchzucker . . Asche 10298 87-58 0-80 1-21 201 3-74 (V37 0-30 1-0313 87-27 2-88 0-51 3-39 3-68 4-94 0-72 90-12 079 1-06 1-85 1-37 619 0-47 1-0355 83-57 4-17 0-98 515 6-18 417 0-93 10305 86-88 2-87 0-89 3-76 407 4-64 0-85 1 -0847 90-58 1-30 0-75 2-05 1-14 5-87 0-36 Die Eigenschaften der Milch anderer Tiere gleichen im großen und ganzen denen der Kuhmilch. Die Ziegenmilch hat einen gelblicheren Farbenton und ein spezifisches Aroma. Sie enthält meistens mehr Fett und mehr Albumin als die Kuhmilch. Die Schafmilch zeichnet sich durch ein höheres spezifisches Gewicht aus und ist sehr fettreich. Die Eselinnen- milch nähert sich in ihren Eigenschaften der Frauenmilch, ist aber be- deutend ärmer an Fett. Die Entscheidung, von welcher Tierart die zur Untersuchung vorliegende Milch abstammt, ist nicht einfach und die diesbezügliche Methodik noch *) Bahrdt und Eddstein, Das Kalkangebot in der Frauenmilch. Jahrb. f. Kinder- heilkunde. 72. Ergänzuugsheft 16. 1910 und Ein Beitrag zur Kenntnis des Eisengehalts der Frauenmilch und seiner Beziehungen zur Säuglingsanämie. Zeitschr. f. Kinderheilk. Bd. 1. 182. 1910. ^) Schloss, Die chemische Zusammensetzung der Frauenmilch auf Grund neuer Analysen. Monatschr. f. Kinderheilk. 9. 636. 1911. ") König, Chemie der menschlichen Nahrungs- und Genußmittel. Bd. 2. 1904. 598. 602. 655 und Sommerfeld, Handbuch der Milchkunde. 233. 1909. Methodik der MilchiinterHucbuug. ^k>_r, nicht sicher. Die Umikq/f?.c\\Q/^) Ueaktion dient zur riitorscheidiintr von Frauen- und Kuhmilch. Heim Erwärmen von b cm^ Milch mit 2':) cm* lOVoin^"! ^^h liuf 600 ,„!(] if) Miiintcii wird reine Frauenmilch violettrot, reine Kuhmilch gelb gefiirbt. Die Zusammensetzun«^' der Milch im allgemeinen i.st grol'tcn Schwan- kungen unterworfen. Sie ist von sehr vielen Faktoren abhängig. Kine wich- tige Rolle spielt die Individualität und die Kasse der Tiere. Die He.schaf- fenheit der Milch wird auch von der Melkzeit beeinflullt. (icwiihidich ist die Mittags- und Abendmilcli verschieden von der Morgenmilch. Die Frauenmilch ist, besonders was ihren Fettgehalt anbelangt, vor und nach dem Anlegen anders zusammengesetzt (Rci/hrr-). Eine wesentlich andere Zusammensetzung besitzt die .Milch der ersten Tage, die sogenannte Kolostralmilch. Das Kolostrum der Kuhmilch ist dickflüssig, nicht amphoter, sondern entweder alkalisch oder sauer und be- sitzt ein viel höheres spezifisches Gewicht. Die Menge der 'I'rockensubstanz ist fast doppelt so groß wie bei der gewöhnlichen Milch, der Stickstoff- gehalt sehr hoch. Ebenso verhält es sich mit dem Gehalt an Ali>umin und Globulin. Der Zuckergehalt ist sehr gering. Nach König'^) ist die mittlere Zusammensetzung des Kuhmilch- kolostrums : Wasser 75-07Vü Trockensubstanz 24-9:io/o Kasein 4i0o/o Albumin und Globulin l'i-OOVo Fett 3-97«/» Zucker 2-28% Asche lö^Vo Die Zusammensetzung des Kolostrums der Frauenmilch unterscheidet sich von der gewöhnlichen Frauenmilch durch ein erhöhtes spezifisches Gewicht und durch einen viel größeren Gehalt an Eiweiß und Asche, be- sonders an AlkaH. Wie bei jeder chemischen Analyse ist auch bei der l'ntersuchung der Milch die Entnahme des Untersuchungsmateriales von großer Wichtig- keit. Bei der polizeilichen Milchkontrolle, wo es sich um den Nachweis der verschiedenen \>rfälschungen und Nerwässerungen handelt, ist die Art der Entnahme des Analysenmaterials eventuell vor Zeugen oder auch an Ort und Stelle (Stallprobe) von entscheidender Bedeutung. Auch für wissen- schafthche Untersuchungen muß die Milch in bestimmter Art zur Analyse ') Umikoß', Zur diffcrenzicllon clieinisclicii Itcaktioii der Knuicii- und Kiilunilrh und über die Bestimmung der Laktatiousduuer der FraiieniMiist. .lalirl-. f Kind-Tliidk. Bd. 42. 356. 1896. -) Reijher, Über den Fettgehalt der Frauenmilch. Jalirbuch f. Kindcrheilk. Bd. 61. 601. 1905. ^) König, Chemie der menschlicheu Nahnings- und Geiiußmittel. Berlin. 2 »XXl IIHH. 426 E. F. Edelstein. Fig. 106. U 'u u :!3 entnommen werden. Vor allem muß darauf gesehen werden, daß eine richtige Durchschnittsprobe vorliegt, und daß ferner die Milch bis zum Zeitpunkt der Analyse an einem kühlen Ort aufbewahrt wird. Es ist zu empfehlen, die Milch sofort zwecks Analyse zu verarbeiten. Ist dies nicht möglich, so soll man sie längstens 2 Tage in einem gut funktionierenden Eisschrank stehen lassen. Es ist unbedingt zu vermeiden, daß sie gerinnt, weil sie in diesem Falle nicht genau abgemessen werden kann, und die Entnahme einer Durchschnittsprobe erschwert wird. Ist sie doch geronnen, so kann man sie für viele Zwecke der Analyse noch immer gebrauchen , z. B. für die Bestimmung der Mineral- bestandteile. Sie muß aber vorher tüchtig durchgerührt, am besten in einem Schüttelapparat durchgeschüttelt werden. Muß die Milch aus irgend welchen Gründen längere Zeit stehen bleiben, so empfiehlt es sich, sie zu konservieren. Als Konservierungsmittel kommen in Betracht: Kaliumbi- chromat, Kupferammoniumsulfat, Formalin u. a. Die Wahl des Konser\aerungsmittels richtet sich meistens danach, Avas man in der Milch bestimmen will. Formalin, die wässerige 40Voige Lösung des Formalde- hyds, ist zur Konservierung sehr gut brauchbar; am besten durch einen Zusatz von 0'05Vo- Man wird es meistens dann anwenden, wenn man auch die Mineralanalyse ausführen will, was man bei Gebrauch von Kaliumbichromat oder Kupfer- jj- l— ammoniumsulfat selbstverständUch nicht machen kann. Auch Kaliumbichromat ist zur Konservierung von Milch zu empfehlen. Nach Eichlof^) wendet man am besten eine Lösung von 1'032 spezifischem Gewicht an, und zwar setzt man auf 100 om 3 Milch l cm^ dieser Lösung zu. Nach Weibull^) erschwert das Kahumbichromat wie überhaupt jedes Konser- vierungsmittel die GottUebsche Fettbestimraung. Kupferammoniumsulfat, in einer Menge von 0*5 — 2^ auf 1 / angewandt, schützt die Milch bei kühler Aufbewahrung sehr gut einige Wochen lang vor Zersetzung. Es ist \äel genauer, die zur Analyse verwendete Milchprobe zu wägen als abzumessen. Man verwendet dazu eine kleine Spritzflasche, die auch in Grade eingeteilt sein kann. Sie wird vor und nach der Entnahme der Probe gewogen. i^i -39 Bestimmung des spezifischen Gewichtes. Diese Bestimmung kann man mit dem Laktodensimeter ausführen. 1) Eichlof, Über die Bestimmung des spezifischen Gewichts der mit Kaliumbi- chromat konservierten Milch. Milch-Zeitung. 25. 511. 1896. -) Weibull, Eine Beobachtung bei der Gottliehschen Methode der Fettbestimmung. Zeitschr. f. Untersuch, der Nahrungs- u. Genußmittel. 17. 442. 1909. Methodik der Milcliimtersuchung. 427 Das Laktodensiineter (nach Sorhlcf, Fif^. 106), ein hei 15» j^eaichtpg Aräometer, gibt direkt das spezifische (iewicht der Milch ;iii. Man {^ioUt die gut durchgerührte Milch in weite Standzylinder, senkt das hensiinetor ein und achtet darauf, dali es sich freischwehend bewegen kann. Man wartet eine kurze Zeit und liest dann die Stelle, his zu welcher ila> Aräometer eintaucht, und zwar am unteren Meniskus ah. Da das Laktodensinieter auf die Normaltemperatur von 15" geaicht ist, .so mulJ entweder die Milch die- selbe Temperatur iiesitzen. oder man mul) an der abgelesenen Zahl eine Korrektur vornehmen. Die Korrektur beträgt für 5" Temperaturdifferenz 0"001. I)ei Temperaturen unter 15" zieht man für jeden Temperaturgrad 00002 ab: bei Temperaturen über 15" addieit man diese Zahl zur abge- lesenen. Für ganz genaue l»estinimungen kann man sich selbstverständlich auch des Pyknometers oder der WcstpIuilschQu Wage bedienen. ') Ist die Milch bereits geronnen und hat sie nicht allzu lange gestanden, so kann man nach Weibull"-) die Milch wieder mit Ammoniak verflüssigen und in dieser Milchammoniakmischuug die Ikstimmung des spezifischen Gewichtes vornehmen. Die geronnene Milch rührt man gut durch, pipettiert dann 100 on'^ in einen Krlenmeyerkolben und gibt 10 cm^ .Ammoniak zu. Man schließt den Kolben gut zu, wartet .so lange, bis die Milch vollkommen verflüssigt ist. millt das \olumen der ammoniakalischen Flüssigkeit und bestimmt in dieser Mischung das spezifische (n'wicht. Kennt man das Volumen der ursprünglich geronnenen .Milch, das Volumen und das spezifische Gewicht des hinzugesetzten Ammoniaks, das Volumen der Milchammoniakmischung und das spezifische (Jewicht der- selben, so kann man daraus leicht das spe7'*ische (iewicht der ursi>rüng- lichen Milch berechnen. Nach Teichert^) erhält man nach diesem \'ei-fahi-en etwas zu ludie Werte. Zur Ermittlung des spezifischen Gewichtes des Milchserums stellt man sich dasselbe her, indem man 100 cni^ .Milch mit 2 cm^ verdünnter (20"/o) Essigsäure versetzt iiud auf 40^ erwärmt. Das spezifi.sche Gewicht wird mittelst Pyknometers bestimmt. Bestimmung der Trockensubstanz. 10 g Milch werden in einer Platin- oder NickeLschale (auch Porzellan- schale) mit \ Tropfen Essigsäure und 10 cm^ Alkohol versetzt, auf dem Wasserbade zur Trockne eingedampft, in einem Lufttrockenschrank bei 105" bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und gewogen. M Man kann auch *) Genaues über Bestimmungoii des spezifischen Gewichtes: Hirhrinijrr, M. \, 437 dieses Handbuches. '-) Weihiill, Beitraitre zur Aualvse diM- Milcli; kann man (his spezifische Gewicht einer Milch, die jjeronnen ist, genau bestimmen? Chem. Zeitunu'. 17. KuO. 18H3. ^) Teichert, Methoden zur UntersuchunL.' von Mildi- und .Molkerciprodiikten. Stuttgart. 46. 1909. ■•) Die zulässige Fehlergrenze zweier Kontrollliostiranningen ist O'l-'i'"». 428 E. F. Edelstein. das Trocknen im Vakuum vornehmen. Am besten bedient man sich so- wohl zum Eindunsten sowie zum Trocknen der Milch des nach Soxhlet von Johannes Greiner, München, konstruierten Trockenofens (Fig. 107) , welcher mit 550/üigem Glyzerin geheizt wird. Der Vorteil dieses Ofens besteht darin, daß die Temperatur bis höchstens 103^ aufsteigt und die Trockensubstanz nicht gebräunt wird, was bei dem gewöhnlichen Trocknen durch den Karamelisierungsprozeß des Milchzuckers unvermeidlich ist. Will man größere Milchmengen eindampfen, bedient man sich verschiedener Auf- saugungsmittel wie Gips, Fig- 107. Glaspulver , geglühten Quarzsand oder Seesand. Nimmt man das Eintrock- nen in einem Fof/e^schen Blechschiffchen vor 1) , so kann man zur gleichen Zeit eine Fettbestimmung daran anschheßen. Fleisch- mann 2) empfiehlt , die Trockensubstanz aus der von ihm angegebenen For- mel zu errechnen, und zwar aus dem Grunde, weil nach seiner Meinung die horn- artig eingetrockneten Ei- weißkörper kleine Mengen Wasser einschließen, die durch noch so sorg- fältiges Trocknen nicht zu entfernen sind, und weil die durch langes Trocknen eintretenden Oxydationen Ungenauigkeiten ergeben. Unter der Voraussetzung, daß das spezifische Gewicht des Milchfettes bei 150 0-93 im Durchschnitt beträgt und das der fettfreien Trockensub- stanz l'ö, kann man aus dem spezifischen Gewicht und dem Fettgehalt der Milch den Prozeutgehalt der Trockensubstanz aus folgender von Fleisch- mann aufgestellten Formel berechnen : t=l.2.f+ 2-665. i^O^i^M. S worin t = den Prozentgehalt der Trockensubstanz, f = den Prozentgehalt des Fettes und s = das spezifische Gewicht der Milch bedeutet. Diese Formel hat nur für Vollmilch Gültigkeit. Fleischmann hat die Werte für f von 2-5— 5-5o/o und die für s von 1-0280— r0369 in die Formel eingesetzt und daraus eine Tabelle zusammengestellt. Derselbe ^) Die Anwendung des VogeUah&n Schiffchens hat außerdem noch den Vorteil, daß mau es in ein Wägegläschen (von bekanntem Gewicht) hineinschiebt und so zur Wägung bringt. Dadurch wird die Trockensubstanz, die sehr hygroskopisch ist, vor Wasseraufnahme während des Wagens geschützt. *) Fleischmann, Lebrb. der Milchwirtschaft. Leipzig, Heinsius Nachfolger. 63 und 67. 1908. Methodik der Milcluiiitcrsuchuiig. 429 Tabelle I. Tabelle zur Ermittlung der Trockensubstanz der Milch nach FI I isT.h ?>ifin ti. p 2-665 ''**'• '-'°"l 8 100.«- 100 R ,, Tansendstel 8 Tausendstel ^ OOi) Tanseodstel • 28-0 7-256 310 H014 34-0 h 76.) 1 7-283 1 8-040 1 87Hr, 2 7-309 2 8-064 >> 8-812 3 7-333 3 8088 3 H-837 4 7-360 4 8-112 4 8-863 5 7-384 5 8138 5 8-8H7 6 7-408 6 8-163 (5 8 913 7 7-432 7 8-186 7 8-937 8 7-462 8 8-213 8 8-962 9 7-486 9 8-238 9 8-9S8 29-0 7-513 320 8-264 35-0 9(»li' 1 7-533 1 8-288 1 9()37 2 7-560 2 8-31 -2 2 9-ui;i 3 7-586 3 8-33S 3 9 . Gleichung für das spezifische (Jewicht 1000 S =: 1000— H-7f>(t — 1-2. f) Wiftr'^) schlägt vor, das spezifische (Jewicht der Milchtrockensubstanz aus dem Fettgehalte derselben so auszurechnen: Die i'rozenti' i-Vit /-\\ischon *) Witte, Fettgehalt und spez. (iewicht der Milchtrnckcnsub.>itaiiz. /citM-nr. i Untersuch, d. Xahrungs- u. (Jenußmittel. 18. 464. VMJ. 430 E. F. Edelstein. Tabelle IL Tabelle zur Ermittlung der Trockensubstanz nach Fleischmann. f 1-2 . f f 1-2 . f f 1-2 . { f 1-2 .f f 1-2 .f f 1-2 - f 2-50 3-000 3-00 3-600 3-50 4-200 4-00 4-800 4-50 5-400 5-00 6-000 51 3012 Ol 3612 51 4-212 Ol 4-812 51 5-412 Ol 6 012 52 3-024 02 3-624 52 4-224 02 4-824 52 5424 02 6-024 53 3036 03 3636 53 4-236 03 4-836 53 5-436 03 6-036 54 3048 04 3 648 54 4-248 04 4-848 54 5-448 04 6-048 55 3-OSO 05 3-660 55 4-260 05 4-860 55 5-460 05 6-060 56 3072 06 3-672 56 4-272 06 4-872 56 5-472 06 6-072 57 3-084 07 3-684 57 4-284 07 4-884 57 5-484 07 6084 58 3-096 08 3-696 58 4-296 08 4-896 58 5-496 08 6-096 59 3-108 09 3-708 59 4-308 09 4-908 59 5-508 09 6108 2-60 3-120 3-10 3-720 3-60 4-320 4-10 4-920 4-60 5-520 5-10 6120 61 3-132 11 3732 61 4332 11 4-932 61 5-532 11 6-132 62 3-144 12 3-744 62 4-344 12 4-944 62 5-544 12 6-144 63 3-156 13 3-756 63 4-356 13 4-956 63 5-556 13 6-156 64 3-168 14 3-768 64 4-368 14 4-968 64 5-568 14 6-168 65 3-180 15 3-780 65 4-380 15 4-980 65 5-580 15 6-180 66 3-192 16 3 792 66 4-392 16 4-992 6(5 5-592 16 6-192 67 3-2U4 17 3-804 67 4-404 17 5004 67 5-604 17 6-204 68 3-216 18 3-816 68 4-416 18 5-016 68 5-616 18 6216 69 3-228 19 3-828 69 4-428 19 5-0-28 69 5-628 19 6-228 2-70 3-240 3-20 3-840 3-70 4-440 4-20 5-040 4-70 5-640 5-20 6-240 71 3-2:)2 21 3-852 71 4-452 21 5-052 71 5-652 21 6-252 72 3-264 22 3-8H4 72 4-464 22 5-064 72 5-664 22 6-264 73 3-276 23 3-876 73 4-476 23 5-076 73 5-676 23 6-276 74 3-288 24 3-888 74 4-488 24 5-088 74 5-688 24 6-288 75 3-300 25 3-900 75 4-500 25 5-100 75 5-700 25 6-300 76 3-312 26 3-912 76 4-512 26 5112 76 5712 26 6-312 77 3-324 27 3-924 77 4-524 27 5-124 77 5-724 27 6-324 78 3-336 28 3-936 78 4-536 28 5136 78 5-736 28 6-336 79 3348 29 3-948 79 4-548 29 5-148 79 5-748 29 6-348 2-80 3-360 3-30 3-960 3-80 4-560 4 30 5-160 4-80 5-760 5-30 6-360 81 3372 31 3972 81 4-572 31 5172 81 5-772 31 6-372 82 3-384 32 3-984 82 4-584 32 5 184 82 5-784 32 6-384 83 3-396 33 3-996 83 4-596 33 5196 83 5 796 33 6-396 84 3-40S 34 4-008 84 4 608 34 5-208 84 5-808 34 6-408 85 3-420 35 4-020 85 4-6-20 35 5-220 85 5-820 35 6-420 86 3-432 36 4-032 86 4-632 36 5-232 86 5-832 36 6-432 87 3-444 37 4044 87 4-644 37 5-244 87 5-844 37 6-444 88 3-456 38 4-056 88 4-656 38 5-256 88 5-856 38 6-456 89 3-468 39 4-068 89 4-668 39 5-268 89 5-868 39 6-468 2-90 3-480 3-40 4-080 3-90 4-680 4-40 5-280 4-90 5-880 5-40 6-480 91 3-492 41 4 092 91 4-692 41 5-292 91 5-892 41 6-492 92 3-504 42 4-104 92 4-704 42 5-304 92 5-904 42 6-504 93 3-516 43 4-116 93 4-716 43 5-316 93 5-916 43 6-516 94 3-528 44 4-128 94 4-728 44 5-328 94 5-928 44 6-528 95 3-540 45 4-140 95 4-740 45 5-340 95 5-940 45 6-540 96 3-552 46 4-1Ö2 96 4-752 46 5-352 96 5-952 46 6-552 97 3-564 47 4-164 97 4-764 47 5-364 97 5-964 47 6-564 98 3-576 48 4-176 98 4-776 48 5-376 98 5-976 48 6-576 99 3-5S8 49 4-188 99 4-788 49 5-388 99 5-988 49 6-588 Für Tau8endtiMinuiiii:. Methode nach Vogel.-) Ein kleines Nickelschiffchen wird mit 15—20// ausgeglühtem Sand oder einem anderen porösen Stoff, z. B. (lips, (Jlaspulver, Asbest, gefüllt. ') Ruj)pel, t}l)cr die Fette de- Frauenmilch. Zcitsehr. f. Biol. M 1. 1S«)5; Larts, Untersuchung des Fettes von B'rauenmilch. Zcitschr. f. phjsiol. Chcin. 19. 3. Ü9. 1894. -) Voffcl, Über Milchuntersuchuugcn. Berlin. Sprintror, 1885. (J — 113. 432 E.F.Edelstein. In dieses so vorbereitete und gewogene Schiffclien werden 10 g Milch hinein- gewogen und die Milch bis zur Trockne eingedampft. Dann umwickelt man das Schiffchen mit fettfreiem Filtrierpapier, legt es in eine Patrone hinein und extrahiert im Soxhletapparat 3 — 5 Stunden mit w^asserireiem Äther. Hat man beim Soxhletapparat als Ätheraufnahmegefäß ein kleines Kölbchen benutzt, so kann man, wenn man das Gewicht desselben kennt, den Äther durch Abdampfen verjagen und den Kolben trocknen und wägen. Sonst führt man die Ätherflüssigkeit quantitativ in ein vorher gewogenes Bechergläschen über (2 — 3mal mit Äther nachspülen!), verdampft die Ätherfettlüsung vorsichtig auf einem Dampfbad, trocknet das Becher- gläschen bei 100« 1 Stunde lang und wägt. Die Gewichtszunahme bedeutet den Fettgehalt. Eine höhere Temperatur als 100" beim Trocknen ist möglichst zu vermeiden wegen der damit verbundenen Gefahr der Fettzersetzung. Methode nach Ädams^) Eine etwas umständliche Methode ist die nach Adams, welche aber sonst sehr brauchbare Resultate liefert. Man tropft 6 — 7 g Milch (das genaue Abwägen kann man sich durch eine kleine abtarierte und mit Strichen versehene Spritzflasche erleichtern) auf einen 56 cm langen Filtrierpapierstreifen ( Schleicher & Schüll) auf, und zw^ar so, daß man den Papierstreifen (der übrigens selbstverständlich fettfrei ist) schwebend an beiden Enden mit Klammern befestigt. Nun tropft man die ]\Iilch allmählich auf, wobei man achtgibt, daß die beiden Ecken in einer Entfernung von mindestens 5 cm trocken bleiben. Man läßt den Papierstreifen an der Luft trocknen, rollt ihn vorsichtig zusammen, trocknet ihn nochmals 2 Stunden bei 100" und extrahiert im Soxhletapparat 5 — 8 Stunden. Die ätherische Lösung wird genau so wie sonst in einem gewogenen Kölbchen verdunstet und nach dem üblichen Trocknen gewogen. Nach G 0 ttlieh-Röse. ^-) Prinzip: Die Eiweißstoffe bzw. das Kasein der Milch werden in Ammoniak gelöst und aus einer ammoniakalisch-alkoholischen Lösung das Fett mit Äther-Petroläther durch Ausschütteln extrahiert. 10^ Milch w^erden in einem genau graduierten Zyhnder oder in be- sonders zu diesem Zwecke hergestellten graduierten und mit geschliffenen Stöpseln versehenen Schüttelbüretten 3) (Fig. 108) zunächst mit 2 cm^ eines lOVoigen Ammoniaks versetzt und leicht geschüttelt. ') Lenz, Bericht über spezielle analytische Methoden. Zeitschr. f. aualyt. Chem. 27. 85. 1888. -) Rose, Zur Analyse der Milch; Fettbestimmung. Zeitschr. f. angewandte Chem. 1. 100.1888; Gottlieb, Eine bequeme Methode zur Bestimmung des Fettes in der Milch. Landwirtschaftliche Versuchsstationen. 40. 1. 1892. ^) Den sogenannten Gottliebschen Röhren (Fig. 108). Methodik der Milclmntcrsucliung. 433 Fig. 108. Nun werden nacheinander 10 cm^ absoluter Alkohol. 25 cw»> , -r Äther und 25 cm^ I'etroliither hinzn{,^ef(igt uiul nach jeder Zu^'ahe f^t durcb- geschüttelt. Nach kurzer Zeit trennt .sich die wä.s.serig-anunoniakali.scho Schicht von der ätheri.schen und man liilit den Zylinder cinip' Stunden stehen. Dann wird die Höhe der ätherischen Schicht ah-relesen und rin aliquoter Teil derselben (20 oder ;50 cm^) mit einer l'ipette entnomuM-n (die Pipette wird nachgespült!), in ein gewogenes kleines IJechergÜischen hineingebracht und der Äther auf einem Dampfbad vorsichtig abgedampft Das Bechergläschen wird bei 100" eine Stunde lang getrocknet und gewogen. Die in der entnommenen Menge Ätherlösung /um WiiLren gebrachte Grammanzahl Fett wird auf die ganze .Uherscliicht umgerechnet. Die Zahl gibt dann die in den abgewogenen 10 y Milch enthaltene ]\Ienge Fett. Statt die Milch abzuwägen, kann man auch 10 cm' Milcii verwenden, hebert aber die ätherische Lösung bis auf 1*5 cw^ der Fettlösung ab. Die nach dem \erdunsten des Äthers gewogene Fettmenge mit 10 multipliziert gibt dann direkt Gewichtspro- zente an. ') In neuerer Zeit haben Hesse-) und Eichlojl'^) das (lott- lieb-Rösesche Verfahren abgeändert. Die GottächsdiQ Methode liefert zu niedrige Werte. Hesse schlägt deshalb vor. die ätheri- sche Fettlösung ganz abzuhebern, mit Äther einmal nachzuspiden und noch einmal mit Äther und Petroläther au.szuschütteln. Da aber das zweite Ausschütteln sehr geringe Mengen Fett liefert, genügt es nach Eichlojf und Grimmer'^), wenn man nach dem Abhebern der Fettlösung zweimal mit Äther nachspült, (ira- duierte Zylinder fallen für diese Methode weg, da man ja nicht mehr aliquote Teile, sondern die ganze Ätherschicht abhebert und eine Umrechnung unnötig wird. Der Schüttelkolben*) (vergl. Fig. 109, S. 434) wird leer gewogen, mit lOcws Milch gefüllt und abermals gewogen. Dann wird l cm .\mmoniak hinzugefügt und leicht umgeschüttelt. Nun setzt man nacheinander IOom* absoluten Alkohol, 25 cm» wasserfreien Äther und 25 e/-schen Azidobutyrometrie ist seine Sal- . methode. 3) Dieselbe vermeidet die Anwendung von Schw efelsilure und den Gebrauch des Amylalkohols. Das Prinzip ist wie folgt : Eine alkalische Sallösung (das Salpulver besteht aus Ätznatrium und Kaliumnatriumtartrat, etwas Kochsalz und einem roten Farbstoff) löst das ') llöiibcrg. Eine Methode zur Färhung des bei der (»'rr/irrschcn .\j!idobiit)To- metrie abgeschiedi-ncii Mih-hfettes. Zeitsclir. f. Fleisch- u. Milohhygiene. 21. 46. 1910; n- tiert nach Chein. ZeDtrallil. II. M'l'x VMO. ') A. Stein, 1. c. ') Gerber, Die „Sal"-Metii<»dc, ein neues säurefreies Verfahren lur »chnellou Fettbestimmuug aller MUcharten. Milch-Zfg. 35. 37. llK)fi. 28» 436 E. F. Edelstein. Kasein der Milch und die Kalksalze derselben. Das Fett wird wie bei der vorherigen Bestimmung durch Zentrifugieren abgeschieden. Dasselbe mrd in dem zugegebenen Isobutylalkohol gelöst und erscheint über der rot- gefärbten alkalischen Lösung als farblose Fettschicht. Die Bestimmung wird folgendermaßen ausgeführt: 1 1 cm^ Sallösung (hergestellt durch Lösen des käuflichen Salpulvers in 1 l Wasser und nachträglicher Filtration), 10 cm^ Milch und O-ßmi^ „Butyl" (Isobutylalkohol) werden in ein Gerbersches Butyrometer gebracht, tüchtig durchgeschüttelt, in einem Wasserbade von 45'' 3 Minuten erwärmt und wieder durchgeschüttelt. Dann zentrifugiert man 3 Minuten lang, bringt wieder auf kurze Zeit in ein Wasserbad von 45° und Uest ab. Auf ähnlichem Prinzip beruht das Verfahren nach Sichler'^), die so- genannte Synazidbutyrometrie und die Neusalmethode nach Wendler.^) Die letztere i^rüiten Nottbohm und Angerhausen ^) nach und fanden, daß sie recht gute Ergebnisse liefert, und zwar mit der GottUeb-Eöse&cheji Methode ver- glichen. Neusal ist eine Mischung von Salizylsäuren und zitronensauren Salzen und einem blauen Farbstoff. 250 g davon werden in 600 Wasser gelöst, 250 Neusalalkohol dazugegeben und mit Wasser auf 2 l aufgefüllt. *) 12 cm^ dieser Neusallösung werden mit 9'9 crn^ Milch in einem Butyrometer gut geschüttelt, auf 3 Minuten in ein Wasserbad von 50'^ gebracht, nochmals geschüttelt und wieder 3 Minuten auf 50" erwärmt. Dann zentrifugiert man 3 Minuten, erwärmt auf 45« und liest ab. Über den Wert der beiden letzten Methoden kann man sich noch kein abschheßendes Urteil erlauben. Bei genauen Bestimmungen soll man sich jedenfalls der anderen, bewährten Methoden bedienen. Das refraktometrisehe Terfahreii nach WoUiiy. Modifikation nach Naumann.^) Stellt man sich nach bestimmter Vorschrift eine Ätherfettlösung her und bestimmt die Lichtbrechung, die ein Lichtstrahl beim Durchgang durch diese Schicht erleidet, so kann man, vorausgesetzt, daß der Brechungs- exponent des Milchfettes einen konstanten Wert hat, aus einer empirisch berechneten Tabelle die Fettmenge bestimmen.") ^) Sichler und Richter, Ein Beitrag zur Beurteilung der Synazidbutyrometrie. Milchwirtsch. Zentralbl. 1. 71. 1905. -) Wendler, „Neusal". Neues säure- und alkalifreies Verfahren. Milcbzeitung. 39. 230. 1910. ^) Notthohm und Anf/erhausen, Nachprüfung der „Neusalmethode von Dr. Wendler"' zur Fettbestimmung in der Milch. Zeitschr. f. Untersuch, der Nahrungs- und Genußmittel. 20. 495. 1910. *) Diese Lösung ist gebrauchsfertig bei Dr. Gerfccr-Leipzig zu haben. ^) Nanmann, Untersuchung der Milch auf den Fettgehalt mit dem Wollnijscheii Müch-Refraktometer. Leipzig 1900. Heinsius Nachf. ^) Über Refraktometrie siehe: Biehringer, Bd. 1. 568 dieses Handbuches. Methodik der Milcliuntersiichuntf. 437 h^ O ! CO :p cp l;- t - »b lO »b «o »o -f -^ X C C>l l;- i_- l;- op X lO »0 »b iO »0 -f CO X ~ Cl X X ac p p »Q iC iC lO ib 2; 5_ i ^ 1' 3 '£ 5 Zi n: 1 ib «b ib cb CD P CO CD cb "b •r /• ~ ^1 — ^'^ o 1— i-McO-ti01--Ol-X350l^'M?0-^if^l--r:i-X)~. ~ — -M CO -»< >0 l^ o tb X C '- CO o ib .b ib ib ib c^ C5 0 C-l -t .7H l-H (?J ^ c>i 0 ic fcb ic »c CO X - M -f c^i c>i CO CO CO «b .b ib .b .b CO X 0 -M -r CO X p c-i -r p p -t -t i< -^ -n .p .p Ji tc to »0 »0 »c |io lO 'O ib »0 '■=. p -5 ^ 5 t^ o 1-H -M CO rt< lO COOOOOSO «CMCOtJ'iO 8 CD l> X C5 p 1-1 IM eo t ic «Dl-/ - . CO .c t- — o it; »o iC iC CO -^ •* -rfH 4lH -^ 1-1 CO 1- r^ ~ p p p p p -f -^1 -^< -^< -^^ — CO .0 CO X (^ 1 - 1 ~ 1 ^ 1 ~ -^< -^< -^< -^l -^ c "M -1" CO X r; -M -T . 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Diese ganze Prozedur des Mischens, Schütteins und Zentrifugierens wird in hierfür geeigneten, mit einem Glas- stöpsel verschließbaren Probe- gläschen (Fig. 114) vorge- Fig. 115. nommen. Ein ganz kleiner Teil von der durch Abzentri- fugieren erhaltenen Ätherfett- lösung wird mit Hilfe enger Glasröhrchen entnommen und auf das Prisma des Refrakto- meters aufgetropft. Fig. 114. -* — -Marhe bei 30ecm Fiißtmg Das Refraktometer (Fig. 115) ist genau auf 17-5'' eingestellt. Dies wird so bewerkstelligt, daß ein auf 17-5" eingestelltes Wasser durch das Prismengehäuse fließt. Das Refraktometer wird zunächst so eingestellt, daß es durch Auf- tropfen von etwas auf 17-5o temperiertem, destilliertem Wasser den Null- punkt der Skala anzeigt. Dann tropft man auf die sorgiältig gereinigten Prismen wassergesättigten Äther auf und stellt genau durch Regulieren der Mikrometerschraube auf den Skalenteil 20*6 ein. 1) M Die von der Firma Zeiss jetzt gelieferten Milchrefraktometer sind auf diesen Punkt bereits geaicht. Methodik der Milchiintersuchung. 4:^9 Fig. 116. Die WoJlni/sche Lauge stellt man nach Xauwanu her: 800.<7K()Ilin Standen werden in weni^^ Wasser gelöst, ii;i- 1, utm Erkalten mit OOO^ Glyzerin gemischt und dazu !'()(» 7 Kupferoxy Hydrat zugegeben. Diese Mischung wird auf HOOO cm^ autVct'iillt. Man lal'.t :\ \ TriL-p stehen unter zeitweiligem starkem rmschütteln. Die WoUni/-Naumamis,che Kefraktometermethode ist sehr genau, und wenn einmal alles an Reagenzien und Apparaten Notwendige vorhereitct ist, bequem und schnell auszuführen. Aräoinetrische llethode nach Soxlilet. >) Das Prinzip dieses Verfahrens beruht darauf, dal) aus einer alkalisch gemachten Milch das Fett mit wassergesättigtem Äther extrahiert wird. Diese Fettlösung wird auf ihr spezifisches Gewicht untersucht und daraus der Fett- gehalt berechnet. Zur Ausführung dieser Bestimmung gehört zunächst der von Greiner - Mün- chen nach Soxhiet ausgeführte Apparat (Fig. 116), eine Kali- lauge vom spezifi- schen Gewicht 1*27 und ein wasserge- sättigter Äther, her- gestellt durch Schüt- teln vom gewöhnli- chen Äther (D. Q-l) mit 1—2 Zehntel Vo- lumen Wasser. Da das Aräo- meter auf eine Tem- peratur von 17-5° geaicht ist, muß so- wohl die zu untersu- chende Milch wie die anzuwendenden Re- agenzien auf diese Temperatur gebracht werden. ') F. Soxhiet, Aräometrische Motliodc zur ItostimmuM^r dos I-". • Milch. Zeitschr. d. landwirtsch. Vereines in Bayern. S. 1. 1SH(). Kefer.it u. f. analvt. Chemie. 20. 452. 1881. ier 440 E. F. Edelstein. Tabelle zur Bestimmung des Fettgehaltes der Milch aus dem spezifische n Gewicht der Ätherfettlösung bei IT'ö". Spez. Gew. Fett 7o Spez. Gew. Fett Spez. Gew. Fett 0,' Spez. Gew. Fett /u Spez. Gew. Fett o; ;o 430 2-07 1 2-08 2 209 3 210 4 211 5 212 6 213 7 214 8 2-16 9 2-17 44-0 2-18 1 219 2 2-20 3 2-22 4 2-23 5 2-24 6 2-25 7 2-26 8 2-27 9 2-28 45-0 2-30 1 2-31 2 2-32 3 2-33 4 2-34 5 2-35 6 2-36 7 2-37 8 2-38 9 2-39 46-0 2-40 1 2-42 2 2-43 3 2-44 4 2-45 5 2-46 6 2-47 7 2-49 8 2-50 9 2-51 47-0 2-52 1 2-54 2 2-55 3 2-56 4 2-57 5 2-o8 6 2-60 47-7 8 9 48-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 490 1 2 3 4 5 6 7 8 9 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 51-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 520 1 2-61 2-62 2-63 2-64 2-66 2-67 2-68 2-70 2-71 2-72 2-73 2-74 2-75 2-76 2-77 2-78 2-79 2-80 2-81 2-83 2-84 2-86 2-87 2-88 2-90 2-91 292 2-93 2-94 290 2-97 2-98 2-99 3-00 301 3'03 304 305 3-06 308 3-09 310 311 312 314 315 52-3 4 5 6 7 8 9 530 1 2 3 4 5 6 7 8 9 54-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 55-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 56-0 1 2 3 4 5 6 7 8 316 317 3-18 3-20 3-21 3-22 3-23 3-25 3-26 3-27 3-28 3-29 3-30 3-31 3-33 3-34 3-35 337 3-38 3-39 3-40 3-41 3-43 3-45 3-46 3-47 3-48 3-49 3-51 3-52 3-53 3-55 3-56 3-57 3-59 3-60 3-61 3-63 3-64 3-65 3-67 3-68 3-69 3-71 3-72 3-73 56-9 570 1 2 3 4 5 6 7 8 9 58-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 590 1 2 3 4 5 6 7 8 9 60-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 610 1 2 3 4 3-74 375 3-76 3-78 3-80 3-81 3-82 3-84 3-85 3-87 3-88 3-90 3-91 3-92 3-93 3-95 396 3-98 3-99 401 4-02 403 4-04 406 407 409 411 412 414 415 416 4-18 4-19 4-20 4-21 4-23 4-24 4-26 4-27 4-29 4-30 4-32 4-33 4-35 4-36 4-37 61-5 6 7 8 9 620 1 2 3 4 5 6 7 8 9 630 1 2 3 4 9 64-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 65-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 66-0 4-39 4-40 4-42 4-44 4-46 4-47 4-48 4-50 4-52 4-53 4-55 4-56 4-58 4-59 4-61 4-63 4-64 4-66 4-67 4-69 4-70 4-71 4-73 4-75 4-77 4-79 4-80 4-82 4-84 4-85 4-87 4-88 4-90 4-92 4-93 4-95 4-97 4'98 5-00 5-02 504 5-05 507 5-09 511 512 200 cm^ Milch werden in einer Schüttelflasche mit 10 cm^ Kalilauge vom spezifischen Gewicht 1-27 und mit 60 cm^ Äther gut verschlossen und kurze Zeit durchgeschüttelt. Dann wird die Flasche durch Hineinstellen in ein großes Gefäß mit Wasser von IT'ö" auf diese Temperatur gebracht und in kurzen Abständen 1/4 Stunde lang, am besten in senkrechter Richtung Methodik der Milchuutersuchung. i i i durchgeschüttelt. Nach etwa 15 Miiuiton scheidet sich eine khire Äther- fettschicht ab. Die Flasche mit der Fettlüsung wird nun mittelst eines Schlauches mit dem Kohr verbunden, in dom sich das Arilomcter befindet. Das Rohr wird durch einen äußeren Mantel mit Wasser von ITf)" «rekühlt. Mittelst eines Gummiballes drückt man die Atlierfettlösunj^' in das Kohr hinein und schließt das letztere von unten mit einer Klemmschraube zu. Man wartet einige Minuten, damit sich die Temperatur ausgleicht und liest dann den Berührungspunkt der .Skala des in der Fettschicht schwim- menden Aräometers mit dem unteren Meniskus der Ätherschicht ab. Aus der von Soxhief empirisch aufgestellten Tabelle ermittelt man den Fett- gehalt in Prozenten. Lezithin. Das in der Milch bzw. im Milchfett enthaltene I'hosjdiatid bat zuerst Rosengren'^) isoliert, und zwar indem er die bei der Gottlicb-Jiösvüvhcn Methode erhaltene Atherfettlösung mit wasserfreiem Äther nochmals extrahierte. Dabei gewann er einen unlöslichen liückstand. der beim \erseifen mit Barvtwasser eine Substanz lieferte, die aus Fettsäuren und aus riiosphorsäure bestand. Burow'^) hatte das Lezithin derart bestimmt, daß er in eine angesäuerte Alkoholäthermischung (100 Äther und 100 jVlkohol) Milch hineintropfen ließ, nach 24 Stunden filtrierte und das Filtrat eindampfte. Der Rückstand wurde mit Äther ausgezogen, der Äther verdampft und in diesem Rückstand Phosphor bestimmt. GWdn 3) bestimmt quantitativ das Lezithin in der Milch, indem er eine bestimmte Menge Milch bis zur Trockne eindampft. Die Trocken- substanz wird 1 — 2 Stunden im Trockenofen getrocknet, dann im Mörser fein zerrieben und in eine Patrone gebracht. Man zieht sie zunächst 4 Stunden mit absolutem Alkohol und dann bis zur Erschöpfnng mit Chloroform aus. Die gesammelten Äthcrchloroformauszüge werden ver- dampft und der Rückstand wird in absolutem Äther aufgenommen. .Man rührt gut durch, filtriert, befreit vom Äther und nimmt einen bestimmten Teil vom getrockneten Rückstand ab, in welcheiu man Phosphor nach Srn- waww bestimmt. Die erhalteue Menge PoOg multipliziert mit ll-;i«)()t> gilit den Gehalt an Lezithin an. Das Ausziehen mit Alkohol bietet insofern Schwierigkeiten, als man über einem Wasser oder Dampfiiad tlen Alkohol kaum zu einem i)erma- nenten Sieden bringen kann. Verfasser hat sich bei Lezithinbestinimiingen im Laboratorium des Kaiserin Auguste Viktoria-Hauses mit gnti'ui Erfolge der Doppelflasche nach Zelmanowitz^) (Fig. 117) als Alkohol-Aufnahme^ kolben bedient. •) Rosengreu, Beitrag zur Frage „Cofflieh" oder „Admtis". Milchzoituiii:. 22. l'.X>4. *) Burow , Der Lezithingehalt der Milch und soiiio Aldiüugigkeit vom rcl.itivpti Hirngewichte des Säuglings. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 30. 495. liKX). *) Glikin, Zur biologischen Bedeutung des Lezithins. Cher den Lezithin- und Eisengehalt in der Kuh- und Frauenmilch. Biochom. Zcit-^chr. 21. 'MH. l".)(»y. *) Zu haben bei den Vereinigten Fabriken für Laboratoriunisbedarf, Berlin. 442 E. F. Edelstein. Fig. 117. Dieser Kolben hat den Vorzug, daß man ein konstantes Sieden des Alkohols erzielt, ohne letzteren direkt mit einer Flamme erhitzen zu müssen, was bei einer längeren Behandlung mit Alkohol immer gefährlich ist. Der äußere Raum der Flasche ist mit Wasser gefüllt, welches, zum Kochen erhitzt, den Alkohol zum Sieden bringt. Methode nach Nerking und Haensel.'^) 100 cm'i Milch werden unter Umrühren mit 200 cm^ Alkohol gefällt und der gut abgesetzte Niederschlag filtriert. Nun wird einerseits der Niederschlag mit dem Filter 30 Stunden lang in einer Soxhlethülse mit Chloroform extra- hiert, andrerseits das alkoholische Filtrat bei geringer Temperatur (50—600) eingedampft und der Rückstand bis zur Erschöpfung mit Chloroform ausgezogen. Beide Extrakte werden vereinigt , durch Ver- dampfen Alkohol und Chloroform verjagt, der Rückstand mit Salpeter- mischung verascht und darin die Phosphorsäure zunächst als Ammoni- ummolybdenphosphat gefällt. Dieses wird in Ammoniak gelöst, die Phosphorsäure als Ma- gnesiumammonium- phosphat gefällt und als Pyrophosphat gewogen. Die Menge Mg, P2 O7 mit 7*27 multipliziert gibt den Gehalt an Le- zithin an. Nach dieser Methode fanden Nerking und Haensel in der Frauenmilch im Mittel 0-0499''/o, in der Kuhmilch im Mittel 0-0629Vo Lezithin. Alle diese Verfahren können keinen Anspruch auf Genauigkeit er- heben. Die Isolierung der Phosphatide weist überhaupt noch große Mängel 1) Nerking und Haensel, Der Lezithingehalt der Milch. Biochem. Zeitschr. XIII. 348. 1908. Methodik der Milcliuntcrsiichung. i lu auf, weil dieselben infolge ihrer leichten Zerset/lichkeit verschiedenen \er- änderun ) Cholesterin. Cholesterin, ein höherer Alkohol (nach H'i/iildus-) ein sekundärer, un- gesättigter Alkohol), ist in sehr gerini-ei- Menge in der Kuhinilch. auch in der Frauenmilch vorhanden. In welcher Form Cholesterin in der Milch vorkommt, ob frei oder als Ester, darüber ist noch nichts Sicheres be- kannt. Emeißstoffe der Milch. ») (Kasein, Albumin, Globulin.) Das Kasein (der Käsestoff) ist in der Milch in ge(|uollenem Zustande suspendiert und zwar als eine Kaseinkalziumverbindung. Kreidl \m(\. Xeumann*) haben die Milch verschiedener Tiere ultru- mikroskopisch untersucht ») und im Milchplasma außer Fettröpfchen noch eine große Anzahl anderer in lebhafter Bewegung sich befindender Teilchen beol)achtet. Diese Teilchen halten sie für Kasein. Sie haben nämlich Lö- sungen von nach Hammursten dargestelltem Kasein mit dem Milcliplasma verglichen, wobei sie feststellten, daß beide (Milchplasma und Kaseinlösung) durch das Ultramikroskop gleich aussehen. Anders sieht das .Milchplasma der Frauenmilch, durch das Ultramikroskop betrachtet, aus. Man sieht nur Fettkügelchen, das übrige Plasma erscheint schwarz. Diese Cntersuchunuen erklären vielleicht die schwere Fällbarkeit des Frauenmilchkaseins. Das Kasein der Kuhmilch stellt man am besten nach der Methode von Hammarsten «) dar. Man verdünnt die Milch mit 4 Teilen Wasser und versetzt diese Mischung mit soviel Essigsäure, daß etwa OT — 1// pro lOoo Flüssigkeit enthalten ist. Das Kasein scheidet sich in dicken Flocken ab ; es wird filtriert und mit Wasser gewaschen. Das bei der Fällung mitgerissene Fett wird durch Behandlung mit Alkohol und nachträglich durch Extrahieren mit Äther entfernt. 0 Das entfettete Kasein wird in sehr verdünntem .Mkali gelöst, und zwar wird es zunächst in einer Reibschale mit 'IhO cm^ Wasser über- *) Siehe auch Schult zc und Winterstein, rbosphatide. Bd. 2 diost>< H.nidliurlios. S. 256. ^) Windaus, über Cholesterin. Ber. d. deutsch, chom. (Jos. 41. Uli und 2.').'>S l',M)S. *) Siehe auch Fr. SaiiiKrli/, Gruppe der nicht kristallisiorbanMi rroteine. III. l)io Eiweißkörper der Milch. Bd. 2 dieses ILoKllKichcs. HHS. *) Kreidl und Neumann, Ultramikroskopischc Betrachtuni/en über das Vorhalten der Kaseinsuspension in der frischen Milcli und 1mm der (ierinniuijr. lyifif/rrs .\rrhiv, Bd. 123. 523. 1908. ^) Siehe Schulz, Ultraraikroskop. Bd. 1. 283 dieses Ilandliuchcs •) Hammarsten, Lehrb. d. physiol. Chemie. (518. ] 1)1(1. ') Diese Entfettung,' muß sehr gnUidlich sein und dauert sehr lange. 444 E. F. Edelstein, gössen und dann unter starkem Rühren allmählich Natronlauge (1 : 10) zu- getropft. Jetzt filtriert man, fällt wieder mit Essigsäure und wäscht gründ- lich mit Wasser aus. Diese Umfällung nimmt man einige Male vor und trocknet dann das Kasein, am besten im Vakuumexsikkator über Schwefelsäure oder bei 60—700. Die durch Lab entstandene Fällung, das Parakasein i), ist wie das Kasein in Alkalien löslich. Das Parakasein enthält Kalk und zu seiner Fällung mit Lab ist die Gegenwart von Kalksalzen notwendig. Man kann dies sehr leicht be- weisen, wenn man zu 100 em^ Milch, der man b cm^ einer P/oigen Na- triumoxalatlösung zugesetzt hat, Lablösung zugibt und auf 40^ erwärmt. Es erfolgt keine Gerinnung, weil das zur Ausfällung notwendige Kalzium an Oxalsäure gebunden ist. Erst auf Zusatz von wenig Chlorkalzium erfolgt die Gerinnung. 2) Man kann das Kasein aus der Milch auch mit einer gesättigten Magnesiumsulfatlösung ausscheiden 3), und zwar in einer in Wässer oder verdünnter Salzlösung löslichen Form. Man sättigt 100 cm^ Milch mit Magnesiumsulfat durch Schütteln mit dem gepulverten Salz. Nun filtriert man durch ein Filter, das mit ge- sättigtem Magnesiumsulfat befeuchtet ist und wäscht mit Magnesiumsulfat- lösung nach. Der Niederschlag, ein Gemenge von Kasein und Fett und etwas Globulin (Albumin wird nicht mitgefällt), wird durch Verrühren mit Wasser gelöst. Die Lösung läßt man einige Zeit stehen, wobei sich das Fett oben absetzt. Filtriert man nun von dem Fett ab und gibt Essig- säure zu, so fällt das Kasein aus. Ganz anders verhält sich die Frauenmilch in bezug auf die Kasein- fällung. Auf Zusatz von Essigsäure fällt meistens kein Kasein aus; man muß die Milch entsprechend vorbehandeln. Fuld und Wohlgemuth '^) bedienen sich des Gefrierens, tauen nach- träglich die Milch auf und fällen direkt mit Säure. Wrohlewski '^) gibt folgende Methode an : Man fällt in der Frauenmilch mittelst Ammoniumsulfat ein Gemenge von Kasein und Albumin und filtriert ab. Der Niederschlag wird mit SO^/oiger Ammoniumsulfatlösung gewaschen und mit Wasser verrieben, wobei alles in Lösung geht. Durch Dialysieren wird die Lösung vom Salz befreit, das Fett wird mit Äther entfernt und das Kasein mit ^ Essigsäure gefällt. Das Ver- *) Siehe Fr. Samuely, Bd. 2 der Arbeitsmethoden. 387. ^) E. Salkowski, Praktikum d. physiol. u. pathol. Chemie. S. 93. 1906. ^) E. Salkowski, Praktikum der physiol. u. pathol. Chemie. 91. 1906. ^) 1. c. ^) Wroblewski, Beiträge zur Kenntnis des Frauenkaseins und seine Unterschiede vom Kuhkasein. Dissertation. Bern 1894. Methodik der Milchuntcrsuchunc. itjj fahren hat eigentlich nur historisches Interesse und liefert kein uanz reines Präparat. Viel besser ist die Methode von Kohntfc^), nach der man die MiUli zuerst durch Zentrifugieren vom Fett befreit, die Magcmiilch mit ' 5 des Gesamtvolumens r^ Essigsäure versetzt und ö Tage lang gegen ("liloroform dialysiert. Das in feinen Flocken sich dabei ausscheidende Kasein wird abfiltriert und in Alkohol und Äther gewaschen. Die Dialyse führt man am besten in abgesprengten, mit Tergament- papier umwundenen liechergläsern aus und stellt sie in ein mit Cliloroform- wasser gefülltes Gefäß ein. Ein sehr reines Frauenmilchkasein liefert das Verfahicn nach IJiufrl. «) 1 / Milch wird mit 700 on^ t^ Essigsäure verdünnt und in einer großen Flasche auf 5000 mit Wasser aufgefüllt, geschüttelt und im Fis- schrank 2 — 0 Stunden stehen gelassen. Dann wird der ganze Inhalt in ein großes Gefäß gegossen und in ein Wasserbad von 40 — 4.')" hineingestellt. Nach 1/4 Stunde, nachdem das Gemisch die Temperatur von HO" ange- nommen hat, filtriert man durch ein doppeltes Filter. Das Kasein, w^elches durch Albumin, F'ett und etwas Milchzucker verunreinigt ist, wird vom Filter in eine Soxhlethülse abgeschalit und darin durch Extraktion mit Äther vom Fett befreit. Das II()hi)rodukt wird in einer Kugelmühle fein gepulvert und dann in einer großen Zentrifuge nacheinander mit schwach essigsaurem Wasser, Alkohol und Äther so lange gewaschen, bis das Kasein frei von Milchzucker und beigemengtem Eiwfii; ist. Das schön weiße, an der Luft zerbröckelnde Pulver wird über ILSO^ im Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute am Reinprodukt beträgt etwa 0-2*' o- Eine bessere Ausbeute hefert das Verfahren nach Langstiin-Kddstein.^) Frische Frauenmilch wird 1 Stunde lang zentrifngiert (HOOO Touren- Zentrifuge), das angesetzte Fett abgeschöpft und die Magermilch mit ' ,, des Gesamtvolumens ^ Essigsäure unter Umrühren versetzt. In wenigen Mi- nuten setzt sich das grobflockig ausfallende Kasein zu Boden. Man gießt von der trüben, darüber stehenden Flüssigkeit ab und wäscht das Kasein durch inniges Umrühren und Zentrifugieren mit Wasser, Alkohol und Äther. Es muß immer je eine halbe Stunde lang zentrifngiert werden. Nachdem das Kasein im Soxhletapparat völlig vom Fett bt'freit ist, wird es fein gepulvert und in vacuo über Schwefelsäure getrocknet Die Ausbeute beträgt zirka 0*4"/o. ') Kohrak, Beiträge zur Kenntnis des Kaseins der Fraueninilch. rßiigefs .\rchiv. Bd. 80. 1900. 2) En(ieJ, Eine oiufaclie Methode zur iiuantitativon Alischeidunjr ih-s Kuseius ans gemeiner Frauonmilcli. Biochcni. Zeitsciir. 13 und Vcrjrleichondp Untorsncluinpen über d.is Verhalten der Frauenmilch zu Säure und Lab. Ibid. 14. 2154. H'.). l'.K)S. 3) L(i)if/.'!fe{n-K'/i, Über die Kinlieitlichkeit des Fraiienniilchkascin«- '"'"'■ f. Kinderlieilk. Bd. 72. Ergänzungsheft 1. lülü. 446 E. ¥. Edelstein. Es kommt allerdings vor, daß ab und zu die Fällung nicht gelingt. Eine Erklärung dafür wurde bis jetzt noch nicht gefunden. Als Kriterium der Reinheit des Kaseins, sowohl des Kuhmilch- als des Frauenmilchkaseins gilt folgendes : Das Präparat darf keine positive MoUscJiRche Reaktion i) geben, höchstens eine ganz minimale Andeutung einer violetten Färbung, ferner keine Reaktion auf Zucker oder Eiweiß und muß fast aschefrei sein. Das letztere gilt besonders für das Kuhrailchkasein. ö' Albumin. Zur Darstellung des Albumins -) wird das Filtrat des Kaseinnieder- schlags, welches Albumin, Milchzucker und Salze enthält, filtriert und am besten in einem emaillierten Eisengefäß auf die Hälfte eingedampft. Das Albumin scheidet sich in groben Flocken aus. Es wird abfiltriert, mit heißem Wasser ausgewaschen und getrocknet. Globulin. Laktoglobulin stellt man nach Sehelien ^) dar, indem man Milch mit Kochsalz sättigt, den Niederschlag abfiltriert, das Filtrat auf 35" erwärmt, von dem restlichen Kasein abfiltriert und nun die Lösung mit Mag- nesiumsulfat fällt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert, in Wasser gelöst, wieder mit Magnesium sulfat gefällt, nochmals gelöst, mit Chlornatrium gefällt und dialysiert. Dabei scheiden sich Flocken aus, die man in lO^/oiger Kochsalzlösung löst und auf Tö" erwärmt. Plierbei erfolgt eine Gerinnung. Sehr oft scheidet sich das Globulin bei der Dialyse nicht aus. Man fällt dann am besten mit Alkohol und trocknet das gefällte Globulin mit Alkohol und Äther. Bestimmung des Stickstoffes in der Milch. 5 oder 10 cin^ Milch werden in einem Kjeldahlkolben mit 10 cni^ konzentrierter Schwefelsäure und 0*4 g gelbem Quecksilberoxyd versetzt und über einer Flamme so lange erhitzt, bis eine klare, farblose Flüssigkeit zurückbleibt. Man muß darauf achten, daß die Flüssigkeit nicht fast zur Trockne eindampft, weil die Stickstoffbestimmung dann Fehler aufweist. ^) Die Molischsche Eeaktion führt man so aus, daß man ganz Menig Kasein in n j^ Natronlauge sorgfältig löst, zu dieser Lösung 1 — 2 Tropfen einer W/o^gQ^ alko- holischen a-Naphthallösung zugil)t und mit 1 cm^ reiner konzentrierter Schwefelsäure überschichtet (violetter Ring). Um auf Eiweiß oder Zucker zu prüfen, schüttelt man etwas Kasein kurze Zeit mit Wasser und filtriert ab. Dieses Filtrat verwendet man für die Reaktionen. Eiweiß : Trübung auf Zusatz von mit Salzsäure angesäuerter Phosphor- wolframsäurelösung. Milchzucker : Reduktion der Fehlingschen Lösung. -) E. Salkowski, Praktikum d. physiol. u. patholog. Chemie. 82. 1906. ^) Sehelien, Beitrag zur Kenntnis der Eiweißkörper der Kuhmilch. Zeitschr. f. physiol. Chemie. Bd. 9. 445. 1885. Methodik der Milchuntersuchung. <«■- Nun wird nach dem Erkalten und Verdünnen mit ;» Teilen dostiliierton Wassers die übliche Destillation nach Kjelduhl und zwiir in deujselhen Kollien ausgeführt, unter Zugabe von etwas Talkuni (um das Stolien /u verhindern), von 10 cwä einer -iöO/oigcn Natriumthiosultatlösun«; und schlielJlich von konzentrierter HlV'/oiger Kalilauge bis zur stark alkalischen lleaktion. Als Vorlage bedient mau sich einer ^ oder I.' Schwefelsilure. '; Aus dem Oesamtstickstoff der Milch kann man durch Multiplikati(m mit einem entsprechenden Faktor den Kiweiligehalt der Milch berechnen. =» Da die Milch außer deii Kiweillstoffen noch andere, wenn auch ge- ringe Mengen stickstoffhaltiger Substanzen (Harnstoffdcrivate) u. a., z. I{. Lezithin enthält, einen sogenannten Keststickstoff, so ist die Eiweili- bestiuimung, aus Stickstoff berechnet, nicht ganz genau und giiit etwas zu hohe Werte. Besonders gilt dies für Frauenmilch, für die li'u-tsrhd^) einen Gehalt von 15 — 20Vo Reststickstoff, Caiuntcnr und Söldner*) einen etwas niedrigeren Durchschnittsgehalt gefunden hat. Man kann das Gesamteiweiß der Milch auch direkt liestinimcn. und zwar nach folgenden Methoden: Gesamteiweißbestimmung in der Milch. Nach Ritthauseti.'') 25 g Milch werden in einen 500 cw3.;^Ie|')kolben hineingefüllt und mit 400 ciit^ destilliertem Wasser verdünnt. Dann werden 10 nn^ Ku[tfer- sulfatlösung (FehlingsdiG Lösung I) und ;-J — 4 crn^ einer Normalkalilauge zugesetzt und bis auf die Marke mit Wasser aufgefüllt. .Man schüttelt um und filtriert das ausgefällte Eiweiß durch ein trockenes Filter, dessen Stickstoffgehalt bekannt ist. Das Filtrat muß fast neutnü oder höchstens schwach sauer sein und ein Tropfen davon darf auf Zusatz von Natron- ») Bona, Bestimmung des Stickstoffes uacli Kjcldahl. Bd. 1. 34U dieses Hand- buches. -) Das Kasein enthält löGö^'o Stickstoff, das Mih-lialliumin l.VT?» „ X (Ch-hiilin kann wegen der geringen Menge vernachlässigt werden;. Duraus ergibt sich der Faktor für Gesamteiweiß 6-37. (Hammarsten, Zur Frage, ob das Kasein ein einheitlicher Stoff ist. Zeitschr. f. physiol. Chemie. VII. 2(59. 1S83.) Slohniaun und Laiifjhrin (Kalorinifirischo Untersuchungen über den Wärmewert der Xahrungsl)estanilteile und deren Id-rivate. N. F. Journ. f. prakt. Chemie. 44. 349. 1891) berechneten den Faktor für Gesamteiweiß zu 6-25, und zwar aus dem Stickstoffgehalt des Milcheiweißes, den sie auf kalorimetri- schem Wege berechnet hatten (Iß^/o N). ä) Rictschel, Über den Keststickstoff (i.T FraueniniU-h. .lalirb. f. Kinderheilk. Bd. 64. S. 125. 190r,. ■») Cammrrcr und Söldner, Analyse der Kraui-nnüb-h. Kuluuilcli und Sttitenmilch. Zeitschr. f. Biologie. Bd. 33. S. 535. Die Bestandteil.- .hr Fnini'n- iiiul Knlimibli. Ibid. 36. 278. 1898. s) Rittimmen, Neue Methode zur Analyse der Milch und uiu-r ein vom Milrh- zucker verschiedenes Kohlehydrat in der Kuhmilch. Journ. f. prakt. (. hemio. N. F. 16. 329. 1877. 448 E. F. Edelstein. lauge weder eine Blaufärbung (gelöstes Kupfer) noch eine Trübung (Eiweiß) geben. Man wäscht den Niederschlag einigemal mit kaltem Wasser nach und bestimmt im Niederschlag den Stickstoff nach Kjeldahl. Die Stick- stoffzahl mit 6"37 multipliziert gibt die in 5 cm^ Milch enthaltene Eiweiß- menge an. 1) Nach Liehermann^) (Sebelien).^) Während die Rifthausensche Methode auf der Fällbarkeit der Eiweiß- stoffe durch Kupfersalze bzw. Kupferoxyd beruht, wird bei dieser Methode zur Ausfällung der Eiweißstoffe Gerbsäure benutzt. Man muß die Fällung in einer stark salzhaltigen Lösung vornehmen, weil nur in einer solchen das Eiweiß quantitativ ausfällt. 20 g Milch werden mit 40 cm^ Wasser verdünnt, dazu werden 5 cm^ einer ISVoigen Kochsalzlösung gegeben und so lange mit einer Gerbsäure- lösung (hergestellt durch Mischen von '20g Tannin, 40 cm^ 25Voiger Essig- säure, 400 cm^ absoluter Alkohol und Auffüllen auf 1 l) versetzt, bis kein merkbarer Niederschlag mehr ausfällt (20 — 30 cm^ Gerbsäurelösung). Der Eiweißniederschlag wird filtriert, mit Wasser nachgewaschen und der Stick- stoff nach Kjeldahl bestimmt. Kaseinb e Stimmung. Will man Kasein in der Milch bestimmen, so muß man es als solches ausfällen, den Stickstoff bestimmen und daraus das Kasein durch Multi- plikation mit 6'39 berechnen. Fast sämtliche Kaseinbestimmungsmethoden beruhen auf diesem Prinzip. Methode nach Hoppe-Segler.^) 20 cm» Milch w^erden mit Wasser auf 400 cin^ verdünnt und unter Umrühren so lange mit einer sehr verdünnten Essigsäure versetzt, bis ein flockiger Niederschlag entsteht; nun leitet man eine V2 Stunde lang Kohlen- säure durch und läßt 12 Stunden bis zum Absetzen stehen. Es kommt sehr oft vor, daß die über dem Kaseinniederschlag stehende Flüssigkeit nicht ganz klar ist. Dann muß man diese Prozedur mit einer anderen Portion wiederholen. Ist nach dem Ausfällen und Kohlensäureeinleiten und nach dem 12stündigen Stehenlassen die Flüssigkeit klar, so wird das Ganze ^) Es ist nicht ganz leicht, den Eiweißniederschlag und Filter in den Kjeldahl- kolben zwecks Oxydation hineinzubringen. Die Oxydation dauert ziemlich lange. Oft wird man die an den Wänden sich absetzende Kohle mit etwas Wasser herunterspülen, oft auch erneut Schwefelsäure zugeben müssen. -) Liebermann, Über den Stickstoff- und Eiweißgehalt der Frauenmilch und der Kuhmilch. Ann. Chem. 181. 90. 1876. ^) Sehelien , Studien über die analytische Bestimmungs weise der Eiweißkörper mit besonderer Rücksicht auf die Milch. Zeitschr. f. phys. Chemie. 13. 144. 1889. *) Hoppe-Seijler, Handbuch der physiol. u. pathol.-chem. Analyse. 1909. S. 723. Methodik der Milcliuntersiichiinp. .1 iq auf ein gewon-enos Filter filtriert und eiimial mit Wasser iiarhL" n. (Etwas Kasein ^eht dabei in Lösung-.) Hierauf wird der Nied< : - mit gewöhnlichem, dann mit absolutem Alkohol und Äther ausgeu.iMiitu, bei 1250 (Jas Filter samt Kasein getrocknet, gewogen und im l'latintiegcl voll- kommen verbrannt und die Asche gewogen; die Differenz gibt die Menge des Kaseins an. Statt das Kasein zur Wiigung /u bringen, kann man auch im Niederschlag (nicht entfettet!) N bestimmen und durch .Multiplikation mit 6o7 das Kasein berechnen. Diese Bestimmung kann für alle Milch- arten verwendet werden, nur für die Frauenmilch gibt sie keine richtigen Resultate. Für die Kaseinbestimmung in der letzteren kann man sich mit Vorteil der Methode von Enyel bedienen. Nach dieser gibt man zu hO cm^ Frauenmilch HO — .^5 011^ . Essigsäure hinzu, veidünnt auf i'nO mi^, .schüt- telt gut um und läßt 2 Stunden bei einer Temperatur von U" stehen. Dann wird das Ganze in ein Wasserbad von 40° gebracht, ' 'j Stunde lang er- wärmt und filtriert und vom Niederschlag der Stickstoff bestimmt. Ebenso ist für Kasein der Frauenmilch, wie auch übrigens der Kuhmilch, die Methode von Schmidt^) anwendbar. Sie besteht in einer Modifikation der Hoppe- Seylcrschon Methode, und zwar darin, (UiIj man 20 im^ Milch lOfach mit Wasser verdünnt und mit einer 0'4<'/oigen Essigsäure so lange versetzt, bis ein körnig-flockiger Niederschlag entsteht. Es wird dann unter Erwärmen eine i/.. Stunde lang Kohlensäure eingeleitet und der Kaseinnieder- schlag nach 24 Stunden filtriert. Der Niederschlag samt dem Filter wird wie bei Hoppc-Seyhr getrocknet, gewogen und verasciit. Methode nach Sebelien.-) Sie beruht darauf, daß man das Kasein mit einer gesättigten Mag- nesiumsulfatlösung ausfällt und wird wie folgt ausgeführt. Eine Mischung von 20 — 5 Teilen Wasser verdünnt, werden in ein Wasserbad von genau 40" gebracht und mit 1 cii)^ gesättigter Kalialaunlösum: verset/t. Man rührt ') Siehe bei Dogicl, Einiges über die Eiwoißkörper der P'raiicnmib'b und Kuli- milch. Zeitschr. f. pbysiol. Clieinie. 9. ."iHl. ISS.'): Schmidt, M:iterialien zur 1'' '•■•nip dcc Eisrenschafteii der Frauenmilch und Kuhniilcli. Dissortati.ui. Moskau 1*^^ ' mich Dogicl; siehe auch Handburli von lloj>iH-Sc!/l(r. ]'MM. !>. <2ii. -) Hoppc-Sejihr, II:nulliucii d. pliysiol. u. |tatliol.-clu'ni. .VnalvM' ,. 3) SchlossDiaiiu, Über die EiweiÜstoffe d.-r Mil. li und dir Mrtl.M!, n ,ir. Zeitschr. f. pbysiol. Chemie. 22. 197. 1896-97. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arboitumethodcn. V. 29 450 E.F.Edelstein. um und wartet, bis das abgeschiedene Kasein sich absetzt. Sonst gibt man noch 0'5 cm3 der Lösung tropfenweise hinzu. Man filtriert den Niederschlag, wäscht ihn gut mit Wasser aus und bestimmt in ihm, noch feucht, den Stickstoff nach Kjeldahl. Eines vollkommen anderen Prinzipes bedient sich neuerdings Matthaio- pulos^), und zwar bestimmt er das Kasein durch Titration. Das Prinzip ist wie folgt : Auf Zusatz von verdünnter Säure zur Milch fällt das Kasein aus, das Albumin dagegen bleibt als Säureverbindung gelöst. Wir wissen ferner, daß das Kasein sich dem Phenolphtalein gegenüber wie eine Säure verhält und mit Alkah in Wasser lösliche Salze bildet. Titriert man nun einerseits gegen Phenolphtalein als Indikator das ausgefällte Kasein + Flüssigkeit mit Natronlauge, so wird sowohl das Kasein wie alle anderen sauren Verbindungen neutralisiert, und es wird eine bestimmte Menge Natronlauge verbraucht. Titriert man aber andrerseits nur die vom Kasein abfiltrierte Flüssigkeit, so werden nur die anderen sauer reagierenden Körper neutrahsiert. Die Differenz der beiden Titrationen ergibt die für Kasein verbrauchte Menge Natronlauge. Weili man nun, wieviel Gramm Kasein 1 cm^ Natronlauge entspricht oder kennt man — mit anderen Worten — das Äquivalentgewicht des Kaseins, so kann man daraus das letztere berechnen. Das Äquivalentgewicht des Kaseins wird von Matthaio- pulos aus dem Vergleich seiner Bestimmung und der nach Hoppe-Seyler zu 0"11315 angenommen. 20 cw» Milch verdünnt man mit ^Ocrn^ Wasser und läßt dazu aus einer Bürette so viel — Schwefelsäurelöung unter Umrühren zutropfen, bis das Kasein in großen Flocken ausfällt. Nach kurzer Zeit filtriert man durch ein trockenes Filter. Ist das Filtrat trübe, so gießt man es noch einmal aufs Filter und dies wiederholt man so lange, bis das Filtrat voll- kommen klar ist. Ist auf diese Weise ein klares Filtrat nicht zu erreichen, so ist noch nicht alles Kasein ausgefällt, und man muß noch einige Zehntel Schwefelsäure aus der Bürette zusetzen. Von dem klaren Filtrat werden 100 cw3 mit 1 (')>/ 3 Phenolphtalein versetzt und mit -^Natronlauge bis auf schwach rot titriert. Andrerseits setzt man zu einem Gemisch von 20 cni^ Milch + 80 Wasser genau so viel — Schwefelsäure zu, als man zur ersten Portion zugegeben hat. Nun wird nicht filtriert, sondern die Mischung Kasein + Flüssigkeit direkt nach Zugabe von 1 cni^ Phenolphtalein mit -^ Na OH bis auf schwach rot titriert. Man berechnet die Zahl der verbrauchten Kubik- zentimeter Normallauge bei der filtrierten Portion auf die ganze Menge (also unter Berücksichtigung der zugesetzten Säure) aus der Formel V) Matthaiopulos, Feststellung des Äquivalentgewichtes des Kaseins und eine neue Methode zur Bestimmung desselben. Zeitschr. f. analyt. Chemie. 47. 492. 1908. Methodik der Milcliuiitprsucliiiiig. er berührt, und läßt wieder einige Zeit stehen. Durch den Druck des Wassers von unten werden die kleinen in die obere Fläche des Tonteller< einge- drungenen Kaseinreste wieder heraiisge|irelit; diese werden mit dein Spatel abgeschabt und der anderen Kaseinportion im Kjeldahlkolben zuge-eben Aus der Stickstoffbestimmung berechnet man die Kaseinmenge in 5cm3 Milch. *) Burr und Berberich, Bcstinimuiig des Kaseingclialtcs der .Milch durch Titration nach dem Verfahren von Matthaiojtulos. Ilildeslicimer Molkoreizeitung. 52. 1453. 1'.' ' -) Lehmann, f'her eine neue Motiiode der Kasein- und Fettbestimniung in der Milch. Annal. d. Chemie. 189. 358. 1877. 29' 452 E.F.Edelstein. Albuminbestimmung. Das Filtrat des Kaseinniederschlags (erhalten sowohl bei der Methode von Hoppe- Sei/ler als bei der nach Schmidt oder Engel) wird einige Minuten erhitzt. Das dabei auskoagulierte Albumin (mit Globulin verun- reinigt) wird durch ein gewogenes Filter filtriert, mit kaltem Wasser naeh- gewaschen , bei 125^ getrocknet und gewogen. Milchzucker. Dampft man das Milchserum bis zur Sirupkonsistenz ein, so scheidet sich die Laktose beim Stehenlassen durch reichliche Kristallisation aus. Zur Darstellung verwendet man die süßen Molken. Durch Erhitzen ent- fernt man das koagulierte Eiweiß und dampft das Filtrat bis zum Sirup ein; am besten im Vakuum. Der auskristallisierte Milchzucker wird wieder- holt umkristallisiert und stellt ein reines, weißes Präparat dar. Er redu- ziert ebenso wie Traubenzucker eine alkalische Kupferlösung und dreht die Polarisationsebene nach rechts. Seine spezifische Drehung i) (a)^ beträgt 52"35ö. Im Gegensatz zu Traubenzucker wird er von reiner Hefe nicht in Gärung versetzt. Dagegen geht er durch gewisse Spaltpilze (Schizomyzeten) in Alkoholgärung über. Die Anwesenheit anderer Kohlehydrate in der Milch und dextrin- artiger Substanzen ( Ritthausen ^), Bechamp^) u.a.) ist nach den Unter- suchungen von Scheibe *) zumindest zweifelhaft. Milclizuckerbestiinnuiiig. Gewichtsanalytische Methode nach Soxhlet.^) 25 g Milch werden nach Ritthausen verdünnt, enteiweißt ") und durch ein trockenes Filter filtriert. Je 100 cm^ des neutralen, höchstens schwach- sauren Filtrates werden für die Zuckerbestimmung verwandt. Man stellt sich eine Fehlingsche Lösung durch Mischen von gleichen Teilen Fehling I und Fehling II her. 50 cm^ dieser Lösung werden in einer tiefen Porzellan- schale über einem Drahtnetz bis zum Sieden erhitzt und zu dieser siedend heißen Lösung 100 cw^ der Milchzuckerlösung (Filtrat) aus einer Pipette eingetragen. Man erhält das Ganze 6 Minuten im Kochen, filtriert rasch durch ein vorher schon vorbereitetes und gewogenes AUihnsches Piöhrchen *) Für Cj2 Hjj 0,j . H^ 0; diese spezifische Drehung ist Ivonstant für Lösungen bis 307o bei einer Temperatur von 20". ^) Eitthausen, 1. c. ^) Bechamp referiert in der Chem.-Ztg. 15, 126, 1891 aus der Sitzung der Society chimique de Paris. *) Scheibe, Die Bestimmung des Milchzuckers in der Milch durcli Polarisation und Redulvtion. Zeitschr. f. anal. Chemie. 40. 1. 1901. ^) Soxhlet, Das Verhalten der Zuckerarteu zu alkalischen Kupfer- und (^ueck- silberlösungen. Journ. f. prakt. Chemie. N.F. 21. 227. 1880. ^) Siehe Gesamteiweißbestimmung nach Bitthausen. Methodik der Milchuntersuchuiig. 4:V^ l FlB.ns. und wäscht (luantitativ mit siedend heißem Wasser iiaeh. Der an der Schale haftende rote Kiipferoxyduhiiedersehhi^: wird v .r mit einer Guinmit'ahne und mit Juiülem Wasser ah'reliist. Ist da- i muit vollkommen farblos, so wäscht man je Hmal mit Alkohol und Äther nach und das AlUImschQ Köhrchen ist nunmehr zur I{e(|iiktioti des Kupferoxy- duls zu Kupfer fertig. Das AUihnsc\n^ Kiihrchen (Fif,^ IIK) wird mittelst eines einfach durchbohrten Gummistopfens auf eine Saugflasche aufgesetzt und zur Bestimmung auf fol- gender Weise präpariert : Zunächst kommt eine Schicht ganz reinei-(das- wollc, dann eine kleine Menge in Salpetersäure und Wasser gereinigten Asbests, darauf wieder ganz wenig Glaswolle und endlich eine 1 ^Z., cu/ hohe Schicht As- best. Das Röhrchen wird zunächst unter ganz schwachem Saugen mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser vollkommen klar ist, dann .'imal mit Alkohol und 3nial mit Äther. Darauf wird es im Luftstrom erhitzt und gewogen. Durch dieses so vorbereitete Piohr wird das Kupferoxydul filtriert. Ist der Kupferoxydulnieder- schlag, wie bereits erwähnt, ausgewaschen, so schreitet man zur Reduktion. Das Röhrchen wird im Wasser- stoffstrom nach vollständiger Entfernung der Luft geglüht, bis sämtliches Kupferoxydul in Kupfer ver- wandelt ist, was ungefähr ö Minuten in Anspruch nimmt. Man läßt im Wasserstoffstrom erkalten und wägt. Aus der durch Gewichtszunahme festgestellten Menge Kupfer wird in der nach SoxJilet berechneten Tabelle der entsprechende Gehalt an Milchzucker fest- gestellt. Das Reduktionsvermögen der Laktose dem Kupferoxyd gegenüber in alkalischer Lösung ist von der Konzentration der Milchzuckerlösung abhängig. Man muß sich deshalb genau an die angegebenen Verdünnungen und an die Zeit der Reduktion halten. Die Fchlim/schQ Lösung wird so hergestellt, dal', man einerseits JUIvM» »7 reines Kupfersulfat in einem öOO cm^-Melikolben in Wasser löst und auf 500 auffüllt. Andrerseits löst man unter Erwärmen ITHy weinsaures Kalium- natrium in wenig Wasser, bringt diese Lösung in einen öOOfws.M,.|;|^oIben, gibt 100 cm^ Natronlauge vom spez. Gew. VM zu imd füllt auf .^«k» auf. Beide Lösungen sollen getrennt aufbewahi't und erst vor i\ry Bestimnnmg gleiche Teile dovon gemischt werden. Scheibe^) hat sich einer kleineu Modifikation bedient. Kr i'iiteiweißt die Milch, indem er in einem Meßkolhen von :){)() cm ^ -Ja// .Milch mit 400 t»/* Wasser und ;> — -icni^ normaler Natronlauge versetzt. Dazu — A^be.st ■ 67tLSifnfIfi -Ashfxf H gibt ') Scheibe, 1. c. 454 E. F. Edelstein. Tabelle zur Ermittlung des Milchzuckergehal tes aus dem reduzierten Kupfer nach Soxhlet. Kupfer Milch- zucker mg Kupfer Milch zucker mg Kupfer] Milch- zucker mg Kupfer Milch zucker mg Kupfer] Milch- zucker mg Kupfer] Milch- zucker mg 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 loo 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 101-3 1021 102-8 103-6 104-3 105-1 105-8 106-6 107-3 108-1 108-8 109-6 110-4 111-1 111-9 112-6 113-4 1141 1149 115-7 116-4 117-2 117-9 118-7 119-4 120-2 120-9 121-7 122-4 123-2 123-9 124-7 125-5 126-2 127-0 127-8 128-6 129-3 130-1 130-9 1316 132-4 133-1 133-9 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 134-7 135-4 136-2 136-9 137-7 138-5 139-2 140-0 140-8 1415 1423 1431 143-8 144-6 145-4 146-2 146-9 147-7 148-4 149-2 149-9 150-7 151-4 152-2 152-9 153-7 154-4 1552 155-9 156-7 157-4 158-2 158-9 159-7 160-4 1612 161-9 162-7 163-4 164-2 164-9 165-6 166-4 167-1 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 167-9 168-6 169-4 1701 1709 171-6 172-4 1731 173-9 174-7 175-4 176-2 176-9 1777 178-5 179-3 180-1 180-9 181-6 182-4 183-2 184-0 184-8 185-6 186-3 187-1 187-9 188-7 189-4 190-2 1910 191-8 192-6 193-3 194-1 194-9 195-7 196-4 197-2 198-0 198-8 199-5 200-3 201-1 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 2H 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 201-9 202-7 203-5 204-3 2051 205-9 206-7 207-5 208-3 209-1 209-9 210-7 211-5 212-3 213-1 213-9 214-7 215-5 216-3 217-1 217-9 218-7 219 5 2203 221-2 2220 222-8 223-6 224-4 225-2 225-9 2-26-7 227-5 228-3 2290 229-8 230-6 231-4 2321 232-9 233-7 234-5 235-3 236-0 316 236-8 360 317 237-6 361 318 238-4 362 319 239-1 363 320 239-9 364 321 240-7 365 322 241-5 366 323 2423 367 324 243-0 368 325 243-8 369 326 244-6 370 327 245-4 371 328 2461 372 329 246-9 373 330 247-7 374 331 248-5 375 332 2493 376 333 2501 377 334 2509 378 335 251-7 379 336 252-5 380 337 253-3 381 338 254-2 382 339 2550 383 340 255-8 384 341 256-6 385 342 257-4 386 343 258-2 387 344 259-0 388 345 259-8 389 346 260-7 390 347 261-5 391 348 2623 392 349 263- 1 393 35) 263-9 394 351 264-7 395 352 265-6 396 353 266-4 397 354 267-2 398 355 268-0 399 356 268-8 357 269-6 358 270-4 359 271-3 272-1 272-9 273-8 274-6 275-5 2763 277-2 278-0 278-9 279 7 280-5 281-4 282-3 283-1 284-0 284-8 285-7 286-5 287-4 288-2 289-1 289-9 290-8 291-6 292-5 293 3 2942 2951 295-9 296-8 297-7 298-6 299-4 300-3 301-1 302-0 302-0 303-7 304-6 305-4 er 20 cm^ einer konzentrierten Fluornatriumlösung i), läßt eine halbe Stunde stehen, füllt auf 500 auf, schüttelt um und filtriert. 100 c»^^ dieses Filtrates werden wie oben verarbeitet. ') Zur Entfernung der Kalksalze, die bei der Bestimmung störend wirken. Methodik der Milchuntersuchung. .jr,»-. Statt das Kupferoxydnl zu roduzioren, k;inri man es auch als Kuifer- oxyd Avägen, indem man das AllihnsvUc Kölirchcn unter I.uft ' rif? so lange erhitzt, bis alles rote Kupferoxydul in schwarzes Kiii.i.i...\mi ver- wandelt ist. Aus dem Kupferoxydul berechnet man «li«' .'iif-i"'' »"».i.. Menge Kupfer. Nach der Methode von Vollhard^) kann man die Men^e des redu- zierten Kupferoxyduls auch maßanalytisch ermitteln.-) Das Prinzip beruht darauf, daß das Ku|t(croxydul in Salpetersilure gelöst wird, worauf man das Kupfernitrat in Kupfi-rsidfat überführt und mit Rhodanammonium titriert. Man löst das Kupferoxydul mit einigen 'l'ropfj'u konzentrierter Sal- petersäure, ver.setzt diese Lösung mit 2 on^ konzentrierter Schwefelsaure und dampft auf dem Wasserbade bis zur Trockne ein. Das als Kückstand verbleibende Kupfersulfat wird in Wasser aufgenommen, in einen ;100 <•»«*- Meßkolben quantitativ übergespült und mit einer Natriumkarbonatlösung so lange versetzt, bis ein Niederschlag entsteht. Durch Hinzufügen von 50 cm 3 einer kaltgesättigten schwefligsauren Lösung wird die Flüssigkeit II klar. Es muß mm vorsichtig aufgekocht und so viel Hhodanammonium- lösung hinzugefügt werden, bis die blaugrüne Farbe verschwunden ist. Dann füllt man auf 'dOO ciit^ mit Wasser auf, schüttelt um und tiltiirit diinii ein trockenes Filter. Das überschüssige Rhodanammonium wird mit — Silber- lösung unter Anwendung von Eisenammoniakalaun als Indikator ztirück- titriert. Dazu werden 100 crn^ des klaren Filtrates mit einigi'u Tropfen Salpetersäure angesäuert und unter Zugabe von ö cm» Eisenammoniakalaun so viel Silberlösung hinzugefügt, bis die rote Farbe (Eisenrhodanidi ver- schwunden ist. Rechnet man die an Silbernitrat verbrauchte Menge auf die gesamte Flüssigkeitsmenge CiOO) um und zieht diese Zahl von den hinznirefügten Kubikzentimetern Rhodanlösung al». so weiß man. wie viel Klwidanlösung zur Bildung des Kupferrhodanürs verbraucht wurde. 1 cm» ^ Rhodanlösung entspricht OVOiu, NH,CNS + SO., +2IL()=2Cu(CNS)-h(NIL),SO, 4-2H,S(^. Maßanalytische Methode nach Si>.r/i/it. Sie beruht auf dem l'rinzip. dai; man feststellt, wieviel Kuhik/enti- meter Fehling^i^her Lösung durch eine iM'stimmte Menge Zuckerlosung ver- braucht werden. ') Siehe Gruhc, ZiuUi rhestinimung in Hd. 2 dieses Hiuidhiiolirs •) Als Kontrollhestinmuing zu verwenden. 456 E.F.Edelstein. Zu einer bestimmten Menge Milchzuckerlösmig, z. B. 5 cm^, gibt man so viel Fehlingscher Lösung zu, bis nach einem 20 Minuten langen Erwärmen in einem kochenden Wasserbade die Reduktion gerade be- endet ist. Man kann auch das Verfahren so anwenden, daß man sich die Zucker- lösung in eine Bürette füllt, andrerseits eine bestimmte Menge, z. B. 20 cm^ Fehlingscher Lösung, in eine tiefe Porzellanschale genau abmißt, mit 50 cm^ Wasser verdünnt und zum Sieden erhitzt. Dann läßt man aus der Bürette so lange die Zuckerlösung in die siedende Fehlinf/sche Lösung hineintropfen, bis die blaue Farbe der Flüssigkeit verschwunden ist. Die Erkennung dieses Punktes ist nicht ganz leicht, und um sich zu vergewissern, daß alles Kupferoxyd reduziert ist, filtriert man einen kleinen Teil ab, säuert mit etwas Salzsäure an und überzeugt sich, ob die Flüssig- keit, mit Ammoniak alkalisch gemacht, nicht blau wird. Dieser ersten Orientierungstitration folgen natürlich weitere, bei denen man viel sicherer den Endpunkt feststellen kann. 20 ciii^ dieser Fehlingschen Lösung entsprechen 0"134(/ Milclizucker. Diese maßanalytische Bestimmung ist ziemlich umständlich und liefert nicht so genaue Piesultate wie die gewichtsanalytische. Kefraktometrisclie Bestimmung des Milchzuckers. Auf ähnliche Weise wie für das P\^tt hat sich Wollny auch für die Bestimmung des Milchzuckers der refraktometrischen Methode bedient, und zwar hat er aus der Ablenkung des Lichtstrahles beim Durchgang durch ein Chlorkalziumserum den Gehalt an Laktose berechnet. Als Refraktometer dient auch hier das Zeisssche Milchrefraktometer. Den dem abgelesenen Refraktometergrad entsprechenden Milchzuckergehalt hat Wollny in einer Tabelle zusammengestellt. Man entnimmt mit dem TFo//Mj/schen Milchprobegläschen (Fig.l 14) 5 em^ Milch, versetzt sie mit 5 Tropfen einer 4 "/oigen Chlorkalziumlösung, verschließt das Gläschen mit einem Korkstopfen, bindet es mit einem Bindfaden fest zu und stellt es auf 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad. Nach Ab- kühlen in kaltem Wasser wird das Serum mittelst eines engen Glas- röhrchens derart aufgesaugt, daß man das Glasröhrchen an einem Ende mit einem Wattebäuschchen verschließt, so daß man dadurch das Serum filtrieren kann. Ein Tropfen des Serums wird auf die Prismen des Re- fraktometers aufgetropft und sofort bei 17*5'' abgelesen. Diese Methode ist nur für die Milchzuckerbestimmung in der Kuh- milch anwendbar ; in der Milch anderer Tiere ergeben sich bei ihrer Aus- führung zu große Differenzen. Die Laktose der Frauenmilch kann man mit dieser Methode über- haupt nicht bestimmen. Methodik der Milchuntcrsuohiiiig. 4:>7 Tabelle zur Berechnung des Milchzuckers hei der ref rak tomotrischen Bestimmung. Skalun- Toile 31 2 3 4 5 6 7 8 9 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 60 M.-Z. /o 1-75 1-80 1-85 1-90 i'.ti; 2-Ul 207 212 218 2-23 2-29 2-35 2-40 2-45 2-50 2-55 2-60 2-65 2-70 2-75 2-80 2-85 2-91 2-9G 301 30() 311 31(5 3-21 3-26 Skalen- Teile M.-Z. 6-1 2 3 4 5 6 7 8 9 70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 90 3-31 3-30 3-42 3-47 3-52 3-57 3-62 367 3-72 3-77 3-82 3-87 3-93 3-98 403 4-08 413 418 4-23 4-28 4-33 4-38 4-44 4-49 4-Ö4 4-59 4-64 4-69 4-74 4-79 Skalon- Toilo 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12-0 M. Z. 4-H4 4H9 4-9Ö r)(M) ÖO.') .rlO nlä rv2() 5 2:) r)-3:j rv4o 04:) irbO 550 ÖCO 5'(')5 5-70 5' 75 5 -HO 5 So 5-90 59.') 6(M) 605 6 K» Gl 5 6 20 625 6-30 Ska! •1. 12 1 2 3 4 .'» r> 8 9 13() 1 2 3 4 5 () 7 8 9 14(1 1 2 3 4 5 t; 8 9 l.VO 6:^ G-40 G4G r.M G :.G 6G1 6r,6 G7I 67«) G-81 GHG 6 91 (;-97 7 02 7< 743 74s 753 7r)S 7(;3 7 «IS 773 7 7S 7S4 Die jK)lariin«'triscli<' Milcli/uckt'rlM'sliininiiii::. Dieses Verfahren gründet sich auf der Kiiicnsehat't dt-r Mih'hziicker- lösung, die Polarisationsebene zn drehen. Ans (h'ni spczifi.sclicn Drchuiif^- vermögen des Milchzuckers, dem Drehungswinkel der Lösung und dem spezifischen Gewicht der Lösung kann man den l'rozentgehalt der Milch an Milchzucker ermitteln (Ge\\ichtspr«)zente). Scheibe^) hat folgende Methode ausgearbeitet: 75 cm^ Milch werden mit 7"ö cm» einer 20" „igen ((;ewicht>pntzente) Schwefelsäure und l-r> cni^ einer Quecksilhcrjodidlösung -) verset/t. auf 100 cm3 aufgefüllt und filtriert. Das Filtrat kann man in einem I ^' Fe,()3 ^'•-'••» SO3 ^•^- P.,(), -'••■-'« ci i->-^^ Die durchschnittliche Zusammensetzung der Frauenmilchasche wird ebenfalls von Söldner») wie folgt angegeben: *) Söldner, 1. c. • t o 1 0 nr^'i v ■ 2) Köni(f, Chemie der menschlichen Naliriinjrs- und (iemiümittol. IM. J^ lAki. i ' • 3) Söldner, Die Aschcnbestandtcilo des neiigchorenen Menschen und der Fm». ..- milch. Zeitschr. f. Biolog. 44. 71. 1903. 460 E.F.Edelstein. Prozent KoO . 32-4 Na^O 13-1 CaO 13-9 MgO 1-9 Fe^Og 0-07 P,05 11-40 Sbs 3-3 Cl 21-7 Bestimmung der Alkalien. Man kann den Ascherückstand (aus der Bestimmung der Asche) direkt zur Ermittlung des Gehalts an Kaüum und Natrium benutzen. Man löst die Asche in warmem Wasser unter Hinzufügung einiger Kubikzentimeter verdünnter Salzsäure, erwärmt auf dem Wasserbade, bis die Kohlensäure ausgetrieben ist und dampft ebenfalls auf dem Wasserbade bis zur Trockene ein. Nun nimmt man mit etwas konzentrierter Salzsäure auf, raucht diese bis zur Trockene ab und wiederholt dies zwei- bis drei- mal. Dadurch ist die eventuell in der Asche vorhandene Kieselsäure un- lösHch geworden. Nunmehr wird mit heißem Wasser und etwas Salzsäure der Inhalt der Schale gelöst und vom eventuellen Rückstand abfiltriert. Dieser besteht aus kleinsten Partikelcheu unverbrannter Kohle und gerin- gen Mengen Kieselsäure. Filtriert man nun einerseits durch ein vorher gewogenes (bei 105° getrocknetes) aschefreies Filterchen und wägt den getrockneten Rück- stand 4- Filter, verbrennt aber andrerseits das Filter in einem gewogenen Porzellantiegel und wägt die zurückbleibende Kieselsäure, so erfährt man aus der Differenz die Menge der noch unverbrannten, in der Asche bei- gemengten Kohle. Handelt es sich um eine ganz exakte Aschenbestimmung, so muß man jene unverbrannte Kohlenmenge von der ursprünglichen Aschenmenge ab- ziehen. Das salzsaure Filtrat wird mit etwas Eisenchlorid versetzt, zur Trockene verdampft, der Rückstand mit heißem Wasser und einigen Tropfen HCl aufgenommen, eventuell filtriert und das Filtrat zunächst mit Chlorbaryum bis zum bleibenden Niederschlag (Umwandlung in Chloride) und nachher mit gesättigter Barythydratlösung bis zur stark alkalischen Reaktion versetzt (Magnesiumausfällung). Man filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit kaltem Wasser nach und versetzt das Filtrat mit Ammo- niumkarbonat in stark ammoniakalischer Lösung (Ausfällen von Kalzium und Baryum als Karbonate). Nachdem das Filtrat bis zur Trockene ein- gedampft und durch Abrauchen von Ammonsalzen befreit (Vorsicht!) worden ist, löst man den Rückstand mit Wasser und fällt nochmals mit Ammoniumkarbonat + Ammoniak, Das Filtrat vdrA eingedampft, das Ab- rauchen der Ammonsalze wiederum vorgenommen und der Rückstand in Wasser und wenig Salzsäure gelöst. Methodik der Milclmntersuchuiif,'. j/»i Diese Lösung enthält nur Kalium- und Xatriumchlorid. nampft iii:in die Lösung- in einer gewogeneu l'latinschalc bis zur Trockene ein "' i f kurze Zeit schwach (bis zur Rotglut) und wiigt, so hat man die der Alkalichloride. Aus der wässerigen Lösung dieser Alkalichloride kann man das Kalium mit Platinchlorid als Kaliiimplatinchlorid ausfällen') und auf diese Weise auch das Natriumclilorid indirekt bestimmen. Statt durch trockene Veraschung, wobei sich wegen der Flüchtigkeit der Alkaiicbloride kleine Fehler einschleichen, ist diese Bestimmung auch mittelst der feuchten \ er- aschung ausführbar. Die Neumamtsche Veraschungsflüssigkeit wird vor- sichtig eingedampft, auf einem Finckener Turm die Schwefelsäure abge- raucht, mit Wasser aufgenommen und wie oben weiterbeliandelt. Es sei hier noch darauf hingewiesen, dal» man in der Asche direkt Ca, Mg, K und Xa bestimmen kann. Die salzsaure Asclielüsung wird auf ein bestimmtes \olumen aufgefüllt und in zwei Teile geteilt. In dem einen bestimmt mau Kalium und Natrium, im anderen Magnesium imd Kalzium. «i Bestimmung des Kalziums und Magnesiums. 25 cm^ Milch werden zunächst mit 10—15 cm^ konzentrierter Salpeter- säure im Kjeldahlkoli)en bis auf ein kleines N'olumen eingedampft und dann nach Neumann verascht. Nach der Veraschung und Zersetzung der Nitrosvl- schwefelsäure durch Kochen spült man quantitativ die Flüssigkeit, nach- dem sie kalt geworden, in ein Becherglas über, macht stark ammoniaka- hsch und darauf schwach essigsauer, filtriert von dem eventuell ungelöst bleibenden Eisenphosphat ab und fällt das Kalzium mit Animoniumoxalat aus. Bestimmung als Oxyd. Das Filtrat des Kalziumoxalatniederschlages wird auf Ys Volumen eingeengt, das darin befindliche Magnesium als Magnesiumammoniumphosphat gefällt und als Magnesiumpvropliosphat ge- wogen. Man kann das Kalzium, das in der NctwunuiM-hcu N'eraschungsflüssii:- keit als Kalziumsulfat vorliegt, auch direkt mit Alkohol fällen, durch einen gewogenen Goochtiegel filtrieren und als Kalziumsultat zur Wriirung brin- gen (Methode nach Aron ^). Für die Bestimmung des Kalziums in der Frauenmilch .m)11 man min- destens 100 cm* gebrauchen. ^ ) Bestimmung der Phosphorsiiure 10 cm» Milch werden nach Xciniiann verascht, die liii-ML'keit wird unter der Voraussetzung, daß man nicht mehr als JO nn^ bäuremisrhunp ») Nach bekannten Methoden, Aschenanalyse ,!»•<>«. Bd. 1. 4ln di.M^ HamUHirhc» '') Siehe Näheres Aron, Bd. 1. 400 dieses Ilandbiu-hes. ') II.Aroii, Eine ciiifaclie Methoih» zur Bcstiinniiini.' des Kalziuuib ... .ij^ani'"-'" " Substanzen. Biocheni. Zeits» hr. IV. 2C)S. 19US. ^) Bahrdt und Edelstein, Das Kalkangehot in der Francnmilch. 72 heft. S. 16. 1910. 462 E. F. Edelstein. zur Oxydation verbraucht hat, mit etwa 120 cm^ Wasser verdünnt, mit 50 cm^ einer öO^/oigen Ammoniumnitratlösung versetzt, auf etwa 70" er- hitzt und die Phosphorsäure mit 40 cm^ Ammoniummolybdatlösung gefällt. Zur weiteren Bestimmung wird nach Neumann folgendermaßen ver- fahren : Nachdem man den Niederschlag tüchtig umgeschüttelt und das Ganze 15 Minuten hat stehen lassen, filtriert man durch einen Goochtiegel, wäscht so lange mit eiskaltem Wasser, bis sowohl der Niederschlag, die Wände des Goochtiegels sowie der Kolben, in welchem die Fällung vor- genommen wurde, keine Spur mehr sauer reagieren. Darauf löst man den gelben Niederschlag aus dem Goochtiegel in denselben Kolben mit einer bestimmten Menge — Natronlauge hinein, bis die gelbe Färbung ver- schwunden ist. Nach Zusatz von einigen Kubikzentimetern -^ Natronlauge im Überschuß erhitzt man die farblose Flüssigkeit so lange, bis die Dämpfe nicht mehr alkahsch reagieren (Prüfung mit feuchtem Lackmuspapier), also alles Ammoniak verjagt ist. Es ist zweckmäßig, vor dem Erhitzen 2 — 3 kleine Glaskügelchen in die Flüssigkeit hineinzuwerfen, die das Stoßen der siedenden Flüssigkeit verhindern. Man läßt erkalten und titriert unter Zugabe von Phenolphtalein (Ptot- färbung) mit -^ Schwefelsäure den zum Lösen des Phosphormolybdän- niederschlages nicht verbrauchten Überschuß an Natronlauge bis auf farb- los zurück. Da aber Phenolphtalein der Kohlensäure gegenüber empfindlich ist, so umgeht man die kleinen Fehler der Titration dadurch, daß man einen Überschuß an -^ Schwefelsäure zugibt, durch längeres Sieden (30 Minuten) die Kohlensäure vertreibt und nach dem Erkalten mit — Natronlauge bis auf Rot zurücktitriert. (NH,)3 PO, . 24 Mo O3 . 4 HNO3 -h 56 Na OH = = 2 Na^ HPO4 + 24 Na^ Mo 0, + 4 Na NO3 + 6 NH3 -f- 32 H., 0. 1 cw 3 -^ Natronlauge entspricht P267 m^ Pg Og. 1) Will man nicht das Neumannsche Titrationsverfahren benutzen, so kann man den gelben Phosphormolybdänniederschlag in Ammoniak lösen, daraus die Phosphor- säure als Magnesiumammoniumphosphat ausfällen und als Magnesiumpyro- phosphat zur Wägung bringen. 2) ') 1 Mol. P2O5 entspricht 56 ^-Mol. NaOH oder 56? u-NaOH, 1 l n-NaüH entspricht ^^ g P, O5, 1 cm^ = 2-535 mg P, 0„ 1 cm^ ^ NaOH = 1-267 mg P. 0^. ^) Genaue Vorschrift Aron, Ascheuanalyse. Bd. 1. 420 dieses Handbuches. Methodik der Milchunterhuchiiiig. ^^^■^ Schwefelsäurebestimmung. Die Milch enthält eine ganz gerini^n- Menge Schwofolsauro. dj«« In der Asche enthaltene stammt wahrscheinlich nur aus den EiweiC.körpcrn der Milch. 25 — bO cm^ werden in einer Platinschale abgewogen, oingoclaiupft, mit einer Salpetermischung (3 Gewichtsteile KN(Jj + 1 (iewichtst«-!! Na, CO,) verascht, in Wasser gelöst, einigemal mit 8alzsiUire ahgeraucht und dann Schwefelsäure als Barvumsnlfat bestimmt. Chlor. Zur Chlorbestimniung wird die eingedampfte .Milch (.") \n,„r^\ mit einer Salpetermischung verascht, in Wasser aufgenommen un« Ihmu Ammoniak die Zitronensäure als xVmmoniumsnlfat vollständig ausgefällt. Man läßt einige Stunden stehen und dekantiert durch ein Filter von der darüberstehenden Flüssigkeit ab. Das Ammoniumzitrat wird zur weiteren ') Scheibe, ülicr den rrsiiiiini: diT /itrononsäiirc als Bestandteil der Milcb. Dio Laiulwirtschaftl. Vcrsuchijstatiuiieii. 3'J, 153. IH'.U. ■-) 1 Teil verdünnter Schwefelsäure (D = 116) mit 1 Teil Wasser verdouiit. Abderhalden, Hundbuch der biochemischeu Arbpitsracthoden. V. 30 466 " E.F.Edelstein. Reinigung mit 1 cm^ Schwefelsäure (2"5fach n), 1 cni^ Wasser und 60 cm^ absolutem Alkohol versetzt und wiederum mit 10 cm^ alkoholischem Am- moniak gefällt. Um das Absetzen des zitronensauren xAmmoniums zu beschleunigen, erhitzt man eine halbe Stunde unter Zusatz von 2 — 8 g Ammoniumkarbonat am Piückflullkühler. Man läßt einige Stunden stehen, bis die Flüssigkeit ganz klar ist und der Niederschlag sich kristallinisch abgesetzt hat. Man saugt ihn auf einer Porzellanplatte ab, wäscht mit absolutem Alkohol nach, löst den Niederschlag in Wasser und konzentriert die Lösung auf etwa 20 cmK Diese konzentrierte Lösung des Ammoniumzitrates wird mit 20 — 30 cm^ (Überschuß) Kaliumbichromatlösung und unter Umschütteln mit 20 — 25 cm^ konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Durch 1/4 stündiges Erhitzen auf etwa 80" wird die Zitronensäure in Kohlensäure und Wasser umgewandelt. CßHgOv + :\ KsCroO, + 1 2 H2SO4 = 3 KoSO^ + 3 Cr^lSO^Ja + 16 U.,0 + 6 CO.,. Die Lösung, die eigentlich grün sein müßte (Chromisalz), ist wegen des Überschusses an Kaliumbichrom at etwas braun gefärbt. Man verdünnt mit zirka 50 cm^ Wasser, setzt Ferroammoniumsulfat im Überschuß zu, bis der grünbraune Farbenton in reines Grün übergeht und titriert mit so\iel Bichromatlösung zurück, bis 1 Tropfen der Flüssigkeit mit 1 Tropfen Ferrocyankalium zusammengebracht (Tüpfeln) keine Blaufärbung mehr gibt. Auf 1 Mol. Zitronensäure braucht man 3 Mol. Kaliumbichromat. Die Kaliumbichromatlösung stellt man sich her durch Lösen von 461 g des Salzes zu 1 / (1 crn^ Kahumbichromatlösung entspricht 0-0102 g Zitronen- säure); die Eisenlösung, indem man 150,7 Ferroammoniumsulfat (il/oÄrsches Salz) in 700 cm^ Wasser löst, dazu 100 cm^ konzentrierter Schwefelsäure zusetzt und auf 1 l auffüllt. Nach E. Desmouliere'^) kocht man 200 cm ^ Milch kurze Zeit mit 100 cm^ 2%iger Essigsäure am Rücldlußkühler, filtriert nach dem Erkalten und dampft 150 cni^ des Filtrats auf dem Wasserbade bis zur Sirupkon- sistenz ein. Nach Zusatz von 2 — 3 g gereinigten Kieseigurs dampft man weiter bis zur Trockene ein, setzt nach dem Erkalten 3 cm^ verdünnter Schwefelsäure zu und läßt 2 — 3 Stunden stehen, unter zeitweiligem Um- rühren. Man fügt nochmals 3 g Kieselgur hinzu und extrahiert das Ganze mit kaltem, wassergesättigtem Äther aus, bis man 1000 cm^ Ätherauszug hat. Der Äther wird bei niedriger Temperatur rasch abgedampft, der Rück- stand in Wasser aufgenommen und auf ein bestimmtes Volumen auf- gefüllt In einem bestimmten Teil der Flüssigkeit wird die Gesamtazidität bestimmt und die Phosphorsäure, wenn sie anwesend ist. In einem anderen Teil werden die flüchtigen Säuren bestimmt. Die Differenz soll die Menge an vorhandener Zitronensäure ergeben. *) Desmouliere , Untersuchung über die Bestimmung der Zitronensäure in der Milch. Bull, de Sciences Pharmacol. 17. 588, 1910, zitiert nach Chem. Zentralblatt. 2. 1952. 1910. Mctliodik der .Milchuntersuchuiig. i^•^J Nach (lieser Methode fand Drstnouliere in \C\0 cm^ Kiiliinilch (>-22 o (im Mittel), in 100 r///» Frauemnilch 0()7S 7 Zitroiicnsauiv. iJei AnwrMi ' dieser Methode in der Kranen-, Schaf- oder Ksciinncnmilcli soll ni.ui «in- Menp:e der zuzugehenden Schwefelsiinrc auf 2 rm-^ hcraiisctzcn. Iii.- '/,,- verlässigkeit dieses Verfahrens ist noch nicht nach}.M'i)rnft worden. Aulierdem enthält die Milch noch verschiedene Enzyme oder Fer- mente, und zwar: 1. eiweißspaltende (proteolytische), 2. kohlehydrats])altende (amylolytischei, 3. fettspaltende (Lipasen), 4. Oxydatiüus- und Ueduktionsfernientc (Uxydasen, Katal;i>t'n und Reduktasen). Der Anwesenheit der letzteren sind verschiedene Kcduktions- und Oxydationseigenschaften der Milch gegenüber hestimintcn Ileagenzien zu- zuschreiben. Bei einer Temperatur von über 75" werden diese Fermente zerstört. Diese Eigenschaft ist zur praktischen Milchuntcrsuchunü' heran- gezogen worden, und zwar zum Nachweis einer statlgdiabten Erhitzung der Milch. In einer gekochten Milch kommen nämlich die Kcaktioncn nicht mehr zustande. Das gilt aber bestimmt nur für die Oxydationsn-aktioncn. weil die Reduktasen auch in gekochter Milch wieder erscheinen könnrn. Dagegen sind die Reduktasereaktionen zur UntersuclHing darüber, ob finc rohe Milch noch frisch ist, gut zu verwenden. ScI'ujukddi ') nimmt fol- gende Unterscheidung vor: Oxyd äsen besitzen: 1. die Fähigkeit, Wasserstoffsuperoxyd in Wasserstoff und Sain-rstoff zu spalten (Superoxydase nach Rdudnitz); 2. die Fähigkeit, eine Reihe von Oxydationen zu vermitteln (Oxydase); B. die Fähigkeit, nur bei Gegenwart von Wasserstoffsuperoxyd die Oxydationen auszulösen. Das H2O2 scheint beschleunigend zu wirken (in- direkte Oxydase). Reduktasen besitzen: 1. die Fähigkeit, Schwefelwasserstoff zu reduzieren (HydrogenaM-). 2. die Fähigkeit. Methylenblau zu entfärben : o. die Fähigkeit, eine Mischung von alkoholischer Methylenblaiilösung mit einer wässerigen Lösung von Formaldehyd {Schnrdvigcrs Reagens) zu entfärben (Aldehydkatalase ). Die einzelnen lieaktionen werden folgendermalien ausgeführt J (Kydaseii. Nach Arnold-) wird frische, umiekoclite Milch mit t majaktinktur (hergestellt durch Auflösen von (iiiajakharz in Alkohol 1 verset/t, worauf 1) Selumanu, tJbor den Kinfluß oinificr Aldohyde. hosoiiders dos Formalin». auf dio Oxydationsfcrmciito der Milch und des (ininnii aiabioiiin. /(>itsclir. f. II i. Infokti«>n«»- kranklieitcn, Ud. 50. i)7. VMh und llandlnicii der Milrlikiind»- von >- . !/. A^JJ. VM<^} ^) Arnold, Einige neue Kcaktioncn der Milch. Zeitsclir. f. anal. Chemie. 21. 285. 1 30» 468 E.F.Edelstein. sofort eine Blaufärbung- eintritt. Gekochte Milch zeigt diese Reaktion nicht, ^lan kann statt Guajaktinktur auch einen Auszug von Guajakholz mit Azeton verwenden, i) Nach Storch -) setzt man zu 10 cm^ ungekochter Milch 1 Tropfen 0-2'^U\^%y Wasserstoffsuperoxydlösung und 2 Tropfen 2''/oig'er I'araplienylendiaminlösung zu und schüttelt stark um (Blaufärbung). Wilkinson und Peters ^) bedienen sich zu dieser Reaktion des Benzidins (Di-p-diamidodiphenyl) : Blaufärbung bei Zugabe von 2 cm^ einer 4''/oigen alkohoUschen Benzidinlösung, 2 — 3 Tropfen Essigsäure und 2 cm^ einer S^/oigöw Wasserstoffsuperoxydlösung zu 10 cui^ Milch. Rothenfusser ^) führt diese Reaktionen nicht direkt in der Milch, sondern im Serum aus. Er enteiweißt 100 cm^ Milch mit 6 cm^ Bleiessig (Bleisubazetat), filtriert und versetzt 10 cm^ Serum mit 1 — 2 Tropfen O'o7oigem Wasserstoffsuperoxyd. Als Reagens wendet er entweder einige Tropfen von salzsaurem Paraphenylendiamin an (1 g dieser Verbindung in 15 cm^ Wasser gelöst und mit einer Auflösung von 2 g Guajakol in 135 cm^ 967oig'en Alkohols vermischt) oder 5 — 10 Tropfen einer 20/oigen alkohoUschen Benzidinlösung unter Zusatz von etwas Essigsäure. Im ersten Falle tritt bei einer ungekochten Milch eine violettblaue, im zweiten eine kornblumenblaue Farbe auf. Reduktasen. Nach Schardinger ^) wird eine Mischung von alkoholischer Methylen- blaulösung mit Formalin (5 cm^ gesättigter alkoholischer Methylenblau- lösung gemischt mit 190 cwi^s Wasser und 5 ci>i^ Formalin) von fi'ischer, un- gekochter Milch entfärbt. Nach Barthel «) versetzt man 10 cm^ Milch mit 0'5 cm^ einer alko- holischen Methylenblaulösung, überscliichtet mit einigen Kubikzentimetern flüssigem Paraffin und stellt in ein Wasserbad von 40 — 45°. Tritt eine Entfärbung nach einigen Minuten ein, so ist die Milch stark bakterien- haltig. Tritt sie dagegen nicht innerhalb von 3 Stunden ein , so ist die Milch als gut zu bezeichnen. ^) Arnold wwA Mentzel, Die Guajakprobe in der Praxis. Milchzeitung. 31. 247. 1902. -) K. Storch, Eine Methode zur Unterscheidung von pasteurisierter und nicht pasteurisierter Milch. Milchzeitung. 27. 374. 1898. ^) Wilkinson und Peters, Neue Reaktion zur Unterscheidung von roher und er- hitzter Milch etc. Zeitschr. f. Untersuchung d. Nahrungs- u. Genußmittel. 16. 172. 1908. *) Rothenftisser, Über den Nachweis von Fermenten unter besonderer Berück- sichtigung der Milch. Zeitschr. f. Untersuchung d. Nahrungs- u. Genußmittel. Bd. 16. 63. 1908. ^) Schardinger, tJber das Verhalten der Kuhmilch gegen Methylenblau und seine Verwendung zur Unterscheidung von ungekochter und gekochter Milch. Zeitschr. f. Untersuchung d. Nahrungs- und Genußmittel. Bd. 5. 1113. 1902. ®) Barthel, Verwendbarkeit der Eeduktaseprobe zur Beurteilung der hygienischen Beschaffenheit der Milcli. Zeitschr. f. Untersuchung d. Nahrungs- u. Genußmittel. Bd. 15, 385. 1908. Methodik der .Milcliuntcrsuchung. Der Nachweis mid die llcstinmiuii^r aiidcicr Ücstaiidtcilr dci >i:,.a. die entweder zufiilli',^ oder ahsiciitlidi ( Vcrfiilscliuii^M'in in ihr vurkomiii-i, (Konservierungsmittel wie Borsäure, 8ali/Als;iure, Fonnaldchyd : fei' Mehl, /ucker, Saccharin, Schniutz etc.), gehürf nicht in den Hahnicn di> Darstellung. M Physikalische Methoden. (Zun-leich eine T^ntersuchun;:- der Milch auf ihre \'erwasserung.) Hierzu gehören die Bestininiungen : 1. der (icfricrpunktscriiicdrigung. 2. der elekirischcn Leitfähigkeit, 3. des Brechungsvermügens von Milchscniiii. 1. Gef'rierjMmk h\l'> Zieociiiiiilch 4T-()1 I90G Kuhmilch 47(>7_4«)-7)^ 3. l)as Lichtbivchmii::svcnnös;eM des .Milchsrniiiis. Das Serum normaler Milch scheint für ein- und dicscliie Milcliart ziemhch konstante Brechungswerte zu liefern. Natürlich kommt es auch auf die Art der Gewinnung des Serums an. Nach Lythgoe und JS'urmherg'^ liefern die niedrigsten Werte das Chlorkalziumserum, dann das Serum aus spontan geronnener Milcli : die höchsten Werte das Essigsäureserura. Mai und Bothenfiisscr^) und Georg Wiegner*) halten umfangreiche Studien über die Art der Herstellung des Serums und seiner rntersurhiing angestellt. Das Chlorkalziumserum besteht aus Wasser, Milchzucker, Serum- eiweiß, Mineralien und Zitronensäure. Wiegner hat für diese Bestandfeile die spezifische Kefraktion bestimmt und hat nachgewiesen, dall die spezifische Befraktion des Serums nur vom Aschegehalt, und zwar in kleinem Maße abhängig ist. Die spezifische Befraktion berechnete er aus der n- — 1 1 Formel B = — -—" .-, wo n den Brechunusexponenten und d die Dichte n^ + l d ^ ^ bedeutet. Zur Herstellung des Serums bedient man sich der sehr schnellen und guten Methode nach Ackermann.^) 30 cm^ Milch werden mit 0""i5 cm^ Chlorkalziumlösung vom spezifi- schen Gewicht 1-1375 versetzt und in ein Beagenzglas gefüllt. Man ver- stopft das Beagenzglas mit einem einfach duichbdhrten (ininiMisti»|)fen. Durch die Bohrung führt ein langes enges IJolir. das als llücktltir'ruhr dient. Man setzt das Glas in ein siedendes Wasserltad und läßt !."> .Minuten darin stehen. Dann wird es in kaltes Wasser von ITö" hineingestellt. Das klare Serum wird auf seinen I^rechuntrsindex durch ein Kintaiich- *) Binaghi, Die elL'ktrisclic Loitfaliigkcit der .Milch iiiul ihif .Viiwoiiduug /um Nachweis der Verwässcrung und eines Zusatzes von Elektrolyten. IJioehem. Zeitschr. 29. 60. 1910. *) LijtlKjoe und Xureuhcr;/, Vau Vi'igliifli dvr Methoden zur HarstollunL.' «h-s .Milcli- serums, zitiert nach d. Cliem. Zentrallil. 1. CiUH. l'.KI9. .lourn. of Ind. and Kni.'in. (Mi«>m. I. 38. 19Ü9. ") ^fai und llotlieuf unser . Heitrair»' zur Kenntnis der liichtlirccliuiiL; dc^ i m.ii- kalziumserums der Milch. Zeitschr. f. L nters. v. Nahrungs- u. (ieniiüniitid. iid. Ul. 7. l'.MkH. *) Wiegner (unter Mitwirkung von Yakmva), Über das I3recliiingsvennö(t<'ii und das spez. Gewicht des t'hlorkalziunisennns der .Milch. .Milchwirtsch. Zentralld. V. 473. 1909. ^) Ackermann, Mitteilung üher den rcfraktometrischen Nachwi-is des WaKSer- zusatzcs zur Milch. Zeitschr. f. Untersuch, d. Nahrungs- u. üenuüniittel. 13. 18G. 1907. 472 E.F.Edelstein. refraktometer untersucht. Der Brechungswert der Kuhmilch beträgt im Mittel 1-3502. Es sei noch kurz bemerkt, daß für den Nachweis einer Verwässerung der Milch oft auch die Nitrat reaktion verwendet wird. Die normale Milch enthiilt fast nie salpetersaure Salze. Fällt also die Salpetersäureprobe positiv aus, so rührt das von dem der Milch beigemischten nitrathaltigen Wasser her. Man weist die Salpetersäure nach auf Grund der bekannten Reaktion mit Diphenylamin (Blaufärbung). Nach Moeslinger i) kocht man 100 cm^ Milch mit 1-5 cm^ einer 20Voigen Chlurkalziumlösung und filtriert. Ein halber Kubikzentimeter dieses Filtrates wird tropfenweise zu 2 cm'^ einer schwefelsauren Diphenyl- aminlösung hinzugefügt und einige Minuten stehen gelassen. Die Diphenyl- aminlösung stellt man sich her, indem man 20 g Diphenylamin in 20 cm^ verdünnter Schwefelsäure löst und auf 100 cni^ mit reiner, Ivonzentrierter Schwefelsäure auffüllt. Die Reaktion führt man am besten so aus, daß man die ^lilch in einem Reagenzglas mit der schwefelsauren Diphenylamin- lösung vorsichtig unterschichtet. Nach Beiss und Sommerfeld 2) soll man vor allem darauf achten, daß die Flüssigkeiten sich nicht erwärmen. Der Säuregehalt der Milch. Frische Milch reagiert gegen Lackmus amphoter. Diese Doppelreaktion rührt w^ch. tioxMet^) vom neutralen Alkaliphosphat her, welches alkalisch reagiert, und von dem sauren und sauer reagierenden Alkaliphosphat. Durch Titration kann man den alkalischen und sauren Anteil feststellen. Er fäUt verschieden aus, je nachdem man Phenolphtalein. Lackmoid oder einen anderen Indikator anwendet. Überhaupt haben ..alle Titrationen mit Indikatoren nur einen konventionellen Wert" {Baudnitz^). Die wahre, absolute Reaktion (nach van Dam '") der potentielle Säure- grad) hängt von der Konzentration der Wasserstoff- und Hydroxyl-Ionen ab, und zwar von dem Verhältnis des Gehaltes der Wasserstoff-Ionen zum Gehalt der Hydroxyl-Ionen (Fricdenthal). Foä ß) hat denn auch mittelst der elektrometrischen Bestimmung nach- gewiesen, daß die Reaktion der frischen Kuhmilch fast neutral ist. ^) Egger und Möslinger, Die Diphenylaminreaktion zum Nachweis der Salpeter- säure in der Milch. Bericht über die 7. Versammlung baj-rischer Chemiker in Speyer. Berlin 1889. S. 82. ■-) Sommerfeld, Handbuch der Milchkunde. 296. 1909. ^) Soxhlet, Beiträge zur physiologischen Chemie der Milch. Journ. f. prakt. Che- mie. 6. 19. 1872. *) Raudnitz, Bestandteile, Eigenschaften und Veränderungen der Milch in: Äsher- Spiro, Ergebnisse d. Physiologie. 1903. 303. ^) van Dam, Beitrag zur Kenntnis der Labgeriunuug. Zeitschr. f. physiol. Chemie. m. 295. 1909 und Milchwirtschaftl. Zentralbl. 5. 154. 1909. ") Foa, Die Reaktion der Milch und des Humor aqueus. vermittelst der elektro- metrischen Methode untersucht. Compt. rend. soc. biol. 59. 51. 1905; zitiei't nach Malijs •Jahresbericht d. Tierchemie. 226. 1905. Motliotiik der Milcliuiitcrsuchuii;;. >-•. van Dam luit mittelst der Restiininiin;,'- der olcktroinotorischon Kraft (Konzentrationskette') den potentiellen SiUirc^M-ad (die Wasserstoffkon- zentration) der Milch zu 0-16 — 0*.'52. K)"" ^^etundcn. Der „konventionelle Wert" der Titration ist für t. Auch die Zugabe von Alkohol zur Milch wird als Kriterium dafür benutzt, ob diese schon zersetzt ist oder noch nicht. Diese sogenannte Alkoholprobe wird ausgeführt, indem man Ldeiche Teile Milch und Alkohol (GS vol.-" oig) in «'inem lleagenzglas nnter Um- ') Sielie Friedcnfhal, Bd. 1. 553 der Arbeitsmethoden. =) Soxhht und Henkel, Titrationsapparat znr Bestininunifj des SäiirepolL-iltes der Milch nach neuer Methode, ref. Chcni. /entralM. 2^1'^. 18S7 und Hfnke}, Dir « ■ '•• ,t der Milch, deren Beziehungen zur Gerinnung beim Kochen und mit .\lkohol, u bestimmuugsmethode, der Nerlauf der Säuerung. Milchwirtschaft!. Zentralld. 3. 340. llfUT. ') Thörncr, Zur Milchsäureliestimmung. Chcm. Zeitung. If). I4t'.'.) IS'VJ. *) Siehe Bd. 1 u. 3 dieses Ilandlmches. 474 E. F. Edelstein. schütteln mischt und feststellt, ob innerhalb einer Minute eine Gerinnung- eintritt. Außer der Milchsäuregärung findet in der sich zersetzenden Milch, durch anärobe Bakterien veranlaßt, die sogenannte Buttersäuregärung statt. Dabei entstehen flüchtige Fettsäuren, wie Buttersäure, Propionsäure, Essigsäure. (Übrigens entwickeln auch ]\Iilchsäurebildner gleichzeitig flüchtige Säuren in nicht geringer Menge, i) Um den qualitativen und quantitativen Verlauf der Bildung flüchtiger Säuren zu verfolgen, genügt die Bestimmung des Säuregrades nicht. Man muß zur Destillation greifen, um im Destillate die flüchtigen Säuren isoheren und bestimmen zu können. Die bisher übliche Wasser- dampf-Destillation ist nicht ganz zuverlässig. Denn abgesehen davon, daß auch Milchsäure mit Wasserdämpfen flüchtig ist, ist bei dieser Methode eine Hydrolysierung des Fettes und der Eiweißstoffe der Milch und da- durch ein Zerfall in flüchtige Säuren nicht zu umgehen. Eine von IVelde und vom Verfasser ausgearbeitete Methode^), die auf der Verbindung der Wasserdampf- mit der Vakuumdestillation beruht (Vakuum-Dampfdestillation), gestattet die flüchtigen Fettsäuren ohne Ge- fahr der Eiweiß- und Fettzersetzung und getrennt von der Milchsäure zu bestimmen. Hier wird nur ganz kurz die Methode angegeben; bezüglich der theo- retischen Begründung und praktischen Ausführung sei auf die Original- arbeiten hingewiesen. 100 ci)(^ Milch werden zunächst direkt 1 Stunde lang bei einer Wasserbadtemperatur von 60° destilliert. Dabei gehen die freien ^) flüch- tigen Fettsäuren über. Nach einer Stunde unterbricht man die Destillation, entleert die Vorlage und destilliert weiter. Die Destillate werden getrennt mit einer — NaOH gegen Phenolphtalein titriert. Diese getrennte Titration gestattet eine Kontrolle der Destillation. Das zweite Destillat darf höchstens V3 des ersten an ^ XaOH ver- brauchen. Will man auch die gebundenen flüchtigen Fettsäuren bestimmen, so destiUiert man weitere zwei Stunden (je eine Stunde, etwa 700 cm^ Destillat, wird titriert) unter Zusatz von 7 — 10 cm^ Phosphorsäure (D=l-12). Die Milchsäure bleibt bei dieser Destillation im Rückstand. Ihre ge- naue quantitative Bestimmung ist noch nicht durchgeführt. 1) Weigmann, Mykologie der Milcb. 44. 1911; i/awwars^ew, Lehrb. d. pbysiol. Cbemie. 610. 1911. ^) E.Weide, Eine neue Metbode zur quantitativen Bestimmung flücbtiger Fett- säuren. Biocb. Zeitscbr. 28. 504. 1910. — Bahrdt, Edelstein, Langstein, Weide: Unter- sucbungen über Pathogenese der Verdauungsstörungen im Säuglingsalter. Zeitscbr. f. Kinderheilkunde. 1. 139. 1910. ") Und die aus ihren Salzen durch andere, nicht flüchtige Säuren (z. B. Milch- säure) freigemachten. MetliDiiik der .Mililimitcrsiiclmiig. t-^ Schließlich vereini'^'t man iillc Dostillatc und hcstiiiinit durch Isolioruni,' die Qualität und Quantität (Sill)orsalzo) der Fettsäuren.') Die Destillation von 2i>i) cm^ frischer, roher Kuh milch Qv^Ah: Ol cm3 ^ NaOII ohne l^)., 0-7 nii^ ^'J^ NaOH mit VA\ die Destillation von 250 cm^ frischer Frauenmilch 012 ^cm''' gesättigter Natronlauge (l'oD — stets mit einem kleinen Meßzylinder abzumessen). Zu der Probe von ca. bg Brei setzt man außer Lauge noch etwa 14 cm^ Wasser und zu derjenigen von ca. 10 g Brei entsprechend etwa lOcw/^ Wasser hinzu usw. Über 20^ Brei ist kein Wasser- zusatz mehr nötig. Handelt es sich um die Verseifung des getrockneten Organpulvers, so nimmt man je nach dem Fettgehalt 2 — bg desselben und gibt zweckmäßig 2b cm^ fünffacher Normalnatronlauge ( 20g NaH( ) in 100 nii^) hinzu. Die \'erseifung geschieht nun in der Weise, daß die in einem Becherglas von 150 bis 200 cws Rauminhalt mit Lauge versetzte Substanz auf dem Wasserbade zwei Stunden zer- kocht wird. Zweckmäßig be- deckt man das Becherglas mit einer nach oben zu einer feinen Öffnung zugespitzten Glasglocke (Fig. 119). Die Temperatur steigt im Innern derselben überall auf 100" G. Während der Verseifung wird die Mischung ein paar Mal mit einem Glasstab umgerührt. Schon nach etwa 10 Minuten erfolgt eine gleichmäßige Auflösun": der Sub- Asbestfilter. "j nat. Gr. A = Asbest. ir = entfettete Watte. ') Die zweckniäßipp Meiit^e liochm(»lcUulaicr Fettsäuren, welche für eine Bestim- muug in Wagiuij,' kommt, betrugt gegen {)2~0'd(j. Abderhalden, Handbuch der biochemiechen Arbeitsmethoden. V. 31 482 ^- Kumagawa. stanz bis auf wenige Flocken. Nach etwa zweistündigem Zerkochen wird die Lösung noch warm in einen hermetisch scliließenden Scheide- trichter von ca. 250 cw3 Rauminhalt hineingebracht. Das Becherglas wird 2 — 3mal mit ein wenig warmem Wasser (etwa 5 cm^) ausgespült. Nun wird die Mischung mit 30 cm^ 20^/oigeY Salzsäure (M D) überneutrah- siert. Zu dem Zwecke werden am besten nach dem Erkalten des Trichters bis auf etwa 40 — 50" C zunächst 20cm^ der Säure hineingegossen, dann wird tüchtig geschüttelt und mittelst Leitungswassers gut abgekühlt. Alsdann werden die übrigen 10 cw^ der Säure zugegeben und ganz ebenso weiter behandelt, wie vorher. Es tritt dabei eine reichliche Ausscheidung auf. Nach guter Kühlung werden nun 70 — 100 cm » Äthyläther hinzugegeben und tüchtig geschüttelt. Tennung erfolgt meist sofort. Der Niederschlag verdichtet sich hierbei zu einer dünnen Schicht in der Mitte. Die klare wässerige Schicht wird nach einigen Minuten abgegossen. Der bräunlich ge- färbte Äther wird vorsichtig in ein Becherglas umgegossen. Der Trichter mit Niederschlag wird zweimal mit ein wenig Äther (5 — 10 cui^) aus- gespült. Der Niederschlag wird alsdann mit etwa bcm^ Normalnatron- lauge unter L^m schütteln nochmals aufgelöst. Diese alkalische Lösung wird von neuem mit 30 — ÖOcm^ Äther tüchtig geschüttelt. Hierzu wird jene stark saure wässerige Lösung der ersteren Schüttelung hinzugebracht und nochmals gut geschüttelt. Die Reaktion wird hierbei sauer und die restierende Fettsäure geht hierbei quantitativ in den Äther über. Durch wiederholte Prüfung wurde festgestellt, daß sowohl in dem neu aus- geschiedenen ganz geringen Niederschlage wie auch in dem Schüttelwasser keine Spur Fettsäure mehr zurückbleibt. Der vereinigte Äther wird ver- dunstet, dann nochmals mit absolutem Äther aufgenommen, durch Asbest- filter (Fig. 120) abfiltriert und verdunstet (zum Verdunsten bedient man sich am zweckmäßigsten der Einrichtung Fig. 121). Das so dargestellte Ätherextrakt, das außer Fettsäuren P'arbstoff, Milchsäure und noch unbekannte Beimengungen enthält, wird jetzt einige Stunden bei öO'' C gut getrocknet und erst dann mit Petroläther extrahiert. Zu dem Zwecke gießt man am zweckmäßigsten auf das noch warme Ätherextrakt aus dem Trockenschrank sofort etwa 20—30«^/^ Petroläther unter sanftem Um- schwenken des Becherglases allmählich hinzu. Es tritt hierbei in der Regel eine milchige Trübung auf. Das Becherglas wird jetzt mit einem Uhrglas bedeckt Va — 1 Stunde stehen gelassen , wobei der größte Teil der emulsions- artigen Ausscheidung sich harzartig zu Boden niederschlägt. Hierauf wird der Petroläther in ein vorher abgewogenes Becherglas von ca. 100 cm^ Rauminhalt durch Asbest abfiltriert, das farblose Filtrat verdunstet und bei 50° C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Diese wird nunmehr in kurzer Zeit erreicht. Eine genügende Trocknung des Ätherextraktes vor der Aufnahme desselben in Petroläther ist ganz besonders wichtig, um die Fettsäuren in reiner, farbloser Form zu erhalten. Hierzu ist auch die Vor- sicht unerläßlich, daß sowohl der letzte Äthyläther \^1e der Petroläther absolut rein und trocken sind. Es ist eine bekannte Tatsache, daß hoch- Fottbestimmuiig nach Kumagawa-Suto. 483 molekulare Fettsäuren heim Trocknen l)ei einer hohen Temperatur infolge der Oxydation mehr oder wenif^er eine Gewichtsveränderung zeigen. Wir haben indes durch wiederholte Kxtraversuche festgestellt, daß diese Oewichts- änderung bei öö" (' und bei einer Trockendauer von einiger Stunden fast unmerklich ist, wenn die Fettsäuren rein genug sind. Daher haben wir vom umständlichen \'erfahren der Trocknung in Kohlensäure- respektive Leuchtgasatmosphäre Abstand genommen. \'or jedei' Wägung wurde indes das Becherglas mit Extrakt im evakuierten Exsikkator mit eingelegtem Chlorkalzium erkaltet. FiR. 121. Einrichtung zum Verdiinstpn der leicht siedenden Flüssigkeiten mit Thi»rin()rpgulator und Ventilator. ' u nat. Gr. S/ = Stativ. Tr = Transmission. 1'= Ventilator. 55 = Schiitzscheibe. U'6 =: Wasserbad mit Holzbifttüburzntf. R — Thermoregniator. U'= Wasser. 5 = Drahtsicbmantel. Br = Bunsenbrenner. B = Becher mit Äther, res. Petroläther. Die so dargestellten Petrolätherextrakte enthalten stets etwas Chole- sterin und eine noch unbekannte unverseifbare Substanz in ganz geringer Menge. Es ist deshalb nötig, die beiden letzteren von den Fettsäuren zu trennen. Quantitative Trennung der unverseifbaren Substanzen (Chole- sterin + X) von den Fettsäuren. Dieses \erfahren stellt gleichzeitig eine neue Methode zur ([uanti- tativen Bestimmung des Cholesterins dar, weil die Menge der unbekannten Substanz in den meisten Fällen anscheinend sehr klein ist und dieselbe bei allen bisherigen Methoden der Cholesterinbestimmung stillschweigend auch mitbestimmt worden ist. 31* 484 M. Kumagawa. Das nach der Verseifung gewonnene Petrolätherextrakt wird noch- mals in Petroläther aufgelöst, in einen Scheidetrichter hineingebracht und das Becherglas gut ausgespült, so daß der hierzu verwendete Petroläther N im ganzen etwa 50 — 70 cm» beträgt. Dazu wird — absolut-alkohohsche Kalilauge in einer solchen Menge hinzugegeben, daß diese einem etwa 30- bis 40fachen Volumen des ursprünglichen Petrolätherextraktes entspricht. Die Mischung wird einmal tüchtig geschüttelt. Es entsteht hierbei stets eine absolut klare Auflösung. Hierzu wird ebensoviel Wasser hinzugefügt, wie die zugesetzte Menge Kalilauge , und ein paar Mal geschüttelt. Indem hier- durch die Konzentration des Alkohols auf ungefähr 50«/o sinkt, erfolgt jetzt sofort eine glatte Trennung der oberen Petroläther- und der unteren Alkoholwasserschicht. Dabei bleiben die unverseifbaren Substanzen im Petrol- äther zurück, während die Seife in die untere Alkohohvasserschicht über- geht. Die abgetrennte alkoholische Seifenlösung wird noch einmal mit 30 — 50 cm3 neuen Petroläthers geschüttelt. Der vereinigte Petroläther wird verdunstet und der Rückstand durch die Nachbehandlung von der geringen Menge beigemengter Fettsäuren vollkommen befreit. Zu diesem Zwecke wird das Petrolätherextrakt nochmals in ein wenig absoluten Alkohol auf- gelöst, jetzt mit 0*5 — l'O cni^ — absolut-alkoholischer Natronlauge ver- setzt, wiederum auf dem Wasserbade verdunstet und 15 — oO Minuten bei 100" C getrocknet. Der Pvückstand wird noch heiß mit Petroläther extra- hiert, durch Asbest abfiltriert, verdunstet und nunmehr bei 100" C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das so dargestellte Extrakt stellt ein Gemenge von Cholesterin und noch unbekannter unverseifbarer Substanz dar, deren Trennung zurzeit uns noch nicht gelungen ist. Wie im Eingange angeführt, ist nur ein Teil der von uns darge- stellten Fettsäuren als Triglyzeride vorhanden. Die übrigen sind in ver- schiedenen Formen von Lipoidsubstanzen oder Phosphatiden verteilt. Will man indes die Gesamtmenge hochmolekularer Fettsäuren i) aus praktischen Gründen als Neutralfett angeben, so berechnet man. wie folgt: [Petrolätherextrakt — (Cholesterin 4- X)] x 1-046 = Neutralfett. Wie man sieht, ist die Ausführung der Methode sehr einfach. Man kann gleichzeitig mehrere Bestimmungen in kurzer Zeit ausführen. Unter den tierischen Bestandteilen durch direkte Verseifung mit gutem Erfolg auf ihren Fettsäuregehalt untersucht worden sind: Skelettmuskulatur, Herz- muskel, Leber, Milz, Nieren, Nebennieren, Haut, Haut mit Haaren, Knochen, Magendarmstücke mit Schleimhaut, Lungen, Aszitesflüssigkeit, Pleuraerguß usw. 2) Flüssigkeiten mit sehr geringem Fettgehalte werden zuerst bei alkalischer Pieaktion auf eine passende Menge verdunstet und durch Zusatz *) Die Reinheit der Petrolätherextrakte als hochmolekulare Fettsänreu wurde von uns durch Elementaranalyse festgestellt (siehe Uriginalahhandlung). °) Die Untersuchungen hierüber hat Y. Shimidzu sowie Rinji Watanahe ausge- führt. Die Resultate darüber wird R. Watanahe demnächst berichten. Fettbestimiming nach Kumagawa-Siito. 485 entsprechender Menge Lauge verseift. Von kleinen Tieren, wie Fröschen und Mäusen, lassen sich ganze Tiere in toto be(iueni und glatt verseifen. Für direkte Verseifung weniger gute Kesultate ergaben sich: Gehirn- substanz, alle Bestandteile des l'.lutes, Filzes und alle j)flaiizliclien Mate- eignen rialien mit Zellulose- und 8tiirkegehalt. Diese direkte \'erseifung nicht, weil die bei der rberneutrali- sation des Verseifungsgemisches auftretende Ausschei- dung sich nicht glatt verdichtet und dieselbe auf die Ätherextraktion störend einwirkt. lilutplasma und I)lut- serum lassen sich zwar ganz glatt verarbeiten . aber die Ausbeute der Fettsäuren ist nach Shimidzu^chQY Untersuchung aus unbekannten T^rsachen stets bedeu- tend geringer als der wahre Wert. Alle genannten Substanzen lassen sich viel zweckmäßiger nach der folgenden Modifikation auf ihren Fettgehalt untersuchen. 2. Alkoholextraktion mit nachfolgender Ver- seifung des Alkoholextraktes. Handelt es sich um Flüssigkeiten wie Blut, de- fibriniertes Blut, Blutplasma, Blutserum oder um wasserhaltiges Material, wie Gehirnsubstanz, Fäzes u. dgl., so wird eine passende Menge ^) derselben mit dem 3 — 5fachem Volumen absoluten Alkohols über- gössen und ül)er Nacht stehen gelassen. Dann wird die Mischung abgenutscht und ein paar Mal mit absolutem Alkohol ausgewaschen. Alsdann wird der Rückstand mittelst des von uns angegebenen Heizextraktors '-) (Fig. V2'2) 3—;") Stunden mit absolutem Alkohol ex- trahiert. Die Erhitzung geschieht mit direkter Flamme, indem der Extraktor auf eine Eisenschale mit auf- gelegtem Asbestpapier gestellt wird. Um das Stoßen zu vermeiden, wird die innere Fläche des Zylinder- bodens mit Fluorwasserstoff rauh angeätzt. Nach der vollendeten Extraktion wird der innere Zylinder mit Substanz herausgenommen und das eingeengte Filtrat des zum Abnutschen und Auswaschen benutzten Alko- hols in den äußeren Zylinder hineingebracht. Hierzu werden 7 — d^cm^ gesättigter Natronlauge (1-51))=') gegeben und jetzt auf dem Wasserbade mit sich insofern für die < _y Heißextraktor. • j nat. Gr. ii = R«ckflnßkUhler. A"=: Destillierkolben. EC:^ Kxtraktiongzylinder. S = Siphon. /'= Papierhlilse. ir = Eiitf(>ttete Watte. ('=:; Kiufaoher Zylinder. H= Drahtbakeo. aufgesetztem Kückflulikühler 1) Boi I51iit 10-30 cm\ -) Die gonauore Boschreiliung des Apparates fiiuiet sich in der Kum. — Der fast gleiche Extraktor wurde schon vor uns von Herrn J. V. Berntrop beschrieben. (Zeitschr. f. angew. Chem. 1902. S. 122). Diese Publikation haben wir damals leider nicht gekannt. ') Die Menge der Natronlauge ist absichtlich im Überscluiü gewählt. 486 ^I- Kumagawa. V2 — 1 Stunde verseift. Schließlich wird der Alkohol durch Entfernung des Kühlers verjagt, der Rückstand in wenig Wasser durch Erwärmen auf- gelöst und in den Scheidetrichter hineingebracht. Die weitere Verarbeitung geschieht genau nach der oben beschriebenen Vorschrift bis auf die Chole- sterintrennung. In den mit Alkohol extrahierten Rückständen bleil)en in der Regel Fettsäuren in so geringer Menge, daß sie für die gewöhnliche Analyse ohne nennenswerten Fehler ganz vernachlässigt werden können. Will man sie auch bestimmen, was bei genauer Fettbestimmung zur Kontrolle unerläßlich ist, so verseift man den Rückstand genau nach der Vorschrift der direkten Verseifung. Nur muß man nach der Verseif ung des mit Alkohol extrahierten pflanzlichen Rückstandes die Überneutralisation im Becherglas selber vor- nehmen und das Amylum durch gründliche Zerkochung bei stark saurer Reaktion invertieren. Sonst erfolgt die nachfolgende Ätherextraktion nicht glatt. Wenn man übrigens diese Maßregel nicht versäumt, so kann man pflanzliches Material ohne viel Zellulosegehalt, wie Reis, von Anfang an nach der ersten Methode direkt verseifen. R. Inaha 1) hat Reis, Gerste und Fäzes ebenfalls nach dieser direkten Methode mit Erfolg auf ihren Fett- gehalt untersucht. Handelt es sich um getrocknete Substanz, wie pflanzliche Mehlarten, so bleibt die vorherige Abnutschung mit Alkohol ganz weg. und die Sub- stanz wird nach gründlicher Pulverisation sofort mittelst des Heizextraktors mit absolutem Alkohol extrahiert usw. Bestimmung des Fettes im Harne (bei Chylurie). Das Fett des chylurischen Harnes kann ebenfalls auf zweierlei Art bestimmt werden. Als K. Suto etwa 50 cm^ des normalen Menschenharnes genau nach unserer direkten Verseif ungsmethode verarbeitete, so resultierte stets eine kleine Menge von Petrolätherextrakt , das natürlich keine Fettsäure ist. Durch die Untersuchung von Kanal Yamada sowie von Samuro Kukiuchi hat sich bald herausgestellt, daß das Petrolätherextrakt des normalen Harnes nach der Verseifung nichts anderes ist als die aus der Hippur- säure durch die Verseifung frei gewordene Benzoesäure, der etwas aro- matische Oxysäuren und Phenole beigemengt sind. Um das Fett in dem chylurischen Harne zu bestimmen , maß man demnach aus dem Petrol- ätherextrakt diese Beimengungen ehminieren. Zu dem Zweck hat S. Ka- kiuchi 2) eine modifizierte Methode ausgearbeitet. Kakiuchi stellte zu- nächst fest, daß der Gehalt des normalen Harnes an hochmolekularen Fettsäuren in Übereinstimmung mit S. Hijhhinette ^) in 10 l im Mittel *) R. Inaha, Über die Fettbestimmungeu der Fäzes und einiger Nahrungsmittel nach der neuen Methode von Kumagawa-Sufo. Biochem. Zeitschr. 8. 348 (1908). ^) Hierüber wird .S'. jS'aÄ;wc/w 'demnächst berichten. ") S. Hybhinette, Über die Gegenwart von nichtflüchtigen fetten Säuren im nor- malen Menschenharne. Skand. Arch. VII. 380. 1897. FettbestimniuDg nach Kuraagawa-Suto. 487 0'024 fi beträgt und somit dieser Wert für die gewöhnliche Analyse ganz vernachliissigt werden darf. Nach Kukiuvhi werden ca. 50 cm^ chyluri- schen Harns durch Zusatz von 14 rw^ gesättigter Natronlauge (l-oD)!) verseift und weiter nach unserer Vorschrift verarbeitet. Alsdann wird das Petrolätherextrakt in einen Porzellantiegel oder in eine Platinschale von bekanntem Gewicht hineingebracht und im nebeuverzeichneten Evakuations- apparat (Fig. 128) auf dem Wasserbade o Stunden durch die Wasserstrahl- pumpe abgesaugt. Hierdurch entweichen Benzoesäure nebst Oxysäuren und Phenolen vollständig. Nun wird der PehiUter herausgenommen und nach dem Erkalten im Chlorkalziumexsikkator zurückgewogen. Dali sich die Benzoesäure hierbei vollständig verflüchtigt, wurde durch Extraversuche mit einem Gemenge von reiner Fettsäure und Benzoesäure festgestellt. Fig. 123. Vakuumverclainiifnngsa]iiiarat nacli Kakiuclii. 'j iiat. (ir. Nach einer zweiten Methode kann man den Fettgehalt des chyluri- schen Harns auf folgende Weise liestimmen. Der chylurische Harn enthält bekanntlich stets mehr oder weniger Kiwcili aufgelöst. Wird dieses unter Zusatz von Kochsalz und Essigsäure durch Aufkochen zur Koagulation ge- bracht, so reißt der Eiweii'iniederschlag ([uantitativ Fett mit. Dieser Nieder- schlag wird durch fettfreies Papier abfiltriert. Der Filter mit samt Nieder- schlag wird mittelst unseres Heizextraktors mit absolutem Alkohol extra- hiert und alsdann das Extrakt nach unserer Vorschrift verseift usw. Kalduchi hat bei einem chylurischen Harne die beiden Methoden vergleichend durchprobiert und dabei fast vollständig übereinstimmende Ke- ') Zur Verseifuiig dos llanis winl die >'iitroulaugc wegen des liarustoffgelialtes etwa in doppelter Menge versetzt wie sonst. 488 M. Kumagawa. Fettbestimmung nach Kumagawa-Suto. sultate erhalten. Im Besitze des Vakuum Verdampfungsapparates führt die erstere Methode viel schneller und zweckmäßiger zum Ziele. Fettverlust beim Trocknen wasserhaltigen Materials. Me bisherigen Fettbestimmungsmethoden konnten nicht anders als an getrockneten Pulvermassen angewendet werden. Man wußte deshalb nicht, ob der Fettgehalt des frischen Materials nach dem Trocknen und Pulveri- sieren auch unverändert bleibt. Da unsere Verseifungsmethode sich ebenso gut am frischen Material wie am getrockneten Pulver anwenden läßt, so hat Y. Shimidzu ^) diese Frage besonders untersucht. Shimidzu hat dabei gefunden, daß der Fettverlust, wenn das Material in kleiner Menge (gegen 100 g) schnell getrocknet wird, nur einige Prozente beträgt, daß derselbe dagegen ca. lOVo beträgt, wenn das Material in größerer Menge (gegen 400 g) verarbeitet wird und zum vollständigen Austrocknen desselben län- gere Zeit in Anspruch genommen wird. Da dieser Befund für Stoffwechsel- fragen und dergleichen große Tragweite besitzt und ferner Shimidzu ge- rade für große Fleischmassen nur wenig Trockenversuche ausgeführt hat, so hat Munemichi Tamura auf meine Veranlassung den Versuch auf etwas breiterer Basis von neuem in Angriff genommen. Obwohl diese Unter- suchungen noch nicht abgeschlossen sind, und es daher verfrüht wäre, schon jetzt ein Urteil darüber zu äußern, so sei doch bemerkt, daß der Fettver- lust beim Trocknen des frischen Materials nicht so bedeutend ist, wie ihn Shimidzu seinerzeit gefunden hat. M. Tamura wird nach dem Abschluß seiner Untersuchungen hierüber berichten. ') Y. Shimidzu, Ein Beitrag zur Kumagawa-SutoBchen Fettbestimmungsmethode. Biochem. Zeitschr. 28. 237 (1910). Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. Von P. A. Leveiie, New-York. Die Arbeitsmethoden bei der partiellen Hydrolyse haben sich nicht gleichmäßig auf alle Nukleinsänren ausgedehnt. Es ist deswegen zweck- mäßiger, die Methoden, wie sie sich am bequemsten für jede einzelne Nukleinsäure oder deren Bestandteile anwenden lassen, anzugeben. Die Substanzen, welche seit dem Erscheinen des zweiten Bandes dieses Handbuches entdeckt wurden, sind die folgenden : 1. Phos{)ho-d-ril)on- säure (diese wird bei der Inosinsäure besprochen) ; 2. Zytidin ; 8. Uridin ; 3. Zytidin und Uridinphosphorsäure. (Die vier letzten Substanzen werden bei der Hefenukleinsäure besprochen.) Außerdem ist die Tritikonukleinsäure untersucht worden. Inosinsäure ^): /OH d-Ribosephosphorsäure:0=P — 0 — CH.,— (CH0H)3C0H. \)n Die Methode zur Darstellung dieser Substanz hat sich verbessern lassen. Man kann nun das Baryumsalz ohne Schwierigkeiten in kristal- linischer Form erhalten. Das \erfahren ist das folgende : 20*0 g inosinsaures Baryum werden mit 500 cm^ P/oiger Salz- säure gekocht. Nach dem Abkühlen wird Schwefelsäure bis auf 2% zugegeben. Dann werden das Hypoxanthin und die Salzsäure mittelst Silber- sulfat entfernt. Das überschüssige Silber fällt man mit Schwefelwasser- stoff und die Schwefelsäure durch Neutralisieren mittelst Baryum- karbonat. Es ist wichtig, das Baryumkarbonat frisch aus chemisch reinem Baryumhydrat zu bereiten. Das Filtrat enthält weder Stickstoff noch freie Phosphorsäure. Es wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt, wobei ein basisches Baryumsalz der gepaarten Phosphorsäure neben wenig Baryumkar- bonat sich abscheidet. Das Ganze wird mittelst Essigsäure in Lösung gebracht und filtriert. Aus dieser Lösung wird das Baryumsalz mittelst absolutem *) P. Ä. Lerene n. W. A. Jacobs, Über die Inosinsäure. Ber. d. Deutsch. Cliem. Ges. Jahrg. 44. S. 746 (1911). 490 P. A. Levene: Alkohol als amorpher Niederschlag gefällt. Nach Abfiltrieren und Waschen mit Alkohol und Äther wird es getrocknet. Die Ausbeute beträgt OO^/o der Theorie. Um es kristallinisch zu erhalten, wird das Produkt fein gepulvert und mit 30 cm^ Wasser versetzt. Beim Umrühren geht die klebrig ge- wordene Masse ziemlich rasch in Lösung. Aus dieser Lösung läßt sich das kristallinische Baryumsalz erhalten. Die Kristallisation wird beschleunigt durch Einimpfen und durch tüchtiges Reiben. Beim Stehen im Eisschrank bildet die Substanz am Boden des Gefäßes eine dicke Kristallschicht, die aus prachtvollen Aggregaten von sechseckigen Platten besteht. Die Mutter- lauge enthält beträchtUche Mengen des Salzes. Wegen der leichten Bildung von basischem Salz ist es jedoch nicht empfehlenswert, die Mutterlauge zu konzentrieren. Zwecks Erhaltung des kristallinischen Salzes wiederholt man die Fällung mittelst Alkohol und verfährt weiter, wie bei der ersten KristaUisation. .OH Phospho-d-ribonsäure: 0 = P — 0— CH, (CH0H)3 COOK läßt sich aus der d-Ribosephosphorsäure durch Oxydation mittelst Brom oder mittelst Salpetersäure erhalten. Salpetersäureverfahren: bO'O g inosinsaures Baryum werden zur Gewinnung der Ribosephosphorsäure hydrolysiert und das Ba-Salz der Substanz dargestellt. Dieses wird in Wasser gelöst und das Baryum quantitativ mittelst Schwefelsäure entfernt. Das Filtrat wird unter ver- mindertem Druck zum Sirup verdampft. Dieser wird in 30 cm^ Sal- petersäure (sp. Gew. 1-2) gelöst und bei 40" C 24 Stunden stehen ge- lassen. Die Lösung wird dann in vier Teilen separat behandelt. Jeder Teil wird auf einem großen Uhrglas auf dem Wasserbade möglichst rasch unter stetem Lim rühren zur Trockene verdampft. Auf diese Weise wird ver- hältnismäßig wenig Phosphorsäure abgespalten. Das Produkt wird dann in 2 Liter Wasser gelöst, mit ein paar Tropfen Phenolphtalein versetzt und sodann Kalkmilch bis zur neutralen Reaktion zugegeben. Die voluminöse Fällung von Kalziumphosphat wird abfiltriert und das Filtrat gekocht. Es bildet sich dabei ein Niederschlag. Die Mutterlauge wird auf 500 cm^ konzentriert und weiter gekocht. Diese Behandlung wird mehrere Male wiederholt. Im Kalziumphosphatniederschlag werden beträchtUche Mengen der gesuchten Substanz mitgerissen. Um diese zurückzugewinnen wird das Kalziumphosphat in Wasser aufgeschwemmt und unter beständigem Turbi- nieren mit Essigsäure versetzt, bis der Niederschlag vollständig gelöst ist. Aus dieser Lösung wird die Phosphorsäure wieder mit Kalkmilch gefällt. Aus den vereinigten Mutterlaugen, die neben der Phosphorver- bindung viel essigsaures Kalzium enthalten, wird die erstere nach dem Kon- zentrieren mittelst Bleiessig gefällt. Der Bleiniederschlag wird in Wasser aufgeschwemmt und mittelst Schwefelwasserstoffes zerlegt. Das Filtrat wird nach Abdunsten des Schwefelwasserstoffes, wie oben, mit Kalkwasser neu- tralisiert und aufgekocht und das Kalziumsalz, wie oben, gewonnen. Die Ausbeute beträgt 14 ^ oder öO^/o der Theorie. Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. 49 j^ Das Brom verfahren. T'O g ribosephosphorsaures Raryum werden in Wasser aufgeschwomnit und das IJaryum quantitativ mittelst Schwefel- säure entfernt. Die Lüsuui;- wird dann auf 25 on^ gebracht und dann mit 5 g essigsaurem Kalzium und o g Drom versetzt. Die Mischung wird geschüttelt, bis das Brom vollständig gelöst ist, und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 24 .Stunden ist das Brom fast verschwunden, und da die Lösung noch stark die Orzinprobe zeigt, werden noch 5 g essigsaures Kalzium und ;3 g Brom zugesetzt. Nach zwei Tagen ist die Orzinprobe nur noch ganz schwach. Die Lösung wird erwärmt und das Brom mittelst Kohlensäure vertrieben. Sie wird mit Wasser verdünnt, mit Schwefelsäure auf Küiigopapier angesäuert und dann mittelst Sill)ersulfat vom Brom be- freit. Das Filtrat wird mittelst Schwefelwasserstoff vom Silber und dann von der Schwefelsäure ([uantitativ mittelst Baryt befreit. Das Filtrat wird auf ein kleines Volumen eingeengt. Die Lösung wird mit dem gleichen Volumen Alkohol versetzt. Der Niederschlag, der wegen Verunreinigung mit essig- saurem Kalzium von etwas gelatinöser Beschaffenheit ist, wird abgesaugt und mit Alkohol und Äther nachgewaschen. Die weitere Reinigung der Substanz wird mittelst Bleiacetat wie bei dem oben angegebenen Verfahren ausgeführt. SpaltungderPhospho-d-ribonsäure. 4"0^ Kalziumsalz werden in wenig Wasser und einem kleinen Überschuß von Schwefelsäure gelöst und das Kalziumsulfat mittelst vier ^ olumen Alkohol gefällt. Es wird abgesaugt, das Filtrat mit Ammoniak neutralisiert und eingedampft und der Rückstand in 50 cm^ Wasser aufgenommen. Es wird dann 4 crn^ 25Voiges Ammoniak zugegeben und dann Eisessig, bis die Lösung auf Lackmus amphoter reagiert. Die Lösung wird im Einschlubrohr drei Stunden auf KiO" erhitzt. Beim Steigen der Temperatur über diesen Grad ist man der (xefahr der Bildung von Brenzschleimsäure ausgesetzt. Die Lösung wird mit Wasser verdünnt und genau mittelst Bleiessig gefällt. Das Filtrat wird sorgfältig mittelst Bleiessig und Baryt gefällt und der Niederschlag abfiltriert. Dieser wird mittelst verdünnter Schwefelsäure zer- legt und die überschüssige Schwefelsäure mittelst Bleikarbonat al)gestumpft. Das Filtrat wird mit Schwefelwasserstoff behandelt und das Filtrat eine Stunde mit Kadmiumkarbonat gekocht. Nach dem Filtrieren wird die Lösung auf dem Wasseri)a(le zum Sirup eingedampft. Der Sirup wird mit ein wenig ribonsaurem Kadmium geimpft und der Kristallisation über- lassen. Nach 24 Stunden erstarrt das Ganze. Es wird nun mit wenig Wasser verrührt und auf eine Nutsche gebracht. Die Ausbeute beträgt etwa 0*H g. Zur Analyse wird die Substanz aus ganz wenig Wasser umkristallisiert. Guanylsäure.M In der Kenntnis dieser Säure ist kein wesentlicher Fortschritt ge- macht worden. Dagegen ist es gelungen, das Guanosin in freiem Zustande M P. A. Lerene und W. A. Jacohn , Über das Vorkommen des freien Gnanosius in der Pankreasdrüse. Biochem. Zeitschr. Bd. 28. S. 127 (lUlü). 492 P. A. Levene: aus der Pankreasdrüse zu gewinnen. Das Verfahren war das folgende : Die Rohguanylsäure, welche direkt aus der Pankreasdrüse nach dem früher angegebenen Verfahren dargestellt ist, wird mittelst eines Überschusses von Ammoniak in heißem Wasser gelöst und auf einer Nutsche heiß in Alkohol filtriert. Es bildet sich dabei ein Niederschlag des Ammoniumsalzes der Guanylsäure; das Filtrat enthält das Guanosin. Wird das Filtrat bei vermindertem Druck eingedampft, so scheidet sich das Guanosin in langen prismatischen Nadeln ab. Zur Analyse braucht die Substanz nur einmal aus verdünntem (etwa 60Voigem) Alkohol umkristallisiert zu werden. Hef enukleinsäure. i) Die Bedingungen zur partiellen Hydrolyse dieser Säure haben sich mehrfach verbessern lassen. An dieser Stelle soll nur die Form angegeben werden, in welcher sie zuletzt ausgeführt wurde. Die Einzelheiten des Ver- fahrens sind nicht veröffentlicht und haben sich allmählich in den Arbeiten von Levene, Jacobs und La Forge ent^^^ckelt. Partielle Hydrolyse. Diese wird am besten mittelst verdünntem Ammoniak ausgeführt. 100 r/ Nukleinsäure werden in einer Lösung, von 80"0 cm» Ammoniakwasser (sp. Gew. 0-90) und 420'0 cm^ Wasser aufgelöst und drei und eine halbe Stunden im Autoklaven erhitzt. Die Temperatur dieses Ölbades muß genau auf 170— 175" C gehalten werden. Kleinere Quantitäten können im Einschmelzrohr hydrolysiert werden. Die Lösung wird in denselben Verhältnissen bereitet, jedoch das Rohr braucht nur auf 135" C erhitzt zu werden. Trennung der einzelnen Fraktionen. Das Reaktionsprodukt läßt sich in drei Fraktionen teilen : die erste enthält das Rohguanosin ; die zweite das Rohadenosin ; die dritte das Zytidin und die Uridinfraktion. Guanosinfraktion. Das Rohprodukt scheidet sich aus dem Produkte der Hydrolyse als gelatinöse Masse beim Abkühlen aus. Das Verfahren zur Gewinnnung des reinen Guanosins hat sich nicht verändert. Da aber einige Forscher bei der Darstellung der Substanz Mißerfolg gehabt haben, so sollen die Einzelheiten des Verfahrens mit größerer Genauigkeit wieder angegeben werden. Es muß erwähnt werden, daß Guanosin sich nur dann in schönen Kristallen ausscheidet, wenn es von Ver- unreinigungen frei ist. Um mit Leichtigkeit Kristalle zu erhalten, müssen die folgenden Punkte beachtet werden. Das Rohguanin wird in heißem Wasser gelöst und heiß mit Blei- essig gefällt, so lange ein Niederschlag entsteht. Die Mischung wird heiß filtriert und das Filtrat abwechselnd mit Ammoniak und Bleiessig versetzt. Es bildet sich dabei ein Niederschlag. Dieser wird abfiltriert, in heißem Wasser suspendiert, mittelst Essigsäure in Lösung gebracht und mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Das Gemisch wird wieder aufgekocht, heiß fil- triert und das Filtrat nur mäßig eingedampft. Das Guanin scheidet sich in *) P. A. Levene und W. A. Jacobs, tJber die Hefe-Nukleinsäure. Ber. d. Deutsch, ehem. Ges. Jahrg. 43. S. 3150 (1910). Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. 493 langen, tyrosinähnlichen Kristallen aus. Bei weiterem Eindampfen der Mutter- lauge erhält man wieder die gelatinierende Sub.stanz. Zur weiteren Reini- gung wird die Substanz in heiltem Wasser suspendiert und soviel Ammoniak- wasser allmählich zugesetzt, bis das Guanosin sich löst. Die Lösung wird dann filtriert, beim Abkühlen scheidet sich das riuanosin in glänzendi-n Massen. Vernin^), C10H13N5O5. Bei dieser Gelegenheit soll auch das Ver- fahren zur Darstellung des Vernins angegeben werden. E. Schulze hat neulich bewiesen, daß das von ihm vor Jahren entdeckte Vernin mit dem Guanosin identisch ist. Man muß also im Vernin das zuerst aufgefundene freie Nukleosid anerkennen. Wässerige Extrakte aus den auf Vernin zu untersuchenden Objekten werden, nachdem sie zuvor von den durch Bleiessig fällbaren Substanzi-n befreit worden sind, mit einer ^lerkurinitratlüsung versetzt. Die durch dieses Reagens hervorgebrachten Niederschläge werden abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen, zwischen Fließpapier abgepreßt, dann mittelst Schwefelwasserstoff zersetzt. Die Filtrate vom Schwefelquecksilber werden, nachdem sie neutralisiert worden sind, auf ein geringes Volumen einge- engt; es wird Sorge dafür getragen, daß während des Eindunstens die Reaktion der Lösungen neutral bleibt. Aus den stark eingeengten Flüssig- keiten scheidet sich nach dem Erkalten das Vernin aus. und zwar in vielen Fällen anfangs als Gallerte ; letztere lieferte dann nach dem Wiederauflösen in Wasser Kristalle. Der Merkurinitratniederschlag kann neben \'ernin noch manche andere Substanzen enthalten, z. B. Asparagin, Glutamin, Arginin und Tyrosin. Wegen seiner Schwerlöslichkeit in Wasser läßt sich das Vernin leicht vom Asparagin, Glutamin und Arginin trennen. Alier auch seine Trennung von dem Tyrosin, das sich speziell in den bei Ver- arbeitung von Kürbiskeimpflanzen erhaltenen ^lerkurinitratniederschlägen in kleiner Menge vorfindet, bietet keine Schwierigkeit, denn das Vernin scheidet sich aus den bei Zerlegung jener Niederschläge erhaltenen Lösungen meistens vor dem Tyrosin aus. Gesetzt aber, daß anfangs das Vernin durch etwas Tyrosin verunreinigt ist, so kann man es davon be- freien, indem man es in heißem Wasser löst und die beim Erkalten sich ausscheidenden Kristalle nach kurzer Zeit abfiltriert und zwischen Filtrier- papier abpreßt ; das Tyrosin geht dann in die Mutterlauge über. Das in solcher Weise aus Kürbiskeimlingen dargestellte Vernin erweist sich nach mehrmaligem Umkristallisieren aus Wasser als ganz frei von Tyrosin, wie aus seinem Verhalten gegen das Millo)ische Reagens zu erkennen ist. Xanthosin: CioHioOeN^ ^vird aus Guanosin bei der Behandlung mittelst salpetriger Säure erhalten. Es kristallisiert mit Kristallwasser und hat dann die Zusammensetzung Cjo H,2 0« N4 + IL ( ). Das Drehungsver- mögen ist (y.) ^^ = 51"21'' in ca. SVoi-^'^i' alkalischer Lösung. Es besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt. Es wird nach folgendem Verfahren liargestellt. ') E. Schulze, Ein Beitrag zur Kenntnis des Vernins. Hoppc-Sei/Iers Zeitschr. f. Physiol. Chem. Bd. 66. S. 128 (lUlO). 494 P. A. Levene 16 g Guanosin werden mit einer Lösung von 25 y Na NO2 in 75 cm^ Wasser aufgekocht. Das Guanosin scheidet sich beim Abkühlen wieder als eine Gallerte aus, die mit einem Glasstab zerteilt wird. Es werden nun 25 cm^ Eisessig zugegeben. Nun wird tüchtig durchgeschüttelt, bis alles Guanosin in Lösung gegangen ist und die heftige Stickstoffentwicklung aufgehört hat, was nach etwa 5 Minuten der Fall ist. Die Lösung wird nun mit dem gleichen Volumen Wasser versetzt und abgekühlt. Beim Reiben fängt alsbald die Kristallisation des Xanthosins an, das sich als gelbes, kristalli- nisches Pulver rasch am Boden des Gefäßes absetzt. Nach 24 Stunden wird es abfiltriert. Die Ausbeute beträgt 6 g. Durch Umkristallieren unter Anwendung von Tierkohle kann man es nicht von den gelben Beimengungen befreien. Zu diesem Zwecke wird es in heißem Wasser gelöst, noch heiß mit ein paar Tropfen Bleizucker versetzt und mit Schwefelwasserstoff be- handelt. Nach dem Aufkochen wird das Schwefelblei abfiltriert und beim Erkalten scheidet sich dann das Xanthosin in farblosen, glänzenden, öfters zentimeterlangen Prismen ab. Es ist das schönste der Nukleoside. In kaltem Wasser ist es nur wenig löslich, leicht aber beim Erhitzen. In heißem, verdünntem Alkohol ist es auch löslich und kristallisiert beim Abkühlen bei längerem Stehen langsam in harten Warzen ohne Kristallwasser. Adenosinf raktion. Das Filtrat vom Guanosin enthält außer dem Adenosin, Zytidin und Uridin noch phosphorhaltige Substanzen. Um diese zu entfernen, wird das Filtrat bei vermindertem Druck eingedampft, mit Ammoniakwasser deutlich alkalisch gemacht und mit 95%igem Alkohol so lange versetzt, als sich ein Niederschlag bildet. Der Niederschlag besteht aus den phosphorhaltigen Substanzen. Das Filtrat enthält das Adenosin, Zytidin und Uridin. Das Adenosin wird als Pikrat isoliert. Zu diesem Zwecke wird die alkoholische Lösung bis zur Sirupkonsistenz eingedampft, mit Schwefelsäure bis zur sauren Reaktion auf Lackmus versetzt und dann so lange mit Pikrinsäure behandelt, als sich ein Niederschlag bildet. Das freie Adenosin wird nach dem früher ange- gebenen Verfahren dargestellt. Inosin aus Adenosin. Die Überführung des Adenosins in Inosin läßt sich auf folgende Weise bewerkstelligen. 5"0 g Adenosin werden in einer Lösung von 20 g NaNO.^ in 60 cm^ Wasser heiß gelöst und die Lösung mit 20 cm^ Eisessig versetzt. Es be- ginnt sofort eine lebhafte Stickstoffentwicklung. Nach einigen Stunden wird die Mischung in Eis gestellt und mit verdünnter Schwefelsäure so lange versetzt, bis sie auf Kongopapier schwach sauer reagiert. Die Lösung wird dann mit mehreren Volumen absoluten iVlkohols versetzt und nach einigem Stehen in einer Kältomischung abgesaugt. Das Filtrat wird mit einigen Tropfen Ammoniak neutraUsiert und zum Sirup eingedampft. Der Rückstand wird nochmals mit wenig Alkohol versetzt und wieder einge- dampft. Er wird dann mit Essigsäureanhydrid übergössen und einige Minuten gekocht. Der Überschuß von Anhydrid wird abdestilliert und der Rückstand mit Chloroform ausgekocht. Nach 24stündigem Stehen im Eis- Partielle Hydrolyse der Nukleinsäuren. 495 schrank \virtl von anorganischen Salzen abl'iltriei-t und das Chloroform abgedunstet. Alle diese ()])erationen sollen bei niöglichst neutraler Iteaktion vorgenommen werden, um Hydrolyse des Ribosids zu vermeiden. Auf die.se Weise wird das entstandene Inosin in ein Azetylderivat übergeführt. Ohne dieses zu isolieren, kocht man den lUickstand mit einem Tberschulj einer verdünnten Darytlösung eine halbe Stunde. Das llaryum wird mit einem kleinen riierschuli von Schwefelsäure gefällt und die Lösung dann, um kleine Mengen aus dem Chlorofoiiii entstandener Salzsäure zu entfernen, mit wenig Silbersulfat versetzt. Das Filtrat wird mit Schwefelwasserstoff behandelt, der Überschuß des letzteren vertrieben und das Filtrat mit reinem Blei- essig genau gefällt. Das Inosin kann nun mittelst lilei und Ammoniak gefällt werden. Zytidin und I' rid i n f raktion. Das Filtrat vom Adenosinpikrat ist nicht ganz von Nukleosiden frei. L'm diese zu entfernen wird die Lösung mit Schwefelsäure bis zu einem Gehalt von 2"/o versetzt und dann zwei Stunden am Iiückflußkidder erhitzt. Die Pikrinsäure wird dann mittelst Äther ausgeschüttelt. Die freien Purinbasen werden dann mit einer Lösung von Merkurisulfat in oo/oiger Schwefelsäure gefällt. Na(di dem Zusatz dieses Pvcagenses wird die Mischung über Nacht stehen gelassen. Das Filtrat vom Niederschlage mnl vom Quecksilber und von Schwefelsäure befreit, auf ein kleines Volumen eingedampft und dann mit einer konzentrierten Lösung von Pikrinsäure versetzt, bis die Lösung zu opaleszieren anfängt. Es ist ratsam, sie dann bei vermindertem Druck auf ein kleines \'olumen einzu- dampfen und im Eisschrank über Nacht stehen zu lassen; es scheidet sich dann das Zytidinpikrat aus. Zytidin: C.H.aNgOe. Zytidinpikrat: CgHiaNaOs Cg H2(N02)3 OH läßt sich aus dem Rohi)rodukte durch LTnikristaUisieren aus Alkohol erhalten. Das Rohprodukt wird in wenig kochendem absolutem Alkohol gelöst und die Lösung über Nacht im Eisschrank stehen gelassen. Schmelzpunkt = 1S5 — 187" C (unkorr.). Zy tidinsulfat : (Cg H13 N3 Og), H.,SOi. Es wird aus dem Pikrate dargestellt. Das Pikrat wird in heißem Wasser gelöst und die heiße Lösung mit Toluol ausgeschüttelt. Sobald die Lösung sich allmählich abzukühlen beginnt, wird sie mit Schwefelsäure bis zu saurer Reaktion auf Kongo ver- setzt und die Pikrinsäure weiter mit Äther entfernt. Nach dem Entfernen der Schwefelsäure wird die Lösung bei vermindertem Druck auf ein ganz kleines Volumen eingedampft, mit Schwefelsäure angesäuert und mit Alko- hol versetzt, bis die Lösung zu opaleszieien beginut. In kurzer Zeit scheidet sich das Sulfat in langen prismatischen Nadeln aus. Schmelz- punkt = 2^30 c. — I X I' ) -;; = + 34-ü«. Zytidinchlorhydrat : CgHiaNsOß . HCl läßt sich auf ähnlicher Weise, wie das Sulfat, erhalten. Schmelzpunkt = 218" C (unkorr.). ') Die Angabc von 29*7" C beruht auf einem licrechnungsfchlcr; die Messung war dann bei 1» = 30" C ausgeführt. 496 P. A. Levene: Tribenzoylzytidin: CgHioN3 05(C6H5CO)3 wird nach der Methode von Schotten-Baumann aus irgend welchem anderen Salze erhalten. Schmelz- punkt = 2050 C (unkorr.). Uridin: CgHigN^Oß. Uridin kann aus Zytidin durch Einwirkenlassen von salpetriger Säure erhalten werden. Die Darstellung wird auf folgende Weise ausgeführt: 10 g Zytidin werden in 70"0 cm ^ Wasser gelöst, in die Lösung 30^ KaUum- nitrit eingetragen und der Lösung 50 cm^ Eisessig zugegeben. Es beginnt sofort eine lebhafte Entwicklung von Stickstoff. Nach 5 Stunden ist die Reaktion vollständig beendigt. Die Lösung wird wieder etwas verdünnt, mit 50"/oiger Kalilauge zuerst neutralisiert und dann mit derselben Lösung bis zu einem Gehalt von 107o der Lauge gebracht. Diese Lösung wird hierauf mit Benzoylchlorid benzoyliert. Das erhaltene Benzoylderivat ist unlöslich in Wasser, leicht löslich in den meisten organischen Lösungs- mitteln und kann nicht in gut kristallinischer Form erhalten werden; es wird deshalb verseift, um die freie Substanz zu erhalten. Zu diesem Zwecke wird das Benzoylderivat in 140"0 cm'^ Alkohol gelöst, zur alkoholischen Lösung eine Lösung von 36*0 g Barythydrat in 800 cm^ Wasser zugegeben und das Gemisch 1 Stunde am Rückflußkühler gekocht. Das Reaktionsprodukt wird dann mit Schwefelsäure vom Baryt und vom größten Teile der Benzoe- säure befreit; die noch in Lösung gebliebene Benzoesäure wird mit Äther ausgezogen. Um das anhaftende Natriumchlorid zu entfernen, wird das Reaktionsprodukt nach dem Ausziehen mit Äther mit Silbersulfat be- handelt. Das Filtrat vom Silberchlorid wird vom überschüssigen Silber und dann von der Schwefelsäure mittelst Barytwasser befreit. Auch nach allen diesen Behandlungen enthält die Lösung außer dem Uridin noch kleine Mengen von Verunreinigungen; um diese zu entfernen, wird das Uridin mittelst Bleizuckerlösung und Barythydratlösung gefällt. Der Niederschlag wird dann vom Blei mit einem Überschuß von Schwefelsäure und von dieser quantitativ mit Barytlösung befreit. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird bei vermindertem Druck bis zu einem ganz kleinen Volumen eingedampft, in einer Schale in den Vakuumexsikkator gebracht und bis zur Konsistenz eines Sirups eingeengt. Der sirupartige Rückstand wird dann mit absolutem Alkohol gut umgerührt, bis die Substanz auskristallisiert. Aus verdünntem Alkohol umkristallisiert, scheidet sich das Uridin in langen prismatischen Nadeln aus. Schmelzpunkt 165" C (unkorr.), [a] ^^ = := + 6"38*' in ca. 9''/oiger wässeriger Lösung. Die Darstellung aus der Nukleinsäure wird bei der Besprechung der Zytidin- und Uridinphosphorsäure angegeben. Zytidin- und Uridinphosphorsäure: /OH /OH 0 = P 0 . C9 Hl, N3 O4 und 0 = P 0 . C« Hj^ No O5. \0H \0H I'artiello llyilrulysf der Nukleinsäuren. 4 ein Cberschuli von Il'-Ionen. und r> lädt sich positiv gegen 2. Es wird also positive Elektrizität in der Richtung 2— o transportiert, also in entgegengesetzter Richtung als vorher. Wenn wir die EMK der ganzen Kette messen, so werden wir infolge des Diffusionspotentials b einen zu kleinen Wert be- kommen, wir müssen infolgedessen das zu berechnende Diffusionspotential zu dem gemessenen Wert der Kette addieren, um den reinen Wert der Kon- zentrationskette zu bekommen. Auch das Diffusionspotential c müßte man in dieser Weise berück- sichtigen. Das ist aber im vorliegenden Fall nicht nötig, weil es an- nähernd == 0 ist. Denn ^- NaCl ist chemisch dem Blutserum so ähnlich, daß o das Diffusionspotential vernachlässigt werden kann. Das Diffusionspotential erreicht gewöhnlich nur in dem Fall einen merklichen Retrag, wenn eine der beiden Flüssigkeiten H- oder OH-Ionen in größerer Menge enthält. Für das Diffusionspotential ist ja nur der Unterschied in der Wanderungs- geschwiudigkeit der verschiedenen lonenarten maligebend. und die IV und ( )H' zeigen die von den übrigen Ionen abweichendsten, nändich größten Werte für die Wanderungsgeschwiudigkeit. Die zweite Methode, die Vernichtung des Diffusionspotentials, er- fordert eine ganz bestimmte Beschaffenheit der Mittelflüssigkeit. Das Diffu- sionspotential zwischen irgend zwei Flüssigkeiten wird nämlich dadurch verkleinert, daß man zwischen dieselben eine möglichst konzentrierte Lösung eines sehr leicht löslichen Elektrolyten einschaltet, dessen Anion und Kation möglichst genau einander gleiche Wanderungsgeschwindigkeiten haben. Diese Bedingung erfüllen nur zwei Salze: KCl und (NH4)N03. Ammoniumnitrat hat den Vorzug noch größerer Löslichkeit, aber den Nachteil, dalj es in Berührung mit alkalischen Flüssigkeiten Ammoniak abspaltet. Deshalb ist im allgemeinen KCl vorzuziehen, welches den Zweck um so besser erfüllt. in je höherer Konzentration es angewendet wiid. Im allgemeinen genügt es also, einfach eine gesättigte Lösung von KCl zwischenzuschaltrn. um das Diffusionspotential auf den praktisch zu vernachlässigenden Wert von » 1*95 Volt ist und im Laufe von Tagen oder Wochen, je nach Benutzung, um ein weniges, etwa auf 1-8 Volt abfällt. Dann tritt eine rapide weitere Entladung ein und der Akkumulator muß aufs Neue geladen werden. Der Akkumulator muß während des Versuches häufig auf seine EMK geprüft werden, oder wenn man mit Vorschaltwiderstand arbeitet, muß dieser häufig reguUert werden, indem stets das Normalelement als Vergleichsobjekt benutzt wird. b) Der Vorschaltwiderstand. Er ist nicht durchaus erforderhch, aber angenehm. Er besteht zweck- mäßig aus einem festen Widerstand aus Kheotandraht von zirka 800 O, 510 L. Michaelis. einem gröberen , von 5 zu 5 O regulierbaren Widerstand von insgesamt 100 11 und einem fein regulierbaren Scliieberwiderstand von insgesamt etwa 10 O. Durch die beiden regulierbaren Widerstände geschieht die gröbere und zum Schluß die feine Regulierung des Vorschaltwiderstandes. Sehr zu empfehlen ist statt dessen auch ein zusammengekoppelter gröberer und feinerer regulierbarer Gleitwiderstand (wie in Fig. 4). ^) c) Die Meßbrücke. Die „Meßbrücke" ist entweder die von den Leitfähigkeitsbestim- mungen her bekannte, oder sie besteht wie in Fig. 127 am besten aus zwei gleichen Widerstandskästen zu je 1110 O, enthaltend: 1 X 1 Ll = 1 2 X 2a = 4 Ix 5 0 = 5 Ix 10 O = 10 2 X 20 O = 40 1 x 50 O = 50 1 X 100 O = 100 2 X 200 O = 400 1 X 500 O = 500 = 1110 o. Bei Nichtgebrauch müssen die Stöpsel locker eingesteckt werden. Zum Gebrauch werden zunächst alle Stöpsel des einen Rheostaten ent- fernt. Die eingesteckten Stöpsel müssen fest eingedreht werden. Von Zeit zu Zeit werden die Stöpsel mit Petroleum zur Säuberung abgerieben, im Notfall mit Schmirgelpapier zart abgerieben. d) Das Elektrometer. Als Elektrometer kommen in Betracht: ein sehr empfindhches Nadel- galvanometer, oder ein Spiegelgalvanometer, oder ein Saitengalvanometer, oder ein Kapillarelektrometer. Zur Einübung der Methode dient zunächst am einfachsten irgend ein empfindliches Nadelgalvanometer. Weiterhin aber empfehle ich mit aller Entschiedenheit das Kapillarelektrometer, und zwar in der Form, wie sie Ostivald gegeben hat. Einige ganz unbedeutende, dem Zweck angepaßte Abänderungen hat das Kapillarelektrometer in der Form erfahren, wie es der Apparatur für Gasketten (Vereinigte Fabriken für Laboratoriumsbedarf) auf meine Veranlassung beigegeben wird. Das Kapillar elektrometer AÜrd folgendermaßen für den Gebrauch vorbereitet. Man verschaffe sich Quecksilber, welches von unedleren Me- tallen absolut rein ist. Man erhält dies aus gewöhnhchem käuflichen Queck- silber, indem man dieses mit einer starken Lösung von Merkuronitrat (in destilliertem Wasser) längere Zeit durchschüttelt, dann die Merkuri- nitratlösung abgießt, mehrere Male mit destilliertem (auf keinen Fall *) Ein für diese Zwecke geeigneter Widerstand wird auf meine Veranlassung in den Vereinigten Fabriken für Laboratoriumsbedarf vorrätig gehalten. Die Bestiuinuui),' der WasserstoffioueiikoiiziMitratiou tlurcli (jusketten. 511 Leitunj^swasser mit Hp: in Berüliniii}^' hriiiiicn:) Wasser wuscht, das Queck- silber in einer Porzellanschale mit Filtrierpapier trocken sautrt und filtriert. Quecksilber wird filtriert, indem man ein {gewöhnliches Filter in einen Trichter einpalit und in die Spitze des Filters mit einer feinen (nicht rostiiienlj Nadel ein Loch stöllt. Das so «^ereini^te Quecksilber wird in die offnuiii;- A einj-efüllt, bis es in den anderen Schenkel überliinft und teilweise in die Ku^cl K ab- tropft. Die Quecksilbermasse zer- reißt dann und es bleii)t ein Niveau Fig.ias. bei B bestehen. Man achte ja dar- A auf, daß in der Kuj^el K so viel H^ sich befindet, daß der ein- geschmolzene riatinkontakt ganz von Hg bedeckt ist. Eine besondere Iieinigung der Glaskapillare vor der Füllung ist bei frischen Röhren nicht notwendig. Schon gebrauchte Röhrchen lassen sich nur mühsam zunächst mit Schwefelsäurel)ichi'omatmis('hiing, dann lange mit durchgesaugtem destillierten Wasser, Alkohol, Äther, Luft wieder reinigen. Nach EinfüUung des Queck- silbers wird in die Öffnung E eine Mischung von 1 N'olum kon- zentrierter Ha SOi + 6 \olum Wasser eingefüllt, durch Wippen die Luftblasen bei B entfernt , so daß der Quecksilljermeniskus B die Schwefelsäure gut i)erülirt. Die beiden Zuleitungsdrähte müssen stets kurz geschlossen werden, was durch den Tauchkontakt C ge- schieht, und nur unmittell)ar vor dem Gebrauch darf dieser Tauchkontakt höclistens auf wenii^e Sekunden geöffnet werden. Ist das Elektrometer in guter Ordnung, so darf sich der Quecksilbermeniscus nach diesem Öffnen ab.^olut nicht bewegen. Die Beobachtung des Quecksilbermeniskus geschieht durch ein kleines Mikroskop, in dessen Okular eine Teilung eingeätzt ist. Auf die Außenseite (die dem Mikroskop zugewandte Seite) der Kapillare wird ein Stück eines Deckgläschens D mit Kanadabalsam befestigt, um die gewölbte Ol)erfläche der Kapillare zu ebnen und das miki-oskopische Bihl des Meniscus zu verschärfen. Das Kapillarelektrometer ist ein vorzügliches, ai)er in der Hand des Ungeübten oft launisches Instrument. Bald ist es hochempfinillich. bald Eapillarelektroineter (.ohne Stativ). 512 L. Michaelis. in imbr.iuchbarer Weise unempfindlich. Einige Regeln werden nützlich sein, wenn man das Elektrometer gut instand halten will. ^lan lasse das. Elektrometer nie ,. geöffnet" stehen. Man schicke niemals einen starken Strom durch das Elektrometer. Ist dies dennoch geschehen, so beobachte man, ob sich eine Gasblase am Meniskus gebildet hat. Ist das der Fall, so bringe man durch Anblasen der Öffnung Ä einen Tropfen Quecksilber von dem Meniskus nach K her- über, um einen neuen Meniskus zu bilden. Außerdem beobachte man, ob der ^leniskus nach dem Öffnen des Tauchkontaktes spontan steigt oder fällt. Ist das der Fall, so lasse man das Elektrometer so lange kurz ge- schlossen, bis nach dem Öffnen keine spontane Bewegung mehr eintritt. Man überzeuge sich gelegentlich , ob der Meniskus frei beweglich ist, indem man eine sehr schwache EMK an das Elektrometer anlegt. Als solches kann man ein kleines galvanisches Element benutzen, das man z. B. aus einem Kupferdraht, einem Messingdraht und dem angefeuchteten Finger improvisiert. Mitunter ist die Beweghchkeit des Meniskus rein mechanisch durch Staubteilchen beeinträchtigt. Gelingt es nicht, durch leichtes Anblasen die Beweglichkeit wieder herzustellen, so blase man einen neuen Meniskus ab. Sehr zu empfehlen sind die neuerdings von F. Köhler (Leipzig) in den Handel gebrachten fertig gefüllten, zugeschmolzenen Capillarelektrometerröhren. e) Das Normalelement. Das gebräuchhchste Normalelement ist das sogenannte Weston- element. Man füllt ein H-förmiges Gefäß, dessen beide Schenkel mit Zuführungsdrähten von ^'^"^^^' Platin versehen sind, ^f^^oWin auf der einen Seite mit einer Schicht ganz reinen Quecksilbers , auf der anderen Seite mit einer Schicht Kadmiumam- algam. Dieses Amalgam wird hergestellt durch Zusammenschmelzen von 1 Teil von ganz reinem Kadmium und 7 — 8 Gewichtsteilen ^jMlilt reinen Quecksilbers. Das Amalgam erstarrt bei Zimmertemperatur zu einem Brei. Es wird flüssig in das H-Gefäß eingegossen und erstarrt in demselben bald. Die Höhe der Schicht muß beiderseits so groß sein, daß die eingeschmolzenen Platindrähte ganz verdeckt werden. Dann bereitet man sich eine ge- Pash W^-^-^J " CdS04-Lc)sun9 «—Cd 5O4- Kristalle Westonscbes Normalelement. Die Bestimmuug der Wasserstoffioncnkouzentration diircli (iaskettc-n. f,l3 sättigte Lösung von reinem kristallisiertem Kadmiiimsulfat durch Verreiben gleicher (lewichtsteile des Salzes und von Wasser. Die gesättigte Lösung wird zu ^veiterem Ciebrancli abgegossen und von dem rcstierenden Kristallbrei eine Schicht von etwa '^ nnn Höhe auf das Kadmium- amalgam geschichtet. Kiiie andere Portiun des Breies mit etwas Mcr- kurosulfat, etwas Quecksilber und etwas gesättigter Kadmiumsulfatlösnng verrieben, dekantiert, die Kadmiumsulfatlösung abgegossen und durch neue ersetzt und auf gleiche Weise mehrere Male mit Kadmiiuusulfatlösung ge- waschen, um alle leicht löslichen Hg-Salze zu entfernen, die das Merkuro- sulfat etwa als Verunreinigung enthalten haben könnte. Schlieltlich wird die gewaschene Taste in einer b iio» hohen Schicht auf das Quecksilber des H-(iefäßes geschichtet. Nun werden die Schenkel des Il-defälies mit erbsgroßen Kristallen von Kadmiumsulfat beschickt und mit gesättigter Kadmiumsulfatlösung angefüllt. Die beiden Schenkel werden mit ge- schmolzenem Paraffin geschlossen, indessen man Sorge trägt, daß eine Luftblase unter dem Paraffin bestehen bleibt, damit bei Ausdehimng durch die Wärme das Gefäß nicht zersprengt wird. Auf das Paraffin kann man noch eine Korkscheibe decken und darauf Siegellack gießen. Das Kleinent ist sofort gel)rauchsfertig. Die EMK des Westonelementes beträgt bei 0" 50 10« 150 20» 25" ;-)0» 1-01S9 1-018*) 1-01S9 1-0188 10186 1-0184 POISI Volt. Die Abweichungen davon betragen I)ei Anwendung reiner Reagenzien nicht mehr als höchstens + 02 Millivolt. Es können natürlich auch Ele- mente benutzt werden, die einen etwa um 1 Millivolt abweichenden Wert haben, nur muß diese Abweichung beständig und bekannt sein. Das Normalelement darf niemals zu einer irgendwie erheblichen Stromentnahme benutzt werden. Ist dies dennoch versehentlich geschehen (Kurzschluß), so regeneriert sich das Element ganz allmählich erst wieder spontan und darf zu ^lessungszwecken erst wieder benutzt werden, wenn es eine konstante EMK angenommen hat, also am nächsten Tage. Die physikalisch-technische Reichsanstalt üi)ernimmt die Aichung solcher Normalelemente. f) Die Gaskette. Die Gaskette ist ein galvanisches Element, welches aus der Vergleich.s- elektrode und der Untersuchungselektrode besteht. Als Vergleichselektrode benutzt man entw^eder eine Wasserstoffelektrode mit einer genau bekann- ten Säurelösung oder die Dezinormalkalomelelektrode. Die Herstellung der Wasserstoffelektrode geschieht genau auf dem gleichen Wege, wie t's so- gleich für die l^ntersuchungselektrode beschrieben werden wird, /u be- sprechen ist nur noch die Säurelösung, mit welcher dieselbe gefüllt werden soll. Diese muß folgende P.ediugungeu erfüllen: die Il-Konzeutration muß genau bekannt sein und die Lösung muß so beschaffeu sein, daß das Dif- fusionspotential gegen die Mittelflüssigkeit entweder verschwindend klein Abderbal do n , Handbuch der biocberaiHcben Arbeittmethodrii. V. 33 §14 L. Michaelis. oder genau berechenbar ist. Diesen Bedingungen wird durch eine der fol- genden Anordnungen genügt : Elektiodenflüssigkeit zugehörige Mittelflüssigkeit a) Salzsäure (am besten ^) NaCl in gleicher Kon- zentration (also gewöhn- lich ^), h) 0-01 n HCl + 0-1 n NaCl(d. h. 10 cm^ ^HCl -f 10 cm^ n . NaCl + 80 cm^ Wasser) . . . . Ol n NaCl, c) noch besser: 10 cm^ n NaOH + 20cin'^ n Essig- säure, mit dest. Wasser aufgefüllt auf 100 cm"- gesättigte KCl-Lösung. Bei der Anordnung a) ist das Diffusionspotential nach der Formel S. 504 berechenbar. Es beträgt: Temperatur Volt 18« 0-0145 38" 0-0154. Dieses Diffusionspotential mar) zu der gemessenen EMK der Gas- kette addiert werden. Die H-Konzentration der Vergleichslösung, Tq HCl, beträgt 0*09 1 n, weil die HCl in dieser Verdünnung zu 91% dis- soziiert ist. Die Anordnung h) ist von Bugarski so gewählt , weil durch das zu- gefügte NaCl das Diffusionspotential ausgeschaltet werden sollte. Dieses be- trägt aber in Wirküchkeit immer noch 0"0056 Volt, welche von der EMK der Gaskette abgezogen werden müssen. Die H"-Konzentration der Ver- gleichslösung beträgt nicht 0009(3 n, wie es einer reinen 0*01 HCl ent- spräche, sondern weil die Dissoziation des HCl durch den Überschuß des NaCl etwas zurückgedrängt wird, nur 0'0091 n. Die Anordnung c) hat den Vorteil, daß das Diffusionspotential — 0 und die H*-Konzentration der Vergleichslösung sehr genau bekannt, = 2o7 . 10~° n ist. Sie hat aber den Nachteil, daß, weil die H--Konzentration der Vergleichs- lösung so niedrig ist, die H •-Konzentration der Versuchslösung bald größer, bald kleiner als diese sein wird, so daß man immer die Stromrichtung be- achten muß, was bei den anderen Anordnungen in der Regel unnötig ist. Die Kalomelelektrode. Viel einfacher ist daher die für diesen Zweck von L. P. S. Sörensen'^) eingeführte Dezinormalkalomelelektrode. Sie wird folgendermaßen hergestellt : Das dazu geeignete Elektrodengefäß wird mit absolut reinem Quecksilber so weit gefüllt, daß der an das untere Ende des Rohres R eingeschmolzene 1) S. P. L.Sörenscn, Enzymstudieii II. Biochem. Zeitschr. S. 131. 21 (1910). Die Bestiminiui'' der \Vasserstoffioiiciikenau herfi:estellten — -Lösunj^ von KCl. I)ann ver- schließt man das Gefäß mit dem Glasrohr /•', welches den l'latinkontakt ent- hält und füllt dieses Kohr mit Quecksilber, in welches der Zuleitungsdraht später hineingesteckt werden kann. Jetzt öffnet man den Hahn Ji, lüftet den Verschluß^ und läßt die KCl-Lösung etwas au.sfließen, bis alle Luft- blasen in dem Ableitungsrohr verdrängt sind, schließt dann li und A wieder. Die Spitze C wird in eine Manne mit gesättigter KCl-Lösung getaucht, wie in Fig. 126 zu sehen ist. Unmittelbar vor der Messung öffnet man den Hahn B. Bei Nichtgebrauch ist er so- fort wieder zu verschließen. An jedem Untersuchungstage lasse man ein wenig von der KCl-Lösung aus dem Gefäß abfließen. Gelegentlich erneuere man die Füllung. Das Quecksilber braucht nicht erneuert zu werden. Das Potential dieser Elektrode gegen die -— n Wasserstoffelektrode be- trägt nach den sehr sorgfältigen Mes- sungen von Sörensen bei 18"= 0";>o77 Volt. Findet man z. B., daß die EMK einer Kette, bestehend aus der Ver- suchselektrode und derKalomelelektrode als Vergleichselektrode Ü"ol00 Volt be- trägt, so weiß man, daß die Versuchs- elektrode gegen die — n die EMK 0-5100 —0-3377 IL-Elekt rollt' KCl Calomel = 0-1723 Volt Kalomelelektrode. betragen würde, welcher Wert dann zur Rechnung benutzt wird. Die Kalomelelektrode hat den großen ^■ort('il, daß sie stets fertig zur Untersuchung ist und man die Einleitung des IL und die öfters not- wendige Instandsetzung der Platin-ll.^-Elektrode wenigstens an der Ver- gleichselektrode spart, und daß ferner das Diffusionspotential gegen jede beliebige KCl-Lösung = 0 ist. Sie hat ferner den Vorteil, daß bei noch .so hoher IL-Konzentration der Versuchslösung keine Umkehr der Strom- richtung eintritt und man auf die Stromrichtung überhaupt nicht mehr zu achten hat, sobald alles einmal richtig montiert ist. 33* 516 L. Michaelis. Die Gaselektrode. Die Gaselektrode, welche zur Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeit dient, hat nach meinen Erfahrungen am besten und einfach- sten folgende Anordnung (Fig. 131) : Sie besteht aus dem Glasgefäß A, der Elektrode B und dem Schlauch C. Die Elektrode wird am besten nicht durch ein Platinblech, sondern ein- fach durch einen Platindraht dargestellt, welcher in einen Glasschliff ein- geschmolzen ist. Oben trägt der Glastubus einen federnden Kontakt zur Ableitung des Stromes. Der Platindraht muß mit Platinschwarz überzogen werden. Man reinige das Platin zunächst mit konzentrierter Salpetersäure und wasche diese mit Wasser ab. Von jetzt an darf das Platin nicht mehr mit dem Finger berührt werden. Nunmehr verbinde man die Platinelektrode mit dem n e- gativen Pol eines Akkumulators Fig. 131. ,-c B~~- Ho-iiir- Wasserstoffelektrode. (oder auch einer Batterie von zwei hintereinander geschalteten Akku- mulatoren), während man die feste Platinelektrode des ..Platinierungs- gefäßes" mit dem positiven Pol verbindet. Das Gefäß wird mit einer Lösung von 3% Platinchlo- rid + einer minimalen Spur Blei- azetat gefüllt und der Strom durch- geleitet. Unter häufigem Drehen der Elektrode lasse man den Strom hindurchgehen. Das Platin über- zieht sich mit einer sammetschwar- zen Schicht von Platinschwarz. So- bald dieser Bezug allseitig und gleichmäßig geworden ist, ist die Plati- nierung beendet. Die Platinierung einer ganz neuen Elektrode geschieht oft langsam und erfordert bis 5 Minuten, alle späteren Platinierungen der Elektrode erfordern gewöhnhch nur 1 — 2 Minuten. Jetzt spüle man die Elektrode gut mit destilliertem Wasser ab und unterwerfe sie sofort einer kathodischen Polarisation. Das hat den Zweck, die dem Platinschwarz noch anhaftenden Pieste von Platinchlorid zu reduzieren. Das ist unbedingt not- wendig. Zu diesem Zweck benutzt man genau die gleiche Anordnung wie beim Platinieren, nur fülle man das Gefäß nicht mit der Platinlösung, sondern mit verdünnter Schwefelsäure. Man lasse die Gasentwicklung einige Minuten vor sich gehen, spüle die Elektrode gut ab und bewahre sie bis zum Gebrauch unter destilliertem Wasser einfach in dem Elek- trodenrohr (Fig. 131) auf. Die Elektrode ist wenige ]Minuten nach dieser Prozedur sofort gebrauchsfähig; das an manchen (Jrten vorgeschriebene 24stündige Wässern ist nach guter Pieduktion ganz überflüssig. Die BestimmiiiiLT räii(leruiijfen: Sie sind natur- gemäß in perakut zum Tode führenden Fällen anders als bei langsam ver- laufenden oder in Erholung ausgehenden Versuchen. x) Bei perakut zum Tode führendem Verlauf findet man ent- sprechend der Tatsache, daß die Tiere an einer durch Krämpfe der Bron- Fig. 137. cbialmuskeln verursachten Erstickung sterben, ein mehr minder hochgradig entwickeltes Lungenemphysem (^wer-Lew^ssches Phänomen '). Während bei andersartig getöteten Meerschweinchen nach Öffnung des Thorax die Lungen zurücksinken und dann nur mehr das hinterste Drittel des Brustraumes einnehmen, füllen sie hier die Brusthöhlen völlig aus, indem sie in Form starrer, maximal geblähter Säcke das Herz ganz oder fast vollständig über- lagern. Sie können dabei anämisch, also auffallend blaß sein, ihre Schnitt- flächentrocken. Doch finden sich auch häufig subpleurale oder auch tief im Ge- webe sitzende ekchymotische bis flächenhafte Blutergüsse oder mehr minder aus- 1) 1. c. Die Arlteitsnicthudeu liei Versuchen über Aiiapliylaxic. öm Fig. 138. gobreitetos Liingontklt'ni.i \'^1. dazu Graetz i), des.sen vorzüglicher Arbeit ich mit seiner Ziistiiiiiiiiiiigdie beigegcl)eiioii Fig. i;')r)uii(l 1. ".6 entnehme: P'ig. 1;J6 zeigt das alveoläre Kmphy.sem dci- Ijiiilicii dcraitiger Tiere in vorzüglichor Weise, Fig. 135 dasselbe, daneben ai)er auch den Jiefund von IMiitiingen, Fig. IHK makrosko])iscli die Liingenblähnng.) Die IJauchorgane werden im Zustande einer hochgradigen kongestiven llyperiimie angetroffen, iji der .Magen- und Darmschleinihaut finden sich manchmal (insbesondere \m etwas pnttra- hierterem Verlauf) lllutungen. Die Gallenblase ist bis zum Tlatzen mit (Talle gefüllt. ß) Bei protrahiertem tödlichen Veilaiif oder subletalen Shocks. Hier fehlt das vlwer-Leii'issche Phänomen ausnahmslos, dem prinzi- piell wesensverschiedenen Todesmechanismus entsprechend. Hingegen ist die Hyperämie der liauchorgane fast ausnahmslos anzutreffen, daneben aber (häufiger bei Kaninchen als bei Meerschweinchen) spärliche bis zahllose Ekchymosen und flächenhafte Blutungen in Magen- und Darm wand. Dafür sei die bei- gegebene, einer eigenen Beobachtung ent- nommene Fig. 1H7 ein Beleg. Im Darme finden sich breiige bis flüssige Faezes neben der Erscheinung einer Gastroenteritis toxica. Als Ausdruck einer Steigerung der Gallensekretion ist auch hier die Gallenblase regelmäßig maximal durch (ialle ausgedehnt. P)ei längerem Krankheits- verlaufe, insbesondere aber bei subletal ver- gifteten und 1 — 2 Tage später getöteten Tieren finden wir manchmal massenhafte ekchymotische Geschwürsbildungen in Magen und Darm, daneben aber schwere bis schwerste parenchymatöse und fettige Dege- nerationen der Leber und insl)esondere dei Fig. DM ein Beispiel. Nieren. Für erstere gibt 2. Der Nachweis einer aktiven Anaphylaxie. a) Die Sensibilisierung. Hnsouitt wwA .{»(Icr^^oii-) haben zuerst den Nachweis erbracht, dal» schon ganz minimale Mengen einer artfremden Eiweiß- oder Seiuinart genügen, um .\naphylaxie zu erzeugen. Man muli ') F. Graet:, Die Hidoutiinir drr LiiiiL'oiiMiilitin!: als Kriterium der .Vnaphylaxio. Zeitschr. f. Immuuitatst'orsciig. Bd. 8. II. .') und (i. l'Jll. S. 740. ^) Rosenau \mA Anderson , A study of the cause df sudden death foliowinc tlic injection nf horse seruni. Hyjr. Laitorator Washingtiui Bull. 25). lOOl!, The specific ua- ture of Aiiaphylaxis. Journ. of infectious diseases 1".M)7. p. hh2. 534 H. Pfeiffer. aber dabei berücksichtigen, daß, worauf insbesondere H. Pfeiffer und S. 3Iita^) liing-ewiesen haben, zwischen dem anaphylaktogenen Vermögen verschiedener Eiweißarten speziell dem Meerschweinchen gegenüber sehr große Unter- schiede bestehen. So ist z. B. das an sich giftige Rinderserum wirksamer als schwach giftiges Pferdeserum, dieses wieder wirksamer als z. B. Hühner- eiweiß und Dotter. Alle diese aber übertreffen darin artgleiche oder körper- eigene und blutfremde Eiweißkörper, wie z. B. die Augenlinse, das Nieren- und Hodengewebe des Meerschweinchens für das Meerschweinchen um ein Beträchtliches. Da die letzterwähnten Sonderfälle organ spezifischer Anaphy- laxien der einschneidenden Differenzen in der Technik wegen für sich be- sprochen werden sollen, gelten die hier zunächst zu machenden Angaben nur für die Sensibilisierung mit artfremden Eiweißkörpern. Soll mit irgend einer der Blut- oder Serum arten unserer Ver- suchstiere vorbehandelt werden, ohne daß dabei besondere Fragen in Be- tracht kommen, so hat die Materialbeschaffung und Verarbeitung meist keine Schwierigkeiten. Zu betonen ist nur für diese und alle anderen zu erwähnenden Versuche, daß man sich vor der Apphkation allzu großer Dosen besonders bei Meerschweinchen hüte; Ol — 0"01 cm^ eines artfremden Ei- weiß sind hier in der Regel vollauf hinreichend und außerdem geeigneter, bei der Reinjektion gleichmäßige und intensive Ausschläge zu geben, als allzu große Dosen. Doch sind auch weitaus kleinere Mengen (bis zu O'OOOOl cm^) wirksam. Ebenso kann die Sensibilisierung in derselben Weise mit reinem Serum oder mit defibriniertem Blute erfolgen. Nur ist es dann ent- sprechend der sich entwickelnden oder ausbleibenden „Hämoglobinana- phylaxie" geboten, die Reinjektion mit demselben Substrat vorzunehmen, mit dem man vorbehandelte. Handelt es sich um hochtoxisches Material (Versuche Portiers und Eichets am Aktinien- und Miesmuschelgift 2), Ver- suche von Doerr und Baubitschek ^) mit Aalserum), so wird eine vorherige Auswertung des Injektionsmateriales (fallende Mengen bei gleichartigen und gleich schweren Versuchstieren und gleicher Einverleibungsart) oder Entgiftung durch noch zu beschreibende Prozeduren am Platze sein, damit man nicht schon bei der ersten Einspritzung dadurch Tiere verliert. Zur Trennung von Eiklar und Eidotter bediente sich der Verfasser mit großem Vorteile der von P. Uhlenhuth^) seinerzeit vorgeschriebenen Methode. In einem Becherglas wird Gelatine eben flüssig gemacht und der durch Hin- und Wiedergießen vom Eiklar befreite Dotter in die Gelatine ^) //. Pfeifer und S. Mifct, Zur Kenntnis der Eiweißanaphjdaxie. Zeitschr. f. Im- munitatsforschung. 11)10. Bd. 6. H. 5. S. 727. ^) Portier et Pichet, De l'action anaphylactique de certains veuius. Soc. de Inol. 1902. T. CLXX. *) Doerr und Panhifschek, Toxin und anaphylaktisierende Substanz des Aalserums. Berliner klin. Wochenscbr. 1908. Nr. 33. *) P. Uhlenhuth und 0. Weidanz, Ausführung der biolog. Eiweißdifferenzierungs- verfahren. Bei G. Fischer, Jena 1909. Die Arbeitsmethoden bei Versuchen iilier Anajjliylaxie. Ö35 unverletzt versenkt. Durch rasches Erkalten erstarrt diese und man ver- mag nun mit einer Pipette (ielatines(diiclit und Dotter zu durchstoDen und aus dem Zentrum des letzteren den Dotter absolut rein zu liewinnen. was für das Eiklar ja ohnehin keinen Scliwieriiikeiten l)ei:e^net. l'm hei Versuchen mit erhitzten Kiweililösnufzen zu sensiliilisieren und die Koaiiulation zu verhüten, veidünut man vorher nach Bt.srvdh-(i ') die Seren auf das Drei- bis Zehnfache ihres \dhimen.s. Sie können dann. ohne zu koagulieren, hohen Hitzegraden ausgesetzt werden. Hat man, wie dies in der forensi.schen Praxis die Kegel ist. mit ge- trockneten Eiweißkörpern zu ari)eiten, so ist es notwendig, sie in der Weise mit ()-S()";„iger Kochsalzlösung oder mit schwacher Sodalösung zu extrahieren, dal) heim Umschütteln stark schaumende, l)eim Dlute geli)liraun ge- färbte, durch die Kochprobe sich deutlich trübende Extrakte (F. Vlilcnhufh) entstehen. Besteht der Verdacht, daß das zur Injektion kommende .Material nicht steril ist, so wird man, um Tierverluste durch Infektion zu ver- meiden, gut tun, durch Berkefeldkerzen zu filtrieren. Was die Zahl der zur Sensibilisierung notwendigen Injektionen an- langt, so genügt in der Pegel eine einzige. Dann aber, wenn möglichst starke Ausschläge gewünscht, oder aber in das sensibilisierende Vermögen einer Substanz (hochgradig verändertes Material!), oder in die Empfind- hchkeit einer Tierspezies Zweifel gesetzt werden (weiße Maus), kann man mehrmals mit kleinen Dosen an einigen aufeinander folgenden Tagen inji- zieren. Dadurch sind einheitlichere und intensivere Ausschläge bei der Reinjektion zu erzielen. Was nun die Einbringungsart selbst betrifft, so wurden für die Vorbehandlung bisher die sui)kutane, die intraperitoneide, intravenöse und intrakardiale und intrazerebrale Methode gewählt. Die letztgenannte (Zie'^/rrfAv/) wird heute wohl kaum mehr ausgeführt, da sie keine wesentlichen Vor- teile bietet. Die beim Meerschweinchen bisher am häufigsten geübte ist die intra- peritoneale Sensibilisierung, wenn auch nach einigen Autoren die intra- venöse gleichmäßigere und bessere Resultate geben soll, wovon wir uns übrigens in eigenen Versuchen nicht vollauf überzeugen konnten. Hinsichtlich der Injektionstechnik sei auf die bei der Peinjektion zu machenden An- gaben, besonders ai)er auf die ausführlichen Anleitungen in den einschlägigen Werken von F. Th. Müller-) und ('. Frudcmann^) verwiesen. Selbst- verständlich ist es, daß die Versuchstiere bei entsprechender nnd hin- reichender Nahrung während des präanaphyhiktischen Stadiums gehalten werden müssen. *) Besredka, De lu tuxiciti' dos Serums tlicrapcutiques et du nunrii do la doser. Compt. rend. Soc. Biol. 1Ü07. T. 62. pag. 477. -) P. Th. Müller, Technik d. sorodiaffnostisclien Metliodon. Bei ti. Fisclier. Jena 1910. 3. Aufl. ^) V. Friedemann, Taschenbuch der Inuuunitätslohre. Bei Barth, Leipzig 1910. 536 H. Pfeiffer. Sollten Versuche über FütteruiiQ:sanapliylaxie angestellt werden, so gelingt es leicht, den Tieren reichliche Mengen des betreffenden Ei- weißkörpers, an Brot oder Hafer eingetrocknet, oder aber mit der Schlund- sonde einzuführen. Bei letzterer Prozedur muß man sich aber, um Fehler- quellen zu vermeiden, vor Verletzungen der Schleimhäute hüten, durch welche eventuell Antigen eindringen könnte. Was das zu Anaphvlaxieversuchen zu verwendende Versuchstier anlangt, so ist, wenn nicht spezielle Fragestellungen in Betracht kommen, wie schon aus früher Erörtertem hervorgeht, vermöge seiner hohen Emp- findlichkeit das Meerschweinchen dazu am geeignetsten. Dabei muli man absolut sicher sein, nicht nur ungebrauchte Tiere in Benützung zu nehmen, sondern womöglich auch solche, welche von nicht anaphylaktischen Eltern abstammen, da bekanntlich die Überempfindlichkeit von der Mutter auf das Junge übergeht und das Fehlerquellen bedingen könnte. Die über- wiegende Mehrzahl der Autoren verwendet 200 — 250 g schwere, also jugendliche Tiere, da sie im allgemeinen bei der Reinjektion als empfind- licher sich erwiesen haben, wie die ganz großen. Ohne aber die Empfind- lichkeitsgrenzen hinaufzusetzen, kann man auch o50 — 400, selbst 450 g schwere Tiere verwenden, die für ein Arbeiten mit dem anaphylaktischen Temperatursturz sogar direkt gefordert werden. Die kurzhaarigen Rassen sind im allgemeinen widerstandsfähiger, aber nicht weniger empfindlich, als die sogenannte ..amerikanische". Die Zahl der Versuchstiere hängt selbstredend von den Zwecken des Versuches ab, doch sollen im all- gemeinen für einen einschlägigen Versuch nicht weniger als 4 Tiere ver- wendet werden. Um Kaninchen sicher zu sensibilisieren, gibt U. Friedemann^) die nachfolgende Methode an: Die Tiere erhalten bei der ersten Injektion pro \ kg Körpergewicht 1-0 cw 3 Serum intravenös und bleiben dann 4 Wochen unbenutzt. Nach dieser Zeit erhalten sie neuerlich dieselbe Menge in die Blutbahn. Dabei treten Krankheitserscheinungen auf, ohne aber den Tod des Tieres herbeizuführen. 8 Tage später erfolgt die Probeinjektion wieder mit derselben Menge. Ihr erliegen die Tiere fast ausnahmslos. Ähnlich, aber noch ungünstiger sind die Verhältnisse am Hunde. Mehrfache intravenöse Injektionen werden auch hier, um sichere und gleichmäßige Resultate zu erzielen, geboten sein. Die notwendige Dosis ist, dem größeren Gewicht entsprechend und der geringeren Empfindlichkeit der Tiere Rechnung tragend, wesentlich größer. Biefll und Kraus % die dies- bezüglich wohl über die reichsten Erfahrungen verfügen, sensibilisierten mit je 3 — 5 cm^. b) Die Eeiiijektioii. Um die einer Probeinjektion folgenden Krank- heitserscheinungen mit Sicherheit als anaphylaktische bezeichnen zu dürfen, ») U. Friechmaiui, Über die Kriterien des anaphylaktischen Zustandes. Zeitschr. f. Immunitätsforschg. 1909. Bd. 3. H. 7. pag. 726. 2) 1. c. Die ArliL'itsuK'thodcii liei \'ersiicheri (ilicr Aiiapliylaxic. .-j;;? ist es notwendig-, liinsielitlicli des /ii verwendenden Materials und seiner Ito- sierung sowie der Technik gewisse Kautelen einzuhalten, will imin sich nicht groben Intiiiiiern aussetzen. Da eine ganze Reihe aitfrenider Seren und Eiweitikiirper auch auf unvorhehandelte Tiere an sich teils eine ge- ringe, teils eine recht hetriichtliche (riftwii-kung iiunern. die sich in ihrer Symptomatologie nicht von den Krscheinungen des anaj)liylaktischen Shocks trennen lätit. teilweise durch die Wirkung von im Substrate enthaltenen hämolytischen Xonnalambozeptorcu und Komi)lem('nten bedingt ist. so mul» in jeder \'ersuchsreihe die Wirkung des Injektionsmaterials mindestens an zwei gleich schweren und gleich grolien, sicher unvorbehan- delten Kontrolltieren ausgeprobt, ihre Wirkungslosigkeit festgestellt oder aber bei vorhandener toxischer Wii-kung — die Temperaturreaktion aus- genommen mit Injektionsmengen gearbeitet werden, die untei- der am Kontrolltier ermittelten Dosis toxica bzw. letalis liegen. Um von vornherein solchen Fehler(|uellen auszuweichen, haben zuerst Doerr und liaubitschek^) bei ihren Studien am Aalserum die toxische Kom- ponente für die Probeinjektion teils durch zweistündiges Erhitzen auf »»no, teils durch Zusatz von 0'4 — l"/oigei' konzentrierter Salzsäure uml nach- träghches Neutralisieren mit Sodalösung zerstört und nun mit diesem an sich für das unvorhehandelte Tier atoxischen, in vorzüglicliei- WCise alter noch die anaphylaktischen Krankheitserscheinungen auslösenden Material gearbeitet. In ähnlicher Weise kann man auch, wie eigene Kiiahrungen lehrten"^), die Seren der gewöhnlichen Schlachttiere vor der Probeinjektion inaktivieren und sie so ihres giftigen Kigenvermögens berauben. \'on Kör- perzellen stammende Eiweiiikörper, z. P). das Eiweiß der Augenlinse, kami man übrigens anch durch Trocknen über Schwefelsäure im N'akuum und länger dauerndes Aufbewahren im trockenen Zustande, ohne ihre shock- auslösenden Eigenschaften zu alterieren , für unvorbehandelte Tiere oder andersartig präparierte Kontrollen entgiften. 3) Nur l)ei uanz indifferenten Flüssigkeiten, wie bei Hühnereiklar, Hämoglobin, kann man diese Präpa- rierung entbehren. Die Emulsionen mancher, auch artgleicher Organe (so insbesondere der Niere) haben au sich eine iiuüerst intensive, dabei abei- thermostabile TÜftwirkung, die nicht an dem /elleneiweü) selbst haftet. Durch wiederholtes Waschen der Emulsion mit erneuten Mengen von Koch- salzlösung kann man hier zu einem Ziele kommen. M Will man mit der Auslösung des anai)hylaktischen Shocks auch noch die Diagnose der Artzugehörigkeit des Antigens der \'orbehandlung ver- binden, so genügt die Entiiiftiuig des Materials und seini' Kontrollierung ') 1. c. -) //. Pfeiffer, Versuchstechiiisclio BcmerUiiiigoi» zum Nacluvcis des aiiapliylakti- scheii Tempcratursturzos. Wiener kliii. Woclieiisclir. l'.lOi). Nr. ."U"). p:ii.'. 1227. ^) S. Mita, Ülier die Verwertbarkeit des aiiapliylaktisclien 'I'iMii|)cr:itiirstiirze<:. Zcitschr. f. Imniunitätsforscliuiig. 1910. Bd. 5. T. 2 ii. 3. pag. 297. ^) II. rfeißer, Zur Organspezifität der Übereinpfindliolikcit. Elu'iida. r.tlO. I". ;{. png. 358. 538 H. Pfeiffer. am nicht präparierten Tiere keineswegs. Es ist vielmehr notwendig, hier, um vor Täuschungen sicher zu sein, auch mit andersartigem Antigen vor- behandelte Meerschweinchen in derselben Weise und mit demselben Ma- terial zu behandeln. Das Ausbleiben des anaphylaktischen Shocks bei dem einen, sein Auftreten bei den anderen sichert allein in zuverlässiger Weise die gewonnenen Resultate des Versuches. Was die Vorbereitung des Materials anlangt, so muß es selbstver- ständKch auf Körpertemperatur erwärmt werden und — wenn man eine größere Reihe von Tieren zu injizieren hat — auch im Wasserbade auf Körpertemperatur erhalten werden. Wlihrend die Beimengung größerer korpuskularer Elemente die Ergebnisse bei der subkutanen und intraperi- tonealen Reinjektion nicht stören, sind solche bei direkter Applikation in die Blutbahn strenge zu vermeiden. Die Menge des Injektionsmaterials variiert selbstverständlich nach der Art ihrer Einführung in den Tierorganismus. Es sei hier nur die für das klassische Versuchstier, für das Meerschweinchen, übliche Menge angegeben. Die subkutane Reinjektion, wie sie Arthus, Smith und auch Otto'^) anwendeten, ist heute der geringen Allgemeinreaktion wegen wohl ganz verlassen, wenn nicht speziell die lokalen Veränderungen beob- achtet werden sollen. Selbst bei der Anwendung großer Serummengen (5 — 10 cm^) wird man, ohne Beobachtung der Temperaturverhältnisse, aus der Schwere der allgemeinen Symptome nicht immer zu einwandfreien Re- sultaten kommen, Tod im anaphylaktischen Shock nur in einem recht ge- ringen Prozentsatze der Fälle eintreten sehen. Die intraperitoneale Injektion erfordert bei gut entwickelter Über- empfindlichkeit Antigenmengen von 1 — 2 — 5 cml Damit kann man regelmäßig deutliche Krankheitserscheinungen, manchmal den Tod der Tiere in 2 — 4 Stunden, fast ausnahmslos aber schwere anaphylaktische Störungen der Temperatur herbeiführen. Am meisten eingebürgert hat sich heute die intravenöse Reinjektion, und zwar ihrer hohen Wirksamkeit wegen, die sich in dem Eintreten des akuten Todes der Tiere äußert. Hier liegt die Injektionsdosis niedriger, sie beträgt im Mittel 0*1 — O'Ol cm^. Manche Autoren, so E. Friedherger und Burkhardt^-) (in ihren Studien über die Inkubationszeit) verwenden aber auch insbesondere dann weitaus größere Mengen (bis zu TO und 2*0 cm 3), wenn zu erwarten steht, daß die Uberempfindlichkeit nur in ge- ringem Maße ausgebildet ist. Doch soll hier nachdrücklich von einer kritik- losen Anwendung dieser Methode gewarnt werden, die bei dem raschen, tödlichen Verlauf eingehende Beobachtungen am lebenden Tier schwierig gestaltet, außerdem die Überprüfung des Resultates durch Feststellung 1) Otto, Das Thcobald Smithsche Phänomen der Serumüberempfindlichkeit. V. Leuthold Gedenkschrift. 1905. Vol. 1. 2) E, Friedherger und ^wr^mrc?^, Weitere Untersuchungen über Eiweißanaphylaxie. Zeitschr. f. Immunitätsforschung. Bd. 4. H. 5. pag. 690. Die Arbeitsmethoden bei Versucfieii iilier Anaphyluxir. 5139 einer x\ntiaiiaphykixie dadiinli miiiiiitilicli macht, daß liiiufiy; alle Vcrsiirhs- tiere im Shock bleiben. Dieselben Menj^enverhältni.s.se fj^elten im allireiiieiiien für die intra- kardiale, von P. Uhh'uhuth ') bevorziij^^e Kinsi)ritzuni;'. Er vorwondet U'2ö bis 10 (')«•' reinen inaktiven Serums oder von rtlaii/.eneiweir.lösniiiien 1 mi^ der 10 — 25''/yiiien Extrakte. Doch sei, insbesondere bei fehlender l'biiiin;, vor dieser Technik ausdrücklich ^^ewarnt. da sie an sich einen nicht un- wesentlichen Eingriff darstellt. Auch die xon Bcsredko -) infolge einer bestimmten Fragestellung früher viel geübte intrazerebrale Methode wird in neuerer Zeit wenig ver- wendet. Auch hier schwankt die injizierte Serumiiieuiie zwischen <»-2.') und 0-01 cin\ Was die Injektionstechnik anlangt, so ist ein aseptisches Arbeiten für sämtliche Methoden ein hier nicht näher zu begründendes Postulat. Da die subkutane und intraperitoneale Methode wohl keine Schwierigkeiten mit sich bringt, so genügt der Hinweis, dal) man zweckdienlich ein Kück- fließen des Materials und die damit zusammenhängende Engenauigkeit durch Verschluß der Injektionsöffnung (Fas.sen der Haut mit l'ean, Ligatur!) verhindert. Die intravenöse Injektion geschi(dit beim Meerschweinchen in die Jugulai-is des gefesselten Tieres. Das Gefäß wird durch einen von innen unten nach oben zu aufsteigenden Hautschnitt sichtl)ar gemacht, rasch freipräpariert und durch zwei Sperrpinzetten abgeklemmt. Dann wird die Spritze zwischen ihnen in die .lugularis eingestoßen, nachdem man sich vorher vergewissert, daß weder in der Spritze noch in der Kanüle Luft- blasen vorhanden sind, und injiziert unter Lüftung der zentralen Pinzette langsam und stetig die Flüssigkeit. Der Gehilfe faßt im Momente des Zurückziehens der Kanüle die Einstichöffnung und ligiert sie. Naht mittelst Michelklammern. Die stets zu entbehrende und niclil empfehlenswerte intrazerebrale Injektion wird nach vorheriger Trepanation des Tieres vorgenommen. HinsichtUch des günstigsten Zeitpunktes für die Probeinjek- tion wird heute allgemein der 10. — 21. Tag nach einer Sensibilisierung mit mittlei'en Dosen angegeben. Nach den ausgedidniteii Erfahrungen von Doerr und Ruß wird man aber dann, wenn nur mit minimalen Dosen oder aber mit einem weitgehend veränderten Antigen vorbehandelt wurde, noch länger warten. Vor dem 25. Tage ist ein positives Ergebnis hier nicht zu erwarten. Hat man somit die Reinjektion der auf Anaphylaxie zu prüfenden Meerschweinchen und der Kontrollen vorgenommen, so ist nach den im ersten Abschnitt wiedergegebenen Kriterien die I>eutung tler Versuchs- n ') P. I'hlenliulh uixl Ilaendel, Untersuchungen über die pniktisdio Voiwertliarkoit der Anaphylaxie. /(Mtsclir. f. IiiiiHiinitätsforschiiiit:. IM. 4. II. V^. patr. 7(51. ■') i.e. 540 H. Pfeiffer. resultate dann eine leichte, wenn schwere Krankheitserscheinungen oder gar der Tod der sensibilisierten Tiere eintritt, die Kontrollen aber gesund bleiben. Bei der Protokollierung der Ergebnisse verfährt man zweckmäßig in der aus der beigegebenen Tabelle 1 ersichtlichen Weise: Tabelle 1. 5 Meerschweinchen, am 1. P'ebruar 1911 intraperitoneal sensibilisiert mit je 001 inak- tivem Rinderserum, 1—3, 6, 7 intravenös reiujiziert mit Oo— Ol inaktivem Rinder- serum (RSe), 4, 5. 8 und 9 reinjiziert mit 05 inaktivem Pferdeserum (PfSe). Tier 6—9 normale Kontrollen. Reinjektion am 15. Februar 1911. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 001 RSe 14. Tag 0-5 0-25 Ol 0-5 0-25 0-5 0-5 0-5 0-5 RSe PfSe RSe PfSe t 10 Minuten unter Krämpfen t 20' unter schwersten Erscheinungen Schwerste Erscheinungen, erholt sich Keine Erscheinungen Dazu ist zu bemerken, daß bei dieser allgemeinen klinischen Beur- teilung der Resultate in ,, schwerste, schwere und leichte Erscheinungen" bzw. „keine Erscheinungen" dem Belieben und der Erfahrung des ein- zelnen Beobachters der weiteste Spielraum gelassen ist und ferner, daß so die leichteren Formen anaphylaktischer Erkrankungen der Beobachtung völlig entgehen. Es war daher dringend geboten, insbesondere für die feineren Untersuchungen über Blutverwandtschaft, über die Möglichkeit, verschiedene von einer Spezies stammende Eiweißkörper zu trennen, in Fällen nur unausgesprochener Überempfindlichkeit exaktere, vor allem objektiv feststellbare und feinere Kriterien zu verwenden. Sie sollen unter einem mit der Maßmethode des anaphylaktisclien Shocks hier kurz be- sprochen werden. c) Die Maßiuethoden des anapliylaktischeu Shocks (H. Pfeiffer ^j. Ihr Prinzip beruht auf dem Nachweis einer Überempfindlichkeit vermittelst des anaphylaktisclien Temperatursturzes. Da das Phänomen einer Tempe- raturerniedrigung an sich nichts Charakteristisches darstellt und auf die Einwirkung der verschiedenartigsten Agenzien hin zustande kommt, be- darf es hier einer bestimmten Versuchstechnik, welche es ermöglicht, die Erscheinung als anaphylaktische sicherzustellen. ') //. Pfeiffer, Versammlung der Naturforscher und Ärzte in Salzlnug 1909. Abgedruckt Vierteljahrschr. f. gerichtl. Medizin , 3. P'olge. Bd. 39. Suppl.-Heft. pag. 115. Vgl. dazu auch S. Mita, Über die Verwertbarkeit des anaphylaktischen Temperatur- sturzes. Zeitschr. f. Immunitätsforschung. 1910. Bd. 5. H. 2/3. pag. 297. Die Arbeitsmetliodoii bei Versuchen über Anaphylaxie. ',4 ) Hinsichtlich der Auswahl der Versuchstiere — Meerschweinchen gilt dasselbe, was bei der ISensibilisierun}^^ und Reinjcktion im all^'emeinen gesagt wurde, nur sind hier etwas iiltcre Tiere im Anfanjjs^'ewicht von 300 — ;)50 r/ vorzuziehen, welche zur Zeit dos \'ersnches dann ein (Jewicht von ;>Ö0 — tOO g erreicht haben. Sensibilisiernnj^- und Keinjektion werden, wenn die \'ersuchsbcdinyungen nicht allzu ungünstig liegen, intraperitoneal ausgeführt. Das zur Reinjektion zu verwendende Antigen muf) vor der I'robe- injektion — was übrigens für alle anai)hylaktischen Untersuchungen, nach welcher Methode sie auch imniei* vorgenonmien werd(Mi mögen, gefordert werden niuli — hi jenen Mengen und darüber hinaus an sicher nnvorbe- handelten normalen und gleich schweren Versuchstieren ausgewertet wer- den. Diese Titrierung hat bei intraperitonealer lleinjektion auf intrai)eri- tonealem, bei intravenöser auf intravenösem Wege zu erfolgen. Krgibt es sich dai)ei, daß dem betreffenden genuinen Serum in den zum \'ersuche niitigen Mengen an sich beträchtliche giftige und temperaturherabsetzende Wirkungen zukommen, so muH es bei 57" C ein- oder mehi-mals durch je €iue Stunde inaktiviert werden. Auf diese Weise erreicht man es leicht, das toxische Eigenvermögeu der Tierseren so weit zu zerstören, dali es als Fehler(iuelle nicht mehr in Detracht kommt. Sollte bei nichtgenügender Inaktivierung an den Kontrollen eine temperaturherabsetzende Wirkung l)e- obachtet worden sein, so ist dies nach den gleich zu l)esprechenden (irund- sätzen genau zu registrieren. Es hat die Reinjektion frühestens 14, besser noch 21 Tage nach der ^'orbehandlung mit jener inaktivierten Serum- oder Eiweiltmenge zu erfolgen, die im Vorversuche sich als unwirksam erwies, bzw. die Tempe- ratur der unvorbehandelten Kontrolltiere nur in geringerem Ausmabe als l"^ C zu alterieren vermochte. Da auch durch zu ausgiebiges Rasieren und Waschen namentlich bei jungen Tieren und in der kalten Jahreszeit gleichfalls nicht auf den ana- phvlaktischen Shock zurückzuführende, al.so unspezifische, wenn auch nur ganz geringfügige Temperaturabnahmen herbeigeführt werden können, so müssen die nur an einer eben genügend grolien Stelle der Rauchhaut ra- sierten und desinfizierten Tiere möglichst schonend und rasch injiziert und weiterhin in einem wohltemperierten Räume verwahrt werden, in wel- chen sie schon 12 Stunden vor Anstellung des Versuches gebracht wurden. Die Injektion darf selbstverständlich nur mit Materialien vorgenommen werden, welche auf Körpertemperatur vorgewärmt wurden. Weiterhin ist die rektal zu messende Normaltemperatur der Meer- schweinchen von Tier zu Tier grolien Schwankungen unterworfen, .so kon- stant sie auch bei entsprechender Rflege für ein und dasselbe Tier ist. l>ei ganz grolien Tieren liegt sie im allgemeinen niedriger (.")S"S) als bei mittelgroßen (HUO) oder bei jungen Tieren (;')'.t-;i). Es ist daher bei iler Prüfung auf das Vorhanden.sein des anaphvlaktischen Temperatursturzes immer kurz vor der Einverleibung, jedoch nach der Desinfektion der 542 H. Pfeiffer. Injektionsstelle die Temperatur genau rektal zu messen und nun von 15 zu 15 Minuten ihr weiteres Verhalten zu verfolgen, bis sie, bei einem positiven Ergebnis, wieder zur Norm zurückgekehrt ist. \'erwendet man zur Reinjektion die Einverleibung in die Blutbahn, so ist zu beachten, daß schon durch die dabei nötige Fesselung der Tiere ihre Körpertemperatur um ein Geringes absinkt, nach der Befreiung der Tiere aber sofort wieder ansteigt und bald die Norm wieder erreicht hat. Es ist des- halb notwendig, hier als Ausgangspunkt der Messung jene Temperatur zu nehmen, welche unmittelbar nach der Befreiung des Tieres festgestellt wurde. Zur Temperaturbestimmung bedient man sich zweckmäßig eines nach den Angaben W. Weichardts konstruierten kleinen , rasch und exakt messen- den Thermometers, welches man tief in den Enddarm einführen kann. Es ist von Gustav Eg er , Graz, Halbärthgasse , zu beziehen. Die Temperatur- messung hat während des Abfalles alle Viertelstunden, während des An- steigens alle halben Stunden so lange zu erfolgen, bis die Normaltempe- ratur wieder erreicht ist. Haben die Kontrollen auf die Injektion gar nicht reagiert, so kann ein Temperaturabfall von mehr als l'S" C unter die Ausgangstemperatur als in positivem Sinne entscheidend angenommen werden, d. h. er beweist, daß zur Reinjektion das bei der Vorbehandlung verwendete Antigen ein- gespritzt wurde, und gestattet noch unter Voraussetzungen die sichere Diagnose ..anaphylaktischer Shock"', wo alle anderen bisher bekannt ge- wordenen Symptome — mit Ausnahme von E. Friedbergers Fieberreak- tion 1) — im Stiche lassen. Um den Verlauf eines derartigen Versuches anschaulich zu machen, empfiehlt es sich, das Resultat in Form einer Kurve in der Weise auf einem Millimeterpapier einzuzeichnen, daß man auf der Ordinate für je 10 mm l^C, auf der Abszisse die seit der Injektion verflossene Zeit so markiert, daß 12 mm. == 60 Minuten entsprechen. Selbstverständlich ist aber, daß dort, wo andere Symptome, wie all- gemeine Depression, Krampfzustände, Dyspnoe usw., sich vorfinden, auch sie zur Diagnose mit herangezogen werden müssen. Bei leichteren Erkran- kungsformen aber wird man auf die Temperaturreaktion allein allerdings angewiesen sein. Die beiden hier abgebildeten, einer Arbeit von H. Pfeiffer und S. Mita 2) entnommenen Kurven w-erden den Verlauf solcher Versuche begreiflich machen. In Fig. 139« wurden zwei Meerschweinchen mit geringen Mengen von Katzenblut intraperitoneal vorbehandelt. Das anaphylaktisch erkrankte Tier erhielt O'ö Katzenblut (Ktzbl.), das andere, welches gesund bleibt, l"5 Hunde- blut (Hdblt.) intraperitoneal. ') 1. c. ^T. 8. ^) H. Pfeiffer und S. Mita, Studie über Eiweißaiiaphylaxie. Zeitschr. f. Immunitäts- forschung. Bd. 4. H. 4. pas,'. 410. Die Arbeitsmethoden lici N'ersucheii über Anaphylaxie. r)43 Fif»-. 1896 zei^t die Temperaturverhiiltnisso von zwei Mccrschweiiichpn, welche mit Schweinesernin sensil)ili.sicrt wurdoii. Das erste Tier erliält ()•.') cm' inaktiven Schweineseninis (S.). Tier -J (licsclhc Mcn^re inaktiven Pfonlc- serums (l'f.) intraperitoneal, Menden, die sieh an nnvorheliandclfcn Kontrollen als völlit; wirkungslos erwiesen hatten. Das erste Tier zeif::te einen Tem- peratursturz bis H4'5<'C, das zweite i)eh;ilt seine Normaltemperatur zu- nächst hei, erkrankt aber, als ihm einii>:e Stunden später glcichialls Schweineserum injiziert wird . tödlich unter einem schweren Temperatur- abfaU. Auf dem Wege der Temperaturmessung gelingt es nun auch, zu einem ziffernmäLiigen Ausdruck für die beobachteten Shockgrölien zu gelangen und das, wie H.Jy'eil/'cr angegeben, S. Mifa^) des Näheren ausgeführt hat, in der folgenden Weise: In Erkrankungsfällen, die in F.rholung ausgehen, besteht regelmäßig ein absoluter l'arallelismus zwischen der Schwere der bei einfacher Beob- Fip. 139". Fig. ISOft. 4^ 38 36 J4 I _ rx/ 1 1 1 1 i l .>sf A K ,/ / ) L V ./ -f / / \ / V y X t Spezif Ita t der Re iktic n . II 1 1 1 1 1^3^56 7 89 Spezifität der Reaktion, achtuug eikeuiibareu Krkrankungs- symptome und zwischen der Größe der Temperatural)nahme und der Zeit, die verstreicht. i)is das Tier seine Normaltempt'ratur wieder er- reicht. Heide der (J rolle des Shocks direkt proportionale Faktoren können demnach als .Mall für den anaphylak- tischen Sliock verwendet werden. Derücksichtigt man die Form der durch fortgesetzte genaue Messung erhaltenen Temperaturkurven, so zeigt es sich, daß sie im allgemeinen Dreiecksform besitzen, (ileich schwere N'ersuchsticre vorausgesetzt, kann denin.icii die Größe des anaphylakti.schen Sjiocks au.sge- drückt werden durch den Flächeninhalt jenes Dreiecks, welches die Temperatur- abnahme zur Höhe, die Zeitdauer bis zur Erreichung der .Vusgangstem|»e- ratur als Basis hat. Es ist demnach die Shockgröl'ie (Se) gleich dem halben 544 H. Pfeiffer. Produkt aus der Größe der Temperatu rabnah nie (ta) und der Zeitdauer der ta Z anaphylaktischen Erkrankung (Z), Se = ^ , wobei als Einheit für ta = Ol" C, für Z = 1 Minute zu wählen ist. Andere Verhältnisse, die hier des Näheren nicht erörtert werden können, liegen bei einem tödlichen A'eiiauf der Erkrankung vor. Als prak- tisch brauchbar hat sich zur ziffernmäßigen Einschätzung dieser Ergeb- ta i" Z t nisse die empirisch gefundene Formel 87= 30.000 + 20.000 — bewährt, wobei unter ta f die bis zum Tode eingetretene Temperatural)- nahme in Zehntelgraden Celsius, unter Z y die bis zum Tode verflossene Zeit in Minuten zu verstehen ist. Einige praktische Ergebnisse werden die Protokollierung und Berech- nung ohne weiteres klar machen. Tabelle 2. Entwicklung der Anaphylaxie. (5. — 40. Tag.) Rinderserum. Vorbehandlung. Intervall. Eeiujektion. Temporatur- Einderserura Tage Einderserum abnahme Zeit Shock Mittel 001 5 2 cm"^ 0 0 (1 0 0-01 10 2 „ 31 530 5.115 001 10 2 „ 27 530 4.450 2.564 0 01 10 2 ,. 0 0 0 001 10 2 ,. 13 105 683 001 15 2 „ 50 60 t t 48.500 001 15 9 52 45 t 1 48.830 37.425 001 15 2 47 60 t t 48.590 001 15 0 — r 36 210 3.780 • 0-01 20 9 -^ Vi 17 150 1.275 001 001 20 20 9 2 ," 50 68 90 t 90 t t 47.750 t 47.165 26.234 0-01 20 9 53 330 8.745 0-01 40 2 .. 5 90 225 001 40 2 ,. 10 75 375 24.131 001 40 2 „ 61 75 t t 47.213 001 40 9 6 75 450 Tabelle 2 (abgedruckt aus S. Mita, 1. c): Sie gibt die Entwicklung einer gegen Rinderserum gerichteten Anaphylaxie. Besondere Kontrollen waren hier nicht nötig, da schon frühere Versuche die völlige Ungiftigkeit des verwendeten Serums in den ange- führten Mengen ergeben hatten. Die tödlichen, nach der S t-Formel berechneten Fälle sind mit dem Kreuzeszeichen kenntlich gemacht, die Mittelwerte sind aus den einzelnen Versuchsgruppen berechnet. Diese Maßmethode ermöglicht es auch, mit an sich den Kontrollen gegenüber nicht ganz ungiftigem Material ohne weiteres zu arbeiten und Die Arbeitsmethoden bei Versuchen über Anaphylaxie. 045 jene ReaktionsfiröCion zu bestiiniiiou , die auf Kecliiiim^' des aiiapliylakti- schen Shocks, nicht aber auf das toxische Ei^^enverniü^^i'U zu beziehen sind. Zu dem /wecke ist es in soU'hen Fiilk'U nur notwendi},', die lloak- tionsgrölien der Kontrollen von jenen der sensii)len Tiere abzuziehen , so daß man den „reduzierten Shock" als rein anaphylaktischen berechnen kann. Tabelle :>, derselben Arbeit S. Mitas entnommen, wird das (dme wei- teres verständlich machen. Die Angaben beziehen sich auf Versuche über Anaphylaxie gegen Uinderlinse. Tabelle 3. l\iiiilerlinsenanapb\ laxie. Vorbehandlung Beinjektion 2 o Zeit Shock absolat redn- zi.rt 0 0 0 VjRindcrlinse /2 » 11 )) 21 21 21 0"08 Rinderlinse, getrocknet 006 Meerschweinchcnlinse, getrocknet 2"0 Rinderserum, inaktiv . 0 0() Meerschweinchenlinse 008 Rindorlinse 20 Rinderserum, inaktiv . 8 120 480 — 0 0 0 6 60 180 — 32 180 2.880 2.880 81 420 17.010 16.530 14 105 735 555 Vgl. dazu übrigens die gleichsinnigen Resultate von F. Kmsius '), die gleichfalls mit Hilfe des anaphylaktischen Temperatursturzes gewonnen, die Feinheit und Exaktheit der Metiiodik widerspiegeln, fber die (Jröl'ten- bestimnning einer im Einzelfalle gegebenen Anaphylaxie aus den beim ana- phylaktischen ^Shock gefundenen Werten vgl. //. Phijfcrs Monographie: Das l'roblem der Eiweißanaphylaxie, Fischer, Jena 1910, S. 110 ff. d) Die DitlVreiitialdiagnose des aiiaj^hylaktischen Shocks ireireii- über verwantiten oder wesensgleichen, aber nicht anaphylaktischen A'ergit'tuni^sbildern. Es wurde schon früher kurz erwähnt. dalJ manche normale Tierseren toxisch auf das Meerschweinchen zu wirken vermögen. Untersnchnngen yow F. UMcnhufh-) und später eigene^) sowie solche von Doerr und Moldovan*) und E. FrirdhfTf/cr^') haben ergeben, dajj das dabei in Erscheinung tretende Vergiftungsbild die grölite Ähnlichkeit mit dem des ana- phylaktischen Shocks aufweist. Hier wie dort gehen die Tiere bei großen Dosen und intravenöser Injektion akut unter den Erscheinungen einer Lungen- ') F. Kn sind vor der Auswertung mit Natronlauge zu neutralisieren. 35* 548 H. Pfeiffer. Hätte ein gegebener Harn die Temperatur um 4"C während eines 40 300 Zeitraumes von 5 Stunden herabgesetzt, so wäre S= — ^ — =6000. Es enthält demnach der Harn in 1 «»^ — 300O E. Bei dem subkutan injizierten Tiere beobachtet man insbesondere die Injektionsstelle. Normaler Harn wird glatt resorbiert, solcher, der aus einer Periode gesteigerten Eiweißzerfalls stammt, vermag in der Regel die Kutis am Injektionsorte in wenigen Stunden unter Bildung einer Ne- krose zu zerstören, welche in ihrem Aussehen und in ihrem weiteren Ver- lauf — Eintrocknen zu einem braunen, lederartigen Schorf, Abstoßung, Geschwürsbildung usw. — absolut jenem , als -^r^Äw.ssches Phänomen be- schriebenen gleicht. Um auch hier die Wirkungsintensität verschiedener Harne vergleichen zu können, ist es empfehlenswert, die Größe des zer- störten Hautbezirkes nach 24 Stunden zu messen bzw. festzustellen, ob der Harn glatt resorbiert wurde oder aber ein Infiltrat vorhanden ist. Parallelversuche mit normalen Harnen werden die Differenzen der Harngiftigkeit ohneweiters erkennen lassen. 3. Nachweis einer passiven Anaphylaxie. Sie besteht in der Übertragung einer aktiven, durch Antigeninjek- tionen erzeugten Überempfindlichkeit auf ein sonst unvorbehandeltes Kontrolltier durch das Serum des überempfindlichen. Wir unterscheiden dabei demnach zwei Akte: a) die passive Sensibilisierung, h) die Re- injektion. a) Die passive Sensibilisierung-. Arbeitet man innerhalb einer Tier- spezies, z. P). nur mit Meerschweinchen (homologe passive Anaphylaxie), so ist die Technik der Sensibilisierung nicht Avesenthch verschieden, wie wenn man von einer Tierart auf eine andere, z. B. vom Kaninchen auf das Meer- schweinchen die Überempfindlichkeit überträgt (heterologe passive Anaphy- laxie). Es kann demnach die Versuchstechnik beider Formen unter einem abgehandelt werden. An die Spitze kann der Satz gestellt werden, daß die Übertragung der Anaphylaxie von einem Tiere auf ein anderes mit jedem Immunserum gelingt, welches in zureichender Menge freies Antieiweiß enthält und daß es um so leichter möglich ist, je höherwertig dieses ist. Man wird deshalb gut tun, insbesondere bei der Beantwortung prinzipieller Fragestellungen, dem anaphylaktischen Versuche eine Auswertung der Immunprodukte solcher Seren (Präzipitinreaktion, eventuell Bestimmung des hämolytischen Immunambozeptors) nach den von L. Michaelis in Band III/2, Seite 1185 ff. des vorliegenden Handbuches aufgestellten Grundsätzen vorauszuschicken. Nach dem eben Gesagten sind auch die Mengen des Immunserums, welche zu einer passiven Präparierung des normalen Tieres notwendig sind, großen Variationen unterworfen und können um so kleiner gewählt werden, je höher der Antieiweißgehalt eines Serums ist. Deshalb können wir hier Die Arbeitsmethoden lici Vcrsuclien ülier Aiiapliylaxie. f^lQ auch auf oine Wiedergalu' der in tWv iiltercii Litoratiii' iiltcr passive Ana- phylaxie .uel)r;iuclili('h(^n Vcrsuchsmengen verzichtou ; noch leichter in An- betracht des Tnistandes. dal» ebenso nialiu-ebciid wie die rriiitarifruntr für den Nachweis des Shocks die Ment;e. die Art und Zeit der rriifnn^% mit dem Antii^en ist. Während bei dem einen Srnim Ol rnt^ hinrciclicn. um bei einer unter gleichen Itedingungen vorgenommenen Ueinjektiun noch stürmische Symptome hervorzurufen, sind von einem anderen \0- 4()rin^ davon nötig. Was insbesondere das Serum von Meerschweinchen anlangt, die ein einziges Mal durch kleine Mengen Antigen aktiv sensibilisi«'rt wurden, so ist es zur Zeit der vollentwickeltcn Iberempfindlichkfit wohl nötig, 2-0— 4-0 cin^ zu injizh-ren. E. Friedhcn/cr und Burckhirdt '), welche in dieser Hinsicht über ganz einheitliche Resultate verfügen, verwendeten unter ihren Versuchsi)ediugungen immer l-ö- 2"ö cm'K Was die Injektionsart des Immunserums aidangt, so gelingt die pas- sive Sensibilisieruug selbstverständlich mit jeder Art der parenteralen Zu- fuhr. Will man rasch sensibilisieren oder verfolgt man, wie es insbeson- dere von Doerr und Ruß-) geschehen ist, spezielle Fragestellungen, so wird die Einbringung in die Vena jugularis notwendig sein. Genügt es, nach 24 Stunden erst sichere Resultate zu gewinnen, so ist die intra- peritoneale Applikation vorzuziehen. Dieser Weg ist es auch, welcher in der überwiegenden Zahl der Versuche zur Präparierung eingeschlagen wurde. W^as die Wahl des Versuchstieres anlangt, so ist unter allen Um- ständen das hochempfindsame Meerschweinchen jedem anderen vorzuziehen, weil hier die einheitlichsten und verläßlichsten Resultate erzielt wurden. Das gilt von einer homologen Übertragung unbedingt, von einei- heterolo- gen jedoch nur bedingungsweise. Es haben nändich seither vielfach bestätigte Versuche von llilen- huth und Hiundd^) weitei- erwiesen, dal'i ein vom Huhn stammendes Immunseriini Meerschweinchen nicht überempfindlich machen konnte. Dal) auch die Umkehrung des ^'ersuches nicht gelingt, zeigte Friedherger*): Er vermochte mit einem Immunkörper von Kaninchen, welcher Meer- schweinchen in \()i'ziiglicher Weise sensibilisierte, an \'ül;i'1ii nur zu nega- tiven Resultaten zu gelangen. Der (irund für die.se Erscheinung ist offen- bar darin gegeben, dali die Immunkörper, welche von einer, dem Wirtstiere fernestehenden Spezies stammen, in ihm keine geeignete, in ihre zyto- phileu (irni)pen einpassende haptophore (irupi)e besitzen. Man wird also, wenn man das passiv-anaphylaktisierende Verhalten eines, von einer bestimmten Tierart stammenden Serums mit Aussicht ») 1. c. -) Doerr iiiul Uiiß, Stiuliiitn ülior .Viiapliylnxie. 2. Zeitsclir. t. Iiiiiiiiiiiitatsforsch. Bd. 2. H. 1. pag. 109. Eltoiida: Studien ülior Aiiapliyla.xie. 3 n. 4. IM. ."{. H. 2. !«:ii.'. 1S1 und 7. 1<)0'J. pag. 70(5. ^) Vhlenhufh und llacndel, l'ntersiicliiiii. pa^'. 7(>1. l'.tOJ». *) K. Friedberger und liurckh(ttu m\h\ die- selben Mengen dessellx'ii Injcktionsniatcrials auf denisfllicii Versuchsw('<»e einzuspritzen, mit welchem der aiiaphylaktische Shock aus<,'elöst wurde. Hinsichtlich des Zeitraumes, welcher verj^ehcn muli. damit eine Antiana- phylaxie sich ausbilden kann, so ist dieser bei intravenöser Mctlutdik kürzer als bei intraperitonealer, hän.u:t iibriL,'ens aber auch von der Mcuf^e des bei der Trobeinjektion einverleibten Antigens und von der Ucaktions- fähigkeit des Tieres ab. Im allgemeinen kann man sagen, dab bei intra- Tabelle 5. Entwicklung der A n t i a n u p li y 1 ;i x i e. Tier Tag Vorbe- handlung PtVrde Serum Intervall ReiDJ>>ktion l'ferdo- ^ierum TemiM'riitur- abnabnic in Zehntel- graden Erholung nach Minuten 8 = ta . Z 3. 4. XI. 09 XI. 09 XI. 09 XI. 09 XI. 09 XI. 09 XI. 09 001 001 001 001 001 001 001 25 Tg. 24 St. 25 Tg. 24 St. 25 Tg. 24 St. 25 Tg. 24 St. 24 St. 25 Tg. 24 St. 24 St. 25 Tg. 24 St. 24 St. 25 Tg. 24 St. 1-5 1-5 l-ö 1-5 15 1-5 1-5 15 lo 1-5 1-5 1-5 20 20 20 20 20 61 6 50 12 30 13 69 10 0 41 4 o 92 24 0 72 10 360 60 4.50 180 420 120 540 180 o 450 60 30 480 180 0 660 180 10.980 180 12.600 1 .080 6.300 780 18.630 900 0 9.225 120 31) 22.080 2.160 0 23.760 90(1 venöser Injektion schon nach 2-4 Stunden eine au.sge.sprochene Abnahme der Überempfindlichkeit nachweisbar sein kann. Es hat sich abi-r auch hier ganz aUgemein die (iepflogcnheit herausgebildet, 12 — 24 Stunden ver- gehen zu lassen, bis man eine neuerliche Injektion vornimmt, was schon deshalb empfehlenswert ist, um einen anapliylaktischrn Shock sicher ab- klingen zu lassen. Hat man den intraperitonealen Versuchsweg einge- schlagen, so möge nie vor 24 Stunden geprüft werden, besser ist es noch, wenn man recht bedeutende Reaktionsunterschiede erzielen will, selbst 48 Stunden zwischen beiden Einsi)ritzungen verstreichen zu lassen. Selbst dann wird man nicht immer komplette .Vntianaphylaxien erwarten dürfen. 554 H- Pfeiffer. sondern nur durch eine quantitative Abschätzung der Resultate den Ein- tritt einer partiellen Unempfindlichkeit feststellen können. Daß auch dafür die Methodik des anaphvlaktischen Temperatursturzes besonders geeignet ist, liegt auf der Hand. Die beigegebene Tabelle ö (einer Arbeit von S. Mita entnommen) wird dies besser als Worte illustrieren. War das Antigen der Reinjektion nicht völlig unschädlich für die normalen Kontrollen, so ist die Beurteilung des Ergebnisses einer neuer- lichen Einspritzung viel schwieriger, weil, wie eingangs erörtert, neben der auf den Verbrauch von Immunkörpern zurückzuführenden Antianaphylaxie auch noch die verminderte Reaktionsfähigkeit in Betracht kommen kann. Reagieren aber die sensiblen Tiere auf ein an sich toxisches Antigen bei der neuerlichen Reinjektion beträchtlich schwächer als das erstemal, hin- gegen stärker als die unvorbehandelten Kontrollen, so kann man diesen Ausfall ohne weiteres auf Antianaphylaxie beziehen. Hätte z. B. ein gegen Rinderserum sensibiUsiertes Tier auf l'O cm^ mit 4000 Einheiten reagiert, die unvorliehandelte Kontrolle mit 250 Einheiten, wären demnach bei einem reduzierten Shock das erstemal o750 Einheiten nachweisbar gewesen und reagiert es neuerlich auf TO cni^ mit 400 Einheiten, so sind davon 150 auf ein partielles Erhaltenbleiben der Überempfindlichkeit, die Differenz gegen 3750 = — 3600 E. als Antianaphvlaxie zu deuten. Endlich sei noch ein Beispiel verminderter Reaktionsfähigkeit (nach H. Pfeiffer und S. Mita) angeführt, aus welchem sich auch die Methodik solcher Versuche ohne weiteres ergibt. 10 Meerschweinchen, welche mit 001—00001 Rinderserum vor 21 Tagen sensi- bilisiert worden waren, erhielten nach dieser Zeit intraperitoneal je 2 cm^ völlig inak- tivierten, für die Kontrollen gänzlich unschädlichen Materials und reagierten darauf mit sehr beträchtlichen Shockgrößen bis zu 13.730 E., die demnach restlos als echte anaphylaktische Ausschläge gedeutet werden müssen. Die zweite Reinjektion erfolgte 2 Tage später mit 2'0 cm^ ganz frischen, aktiven Rinderserums, welches unvorbe- handelte Tiere des gleichen Gewichtes im Durchschnitte mit 18.000 E. schädigte. Die antianaphylaktischen Tiere waren aber nunmehr gegen die ihnen einverleibte große Gift- dosis entweder vollkommen oder nahezu vollkommen refraktär und lieferten einen Mittelwert von 573 E. Sie waren, wenn man die 73 E. vernachlässigt, 36mal weniger empfindlich gegen die Hämolj'sinwirkung als normale Tiere. Es ist einleuchtend, daß dieses Resultat nicht allein aus einer Antianaphylaxie, sondern auch aus dem durch eine verminderte Reaktionsfähigkeit erklärt werden muß. 5. Der Nachweis organspezifischer Reaktionen. Solche w^urden zuerst von Kraus, Dörr und Sohma^), Andrejew^) mit dem Linseneiweiß, H. Pfeiffer ») mit Erythrozyten und Linsen, H. Pfeiff'cr *) Kraus, Dörr und Soma, Wiener klin. Wochenschr. 1908. Nr. 30. pag. 1084. ^j Andrejetv, Über Anaphylaxie mit Eiweiß tierischer Linsen. Arbeiten a. d. kaiserl. Gesundheitsamte. 1909. Bd. 30. H. 2. ^) //. Pfeiffer, Über den anaphylaktischen Temperatursturz usw. Sitzungsbericht d. kaiserl. Akademie d. Wissenschaften in Wien. 1909. Abt. III. Bd. 118. Die Ailicitsmetliodcii lici Versiu-hcii ülit-r Aiuiiihylaxie. 555 und S. Mita^) mit Kiklar, Sj)cnnatozoen und von II. I'feijf'er-) mit Nioren- eiweil) ausgeführt. l)ai)ei handelt es sich iiiii (h-ii Nachweis verschiedener von einer i)estimmten Tierart stammemh-r Kiweillkörper. Diese können wieder artfremde, oder arteigene, ja arteigene und körpereigene, dahei al»er hlut- frein(h' sein. Was die Durchfülirung soh-her minutiöser X'ersuciie aidangt. so \>\ eine mögUchste Reinheit sowolil des Kiweilles der Wtrheliandlung, als von jenem der Ileinjektion (Irundvoraussetzung für kkire Ergehnisse. Die.se Forderung kann für das EiweiÜ isoliert zu gewinnender Zellen leicht durch wiederholtes Waschen in der Zentrifuge und Wiederersatz «Icr Kochsalz- lösung erreicht werden. Dies gilt insbesondere für Erythrozyten und Sper- matozoen. Will man spezielle Hamoglol)inana[)hylaxie erzeugen, so kann man nach A. Kleins ^) Präzipitinversuchen so voriichen. dali man die ge- waschenen Erythrozyten in Wasser löst und durch uachtriigliches Aus- salzen mit Kochsalz die Stromata zur Ausfüllung bringt. Diese können dann wieder durch wiederholtes Waschen von dem anhaftenden Hämogloliiii befreit und zur Sensibilisierung verwendet werden. Handelt es sich um Zellen von Organen oder Geweben, so ist ihre ..Keindarstellung" wohl un- mögüch, da man immer undifferenzierte Zellelemente mitinjizieren muH. Ge- rade hier aber ist es notwendig, um nicht die feineren Differenzen in erejiipfiiitllicbkeit. Zeitschr. f. liunnmi- tätsforsohiintr. Bd. 8. II. 3. liHU. \)ng. 3ä8. •') A. Klein, Über Kr\ thniprazipitiiie etc. Zciitralld. f. Biikteriolopic. Abt. 1. VM). Bd. 39. Nr. 3. pag. 303. 556 H. Pfeiffer. Arbeiten mit der früher skizzierten Größenbestimmung" des anaphylakti- schen Shocks aufs beste bewährt. (Vgl. dazu z. B. die gründlichen Versuche von E. Krusius mit Linseneiweiß etc.) Dabei ist zu bedenken, daß, insbe- sondere was die intraperitoneale Reinjektion anlangt, das erste Auftreten und der Ablauf der Krankheitserscheinungen dann ein verlangsamter ist, wenn Organbrei oder Zellemulsionen verwendet werden. In solchen Ver- suchen bedarf es offenbar längerer Zeit, bis aus diesen im Tierleibe das wirksame Zelleiweiß in Freiheit gesetzt wird und in Reaktion treten kann. Es versteht sich von selbst, daß unter den eben erwähnten Versuchsbe- dingungen die Einführung der Aufschwemmung in die Blutbahn wegen der Bildung von Zellembolien zu schweren Fehlschlüssen Anlaß geben kann, die Einspritzung in die Bauchhöhle daher unter allen Umständen vorzuziehen ist. Wünscht man aber dennoch aus bestimmten Gründen die Blutbahn für den Versuch zu benützen, so kann man sich noch in der Weise helfen, daß man den gewaschenen Zellbrei bei hohem Druck in einer Buchner- presse auspreßt, die Preßsäfte von Zelltrümmern und Sand in der Zentri- fuge befreit und die nunmehr geklärte Flüssigkeit für die Injektion ver- wendet. Ausgiebige Kontrollen an unvorbehandelten Tieren sind selbstver- ständlich auch hier absolut notwendig. Ein Beispiel einer spezifischen Rinder-Erythrozyten- und Serumana- phylaxie bei Meerschweinchen ergibt die folgende, der mehrfach erwähnten Arbeit von H. Pfeiffer und S. Mita entnommene Zusammenstellung der Mittelwerte der erhaltenen Reaktionen; es reagierten: Erythrozytentiere auf Erythrozytenlösung (in an sich unschädlichen Dosen) mit 1.620 E. im Mittel Serumtiere auf Erythrozytenlösung mit 30 E. „ ^^ Serumtiere auf Serum (in an sich unschädlichen Dosen) mit 22.410 E. „ „ Erythrozytentiere auf Serum mit 11.040 E. „ „ Während also die mit Blutkörperchenlösungen normal vorbehandelten Tiere gegen die Wiedereinbringung desselben Materiales 54mal empfind- licher waren als die mit Serum sensibilisierten, reagierten die Hämoglobin- tiere auf Serum nur halb so stark als Serumtiere. Vgl. übrigens dazu die unter Maßmethoden des anaphylaktischen Shocks gebrachten Beispiele von Linsenanaphylaxie. Um das Sensibilisierungsvermögen körpereigener und blutfremder Eiweißkörper zu prüfen, ging Andrejew für das Linseneiweiß so vor, daß er eine der beiden Augenhnsen verwendete und mit der zweiten dann sensibilisierte. Verfasser wies in Gemeinschaft mit Hertle V) die anaphylak- togenen Eigenschaften von körpereigenem Nieren- und Hodeneiweiß nach, indem eine Niere oder beide Hoden zerquetscht und dann in die freie Bauchhöhle reponiert wurden. Nach 3 Wochen ergab die Reinjektion deut- 1) Hertle umlH.Pfeifer, Über Anaphylaxie gegeu artgleiches, blutfremdes Eiweiß. Zeitschr. f. Immunitätsforsch. 1911. Im Druck. Die Arbeitsmethoden bei N'ersucheii über Anaphylaxie. 'y^n liehe anapliylaktischo Ausschläfro. In iilmlichcr Weise könnte mit anderen drüsigen Organen verfahren werden. 6. Der Nachweis von Anapliylatoxin (E. Friedberger). \on besonderer liedeutnng für die Anaphylaxieforschung sind in letzterer Zeit die lieagen/glasversuche geworden , unter ihnen wieder der von E. Friedberger ^) zuerst eri)raehte Nachweis, dati l)eini Zusammentreffen von Ambozeptor. Komplement und Antigen ein (Üft in vitro sieh bilde, welches akut unter den Erscheinungen des anaphylaktischen Shocks die Tiere zu töten vermag. Die dabei gebräuchliche \'ersuchstechnik, bei deren Wieder- gabe wir uns an die Angaben E. Friedberger s anlehnen, ist die folgende: Bei der (iewinnung von Anaph ylatoxiu aus Eiweißlösungen spielen, wie E. Friedberger und C.Vallardi"-) zuerst erkannten, folgende Faktoren eine Kolle, deren genaue Berücksichtigung eine conditio sine qua non für die Erzielung giftiger Abgüsse biklct: Die Beschaffenheit (Wertig- keit) und Menge des Ambozeptors (also des Immunserum.'^), die Antigenmenge, die Komplementmenge und endlich die Zeitdauer sowie die äußeren Bedin- gungen ihres gegenseitigen Aufeinanderwirkens. ^Vls optimal hat sich den Autoren die nachfolgende Versuchsbedingung erwiesen: Bereitung der Antisera: Kaninchen erhalten pro Kilogramm Körpergewicht 1 cni^ Hammelserum intravenös eingespritzt. Nach ö Tagen wird die Injektion wiederholt und nach weiteren 7— S Tagen eine Blut- probe aus der Ohrvene entnommen. Wenn das Serum Hammeleiweill min- destens 1 : 10.000 in wenigen Minuten bei Zimmertemperatur präzipitiert, wird das Tier entblutet, das Serum abgeschieden und kurze Zeit bei öH" inaktiviert. Ein zu langes Inaktivieren schädigt die Giftbildung ganz enorm, muß daher vermieden werden. Giftdarstellung: Mengen von je 2 cm^ des präzipitierenden Immun- serums werden mit je 1 cm^ in gleicher "Weise inaktivierten ll.tmmel- serums versetzt. Die Proben kommen auf eine Stunde in den Brut>chrank und werden dann noch 24 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunklen stehen gelassen. Am nächsten Tage werden die rräzijiitate von der dar- überstehenden Flüssigkeit abzentrifugiert, einmal, oder besser noch mehr- mals mit physiologischer Kochsalzlösung zur Entfernung der letzten, an sich giftig wirkenden Antiserumspuren gewaschen und mit je ;'» rw/' frischen Meerschweinchenkomplements versetzt. Zur (iewinnung des Komplenn*nts sollen selbstverständlich nur ungebrauchte, am besten ;iOO — .•'»;'>() y schwere Meerschweinchen ausgeblutet und ihr Seium sofort verwendet werden. Die Mischung von Präzipitat und Komplement wird wieder eine Stnntle Itei l-iT^» und weitere 24 Stunden bei Zimmertem|)eratur stehen gelassen, zentri- fugiert und der Abguß, welcher das freie Anapliylatoxin enthält, auf seine ') E. Friedberger, Weitere Uutersnchuni:cii iUn-r Eiweißan.Tpbvl.ixip. Zeitsrbr. f. Immuuitiltsforsch. Bil. 4. H. ö. pag. 636. '-) E. Fried hcri/ir \md C. VaUardi, über Aiiapliylaxie. S. Mut. /eirMiir. i inineim- tätsforschung. Bd. 7. II. 1/2. pag. U4. 558 H. Pfeiffer. Giftigkeit an Meerschweinchen von 200 — 250 g bei intravenöser Einspritzung geprüft, und zwar in Mengen von durchschnittlich 3 cm^. Die Flüssigkeit muß langsam und unter stetem Druck in die Halsvene aus der Spritze entleert werden. In den Fällen, wo eine Antigen-Antikörperverbindung zuerst kein Gift liefert, gelingt es oft noch durch eine zweite oder dritte Digerierung mit neuen Komplementmengen Gifte abzuspalten. Im Folgenden sei eine übersichthche Zusammenstellung eines solchen Versuches aus der Arbeit von E. Friedhcrger und C. VaUardi abgedruckt, welche zugleich die Bedeutung wechselnder Ambozeptormengen anschaulich macht: t. , ,, „ Tabelle 6. Hammelserum in Präzipit. Kaniuehenserum Komplemeutdosis Eesultat 1:0 1:1 1:10 1 : 100 1:0 1:1 1:10 1:100 1 : 1 .000 1 : 10.000 1 : 100.000 20 cm^ 20 „ 2-0 „ 2-0 „ 2 0 .. 20 .. 2-0 „ 2-0 „ 2-0 2-0 „ 2-0 „ 3-0 cin^ 30 „ 3-0 ,. 30 „ 30 „ 30 „ 3-0 „ 3-0 „ 30 „ 30 „ 30 „ gesund anaphylaktisch tot n gesund anaphylaktisch ?? tot leicht anaphylaktisch gesund Bei dieser Versuchsanordnung wird man, um die erhaltenen Resul- tate mit Bestimmtheit auf Anaphylatoxinbildung zurückführen zu dürfen, gut daran tun, wie es in Friedhergcrs Versuchen immer geschehen ist, in gleich großen Versuchsmengen das verwendete Komplement für sich an Kontrolltieren auf ihm etwa eignende Giftwirkungen zu prüfen. Solche wurden übrigens bisher noch nie vorgefunden. Auch eine Prüfung des ver- wendeten Antiserums auf seine Giftigkeit ist zu Kontrollzwecken anzu- raten, obwohl es ja durch das wiederholte Waschen der Präzipitate entfernt wurde und für die Giftwirkung des Abgusses nicht in Betracht kommt. Sie ist eine oft recht hohe und wesensgleich mit der des Anaphylatoxins. Auf diesen eben besprochenen Versuchswegen konnten bisher mit ver- schiedenen Serumarten, Blutschatten und Hämoglobinlösungen giftige Spalt- produkte nachgewiesen werden. Bei Versuchen mit letzteren muß man nach Friedherger und VaUardi die toxische Eigenwirkung des Hämoglobins mit in Betracht ziehen. In prinzipiell derselben Weise gelingt es, aus den verschieden- artigsten Bakterienzellen, lebenden und abgetöteten, akut tödhch wir- kendes Anaphylatoxin durch Einwirkung von Immunseren zu gewinnen. Hier ist übrigens schon normales aktives Meerschweinchenserum an sich, und das vermöge seines natürlichen Gehaltes an Ambozeptoren geeignet, hinreichende Giftmengen zu liefern, worauf später des Näheren eingegangen Die Arbeitsmethoden lioi Vorsucheii über AiuipliNlasii' 559 werden soll. I»ei solchen Vorsiichcn können dii' ll;iktori«'ii sowohl im leiten- den als im al)L;et(iteten oder iickochtcn Znstaiidc verwendet werden. Ks ist selbstverständlich, daß solche Stiimnu' hinsichtlich ihrei- Virnlenz usw. im Tierversuch i^enau ausgewertet sein müssen. Zur (lifthildnn«,' verwendeten E.Friedberger und seine Mitarbeiter') bisher \ilirii) Metschnikoff (im Chloroformdampf abgetötet), Tvphusbazillen CUJigige Airarkultur), l'ro- digiosus (24 Stunden alte Schrägagarkultur), Tuberkelbazillen (üppig ge- wachsene Schrägagarkultur), Staphylococcus pyogenes aureus (24 Stunden alte Schrägagarkultur). Die Bakterien werden entwedei' nach vorheriL^er Abtötung im Dampfstrom, durch direktes Kochen oder durch Chloroform- dämpfe in bestimmter Menge in Kochsalzlösung aufgeschwemmt und ge- waschen, dann mit dem Immunserum meist 18 — 24 Stunden in Kontakt gelassen. Dabei findet die Verankerung der Ambozeptoren an die P.akterien- zellen statt. Sodann werden die beladenen Bazillen mit reichlichen Mengen physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, um überschub von Ambozeptoren- serum zu entfernen, die eine Komplementablenkung hätten bedingen können. Die gewaschenen Bakterienleiber werden dann in der Begel mit 4 cy//- nor- malen und frischen Meerschweinchenkomplements versetzt und nach 24- stündigem Aufenthalt im Kiisschrank oder bei Zimmertempei'atui- im Dunklen abzentrifugiert. Der Abguß wird normalen Meerschweinchen intra- venös injiziert und diese mit der bei Anaphylaxieversuchen üblichen Me- thodik auf Krankheitserscheinungen geprüft. Die Injektion der Abgüsse raulj stetig und langsam in die Vena jugularis vorgenommen werden. Schwangere Tiere oder solche , die kurz vorher geboren haben , sind für solche \'ersuche nicht verwendbar. In der jüngsten Zeit hat es sich den- selben Autoren ergeben, dab auch normales Meerschweinchenserum an sich — bestimmte Versuchsbedingungen vorausgesetzt — geeignet ist. vermöge seines normalen Gehaltes an Antikörpern aus Bakterien akut wirksames Anaphylatoxin abzuspalten. Die im Folgenden abgedruckten \'ersuclispara- digmen mögen einen Einblick in die Mengenverhältni.sse sowohl beim Ar- beiten mit Immun- als auch mit normalen Ambozejjtoren allein geben. Sie sind den Ari)eiten von E. Friedberger und Goldschmidf d. c.) bzw. E.Fried- berger und Schütze (1. c.) entnommen. Bestiramunir iler Giftigkeit der liazilleii: Je ein Drittel dreitägiger T3rphns-Schrägagarkultur wird in 4 cw' destillierten Wassers anfgenommen und 1", Stun- den im Schiittclapparat geschüttelt. Kin Meerschweinchen erhält die gesamte Aufschwemmung, nachdem ilie l-lilssiir- keit auf O'S" „ Kochsalz geliracht worden ist. intraven<>?. .Vhgeselien von gerinL'i-r .\teni- beschlcunigung keine Symptome. A iiapli vlatox i nli ild iing : Je '„ einer ilreitagigen 'rvphus-Sclirairairarknltur wird in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt, mit fallenden Mengen von Ty- phusimmuuserum vom Pferde versetzt. Alle Köhrchen, auf 10 cm^ aufgefüllt, kommen eine Stunde in den Thermostaten von 37", dann 24 Stunden in den Kissclirank. I»ii- Bazillen werden dann abzentrifugiert. sorgfältig gewasdien. mit je 4 rw' norniaU>u Meej>ch\\ein- chenscrums versetzt. Am folgenden Tage Prüfung der Komplcineiitabi:iisse wie folgt: •) E. Frirdhergcr und seine Mitarbeiter, fber Anaphylaxie. 12. — 15. Miit. Zeit- schrift f. Immunitätsforsjch. lUU. Bd. 9. 11.3. patr. 3i'.'>. 560 H. Pfeiffer. Kultnr- menge Iramun- Serum i s ^ X © CO .— P S N ^ Krankbeits verlauf Anggang 1 2 3 4 5 6 7 8 »/, Kultur 1 ' 2 ^ 1 ' '/2 1 o •I !) 005 Ol 0-25 0-5 10 2-5 5-0 100 4-0 4-0 40 40 40 40 40 40 40 40 3-5 4-0 40 4-0 30 4-0 deutliche Anaphylaxie sehr schwere Anaphylaxie keine Erscheinungen leichte erholt sich Tod in 4 Stunden erholt sich Tod in 2 Stunden 2 r) rr -* rt leht Der Versuch läßt deutlich erkennen, wie auch hier ein Überschuß an Immunserum ungünstig für die Giftabspaltung ist. Bereitung von Anaphylatoxin mit Xormalserum: 0'2 g Tu- berkelbazillen werden in 10 on^ Q-Sb^/oiger Kochsalzlösung fein verrieben und suspendiert, so daß 1 cm^ = O'Ol a/u muß iienierkt wei-den. daß, um Fehler durch mantrelhaftc Kuteiweißunt!; zu vermeiden, unbedingt Kinübung in dir Technik und sod.inn von vorne- herein kleine \'ersuchsniengen notwendig sind. Sonst sind |)ositive Hiiiret- reaktionen auch bei den Kontrollnihrchen /u erwarten, die aber andrerseits, wie Hunderte einschlagiger Kontroiiuntersuchinigen gelehrt haiien, bei j)ein- lichster Einhaltung der Technik konstant vermeidbar sind. Ich betone hier neuerdings die Schwierigkeiten derartiger Versuche, auf welche jüngst auch ySfAewA; hingewiesen hat. Ich glaube aber, und das im Hinblicke auf die neuesten Versuche von E. Friedhcnjer und S. Mifa und im Hinblicke auf die große Zahl unserer Kontrollversuche, jeden Irrtum methodischer Art ausschließen zu dürfen. Die zu untersuchenden Seren und Serumgeniische werden in der Menge von 4 bis höchstens 8 cni^ mit der zehnfachen Menge destillierten Wassers verdünnt und in einer I'orzellanschale auf dem Wasserbade bis zu zirka 80" erhitzt. Noch besser hat sich mir in jüngster Zeit Kochen der Flüssigkeiten in Erlenmeierkölbchen in dem siedenden Wasser des Bades bewährt. Euter fortwährendem Weitererwärmen wird tropfenweise sehr stark verdünnte Essigsäure so lange zugesetzt, bis eine eben deutlich saure He- aktion gegen Lackmus nachweisbar wird, die rierinnung des Eiweiß groß- flockig erfolgt, dieses sich vollständig abscheidet, die Flüssigkeit :e \ Cr- suchsanordnunü- klarmachen : Vorbehand- lung 001 001 001 001 PfS. Kntblutet nach 25 Tg. Immun- suruin Antigen nn" 2 PfSe. 2 RSe. 2 l'fSe. 2 RSe. Priusipitst Kinrptprobo dif,5 oder (bei Mäusen) in GlasgefiUioii im Dimklfii liiilt.-. l)ies ^nlt insliosomioro von Substanzen, die man auf ihre toxische Ei^'cnwiikiiiif? noch nicht sorg- fältig ausgewertet hat. Sie kann unter Tniständen (wie /. l;. hei llimler- galle) eine sehr hohe sein. Treten sclion im (iefoige der Sensibihsiening Krankheitserscheinungen bei den Tieren auf. mui; mit einer Hehchtung jedenfalls solange gewartet werden, bis die Tiere von ihrer \ergiftung sich vollständig wieder eriiolt haben. Genützt man. wie dies zweckmiil'.ig i.st, zum Nachweis solcher Wirkungen die Temperaturreaktion, so warte man mit der Behchtung so lange, bis die Tiere ihre Ausgangstemperatur wieder erreicht haben. Ist dies nicht der Fall, so lälU man mindestens 2 Stunden nach der Injektion die Tiere im Dunklen, damit das Sensibilisans sich gleichmäl.ig in der Haut verteile. Das zeigt sich bei stärker tingierenden Farbstoffen, wie z. IJ. bei Eosin oder bei Hämatoporphyrin darin, dali die Hautdecken die Farbe des betreffenden Körpers angenommen haben, im ersten Falle rosenrot, im letztgenannten braunrot erscheinen, /wischen Sensibilisierung und Belichtung möge kein zu langer Zeitraum eingeschaltet werden, damit nicht eventuell durch eine Ausscheidung des Farbstoffes negative Resultate vorgetäuscht werden. Als Injektionsflüssigkeit wählt man am besten eine Lösung oder Emulsion des Farbstoffes in 0-86Vo Kochsalzlösung. Man hüte sich vor stark alkalischen, insbesondere aber vor einer sauren Reaktion, weil da- durch die ^'ersuchstiere an sich schwer geschädigt werden. Um das sensi- bilisierende Vermögen eines Körpers zu bestimmen, tut man gut daran, zunächst seine Dosis toxica tolerata bei verschiedener Konzentration fest- zustellen und darunter dann jene zu wählen, welche den Stoff in gröljter Menge enthält. Hat sich unter steter Berücksichtigung der Resultate mit uubelichteten Kontrollen eine photodynamische Wirkung feststellen lassen, so geht man in neuen Versuchen mit der Injektionsdosis herab und ver- suche, ob nicht doch an sicli unschädliche Mengen sensibilisierend wirken. Von den bisher untersuchten Farbstoffen steht hinsichtlich seines sensibilisierenden \'ermögens sowohl als auch hinsichtlich seiner fast völlig fehlenden toxischen Eigenschaft auf .Mäuse und Meerschweinchen das reim* krystallisierte Hämatoporphyrin in alkali.>. Unnh^) erhielt mit (>2 — 0-4r) Eosin pro Kilogramm, .1. Jodllmun- und />'. lUisk'^) mit 0-2 0-4 Eosin, 01=()-2 Erythrosin chronische Effekte. Soll, wie das insbesondere von lidithitsrluk und U'>rhac:ruski ge- schehen ist, durch Fütterung, z. B. mit l'olenta oder, wie in den \er- '- ') Zitiert nach Jodlhawr ii. Hiisl,-. .\rchiv. de [iliarmai-. L'ersch\veinchen rasch wieder zur Norm zurückkehrt. Aus diesem (iiiimle hat der Verfasser in letzter Zeit die Belichtung im Glasgefäß vorgezogen. Während man selbst- redend im SonnenHchte sensibilisierte Tiere und die unvorbehandelten Kon- trollen gleichzeitig aussetzen kann, ist dies beim Logenlichte nicht miiglich. Die Tiere müssen dann nacheinander belichtet worden. 2. Die Krankheitserscheinungen.') a) Die akute Erkrankung der weißen )Ians. Las l'^rkrankungs- bild deckt sich absolut mit jenem der Müuseurämie. Mit Lrfelg sensi- bilisierte ]\L\use zeigen im Lichte und das im (Jegensatze zu den unvor- behandelten und belichteten Kontrollen, sofort das von U'. Hiiuswnnn be- schriebene Juckphänomen, indem sie sich heftig die Schnaulze. Körper und Schwanz ohne Unterlaß kratzen und putzen. Lald stellt sich eine auf- fallende Lichtscheu und ein Aufregungszustand ein, so daß die Tiere sich hinter den normalen Kontrollen zu verkriechen und so dem Licht** auszu- weichen versuchen. Charakteristisch ist auch die bald folgende ödematö.se Anschwellung von Kopf und ( »hren und Tränenflut). Bei grölleicn sensi- bilisierenden Losen (OOUl Hämatoporphyrin in L'oganz schwach alkalischen Lösungen) werden die Tiere in kurzer Zeit im Lichte matt imd somnolent und gehen noch während der ISeliclitung zugrunde, naclulcui juanchmal auch hier ein ganz kurz au.sgeprägtes Stadium der lleflexerrcgbarkoit (Fußklonus, Anfälle tetanischer Starre, rauschähnliche Zustandsbilder) nach- weisbar waren. Die noiinalen belichteten, sowie die sensibilisierten unbe- lichteten Tiere bleiben völlig gesund. Wird die sensibilisierende Dosis kleiner gewählt, so ist der gan/c Krankheitsverlauf ein protrahierterer und charakteristischer. Die Tiere ') Dabei ist iiisl)esoii(lrT(' die Sensiltilisieruiig mit llainatoporpliviin uiiti Komh in Betracht gezogen. 568 H. Pfeiffer. Fig. 141. überstehen die zweistündige Bestrahlung unter lebhaftem Juckreiz und ver- fallen erst, wenn sie aus dem Lichte gebracht werden. In wenigen Minuten oder in einer halben Stunde stellt sich Mattigkeit, später Somnolenz ein. Bei Progredienz der Erscheinungen kann man nunmehr bald durch Kneifen in das Hinterbein klonische Zuckungen des ganzen Tierkörpers auslösen, ein Ausdruck gesteigerter Reflexerregbarkeit, der bald in Anfälle von tetanischer Starre hinüberleitet. Sie bestehen darin, daß die Mäuse bei sistierter Atmung, krampfhaft ausgestreckten Extremitäten und gebeugtem Ilücken wie tot daliegen. Dieser Tetanus, der bis zu mehreren Minuten dauern und sich durch viele Stunden immer wiederholen kann, währt mehrere Sekunden bis einige Mi- nuten. Dann kommt die Atmung wieder in Gang, die Starre er- schlafft, bis ein neuer Anfall die Tiere befällt. Noch später über- kommt die Tiere ein ganz eigen- tümliches, rauschähnliches Zustands- bild , in dem sie wie betrunken herumtaumeln, bald aber wieder in Tetanus verfallen und endlich nach stundenlanger Agone unter Er- löschen der Reflexe zugrunde gehen. Während der ganzen Erkrankung besteht eine auffallende Polyurie, häufig werden breiige bis flüssige Faezes entleert. Interessant ist das Ver- halten der Körpertemperatur, welche wohl den feinsten Ausdruck photodynamischer Schädigungen darstellt (photodynamischer Tempe- ratursturz, H. Pfeifer). Registriert man die Körperwärme solcher Tiere vom Momente der Belichtung an, so wird man bei mittleren und kleineren Dosen, während die Mäuse noch in jenem Zustande von Aufregung sich befinden, häufig einen leichten Anstieg über die Norm wahrnehmen. Als Vorläufer der Mattigkeit aber, und mit ihr immer zunehmend, setzt ein Temperaturabfall ein, welcher, den Krankheits- erscheinungen absolut parallel gehend, intra vitam zu Temperaturen von 24 — 20*" C führen kann. Daß es sich dabei nicht um agonale Erscheinungen, sondern um ein wesentliches Erkrankungssymptom handelt, ergibt sich aus den beigegebenen Kurven, von denen die erste (Fig. 141) die Körpertemperatur eines letal, die andere eines subletal geschädigten Versuchstieres nebst den Kontrollen wiedergibt. Es zeigt sich in dem ersten Falle, daß schon stunden- lang vor Eintritt der Agone als erstes Anzeichen der Schädigung der ra- pide Absturz der Körpertemperatur einsetzt und zu seinem Minimum ge- 1 _. 1 ■- X _" ^': . \ \ 4- ■ |llill:lIfli!«IHIIItf -.' ■' Der Nachweis photodyiiamisclier Wirkuiiiyroii fluoresziiTcmler Stoffe etc. 569 führt hat. Das subletal im Lichte f^oschädif^tc Tier {\'i:\. Fip. 142) -/.vi^x mit Zunalime der Kraiiiis zu 21-0^ C. während mit Ueginn der Wiedereriiohm«? die Temperatur all- mählich wie(U'r zur Norm an.steip:t, später einem oft taj:ehin^' anhaltenden Fieber I'hitz macht. Dabei bleibt, wie die Kontrollen der Kurven lehren, die Körpertemperatur der belichteten unvorbeiiandelten und der .sensibili- sierten unbelichteten Kontrollen normal. Der Obduktionsbefund solcher im Lichte akut zup^nmde ij^ei/an- gener Tiere charakterisiert sich häufig nur in einer hochgraditren Hyperämie der Bauchorgane. I!ei etwas protrahierterem Verlauf aber finden sich nicht selten die Erscheinungen einer akuten, meist hämorrhagischen Gastroen- teritis, mittlere bis schwere fettige Degeneration insbesondere der Nieren, aber auch der Leber und des Herzens. Auffallend ist auch die bis zum Platzen prall mit Galle gefüllte Gallenblase. Fig. 142. b) Der chronisclie Erkrankungsverlauf der weißen Xaus. Er ist die mildeste Form der photodynamischen Schädigung. Nach einem mehr minder ausgespro- chenen akuten \'orsta- dium, welches, wie oben geschildert, in Erholung ausgeht, aber auch ohne jede schwerere allgemeine Krankheitserscheinung, erkranken die Tiere ins- ^ '■ ■ ' besondere im diffusen Tageslichte nach Tagen bis Wochen unter Tränenfliir». der bald zu einer au.sgesprochenen Kon- junktivitis überführt, kenntlich an den durch Sekret verklel)ten .\iigen. Auch hier sind intensive Ödeme, insbesondere wieder am Kopf und (lenick. aber auch am übrigen Körper wahrzunehmen. Der Pelz der Tiere wird schäbig. Es entwickelt sich ein nässendes, oft einen (JrolUeil der Körper- obei-fläche einnehmendes Ekzem oder ausgebreitete Hautnekrosen. Besonders auffallend ist dabei eine Gangrän, welche die Ohrmuscheln ergreift und zu einer Abstellung dieser Körperteile luhren kann. Die Tiere gehen schliel'.lich kachektisch zugrunde, oder erholen sich, ins Dunkel gebracht, vollständig. c) Die photod.vnainische Srliiidiü:uni,' des Meersciiweinchens (H. Pfäß'cr). Im Lichte zeigen ältere Tiere aul'.er einer hochgradigen .\uf- regung. Lichtscheu. Juckreiz und Polyurie meist keine schweren Krank- heitserscheinungen. Werden die Tiere aber aus der Licht(|uelle entfernt. so beginnt — eine Schädigung von genügender Intensität vorausgesetzt 570 H. Pfeiffer. Fig. 143. sich rasch ein außerordentlich charakteristischer Symptomenkomplex zu ent^Yickeln. In seinem Zentrum steht wieder ein initialer, enorme Grade erreichender Temperatursturz, der bei tödlichem Ausgange 10 — 16° unter die Norm betragen kann. Dabei wird das Tier zunächst matt, sein Fell sträubt sich in eigentümlicher Weise, die Hinterbeine sind paretisch. Später schauert das Tier alle paar Minuten zusammen, zeigt konische Zuckungen der Körpermuskulatur, wird später somnolent, und geht schließlich in einer lange hingestreckten Agone oft unter Erscheinungen einer profusen Diarrhöe zugrunde. Die Kontrohtiere bleiben völhg intakt. (\'gl. Fig. 143.) Verfolgt man durch Blutent- nahme (am besten hinter den Ohren und aus der Genickgegend) die Leukozytenzahl solcher Tiere, so beobachtet man unmittelbar nach der Entfernung aus dem Lichte eine, oft sehr intensive polynucleäre Leukocytose, die dann mit Progredienz der Erscheinun- gen rasch in eine Leukopenie über- geht. Die peripheren Gefäße wer- den dabei sehr häufig fast völlig blutleer angetroffen, so daß oft kaum aus der Vena jugularis ge- nügende Mengen von Blut ge- wonnen werden können. Tritt der Tod nicht akut ein, so können sich die Tiere unter Anstieg ihrer Körpertemperatur allmählich er- holen. In den nächsten Tagen be- steht meist hohes Fieber fort und es entwickeln sich nun an der BeUchtungsstelle charakteristische Veränderungen. Während nicht behchtete Tiere die Farbstoffe (Eosin und Hämatoporphyrin) reaktionslos resorbieren, entwickelt sich bei belichteten zunächst ein teigiges Ödem, welches nach 2 Tagen in ein derbes Infiltrat sich umgewandelt hat. Dieses beginnt nach 48 weiteren Stunden mit der lebhaft entzündeten Haut nekrotisch zu werden, vertrocknet zu einem rotbraunen, lederartigen Schorf, der sich von den un- belichteten Hautpartien zu demarlderen beginnt; er stößt sich im weiteren Verlaufe von den unbelichteten und gesund gebliebenen Hautpartien ab. Das nunmehr zurückbleibende tiefgreifende Geschwür verheilt glatt im A'erlaufe von Wochen. Manchmal kann auch Spättod unter hochgradiger Kachexie zur Beobachtung kommen. Ebenso wie bei der Maus, kann auch beim Meerschweinchen (vgl. dazu die Erfahrungen Lodes'^) an mit Polenta ^) Lode, Vortrag, Wissenschaft! Ärztegesellschaft in Innsbruck. Referat in Wiener klin. Wochenschr. 1910. Xr. 31. p. 1160. Der Nachweis pluitodynainisclicr Wirkungen fliuMcszicroiKlcr Stoffe etc. f,7[ gefütterten Meerschweinchen) je Von Emil Fischer, Berlin. Zur Bereitung der Lösung dient das nebenstehend (Fig. 1 44) in natür- licher Größe abgebildete Glasgefäß mit sorgfältig eingeriebenem Stöpsel. In ihm mrd die Substanz und das Lösungsmittel abgewogen und '^■^*^' dann die Lösung am besten durch Umschütteln hergestellt. Da eine geringe Menge Flüssigkeit sich zwischen Glaswand und Stöpsel setzen kann, so ist es nötig, diesen zum Schluß zu lüften, ^^^eder aufzusetzen und nochmals zu schütteln. Um das Mischgefäß be(iuem wägen zu können, wird es in einen kleinen gläsernen Zylinder eingestellt. Das Pyknometer hat die gewöhnliche Form (Fig. 145) und ist so dickwandig, daß es nur 0"07 cm^ faßt. Das Polarisationsrohr von 5 cm Länge hat einen inneren Durchmesser von 1'5 mm und faßt nicht mehr als Ol cm^. Es besteht aus weißem Glas, ist aber ganz mit Hartkautschuk bekleidet. Für genauere Messungen verwendet man ein ebenso konstruiertes Rohr von 10 cm Länge, dessen Inhalt dann aber 0"2 cm^ beträgt. Die Überführung der Flüssigkeit aus dem Misch- Fig.us. gefäß in das Polarisationsrohr oder Pyknometer geschieht mit einem engen Glasrohr, das zu einer Kapillaren ausgezogen ist. Letztere muß so lang sein, daß sie bis auf den Boden des Polari- sationsrohrs reicht, dessen Füllung dann keine Schwierigkeiten bietet. Auf dieselbe Weise kann man die Flüssigkeit wieder aus dem Polarisationsrohr entnehmen und in das Pyknometer ein- führen. Die Wägung muß selbstverständlich mit einem empfind- lichen Instrument ausgeführt werden. Es genügt aber dafür eine gewöhnliche zweiarmige Wage, welche bei einer Maximalbelastung von 10 g noch 0"05 mg zuverlässig angibt. Die Abbiendung des polarisierten Lichtes mrd am besten der inneren Weite des Polarisäüönsrohres angepaßt. |Die Ablesungen sind bei Anwen- *) E. Fischer, Synthese von Polypeptischen. Sitzungsber. der Berliner Akademie. 1908, 552 ; vgl. Chem. Zentralbl. 1908. II. 315. Ferner : Über Mikropolarisation. Ber. d. deutsch, chem. Gesell. 44. 129 (1911). über Mikropolarisation. 573 dunii- von aasglühliclit sehr leicht aiisziifiihrcii. Natritiiiilidit, das auf die ^('wölinliclio Weise (lunli \'ei(laiiii)feii von Clilonialriuiii oder Hrom- iiatriuin in der ßwif>cft-¥\ininnv eizeii^t wird, ist allcrdinj^s zu scliwach, um schaiio Ablesungen zu f^estatten. Vorzii'iliclie Dienste leistet da''e<'eii der Polarisationsapparat der Firma Schmidt & Hatnsch in IJerlin, bei dem homogenes Licht durch 8pektrab;eiief,Min<4- von iSVT«.s7-Licht her^^estellt wird. Die Ablesungen werden mit diesem Apparat bei passender I'.Iend- vorrichtung aucli im 10 r<>/-l!()lii- ii so scharf, dal) der mittlere Kehler nur U-02" l)etr;igt. Die Leistungsfähigkeit (\vv Methode ergibt -icli aus folgenden lie- stimmungen mit Rohrzucker, für den |a|-*'" = + (jfVHf)" in 10"oiger Lösung und + eß-Tß" in öVoiger wässeriger Lösung beträgt. >j Alle l'.e- stimmungen sind bei 20" und mit D-Licht ausgeführt. Der durch Ungenauigkeit der Wiigung entstehende Fehler könnte durch die Denutzung feinerer Wagen noch erheblich herabge>etzt werden. Aber in der jetzigen Form ist die Methode schon für die allermeisten Fälle ausreichend, wenn es sich darum handelt, mit ö — 10 my Substanz eine orientierende polarimetrische Bestimmung auszuführen. Gewicht der Rohrliinf;i.< Substanz Lösang Spez. Gewicht UrebTinf? 002140 0-211(50 1-043 349" 5 002230 0-24115 1-034 318" 5 0 02020 0-20705 1-037 3-38« 5 01)20()0 0-201S5 1041 342" 5 001043 0-21 21 H 1-017 1-67" 5 001015 0-21218 1-018 1-63° 5 001140 0-20882 1-019 1-88° ö 000970 0-18405 1-018 1-80» 5 0-00575 0-1293U 1-018 1.52» .5 0-01280 0-25790 1-016 3-39" III ["1 •JO» 0(5 2 66-5 66-8 66 3 668 669 67-6 67 1 672 67 2 Die Lolarisationsröhren noch niehi* /u verengen, ist ans folgenden Gründen nicht zweckmäßig: Postens wird dann die Kinfüllnng mit dem kapillaren Glasrohr zu schwierig und zweitens gestattet die jetzige Weite des Kohres noch die Klärung schwach getrübter Flüssigkeiten durch Sedi- mentierung. Es ist nändich bei präparativeii .Vrbi'iten mit sehr kleinen Mengen öfters unmöglich, ganz klare Lösungen herzustellen. KiUirt tue Trübung von Substanzen her, die nicht allzu leicht sind, so klären sie sich beim ruhigen Liegen im l'olarisationsrolir. l'.ei der oben angegebenen Weite des l'olarisationsrohres tritt diese Klärung tatsächlich noch in vielen Fällen ein. Wenn statt Wasser andere i.ö>nngsmittel zur Anwendnm: kommen, ist es ratsam, die leicht fliiclitiucii Flüssii^keiteii zu vermeiden, da bei (h-r ') ToUens, Ber. d. deutsch, cheiii. (icscll. Bd. 10. 1410(1877). 574 E. Fischer. Über Mikropolarisatioii. geringen Menge der Lösung durch Verdunstung beim Umfüllen ziemlich große Fehler entstehen können. Gleichzeitig mit E. Fischer hat sich J. Donau ') im Laboratorium von F. Emich in Graz damit beschäftigt, Kapillarröhren für polarimetrische Beobachtungen zu verwenden: Donau benutzt Kapillarröhren aus schwarzem Glas, die noch erheblich enger sind, als die zuvor erAvähnten, dafür aller- dings auch kaum mehr die Klärung von trüben Flüssigkeiten gestatten werden. Donau hat sich damit begnügt, die Verwendbarkeit solcher Ka- pillaren für polarimetrische Zwecke gezeigt zu haben, ohne die Herstellung von Lösungen und die Bestimmung des spezifischen Gewichtes in dem- selben kleinen Maßstabe durchzuführen. In dieser Kombination liegt aber der Hauptvorteil der Methode, die in den letzten Jahren so häufig polarimetrische Bestimmungen gestattet hat, wo man früher auf solche Beobachtungen wiegen Mangel an Material verzichten mußte. Die Firma Schmidt & Baensch in Berhn hefert zu ihren Polarisations- apparaten auch die engen Röhren, sowie die beiden, oben erwähnten Glas- gefäße. Letztere können übrigens auch von jedem geschickten Glasbläser augefertigt werden. 1 ^) Julius Donau, Polarimetrische Versuche mit kleinen Flüssigkeitsmengen. Monatsh. f. Chemie. 29. 333 (1908) ; vgl. Chem. Zeutralbl. 1908, II. 475. Die optische Metliode und ihre WrweiKluiig bei biologischen Fnigestelliiiigen . Von Kmil Abdcrhaldm, Hcrlin. Mit dem Namen „optische Methode" hat dci Verfasser die Ver- folgung biologischer Vorgänge mit Hilfe des Polarisationsapparatcs be- zeichnet. Die P'eststellung des Abbaus bestimmter Substrate durch Fermente durch fortlaufende Beobachtung des Drehungsvermögens (\(^< Ffi-incnt- Substratgemisches ist wiederholt mit groi^eiu Erfolg durchgeführt worden. Für diese bekannte Methode war eine besondere P>ezeichnung nicht nötiy. Wir haben es hier meistens mit ganz klaren Verhältnissen /.u tun. Die Bezeichnung ..optische Methode" ist für \orgänge gebraucht worden, bei denen wir Drehungsänderungen feststellen können, ohne dall wir a priori imstande sind, etwas über den ^'organg auszusagen, welcher der \'er- änderung des optischen Verhaltens zugrunde liegt. Die optische Methmle kann in dieser Form uns i)estimmte Vorgänge, die unserer Beobachtung zunächst nicht zugänglich sind, zur Wahrnehmung bringen. Mit anderen Methoden ist dann der Nachweis zu führen, welcher Art der \organg ist. Ein Beispiel möge zeigen, in welcher Art die Anwendungsweise der optischen Methode gedacht ist. Systematische l'utersuchungen hatten er- geben, daß das Plasma resp. Serum von normalen Hunden seine Anfang.s- drehung bei 87" beibehält. Veränderungen beobachtet man nur bei kranken Tieren und speziell i)ei Infektionskrankheiten imd bei diesen vor allem bei hohem Fieber. Ob ein regelmälüger Befund itei den erkrankten Tieren vor- liegt, läßt sich zur Zeit nicht entscheiden. Das untersuchte Material ist ein zu geringes. Feststehend ist dagegen der Befund, dad l'lasma resp. Serum normaler Hunde seine Anfang.sdrehung beibehält. Fügt man /n solcher Blutflüssigkeit einen Eiweißkörper. /. l\. Fiereiweiß oder aus Pro- teinen gewonnene Peptone, dann bleibt unter normalen Verhältnissen das Drehungsvermögeu do^ (Jemisches unverändert. Durch mehrere Jahre systematisch durchgeführte \'ersuche hatten ergeben. dal.(iie l'iUMueleinente des Blutes reich an Fermenten sind. Diese Beobachtung führte zu der Forderung, daß das zu derartigen \'ersuchen verwendete Plasma resp. Serum 576 E.Abderhalden. unter allen Umständen frei von aus den Zellelementen stammenden Pro- dukten sein muß. Zu ganz anderen Resultaten kommt man, wenn Plasma resp. Serum von Hunden verwendet wird, denen vorher subkutan, intraperitoneal oder intravenös Proteine oder Peptone eingeführt worden sind. Munmehr beob- achtet man, daß das Plasma resp. Serum plus zugesetztem Eiweiß resp. Pepton die Anfangsdrehung beständig ändert. Ein bestimmter Schluß über die Art des Vorganges kann aus diesem Befund nicht gezogen werden. Erst der Nachweis, daß Serum derart vorbehandelter Tiere mit Eiweiß zusammengebracht, Peptonbildung erkennen läßt (Dialysierversuch), läßt den Schluß zu, daß der Drehungsänderung ein Abbau von Eiweiß, durch Fermente zugrunde liegt. Die parenterale Zufuhr von körperfremden Eiweißstoffen resp. Peptonen, bewirkt das Auftreten, oder allgemeiner aus- gedrückt, das Wirksamwerden von proteolytischen Fermenten im Plasma. Nachdem nun festgestellt ist, daß der beobachteten Drehungsänderung eine Formentwirkung zugrunde liegt, ist es nicht mehr nötig, von einem optischen Verhalten des Plasmas unter den genannten Bedingungen zu sprechen, wir sind jetzt vielmehr berechtigt, das Auftreten von Fermenten und den dadurch bedingten Abbau bestimmter Substrate als Ursache der Veränderung der Anfangsdrehung anzugeben. Die „optische Methode" er- möglichte das Auffinden dieses biologischen Vorganges, dieser interessanten Reaktion des Organismus auf die Zufuhr körperfremder Stoffe. Sie allein vermochte jedoch den Prozeß, der der Drehungsänderung zugrunde liegt, nicht aufzuklären. Genau die gleichen Bemerkungen gelten für die Feststellung einer Drehungsänderung eines Plasmarohrzuckergemisches. Wurde Plasma von Hunden verwendet, denen Rohrzucker parenteral zugeführt worden war, dann trat eine sehr deutliche Änderung der Anfangsdrehung auf. Plasma von normalen Hunden zeigte keine Veränderung des optischen Verhaltens. Hier war aus der ganzen Art der Drehungsänderung der Schluß gegeben, daß das Plasma von Hunden, denen Rohrzucker parenteral zugeführt worden war, Invertin enthält. Zwingend wurde diese Schlußfolgerung jedoch erst durch den direkten Beweis einer Zerlegung des zugesetzten Rohrzuckers in Dextrose und Laevulose mit Hilfe chemischer Methoden. Die optische Methode wird ohne Zweifel noch viele analoge Vorgänge aufdecken. Haben wir doch sicher bei den verschiedensten In- fektionskrankheiten eine Zufuhr artfremder Bestandteile! Sollte der Organismus nicht auch hier Fermente mobil machen, um all diesen Bestandteilen ihre spezifische Struktur zur nehmen? Vielleicht sind hier Fermente vorhanden, die auf die Bausteine der Bakterienleiber spe- zifisch eingestellt sind. Als Substrate wären in all diesen Fällen Produkte aus den entsprechenden Mikroorganismen anzuwenden. So wurde beispiels- weise versucht, aus Rotzbazillen durch partielle Hydrolyse Produkte zu gewinnen, die dazu dienen sollten, im Plasma rotzki'anker Tiere spezifische Die optische Methode und ihre Verwendung hei hiulop. Fra^esteUiinL'en. f)77 Fermente .uifztifindcn. Ferner wurde Tu berkeleiweill peptonisieit und beobachtet, ol) Plasma von tuberkulösen 'riercn mit solchem IVpton eine Änderung der Anfangsdrehunc <'i-gibt. hie l!(M>b;iclitiino-f'n waren durchwt'i^s ermunternd. Von der gleichen ( rrundlagc ausgt'liciid i>t auch gcprült woidcn. ob im Plasma Schwangerer Fermente vorhanden sind, die Chorionzoiteri- bestandteile abi)auen. Als Substrat /u diesen N'ersuchen diente Pepton, das aus Plazenta gew^onnen war. Im Zusammenhang mit diesen Studien konnte auch ein Einblick in das Vei'halten des Plasmas wahrend der Kklanipsie gewonnen werden. Die Anvvendungsmöglichkeit der optischen Methode als Pt'adfindei in ist mit den genannten Peispielen noch keineswegs ei-schöpft. Fs sei nur daran erinnert, daß die optische Methode sich auch bei A najdi vlaxie- studien bewährt hat. Ferner düi-fte auch eine systematische N'erfol- gung der Präzipitinbildung neue Einblicke in dieses interessante Phäno- men bringen. Klinisch sind unzählige Fragestellungen angreifbar. Schon die Feststellung des Drehungsvermögens des Plasmas untei- veischieilen- artigen Verhältnissen mulJ zu bestimmten Resultaten führen, \erfasser denkt hiei' an die verschiedenartigsten Infektionskrankheiten, an Stoff Wechselstörungen, speziell an Diabetes etc.. ferner an Asthma. an Epilepsie usw. In keinem Falle ist zu erwarten, dal» die optische Methode auf bestimmte Fragestellungen ohne weiteres eine bestimmte Ant- wort gibt. Sie wird einzig und allein auf bestimmte Eigentümlichkeiten aufmerksam machen können. Es wäre z.B. denkbar, daß bei bestimmten Fällen von Diabetes ein auffallend hohes Drehungsvermögen des Plasmas vorhanden ist, das nach einer bestimmten Art dei' Ernährung sich in ganz typischer Weise ändert. Das Drehungsvermögen des Plasmas läßt sich mit wenig Plut in ganz kurzer Zeit feststellen. Ergibt ein großes Material die gleichen Kesultate, dann ist der Boden gegeben zu exakteren, mit anderen Methoden in Angriff zu nehmenden P'ragestellungen. Schon eine große Reihe von Beobachtungen des Drehungsvermögens des Plasmas bei verschiedenen Fällen von Diabetes, bei mannigfaltigen Infektionskrank- heiten, z. B. bei der Pneumonie etc., dürfte Anhaltspunkte zu neuen Fragen geben. Für die einzelne Untersuchung genügen "i -lOcm^ Blut. E> wird am besten direkt in das mit Ammonoxalat besc-hickte Zentrifugierröhrchen einlaufen gelassen. Nun schüttelt man ca. 5 Minuten und zentrifugiert. Das Plasma füllt man in ein V* c^w-Polarisationsrohr und liest ab. Der ganze Versuch nimmt höchstens 10 — 15 Minuten in Anspruch. Das Plasma kann dann noch zu anderen Versuchen Verwendung finden. In vielen Fällen lohnt es sich, das Drehungsvermögen des Plasmas ohne weiteren Zt^at/ wiederholt während mehrerer Stunden _al)zule.sen. Auch Beobachtimgcn nach Zusatz von Peptonen etc. sind von Interesse. Verfasser hat l>is jetzt nach dieser Richtung die Pneumonie und den Kotz eingehender studiert Ka wäre sehr erwünscht, wenn in klinischen Laboratorien die optischen Metho- den häufiger verwendet würde. Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arboitemethodon. V. 37 578 E. Abderhalden. Aus der Fülle von Fragestellungen, die sich ohne weiteies aus den bis jetzt erhobenen Befunden ergeben, seien noch folgende erwähnt. Der nor- male Organismus reagiert auf die Zufuhr ai'tfremder Stoffe mit der Mo- bilmachung von Fermenten. Wie verhält sich der kranke Organismus V Finden wir auch beim Diabetiker nach parenteraler Ilohrzuckerzufuhr In- vertin im Rlute .-' Weiterhin gibt uns die optische Methode die Möglichkeit in die Hand, nicht nur den Verlauf von Infektionskrankheiten zu verfolgen, sondern wir sind auch in der Lage, das Verhalten des Organismus nach Zufuhr von Antiseris zu studieren. Endlich ist die Möglichkeit gegeben, bei Verwendung bekannter Sub- strate das Wachstum von Mikroorganismen optisch zu differenzieren. Die verschiedenen Lebewesen greifen ein bestimmtes Substrat an ver- schiedenen Stellen an. Die Folge ist. daß verschiedenartige Bruchstücke entstehen. ITnsere Methoden reichen noch nicht aus, um diese selbst zu identifizieren. Vorläufig müssen wir die fortlaufende Verfolgung der Ver- änderung des Drehungsvermögens während des Wachstums der Mikroor- ganismen als Erkennungsmittel eines spezifischen Abbaus zu Hilfe nehmen. Die gegebenen Beispiele lassen ohne weiters erkennen, daß die optische Methode dazu berufen ist. noch nach vielen Pachtungen als Pfadfinderin zu dienen. Es sind bis jetzt nur ganz wenige Probleme durchgearbeitet. Es bedarf noch vieler Erfahrungen, um ihre Anwendung zu einer allge- meinen zu gestalten. Die wesentlichste Schwierigkeit beim Fahnden auf Fermente ergibt sich bei der Wahl des Substrates. Genuine Proteine sind in den meisten Fällen nicht zur Stelle. Wo es immer geht, sollte man von diesen ausgehen. Man könnte daran denken, bei der Prüfung auf Fermente, die auf Mikroorganismen, d. h. auf bestimmte, diesen ange- hörenden Bestandteile eingestellt sind, Preßsäfte aus diesen zu verwenden. Meist scheitert jedoch ihre Anwendbai'keit am Auftreten von Trübungen beim Zusammenbringen von Plasma resp. Serum und Preßsaft. Dazu kommt noch, daß Kontrollversuche notwendig sind, weil im Preßsaft der Mikroor- ganismen auch Fermente enthalten sind. Bis jetzt erwiesen sich durch partielle Hydrolyse gewonnene Pro- dukte am geeignetsten. Es sei die Darstellung von Seidenpepton genau geschildert, Darstellung von Seidenpepton, Als Ausgangsmaterial verwendet man Seidenabfälle. Diese werden, nach- dem sie 48 Stunden bei lOO" getrocknet worden sind, in TO^/oige (\o\. Proz.) Schwefelsäure eingetragen. Am besten geht man von 1kg Seidenabfällen aus und verwendet die öfache Menge Schwefelsäure. In neuerer Zeit hat \'erf asser aber auch weniger angewandt. Bei Verwendung der ^fachen Menge Avaren die Besultate noch ganz gute, während die Anwendung der 2fachen Menge unbefriedigende Besultate ergab. Es traten dabei schwer Die iiptisclio Motliodc mnl ilin- Ncrwoiitlniif,' hei liioloL'. Kniirt'stelliiiiuroii. r)79 lösliche liallerti^^e rrodiiktf auf, ilic die \veit<'re \\'rarl)(Mtiiiiann wird die Lösung mit der lot'achcii Mciit^r Wasser vcrdiiiint. nachdem vor- her das (iefäli mit der Seidcnpcptoidösnng in Kis gestellt worden ist. Nun entfernt man die Schwcfelsiinre durch Zusatz der hcn-ciineten Menge an festem, feingepulvertem Barvumhvdrowil. Ilicrhci wird fort- während umgerührt. Am Ix'sten turhiniert man das (ieinisdi. Nadi etwa iL^stündigem Stehen wiid dann das liaryunisnlfat durch doppelte Kalten- filter filtriert odei' durch mit Tierkohle getriinkte. gehärtete Filter ahge- nutscht. Dei- ßarvumsnlfatniederschlag wird wiederholt in der Ueihschale mit destilliertem Wasser von 2.')" zerrieben imd wieder durch Filtration oder durch Dekantieren vom Waschwasser getrennt. \'erfolgt man keine besonderen Zwecke, so kann man den Baryumsulfatniedj'rschlag auch mit Wasser auskochen. Fine (iefahr ist nur dann vorhanden, wenn die Neutra- lisation der Schwefelsäure mit Baryt keine ^icuügende war. d. Ii. wenn noch ein Cberschuli an Schwefelsäure oder an l!ai\t vorhanden ist. Durch das Kochen besteht dann die Mödichkeit eines weiteren Abbaues des Peptons bis zu Aminosäuren. Nachdem man sicli nochmals überzeiiirt hat, dal'i die vereinigten Filtrate vom Baryumsulfatniedeischlau frei von Schwefelsäure uml Baryt sind, wird unter vermindertem hruck bei einer 40" des Wasserbades niciit übersteigenden Temperatur eingeengt. Meistens verläuft die Destillation ganz ghitt. manchmal jedoch verhindert lebhaftes Schäumen der Flüssigkeit das F^im'ugeii. In diesem Fall kommt man am besten zum Ziel, weini man die Seidenpeptonlösung während der Destil- lation aus eiiu'm Scheidetrichter in den Destillationskolben eintro|ifen läl.)t. Hat man die Seidenpei)tonlösung auf ein kh'ines \'olumen gebracht. dann prüft man noch einmal auf Schwefelsäure und I^aryt. Aus unbe- kannter Ursache entziehen sich oft ganz beträchtliche Mengen von Baryt dem Nachweis. Es empfiehlt sich, auf alle Fälle eim- i'robe einzudampfen und zu vera.schen. Ergibt sich ein Baryum enthaltende)- Rückstand, dann verdünnt man am besten die Seidenpeptoidö.sung und erwärmt sie auf etwa 60° und fügt nunmehr die berechnete Menge Schwefelsäure hinzu, (iewöhnlich gelingt es dami leicht, die letzten Keste von llaryt zu entfernen. Nunmelii- engt man die Seidenpeptonlösuni^ noch weit»'r ein, bis sie dickflüssig wiid. .letzt ti'ägt man die gelbbraun gefärbte Lö- sung unter beständigem l.'iiliren in absoluten Alkohol ein. I>ai)ei fallt das Seidenpepton in I<'orm \on lielliielii gefärbten bis farblosen Flocken aus. Es ist von Wichtigkeit, das Zuiiielien der Seidenpe|)tonlösung zu einer bestimmten Menge Alkohol nui- so lange fortzusetzen, als das Seideu- pepton sich sofort in fester Form und möglichst farbh)s abscheidet. So- bald das Seidenpejjton in Sirupform im .Alkohol untersinkt, mnl» der Zu- satz von Seidenpeptonlösung abi^cbrochen werden, d. h. man nimmt eine neue Menge Alkohol und beobachtet hier dieselben \ Orsichtsmaliregeln wie vorher. Man kann so aus \ kf/ Seidenabf.dlen leicht 2(K)— .-»(X)// und mehr Seidenpepton erhalten. Dampft man die alkoholischen l'iltrate nochmals «'in 580 E. Abderhalden. und wiederholt man den ganzen Prozeß, so kann man noch ganz beträcht- liche Mengen von brauchbarem Seidenpepton gewinnen. Noch reinere Präparate von Seidenpepton erhält man, wenn die wässerige Seidenpeptonlösung möglichst stark eingedampft und dann der Rückstand mit Methylalkohol ausgekocht wird. Die heiße methylalkoholische Lösung wird dann in absoluten Äthylalkohol eingetragen. Die so darge- stellten Präparate lösen sich in Wasser sehr leicht und geben eine hell- gelb gefärbte Lösung. Die Reaktion der Lösung ist schwach sauer bis amphoter. Die Substanz ist nicht hygroskopisch. Noch reinere Präparate, die speziell für die optische Methode zu empfehlen sind, werden gewonnen, wenn die wässerige Seidenpeptonlösung aus l/'/oiger Lösung mit lOVoigci" Phosphorwolfram Säurelösung gefällt wird. Wird der Niederschlag in der üblichen Weise mit Baryt zerlegt, dann erhält man schneeweißes Seiden- pepton, das vollständig luftbeständig ist und absolut farblose Lösungen gibt. In genau der gleichen Weise können nun auch Organe, Mikro- organismen etc. partiell hydrolysiert werden. Die Erfahrung muß von Fall zu Fall zeigen, ob der Abbau ein genügender ist oder ob er gar so weit gegangen ist, daß die spezifische Struktur des Proteins ganz . ver- wischt worden ist. Hier lassen sich keine allgemeinen Regeln angeben. Man ist auf die Versuche selbst angewiesen. Bis jetzt sind aus Rotz- bazillen, Tuberkelbazillen, Staphylokokken, aus Tier- und Menschenblut, aus Plazenta, aus den verschiedenartigsten Organen und zahlreichen Proteinen durch partielle Hydrolyse Produkte ge- wonnen worden, die sich beim Suchen nach Fermenten bewährten. Selbst- verständlich muß das Substrat genügend organische Substanz enthalten und in einer Konzentration anwendbar sein, die ein deutliches Drehungsver- mögen aufweist. Geht man von Lösungen aus, die sehr verdünnt sind, so kann man nicht erwarten, deutliche Drehungsänderungen zu beobachten. Es empfiehlt sich im allgemeinen, mit lO^oigen Lösungen der Peptone in isotonischer Kochsalzlösung zu arbeiten. Diese müssen voll- ständig klar und farblos sein. Sind Trübungen vorhanden, dann muß filtriert werden. Oft genügt die Filtration durch ein gewöhnliches Filter. Kommt man damit nicht zum Ziele, dann saugt man die Lösung am besten durch eine Chamberlandkerze. Um gut vergleichbare Versuche durchführen zu können, ist es sehr wünschenswert, von einer größeren Menge einer bestimmten Peptonlösung auszugehen. Sie läßt sich leicht aufbewahren, indem man das Pepton in physiologischer Kochsalzlösung löst, die man vorher mit Chloroform geschüttelt hat. Oder man überschichtet die Lösung des Peptons in physiologischer Kochsalzlösung mit Toluol. Die einzelnen Proben entnimmt man dann mit einer Pipette. Die größte Schwierigkeit in der Anwendung der Methode ergibt sich aus dem Verhalten der Peptonlösung gegenüber dem Plasma re- spektive Serum. Daß dieses selbst vollständig frei von Bestandteilen der Formelemente des Blutes sein muß, wurde oben schon betont. Ist die Peptonlösung sorgfältig dargestellt worden, so bleibt das Gemisch von Die optisflio Mctliudr und ilirc Xeiwciiiliinp lioi liioloir. l-ragcstollungen. ;">K1 l'eptüii und l'.hitilüssii^kcil meist uaiiz klar. Kiitliiilt dage^'oii die Lioiiii^; noch Spuren von Haiyt odei- Sclnvcfolsäuro oder sonstifi;e zum Pepton nicht hinzui>ehören(h' Stoffe, wie /. \\. reichlich Salze, dann sind Trühunt^en bis Fälluniicn unvernieidhar. Auf die Darstelhinj,'' des Peptons mul.) die allergrößte Sorgfalt, verwendet werden. Bei allen wichtigen Versuchen sind nur gereinigte Peptone zu verwenden. Das Ahfiltrieren entstandener Trü- l)nngeii enii)fiehlt sich nicht. Kinnial können in s(M- \ cii/'' Plasma und 1 -■//' der lOVoii^en Peptonlösung. dazu koiumt dann, um das Polarisationsrohr zu füllen, physiologische Kochsalzlösung. l»a Temperaturunterschiede nicht ohne Finfluli auf das Drehungsvermögen von Lösungen sind, ist es von gröl-ter Wichtigkeit, während der uanzen P.eobachtuuL'-sdauer bei gleicher Tem- 582 E. Abderlialdeii. peratur zu arbeiten. Fast alle bisherioen Untersuchungen sind bei :>7" aus- geführt worden. \' erwendet man zu den A'ersuchen die gewöhnlichen Po- larisationsrohre, dann läuft man (iefahr, dali während des Al)lesens die Temperatur sinkt. Bei großer f^bung reduziert sich die Ablesungszeit auf ein Minimum. Besser ist es auf alle Fälle, Polarisationsrohre anzuwenden, die von einem Mantel umgeben sind, der mit Wasser gefüllt werden kann. (^'gl. die Fig. 146.) Am besten geht man so vor, daß man den Mantel des Polarisations- rohres mit Wasser von ca. 45" füllt. Man kontrolliert dann mit dem Thermometer, bis der Mantel eine Temperatur von oT" zeigt. Jetzt füllt man das Gemisch ein. Es ist unter allen Umständen besser, das ganze Gemisch in einem Pteagenzglas vorzubereiten und nicht im Pohr selbst zu mischen. Trübungen lassen sich so leicht vor dem Einfüllen erkennen. Das Polarisationsrohr wird nicht gleich verunreinigt und steht zu weiteren Versuchen bereit, falls eine Probe unbrauchbar ist. Nun wird sofort das Drehungsvermogen aligelesen. Zu all diesen Versuchen ist unter allen Umständen ein erstklassiges Instrument not- Avendig. Arbeitet man mit einem der gewöhnlichen Polarisationsapparate. dann läuft man Gefahr, durch Ablesungsfehler grolle Täuschungen zu erleben. P)ewährt hat sich bis jetzt nur der dreiteilige LandoJt-Lipjnchsche Polarisationsapparat. Er wird von der Firma Schmidt & Hänsch, Berlin, nebst den nach den Angaben des \'erfasser für diesen Zweck konstruierten Polarisationsröhren geliefert (vgl. die nebenstehende Abbildung). Nur Unter- suchungen, die mit einem sehr guten Polarisationsapparat ausgeführt sind, haben Anspruch auf Zuverlässigkeit. Die Ausschläge, die man bei der- artigen Untersuchungen erhält, sind naturgemäß keine großen. Die einzelne Ablesung muß daher mit großer Exaktheit vorgenommen werden können. Am besten läßt man der sofortigen Ablesung nach .ö Minuten eine ZAveite folgen. Nun hat das ganze (iemisch sicher o7°. A'on nun an liest man in bestimmten Zeitabschnitten regelmäßig ab. Meist genügt es, wenn alle Stunde abgelesen wird. Mehr als zwei Tage wird man meist nicht beobachten. Unter allen Umständen muß man Kontrollversuche ausfiUiren. und zwar bei jedem Einzelversuch. Einmal ist das Pepton als solches zu prüfen, dann wird ein Bohr gefüllt mit der Peptonlösung und Plasma re- spektive Serum von einem normalen Tier und endlich läßt man gleich- zeitig einen Versuch mit dem inaktivierten Plasma (Erwärmen auf 60'^') laufen. Durch die Kontrollversuche schließt man Täuschungen aus. ]\Ian wird auch nie sich mit einem ^'ersuch liegnügen dürfen. Nur der mehr- fach erhobene gleichsinnige Befund ist von Wert. Meist verlaufen die Versuche in der geschilderten Weise ganz glatt. Die Piesultate lassen sich in Kurven wiedergeben. Auf der ( )rdinate zeichnet man z. B. die in bestimmten Zeiten festgestellte Drehung auf, und auf der Abszisse trägt man die Zeiten ein. Unbrauchbar werden die Versuche, wenn während der Beol)achtung sich Trübungen und Fällungen zeigen. Es ist besser, in solchen Fällen den Die optischo Motliiidc und iluf \ ciwciulimt,' liri liioloi:. Fr;igestelluii:;i-ii. _,is.i Versuch ahznhrwlicn. Dui-cli das Ausfallen or^'^anischcr Substanzen kann an und für sich ciiu; l)i('liun{i;siinderunj;- auftreten, (»hin' daC eine Kermcnt- wirkuiii»- vorliegt. Setzt sich der Niederschlag im Köln- iili. dain> kann man in besonderen Fällen auch weitei" beobachten. Man muri in diesem Fall dann nur die Drehungsändernng vor der Fällung in lletracht ziehen und dann gewissermalien für die weitere Beurteilung des \ erlaufs ;/-Höhreii auskommen. Nur. wenn die Lösung intulge des Farbstoffgehaltes des l'lasmas in gröl.ierer Schicht nicht genügend durchsichtig ist'), wird man ' ., oder gar '., f////-IJohre anwemlen. liCtztere eignen sich vorzüglich zur Bestimmung des Drehuiiüsver- mögens von Plasma. Auch zum Studium der Präzipitinbilduug eignen >icli diese kurzen Rohre sehr gut. I>ringt man zwei Sera zusammen, so wird sich das Drehungsvermögen beider addieren, wenn nicht besondere \'erli;dt- nisse vorliegen. Hat man Sera, die aufeinander eingestellt sind, dann lassen sich oft deutlich beim Vermischen Werte beobachten, die mit dmi berechneten nicht übereinstimmen. liier liegt noch ein weites I-"eld zu um- fassender Anwenduugsweise der .Methode vor. Die Anwendungsweise der optischen Methode zur Prüfung auf Drehungsänderung bei Verwendung von Plasma und Le])t(Mdösung k.mn in genau der gleichen Weise auch auf Polypeptide und Kohlehydrate übertragen werden. Selbstverständlich kann auch ein eventueller Abbau von Nukleinsäuren und deren Abbauprodukten verfolgt werden. Es sei ein Beispiel angeführt. Ein Polarisationsrohr, das S cm' fallt, wird gefüllt mit einem Gemisch von Oö ry^^ Serum, 0-ii ci»-^ einer ö» „igen Ilohrzucker- lösung und 7 cm'^ physiologischer Kochsalzlösung. Nun wird die Anfangs- drehung festgesteüt und dann von Zeit zu Zeit die Drehung abgelesen. Zum Schlüsse sei nochmals betont, dab die optische Methode nui- als eine Pfadfinderin aufzufassen ist. Sie in uocli weiteres Feld ■;iiliern. ;il«. es his jetzt der Fall war. Die wichtigsten Methoden beim Arbeiten mit Pilzen und Bakterien. Von Franz Fnhrniann, Graz. Anlage von Massenkulturen auf schräg erstarrten Nährsubstraten. Man benutzt als Nährböden entweder Nährgelatine, Nähragar, Blutserum oder Gemische der genannten Nährsubstrate. Nach dem Vorgange von Paul Lindner ^) dienen vierkantige Glasflaschen von etwa bO—^Ocm^ Rauminhalt als Kulturgefälie. Diese Kulturflaschen werden wie Eprouvetten mit einem Watteverschluß versehen und vor ^'^■^''- dem Einfiülen des Nährmittels im Heißluftschrank bei 155 bis 160° C 2 Stunden trocken sterih- siert. Je nachdem man eine dickere, schräg erstarrte oder dünnere flacherstarrte Nährbo- denschichte benützen will, füllt man mehr oder weniger vom ver- flüssigten Nährsubstrat ein, steri- lisiert dreimal diskontinuierlich und läßt dann erstarren. Dabei liegt die Flasche mit ihrer Breit- seite entweder eben am Tisch oder schräg durch Anbringen einer Unterlage. Nebenstehende Fig. 147 zeigt uns die Kulturflasche mit dem Nährsubstrat beschickt auf dem Tisch eben liegend und unter- stützt zum schrägen Erstarren des Nährbodens. Mit Litiditer überein- stimmend sei, abgesehen von ihrer geringeren Zerbrechhchkeit , als Vor- teil derselben besonders hervorgehoben, daß sie ohne Gestell von selbst sicher und fest steht. Außerdem bieten diese Kulturen die Annehmlichkeit, beträchtliche Mengen von Bakterienmaterial auf der großen Nährboden- Kulturflasche nach Paiil Lindnrr. *) Faul Lindner, Mikroskopische BetriebskoutroUe in den Gäruugsgewerlieii. S. Berlin, Paul Parey, 1909. 207. Die wichtipstoii Motliodon \mm Arboitm mit l'ilziMi iiml Halitoruii. .",^0 Oberfläche zu erhalten, oliiic Venuireiiii^'uni.'-en het'üichteii /n müssen, dk» l)ei der XerwendunL^' von Platten in iVtrischalen /ii Massenkiiltiiren .sich nur allzuleicht einschleichen. Durch den verhältnisniärii^' enrimi)funi: diircli l'bergielk'ii mit der llakterienemulsion vorzu- nehmen. Man schwemmt in einem Proberöhrchen mit steiiler O'Tö'^ „ij^er C'hlornatriumlösung- eine Reinkultur der betreffenden liakterienart auf und gielit nach .Vbflammung des Proberöhrchenrandes und des Kandes der Kulturflasche die Bakterienaufschwemmung in das Kulturgefäb, bedeckt damit durch vorsichtiges Neigen die ganze Nährbodenol)ertl;iche und schüttet den Ilberschuli weg. Der benetzte Flaschenhals wird in der Flamme vor- sichtig bis zum Trocknen erwärmt, dann kurze Zeit eihitzt und hierauf dei- Wattebausch wieder eingesetzt. Auf diese Weise bedeckt man die jranze Nährbodenoberfläche gleichmäßig mit Bakterien und eriiält innerhalb weniger Tage eine Massenkultur, die man mit der sterilen Platinöise leicht ab- heben kann. Burris Tusclieverfahren zur Reinkultur aus einer Zeile.'» Das Tuscheverfahren von Burri eignet sich zur Ileinkultur aus einer einzelnen Zelle für alle züchtbaren Bakterienarten. Hefen- und Schimmel- pilze und kann wegen seiner leichten Ausführbarkeit bestens empfohlen werden. Auüerdem bietet es für das Studium der Koloniebildunt: und der Vermehrung der P»akterien ein wertvolles Hilfsmittel. Das Verfahren besteht aus zwei Teilen, der Lsolierung des Keimes und der Zucht desselben. Der erste Teil, die Isolierung, ist in allen Fällen die gleiche. Die Zucht dagegen kann allen Ansprüchen der be- treffenden Mikrobenart angepabt werden, da der einmal i.solierte Keim leicht in jedes beliebige Nährsubstrat eingebracht und unter den ver- schiedensten Bedingungen gehalten werden kann. Zur .\usfiihrung der I.so- lierung braucht man folgende (ierätschaften. 1. Fine (Jhisglocke von 10 — lö cm Durchmesser. 'J. Sterile Objektträger größeren Formates. Sehr zweckmäiiig sind solche vom Formate H\ ::\'y ttnn. Die Objektträger sind entweder durch Erhitzen in der Flamme unmittelbar v(U' dem (lebrauche zu sterilisieren oder in kupfernen Büchsen im Heiriluftsterilisator keimfrei zu machen. Sie müssen sehr gut entfettet sein. Am boti'u ist es. die Objektträirer mit alkalireichei" Waschseife und Wasser unter Zuhilfenahme eines entfetteten Wattebausches zu reinigen und senkiccht aufgestellt zu trocknen. 3. Sterile Deckgläser vom Formate IS : 18- 20 : 20 /////' und sterile Deckglassplitter von unaefähr ."> — f) tiiin Seitenlänge. Ihori sterilisiert - und sind zu vernn'iden. Die Tu sc h eni etil od e fulU nun darauf, dali in der dünnen Tu.sche- schichte die Üakterien und Heien, hei durchtallendeni Licht betrachtet, als helle Stellen besonders aus;:>ezeichnet sichtbar sind. Wenn man nun in der Tusche Bakterienmaterial so verteilt, dal', kleinste TniptVhen der Tusche- bakterienmischuni»- meistens nur I Zelle enthalten, so ist diese in dem kleinen Tropfen gut sichtbar, bzw. es ist leicht, jene Tiopfen auszu- wählen und anzumerken, die nur eine Zelle enthalten. Der mit dem sterilen Decki>las bedeckte Tuschetropfen mit dei- einen Zelle kann nun (lauernd beoliachtet und die Koloniebilduuii- unt<'rsu(dit werden. .\b- impfuni>en der entstandenen Kolonie ergeben also sicher Kul- turen, die nur von einer einzigen Zelle abstammen, fberdies bleibt beim Abheben des Deckgläschens der Tuschetropfen samt der einzelnen Bakterienzelle an demselben haften und kann -o in jedes beliebige Xährsubstrat übertragen werden. Man erhidt dann dort eine Kultur, ausgehend v(ni einei- einzigen Zelle Diese Eigen.M'haft (\{'s Haftenliieibens macht diese Heinzuchtmethode ,so aur.erordentlich wei1- voU. \ iele Bakterien, wie gewisse Spirillen, rurpurbaktei-ien. Kisenbakterien etc.. sind mit Hilfe dei' galleiligen Nährsubstrate schwierii:- oder häufig- gar uiclil rein zu kultivieren. Mit dem Tuscheverfaliren iiclingt es sehr leicht, indem mau einfach eine Zelle in das sterilisierlr .\usgangsmaterial (Teichwasser etc.) Iiineinverimpft. Tusche vei'liält sich übrigens gegenüber maucln ii l'.akteiienarteu als wachstumshemmend, weshalb sichei' zum Zieli' bei allen Ai'feu um- die Isolierung mit sofortigei' nacliheriger fberti'aiiunL; dei' einzelnen Zi'llc in ein neues flüssiges Substrat fühi-t. .Man trachte daher immer. >o r.ivcli .ds möglich zu aibeiten. Der .Vibeitsgaug ist nun folgende)-: l m nuiglichst staubfrei zu aibeiten. überwischt man den Arbeit^^tisch luit öOVoi.i^''"' Alkohol. .M;iu liiel'it d.inn mit 10" oJ,ii''i" Nährgelafiiie Platten in Pe^nsche Schalen. Nach dem Erstarren derselben entnimmt mau dem Kupferblechbehälter einen sterilen Objektträger oder sterilisier! einen solchen durch Kiliitzeii in der Flamme. Nach dem Kikalteii legt mau ihn auf den Tisch und bedeckt ihn sofort mit dei- ( ila^iilocke. .letzt glüht mau die beiden Platinöseii ans und sterilisiert die Zeicheiifeder durch V(»r- sichtiges Krhitzen in dei- Flamme. Mau /ielit zu dem Fnde die Feder samt dem Halter rasch eiiiiiii- Male durch dir I lamme. Sic darf aber nicht ;^liHie!Ml weiden, damit die Spitze nicht leidet. Nun stellt man noch ein (Jlav mit Wasser liaiidgerecht in die Nähe. .Man bringt nun rasch vier Tr«>pfeu Tusche mit di-r grol'ien (Vsc« auf den steiilen ( )bjektträucr. etwa in dei- .\nordnuiig. \\i<' .1 iler I-'igur 1-4H 588 F- Fuhrmann. zeigt. Damit die Tusclio in der Öse nicht ciiitiockiiet und einen Asclien- rückstand beim Glülien gibt, spült man im bereitstehenden Wasser die Öse knrz ab. Jetzt entnimmt man mit einer Phitinnadel etwas ]3akterien- material und verteilt es rasch nnd tüchtig in den ersten Tuschetropfen. Nun bringt man mit der kleinen Öse ein wenig vom ersten Tropfen in den zweiten, verteilt wieder gleichmäliig, vom zweiten in den dritten usf. Jetzt taucht man in den letzten Tropfen die Feder mit dei- kon- kaven Seite ein, wobei man den Halter möglichst horizontal hält, wie es E der Figur 148 zeigt. Auf der Gelatineplatte erzeugt man hierauf rasch kleine Tuschpunkte, indem man bei fast senkrechter Haltung (h'r Feder die Spitze derselben mit der Gelatineoberfläche kurze Zeit eben in Be- rührung bringt, ohne die Gallerte zu verletzen. Die Federhaltung ist in Figur 148/' wiedergegeben. So führt man in nächster Nähe 6 — 8 Punkte aus und kontroUiert mit der i)-Linse von Zeiß und einem stärkeren Okular die 'Iröpfchen sofort unter dem Mikroskop auf ihren Bakteriengehalt. Finden sich keine Tröpfchen mit einer Zelle, sondern nur solche mit mehreren, so legt man eine neue \'(M"dünnungsreihe an. Sehi* bald bekommt man für die Beurteilung der Imi)fnienge eine groUe Übung. Aul^erdem dürfen die Tröpfchen nicht gröUer ausfallen als das (iesichtsfeld der Zeiß- hnsejPoder wenigstens E, um den ganzeii Tropfen auf einmal überschauen und durchmustern zu können. Stimmt die ^'erdünnuug und die Tropfengröße, dann schreitet man auf einer frischen Gelatineplatte zur endgültigen Ileinzucht. Will man unmittelbar auf der Platte züchten, dann bringt man die Tuschepunkte so an, daß regelmäßig in einem (ieviert verteilt, auf 18mm Seitenlänge je 5 — 6 Punkte kommen. G der Figur 148 zeigt uns Unks unter einem Deckglase die Anordming der Punkte für diesen Zweck. Jetzt spült man die Feder in Wassei' ab odei' bei pathogenen Arten am besten in einer Formollösung und trocknet mit einem weichen Tuche ab. Nunmehr bedeckt man die Tuschepunkte mit einem sterilen Deckglas und mikroskopiert bei stärkerer Vergrößerung Tropfen für Tropfen. Alle jene Tröpfchen werden notiert, die nur eine einzige Zelle ent- halten. In Figur 148 i/ ist ein solcher Tropfen mit nur einer Stäbchen- bakterienzelle abgebildet. Er füUt das durch eine Kreisünie angedeutete objektive Gesichtsfeld der i'-Linse von Zeiß nicht einmal aus. Sobald sich nach einigen Stunden oder Tagen eine kleine Kolonie von der einzelnen Zelle ausgehend gebildet hat, impft man nach Abnahme des Deckgläschens unter mikroskopischer Kontrolle mit der Impfnadel in einen beliebigen Nährboden ab. In vielen Fällen wird man so zum Ziele kommen, in der Mehrzahl der llntersuchungen aber nicht. Denn abgesehen davon, dal) die Tusche selbst auf zahlreiche Bakterienarten wachstumshemmend wiikt. ist Nähr- gelatine an und für sich ein Nährsubstrat, das sich vielfach zur Zucht nicht eignet. Weitaus besser ist es daher, die Gelatine zui' Isolie- rung zu verwenden und in einem anderen tauglicheren Substrat zu züchten. Die wichtigsten Metliodni lieini Arbeiten mit I'ilzon und B:ikt<'ri.-n. ')89 In (licscin Falle verfährt man folüciiilennal'icii: Ks werileii die Ver- diiniiuiiiioii wie IViilicr aii^cHcheii aii^dei^t. dami die rrohetropfeii auf einer (ielatiiie gemacht und hei entspnrhender \ erdüimiin- die endi^iilfiL'«-!! Tröpfchen sofoit auf einer neuen (;('hitinei)latte her;.M'stellt. Man niaeht sie aher nicht icuclmälli^ in kleinen Ahständen. sonch'rn in j^rölieren Ah- ständen von 10 20ni)n. Dann hedeckf man jedes Tröpfchen mit einem sterilen I)ecki>iassplittei-. der mit eim-r sterih-n Federzanji-e auff;ele^'t wird. Nun unteisucht man die einzelnen 'l'röpfchen mikroskopisch und heht mit der steiilen Tinzette diejenincn Deckpliittchen wieder al>. unter denen ein Tröpfchen mit einer einziijen Zelle sich hefindet. Dabei hleiht das 'l'usche- tröpfclieii samt der Zelle auf dem Deck^^läschen haften. So ^'clinj^^t es. mit dem Deckiiläschen die isolierte Zelle in jedes beliel)it. So wird man bei strenf?en Anaerobiern die einzelne Zelle in ein Röhrchen mit verfliissisarme oder nahruiigsfreie Substrate zu l)riui>eu. die feucht gehalten und dem Luft Sauerstoff leicht zugänglich sind. Wohl als beste Unterlage bewährte sich der Gipsblock oder der in die Eprouvette eingelegte ( Jipsstreifen. Zur Feuchthaltung dient steriles Leitungswassei-. Der ursprünglich vou Engel schon angegebene (iipsblock wurde dann von Emil Christian Hansen zweckentsprechend abgeändert und in dieser oder ähnlicher Form auch jetzt für die Sporenuntersuchungen bei der Hefe verwendet. Der (iipsblock ist ein Kegelstumpf von etwa 3 — 4: cm Höhe und 5 6cm P.reite an der Basis; die obere Fläche besitzt einen Durch- messer von 4: bctn. Man steht sich diese Gipsblöcke auf A'oi'rat selbst her. indem man S liaumteile frischen (ups mit 3 Raumteilen ^^'asser zu einem steifen Drei vei'rührt und diesen in eine entsprechende Dlechform preßt, die aber nicht gefettet sein darf. Man steht dabei die Blech- form mit der kleinen Fläche auf eine blanke (ilasplatte. Nach 2- 3 Stun- den läßt sich der Block sehr leicht herausdrücken, sofern man daiaut achtet, daß die lilechform keine Eindrücke hat. Der frische (iipsblock wird ruin gi'ündlich in Wasser ausgekocht und dann in Filtrierpapier ge- wickelt im Heil'iluftsterilisator bei 110" duich ein und eine hah)e Stunde erhitzt. Dabei trocknet er stark aus und ist dann auch keimfrei. Jetzt ist er gebrauchsfertig. ( ileichzeitig- bereitet man Schalen mit Deckeln vor, die imr lose aufliegen und der Luft genügend Zutritt gestatten. Diese Schalen soUen füi- di(^ angegebene (üpsblockgröße eine Höhe von 5 cm und einen Durchmessei' \o\\ 8 cm aufweisen. Sie werden in Papier eingewickelt und in der üblichen Weise trocken sterihsiert. Die Hefe muß für die Gipsblocksporenkultur ebenfahs vorbereitet Averden. Man züchte sie möghchst in einem flüssigen Nährsubsti'at. und zwai' in zwei (ienerationen. bevor man zur Sporenzucht schreitet. Nach den Untersuchungen von Hansen^ Aderhold u. a. tritt bei Hefen die Sporulation schwer ein, wenn sie längere Zeit in stark alkoholhaltigen Nährsubstraten sich befunden haben. Jede ältere Kultur weist diese Erscheinung auf. Demnach soU die Aussaat zur Sporengewinnung von gutgenährten, jungen Kulturen erfolgen, die in optimalen Ernährungs- bedingungen und Temperaturverhältnissen waren. Bierhefen wird man demnach vorher in ungehopfter Bierwürze, Weinhefe in Most usf. züchten. Man legt eine erste Vorkultur an. die man einige Tage bei Zimmertemperatur hält. Wählen wii' als Beispiel Bierhefe. Diese verimpfen wir in einen Kolben mit steriler, durchlüfteter, nicht gehopfter Bierwürze und lassen sie einige Tage hindurch gären. Von der entstandenen Bodensatzhefe überimpfen wir mit einem sterilen (ilasrohr in eine frische Bierwürze und züchten nunmehr bei 25" C durch 24 Stunden. Es hat sich wieder Bodensatzhefe g^ebildet. die nun auf einen (iipsblock übertragen wird. Dabei verfahren wir folgendermaßen: Der (jipsblock wird aus dem Papier gewickelt und ohne Finger- bertihrung in die eröffnete, sterile Kulturschale geroht. Nun entfernt man die über der Satzhefe stehende Flüssigkeit der zweiten Vorkultur durch Die wichtigsten Mctlioiloii heim Ailipiteii mit i'ilzcii iiml Hiiktorioij. r,g| l'ii?. 14!l. Kig. l-iO. ! sehr vorsiclitiiics Al),üici;('ii. Ndn der r.(Mlt'iisat/lictf üIm rtrii;;! man iiitn mit ("iiicm sti'iik'ii (ilasrolir ein w.-nin mit ,|i,. ,,1mmc Fläche des (iijislilorkcs 1111(1 broitot sio über die ()l)crtl.i( lic ;iii>. Niiiiiiit-hr l:ii;t man. chiir die (iil)shlockoi)('rflii('h(' zu hcspülcn. stcrilrs Wasser in die Sdialc laiif.-n : das Wasser soll anfangs etwas über die Milte des Dlorkes reichen. Nach- dem er sich von iintni viüli- diiichfeiichtet hat . i>t dann i^eiade der richtii-c Wasserstand erreicht. Dann schlielW man (h-n Schalendeckel und züchtet hei 25" C. Schon nach 24 Stunden werden wir die AnfiinLM- der Sporenl)il(lnnu beobachten köniK'ii und nach 4^ Stund. -n ivichlicli tVrti^M' Sporen. l"i^. 149 zeiiit nn> die eben fertiu «gestellte (ii|»s- l)locksj)orenkiiltiir im hnrch- schnitt. Ks wird natürlich iiiiler den iieiiannteii Versuchsbe- tliiiiiiiniicn besonders bei lim- iicrer Beobachtnnusdaner schwierig sein, eine solche Sjjoi'enkultur rein zu erhalten. Diesem Übelstand abzuhelfen, verwendet Schiüfininy ein Hansenkölbclieii . in dein der (iipsblock im kleinen aniicleut wird. Man kann sich aber mit Ki)rouvetten ausüczeichnet helfen, in die man (iips- streifen einbriniit. Für die Herstellung: der (iipsstr«'ifen verwendet man rechtwinklig' al).U('boiii'iie Hlechstreifeii oder Kahmeii. wie sie zur l'araffineinbettunii benutzt werden. Den obeniiciiannten (üpsbrei ininiit man in diese auf (ilasplatten liei>enden Formen in H \ iinii dicker Schicht. Nach dem Frstarren kocht man die Streifen eine halbe Stunde in Wasser aus und briniit sie noch feucht in die sterilisierten mit Watte verschlossenen Froberöhrchen. Die mit den (üjisstreifen beschickten IJöliichen werden dami 1 Stunde im Trockeiisclii ank bei 1 10" (' erhitzt und. sind nun iiebraiichsfertiü. Man verimpft das Hefenmaterial mit eiiu' Flatinü.se auf den oberen Teil (Ws Streifens und lälit mm etw.i 1 mi hoch steriles Wasser ein- flieüeu. Firsere Fii». löO zeitit die (iipsstreifenkulturridiren fertiii im l^Mier- schnitt dar<:estellt. Diese Si)(M-enzüchtuiiii auf (li|)sblöckeii und (iipsst reiten tand eiL:eiitlich l)ei den 15akterioloakterien verhalten sich i;anz so w'w die Saccharoinyzeten. .Mit Hilfe dieser Kulturmethoden bekommt man ebenfalls eine aiiberoi-dentlich rasche und prompte Sporenbihliin.ü. Hesondei> bemerkenswert ist die (ileichmiibiijkeit des Voriian^es in den meisten aiis^^csäteii Zellen. Natürlich nuib man auch hier von iiinuen. uut i^cnährten und in voller l'.ntwicklun.ii bei:riffenen 592 F. Fuhrmanu. Bakterien ausgehen. Man kann sowohl Flüssigkeits- als auch Agar- oder Gelatinekulturen als Ausgangsmaterial wählen. Aber auch zur Untersuchung der verschiedenen Entwicklungsstadien nicht sporenbildender Bakterienarten ist die Zucht auf der Gipsplatte ausgezeichnet verwendbar, da hier die vielen Involutionsformen sehr in den Hintergrund treten. Man vermeidet ja die Anhäufung schädhcher Stoffwechselprodukte, die diese Formen be- sonders hervorrufen. Es läßt sich so klar und einwandfrei entscheiden, wie Bakterien, die in voller Lebenskraft sich befinden, auf den Mangel an Nährmaterial reagieren und welche Organisationserscheinungen sich dabei abspielen. Kultur anaerober Bakterien. Wenn auch die im V.Band der Arbeitsmethoden beschriel)en('ii Apparate und Versuchsanstellungeu zur Gewinnung und Züchtung anaerober Bakterien- arten ausreichen, so gestatten sie dennoch nicht, die Sauerstoffminima zu bestimmen, bei denen Wachstum überhaupt noch stattfindet oder die Sporenbildung und Sporenkeimung einsetzt. Für die physiologische Charak- terisierung der Mikrobenarten sind solche Untersuchungen abei- äußerst wertvoll, wie aus den schönen Arbeiten Arthur Meyers und seiner Schüler hervorgeht. Arthur Meyer^) und G. Bredemann-) haben nun eine Versuchsan- ordnung zur Bestimmung der Sauerstoffminima angegeben, die in bezug auf Brauchbarkeit und Genauigkeit für biologische Versuche vollauf genügt. Meyer benutzt eine Art Exsikkator als Kulturgefäß, in dem aus dem darin herrschenden Druck die vorhandene Sauerstoffmenge im Liter in Milligrammen bestimmt wird. Für die Bestimmung der niederen Drucke dient ein in das Kulturgefäß eingehängtes Quecksilbermanometer, während größere Drucke in einem dem Kulturgefäß außen angeschlossenen Queck- silbermanometer gemessen werden. Die Luft Verdünnung wird mit einer öer«/Ä:-Luftpumpe von Arthur Pfeiffer in Wetzlar vorgenommen. Letztere soll sich dafür ausgezeichnet bewähren, sofern eine Trockenröhre zwischen Kultur und Pumpe zwischengelegt ist, um eine Durchfeuchtung des Öles der Pumpe sicher hintanzuhalten. Von der Beschreibung der Pumpe kann hier abgesehen werden, da dieselbe im ersten Band der Arbeitsmethoden, S. 138 (samt der Literatur) beschrieben ist. Natürhch können auch Queck- süberluftpumpen an die Stelle der Ölpumpe treten. Die ,.Trockenröhre nach Arthur Meyer'' ist so zusammengesetzt, daß sie einerseits organische Dämpfe der Kulturen möglichst durch kon- zentrierte Schwefelsäure absorbiert und andrerseits jede Spur Wasserdampf ') A. Meyer, Apparat für die Kultur von anaeroben Bakterien und für die Be- stimmung der Sauerstoffminima für Keimung, Wachstum und Sporenbildung der Bak- terienspezies. Zentralbl. f. Bakt. 11. Abt. Bd. 15. 1906. S. 337. -) G. Bredemann , Bacillus amylobacter A. M. et Bredemann in morphologischer, physiologischer und systematischer Beziehung. Zentralbl. f. Bakt. II. Abt. Bd. 23. 1909. S. 411. Die wichtigsten Motliodeii lioim Arhoiteii mit l'ilzcii timl Hakterion. r»*»3 (Inrcli riiosi)liorpoiitoxy(l ciitrcnit. Ww aus V\9^ wie aus der Fi^-. 102« oliiic Scliwicrijikcit /ii ciitiicliiiicn i>t. liilol{,'e dieser siiuircichcii Konstruktion ist eine uusM-czeichnctc Dichtun;.' des Apparates verhür^^t. Das untere Ende (\vs Ilalinliolzcns dai-f nicht ühcr die Konkavität Fig. lüS. Fig. 164. r\ des Deckels InTVorra^'eii. damit heim Abziehen desselben ein Zerbrechen des Hahnes sicher ver- mieden ist. Als Dichtungsmittel fiii' die Schliffflächeii empfiehlt Arthur Meyer beim (Jebrauch ih's Apparates in Temperatui-en unter 2>^'^ C wasser- freies Lanolin (Adeps lanae pui'iss. anhydric. T. 38 — 40** C). P'ür höhere Temperaturen benutzt Meyer ein geschmolzenes (Jemisch von 40 // Wollfett und 80 _y Karnaubawachs. Damit werden die Schhffe einiicfettet und die Masse durch Drehen und Drücken dei- anfgepaliten Schliffteile dazwischen gleichmälUg blasenfrei verteilt, /in- Sicherung des Verschlusses zwischen Hahnbolzen und Tubus wii-d die Rinne t noch mit frisclige- schmolzenem Lanolin vergossen. Zur Erleichterung (\v^ .Vbhebens des Deckels vom Kulturvakuum dient der in Fig. 15;) abgebil- dete Holzblock, wie ihn Hredemann (I.e.) an- gibt. In diesen wiid das Kulturvakuum eing'c- schoben und dann der Deckel, mit der flachen Hand gehalten, seitlich wagrecht abgeschoben. Nötigenfalls wäimt man den Deckelran mm Kulturmanometer A. Meyers. Dasselbe ist unmittelbar au dem Kulfurschalentriiger n)if einer Kuijel- aufhängevorrichtung angebracht, so dali es sich von selbst immer .«senk- recht einstellen mub. Fig. l.')4 zeigt uns das einseitig geschlossene Manometerrohr nach einer .\l)bildung aus Meyers Heschreibung in natür- lichei" (ii'öl'ie. Dasselbe ist \'2^) txm lang und besitzt eine innere Lichte von 596 F. Fuhrmann. Fig. 155. 5 mm, die an den für die Messung bestimmten Teilen genau eingehalten ist. Der offene Schenkel besitzt bei K eine kugelförmige Erweiterung, die sich nach unten in eine Verengung (j) von etwa 1-5 mm innerem Durch- messer fortsetzt. ..15 mm vom untersten, äußersten Punkte der gebogenen Stelle des Rohres entfernt ist im offenen Schenkel eine nach oben offene 6 mm lange Spitze (s) zum Abfangen der Luftl)lasen eingeschmolzen.*^' Das Manometer wird bis 4 mm- über die genannte Spitze mit reinstem, trockenem Quecksilber gefüEt. In die kugehge Erweiterung K kommt zuerst ein wenig Baumwolle, dann ein Gemenge von Watte und echtem Rausch- gold, um austretende Quecksilber- dämpfe zu absorbieren. Das Manometer ist an einer vernickelten oder besser vergol- deten Skala angebracht, die eine durchgehende Mülimeterteilung trägt. Meyer Heß zum leichteren Ablesen je 5 mm durch Punkte markieren und von 10 zu 10 mm^ beiderseits Zahlen einschlagen. An der Manometerskala ist noch ein in halbe Grade geteiltes Thermo- meter angebracht, dessen Meß- bereich zwischen -\- \2 und 4- 45°C liegt. Fig. 1 55 stellt die Kulturschale mit dem daran aufgehängten Kul- turmanometer dar. Bei K ist letzteres in einer konischen Bohrung mit einer Kugel aufgehängt. M ent- spricht dem Manometerrohr, wäh- rend S die Skala ist. An ihr be- festigt ist noch das Thermometer T. Das Manometer ist, wie ersichthch, fertig gefüllt und enthält in der Erweiterung bereits die mit Schaumgold gemischte Watte. Um nun auch Drucke über 9b mm Hg messen zu können, bedient man sich eines Quecksilbermanometers, das Arthur Meyer ^) für die Messung der hohen Sauerstoffkonzentrationen unter Überdruck benutzt. ]Man schaltet dann nur ein T-Stück zwischen Kulturvakuumgefäß und ^Manometer, wie *) Arthur Met/cr, Apparat für die Kultur von Bakterien bei hohen Sauerstoff- konzentrationen, sowie zur Bestimmung der Sauerstoffmaxiraa der Bakterieuspezies und der Tötungszeiten bei höheren Sauerstoffkonzentrationen. Zentralbl. f. Bakt. IL Abt. Bd. 16. 1906. S. 392. Die wichtigstoii Methoden beim Arlteiteu mit Pilze» iiud Bakterien. 097 es Bredemann (1. c.) angibt. \'orerst sei das Manonietor kurz beschrichcii. Dieser l)ni('kiiior»ai)i)arat besteht aus einem Ilelier- barouieter und einem offenen Manometer. In der Fig. 15(3 bedeutet iidas IJarumeter und M das Manometer. Beide sind auf ein Brett von 100-1: c;w Hölie aufizemacht. Das vertikale Brett ruht auf einem (iiiind- brett mit Stellschrauben, um den Ai)i)arat lotrecht einstellen zu können. Die Uöhreu sind mit Milchi^lasplatten hinterkleidet. Das Barometer tränt eine Haibmillimeterteilunii', die korrespondierend vorne und hinten an- gebracht ist, was die richtige Ablesung sehr erleichtert. Das Manometer trägt eine gleiche Einmillimeterteilung. Beide Ilöhren haben ihren Nullpunkt unten am Ende der ]\Iilchglasplatten. Die Skala erstreckt sich über 90c»«. Der rechte Manometerschenkel trägt oben eine seitlich gekehrte kugelige Erweiterung, von der eine Spitze mit 1/2 ''^'"' Bohrung in das Rohr hineinragt. Diese Er- weiterung ist mit einem (Jemisch von Watte und echtem Blattgold angefüllt. Der rechte Schenkel mündet in die entspre- chende Bohrung eines Metallstückes, in das er luftdicht eingekittet ist. Mit einer Holländerverschraubung wird dann der Druckschlauch angelegt. Dieser fiüirt f nun zu dem schon früher genannten T-Stück. Dasselbe ist in "Fig. 157 abge- Fig. 167. bildet. I\s hat an den beiden horizontalen Schenkeln einen .-ichr gut ge- schliffenen Glashahn, au den sich die Schlauchansätze anschheCen. Der 598 F. Fuhrmann. senkrechte Schenkel wird mit dem Schlauchansatz des Kulturvakuums (s) durch einen guten Druckschlauch verbunden. Alle drei Hähne werden nun geöffnet und je ein horizontaler Schlauchansatz mit der Luftpumpe und mit dem Quecksilbermanomoter verbunden. Nun pumpt man bis zum gewünschten Manometerstand aus. Jetzt schließt man zuerst den Hahn des Kulturvakuums, dann die beiden anderen Hähne und nimmt Manometer und Pumpe ab. „Man hat, wenn man in dieser Weise verfährt, allerdings keine an- dauernde Kontrolle über den im Kulturvakuum herrschenden Druck, wie das bei der Benutzung des Kulturmanometers, welcher sich im Kultur- vakuum selbst befindet, der Fall ist. doch läßt sich der Druck jederzeit leicht kontrollieren. Zu diesem Zwecke setzt man das System Kulturvakuum, T-Rohr, Manometer und Luftpumpe wieder zusammen, öffnet nur die T-Rohr- hähne und evakuiert, bis das Manometer den zu kontrollienden Stand an- zeigt, dann erst öffnet man den Hahn des Kulturvakuums, es mulj nun natürlich, wenn der Druck unverändert geblieben ist, auch der Quecksilber- stand des Manometers unverändert bleiben." i) Die Zucht mit dieser Apparatur wird nun folgendermaßen aus- geführt: Das unmittelbar vor dem Gebrauch sehr gut ausgekochte Nährsubstrat wird möglichst rasch zu Platten verarbeitet, die dann nach dem Erstarren sofort in den Schalenträger eingesteht werden. Hierauf wird maximal eva- kuiert. SoU jedwede Spur von Sauerstoff entfernt werden, so stellt man noch eine Schale mit alkaüscher PyrogalloUösung ein. (Siehe d. Handbuch, Bd. IV, S. 1245, wo die am besten 0 absorbierenden Gemische angegeben sind. Li diesem Falle verwendet man sofort die Lösung, da ja nachherige Wasser- auffüUung ausgeschlossen ist.) LTm einen wasserdampfgesättigten Raum zu haben, gießt man vorher in das Vakuumgefäß ein wenig Wasser. Die ver- wendeten Petrischalen sollen einen Durchmesser von 10 mm haben. Man kann auch an Stelle einer PyrogaUollösung die Durchspülung des Vakuums mit Wasserdampf anwenden, um den Sauerstoff zu verdrängen. Li diesem FaUe gießt man etwas mehr Wasser ein und erwärmt das Kulturvakuum auf ca. 26° C. dann evakuiert man längere Zeit, wobei das Wasser im Sieden bleibt. Man mui» dabei den ganzen Apparat bei dieser Temperatur halten. Außerdem ist es zweckmäßig, in diesem Falle einen Schwefelsäureturm zwischen Kulturgefäß und Trockenröhre noch einzuschalten, um in letztere möghchst wenig Wasserdampf zu bekommen. Viel wichtiger noch ist der M/yersche Apparat aber für die Züch- tung in einer Atmosphäre von bestimmtem Sauerstoffgehalt. Um nun zu möglichst genauen Ergebnissen zu gelangen, ist es notwendig, in erster Linie den Nährboden so luftfrei als möglich zu haben. Bekanntlich enthalten die an der Luft stehenden Gallerten, Agar, Gelatine und alle flüssigen Nährsubstrate ziemlich beträchtliche Giengen Luft, also auch Sauer- stoff, die sich unter dei- Luftpumpe nicht so leicht ohne weiteres entfernen ') Zitiert Bredemann, Zentralbl. f. Bakt.. II. Abt. Bd. 23. 1909. S. 413, 414. Die wichtigsten Methoden beim Arbeiten mit Pilzen und Bakterien. r)99 lassen. Nach Bredemann (1. c.) vcii'iilnt inaii hei festen Niihrsiihstratrii in der Weise, dali man sie schon vor (h-i' NCrinipliiniz im Xakuum mit «'in«»r LeiU'htbaivterienknltur eini-ic Wochen hält, ans deren Kiliisclien tler M:int.'el jedweilen Sauerstolles eisclilossen werden kann. Die ( iallertmihilMtdeii werden 1/2 Stunde im strömen(k'n Dampf eiliit/.t und dann ia am l'.nden niit Wasser beschickt ist. Jet/t wird sofui't mö^licli^t weit evakuiert. Fhissi{;e Nährböden werden «iieich beinindelt. mir jicht es bi-i ihnen sciim-ller. weil man sie durcli lici'in^'es Krwiirmen mit (h'iii \'aknnmapparat im sehr hit't- ver(iüiinten Kaum auskochen kann. Dalx'i i,Nt nur darauf zu achten. d;iL> sie nicht durch zu starkes Schiiumen die Wattebäusche benetzen. Cnmittel- bar vor der Verimpfuiiii- werden die Ilöhrclien erst ans (h'ni \akuum ent- fernt, rasch infiziert und sofort in die gewünschte .Sauerstoffatnmspliäre gebraclit. Bestiin niunii' des Sauerstoffgehaltes und der driilie der Evakuierung bei Verwendung {{(^^ Kulturmanometers. Nachdem wir jederzeit den Di'uek und die Temperatur im Kultur- raum bestimmen können, sind wii- in der Lage, auch den Sauerstoffgelialt im Liter Kulturvakuum zu berechnen. Arthur Meijcr (\. v) gibt dafür dieFor- mehi an. Für die l)estimmung ist besonders eine genaue Ablesnng des Druckes und der Temperatur im Kultui'vakuum erfoi-derlich. 'Awr Lösung der Frage, wieviel Sauerstoff in einem Liter vei-dünnter Fuff iles •Kulturraumes von einem bestimmten Druck (p) in Millimetern Quecksilber und einer bestimmten Temperatur (t) vorhanden sind, müssen wir nach Arthur Meyer (1. c.) folgende Zahlen kennen: den (behalt der Luft an Sauerstoff in \'olumprozeiiten = 209 das Gewicht von 1 l O bei 0" und 7H0 mm Quecksilbei-- druck in( irammen für die geogiai)liische Hreite voiUn" = 1 1292 die Tension des gesättigten Wasserdampfes bei der Temjx'ratur t. ausgediiickt in (^)iu'cksill)erhöhen bei 0® und in 45° geograi)hischer Breite und am Meeres- spiegel = <• die Temperatur der .\tm()si)häi-e im Kidturvakmiiii während der Druckai)lesung = t den Druck in Millimetei-n (^)uecksilbei- ^rv Atmo-pli.ni im Kultunaum '' V den absoluten Nidlpimkt ~ 2TH' r)ie Formel lautet für die Üe-timmung von Sauerstoff in (ii-.immen = 2U;9 27:'. + ( ) p e ybei t«) ^.^.,^ 100 ■ 27;i -F t ■ 760 wenn es sich um einen wasserdampfgesättigten IJaum handelt. Sobald man aber an Stelle des Wassers eine Kalilange einfüllt. w:i.< für die Absorption entstehender Kohlen^:iiire mitunter notwendig ist. «lann 600 F. Fuhrmann. inuü in obige Formel für e die Tension von Wasserdampf aus Kalilauge (k) eingesetzt werden. n- 17 11 .+ ^ 20-9 273+0 p— k(beito) Die Formel lautet dann j^ . ^^^ ■ f^Q — • ^''^^^• Meistens verfolgt man den Zweck, in einer ganz bestimmten Sauer- stoffmenge im Liter züchten zu können und muß dann natürlich wissen, bis zu welchem Druck (p) man zu evakuieren hat, um denselben bei der bestimmten Temperatur zu erhalten. Da gilt die Formel [Arthur Meyer, 1906) p - e (oder k) (bei t«) + fe- 100- 760).(27:3 + t) p_e,^o(RiK; i tu j-^ 1-429. 20-9. 273 ' worin g den Gehalt an Sauerstoff, in mg ausgedrückt, im Liter des Gas- gemisches bedeutet. Zur rascheren Berechnung seien hier 2 Tabellen über die Tension des Wasserdampfes über Wasser und die Tension des Wasserdampfes aus Lösungen von Kaliumhydroxyd bei verschiedenen Temperaturen angeführt. Tabelle I. Tension des Wasserdampfes über Wasser. (Aus Landolt-Börnstein, Physikalisch-chemische Tabellen, 1905.) Temperatur C mvi 15 12-728 16 13-505 17 14-450 18 15-383 19 16-367 20 17-406 21 18 503 22 19-661 23 20883 24 22-178 25 28-546 Temperatur C mm 26 24-987 27 26-505 28 28103 29 29-785 30 31-555 31 33-416 32 35-372 38 37-427 34 39-586 85 41-853 36 44-230 In der folgenden Tabelle III (S. 602), die von Bredemann (1. c.) be- rechnet ist, sind diejenigen Drucke p in MiUimetern angegeben, bis zu denen bei den Temperaturen von J5 — 36'' C (t) zu evakuieren ist, wenn im absolut trockenen Kulturvakuum (A) oder im Wasserdampf gesättigten Kulturraum (B) ein Sauerstoff gehalt von O'l — 25 mg (g) im Liter vor- handen sein soll. Befindet sich aber eine Auflösung von KOH im Kulturvakuum, so müssen die entsprechenden Tensionen aus Tabelle II den Werten der Tabelle IIIA zugezählt werden. Als Beispiel diene folgendes: Um einen Sauerstoffgehalt von 0-2 mg im Liter bei 16" C über 23-08 Vüig'^^r KOH-Lösung in Wasser im Kulturvakuum zu haben, muß also ausgepumpt werden bis zum Druck 0-539 + 10-82 = 11-359 mm. Wenn andere Lösungen eingestellt werden, muß deren Tension nachgesehen und ebenfalls addiert werden. Die wichtigsten Metliodea beim Arbeiten mit Tilzen und Bakterien r.oi Tabelle II. Tension des Wasserdanipf es ans Liisungen von K O II. (Entnommen ans liredeniann , Bacillns aniylobacter A. M. et Hrcdt-mann in niorpho» logischer, physiolofrischer und systeinatiscbor Bi'ziohiiiitf. Zfiitralld f. Hakt. II. Abt. Hd.23. l'.lll. S. 41.').) 10 KOH 20 KOH 30 KOH 10 KOH 20 K(lH 30 Kuli 4- 100 HjO 4- 100 HjO + 100 U.i( ) 4- 100 Ji,u 4 Kh. 11 Ü . l.M, M (J Tempera- 9 09»/o 16-66% 23 0»»/o 'l'üinpcra- B-09»/o ~1' tur Grad C KOH KOH KOH tur (irad C 1 KOH Koii J\« fit B lilliniete r Milliinnt,. r 1447 10-00 8-62 8-01 7-31 22-60 19 09 16-25 10-50 891 8-28 7-56 2300 19-(;h 16-75 14 92 1100 9-21 8-56 7-82 23 65 2047 17-43 15 52 11-70 9-64 8-97 8-19 24-00 20-92 17-80 15 86 1210 9-90 9-21 8-41 24-50 21-54 18-35 16 35 12-50 1016 9-46 8-63 2bm 22- 19 18-91 16-85 13-00 10-50 9-77 8-92 25-50 22 90 19-52 17-40 13-50 10-85 1009 9-22 26(X) 23-55 20-07 17-«'.l 13-95 11-17 10-39 9-49 26-50 24-26 20-68 1843 14-50 11-57 10-77 9-83 26-98 2495 21-27 18 96 1515 12-06 11 22 10-25 27-50 2573 21-94 1957 15-30 12-18 1133 10-35 27-93 26-38 22-51 2007 lG-00 12-74 11-85 10-82 28 60 2744 2341 20 89 16-35 13 03 12-12 1107 29-UO , 2808 23-96 2138 17-00 1357 12-63 11-54 29-50 28-91 24-67 2202 17-50 14-01 1304 11-91 3000 29-76 25-40 22-67 18-00 14-46 13-45 12-29 30-65 30-89 2637 23-54 18-50 i 14-92 13-88 12-69 3100 31-51 26-91 24-03 19-00 15-39 14-33 13-09 31-50 32-42 27-70 24 73 19-40 15-78 14-68 13-41 32-13 33-61 28-72 25-65 20-00 16-38 1525 13 93 32-50 34-32 29-33 2621 2025 16-63 15-48 14-15 33-00 35-30 3018 2695 21-00 17-42 16-22 14-82 33-50 36-31 31-05 2776 21-50 17-96 16-72 15-29 34 00 37-34 31-94 2856 21-82 18-32 1706 15-59 34-50 38-40 1 32-86 29 38 Bestimmung des Sauerstoffjielialtes l)ei An wcihIuii;^ des (^hnck- silluM-inniiomctoi-s (S. öHT). Bei dieser Bestimmuiiii ist natürlich der llaromctcrstaiid mit in Eechnunii zu ziehen. Sie ertolt»t nach Artliiir M/i/i r^) und (i. Ih(dnunnu-) nach Ablesung- folgender Daten: 1. ..Die Höhe der Quecksilbersäule des Hai-onictcrs — b (also dio am langen Schenkel abgelesene Zahl in nnv (1). weniiicr der abirelesenen Zahl am kurzen Schenkel (k): 1 — k = I)). 2. Die Höhe der (,)uecksilbersaule ih-s Manometers = m." ') Arthur Meyer, Apparat für die Kultur von Bakterien bei liohon Sauerstoff- konzentral ionen etc. Zentralblatt f. Bakt. 11. Abt. Bd. 10. 190«i. S. 395. ■-) G. Urcdrma/in, Bacillus amyloliacter A. M. et Breiieniann. /.-ntraibl. f. Bakt. IL Abt. Bd. 23. 1909. S. 418. 602 F. Fuhrmann. Tabelle A. Druckhöhen (p), bis zu welchen zu evak aieren ist^ wenn im absolut trockenen Kult urraum Temperatur Grad C 0-1 mg g = 0-2 »!<7 g = Q-Zmg g = d'img g = 0"5 m.g g = 0-6 mg g = a-lmg g = O-Smgr g = 0-9 mff g = l'O mg g = 20m(7 P = mm 15 0-268 0-537 0-805 1-074 1-342 1-611 1-879 2-148 2-416 2-684 5-369 16 0-269 0-539 0-808 1-078 1-347 1-616 1-886 2156 2-424 2-694 5-388 17 0-270 0-541 0-811 1-081 1-352 1-622 1-892 2-163 2-433 2-7U3 5-406 18 0-271 0-543 0-814 1-085 1356 1-627 1-899 2-170 3-441 2-712 5-425 19 0-272 0-544 0-817 1-089 1-361 1-633 1-905 2-178 2-450 2-721 5-443 20 0-273 0-546 0-819 1-093 1-366 1-639 1-912 2-186 2-458 2-731 5-464 21 0-274 0-548 0 822 1-096 1-370 1-644 1-918 2-193 2-466 2741 5-482 22 0275 0-550 0-825 1-100 1-375 1-650 1-925 2-200 2-475 2-750 5-500 23 0-276 0-552 0-828 1-104 1-380 1-655 1-931 2-208 2-483 2-759 5-518 24 0-277 0-554 0-831 1-107 1-384 1-661 1-938 2-215 2-492 2-768 5-537 25 0-278 0-556 0-833 1-111 1-389 1-667 1-944 2222 2 500 2-777 5-555 26 0-279 0557 0-836 1-115 1-394 1-672 1-951 2-230 2-508 2-788 5573 27 0-280 0-559 0-839 1-118 1-398 1678 1-957 2-237 2-516 2-797 5-593 28 0-281 0-561 0-842 1-122 1-403 1.683 1-964 2-244 2-525 2-806 5-611 29 0-281 0563 0-845 1-126 1-408 1-689 1-971 2-252 2-533 2-815 5-630 30 0-282 0-565 0-847 1-130 1-412 1-695 1-977 2260 2-542 2-824 5-649 31 0-283 0-567 0-850 1-134 1-417 1-700 1-984 2-268 2-550 2-834 5-667 32 0-284 0-569 0-853 1-137 1-421 1-706 1-990 2-275 2.559 2-843 5-686 33 0-285 0-571 0-856 1-141 1-426 1-711 1-997 2-282 2-567 2-852 5-705 34 0-286 0-572 0-858 1 144 1-431 1-717 2003 2 289 2575 2-862 5-723 35 0287 0-574 0-861 1148 1-435 1-723 2-010 2-296 2-584 2-871 5-742 36 2-288 0-576 0-864 1-152 1-440 1-728 2-016 2-304 2-592 2-880 5-761 B. Bruckhöl len (p), b s zu welchen zu evakuiere n ist, we nn in dei 1 w a s s e ) r d a m p f g e B ä 1 1 igtfn Kultur- Temperatur Grad C g = 0"1 mg g = 0-2 mg g = 0-3 W(/ g = 0+ mg g = 0-5 mg g = 0 6 mj g = 0'7 mg g = 0-8 mg g = 09 mg g = l'O mg g =^ 20 mg P = vim 15 13-0 13-3 13-5 13-8 14-1 14-3 14-6 14-9 15-1 15-4 18-1 15-5 13-4 13-7 14-0 14-2 14-5 14-8 15-1 15-3 15-6 15-9 18-6 160 13-8 141 14-4 14-6 14-9 15-2 15-5 15-7 16-0 16-3 19-0 16-5 14-3 14-6 14-9 15-1 15-4 15-7 15-9 16-2 16-5 16-8 19-5 170 14-7 15-0 15-3 15-5 15-8 16-1 16-3 16-6 16-9 17-2 19-9 17 5 15-2 15-4 15 8 16-0 163 16-6 16-8 17-1 17-4 17-7 20-3 18-0 15-7 15-9 16-2 16-5 16-7 17-0 17-.^ 17-6 17-8 181 20-8 18-5 16-2 16-4 16-7 170 17-2 17-5 17-8 18-1 18-3 18-6 21-3 19-0 16-6 16-9 17-2 17-5 17-7 18-0 18-3 18-5 18-8 19-1 21-9 19-5 171 17-4 17-7 18-0 18-2 18-5 18-8 19-0 19-3 19-6 22-3 200 17-7 17-9 18-2 18-5 18-8 191 19-3 19-6 19-9 201 22-8 20-5 18-2 18-5 18-7 19-0 19-3 19-6 19-8 20-1 20-4 20-6 23-4 210 18-8 19-1 19-3 19-6 199 20-1 20-4 20-7 21-0 21-2 24-0 21-5 19-3 19-6 19-6 20-2 20-4 20-7 21-0 21-3 21-6 21-8 24-6 22-0 19-9 20-2 20-5 20-8 210 21-3 21-6 21-9 221 22-4 25-2 22-5 20-5 20-7 21-1 21-4 21-6 21-9 22-2 225 22-7 23-0 25-8 23-0 211 21-4 21-7 22 0 223 22-5 22-9 23-1 23-4 23-6 26-4 23-5 21-8 22 0 22-3 22-6 230 232 23-5 23-7 240 24-3 27-0 240 22-5 22-7 230 23-3 23-6 23-9 241 24-4 24-7 250 27-7 24-5 23-2 23-4 23-7 24-0 24-2 24-5 24-8 25-1 25-4 25-7 28-4 25-0 23-8 241 24-4 24-7 24-9 25-2 25-5 25-8 26-1 26-3 29-1 25-5 24-6 24-8 25-1 25-4 25-7 25-9 26-2 26-5 26-7 27-0 29-8 26-0 25-3 25-5 25-8 261 26-4 26-7 26-9 27-2 27-5 27-8 30-6 26-5 26-0 26-3 26-5 26-8 27-1 27-4 27-7 28-0 28-2 28-5 31-3 27-0 26-8 27-1 27-3 27-6 27-9 28-2 28-5 28-7 290 29 3 32-1 27-5 27-6 27-9 28-1 28-4 28-7 29-0 293 29-5 29-8 30-1 32-9 28-0 28-4 28-7 29-0 29-2 29-5 29-8 30-1 30-3 30-6 30-9 337 28-5 29-2 29-5 29-8 30-0 30-3 30-6 30-9 311 31-4 81-7 34-5 290 30-1 30-4 30-6 30-9 31-2 31-5 31-8 32-0 32-3 32-6 35-4 Die wichtigsten Motliodon licim Arbeiten mit Pilzen untl Uuktoricn. i\()'.\ III. bei den angegebenen Temperaturen ein (((iuhalt ((ji von O'l — 'Jö iinj im Litur vurliaipl. e = 30 m^ g = e = 40 mg 5'0 mg B = 6"0 mg S = 7'0 mg e = 8-0 mg 9 = B'O mg e = lO'Om; K I50»ij/j ÜU 0 («y; 2ii 'J ii.g _p_=__mni 8053 8-081 8-109 8137 8160 8- 193 9-221 8-249 8-277 8-3or) 8333 8-361 8-389 8-417 8-445 8-473 8-501 8-528 8-558 8-585 8-613 8-641 10-74 10-78 1081 10 8.') 10-89 1093 10-96 11 00 1104 1107 1111 11-15 1118 11-22 11-26 11-30 11-34 11-37 11-41 11-44 11-48 11-52 18-42 13-47 13-52 13 56 13 61 13()6 13 70 13-75 13-80 1384 13-89 13 94 13 98 1403 14(18 1412 14-17 14 21 14-26 14-31 14-35 14-40 16-11 18-79 1616 18 86 l(;-22 18 92 16-27 18 99 16 33 19 05 l()-39 19-12 16-44 19-18 16-50 19-25 1()55 1931 1661 19-38 16-67 19 44 16-72 19-51 16-78 19-57 l(')-83 19r.4 16-89 1971 l()-95 19 77 17 00 19-84 17 06 19-90 1711 19-97 1717 20(J3 17-23 20 10 17-28 20- 16 40 27 4041 40-55 4(m;9 4()-83 40-97 41 11 41 25 41 39 41 53 41 (17 41-81 4195 4208 42 22 42-3r5 42-50 42 (U 42-78 42-92 43()(j 43 20 53-88 54-06 54 25 54-44 54 63 54-82 5500 55-18 5537 55-55 55-73 55-93 5(5 11 5(5-30 56-49 5(5-67 56-86 5705 57-23 5742 57-61 '.. 12 «57 -.-{5 (57-5S (57hl 6804 I5K-27 68-51 (5S-74 68-98 69 21 69-44 (5967 70 14 70-38 70-61 70 85 71-08 71-31 71-54, 71-771 72-ni räum bei den angegebenen Temperaturen ein 0-üehalt (g) von 0*1 — 26 «13 im Liter vorbanden sein ioll. g = 3'0 mg 4"0 mg 5'0 mg g — 6'0 mg g = 7'0 mg g = 8-0 mg g = 9'0 mg g = lO'Omj g = 15 0 mg g =: g = 200 mg 26*0 my p = mm 20-8 21-3 21-7 222 226 231 23-5 24-0 24-5 25-0 25-6 26-1 267 27-3 27-9 28-5 29-2 29-8 30 5 31-2 31-9 32-6 33-5 34-2 34-9 35-7 36-5 37-3 38-2 23-5 240 24-4 249 25-3 25-8 26-2 26-7 273 27-8 28-3 28-9 29-5 30-1 30-7 313 31-9 32-6 333 340 34-7 35-5 36-1 36-9 37-7 38-5 39-3 402 411 26-2 266 27-0 27-5 28-0 28-4 28-9 29-4 300 30 5 31-1 31-6 32 2 32-8 334 34-0 34-7 35-4 360 36-7 37-4 38-2 38-9 39-7 40-5 41-3 42 1 43-0 43-9 28-8 29 2 29-7 302 30-7 312 31-7 32-2 327 33-2 33-8 34-3 34-9 35-5 362 36-8 37-4 381 38-8 39 5 40-2 410 41-7 42-0 433 44-1 449 45-8 46-7 31-5 32-0 324 32-9 33-4 339 34-4 34-9 35-4 35-9 36-5 37- 1 37-7 38-3 38-9 39-5 40 2 409 41 (5 423 430 438 44 5 45-3 46-1 4(5-9 47-7 48-6 49-5 342 34-7 35-1 35 6 38-1 366 37-1 37-6 38-2 38-7 39-2 39-8 40-4 410 41-7 42-3 430 437 44-3 450 45-8 46(5 473 481 48-9 49-7 50 5 51-4 52-3 36-9 37-4 37-8 38-3 38-8 39 3 39-8 40-3 40-9 41-4 420 42-6 43 2 43-8 44-4 450 45-7 46-4 47-1 47-8 48-6 49-4 501 50-9 51 7 52-5 53-4 543 551 396 4(J-1 40-5 41-0 41 5 42-0 425 43-0 43-6 441 44-7 453 45-9 46-5 472 47-8 48-5 49-2 499 50-7 51-3 52-1 52-9 537 54-5 553 56-2 571 57-9 53-0 535 54-0 54-5 550 55-5 561 5(5(5 57-2 57-8 58-4 590 596 60-2 609 61-6 623 63-0 637 64-4 652 65-9 66-8 (57(5 685 (593 70-2 71 1 720 liC) .1 67 U 67 5 6S-0 (585 690 696 70-2 708 71-4 720 72-6 79-9 80-4 80-9 81-4 820 82-6 832 838 84-4 85 1 857 8(52 Temperatnr Orkd C 738 87t» 74-0 87 7 747 88-4 ' 75-4 89 1 76-1 89 9 7(5-8 90 6 776 91 4 784 92 2 791 92 9 799 .1-1 v 80-7 81-5 '.!.... 82-4 9(5 4 83 3 97:» 84 2 . ..^ . 85-1 i 86-1 1 lmi2 15-0 15 5 1(5-0 16 5 170 17 5 180 18 5 19 (» 19 5 j(lü 2») .■> 2111 2 15 22 0 225 ■23 0 235 24(1 24 5 250 255 2(5-0 26-5 270 27 5 281» 285 2*>0 604 F. Fuhr man n. Tabelle IV. Manometerstand mvi Baro- meter- Btand 15" 160 170 igo 190 20" 21" 22" 23" 24" 250 26" 27" 28" 29" 30" Sauerstoff mij (= 95 ,Atmosph.) 760 '|239 237 750 |i242 241 740 1245 244 236 239 242 235 238 241 233 232 236 235 240,238 230 233 236 228 227 231 235 230 233 225 229 231 223 227 230 222 220 225 223 228.226 218216214 22l|219 224 222 218 220 190 (= "/^ Atmosph.) 760 750 740 2051203 202 2011200:199 '208 206'205 204'202;201 210 209 208 206!205|204 197 200 203 196194 198197 201200 193 196 198 191 194 197 190 193 195 188 191 194 186 185 189 188 192,191 184 187 189 285 (= 7« Atmosph.) 760 750 740 171 173 175 170 169 172 171 174 173 172 168 170 167il65 169 168 171 170 164163 167 169 165 168 162 164 167 161 163 165 160158 162161 164 163 157 159 162 156 158 155 157 160159 153 155 157 380 (= V2 Atmosph.) 760 750 740 137136 1381.37 140 139 135134 137J136 138138 133 132 135 134 137 136 131 133 135 1311130 132 131 134 133 129128127126 1311129 132:131 128127 130129 125 126 128 124 125 127 123 124 126 475 (= ^/g Atmosph.) 760 102 102 101 101100 99 99 98 97 97 96 95 94 94 93 750 104 103 103 102 101 101 100 99 99 98 97 96 96 95 94 740 105 105 104 103103 102 101 101 100 99 98 98 97 96 95 92 93 94 570 (=74 Atmosph. 760 68 68 67 67 66 66 65 65 64 64 63 63 62 62 62 750 69 69 68 68 67 67 67 66 66 65 65 1 64 64 63 63 740 70 70 69 69 68 68 68 67 67 66 66 65 65 64 64 61 62 63 665 (= Vs Atmosph.) 760 34 34 34 34 33 33 33 33 32 32 32 32 31 31 i 31 ; 750 35 34 34 34 34 34 33 33 33 33 33 32 32 32 31 |740 35 35 35 34 34 34 34 34 33 33 33 33 32 32 32 31 31 31 3. Die Teinperatur der Quecksilbersäule und der Luft im Kultur- vakuum — t (Ablesung nach längerem Aufenthalt der Zusammenstellung im Arbeitsraum). Die Höhe der Quecksilbersäule p*, die dem negativen Druck im Kulturraum entspricht, wird erhalten durch Subtraktion der Höhe m der Quecksilbersäule des Manometers vom Barometerstand b. p* = b — m. Diese wirkliche Länge der Quecksilbersäule mul> auf die Länge der Säule bei 0° (p°) reduziert werden nach der Formel: pO = pt (1 — 0-000181 . t). Jetzt rechnet man den Gehalt g des Kulturvakuums an Milligrammen Sauerstoff nach der Formel 8' 20-9 273 + 0 p' 100 ' 273 + t ' o 760 1-4292 . 1000 Die wichtigsten Metliodeu l)eiui Arlieitou mit l'ilzcii iiiid Bakterien. (JOö in der e = Tension des WasserdaiiiptVs dci- 'hilx-llc 1 ist. Ist Kalilautro im Kiilturuefäl), wird an stelle von e k (Nt Talieile 11 eiui^n-sctzt. Brc'deniann (l. v.) hat tür eine IJejIie Maiionieterstiiiide die /.u^'e|j(iri;.'en Sanerstoffiiieiiiieii berechnet, die in 'ralielle 1\ (.S.tK)4) zuMunnienj.r,. stellt sind. Mit Hilfe der vorhei' iicnaii heschrieheneii .\|)|)ai'at/,usaninieiincluint,'- des Bakterienwachstumes unter erhöhtem Di'uck in l'i-eliluft oder komprimiertem Sauerstoff steht an erster Stelle derjenige von Arthur Mci/er.^) Die «xanze Einrichtung' besteht aus einem Preliapparat und einem hruckraum mit den Manometern etc. Als Preßapparat dient eine Stahlflasche, die mit komi)riniiei-ter Luft iiefüllt ist. Dieselbe hat einen Ivauminhalt von ca. 10 / und die Luft steht unter einem Drucke von 100 löU kr/. An dem Stahlzylinder wird mit Holländerverschranbun^- ein ..S-Automat" aniide^it. Derselbe ist aus zwei Federmanometern, einem Druckreduzierventil, einem Sicherheit.s- ventil und einem Absperrhahn zusammeniiestellt. Das Anschlulirohi- zur (ias- tiberleitunii in den später zu beschreibenden Druckraum ist am besten aus Kupfer gefertigt. Das der Stahlflasche zunächst stehende Manometer dient zur Messung des (iesamtdruckes im Stahlzyhnder, aus dem sich der Iidialt leicht berechnen läßt. Es darf aber nur Ins zu ein(Mn Drucke von 150 Ay/ gebraucht werden und trägt eine Skala mit einer Teilung: nach 10 %-Drucken. Die in der Flasche befindliche Luftmenge imi wird nach der Formel m = p . 1 berechnet, in der j) den abgelesenen Manometerdnu'k und 1 den auf der Stahlflasche angeschriebenen Rauminhalt derselben in Litern bedeutet. Das zweite Manometer gehört zum Druckreduzierventil und zeigt an, unter welchem Druck das in den Druckraum einströmende (ias steht. Es wird entweder für einen Maximaldruck von 1.') oder :\0 hy geliefert und besitzt eine Skala mit 1 Ay/ Teilung. In Verbindung mit diesem Druck- messer steht das Reduzierventil. Im wesentlichen besteht es aus einem Reduzierventilkasten, in den die Preßluft aus einer beliebig veränderlichen, aber kleinen Öffnung einströmt, wobei sie entspannt wird. Kin Ilebelwt'rk. auf das eine Flügelschraube von außen einwirkt, besorgt die feine Verstellung der Größe der Einströmöffnung. Herausschrauben der Flügelschraube ver- mindeit den Druck. Ilineinschrauben eihöht ihn. Das Druckrednzierventil ist durch ein Sicherheitsventil gesichert. Inbenützt soll die Druckredu/ier- schraube des ^■entils immer so weit herausgeschiaubt sein, bis kein Feder- druck mehr darauf herrscht, was sich am leichten (lang sofort bemerkbar 606 F. Fuhrmann. Flg. 158. macht. Zum Gebrauch schUeiit man den Automaten au die Stahlflasche an, dann öffnet man langsam den Radhahn des Stahlzyhnders und über- zeugt sich vom herrschenden Druck in demselben. Hierauf schraubt man vorsichtig- die Fliigelschraube des Druckreduzierventils so weit hinein, bis das Manometer desselben den gewünschten Arbeitsdruck anzeigt. Unter diesem strömt dann nach Öffnung des Absperrliahnes am Automaten die Preßluft so lange aus, als der Innendruck in der Stahlflasche ausreicht. Der ..Druck räum" ist ein für Preßgase besonders konstruierter Autoklav aus Kupfer, der auf 50 hj Druck geprüft ist und zum Arbeiten bis 25 kg dient. Der Druck- raum selbst ruht in einem eisernen Mantel, der auf einem Arbeitstisch mit 3 Schrauben fix befestigt wird. Der Druckraum ist mit Zapfen in diesen Mantel fest eingelagert. Fig. 158 zeigt uns den ganzen Druckapparat in A^rbindung' mit dem Reduzierventil und der Stahlflasche fertig zu- sammengestellt. Mit einem starken Mantel, der mit drei Schrau- ben am Tische befestigt ist, ist in verschraub- ten Lagern der eigent- liche Druckraum fest ver- bunden. In der Fig. 159 ist (las zylinderförmige Druck- gefäß mit dem nebenhe- genden Deckel wiedergege- ben. Das Druckgefäß A' ist 20 cm hoch und hat oben bei R einen äußeren Durchmesser von 15-5 cm, unten einen solchen von 1;V5 cm und einen Piauminhalt von 2000 cm^. Oben am KulturgefäL) ragt nach außen und innen ein 8-5 cm breiter Rand E vor. so daß die Öffnung des Raumes nur 8'5 cm im Durchmesser mißt. Dieser breite Rand besitzt vier konzentrische Ringrillen. ITnter dem Rande befindet sich der dicht angelegte Eisenring E. in dem auf Zapfen drehbar der starke Stahlbügel B mit der Schraube S ruht. Die Schraube drückt den Deckel nieder. Der Deckel selbst ist aus Phosphorbronze gefertigt und nach oben gewölbt. Mit einem 3'5 cm lireiten Rande, der ebenfalls 4 Rillen trägt, sitzt er auf dem Rande des Kulturgefäßes auf. Außerdem paßt er mit der Die wichtigsten Motliodeii beim Arlioitilliei-. <»' uuu -io- yeu- iiTuphische lireite. in (Iranmien aiis^ediiickt. Für das nowöhnliclie Federnianonieter ist t'ilr k 7>>(J einzusetzen. IV'i den t'eiueii Federinaiiuineteni ist der Üaroinetersfand. hei dem sie L'e.iicht wurden, angegeben. Die folgende ZusainniensteUnng I enthalt die Konzentration des Sauerstoffes in dem mit Preltluft gefüllten Kulturgefäli. ausgedrückt in Milligrammen im Liter hei einem riieidruek von 2 — 20 Av/ und den Temperaturen zwischen 17 und "JS" (' unter NCrwendnuL! de< Feilerniano- meters. (Nach A. Meyer, 1. c. S. :>95.) Tabelle I. Am 1 Manometer abgelesener Druck Luttt umperatiir im Ürui-kge fuU, (irad l 17 18 19 20 21 22 23 24 26 se n*T 2 824 821 818 816 813 810 807 804 802 799 797 3 1097 1093 1089 1086 1082 1078 1075 1071 1067 10C)4 106(J 4 1372 1368 1363 1358 1354 1349 1344 1340 1335 1331 1326! 5 1642 1636 1631 1625 1620 1614 1609 161)3 1598 1593 1588 6 1915 1908 1902 1895 1889 1883 1876 1870 1863 1857 1851 7 2185 2177 2170 2163 2155 2148 2141 2133 2126 2119 2112 8 2458 2449 2442 2433 2424 241(5 2408 2399 2:i92 2--t84 2H76 9 2728 2718 2709 2700 2691 2682 2672 2()63 2654 2646 2637 10 3001 2990 2980 297(J 2960 2950 2940 2930 2920 2910 2900 11 3273 8262 3251 3240 3229 3218 3207 3196 3185 3175 MM 12 3546 3534 3522 3510 3498 3486 3474 3464 3451 :i439 34 2S 13 3819 3805 3793 3780 3767 3754 3741 3728 3716 3704 3692 14 4091 4077 4064 4050 4036 4022 4(X»9 3994 3982 39C>8 3955 15 4364 4349 4335 4320 4305 4 290 4276 426! 4247 4233 4219 20 5714 5694 5675 5655 5636 5617 5598 5578 5561 5542 5524 794 1057 1322 15X2 1845 2105 2.3r>8 2628 2891 31.54 3416 3679 3942 42(J5 5:)05 Wird zur Messung von Überdrucken unter '2 kg das ..Quecksilher- manometer- benutzt, dann inuli besonders langsam die rrel''luft in das DruckgefäU eingelassen werden. Aul'.erdem müssen die Apparate hmgere Zeit in dem gleichtemperierten Arbeitsraum stehen, damit alle< L'leiclimär.iir erwärmt ist. Zur Berechnung der im Liter Druckluft vorhandenen Sauerstoffnienge bestimmt man folgende Gröl'ten: L Die Höhe der drückenden (.»uecksilbersäule (p'i Man liest am Barometer den Quecksilberstand am langen (1) und kurzen {k) Schenkel ab. 1—k = Barometerstand = b. Die gleiche Ablesun- macht man an der Qupcksilhersiude d(>s Manometers. 1'- k'rr: .Manometerdruck =: m. Baronieter- druck und .Manonn'terdruck addiert n-eben den Druck im Innern des TrcÜ- gefiißcs (pM: p' = b + m. Abderhalden, Handbuch der biochemifchi-n Arbeiiinipthodcn. V. 39 610 F. Fuhr manu. 2. Temperatur (t) der Quecksilbersäulen und der Preßluft im Druck- raum, t muß in beiden gleich groß sein, weshalb man die Zusammen- stellung einige Zeit stehen läßt, bis der Temperaturausgleich erfolgt. 3. p* muß nun auf p^ reduziert werden, p" entspricht der Länge der bei t Graden gemessenen Quecksilbersäule bei 0". pO z= pt (1—0-000181 1). 4. Dann ist aus der Tabelle (8. 600) die Tension (e) des Wasserdampfes über Wasser in Millimeter Quecksilber bei Temperatur t nachzusehen. Die Berechnung der Sauerstoff menge im Liter der Preßluft in Milli- grammen erfolgt nach der Formel: 20-9 2T3^fO po-e 100 273 + t 760 ■ worin die übrigen Größen dasselbe bedeuten, wie in der früheren Formel auf S. 608. Arthur Meyer (1. c. S. 396) hat eine Zusammenstellung ausgearbeitet, die in Milligrammen die Sauerstoff mengen im Liter der Preßluft für Drucke z^^1schen 760 und 1550»?«? Quecksilber und Temperaturen zwischen 17 und 28° C angibt und im folgenden als Tabelle II wiedergegeben ist. Tabelle IL Abgelesener u. berechneter ; Überdruck (pt) Ijufttemperatur im Druckgefäß, Grad C 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 mm Hg. 760 275 274 272 271 270 268 267 265 264 263 261 260 800 290 288 287 286 284 283 281 280 278 277 275 274 850 308 307 305 304 302 301 299 298 296 295 293 292 900 327 325 324 322 320 319 317 316 314 312 311 309 950 345 344 342 340 339 337 335 334 332 330 329 327 1000 363 362 360 359 357 355 353 352 350 348 347 345 lOöO 382 380 378 377 375 373 372 370 368 366 364 362 1100 400 399 397 395 393 391 390 388 386 384 382 380 1150 419 417 415 413 411 409 408 406 404 402 400 398 1200 437 435 433 432 430 428 426 424 422 420 418 416 1250 456 454 452 450 448 446 444 442 440 438 436 434 1300 474 472 470 468 466 464 462 460 457 455 553 451 1350 492 490 488 486 484 482 480 478 476 473 471 469 1400 510 509 507 505 502 500 498 496 494 491 489 487 1450 529 527 525 523 520 518 516 514 512 509 507 504 1500 548 546 543 541 539 536 534 532 529 526 524 522 1550 566 564 561 559 557 555 552 550 547 545 542 540 1 An Stelle von Preßluft kann natürlich auch komprimierter Sauer- stoff oder Stickstoff etc. verwendet werden. In diesem P'alle muß zu- erst das käufliche komprimierte Gas auf seine Reinheit mit den ül)hchen chemischen Methoden untersucht werden. Wenn ^Verunreinigungen vor- liegen, so ist der Yolumprozentgehalt s an reinem Gase nach den gas- analytischen Methoden zu ermitteln, nachdem man das verunreinigte Gas von der Kohlensäure befreit hat. Dio wichtigsten Methoden heim Arheiten mit l'ilzen und Uaktcrien. ßj \ Dil' lU'i-ccliiiiniii der Saiicrstoffmoiiirc in Miiii-iuiuuu-u un i.ilcT erfolgt nach der aui' Seite (;U8 an.gcgchcnt'n Forim-l iür die IJcstimnnm^ des Luftsaiierstoffes, in der an Stelle der (Iröl'.e für 200 (\(iliiinj)i-n/i'iit o dei- Lnft) s einj^esetzt wird. Sie lantet denmacli s 273 + 0 760 + (k.73rr5) ,.-,,,, 100 273 + t 760 -i-i-'A "^ wenn das f»ewöhnlielie Federmanometer zur Anwendiinj^ },'elanf^t. Aualo;,' kann man auch die Menden anderer komi)iimierter (iasc berechnen. Wird nur mit schwachen Überdrucken bis 2% ^^earbeitet. so kann natürlich auch das Cjuecksilbermanometer Verwenduuf»' finden. 15ei der IJerechnunj^ i.st die Formel der Seite (310 entsprechend al)zuäud<'rii. Gewinnung und Zucht der Eisenbakterien. Malisch^) ist es gelungen, auch Keinkultureii von Hiseiibakterien zu erhalten. Auch gibt er uns eine Reihe leicht zugänglicher Fundstellen für die (iewinuung bekannt, auf die vorerst niihei' eingegangen werden soll. Siderocapsa Treubii nov. gen. et nov. sp. (Molisch, 1. c.) Eine weit verbreitete Wasserbakterie, die auf zalihcichen einiii-tauch- ten Teilen höherer Wasserpflanzen des Süliwassers epiphy tisch lebt. Man erhält sie rasch, wenn man ältere Sprossen von Floilea. liie l'nterseite der Xyinphaeablätter oder ..Wiirzelhaare" von Salvinia auriculata mikro- skopiert. Die Oberfläche dieser Teile erscheint von einer ockerfarbigen Kruste überzogen, die von lauter kleinen hellen Höfen durchsetzt ist. l'.ei der Behandlung' der Kruste mit dem Schiffsdwn IJeagcns auf .Vldeh\ d be- merkt man in dem tiefrot umwallten runden Hof die i'.akterienzellen von Kugelform. Chlamydothrix sideropous n. sp. (Molisch, 1. c.) Soll nach Molisch eine häufige Art si'in. die Fäden bildet und in Haftscheiben auf Blättern verschiedener Wasserpflanzen festsitzt. Die Zell- fäden speichern in ihrer Scheide an der Spitze kein Fiisen. wohl aber ist ihre Basis und l)eson(lers die rundliche Haftscheibe von Fisenowdhydrat durchsetzt. Die Zellen haben eine zylindrische (iestalt. Auch die anderen Iv.seubakterien C/Iadothrix. t'renothrix. i.eptotlirix. Clonothrix und (iallionella sind Wasserbewohner und finden sieb /iiinlich häufig in den stärkei- eisenhaitiucn Wässern. Nährsubstrat für die Zucht von Leptothrix ochracea. (Molisch. 1. c.) 100(1 ;/ Torfwasser, 0"2ofj Mangaii])ept()!i. 100 ,/ (ielatiiic. ') Jfan.s Molisch, Die Eiseukikterien. (iustav Fisciior. Jena lUlO. 39» 612 F. Fuhrmann. Die wichtigsten Methoden beim Arbeiten mit Pilzen etc. Vor dem Erstarren durch Zusatz von Xormalkalilauge leicht alkahsch zu machen. Das Torfwasser wird durch Auskochen eines faustgroßen Stückes Torfziegel in 1 Liter destilliertem Wasser hergestellt. Manganpepton scheint eine sehr ungleiche Substanz zu sein, da Molisch mit Proben verschiedener Herkunft mitunter schlechtere Erfolge hatte. Er empfiehlt besonders das Manganpepton der chemischen Fabrik List, Seelze bei Hannover. Für die Reinzucht dieser Eisenbakterie empfiehlt Molisch die Anlegung einer Rohkultur in einer O^öö^/oigen Manganpeptonlösung im Prager Lei- tungswasser (Flußwasser), in der sich die Leptothrix besonders an der Oberfläche als braune Haut ansiedelt. Von der Vorkultur legt man eine Kultur in einer 2^/oigeB. Peptonlösung im Moldau (Fluß-)wasser an. In dieser stickstoffreichen Nährlösung bilden die Fäden rasch Schwärmer aus, die dann in der Plattenkultur mit dem erstgenannten Gelatinenährboden reinsezüchtet werden. Darstellung von Lipoiden aus (iehirn und andiMm Geweben. Von Sii^muiul Friliikrl, Wien. In Folgendem sollen hauptsächlich die Methoden beschrioboii worden, welche in unserem Institute zur Aufurheitung der Lipoide \'er\vendim},' finden und insbesondere diejenigen, welche sich auf die Verarbeitung des Gehirns beziehen. Für die anderen Organe müssen jeweilig die Methoden abgeändert werden, nach speziellen Plrfahrungen, welche man erst bei der Aufarbeitung gewinnt. Uns stehen solche Krfahruiigen für Leber, Neben- niere, Niere, Placenta, Pankreas, Magen- und Darnischleinihaut, sowie für Prostata zur Verfügung. AVir haben es bei einzelnen ( Mii tiie preparation of ciioh>t.rui froni bniin. Journ of physiology. 34. 104 (I'.)ÜG), Cholesterin auf diese Weise dargestellt; ferner seine Mu- arbeiterin M. Chri.stine Tebb, The Cholesterin of the brain. Journal of pli ysioloff) . •'»» IOC. (I'.IOO). , , . ..,,., ■ ) A. Windaus, Über die (|uantitative Bestimmung des Cholesterin« tind der l-hoie- sterinester in einigen normalen und pathologischen Nieren. Zeitschr. f. phyuiol. Chcmio. 6.5. 110 (P.)IO). 616 Sigmund Fränkel. tionsapparate benutzen muß; so kann man diese Methodik wohl nur mit Vorteil bei kleinen Versuchen verwenden, wie es auch A. Windaus getan hat. Für die Darstellung von Cholesterin und auch für Protagon hat man vorgeschlagen, das zerkleinerte Hirn mit ungefähr der anderthalbfachen Menge wasserfreien Natrium sulfats zu zerreiben und dann durch ein Sieb zu reiben. B. Bünz i) hat zuerst dieses Verfahren vorgeschlagen, dann haben A. C. Lochhead und W. Gramer ~) dieses ^'erfahren verwendet. Wir wurden auf dieses Verfahren erst aufmerksam, nachdem wir mit Aladar Elfer eine Methodik veröffentlicht hatten, Blut, insbesondere Blutserum mit Glauber- salz zu trocknen und dann die Lipoide aus diesem trockenen Pulver zu extrahieren. '^) Beim Serum ermittelten wir vorerst den Wassergehalt und setzten dann um lO^/o mehr als die berechnete Menge gut ausgeglühten Glaubersalzes zu. Um das ganze Wasser von 1 kg Serum zu binden, wären nun theoretisch 610^ geglühten Glaubersalzes notwendig. Wir setzen aber ca. 670 g pro 1 kg Rinderserum zu. In 1 — 2 Stunden ist das Serum zu einer festen Kristallmasse erstarrt, die man im Stahlmörser oder auf der Kugelmühle pulvern kann. Dasselbe Verfahren nun verwendeten wir bei einer Reihe von Geweben, insbesondere aber beim Gehirn. Da das Gehirn im Durchschnitt TO^/o Wasser hat, kommt man mit viel weniger Glaubersalz aus als beim Serum. 142 Teile geglühten Glaubersalzes vermögen 180 Teile Wasser zu binden. Auf 1 kg Hirn verbrauchen wir nur 600 g Glaubersalz, so daß die Be- schwerung nur ßO^/o ausmacht, während die früher erwähnten Forscher das Gewebe mit der anderthalbfachen Menge, also mit löO^/p beschweren. Das ist durchaus kein unwesentlicher Vorteil. iVber so gute Resultate dieses Verfahren in unseren Händen auch gezeitigt hat, und so häufig wir es auch in verschiedenen Fällen angewendet, so konnten wir uns doch bei unseren Erfahrungen nicht der Erkenntnis verschüeßen. daß dieser Methodik einige Fehler anhaften. Als solche Fehler sehen wir folgende an: Es ist sehr schwer, die Substanz nach dem Aus- kristallisieren mit Glaubersalz in größeren Mengen sehr fein zu pulvern und man hat viele große Kristalle vor sich, so daß die Extraktion sehr lange dauert. Ein zweiter Nachteil, der sehr ins Gewicht fällt, ist, daß die ungesättigten Phosphatide, insbesondere das Kephalin, wie wir schon in den Untersuchungen mit E. Neuhauer ^) gezeigt haben, Glaubersalz in Petroläther aufzulösen vermögen, und zwar etwa 17% ihres Eigengewichtes. Wir haben uns auch überzeugt, daß bei der Verarbeitung des Gehirns nach dieser Methode das dargestellte Kephalin deutlich die Reaktion der Schwefelsäuj-e gab. Ein weiterer *) i?. Bünz , Ülier das Vorkommen von Cholesterinester im Gehirn. Zeitschr. f. physiol. Chemie. 46. 47 (1905). ^) A. C. Lochhead und W. Gramer, On the phosphorus percentage of various sam- ples of Protagon. Biochem. Zeitschr. 21. 321 (1909). ^) Sigmund Fränkel und Aladar Elfer, tlber ein Vei'fahren der Serumtrocknung. Biochem. Zeitschr. 28. 330 (1910). *) S. Fränkel und E. Neubauer, Über Kephalin. Biochem. Journ. 2. 350 (1907). DarstelluiifT von Lipoiden ans (ichirn iimi iimlorcn Geweben. i;\1 Nachteil war, daß bei den Extraktioiion, selbst mit sciir leicht siedendem Tetrol- äther, am Boden des Kxtraktionskolbens sich «-in weiiij/ mit Glatibf-rsalz {fo- sättigte Flüssigkeit absetzte. Dieser letztere Naelifeil könnt.' aber durch nenerlicli(\s AufnehnKMi des liodensatzes in retn.läther behoben werden. AVir siiciiten nun nach einem anderen TrocknunL^sverfahren, • " ' all die Vorteile liat, die man durch das rrinzij) des Binden^ n.,„ Wasser an wasserfreie anorganische Salze erzielen kann, aber ohne die bei unserer Glaubersalzmethode beobarhteten Nachteile ist. Wir haben mit Vorteil versucht, sowohl bei Gehirn als auch bei I'.lut und Leber, diese Gewebe in der Weise zur Trockene /.u bringen, dab wir sie mit etwas mehr als der berechneten Menge wasserfreien , phosjjhorsauren Natrons behandelten. Wir verwenden das Dinafriumphosjjhat . welches 12 Moleküle Kristallwasser bindet. Es ist zweckmäliig. das I>inatriuinj»h(K- phat (gewöhnliches einfach saures jihosphorsaures Natron) selbst im Labd- ratorium zu entwässern, um kein pyrophosphathaltiges .Material zu bekommen. Bei der Bereitung hielten wir uns an eine Angabe von T. C Whitlod- und C. E. Barfield^) und entwässerten das Salz bei einer Temperatur von \h{) bis ITU". 142 Teile des wasserfreien Salzes binden nun 216 Gewichtsteile Wasser. Für 1 hg Hirn mit 700 g Wasser benötigt man also mit einem Aufschlag von etwa lOVo insgesamt 500 ^z des wasserfreien Natriumphosphates, so daU theoretisch die Beschwerung nur oO^/o wäre, während sie beim Glaubersalz ca. ßO^'/o beträgt. Aber wir haben bei Ausarbeitung^ liesi-r Methode beob- achten können, daß sie gegenüber der Glaubersalzn-j. ihode noch einige an- dere große Vorteile besitzt. Wenn man den Gehirr ^rei rasch in womöglich im Thermostaten vorgewärmten Beibschalen mit uem Phosphat zusammen- bringt, so bleibt die Masse flüssig und man sieht, wie eine konzentrierte Salzlauge in der Masse verteilt ist. Bringt man nun rasch diese noch warme Mischung in eine ebenfalls auf 40" gewärmte Presse, so gelingt "es, einen sehr großen Teil des Natriumphosphats mitsamt dem Wasser abzupressen. Auf diese Weise verringert man das \olumen sehr beträcht- lich. Es beruht dies darauf, daß die Kristalle des Natriumplio>pliats mit 12 Mol. Wasser bei 85o schmelzen und selbst nach dem Kikalten bleiben die geschmolzenen Kristalle nach Marx lange Zeit flü.ssig. werden dann sirupartig und gestehen endlich zu einer seidenglänzenden, strahligen Ma^se.') Die Methode des Arl)eitens mit Natriumphosj)hat bat nun iregen- über den vorher beschriebenen nach unseren Frtaln ungen den \drteil. dalJ man von Haus aus das Gewebe mit weniger Salz beschwert, daß man aber einen großen Teil des Salzes und mit ihm des Wassers abpressen kann und somit sowohl das Volumen als ancli das(;ewicht des zu extrahieren- den Gutes ungemein verringert. Bei (b'i- l-ixtraktion gebt das Natriuni- phosphat nicht in die Lösungsmittel, man erhält auch am l'.oden der Ex- *) T.C.Whitlock und C. K. Harßcld, Kntwässoninp (Ie- stimmte Zwecke wenigstens, wenn auch nach starker Modifikation der Grundidee, ihrer noch sehr gut bedienen kann ; jedenfalls dann, wenn es sich um die Kontrolle auf anderem Wege gefundener Resultate handelt, um festzustellen, ob ein gewonnenes Produkt tatsächlich ein rrimärprodukt oder etwa ein Spalt- oder Kunstprodukt ist. Es v^'urde auch der Versuch gemacht. Lipoidi' direkt ans feuchten Geweben zu isolieren. Man muß sich vor Augen halten, daß dabei, insbe- sondere wenn man Äther oder Petroläther als Extraktionsmittel benüt/t, wie dies bis jetzt geschehen ist, nur daran zu denken ist, daß man Chole- sterin, Cholesterinester und die ungesättigten Phosi»hatide erhält. Ferner ergibt sich eine andere Schwierigkeit nach der Richtung hin, tlaß einzelne ungesättigte Phosphatide aus ihren wässerigen Pseudolösunucn mit Äther nicht extrahierbar sind, wie dieses schon J. /.. H'. Tlnn/irlmm be- kannt war. Es ist bis jetzt nach keiner Richtung hin ein l'.eweis erbracht wor- den, daß chemische Verbindungen zwischen Lipoiden und i;i\\eil'iköri)ern existieren. Es ist dieses auch höchst unwahrscheiidich, da man nach Ex- traktion von Geweben mit verschiedenen Lösungsmitteln nnd nach Ver- dauung des Rückstandes doch wieder Phosi)hatide erhalten mül'.te, was uns aber in unseren Versuchen durchaus nicht gelungen ist. Wir niü-en daher die Existenz .solcher Lipoideiweißsubstanzen in chemischem Sinne vorläufig leugnen: nnders ist aber an eine i)h\sikalische Verbindnn.T zwischen beiden zu denken. 620 Sigmund Fränkel. Gegen die Methodik, Gehirne mit Aceton zu trocknen, hat Ivar Bang^) Einwendungen erhoben. Er vermißt den Beweis, daß Aceton die ent- sprechenden Dienste leistet und wünscht Kontrolluntersuchungen über die Zusammensetzung des Ätherextraktes einmal nach dem Trocknen und das andere Mal nach Acetonbehandlung. Für solche Untersuchungen schlägt er Herzmuskel als das bestgeeignete Material vor. Jedermann, der solche Einwände erhebt, muß vorerst sagen, weshalb er sie erhebt, oder mindestens ein Experiment ausführen, aber wir können bei unserem neuen Trocknungs- verfahren mit Salz (Glaubersalz oder Natriumphosphat) genau die gleichen Beobachtungen machen wie bei dem früheren Verfahren der Acetontrocknung, müssen aber von vornherein sagen, daß eine Kontrolle einer Gehirnmethodik am Herzmuskel durchaus nichts beweisen würde, denn die Phosphatide der verschiedenen Organe sind, wie wir in zahlreichen Untersuchungen fest- gestellt haben, verschieden und wir haben schon öfter darauf hingewiesen, daß die Methodik der Lipoidextraktionen füi' jedes Organ erst adaptiert werden muß und selbst Ivar Bang, welcher auf S. 41 dieses Verlangen an uns stellt, sagt auf S. 28 wörtlich: ,,es ist demgemäß gar nicht gesagt, daß ein Darstellungsverfahren, das sich für gewisse Organe bewährt hat, nun auch allgemeine Gültigkeit besitzt; im Gegenteil, man muß überall für jedes bestimmte Organ erst die Versuchsbedinguugen ausprobieren, auch kann dasselbe Organ unter wechselnden Umständen sich recht verschieden ver- halten'-, was wir alles um so eher bestätigen, als diese Behauptung I. Bangs auf unseren Versuchen und auf unseren Darstellungen basiert. Vorläufig haben wir über pathologische Organe noch nicht genügende Er- falu'ungen, um ihnen unsere Methodik zu adaptieren, und gehen genau so vor wie bei physiologischen. Jüngst hat Budolf AJlers ^) diese Methodik der Acetonextraktion mit großem Vorteil bei der Untersuchung pathologischer Gehirne (senile Demenz) verwendet und hierbei das Auftreten von Spaltungs- produkten der hochkomplexen Phosphatide wahrscheinlich gemacht, Methodik der Extraktion. Als Ausgangsmaterial verwenden wir insbesondere bei Gehirnen menschliches Material, da uns dieses leichter zugängUch ist als tierisches und da auch der Lipoidgehalt ein höherer und die Gehirne sehr schwer sind. Außerdem verwenden wir nach Maßgal)e der Versuche verschiedene tierische Organe, welche möglichst frisch zur Verarbeitung kommen können. Das auf eine der beschriebenen Weisen getrocknete Gut extrahieren wir in großen metallenen Extraktionsapparaten (s. Fig. 161). Diese Extraktions- apparate fassen imNutzraume zirka 2kg Extraktionsgut. Auf einem Siebboden aus Zinn steht die Papierhülse aus schwedischem Filtrierpapier, in welche das gewogene Gut eingefüllt wird. Das Hauptextraktionsgefäß ist aus Kupfer, innen stark verzinnt, außen ist Quecksilberrot aufgetragen. Die Zuführungen ') Ivar Bang 1. c. p. 41. ^) Rudolf Allers, Zeitschr. f. d. gesamte Neurologie u. Psychiatrie. 5. 467 (1911). Darstellung von Lipoiden aus (ioliirn und anderen Ol-wcI Fiff. 161. ICU. Erklärung der Figur 161: niolii- Ki'rrtireiljniiK, 021 KOHXDICinUND kann man hei diesem Auslanf. wenn lUhn A - H « C I KxtraktiMir. ■2 Hotir für auriit«i|r«Ddo KsiraklioD*flaMl|rk*tl 'A I{i>t)errolir. 4 StatiT. 5 «li'ktriiirho lii>iKpl»lt«. •i KtindkoUx-n uun (um. 7 Sriiiilrhon mit Ug. 8 (ilanrobr. 0 dnppxlt wirkendor Kublttr. 10 Knrkstopfen. 11 l'J Scbraaben. sind aus Ziniimlir. die lliUine aus Mcssinj; und iindcrst ^enau t'inf^o- sehliitVn. Der Extraktionsapparat ist nichts anderes als ein g^rolW-r Soxhletapparat. Das weitere Kolir für das aufsteiu^cnde Kxtraktions- mittel ist mit Isolierschniir {j^ut isoliert, um dir Kondensationen innerliall) dieses Ktdires möf^liehst liintanzuhalten und «larf nicht /u en«; Ln'Nvählt sein. In unserem Falle istsein äulierer Durchmesser 2':') cm. An dem Hel)er aus Zinn haben wir zwei neue N'orrichtuniren an- gebracht (ich verdanke «lie Kon- struktion dieses Apparates nu'inem früheren Assistenten Dr. Wultrr L. H- passender Hxtraktionsmittel zn scheiden.») Wir führen aus Gründen, die ich anderweitii,' schon entwickelt habe. bei Gehirn besonders zuerst die Extraktion mit Aceton durch. I-'ür die Wahl dieses Lösuugsmittels treten wir aus mehreren (Jründen ein. \'or allem ex- trahiert Aceton sehr «.iründlich die Gewebe, indem es alles Cholesterin auflöst, ebenso alle Cholesterinester und dann auch die acetoidöslichen Phosphatide. Es ist für jeden in der Gewebechemie ?]rfahrenen von vornherein verstilndlich, dali bei einer solchen Extraktion auch andere, in die.sem Lösunirsmittel .sonst nicht lö.sliche Substanzen bei der ersten Extraktion mitgeführt werden und daß eine weitere Reinigung von diesen unter allen rmständen notwendig sein wird, denn es handelt sich dann nicht um eine J.ösun^ in Aceton. sondern um eine Lösung in einer acetoni;^-en ("liole>terinlösnn.ü etc. In Wirklichkeit gehen sehr wenig acetonunlösliche Phosphatide mit in den warmen Aceton hinein. Hingegen ist es sehr schwer, Cholesterin völlig mit Aceton aus Hirn zu extrahieren und ganz kleine Mengen findet man dann noch immer bei der Aufarbeitung der Kephalinfraktion (s. d.). Wollte man mit kaltem Aceton die großen Mengen von Cholesterin aus dem (lehirn extrahieren, so würde man eine sehr lange Zeit inid sehr viel Aceton benötigen. AVir ziehen es nach unseren bisherigen Erfahrungen vor, auf dem oben beschriebenen Extraktionsapparat mit Aceton zu e.\trahi<-- ren, der im Extrakteur etwa Körpertemperatur hat. Es .schwankt die Tempe- ratur im Extraktionsgefäß natürlich sehr, je nach der Temperatur in» Labora- torium. Warmes Aceton nimmt aus dem Gehirne die großen Massen von ( ho- lesterin leicht auf, aber mit dem Aceton geht ein acetonlösliches Phosphatid mit. welches man sowohl in den acetonigen Mutterlaugen findet, nachdem das Cholesterin auskristallisiert ist, als auch in den alkoholischen Mutterlaugen des Cholesterins. Aber es ist nicht gerade leicht, das Cholesterin völlig von dem Phosphatid zu befreien. Bei den grol-eu Mengen von Cholesterin, mit denen wir es zu tun haben, hat es sich manchmal bewahrt, das Cholesterin, nachdem es roh aus dem Aceton auskristallisiert war. mit Wa.sser zu waschen und dann erst dem Lmkristallisieren zuerst aus Aceton, spflter aus BöVoigem Alkohol zu unterwerfen. Einigemal haben wir die uns von Julius Mauthner empfohlene Methode, vorerst aus Eisessig und dann erst aus 85"/oiiit'm Alkohol zu kristallisieren, angewendet und gute Erfolge er- zielt. In den acetouiucn Mutterlaugen findet sich da> von un- u'it Jh>}.,rt ') Sif/miind Fninhrl, Ühcr l.ipoiili-. \ 1. Mittnlimg. tn)er ein neiips Verfahren der fraktionierten K.Ktraktion der Geliirnlipdidc. üiocliein. Zpit>5i-hr. 19. 2:>4 (1909). 624 Sigmund Fränkel. Elias^) beschriebene Phosphatid Leukopoliin, welches Kohlenhydratreaktionen nach der Spaltung gibt, aber dieser Kohlenhydratspaltling ist keine Galak- tose und reagiert nicht mit Hydrazinen. Es dürfte sich anscheinend um eine vielleicht stickstoffhaltige Kohlenhydratsäure handeln. Die Aveitere Unter- suchung wird erst Klarheit über die Natur dieser Substanz bringen. In den Aceton gehen außer diesen zwei Hauptsubstanzen noch kleine Mengen schmieriger Körper hinein und auch anderer färbender Substanzen, wahrscheinlich auch organische Salze etc., welche man durch die Wasser- behandlung zum größten Teil entfernen kann. Der Acetonextrakt des mensch- lichen Gehirnes enthält der Hauptsache nach an Lipoiden nur freies Cho- lesterin und Leukopoliin. Petrolätherextraktion. Nachdem man sich überzeugt, daß Aceton im Extraktionsapparat nichts mehr aufnimmt, geht man zur Extraktion mittels Petroläther über. Die früheren Untersucher haben ausschließlich mit Äther gearbeitet. Wir haben aus mehreren Gründen den Äther vermieden. Äther sowie Petroläther nehmen der Hauptsache nach nach unseren Befunden nur die ungesättigten Phosphatide auf. Äther ist aber, wenn man ihn nicht ganz rein und frisch destilliert für die Extraktion verwendet, bekanntlich eine stark oxydierende Substanz, dabei bei weitem teurer und durchaus nicht bei großen Massen ungefährlicher als der von uns vorgeschlagene und verwendete Petroläther. J. Parnas 2) hat unsere Methodik zu modifizieren gesucht, indem er ohne vorher mit Aceton zu erschöpfen, Benzin angewendet. Er bringt das viele Cholesterin nun in die Benzinfraktion hinein. Ferner ist das eine bedeu- tende Verschlechterung des Verfahrens auch nach der Richtung hin. daß es nämlich durchaus nicht gieichgiltig ist, welche von den Petrolbenzinfrak- tionen man für die Extraktion anwendet. Schon niedrig siedender Petrol- äther nimmt ebenso wie Äther während der Extraktion die weißen Sub- stanzen der gesättigten Gruppe mit, welche sich im Extraktionsgefäß am Boden des Lösungsmittels ansammeln, insbesondere, wenn das Lösungsmittel erkaltet ist. Nimmt man aber höhere Fraktionen der Petroleumkohlen- wasserstoffe, so werden immer mehr und mehr von der gesättigten Gruppe mitgenommen und gelöst, denn mit Ligroin z. B. kann man die ge- sättigten Substanzen völlig aus dem Gehirn herausholen, was wir auch mit Vorteil benützen. Will man daher nach unserem Vorschlag tat- sächhch eine Methode der fraktionierten Extraktion anwenden, das heißt schon während der Extraktion durch passende Wahl und passende Aufeinanderfolge der Lösungsmittel eine Trennung der drei großen Gruppen der Lipoide, wie wir sie vorgeschlagen haben : des Cholesterins und seiner Derivate, der unge- sättigten Phosphatide und der gesättigten Phosphatide, Sulfatide und phosphor- *) Sigmund Fränkel und Herbert Elias, Über Leukopoliin. Biochem. Zeitschr. 28. 320 (1910). ^) 1. c. Dai-stellui)',' von Ij|ioi(lt'ii :nis (iiliim miil aiidcrcu r;. -.-i...., , .> und schwefelfreien Sphinnoualaktosidc (iiirclifiilnvii, so venvcrulo man leuhl siedeiuleii I'otroläthcr. Nach iiiiscivii Mrf.iliniii;;»'» ist es am In-stou. ciiicu IVtroliitlici' zu vcM-wciideii, dessen höchste Kniktion hei .'.:)■ ü' jx.^ käut'lirhe l'etroläther entspricht dii'son Anfonh-nnip-n (hn«li;iu- i.ui,u Wir raffinieren ihn duher durch luidestilheren mit einem !• rakth-niera:;' • und entnehmen dem käutnchcii nur so viel, his das Thermometer au. .... ansteigt. Der große iihrigi)hMi)ende Kest wird für andere /wecke verwendet. Auf diese Weise erhalten wir nur sehr wenig von der gesilttigten Fraktion in den Extrakt der ungesättigten riiosphatide. \>\ die Extraktion heendet. so ^vird nach gutem Auskidilen des Petroliithers die Hauj»tmasse der pe- trolätherischen Lösung in einem Fraktionierkolhen ahfraktioniert, der liest mit der kleinen Menge gesättigter Suhstan/.en wird auf einem kleinen Filter filtriert. .\m besten veiweudet man schwedische Filter, welche dieso allerleinste Pulver ebenso wie Barytfilter zurückzuhalten vermögen. Die petrohitherisclie Lösung wird nun einfach destilliert; wenn der größte Teil des I'etroläthers abdestilliert ist und das Thermometer gegen 40" ansteigt, (h-stiliierf man unter Anwendung von Vakuum weiter, und zwar vom \akuum der Wa.sser- strahlpumpe. da sonst die Leitungen dei- Koll)enj)umpen zu sehr vom l'etrol- äther trotz stärkster Kühlung angefüllt werden. Scheidung des Petrolätlierextraktes. Alkoholunlösliche Fraktion der ungesättigten Phosphatide : Kephalin. In den stark konzentrierten Extrakt gielit man hierauf etwa die vierfache Menge absoluten Alkohols und rührt stark um. Im ersten Moment fällt das Kephalin, welches die Ilaujttmasse des Extraktes bildet, als eine noch flüssige, und zwar sehr dickflüssige .\Lisse, zu i'.oilen. Man rührt sehr stark mit dicken Glasstäben um und nachdem sich ilie alkoholische Lösung geklärt, kann man diese dekantierend abgiel'icn. Iii«'raul gießt man nochmals absoluten Alkohol auf das gefällte Ke|(halin. rührt wieder stark um, wobei sich dieses in eine feste, fast wachsartige .Masse verwandelt. Zur Keinigung wird diese >L"isse nach sorgfältigem .\bgielien und Abpressen des Alkohols mit einem Pistill wieder in nn'iglichst wenig leicht siedendem Petroläther unter starkem Kühren gelöst. Sollte die Lösunir nicht ganz klar sein, so schleu-ii.'e Masse, die man mit dem Spatel leicht zerteilen und dann nach wiederholtem Trocknen in ein feinstes, leicht gelbes Pulver verwandeln kann. Beim Kephalin ist. wie bei keiner anderen Substanz, möglichst rasches Arbeiten und möglichst rasches Entfernen der Lösungsmittel notwendig', da Abderhalden, Handbuch der biochemischen ArbeiHmolhcHlen. V 40 (326 Sigmund Fränkel. man statt einer leicht gelb gefärbten Masse eine schwarze Substanz infolge der Oxydation erhält. Das so gewonnene Ivephalin ist durchaus noch keine chemisch reine Substanz. Vor aUem enthält es , wie alle Beobachter über- einstimmend gefunden haben, in rohem Zustande noch verschiedene Aschen- bestandteile. Schon Thudichum hat vorgeschlagen, das nach seiner Methode dargestellte Kephalin über Wasser zu reinigen ^ ), und in unseren Unter- suchungen mit E. Neubauer^) haben wir tatsächlich für die Elemeutaranalysen Kephalin über AVasser gereinigt, indem wir es in diesem durch feines Verreiben zur Quellung brachten, abschleuderten und mit Säure fällten. Diese Reinigungsmethode ist keineswegs eine ideale. Man verliert sehr viel von der Substanz, um zu Präparaten zu gelangen, welche stimmende Ana- lysenzahlen geben. Dem Umstände, daß die Eeinigung des Kephalins schwie- rig ist , ist es zuzuschreiben , daß im F. Hof }neister sehen Laboratorium von F. Falk ^) das Gehirnkephalin zuerst als Diaminomonophosphatid beschrieben wurde, entgegen den Angaben von Thudklnun und daß erst, nachdem wir mit £". iVewifmer'^) das in der beschriebenen AVeise gereinigte Kephalin analysiert und genaue Zahlen für ein Monoaminomonophosphatid erhalten haben, J. Farnas nachher im Straßburger Laboratorium zu gleichem Eesultate Avie wir gelangen konnte.*) Alkohollösliche Fraktion der ungesättigten Phosphatide. Die alkohollösliche Fraktion wird nun im Vakuum stark eingeengt und hierauf wieder mit absolutem Alkohol aufgenommen, wobei sich manch- mal noch kleine Mengen einer Substanz, die wahrscheinlich mit Kephalin identisch ist. ausscheiden. Die alkoholische Lösung gibt, wie schon Thu- dichum beobachtet hat, mit einer schwach ammoniakalischen alkoholischen Bleiacetatlösung einen Niederschlag. Thudichum hat diesen Niederschlag weiter untersucht und aus demselben eine phosphor- und stickstoffhaltige Substanz, das Myelin , sowie eine verwandte : das Paramyelin gewonnen. Bei unseren Untersuchungen mit i?ir/?örd' i>örr 5) haben wir den Bleinieder- schlag nach Ausw^aschen mit Alkohol in Benzol gelöst, und aus der benzohgen Lösung wieder mit Alkohol gefällt. Als wir aber die Bleiverbindungen hierauf in alkoholischer Suspension in der Wärme mit Schwefelwasserstoff behandel- ten, erhielten wir eine kristallisierende Substanz mit sauren Eigenschaften, welche sich als völhg frei von Phosphor und Schwefel erwies, aber stickstoff- haltig war und ungesättigten Charakter zeigte. Die Untersuchung dieser Sub- stanz sowie die Ermittlung ihrer Spaltungsprodukte ist noch nicht beendet. Thudichum hat vorgeschlagen, das im Überschuß zugesetzte Blei mit Schwefelw^asserstoff aus dem alkohoüschen Filtrat zu entfernen, was wir aus dem 1) 1. c. p. 129, 130. -) S. Fränke.J u.E. Neiihmter, Über Kephalin. Biochemische Zeitschr. 21. 321 (1909). ^) Fritz Falk, Zur Kenntnis des Kephalins. Biochemische Zeitschr. 16. 187(1908). *) Jakob Parnas, Über Kephalin. Biochemische Zeitschrift. 22. 411 (1910). *) Noch nicht veröffentlicht. Darstellung' vnn l,i|iuii|(>ii :ui> (idiirn mnl iiKlrnjr (:••«. .1 ^9a|»it'r aurierst srliwaiu ' rd DerNiederscIdau- von Cldorhlei resp. C'hlorhlciammoniak setzt sich s. .,, -..i ali und kann leicht ai)filtriert wenh'U. Man liltricit nun. fu^t di<' Lösuiit: im Va- kuum wieder ein, nachih-m man mit einer Spur alkoholischen Ainujoniaks die Spur freier Salzsäure ahLrestumjjft hat. hie konzentrierte lÄlsung wird nun mit reinem, wasserfreiem Aceton ausirefällf. wieder in Alkcdiol Lrelüst und wieder mit Aceton liefiillt. Aus dem so darj^estellten l'raparat hahen wir dann als Chlorcadmiumverhindunir das Sahidin L'ewonnen. In den Mutterlauiien des Sahidins fanden wir kaum Spuren von andi-ien Suhstanzen. Dieses Sahidin erwies sich als nicht identisch mit ( )volecithin.M Ich möchte an dieser Stelle eine llemerkunt,' über die N'erwenilunj; von Cadmiumsalzi II in der Analyse dei- Phosphatide einschalten. Uii.sj're Kennt- nisse über die Lecithiii{iruppe heiuheii. wie jeder, der sich nur ein wniit' in dei' Literatur dieser Veri)iiidunf:('ii zureclitu'efuiideii. weil», auf der Aiiaivse der riatinverhindun^- von Strecker und auf den .\iialyseii der Cadmiuni- verbiiidungen vieler Autoren . iiishesonders von Strich r und Thid/idium. Kiiii|ioliiii benutzt, nicht die gleichen p]rfaliruiigeii gemacht, können aber davor nur warnen, wahllos in rhosphatidgemisclie, wie ..Lecithin''. Catlminmlösung liineiu- zuschütten und aus der Analyse „Schlüsse iilier die Zersetzung" zu ziehen. wie es kritiklos W. Hcubmr-) tut. Die gesättigte Gruppe. Wenn man Hirn mit Aceton und Tetroläther oder mit l'etroläther allein oder auch mit Äther ers(höpft hat. so hinterbleibt in die.sem eine (iruppe gesättigter Substanzen, welche man mit verschiedenen Lösungsmitteln, am besten in der Siedehitze derselben, extrahieren kann, und as größte Venlienst nach dieser IJiehtnng hin ist 'l'liudichuni /nzuschrcibcn. welcher zwei >olrhe phosphorfreie Substanzen isoliert und beschrieben hat. von denen er aurh die Konstitution zum Teil feststellen konnte. Er benannte sie Phrenosin und Kerasin. Andere Forscher nannten diese phosphorfreien Sidistanzen Cerebro- side, aber wie ich glaul)e. haben auch die.se Forscher die ('erel)rosi(U' niclit in einem reineren Zustande in Händen gehabt als Thudiihum. Krst als (innujcf^) und Thi erfehl er'-) das sogenannte Pseudocerebrin oder Ci-rebroii kristallisiert erhielten und Thierf ekler'') die Hydrolyse durchfidirte. welche bis anf einen Punkt identische Resultate mit T/iuilichinns*) llydiolyse des Phrenosin gab. konnte man von einer reinen isolierten Substanz s|)rechen. .Man mulit«' die Frage aufwerfen, warum die verschiedenen Forscher — und wir zählen die ersten Namen unserer Wissenschaft dazu — so verschiedene Pesultate erhielten und an welchem Punkte ihre Methodik scheiterte'.' Wenn man die Verfahren, welche Thurfeldtr zur IsolieriniLT de^ Cerebrons iiiuner w(^chseln(l veröffentlicht hat. betrachtet und sieht, mit welchen .S-hwierig- keiten er zu kämpfen hatten luid erst nach wievielfachem l'mkristallisieren er aus dem phosphorfreien rTenienge Cerebron isolierte, so wird man Fol- gendes darüber aussagen können. Die C'erebroside oder, wie ich sie be- nannte , die Sphingogalaktoside geben sehr wech.selnde Stickstoffzahlen, welche immer höher liegen als die Stickstoffzahl ([v< reinen Cerebrons. sowie seiner aus den Spaltungsprodukten berechneten theoreti.schfn For- mel. FiS mulj daher in grober Menge eine zweite Substanz, mindestens eine, neben dem Cerebron vorhanden sein, welche mit dem Cerebron ge- mischt physikalisch ähnliche Eigenschaften zeigt nnd anch sehr nahe ver- wandte oder identische Spaltungsprodukte gibt. JSo hat von all den ana- lysierten Cerebrosiden verschiedener Darsteller nur das Cerebron so niedrige Stickstoffzahlen. Es ist gaj- kein Zweifel, dali Cerebron kein Spaltling ist, .sondern direkt im (lehirn vorkommt, und nach unseren rntersuchnngen besteht kein Zweifel, und darin stimmen wir mit J'osncr und (iits iiberein. dal'. Tku(lichi())is Phrenosin mit dem Ceri bron identisch if. dab >ie die.se Substanzen in weitaus reinerem Zustande in I Linden hatten: man kann Thier- f'rJdrrs Verdienst nicht bestreiten, gezeigt /n haben. dal\ die FettsiUire, iini die es sich handelt, nicht Stearinsäure, wie 'rintdichuin inni wie anch •) fimuf/K. Ti'XtlMK.k i<\ i.li\sioloL'ir;il rlifiiiistn-. Loiiilmi. |> 441 (lS.*<(h -) //. Tliirrfrh/rr und /:'. ]\'öni>r. (Iflmii /i-itsrlir. f. pli^siol. ( lu-uiie 30. äi:?!!".**»! ') //. Thicrfelder. Cercltron. Zcitsclir. f. plivsiol. Chomi«'. \.\. >\ «11104 »». ibid. 44 3fl6 (190:>), ibitl. '46. 5lS (1905). il-i.l 49 'iSC, (HKMJt. *) 1. c. p. 182 ff. 55Q Sigmund Fräiikel. Kossel angenommen haben, ist, sondern eine Oxysäure, die Cerel)ronsäure. Es ist nun die Frage, was ist denn das eine oder die mehreren anderen Cerebroside, welche vom Cerebron so schwer trennbar sindV Fernerhin hat man die Frage aufgeworfen, was die phosphorhaltigen Anteile dieser weißen Materie sind. Mehrere Forscher, insbesondere aber Kossei und Freytag haben darauf hingewiesen , daß in dieser weißen Ma- terie neben Phosphor auch größere Mengen Schwefel vorhanden sind, und zwar in Form von Schwefelsäure. Thudichum selbst erwähnt nur nebenbei solche Sulfatide, ohne besonderen Wert darauf zu legen und hat nur ein Phosphatid als Cadmiumsalz isoliert und als Sphingomyelin beschrieben. Viele Forscher haben den Schwefelgehalt entweder geleugnet oder nur wenig Schwefel gefunden. Wir haben in allen unseren Präparaten ohne Aus- nahme neben Phosphor auch Schwefel gefunden. Man muß nun fragen, ob der phosphorhaltige Anteil ein gesättigtes Phosphatid ist und daneben ein Sulfatid vorkommt, oder ob es sich um ein Phosphorsulfatid als Individuum handelt. Die Methodik der Verarbeitung dieser weißen Materie muß daher so eingerichtet sein, daß sie allen diesen aufgeworfenen Fragen gerecht wird und daß man jedenfalls dazu kommt, Substanzen darzu- stellen, und zwar in solchen Mengen, daß man an ihre Hydrolyse gehen kann, da die bloße Analyse so komplizierter Gel)ilde, wenn sie auch rein dargestellt sind, vorläufig nichts besagt, ebensowenig wie etwa beim Eiweiß, solange wir nichts über die Spaltlinge aussagen können. Die Methoden der Trennung des phosphor- und schwefelhaltigen Anteiles der gesättigten Gruppe von den Cerebrosiden sind um so mannig- faltiger, als alle Forscher auf diesem Gebiete sehr große, fast unüberwind- liche Schwierigkeiten fanden. Thudichum hat die weiße Materie mehrfach aus Alkohol umkristallisiert und so den Phosphorgehalt bis auf 0"8Vo heruntergedrückt. Die weitere lieinigung führte er nach einer Methode durch, die wir die Bleimethode nennen wolhn. Die feuchte weiße Materie wird im Mörser mit einer alkoholischen Bleizuckerlösung, welche kleine Mengen von Ammoniak enthält, zerrieben und in heißen 85<>/oigen Alkohol eingetragen. Dann setzt man noch weiter Bleizucker und Ammoniak der heißen Lösung zu. so lange noch ein Nieder- schlag entsteht. Man filtriert heiß und kocht den Bleiniederschlag er- schöpfend mit Alkohol aus. Die in heißem Alkohol gelöst gebliebenen Cere- broside fallen iieiin Abkühlen aus und werden aus absolutem Alkohol um- kristallisiert, wobei zuerst Phrenosin ausfällt, später Kerasin. In der Mutter- lauge ist noch Sphingomyelin und Kerasin enthalten, die durch Cadmium- chlorid trennbar sind, da nur das Sphingomyelin eine Cadmiumverbin- dung gibt. Das rohe Phrenosin wird durch fraktionierte Kristallisation vom Kerasin befreit, und zwar in der Weise, daß die alkoholische Lösung zwischen 50" und 40*^ Phrenosin in Piosetten auskristallisieren läßt. Die Bil- dung dieser Ptosetten hört bei 28" auf und die über denselben stehende Flüssigkeit bleibt klar, bis sie auf 26" ausgekühlt ist. Dann fällt das Ke- rasin als dichte aelatinöse Wolke aus. Das Phrenosin wird durch 8maliges DaistelliiiifT von Lipoiden ;iii8 (ichirn und anderen O ,;;;| Umkristallisi(Mon kcrasiiifici ^rcwoniicii. Das so gewoniHMn- l'liniiu>in war aber iiocli nicht frei von l^liospliafidcn. Cm fs von »ii.-.-n vi.;" i reinigen, wnrde riirenosin mit Clilorcadminm \«'r>;«'tzt, LM'tidirt. die aber naeh seinen zahlreichen Angaben und nach un.screr Nacli|iriitiing auch niciit \ulli'_' gute Resultate liefert. Er entwässert') (iehirn mit Aceton und extrahiert mit Äther. Bei 0" kristallisiert aus dem Äther eine weil'.e Mas.se au.s. welche man dem (iehirnbrei zufügt und das (ianze wird mit H;')%ig«'m Alkcdioj bei 45" bis 50 '^ wiederholt ausgezogen. Die ausfallenden Massen wäscht man mit Äther, trocknet und löst in Methylalkohol, welcher 75%, Chlontfonn enthält. Auf einen Teil der weißen Materie nimmt man ."» Teile des Lö>nni:^- mittels und löst unter leichtem Erwärmen, filtriert nnd lallt verschlossen stehen. Es scheidet sich an der Oberfläche eine weiCie .Masse ab . ebenso aus dem ausgekühlten Filtrat. Durch wiederholtes Umkristallisieren erhalt man eine harte weiße Kruste, welche sich an dei- Olierfläche abscheidet. Alle Abscheidungeu, auch die aus der Mutterhuige, werden vereinigt und in der HOfachen Menge eines r.ösungsmittels. bestehend aus 1 Teil Chloro- form und 4 Teilen Methyhükohol. heiß gelöst. Die auskristallisierende Masse wird mit einem Zinkreagens i)eliaiidelt. Man erhält die.^'s durch SusjuMidieren von Zinkhydroxvd in Methylalkohol, Einleiten von Ammoniak uiul /ufüiien von Ammoniumacetat. Man löst das Cerebron heiß in Methylalkohol, welcher 10% Chloroform enthält, setzt das Reagens zu und kneht, bis si<-h eine flockige Masse ausscheidet, welche fast alle phosphorlialtiiren Substanzen enthält. Hierauf filtriert man. Das sich ausscheidende Cerebron kristalli- siert man noch einmal aus der Chloroformmetliyialk(diolmischung um. In .seiner jüngsten Arbeit gibt llncrfddcr-] an. daß er nel»en dem Cerebnm eine dem Cerebron sehr ähnliche und schwer von ihm abtrenid>are Substanz gefunden. Er arbeitet bei der Darstellung i\Q)> Cerebrons gegenwärtig in di-r Weise, daß er die fein zerhackte lliinmas.se auf (dasplatteu in «liinner Schicht aufträgt. Die Platten liegen auf einer mit dicker Samlschicht Ih«- deckten Eisenplatte und werden durch unterstellte Rrenner .so erwärmt. daß die Temjjeratur des Sandes an keiner Stelle :)()ö bis 5;i" übersteigt. Ein über den Platten angebrachter Flügelventilator sorgt für rasche Erneue- rung der Luft. In den ersten drei Stniuleii wird die Ma->e vXwa alle ') F. Ki/tn/inra iirnl //. r/iicrf'rl'frr, V\tor das Cert-bron. /eitsrhi. I. jih>»iol. Ch«IU. 49. 286 (190G). '-) Ilirmann Löhnuii;/ und //. T/ihrtihlir, TIht ila- ' rrohroD. W MiHolunt: Zeitschr. f. physiol. ( liom 08. 4t)4 (li)lO). g32 Sigmund Fräukel. 10 Minuten mit einem Spatel gewendet, dann seltener. Nach 10 Stunden hat sie eine Wassermenge, welche zwischen 72 und Tö^/o des Gewichtes des frischen Gehirns schwankt, abgegeben und eine helle Heischfarbe an- genommen, sie verbleibt nun noch längere Zeit im Exsikkator und wird darauf im Soxhlet^chen Extraktionsapparat mit Äther ausgezogen, und zwar unter zweimaligem Wechsel des Äthers je 3 — 4 Stunden. Die in den ätherischen Lösungen erfolgenden Abscheidungen trennt man auf der Zentrifuge, zerteilt den Bodensatz in frischem Äther, zentrifugiert wieder und wiederholt die Behandlung nochmals für den Fall, daß der Äther noch gefärbt ist Nach einem, wie die Verfasser angeben, unendlich mühsamen Verfahren verarbeiten sie nun die so erhaltene weiße Masse. Nur die Grundzüge des Verfahrens sind veröffentlicht. Zunächst erfolgt eine 6mal wiederholte Umlösung aus 75"/o Chloroform enthaltendem Methylalkohol. Hierauf werden die weißen Massen in großen Mengen heißen, den fünften Teil Chloroform enthaltenden Methylalkohols gelöst und die beim Abkühlen innerhalb gewisser Temperaturgrenzen erfolgenden Abscheidungen mittelst Filtrierens durch Warmwassertrichter voneinander getrennt. Auf diese W^eise trennen sich die kristallisierenden Anteile von den später ausfallenden amorphen. Eine weitere Trennung innerhalb der so gewonnenen Frak- tionen läßt sich durch wiederholte Extraktion mit 10»/o Chloroform ent- haltendem Methylalkohol und weiterhin mit Methylalkohol bei öO" erzielen. So konnten Löhnung und Thierfelder Cerebron und die amorphe Substanz trennen. Aber sie können nicht angeben, ob diese amorphe Substanz nicht etwa verunreinigtes Cerebron ist oder ob es sich um einen von den übrigen Forschern schon beobachteten Körpei- handelt. Bei unseren zahlreichen Untersuchungen haben wir schließlich zu einer Methodik gegTiffen, die wir als den Ausbau eines schon von Kossei und Freytag^) beschriebenen Verfahrens angesehen haben wollen. Man hat früher die Cerebroside in der W^eise gewonnen, daß man die Gehirnsub- stanz mit siedendem Barytwasser versetzt und aus dem abgeschiedenen Gemisch die Cerebroside mit Alkohol auszog. Kossei und Freytag lösten Protagon (die weiße Materie) in Methylalkohol und versetzten die Lösung bei W^asserbadtemperatur mit einer methylalkoholischen Lösung von Ätz- bai-yt, wobei sich sofort ein voluminöser Niederschlag bildete. Nach dem Dige- rieren der Flüssigkeit einige Minuten lang auf dem Wasserbade trennt man den Niederschlag ab. wäscht ihn mit barythaltigem Methylalkohol einmal, zerteilt ihn hierauf in Wasser und zerlegt die Barytverbindung mit Kohlen- säure, filtriert hierauf den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Alkohol und zieht ihn sodann bei 50" mit absolutem Alkohol aus, wobei nach den An- gaben der beiden Forscher die Verunreinigungen, welche sonst den Cere- brosiden hartnäckig anhaften, insbesondere die Barytseifen der höheren Fettsäuren, nur zu geringem Teil in Lösung gehen. Die letzten Reste baryt- ') A. Kossei und Fr. Frenfan, tlber einige Bestandteile des Nervenmarks und ihre \ erliieitun<>- in den Geweben des Tierkörpers. Zeitsehr. f. phys. Chem. 17. 431 (1893). Daistt'lliuii,' Villi l.ipdiilcii aus (irhirii iiiiil aiiih n i, t,.v\.-|.fn. |j;j^-j haltiiicr W'rliiiuluiigcii werden ciitlcnit. iiidciii man sie zunnchht anmht lind wieder mit Kolilensänre läiif^^or boliaiidelf. |)en alij^^et rennten Nieder- schlag' nimmt man mit absoUitom Alkohol hei ;')()" auf. Aus den» Alkohol kristallisiert hei Zimmertemperatur zunächst Cerehrin (^Cerehriir ist wohl identisch mit Thudiclmms riireiiosinK nach 2 Stunden vorwie^'en«! Kt-ra'iin und durch Smali^cs rmkristallisieren aus Alkohol kann man dieM- h.-iden Substanzen voneinander trennen. /vV.sv/ und Fni/tn;/ haben aber den in Alkohol unlöslichen Küekstand. welcher die Phosphatide und Sulfatide ent- halten niul». in ihrei- Tutersuchun},' nicht weiter bi-riicksichti;:!. Wir haben durch den Ausbau dieser Methodik, die nach unseren Krfah- runtiiMi durchaus die beste uiid einfachste ist und weitaus allen übri<,'en. inslxj- sondere den T/iier/'chler^c]wn mühselifren und kaum literarisch darstellbaren \'erfahren überlegen ist. jedenfalls bis jetzt bei der weiteren Trennunt: die besten Krfolge gehal)t. Wie oben angegeben, extrahieren wir die mit Aceton und Petroläther völlig erschöpften (Jehirne mit siedendem absolutem Al- kohol. Nach dieser FAtraktion finden wir in den Kückständen Ai-> (iehirns nur mehr minimale Mengen mit Lösungsmitteln extrahierbarer Anteile. Die Absätze aus dem absoluten Alkohol werden mit den kleineren Meiiiren weißer Absätze aus dem Petroläther einfach vereinigt und im I-Asikkator vöUig nach vorhergehendem gründlichen Auspressen von Äthylalkohol be- freit. Mau miil'i sehr schart' alle Protag(Hi- und ("ereliro'^iilpriiparate pressen, um die groi'ieii Mi'iigeii Mutterlauge, welche sie einsclilielien, zu entfernen, da sonst jedes I'mkristallisieren iUr.^prisch ist. Hie ganz trockene Masse wird in siedendem absoluten Meth\iailkoliol. und zwar in der gerade aus- reichenden Menge gelöst, wobei sie fast ohne jeden llückstand in \Äi- sung geht. In diese siedende Flüssigkeit lassen wir so lange methyl- alkoholische Atz])arytlösung-, dargestellt aus reinstem, mehrfach iimkri- stallisiertem Atzbaryt in absolutem .Metliylalkohid. ziiflier.en. so lange noch ein Niederschlag in der schwach sie(len(len Flüssigkeit entsteht und bis die Flüssigkeit, die über dem Niederschlag steht, deutlich Phenol- phtalein rot färbt. Hierauf läßt man die Flüssigkeit auskühlen, filtriert den Methylalkohol ab. in welchem nur geringe Mengen organischer Sub- stanz enthalten sind. Nach gutem Abpressen des Nieilerschlages auf der Nut^che "^verteilt man den Niederschlag' in destilliertem Wasser und leitet, nachdem der Niederschlag sehr fein verrieben ist. unter öfterem iMirch- leiben Kohlensäuie ein. Nach mehrstündigem Durchleiten der Kohlen- säure wird die Masse auf der Niitsche möglichst scharf abge.sau'jt. mehrere Male mit destilliertem Wasser durchgewaschen. woi»ei noch kleine Men^ni eines gelben Farbstoffes mitgehen, und hierauf mit «M'." „igem Alkohol und .M'hheiilich mit kleineren Mengen alisoluten AtliylalkohoF gewa,v/ und l'n iftatj nicht weiter untersuchten liarvtrückstand. Dieser besteht aus den Sub>tan/en. 634 Sigmund Frank ol. welche Thudichum aiischeiiieiid als Sphingomyelincadmiumchlorid darge- stellt, und zwar in Form von Barytsalzen. Phosphorsulfatidfraktion. Wir arbeiten den Barytrüekstand in folgender Weise auf : Verfahren a) : Mit etwa 5o/oiger Salzsäure wird der unlösliche Rück- stand angerieben und so lange mit der verdünnten Salzsäure kalt ausge- waschen, bis alles kohlensaure Baryum und das in den sauren Sub- stanzen salzartig gebundene Baryum entfernt ist. Sobald das Filtrat mit Schwefelsäure keinen Niederschlag mehr gibt, wird die Masse mit Wasser so lange ausgewaschen, bis aus dem Filtrat die Chlorreaktion verschwindet. Dann wird die Masse mit wenig kaltem Alkohol gewaschen und hierauf aus absolutem Alkohol umkristallisiert. Man erhält so eine sehr stark saure Substanz, mit deren Untersuchung wir beschäftigt sind. Wird sie in siedendem Methylalkohol gelöst und wieder methylalko- holische Barytlösung zugesetzt, so fällt das Barytsalz der Substanz aus, welches glatt in Chloroform in der Kälte löslich ist. ('l)enso in Ligroin. Als wir diese Beobachtung gemacht hatten, haben wir unser Verfahren abändern können. Verfahren b): Die phosphorschwefelhaltige Hirn säure, wie wir sie vorläufig nennen wollen, erhält man aus dem oben beschriebenen, Baryumkarbonat enthaltenden Barytniederschlag nach vorhergehendem Auskochen mit absolutem Äthylalkoi^^jl und so durchgeführtem Befreien von Cerebrosiden . in Form ihres Baryumsalzes , indem man den in absoluten Alkohol unlöslichen Rückstand mit Chloroform anreibt, und zwar mit sehr viel Chloroform oder noch besser mit Ligioiu und von dem suspendierten und äußerst schwer durch Filtration entfernbaren Baryumkarbonat durch wiederholtes Zentrifugieren befreit, bis bei wei- terem Zentrifugieren in den Gläsern kein Bodensatz mehr sichtbar und nur auf der Oberfläche eine kleine weiße iVusscheidung zu bemerken ist. Von dieser trennt man durch Abrahmen mittelst eines kleinen Löffels. Nach dem Einengen der Chloroform-, resp. Ligroinlösung des Baryumsalzes kann man dieses entweder aus Chloroform auskristallisieren lassen oder durch Alkohol fällen. Aufarbeitung der Cerebroside. Die Cerebroside trennen wir nun durch wiederholtes l^mkristal- lisieren aus siedendem absoluten Methylalkohol mit einer zur völligen Lösung nicht ausreichenden Menge. Bei diesem Verfahren erhält man in absolutem Methylalkohol lösliches Cerebron, welches genau die empi- rische Zusammensetzung und die Spaltlinge, wie sie Thierfeldcr be- schreibt, zeigt und eine in Methylalkohol unlösliche, aber aus absolutem Alkohol kristallisierl)are Substanz, w^elche weitaus stickstoffreicher ist als Cerebron und welche als Spaltlinge ebenfalls Cerebronsäure und Sphin- Daistellunir viui Lipoiden aus (ipliiiii uiid :iii»Ini<'ii j;«'«i I.in (^-y^ gosin, aber koint' (Jahiktosc liefert, soiidcni ciiif reduzierende Suh.staii/. die sich mit Hydra/.iiicn nicht vcrliindct, ali.T aus WasM-r und aus Alkohol in makroskopischen Kiistallcn krisfalhsicrt. Durch wicih-rholtc Scli ans nn/nrcichcmk'n Monircn Methylalkohol und J'hirr/rHrr- sehen Cerebrons, erwies sich aber als aschehaltiL^ \Vii- haben diese beiden Cerebrosidpräparate durch Auswaschen mit kalter P/oif^er w.isseri^rer Salz- säure fast aschefrei machen können, sahen aber hierlu'i. dal'i die Schmelz- punkte der gewaschenen Präparate absanken. p]s bleibt noch ein Verfahren zu erwähnen, welches (}. Ji'i.sr/ihini und Christine Tchh angegeben haben, welches es erlauben soll, bei der Kx- traktion aus dem Gehirn direkt die Zerebroside von den Phosphatiden zu trennen. Dieses Verfahren l)eruht darauf, dali Pyridin die Cerebroside schon in der Kälte, die gesättigten Phosphatide erst in der Wärme löst. Wir haben dieses Verfahren nicht direkt mit (iehirn. aber mit dei weißen Materie nachgeprüft und haben nicht ilas aiiL-^egebene Kesultat er- reicht, ein Resultat, welches überdies nicht durch .\nalypliinLM)- myelin und die phosi)liorfreien (ialaktoside separat zu extrahieren, indem er Pyridin als Lösungsmittel verwendet. Kr vt'ht dabei so vor. «lall er zu- erst das (iehirn mit kaltem Aceton entwässert inid vnn Cholesterin und Extraktivstoffen befreit. Ilieiaiif erschöpft er das (iehirn mit Äther oder Petroläthei-. vei-mahlt den llück>tand auf eim'r Midde und erwärmt das Pulver mit :■} \ol. Pyridin 10 Minuten laui^ bei HU 4()" und läl'.t auf I;'»" vor der Filtration ai)knhleii. Man erhidt ein klares rötliche«- KAtrnki. weh-lie-; Absorptionsbanden ähnlich jenem iU'^ Häniochromo^en-« zeigt. Die>er Kx- tralit bi'konimt fortschreitend eine olivengrüne Farbe: man glelit ihn in S 4 Vol. .Vceton und erhält ein schweres Pi-äzi|titat von unreinen (Jalak- tosiden. welches im rohen Zustande nngefiUir '/./'/i. Phosphor enthält und durch fraktioniei'te Kristallisation in •_' Ilanptteile geschieden wt-rdeii kann: in das Phrenosin und Kerasin aus Hö^/oig«^'»' Alkohol bei :',(•)" imd bi-i 0«. Die letzten Spui'en Phosphor können mit essigsaurem llh-i nml ("Idorcadmium - nach lliudiihum odei- mit /inkannnonacetat nach Thicrjrhlrr oder durch rmkiistallisieren aus Fisessig nach IT. /v "• A entfernt wer- den. Das Sphingomyelin wird nun in der Weise dargestellt, «lal'. man da> Gehinijmlver mit ;j \'ol. reinem Pyridin bei 40-45» eine «.Stund.- lani: 686 Sigmiiiiil Fränkol. Darstellung von Lipoiden aus Gehirn n. anderen Geweben. erhitzt, das wuiiiu' klare Filtrat kühlt iiiaii auf Eis bis zur Zimiiiertenipe- ratui" von IT)". Die Lösuu^- wird j>rüiih('hopalisiereud und es setzt sich ein durchsieht ilutkörperchen in dei' Weise angewendet, daß vorei'st mit 95''/oigem Alkohol und dann mit Petroläther extrahiert wurde. Engt man die alkohohsche Lösung bei hohem \'akuum ein, so kann man sowohl die Sterine als auch die Phosphatide, welche vorher in Petroläther nicht in Lösung gingen, nun mit Petroläther aus der einge- engten Flüssigkeit bei-auslösen und der weiteren Bearbeitung unterziehen. Während im Gehirn kaum Fett zu finden ist, so^ daß dieses die Trennungsverfahien nicht alteriert, ergibt sich bei den anderen fetthaltigen Geweben die große Schwierigkeit, die Phosphatide und die Cholesteringruppe vom Fette zu befreien. AVir haben nach dieser Pachtung hin die besten Erfolge bei der Auslaugung der Aceton- und Petrolätherfraktion mit kaltem 95°/oigem Alkohol gesehen. ^) M Otto Rosenheim und Christ ine Tebb, Journal of Phj'siology. 40. Proc. of Physiol. Soc. Juli (1910). '-) .S'. Ffänke.J und G. A. Pari, Über die Phosphatide des Rinderpankreas. Biochem. Zeitschr. 17. 68 (1909). Die Metliodik der Plaiiktoii-liit<'rsii(liuiig. \ Oll Vik1<»r llcnscn, Ki<'l. Der Herr Horaiisiichcr hat «lic Frciindliclikcit u'i-liaht. micli an»/ii- fordeni. über die Methodik der Gcwiimunf; des Planktons /.n hfricliten. Da die Sache eist iicuerdiiius die Aufinerksaiiikcit wi-itcrcr Kn-ix- auf sich iiezoi>eii hat. ulauhe ich /.uiiächst die .\I»i«hi und die Bcdciitmi;: dieser Metliodik durch eine flM'i-sicht dessen, was gewonnen werden voll, klären zu dürfen. Der Stoffwechsel im Meere hat fiii- uiixTe the(n-etiNclien .\n-rhauiin'_'"'ii. soweit sie weiiiustens das Entstehen und Verirehen der rheinischen \'ei- biudnniicn in den Oruanismeii betreffen, erhebliche Üedeiitiin;:. da ja die Meeresflächen fast Va '''''" Pandflächen der Knie aiHinacheii. Das Siudiiini des Stoffwechsels im .Meere hat trej^enüber dem iles Stoffwechsels auf dem Lande seine Vorteile und seine Schwierijjkeiteii. .\iif dem Lande lieiren Her<>e. Täler. Flüsse und Seen. AVald. Wiese. Heide. Moor iiiid NVii>te in buntem Wechsel nebeneinander. Ks sind dorl überdies die ri7.ii>t;iiuic. von denen die AVisseuschaft auszugehen hat. wenn >ie sich mit dem Wclt- rätsel beschäftii>en will, in so ausiicdelintem Malie durch den Menschen i?estört. daU das Auffinden und die .Viiswertunti des natürlichen (ie- .schehens überall in hohem (irade erschwert ist. \«m den kultivierten Land- flächen sind wohl Mittelwerte durch den Krtrajr an ilüln'n. (iras. Getreide. Weinbau und Holz »ewonneii worden, aber wieviel orü^anische Substanz die Wurzeln i>ebildet haben und wieviel davon durch Insekten. Schne<-ken. W^ürmer. Säuiictiere und \öin'\ verzehrt \\(»rdeii ist. dafür fehlt so /iendirh jede Vorsteiliinu sowie die Methodik, solche N'orsteiliiii;; zu ji-ewinneii. Wir wissen mir. daß diese Zehrunucn zuweilen ^^rol't ^^emiir werden künnen. um die f>anze P>nte zu vernichten, abt-r mittlere Werte fehlen franz. Wenn auch durch Spezialkultureii die Ma<tan(le eine AbschätznuL'. Im Meer treffen wir auf rrziistände. Die W.iudlnniren. •'- '■;■•- .ti«i-.»< den Menschen Ix'wirkt sind, müssen trotz aller Kla'.'m i b.r als verschwindend klein erachtet werden. Kine ixvwi in der (|uantitativen Bestimmuni: der irut beweirlicheii Meerrson:anieiMe l'rliestandteile CO, und niedei-e X-Vorbinduniicn. Kin kleiner Rest sinkt in Form alt^^M-storlwiior Tierleiher zu Hoden und wird auf die-em Weiie teilweise aufgelöst. In nicht sehr ;irolien Tiefen finden sich Schalenreste anj.M'liauft. in sehr ;rr«)tleii Tiefen scheinen aber auch diese vollständig der Auflösunj.»^ zn verfallen. Man sollte ulauben. dal'» hier (mu lii'oller rnterschied ue;.fenüber «lem Lande jieiicu mülUe. aber auch doit verschwinden die Tierleiber, die wcL'en «ler starken /euizunt»- der Tiere mindestens so zahlicirh sein müssen, wie die Tierwelt ist. die wir im Frühlingsanfang um un< erblicken, .so . Dieser Teil überwiest auf dem Lande, mindestens im l'r/u- stand, noch heute den als Nahrung verbrauchten Teil i:anz enoini. I>er Anteil, der von Früchten. Blättern. Wurzeln und Holz verzelirt wird, ist zwar nicht abi>-eschätzt. abei- zweifellos minimal. Im Meei* lieirt die Sache anders. F'>s finden sich zwar in gewissen Zonen kalten \\'assers Abla;:e- rung-en kieselschalitier Algen, aber sehr ausgedehnt >ind diese Fhichen doch nicht. Namentlich ergibt aber die direkte Bestimmung ten. nur noch durch Filter und Zentrifuge gewinnbaien Organisnn'ii des .sogenannten Xanoplanktons ungenügend unterrichtet, aber auch das Volumen der kleinsten tierischen Wesen ist noch unbekannt. Jedenfalls ist boden ozeanischer Tiefe erreichen, ist bisher nicht sicher ermittidt. In «lern Stillen Ozean finden sich grol'ie (Jebiete. auf denen noch di«* Zahne vor- weltlichei- Haifische ohne jeden Tberzug organischen Schlamms vielfach gefunden woiden sind. Dagegen ist in anderen (legemlen ein Kohle hal- tender, oft >ehi' weicher Schlamm heraufgeholt worden, F- bleibt hier hImt die .Möglichkeit bestehen, dal', die derberen Beste der Fferve-etationen hingeflossen und diese Schlammassen nicht auf il stimmuiiii' (U^^ Wassornohalts mihlicli. weil sie mristcii rf oiI.t mit iiiancliorlci Fortsätzoii hcdcckt. .I.iIht nur iiiivollkoiimin, ,|,.,ii an- liaiii-oiidcii Wasser zu hcfrcicii >iii(l . Willircii»! >\r <-i\\ ,,|iol al>. •ii'spült Wassorvcrlust ciicidcn wcnlcii. Uri Fonncn aus - wird aucli der Asclicnrhalt der Ornauisuh-u durch dio anli;iii;.Mi,u- >>avM'r zu uugeuau hestiimnt werden. (Jauz telilciin-i wird die liest iujuiuiit: des Wasserji-elialts uicht zu niaclieu sein, aber die (Jr;.Mnisnien wntUu y umU ihrem Ernährunj^szu.stand versehieih'u wasscrhalti«; sein, so dati der IVhlrr bei sorgfältiger Behaudhiu- ihn- untersin-htcn Form keine firoUc Itcdeutnng haben dürfte. Die Trennung (h'i- kleineren Organismen hltlt sieh in die.MT Weise nielit ausführen. Es bh-ibt nichts ül>rig. als für diesen /weck das sog', monotone Tiankton abzuwarten und zu benutzen. Fs kommen Zeiten vor, wo in dem kalten Wasser eine (Jruppe von I'lanktonten , z.H. die Kieselalgen (Chaetoceras) oder die Phvtoflagellate Ceratinm tri|)os. so .sehr überwiegt, daß alle anderen rianktonten dagegen ver.scjiwinden. Letztere werden zwar durehaus nicht fehlen, im Gegenteil auch vermehrt .sein. af»er ihr (Jewieht tritt gegen das Gewicht der ganzen Masse doch sehr zurück. Fm soh'he monotonen Fänge zu gewinnen, eignet sich ei völliger Windstille entsteht zuweilen im Sommer eine grüne Rahmsehicht im Wasser, die jeweilig aus Algen einer Art be- steht und die neben der bezügüchen Art fast nichts Fremdes enthalt, in den sog. Schwärmen finden sich gleichfalls Masx-u von Tieren einer .\rt. Diese Scliieht eignet sich besonders für chemisehe Analysen. Es ist (hibei aber zugleich die Zahl dei- Zellen bei Pflanzen oder der TierarttMi bei der Analyse tierischer Planktonten auf die später anzugebende Wei.se fest- zustellen, wenn die Analysen allgenu'im'r nutzbar gemacht werden sollen. Auf diese Weise erfährt man nämlich den Gehalt von einer bestimmten Anzahl Zellen oder von den Tieren einer Art. Wenn dann später die Ge- samtanalysen gemischter Fänge gemacht werden um! diese Fänge gezählt sind, kami bestimmt werden, wie sich der Befund an Eiweiß. Fetten. Kohlehydraten und Salzen etwa auf die Formgruppen «ies Fangs verteilt. Auch die \olumina dei- einzelnen ()rganismengrupi)en zu bestimmen, kami auf Grund solchei' Zählungen ausgefidiit werden, l.ofnnann ^) hat in dieser Richtung den Anfang gemacht. Er hat die Ilaujjtformen nach ihren ver- schiedenen L)imensionen gemessen und auf (Jrund diest-r Messungen unter Beachtung der Pjuzelheiten der Formen Modelh« angefertigt. ) Lohmami, T'ntersiicluini,'en zur !• .•st>tolliiii>j .l.-s v..llMHmHi!<'H (Jrhalt* At* Meeres an Pluukton. W isseiiscli. MeeresuiiUTSuciiun^MMi. Kifl. N. I U'l 10- ^ '•*! •'••>*' Abderhalden, Handbuch der biochemiacben Arb«llsnicthodeD. V. H (342 Viktor Henseii. Reiiianalysen es eriiiöijlicbon kann, auch dem Aufbau solcher Organismen, die gesondert zu gewinnen nicht möghch ist, näher zu Ivommen. Wenn dem Stoffwechsel näher getreten werden soll, muß die gesamte Masse des Planktons bestimmt werden, die im Meer oder doch wenigstens in begrenzten Regionen eines Meeresteils vorhanden ist. Dies kann nicht dui'ch Horizontalzüge, sondern luir durch Vertikalzüge erreicht werden. Diese Züge werden dadurch ausgeführt, daß ein Netz auf den Boden hinabgelassen und dann von da aus senkrecht aufgezogen wird. Ein und dasselbe Netz wird dann vergleichbare Fänge geben, die alles enthalten, was die Wassersäule, deren Querschnitt durch das Netz filtriert wird, an fangbarem Material enthält. Die Forderung ist freihch leichter zu stellen als zu erfüllen. Wenn das Meer die Tiefe von 4000 bis 5000m hat, so ist die Zeit, die erforderhch ist, um ein Netz so tief hinabzulassen und wieder aufzuziehen, sehr groß. Der Aufzug kann nicht rascher als 1 m die Sekunde sein und nur ein sehr günstig für den Zweck konstruiertes Netz wird rascher als 1 m die Sekunde sinken. Außerdem muß die Tiefe aus- gelotet sein , weil man nicht wird fühlen können . wann das Netz den Boden berührt, dazu ist das Gewicht des hängenden Seils viel zu groß. Nur wenn mit einer Lotmaschine gefischt Averden kann, wird die Boden- berührung erkannt werden können. In der erforderlichen Zeit von 13o*3 Mi- nuten oder 2 2 Stunden treibt das Schiff, das ja nicht verankert werden kann, eine sehr erhebhche Strecke, kann aber doch mit Hilfe des Pro- pellers ziemlich am Platz gehalten werden. Jedoch der Zeitverlust ist ein so lästiger, daß viele solche Fänge schwer ausgeführt werden können. Es ergibt sich aber, daß ganz überwiegend die Masse von Plankton imr bis höchstens 400 m Tiefe geht , so daß nur für besondere Zwecke das Netz tiefer zu gehen braucht. An flacheren Stellen kann man noch fühlen, wenn das Netz den Boden erreicht hat, hier ist also die genannte Aufgabe leichter zu erfüllen und muß erfüUt werden. Bei solchen Fängen handelt es sich immer um Stichproben: es ist also zunächst die Frage zu erörtern . welchen Wert solche Stichproben für die Bestimmung des Planktongehalts haben. Es ist wesentUch Sache der Praxis, hier die Entscheidung zu bringen, doch hat auch die Theorie mitzusprechen. Die Praxis bestätigt in einer größeren Reihe von Fällen die Brauchbarkeit der Stichproben, die freilich im Verhältnis zur Meeres- fläche immer imr äußerst klein sind. Die Zählungen der Fänge der Planktonexpedition führen den Nachweis, daß von einer Anzahl seltener Tierarten in 4 Ins 6 sich folgenden Fängen gerade nur 1 Tier der Art auf der Strecke von 1000 und mehr Kilometern gefangen wurde, also die Verbreitung so gleichmäßig gefunden wurde, wie sie nach der Größe der Netzöffnung gefunden werden konnte. Wenn der Fang 100 oder 1000 und mehr Individuen aufbrachte, schwankten die Zahlen natürhch stärker, aber auch hier wurden gewisse Arten so gleichmäßig gefangen, daß die Nachl)arfänge um weniger als ö^/o verschieden waren. Wenn aber solche Fänge noch als wesentlich gleich angesehen werden, die Die Mctlioilik Doppelte voiieiiiMu.ler :ili\veirlieii, .>o um- fü,- manrhc gilt faiiMharo Foniieii diese (ileiclilieit in ind. desto kleiner wird die Sech.*»- eckfläche werden, in der er liegt. Sei nun zunächst entsprechend der Fig. 162 das Sechseck für einen Planktonten genau von so großem Querschnitte, wie die Fläche des fis«-lienden Netzeingangs, der in der Figur als ein runder, kontinuierlich gezeichneter Kreis hervortritt, dann können drei Fidle eintreten. Wenn der Mitlel- piinkt des Netzeinganges irgendwo durch die weiße Fläche himlnrcligeht. wird immer nur der eine Planktont 1 gefangen weiden können. (Jeht alnT die Mitte des Netzeinganges durch die gestrichelte Fläche, so worden die zwei Planktonten I und II gefangen werden, (ieht aber die Mitte durch die gekreuzt schraffierte Fläche, so wird kein'.Planktont erbeutet wenlen. Die Wahrscheinlichkeiten dieser Fälle verhalten sich wie die «'ntsprechendon 41» 644 Tiktor Hensen. Fla dien des Sechseckes , d. h. wie 92'5 zu 3' 7 5. Wird der Netzeiiii^ang- so klein . wie es der gestrichelte Kreis andeutet , so hört die Möglichkeit, daß zwei Planktonten gefangen werden, auf, dagegen steigt die Gefahr, daß kein Planktont gefangen wird. Wenn sich die Zahl der Planktonten,' die innerhalb der Fläche des fischenden Netzeinganges liegen, vermehrt, so wird immer noch die Zahl der Planktonten eine wechselnde sein, je nach der Lage, die das Zentrum des fischenden Netzeinganges gehabt hat. Die mathematischen Formeln zur Berechnung der möglichen Unterschiede sind schwerfällig , ich habe aber , um einen Begriff über die bezügUchen Chancen der Fänge zu geben, eine kleine Tabelle graphisch festgestellt, die hier folgt : Aufstellung Nr. 2. Wahrscheinlichkeit des Fanges. Wenn sich unter der Fläche des Netzeinganges finden 1 o 3 4 5 6 7 8 9 10 n ^ a S a wird in 100 Zügen die in der letzten Kolonne ver- zeichnete An- zahlPlanktonten gefangen 3-75 925 3-75 — 100 2911 46 42 24-47 100 2-61 7-95 7961 9-83 100 2104 7206 BIO 0-34 0-46 100 3913 4144 916 10-27 100 2-97 32-20 35 65 29-08 99-9 23-53 64 50 11-97 100 2-ßl 29-18 44 56 23-65 100 12-57 1934 4977 17-53 0-79 100 3-32 4-70 3701 3913 6-56 9-08 99-80 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Diese Tabelle weist nach, daß sich mit der steigenden Zahl der Plank- tonten unter dem Netzeingang die Zahl fehlerhafter Fangmöglichkeiten ver- mehrt und daß die Chancen völlig richtiger Fänge entsprechend vermindert werden. Dagegen werden die Prozente der möglichen Anzahl von Planktonten, die fälschlich gefangen werden könnten, mit den steigenden Zahlen immer kleiner. Liegen in der Netzeingangsfläche 10 Planktonten vor, so kann der Fehler noch 20Vo betragen, hegen dort 100 Planktonten, so beträgt er nur 3-4Vo, bei 28.000 betragt er l-2"/o und bei 100.000 nur noch 0-3Vo- Diese Ilechnung setzt aber eine vollkommen gleichmäßige Ver- teilung der Planktonten voraus, die nicht zutreffen kann, weil die meisten Formen sich willkürlich bewegen können, und außerdem durch die Bewegung des Wassers durcheinandergewirbelt werden müssen. Ginge die Bewegung auch nur soweit, daß jeder Planktont bis an die Grenze seiner Sechseck- fläche kommen könnte, so würden, wie ein Blick auf die Figur zeigt, statt 0 1 und 2 bis zu 7 Planktonten gefangen werden können, und nichts spricht dafür, daß diese Grenze eingehalten werden muß. Ein Überschreiten dieser Grenze wäre übrigens weniger störend, wenn viele Planktonten im Die M.thoilik dfi riankton-IHtersm-luiia'. lUÖ Bereich des Netzeinsan-es lioo^en, also wenn die Flache dn ScV,,..- 1.. ii..;,, ist. Dies theoretische Verhalten ist daher sehr stiirend, nan, , |, für diejenigen, die den Nachweis führen wollen, dali die Vcrtpilunu' der Planktonten ungleichniäliig .sei. Die Praxis lautet etwas anders. K> hat si.-h zwar unter unseren etwa lOo.ooo /ahl.'ii kein Kall gefunden, in dem 90'»/., der Fiiuge nur 1 und lU" „ keinen oder i> l'lankf.mten' " i,t hätten, aher das hegt zum Teile daran, dai; in k.-in.-in Strome. ..,.; .,.-s Ozeans so viele Fänge gemacht worden sind. dal. diese Kerhnun- lutte sich genügend prüfen lassen. Fs findet sich aher doch auf der siebenten der jetzt veröffentlichten /ähltahellen von der .Mziope. einem Wurm mit ganz gewaltigen Augen, der daher auf die Jagd angewiesen ist. die fol- gende Fangreihe : 0.4.1 . 1 .1 .1 .1.2.2.1 .ö.l.(;.^<.] .C.O. I . 1 . I . 1 .7.2.4.(13.20). Kig. 163. Vig. 164. Das sind 24 Fänge, die sich auf einer .'^trecke \oii 4o folgten Die fangende Fläche des Netzeinganges hat THf) an- betragen. Wi. man sieht, fällt nur der eine Fang von 8 Stück aus der nach ol>i;;er I i- tiing zu erwartenden Reihe. Die Stromgebiete waren SargassoM c. Kanarien- strom. Nord-A(|uatorialstroHi uiul (iuineastrom. also sehr \ersehiedene Strömungen. Dennoch könnte nach den /ahlen allein nicht In-hauptol werden, dali ein sicherer rnterschied in der Dichte der Tiere • ' Nur wenn man die Zahlenfolge zergliedert, wird ein trewisser Tut .< d der \erteilung wahrscheinlich. Ich habe die Fangreihe wo.nt'irh we-.ii der groiien Beweglichkeit der Tiere ausgewiddt. Ks wird er fui nicht zu hoch gespannte .Vnforderun.ireii die Stichproben irt'nügen können. 646 Viktor Hensen. namentlich wenn größere Netzeingänge gewählt werden und wenn die Fänge aus einem Stromgebiete vereint und deren Mittelwert genommen wird. Die Netzform, mit der die Hauptplanktoiimasse gefischt wird, zeigt die Fig. 163. Daran sind zu unterscheiden 1. ein dichter konischer, den Ein- ürano- erheblich verengender Aufsatz Ä. 2. das eigentliche Netz B aus Müllergaze Nr. 25 (früher Nr. 20 bezeichnet) mit einem Schutznetz aus einem weitmaschigen gewöhnlichen Fischnetz bestehend. Dies Übernetz hat die Aufgabe, das eigentliche Netz bei zu großem Innendruck zu stützen und vor Zerreißung auf diese Weise zu schützen. Außerdem kann der Ap- parat daran angefaßt werden, während das Netzzeug selbst leicht zerreißt, wenn rauhe Hände es anfassen; 3. der Filtriereimer C, in den die ge- Fig. 165. fangene Masse schließlich hineingespült wird und der sich von einem unteren Ring, an dem das Netz befestigt ist. abtrennen läßt. Das eigentUche Netz besteht aus eigentümlich gewebten, sehr feinen seidenen Fäden (Fig. 164). Die Poren haben eine Seitenlänge von im INlittel 0-049 mm. Die Fig. 163 zeigt ein Stück dieses Gewebes vergrößert. Es war nötig, die Filtrationsgröße dieses Gewebes zu bestimmen. Dazu hat der in Fig. 165 im Durchschnitt gezeichnete Apparat gedient. Ein geschlossenes Rohr, Ä, ist an seinem einen Ende mit der zu untersuchenden Müllergaze B geschlossen. Durch das Rohr C wird in D filtriertes Wasser mit einer durch feine Hahnstellung regulierbaren Ge- schwindigkeit eingeleitet. In dem zweiten Rohr E steht ein Manometerrohr. in dem Blechkasten F, der mit Wasser gefüllt ist. Aus der Tülle G eines umhiülenden Kastens läuft das aus dem Rohr Der ganze Apparat liegt nie Mctliuilik ,l,.r l'limktiiii-l'iitcrsucliiiiii:. «J4T A hinaus filtriorciule Wasser. l);is ahlaiitciidc Wasst-r wird ii, . ,,1. ,„ McU- K^efäß eine bestimmte Aiizaiil von SckiiiKicii auft,M'i'ang.n und treiiiessen. Auf diese Art wird also bestimmt, wieviel Wasser sich unter bestimniffm Druck durch den cm- der Gaze entleert. Die verschiedenen lleobachtun werden j^raphisch verzeichnet und zu einer Knrve verarbeitet. Von di' Kurve sind die gleich zu verzeichnenden Zahlenreihen gewonnen. Man könnte iilauben, da!', diese Zahlenreihen besser durch eine j;eei^r,„.ff. Formel zu gewinnen wären. Das ist aber nicht zutreffend, denn es zeigt sich, daü das Wasser nicht lediglich dinch die Poren fliebt, sondern dali es mit einer mit dem Druck wachsenden Quote durch die Seidenfäden .selbst hindurrh filtriert, so daß die Filtrationsgrüße nur empirisch bestimmt werden kann. Eine solche Hestimmung entnehme ich den Tabellen in meiner Methodik'), sie lautet für Seidengaze Nr. 25 (früher Xr. '20): Druck cm Filtrat cm^ Sek. Ol Ü-2 0-3 0-4 0-5 0-6 0-7 0-8 09 10 0 2393 0-4627 ()C)760 0-8808 1-0788 1-2712 1-4Ö82 1-G406 1-8195 1-9950 0-2234 0-2133 0-204S 01980 01924 01870 0-1824 0-1789 01755 01726 iJruck an Kiltrat cm^ See. 1-1 2 1676 12 2-3374 1-3 2-5047 1-4 2-6697 1-5 2-8327 1-6 2-9939 1-7 3-1530 1-8 3-:Ul)S 1-9 3-4670 2-0 3(i218 0 1698 01673 OlCl.")!! Oir)3n 111612 1)1591 01 57s 015(')2 0-1548 Wenn g die Deschleunigung der Schwere, d den Druck bedeutet, so bestimmt sich die dem Druck äriuivalente Geschwindigkeit v nach ib-r Formel 2g.d = vi Nicht jedes Stück der (iaze gibt genau dieselbe FiltrationsgröiW'. auch hat das Zeug die Eigenschaft, bei längerem (iebrauch zu .> bis 1 /// und darüber zu erreichen. Dazu kann sich das Schlingern und Stampfen des Schiffes addieren. Das Netz, das mit O'ö /// (ieschwindigkeit aufgezogen zu wenlen pflegt, wird in solchem Fall relativ sinken und sein Fang, der besonders an der großen oberen l'eriitherie abgesetzt ist. wird ausgespült un. . S. -jo vorge.scldag<-n. einen (Jartenschlauch von 'lOO m Länge und 'Inti Fichfeniinrclunes.MM-. der an dem Ende mit einem (Jewicht besclnveit ist und de>>en andere> Ende am Deck liegt, senkrecht hinabgehen zu lassen. Dabei wiid dann eine Wassersäule, die den Querschnitt der Fichtenweite des Schlauches hat. gleichsam ausgestochen. Dann wird die Schlauchmündung an Deck geschlossen und l analy.siert werden können. Es werden etwa .')(»/ Was.ser liei tlieseiii NCrtahren ver- arbeitet werden müssen. Zum eistenmal auf der antarktix'hen Fahrt von Fllchner wird das \'erfahren verwendet werdeu. Da zunächst nicht einzu- sehen ist. was den Erfolg dieses Verfahrens hin- stein^) einen zweckmäßigen Apparat angegeben. Ich gehe aber auf das Verfahren zur Volumenbestimniung nicht weiter ein. weil sich bisher er- geben hat, daß doch immer nur die Zählung gute Hesultate gegeben hat. Es hat aber, wie schon erwähnt, Lohmann begonnen, das mittlere \'olumen der einzelnen Planktontenarten plastisch nachznbild(Mi und auf diese Wei.se deren \'olumen im einzelnen festzustellen, .so daß mit Hilfe der Zählungen das wahre Volumen der Fänge würde festgestellt werden können wenn die mittleren Volumina aller Planktonten bekannt sein werden. Für die Zählungen wird der ganze Fang in Wasser auf ein ange- messenes Volumen gebracht und von diesem Volumen werden mit Hilfe des Schüttelgefäßes (Fig. 168) Stichproben entnommen. Für diesen Zweck dient die Stempelpipette B, ein Glasrohr, in dem eine Heihe von Kork- scheiben, die nach Px-darf durch kleine Schrauben zusammengepreßt werden können, an einer Führungsstange befestigt sind und an deren unterem Ende ein messingner Ilohlz\ linder befestigt ist. Widireiid die Flüssigkeit stark durchschüttelt wird, stößt man das (Jlasrohr auf den Boden des •; Apfitcin, Neue Apparate für Mecresforscliuiicr. Mitteilungen cl. Deutsch. Sco- fischerei-Vcreins. Uerlin. IDU'.K -Ni. 11. 656 Viktor Hensen. Fig. 168. Schüttelgefäßes und fängt dadurch die beabsichtigte Quote des Volumens aus der ganzen Masse heraus. Der Messingzyliiider ist so ausgedreht, daß der Raum zwischen ihm und der Glaswand genau das verlangte Volumen enthält. Dies Volumen wird durch Wägungen festgestellt. Es sind Pipetten zu benutzen , die ^'olumina von 0"1, 0'2, 0"5, 5 und 10 cm^ fassen. Diese Einrichtung ist erforderlich, um während des Schüttelns die Proben ent- nehmen zu können. Zugleich muß die Pipette eine weite Mündung haben, um die Fehler, die die Stichproben suspensierter Teile mit sich bringen, möglichst zu vermindern. Eine gewöhnliche Pipette mit enger Mündung kann für diese Ent- nahmen nicht dienen. Die Pipette wird dann auf eine liniierte Glasplatte entleert und ihr Inhalt an Planktonten wird ausgezählt. Bei der Zählung von Blutkörper- chen pflegt man nur eine Anzahl von Quadraten der entsprechend geteilten Zählkammer zu be- stimmen und zieht nicht die Größe des Tropfens in Rechnung. Bei den Planktonzählungen muß der ganze Pipetteninhalt ausgezählt werden, was bessere Resultate gibt. Zuerst werden nur die Volumina von 0"1 cm^ gezählt und sofern es sich dabei um Diatomeen handelt, läßt man das Präparat trocken werden, weil dann die kiesel- schaligen Formen am deutlichsten hervortreten. Da zu gewissen Zeiten über 100 Millionen einer Diatomeenart gefangen werden, müssen eigentlich 10.000 Stück durchgezählt werden, aber jeden- falls sollten über 1000 Stück durchzählt sein. Es empfiehlt sich in solchem Fall, jedes 100 durch eine hingelegte Marke zu registrieren, da man dabei die Augen nicht von dem Mikro- skop zu entfernen braucht und die Stelle, wo 100 erreicht worden sind , nicht aus dem Auge verliert. Bei diesen Zählungen darf keine zu kleine Vergrößerung verwendet werden. Man glaubt freilich die Formen deutlich genug bei kleiner Ver- größerung erkennen zu können; meine Versuche haben aber gezeigt, daß eine Nachzählung desselben Präparates mit stärkerer Vergrößerung ergibt, daß 20o/o und mehr bei der zu kleinen Vergrößerung übersehen sind. Da sich mit kleiner Vergrößerung bequemer zählen läßt, wird, glaube ich, in dieser Richtung oft gesündigt. Die Diatomeen mittlerer Größe sollten immer bei mindestens 200f acher Vergrößerung gezählt werden. Nachdem ^) Hensen, Über die Bestimmung des Planktons. 5. Berieht d. Kommission z. wiss. Unters, d. deutschen Meere. 1887. Die Methodik der ri.uiktoii-l ntersucluiiik'. (;;,7 von den kleineren Formen genufj: ^^ezälilt \\(»r(l('ii sind, ciit nimmt man für die Zählung' der größeren Formen «rrölien' NOIumina und schwürlicrc« Ver- größerung- und schreitet so fort, bis man ein Vohimcn von 10r»M» hat ni'hmcii können. Auf die größten und daher kMcht sichthan-n Formen wird seh! lieh der ganze Rest dnnli/ählt. Für diese /Mhliingen Itrauchf man n keine Bedeckung durch Deckgläser. Die ( )l)jekte legen sich auf (hm ■ uum. fest, selbst wenn das Präparat eingetrocknet ist. sind kaum N'erschiebnii"" zu fürchten. Um die größeren Volumina zu zählen, bedarf es <:roi;er < ■ platten und überhaupt sind Einrichtungen ei-forderlich. um da.«; Träparat mechanisch sicher den Kolonnen der (ilasplatte entlang schieben zu können. Ich habe dafür ein großes Zähhnikroskop anfertigen lassen, an dem mittelst zweier Schrauben die Verschii'bungen bewirkt werden und an dein immer sichtbar wird, in welcher Richtung die Bewegung gegan^'en ist. M Dann schadet es nichts, wenn man bei der Zählung gestört wird. Meistens begnügt man sich mit gewöhnlichen Mikroskopen, an denen dann Hinrich- tungen für die mechanische Bewegung der Platte getroffen sind. Für Zählungen kleinerer Fänge genügt dies auch, aber es muTp betont wenien, daß die Re.sultate mit großen Fängen erheblich genauer werden. Für das Nanoplankton und die Zentrifugenfänge kommen nur sehr kleine N'olumina zur Zählung, die aber starke Vergrößerungen erfordern, unter Deckt:las geschehen müssen und entsprechend schwierigei'. unbetiuemer. auch wohl noch weniger genau sind. Überhaupt müssen vorläufig die .\nforderung<'n an Genauigkeit nicht hoch gespannt werden. Das ganze Fntersuchnngsb'ld ist noch so wenig bebaut, die Unterschiede der Dichte sind nach den Jahreszeiten und nach den Gewässern noch so groß, daß feinere Unter- schiede vorläufig bedeutungslos sind. Die Mühen und Kosten, die mit der (Jewinnung und Verarbeitiiuf; einer Fangreihe verbunden sind, werden so grol'i. daß dagegen die Kosten eines guten Unter.suchungsapparates sehr zurückstehen. Da aber der Apparat meistens erst später in der erforderlichen Ausdehnung ange- schafft wird, drückt darauf die Cieldfrage und bewirkt eine Sparsamkeit, die nicht proportional dem Zwecke und tU'u Konten des ganzen Fnter- nehmens ist. Das drückt dann nicht nur (h-n Frfolg der bezüghchen Untersuchung hinunter, sondern scluuligt auch noch ih'U Kredit besserer Untersuchungen. Die Zählungen, die restlos durchgeführt werden können, sind selbst- verständlich möglichst genau. Die Fehlergrößen und deren Wahrscheinlich- keiten bei Zählungen, bei denen auf den ganzen Fang aus Teilzählungen geschlossen werden muß, sind von Ahbr in meimi- Methodik rechnungs- mäßig genau nachgewiesen. Je größer die Summen sind, die u« /;ddt wurden, und je häufiger die Probeentnahmen waren, von denen schließlich das Mittel zu nehmen ist, desto geringer sind wahrscheinlich die Fehler, alter es können dennoch die Zählunirrn um große Prozentzahlen falsch aii>^faIlon. Wenn etwa die Cjuadratwurzel der in dem Fang enthaltenen Anzahl durch- zählt worden ist, so werden die wahrscheiidichen Fehler hei ZflhlunpiMi, Abderhalden. Handbuch der biochemischen ArbciUinethoden. V. 4- 658 Viktor Hensen. Die Methodik der Plankton-Untersuchung. die über 100 Stücke hinausgehen, nur einige Prozente betragen. Für Ge- naueres darf auf die ausführliche Abhandlung Abbes verwiesen werden. Sind die Formen so klein, daß von ihnen ein Teil bei dem Fang oder doch bei der Hebung des Netzes über den Wasserspiegel verloren gehen muß , so werden die Resultate der Zählung sehr unsicher. Wenn die zu vergleichenden Fänge nahe das gleiche Volumen haben, kann der Fang der kleinen Planktonten vielleicht noch proportional, wenngleich immer un- vollständig sein, sind aber die Volumina erheblich verschieden, so werden sich in dem größeren Volumen noch mehr der kleinen Planktonten ge- halten haben als in dem kleinen Volumen. Die Zählungen werden nicht einmal über die relative Dichte dieser Formen ein richtiges Bild geben können. Unter allen Umständen wird es richtig sein, das Schlauchverfahren anzuwenden, wo es auf die Verfolgung dieser Nanoplanktonten ankommen sollte. Für flache Gewässer läßt sich auch immer ein Schlauch von größerem Lumen, als dem für die Befischung der Hochsee angegebenen, verwenden. Dadurch fallen dann die Stichproben entsprechend zuverlässiger aus. Zum Schluß sei noch eine kleine Übersicht über die Zusammen- setzung der Netzfänge in der Beltsee in verschiedenen Jahren und Jahres- zeiten, wie sie von K. Brandt ') gefunden worden ist, hier mitgeteilt. Frozen tische Zusammensetzung der trocknen Fänge. Datum Eiweiß Fett Kohle- hydrat Oi- ganisch Asche SiO, Asche ohne SiOj 3. Oktober 1892 21-84 13. Oktober 1892 2024 15. November 1892 2101 14. Februar 1893 2041 15. März 1893 13-4Ö 4. April 1893 ! 15-56 5. Mai 1893 3654 18. August 1893 i! 33 56 18. September 1893 21-29 23. Februar 1894 ! 58-80 212 2-26 3-21 4-35 2-58 4-24 1-58 8-72 3-20 7-40 66-10 68-95 6007 45-50 23 66 18-79 23-07 38-31 29-30 22-88 90-06 91-45 84-29 71-17 3969 38-59 6119 80-59 63-79 89-08 914 8-55 15-71 29-68 6008 61-41 38-81 19-41 36-14 10-92 4-95 4-59 9-59 16-33 4716 51-26 2700 10-95 26-40 2-31 4-99 3-96 6-12 13-35 12-92 10-15 11-81 8-46 9-74 8-61 Der Gehalt der Asche an Kieselsäure entfällt fast allein auf die Diatomeen, eine Bestimmung des Zellulosegehaltes würde sich auf die Haupt- masse der anderen Pflanzen beziehen, eine Bestimmung des Chitingehaltes würde hauptsächhch den Bestand an Krebsen treffen. Dabei wird es sich immer nur um eine annähernde Scheidung der Bestandteile eines Fanges und der Mischung der Meeresbewohner handeln können. *) K. Brandt, Beiträge zur chemischen Zusammensetzung des Planktons. Wiss. Meeresuntersuchungen. N. F. Kiel. Bd. 3. 1898. Das Arbeiten mit Orgaueiweii]. Von .1. Pohl, Prag. Das Blut hat, mit Ausnahme (Ut respiratoiisclicii. (»iiiotischcii und Alkahfunktion. nur sehr wenige selbständige chemische Autgal>en: so könnten sich, da die als Vorstufe der Antitoxinbildung angenommene Ahstoliung toxophorer (iruppen zu keiner bisher nachweisbaren Änderung in der analytischen Zusammensetzung der Organe geführt hat. auch dit- wesent- lichsten Phasen der Antigenleistung in ihm abspielen, wofür nlaM!i«'»v'n Eiweißkörper; -J. ein bei 70" koaf^Milablcs Niikleoalbuinin (heut«« ^\^ man die Nukleoalbiiniinc als iiikoairulablc Eiw»'ilikör|»t'i i ; :\. *Mn»*n ' koaijiilal)len Körper. Ifnl/ihuriou^) deutete zuerst dit- Oriraii.']- ;,. i für Nukleoalbnniinc idciitiscb mit riowcbsfiln'inogcn. Sp.itcr !»• in der Leber ein im Cberschuli von Kssiirsiiuro Ii-jcht löslirli- globin, ein bti OS — 70" ausfüUbarcs (;inlinlin. daneben ein \n! und etwas Albumin. Bottazzi^) gewann 1805 aus der Milz ein /vtoglobnlin 7. kna.tni- lierbar bei 49", ein Protein, koagulierbar bei (WJ — iHi", ein Zytoglobulin .'i. bei 74 — 74" koagiilierbar, und Zvtoalbumine. Die Muskeleiweilikörper, wie si(^ durch v. Fürth ^) eine grundht h-- Revision erfahren haben, sowie die Schilddrü.M'ueiweibkörper. ilie von Ostruhl genau beschrieben worden sind, mögen bei der nachfolgenden /nM-ii sich derartige Kiweibauszüge gewinnen. Die Ausspülung, die bei der L.-ber von der Vena cava rückläufig erfolgt, wird mit einer kalziunifreim. au- reinstem Kochsalz dargestellten 0-8"/oigen Kochsalzlösung so lange durch- geführt, bis das Spülwasser aus den abführenden (Jefäl^on farblos abhkuft. Für qualitative Arbeiten genügt es, das völlig entblutete Organ so- dann zu einem Brei zu zerkleinern, eventuell durch ^iebe .bn, l,/iii.r,.v.,.n und den mit entsprechenden Mengen physiologischer Koch-.. Toluol- oder Benzolzusatz tüchtitr durchgeschüttelten Organbrei 24 Stimden in der Kälte stehen zu lassen. Dann wird filtriert, die ersten .\nteile .«ind ») W. D. HaUihiirtoii , Tlif piotcids of kiilin'v am! livi-r i. Uv .louri»*i ol pUv- siology. Vol. 13. 808. 1880. ■^) Boifazzi, Los siilistanros albiiminoides «le la rii-' Arrh iIäI H S. 453. ") V. Fürth, Über die EiweiUkorpor des Muskelplasma- ■ vi-" • ' •^» S. 231. 1895. 662 J. Pohl. gewöhnlich trüb, nach wiederholtem Zurückgießen des Filtrates erhält man aber schließlich völlig klare, in ihrem Aussehen an ein Blutserum erinnernde Lösungen. Selbst aus glykogenhaltigen Lebern wird schüeßlich ein hellgelbes Plasma gewonnen. Für quantitative Arbeiten ist es besser, den Organbrei nach Durch- pressen durch Siebe auf Glasplatten im Ventilator bei Zimmertemperatur rasch zu trocknen. Die getrockneten Pulver i) verwahrt man über konzen- trierter Schwefelsäure, wodurch sie wochen- und monatelang unverändert bleiben. Die weitere Verarbeitung siehe im Folgenden S. 667. Doch sei her- vorgehoben , daß in wechselnden Verhältnissen schließüch ein Teil der Ge- webseiweißkörper wasserunlöslich wird, somit rasches Verarbeiten wohl immer zu empfehlen ist. II. Eigenschafteu der Orgauplasineu. Das Organplasma gibt alle Farben- uud Fällungsreaktionen der Ei- weißkörper, so z. ß. eine positive Glyoxylsäure, positive Xanthoprotein- und 3/i/^wsche Pteaktion. Mit Neutralsalzen kann man Fällungen erzwingen. So gibt konzentrierte Kochsalzlösung innerhalb 24 Stunden flockige FäUung: das Filtrat gibt auf Eintragen von Kochsalz in Substanz neuer- Uch einen Niederschlag; das Filtrat hiervon, verdünnt, gibt wieder mit Ammonsulfatfällung und selbst das weitere Filtrat läßt auf Säurezusatz noch spärliche Flocken ausfallen. Bei Verwendung konzentrierter Ammon- sulfatlösung ist eine deutliche, spatiengesonderte, fraktionierte Scheidung in verschiedene Eiweißindividuen nicht möglich. Die Eigenschaften solcher Organplasmen ähneln in vielem den durch ein homologes Verfahren gewonnenen Muskelplasmen. Schon durch die be- kannte Micschersche Beobachtung vom Schwund der Muskelsubstanz beim Aufbau der Genitaldrüsen des Lachses ist eine gegenseitige Beziehung zwischen Muskel und parenchymatösen Organen zu vermuten. Immerhin bestehen zwischen Muskel- und Organplasma deutliche Unterschiede. 2) Aus den Organplasmen läßt sich durch verdünnte Essigsäure (0"1 bis 0"2''/o), besonders sicher nach Zusatz kleiner Mengen gesättigter Kochsalz- lösung (z. B. auf 100 an" Plasma 5 — 6 cm^ konzentrierter Kochsalzlösung) ein flockig ausfallender Körper gewinnen, der im Gegensatz zur Säure- fällung aus verdünntem Serum(Para-)globuhn in Neutralsalzen unlöslich ist, er sei in Folgendem als Essigsäurekörper bezeichnet. Dieser Eiweißkörper ist optisch inaktiv, durch Diffusion nicht fällbar, sondern nur in Form einer opaleszenten visziden Kolloidlösung zu erhalten. Die Kolloidlösung koaguliert nicht, gewinnt aber dieses Vermögen sofort ^) W. Wiechowski, Eine Methode zur chemischen und biologischen Untersuchung überlebender Organe. Hofmeisters Beiträge. 9. 240. 1907. -) Näheres über dieses Verhalten siebe in meiner Arbeit „Über Organeiweiß". Hofmeisters Beiträge. Bd. 7. S. 390. 1905. Das Arbeiten mit ürifaneiweiO. ^-j auf Salzzusatz und ohonso wird du- KssiKsaun-lallmii.' i.ci «miht diffundierten Lösunii erst naci» Salzzusat/. iiiö^dich. Uiinli '' kung ist der Or^anciweil^körper l)is auf kleine Heste ^■' daulich. Höchst eigenartig und sicher von hiolngischcr Ü- Koagulationstemperatur. Er koaguliert (sowohl im als auch aus der Säurefallung in Alkali gelöst) hei uuffall<'iid ji Temperatur, hei 38—39° vollst!lndi^^ ja seihst hei 3;') und partiell ii«mIi hei tieferer Temperatur. Die Plasnialiisungcn hahen üherhaiipt, sonst Glohuline, die Tendenz, allmählich schon hei /imniurtott). dem .Muskel- albumin nahestehen soll, sowie auch das \i'o/il(/cmui/iM-\\o Li-berprotein zu besprechen sein." Vor allem aber ist das mir damals entgangene l» sehe Pankreasproteid hier einzubeziehen. Nun konnte ich .seitdem le.^t- stellen, daß der Essigsäurekörper tyi)i.^che ()r/inreakti(ui gibt. Das Absorptionsbaud des ( Mzinfarbstotfes in Amylalkohol war . !•. bei Arabinose zwischen C und D, respektive zwischen ss.') und 102. \m einem Schweinsleberessigsäurekörper zwischen ,^1V.') und «H» der Skala meines Spektralapparates. Der Komplex enthält .somit sicher eine Pentose. Der Peichtum der Organe an Pentosen erhellt bereits aus früheren Pefunden: ich erinnert* nur an die quantitative Studie von (.'ntml'i der unter BenUt/nng «les Furfnrolverfahrens für eine Leber allein einen (iehalt von IS.'' Mr den Muskel einen solchen von 7-:'.s annimmt und ber.Mf^ auf die . ») Grund, Clior doii (ii-lialt des (Jrpaiiisnuis an gebundenen Pcnlown f. phys. Cheni. Bd. 35. S. 131. 1U02. 664 J.Pohl. zipielle Bedeutung seines Befundes hinweist. Es scheint mir wichtig, zu betonen, daß auch in den Organplasmen pentosehaltige Eiweißkörper von geradezu universeller Verbreitung vorliegen. Ferner ließ sich im Essigsäurekörper nach Salzsäurehydrolyse ein Purinkörper nachweisen. Verfuhr ich nach dem ümberschen Verfahren, so erhielt ich kein Guanin, wenn ich aber die eingeengte Schlußlösung mit ammoniakalischem Silber fällte, den mit Schwefelwasserstoff zersetzten Niederschlag filtrierte und einengte, so gab die Lösung die charakteristi- sche Salpetersäurereaktion, die Sublimatreaktion positiv, die Weidehche Chlorreaktion bheb negativ. Trotz der kleinen Mengen des Ausgangsmate- rials, wodurch naturgemäß nur qualitative Reaktionen vorgenommen w^er- den konnten , entscheiden diese Erfahrungen . daß der Essigsäurekörper ein Nukleoproteid ist, wofür sich seither auch Hammarsten^) ausge- sprochen hat. Die Bezeichnung Nukleoproteid ist in chemischem Sinne zu nehmen, dem Kern allein gehören die löslichen Organeiweißkörper nicht an. Am nächsten steht der Körper dem Umber&chen Pankreasproteid und ist vielleicht mit ihm identisch. Den Umfang der Verdaulichkeit des- selben lehren folgende Zahlen: 1-06 chlorfrei gewaschener und getrockneter Hundeleberessigsäurekörper hinterläßt nach mehrtägiger Pepsinsalzsäure- verdauung einen unansehnlichen, braun pigmentierten Rückstand von 0-011 g. Zur erschöpfenden Charakteristik eines Eiweißkörpers gehört neben der Feststellung der Eigenschaften des unveränderten genuinen Stoffes die Beschreibung seiner Spaltungspi'odukte. Da aber die Emil FischerschQ Methode der Aminosäurebestimmung und noch weniger das Kossel-Kut- schersche Verfahren der Basenbestimmung quantitativ sind , es außerdem mir nicht möghch war, jene großen Mengen an Material darzustellen, wie sie zur Anwendung dieser Methoden Voraussetzung sind (eine ganze Schweinsleber liefert nur ?)2ö g lufttrockenes Pulver, aus dem nach Be- handlung mit Toluolazeton nur 8*2 g unseres Körpers gewonnen werden, ebenso aus 10 Jcg frischer Rindsleber nur 23 g), so bediente ich mich des Ffaundler-Gümbehchen Verfahrens zur Bestimmung der N-Verteilung. Zur Beurteilung der gewonnenen Zahlen sei hervorgehoben, daß im Gegensatz zu den Bluteiweißkörpern eine Reinigung des Essigsäurekörpers in strengem Sinne nicht möglich ist ; während man Globulin, Albumin mit den fällenden Salzlösungen auswaschen, wiederholt lösen und fällen kann, ist dies hier nicht zulässig. Beim Auflösen des sauren Niederschlages in Alkali bildet sich äußerst leicht Alkalialbuminat. Beim Neutralisieren ent- weicht Schwefelwasserstoff, ein Beweis für eine stattgehabte Zystinzer- setzung. Die Proben sind dann niemals klar und geben, im Gegensatz zum ursprünglichen Plasma, bereits mit i/e Ammonsulfat reichliche Niederschläge. *) Hanimarsten, Lehrb. d. physiol. Chem. 9. Aufl. 1910. Das Arlieiten mit Organeiweiß. 'l'.ll.rllc Gesamt-X in "j II s SS, NH3-N Mouoamiiio- säure-N . . . Melanin- und Diamino- säuro-N . . . IfiOOi 15'.» 70Ü 81 61-5 ,Ü14 31-43 ^'^1 ber. 26.7) III 15-98 7-77 63-64 0-53| IV 5.5 ». 15-i»8 7-0 594 1-37 3223 VI 15-24 15 24 i:)H3 l.")'.! 7-79 7 2 K«J r. } 66 05 147j 2i4'..('2:,()| "S. •^-" 30-5 28 59 33-60 2596 26-74 66 5 V)H-3 62 6 Di.« Zahlen := I Prozent ile« l-7j| (tesanit-N .24 9 i>ie Zahlen Prozent «ies Gesanit-N Die Tabelle zeigt, daß drr Essigsäurekörpcr sich im wcsoiitliclieii di-n Serumeiweilikörpern nähert, es fällt z. K das Mittel der .Moiioaniinosaun'n mit 63^0 zwischen die entsprechenden (Mohnlin- nnd AllHnniiiwcrt«'. Neben dem durch ()-2''/o Essi^sänre fällbanMi Kürper ciithaltiMi totls im hiwiMümon-Mn f. phjsiol. ( liom. 27. S. 104. Tahtdlc IV. 1899. *) Rothera, Zur Kenntnis der Stickstoff lündung im Kiwoiß. Ho/meülert Heit: V. 447. 1904. =>) Wicrhoic.ski, I.e. Ihfmcisfers Beitrage IM «1 "^ "ri" lOnT 666 J- Pohl. Tabelle 2. Schema I. Organ, ausgespült bei 30° getrocknet, mit Toluol ver- mählen und erschöpft I. Toluolextrakt Rückstand mit Alkohol er- schöpft II. Alkoholextrakt Rückstand mit OS^/oiger Kochsalzlösung erschöpft (Filtration) III. Filtrat „Plasma" Rückstand mit 0-U57oiger Sodalösung erschöpft (Fil- tration) IV. Filtrat Rückstand (in Säuren und Laugen lösl. Eiweißkörper Schema II. Mit Toluol und Alkohol extrahiertes Organpulver mit 0'87oiger NaC-Lösung vermählen und auf dem Filter eiweißfrei gewaschen v Plasma" Rückstand mit OOöVoiger Soda ver- mahleu und gegen dieselbe Flüssig- keit dialysiert, danu zentrifugiert Öpaleszentlösliche Organfraktiou Rückstand zusammen mit Fraktion IV des vorhergehenden Schemas Schema III. Mit Toluol und Alkohol extrahiertes Organpulver mit0057qiger Sodalösung vermählen und gegen dieselbe Flüssigkeit dialy- siert. Suspension gegen OOö^/o Sodalösung dialysiert, hierauf mit der gerade ausreichenden Menge Kaliumazetat gefällt und filtriert, Umfallen, bis das Filtrat eiweißfrei ist Filtrat-Plasma -f Rückstand nach Dialyse zentri- Fraktion IV des Schema I fugiert und durch Zentrifugieren völlig ausgewaschen V. Zentrifugat opaleszent VI. Rückstand III. Das Arbeiten mit Organen erstrebt verschiedene Ziele, von denen die wesentlichsten hier angeführt werden mögen : a) Die Feststellung spezifischer Giftwirkungen derselben (Nebenniere, Hypophyse, Schilddrüse), b) Darstellung von Zytotoxinen, Antikörpern, c) Fermentisolierung und Fermentbestimmung, d) Änderung ihrer quantitativen Zusammensetzung unter physio- logischen und pathologischen Verhältnissen. Die folgenden Ausführungen können sich nur mit dem letztgenannten Problem befassen, da die ersteren bereits an anderen Stellen dieses Werkes eine zusammenfassende Darstellung gefunden haben. Das Arlifiton mit (»rt^aia-iweiß. gg-j Die nacli^c'wicst'iic .M()j,'lichk«'it tlcr l.solicnm^ »•iii/.j'liuT < ' -:•■ iß. kürper gestattet nminuihr, an lu'stiimiit»' Itiolo^^ische Viimvu !i n. Vor allem erhebt sich die Fra<,M': Ändert sich di«- Zu ,ng eines Organes in hezu^ auf seine Eiweillkörner hei hestininiten Krknin- kungen V Als Beispiel einer Methodik in dieser Kichtung sn auf d. Iie Orf/dnicisters^) über die Änderung des Kiwellihestandes der Nien; aurrh Entzündung hingewiesen. Zur Feststellung von ^■eränderungen dieses ( »r-raiiplasmas wurde in diesen Versuchen, die nunmehr sehen einige Jahre zurüekdatieren, ähnlich uie es sonst beim Blutserum üblieh ist, durch Bringen des Nierenpla>ma« auf eine Konzentration von 25, 3:i und .'jO" o Amninnsulfat ein«- quanti- tative Vorstellung über die Zusammensetzung des Organs gewonnen. Die Nieren werden, womöglich unmittelbar nach dt-m Tode des Tieres, direkt von der Arteria renalis aus mit ph\siologischer Kochsaizlösuii'»' durcli>pult und möglichst vollkommen vom Blute befreit. Wegen des ziemlich großen Widerstandes, den die Klüs.sigkeit in den Nierengefäßen findet, eignet sich hierzu am besten eine .')0— lOOrm» fassende Spritze. Zur Ausspülung benötigt man nur einige Minuten. Hier- auf werden die Nieren von der Kapsel und den Ililusgefiltieii befreit, zer- kleinert, der Brei gewogen, mit der doppelten Gewichtsmenirc j)iiysiolo^Mscher Kochsalzlösung und einigen Tropfen Toluol verset/t und in einen ver- schlossenen Glaszylinder aufbewahrt: das Filtrat wird nun. wie oben aus- geführt, fraktioniert. In der Norm ergab sich das \erh,dtnis von SSVü Sättig, (homolog mit Euglobulin) :50"/o Ges.-tJlobuliiu Ku- u. B., ,,,, .,-; Dieser Versuchstyi)us ist wohl als (irundlage für fernere Venu. h. u\u-t die Assimilation zu verwerten. Welcher Art müssen die 1 -r sein, die am schnellsten zur Wiederherstellung; des normalen V.iw h- gewichts führen? Sind die abiureten Spaltungsprodukt«' im tfan/.on oder fraktioniert — auch in dieser Richtung imstande, die nativt-n NAhrstoffe zu ersetzen? Als Grundlage für diese und iihidiehf Versuche ist es wünschenswert, die Karnivoren heranzuziehen: diesem /wecke dion'-n folgende Tabellen. Tabelle .'-). X II rill .1 1 - n u n (1 r 1 r li (■ r , Tu] ii n 1 1- \ 1 r:i li i 1- rt \'oisuchs-Xr. Gesamteiweiß prn 1 . H uiulcleber. Hunger versuche. Versuchs-Nr. 10 11 12;i l.olior Gewicht zu Beginn I 4./XII. i 6200 Zu Ende des Ver- 12./XII. suches . . . . 5000 Gesamteiweiß pro 1 ff U-746 Gesamteiweiß des Plasmas von 1 q (auf 100) . . '. 0164 0-2"/o Essigsäure auf 1 ff . . . . I ö 109 lOO'/o 21-97o 14-57o 2./I. 8600 lO./I. 7200 0 794 Niert» 100»/o C. 11 H6U) h(-.u) 24. II. 64r)ü r>4:)0 0 7ri8 !(«• 0-263; i:)«o 0 2K7 37 0-119 1 337o t>-'"^ I) ICC Trotz andauernden Hungers ist also beim Hunde /war ein ZuiiJok- gehen, aber kein dem Kaninchen hemologes machtiges Absinken des Essig- 670 J. Pohl. Säurekörpers der Leber zu verzeichnen (siehe die Prozentzalilen). Hier spielen gewiß Rasse und Fiitterungsart vor dem Hungerversuch sehr bedeutsam mit. So war es merkwürdig, wie munter der letzte Hund trotz IStägigem Hun- gern war: voll Temperament und Beweglichkeit konnte er nach dieser Zeit kaum zum Stillstehen auf der Wage gebracht werden. Gerade für Gift- wirkungen, die am Hunde quoad Einflußnahme auf das Organeiweiß durch- zuführen sein werden, ist es von Wichtigkeit zu wissen, daß der verringerten Nahrungsaufnahme für die Leberzahlen keine rasch eintretende Bedeutung zukommt. Von der Vorstellung ausgehend, daß in der Darm wand als der Stelle der Eiweißsynthese oder der Eiweißanhydrierung sich Ansatz oder Verbrauch äußern könnte, wurde in folgenden Versuchen der Gehalt der Darmschleimhaut an unseren Eiweißkörpern unter wechselnden Verhält- nissen bestimmt (Tabelle 6). Tabelle 7. Darmschleimhautversuche. Gefütterte Hunde. Versuchs-Nr. 13 14 Gesamteiweiß pro 1 g . Plasmaeiweiß pro 1 g . Essigsäurekörper pro 1 g 0-738 0-3004 015 ]00°/o 40-67o 20-2«/o 0-75 0-254 018 ioo°/o 33-887o 24»/o HuDgerhunde. Yersuchs-Nr. 15 16 Bemerkung . Gesamteiweiß pro 1^ Plasmaeiweiß pro 1,9 Essigsäurekörper pro \ g . . . . 2 Hungertage 0767 0192 0-11 looVo ^" in U-2''' 15 Hungertage 0-804 0-180 0-087 1007o 22-47o 10-8% Tier des Versuchs 16 von26-15auf20-35Ä-,(7 abgenommen, wird verblutet Die Hungerdarmschleimhautversuche des Hundes stimmen prinzipiell mit den Leberhungerversuchen am Kaninchen: die absoluten Eiweißmengen pro Gramm ürganpulver gehen in die Höhe, die löslichen Eiweißkörper, insbesondere die Essigsäurekörper, schwinden beträchtlich. Das Arbeite» mit Oreaneiwciü 671 Von Giften, die den Eiweiübestand aiit;n'if<-ii uii.l ...i, ,i,.w,u tin Einfluß auf die Leber zu erwarten war. wühlte irh ri,.,.,.!.,,, ,,.,.» \ r. senik. i) \('rsueli 17. Ein 17r)0.7 Kaninchen erlnilt 151ut. eine Intoxikationsforni. wie sie ausschließlich beim Menschen vorkommt. Führt man den Phosphor subkutan zu. dann ist die Lebereiweili- schädigung trotz hochgradiger Verfettuni: nicht nachweisbar gewp.«ien. Versuch 19. Hund 7820, erhält an .") Tagen je 1 cm' ()"_*° oi!-'**^ Phos- phoröl subkutan. Am (3. Tage Gi)50, wird verblutet. Leber: mikroskopische Fettinfiltration. Eiweißverteilung: Gesamteiweiß pro 1 // = 0'724. lösliches EiweiÜ = 0"257, Essigsäure fällbar = 0'1548. Hier ist als Maß der Into.xikation die Fettbestimmung ent.scheidend. Jedenfalls zeigt der Versuch, was bei der Proteusnafur der Vergiftungs- bilder mit P ohnehin zu erwarten, daß sich eine hochgradige Störun«: des Fettgehalts völlig unabhängig vom Eiweißbestande vollziehen kann. Über den Verlauf der Arsenik versuche nur kurz folgendes: Versuch 20. Kaninchen von 1()3()// i;dll nach zweimal OH2.7 AS2O3 p. K. in 4 Tagen auf 900^ Gewicht. 1 g Leberpulv. gibtO-7Gesamteiweißmit Oil Plasmaeiweiß 11. (»-07 I i» in Prozenten: 100 : L'> '" Versuch 21. Kaninchen von 1C)20 7 fällt nach zweimal o()2 /; AsoOsp. K. in 3 Tagen auf 1470// (iewicht. l^Leberpulv. gibt 073 Ge.samteiw. mit 0 1:17 Pla>maei\\. u.uu:k>i..sMg.s.-Kurp. in Prozenten: loO L^ : l-^'-* In ähuHcher Weise geht nach wicdeiholten Aderlässen, d'- '-r starker Gewichtsabnahme bis zum Tode der Tiere dnivl.'.fnlü-f w.- Menge des Essigsäureproteitls beträchtlich herunter. I ') Siehe die zu ähnlichen Rosnltatra gflant.'en«lf .\ chemischen Veränderungen in I'hosphorleborn. Hiochem. /«-i'. 672 J.Pohl. Das Arbeiten mit Organeiweiß. vorstehenden Erfahrungen zusammenfassend, der Satz aufstellen, daß jeder zu deutlichem Gewichtsverlust führende Prozeß, möge er auf welche Art auch immer ausgeführt worden sein, sich in einer mehr minder deutlichen Abnahme unserer Leberproteide spiegelt: eine Spezifität kommt diesem Befund nicht zu. So möchte ich noch erwähnen, daß Immunisierung von Tieren mit heterologem Serum bis zum Auftreten kräftigster, schon bei Zimmertemperatur erfolgender Präzipitation durchaus zu keiner Ände- rung der Eiweißquotienten zu führen braucht, falls die Tiere keine Ge- wichtsabnahme zeigen. Tritt aber der letztere Fall ein, so kommt es auch hier zur beschriebenen Änderung im Organeiweißbestand. Vorstehende Ausführungen mögen die Anregung zu weiteren Ver- suchen mit Bestimmung der Eiweißkörper der Organe unter wechselnden Bedingungen geben. Ich schließe mit folgendem Ausspruch E. Abderhaldens ^ ) : „Organeiweiß" unter normalen und pathologischen Verhältnissen zu unter- suchen, hat viel Verlockendes für sich. Es ist ein reizvoller Gedanke, dem rein morphologischen Studium pathologischer Zellabartungen eine genauere Kenntnis der Lebensprozesse der veränderten Zelle an die Seite zu setzen, denn, daß nicht äußere Strukturverschiebungen das Wesen krankhafter Prozesse ausmachen, sondern ganz offenbar in erster Linie Veränderungen im gesamten Stoffwechsel der Zelle, ist ganz klar." *) E. Abderhalden , Klinische Eiweißuntersuchungen. Zeitschr. f. exp. Pathol. u. Ther. Bd. 2. S. 648. 1906. N. C. Stau a/iiü Druck von Gottlieb Gistel & Cie. in Wien.