人 八 K 结构 .功能 与 合成 (上册 ) ER FS eee 生物 化 学 丛书 核 Be 结构 .功能 与 合成 oe ERE BER 主编 a 4 -一 人 FF 4 ~H- e ev: Pe a a | lJ \ id Mi 1 中 科 院 植物 所 国 书包 WA $0011891 at 2 mm ke 社 1986 A & fi 介 本 书 根 据 中 国 科学 院 生 物化 学 研究 所 于 1979 年 和 1983 年 举办 的 大 型 生化 训练 班 教材 补充 修改 而 成 。 内 容 包括 核酸 的 结构 (一 级 结构 和 高 级 结 构 )、 主 要 生物 功能 《复制 .转录 和 翻译 ) 与 人 工 合成 (化 学 合成 和 酶 促 合 成 ) 的 基础 知识 及 新 进展 。 同 时 也 介绍 近年 来 研究 较 多 的 具有 生物 活性 的 核 苷 酸 类 化 合 物 以 及 一 些 较 新 的 核酸 分 离 纯化 方法 。 分 上 下 两 册 出 版 。 本 册 主 要 内 容 是 核酸 的 成 分 和 结构 。DNA 的 复制 、 转 录 与 加 工 等 。 本 节 可 供 生物 化 学 、 分 子 生 物 学 分子 遗 传 学 研究 工作 者 和 高 等 院 校 包括 研究 生 在 内 的 有 关 专 业 师 生 参 考 。 生物 化 学 丛书 核 酸 结构 、 功 能 与 合成 aw 册 斑 德 宝 ， 祁 国 荣 主编 EMR RAM Exe me iH RK IER BRNIAKGS 1375 «© +4 sito AS Dhl 新 华 书 店 北京 发 行 所 发 行 ” 各 地 新 华 书店 经 售 来 1986 年 11 月 第 — Rm 开本 :787x1092 1/16 1986 年 11 月 第 一 次 印刷 印张 : 12 5/8 印 数 : 0001 一 3,150 字数 : 276,000 统一 书号 ;: 13031。3334 本 和 社 书 号 : 4055。13 一 10 = ft: 3.00 元 Fr 生物 化 学 研究 所 举办 的 生化 训练 班 始 自 1950 年 ,开始 时 着 重 实验 室 训 练 ， 我 们 的 目 的 是 为 了 使 青年 生化 工作 者 掌握 这 门 学 科研 究 的 一 些 新 方法 、 新 技术 。 以 后 随 着 我 所 高 研 人 员 的 增多 ,又 落 加 了 讲课 内 容 ,围绕 当时 的 生化 生长 点 ,系统 地 讲述 国际 生化 的 新 进展 。 课文 内 容 逐 渐 发 展 充实 ,并 结合 在 上 海 科 技 大 学 讲授 高 级 生化 课 的 需要 ,编写 成 高 级 生化 训练 班 讲义 。 1960 年 中 国 科学 院 在 上 海 召 开 第 一 次 全 国生 化 学 术 会 议 , 会 议 期 间 各 地 代 表 纷 纷 要 求生 化 所 举办 一 次 大 型 高 级 生化 训练 班 ， 为 全 国 各 有 关 单 位 培训 生化 人 才 。 因 此 ,生化 所 于 1961 年 举办 了 一 次 有 四 百 多 学 员 参 加 的 高 级 生化 训练 班 ， 以 系统 介绍 生化 学 科 新 知识 为 主 ,部 分 学 员 并 参加 了 实验 训练 。 十 几 年 来 ,我 们 发 现 通过 该 次 训练 班 学 习 的 学 员 ， 大 部 分 已 成 为 各 有 关 单 位 的 生化 科研 或 教学 骨干 。 这 个 发 现 给 予 生 化 所 同志 以 极 大 鼓舞 。 文化 大 革命 "中 ,高 级 生化 训练 班 横 遭 批判 ,但 1972 年 以 后 ,各 方面 仍 不 断 有 呼声 ,要 求生 化 所 再 次 举办 高 级 生化 训练 班 。 1976 年 我 们 在 所 内 作 一 次 小 型 尝试 ， 着 重 发 挥 部 分 中 级 科研 人 员 在 教学 中 的 作用 ,包括 从 编写 讲义 到 讲课 。 1979 年 在 中 国 科 学 院 一 局 的 催促 和 支持 下 ,为 克服 住宿 的 困难 ,我 们 再 次 在 沪 杭 两 地 同时 举行 一 次 大 型 高 级 生 化 训练 班 , 人 数 近 五 百人 ,课程 内 容 大 为 扩充 ， 包 括 十 余年 来 进展 最 迅速 的 生化 或 分 子 生 物 学 领域 ， 如 分 子 遗 传 、DNA 重组 、 生 物 膜 、 免 疫 生化 等 等 。 为 适应 国内 广大 生化 工作 者 的 需要 , 特 将 上 述 讲 课 内 容 整 理 成 书 , 分 册 付 印 , 定 名 为 生物 化 学 丛书 "。 本 丛书 已 经 出 版 了 三 分 册 ， 即 《蛋白 质 化 学 》《 酶 的 作用 原理 》 和 《生物 膜 的 结构 与 功 能 》。 在 此 分 册 付 印 之 前 ， 生 化 所 又 于 1983 年 在 上 海 科技 大 学 和 第 二 军医 大 学 举办 了 大 型 高 级 生化 训练 班 , 因 此 本 分 册 吸 取 一 些 近 几 年 内 核酸 领域 中 的 重大 进展 以 充实 内 容 , 如 我 国 酵母 丙 氮 酸 转移 核糖 核酸 的 人 工 合成 ，DNA 顺序 测定 方法 的 新 进展 以 及 DNA 结 构 的 一 些 新 发 现 等 等 。 今 后 , 随 着 本 门 学 科 领 域 的 发 展 ， 本 丛书 亦 将 尽量 补充 新 内 容 , 并 望 国内 同行 对 本 书 内 容 不 音 批 评 指 正 , 供 今后 再 版 时 修改 参考 。 illlg x BR 前 言 ” 核 酸 的 历史 和 文献 简介 .et ERY (vii) es BE 4-10) 02) eee eee eee eee HH (1) 区 (2) = 成 糖 ososooosooosooooosoooooooooooooooeoooooooooooooooooooooeosooeooooooooooooooooooooosooooes。 低 : ) poy °4 = ee ore C3) DU, 核 苷 酸 ene ce ence eeecceeescceeeecceeeeceseeneecceeeseerenesepnangeenensceemsecreeesetecssons (11) 五 、 核 酸 成 分 的 缩写 符号 及 核 苷 酸 在 核酸 链 中 的 表示 方式 crretteeeeseeeseteeseees (12) 六 、 核 酸 成 分 的 分 离 览 定 pp (13) 第 二 章 DNA 结构 pp SRM AAR (15) I Hay in oa wn in wn on ole alee nese nad anny recanssspaurns und «¥sedeenamnaguactsove (16) I loosen ox ens te Nada As a a cg eta gS (17) ee (18) Wp FB PER --rerneenserecrcceesesesteveascesecssnncctsensesscnsnccensceecesnnsnscessessaccesneecossesseecsecs (20) 测定 DNA 顺序 的 方法 ee (21) = DNA JI RE Brewer eee ee eee e ec ec ence ce ecee enc eneeceeeeeeteeeeeceneeeseeseseenseeeeeeaseens (28) 原核 生物 DNA 顺序 组 织 ee (28) BREAD DNA 顺序 组 织 站 全 全 仙人 ph neue caniadanehiosvne 6 ue etindele seseacieardaneunenceann (35) =. DNA 国光 年 的 六 和 和 人 eect re 人 (41) DNA 双 螺 旋 pe (41) 双 螺 旋 结 构 的 研究 动态 pp (46) Dd ry p= 0 eee stneeeeseeeeeeseneenncsneeassnsesacensensasenscsnsensensassassnsenreansansananesatens (48) DO, DNA (R= Fee Hine ees cee ccc rnccceccnescccccscesescnsscnsessnasessnnsecsansebs cncensens (53) 超 螺旋 ee (53) 生物 体内 的 超 螺旋 。eee ee (56) 第 三 章 RNA 结构 PP REF WH (61) 一 、RNA 的 结构 pp (63) BR Aceseescageccceccqccecccencdsnqencagscananencaccneccqennccacsnascngaaces sdaubbdudeadeusacedasace socces sas (63) FRINA . ccccacoceccccccccccccceqccccccccacccccncancccccccaccccccncbescsccccos ccnsssccccesececcedanccecesccecce (71) 0 (82) RNA BERTIE AK BY Bien eee veneer sree ccveesncscreaseneenasccsenamasancseoeesors (92) BB SA PAW 0200 snynnsenesessesecasnanansnsitsasaannenntoneneannociodsnnawesennndusn Seviiyat eave tet sat (92) FTIR -ceceevccsccccccnsrenscnsncscccscnscnsseneencescnsecnsascccnccncscessseneseassscesssoscsenenscsegeens (94) 2 (95) EE ANAT SEAIBE ocescecescovensecavssccssgevesccpusaeetceseuescnspaanninsacyacie nn asoush candi. do giiMitnass (96) 三 、RNA —SR PATE Beeeenee ere encescenscccntecescrotenssenescsceasadeossseuameaneres (97) 直 读 法 :ee (100) 第 四 章 DNA 复制 pp SPM AAR (104) 一 ”复制 机 制 (105) DE PAGES Ba acsencnsnsecnsonorssssscecserensenssenercss ones tuacsnasensnedasyecoungsenessooss¥eouantennaay (105) OFT SRF Ty Tho nnn cence cc cesenececscccecenecesseceecsnssessesseencansenccesse nen ean ones senesasenas (109) eh IN AVE WES AI Dy [Al --v eve cen nce cee 全 全 全 半生 全 全 生计 全 (110) 半 不 连续 复制 .ee (113) RNA BG c-sescccnseecsnenosseccesoeseaccereeserseneoaneesensusybe soedeedgunsasb« «cube wes aeiunaeanenE (114) 引 | 大 下 和 ne 人 (115) GES TIE [ene ee eee eceeeeceeseeceescecstaeeceesenscessseneetsanaseecseeeneecescneeeteetsenerssaereeeneeewens (117) 链 的 终止 ooeeooeeoeooeseeoseoeeoosooovosooeooosoosooooioooooooieooocooooooooooooooooooovooviaaoodoiseoss (118) SHEA RSE i enennccecceeneccnecerenscncceceeececeeenesencesencesseseenretsesseeesseeeeeraueesreseanane (118) J]\G ee nvee ee eneceesencneceeeeeeeeseeeeeseenseerenseteeeecteetectenscetcensstenscecsnerersesenensneeessesenees (119) = DNA Be BRA] DNA 连接 酶 fee-0cc00c0eceaete cesses serene (119) 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 工 站 pe (119) 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 下 pe 人 (123) 天 鹏 杆菌 :ONA BB -Avige TI ZORy ots sta seuss dane sndy-o90ten Meekdecnesen anny caste reef (124) 真 核 生 物 中 的 DNA 聚合 酶 ee (125) DNA 连接 酶 ee (126) =. DNA 双 螺 旋 的 解 开 PN (126) 单 链 结合 蛋 和 ee (126) DNA 解 链 酶 ee (127) 拓扑 异 构 酶 I oer eeeececececceccceccccecseeencsececeetecseesaesecsecsaneeesesseeseetessessessaeseeeserans (128) 拓扑 异 构 酶 匡 .eeeeeeeeeeeeeeee (129) 四 、 真 核 生 物 DNA 的 复制 pp (131) $3 | \ ER FURY fe ---nveecccnsnsecssossnssnteesenscosecsenscscoeseneaetoessccoeconsquscsunenescacsaseshonne (131) 4p Hea FE A BS al Bp == ee cee nn snsccccecsnscceccccesscccseescceccanssssansaessccacseesensesseesens cesses (132) DNA 复制 单元 或 复制 子 pe (133) 染色 体 的 合成 .ee (133) Fly DNA 复制 的 调 探 ppp (133) 第 五 章 Lis ap) ee eo RS (138) 一 、RNA 聚合 酶 pe (138) 原核 生物 RNA 聚合 酶 .ee (139) , 真 核 生 物 RNA 聚合 酶 .ee (140) 二 、 转 录 的 机 制 pp (141) dete SY eee eee ceeaeeeecanececanseecsscescaaseccnsusesseunesesenescesauenssaeeeesessunseesanseesaneeeseee (142) RNA 链 的 延伸 .ppp (143) 和 (144) 三 、 转 录 的 抑制 章 ccc ece eee rece eeee eee eeeuteeneseeeeesseneecneeeeerseeenseeseenseeseeeae eens (148) 与 DNA 模板 作用 的 转录 抑制 剂 .pp (149) 与 RNA BERGE FA ADEE SEH AA Fl ce ceeeeeeeeeeeeesesecaeceeeeeceeeenrerrarsessaeseeseeseecesenerens (152) Pd, mRNA 的 转录 与 加 工匠 (153) mRNA 概念 的 提出 和 m RNA 的 发 现 pp (153) 原核 生物 mRNA 的 转录 .pe (155) 真 核 生 物 中 RNA 的 转录 与 加 工 .ee (161) 五 、rRNA Wn: SE ==: oe 9) eee (170) rRNA 基因 与 rRNA 前 体 pe (170) rRNA 前 体 的 加 工 间 pe (171) BOI ROE Ya es Rteeneeeseeeseeesetesensen 人 (176) 7. tRNA 的 转录 与 加 工 adsiceeiecigne caetennere semee raceme eee ss asics ces ae 起 (177) CRNA 基因 与 tRNA 前 体 pe (178) CRNA 前 体 的 加 工 间 pe (182) Vs a” 全 ‘MS,’ Sartre eee sh thew me eo 1 < asd ° se im =e! ' as - \ | 而 1 - ‘ re. E a 到 和 oY 和 iy, 阿 “9 : , 和 © eee «3 J mt rt « rt P “*< 3 te “Te hy ty a vo Rit he. , ve Big ae ak 22. 前 言 “” 核酸 的 历史 和 文献 简介 EM 是 十 八 世纪 后 期 从 鸟 状 和 人 尿 中 发 现 尿酸 ,这 是 世界 上 发 现 的 第 一 个 叮 吟 化合物, 十 九 . 世纪 又 相继 从 膀胱 结石 中 找到 黄 叮 哈 ， 从 鸟 羡 中 找到 鸟 ( 便 ) 味 叭 ,从 牛 脾 找到 次 黄 味 叭 ， 这 些 都 是 发 现 核 酸 以 前 的 一 些 重要 发 现 , 当然 , 味 叭 究竟 具有 怎样 的 结构 ,上 述 几 种 嗓 吟 化 合 斩 有 什么 生物 意义 或 功能 ,在 当时 是 不 清楚 的 。 差不多 与 此 同时 ,生物 学 家 们 发 现 了 细胞 核 ,并 且 认 识 到 细胞 是 生物 体 的 基本 组 成 单 位 ,是 由 细胞 核 及 其 周围 的 细胞 质 组 成 。 1868—1869 年 瑞士 Basel 青年 科学 家 Friedrich Miescher (1844—1895) 到 德国 Ti- bingen, Bi F. Hoppe-Seyler 学 习 , 研 究 细胞 核 的 化 学 成 分 。 他 以 实验 室 附 近 的 外 科 医 院 收 集 到 的 绷带 为 材料 ,把 脓 细 胞 从 绷带 上 洗 下 来 , 先 用 胃 酶 盐酸 混合 液 消 化 这 些 脓 细胞 , 再 用 乙醚 抽 提 ,细胞 核 留 在 水 相 , 沉 在 器 严 底 部 ， 可 用 过 滤 的 方法 收集 。 从 这 样 得 到 的 细胞 核 中 ,他 提取 得 到 一 类 化 合 物 , 呈 酸性 ,不 咨 于 稀 酸 , 但 能 溶 于 稀 碱 , 而 且 含 有 相当 量 的 磷 元 素 。 这 一 点 引起 了 Miescher 的 重视 ,因为 在 当时 从 动物 组 织 中 得 到 的 含 磷 化 合 物 只 有 卵 磷 脂 一 种 ,也 是 Hoppe-Seyler 实验 室 的 人 发 现 的 。 Miescher 把 他 新 发 现 的 化 合 物 命 名 A“ ia” (Nuclein) ,并 将 他 的 实验 结果 写成 论文 送 给 Hoppe-Seyler。 为 了 慎重 起 见 ，Ho- ppe-Seyler 没有 马上 发 表 , 而 坚持 要 末 和 目 重 复 Miescher 的 实验 ,等 得 到 同样 的 结果 后 ， 才 把 Miescher 的 论文 和 他 自己 重复 的 结果 在 他 所 主编 的 杂志 上 同时 发 表 了 。Miescher 发 现 的 核 质 ,实际 是 含有 有 蛋白质 的 核酸 制品 ， 以 后 R. Altmann 制 得 不 含 蛋白 质 的 核酸 ,并 首先 使 用 核酸 ”命名 他 的 制品 ,这 是 Miescher 发 现 核 酸 二 十 年 以 后 的 事 了 。 自 此 以 后 ,核酸 吸引 了 不 少 著名 化 学 家 的 注意 ,他 们 对 核酸 的 组 成 成 分 感到 兴趣 ,用 各 种 方法 分 解 核 酸 , 并 从 中 分 离 得 到 叮 叭 碱 \ 喀 啶 碱 \ 核 糖 \ 脱 氧 核 糖 等 。 其 中 贡献 最 大 的 是 A. Kossel 和 他 的 学 生 们 ,以 及 P. A. Levene 和 他 的 同事 。 玉 ossel SRT RIK ICR BS AW SE J. Piccard 发 现 的 ) 核 酸 中 常见 的 其 他 四 种 碱 基 , 即 腺 味 叭 、 尿 旷 啶 、 胞 喀 啶 和 胸腺 喀 啶 -Levene 等 则 对 核糖 ,2- 脱 氧 核 糖 \ 核 苷 和 核 背 酸 的 鉴定 等 作出 了 贡献 。 但 是 核酸 究竟 具有 怎样 的 结构 ,大 小 如 何 , 在 生物 体内 起 什么 作用 ,有 什么 功能 ,直到 本 世纪 初 仍 然 不 知道 甚至 从 事 核 酸化 学 组 成 研究 了 几 十 年 的 Kossel 也 认为 核酸 没有 多 大 的 重要 性 ,因而 于 1905 年 改行 研究 细胞 核 中 的 碱 性 蛋白 质 。. 不 久 第 一 次 世界 大 战 发 生 , 当 时 世界 核酸 研究 中 心 的 德国 是 参战 的 主要 一 方 , 核 酸 的 研究 当然 受到 影响 而 停顿 下 来 了 。 直到 本 世纪 二 十 年 代 ， 核 酸 的 主要 来 源 是 胸腺 和 酵母 。 从 胸腺 得 到 的 核酸 含 胸腺 喀 啶 ,从 酵母 制 得 的 核酸 则 不 含 胸腺 喀 啶 而 含 尿 喀 啶 ,其 他 三 种 碱 基 , 即 腺 味 叭 、 鸟 味 叭 和 胞 喀 喧 则 两 者 都 有 。 另 外 还 有 一 个 差别 ,就 是 从 胸腺 核酸 得 到 2- 脱 氧 核糖 ,而 酵母 核酸 则 含 有 核糖 。 限 于 当时 的 技术 水 平 , 从 其 他 动物 组 织 制 得 的 核酸 都 类 似 胸 腺 核酸 ,而 从 麦 胚 这 样 的 植物 来 源 的 则 和 酵母 核酸 相同 ， 因 此 一 度 以 为 核酸 可 以 分 为 动物 核酸 和 植物 核酸 两 e ViIl 。 大 类 。 以 后 发 现 无 论 在 动物 或 植物 细胞 核 内 部 都 可 找到 胸腺 核酸 类 型 的 核酸 ,而 在 细胞 质 内 却 含 有 象 酵母 那样 的 核酸 ,于 是 不 再 有 动 植物 核酸 之 分 。 而 出 现 了 核 灶 核 酸 (RNA & 核糖 ) 和 脱氧 核糖 核酸 CDNA 含 脱氧 核糖 ) 这 样 的 分 类 ,一 直 沿用 至 今 。 最 近 有 人 从 艾 氏 腹水 瘤 中 找到 含 葡萄 糖 的 核酸 ,叫做 葡萄 糖 核酸 (GNA) ,其 功能 还 不 清楚 。 无 论 RNA 或 DNA 都 是 由 许 许多 多 核 背 酸 组 成 的 。 核 昔 酸 则 由 含 氨 有 机 碱 ( 咱 叭 AURA GE) CRORE) = MRR. BORA ES 酯 (磷酸 和 相 邻 两 核 昔 酸 的 戊 糖 形成 的 ) 键 连接 起 来 的 。 由 于 当时 实验 条 件 的 限制 。 核 酸 分 子 的 大 小 是 不 清楚 的 ,但 是 从 分 析 结 果 看 ，RNA 或 DNA 都 含有 四 种 碱 基 , 它们 的 克 分 子 2 比例 接近 于 1:1:1:1, 因此 出 现 了 “四 核 蔡 酸 * 的 说 法 认为 核酸 就 是 四 核 音 酸 或 者 四 核 苷 酸 的 重复 。 现 在 看 来 四 核 背 酸 的 说 法 当然 是 错误 的 。 简 单 而 明显 的 理由 是 ;最 小 的 核酸 的 分 子 量 也 有 几 万 道 尔 顿 , 不 可 能 是 四 核 昔 酸 ; 核 酸 中 四 种 常见 碱 基 的 克 分 至 比 坟 Fee | « : Bi : A GAS s ber | | 和 ee ]5 eS i ee ag Nees / 1 个 eae iy: Pi ba Lv Ly | e ¢ a ‘ is 所 名 4" a | ' r ) 4 if . ~ gays : atv OR j & A ; ; i k oak by ee Sa ee ee bi i gt Re ns Aa TI Res * 本 ry 和 Fe e 站 A qe . es 加 / 《 Ee ‘ 7 i Wiad ti “« i ade 4 y i ’ ty 时 sa Pie) fr Pee 7 F ; hohe 好 ne . . wie iia ra ual tg." Ho a. | 4 四 ; i wy # ’ ‘ + a ¥ . We Ty 2g fal 有 : ery eae se ; 地 “ . ao Aa co) ee WBNS | My 第 一 章 核酸 的 成 分 th HOR 核酸 的 组 成 单位 是 核 苷 酸 , 核 苷 酸 由 含 所 有 机 碱 碱 基 )\ 戊 糖 和 磷酸 三 者 构成 。 核 昔 骏 组 成 核酸 链 的 模式 如 图 示 : 图 中 BB, Bess Boi, B, 代表 任 一 相同 或 不 同 的 碱 基 ; 若 R 是 OH 则 成 糖 为 核糖 。 本 1 四 由 它 组 成 的 核酸 为 RNA。 若 R 是 互 则 成 糖 为 脱氧 核糖 ， 构 成 DNA， 此 外 在 某 些 RNA 中 ,少数 R 可 以 是 OCH:; 图 中 方 框 分 别 代表 3- 核 音 酸 (由 碱 基 、 戊 糖 和 3 位 上 磷酸 根 构 成 )、5 - 核 苷 酸 ( 磷 酸根 连接 在 戊 糖 的 5 位 上 ) 和 核 背 (只 由 碱 基 和 成 糖 组 成 ) 残 基 。 核酸 的 成 分 早 在 上 世纪 末 和 本 世纪 初 已 经 确定 ( 见 前 言 )o 即 RNA HRA, SH 酸 \ 胞 苷 酸 和 尿 昔 酸 组 成 ,而 DNA 组 成 分 为 脱氧 腺 背 酸 脱氧 岛 音 酸 、 脱 氧 胞 昔 酸 和 脱氧 胸 昔 酸 。 但 是 近 一 、 二 十 年 来 在 不 同 核酸 分 子 中 陆续 发 现 为数 众 多 的 修饰 成 分 〈modified component)， 据 不 完全 统计 有 近 八 十 种 。 所 谓 修饰 成 分 就 是 除了 上 述 八 种 主要 成 分 外 ， 存在 于 核酸 中 含量 较 少 或 很 少 的 成 分 ,它们 绝 大 部 分 是 主要 成 分 的 衍生 物 , 有 的 修饰 成 分 的 结构 非常 复杂 , 则 被 叫做 高 度 修 饰 成 分 〈hypermodified component), 核酸 中 的 修饰 成 分 与 主要 成 分 的 连接 方式 完全 相同 ， 即 它们 的 糖苷 键 均 为 8- 构 型 ， 也 都 是 通过 3’, 5 -磷酸 二 酯 键 联 成 核酸 链 。 —. BAAD (WE) 2A BAA RBH Bade EB Ay ERY AR SE TE. ACRE DNA 或 RNA = Beane qe MARR USE. FE DNA PABY Sa Be ame TE Dy A Hee ee A He DR ET 蔡 胸腺 喀 啶 则 构成 RNA 中 两 个 主要 喀 啶 碱 ,它们 的 结构 式 分 别 如 下 : 时 NAAAN SO un’ SN” SN H H = H Wea nS AREA er (6-A 2G) (2-4 £-6- Mi ISH) Oo NH, Oo | | | CHs Fae ee. 3N | HN | HN RN | A yf" ON 7 An/ ANNA H H H Lana 尿 喀 了 喧 fae me Fea FR ee (2:4- 二 酮 基 喀 啶 )(2- 酮 基 -4- 氮 基 喀 啶 ) «=O- AE Re) 此 外 ,还 发 现 有 几 十 种 修饰 碱 基 ( 常 称 稀 有 碱 基 ), 绝 大 部 分 为 叮 吟 、 喀 啶 化 合 物 ， 但 ARE TREN RBA EE, 一 类 是 7- 去 氮 味 叭 , 另 一 类 是 由 鸟 味 叭 衍生 出 来 的 三 杂 环 母 核 。 所 有 已 发 现 的 修饰 碱 基 的 结构 将 在 “ 核 苷 ”一 节 中 一 并 讨论 (结构 式 见 附录 一 )o 1) 修饰 成 分 以 前 常 被 叫做 补 有 成 分 或 附加 成 分 ,英文 曾 用 名 有 : «minor. unusual, additional, rare, odd com- ponent 等 。 Bo)? «© ST Le. 构成 RNA 链 的 成 糖 是 D-H, DNA 链 中 的 戊 糖 是 D-2- 脱 氧 核糖 。 在 某 些 RNA ”中 发 现 有 部 分 D-2-O- 甲 基 核 糖 。 所 有 这 三 种 糖 与 碱 基 连 接 都 是 - 构 型 。 HO O OH HO fe} OH HO O OH ‘ig CoE as aay -一 | | HO OH HO H HO OCH; 6-D- 核 糖 B-D-2- 脱 氧 核糖 8-D-2-O- 甲 基 核糖 在 核酸 中 还 发 现 有 几 个 己 糖 ,如 RNA 中 的 甘露 糖 、 半 乳糖 ，DNA 中 的 葡萄 糖 . 甘 露 糖 等 ,但 这 些 己 糖 并 不 组 成 核酸 的 骨架 ,而 是 与 碱 基 的 侧 链 相 联接 ( 见 核 背 ”一 节 )o _ & F 由 碱 基 与 核糖 化 合 物 形成 的 CREAM BRN RADAR, 故 核 苷 可 分 为 核糖 核 音 (简称 核 音 )、 脱 氧 核糖 核 背 (简称 脱氧 核 背 ) 和 2 -O- 甲 基 核 背 。 在 核 苷 分 子 中 , 糖 环 上 的 原子 编号 是 1、2、3、4'、 5 ,以 区 别 于 呆 叭 、 喀 啶 环 上 的 1、2、3、4、5、……o 核糖 核 音 主要 有 四 种 : RE. SH. EMRE MARRREER DEH: 脱氧 腺 苷 \ 脱 氧 岛 彰 、 脱 氧 胞 背 和 脱氧 胸 背 ,结构 式 分 别 如 下 : NH, O | N N 2 ego See H- Pet iy hg eri HO—’* oO Ho— re) 4 ‘a — be HO R HO R R =OH, RE CA) R =OH, %7F (G) R=H, BAAR (da) R=H, BMS (dG) NH, O O i Be ) ne) nt) | 3 | oF S\N oF \nZ oF \nZ HO Oo HO O HO; O Hemet eae pe ol 六 — HO’ UR HO OH HO: "Hi R =OH, IH (C) Rt (U) 脱氧 胸 昔 《〈dT) R=H, BRIE (dc) FCA TERY EX al] MAY 3p OR A AE AS, 前 者 通过 Ny —Cy 连接 ， 后 者 则 是 六 一 Cy TARE. N-APENREAR EN EAPC LIC RRM INTE RAY N- 糖 苷 键 可 自 >» 8 e ZI Hd Bz \ 了 UW | | NAS NS NS Gis 43 o: ot vB H—O O 1 NS ot. ae | N -一 | J H—N N HA Nu U H UW | | | yu Me Ne cori SA -本 | ox NA BO: L Had «SRAURANL HY HIS 1-1% HO WHR UW (MAR MEMAK u * 5 i ME 1 37 Ls HB es MNES HZ Ta EN pet | yu ad (a ge a= ARM ess NE Oa ay eh RB H Oo | LE H— Aas ee NS a’ Nw tHe + 由 转动 , EX LSM BRAK, 反 式 (anti-form) 构象 HWS (syn-form) 更 为 合适 , 在 DNA 双 螺旋 中 碱 基 配 对 也 是 以 反 式 定位 的 。 顺 式 构 象 的 写 出 方式 仅仅 是 习惯 上 的 方便 。 ION LYN ene: Ka hay 7° Pe a ph, ES aac 顺 式 反 式 在 核 苷 中, 杂 环 上 的 毛 基 或 酮 基 可 以 互 变 为 亚 氨基 或 烯 醇 基 , 它 们 在 不 同 pH 条 件 下 的 解 离 态 见 表 1-1。 核酸 中 的 修饰 成 分 大 部 分 是 以 修饰 核 音 产物 被 分 离 鉴定 的 。 修饰 核 音 可 分 为 三 类 : 《1) 由 修饰 碱 基 组 成 的 核 苷 ,(2) 由 2-O- 甲 基 核 糖 组 成 的 核 痛 ,3) 磊 基 与 戊 糖 连接 方式 与 众 不 同 的 核 苷 。 其 中 以 第 1 类 发 现 最 多 ,第 3 类 肯定 结构 的 只 有 假 尿 背 〈 风 及 其 衍生 物 。 据 1982 年 不 完全 统计 ,RNA 修饰 核 苷 共 69 个 ,而 DNA 中 只 有 9 个 。RNA 中 修饰 成 分 绝 大 部 分 是 在 RNA 中 发 现 的 ,而 DNA 中 修饰 成 分 主要 由 鸣 菌 体 DNA 分 离 得 到 。 RNA 中 修饰 核 背 可 区 分 为 修饰 腺 背 ,修饰 岛 萌 、 修 饰 胞 背 、 修 饰 尿 背 和 2-O- 甲 基 核 昔 , 以 下 分 别 进 行 讨论 。 表 1-2 RNA 中 的 修饰 腺 苷 1 RNA 中 分 布 #* REE D* 1- RRR + 2- FRE + N'- 甲 基 腺 苷 m5A 一 N"…，N' -二 甲 基 腺 苷 m$A 一 2-F RE RE ms*A + N*-HARREREY gc5A + N’-FABREREY tc5A 一 N°-FHE-N*- FARRER mtc5A 一 2- FA taé-N‘-FHKABREREY ms*tc*A F N’-=RAEPAERARREREO (Nt) + N®-(A?- 54K 5) - RF icA + 2- FA ite -N°-(A?- 52 hi) - BRE ms7iSA + N*~(llGi- 4-33 RH) = ARE oi*A (Ili st) > N*- (Be - 4-32 HE) - RE oi A 〈 反 式 ) 一 2- 甲 硫 基 -N'*-( 顺 -4- 羟 异 成 烯 )- 腺 苷 mszoi“A (xk) 5 WE CRAKE) + 1- FAME m!1 + * 结构 式 见 附录 一 ;有 “十 ?号 的 不 是 标准 命名 。 ** 【TI m, sn 分 别 代 表 tRNA, rRNA, mRNA (包括 病毒 RNA) 和 snRNA (细胞 核 小 分 子 RNA), ea 5 。 修饰 RR F # 1-2 列 出 RNA PREN+CHRATEDRED HA, BHEPEIRE (A-I 至 A-IV, A-VIII 和 A-XVII), Wet? ARRHRE 〈A-VI 至 A-X)， 侧 链 含 异 成 烯 基 的 细胞 激动 素 类 似 物 (A-XI 至 A-XV)， 有 的 含 硫 (A-V，A-IX，A-XII 和 A-XV)， 也 有 脱 氮 产 物 (A-XVI 和 A-XVII)。 其 中 m'A 在 碱 性 下 可 互 变 为 mA， 酸 性 处 理 则 ERISTRFF IA; tcA、mttcA 和 mi 则 易 为 碱 所 破坏 。 修 饰 & F 虽然 Q 核 苷 和 WY) 核 苷 化 合 物 的 碱 基 母 核 不 是 嘲 吟 环 ， 但 可 以 把 它们 看 作 是 鸟 背 的 衍生 物 ( 见 结构 式 )。 表 1-3 列 出 已 知 的 12 种 修饰 岛 昔 ,主要 为 甲 基 化 鸟 背 〈G-=-I 至 G- VD. 7-fr REUSE (G-IV 至 G-VI) 易 为 碱 打开 咪唑 环 ， 然 后 经 酸 处 理 使 糖 昔 键 断 裂 。 利 用 这 个 性 质 可 以 特异 地 在 m’G 处 切断 tRNA 分 子 , 研 究 其 结构 与 功能 的 关系 。 CH; CH; CH; \+ | 0 ae | AN 外 | N—eHO | AN-cHO OH- Ht HN \— HN ye HN ace HN’ NN SN H,N’ ‘NZ \nNH HNA SNAANNH， | R R 表 1-3 RNA 中 的 修饰 鸟 苷 * RNA 中 分 布 SATED 1-H m'G 1958 N?- ef n’G 1958 N’?, N?-— BASF mG 1959 7- 甲 基 鸟 苷 m7G 1963 N’, 7-LF£SF m?’7G 1977 N?, N?,7-=HFESH m3>?*7G 1969 W yosine WCYt) 1971 W yobutosine yYW(Y) 1968 Peroxywyobutosine oyW (Yr, Yw) Q manQ galQ Queuosine Mannosylqueuosine Galactosylqueuosine * 注释 见 表 1-2。 1968 年 从 酵母 t RNA * 中 分 离 出 一 种 莉 光 核 苷 Y ,其 后 在 其 他 来 源 上 RNA” 中 也 BLY WAY , 依 其 来 源 分 别称 为 Yt、Yw 和 Yr (小 写字 母 分 别 标明 来 自 圆 酵母 、 小 麦 胚 和 鼠 肝 中 NAP“)， 所 有 这 些 化 合 物 都 含 相同 的 二 甲 基 三 杂 环 部 分 ,学 名 叫 1, NF 丙烯 -3- 甲 基 岛 苷 ,但 Y 和 Yw 带 侧 链 而 Ye 则 无 。 有 人 建议 将 Y 改 为 W，, 它们 的 结构 和 对 应 关系 见 表 1-40 WY) BEAL tRNA™ 的 反 密 码 子 的 3 邻 位 ( 见 第 三 章 为 它们 都 是 酸 碱 不 稳定 化 合 物 , 因 此 可 用 特异 条 件 在 该 修饰 核 背 处 切 开 tRNA” 分 子 。 °* 6 « 1-4 WY) 核 苷 的 命名 和 结构 fs “名 * =a | W yosine | RN N COOocH PN 7 : : H.C | W ybutosine —CH,CH,CH IN | 、NHCcoocH， NZ \N7% \Nn | | COOCH; CH, R Peroxywybutosine|—CH,CHCH i 入 NHCcoocH， OOH * 其 碱 基部 分 分 别 叫 Wye, Wybutine 和 Peroxywybutine, QR HE 1968 年 发 现 的 ,但 1975 年 才 确 定 其 结构 , 碱 基 骨架 为 7- 去 氮 鸟 味 叭 ,Cr 通过 毛 甲 基 与 环 戊 烯 二 醇 相 连 ， 有 的 Q 化 合 物 其 侧 链 羟 基 与 糖 连 接 形成 @-D-4+BRT (man Q) 和 @-D--4¥ FLEE (eal Q) 〈 见 表 1-5)。Q 核 苷 对 酸 碱 稳 定 ， 常 出 现在 某 些 tRNA 反 密 码 子 的 摆动 位 置 上 (《 见 第 三 章 )。 #15 Q 核 苷 的 结构 CH,NH * Queuosine 的 符号 其 碱 基 叫 Queuine 修饰 胞 和 霸 RNA 中 胞 苷 衍生 物种 类 较 少 ,目前 只 发 现 六 种 , 其 取代 侧 链 遍布 于 胞 喀 啶 环 上 各 个 部 位 ( 见 表 1-6)。 miC 〈C-I[D) 和 ac'C 〈(C-IV) 为 碱 不 稳定 化 合 物 ， 前 者 碱 处 理 后 易 失 EAR ID RMF MES ft tf k F EC RUN ECHAEH URGED HARES , 共 廿 五 种 ( 表 1-7)， 其 中 大 部 分 为 . 7 四 表 1-6 RNA 中 的 修饰 胞 苷 * RNA 中 分 布 aA Tew 2- i ie 3-F ae N‘*- AE Ha N‘-C ila 5- FA af * 注释 见 表 1-2, 表 1-7 RNA 中 的 修饰 尿 苷 * RNA 中 分 布 尿 苷 衍生 物 eee 符 号 发 现年 份 t 2-RRRA U-I sz + 1981 3-F RE U-II maU + 1963 3-(-K3t-3-B RE) RE U-III ncp°U(X) ae 1974 4- 硫 代 尿 苷 U-IV s+U + 1965 5-BERE U-v o°U + 1966 5- RAE RE U-vI mo5U 十 1976 5- 羧 甲 氧 基 尿 苷 U-VII cmo*U(V) 3 1971 5- 甲 氧 基 状 基 甲 氧 基 尿 苷 U-VIII memo’U(mV) + 1977 5- 甲 基 尿 苷 ( 胸 苷 ) U-IX m5U(CT) 十 1958 5- 甲 基 -2- 硫 代 尿 苷 U-X mss2U 十 1971 5-2 PERE U-XI om’U + 1968 5-FR FAZER U-XII cm’U ete 1967 5-32 ASE -2- He RE U-XIII cm’s*U + 1973 5-(2-#BR BK) RE U-XIV com?U 了 1979 5— FA A JE Be FRE REF U-XV mem’U + 1970 5 - FA Sa Je He FA JE -2- HRS U-XVI mem’s?U + 1968 5-2, FA i FA 2 RF U-XVII ncm?U at 1972 5- FA a AE -2- Ti RA U-XVIII mnm/’s?U a 1968 5- 羧 甲 基 氮 甲 基 尿 苷 U-XIX cmnm’U + 1978 5-38 FA aa ASE -2- GR RF U-XxX cmnm/’s*U + 1981 5,6-—ARE U-XXI D(hU) + 1965 5-FA3t-5,6-—AeH** U-XXII m’U 1968 BR U-XXIII aa + 1957 1-FS RR U-XXIV m'W + 1982 1- 甲 基 -3-(3- 氮 基 -3- 羧 两 基 )- 假 尿 苷 U-XXV m'ncp’W (am¥) 1974 * 见 表 1-2 注释 。 ** 在 染色 体 RNA 中 发 现 。 5- 位 取代 化 合 物 CU-IV 至 U-XX 和 U-XXII)。 侧 链 基 团 有 甲 基 、 羟 基 、 甲 氧 基 、 羟 甲 基 、` 羧 甲 氧 基 及 其 甲 酯 、 羧 甲 基 及 其 甲 酯 和 酯 胺 衍生 物 、 氮 基 酸 、 羟 基 酸 等 , 它们 具有 通常 的 有 机 反应 性 。 有 的 侧 链 含 硫 ( 七 种 ); 有 的 5，6- 加 氨 〈U-XX 和 U-XXIID) ,加 氧 后 共 斩 体系 被 破坏 而 失去 紫外 吸收 特性 ,因而 早期 不 易 为 人 们 所 发 现 , 5，6- 二 氢 尿 苷 (D) 经 碱 处 理 得 到 p- 丙 氨 酸 ，5- 甲 基 -5，6- 二 氧 尿 苷 (m’D) 则 转变 为 6- 氨基 异 丁 酸 ， 故 测定 其 es i ae 一 | oF \N’ Sa oF \N7 Nu ra | | R R ar, D 8- 丙 氨 酸 T OH Lee A cx, C008 HN OH- HN \y OH” CH-CHs | 一 > | —> oF \N/ oF \N/ Nu, st | | A NH, m’D b-R ETE 产物 可 作为 D 和 msD 的 定量 分 析 。 msU (U-I) 与 mC (C-Il) 相似 ， 易 为 碱 所 破坏 。 ms5U (T) (U-IX) 为 胸腺 喀 啶 核糖 核 昔 即 胸 昔 。 我 们 知道 ,RNA 和 DNA 组 成 中 差异 之 EMSA RG. ASU RES MERBARMTAWR, BRI RNA 中 含 胸腺 喀 啶 ,有 的 DNA 中 存在 尿 旷 啶 ( 见 表 1-9); 特 别 在 tRNA 中 ,由 胸腺 喀 啶 组 成 的 胸 昔 酸 几 乎 已 是 不 可 缺少 的 组 分 。 结构 比较 奇特 的 是 假 尿 苷 〈%，U-XXII) 及 其 衍生 物 (U-XXIV 和 U-XXV)。 这 是 目前 确定 的 糖苷 键 连接 方式 唯一 与 众 不 同 的 核 苷 ， 在 假 尿 苷 中 ， 其 碱 基 为 一 般 的 尿 旷 啶 ;成 糖 亦 是 通常 的 D- 核 糖 。 但 连接 方式 为 C, 一 Cv ,而 不 是 常规 的 N, 一 Cv， 构 成 C 一 C 键 而 不 是 N 一 C 键 ， 因 而 产生 一 系列 奇特 的 物理 和 化 学 性 质 。 假 尿 音 是 尿 昔 的 异 构 体 ， GO GO | | Lo SN us) HN N | | N | a” Nn” ~ iL Ri (UV) > BRE (CY) FA IN HC! 100% CQHRRE. Wiki FWSM +—AWF MACH FI) 2-O- 甲 基 核 昔 RNA 中 含有 少量 的 D-2-O- 甲 基 核 糖 代 替 D- 核 糖 , 由 它们 构成 的 核 昔 称 2-O- 甲 基 AB. # 1-8 列 出 已 发 现 的 2-O- 甲 基 核 苷 , 其 中 有 几 个 为 碱 基 和 核糖 双 取 代 的 化 合 物 。 DNA DFE HR, PRY N - 甲 基 脱 毛 腺 苷 (mdA) 和 5- 甲 基 脱 氧 胞 背 《mdC) 较为 广泛 分 布 外 ,其 余 修 饰 成 分 都 是 在 鸣 菌 体 DNA 中 发 现 的 ( 见 表 1-9)， 其 中 茶 些 修饰 成 分 的 碱 基 进 一 步 被 糖 基 所 取代 ; 故 也 称 作 高 度 修 饰 成 分 。 如 大 肠 杆菌 T2、T4 和 TI6 KR DNA 含有 与 5- 羟 甲 基 胞 喀 啶 中 羟基 相连 的 葡萄 糖 ， 枯 草 杆 菌 SP8 鸣 菌 a49/i4 1 1 Pei i HN NH Be NH | | | Ny No HO O | 一 O A WA / iy HO OH HOHO on 5-8-D-RK KE REY) 5-6-D- 吡 喃 核糖 基 尿 喀 啶 O HO OH HO O Oo KAN. SCE ae HO On Hons 活 ce One HN NH HN NH Ry oS I I Oo oO 5-a-D-RK i x Ba aE PRE 5-x-D- 吡 喃 核糖 基 尿 喀 啶 表 1-8 RNA $9) 2'-O-mae way 2'-O-FEBRE 发 现年 份 2'-O- FARR 2'-O- Age SF 2'-O- Fae 2'-O- FER 2'-O- Fe Kot 2'-O- FERRE 2’-O- FEM N‘, 2'-O-- HERE N*，2 -O- 二 甲 基 胞 苷 5- 羧 甲 基 -2 -O- 甲 基 尿 苷 528 FA it AE -2’-O- FAZER 1959 1959 1959 1959 1974 1964 1974 1977 1966 1975 1976 + + + + 一 + * 注释 见 表 1-2。 体 DNA 也 含有 葡萄 糖 ， 其 变种 SP8 Ts 则 发 现 有 甘露 糖 ，SP15 噬菌体 DNA 的 脱氧 尿 苷 侧 链 的 4- 羟 基带 三 个 葡萄 糖分 子 。 * 10 « 表 1-9 DNA 中 的 修饰 成 分 * 现年 份 名 称 RF 发 现年 N - 甲 基 脱 氧 腺 昔 Synechococcus 1977 2-ZERARE elongatus 5- FRE i hee 黄 单 孢 杆菌 1968 5- 产 甲 基 脱 氧 胞 苷 ABTA 1953 RARE 枯草 杆菌 1963 5-RRPERARE 枯草 杆菌 1962 5-(4,5-—#RE) RARE 枯草 杆菌 1969 c- 丁 二 胺 脱氧 胸 苷 + 假 单 孢 杆菌 1973 cx- 谷 氨 酸 脱氧 胸 苷 +? 枯草 杆菌 1971 * 结构 式 见 附录 一 《十 ) 表 示 非 标准 命名 。 碱 基 侧 链 连 有 糖 基 的 见 正文 说 明 。 四 、 核 苷 B 核 音 的 磷酸 酯 叫 核 苷 酸 。 核 糖 有 三 个 游离 羟基 ,所 以 核糖 核 苷 酸 有 2-、3'- 和 SRE 酸 三 种 ,脱氧 核糖 只 有 二 个 羟基 可 以 酯 化 ; 故 脱氧 核糖 核 音 酸 只 有 3- 和 3- 核 昔 酸 ,2'-O- 甲 基 核 彰 酸 也 只 有 二 种 。 以 腺 味 叭 核 苷 酸 为 例 : NH, ES. N pen N Bo Oo oS SN i Kn N O SN A, HO fe) eS co 一 -oo }— Spey i; % HO oO O OH HO OH noe ae pen ‘. i 2 - 腺 苷 酸 3 - 腺 苷 酸 (Ap) 5 - BRET RBC pA) _ rm N N CARD ee Ae Ke most aad — ihe OH HO H 6 之 好 中 3 -脱氧 核 苷 酸 5’ - Pia aR BROT EHR 3) 磷酸 二 酯 键 连接 而 成 ,因此 在 核酸 链 中 可 以 认为 只 有 3'- 和 5- 两 种 核 昔 酸 ,而 不 存在 2- 核 苷 酸 ( 见 第 1 页 图 )。 但 1978 年 发 现 的 一 类 活性 寡 核 昔 酸 pppA (2’) p(5’) A(2’) p(s’)A 中 腺 背 酸 间 却 是 2 一 5 连接 ( 见 第 九 章 第 六 节 ),RNA 要 是 全 二 被 碱 水 解 经 过 环 化 中 间 物 , 则 可 得 到 2 -与 3- 核 背 酸 混合 物 。 2'-O- 甲 基 核 苷 酸 构成 的 RNA 中 磷酸 二 酯 键 具有 特殊 的 性 质 , 如 不 能 被 碱 或 3- RNase 所 水 解 ( 因 为 不 能 形成 2, 3- 环 化 磷酸 中 间 物 )， 故 可 以 从 RNA 的 碱 解 或 酶 解 产 物 中 分 离 出 各 种 碱 稳定 的 寡 核 苷 酸 。2'-O- 甲 基 核 背 酸 广泛 分 布 于 各 种 RNA 中 ,是 真 核 mRNA 帽子 结构 的 常见 组 分 。 ee eKi> Pa ip, O OCH; spe of O | “OCH, o-—P=0 o--P-o co- 一?-o re) O : 75 O kK Ray "Ca ro oe ©. OF , OCH; ° OCH; | Oo-— P=O C-— es o-— ?一 o | B O- re) oO = BEER an ps 2 y 广 一 | | Ox O8 ° OCH; | O-— P=O o--?-o ， ns on" BATE Nes >| 全 二 oO OH | ore o- tate ORES 五 、 核 酸 成 分 的 缩写 符号 及 核 苷 酸 在 核酸 链 中 的 表示 方式 由 于 核酸 组 成 分 种 类 繁多 ， 核 背 酸 在 核酸 链 中 的 排列 顺序 及 其 方向 性 对 于 核酸 结构 及 功能 表达 至 关 重 要 ， 因 此 统一 缩写 符号 及 书写 方式 是 非常 必要 的 。 按 照 目前 文献 常用 表示 法 归纳 如 下 : 《1) 因为 在 核酸 结构 中 是 以 核 苷 或 核 苷 酸 符号 表示 的 ， 故 碱 基 符号 使 用 不 多 。 为 了 与 核 苷 符号 相 区 别 ， 碱 基 一 般 采 用 三 字符 号 ， 即 英文 名 称 前 三 个 字母 表示 ， 如 腺 味 吟 (adenine) 4 Ade, fg hRMEWE (thymine) 为 Thyo (2) BEARS SAR URE. SAME MRADAIA A, G. CMU; 脱氧 核 苷 则 在 单字 符号 前 加 一 小 写字 母 d, 如 dA, dG, dC 和 dT HRRARARA. HAS 苷 、 脱 氧 胞 背 和 脱氧 胸 背 。 对 于 由 修饰 碱 基 组 成 的 修饰 核 苷 ， 除 部 分 有 独自 的 单字 符号 (如 DI, Q. W 等 ) 外 ;其 余 均 在 A、G、C、U 和 dA, dG, dC, dT 的 左面 以 小 写字 母 及 数码 注 明 其 取代 基 团 性 质数 目 和 位 置 ( 见 表 1-2、1-3、1-6、1-7、1-9 及 附录 一 ), 如 mA 标明 腺 昔 的 六 位 有 三 个 甲 基 即 N®, N -二 甲 基 腺 苷 ,m3””G 表示 鸟 背 的 第 二 位 有 三 个 甲 se 12 。 基 ; 第 七 位 有 一 个 甲 基 , 共 三 个 甲 基 , 即 N’, N’, 7-=RRE A; 2'-O- 甲 基 核 背 的 表示 是 在 核 苷 右 方 注 上 小 写字 母 m, 如 Am 代表 2-O- 甲 基 腺 苷 ,m'Ccm 为 N ,2'-O- 二 甲 基 胞 苷 等 ( 见 表 1-8)。 (3) 核 苷 酸 的 表示 方法 是 在 核 苷 符号 的 左 方 小 写字 母 2 表 示 5 -磷酸 酯 ， 右 方 代表 3'- 磷 酸 酯 ;如 pA 为 5- 腺 昔 酸 。Cp 为 3- 胞 背 酸 ， 依 次 类 推 。 核 背 多 磷酸 的 表示 法 是 : ppU 代表 5- 尿 苷 二 磷酸 ，pppA 为 5- 腺 背 三 磷酸 , 即 ATP, ppGpp 表示 鸟 背 四 磷酸 ,其 中 二 个 磷酸 根 在 鸟 背 的 5 位 ， 另 二 个 在 3 位。2- 核 苷 酸 无 专 一 表示 符号 。2' ,3“- 环 化 核 苷 酸 一 般 用 >>P 表示 ,如 USP 代表 2 ,3'- 环 化 尿 苷 酸 ，3', 5- 环 化 核 昔 酸 一 般 书 写 为 cAMP, cGMP 等 。 (4) 书写 一 条 核酸 链 通常 从 5 端 至 3A A RAR HN(5’)pApGpC: - - pUpC(3’), 其 中 的 P 在 核 苷 的 右 方 代表 3 连接 ， 在 左下 方 表 示 5 相连 。 KERR ZA 正好 表示 3' 一 5 连接 。 在 书写 一 条 互补 双 键 核酸 分 子 时 ， 由 于 两 条 链 是 互 为 反 向 的 ,因此 在 末端 写 上 5 和 3 必 不 可 少 , 如 c “ : ; 3’ HT-KENRRE MAVAMADTTBS, Serr n AG 或 者 连续 转弯 书写 均 可 (如 tRNA 的 三 时 草 结构 ， 见 第 三 章 ), 这 时 只 要 从 5 端 开始 顺 着 核酸 链 往 下 阅读 便 是 。 为 了 简便 ,核酸 链 中 的 P 通常 被 省 略 (末端 的 让 线 , mm (5’) pAGC---UC (3’) 或 (5") pA+G-C--+---U-C (3’) Be (5’)pA-G-C-- -U-C 3"). 若 为 2 一 5 连接 ， 书 写 时 必需 注 明 ( 见 第 九 章 第 六 节 ), 5 一 5 连接 也 需要 标明 ,如 真 核 生物 mRNA 的 帽子 结构 ( 见 第 三 章 )。 以 免 产 生 误 会 。 六 、 核 酸 成 分 的 分 离 鉴定 在 1955 年 出 版 的 E. Chargaff 和 J. N. Davidson 合 编 的 《The Nucleic Acids)( Academic Press, Vol. I) 一 书 中 , 曾 分 章 详细 地 叙述 了 用 离子 交换 柱 层 析 、 纸 层 析 和 纸 电 泳 分 离 核 酸 组 成 分 的 方法 。 对 于 核酸 中 主要 成 分 包括 碱 基 、 核 苷 、 核 苷 酸 及 多 磷酸 衍生 物 的 分 离 ， 许多 后 来 发 展 的 生化 技术 如 气相 层 析 \ 反 相 层 析 \ 薄 层 层 析 和 高 压 波 相 层 析 等 都 能 够 达到 良好 的 效果 。 随 着 修饰 成 分 的 不 断 发 现 ，1971 年 Hall 在 他 的 专著 中 较为 详细 地 介绍 了 当时 已 发 现 的 修饰 核 背 的 分 离 方 法 (文献 [1])。 由 于 核酸 中 修饰 成 分 含量 甚 微 ,从 上 分 之 几 到 万 分 之 几 , 一 般 需 采用 灵敏 的 分 离 鉴 定 技术 ,如 同位 素 标记 技术 。 为 了 分 开 尽 可 能 多 的 核酸 成 分 , 常 采 用 快速 而 微量 的 双向 薄 层 层 析 图 谱 法 。 附 录 二 给 出 几 个 图 谱 ; 并 且 列 出 其 分 离 条 件 ,包括 20 几 种 3- 核 背 酸 的 分 离 , 近 20 种 5 - 核 苷 酸 的 分 离 , 以 及 分 开 16 种 可 能 排列 的 碱 稳定 二 核 苷 酸 中 的 14 种 。 1975 年 提出 一 种 可 以 分 离 近 40 种 修饰 核 苷 的 双 向 薄 层 层 析 法 ,是 目前 分 离 核酸 组 成 效果 最 好 的 一 种 方法 。 鉴定 核酸 成 分 常用 的 方法 是 在 不 同 pH 条 件 下 测定 其 紫外 吸收 光谱 包括 1 ax、 E 有 大 值 、1 县 个 和 一 些 特征 光 吸 收 比值 ,这 些 都 是 鉴定 和 定量 测定 不 同 核酸 组 成 的 重要 数据 〈 见 文献 [2] )。 一般 地 说 ,同一 碱 基 的 核 苷 酸 光 谱 与 其 核 背 差异 不 大 ; 同样 ， 相 同 碱 基 的 1) 有 中 译本 < 核酸 >( 第 一 卷 ), 科 学 出 版 社 , 1963， 译 者 : 黄 德 民 。 2'-O- 甲 基 核 苷 或 脱氧 核 苷 与 其 核 昔 的 光谱 接近 ; 但 是 游离 碱 基 光 谱 与 其 核 背 或 脱氧 核 苷 相 比 则 往往 差异 甚大 。 例 如 PC、Cp、C、dC 和 Cm 光谱 性 质 相 似 , 它 们 与 Cy WA 明显 的 不 同 。 包括 大 部 分 已 发 现 的 修饰 成 分 在 内 的 核酸 组 成 分 的 紫外 吸收 高 峰 的 波长 在 260nm 附 近 。 范 围 常 在 250 一 280nm 之 间 , 低 峰 波 长 为 220 一 240nm 左右 。 乌 叮 叭 、 鸟 苷 及 其 衍生 物 的 光谱 曲线 除了 常见 的 吸收 高 峰 外 ,在 红 向 还 有 一 弯曲 部 分 , 称 作 - 扁 膀 (Shoulder)”。 有 的 修饰 成 分 的 紫外 吸收 光谱 较 特 殊 ; 如 D, s*U, ac'C, ms‘i®A, mnm’-s'U 等 的 紫外 吸收 高 峰 远 离 260nm 《〈 见 文献 [2] )o 附录 三 列 出 以 核 背 为 代表 的 核酸 组 成 分 的 紫外 吸收 性 质 , 以 供 查 阅 。 利用 曹 光 性 质 也 是 鉴定 某 些 核酸 成 分 的 方法 之 一 。 鸟 味 叭 及 其 衍 生物 在 某 些 条 件 下 表示 出 很 高 的 曹 光 强度 。W 核 苷 也 具有 很 强 的 草 光 性 质 。 一 般 喀 喧 化合物 和 腺 味 叭 衍生 物 的 莉 光 强度 甚 低 , 但 某 些 核酸 组 分 可 特异 地 与 莉 光 试剂 结合 产生 曹 光 化 合 物 ， ional 蓝光 法 测定 这 些 成 分 。 要 想 最 后 确定 一 个 未 知 结构 的 成 分 ,最 好 与 标准 样品 进行 比较 ,包括 光谱 性 质 、 层 析 、 电泳 行为 ,以 及 需要 分 析 的 其 他 性 质 如 pK 值 、 降 解 产 物 鉴 定 等 。 如 果 掌 握 一 些 已 有 的 标 准 分 离 技 术 ， 采 用 图 谱 对 照 方 法 也 可 初步 判断 某 些 修饰 成 分 。 对 于 结构 复杂 的 高 度 修 饰 成 分 ,只 有 采用 新 的 物化 技术 鉴定 其 结构 才 成 为 可 能 ,常用 方法 有 质谱 、 核 磁 共 振 光 谱 、 红 外 光谱 等 。 除了 上 述 介绍 的 近 80 种 修饰 成 分 外 ;有 关节 刊 杂 志 还 报道 了 存在 的 其 他 一 些 修饰 成 分 ,但 有 的 证 据 不 足 ; 有 的 已 被 否定 ,有 的 其 结构 和 性 质 有 待 进一步 鉴定 , 故 本 书 未 列 人 。 2 4 xX 献 [1] Hall, R. 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Palo Alto Califonia, 34 137. es 14 。 第 二 但 DNA # 构 SRR @ AR DNA 是 十 分 巨大 的 生物 高 分 子 。 它 是 由 四 种 脱氧 核糖 核 苷 酸 通过 磷酸 二 酯 键 聚 合 而 成 的 。 最 小 的 天 然 DNA 分 子 也 包含 了 几 千 碱 基 对 ， 分 子 量 在 10 以 上 。 每 个 人 的 细 胞 染色 体 中 含有 10 碱 基 对 。 表 2-1 列 出 了 若干 生物 中 每 个 细胞 所 含 DNA 的 碱 基 对 数 目 。 从 表 中 所 列 的 数据 可 以 看 出 , 每 个 细胞 中 DNA 碱 基 对 总 数 随 着 生物 进化 水 平 的 上 升 而 相应 增加 。 但 是 也 存在 一 些 例外 的 情况 ， 例 如 南美 肺 鱼 的 DNA 大 小 约 为 10.2 x 10" 碱 基 对 ,当然 我 们 并 不 认为 肺 鱼 的 进化 水 平 比 人 类 的 水 平 更 高 。 在 植物 和 两 栖 类 动物 中 还 有 一 些 例外 。 表 2-1 DNA 分 子 和 基因 组 的 大 小 碱 基 ( 对 7 数目 SRE (mm) SERS 5.1 10° 0.0017 环 状 SV40 5226 0.0018 环 状 M13 6407 0.0019 环 状 fd 6408 0.0019 环 状 P4 1.5X10¢ 0.0051 线 状 17 3 5X304 0.012 线 状 a 48502 0.016 线 状 WE25T4A T6 1.8X10 0.061 线 状 $B: KK 0.26 环 状 大 肠 杆菌 1.36 环 状 真 核 生物 ( 单 倍 体 ): 酵母 1.35X10’ 4.6 NAF 7 对 染色 体 中 果 蝇 1.65X10° 56 分 布 于 4 对 染色 体 中 XK 2.910? 990 分 布 于 23 对 染色 体 中 南美 肺 鱼 1.0210" 34,700 分 布 于 19 对 染色 体 中 DNA 分 子 能 以 线 状 或 环 状 的 形式 存在 。 绝 大 多 数 DNA 分 子 是 由 两 条 碱 基 互 补 的 单 链 构成 的 ,只 有 少数 几 种 DNA 是 单 链 的 ,如 6X174,M13 等 。 线 状 双 链 DNA. 的 末端 可 能 是 齐 头 的 ， 也 可 能 带 有 单 链 粘性 末端 ,也 可 能 是 粘性 末 端 补 满 以 后 形成 5 ，3 末端 重复 顺序 ,也 可 能 具有 特殊 的 “ 转 排 ? 结 构 。 它 们 之 间 的 相互 关 系 可 以 通过 图 2-1 的 例子 联系 起 来 。 DNA 分 子 主要 由 四 种 碱 基 组 成 , 即 腺 味 叭 \ 鸟 嘎 叭 . 胞 喀 啶 和 胸腺 旷 啶 , 修饰 碱 基 含 量 很 低 。 真 核 生 物 DNA 中 有 少量 5- 甲 基 胞 喀 啶 和 6- 甲 基 腺 味 哈 ， 大 肠 杆菌 DNA 中 也 含有 一 些 甲 基 化 碱 基 。 某 些 叹 菌 体 中 存在 大 量 修饰 碱 基 ( 人 参见 第 一 章 )。 asco 48 CO aocd od 双 链 线 状 AB 〈 转 排 结构 ) sorneoratee ce nsre bcd abe Semmes seems ca abc 2-1 细菌、 病毒 和 细胞 器 DNA 分 子 的 不 同 结构 形式 图 中 3 为 了 5 为 了 以 上 是 有 关 DNA 分 子 的 一 些 概 况 ， 以 下 就 DNA 的 一 级 结构 。 DNA 顺序 组 织 ， DNA 的 二 级 和 三 级 结构 分 别 讨论 。 一 、DNA 的 一 级 结构 DNA 是 双 螺 旋 的 大 分 子 。 生 物 信 息 绝 大 部 分 都 贮存 在 DNA OTH, 这 些 信 息 以 核 昔 酸 不 同 的 排列 顺序 编码 在 DNA 分 子 上 , 核 苷 酸 排列 顺序 变 了 , 它 的 生物 学 含义 也 就 Ald Jo DNA 的 一 级 结构 就 是 指 核 苷 酸 在 DNA 分 子 中 的 排列 顺序 。 因此 测定 DNA 的 碱 基 排列 顺序 是 分 子 生物 学 的 基本 课题 之 一 。 我 们 首先 了 解 一 下 怎样 测定 DNA 的 一 级 结构 ,其 次 将 讨论 某 些 特定 的 序列 有 些 什 么 生物 意义 。 尽管 测定 DNA 顺序 是 一 个 十 分 重要 的 课题 ,然而 在 不 久 以 前 它 还 是 一 个 令 大 望 而 ARAN. DNA 顺序 测定 工作 大 大 迟 于 蛋白 质 的 顺序 测定 ， 也 晚 于 RNA 的 顺序 测 定 。 用 于 和 蛋白质 或 RNA 的 顺序 测定 的 战略 都 是 建立 在 小 片段 重 伙 的 原理 止 。 也 就 是 把 待 测 分 子 用 专 一 性 的 水 解 酶 水 解 成 很 小 的 片段 ,测定 每 个 小 片 妈 的 顺序 , 找 出 能 把 这 些小 片段 连 起 来 的 重 登 片 疏 ， 然 后 推断 整个 分 子 的 顺序 。 但 是 这 个 战略 不 完全 适用 于 DNA 顺序 测定 。 存 在 的 问题 首先 在 于 没有 相应 的 碱 基 专 一 的 脱氧 核糖 核酸 酶 ,因此 要 获得 稳定 的 小 片 眉 十 分 困难 ;其 次 ，DNA 分 子 量 一 般 都 很 大 , 获得 重合 片段 的 困难 将 随 着 分 子 量 的 增加 而 增加 。 由 于 这 些 固有 的 困难 使 得 DNA 顺序 测定 工作 长 期 以 来 进展 不 大 。 很 明 显 ， 测 定 DNA 顺序 的 战略 如 果 仍 建立 在 小 片段 重 倒 的 原理 上 ， 那么 即使 发 现 了 对 碱 基 专 一 的 脱氧 核糖 核酸 酶 ,测定 DNA 顺序 所 面临 的 困难 比 RNA 或 蛋白 质 BAKES. @ 来 ，DNA 顺序 测定 工作 要 有 所 进展 ， 必 须 罕 破 原 有 的 顺序 测定 的 战略 。 七 十 年 代 后 期 这 个 难关 已 经 克服 ,主要 是 从 两 个 方面 进行 的 : 首先 是 限制 性 内 切 酶 的 发 现 和 广泛 应 用 ， 现在 很 容易 完成 含有 几 和 于 个 以 上 的 核 背 酸 大 片段 的 重 倒 ; 其 次 是 建立 了 一 种 在 凝 胶 电泳 . 16 . Ce Oe > ers. 板 上 直接 而 快速 地 测定 DNA 顺序 的 方法 。 在 这 种 新 方法 中 , 碱 基 顺 序 的 测定 不 是 建立 在 小 片 假 重 登 的 原则 上 。 在 较为 详细 地 讨论 这 些 突破 之 前 , 先 简单 地 回顾 一 下 在 此 以 前 探索 DNA 顺序 测定 的 方法 ,这 不 仅仅 是 一 个 历史 的 回顾 ,其 中 有 些 技术 目前 也 还 有 一 定 的 用 途 。 简单 的 回顾 七 十 年 代 初 ，DNA 顺序 测定 还 处 在 探索 时 期 。 人 们 从 各 个 角度 摸索 测定 DNA I 序 的 方法 。 当 时 人 们 的 思路 还 没有 跳出 小 片段 重合 的 框框 ,因此 所 发 展 起 来 的 DNA Ii 序 测定 方法 工作 量 都 比较 大 ,而 且 缺 乏 通用 性 ,只 能 适用 在 一 些 特定 的 例子 中 。 例如 RNA 顺序 测定 方法 建立 以 后 ,人 们 就 想 先 把 DNA 转录 成 RNA, 测 定 了 RNA 顺序 以 后 ,应 用 互补 原理 来 推测 DNA 的 顺序 。 比较 成 功 的 例子 是 大 肠 杆菌 的 乳糖 操纵 子 调控 基因 这 一 段 DNA 顺序 的 测定 。 但 是 在 多 数 条 件 下 转录 的 起 始点 和 终止 点 是 不 专 一 的 ,因此 产生 的 RNA 是 不 均一 的 ,有 时 比 模板 还 要 长 , 一 般 DNA 的 二 条 链 都 转录 出 来 。 如 果 能 获得 一 段 与 待 测 DNA 互补 的 引物 ,转录 产物 就 比较 均一 。 但 在 很 多 情况 下 ， 选择 合适 的 引物 是 很 困难 的 ,这 些 都 是 使 用 转录 方法 测定 DNA 顺序 的 重要 障碍 。 用 一 种 核糖 核 苷 酸 取代 DNA 中 的 脱氧 核糖 核 苷 酸 ， 从 而 可 以 获得 在 特定 的 碱 基 位 置 专 一 地 降解 的 片段 ,这 在 当时 是 一 个 很 诱 人 的 设想 。 例如 用 DNA 聚合 酶 在 试管 中 复 制 待 测 DNA， 反 应 中 所 必须 的 四 种 核 昔 三 磷酸 底 物 ， 其 中 三 种 仍然 是 用 脱氧 核糖 核 彰 三 磷酸 ,一 种 如 用 核糖 岛 音 三 磷酸 代替 ,在 这 样 的 条 件 下 合成 的 DNA 在 鸟 味 叭 的 位 置 都 是 核糖 核酸 键 , 而 核糖 核酸 键 可 以 用 碱 或 核糖 核酸 酶 CRNase) 降解 ， 用 这 种 方法 可 以 达 到 碱 基 专 一 性 水 解 的 目的 。 但 是 在 这 种 条 件 下 ,复制 是 否 真实 ， 还 是 一 个 有 争论 的 问题 ， 而 且 在 这 个 方法 中 需要 特定 的 引物 ,因此 现在 已 没有 人 用 这 种 方法 测定 一 个 较 长 的 DNA 片段 的 顺序 了 。 ARABKAARIT TED 20 个 核 昔 酸 以 下 的 DNA 片段 具有 特殊 的 优点 。 一 个 亮 核 音 酸 片 段 ,其 5 末端 (或 3 末端) 用 放射 性 同位 素 标 记 以 后 ,用 外 切 酶 逐个 切 去 非 标 记 未 端的 核 音 酸 , 这 样 就 得 到 5 末端 都 是 带 标记 的 , 片 眉 长 度 只 差 一 个 核 昔 酸 的 寡 核 背 酸 - 混合物。 将 这 组 寡 核 背 酸 混合 物 先 进行 电泳 ;各 个 片段 基本 上 按 电 荷 大 小 分 离 ,然后 进行 同系 层 析 ,使 其 按 不 同 链 长 分 离 。 当 一 个 寡 核 苷 酸 末端 钞 加 一 个 新 的 核 苷 酸 时 ,会 影响 袁 核 音 酸 的 电泳 迁移 率 , 影 响 的 程度 由 落 加 上 去 的 核 苷 酸性 质 所 决定 ,因此 可 以 根据 迁移 率 的 变化 逐个 推断 出 加 上 去 的 是 哪 一 种 核 昔 酸 。 只 是 迁移 率 还 受到 其 他 一 些 因素 的 影响 ， 这 会 给 判读 带 来 困难 。 但 是 由 于 它 的 简便 性 ,这 个 方法 在 某 些 情况 下 还 是 有 用 的 ,例如 用 于 测定 限制 性 内 切 酶 的 识别 顺序。 这 个 方法 也 能 用 于 RNA NA RWIDF DAT. 用 二 苯胺 和 甲酸 处 理 ， DNA 分 子 中 含 厢 了 叭 的 糖苷 键 都 断裂 ， 而 含 喀 喧 的 键 不 受 影 响 ， 这 样 得 到 喀 啶 连 在 一 起 的 寡 核 苷 酸 称 为 喀 啶 堆 或 喀 啶 群 。 用 双向 电泳 同系 层 析 可 以 测定 旷 啶 堆 的 组 成 ,借助 一 些 酶 的 帮助 还 可 以 推断 旷 啶 玲 的 顺序 。 这 个 方法 因 其 简便 ,也 可 以 用 来 验证 用 其 他 方法 测定 的 顺序 的 可 靠 性 。 某 些 顺序 特别 简单 的 DNA， 例 如 豚鼠 卫星 DNA 顺序 就 是 用 这 个 方法 测定 的 。 测定 噬菌体 1DNA 粘性 末端 顺序 的 工作 可 以 认为 是 成 功 地 测定 DNA 顺序 的 第 一 TOF. ETE 1971 年 前 后 利用 粘性 未 端 本 身 作为 模板 引物 体系 ,用 DNA 聚合 酶 把 不 yy . MASH hIicCKHRSASMAK DNA 链 内 ， 分 析 新 合成 的 链 中 标记 核 背 酸 的 种 类 和 数量 可 以 推断 原来 粘性 未 端的 顺序 ,用 这 个 方法 测定 DNA 顺序 的 工作 量 是 十 分 浩大 的 。 1 DNA 粘性 未 端 只 有 十 二 个 核 昔 酸 ,而 用 这 个 方法 测定 它 的 顺序 却 化 费 一 ` 二 年 之 久 ,天 此 这 个 方法 无 法 推广 。 但 是 利用 DNA 聚合 酶 在 模板 引物 体系 上 进行 有 限 的 合成 ,这 对 以 后 发 展 起 来 的 “加 减法 "测定 顺序 的 方法 是 有 启发 的 。 在 这 段 时 期 也 有 人 探索 直接 测定 DNA 顺序 的 方法 ,但 是 由 于 沿用 测定 RNA 顺序 - 的 老路 ， 而 又 没有 类 似 核 糖 核酸 酶 的 有 碱 基 专 一 性 的 脱氧 核糖 核酸 酶 ， 困 难 就 显得 更 加 : 罕 出 。 1974 年 完成 含 四 、 五 十 个 核 苷 酸 的 $X174 DNA RAM METER TRARY 力量 , 按 这 样 的 效率 去 完成 含有 五 千 多 个 核 音 酸 的 整个 %X174 DNA 的 顺序 是 寺 分 困难 : 的 。 总 之 ,在 这 一 段 探 索 时 期 ,人 们 只 能 对 一 段 为 数 不 大 的 特定 DNA FEAR EMA 测定 其 顺序 ， 方 法 上 普遍 性 不 足 ， 而 工作 量 却 很 大 。DNA 顺序 测定 的 突破 是 从 1975 年 - Sanger 发 展 的 "加 减法 ?而 开始 的 。 在 讨论 这 个 方法 之 前 , 还 应 该 先 介绍 一 下 限制 性 内 切 : hea] DNA 的 物理 图 谱 。 限制 性 内 切 酶 微生物 中 的 修饰 和 限制 现象 是 五 十 年 代 初 发 现 的 ， 这 是 细菌 自 卫 的 一 种 方式 。 例 如 从 大 肠 杆 菌 玉 株 繁殖 出 来 的 噬菌体 ACK) 只 能 感染 大 肠 杆 菌 K 株 ， 不 能 感染 大 肠 杆 菌 B 株 ,反之 亦 然 。 这 个 现象 称 为 “限制 ” 现象 。 然 而 被 某 菌株 限制 的 噬菌体 群体 中 也 会 有 极 . 少 个 体 幸存 下 来 ,幸存 者 的 子 代 可 以 在 原来 受 限 制 的 菌株 中 正常 繁殖 ， 这 个 现象 称 为 “ 修 饰 >。 修 饰 和 限制 的 性 质 都 是 由 宿主 的 基因 所 决定 的 , 同 噬菌体 的 基因 无 关 。 Arber 和 他 的 合作 者 对 这 个 现象 作 了 深入 研究 ,并 从 生物 化 学 角度 提出 一 种 假设 。 他 . 认为 细菌 内 有 两 种 不 同 功能 的 酶 , 一 种 是 核酸 内 切 酶 ， 它 能 识别 并 切 开 DNA 分 子 上 一 个 特定 的 碱 基 序列 ,这 就 是 限制 性 内 切 酶 ; 另 一 种 酶 是 甲 基 化 酶 ， 它 能 识别 限制 任 内 切 酶 所 识别 的 碱 基 顺 序 ,并 把 其 中 某 些 碱 基 甲 基 化 ,这 是 修饰 梅 。 被 修饰 酶 甲 基 化 了 的 _DNA 就 不 能 被 限制 性 内 切 酶 降解 了 。 细 菌 的 DNA 总 是 被 自身 的 修饰 酶 修饰 好 了 ， 因 此 不 会 被 自身 的 限制 酶 所 降解 。 异 源 的 DNA 由 于 没有 被 修饰 过 , 它 一 旦 侵入 细菌 就 会 被 限制 酶 降解 ,因此 这 个 系统 可 以 保护 细菌 免 受 外 来 DNA 的 人 侵 。 六 十 年 代 未 已 分 别 从 大 肠 杆 菌 K 株 和 了 株 分 离 到 限制 性 内 切 酶 。 这 些 酶 具有 Arber 所 预言 的 若干 特性 ,如 它 能 降解 同 限制 性 内 切 酶 不 同 源 的 DNA ,而 不 降解 同 源 的 DNA。 这 个 酶 在 DNA 分 子 上 仅 切 开 为 数 不 多 的 几 个 切口 。 可 惜 这 两 个 限制 性 酶 都 不 能 在 DNA 分 子 上 产生 专 一 性 的 切口 。 重大 的 进展 是 在 1970 年 。Smith 及 其 同事 在 流感 噬 血 杆菌 d 株 中 分 离 到 一 个 限制 性 内 切 酶 , 并 且 发 现 这 个 酶 可 以 在 下 列 顺序 中 箭头 所 指 的 位 置 切 开 , 这 个 酶 现在 称 为 Hind I。 此 处 Py 和 Pu SRC EM, 显然 ， 限 制 性 内 切 酶 的 这 种 性 质 是 一 种 十 分 奇异 的 特性 。 人 们 也 立即 认识 到 这 种 性 昌吉 |- Inet DNA 结构 和 功能 的 研究 将 会 带 来 巨大 的 好 处 。 WD See BR il Me Ie 限制 性 内 切 酶 应 用 于 DNA 研究 的 工作 广泛 地 开展 起 来 。 限制 性 内 切 酶 的 命名 是 用 Nathans 等 人 所 提议 的 方案 。 限 制 性 内 切 酶 名 称 的 第 一 个 字母 取 自 获得 此 内 切 酶 的 细菌 的 属 名 的 第 一 个 字母 ,用 大 写 ,名称 的 第 二 、 三 个 字母 取 自 该 细菌 种 名 的 头 二 个 字母 ,用 小 写 。 如 果 该 细菌 还 有 不 同 的 株 系 , 则 另 加 第 四 个 代表 株 系 的 字母 或 数字 ,最 后 是 用 罗马 字 大 写 的 数字 、 代 表 同 一 菌株 中 不 同 限制 性 内 切 酶 的 编号 。 如 Hind II 代表 从 流感 噬 血 杆菌 d 株 (haemophilus influenzae) 中 分 离 到 的 第 三 种 内 切 酶 。 到 1982 年 为 止 已 分 离 到 的 限制 性 内 切 酶 有 400 HOE MARA) ,主要 是 从 细菌 和 霉菌 中 得 到 的 。 现 在 也 有 人 报告 可 以 从 核 原 体 和 真 核 细 胞 中 分 离 到 限制 性 内 切 酶 。 已 搞 清 识别 顺序 的 限制 性 酶 约 300 种 以 上 ， 但 其 中 很 多 具有 相同 的 识别 顺序 。 具 有 相同 的 识 别 顺序 而 来 自 不 同 菌 种 的 限制 性 内 切 酶 称 为 同 工 异 源 酶 。 按 识别 顺序 分 类 总 共 约 有 五 十 多 种 识别 顺序 。 很 明显 作为 工具 酶 ,不 同 专 一 性 的 限制 性 内 切 酶 越 多 ,对 DNA 结构 功能 的 研究 的 帮助 也 越 大 。 用 作 工 具 酶 的 限制 性 内 切 酶 属于 所 谓 第 二 类 限制 性 内 切 酶 ， 它 们 共同 的 特点 是 在 DNA 分 子 上 产生 的 切口 的 位 置 是 专 一 的 。 此 外 ,这 类 内 切 酶 的 分 子 量 一 般 不 大 , 通常 小 于 100,000。 镁 离子 是 唯一 必需 的 辅 因 子 。 限 制 性 内 切 酶 的 识别 顺序 通常 只 有 4 一 6 个 碱 基 对 。 一 个 分 子 量 不 太 大 的 DNA 中 所 包含 的 内 切 酶 识别 点 是 有 限 的 ,因此 酶 切 后 产生 的 片段 的 大 小 和 数目 都 是 固定 的 。 这 些 片段 用 凝 胶 电 泳 分 离 后 的 电泳 图 谱 对 每 一 种 酶 而 言 是 具有 特征 性 的 ,这 是 目前 最 常用 的 鉴定 内 切 酶 的 种 类 和 活力 的 基本 方法 。 从 附录 四 中 所 列 出 的 限制 性 内 切 酶 的 识别 顺序 可 以 看 出 多 数 酶 的 识别 顺序 是 很 严格 的 ,少数 酶 的 识别 顺序 有 一 定 的 变动 余地 。 如 前 面 所 提 到 的 Hind II,， 它 的 识别 顺序 中 5 端 第 三 个 碱 基 可 以 是 C 或 工 第 四 个 碱 基 可 以 是 A 或 G。 大 多 数 识别 顺序 具有 二 次 旋转 对 称 性 ,就 是 说 以 对 称 中 心 为 轴 。 把 这 个 序列 转动 180", 仍然 得 到 原来 的 序列 。 从 附录 四 还 可 以 看 出 , 限制 性 内 切 酶 在 DNA 双 链 分 子 上 的 切 点 绝 大 多 数位 于 识别 顺序 上 ,只 有 少数 酶 的 切 点 在 识别 顺序 之 外 ， 而 且 它 们 的 识别 顺序 都 不 具有 旋转 对 称 性 。 如 了 ga I 的 识别 顺序 是 GACGC， 而 切 点 在 这 个 识别 顺序 之 后 5 一 10 个 碱 基 。 DNA 分 子 被 限制 性 内 切 酶 切 开 之 后 , 它 的 片 眉 可 能 有 三 种 形式 : 一 种 是 DNA 片 段 的 未 端 是 平 齐 的 ,一 种 是 带 有 5 粘性 末端, 一 种 是 带 有 3 粘性 末端 。 如 Hae III 的 切口 是 : 5 GGCC 3 MPN EK MALAY 5’ CC……GG 3’ nu ee oy 3”GG……: GCC 9 Y EcoRI 的 识别 点 是 : 5’ GAATTC 3’ 产物 带子 -粘性 未 端 BS MATT Conese G 3" sf a ag Ph S Greeeee CA 5S . 一 , Y 着 Pst 的 识别 顺序 是 ， 5”CTGCAG 3” 切 下 片段 带 有 3- 粘性 未 端 “5 G……， CTGCA 3’ 3 ah 2, 3 ACGTC::+-G 5’ 正 因 为 有 了 限制 性 内 切 酶 ,分 子 量 很 大 的 DNA 才 有 可 能 切 成 一 定 大 小 的 片 朋 ,只 有 FAKE Re /\ AO EE, DNA 顺序 测定 才 成 为 可 能 。 一 个 DNA 分 子 用 限制 酶 酶 解 后 得 到 ， 很 多 片段 ,那么 这 些 片 段 在 DNA 分 子 中 原来 的 排列 次 序 如 何 ? 这 就 是 下 一 节 物 理 图 谱 要 解决 的 问题 。 物 理 图 谱 物理 图 谱 就 是 DNA 分 子 的 限制 性 内 切 酶 酶 解 片段 的 排列 顺序 。 物理 图 谱 可 以 用 多 种 方法 来 测定 ， 其 中 以 部 分 酶 解 方 法 和 两 种 不 同 专 一 性 限制 酶 交叉 酶 解 方法 最 为 简便 和 常用 。 部 分 酶 解 方 法 是 其 他 各 种 测定 物理 图 谱 方法 的 基础 。 测定 物理 图 谱 的 第 一 步 是 测定 DNA 完全 酶 解 片段 的 数目 和 每 个 片段 的 分 子 量 。 选 择 合适 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 或 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 作为 载体 进行 电泳 ， 通 常 能 把 绝 大 多 数 酶 解 FEED FP. OSH BRO AEM ORO PB AT, DO ES SEAN REE PHA PS fi DNA 分 子 量 的 对 数 成 反比 。 如 果 DNA 片段 是 放射 性 2P 全 奈 记 的 ,那么 就 可 以 从 每 个 片 侦 的 放射 性 占 整 个 分 子 的 放射 性 量 的 百分比 推算 出 分 子 量 。 用 电子 显微镜 方法 可 以 测定 每 个 DNA 片 眉 的 长 度 , 从 而 计算 出 分 子 量 , 但 没有 电泳 方法 方便 。 测定 了 完全 酶 解 片段 的 数目 和 分 子 量 之 后 ， 接 着 把 DNA 用 限制 性 内 切 酶 进行 部 分 敌 解 ， 测 定 每 个 部 分 酶 解 片段 的 分 子 量 。 从 部 分 酶 解 片段 的 分 子 量 就 可 以 直接 推测 哪 几 个 完全 酶 解 片段 是 相 邻 的 。 例如 有 一 个 由 X174 (SHR) Hind Il HRB, HOEK 小 是 1030 FREER (bp), 这 个 片 外 用 Alu I 可 以 切 成 A，B，C，D 四 个 片段 ,分 子 大 小 分 别 是 750bp。150bp，80bp 和 50bp。 为 了 测定 这 四 个 片 外 的 排列 顺序 ， 可 以 用 Alu I 部 分 酶 解 ， 在 部 分 酶 解 片段 中 得 到 分 子 大 小 分 别 为 810bp，230bp 130bp SSH Bo 从 这 些 数据 立即 可 以 推断 Alu I 酶 解 的 四 个 片段 的 排列 次 序 为 150-80-50-750( 见 图 2-2)o 当 然 也 可 以 把 每 个 酶 解 片段 从 凝 胶 上 洗 下 用 同样 的 酶 完全 酶 解 ， 这 样 得 到 的 酶 解 片 眉 应 是 相 邻 的 片段。 Brule arava ih A tue] 230 : 六 180 一 | 一 一 一 一 一 一 610 图 2-2， 用 部 分 酶 解 方法 测定 物理 图 谱 用 两 种 限制 性 内 切 酶 交叉 酶 解 也 是 测定 物理 图 谱 常用 的 方法 。 当 由 于 某 种 原因 ， 例 如 高 级 结构 的 影响 某 些 部 分 酶 解 片段 产 率 特别 低 和 对 ， 这 就 需要 第 二 种 酶 来 帮忙 。 交 又 酶 解 不 仅 可 以 得 到 两 种 或 多 种 限制 性 内 切 酶 的 物理 图 谱 , 而 且 可 以 相互 校对 ,使 结果 更 加 可 靠 。 一 般 先 建立 产生 片段 比较 少 的 限制 性 和 内 切 酶 的 物理 图 谱 ， 然 后 在 这 个 基础 上 去 建立 产生 片段 比较 多 的 限制 性 内 切 酶 的 物理 区 谱 。 如 前 所 述 ,部 分 得 解 的 方法 是 建立 物理 图 谱 的 基本 手段 ,但 是 部 分 酶 解 片段 的 数目 大 大 多 于 完全 栈 解 片 人 段 的 数目 ,这 给 分 离 带 来 很 多 困难 。 现 在 有 一 种 改进 的 部 分 酶 解 方法 ， 先 把 DNA 分 子 的 一 端 用 放射 狂 同 位 素 标 记 ， 部 分 酶 解 后 电泳 分 离 ， 那 末 只 有 带 同位 素 ea 20 。 的 片段 出 现在 放射 自 显影 图 上 RA BS TS HS Bo FAB AY Bh 基 对 数目 之 差 就 是 两 个 相 邻 点 之 间 这 段 DNA 片段 的 大 小 。 例如 某 个 组 蛋 昌 基 因 片 段 共 5900 bp， 末 端 标记 之 后 ,用 Hpa I 部 分 酶 解 后 得 五 个 片段 ,其 分 子 大 小 分 别 是 5900bp， 4210 bp，3260bp，2950bp，1020bp， 显 然 , 最 大 的 部 分 酶 解 片段 和 其 次 一 个 片段 核 背 酸 数 之 差 是 最 靠 右边 的 片段 的 分 子 大 小 ,其 余 以 此 类 推 , 就 可 以 推 得 全 酶 解 五 个 片段 的 排 死 次 序 是 : 1020-1930-310-930-1690 (ILA 2-3), 4210bp 3260bp 930-— A 2-3 用 末端 标记 法 测定 物理 图 谱 测定 物理 图 谱 的 方法 还 有 很 多 ,如 引物 脉冲 标记 法 、 双 向 杂交 法 ,电子 显微镜 法 ` 基因 互补 法 ` 基 因 删 除 突 变 株 和 野生 株 比 较 的 方法 、 外 切 酶 逐步 酶 解法 等 ,这 里 不 一 一 详 述 耳 。 测定 了 某 一 DNA 分 子 的 物理 图 谱 之 后 ， 就 可 以 着 手 测定 每 一 片段 的 核 背 酸 排 列 顺 诺 Te 测定 DNA 顺序 的 方法 前 面 已 经 讨论 过 ,用 于 RNA 或 蛋白 质 顺序 测定 的 基本 战略 是 小 片段 的 重 谷 。 而 这 种 战略 用 于 DNA 顺序 测定 困难 就 很 大 ,几乎 是 行 不 通 的 。1975 年 Sanger 突破 了 这 个 框框 ,提出 了 一 种 新 的 战略 , 他 不 是 直接 测定 DNA 片段 中 碱 基 的 组 成 和 顺序 ,而 是 以 测 定 片 眉 的 分 子 长 度 来 推测 碱 基 的 顺序 ， 用 不 同 的 处 理 方法 来 决定 碱 基 的 性 质 。 其 后 发 展 起 来 的 各 种 DNA 顺序 测定 的 新 方法 都 是 以 这 个 原理 为 基础 的 。 近来 这 个 原理 也 用 到 RNA 顺序 测定 中 ,发 展 了 很 多 新 的 RNA 顺序 测定 的 新 方法 ( 见 第 三 章 )。 因 此 这 个 原理 的 提出 在 核酸 的 顺序 测定 中 是 有 划时代 意义 的 。 这 个 方法 的 原理 并 不 复杂 。 假 定 有 一 个 DNA FE, GH 5 末端 用 放射 性 同位 素 标 记 好 了 ,这 是 片段 长 度 的 参考 位 置 。 又 假定 这 个 DNA 片 明 中 有 二 个 腺 叮 哈 ， 以 5 未 端 为 起 点 ,一 个 在 第 六 位 ;一 个 在 第 十 位 。 如 果 我 们 设计 一 种 方法 ， 能 使 与 腺 嘎 吟 相 邻 的 磷 酸 二 酯 键 断 开 ,而 与 其 他 碱 基 相 邻 的 链 不 受 影 响 , 那么 将 可 以 得 到 二 个 片段 , 一 个 是 六 核 苷 酸 , 另 一 个 是 十 核 苷 酸 , 这 二 个 片段 可 以 用 电泳 方法 分 开 , 并 决定 它们 的 长 度 。 反 过 来 ， 如 果 测 得 片段 的 长 度 ,我 们 可 以 推测 ,以 5 末端 为 参考 位 置 ， 第 六 位 和 第 十 位 由 腺 味 叭 占 据 着 ,其 他 三 种 碱 基 的 位 置 可 以 用 类 似 的 方法 推测 。 显 而 易 见 ,这 个 新 方法 能 否 成 功 取决 于 两 点 ,首先 是 要 有 一 种 方法 能 把 仅仅 相差 一 个 核 苷 酸 的 同系 核 苷 酸 片段 都 分 开 ,这 一 点 现在 是 办 得 到 的 ， 例 如 在 40 厘米 长 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 就 可 以 把 100 一 200 RFR 都 分 开 , 分 辩 率 达到 一 个 核 苷 酸 的 水 平 其 次 要 有 一 种 手段 能 制备 四 种 末端 碱 基 专 一 的 片 Bro 1975 年 Sanger 设计 的 “加 减法 ”首先 满足 了 这 个 要 求 。 从 此 以 后 发 展 了 很 多 制备 片 BR, RAH MA DNA (或 RNA) 顺序 测定 方法 ,其 原理 都 是 如 此 ， 不 同 的 方 法 区 别 就 在 于 制备 片段 的 方法 不 同 。 按 制 备 片段 的 方法 不 同 可 以 把 这 些 方法 分 成 两 大 sa 2 « 28: 一 类 是 用 DNA 聚合 酶 ,简称 酶 法 ; 另 一 类 是 用 化 学 降解 ,简称 化 学 法 。 酶 法 ”从 链 长 决定 碱 基 位 置 的 新 的 顺序 测定 方法 首先 是 由 Sanger 于 1975 年 设计 的 加 减法 "实现 的 。 以 单 链 DNA 为 模板 ， 加 一 个 合适 的 引物 〈 一 般 用 限制 性 内 切 酶 的 酶 解 片段 ), 再 加 入 四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 〈(dNTP)， 其 中 一 种 是 同位 素 标 记 的 。DNA 聚合 酶 就 从 引物 开始 合成 一 条 与 模板 互补 的 DNA 链 。 对 于 DNA 顺序 分 析 最 理想 的 情况 是 ,使 合成 反应 进行 的 程度 尽 可 能 是 随机 的 ,就 是 使 合成 产物 中 各 种 长 度 的 片段 都 存 在 。 然 后 从 反应 混合 物 中 除去 四 种 dNTP， 反 应 产物 分 成 二 部 分 ,一 部 分 用 在 加 法 系统 ， 一 部 分 用 在 减法 系统 。 用 于 加 法 系统 的 产物 再 分 成 四 小 分 ,每 一 小 分 中 仅仅 将 四 种 dNTP 之 中 的 一 种 加 入 反应 体系 ;比如 仅仅 加 入 dATP。 由 于 所 用 DNA 聚合 酶 具有 3 一 5 的 外 切 酶 的 活性 ( 见 第 四 章 )， 而 反应 体系 中 缺少 另外 三 种 必要 的 dNTP， 合 成 产物 就 从 3 一 5 方向 降解 。 然而 由 于 存在 dATP， 显 然 遇 到 腺 嗓 叭 的 位 置 降解 反应 就 停止 了 。 A 此 所 有 的 片段 都 是 以 A 为 结尾 的 。 同 理 , 可 以 分 别 制备 以 C、G 或 工 结 尾 的 另外 三 组 片 段 。 四 组 片段 在 同一 块 凝 胶 板 的 不 同样 品 槽 中 同时 电泳 ,从 放射 自 显 影 图 上 就 可 以 推断 碱 ZEN, AAO A 样品 槽 走出 的 放射 性 区 带 代表 和 A 在 片段 中 的 位 置 , 同 理 也 可 以 定 出 'C、 G 和 T 的 位 阐 。 因 此 根据 同一 凝 胶 电泳 上 的 四 组 区 带 就 可 以 推断 碱 基 的 顺序 。 按 理 只 用 一 个 加 法 系统 就 足以 推断 DNA 的 碱 基 顺 序 了 。 但 是 由 于 技术 上 的 原因 ， 只 用 一 种 方 话 有 时 不 能 得 到 完全 正确 的 结果 ， 因 此 还 设计 了 一 种 减法 系统 。 在 减法 系统 中 ， 也 是 将 上 述 酶 促 产 物 分 成 四 小 分 ， 每 一 小 分 中 只 加 和 三 种 dNITP， 比 如 缺少 dATP。 在 这 个 反应 体系 中 ，DNA 聚合 酶 能 够 把 片段 继续 合成 下 去 ， 但 是 在 遇 到 应 该 是 dATP 参 人 的 位 置 DNA 模板 引物 aie Tee ATGCTG DNA RAB 4dNTP (HEP BIZ) 模板 “一 一 -一 -一 一 ATGCTG -一 5 @P CM ANE (如 -A) Kes Bs +A) 电泳 分 离 八 组 加 减法 混合 物 O-C-T-A igi i ET 图 2-+ “加 减法 ?测定 DNA 顺序 的 原理 se。 22 。 A SRAM CRT. BRUSSEL ARLE A ROH 同样 可 以 定 出 A 的 位 置 。 斩 减 法 是 第 一 个 成 功 地 把 片 眉 长 度 和 碱 基 位 置 联系 起 来 的 新 的 顺序 测定 方法 ,4X 174 DNA 全 部 顺序 就 是 用 这 个 方法 测定 的 。 在 DNA 顺序 测定 方法 的 发 展 过 程 中 ,加 减法 的 历史 性 位 置 是 不 可 低估 的 。 但 由 于 技术 上 的 问题 ， 这 个 方法 的 实际 效果 还 不 够 理 想 。 可 能 由 于 在 基 的 特异 性 和 DNA 的 高 级 结构 的 影响 , 聚合 反应 并 非 如 希望 的 那样 不 同步 ,反应 速度 有 差异 ,有 些 片段 可 能 多 些 , 另 外 一 些 片段 可 能 少 些 ; 有 时 可 能 导致 调 读 和 重读 ,有 时 图 谱 上 还 会 出 现 假 谱 线 , 当 同样 的 碱 基 联 排 时 图 谱 上 有 时 只 出 现 一 条 带 。 因 此 用 这 个 方法 测定 的 DNA 片段 可 能 有 五 十 分 之 一 的 误差 e 对 加 减法 的 一 个 最 成 功 的 改进 是 “未 端 终止 法 ”, 其 基本 反应 也 是 利用 DNA RABE 的 酶 促 反 应 。 在 反应 混合 物 中 有 模板 .引物 、 酶 和 四 种 dNTP。 除 了 四 种 正常 的 dNTP 之 外 ,另外 再 加 入 一 定 比例 的 2’, 3' 双 脱氧 核糖 核 昔 三 磷酸 ,比如 ddATP (图 2-5)。 因 此 在 人 O--P-O-P-O-P-O-CH, A " Hi 1 O ORD) 9 H H H H 2-5 2、3 双 脱 氧 核 糖 腺 苷 三 磷酸 的 结构 合成 过 程 中 遇 到 应 该 dATP 参 人 的 位 置 就 有 二 种 可 能 的 情况 发 生 。 如 果 是 dATP BA 则 链 可 以 继续 延伸 ,如 果 是 ddATP 人 参 人 合成 反应 就 不 能 进行 了 , 因为 ddATP 的 3' 位 置 没有 产 基 。 因 此 ,可 以 得 到 一 系列 不 同 长 度 的 以 -ddA 为 结尾 的 一 组 片段 。 同 理 ,， 也 可 以 得 到 以 GT 或 C 为 结尾 的 片 眉 , 电 泳 之 后 ,就 可 以 直接 “ 读 出 碱 基 有 顺序 ， 这 是 一 个 十 分 方便 和 精确 的 方法 。 当 然 如 果 原 始 的 DNA 是 双 链 ,而 不 是 单 链 ,那么 分 离 单 链 DNA 片 用 是 困难 的 ,而且 制 备 合适 的 引物 也 是 一 个 环 手 的 问题 。1980 年 以 来 发 展 起 来 的 把 DNA 重组 到 单 链 鸣 菌 体 M13 中 ,增殖 之 后 ;可 以 获得 大 量 的 单 链 DNA ( 酶 法 正 需 要 单 链 DNA 作为 模板 进行 顺序 测定 ) ,而且 由 于 组 建 的 -MI3 载体 含有 通用 的 引物 结合 位 置 ,因此 可 以 利用 同一 种 引物 ,这 样 简 化 了 单 链 DNA 分 离 和 引物 制备 的 步 又， 大 大 推动 了 末端 终止 法 的 发 展 。 以 这 个 方法 为 主 ， 已 于 1982 年 完成 了 1 噬菌体 DNA 全 顺序 (48502bp) 的 测定 ,目前 正 向 更 大 的 DNA 进军 。 1982 年 洪 国 藩 改进 了 上 述 双 脱氧 与 M13 克隆 系统 相 结合 的 方法 。 由 于 原 有 方法 是 拜 机 的 ,不 可 避免 地 出 现 测定 的 多 次 重复 ,而 这 种 重复 在 测定 的 后 期 更 为 严重 。 改 进 后 的 方法 叫做 “DNA 顺序 的 连续 测定 法 ”( 见 示意 图 2-6)。 连续 法 的 关键 是 将 克隆 的 外 源 DNA 的 一 端 固定 起 来 ， 而 另 一 端 则 用 没有 专 一 性 的 DNase I 将 其 逐渐 缩短 ， 然 后 通过 “MMH RAKE AA 200 个 核 苷 酸 差 异 的 克隆 ; 实验 设计 使 得 缩短 的 一 端 发 生 在 共 同 引物 区 ,这 样 ,对 这 些 克隆 的 顺序 的 逐个 测定 ,就 实现 了 对 长 链 DNA 的 连续 测定 。 用 这 个 方法 完成 了 2300bp 的 顺序 。 化 学 法 Gilbert 及 其 同事 Maxam 利用 某 些 化 学 试剂 能 专 一 地 修饰 碱 基 ， 使 相应 的 糖苷 键 变 得 不 稳定 ， 这 样 也 可 以 得 到 以 特定 碱 基 结尾 的 四 组 片段 (图 2-7)。 他 们 所 选 用 的 化 学 试剂 一 种 是 硫酸 二 甲 酯 ,一 种 是 有 。 硫 酸 二 甲 酯 可 以 使 鸟 吐 叭 的 N-7 AR e 22's T 连接 酶 连接 和 转 导 ， A c) d) | 4 As Mt e) | PA 9, FUDNAR ABE AH Bt HOE {| 3. RADA ER cM ee ’ a 一 > 一 SS: a ee 了 es IN | TADNAR G Ai EK ARS: “Pp A KP p Aj2-0 eS DNA 顺序 示意 图 。 A 和 8 为 二 个 不 同 的 限制 性 内 切 酶 只 的 N-3 位 甲 共 化 ,被 甲 基 化 的 厌 叭 的 糖 音 键 是 不 稳定 的 ,在 中 性 pH 加 热 就 会 使 甲 基 化 的 嘲 吟 脱落, 当 陪 闲 叭 的 DNA 在 碱 性 溶液 加 热 时 ,磷酸 二 酯 键 就 会 断 开 ， 这样 一 组 片 段 电泳 之 后 在 放射 四 显影 图 上 有 一 深 一 浅 工 组 谱 线 , 深 的 是 由 于 G 降 解 而 产生 的 , 浅 的 是 由 于 和 降解 而 产生 的 。G 之 所 以 比 A 深 是 因为 G 甲 基 化 的 速度 比 A 快 五 倍 。 用 硫酸 二 甲 RE ERIE LAY DNA 片 外 ,如 果 先 用 稀 酸 处 理 , 脱 叮 叭 反应 主要 是 在 A 的 位 置 上 进行 ,因为 在 这 种 条 件 下 甲 基 化 的 A 比 甲 基 化 的 G 更 不 稳定 ,然后 再 用 碱 断 开 磷酸 二 琵 键 ,电泳 图 谐 © 24 « 上 深 的 谱 线 代 表 A, 浅 的 谱 线 代表 Go PFRRADBAKAM MOH HR, RAKE 催化 如 消除 反应 ;使 磷酸 基 团 掉 下 ;此 条 件 对 C 和 T 没 有 选择 性 , 当 肝 解 时 存在 2M NaCl,. A NH, G O Cc NH, O -NIH: N Ny N ‘y ie As HN CH, | -NE 3 lina ‘ ONAN N o LN, Ae Rae : ek Penske = oat eu Kon O- O- | i 9 0 8 Al 4a qp=o O-—p=0 O-=p=C O-—p=0 / O : ; / O O ,O 3'f 4 ie! 中 s+ NH,NH “ 1 “idles Catal jer OgGGH: igi ci day O mA NH, m7G fe) 9Ha (+NaCl) O(-NaCDb VS ay Hy CH) i Ky: N Haw Aw? *S r a CH; _ g O 5~ /O 3 | 3’ a 3 H ~~ 5 一 /OH CH=N+ ) {on K 4 yy, H OH | OH- ra oO E K wre Ne 0-—p=0 oF 0 O-—-p= 3'1 O \ Me It 1 § So-—Pp—-OH o- A 2-7 DNA 化 学 降解 的 反应 历程 2-2 DNA 顺序 分 析 的 化 学 降解 反应 NH,NH, + # > | | 5 Ce DMS [组 6 Gta 酸 #* Di hE 7 C+T NH,NH, Oe Ge 8 g NH,NH, + # Hie Me 9 ASc NaOH 有 哌 啶 IT 组 10 G>A DMS Aik ae ll G 甲 烯 蓝 哌 喧 12 中 四 氧化 娥 Die We * DMS Hot — FRE. ** pH2 甲酸 吡啶 。 ea 抑制 了 膜 同 T 的 反应 ， 这 样 产生 的 谱 线 相当 于 C 的 位 置 (Al 2-7)o ; 在 对 二 种 碱 基 专 一 的 化 学 反应 中 ， 酸 处 理 通 过 质子 化 作用 使 味 叭 糖苷 键 不 稳定 ， 碱 处 理 优 先 打开 腺 味 哈 和 胞 喀 啶 环 ,最 后 均 可 被 哌 啶 所 消除 ， 使 DNA 链 在 G 和 A( 酸 处 理 ) 或 A 和 C( 碱 处 理 ) 处 断 链 。 此 外 , 甲 烯 蓝 , 四 氧化 娥 也 曾 被 用 于 DNA 顺序 分 析 ( 见 表 2-2)。 如 果 单 链 DNA 的 一 端 被 标记 , 用 上 述 方法 可 产生 以 同一 种 碱 基 〈 或 周二 种 碱 基 ) 结尾 的 片 段 ,只 要 能 区 别 四 种 碱 基 , 便 可 直接 在 凝 胶 电 泳 上 读 出 核 苷 酸 排列 顺序 。 表 2-2 列 出 的 三 组 化 学 降 解 反 应 可 被 使 用 ,其 中 以 第 工 组 效果 较 好 。 若 在 AU ABME A > C 反应 ( 见 第 II 组 的 9), 共 五 个 反应 条 件 ,能 得 到 更 为 满意 的 结果 (图 2-8)。 化 学 降解 的 精确 程度 在 理论 上 应 达到 100 驳 ， 但 在 实际 测定 中 并 非 如 此 理想 。 如 果 用 厚 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 板 〈1.5mm), 没有 其 他 手段 核对 并 且 仅 测定 一 次 的 话 ， 精 确 率 可 能 只 有 85% 5 如 果 从 二 个 方向 测定 则 可 提高 到 99% 5 如 果 用 薄 的 凝 胶 板 (0.3mm ) ,一 次 测定 的 精确 度 就 可 以 达到 99 驳 。 DNA 顺序 测定 方法 主要 是 前 面 讨论 的 化 学 降解 法 和 末端 终 止 法 ， 也 有 人 设计 一 些 其 他 的 专 28 jie DNA mmm 一 性 断裂 DNA 的 方法 ， 但 基本 上 还 是 模 伤 花 学 射 自 显影 图 ( 共 采 用 五 个 反应 条 件 ) 降解 和 末端 终止 法 。 事 实 上 ， 除 了 这 二 种 方法 以 o 20. 6 > 9 > FNA AX 22DNN0NAOA QONAON>> OF3254 44 0) gf) eG at). Severe Sh, ABBOT EEDA A RS (SEE ARE AIRY IE RELL RE MA ARM, HM GE DNA ffi AWA LEBEN, CER EATCORELREM, BER 室 也 很 乐意 采用 。 近 年 来 由 于 将 未 端 终止 法 与 M13 克隆 系统 相 结合 已 经 把 DNA 顺序 分 析 推 向 一 个 新 阶段 。 由 于 方法 上 的 突破 , DNA 顺序 测定 已 成 为 分 子 生 物 学 中 发 展 最 快 的 分 枝 之 一 。 报道 DNA IMHO, 第 一 个 完整 的 DNA 分 子 的 已 知 结 构 是 由 XK174DNA (5386, 1977 年 ), 接 着 测定 了 SV40 DNA (5226, 1977 年 )、G4 DNA (5577,1978 年 ) 和 fd DNA (6408,1978 fe), 1981 年 报道 了 人 和 午 线 粒 体 DNA (16569bp 和 16338bp) 的 全 结构 。1982 FRAN 1A DNA (48502bp)> 在 测定 大 的 _DNA 过 程 中 , 必须 使 用 电子 计算 机 储存 、 处 理 和 比较 已 经 获得 的 顺序 信息 ;这些 工作 单纯 依靠 人 力 已 很 难 胜任 了 。 几 年 前 ， 人 们 还 千方百计 设法 把 DNA 转录 成 RNA， 用 测定 RNA 的 方法 来 反 推 DNA 的 顺序 。 现 在 ，DNA 顺序 测定 的 方法 已 达到 这 样 的 水 平 , 就 是 把 RNA 变 成 DNA 来 测定 。 已 完成 的 一 些 最 大 的 RNA 的 顺序 如 卵 白 蛋 白 的 mRNA、16S rRNA 等 都 是 经 过 反 转 录 成 DNA 后 测定 顺序 的 。 另 一 方面 ,把 核酸 分 子 特 异性 地 降解 ,然后 用 测定 片段 长 度 来 确定 碱 基 位 置 也 已 用 于 RNA 顺序 测定 上 ， 这 方面 近 几 年 有 很 多 发 展 ( 见 第 三 章 “RNA 结构 ”)。 总 的 来 说 ，RNA 顺序 测定 进展 还 不 如 DNA, 由 于 DNA 顺序 测定 方法 已 十 分 简便 , 因此 只 要 有 可 能 。 就 把 蛋白 质 顺序 测定 转化 成 DNA 的 顺序 测定 。 例 如 猴 病 毒 SV40 全 部 顺序 测定 已 完成 ,只 要 分 离 到 SV40 编码 的 蛋白 质 , 测 定 其 N 端 开始 的 几 个 氨基 酸 , 就 可 以 很 容易 地 按 氨 基 酸 密码 表 推 断 出 蛋白 质 的 全 结构 。 又 如 噬菌体 %X174 的 全 部 顺序 已 知 后 。 按 照 一 些 规 则 可 以 从 这 个 顺序 预言 4X174 可 能 还 编码 一 些 至 今 我 们 未 知 的 蛋白 质 。 事实 也 是 如 此 ，X174K 基因 和 蛋白 就 是 在 这 个 预言 指导 下 新 找到 的 _%X174 编码 的 蛋白 质 。 DNA 顺序 测定 还 可 以 核对 过 去 测定 的 蛋白 质 的 顺序 是 否 正确 。 例如 大 肠 杆 菌 ; 基因 的 顺序 测定 完成 后 ， 比 较 该 DNA 顺序 和 阻 歇 蛋白 的 氨基 酸 顺序 ,发现 两 者 有 所 不 同 。 后 来 知道 ,这 个 差别 是 由 于 在 氨基 酸 We PRE TRIKE 3 如 果 对 DNA 顺序 测定 作 一 个 乐观 的 估计 ,可 以 设想 现在 所 有 的 DNA 顺序 原则 上 都 能 测定 。 主 要 是 工作 量 的 问题 。 我 们 可 以 设想 , 先 把 一 个 生物 体 的 全 部 DNA 做 成 基 因 库 , 每 个 克隆 里 面包 含 了 几 千 个 到 几 万 个 碱 基 对 长 度 的 DNA 片 钼 , 按 目 前 的 水 平 , 每 一 个 这 样 长 短 的 _DNA 片 朋 的 顺序 可 以 在 合理 的 时 间 内 把 它 测定 完毕 。 下 一 步 是 如 何 确定 每 个 克隆 所 包含 的 DNA 片段 在 整个 染色 体 上 的 排列 。 可 能 有 很 多 途径 来 解决 这 MAB, 例如 制备 同一 种 DNA 用 两 种 不 同 限制 性 内 切 酶 酶 解 后 制备 两 套 基因 库 ， 分 别 测定 他 们 的 顺序 之 后 就 可 以 找到 必要 的 重 释 片 侦 , 从 而 把 基因 库 中 的 DNA BEER 一 个 完整 的 染色 体 。 另 一 种 方法 是 把 每 个 基因 库 所 含 的 基因 表达 出 来 ， 同 遗传 学 得 到 的 基因 图 对 照 , 也 可 决定 很 多 基因 库 的 顺序 ， 象 大 肠 杆 菌 DNA 的 顺序 在 现 有 水 平 上 是 能 够 解决 的 ,以 上 的 估计 可 能 乐观 一 些 , 问 题 在 于 即使 已 知 全 部 顺序 ， 要 理解 它们 的 功能 将 ' 困难 得 多 。 © 27 。 =, DNA 顺序 组 织 DNA 分 子 中 不 同 的 区 域 有 不 同 的 功能 ,有 些 区 域 是 编码 蛋白 质 的 结构 基因 ， 有 些 包 : 含 了 复制 、 转 录 或 翻译 等 调控 信号 。 具有 不 同 功 能 的 DNA 区 域 在 整个 分 子 中 的 分 布 精 - 况 就 是 DNA 顺序 组 织 所 要 讨论 的 主题 。 在 原核 生物 中 结构 基因 占 了 整个 DNA WAM. 分 ;而 在 真 核 生 物 中 ,可 能 只 占 一 小 部 分 。 人 们 相信 非 结构 基因 部 分 包含 了 调节 基因 表达 的 信号 。 它们 的 分 布 情况 对 基因 的 调控 是 直接 有 关 的 。 研究 DNA 顺序 的 组 织 是 结构 功能 研究 的 一 部 分 。 从 广义 上 讲 ，DNA 一 级 结构 也 是 DNA 顺序 组 织 的 二 部 分 ， 一 级 结构 可 以 看 作为 最 精细 的 DNA 顺序 组 织 。 当 然 从 另 一 个 角度 而 言 , 染色 体 上 的 基因 图 也 属于 DNA 顺序 的 组 织 , 因 此 DNA 顺序 组 织 也 称 为 基因 的 组 织 。 在 这 一 节 种 我 们 主 . 要 从 DNA 顺序 的 角度 讨论 它们 的 分 布 特点 。 测定 DNA 顺序 的 组 织 可 以 用 不 同 的 方法 ,主要 有 : (1) 测定 DNA 核 背 酸 有 顺序。 近年 来 核 苷 酸 顺 序 的 快速 测定 方法 已 经 解决 ， 这 为 了 解 DNA 顺序 的 组 织 打 下 了 和 良好 的 基础 。 但 是 测定 DNA 核 昔 酸 顺序 并 未 等 于 了 解 DNA 顺序 的 组 织 , 还 要 与 生化 的 和 遗传 的 方法 相配 合 ,了 解 这 一 段 DNA 的 生物 功能 ;这 样 才能 对 顺序 组 织 有 比较 清晰 的 理解 。 (2) 核酸 杂交 。 用 已 知 功能 的 DNA 或 RNA 片段 同 DNA 杂交 ,再 配合 电子 显 微 镜 的 观察 ， 是 测定 DNA 顺序 组 织 十 分 有 效 的 手段 。 特 别 是 近 几 年 来 ， 利 用 重组 DNA 技术 能 获得 大 量 特定 的 探 针 ,这 样 就 为 研究 基因 的 数目 和 分 布 提 供 了 有 利 的 条 件 。 (3) 复 性 动力 学 方法 。 测定 变性 DNA 的 复 性 动力 学 的 过 程 可 以 推测 同 源 DNA 片 毁 的 数目 和 分 布 情况 。 十 多 年 前 ， 这 个 方法 在 探索 真 核 生 物 的 基因 组 织 中 作出 了 很 好 的 开端 ;现在 仍然 是 一 个 十 分 有 用 的 手段 。 (4) 遗传 学 方法 。 利 用 基因 突变 的 重组 、 交 换 和 互补 等 方法 可 以 测定 基因 的 数目 和 位 置 ,还 能 测定 基因 的 精细 结构 。 在 微生物 中 , 遗传 学 的 方法 显 出 特殊 的 优点 ， 因 为 微 生 物 的 突变 容易 获得 和 检 出 。 以 下 我 们 通过 几 个 例子 来 简要 地 说 明 原核 生物 中 和 真 核 生物 中 DNA 顺序 组 织 的 某 : 些 特点 。 由 于 生物 的 复杂 性 , 特别 在 真 核 生物 中 ， 因 此 以 下 讨论 的 某 些 DNA 顺序 组 织 . 的 特征 有 可 能 仅仅 是 一 种 特殊 的 现象 ,而 不 是 一 种 普遍 的 规律 。 原核 生物 DNA 顺序 组 织 噬菌体 vit KK mX174 和 G4 Kio aM aK pX174 和 G4 都 是 小 球形 病毒 ,包含 单 链 环 状 DNA。 这 二 个 病毒 在 血清 学 上 有 交叉 反应 ， 然 而 在 遗传 学 上 两 者 不 能 有 效 地 互补 和 重组 。 从 电子 显微镜 观 察 , 这 二 种 DNA 的 异 源 杂交 双 链 有 39% 碱 基 是 误 配 的 , 二 者 的 物理 图 谱 的 差别 更 加 证 _ 实 了 这 一 点 。 现 在 二 个 DNA 的 全 部 顺序 已 测定 完毕 , 对 这 二 个 噬菌体 的 遗传 学 分 析 稳 生化 研究 也 十 分 详尽 ， 因 此 可 以 对 这 两 个 分 子 进行 详细 的 比较 。 令 人 惊奇 的 是 两 者 虽然 顺序 上 的 差别 可 达 将 近 40 多 ,而 在 DNA 顺序 组 织 上 又 那么 相似 (图 2-9)。 从 DNA Ii °, 2B 。 要 36 110 8. | 一 二 二 全 care Somer tm [Cao oor le od 有 Ov ' BR / | 59 32 45 136- 10 4 | BK | G4 | ee od || p 4 、 J = 4 4 * 及 Ov B Py, RNA (Oo 插入 3 138 3 6 3 42 G4 He «18 «3 39 可 和 he u 1 I i 1 | 3 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 2-9 鸣 菌 体 %X174 和 G4 的 基因 图 第 一 、 第 二 行 分 别 是 %X174 和 G4 的 基因 图 ;第 三 行 表示 相对 于 $X174 的 G4 编码 区 中 插 人 和 人 缺 失 的 核 苷 酸 的 数目 和 位 置 ; 第 四 行 是 核 背 酸 数目 尺度 。PA、Pa 和 Pp 为 三 个 启动 子 的 位 点 ，Ov 和 Oc ABRAM DNA 链 和 互补 DNA 链 合成 的 起 始 部 位 。 许 组 织 的 角度 比较 叭 菌 体 4X174 和 G4, 以 下 三 个 特点 是 值得 注意 的 。 (1) 虽然 _%X174 和 G4 都 编码 了 11 个 蛋白 质 ， 但 是 只 转录 成 三 个 mRNA. 每 个 mRNA 包含 了 多 个 顺 反 子 ,而 且 功 能 上 有 关 的 有 顺 反 子 通常 串联 在 一 个 mRNA 分 子 上 。 例如 从 启动 子 Pe 开始 转录 的 mRNA 包含 了 基因 D-(E)-J-F-G-H。 其 中 基因 J,F,G， 百 都 是 编码 噬菌体 的 外 壳 蛋 和 白 的 。D 和 蛋白 同 吧 菌 体 的 装配 有 关 ， 卫 蛋白 是 裂解 细菌 的 蛋 45, 这些 编码 在 一 个 mRNA 分 子 中 的 蛋白 质 在 生理 功能 上 都 是 密切 相关 的 。 这 种 DNA 颁 序 组 织 的 方式 可 能 是 使 这 些 基 因 协 同 表 达 的 一 种 调控 方式 。 功 能 上 相关 的 基因 组 织 在 一 起 ,并 转录 在 同一 个 mRNA 分 子 中 ,这 种 现象 在 原核 生物 中 是 很 普遍 的 。 在 真 核 生物 中 ,如 果 说 不 能 绝对 排除 这 种 现象 ,至 少 也 是 很 稀有 的 。 (2) $X174 和 G4 DNA 分 子 的 绝 大 部 分 是 用 来 编码 蛋白 质 用 的 。 只 有 一 小 部 分 是 未 翻译 出 来 的 。 不 翻译 出 来 的 部 分 在 $X174 DNA 中 占 21715386， 在 G4 DNA HG 282/15577，。 也 就 是 说 不 到 5 多 。 染色 体 的 绝 大 部 分 用 来 编码 蛋白 质 ， 这 也 是 原核 生物 的 DNA 顺序 组 织 的 一 个 特点 。 不 翻译 出 来 的 DNA _ 区域, 或 称 间隔 区 ,经 常 包含 了 一 些 控 制 基因 表达 的 DNA 顺序 。 如 基因 上 和 A 之 间 的 间隔 区 包含 了 RNA 聚合 酶 的 结合 点 ， 村 录 的 终止 信号 、 核 糖 体 结合 位 点 等 控制 表达 的 部 分 。 MURA $X174 而 言 ， 所 有 的 间隔 区 (除了 基因 G 和 互 之 间 的 间隔 之 外 ) 都 可 以 形成 一 个 稳定 的 发 夹 结构 。 据 推测 控制 信号 可 能 同 这 类 二 级 结构 有 关 。 (3) MEEK 由 X174 和 G4 而 言 ; 在 DNA 顺序 组 织 上 最 大 的 特点 是 基因 重 登 。 其 他 二 些 病毒 ,如 猴 病 毒 SV40 DNA 中 也 发 现 有 基因 重 登 的 现象 ,至 今 还 只 是 在 病毒 DNA 中 发 现 这 种 现象 。 一 般 而 言 , 这 一 类 病毒 DNA 分 子 都 不 大 ， 但 又 必须 装 人 相当 多 的 基 因 , 可 能 这 种 压力 导致 病毒 DNA 在 进化 过 程 重 倒 起 来 。 从 图 2-9 可 以 看 到 ,基因 了 和 基 因 攻 重 释 在 基因 A 之 内 ， 基 因 匡 重 倒 在 基因 D 之 内 。 这 些 重 倒 在 一 起 的 基因 使 用 的 码 组 是 不 同 的 ,因此 虽然 是 同样 的 DNA 顺序 ,而 转译 出 来 的 是 不 同 的 蛋白 质 。 图 2-10 列举 9 了 部 分 核 音 酸 顺 序 , 它 们 用 在 三 个 码 组 之 中 ,含意 各 不 相同 。 T ATG —KERheRES 玫 基 因 的 Asn.Glu 密 码 = 一 (基因 的 Met',Arg 密 码 — AAATGAGG t : A 基因 中 的 Lys 和 终止 密码 2-10 在 重 伙 基因 中 同一 核 苷 酸 顺 序 包含 着 多 种 生物 信息 由 于 基因 的 重 倒 ,在 重 伙 部 位 一 个 碱 基 的 突变 将 影响 二 个 蛋白 质 甚至 三 个 蛋白 质 , 因 此 我 们 可 能 猜想 在 进化 过 程 中 位 于 基因 重 倒 区 的 _DNA 顺序 的 保守 性 将 比 非 重 县 区 的 大 一 些 。 实验 比较 了 $X174 和 G4 的 DNA 顺序 的 变化 频率 ,发现 重 倒 区 的 变化 频率 仅仅 比 非 重 委 区 稍 低 一 点 。(22 匈 对 33 匈 ), 因 此 基因 的 重 全 并 不 是 进化 的 严重 阻碍 。 GR. mera. 是 感染 大 肠 杆菌 的 温和 性 噬菌体 。1 DNA 人 侵 宿主 以 后 ;可 ， 以 有 二 条 发 育 途径 ， 一 条 是 溶菌 途径 ， 另 一 条 是 溶 原 途 径 。 所 谓 溶菌 途径 就 是 人 侵 的 1 DNA 在 宿主 内 增殖 ,指导 合成 噬菌体 的 mRNA， 并 翻译 出 噬菌体 的 蛋白 质 , 装 配 成 成 熟 的 噬菌体 ， 使 宿主 细胞 裂解 。 所 谓 溶 原 途 径 就 是 人 侵 的 1 DNA 整合 到 大 肠 杆 菌 的 染 色 体 中 ，1 DNA 基因 的 表达 受到 阻 遇 ，2 DNA 作为 宿主 _ DNA 的 一 部 分 与 宿主 DNA 一 起 复制 。 在 某 尘 条 件 下 ,比如 紫外 光照 射 之 后 ,可 以 诱导 1 DNA 从 宿主 DNA 上 切 下 ， 独立 增殖 ,发 育成 成 熟 的 叹 菌 体 , 使 宿主 细胞 破裂 。 1 叭 菌 体 的 这 二 条 发 育 途径 可 以 看 作 一 种 最 原始 的 分 化 现象 。 MEK 2DNA 顺序 组 织 具 有 一 般 原核 生物 所 具有 的 共同 特点 ,如 大 部 分 DNA 是 用 来 编码 蛋白 质 的 ,功能 上 相关 的 基因 组 织 在 一 起 , 并且 一 起 转录 成 一 个 mRNA, HE 的 组 织 方 式 同调 控 的 关系 就 不 详 述 了 ， 这 里 仅 讨论 d 基因 两 边 二 个 操纵 基因 的 结构 (图 2-11,2-12)。 IDNA 人 侵 细菌 之 后 , 首先 利用 宿主 的 生物 合成 系统 分 别 从 PE 和 Pr 转录 翻译 成 二 .个 蛋白 质 , N 和 cro 蛋白 。 这 二 个 mRNA 在 转录 终止 信号 ty, 和 ta 位 置 转录 结束 。 这 二 个 终止 信号 是 受 e (宿主 转 录 终 止 因 子 ) 控 制 的 。 鸣 菌 体 编 码 的 蛋白 N Site 因子 的 能 力 , 因 此 蛋白 N 的 合成 就 使 转录 可 以 延伸 到 te 和 ta 之 外 ,进一步 合成 蛋白 ad O, P, dl 等 基因 产物 。 蛋白 O 和 了 是 引发 1DNA 复制 的 蛋白 质 ，cI 和 dill 是 同 鸣 菌 体 进 人 溶 原 途 径 有 关 的 蛋白 质 。 什 么 因素 决定 ) 喉 菌 体 的 发 育 途 径 这 个 问题 还 没有 解决 。 如 果 是 进入 溶 原 途 径 , 由 于 蛋白 dM dl 是 正 调节 因子 ,在 它们 的 帮助 下 ， 使 得 从 Pe 开 始 的 转录 能 够 起 动 。 转 录 一 直 进 行 到 珠 蛋白 和 8 珠 蛋 白 构 成 ar, 和 a6 fl 红 蛋 白 。 在 胎儿 血液 中 主要 是 wy; 血红 蛋白 ,一旦 出 生 后 ,血液 中 血红 蛋白 的 类 型 就 逐步 变 成 wp, 型 ,以 及 少量 0,6, Bo Bo, 7 (包括 ^y 和 sy) 珠 蛋白 都 属于 B 类 型 。B 类 型 的 珠 蛋 白 基 因 都 串联 在 一 起 ,中 间 以 间隔 区 隔 开 。 每 种 类 型 的 珠 蛋 白 都 是 分 别 转 录 的 (图 2-20)。 1 人 Ar 8 : B A2-20 人 B 类 型 珠 蛋白 基因 的 排列 (Kb 代表 千 碱 基 对 )( 图 中 Gr 应 为 sy,， Ar 应 为 Ar) H2B H3 HH2A Hi BS WA. G_£Vh_£$G Al2-21 组 蛋白 基因 的 排列 图 2-21 是 组 蛋白 基因 的 组 织 ， 细 胞 核 内 组 蛋白 一 共有 五 种 ， 分 别称 为 H1, H2A, H2B、H3 和 H+, 这 五 种 蛋白 质 的 基因 串联 在 一 起 ,构成 一 个 重复 单位 。 在 海胆 中 ,这 个 重复 单位 长 约 5,400 bp， 在 整个 基因 组 中 重复 几 百 次 。 虽然 过 去 有 人 认为 组 蛋 自 基因 可 能 转录 在 一 个 mRNA 中 ,然后 分 别 翻译 出 不 同 的 组 蛋白 , 即 认 为 组 蛋白 基因 是 多 顺 反 子 的 。 但 最 近 的 实验 结果 表明 五 个 组 蛋白 基因 是 分 别 转录 出 各 自 的 mRNA, 就 是 说 组 蛋白 基因 也 是 单 顺 反 子 结构 。 途 今 为 止 在 真 核 生物 中 还 没有 发 现 一 个 蛋白 质 基因 是 多 顺 反 子 结构 的 ,这 是 真 核 生 物 和 原核 生物 蛋 白 质 基 因 结构 的 一 个 很 重要 的 区 别 。 虽然 现在 普遍 认为 真 核 细 胞 中 ,蛋白 质 基 因 组 织 中 都 是 单 顺 反 子 结构 ,也 就 是 说 一 个 基因 对 应 一 个 mRNA， 一 个 mRNA 对 应 一 条 肽 链 , 但 是 这 并 不 排除 一 个 肽 链 通过 后 加 工 可 以 生成 几 种 不 同性 质 的 蛋白 质 或 多 肽 。 例如 促 肾 上 腺 激素 -8- 脂 肪 酸 释 放 因子 前 体 的 mRNA (EM cDNA 核 背 酸 顺 序 已 完成 ， 共 /1091 核 背 酸 ) 能 翻译 成 一 条 蛋白 链 。 这 * 38 ° 个 前 体 蛋白 通过 后 加 工 能 生成 促 肾 上 腺 素 、6- 脂 肪 酸 释放 因子 、 促 黑 激 素 ,8- 内 非 肽 等 不 同 的 激素 ,而 且 从 前 体 的 顺序 ， 还 能 推测 可 能 存在 的 但 目前 尚未 发 现 的 激素 。 图 2-22 就 表示 促 肾 上 腺 激素 -86- 脂 肪 酸 释放 因子 前 体 通 过 后 加 工 可 以 产生 很 多 种 激素 。 | 转录 mRNA rr 人 个 八 人 AAVU | | at 蛋白 质 前 体 。 TGSYTZRZPSIOUOOSOCZOONOOSSRTRP 二 加工 wx TION TOSS +-MSH ACTH, B-LPH TH TD GIO WR a-MSH CLIP vie Fae Ts ss B-MSH 甲 硫 脑 啡 咏 图 2-22 促 肾 士 腺 激素 -6B- 脂 肪 酸 释 放 因子 前 体 及 后 加 工 产物 ACTH, LIER; MSH， 促 黑 激 素 ; LPH, 脂肪 酸 释放 激素 ; CLIP, ER RRA PAK. 总 之 对 真 核 生 物 而 言 ,功能 上 相关 的 基因 可 能 串联 在 一 起 , 也 可 能 相隔 很 远 , 但 是 不 论 哪 种 情况 ,蛋白 质 基 因 都 是 单 顺 反 子 结构 。 (3) 很 多 蛋白 质 基 因 包 含 插 人 顺序 上 一 节 已 提 到 ,酵母 tDNA AIR rDNA SHAME. 许多 目前 研究 得 比较 多 的 蛋白 质 的 基因 都 发 现 有 插 人 顺序 (但 组 蛋白 基因 没有 插 人 顺序 ,这 一 点 已 从 核 苷 酸 顺 序 测 定 予 以 最 后 肯定 )。 由 于 基因 上 有 了 插 人 顺序 ， 使 得 编码 一 个 蛋白 质 的 DNA 顺序 在 基 图 2-23， 鸡 卵 白 蛋白 基因 中 的 插 人 顺序 带 斜 线 方 框 为 编码 蛋白 质 的 结构 基因 , 即 外 显 子 , 外 显 子 之 闻 为 插入 顺序 ， 即 内 含 子 。 图 中 有 七 个 内 含 子 和 七 个 外 显 子 加 一 个 前 导 顺 序 工 。 « SERBS 1 30 31 104 105 146 本 | 5/ 非 编码 区 插入 顺序 I 插入 顺序 Q 。 3 SERB (ll6bp) (647bp) 2-24 小 鼠 BRERA RAI B 珠 蛋白 由 146 氨基 酸 组 成 ,被 三 个 隔 开 的 外 显 子 所 编码 ? 基 因 中 除 插 和 顺序 外 ,还 转录 出 两 端的 非 编码 区 。 es 39 。 因 上 是 不 连续 的 。 已 有 几 十 种 蛋白 质 基因 含有 插 人 顺序 ,如 c\8、5 珠 蛋白 ,免疫 球 蛋白 的 重 链 和 轻 链 , 卵 白 蛋 白 ( 见 图 2-23), 溶菌 酶 ，SV40,， 腺 病毒 等 。 图 2-24 是 8 珠 蛋 自 基因 插入 顺序 的 分 布 情况 。 插 人 顺序 有 一 专 有 名 称 ， 称 为 内 含 子 ,编码 蛋白 质 顺 序 的 那 部 分 DNA 称 为 外 显 子 (也 见 第 五 章 第 165 页 )。 插入 顺序 的 生物 功能 还 很 不 清楚 。 在 产生 卵 白 蛋白 和 不 产生 和 卵 白 蛋白 的 细胞 之 间 ， 卵 白 蛋白 基因 的 插入 顺序 没有 区 别 ， 因 此 播 人 顺序 和 转录 的 效率 没有 关系 。 在 分 化 细胞 . 和 生殖 细胞 之 间 , 卵 白 蛋 白 基 因 的 插入 顺序 也 没有 区 别 ,因此 在 分 化 过 程 中 插入 顺序 没有 变化 。 但 是 在 不 同 的 个 体 中 插入 顺序 有 细微 的 差 异 。 有 些 实验 结果 说 明 ， 插 人 顺序 同 mRNA 转 录 后 的 命运 密切 有 关 ; 也 有 人 认为 插 人 顺序 是 对 生物 进化 十 分 有 利 的 基因 组 织 方式 ， 因 为 有 了 这 图 2-25 ”免疫 球 蛋 白 肽 链 的 基本 结构 种 方式 ， 基 因 很 容易 通过 重组 而 产生 带 有 新 功能 的 蛋白 质 。 免 疫 球 蛋 白 重 链 的 插 人 顺序 的 排列 方式 支持 这 个 假说 ， 因 为 免疫 球 蛋白 的 每 个 外 显 子 所 编码 的 肽 眉 实 际 上 是 一 个 独立 的 功能 单元 。 图 2-25 是 免疫 球 蛋白 的 肽 链 的 基本 结构 。 免 疫 球 蛋白 由 二 条 重 链 和 二 条 轻 链 构成 > 轻 链 和 重 链 都 可 分 成 二 部 分 ,一 部 分 是 恒定 区 ,这 个 区 域 的 氨基 酸 顺 序 在 不 同 的 抗体 中 是 不 变 的 ; 另 一 部 分 是 可 变 区 ,可 变 区 的 氮 基 酸 顺 序 随 抗体 专 一 性 而 变化 。 重 链 的 恒定 区 又 可 分 成 三 个 部 分 〈CH:、CH、CH:)， 每 个 区 域 约 由 110 个 氨基 酸 组 成 。CH' 区 域 同 轻 链 的 Cy (ial Va 和 Vi 一 起 ) 构 成 > 球 蛋白 的 Fe 部 分 , 二 条 重 链 的 CH, 和 CH; 组 成 Fe 部 分 。Fe 和 Fe 由 一 个 绞 接 区 连接 。 对 免疫 球 蛋 白 的 功能 进行 深入 研究 后 发 现 ， 这 些 区 域 各 上 自 都 有 自己 特有 的 功能 。 Vu Vi 配 信号 肽 _V; 绞 链 区 Cr 对 , 这 部 分 是 负责 同 抗原 结合 的 ; CH， 是 轻 。。 轻 细 基因 WWW 链 的 附着 ;配对 的 CH， 用 于 补体 固定 ;配对 的 CH, 负责 同 细胞 表面 相互 作用 。 还 有 一 odes ee ANinfa sik, ARKBANDDWAX Dit 重 链 基 因 LERERZANRERMFRRD—-MR 籽 | | | | 有 意义 的 事实 ， 即 编码 每 个 功能 部 分 的 顺序 “区 8 so YY ty Ao ZoZ 都 被 一 个 播 入 顺序 分 开 。 图 2-26 1 Pape a (290bp) (39bp) (2205p) (320bp) 免疫 球 蛋 白 的 轻 链 和 重 链 的 基因 结构 。 从 图 图 2-26 免疫 球 蛋 白 重 链 和 轻 链 基 因 的 结构 中 可 以 很 铺 楚 地 看 到 每 个 外 显 子 都 编码 一 个 有 一 定 功 能 的 肽 链 。 6 珠 蛋 白 有 三 个 外 显 子 ( 见 图 2-24)， 虽 然 每 个 外 显 子 的 功能 没有 象 免疫 球 蛋 白 区 分 得 那么 明显 ， 但 是 可 以 发 现 同 血 红 素 结合 的 氮 基 酸 大 多 处 于 中 间 的 那个 外 显 子 中 。 有 的 实验 指出 , 一 个 基因 中 的 内 含 子 就 是 另 一 个 基因 的 外 显 子 ， 表 明 这 段 DNA 序列 也 有 编 码 功能 。 近 来 发 现 , 在 酵母 线粒体 中 有 一 个 内 含 子 同 时 存在 着 起 始 密码 子 和 终止 密码 子 ， 能 编码 一 个 有 235 个 氮 基 酸 的 蛋 自 质 ， 表 明 所 谓 内 含 子 其 本 身 可 能 是 一 个 独立 的 结构 基 因 。 总 结 以 上 例子 有 人 提出 ,每 个 外 显 子 实际 上 是 来 自 一 个 原始 蛋白 质 , 内 含 子 也 可 能 具 有 生物 功能 。 外 显 子 和 内 含 子 镶嵌 的 方式 可 能 是 蛋白 质 进 化 的 遗迹 ， 而 且 也 是 进一步 进 化 的 原料 。 可 能 正 因 为 有 了 插 大 顺序 这 种 基因 组 织 , 大 大 加 速 了 真 核 生 物 的 进化 。 « 40 。 CH, 2K CH, CH, 2-27 在 生殖 细胞 和 浆 细 胞 中 A, 基因 组 织 的 比较 (4) 在 一 个 生物 中 ，DNA 顺序 组 织 可 能 是 可 变 的 。 一 个 例子 是 免疫 球 蛋 蝗 fo. ”和 轧 链 的 基因 在 浆 细胞 中 ,V:〈 可 变 区 ) 和 J\ 绞 链 区 ) 是 连 在 一 起 的 , 而 在 胚胎 细胞 中 这 二 个 区 域 是 分 开 很 远 的 ; 如 图 2-27 所 示 ， 在 分 化 过 程 中 通过 基因 重组 Vi MI RRA 在 一 起 。 这 种 基因 重组 的 方式 是 产生 多 种 免疫 球 蛋白 的 机 制 之 一 。 除 了 在 免疫 反应 过 程 中 基因 有 重组 现象 外 ;在 真 核 生 物 中 也 观察 到 类 似 原 核 生物 的 基因 转移 。 五 十 年 代 早 期 ; 大 们 就 发 现 ， 某 种 可 转移 的 基因 决定 了 玉米 粒 的 色泽 和 形状 。 后 来 又 发 现 果 蝇 的 眼睛 的 颜色 取决 于 某 个 可 转移 的 多 拷贝 基因 ,因此 某 些 DNA 片段 可 以 在 染色 体 转 位 的 现象 是 肯定 的 。 现在 还 不 知道 这 种 现象 是 局 限于 某 些 生物 某 些 基 因 的 特例 ， 或 是 在 其 分 化 过 程 中 也 . 会 产生 DNA 顺序 组 织 的 变化 。 从 已 有 的 实验 结果 似乎 说 明 ; 在 细胞 分 化 过 程 中 ，DNA 顺序 组 织 的 变化 即使 存在 ,也 不 是 一 种 普遍 的 现象 《5) 在 真 核 生 物 中 ， 可 能 存在 一 种 原核 生物 中 不 存在 的 基因 表达 的 调控 单元 ， 称 为 “ 增 效 子 ” (enhancer)， 猴 病毒 40 (SV40) DNA 中 存在 二 段 顺序 和 方向 完全 一 样 的 72: 碱 基 对 的 片段 , 它 对 SV40 早期 基因 的 表达 是 必须 的 ,把 这 一 DNA 片段 和 其 他 基因 ( 比 如 有 B 珠 蛋白 基因 ) 连 在 一 起 转化 细胞 以 后 ,测定 珠 蛋 白 基 因 的 表达 效率 ， 实 验 结 果 表 明 这 72bp 片段 大 大 促进 了 珠 蛋 白 表达 ， 而 且 这 种 效应 同 72bp 片段 同 珠 蛋白 基 因 之 间 的 相对 距离 和 方向 都 没有 关系 ， 但 和 细胞 的 种 类 有 关 。 具 有 这 种 效应 的 DNA 片段 称 为 “ 增 效 子 "。 不 但 SV40 RABAT” ,其 他 一 些 肿 瘤 病 毒 中 也 有 类 似 的 增 效 子 ”， 但 碱 基 顺 序 差异 很 大 。 除 病毒 外 , 某 些 真 核 基 因 内 也 具有 这 样 类 似 的 调控 单元 。 Baz, 真 核 生物 DNA 顺序 组 织 是 很 复杂 的 ， 没 有 一 个 简单 的 规律 可 循 。 我 位 对 它 的 认识 还 处 在 初步 阶段 。 至 于 顺序 组 织 和 功能 的 关系 更 是 知之 不 多 ， 有 待 于 进一步 研究 。 三 、DNA 的 二 级 结构 DNA 双 螺 旋 DNA 的 水 溶液 是 俱 粘 稠 的 ,加 热 又 能 使 溶液 粘度 大 大 降低 , 这 说 明 DNA FRA 一 定 结构 。DNA 分 子 应 该 具有 怎样 的 结构 才能 使 它 的 溶液 有 这 种 流体 力学 性 质 呢 ? 四 十 年 代 Pauling i SRAM o 螺旋 模型 ， 同 时 人 们 已 经 知道 DNA 是 遗传 信息 的 载 体 , 那 么 DNA 应 该 具有 怎样 的 结构 才能 成 为 基因 载体 呢 ? 1953 年 Watson 和 Crick 二 人 提出 了 DNA 双 螺 旋 模 型 ， 这 个 模型 不 仅 解释 了 当时 所 知道 的 DNA 的 一 切 理化 性 质 ， 而 且 将 结构 与 功能 联系 起 来 ;大 大 推动 了 分 子 生物 学 的 发 展 , 其 历史 功绩 怎样 评价 也 不 过 e 4] e 分 。 双 螺 旋 提出 的 根据 当时 提出 DNA 双 螺 旋 结构 的 根据 主要 有 三 方面 。 第 一 ，Astbury 很 早 就 用 射线 衍射 方法 研究 DNA 纤维 的 结构 ， 后 来 Wilkins 等 人 得 到 更 加 精美 的 DNA 纤维 的 和 射线 衍射 图 ,这 些 衍 射 图 提示 DNA 分 子 可 能 具有 螺 旋 结 构 。 一 些 强 的 衍射 点 表明 DNA 分 子 中 有 3.4 人 和 34 人 的 周期 性 的 结构 。 其 次 ，Chargaff 分 析 了 大 量 不 同 来 源 的 DNA 的 碱 基 组 成 ,发 现 不 象 原来 假定 的 那 RE, DNA 是 由 等 量 的 A、G、C、T 组 成 。 相 反 ， 不 同 来 源 的 DNA, HEL 例 是 未 同 的 ,但 是 有 一 个 共同 的 规律 , 即 胸腺 喀 啶 的 摩尔 含量 等 于 腺 味 叭 的 摩尔 含量 ， 胞 喀 喧 的 摩 尔 含量 总 是 等 于 鸟 嘎 叭 的 摩尔 含量 ; 即 [A] = [T] 和 [G] = [C]. 第 三 ,根据 四 种 碱 基 的 物化 数据 , 碱 基 可 以 分 成 大 小 二 种 , 嘎 叭 比 院 天 些 , 如 果 A-T 配对 或 G-C 配对 ,二 个 碱 基 对 的 几何 大 小 十 分 相近 ;同时 这 两 种 碱 基 配 对 在 化 学 EBA 理 的 ， 因 为 从 味 叭 和 喀 啶 的 氨基 和 酮 基 以 及 它们 的 键 长 键 角 来 看 ，A-T 之 间 以 及 G2C 之 间 能 形成 合适 的 氢 键 ; 从 酸 碱 滴 定 的 实验 结果 看 ， DNA 分 子 中 氨基 和 了 酮 基 可 能 是 形 图 2-28 双 螺 旋 DNA 的 分 子 模型 左 为 实心 模型 右 为 相应 的 糖 -磷酸 主 链 , 并 标明 大 沟 和 小 沟 。 RABERY o 如 果 我 们 把 DNA 想象 成 是 双 螺旋 分 子 ， 那么 以 上 的 结果 都 可 以 得 到 完满 的 解释 。 按照 这 个 假定 去 建立 DNA 分 子 模 型 ,立即 发 现 DNA 必然 是 由 二 条 链 组 成 的 右手 双 螺 旋 ( 图 .2-28)。 双 螺 旋 的 基本 特征 主 甸 脱氧 核糖 和 磷酸 基 相 互 间隔 连接 构成 DNA 的 主 链 。 从 化 学 键 的 方向 来 看 , 双 螺 旋 中 两 条 多 核 昔 酸 链 是 反 平 行 的 。 二 条 主 链 处 于 螺旋 的 外 侧 , 碱 基 处 于 螺旋 的 内 部 ,由 于 糖 和 磷酸 根 的 化 学 性 质 , 主 链 是 亲 水 性 的 。 两 条 链 形 成 右手 螺旋 ， 有 共同 的 螺旋 轴 , 螺 旋 的 直径 是 20A。 碱 基 对 由 于 几何 形状 的 限制 ， 只 能 由 喀 喧 和 味 叭 配对 才能 使 碱 基 对 合适 地 安置 在 双 螺 旋 内 。 若 二 个 喀 啶 配对 则 几何 形状 太 小 ;二 个 吐 叭 配对 则 几何 形状 又 太 大 ,为 双 螺 旋 所 容纳 不 下 。 只 有 A-T DENA G-C 碱 基 对 的 几何 形状 正 适 合 双 螺旋 的 大 小 。 这 两 种 碱 基 对 有 一 个 重要 的 特征 ,就 是 它们 具有 二 次 旋转 对 称 性 , 即 一 对 碱 基 对 旋转 180"，- 并 不 影响 双 螺 旋 的 对 称 性 ， 因 此 双 螺 旋 结 构 只 限定 了 配对 的 方式 ， 并 不 限定 碱 基 的 顺序 (图 2-29)。 2-29 DNA 双 螺 旋 中 的 碱 基 对 碱 基 环 是 一 个 共 斩 环 ,本 身 构 成 一 个 平面 分 子 。 在 双 螺 旋 中 这 个 平面 垂直 于 螺旋 轴 ， 相 邻 的 两 个 碱 基 上 下 间隔 3.4A， 每 十 对 碱 基 组 成 一 节 螺 旋 ,， 因 此 双 螺 旋 的 螺 距 是 34A。 一 条 链 中 每 个 相 邻 的 碱 基 的 方向 相差 36"。 碱 基 之 间 的 朴 水 作用 可 导致 碱 基 堆 积 ， 这 个 引力 同 碱 基 对 之 间 氢 键 一 起 稳定 了 双 螺 旋 结构 。 大 沟 和 小 沟 ， 沿 螺旋 轴 方 向 观察 ， 配 对 的 碱 基 并 不 充满 双 螺旋 的 空间 。 由 于 碱 基 对 的 方向 性 ,使 得 碱 基 对 占据 的 空间 是 不 对 称 的 ,因此 在 双 螺 旋 的 表面 形成 二 个 目下 去 的 KEKE ,一 个 糟 小 些 , 分 别称 为 大 沟 和 小 沟 。 双 螺 旋 表 面 的 沟 对 DNA 和 和 蛋白质 的 相互 识别 是 很 重要 的 ,因为 只 有 在 沟 内 才能 觉察 到 碱 基 的 顺序 , 而 在 双 螺 旋 的 表面 , 是 脱氧 核糖 和 磷酸 的 重复 结构 ,没有 信息 可 言 。 双 螺 旋 的 种 类 上 面 我 们 所 讨论 的 双 螺 旋 的 特征 是 属于 所 谓 B 型 双 螺 旋 。 这 是 DNA 钠 盐 的 纤维 在 相对 湿度 90 多 时 所 处 的 状态 。 当 外 界 条 件 变 化 时 , 双 螺 旋 的 特征 也 有 变化 ， 出 现 了 新 的 形式 。 一 般 认 为 B 型 双 螺旋 最 接近 于 DNA 分 子 的 溶液 状态 。 当 DNA 钠 盐 〈 或 钾 盐 、 铭 盐 ) 在 相对 湿度 75%}, DNA 纤维 就 处 于 A 型 的 构象 EA B 型 的 区 别 在 于 碱 基 平 面 不 是 垂直 于 螺旋 轴 ， 而 是 倾斜 20", 每 个 碱 基 升 高 2.56A， 二 个 相 邻 的 碱 基 夹 角 为 32.7"， 螺 距 是 28 A， 糖 磷酸 主 链 的 构 型 也 稍 区 别 于 B 型 (图 2- 30)。 图 2-30 A-DNA 和 B-DNA 的 比较 A 型 和 B 型 是 DNA 分 子 的 二 个 基本 的 双 螺 旋 形 式 。 在 一 些 均 聚 或 共聚 核 背 酸 中 ， 还 可 能 出 现 一 些 其 他 的 构象 形式 ， 但 它们 可 以 分 别 归 人 人 A 型 或 B 型 。 如 B' 型 可 以 在 多 KE d(A)- 多 聚 d(T) MAR dGD)- 多 聚 dC) 中 看 到 ， 它 们 的 结晶 形式 稍 区 别 于 BA DNA， 但 是 其 螺旋 常数 (4 = 3.25A, += 36°) 还 是 属于 了 B 型 的 变种 。 当 DNA 2B 盐 相对 湿度 降 到 66 匈 时 ，DNA 变 成 C 型 。 原 来 认为 C 型 和 3B 型 差别 很 大 ， 研 究 表明 并 非 如 此 。C 型 DNA +h, 碱 基 的 倾角 是 6°, 每 个 碱 基 升 高 3.31A， 二 个 相 邻 碱 基 对 的 夹 角 是 38°, 螺 距 是 31A , 这 些 数据 都 和 B 型 接近 。 近 似 于 B 型 双 螺旋 的 还 有 D 型 ,这 种 型 式 在 多 聚 d(AT)- 多 聚 d(AT), BH d(GC)- 多 聚 d(GC)、 多 聚 d(ATT)- 多 聚 d(AAD) FIZ d(AIC)-BH ICT) 等 多 聚 物 中 出 现 。 它 同 B 型 DNA 在 结构 上 的 主要 差别 在 于 每 个 碱 基 仅 升 高 3A ,倾角 增加 到 45? ,小 沟 的 宽度 明显 减 小 。 在 这 种 结构 中 ,大 分 子 © 44 。 在 外 部 不 能 从 小 沟 中 感觉 到 碱 基 顺 序 的 变化 。 属于 A 型 一 类 的 双 螺 旋 还 有 A' 型 和 A”, A’ MARES R d(CT)- 多 聚 d(A)-BR d(T) 三 股 螺旋 中 看 到 。 A” 型 只 是 在 多 聚 dCC)- 多 聚 d1)-SR AC) PHBL. HHA 型 中 它们 的 Cy 都 是 内 糖 环 构 型 ,就 是 C 和 Cy 是 在 同一 方向 ,因此 在 A 型 DNA 中 碱 基 对 在 螺旋 轴 之 前 。 表 2-3 列 出 不 同 右 旋 双 螺旋 DNA 的 结构 参数 。 表 2-3 不 同 右 旋 双 螺旋 DNA 的 结构 参数 小 沟 宽 | 大 沟 宽 | DWAR | ABR m M d D 7:5& |} 8-58 6.5 8.5 7.9 7.5 6.7 5.8 一 | 一 | 一 | 一 一 | ES | 一 -一 | 一 -一 4.2 12.6 4.4 U2e2 2.8 3 总 的 看 来 , A 型 螺旋 比 B 型 螺旋 拧 得 紧 一 些 , 碱 基 的 倾角 大 一 些 ， 大 沟 的 深度 大 大 超 过 小 沟 的 深度 。 在 了 B 型 螺旋 中 ,大 沟 的 宽度 比 小 沟 大 ,而 两 者 的 深度 相差 不 远 。 外 界 因素 明显 影响 到 DNA 的 构 型 。 前 面 已 经 提 到 ,相对 湿度 对 DNA 纤维 的 构 型 很 有 影响 ,在 90% 相对 湿度 时 DNA 呈 B 型 , 当 相 对 湿度 降 到 75 多 时 就 变 成 A 型 。 盐 的 种 类 和 浓度 对 构 型 同样 有 明显 的 影响 , 当 NaCl 浓度 较 低 时 (二 3%), 即使 相对 湿度 仍 在 92%, DNA 还 是 以 A 型 存在 ; 当 DNA 是 钠 盐 时 , A、B、C 三 种 构 型 都 可 能 出 现 ， 而 改 成 锂 盐 时 ,只 有 C 型 和 B 型 可 能 出 现 。 男 一 个 影响 螺旋 构 型 的 因素 是 DNA 的 碱 基 组 成 和 顺序 以 及 顺序 的 重复 性 , 其 中 起 主要 作用 的 是 碱 基 的 顺序 。 大 多 数 A-T 丰富 的 DNA 自然 倾向 于 形成 B 型 双 螺 旋 。 但 碱 基 顺 序 不 同 会 发 生 构 型 改变 ,如 多 聚 d[LAGT]- 多 聚 d[ACT] 虽然 也 是 A-T 丰富 的 ， 而 它 的 构 型 类 似 于 多 聚 d[G]- 多 聚 d[C]; FH d[GC]- 多 聚 d[GC] 的 构 型 不 象 它 的 组 成 类 似 物 多 聚 dLG]- 多 聚 d[C]， 而 象 它 的 顺序 类 似 物 多 聚 d[AT]- 多 聚 d[LAT]。 总 的 来 讲 , 顺 序 和 构 型 之 间 的 关系 仍 是 很 不 清楚 的 。 很 明显 构 型 的 变化 对 DNA 的 生物 功能 将 会 有 明显 的 影响 ,例如 由 于 RNA 分 子 存 在 2-=OH， 使 得 凡是 含 RNA 的 双 链 分 子 只 能 以 A 型 的 构 型 存在 。 当 RNA 聚合 酶 在 DNA 模板 上 合成 RNA 时 ，DNA 很 可 能 必须 变 成 A 型 。 另外 也 有 人 讨论 DNA 的 变 构 效应 和 长 距离 效应 。 例如 在 阿拉 伯 糖 操纵 子 中 ， 阻 遏 蛋白 作用 于 离 转录 起 始点 150bp 以 外 的 位 点 上 ,即使 距离 如 此 远 仍然 能 阻 遇 RNA 聚合 酶 的 转录 作用。 据 猜 测 可 能 阻 遏 蛋白 结合 到 DNA 分 子 上 去 以 后 改变 了 DNA 的 构 型 ,比如 说 碱 基 的 倾角 ， 这 种 效应 可 以 传 到 启动 子 上 ,使 得 转录 不 能 进行 。 又 例如 小 牛 胸腺 DNA 结合 了 一 种 抗菌 素 后 ， 即 使 结合 量 只 占 DNA 分 子 的 15% ,但 整个 分 子 同 溴 乙 锭 结合 的 能 力 都 变化 了 。 可 能 15 匈 DNA 结构 的 变化 引起 了 整个 分 子 的 构 型 的 变化 。 总 之 ， 以 上 的 迹象 都 提示 了 DNA 双 螺旋 的 构 型 不 是 僵化 不 变 的 。 ， 双 螺 旋 在 溶液 中 普遍 认为 DNA 分 子 在 水 溶液 中 也 是 以 双 螺 旋 的 形式 存在 ，DNA 溶液 的 物理 化 学 : 性 质 如 变性 和 复 性 ,粘度 ` 圆 二 色 性 和 小 角度 和 光 散 射 等 结果 支持 这 个 观点 。 而 且 普 遍 认 为 在 水 溶液 中 DNA 呈现 B 型 构 型 ,对 这 个 假定 也 有 一 些 实验 支持 。 近来 有 一 些 实验 表明 在 水 溶液 中 DNA 的 构 型 可 能 稍 偏离 于 B 型 。 从 能 量 角 度 出 发 作 理 论 计 算 , 预 言 在 溶液 中 DNA 最 稳定 的 构 型 的 螺 距 应 该 是 10.5 4S bp, 而 不 是 B 型 所 规定 的 10 bpo 用 由 X174 DNA 复制 型 作 电 镜 观 察 , 也 认为 螺 距 应 该 是 10.53bp， 每 个 碱 基 升 高 2.9 人 入 , 既 区 别 于 B 型 的 3.4A ,也 区 别 于 A 型 的 2.55A。 FERRI, DNA 双 螺 旋 的 构 型 随 条 件 而 变化 。 例如 在 水 溶液 中 加 入 酒精 ， 双 螺旋 就 会 从 B 型 变 到 C 型 ,最 后 变 成 A 型 。B 型 是 极 性 溶液 中 最 稳定 的 结构 。 双 螺 旋 结 构 的 研究 动态 以 上 介绍 了 经 典 的 _DNA 双 螺 旋 模 型 的 结构 ， 概 括 地 说 这 个 模型 有 三 个 基本 特征 ; DNA 的 两 条 链 是 反 向 平行 排列 的 ; 两 条 链 的 互补 碱 基 对 之 间 以 氨 键 相 联 ; 两 条 链 单 向 地 . 按 右 旋 方 式 互相 绕 在 一 起 。 双 螺旋 结构 的 这 些 性 质 已 为 大 量 实 验 事实 所 证 明 ， 可 以 认为 是 客观 地 反映 了 DNA 的 内 在 本 质 , 因 而 是 正确 的 。 近 年 来 ， 发 现 了 DNA 帮手 双 螺 旋 构 型 ,这 是 对 DNA 双 螺 旋 结 构 的 一 个 补充 和 发 展 。 另 外 ;有些 科学 家 对 DNA 两 条 链 互 绕 成 螺旋 的 真实 性 提出 了 不 同 的 见解 。 A. Rich 等 人 用 和 射线 衍射 法 分 析 人 工 合成 的 DNA 小 片段 的 晶体 时 ， 出 乎 意料 地 发 现 d(CGCGCG) BAKA WHE. 在 这 种 双 螺 旋 中 两 条 六 核 昔 酸 分 子 链 以 反方 向 的 形式 排列 着 ,其 间 互 补 GC 碱 基 对 以 氢 键 互相 联结 ， 相 邻 碱 基 对 互相 平行 。 这 些 性 质 基 本 上 与 右 旋 DNA 一 样 , 引 人 注 意 的 双 链 的 旋转 方向 与 右 旋 相反 ， 而 且 磷 原子 联结 线 旺 RUIZ kth DNA 被 命名 为 Z-DNA (A 2-31). Ale Z-DNA 和 右 旋 B-DNA AYE 要 差异 列 于 表 2-4 中 。 Z-DNA 并 不 只 限于 GC 相间 的 DNA 顺序 中 , 很 可 能 嘎 吟 和 喀 啶 相间 排列 的 顺序 有 助 于 Z-DNA 结构 的 稳定 性 。 通 过 从 鼠 和 免 血 中 诱发 的 Z-DNA 抗体 ,已 经 发 现 天 然 DNA 中 有 的 部 分 可 以 与 Z-DNA 的 抗体 相 结合 ,因此 Z-DNA 的 确 是 DNA 的 一 种 存 在 形式 。 由 于 人 工 合成 脱氧 寡 核 音 酸 的 技术 已 日 趋 成 熟 ， 合 成 5 一 10 个 任意 指定 顺序 的 小 片 & DNA 已 不 成 问题 ( 见 第 十 章 ), 这 就 为 进一步 的 结构 分 析 提 供 足 够 的 样品 。 因此 近年 来 从 人 工 合成 的 小 片 侦 DNA 晶体 结构 分 析 获 得 了 大 量 有 关 DNA 结构 的 信息 ,从 而 证 sx A-DNA (CCGG) B-DNA (CGCGAATTCGCG) #1 Z-DNA (CGCG) 的 存在 避 有 趣 的 是 在 两 段 CGCG ,中 插入 AATT 后 的 十 二 核 昔 酸 片 段 以 B-DNA 的 形式 存在 〈 见 第 十 章 表 10-22)。 这 意味 着 一 级 结构 对 DNA 双 链 的 绕 向 及 其 空间 结构 有 一 定 影响 。 最 近 在 测定 pBR322 DNA 的 拓扑 环绕 数 时 发 现 了 另 一 个 用 经 典 的 双 螺 旋 结 构 难 以 解释 的 现象 。 在 4326 对 碱 基 组 成 的 这 种 环 状 DNA 中 , 若 按 每 10 对 碱 基 组 成 一 个 右 螺 旋 计 算 , 则 闭环 状 pBR322 DNA 的 拓扑 环绕 数 应 为 4 x 10?， 但 实际 测 得 的 数值 较 此 小 得 多 ,这 说 明 在 pBR322 DNA 中 可 能 同时 存在 着 左旋 和 右 旋 的 结构 。 e 46 。 Z-DNA B-DNA 图 2-31 Z-DNA (左旋 ) 和 B-DNA (Ale) HAT RB 2-4 B-DNA 5 Z-DNA 的 比较 B-DNA 螺旋 方向 看 旋 每 一 转 的 核 背 酸 数目 10° BH €@ ~20A et KE BAL A Sh BE BS 3.44 Le 2) 34A 碱 基 平 面 的 倾斜 角 6° 相 邻 碱 基 对 之 间 的 转角 36° 糖苷 键 构象 d_Gr 反 = q@ Gr R = AB) HAIER BS d GpC 9.0A . dCpG 9.0A 轴 心 与 碱 基 的 关系 穿 过 碱 基 对 i ok ie. ey 8.0A 6.9A 不 穿 过 碱 基 对 前 几 年 新 西 兰 的 几 位 科学 家 提出 可 能 存在 一 种 “ 扁 并 肩 ”的 DNA 结构 。 在 此 结构 中 ，DNA 分 子 的 两 条 链 不 象 经 典 双 螺 旋 那 样 顺 右 旋 方向 绕 在 一 起 ， 而 是 绕 了 半 周 又 BAMA, mA 2-32 右 图 所 表示 。 左 图 为 经 典 双 螺旋 DNA 模型 ， 两 条 分 子 主 链 顺 右 旋 方向 绕 在 一 起 ， 其 间 以 氢 键 维 系 ; 右 图 为 AIA” DNA 模型 ,两 条 分 子 的 主 链 间 同 样 以 氢 键 维系 ， 但 并 不 绕 在 一 起 。 他 们 认为 这 样 可 以 比较 容易 解释 DNA 的 复制 机 制 。 1953 年 Watson 和 Crick #2HIA9 DNA he ye Ri 已 经 30 年 了 ,但 DNA 的 精细 结构 究竟 如 何 ? 双 螺旋 的 绕 向 与 其 一 级 结构 关系 怎样 ? 双 螺 旋 结 构 怎 样 受 外 界 因 素 影 2-32 两 种 DNA 结构 示意 图 左 为 经 典 的 双 螺 旋 模 型 , 右 为 " 肩 并 肩 "模型 。 ° 492 i? DNA 结构 在 复制 与 转录 中 的 作用 如 何 ? 等 等 ,都 需要 进行 更 为 深 人 的 研究 。 变性 和 复 性 维持 双 螺 旋 分 子 的 力 维持 双 螺 旋 分 子 的 力 有 二 种 ,一 种 是 氢 键 ,一 种 是 蕊 水 键 。 乞 键 ”和 氢 原 子 同 一 些 带电 负 性 的 原子 形成 共 价 键 时 ， 电 子 云 偏向 带电 负 性 原子 一 边 , 氢 原子 带 部 分 正 电荷 。 这 种 氢 原 子 同 另 一 个 带电 负 性 的 原子 相互 吸引 而 形成 的 氢 键 。 氢 键 的 受 体 可 以 是 带 部 分 负电 荷 的 原子 ， 也 可 以 是 带 单 位 负电 荷 的 原子 。 如 果 受 体 和 供 体 都 是 带 单位 电荷 的 原子 , 那 就 是 离子 键 了 。 离 子 键 是 氢 键 的 一 个 特例 。 在 氢 键 中 ， 氢 原子 都 是 以 共 价 键 连 在 氧 原 子 或 氮 原 子 上 。 带 电 负 性 的 受 体 大 多 也 是 氮 原 子 和 和 氧 原子 。 氢 键 的 键 能 在 3 一 7 千 卡 / 克 分 子 之 间 。 受 体 和 供 体 之 间 的 电荷 差别 愈 大 ;它们 之 间 的 键 能 也 越 大 。 氢 键 的 强度 比 共 价 键 弱 得 多 ,但 比 范 德 瓦尔 斯 力 大 得 多 。 氢 键 不 同 于 范 德 瓦 尔 斯 力 还 在 于 前 者 有 方向 性 ,后 者 没有 方向 性 , 当 氢 原子 直接 指向 受 体 原 子 时 ,其 引力 最 大 。 若 方向 偏差 一 点 , 键 能 就 小 多 了 。 氢 键 的 受 体 和 供 体 原 子 都 有 一 定 的 特点 ,因此 氢 键 的 专 一 性 比 范 德 瓦 尔 斯 力 要 强 得 多 。 有 关 DNA 双 螺 旋 中 的 碱 基 之 间 的 氧 键 前 面 已 经 讨论 过 了 。 还 要 指出 的 是 G-C 之 间 可 以 形成 三 个 氧 键 ，A-T 之 间 可 以 形成 二 个 氢 键 。 因 此 G-C 配对 的 强度 比 A-T 配 对 要 强 些 。 RR ”” 蕊 水 键 本 质 上 是 一 种 范 德 瓦 尔 斯 力 。 当 二 个 原子 彼此 接近 时 便 产 生 诱导 的 振动 电荷 ,由 于 这 种 电荷 的 分 布 而 产生 了 非特 异性 的 吸引 力 , 这 就 是 范 德 瓦尔 斯 力 。 很 明显 , 范 德 瓦尔 斯 力 没 有 分 子 的 特异 性 , 极 性 和 非 极 性 的 分 子 都 可 以 产生 。 这 种 力 同 作用 基 团 之 间 的 距离 的 六 次 方 成 反比 ， 因 此 随 着 基 团 之 间 的 距离 减 小 ， 范 德 瓦 尔 斯 力 很 快 增 加 ; 另 一 方面 , 当 距 离 太 近 时 ,由 于 外 层 电子 云 重 八 ,又 引起 了 强大 的 斥 力 。 斥 力 和 引力 达 到 平衡 的 距离 称 为 范 德 瓦 尔 斯 力 半 径 ， 一 般 在 1.2 一 2.0A 之 间 ( 表 2-5)。 范 德 瓦尔 斯 键 能 平均 在 工 干 卡 / 克 分 子 左右 ， 仅 仅 比 分 子 的 平均 热能 (在 室温 约 0.6 千 卡 / 克 分 子 ) 稍 大 一 些 。 这 意味 着 必须 使 分 子 的 几何 状态 精确 地 配合 ， 并 且 几 个 基 团 协同 作用 才能 使 范 德 瓦尔 斯 力 有 效 地 成 为 分 子 间 的 引力 。 表 2-5 范 德 瓦尔 斯 半径 原 OF 半径 (A) H 1.2 N to Oo 1 .4 P 1.9 S 1.85 甲 基 2.0 芳香 环 半 厚 7 范 德 瓦 尔 斯 力 比 氢 键 的 能 量 弱 得 多 ， 因 此 凡是 能 形成 氢 键 的 分 子 主要 是 形成 氧 键 而 不 是 形成 范 德 瓦 尔 斯 键 。 大 家 知道 ,水 分 子 之 间 能 形成 较 强 的 氢 键 ,构成 一 种 局 部 有 序 的 w 48 。 类 似 晶 格 的 结构 。 因 此 假如 一 种 不 能 同 水 形成 氢 键 的 化 合 物 (比如 葵 ) 同 水 混合 ,水 分 子 和 葵 分 子 虽 能 形成 范 德 瓦 尔 斯 力 , 但 没有 水 分 子 本 身 的 氢 键 能 量 大 ,因此 水 分 子 仍 然 自 身 维持 在 一 起 ,而 排斥 葵 分 子 的 插入 ,所 以 水 和 茶 不 能 互 溶 。 一 些 极 性 分 子 , 比 如 葡萄 糖 , 它 含有 很 多 能 形成 氢 键 的 基 团 ,因此 当 葡 萄 糖 插 和 人 到 水 的 结构 中 去 的 时 候 , 虽 然 破坏 了 水 分 子 之 间 的 氢 键 ,但 水 和 糖 之 间 可 以 形成 新 的 氨 键 。 假 如 葡萄 糖 上 一 个 氢 原 子 被 甲 基 取 代 ， 甲 基 比 氧 原子 更 严重 地 破坏 水 分 子 的 结构 ， 也 就 是 说 需要 更 多 的 能 量 才能 把 这 个 分 子 插 人 到 水 分 子 中 间 去 。 反之 ， 与 氢 原 子 相 比 ， 水 分 子 以 更 多 的 能 量 把 甲 基 推出 水 的 结构 ， 这 个 能 量 约 在 2 一 3 千 卡 / 克 分 子 左右 。 水 分 子 排斥 非 极 性 基 团 的 这 种 倾向 经 常 称 为 朴 水 键 。 这 个 名 称 可 能 不 太 恰 当 , 因 为 在 这 种 情况 下 并 没有 产生 新 类 型 的 键 , 水 分 子 仍 以 氢 键 结合 在 一 起 ， 非 极 性 键 仍 以 范 德 瓦尔 斯 力 结合 在 一 起 。 但 是 这 个 词 比 较 形 象 地 表达 了 非 极 性 分 子 有 不 愿 同 水 接触 而 自己 聚集 在 一 起 的 倾向 。 很 明显 ， 一 切 破坏 水 的 氢 键 结构 的 试剂 也 都 能 破坏 芒 水 键 。 DNA 分 子 的 碱 基 都 是 由 芳香 环 构成 的 ,有 很 强 的 臣 水 性 质 。DNA 双 螺 旋 在 水 咨 液 中 ,由 于 碱 基 有 规则 的 排列 ， 能 形成 较 强 的 蕊 水 键 。 AAMT BiB DNA 双 螺 旋 稳 定性 的 贡献 可 能 大 于 氢 键 的 贡献 。 破坏 双 螺 旋 的 条 件 上 面 讨论 了 维持 双 螺 旋 的 力 是 由 氢 键 和 芷 水 键 提供 的 ， 因 此 凡是 破坏 氧 键 和 朴 水 键 ， 的 因素 都 能 导致 双 螺旋 的 破坏 ,如 加 热 \. 极 端的 pH\ 有 机 溶剂 .尿素 酰胺 等 试剂 。 DNA 双 螺 旋 的 破坏 称 为 变性 。 DNA 的 变性 不 仅 受到 外 部 条 件 的 影响 而且 也 取决 于 DNA 分 子 本 身 的 稳定 性 , 比 如 DNA DTH G-C 含量 高 ,分 子 就 比较 稳定 。 因 为 G-C 之 间 有 三 对 氢 键 ， 而 A-T 之 间 只 有 二 对 氢 键 。 又 比如 环 状 双 键 DNA 比 相 应 的 线 状 DNA 稳定 ,因为 拓扑 学 的 原 因 , 使 得 双 螺 旋 不 容易 解 开 。 变性 现象 的 宏观 表现 双 螺 旋 DNA 分 子 具 有 一 定 的 刚性 ,而 变性 之 后 就 成 为 无 规 线 团 ， 伴 随 着 变性 过 程 DNA 深入 的 流体 力学 性 质 也 发 生变 化 。 天 然 DNA 的 发 色 基 团 藏 在 双 螺 旋 的 里 面 , 变 性 后 碱 基 都 暴露 出 来 了 ,因此 变性 过 程 也 伴随 着 DNA 光学 性 质 的 变化 。 由 于 以 上 原因 ，DNA 变性 后 表现 为 溶液 的 粘度 大 大 降低 ,沉降 速度 增加 , FORE 上 升 ; 紫 外 吸收 值 升 高 。 我 们 可 以 利用 这 些 性 质 上 跟踪 DNA 的 变性 过 程 。 利用 DNA 变性 后 的 增色 效应 跟踪 变性 过 程 是 最 方便 的 手段 。 如 果 用 升 高 温度 使 DNA 变性 ,以 温度 对 紫外 吸收 值 作 图 ,得 到 一 条 SHH. 在 一 个 相当 狭 的 范围 内 ， 增 色 效 应 是 一 个 跳跃 (图 2-33), 这 同 结晶 的 融化 现象 类 似 。 产 生 紫 外 吸收 值 跃 变 的 温度 称 A DNA 的 融 点 ， 通 常 是 以 增色 效应 达到 一 半 的 温度 作为 融 点 。 在 一 定 的 条 件 下 , BA 的 高 低 由 DNA 分 子 中 的 G-C 含量 所 决定 ， 融 点 和 G-C 的 含量 可 用 下 列 经 验 公 式 表 人 让: %(G 十 C) 一 (T。 一 69.3) X 2.44 Tu 是 DNA 的 融 点 。 图 2-34 示 出 Ta 与 G-C 合 量 的 关系 。 e 49 « 次 2d (A-T) DNA 1.0 60 80 100 Tey 2-33 DNA 的 变性 曲线 2-34 DNA 融 点 (Ta) 与 G-C 含量 的 关系 与 不 含 G-C 的 多 聚 d(CA-T) 比 较 。 纵 坐标 A, 0.01M PO3- 十 0.001M EDTA; 为 相对 的 260nm 吸收 值 , 横 坐标 为 温度 。 B, 0.15M NaCl + 0.015M 柠 样 酸 钠 。 融 点 不 仅 受 DNA 本 身 性 质 的 影响 ,而 且 受 溶 液 条 件 的 影响 。 例如 低 离子 浓度 溶液 中 融 点 较 低 , 融 点 范围 也 较 宽 ;离子 强度 升 高 ,转变 范围 也 变 狭 。 DNA 组 成 比较 均一 , 它 就 在 一 个 狭 的 温度 范围 内 变性 ,如 果 DNA 组 成 不 均一 ,或 者 挨 杂 其 他 DNA， 融 程 就 拉 长 了 。 变性 的 微观 机 制 从 DNA 的 变性 曲线 看 , 融 程 比较 狭 , 反 映 了 变性 过 程 是 一 个 协同 的 过 程 , 就 是 在 达 到 融 点 时 DNA 双 螺 旋 是 同时 解 开 的 。 实 际 上 由 于 DNA 分 子 的 碱 基 分 布 不 均一 ;DNA 双 螺 旋 的 融化 是 一 步 一 步 进 行 的 ,是 一 个 区 域 接着 一 个 区 域 发 生 的 ,而 不 是 协同 地 瞬时 地 ， 进行 。A-T 丰富 的 区 域 先 融化 ，G-C 丰富 的 区 域 后 融化 ,因此 在 精细 的 变性 图 上 变性 曲 线 不 是 一 条 平滑 的 S 形 曲线 ， 而 是 包含 了 很 多 肩 肥 〈shoulder)。 如 果 把 这 条 曲线 对 温度 微分 ,就 得 到 一 系列 小 的 峰 , 每 一 个 峰 代 表 一 个 小 的 融化 区 域 ， 峰 的 高 度 大 体 等 于 融化 区 的 碱 基 长 度 。 因 此 可 以 从 这 些 数据 计算 出 各 融 区 的 大 小 \G、C 含量 以 及 各 个 小 融化 区 的 排列 次 序 。 复 性 动力 学 解除 变性 条 件 以 后 ,变性 的 二 条 互补 链 可 以 重新 结合 起 来 ,恢复 成 原来 的 双 螺 旋 ， 这 个 过 程 称 为 复 性 。 很 多 因素 影响 复 性 的 速度 。 简 单 顺 序 的 DNA 分 子 , 如 多 聚 d(G)-BR d(C) 彼此 . 发 现 互补 顺序 并 不 困难 ,因此 很 快 就 复 性 了 。 假 如 是 一 个 真 核 DNA, 显然 一 些 顺 序 在 与 互补 链 相 碰 撞 之 前 ,必然 会 碰 到 很 多 非 互 补 链 , 因 此 在 同样 条 件 下 , 顺序 复杂 的 DNA 比 顺序 简单 的 DNA 所 需 的 复 性 时 间 要 长 些 。 同 一 种 DNA， 当 浓度 高 时 ， 互 补 顺序 相 碰 撞 的 机 会 增加 , 复 性 速度 也 快 。 DNA 片段 的 大 小 也 影响 复 性 的 速度 ,因为 大 的 线 状 单 链 扩散 速度 受到 妨碍 ,减少 了 发 现 互补 顺序 的 机 会 ,因此 在 复 性 实验 中 , 往往 把 DNA 用 机 械 剪 力 切 成 一 定 大 小 的 片 侦 。 温 度 也 影响 复 性 的 速度 ， 低 温 不 仅 减 少 了 互补 链 的 碚 拉 机 * i)',° 会 ， 而 且 使 已 经 误 配 的 片段 再 解 开 寻找 正确 的 互补 链 变 得 困难 。 因此 复 性 温度 不 能 过 低 ， 一 般 比 融 点 低 25%c AAR EME ARN ToREE th a Me Bl SS EA REE, — Pair 很 多 同性 电荷 的 DNA 会 相互 排斥 ,因此 在 复 性 咨 液 中 必须 有 一 定 浓度 的 盐 。 一 般 来 讲 ， 盐 浓度 高 复 性 速度 快 。 复 性 过 程 是 一 个 复杂 的 多 步骤 的 反应 过 程 。 复 性 的 第 一 步 是 当 二 条 链 相 互 碰撞 时 ， 假如 在 某 个 区 域 遇 到 正确 的 配对 ， 就 会 先 形成 一 个 双 链 核心 。 核 心 形成 后 互补 链 就 能 很 快 地 找到 同伴 ,相互 配对 ,完成 复 性 过 程 。 核 心 的 形成 是 反应 速度 的 限制 因素 。 复 性 过 程 可 以 用 二 级 反应 动力 学 公式 来 处 理 : S+S—D S 和 S 是 DNA 互补 单 链 ,D 是 双 链 DNA。 按 二 级 反应 动力 学 公式 : ee ee < 是 * 时 间 的 单 链 DNA 的 浓度 。 积 分 后 C 1 Ct eb Can C, EM GE DNA 的 起 始 浓度 ,以 每 升 溶液 中 核 苷 酸 的 摩尔 数 表 示 。 玉 和 KR’ 是 速率 常数 。 因为 在 一 个 指定 的 实验 中 C, 是 已 知 的 , C 的 浓度 是 可 以 测定 的 ,如 以 人 对 Cu 作 图 ， 得 到 如 图 2-35 所 示 的 曲线 ,在 曲线 的 中 点 , 即 ws Cohn = = 如 前 所 述 , 很 多 因素 会 影响 复 性 的 速度 ,但 是 我 们 如 果 把 所 有 的 可 变 因 素 , 包 括 温度 、 离 于 强度 片段 的 长 短 都 控制 起 来 ;那么 剩 下 的 唯一 可 变 因 素 就 是 顺序 的 复杂 性 。 实 验 指 出 ,速度 常数 K’ 与 DNA 中 的 复杂 性 六 成 反比 : pec N 例如 大肠 杆菌 DNA Le 2 MER DNA 分 子 大 100 倍 。 这 样 , 大 肠 杆 菌 DNA 复 性 速 度 也 比 1DNA 要 小 100 fo Ai Con 的 大 小 代表 了 基因 组 的 大 小 ， 每 个 基因组 的 顺 | 核酸 对 1 10? lot 10 108 1010 Cot (mol x #/F) A 2-35 DNA Aye ee thee 序 都 不 一 样 ,因此 Coin 也 代表 了 DNA 顺序 的 复杂 程度 。 如 果 用 这 种 方法 测定 真 核 DNA 的 Co, 按理 它 的 Coe 数值 是 很 大 的 ， 但 是 实验 结 RAD Kf Co 作 图 并 不 是 一 条 单纯 的 S 形 曲线 ;而 可 以 看 作 几 个 $ 型 曲线 的 加 和 。 比 如 鼠 的 DNA 中 10% DNA 的 复 性 速度 甚至 比 已 知 最 小 的 病毒 DNA SHREK, 此 说 明 这 部 分 是 由 很 多 短 的 重复 顺序 所 组 成 。 对 于 真 核 生 物 DNA 顺序 的 组 织 的 知识 就 是 从 复 性 动力 学 开始 获得 的 。 应 用 在 DNA 研究 工作 中 ,很 多 手段 都 是 同 DNA 的 变性 和 复 性 有 关 的 ,前 面 已 经 提 到 了 一 些 这 方面 的 工作 。 2-36 RRMA DNA 的 部 分 变性 图 箭头 表示 重复 区 的 边界 前 面 已 经 提 到 ，DNA 变性 是 一 个 区 域 一 个 区 域 发 生 的 ，A-T 丰富 的 区 域 最 容易 变 性 ， 电 子 显 微 镜 下 确实 也 看 到 这 种 情况 。 在 一 定 的 条 件 下 ，DNA 分 子 长 链 上 容易 变性 的 部 分 呈现 一 个 个 小 泡 , 而 没有 变性 的 部 分 保持 一 条 双 链 (图 2-36)。 每 一 种 DNA 的 局 部 变性 图 谱 都 是 不 一 样 的 ， 因 此 可 以 利用 这 个 手段 识别 DNA 分 子 中 某 种 基因 的 位 置 ， 或 者 作为 一 个 参照 位 置 用 来 确定 其 他 功能 的 位 点 。 杂交 方法 广泛 应 用 于 DNA 研究 中 。 杂 交 的 基础 就 是 DNA 的 变性 和 复 性 ,因此 应 该 注意 影响 变性 和 复 性 的 各 种 因素 。 利 用 杂交 方法 可 以 求 出 特定 基因 的 频率 、, 异 源 DNA 的 相似 程度 ， 配 合 电镜 方法 可 以 了 解 基因 的 组 织 、 基 因 的 定位 。 近 几 年 发 现 真 核 DNA ° 526 中 有 插 人 顺序 最 早 就 是 借助 于 DNA 和 RNA 的 杂交 方法 。 四 、DNA 的 三 级 结构 DNA 的 三 级 结构 指 双 螺 旋 链 的 扭曲 。 超 螺旋 是 DNA 三 级 结构 的 一 种 形式 ，DNA 在 核 小 体 结构 中 的 扭曲 方式 也 是 一 种 超 螺旋 结构 。 核 小 体 可 以 组 成 更 高 层次 的 结构 ， DNA 分 子 也 将 进一步 扭曲 ,因此 DNA 三 级 结构 还 可 以 分 成 若干 层次 。 起 二 在 DNA 双 螺 旋 中 ;每 10 个 核 痛 酸 长 度 旋转 一 圈 , 这 时 双 螺 旋 处 于 能 量 最 低 的 状态 。 如 果 这 种 正常 的 双 螺 旋 DNA 额外 地 多 转 几 圈 或 少 转 几 圈 , 就 会 使 双 螺 旋 内 的 原子 偏离 正常 的 位 置 ,在 这 种 双 螺 旋 中 存在 额外 的 张力 。 如 果 双 螺旋 的 末端 是 开放 的 ,这 种 张力 可 以 通过 链 的 转动 而 释放 出 来 ，DNA 将 恢复 到 正常 的 双 螺旋 状态 。 如 果 DNA 分 子 的 二 端 是 以 某 种 方式 固定 的 ,或 者 是 环 状 分 子 ， 这 些 额 外 的 张力 就 不 能 释放 到 分 子 之 外 ,而 只 能 在 DNA 内 部 使 原子 的 位 置 重 排 , 这 样 DNA 分 子 本 身 就 会 扭曲 ,， 这 种 扭曲 就 称 为 超 BE Iie 0 为 了 说 明 超 螺旋 DNA 的 性 质 , A 们 和 常用 拓扑 学 的 研究 成 果 来 表示 两 个 互 相 绕 在 一 起 的 环 在 几何 形态 上 的 相互 关 系 。 当 两 个 连续 不 断 的 环 状 分 子 互相 绕 在 一 起 而 又 不 能 用 物理 方法 分 开 时 ， 这 种 分 子 的 性 质 就 可 以 用 拓扑 环绕 数 (区 天 ) PURE CLA 2-37). 当 两 个 环 中 的 一 个 放 在 某 一 平面 上 ， 另 一 个 环 就 要 从 这 个 平面 的 上 下 穿 过 ， 图 2-37 的 〈a)、 (b) fl (c) 分 别 表示 另 一 个 环 穿 过 平面 环 的 一 二 和 十 次 , 这 样 , 它们 的 拓扑 环 绕 数 分 别 为 1、2 和 10。 图 2-37 中 的 (d) Al (c) 的 意义 是 完全 相同 的 ,只 是 (d) 表 示 两 个 环 分 别 围 着 一 个 公共 轴 互 相 绕 在 一 起 。 如 果 令 此 公共 轴 保 持 在 一 个 平面 os ey a ite dee 上 ， 则 绕 在 一 起 的 两 个 环 的 投影 就 一 定 结构 在 拓扑 学 上 是 相同 的 ) 有 偶数 交点 ， 此 偶数 应 为 拓扑 环绕 数 的 一 倍 。 只 要 两 个 环 状 分 子 都 没有 发 生 临 时 的 或 永 入 的 断裂 ,双环 之 间 的 拓扑 环绕 数 就 是 一 个 恒定 不 变 的 整数 ,永远 不 会 发 生变 化 。 因 而 这 个 原理 适用 于 由 两 条 互补 单 链 组 成 的 环 状 DNA 分 子 。 拓扑 环绕 数 尽管 是 两 个 闭合 环 状 线段 之 间 相 互 关系 的 重要 数据 ,但 是 ,有 相同 拓扑 环 绕 数 的 闭环 物 却 可 以 有 种 种 不 同 的 空间 关系 。 图 2-38 表示 ZX 一 0 时 出 现 的 情况 ，(a) 表示 拓扑 环绕 数 为 0 的 两 个 环 平行 地 排 在 一 起 ,(b) 表 示 引 入 三 个 右 螺旋 时 ， 必 须要 同时 引入 三 个 左 螺旋 才能 保持 ZK 一 0，(c) 和 (d) 分 别 表示 在 〈b) 中 引入 的 三 个 左 螺旋 可 以 6.597 ¢ 表现 为 空间 盘 绕 的 形式 ,也 可 以 表现 为 双 链 互 绕 的 形式 。 很 明显 ,在 (c) 和 (d) 中 双 链 的 公 共 轴 都 绕 着 处 于 同一 平面 上 的 超 螺旋 轴 转 了 三 次 。 一 一- 为 了 说 明 两 个 闭合 环 状 线 侦 之 间 的 上 “空间 关系 ;数学 家 已 经 证 明 ; 忌 一 尼 十 To 其 中 即 为 拓扑 环绕 数 Lk, BAM 链 环绕 数 , 又 称 全 绕 率 (total twist), 在 核酸 化 学 中 ，6 一 十 1 定义 为 双 链 向 右 SJ it 360°, + iB RHE RL BRIER (writhing cb) number)o 这 个 公式 与 常见 于 文献 的 LA 5 Tiny Ta 意义 相同 。 由 上 述 公式 可 直接 导出 了 一 < 一 8， 其 含意 为 : 拓扑 环绕 数 与 双 链 环绕 数 之 差 即 为 超 螺 旋 数 。 当 z 一 0 时 , 环 状 双 链 DNA 就 处 于 松弛 态 ; a> It, 环 状 分 子 呈 正 超 螺旋 ; 当 < 8 时 , 则 为 Ge) 负 超 螺旋 。 实 际 上 所 有 的 已 知 环 状 双 链 图 2-38 ”拓扑 环绕 数 为 .0 时 闭环 双 链 的 空间 关系 DNA 的 超 螺旋 数值 都 是 负 的 ， 即 其 拓 扑 环绕 数 总 是 小 于 双 链 环绕 数 。 以 含 5226 KERMA SV40 DNA 为 例 ， 按 B 型 DNA 双 螺 旋 模 型 ,其 pa 522, XMS r — 26) Alb oar +26 Bear = 496. 说 明正 是 由 于 双 链 之 间 少 纸 了 26 圈 才 使 整个 DNA DFAPE—EKDA, 使 双 链 闭环 的 SV40 DNA 以 超 螺 旋 的 形式 存在 。 当 其 中 有 一 个 缺口 或 260 对 碱 基 闻 的 氢 键 遭受 破坏 ,此 张力 就 会 消失 。 超 螺旋 数目 是 以 一 个 DNA 分 子 为 单位 的 。DNA 分 子 有 大 有 小 ,比如 带 10 个 超 螺 旋 对 大 肠 杆 菌 DNA 的 性 质 可 能 影响 不 大 ,而 对 SV40 DNA 的 影响 可 能 很 明显 ,因为 前 者 分 子 量 比 后 者 大 三 个 数量 级 。 因 此 为 了 便于 比较 引信 超 螺旋 密度 这 个 概念 ， 超 蝶 许 客 度 的 定义 为 : ogg 7 ad bape f ip , a eee IN NR yn ae, Se ES wee | EN ght: ia Mas ba % 3 LTE, La CH BS se — 0.lpm 2-39 小 Col El 质粒 三 倍 体 DNA Okb) MAR BRRBANE TDi © 54 。 o 为 超 螺旋 密度 , 8 是 DNA 分 子 的 碱 基 对 数目 的 十 分 之 一 。 线 状 DNA 或 环 状 DNA 都 可 以 有 三 级 结构 ,但 对 于 研究 工作 利用 小 分 子 环 状 DNA 是 最 方便 的 ,因为 环 状 分 子 在 体外 容易 保留 超 螺旋 状态 。 尽管 线 状 DNA 在 体内 也 有 超 螺旋 ， 但 在 体外 我 们 没有 办 法 把 它 的 两 端 固定 ， 因 此 在 分 离 过 程 中 内 部 的 张力 都 释放 掉 了 。 以 下 提 到 的 有 关 超 螺旋 DNA 的 性 质 \ 测 定 等 内 容 都 是 用 小 分 子 环 状 DNA 作为 实 验 材料 获得 的 。 图 2-39 是 环 状 DNA 的 电子 显微镜 图 。 由 于 共 价 闭环 双 链 DNA 没有 可 以 自由 转动 的 末端 , 因此 需要 有 更 高 的 温度 ， 也 需 要 较 高 的 pH 才能 破坏 超 螺 旋 DNA 中 的 碱 基 对 。 例 如 超 螺旋 的 多 瘤 病毒 DNA 融 点 达 140?" ,而 它 的 复制 型 I DNA 的 融 点 只 有 89"。 超 螺旋 分 子 的 结构 比较 紧密 ,因此 它 的 粘 度 比 较 低 ,浮力 密度 比较 大 ,沉降 速率 比 同样 大 小 的 线 状 分 子 快 202% 。 AAR MIRC HE. AEN WE MARA DSA WA DNA 双 螺 旋 碱 基 对 之 间 的 空间 中 去 ,从 而 改变 超 螺旋 的 状态 。DNA BS TIRCRUWIA, 降低 了 8 数 ， 使 负 的 超 螺旋 减少 。 随 着 省 乙 锭 量 的 增加 , 负 超 螺旋 不 仅 可 以 完全 松 开 ,甚至 可 以 进一步 站 入 正 的 . 超 螺 旋 , 测 定 超 螺 旋 的 方法 之 一 就 是 利用 省 乙 锭 引起 超 螺旋 变化 这 一 特性 。 (a) 0 O08) ated. GIR = 82 每 个 核 苷 酸 结合 的 溴 乙 锭 分 子 数 (b) ° 2-40 RCE SMA DNA 沉降 常数 的 影响 及 其 解释 (a) ORAM, 人 为 非 超 螺旋 态 。 @ 只 形成 单一 沉降 区 带 的 DNA 分 Fo Cb) 为 (a) 实 验 的 解释 。 及 螺旋 以 单一 的 连续 线 表示 。 从 A 至 王 说 明 由 于 省 乙 锭 的 结合 ,使 得 负 超 螺旋 减少 (B), 完 全 松弛 (C), 并 引进 正 超 螺旋 CD fl E), 。 55 。 上 面 已 经 提 到 , 同 松弛 形 DNA 相 比 较 ， 超 螺旋 DNA 的 沉降 常数 大 一 些 。 如 果 在 、 不 同 浓度 的 省 乙 锭 溶液 中 测定 一 个 超 螺旋 DNA 的 沉降 常数 (S) ,将 会 发 现 ;, 随 着 省 乙 锭 的 增加 S 值 先 是 下 降 ,达到 一 个 最 低 值 以 后 S 值 又 上 升 〈 图 2-40)。 S 值 最 小 的 状态 就 是 DNA 完全 松弛 的 状态 。 从 处 于 松弛 态 DNA 结合 省 乙 锭 的 数量 可 以 推算 分 子 内 包含 多 少 超 螺旋 ,因为 每 结合 一 个 省 乙 锭 能 使 双 螺 旋 解 开 26° 左右 (以 前 认为 每 结合 一 个 溃 乙 锭 能 使 双 螺旋 解 开 12°, 现在 看 来 这 个 数值 大 大 偏 低 了 ) 用 粘度 方法 可 以 代替 超 离心 的 方 法 ,原理 是 一 样 的 ,技术 上 可 能 更 方便 一 些 。 我 们 注意 到 ， 加 入 省 乙 锭 以 后 $ 值 出 现 一 个 低谷 ,这 意味 着 该 DNA 分 子 中 包含 了 负 的 超 螺 旋 ， 如 果 DNA 分 子 中 包含 的 是 正 的 超 螺旋 ,将 不 会 出 现 这 样 一 个 低谷 。 现 在 发 现 所 有 天 然 DNA 中 的 超 螺旋 都 是 负 的 。 由 于 超 螺旋 的 DNA 分 子 比较 紧密 , 在 凝 胶 电 泳 中 的 电泳 速度 比较 快 。 利 用 这 个 性 : 质 也 可 以 测定 超 螺旋 的 数目 。 用 拓扑 异 构 酶 I 温和 作用 于 超 螺旋 的 DNA， 可 以 产生 一 系列 带 有 不 同 超 螺 旋 数 目的 中 间 体 。 这 些 中 间 体 可 以 用 电泳 方法 分 开 ， 每 个 中 间 体 只 相 差 一 个 超 螺旋 数目 ,因此 只 要 计数 电泳 图 上 中 间 体 的 数目 就 可 以 知道 超 螺 旋 的 含量 。 生物 体内 的 超 螺旋 生物 体内 的 DNA 都 具有 某 种 形式 的 三 级 结构 。 比 较 小 的 双 链 环 状 DNA, Mins 和 质粒 DNA 在 体内 都 以 负 超 螺旋 的 形式 存在 。 大 肠 杆菌 DNA 是 环 状 双 链 分 子 , 整个 分 子 长 达 lmm 多 ,在 体内 压缩 成 lem 直径 的 小 体 。 大 肠 杆 菌 DNA 包含 了 几 个 独立 的 超 螺 旋 。 据 推 断 , 折 和 迭 的 大 肠 杆菌 染色 体 可 能 有 一 个 RNA 核 心 ; 核 心 外 面 是 DNA 环 ，DNA 环 的 数目 在 12 一 80 个 之 间 ， 每 个 环 都 构成 一 个 独立 的 超 螺旋 。 用 脱氧 核糖 核酸 酶 轻微 作用 ， 可 以 仅 松 弛 一 个 超 1558 螺旋 环 而 不 影响 其 他 环 的 超 螺旋 结构 ， 但 是 再 用 核糖 核酸 酶 处 理 可 以 把 所 有 的 超 螺旋 打开 ， 按 照 这 些 实验 结果 推测 大 肠 杆菌 染色 体 的 结构 如 图 2-41 所 示 。 Kye BRAM DNA 主要 存在 于 染 图 2-41 ”大肠 杆 茵 染色体 的 结构 示意 图 色 体 中 。 染 色 体 除了 包含 DNA 之 外 , 还 包含 了 组 蛋白 。 对 DNA 染色 体 复 杂 的 构 型 以 前 了 解 得 很 少 。 自从 发 现 了 核 小 体 之 后 ，DNA 在 染色 体内 的 构 型 逐步 明朗 起 来 。 染色 质 丝 在 电子 显微镜 中 呈 念 珠 状 。 一 根 长 丝 上 附着 很 多 小 球 , 小 球 的 直径 为 100 人 及 左右 ,小 球 之 间 是 一 根 细 丝 ， 小 球 和 细 丝 互相 间隔 重复 无 数 次 (图 2-42)。 每 一 个 重复 单 位 称 为 一 个 核 小 体 。 每 个 核 小 体 包含 了 200 对 碱 基 和 五 种 组 蛋白 。 在 细 丝 上 结合 有 组 蛋 白 H1, 其 他 四 种 组 蛋白 (H2A, H2B, H3 和 H4) 位 于 小 球 内 。 如 果 把 小 球 两 边 的 细 丝 用 核酸 酶 消化 掉 , 留 下 来 的 小 球 称 为 核 小 体 的 核心 。 核心 的 DNA 长 约 140 TEM, 一 段 DNA 绕 在 由 组 蛋白 H2A, H2B, H3, H4 各 二 个 组 成 的 八 聚 体 蛋 白 核心 之 外 。 从 不 同 生物 获得 的 核 小 体 DNA 长 短 有 所 区 别 ， 从 140 到 240 REM, 而 核 小 体 核 心中 « 56 « 2-42 染色 质 丝 的 电子 显微镜 图 DNA 的 长 度 几 乎 总 是 140 碱 基 对 。 从 电子 显微镜 看 ， 核 小 体 的 核心 好 象 是 一 个 圆 球体 。 用 中 子 散 射 和 和 射线 衍射 方法 : 测定 溶液 中 核 小 体 的 外 形 ,发 现 核 小 体 不 是 球形 而 是 短 粗 的 圆柱 体 ,直径 100A ,高 50A。 更 直接 的 证 据 来 自 对 核 小 体 核心 结晶 的 研究 ， 用 和 射线 衍射 配合 电子 显微镜 ， 测 定 核 小 体 核心 的 分 辩 率 可 达到 20 一 25 A 水 平 。 这 些 结果 表明 ， 核 心 是 平 盘 状 的 ， 直 径 110A ， 高 57 人 ,这 和 中 子 散 射 的 结果 是 一 致 的 。 在 这 个 分 辩 率 水 平 ， BRERA DNA 链 的 走 向 ， 但 是 从 中 子 散射 的 实验 可 以 肯定 ，DNA 双 螺 旋 是 绕 在 组 蛋白 八 聚 体 之 外 ， 因此 可 以 推测 DNA 双 螺 旋 形成 90 人 直径 的 超 螺旋 , 绕 在 蛋白 核心 之 外 , 一 共 绕 1 = 圈 , 螺 距 为 28A, 这 和 B 型 双 螺旋 可 形成 每 圈 75 一 82 碱 基 对 的 超 螺旋 的 推算 是 一 致 的 ( 见 图 2- 43)o 图 2-43 ” 核 小 体 结构 示意 图 当中 黑 点 表示 由 H2A、H2B、H3 MH, 各 二 分 子 组 成 的 八 聚 体 蛋白 核心 ,外 面 为 由 140bp 围 绕 的 DNA 分 子 ， 构成 一 个 核 小 体 核 心 。 DNA 在 米色 体内 的 高 次 结构 在 核 小 体内 DNA 被 压缩 了 7 倍 。 而 在 染色 体内 ~ DNA 双 螺 旋 压 缩 了 将 近 10,000 倍 ， 那 么 核 小 体 如 何 进一步 压缩 而 构成 染色 体 呢 ? 这 方 面 还 没 定论 。 但 是 有 些 迹 象 表明 染色 体 是 多 层次 的 螺旋 结构 。 ye fa (KYW AEN 100A, 现在 可 以 肯定 ， 染 色 体 细 丝 是 由 核 小 体 串 连 而 构成 的 。 染色 体 的 粗 丝 直径 约 300A, 中 子 散 射 的 结果 提示 ， 粗 丝 是 一 种 螺 线 管 的 形式 ,外 径 300 A , 螺 距 100—110A, 中 间 有 100A 的 空洞 。 因 此 可 以 推测 粗 丝 是 由 细 丝 绕 成 的 螺旋 , 粗 丝 每 一 螺旋 包含 了 6 个 核 小 体 。 当 深 液 中 存在 镁 离子 时 ， 用 电子 显微镜 可 以 看 到 这 种 300A 的 结构 ,如 果 没 有 镁 离子 ,只 能 看 到 100A 的 细 丝 ,因此 镁 离子 对 螺 线 管 的 形成 是 重 要 的 。 另 外 组 蛋白 的 Hl 可 能 对 核 小 体 的 压缩 也 有 关 。 从 核 小 体 到 螺 线 管 ，DNA 双 螺 旋 压 缩 了 6 倍 ， 进 一 步 的 压缩 可 能 是 通过 形成 所 谓 超 螺 线 管 而 达到 的 。 有 迹象 表明 ,中 期 染色 体 是 一 个 长 的 中 空 的 圆 简直 径 约 4,.000 人。 这 AE HAE 300 人 的 螺 线 管 绕 成 的 ,压缩 比 是 40。 这 个 超 螺 线 管 称 为 单位 纤维 。 单 位 纤维 本 身 还 可 以 压缩 5 倍 。 这 样 总 的 压缩 比 是 7 X 6 X 40 X 5, 同 总 的 DNA 压缩 比 接近 (图 2-44a)o 也 有 人 认为 核 小 体 细 丝 先 形成 发 夹 形状 的 环 , 这 种 环 进一步 绕 成 一 个 螺旋 ,形成 染色 体 结构 (图 2-44b)。 vt COO Cre ph Poh t t 980000000000000 — -esnenenesersesannener (a) (b) 图 2-44 DNA 在 染色 体 中 的 高 层次 结构 有 一 点 可 以 肯定 ， 染 色 体 看 来 是 一 层 层 螺旋 绕 起 来 的 。 DNA 双 螺 旋 就 在 这 些 有 层 次 的 结构 中 绕 缠 ,形成 有 层次 的 超 螺旋 。 DNA 超 螺旋 有 结构 上 的 作用 ， 更 可 能 有 功能 的 意义 。。 但 是 这 些 功 能 的 意义 还 有 有 待 开发 ,这 里 只 提 几 个 迹象 。 很 多 病毒 的 复制 都 要 经 过 具有 超 螺旋 的 双 链 环 状 DNA 阶段 。 例如 鸣 菌 体 %X174 是 一 个 单 链 环 状 DNA, ERIE 6X174 DNA 先 复制 成 双 链 环 状 DNA， 然 后 由 病毒 自身 编码 的 A 蛋 白 在 双 链 DNA 的 特定 位 点 上 切 一 刀 ， 使 得 %X174 DNA FER 简 复 制 的 方式 复制 出 来 。 有 趣 的 是 A 蛋白 作用 的 底 物 必须 是 具有 超 螺旋 的 闭环 双 链 的 DNA， 如 果 用 同样 闭环 双 链 DNA。 而 不 具有 超 螺旋 ,A 和 蛋白 就 不 起 作用 。 如 果 人 为 地 把 一 段 回 文 结构 的 DNA 片 朋 引入 一 个 双 链 环 状 分 子 中 , 再 向 这 个 环 状 分 子 引 入 负 的 超 螺旋 。 这 样 在 电镜 中 看 到 在 这 个 环 状 分 子 上 长 出 二 个 “触角 ”， 这 是 在 回 文 区 形成 的 发 夹 结 构 〈 图 2-45)。 因此 超 螺旋 可 能 有 助 于 正常 细胞 中 回 文 结构 从 规则 的 蝶 旋 中 突出 来 ,成 为 一 个 容易 识别 的 信号 。 图 中 所 示 的 三 个 人 工 制 造 的 闭环 DNA 中 都 有 很 长 的 回 文 结构 , 当 用 拓扑 异 构 酶 工 引入 较 多 的 超 螺旋 后 ， 整 个 分 子 由 于 超 螺旋 引起 ° 58 。 2-45 带 回 文 结 构 的 超 螺 旋 DNA 的 张力 会 消失 在 回 文 结构 形成 的 发 夹 结构 中 。 超 螺 旋 可 能 对 转录 的 控制 也 有 关系 。SV40 DNA 如 果 具 有 超 螺旋 ,那么 它 在 体外 转 录 是 不 对 称 的 ;而 松弛 型 的 SV40 DNA 在 体外 转录 是 对 称 的 。 在 $X174 复制 型 DNA 上 ， 转 录 时 转录 的 RNA MH DNA 形成 一 个 R 环 ， 这 个 环 的 形成 需要 超 螺 旋 释 放 的 自由 能 。 这 样 超 螺旋 就 成 了 一 种 调控 因素 ， 因 为 在 一 个 启 动 基因 上 消耗 了 超 螺旋 的 自由 能 之 后 ,就 妨碍 了 其 他 启动 基因 的 转录 ,也 妨碍 了 DNA 的 复制 。 $$ 4 & {1] Adams, R. 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~2000 0% 稳定 28S 1.7108 ~5000 Biz tRNA 4S 2.5—3xX10* ~80 稳定 a A ee mRNA 不 稳定 细胞 核 tRNA 前 体 rRNA 前 体 45S 4.1106 41S 3.110° 32S ZL 0 11% 20S 9x10? mRNA 前 体 1X10* 一 2X107 极 不 稳定 snRNA 4—8s 80—260 稳定 线粒体 或 叶绿体 tRNA 4S(3S) rRNA 类 似 原 核 生 物 或 更 小 15% mRNA 类 似 原核 生物 * 为 哺乳 动物 肝 细 胞 中 的 含量 。 的 载体 而 参与 细胞 膜 的 合成 ,例如 表皮 葡萄 球菌 中 的 尽 NAS7 在 细胞 壁 合成 时 是 甘氨酸 的 载体 。 还 有 一 些 RNA 分 子 是 一 些 酶 活性 不 可 缺少 的 组 成 成 分 ,例如 ， 免 肌 1,，4-c- 葡 聚 糖分 支 酶 含有 31 KRY 2.5S RNA 分 子 ， 特 异性 地 作用 于 tRNA 前 体 的 RNase PHA 77 多 的 成 分 是 核糖 核酸 ( 详 见 第 五 章 )。 真 核 细 胞 的 核 内 还 存在 着 多 种 代谢 稳定 的 小 分 子 RNA (snRNA)， 其 大 小 从 4S 到 8S 不 等 ;大 约 由 80 到 260 RA MAM, HA 有 些 snRNA 在 RNA 成 熟 过 程 中 起 重要 作用 。 另外 ， 还 有 一 些 与 染色 质 结 合 的 RNA (chRNA), chRNA 的 生物 功能 目前 尚 不 十 分 清楚 , 有 关 这 方面 的 细节 可 参看 第 八 章 。 前 体 RNA ” 绝 大 多 数 RNA 分 子 都 是 在 细胞 核 内 合成 的 。 核 内 存在 着 各 种 RNA 的 前 体 , 例 如 , tRNA 前 体 、rRNA 前 体 和 mRNA 前 体 , 详 见 第 五 章 。 这 些 前 体 RNA 的 分 子 量 一 般 要 比 对 应 的 成 熟 RNA 大 得 多 ,例如 ;哺乳 动物 肝 细 胞 的 rRNA 的 前 体 是 45S 细胞 核 RNA (CnRNA)， 在 成 熟 过 程 中 产生 41S nRNA、32S nRNA 和 20S nRNA 等 中 间 物 ,最 后 成 为 28$S、5.8S 和 18S rRNA, 前 体 RNA 都 是 由 细胞 核 DNA 转录 产生 的 > 经 过 剪 切 、 装 配 和 修饰 等 一 系列 加 工 过 程 以 后 产生 成 熟 的 IRNA、rRNA 和 mRNA, x A 细胞 质 中 行使 其 生物 功能 。* 有 人 把 在 细胞 核 内 合成 后 离开 细胞 核 去 行使 生物 功能 的 RNA 分 子 称 作 迁 移 性 RNA (migrating RNA), 而 始终 存在 于 核 内 的 叫 作 非 迁 移 性 RNA (nonmigrating RNA)。 有 关 细 胞 核 内 RNA 的 细节 可 参看 第 八 章 。 病毒 RNA ”病毒 中 的 遗传 物质 有 的 是 DNA， 也 有 的 是 RNA。 绝 大 多 数 植物 病 毒 和 RNA 肿瘤 病毒 以 RNA 作为 遗传 物质 。 一 般 讲 ， 病 毒 RNA (RARE RNA 病毒 Sh, IBM RNA) 既是 遗传 信息 的 载体 ， 也 具有 mRNA 的 功能 。 类 病毒 (viroid) es 62 « 是 高 等 植物 的 一 类 病原 体 , 它 是 一 个 没有 外 壳 蛋 白 的 游离 RNA 分 子 , 分 子 量 约 12 万 。 关 于 病毒 RNA 的 细节 也 参看 第 八 章 。 这 一 章 着 重 介绍 细胞 质 中 与 蛋白 质 生物 合成 有 关 的 RNA 的 结构 和 与 测定 RNA 一 级 结构 有 关 的 一 些 问题 。 一 、RNA 的 结构 tRNA 1965 年 _Holley 等 首先 测定 了 酵母 两 氨 酸 RNA 的 核 苷 酸 排列 顺序 以 来 , 对 各 种 不 同 来 源 的 tRNA 的 一 级 结构 进行 了 广泛 和 深入 的 研究 。 据 不 完全 统计 ,迄今 已 测定 一 级 结构 的 衣 NA 有 二 百 五 十 多 种 。 在 原核 生物 中 以 大 肠 杆 菌 tRNA 最 多 , 除 且 氨 酸 外 其 余 19 种 都 已 测定 。 在 真 核 生 物 中 ,酵母 的 二 十 种 氨基 酸 对 应 的 RNA 都 已 测定 。 根 据 目 前 已 经 测定 的 (RNA 一 级 结构 的 资料 ,经 过 归纳 和 分 析 它 们 有 以 下 共同 的 特征 :组 成 tRNA 的 核 苷 酸 通 常 为 74 一 93 个 ,其 中 大 多 数 为 76 个 ; 几乎 所 有 tRNA 都 具有 三 叶 草 式 的 二 级 结构 ( 见 图 3-1)。 OOOOOO 上 | © | Pace 5s tad 图 3-1 tRNA ~RA WAAR RHNKE RRABRAAAM tRNA 的 次 序 ) O 〇 表示 所 有 tRNA EXMIBLRAKHREE;, 表示 所 有 RNA 在 这 个 位 置 上 都 是 固定 不 变 的 ?或 者 变 化 较 少 ; 品 表 示 并 非 所 有 (RNA 在 这 个 位 置 上 都 有 核 背 酸 存在 。 在 IRNA 中 加 入 核 背 酸 , 其 命名 法 如 下 : 以 加 人 的 核 苷 酸 前 一 个 核 背 酸 的 序号 加 冒号 后 再 编号 。 例 如 20: A 和 20: B 表示 在 第 20 位 核 背 酸 之 后 加 人 的 第 一 个 和 第 二 个 核 背 酸 。 1, 二 氢 尿 障 啶 环 (D A); II， 反 密码 子 环 ; Ul, 可 变 环 ; Iv, THC 环 (简称 工 环 ) tRNA 的 一 级 结构 不 变 和 半 不 变 的 核 昔 酸 一 从 噬菌体 细菌、 真菌、` 昆 虫 \ 植 物 \ 哺 乳 动物 (以 及 真 核 生 Aiea AAR an SAY tRNA 分 子 一 级 结构 的 资料 分 析 , 约 有 二 十 多 个 位 置 上 的 核 彰 酸 是 不 变 和 半 不 变 的 。 其 中 十 多 个 位 置 上 的 核 苷 酸 在 几乎 所 有 tRNA 中 都 是 不 变 的 ， e。 63 。 i @-—v¥--} 72 i / 2 71 i ee i 2) Cme— 5 a ; Eucaryotes wer 4 only O-mG— 6 67, wD. @, 5 Dj grams Ouicp wis gO VY “ 1 procaryotes e—sU A . a ss 也 2 Ln @Y. 2-755 Be es 4 - nN oS 66 0 62 : 2 © 8 注 8 人 46 全 & ° @ 7 时 Gn” . we ° ’ 本 eV d @) 0 2% “Qe cept ~ 3-2 tRNA 中 修饰 核 音 酸 的 分 布 修饰 成 分 符号 见 第 一 章 。 数 字 代表 在 该 部 位 出 现 特定 修饰 核 背 的 已 知 tRNA 数 (圆圈 内 的 数 为 真 核 生物 的 ;没有 圆圈 的 数字 为 原核 生物 的 O Eucaryotes: 真 核 生 物 ，Eucar.: 真 核 ; Procaryotes: 原核 生物 ，Proc.: 原 核 ) Pq 3’ CCA， 第 8 位 的 U( 或 的 衍生 物 );18 和 19 位 的 G (或 G 的 衍生 物 )，53 位 的 G, 61 位 的 C 和 58 位 的 A( 或 A 的 衍生 物 ) 等 。 所 谓 半 不 变 的 核 背 酸 则 是 那些 只 可 能 发 生 味 叭 间或 喀 啶 间 的 互 换 的 核 苷 酸 。 这 些 不 变 和 半 不 变 的 核 昔 酸 对 于 维持 tRNA 倒 世 型 的 高 级 结构 和 实现 其 生物 功能 起 着 重要 作用 ,同时 也 说 明了 tRNA 分 子 在 进化 上 的 保 守 性 。 TCG 序列 一 一 在 绝 大 多 数 tRNA 的 第 54 到 57 位 存在 着 TyCG 序列 。 该 区 域 称 为 ThC 环 。TywCG 对 于 tRNA 分 子 与 5$ rRNA 的 结合 和 tRNA 高 级 结构 的 维系 起 着 重要 作用 。 但 是 在 少数 tRNA 中 不 存在 这 一 序列 。 已 知 的 大 多 数 真 核 生 物 起 始 tRNA 上 这 一 序列 被 AyCG 或 AUCG 所 取代 。 一 些 具 有 特殊 功能 的 tRNA 分 子 , 例 如 作为 肿瘤 病毒 反 转 录 酶 的 引物 的 tRNA 分 子 , 该 处 是 ypCA，TmwCA 或 PCG; 在 表 皮 葡 萄 球菌 中 参与 细胞 壁 合 成 的 tRNASY XA UGCG 等 。 (Ei RRNA 分 子 中 含有 大 量 修饰 核 苷 酸 , 也 叫 稀有 核 苷 酸 ,迄今 已 发 现 近 七 十 种 稀有 核 苷 酸 中 近 五 十 种 存在 于 tRNA 中 ( 见 第 一 章 )。 每 个 RNA 分 于 中 少 则 合 ° 64 。 有 2 个 ,多 则 含有 19 个 修饰 核 背 酸 ， 它 们 大 多 分 布 在 分 子 的 非 配对 区 。 特 别 在 反 密 码 子 3 端 邻 位 出 现 修饰 核 昔 酸 的 频率 最 高 ( 见 图 3-2)* 而 且 大 多 属于 修饰 的 叮 叭 核 彰 酸 , 这 对 于 反 密 码 子 环 三 级 结构 的 稳定 \ 反 密码 子 第 三 字母 和 mRNA 上 密码 子 第 一 字母 间 产 格 而 鹤 确 的 结合 是 重要 的 。 在 反 密 码 子 第 一 位 置 或 叫做 摆动 位 置 上 ,也 常常 是 修饰 核 背 酸 ( 见 图 3-2)e 在 密码 子 与 反 密码 子 相互 作用 时 摆动 位 置 的 配对 情况 参阅 第 七 章 。 迄 今 对 于 修 RARE RNA 分 子 存在 的 生物 学 功能 了 解 还 很 少 。 表 3-3 tRNA 二 级 结构 的 证 据 方 法 结 果 1. 紫 外 吸收 光谱 酵母 tRNA 有 50% 双 链 2. 红 外 吸收 光谱 大 肠 杆 菌 tRNAM* 配对 碱 基 占 5392 3 .旋光 色 散光 谱 酵母 IRNA4AL 双 链 占 50% 4. 核 磁 共 振 tRNAPSY 有 21 士 3 碱 基 对 5. Ft RARA RAS 能 结合 部 位 不 能 结合 部 位 ASHER URNA" ACCAon 所 有 茎 区 D 环 TR 反 密 码 子 环 可 变 环 酵母 tRNA’ ACCAou TH 反 密 码 环 DK 6. 化 学 修饰 的 研究 可 修饰 不 可 修饰 酵母 tRNAPhe CCAon 所 有 茎 区 D 环 工 环 反 密 码 子 环 可 变 环 7. 自 由 能 的 计算 及 其 分 布 的 研究 对 62 种 tRNA 的 一 级 结构 研究 结果 三 叶 草 型 二 级 结构 具有 最 低 的 自由 能 》 tRNA 的 二 级 结构 tRNA 分 子 的 三 时 草 式 二 级 结构 也 是 Holley 等 人 在 1965 年 首先 提出 的 ,当时 的 主要 依据 是 酵母 丙 氨 酸 tRNA 的 一 级 结构 信息 和 Watson-Crick 碱 基 配 对 原则 。 根 据 这 个 模型 ， 酵母 两 氨 酸 tRNA 分 子 中 有 20 到 21 对 碱 基 对 ， 即 占 该 tRNA 中 总 数 53 多 的 核 苷 酸 处 于 碱 基 配 对 之 中 。 随 后 许多 物理 和 化 学 (包括 大 量 一 级 结构 的 信息 ) 性 质 的 研究 证 明 ， 在 RN tRNA 分 子 确实 存在 着 与 三 叶 草 模 型 为 数 相当 的 碱 基 对 。 这 些 方法 包括 紫外 人 豚 收 光谱 \ 红 外 吸收 光谱 \ 旋 光 色 散 特 性 \ 核 磁 共 振 、 互 补 核 苷 酸 片 段 结合 、 化 学 试剂 修饰 和 在 多 种 状态 下 自由 能 的 计算 等 的 研究 , 见 表 3-3。tRNA 二 级 结构 模型 也 已 经 由 酵母 丙 ZAR tRNA 的 和 射线 衍射 分 析 的 结果 所 证 实 。 在 三 时 草 构 型 中 (图 3-1) tRNA 分子 一 般 可 分 为 氨基 酸 接 受 蕉 、 二 氢 尿 旷 啶 苍 (D 2). RHBFA. ToC SHH tRNA 还 有 可 变 葵 ` 二 氧 尿 罚 啶 环 (D 环 、1)、 反 密码 子 HK (I), TéC HAV) MARA). Hepes Aww A 7 对 碱 基 对 , 反 密 码 子 苓 5 对 碱 AEX, THC 25 对 碱 基 对 ; 反 密 码 子 环 7 个 核 背 酸 和 TyC 环 7 个 核 苷 酸 在 各 种 tRNA es。 65 。 中 保持 不 变 。 由 此 可 见 ， 各 种 不 同 的 tRNA 分 子 在 长 度 上 的 变化 主要 发 生 在 三 个 区 域 。 即 D 环 和 可 变 环 的 核 昔 酸 数目 以 及 D 共 的 碱 基 对 数目 的 不 同 。 为 了 便于 研究 ， 大 们 根据 tRNA 分 子 可 变 区 域 的 特征 ,把 tRNA 分 成 三 种 类 型 : 第 一 类 tRNA，D 革 3 对 碱 基 对 ， 可 变 环 3 一 5 个 核 昔 酸 (DiV;_,); 第 二 类 RNA, DA3 HMM, BAM 13-21 个 核 oe CBsVis-siS 第 三 类 tRNA, DA 4 WARM, BAEK 3 一 6 NB BEB (DiVa za 从 已 经 测定 了 一 级 结构 的 tRNA 的 结构 类 型 来 看 ,第 三 类 结构 (D,V;-) 的 RNA AAR 数 的 50% 左右 。 刻 今 为 止 发 现 的 一 个 例外 是 哺乳 动物 线 . 粒 体 丝氨酸 RNA 只 有 .63 个 核 苷 酸 ， 呈 现 三 叶 草 式 二 级 结构 ( 见 图 3-3), 其 沉降 系数 为 3S (一 般 tRNA 为 4S), 这 . 至 o 8 G -c rs 一 结果 也 从 tRNA 基因 的 结构 分 析 得 到 进 二 步 确证 。 3 tRNA 的 三 级 结构 二 LU fA) ~ ne “Ue ae 70 年 代 以 来 RNA 立体 结构 的 研究 有 了 很 大 的 进展 。 ae 先后 有 人 利用 许多 物理 学 和 化 学 的 方法 来 测定 tRNA 等 的 立体 结构 。 这 些 方法 有 激光 拉 曼 光谱 研究 、 碱 基 特 异性 bee HAE UI FE UF SRS SE BTR TE BE EP FE 等 等 。 但 是 除了 少数 方法 能 够 提供 较 多 的 结构 信息 包括 核 RNA 2 烙 碘 酸 骨架 的 走向 外 。 其 余 方法 所 提供 的 结构 信息 是 局 部 酸 ; (); 半 不 变 核 音 酸 ; O55 ， 的 和 零碎 的 ,因而 不 能 构 画 出 tRNA 分 子 清 晰 的 三 度 空间 eee 结构 。 直 到 1973 年 一 1975 年 间 , 由 于 制备 适合 于 高 分 辩 率 X 射 线 衍 射 分 析 的 (RNA 结晶 方法 的 突破 , Kim, Rich 和 Robertus 等 大 利用 这 一 方法 ， 分 别 以 两 种 不 同 的 晶 型 ( 斜 方 晶 和 六 方 晶 ) 测 定 了 酵母 茶 丙 氨 酸 RNA 的 三 度 空 间 结构 ， 得 到 了 几乎 完全 一 致 的 结果 ,提出 了 tRNA 分子 的 倒 工 型 三 级 结构 模型 ( 见 图 3-4)。 随后 还 有 几 种 tRNA (ANBAR RNA, MEH RNA 和 大 肠 杆 蓝 精 氨 酸 RNA 等 ) 先后 用 同样 方法 测定 了 三 级 结构 。tRNA 是 三 级 结构 了 解 较 详细 的 一 种 天 然 存在 的 具有 特定 生物 功能 的 RNA 分 子 。 根据 3A 分 辩 率 的 射线 衍射 分 析 结果 ,酵母 RNA 分 子 具 有 像 字 母 工 那样 的 折 倒 , 有 下 面 这 些 特征 : 〈1) 分 子 的 全 狐 像 字母 L。 氮 基 酸 接受 共和 ToC 4 R— PMB 旋 ，PD 共 和 反 密 码 葵 形 成 另 一 个 近似 连续 的 双 螺旋 ， 这 二 个 双 螺 旋 构 成 了 像 字 母 工 的 形 状 。 工 的 一 端 是 3’ 端 CCA， 另 一 端 是 反 密 码 子 , 两 端 之 间 的 距离 约 70A。Twc KMD 环 构成 工 的 拐角 。 整 个 分 子 是 扁平 的 ,厚度 约 20 信 。 工 型 分 子 中 的 螺旋 类 似 DNA OF 中 的 A 型 结构 。(2) 分 子 中 存在 着 维系 三 级 结构 的 氢 键 。 大 多 数 维系 三 级 结构 的 氢 键 是 在 tRNA 分 子 的 许多 不 变 和 半 不 变 的 碱 基 与 构成 RNA 二 级 结构 的 碱 基 之 间 形 成 的 ( 详 见 图 3-4C)。 除 有 标准 的 Watson-Crick 配对 外 ， 还 有 许多 非 标准 的 配对 ( 见 图 3-5)。 图 3-5 中 a 和 bb 是 标准 Watson-Crick 配对 ; cy dy ay ef fey gy ix hy 和 hi 是 非 标准 配 对 。 (3) 维系 三 级 结构 的 氢 键 中 包含 有 碱 基 与 核糖 或 磷酸 之 间 形 成 的 氨 键 。 例 如 ,Aza WN, 与 Us 9 Oy»; Us; 的 Ni 与 Ax AY Os 或 磷酸 上 的 氧 形成 的 氨 键 〗 册 ss 的 Ni 5 Ass 的 磷酸 上 的 氧 之 间 形 成 的 氢 键 等 等 。 后 二 种 情况 的 氢 键 分 别 稳定 了 反 密 码 环 和 ToC 环 上 人 尖 的 弯曲 。 在 DNA 中 没有 Oy, 因而 不 能 与 之 形成 氢 键 ,这 也 许 是 DNA 分 子 往往 是 长 链 的 一 个 原 和 66 。 3! 过 分 端 pGi ° ‘ 2 & 气 基 酸 接合 此 D¥ te Ue U (G (A s po RoucRs > fas 729 a eae 25 a8Chj 20 (GIAG SU % Sa iC “ Uy, G C 图 3-4 酵母 茶 丙 氨 酸 tRNA 的 三 级 结构 (a) 链 走向 图 ; (6) 射线 衍射 分 析 得 到 的 立体 结构 模型 ; () 分 子 中 维持 二 级 和 三 级 结构 氧 键 的 位 置 。 Blo (4) tRNA? 的 三 级 结构 具有 假 双重 对 称 性 。tRNA" 分 子 上 所 有 的 碱 基 几 乎 都 有 围绕 着 并 包含 在 二 个 螺旋 结构 之 中 的 趋势 。 约 占 分 子 409 的 结构 是 对 称 的 。 在 氨基 酸 LAA T6C 葵 与 反 密 码 子 蕉 和 反 密 码 子 环 的 一 部 分 包括 D 共 之 间 有 一 个 假 双 重 对 称 轴 ;* 即 在 三 个 螺旋 的 交接 处 的 中 心 有 一 个 双重 对 称 轴 。 tRNA 三 级 结构 的 共同 特征 一 一 酵母 茶 丙 氮 酸 tRNA 三 级 结构 中 发 现 了 许多 维持 三 级 结构 折 且 的 氢 键 大 多 数 是 由 不 变 和 半 不 变 的 碱 基 参 与 形成 的 。 因 此 目 然 可 以 推测 工 型 ADT Beha tRNA 具有 类 似 二 级 结构 特征 的 tRNA (D.V;) 所 共有 的 。 目 前 已 经 测定 了 三 级 结构 的 几 种 CRNA 包括 起 始 RNA( 大 肠 杆菌 起 始 tRNA 和 酵母 起 始 tRNA) 和 延伸 tRNA (KBAR tRNA) 等 都 具有 类 似 酵母 茶 丙 氨 酸 tRNA 那样 的 倒 志 ° 67 。 型 结构 。 例 如 ,大 肠 杆菌 精 所 酸 tRNA (Di;V;) 的 X 射 线 衍射 分 析 结果 显示 , 尽管 组 成 它 的 核 苷 酸 有 四 十 二 处 与 酵母 tRNA 的 不 同 ， 它 的 二 级 结构 类 型 (DiV;,) 也 与 酵母 tRNA 〈D4V;) 不 同 , 但 其 三 级 结构 仍 具 有 工 型 的 折合 。 由 此 可 网 , 世 型 的 折 和 县 可 能 是 所 有 tRNA 包括 真 核 tRNA 和 原核 tRNA 以 及 延伸 tRNA 和 起 始 tRNA 所 共有 的 。 当 然 仔 细 观 察 已 经 得 到 的 几 种 tRNA 分 子 的 三 级 结构 模型 可 以 发 现 它们 之 间 在 精细 结构 上 还 是 有 差别 的 ， 这 包括 分 子 上 两 个 螺旋 形成 的 拐角 的 大 小 ; CCA 未 端 伸展 的 程度 ; D 环 在 分 子 上 的 松紧 程度 ; 反 密 码 子 臂 的 构象 和 反 密 码 子 环 上 的 Us 碱 基 的 方向 等 等 。 tRNA 高 级 结构 与 其 生物 功能 的 关系 一 一 1975 年 Kim 根据 酵母 tRNAP 结晶 的 射线 衍射 分 析 结 果 ,提出 了 氨 酰 tRNA 合成 酶 与 tRNA 的 对 称 辨认 假说 , 他 认为 合成 酶 辨认 tRNA 时 分 二 步 。 第 一 步 是 一 般 辨 认 ; 第 二 步 是 特异 性 辨认 。 第 一 步 是 由 合成 酶 辩 认 tRNA 分 子 的 工 型 骨架 结构 , 即 通过 与 假 双 重 对 称 分 子 上 相当 大 的 部 分 的 结合 实现 的 〈 见 图 3-6)。 这 个 假说 可 以 说 明 大 肠 杆 菌 的 氨 酰 tRNA 合成 酶 可 以 酰 化 某 些 真 核 生 物 tRNA 的 现象 ,但 目前 还 缺乏 直接 的 实验 证 据 。 tRNA 与 5S rRNA 的 相互 作用 。 原 核 生物 的 tRNA 分 子 上 的 THC 环 上 有 一 段 序列 GT¢C 与 其 同 源 的 5S rRNA 分 子 上 的 一 段 序列 GAAC 相互 补 。 已 有 证 据 表明 tRNA 与 5S rRNA 相互 作用 发 生 在 RNA 处 于 核糖 体 的 A 位 上 。 许 多 证 据 包括 tRNA 高 级 结构 se 68 。 Nu anne Oo 4H . mes nN oO 4 lo) "r+ . tS ng tee (bp) Pi eae é hed \ u69 (c) ‘ Y 1 eee H-N o----H-NN UN Ga. 人 Yr he 5 y's 1 (@) are us Nae of wl YX ak Ree N-H H miG9 wh - ony * Pia dt ae gp. AC i NH N-H i aexl FN ) bi2 3? 人 we oa G12 Va vs “ 人 人 电 3-5 MEAAAM (RNA 中 a 和 bb 为 标准 Watson-Crick 配对 ; cy dy ei fir 测定 的 结果 显示 : GTWwC 是 被 tRNA 分 子 内 的 氧 键 维系 着 的 ,或 者 具有 严格 的 碱 基 堆积 构象 , 即 它 像 tRNA 分 子 上 茎 区 的 碱 基 一 样 , 化 学 上 是 不 活 涛 的 ( 见 表 3-3)。 因此 只 有 通 过 核糖 体 或 mRNA 的 诱导 使 tRNA 发 生 构象 的 变化 才能 与 5S rRNA 相互 作用。 从 酵 BAARR tRNA 结晶 的 和 射线 衍射 结果 得 知 Gu 5 Coo 之 间 的 碱 基 对 比 正 党 的 GC 对 的 稳定 性 差 , 二 个 碱 基 不 在 同一 平面 上 ,形成 30” 的 扭 角 。5S rRNA 与 tRNA 相互 作 用 的 可 能 的 机 制 如 图 3-7 所 示 。 首先 5$S rRNA 上 的 CCGAAC 中 的 G 或 另外 一 个 G 残 基 与 Cx 形成 另 一 个 扭 角 碱 基 对 ,产生 一 个 双 碱 基 对 的 中 间 物 (图 3-7, b)， 这 个 碱 基 对 降 (KY Cso* G。 碱 基 对 的 稳定 性 ,并 最 后 打开 了 它 , 转 而 触发 了 Gy 的 解 堆 积 ， 至 少 拆 开 二 个 维持 三 级 结构 的 碱 基 对 Pss* Gis 和 Ts Ass» 可 能 还 有 Gs + Ce. 这 样 工 环 与 D 环 解 开 ( 图 3-7, ¢), GTPC 与 5S rRNA 上 的 GAAC 即 可 形成 互补 的 碱 基 对 。 在 蛋白 质 生 物 合成 中 延伸 tRNA 与 起 始 tRNA 的 重要 区 别 或 许 在 于 氮 酰 化 的 (RNAP 是 直接 进入 核糖 体 的 P 位 ， 而 氮 酰 化 的 延伸 tRNA 则 首先 进入 核糖 体 的 A 位 ， 然后 再 转移 到 P 位。 Rich 等 根据 大 肠 杆菌 tRNAM 的 和 射线 衍射 分 析 结 果 , HE SE 伸 tRNA 和 起 始 RNA 功能 上 的 不 同 所 依赖 的 结构 基础 或 许 在 于 Un 碱 基 在 反 窗 码 子 环 上 的 不 同方 向 , 即 所 谓 的 Us “转动 假说 "。 Rich 等 发 现 大 肠 杆菌 tRNAM 上 Us 的 碱 基 Re ER BETAS tRNA 的 则 在 环 内 。 尿 喀 啶 的 不 同方 位 可 能 允许 33 位 的 a = > ee ? ra ? (f,) ed N N-H r hits ) vas 218 ef = i oF (2); 2 N MEd 9 i aa 1 SS CH, c SA f oON Q ie “HN 4 ly O45 en rea N oN G22 H- yn PP tate by te iM ‘Ge ae) i 1 mye H hz co AAA eee | all cia |, oe 的 部 分 碱 基 对 和 假定 的 碱 基 对 tz、ez gy i, hy 和 h, 是 非 标准 配对 。 e 69 。 / Gee \ 氨基 酸 接 受 芭 | oe e (b) (c) so 图 3-6 tRNA 5am tRNA 合成 酶 相互 作用 的 模型 (a) tRNA 分 子 的 构象 ; (b) AM tRNA 合成 酶 的 构象 ; (c),(d) tRNA 5AM tRNA 合成 酶 相互 作用 的 可 能 的 模式 。 核糖 的 0x 与 36 位 的 磷酸 之 间 形 成 一 个 氢 键 。 这 样 36 位 的 磷酸 被 拉 向 环 的 中心， 这 与 正常 的 磷酸 所 受 的 向 外 的 力 不 同 ,于 是 形成 了 一 个 焉 斜 的 反 密 码 子 环 ,而 这 种 构象 与 酵母 tRNA! 是 不 同 的 。 这 种 构象 的 不 同 导 致 反 密码 子 碱 基 排 列 的 轻微 差别 ， 这 可 ERE 许 起 始 tRNA 首先 进入 核糖 体 P 位 的 原因 。Rich 认为 , 真 核 起 始 RNA 的 33 位 虽 是 胞 RENE XR CRA SABHA RNA 相同 的 构象 ， 其 实 核酸 酶 降解 的 研究 已 经 表明 大 肠 杆菌 起 始 RNA SAK RNA 有 相同 的 构象 。 延 伸 RNA 在 从 核糖 体 上 的 A 位 向 P 位 转移 时 会 与 核糖 体 上 的 一 个 元 件 相 互 作用 ， 结 果 反 密码 子 环 从 一 种 构象 弹 向 另 一 种 使 Us 碱 基 向 外 的 构象 。 如 果 是 这 样 的 话 , Us 可 能 在 (RNA 占据 P 位 时 起 一 CE I ，5S rRNA d 3-7 tRNA 与 5S rRNA 相互 作用 的 一 个 假设 的 示意 图 a, tRNA 分 子 上 的 工 环 与 D 环 之 间 的 碱 基 对 ; b, WB RNA 上 的 G 残 基 Sif G.C 对 相互 作用 ; “，T 环 与 D 环 之 间 的 碱 基 对 打开 ; 4, 5S rRNA 与 tRNA 之 间 形 成 的 碱 基 对 。 种 结构 作用 。 在 mRNA 与 A 位 及 P 位 上 的 tRNA 形成 三 维 复合 物 时 ,，U: 上 的 Oy 可 能 与 在 A 位 上 的 tRNA 的 2oOH 形成 氢 键 ,同时 两 个 反 密 码 子 与 mRNA 上 两 个 相 邻 的 三 联 密码 子 相 结合 ,此 时 两 个 下 NA 分 子 上 CCA 末端 彼此 靠近 ， 造 成 肽 链 转移 的 有 利 的 es。 70 « ad i as re a 结构 。 这 个 ”转动 假说 "还 有 待 直 接 的 实验 证 实 。 tRNA 结构 的 研究 在 过 去 十 几 年 间 是 相当 活 妈 的 课题 , 近 几 年 来 人 们 又 注意 到 tRNA 前 体 一 级 结构 。tRNA 前 体 的 结构 可 为 tRNA 生物 合成 的 研究 提供 重要 的 信息 。 tRNA 的 转录 有 三 种 方式 ， 单 师 反 子 转录 、 双 (多 ) 顺 反 子 转录 和 含有 插 人 顺序 的 基因 转录 。 相 应 地 在 tRNA 生物 合成 中 也 有 三 类 不 同 的 tRNA 前 体 ( 详 见 第 五 章 )。 rRNA rRNA 是 核糖 体 的 组 成 成 分 ( 见 表 3-4), 它们 对 于 核糖 体 的 自动 装配 和 活力 表现 起 着 重要 作用 。rRNA 结构 的 研究 无 疑 是 了 解 核糖 体 结构 与 功能 关系 的 重要 途径 之 一 。 近 表 3-4 不 同 核糖 体 中 的 rRNAx 大 亚 基 | 小 亚 基 核糖 体 源 - : K sy RNA 5 oe RNA 80S 真 核 生 物 (将 椎 动物 ) 60S 28—29s 40s 18s 5S 5.8S 80S HRA DCAMMIESR DY) 60S 25S 40s 16—18S 5s 5.88 70s 原核 生物 50S 23s 30s 16S 5S 55S 兰 柱 动物 线粒体 40S 16 一 17S 30S 12—13s * 也 参阅 第 六 章 中 表 6-1 MR 6-2, 二 十 年来 rRNA 结构 的 研究 已 经 取得 了 很 大 的 进展 ,特别 是 近年 来 运用 快速 核 苷 酸 序 列 测定 方法 ， 不 少 过 去 难以 测定 的 高 分 子 量 的 rRNA 的 一 级 结构 得 以 前 明了。 与 此 同时 ， 综合 运用 现代 生物 、 化 学 和 物理 技术 测定 了 它们 的 二 级 结构 乃至 三 级 结构 ， 其 中 以 大 肠 杆菌 核糖 体 中 的 三 个 rRNA 一 -5S rRNA (120 个 核 苷 酸 )、16S rRNA(1542) 和 23S rRNA (2904) 的 结构 研究 最 为 详细 。 其 他 原核 生物 及 真 核 生 物 ( 包 括 真 核 细胞 器 ) rRNA WH 究 也 取得 不 少 进 展 ， 这 对 于 进一步 深入 研究 核糖 体 的 精细 结构 与 功能 的 关系 提供 了 重要 的 信息 。 小 分 子 rRNA 〈 如 5S、5.8S) 的 一 级 结构 可 以 用 经 典 的 或 直 读 的 方法 进行 测定 ( 详 见 第 三 节 )， 而 大 分 子 rRNA 则 通常 先 测定 其 基因 序列 并 辅 之 以 RNA 组 成 和 序列 分 析 等 手 眉 推导 得 到 。 通 过 电子 计算 机 处 理 可 以 排出 已 知 结构 的 rRNA 的 可 能 二 级 结构 模型 ， 然后 用 化 学 修饰 以 及 酶 解 敏 感 部 位 的 确定 予以 选择 和 校正 ; rRNA 上 功能 部 位 的 研究 也 有 助 于 其 二 级 结构 的 建立 。 由 于 rRNA 分 子 具 柔性 ， 因 此 企图 像 tRNA 那样 通过 晶体 的 X 射 线 衍 射 测定 其 三 级 结构 是 困难 的 , 虽然 最 近 根 据 小 角度 X 射线 衍射 分 析 以 及 氢 动 力学 研究 等 已 建立 了 5S rRNA 的 三 级 结构 模型 ( 见 图 3-10)。 RNA 是 单 链 结构 ， 它 不 像 DNA 那样 处 在 完全 的 螺旋 结构 之 中 ， 但 许多 分 析 方 法 es。 71°. 确认 RNA 中 确 也 存在 大 量 氢 键 对 ( 见 tRNA 一 节 的 表 3-3), Alt, RNA 分 子 必 RE FHSAA ATA Mo tRNA 是 这 样 ，rRNA 更 是 如 此 。 下 面 将 看 到 ，rRNA 特别 是 大 的 rRNA 分 子 中 存在 许多 由 螺旋 区 和 环 区 组 成 的 区 域 ， 每 个 区 域 大 概 是 在 结构 上 和 功能 上 . 相对 独立 的 单位 。 5S rRNA 5S rRNA 存在 于 核糖 体 大 亚 基 上 。 真 核 生 物 和 原核 生物 的 核糖 体 都 有 5S rRNA。 从 . 其 结构 特征 不 同 可 以 分 成 四 种 : 〈1) 真 核 型 (120 个 核 背 酸 , 在 高 等 植物 中 是 116 一 118 + aR); (2) 古 细菌 型 (121 个 核 昔 酸 );(3) 细 菌 型 ( 革 兰 氏 阴 性 菌 , 120 个 核 苷 酸 ) 红 47 细菌 型 ( 革 兰 氏 阳 性 菌 ,1156 RAR. AW 117 个 核 背 酸 )。 图 3-8 是 Fox 和 Woese 在 1975 年 提出 的 大 肠 杆 菌 5S rRNA 的 二 级 结构 模型; 当 时 是 根据 6 种 原核 和 4 种 真 核 生 物 的 5S rRNA 的 一 级 结构 信息 提出 来 的 。 其 后 许多 实 验 室 提 出 了 许多 模型 。 直 至 最 近 〈1982 年 ) 由 De Wachter 等 提出 的 模型 , 它 适 用 于 各 种 : 不 同 来 源 ( 包 括 原核 \ 真 核 和 真 核 细 胞 器 ) 的 5S rRNA《〈 见 图 3-9)。 图 3-8 Fox 和 Woese 提出 的 天 肠 杆菌 SS rRNA 二 级 结构 模型 图 中 阴影 部 分 是 与 50S 亚 基 上 的 蛋白 质 结合 的 部 分 。 MA 5” 端 起 每 10 MARES A @ Pride 根据 Fox 和 Woose 模型 , 大 肠 杆菌 5S rRNA 由 四 个 螺旋 区 及 其 他 单 链 部 分 构成 4 四 个 螺旋 是 : 〈1) 分 子 柄 螺旋 (1 一 10 和 110—120); 〈2) 弱 调节 螺旋 (18 一 23 和 60—65)5 《3) 共 同 臂 螺 旋 (31 一 34 和 48 一 51);5(4) 原 核 环 螺旋 (82 一 86 和 90 一 94)。 5S rRNA 的 分 子 柄 通常 由 连续 伸展 的 10 一 11 对 碱 基 对 组 成 , 它 把 分 子 的 二 端 维系 在 一 起 。 不 同 来源 的 5S rRNA 这 个 区 域 的 核 苷 酸 序列 是 易 变 化 的 , 且 常 常 含 G-U 对 ， 例 如 巨大 芽孢 杆菌 的 柄 区 有 三 个 连续 的 G-U Ho 大 肠 杆 菌 5$S rRNA 中 的 弱 调 节 螺 旋 相 当 奇 特 和 容易 发 生变 化 ,这 在 海 生 的 原核 生物 中 是 极 弱 的 ,在 非 海 生 的 原核 生物 中 有 中 等 的 稳定 性 ,而 在 真 核 生 物 中 则 相当 稳定 。 这 个 螺旋 只 有 六 对 碱 基 对 , 且 是 高 度 保守 的 ,其 末端 的 G-C 对 (在 大 肠 杆 菌 中 位 于 23 和 60) 在 所 有 5S rRNA 中 都 是 桐 同 的 。 由 31 一 34 和 48 一 51 构成 的 螺旋 叫 共 同 臂 螺旋 ,共同 劈 螺 旋 在 所 有 的 5S rRNA 中 都 含 4 对 碱 基 对 (酵母 只 有 3 对 ,是 个 例外 )。 紧 靠 着 这 个 螺旋 的 环 , 在 绝 大 多 数 原核 生物 中 都 含有 CGAAC 序列 (在 大 肠 杆菌 中 的 43 至 47 位 ), 它 是 5S rRNA 与 tRNA 分 子 上 的 不 变 序 列 GTYCG 相互 作用 的 部 位 〈 见 第 69 页 )。 这 种 相互 作用 使 5S rRNA 与 tRNA. “ 打 结 ”, 构 成 一 个 连续 的 伸展 碱 基 对 ,可 多 至 14 对 (如 果 5S rRNA 与 tRNA 间 有 五 对 碱 0. 720 基 配 对 的 话 ), 即 5S rRNA 上 4 对 ，5S rRNA 与 tRNA 间 4 一 5 8, tRNA E5 Xf, 这 种 分 子 闻 螺旋 的 形成 对 于 tRNA 上 的 TVCG 和 臂 的 几何 构象 ,进而 对 于 整个 tRNA 分 子 三 级 结构 的 影响 是 非常 大 的 。 原核 环 螺旋 一 般 有 4 对 以 上 碱 基 对 ,如 含有 G-U 对 的 话 , 碱 基 对 可 增加 ， 如 大 肠 村 AA 8 对 。 紧 靠 的 原核 环 ( 大 肠 杆菌 为 87 一 89) 有 3 个 喀 喧 或 4 个 非 配对 的 核 苷 酸 。 原 核 环 及 其 螺旋 构成 一 个 紧密 的 发 夹 。 尽管 该 处 一 级 结构 可 变 ， 但 它 总 是 有 较 多 的 G-C 对 ,因而 比较 稳定 。 大 肠 杆 菌 中 这 个 区 域 是 抗 核酸 酶 作用 的 。 在 5S rRNA 分 子 上 , 单 链 区 较 双 链 区 的 一 级 结构 保守 。 其 中 一 个 单 链 区 ，GCGCC% AUGGUAGU (在 大 肠 杆菌 中 位 于 67 一 80) 25 50S 核糖 体 亚 基 上 的 蛋白 质 如 LS, L11 和 L25 (也 见 图 3-16) 相 互 作用 的 部 位 。 这 个 序列 虽 普 遍 存 在 于 细菌 5S rRNA 中 ,但 在 真 核 生 物 中 则 找 不 到 。 大 肠 杆 菌 5$S rRNA 的 第 72 到 83 位 ; 共 12 个 核 背 本 是 与 23S rRNA 上 的 5 端 143 一 154 位 之 间 互 补 的 ,说 明 该 区 域 可 能 是 与 23S rRNA 相互 作用 的 部 位 。 因此 ， 整 个 5S rRNA 分 子 可 以 粗略 地 分 为 二 大 部 分 :一 部 分 在 识别 功能 上 ( 即 与 tRNA 相互 作用 ) 是 重要 的 , 另 一 部 分 则 在 结构 上 ( 即 与 50S 核糖 体 亚 基 相 互 作 用 ) 是 重要 的 ,而 隔 开 这 两 部 分 的 是 弱 调 节 螺 旋 ( 见 图 3-8)。 1982 年 DeWachter 等 人 提出 一 个 新 的 5S rRNA 二 级 结构 模型 , 这 个 模型 适用 于 各 种 不 同 来 源 的 近 一 百 种 5S rRNA， 表 明 它 们 是 有 共同 的 起 源 的 。 图 3-9 是 这 个 模型 的 示 意图 。 该 模型 由 以 下 几 部 分 构成 : 五 个 双 链 区 (分 别称 为 A、B、C、D ME), 一 个 多 分 支 的 环 CM) ,二 个 中 间 环 (6 和 L)7 和 二 个 发 夹 环 (CH, 和 H:)。 这 个 模型 与 上 面 介 绍 的 大 肠 杆 fA 5S rRNA 模型 基本 上 是 类 似 的 。 但 DeWachter 等 人 模型 则 把 所 有 5S rRNA 以 150 个 位 置 表示 ,以 容纳 在 进化 过 程 中 核 苷 酸 残 基 的 缺失 以 及 变异 产生 的 核 苷 酸 残 基数 的 增 减 。 此 外 ,还 有 以 下 特点 : 它 有 较 低 的 自由 能 ， 碱 基 对 占 碱 基 总 数 的 61%; 有 21 个 位 置 上 的 核 普 酸 残 基 是 保守 的 :有 24 个 位 置 具 有 保守 的 了 喀 啶 或 叮 叭 碱 ; 而 五 个 双 链 区 的 碱 基 对 数 目 和 各 个 环 区 的 核 苷 酸 数目 则 因 5S rRNA 的 来 源 不 同 而 不 同 。 A M B LF c H, 3-9 58 rRNA 共同 的 二 级 结构 模型 A 一 E: 双 链 区 ; M: SAH; I, Al I: 中 间 环 ; H, 和 H,: 发 夹 环 。 经 过 多 年 努力 已 有 三 家 实验 室 分 别 根据 小 角 X 射线 衍射 分 析 、 氢 动力 学 研究 和 特异 性 酶 解 研究 等 结果 提出 了 大 肠 杆 菌 5S rRNA 的 三 级 结构 模型 ,图 3-10 是 其 中 的 一 种 其 特征 是 除了 二 级 结构 形成 的 氢 键 以 外 (与 图 3-8 比较 )， 还 存在 着 4 对 维持 三 级 结构 的 氢 = e 73 。 fe ee 键 (41 一 44 和 74 一 77), 以 使 5S rRNA RRA ERT BIKA 3-10), AP G oocooanmolSsec t 3 the ° SREEEOGES 图 3-10 ABE 5S rRNA 的 三 级 结构 模型 (与 图 3-8 比较 ) 5.8 S rRNA 真 核 生物 核糖 体 大 亚 基 RNA 的 组 成 与 原核 生物 的 最 明显 的 差别 是 含有 5.8S rRNA, 5.88 rRNA 是 在 变性 条 件 下 从 28S rRNA 上 解 离 出 来 的 〈 见 第 五 章 )o。。 已 有 十 多 种 5.8S rRNA 的 一 级 结构 被 测定 了 。 与 5S rRNA 相 比较 ，5.8S rRNA 略 大 些 , 通 常 含 有 160 个 左右 的 核 苷 酸 残 基 ; 分 子 中 含有 修饰 核 萌 酸 (如 中 和 核糖 上 甲 基 化 的 核 背 酸 等 刀 其 一 级 结 构 中 含有 原核 生物 5S rRNA 的 共同 序列 CGAAC 〈 见 图 3-11)。 可 见 它 可 能 是 真 该 生 物 蛋白 质 生 物 合成 时 参与 和 RNA 相互 作用 的 部 位 ， 起 着 原核 生物 5S rRNA 相似 的 功 能 。 不 同 来 源 的 真 核 5.8S rRNA 之 间 的 共同 性 约 为 75 多 。 5.88 rRNA 的 二 级 敌 构 已 有 c Conall 5 > oFfanna0000c¢ 基站 人 AGCAGC GMCS u- AWN 人 4 > ps ° ° 一 二 ODNA > ororccarca-oF Qqeocrrcc 蕊 区 中 口 口 口 虽 DoDo 图 3-11 Novikoff 腹水 瘤 5.8S rRNA 可 能 的 二 级 结构 模型 图 中 特别 标 出 的 *vCGAAC#(103 一 107) 是 可 能 与 tRNA 中 ”GTYCG3? 相互 作用 序列 eo 74 。 lle ER 许多 人 提出 了 许多 可 能 的 模型 ， 但 迄今 没有 定论 。 图 3-1] 显示 的 是 一 种 可 能 的 模型 ,这 个 模型 的 特点 是 含有 一 个 富有 G-C 碱 基 对 的 发 夹 环 \116 一 138)， 一 个 富有 A-U 磊 基 对 的 稳定 性 较 差 的 发 夹 环 (64 一 91) 和 二 个 近似 对 称 的 突起 (分 别 在 15 一 25 和 40 一 44)o 16S rRNA 已 有 几 种 原核 生物 (或 真 核 生 物 细胞 器 ) 的 16S rRNA 的 一 级 结构 被 盖 明 了 ，, 它们 是 大 肠 杆 菌 16S rRNA (1542 KER) SBE IEE ER (Proteus vulgaris) 16S rRNA(1544 AEB) ARR CEuglena gracilis) 时 绿 体 16S rRNA (1491 AERA (Chla- mydomonas reinhardi) 叶绿体 16S rRNA (1475 个 核 苷 酸 ) 等 。 这 些 16S rRNA 中 除 四 种 常见 核 苷 酸 外 ， 还 含有 少量 修饰 核 苷 酸 ， 如 在 大 肠 杆 菌 16S rRNA 中 有 五 种 一 mA、 mG、mC、m'C 和 Gm, AKIN 16S rRNA 具有 相似 的 二 级 结构 ;并 且 发 现 核 糖 体 小 亚 基 rRNA (包括 真 核 18S rRNA， 线 粒 体 12S rRNA) 的 二 级 结构 模式 也 是 类 似 的 《 见 后 面 图 3-13 及 正文 说 明 )。 下 面 以 大 肠 杆 菌 16S rRNA 为 例 简单 介绍 16S rRNA 的 结构 特征 。 图 3-12 是 Noller 和 Woese 提出 的 大 肠 杆 菌 16S rRNA 的 二 级 结构 模型 。 该 模型 有 下 列 特征 : 整个 分 子 被 三 个 分 子 内 的 长 距离 相互 作用 形成 的 螺旋 分 隔 成 4 个 相对 独立 的 部 分 ， 这 就 是 5 末端 区 域 (1，1 一 556) 中 心 区域 CI, 564—916), 3’ 末端 大 区 域 (II,，926 一 1391) #1 3’ 未 端 小 区 域 (IIL，1392 一 1542)o。 在 该 模型 中 约 有 46% 的 碱 基 处 在 螺旋 结构 之 中 (这 与 tRNA 有 50%.5S rRNA 有 45 多 的 双 链 区 数值 是 接近 的 )， 但 用 物理 方法 测 定 则 有 60 一 70% 双 链 结构 。 这 个 差异 表明 ,在 16S rRNA 中 肯定 也 存在 三 级 结构 , 二 级 结构 中 不 配对 区 域 之 间 可 能 包括 非 Watson-Crick 的 相互 作用 。 另 有 证 据说 明 。 5 末端 区 域 和 3 末端 大 区 域 中 的 不 配对 环 至 少 是 部 分 结构 化 了 的 。 在 大 肠 杆菌 16S_ rRNA 中 ， 许 多 螺旋 含有 G-U 对 ， 有 的 《例如 830 一 860) 含有 多 个 G-U 对 。 分 子 中 不 存在 长 的 、 连 续 的 标准 氢 键 对 ， 最 长 的 螺旋 只 有 8 对 。 这 与 16S rRNA 前 体 中 处 于 成 熟 16S rRNA 旁 侧 的 RNase II 剪 切 部 位 有 很 大 区 别 , RAR 17 个 连续 的 标准 碱 基 对 构成 。 在 16S rRNA 分 子 的 一 些 共 区 中 还 出 现 单 碱 基 突 起 ,如 Gs, Ans. Aw 和 Ar ， 至 少 其 中 二 个 (Ga 和 Aw) 被 认为 与 核糖 体 蛋 白质 的 识别 有 关 。 与 tRNA 一 样 , 16S rRNA 也 存在 着 复合 螺旋 结构 , 几 个 (多 至 5 一 6 个 ) 短 的 螺旋 处 在 一 个 复合 螺旋 之 中 ,它们 被 环 所 隔 开 。 在 16S rRNA 中 有 上 帮 处 的 核 背 酸 序列 能 与 多 于 一 处 的 分 子 的 其 余部 分 互补 , 这 种 多 相互 作用 结构 被 称 作 “ 开 关 ” 结 构 ， 例 如 在 3 末端 大 区 域 的 大 环 区 就 存在 这 种 结构 。“ 开 关 ” 结构 的 存在 是 16S rRNA 在 核糖 体 中 进行 蛋白 质 生 物 合成 的 不 同 阶段 上 发 生 构 象 变 化 的 基础 。 但 是 ， 绕 观 整个 16S rRNA 分 子 ， 其 中 并 不 存在 HA HAW, NAPE 样 的 区 域 : 一 个 碱 基 配 对 区 的 一 条 链 处 于 另 一 螺旋 的 两 条 链 之 间 ， 也 即 邻 近 螺旋 的 环 区 并 不 与 另 一 条 链 互 补 。 这 可 能 对 核糖 体 的 装配 有 重要 意义 。 因 为 没有 ` 结 ”的 结构 可 以 避 免 在 核糖 体 装 配 时 产生 中 间 物 同 分 异 构象 物 〈conformers)。 实 际 上 ,已 知 RNA【〈 包 括 5S rRNA, tRNA 和 16S rRNA) 的 结构 都 是 按照 这 个 原则 构成 的 。 假定 核 背 酸 间 的 平均 距离 为 3 人 A, 那么 图 3-12 的 16S rRNA 结构 大 小 为 300 X 450 和 A。 从 小 角度 和 X 射线 衍射 和 电镜 观察 到 ,其 大 小 分 别 为 55 X 200 X 220 AAI 80 x 190 5953 2%, ee ess os Tee mm 4 “ So a ea 5 。 [一 a 要 要 . s ’ sy on. ae Vets et gu" 广博 zw 10° & ms os ore o = > Eb eSeue a2 . _ - < s E BA sAUAC a me 6 全 1 Se west Cs bg OORT a ‘ 多 e 各 和 要 «748 ec 4 ae awe oy rey a s « on 6 =e ros é : be oad ve f 4.¢ G . s 4 a Ones on 70-6 © Cock oo” 2 1 Sseerr — r) fe cs or Ee 86 g¥Acyss CaGsnes 0885 ~ 6 ee ~ % ine i Ld tec eov 5 anu teh ors “er 入 Patt aS uf of. = * 人 uv aS Ae ce 时 x, ae Py ad D3 5= D a 2 UG, 0 YA Gre CG. 6 a: cov west 全 asa SoS Ac. ss get oot: “Cs ws ws <#e 8 0. gas % 6-00 %, bay oY SASS ASRS 名 ”55 5 * % i a ores * v “65 OS ales wre 了 se = Cine “UG 2 " weeks oy” Ae ‘% x he ye gah sate, Zoe am 2% “Sea” ro) We Bes 6. Se eeu Pepaal pa om at", 6 a 6-o *6 vio? ual Gay 二 a ae Py 4! 6-0 fas yyoes «| pe 9A 55 机 一 Rn Ce on = 156 04,8 a f- eos se ares = seo’ eScoa ur = ws cast 从 cde, — 和 . ° et 4s , a are wale a2 re tt is, sMicodtyy So tgeoecutee sg Cok gg ceeteetae - A td - Cae U tA CCUG CC UCCC SAG, 5 “Ne? é Os Aue FeO amu" 96, net pla sp guochevabatasvac © «a * Rev aon “$30 Hers 和 ‘nO Ad ge Re [到 和 了 6-¢ ee a! a 3% 或 全 o:8 Fa apo 人 ; 7 ope sc - 60g cpanugasduchescsectcc® % ~ * wouereré 多 “ch 6 v 上 5- Ce Py co shuts es mou 人 CC 人 3 nee, gee : a ee a 加 | suzac: 3 Se’ 6 Beh aves ‘oat c 80-0 二 ,5A Gar 有 A on 6 ue is 7AA 608 be J ae ate ceu « A we 1 ANSE “eS ae v BS oo 全 中 AAS ate oS. ace “, Scat & “hy 5 eo ¢' Jouuss suf 20-y ms € 70," bed am ck, aulcuce-¢ _ o, HTS Rau gauegsy® mo gente aoe %, Oy St : = " Set es: Se Tad abaceus’ uesnece ates < 全 (76, bx ty ACGUU tee 4 eG 100 vee aah ar ie ee . 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〈4) 先 经 核酸 酶 作用 ， 然 后 分 ° 77 。 离 和 分 析 得 到 的 RNA- 蛋 白质 络 合 物 中 的 RNA FRM SEA is (5) 交 链 分 析 , 即 先 经 紫外 光照 射 或 双 功 能 试剂 处 理 使 分 子 间 发 生 交 链 ， 然后 确定 彼此 交 链 的 蛋白 质 和 RNA 廊 眉 ;(6) 单 链 特异 性 的 试剂 处 理 , 例 如 ， 在 一 个 蛋白 质 结合 到 RNA 链 上 前 后 分 别 二 全 扎 次 基 了 柄 五 处 理 , 分 析 两 者 被 修饰 部 位 的 差异 ,从 而 判断 与 蛋白 质 作用 的 部 位 ;(7) 蛋 日 质 分 子 上 特异 性 的 氨基 酸 被 修饰 后 ,对 RNA 结合 能 力 的 影响 ;《〈8) 突 变型 的 蛋白 质 与 野生 型 的 蛋白 质 结合 RNA 能 力 的 比较 ; (9) 电子 显微镜 观察 RNA 与 蛋白 质 结合 位 点 ;10) 用 超 滤 膜 和 其 他 方法 测定 RNA 与 蛋白 质 的 结合 常数 ; (11) 物 理 技术 .例如 小 角 和 射线 衍射 、 中 子 衍 射 、 气动 力学 分 析 和 圆 二 色 性 测量 等 等 ， 能 够 推测 出 蛋白 质 结 合 到 RNA 链 上 以 后 引起 RNA 分 子 构象 的 变化 ; (12) 天 人 然 核糖 体 蛋白 质 的 董 光 分 光 光 度 研 究 ， 能 给 出 蛋白 质 结合 后 有 关 氨 基 酸 微 环境 的 变化 的 信息 。 综合 以 上 这 些 研究 得 到 的 结 采 见 表 3-5 和 图 3-14。 从 中 可 以 看 出 ;16S rRNA 链 上 的 这 些 结合 位 点 在 结构 上 是 多 种 多 样 的 ,在 长 度 上 也 是 长 短 不 一 的 ,如 S8 和 S15 的 结合 部 位 约 为 40 一 60 个 核 苷 酸 残 基 而 S4 则 大 约 有 500 个 核 苷 酸 残 基 。 表 3-5 大 肠 诗 菌 16S rRNA 的 结构 部 位 与 功能 的 关系 16 SrRNA 上 的 部 位 结合 的 蛋白 质 在 核糖 体 上 的 定位 Of 5 未 端 区 域 25—420 $4, S20 基部 与 核糖 体 上 蛋白 质 结合 5 末端 区 域 420 一 460 S4 基部 与 核糖 体 上 蛋白质 结合 中 心 区 域 560 一 890 $6,S8,S15,$18 平台 亚 基 结 合 3 未 端 大 区 域 920—1400 $7,S9,S10,S13,S19 头 部 与 IRNA 结合 3 末端 小 区 域 1400—1541 S1 和 s2 平台 亚 基 结合 ,起 始 除 与 核糖 体 上 蛋白 质 相 互 作用 外 ，16S rRNA 还 与 参与 蛋白 质 合 成 有 关 的 核 BAR 相互 作用 。168 rRNA 的 3 未 端 区 域 存在 着 一 段 序列 AcCcrccU 是 与 mRNA 的 翻译 起 始 区 相互 补 的 ( 见 第 六 章 ), 这 一 区 域 处 于 核糖 体 308 WASHS 7 GE BER Be ch , By AE SY JP 图 3-14 大 肠 杆菌 16S rRNA 二 级 结构 在 核糖 体 30s 亚 基 上 的 定位 〈 亚 基 模 型 见 第 六 章 ) ° 78 。 Sr ae bas > ” 4KASER—TS5 mRNA 结合 和 密码 子 与 反 密码 子 辨认 的 部 位 。 3 末端 小 区 域 中 二 个 不 配对 的 区 域 有 高 度 的 保守 性 ， 已 有 许多 证 据说 明 它 们 与 核糖 体 50S 亚 基 结合 有 关 。 有 的 tRNA 占据 P 位 时 ,分 子 上 的 反 密 码 子 的 了 末端 核 背 酸 能 与 16S rRNA 通过 紫 外 光照 射 局 效 地 共 价 交 链 在 一 起 。 这 个 交 链 部 位 在 16S rRNA 分 子 的 1390 一 1497,1390 一 1410 是 十 分 保守 的 ,有 可 能 这 就 是 各 种 核糖 体 小 亚 基 rRNA 起 关键 的 和 共同 的 功能 的 部 位 。 这 样 ,密码 子 和 反 密 码 子 相互 作用 点 被 置 于 3 末端 大 小 区 域 之 间 的 连接 部 位 ,而 这 个 位 置 有 人 推测 正好 在 30S 亚 基 电子 显微镜 模型 的 头 部 和 平台 的 连接 部 位 ， 这 就 是 有 可 能 在 该 模型 的 裂 锋 处 ,这 一 点 与 核糖 体 上 和 RNA 有 很 强 的 结合 力 的 蛋白 质 在 该 模型 上 的 位 置 是 一 致 的 (就 是 S2、S3、S10、S1 4 S18、S19 和 S21) ,这 些 蛋白 质 都 环绕 着 裂 锋 区， mRNA 的 结合 部 位 也 在 该 处 。 核糖 体 30S 亚 基 和 50S 亚 基 的 结合 也 有 16S rRNA 人 参与。 核酸 酶 限制 性 水 解 和 化 学 修饰 研究 显示 , 当 与 50S 亚 基 结 合 以 后 ,其 中 心 区 域 的 3 末端 大 区 域 和 3 末端 小 区 域 是 绝 对 地 抗 核酸 酶 和 p- 乙 氧 炭 基 丁 酮 醛 作用 的 。 这 些 结合 部 位 上 存在 着 起 关键 作用 的 G 残 基 。 由 此 看 来 16S rRNA 的 中 心 区 域 、3 未 端 大 区 域 和 小 区 域 在 核糖 体 行使 生物 功能 上 起 着 重要 作用 。 这 些 区 域 的 单 链 区 的 结构 显示 了 种 属 间 的 保守 性 。 18S rRNA 迄今 只 有 三 种 真 核 生物 18S rRNA 的 一 级 结构 被 确定 ,它们 是 通过 测定 基因 的 一 级 结构 并 辅 之 以 RNA 组 成 和 部 分 RNA 序列 分 析 结果 推导 出 来 的 。 前 面 已 经 提 到 , 酵母 18S rRNA 含有 1789 AHR, HAY 25 PHILA ame Bil mincpip、m7G、 mA、msA 和 各 种 .2-=0- 甲 基 核 音 屋 和 许多 假 尿 昔 酸 ; Mss 18S rRNA 含有 1,825 VEE 酸 ,其 中 有 40 个 甲 基 化 核 背 酸 和 许多 假 尿 苦 酸 。 这 两 种 rRNA 的 核 苷 酸 序列 有 70% 以 上 是 相同 的 ， 也 存在 部 分 相同 以 及 完全 不 同 的 区 域 。 几 乎 所 有 甲 基 化 的 修饰 成 分 都 处 在 结构 高 度 保守 的 区 域 。 HHH 18S rRNA 的 一 级 结构 也 进行 了 测定 ; 发现 它们 与 酵母 和 爪 蟾 有 许多 相似 性 ,特别 是 含有 修饰 成 分 的 片段 。 例 如 鼠 18S rRNA 中 的 UAmeACAAG 和 m$Am$ACCUG 片 朋 分 别 存在 于 酵母 和 爪 蟾 的 靠近 3' 末 端 区 域 ; 鼠 中 有 m’GAAU (%,C,) AG, MRA Mesh 45 BI GAAUUCCUAG 和 m7GAAUUCCCAG, JES, AUT HE AA WER 18S rRNA 中 的 修饰 成 分 比 酵 母 多 。 虽然 真 核 生 物 18S rRNA 间 有 很 强 的 保守 人 性 ,但 与 原核 生物 16S rRNA 相 比 ， 除 了 3' 未 端 处 ;二 级 结构 很 少 有 共同 序列 。 图 3-13 比较 了 三 种 不 同 来 源 ( 原 核 \ 真 核 和 真 核 细 胞 器 ) 的 核糖 体 小 亚 基 rRNA 的 二 级 结构 ,发现 它 们 是 非常 保守 的 , 即 分 开 为 几 个 区 域 都 具有 相似 的 二 级 结构 。 看 来 二 级 结构 上 的 保守 区 域 可 能 是 这 类 rRNA 行使 功能 的 关键 部 位 。 23S rRNA 1980 年 Brosius 等 利用 23S rRNA 基因 顺序 测定 方法 推导 出 大 肠 杆 菌 23S rRNA 的 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 ,整个 分 子 含 有 2904 个 核 昔 酸 。 已 经 测定 了 一 级 结构 的 还 有 玉米 叶 绿 体 23S rRNA。1981 年 有 三 家 实验 室 相继 提出 了 大 肠 杆 菌 23S rRNA 的 二 级 结构 模 » For 型 ,其 中 Noller 等 人 提出 的 模型 见 图 3-15。 整 个 分 子 被 许多 长 距离 相互 作用 的 碱 基 对 分 成 相对 独立 的 六 个 部 分 ,其 中 5 末端 与 3 末端 的 一 段 序列 〈8 核 音 酸 ) 互 补 , 构 成 一 个 闭合 环 。 中 心 环 的 四 周 呈 放射 状 。 该 模型 中 约 有 52% 的 核 苷 酸 残 基 处 于 螺旋 结构 之 中 ,螺旋 区 是 不 规则 的 ,大 体 有 下 列 三 种 情况 : 〈1) 由 标准 Watson-Crick 碱 基 对 构成 的 螺旋 ;《〈2) 由 许多 G-U 对 组 成 的 螺旋 ;(3) 含 有 特殊 的 碱 基 对 (如 A-G 对 ) 和 包含 有 碱 基 突起 的 螺 旋 。 从 图 3-15 可 以 看 到 , 像 16S rRNA 一 样 ，23S rRNA 也 不 存在 “ 打 结 ”结构 ， men “开关 ”结构 ,这 些 结构 特征 暗示 或 许 它 们 在 功能 上 是 重要 的 。 23S rRNA 分 子 上 存在 与 RNA、5S rRNA、5.8S rRNA 以 及 叶绿体 4.5S rRNA, 昆虫 2S rRNA 相互 作用 的 位 点 。 如 23S rRNA 有 一 段 顺序 (1984—2001) 与 同 源 的 tRNA 上 的 一 段 顺序 〈《G;*-D:) 互补 ; 靠近 5 末端 的 一 段 12 核 昔 酸 《143 一 154) 与 5S ec ass< 9%, i ws "ay *. “es at ? | ee < 人 ce 和 v 0 ef. < cf. Pic er < ice Fuge 4 ge < Cee OO 2 5 ry foe a’Ecccassauce ecu “cco Ga ra ase “ac GGCEUUUUCEU CEG, cece, aS ag ssf 和 Te M gee beet in ° conte, Le ° wet 的 vte 办 ao? a yr Ge cca’ © cw ‘ ‘6 a , 6 & A vee 《wm [4 a ¥ S46 ee ude soe « te 人 Hag esc x one ¢ my tee ; we 多 o eeu, cm as 4 toe! rea aes ot § ca aie, 5 a f fete aucce ae ae we ee e-c a el . . ev we 和 sue evccuua a Ss Ar acvecss cy Nees ae Ste. 48 tes $25 ev c othe y . 和 8 af : F “4 ca aoe Be, vuscus seeco 6% 6 wee C Ce 650894 6C Ow ces ww . “Eeu-8 youre af? Cuacaay uc tad sf £:& ‘ Paes Se ms sé 5 和 es. 4 vie nace 4 twa be, Fh “ags “nae c c vc < x a ac-e ¢ c cou s 3. et Sec Se es agacacccaste™ AR % 让 tan atic See Gee Se 66eroce 区 GEE Sou Se * accuats 2 Ed 六 a eee © 7S, Ca fd accaus® a a Cou oy Oe at “c%e* 。 ca 6 oo 48 5 Ra = é G4 S Me FC, Se CU ea 5 cc AT co “vccvcc = aceuz OP - a Saga naste® = v a 6 fh acy ee a ta 《2 eaveo-c -6 6 Yoo i s CeGCgu-* < 人 a ‘au 8 WwW s ‘Ua s 5 a 下 -Ce ett, 上 ani oo aaa i baer ua Pon fost eae 1 ta J . a. a S Revie te Se es ys a “+ ofa we Seg acv65 eee tance 6 6。 WE 和 - Cay oe’ ae 50279 eye ut uas $88. S le 8 外 ccc fe 72 ee Yee, ee eee cet ~ e's m 45.~¢ ie A-vU oo7 d ~¢ > © .G 一 C、 一 5~G eNNeC uv 6- vos BOA DP ' u-a 3 eS GTS SOY a or 12 an Ve Se he 人 人 AN A—uU b vv AP ee SS ' 2 G---U 中 uv eS» é SS a Gacdecucaacc® Yacucsucauuccaucc a 8-619 6 a osu 18 ory “© ucasu dtea CAAGGCGGU, A Paes te 人 [ fre No" G ee rT) CaC 一 Gm ctu. ed W” .ee “6-C G 15 »o ' 6-6 é to e SLA ot 19 cc es R U C won 20 CAAGCAACUUCc6ACGGGGuUCEUGAAUGGA 让 ye * JAAGCUGUCEEAGGAcuUAcE Moe™ 0: PARTS -ACRNACAG 党 f4 AA oN ceuaacaeA Gy WE AcSNSeece gua Ag ngs Him ve Gal HON No 4&8 P44 Pag 2, ° in %6 25 Ps eee ‘od s 7) Noo? 所 c uv 过 四 \e? Coe 2 i k or OF ENS - ~, : oy wee J 图 3-19 鸣 菌 体 MS2 RNA 分 子 中 外 壳 蛋 白 基 因 的 二 级 结构 图 〈 从 表示 RNase 三 限制 性 水 解 点 ) 总 长 500 到 5000 核 将 酸 长 度 不 定 300 到 3000 - 100 51250 3031200 5 (帽子 ) tanita y- (mA) CRA) 3° i La TTP ENE a m7G‘ ppp*Nm (Nm) AUG GRE UAA ou : fe a 核糖 体 结合 部 位 3-20 ， 真 核 生 物 mRNA 的 结构 示意 图 -近年 来 由 于 电子 计算 机 在 结构 分 析 中 的 应 用 ;已 推测 出 mRNA HEE — Bee Fal a-2i 35 原核 生物 和 真 核 生 物 mRNA 结构 的 比较 《1) 真 核 生 物 mRNA 有 帽子 结构 ,原核 生物 mRNA 无 帽子 结构 。 真 核 生物 mRNA 5 端 帽子 结构 见 表 3-7 和 图 3-22。 帽子 结构 通常 有 三 种 类 型 (mxGy pppzNp，mrG*pppyNmpNP 和 mrGypppyNmpNmp Np)» tt U2 3-7。 除 真 核 生 物 mRNA 外 ,5" 端 帽子 结构 也 是 高 等 动 植物 病毒 mRNA 所 特有 的 ,有 的 病毒 RNA 具有 特殊 的 帽子 结构 ( 详 见 后 述 )。 这 些 帽 子 结构 都 是 转录 后 早 期 加 上 去 的 ( 见 第 五 章 )。 帽子 结构 对 于 mRNA 的 翻译 活性 是 重要 的 。 它 可 使 mRNA fit 外 切 核 酸 酶 的 降解 « 85 « XBL 818-1726 3-21 SVAOLS ARG mRNA 前 傈 的 三 级 结构 模型 (英文 字母 表示 52 个 环 区 部 位 ) 所 和 mRNA 与 核糖 体 的 结合 包括 翻译 起 始 区 的 辨认 都 是 重要 的 。 呼 肠 孤 病毒 (reovirus) 和 | 水 泡 性 口 炎 病毒 (vesicular stomatitis virus) mRNA 都 有 甲 基 化 的 KT AW, HS 端 甲 基 化 的 mRNA 比 5 端 不 带 甲 基 化 的 在 麦 胚 系统 中 合成 蛋白 质 的 速度 快 得 多 。 如 果 用 化 学 方法 除去 mG， 病 毒 RNA 和 免 珠 蛋白 mRNA 的 绝 大 部 分 模板 活性 就 消失 了 。 5“ 端 帽子 结构 与 蛋白 质 翻译 的 起 始 有 关 。 无 mG 的 呼 肠 孤 病毒 不 能 与 40S WHE 成 复合 物 , 而 有 mG 的 则 能 形成 。 合 成 的 有 WG 的 短 的 寡 聚 核 苷 酸 也 能 与 408 WEB 成 复合 物 。m?G 可 能 是 侣 成 蛋白 质 起 始 的 辨认 信号 的 一 部 分 ， 如 小 鸡 卵 白 蛋白 mRNA, 其 5 末端 的 帽子 结构 附近 区 域 能 形成 发 夹 结 构 , 见 图 3-23。 这 样 的 结构 使 5 端 帽子 结构 与 蛋白 质 合 成 的 起 始 密码 子 在 空间 上 靠近 了 ,这 种 5" 端 附近 的 发 夹 结构 在 其 他 真 核 mRNA 上 也 有 ;因此 有 人 推测 帽子 结构 与 蛋白 质 合成 的 启动 有 关 。 (2) 真 核 生 物 mRNA 一 般 都 有 HREM. We 3-6 和 图 3-20。 它 是 转录 后 早 期 由 腺 苷 酸 聚 合 酶 催化 加 上 的 ( 见 第 五 章 )。 其 长 度 一 般 为 20 一 200 KER, BH 究 发 现 ,组 蛋白 mRNA 和 真 核 生 物 病毒 'RNA 无 聚 腺 苷 酸 ,但 近年 来 的 研究 已 证 实 , 组 蛋 A mRNA 也 有 聚 腺 苷 酸 结构 ,如 两 栖 类 卵 母 细胞 组 蛋白 HS 的 mRNA ARR CR 0 CHs ce N+ HN | 人 > O 0 90 N kraiyy-0-P-0-P-0-P-07 0. 31 9 0- 90- 0- kK O O(CH;) ve Tay B _ O 2 9- 可 @ DCHy) OF p-O:--s« 1 人 ~ 图 3-22” 真 核 生 物 mRNA 5' 端 帽子 结构 通 式 © 86 « > > 3-6); 植物 病毒 如 大 麦 条 纹 花 叶 病毒 mRNA 等 也 发 现 有 3 端 聚 腺 苷 酸 。 原 核 生 物 mRNA 二 般 没有 或 仅 有 很 短 (DF 10 个 ) 聚 腺 昔 酸 结构 。 目 前 一 般 认 为 聚 腺 昔 酸 对 于 -mRNA 的 翻译 功能 并 非 必须 , 如 小 鼠 工 细胞 mRNA， 除 去 其 3 端 聚 腺 昔 酸 并 不 影响 它 的 翻译 活性 。 另 外 , 珠 蛋 白 mRNA 和 除去 聚 腺 昔 酸 的 珠 蛋 白 mRNA, 两 者 起 初 有 相 同 的 翻译 活性 , 但 是 全 部 除去 聚 腺 背 酸 的 mRNA en gay Ma G a AUG 和 少 于 20 个 腺 背 酸 残 基 的 mRNA 其 活性 很 快 就 起 妓 密码 子 降低 了 。 这 些 实验 表明 mRNA 的 降解 与 聚 腺 苷 ”图 3-23 真 核 mRNA SHEAR 酸 的 存在 与 否 以 及 其 长 度 有 关 。 但 是 聚 腺 苷 酸 是 如 何 影响 mRNA 降解 的 目前 还 不 清楚 。 Hob ARR mRNA 顺利 通过 核 模 进入 细胞 浆 的 过 程 有 关 ; BA ADA 表 3-7 细胞 内 mRNA 5' 端 结构 和 甲 基 化 核 昔 mRNA | 5 末端 结构 分 子 中 间 甲 基 化 核 背 > GrFcacnongns HB2eararOooacd o (0 Rar, 4 ® m’G” ppp” N’mpNp, m’G” ppp” N’mpN’’mp m°A HeLa 细胞 (N’m = m6Am,Am,Gm,Um,Cm Nm = Gm,Um,Cm) )\R 5 ee m’G” ppp” NmpNps m’G” ppp” NmpNmp m*A(1.8m*A:1m’G) 大 鼠 肝 细胞 瘤 m’G” ppp” NmpNp; m’G” ppp” NmpNmpNp| ”msA(3msA:lm7G) (Nm = Am,Gm,Um,Cm) & (BHK-21) m’G”’ ppp” Nmp ' m*A,m’°C (Nm = Gm,m*Am,Um,Gm) (1.$m*%A:1m’G) 海 是 m’G” ppp’ N 未 知 7G?’ vN 粘 霉菌 ee 无 m*A (N = A,G,Gm) 酵 Et m’G” ppp” Ap (73%) x m’G” ppp’ Gp (25%) 丝 心 蛋 白 m’G” ppp” AmpUmpCp | m*°A REA m’G™ ppp” Nmp FE mA BREA xX’ ppp” NmpNp, X” ppp” NmpNmpNp Fi 小 鼠 免 疫 球 蛋白 轻 链 m’G” ppp” N 组 蛋白 m’G”*’ ppp’ N 与 病毒 的 侵 染 性 有 关 。 (3) mRNA 分 子 的 编码 区 一 一 是 所 有 mRNA 分 子 的 主要 结构 部 分 ; 该 区 域 编码 特 定 蛋白 质 分子 。 迄 今 为 止 ,大 量 的 材料 证 明 除 某 些 已 知 线粒体 外 ;三 联 体 密码 子 在 所 有 的 生物 中 是 通用 的 ,密码 字典 是 正确 的 。 编 码 过程 和 密码 子 的 使 用 情况 详 见 第 六 ,七 两 章 。 (4) mRNA 中 的 非 编码 区 一 一 无 论 原 核 或 真 核 生 物 mRNA 都 存在 5 端 和 3 端的 两 个 非 编码 区 。 由 间隔 区 转录 得 到 的 非 编码 区 广泛 存在 于 原核 生物 mRNA He EME = 太志 fk MS2 和 R17 RNA 的 5 未 端 非 编 码 区 129 个 核 苷 酸 中 有 三 个 AUG 和 一 个 GUG ,但 它们 都 不 起 起 始 密码 子 的 作用 ; 在 噬菌体 RI17 RNA 的 外 壳 蛋 白 和 复制 酶 基因 之 间 还 存 在 相 邻 的 终止 密码 子 UAA 和 UAG (AZ 3-24), 这 种 现象 可 能 是 噬菌体 RNA 为 了 防止 密码 子 读 过 头 而 设置 的 一 种 重复 终止 信号 ;可 以 保证 蛋白 质 合成 的 准确 终 上 。 124 129 : Ala Asn Ser Gly Te Tyr fMet Ser Lys Thr Thr Lys GA AAC UCC GGU AUC UAC UAA UAG i CCG GCC AUU CAA ACA UGA GGA UUACCC AUG UCG AAG ACA ACA AAG C [加 oF Se es MS? RNA ie ee SL i 3-24 R17 RNA 外 壳 蛋 白 和 复制 酶 基因 之 间 间 隔 区 的 结构 MEK RNA 的 非 编 码 区 在 结构 上 比 其 他 区 域 更 为 保守 。QpRNA 的 3 端 非 编 码 区 改变 一 个 核 苷 酸 就 会 形 失 活性 。 前 面 已 经 讲 到 原核 生物 mRNA 编码 区 的 前 端 及 非 编码 区 的 一 部 分 是 与 核糖 体 结合 的 部 位 ， 图 3-25 显示 R17 RNA 的 复制 酶 基因 起 始 区 和 间 局 区 的 一 部 分 形成 一 个 发 夹 结构 ,这 一 部 位 正 是 与 核糖 体 的 结合 点 。 io) & > > 中 本- U U Ue Aly A A c*G|x in Gec GeC AeuU A UeG GeC Gec UeAdA Git A 。U | 起 始 密码 子 case Ces Cele AeU 5” see CAAACU CCAUUC'K A CGreemmest 图 3-25 RI7 RNA 中 外 壳 蛋 白 和 复制 酶 基因 之 间 间 隔 区 的 二 级 结构 大 肠 杆 菌 色 氮 酸 操 纵 子 mRNA 的 trpB 蛋白 和 trpA 蛋白 编码 区 之 间 的 间隔 区 只 ARR (UG), rp A 蛋白 的 起 始 密码 子 是 _AUG ， 这 样 就 形成 UGAUG 序列 ;前 三 个 核 音 酸 UGA 起 终止 密码 子 的 作用 ,后 三 个 核 背 酸 AUC 起 起 始 密码 子 的 作用 ， 这 种 前 后 一 个 密码 子 共用 一 个 核 苷 酸 的 现象 是 原核 生物 使 用 密码 的 一 个 特 喜 。 某 些 mRNA 的 间隔 区 存在 着 从 DNA 模板 上 调控 区 域 转录 下 来 的 序列 ， 如 大 肠 杆 菌 色 氮 酸 操 纵 子 mRNA 的 > 端 非 编码 区 存在 着 一 段 序列 是 从 所 谓 的 衰减 子 上 转录 下 来 的 ,该 < 衰减 RNAz 的 3 端 是 CUUUUUUUaa， 这 个 结构 十 分 相似 于 在 几 个 大 肠 杆菌 小 分 子 RNA ,和 它 的 噬菌体 中 发 现 的 序列 UUUUUUAoa 和 CUUUUU one 这 些 序列 被 认为 是 转录 终止 信号 的 一 部 分 ( 见 第 五 章 )。 真 核 人 生物 mRNA 的 3 端 非 编 码 区 有 一 段 共同 序列 4AAUAAA， 这 可 能 是 蛋白 质 翻 译 终 目的 协同 信号 ,也 可 能 与 mRNA 的 转录 终止 有 关 。 在 某 些 真 核 生物 mRNA AYES es 88 e 码 区 还 发 现 有 msA 和 mC 等 修饰 核 昔 酸 ,其 确切 的 功能 还 不 请 楚 。 动 植物 病毒 RNA 病毒 RNA 包括 鸣 菌 体 RNA， 植 物 病毒 RNA, 部 分 动物 病毒 (RNA 肿瘤 病毒 ) RNA， 类 病毒 RNA 及 由 病毒 感染 寄主 后 产生 的 小 分 子 RNA So 关于 病毒 RNA 的 详细 知识 可 参看 第 八 章 。 叭 菌 体 RNA 前 面 也 已 作 了 简略 介绍 。 高 等 动 植物 病毒 "RNA 的 结构 类 似 于 真 核 生 物 的 mRNA， 即 一 般 由 5 端 帽子 结构 ( 表 3-8)，5 端 非 编 码 区 ， 编 XK, 34 端 非 编 码 区 和 3" 端 聚 腺 苷 酸 构成 。 但 有 的 没有 5 端 帽子 结构 或 3 端 聚 腺 音 酸 。 一 些 植物 病毒 RNA 有 类 似 tRNA 结构 的 3 端 , 并 能 接受 氨基 酸 ( 详 见 第 八 章 )。 与 真 核 生 物 mRNA 一 样 ,高 等 动 植物 病毒 mRNA 也 是 单 顺 反 子 结构 的 ,一 般 讲 ,一 个 真 核 病毒 mRNA 先 被 翻译 成 一 个 大 的 蛋白 质 ， 然 后 再 被 裂解 成 几 个 较 小 的 具有 生物 活性 的 蛋 日 质 。 表 3-8 动 植物 病毒 RNA 的 5 端 和 中 间 甲 基 化 的 核 昔 RNA 5” 端 帽 子 结 构 中 间 甲 基 化 核 昔 细胞 质 多 角 体 病毒 mRNA m’G” ppp” AmpGp % IF Mii mRNA m'G” ppp’ GmpCpUp a 牛痘 病毒 mRNAs m’G*’ ppp” GmpNp 和 无 m’G” ppp” AmpNp 水 泡 性 口 炎 病毒 mRNA m'G* ppp” AmpAp 和 + m’G” ppp” AmpAmp Sindbis 79% “26S” mRNA mG7 ppp* Np #%m’G” ppp” Ap m’C(E mSA) 劳 氏 肉瘤 病毒 35$ 病毒 RNA m’G”* ppp’ GmpCp ey AMR RNA wy m’G” ppp” GmpCp m*A SV40 mRNA m’G* ppp’ Amp A#lm’G” ppp’ Gmp S mA 腺 病毒 mRNA m’G” ppp” m' Amp msA Brome mosaic 病毒 RNA4 m’G”’ ppp” GpU : = 黄瓜 花 叶 病毒 m7G ppp” Np 4 烟草 花 叶 病毒 m’G* ppp” Gp ca BwmiEH (Alfalfa mosaic) 病毒 RNA m"G ppp’ Gp Srey AFB GK ARIA RNA 一 个 22 个 氨基 酸 的 多 肽 KA GRIR RIA (poliovirus) RNA 〈 人 参阅 第 八 章 ) 是 第 一 个 被 测定 了 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 的 病毒 RNA， 由 7,433 RRM, 具有 典型 的 高 等 动 植物 病毒 mRNA 的 特点 。 它 具有 一 个 特殊 的 通过 5 端 磷酸 根 与 一 个 小 蛋白 共 价 相连 接 的 5 端 (不 同 于 前 面 所 述 的 含 m'G 的 帽子 结构 )， 随 后 依次 是 5 端 非 编码 区 (740 个 核 昔 酸 )， 编 码 区 (6,621 个 核 背 酸 )，3 端 非 编码 区 (72 RRR) 和 3' 端 聚 腺 背 酸 。 A ARIK RAIA RNA 的 特殊 5 端 见 图 3-26, 它 含 一 条 由 22 个 氨基 酸 构 成 的 肽 链 ,通过 酷 氨 酸 上 的 羟基 与 其 5 端 朱 苷 酸 上 的 磷酸 共 价 相连 接 。 这 个 肽 段 是 由 病毒 RNA 本 身 编码 的 ( 见 表 3-9)s 该 病毒 的 es。 89 « *NHs Gly uAc , 20-6 C M 5 O "y ae f E GC ? ody! 66-30 | “ire Oot -Cha UA a 他 Ke . UA : Tyr "Ta 0 OH 10 ae: Gly p-UAAAACA’ ecageueeceecuheuAcucceeyAUueceeuAGcCUUGUaceccuem al 60 70 80 1 Pro-Asn ~63-G3)- Pro~ Asn~Val=Pro~Thr=Tle ~Grg- Thr Ata Cys) Val~Gin-CODs; 10 20 3-26 AABRA BRIGG RNA 了 端的 结构 (为 RNase III 裂解 点 片段 ) 5 端 非 编 码 区 构成 一 个 发 夹 结构 (由 9 一 36 核 昔 酸 构成 )， 这 个 区 域 与 调节 和 辨认 的 功能 有 关 。 而 其 蛋白 质 末 端 可 能 与 RNA 合成 的 起 始 有 关 。 虽然 RNA 上 结构 基因 的 翻译 起 始 于 大 的 阅读 框架 (其 起 始 密码 子 的 位 置 在 741)， 但 在 741 的 前 面 , 即 5 端 非 编码 区 ， 多 次 出 现 不 作 起 始 信号 的 AUG， 如 位 于 185, 237, 276, 318, 376, 387, 455 和 584。 这 # AUG 是 潜在 的 起 始点 ,有 的 后 面 紧 跟着 终止 信号 ; 其 中 185, 376 和 584 分 别 可 以 作 为 起 始 信号 而 合成 分 子 量 为 4725，8,425 和 7,187 的 三 个 肽 段 , 这 些 潜 在 的 编码 序列 的 意 MIB FE 0 23-9 FRKAARRSSARHER ZA ih alii : 分 子 量 电荷 病毒 肽 的 编码 区 741 一 7361 246530 +44 SS |S ES | Pl-la 744—3380 97247 +12 VP0 744—1760 37352 +3 | | vP4 744—947 7385 +2 一 | 一 一 | 一 -一 | 一 -一 | 一 一 VP2 948 一 1760 29985 rl a eee VP3 1761—2474 26410 0 一 | 一 | 一 | 一 | VPI 2475—3380 33521 +9 —— ee | EEE P2—3b 3381—5105 64953 +16 | 一 | 一 | 一 | 一 一 P2—5b 3828—5105 48273 +15 — ———— ee 一 P2—X 4119—5105 37555 +15 P3—1b 5106—7361 84234 +16 ee SECS Ls 一 VPg* 5367—5432 2354 +4 一 一 | 一 | 一 | 一 | 一 一 P3—2 5433—7361 72132 +11 P3—4b 5979—7361 52481 +6 B3——7¢ 5433—5978 19669 +5 * 为 病毒 RNA 了 端 连接 的 小 蛋白 〈22 肽 )。 « 90 « 编码 区 是 由 2207 个 连续 的 三 联 体 密码 子 共 6621 个 核 彰 酸 构成 , 占 整个 病毒 分 子 核 苷 酸 数目 的 89 匈 , 被 翻译 产生 一 个 大 蛋白 ， 然 后 裂解 成 有 生物 功能 的 KE CWA 3-9)。 有 裂解 点 通常 位 于 谷 氨 酰 胺 和 甘 氢 ， 酸 的 连接 处 。 其 翻译 终止 信号 是 由 连续 的 二 个 终止 密码 子 构成 的 (UAG 和 UAA)。 3 端 非 编 码 区 由 72 SERA, 缺乏 在 真 核 生物 mRNA 中 存在 的 AAUAAA 顺序 。 这 个 六 核 昔 酸 的 缺乏 说 明 该 病毒 RNA 的 聚 腺 背 酸 是 由 病毒 负 链 RNA 的 5 端 聚 尿 昔 酸 转录 产生 的 。 该 病毒 RNA 的 聚 腺 彰 酸 长 度 不 是 均一 的 ， 其 平均 链 长 为 60. FARA WHE SHH RNA 合成 的 起 始 有 关 。 ShikRRAS RNA 核 背 酸 顺 序 是 用 测定 其 cDNA 顺序 的 方法 推测 得 到 的 。 最 近 报 道 用 同样 方 法 也 测 出 了 烟草 花 叶 病毒 RNA 的 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 。 类 病毒 RNA 类 病毒 是 一 类 高 等 植物 的 病原 体 ,通常 由 200 一 400 KEM, 分 子 量 约 12 万 ,已 经 发 现 的 类 病毒 有 十 多 种 。 关于 类 病毒 的 一 般 知识 详 见 第 八 章 ， 这 里 就 类 病毒 的 结构 简介 如 下 : Diener 等 人 1967 年 发 现 马 ” 铃 暮 块 荟 纺 锤 状 病 的 病原 体 是 一 种 无 蛋白 外 壳 的 裸 露 的 RNA 分 子 (其 沉降 系数 为 10S)。 这 种 低 分 子 量 的 RNA 一 旦 进入 宿主 细胞 ， 便 在 其 中 复制 。Diener 称 这 种 具有 感染 活性 的 RNA 为 类 病毒 。 电 子 显 微 镜 观 察 马铃薯 块 苓 纺锤 状 病 类 病毒 (PSTV), 其 分 子 平均 长 度 为 50nm, 具有 近似 DNA 宽度 (20A) 的 棒状 结构 。 在 变性 条 件 下 ， 电 镜 观察 到 的 类 病毒 呈 现 网 球拍 状 ， 有 人 缺口 的 单 链 环 状 分 子 。 多 核 昔 酸 激 酶 在 [7-?P]-ATP 存在 时 不 能 标记 天 然 PSTV， 高 碘 酸 氧化 PSTV 的 实验 表明 它 没有 游离 的 3' 端 邻 位 羟基 。 这 些 结果 说 明 类 病毒 是 单 链 环 状 的 RNA 分 子 。1978 年 Gross 小 组 报道 了 由 359 个 核 背 酸 构 成 的 PSTV 的 一 级 结构 ( 见 图 3-27)。 这 个 结果 证 实 了 PSTV 是 一 个 单 链 环 状 分 子 。 整 个 分 子 具 有 高 度 的 二 级 结构 ,359 个 核 昔 酸 中 约 有 244 个 核 昔 酸 处 ‘@ U U c ¢ WwW ume@ ¢@ CG AGGA cCCG GAAA accouY PE CTEEOTE OPEL OTUEDE CUED UE GOt CE OOEE Ot one teen Gee anes GuGGGC CuUuu ucccA 半 uu cw @ A cc Goo" 6 C CA A c CAC GG CGCCCGC wuccu A c ® H , / é AC t guvucc ccccucc GGC AAAGG GGUGGGG GUG c oMAay aC. APA TC GGAGCGA U GG CUUCGCU GUCG peel U_.U ’ 1 1 ' 1 1 ‘ ’ ! UCCCCGGG Pibdetie AGG GGCCC hay G GG CUCG GGAG CUUCAG GAGCCCUC GAAGUC AA c°G =6GA OCG AA Aa tittl uu A G UA CE GAGC AGA AGAAAAA C oo a 4 peer eed bbb UGUGGG 6GGG UUCG UCU JU Age s co) ry “Gouu A pede oben 6 , CCG G uye U uc6uccuugc a U AAC 相生 和 区 县 和 cf VUGGUUGACGCCAAG a 已 6AAC G)-c @" BL - ’ eo? of UCU UJUUUC CC OY e Tae e 91 e 图 3-27“ 马 铃 暮 块茎 纺锤 状 病 类 病毒 (PSTV) 的 结构 在 碱 基 配 对 之 中 《〈 占 68 多 )， 分 子 像 一 根 僵 直 的 棒 。 在 整个 序列 中 没有 发 现 真 核 生 物 mRNA 通常 使 用 的 起 始 密码 子 AUG, 但 GUG 却 有 七 处 。 终 止 密码 子 CUAA, UAG 和 UGA) 有 六 处 。 类 病毒 分 子 如 此 之 小 ， 以 至 于 所 带 的 信息 量 仅 够 编码 一 个 蛋白 质 。 它 进 人 寄主 以 后 如 何 复制 自己 ， 如 何 干 扰 寄主 的 正常 复制 机 制 ， 它 本 身 的 结构 的 生物 学 意义 是 什么 ， 感 染 活性 的 结构 基础 又 是 什么 ” 所 有 这 些 都 有 待 于 进一步 探讨 。 阁 今 已 经 测定 TRB RAS BA EEA. HS A, HB Cadang Cadang Jy A 等 的 类 病毒 , 它们 都 是 单 链 环 状 的 RNA 分 子 ， 其 结构 特征 与 PSTV 相同 。 =, RNA 结构 研究 有 关 的 工具 酶 核酸 一 级 结构 研究 的 发 展 历史 说 明 , 无 论 是 RNA 还 是 DNA 的 一 级 结构 的 阐明 都 离 不 开 巧 妙 地 使 用 各 种 工具 酶 。 六 十 年 代 RNA 一 级 结构 研究 所 以 取得 飞 婚 发 展 ， 重 要 条 件 之 一 是 许多 作用 于 RNA 的 工具 酶 的 相继 提纯 和 它们 的 专 一 性 的 阐明 。 一 些 重要 工 具 酶 ,例如 牛 胰 核糖 核酸 酶 (RNase A). RRS T (RNase Tu) 及 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 等 的 专 一 性 物理 化 学 性 质 和 化 学 结构 等 都 已 作 了 详细 的 研究 。 七 十 年 代 以 来 ， DNA 一 级 结构 研究 的 突破 在 很 大 程度 上 也 取决 于 大 量 有 序列 特异 性 的 限制 性 内 切 酶 的 发 现 、 提 纯 和 实际 应 用 ( 详 见 第 二 章 )e 因 而 工具 酶 的 研究 是 核酸 结构 研究 不 可 缺少 的 一 个 重要 方面 下 面 就 已 用 于 RNA 结构 分 析 的 一 些 比较 重要 的 工具 酶 作 一 简要 介绍 ( 见 表 3-10) ,内容 主要 涉及 与 结构 分 析 有 关 的 一 些 问题 。 核糖 核酸 酶 (RNase) RNase 是 一 类 水 解 RNA 的 酶 的 通称 ， 它 们 广泛 存在 于 所 有 的 动 、 植 物 和 微生物 之 中 。 目前 已 用 于 结构 研究 的 有 RNase A, RNase T,, RNase U2, RNase Phy M 及 RNase T: 等 。 根 据 水 解 专 一 性 ，RNase 可 以 分 为 碱 基 特 异性 的 RNase 和 非特 异性 的 RNasee 上 . 面 提 及 的 前 四 种 为 碱 基 特 异性 的 RNase， 后 一 种 为 非特 异性 的 。 RNase A RNase A 是 具有 碱 基 特 异性 的 RNase， 它 专 一 性 地 水 解 RNA 链 中 的 Me eK Ae Be PoE 3 喀 啶 核 苷 酸 和 以 3 端 为 喀 啶 核 苷 酸 的 寡 核 背 酸 。 它 水 解 胞 喀 啶 核 苷 酸 键 的 速度 大 于 尿 喀 了 喧 核 苷 酸 键 的 速度 。 也 水 解 许多 碱 基 上 被 修饰 的 喀 啶 核 背 酸 〈 见 表 11)。 有 人 曾 提 出 RNase A 的 作用 机 制 , 认 为 该 酶 对 水 解 部 位 的 主要 要 求 是 : (1 喀 WE TRAY C, 为 氧 等 负电 性 原子 ;(2) Ni 必须 有 氢 质 子 。 为 了 进一步 提高 RNase A 的 碱 基 专 一 性 有 人 使 其 肽 链 第 41 位 上 的 赖 氨 酸 凑 甲 基 化 形成 羧 甲 基 RNase A (CM RNase A)， 羧 甲 基 RNase A 在 适当 条 件 下 只 水 解 胞 喀 啶 ARERR (—-CpA—) Zi Rete MRAM BER (—UpA—) 之 间 的 磷酸 二 酯 键 ; 对 一 CpG 一 和 一 UpG 一 的 水 解 极 慢 ,而 对 两 个 喀 啶 核 背 酸 之 间 的 磷酸 二 酯 键 则 不 能 水 解 。 RNase A 的 水 解 专 一 性 不 是 绝对 的 , 当 它 在 高 酶 浓度 时 也 水 解 聚 腺 ER. AE 3 腺 Bo RNase T, — EAE — OK CE IS. A BEY SE BE 地 裂解 RNA 产生 27 DAMA 3 ' 端 为 岛 苷 酸 的 寡 核 苷 酸 。 该 酶 也 能 水 解 肌 苷 酸 (IP) 和 部 w 92 本 二 7 表 3-10 常用 工具 酶 及 其 性 质 * 名 称 底 DB 产 物 RNase T, —GpN— Gp, —Gp RNase A —PypN—< Pyp, —Pyp RNase U, —PupN— Pup, —rap RNase T: NN Np RNase Phy I —ApN—,—GpN— Ap,—Ap,Gp,—Gp 一 UPN 一 ?一 CPN 一 Up, 一 Up， 极 慢 产生 C>PAI-C>P RNase Phy M 同 Bl is fal as CBR rile BE RK (Up,—Up,Ap,—Ap) —ApN—, —UpN—) RNase M —NpN— Np 核酸 酶 P, DNA、RNA pN BEB M DNA,RNA Np RAS S, 单 链 DNA 或 RNA pN we ae RE — BRS RNA,DNA pN 和 牛 脾 磷 酸 二 酯 酶 RNA,DNA Np PNPase Pi 十 一 NPN 一 ppN** 磷酸 单 酯 酶 pNpNp 2Pi+NpN SRERES ATP+ yoNpN— pNpN— + ADP * Py, Pu PAIRRSEKEASLEAE. NEARER. ** PNPase 为 多 核 背 酸 磷 化 酶 , 它 磷 酸 解 RNA SAHRATOPALA_-BE-ARR—RBE_AE, 分 碱 基 上 被 修饰 的 鸟 背 酸 键 ( 见 表 3-11), 其 中 水 解 miGp 键 的 产物 是 2 、3 - 环 化 的 miGp (miG > P). 有 人 提出 RNase Ti 对 底 物 的 要 求 是 叮 叭 环 6 位 上 的 酮 基 和 7 位 上 的 三 价 氮 原 子 。 当 N-1 存在 有 一 个 质子 时 ,将 更 易 受 酶 的 攻击 。 因 此 这 些 位 点 被 认为 是 酶 的 专 一 性 结合 点 。 这 个 假说 可 以 解释 能 被 RNase T, 水 解 的 许多 修饰 核 背 酸 , 但 I-A SEALER 〈mllp) 键 不 能 被 酶 解 是 个 例外 。 表 3-11 RNase A 和 RNase T, 的 专 一 性 名 称 水 解 RNA 后 产生 的 核 苷 酸 不 能 水 解 的 核 苷 酸 键 Cp,Up,m’Cp,ac*Cp,s?Cp, m’Up(Tp), m®°CpN,m*UpN, ncp*UpN RNase A cmo’Up,mnm/’s?Up,m’S*Up,s*Up,Dp, ; op RNase T, Gp,Ip,.Xp,m'Gp,m’?Gp,m3Gp m’GpN,m'IpN, QpN, WpN * 符号 和 结构 分 别 见 第 一 章 和 附录 一 。 RNase U 该 酶 是 从 一 种 黑 粉 菌 〈《Tszlago sphacrogena) 的 培养 液 中 提取 的 一 种 对 RRR HY RNaseo 其 水 解 专 一 性 正好 与 RNase A 互补 ,但 产物 往往 是 2，3 ° 93 6 一 一 一 环 状 的 叮 叭 核 苷 酸 ,与 RNase T, FELLER, RNase U, 的 水 解 专 一 性 不 是 绝对 的 ， 其 水 解 二 核 萌 一 磷酸 的 速度 依次 是 A 一 N > G 一 N >C-N>U—-N, 在 结构 分 析 中 使 用 该 酶 时 常常 先 将 RNA 分 子 上 的 鸟 叮 叭 碱 基 用 特异 性 的 化 学 试剂 (例如 水 溶性 碳 二 亚 胺 等 ) 化 Sin, tia SAMBA RNase U, 的 攻击 。 这 样 RNase U, 只 水 解 RNA 链 上 的 腺 苷 酸 键 。 除 A 和 G 外 ,该 酶 还 能 水 解 I 和 VAAN BE ZK AR EX, PA, msiAytA、mIG 和 mG Seiko Re. RNase T, 与 RNase T, —##, RNase T, 也 是 从 米 逆 中 制 得 的 一 种 RNase, Ait 这 是 一 种 非特 异性 的 RNaseo 它 水 解 RNA 的 最 适 pH 在 4.5, 水 解 各 种 2 ，3' 环 状 核 背 酸 的 最 适 pH 在 6.0 一 6.3; 水 解 腺 苷 酸 键 的 速度 最 快 ,2 ，3“ 环 状 腺 苷 酸 几乎 不 积累 ,显示 腺 苷 酸 特异 性 内 切 酶 的 性 质 。 水 解 各 核 背 酸 键 的 速度 依次 是 A>U>GSC, 它 能 水 解 所 有 的 修饰 核 背 酸 键 , 包 括 RNase T, 和 U: 不 能 水 解 的 m’G 等 ,但 不 能 水 解 CMC-G 和 CMC-U (〈CMC- 为 水 溶性 碳 二 亚 胺 修饰 基 团 ) 以 及 所 有 的 2 -0- 甲 基 化 的 核 苷 酸 键 。 净 物 分 子 的 构 型 对 RNase T, 的 作用 是 敏感 的 , 在 水 咨 液 中 的 聚 腺 昔 酸 与 RNA 分 子 上 的 腺 彰 酸 比较 是 抗 RNase T, 的 ,但 在 40 多 甲醇 中 对 聚 腺 苷 酸 的 水 解 速度 明显 加 快 ， 可 见 具 有 高 级 结构 的 RNA 分 子 是 抗 RNase T, 的 。 RNase Phy | [多 头 统 孢 菌 核糖 核酸 酶 I] ， 这 是 一 个 特异 性 不 强 的 RNase， 它 能 很 快 地 水 解 聚 尿 背 酸 和 聚 腺 苷 酸 , 产 生 2 ，3 环 状 单 核 背 酸 ， 然 后 很 慢 地 水 解 环 状 单 核 背 酸 成 为 3 核 萌 酸 ; 它 水 解 聚 胞 苷 酸 的 速度 极 慢 ， 且 产物 为 2，3 环 状 胞 苷 酸 。 除 CPN 以 外 所 有 的 二 核 背 酸 均 能 很 快 地 被 该 酶 水 解 。 由 于 它 水 解 胞 背 酸 键 的 速度 特别 慢 ， 人 们 已 将 它 在 结构 分 析 中 与 RNase A 相配 合 使 用 以 区 分 两 个 喀 啶 核 苷 酸 C 和 癌 ( 见 第 101 页 入 RNase phy M (多 头 线 孢 菌 核糖 核酸 酶 M) ”该 酶 的 性 质 与 RNase phy I 在 通 常 酶 解 条 件 下 完全 一 样 , 即 其 水 解 二 核 背 一 磷酸 的 速度 次 序 如 下 :UPN > APN > GpN > CpN; NpA > NPC > NPG > NPU。 因 此 UpC, UpA, ApA 和 ApC 最 易 水 解 ， 而 CpU, CpC 最 不 易 水 解 。 但 在 限制 性 条 件 下 (7M 尿素 ,50"C2，pH 5.0) 该 酶 只 水 解 UpN 和 ApNo 因而 较 之 RNase Phy 1 RAAF RNA 序列 分 析 ( 图 3-33)e -< RNase M ZS — MAB (Aspergillus saito) 中 提取 的 非特 异性 RNase, 7K 解 RNA HEMKARARHREND KE AD>U>CSG, Ris pH 是 4.0， 其 活性 能 被 二 价 铀 离子 和 二 价 锌 离子 所 抑制 。 其 他 RNase 用 于 RNA 结构 分 析 的 RNase 还 有 RNase U,, BS RNase( 枯 草 杆 菌 RNase) 和 RNase N, (40 ##79% RNase) 等 。RNase U, 的 性 质 与 RNase T， 极 相 似 ;, 是 鸟 味 叭 特异 性 的 RNase， 其 最 适 pH 在 8.0—8.5, 可 代替 RNase T, 用 于 RNA 的 结构 分 析 。RNase N, 的 水 解 专 一 性 与 T 和 WU 相似 ,但 它 的 转 磷酸 活性 比 水 解 活性 大 得 多 ， 水 解 产物 往往 是 鸟 味 叭 2 ，3' 环 状 核 苷 酸 ， 延 长 水 解 时间 也 可 以 产生 3 SER. BS RNase 是 一 种 非特 异性 的 RNase， 它 水 解 RNA 的 产物 往往 是 2…，3“ 环 状 核 苷 酸 。 核酸 酶 (Nuclease) 这 是 一 类 既 能 水 解 RNA 也 能 水 解 DNA 的 酶 ， 其 水 解 特 性 类 似 于 磷酸 二 酯 酶 , 产 物 通 常 为 单 核 苷 酸 。 这 类 酶 已 被 用 于 结构 分 析 的 有 核酸 酶 P、 核 酸 酶 M 和 核酸 酶 Sio 核酸 酶 PR， 核酸 酶 P, 是 从 桔 青 霉 (Penicillium citrinum) 中 提取 并 提 纯 的 一 个 工 sa 94 。 具 酶 。 它 水 解 核酸 产生 5 核 苷 酸 ; 没 有 碱 基 特 异性 ; 最 适 pH 4.5 一 6.0， 最 适 温度 70°C; 降解 核酸 时 需要 锌 离子 。 这 个 酶 兼 有 3 ARATE HE. BD BRE TK 3 端 磷酸 ; 作为 3' 核 昔 酸 酶 时 它 水 解 核 糖 核 背 3' 磷 酸 的 速度 比 水 解脱 氧 核糖 核 苷 3' 磷 酸 的 速度 快 30 倍 。 由 于 它 具 有 良好 的 水 解 核酸 的 活性 ,来源 方便 ， 已 被 广泛 地 用 于 核酸 研 究 的 各 个 方面 。 核酸 酶 M ”核酸 酶 M 是 从 金黄 色 葡 萄 球菌 培养 液 中 制 得 的 一 种 核酸 酶 。 它 能 水 解 核酸 产生 RMS 它 水 解 变 性 DNA 的 速度 快 于 天 然 DNA; 能 水 解 RNA 但 不 能 水 解 核糖 核 苷 2 ，3' 环 化 磷酸 酯 ,这 说 明 它 的 水 解 机 制 不 经 过 2，3' 环 状 磷酸 的 中 间 阶 段 ;该 酶 被 带 有 了 磷酸 根 的 单 核 昔 酸 或 寡 核 苷 酸 抑制 ; 3' 磷 酸根 的 存在 却 能 促进 邻近 核 背 酸 键 的 水 解 ; 它 水 解 产 生 Ap 和 Up 的 速度 大 于 产生 Cp 和 Gp 的 速度 ;如 果 用 二 价 钢 离 子 代 蔡 二 价 钙 离 子 作 激活 剂 , 则 它 只 能 水 解 DNA 而 不 能 水 解 RNA。 由 于 它 水 解 RNA 的 产 物 与 RNase T, 的 相似 ,因此 可 替代 RNase T, 作 组 成 分 析 。 核酸 酶 S, ”核酸 酶 S, FEM — BBWAA (Aspergillus oryzae) 提 取 的 一 种 单 链 核酸 酶 。 它 只 水 解 单 链 核酸 ,不 能 水 解 天 然 的 双 链 DNA; 产物 是 5 核 苷 酸 ; 它 水 解 DNA 和 RNA 有 相同 的 最 适 pH (pH4.5); 它 的 水 解 DNA 的 活性 能 被 RNA 所 抑制 。 该 酶 已 被 广泛 地 用 于 单 链 核酸 的 检定 和 核酸 高 级 结构 的 研究 等 方面 。 外 切 核 酸 酶 (exonuclease) 外 切 核酸 酶 是 指 一 类 水 解 核酸 (包括 DNA 和 RNA) 时 是 从 核酸 分 子 的 一 端 开 始 逐 个 地 把 核 音 酸 顺 次 水 解 下 来 的 核酸 水 解 酶 。 用 于 结构 分 析 的 这 类 酶 有 蛇 毒 磷酸 二 酯 酶 ， 和 牛 脾 磷 酸 二 酯 酶 和 多 核 苷 酸 磷 酸化 酶 〈PNPase)。 RRR PKR RRM 3 端 开始 将 5 单 核 童 酸 逐 个 地 顺 次 水 解 下 来 ; 既 能 水 解 DNA 也 能 水 解 RNA ,产物 都 是 5 核 彰 酸 ; 它 水 解 变性 DNA ,也 水 解 天 然 双 链 DNA, 而 且 速 度 更 快 ;对 单 链 RNA 的 水 解 能 很 快 完成 ,对 于 水 解 双 链 RNA 虽 有 不 同 的 ”说 法 ,但 一 般 认 为 高 级 结构 对 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 的 水 解 活性 没有 明显 的 影响 ; 它 能 水 解 2-O - 甲 基 化 的 核糖 核 背 酸 键 ,但 水 解 速度 比 没 有 甲 基 化 的 慢 一 些 ， 它 还 能 水 解 一 个 或 二 个 核 彰 都 是 阿拉 伯 糖 彰 的 二 核 背 一 磷酸 ， 可 见 糖 基 的 性 质 对 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 的 水 解 活性 影响 不 大 (这 个 性 质 与 核酸 酶 M 不 同 ， 核 酸 酶 M 不 能 水 解 带 有 阿拉 伯 糖 基 的 核 背 酸 键 ); EX 稼 见 的 四 种 核 苷 酸 没 有 明显 的 碱 基 专 一 性 ， 但 对 某 些 稀有 核 苷 酸 的 水 解 速度 与 常见 核 昔 酸 的 不 同 , 它 水 解 miGpCp Lt GpCp 慢 得 多 ,水 解 Tpy 非常 慢 ,水 解 Cpy 的 速度 只 有 CPU 的 一 半 。 经 水 溶性 碳 二 亚 胺 修饰 后 的 尿 音 酸 键 则 不 能 被 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 水 解 , 可 见 它 水 解 核酸 的 活性 也 有 一 定 的 碱 基 专 一 性 ; 它 对 被 水 解 的 核酸 的 末端 磷酸 基 有 严格 的 要 求 , 同 一 核 背 酸 片 段 如 果 5 端 带 磷 酸根 的 则 水 解 最 快 ,去 除 5 端 磷酸 根 的 则 水 解 速度 降低 10 倍 ; 如 果 3 端 带 有 磷酸 根 的 则 水 解 速度 降低 100 倍 ( 比 5 端 带 有 磷酸 根 3 端 不 带 磷 酸 FRAY UU 1,000 倍 )。 可 见 5 端的 磷酸 根 促进 水 解 ,3' 端 磷酸 根 抑制 水 解 。 AP RRA UCR LE — POMS. E 7k fe RNA 或 DNA 是 从 核酸 分 子 的 对 端 开始 逐个 顺 次 地 把 3 核 昔 酸 水 解 下 来 ; 在 pH 4.8 时 它 不 能 水 解 了 端 带 有 磷酸 根 的 tRNA， 但 它 能 很 好 地 水 解 ? 端 脱 去 磷酸 根 的 tRNA; 在 pH 6.2 时 , 它 能 够 水 解 3 端 带 有 磷酸 根 的 IRNA， 但 其 水 解 速度 低 于 脱 磷 的 CRNA, FTL 5 端 磷酸 根 的 存在 会 抑 95 。 — 制 或 降低 其 水 解 速度 ; 它 的 水 解 活性 对 底 物 的 二 级 结构 敏感 ， 它 水 解 天 然 胸 腺 DNA 的 速度 只 有 变性 DNA 的 百 分 之 四 , 双 链 DNA 片段 (20 一 50 个 碱 基 对 ) 不 能 为 该 酶 作用 ， 在 水 溶液 中 能 形成 双 链 结构 的 ,如 聚 肌 胞 苷 酸 等 完全 不 能 为 该 酶 水 解 ; 它 能 水 解 RNA 分 子 产生 2-O- 甲 基 化 的 核 苷 酸 和 许多 碱 基 上 修饰 的 核 苷 酸 ,但 不 能 水 解 2-O- 乙 酰 化 的 核 苷 酸 键 , 也 不 能 水 解 核 昔 2 ，3' 环 状 磷酸 。 SRPRARILCM PNPase 是 一 个 具有 外 切 核 酸 酶 性 质 的 核 背 酸 转移 酶 。 这 个 酶 实际 上 催化 三 个 反应 : (OU 5 核 苷 二 磷酸 为 底 物 使 其 聚合 成 多 核 苷 酸 , 同 时 释放 出 无 机 磷酸 ;(2) 以 多 核 背 酸 为 底 物 ， 在 无 机 磷酸 存在 下 使 多 核 背 酸 磷 酸 解 产 生 SRAM (为 1 的 逆反 应 ); (3) 催化 无 机 磷酸 交换 反应 。 它 在 催化 磷酸 解 多核 昔 酸 时 是 从 3 端 开 始 逐 个 顺序 地 把 核 苷 酸 水 解 下 来 ,产物 为 SRA IRR: 3" 端 磷酸 根 抑制 磷酸 解 反 应 ; 它 磷酸 解 多 核 苷 酸 链 最 后 得 到 该 多 核 萌 酸 5 端的 二 核 苷 一 磷酸 或 三 核 昔 二 磷酸 ; 它 对 底 物 无 明显 的 碱 基 专 一 性 , 既 作 用 于 RNA 也 作用 于 DNA。PNPase 曾 被 用 于 RNA 或 DNA FERNDALE RK LA +E). 其 他 有 关 的 酶 核酸 结构 分 析 中 常用 的 工具 酶 还 有 磷酸 单 酯 酶 〈(PMase) ,多 核 昔 酸 激酶 (PNKase) 和 RNA 连接 酶 等 。 3 BRR BOSH = PMase 有 非特 异性 磷酸 单 酯 酶 和 特异 性 磷酸 单 酯 酶 二 类 。 非 特异 性 磷酸 单 酯 酶 如 大 肠 杆 菌 碱 性 磷酸 酯 酶 , 它 能 够 水 解 单 核 苷 酸 或 寡 核 昔 酸 的 3 或 5 端 磷酸 单 酯 键 , 产 生 无 机 磷 。 它 也 能 水 解 核 苷 -2' 一 磷酸 单 酯 、 核 苷 二 磷酸 、 核 苷 三 磷酸 、 糖 磷 酯 、 对 硝 基 酚 磷酸 和 焦 磷 酸 等 范围 广泛 的 磷酸 单 酯 化 合 物 。 此 外 ， 它 还 能 水 解 硫 磷 酯 。 大 肠 杆菌 碱 性 磷酸 单 酯 酶 有 很 高 的 催化 活性 ， 已 被 广泛 地 用 于 核酸 研究 的 许多 方面 它 已 被 制 成 固 相 酶 ,使 用 和 除去 更 为 方便 。 非特 异性 磷酸 单 酯 酶 还 有 哺乳 动物 的 肠 粘膜 肾脏、 肝 胜 和 胎盘 的 碱 性 磷酸 酯 酶 及 许 多 其 他 来 源 的 酸性 磷酸 酯 酶 ,例如 前 列 腺 、 红 血球 肝脏、 脾脏 血清 等 来 源 。 特异 性 磷酸 单 酯 酶 与 核酸 结构 分 析 有 关 的 有 TRB RR, ENDS 异性 地 水 解 核 苷 酸 或 寡 核 昔 酸 的 5 磷酸 单 酯 键 和 3' 磷 酸 单 酯 键 ,产生 无 机 磷酸 。5' 核 苷 酸 酶 的 来 源 有 肴 椎 动物 组 织 \ 精 液 、 蛇毒 、 猪 血 和 微生物 等 许多 方面 ， 其 中 已 用 于 核酸 结构 分 析 的 有 大 肠 杆 菌 % 核 背 酸 酶 ， 蛇 毒 5 核 苷 酸 酶 等 。 它 们 的 共同 特性 是 既 水 解 核糖 核 苷 5 磷酸 也 水 解脱 氧 核糖 核 苷 的 5 磷酸。 大 肠 杆菌 5 核 苷 酸 酶 还 能 水 解 ATP, UTP, CTP, GTP 和 UDP- 葡 萄 糖 等 , 它 水 解 核糖 核 背 单 磷酸 的 相对 速度 是 : A>G>S>C>USI, 蛇毒 5' 核 背 酸 酶 水 解 核糖 单 核 昔 酸 的 相对 速度 是 : A > C >I> G>Uo。 3' 核 苷 酸 酶 有 黑 麦 草 、, 麦 苗 、 绿 豆 和 微生物 等 多 种 来 源 的 制剂 。 它 们 特异 性 地 水 解 核 苷 酸 或 寡 核 苷 酸 的 3' 磷 酸 。 多 核 苦 酸 激酶 “， T4 喉 菌 体感 染 大 肠 杆 菌 产生 的 多 核 苷 酸 激酶 能 催化 ATP 上 的 7 MERLE ARBRE RH BUR RRR REL. CHEB EAT DNA 亦 能 作用 于 RNA; 作用 于 DNA 的 速度 比 RNA #3 CES PRA Re BED 化 的 速度 取 决 于 寡 核 苷 酸 的 链 长 .组 成 及 其 糖 基 的 种 类 。 一 般 情 况 下 * 它 磷 酸化 3' 单 核 背 酸 的 速度 是 SREB 2 到 5 倍 。T4 噬菌体 感染 的 大 肠 杆菌 多 核 背 酸 激酶 伴 有 3' 核 苷 酸 酶 的 活性 ， es 96 。 它 的 激酶 活性 的 最 适 pH 在 6.5 一 8.5， 而 7 RAN RIE pH 在 5.9， 该 酶 水 解脱 氧 核 糖 核酸 3' 磷酸 的 速度 比 水 解 核 糖 核酸 的 更 快 些 ; 已 经 有 人 从 T4 噬菌体 突变 株 感 染 的 大 | 肠 杆菌 中 制 得 了 不 含 3' 核 苷 酸 酶 活性 的 激酶 。 多 核 苷 酸 激酶 已 被 广泛 用 于 核酸 的 结构 研 究 。 RNA 连接 酶 〈 详 见 第 十 章 )。 三 、RNA 一 级 结构 测定 方法 RNA 一 级 结构 测定 方法 可 以 分 为 两 大 类 : 片段 重 伙 法 和 直接 阅读 法 。 前 者 为 经 典 方法 ,现在 仍然 在 使 用 ;后 者 是 由 DNA 顺序 分 析 衍 生 而 来 的 快速 简便 的 新 技术 ， 它 问世 仅 几 年 时 间 , 已 经 使 核酸 一 级 结构 的 研究 出 现 了 轩 新 的 局 面 。 FR BBE 重 公 法 是 测定 包括 蛋白 质 在 内 的 生物 大 分 子 一 级 结构 的 一 种 战略 ,其 原理 如 下 :RNA 分 子 分 别 被 二 种 以 上 的 具有 不 同 碱 基 专 一 性 的 核糖 核酸 酶 水 解 成 各 种 寡 核 背 酸 片段 ; 然 后 分 别 分 离 和 检定 水 解 产物 ,并 测定 它们 的 核 苷 酸 顺 序 及 其 相对 含量 ;二 种 不 同 专 一 性 的 酶 得 到 的 二 组 寡 核 背 酸 的 切 点 是 相互 重 登 的 。 利 用 这 个 原理 ， 使 用 更 多 种 专 一 性 不 同 的 酶 水 解 RNA 分 子 , 解 析 结构 的 能 力 就 更 强 。 这 就 是 片段 重 公 法 测定 一 结构 的 基本 原理 。 例如 我 们 现在 要 解析 ABCDCAD 这 个 假定 的 顺序 ,有 两 种 酶 可 供 使 用 , 一 种 专 水 解 A 和 _B; 另 一 种 专 水 解 D。 结 果 如 下 : Ey v 7k ## A Ad BsABCDCAD = A +B+CDCA +D 水 解 D: ees = ABCD + CAD ORPRR ET AHEM AH ERA FES ABCDCAD, 因为 第 一 个 酶 解 产 物 中 有 CDCA 序 = 列 ,说 明 该 序列 在 片 眉 中 是 存在 的 ;第 二 个 酶 水 解 得 到 ABCD 和 CAD 二 个 片段 ,其 排列 有 二 种 可 能 性 ABCDCAD 和 CADABCD ， 因 为 其 中 有 CDCA 顺序 ,所 以 应 该 是 前 一 种 序列 。 重 伙 法 的 基本 实验 方法 和 技术 。 碱 基 组 成 分 析 | kee: RNA 经 碱 水 解 产生 2’ 和 3' 核 背 酸 。 注 意 下 列 核 苷 对 WARP: Dy, mA, mC, mG, mT, aC, VS BRR: 利用 非特 异性 核糖 核酸 酶 (RNase T, Bt M) 水 解 ,产物 是 3' 核 昔 酸 。 上 述 水 解 产 物 可 经 电泳 或 双向 电泳 层 析 进 行 组 成 分 析 ( 见 附录 二 )。 ADR 5 端 和 3“ 端 核 苷 酸 目前 一 般 用 同位 素 标记 的 方法 进行 测定 。 5 端 同位 HP? 标记 用 多 核 昔 酸 激酶 在 [y-?2P]-ATP 存在 下 使 RNA FBR 5 端 羟基 磷酸 化 来 实 现 。3' 端 也 可 以 用 2?P 进行 同位 素 标记 ,通过 RNA 连接 酶 催化 [2?P]-pCp 与 被 WARE 酸 之 间 的 单 加 反应 来 实现 。 末 端 同位 素 标记 的 寡 核 苷 酸 经 核酸 酶 降解 后 ， 用 测定 核 昔 酸 组 成 的 方法 确定 带 有 同位 素 [2P] 的 3' 或 5 端 。 特异 性 酶 解 和 酶 解 产物 的 分 离 ”通常 使 用 的 二 种 酶 是 RNase TI 和 RNase A, 前 者 对 鸟 背 酸 键 专 一 ， 后 者 对 喀 啶 核 昔 酸 键 专 一 。 得 到 的 全 酶 解 产物 可 通过 7M 尿素 柱 层 e 97 e 析 进 行 分 离 〈 见 图 3-28)。 中 性 尿素 柱 层 析 可 以 按 链 长 把 十 核 背 酸 以 下 的 寡 核 昔 酸 片段 分 开 。 该 法 一 般 用 于 非 放射 性 样品 的 分 离 。 © 20 40 60 60 WO i20 HO KO ISO 200 220 240 260 290 300 320 其 号 图 3-28 DEAE- 纤 维 素 柱 层 析 分 离 寡 汉 核 背 酸 混 合 物 。 洗 脱 溶剂 为 pH 6.5 碳酸 气 三 乙 胺 梯度 ,内 含 7M 尿素 。 图 中 数目 字 表示 链 长 。 ， 此 外 ， 还 可 以 用 双向 电泳 法 分 离 同位 素 标记 的 酶 解 产物 ， 有 人 把 这 种 方法 称 为 指 效 法 。 图 3-29 显示 了 用 Sanger 建立 的 双向 电泳 法 分 离 放射 性 [”P] 标 记 的 核酸 水 解 产物 的 图 谱 , 该 法 简便 易 行 ;已 广泛 地 用 于 RNA 一 级 结构 特别 是 小 分 子 RNA 的 测定 。 BAI BEAD BS ARR FAR PA es BH Be DB HB Dk EAT sc eo, oP sae si 7A ee) $fe u- c SA . Jes u Ay uv c U U A 2 ! 3-29 ”用 双向 电泳 法 分 离 RNA 酶 解 产物 图 3-30 ”打点 法 测定 寡 核 将 酸 (CERAM 22H CRNAS!” 的 RNase T, 全 酶 解 ) 片段 的 核 苷 酸 排列 顺序 第 一 向 : 酷 酸 纤维 素 薄 膜 电泳 。pH 3.5 (醋酸 -吡啶 ); 第 一 向 : pH 3.5 醋酸 纤维 素 电 泳 ; 第 二 向 : DEAE oR ik 5 7%o BB, 第 二 向 : 同系 层 析 。 es 98 。 Wy FARRAR HR FR] C1) SRR — wT Ree —_FEW 5 端 经 [>P] 标 记 后 ,蛇毒 磷 和 酸 二 酯 酶 部 分 酶 解 ,双向 电泳 层 析 分 析 ( 第 一 向 电泳 按 碱 基 组 成 分 离 ; 第 二 向 同系 层 析 , 按 KE), 根据 同位 素 资 点 在 图 谱 上 顺 次 排列 的 轨迹 即 可 推导 出 核 苷 酸 的 排列 顺序 (图 3-30) AWS AFA BE DNA 顺序 的 测定 ( 见 第 二 章 第 17 页 )。 (2) 高 磺 酸 氧化 法 一 “ 先 用 高 碘 酸 氧化 RNA 3’ 端 邻 位 羟基 ,然后 在 弱 碱 性 条 件 下 发 生 8 消除 反应 ,测定 8 消除 反应 产生 的 碱 基 , 即 可 知道 3 端 第 一 位 核 背 酸 。 切 除 第 一 个 RERNRREBA AE MEO 3 MR REA BO ECLA 3-31)。 由 HAAR PEARED THEN RRO, AAR SW mK 29 次 。 该 法 不 能 用 于 带 有 2'-O-FLCMERHRH ER; 高 碘 酸 对 假 尿 苷 和 二 氢 尿 苷 有 破坏 作用 ,使 用 时 要 注意 。 产 物 除 用 紫外 明 收 法 测定 碱 基 外 ,还 可 以 用 刘 望 夷 等 人 提出 的 RNA—O a N; O OH O=P-O— Ne es. a=. ) OH O=P-O 于 oth Oo OH OH 2] Z ‘i fo) Pah 党 o : R-NH, pokey O Na 了 O- 9 OH O-P—O de lO: H CHCH | T w Oo Oo RNA-—O d ; en key! PMase ? OH 证人 9 OH O=P-O O=P-O | O N: 让 O\N:2 O- OH OH : = OH O=P-O- OR ext 第 二 轮 循环 N, 3-31 ”高 碘 酸 氧化 法 测定 寡 核 昔 酸 的 顺序 e 99 。 4 HOGA LET Ml HN RB SRA Oar EIR Sat AR, SOCEM AE natin FERS A 3-32), 检测 核 苷 腕 的 草 光 性 比 上 述 紫外 方法 灵敏 得 多 。 二 B OF RNEHNH Vo HO7,0O NalO, Ke H 2NFi2 HH ‘oes CK, Shel H 人 OH HO OH oO O 1 R O - CH 2 B UHo-P-o O.B 1.NalO, 20 B RNH.NH, 6° re a ae WA HOG HO OH pHs.5 a Ho N OH} 37'C,10 小 时 2 了 B 王 碱 基 ( 腺 嘎 哈 、 乌 呀 哈 、 胞 喀 啶 . 尿 喧 啶 ) N(CH3)2 R= O i SO,—NHCH,C — 3-32 用 莉 光 法 检测 DNS-Gly- 核 背 逐 或 一 次 甲 基 核 昔 逐 By ge 寺 关于 直 读 法 的 原理 详 见 DNA 结构 一 章 。 利 用 特异 性 降解 或 在 控制 条 件 下 合成 得 到 的 以 RNA 分 子 中 某 种 特定 碱 基 ( 如 A) 为 未 端 (3' 端 或 ? 端 ) 的 不 同 链 长 的 寡 核 苷 酸 片 妥 混合 物 ,经 变性 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 按 链 长 分 离 , 凝 胶 电 泳 上 显示 的 各 条 带 的 链 长 就 表示 RNA 分 子 上 各 个 A 碱 基 的 位 置 。 同 样 , 亦 可 得 G\C 和 TU 接 尾 的 各 组 片 豚 ,并 定 出 它们 在 RNA 分 子 中 的 位 置 。 由 此 可 以 很 快 排出 RNA 分 子 的 核 音 酸 顺 序 ( 见 图 3-33)。 该 方法 © 的 特点 是 简便 快速 。 根 据 阅 读 的 方法 不 同 又 可 分 为 以 下 几 种 : 利用 专 一 性 核糖 核酸 酶 控制 酶 解 的 直 读 法 Fe RNA 水 解 酶 具有 特定 的 碱 基 专 一 性 ,如 前 介绍 : RNase A 专 一 水 解 C 和 U; RNase Ti 专 一 水 解 G; RNase U, 在 适当 条 件 下 专 一 水 解 A; RNase phy 工 能 水 解 A\U 和 G;, 水 解 C 的 速度 特别 慢 ;RNase phy M 在 适当 条 件 下 专 一 水 解 A 和 TU; 葡萄 球菌 核酸 酶 在 pH7.5, 10mM Ca 条件 下 :水解 N-A 和 N-U 很 快 ;小 球菌 核酸 内 切 酶 在 7M 尿素 存在 时 能 水 解 C 一 N 键 。 如 果 RNA 分 子 的 5 端 被 ”P 标记 ,适当 选择 几 种 酶 相配 合 进 行 控制 性 水 解 。 通过 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 的 分 离 , 可 得 到 几 组 以 5 端 为 ?P 而 3" 端 为 某 一 特定 碱 基 的 片段 。 放射 自 显 影 后 即 可 阅读 顺 序 ( 见 图 3-33)。 此 方法 受 RNA 二 级 结构 影响 较 大 ,同时 也 不 能 阅读 修饰 核 背 酸 。 利用 专 一 性 化 学 降解 的 直 读 法 RNA 在 RNA 连接 酶 的 作用 下 , 在 其 3 端 接 上 3pCp 后 分 别 用 硫酸 二 甲 酯 (修饰 G)、 焦 碳酸 二 乙 酯 〈 主 要 修饰 A)、 腊 (修饰 U)、 无 es 100 。 有 4 图 3-33 酶 解 阅读 法 测定 RNA 结构 凝 胶 电泳 图 7KBECE 3M NaCl 中 主要 修饰 C) 进行 特异 性 碱 基 的 限制 修饰 (其 原理 可 参见 DNA 结 构 一 章 ) ,得 到 几 组 以 3' 端 为 ?2P 标记 ;5' 端 表示 特定 碱 基 的 片段 ,用 变性 凝 胶 电 泳 分 离 各 片 HRI. 该 方法 的 优点 是 不 受 RNA 二 级 结构 的 影响 ， 但 也 不 能 阅读 修饰 核 昔 酸 。 利用 RNA 复制 特异 性 未 端 终止 的 直 读 法 ”在 有 四 种 核 昔 三 磷酸 存在 时 ， 以 寡 聚 RAVES! WM, HRI RNA 的 RNA 聚合 酶 能 在 RNA 模板 上 合成 互补 的 RNA 链 。 如 果 在 反应 体系 中 加 入 某 种 一 定量 的 [cu-2P]-3'- 脱 氧 核 背 三 磷酸 , 则 RNA 合成 就 会 在 这 一 核 音 酸 位 置 上 终止 ， 结 果 产 生 一 系列 以 引物 为 5 端 ， 以 [?P] 标记 的 MARR 为 3' 端 的 不 同 链 长 的 RNA 片段 。 利 用 A、G、C、U 四 组 不 同 [c-?P]-3'- 脱 氧 核 背 三 磷 酸 的 反应 体系 ,经 变性 凝 胶 电 泳 分 离 , 即 可 阅读 其 核 昔 酸 顺 序 。 这 种 方法 受到 [ac-2?P]-3'- 脱氧 核 背 三 磷酸 和 依赖 于 RNA 的 RNA 聚合 酶 的 来 源 的 限制 。 另 外 ,如 果 RNA 链 上 有 稀有 核 苷 酸 ,那么 RNA 复制 就 会 受到 影响 而 不 能 阅读 出 RNA 的 全 序列 。 这 种 直 读 es。 101 。 Ba oS © 8 @ 6 @: C6 © exe. a 原 位 水 解 5 —GCGUAUCCUAGU—3’ 3-34 利用 末端 鉴定 直 读 法 测定 RNA 顺序 示意 图 9 ,同位 素 标记 ; © :放射 自 显影 斑点 。 法 目前 应 用 较 少 。 AA Kame LY RRA RNA 在 无 离子 甲 酰 胺 或 双 蒸 水 的 限制 性 水 解 条 件 下 ,从 ”统计 角度 而 言 , 每 一 分 子 RNA 只 有 一 个 磷酸 二 酯 键 被 水 解 。 因 水 解 无 碱 基 专 一 性 , 得 ， 到 一 组 3 端的 片段 和 一 组 5 端的 片段 。 如 果 原 来 的 RNA 分 子 5 端 带 有 磷酸 基 团 ， 那 么 只 有 3 端的 一 组 片 眉 的 5? 端 有 游离 羟基 ,这 组 片段 经 5 端 标记 ?*? 后 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 上 按 链 长 分 离 。 切 下 凝 胶 条 带 或 转移 至 DEAE- 纤 维 素 薄 板 上 ,经 水 解 鉴定 它们 的 5 端 的 核 背 酸 ,就 可 排出 RNA 的 核 背 酸 序列 (图 3-34)。 该 方法 的 优点 是 能 克服 RNA 分 子 二 级 结构 对 测定 的 影响 也 能 测定 稀有 核 苷 酸 ,缺点 是 对 多 核 苷 酸 激酶 的 质量 要 求 很 高 , 且 操作 比较 碰 烦 。 反 转 录 成 cDNA HAR ”在 有 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 存在 时 ,用 反 转 录 酶 或 大 肠 杆菌 DNA RAMZE RNA 样板 上 反 转 录 成 DNA. 然后 用 DNA 直 读 法 测定 cDNA 的 序列 再 推导 出 RNA 的 序列 。 DNA 序列 测定 法 详 见 DNA 结构 一 章 。 目前 许多 mRNA 和 病毒 RNA 都 是 用 这 种 方法 测定 序列 的 。 * 102 + 近年 来 许多 核酸 分 子 一 级 结构 的 测定 大 都 是 用 快速 直接 阅读 法 完成 的 ， 然 而 经 典 的 片段 重 登 法 仍 不 失 其 特点 , 它 的 一 套 基本 实验 方法 ,包括 末端 分 析 、` 组 成 分 析 \ 修 饰 核 苷 酸 分 析 等 ,仍然 是 RNA 特别 是 tRNA 以 及 snRNA 顺序 测定 的 常用 方法 。 $ 4+ X mk [1] Schimmel, P. R. Sdll, D. and Abelson, J. N. (eds.), Transfer RNA: Structure, Properties, and Recognition, 1979, Cold Spring Habor Laboratory. [2] Kim, S. H, 1978, Three-Dimensional Structure of tRNA and its Functional Implications, in Ad- vances in Enzymology, 46, 279, eds. Meister, A, An Interscience Publication, John Wiley and Sons. [3] Wittmann, H. G. 1982, Components of Bacterial Ribosomes, in Ann. Rev. Biochem. 51, 155— 183. [4] Erdmann, V. A. et al (eds.), 1983, Collection of Published 5S and 5.88 Ribosomal RNA Se quences, Nucleic Acids Res. 11, 1105—1r133. / [5] Noller, H. F. and Woese, C. R. 1981, Secondary Stucture of 16S rRNA, Science, 212, 405— 410. [6] Noller, H. F. et al, 1981, Secondary Structure Model for 23S rRNA, Nucleic Acids Res. 9, 6167. [7] Veldmann, G. M. et al. 1981, The Primary and Secondary Structure of Yeast 26S rRNA, Nuc- leic Acids Res. 9, 6935. [8] Fiers, W: et al. 1976, Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage MS2 RNA, Nature, 260, 500—507. [9] Cohn, W. 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J. et al, 1978, Nucleotide Sequence and Secondary Structure of Potato Spindle Tuber Viroid, Nature, 273, 203—208. . ¢ 103 e Spyz DNA B&B 制 SLR RAR 在 细胞 分 裂 过 程 中 ， 亲 代 细 胞 所 含 的 遗传 信息 源源 本 本 地 传递 到 二 个 子 代 细胞 。 我 们 知道 , DNA 携带 了 细胞 的 一 切 遗 传 信息 ,因此 亲 代 DNA 也 必须 准确 地 复制 成 二 个 捞 贝 ， 分 配 到 二 个 子 代 细胞 中 去 。 研究 DNA 复制 的 目的 就 是 要 了 解 (1) 子 代 DNA 为 什 么 能 够 真实 地 获得 亲 代 DNA 的 遗传 信息 ; 〈2) 复 制 是 怎样 进行 的 ?9 〈3) 生物 体 是 怎样 对 DNA 复制 进行 调控 的 ? 对 于 前 两 个 问题 ，Watson 和 Crick 在 发 表 DNA 双 螺 旋 模 型 时 就 进行 了 探讨 。 在 DNA 双 螺 旋 模 型 中 ,G 只 能 和 C 配对,A 只 能 和 工 配对 ,因此 按 碱 基 配 对 规则 , 任意 一 条 链 的 碱 基 顺 序 可 精确 地 决定 它 的 互补 链 的 顺序 。 在 DNA 复制 时 ， 只 要 简单 地 把 DNA 双 链 拆 开 , 每 一 条 链 都 可 作为 模板 ,合成 结构 上 完全 一 样 的 二 条 DNA 双 链 (图 4-1)。 然而 ,这 样 一 个 表面 上 看 来 很 简单 的 过 程 , 并 不 象 最 初 提出 时 那样 ， 可 以 象 拉 * 拉 链 ” EF GE $3 iil te 复制 链 Wee 图 4-1 双 螺 旋 DNA 复制 过 程 * 1046 二 祥 不 靠 任何 酶 的 帮助 而 自动 完成 。 现 在 知道 ,复制 过 程 十 分 复杂 ， 涉 及 30 多 种 酶 和 蛋 白质 的 协同 作用 。 表 4-1 列 出 部 分 与 大 肠 杆 菌 复 制 有 关 的 蛋白 质 及 其 性 质 。 其 中 大 部 分 酶 和 和 蛋白质 的 结构 和 作用 已 经 弄 清楚 ， 对 双 链 如 何 解 开 以 及 怎样 保持 复制 真实 性 也 有 了 一 定 的 了 解 ,但 仍 是 知 其 然而 不 知 其 所 以 然 。 由 于 复制 是 生命 活动 中 极为 重要 的 一 环 , 感 兴趣 的 实验 室 很 多 ,在 这 个 领域 里 进展 很 快 ,因此 我 们 只 能 把 复制 的 基本 过 程 作 一 介绍 。 表 4-1 与 大 肠 杆 菌 复制 有 关 的 蛋白 质 蛋白 质 名 称 * |OFRXIC | WERE 功 te feta te BREE SSB 4 与 单 链 结合 300 20 u i 蛋白 4 预 引发 50 0.5 n 蛋白 1 预 引发 30 on 蛋白 1 部 位 识别 ，ATPase 70 0.3 a” 蛋白 1 预 引 发 一 dnaC 1 预 引 发 100 dnaB 6 移动 启动 子 ,ATPase 20 0.3 引发 酶 1 引发 合成 50 0.2 Pol Ill 全 酶 Qa . l 一 & 1 一 6 2 een ats 0.5 8 1 300 Yr 2 20 6 1 £ 1 Pol I 1 填补 缺口 和 切 去 引物 300 10 ERB 1 RE 300 10 拓扑 异 构 酶 H 4 Si a 2 引进 超 螺旋 250 6 2 25 rep EA 1 解 开 双 链 50 0.6 fee EAS U1 1 5000 | dnaA 复制 起 始 200 ”SSB， 单 链 结合 蛋白 ; Pol, DNA RAM; rep 蛋白 是 一 种 大 肠 杆菌 解 链 酶 。 一 、 复 制 机 制 半 保 留 复制 Watson 和 Crick 提出 的 DNA 复制 方式 可 称 为 半 保 留 的 复制 方式 ， 因 为 每 个 子 代 DNA 分 子 中 一 条 链 是 完整 的 亲 代 DNA 链 , 另 一 条 链 是 新 合成 的 链 。 在 理论 上 还 可 以 设 想 其 他 一 些 复 制 方式 。 例 如 二 个 子 代 DNA 分 子 中 一 个 分 子 完全 是 亲 代 的 分 子 , 而 另 一 个 分 子 完全 是 新 合成 的 分 子 , 这 种 方式 可 以 称 为 全 保留 的 复制 方式 ;又 比如 可 以 设想 亲 代 链 被 分 解 成 很 多 片段 ,散布 在 新 的 子 代 分 子 中 , 这 种 方式 称 为 散布 式 复制 机 制 (图 4-2)。 "105。 ‘oahu nape ln Ep pss i Gul 半 保留 式 全 保留 式 ' 散布 式 4-2 复制 机 制 的 三 种 可 能 方式 生物 体内 究竟 以 什么 方式 进行 复制 ， 必 须 用 实验 来 证 明 。1958 年 Meselson 和 Stahl 设计 了 一 个 很 巧妙 的 实验 。 他 们 先 把 大 肠 杆菌 在 96.5 % 同位 素 纯度 的 “5NH4CI 培养 液 中 生长 十 五 代 , 使 所 有 的 DNA 都 被 重 的 YN 标记 。 然后 把 细胞 转 到 含 ANH4CIL 的 介质 中 培养 ,在 不 同 的 时 间 取 出 样品 ,每 个 样品 都 用 SDS Sle omi, 裂解 液 放 在 CsCl 溶液 中 以 140,000g 离心 二 十 小 时 。 离 心 结 束 , 从 管 底 到 管 口 CsCl 密度 形成 一 个 梯度 分 布 , 越 LEB. DNA 分 子 的 密度 如 果 同 某 一 层 Cl 密度 相等 时 ， 它 就 趟 上 也 不 下 ,在 a a a ad ° 0.3 0.7 2 3.0“ 2 4.1 ! 0 代 和 1.9 代 混合 2 rr 。 0 代 和 4.1 代 混合 4-3 2N 标记 DNA 在 复制 时 密度 的 变化 “106。 紫外 光 下 可 以 看 到 一 条 吸收 带 。 通 常 DNA 分 子 的 密度 在 1.71g/cm' 左右。 用 SN 标记 的 DNA 密度 大 于 正常 的 DNA 密度 , 它 在 离心 管 较 低 的 部 位 形成 一 条 区 带 。 让 这 种 重 标记 DNA 在 %N 培养 液 中 生长 一 代 ,， 我 们 看 到 新 复制 的 DNA 在 密度 稍 低 的 地 方形 成 一 条 新 的 区 带 , 称 为 中 间 密 度 带 。 注 意 ,这 时 在 重 密度 区 域 的 位 置 已 没有 DNA 区 带 了 。 再 复制 一 代 ,在 .Cscl 密度 梯度 中 出 现 了 二 条 带 , 一 条 在 中 间 密 度 的 区 域 ， 另 外 一 条 在 轻 密度 的 区 域 。 当 然 重 密度 的 区 域 仍然 没有 DNA 区 带 。 随 着 在 2%N 培养 液 中 培养 的 代数 增加 ,中 密度 区 带 的 量 逐 渐 减 少 , 低 密度 区 带 的 量 逐 渐 增 加 。 但 是 并 不 出 现 具有 新 的 密度 的 区 带 ( 图 4-3)。 | 这 个 实验 结果 表明 在 体内 大 肠 杆 菌 DNA 是 以 半 保 留 的 方式 进行 复制 的 。 在 AN 培 养 的 第 一 代 DNA 中 j; 重 密度 区 带 完全 消失 , 排除 了 全 保守 的 复制 方式 ,因为 在 全 保守 复 制 方式 中 亲 代 DNA 毫 无 变化 转移 到 子 代 中 , 重 密度 的 DNA 区 带 不 会 消失 ,在 以 半 保 留 方式 复制 的 子 代 DNA 中 ;一 条 链 是 亲 代 ON 标记 的 重 链 , 另 一 条 链 是 含 YN 的 轻 链 ， 二 条 链 形成 密度 上 杂交 的 ,DNA。 因此 所 有 的 子 代 DNA 的 密度 都 比 亲 代 DNA 的 密度 小 ,但 又 比 正常 DNA 的 密度 大 ， 形 成 一 个 中 间 密 度 的 区 带 。 如 果 把 这 种 密度 上 杂交 的 分 子 在 AN 培养 液 中 再 培养 一 代 , 按 半 保 留 复制 方式 就 会 形成 “NAN 和 NIMN 二 种 分 子 ， 而 且 随 着 在 YN 中 复制 的 代数 增加 , MN“N DNA 的 相对 量 减 少 ,而 MN“N AY DNA 的 相 对 量 增加 ,但 不 会 出 现 其 他 密度 的 DNA。 实验 结果 正 符合 这 种 半 保 留 复制 的 方式 。 1963 年 Cairns 用 放射 自 显影 的 方法 阐明 大 肠 杆菌 DNA 是 一 个 环 状 分 子 ， 并 以 半 保留 方式 进行 复制 。 把 大 肠 杆 菌 放 在 含 3H 脱氧 胸 昔 培养 液 中 生长 二 代 左 右 , 然 后 用 溶菌 酶 把 细胞 壁 消化 掉 , 提 取 DNA， 十 分 小 心地 放 在 一 张 透 析 膜 上 , 再 把 膜 转移 在 显微镜 载 片上 ,上 面 覆 上 照相 乳胶 ,在 暗 处 曝光 二 个 月 。 在 这 期 间 :6 由 于 放射 性 衰变 ， 放 出 8 粒 子 , 使 乳胶 曝光 。 显 影 以 后 ,发 射 的 8 粒子 作为 黑 点 记录 下 来 (图 4-4)。 ACH WEE 网 a + te anes e * ~ i a dk: ° Su é “4 i j | Nxdene mre: s 7 2 和 i : 4 ‘ ; 1 H : ‘ * vf . ae iN a. : i ey 到 ae ° oes . . awe i ee ot ze oo 4-4 复制 中 的 大 肠 杆 菌 染 色 体 放射 自 显 影 照 片 子 能 量 很 低 , 只 能 透 过 lum 距离 , 银 粒子 的 位 置 正确 地 代表 了 : 瑟 在 染色 体 中 的 位 置 。 在 乳胶 中 黑 点 的 数目 代表 了 HE DNA 分 子 中 的 密度 。 把 显影 好 的 载 片 放 在 光学 显微镜 底下 就 可 以 观察 到 染色 体 的 形状 。 用 这 方法 Cairns 观察 到 大 肠 杆菌 DNA 是 一 个 环 状 分 子 (图 4-4 左 )。 当 DNA 复制 时 它 的 中 间 产 物 是 6 形 的 (图 4-4 A), 非 复制 的 部 分 银 粒子 的 密度 较 低 ,由 一 条 热 链 ”和 一 条 冷 链 构成。 复制 中 的 二 条 双 链 ,其 中 一 条 双 链 的 一 条 链 是 标记 的 (一 条 热 链 ” ,一 条 冷 链 ”), 另 一 条 双 链 的 二 条 链 都 标记 。 因 此 可 以 推断 *。 107。 在 DNA 复制 过 程 中 必须 经 过 链 分 离 阶段 ,复制 是 以 半 保 留 方式 进行 的 。 真 核 生 物 的 染色 体 复制 也 是 以 半 保 留 方式 进行 的 。1957 年 Taylor 把 蚕豆 苗 放 在 含 所 脱氧 胸 背 的 溶 流 中 生长 ,所 有 在 细胞 分 裂 过 程 中 合成 的 DNA 都 被 同位 素 标 记 了 ，8 个 小 时 以 后 转 到 正常 的 盗 液 中 让 它 继 续 生 长 ， 然 后 把 细胞 染色 体 放 射 自 显影 。 从 显影 图 ， 上 可 见 , 在 *H 脱 氧 胸 背 中 生长 一 代 以 后 ,每 个 中 期 染色 体 的 二 个 染色 单 体 都 是 标记 的 在 正常 介质 中 生长 一 代 以 后 ， 每 个 中 期 染色 体 有 一 个 染色 单 体 是 标记 的 ;， 另 一 个 是 非 标记 : 的 。 再 生长 一 代 后 ， 有 一 半 染 色 体 是 非 标 记 的 ， 还 有 一 半 染 色 体 中 一 半 梁 色 单 体 是 标记 的 , 另 一 半 是 非 标记 的 《图 4-5)。 第 一 次 分 裂 中 痢 第 二 次 分 裂 中 期 “第 三 次 分 裂 中 其 ou x o~ Ky 从 ~ ZA 复制 前 第 一 次 分 裂 中 期 第 三 次 分 裂 中 其 第 二 次 分 裂 中 期 第 二 次 分 裂 中 其 4-5 [H] TdR 标记 的 委 豆 染色 体 在 各 代 中 的 放射 自 显影 示意 图 小 点 表示 有 放射 性 的 部 位 * 下 图 是 上 图 的 解释 。 对 上 述 实 验 结果 最 简单 的 解释 是 复制 前 的 染色 体 是 双 元 结构 ,在 第 一 次 分 裂 中 间 ;每 - 一 个 染色 单 体 是 由 一 条 标记 的 和 一 条 非 标记 的 链 组 成 ,在 正常 培养 液 中 培养 一 代 后 ,每 一 个 中 期 染色 体 将 有 一 个 染色 单 体 中 一 条 链 是 标记 的 ， 另 一 个 染色 单 体 完全 没有 标记 。 这 个 结果 表明 在 真 核 生 物 中 染色 体 的 复制 也 是 以 半 保 留 的 方式 进行 的 ， 而 且 表 明 一 个 染色 体 中 只 含 一 个 非常 长 的 DNA 分 子 。 。108。 从 以 目的 实验 得 到 一 个 共同 的 结论 ，DNA 双 链 复制 是 以 半 保 留 方式 进行 的 ， 无 论 是 原核 还 是 真 核 生物 都 是 如 此 。 6 方式 和 滚 简 方 式 复制 时 双 链 DNA 解 成 二 股 链 分 别 进 行 ,因此 这 个 生长 点 呈现 叉子 的 形式 称 为 复制 Mo 双 链 环 状 DNA 复制 的 中 间 产 物 形 成 一 个 6 形式 。 这 是 由 Cairns 在 大 肠 杆 菌 染 色 体 的 复制 的 中 间 产 物 放射 自 显影 图 上 最 早 观 察 到 的 ， 因 此 这 种 复制 方式 称 为 Cairns 方 Kio 另 有 一 种 滚筒 式 复制 模型 ， 这 个 模型 可 以 解释 噬菌体 由 174 复制 的 中 间 过 程 ， 特 别 是 解释 单 链 的 子 代 DNA 怎样 从 双 链 的 复制 型 产生 的 。 实 验 发 现 噬菌体 $X174 初始 合成 的 单 链 产物 比 单位 长 度 要 长 得 多 ,而 且 是 和 亲 代 分 子 连 在 一 起 的 。 若 %X174 共 价 闭 环 的 双 链 复制 型 (REFI) 的 正 链 由 一 内 切 酶 切 开 一 条 链 ， 原 来 的 5 端 从 双 链 上 “和 剥 出 ， 然后 可 能 附着 在 膜 上 ， 留 下 正 链 的 3 OH 作为 引物 ， 以 负 链 作为 模板 就 可 连续 合成 比 原 长 的 度 长 达 几 倍 的 正 链 。 现 在 有 些 实 验 指出 某 些 双 链 DNA 的 合成 可 能 也 是 以 滚筒 的 形 式 进 行 的 。 当 双 链 DNA 以 这 种 方式 合成 时 ， 正 链 以 上 述 的 方式 “AM”, MAB I 直线 双向 1 多重 起 始 双向 图 4-6 半 保 留 复制 的 几 种 方式 es 109 = 滚 出 的 正 链 为 模板 连续 合成 。 在 噬菌体 1 SHIN ABIU SKS RAK. MYR 母 细胞 中 核糖 体 RNA 基因 的 扩 增 可 能 也 是 以 这 种 方式 进行 。 但 是 总 的 来 说 这 都 是 一 ”. 些 特例 ， 绝 大 多 数 的 复制 是 以 复制 叉 的 形式 进行 的 。 图 4-6 归纳 了 上 述 几 种 复制 的 机 制 。 复制 的 起 始 和 方向 一 个 DNA 分 子 的 复制 当然 不 是 瞬时 能 完成 的 , 复制 过 程 在 空间 上 是 井然 有 序 的 复 杂 生 化 反应 历程 。 那么 从 哪 一 个 位 置 首先 开始 复制 ? ”这 个 位 置 在 DNA 分 子 上 是 任意 的 还 是 特定 的 ? 从 很 多 体系 用 不 同 的 实验 手段 所 得 出 结果 都 证 明 , 原 核 生 物 DNA 复制 都 是 在 DNA 分 子 特定 的 位 置 起 始 的 ,复制 方向 大 多 是 双向 进行 的 ,也 有 一 些 以 单 向 的 或 不 对 称 方式 进 行 的 。 用 遗传 的 方法 可 以 证 明 大 肠 杆 菌 DNA 复制 是 定点 开始 双向 进行 的 (图 4-6、IDo。 细菌 染色 体 复 制 所 需要 的 时 间 相 当 于 细胞 生长 一 代 的 时 间 ， 在 一 个 生长 的 群体 中 几乎 所 有 的 染色 体 都 在 复制 中 。 假 定 每 个 染色 体 都 在 同样 的 起 始点 ( 切 开 始 复制 ,那么 大 部 分 细 菌 将 复制 i 附近 的 基因 ， 而 远离 i 的 基因 将 复制 得 少 些 。 因 此 在 一 个 群体 中 离 1 点 越 近 的 基因 出 现 频 率 越 高 。 假 如 复制 是 单 向 进行 的 ,基因 频率 在 基因 图 上 呈 单 向 梯度 ,最 高 和 最 低频 率 的 基因 应 该 是 连锁 的 。 如 果 是 双向 复制 ， 基 因 频 率 将 以 i 为 中 心 出 现 一 个 双向 的 梯度 。 测 定 了 大 肠 杆 菌 染 色 体 上 很 多 基因 的 频率 ,发 现 以 ori A OMA PM, Ast WERK DNA 复制 是 起 始 于 oriC 基因 附近 双向 进行 的 。 大 肠 杆 菌 复 制 起 始 区 oriC 位 于 其 遗传 图 的 iv BA (83 Sit). 一 且 复 制 起 始 以 后 ， 复制 又 就 以 双 门 等 速 前 进 , 两 个 又 在 距 起 始 180° 的 trp 基因 处 (33 分 附近 ) 相 会 (图 4-7)o (rpoD) dnaG dnal lig nalA 图 4-7 ”大 肠 杆 菌 复制 起 始 区 在 遗传 图 上 的 位 置 * 110。 大 肠 杆 菌 和 其 他 几 种 革 兰 氏 阴性 细菌 起 始 区 的 顺序 已 经 测定 (图 4-8)， 测 定 结果 表 明 ,这 一 起 始 区 的 结构 是 很 保守 的 ,其 中 GATC 和 TTATCCACA 出 现 多 次 。 这 245 碱 基 对 能 被 细菌 酶 系 识别 。 2 ”直接 的 放射 自 显影 观察 可 以 确证 复制 是 双向 的 。 利 用 大 肠 杆 菌 一 个 温度 突变 种 ， 它 在 42°C 能 使 复制 中 的 DNA 合成 完成 , 但 不 能 开始 新 的 复制 循环 ， 而 在 25°C 生长 是 正 常 的 ,因此 有 了 一 个 简单 的 手段 保证 群体 中 所 有 的 细胞 都 在 同一 时 间 开 始 复制 , 即 称 为 同 步 生长 。 细 菌 先 在 含 低 比 放射 性 的 *H 脱氧 胸 音 溶液 中 进行 标记 ,然后 在 第 一 个 复制 循环 即将 结束 、 第 三 个 循环 刚 开 始 之 前 几 分 钟 转移 到 高 比 放 射 性 的 3H 脱氧 胸 苷 溶液 培养 一 自 不 长 的 时 间 。 假 如 复制 是 单 向 的 ,起 始点 和 终止 点 应 该 是 邻近 的 ,如 果 是 双向 的 ， 则 二 个 区 域 应 该 是 分 离 的 ,实验 结果 表明 复制 是 双向 进行 的 (图 4-9)。 以 上 是 原核 生物 中 的 一 些 实验 结果 ,在 真 核 生物 中 ,实验 表明 ， 复 制 也 是 从 特定 的 位 置 起 始 , 以 双向 延伸 的 方式 进行 ,在 SV40DNA 复制 时 , 随 着 时 间 延 长, 增加 标记 的 比 强 度 ,把 复制 完成 的 DNA 分 子 分 离 出 来 ,用 限制 性 内 切 酶 消化 , 测定 每 个 片 眉 的 比 放射 性 强度 ,并 按 物 理 图 谱 排 列 起 来 ,发 现 放射 性 强度 呈 梯 度 分 布 ， 最 小 的 放射 性 区 域 是 复制 的 起 始点 ,二 边 的 放射 性 对 称 地 增强 。 用 限制 性 内 切 酶 把 SV40 DNA 切 成 线 状 ,作为 DNA 分 子 内 位 置 的 标志 , 用 电镜 也 可 观察 到 复制 眼 和 它 的 延伸 过 程 , 因 此 SV40 DNA 的 复制 也 是 从 定点 开始 ,双向 进行 的 。 用 哺乳 动物 细胞 做 材料 ,从 放射 自 显影 图 上 也 可 看 到 复制 是 双向 的 ;而 且 在 第 一 个 复 制 周 期 所 用 的 起 始点 看 来 也 用 在 第 二 个 复制 周期 中 , 这 些 材料 都 说 明 DNA 复制 是 在 特 定 的 区 域 起 始 , 向 两 个 方向 等 速 进行 的 。 ， 大 多 数 生物 体内 DNA 的 复制 都 是 以 这 种 方式 进行 的 ， 但 是 也 有 一 些 例外 的 情况 ， 例如 在 枯草 杆菌 中 ， 复 制 是 从 DNA 上 特定 的 点 开始 的 , 但 是 二 个 复制 又 的 移动 是 不 对 称 的 。 一 个 复制 又 仅 移动 染色 体 的 五 分 之 一 的 上 距离; 然后 停 下 来 等 另 一 个 复制 又 走 完 五 分 之 四 的 距离 。 用 限制 性 内 切 酶 的 切 点 作为 参考 点 ,用 电镜 观察 分 离 质 粒 ROK 的 复制 中 间 产 物 , 改 现在 复制 又 移动 不 太 远 的 复制 中 间 体 中 ,复制 又 离开 参考 点 的 距离 是 恒定 的 ,说 明 复制 的 早期 是 单 向 进行 。 然而 复制 得 更 远 的 中 间 产 物 显 示 出 第 一 个 复制 又 在 离 起 始点 20% 左 右 的 位 置 停 下 来 ,而 从 反方 向 开始 形成 第 二 个 复制 又 ;因此 质粒 ROK 的 复制 是 不 对 称 进 行 的 。 质粒 ColEI 的 复制 完全 是 单 向 进行 的 。 在 ColEI DNA 中 限制 性 内 切 酶 EcoRI 只 有 一 个 切 点 ， 这 个 切 点 可 以 作为 参考 点 。 从 体内 或 体外 合成 系统 分 离 到 的 复制 中 间 体 其 一 个 复制 又 虐 离 参考 点 约 17 一 18 % 左右 ,而 另 一 个 复制 又 的 距离 是 可 变 的 ,因此 说 明 ColFI 的 复制 起 点 是 固定 的 ,但 只 向 一 个 方向 移动 。 线粒体 DNA 的 复制 也 是 不 对 称 进行 的 ， DNA 双 链 中 一 条 链 先 复 制 ， 另 一 条 链 保 持 单 链 , 电 镜 中 呈 D 环 形状 ; 待 一 条 链 复 制 完毕 ; 另 一 条 链 才 开始 复制 ( 见 图 4-6\VY、Q 型 置换 方式 )。 从 已 研究 过 的 DNA 复制 形式 来 看 ， 复 制 是 在 _DNA ”分子 中 一 个 特定 的 位 点 开始 的 ,至 今 还 没有 例外 。 复 制 又 移动 的 方向 和 速度 是 多 种 多 样 的 ,但 主要 是 双向 等 速 方式 移 动 的 。 了 OSE BRE wr YEVMING SL WT ak SSL ha oe CB ST YT EY hk Le Bf AY C1 GH Rel EN Bk a © Se fg oS CU YG SY 2S TG FAT WT) > Ba SG C8 X14 4 AS Se dE gb Be hy DUOAOJOUDS DIMAS = Ye9II'LD WILL "fd O'Wi'WWOVIIW WIL 3 9 aay: 3 of 3B etn ge hI MH : “-LVL YY “Vvv9 igs geet pa , see 7 "VV WV .DOVOLL sauabouav va3oDqcva3M3: “939179yY “V9 ee See cs ee SP OV Fe “St tL va)° = MYLIRQRAW : * = 395° 5) *O1lV guy «foe | gl 1 eee = * 四 v “yy *v91L9° BuAY * tame hoe cies: “VD pot} WoL aa) ee oe eee * * . ee, 9 V'ivyv “v919° ] BANE) ye Adi fo + ae vurguulour Wyo 1Wilov Ov juvesiissowvodivollodoWLIWWLVSI L121 LeL1992°¢Jvesouvyy OSZ 11)P42H yoo a°°oL v 2°" 42 419999 vvov9o vv-y v's 了 9 "vv 是 Sh” See 41°39 °**ovv 11999 3 8 i°3 3 ow = 2 COAL Loe” i’viv ~= OVY. 1399¥ vis oe iv :; 9vi99 3 “到 Sap aa ae ) | *e*v99 13992 Vv wv ar 2°40 # ae Se v'*lv ***V¥99>J3¥V3 : 到 人 >eyovogdWv9s8u¥¥e¥91¥99019001¥1920+291>21¥919901¥91 WVS18139¥ gal 1 \ . 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Th RNA 对 碱 是 不 稳定 的 ,除去 RNA 后 产生 新 的 DNA 的 OH， 再 标记 上 去 的 磷酸 是 对 。114。 BFE Ao MK RGF ce SH RAY Dey BK MF PE (6) 分 离 出 的 RNA 引物 经 常 只 能 杂交 到 双 链 DNA WARE, EM 2 和 TI7\I4 复制 中 可 看 到 这 种 例子 。 以 上 这 些 实验 结果 都 有 利于 说 明 RNA 引物 共 价 连 接 在 新 生 的 DNA 链 上 。 但 是 对 上 述 的 证 据 也 可 从 不 同 的 角度 提出 反对 意见 。 对 密度 迁移 实验 的 结果 现在 认为 是 不 可 靠 的 。 用 碱 处 理 在 DNA 分 子 上 产生 可 以 磷酸 化 的 S'OH 这 个 证 据 也 不 可 靠 。 因为 在 DNA 修复 系统 脱 喀 啶 的 DNA 链 对 碱 也 不 稳定 ,会 产生 5 OH 末端 。 企 图 直接 证 明 RNA 和 DNA 共 价 相连 ,困难 在 于 引物 RNA 的 量 极 微 ， 而 体内 其 他 的 RNA 极 丰 富 ， 混杂 痕迹 量 的 RNA 就 可 能 使 实验 结果 不 易 解释 。 ATRIA BHA RNA 引物 最 过 硬 的 证 明 是 用 多 瘤 病毒 完成 的 。 在 体外 核 系统 tH BRAY Pal is Hr BE 5 端 是 一 个 约 10 核 昔 酸 长 的 以 5 三 磷酸 为 结尾 的 RNA。RNA 的 顺 序 近 来 已 初步 了 解 。 表 4-2 列 出 了 几 种 生物 的 RNA 引物 长 度 及 其 主要 结构 。 RNA 5] 物 的 长 度 不 是 恒定 不 变 的 。 在 动物 细胞 中 引物 长 度 接近 10 核 背 酸 ， 第 一 个 核 音 酸 常 是 ATP， 引 物 RNA 的 起 始 和 终端 的 位 置 受 解 链 酶 〈helicase)、 引 发 酶 (primase), AAI 表 4-2 DNA 复制 时 RNA 引物 的 长 度 和 结构 基 因 组 RNA 引物 长 度 主 要 结 构 7 1 一 5 pppApCpC/A(pN)#-2 ae | ase pppApC(pN)s 大 肠 杆菌 1 一 3 ”未 测定 中 X174 i pppA.……- SV40 一 10 pppA/G (pN)s 海胆 1 一 8 pppA/G (pN); * C/A 表示 此 位 置 是 C 或 A, N: A 和 C 较 常见 。 序 及 其 二 级 结构 的 影响 。 引 发 DNA 复制 过 程 中 需要 合成 RNA 引物 ， 这 可 以 说 是 合成 后 随 链 的 普遍 规律 。 RNA 引物 的 合成 称 为 引发 。 引 发 是 一 个 十 分 复杂 的 过 程 s 现在 知道 大 肠 杆菌 DNA 的 复制 需要 多 种 蛋白 质 和 酶 的 协同 作用 , 其 中 的 不 少 蛋 白 质 都 与 引发 有 关 ( 见 表 4-1)。 由 于 大 肠 杆 菌 的 引发 机 制 过 于 复杂 ,人 们 首先 研究 了 大 肠 杆菌 噬菌体 的 引发 过 程 。 在 大 肠 杆 菌 中 ,噬菌体 M13 DNA 可 以 利用 细菌 本 身 的 RNA 聚合 酶 ， 首 先 在 M13 单 链 DNA 上 合成 一 小 段 RNA 引物 ,然后 在 DNA 聚合 酶 的 作用 下 , 以 M13 为 模板 延伸 新 生 的 DNA 链 ， 图 4-11 表示 M13 的 全 部 复制 过 程 。 在 有 利 福 平时 ， 这 种 单 链 MI3DNA 变 为 双 链 DNA 的 反应 就 完全 被 抑制 了 ,因为 利 福 平 可 以 抑制 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 活力 ( 见 第 五 章 )。 但 是 ,在 一 种 大 肠 杆菌 的 突变 株 中 ，M13 DNA 的 合成 不 受 利 福 平 的 抑制 。 此 外 , 单 BE X174 DNA 变 为 双 链 的 RF 型 也 完全 不 受 利 福 平 的 影响 ,因此 可 能 存在 一 种 以 前 未 4 23 < 认识 到 的 RNA 合成 系统 。 追 踪 的 结果 导致 了 引发 体 (primosome) 的 发 现 。 Cer HEHKBHA. WAP. SV40 和 淋巴 细胞 内 DNA 复制 时 都 要 靠 它 来 引发 。 图 4-12 是 由 X174 单 链 DNA 转变 为 双 链 复制 型 DNA wit. aie: I. Wal, 1, 438, Wl, HA, IV, SIA. Vy EM VI 切除 (缺口 填 满 和 连接 ), 其 中 引发 前 体 (preprimosome) 由 ny n’, n”, dna By dna C Mi 六 种 蛋白 质 组 成 ， 这 六 种 蛋白 质 都 已 5 PPP PP? PESORE BNA (-) 4 h Po \ 2 DNA RF4 allt Bg 人 了 ae DHA S PRHARA yom erp 聚合 mes 1, HER 全 图 4-11 M13 由 单 链 DNA 变 为 双 链 时 的 必要 过 程 Cr aan 三 --- 引 发 体 图 4-12 X174 DNA 由 单 链 转变 为 双 链 时 的 必要 步 遇 提纯 只 有 把 六 种 蛋白 质 合 在 一 起 并 与 引发 酶 〈primase) 进一步 组 装 成 引发 体 时 才能 发 挥 其 功效 。 引发 体 可 以 像 火 车 头 一 样 在 后 随 链 上 向 分 又 的 方向 前 进 ， 并 在 模板 上 断断续续 地 引 发 生成 后 随 链 的 引物 RNA “aE CA 4-13), dm B 蛋白 的 作用 就 在 于 识别 大 肠 杆 菌 DNA ,的 起 始 位 置 ,结合 在 两 条 链 上 并 以 5 一 3 方向 运动 (图 4-14)o ° 1166 链 的 延伸 - 前 面 讨论 DNA 复制 的 引发 机 制 时 已 经 讨论 到 DNA 链 的 延伸 问题 (图 4-12 一 图 4- 14)。 链 的 延伸 是 在 DNA 聚合 酶 催化 下 进行 的 , 它 可 以 在 引物 的 3 -OH 上 一 个 一 个 地 按 模板 要 求 延 伸 新 生 链 。 在 大 肠 杆 菌 中 发 现 有 三 个 DNA 聚合 酶 ， 按 发 现 先后 分 别 叫 Pol I, Pol I 和 Pol I, 在 体内 ，Pol II 是 延伸 DNA 的 主要 的 酶 ， 这 个 酶 的 缺陷 株 4_13 ”大肠 杆菌 双向 复制 的 示意 图 起 点 niitinnttitiittutttttu: 1) 在 起 点 解 旋 2) dnaB 蛋白 结合 5’ 3 7 = RNA 引物 图 4-14 复制 时 两 个 分 又 的 双向 运动 e117 ¢ 是 致死 的 ,而 PalI 和 Pol I 的 突变 株 则 是 能 存活 的 。 按 DNA 复制 的 速率 计算 , BR 有 Pol Il 能 满足 体内 复制 的 需要 。 关于 DNA 聚合 物 的 详细 性 质 见 第 二 节 。 链 的 终止 DNA 链 在 延长 阶段 结束 后 ,就 会 迅速 地 受到 酶 的 作用 ,切除 引物 RNA. 已 经 知道 ， RNase H 能 识别 DNA-RNA 杂交 链 并 水 解 杂 交 链 中 的 RNA。 但 RNaseH 不 能 完全 去 除 RNA， 很 可 能 在 生物 体内 引物 的 除去 要 由 DNA 聚合 酶 I 来 执行 ， 因 为 这 个 酶 具有 5 一 3 外 切 酶 的 功能 。 引 物 除去 后 所 留 下 的 空缺 靠 DNA RAMI 利用 四 种 脱氧 核 彰 三 磷酸 为 原料 按 模板 的 要 求 将 空缺 补 满 。 空缺 补 满 后 再 靠 DNA 连接 酶 将 相 邻 二 个 核 苷 酸 以 磷酸 二 reine DNA 的 复制 到 此 可 以 说 告 一 段落 。 环 状 双 链 DNA 双向 复制 中 有 一 个 问题 : 复制 在 什么 地 方 终止 ? 一 般 来 说 链 的 终止 不 需要 特定 的 信号 ， 也 不 需要 特殊 的 蛋白 质 来 参与 。 例 如 鸣 菌 体 1 就 没有 特定 的 终止 顺序 。2DNA 按 6 方式 复制 时 , 它 的 终止 点 和 起 始点 相差 180 。 如 果 删 去 一 些 非 必 需 区 域 或 者 插 人 一 些 无 关 的 片段 ， 这 就 改变 了 复制 起 始点 和 终止 点 的 相 对 距离 ,如 此 一 个 突变 株 的 终止 点 仍 在 起 始点 的 180? 位 置 ,而 不 是 在 原来 的 终止 点 上 。 这 个 实验 表明 在 ADNA 分 子 上 没有 特定 的 终止 点 。 但 是 在 不 对 称 复制 时 ， 一 个 复制 叉 怎么 会 在 复制 的 中 途 停 下 来 还 很 不 清楚 。 RK DNA 复制 是 如 何 结束 的 也 有 待 进 一 步 研究 。 复制 的 忠实 性 在 双 螺 旋 模型 提出 和 DNA 聚合 酶 I 发 现 后 ,很 多 人 认为 DNA Pr 了 ,现在 看 来 并 非 如 此 ，DNA 人 生物 体 为 什么 用 这 样 的 机 制 来 复制 DNA 呢 ? ”能 不 能 用 一 种 3' 一 5' 的 复制 酶 解决 双 螺旋 反 向 平行 问题 ? 在 生物 体内 这 个 重要 的 过 程 中 为 什么 表现 得 如 此 呆板 ,在 能 量 上 如 此 浪费 呢 》 其 实 这 一 套 复制 机 制 可 能 有 利于 复制 的 调控 和 复制 忠实 性 的 维持 ,对 前 一 点 我 们 了 解 不 多 ,对 后 二 点 人 们 已 有 初步 的 认识 ，DNA 复制 的 高 度 忠实 性 要 求生 物体 具有 如 此 的 机 制 。 大 肠 杆 菌 复制 10°—10° 碱 基 对 仅 有 一 个 误差 。 如 前 所 述 ，DNA 聚合 酶 要 求 有 引物 存在 ,而 且 引物 的 3'OH 未 端 必须 和 模板 正确 配对 。 如 果 模 板 引物 带 有 一 个 错 配 的 未 端 ， 那么 聚合 酶 将 应 用 它 的 3' 一 5' 外 切 酶 活力 切 去 错 配 的 碱 基 ， 这 个 反应 一 直 进 行 到 出 现 正 确 碱 基 配 对 的 未 端 为 止 。 如 果 聚 合 酶 有 选择 正确 碱 基 的 能 力 ,同时 又 有 独立 的 校对 功能 ， 就 可 以 保证 复制 的 高 度 忠实 性 。 从 化 学 角度 估计 碱 基 误 配 的 机 率 不 可 能 小 于 10-*， 在 这 种 情况 下 ， 至 少 要 有 一 个 校对 步骤 才能 使 误差 水 平 降 到 可 以 耐 受 的 水 平 (C107 x 107% 10"), 按照 这 个 观点 ，DNA 复制 机 制 中 的 一 些 现 条 就 都 可 以 得 到 合理 的 解释 (1) 为 什么 没有 一 个 DNA 聚合 酶 具有 开始 合成 新 的 核酸 链 的 能 力 而 必须 要 用 一 个 3' 端 配对 的 引物 来 开始 一 个 新 的 链 ?》 这 是 因为 自我 校对 的 功能 必须 要 使 DNA 聚合 酶 能 识别 未 端 是 否 正确 配对 ,而 另 一 方面 如 果 要 求 酶 在 没有 引物 的 情况 下 开始 新 链 合 成 ,而 又 ¢ 118 ¢ EE RE es ee wa ee aa ea “ev Ge ee -vv 不 失去 对 碱 基 配 对 和 不 配对 的 3'OH 的 鉴别 ,这 是 目 相 矛 盾 的 。 为 了 保证 高 度 的 真实 性 ， 生物 体 就 选择 了 不 能 重新 开始 新 链 合 成 的 DNA 聚合 酶 来 复制 DNA。 (2) 为 什么 生物 体内 找 不 到 3 一 5 方向 的 聚合 酶 ? 如 果 DNA 链 是 3 一 5 AK, Il) 生长 中 的 链 5 端 带 有 活化 三 磷酸 , 这 使 得 聚合 的 误差 不 能 得 到 校正 ， 因 为 切 去 误 配 的 了 端 就 失去 进一步 合成 所 必须 的 高 能 键 , 除 非 生 物体 内 有 另 一 套 酶 系统 再 磷酸 化 5 端 ,而 这 在 能 量 利 用 上 就 不 经 济 了 。 (3) 为 什么 引物 都 是 用 RNA? 因为 RNA 引物 都 是 重新 开始 合成 的 , 它 错 配 的 可 能 性 大 ,用 RNA 做 引物 , 它 自 动 标志 这 一 般 核 彰 酸 是 必需 删 去 的 坏 拷贝 , 这 种 明显 的 区 别 在 进化 上 是 有 优越 性 的 。 小 结 | 综 上 所 述 ，DNA 的 复制 遵循 以 下 基本 法 则 : (1) 复制 是 半 保 留 的 。 (2) 复制 起 始 于 细菌 或 病毒 的 特定 位 置 ， 真 核 生 物 有 多 处 起 始点 。 因 此 大 肠 杆 菌 复 制 一 代 约 需 20 分 钟 , 而 染色 体 DNA 比 大 肠 杆 菌 大 40 倍 的 果 蝇 只 要 3 分 钟 就 可 以 完成 其 DNA 的 复制 。 (3) 复制 可 以 是 单 向 的 ,也 可 以 是 双向 的 。 双 向 复制 的 速度 不 一 定 相同 。 (4) 复制 的 速度 取决 于 起 始 。 复 制 叉 前 进 的 速度 是 比较 恒定 的 ， 原 核 生物 每 分 钟 约 A) 10° 碱 基 对 , 真 核 生 物 在 5 X 10 一 5 X 10° 碱 基 对 。 (5) 复制 时 每 条 链 都 由 5 端 向 3 端 延 长 ,每 次 增加 一 个 核 苷 酸 。 (6) 复制 是 半 不 连续 的 。 在 前 导 链 上 是 连续 的 ， 在 后 随 链 上 是 不 连续 的 。 在 动物 细 胞 中 每 个 网 崎 片段 长 约 100 一 200 个 核 苷 酸 ， 在 原核 生物 中 每 小 段 长 约 1,000 一 2,000 个 核 苷 酸 。 这 些小 片段 再 由 DNA 连接 酶 连接 到 生长 中 的 长 链 上 去 。 @) 新 生 DNA 靠 RNA 来 起 始 。 这 一 小 段 作 为 引物 的 RNA 在 以 后 被 酶 切除 。 缺 口 由 DNA 补 满 并 与 生长 中 的 DNA 连 在 一 起 。 《8) 双向 复制 有 时 在 一 固定 的 位 置 结 束 。 (9) 即使 在 一 个 单 细 胞 中 ,复制 也 可 以 采用 不 同 的 方式 。 二 、DNA 聚合 酶 和 DNA 连接 酶 DNA 聚合 酶 是 指 以 脱氧 核 背 三 磷酸 作为 底 物 催化 合成 DNA 的 一 类 酶 ， 从 广泛 不 同 的 生物 ,包括 细菌 ,植物 ,动物 中 都 发 现 这 种 酶 , 所 有 DNA 聚合 酶 作用 方式 基本 相似 ， 它们 催化 脱氧 核 背 三 磷酸 加 到 复制 中 DNA 链 的 3 羟基 末端 。 合 成 方向 是 从 53’, KR 加 的 脱氧 核 背 酸 的 种 类 由 模板 DNA 决定 。 因此 DNA 聚合 酶 需要 的 条 件 包括 四 种 脱 氧 核 背 三 磷酸 , 镁 离子 ,模板 DNA 和 引物 。 还 没有 发 现 一 种 不 需 引 物 能 重新 合成 DNA FEA Bio 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 1 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 1 是 1956 年 Kornberg 及 其 合作 者 发 现 的 第 一 个 DNA 聚 。 119。 ANS, Hct PR Kornberg 酶 。 在 各 种 DNA 聚合 酶 中 ,这 个 酶 是 研究 得 最 透彻 的 ， 它 的 一 些 特 点 代表 了 DNA 聚合 酶 的 基本 特点 ,以 下 对 这 个 酶 作 比较 详细 的 讨论 。 当 存 在 ATP、Mg'+ 时 ,大 肠 杆菌 的 无 细胞 提取 液 能 使 MC 脱氧 胸 背 变 成 酸 沉 淀 的 产 物 ;, 此 酸 沉 淀 物 用 脱氧 核糖 核酸 酶 作用 之 后 变 成 酸 不 沉淀 的 ,说 明 这 个 产物 具有 DNA 的 ， 性 质 。 以 后 用 标记 的 _dTTP 作为 底 物 , 以 酸 沉 淀 产 物 的 生成 作为 指标 ,已 把 DNA 聚合 BS I 纯化 到 相当 均一 的 水 平 。 用 比较 纯 的 酶 做 试验 发 现 , 为 了 得 到 比较 高 的 参 人 水 平 ， 除 了 变性 的 DNA 模板 和 Mgt 之 外 ,必须 有 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 同时 存在 ,缺少 任何 一 种 ， 参 人 的 水 平 将 大 大 降 - 低 。 脱 氧 核 苷 二 磷酸 不 能 代替 三 磷酸 , 用 纯 的 酶 制剂 可 以 计算 出 DNA .的 净 合 成 大 约 增 加 10 一 20 倍 , 因 此 90—95% BY DNA 是 新 合成 的 。 DNA 聚合 酶 I 还 包含 一 些 其 他 酶 活性 ,它们 是 整个 酶 分 子 的 组 成 部 分 。 其 中 三 个 外 切 酶 ,一 个 5 一 >3' 外 切 酶 ,一 个 3 一 5 外 切 酶 ,后 面 将 讨论 到 这 二 个 酶 活性 是 DNA 复制 过 程 中 所 必需 的 。 DNA 聚合 酶 [是 DNA 指导 的 DNA RAM. 但 是 新 合成 的 DNA 是 否 确实 是 在 模板 指导 下 进行 的 ? 下列 证 据 给 予 明确 的 回答 : (1) 最 明确 的 证 据 是 这 个 酶 能 忠实 地 复制 噬菌体 X174DNA， Shee 核 昔 酸 连接 酶 环 化 以 后 具有 生物 感染 活力 。X174DNA 是 由 5386 个 核 昔 酸 构成 的 单 链 DNA, MER AEGAN DNA FIER DNA, CAHIR ee MH DNA。 正 链 DNA , 同 大 肠 杆菌 DNA RAH. DNA EA. AA = BR. NAD, Me* UR RRA FRE BIA (RCE, FREE HE NY | FEWER DNA, 它 的 性 质 同 天 然 的 复制 型 (REF) 完 全 一 样 。 如 果 用 S-ARAR (BrdU) 三 磷酸 代替 dTTP, 用 a-"P 代替 非 标记 的 dATP 合成 的 REF 分 子 中 的 负 链 (图 4-15A)。 因 为 含 Brd 总 的 负 链 密度 比 正 链 要 重 些 ， 并 带 有 同位 素 标记 。 在 每 个 RF 分 子 中 用 DNase 引信 一 个 切 口 , 再 热 变性 以 后 ,可 把 正 链 和 负 链 用 密度 梯度 离心 方法 分 开 。 完 全 新 合成 的 负 链 不 含 天 然 的 正 链 DNA (J 4-15B)。 这 个 DNA 能 感染 原生 质 体 , 复 制 出 新 的 病毒 颗粒 。 现在 再 用 完全 是 人 工 合成 的 带 Brd U 的 负 链 DNA 为 模板 ,用 正常 的 四 种 dNTP 合成 RF 分 子 。 分 开 正 链 负 链 之 后 ， 这 样 获得 的 正 链 具 有 天 然 _ %X174DNA 一 样 的 感染 力 。 而 且 理 化 性 质 也 完全 同 天 然 的 一 样 (图 4-15C)。 这 个 结果 表明 DNA RABE I 能 在 模板 DNA 指导 下 忠实 地 合成 新 的 .PNAs (2) 用 DNA 聚合 酶 I 合成 的 新 DNA 样品 ,在 化 学 上 或 物理 化 学 上 的 性 质 都 同 模 板 DNA 一 样 ; 具 有 天 然 ` DNA 一 样 的 双 螺 旋 结 构 和 同样 的 分 子 融 点 ， 也 符合 AST. G=C 的 Chargaff 规则 。 用 碱 基 比 例 相差 很 大 的 DNA 作为 模板 ， 新 合成 DNA 的 碱 基 比 例 也 同 所 用 的 模板 完全 一 样 。 如 果 用 合成 的 多 聚 d(A-T) 作为 模板 ,即使 反应 混合 物 中 有 四 种 dNTP, th AA dATP 和 dTTP 参 人 到 产物 中 去 。 (3) 用 毗邻 分 析 的 方法 可 以 证 明 新 合成 的 DNA 的 顺序 同 模 板 是 完全 互补 的 DNA 聚合 酶 同 模板 和 所 有 四 种 脱氧 核糖 三 磷酸 一 起 保温 其 中 一 种 ， 璧 如 dATP 是 [c-2P] 标记 的 ,在 合成 反应 中 ,这 个 标记 的 磷酸 同 它 左边 相 邻 的 核 音 酸 (N) 结 合 。 用 脾 磷 酸 二 酯 酶 和 小 球菌 DNase 完全 水 解 以 后 产生 脱氧 核 苷 3' 磷酸 ,2?P 就 转移 到 N， 上 (N， 是 四 种 3 核 昔 酸 中 的 任何 一 种 )。 分 析 四 种 标记 的 核 苷 酸 的 含量 ,就 可 以 推 听 A 的 左 邻 d(ApA)、 ”120。 fe-2P}dATP “ dCTP dB rUTP 象 B 一 样 用 DNase 处 理 图 4-15 DNA 聚合 酶 的 实验 检查 d(CpA), d(TpA) 和 d(GpA) 在 整个 分 子 中 的 频率 ;同样 也 可 推断 其 他 各 种 二 核 背 酸 的 相对 频率 。 用 这 个 方法 可 以 证 实 新 合成 的 DNA 的 顺序 同 模板 DNA 的 顺序 是 互补 的 。 纯 的 DNA 聚合 酶 1 由 分 子 量 109,000 的 一 条 肽 链 构成 ， 每 个 大 肠 杆菌 细胞 内 大 约 @ 400 个 酶 分 子 。 用 枯草 杆菌 蛋白 酶 处 理 这 个 酶 ,获得 两 个 片 人 段 ,大 的 片段 分 子 量 76,000， 保留 聚合 酶 和 3 一 5 外 切 酶 活力 (被 叫 作 Klenow Be. S zt DNA 序列 分 析 ， 见 第 二 章 。)。 小 的 片段 分 子 量 34,000, 具有 5 一 3 外 切 酶 的 活力 。 DNA 聚合 酶 I 具有 多 种 酶 活力 。 C1) 在 引物 的 3 -OH 末端， 以 脱氧 核 背 三 磷酸 为 底 物 在 模板 指导 下 逐个 加 上 脱氧 BER. SRD HARI 1,000 个 单 核 苷 酸 。 (2) 在 没有 脱氧 核 背 三 磷酸 底 物 时 ,能 从 3 -OH 开始 以 3 一 5 方向 水 解 DNA， 产 «121 ¢ EES” 单 核 音 酸 。 (3) 从 5 一 3 方向 水 解 "DNA 链 ; 主 要 产生 5 BRM. (4) 从 3 末端 焦 磷 酸 解 DNA 分 子 。 CS) 催化 脱氧 核糖 核 背 三 磷酸 的 末端 焦 磷 酸 同 无 机 焦 磷 酸 的 交换 反应 。 后 二 个 反应 是 聚合 反应 的 逆反 应 。 在 体内 这 二 个 反应 没有 重要 意义 。 因 为 它们 需要 高 浓度 的 无 机 焦 磷 酸 。 DNA‘ 聚合 酶 1 具有 3' 一 5 的 外 切 酶 活性 ， 这 个 外 切 酶 能 识别 和 消除 不 配对 的 引物 末端 。 当 模 板 和 引物 的 末端 错 配 时 ， 即 使 存在 四 种 脱氧 核 背 三 磷酸 ，DNA 聚合 酶 也 是 首先 除去 了 错 配 的 碱 基 , 然 后 才 进 行 聚合 反应 ,因此 3 一 5 外 切 酶 活力 能 够 校正 聚合 过 程 中 的 碱 基 错 配 。DNA 聚合 酶 I 的 3 一 5 外 切 酶 活力 是 聚合 酶 的 必要 组 成 部 分 。 如 有 果 没 有 这 种 活性 ，DNA 复制 的 忠实 性 将 大 大 降低 。 叹 菌 体 T4 的 一 种 突变 株 , 变 异 率 很 高 ， 逆转 率 也 高 ,这 说 明 DNA 复制 的 忠实 性 低 , 错 误 多 。 从 这 种 突变 株 得 到 的 T4 DNA FR 合 酶 , 3 一 5 的 外 切 酶 活力 也 低 ， 因 此 降低 了 DNA 的 复制 的 忠实 性 。 另 一 种 T4 突变 株 , 具 有 很 高 的 抗 变异 能 力 , 它 的 DNA RARE 3 一 5 外 切 酶 活力 比 野生 型 要 高 得 多 ， DNA 复制 的 真实 性 十 分 好 ,变异 率 很 低 。 这 个 实验 结果 表明 ，3 一 5 外 切 酶 的 校对 功能 对 DNA 复制 是 十 分 重要 的 。 DNA AH IBAA 5 一 3 外 切 酶 活性 ， 它 能 作用 于 DNA 的 碱 基 配 对 部 分 ， 从 5 端 释放 户 核 苷 酸 ( 图 4-16)。 它 也 能 跳 过 几 个 核 音 酸 起 作用 , 所 以 它 能 除去 紫外 光照 形 BRAY Ho PREM FE DNA 损伤 修复 中 它 也 可 能 起 重要 作用 《图 4-17)e 除去 冈 崎 片 Be 5’ 端的 RNA 引物 可 能 也 有 赖 于 这 个 外 切 酶 的 活性 。 Sat G P =e et arr Se 3 SRO Nae / Ne Zz —A =t——, O P 1P 一 一 一 一 一 一 一 ted] Sieh ama oe en a P 三 磷酸 位 置 an, Al 4-16 DNA RAR I AY 5’ > 3’ 外 切 活 性 虽然 DNA 聚合 酶 1 能 延伸 DNA 链 , 图 4-18 表示 OX174 BL M13 可 以 被 Pol I 从 单 链 环 状 生 成 复制 形 产物 ， 但 是 ，DNA 聚合 酶 I 不 是 复制 大 肠 杆菌 染色 体 的 主要 聚 合 酶 ,因为 : C1) 纯 的 酶 催化 核 苷 酸 参 人 的 速率 约 每 分 钟 1,000 个 核 昔 酸 ， 而 体内 实际 的 合成 速 率 要 比 这 个 速率 高 二 个 数量 级 。 (2) 大 肠 杆菌 有 一 种 突变 株 , 从 中 分 离 出 来 的 DNA RAM I 的 活性 是 正常 的 ， 但 染色 体 复制 是 不 正常 的 。 (3) 说 明 DNA 聚合 酶 I 不 是 大 肠 杆 菌 主要 的 复制 酶 的 最 有 力 的 证 据 是 分 离 到 一 个 “122。 4-17 DNA AREA | 工 删除 胸腺 喀 啶 双 体 突变 株 (PolA-)， 它 的 DNA RAR 1 的 活力 仅仅 是 野生 型 的 1 多 ， 但 它 的 复制 是 正常 的 。 这 个 突变 株 减低 了 冈 崎 片 眉 连 接 的 活力 ,增加 了 对 紫外 光 \ 烷 化 剂 和 离子 辐射 的 敏感 性 。 这 意味 着 DNA 聚合 酶 I 在 大 肠 杆菌 DNA 复制 中 不 是 主要 的 合成 酶 ,而 是 在 除去 RNA 引物 和 损伤 修复 中 起 作用 。 大 肠 杆菌 DNA Rss Il 纯化 的 DNA .聚合 酶 I 分 子 量 90,000 一 120,000,。 由 一 条 肽 链 构成 。 它 也 是 从 5 一 3 方向 合成 DNA， 达 到 最 大 活力 需要 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 ，Mg“, NH+ 和 一 个 带 50 一 200 碱 基 对 缺口 的 双 链 DNA， 当 缺口 加 大 时 ,反应 速度 降低 ， 但 加 入 DNA 结合 蛋白 时 能 恢复 到 原来 的 活力 。 这 个 酶 也 需要 带 3'-OH 末端 的 引物 , 具有 3 一 5 的 外 切 酶 活性 ， 但 没有 5 一 3” 外 切 酶 活性 。 它 的 合成 速率 比 体内 的 速率 要 低 得 多 ， 带 有 这 个 酶 缺陷 的 大 肠 杆 菌 突 变 株 染色 体 的 复制 各 方面 都 正常 , 它 在 体内 的 功能 可 能 和 DNA RGM IB * 123° : 5 3 5) as 2 3'-> 5" x174 退火 re or —— M13 5 RAS SS 3 5'->3’ 4 外 切 Threw eee ee 图 4-18 DNA RAB! E5|\HMEUH DNA 链 Ch Ri FAAS HD = FB HED Wo 大 肠 杆 菌 DNA RSH Ill SHH 带 有 DNA RAMS MW 的 温度 敏感 突变 (pol C) 的 大 肠 杆 菌 在 限制 温度 是 不 能 存活 的 ,从 这 种 菌株 得 到 的 裂解 小 也 不 能 合成 DNA， 当 加 入 正常 细菌 的 DNA AAAS II 时 可 以 恢复 它 的 聚合 能 力 , 因 此 不 同 于 DNA 聚合 酶 I 和 I, RAM II 是 体内 DNA 复 制 所 必需 的 酶 。 虽然 每 个 大 肠 杆菌 只 含 10 个 DNA RAB II 分 子 ， 然 而 它 的 合成 速 率 达 到 了 体内 DNA 合成 的 速率 。 类 似 DNA RAR [, DNA RAB II 具有 3 一 5 和 5 一 3 的 外 菇 酶 活力 。 纯 的 DNA RAS II 不 能 利用 带 有 引物 的 长 的 单 链 DNA 作为 底 物 ,而 也 象 DNA 聚合 酶 贡 一样, 可 利用 带 缺 口 的 双 链 DNA 作为 底 物 ,但 是 KAD RAB I ATH 所 说 的 Pol IT) 能 利用 单 链 DNA 作为 模板 。 大 肠 杆菌 DNA RA Il 全 酶 由 多 种 亚 基 组 成 ,这 些 亚 基 很 容易 解 离 , 而 且 在 每 个 大 肠 杆菌 中 只 有 10 到 20 个 酶 分 子 ， 因 此 不 易 获 得 均一 的 纯 酶 。 仅 在 不 久 前 才 对 其 性 质 有 一 定 了 解 。 但 每 一 组 分 起 什么 作用 还 不 十 分 清楚 。 在 DNA Pol III 全 酶 中 , 由 c\ss6 三 种 亚 基 组 成 全 酶 的 核心 部 分 Pol IE) ， 但 此 核心 只 有 很 低 的 酶 促 活性 ， 加 上 + WH 后 ,组 成 的 Pol II 就 可 以 利用 长 的 单 链 DNA 为 模板 了 。 但 Pol II 在 SSB 包围 了 单 链 DNA 模板 后 就 完全 不 能 表现 出 酶 活性 来 ,因此 各 个 亚 基 都 有 一 定 用 处 。 Pol Ill, Pol II 和 Pol II* 都 是 不 完整 的 Pol III SR WR 4-3, 参 阅 表 4-1)( 第 105 页 )。 Pol I 全 酶 由 工 个 < 亚 基 、1 个 se 2 个 81 个 r\ 2 个 yY\、 1 个 5 和 1 个 6 共 九 个 亚 基 组 成 在 复制 时 DNA Rahs II 全 酶 十 分 重要 , 它 可 以 在 DNA 的 单 链 模板 上 ， 在 引物 的 3'OH 上 以 每 分 钟 约 60,000 个 核 背 酸 的 速率 逐个 延长 新 生 的 DNA 链 。 三 种 酶 的 性 质 比 较 见 表 4-4e 。124。 4-3 DNA RES Ill 全 酶 的 组 成 了 人 FH x 10° 其 他 名 称 a 140 dnaE 蛋白 ，pol CHA + 25 Poy Ul 6 10 Pol III’ Tt 83 Pol III* 到 52 6 32 dnaZ 蛋白 AF Ul, dna X BA 因子 I,dnaN A, copol III* js= II 8 37 R44 三 种 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 性 质 的 比较 Pol I Pol II Pol III 功能 : S'>3' RA + + + 3 一 5 外 切 十 + ， 于 ->3 ”外 切 十 一 十 焦 磷 酸化 和 PPi 交换 十 十 模板 -引物 : 完整 双 链 一 一 一 有 引物 的 单 链 ~ 一 = 有 断口 的 双 链 (多 聚 dAT) ~ 一 = 有 缺口 的 双 链 或 5” 端 突出 的 单 链 : BREE <100 KER + + + MeER>100 BEE 十 二 = 分 子 量 X1000 109 120 140 每 个 菌 体 中 的 分 子 数 (估计 值 ) 400 10—20 结构 基因 polA pol B polC 真 核 生 物 中 的 DNA ROB 所 有 责 核 生物 中 的 聚合 酶 的 性 质 基本 上 同 大 肠 杆 菌 中 的 聚合 酶 相似 ， 它 的 活性 有 赖 于 模板 , 带 3-OH 的 引物 ,四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 。 动 物 细胞 的 DNA 聚合 酶 活性 分 布 在 好 几 个 细胞 级 分 中 ,但 至 今 只 对 可 溶性 的 DNA 聚合 酶 研究 得 比较 多 。 DNA 聚合 酶 在 迅速 增殖 的 细胞 中 活力 最 高 。 这 个 酶 的 分 子 量 在 165,000—175,000 之 间 。 它 的 最 合适 的 底 物 是 带 缺 口 的 双 链 DNA， 但 是 带 引 物 的 变性 DNA 也 是 很 好 的 底 物 。 它 同 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 最 大 不 同 之 处 在 于 不 含 外 切 酶 活性 。 DNA 聚合 酶 p 是 一 个 小 分 子 量 (43,000) 的 聚合 酶 。 在 整个 细胞 周期 中 它 的 活力 没 有 变化 , 它 利用 DNase I 处 理 过 的 天 然 DNA 作 模 板 , 对 变性 的 DNA 几乎 没有 活力 ,这 个 酶 也 没有 外 切 酶 的 活力 。 DNA 聚合 酶 > 是 一 个 大 分 子 酶 ,在 细胞 内 含量 很 低 , 因此 不 容易 纯化 。 这 个 酶 可 以 使 用 带 缺 口 的 DNA 作为 底 物 ,但 用 多 聚 (A): BK (dT) 作为 底 物 ， 酶 活力 更 高 ， 因此 象 是 一 个 反 向 转录 酶 。 DNA RAK c 可 能 是 真 核 生 物 的 复制 酶 ,主要 的 根据 是 聚合 酶 “ 的 活性 随 细胞 周期 . 125 . Mek EME lh, RAR HEM DNA 合成 的 周期 是 一 致 的 。 而 聚合 酶 f 的 活力 升 高 要 滞后 一 段 时 间 , 在 HeLa 细胞 中 ,聚合 酶 的 活力 从 G 期 开始 升 高 10 倍 :一 ELS 期 结束 , 酶 活力 也 降低 ,而 聚合 酶 8 在 整个 过 程 中 没有 变化 。 DNA 连接 酶 DNA 连接 酶 催化 一 个 DNA 链 的 5 磷酸 根 与 另 一 个 DNA 链 的 3 羟基 形成 磷酸 二 酯 键 ， 但 是 这 二 个 链 必需 都 与 同一 个 互补 链 结合 ， 二 个 链 必须 是 相 邻 近 的 。 连 接 所 需 的 能 量 或 来 自 NAD+ (如 大 肠 杆 菌 ) 或 ATP (如 T4 诱导 的 连接 酶 和 动物 细胞 中 的 连接 Be). T4 诱导 的 连接 酶 不 仅 能 在 模板 上 连接 DNA 和 DNA 之 间 的 切口 ， 也 能 连接 RNA—RNA, RNA—DNA, #1 DNA—RNA ZVIHIWWH. 大 肠 杆菌 连接 酶 只 能 连接 DNA 和 RNA 一 DNA 之 间 的 切口 。IT4DNA 连接 酶 不 仅 能 连接 双 链 DNA 中 的 单 链 切 口 或 双 链 的 粘性 未 端 ， 而 且 能 连接 无 单 链 粘性 未 端的 平头 双 链 DNA， 大 肠 杆 兰 连接 酶 则 不 行 。 酶 的 反应 机 制 是 ATP( 或 NAD*) 先 与 酶 连接 成 共 价 中 间 体 E-AMP。E-AMP 和 产物 形成 高 能 的 焦 磷酸 键 Ap-p-DNA， 这 个 中 间 体 和 相 邻 的 DNA 的 3 -OH 结合 成 磷酸 二 酯 键 ( 见 第 十 章 )。 DNA 连接 酶 在 DNA 复制 重组、 修复 中 的 作用 是 明显 的 ,缺陷 DNA 连接 酶 的 大 肠 杆 菌 突变 株 中 冈 崎 片段 积累 ， 对 紫外 光敏 感性 增加 ， 每 个 大 肠 杆菌 约 有 300 SERS 33 ¥ » 30°C 每 分 钟 能 连接 7,500 个 切口 而 在 实际 过 程 中 , 每 分 钟 大 约 只 有 .200 切口 需 要 连接 ,因此 连接 酶 的 含量 对 DNA 复制 而 言 是 足够 的 。 三 、DNA 双 螺 旋 的 解 开 DNA 是 双 螺 旋 ， 在 复制 中 双 螺 旋 要 解 开 ,而 螺旋 的 解 开 使 得 复制 叉 前 面 产 生 正 超 螺 旋 , 如 果 这 些 应 力 不 以 某 种 方式 释放 将 妨碍 复制 又 前 进 ; 如 果 让 这 些 超 螺旋 传 到 分 子 未 端 Ai NABH aia, DNA 分 子 必须 每 分 钟 要 转 20,000 转 左 右 。 而 且 环 状 分 子 还 不 能 以 这 个 方式 释放 正 的 超 螺旋 ， 除 非 分 子 内 有 一 个 切口 使 链 可 以 自由 转动 。 现 在 已 找 到 一 些 酶 和 蛋白 质 ， 它 们 或 者 能 使 DNA 双 链 变 得 易于 解 开 , 或 者 可 以 使 超 螺旋 分 子 松 弛 ,以 下 将 介绍 一 些 这 类 蛋 白 。 单 链 结合 蛋白 〈single-strand binding protein， 人 简称 SSB) 最 初 发 现 史 菌 体 T4 的 基因 32 蛋白 可 以 在 远 低 于 Tu 的 温度 下 使 双 链 DNA HF, 并 牢 牢 地 结合 在 单 链 DNA 上 ,后 来 发 现 多 种 生物 中 都 有 这 类 蛋白 。 在 文献 中 ， 这 类 和 蛋 白 曾 使 用 过 多 种 名 称 ; 解 旋 蛋白 Cunwinding protein)、 熔 化 蛋白 (melting protein)， 螺 旋 降 稳 蛋 白 helix destabilizing protein), 从 原核 生物 得 到 的 SSB 与 DNA 结合 时 表现 出 协同 效应 〈 图 4-19)。 比如 第 一 个 SSB 结合 到 DNA 上 去 的 能 力 为 1 第 二 个 SSB 结合 能 力 高 达 10?, 这 可 能 由 于 蛋白 质 和 蛋白 质 之 间 的 互相 作用 增强 了 结合 能 力 , 也 可 能 由 于 第 一 个 SSB 的 结合 使 DNA 链 的 结 构 发 生 了 变化 ;有 利于 后 来 的 SSB 与 DNA 相 结合 , 极 有 可 能 二 者 兼 而 有 之 。 从 真 核 生物 如 牛 、 鼠 和 人 细胞 中 得 到 的 SSB SR DNA 结合 时 没有 表现 出 协同 es {26.6 RARE me 图 4-19 原核 生物 单 链 结合 蛋白 的 协同 作用 效应 。 SSB 能 刺激 同 源 的 DNA 聚合 酶 活力 。 如 T4 的 基因 32 蛋白 能 刺激 T4DNA FR 合 酶 的 活力 ,但 不 能 刺激 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 的 活力 ,反之 亦 然 。 SSB 能 使 天 然 DNA 的 融 点 降低 ,这 可 能 不 是 它 在 体内 的 唯一 生物 功能 。 单 链 DNA 与 SSB 结合 之 后 能 抵抗 核酸 水 解 酶 的 作用 。 如 大 肠 杆菌 SSB 能 保护 单 链 DNA 不 受 脱氧 核糖 核酸 酶 .蛇毒 磷酸 二 酯 酶 、S' 核酸 酶 、 红 色 链 胞 霉 内 切 酶 以 及 DNA RA I 和 II 的 3 一 5 外 切 酶 的 降解 ， 但 对 小 球菌 核酸 酶 、 大 肠 杆菌 外 切 酶 I 仍然 敏感 ， 因 此 SSB 的 另 一 个 重要 生物 功能 可 能 就 在 于 保护 复制 中 的 DNA 单 链 部 分 不 被 核酸 酶 降解 。 真 核 生物 的 SSB 和 原核 生物 的 SSB 可 能 有 些 不 同 ， 原 核 的 SSB 同 双 链 DNA 结 合 的 能 力 很 弱 , 而 真 核 的 SSB 有 一 定 结合 能 力 ; 原 核 的 SSB 能 促使 变性 DNA 复 性 , 而 HRN SSB 没有 这 种 能 力 。 因 此 原核 SSB 的 作用 方式 是 它 先 结合 已 存在 的 单 链 区 ， 并 从 此 侵蚀 双 链 部 分 ,而 真 核 的 SSB 是 先 结合 DNA 双 链 并 使 之 融化 (图 4-20)。 二 a ar 人 白 ， co Al4-20 BHAAER AN Rh DNA 解 链 酶 (DNA helicase) 有 一 类 能 通过 水 解 ATP ARGS SEER IT GE DNA 的 酶 称 为 DNA 解 链 酶 。 表 4-5 列 出 了 这 些 酶 的 部 分 性 质 。 解 链 酶 分 解 ATP 的 活力 依赖 于 单 链 DNA 的 存在 。 如 果 双 链 DNA PA MEER e127» R45 解 链 酶 的 性 质 解 链 酶 来 源 Fmx1000) BRE | 方 向 酶 分 子 数 /细胞 功能 ABFA I 180 十 _ 53’ 600 KA ; fill ABH U = 5-53 6000 (和 Led 5 大 肠 杆菌 III + 5’ 3’ 20 未 知 大 肠 杆 菌 rep 十 3’->5’ 50 (ox174' M13) 大 肠 杆 菌 引 发 体 (n“, dna B) 十 5 一 3 20 引发 大 肠 杆 菌 rec BC 重组 大 肠 杆菌 rec A 2000 重组 T4 基因 41 5 ->3 引发 T4 dda = 6000 未 知 T7 基因 4 十 5 -3 引发 人 细胞 5 ->3 未 知 端 或 缺口 , 则 DNA 解 链 酶 可 以 首先 结合 在 这 一 部 分 ， 然 后 逐步 向 双 链 方向 移动 。 复制 时 大 部 分 DNA 解 链 酶 可 以 沿 着 后 随 链 模板 的 5 一 3' 方向 随 着 复制 叉 的 前 进而 移动 ; 只 有 rep 蛋白 是 沿 前 导 链 模板 的 3' 一 5 方向 移动 。 因此 在 复制 时 很 可 能 rep 蛋白 和 某 种 人 | wamn ns 图 4-21 解 链 蛋 白 和 rep 蛋白 的 协同 作用 DNA 解 链 酶 分 别 在 DNA 的 两 条 母 链 上 协同 作用 ， 以 解 开 双 链 DNA (图 4-21)。 已 经 发 现 ,有 些 DNA 解 链 酶 同时 还 有 引发 酶 的 功能 ， 例 如 喉 菌 体 T7 的 基因 4 蛋 白 可 以 优先 与 单 链 DNA 结合 ,并 在 母 链 的 5 一 3 方向 靠 水 解 NTP 而 移动 并 解 开 双 链 ， 直到 DNA 母 链 的 某 一 专 一 识别 位 置 , 这 时 它 就 可 以 按 模板 的 要 求 而 合成 小 片段 的 RNA 作为 后 随 链 的 引物 ,比较 多 的 引物 链 是 pppACCC 或 pppACCA (图 4-22)。 s NOP+P; ? i Coe 3 ap, / T7DNAKXAKB-—— CCCAG LLL : 2 _— a 3 4-22 17 基因 4 蛋白 的 解 链 作用 和 引发 作用 拓扑 异 构 酶 I (type [ topoisomerase， 简 称 Topo 1) 最 初 从 大 肠 杆菌 中 分 离 到 一 种 酶 叫 吕 蛋白 , 它 可 以 将 共 价 闭环 状 的 超 螺旋 DNA 变 sa 128 。 为 松弛 态 ,而 并 不 改变 其 化 学 组 成 或 结构 。 由 于 反应 的 产物 还 是 闭环 状 DNA, 因此 酶 反 应 的 机 制 只 能 是 先 切 开 双 链 DNA 中 的 一 条 链 , 使 链 的 末端 沿 螺旋 轴 按 拧 松 超 螺 旋 的 方 向 转动 ,然后 再 把 切口 封 起 来 。 后 来 发 现 这 种 酶 广泛 存在 于 各 种 生物 中 ,不 同学 者 曾 分 别 给 以 各 种 命名 :， 转轴 酶 〈swivelase) ， 松 旋 酶 Cuntwisting enzyme), DNA 松弛 酶 CDNA relaxing enzyme)， 切 割 封 口 酶 (nicking-Closing enzyme) Topo | 酶 松弛 超 螺旋 DNA 时 不 需要 ATP， 它 可 以 催化 三 种 拓扑 转换 反应 〈 图 4- 2 3 站 图 4-23 “拓扑 异 构 酶 工 的 作用 Topo | 酶 在 复制 中 的 作用 还 不 十 分 清楚 , 某 一 大 肠 杆 菌 的 突变 株 是 没有 Topo I 酶 基 因 的 ,但 它 的 生长 速度 只 比 正 常 细菌 稍稍 慢 一 点 ,因此 它 并 不 是 细菌 生长 必 不 可 少 的 酶 拓扑 异 构 酶 IL (type II topoisomerase, (2K Topo IL) 拓扑 异 构 酶 I 又 称 DNA 旋转 酶 (DNA gyrase) 或 紧 旋 拓扑 异 构 酶 (twisting to- poisomerase)。 它 由 两 个 & 亚 基 和 两 个 8 WHAM, 拓扑 异 构 酶 工 可 以 在 水 解 ATP 的 同时 使 松弛 态 环 状 DNA 转变 为 负 超 螺旋 DNA， 其 反应 机 制 不 同 于 拓扑 异 构 酶 1, 每 次 引起 的 超 螺旋 数 变化 为 2( 见 图 4-24)。 这 种 反应 说 明 拓 扑 异 构 酶 I 每 次 能 使 DNA 的 两 条 链 同 时 切断 ,让 另 一 条 双 链 DNA Sitio, 再 将 已 切断 的 末端 重新 封 接 起 来 ,其 反应 过 程 可 参考 图 4-25。 图 4-24 拓扑 异 构 酶 U 的 符号 变换 反应 2 —__ WT IDNA RHE 图 4-25 ”拓扑 异 构 酶 U 的 作用 机 制 拓扑 异 构 酶 不 能 非常 专 一 地 识别 DNA 的 顺序 ,但 常见 的 结构 是 c’—-TATYGNTN by My! oe pp wee) Or ov ae i, A TAY GaN A Ny NAS’, 在 加 工 过 程 中 ,两 条 链 也 不 是 平头 的 (临时 切断 处 用 箭头 表示 ), 两 条 链 之 间 相 差 四 个 核 昔 酸 。 SV40 单 体 图 4-26 Topo II 的 功能 示意 图 垂直 箭 号 表示 在 Topo II 作用 下 ,逐渐 拓扑 异 构 化 过 程 ; 横向 箭 号 表示 DNA 合成 ;最 后 得 到 二 个 分 开 的 超 螺旋 单 体 。 Topo Il 在 没有 ATP 时 ,可 使 超 螺 旋 DNA 变 为 松弛 态 。 Topo Il 广泛 存在 于 各 种 生物 中 , 其 功能 十 分 重要 ， 它 是 完成 复制 所 必须 的 一 种 酶 ， s。 130° 至 少 可 以 使 完成 了 复制 的 两 个 子 代 环 状 双 链 DNA 互相 分 开 。 图 .4-26 表示 SV40 DNA 在 Topo I 作用 下 的 复制 与 子 代 DNA 的 分 开 。 四 、 真 核 生 物 DNA 的 复制 真 核 生 物 的 DNA 比 原核 的 大 得 多 ,而 且 都 和 组 蛋白 一 起 构成 核 小 体 。 因此 真 核 生 物 DNA 的 复制 有 一 些 原 核 生 物 所 没有 的 特点 。 核 小 体 和 染色 体 真 核 生 物 的 DNA 通常 总 与 许多 蛋白 结合 在 一 起 ,以 染色 质 的 形式 存在 于 细胞 核 中 ， 在 染色 质 中 组 蛋白 的 重量 约 占 一 半 左 右 。 组 蛋白 的 组 成 和 结构 都 是 非常 保守 的 ， 几 乎 所 有 的 真 核 生物 中 都 可 以 找到 五 种 组 蛋白 : Bl HI, H2A, H2B, H3 和 H4, 它们 在 不 同 的 生物 和 不 同 的 器 官 中 都 有 十 分 相似 的 氨基 酸 排 列 顺序 。 其 中 H4 特别 保守 , 牛 、 鼠 和 猪 的 H4 性 质 完全 相同 ,其 结构 与 殉 豆 的 H+ 相 比 也 只 有 两 个 氨基 酸 不 同 : MARAF 亮 氨 酸 所 取代 , 赖 氨 酸 为 精 氨 酸 所 取代 。 染色 质 是 由 核 小 体 串 连 而 成 的 。 在 第 二 章 已 经 介绍 过 ， 核 小 体 结构 的 发 现 是 近年 来 生物 化 学 中 很 重要 的 进展 之 一 ，A. Klug 博士 为 此 获得 了 1982 年 的 诺 贝 尔 奖 。 染色 质 中 DNA 接头 区 是 十 分 柔软 的 , 因此 可 以 人 允许 串珠 状 的 染色 质 按 某 种 方式 进 一 步 绕 。 细胞 核 内 的 染色 质 非 常 细 , 只 有 在 电子 显微镜 下 才能 看 到 。 但 是 到 了 细胞 分 裂 期 ,在 核 内 的 染色 质 会 发 生 形态 和 结构 的 重大 变化 ,形成 高 度 紧密 的 染色 体 〈 图 4-27)。 经 碱 性 染料 染色 后 ,即使 在 光学 显微镜 下 也 可 以 看 到 染色 体 的 棒状 小 体 。 os ne ee ee A ae Al4-27 ”人 染色 体 12 的 电子 显微镜 照片 染色 体 以 两 根 平 行 的 染色 丝 〈chromonema)- 为 主体 ， 其 中 有 一 个 不 易 染 色 的 小 颗粒 叫 着 丝 点 〈centromere)。 整个 染色 体 由 一 条 连续 的 双 链 DNA 贯穿 着 , 即使 在 着 丝 点 也 不 断 。 动 物 细胞 每 条 染色 体 中 DNA 的 长 度 不 一 ， 长 的 可 达 4 厘米 左右 ,其 分 子 量 约 为 80 x 10’, 各 种 生物 的 细胞 核 中 染色 体 的 数目 是 不 同 的 。 人 的 细胞 核 中 共有 16 条 染色 体 , 其 中 两 条 是 性 染色 体 , 人 的 染色 体 DNA 长 度 约 为 1.6 厘米 到 8.2 厘米 《相当 于 分 子 量 3.2 X 10’—160 X 10’), 细胞 周期 和 复制 起 始 真 核 细 胞 的 生命 周期 可 以 分 为 四 个 时 期 : Gi. S. G. #1 M， 如 图 4-28 所 示 。 这 四 个 时 期 所 经 历 的 时 间 明 显 不 同 ,动物 细胞 组 织 培养 时 SG. 和 M 期 的 三 段 时 间 是 相对 稳定 的 。S 期 即 DNA 复制 的 时 间 约 为 7 小 时 ，G， 期 即 有 丝 分 裂 前 的 准备 期 约 为 4 小 时 ,有 丝 分 裂 过程 为 1 小 时 ,而 G. 期 所 需要 的 时 间 较 长 并 有 很 大 的 变动 范围 ， 一 般 在 12 小 时 以 上 ,但 也 有 短 的 ,例如 酵母 菌 可 以 在 1.4 小 时 内 繁殖 一 代 。 在 分 化 的 细胞 中 ，G: 期 可 以 进行 DNA 复制 前 准备 ,而 在 非 分 化 的 细胞 中 , 可 以 存 在 一 个 性 质 上 完全 不 同 的 Go 期 ， 这 时 细胞 处 于 静止 状态 ， 成 年 组 织 大 部 分 细胞 都 处 于 Gy Ho 从 Gu 转 为 G: 的 关键 反应 是 什么 目前 还 不 清楚 ,但 有 些 化 合 物 如 Ap\A《 见 第 九 章 第 五 节 ) 可 以 明显 地 促进 细胞 由 G 期 转 人 G 期 。G, 期 对 细胞 的 生长 周期 是 非常 重要 的 。 真 核 生物 染色 质 的 复制 与 原核 生物 DNA 的 复制 有 三 个 明显 的 不 同 之 处 : 〈1) 真 核 生物 每 条 染色 质 上 可 以 有 多 处 起 始点 ,而 原核 生物 总 是 只 有 一 个 起 始点 ; 〈2) 真 核 生物 的 染色 体 在 全 部 复制 完成 之 前 ， 各 个 起 始点 上 DNA 的 复制 不 能 再 开始 , 而 在 快速 生长 的 pp 大 es . 4 o ~ wow “ 进 和 DNA Bl 一 oo” vs 小 时 mm we 8 一 9 图 4-28 真 核 细胞 的 生长 周期 。132。 原核 生物 中 ,在 起 始点 上 可 以 连续 地 开始 新 的 DNA 复制 ; (BRAM DNA 复制 起 始 点 并 不 固定 在 某 一 DNA 顺序 处 ,在 酵母 基因 组 的 400 多 处 有 一 种 自发 复制 顺序 ars(au- tonomous replicating sequence)， 这 种 顺序 广泛 存在 于 线粒体 中 ,但 在 大 肠 杆 菌 中 却 是 找 不 到 的 。 DNA 复制 单元 或 复制 子 (DNA replication unit 或 replicon) 如 上 记述, 原核 生物 如 大 肠 杆 菌 DNA 复制 时 只 有 一 个 复制 起 始点 ,然而 在 真 核 DNA 的 复制 时 有 多 个 复制 起 始点 。 在 哺乳 动物 复制 中 的 DNA 放射 自 显影 图 上 可 以 看 到 很 多 复制 眼 , 每 个 复制 眼 都 有 独立 的 起 点 。 双 向 延长 〈 见 图 4-6 IID)。 每 一 个 这 样 的 DNA 单位 称 为 复制 单元 。 复 制 单 元 大 小 是 不 均一 的 ,大 约 15 一 300wm(45 一 900kb),， 大 多 数 在 10—100um 之 间 。 各 种 不 同 的 生物 其 复制 单元 的 大 小 有 区 别 ， 就 是 同一 种 生物 在 不 同 的 生长 条 件 下 复制 单元 的 大 小 也 有 区 别 , 同 一 个 DNA 上 不 同 的 复制 单元 大 小 也 不 均一 , 生 长 比较 快 的 细胞 ,复制 单元 也 短 一 些 。 另 外 病毒 感染 也 影响 复制 单元 大 小 ,例如 SV40 转 化 的 中 国 田 鼠 细胞 的 起 始 间 隔 就 比 未 转化 的 要 小 。 如 果 用 SV40 的 工 抗原 温度 突变 株 转 化 的 细胞 ,在 允许 温度 复制 单元 要 短 些 ， 而 在 限制 温度 复制 单元 的 大 小 恢复 到 正常 ,这 些 实验 都 指出 ， 复 制 单 元 的 大 小 受 功能 方面 的 因素 影响 。 另 一 方面 ,有些 工 作者 认为 复制 单元 的 大 小 可 能 受 染 色 体 的 结构 控制 ,在 果 蝇 的 多 线 染色 体 中 ,一 个 横 带 所 含 的 DNA 就 是 一 个 复制 单元 。 几 个 邻近 复制 单元 可 能 组 成 复制 单元 簇 ， 复 制 单元 簇 可 以 由 少 至 二 个 复制 单元 多 达 250 个 复制 单元 构成 。 复 制 单元 簇 是 受 协同 调节 的 ,不 同 的 复制 单元 往 在 开始 复制 的 时 间 上 有 先后 ， 同 一 复制 单元 簇 各 个 复制 单元 基本 是 同步 的 ， 若 用 射线 或 抑制 剂 抑制 DNA 合成 的 起 始 , 则 同一 复制 单元 簇 呈 协同 一 致 的 反应 。 染色 体 的 合成 在 真 核 生 物 DNA 复制 的 同时 组 蛋白 也 在 不 断 产生 ,因此 新 生成 的 DNA 可 以 很 快 地 与 组 蛋白 结合 在 一 起 。 在 染色 体 复制 过 程 中 亲 代 组 蛋白 是 同 新 合成 的 组 蛋白 打 乱 重新 组 合 分 配 到 子 代 中 ， 还 是 亲 代 组 蛋白 作为 一 个 整体 传 下 去 ? 用 鸡 肌 母 细胞 作为 材料 , ACH] MAR “CK 5N 氮 基 酸 标 记 染 色 体 ,从 这 种 细胞 中 分 离 核 小 体 , 每 个 核 小 体 中 的 组 蛋白 用 化 学 方法 交 AR DNA 后 分 析 交 联 的 组 蛋白 密度 , 尽管 新 合成 的 组 蛋白 仅 占 总 组 蛋白 七 分 之 一 ， 然而 所 有 新 合成 的 组 蛋白 都 含有 标记 同位 素 ， 这 表明 新 合成 的 组 蛋白 和 老 的 组 蛋白 是 不 混杂 的 。 这 个 实验 证 明 核 小 体 复 制 进程 中 , DNA 复制 是 半 保 留 的 ,而 组 蛋白 却 以 全 保留 的 方式 传 给 子 代 。 五 、DNA 复制 的 调控 分 子 生 物 学 家 们 并 不 满足 于 对 DNA 复制 过 程 的 观察 和 描述 , 而 是 希望 了 解 复 制 过 程 中 各 种 酶 和 和 蛋白质 的 作用 ，, 它们 与 DNA 的 关系 以 及 复制 是 怎样 受到 调节 和 控制 的 。 现 以 1DNA 为 例 来 说 明 原 核 生物 中 DNA 复制 是 怎样 调节 的 。 «133° Wi ead A A 以 及 其 他 若干 种 温和 叹 菌 体 是 非常 令 人 感 兴趣 的 , 它们 的 DNA 不 但 可 以 自主 地 进行 复制 ;也 可 以 转变 为 溶 原状 态 ， 即 插 和 人 到 大 肠 杆菌 的 染色 体 中 ,从 而 与 寄主 处 于 共生 的 潜伏 状态 ,这 时 1 DNA 的 基因 都 不 积极 活动 〈 见 第 二 章 )。 因 此 这 类 温和 鸣 菌 体 成 为 我 们 了 解 原核 生物 中 DNA 复制 调控 过 程 的 良好 实验 材料 。 MRK. 是 一 个 带 有 长 尾 的 20 面体 ， 头 部 蛋白 外 壳 中 含 48Kb 长 的 一 条 DNA。 4 DNA 线 状 分 子 两 端 有 12 个 核 音 酸 长 度 的 粘性 末端 (图 4-29)。 3 ad GCGCCCA cccGccGcTcGA 。 GGGCGGCGACCT 了 GTTAcG 5 =" . 3 粘性 末端 | 4-29 ADNA 的 粘性 未 端 Mak. 遇 到 大 肠 杆 菌 后 ,其 尾部 的 三 个 蛋白 分 子 (为 1 DNA 中 丁 基因 所 编码 ) 可 以 专 一 地 识别 寄主 的 菌 壁 。 鸣 菌 体 将 其 DNA 注 人 大 肠 杆菌 后 , 线 状 的 1 DNA 分 子 立刻 靠 粘性 末端 ,连接 酶 、 拓 扑 异 构 酶 I 以 某 种 尚 不 知道 的 机 制 很 快 地 转变 为 超 螺旋 状 态 。 这 时 寄主 就 面临 着 两 种 完全 不 同 的 命运 。 一 种 是 1 DNA EAMES, PEELE 个 有 感染 活力 的 新 病毒 ， 直 接 导 致 寄主 的 裂解 和 死亡 , 另 一 种 是 1DNA 插 人 寄主 的 “ 染 tk? DNA 中 。 两 条 道路 的 选择 取决 于 当时 寄主 和 喉 菌 体 中 的 多 种 因素 ,这 些 因素 的 微 妙 平衡 综合 在 一 起 可 以 决定 基因 采用 那 种 表达 方式 。 Jacob 等 人 首先 研究 了 复制 子 的 调制 。 所 谓 复制 子 是 遗传 上 的 一 个 复制 单元 ,其 中 有 一 个 特定 的 复制 起 始点 可 以 作为 一 个 整体 而 被 复制 。 最 简单 的 复制 子 之 一 是 只 菌 体 1 申 占 10% AJ—Be DNA, 称 为 Advo Adv 是 人 工 制造 的 环 状 DNA 〈 见 图 4-30)。 它 包括 O..Pi vc ,OgyPaycro,cll,ori,O,P 等 基因 ， 其 中 dl 不 是 自我 复制 所 必需 的 基因 , 但 PR、 O,,cro,O, Pyori 基因 都 是 必 不 可 少 的 。 它 与 转录 的 控制 基因 紧 挨 在 一 起 〈 见 第 二 章 图 2-11)。 这 是 一 个 能 自我 调控 的 复制 子 , 这 个 调控 是 通过 基因 cro 的 产物 cro 蛋白 结合 在 P,,O, 处 ,能 阻止 co 蛋白 本 身 的 产生 ,同时 也 能 调节 基因 P、O 二 个 产物 的 生成 ,因为 这 二 个 基因 也 是 从 PakOx 开始 转录 的 ,转录 本 身 也 是 复制 起 始 所 必须 的 ,起 始点 附近 没有 这 转录 起 始点 就 不 能 活化 ,有关 的 机 制 还 不 清楚 。 基 因 O 和 了 ?的 产物 是 复制 的 引发 蛋白 ， 因为 基因 co 同 基因 0 和 了 ?是 同步 转录 的 。 从 Pp 转录 一 次 , 不 仅 产生 新 的 O 和 了 蛋白 。134。 使 DNA 复制 一 次 ,而 且 产生 更 多 的 co 蛋白 ,而 cro 蛋白 浓度 增加 ,作为 一 个 阻 遇 蛋白 阻止 了 新 的 O 和 了 蛋白 的 产生 。 因 此 co 又 是 这 个 复制 子 的 自我 调节 基因 。 用 cro iia 度 敏 感 株 做 实验 ,表明 Adv 在 细胞 内 的 数目 同 cro 的 浓度 直接 有 关 ,在 限制 温度 培养 时 DNA 的 合成 速率 大 大 增加 ,这 种 情况 对 宿主 细菌 是 致死 的 , 可 能 宿主 容纳 不 了 这 么 多 质 粒 。 这 个 结果 指出 ，cero 对 Adv 在 细菌 内 的 维持 是 必要 的 。 Or Or NR 图 4-30 ADNA 的 复制 控制 区 ADNA 带 有 较 多 的 基因 ， 因 此 复制 的 调控 比较 复杂 。 现在 已 经 明确 ，2DNA 进 人 大 肠 杆 菌 后 不 久 ， 蓝 体内 就 会 出 现 若 干 种 阻 遏 蛋白 。 它们 是 d 基因 和 :cro 基因 的 产 物 , 能 作用 在 1DNA 的 Og 和 Or 位 点 上 阻止 1 DNA 的 转录 (参见 第 二 章 ), 阻 过 蛋白 复制 后 期 gamme 和 蛋白 4 recBC 核酸 酶 期 图 4-31 MAA 复制 的 方式 前 后 期 不 同 。135。 的 多 少 可 以 通过 调节 0 蛋白 的 含量 来 决定 1DNA 采用 那 一 种 复制 方式 。 在 寄主 受到 噬 菌 体 感 传 的 早期 O 蛋白 浓度 较 高 ,这 时 1 DNA 可 进行 双向 复制 。 在 后 期 0 蛋白 浓 度 较 低 因而 1 DNA 以 单 向 的 滚 环 方式 复制 (图 4-31 是 总 的 示意 图 )。 早 期 1 DNA 的 复 制 以 8 方式 进行 。 这 时 复制 需要 0 基因 和 了 基因 的 产物 , 以 及 寄主 的 蛋白 如 RNA 聚合 酶 ，dna B 蛋白 ,引发 酶 和 DNA RAK 等 。 近年 来 0 蛋白 和 了 P 蛋白 已 分 别 用 遗传 工程 技术 提纯 ,分 子 量 分 别 为 35 X 10 和 26 X 10°, 纯化 的 O 蛋 白 和 P 蛋白 加 到 oriC 酶 系统 后 ,可 以 从 一 个 1 DNA 的 起 始 区 上 引起 很 激烈 的 复制 。 在 复制 后 期 ，gam 基因 产生 的 7 蛋白 可 以 抑制 rec BC 基因 编码 的 核酸 酶 含量 ,因而 可 以 使 DNA 按 滚 环 方式 复制 DNA。 然 后 在 基因 Nol 产物 和 寄主 中 其 他 因子 的 帮助 下 ;成 熟 的 多 聚 1 DNA 可 以 和 5 种 外 壳 蛋 白 ( 分 别 由 基因 B. C. N3. D. 蕊 编码 ) 组 装 成 噬菌体 1 的 头 部 。 每 个 头 部 只 能 容纳 一 条 1 DNA 单 体 ， 多 余 的 部 分 由 基因 A 的 产物 加 工 , 切 出 带 粘 性 未 端的 单 体 ,最 后 形成 完整 的 噬菌体 1。 当 int 基因 产生 足够 的 im 蛋白 时 ， 超 螺旋 1 DNA 才 会 整合 到 寄主 DNA 中 去 。 一 旦 1 DNA 进入 溶 原状 态 , 低 水 平 的 cf 阻 歇 蛋白 就 足以 阻止 溶菌 的 发 生 , 并 保持 Gf PB 遏 蛋白 的 合成 维持 在 比较 低 的 水 平 上 。 在 溶 原状 态 时 , 1 基因 与 寄主 DNA 一 同 复制 。 只 有 在 受到 外 来 因子 如 紫外 线 照 射 、 胸 腺 喀 啶 供应 不 足 或 丝 裂 霉 素 破坏 了 阻 遏 蛋白 的 抑制 状态 时 , 1 DNA 才 会 大 量 地 增生 。 A ATA ae | T-A Rhee G= 6 Xe et, y rs My ak a rccecr 06666AT 7G 和 AAGGGAG CTCCCTA,C C= 6 A Oo kay C=G A 146 fb, = fie G=C ° Asul 和 ae Sau3A Ava} oC Gola 和 人 (921):T 5 =cATa ee aa Maar AeA _"AAAAGACACTATTACAAAAGAAAAAAGAAAAGATTATTC .CAGCCAGAAAACGACTTICTGTGGTGAAAC-3 3'-CGIACAAACCTGGTTTATIITIGTAGAGICTTACCA TITICTGTGATAATGTTTICTITY TTTTCTAATAAS, __GTCGGTCTTITCCTGORAAGACACCACTJT-5 ie i A - (B21):A bat p 7 = si =f ; it er ah OF a 7 a ty , 4 - , Tesete GAGGGAT'G Aca | AGGGGA Eccecriyc ce Ny its T T Fi 28 tig ; ¥-§ a ae TT 4-32 RRR TA A 复制 起 始点 的 顺序 和 二 级 结构 ° 136。 —HADNA 进行 恶性 繁殖 ,在 早期 阶段 超 螺 旋 1 DNA MORAN ERA Et 开始 从 两 个 方向 复制 DNA。 早期 复制 所 需 的 一 切 必要 基因 都 在 起 始点 附近 2,500 碱 基 对 范围 以 内 ,其 结构 如 图 4-32 所 示 , 呈 四 时 草 形 , 并 能 为 某 种 蛋白 专 一 地 识别 。 通过 对 鸣 菌 体 和 病毒 的 研究 ,人们 现在 对 原核 生物 中 DNA 的 调控 过 程 有 了 一 些 了 解 , 当 然 原 核 生 物 DNA 复制 要 比 病毒 和 鸣 菌 体 复杂 得 多 。 原核 生物 的 生长 和 繁殖 可 以 有 不 同 的 速率 ,这 取决 于 培养 的 条 件 , 但 是 一 旦 DNA FF 始 复制 ，DNA 链 的 延伸 速率 却 是 相对 恒定 的 。 例 如 大 肠 杆菌 一 般 在 37°C 时 从 DNA 复 制 起 始 到 完成 一 般 要 40 分 钟 ,在 两 个 基因 组 之 间 形 成 膜 并 分 裂 为 两 个 子 细胞 要 20 分 钟 ， 两 者 几乎 是 恒定 不 变 的 。 细 菌 生 长 周期 中 变动 最 大 的 是 复制 的 起 始 , 新 的 DNA 可 以 在 前 一 条 链 尚 未 完成 之 前 就 又 开始 复制 的 起 始 , 也 可 以 在 细胞 分 裂 以 后 很 久 才 发 生 , 这 与 细 菌 中 各 种 激发 因子 抑制 因子 去 抑制 因子 的 复杂 相互 影响 有 关 ， 染 色 体 复制 同 细菌 的 分 裂 也 直接 有 关 , 用 和 氧 霉 素 抑制 蛋白 质 合 成 ,染色 体 复 制 不 完全 , 最 后 有 05% 是 不 复制 的 ， 而 这 些 染色 体 复制 的 完成 是 细胞 分 裂 的 信号 。 真 核 生 物 DNA 的 复制 又 比 原 核 生 物 复 杂 得 多 ,至 今 我 们 还 不 清楚 真 核 生物 中 DNA 复制 是 怎样 调控 的 ,为 什么 胚胎 细胞 会 迅速 地 生长 而 成 年 细胞 生长 很 缓慢 ;有 的 成 年 细胞 甚至 在 几 十 年 里 都 不 生长 ,什么 因素 会 使 一 个 正常 细胞 转变 为 恶性 生长 的 肿瘤 细胞 ,这些 都 是 生命 世界 向 人 类 提出 的 带 有 挑战 性 的 问题 。 近年 来 真 核 生 物 DNA 的 复制 和 基因 的 调控 正 受 到 越 来 越 大 的 重视 , 很 可 能 这 方面 的 研究 会 为 细胞 分 化 \ 再 生 、 衰 老 等 现象 提供 生物 化 学 的 说 明 ， 也 可 能 为 肿瘤 的 预防 和 治 疗 提 供 有 价值 的 线索 ,从 而 为 生物 世纪 的 来 临 铺 平 道 路 。 参 ， 4% xX ® [1] Kornbery, A. DNA Replication, W. H. Frecman and Company, San Francisco, 1980. [2 ] Kornbery, A. Supplement to DNA Replication, W. H. Frecman and Company, San Francisco, 1982. [3] Smith-keary, P. F. Genetic structure and function. Macmillan Press Ltd. 1975. [4] Nossal, N, G. 1983, Ann. Rev. Biochem. 52, 581. [5] Challberg, M. D. and Kelly, T. J. 1982, Anu. Rev. Biochem. 51, 901. [6] Itobom, G. 1981, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 94, 93. [7] McHenry, C. and Kornbery. A. 1981, Enzymes, 14, 39 [8] Kolter, R. and Helinski, D. R. 1979, Ann. Rev. Genet. 13, 355. [9] Wood, W. B. et al, 1981, Biochemistry, A Problems Approach, 2nd ed., The Benjamin Cummigs Publishing Company, [10] Crow, J. F. 1983, Genetics Notes, 8th ed. Burgess Publishing Company. °* 137 « She 转录 与 加 工 WER RE SAR 核酸 和 蛋白 质 是 组 成 生物 体 的 两 大 类 重要 物质 ， 它 们 相互 依存 ,彼此 制约 。 1958 年 Crick 提出 的 中 心 法 则 ,提出 信息 流向 为 DNA->RNA-> 蛋白 质 , 揭 示 了 核酸 与 蛋白 质 的 内 在 关系 ,核酸 (主要 是 DNA) 是 信息 的 贮存 者 ， 而 蛋白 质 则 是 信息 的 展现 者 , 由 于 蛋白 质 的 活动 ,表现 出 生物 体 的 各 种 性 状 和 功能 。 遗 传 信息 从 DNA 经 过 RNA 传递 到 蛋白 质 , 称 为 基因 表达 ,基因 表达 的 第 一 步 , 即 信息 从 DNA 到 RNA 的 转移 ， 叫 做 转录 。 转 录 过 程 是 以 DNA 为 模板 ,在 依赖 DNA 的 RNA 聚合 酶 催化 下 ,由 四 种 核糖 核 苷 三 磷 酸 (NTP) 合成 RNA 的 过 程 : n ATP n. GTP DNA #&4R, Mg’t n CTP {Kifi DNA AY RNA 聚合 酶 ine OPE 转录 是 依赖 DNA 的 或 叫 DNA 指导 的 RNA 生物 合成 , 它 不同 于 RNA 病毒 复制 时 依赖 RNA 的 RNA 生物 合成 ， 催 化 后 者 的 酶 叫 依赖 RNA 的 RNA RAR Hoe RNA 病毒 (例如 肿瘤 病毒 ) 可 把 信息 从 RNA 流向 DNA， 即 依赖 RNA 的 DNA 生物 合成 ,鉴于 它 与 “转录 ”的 对 应 关系 ,被 叫做 “ 反 转 录 ”, 它 们 的 关系 可 图 示 为 : DNA 复制 (brs RNA 、 ) RNA 反 转 录 ( 某 些 病毒 中 ) 关于 RNA 复制 和 反 转 录 将 在 第 八 章 讨论 。 近 一 ` 二 十 年 来 在 分 子 生物 学 上 有 一 个 重大 的 发 现 , 即 转录 的 原始 产物 是 没有 功能 的 RNA 分 子 , 它 必须 经 过 加 工 〈processing) 才能 得 到 成 熟 产 物 肖 原核 生物 mRNA 的 原始 转录 产物 一 般 不 需要 加 工 是 一 个 例外 )。 原 始 转 录 产 物 叫 RNA 前 体 , 加 工 过 程 中 还 可 能 产生 各 种 中 间 前 体 , 最 后 才 得 到 有 功能 的 RNA 分 子 。 因此 将 加 工 和 转录 一 起 讨论 是 必 要 的 。 和 转录 有 关 的 加 工 叫 转录 后 加 工 〈Post-transcriptional processing) 以 区 别 于 和 翻译 有 关 的 加 工 翻译 后 加 工 Cpost-translational processing)( 见 第 六 章 )。 不 同 种 类 的 RNA 前 体 的 加 工 是 很 不 一 样 的 。 RNA + 4n PPi __ RNA 聚合 酶 (依赖 DNA 的 RNA 聚合 酶 ,转录 酶 ) 转录 是 由 RNA 聚合 酶 来 完成 的 1955 年 Ochoa 等 发 现 了 多 核 彰 酸 磷酸 化 酶 (PNPase) 以 后 , 曾 一 度 认 为 RNA 生物 合成 问题 可 以 解决 了 ,但 是 在 仔细 分 析 该 酶 的 作用 特点 及 所 合成 产物 的 特性 以 后 ,许多 研究 者 对 此 发 生 了 怀疑 。 Weiss 于 1959 年 首先 在 鼠 肝 细胞 核 。138。 系统 中 观察 到 NTP 可 参 人 到 RNA 产物 中 ;其 后 不 久 , 数 家 实验 室 从 多 种 材料 报道 了 依 Ri DNA 模板 的 RNA 聚合 酶 活性 ;并 进行 了 酶 的 初步 提纯 ,发 现 合成 的 RNA 产物 与 所 加 人 的 DNA 模板 是 互补 的 。 不 同 DNA 来 源 对 合成 的 RNA 碱 基 组 成 的 影响 见 表 5-1. #5-1 DNA 模板 与 RNA 产物 碱 基 对 应 关系 A 十 工 A+U DNA 来 源 DNA re RNA Hh Aa T2 mak 1.86 1.85 小 牛 胸腺 has 1.52 ABE 1.0 0.93 小 球菌 0.40 0.48 大 量 研究 表明 ， 原 核 细 胞 与 真 核 细 胞 的 RNA 聚合 酶 在 结构 上 、 性 质 上 是 很 不 相同 的 。 原核 生物 RNA REE 迄今 为 止 , 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 是 研究 得 比较 透彻 的 一 个 酶 。 大 肠 杆 菌 RNA KR 合 酶 全 酶 (holoenzyme) 可 用 磷酸 纤维 素 柱 层 析 分 离 为 一 个 核心 酶 (core enzyme) 和 一 个 称 为 5 的 多 肽 。 核 心 酶 又 由 4 TWH (ape) 组 成 , 亚 基 及 全 酶 的 分 子 量 见 表 5-2。 在 用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 测定 分 子 量 时 ， 各 家 报道 的 分 子 量 略 有 出 人 。 此 外 还 有 一 个 低 分 子 量 的 成 份 (9,000 一 12,000d) 存在 于 某 一 些 酶 制剂 中 〈 每 个 酶 分 子 含 0.2 一 2 个 分 子 )。 Rak T3,T7 RNA 聚合 酶 只 有 一 条 肽 链 ,分 子 量 为 110 X 10°d, 表 5-2 原核 生物 RNA 聚合 酶 亚 基 组 成 全 酶 分 子 量 WES} FBC XK10-*) (x10-%) 酶 来 源 亚 基 结 构 454 xc:68'"0 37 150 160 70 500 aa8B'0 44 155 165 98 420 aiBB'a 45 155 155 57 436 asB8B'0 39 147 125 86 大 肠 杆菌 # 假 单 胞 菌 枯草 杆菌 Anacystis nidulans * 大 肠 杆菌 RNA RAB <\6 和 0 亚 基 的 氨基 酸 顺 序 已 经 测 出 分 别 为 329.1342 和 613 残 基 ， 准 确 分 子 量 分 别 是 36512,150619 和 70263d。 在 RNA 聚合 酶 的 亚 基线 构 中 ，w\、8 Me 亚 基 对 酶 活性 的 重组 是 必需 的 ，w 则 是 不 必需 的 ,其 功能 尚 不 清楚 。 核 心 酶 具 催化 活性 而 5 亚 基 本 身 没 有 催化 活性 ， 其 作用 是 识别 DNA 分 子 上 RNA 合成 的 起 始 信号 。 但 5 亚 基 不 能 单独 与 DNA 结合 , 它 结合 到 核心 酶 后 可 能 引起 酶 构 型 的 变化 ,因而 改变 核心 酶 与 DNA 结合 的 特性 。 根据 单个 亚 基 或 单个 亚 基 聚 集体 的 功能 特征 \ 亚 基 的 特异 探 针 和 变异 体 混合 重组 的 研究 , 表明 fp 亚 基 是 仅 有 的 可 以 单独 与 DNA 结合 的 亚 基 , 它 参 与 RNA 聚合 酶 与 模板 反应 ,同时 68” WE 也 与 核心 酶 和 5 亚 基 结 合 以 及 转录 的 终止 有 关 。p 亚 基 具 有 利 福 霉 素 和 利 链 菌 素 〈 见 第 三 节 ) 的 结合 点 ,也 与 和 亚 基 结合 有 关 , 它 参与 RNA 链 的 引发 和 延伸 ,催化 底 物 形成 ° 1396 FABIA. BCR) 也 可 与 终止 因子 CLAIM REHERM. o 亚 基 具有 与 8 的 结 合 点 ;参与 特定 的 基因 表达 ,可 能 与 酶 和 DNA 上 的 启动 区 域 的 反应 有 关 。 除了 四 个 多 肽 亚 基 外 ;大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 还 含 2 个 Za 原子 ;它们 与 6 We 联接 。 无 论 在 体外 或 体内 ，RNA 聚合 酶 通过 下 列 四 步 反 应 聚集 而 成 : 2c 一 22 2 十 86 一 >X26 a,8 十 6 一 ci66- cz66 + 0—>a,68'0 细菌 RNA RABEWIMAS TIRE PAM aw RARE, Himxkbitaeis 在 0.1M 以 上 的 离子 强度 时 以 单 体 存在 , 在 较 低 的 离子 强度 下 则 形成 二 聚 体 。 核心 酶 在 较 低 离子 强度 下 则 是 以 六 聚 以 上 的 多 聚 体形 式 存在 。 所 有 RNA 聚合 酶 都 具有 相同 的 功 能 一 一 合成 RNA， 但 还 可 能 与 转录 调节 有 关 。 如 枯草 杆菌 芽孢 化 是 与 " 因子 的 失去 和 B” 亚 基 的 修饰 联系 在 一 起 的 ， 因 而 枯草 杆菌 的 RNA 聚合 酶 突变 株 可 阻止 该 菌 的 芽 移 化 。 原核 生物 RNA 聚合 酶 能 催化 所 有 类 别 的 RNA 的 生物 合成 ,被 利 福 平等 抑制 《网 第 三 节 )。 真 核 生 物 RNA 聚合 酶 与 细菌 仅 含 一 种 类 型 的 RNA 聚合 酶 不 同 ， 在 动物 、 高 等 植物 和 真菌 的 细胞 核 中 却 有 多 种 形式 的 RNA RAB. We, 这 些 RNA RAM MR CE IAB i Stk EIT 29. AE CE EAD ROPE (o-amanitin) 的 敏 RHE WEARS KD eZ, EMR RIEL, MAW BIER 5-30 RS-3 Ree RNA RSH RNA RAK 或 A) CR B) III( 或 c) 别名 rRNA AKG 不 均一 RN 小 分 子 RN 聚合 酶 RA 细胞 内 位 置 核 仁 核 质 核 质 转录 产物 (前 体 ) rRNA mRNA tRNA,5S rRNA — FE PE HE Ti SN * >10-°M 抑制 10-" 一 10-*M 抑制 10-: 一 10-*M 抑制 | . 〈 不 敏感 ) (re BE BUR) 《中 度 敏 感 ) * 屁 虫 和 酵母 的 RNA 聚合 酶 II 对 o- RM RB EARN AU RNA RAK I. BRED RNA 聚合 酶 的 亚 基 情 况 相当 复杂 ， 动 植物 来 源 的 各 举 一 例 列 于 表 5-4, 从 已 经 测定 的 足 核 生物 RNA 聚合 酶 的 亚 基 组 成 分 析 , 亚 基数 从 4 一 10 个 不 等 ,有 的 多 至 14 人 外 (SDS 凝 胶 电 泳 ), 种 类 有 4 一 6' 种 ,其 中 有 二 种 为 大 亚 基 ( 分 子 量 >100 x 10°), 余 为 小 亚 基 ， 可 能 出 现 小 分 子 量 的 降解 产物 。 真 核 RNA 聚合 酶 也 紧密 结合 Zn 原子 。 从 酵母 和 胸腺 组 织 中 可 以 分 离 出 缺乏 一 种 或 二 种 小 亚 基 的 RNA RGA A, HEAR 性 ,表明 这 些 亚 基 对 催化 活性 是 不 必要 的 ， 可 能 与 转录 调节 有 关 ， 或 功能 上 类 似 于 原核 生物 的 喜 亚 基 , 虽 然 尚 无 直接 证 据说 明 趴 核 生 物 有 类 似 于 原核 的 c 亚 基 存在 。 实 验 指出 ， .140。 RNA 聚合 酶 A 和 了 B 中 三 个 小 亚 基 的 胰 蛋 白 酶 水 解 的 肽 图 是 相似 的 ， 同 时 二 者 也 具 免 疫 相关 性 。 表 5-4 牛 胸腺 和 椰子 RNA 聚合 酶 的 亚 基 和 分 子 量 除了 上 述 细 胞 核 RNA 聚合 酶 外 ,也 分 离 出 线粒体 RNA 聚合 酶 。 叶绿体 中 也 存在 AAR. 某 些 线粒体 RNA 聚合 酶 具有 非常 简单 的 结构 ， 是 由 一 种 单一 亚 基 聚集 而 成 。 线粒体 和 时 绿 体 RNA 聚合 酶 不 同 于 真 核 细 胞 核 RNA RAM, 而 与 原核 生物 相 似 , 能 催化 所 有 类 别 RNA 的 生物 合成 。 二 、 转 录 的 机 制 ”关于 转录 机 制 的 研究 是 从 大 肠 杆菌 开始 并 深入 的 ,其 它 原 核 生物 也 有 类 似 的 特性 。 虽 然 哺乳 动物 细胞 的 转录 调控 和 转录 产物 的 加 工 与 原核 生物 是 不 一 样 的 ， 但 这 两 类 生物 的 转录 过 程 却 十 分 相 象 。 在 DNA 双 链 分 子 中 ,被 转录 为 RNA 的 那 一 条 链 叫 有 意义 链 (sense strand)， 该 基 因 上 的 另 一 条 链 则 称 反 意义 链 (antisense strand)(Al 5-3)o 在 含有 许多 基因 的 DNA RHE 中 , 每 个 基因 的 有 意义 链 并 不 总 是 在 同一 条 DNA 链 上 ， 就 是 说 一 条 链 上 具有 某 些 基因 的 有 意义 链 和 另 一 些 基因 的 反 意 义 链 。 这 个 现象 的 一 些 具体 例子 已 在 第 二 章 介 绍 过 。 。141 。 转录 可 以 分 为 起 始 、RNA 链 的 延伸 和 转录 终止 三 个 步骤 。 转录 的 起 始 虽然 RNA 聚合 酶 的 核心 酶 在 DNA 模板 、 核 苷 三 磷酸 底 物 和 - Mg# 存在 下 也 可 以 合成 RNA， 但 产物 是 不 均一 的 ,没有 固定 的 起 始点 ,而 且 DNA 双 链 的 每 一 条 链 都 能 作 为 模板 。 RNA 聚合 酶 全 酶 则 能 专 一 地 与 DNA 上 RNA 合成 的 起 始 位 点 【该 位 点 被 叫 作 启 动 基因 或 启动 子 ) 结 合 , 全 酶 合成 的 RNA 链 是 均一 的 , 并 且 只 选择 一 条 DNA 链 作 模板 。 那 么 ,启动 子 究竟 具有 什么 样 的 特殊 结构 使 全 酶 能 够 识别 呢 ? 近 年 来 ;已 测定 山 相 当 多 的 启动 子 的 一 级 结构 ,这 些 结构 通常 是 用 下 述 方法 分 离 得 到 的 : 在 全 酶 与 双 链 DNA 结合 后 ,用 DNase 水 解 , 便 可 得 到 一 个 全 酶 保护 的 DNA FB. Bilan, fd. T,A2, TAs, der 和 LacUV, DNA 的 全 酶 保护 片 仆 有 41 一 44 个 碱 基 对 ， 在 一 定 条 件 下 ，RNA RABE 酶 可 以 在 被 保护 的 DNA FR ESR RNA 的 合成 ,合成 的 产物 链 长 约 17 一 20 BER, 并 且 对 应 于 各 自 的 mRNA 5 端的 起 始 顺序 。1975 年 Pribnow 比较 了 上 述 五 种 DNA 片 段 的 核 音 酸 顺 序 ， 观 察 到 有 一 个 七 个 碱 基 的 同 源 区 ， 即 TATAATG， 后 被 称 为 Pribnow 盒 , 其 中 心 是 位 于 mRNA 起 始点 前 大 约 10 个 碱 基 对 位 置 。 以 后 ，Schaller 等 人 发 现 , 若 把 被 全 酶 保护 的 DNA FES, RNA 聚合 酶 全 酶 不 能 再 重新 结合 或 者 不 能 再 选择 正 确 的 引发 点 ,对 于 这 个 现象 的 解释 是 ,在 被 保护 片段 以 外 一 定 还 有 一 些 顺 序 对 于 酶 识别 启 动 子 是 必需 的 。 从 2 和 SV40 的 研究 表明 ,启动 子 区 域 的 DNA 顺序 必需 从 mRNA 的 起 始点 向 左 延 伸 到 35 个 碱 基 对 以 远 ,而 乳糖 操纵 子 的 启动 子 区 域 必 需 从 RNA 合成 起 始 点 向 左 延 伸 到 60 个 碱 基 对 以 远 。 在 12 的 左右 启动 子 和 SV40 启动 子 的 -35 位 上 有 一 个 共同 的 顺序 ， 它 是 Hin 限制 性 内 切 酶 的 切 点 ， 用 Hn 酶 切 开 后 便 失 去 了 启动 子 活性 。 Schaller 和 Gilbert 比较 了 大 肠 杆 菌 RNA RAHN 46 个 启动 子 结构 ,把 Pribnow SHE 在 一 起 ,发 现 它们 都 存在 着 两 个 同 源 区 ， 即 位 于 -10 碱 基 对 左右 的 TATAATG 顺序 和 位 于 -35 碱 基 对 左右 的 TTGACA 顺序 (图 5-1)。 这 两 个 顺序 中 的 碱 基 在 每 一 个 启动 子 中 虽 不 尽 相 同 , 但 它们 具有 很 大 的 保守 性 。 例 如 ,在 Pribnow 盒 中 , 所 有 启动 子 都 具有 其 中 第 六 位 碱 基 T CFATAATG), TA 和 TAA 也 有 很 强 的 保守 性 。-35 碱 基 对 位 置 的 同 源 顺序 TTGACA 中 的 TTG 也 是 很 保守 的 (图 5-1)。 由 此 看 来 ， 启 动 子 结构 至 少 由 三 部 分 组 成 ,第 一 部 分 是 RNA 育 合 酶 全 酶 的 识别 信号 (-35 碱 基 对 左右 7 第 二 部 分 是 酶 的 紧 密 结合 点 (-10 碱 基 对 左右 ); 第 三 部 分 是 RNA 合成 的 引发 点 。 一 些 化 学 和 光化学 探 针 对 RNA 聚合 酶 和 启动 子 结合 的 研究 揭示 ,两 者 之 间 的 专 一 接触 点 ,主要 是 上 述 两 个 同 源 区 ， 但 也 存在 于 其 他 区 域 。 有 时 正 、 负 调节 转录 的 蛋白 结合 位 点 也 包括 在 启动 子 结构 内 (HA PAT). — 35K “10K Seccee 工 T G A C A- coors T A oi A A (a G ae a scl 38 37 35 2Z 29 28 40 41 25 29 30 46 17 图 5-1 原核 生物 启动 子 中 -10 与 -35 区 域 的 同 源 性 比较 了 46 个 启动 子 ， 图 中 核 苷 酸 下 面 数字 表示 出 现 的 数目 。 参 阅 Ann. Rev. Genetics, 1979, 13,319—353, 关于 原核 生物 DNA 转录 的 起 始 过 程 ,根据 目前 知识 大 致 可 概括 如 下 : ©1426 (1) 核心 酶 在 c 亚 基 参与 下 与 DNA 分 子 接 触 ， 形 成 非 专 一 复合 物 , 这 样 的 复合 物 是 很 不 稳定 的 ; (2) 起 始 识别 ,全 酶 与 启动 子 结合 生成 封闭 的 启动 子 复 合 物 〈closed promoter comp- lexz)， 这 时 酶 与 DNA 外 部 结合 ,识别 部 位 大 约 在 启动 子 的 -35 位 处 ; (3) 活化 ,得 到 开放 的 启动 子 复合 物 〈open promoter complex), M¥TE-10 位 处 紧密 与 启动 子 结合 , 解 开 双 链 后 识别 有 意义 链 。 由 于 该 部 位 富 含 A-T 碱 基 对 ， 故 有 利于 DNA 解 链 ; (4) 形成 三 元 起 始 复合 物 : 酶 移动 至 起 始点 ,加 入 第 一 个 核 苷 三 磷酸 得 到 (启动 子 . 全 酶 . 核 苷 三 磷酸 ) 复 合 物 , 即 开始 转录 。 差不多 所 有 情况 下 ，RNA 链 的 开头 碱 基 总 是 味 叭 , 大 多 数 大 肠 杆菌 转录 得 到 RNA 的 原始 产物 的 第 一 个 核 背 酸 是 pppG 而 $X174,T7DNA 为 模板 时 ， 更 多 的 起 始 核 昔 酸 为 pppAc 以 上 是 原核 生物 启动 子 的 情况 ,近年 来 , 对 真 核 生 物 DNA 上 启动 子 的 研究 也 发 现 ， 在 转录 起 始点 5 端 上 游 约 30 bp 处 也 存在 一 个 A-T 丰富 的 同 源 区 -TATAAA(AG)， 它 与 原核 生物 启动 子 -10bp 处 的 Pribnow 盒 很 相似 ,被 称 作 Hogness 盒 。 真 核 RNA 聚合 Be Il 42st (T) ATA M5 DNA 结合 ,然后 在 下 游 约 30bp 处 转录 mRNA 前 体 。 比较 了 珠 蛋 白 基因 5 端 上 游 的 核 昔 酸 顺 序 观察 到 有 如 图 5-2 所 示 的 规律 性 ， 从 起 始 密码 子 ATG 开始 向 左 延 伸 , 有 一 个 同 源 AC 顺序 (此 处 转录 生成 帽子 结构 ), 再 左 延 伸 出 现 一 个 ATA 的 保守 同 源 区 ,为 珠 蛋白 基因 有 效 转录 所 必需 ,缺失 ATA， 则 转录 起 始点 不 准确 ,同时 转录 效率 大 大 降低 。 此 外 ,5' 旁 侧 还 有 一 个 CCAAT 同 源 顺序 ( 见 图 5-2). CCAAT ATA 帽子 起 始 密码 CCAAT 一 型 一 CATAAA-26_AC 一 5 _ATC CCAAT > CATAAA —26_ AC ms UE ATG CCAAT —*4— CATAAA -2_AC-37_ATG 图 5-2 EASA 5 端 上 游 顺 序 的 同 源 性 (数字 代表 核 苷 酸 数目 ) ‘ RNA 链 的 延伸 WRIA KB MARR, RNA 链 延 伸 随 之 进行 。 从 起 始 到 延伸 过 程 的 转变 ， DNA 分 子 与 酶 分 子 可 能 发 生 构象 变化 ,以 适应 延伸 过 程 的 需要 。 当 酶 从 起 始点 往 下 游 移 动 , 解 旋 也 随 酶 一 起 进行 (图 5-3)。 而 原来 部 位 则 重新 形成 完整 双 螺 旋 , 表 明 DNA 螺旋 在 酶 (核心 酶 ) 作 用 下 有 一 个 可 逆 过 程 , 同 时 酶 分 子 的 构象 也 发 生变 化 。 在 转录 起 始 阶段 ， 全 酶 与 DNA 形成 稳定 的 复合 物 , 对 连接 部 位 的 一 级 结构 有 强 的 专 一 性 ; 而 在 延伸 阶段 ， 为 了 能 沿 模板 移动 , 它 必须 放松 对 DNA 的 结合 ， 同 时 对 拷贝 每 一 个 核 苷 酸 应 具 同 等 能 力 ; 而 不 应 有 所 偏向 。RNA BARS DNA 模板 相互 作用 的 这 些 变化 , 使 得 转录 起 始 后 立即 从 酶 分 子 上 释放 亚 基 ; c 亚 基 存 在 与 否 ,引起 8 与 8 亚 基 构 象 上 的 变化 : Mo 亚 基 缔 合 时 , 6 与 8 表现 为 有 利于 专 一 与 DNA 结合 的 构象 ,而 5 释放 后 留 下 核心 酶 , 则 5 DNA 结合 不 专 一 , 失去 识别 或 优先 于 任 一 核 背 酸 顺 序 的 能 力 ， 不 能 形成 稳定 的 复合 物 。 转 录 起 始 至 延伸 的 过 程 ,包括 一 个 5 因子 的 缔 合 与 解 离 循环 ( 见 图 5-8)o ©1436 图 3-3 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 核心 酶 沿 模板 的 有 意义 链 移 动 合成 RNA 下 列 实验 证 明了 转录 的 延伸 方向 是 沿 模 板 链 ( 有 意义 链 ) 的 3 一 了 ,生成 5 一 3RNA 产物 。 在 RNA 生物 合成 系统 中 加 入 7-*P-ATP 或 y-"P-GTP, WEP 参 人 到 RNA 中 的 动力 学 表明 ,合成 早期 参 人 最 多 ,然后 随 着 时 间 延 长 而 下 降 ; 同 时 ,已 被 ?3 标记 的 RNA 总 剂量 并 不 因 反 应 液 中 加 入 大 量 非 同位 素 ATP 或 GTP 而 有 所 影响 。 At, *P 进入 RNA 是 在 合成 的 起 始 而 不 是 合成 的 最 后 。 由 于 DNA 模板 与 RNA 产物 具 反 平 行 关 系 , 所 以 转录 时 RNA RABE DNA 的 有 意义 链 3' 一 5 移动 ， 而 从 5 一 3 方向 合成 RNA。 以 jy-?P-ATP 为 底 物 合成 为 例 : A A ON OOO LvEowint @ ko ih ashe PLE: NTP ‘ | TERE @-0-@LQh@ bon PPi 当 用 3- 脱 氧 ATP BA) RNA SEH, HE REATMEMR IE, Tk HRS TA 是 5’ > 3’, ! 一 般 来 说 ，RNA #HAKWREEAN A OMERUN, AA Git ABER 37°C 时 ,延伸 速度 是 25 一 50 个 核 音 酸 / 秒 。 RNA 链 延 伸 时 所 合成 的 多 核 背 酸 链 并 不 全 保留 在 模板 上 ， 对 一 条 RNA 合成 链 而 = ,在 任何 时 候 只 有 一 个 连接 点 ,该 点 沿 DNA 链 移动 , 连续 转录 出 相同 的 RNA 产物 ,其 长 度 随 远离 起 始点 而 增加 。 图 5-4 是 两 栖 类 细胞 RNA 基因 转录 过 程 的 电镜 图 。mRNA 生物 合成 的 电镜 照片 见 图 5-21, 从 图 中 可 以 看 到 mm RNA 上 已 经 附着 许多 核糖 体 。 转录 过 程 与 复制 有 许多 相似 之 处 ,但 由 于 尚未 发 现 转录 有 像 复制 那样 的 校正 系统 /所 以 转录 较 之 复制 出 现 错误 的 频率 应 是 很 低 的 , 即 转录 应 具有 高 度 的 忠实 性 。 转 录 的 终止 在 DNA 分 子 上 有 终止 转录 的 特殊 信号 ,这 些 信 号 中 有 一 些 被 RNA 聚合 酶 自身 识 别 ,而 另 一 些 则 需要 一 个 蛋白 因子 e 的 帮助 。p 是 一 个 分 子 量 为 20 万 的 四 聚 体 ， 它 能 与 RNA 聚合 酶 结合 ,但 不 是 酶 的 组 分 。 体 外 实验 表明 , p 存在 与 否 对 RNA 链 合 成 的 长 短 甚 有 影响 ,以 fd MRK DNA 为 例 , 在 无 p 因子 时 ,合成 的 RNA 产物 为 26S, 在 合成 开 始 后 不 同时 间 加 入 2 因子 ,将 分 别 得 到 138,178 和 23SRNA, 这 说 明 模 板 上 至 少 有 三 个 为 p 识别 的 终止 信号 (图 5-5)。 9 TI44。 - J . 由 ~*~ : ¥ ’ : ER PA CHEE ei PAL) 它 it j ite i j i { at { > ' i ' iF ' tL Se 8 AVA 站 1 六 图 5-4 BR RNA 基因 转录 过 程 电镜 图 "ate wie | ‘DNA SHE | at) 0 人 全 tile CAAT IBD) . 5-3 0 因子 对 转录 终止 的 影响 (BR DNA GSO (FRA) ”现在 已 有 许多 RNA BPM 3 端的 顺序 和 DNA OF ERIKA 了 。 虽 然 其 一 级 结构 没有 什么 共同 之 处 ， 但 发 现 终 止 区 域 在 接近 终点 的 部 位 都 有 一 个 二 元 对 称 结构 ; 亦 即 回 文 结 构 , 紧 随 着 有 数 个 工 连 在 一 起 RNA 终 直 通常 发 生 在 二 元 对 称 结构 中心 以 外 2044 个 核 音 酸 的 位 置 。 图 5-6 列 出 部 分 终止 子 反 意 义 链 的 序列 ， 具 有 了 明 145 。 WAN Zh a HME IN BER To ac ECielc 四 四国 T EGGSHA ET arr ene w+» 'TAGAACGCTOGGTY (4) [GCOGGGOGTITI TTATT +00 ++» BACGCTOGGT (7) [KCCGGGOGTH|TITT + « +n, SS tm 4) [GCAGT] c EIGAGGCH crrrrrrr 。vw Cee ] ©) $CIGGCGGG: ATTIT.... - (4) (GAGCOGTITATT Trrcr 2 。。 Sia amare et G) ECG 可 图 5-6 部 分 操纵 子 叹 菌 体 的 终止 子 结构 特征 方 框 表 示 二 元 对 称 结构 的 碱 基 配对 部 分 ， 组 成 茎 环 结构 的 茎 ， 其 中 包括 G-T 对 ; 括 弧 内 为 构成 苍 环 结构 的 环 的 核 苷 酸 数 ; 在 所 有 例子 中 下 游 都 紧 随 数 个 工 。 摘自 Ann. Rev. Genetics, 1979, 13, 319—353, DNA 终止 子 部 位 的 二 元 对 称 结构 可 以 解释 为 什么 RNA 聚合 酶 在 该 处 停止 延伸 : 〈1) 早 在 1966 年 Gierer 提出 ,二 元 对 称 结构 (A) 可 以 形成 十 字 结 构 (B), 同时 两 者 之 间 存 在 一 个 平衡 ;(B) 结 构 由 于 少 了 几 个 碱 基 对 ,不 如 (A) 结 构 稳 定 ， 但 (B) 形 式 结构 可 以 为 酶 蛋 折 所 识别 并 与 之 反应 ， 从 而 防 碍 RNA 聚合 酶 的 移动 ,因而 使 转录 延伸 停止 。(2) 二 元 对 称 结 构 转 录 产 生 的 RNA 部 分 可 以 形成 蕉 环 结构 ,这 样 的 结构 可 使 RNA 聚合 酶 发 生 构象 变化 ， 使 之 从 延伸 ”构象 变 为 终止 "构象 而 终止 转录 ， 图 5-7 是 RNA 聚合 酶 终止 HHaAP>O | GTTCAGTCTGAAC mL = lt Se ee eee eee 2I- re \c.H, Sr’) 黄 曲 霉 毒素 (aflatoxin) 和 2- 乙 酰 氨基 药 (2-acetyl-aminofluorecene) 作用 于 DNA, 同时 抑制 复制 与 转录 。 黄 曲霉 毒素 从 生长 在 花生 上 的 黄 曲 霉菌 〈4sbergzllaxs flavus) 中 分 离 得 到 ,2- 乙 酰 氨基 药 则 是 人 工 合成 化 合 物 ,两 者 均 为 烈性 致癌 物 ,能 诱发 肝癌 。 1 O AN Oe wes KS pe Bat BEER B 2-C MAEDA BBX (anthramycin) 也 是 一 种 与 DNA 共 价 结合 的 抑制 剂 ， 抑 制 DNA 和 RNA 的 生物 合成 。 5 RNA 聚合 酶 作用 的 转录 抑制 剂 表 5-6 列 出 几 个 主要 的 与 RNA RAMEN RMA, AMAT HAR 录 机 制 和 RNA 聚合 酶 的 性 质 起 着 很 大 的 作用 。 #5-6 与 RNA 聚合 酶 作用 的 转录 抑制 齐 抑制 fe 月 wR ml 效应 i 与 微生物 和 线粒体 RNA ATi 6 利 福 平和 轴 张 链 苗 素 | 韭 革 从 引信 RBM DNA A, MiB | FMF RNA 链 的 起 反 码 第 一 个 弛 核 背 三 确 酸 进 人 Alem | 与 细菌 RNA RAM 6 亚 基 结 合 优先 阻 断 RNA 链 的 延伸 _ 与 哺乳 动物 细胞 核 RNA_ ARE ML 优先 -区 育 昔 碱 。 | 结合 ;不 影响 细 兽 、 线粒体 和 叶绿体 的 RNA | << SURI DL aby RN 的 会 成 。。 高 党 ARG 利 福 平 (rifampicin) 是 利 福 霉 素 的 衍生 物 , 利 福 霉 素 是 链 霉 菌 属 产生 的 一 种 抗生素 ， 它 有 效 地 对 付 抗 酸 (acid-fast) 菌 和 划 兰 氏 阳性 菌 。 利 福 平治 疗 结核 病 特别 有 效 。 利 福 平 是 细菌 RNA 聚合 酶 的 非常 有 效 的 抑制 剂 ,2X10-sM 浓 度 可 抑制 50 多 活性 。 搁 制 机 制 是 与 酶 的 8 亚 基 结合 , 而 防 碍 了 5- 顺 叭 核 背 三 磷酸 的 进入 ,结果 阻 断 RNA 链 的 起 始 。 利 福 平 并 不 影响 酶 与 DNA 的 结合 。 利 福 平 对 真 核 RNA 聚合 酶 无 作用 ， 然而 在 某 些 特 定 情况 下 , 真 核 RNA 聚合 酶 可 被 一 些 利 福 平 衍生 物 所 抑制 。 O CH, CH, CH; ou,to | ‘| | >» iki hee CH;0 | OH ONR 2O | CH, ~ \cu,; OH OH Ve CH; | NH Sous ot 2 Siar CH; SS / 利 福 霉 素 B: R, = —OCH,COOH, R, = —Ho 利 福 平 : R, = —OH, R, = 一 CH = N—N N—CH;o 曲张 链 菌 素 (streptovaricin) 具有 与 利 福 平 同 一 专 一 性 和 作用 方式 ,来源 也 相同 。 利 链 菌 素 (streptolydigin) 与 利 福 平 不 同 , 虽 然 作 用 部 位 仍然 是 细菌 RNA 2a Bey 6 亚 基 , 但 却 优先 阻 断 RNA 链 的 延伸 。 ¢ 152. CH; CH; CH, | CHs Oo Ne JON unt Weep CHCONHCH, ou, 利 链 菌 素 xz- 怨 膏 草 碱 (a-amanitin) EWS Amanita phalloides 分 离 出 来 的 一 个 剧 毒物 质 二 为 一 环 八 肽 化 合 物 , 由 Gly 二 分 子 和 Le, -二 羟 He、 LI-Asn、L- 产 Pro, L-#% Trp 和 氧化 Cys 各 一 分 子 组 成 ,其 中 Trp 残 基 中 心 与 氧化 的 Cys 莹 基 相 联接 。 OH | HC\、 /CH 一 CH2OH CS Ver-a-ca|-sereareo -warom-oo | | | _ NH | HS CH, CO hag RE IE ie edt ces eee y aN co | (NOH wagte pee Se CO—CH—NH—CO—CH—NH—CO—CH,—NH Ci $5 MR o- SAB RMHN—H Ne RECA HAMDEN Leu 代替 ， 则 产生 完 全 无 毒性 的 -Amanulline。 从 毒 麻 菇 中 也 分 离 出 几 个 毒性 七 肽 。 c- 狼 膏 划 碱 完全 阻 断 真 核 RNA 聚合 酶 I 以 及 亚 产生 的 转录 作用 ， 特 别 抑制 mRNA 的 生物 合成 ,从 而 也 抑制 了 整个 细胞 的 蛋白 质 生 物 合成 。 但 对 细菌 、 线 粒 体 和 时 KH RNA 聚合 酶 没有 影响 。 此 外 ，RNA 聚合 酶 的 非特 异 抑制 州 有 : 多 核 背 酸 、 肝 素 、 聚 乙 二 醇 磷 酸 、 核 背 三 磷 酸 类 似 物 ,如 3 -脱氧 ATP，3“- 氮 基 -3 -脱氧 ATP 和 2-O- 甲 基 ATP 等 。 、mRNA 的 转录 与 加 工 mRNA 概念 的 提出 和 mRNA 的 发 现 mRNA 概念 是 Jacob 和 Monod 于 1961 年 提出 的 。 在 这 之 前 ,已 有 许多 研究 工作 者 在 思考 基因 (DNA), RNA 与 蛋白 质 生 物 合成 之 间 的 关系 。 在 真 核 细胞 中 , 遗传 信息 贮 存 于 细胞 核 的 DNA 24, 而 蛋白 质 合 成 部 位 却 在 细胞 质 ， 那 么 在 这 两 者 之 间 必 定 有 一 个 或 一 类 化 学 中 间 物 存在 ， 它 能 把 DNA 上 的 信息 传递 蛋白 质 。 该 化 学 中 间 物 曾 被 称 ©1536 He“ oe HOS (2 BR PRE (E” > Jacob 和 Monod EHRABH ABS ROL RN EL, KR 加 诱导 物 在 数 分 钟 内 诱导 酶 可 以 上 千 倍 地 增加 ,而 移 去 诱导 物 则 酶 合成 迅速 停止 。 因 此 ， 他 们 设想 这 些 大 量 的 酶 在 稳定 的 模板 上 直接 形成 是 不 可 想象 的 ， 而 必然 存在 一 个 短命 的 中 间 物 即 信使 作为 合成 酶 的 模板 ,这 个 信使 应 具有 下 列 性 质 : (1) 信使 应 是 多 核 昔 酸 ; (2) 信使 的 碱 基 组 成 应 该 反映 于 DNA 所 特有 的 碱 基 组 成 ; (3) 由 于 生物 体内 蛋白 质 种 类 繁多 , 故 信使 的 大 小 应 是 很 不 均一 的 ,根据 三 个 核 背 酸 编码 一 个 氨基 酸 计 算 , 信 使 的 分 子 量 至 少 50 万 ; (4) 信使 应 能 短暂 地 与 核糖 体 结合 ; (5) 信使 的 合成 与 分 解 应 该 是 迅速 的 。 当时 已 经 知道 的 二 类 RNA (tRNA 于 1957 年 发 现 ，rRNA 在 1959 44} EO) MAA 有 这 些 性 质 。 第 一 ，rRNA 和 tRNA 的 碱 基 组 成 与 DNA 相差 甚大 ， 它 们 如 何 接受 来 自 DNA 的 信息 ?第 二 ，rRNA 和 tRNA 分 子 相 对 比较 均一 〈 见 第 三 章 )， 何 以 解释 生 物体 内 存在 千 差 万 异 的 蛋白 质 种 类 ? 第 三 ， 这 两 类 RNA 代谢 率 太 低 ， 不 能 说 明生 物体 具有 高 速度 合成 蛋白 质 的 能 力 ; 第 四 ， 不 同 生物 体 rRNA 以 及 tRNA 碱 基 组 成 彼 些 相 似 , 具 有 很 大 的 同 源 和 亲缘 性 ( 见 第 三 章 ), 如 果 它 们 是 蛋白 质 合成 的 模板 的 话 ， 很 难说 明 蛋白 质 的 种 族 差异 性 。 因 此 Jacob 和 Monod 认为 ,除了 rRNA 和 tRNA 以 外 ,必定 还 有 一 类 RNA 存在 , 这 类 RNA 必需 满足 上 述 要求 ， 在 蛋白 质 合 成 中 决定 氨基 酸 的 排列 顺序 ,把 从 DNA 分 子 得 到 的 信息 传递 给 蛋白 质 分 子 。 这 类 RNA 就 被 定名 为 信使 RNA (mRNA)。 mRNA 假说 提出 后 不 久 ,许多 实验 室 立 即 证 实 了 它 的 存在 。 FAWKES (A T2. T7 感染 大 肠 杆 菌 后 ， 虽 然 _RNA 总 量 没有 什么 变化 ， 但 约 有 1% RNA 是 新 合成 的 ,而 且 更 新 率 很 快 。 同 时 发 现 这 类 新 合成 的 RNA 的 碱 基 组 成 和 大 肠 杆 菌 原来 有 的 RNA 不 同 ,而 与 噬菌体 DNA 则 甚 类 似 ( 表 5-7)。 表 5-7 大 肠 杆菌 经 噬菌体 感染 后 新 生成 的 RNA 的 碱 基 组 成 9 核 酸 种 类 大 肠 杆菌 RNA T2DNA T2 感染 后 生成 的 RNA T7DNA T7 感染 后 生成 的 RNA 32 一 -| 一 | 一 一 | |] 一 26.6 *# 为 5- PRIME. TEX Hot cae FA al PR AI BS EA, 加 入 “C By YP 同位 素 标 记 的 化 合 物 进 行 短 时 间 培 养 ， 经 密度 梯度 超 离 心 分 离 。 都 能 得 到 含 高 放射 性 的 新 峰 ， 它 既 不 是 4S 的 tRNA, thASE 16S A 23S 的 rRNA， 而 是 一 类 新 RNA。 同时 进一步 发 现 ， 这 个 新 的 放射 性 高 峰 可 由 于 在 非 放 射 物 中 较 长 时 间 培 养 (如 37°C 保温 15 分 钟 ) 而 消失 ， 说 明 这 类 RNA 含量 既 少 , 代谢 很 快 。 虽 然 这 类 放射 性 物质 主要 和 核糖 体 结合 在 一 起 ， 但 其 ©1546 沉降 常数 不 是 rRNA， 并 且 可 用 电泳 将 其 分 离 出 来 。 1961 年 Spiegelman 发 展 了 一 种 新 的 杂交 技术 ,为 mRNA 的 存在 提供 更 有 说 服 力 的 HEH. FA “P 标 记 经 T2 叹 昔 体感 染 大 肠 杆菌 后 生成 的 RNA Bl T2 mRNA， 同 时 制备 标记 的 T2 DNA, 将 T2 mRNA 与 T2 DNA 混合 物 加 热 到 10p*C。 然 后 缓慢 冷却 到 室温 ,冷却 混合 物 进 行 密度 梯度 超 离心 ， 分 析 结 果 见 图 5-10。 *P 和 双重 标记 的 杂 交 体 的 存在 表明 ,TI2 mRNA 不 但 其 组 成 与 T2DNA 相似 ( 见 表 5-7) ,而 且 两 者 的 核 苷 酸 排列 顺序 也 有 对 应 的 互补 关系 。 © 图 5-10 T2 鸣 菌 体感 染 大 肠 杆 菌 生成 的 RNA 与 T2 DNA 的 杂交 实验 不 入; 采用 双 标 记 法 CH 标记 DNA 链 ,，P 标记 RNA 链 ) 也 可 在 体内 找到 这 种 杂交 产物 。 用 硝 基 纤 维 过 滤 法 能 够 更 简便 而 快速 地 分 离 鉴 定 杂 交 分 子 。 这 样 ， 经 过 许多 实验 室 的 努力 ,完全 证 实 了 Jacob 和 Monod 预言 的 mRNA 的 存在 。 稍 后 ,在 真 核 生 物 中 也 发 现 mRNA。 真 核 生 物 mRNA 中 3 REA SRA RE, 为 分 离 鉴定 带 来 了 很 大 的 方便 ( 见 第 十 一 章 )。 鉴定 mRNA ‘di tacoma FAS» Fe ABA eC HARE » AZT HR RAE SO 原核 生物 mRNA 的 转录 原核 生物 mRNA 转录 有 以 下 几 个 特点 : 〈1) 多 顺 反 子 转录 ， 以 操纵 子 作为 转录 单 fr; 〈2) 转 录 与 翻译 偶 联 在 一 起 ,往往 mRNA 还 未 转录 完全 ， 和 蛋白 质 合成 就 已 开始 ; 而 且 , 翻 译 成 为 调节 转录 的 一 个 因素 ; 〈3) 除 个 别 mRNA 外 ,一 般 原 核 生物 mRNA 不 需要 ML; 〈4) 原 核 生 物 mRNA 的 寿命 比较 短 , 大 肠 杆菌 mRNA 的 半 寿 期 一 般 只 有 几 分 钟 或 者 更 短 。 I. 原核 生物 DNA 分 子 上 的 转录 信号 一 一 操纵 子 及 其 调控 区 。 在 原核 基因 组 织 中 , 几 个 相关 的 蛋白 质 或 几 个 相关 的 RNA 的 基因 常 被 组 织 为 一 个 转录 单位 。 包 括 几 个 蛋白 质 基 因 的 转录 单位 被 转录 为 一 个 多 顺 反 子 mRNA, 产物 除 编码 几 个 蛋白 质 的 序列 外 ,也 包括 位 于 分 子 两 端 或 顺 反 子 间 的 非 编 码 区 ， 非 编码 区 是 mRNA 的 结构 特征 之 一 ( 见 第 三 章 ), 它 不 翻译 ,但 转录 后 这 部 分 并 不 被 加 工 释放 。 1961 年 Jacob 和 Monod 在 提出 mRNA 概念 的 同时 ,也 提出 操纵 子 学 说 , 为 原核 生 物 转录 及 其 调控 方式 设计 了 一 个 简单 的 模型 。 虽 然 自 此 以 后 ,大 量 研究 结果 表明 ,他 们 的 模型 是 相对 简单 化 了 ， 但 所 有 原核 生物 的 基因 表达 都 可 以 用 操纵 子 作为 转录 单位 予以 描 ©1556 述 。 操 纵 子 包括 数 个 相关 的 结构 基因 及 其 调控 区 ， 是 一 个 基因 表达 的 协同 单位 。 调 控 区 - 主要 可 分 为 三 个 部 位 一 一 操纵 基因 、 局 动 子 和 降解 物 基因 活化 蛋白 (CAP) 连接 部 位 ;, 它 们 之 间 通 常 相互 重 登 。 启动 子 是 RNA 聚合 酶 的 结合 部 位 ， 结 合 后 启动 RNA Ape 纵 基 因 是 操纵 子 以 外 的 调节 基因 生成 的 阻 遏 蛋白 的 结合 部 位 ， 二 者 结合 后 ， 转 录 即 被 阻 Bt RAK Hom MEER RE, OMAR RAN“ HVAT”; CAP 由 分 子 量 为 45,000 的 两 个 亚 基 组 成 ， 也 叫 cAMP 受 体 蛋白 ，cAMP 促进 CAP 与 DNA 结合 而 加 快 转录 速度 ,可 能 是 由 于 它 们 在 结合 点 使 DNA 局 部 变性 , 增强 RNA 聚合 酶 对 启动 分 子 的 结合 而 促进 转录 。 这 叫 转录 的 正 调 节 ”。 此 外 ,在 某 些 操纵 子 的 调控 区 中 存在 衰减 子 , 这 个 部 位 不 同 于 结构 基因 下 游 的 终止 子 , 它 既是 一 个 终止 信号 ,也 是 一 个 调节 信号 。 对 二 类 操纵 子 进行 了 详细 的 研究 : 一 是 可 诱导 操纵 子 ， 另 一 为 可 阻 遏 操纵 子 。 可 诱 导 操 纵 子 指 在 正常 的 情况 下 不 表达 或 仅 在 低 水 平 上 表达 的 转录 单位 ， 如 果 环 境 发 生 某 些 : 变化 ， 则 操纵 子 开放 ， 转 录 mRNA, 从 而 合成 诱导 酶 以 适应 细胞 的 需要 。 许 多 负责 糖分 解 代谢 的 操纵 子 属 于 这 种 类 型 ， 如 乳糖 Cac) 操纵 子 、 半 乳糖 (gal) 操纵 子 和 阿拉 伯 炉 (ara) 操纵 子 等 。 可 阻 遏 操纵 子 则 主要 是 调控 氨基 酸 过 剩 的 ,氨基 酸 过 多 ， 可 以 通过 两 条 . 途径 调节 ,其 一 是 负 反 馈 以 抑制 合成 该 氨基 酸 所 需要 的 一 系列 酶 中 的 关键 酶 , 另 一 种 方式 . 是 关闭 基因 使 酶 不 能 合成 ， 显 然后 者 是 最 有 效 的 。 可 阻 遇 操纵 子 就 是 负责 氮 基 酸 合 成 代 谢 调控 的 操纵 子 , 如 色 氮 酸 (trp) 操纵 子 ` 组 氨 酸 Chis) 操纵 子 等 。 为 了 简便 ,在 下 列 分 述 的 操纵 子 中 ,统一 采用 以 下 符号 和 代号 : i, 调 节 基 因 ; py Bop 子 ; o， 操 纵 基 因 ; a， 衰 减 子 ;结构 基因 则 以 相应 大 写 符号 表示 。 候 ,RNA RAM O- 383A, CAP-cAMP (CAP 与 cAMP 的 复合 物 ); 一 一 ,mRNA; mA IAM) lac 操纵 子 是 研究 得 最 早 而 又 最 详细 的 ,其 基因 结构 排列 在 第 二 章 已 介绍 过 了 ;图 天 11 示 出 lac 操纵 子 的 阻 遇 (正常 情况 下 ,无 诱导 物 存在 ) 和 诱导 (加 入 乳糖 或 其 类 似 物 ) 过 程 。 在 lac 操纵 子 的 调控 区 中 ,各 信号 蛋白 结合 部 位 的 核 背 酸 顺 序 已 经 测 出 ( 见 图 1 六 其 中 启动 子 的 序列 具有 通常 的 保守 序列 ( 见 第 二 节 , 转 录 的 起 始 )，CAP-c AR BE 5 — 19 Da 26 BA °° 4e AO BE oe A FFE — PIA TB SK P, AUP2, (A Pl DLA SD, ERD PL BAe ° 157 "4, VEO BEE SRWRAAS, SHA CL 5-144); 有 阿拉 伯 糖 时 ，P' 转变 为 P,, 能 作为 激活 剂 与 启动 子 结合 ,实现 正 调节 ( 见 图 5-14B)。 此 外 CAP-cAMP 和 ppGpp ( 见 第 九 章 ) 也 都 能 促进 ara 操纵 子 基因 表达 ,但 结合 部 位 不 很 清楚 。 Cc B A ‘aa O RE 人 图 5-14 ara 操纵 子 的 调控 图 5-15 tp 操纵 子 的 早期 调控 模型 trp 作为 共 阻 遏 物 与 阻 过 蛋白 结合 后 抑制 转录 trp RAF PEE AIRE RANT BRAT. A5-15 是 早期 建立 的 trp 操纵 子 结构 和 调控 模型 , 它 包 括 五 个 结构 基因 以 及 5 旁 侧 的 调控 区 。 五 个 基因 产物 组 成 的 酶 系 可 以 催化 从 分 支 酸 合成 trp (图 5-15A) trp 过 剩 时 , 则 阻 遏 转录 进行 。 按 照 Jacob 和 Monod 的 操纵 子 概念 ,提出 trp 是 一 个 共 阻 过 物 (corepressor) , 当 它 与 阻 遏 蛋白 结合 后 , 即 与 操纵 基因 连结 而 阻 断 转 录 ( 图 5-15B)。 但 是 后 来 发 现 ,有些 实验 结果 并 不 能 用 上 述 模型 解释 ， 如 于 trp-tRNAT 变异 株 中 加 入 Trp 并 不 减低 trp 操纵 子 的 基因 表 达 ; 加 Trp 于 Trp 饥 狐 细胞 并 不 关闭 转录 的 起 始 , 而 只 抑制 起 始 片 仆 上 转录 的 延伸 ， 同 甜 也 有 实验 说 明 , 在 操纵 子 的 起 始 片 有 中 可 能 存在 终止 部 位 ,因为 在 trp 操纵 子 5 端 序列 产生 的 mRNA 中 ， 相 当 于 操纵 子 的 前 导 序列 140 bp 的 寡 核 背 酸 多 于 来 自 其 他 部 分 的 片 段 几 倍 。 基 于 这 些 观察 ,人 们 提出 另 一 种 调控 机 制 , 叫做 衰减 作用 (attenuation)， 即 通过 转录 的 终止 (而 不 是 转录 的 起 始 ) 对 基因 表达 进行 调控 一 一 Trp 缺少 ,转录 进行 ; ITIP 过 HK) ERK iko | 1981 年 已 全 部 测 出 trp 操纵 子 中 7,000 多 个 bp 的 排列 顺序 ， 其 中 6,800bp 构成 五 个 结构 基因 ,编码 酶 或 其 亚 基 ,催化 从 分 支 酸 经 过 五 步 反 应 合成 L-Trp( 图 5-16)o trp ® 纵 子 结构 有 以 下 几 个 特点 : 〈1) 在 结构 基因 前 有 一 段 162 核 苷 酸 的 前 导 序 列 (L)， 能 编码 出 一 个 14 肽 ,其 转录 产物 具有 一 奇特 的 二 级 结构 ,其 中 含有 被 称 作 误 减 子 (a) 的 转录 终止 的 调节 信号 ; 〈2) 启 动 子 与 操纵 基因 大 部 分 重 登 ; (3) 除 了 5 旁 侧 的 启动 子 外 ， 在 操纵 于 内 部 存在 另 一 弱 的 启动 子 (P;); (4) 结 构 基 因 之 后 出 现 二 个 终止 信号 CM’), RAF (人 t) 为 e 因子 所 识别 ( 见 第 147 页 )。trp 操纵 子 的 调控 区 排列 见 图 5-17。 rp 操纵 子 前 导 序 列 的 转录 产物 具有 下 列 奇特 的 可 变 二 级 结构 (图 5-18)， 图 中 方 框 内 为 典型 的 终止 信号 ( 见 第 二 节 )， 结 构 左 面包 括 前 导 肽 羧 端 的 6 个 氨基 酸 密 码 子 及 其 终 sk BAF CHL 1 SATE) © | ©1586 邻 氨 基 BRE wa sic HER A> GRERER A 氨基 革 申 酸 一 用 时 村 和 Gla PRPP -5- BR cr 5-16 up 操纵 子 结构 基因 排列 及 其 表达 产物 tt 表示 两 个 终止 子 其 顺序 见 第 147 页 ;数目 字 代表 从 启动 子 右 侧 起 的 核 背 酸 对 数 。 : 1 转录 起 始 转录 终止 图 5-17 up 操纵 子 的 调控 区 排列 U G A U G A C C A C A U A U C C NG U*®GA Trp G UPA : C AeU G U*A Cc ec A [ Cc ‘140 Bictec | NA UUUUUUUU EEC CN o. Cc GAC G ee ae U GeC G 1 CEG C WA G A Cc az UAAU Il 5-18 wp 操纵 子 前 导 序列 的 转录 产物 的 二 级 结构 图 在 结构 基因 前 存在 这 样 结构 的 衰减 子 可 以 解释 基因 表达 是 如 何 通过 转录 终止 进行 调 控 的 ， 由 于 原核 生物 转录 与 翻译 是 偶 联 在 一 起 的 ,这 种 情况 下 ， 若 \1)， 前 导 肽 不 被 翻译 ° 159 nN, | 型 结构 稳定 ， 则 转录 在 终止 信号 ( 方 框 处 ) 停 止 ; (2) Trp 缺少 ， 则 Trp-tRNAT* 不 能 生成 ,翻译 至 Trp 密码 子 处 停止 ,这 时 ,核糖 体 使 I 型 结构 破坏 ， 从 而 不 存在 终止 信 号 结构 ,得 到 类 似 I 型 的 结构 。 RNA 聚合 酶 于 是 顺利 通过 进行 转录 以 合成 Trp; (3) Trp 过 量 , 当 然 还 要 存在 正常 量 的 tRNA™ 以 及 Trp-tRNAIe 合成 酶 ， 则 前 导 14 AR 翻译 ,这 时 ,核糖 体 破 坏 工 结构 中 左 侧 的 氢 键 配对 区 而 保留 其 终止 信号 , 故 转录 也 停止 。 三 种 情况 的 示意 图 见 图 5-19。 (1) (2) (3) 没有 翻译 ， Trp 缺少 ， 核 Trp 过 量 ,核糖 转录 在 方 糖 体 不 能 翻译 体 翻 译 前 导 肽 ， 框 处 终止 。 抽 转录 “转录 终止 。 照常 进行 。 图 5-19 大 肠 杆菌 rp 操纵 子 中 衰减 作用 模型 四 表示 核糖 体 ,核糖 体 大 小 见 第 六 章 约 能 遮盖 16-20 KR. 综 上 所 述 , 在 trp 操纵 子 的 基因 表达 中 ， 受 到 TrptRNAt? 的 影响 ,而 tRNAT? 与 Trp-tRNAT? 的 相对 浓度 则 决定 于 细胞 内 Trp BE, Trp-tRNA™? 合成 酶 的 量 和 活性 、 (RNAT? 量 、 甚 至 最 重要 的 是 细胞 内 整个 蛋白 质 合成 的 速度 。 通 过 阻 遏 作用 进行 转录 调 - 控 ( 见 图 5-15) 不 是 trp 操纵 子 的 唯一 机 制 , 而 衰减 作用 模型 (图 5-19)， 则 能 解释 许多 已 经 存在 的 实验 结果 。 his 操纵 子 它 具 有 类 似 up 操纵 子 的 调控 方式 ， 实际 上 衰减 作用 概念 最 早 是 从 沙门 氏 杆 戎 his 操纵 子 研究 中 首先 提出 的 。 在 his 缺乏 时 ，his ee 化 从 ATP 和 PRPP 合成 Hiso his 操纵 子 中 基因 排列 如 下 : his 操纵 子 结构 基因 3 | G D [Gs B H A F I E : a ee LO aa] py on 转录 方向 和 其 他 操纵 子 有 类 似 情 况 ，his 操纵 子 的 结构 基因 顺序 与 酶 的 作用 顺序 并 不 一 致 。his 操 纵 子 没有 一 个 专门 的 调节 基因 ， 而 是 由 第 一 个 结构 基因 G 产物 一 一 磷 栈 核糖 基 -ATP 合 his 操 纵 子 SC 25 ASE OES =) FA PRPP_ C= J -[ ts His, 合成 酶 His { —— tRNA IA tRNA 前 体 His -tRNA 图 5-20 his 操纵 子 的 负 调 控 R 是 tRNAM 结构 基因 ; UW 为 tRNA 加 工 酶 基因 ; T 为 修饰 酶 基因 ， 访 酶 催化 U>p; S 表达 产生 His-tRNA9I 合成 酶 。 * 160 » RBA HistRNA™ 一 起 组 成 有 活性 的 阻 遏 物 进行 负 调 节 ， 因 此 所 有 有 关 形 成 His- tRNAHi 的 酶 基因 的 突变 都 直接 影响 his 操纵 子 的 表达 (图 5-20)。 his 操纵 子 的 调控 区 序列 已 经 测定 ,其 前 导 序 列 能 编码 一 个 16 肽 ,其 中 含有 连续 的 七 个 组 氨 酸 残 基 。 前 导 序 列 转录 产生 mRNA 具有 类 似 于 up 前 导 mRNA 的 可 变 二 级 结 构 。His 缺少 , 转录 通过 结构 基因 ; His 过 量 或 缺乏 对 应 于 His 密码 子 前 任 一 氨基 酸 密 OF WR tRNA, WATS mRNA 上 出 现 终止 信号 而 使 转录 在 衰减 子 处 停止 。 但 是 ， his 操纵 子 前 导 序 习 形 成 的 二 级 结构 较 up 操纵 子 复杂 ， 正 常情 况 下 出 现 四 个 长短 不 一 MARK. ; | II. 原核 生物 转录 与 翻译 偶 联 在 一 起 ,一 般 原核 mRNA 不 需 加 工 从 拍摄 的 原核 生物 转录 过 程 的 电镜 图 (如 图 5-21)， 可 以 观察 到 在 新 生 的 mRNA 链 止 附着 许多 核糖 体 , 这 意味 着 转录 尚未 结束 而 翻译 早已 开始 ,新 生 RNA 即 为 成 熟 RNA， 而 不 必 经 过 进一步 加 工 。 而 其 他 所 有 种 类 的 细胞 质 RNA 都 是 要 进行 加 工 的 〈 见 下 文 )。 图 5-21 大 肠 杆 菌 转录 与 翻译 的 偶 联 但 是 也 有 例外 ,如 T7 DNA 由 一 个 启动 子 、5 个 结构 基因 和 一 个 终止 子 组 成 , 被 大 ita RNA 聚合 酶 全 部 转录 得 到 较 大 的 RNA 前 体 ,然后 由 加 工 酶 RNaseII 剪 切 成 五 企 成 熟 的 mRNA 分 子 。 真 核 生物 mRNA 的 转录 与 加 工 第 三 章 已 经 讨论 mRNA 的 结构 问题 。 真 核 细 胞 的 核 \ 质 分 明 , 转录 与 翻译 有 一 个 生 理 上 的 屏障 ,与 原核 细胞 有 明显 不 同 的 特点 。 关 于 mRNA 的 转录 问题 ,应 该 深 人 研究 细 息 核 才能 解决 。 由 于 真 核 细胞 及 其 DNA 的 复杂 性 ， 花 了 很 长 时 间 才 找到 了 追踪 的 线 妆 , 首 先 发 现 核 内 存在 一 类 含量 不 算 太 少 的 RNA， 分 子 很 不 均一 , 无 论 在 体内 或 体外 标 记 实 验 , 可 以 很 快 分 离 得 到 一 系列 标记 化 合 物 。 同 时 证 明了 这 些 化 合 物 不 是 rRNA (18S 和 28S) 及 其 前 体 (45S)。 这 类 RNA 就 被 称 为 不 均一 的 细胞 核 RNA(ChnRNA heteroge- Meous nuclear RNA)。hnRNA 一 般 要 比 细 胞 质 mRNA 大 ， 大 约 从 10S 到 100S。 哺 乳 动 物 hnRNA 和 链 长 在 5,000 到 50,000 核 背 酸 之 间 。 组 织 培养 的 哺乳 动物 细胞 如 世 细胞 , 每 一 细胞 约 含 2pghnRNA ,大 约 是 细胞 质 mRNA 的 四 倍 。 hnRNA 半 寿 期 变化 很 大 ,不 同 种 类 细胞 有 不 同 的 半 寿 期 。 一 般 来 说 hnRNA 半 考 期 。161。 很 短 ;, 比 细胞 质 mRNA BARE ML 细胞 hnRNA 4AIARA 04 小 时 ,而 其 细胞 质 mRNA 半 寿 期 为 1 一 10 小 时 。 海 胆 胚 胎 hnRNA 半 考 期 仅 为 7 分 钟 , 而 其 细胞 质 mRNA AAA 3 小 时 。 很 早 人 们 就 设想 hnRNA 可 能 是 mRNA 的 前 体 ,或 至 少 部 分 是 mRNA. 前 体 。 至 今 已 有 大 量 实验 证 据说 明 这 一 点 ， 而 序列 分 析 的 进展 提供 了 肯定 的 证 据 。 既然: 有 前 体 , 就 必需 经 过 加 工 才能 产生 有 功能 的 成 熟 mRNA。 真 核 生 物 RNA 包括 mRNA 的 转录 具有 与 原核 生物 明显 不 同 的 特点 。 如 转录 起 始 : 信号 有 所 不 同 ( 见 第 二 节 ); 真 核 转录 单位 往往 是 单 顺 反 子 ,不 象 原核 生物 那样 组 织 为 操纵 子 ; 大 多 数 蛋白 基因 以 及 个 别 RNA 基因 〈 如 酵母 )、rRNA RACER AAI 序 , 它 把 同一 结构 基因 分 成 数 段 , 同 时 在 许多 情况 下 , 插 人 顺序 链 长 比 结构 基因 还 长 ;5 随 之 而 来 的 是 ,加 工 过 程 更 为 复杂 等 等 。 hnRNA 是 mRNA 的 前 体 hnRNA 与 mRNA 存在 非常 密切 的 关系 ,表现 为 : (1) 与 mRNA 相似 ,有 类 似 于 DNA 的 碱 基 组 成 ,而 与 rRNA 碱 基 组 成 很 不 相同 。. 如 HeLa 细胞 hnRNA #&% 43—45% 的 G 十 C， 非 常 类 似 于 细胞 DNA (42—47% 的 G 十 C)， 而 明显 不 同 于 rRNA (>60%K G 十 C)。 当然 亦 有 少数 情况 hnRNA 的 碱 基 组 成 与 DNA 并 不 一 样 , 在 同一 细胞 核 中 不 同 染色 体 上 ， 甚 至 同一 染色 体 不 同 部 分 上 合成 的 hnRNA 碱 基 组 成 亦 是 不 一 样 的 。 (2) hnRNA 有 与 mRNA 相同 的 5 端 hnRNA 5’ 端 具 有 m’G” ppp” NmpNP- 结 构 ， 与 细胞 质 mRNA 5’ 端 相同 。 鼠 世 细胞 hnRNA 与 mRNA 具有 十 分 相似 的 子 端 组 成 ;如 5' 端 为 m7G7ppp*m'AmpG- 的 都 占 20% 5 if 5’ via 4) m’G” ppp” UmpG-Ay AA FI) 1% (3) hnRNA 的 合成 和 细胞 质 mRNA AR-H, 不 为 低 剂 量 放 线 菌 素 D 所 抑制 《 低 : 剂量 放 线 菌 素 D 能 选择 性 地 抑制 rRNA 的 合成 ), 但 能 为 高 剂量 放 线 菌 素 D 所 抑制 , Be BH hnRNA 与 mRNA 为 同一 类 型 RNA RABMARK, ie hnRNA. 5 mRNA 之 间 存 在 着 前 体 与 产物 关系 的 设想 。 (4) hnRNA 与 细胞 质 mRNA 存在 着 类 似 的 加 上 多 聚 A 过 程 。 大 多 数 真 核 细胞 . mRNA 中 存在 着 3 端 多 聚 A, 而 hnRNA 分 子 中 却 只 有 10-40% BASRA MAS 物 hnRNA 中 多 聚 人 长 度 平均 为 150 一 200 个 核 背 酸 , 而 其 mRNA 中 多 聚 人 长度 为 20 一 200 KB. hnRNA 和 mRNA3’ 端 多 聚 A 不 是 由 DNA 转录 的 , 而 是 转录 后 再 加 上 的 。 细 胞 核 DNA 中 并 不 含有 大 于 50 个 核 苷 酸 的 多 聚 (dA-dT) 顺序 ， 而 hnaRNA 与 mRNA 却 含有 直至 200 个 核 苷 酸 的 多 聚 人 片段 。 3'- 脱 氧 腺 背 能 抑制 rRNA 前 体 合成 和 mRNA 在 细胞 质 中 出 现 ， 但 不 影响 hnRNA 合成 。 进 一 步 研究 表明 3' 脱氧 腺 苷 能 抑制 多 聚 A 合 成 ,结果 阻止 多 聚 A 加 到 hnRNA 与 mRNA 分 子 上 。 由 于 多 聚 A 的 添加 是 mRNA 成 熟 的 重要 一 步 ， 也 是 mRNA vA Ale 质 所 必须 的 ， 所 以 上 述 结 果 并 不 影响 hnRNA 与 mRNA 是 前 体 与 产物 关系 。 细 胞 核 或 细胞 质 中 RNA 加 上 多 聚 A 的 动力 学 是 很 复杂 的 , 不 能 由 此 得 出 hnRNA 与 mRNA 之 间 存 在 着 简单 的 前 体 与 产物 关系 的 结论 。 细 胞 核 中 多 聚 A 顺序 的 消失 ， 一 部 分 是 由 于 多 聚 A 随 mRNA 进入 细胞 质 , 也 有 一 部 分 是 在 细胞 核 内 被 降解 的 。 另外 在 细胞 质 中 也 存 在 着 加 上 多 聚 A 的 作用 。 。 1626 (5) hnRNA 5 mRNA 中 存在 着 相同 的 顺序 。 若 hnRNA 是 细胞 质 mRNA 前 体 ， 那么 hnRNA 将 含有 存在 于 细胞 质 mRNA 中 的 所 有 顺序 。 不 同 细胞 hnRNA 和 细胞 质 mRNA 与 细胞 核 DNA 进行 竞争 杂交 的 实验 清楚 表明 ,在 细胞 质 mRNA 中 存在 的 顺序 都 在 hnRNA 中 ， 但 在 hnRNA 中 却 存在 着 许多 细胞 质 mRNA 中 不 存在 的 顺序 。 这 一 事实 虽 不 是 最 后 证 明 , 但 却 有 力 地 支持 haRNA 是 细胞 质 mRNA 前 体 的 想法 , 同时 也 表 明 hnRNA 的 顺序 要 比 细胞 质 mRNA 复杂 得 多 。 hnRNA 中 大 部 分 顺序 是 不 进入 细胞 质 的 。 目 前 对 留 在 细胞 核 内 的 顺序 知道 得 还 很 少 ， 至 于 为 何 选择 这 些 顺 序 留 在 细胞 核 内 则 更 不 清楚 。 大 多 数 mRNA 是 从 非 重复 顺序 DNA 转录 而 来 。hnRNA 中 重复 顺序 要 比 mRNA 多 ,这 表明 绝 大 部 分 重复 顺序 已 在 细胞 核 内 降解 。hnRNA 中 重复 顺序 大 多 在 5 端 , 而 非 重复 顺序 在 3 端 ,因此 很 可 能 mRNA 主要 从 邻近 hnRNA3' 端的 非 重复 顺序 得 来 。( 图 5-22)。 (6) 在 hnRNA 中 存在 特异 性 mRNA 顺序 。hnRNA 能 和 与 细胞 质 特 异性 mRNA 互补 的 DNA 或 RNA 进行 杂交 。 与 鸭 珠 蛋白 mRNA 互补 的 DNA 能 与 鸭 红 细胞 28- 100S hnRNA 进行 杂交 ， 这 表明 在 较 大 的 鸭 红 细胞 hoRNA 中 存在 有 珠 蛋 白 mRNA 顺 序 。 卵 清 蛋白 mRNA 顺序 亦 在 鸡 输卵管 hnRNA 中 测 到 。 在 病毒 转化 细胞 中 ，hnRNA 能 与 转化 细胞 所 用 的 病毒 DNA 或 RNA 进行 杂交 。 SV40 转化 的 细胞 中 含有 SV40DNA ， 它 与 细胞 染色 体 共 价 结合 。 通过 杂交 试验 可 以 证 明 在 转化 细胞 hnaRNA 与 多 核糖 体 RNA (主要 是 细胞 质 mRNA) 中 存在 SV40 特异 性 顺序 。 双 股 SV40DNA 分 子 量 为 3 x 10'd, 而 含有 SV40 特异 性 顺序 的 hnRNA 分 子 量 为 1.5 一 4 x 105d, SA SV40 特异 性 顺序 的 mRNA 分 子 量 为 -0.5 Xx 105d。 这 表明 SV40 转化 细胞 转录 的 RNA 要 比 单 股 SV40DNA 或 细胞 质 中 发 现 的 SV40 病毒 特异 性 mRNA 要 长 。 另 外 在 腺 病毒 与 疱疹 病毒 转化 的 细胞 中 都 已 发 现存 在 着 病毒 特异 性 顺序 的 hnRNA 与 细胞 质 mRNA。 鼠 乳腺 肿瘤 病毒 特异 性 RNA 顺序 亦 存在 于 肿瘤 细胞 hnRNA 与 细胞 质 mRNA 中 。 所 以 在 hnRNA 中 存在 着 与 正常 顺序 共 价 连结 的 病毒 特异 性 顺序 ， 这 可 能 是 病毒 转化 细胞 的 一 种 普遍 现象 。 这 一 点 尽管 还 不 能 最 终 证 明 hnRNA 是 mRNA 前 体 ,但 与 hnRNA 是 mRNA 前 体 的 想法 相符 。 (7) hnRNA 能 被 翻译 为 特定 蛋白 质 。hnRNA 能 为 核糖 体 特 异性 识别 ,表明 hnRNA 含有 与 核糖 体 特异 性 结合 位 置 。 这 种 结合 类 似 于 mRNA 与 核糖 体 结合 ， 需 要 特异 性 蛋 白 因子 (可 能 就 是 起 动因 子 ), 同 时 这 种 结合 又 为 蛋白 质 合 成 起 动 抑 制剂 所 抑制 。 hnRNA 中 存在 mRNA 顺序 的 更 为 直接 的 证 据 是 hnRNA 能 在 体外 蛋白 质 合 成 系 统 中 被 翻译 。 如 合成 珠 蛋 白细胞 ( 鼠 胚胎 肝 细 胞 与 鸡 非 成 熟 红细胞 等 ) 的 hnRNA ,在 爪 蟾 卵 母 细胞 中 与 无 细胞 蛋白 质 合成 系统 中 都 能 促进 珠 蛋 白 合成 ,而 用 脑 细胞 hoRNA 就 观察 不 到 珠 蛋 白 的 合 记 。 来 自 各 种 组 织 的 hnRNA 都 可 在 体外 蛋白 质 合成 系统 中 被 翻译 为 多 肽 ,但 翻译 产物 往往 要 比 mRNA 复杂 。 如 鸡 非 成 熟 红细胞 hnRNA 在 无 细胞 蛋白 质 合 成 系统 中 翻译 为 珠 蛋白 的 量 不 到 总 翻译 量 的 20 多 ,而 其 细胞 质 mRNA 翻译 产物 70 多 以 上 是 珠 蛋 白 。 如 用 鸡 网 织 红细胞 hnRNA 进行 体外 翻译 ， 所 产生 的 珠 蛋 白 “与 8 链 之 间 比例 亦 与 其 珠 蛋白 mRNA 翻译 产物 不 同 。 此 种 差别 不 仅 是 因为 hnRNA 种 类 复杂 ， 还 可 能 与 hnRNA 有 比 mRNA 更 为 复杂 的 二 级 与 三 级 结构 有 关 。 "163。 综 上 所 述 ，hnRNA 与 mRNA 之 间 具 有 密切 关系 ,虽然 不 能 说 全 部 ,至 少 部 分 hnRNA 是 mRNA 的 前 体 。 实 验 表 明 , 只 有 10—40% hnRNA 分 子 具 有 多 聚 A， 而 3 端的 多 聚 A 被 认为 是 mRNA 进 人 细胞质 所 必须 的 , 那么 不 具有 3’ 端 多 聚 人 的 hnRNA 分 子 是 不 是 mRNA 前 体 ? 没有 多 聚 A 的 被 严格 限制 在 核 内 的 hnRNA 功能 是 什么 ” 这 些 问 题目 前 还 不 能 得 到 满意 的 回答 。 在 分 离 纯化 hnRNA 时 遇 到 一 个 很 大 的 困难 ,就 是 hnRNA 很 易 聚 合 ,在 温和 条 件 下 hnRNA 解 聚 不 完全 ,而 在 强烈 变性 条 件 下 则 又 会 引起 hnRNA 降解 ， 因 此 要 分 离 纯化 到 完整 的 hnRNA 并 准确 地 测定 其 大 小 是 困难 的 。 hnRNA 的 分 子 结构 上 节 提 到 ，hnRNA 与 mRNA 具有 相似 的 5 帽子 结构 和 3' 多 聚 A 未 端 。 由 于 发 现 有 形成 帽子 结构 和 附加 多 聚 A 的 酶 ,( 见 “mRNA 前 体 的 加 工 ” 一 节 )， 因 此 ,hnRNA 并 不 是 转录 的 原始 产物 。 此 外 ，hnRNA 的 5 端 一 般 有 3 TRU GHEE, 每 个 长 约 30 个 核 昔 酸 ,这 些 片段 似 由 DNA 转录 而 来 。 图 5-22 是 hnRNA 的 分 子 结构 示意 图 。 mRNA 部 分 CAR Prt INEULEUE 5/ 3/ :nmTCG37 x -UJ < 000. Ja Ly eet Jal .11 一 一 一 一 一 一 一 一 一 A.…A miGrppp* Nmp Np-U-+---U-U-U-UU + dsRNA dsRNA gua ， 帽子 区 i mC Mt FS 5-22 haRNA 的 分 子 结构 示意 图 hnRNA 分 子 中 分 散 着 重复 顺序 与 非 重 复 硕 序 ,它们 的 数量 、 长 短 和 分 布 随 细胞 种 类 不 同 而 不 同 。 鼠 腹水 细胞 hnRNA 中 ,28 多 是 1,200 个 核 苷 酸 长 的 非 重复 顺序 分 散在 200 个 核 背 酸 长 的 重复 顺序 中 ,而 43% 则 是 由 900 个 核 背 酸 长 的 非 重复 顺序 分 散 于 200 TK 苷 酸 长 的 重复 有 顺序 中 。HeLa 细胞 hnRNA3”′ 端 多 聚 A 旁 有 一 非 重 复 顺 序 , 它 的 长 度 类 似 或 稍 大 于 其 mRNA 平均 长 度 。 除 这 一 特殊 区 域外 ，HeLa 细胞 hnRNA 中 非 重复 顺序 均匀 地 分 散 于 重复 顺序 之 中 。 海 胆 胚 胎 hnRNA 中 也 存在 大 量 800 个 核 昔 酸 长 的 非 重复 顺序 ,它们 分 散 于 300 RARE ES MMF ZH, hnRNA 的 主要 部 分 是 由 DNA 中 非 重复 顺序 和 重复 顺序 转录 而 来 。 hnRNA 的 另 一 特点 是 大 多 数 hnRNA 都 含有 茎 环 结构 即 dsRNA 区 ,这 种 茎 环 结构 是 由 分 子 内 碱 基 配 对 形成 的 。 这 种 葵 环 结构 并 不 多 ， 可 能 位 于 或 靠近 编码 蛋 白 质 的 非 重 复 顺 序 两 端 。 将 hnRNA 用 核酸 酶 处 理 而 后 用 羟基 础 灰 石 柱 或 纤维 素 柱 吸附 可 分 离 制 备 到 葵 环 区 。 鼠 肝 细 胞 hnRNA 中 葵 环 区 长 约 60 RAR. 鼠 腹 水 细胞 haRNA HS 环 区 长 分 别 为 10 一 20 个 与 100 FRA. 和 细胞 质 mRNA 一 样 ,在 hnRNA HIPAA N° EWR Ee 。164 。 真 核 生 物 mRNA 基因 中 的 插 人 顺序 (内 含 子 ) 被 转录 在 hnRNA 分 子 中 在 DNA 结构 一 章 曾 经 提 到 ,许多 真 核 蛋白 质 基 因 含 有 内 含 子 。 这 种 结构 基因 的 不 连续 现象 正在 越 来 越 多 地 出 现 , 看 来 这 是 真 核 生 物 所 特有 的 普遍 现象 。 除了 第 二 章 提 到 的 例子 外 ， 下 面 二 个 基因 也 是 研究 较为 详细 的 。 鸡 卵 白 蛋白 基因 含有 多 至 七 个 内 含 子 和 八 个 外 显 子 (图 5-23)。 腺 病毒 Ad2 的 Hexon 〈 一 种 主要 外 壳 蛋 百 ) mRNA 基因 在 外 显 子 间 存 在 三 个 内 含 子 , 见 图 5-24。 8 9 10 O41 2-35 2 sy eae Kb i, 和 7 Re mRNA 图 5-23 ” 鸡 卵 白 蛋白 基因 中 的 插入 顺序 部 分 黑色 为 外 显 子 ; 外 显 子 间 为 内 含 子 。 mRNA 0 2480p1!0 80503400 35000 1000 2350 图 5-24 Ad2 Hexon mRNA 基因 区 域 黑色 部 分 代表 外 显 了 于 ; 外 显 子 间 为 内 含 子 ; 图 中 数目 字 代 表 核 苷 酸 对 数 。 从 已 研究 的 蛋白 基因 中 内 含 子 情况 可 以 看 出 ， 在 一 个 基因 中 往往 有 多 个 内 含 子 ， 同 和 时， 内 合子 的 总 链 长 比 结构 基因 编码 部 分 还 要 长 ,甚至 长 得 多 。 至 于 内 含 子 的 生物 功能 ， 目前 还 是 很 不 清楚 的 ， 除 了 第 二 章 提 到 的 可 能 功能 外 ， 近 年 来 有 的 实验 指出 ， 个 别 基 因 中 的 内 含 子 是 另 一 基因 的 外 显 子 ， 表 明 这 段 DNA 序列 具有 明确 的 生物 功能 。 还 发 现 ， 在 酵母 线粒体 的 个 别 内 含 子 中 同时 存在 起 始 密码 子 和 终止 密码 子 ， 它 们 编码 一 个 235 个 氨基 酸 的 蛋白 质 , 表 明 内 含 子 本 身 可 能 是 一 个 独立 的 结构 基因 。 由 于 成 熟 mRNA 并 不 含有 这 些 内 含 子 , 因 此 有 人 曾经 提出 ,可 能 在 RNA 聚合 酶 进 FERN, MAR ERO A MAIS, AS TRRER, RAKE 设 被 否定 ， 而 代 之 以 下 述 结论 : 内 含 子 和 外 显 子 一 起 被 转录 为 原始 转录 产物 ， 然 后 加 工 为 mRNA, hnRNA 含有 与 内 含 子 互补 顺序 是 内 含 子 与 外 显 子 一 起 被 转录 的 很 有 力 的 证 据 。8 珠 蛋白 mRNA 前 体能 与 8 珠 蛋白 基因 完全 互补 ， 实 验 是 这 样 进 行 的 : 用 同位 素 短 时 间 标 记 细 胞 核 RNA ,得 到 一 个 15S RNA , 它 具 有 与 10S 的 8 REA mRNA 相似 的 5 端 帽子 结构 和 3 端 多 聚 A 顺序 , 而 且 与 8 珠 蛋 白 基 因 的 长 度 相当 , 因此 , 一 般 认 为 15S RNA 是 1088 珠 蛋 白 mRNA 的 前 体 。 将 6 珠 蛋白 基因 片段 分 别 与 纯化 的 15S RNA 和 10S mRNA 杂交 ,在 电镜 下 观察 形成 的 R 环 (RNA 与 DNA 杂交 后 所 形成 的 环 )， 结 果 发 现 15SRNA *。165。 与 DNA 形成 的 R 环 是 完全 互补 的 ， 而 10SmRNA 与 DNA 杂交 时 ， 则 有 DNA 球 出 现 ,说 明 15SRNA 中 含有 与 内 含 子 互补 的 顺序 ,在 10SmRNA 中 。 这 个 顺序 已 被 遇 夫 《加 A254 A B 一 5-25 15S 珠 蛋白 mRNA 前 体 (A) 和 10S HAA mRNA(B) 分 别 与 含 珠 蛋 白 基 因 的 DNA 片 女 杂交 的 电镜 示意 图 箭 号 指出 的 R 环 是 RNA-DNA 杂交 链 ， 粗 线 为 双 链 细 线 为 单 链 。 FSS, 核酸 酶 降解 技术 也 说 明了 免疫 球 蛋白 轻 链 mRNA 前 体 上 含有 与 内 含 子 互 补 的 顺序 。 将 轻 链 mRNA 在 引物 存在 下 进行 反 转 录 , 可 以 得 到 两 种 产物 ,一 种 在 不 变 区 〈C), Aik, cDNA 链 长 为 200 一 300 核 昔 酸 ; 另 一 种 含有 不 变 区 和 可 变 区 (C 十 V), 其 链 长 约 500 一 700 RHR. 用 同位 素 标 记 DNA, Ra DNA 或 RNA 杂交 。 如 果 这 些 . DNA 与 RNA 是 连续 的 ( 即 无 内 含 子 ), 那 么 杂交 体 是 完全 抗 S， 核 酸 酶 的 ; 如 果 含 有 内 含 子 的 DNA 或 RNA 与 之 杂交 ,由 于 S, 酶 是 专 一 水 解 单 链 或 错 配 对 区 的 ( 见 第 三 章 )， 因此 将 得 到 的 是 部 分 抗 S 核酸 酶 的 结果 。 FAP 标记 的 (C+ V) cDNA 与 纯化 的 轻 : 链 mRNA 杂交 后 用 S, 酶 处 理 ,， 得 到 约 700 核 昔 酸 的 标记 DNA， 说 明 是 完全 抗 S， 酶 的 ; 若 用 轻 链 mRNA 的 27S 前 体 进 行 同样 杂交 ， 酶 解 后 ， 仅 得 到 290 核 昔 酸 长 的 标记 cDNA， 表 明 是 部 分 抗 S, 酶 的 ;用 含 轻 链 基 因 的 DNA 片段 与 (V+C)cDNA #2,H% S: 酶 处 理 , 也 得 到 295 BBR S. 酶 的 EDNA。 上 述 实验 充分 说 明 , 在 免疫 球 蛋 白 轻 链 mRNA 前 体 上 含有 在 可 变 区 与 不 变 区 间 的 内 含 子 ， 同 时 该 顺序 是 与 结构 基因 同时 转录 的 。 目前 尚 没 发 现 内 含 子 不 被 转录 的 例子 ，rRNA、tRNA 基因 中 的 插 人 顺序 (如 果 存 在 的 话 ) 也 都 是 同时 转录 在 前 体 分 子 之 中 的 ( 见 下 文 )。 真 核 生 物 mRNA 基因 结构 及 上 游 的 转录 调控 部 位 如 图 5-26 所 示 (也 参阅 图 5-2)v 原始 转录 产物 中 除了 内 含 子 外 ,也 包括 两 端的 非 编码 区 。 上 游 9 端 :5“- 非 编 ; :3“- 非 编 下 游 3 端 ‘mk : : 码 区 : | ei 5! SE 3! SUM Sw mRNA 前 体 图 5-26 真 核 生 物 mRNA 基因 结构 及 上 游 调控 部 位 * 166。 mRNA 前 体 的 加 工 原始 转录 产物 通过 hnRNA 变 为 成 熟 的 mRNA ， 需 要 经 过 下 列 一 些 步骤 : 1. hnRNA 被 剪接 (splicing)， 除 去 由 内 含 子 转录 来 的 序列 , 将 含 信 息 的 结构 部 分 联 接 起 来 ; 2.5 端 帽子 的 形成 ; 3. 3 端 多 聚 A 的 附加 ; 4. 内 部 顺序 的 甲 基 化 。 关于 mRNA ARH HR 在 mRNA 的 原始 转录 产物 中 ,内 含 子 转录 顺序 是 如 何 被 剪接 的 呢 ? 目前 , 除了 个 别 报道 如 四 腊 虫 RNA 前 体 的 剪接 可 以 自我 催化 外 ( 见 下 文 ), 一 般 认 为 是 存在 一 个 剪接 酶 系 , 但 是 迄今 并 不 像 cRNA 和 tRNA 加 工 酶 那样 已 被 纯化 ; 同时 由 于 加 工 可 能 在 核 蛋白 颗粒 〈hnRNP) 内 进行 ,所 以 情况 更 为 复杂 。 后 来 发 现 有 些 由 细胞 核 小 分 子 RNA 构成 的 核 蛋白 〈snRNP) 离心 时 常 与 hnRNP 一 起 沉降 ,因而 提出 snaRNA 可 能 与 hnRNA 剪 接 有 关 。 关 于 snRNA 的 结构 与 功能 见 第 八 章 。 剪接 酶 和 snRNA 等 究竟 怎样 与 hnRNA 发 生 关 系 呢 ? 比较 了 近 四 十 个 内 含 子 与 外 显 子 联接 部 位 附近 的 核 苷 酸 序列 ,并 没有 找到 令 人 信服 的 通常 为 酶 识别 的 二 元 对 称 结构 ， 但 是 在 接头 处 都 存在 不 太 长 的 同 源 顺 序 ( 见 图 5-27)。 这 个 同 源 顺 序 正好 与 某 些 snRNA 如 UIRNA 有 约 15 对 碱 基 配 对 , 因此 推测 正 是 形成 这 样 的 特殊 高 级 结构 而 为 酶 所 剪接 。 关于 UIRNA 与 haRNA 中 内 含 子 和 外 显 子 联接 部 位 互补 可 能 方式 见 第 八 章 图 8-2, C 1 1 0 2s 3 213099 4 的 六 work, OF a0 7 A 7,31; 4 }-} 0. 25.) 27 . 4 Set OR Sse eee GO FM26 -0 4 G Ter hee 23.0 37) 0 4 8 4 3S ee eee ee 88 Ole el ca 23 0 0 0-39. 4) Soo Tee 2GeeS 2S 22 ae LS ete e172) Oo A~ A G6 G UA’ Ar‘@ 加 EU OO eS us us Oe. Acie G c Ga Che cle 外 显 子 内 含 子 外 显 子 5-27 mRNA 前 体 中 内 含 子 与 外 显 子 联接 部 位 附近 的 核 苷 酸 的 分 布 几率 用 数字 表示 及 其 同 源 性 关于 mRNA 剪接 酶 的 纯化 及 其 作用 方式 目前 了 解 得 还 很 少 。 5 痪 帽子 的 形成 5 端 帽子 结构 存在 于 hnRNA 中 , 它 在 转录 的 早期 阶段 甚至 可 能 在 转录 终止 前 形成 。 帽子 结构 的 形成 与 3 taht Ms RA 和 内 含 子 的 剪 切 都 可 能 与 核 中 mRNA 前 体 转 变 为 细 胞 质 mRNA 有 关 。 关于 戴 帽 机 制 主要 来 自 对 病毒 mRNA 的 研究 结果 ， 实 验 表 明 戴 巾 有 两 种 途径 : C1) 转录 起 始 不 久 进 行 戴 帽 一 一 从 原始 转录 产物 3 端 三 磷酸 脱 去 一 个 磷酸 ,然后 与 。 167。 GTP 反应 生成 5 ,5” 三 磷酸 联结 的 键 ， 并 释放 出 无 机 焦 磷 酸 ; 最 后 以 SREP RS (SAM) 进行 甲 基 化 产生 帽子 结构 。 pppXpYpZp:----- (Tp PPXPYpZp ls = Biet (+pi) rt, eee ppp’ XpYpZp--:-:: (+ ppi) SR ae wv iy ppp’ XpYpZp:-++:: (+S-RA SAB) SAME is oo = a jai PPpPp”XmpYPZD 〈 十 S- 腺 苷 高 半 胱 氨 酸 ) 以 这 种 方式 戴 帽 的 为 呼 肠 孤 病毒 和 牛 总 病毒 RNA。 催 化 上 述 反 应 的 酶 分 别 是 :CDJRNA 三 磷酸 酶 ，(2) mRNA 鸟 背 酰 转移 酶 ,(3) mRNA ( 鸟 呀 吟 一 7) 甲 基 转移 酶 ，(4) mRNA ( 核 昔 -2") 甲 基 转 移 酶 ,也 叫 2'-0 甲 基 转 移 酶 。 这 些 酶 都 已 从 牛痘 病毒 纯化 ， 从 其 他 病毒 和 动物 组 织 中 也 测 到 或 纯化 了 这 些 酶 。 牛 斗 病 毒 中 的 酶 (2) 和 了 酶 (3) 无 论 用 亲 和 层 析 或 离子 交换 柱 层 析 都 很 难 分 开 , 纯 化 的 酶 (2 ) 分 子 量 为 127,000d, 含 二 条 链 ( 分 子 量 分 别 为 95,000d 和 31,400d)。 此 酶 专 一 底 物 是 5 端 为 二 磷酸 的 mRNA 或 多 聚 A 或 多 聚 Go (3) 的 甲 基 供 体 是 SAM, 专 一 甲 基 化 帽子 上 的 G。2'-o- 甲 基 转 移 酶 也 是 以 SAM HUE, 专 一 甲 基 化 mRNA5' 端的 第 一 个 核 苷 酸 的 核糖 2'- SIE, BSD FEY 38,000d, 以 pbN、 ppN 或 G” “pppN 结尾 的 RNA 不 能 作为 酶 的 底 物 , 而 未 端 为 mGzpppzxN 的 多 聚 及 和 多 聚 工 是 最 好 的 底 物 。 (2) 戴 帽 是 在 剪 切 后 进行 一 这 种 戴 帽 方式 以 疱疹 口 炎 病 毒 RNA 为 代表 首先 用 剪 切 酶 (可 能 是 RNaseIIT) 切 开 转 录 的 RNA 链 , 产 生 5’ 磷酸 末端 ,然后 形成 子 , 5 三 磷酸 联结 的 键 ， 并 甲 基 化 得 到 帽子 结构 。 pppNp ev ee ee pN’pN’’pN’”’p oo Pie wim RNaselll 一 一 一 一 一 :2 te G*ppp”N’pN”’pN’"+ ++ +++ (BAS ade OEE FA Lee eS RP BY A BEM mRNA 合成 、 输 送 及 在 翻译 中 的 影响 。 S- tubercidinyl homocysteine 能 有 效 地 抑制 Novikoff 肝癌 mRNA 帽子 上 的 核糖 2 = 里 基 化 和 RNA 内 部 的 A 的 6- 甲 基 化 ,但 不 影响 帽子 mG 的 生成 。 由 于 该 抑制 剂 并 不 抑制 细 胞 的 生存 ,所 以 核糖 的 2- 甲 基 化 或 链 内 部 A 的 6- 甲 基 化 被 认为 对 于 mRNA 从 细胞 核 输 送 至 细胞 质 以 及 随后 进行 翻译 是 不 必需 的 。 环 亮 氨 酸 (Cycloleucine) 是 L-Met S-PREIE 转移 酶 的 竞争 性 抑制 剂 ， 能 阻 断 肉瘤 病毒 RNA 帽子 上 的 核糖 和 链 内 部 的 甲 基 化 ， 但 不 Silat GA 7- 甲 基 化 ， 对 病毒 复制 也 无 明显 影响 ,表明 核糖 和 内 部 甲 基 化 对 于 该 病 毒 RNA 的 合成 ,加 工 和 输送 也 不 是 必需 的 。 相反 ， 腺 苷 高 半 胱 氮 酸 类 似 物 5 -脱氧 -5 一 异 丁 酰基 腺 苷 却 能 抑制 劳 氏 肉 瘤 生 长 90% 以 上 , 分 析 表 明 ，, 该 抑制 剂 可 能 抑制 mRNA ( 鸟 味 叭 -7) 甲 基 转 移 酶 ， 而 这 个 酶 对 。 168。 mRNA 合成 是 很 重要 的 。 3 端 多 聚 A 的 附加 多 聚 A 的 附加 是 在 多 聚 A 聚 合 酶 即 RNA 末端 腺 昔 酸 转移 酶 催化 下 完成 的 。 该 酶 : 以 具 3OH 的 RNA 为 受 体 ，ATP 作 供 体 ， 需 Mg? 或 Mn+, 其 他 NTP 特别 是 GTP 是 聚合 酶 的 抑制 剂 。 大 部 分 多 聚 A 聚合 酶 存在 于 细胞 核 内 ,但 在 某 些 来 源 的 细胞 质 . 中 也 发 现 有 酶 的 活性 。 SR + nATP WER MD 多 核 昔 酸 (Adm + nppi 对 腺 病毒 MRNA 的 研究 揭示 ,转录 时 RNA 聚合 酶 并 不 在 mRNA 末端 处 停止 , 因 此 ,在 附加 多 聚 人 前 需要 修剪 3 未 端 。 前 面 提 到 ，hnRNA 和 成 熟 mRNA 两 者 都 能 测 出 多 聚 A 尾 巴 。 随 着 生活 时 期 的 变化 ,多 聚 A 的 链 长 逐渐 缩短 。 序列 分 析 表 明 ,在 mRNA- 多 聚 A 接 头 附近 ,并 无 同 源 顺序 。 但 在 许多 真 核 mRNA HY 2 AEA 5! 端 起 约 13 一 20 核 背 酸 处 ,发现 一 个 同 源 区 AAUAAA, 这 被 认为 可 能 是 多 聚 A- 附加 的 识别 部 位 。 mRNA 的 内 部 甲 基 化 mRNA 内 部 甲 基 化 主要 指 msA 的 生成 。 一 些 实验 说 明 , & mA 的 顺序 在 hnRNA; 中 已 经 存在 ， 同时 在 加 工 中 被 保存 。 一 般 来 说 ，m5A 在 真 核 生物 或 病毒 mRNA 的 内 部 位 置 是 不 确切 的 ,但 在 HeLa 和 工 细胞 中 ,在 SV40 晚期 mRNA 中 分 离 到 两 个 含 mA 顺序 :Apm'ApCp 和 Gpm'ApCp。 由 于 许多 病毒 和 细胞 mRNA 并 不 存在 mA， 似乎 这 个 修饰 成 分 对 mRNA 翻译 不 是 必要 的 。 我 们 已 经 讨论 了 DNA 模板 、RNA 的 原始 转录 产物 和 mRNA 成 熟 的 各 个 步骤 。 这 些 过 程 大 多 是 在 细胞 核 内 完成 的 。 但 是 mRNA 在 细胞 内 的 状态 是 怎样 的 呢 ? 它 是 怎样 由 细胞 核 运 到 细胞 质 中 的 呢 ? 现在 了 解 到 在 真 核 生 物 中 ，mRNA 在 其 生命 的 所 有 过 程 . 中 都 是 以 核 蛋白 复合 物 形 式 存在 的 ， 这 种 复合 形式 可 能 是 一 种 调节 mRNA 由 细胞 核 向 细胞 质 运 输 的 形式 ,也 可 能 是 细胞 内 保卫 mRNA 的 一 种 方式 , 还 可 能 是 在 mRNA 的 翻 译 水 平 上 调节 蛋白质 生 物 合成 的 一 种 形式 。 这 种 mRNA 与 蛋白 质 组 成 的 复合 物 不 同 于 核糖 体 (ribosome) 〈 见 第 六 章 ) , 兽 被 称 为 信息 体 (informasome)。 信息 体 的 沉降 系数 与 其 中 RNA 的 沉降 系数 有 关 ,一 般 比 RNA 大 2 一 2.5 倍 ; 当 mRNA 分 子 不 均一 时 , 信息 体 显示 出 不 均一 的 沉降 分 布 ,但 如 仅 一 种 mRNA 存在 ,信息 体 是 均一 的 。 信 息 体 在 CsCl 中 的 沉降 密度 为 1.46g/cms 到 1.36g/cms, 介 平 蛋 白质 (1.2—1.3 gs/cm ) 和 RNA(1.9 一 2.0g/ cm ) 之 间 , 用 放射 性 尿 喀 啶 或 放射 性 氨基 酸 标 记 时 ， 信息 体 都 带 有 放射 性 , 说 明 信 息 体 含 有 -RNA 和 蛋白质 。* 实验 证 明 信 息 体 不 是 人 为 的 矫 作物 ,其 中 的 RNA 是 mRNA 〔 能 与 DNA 杂交 ，, 在 无 细胞 系统 中 被 翻译 ) ,从 不 同 来 源 的 信息 体 中 可 分 离 出 多 种 多 肽 或 蛋白 质 ， 其 中 许多 组 分 的 分 子 量 已 经 测定 。 hnRNA 也 是 以 核 蛋 白 颗 粒 形式 存在 , 即 生成 hnRNA 颗粒 ,在 这 些 颗 粒 中 约 含 20 允 RNA 和 80% 蛋白 质 。 有 人 已 经 测 出 hnRNA 颗粒 中 存在 多 聚 A 聚 合 酶 、 戴 帽 的 酶 、 核 es。 169 。 和 酸 酶 和 蛋白 激酶 等 酶 的 活性 ,甚至 认为 boRNA 剪接 酶 系 也 可 能 存在 于 hnRNP 颗粒 中 ， 这 对 于 hnRNA 加 工 的 研究 无 疑 是 很 有 意义 的 。 五 、rRNA 的 转录 与 加 工 rRNA 的 结构 与 功能 分 别 在 第 三 章 和 第 六 章 进 行 讨论 。 以 rDNA 为 模板 在 RNA 聚合 酶 ( 真 核 生 物 为 RNA 聚合 酶 ID) 催化 下 得 到 的 原始 转录 产物 是 rRNA 前 体 , 然 后 经 -过 逐步 加 工 成 为 成 熟 的 rRNA 分 子 。 rRNA 基因 (rDNA) 与 rRNA 前 体 在 细菌 基因 组 中 ,一 个 转录 单位 内 含 三 个 rRNA 基因 ,同时 插 人 多 个 RNA BAR 一 定 顺 序 排 列 在 一 起 。 构 成 大 肠 杆 菌 的 转录 单位 约 有 5,300—5,500 碱 基 对 ， 转 录 后 得 到 30S 的 rRNA 前 体 。 前 体 分 子 可 从 缺乏 RNaselll 加 工 酶 的 突变 株 中 分 离 。 BK rRNA 基因 一 般 是 中 度 重 复 顺 序 ,不 同 生物 的 拷贝 数 在 五 十 至 几 千 之 间 ， 它 们 成 往 排 列 在 一 起 。 哺 乳 动物 的 每 一 重复 单位 包括 18S.5.8S 和 28SrRNA 序列 , 彼此 被 隔 间 区 所 分 开 ， 转 录 产 生 一 个 长 的 rRNA 前 体 。 不 同 生物 的 rRNA 前 体 大 小 是 不 一 样 的 ,如 哺乳 动物 为 45S, 爪 蟾 40S, 果 蝇 38S ,酵母 37S。rDNA PHA IA CVS) 存在 情况 也 有 不 同 , 有 的 不 存在 IVS， 有 的 有 一 个 或 两 个 IVS; 个 别 基 因 内 带 有 缺口 〈gap)73; AM 表 5-8 rRNA 基因 (rDNA) 的 种 类 生物 来 源 基 A 顺序 rRNA 前 体 原核 生物 16S-tRNA-23S-5S-rRNA 30S 大 鼠 、 小 鼠 、 人 18S-5.8S-28S 45S IT 86 18S-5.8S-28S 40S Ear 18S-5.8S-2S-28S,-{jk H-28S, 38S 酵母 17S-5.8S-26S 37S SR il Bs 19S-5.8S-28S,-IVS,-28S,-IVS,-28S, 40s Po fea rh 17S-5.8S-26S,-IVS,-28S, >35S Alt} Sw 16S-5.8S-26S。- 缺 口 -26Sp WNBA tRNA-12S-tRNA-16S-tRNA 酵母 15S-tRNA-21S,-IVS-21S, pt ae 17S-tRNA-25S,-IVS-25S,-tRNA EKER 16S-tRNA-23S-4.5S-5S AR 16S-tRNA-23S-5S Kk 16S-tRNA-7S-3S-23S,-IVS-23S,-5S *Ivs 代表 插 人 顺序 。 摘自 Ann. Rev. Biochem., 1982, 51, 642, 体 和 叶绿体 的 rDNA 具有 与 原核 生物 类 似 的 基因 排列 ， 但 本 身 存 在 某 些 特点 《〈 见 第 人 章 )。 表 5-8 列 出 已 知 rRNA 基因 的 种 类 。 从 表 5-8 可 以 看 到 rDNA 具有 下 列 一 些 特 性 : * 170° C1) 基因 的 极 性 是 保守 的 : BY 16—18SRNA 在 前 体 的 5 端 ,而 23—28S RNA 在 3 端 。 (2) 原核 生物 和 叶绿体 基因 的 3 ta SS rDNA。 (3) 原核 生物 \. 叶 绿 体 和 线粒体 的 rRNA 基因 中 连 有 tRNA 基因 ,有 的 在 内 部 ， 有 的 在 两 端 。 (4) 真 核 生 物 rRNA 基因 与 5S rDNA 和 tDNA 分 离 , 代 之 以 5.8S rDNA, FFE 16 一 18S rDNA 与 26 一 28S rDNA 之 间 。 不 同 真 核 生 物 5S rDNA 虽 都 是 一 个 独立 的 转 录 单 位 ,但 分 布 却 有 不 同 ( 见 第 二 章 )。 《5) 高 等 植物 时 绿 体 基因 含 4.5S rDNA。 rDNA 经 过 转录 得 到 与 rDNA 同样 大 小 的 rRNA 前 体 , 其 中 包括 tRNA 前 体 、 间 由 区 以 及 插 人 顺序 等 。 在 正常 情况 下 , 迅速 被 加 工 为 成 熟 的 rRNA 和 tRNA ZF. 但 是 某 些 缺 乏 加 工 酶 的 变异 株 或 用 氧 霉 素 处 理 细 胞 使 蛋白 质 合成 受阻 ， 则 大 量 堆 积 核酸 原 始 前 体 或 中 间 前 体 , 这 是 研究 加 工 过程 和 加 工 酶 性 质 的 很 好 材料 ,许多 结果 就 是 通过 分 离 鉴定 中 间 前 体 而 得 到 的 。 rRNA 前 体 的 加 工 rRNA 前 体 的 加 工 也 是 在 一 系列 酶 催化 下 进行 的 。 与 rRNA 前 体 加 工 有 关 的 酶 主 要 有 二 类 :〈i) 能 使 前 体 被 剪 切 成 一 定 链 长 的 rRNA 分 子 , 这 类 RNA 加 工 酶 中 研究 得 较 多 的 有 大 肠 杆 菌 RNaseII，RNaseE ， 枯 草 杆 菌 RNaseM5 等 。 真 核 生物 也 有 类 似 的 加 工 酶 活性 。(iib) 修 饰 酶 ,催化 rRNA 中 修饰 成 分 的 形成 。rRNA( 除 5S RNA 外 ) 都 含有 修 饰 成 分 ,主要 是 核糖 2 位 的 甲 基 化 以 及 一 些 特 诛 的 修饰 碱 基 〈 如 m'ncp’> 等 见 第 一 章 )。 对 rRNA 修饰 酶 的 研究 远 没 有 tRNA 修饰 梅 的 详细 和 深 人 。 图 5-28 是 大 肠 杆 菌 RNA 加 工 变异 的 基因 图 ，RNA 加 工 基因 在 圆圈 的 内 部 , 其 中 与 rRNA 有 关 的 是 rnc(RNaseIII 基因 ) 和 rne(RNaseE 基因 ), 其 他 几 个 则 与 tRNA 加 工 有 关 ( 见 第 六 节 )。 由 于 原核 生物 的 rDNA 中 通常 插 有 rDNA， 因 此 其 原始 转录 产物 的 purC 图 5-28 大 肠 杆菌 K-12 中 RNA 加 工 变异 的 基因 图 fnc，RNaseIII; rne，RNaseE; rnd, RNaseD; rnp, RNaseP (rnpA 变异 影响 RNaseP 中 的 多 肽 组 分 ，rnpB 变异 则 影响 其 中 的 RNA 组 分 ); cca,tRNA 核 苷 酰 转移 酶 。 st 加 工 是 两 者 同时 进行 的 。 RNaseIII 是 一 个 内 切 核酸 酶 ,虽然 在 一 定 条 件 下 能 作用 于 单 链 RNA， 但 该 酶 的 识别 部 位 为 特定 的 螺旋 区 。1973 年 发 现 它 与 rRNA 前 体 加 工 有 关 ，, 它 水 解 rRNA 前 体 产生 16S 和 23S rRNA 部 分 。RNaseIII 由 两 个 相同 的 分 子 量 为 25,000 WWMM, KAS RNA 组 分 (用 于 tRNA 前 体 加 工 的 RNaseP 含 2/3 RNA， 见 第 六 节 )。 RNaselll 识别 rRNA 前 体 以 及 T7 WEES mRNA 前 体 的 位 点 已 经 确定 ,被 认为 与 RNA 双 螺旋 区 的 三 级 结构 有 关 。RNaseE 作用 于 较 大 前 体 产 生 5S RNA 前 体 ( 比 成 熟 5S RNA 在 两 端 各 长 三 个 核 昔 酸 ) ,天 然 酶 的 分 子 量 为 70,000d, 亚 基 结 构 不 详 。 RNaseE 的 识别 位 点 蔬 是 螺旋 区 域 。RNaseM5 加 工 枯草 杆菌 SS RNA 前 体 得 到 成 熟 的 5S RNA, 2 AAO 链 区 。 部 分 纯化 的 酶 由 与 8 两 个 亚 基 组 成 , p 亚 基 具 底 物 结合 能 力 ,而 “ 亚 基 为 催 楷 亚 基 。 大 肠 杆 菌 中 使 16S 和 23S rRNA 成 熟 的 酶 分 别 叫 RNase M16 和 RNase M23, 它们 都 是 内 切 核酸 酶 。 某 些 真 核 生 物 ( 如 四 膜 虫 ` 绒 泡 菌 ) rRNA 前 体 含 插 和 顺序， 通过 剪接 切除 这 些 播 大 顺序 可 能 和 mRNA 前 体 加 工 一 样 ， 也 是 在 一 个 酶 系 催化 下 完成 的 。 但 是 1982 年 Cech 研究 组 发 现 , 四 膜 虫 rRNA 前 体 含 413 个 核 昔 酸 残 基 的 插入 顺序 ， 可 以 在 完全 不 存在 蛋 白质 ( 酶 ) 条 件 下 自我 准确 地 切除 ,表明 RNA 分 子 本 身 具 有 催化 活性 (图 5-29)， 这 是 二 个 很 有 意义 的 发 现 。 了 IV: =) rRNA 前 体 5’ Up GpU pG-OH W, 5’ ¢ U-OH GPU / UpU-——>- pGpA~~ UpA H6-G pGpA-U-OH {goo 图 5-29 RNA 的 自我 剪接 一 个 鸟 背 辅助 因子 在 插入 顺序 5 端 通过 亲 核 反应 启动 一 系列 反应 而 切除 播 人 顺序 ， 同 时 把 外 显 子 联结 起 来 。 图 中 也 表示 被 切除 的 插入 顺序 产生 第 二 次 亲 核 反应 得 到 特定 的 最 终 产 物 。 3’ 成 熟 rTRNA 5/ 原核 生物 rRNA 的 加 工 大 肠 杆 菌 rRNA 基因 的 原始 转录 产物 沉降 常数 为 30S(p30)， 分 子 量 2.1 x 10 d, 约 含 6,300 BHM HY pppA。 通 过 分 子 杂 交 `\ 中 间 前 体 分 离 及 其 末端 鉴定 、 酶 解 图 谱 分 析 等 技术 ,已 基本 和 弄 清 大 肠 杆菌 rRNA 前 体 的 加 工 过 程 。 表 5-9 列 出 rRNA IAS 成 熟 rRNA 某 些 性 质 的 比较 。 从 表 5-9 可 以 看 出 : (1) p30 中 有 80% 左右 的 核 音 酸 顺 序 被 加 工 为 成 熟 rRNA; (2) p16 与 ml16 及 p23 与 m23 分 别 相差 250 或 500 KM 。 172。 FR BE SE 5! 端 和 3 端 分 别 为 不 同 的 核 昔 酸 顺序 ， 说 明 要 在 两 端 同时 剪 切 或 修剪 才能 得 到 成 熟 产物 。 也 已 分 离 出 更 接近 于 16S rRNA 的 16.3S 中 间 前 体 ， 比 16S 只 多 60 PRA 酸 。(3) 分 离 出 三 种 5S rRNA 中 间 前 体 分 别 只 在 了 端 多 三 个 ,二 个 和 一 个 核 苷 酸 ， 而 3 端 完全 相同 。 在 变异 株 中 也 找到 了 更 大 的 9S 中 间 前 体 , 它 被 RNaseE 水 解 生成 5S rRNA。 表 5-9 大 肠 杆菌 rRNA 前 体 与 成 熟 rRNA* rRNA oe. aE BRBRE 了 末端 3 末端 Ze tx LU: = pppACUG p30rRNA 6300 (ae SEE pl6rRNA 0.6xX 10° ~ 1800 PUG reeree | ewe ree CACACAoH ml6rRNA 0.55 x 10° 1542 pAAAUG erree | wee nee CUUCAon p23rRNA 1.15 x 10° ~ 3400 m23rRNA 1.1 10° 2904 PPGGU.…… p5rRNA-1 123 pAUUUG +--+. | eee eee GGCAUon p5rRNA-2 122 DUUUG…… GGCAUoH p5rRNA-3 iy LN 121 pUUG:----- GGCAUox m5rRNA 120 PUG.………。 GGCAUoy *p 表示 前 体 ;m 代表 成 熟 RNA, 大 肠 杆菌 全 部 三 种 成 熟 rRNA 的 一 级 结构 都 已 测 出 ( 见 第 三 章 )。 KIER p30 的 半 寿 期 只 2 分 钟 ， 故 在 正常 细胞 中 迅速 被 加 工 为 成 熟 rRNA。 RNaselll 缺陷 型 可 使 p30 堆积 ， 当 用 RNaseIII 体外 作用 于 p30， 并 分 离 出 其 中 间 产 物 时 ;发 现 p16(16SrRNA 的 中 间 前 体 ) 的 5’ 端 与 p30 相同 ， 均 为 pppA， 故 确定 在 p30 中 p16 位 于 其 5 端 。p30 的 加 工 过 程 见 图 5-30, 图 中 也 包括 tRNA 的 加 工 (关于 tRNA 加 工 酶 见 第 六 节 )。 和 (17.5S) =a ' (25S) (7S) yp i: NT nei eran I Wink Eee pl16 p23 | | “- ott 1 口 1 a ie | | é 1 医 画 5 可 Cea ee ml6 mys m23 a tRNA A 5-30 ”大肠 杆 菌 rRNA 前 体 加 工 过 程 I 表示 第 一 阶段 加 工 ， 令 为 RNaseIII MA, YH RNaseE 切 点 ;I 表示 第 二 阶段 加 工 ， 人 为 RNaseM 切 点 ; tRNA 加 工 酶 是 RNaseP 和 RNaseF， 同 时 进行 剪 切 。 在 不 存在 蛋白 质 生物 合成 条 件 下 ， 可 分 离 出 两 个 枯草 杆菌 5S RNA Bik: p5A 与 p5B， 前 者 为 179 核 昔 酸 ,后 者 140 一 150 核 童 酸 ， 它 们 都 比 成 熟 5S RNA (118 BARE) 长 数 十 个 核 苷 酸 之 多 。 由 于 p5A 与 p5B 的 核 苷 酸 序列 有 差 , 因此 它们 可 能 为 不 同 基因 。173。 的 转录 产物 。 p5A 作为 RNase M5 体外 底 物 , 要 求 有 紧密 的 螺旋 结构 ; 同时 实验 指出 ， pA 中 两 端 元 长 的 序列 对 RNase M5 与 p5A 相互 作用 关系 密切 。 原核 生物 rRNA 含有 较 多 的 甲 基 化 修饰 成 分 ,特别 是 2- 甲 基 核 糖 。 比 较 成 熟 rRNA 及 其 前 体 中 的 甲 基 化 成 分 可 看 出 ,p30 含有 23S rRNA 中 的 全 部 甲 基 化 成 分 ,但 16STRNA 中 修饰 成 分 较 少 ,人 这 表 明 在 rRNA 前 体 中 两 个 RNA 组 分 的 修饰 不 是 协同 的 ， 即 23 S rRNA 的 修饰 在 加 工 的 早期 阶段 ,而 16S rRNA 在 后 阶段 。 原核 16S rRNA 和 23S rRNA 中 修饰 成 分 见 第 二 章 ,其 中 m'Gm 看 来 是 16S rRNA 一 个 特征 成 分 。 一 般 5S RNA 中 无 修饰 成 分 ;, 故 不 存在 修饰 加 工 问题 。 真 核 生 物 rRNA 的 加 工 真 核 生物 rRNA 的 前 体 具 有 与 原核 生物 不 同 的 结构 特征 。 通常 真 核 生物 有 更 大 的 BU A, WZ 5-8 ,最 大 的 哺乳 动物 的 原始 转录 产物 为 45S(4.6 x 10'"d) ， 较 低 等 真 核 生 物 也 有 36 一 38S(2.6 一 2.8 X 105d)。 其 次 ; 真 核 生 物 5S RNA 前 体 由 独立 于 其 他 三 种 zRNA 的 基因 转录 ; 线粒体 中 未 发 现 5S RNA, ， 而 时 绿 体 的 5$S RNA 则 与 原核 生物 一 样 存 在 于 三 种 rRNA 组 成 的 前 体 之 中 ( 见 表 5-8 和 第 八 章 )。 另 外 ， 在 真 核 的 rRNA 前 体 中 含有 独 特 的 5.8S rRNA， 它 位 于 其 他 二 个 大 的 rRNA 之 间 并 为 间隔 区 所 隔 开 ,由 于 5.8S rRNA 与 28S rRNA 间 具 有 较 长 的 互补 氢 键 对 ,因而 只 在 变性 后 才 释 放出 5.8S rRNA} 从 原始 转录 产物 加 工 产生 成 熟 rRNA ， 真 核 生 物 与 原核 生物 相 比 ,过 程 更 为 复杂 , 同 时 也 可 能 存在 不 同 的 加 工 方式 。 将 正在 生长 的 哺乳 动物 细胞 置 于 CH RR MC RAR 短 时 间 (5 一 10 分 钟 ), 则 45S RNA 迅速 被 标记 ,延长 标记 时 间 ,45S RNA 放射 性 增加 ，20 分 钟 后 ,放射 性 出 现在 32S 和 18S RNA 中 ,更 长 时 间 后 ( 约 60 分 钟 )28S RNA 被 标记 这 了 18S ae 28S ——__ + 一 @ (41S) TOS gen = Sa a a (20S) (32S) aa Sf 5 SL BA | CR ae eee (32S) (18S) (28S) er] ee O 四 (5.8S) (28S) HeLa 细 胞 型 器 〈5.8S) L 细胞 、 爪 蟾 型 图 5-31 AA rRNA 前 体 的 二 种 加 工 方式 sa。 174 。 表明 rRNA 前 体 加 工 是 以 特定 方式 进行 的 用“H- 尿 背 脉 冲 标记 后 给 与 放 线 菌 素 D, 由 于 阻 断 了 45S RNA 的 合成 ,因而 使 45S RNA 消失 ， 而 增加 了 32S RNA 和 18S RNA 组 分 ， 以 及 稍 后 使 28S RNA 中 的 放射 性 堆积 。 45S RNA 前 体 转变 为 28S RNA 和 18S RNA 是 一 个 多 步 加 工 过 程 , 用 育 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 可 从 细胞 核 RNA 中 分 离 出 许多 中 间 HUA ,沉降 常数 有 41S\36S\.24S 和 208 等 ,标记 动力 学 也 证 实 它 们 是 rRNA 生成 途经 中 的 真正 中 间 物 。 结 合 其 它 分 析 数 据 , 提 出 了 rRNA 前 体 可 能 存在 二 种 加 工 类 型 ( 见 图 5-=31)， 一 类 是 18S 与 28S rRNA 近乎 同时 成 熟 (HeLa 细胞 型 ), 另 一 类 则 是 18S 先 于 28S RNA HOLL 细胞 \ 爪 蟾 型 )。 图 中 也 表示 了 5.8S rRNA 的 加 工 。 一 些 真 核 生 物 rRNA 的 加 工 过 程 列 于 表 5-10。 由 于 中 间 前 体 的 不 断 发 现 ， 还 可 能 有 补充 和 修改 。 表 5-10 不 同 真 核 rRNA 前 体 加 工 过 程 的 比较 原始 转录 产物 中 fl 前 体 28 S -二 the 20S 一 一 ~ 45S 28 S L 细胞 45S his eae 28s IN 40s 二 鼠 肝 45S —>37.5s—>36s—|__ 5858S ms Novikoff 了 5 28S 腹水 瘤 23S 一 一 18S 屁 虫 * (ee 28s 植物 ## 一 38 一 -20 一 25s oly pe AS SS 258 和 en er SUE Ts 26s * 楼 小 体 中 的 28SRNA, * 为 某 些 屁 虫 和 植物 来 源 ? 不 同 来 源 加 工 过 程 是 不 同 的 。 对 真 核 生 物 rRNA 前 体 的 加 工 酶 的 了 解 不 如 原核 生物 , 它 大 概 由 类 似 RNaseIII 以 及 其 他 内 切 核酸 酶 所 完成 。 少 数 rRNA 前 体 〈 主 要 在 28S RNA th) 存在 插 人 顺序 ( 见 表 5-8) 对 于 四 膜 虫 rRNA 前 体 加 工 的 研究 指出 , 接 前 过程 是 在 不 存在 酶 蛋白 情况 下 自 我 完成 的 ( 见 第 172 页 ); 也 有 实验 指出 , 某 些 小 分 子 细胞 核 RNA(snRNA) 如 U3、7S-1、 8S 等 在 rRNA 前 体 加 工 中 起 作用 ( 见 第 八 章 ) 真 核 生 物 rRNA 中 也 含有 较 多 的 甲 基 化 成 分 ， 其 中 核糖 的 2- 甲 基 化 占 甲 基 化 成 分 AY 80% 以 上 ,如 HeLa 细胞 28S rRNA 有 65 个 2-o- 甲 基 核 背 和 5 个 甲 基 化 碱 基 ，18S cRNA 则 含 40 个 糖 的 甲 基 和 6 个 碱 基 上 甲 基 。 用 甲 基 标 记 的 甲 硫 氮 酸 培养 HeLa 或 工 *175 。 细胞 ,早期 差不多 全 部 同位 素 集中 在 核 仁 的 45S RNA 中 ,其 后 扩散 至 32S 以 及 28S RNA, 与 用 标记 尿 苷 培养 得 到 完全 相同 的 结果 。 利用 2'- 甲 基 化 核 苷 酸 键 的 碱 稳定 性 比较 带 放射 性 的 碱 稳定 二 核 苷 酸 种 类 观察 到 ，32S RNA 中 的 与 28S RNA 相当 ，45S 的 则 等 于 288-5 18S 两 者 的 总 和 。 这 些 结果 不 仅 支持 上 述 加 工 过 程 的 确定 ,同时 指出 ,差不多 所 有 2'- 产 基 的 甲 基 化 是 在 45S RNA 前 体 阶段 进行 的 ,表明 修饰 在 剪 切 之 前 。 同 样 江 RN 中 的 亚 也 是 在 45S BR ER URE. 另外 在 酵母 17S rRNA 和 HeLa 细胞 18S rRNA 中 发 现 有 一 高 度 修饰 成 分 mincp 姬 《〈 见 第 一 章 ), 它 的 生物 合成 经 过 三 个 步 又: WO RH, Gi) 甲 基 化 和 Gi) SA 3- 氨 基 -3- 羧 两 基 。 结 果 指 出 ,第 @,.G) WHER 期 前 体 中 进行 ,第 (iii) 步 则 在 核糖 体 接近 成 熟 时 的 18S 中 间 前 体 中 反应 。17 一 18S rRNA 的 3’ 端 部 位 具有 通用 同 源 顺 序 -mSA-m$A- ,以 及 含 其 他 修饰 碱 基 如 m'5A mrG 等 ,对 于 它 们 的 修饰 过 程 了 解 很 少 。 O O O | eh Si ie HN | @) HN NH (ii) N NH | > a | er | | of \nZ% A Gee NI Rp. HBS. apy Up se Vp m'Yp 各 三 总 了 O oc he By /SHCHCH ey + é ESP so NI Rpv m'nbt?Yp 前 面 提 到 , 真 核 生 物 5S rRNA 基因 的 转录 与 其 他 rRNA 基因 (构成 45$ 的 大 前 体 ) 不 是 联 在 一 起 的 。 在 爪 蟾 的 卵 早 期 发 生 过 程 中 ,5S RNA 大 量 堆积 , 比 18S RNA 和 28S RNA 大 100 倍 。 低 浓度 放 线 菌 素 D 抑 制 世 细胞 中 核 仁 的 转录 ,但 仍 允 许 5S RNA 继续 条 成 。 与 45S RNA 前 体 不 同 ，5S RNA 却 与 tRNA 相似 ， 由 RNA RABI BE, A 5S RNA 基因 与 RNA 基因 具有 相同 的 转录 终止 信号 。 由 于 同位 素 短 时 期 标记 能 很 快 直接 进入 SS RNA, MARE 5S RNA 的 原始 转录 产物 不 需 进 一 步 加 工 。 真 核 生物 5S RNA 的 5 端 通常 为 pppPG， 也 有 pppA 末端 ,至 少 说 明 转 录 产 物 没有 前 导 顺 序 ， 不 fig ETT BS Do 核糖 体 的 生物 合成 以 上 我 们 只 是 “孤立 地 ?讨论 rRNA 的 生物 合成 问题 ,其 实 ，rRNA 的 转录 与 加 工 是 以 核 蛋白 方式 进行 的 , 即 rRNA 前 体 与 核糖 体 蛋 白质 结合 成 核 蛋 白 颗 粒 , 然后 进行 加 工 。 细 蓝 新 合成 的 核糖 体 蛋白 质 一 般 比 成 熟 的 核糖 体 蛋白 质 稍 大 一 点 ， 切 去 其 六 端 甲 酰 甲 硫 氨 酸 及 其 他 几 个 氨基 酸 后 ， 则 成 为 成 熟 的 核糖 体 蛋 白质 。 真 核 细 胞 质 的 核糖 体 蛋白 质 则 * 176° 是 在 细胞 质 中 合成 后 进入 细胞 核 ,置换 核糖 体 颗粒 上 的 核 仁 蛋 白质 ,形成 新 生 的 核糖 体 。 核糖 体 的 体内 装配 首先 由 rRNA 前 体 与 核糖 体 蛋白 质 结合 ,随后 可 能 通过 不 断 沃 加 核糖 体 蛋白 质 并 进行 rRNA 前 体 加 工 , 产 生 未 成 熟 的 核糖 休 亚 基 ， 最 后 经 过 必要 的 修饰 (包括 RNA 和 蛋白质 修饰 ) 才 成 为 活性 亚 基 ,这 个 成 熟 过 程 无 论 对 原核 生物 或 真 核 生 物 都 是 必需 的 。 大 肠 杆 菌 核糖 体 生 成 过 程 见 示意 图 5-32。 其 中 符号 p 代表 RNA 前 体 ,m 表示 成 熟 RNA, ;图 中 也 以 沉降 常数 s 示 出 成 熟 过 程 核 蛋 白 颗 粒 的 大 小 ， 但 没有 指出 rRNA 的 加 Te A ay 2: EAR 蛋白 质 蛋白 质 PR -人 ~ 21-28S 颗 粒 一 ~ 26-28S 颗 粒 一 \ 。30S 亚 基 (P16) (P18) (m6) Pas, ei 蛋白 质 蛋 自 质 } 一 一 30-325 ——S— 40-42S 颗 粕 一 、* .50S 亚 基 PS (P23, P5) (p23, p5) (m23,m5) 5-32 大肠 杆菌 核糖 体 的 生物 合成 真 核 生物 细胞 质 核糖 体 的 RNA 在 核 仁 中 合成 ,新 生 的 rRNA 前 体 与 核 仁 蛋白 质 形 成 蛋白 颗粒 , 核 仁 蛋 白质 然后 被 来 自 细胞 质 的 核糖 体 蛋白 质 所 置换 。 颗 粒 中 的 rRNA 前 体 经 过 逐步 加 工 , 并 进入 核 质 和 通过 核 膜 达到 细胞 质 , 这 时 可 能 也 象 原核 生物 那样 有 一 个 成 熟 过 程 ,包括 rRNA 的 最 后 加 工 和 某 些 修饰 反应 〈 但 大 部 分 修饰 是 在 更 大 前 体 水 平 上 进行 的 , 见 第 175 页 )。HeLa 细胞 核糖 体 生 物 合成 可 以 图 5-33 表示 。 圆 圈 代 表 核 蛋白 颗 粒 ， 圈 外 代表 颗粒 的 沉降 常数 , 圈 内 为 rRNA 的 沉降 常数 。 @0S fc 395 | 141S< 20S a 一 一 1 1 RE 多 核糖 体 5-33 HeLa 细胞 核糖 体 的 生物 合成 5S(?) 表示 5S RNA 的 生成 和 成 熟 过 程 不 清楚 (图 中 58S 应 为 5.8S) 真 核 细 胞 器 如 线粒体 叶绿体 具有 自己 独特 的 核糖 体 , 同 时 组 成 一 个 区 别 于 细胞 质 的 蛋白 质 生物 合成 体系 ( 见 第 八 章 )o 六 tRNA 的 转录 与 加 工 (RNA 的 结构 与 功能 已 在 第 三 章 和 第 六 章 进行 了 讨论 和 其 他 种 类 RNA —ff, tRNA 。 177。 的 生物 合成 是 以 tDNA 为 模板 ,被 RNA 聚合 酶 ( 真 核 生物 为 RNA 聚合 酶 IT) 转录 产 生 tRNA 前 体 , 然 后 经 过 加 工 得 到 成 熟 的 tRNA 分 子 。 上 节 提 到 ,一 些 RNA BRR 在 原核 生物 rRNA 基因 之 中 的 ,因而 它们 与 rRNA 一 起 转录 ,并 大 致 同时 成 熟 。 tRNA 基因 (tDNA) 与 tRNA 前 体 tRNA 的 种 类 远 较 rRNA 为 多 ,包括 同 功 受 体 在 内 一 般 原核 生物 有 三 \ 四 二 种, 而 真 核 生 物 则 有 五 ,六 十 种 或 更 多 。 在 原核 生物 中 ,一 些 tRNA 基因 是 与 rRNA 基因 联接 在 一 起 的 ,包括 间隔 区 中 的 tRNA 基因 和 末端 区 的 tRNA 基因 ( 表 5-11)。 如 大 肠 杆菌 区 12: 有 七 个 rRNA EAH, EN 16S rRNA 和 23S rRNA 基因 之 间 都 插 有 tRNA 基因 , 其 中 三 个 编码 tRNA 和 tRNA 针 *， 另 外 四 个 编码 tRNAS™; 另外 有 几 个 tRNA, do tRNA“**,, tRNAT? 和 tRNA™* 则 由 rRNA 基因 往 中 远离 启动 子 的 末端 顺序 转录 ( 表 5-11)。 表 5-11 ABA 发 12 中 和 rRNA 操纵 子 相 联 的 tRNA 基因 rRNA 操纵 子 染色 体位 置 间隔 区 tRNA 末端 区 RNA rrnA 85 tRNAILe:tRNA 名 sa rrnB 88 IRNAGD rrnC 83 tRNASD tRNA4*?,tRNAT#P : rrnD 71 RNAIe:tRNA 和 sa LIRNAThr rrnE 89 tRNASGD 44 I 一 tRNAT!© tRNAAY tRNAAsp 组 Il 一 tRNASn Glu2(1) Thr3(1) Thr4(1) 3 Gln2(2) Gly3 (B34) Tyr2(1) 了 多- a Gini (2) A reef Ile (1), 14) > “Asa. Ser Asp C. M, Y (C 可 能 是 Cysy》 5-34 ”大肠 杆 菌 基 因 图 上 tRNA 基因 的 位 置 图 中 也 标明 同 功 受 体 基因 ; 括 允 内 是 基因 拷贝 数 , 贺 圈 内 数字 以 分 表示 C\E\ 玉 、 M,P 和 YY 是 未 确定 的 tRNA 基因 。 * 178。 iy, (RNA BAKRURAREE, MRSMRTRRS. KABAFRSZAALE tRNA 基因 的 已 知 位 置 见 图 5-34, 已 经 测定 了 大 肠 杆菌 中 的 约 60 个 tRNA BALAI 摆动 假说 , CNAME 61 个 密码 子 所 需要 的 二 倍 ( 参 阅 遗 传 密码 一 章 )o 1981 年 鉴定 了 一 个 大 肠 杆 菌 操纵 子 ， 其 中 含 七 个 tRNA BA: Met,-Leu-Glnl- Gln1-Metm-Gln2-Gln2《〈 基 因 图 的 15 分 处 ), 各 tRNA 基因 间 被 二 级 结构 所 隔 开 , 推 想 为 RNA 加 工 酶 的 识别 点 。 T4 Maia RNA 转录 单位 长 约 3,000 个 核 苷 酸 ， 其 中 含 一 个 蛋白 质 基 因 和 各 二 个 RNA SAR: —MEA tRNA*® 和 二 个 未 知 功能 的 稳定 RNA,B—-TEMS 一 3' 编码 七 个 tRNA: Gln-Leu-Gly-Pro-Ser-Thr-Ile( 图 5-35)。 Leu Ser me UAA UGA CAU 3 §’ «-“UUUGUUAAUAAUCCCA AAUUUCC AAUUUAAUUUACUUA AUUUUCCAAUAUUU «33! * UGU Gln. Gly Pro Thr 图 5-35 T4 tRNA 基因 中 一 个 含 七 个 RNA LHRHRRED 由 于 加 工 紧 随 着 转录 之 后 ,转录 没有 终止 或 开始 不 久 加 工 就 已 进行 (原核 生物 rRNA 合成 也 有 类 似 情况 ,如 上 述 )， 所 以 在 野生 型 细菌 很 难 分 离 出 大 的 转录 产物 。 企图 从 T4 感染 细胞 分 离 单 一 的 多 顺 反 子 转录 产物 也 没有 成 功 。 图 5-36 示 出 双 顺 反 子 tRNA 基因 转录 与 加 工 过 程 , 一 种 为 单 顺 反 子 产物 , 另 一 种 是 双 顺 反 子 产物 ， 后 者 常 在 加 工 酶 缺陷 型 菌 中 分 离 得 到 ;两 种 产物 都 需要 进一步 加 工 才 产生 成 熟 tRNA 分 子 。 (a) kan ar ’ RNA ae 1 t wos : —5’tDNA ppp \ \ ca tRNA, =} ERNA, 终止 3/ 5/tDNA ~ PPP ppp Ppp ; ppp ~ 图 5-36 (DNA 的 转录 与 加 工 关 系 示意 图 e@ 表示 RNA RAM; 个 为 RNA 加 工 酶 的 剪 切 位 置 ; 二 一 代表 前 导 顺 序 或 GK. (a) 为 单 顺 反 子 转录 产物 ; (b) 为 双 顺 反 子 转录 产物 。 目前 ,有 三 类 tRNA 前 体 已 被 分 离 纯化 ,并 对 其 加 工 过 程 进行 了 研究 。 它们 是 (i) 单 RFR DM, Gi) MS KTR BAR Gi) 在 真 核 生物 中 发 现 的 有 插 人 顺 序 的 转录 产物 。 °179« 最 早 分 离 并 测定 其 一 级 结构 的 tRNA 前 体 是 大 肠 杆菌 SUS tRNAT™ Bik, SRR 的 tRNAs 比较 (结构 见 第 六 章 ) 在 5 端 从 pppG 开始 多 了 41 RAB, 3 端 也 多 了 JL ER, 同时 前 体 中 不 存在 修饰 成 分 ,但 分 子 内 已 含有 3’-CCA 末端 。 在 缺乏 加 工 酶 RNaseP 的 变异 株 中 ， 可 分 离 出 一 些 tRNA 前 体 , 已 测定 序列 的 单 顺 反 子 前 体 有 tRNAP™, tRNAZ™ 和 tRNA“? 前 体 等 ; 这 些 前 体 也 都 在 5 端 含 附加 顺序 ， 但 3 端 是 成 熟 的 。SUftRNA5 前 体 的 结构 见 图 5-37。 AU G a RNaseE RNase E ye) Zz, ~ 名 已 | 40 AGGCCAGUAAAAGCAUUACCCC AAFANA > > 7 -GQaceaq PP RNase P -» QANQNAGCAACH: ra) QAAAAY BOK ADY ao 5-37 tRNATY: 前 体 的 三 叶 草 结构 箭 号 处 表示 与 成 熟 RNALE 不 同 或 需 剪 切 部 位 从 大 肠 杆 菌 中 也 分 离 鉴 定 了 一 个 双 顺 反 子 前 体 耻 NA22"-IRNA， 除 了 在 5 和 3 Si 含 附加 顺序 外 ,两 个 tRNA 间 存 在 6 核 音 酸 的 间隔 区 (图 5-38)。 从 图 中 可 以 看 到 , 前 体 “5 -e if U -A A-U c BO. a ofS c c-6 y& » wv © C-Gc aA = cGAcu YacGGGEG 村 GUGGG 1 ig iz! gasguthces Urcgee same COanhs , eee eu G 可 A GA 人 = G -C EwE c-G G-c U-A YA 站 sien 由 A A A Pe G D G G 0G 图 5-38 大肠 杆菌 t(RNASY-tRNAT™* 双 顺 反 子 前 体 方 框 表示 需要 被 切除 部 分 se。 180° 分 子 中 已 经 存在 成 熟 tRNA 的 修饰 成 分 。 CHRAAN MAA tRNA 前 体 都 含 有 tRNA 的 3-CCA 顺序 ,但 其 他 生物 的 tRNA 前 体 链 中 ,并 不 都 含有 3 -CCA。 从 I4 喉 戎 体 的 转录 产物 中 也 已 分 离 出 单 顺 反 子 tRNA 前 体 以 及 双 顺 反 子 前 体 , 如 tRNAR-tRNAS tRNAS-tRNALe tRNATIE-tRNAIe。 在 这 些 双 体 的 tRNA 前 体 中 ,其 5 和 3 端 两 侧 均 有 长 短 不 一 的 附加 顺序 ;此 外 两 个 tRNA 之 间 也 为 数 个 或 者 一 个 核 苷 酸 所 隔 开 ; 在 T4 双 体 tRNA 中 ,有 的 tRNA 已 经 存在 3 -CCA 未 端 , 另 一 些 则 不 是 。 值 得 注意 的 是 ,在 这 些 双 体 分 子 中 含有 大 部 分 修饰 成 分 ,表明 修饰 在 剪 切 之 前 出 现 〈 图 5-39)。 pu U U ae C ccc U A | A U T oa cee (a) Gec A e-¢ 856 A。U 4U Bou C*G Dey Gec U A U。，A U eo ceG uU U A*Uc we ms2i6 us CG mal Aa? G USA GS A 入 N, AGUCC GUGCCUC ccuccGcc GGCCA A G Ce 828 610 SU § “ee sy wee o FF Oe oe) eee ere A Ry BAe ane G ,¥CAGG a aCe eS ee ee CCGGUG te G.: CAeuU Gec mcGU A。U a ces 本 Ae fi 和 G A T U A A y A G U U D CU 二 本 GGDb A Gc 号 A pA 6 A (b) Se A - Ca eee 2 帮 Bi hal Bie uh G:C A OH C*G U 人 c,6 GCC .全 A 人 AUC.G _ nC s4U <— C -GU ¢G 8 2) “iedioabe TAAGC Ce Cece anew: h GuceyAAA Gc ane oe ee eee: ‘els A Sec VGCUA AUAVUUcccAGCAGc6AGAAU cAGcCAC RN A Ca.y G A U UG A G:c -U U。G G。C C .9 , G。C A A U A A bd G A A cC 6 8 6G9 图 5-39 T4 !IRNAPco-tRNASer(a) 和 tRNAGIa-tRNALeo(b) 前 体 分 子 真 核 生 物 tRNA 基因 数目 比 原核 生物 大 得 多 ,如 大 肠 杆 菌 有 大 约 60 个 tRNA 基因 ， 酵母 则 有 320 一 400 4, RHE 750 个 ,而 爪 蟾 差不多 有 8,000 个 ， 其 中 每 种 RNA HEY 200 个 拷贝 。 真 核 生物 RNA 基因 大 概 也 是 以 匀 存 在 的 ,并且 为 间隔 区 所 分 开 。 但 目 前 分 离 得 到 的 tRNA 前 体 都 是 单 顺 反 子 的 。 用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 可 以 从 脉冲 标记 的 HeLa 细胞 ,家 凑 、 酵 母 中 分 离 出 较 多 的 介 平 4 和 58 之 间 ( 约 4.58) 的 NA 前 体 分 子 ， 这 些 分 子 与 成 熟 48 比较 ,主要 是 A 3 端 存在 附加 顺序 。5' 端 含 核 背 -5 -三 磷酸 ,表明 是 原始 转录 产物 ,同时 在 前 体 中 已 经 存在 部 分 修饰 成 分 。 1978 年 以 来 从 酵母 变异 株 中 分 离 出 含 插入 顺序 的 “RNA 前 体 ， 所 有 这 些 前 体 都 在 反 密 码 臂 处 插入 十 几 至 三 十 几 个 核 蔡 酸 ， 图 5-40 列 出 的 tRNA 前 体 中 ,tRNATe 和 RNAS" 的 插 人 顺序 部 分 还 出 现 一 个 新 的 茎 环 结构 。 在 其 他 一 些 来 源 的 真 核 tRNA 前 体 *。 181。 中 也 发 现 有 插 人 顺序 存在 ,虽然 它 不 如 mRNA 前 体 那 么 普遍 ,但 至 少 表明 ， 插 人 顺序 是 真 核 生物 与 原核 生物 区 别 的 一 个 重要 标记 。 & tRNATIYT 前 体 Aon AOH 上 tRNAPhe 前 体 ， S tRNASer 前 休 E S 2 G-c = 到 PCG Fane C+G Gee :8 U'G axe wg Gie c UA v ars ; urA uuSA US'cccceccU A, 3 yurAcacac C A G 5-0 deh A A) ae uU A cucc 4 uUVA U c CC- = G GEESE nm uc T = CUGUG y Yc G ccooS TO 二 全 一 U G GAGC Cy - eee uyc TUDAA Seg ach CQ Sy AAS Gy . C*G u 7g Ast ce 1 acu ， AT Gc A‘ UCUAU Gc ny aS, cc’ » of Ag” Pc-cgA C*G pose 2 UA A U'G fe-¢ Lau C Aon Fi a . TAG c ASU < A Ca+u AU C U G ee pe axa G.C GUC A G A UAU AT at Tee er *, 入 AU A AA cok A Fe GG 3 “uA 6 $36 % v®’© ucucc UA Ue Auyeyct*a U" * cuce GCAGG 5 ee acca @ Foes. Seed “s uye G rae AAGAGY CG G yA GAL y % UG pa MO 6 “Sy pao nee, ge aa a: ae ean, Gc 已 全 从 G-c AcG0T AUf GT AU'A: 入 i cay TrP? yt? U+A 入 U netic! maya” reso *s ua! 4RNAL™ 前 体 reg eG . u* AtU Ge" ma Ae urA SA+U 3% A+U c*Sg -GeC A+ 0 Ue A. CnC A” te. Gac U u A. ag UNA AAA AU vA 5-10 五 个 酵母 tRNA 前 体 的 二 级 结构 其 中 个 为 剪接 点 ,[ ABA tRNA 的 反 密 码 子 。 tRNA 前 体 的 加 工 tRNA 前 体 的 加 工 内 容 具有 与 其 他 种 类 RNA 的 共性 ,同时 也 有 本 身 的 特点 ,主要 和 包 括 以 下 三 个 方面 内 容 : (1) 剪 切 、 修 剪 (trimming, clipping) 和 剪接 (splicing); (2) 如 果 需 要 ,在 3 MEIN CCAor ; (3) BEE Tio. Fk 22 EE EE PEAT. ADK, tRNA 加 工 所 需 用 的 酶 比 _mRNA 或 rRNA 加 工 都 要 多 ,特别 是 多 顺 反 子 RRNA 基因 转录 产物 的 加 工 更 为 复杂 ， 往往 需要 多 个 酶 的 协同 作用 。 By tn AF WY Fo Hy HE tRNA 剪 切 酶 是 一 类 主要 的 加 工 酶 , 属 内 切 核 酸 酶 性 质 ， 它 在 tRNA 前 体 两 旁 附 加 顺序 处 水 解 ,以 得 到 一 定 大 小 的 tRNA 分 子 。 大 肠 杆 菌 RNaseP 是 特异 剪 切 差不多 所 有 大 肠 杆 菌 及 其 吻 菌 体 tRNA 前 体 的 5 旁 侧 顺序 的 ,生成 成 熟 tRNA 的 对 末端 ， 因 此 这 个 5 -内 切 核 酸 酶 也 被 叫 作 tRNA 5’ 成 熟 酶 ， 比 较 了 几 个 tRNA 前 体 的 RNaseP 作用 位 点 指出 ， RNaseP 的 专 一 性 来 看 与 其 剪 切 点 周围 的 一 级 结构 以 至 二 级 结构 并 无 直接 关 系 。 在 体外 ,人 工 除去 tRNAs 前 体 中 前 导 顺 序 41 个 核 苷 酸 中 的 32 SRR, HAW 182。 i] RNaseP 的 作用 ; 由 于 人 工 合 成 tRNA??-tRNAS* 前 体 中 RNaseP 剪 切 点 周围 4 和 14 核 萌 酸 长 的 寡 核 昔 酸 片段 不 能 作为 RNaseP 的 底 物 , 因 此 认为 RNaseP 的 严格 的 专 一 性 可 能 与 tRNA 前 体 分 子 的 特殊 构 型 有 关 。 RNaseP 也 能 加 工 某 些 非 tRNA 前 体 分 子 ， 如 大 肠 杆 菌 4.5S RNA 前 体 , 680 吻 菌 体 编码 的 另 一 RNA。 经 过 分 析 ， 发 现 这 些 RNA 也 具有 类 似 tRNA 的 三 叶 草 结构 。3 ` 端 无 CCAoa 的 tRNA 前 体 不 能 作为 RNase P 的 交 物 ,或 不 是 好 的 底 物 。 用 化 学 方法 或 酶 法 除去 大 肠 杆 菌 RNAI” 的 3 -CCAoa 一 个 或 二 个 末端 核 昔 酸 , 即 明显 影响 它们 被 RNaseP 的 水 解 速度 。 1978 年 Altman 等 发 现 大 肠 杆菌 RNaseP 是 一 种 不 寻常 的 酶 分 子 ， 它 由 至 多 23% 和 蛋白质 和 至 少 77% RNA 所 组 成 ,沉降 密度 为 1.71g/ cms(CsCl 中 ) 和 1.55g/cm*(Cs,SO, 中 )， 是 一 个 特征 的 RNA- 和 蛋白 质 复 合 物 ， 其 中 多 肽 分 子 量 约 17,500d，RNA 分 子 量 为 120,000d,4% 360 核 背 酸 长 。 用 蛋白 水 解 酶 \ 固 定 化 RNaseA 或 依赖 Ca” 的 小 球菌 核 酸 酶 处 理 则 RNaseP 失 活 ; 拆 开 蛋 白质 和 RNA， 两 者 不 具 活 性 ,重组 则 活性 恢复 。 1980 年 分 离 得 到 的 枯草 杆菌 RNaseP 也 是 一 个 由 RNA #1 ERA RAND RNaseP 中 存在 RNA 组 分 表明 , 它 可 能 是 一 个 识别 亚 基 ,具有 仅 与 RNA 及 结构 类 似 的 RNA 相互 作用 的 特定 顺序 与 构象 。 从 其 他 许多 来 源 如 酵母 .昆虫 .哺乳 动物 中 也 都 发 现 有 类 似 RNaseP 活性 。 除了 RNaseP 作为 5 -内 切 核 酸 酶 外 ,加 工 tRNA 前 体 至 少 还 需要 一 个 3- 内 切 核酸 Cn RNaseF )， 它 从 较 大 前 体 切 下 3 端 带 aa ae 有 不 太 长 的 核 背 酸 顺 序 。 用 于 rRNA 加 工 的 插入 顺序 nnn 3’ RNase III 和 RNaseE 在 tRNA 加 工 中 可 能 | wren 也 起 作用 ,但 RNase III 对 于 体内 tRNA 成 st 1 tied 3/4 数 并 非 绝 对 需要 ,而 RNaseE 剪 切 仅 用 于 很 少数 tRNA 前 依 中 ,这 两 个 酶 的 功能 大 概 是 2', 3 KBR @ppA SEAMEN tRNA 转录 产物 转变 为 小 的 NT 产物 ,后 者 是 RNaseP 更 有 效 的 底 物 。 为 了 使 tRNA 分 子 得 到 成 熟 的 3 端 , 还 需要 有 一 个 外 切 酶 进行 修剪 , 从 3 端 逐个 切 去 附加 的 顺序 ， 以 暴露 出 IRNA3” 端 。 这 个 修剪 酶 是 RNaseD， 分 子 量 为 38,000d ,为 单 一 亚 基 的 蛋白 质 。 它 不 同 于 另 一 3 IRS RNase I[，RNaseD 具 更 为 严格 的 选择 活性 ， 因此 RNaseD 是 一 个 体内 的 3 -tRNA BA ‘Bi. tRNA 前 体 中 插入 顺序 的 除去 ， 是 靠 一 非常 复杂 的 酶 系 来 完成 的 。 现 已 从 酵母 中 分 离 得 到 用 于 剪接 反应 的 内 切 核 酸 酶 和 RNA 连接 酶 -DA st “pS (+18) seat —— 7] Be 一 -一 一 由 上 一 一 成 熟 的 tRNA 图 5-41 tRNA 前 体 中 插 和 顺序 的 切除 《T /2 代表 半分 子 ) 连接 酶 。 内 切 核 酸 酶 可 将 CRNA 前 体 加 工 成 带 有 2 .3’ 环 磷酸 的 5 半分 子 和 5’ 羟基 的 3’ 半分 子 , 同 时 释放 出 完整 的 插 人 顺序 。 它 是 一 种 单一 的 内 切 核酸 酶 ,可 识别 所 有 tRNA 前 体 的 共同 结构 特征 ,加 工 各 种 不 同 的 同 源 或 异 源 的 tRNA 前 体 。5 半分 子 在 2、3' 环 磷 "183。 酸 3’ 单 酯 酶 作用 下 成 带 2 磷酸 的 5 半分 子 。3 半分 子 在 激酶 作用 下 生成 带 5 磷酸 的 3 He P 43 F oRNA BET KP THM LHS HOE N 一 。 P 由 于 产物 中 2 磷酸 不 能 被 一 般 的 磷酸 单 酯 酶 除去 , 故 推测 还 存在 一 种 新 的 特异 性 的 磷酸 单 酯 酶 。 反应 机 制 如 图 5-41 Pra. WAR Zin RA, Bie ERAT A 系 。 不 过 有 证 据 表明 ,剪接 反应 的 机 制 是 多 种 多 样 的 ,可 能 有 几 种 反应 途径 。 CCA 添加 缺乏 或 具有 不 完全 的 3-CCAoa 末端 的 tRNA 是 没有 活性 的 。 有 的 tRNA 基因 中 带 有 一 CCA 模板 顺 厚 ,而 另 一 些 则 无 ， 因 此 经 过 剪 切 或 修剪 后 的 tRNA, # 3’ 端 可 能 存 在 但 也 可 能 没有 3 -CCAor, 对 于 后 者 ,需要 在 tRNA 核 童 酰 转 移 酶 催化 下 进行 末端 加 成 : fk CCAoa 未 端的 tRNA (或 tRNA 前 体 ) -_“cTT TAT? >、 带 CCA 未 端的 tRNA (或 tRNA 前 体 ) (RNA BRE BMS 7 eS a (RNA 核 音 栈 转移 酶 广泛 分 布 于 所 有 细胞 、 细 胞 器 和 病毒 中 , 它 对 供 体 的 要 求 是 非常 专 一 的 , 除 CTP 和 ATP Sh, 其 他 NTP 不 能 作为 供 体 。 体 外 实验 表明 , 若 只 存在 一 种 供 体 (CTP 或 ATP)， 也 可 催化 下 列 反应 ; tRNA-N 十 CTP 一 ->tRNA-C 或 RNA-CC 十 PPi tRNA-C + CTP 一 >tRNA-CC + PPi tRNA-CC 十 ATP——>tRNA-CCA 十 PPi 同时 ;在 某 些 特殊 情况 下 ;该 酶 也 能 催化 不 正常 的 合成 ,如 tRNA-N 十 ATP—->tRNA-A,tRNA-AA,tRNA-AAAo tRNA-C 十 ATP 一 >tRNA-CA:IRNA-CAA。 tRNA-CCA + CTP 一 tRNA-CCACC。 Re RIM tRNA 分 子 中 含有 许多 修饰 成 分 ， 不 同 tRNA 所 含 修饰 成 分 种 类 和 数目 都 各 不 相同 ( 详 见 第 一 章 和 第 三 章 )。 虽 然 修饰 成 分 在 RNA 中 的 生物 功能 仍 了 解 很 少 , 但 对 其 生物 合成 已 有 不 同 程度 的 了 解 。 核 音 修 饰 问题 是 RNA 特别 是 RNA 加 工 的 主要 内 容 。tRNA 的 修饰 是 在 多 核 苷 酸 链 上 进行 的 ,由 一 类 统称 为 修饰 酶 所 催化 : 缺 修饰 成 分 的 tRNA 《或 前 体 ) ACHE (etm tRNA (或 前 体 ) (RNA 修饰 酶 具有 高 度 专 二 性 ，DNA 、rRNA (THEA BID), SRR 核 昔 都 不 能 作为 修饰 酶 的 底 物 。 由 于 tRNA 中 修饰 成 分 人 多 ,因而 修饰 酶 种 类 很 多 ， 一 般 来 说 ,每 种 修饰 核 音 都 有 催化 合成 本 身 的 修饰 酶 。 CRNA 甲 基 转 移 酶 (简称 CRNA 甲 基 化 酶 ) 是 研究 较 早 也 较 详细 的 一 类 修饰 本 它 不 同 于 前 面 的 mRNA 甲 基 转移 酶 ,与 甲 基 化 rRNA 分 子 的 酶 也 可 能 不 相同 。 近 年 来 ,由 于 酶 分 离 纯化 技术 的 进展 ,已 经 得 到 对 碱 基 以 及 排列 顺序 高 度 专 一 的 tRNA 甲 基 化 酶 ， 如 CRNA (了 腺 嘎 岭 -1) 甲 基 化 酶 催化 tRNA 中 特定 位 置 的 A -> m'A, tRNA ( 岛 呆 叭 -7) 甲 。184 。 基 化 酶 可 使 RNA 中 第 55 位 的 G 一 m?G， 其 他 如 催化 tRNA 中 生成 mG、m'G、m5C- 以 及 rT 的 酶 也 已 高 度 纯 化 。 有 的 甲 基 化 酶 则 能 同时 催化 二 种 以 上 核 背 ， 可 能 是 不 同 甲 基 化 酶 的 混合 物 。RNA 甲 基 化 酶 也 具有 严格 的 顺序 要 求 ， 如 从 酵母 分 离 得 二 个 RNA (SR4-1) 甲 基 化 酶 , 它们 能 分 别 甲 基 化 CRNA 中 的 Ge 和 G 生成 m'Gy 和 m'Gyo 从 枯草 杆菌 分 离 的 RNA( 腺 味 叭 -1) 甲 基 化 酶 能 催化 tRNA 中 的 … .YAAGGCmiG 一 > YAm'AGGCmiG; 而 鼠 肝 中 得 到 的 同一 酶 则 使 GTPCGAAU 一 GTWCGAmlAU。 差不多 所 有 tRNA 甲 基 化 酶 的 甲 基 供 体 均 为 S- 腺 苷 甲 硫 氮 酸 (SAM), ,使 用 放射 性 标记 的 SAM 进行 实验 ,可 以 简便 地 测定 甲 基 化 酶 活性 : tRNA 十 3H 或 “C-SAM 一 >H 或 “C- 甲 基 tRNA + S- 腺 背 高 半 胱 氨 酸 但 也 有 报道 ,在 某 些 革 兰 氏 阳 性 菌 中 分 离 出 RNA( 尿 喀 啶 -5) 甲 基 化 酶 ( 即 rT 甲 基 化 酶 ), 所 用 供 体 不 是 SAM， 而 是 5;,10- 甲 又 四 氧 叶酸 ， 同 时 以 FADH, 作 还 原 剂 , 反应 如 下 : tRNA(U¢C) + CH, = THF + FADH, — >tRNA(T¢C) + THF + FAD 被 广泛 进行 研究 的 tRNA 修饰 酶 还 有 : tRNA FPR CCRNAL’ HRA Re BS), PA 上 的 异 戊 烯 侧 链 的 供 体 是 人 - 异 戊 烯 焦 磷 酸 ; tRNA CA AR, 在 碳酸 氧 盐 ， 存在 下 ，Thr 进入 tRNA, PR AS 催化 yw(Y) 生 成 的 酶 ,YY 的 第 三 环 来 自 Met 中 的 3- 氮 基 -3- 羧 两 基 ; tRNA: SERB, Het tRNA 中 QQ 的 生成 , 即 Q 碱 基 的 进入 是 通过 N- 糖 背 键 断裂 进行 的 ; RNAY 合成 酶 ,至 少 有 二 个 酶 分 别 催化 反 密 码 区 上 几 的 生成 和 其 他 区 (包括 TwC 区 ) 上 几 的 生成 ,实质 上 酶 催化 异 构 化 作用 : tRNA(5-3H-U) 一 ->tRNA(CU 一 消 ) + 3H tRNA. 硫 转 移 酶 不 止 一 种 ,催化 SU 以 及 其 他 含 硫 的 罚 喧 化合物 的 生成 , 供 体 是 Cys 或 8- 莹 基 丙 酮 酸 ;催化 tRNA 中 生成 I、D、ncpU 的 酶 活性 也 已 发 现 。 关于 tRNA 中 修饰 核 背 的 生物 合成 详 见 本 丛书 "代谢 部 分 的 核酸 代谢 一 章 。 下 面具 体 介绍 几 个 tRNA 前 体 的 加 工 过 程 。 图 5-37 是 了 NA， 前 体 的 三 叶 草 结 构 ,图 中 也 示 出 剪 切 和 修剪 部 位 和 所 需 的 加 工 酶 : RNase P、RNaseE 和 RNase D3 修饰 成 分 的 生成 包括 Us 与 U 一 SU、Gv 一 Gm、Aas at fA 生成 ms'iSA, Un 转变 为 Oy Uss 和 Us SAFER T Ad 较为 复杂 的 例子 是 前 面 提 到 T4 WR RAE CH tRNA AAA ERC A5S-35), 但 一 般 分 离 不 到 完整 的 转录 产物 ,因为 感染 后 很 快 就 出 现 剪 切 产 物 , 并 且 得 到 成 熟 下 NA。 但 在 早期 也 分 离 出 三 个 tRNA 双 顺 反 子 前 体 ( 见 第 181 页 ): tRNA?-tRNAS*, tRNAT- tRNA": 以 及 了 归 NASm-tRNAL"， 后 者 含量 很 少 , 因 为 它 被 迅速 剪 切 为 成 熟 的 tRNA 和 tRNAS” 前 体 。 一 种 解释 是 ， 在 tRNAS-tRNAL™ 双 体 中 的 tRNAIe 的 3’ 端 存在 CCAoa 末端 ( 见 图 5-39b) 而 使 RNaseP 表现 出 较 高 活性 ( 见 第 183 页 )， 而 在 tRNA? tRNASc 和 tRNAT*-tRNA"* 前 体 中 ,由 于 3 BRIE CCAoa (图 5-39a)，RNaseP 不 能 其 3 部 分 的 tRNA 的 5 端 成 熟 , 故 双 体 堆积 。 而 只 有 当 这 些 双 体 分 子 的 3 ” 端 在 tRNA 核 苷 酰 转 移 酶 催化 下 加 上 CCAoa，RNaseP 才 作 用 于 双 体 ,产生 tRNA, tRNA" 以 及 * 185 Tu tRNA’? 前 体 和 tRNAT® 前 体 。 以 tRNA?°-