FS a ee Ad Ad 的 结构 及 其 生物 活性 xt Rin 沈 同 +k ae 和 aor i » a ‘| Na a. A RS AY Yo ae gt SS ior he 六 本 jn 4: nF te ee Arey 4 Deg t spats hx Z yY - Was “he ; } ‘er . A re : , 7 ED ere ree oe a ee Oe ee ee oS ae a Be He Bh de ty J SE A Hh OBER RENO 医学 专题 丛书 ~ ’ ° i 4 ee Ca a ees oe - ' i 人 oy. “ 2 内 容 提 要 ee 本 书 汇集 北京 市 生理 科学 会 于 1962 年 春季 举办 的 “核酸 的 RAISE ETE ER” RERUNS EWG 14 篇 讲演 ) 稿 ， 介 弗 近 年 来 国内 外 在 核酸 研究 方面 的 若干 动向 ， 内 容 涉 及 (一 ) 核 酸 的 糙 构 问题 ，( 二 ) 核 酸 、 核 蛋白 与 蛋白 质 生 物 合成 问 题 ，( 三 ) 核 酸 的 生物 活性 (感染 ,分 化 及 致癌 ) 问 题 , 以 及 (四 ) 影 响 核酸 代 猎 的 理化 因素 问题 ， 可 供 生 物化 学 专业 人 员 以 及 广大 Bae: 医学 界 与 生物 学 界 工作 人 员 贿 考 。 作 学 专题 丛书 术 酸 的 结构 及 其 生 物 活 性 (北京 市 生理 科学 会 系 就 学 术 讲演 ) . Se ENOL Yk ERE LARA BR HEH Chena — ps 450 号 ) ie rs 5 7B RE a HE 093 号 上 海 洪 兴 印 刷 厂 印 刷新 华 书 店 上 海 发 行 所 发 行 _ FA 850X1168 1/32 FUE 11 28/32 PEK FH 313,000 1964479 月 第 1 版 1964 年 9 51 KEDH - 替 一 书号 13119。560 ”定价 (A) 2.00 元 前 = = x BSE EME AE FRYE LH, PS IIE AP RE ， 术 成 就 ,不 但 丰富 了 核酸 的 化 学 知 项 (特别 在 核酸 结构 方面 ), 而 且 ”开辟 了 新 的 研究 途径 ,对 于 多 少年 来 科学 家 切 望 解决 的 问题 ,如 蛋 — AURA AAPL REAR MUD EKO SEARO ROSE, MOLLE T Bi ES , ORRIN A rH UB Bh FARA RARE HRS AMES, 我国 在 核酸 的 研究 方面 正在 开始 ， 从 事 此 项 工作 的 科学 家 还 ， 系 多 。 为 了 推动 它 的 发 展 , 北 京 市 生理 科学 会 于 1962 年 春 举办 了 。 在 训 的 一 部 分 从 事 有 关 核 酸 研究 的 科学 家 检 法 介 帮 近年 震 二 方面 ERLE FEMUR T CRT. BER) PARADE A ei S sma. 只 选择 了 下 列 四 个 问题 : 〈 一 ) 核 酸 的 烙 构 问题 ;( 二 ) 核 U。 酸 、 核 蛋 自 与 蛋白 质 生物 合成 问题 ;〈 三 ) 枝 酸 的 生物 活性 (BO, 。 分 化 及 和 致癌) 问题 ;〈 四 ) 影 响 核酸 代谢 的 理化 因素 问题 , 共 分 为 十 | 五 讲 。 讲 演 会 千 束 之 后 , 所 有 讲稿 双 泾 整理 补充 , 汇 篇 成 为 本 书 ， 国 。 其 中 韩 够 同志 所 讲 “ 抗 肿瘤 药 与 核酸 代谢 ”一 稿 , 因 已 在 “生理 科学 BER" eS APR, : PERTTI Fz BAB De, SCARE OL ZL ARS RCSB A BY SAEZ TR, (LAB HEAL 5 PE EER HY eR 已 。 现 应 北京 各 界 的 要 求 SL AIAD HE SE BERS 考 。 汇 重工 作 中 由 于 缺乏 经 验 , 缺 点 在 所 难免 , 敬 希 读者 指正 。 刘 培 楠 ” 梁 植 权 沈 同 瑟 ” 最 近 七 八 年 中 核酸 的 研究 进展 得 很 志 ， 不 仅 是 生物 化 学 家 对 Be

) BRR 130 (—) RA RARE 131 《三 ) 酶 活性 138 ve (—) Bae SRB 134 (= eee ti ES Ee a. 7 f Ree RR BRB ~ 4 —s (+) 氨基 酸 并 合 过 程 中 核 胸 征 粒 的 特异 作用 144 〈 二 ) 特异 蛋白 质 合成 ee PCE RE 145 (=) RRL Sh OR WAR 148 (PH) ANTRAL TS RRMA 149 《五 ) le ¥ POR S KA Rem 150 3 sa ‘i Sik MANA ERR ALD a EE 6 eo 0s. ns conryns OS: aia ay © “i 如 ee et) ae (=) 信使 核糖 核酸 的 发 现 159 〈 二 ) 信 使 核糖 核酸 的 某 些 特 狂 160 | 三 、 信使 术 贸 术 酸 的 合成 与 相应 胸 氧 术 往 杷 酸 的 复制 关系 166 四 hy ie has ees > Ae , ae a ; A ) (一 ) 核糖 核 酸 由 觅 氧 核糖 核酸 复制 而 来 的 理论 与 实 允 根据 166 (—) fF 使 核 猪 核酸 与 相应 觅 氧 核 措 核 酸 的 杂交 键 的 形成 以 及 天 然 核 久 核酸 -脱氧 入 糖 核酸 杂交 链 的 发 现 168 < W. SRRERRSEARARELOKR: 0 ……169 (一 ) 核酸 在 蛋白 质 合成 上 的 作用 169 (=) 天 然 及 人 工 信 使 核糖 核酸 在 . 蛋白质 合 成 上 的 作用 169 (=) 应 用 人 工 高 聚 核糖 核 背 酸 对 蛋 自 质 合成 的 密码 复制 作用 的 研究 171 第 七 进 AG EMELMES TOMO es 及 其 某 些 理化 性 质 ” 黄 华 漳 和 —. B\z-- pat ais * 6 5 | 9 534 2954 OF 1) ap > ee 178 Pe (一 ) BE 178 (=) 去 活 剂 法 182 (=) 热处理 法 182 (PH) MM 法 183 (五 ) 去 污 剂 -本 并 用 法 183 (A) 氟 碳 化 合 物 法 184 三 、 核 糖 酸 提取 过 程 中 防止 降解 与 变性 的 问题 … rd (—) 核糖 锌 酸 酶 的 抑制 186 〈 二 ) 应 避免 的 化 学 因素 187 (=) 应 避免 的 物理 因素 187 四 、 提 高 楼 糖 必 酸 制剂 炖 度 的 方法 … 0 187 (一 ) 蛋白 质 迭 杂 问题 187 (—) HBR 191 (=) 几 类 除去 摊 杂 物 的 方法 192 ， 五、 具有 生物 活性 的 高 分 子 核糖 极 酸 的 某 些 理化 性 质 … 194 (一 ) 分 子 大 小 195 (=) 沉降 行为 195 (=) 粘度 198 六 、 核 糖 核酸 的 生物 活性 的 检定 到 存在 的 问题 … vhanki ch sauseeswng ie (—) 何谓 生物 活性 198 (=) 检 驹 核糖 核 酸 活性 的 体外 和 柔 纺 方法 举例 199 《三 ) 关于 核糖 核酸 制剂 的 低 活 性 的 一 些 推 想 200 BAN aoe FIR > als. dvnavandeset> sovsceensevceeess OG Ni, NTN sens eer eee cecccccevcassenccrsccscesectsenecsansssacsesscneen 207 (一 ) RAF HR 207 (=) MRMMMMER 208 (=) 蛋 自 质 的 ; ) 和 藉 构 217 =, 病毒 核 酸 的 生物 活性 … 人 7 本 218 eh ip 《一 ) 核糖 核酸 感染 性 的 发 现 和 肯定 218 (二 ) WTF ABM 219 (SB) 关于 核酸 活性 的 健 花 220 ; ”四 、 神 酸 籍 构 的 改变 eeeooooeeeeee; 295 he 二 = Woo oo 0D27 ce panortell 柳 元 元 a8 oo 0D31 (=) BERERNAM TAI 232 (—) 提取 感染 性 病毒 核糖 核酸 的 材 ”将 来 源 233 (=) 影响 感染 性 核糖 核酸 滴 度 的 因素 237 ee. PRL ETA IR UGB AG SE FRIES cere rere tee verperneneesseenene DA (一 ) ERR RA RAIA 5 AE RAE YE EM EH 243 4 eee SAME RE 247 【一 ) ERM RMS AL RAB 250 (=) 合成 病毒 核酸 的 基础 材料 251 (=) 受 染 条 胞 内 病毒 核酸 和 和 蛋 自 质 生 物 合成 的 相互 关系 253 ee oo 2 ag aiming Bem | ena 与 蛋 髓 质 的 合成 状态 … 2262 Be PEREARARS ERA RMR 262 (=) tiled ERR EY BR) PARSE TR 265 eee eee ERA Se Ste 269 0 (一 ) 想 织 者 的 命名 及 其 化 学 性 质 269 (=) 粗 织 者 的 核酸 与 蛋白 质 代 i 271 “sie Misiianareinla RRR STE 274 (—) BEAWBSEA 276 (=) ONE RROU RE eA BIEH fa pie gas 279 | B+ it Se SHARED 刘 士 廉 5 re 0 304 第 十 二 进 ene ener 3 陆 如 山 1 eee seeeeesee B08 中 、 病毒 感染 与 宿主 和 胞 内 的 核酸 代谢 … 0 & = 引言 … 7 ve seercereseseesenss DG] - 四 394 Wat on ER IR AIO so elakenaneet b 66d b oe 6 POR Soa Was pine Lee DOB my 本 ‘de 浊 a bi | | ay ae WO DS MO ee OA eh el ek A a ee ey A A a Wi LP Ue Soh aa 人 iy IRE 上 | ay ， ! Lay | y ti ; ’ : r 网 a ¥ 站 f Nan KY f ay ward at th) iy ys , A sa eee RI POA .308 (—) 电离 辐射 对 标记 前 体 并 合 到 脱氧 核糖 核酸 中 的 影响 308 (—) 电离 辐射 对 腕 氧 核糖 核酸 中 加 代谢 物 含量 的 影响 313 (=) Baa 糖 核酸 中 间 代 谢 物 从 体内 排出 的 影响 314 (PD) 电离 辐射 对 胶 氧 核糖 核酸 酶 的 影响 316 = sa 55- A So os AR I LIRR RAEI env ve veneer 18 | (一 ) BAAS 318 〈 二 ) 再 生 肝 320 Sg Aetna DO, He Bee ASHP RSA RYT AE BLE -- near eneaseuicatenee QOD (一 ) RAS RRR Em 324 (=) RAR 合成 酶 系 的 影响 325 (SH) 电离 辐射 对 鹏 氧 核 糖 核酸 含 成 引物 的 影响 326 第 十 三 进 ” 电 离 辐射 对 核 攀 代谢 的 影响 (二 ) “ww A 一 、 电离 辐射 对 核酸 代 叶 影响 的 三 个 不 同 水 平 的 研究 . 3333 二、 电离 辐射 对 胸 氧 核糖 桶 酸 水 洲 液 的 影响 … +0 #00 one ane Ae tate aa (—) 水 的 电离 335 (=) RAB TON 336 (= ) Ste AA ER Tee PRAM ETE A 337 《四 ) RCAC” 液 中 的 O, 和 觅 氧 核糖 核酸 分 于 上 的 看 白质 杂质 338 by 三 、 eis TAS St St et AIH HEBER IEE ee eal ale 1202238 (一 ) #uIee%) 339 (—) RARER BORE 339 (=) AMMAR RRA 939 《四 ) Mant ee EA PTAA HER 3.40 eas) Do, Ha Biel ek Bh OI …， og (一 ) 整体 高 等 动物 340 (=) WE 341 (=) 体液 343 〈 四 ) 生物 高 hag as bia sre SRE Ei Date rh ales seen wasisind 2 Chie on TN BUDA verre eect eect ttetteteteerneteeneenseneene eich 346 (—) Rpt 346 (—) 喀 喧 类 抗 代 谢 物 350 (=) 叶酸 类 抗 代 SRO 355 《四 ) BARGER A 367 “五 ) MRAMAA mE 369 MCA ia 第- 一 讲 “核酸 的 化 学 降解 及 其 产物 的 分 离 鉴定 Wo mR BB) Bs 2 Se Bic Se et BE SET AE te eRe) eM KAFROR AR SORE IR. ARTA AE Xe HE, TERETE Mas eae, 因此 ， pilin lr a i 核酸 一 毅 千 构 的 研究 通常 可 以 通过 合成 与 降解 西 途径 。 本 讲 帮 一 些 从 降解 大 手 研究 村 酸 一 般 结 攀 所 用 的 一 些 方 污 ， 和 泊 其 Rion. | ee a Heme petra mae TCA, eteMeRNI if, AGM AIMEE BL) REAM LR, A RRA RAAT RE. 核 背 、 核 苷 酸 以 及 多 核 苷 酸 等 不 同 产物 。 。。 答 得 到 这 些 产 胸 ,核酸 的 种 关 \ 降 解 的 评 与 条 件 等 都 是 重要 的 因 。 素 ,总 的 来 说 ,可 以 概括 下 列 几 个 方面 ; ee q SB, HF AE AEH BE REL HRN BB ae y ; Se Ry i j ii 4 人 oe 2， O Ors O 0 有 ig ae A’ my 5 00 N* | oe Gi. OH ae ox A OTS FP SE RR ANS A Ha PRE ( sm ee 糖 核酸 ， 以 下 简称 DNA), ARS BA, Ait 1N 碱 在 室温 即 能 使 核糖 核酸 (以 下 简称 RNA) MEERA RE, 而 DNA Fe 降解 极 少 。 =, DNA RRNA 易 为 酸 (如 过 氧 酸 、 甲 酸 等 ) 所 了 水解; — we RE ES ICEL 水 解 。 BE» SRM AEF GE ae ee nk Oe 的 核 苷 键 更 不 稳定 ， DNA 或 RNA 均 具 有 此 特性 。 核酸 的 降解 常 应 用 的 方法 有 化 学 ( 酸 ， 区 和 化 学 议和 和 的 二 方法 ) 本 讲 训 到 的 是 一 些 化 学 方法 ; ;关于 酶 解 的 方法 将 在 下 一 讲 内 述 及 。 (—) 降解 成 碱 基 1, WRBC70~72%) FE 100 度 加 热 了 小 时 , RNA 或 DNA 均 能 水 解 碟 自 由 的 味 哈 和 喀 啶 碱 。Fresco 等 ca9 报告 本 方法 水 解 的 效果 与 酸 的 浓度 和 水 解 的 时 间 有 很 大 关系 ( 玫 1)。 WARE AD Pe BERBERS , PT FSS EO AR BR Fe, 收集 沸点 203 一 205sC 的 部 分 应 用 。 但 在 蒸 溜 时 易 引 起 爆炸 ， 需 特别 注音 。 此 水 解 方 法 喀 吓 回收 量 较 低 ，5- - 交 甲 基 胞 喀 啶 在 水 解 时 会 被 破坏 。 #1 过 氧 酸 水 解 核 酸 的 娃 果 [aa (100°C) hs ; k ‘ 站 人 水 解 oat. He tH eR 2 10° 20° 40 水 解 奉 ”酵母 'B 60 8.6 35 57 酵母 RNA 70 86 96 96 70 83 98 100 小 牛 胸腺 DNA 2. 甲酸 (98 一 10095)175"O 封 管 中 加 热 2 小 时 ,RNA 或 DNA a 均 可 水 解 成 自 由 碱 基 ， 其 缺点 也 为 喀 啶 回收 量 低 ，Wyatt 等 23 在 水 解 天 肠 杆 菌 双 数 噬菌体 DNA 时 改 用 88 和 甲酸 175"0 作 用 80 分 钟 从 而 得 到 了 5- 卷 甲 基 胞 喀 啶 。 0 3.IN 盐酸 或 硫酸 100°C 加 热 1 小 时 ，RNA 水 解 后 的 产生 ”是 味 办 破 及 喀 啶 核 音 酸 。 此 法 缺点 是 在 水 解 过 程 中 喀 吓 核 音 酸 可 。 能 会 部 分 的 转变 成 核 昔 。 4. 三 氛 乙 酸 于 155*0 加 热 80 分 钟 (RNA) 或 60 分 钟 (DNA) 。 芍 可 得 到 自由 核 碱 。 上 比较 来 看 , 本 方法 较 好 ， 胞 喀 喧 无 腊 氨 现象 ; ， 土管 加 热 时 也 志 甲酸 法 产生 的 压力 为 小 , 管 不 易 炸 裂 ; 靳 层 析 时 样 ， 品 点 样 易 干燥 ,也 无 腐 创 滤纸 的 焦化 现象 。 ”在 不 同 的 水 解 条 件 下 均 要 防止 胞 喀 啶 可 能 发 生 的 腊 氨 现象 ， _ Fresco 等 om] 提出 ,每 m mole 胞 喀 喧 和 0.3 BEF 92% 甲酸 作用 。 了 20 小 时 (140?0) 可 以 定量 的 由 胞 喀 啶 转变 为 尿 喀 啶 。 (=) 降解 成 核 苷 “RNA 降解 成 核 背 的 方法 最 早 系 用 浓 氨 ” 洲 液 在 加 压 下 于 4175 一 180?"0 作用 3.5 小 时 或 在 吡啶 水 洲 液 中 辐 * $64.5 日 而 得 到 。 近 时 ,也 ayesc] 用 5095 甲 酰 腕 水 溶液 于 100?C ”作用 10 小 时 可 得 到 A,G,O,U puppy ty, EHP Pe Hume me AK HF 20% Kis, HRB. FA LacOH), fF pH 9 -F 80~90°C 加 热 48 一 60 小 时 也 可 得 到 95 FO, 用 化 学 方法 自 DNA 制备 核 背 是 相当 困难 的 。 . es ees | ies. . - San? ‘Go “414 bs vy euler ex mer Pe ee ee eee SP a tt, eee (we. RAGE Ly ey Nal asf? 5 ey Hn SOPs RE AR ae pe yore are ‘ ty Me te te isd y -a J a ae” By ped shee “4 uh J oP ee : ‘ 9 x ‘ ‘ “y ‘ dem t iH ,本 RE Beep. Ty A eS) ‘mas Ya iy 4 ‘ oy . 4 Ts | ak (=) ARR RNA MRR SE MEE, 用 的 方法 是 0.3-1N NaOH ok KOH 4 3 i 37°C 作用 16~24 ， 小 时 或 0.6N Ba(OH), 100°C 作用 2 小 时 , 均 能 得 到 单 核 昔 酸 。 ， Singer 4077 °°) 便 应 用 0.3N KOH 在 37°C MEMES ， 酸 (以 下 简称 S-RNA), 18 小 时 后 得 到 单 核 昔 酸 。 最 近 ， 也 有 人 用 更 稀 的 碱 水 解 而 获得 单 核 苷 酸 。Herbert 等 r“] 自 鼠 肝 中 分 出 三 部 分 SRNA, 以 0.1N NaOH 在 85"C 水 解 4 分 钟 比 坊 测 定 了 各 部 分 的 租 成 。 碱 水 解 的 方法 较 其 他 水 解 方法 为 完全 ,因此 ,全 被 认为 测定 核 酸 组 成 中 过 为 理想 的 水 解 方法 。 由 于 DNA 不 易 为 硕 水 解 ,同时 味 吟 腊 氧 核 背 的 背 键 又 对 酸 很 不 稳定 ， 所 以 也 没有 较 好 的 化 学 方 法 自 DNA 制备 核 背 酸 。 - (四 ) 降解 成 多 核 苷 酸 ”降解 成 多 核 背 酸 的 试剂 有 酸 和 碱 两 种 ， 随 作用 条 件 的 不 同 可 采用 不 同 的 浓度 。Lanereo 用 1M KOH 26°C 7k ff 4~18 小时， 从 RNA 得 到 了 二 核 背 酸 片段 。 Chargaff 等 co 以 0.1M H,SO, 100°C 水 解 30 分 钟 , 自 DNA 4 HATHA. ABEMRET RARER MMR, HEH GA TAMA, WIGS. Merrifield'™ AEN 酸 于 25°C 水 解 酵母 RNA 3 分 钟 得 到 了 二 ,三 核 背 酸 。 (五 ) 无 嗓 哈 酸 和 无 喀 啶 酸 的 制备 ”由 于 顺 哈 和 喀 喧 腊 氧 核 abel - z te oe AY CERRO TEJA AY ee JE HE AF Ze Bl. ~Chargaff 和 Tamm! 11°] 用 稀 酸 处 理 DNA GE 7 AOA RR SAE, PI} FRAN 15,000, 仅 为 DNA 分 子 量 的 1 和 ,因此 在 研究 WAR Ewe DNA 容易 。 得 到 的 这 种 酸 常 称 之 为 无 嘎 喻 酸 (APA), 其 制备 方法 有 四 :(1) 用 酸 铀 节 DH 至 1.6 46 37°C 对 水 透 析 24 小 时 ; (2) 用 酸 届 节 至 pH 2.8 在 100°C ME 1 NS (Q) DNA fe HO) 存在 下 和 乙 硫 醇 作 用 14 小 时 (18°C)"%43 (4) DNA 在 无 水 毛 化 人 和 硫酸 人 钠 存 在 下 和 豆 基 乙酸 作用 (37*C)5so1， 均 可 获得 APA, -二 R——S—CH,COOH 一 一 8 一 0， it, ; PA GRAD PAU MSR 91, PT FLAME RRR EE ie a aL OT APA 分 解 。 ， RNAS a, DNA 在 60°O FAME We 1 小 时 可 得 到 无 喀 啶 碱 的 SEER. (六 ) 其 他 Markham!) RNA ZF 100°C BaOO, 水 解 ， 1 小 时 ,水 解 液 再 逻 电泳 分 离 得 到 了 环 状 核 背 酸 。 Shapiro 和 Ohargaffrs3 报 导 DNA # 0.2 M H,SO, 100°C ; 水 解 2 小 时 ， 过 量 酸 用 Ba(OH), 调整 至 pH5.5, BORA BaSO,, HME pH 10， 离 子 交 换 层 析 分 离 出 数 种 吵 啶 、 核 背 酸 衍生 物 (pMp, pMpTp, pMpCp, pOpCp 和 pCpTp)*, 此 外 ， 有 些 工作 者 利用 不 同化 学 武 剂 和 核酸 或 核酸 的 组 分 相 作用 ,以 观察 其 反应 情况 ， 霸 分 析 反 应 产物 ， DLA PEERAGE BAY KSA, ERRAD ? WE RECN EERASSEA . 基 可 与 HNO, 进行 以 下 反应 : R_NH,+ HO_N—0-— > R—- Noe | 1 ae —>(R—N=N-—OH ]—>R—OH +N, Fk, WS RIE. KF WARES 机 制 ，Lavalle 和 Roberet***? 提出 当 其 复制 时 哄 啥 与 喀 啶 核 苷 酸 被 其 腹 氨 衍生 物 ( 了 一 N 互 :一 > 了 一 OH) 所 代替 。 动 植物 的 DNA 和 烟草 花 叶 病毒 (CTMV) 的 RNA 中 , 合 氮 碱 的 腊 氨 速度 基本 上 相 同 ， 其 中 由 于 腺 味 啥 、 胞 喀 啶 的 氨基 具有 和 氢 键 与 NO 作用 的 速 ， a HES He EA BO, EO FI RD ERB eR. PPAR BJS Hk fe ose A, Ze DN A 主要 作用 于 胞 喀 啶 ; 在 RNA 则 主要 下 和 胞 喀 啶 和 尿 喀 喧 作用, 对 羟 甲 基 胞 喀 喧 作用 极 小 , (ELE RO Fra BAS. Big WR oe FE ELE ME BES DR A EF ES ERA ALAS BE AT RM EK ET AARP E A. FE4G RNA (EAT, pH 6.0 fF AF Same he HSE EE BAF RM ME 30 1% 31H Ze pH 9.0 上 上 = 磷酸 基 ; M= iA 5-H ieee I = 胸腺 喀 啶 ; C= aR. ere em Shy Oe fae eet os er ee Be lee . |. Sa Sis 了 人 one a Py ’ aa 7 4 \ he i) a oe ¥ 5 A ww ad ut Fe * 了 - x4 a ] * ae i 5 7 ww Bs ot cee lb AY Vs AERTS VE, SPT SH DL TE OM EAA A OT. ML IS each。 人 nm 时 “较为 群 尽 的 报告 了 郑 胺 对 于 尿 喀 啶 核 苷 及 其 核 昔 酸 、 胞 喀 啶 核 昔 及 其 核 背 酸 的 作用 精 果 。 认 为 ， 在 PH 7.5 尿 喀 吓 核 音 或 核 音 本 ba RIAL 5- SHRM fe pH 6.0 郑 胺 首先 加 成 胞 喀 啶 核 童 或 尾 酸 团 啶 环 的 C,—C, 双 键 ,进一步 以 后 基 取 代 Ce 氨基 ,以 后 继 ee am et ee ee te Ak 7 —&B q , 4 4 Oo e a | Pa at N q ms a : oN NH, be 2 AN | jz: 用 有 下 O O C ‘4 本 a | O 3S Tee O Ta tA date O nt FE Eap O Sa ae: O OH O OH |. | wy | | N= =CH ie NH, bi Saeed NOH x 4 be 站 —O—CH, NHOH | fe i HO—O—H 7 he 一 一 一 一 上 1 H—C—OH Pa H, uy — 7 — vans ie 8 4 Ob), Verwoerd 等 cue 这 ? Ss teschamage. snunn ok) VS, RUMEN MEK AIE, “ .) ye : HO 9 HO O 2 一 PE be 225, No oo Hd 07) CHN—)HO*HN "HD HO'HN ty HOHNN AAA 9 ANN_ 9 i ¥ meee Q- EX - HO-HN— ( __'eHO) | “(De00TeH) BORE BEIT ACHE. Burton’ 研究 在 不 同 肤 的 存在 下 66% 甲酸 降解 DNA, 观察 释放 磷 的 速度 。 诈 明 以 二 菏 胺 的 效 BGs fs MUA Le PE Ee PEF RR RCH SEE BY DN A 到 p Fe | 效 出 来 ,由 此 推荐 在 与 DNA 或 肌 氧 多 核 苷 酸 反 应 中 可 引起 磷酸 1 = 天 人 与 顺 哈 核 阁 残 基 开 裂 而 释放 出 喀 喧 多 核 并 酸 借 此 推测 哮 吁 ， 核 背 酸 的 大 致 排列 。 三 、 极 酸 降 解 物 的 分 离 与 鉴定 。 交 台 往 县 析 法 和 帘子 交换 多 层 析 法 。 有 关 这 考 面 的 工作 有 部 多 和 px Wyatt 4) age LA BT MRM Mark- ham!"9) gta RA BDH Cohn!) meat As By te 。 离子 交换 柱 上 的 层 析 分 离 等 。 。 (一 ) a TE SUR EASE MH AE A PMLA, TUR RRS ETS 考 , 这 里 不 再 叙述 。 ， ， 耗 层 析 法 可 将 核酸 各 粗 分 自 混合 体系 中 分 离 ， 但 在 应 用 上 有 一 定 隐 度 ,分 高 效果 以 分 离 小 分 子 的 组 分 如 核 碱 、 核 昔 、 核 背 酸 以 及 二 ,三 等 低 聚 核 背 酸 为 佳 ,但 在 分 离 较 大 分 子 如 四 以 上 多 核 并 本 AUR. i MEDEA ERE RR ERED MM EN IESE, AVE . 1, RRA AB PAAR UCR E NY HED , AKL BE Bp RCE _L, FETE GRE PF RIG, BAD BA Mh. PEREXE 0.5~1 GE /BEFL AT CUS IH, Markham!*® 7°). Smi- tho") Ohargaffc 和 Wyatt) 提出 分 离 RNA ok DNA 核 碱 的 方法 ,全 广泛 为 大 家 采用 。 表 2 是 核 碱 在 不 同 溶剂 中 的 Ri 值 。 | hie, wernt DNA ppt。 Site, AMT Arm OR RE RARE RR DEO AN HABE, BELL IGE wR EE SS 4 DE ERO Fe Ei Re, oe 一 一 一 一 ~ é 号 一 》 ie “4 Marshak 和 Vogel!?7] 4 FA yt ame Tk fH, 可 以 未 需 从 不 含 脂 类 的 生物 材料 中 将 核酸 用 三 氧 醋酸 提取 分 离 出 来 ， 即 可 进行 核 碱 的 微量 分 析 。 核 大 的 颜色 反应 ,对 核 碱 从 攻 上 检 出 极为 重要 ， 因 为 这 样 可 以 避免 由 于 含有 能 干扰 一 般 分 光 光 度 测 定 的 吸收 杂质 所 引 RE, 有 关 这 方面 的 工作 Woodrl21]，Boser[l28]，Glerlachtl2 SARS Ai. | K2 RRB EH R, a Ye 剂 RK Hk BG RK Po hog tg gs | 9 | 10 BRUR Mr 0.38} 0.28] 0.40} 0. 0.83} 0.44| 0.37 Fe ORM 0.15] 0.11] 0.15 0.70) 0.02} 0.40, TRORGE 0.31] 0.19] 0.33 0.67| 0.73| 0.76 Ra BRE 0.52] 0.35} 0.50 0.78] 0.73| 0.74 i ete 0.22] 0.24] 0.28 0.80] 0.73| 0.70 5- FA 3 i, ee 0.29} 0.27| 0.36 一 | 一 | 0.78 5- 羟 甲 基 胞 喀 啶 | 0.13) 0.12) 一 一 | 一 | 0.75 DRURY 0.20] 0.22] 0.33 0.91| 0.54] 0.49 Breet 0.15} 0.03] 0.10 0.59| 0.62| 0.68 DROME RE 0.17] 0.08) 一 0.60] 0.79] 0.84 a RE 0.12] 0.11) 0.15 0.73] 0.76| 0.76 CRA - : 1, 86% (v/V)SXKTR, Whatman 1 3407 47 (Markham, Smith"), 2. 86% (Vv/V)SAIETR, BASS 容积 的 浓 NU; Wek (比重 0.88) MFRS #8, Whatman 1-34, }47(Markham, Smithc?0l)。 3. 正 丁 醇 〈 在 狗 23°C TP UzkfidM) 100 27+, 15 N NH,OH 1 277, Whatman a4 Bt, b4¢(MacNutt'*2, Hotchkiss‘) , 4, SES 8% 77%>2K 13%, HR 10% v/v/v, Whatman 1 号 下 行 (Markham, Smi- th570 )。 5。 异 丙 醇 85 毫升 ， 水 15 毫升 ， 28 多 浓 氨 液 1.3 Bt, Whatman 1 Bg, 下 行 (Hershey‘##3 ae), 6。 异 两 醇 170 毫升 ; 浓 HCl ( 比 午 1.19) 41 毫升 , 加 水 至 250 毫升 ， Whatman 1 BR, PAT CWyatte), ‘7. SRRH 1 AR, RK 2 BRU 1.6 SHUKMM, Schleicher 和 Schill 第 597 8 史 T 卫 400 毫升 ,水 208 Ft, 25% Bk 0.4 Ft» Whatman 43K, V4 _ Géigren'), 5 8. 5% Na,HPO, 水 次 液 以 异 成 醇 全 和 ， ARE ARETE Whatman 1 号 ,下 行 (Carterte)。 10. 2 1N NH,OH 调节 至 pH 10, Whatman 1 号 ,上 行 。. 2. 靶 苷 的 分 离 DHBAH Ae Sew” , fez 2 内 。 Vennereao 用 多 种 推进 剂 研究 分 离 核 背 。 正 丁 醇 - 丙 醋 -水 -此 0 啶 -N- 乙 基 - 哌 啶 (20:25:7.5:0.75:0.75) 和 正 丁 醇 -丙酮 -水 - 哌 We (20:25:7.5:1.5) 5 A,G,C,U BHA, MIE 定量 测定 。 他 们 也 提出 用 同一 溢 剂 两 次 推进 以 分 离 核 彰 ， 如 甲醇 - 。 盐酸 -水 (70:20:10) 或 甲醇 -乙醇 -盐酸 -水 (50:25:6:19) 第 一 次 层 Bt, UC 核 背 重 生 不 能 分 开 ,但 当 第 二 次 用 同样 洲 剂 推进 后 AyG 。 QU 四 种 核 苷 即 能 清楚 分 离 。 3. 枝 昔 酸 的 分 离 ” 由 于 核 苷 酸 的 结构 可 能 有 三 种 形式 ,2 ;3 或 中 - 核 昔 酸 , 因此 在 分 离 上 就 带 来 了 困难 。 一 般 认 为 A,G,C,U DORR FES, PUB TIER BH DE RAE. Markham 和 Smith") & —-KANBAEKLD BEB, aA SR 19%, 水 19% FAW 2% v/v/v HRAKKROS — ft Re ele gee aia) 分开 。Boulanger 等 css] 提出 用 酚 - 异 丙 醇 -甲酸 系 和 纹 定 量 分 离 «A, G,0,U 四 种 核 背 酸 , RFA ER. Caster) 的 工作 是 很 。 有 价值 的 , 他 们 用 595NasHPO,- 异 成 醇 洲 剂 系统 进行 双向 层 析 ， 可 将 大 部 分 核 碱 、 核 背 和 核 昔 酸 分 开 。 关 于 中- 核 昔 酸 的 分 离 , 最 近 Moscarell 等 8] 建 广 用 异 两 醇 - 乙 醇 - 焦 磷酸 稳 冲 液 (25:40:35 V/V/VY) 为 溶剂 ,他 们 分 离 pA, pU, pC 和 pG 取得 了 和 良好 的 效果 。 s-RNA 中 新 核 苷 酸 的 分 离 ， Lipshitz'**). #q Brawerman!*° ， 等 应 用 双向 层 析 技 术 进 行 研 究 ，s-RNA 的 碱 水 解 物 在 Whatmamn | 3 毫米 滤 和 约 上 双向 层 离 ， 推进 剂 第 一 向 为 异 丙 醇 -INNHO (7:3); 第 二 向 是 异 丁 酸 -0.5N NH,OH (10:6) pH 3.6~3.7, 4 al: 提出 的 洲 剂 可 以 将 A,G,C,U 四 种 核 背 分 开 。 近 期 ， so sink 3 5- 高 便 顺 哈 核 音 酸 ，2_N- 甲 基 13 immo BEER, en) 4 Ft SE REIS fe EF FE DR ME AA PT LS A 分 离 核 苷 酸 常用 的 溶剂 和 层 析 条 件 ( 表 3)。 a H3 Beww R, fac Pek ame, 2 -R RRB - 8 | 一 0 "3 /-BRUR PR ERE 0.50 | 0.4 0.35 | 0.49 | 0.7 2’- BPRS 0.46 | 0.43 | 0.20 |.0.67 | 0.24 | 0.46 3+ BERGE ; ‘ aE EE _| 0.80 | 0.77 | 0.51 | 0.43. | 0.24 | 0.35 Re ae SR 0.56 | 0.58 | 0.34 | 0.26 | 0.37 | 0.57 | 5 ARO GR 一 | 0.43 | 0.37 | 0.28 | 0.48] —— BER me BF BE = 10664.) —) | — be Bed BR PRE AA — 10.81) 一 CHa “二 LTB 26°CH 700 SFt, 恒 沸 HCl 132 Bs, gmk Ft, Whatman 15 ‘#, P47(Smith, Markham®), Boulanger, We a ee 2. FIX 2s60 aia 3. FAR 75 tH(v), 25% (w/v) =SARERE 25 份 (V)， Whattaan 1 Sa, Bo (int rows!!4] 等 )o i | &。 异 成 醇 ,四 氢 糠 醇 ，0.08 M ane Sn RODE 3.02)4 1 份 (v) Whatman 1 & BP 4 (Carpenter!), y Bs HT R10 GF (v), 0.5 N NH,OH 6 ¢} (v) pH 3,643.7, Schleicher, se om 597 3, P47 (Magasanik!6714¢ ) , 14 Be 0%E 含水 酚 84 Ut .a.T BE 6 Ht, BRE 10 份 ,水 100 份 (SOR, Whatman 1 Ne | Bak, P47(Boulanger, Montreuil), ae ba, Oe FIZ 2,90 3 ee . 8. 信和 (NH,)280, 水 滩 液 79 (9, 0.1 M 稻 冲 波 (pH 6) 19 4, RPNNE 2H) What- man 1 $#t, -4(Markham, Smith!7!1) , | " FAK 2', 3! AFH A «=Heppel 和 Whitfeldt*, 42) fe 报告 了 环 状 2 ,3' UE me EF HE HY 2 ES HE 5 SERA, OB AMES AG EF. DRS EA DL Be ee EHR RN BTS a 1s 考 Bi a ‘i ee 12) Re | Ar Rtas «5, ABRAHAM Meets Smith, Allen Be nb il 用 异 丁 酸 - 氨 和 异 丙 醇 -醋酸 -水 为 溶剂 ， 双 向 层 析 分 离 出 多 核 音 酸 。 区 horanarse1 采用 氨 条 葬 推 进 剂 分 离 多 聚 体 T(Poly T) ALAR AT AC (PolyT 和 0)。 首 先 将 分 离 物 通过 Dowex-50 讨 子 交换 柱 转变 成 钱 盐 后 ,以 异 丙 醇 -氨水 -水 (7:1:2v/v/v) 或 乙 醇 工 M NH,AC (pH 7.5)(5:2 v/v) BIBRA Es HT _®-1 M NH,OH-0.1M EDTA (100:60:1.6 v/v/v) 长 时 间 层 过 | MRE AB. Rushizky" 等 用 RNaso T, 降解 酵母 RNA, 在 含有 40%(NH,),SO, 的 0.1 M BRRRGMBEDP PH 7 中 分 一 二 、 三 核 昔 酸 片段 ( 表 4 )。 «#4 BERNA i RNase T,, 降 解 分 高 的 B=. Shee R, 值 rs] 化 & . - Rp (Ap 41.0) G-Cyclic-p - 1.5 ae | 2.5. ApGp. ; 0.95 CpGp | 2.5 UpGp oes 2.5 ApG-Cyclic-p 0.6 CpG-Cyclic-p 1.7 4 , UpG-Cyclic-p 1.7 | 全 ApUpGP + 0.68 k, i UpApGp 1.1 a aha _ UpCpGp 1.8 4 Me hg: _ . CpUpGp id cere 1.8 i Fieri. UpUpGp 1.8 a 1 ApApGp | 0.5 a as CpCpGp 1.9 me by ! ApCpGp 0.83 eae fe CpApGp 1.3 eae pe. Sonat Staehelinrt 研究 了 二 、 SRR LRN AR 3 -磷酸 单 酯 后 的 薄 层 析 行 为 。 在 正 丙 醇 -NH, 一 HsO (60:30:10) io meni 溶剂 中 ,二 ,三 核 昔 酸 异 构 体 具 有 不 同 的 Ri 值 ( 表 5)。 HS -,SRERVRGEREARI-p 后 的 R, 0" 物 | Re (JJ Ap 41.0) ApC 1.6 ApU 1.3 GpC 0.88 GpU 0.73 ApApC 0.93 ApApU 0.80 GpApC 0.46 ApGpC 0.51 GpApU 0.41 ApGpU 0.45 GpGpC 0.29 GpGpU 0.22 AE TEE FR BY A TS TOY SOK A CREE: UO SIS, fF] CLAN en eRe ER A KGET BRE, DIED He. MEVERAPERO, WTAPER. HERB te ML ARIL IS FE BY FDL 4 AH D SEM, VERE 适当 波长 用 分 光 光 度 计 测定 吸收 值 , 即 可 计算 出 各 粗 分 的 含量 上 四。 但 应 用 这 种 方法 测定 时 , 由 于 必需 沟 过 层 析 分 离 和 洗 腊 等 步 又 , 因 而 测定 时 间 需 要 较 长 (50 小 时 左右 ), 测定 回收 这 波动 较 大 ; MEE 杂质 的 干扰 影响 测定 的 重复 性 也 较 难 恒定 ， 故 想得到 准确 烙 果 必 损 进 行 多 次 重复 。 许 多 工作 者 为 克服 上 壕 人 缺点， 多 研究 核酸 棚 分 示 狐 分 离 的 直接 测定 法 。Kerr5s5，Loring 等 [9 65) 先 用 续 盐 沉 淀 法 将 RNA 降解 物 分 离 成 味 吟 和 喀 啶 丽 部 分 ， 再 分 别 测定 每 部 “分 两 处 波长 的 光 密度 值 ， 借 二 元 联 立方 程 求解 出 AGO)TU pam «yar. Emanuel 和 Chaikoff"") 以 类 似 的 方法 分 析 了 DNA H% 碱 的 含量 。 从 四 元 混合 体系 直接 测定 核酸 组 成 的 工作 近期 也 有 很 KRG. Suzuki 通过 省 化 作用 使 RNA 的 粗 分 改变 糙 构 咎 成 租 劳 相互 间 的 光 谐 益 异 ， 便 找到 混合 体系 中 各 核 碱 或 核 昔 的 含 一 14 一 | 性 最 。 硬 此 方法 向 未 应 用 到 核酸 样品 。Reid re，Prattr* 等 人 报 | 告 在 更 多 波长 处 直接 测定 RNA 或 多 核 彰 酸 水 解 液 的 吸收 值 , 利 | 而 借 电 子 计算 机 帮助 直接 奸 算 出 混合 体系 中 核 琶 或 核 背 酸 的 合 "fk. Bacuxenno!®) 等 也 用 最 小 二 程 方 原理 提出 了 直接 测定 RNA 核 FR TI. URGE 巴 ” 利用 泥 合体 系 在 一 定 波长 下 的 总 吧 HED) SP LH MDH 2 HS i PE 13 WR PFA RAE REE, ABER A id 的 含量 。 Eredericq 等 588] 发 现在 DNA pH 3 Ky E 260/ E280 比值 有 随 A 或 下 核 背 酸 的 克 分 子 比例 不 同 而 改变 的 特点 ， ， 利用 此 一 性 质 ， 报 告 了 简便 推算 DNA 粗 契 克 分 子 比 例 的 方法 。 we PER RUT MERE RAS ROMA, WH, wa Se ” 剂 星 色 的 比 色 法 5 212, FPN HL FA Sn HS ， 释 法 测定 尿 喀 呈 和 胸腺 喀 啶 含量 的 方法 C%]1。 但 这 些 方法 在 一 定 程 。 度 上 受到 测定 条 件 的 限制 ,实际 上 较 少 采用 。 CS) RR EE eee ek RIL EME A A BARA RE FEA WRAL, TT AS IE EE RY OH FB AR, FU, DUC rete TR BOY, A, GC, U PU Fh inet Ae FY DI Fire tite DS EBERLE pH 3.5 Bap He Hd 8 — RIE (I P—OH ) 2 i Tn SS — ER IE (ITP — OL) 2 ARIES 5 氨基 解 离 程度 也 因 各 含 氨 基 的 核 音 酸 的 解 离 党 数 不 同 而 有 所 不 同 ( 表 6 )。 | 由 于 每 一 种 核 昔 酸 带 有 工人 负电 荷 (ILP 一 OH)， 所 以 奖 负 电荷 ”在 p 且 3.5 时 则 为 : AMP 0.46 (1—0.54) GMP 0,95 - (1—0.05) AGB ENR TR HIDE ey FEAL 70 O LME BUENA A, G,C (Dt DNA-A. G,C,T putas tte pH1 BR _ Udenfriend ¢°**) 研究 了 在 pH 11 Ayer CREAR EE we; i wv), wl 7% VANS treo od tr? ee rz vn PF "’ he eae | 5 uae PMN NN rg Nee SRST RE ee ae a 站 { : . . a p> ‘ . . te .. . - ‘ . F CMP 0.16 (10.84) UMP 1.00 #6 Ay G,C,U WR pH 3.5 NHREBE wm Ff 了 酸 PKa, i 刘 a AMP 3.70 0.54 GMP 2.30 0.05 CMP 4.24 0.84 UMP 一 . 一 因此 ，, 在 进行 电泳 时 单 核 苷 酸 向 正极 移动 的 速度 各 异 ， 其 欢 序 是 : UMP>GMP>AMP>OMP， 可 以 达到 良好 的 分 离 效果 ca。 BI RAPE NARRATE A ROR, TE , ”pH 9.2 YAR SHARE AS, Crestfielde'*) Fi) AWE TE PH 9.2 的 三 酸 稳 冲 液 中 将 5 与 2，3 异 构 体 分 开 。 在 pH 3.5 MT AR ‘ REDS HER Spe PTO HAT EE ITH LAB 2a RM, ye pH 8.5 时 单 、 二 、 三 核 并 酸 所 带 的 次 电 a a Ae a ae By a ok i =, we ae ee a ee (a Btn yk ae ape el EA Le 7 * . + ie =. 5 ee —~—. On . 全 x= . = 机 天 ae » IS . = a eae , / Aa, = PAY BO A Ae 7) ae a 三 核 背 酸 > 二 核 背 酸 > 单 核 并 TN Na : KT RPEBXSKERMKLE A ‘ | K 4 酸 a ee: 1 1.4 Pe i | SiG 1 2 3 id me BA Ay ( roti 45 / HESS ES 3 HE) 1 1.43 2 Wee T 数值 和 在 某 -- pH Hi ARR, AR 出 任何 单 ,二 ,三 核 苷 酸 的 移动 速度 。 例 如 ,在 p 了 3.5 时 AG AC Me 和 AAU* 的 移动 深度 (以 尿 喀 啶 核 背 酸 的 移动 速度 为 ) 如 下 : AG=0.46 + 0.95/1.43=0.99 AO=0.46 + 0.16/1.43=0.43 + AG ARBAB AC 为 腺 胞 二 核 背 酸 ; AAU 为 腺 腺 尿 三 核 音 酸 。 一 了 一 | AAU =0.46 + 0.46 +1.0/2.00=0.96 ed WF. =D Lee ee 电泳 法 应 用 在 核 | 栈 降 解 产 临 分 离 上 则 有 限制 ， 以 分 离 三 核 背 酸 以 下 的 和 组 分 较为 适 H, Edstrom!) 自 组 积 的 单一 秋 胞 提出 RNA, RRR Rene NS aL. RE LALA ,7T BEAST 100~1000 微微 克 的 超 es vee 上 机 种 方法 联合 用 来 分 高 术 山 史明 so, RZ “RCE”, Rushizky 和 Knight 分 离 了 TMY-RNA fy RNase KE AEH" s 和 RNase T, My 2; 酵母 RNA fy RNase T, MARY) 以 及 s-RNA 的 酶 降解 物 c9。 了 erbert 等 co ， | ASAD TF s-RNA 的 RNase 降解 物 。 他 们 用 的 方法 是 第 一 向 进行 狐 电 泳 分 离 ， 焰 冲 液 为 0.08 M HCOOH (以 NH,OH 调 至 p 联 2.7)， 第 二 向 是 下 行 耗 层 析 , 推 进 剂 是 0.08 M _ NH,COOH pH 3.8 上 直 丁 醇 (1:1)， 在 一 张 滤 纸 上 同 时 可 以 将 一 些 单 .二 、 三 核 背 酸 异 构 体 分 开 。 ws 得 Petersen'**) 将 DNA 用 含有 2% w/v —SERRY 66% v/v IF EE AEDT ESR, (=) BFRRERRA OU LBAOHESENT SEE 品 的 分 离 ,分 离 大 量 的 样品 柱 层 析 法 则 具有 特殊 的 优点 。 离 子 交 换 ， 树脂 柱 屋 析 在 近 几 年 来 发 展 很 快 ， 尤 其 是 取代 徐徐 素 离 子 交 换 树 ， 脂 的 合成 ,对 核酸 降解 物 的 分 离 , 特 别 是 静 大 核 昔 酸 片段 的 分 离 提 二 和 供 了 有 利 的 条 件 。 方 法 是 在 交换 柱 内 , 装 大 离子 交换 树脂 ,把 降解 液 调节 至 适当 pH, 通过 层 析 柱 ,被 分 离 的 组 分 通过 离子 交换 作用 吸附 在 柱 上 ， 然 后 用 含有 竞 等 性 离子 的 洗 腊 剂 进行 洗 腊 。 洗 腊 液 搂 一 定 体积 连 秆 收集 ， 用 分 光 光 度 计 量 一 定 波长 下 每 一 小 份 收集 液 的 吸收 值 , 井 给 出 吸收 曲线 。 将 同一 峰 内 的 洗 胸 液 合并 干燥 , 即 得 到 不 同 的 分 离 产 物 。 洗 腹 液 的 浓度 可 以 成 阶段 的 二 加， 也 可 以 连 苇 不 断 的 增加 。 选 择 适 宜 的 洗 腊 剂 对 分 离 效 果 至 为 重要 。 洗 腊 剂 内 车 含有 某 种 盐 时 ,从 洗 腹 剂 中 回收 分 离 物 时 则 会 增加 困难 , 必 须 逻 过 胸 盐 步 屡 始 能 获得 纯 品 。 因 此 ， 一 般 多 采用 盐酸 或 甲酸 等 ’ / he aig See » in r 洗 腊 剂 如 碳酸 胺 、 碳 酸 氢化 .三 乙 胺 等 , 收 到 较 好 的 效果 。 UE, 分 述 于 后 : 的 工作 最 为 出 色 。 CL) Beli BAPE: 因为 核 碱 、 核 苷 分 子 内 均 含 有 未 同 的 及 其 核 背 则 不 能 。Cohnr1 用 氢 型 阳 郊 子 交换 树脂 (Dowex-50) 分 离 了 A,G,C,U 四 PE AK Ti Cohnr2a 同样 用 Dowex-1 BAS F-2CRt Ne A DIA Ta 9 BY, 主要 是 因为 G,U,T 以 及 相应 的 ' 核 彰 均 具有 可 解 离 成 阴离子 的 _NH__O_” 关 团 。 Andersonc] 等 用 Powex-2 CI 型 树脂 制备 股 氧 核 苷 ,他们 指出 这 类 核 音 在 _. Dowex-50 树脂 上 会 发 生 分 解 。Oohn rzg] tS RM, ZED 酸 盐 存 在 时 ， 可 使 吸着 较 弱 的 OC, A 核 背 在 阴离子 交换 树脂 上 吸 有 作用 增强 ,因此 不 难 分 离 。 最 近 Hayesteo 也 用 Dowex 树脂 BEST RNA 2h 5076 甲 酰胺 水 解 的 产物 ,得 到 了 核 昔 。 。，，(2) 单 核 痛 酸 的 分 离 : 梳 在 酸 具有 可 解 离 的 态 酸 基 故 可 志 现 出 与 核 碱 和 核 背 顺 不 相同 的 离子 交换 特 性。 最 早 Oohntzo a3 允 核酸 碱 水 解 液 以 Dowex-2 PAY Ss BR FAS ERT Ps He VENER 分 离 出 A,G,C,U 四 种 单 核 苷 酸 。 其 后 ,将 Dowex-1 例 脂 处 理 成 醋酸 型 或 甲酸 型 以 醋酸 钠 或 FF RSA AR YR VE IE , 将 C, U 单 核 苷 酸 弄 构 | PANS 用 相同 树脂 处 理 成 氢 型 ， 以 含有 氧化 销 的 醋酸 餐 冲 流 (PH 5.5) 分 离 了 原味 叭 核 背 酸 的 异 构 体 [1。 最 近 ，Oohnaa 用 Dowex-1 Cl” 型 X* 以 易 蒸发 的 碳酸 氢 贸 (分解 点 60*0) BEM RAST, SBR EY AR BE ie BRS, (eames = 16 + ; 可 解 离 的 基 团 ， 故 可 用 离子 交换 法 来 分 离 。 在 酸 洲 液 中 梳 碱 A, CoC DSS HO aN, J, a ae RB, (UT TOBA. HEH TEP, HEAR MBAR ee eee ts ADA RT 2e te HS, BURA Ce RS AE LR CMA RAR ZEST 得 ,常用 的 有 Dowex-1; Powex-2( 阴 离子 交换 树脂 ) 和 DoWex-50 2 《阳离子 交换 树脂 ) SE. RAED RM, DL Oohn a ee a Se ee ~~ . *. = 4 一 . ver ar | 和 ii ESSAY ies RUA a Ny Mt : hp | ‘ Ey aN pee Nye UW ot 1 痊 酸 存在 于 s_RNA 中 ， Cohn 报告 了 应 用 Dowex-1, HOOO- 型 Te 的 方法 。 > wex 1 me FEET Alo RNA. 0. 3 N NaOH 水 解 的 SS-NERODSseTER, ONSEN tee, UAE Re LASER GMP Beime. 后 两 种 核 音 酸 在 用 HLCL 水 解 时 划 没有 |， 获得 。OCantoni 等 OP 也 以 同样 的 分 离 方法 自 殉 肝 s-RNA 中 分 | 离 出 五 种 新 组 分 : 2- 郑 基 -4- 甲 氨基 喀 喧 核 背 酸 , 1- SE pire, FE EMO BE HF, 2-— 1 AE 6-H A AREER TB (8) 多 核 背 酸 的 分 离 : Singer”) 等 报告 将 聚合 体 A 酶 解 后 ， 用 Dowex-1Cl- 型 X 分 离 了 AMP——pApApApA PUR, th ， 栖 采 用 的 洗 胸 游 剂 为 0.005 N-0.01 N 互 C1 溶 液 ,内 含有 不 同 量 的 NaCl, 并 提出 分 离 后 洲 波 内 的 OL- 可 借 与 596 Same HR He aR ， 去， 过剩 的 腕 可 用 醚 抽 提 去 除 。 McCully 和 Cantonil™) 在 Do- 。 wex- 柱 上 也 研究 了 多 核 音 酸 以 硫酸 单 酯 栈 腹 去 末端 3-p 后 的 分 。 BSR, 他 们 将 s-RNA 用 RNase T, 降解 ， 以 水 和 0.3N 甲酸 | BrBevbt, BHT A, G 核 昔 和 以 G 为 末端 的 和 本 OpOpG,， ApG)。 i; 2. BR BAER F-ZC AE ROGER MB Fy | «PBL A Nh, a: (1) Heteola-Cellulose RHRFAAWE, =LESRHEDH © FEWETE PHATE AS", Sha EAE, Veder 42014) 全 BET TM SED EE. (2) Diethyl aminoethyl] Cellulose (DEA E-Cellulose) % 4 SCF IRB BLAS ro ene i C,H, Cl—CH,CH,OH H, NE 一 一 一 »N-0, H,OH O,H, NaOH O,H, a i 一 划一 ow tas i5 0O.H SOC]， di HER 2 5 四 个 峰 ( 图 1 )。 2.0 if > 1.5 : a s ANS a Y Ei) Ae Rt Ry | 0.5 al u i y 0 ——~_ + “ iy 0 200 400 600_ $ 站 洗 腕 液体 积 (毫升 ) 7 a: ay Bl 1 多 聚 腺 嗓 叭 极 苷 酸 径 牛 胰 术 糖 槐 酸 酶 水 解 后 产物 的 1m | Sas me? | ee 树脂 : Ecteola—give serie Cl- 型 (1,2x4 ,5 EER), ate VERA: MLM, Wey, | “Ey. fC! “on DEAT ”eers 等 [9 将 Poly A 以 牛 胰 RNase 降解 后 ， 在 Ecteola- 本 Cellulose 树 脂 上 吸附 ,用 LiCl VST GEE ASB Ap 一 一 ApApApAp BR ee, ha) lay, 4 - ; «GU BERR 3x, ae, ca 20 “ 和 ae : : 党 中 ， Lie, Set 3 : era ee ae \ 4 A. Staehelin 等 co9 提出 DEA B-Cellulose 容易 吸附 低 聚 核 昔 : 国 。 又, 并 可 在 PH 8.6 Beit ti (NHH,),00, 1 (NH)HCO, ge HRC 38.6) 为 游 剂 分 离 了 Poly A 降解 物 , 得 到 二 这 天 枝 普 融 ， 疗 县 (图 2 )。 大 以 同样 分 离 条 件 分 离 了 牛 胰 RNase 降解 RNA 5 1B MRA ORES, AC, AUK FEO, -_ 。 ghee -一 ww or pApApApApApA Bs? “a0Q 460 ”600 800 1;000 ee Bene AR EF) ss SRR SRA RE RK ar ; 了 的 分 离 图 蓄 5104 树脂 : DEAE- Sixes (HCOs ” 型) 230~325 ffl, 0.9 meq N/g， 0.9x30 厘米 。 PERF: NEH4HCO: (pH 8.6) 递 度 洗 腕 法 。 400 600 800 洗 脱 液体 积 (毫升 ) 图 3 “ 牛 胰 核 糖 核酸 酶 水 解 酵 生 RNA Jerks ea" 和 树脂 : _DEAE-gt esky fg (HCO; - 3)230~325 节 孔 ，0.9 meq N/g。 ee 涉 脱 剂 : NH,HCO, (pH 8.6) 3 HE yee. . why iy 一 一 在 260 my 测定 ; Fae xe 300 ar ee —21— | . Nie 人 人 i” Soa , 内 2 ya t J ¥ ’ Ty, 4 } ae GAC 则 早 于 AGO; GAU 旭 早 于 AGU(A 3), oe ese : $5 — AE a PS ML PL, A OR AA URE 早出 现 ,如 AC 先 于 AU,， GO 先 于 GU BEET. 第 三 ,在 含 G 的 聚合 体 中 ，G 离 未 端 喀 啶 意 远 者 僵 早 出 现 , 如 ， 在 pH 8.6 条 件 下 不 能 清楚 分 离 的 组 分 如 图 3 中 GU 与 AAOC 等 ,可 将 洗 腊 条 件 调 整 至 p 了 7.0 重新 分 离 。 Tener 等 54 分 别 用 DEAE-Cellulose #9 Ecteola—Cellulose 树脂 以 LiCl 为 洗 腊 剂 分 离 了 Poly T 五 聚 体 ( 图 4 )。 yar FEDS RAW SEE BAD ii, Khoranal**) 进行 了 尝试， i AS BIE —_= ZEB EE HVE, Ze DEAE- © Cellulose 树脂 上 成 功 的 将 Poly T MEM IF ES, KAP PROD EO AS). HED BNET RS 四 ws ai ee 4 a & .2 fa 区 — 0 0 400 600 3 BEAR I) re ae Y | 40.2 | ~ ’ res = 0.5 er a Laat 0.1 8 Pb E K DI TRI TETRA PENTA 0 120 360 0° SARI #1 图 4 ARLE RR Be 94 (上 ) 树脂 : DEAK- ine ahs Cl-% 16.5 x0.9 厘米 。 MERE: Su 1 PRS HE YEAR , VRE 1.2 BFt/Fo (下 ) 和 树脂: Ecteola—iatseatis C1- 型 8x 0.9 厘米 。 Wee Hl: 所 化 锂 洲 液 递 度 洗 腕 法 ,流速 0.7 毫升 /分 。 AS 4) ‘| Bh Zen page, SON 100 200 图 5 ”多 聚 胸腺 喀 啶 权 苷 酸 的 分 离 图 潮 c5: 10 300 ooo io mt (NEAR 收集 液 数 sume: DEAE- HERG COs 型 (4x 30 厘米 )。 vem: 三 乙 胶 重 碳酸 盐 (PH7.5) BEPRIE, TE 2~2.3 毫升 /分 ， 每 20 SIVA. 峰 2 产物 ， 峰 3 产物 ， 峰 4 产物 ， 峰 6 产物 ， ke 7 产物 ， 峰 9 产物 ， 峰 10 产物 ， 峰 12 产物 ， 4 13 产物 ， 峰 14 产物 ， 峰 16 产物 ， 峰 17 产物 ， 峰 18 产物 ， ie 19 产 物 ， 峰 20 产物 ， 峰 21 产物 ， 峰 22 产物 ， SPAR 3’ 5’ Sa RR RE er BES 5 — ihe) BR Re RE BB ? 主要 是 环 状 二 核 音 酸 ; 直 链 二 核 背 酸 ; 环 状 三 核 背 酸 ; R= ewe RAR GA BBS 直 链 四 核 苷 酸 ; PRAGMA Ds ge KEES 直 链 天 核 苷 酸 ; 直 链 七 核 背 酸 ; TEL ZAK EF BE (ee UAE BE 直 链 十 核 苷 酸 ; 直 链 十 一 核 背 酸 ; 直 链 十 二 核 苷 酸 。 核 昔 酸 环 状 者 较 直 链 者 先 洗 腊 下 来 。 在 相同 条 件 下 将 第 一 次 分 离 oe ill 6), BAB BAS, WH 52~ 95%. 最 近 ，8taehelin[los] 用 DEA E-Cellulose 进行 了 多 方面 的 研究 ， 以 碳酸 氢 饶 为 洗 腊 剂 分 离 了 一 、 二 、 三 磷酸 核 背 (图 7 ); 将 高 分 子 量 的 酵母 RNA AA 1 N KOH 在 28*0 水 解 24 小 时 ,水 解 UIA ES, TET RH RAC 8 )。 有 异 构 体 在 柱 层 析 分 离 不 清 的 部 分 ， 可 再 烃 过 纸 层 法 分 开 。 酵 母 RNA 的 RNase 解 产物 , 也 可 用 这 种 条 件 分 离 , 得 到 单 、 二 .三 核 昔 酸 的 不 sc lide a ¥ . » + < e 2 ~ * - a A eed oe | — . er oe > ~ mar ee - > 4 ‘ _ ob wa 总 一 二 2 At m 4 x Fz ies x Re) : ae 2 4 ~ * 7 ae a a . > gy : er . q ‘ ne fe “ i a ' * ‘ae a ‘ie Rg Le © ae ~ fv 一人 - , = a < ty 全 ES i = r -~ ~~ i oe ae ~~ 4 7 AS : Tey oe bey " Li = 4 apie. 6M Pr - ae Sima oa b oa els Sa ee 2 世 SS ee ee a — ae = aor 图 6 四 聚 胸腺 喀 啶 楼 苷 酸 的 再 分 离 cal ”树脂 : DEAE- 崔 维 未 树脂 COZ 型 (2x 20 厘米 )。 te sal: =Z RB RB RHE10~ 15 EIU —K, SREB ante 0.5 VR EH BRC Ft) 7 BRAD HD 树脂 : DEA B-iHe MHS (230~325 ABTL) «0 wees: NH,HCO, (0.01 M,0.05M, 0.1M, #10.15M 4 400 毫升 ) pH 8.6 SB REVERIE, WEE 4 毫升 /10 分 。 '-GMP , 路 2.0 > ‘UMP o-aMP | 3 ay sudan a AMP 3'-GMP |?" 3’°-CMP 3’-UMP eer As MePRR Hehe 上， RHR: DEAB-He RUNS (50x 1 BOK) > a ye: NH,HCO,(0.01 M, 0.025 M, 0.05 M, 0.075 M, 0.1 M #1 0.125 M 4% 400 29) pH 8.6 BERR. —#e 260 my 测定 ; 一 一 在 290 my 测定 。 6.0 Chiu ， : 4.0 : 号 Pale BRIT) _ 9 PARR RNA #4b BE RNase aoe eis OO ， 。 PRR: DEAE-gaHtse URW 50 x 1 MK 洗 腊 剂 : NH,HCO, (0.01 M, 0.24 M, 0.01 M, 0.2 M, 0.2M, 0.4M, 各 、 400 毫升 ) pH 8.6 流速 3.85 毫升 /分 。 一 25 一 - mm ee 人 ss ee . . (AO). BER HR RNase 降解 物 用 单 酯 tS BE JS AR itd 3'-p 后 , 仍 可 以 在 DEAE-Cellulose MIRTH’. Spencer 和 Chargaffcios 将 20 毫克 DNA 用 0.1 M H,80,1 毫升 在 100*C 水解 30 分 钟 , 水 解 液 导 至 中 性 , 通过 工 克 DEAD Cellulose 柱 ,以 含有 不 同 量 氧化 鲁 的 0.01 M 醋酸 刍 艾 神 液 (pH 5) 洗 腹 , 得 到 了 一 至 八 喀 啶 核 苷 酸 的 片段 (图 10)。 : 洗 觅 液体 积 (毫升 ) 10 DNA 酸 水 解 后 多 喀 喧 楼 苷 酸 的 分 离 树脂 : DAEA- 徐 礁 素 树脂 。 VERA: 氛 化 鱼 在 0.01 M BARRE 最 高 流 度 为 0.32 M (PH 5.0)。 此 外 ，Davey[] 最 近 在 TEAE-Cellulose 柱 上 用 酯 酸 锁 稻 whe (pH 4.68) FHM (pH 4.72) 洗 胸 分 离 了 了 5- 核 背 酸 及 HAW. (四 ) BFARETR POLAT BT AMBER ROK, AAR MS TH HEM. HR TERME Rt IS Leb a PEE fly Fy wey, Ls — sy TSE, Smaillis(**) 将 Am- berlite XE-119 #@7e4t_ EL, #FAbHERR HCOO- 4, fb A,G,C,U 四 种 单 核 苷 酸 清 楚 的 分 开 。 在 分 离 中 采用 了 两 种 推进 剂 ，3.8 N MATH U,G 分 开 ;但 不 能 将 0,A 分 离 ， CO,A 则 在 第 二 次 推进 时 用 0.5 M 栈 酸 铸 (PH 5.0) 分 开 。 (五 ) 测定 多 核 苷 酸 排列 的 工具 酶 及 其 特异 性 — 26 一 ~*~ Jha yy * Pit A ij | 和 一 “作用 极 慢 或 无 作用 ete G eS —— ae ' we as . 5 (3 i 牛 脾 双 酯 酶 : ? | eae @ ee 5’ AY EF BG : se? A , | TERE DS RAD ME PRES Ce Nit os Ce nS 2. 酶 解 产物 Fi 底 % 产 有 物 +f RNasec73 MEER RIRHIR 3'- 喀 叶 核 苷 酸 牛 脾 了 Nasers3 MEER =.’ me Pete 牛 脾 RNaselss,681 MEME TPR EIR 2/- 喀 喀 楼 昔 酸 OSPR IR © 2) Ie ete 鼠 肝 酸 性 RNase!1273 ERR 2 4M eRe SSSR 2's ete 蛇毒 磷酸 双 酯 酶 (1% so， 95) gy 45 re 5“- 喀 啶 要 苷 酸 5’ RS + PETRI IU as 543) BATE 3’ MBE SEER a ae 3's etre : 牛 肠 磷 酸 双 酯 酶 c43 ESR 3’ WME BEER a CREM 93s trRe a RERE 38'S RM 3'- 核 苷 酸 iE WR - 牛 精 5! erp mgt 5'- 核 苷 本 et wee 有 蛇毒 5"- 槐 苷 酸 酶 ce 5-H et REE | MA 5“- 柜 苷 酸 酶 21 Bete St t PRUE AGES? BEEP BAF DR 骨 磷 酸 单 酯 酶 cm pare Bet eRe a CA) 多 核 背 酸 的 末端 测定 ”Markham 和 Smith rz 提出 RNA 未 问 可 能 有 四 种 形式 和 它们 的 检 出 方法 ; Beriey. 末端 形式 RAH | ‘ 2’ 或 3B Fl RNase ME (92 48 312" ny SRS BF BD By 认为 是 末端 。 hi Be AAA RNase 活性 的 提 炖 前 列 腺 “ 、 单 酯 酶 处 理 , 后 以 碱 水 解 , 检 出 的 核 兰 即 为 未 喘 , 但 有 二 种 可 能 : 末 喘 可 能 是 2 或 3 楼 昔 酸 或 是 要 苷 。 为 证实 后 者 ,可 直接 用 了 碱 水 解 ， SRR BERR. 4E— 2 2 fF (55°C, 0.1 mews /ze5+ pH 7.63. We Fil RNase 水 解 得 到 味 哈 环 状 核 苷 酸 即 为 未 ， ui Wil et (uae ili ai aaa A a ia deed ce A N J ie A ; . A da Seg Ws a) wt ve 4 #} | + WAP we hye eee Wipe heen, Hy! ect ae ie . ee eee re ery LY po Jil fe : , \ 给 } 本 的 末了 可 雪 考 过 和 此 外 ， 由 于 -- 般 未 端 核 埋 酸 的 特征 不 是 一 个 磷酸 单 酷 和 一 个 自由 的 状 基 就 是 存在 着 两 “个 顺 位 的 自由 郑 基 ， 因 此 ， 告 可 用 化 学 方法 标记 末端 进行 测 1, SOR ZR Khorana™ FRAP RIG rk sD BREE PEA at & BRET COC, FARE BS HE, ZB LE AS By : 2. Awa Me A Khoranal*”) $8 yi — Fh ae dik Be AE, — Bh & te TF We HY BE BL fe DCC (dicyclohexyl carbodiimide) BHT THAT RIE, WEAR PI 产物 。 | i a? | | a i ot ae OH, pee) oh ae poo k SJ xn, ono ee > LR sa ore O | O—p—on pen O—p—OH ed oA \on 1 OH OCH, RERUN SRE TERRGE, FI) RNase 和 双 栈 酶 联合 降解 鉴别 未 端 。 车 以 CH,OH—O* 为 甲 基 化 剂 ,对 未 端的 鉴别 更 为 容易 。 8, RRA A Bem O's, Oy BRIA fir RIE 35 A i WBORARS, ANWR RG RIAL, LAR 稳定 ， 在 pH 10.5 MNT, BS rea Cy, OC, “UAE 基 呈 游离 状态 时 ， 可 用 此 法 鉴别 末端 ， 末 端 碱 基 可 用 颖 层 析 法 检 HS 9), 车 末端 存在 2 或 SRR ART, ZC ARISE Jesh BL : 一 29 一 fe ee ee ” 般 不 能 完全 。Yu EOE Rk Py EMS LEME TEE YRS OIL ALL JETER BEY FH, PEEP BR SES SRSRRA RR TEeM. Knee 2 Y==N-C.H H,NC,H,, ae a a er io if HO p—O-RNA itt H OH 1 5 A HOUPLOOCRNA 4+ Oe cae + PRE As ie N\cEn.0,Hi; 6 Poe ie "aes _ HH OHOH 作者 将 此 方法 用 到 酵母 S-RNA AOA SREP LE, REBT 次 降解 得 到 的 测定 车 果 与 用 碱 水 解 得 到 的 符合 。 但 这 种 方法 对 假 PR ne We AL EF BU ABE FA??? , Dulbecco 等 cs] $2 Ht HAA ARSE x aco BU see A RE 19 FH HE, Ai RUMBA aM — a ese oR -8” 作 用 , 根据 测 FEE A He PEA PRE, HAPS 4 Il J BB, RSET —PRERLR WME EE, PH kk OB OS® 标记 物 的 方法 ,可 适用 于 二 核 苷 酸 。 最 近 ，Young 等 6] 提出 pA, pApApA, pUpUpU 或 d- pOpCpO 在 二 异 两 基 碳 化 二 亚 氨 存在 下 于 PH 8 介质 中 葵 腕 可 与 RYin 5'—p 作用 ， 得 到 807% 的 产 率 。 这 种 反应 在 与 s-RNA 作用 时 也 得 到 相同 和 结果 《Ce 了 IN 也 一 pPGP……… )。 群 细 反 应 条 件 傈 无 报 告 。 胡 等 发 现 1- 所 -2,4- 二 确 基 葵 在 4% 碳酸 氧 钠 溶液 中 与 大 肠 杆 菌 S-RNA fe JA, DNP-H SG A7E s-RNA 的 末端 5 -磷酸 ”上 。 借 此 可 以 研究 s-RNA 的 非 接 受气 基 酸 一 映 核 苷 酸 的 排列 。 (bt) 单 、 二 、 三 核 苷 酸 民 构 体 的 鉴定 ， 核 苷 酸 腊 构 体 的 鉴定 Bop eee "Hi 了 vy aie 本 TY 人 | Maer ee . 对 研究 核 疹 酸 排列 顺序 平 为 重要 FRB OH, 1; 鉴别 末端 RS BH YB (1) 末端 无 3' 磷酸 单 酯 者 : q a. OEE AAT FRACS | 6 eae AS A 无 作用 <4 | ay EMER P | Sy Bi cei! 5! EEDA ASU Ne D-H b. FY DBR MF, SRE en DURE, 3 wn 小 ee | ates Ul Peep % ’ A aH OO » xX, He Te —— GF + 2! BR 3! A + 2" 5’ we 3", 5’ ‘ie (3) 2). 4) Cs. as (3) c. 可 以 和 NalO, 作用 成 双 醛 化 合 物 : (2) 末端 有 3' 磷酸 单 酯 者 : a. A A A » a “FATE REIL is 3 AY b. 碱 水 解 得 到 2 或 3' BHT EAE. c、 和 过 碘 酸 钠 不 起 作用 。 2. 二 巷 昔 酸 异 构 体 的 鉴定 ”样品 车 为 ApOp 则 可 通过 下 烈 — 32 一 Na EERE RE NER ere > : Jee ARAB 3 dai | ag x v3 We - Ts 人 了 人 yeh wa " ht my) Ata aad Se rth ts hi 了 | A UPON. ey ‘td seid i an 有 hats ah | en J 4 r t So vee Anes Wiig RR Fe ART HUN LER HG 3 -磷酸 。 4 (2) 酶 处 理 物 用 过 量 的 NaIO, 氧化 。 8) 氧化 后 反应 液 加 入 环 已 腕 , 层 析 分 离 ,根据 层 析 计 鉴 别 出 ， 为 ApCp (图 11)。 溶 齐 为 异 两 醇 - 水 (70:30v/v) BINH, AR Bitte ‘a 证 az ave os = 一 一 PR “ Ee hs det oe ae ‘+. eS a Se an Ser SD 人 = 了 ee a, 11 “BHR DAHESE 1= 样 品 APCP(A) 2= 样 品 径 苹 狂 单 酯 酶 处 理 后 ( 卫 ); ”3= 切 去 3- 磷酸 的 化 合 物 与 NaIO: 作用 产物 (C)， ¥ eg Mig Sith) NalO,; 4=NBLEWDSHORRMEB: (E) ARR Se -3’- BE, (CF) 为 胞 路 啶 碱 ; 5 = Frye ROR Be —3’ PS RR(G) 5 6 = trie Em (1). 氧化 后 产物 也 可 以 不 加 大 环 已 胺 而 在 PH 10.5 稻 冲 液 中 保 Ya, res wt), | 3. 三 核 昔 酸 异 构 休 的 鉴定 ”样品 车 为 GpApU，ApGpU 可 HLF PUSS ES BI: PE PRES RE WS EE A, DUR HERE ， 核 音 酸 作对 照 进 行 层 析 分 离 鉴别 。 层 析 推 进 剂 为 正 丙 醇 一 N 互 :一 水 (60:30:10)( 图 12)。 1s —, ee , > = — ss I see FRE it LS GAL HB Js iv eT PT SRA PR: ‘ 大 好 严 , , ¢ 天 , ‘ 天 天 太 . 严 7 ¢ , ¢ 六 FF 7 7 7 7 了 ‘ 7 天 7 大 , . . ‘ ca *¢ 7 s Fr s ca a Ha BT RIE AD BT PE (1) (2) BUY 2 EP, Fe BD ETE TEAS AEE DUE SRA a, RR RO A 3 -磷酸 BY, FU SG FABRE Ds 3’, Ft bk HAE Hl. 12 GpApU 与 ApGpU 和 经 蛇毒 磷酸 双 酯 酶 处 SME hion am 工 = 样品 GpApU(A); ake | 2=5’-UMP(B), B’-AMP(C), G #4#(D)3 : 3= 样 品 ApGpU(E); ae 4=5'-GMP (F), 5’-UMP(G), A 核 音 (H). sk, Rushizky 等 [al s¢gniy grat THER: RNA #¢ RNase T, MRR AIA, SRR RRA YA. A, ABERHKAAR “根据 一 种 化 合 物 的 光 谢 性 质 特点 ， 鉴别 化 合 物 的 和 车 构 是 广泛 应 用 的 一 种 方法 。8taehelinti5 全 在 0.1M NH,HOO, (pH 8.6) 和 0.1N HOl (pH 1) 沙 液 中 进 49 ApCp, ApUp, GpCp, GpUp 二 核 苷 酸 异 构 体 紫外 吸收 光 er， 它们 之 间 具 有 显著 差异 ， 借 此 可 以 鉴别 二 核 dup ice a 的 结构 (图 13). ApUp 260 300 260 300 22 OK 图 13 二 核 苷 酸 的 紫外 和 线 吸收 光谱 19%? —— 0.1M NH,HCO, pH 8.6; —~-~- 0.1N HCl (pH 1.0). TU. t7 OR Fe ESE FA HEI TB, AAT RNS) BS DB AR Mies FASE OR BE A FE SEE AS TEKS RR, AE IE I SPRUE, TERRE — Be 2) PAE DE UM FF A AB 距离 。 目 前 仍 处 在 找寻 适宜 方法 的 阶段 。 因 为 核酸 的 粗 成 比较 简 单 ,各 核 苷 酸 均 通 过 同样 的 磷酸 双 酯 键 相 连 ， 彼 此 间 差 异 极 小 , 如 ” 仿 河 缺少 能 破坏 一 定 类 型 键 的 专 一 性 强 的 酶 制剂 。 因 此 ， 需 要 付 出 更 大 的 力量 来 克服 这 些 困难 。 研究 多 核 苷 酸 的 分 离 和 排 烈 顺序 ， 均 需要 适宜 大 小 的 多 核 萌 酸 片 段 为 材料 。 从 降解 丰 手 分 离 出 十 个 核 昔 酸 以 上 的 片断 脊 难 做 到 , 究 其 原因 ,可 能 在 选择 降解 方法 和 条 件 时 存在 问题 ; 或 由 于 核 so oy Sey AT Nie ’ , ¥ oes { : a } . GA Le A RTA ET AR ATES RI Ae SEE A EE De Ha A 9 在 每 区 降解 未 端 时 ， 如 何 保持 原 RNA 链 不 断 要 则 是 一 个 关键 间 ， 题 。 在 降解 条 件 以 及 RNA 的 收回 等 步 又 上 也 均 需 要 进一步 研究 。 多 核 苷 酸 异 构 体 的 光 性 性质, 目前 研究 的 傈 少 ,通过 光 讲 表现 | 的 特异 性 来 鉴别 多 核 昔 酸 的 排列 ,是 最 简便 的 鉴别 方法 ,这 种 方法 将 具有 一 定 的 发 展 前 途 。 此 外 ,研究 核酸 的 一 毅 粘 构 ， 对 样品 的 纯度 要 有 一 定 要 求 , 目 前 制备 分 子 均一 的 核酸 舟 存 在 相当 困难 ， 故 在 核酸 的 提取 与 纯化 等 方面 均 需 要 进一步 改进 。 [i] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] if [10] [11] [12] (18) [14] [15] [16] [17] [18] 24 Xm SSR » WS Be BORLA, A te SE 5 A: Un EB AEAB, 2: 84, 1962, WR, MIE, SE WAIL, ibid., 2: 173, 1962, PAA Be > KURA, AZ, ibid., 3: 74, 1963, BAS Bk» KUM» Se», EFM, ibid., 4:24, 1964, 2G OH FEE SE ARAL REIB, 1: 232, 1958, Bacuzeuko, O. K., Kamaoxoza, OC. T. a Knoppe, J. T., Buoxumua, 27: 142, 1962. | 3 Andersen, A. W., Dakker, C. A. and Todd, A. R., J. Chem. Soe., 2721, 1952. | | { Beers, R. F., J. Biol. Chem., 235: 2393, 1960. Bendich, A., Methods in Enzymology, Edited by Colowick, S. P. and Kaplan, N. 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PK PE KB hig (—) 牛 胰 核糖 核酸 酶 (简写 为 牛 胰 RNase) 1940 年 Kuni- bat?) 自 牛 胰 首 先 用 硫酸 贸 分 段 沉淀 法 提出 RNase My hh, Best 化 学 观点 ,此 酶 萤 无 间 题 是 单一 纯 品 。1953 年 Hirs 47°) 用 离子 交换 剂 Amberlite IRC-50 x E-64 将 RNase 和 结晶 分 成 A,B 两 个 部 分 ，A 占 绝 大 部 分 ,如 图 1 。 此 后 人 们 利用 各 种 离子 交换 剂 、 电泳 等 新 技术 分 离 提纯 RNase, 1959 年 有 人 利用 OMe 64 on Dl 酶 活性 (Kunitz 单位 ) 60 100 140 人 Be BE He RR hg | 图 1 RNase 在 IRC-50 # hye eee ae me 来 分 离 千 晶 RNase， 得 出 4 个 有 活性 部 分 。 AIAN i banat RNaser ”分离 后 , FF5 POD, (A585 1 部 分 无 活性 。 | 他 们 的 工作 只 限于 将 RNase 分 成 4 个 或 5 个 部 分 ， 表 示 RNase 蛋 自 的 非 均 一 性 , 卉 未 深入 到 RNase te SA t PE WEA PE. 4 q ; 1957 年 Hakim"*)¢% Hirs 等 法 先 用 IRO-50 将 gu 不同 in 。 源 的 商品 RNase SASH ALB 两 部 分 ， 从 中 分 析 A，B 各 部 K1 4 种 了 RNase 中 AJB aE aaa Wan ge x eae ee ee 克 分 子 /100 克 分 子 阿 摩 厂 出 品 原 酶 1.2 16.7 eR 180 Bat A oe 1.0 16.7) / 1866 Beets: B 一 1.8 |) i BR AS EL HD 一 0.9 16.0.) eo. | A 一 0.8 16.8 48.2.9 er Bo 一 9.8 one oo) iar ae GIL 1B Bh DR 人 1.0 16.99) 2 41866) : A 一 0.7、 eae 18.1 i B pe 10.8 9.2 0.8) 49 Hee ae HG Hh Da 一 1.0 17.1 18.2504 Nap | 一 0.9 17.5 1882.8 B 一 13.3 13.0.) a 4 PERM D Oe ly gi ep hye, yd he) AT SRE ae Sah RS, Wher’) r i YA a Bilis vA Vath ay aN aay ‘if i " ih ay pd las ih hed ‘a Hames beg el a qi TY i: i Pe Ny AES AY a ar bie Het) ’ » ; ) ‘aby : 7 \ it se &§ eRe Reeth BE, 比较 后 得 到 一 个 初步 结论 ,他 认 为 RNase A 的 降解 产物 中 以 胞 核 背 酸 、 尿 核 背 酸 最 多 ,篇 核 苷 酸 极 少 ,而 RNase B 的 降解 产物 中 以 岛 核 背 酸 比 RNase A 的 多 10 倍 , 如 表 1。 Ah 了 这 条 和 线索 后 ，Hakim Akg 用 磁 狂 电泳 法 将 RNase A 及 : 双 分 为 RNase A,，A,，B,，B，。 4 个 活性 部 分 bstsl。 在 不 同 来 “Wits RNase 中 它们 所 占 的 比例 不 同 。 从 所 降解 的 核酸 产物 来 看 ， “ABBA MMH: RNase A, 及 A, 释放 喀 喧 单 核 音 酸 多 些 ,对 AEE PRR TARR OEAT IEHHe, RNase By 及 B, 释放 嘎 哈 核 首 酸 多 些 ,对 顺 吟 环 状 磷 酯 键 有 高 活性 ,如 表 2 。 #2 RNase A, A,B, B, 降解 核 酸 时 释放 单 Ay HE EY 3 ON | Re 060 OER RRC ERE inte (充分 子 /100 达 分子 ) a | 17.4 17.3 0.8 0.8 A,’ tT i) ee ey 0.4 B, 13.5 14.8 6.5 1.5 B, ‘ 13.4 12:3 6.8 8.2 ___ Staehelin'**1)j RNase 降解 酵母 核糖 核 酸 后 ,用 DEAE 蕉 素 树脂 分 离 产 物 ， 得 到 以 喀 啶 单 核 音 酸 及 以 喀 啶 为 未 端的 片段 等 ,如 表 3 。 %3 RNase 降解 酵母 枝 酸 后 产物 的 分 布 8] ME —-exiem | = Rw + B 其 ”他 Cp ApCp ApApCp ApGpCp ApApApCp Up ApUp ApApUp ApGpUp GpCp GpApCp GpGpCp GpUp GpApUp GpGpUp 从 表 3 看 来 ， 对 于 初步 观察 核酸 分 子 中 核 昔 酸 顺序 情况 已 具 备 有 利 的 条 件 。 作 者 已 用 这 个 方法 在 TMV-RNA 的 降解 方面 。 所 ， 得 千 果 留 在 关于 酶 解 TMV-RNA 的 进展 部 分 再 训 。 本 e Rn < = = . x, ee aS See ee, en ar Sp a ee ee 关于 RNase A kB 的 特异 性 还 有 一 些 报导 , mS 酸 中 喀 喧 粗 分 含量 减少 , 酶 解 速度 就 变 小 [42]。 ay PENSE “FG RN- a8e 对 于 无 喀 啶 核 粳 核 酸 却 仍 照 样 降 解 。 作 者 推测 RNase 中 除 q — ARB, aA AIEEE MO IUISAS, PE yrath RNase 可 降 解 ,无 旷 啶 酸 , 而 A 或 B 及 A + BKM RE. (=) 核糖 核酸 酶 T, 及 T。 核 狂 核酸 酶 的 来 源 不 限于 牛 胰 ， 关于 曲霉 菌 制剂 中 所 和 纯化 的 核糖 核酸 酶 (通常 称 为 RNaseT， 及 T,), 已 进行 了 较 深 入 的 研究 。 Sato 与 Egamic* 自 曲霉 苗 制 剂 中 提取 核糖 核酸 酶 后 ， 双 从 其 中 分 离 出 耐 热 的 部 分 。 一 是 Ty 为 主要 成 分 ,一 是 ARs, 每 100 克制 剂 只 能 提出 工 毫克 人,。 丙种 酶 的 适宜 pH: T, 在 pH 7.5, T, 在 pH 4.5, 各 有 显著 不 同 的 特异 性 .如 下 降解 核糖 核酸 后 ,产物 为 高 音 -3'- 磅 酸 (G-3'-p) 或 以 高 核 萌 酸 为 未 端的 片 妥 。 eB BESET RAE He DLT STE WL EAS WE ERR DR BEB, HE 形成 单 核 音 酸 或 片段 (如 图 2)。 尤 其 合 人 感 兴趣 的 是 :对 牛 胰 RN- ase 所 不 能 降解 的 核糖 核酸 “ 心 >(RN 4 core ”) 部 分 奏效 。 这 个 部 DERBI, RNase T, 的 其 他 性 质 与 牛 胰 RNase #3 近 , 也 能 被 乙 二 膀 四 栈 酸 (EDTA ) 活 化 ,被 位 、 钙 等 离子 所 拖 利 。 RNase Ty 能 水 解 核 糙 核 酸 中 的 饲 苷 酸 与 其 他 核 普 酸 间 的 磷 酸 双 酯 键 成 G-3-p， 也 能 将 H-2’, Vp BX, 3p gemey H-3'-p, X-3!—p*, (ARAB IK AE A-2', 3p, FY AE Ay FEMA Ep 上 第 6 位 置 上 是 羟基 或 酮 基 时 ，T， 才能 作用 如 下 : OH OH ey \ —NH, Ae EL? > 2 H,N% ‘N’*N’ HO” ‘N**N H H EUR 7 Ba OR My * XARA , HCH HES, aN; Sleek a Gt Eg H H RNR Pees cu 能 降解 腹 人 所 的 RNA 可 以 证 明 上 述 这 一 特异 性 c9 如 图 2: am al ts _U x aA U ou 一 ee P Pah PSS P P P : as en RE? a : U At eel mal U ue i a a” aan: P P P as 4 Se ea "eae P P nS | H H— P 了 P es Bs x 和 “p P P ‘2 RNase T, HIRI RNA 降解 方式 RNase T, 及 Ty, SFGME ME AL BEAR HY HE La , Th PATE PL TEM i RL ERE AIA, iT. PERI RES 快 cs]。T， 降解 核糖 核酸 后 的 产物 以 腺 苷 酸 为 未 端的 片段 最 多 ,但 没有 腺 味 吟 单 核 昔 酸 。 所 以 推测 纯化 的 Ts 是 专门 切断 核糖 核酸 内 部 腺 昔 酸 和 其 他 核 苷 酸 问 的 磷 酯 键 c29。 虽 然 如 此 , T。 对 腺 苷 酸 的 特异 作用 ;还 需 再 进一步 在 无 顺 吟 酸 上 诈 明 。 从 最 近 的 查 料 看 来 ， — 45 一 ”RNase T, 及 T。 对 于 研究 核糖 核酸 的 化 学 辣 构 是 很 有 用 的 。 例 | 如 RNase T, MF SHETET REO RR Se Rest, WIE ROB TRAE. AARNE 呈 s-RNA"*}, fi s-RNA fyilJoP OLE EA RI eS RNase T, 能 将 全 部 饲 苷 酸 的 磷 酯 键 切断 ,但 对 甲 基 衔 生物 的 磷 酷 ， 键 不 能 切断 。 同 时 这 也 证 明 T, 确 只 能 降解 6- 羟 基 或 酮 基 叶 啥 的 PTR, 而 第 1, 2 位 置 上 还 不 能 有 其 他 基 团 取代 , 如 6-OH-2 = © 甲 基 氨 基 嘲 啥 及 1- 甲 基 岛 便 呀 吟 等 都 不 能 被 Ti, 所 降解 。 Jl RNase Ti 降解 s-RNA 后 初步 千 果 可 得 出 下 面 的 规律 :， 3’ ,5'-[p(Xp).Gp(Gp)a(Yp)s]—> 3’,5’-[p( Xp), Gp] +nG-3’—p +3',5'-(Yp), 只 有 在 2 TDLEAU BERRA TE ent, abe TL TR 音 酸 ,否则 少 于 2 PY, ABI RR DL PR a BE 最 近 RNase T, 被 利用 测定 酵母 中 s-RNA 的 未 端 5 个 核 音 酸 的 顺序 css]。 先 使 较 纯 的 s-RNA 和 Cite HA, RAB RNase T, MEfR, A TERET EE (Sephadex G-50) 及 也 BEAEE |Sp| ApCpCpA 。 从 而 不 仅 解决 了 第 4 PUP RAE A p 9 疑 团 ,更 确定 第 5 未 端 为 Gp。 利 用 过 碘 酸 测定 未 端 核 昔 酸 时 ,对 于 s-RNA 的 第 三 未 端 从 很 难 确定 9。RNase T, 在 解决 s-RNA 的 车 构 方面 具备 了 优越 性 。 RNase T, 及 牛 胰 RNase 斌 有 不 同 特点 ,有 人 就 想到 将 这 二 种 酶 降解 一 种 核酸 。Reddirs 用 两 者 各 降解 同一 TMV-RNA 后 ， 产物 如 下 : RN RNA———5Gp + ApGp +--+ RN 1 RNA————>Cp + Up+ApCp + «+++ + | Gp 是 根据 RNase T, 的 规律 性 而 作 的 推 花 。 一 特 一 a J ~) 2 278 fal . aa Vv 本 we eM ae * nm (rb) Oi cai an pei bays ‘es Hy, Pandy lad ae yk eo pay 4 had A elaut as ee i 4 5 i 条 } Pah } ) es 14? Ga Wey 了 $i *' : yee! ‘ Ph 4 ey a re | eS 5 mR S ALAIN, LO OER th 一 物 如 图 3: Bi. . |. Ry RNase 1 } ( 牛 胰 ) adulacacdaui@ uulc AACG AdadaA + 4 RNase T, aicu Acicic AuGiv UCGIAACGIAGICA . UIAGIGIC RNase 1 ki RNase T, Gye sina 中 6 4 AG oA 图 3 RNase T,% RNase 1 XH RNA HAR” By ETRRSRES BUREN S FUG. FT DUB T RRR “JE. Bl AGGO 中 是 GAGC 还 是 GGAC, Ji RNase T, 就 可 以 知 道 是 AGGC, BRIE AM Ke AER RAR, Ahn ase Tiff Fl, 1 G|CUAG|------ 424 AB} Ly G|C| U| AG]. ii i, MRP AGGC|GO|U| AU | tak GC|U|AGGC|AU], RNase 1 切断 方式 仍 相同 ， 但 RNase T, 切断 方式 已 不 同 ， 产 物 就 变 成 AG1GCGICUA U.…… ,不 是 原来 的 QICUAGIGICATU Ghee TS, AI Tee TRON ARH, (=) 其 他 来 源 的 核酸 酶 ”自从 Cuningham!*) 4545 ek 培养 液 中 发 现 核酸 酶 以 来 ， 在 提纯 方面 及 从 不 同 菌株 中 寻找 核酸 酶 有 一 些 工 作 。 Reddit) 发 现金 黄色 化 腑 小 球菌 变种 的 核酸 酶 降解 TMV- RNA 时 ， 产 物 的 规律 为 : (1) 大 部 分 是 呀 啥 或 喀 啶 -3'- 核 苷 酸 ， (2) 其 余 是 二 核 昔 酸 ,(3) 对 叹 哈 或 喀 啶 环 状 磷 酯 不 起 作用 。 Hilmore 等 自 一 种 固氮 菌 中 分 离 出 一 种 核酸 酶 ?4 ,对 核糖 核酸 及 腊 氧 核糖 核酸 都 可 降解 。 狼 过 硫酸 钱 两 次 沉淀 及 柱 层 析 等 步 又 后 可 提高 活性 30 余 倍 ， 比 活性 达 1000 单位 ， 降 解 腺 苷 酸 高 聚 物 (Poly A) 时 产物 中 没有 单 核 背 酸 或 核 昔 存在 。 说 明 此 酶 具有 切断 内 部 磷 酯 键 的 特点 。 产 物 以 二 ,三 核 背 酸 片 假 最 多 。 由 屿 毒 双 酯 酶 降解 其 产物 ,全 部 为 也- 单 核 背 酸 , 不 含有 核 苷 及 核 苷 二 磷酸 。 wo Of = 着 明 这 些 片段 都 是 以 5'- 磷 酯 为 未 端 的 。 从 制备 或 生产 忆 - 单 核 背 酸 的 角度 来 看 ,此 酶 是 有 烃 济 价值 的 .更 有 兴趣 的 是 此 酶 对 尿 音 酸 ， BRO MRE WMT A Roe Ne SRR RIG (EFA. TRE Se PRY, WF 4 。 #4 Bi AR te oy Ra ak BB UM = op KM He ie he EH 经 NaOH Aste ( Hi 4 fir ) (au M) Bx 0.43 0.052 TR 4.3 0.040 胞 12.9 0.006 B 12.9 ”很 难 发 更 从 上 面 烙 果 看 来 ， 此 酶 对 腺 苷 酸 的 磷 酯 键 有 特异 性 。 可 惜 没 “ 有 用 核糖 核酸 的 降解 产物 来 证 明 。 如 果 此 酶 趴 具有 对 腺 嗓 喻 作用 的 特点 ,又 是 专门 从 内 部 切断 磷 酯 键 , 那 未 对 于 核糖 核酸 烙 构 问题 “ 双 会 大 大 推进 一 步 。 从 并 老 素 链 霉 菌 的 菌 冰 体 中 也 全 提纯 卫 Nase5 约 ,其 性 质 与 曲 AP RNase T, 相近 ,专门 切断 高 苷 酸 的 中 - 磷 酯 键 。 对 核糖 核酸 “ 心 ? 也 能 作用 ,不 过 放 不 能 完全 降解 ,不 能 切断 的 部 分 仍 是 以 BEA HAMM SRE. MMT PEARSE, pH 5.6 By 80°C 5 分 钟 不 失 活 性 , 100°C 10 4 SP-RATH PEL 10%, Ht 从 微生物 中 寻找 新 的 特异 酶 是 很 有 发 展 的 , 1959 年 久 前 的 文 | APB RNase T， 外 ， 人 肖 看 不 出 微生物 的 核酸 酶 重要 性 。 1960 年 以 来 这 方面 发 展 很 快 。 从 微生物 中 寻找 新 的 工具 酶 的 潜力 很 大 ,方法 及 来 源 都 比 从 动 植物 组 答 中 提取 要 简易 得 多 。 还 有 人 自 大 肠 杆菌 核 胸 微 粒 中 提出 核酸 酶 7] 对 6- BIER 酸 ( 腺 味 哈 及 胞 喀 啶 的 核 昔 酸 ) 降 解 速度 机 比 对 CREE CB 便 味 啥 及 尿 喀 啶 的 核 苷 酸 ) 快 5 倍 ,因此 在 降解 初期 , 腺 嘎 哈 、 胞 喀 啶 多 于 篇 便 嘎 哈 和 尿 喀 啶 。 菠 荣 中 也 全 被 提出 核酸 酶 5] 专门 降解 单 核 音 酸 的 环 状 磷 meet. 天上 这 些 酶 都 是 属 大 性 核酸 酶 ,从 和 肝 中 找 出 一 种 核酸 酶 4， ii st pH 在 5.7 至 7.8。 可 将 A-2’ 区 打开 ， 成 为 A-2-p， 物 中 没有 A-3'-Pp。 另外 有 人 报告 提取 栈 的 方法 不 同 ,分 离 出 的 酥 部 分 也 不 同 ol 例如 用 0.25 N H,SO, 提取 和 牛 胰 中 RNase 时 ,在 IRC-50 层 析 图 谱 上 表现 出 两 个 峰 ,如 用 磷酸 权 冲 液 或 芒 糖 液 等 提取 ,可 分 出 3 个 峰 来 。 不 论 牛 胰 、 鼠 胰 都 得 同样 烙 果 。 不 过 直到 现在 还 未 看 到 进 一 步 报告 第 3 个 部 分 的 酶 在 作用 方式 上 与 其 他 两 者 有 何不 同 。 。”“( 四 ) 核糖 核酸 酶 对 烟草 花 叶 病 毒 核糖 核酸 降解 Reddi 用 RNase 1%} TMV-RNA 降解 时 5 没有 发 现 产物 中 有 GpCp, 而 ApGpCp @ Bim. Rushizky 4:7] 7 RNase ld 降解 三 种 不 同 株 MYV-RNA 后 ， 找 出 酸 洲 部 分 与 酸 不 溶 部 分 中 核 苷 酸 含 量 的 百分率 是 相近 的 ， 三 个 菌株 的 差异 表现 在 核 苷 酸 顺序 上 ,如 表 5 。 #5 RNasel 降解 三 种 不 同 株 TMV-RNA Je By ao ‘ TMV M HR Ge |. (微克 /毫克 RNA) Up 125 125 123 Cp 81 80 78 GU | 56 55 62 AU 53 51 47 AAU | 27 26 17 AGU 21 21 15 GGU 14 13 20 AAC 12 12 17 (A,G)U 17 18 23 (AG,)U 12 12 7.2 (AG, )C 14 15 10 4 * LRAT AME HMI] | Staehelintss] 也 用 RNase 1 降解 TMV-RNA free Ig Reddi 的 稍 有 不 同 ， 与 Rushizky 等 的 结果 相同 ， 即 Reddi 未 发 lef AR 如 AN a + Ue tay { * 2 AAA 全 站 50h, rar Wes a reas? we : re yo ae A, sity GpCp 作者 已 找到 ，ApGpOF SKK Reddi Hew 样 高 如 表 6 ° 7 #6 RNasel &#@TMV BR TYMV* ete E Ph hae ROM TMV TYMV ae 核 Ff 本 ( 占 总 核 背 酸 百 分 数 ) Bi oy ep | 8.05 22.8 be Up 12.8 13.2 ¥ ApCp 4.6 10.2 ae GpCp 4.1 8.0 .* © se yt. $ 8 。 °. 二 全 6 oi A jy GpApCp 1.72 2.7 . 4 ApGpCp Peek Ph 2.7 村 + HENS. a 注 : 此 才 只 采用 Taare ; P 此 外 降解 条 件 不 同 , 影 响 了 产物 的 分 布 。 如 在 DHL 7.0 BERR 。。。 冲 液 中 18 小 时 与 在 PH 8.6 三 甲 基 人 氨基 甲 柑 模 冲 液 中 75 分钟 产 | ey ~ teh dali ia is ai anak : By KT 不 同 条 件 下 对 酶 解 产物 分 布 的 影响 [9 a | a ae 实验 3 (5 ERIE) Cp 和 你， 8.3 8.5 Up ry 17.2 12.8 12.6 Ap ; cp ee a sce 1, pH. 7.0, 0.1 M 磷酸 艘 冲 液 , 18 小 时 ， 37°. Reta ‘ tS SR 2, pH8.6, 0.1 Cay ley 75 分 钟 ， 37° ae | SiR, PH7.7, th RH. | seh EE SER ER FT SRL Bet ee iu | =. = ne we mw a va ) 蛇毒 磷酸 双 酯 酶 ”蛇毒 双 酯 酶 的 纯化 问题 主要 是 如 合 站 与 5 梳 背 酸 酶 的 分 离 。 自 从 Cohn 和 Volkin 发 现 此 酶 有 将 RNA x 6} 3 磷酸 酯 没有 作用 以 求 ， 还 是 有 人 认为 它 能 降解 核 背 -2 ,3'- 环 状 磷 酯 ,很 慢 地 变 成 核 苷 -3'- 磷 酸 。 g WARE, 如 腺 昔 酸 的 或 胸腺 吵 喧 多核 昔 酸 作用 后 ,都 得 核 背 -5'- 磷 酸 或 腊 氧 核 苷 -5'- 磷 酸 C9。 守 核 苷 酸 无 未 端 5 -磷酸 者 | 也 能 被 此 酶 降解 ce , 但 速度 较 慢 。 最 近 Razzell 等 证 明 , 蛇 毒 双 酯 酶 水 解 TpITpT 的 速度 只 有 pT pTpT 的 1/202 一般 认为 含 3- 磷酸 为 未 端的 多 核 彰 酸 不 能 为 蛇毒 双 酯 酶 所 降解 四 ,但 这 种 抗 性 不 是 存 对 的 ,如 果 将 双 酯 酶 浓度 提高 1000 48 降解 依然 能 进行 c。 Razzell 等 527] 发 现 蛇 毒 双 酯 酶 有 如 降解 气 基 酸 间 肽 链 的 次 肽 AE FA, PI D1 NS 得 5- 单 核 苷 酸 ， MLA TU OUR ‘oes tal ma ter) D, ; Rana, oR, 2 3 Fone; |) P PY? Pent © ay 7 Sa A Ts), Bef T, + —OH . PN) yy /人 \_owtou !_p aT WBE ILRI HS He ARS I~ I — i St, 用 pT pT pC 来 证 实 。 如 果 最 初 产物 是 T-5'—p 则 表示 酶 无 专 一 性 ， 如 果 在 产物 中 首先 有 Q-5-p， 则 表示 酶 有 专 一 性 ,结果 如 这 HO~ 一 > HO 一 十 —OH 4. --CH,OH —CH,OH 一 Fit KR 切断 的 位 置 | 一 OH + A —CH,0OH ek 5'- ALERT, HED ABRAMS 5’ WERE, O Peis HO— p AN OH R, (0.22) 2 二 0.08uM O 5 + 0.06uM O 15 —-.0.044.M 党 O ’ Std prpT pC pr Lab ener se pT pC, 证 明 此 酶 确 是 自 3’-OH 处 加 磷 酯 键 , 而 不 在 5-p 的 一 端 。 4 Laskowski 50") C1 i435 MGB BB 294 i Wee Mt | 氧 核 精 核 酸 酶 和 5- 核 昔 酸 酶 ,逐个 切 下 5- 单 核 董 酸 ,而 不 形成 其 他 如 核 苷 等 。 不 过 他 所 用 的 是 觅 氧 型 的 寡 核 背 酸 ， 至 于 能 理应 用 在 大 分 子 核酸 上 还 不 知道 。 目前 已 知 蛇毒 双 酯 酶 降解 多 核 苷 酸 的 规律 如 下 司 ]: 1. 一 妇 有 磷 , 则 自 对 倒 末 端 开 始 。 (1) 带 5- 磷 酯 者 。. 中 an By B B | fare : < BR | 再 al 了 Be. \ Nee P if 让 ‘ 下 r | oN NewN No NON (2) 带 3’-WEBE Ho - 52 = P EIN TPG EY) Sa Ba NN aah 2. 两 端 无 未 端 磷 栈 , 则 自 3-OH 的 一 端 开 始 。 ee ee fre a a ait we 7 ] Se ORE ae > ree a tp P aah Mee | P Pei ae ips ach Sa TARA a 3. BN As AMAT £1 5-b 的 一 端 开 始 。 C8 oR | Se Baie in ry \ P 了 卫 P PP P SS BoM A EF 1 (1) 还 有 不 同 襄 法 , 按 Razzell WER, hi wea 解 带 3- 磷 酯 的 可 能 1。 但 有 人 认为 增加 酶 浓度 ， 也 能 进行 降 fe?) (=) 牛 脾 磋 酸 双 酯 酶 ”Hilmore 最 初 自 牛 脾 提 出 了 双 酯 AO), 发 现 其 降解 方式 与 蛇毒 双 酷 酶 相反 cs]。RNA 烃 此 酶 作用 后 ,产物 为 3'- 单 核 背 酸 ,但 对 于 带 5/- 未 端 磋 的 核糖 多 核 背 酸 是 不 作用 的 cs9。 近来 也 发 现 这 种 情况 不 是 契 对 的 ,与 蛇毒 双 酯 酶 一 样 ， 增加 酶 浓度 许多 倍 , 也 可 进行 较 慢 的 降解 ,不 论 牛 脾 或 蛇毒 中 分 离 出 来 的 双 酯 酶 ,对 嗓 哈 或 喀 啶 硕 基 都 无 选择 性 。 近来 Razzell 3) 的 实验 臣 明 牛 脾 双 酯 酶 提纯 240 倍 后 ,对 了 -OH 的 核 昔 酸 片段 表现 出 逐个 切断 磷 键 的 作用 ， 如 对 TpTpO 的 降解 见 表 8 。 8 牛 脾 双 酯 酶 对 TpTpO 降解 方式 Cj TpTpC TpC Tp a 量 (267 Mu Jes He) mae 4.0 0.84 0.56 O 5.9 3.1 1.0 0.80 0.15 S48 2.1. 1.6 0.91 0.22 | 5.7 此 酶 对 核糖 核酸 “ 心 ” 完 全 降解 ,产生 3! — EP, ME RL 程 不 象 其 他 核糖 核酸 酶 先 形 成 2 ,3'- 环 状 磅 酯 键 的 中 间 产 物 。 另 外 对 A-3'，5-U 可 作用 ,对 A-2 ,5-U 不 作用 。 ey Sa iris 3 5 4 OP A ER PEASE, ARTE 如 何 发 挥 外 端 核酸 酶 (exonuclease) #f 4} AYR OB EMRE HIE 用 。 如 果 能 找到 较 好 的 井 且 对 大 分 子 RNA RAE AIR ma RNA 分 子 上 其 他 部 分 的 外 端 核 酸 酶 ， 那 未 对 于 核酸 灶 构 的 了 解 就 会 大 大 加 快 了 。 现在 将 这 两 种 酶 在 核 攻 酸 片 恨 上 的 作用 考 式 糙 合 示意 如 图 于 OL STS SR bed Sc EPA Boye. 3 P P| py aaa r, ys * a NY RN ae 极 慢 或 不 作用 I aur 快 3/-AMP 5’/-AMP 3/-AM 5/-AMP 3/-UMP U-3' ,5 一 一 磷 A-3' ,5'- 一 磷 “” 5-UME ) ae | <5: 单 酯 酶 1 3/-A MP Beet pes fo ON >-UME wae) et Pe P AN my ~~ \ Ps \ i AN ”二 者 都 极 慢 或 无 作用 I 牛 脖 双 酯 酶 Il RES: SRE Be 图 1 和 牛 脾 及 蛇毒 双 栈 酶 作用 方式 示意 图 有 了 这 两 种 酶 ， 在 鉴定 工作 上 已 烃 可 以 顺利 地 解决 了 片段 上 未 映 问 题 , 如 果 擎 握 了 它们 的 外 端 核酸 酶 部 分 ， * Be Eee mem 区 序 问 题 就 可 以 准确 地 解决 了 。 te ~~ 站 站 he y b Sia DANN ; - . Ji’ _ oe 和 各 Neds Agr 四 、 磷 酸 单 酯 酶 。 常用 的 磷酸 单 酯 酶 来 源 于 肥大 症 的 前 列 腺 中 ， 成 人 尸体 的 前 ， 列 腺 也 可 用 。 由 于 单 酯 酶 的 作用 方式 较 简 单 ， 专 一 ， 近 来 的 研究 | 报导 也 航 限 于 提 相 方面 ,如 和 节 化 提取 操作 、 提 高 入 度 等 难 除去 的 | 杂质 为 磷酸 双 酯 酶 和 核 精 核 酸 酶 。Frankel-Conrat 等 c] 信 用 磷 酸 单 酯 酶 研究 TMV-RNA 未 端 磷 与 感染 性 的 关系 时 ,不 能 肯定 “未 端 杰 倒 底 是 在 3'- 位 置 ,还 是 在 5- 位 置 ,只 好 推测 可 能 性 最 大 的 ”还 是 在 3'- 位 置 。 作 者 认为 可 能 单 酯 酶 中 杂 有 双 酯 酶 ,使 整个 RNA 分 子 可 能 有 了 改变 ,因此 感染 性 虽 有 了 降低 ,这 种 降低 还 不 能 肯定 RBBAWRET 3'- 未 端 磷 还 是 RNA 分 子 中 有 了 变化 。 Ostrowski 等 °°") 认为 以 前 纯化 单 酶 时 5c3， 双 酯 酶 淋 存 0.05% FARE THAME. AME AED A RAE MES ES DUA ES EHH MRF 作者 报告 此 酶 对 未 端 2 或 3’ BEARGR ER MAES: , Oe 5’ RHEE 则 肌 得 慢 ,对 磷酸 双 酯 键 则 不 作用 , 并 对 RNA AiR AB 如 下 面 示意 图 c25]: n 5! 2 按 Frankel-Conrat MAE", RNA PAK Hw AREA ”种 形式 : 和 (六 ) 。 单 栈 栈 将 式 (_-)( 二 三) 都 能 腊 磋 , 现 留 下 的 问题 是 (五 )( 关 ) | 至今 还 未 见 有 文献 报导 。 五 、 精 OR BB SS | SARIN, Kh RNase T, 以 及 其 他 微生物 中 已 发 现 的 “ 酶 来 看 ,在 这 方面 寻找 比 在 动物 或 植物 棚 万 中 寻找 可 能 更 好 些 。 如 采用 化 学 方法 与 酶 降解 法 相知 合 的 办 法 , 则 收效 可 以 更 块 。， 人 最 近 Sugiyama 等 co 用 碱 解法 测定 TMV-RNA 的 未 端 为 腺 苷 ， 井 认为 另 一 端 没 有 5/'- 磅 ， 因 碱 解 后 没有 发 现 核 昔 -3， 5 二 磷酸 的 物质 。 Whitfieldc 各 "] 用 牛 胰 RNase ig RNA 也 获 得 一致 的 千 果 ， 证 明 其 一 端 为 腺 苷 。 另 外 作者 又 用 RNase T, 及 RACHA RNase 降解 训 RNA ,希望 找 出 与 腺 昔 相 邻 的 第 2 3 或 4 未 端 核 昔 酸 的 顺序 。 实 葵 和 结果 利用 了 反 证 法 推测 该 RNA 的 第 2， 3 Ab He a AL (ELC MY Ye big 人 me. 。 可 以 认为 TMV-RNA 的 部 分 千 构 如 下 : 1 ae oF PS 3 a ‘ Py. # RRS be ada AEs on Te 4 4 ee an 4 es | i A 0 一 2 3! HOSS A 867 a Weed : Fg A: Pi 2 n 5 OH5! n 为 6500; Py 为 喀 呢 ; B 为 何 何 碱 基 。 Rushizky (8281 比较 了 TMV 的 三 种 不 同 株 的 RNA 被 RNase T, 降解 后 ,产物 中 发 现 HR PEAS ST HR RRA MEA EEA IA ini HR #4; UpGp, CpGp iy ieee, UpUpGp 的 量 则 比 另 二 > eH AR 株 的 顺序 与 另 两 株 有 所 不 同 。 s-RNA 方面 , Herbert 等 的 用 蛇毒 双 酯 酶 短促 时 间 的 接 鲤 降解 后 ， 发 现 所 分 离 出 的 蔷 s-RNA 接受 苏 氨 酸 的 能 力 还 可 因 再 “MA ATP, OCTP，UTP 而 完全 恢复 ,但 接受 疾 氨 酸 的 能 力 在 同样 条 件 下 不 能 完全 恢复 原状 。 这 个 现象 可 谣 明 接受 不 同 氮 基 酸 的 特 异 s-RNA 的 顺序 可 能 是 各 不 相同 的 。Nihei 0% 4 Fie EMM 酷 酶 降解 更 肝 s-RNAL ,在 不 同时 间 内 观察 产物 分 布 ,如 4.5 小 时 、 16 小 时 及 22 小 时 内 各 降解 s-RNA 1) 19.4% 53.3% K 98.8%, 推算 出 s-RNA 为 70 个 核 背 酸 组 成 。 除 和 种 主要 碱 基 外 ,还 有 少 量 的 拟 尿 苷 酸 、 甲 基 胞 苷 酸 、 甲 基 饲 苷 酸 、 甲 基 腺 昔 酸 以 及 两 种 未 4 BAL FEHR, ~McOully 等 ca 用 RNase T, 降解 更 肝 s-RNA ,和 欲 了 解 Gp 与 Gp 之 问 常 出 现 些 何 种 顺序 的 片段 。 作 者 认为 下 列 片 段 常 出 现 于 s-RNA #549", ---pGp(Gp),---,--pGpApGp---, ---pGpOpGp--- K-:-pGpCpCpGp--- SO A RNase 降解 酵母 s-RNA, #€ Dowex 1X2 BB, tay Cp,Up,RUp*,ApCp,ApApCp,GpCp 等 6 个 峰 ， * RUp MRR. NE SD a 站 * 由 于 RNase 1 不 能 将 s-RNA PEMESEA IEE, HF RNase 1 “ty” IER ZZ) BH 5 TAR BB 5 BS Fh BS BE FFE a De, BLA 足 , 推 测 s-RNA 的 顺序 , 因此 , 解决 分 离 较 大 片段 的 技术 可 能 是 目前 最 人 迫切 的 任务 。 f11] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9]. [10] [it] 112] [13] 时 [14] [15] [16] [17] [18] SX Rm PAHit HMA": 蛋白 质 ,核酸 ,酵素 ,6: 458, 1961, BAK BARAG: HAM, BB, BS, 6: 13, 1961, Aqvist, E, G. and Anfinsen, C. B., J. Biol. Chem., 234: 1112, 1959, Boman, H.G. Arkiv. Kemi., 12: 453, 1958. Cohn, W. E. and Volkin, E. J. Biol. Chem., 203: 319, 1953. | Cuningham, L., Callin, B» W. and Be Cerne M. P., J. Amer. Chem. Soc,, 78: 4642, 1956. Davison, H. M. and Fishman, W. H., J. Biol. Chem., 234: 526, 1959. De Garilhe, M. P. and Laskowski, M., J. Biol. Chem., 223: 661, 1956, De Garilhe, M, P., Cunningham, L., Laurila, U. and Taner M., J. Biol. Chem., 224: 751, 1957. Dickman, R., Morrill, G. A. and Trupin, K. M., J. Biol. Chem., 235: 169, 1960. | Dirksen, M. L. and Dekker, C. A., Trans. Faraday Soc., 55: 488, 1959. 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Acta, 27; 495, 1958, , a = ”核酸 的 千 构 4 a a ae PP BES SACS ATT Ate th ee meee | 化 学 、 和 站 胸 学 以 及 息 传 学 的 研究 指出 核酸 是 构成 生物 体 的 基 未 物质 之 一 , 它 在 控制 生物 体系 的 代谢 生殖 及 生长 中 占 主要 的 地 位 。 一 般 认 为 胎 氧 核糖 核酸 (以 下 简称 DNA) 是 遗传 信息 的 携带 者 ,而 核 精 核 酸 (DLT ARR RNA) 则 在 蛋白 质 的 合成 中 起 模板 的 作用 。 目 前 ,除了 高 分 子 的 RNA 之 外 ,还 发 现 了 分 子 较 小 的 信息 核糖 核酸 (m-RNA), 以 及 分 子 更 小 的 可 溶性 核 糟 核酸 (s-RNA)。 m-RNA &s-RNA 另 有 报告 介 络 ,不 在 此 重复 。 本 报告 只 拟 介 DNA 及 高 分 子 RNA 的 车 构 。 核酸 是 核 昔 酸 的 聚合 体 。 它 的 单 休 一 一 核 苷 酸 ,含有 三 种 粗 成 成 分 : WE CRM, FUME) , 友 糖 ( 友 糖 或 腹 氧 皮 精 ) 和 磷酸 。 含 有 成 糖 的 核酸 称 为 枝 粮 核酸， 而 含 腊 氧 成 糖 的 名 为 腊 氧 核糖 核酸 。 这 两 类 核酸 都 主要 含有 四 种 碱 基 , 亦 即 主要 为 四 种 核 背 酸 所 粗 成 ,其 中 有 三 种 碱 基 是 二 者 都 有 的 ， 即 孤 叶 哈 CA), 和 饲 便 味 喻 (G ) 和 胞 喀 啶 ( C ); 有 一 种 不 同 , 即 DNA 含 胸腺 喀 喧 (下 ), 而 RNA 则 含 尿 喀 啶 (U)。 此 外 ， ， 字 们 还 可 能 含有 一 些 其 他 硕 基 ,但 一般 含量 都 很 低 。 Aika DNA 之 所 以 能 携带 不 同 的 得 传 信息 是 由于 它们 具 Dill 有 不 同 的 核 苷 酸 排列 顺序 ,不 同 的 链 长 ,以 及 一 定 的 立体 和 结构 。 同 RE, RNA 之 所 以 能 合成 各 式 各 样 的 蛋 自 质 也 是 由 于 同样 的 原因 。 由 此 可 见 核 酸 的 功能 决定 于 它们 的 和 结构 ， 所 以 灶 构 的 研究 是 有 极 一 84 — . AA Woy i " aye Let NA may it ‘a ‘4 加 名 “a : 上 Rt j l PA LAY } 和 ae! | ng 4 , . t x wp a aL by % 7 ew a int Ma « — “we SY LUISE. USE, FT PL A — 22 Sb SA Ri Pg BA sm im a tS he 了 >. ~ x ok 7 oa 重要 意义 的 。 核酸 的 千 构 可 以 从 它 的 不 同 粗 积 水 平 划分 为 一 直 车 构 、 二 上 般 和 结构 及 三 授精 构 。 一 航 结 构 包含 核 背 酸 的 连接 方式 和 排列 顺序 细 DRAMA KS hrs SST A, Sey SERN RRA, SMe mem “是 ALR ARDY RS EE OE, KA IRAE AP AB, Ak, Fea HL A a 5 = EE 题 。 核酸 千 构 的 研究 可 以 分 为 两 类 :一 类 是 固体 状态 的 观察 , 另 一 类 是 在 溶液 中 ， 主 要 是 在 水 洲 液 中 的 观察 。 固 体 状 态 的 观察 依靠 X AT St TR, 在 溶液 中 的 观察 利用 了 便 轰 用 于 蛋 和 白质 理 化 性 质 研 究 的 各 种 方法 ， 如 超速 离心 、 粘 度 、 扩 散 、 光 散 ， 改变 和 破坏 (变性 和 降解 )， mine 和 全 全 的 全 的 fos ip 3 酸 的 结构 有 Bt We =. HEAR PEAR RAY et (—) 固体 状态 的 观察 1. XAT HIEW FAR Watson-Oriek 关于 DNA A ， 423% 1938 46 Astbury 及 Bellc 研究 了 DNA gepeeeeny X CTHARM, ROURKE Kes KE 3.34 A 的 重复 间隔 。 —— ADAPTS ie PRRs ae een 7B ER EP Ee | te BaP 面 与 长 轴 垂 直 。 他 们 5 双 观 察 到 核酸 的 结构 型 式 每 27 A ee 砍 。 如 核 昔 酸 都 是 平局 的 而 且 上 下 积 琶 的 话 ， 则 此 距离 相当 于 8 Pera. Astbury 井 假定 在 核 音 中 ， 顺 哈 或 喀 吓 环 和 精 环 是 在 同一 平面 。 Furberg!" iy X 闭 衍 射 的 研究 指出 在 胞 核 董 引 暑 啶 环 与 糖 环 不 在 同一 平面 ， 而 是 几乎 成 垂直 方向 ， 二 环 间 的 角度 大 和 致 为 90"。 他 对 尿 核 苷 、 腺 核 音 及 岛 便 核 苷 的 精 构 也 全 加 以 研究 , 帮 证明 EPR, Furberg sy pte AIRF ROBE, 但 一 般 认 为 在 一 62 — oC NO ”第 一 模型 SP 第 二 模型 图 :1 Furberg 的 两 种 衙 构 异型 et ae BEEK Coy HE ATR, KAT eee ‘BUS, Furberg) 根据 他 对 核 背 的 研究 提出 核酸 的 两 种 可 能 车 构 形 式 ( 图 1)。 在 他 提出 的 车 构 中 , 味 哈 及 喀 啶 环 和 分 子 的 长 轴 成 直角 ,但 糖 环 及 P-O'。 键 则 与 长 轴 平 行 。 两 个 相 邻 核 昔 酸 的 相 当 基 困 ( 如 磷 原 子 , 叶 喻 环 , 喀 啶 环 等 ) 问 的 距离 大 锡 为 3.4A。 Pauling 及 Corey ©") 于 1953 年 提出 另 一 核酸 的 结构 模型 。 他 个 的 模型 是 由 三 条 互相 盘 线 的 螺旋 形 多核 背 酸 链 所 构成 ， 螺 旋 周 数 七 周 中 有 狗 24 个 核 昔 酸 , 螺旋 方向 为 右手 螺旋 , 磷酸 基 在 中 心 , 糖 基 围绕 在 它们 外 面 , BARRE, 碱 基 环 的 平面 大 致 和 长 轴 垂 直 。 他 们 认为 此 模型 符合 芍 衍 射 周 果 , 并 且 也 和 核酸 的 许 多 化 学 性 质 一 致 。 但 是 Pauling 及 Corey 的 结构 模型 和 某 些 试 骏 周 果 不 符 合 Gulland 等 钙 的 电位 涌 定 数据 指出 磷酸 基 可 以 涌 定 ， 而 味 叭 及 喀 啶 的 氨基 及 -NH-CO- 基 则 不 能 涌 定 ， 它 们 是 被 氢 键 连 系 起 来 的 。 染 料及 蛋白 质 吸 附 试验 也 指出 磷酸 基 能 和 大 离子 结合 。 这 些 事实 都 说 明 磷酸 基 不 在 分 子 内 部 而 是 在 分 子 外 部 。Watson 及 Crick’) 认为 在 此 结构 中 许多 Van der Waals RBH. 继 Pauling 及 Corey 之 后 ，Watson & Crick (1953) 已] 提出 了 DNA 的 另 一 结构 模型 。 他 们 所 提出 的 模型 看 来 和 大 量 物 — 68 一 理 及 化 学 的 实验 数据 相符 合 ， 因 此 目前 为 一 ， 般 所 接受 (图 2 )。 og Watson & Crick WEWASRALE HRS Awe, AG 是 右手 螺旋 。 每 一 多 核 昔 酸 链 的 构 型 和 Furberg 的 第 一 模型 一 样 ， 糖 和 味 喻 及 喀 啶 的 相对 位 置 也 和 Eurberg 提出 的 胞 核 背 的 © SEL, WS RINE ME TERR EN EB, we 酸 基 在 外 部 。 顺 长 轴 方 向 ,每 3.4A 有 一 个 © ATR, 核 音 酸 间 成 36” fo, 因此 每 周 有 10 © eR, 且 每 隔 34A 重复 出 条 同一 烙 ° a Watson-Crick | } q Bical iss ae PR SR Se — 5 ey 2m he A ERE FR 旋 结 构 在 一 起 。 每 链 提供 一 个 碱 基 ， 碱 基 的 平面 和 分 子 的 长 轴 垂 直 。 互 相配 偶 的 大 基 有 一 定 的 规律 。 这 是 由 于 下 面 的 假定 : 糖 -磷酸 链 所 形成 的 螺旋 的 直径 是 20 和， 由 于 螺旋 的 直 径 是 固定 的 ， 为 了 在 二 链 间 形成 均一 键 ， 则 必需 一 条 链 上 的 顺 喻 | 和 另 一 链 上 的 喀 啶 相 烙 合 ,如 果 两 个 嘎 啥 精 合 , 则 链 间 的 距离 将 过 得, 不 能 容 炳 。 如 果 两 个 喀 喧 配合， 则 链 间 的 距离 过 长 ,不 能 形成 键 。 从 碱 基 的 异 构 的 最 可 能 存在 形式 考虑 ， 唯 一 可 能 的 配偶 是 腺 ， 嗓 险 与 胸腺 喀 啶 ， 饲 味 哈 与 胞 喀 啶 。 因 此 DNA 分 子 中 有 一 个 饥 图 3 FRIST a ee Fl SE 大 秦 时 ,也 必定 有 一 个 胞 喀 啶 , 同样 有 一 个 腺 顺 哈 时 ， 也 必然 有 -- 4 a RMN 也 就 是 悦 DNA FP fy J OMIM Fi UME ME 9 24 SE Ws cA a ROE HA 不 同 来源 的 DNA 的 大 量 分 析 竺 果 恋 明 这 是 大 致 正确 的 ,虽然 在 不 同 来 源 的 DNA 中 ，, 腺 嘎 哈 与 高 味 哈 的 比例 可 以 有 很 大 的 差别 (图 3,4 )。 ee 2a 图 4 (MG Foon A A 这 千 构 对 碱 基 对 的 顺序 没有 限制 性 ; 任何 一 BRIER ABE RISE 2, SEY A BB il EPA BY TE &. DEMS HHS AND X 线 衍 射 的 工作 所 支持 ， 尤 其 是 Wilkingsr12] 及 其 同 工 的 工作 。 在 进行 X 萎 衍 射 观察 时 ， 需 将 DNA Seb hl RHE HK. 制 法 系 将 一 针 夫 从 核酸 的 硬 凝 胶 中 徐徐 牵引 而 出 ， 便 可 以 制 成 具 有 高 度 排 烈性 的 蕉 蕉 状 晶体 ， 使 用 不 同 的 牵引 速度 及 不 同 含水 量 的 凝 胶 可 以 制 出 直径 为 1~100 Am 的 催 蕉 。 改 变 徐 和 维 周 围 的 大 气 相对 温度 可 以 得 到 两 种 类 型 的 广 线 衍射 图 讲 。 温 度 为 755%5 时 ， ROCHE NT AK WEF 40~45%, PEA HEM BEALE, X EAM ELBE 100 个 衍射 点 。 这 种 核酸 型 名 为 A 型 (图 5)。 相对 温度 达 929 时 ， 核 酸 具 有 另 一 结构 , 称 为 B 型 (图 6)， 其 和 eA 射 点 不 其 清晰, GLARE EAA SESE, 但 在 子午 线 3.4A 处 有 相当 强 的 街 射 点 。A 和 也 两 型 间 的 转变 是 可 逆 的 。 a Caer iat Bae YX Beit at x 型 晶体 的 Ra Tin Sie oy 的 A 的 了 型 晶体 yee 钠 盐 5 DNA 纳 盐 6 DNA en ees is 1 xy es] eed Peet 二 Fe he Pay ove eae (es oe veer ¥, 来 源 于 大 肪 杆菌 及 小 牛 胸腺 的 DNA 钠 盐 的 X ge BF, 一 般 地 证 实 了 Watson-Crick 和 结构 的 主要 论点 。 | 更 精确 的 X 痿 研究 指出 ， 虽 然 Watson-Crick tegen | 是 正确 的 ， 但 它 的 Fourier 转变 计算 和 X MABKAS 需要 一 些 修正 。 修 正 主要 在 分 子 的 大 小 。Watson-~Orick DNA 分 子 的 直径 为 20 A， 此 数值 过 大 。 DUB, (EF DNA 的 鲁 盐 及 锣 盐 以 代替 钠 盐 进 行 和 疙 的 研 穹 , 在 技术 上 有 了 改进 。 旬 盐 的 B 型 能 烙 晶 , 其 X BARA 肠 衍 射 点 ， 可 以 准确 地 加 以 测量 。 鲁 盐 的 另 一 有 利之 点 是 锂 离子 ee es RERESRRE, 12 4 DNA 的 A,B BERING DLE REO MF Ce 1 及 图 7)。 a #1 DNA 的 全,B 二 型 的 区 别 yy ys } Uae B 直径 人 18 17 二 链 问 距离 A 14 a 823% (Pitch) A 28.1 33.1 A(34 A) 各 链 等 一 图 的 核 背 酸 数目 11 10 碱 基 对 形状 棒状 棒状 HR FE Hy OF He th FH RE #1 65。, 不 通过 加 90° , 3st Bh DNA 的 构 型 除了 上 述 二 型 之 外 , BBR A BS, — 洪 是 四 种 构 型 。 四 种 构 型 都 是 双 股 螺旋 ,而 且 可 以 互相 转变 .它们 不 同 之 点 在 于 每 圈 的 核 背 酸 数目 不 同 (9.3 一 1L.0 个 )， Dh Be Bits 对 和 螺旋 轴 问 的 角度 不 同 。 最 近 Pauling 及 Corey"**! $2 1h Hemme +5 8 (EMMA Py AB i= BRUTE A 8) IXGH=7 AGES, CEA Hy AE A MEE HY SRA MOY, 7 SREY FETE OE 0 RE BER 胸 碱 基 对 为 稳定 。 不 同 成 分 的 DNA 的 热 变 性 诈 实 这 一 假定 。 饲 - 胞 含量 较 高 的 DNA ,其 变性 温度 也 较 高 。 2 电子 显 微 贷 的 观察 ”近年 来 电子 显微镜 的 分 辩 能 力 有 很 ne ee Se Pee 条 red | hey Tey 4 mag pit! ty ¢ Se ‘ Bic, si Be Mf mh als ’ 计 Dey es ef, wy 和 / iM . At a) ‘ ue oe \ a a; 4 is : ‘ es 图 8 Rey fas Ze Hara eH 大 的 进步 ， 可 以 达到 10A DO, FAROE AT Due Heme 酸 的 形状 及 大 小 ， 在 和 理化 性 质 测定 的 互相 印证 中 ， 有 很 重要 的 意义 。 但 我 们 不 应 后 记 , 尤 其 是 在 分 子 大 小 的 解释 上 ,所 观察 的 是 FIR FEA PEAS IB 9 HL RMS , Hall15) 提出 的 样品 制备 方 法 较 好 。 这 个 方法 的 主要 特点 是 将 DNA Snth Be ES 母 薄片 上 ,以 铅 投 影 ， 再 于 销 上 沉积 一 层 氧 化 砂 , 最 后 以 洲 于 乙酸 友 酷 的 火 棉 胶 喷 布 于 表面 上 ,干燥 后 将 薄片 在 水 中 和 云母 片 分 开 。 以 此 法 制备 样品 测 得 DNA 钠 盐 分 子 的 直径 是 25 士 5A, FIX — Oo: 3 Jt Ls he ie ee (Hall 等 co 在 极力 避免 核酸 变 狂 的 措施 下 ， 进 一 步 详 相 研究 .了 DNA 钠 盐 。 他 们 着 实 DNA 铀 盐分 子 的 直径 是 20 A, Heme ” 察 到 分 子 的 未 端 是 方形 的 ， 表 示 末 端 仍 保持 双 螺旋 结构 。 假 如 汉 螺旋 的 两 条 链 在 未 端 分 开 , 则 分 离 的 单 核 昔 酸 键 会 知 曲 起 来 。 图 9 是 两 个 DNA BF, ARERR AM, 值得 注意 是 尖端 的 知 曲 。 了 all 及 Litt’? 认为 这 是 尖端 发 生 部 分 变性 的 千 ” 果 , 此 种 矢 曲 都 发 现在 尖端 , 而 不 发 生 在 中 间 部 分 , 这 可 能 表示 双 ”螺旋 的 断裂 都 是 从 失 端 部 分 开始 ,而 向 内 发 展 。 这 一 点 支持 DNA | ARB E. 图 9d 是 DNA HBR AM. 以 特性 粘度 法 测定 的 重 ” 鸭 分 子 量 是 9.7x 10 ， 而 电子 显 微 镭 得 出 的 数 均 分 子 量 是 4.2 x10°, 重 均 分 子 量 是 7x 10° (假定 质量 对 长 度 的 比值 是 200)5]。 ”于 弯曲 ， 此 点 说 明 分 子 略 有 和 柔 利 HES 千 曲 。 此 点 证实 Doty 等 所 ?的 观 “shy DNA 都 是 在 溶液 中 的 ， 因 分 子 都 是 横 切 折 断 的 ， 拓 端 没有 点 ， 即 超声 波 碎 片 仍 保持 双 螺 旋 车 构 。 又 从 图 上 可 以 看 到 当 粒 子 彼此 间 距 离 较 远 时 ， 其 形状 一 般 是 直 的 ; 当 它 们 挤 在 一 起 时 则 趋 (>) 液体 中 的 观察 ”上述 X PEAT AHL Ae HK HE Hy ML FZ 是 对 固态 样品 的 观察 ， 而 天 然 状 POA DNA TERA ESEE TAs 图 9 能 打 精 于 DNALN fii Fi 如 大 小 .形状 分子量 .刚性 等 ,可 微 镜 摄 影 ( x #9 100,000 #4) 以 和 固态 的 观察 结果 互相 印证， (a) 相对 高 浓度 情况 下 ;j，(b) 有 分 支 的 DNA 分 子 (两 个 )》 〈c) 显 示 由 于 变性 而 引起 了 ERM BOAR din FY PE (39 FD) (4) RE eT 状态 下 的 和 结构。 碎 的 片断 。 ~ . Oa . » e Rus > . = Me oy —— = » ate a es DNA 溶液 理化 性 质 的 测定 存在 着 一 定 的 困难 。 早期 的 工作 由 于 朱 提 方法 不 够 完善 ， 产 品 有 了 降解 或 变性 。 使 用 这 种 材料 进 行 的 理化 性 质 测 定 的 结果 是 不 正确 的 ， 而 且 各 工作 者 所 获得 的 结 果 也 不 一 致 。 在 水 中 ，DNA 的 淡 度 小 于 2x10“<“M 或 溶液 中 NaCl 的 浓度 小 于 '10-* M py, fl) DNA 发 生 不 可 逆 的 变性 。 因 此 先 将 DNA 深 于 水 中 ,然后 再 加 太 电 解 质 ,或 将 DNA 溶液 对 水 过 次 地 透析 都 应 当 避 免 。 早期 的 工作 者 未 注意 到 这 一 点 ， 也 是 造成 慰 差 的 原因 之 一 。 | 以 目前 最 好 的 方法 制备 的 DNA 在 分 子 量 ， 基 至 在 构 型 和 化 学 组 成 上 都 是 不 均一 的 ， 所 以 理化 性 质 的 测定 数值 只 具有 芜 计 学 DN A 溶液 的 准确 测定 还 存在 着 困难 。 目 前 涩 度 的 测定 是 和 根 ， 据 磷 含 量 的 分 析 或 此 外线 吸收 的 测定 ， 但 是 这 些 测 定 都 是 根据 固 fk DNA 钠 盐 桩 品 的 重量 计算 的 ,而 DNA 钠 盐 的 含水 量 不 能 准 ， 确 知道 。 在 110*C LE, RARE REPRE MK 定 能 把 水 分 完全 去 掉 。 以 上 的 情况 是 在 DNA 理化 性 质 测定 中 应 当 注意 到 的 。 A, 胸 氧 核 焊 核酸 钠 盐 的 分 子 量 ”测定 DNA Meh Fw | BAHT: (1) 用 Svedberg 公式 从 沉降 系数 和 扩散 系数 计算 ; (2) 用 Mandelkern, Krigbaum, Scheragar 及 ， sia BAK | “ 降 系 数 和 粘度 计算 ;(3) 用 光 散 射 法 。 (1) 以 沉降 系数 和 扩散 系数 计算 : 利用 Svedberg 公式 RTS, D(1—Vp) WOHAOTE, 式 中 So 代表 样品 浓度 外 推 怪 堵 时 的 沉降 系数 ， | D 代表 扩散 系数 , 7 代表 微分 比 容 ,p RIAA, RRA 常数 ,下 代表 绝对 温度 。 S 值 是 用 超速 离心 机 测 出 的 。 早 期 的 核酸 工作 者 业已 发 现 DNA 在 梁 度 低 于 2.5x1l10-3 gj/mml 时 (在 0.3M NaCl 中 )， 沉降 系数 对 样品 获 度 有 显著 依 顿 性 。 当 DN A BREE AKITE 3 x 10-4 H/ M = Hace ee sas Hh oi GAA ee I 数 准确 (图 10), 但 是 在 这 样 低 的 浓度 常用 的 、 利 用 折射 率 ethene 《如 Philpot-Svensson 光学 系统 ) 18 RBI AB. @ 0Othc 和 Coates K Jordan”) 使 用 液 柱 为 30 毫米 的 沉降 | 本 测定 了 以 去 污 剂 法 提取 的 小 牛 胸 腺 DNA HOUT RBC HER So 是 29.4 S。 样 品 浓度 的 范围 是 6.3~12.6 x 10-* ¥e/2EF-. 用 > B®: 3 i i _ @ Peacocke & Schachman _ : 25}6 © Coates % Jordan : ? ® Oth q 2 © Shooter 及 Butler a | . F hi : d 0 0.05 0-10 0.015 RIE (%) B10 BEBE BRAY DNA sth AOE 降 系 数 的 影响 Shooter 及 Butlertanan fi FROME AE, ARR ET 以 去 活 剂 法 制备 的 小 千 胸 腺 DN A 钠 盐 的 沉降 系数 ， 千 果 So 为 298, 与 Oth 等 所 得 的 结果 很 符合 。 彼 等 也 测定 了 另 一 以 酶 法 制 备 的 小 牛 胸腺 DNA 钢 盐 样品 , 千 果 3 24S (AA 11). Stern 及 Atlasc2] @ eee 7 NaCl 浓度 对 DNA FR Eb TE 降 系 数 的 影响 。 玉 ahler, 及 Shack”) 研究 了 MeCl, 浓度 对 DNA 负 盐 沉降 系数 的 影响 。 他 们 都 发 现 当 电解 质 普 度 培 加 时 ， 沉 降 系 数 即 迅速 上 上升， NaCl 浓度 增 至 0.2 M 时 ,沉降 系数 便 不 再 上 升 ， 而 MgCl, 演 度 则 只 需 增 至 0.05 M (图 12)。 ”一 入 一 a o MEN x 去 污 剂 法 制备 “ 了 ae 11 低 流 度 的 DNA Sth ot PeKESR ASEM ws (在 0.2M NaCl rh) — 10" yo? fo? 107 1? BRE FE FURIE) 图 12 电解 质 浓度 对 DNA 纳 盐 的 沉降 有 系数 的 影响 注 浓度 对 沉降 系数 的 影响 也 因 DNA 钠 盐 来 源 的 不 同 而 异 。 从 ”肠炎 沙门 兵 菌 的 噬菌体 D, 制备 的 DNA 钠 盐 在 沉降 中 洽 度 对 沉 ESRB RMA, PEA TARR IA TB 虽 测定 浓度 稀 至 1x10- 克 /毫升 亦 无 济 于 事 。 DNA 钢 盐 的 扩散 系数 测定 有 很 大 困难 。 原 因 之 一 是 DNA 钠 盐分 子 的 不 对 称 性 较 大 ,因此 浓度 对 扩散 系数 有 很 犬 影响 ,以 致 ， 一 72 一 MAREN RAI (ERASE, Aes, DNA 扩散 系 煞 的 研究 为 数 不 多 。 根 据 Tames"**) Li Je Coates?) fy tt Be A HR HOBERE, DNA 的 扩散 系数 当 为 2 一 3x 10…” 平方 厘米 / 秒 。 按 Svedberge 公式 ， 用 D=2xl10 ”和 8%=248〈 用 酶 法 制 felis Ha DNA 钠 盐 的 数值 ) ,算出 小 牛 胸腺 DNA 铀 盐 的 分 FHC 6< 10°, 如 用 D=3x10-* 与 用 去 污 剂 制备 的 小 牛 胸腺 DNA 钠 盐 样品 的 沉降 系数 (29 8) 计 算 ,分 子 量 则 为 5x 10*。 工 他 数据 合 井 来 计算 分 子 量 。 最 常用 的 是 将 沉降 系数 和 特性 粘度 AFH. sae Liters (2) 以 沉降 系数 和 特性 粘度 计算 : 可 用 Mandelkern 等 的 东 式 从 沉降 系数 和 特性 粘度 计算 DNA 的 分 子 量 。Mandelkern BAUER 2 Sn]? nN « ubigg Sage eS) M NaCl; (C) 4x 10° M NaCl; (D) 1x10"! M NaCl, ae a ee IO is, r* Ea ee >») a i n (=) 腕 氧 核糖 核酸 的 变性 作用 “核酸 分 子 中 的 主要 化 学 键 ABE: 〈1) 核 昔 酸 间 的 共 价 多 酯 键 ;(2) 嘎 吟 及 喀 啶 环 间 的 氢 键 ， 此 类 键 对 核酸 分 子 的 双 螺 旋 结 构 起 稳定 作用 。 核 酸 的 变性 作用 主 要 是 指 氢 键 的 断裂 ， 而 分 子 量 不 变 这 一 过 程 。 核 酸 的 变性 可 以 用 四 种 方法 引起 : (1) DNA 溶 于 水 或 极 稀 电 解 质 洲 液 ; (2) 洲 液 的 酸碱度 调节 至 一 定 程度 ;〈3) 加 热 ;〈4) 加 大 破坏 氧 键 的 试剂 。 变 性 作用 的 观察 可 以 对 DNA 的 结构 提供 论证 。 1。 肌 氧 核糖 核酸 深 于 水 或 极 舌 电解 质 深 流 所 避 起 的 变性 将 DNA 溶 于 水 或 极 稀 电 解 质 溶液 中 可 以 引起 变性 。 这 种 变性 作 用 可 以 用 紫外 萎 吸 收 光 计 的 改变 来 追随 。 天 然 状 态 的 DNA 的 磷 原子 消光 系数 e(P) 在 259 毫 微米 时 狗 为 6600, 变 性 时 则 增加 。 Thomas5s] Agathets i, aks 1M NaCl 的 DNA WHR i& NaCl ye HERI 1x 10M By, PAHO Ea EE 始 上 升 , 至 NaOl eH KK 1x 10-*M 时 达到 最 高 点 ,此 时 其 升 高 的 数值 狗 为 其 原来 的 25%; 如 再 加 入 NaCl 至 开始 的 浓度 , 则 光 密 度 下 降 ， 但 不 能 恢复 到 原来 的 数值 ， 而 高 出 原 值 狗 11 儿 (图 15), Thomas 认为 光 密度 不 能 恢复 至 原来 的 数值 表示 发 生 了 不 可 逆 的 变性 作用 。 因 此 在 核酸 的 提取 制备 中 必需 充分 注意 电解 质 RUE, USAR MRE SEES. Fea eB 或 (P) 值 可 以 作为 变性 的 指标 。 一 一 一 一 一 —— 8 ee ee eo 和 -LogCmgso, 图 15 Je pnek ee ce eR BEXt DNA 在 260 BAOKH ERE 的 影响 -7 “4 seg ‘aa t ‘ yr, 人 a at ae & 站 i 和 a~ Te 1 Fd) c Oe A 1d, - wie tlhe eae D Py 性 ae Is ， at \s rs 站 4 4s ai a A ie ‘ , a 2 ye ae S f wim Fa oe cay : at : iin 7s Tuas .. r ‘ b FF “ mes wl 个 了 NE So ae : ay) ty i a , = - . ‘ AL " ma; . " oy a : rs: i =* oa 二 Kosoff 及 Rosenberg’ 便 沟 醋 完 过 除去 电解 os pra et AA, 他 们 认为 这 种 变性 作用 和 加 酸 ta A REAM SESE LBA tt 2. EMO A a EB 的 断裂 (HI 一 亚 )。 2, 酸 或 碱 避 起 的 变性 作用 酸 或 碱 可 以 引起 DNA 的 不 可 道 变性 。 如 将 原来 pH 是 6~7 fy DNA 钠 盐 用 酸 或 碱 分 别 涌 定 到 pH 2.5 或 p 也 12, 则 在 逆 涌 定时 , 涌 定 曲线 与 原 涌 定 曲 薰 不 重生 ， wel] DNA 发 生 了 不 可 逆 的 变化 〈 图 16)。 这 现象 可 以 用 DNA 的 氮 键 辣 构 解释 。 从 图 16 可 以 看 出 EMTS ERS SEE ea (p 互 4.5~11.0)， 而 在 逆 涌 定时 非 胡 冲 地 带 较 狂 。 这 是 由 于 核 碱 的 氨基 和 一 N 互 一 CO 一 基 千 合 ， 生成 氨 键 ,在 涌 定 到 -一定 酸 碱 度 时 , 氢 键 方 始 断裂 ， 因 此 在 顺 涌 定 时 非 检 冲 地 带 声 宽 ; 达 到 -- 定 酸 < 4 Near 和 六 sid ns aad ane ran OR thal ot Y tts var iA) "Wag 7 a pak | iach 2 KL et { 4 ’ 4 ; J j } : : 4 Ey | dae? 2.0 GL ET) , BROT, PE HH SE SE ee SRE, pH 的 改变 就 比较 徐 ， 1.0 绥 。 当 氧 键 业已 被 断裂 ， 如 在 逆 】 涌 定 时 ， 则 质子 和 基 团 间 的 烙 合 是 不 再 受 氧 键 的 阻碍 ， 非 餐 冲 地 带 是 Zo. Fy He PAK : 1 ag a5 PE OPER EFA 4 FEE SR RRS BOE) Pista e 5 H DB J> 2.0 j in vee Z coal SRR, SIGE BER 0 ; 5s 46 67 8 9101113 pH Be ti. EE HY OR Bik EE BS Cox 及 Peacocke!®"*1h32 YT FEIAig ete PH pH 降低 到 ] — BFR EP ENTREE, MTT BAR AT SE WPA AMAA. HE 25°C, 中 性 ， 存 在 有 0.05 M NaCl 的 DNA 洲 液 加 酸 涌 定 ,使 PH 由 中 人 性 下 降 至 不 同 数值 ,如 也 及 也, 然后 加 碱 逆 洱 定 ,可 以 在 顺 涌 定 曲线 APD 和 逆 育 定 曲线 DRA ， 之 间 得 到 一 柔 列 曲 糙 ， 如 灶 合 的 酸 不 超过 每 4 克 原 子 磷 0.2 当量 ( 即 达 图 17 也), 则 赣 清 定 曲 炮 和 顺 育 定 曲 纤 重合 , 即 , 在 25"C, 最 初 的 10 和 多、 以 氨 键 结合 的 氨基 的 离 解 是 可 逆 的 。 从 汉 定 曲 蕉 看 ， 氮 键 的 断裂 不 超过 此 量 ，DNA 可 以 恢复 到 原来 的 天 然 状 态 。 氢 键 的 断裂 如 超过 此 值 , 则 DNA 的 结构 产生 永久 性 改变 , 此 时 ， 逆 BLANCA EMEKES. FIM ME E, Ue eS 顺 EFA 进行 。 了 EEA 表示 DNA 发 生 了 部 分 变性 。 酸 碱 所 引起 的 变性 作用 与 温度 有 关 ; 温度 较 低 则 引起 的 变性 — $2 — 的 多 寡 ， 氢 键 破坏 至 一 定 程 度 则 ， 发 生 不 可 赣 的 变性 。 如 果 氢 键 破 ， . 持 其 相对 的 位 置 , 从 而 中 和 后 , 氨 ， 键 可 以 重新 形成 ， 则 变性 成 为 可 。 Sh, (ASL, WMH RE ， 图 16 ”小 牛 胸腺 的 DNA gibi ”意味 着 恢复 到 原来 的 样子 ， 因 为 ， | vee es 中 和 后 所 形成 的 氢 键 可 能 特异 性 Beh. 45 FT SU A BG AE BA RO OR HC .> — ————— ee 每 4 克 原 子 磷 项 合 的 酸 当 量 图 17 DNA th7e 25°C 和 0.05 M NaCl 次 液 中 的 滴定 曲线 。APED， 加 酸 的 不 可 逆 . 滴定 曲线 ;HEEFA,，DRA， 分 别 由 了 及 了 加 碱 的 可 道 反 滴定 曲线 ; AOB ,天 然 状态 的 DNA 的 可 道 滴 定 曲线 ;AQD;, 有 252% 变 性 的 DNA 的 顺 闹 定 曲线 。 作用 较 小 。Oox Peacockel*?] 根据 这 种 现象 提出 从 温度 对 涌 定 HREM KA DNA 的 理论 可 逆 涌 定 曲 巷 。 将 DNA 在 0.4°C 的 pH 调节 至 3 ,恢复 至 中 性 ， 然 后 在 25°C VEIN eR 赣 涌 定 , 糙 果 和 完全 变性 的 涌 定 曲线 相 比较 ,发 现 沟 0.4*0 的 处 理 后 ,有 60% 的 氧 键 保持 完整 。 根 据 此 车 果 得 到 可 逆 清 定 的 理论 曲 ， 线 ( 图 17,，AOB)。 一 旦 获得 了 天 然 的 和 变性 的 DNA fy A IR 定 曲线 (AOB 及 AD), 就 可 以 从 二 者 之 问 的 可 逆 涌 定 曲线 如 AI， ARAMA TUBS, TR =o OYE AFE Heb FP SAKA ie ee EW, RAS APE 曲线 上 了 点 的 完全 变性 满 定 曲 继 上 的 点 。 温度 对 顺 涌 定 过 程 中 所 引起 的 不 可 逆 变 性 的 百分数 的 影响 有 如 图 18 所 示 。 从 图 上 可 以 看 出 在 任何 一 定 离 解 度 时 ,变性 的 程度 决定 于 温度 。 在 25°C, HEAR 0.0~0.2 当量 时 ，B8 是 雳 ,但 千 合 量 增 至 1.9 一 2.2 当量 时 , 8 迅速 增长 至 1。 在 35"C,， 曲线 更 “ 陡 。 在 酸 和 结合 量 达 1.86 当量 时 ， 变 性 达到 10092， 即 B=1, 在 0.4°C, “4M A mA 2.2 当量 时 ,8 未 超过 0.4。 根 据 Peacocke — 83 一 每 4 克 原 子 磷 烙 合 的 酸 当 量 图 18 ”在 不 同 温 记 ,和 结合 酸 量 与 不 可 递 断 裂 的 氨 键 分 数 ( 6 ) 的 画 数 关系 ; 虚线 表示 如 果 在 变性 时 ， 氢 键 的 断裂 都 是 不 可 逆 的 情况 下 , 8 SEGRE. 及 Preston!*"),4#¢— 0.75°C BY, Bab 在 不 同 温度 的 加 酸 注定 不 仅 是 酸 变性 ， 同时 也 包含 温度 变性 ， 4q 。 因此 加 酸 引 起 分 子 的 全部 变性 时 ， 氢 幼 破 型 的 临界 数值 是 温 谍 的 画 数 。Cavalierirse 等 的 工作 指出 (图 19) ,在 一 切 温 度 下 存在 有 SEAS E OEE, 它们 是 天 然 的 和 变性 的 DNA 的 可 】 逆 涌 定 曲线 ,但 是 在 顺 涌 定 曲线 上 ,从 何 处 开始 发 生 不 可 逆 变 性 作 用 ， 则 依 温度 而 定 。 他 们 的 烙 果 和 Cox 及 Peacocke’) 的 近似 ，， 因 图 19 的 FY FY 等 相当 于 图 17 的 也， 因此 在 转折 点 之 前 ， 涌 定 盟 线 是 可 逆 的 ,在 转折 点 之 后 , 则 不 可 道 。 tS HA ER aH DL, BE a De a FP, DNA AAAS HE HY RS AE ER TR, 但 热能 较 小 , 双 HT FS ka A 9 SR RARE» BNE: FE MER Ui, F LED IBA 了 解 。 在 DNA 溶液 中 加 大 酸 或 碱 , 除了 可 以 观察 到 请 定 曲线 的 改 ， 变 之 外 ,也 引起 了 DNA 物理 性 质 的 改变 。 当 DNA 洲 液 的 PH PRI MEE 2.6 时 , 分子 量 未 发 生 改 变 ， 但 DNA 离子 有 显著 收 缩 5””"。 根 据 光 散 射 的 测定 ,在 p 互 6.5，3.0 及 2.6 时 ,，DNA 离 一 84 一 盐酸 (毫克 当量 ) : 1/ pe © 37°C Mt He vs 63°C : Shanes vi © 78°C MAI % i ais ms ae 图 19 DNA-Na 在 不 同 温度 的 滴定 曲线 。 te 各 点 表示 不 同 温度 的 曲线 .在 78°C HITS a Pa eee eet area a a FEED Ws 2050 A, 1770 A 及 880 Acs1。 加 碱 时 也 发 ALTA PETES, WOCHCN BAR HC, PHT my, 4 774F By 2600 A (w=0.165) ,在 pH 12 时 ,下 降 至 950 有 ,变化 和 加 酸 时 平行 rs。 在 加 酸 或 加 破 时 ， 粘 度 也 有 改变 。 当 pH 达到 狗 3.7 时 ，DNA 游 液 的 特性 粘度 开始 下 降 , 在 pH 3.7 和 2.8 之 问 有 猛烈 下 降 oe ee eee Oe WO) eee ae pH 20 p 互 对 小 牛 胸腺 的 DNA 钠 盐 的 特性 粘度 hapa 的 影响 四 ) 二 4 { Ns \ . (图 20)5?e21。 同 样 ,特性 粘度 在 p 联 达 12 时 ,开始 迅速 下 降 c。 此 外 5 随 DNA 溶液 的 pH (i Ages, OE A, 这 些 物 理性 质 的 改变 显示 加 酸 或 加 碱 引起 了 DNA 氢 键 的 部 分 断 是 2, FMAM, DNA SPRATT OG BIRTH, DBA MIA | ae 3. MRA IBRMEREAR DNA 洲 液 加 热 时 可 以 发 生 不 时 可 逆 的 变性 作用 。 这 种 变性 只 在 一 定 临 界 温度 之 上 发 生 c。 临 时 。 界 温 度 的 高 低 和 离子 强度 以 及 DNA 的 天 然 状 态 和 来 源 有 关 。 临 界 温 度 的 范围 是 70~85?C。 q 如 将 DNA 溶液 在 临界 温度 以 上 的 某 一 温度 加 热 一 定时 间 ， 然后 痊 却 至 室温 ， 则 变性 DNA 的 理化 性 质 与 未 变性 的 有 显著 的 不 同 。 例 如 ,将 小 牛 胸腺 DNA( 痪 子 强度 0.15, 中 性 .5 也 ) 在 1002C 加 热 ， 特 性 粘度 即 由 原来 的 72 下 降 至 4; 均 方 千 径 由 原来 的 3000 A FRE 1000 A, 但 数 均 分 子 量 (M。=7.7x10) 及 沉降 系 ， 数 (S20(10"*) = 24] 均 不 改变 ce]。 可 见 热 变 性 的 DNA 的 性 质 更 接近 于 无 规 线 团 。 如 将 DNA 溶液 在 临界 温度 以 上 的 不 同 温度 加 热 一 定时 间 (20 分 钟 ) , 沦 却 至 室温 后 ,测定 其 比 粘度 , 则 发 现 比 粘度 下 降 依 加 热 温 度 的 不 同 而 各 异 。 加 热 温 度 较 高 的 ， 其 比 粘度 下 降 较 多 。 比 粘度 下 降 至 一 定 程 度 即 不 再 下 降 ， 虽 延长 加 热 时 间 也 不 改变 〈 图 21)[s%s5]。 这 可 能 是 由 于 DNA 分 子 是 不 均一 的 ， 当 某 些 分 子 已 完全 变性 时 ， 另 一 部 分 可 能 完全 没有 变性 。 如 果 这 是 正确 的 , 则 DNA 的 热 变性 是 一 种 “全 或 无 "的 过 程 。 但 另 一 可 能 是 分 子 各 部 分 氢 键 的 稳定 程度 是 不 相同 的 。 当 某 一 温度 时 ， 某 些 氢 键 发 生 断 有 裂 ， 而 其 他 部 分 则 未 断裂 。 如 果 这 是 对 的 ， 则 热 变 性 应 具有 中 间 阶段 。 目 前 一 般 伺 趋 向 于 认为 后 者 具有 较 多 的 理论 依据 ,Marmue 及 Doty [ee] 的 试验 指出 饲 - 胞 核 碱 间 的 氢 键 较 腺 - 胸 核 碱 间 的 为 RE, 饥 - 胞 核 碱 含 量 较 高 的 DNA 的 变性 温度 也 较 高 。 图 22 显 示 变 性 温度 (Tn) 是 核酸 的 高 - 胞 核 碱 含 量 的 画 数 。 当 曲线 外 推 EM - 胞 核 碱 含量 为 零 时 ， 变 性 温度 为 69"C， 此 温度 与 合成 的 — 86 一 一 [mr]es-o/ nas] a=0 12 16 20 24 28 382 时 fl €... 8 图 21 ”在 不 同 温度 .处理 时 间 与 DNA-Na 特性 粘度 的 关系 。 0 SLUM + HUE Tm(°C) 图 22 ”变性 温度 (Tm ) SE - lame SAAR 1.。 草 分 枝 杆菌 ; 2. 沙 雷 氏 菌 属 ; 3. 大 肠 杆菌 ; 4 ER 5. 小 牛 胸 脐 ; 6. 肺 类 球菌 ; 7. 酵 母 ;3 8. 噬菌体 Tes 9. 只 BZARTHAKRS RRR. — Shae 腺 - 胸 DNA 的 变性 温度 极为 符 | 合 。 加 热 变性 的 DNA PEATE 外 吸收 增高 ,在 洲 液 冷却 后 ,紫外 吸收 有 所 下 降 ， 但 远 不 能 恢复 原 来 的 数值 (图 28), TRB " 20 80 40 50 60 70 80 90 100 肖 oe pcp i re ia 温度 CO) APSE ERA, UBER aD ‘4s B23 DASH A-RSRAETR, SR 4 中 的 楷 外 吸收 改变 新 形成 的 程度 与 气 键 破坏 的 程度 有 关 ， 破 坏 程 度 合 大 ， 则 恢复 仍 少 。 ”变性 作用 发 生 的 临界 温度 和 溶液 的 离子 强度 有 关 cem。 降低 四 。” ， 游 液 的 离子 强度 则 临界 温度 也 下 降 ， 也 即 电解 质 对 DNA HTN ， 变性 具有 保护 作用 。 ee 而 显著 增加 。 1 4 变性 剂 对 腕 氧 核糖 核 酸 的 影响 RB 盐酸 股 及 水 杨 酸 钠 ， 等 能 使 蛋 自 质 所 名 断裂 的 物质 应 当 也 能 促进 DNA i iE fr | 用 。 Rice 及 Doty HET SMIRK, 3.2MERMMERO. SMA REM ! | 对 DNA 变性 的 影响 。 彼 等 指出 ,在 加 入 这 些 物 质 时 ,加热 变性 的 We SRE BUTS MCP 24)[s9。 脲 的 影响 便 沟 相当 广泛 地 研究 过 , 但 ， 是 不 同 工 作者 所 得 的 车 果 有 差别 。Rice 及 Doty") 发 现 ， 在 室 。 Hk, WRATAG 0.15 M NaCl 存在 下 的 DNA 洲 液 的 特性 粘度 无 影 Hy , 4. Conway!**) 则 发 现 粘 度 上 升 ，Mathieson 及 Porter") 发 | 现在 含有 0.2M NaCl 的 DNA 溶液 中 加 入 脲 时 ,其 流动 双 折 身 ， ， 测定 显示 分 子 的 柔韧 性 增加 ,表示 有 部 分 氨 键 断裂 。 以 上 的 精 果 以 及 其 他 的 一 些 工作 显示 引起 蛋白 质 氢 键 断裂 的 RA) ORS HOR ART Lie DNA 的 任何 明显 的 变性 ,但 它们 可 | ，， 乌 在 其 他 方法 引起 的 变性 作用 中 起 辅助 作用 。 | an BZ DUEJL REPEL E AIDA IE oe SEE PE EES CE — ss — 4 08.2 MiX-HCl 20.8 M 水 杨 酸 纳 [nrla=0/[Msla=0 图 24 DNA-Na 在 氧 键 破坏 剂 存在 - 1 下 加 热 一 小 时 的 特性 粘度 改变 的 断裂 , 以致 原来 的 、 较 具有 刚性 的 分 子 崩 溃 ， 变 成 具有 索 大 和 柔 利 性 的 形式 。 有 些 DNA 在 变性 后 ， 两 条 链 由 于 残留 的 或 是 重新 形 成 的 氢 键 的 存在 , 仍 糙 合 在 一 起 而 不 分 离 , 但 近来 也 发 现 一 些 来 源 FH DNA 的 变性 之 后 ， 两 链 可 以 完全 分 开 。 因 此 从 DNA 变性 的 太 究 可 以 证实 Watson-~Orick 所 提出 的 DNA Je rh St HE BB. (四 ) PRSIHERERAUERSE © “Watson-Crick 为 所 人 DNA 稳定 性 的 主要 的 甚至 是 唯一 的 因素 。 在 以 上 各 节 也 只 介 狠 了 和 氢 键 在 DNA 稳定 性 中 的 作用 。 目 he 是 DNA 稳定 性 的 唯一 来 源 。 相 邻 碱 基 对 之 问 的 非特 异性 吸引 也 有 同样 重要 性 。 关 于 这 方 面 的 证 据 有 以 下 两 方面 。 首 先 ,蛋白 质 的 变性 剂 ,如 脲 、. 且 ,水 杨 酸 盐 等 几乎 对 DNA 没有 变性 作用 。 这 些 坛 剂 是 打 断 氢 键 的 ， 因 此 氨 键 可 能 不 是 主要 负责 DNA 稳定 性 的 。 其 次 ， 变 性 的 竹 计 力学 处 理 要 求 有 相当 的 、 碱 基 对 之 问 的 ,作用 方向 与 长 轴 平 行 的 相互 作 用 ,以 便 变 性 作用 能 发 生 在 狭窄 的 温度 范围 之 内 57o79。 从 非 水 洲 剂 对 螺旋 结构 影响 的 研究 中 ,Helmkamp 及 Ts'o572 一 89 一 _—~ = iS * ” © all — 7 a 7 = - ~ — ~~ _ St —_ oe 0 Pl ee 6? ae, 4 “ > ~ a a a Re -ia Epo ‘Pe. near: ay ho omer, Saray res ea Ser Se - Yi a AAA en ee " A x A F _ > ‘ = eS " 二 - Ys = a a we. —_——- - ne. 二 . . > " . 1 =f ’ 7 =" = 本 四 “ Wi — re rage ange “os, ser tio ts, Fe ee Te Peay Cae ae Sey ee ee ee Dine : , le bid vl le 研究 了 甲 酰 腕 及 二 甲 基 亚 硕 的 影响 ; Herskovits, Singer 及 Gei- quschek7] 除了 上 渡 两 种 试剂 之 处 还 研究 了 二 甲 基 甲 酰 腕 及 数 种 醇 类 的 影响 。 这 些 和 车 有 果 都 指出 恰 水 力 对 螺旋 车 构 的 重要 性 。 所 。 有 这 些 溶剂 ,如 加 入 足 量 至 水 溶液 中 , 都 能 使 螺旋 千 构 破坏 ， 其 用 量 可 以 表示 腊 称 定 作 用 的 强 蚤 。 最 强 的 腊 稳 定 剂 是 二 甲 基 亚 硕 及 二 甲 基 甲 酰胺 ,它们 能 接受 氢 键 , AREER, 因为 它们 没有 活泼 的 所 。 醇 类 中 甲醇 及 乙醇 则 赤 好 。 这 些 和 结果 不 符合 氢 键 在 稳 jE DNA 的 车 构 中 起 主要 作用 的 看 法 ， 但 符合 愉 水 力 的 概念 。 根 ， 据 恰 水 力 的 概念 ， 有 机 洲 剂 的 胸 稳 定 作 用 是 它们 对 螺旋 内 部 呀 只 FM OE EET BHR. | - Lerman!’ 及 Luzzati, Masson & Lerman!) 研究 了 DNA 和 人 氮 草 、 氮 韶 橙 及 前 黄 素 等 染料 的 结合 。 此 等 染料 的 分 子 是 局 平 的 ;和 DNA 猪 合 时 ， 则 千 合 在 相 邻 碱 基 对 之 间 ， ERR eh 长 与 硬化 , 件 以 特性 粘度 的 大 量 增 加 。 沉 降 系数 只 有 很 少 改 变 , 毅 明 没 有 发 生 聚 合 。 这 现象 也 符合 上 壕 的 愉 水 力 概 念 。 也 应 当 考 虑 静电 吸引 力 对 DNA 稳定 性 的 作用 。 在 中 性 PH, 每 一 磷酸 基 团 带 有 一 个 负电 荷 ， 因 此 螺旋 上 的 电荷 密度 是 相当 大 的 。 但 由 于 一 个 磊 基 对 的 两 个 电荷 间 的 距离 狗 为 20 及 ,它们 之 HV OAR BEER. BERLE, BIRR 对 变性 温度 有 显著 影响 ,例如 在 0.1 M NaCl 中 , 小 牛 胸腺 DNA 的 变性 温度 在 90°C 左右 ,在 0.001 M NaCl 中 则 降 到 室温。 二 价 阳离子 在 隔断 电荷 的 作用 中 更 为 有 效 ， 如 10-* M MgSO, 可 以 在 ink DNA 稳定 。 (五 ) 胸 氢 核糖 核酸 的 降解 加 热 、. 酸 碱 、 超 声波.X 线 .DNA 酶 等 都 可 以 引起 DNA 的 降解 ,但 降解 的 机 制 则 不 相同 。 加 热 或 加 酸 碱 最初 引 起 DNA 变性 , 氢 键 断裂 , 继 之 以 磷酸 酯 ” 键 断 裂 ， 引 起 降解 ， 因 此 在 大 量 降解 发 生前 ， 螺 旋 的 双 链 已 大 至 BFR, DNA 酶 、 超 声波 、 驻 龙 的 作用 恰恰 相反 。- 以 粘度 及 260 毫 微米 此 外 吸收 妃 随 上 述 处 理 过 程 的 试验 显示 粘度 已 有 相当 大 的 下 降 时 ，260 毫 微米 的 紫外 吸收 则 并 未 上 升 cs9。 这 散 明 在 Ae ee . ~ Ree Re CIES A BS RB TH Ee 在 DNA HORMEL EE HP , RIPPLES BERET PADI BL), He Fe DNA 是 双 链 烙 构 的 理论 。 因 为 在 开始 时 , 双 链 的 相应 部 分 同 时 受 酶 的 作用 而 断裂 的 可 能 性 较 小 ,但 酶 解 过 程 继续 下 去 的 时 候 ， 这 种 可 能 性 增加 了 。 《从 降解 压 记 的 片断 的 分 子 量 与 沉降 未 数 之 间或 分 子 量 与 特性 粘度 之 间 的 一 定 关系 可 以 推测 DNA 的 分 子 构 型 。 在 “DNA 在 洲 液 中 的 分 子 构 型 ”一 节 中 已 沟 提 到 Doty 等 的 工作 。 Cox 等 ce JAX RSS te DNA 的 降解 ， 糙 果 指 出 分 子 量 (M) 与 特性 粘 度 ([5]) 服 从 以 下 关系 : [7]=kM?%， 属 明 分 子 烙 构 介 于 刚性 棒 (指数 为 1.7) 与 无 规 线 团 ( 指 数 为 0.66) 之 间 。 =, BoB ats (一 ) 核糖 核酸 的 X THO MRNA 的 浓 溶 液 中 用 玻璃 棒 率 引 的 方法 虽然 也 能 得 到 RNA 内 礁 ， 但 不 能 摄 得 清楚 的 X 绪 衍射 照片 。 这 可 能 是 由 于 分 子 的 排列 程度 不 佳之 故 。RNA 的 和 X 线 衍射 照片 如 图 25 所 示 s1。 求 源 于 酵母 小 牛 肝脏 ,小 牛 胸 腺 以 及 烟草 斑 粒 病毒 的 RNA iy XARA, TARR 明 不 同 来 源 的 RNA 都 具有 相同 的 精 构 ,但 也 可 能 照片 还 不 够 好 ， SRE HN een ie a m_° ¥ i. 图 25 RNA 和 峨 和 维 的 民 线 衍射 图 i A Sn TG Na Ra Ah Aa Ue aU a) RAG BASH AUCH BI iit. FIMO me 8.3~4.0 A 的 规则 间 隔 的 衍射 的 二 灯 重 复 距离 。 在 子午 线 的 13 A 和 4A PE A ok, RNA 和 DNA 的 量度 有 显著 的 类 似 ， 但 是 ， 根 据 驻 缕 衍 射 ABS ENR! oo ‘ ae tes «4, 人 v ‘ “iat 尽管 RNA 的 X AEN AMER BIE MELT CP HE Mo RAE ORBEA, MaRS 距离 是 25 一 28 信 ， 而 结晶 型 (A 型 ) DNA 的 则 为 28 A， 牛 结晶 型 (B 型 ) DNA 的 则 为 34A。 此 外 图 形 从 显 示 在 12~14 Aa 认为 是 有 螺旋 千 构 的 表示 "1。 赤 道 攻 街 射 点 不 够 清晰 , 因此 难 时 于 准确 地 测定 螺旋 的 直径 ,根据 估计 ,在 中 一 25 A 之 问 。 如 此 看 FARRAR AE REDS RNA 是 双 链 抑 或 单 链 反 折 狂 成 的 双 螺旋 分 子 。 q Zubay 及 Wilkins!**) 认为 RNA 可 能 类 似 DNA RSE 酸 的 略为 不 规则 的 混合 物 , 也 有 非 螺旋 区 。 q EEK, MAM eee X EATER EE 合成 多 核 昔 酸 都 具有 螺旋 结构 ,而 且 都 是 核 碱 在 里 面 ， 糖 -磷酸 链 在 外 面 。 多 腺 核 苷 酸 形成 双 链 千 构 。 在 中 性 ， 多 腺 核 昔 酸 与 多 尿 核 背 酸 互相 盘 红 形成 螺旋 复合 体 ， 其 结构 与 DNA 的 相仿 佛 。 但 是 天 然 RNA 是 否 也 具有 相同 的 车 构 ， 则 不 能 断言。 很 可 能 天 然 RNA 在 千 构 的 规律 性 上 上 比 合成 的 RNA 或 天 然 DNA Be (=) 核糖 核酸 的 核 碱 组 成 ”在 DNA， RE Slee KO 从 组 织 及 姻 胞 中 提取 的 一 些 RNA 的 区分 子 头 系 ， a + a 牛 肝 17.10 | 27.30 | 38.90 | 21.70 0.79 0.80 4 ae 19.70 | 26.70 | 33.40 | 20.20 0.97 | 0.80 | RG 19.40 | 29.50 | 30.70 | 20.40 0.95 0.96 海胆 ， 22.56 | 29.42 | 27.19 | 20.82 1.09 1.09 酵母 25.40 | 24.60 | 22.63 | 27.37 0.93 1.09 粘 质 沙 赴 氏 菌 20.30 | 31.20 | 24.30 | 24.10 0.84 1.28 KR 25.30 | 28.80 | 24.70 | 21.20 1.19 1.16 REIT 20.85 | 20.75 | 27.10 | 21.25 0.98 | 1.18 aN? ay ibs 四 】 ‘ rr a atti 1 es | EES ep arn en .但 在 RNA， 有 不 能 配对 的 环 状 部 分 (成 环 作用 , 见 下 女 )。 四 天 方法 已 有 很 大 进步。 Fraenkel—Conrat**] 及 Gierer 及 Sch- ramm®*9) 3261, MIG SEO TETHER PERE, BE PHONO HEAL TRMARE I. FRNA 的 分 子 量 过 去 有 过 等 论 。 最 近 认 为 未 降解 的 样品 所 测 得 的 分 子 量 一 般 竺 超过 10° ( 表 7 ), 早 期 获得 的 数值 , 在 1 或 10° 以 下 的 ， 表 示 样 品 有 降解 。 烟 草 斑纹 病毒 核酸 的 分 子 量 多 过 许多 人 的 测定 ,都 认为 在 2x10* 上 下 。 由 此 可 见 RNA HF HAE DNA 的 小 太 多 ， 如 果 烟 草 斑纹 病毒 RNA 证 明 是 单 链 螺旋 , 则 二 者 的 一 条 多 核 苷 酸 链 的 分 子 量 是 很 近似 的 。 RNA 高 子 的 长 度 因 洲 液 离 子 强度 的 改变 而 不 同 。 Hopkins & Sinsheimer®") 以 光 散 射 法 测 出 RNA (烟草 斑 和 纹 病 毒 ) 分 子 Hef auth 1 ( 表 6 )。 这 可 能 是 由 于 RNA 具有 非 螺旋 区 , 久 及 “三 ) 在 溶液 中 核糖 核酸 的 形状 和 大 小 ”近年 来 , RNA 的 担 的 长 度 为 1600A， {AMA ARKH 1050A, Boedtker (100) 测 出 烟草 斑 坟 病毒 RNA 的 均 方 个 径 为 300A， Timasheff 等 69 测 出 腹水 癌 的 高 分 子 RNA 的 均 方 后 径 为 320 A( 在 0.02 M 磷酸 钠 及 0.08 M NaCl 中 ), 和 全 伸展 时 的 长 度 比较 , 襄 明 分 子 不 RT 不 同样 品 的 RNA 的 分 子 量 源 ， 分 子 量 x 10-5 油性 2 B GBC 献 酵母 1.0~3.0 沉降 ， 特 性 粘度 [91] TAR 1.5 ” 光 散 射 [93] BU 2.64 | 沉降 - [93] 牛 肝 1~8 沉降 ,特性 粘度 [91] KASEI 2.0~2.9° 沉降 ,扩散 [94] A ERA: 1.5~1.8 沉降 ,特性 粘度 [94] iA ERUA 16 沉降 ,特性 粘度 [95] KA EBA Te 10~20 沉降 ,特性 粘度 [91] 烟草 斑纹 病毒 11 光 散 射 [96,97] 腹水 癌 11 光 散 射 [98] 一 93 — 是 棒状 ,而 是 具有 高 度 盘 线 的 构 型 。 Boedtker‘* 指出 RNA 的 特性 粘度 依 宛 子 强度 而 改变 。 将 烟草 斑 科 病 毒 RNA 溶液 的 离子 强度 由 雳 二 这 0.2(p 互 保持 中 性 )， 则 其 特性 粘度 下 降 两 倍 。 这 表示 分 子 有 和 柔韧 性 ,但 下 降 程 度 】 AK, 此 点 很 难 理解 , 尤其 是 Hopkins 及 Sinsheimer!"! Rie 报告 烟草 斑 和 蒋 病毒 RNA 在 离子 强度 为 雳 时 是 棒状 构 形 。 离 子 强 】 度 对 大 肠 杆 菌 RNA 的 粘度 则 有 较 大 的 影响 ， 离 子 强度 从 雳 增 至 时 0.2 时 ， 特 性 粘度 下 降 60 倍 Pe9。 因 此 不 同 来 源 的 RNA 在 和 结构 上 也 可 能 有 不 同 之 处 。 RNA 的 粘度 也 依 温度 而 改变 。Boedtkerc"] etm CW 毒 RNA J 6°C 增 至 25"0 时 ,发 现 粘度 增加 50 匈 , 但 改变 是 可 敌 慎 的 ， 与 此 观察 相符 合 , 光 散 射 测定 显示 分 子 因 温度 的 增加 而 每 张 ， 上 sbecliminmngimmtalalitelilatiniie PID. } RNA Wye A IES. Sem SFB Ee BOLT St PRE, 在 0.1M 以 上 NaCl 中 , 流动 双 折射 变 为 弱 人 值 。 这 与 DNA fa, DNA 具有 强 负 值 的 流动 双 折射 。 j 8 GRE my TMV RNA ATH BK T (°C) M.(x10") | 均 F 中 @ nsp/¢ : 开 始 6 2.0 306 A 0.725 ) 25 1.9 375 A 1.10 | 恢复 至 6 1.9 326 A 0.82 ; | 游 剂 是 磷酸 缓冲 液 0.06 B 子 强度 ， pH 8.5, | MPM RNA 都 有 高 度 的 低 色 性 。 低 色 性 傅 温度 而 改变 。 光 度 升 高 则 低 色 性 降低 ,但 影响 是 比较 徐 绥 而 不 是 突然 的 。 转变 温度 的 高 低 与 RNA 的 化 学 成 分 有 关 ， 篇 便 味 只 含量 增加 时 则 转变 温度 升 高 ks， 但 有 一 点 与 DNA 不 同 , 即 在 温度 升 高 时 所 引起 的 紫外 吸收 的 增加 是 完全 可 道 的 。 天 然 RNA 在 低温 有 较 高 的 比 旋 度 ( 右 旋 )。 在 20°C, 烟草 斑 ae Ls fy RNA 的 此 施 度 网 为 +190etea， 但 在 80°C 则 降 至 接近 BUEN NESE AUN te TN, Doty RIAU wi RNA 分 子 中 有 多 数 不 完 整 OR 许 区 ,温度 上 升 至 一 定 程度 时 螺旋 千 构 转 变 为 无 规 线 团结 构 。 根据 温度 对 RNA 的 低 色 性 和 比 旋 度 的 影响 ，Doty 等 cs5 提 Hatt RNA 螺旋 程度 的 方法 。 假 定 合成 的 多 腺 核 背 酸 和 多 RABE BRINE Atk (Poly A + U) 在 低温 的 螺旋 程度 为 100 匈 ， 加 温 至 一 定 程度 可 以 使 螺旋 程度 降 至 雳 ， 比 较 Poly A+U 和 天 然 RNA 在 低温 及 高 温 间 的 低 色 性 或 比 旋 度 就 可 以 估计 出 天 然 样品 ， 的 螺旋 程度 。 使 用 此 法 ，Boedtkerrto21 估计 烟草 斑 蒋 病毒 RNA 的 螺旋 程度 是 60%, » Timasheff 等 cs] 以 Luzzati 氏 的 绝对 小 角度 X KERR 究 了 了 RNA,， 发 现在 稀 盐 溶液 中 RNA 分 子 具 有 短 的 刚性 棒 烙 构 ， 其 单位 长 度 的 质量 和 厚度 和 DNA 的 相似 。 棒 状 烙 构 虽 对 蒸 饮水 透析 数 小 时 后 仍 保持 不 变 。 棒 状 糙 构 占 RNA 总 质量 的 9095， 此 数值 较 Doty 的 估计 高 很 多 。 总 之 ， 对 RNA RARE TM, MU RNA 具 有 较 DNA 和 柔韧 的 辣 构 ， 具 有 部 分 螺旋 区 ， 螺 旋 的 规律 性 也 吏 DNA 为 低 , 螺 旋 是 双 链 棚 成 抑或 单 链 反 折 粗 成 ,还 不 清楚 。 (四 ) Doty 等 关于 核糖 核酸 二 级 结构 的 “成 环 ” 假 说 ”最近 Doty 等 2o9 对 RNA 的 二 航 烙 构 提 出 一 个 所 谓 “ 成 环 ” 假 裔 。 根 据 他 们 过 去 的 工作 ， 诈 明 RNA Ae eR HER (40~60%), 18 是 有 两 个 问题 未 能 得 到 解决 ， 一 是 占有 大 狗 牢 数 的 碱 基 是 如 何 适 当 生 入 这 些 螺旋 区 的 ; 二 是 螺旋 区 的 长 短 如 何 。 关 于 这 方面 的 间 题 ,他 们 从 以 下 的 研究 得 到 启发 。 Fresco 及 Albertrtos1 发 现 含有 一 些 杂乱 排列 的 尿 核 昔 酸 的 多 聚 腺 核 背 酸 链 仍然 可 以 和 多 聚 尿 核 苷 酸 链 千 合成 双 链 螺旋 。 同 样 ， 含 有 一 些 腺 核 背 酸 的 多 聚 尿 核 昔 酸 链 也 可 以 和 多 聚 腺 核 音 酸 SHAKE Le TED ees, 因此 他 们 推测 在 形成 螺旋 时 ,不 能 成 对 的 碱 基 可 能 形成 < 环 ” 而 被 排出 于 螺旋 之 外 。 据 此 Doty 等 ee 认为 天 然 了 NA 也 有 同样 情况 。 如 果 有 万 IME, 则 碱 基 问 可 能 形成 的 氢 键 数目 将 大 为 增加 ， 例如 2274 意 排 列 的 核 上 酸 租 成 的 多 核 音 酸 最 多 只 能 形成 三 个 氢 键 ， 平 均 罚 两 个 ， 如 果 尤 许 成 环 ， 则 最 多 可 以 形成 七 个 氢 键 ， 平均 为 6 个 (图 26)。 Ms BX, . G 7-6 任 村 ‘ NA or= > pU=---A y ’ ‘ A 1 a en OTE by A G (a) G---C , ae: ye ce YA--- a 3 C-G---C A C¢-U-C-U AD 图 26 ”核糖 性 酸 的 成 环 作用 成 环 的 烙 果 会 使 螺旋 的 稳定 性 下 降 。 这 是 由 于 % 环 ?的 形成 成 负电 荷 的 堆积 而 增加 静电 斥 力 所 致 。 同 时 ,“ 环 ”会 对 邻近 的 螺 必 旋 区 造成 张力 。 以 Tu (转变 温度 范围 的 平均 值 ) 值 为 螺旋 稳定 性 的 指标 ,多 聚 AU 及 多 聚 吕 的 螺旋 (A 代表 腺 核 音 酸 , U 代 表 尿 核 】 FPR) ,在 成 环 的 核 背 酸 残 基 不 超过 1/3 时 ， 能 在 25°C 稳定 ， 在 此 ， 复合 体 中 只 有 多 聚 AU 键 上 有 环 。 。 在 天 然 RNA 的 情况 下 ,应 当 形成 螺旋 的 双 股 都 有 环 ， 这 可 能 | ”使 螺旋 的 稳定 性 更 为 降低 ， 但 天 然 RNA 具有 较 强 的 饲 便 嘎 哈 和 ， 胞 喀 啶 间 的 氢 键 ， 可 能 补偿 上 述 影响 而 有 余 ， 因此 推测 在 天 然 ， RNA '} , BEGEA 1/3 核 苷 酸 残 基 形成 环 , 仍 能 在 25°C BE. 螺旋 优 短 则 Tu BA, Doty 等 以 长 链 多 聚 了 和 不 同 长 度 的 短 链 多 聚 A 糙 合 , 观 察 其 Tu， 灶 果 指出 当 多 聚 A 的 核 彰 酸 数目 为 ， 4 对 ，T。 狗 为 25"0。 天 然 RNA 由 于 有 篇- 胞 键 ， ee 的 稳定 程度 ,因此 推测 在 20°C, ASLAM RE EMRE eI Hi Doty 等 的 假说 有 下 列 特 征 。 1. RNA 是 单 链 分 子 , 其 二 和 级 结构 是 分 子 内 部 的 相互 作用 而 ， 产生 的 。 1 pea 4 « , . G---C U-y. - Sal ' + ie rN a ' Nay a=, vy - % o \ > ‘ ” ul 7. SN c ~ *~ (b) Sonn Saas: & 2. 几 种 可 能 的 二 般 和 结构 中 以 DNA 型 的 双 链 螺旋 最 为 稳定