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生物 化 学 丛书

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1 中 科 院 植物 所 国 书包 WA $0011891 at 2 mm ke 社

1986

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本 书 根 据 中 国 科学 院 生 物化 学 研究 所 于 1979 年 和 1983 年 举办 的 大 型 生化 训练 班 教材 补充 修改 而 成 。 内 容 包括 核酸 的 结构 (一 级 结构 和 高 级 结 构 )、 主 要 生物 功能 《复制 .转录 和 翻译 ) 与 人 工 合成 (化 学 合成 和 酶 促 合 成 ) 的 基础 知识 及 新 进展 。 同 时 也 介绍 近年 来 研究 较 多 的 具有 生物 活性 的 核 苷 酸 类 化 合 物 以 及 一 些 较 新 的 核酸 分 离 纯化 方法 。 分 上 下 两 册 出 版 。 本 册 主 要 内 容 是 核酸 的 成 分 和 结构 。DNA 的 复制 、 转 录 与 加 工 等 。 本 节 可 供 生物

化 学 、 分 子 生 物 学 分子 遗 传 学 研究 工作 者 和 高 等 院 校 包括 研究 生 在 内 的 有 关 专 业 师 生 参 考 。

生物 化 学 丛书 核 酸 结构 、 功 能 与 合成 aw 册 斑 德 宝 ， 祁 国 荣 主编 EMR RAM Exe me iH RK IER BRNIAKGS 1375 «© +4 sito AS Dhl 新 华 书 店 北京 发 行 所 发 行 ” 各 地 新 华 书店 经 售 来

1986 年 11 月 第 — Rm 开本 :787x1092 1/16 1986 年 11 月 第 一 次 印刷 印张 : 12 5/8 印 数 : 0001 一 3,150 字数 : 276,000

统一 书号 ;: 13031。3334

本 和 社 书 号 : 4055。13 一 10

= ft: 3.00 元

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生物 化 学 研究 所 举办 的 生化 训练 班 始 自 1950 年 ,开始 时 着 重 实验 室 训 练 ， 我 们 的 目 的 是 为 了 使 青年 生化 工作 者 掌握 这 门 学 科研 究 的 一 些 新 方法 、 新 技术 。 以 后 随 着 我 所 高 研 人 员 的 增多 ,又 落 加 了 讲课 内 容 ,围绕 当时 的 生化 生长 点 ,系统 地 讲述 国际 生化 的 新 进展 。 课文 内 容 逐 渐 发 展 充实 ,并 结合 在 上 海 科 技 大 学 讲授 高 级 生化 课 的 需要 ,编写 成 高 级 生化 训练 班 讲义 。 1960 年 中 国 科学 院 在 上 海 召 开 第 一 次 全 国生 化 学 术 会 议 , 会 议 期 间 各 地 代 表 纷 纷 要 求生 化 所 举办 一 次 大 型 高 级 生化 训练 班 ， 为 全 国 各 有 关 单 位 培训 生化 人 才 。 因 此 ,生化 所 于 1961 年 举办 了 一 次 有 四 百 多 学 员 参 加 的 高 级 生化 训练 班 ， 以 系统 介绍 生化 学 科 新 知识 为 主 ,部 分 学 员 并 参加 了 实验 训练 。 十 几 年 来 ,我 们 发 现 通过 该 次 训练 班 学 习 的 学 员 ， 大 部 分 已 成 为 各 有 关 单 位 的 生化 科研 或 教学 骨干 。 这 个 发 现 给 予 生 化 所 同志 以 极 大 鼓舞 。 文化 大 革命 "中 ,高 级 生化 训练 班 横 遭 批判 ,但 1972 年 以 后 ,各 方面 仍 不 断 有 呼声 ,要 求生 化 所 再 次 举办 高 级 生化 训练 班 。 1976 年 我 们 在 所 内 作 一 次 小 型 尝试 ， 着 重 发 挥 部 分 中 级 科研 人 员 在 教学 中 的 作用 ,包括 从 编写 讲义 到 讲课 。 1979 年 在 中 国 科 学 院 一 局 的 催促 和 支持 下 ,为 克服 住宿 的 困难 ,我 们 再 次 在 沪 杭 两 地 同时 举行 一 次 大 型 高 级 生 化 训练 班 , 人 数 近 五 百人 ,课程 内 容 大 为 扩充 ， 包 括 十 余年 来 进展 最 迅速 的 生化 或 分 子 生 物 学 领域 ， 如 分 子 遗 传 、DNA 重组 、 生 物 膜 、 免 疫 生化 等 等 。 为 适应 国内 广大 生化 工作 者 的 需要 , 特 将 上 述 讲 课 内 容 整 理 成 书 , 分 册 付 印 , 定 名 为 生物 化 学 丛书 "。

本 丛书 已 经 出 版 了 三 分 册 ， 即 《蛋白 质 化 学 》《 酶 的 作用 原理 》 和 《生物 膜 的 结构 与 功 能 》。 在 此 分 册 付 印 之 前 ， 生 化 所 又 于 1983 年 在 上 海 科技 大 学 和 第 二 军医 大 学 举办 了 大 型 高 级 生化 训练 班 , 因 此 本 分 册 吸 取 一 些 近 几 年 内 核酸 领域 中 的 重大 进展 以 充实 内 容 , 如 我 国 酵母 丙 氮 酸 转移 核糖 核酸 的 人 工 合成 ，DNA 顺序 测定 方法 的 新 进展 以 及 DNA 结 构 的 一 些 新 发 现 等 等 。 今 后 , 随 着 本 门 学 科 领 域 的 发 展 ， 本 丛书 亦 将 尽量 补充 新 内 容 , 并 望 国内 同行 对 本 书 内 容 不 音 批 评 指 正 , 供 今后 再 版 时 修改 参考 。

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前 言 ” 核 酸 的 历史 和 文献 简介 .et ERY (vii) es BE 4-10) 02) eee eee eee eee HH (1) 区 (2)

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DU, 核 苷 酸 ene ce ence eeecceeescceeeecceeeeceseeneecceeeseerenesepnangeenensceemsecreeesetecssons (11) 五 、 核 酸 成 分 的 缩写 符号 及 核 苷 酸 在 核酸 链 中 的 表示 方式 crretteeeeseeeseteeseees (12) 六 、 核 酸 成 分 的 分 离 览 定 pp (13)

第 二 章 DNA 结构 pp SRM AAR (15) I Hay in oa wn in wn on ole alee nese nad anny recanssspaurns und «¥sedeenamnaguactsove (16) I loosen ox ens te Nada As a a cg eta gS (17) ee (18)

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测定 DNA 顺序 的 方法 ee (21)

= DNA JI RE Brewer eee ee eee e ec ec ence ce ecee enc eneeceeeeeeteeeeeceneeeseeseseenseeeeeeaseens (28) 原核 生物 DNA 顺序 组 织 ee (28) BREAD DNA 顺序 组 织 站 全 全 仙人 ph neue caniadanehiosvne 6 ue etindele seseacieardaneunenceann (35)

=. DNA 国光 年 的 六 和 和 人 eect re 人 (41) DNA 双 螺 旋 pe (41)

双 螺 旋 结 构 的 研究 动态 pp (46)

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DO, DNA (R= Fee Hine ees cee ccc rnccceccnescccccscesescnsscnsessnasessnnsecsansebs cncensens (53)

超 螺旋 ee (53) 生物 体内 的 超 螺旋 。eee ee (56)

第 三 章 RNA 结构 PP REF WH (61) 一 、RNA 的 结构 pp (63) BR Aceseescageccceccqccecccencdsnqencagscananencaccneccqennccacsnascngaaces sdaubbdudeadeusacedasace socces sas (63)

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三 、RNA —SR PATE Beeeenee ere encescenscccntecescrotenssenescsceasadeossseuameaneres (97)

直 读 法 :ee (100) 第 四 章 DNA 复制 pp SPM AAR (104) 一 ”复制 机 制 (105) DE PAGES Ba acsencnsnsecnsonorssssscecserensenssenercss ones tuacsnasensnedasyecoungsenessooss¥eouantennaay (105) OFT SRF Ty Tho nnn cence cc cesenececscccecenecesseceecsnssessesseencansenccesse nen ean ones senesasenas (109) eh IN AVE WES AI Dy [Al --v eve cen nce cee 全 全 全 半生 全 全 生计 全 (110) 半 不 连续 复制 .ee (113) RNA BG c-sescccnseecsnenosseccesoeseaccereeserseneoaneesensusybe soedeedgunsasb« «cube wes aeiunaeanenE (114) 引 | 大 下 和 ne 人 (115) GES TIE [ene ee eee eceeeeceeseeceescecstaeeceesenscessseneetsanaseecseeeneecescneeeteetsenerssaereeeneeewens (117) 链 的 终止 ooeeooeeoeooeseeoseoeeoosooovosooeooosoosooooioooooooieooocooooooooooooooooooovooviaaoodoiseoss (118) SHEA RSE i enennccecceeneccnecerenscncceceeececeeenesencesencesseseenretsesseeesseeeeeraueesreseanane (118) J]\G ee nvee ee eneceesencneceeeeeeeeseeeeeseenseerenseteeeecteetectenscetcensstenscecsnerersesenensneeessesenees (119) = DNA Be BRA] DNA 连接 酶 fee-0cc00c0eceaete cesses serene (119) 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 工 站 pe (119) 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 下 pe 人 (123) 天 鹏 杆菌 :ONA BB -Avige TI ZORy ots sta seuss dane sndy-o90ten Meekdecnesen anny caste reef (124) 真 核 生 物 中 的 DNA 聚合 酶 ee (125) DNA 连接 酶 ee (126) =. DNA 双 螺 旋 的 解 开 PN (126) 单 链 结合 蛋 和 ee (126) DNA 解 链 酶 ee (127) 拓扑 异 构 酶 I oer eeeececececceccceccccecseeencsececeetecseesaesecsecsaneeesesseeseetessessessaeseeeserans (128) 拓扑 异 构 酶 匡 .eeeeeeeeeeeeeeee (129) 四 、 真 核 生 物 DNA 的 复制 pp (131) $3 | \ ER FURY fe ---nveecccnsnsecssossnssnteesenscosecsenscscoeseneaetoessccoeconsquscsunenescacsaseshonne (131) 4p Hea FE A BS al Bp == ee cee nn snsccccecsnscceccccesscccseescceccanssssansaessccacseesensesseesens cesses (132) DNA 复制 单元 或 复制 子 pe (133) 染色 体 的 合成 .ee (133) Fly DNA 复制 的 调 探 ppp (133) 第 五 章 Lis ap) ee eo RS (138) 一 、RNA 聚合 酶 pe (138) 原核 生物 RNA 聚合 酶 .ee (139) , 真 核 生 物 RNA 聚合 酶 .ee (140) 二 、 转 录 的 机 制 pp (141) dete SY eee eee ceeaeeeecanececanseecsscescaaseccnsusesseunesesenescesauenssaeeeesessunseesanseesaneeeseee (142) RNA 链 的 延伸 .ppp (143) 和 (144) 三 、 转 录 的 抑制 章 ccc ece eee rece eeee eee eeeuteeneseeeeesseneecneeeeerseeenseeseenseeseeeae eens (148) 与 DNA 模板 作用 的 转录 抑制 剂 .pp (149) 与 RNA BERGE FA ADEE SEH AA Fl ce ceeeeeeeeeeeeesesecaeceeeeeceeeenrerrarsessaeseeseeseecesenerens (152)

Pd, mRNA 的 转录 与 加 工匠 (153)

mRNA 概念 的 提出 和 m RNA 的 发 现 pp (153) 原核 生物 mRNA 的 转录 .pe (155) 真 核 生 物 中 RNA 的 转录 与 加 工 .ee (161) 五 、rRNA Wn: SE ==: oe 9) eee (170) rRNA 基因 与 rRNA 前 体 pe (170) rRNA 前 体 的 加 工 间 pe (171) BOI ROE Ya es Rteeneeeseeeseeesetesensen 人 (176) 7. tRNA 的 转录 与 加 工 adsiceeiecigne caetennere semee raceme eee ss asics ces ae 起 (177) CRNA 基因 与 tRNA 前 体 pe (178) CRNA 前 体 的 加 工 间 pe (182)

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22.

前 言 “” 核酸 的 历史 和 文献 简介

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十 八 世纪 后 期 从 鸟 状 和 人 尿 中 发 现 尿酸 ,这 是 世界 上 发 现 的 第 一 个 叮 吟 化合物, 十 九 . 世纪 又 相继 从 膀胱 结石 中 找到 黄 叮 哈 ， 从 鸟 羡 中 找到 鸟 ( 便 ) 味 叭 ,从 牛 脾 找到 次 黄 味 叭 ， 这 些 都 是 发 现 核 酸 以 前 的 一 些 重要 发 现 , 当然 , 味 叭 究竟 具有 怎样 的 结构 ,上 述 几 种 嗓 吟 化 合 斩 有 什么 生物 意义 或 功能 ,在 当时 是 不 清楚 的 。

差不多 与 此 同时 ,生物 学 家 们 发 现 了 细胞 核 ,并 且 认 识 到 细胞 是 生物 体 的 基本 组 成 单 位 ,是 由 细胞 核 及 其 周围 的 细胞 质 组 成 。

1868—1869 年 瑞士 Basel 青年 科学 家 Friedrich Miescher (1844—1895) 到 德国 Ti- bingen, Bi F. Hoppe-Seyler 学 习 , 研 究 细胞 核 的 化 学 成 分 。 他 以 实验 室 附 近 的 外 科 医 院 收 集 到 的 绷带 为 材料 ,把 脓 细 胞 从 绷带 上 洗 下 来 , 先 用 胃 酶 盐酸 混合 液 消 化 这 些 脓 细胞 , 再 用 乙醚 抽 提 ,细胞 核 留 在 水 相 , 沉 在 器 严 底 部 ， 可 用 过 滤 的 方法 收集 。 从 这 样 得 到 的 细胞 核 中 ,他 提取 得 到 一 类 化 合 物 , 呈 酸性 ,不 咨 于 稀 酸 , 但 能 溶 于 稀 碱 , 而 且 含 有 相当 量 的 磷 元 素 。 这 一 点 引起 了 Miescher 的 重视 ,因为 在 当时 从 动物 组 织 中 得 到 的 含 磷 化 合 物 只 有 卵 磷 脂 一 种 ,也 是 Hoppe-Seyler 实验 室 的 人 发 现 的 。 Miescher 把 他 新 发 现 的 化 合 物 命 名 A“ ia” (Nuclein) ,并 将 他 的 实验 结果 写成 论文 送 给 Hoppe-Seyler。 为 了 慎重 起 见 ，Ho- ppe-Seyler 没有 马上 发 表 , 而 坚持 要 末 和 目 重 复 Miescher 的 实验 ,等 得 到 同样 的 结果 后 ， 才 把 Miescher 的 论文 和 他 自己 重复 的 结果 在 他 所 主编 的 杂志 上 同时 发 表 了 。Miescher 发 现 的 核 质 ,实际 是 含有 有 蛋白质 的 核酸 制品 ， 以 后 R. Altmann 制 得 不 含 蛋白 质 的 核酸 ,并 首先 使 用 核酸 ”命名 他 的 制品 ,这 是 Miescher 发 现 核 酸 二 十 年 以 后 的 事 了 。

自 此 以 后 ,核酸 吸引 了 不 少 著名 化 学 家 的 注意 ,他 们 对 核酸 的 组 成 成 分 感到 兴趣 ,用 各 种 方法 分 解 核 酸 , 并 从 中 分 离 得 到 叮 叭 碱 \ 喀 啶 碱 \ 核 糖 \ 脱 氧 核 糖 等 。 其 中 贡献 最 大 的 是 A. Kossel 和 他 的 学 生 们 ,以 及 P. A. Levene 和 他 的 同事 。 玉 ossel SRT RIK ICR BS AW SE J. Piccard 发 现 的 ) 核 酸 中 常见 的 其 他 四 种 碱 基 , 即 腺 味 叭 、 尿 旷 啶 、 胞 喀 啶 和 胸腺 喀 啶 -Levene 等 则 对 核糖 ,2- 脱 氧 核 糖 \ 核 苷 和 核 背 酸 的 鉴定 等 作出 了 贡献 。

但 是 核酸 究竟 具有 怎样 的 结构 ,大 小 如 何 , 在 生物 体内 起 什么 作用 ,有 什么 功能 ,直到 本 世纪 初 仍 然 不 知道 甚至 从 事 核 酸化 学 组 成 研究 了 几 十 年 的 Kossel 也 认为 核酸 没有 多 大 的 重要 性 ,因而 于 1905 年 改行 研究 细胞 核 中 的 碱 性 蛋白 质 。. 不 久 第 一 次 世界 大 战 发 生 , 当 时 世界 核酸 研究 中 心 的 德国 是 参战 的 主要 一 方 , 核 酸 的 研究 当然 受到 影响 而 停顿 下 来 了 。

直到 本 世纪 二 十 年 代 ， 核 酸 的 主要 来 源 是 胸腺 和 酵母 。 从 胸腺 得 到 的 核酸 含 胸腺 喀 啶 ,从 酵母 制 得 的 核酸 则 不 含 胸腺 喀 啶 而 含 尿 喀 啶 ,其 他 三 种 碱 基 , 即 腺 味 叭 、 鸟 味 叭 和 胞 喀 喧 则 两 者 都 有 。 另 外 还 有 一 个 差别 ,就 是 从 胸腺 核酸 得 到 2- 脱 氧 核糖 ,而 酵母 核酸 则 含 有 核糖 。 限 于 当时 的 技术 水 平 , 从 其 他 动物 组 织 制 得 的 核酸 都 类 似 胸 腺 核酸 ,而 从 麦 胚 这 样 的 植物 来 源 的 则 和 酵母 核酸 相同 ， 因 此 一 度 以 为 核酸 可 以 分 为 动物 核酸 和 植物 核酸 两

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大 类 。 以 后 发 现 无 论 在 动物 或 植物 细胞 核 内 部 都 可 找到 胸腺 核酸 类 型 的 核酸 ,而 在 细胞 质 内 却 含 有 象 酵母 那样 的 核酸 ,于 是 不 再 有 动 植物 核酸 之 分 。 而 出 现 了 核 灶 核 酸 (RNA & 核糖 ) 和 脱氧 核糖 核酸 CDNA 含 脱氧 核糖 ) 这 样 的 分 类 ,一 直 沿用 至 今 。 最 近 有 人 从 艾 氏 腹水 瘤 中 找到 含 葡萄 糖 的 核酸 ,叫做 葡萄 糖 核酸 (GNA) ,其 功能 还 不 清楚 。

无 论 RNA 或 DNA 都 是 由 许 许多 多 核 背 酸 组 成 的 。 核 昔 酸 则 由 含 氨 有 机 碱 ( 咱 叭 AURA GE) CRORE) = MRR. BORA ES 酯 (磷酸 和 相 邻 两 核 昔 酸 的 戊 糖 形成 的 ) 键 连接 起 来 的 。 由 于 当时 实验 条 件 的 限制 。 核 酸 分 子 的 大 小 是 不 清楚 的 ,但 是 从 分 析 结 果 看 ，RNA 或 DNA 都 含有 四 种 碱 基 , 它们 的 克 分 子 2 比例 接近 于 1:1:1:1, 因此 出 现 了 “四 核 蔡 酸 * 的 说 法 认为 核酸 就 是 四 核 音 酸 或 者 四 核 苷 酸 的 重复 。 现 在 看 来 四 核 背 酸 的 说 法 当然 是 错误 的 。 简 单 而 明显 的 理由 是 ;最 小 的 核酸 的 分 子 量 也 有 几 万 道 尔 顿 , 不 可 能 是 四 核 昔 酸 ; 核 酸 中 四 种 常见 碱 基 的 克 分 至 比 坟 Fee <A, Bs

第 一 次 世界 大 战 结束 ,德国 战败 了 ,核酸 研究 随 着 分 散 到 世界 其 他 国家 ， 特 别 是 美国 和 西欧 。 二 十 世纪 30 年 代 又 发 生 第 二 次 世界 大 战 , 核 酸 研究 工作 又 受到 了 严重 冲击 而 进 展 迟 缓 。 然 而 就 在 这 次 大 战 结束 前 一 个 很 重要 的 工作 发 表 了 , 它 对 核酸 的 重要 生物 功能 做 了 最 直接 的 阐明 ,推动 了 近 四 十 年 来 深入 广泛 的 研究 ,使 核酸 研究 成 为 生物 化 学 和 分 子 生 物 学 领域 内 最 引 人 注 目的 一 个 分 支 。1944 EO. T. Avery, C. M. Macleod 和 M. Mc- Carty 在 研究 肺炎 球菌 的 转化 现象 时 ,发 现 从 一 种 类 型 的 肺炎 球菌 制备 得 到 的 DNA 可 以 引 到 另 一 类 型 的 肺炎 球菌 体内 ,并 使 后 者 的 遗传 性 状 改变 成 前 者 他 们 得 出 结论 遗传 物质 是 DNA。 但 由 于 当时 流行 的 观点 ;蛋白质 (而 不 是 核酸 ) 是 遗传 的 物质 基础 ，Avery 等 的 实验 结果 曾 一 度 被 怀疑 ,认为 他 们 的 _DNA 制剂 内 杂 有 和 蛋白质。 然而 Avevy 等 的 工作 以 令 人 信服 的 证 据 证 明 ，DNA 而 不 是 蛋白 质 才 是 遗传 物质 ,改变 了 当时 的 流行 看 法 ， 从 此 核酸 的 重要 性 受到 了 广泛 的 注意 。

1953 年 核酸 研究 的 又 一 个 重要 里 程 砷 出 现 了 ， 这 就 是 J， D. Watson 和 了. H.C. Crick 的 DNA 双 螺 旋 结 构 学 说 。 这 个 学 说 不 但 阐明 了 DNA 的 结构 ,并 且 为 一 不 DNA 分 子 如 何 复制 成 两 个 相同 结构 的 DNA 分 子 以 及 DNA 怎样 传递 生物 体 的 遗传 性 状 提 供 了 合理 的 说 明 。 这 项 工作 为 现代 分 子 生物 学 的 黄 定 起 到 了 关键 性 的 作用 ， 受 到 了 科学 界 的 普遍 重视 。

自 此 以 后 的 三 十 年 ,核酸 研究 进展 之 快 ,涉及 范围 之 广 , 影 响 之 大 , 内 容 之 丰富 , 在 生 物 科学 领域 内 是 少见 的 。 大 体 说 来 有 下 面 这 些 工作 。

(1) 核酸 的 生物 合成 ， 包 括 DNA 的 复制 ，DNA 转录 成 RNA 和 转录 后 的 加 工 以 及 RNA 反 转 录 成 DNA 等 。

(2) DNA 不 仅 存在 于 细胞 核 内 ,在 核 外 的 一 些 细胞 器 中 也 找到 , 如 真 核 生 物 的 线 粒 体 \ 叶 绿 体 等 ,原核 生物 的 质粒 等 。 RNA 病毒 和 叭 菌 体 ，DNA 病毒 和 叹 菌 体 的 发 现 。

(3) RNA 和 和 蛋白质 生物 合成 的 关系 ，tRNA, mRNA 和 rRNA 的 发 现 。 三 联 密码 的 确定 ,蛋白 质 生物 合成 的 过 程 等 。

(4) 核酸 的 新 陈 代谢 , 叮 叭 和 喀 啶 核 音 酸 的 生物 合成 。

1) 1 克 分 子 (M) =1 mol; 1 克 分 子 浓 度 (M)=1 mol!/1,

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6) BERMIUAMMW HARES, UR RA IRAE ERS,

(6) 核酸 分 子 中 核 昔 酸 排列 顺序 (一 级 结构 ) 的 测定 。

(7) 核酸 高 级 结构 的 测定 。

(8) 基因 表达 和 调节 控制 的 机 理 。

(9) 真 核 生 物 DNA 和 RNA 与 原核 生物 DNA 和 RNA 的 差异 , 真 核 生 物 结构 基 因 的 不 连续 性 ,剪接 现象 的 发 现 等 。

(10) 修饰 核 音 酸 和 具有 重要 生物 功能 小 分 子 活性 核 背 酸 的 发 现 。

(ll) 不 同 核酸 之 间 以 及 核酸 和 蛋白 质 之 间 的 相互 作用 。 核 酸 蛋 白质 复合 体 (如 染色 体 、 核 糖 体 \ 复 制 体 \ 病 毒 \ 噬 菌 体 等 ) 结 构 的 研究 。

(12) 细胞 核 内 和 其 他 小 分 子 RNA 的 结构 和 特殊 功能 。

(13) 核酸 的 人 工 合成 。

(14) 综合 利用 上 述 核酸 研究 的 成 就 ， 衍 生出 了 分 子 遗 传 学 和 基因 工程 ， 为 医学 、 农 业 、 工 业 `\ 环 境 保护 等 打开 了 新 局 面 。

为 了 说 明 三 十 年 来 核酸 研究 的 大 体 进展 过 程 和 科学 界 对 核酸 研究 成 果 的 重视 程度 ， 现在 把 近 三 十 年 来 因 从 事 这 方面 的 研究 而 获得 诺 贝 尔 奖金 的 科学 家 列表 如 下 :

科 学 家 年 份 种 类 成 果

A. R. Tood 〈 英 ) 1957 化 学 确定 核 背 酸 结构 ,合成 二 核 背 酸 等 G. W. Beadle (34) 1958 生理 学 、 医 学 化 学 试剂 对 基因 的 控制 和 影响 E, L. Tatum (3) 1958 生理 学 、 医 学

J. Lederberg (3) 1958 生理 学 、 医 学 提出 新 的 遗传 论点

S. Ochoa ( 美 ) 1959 生理 学 、 医 学 酶 促 合 成 核糖 多 核 背 酸

A. Kornberg (2) 1959 生理 学 、 医 学 酶 促 合 成 DNA

J. D. Watson (#) 1962 生理 学 、 医 学 DNA 的 双 螺 旋 结 构

E. H。C。CricK ( 英 ) 1962 生理 学 医学

M. H. F. Wilkins ( 英 ) | 1962 生理 学 、 医 学 DNA 的 X 射 线 衍射 研究

F. Jacob (法 ) 1965 生理 学 、 医 学 基因 对 酶 和 病毒 合成 的 控制

A. M. Lwoff (法 ) 1965 生理 学 、 医 学

J. L. Monod (法 ) 1965 生理 学 ,医学

R. W. Holley (34) 1968 AE PBS Pee MG tRNA Ala 一 级 结构 测定 H. G. Khorana ( 美 ) 1968 生理 学 、 医 学 合成 遗传 密码

M. W. Nirenberg (32) 1968 生理 学 、 医 学 RIB SBR

M, Delbriick (#) 1969 生理 学 、 医 学 基因 结构 和 病毒 复制 机 制

A. D. Hershey (3) 1969 ATE aS

S. E. ‘Luria (3) 1969 Ae PB Re ee

E. W. Sutherland (3) | 1971 | 生理 学 、 医 学 42 3’ ,5- 环 AMP 和 激素 作用 机 制 H. M. Temin 〈 美 ) 1975 生理 学 、 医 学 发 现 反 转录 酶

D. Baltimore (2) 1975 生理 学 医学

R. Dulbecco 〈 意 ) 1975 生理 学 、 医 学 肿瘤 病毒 和 细胞 遗传 物质 之 间 的 相互 作用

续 表

科 学 家 ay | 种 “类 成 果 Ww. Arber ( 瑞 十 ) | 1978 | 生理 学 \ 医 学 发 现 细菌 限制 性 内 切 栈 LO. Smith ( 美 ) | 1978 | 生理 学 \ 医 学 发 现 限制 性 内 切 酶 作用 方式 的 特点 Dp, Nathans ( 美 ) | 1978 | 生理 学 \ 医 学 用 限制 性 内 切 酶 制 成 肿瘤 病毒 的 基因 图 谱 二 化 学 建立 DNA 重组 技术 ae Gite 1981 化 学 DNA 一 级 结构 测定 方法 81 化 学 DNA 一 级 结构 测定 方法

A. Klug ( 英 ) 1982 化 学 建立 晶体 电子 显 微 技术 测定 核酸 -蛋白 质 复合 体 的 构造

此 外 在 早期 获得 诺 贝尔 奖金 者 中 ， 和 核酸 及 遗传 有 关 的 还 有 A. Kossl 〈 德 国人， 1910 年 生理 学 医学 奖 ,核酸 成 分 的 性 质 结构 等 )，I. H. Morgan (EBA, 1933 年 生理 学 、 医 学 奖 , 发 表 基 因 论 ) 和 H. J. Muller Geb A, 1946 年 生理 学 、 医 学 奖 ， 发 现 和 射线 能 促使 基因 变异 ) 等 ,这 种 情况 在 其 他 科学 领域 内 是 罕见 的 。

几 十 年 来 深入 广泛 的 研究 ,大 量 资料 的 积累 ,核酸 的 文献 可 以 说 是 谋 牛 充 栋 。 下 面 简 单 介绍 一 下 这 方面 的 情况 , 供 有 志 从 事 核 酸 研究 的 同志 们 参考 ,自然 只 能 选择 一 些 有 代表 性 或 个 人 认为 比较 重要 的 书籍 和 期 刊 ( 列 到 1983 年 止 ), 不 可 能 全 部 罗列 出 来 。

I 书籍

(1) P. A. Levene and L. W. Bass, Nucleic Acids, Chemical Catalog Company, New York, 1931. 这 本 书 的 作者 Levene 是 早期 从 事 核酸 研究 最 有 成 就 的 人 之 一 , 对 发 现 核酸 以 来 六 十 年 的 研究 历程 有 较 详 尽 而 亲切 的 叙述 。

(2) E. Chargaff and J. N. Davidson (eds.) The Nucleic Acids, Academic Press, Inc, New York, Vol.1, 1955; Vol. 2 1955; Vol.3 1960. 这 是 本 世纪 六 十 年 代 以 前 收集 到 的 有 关 核 酸化 学 和 生物 学 材料 最 丰富 的 一 部 书 , 全 书 共 四 十 章 , 每 章 均 由 专家 撰写 。

(3) J. N. Davidson, The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall and Science Paperbacks. 此 书 已 出 九 版 ,第 一 版 1950 年 发 行 ,至 第 七 版 (1972) 均 由 Davidson 编 著 。Davidson 去 世 后 第 八 版 1976 年 ) 起 是 由 他 的 同事 和 学 生 修订 的 ， 第 九 版 于 1981 年 出 版 。

(4) A. Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman and Company, San Francisco, 2nd ed., 1980; Supplement, 1982. 4

(5) J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, Benjamin/Cummings Menlo Park, California, 3rd ed., 1976.

(6) J. D. Watson and J. Tooze, The DNA Story, W. H. Freeman and Company | San Francisco, 1981.

(7) P. R. Stewart and D. S. Letham (eds.) The Ribonucleic Acids, Springer-Verlag, New York, 2nd ed. 1977,

(8) P. R. Schimmel, D. Séll and J. N. Abelson (eds) Transfer RNA. Structure, Properties and Recognition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1979.

* x se

(9) D. Séll, J. N. Abelson and P. R. Schimmel (eds.) Transfer RNA. Biological Aspects. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980.

(10) Kivie Moldave (ed.) RNA and Protein Synthesis, Academic Press, Inc, New York, 1981. 此 书 是 从 “Methods in Enzymology” 从 书 中 收集 有 关 文 章 编 成 的 。

(11) G. D. Fasman, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Nucleic Ac- ids, Vols. I & II, 3rd. ed., 1975, CRC Press, Cleveland.

I 丛书

(1) J. N. Davidson and W. E. Cohn (eds.) Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Academic Press, Inc., New York. 1963 年 起 出 第 一 卷 , 第 一 、 二 卷 原名 “Progress in Nucleic Acid Research”， 从 第 三 卷 起 改 现 名 ，Davidson 去 世 后 ， 从 第 十 四 卷 起 由 Cohn 单独 主编 (第 十 九 卷 为 mRNA 专集 ,由 Cohn 和 E. Volkin 合 编 )o

(2) S. P. Colowick and N. O. Kaplan (eds.) Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., New York, 1955 F#HRWS—#, 至 1982 年 底止 已 出 九 十 卷 。 其 中 第 十 二 郑 分 Part A 和 Part B 二 册 , 第 二 十 卷 (Part C) ， 第 二 十 一 卷 (Part D) ， 第 二 十 九 卷 (Part E)， 第 三 十 卷 《Part F), BATILA (PartG) BATH (Pat), BATHE (Part D) 为 核酸 或 核酸 和 蛋白 质 合成 专 册 。 第 五 十 一 卷 为 叮 哈 和 喀 啶 核 昔 酸 新 陈 代 谢 专 册 。 第 六 十 八 卷 为 重组 DNA Fito

(3) Cold Spring Harbor Laboratory, Symposium on Quantitative Biology, 1933 年 出 第 一 卷 , 除 第 二 次 世界 大 战 期 间 停 出 三 年 外 ,每 年 一 卷 ,都 是 前 一 年 讨论 会 中 报告 的 论文 ， 其 中 许多 卷 是 有 关 核 酸 、 分 子 遗 传 . 病 毒 等 的 专著 。

《4) ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, Academic Press, Inc., New York. 1972 年 起 出 第 一 郑 。

(5) J. M. Luck 等 (eds.) Annual Review of Biochemistry, Annual Reviews, Inc., Palo Alto California, 1932 年 起 出 第 一 卷 。

(6) C. E. Clifton 等 〈eds.) Annual Review of Microbiology, 1974 年 起 出 第 一 卷 。

(7) H. L. Roman “ (eds.) Annual Review of Genetics, 1967 年 起 出 第 一 卷 。

(8) M. F. Morales 4 (eds.) Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 1972 年 起 出 第 一 卷 。 第 6 一 8 卷 的 出 版 商 同 第 5 卷 。

II 期 刊

没有 一 种 生化 期 刊 不 登载 核酸 研究 的 文章 的 ,因此 世界 各 国 的 生化 期 刊 都 应 该 阅览 ， 但 由 于 时 间 有 及 其 他 条 件 的 限制 ,很 难 或 甚至 不 可 能 这 样 做 ,下 面 举 一 些 比较 重要 的 期 刊 供 选读 。

(1) Analytical Biochemistry

(2) Archives‘of Biochemistry and Biophysics

(3) Biochemical and Biophysical Research Communications

(4) Biochemical Genetics

(5) Biochemical Journal

(6) Biochemistry

(7) Biochimica et Biophysica Acta (1960 年 起 出 核酸 专 号 ;1965 年 起 改 为 核酸 和 蛋白

* x1 e

RAKES, 1982 年 起 又 改 为 基因 结构 和 表达 专 号 )。 Duy (8) Biochimie ‘ (9) Buoxumua (10) Biopolymers (11) Bioscience Reports (12) Cell (13) European Journal of Biochemistry (14) Federation of European Biochemical Societies Letters (15) Federation Proceedings (16) Gene (17) Hoppe-Seyler’s Zeitschrift far Physiologische Chemie (18) Journal of American Chemical Society (19) Journal of Bacteriology (20) Journal of Biochemistry (21) Journal of Biological Chemistry (22) Journal of Molecular Biology (23) Journal of Virology (24) Microbiological Reviews (25) Molecular Biology Reports (26) Molecular and General Geneties (27) Nature (28) Nucleic Acids Research (29) Plasmid (30) Proceedings of the National Academy of Sciences, U. S. A. (31) Progress in Biophysics and Molecular Biology (32) Science (33) Scientific American (34) Trends in Biochemical Sciences (35) Virology 等 。

我 国 出 版 的 有 关 期 刊 有

(1) PRA Be

(2) 生物 化 学 与 生物 物理 学 报

(3) 生物 化 学 与 生物 物理 进展

(4) 生命 的 化 学

(5) 生物 科学 动态 a (6) 实验 生物 学 报

(7) 细胞 生物 学 杂志

(8) 科学 通报

(9) 遗传 学 报

* xii ¢

(10) 微生物 学 报 等

中 国 科 学 和 科学 通报 同时 出 外 文 版 。

IV 文摘

有 关 核 酸 的 文章 实在 太 多 , 单 看 上 面 几 十 种 期 刊 还 是 不 免 遗 漏 ( 有 时 甚至 是 重要 的 遗 漏 ), 因 此 还 要 查看 文摘 ,以 弥补 这 个 缺陷 。

(1) Biochemical Abstracts, Part Nucleic Acids 1971 年 起 出 版 ， 原 名 “Nucleic Acids Abstracts”, 1980 年 起 改 现 名 。

(2) Biological Abstracts, 1926 年 底 起 出 版 。

《3) Chemical Abstracts，1907 年 起 出 版 ， 是 目前 世界 上 化 学 方面 最 大 最 全 的 一 部 文 搞 。

(4) Genetics Abstracts, 1968 年 起 出 版 。

(5) Virology Abstracts, 1967 年 起 出 版 。

我 国 的 核酸 研究 起 步 较 晚 ,到 本 世纪 五 十 年 代 中 期 才 开 始 ,由 于 种 种 原因 ， 研 究 的 广 度 和 深度 除 少数 工作 外 ,和 世界 先进 水 平 有 不 小 的 差距 。 这 种 情况 当然 要 反映 到 核酸 的 书 籍 方面 来 ,建国 以 来 虽然 也 出 版 过 几 种 外 文 译 本 ,但 到 现在 还 没有 我 国 自己 编写 的 比较 系 统 的 核酸 书 , 不 无 遗憾 。 为 了 弥补 这 个 空白 ,我们 组 织 我 所 部 分 同志 ,编写 了 这 样 一 本 书 。 由 于 本 书 是 生物 化 学 丛书 的 一 部 分 ,在 这 套 丛 书 里 还 有 分 子 遗 传 学 和 基因 工程 .新 陈 代谢 等 分 册 , 因 此 有 些 内 容 如 基因 的 表达 和 调控 ,染色 体外 的 DNA， 病 毒 和 吧 菌 体 的 DNA, DNA 重组 ,基因 工程 等 将 在 分 子 遗 传 学 和 基因 工程 一 书 中 介绍 ， 而 核酸 的 新 陈 代谢 , 核 苷 酸 的 生物 合成 等 则 在 新 陈 代 谢 书 中 令 述 。

这 本 书 经 过 许多 同志 的 共同 努力 写成 了 ,本 来 应 该 高 兴 , 但 由 于 下 面 一 些 原 因 又 感到 不 足 。1. 作者 不 是 一 个 人 ,因此 带 来 一 些 问 题 , 如 文字 风格 和 表达 方式 不 一 致 ， 内 容 难免 重复 ,又 可 能 有 遗漏 。2. 作者 们 都 不 是 教师 ,又 缺少 教书 经 验 ， 不 善于 对 复杂 的 问题 作 深 人 浅 出 的 阐述 。3. 这 本 书 是 为 高 级 生化 训练 班 写 的 ,虽然 过 去 也 办 过 这 样 的 训练 班 ; 曾 写 过 一 些 讲义 ,但 核酸 的 研究 进展 很 快 , 可 说 是 日 新 月 异 , 几 年 一 过 ,就 须 重 写 。 这 次 的 改写 比较 匆忙 ;而且 写 书 的 同志 手头 都 有 其 他 工作 ,不 可 能 花 很 多 时 间 脱 产 写 书 。4. 更 主要 的 是 我 们 的 学 术 水 平 有 限 。 因 此 这 本 书 的 选材 是 否 妥 当 ， 繁 简 是 否 合适 ， 有 无 重大 错误 等 等 ,我 诚 屋 地 请 求 广大 读者 ,包括 大 专 学 校 的 老师 和 同学 \ 科 研 单 位 和 生产 单位 的 同志 们 ， 多 提 宝 贵 意见 ,指出 缺点 和 错误 ,以 便 今 后 重 版 时 加 以 改正 ,不 胜 企 队 之 至 。

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第 一 章 核酸 的 成 分 th HOR

核酸 的 组 成 单位 是 核 苷 酸 , 核 苷 酸 由 含 所 有 机 碱 碱 基 )\ 戊 糖 和 磷酸 三 者 构成 。 核 昔 骏 组 成 核酸 链 的 模式 如 图 示 :

图 中 BB, Bess Boi, B, 代表 任 一 相同 或 不 同 的 碱 基 ; 若 R 是 OH 则 成 糖 为 核糖 。

本 1 四

由 它 组 成 的 核酸 为 RNA。 若 R 是 互 则 成 糖 为 脱氧 核糖 ， 构 成 DNA， 此 外 在 某 些 RNA 中 ,少数 R 可 以 是 OCH:; 图 中 方 框 分 别 代表 3- 核 音 酸 (由 碱 基 、 戊 糖 和 3 位 上 磷酸 根 构 成 )、5 - 核 苷 酸 ( 磷 酸根 连接 在 戊 糖 的 5 位 上 ) 和 核 背 (只 由 碱 基 和 成 糖 组 成 ) 残 基 。

核酸 的 成 分 早 在 上 世纪 末 和 本 世纪 初 已 经 确定 ( 见 前 言 )o 即 RNA HRA, SH 酸 \ 胞 苷 酸 和 尿 昔 酸 组 成 ,而 DNA 组 成 分 为 脱氧 腺 背 酸 脱氧 岛 音 酸 、 脱 氧 胞 昔 酸 和 脱氧 胸 昔 酸 。 但 是 近 一 、 二 十 年 来 在 不 同 核酸 分 子 中 陆续 发 现 为数 众 多 的 修饰 成 分 〈modified component)， 据 不 完全 统计 有 近 八 十 种 。 所 谓 修饰 成 分 就 是 除了 上 述 八 种 主要 成 分 外 ， 存在 于 核酸 中 含量 较 少 或 很 少 的 成 分 ,它们 绝 大 部 分 是 主要 成 分 的 衍生 物 , 有 的 修饰 成 分 的 结构 非常 复杂 , 则 被 叫做 高 度 修 饰 成 分 〈hypermodified component),

核酸 中 的 修饰 成 分 与 主要 成 分 的 连接 方式 完全 相同 ， 即 它们 的 糖苷 键 均 为 8- 构 型 ， 也 都 是 通过 3’, 5 -磷酸 二 酯 键 联 成 核酸 链 。

—. BAAD (WE)

2A BAA RBH Bade EB Ay ERY AR SE TE. ACRE DNA 或 RNA = Beane qe MARR USE. FE DNA PABY Sa Be ame TE Dy A Hee ee A He DR ET 蔡 胸腺 喀 啶 则 构成 RNA 中 两 个 主要 喀 啶 碱 ,它们 的 结构 式 分 别 如 下 :

时 NAAAN SO un’ SN” SN H H = H Wea nS AREA er (6-A 2G) (2-4 £-6- Mi ISH) Oo NH, Oo | | | CHs Fae ee. 3N | HN | HN RN | A yf" ON 7 An/ ANNA H H H Lana 尿 喀 了 喧 fae me Fea FR ee

(2:4- 二 酮 基 喀 啶 )(2- 酮 基 -4- 氮 基 喀 啶 ) «=O- AE Re)

此 外 ,还 发 现 有 几 十 种 修饰 碱 基 ( 常 称 稀 有 碱 基 ), 绝 大 部 分 为 叮 吟 、 喀 啶 化 合 物 ， 但 ARE TREN RBA EE, 一 类 是 7- 去 氮 味 叭 , 另 一 类 是 由 鸟 味 叭 衍生 出 来 的 三 杂 环 母 核 。 所 有 已 发 现 的 修饰 碱 基 的 结构 将 在 “ 核 苷 ”一 节 中 一 并 讨论 (结构 式 见 附录 一 )o

1) 修饰 成 分 以 前 常 被 叫做 补 有 成 分 或 附加 成 分 ,英文 曾 用 名 有 : «minor. unusual, additional, rare, odd com-

ponent 等 。

Bo)? «©

ST Le.

构成 RNA 链 的 成 糖 是 D-H, DNA 链 中 的 戊 糖 是 D-2- 脱 氧 核糖 。 在 某 些 RNA ”中 发 现 有 部 分 D-2-O- 甲 基 核 糖 。 所 有 这 三 种 糖 与 碱 基 连 接 都 是 - 构 型 。

HO O OH HO fe} OH HO O OH ‘ig CoE as aay -一 | | HO OH HO H HO OCH; 6-D- 核 糖 B-D-2- 脱 氧 核糖 8-D-2-O- 甲 基 核糖

在 核酸 中 还 发 现 有 几 个 己 糖 ,如 RNA 中 的 甘露 糖 、 半 乳糖 ，DNA 中 的 葡萄 糖 . 甘 露 糖 等 ,但 这 些 己 糖 并 不 组 成 核酸 的 骨架 ,而 是 与 碱 基 的 侧 链 相 联接 ( 见 核 背 ”一 节 )o

_ & F

由 碱 基 与 核糖 化 合 物 形成 的 CREAM BRN RADAR, 故 核 苷 可 分 为 核糖 核 音 (简称 核 音 )、 脱 氧 核糖 核 背 (简称 脱氧 核 背 ) 和 2 -O- 甲 基 核 背 。 在 核 苷 分 子 中 , 糖 环 上 的 原子 编号 是 1、2、3、4'、 5 ,以 区 别 于 呆 叭 、 喀 啶 环 上 的 1、2、3、4、5、……o 核糖 核 音 主要 有 四 种 : RE. SH. EMRE MARRREER DEH: 脱氧 腺 苷 \ 脱 氧 岛 彰 、 脱 氧 胞 背 和 脱氧 胸 背 ,结构 式 分 别 如 下 :

NH, O | N N 2 ego See H- Pet iy hg eri HO—’* oO Ho— re) 4 ‘a — be HO R HO R R =OH, RE CA) R =OH, %7F (G) R=H, BAAR (da) R=H, BMS (dG) NH, O O i Be ) ne) nt) | 3 | oF S\N oF \nZ oF \nZ HO Oo HO O HO; O Hemet eae pe ol 六 — HO’ UR HO OH HO: "Hi R =OH, IH (C) Rt (U) 脱氧 胸 昔 《〈dT) R=H, BRIE (dc)

FCA TERY EX al] MAY 3p OR A AE AS, 前 者 通过 Ny —Cy 连接 ， 后 者 则 是 六 一 Cy TARE. N-APENREAR EN EAPC LIC RRM INTE RAY N- 糖 苷 键 可 自

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由 转动 , EX LSM BRAK, 反 式 (anti-form) 构象 HWS (syn-form) 更 为 合适 , 在 DNA 双 螺旋 中 碱 基 配 对 也 是 以 反 式 定位 的 。 顺 式 构 象 的 写 出 方式 仅仅 是 习惯 上 的 方便 。

ION LYN ene: Ka hay 7° Pe a ph, ES aac

顺 式 反 式

在 核 苷 中, 杂 环 上 的 毛 基 或 酮 基 可 以 互 变 为 亚 氨基 或 烯 醇 基 , 它 们 在 不 同 pH 条 件 下 的 解 离 态 见 表 1-1。

核酸 中 的 修饰 成 分 大 部 分 是 以 修饰 核 音 产物 被 分 离 鉴定 的 。 修饰 核 音 可 分 为 三 类 : 《1) 由 修饰 碱 基 组 成 的 核 苷 ,(2) 由 2-O- 甲 基 核 糖 组 成 的 核 痛 ,3) 磊 基 与 戊 糖 连接 方式 与 众 不 同 的 核 苷 。 其 中 以 第 1 类 发 现 最 多 ,第 3 类 肯定 结构 的 只 有 假 尿 背 〈 风 及 其 衍生 物 。 据 1982 年 不 完全 统计 ,RNA 修饰 核 苷 共 69 个 ,而 DNA 中 只 有 9 个 。RNA 中 修饰 成 分 绝 大 部 分 是 在 RNA 中 发 现 的 ,而 DNA 中 修饰 成 分 主要 由 鸣 菌 体 DNA 分 离 得 到 。

RNA 中 修饰 核 背 可 区 分 为 修饰 腺 背 ,修饰 岛 萌 、 修 饰 胞 背 、 修 饰 尿 背 和 2-O- 甲 基 核 昔 , 以 下 分 别 进 行 讨论 。

表 1-2 RNA 中 的 修饰 腺 苷

1 RNA 中 分 布 #* REE D* 1- RRR + 2- FRE + N'- 甲 基 腺 苷 m5A 一 N"…，N' -二 甲 基 腺 苷 m$A 一 2-F RE RE ms*A + N*-HARREREY gc5A + N’-FABREREY tc5A 一 N°-FHE-N*- FARRER mtc5A 一 2- FA taé-N‘-FHKABREREY ms*tc*A F N’-=RAEPAERARREREO (Nt) + N®-(A?- 54K 5) - RF icA + 2- FA ite -N°-(A?- 52 hi) - BRE ms7iSA + N*~(llGi- 4-33 RH) = ARE oi*A (Ili st) > N*- (Be - 4-32 HE) - RE oi A 〈 反 式 ) 一 2- 甲 硫 基 -N'*-( 顺 -4- 羟 异 成 烯 )- 腺 苷 mszoi“A (xk) 5 WE CRAKE) + 1- FAME m!1 +

* 结构 式 见 附录 一 ;有 “十 ?号 的 不 是 标准 命名 。 ** 【TI m, sn 分 别 代 表 tRNA, rRNA, mRNA (包括 病毒 RNA) 和 snRNA (细胞 核 小 分 子 RNA),

ea 5 。

修饰 RR F

# 1-2 列 出 RNA PREN+CHRATEDRED HA, BHEPEIRE (A-I 至 A-IV, A-VIII 和 A-XVII), Wet? ARRHRE 〈A-VI 至 A-X)， 侧 链 含 异 成 烯 基 的 细胞 激动 素 类 似 物 (A-XI 至 A-XV)， 有 的 含 硫 (A-V，A-IX，A-XII 和 A-XV)， 也 有 脱 氮 产 物 (A-XVI 和 A-XVII)。 其 中 m'A 在 碱 性 下 可 互 变 为 mA， 酸 性 处 理 则 ERISTRFF IA; tcA、mttcA 和 mi 则 易 为 碱 所 破坏 。

修 饰 & F

虽然 Q 核 苷 和 WY) 核 苷 化 合 物 的 碱 基 母 核 不 是 嘲 吟 环 ， 但 可 以 把 它们 看 作 是 鸟 背 的 衍生 物 ( 见 结构 式 )。 表 1-3 列 出 已 知 的 12 种 修饰 岛 昔 ,主要 为 甲 基 化 鸟 背 〈G-=-I 至 G- VD. 7-fr REUSE (G-IV 至 G-VI) 易 为 碱 打开 咪唑 环 ， 然 后 经 酸 处 理 使 糖 昔 键 断 裂 。 利 用 这 个 性 质 可 以 特异 地 在 m’G 处 切断 tRNA 分 子 , 研 究 其 结构 与 功能 的 关系 。

CH; CH; CH;

\+ | 0 ae | AN 外 | N—eHO | AN-cHO OH- Ht HN \— HN ye HN ace HN’ NN SN H,N’ ‘NZ \nNH HNA SNAANNH， | R R

表 1-3 RNA 中 的 修饰 鸟 苷 *

RNA 中 分 布

SATED 1-H m'G 1958 N?- ef n’G 1958 N’?, N?-— BASF mG 1959 7- 甲 基 鸟 苷 m7G 1963 N’, 7-LF£SF m?’7G 1977

N?, N?,7-=HFESH m3>?*7G 1969 W yosine WCYt) 1971 W yobutosine yYW(Y) 1968

Peroxywyobutosine oyW (Yr, Yw) Q

manQ galQ

Queuosine

Mannosylqueuosine

Galactosylqueuosine

* 注释 见 表 1-2。

1968 年 从 酵母 t RNA * 中 分 离 出 一 种 莉 光 核 苷 Y ,其 后 在 其 他 来 源 上 RNA” 中 也 BLY WAY , 依 其 来 源 分 别称 为 Yt、Yw 和 Yr (小 写字 母 分 别 标明 来 自 圆 酵母 、 小 麦 胚 和 鼠 肝 中 NAP“)， 所 有 这 些 化 合 物 都 含 相同 的 二 甲 基 三 杂 环 部 分 ,学 名 叫 1, NF 丙烯 -3- 甲 基 岛 苷 ,但 Y 和 Yw 带 侧 链 而 Ye 则 无 。 有 人 建议 将 Y 改 为 W，, 它们 的 结构 和 对 应 关系 见 表 1-40 WY) BEAL tRNA™ 的 反 密 码 子 的 3 邻 位 ( 见 第 三 章 为 它们 都 是 酸 碱 不 稳定 化 合 物 , 因 此 可 用 特异 条 件 在 该 修饰 核 背 处 切 开 tRNA” 分 子 。

°* 6 «

1-4 WY) 核 苷 的 命名 和 结构

fs “名 *

=a |

W yosine

| RN N COOocH PN 7 : : H.C | W ybutosine —CH,CH,CH IN | 、NHCcoocH， NZ \N7% \Nn | | COOCH; CH, R Peroxywybutosine|—CH,CHCH i 入 NHCcoocH，

OOH

* 其 碱 基部 分 分 别 叫 Wye, Wybutine 和 Peroxywybutine, QR HE 1968 年 发 现 的 ,但 1975 年 才 确 定 其 结构 , 碱 基 骨架 为 7- 去 氮 鸟 味 叭 ,Cr 通过 毛 甲 基 与 环 戊 烯 二 醇 相 连 ， 有 的 Q 化 合 物 其 侧 链 羟 基 与 糖 连 接 形成 @-D-4+BRT (man Q) 和 @-D--4¥ FLEE (eal Q) 〈 见 表 1-5)。Q 核 苷 对 酸 碱 稳 定 ， 常 出 现在 某 些

tRNA 反 密 码 子 的 摆动 位 置 上 (《 见 第 三 章 )。 #15 Q 核 苷 的 结构

CH,NH

* Queuosine 的 符号 其 碱 基 叫 Queuine

修饰 胞 和 霸 RNA 中 胞 苷 衍生 物种 类 较 少 ,目前 只 发 现 六 种 , 其 取代 侧 链 遍布 于 胞 喀 啶 环 上 各 个 部 位 ( 见 表 1-6)。 miC 〈C-I[D) 和 ac'C 〈(C-IV) 为 碱 不 稳定 化 合 物 ， 前 者 碱 处 理 后 易 失 EAR ID RMF MES ft tf k F EC RUN ECHAEH URGED HARES , 共 廿 五 种 ( 表 1-7)， 其 中 大 部 分 为

. 7 四

表 1-6 RNA 中 的 修饰 胞 苷 *

RNA 中 分 布 aA Tew

2- i ie

3-F ae

N‘*- AE Ha

N‘-C ila

5- FA af * 注释 见 表 1-2,

表 1-7 RNA 中 的 修饰 尿 苷 * RNA 中 分 布 尿 苷 衍生 物 eee 符 号 发 现年 份 t

2-RRRA U-I sz + 1981 3-F RE U-II maU + 1963 3-(-K3t-3-B RE) RE U-III ncp°U(X) ae 1974 4- 硫 代 尿 苷 U-IV s+U + 1965 5-BERE U-v o°U + 1966 5- RAE RE U-vI mo5U 十 1976 5- 羧 甲 氧 基 尿 苷 U-VII cmo*U(V) 3 1971 5- 甲 氧 基 状 基 甲 氧 基 尿 苷 U-VIII memo’U(mV) + 1977 5- 甲 基 尿 苷 ( 胸 苷 ) U-IX m5U(CT) 十 1958 5- 甲 基 -2- 硫 代 尿 苷 U-X mss2U 十 1971 5-2 PERE U-XI om’U + 1968 5-FR FAZER U-XII cm’U ete 1967 5-32 ASE -2- He RE U-XIII cm’s*U + 1973 5-(2-#BR BK) RE U-XIV com?U 了 1979 5— FA A JE Be FRE REF U-XV mem’U + 1970 5 - FA Sa Je He FA JE -2- HRS U-XVI mem’s?U + 1968 5-2, FA i FA 2 RF U-XVII ncm?U at 1972 5- FA a AE -2- Ti RA U-XVIII mnm/’s?U a 1968 5- 羧 甲 基 氮 甲 基 尿 苷 U-XIX cmnm’U + 1978 5-38 FA aa ASE -2- GR RF U-XxX cmnm/’s*U + 1981 5,6-—ARE U-XXI D(hU) + 1965 5-FA3t-5,6-—AeH** U-XXII m’U 1968 BR U-XXIII aa + 1957 1-FS RR U-XXIV m'W + 1982 1- 甲 基 -3-(3- 氮 基 -3- 羧 两 基 )- 假 尿 苷 U-XXV m'ncp’W (am¥) 1974 * 见 表 1-2 注释 。

** 在 染色 体 RNA 中 发 现 。

5- 位 取代 化 合 物 CU-IV 至 U-XX 和 U-XXII)。 侧 链 基 团 有 甲 基 、 羟 基 、 甲 氧 基 、 羟 甲 基 、` 羧 甲 氧 基 及 其 甲 酯 、 羧 甲 基 及 其 甲 酯 和 酯 胺 衍生 物 、 氮 基 酸 、 羟 基 酸 等 , 它们 具有 通常 的 有 机 反应 性 。 有 的 侧 链 含 硫 ( 七 种 ); 有 的 5，6- 加 氨 〈U-XX 和 U-XXIID) ,加 氧 后 共 斩 体系 被 破坏 而 失去 紫外 吸收 特性 ,因而 早期 不 易 为 人 们 所 发 现 , 5，6- 二 氢 尿 苷 (D) 经 碱 处 理 得 到 p- 丙 氨 酸 ，5- 甲 基 -5，6- 二 氧 尿 苷 (m’D) 则 转变 为 6- 氨基 异 丁 酸 ， 故 测定 其

es

i ae 一 | oF \N’ Sa oF \N7 Nu ra | | R R ar, D 8- 丙 氨 酸 T OH Lee A cx, C008 HN OH- HN \y OH” CH-CHs | 一 > | —> oF \N/ oF \N/ Nu, st | | A NH, m’D b-R ETE

产物 可 作为 D 和 msD 的 定量 分 析 。 msU (U-I) 与 mC (C-Il) 相似 ， 易 为 碱 所 破坏 。 ms5U (T) (U-IX) 为 胸腺 喀 啶 核糖 核 昔 即 胸 昔 。 我 们 知道 ,RNA 和 DNA 组 成 中 差异 之 EMSA RG. ASU RES MERBARMTAWR, BRI RNA 中 含 胸腺 喀 啶 ,有 的 DNA 中 存在 尿 旷 啶 ( 见 表 1-9); 特 别 在 tRNA 中 ,由 胸腺 喀 啶 组 成 的 胸 昔 酸 几 乎 已 是 不 可 缺少 的 组 分 。

结构 比较 奇特 的 是 假 尿 苷 〈%，U-XXII) 及 其 衍生 物 (U-XXIV 和 U-XXV)。 这 是 目前 确定 的 糖苷 键 连接 方式 唯一 与 众 不 同 的 核 苷 ， 在 假 尿 苷 中 ， 其 碱 基 为 一 般 的 尿 旷 啶 ;成 糖 亦 是 通常 的 D- 核 糖 。 但 连接 方式 为 C, 一 Cv ,而 不 是 常规 的 N, 一 Cv， 构 成 C 一 C 键 而 不 是 N 一 C 键 ， 因 而 产生 一 系列 奇特 的 物理 和 化 学 性 质 。 假 尿 音 是 尿 昔 的 异 构 体 ，

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2-O- 甲 基 核 昔

RNA 中 含有 少量 的 D-2-O- 甲 基 核 糖 代 替 D- 核 糖 , 由 它们 构成 的 核 昔 称 2-O- 甲 基 AB. # 1-8 列 出 已 发 现 的 2-O- 甲 基 核 苷 , 其 中 有 几 个 为 碱 基 和 核糖 双 取 代 的 化 合 物 。

DNA DFE HR, PRY N - 甲 基 脱 毛 腺 苷 (mdA) 和 5- 甲 基 脱 氧 胞 背 《mdC) 较为 广泛 分 布 外 ,其 余 修 饰 成 分 都 是 在 鸣 菌 体 DNA 中 发 现 的 ( 见 表 1-9)， 其 中 茶 些 修饰 成 分 的 碱 基 进 一 步 被 糖 基 所 取代 ; 故 也 称 作 高 度 修 饰 成 分 。 如 大 肠 杆菌 T2、T4 和 TI6 KR DNA 含有 与 5- 羟 甲 基 胞 喀 啶 中 羟基 相连 的 葡萄 糖 ， 枯 草 杆 菌 SP8 鸣 菌

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HO O | 一 O A WA / iy HO OH HOHO on 5-8-D-RK KE REY) 5-6-D- 吡 喃 核糖 基 尿 喀 啶 O

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ce One HN NH HN NH Ry oS I I Oo oO 5-a-D-RK i x Ba aE PRE 5-x-D- 吡 喃 核糖 基 尿 喀 啶

表 1-8 RNA $9) 2'-O-mae way

2'-O-FEBRE 发 现年 份 2'-O- FARR 2'-O- Age SF

2'-O- Fae

2'-O- FER 2'-O- Fe Kot

2'-O- FERRE

2’-O- FEM

N‘, 2'-O-- HERE

N*，2 -O- 二 甲 基 胞 苷

5- 羧 甲 基 -2 -O- 甲 基 尿 苷 528 FA it AE -2’-O- FAZER

1959 1959 1959 1959 1974 1964 1974 1977 1966 1975 1976

+ + + + 一 +

* 注释 见 表 1-2。

体 DNA 也 含有 葡萄 糖 ， 其 变种 SP8 Ts 则 发 现 有 甘露 糖 ，SP15 噬菌体 DNA 的 脱氧 尿 苷 侧 链 的 4- 羟 基带 三 个 葡萄 糖分 子 。

* 10 «

表 1-9 DNA 中 的 修饰 成 分 *

现年 份 名 称 RF 发 现年 N - 甲 基 脱 氧 腺 昔 Synechococcus 1977 2-ZERARE elongatus 5- FRE i hee 黄 单 孢 杆菌 1968 5- 产 甲 基 脱 氧 胞 苷 ABTA 1953 RARE 枯草 杆菌 1963 5-RRPERARE 枯草 杆菌 1962 5-(4,5-—#RE) RARE 枯草 杆菌 1969 c- 丁 二 胺 脱氧 胸 苷 + 假 单 孢 杆菌 1973 cx- 谷 氨 酸 脱氧 胸 苷 +? 枯草 杆菌 1971

* 结构 式 见 附录 一 《十 ) 表 示 非 标准 命名 。 碱 基 侧 链 连 有 糖 基 的 见 正文 说 明 。

四 、 核 苷 B

核 音 的 磷酸 酯 叫 核 苷 酸 。 核 糖 有 三 个 游离 羟基 ,所 以 核糖 核 苷 酸 有 2-、3'- 和 SRE 酸 三 种 ,脱氧 核糖 只 有 二 个 羟基 可 以 酯 化 ; 故 脱氧 核糖 核 音 酸 只 有 3- 和 3- 核 昔 酸 ,2'-O- 甲 基 核 彰 酸 也 只 有 二 种 。 以 腺 味 叭 核 苷 酸 为 例 :

NH, ES. N pen N Bo Oo oS SN i Kn N O SN A, HO fe) eS co 一 -oo }— Spey i; % HO oO O OH HO OH noe ae pen ‘. i 2 - 腺 苷 酸 3 - 腺 苷 酸 (Ap) 5 - BRET RBC pA) _ rm N N CARD ee Ae Ke most aad — ihe OH HO H 6 之 好 中 3 -脱氧 核 苷 酸 5’ - Pia aR

BROT EHR 3) 磷酸 二 酯 键 连接 而 成 ,因此 在 核酸 链 中 可 以 认为 只 有 3'- 和 5- 两 种 核 昔 酸 ,而 不 存在 2- 核 苷 酸 ( 见 第 1 页 图 )。 但 1978 年 发 现 的 一 类 活性 寡 核 昔 酸 pppA (2’) p(5’) A(2’) p(s’)A 中 腺 背 酸 间 却 是 2 一 5 连接 ( 见 第 九 章 第 六 节 ),RNA

要 是 全 二

被 碱 水 解 经 过 环 化 中 间 物 , 则 可 得 到 2 -与 3- 核 背 酸 混合 物 。

2'-O- 甲 基 核 苷 酸 构成 的 RNA 中 磷酸 二 酯 键 具有 特殊 的 性 质 , 如 不 能 被 碱 或 3- RNase 所 水 解 ( 因 为 不 能 形成 2, 3- 环 化 磷酸 中 间 物 )， 故 可 以 从 RNA 的 碱 解 或 酶 解 产 物 中 分 离 出 各 种 碱 稳定 的 寡 核 苷 酸 。2'-O- 甲 基 核 背 酸 广泛 分 布 于 各 种 RNA 中 ,是 真 核 mRNA 帽子 结构 的 常见 组 分 。

ee eKi> Pa ip,

O OCH; spe of O | “OCH, o-—P=0 o--P-o co- 一?-o re) O : 75 O kK Ray "Ca ro oe ©. OF , OCH; ° OCH; | Oo-— P=O C-— es o-— ?一 o | B O- re) oO = BEER an ps 2 y 广 一 | | Ox O8 ° OCH; | O-— P=O o--?-o ， ns on" BATE Nes >| 全 二 oO OH | ore o- tate ORES

五 、 核 酸 成 分 的 缩写 符号 及 核 苷 酸 在 核酸 链 中 的 表示 方式

由 于 核酸 组 成 分 种 类 繁多 ， 核 背 酸 在 核酸 链 中 的 排列 顺序 及 其 方向 性 对 于 核酸 结构 及 功能 表达 至 关 重 要 ， 因 此 统一 缩写 符号 及 书写 方式 是 非常 必要 的 。 按 照 目前 文献 常用 表示 法 归纳 如 下 :

《1) 因为 在 核酸 结构 中 是 以 核 苷 或 核 苷 酸 符号 表示 的 ， 故 碱 基 符号 使 用 不 多 。 为 了 与 核 苷 符号 相 区 别 ， 碱 基 一 般 采 用 三 字符 号 ， 即 英文 名 称 前 三 个 字母 表示 ， 如 腺 味 吟 (adenine) 4 Ade, fg hRMEWE (thymine) 为 Thyo

(2) BEARS SAR URE. SAME MRADAIA A, G. CMU; 脱氧 核 苷 则 在 单字 符号 前 加 一 小 写字 母 d, 如 dA, dG, dC 和 dT HRRARARA. HAS 苷 、 脱 氧 胞 背 和 脱氧 胸 背 。 对 于 由 修饰 碱 基 组 成 的 修饰 核 苷 ， 除 部 分 有 独自 的 单字 符号 (如 DI, Q. W 等 ) 外 ;其 余 均 在 A、G、C、U 和 dA, dG, dC, dT 的 左面 以 小 写字 母 及 数码 注 明 其 取代 基 团 性 质数 目 和 位 置 ( 见 表 1-2、1-3、1-6、1-7、1-9 及 附录 一 ), 如 mA 标明 腺 昔 的 六 位 有 三 个 甲 基 即 N®, N -二 甲 基 腺 苷 ,m3””G 表示 鸟 背 的 第 二 位 有 三 个 甲

se 12 。

基 ; 第 七 位 有 一 个 甲 基 , 共 三 个 甲 基 , 即 N’, N’, 7-=RRE A; 2'-O- 甲 基 核 背 的 表示 是 在 核 苷 右 方 注 上 小 写字 母 m, 如 Am 代表 2-O- 甲 基 腺 苷 ,m'Ccm 为 N ,2'-O- 二 甲 基 胞 苷 等 ( 见 表 1-8)。

(3) 核 苷 酸 的 表示 方法 是 在 核 苷 符号 的 左 方 小 写字 母 2 表 示 5 -磷酸 酯 ， 右 方 代表 3'- 磷 酸 酯 ;如 pA 为 5- 腺 昔 酸 。Cp 为 3- 胞 背 酸 ， 依 次 类 推 。 核 背 多 磷酸 的 表示 法 是 : ppU 代表 5- 尿 苷 二 磷酸 ，pppA 为 5- 腺 背 三 磷酸 , 即 ATP, ppGpp 表示 鸟 背 四 磷酸 ,其 中 二 个 磷酸 根 在 鸟 背 的 5 位 ， 另 二 个 在 3 位。2- 核 苷 酸 无 专 一 表示 符号 。2' ,3“- 环 化 核 苷 酸 一 般 用 >>P 表示 ,如 USP 代表 2 ,3'- 环 化 尿 苷 酸 ，3', 5- 环 化 核 昔 酸 一 般 书 写 为 cAMP, cGMP 等 。

(4) 书写 一 条 核酸 链 通常 从 5 端 至 3A A RAR HN(5’)pApGpC: - - pUpC(3’), 其 中 的 P 在 核 苷 的 右 方 代表 3 连接 ， 在 左下 方 表 示 5 相连 。 KERR ZA 正好 表示 3' 一 5 连接 。 在 书写 一 条 互补 双 键 核酸 分 子 时 ， 由 于 两 条 链 是 互 为 反 向 的 ,因此 在 末端 写 上 5 和 3 必 不 可 少 , 如 c “ : ; 3’ HT-KENRRE MAVAMADTTBS,

Serr n AG 或 者 连续 转弯 书写 均 可 (如 tRNA 的 三 时 草 结构 ， 见 第 三 章 ), 这 时 只 要 从 5 端 开始 顺 着 核酸 链 往 下 阅读 便 是 。

为 了 简便 ,核酸 链 中 的 P 通常 被 省 略 (末端 的 让 线 , mm (5’) pAGC---UC (3’) 或 (5") pA+G-C--+---U-C (3’) Be (5’)pA-G-C-- -U-C 3"). 若 为 2 一 5 连接 ， 书 写 时 必需 注 明 ( 见 第 九 章 第 六 节 ), 5 一 5 连接 也 需要 标明 ,如 真 核 生物 mRNA 的 帽子 结构 ( 见 第 三 章 )。 以 免 产 生 误 会 。

六 、 核 酸 成 分 的 分 离 鉴定

在 1955 年 出 版 的 E. Chargaff 和 J. N. Davidson 合 编 的 《The Nucleic Acids)( Academic Press, Vol. I) 一 书 中 , 曾 分 章 详细 地 叙述 了 用 离子 交换 柱 层 析 、 纸 层 析 和 纸 电 泳 分 离 核 酸 组 成 分 的 方法 。 对 于 核酸 中 主要 成 分 包括 碱 基 、 核 苷 、 核 苷 酸 及 多 磷酸 衍生 物 的 分 离 ， 许多 后 来 发 展 的 生化 技术 如 气相 层 析 \ 反 相 层 析 \ 薄 层 层 析 和 高 压 波 相 层 析 等 都 能 够 达到 良好 的 效果 。 随 着 修饰 成 分 的 不 断 发 现 ，1971 年 Hall 在 他 的 专著 中 较为 详细 地 介绍 了 当时 已 发 现 的 修饰 核 背 的 分 离 方 法 (文献 [1])。 由 于 核酸 中 修饰 成 分 含量 甚 微 ,从 上 分 之 几 到 万 分 之 几 , 一 般 需 采用 灵敏 的 分 离 鉴 定 技术 ,如 同位 素 标记 技术 。 为 了 分 开 尽 可 能 多 的 核酸 成 分 , 常 采 用 快速 而 微量 的 双向 薄 层 层 析 图 谱 法 。 附 录 二 给 出 几 个 图 谱 ; 并 且 列 出 其 分 离 条 件 ,包括 20 几 种 3- 核 背 酸 的 分 离 , 近 20 种 5 - 核 苷 酸 的 分 离 , 以 及 分 开 16 种 可 能 排列 的 碱 稳定 二 核 苷 酸 中 的 14 种 。 1975 年 提出 一 种 可 以 分 离 近 40 种 修饰 核 苷 的 双 向 薄 层 层 析 法 ,是 目前 分 离 核酸 组 成 效果 最 好 的 一 种 方法 。

鉴定 核酸 成 分 常用 的 方法 是 在 不 同 pH 条 件 下 测定 其 紫外 吸收 光谱 包括 1 ax、 E 有 大 值 、1 县 个 和 一 些 特征 光 吸 收 比值 ,这 些 都 是 鉴定 和 定量 测定 不 同 核酸 组 成 的 重要 数据 〈 见 文献 [2] )。 一般 地 说 ,同一 碱 基 的 核 苷 酸 光 谱 与 其 核 背 差异 不 大 ; 同样 ， 相 同 碱 基 的

1) 有 中 译本 < 核酸 >( 第 一 卷 ), 科 学 出 版 社 , 1963， 译 者 : 黄 德 民 。

2'-O- 甲 基 核 苷 或 脱氧 核 苷 与 其 核 昔 的 光谱 接近 ; 但 是 游离 碱 基 光 谱 与 其 核 背 或 脱氧 核 苷 相 比 则 往往 差异 甚大 。 例 如 PC、Cp、C、dC 和 Cm 光谱 性 质 相 似 , 它 们 与 Cy WA 明显 的 不 同 。

包括 大 部 分 已 发 现 的 修饰 成 分 在 内 的 核酸 组 成 分 的 紫外 吸收 高 峰 的 波长 在 260nm 附 近 。 范 围 常 在 250 一 280nm 之 间 , 低 峰 波 长 为 220 一 240nm 左右 。 乌 叮 叭 、 鸟 苷 及 其 衍生 物 的 光谱 曲线 除了 常见 的 吸收 高 峰 外 ,在 红 向 还 有 一 弯曲 部 分 , 称 作 - 扁 膀 (Shoulder)”。 有 的 修饰 成 分 的 紫外 吸收 光谱 较 特 殊 ; 如 D, s*U, ac'C, ms‘i®A, mnm’-s'U 等 的 紫外 吸收 高 峰 远 离 260nm 《〈 见 文献 [2] )o

附录 三 列 出 以 核 背 为 代表 的 核酸 组 成 分 的 紫外 吸收 性 质 , 以 供 查 阅 。

利用 曹 光 性 质 也 是 鉴定 某 些 核酸 成 分 的 方法 之 一 。 鸟 味 叭 及 其 衍 生物 在 某 些 条 件 下 表示 出 很 高 的 曹 光 强度 。W 核 苷 也 具有 很 强 的 草 光 性 质 。 一 般 喀 喧 化合物 和 腺 味 叭 衍生 物 的 莉 光 强度 甚 低 , 但 某 些 核酸 组 分 可 特异 地 与 莉 光 试剂 结合 产生 曹 光 化 合 物 ， ional 蓝光 法 测定 这 些 成 分 。

要 想 最 后 确定 一 个 未 知 结构 的 成 分 ,最 好 与 标准 样品 进行 比较 ,包括 光谱 性 质 、 层 析 、 电泳 行为 ,以 及 需要 分 析 的 其 他 性 质 如 pK 值 、 降 解 产 物 鉴 定 等 。 如 果 掌 握 一 些 已 有 的 标 准 分 离 技 术 ， 采 用 图 谱 对 照 方 法 也 可 初步 判断 某 些 修饰 成 分 。 对 于 结构 复杂 的 高 度 修 饰 成 分 ,只 有 采用 新 的 物化 技术 鉴定 其 结构 才 成 为 可 能 ,常用 方法 有 质谱 、 核 磁 共 振 光 谱 、 红 外 光谱 等 。

除了 上 述 介绍 的 近 80 种 修饰 成 分 外 ;有 关节 刊 杂 志 还 报道 了 存在 的 其 他 一 些 修饰 成 分 ,但 有 的 证 据 不 足 ; 有 的 已 被 否定 ,有 的 其 结构 和 性 质 有 待 进一步 鉴定 , 故 本 书 未 列 人 。

2 4 xX 献

[1] Hall, R. H. 1971. The modified nucleosides in nucleic acids, Columbia University Press.

{2] Dunn, D. B. and Hall, R. H. 1975, Purines, pyrimidines, nucleosides and nucleotides; Physical constant and spectral properties, in “CRC Hzendbook of biochemistry and molecular biology, 3rd ed, Fasman, G. D. (ed.), Chemical Rubber Co. Press, Cleveland.” 1, 65.

{3] Hall, R. H. and Dunn, D. B. 1975. Natural occurrence of the modified nucleoside, ibid, 1, 216.

[4] Nishimura, $. 1972. Minor component in tRNA: Their characterization, location and function. in “Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., ed. Davidson, J. N. and Cohn, W. E.” 12, 49.

[5] Feloman, M. Ya, 1977, Minor Components in tRNA: The Location-Function Relationship, in Prog. Biophys. Mol. Biol., 32, 83—102, eds. Butter, J. A. V. and Noble, D., Pergamon Press.

[6] Agris, P. F. 1980, The Modified Nucleosides of tRNA: A bibliography of biochemical and bio- physical studies from 1970—1979, N. Y. Liss.

[7] Warren, R. A. J. 1980. Modified bases in bacteriophage DNAs in Azan. Rev. Microbiol. Ann. Rev. Inc. Palo Alto Califonia, 34 137.

es 14 。

第 二 但 DNA # 构

SRR @ AR

DNA 是 十 分 巨大 的 生物 高 分 子 。 它 是 由 四 种 脱氧 核糖 核 苷 酸 通过 磷酸 二 酯 键 聚 合 而 成 的 。 最 小 的 天 然 DNA 分 子 也 包含 了 几 千 碱 基 对 ， 分 子 量 在 10 以 上 。 每 个 人 的 细 胞 染色 体 中 含有 10 碱 基 对 。 表 2-1 列 出 了 若干 生物 中 每 个 细胞 所 含 DNA 的 碱 基 对 数 目 。 从 表 中 所 列 的 数据 可 以 看 出 , 每 个 细胞 中 DNA 碱 基 对 总 数 随 着 生物 进化 水 平 的 上 升 而 相应 增加 。 但 是 也 存在 一 些 例外 的 情况 ， 例 如 南美 肺 鱼 的 DNA 大 小 约 为 10.2 x 10" 碱 基 对 ,当然 我 们 并 不 认为 肺 鱼 的 进化 水 平 比 人 类 的 水 平 更 高 。 在 植物 和 两 栖 类 动物 中 还 有 一 些 例外 。

表 2-1 DNA 分 子 和 基因 组 的 大 小

碱 基 ( 对 7 数目

SRE (mm)

SERS 5.1 10° 0.0017 环 状 SV40 5226 0.0018 环 状 M13 6407 0.0019 环 状 fd 6408 0.0019 环 状 P4 1.5X10¢ 0.0051 线 状 17 3 5X304 0.012 线 状 a 48502 0.016 线 状 WE25T4A T6 1.8X10 0.061 线 状 $B: KK 0.26 环 状 大 肠 杆菌 1.36 环 状 真 核 生物 ( 单 倍 体 ): 酵母 1.35X10’ 4.6 NAF 7 对 染色 体 中 果 蝇 1.65X10° 56 分 布 于 4 对 染色 体 中 XK 2.910? 990 分 布 于 23 对 染色 体 中 南美 肺 鱼 1.0210" 34,700 分 布 于 19 对 染色 体 中

DNA 分 子 能 以 线 状 或 环 状 的 形式 存在 。 绝 大 多 数 DNA 分 子 是 由 两 条 碱 基 互 补 的 单 链 构成 的 ,只 有 少数 几 种 DNA 是 单 链 的 ,如 6X174,M13 等 。

线 状 双 链 DNA. 的 末端 可 能 是 齐 头 的 ， 也 可 能 带 有 单 链 粘性 末端 ,也 可 能 是 粘性 末 端 补 满 以 后 形成 5 ，3 末端 重复 顺序 ,也 可 能 具有 特殊 的 “ 转 排 ? 结 构 。 它 们 之 间 的 相互 关 系 可 以 通过 图 2-1 的 例子 联系 起 来 。

DNA 分 子 主要 由 四 种 碱 基 组 成 , 即 腺 味 叭 \ 鸟 嘎 叭 . 胞 喀 啶 和 胸腺 旷 啶 , 修饰 碱 基 含 量 很 低 。 真 核 生 物 DNA 中 有 少量 5- 甲 基 胞 喀 啶 和 6- 甲 基 腺 味 哈 ， 大 肠 杆菌 DNA 中 也 含有 一 些 甲 基 化 碱 基 。 某 些 叹 菌 体 中 存在 大 量 修饰 碱 基 ( 人 参见 第 一 章 )。

asco 48 CO aocd od

双 链 线 状 AB 〈 转 排 结构 ) sorneoratee ce nsre

bcd abe

Semmes seems ca abc

2-1 细菌、 病毒 和 细胞 器 DNA 分 子 的 不 同 结构 形式 图 中 3 为 了 5 为 了

以 上 是 有 关 DNA 分 子 的 一 些 概 况 ， 以 下 就 DNA 的 一 级 结构 。 DNA 顺序 组 织 ， DNA 的 二 级 和 三 级 结构 分 别 讨论 。

一 、DNA 的 一 级 结构

DNA 是 双 螺 旋 的 大 分 子 。 生 物 信 息 绝 大 部 分 都 贮存 在 DNA OTH, 这 些 信 息 以 核 昔 酸 不 同 的 排列 顺序 编码 在 DNA 分 子 上 , 核 苷 酸 排列 顺序 变 了 , 它 的 生物 学 含义 也 就 Ald Jo DNA 的 一 级 结构 就 是 指 核 苷 酸 在 DNA 分 子 中 的 排列 顺序 。 因此 测定 DNA 的 碱 基 排列 顺序 是 分 子 生物 学 的 基本 课题 之 一 。 我 们 首先 了 解 一 下 怎样 测定 DNA 的 一 级 结构 ,其 次 将 讨论 某 些 特定 的 序列 有 些 什 么 生物 意义 。

尽管 测定 DNA 顺序 是 一 个 十 分 重要 的 课题 ,然而 在 不 久 以 前 它 还 是 一 个 令 大 望 而 ARAN. DNA 顺序 测定 工作 大 大 迟 于 蛋白 质 的 顺序 测定 ， 也 晚 于 RNA 的 顺序 测 定 。 用 于 和 蛋白质 或 RNA 的 顺序 测定 的 战略 都 是 建立 在 小 片段 重 伙 的 原理 止 。 也 就 是 把 待 测 分 子 用 专 一 性 的 水 解 酶 水 解 成 很 小 的 片段 ,测定 每 个 小 片 妈 的 顺序 , 找 出 能 把 这 些小 片段 连 起 来 的 重 登 片 疏 ， 然 后 推断 整个 分 子 的 顺序 。 但 是 这 个 战略 不 完全 适用 于 DNA 顺序 测定 。 存 在 的 问题 首先 在 于 没有 相应 的 碱 基 专 一 的 脱氧 核糖 核酸 酶 ,因此 要 获得 稳定 的 小 片 眉 十 分 困难 ;其 次 ，DNA 分 子 量 一 般 都 很 大 , 获得 重合 片段 的 困难 将 随 着 分 子 量 的 增加 而 增加 。 由 于 这 些 固有 的 困难 使 得 DNA 顺序 测定 工作 长 期 以 来 进展 不 大 。 很 明 显 ， 测 定 DNA 顺序 的 战略 如 果 仍 建立 在 小 片段 重 倒 的 原理 上 ， 那么 即使 发 现 了 对 碱 基 专 一 的 脱氧 核糖 核酸 酶 ,测定 DNA 顺序 所 面临 的 困难 比 RNA 或 蛋白 质 BAKES. @ 来 ，DNA 顺序 测定 工作 要 有 所 进展 ， 必 须 罕 破 原 有 的 顺序 测定 的 战略 。 七 十 年 代 后 期 这 个 难关 已 经 克服 ,主要 是 从 两 个 方面 进行 的 : 首先 是 限制 性 内 切 酶 的 发 现 和 广泛 应 用 ， 现在 很 容易 完成 含有 几 和 于 个 以 上 的 核 背 酸 大 片段 的 重 倒 ; 其 次 是 建立 了 一 种 在 凝 胶 电泳

. 16 .

Ce Oe > ers.

板 上 直接 而 快速 地 测定 DNA 顺序 的 方法 。 在 这 种 新 方法 中 , 碱 基 顺 序 的 测定 不 是 建立 在 小 片 假 重 登 的 原则 上 。

在 较为 详细 地 讨论 这 些 突破 之 前 , 先 简单 地 回顾 一 下 在 此 以 前 探索 DNA 顺序 测定 的 方法 ,这 不 仅仅 是 一 个 历史 的 回顾 ,其 中 有 些 技术 目前 也 还 有 一 定 的 用 途 。

简单 的 回顾

七 十 年 代 初 ，DNA 顺序 测定 还 处 在 探索 时 期 。 人 们 从 各 个 角度 摸索 测定 DNA I 序 的 方法 。 当 时 人 们 的 思路 还 没有 跳出 小 片段 重合 的 框框 ,因此 所 发 展 起 来 的 DNA Ii 序 测定 方法 工作 量 都 比较 大 ,而 且 缺 乏 通用 性 ,只 能 适用 在 一 些 特定 的 例子 中 。

例如 RNA 顺序 测定 方法 建立 以 后 ,人 们 就 想 先 把 DNA 转录 成 RNA, 测 定 了 RNA 顺序 以 后 ,应 用 互补 原理 来 推测 DNA 的 顺序 。 比较 成 功 的 例子 是 大 肠 杆菌 的 乳糖 操纵 子 调控 基因 这 一 段 DNA 顺序 的 测定 。 但 是 在 多 数 条 件 下 转录 的 起 始点 和 终止 点 是 不 专 一 的 ,因此 产生 的 RNA 是 不 均一 的 ,有 时 比 模板 还 要 长 , 一 般 DNA 的 二 条 链 都 转录 出 来 。 如 果 能 获得 一 段 与 待 测 DNA 互补 的 引物 ,转录 产物 就 比较 均一 。 但 在 很 多 情况 下 ， 选择 合适 的 引物 是 很 困难 的 ,这 些 都 是 使 用 转录 方法 测定 DNA 顺序 的 重要 障碍 。

用 一 种 核糖 核 苷 酸 取代 DNA 中 的 脱氧 核糖 核 苷 酸 ， 从 而 可 以 获得 在 特定 的 碱 基 位 置 专 一 地 降解 的 片段 ,这 在 当时 是 一 个 很 诱 人 的 设想 。 例如 用 DNA 聚合 酶 在 试管 中 复 制 待 测 DNA， 反 应 中 所 必须 的 四 种 核 昔 三 磷酸 底 物 ， 其 中 三 种 仍然 是 用 脱氧 核糖 核 彰 三 磷酸 ,一 种 如 用 核糖 岛 音 三 磷酸 代替 ,在 这 样 的 条 件 下 合成 的 DNA 在 鸟 味 叭 的 位 置 都 是 核糖 核酸 键 , 而 核糖 核酸 键 可 以 用 碱 或 核糖 核酸 酶 CRNase) 降解 ， 用 这 种 方法 可 以 达 到 碱 基 专 一 性 水 解 的 目的 。 但 是 在 这 种 条 件 下 ,复制 是 否 真实 ， 还 是 一 个 有 争论 的 问题 ， 而 且 在 这 个 方法 中 需要 特定 的 引物 ,因此 现在 已 没有 人 用 这 种 方法 测定 一 个 较 长 的 DNA 片段 的 顺序 了 。

ARABKAARIT TED 20 个 核 昔 酸 以 下 的 DNA 片段 具有 特殊 的 优点 。 一 个 亮 核 音 酸 片 段 ,其 5 末端 (或 3 末端) 用 放射 性 同位 素 标 记 以 后 ,用 外 切 酶 逐个 切 去 非 标 记 未 端的 核 音 酸 , 这 样 就 得 到 5 末端 都 是 带 标记 的 , 片 眉 长 度 只 差 一 个 核 昔 酸 的 寡 核 背 酸

- 混合物。 将 这 组 寡 核 背 酸 混合 物 先 进行 电泳 ;各 个 片段 基本 上 按 电 荷 大 小 分 离 ,然后 进行

同系 层 析 ,使 其 按 不 同 链 长 分 离 。 当 一 个 寡 核 苷 酸 末端 钞 加 一 个 新 的 核 苷 酸 时 ,会 影响 袁 核 音 酸 的 电泳 迁移 率 , 影 响 的 程度 由 落 加 上 去 的 核 苷 酸性 质 所 决定 ,因此 可 以 根据 迁移 率 的 变化 逐个 推断 出 加 上 去 的 是 哪 一 种 核 昔 酸 。 只 是 迁移 率 还 受到 其 他 一 些 因素 的 影响 ， 这 会 给 判读 带 来 困难 。 但 是 由 于 它 的 简便 性 ,这 个 方法 在 某 些 情况 下 还 是 有 用 的 ,例如 用 于 测定 限制 性 内 切 酶 的 识别 顺序。 这 个 方法 也 能 用 于 RNA NA RWIDF DAT.

用 二 苯胺 和 甲酸 处 理 ， DNA 分 子 中 含 厢 了 叭 的 糖苷 键 都 断裂 ， 而 含 喀 喧 的 键 不 受 影 响 ， 这 样 得 到 喀 啶 连 在 一 起 的 寡 核 苷 酸 称 为 喀 啶 堆 或 喀 啶 群 。 用 双向 电泳 同系 层 析 可 以 测定 旷 啶 堆 的 组 成 ,借助 一 些 酶 的 帮助 还 可 以 推断 旷 啶 玲 的 顺序 。 这 个 方法 因 其 简便 ,也 可 以 用 来 验证 用 其 他 方法 测定 的 顺序 的 可 靠 性 。 某 些 顺序 特别 简单 的 DNA， 例 如 豚鼠 卫星 DNA 顺序 就 是 用 这 个 方法 测定 的 。

测定 噬菌体 1DNA 粘性 末端 顺序 的 工作 可 以 认为 是 成 功 地 测定 DNA 顺序 的 第 一 TOF. ETE 1971 年 前 后 利用 粘性 未 端 本 身 作为 模板 引物 体系 ,用 DNA 聚合 酶 把 不

yy .

MASH hIicCKHRSASMAK DNA 链 内 ， 分 析 新 合成 的 链 中 标记 核 背 酸 的 种 类 和 数量 可 以 推断 原来 粘性 未 端的 顺序 ,用 这 个 方法 测定 DNA 顺序 的 工作 量 是 十 分 浩大 的 。 1 DNA 粘性 未 端 只 有 十 二 个 核 昔 酸 ,而 用 这 个 方法 测定 它 的 顺序 却 化 费 一 ` 二 年 之 久 ,天 此 这 个 方法 无 法 推广 。 但 是 利用 DNA 聚合 酶 在 模板 引物 体系 上 进行 有 限 的 合成 ,这 对 以 后 发 展 起 来 的 “加 减法 "测定 顺序 的 方法 是 有 启发 的 。

在 这 段 时 期 也 有 人 探索 直接 测定 DNA 顺序 的 方法 ,但 是 由 于 沿用 测定 RNA 顺序 - 的 老路 ， 而 又 没有 类 似 核 糖 核酸 酶 的 有 碱 基 专 一 性 的 脱氧 核糖 核酸 酶 ， 困 难 就 显得 更 加 : 罕 出 。 1974 年 完成 含 四 、 五 十 个 核 苷 酸 的 $X174 DNA RAM METER TRARY 力量 , 按 这 样 的 效率 去 完成 含有 五 千 多 个 核 音 酸 的 整个 %X174 DNA 的 顺序 是 寺 分 困难 : 的 。

总 之 ,在 这 一 段 探 索 时 期 ,人 们 只 能 对 一 段 为 数 不 大 的 特定 DNA FEAR EMA 测定 其 顺序 ， 方 法 上 普遍 性 不 足 ， 而 工作 量 却 很 大 。DNA 顺序 测定 的 突破 是 从 1975 年 - Sanger 发 展 的 "加 减法 ?而 开始 的 。 在 讨论 这 个 方法 之 前 , 还 应 该 先 介绍 一 下 限制 性 内 切 : hea] DNA 的 物理 图 谱 。

限制 性 内 切 酶

微生物 中 的 修饰 和 限制 现象 是 五 十 年 代 初 发 现 的 ， 这 是 细菌 自 卫 的 一 种 方式 。 例 如 从 大 肠 杆 菌 玉 株 繁殖 出 来 的 噬菌体 ACK) 只 能 感染 大 肠 杆 菌 K 株 ， 不 能 感染 大 肠 杆 菌 B 株 ,反之 亦 然 。 这 个 现象 称 为 “限制 ” 现象 。 然 而 被 某 菌株 限制 的 噬菌体 群体 中 也 会 有 极 . 少 个 体 幸存 下 来 ,幸存 者 的 子 代 可 以 在 原来 受 限 制 的 菌株 中 正常 繁殖 ， 这 个 现象 称 为 “ 修 饰 >。 修 饰 和 限制 的 性 质 都 是 由 宿主 的 基因 所 决定 的 , 同 噬菌体 的 基因 无 关 。

Arber 和 他 的 合作 者 对 这 个 现象 作 了 深入 研究 ,并 从 生物 化 学 角度 提出 一 种 假设 。 他 . 认为 细菌 内 有 两 种 不 同 功能 的 酶 , 一 种 是 核酸 内 切 酶 ， 它 能 识别 并 切 开 DNA 分 子 上 一 个 特定 的 碱 基 序列 ,这 就 是 限制 性 内 切 酶 ; 另 一 种 酶 是 甲 基 化 酶 ， 它 能 识别 限制 任 内 切 酶 所 识别 的 碱 基 顺 序 ,并 把 其 中 某 些 碱 基 甲 基 化 ,这 是 修饰 梅 。 被 修饰 酶 甲 基 化 了 的 _DNA 就 不 能 被 限制 性 内 切 酶 降解 了 。 细 菌 的 DNA 总 是 被 自身 的 修饰 酶 修饰 好 了 ， 因 此 不 会 被 自身 的 限制 酶 所 降解 。 异 源 的 DNA 由 于 没有 被 修饰 过 , 它 一 旦 侵入 细菌 就 会 被 限制 酶 降解 ,因此 这 个 系统 可 以 保护 细菌 免 受 外 来 DNA 的 人 侵 。

六 十 年 代 未 已 分 别 从 大 肠 杆 菌 K 株 和 了 株 分 离 到 限制 性 内 切 酶 。 这 些 酶 具有 Arber 所 预言 的 若干 特性 ,如 它 能 降解 同 限制 性 内 切 酶 不 同 源 的 DNA ,而 不 降解 同 源 的 DNA。 这 个 酶 在 DNA 分 子 上 仅 切 开 为 数 不 多 的 几 个 切口 。 可 惜 这 两 个 限制 性 酶 都 不 能 在 DNA 分 子 上 产生 专 一 性 的 切口 。

重大 的 进展 是 在 1970 年 。Smith 及 其 同事 在 流感 噬 血 杆菌 d 株 中 分 离 到 一 个 限制 性 内 切 酶 , 并 且 发 现 这 个 酶 可 以 在 下 列 顺序 中 箭头 所 指 的 位 置 切 开 , 这 个 酶 现在 称 为 Hind I。 此 处 Py 和 Pu SRC EM,

显然 ， 限 制 性 内 切 酶 的 这 种 性 质 是 一 种 十 分 奇异 的 特性 。 人 们 也 立即 认识 到 这 种 性

昌吉 |-

Inet DNA 结构 和 功能 的 研究 将 会 带 来 巨大 的 好 处 。 WD See BR il Me Ie 限制 性 内 切 酶 应 用 于 DNA 研究 的 工作 广泛 地 开展 起 来 。

限制 性 内 切 酶 的 命名 是 用 Nathans 等 人 所 提议 的 方案 。 限 制 性 内 切 酶 名 称 的 第 一 个 字母 取 自 获得 此 内 切 酶 的 细菌 的 属 名 的 第 一 个 字母 ,用 大 写 ,名称 的 第 二 、 三 个 字母 取 自 该 细菌 种 名 的 头 二 个 字母 ,用 小 写 。 如 果 该 细菌 还 有 不 同 的 株 系 , 则 另 加 第 四 个 代表 株 系 的 字母 或 数字 ,最 后 是 用 罗马 字 大 写 的 数字 、 代 表 同 一 菌株 中 不 同 限制 性 内 切 酶 的 编号 。 如 Hind II 代表 从 流感 噬 血 杆菌 d 株 (haemophilus influenzae) 中 分 离 到 的 第 三 种 内 切 酶 。

到 1982 年 为 止 已 分 离 到 的 限制 性 内 切 酶 有 400 HOE MARA) ,主要 是 从 细菌 和 霉菌 中 得 到 的 。 现 在 也 有 人 报告 可 以 从 核 原 体 和 真 核 细 胞 中 分 离 到 限制 性 内 切 酶 。 已 搞 清 识别 顺序 的 限制 性 酶 约 300 种 以 上 ， 但 其 中 很 多 具有 相同 的 识别 顺序 。 具 有 相同 的 识 别 顺序 而 来 自 不 同 菌 种 的 限制 性 内 切 酶 称 为 同 工 异 源 酶 。 按 识别 顺序 分 类 总 共 约 有 五 十 多 种 识别 顺序 。 很 明显 作为 工具 酶 ,不 同 专 一 性 的 限制 性 内 切 酶 越 多 ,对 DNA 结构 功能 的 研究 的 帮助 也 越 大 。

用 作 工 具 酶 的 限制 性 内 切 酶 属于 所 谓 第 二 类 限制 性 内 切 酶 ， 它 们 共同 的 特点 是 在 DNA 分 子 上 产生 的 切口 的 位 置 是 专 一 的 。 此 外 ,这 类 内 切 酶 的 分 子 量 一 般 不 大 , 通常 小 于 100,000。 镁 离子 是 唯一 必需 的 辅 因 子 。 限 制 性 内 切 酶 的 识别 顺序 通常 只 有 4 一 6 个 碱 基 对 。 一 个 分 子 量 不 太 大 的 DNA 中 所 包含 的 内 切 酶 识别 点 是 有 限 的 ,因此 酶 切 后 产生 的 片段 的 大 小 和 数目 都 是 固定 的 。 这 些 片段 用 凝 胶 电 泳 分 离 后 的 电泳 图 谱 对 每 一 种 酶 而 言 是 具有 特征 性 的 ,这 是 目前 最 常用 的 鉴定 内 切 酶 的 种 类 和 活力 的 基本 方法 。

从 附录 四 中 所 列 出 的 限制 性 内 切 酶 的 识别 顺序 可 以 看 出 多 数 酶 的 识别 顺序 是 很 严格 的 ,少数 酶 的 识别 顺序 有 一 定 的 变动 余地 。 如 前 面 所 提 到 的 Hind II,， 它 的 识别 顺序 中 5 端 第 三 个 碱 基 可 以 是 C 或 工 第 四 个 碱 基 可 以 是 A 或 G。 大 多 数 识别 顺序 具有 二 次 旋转 对 称 性 ,就 是 说 以 对 称 中 心 为 轴 。 把 这 个 序列 转动 180", 仍然 得 到 原来 的 序列 。

从 附录 四 还 可 以 看 出 , 限制 性 内 切 酶 在 DNA 双 链 分 子 上 的 切 点 绝 大 多 数位 于 识别 顺序 上 ,只 有 少数 酶 的 切 点 在 识别 顺序 之 外 ， 而 且 它 们 的 识别 顺序 都 不 具有 旋转 对 称 性 。 如 了 ga I 的 识别 顺序 是 GACGC， 而 切 点 在 这 个 识别 顺序 之 后 5 一 10 个 碱 基 。

DNA 分 子 被 限制 性 内 切 酶 切 开 之 后 , 它 的 片 眉 可 能 有 三 种 形式 : 一 种 是 DNA 片 段 的 未 端 是 平 齐 的 ,一 种 是 带 有 5 粘性 末端, 一 种 是 带 有 3 粘性 末端 。

如 Hae III 的 切口 是 : 5 GGCC 3 MPN EK MALAY 5’ CC……GG 3’

nu ee oy 3”GG……: GCC 9 Y EcoRI 的 识别 点 是 : 5’ GAATTC 3’ 产物 带子 -粘性 未 端 BS MATT Conese G 3" sf a ag Ph S Greeeee CA 5S . 一 , Y 着 Pst 的 识别 顺序 是 ， 5”CTGCAG 3” 切 下 片段 带 有 3- 粘性 未 端 “5 G……， CTGCA 3’

3 ah 2, 3 ACGTC::+-G 5’

正 因 为 有 了 限制 性 内 切 酶 ,分 子 量 很 大 的 DNA 才 有 可 能 切 成 一 定 大 小 的 片 朋 ,只 有 FAKE Re /\ AO EE, DNA 顺序 测定 才 成 为 可 能 。 一 个 DNA 分 子 用 限制 酶 酶 解 后 得 到 ， 很 多 片段 ,那么 这 些 片 段 在 DNA 分 子 中 原来 的 排列 次 序 如 何 ? 这 就 是 下 一 节 物 理 图 谱 要 解决 的 问题 。

物 理 图 谱

物理 图 谱 就 是 DNA 分 子 的 限制 性 内 切 酶 酶 解 片段 的 排列 顺序 。 物理 图 谱 可 以 用 多 种 方法 来 测定 ， 其 中 以 部 分 酶 解 方 法 和 两 种 不 同 专 一 性 限制 酶 交叉 酶 解 方法 最 为 简便 和 常用 。 部 分 酶 解 方 法 是 其 他 各 种 测定 物理 图 谱 方法 的 基础 。

测定 物理 图 谱 的 第 一 步 是 测定 DNA 完全 酶 解 片段 的 数目 和 每 个 片段 的 分 子 量 。 选 择 合适 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 或 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 作为 载体 进行 电泳 ， 通 常 能 把 绝 大 多 数 酶 解 FEED FP. OSH BRO AEM ORO PB AT, DO ES SEAN REE PHA PS fi DNA 分 子 量 的 对 数 成 反比 。 如 果 DNA 片段 是 放射 性 2P 全 奈 记 的 ,那么 就 可 以 从 每 个 片 侦 的 放射 性 占 整 个 分 子 的 放射 性 量 的 百分比 推算 出 分 子 量 。 用 电子 显微镜 方法 可 以 测定 每 个 DNA 片 眉 的 长 度 , 从 而 计算 出 分 子 量 , 但 没有 电泳 方法 方便 。

测定 了 完全 酶 解 片段 的 数目 和 分 子 量 之 后 ， 接 着 把 DNA 用 限制 性 内 切 酶 进行 部 分 敌 解 ， 测 定 每 个 部 分 酶 解 片段 的 分 子 量 。 从 部 分 酶 解 片段 的 分 子 量 就 可 以 直接 推测 哪 几 个 完全 酶 解 片段 是 相 邻 的 。 例如 有 一 个 由 X174 (SHR) Hind Il HRB, HOEK 小 是 1030 FREER (bp), 这 个 片 外 用 Alu I 可 以 切 成 A，B，C，D 四 个 片段 ,分 子 大 小 分 别 是 750bp。150bp，80bp 和 50bp。 为 了 测定 这 四 个 片 外 的 排列 顺序 ， 可 以 用 Alu I 部 分 酶 解 ， 在 部 分 酶 解 片段 中 得 到 分 子 大 小 分 别 为 810bp，230bp 130bp SSH Bo 从 这 些 数据 立即 可 以 推断 Alu I 酶 解 的 四 个 片段 的 排列 次 序 为 150-80-50-750( 见 图 2-2)o 当 然 也 可 以 把 每 个 酶 解 片段 从 凝 胶 上 洗 下 用 同样 的 酶 完全 酶 解 ， 这 样 得 到 的 酶 解 片 眉 应 是 相 邻 的 片段。

Brule arava ih A tue]

230 :

六 180 一 | 一 一 一 一 一 一 610

图 2-2， 用 部 分 酶 解 方法 测定 物理 图 谱

用 两 种 限制 性 内 切 酶 交叉 酶 解 也 是 测定 物理 图 谱 常用 的 方法 。 当 由 于 某 种 原因 ， 例 如 高 级 结构 的 影响 某 些 部 分 酶 解 片段 产 率 特别 低 和 对 ， 这 就 需要 第 二 种 酶 来 帮忙 。 交 又 酶 解 不 仅 可 以 得 到 两 种 或 多 种 限制 性 内 切 酶 的 物理 图 谱 , 而 且 可 以 相互 校对 ,使 结果 更 加 可 靠 。 一 般 先 建立 产生 片段 比较 少 的 限制 性 和 内 切 酶 的 物理 图 谱 ， 然 后 在 这 个 基础 上 去 建立 产生 片段 比较 多 的 限制 性 内 切 酶 的 物理 区 谱 。

如 前 所 述 ,部 分 得 解 的 方法 是 建立 物理 图 谱 的 基本 手段 ,但 是 部 分 酶 解 片段 的 数目 大 大 多 于 完全 栈 解 片 人 段 的 数目 ,这 给 分 离 带 来 很 多 困难 。 现 在 有 一 种 改进 的 部 分 酶 解 方法 ， 先 把 DNA 分 子 的 一 端 用 放射 狂 同 位 素 标 记 ， 部 分 酶 解 后 电泳 分 离 ， 那 末 只 有 带 同位 素

ea 20 。

的 片段 出 现在 放射 自 显影 图 上 RA BS TS HS Bo FAB AY Bh 基 对 数目 之 差 就 是 两 个 相 邻 点 之 间 这 段 DNA 片段 的 大 小 。 例如 某 个 组 蛋 昌 基 因 片 段 共 5900 bp， 末 端 标记 之 后 ,用 Hpa I 部 分 酶 解 后 得 五 个 片段 ,其 分 子 大 小 分 别 是 5900bp， 4210 bp，3260bp，2950bp，1020bp， 显 然 , 最 大 的 部 分 酶 解 片段 和 其 次 一 个 片段 核 背 酸 数 之 差 是 最 靠 右边 的 片段 的 分 子 大 小 ,其 余 以 此 类 推 , 就 可 以 推 得 全 酶 解 五 个 片段 的 排 死 次 序 是 : 1020-1930-310-930-1690 (ILA 2-3),

4210bp 3260bp 930-—

A 2-3 用 末端 标记 法 测定 物理 图 谱

测定 物理 图 谱 的 方法 还 有 很 多 ,如 引物 脉冲 标记 法 、 双 向 杂交 法 ,电子 显微镜 法 ` 基因 互补 法 ` 基 因 删 除 突 变 株 和 野生 株 比 较 的 方法 、 外 切 酶 逐步 酶 解法 等 ,这 里 不 一 一 详 述 耳 。 测定 了 某 一 DNA 分 子 的 物理 图 谱 之 后 ， 就 可 以 着 手 测定 每 一 片段 的 核 背 酸 排 列 顺 诺 Te

测定 DNA 顺序 的 方法

前 面 已 经 讨论 过 ,用 于 RNA 或 蛋白 质 顺序 测定 的 基本 战略 是 小 片段 的 重 谷 。 而 这 种 战略 用 于 DNA 顺序 测定 困难 就 很 大 ,几乎 是 行 不 通 的 。1975 年 Sanger 突破 了 这 个 框框 ,提出 了 一 种 新 的 战略 , 他 不 是 直接 测定 DNA 片段 中 碱 基 的 组 成 和 顺序 ,而 是 以 测 定 片 眉 的 分 子 长 度 来 推测 碱 基 的 顺序 ， 用 不 同 的 处 理 方法 来 决定 碱 基 的 性 质 。 其 后 发 展 起 来 的 各 种 DNA 顺序 测定 的 新 方法 都 是 以 这 个 原理 为 基础 的 。 近来 这 个 原理 也 用 到 RNA 顺序 测定 中 ,发 展 了 很 多 新 的 RNA 顺序 测定 的 新 方法 ( 见 第 三 章 )。 因 此 这 个 原理 的 提出 在 核酸 的 顺序 测定 中 是 有 划时代 意义 的 。

这 个 方法 的 原理 并 不 复杂 。 假 定 有 一 个 DNA FE, GH 5 末端 用 放射 性 同位 素 标 记 好 了 ,这 是 片段 长 度 的 参考 位 置 。 又 假定 这 个 DNA 片 明 中 有 二 个 腺 叮 哈 ， 以 5 未 端 为 起 点 ,一 个 在 第 六 位 ;一 个 在 第 十 位 。 如 果 我 们 设计 一 种 方法 ， 能 使 与 腺 嘎 吟 相 邻 的 磷 酸 二 酯 键 断 开 ,而 与 其 他 碱 基 相 邻 的 链 不 受 影 响 , 那么 将 可 以 得 到 二 个 片段 , 一 个 是 六 核 苷 酸 , 另 一 个 是 十 核 苷 酸 , 这 二 个 片段 可 以 用 电泳 方法 分 开 , 并 决定 它们 的 长 度 。 反 过 来 ， 如 果 测 得 片段 的 长 度 ,我 们 可 以 推测 ,以 5 末端 为 参考 位 置 ， 第 六 位 和 第 十 位 由 腺 味 叭 占 据 着 ,其 他 三 种 碱 基 的 位 置 可 以 用 类 似 的 方法 推测 。 显 而 易 见 ,这 个 新 方法 能 否 成 功 取决 于 两 点 ,首先 是 要 有 一 种 方法 能 把 仅仅 相差 一 个 核 苷 酸 的 同系 核 苷 酸 片段 都 分 开 ,这 一 点 现在 是 办 得 到 的 ， 例 如 在 40 厘米 长 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 就 可 以 把 100 一 200 RFR 都 分 开 , 分 辩 率 达到 一 个 核 苷 酸 的 水 平 其 次 要 有 一 种 手段 能 制备 四 种 末端 碱 基 专 一 的 片 Bro 1975 年 Sanger 设计 的 “加 减法 ”首先 满足 了 这 个 要 求 。 从 此 以 后 发 展 了 很 多 制备 片 BR, RAH MA DNA (或 RNA) 顺序 测定 方法 ,其 原理 都 是 如 此 ， 不 同 的 方 法 区 别 就 在 于 制备 片段 的 方法 不 同 。 按 制 备 片段 的 方法 不 同 可 以 把 这 些 方法 分 成 两 大

sa 2 «

28: 一 类 是 用 DNA 聚合 酶 ,简称 酶 法 ; 另 一 类 是 用 化 学 降解 ,简称 化 学 法 。 酶 法 ”从 链 长 决定 碱 基 位 置 的 新 的 顺序 测定 方法 首先 是 由 Sanger 于 1975 年 设计 的 加 减法 "实现 的 。 以 单 链 DNA 为 模板 ， 加 一 个 合适 的 引物 〈 一 般 用 限制 性 内 切 酶 的 酶 解 片段 ), 再 加 入 四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 〈(dNTP)， 其 中 一 种 是 同位 素 标 记 的 。DNA 聚合 酶 就 从 引物 开始 合成 一 条 与 模板 互补 的 DNA 链 。 对 于 DNA 顺序 分 析 最 理想 的 情况 是 ,使 合成 反应 进行 的 程度 尽 可 能 是 随机 的 ,就 是 使 合成 产物 中 各 种 长 度 的 片段 都 存 在 。 然 后 从 反应 混合 物 中 除去 四 种 dNTP， 反 应 产物 分 成 二 部 分 ,一 部 分 用 在 加 法 系统 ， 一 部 分 用 在 减法 系统 。 用 于 加 法 系统 的 产物 再 分 成 四 小 分 ,每 一 小 分 中 仅仅 将 四 种 dNTP 之 中 的 一 种 加 入 反应 体系 ;比如 仅仅 加 入 dATP。 由 于 所 用 DNA 聚合 酶 具有 3 一 5 的 外 切 酶 的 活性 ( 见 第 四 章 )， 而 反应 体系 中 缺少 另外 三 种 必要 的 dNTP， 合 成 产物 就 从 3 一 5 方向 降解 。 然而 由 于 存在 dATP， 显 然 遇 到 腺 嗓 叭 的 位 置 降解 反应 就 停止 了 。 A 此 所 有 的 片段 都 是 以 A 为 结尾 的 。 同 理 , 可 以 分 别 制备 以 C、G 或 工 结 尾 的 另外 三 组 片 段 。 四 组 片段 在 同一 块 凝 胶 板 的 不 同样 品 槽 中 同时 电泳 ,从 放射 自 显 影 图 上 就 可 以 推断 碱 ZEN, AAO A 样品 槽 走出 的 放射 性 区 带 代表 和 A 在 片段 中 的 位 置 , 同 理 也 可 以 定 出 'C、 G 和 T 的 位 阐 。 因 此 根据 同一 凝 胶 电泳 上 的 四 组 区 带 就 可 以 推断 碱 基 的 顺序 。 按 理 只 用 一 个 加 法 系统 就 足以 推断 DNA 的 碱 基 顺 序 了 。 但 是 由 于 技术 上 的 原因 ， 只 用 一 种 方 话 有 时 不 能 得 到 完全 正确 的 结果 ， 因 此 还 设计 了 一 种 减法 系统 。 在 减法 系统 中 ， 也 是 将 上 述 酶 促 产 物 分 成 四 小 分 ， 每 一 小 分 中 只 加 和 三 种 dNITP， 比 如 缺少 dATP。 在 这 个 反应 体系 中 ，DNA 聚合 酶 能 够 把 片段 继续 合成 下 去 ， 但 是 在 遇 到 应 该 是 dATP 参 人 的 位 置 DNA 模板 引物 aie Tee ATGCTG

DNA RAB 4dNTP (HEP BIZ)

模板 “一 一 -一 -一 一 ATGCTG

-一 5

@P CM ANE (如 -A) Kes Bs +A)

电泳 分 离 八 组 加 减法 混合 物

O-C-T-A igi i

ET

图 2-+ “加 减法 ?测定 DNA 顺序 的 原理

se。 22 。

A SRAM CRT. BRUSSEL ARLE A ROH 同样 可 以 定 出 A 的 位 置 。

斩 减 法 是 第 一 个 成 功 地 把 片 眉 长 度 和 碱 基 位 置 联系 起 来 的 新 的 顺序 测定 方法 ,4X 174 DNA 全 部 顺序 就 是 用 这 个 方法 测定 的 。 在 DNA 顺序 测定 方法 的 发 展 过 程 中 ,加 减法 的 历史 性 位 置 是 不 可 低估 的 。 但 由 于 技术 上 的 问题 ， 这 个 方法 的 实际 效果 还 不 够 理 想 。 可 能 由 于 在 基 的 特异 性 和 DNA 的 高 级 结构 的 影响 , 聚合 反应 并 非 如 希望 的 那样 不 同步 ,反应 速度 有 差异 ,有 些 片段 可 能 多 些 , 另 外 一 些 片段 可 能 少 些 ; 有 时 可 能 导致 调 读 和 重读 ,有 时 图 谱 上 还 会 出 现 假 谱 线 , 当 同样 的 碱 基 联 排 时 图 谱 上 有 时 只 出 现 一 条 带 。 因 此 用 这 个 方法 测定 的 DNA 片段 可 能 有 五 十 分 之 一 的 误差 e

对 加 减法 的 一 个 最 成 功 的 改进 是 “未 端 终止 法 ”, 其 基本 反应 也 是 利用 DNA RABE 的 酶 促 反 应 。 在 反应 混合 物 中 有 模板 .引物 、 酶 和 四 种 dNTP。 除 了 四 种 正常 的 dNTP 之 外 ,另外 再 加 入 一 定 比例 的 2’, 3' 双 脱氧 核糖 核 昔 三 磷酸 ,比如 ddATP (图 2-5)。 因 此 在

人 O--P-O-P-O-P-O-CH, A " Hi 1 O

ORD) 9 H H H H

2-5 2、3 双 脱 氧 核 糖 腺 苷 三 磷酸 的 结构

合成 过 程 中 遇 到 应 该 dATP 参 人 的 位 置 就 有 二 种 可 能 的 情况 发 生 。 如 果 是 dATP BA 则 链 可 以 继续 延伸 ,如 果 是 ddATP 人 参 人 合成 反应 就 不 能 进行 了 , 因为 ddATP 的 3' 位 置 没有 产 基 。 因 此 ,可 以 得 到 一 系列 不 同 长 度 的 以 -ddA 为 结尾 的 一 组 片段 。 同 理 ,， 也 可 以 得 到 以 GT 或 C 为 结尾 的 片 眉 , 电 泳 之 后 ,就 可 以 直接 “ 读 出 碱 基 有 顺序 ， 这 是 一 个 十 分 方便 和 精确 的 方法 。 当 然 如 果 原 始 的 DNA 是 双 链 ,而 不 是 单 链 ,那么 分 离 单 链 DNA 片 用 是 困难 的 ,而且 制 备 合适 的 引物 也 是 一 个 环 手 的 问题 。1980 年 以 来 发 展 起 来 的 把 DNA 重组 到 单 链 鸣 菌 体 M13 中 ,增殖 之 后 ;可 以 获得 大 量 的 单 链 DNA ( 酶 法 正 需 要 单 链 DNA 作为 模板 进行 顺序 测定 ) ,而且 由 于 组 建 的 -MI3 载体 含有 通用 的 引物 结合 位 置 ,因此 可 以 利用 同一 种 引物 ,这 样 简 化 了 单 链 DNA 分 离 和 引物 制备 的 步 又， 大 大 推动 了 末端 终止 法 的 发 展 。 以 这 个 方法 为 主 ， 已 于 1982 年 完成 了 1 噬菌体 DNA 全 顺序 (48502bp) 的 测定 ,目前 正 向 更 大 的 DNA 进军 。

1982 年 洪 国 藩 改进 了 上 述 双 脱氧 与 M13 克隆 系统 相 结合 的 方法 。 由 于 原 有 方法 是 拜 机 的 ,不 可 避免 地 出 现 测定 的 多 次 重复 ,而 这 种 重复 在 测定 的 后 期 更 为 严重 。 改 进 后 的 方法 叫做 “DNA 顺序 的 连续 测定 法 ”( 见 示意 图 2-6)。 连续 法 的 关键 是 将 克隆 的 外 源 DNA 的 一 端 固定 起 来 ， 而 另 一 端 则 用 没有 专 一 性 的 DNase I 将 其 逐渐 缩短 ， 然 后 通过 “MMH RAKE AA 200 个 核 苷 酸 差 异 的 克隆 ; 实验 设计 使 得 缩短 的 一 端 发 生 在 共 同 引物 区 ,这 样 ,对 这 些 克隆 的 顺序 的 逐个 测定 ,就 实现 了 对 长 链 DNA 的 连续 测定 。 用 这 个 方法 完成 了 2300bp 的 顺序 。

化 学 法 Gilbert 及 其 同事 Maxam 利用 某 些 化 学 试剂 能 专 一 地 修饰 碱 基 ， 使 相应 的 糖苷 键 变 得 不 稳定 ， 这 样 也 可 以 得 到 以 特定 碱 基 结尾 的 四 组 片段 (图 2-7)。 他 们 所 选 用 的 化 学 试剂 一 种 是 硫酸 二 甲 酯 ,一 种 是 有 。 硫 酸 二 甲 酯 可 以 使 鸟 吐 叭 的 N-7 AR

e 22's

T 连接 酶 连接 和 转 导 ， A

c)

d) |

4 As Mt e) | PA 9, FUDNAR ABE AH Bt HOE {| 3. RADA ER cM ee ’ a 一 > 一 SS: a ee 了 es IN | TADNAR G Ai EK ARS:

“Pp A KP p

Aj2-0 eS DNA 顺序 示意 图 。 A 和 8 为 二 个 不 同 的 限制 性 内 切 酶 只 的 N-3 位 甲 共 化 ,被 甲 基 化 的 厌 叭 的 糖 音 键 是 不 稳定 的 ,在 中 性 pH 加 热 就 会 使 甲 基 化 的 嘲 吟 脱落, 当 陪 闲 叭 的 DNA 在 碱 性 溶液 加 热 时 ,磷酸 二 酯 键 就 会 断 开 ， 这样 一 组 片 段 电泳 之 后 在 放射 四 显影 图 上 有 一 深 一 浅 工 组 谱 线 , 深 的 是 由 于 G 降 解 而 产生 的 , 浅 的 是 由 于 和 降解 而 产生 的 。G 之 所 以 比 A 深 是 因为 G 甲 基 化 的 速度 比 A 快 五 倍 。 用 硫酸 二 甲 RE ERIE LAY DNA 片 外 ,如 果 先 用 稀 酸 处 理 , 脱 叮 叭 反应 主要 是 在 A 的 位 置 上 进行 ,因为 在 这 种 条 件 下 甲 基 化 的 A 比 甲 基 化 的 G 更 不 稳定 ,然后 再 用 碱 断 开 磷酸 二 琵 键 ,电泳 图 谐

© 24 «

上 深 的 谱 线 代 表 A, 浅 的 谱 线 代表 Go PFRRADBAKAM MOH HR, RAKE 催化 如 消除 反应 ;使 磷酸 基 团 掉 下 ;此 条 件 对 C 和 T 没 有 选择 性 , 当 肝 解 时 存在 2M NaCl,.

A NH, G O Cc NH, O -NIH: N Ny N ‘y ie As HN CH, | -NE 3 lina ‘ ONAN N o LN, Ae Rae : ek Penske = oat eu Kon O- O- | i 9 0 8 Al 4a qp=o O-—p=0 O-=p=C O-—p=0 / O : ; / O O ,O 3'f 4 ie! 中 s+ NH,NH “ 1 “idles Catal jer OgGGH: igi ci day O mA NH, m7G fe) 9Ha (+NaCl) O(-NaCDb VS ay Hy CH) i Ky: N Haw Aw? *S r a CH; _ g O 5~ /O 3 | 3’ a

3 H ~~ 5 一 /OH CH=N+ ) {on K 4 yy, H OH | OH-

ra oO E K wre Ne 0-—p=0 oF 0 O-—-p= 3'1

O \ Me It 1

§ So-—Pp—-OH o-

A 2-7 DNA 化 学 降解 的 反应 历程

2-2 DNA 顺序 分 析 的 化 学 降解 反应

NH,NH, + #

> | |

5 Ce DMS

[组 6 Gta 酸 #* Di hE 7 C+T NH,NH, Oe Ge 8 g NH,NH, + # Hie Me 9 ASc NaOH 有 哌 啶

IT 组 10 G>A DMS Aik ae ll G 甲 烯 蓝 哌 喧 12 中 四 氧化 娥 Die We

* DMS Hot — FRE. ** pH2 甲酸 吡啶 。

ea 抑制 了 膜 同 T 的 反应 ， 这 样 产生 的 谱 线 相当 于 C

的 位 置 (Al 2-7)o ;

在 对 二 种 碱 基 专 一 的 化 学 反应 中 ， 酸 处 理 通 过 质子 化 作用 使 味 叭 糖苷 键 不 稳定 ， 碱 处 理 优 先 打开 腺 味 哈 和 胞 喀 啶 环 ,最 后 均 可 被 哌 啶 所 消除 ， 使 DNA 链 在 G 和 A( 酸 处 理 ) 或 A 和 C( 碱 处 理 ) 处 断 链 。 此 外 , 甲 烯 蓝 , 四 氧化 娥 也 曾 被 用 于 DNA 顺序 分 析 ( 见 表 2-2)。

如 果 单 链 DNA 的 一 端 被 标记 , 用 上 述 方法 可 产生 以 同一 种 碱 基 〈 或 周二 种 碱 基 ) 结尾 的 片 段 ,只 要 能 区 别 四 种 碱 基 , 便 可 直接 在 凝 胶 电 泳 上 读 出 核 苷 酸 排列 顺序 。 表 2-2 列 出 的 三 组 化 学 降 解 反 应 可 被 使 用 ,其 中 以 第 工 组 效果 较 好 。 若 在 AU ABME A > C 反应 ( 见 第 II 组 的 9), 共 五 个 反应 条 件 ,能 得 到 更 为 满意 的 结果 (图 2-8)。

化 学 降解 的 精确 程度 在 理论 上 应 达到 100 驳 ， 但 在 实际 测定 中 并 非 如 此 理想 。 如 果 用 厚 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 板 〈1.5mm), 没有 其 他 手段 核对 并 且 仅 测定 一 次 的 话 ， 精 确 率 可 能 只 有 85% 5 如 果 从 二 个 方向 测定 则 可 提高 到 99% 5 如 果 用 薄 的 凝 胶 板 (0.3mm ) ,一 次 测定 的 精确 度 就 可 以 达到 99 驳 。

DNA 顺序 测定 方法 主要 是 前 面 讨论 的 化 学 降解 法 和 末端 终 止 法 ， 也 有 人 设计 一 些 其 他 的 专 28 jie DNA mmm 一 性 断裂 DNA 的 方法 ， 但 基本 上 还 是 模 伤 花 学 射 自 显影 图 ( 共 采 用 五 个 反应 条 件 ) 降解 和 末端 终止 法 。 事 实 上 ， 除 了 这 二 种 方法 以

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Sh, ABBOT EEDA A RS (SEE ARE AIRY IE RELL RE MA ARM, HM GE DNA ffi AWA LEBEN, CER EATCORELREM, BER 室 也 很 乐意 采用 。 近 年 来 由 于 将 未 端 终止 法 与 M13 克隆 系统 相 结合 已 经 把 DNA 顺序 分 析 推 向 一 个 新 阶段 。 由 于 方法 上 的 突破 , DNA 顺序 测定 已 成 为 分 子 生 物 学 中 发 展 最 快 的 分 枝 之 一 。 报道 DNA IMHO, 第 一 个 完整 的 DNA 分 子 的 已 知 结 构 是 由 XK174DNA (5386, 1977 年 ), 接 着 测定 了 SV40 DNA (5226, 1977 年 )、G4 DNA (5577,1978 年 ) 和 fd DNA (6408,1978 fe), 1981 年 报道 了 人 和 午 线 粒 体 DNA (16569bp 和 16338bp) 的 全 结构 。1982 FRAN 1A DNA (48502bp)>

在 测定 大 的 _DNA 过 程 中 , 必须 使 用 电子 计算 机 储存 、 处 理 和 比较 已 经 获得 的 顺序 信息 ;这些 工作 单纯 依靠 人 力 已 很 难 胜任 了 。

几 年 前 ， 人 们 还 千方百计 设法 把 DNA 转录 成 RNA， 用 测定 RNA 的 方法 来 反 推 DNA 的 顺序 。 现 在 ，DNA 顺序 测定 的 方法 已 达到 这 样 的 水 平 , 就 是 把 RNA 变 成 DNA 来 测定 。 已 完成 的 一 些 最 大 的 RNA 的 顺序 如 卵 白 蛋 白 的 mRNA、16S rRNA 等 都 是 经 过 反 转 录 成 DNA 后 测定 顺序 的 。 另 一 方面 ,把 核酸 分 子 特 异性 地 降解 ,然后 用 测定 片段 长 度 来 确定 碱 基 位 置 也 已 用 于 RNA 顺序 测定 上 ， 这 方面 近 几 年 有 很 多 发 展 ( 见 第 三 章 “RNA 结构 ”)。 总 的 来 说 ，RNA 顺序 测定 进展 还 不 如 DNA,

由 于 DNA 顺序 测定 方法 已 十 分 简便 , 因此 只 要 有 可 能 。 就 把 蛋白 质 顺序 测定 转化 成 DNA 的 顺序 测定 。 例 如 猴 病 毒 SV40 全 部 顺序 测定 已 完成 ,只 要 分 离 到 SV40 编码 的 蛋白 质 , 测 定 其 N 端 开始 的 几 个 氨基 酸 , 就 可 以 很 容易 地 按 氨 基 酸 密码 表 推 断 出 蛋白 质 的 全 结构 。 又 如 噬菌体 %X174 的 全 部 顺序 已 知 后 。 按 照 一 些 规 则 可 以 从 这 个 顺序 预言 4X174 可 能 还 编码 一 些 至 今 我 们 未 知 的 蛋白 质 。 事实 也 是 如 此 ，X174K 基因 和 蛋白 就 是 在 这 个 预言 指导 下 新 找到 的 _%X174 编码 的 蛋白 质 。 DNA 顺序 测定 还 可 以 核对 过 去 测定 的 蛋白 质 的 顺序 是 否 正确 。 例如 大 肠 杆 菌 ; 基因 的 顺序 测定 完成 后 ， 比 较 该 DNA 顺序 和 阻 歇 蛋白 的 氨基 酸 顺序 ,发现 两 者 有 所 不 同 。 后 来 知道 ,这 个 差别 是 由 于 在 氨基 酸 We PRE TRIKE 3

如 果 对 DNA 顺序 测定 作 一 个 乐观 的 估计 ,可 以 设想 现在 所 有 的 DNA 顺序 原则 上 都 能 测定 。 主 要 是 工作 量 的 问题 。 我 们 可 以 设想 , 先 把 一 个 生物 体 的 全 部 DNA 做 成 基 因 库 , 每 个 克隆 里 面包 含 了 几 千 个 到 几 万 个 碱 基 对 长 度 的 DNA 片 钼 , 按 目 前 的 水 平 , 每 一 个 这 样 长 短 的 _DNA 片 朋 的 顺序 可 以 在 合理 的 时 间 内 把 它 测定 完毕 。 下 一 步 是 如 何 确定 每 个 克隆 所 包含 的 DNA 片段 在 整个 染色 体 上 的 排列 。 可 能 有 很 多 途径 来 解决 这 MAB, 例如 制备 同一 种 DNA 用 两 种 不 同 限制 性 内 切 酶 酶 解 后 制备 两 套 基因 库 ， 分 别 测定 他 们 的 顺序 之 后 就 可 以 找到 必要 的 重 释 片 侦 , 从 而 把 基因 库 中 的 DNA BEER 一 个 完整 的 染色 体 。 另 一 种 方法 是 把 每 个 基因 库 所 含 的 基因 表达 出 来 ， 同 遗传 学 得 到 的 基因 图 对 照 , 也 可 决定 很 多 基因 库 的 顺序 ， 象 大 肠 杆 菌 DNA 的 顺序 在 现 有 水 平 上 是 能 够 解决 的 ,以 上 的 估计 可 能 乐观 一 些 , 问 题 在 于 即使 已 知 全 部 顺序 ， 要 理解 它们 的 功能 将 ' 困难 得 多 。

© 27 。

=, DNA 顺序 组 织

DNA 分 子 中 不 同 的 区 域 有 不 同 的 功能 ,有 些 区 域 是 编码 蛋白 质 的 结构 基因 ， 有 些 包 : 含 了 复制 、 转 录 或 翻译 等 调控 信号 。 具有 不 同 功 能 的 DNA 区 域 在 整个 分 子 中 的 分 布 精 - 况 就 是 DNA 顺序 组 织 所 要 讨论 的 主题 。 在 原核 生物 中 结构 基因 占 了 整个 DNA WAM. 分 ;而 在 真 核 生 物 中 ,可 能 只 占 一 小 部 分 。 人 们 相信 非 结构 基因 部 分 包含 了 调节 基因 表达 的 信号 。 它们 的 分 布 情况 对 基因 的 调控 是 直接 有 关 的 。 研究 DNA 顺序 的 组 织 是 结构 功能 研究 的 一 部 分 。 从 广义 上 讲 ，DNA 一 级 结构 也 是 DNA 顺序 组 织 的 二 部 分 ， 一 级 结构 可 以 看 作为 最 精细 的 DNA 顺序 组 织 。 当 然 从 另 一 个 角度 而 言 , 染色 体 上 的 基因 图 也 属于 DNA 顺序 的 组 织 , 因 此 DNA 顺序 组 织 也 称 为 基因 的 组 织 。 在 这 一 节 种 我 们 主 . 要 从 DNA 顺序 的 角度 讨论 它们 的 分 布 特点 。

测定 DNA 顺序 的 组 织 可 以 用 不 同 的 方法 ,主要 有 :

(1) 测定 DNA 核 背 酸 有 顺序。 近年 来 核 苷 酸 顺 序 的 快速 测定 方法 已 经 解决 ， 这 为 了 解 DNA 顺序 的 组 织 打 下 了 和 良好 的 基础 。 但 是 测定 DNA 核 昔 酸 顺序 并 未 等 于 了 解 DNA 顺序 的 组 织 , 还 要 与 生化 的 和 遗传 的 方法 相配 合 ,了 解 这 一 段 DNA 的 生物 功能 ;这 样 才能 对 顺序 组 织 有 比较 清晰 的 理解 。

(2) 核酸 杂交 。 用 已 知 功能 的 DNA 或 RNA 片段 同 DNA 杂交 ,再 配合 电子 显 微 镜 的 观察 ， 是 测定 DNA 顺序 组 织 十 分 有 效 的 手段 。 特 别 是 近 几 年 来 ， 利 用 重组 DNA 技术 能 获得 大 量 特定 的 探 针 ,这 样 就 为 研究 基因 的 数目 和 分 布 提 供 了 有 利 的 条 件 。

(3) 复 性 动力 学 方法 。 测定 变性 DNA 的 复 性 动力 学 的 过 程 可 以 推测 同 源 DNA 片 毁 的 数目 和 分 布 情况 。 十 多 年 前 ， 这 个 方法 在 探索 真 核 生 物 的 基因 组 织 中 作出 了 很 好 的 开端 ;现在 仍然 是 一 个 十 分 有 用 的 手段 。

(4) 遗传 学 方法 。 利 用 基因 突变 的 重组 、 交 换 和 互补 等 方法 可 以 测定 基因 的 数目 和 位 置 ,还 能 测定 基因 的 精细 结构 。 在 微生物 中 , 遗传 学 的 方法 显 出 特殊 的 优点 ， 因 为 微 生 物 的 突变 容易 获得 和 检 出 。

以 下 我 们 通过 几 个 例子 来 简要 地 说 明 原核 生物 中 和 真 核 生物 中 DNA 顺序 组 织 的 某 : 些 特点 。 由 于 生物 的 复杂 性 , 特别 在 真 核 生物 中 ， 因 此 以 下 讨论 的 某 些 DNA 顺序 组 织 . 的 特征 有 可 能 仅仅 是 一 种 特殊 的 现象 ,而 不 是 一 种 普遍 的 规律 。

原核 生物 DNA 顺序 组 织 噬菌体 vit KK mX174 和 G4

Kio aM aK pX174 和 G4 都 是 小 球形 病毒 ,包含 单 链 环 状 DNA。 这 二 个 病毒 在 血清 学 上 有 交叉 反应 ， 然 而 在 遗传 学 上 两 者 不 能 有 效 地 互补 和 重组 。 从 电子 显微镜 观 察 , 这 二 种 DNA 的 异 源 杂交 双 链 有 39% 碱 基 是 误 配 的 , 二 者 的 物理 图 谱 的 差别 更 加 证 _ 实 了 这 一 点 。 现 在 二 个 DNA 的 全 部 顺序 已 测定 完毕 , 对 这 二 个 噬菌体 的 遗传 学 分 析 稳 生化 研究 也 十 分 详尽 ， 因 此 可 以 对 这 两 个 分 子 进行 详细 的 比较 。 令 人 惊奇 的 是 两 者 虽然 顺序 上 的 差别 可 达 将 近 40 多 ,而 在 DNA 顺序 组 织 上 又 那么 相似 (图 2-9)。 从 DNA Ii

°, 2B 。

要 36 110 8. | 一 二 二 全 care Somer tm [Cao oor le od 有 Ov ' BR / |

59 32 45 136- 10 4 | BK | G4 | ee od || p 4 、 J =

4 4 * 及 Ov B Py, RNA (Oo 插入 3 138 3 6 3 42 G4 He «18 «3 39 可 和 he u 1 I i 1 | 3 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000

2-9 鸣 菌 体 %X174 和 G4 的 基因 图 第 一 、 第 二 行 分 别 是 %X174 和 G4 的 基因 图 ;第 三 行 表示 相对 于 $X174 的 G4 编码 区 中 插 人 和 人 缺 失 的 核 苷 酸 的 数目 和 位 置 ; 第 四 行 是 核 背 酸 数目 尺度 。PA、Pa 和 Pp 为 三 个 启动 子 的 位 点 ，Ov 和 Oc ABRAM DNA 链 和 互补 DNA 链 合成 的 起 始 部 位 。

许 组 织 的 角度 比较 叭 菌 体 4X174 和 G4, 以 下 三 个 特点 是 值得 注意 的 。

(1) 虽然 _%X174 和 G4 都 编码 了 11 个 蛋白 质 ， 但 是 只 转录 成 三 个 mRNA. 每 个 mRNA 包含 了 多 个 顺 反 子 ,而 且 功 能 上 有 关 的 有 顺 反 子 通常 串联 在 一 个 mRNA 分 子 上 。 例如 从 启动 子 Pe 开始 转录 的 mRNA 包含 了 基因 D-(E)-J-F-G-H。 其 中 基因 J,F,G， 百 都 是 编码 噬菌体 的 外 壳 蛋 和 白 的 。D 和 蛋白 同 吧 菌 体 的 装配 有 关 ， 卫 蛋白 是 裂解 细菌 的 蛋 45, 这些 编码 在 一 个 mRNA 分 子 中 的 蛋白 质 在 生理 功能 上 都 是 密切 相关 的 。 这 种 DNA 颁 序 组 织 的 方式 可 能 是 使 这 些 基 因 协 同 表 达 的 一 种 调控 方式 。 功 能 上 相关 的 基因 组 织 在 一 起 ,并 转录 在 同一 个 mRNA 分 子 中 ,这 种 现象 在 原核 生物 中 是 很 普遍 的 。 在 真 核 生物 中 ,如 果 说 不 能 绝对 排除 这 种 现象 ,至 少 也 是 很 稀有 的 。

(2) $X174 和 G4 DNA 分 子 的 绝 大 部 分 是 用 来 编码 蛋白 质 用 的 。 只 有 一 小 部 分 是 未 翻译 出 来 的 。 不 翻译 出 来 的 部 分 在 $X174 DNA 中 占 21715386， 在 G4 DNA HG 282/15577，。 也 就 是 说 不 到 5 多 。 染色 体 的 绝 大 部 分 用 来 编码 蛋白 质 ， 这 也 是 原核 生物 的 DNA 顺序 组 织 的 一 个 特点 。 不 翻译 出 来 的 DNA _ 区域, 或 称 间隔 区 ,经 常 包含 了 一 些 控 制 基因 表达 的 DNA 顺序 。 如 基因 上 和 A 之 间 的 间隔 区 包含 了 RNA 聚合 酶 的 结合 点 ， 村 录 的 终止 信号 、 核 糖 体 结合 位 点 等 控制 表达 的 部 分 。 MURA $X174 而 言 ， 所 有 的 间隔 区 (除了 基因 G 和 互 之 间 的 间隔 之 外 ) 都 可 以 形成 一 个 稳定 的 发 夹 结构 。 据 推测 控制 信号 可 能 同 这 类 二 级 结构 有 关 。

(3) MEEK 由 X174 和 G4 而 言 ; 在 DNA 顺序 组 织 上 最 大 的 特点 是 基因 重 登 。 其 他 二 些 病毒 ,如 猴 病 毒 SV40 DNA 中 也 发 现 有 基因 重 登 的 现象 ,至 今 还 只 是 在 病毒 DNA 中 发 现 这 种 现象 。 一 般 而 言 , 这 一 类 病毒 DNA 分 子 都 不 大 ， 但 又 必须 装 人 相当 多 的 基 因 , 可 能 这 种 压力 导致 病毒 DNA 在 进化 过 程 重 倒 起 来 。 从 图 2-9 可 以 看 到 ,基因 了 和 基 因 攻 重 释 在 基因 A 之 内 ， 基 因 匡 重 倒 在 基因 D 之 内 。 这 些 重 倒 在 一 起 的 基因 使 用 的 码 组 是 不 同 的 ,因此 虽然 是 同样 的 DNA 顺序 ,而 转译 出 来 的 是 不 同 的 蛋白 质 。 图 2-10 列举

9

了 部 分 核 音 酸 顺 序 , 它 们 用 在 三 个 码 组 之 中 ,含意 各 不 相同 。

T ATG —KERheRES 玫 基 因 的 Asn.Glu 密 码 = 一 (基因 的 Met',Arg 密 码

—

AAATGAGG

t : A 基因 中 的 Lys 和 终止 密码 2-10 在 重 伙 基因 中 同一 核 苷 酸 顺 序 包含 着 多 种 生物 信息

由 于 基因 的 重 倒 ,在 重 伙 部 位 一 个 碱 基 的 突变 将 影响 二 个 蛋白 质 甚至 三 个 蛋白 质 , 因 此 我 们 可 能 猜想 在 进化 过 程 中 位 于 基因 重 倒 区 的 _DNA 顺序 的 保守 性 将 比 非 重 县 区 的 大 一 些 。 实验 比较 了 $X174 和 G4 的 DNA 顺序 的 变化 频率 ,发现 重 倒 区 的 变化 频率 仅仅 比 非 重 委 区 稍 低 一 点 。(22 匈 对 33 匈 ), 因 此 基因 的 重 全 并 不 是 进化 的 严重 阻碍 。

GR. mera. 是 感染 大 肠 杆菌 的 温和 性 噬菌体 。1 DNA 人 侵 宿主 以 后 ;可 ， 以 有 二 条 发 育 途径 ， 一 条 是 溶菌 途径 ， 另 一 条 是 溶 原 途 径 。 所 谓 溶菌 途径 就 是 人 侵 的 1 DNA 在 宿主 内 增殖 ,指导 合成 噬菌体 的 mRNA， 并 翻译 出 噬菌体 的 蛋白 质 , 装 配 成 成 熟 的 噬菌体 ， 使 宿主 细胞 裂解 。 所 谓 溶 原 途 径 就 是 人 侵 的 1 DNA 整合 到 大 肠 杆 菌 的 染 色 体 中 ，1 DNA 基因 的 表达 受到 阻 遇 ，2 DNA 作为 宿主 _ DNA 的 一 部 分 与 宿主 DNA 一 起 复制 。 在 某 尘 条 件 下 ,比如 紫外 光照 射 之 后 ,可 以 诱导 1 DNA 从 宿主 DNA 上 切 下 ， 独立 增殖 ,发 育成 成 熟 的 叹 菌 体 , 使 宿主 细胞 破裂 。 1 叭 菌 体 的 这 二 条 发 育 途径 可 以 看 作 一 种 最 原始 的 分 化 现象 。

MEK 2DNA 顺序 组 织 具 有 一 般 原核 生物 所 具有 的 共同 特点 ,如 大 部 分 DNA 是 用 来 编码 蛋白 质 的 ,功能 上 相关 的 基因 组 织 在 一 起 , 并且 一 起 转录 成 一 个 mRNA, HE 的 组 织 方 式 同调 控 的 关系 就 不 详 述 了 ， 这 里 仅 讨论 d 基因 两 边 二 个 操纵 基因 的 结构 (图 2-11,2-12)。

IDNA 人 侵 细菌 之 后 , 首先 利用 宿主 的 生物 合成 系统 分 别 从 PE 和 Pr 转录 翻译 成 二 .个 蛋白 质 , N 和 cro 蛋白 。 这 二 个 mRNA 在 转录 终止 信号 ty, 和 ta 位 置 转录 结束 。 这 二 个 终止 信号 是 受 e (宿主 转 录 终 止 因 子 ) 控 制 的 。 鸣 菌 体 编 码 的 蛋白 N Site 因子 的 能 力 , 因 此 蛋白 N 的 合成 就 使 转录 可 以 延伸 到 te 和 ta 之 外 ,进一步 合成 蛋白 ad O, P, dl 等 基因 产物 。 蛋白 O 和 了 是 引发 1DNA 复制 的 蛋白 质 ，cI 和 dill 是 同 鸣 菌 体 进 人 溶 原 途 径 有 关 的 蛋白 质 。 什 么 因素 决定 ) 喉 菌 体 的 发 育 途 径 这 个 问题 还 没有 解决 。 如 果 是 进入 溶 原 途 径 , 由 于 蛋白 dM dl 是 正 调节 因子 ,在 它们 的 帮助 下 ， 使 得 从 Pe 开 始 的 转录 能 够 起 动 。 转 录 一 直 进 行 到 <cL 基因 ,产生 蛋白 cl。 和 蛋白 d 是 一 个 阻 过 蛋白 , 它 结合 到 操纵 基因 Op 和 Or 上 ， 阻 止 了 从 启动 子 Pe 和 Py 开始 的 转录 。 这 时 <c 和 dil 的 转录 也 被 阻 过 蛋白 所 阻 遏 ，cL 的 转录 从 Pim 开始 ,这 时 阻 遏 状 态 就 确立 了 。 在 阻 遏 状 A, 1 DNA MMA RIES d, 24 d 结合 在 操纵 基因 Op 和 or 阻止 了 所 有 1 基 因 的 表达 。 图 2-11 列 出 1 鸣 菌 体 的 部 分 基因 排列 图 。 特 别 列 出 与 转录 调控 有 关 的 部 分 ， 与 复制 调控 有 关 部 分 将 在 第 四 章 第 五 节 讨 论 。

WERK 2 中 和 转录 调控 有 关 的 操纵 基因 Ox 和 Or 分 别 由 80 个 左右 碱 基 构 成 , 结构 上 十 分 相似 ,两 者 又 可 大 致 分 成 三 个 区 域 ( 见 图 2-12)。 下 面 我 们 着 重 分 析 Op 中 的 细节

e 30 。

0 ， 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %A a Se a ee -

A ] ”kmeae azd att Qg_R ; ene RR? “Ee ie =a 头 尾 形态 pis! \、 eM 学 ， \ = \ pi we red \ "ee -- : alin So feat dl att int xis exo bet gam cll N tire eIpgro cll ori OPQ ip 重组 整合 一 般 重组 和 转录 调控 DNA 复制 DNA RH

图 2-11 ， 吗 菌 体 和 的 部 分 基因 图 ， 图 中 cI 应 为 cl, CII 为 ell, CIII % clill

问题 。 在 这 个 操纵 基因 区 域 有 三 个 阻 遏 蛋 自 结合 点 ,分 别称 为 On, Ow 和 Ono 每 一 个 结合 点 包含 17 个 核 背 酸 ,二 个 结合 点 之 间 有 若干 个 核 音 酸 间隔 。 而 On, Om 和 On 的 核 音 酸 顺 序 十 分 相似 ， 仅 稍 有 差异 ， 构 成 一 个 小 的 重复 家 族 。 这 些 顺 序 的 相似 而 不 相同 对 调控 有 微妙 的 影响 。 因 为 这 些 顺 序 都 很 相似 ， 所 以 都 能 结合 阻 过 蛋白 cI。 但 又 因为 这 些 顺 序 有 所 区 别 ， 它 们 的 结合 能 力 稍 有 不 同 。Onmw 结合 阻 遏 蛋白 I MADR, Om 次 之 ，O 最 弱 。 当 环境 中 阻 遏 蛋白 的 浓度 不 高 时 ， 它 首先 结合 到 On 阻止 Pr 的 右 向 转 录 , 但 是 不 影响 从 Pmm 的 左 向 转录 。 因 为 这 二 个 启动 基因 都 在 Ox 和 Op 之 间 ， 这 样 可 以 保证 4DNA 处 于 阻 遏 状 态 , Ie cl 可 以 继续 合成 。 当 <LI SAKE TCH

Or Or N Or, Ov, Ox; cl On Or, Or: cro

Or: et Ab ge Cn Aven GeO GriiCy, i ee G A (Cee Cakes irae? ee a a ON Ae COG Er Ge Gl kG Or Tae Ors Loa Lene As. Cr Co Gy. C A A G G G A PR) 5 AA. Ou CA G i ie Gra Gt a cA Soe A Ane AGC. CGC CAG. Ay GiAey TE Ou; Tee oO CAA Mes °C aa oe Ba i pt A pelt CS Ce Ad Fh iE ene hy Ge Agr ata, Gat eniCa Capa Ges Tan GaeGs, JE A.

Cl A, fe Or Ag) Ag A, G,

G,_. G; ree WO 7%

图 2-12 mB PR A 操纵 基因 Or 和 Ox 的 顺序

不 仅 同 Om 结合 ,也 可 以 同 On, Om 结合 了 ,这 就 阻 遇 了 d 基因 的 上 自我 表达 。 因 此 d 蛋 息 的 浓度 是 可 以 自我 调节 的 , 它 不 受 细菌 本 身 生 产 情况 的 影响 ,而 维持 4 DNA 处 于 阻 遏 状态 。 以 后 我 们 将 看 到 真 核 细胞 中 有 很 多 重复 顺序 家 族 ， 对 这 些 顺 序 的 功能 我 们 还 了 解 很 少 。 我 们 能 否认 为 Om, On 和 On 这 种 DNA 顺序 组 织 形式 是 真 核 生 物 中 重复 有 叮 序 的 原始 形式 ?如 果 低 等 的 噬菌体 1 的 重复 顺序 有 如 此 巧妙 的 调节 功能 ， 那 么 真 核 生 物 中 的 重复 顺序 是 否 有 更 加 巧妙 的 调控 功能 ? 这 就 需要 进一步 用 实验 证 据 来 回答 了 。

e 局 外 了 5

大 肠 杆菌

大 肠 杆菌 染色 体 是 由 4 X 10° BRM AMM MK DNA， 对 大 肠 杆菌 的 基因 ， 国 已 有 大 量 的 详细 分 析 , 其 中 一 些 片 段 的 DNA 顺序 也 已 测定 。 从 DNA 顺序 组 织 的 角 度 来 说 以 下 几 个 方面 值得 着 重 讨论 。

C1) 同 前 面 提 到 的 几 种 吻 菌 体 一 样 ， 大 肠 杆 菌 的 很 多 基因 也 是 以 操纵 子 的 形式 组 织 起 来 的 。 操 纵 子 包括 功能 上 相关 的 几 个 蛋白 质 基因 和 一 个 共同 的 调控 区 域 ， 如 乳糖 操纵 子 包括 了 三 个 编码 酶 蛋白 的 结构 基因 (Z,Y, A) 和 一 个 相连 的 调控 区 ， 即 启动 基因 (局 动 子 )、 操 纵 基 因 、CAP 结合 区 等 。 这 些 功 能 上 相关 的 结构 基因 转录 在 一 个 mRNA 分 村 士 (图 2-13)。

i (1020) | PO | Z(3510) Y(780)} A (825)

启动 基因 (P) ， eee Se RE ET 二 一 1

二

CAP-cAMP RNA 聚 合 酶 ”操纵 基因 (0) 结合 部 分 | #3 (mRNA) 图 2-13 FRA FAR 括 弧 内 为 核 苷 酸 数目 ,调控 区 的 DNA 顺序 见 第 五 章 图 5-12

另 一 方面 ,也 并 不 是 所 有 功能 有 关 的 基因 都 组 织 在 一 起 ,例如 同 大 肠 杆 菌 复制 有 关 的 、 十 多 个 基因 散布 在 整个 染色 体 的 各 个 部 分 ， 而 并 没有 组 织 在 一 起 成 为 一 个 所 谓 复制 操纵 子 。 我 们 知道 DNA 复制 的 调控 是 一 个 远 比 乳糖 操纵 子 的 调控 更 为 复杂 的 过 程 , 因此 似 乎 可 以 这 样 说 ,如 果 一 组 基因 同一 个 复杂 的 生理 功能 有 关 , 那 么 这 些 基 因 不 组 织 在 一 起 可 能 更 有 利于 利用 复杂 的 调控 方式 。

(2) 以 RNA 为 最 终 产物 的 基因 ,它们 的 拷贝 数 往往 不 止 一 个 。 大 肠 杆 菌 中 编码 核 糖 体 RNA (rRNA) 的 基因 有 7 个 拷贝 ,每 个 拷贝 都 是 以 16S 一 23S 一 5S 的 顺序 串联 在 一 起 〈 详 见 第 五 章 )， 尽 管 每 个 拷贝 都 转录 出 同样 的 核糖 体 RNA， 但 是 这 些 RNA 基因 前 后 的 核 音 酸 顺序 每 个 拷贝 都 是 不 同 的 。 这 些 差别 对 核糖 体 RNA 转录 的 调控 有 些 什 么 影 响 还 很 不 请 楚 。

大 肠 杆菌 转移 核糖 核酸 (CRNA) 基因 总 共有 60 个 拷贝 ,主要 分 布 见 第 五 章 图 5-34。 大 肠 杆 菌 中 NA 基因 并 不 串联 在 一 起 构成 一 个 大 的 转录 单位 ,而 是 分 成 若干 小 的 转录 单 位 ,一 般 每 个 转录 单位 含 二 、 三 个 tRNA 基因 ， 受 同一 个 启动 子 控制 ， 因 此 一 个 转录 单 位 内 的 tRNA 的 产量 是 一 样 的 ， 而 不 同 转录 单位 之 间 的 tRNA 产量 可 能 不 一 样 。 现在 还 不 知道 不 同 的 转录 单位 是 否 包 含 能 共同 协调 的 调控 顺序 。 某 些 tRNA 基因 被 组 织 在 rRNA 操纵 子 之 中 。

(3) 位 于 转录 控制 区 域 的 DNA 顺序 的 组 织 形 式 是 多 种 多 样 的 , 不 同 的 组 织 形 式 与 不 同 的 生物 功能 有 明显 的 关系 。

最 早 被 前 明 转 录 调 控 区 域 的 DNA 顺序 组 织 是 乳糖 操纵 子 ( 见 图 2-13) 调 控 区 由 二

es。 32 。

NS 一 一 -一 一 一 一 一 一 \

个 基因 【其 中 有 三 个 结合 部 位 ) AM CA 2-13), 三 个 结合 部 位 从 左 至 右 排列 是 CAP- cAMP 结合 部 位 、RNA 聚合 酶 结合 部 位 和 阻 遏 蛋白 结合 部 位 ， 紧 接 在 后 是 z 结构 基因 。 当 转 录 开 始 时 ，RNA 聚合 酶 首先 同 启动 子 \P) BA. Raa, 到达 一 定 部 位 开 BAX 4HBSA SRILA (0) 结合 ;就 会 在 空间 上 妨碍 RNA 聚合 酶 滑 向 转录 开 始 部 位 ;因而 不 能 产生 与 乳糖 代谢 有 关 的 酶 。 但 如 加 入 诱导 物 ( 如 乳糖 或 其 类 似 物 ), 可 与 阻 遏 蛋白 形成 复合 物 而 使 阻 遇 蛋白 失 活 , 结 果 基 因 表 达 开 放 , 转 录 出 一 条 多 顺 反 于 mRNA 链 ;, 继 而 翻译 出 三 个 相关 的 酶 (图 2-14)。RNA 聚合 酶 结合 部 位 的 上游 是 CAP-c<AMIP 结合 部 位 。CAP【《 降 解 代 谢 活化 蛋白 ) cAMP 的 受 体 蛋 白 。 当 细胞 内 葡萄 糖 供 应 不 足 fy, cAMP 浓度 比较 高 ,因此 结合 到 乳糖 操纵 子 上 的 CAP-cAMP 复合 物 也 比较 多 ，CAP- cAMP 是 一 个 正 调 因子 ,这 时 转录 增加 ; 但 当 和 葡萄 糖 供应 充分 时 ，cAMP 浓度 下 降 , 阻 碍 了 许多 降解 代谢 基因 包括 乳糖 操纵 子 的 转录 。 这 是 一 种 很 合理 的 调控 方式 ， 因 为 葡萄 糖 供应 充分 时 ， 细 将 没有 必要 通过 降解 其 他 种 类 的 糖 来 获得 能 量 。 当 用 乳糖 和 葡萄 糖 同 时 培养 细菌 时 ,细菌 首先 利用 葡萄 糖 的 碳 源 ,只 有 在 葡萄 糖 耗 尽 后 ， 经 过 一 个 潜伏 期 才 开放 乳糖 操纵 子 以 产生 降解 乳糖 的 酶 ， 由 乳糖 供给 碳 源 〈 图 2-15). CAP-cAMP 同 DNA 结 合 以 后 ,可 能 有 利于 RNA 聚合 酶 同 启 动 子 结合 ， 从 而 发 挥 正 调 作 用 , 它 与 作为 负 调 因子 的 阻 遏 蛋白 表现 为 相反 的 调节 作用 。

#8 = = m 三 手 & ae ae ae 图 2-14 FLREORAA F AOBLACA) 与 诱导 (B) 图 2-15 Aaa gL ~~, mRNA; 0, HHH: ©, A BRTUEIEK Bo

RNA aie; Z, 8-47 HS; Y, EPL AS; A, EFL ACL.

半 乳 糖 操纵 子 的 调控 区 域 的 DNA 顺序 组 织 同 乳糖 操纵 子 稍 有 不 同 , 半 乳 糖 操纵 子 中 DNA 顺序 组 织 的 次 序 从 左 到 右 是 操纵 基因 、 启 动 子 ，CAP-c<AMP 结合 部 位 位 于 操纵 基因 而 不 是 启动 子 中 。 如 前 所 述 ，CAP-c<AMP 是 一 个 正 调 因 子 , 当 它 结合 到 半 乳糖 操纵 于 时 就 加 快 了 转录 。 这 时 转录 从 十 1 开始 。 但 是 当 阻 遏 蛋白 结合 到 操纵 基因 时 ， 使 转录 水 平 大 大 降低 而 且 转 录 从 一 5 位 开始 。 但 不 完全 破坏 RNA 聚合 酶 与 启动 子 的 相互 作 用 , 即 并 不 完全 关闭 半 乳 糖 操纵 子 mRNA 的 转录 。 相 反 , 乳 糖 操纵 子 结 合 了 阻 BEAS 后 ,转录 几乎 完全 停止 了 。 这 两 个 操纵 子 对 阻 遏 蛋白 的 反应 性 不 同 与 它们 的 DNA 顺序 组 织 有 关 ， 乳 糖 操纵 子 的 操纵 基因 在 启动 子 右边 ,一 旦 结合 了 阻 遏 蛋白 使 RNA RAR 完全 不 能 通过 ， 而 在 半 乳 糖 操 纵 子 中 ， 操 纵 基 因 在 启动 子 的 左边 ,结合 阻 遏 蛋白 之 后 ,并 会 妨碍 RNA RAMU, EH Ra al Ae TAT CAP-cAMP 的 正 调 效应 。 图

e 33 。

2-16 是 半 乳 糖 操纵 子 调控 区 的 DNA 顺序 组 织 。

通过 以 上 二 个 例子 我 们 可 以 看 到 DNA 顺序 的 组 织 对 代谢 调控 方式 是 有 很 重要 影响 的 ， 而 这

D 人 种 不 同 的 调控 方式 可 能 与 不 同 的 生理 效应 有 关 8 CAE-AMP PP ， 半 屯 糖 是 大 肠 杆 菌 糖 蛋白 的 必要 的 组 成 成 分 ， 即

结合 部 位 PPP rrr 使 半 乳 糖 不 用 作 能 源 ， 少 量 的 代谢 半 乳 糖 的 酶 仍 Li DA meinig 然 是 必需 的 ;而 乳 净 仅 被 用 作 细 胞 的 能 源 3 下 果 细

ASAM I-14, 调控 区 人 于 大 全 披 音 本 数 党 月， 胞 环境 中 有 其 他 能 源 时 ,如 上 记述 ,细菌 就 没有 必 负 号 表示 ,P 在 1 至 -60 处 , 0 位 于 -60 至 -90。 要 合成 有 关 乳 糖 代 谢 的 酶 。

在 操纵 子 的 调控 部 位 中 ,除了 上 述 的 启动 子 、 操 纵 基 因 和 CAP-cAMP 结合 点 等 单元 之 外 ,七 十 年 代 还 发 现 了 一 个 新 的 调控 单元 , 称 为 衰减 基因 (衰减 子 ，attenuator)。 BRT 都 位 于 启动 子 之 后 ， 也 都 存在 于 同 氨基 酸 合成 代谢 有 关 的 操纵 子 中 。 它们 表现 出 共同 的 生理 现象 , 当 体内 某 种 氨基 酸 丰 富 时 ,转录 进行 到 衰减 子 就 停止 了 。 因 为 细胞 没有 必要 去 合成 已 经 富裕 的 氨基 酸 ;如 果 体 内 某 种 氨基 酸 缺 乏 时 ,转录 可 以 通过 衰减 子 ， 一 直 转 录 到 结构 基因 ,并 翻译 出 相应 的 蛋白 质 ( 酶 ), 合 成 相应 的 氨基 酸 。 关 于 色 氮 酸 操纵 子 的 顺序 组 织 见 第 五 章 图 5-17。1981 年 测定 了 该 操纵 子 中 7,000 多 个 核 音 酸 的 排列 顺序 , 已 能 从 忆 级 结构 水 平 上 阐述 衰减 子 的 调 榨 方 式 ( 详 见 第 五 章 , 第 159 页)。 ~

(4) 很 久 以 来 人 们 就 为 细菌 抗生素 抗 性 的 迅 速 传播 所 困惑 : 常用 的 抗生素 对 不 少 病菌 已 经 无 能 为 力 , 各 种 新 的 抗生素 用 于 临床 以 后 不 久 ,就 会 发 现 有 些 病菌 对 它们 也 产生 了 抗 药性 。 经 多 方面 的 探索 发 现 ， 其 原因 之 一 就 是 抗 药 基因 可 以 借助 于 转 座 子 由 一 种 细菌 的 质粒 上 转移 到 另 一 种 细菌 的 质粒 上 去 ,如 图 2-17 所 示 。 Soest ite

转 座 子 (transposon) 或 转 位 因子 (transposable SC50 质 粒 重组 质粒 element) 的 DNA J2#BAW RRA EH SIM, ”图 2-17 抗 氨 蔡 青 霉 素 (AD DNA HB 该 反 向 重复 顺序 的 长 度 可 由 几 对 核 背 酸 到 2,000 PS05 Behe! sc 二 WER, YER THM DNA 拆 开 成 单 链 后 , 在 适当 的 条 件 下 退火 ， 转 座 子 的 单 st DNA 可 形成 环 状 发 夹 结构 :

O)

*_ ABC-——X—Y—-7-—C’B’ A’r__9? 3’—A’B’C’—-X —Y-Z-— C BA 5"

5/-—— ABC —— X~-y~—Z-——C’ B’ A’ —3!

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° 34 e

转 座 子 可 以 把 彼此 无 关 的 DNA Freee ee Ae ae Ee 识别 反 向 重复 顺序 的 酶 在 起 作用 。 果 然 ,实验 证 明 转 座 子 Tn3 中 带 有 转 座 酶 基因 和 一 种 编码 阻 遏 物 的 基因 。 在 转 座 酶 基因 区 域内 如 发 生 突变 就 会 影响 转 座 子 的 转 位 ， 而 在 阻 歇 物 基 因 区 的 突变 可 以 增加 Tn3 在 不 同 质粒 间 转 移 的 效率 。

- 虽然 转 座 字 可 以 将 它 自身 及 连接 于 其 中 的 其 他 基因 一 同 插 人 到 受 体 DNA 分 子 的 许多 位 点 上 ,但 这 种 插入 并 不 是 随机 的 。 受 体 分 子 的 某 些 部 位 特别 容易 被 转 座 子 插入, 这 些 被 称 作 * 热 点 ”的 顺序 与 转 座 子 两 端的 反 向 重复 顺序 非常 相似 。

转 座 子 不 仅 可 以 在 质粒 之 间 转 移 抗 药 基因 ,也 可 以 转移 其 他 性 状 ( 抗 落 化合 物 ， 合 成 细菌 毒素 ,代谢 各 种 碳水 化 合 物 ……) 的 基因 。 转 座 子 的 受 体 分 子 可 以 是 质粒 DNA, th 可 以 是 细菌 染色 体 或 病毒 DNA, 因此 转 座 子 可 以 实现 基因 和 片 眉 的 来 回转 移 和 染色 体 上 遗传 信息 的 重 排 。

以 上 极其 简单 地 讨论 了 原核 生物 中 DNA 顺序 组 织 的 某 些 特点 。 可 以 看 到 , 即使 在 低 等 生物 中 ，DNA 顺序 组 织 也 是 很 复杂 的 。 以 下 我 们 将 讨论 真 核 生 物 的 DNA 顺序 组 织 。 很 显然 要 总 结 出 真 核 生物 DNA 顺序 组 织 的 规律 就 更 加 困难 了 。

真 核 生物 DNA 顺序 组 织

BRED DNA 比 原 核 生 物 DNA 大 得 多 ,， DNA 顺序 组 织 也 相应 地 复杂 得 多 。 有 关 页 核 DNA 的 顺序 组 织 的 认识 最 早 来 自 对 DNA 复 性 动力 学 的 研究 ,这 样 得 到 的 有 关 DNA 顺序 组 织 的 知识 是 粗 线 条 的 。 近 几 年 来 ,借助 于 DNA 重组 、 杂 交 、 核 苷 酸 顺 序 测 定 等 技术 ， 对 真 核 DNA 顺序 组 织 有 了 比较 深入 的 了 解 ， 但 其 深度 远 远 比 不 上 对 原核 DNA 的 认识 。

从 DNA 复 性 动力 学 观察 , 真 核 DNA 可 以 分 成 三 个 部 分 。 一 部 分 是 能 很 快 复 性 的 DNA， 这 种 DNA 是 由 几 种 不 太 长 的 核 苷 酸 顺 序 重复 几 百 万 次 构成 的 ,这 种 顺序 称 为 高 度 重复 顺序 。 如 卫星 DNA 就 是 一 种 高 度 重 复 顺 序 。 另 一 种 是 中 度 重复 顺序 , 他 们 的 重 复 次 数 从 几 十 次 到 几 千 次 之 间 。 如 rRNA 基因 、tRNA 基因 、 某 些 蛋白 质 的 基因 (如 组 蛋白 , 肌 动 蛋白 , 角 和 蛋白 等 )。 第 三 类 是 单 拷贝 基因 ,它们 在 整个 基因 组 织 中 只 出 现 一 次 或 少数 几 次 ;如 珠 蛋 白 基因 , 卵 白 蛋 白 基因 , 丝 心 蛋白 基因 等 。

有 些 高 度 重 复 顺 序 DNA 的 浮力 密度 同 主体 DNA 有 区 别 ， 在 密度 梯度 超 离心 时 ， 它 狼 立 于 主体 DNA 而 自 成 一 个 小 峰 , 卫星 DNA 的 名 称 就 是 由 此 而 来 的 。 高 度 重 复 顺 Fe DNA 可 能 是 由 极其 相似 的 含有 2 一 10 个 碱 基 对 的 顺序 片段 重复 多 次 而 构成 。 有 些 卫星 DNA 的 基础 顺序 已 测定 ， 如 豚鼠 卫星 DNA 是 以 CCCTAA 为 基础 顺序 ， 其 他 的 顺序 都 是 从 这 个 顺序 经 过 罕 变 而 衍生 出 来 的 。 后 来 发 现 卫星 DNA 的 基础 顺序 可 能 要 长 得 多 。 例 如 非洲 绿 钦 DNA 用 限制 性 内 切 酶 Hind III 酶 解 ,总 共 7% DNA 都 是 以 172 个 碱 基 对 的 基础 顺序 重复 了 几 百 万 次 而 构成 。 高 度 重 复 顺 序 一 般 位 于 异 染 色 质 上 ,可 能 不 转录 成 RNA， 它 的 功能 还 不 清楚 。 近年 来 发 现在 高 度 重 复 顺 序 中 也 间隔 了 可 以 转 录 的 顺序 。

用 不 同 长 度 的 DNA 作 探 针 , 发 现 真 核 DNA 中 单 拷贝 顺序 和 重复 顺序 是 间隔 排列 的 。 这 里 讲 的 重复 顺序 是 指 从 复 性 动力 学 看 复 性 比较 快 的 、 功 能 上 未 知 的 一 类 DNA 片 眉 。 这 种 间隔 排列 可 以 分 成 二 类 ,一 种 称 为 爪 蟾 型 ,一 种 称 为 果 蝇 型 。 绝 大 多 数 真 核 DNA

© 35 。

都 属于 爪 蟾 型 。 它 的 组 织 形式 是 约 300bp 长 度 的 重复 顺序 .中间 间 隔 了 大 约 800—1,000bp 长 度 的 单 拷贝 顺序 。 重 复 顺 序 约 占 整个 基因 组 的 25% WKADSEKEN 2,000—6,000bp 长 度 的 重复 顺序 , 约 占 5 多。 在 果 蝇 型 中 ,重复 顺序 长 达 3,500 一 5,000bp, 间隔 的 单 拷 贝 顺 序 的 长 度 大 于 13,000bp。 近 来 也 发 现 有 介 于 二 者 之 间 的 组 织 类 型 ,如 鸡 的 .DNA 顺序 组 织 就 是 如 此 。

这 些 重复 顺序 按 顺 序 相 似 程度 可 以 分 成 不 同 的 家 族 ,每 个 家 族 的 大 小 可 以 不 同 , 但 都 包含 一 些 成 员 。 重 复 顺 序 大 多 是 可 以 转录 的 ,不 同 的 家 族 转录 的 频率 也 不 同 。 有 类 指出 ， 重复 顺序 的 转录 有 明显 的 组 织 特异 性 。 在 多 核糖 体内 没有 发 现 这 些 重复 顺序 的 转录 产物 ， 可 能 它们 仅 局 限于 细胞 核 内 。

复 性 动力 学 是 研究 DNA 顺序 组 织 一 个 很 好 的 手段 , 但 是 用 这 个 方法 得 到 的 是 统计 学 上 平均 的 结果 ,是 一 种 粗 线条 的 概 瑶 , 要 得 到 比较 精细 的 结果 必须 结合 其 他 的 手 疏 。 以 下 就 不 同类 型 的 基因 的 组 织 作 些 简 单 的 讨论 。

最 终 产物 是 RNA 的 基因

这 里 指 的 是 编码 核糖 体 中 RNA 的 基因 和 编码 tRNA 的 基因 。 这 些 基 因 的 产物 都 是 铅 蛋 白质 的 生物 合成 有 关 的 RNA, 在 细胞 内 的 含量 比较 高 ,都 属于 中 度 重 复 顺 序 。

(DNA #H DNA 中 ，rDNA 一 般 重 复 程度 达 几 百 次 。 如 酵母 中 rDNA 重 复 140 次 , 果 蝇 中 130 一 250 ve, MHS 400—600 次 ， 人 是 300 次 左右 。 真 核 生 物 的 核糖 体 包含 四 种 RNA， 即 28S, 188, 5.88 和 5S RNA。 在 低 等 真 核 生物 中 ,这 四 种 RNA 的 基因 都 串联 在 一 起 。

_5S 18S 5.89 25S

[4 Waa Wi.)

2-18 酵母 rDNA 的 顺序 组 织

图 2-18 是 酵母 的 rDNA 的 顺序 组 织 , 图 中 带 斜 线 的 部 分 代表 rRNA EA, RHE 间 的 间隔 , 带 箭头 的 波纹 线 表示 转录 的 方向 和 长 度 。 从 图 中 我 们 可 以 看 到 ,18S、5.8S 和 25S 组 成 一 个 转录 单位 ，5S 构成 一 个 独立 转录 单位 ， 两 个 转录 单位 的 方向 是 相反 的 。 同 时 ,基因 和 基因 之 间 有 间隔 区 ,间隔 区 可 分 为 两 类 :一 类 是 不 转录 RNA 的 ;如 5S 和 18S 之 浊 的 间隔 区 ; 另 一 类 是 可 以 转录 在 原始 RNA 产物 中 ,如 18S 和 5.8S、5.8S 和 258 之 间 的 间隔 区 ,但 不 出 现在 成 熟 的 RNA 分 子 中 , 这 些 间 隔 区 在 RNA 成 熟 过 程 被 修剪 掉 了 。

在 比较 高 等 的 真 核 DNA 中 ,5S 基因 不 同 其 他 rRNA 基因 串联 在 一 起 ,因此 rDNA 一 般 只 包含 26$S,，5.8$，18S 三 个 基因 串联 在 一 起 的 一 段 DNA, MRAN rDNA HAA 如 可 2-19 所 示 。

140

18S 5.8S 26S

2-19 He rRNA 的 顺序 组 织 每 个 重复 单元 的 大 小 是 6.9 X 10 ,其 中 6 X 10 是 转录 成 rRNA 的 前 体 , 1 x -10° 的 顺序

“6 «

不 转录 成 RNA. KB rDNA 的 间隔 区 组 成 和 长 度 都 是 均一 的 ,这 种 例子 并 不 多 见 ,在 大

多 数 生物 中 rDNA 的 间隔 区 在 长 度 上 和 组 成 上 都 有 些 变 化 。

有 些 . rDNA， 如果 蝇 的 28S 基因 被 插入 顺序 (intervening sequence) 分 开 。 间 隔 区 是 指 基因 之 间 的 不 出 现在 成 熟 产物 中 的 顺序 ,而 插 人 顺序 则 是 指 基 因 〈 结 构 基 因 ) 内 部 的 不 出 现在 成 熟 产 物 中 的 顺序 ;在 RNA 成 熟 即 加 工 过 程 中 ,间隔 区 只 要 删除 即 可, 而 插 人 顺序 非但 要 删 去 ,而 且 还 要 把 断 开 的 RNA 拼接 起 来 才能 保持 基因 产物 的 完整 性 (关于 斩 工 细 节 见 第 五 章 )。

5S DNA 上面 已 经 提 到 了 ，, 在 比较 高 等 的 真 核 生 物 中 5S DNA 独立 组 成 一 个 转 录 单 位 ,不 与 其 他 rRNA 基因 串联 在 一 起 。 不 同 的 生物 中 SS DNA 的 组 织 也 很 不 同 。 例 如 人 的 5S DNA 仅仅 集中 在 染色 体 的 一 个 部 位 上 , 果 蝇 的 SS DNA 位 于 染色 体 .I 的 在

臂 , 而 爪 蟾 的 5S 基因 却 散布 在 18 个 染色 体 中 的 15 个 上 面 。

果 蝇 的 SS 基因 组 织 比 较 简单 。 果 蝇 染色 体 共有 160 个 5S 基因 的 拷贝 串联 在 一 起 ， 前 80 个 拷贝 和 后 80 个 找 贝 在 功能 上 可 能 独立 起 作用 而 不 相互 干扰 。5S 基 因 中 还 没有 发 现 插 人 顺序 。 每 个 拷贝 之 间 的 间隔 区 的 长 度 和 组 成 稍 有 变化 ,特别 有 趣 的 是 5S 基因 的 间 隔 区 不 转录 成 RNA， 原 始 的 转录 产物 就 是 成 熟 的 5S RNA。

在 爪 蟾 中 有 9,000 一 24,000 个 5S EA, as 5S 基因 包括 四 种 不 同 的 5S RNA, 25 最 大 的 两 种 5S RNA 有 七 个 碱 基 不 同 。 在 爪 蟾 卵 中 , 合成 所 有 这 四 种 5S RNA; 在 肾 细胞 中 只 合成 一 种 。 肾 细胞 中 所 表达 的 5S 基因 可 能 只 占 总 的 5S 基因 的 3%. OT SB 5S 基因 的 核 昔 酸 顺 序 以 后 ,发 现 有 一 个 特殊 的 现象 ,就 是 除了 5S 基因 之 外 , 紧 接着 一 个 不 转 录 的 5S 基因 ， 称 为 伪 5S 基因 。 它 比 正 常 的 SS 基因 短 20 个 碱 基 对 。 这 种 伪 基因 起 什么 作用 目前 还 一 无 所 知 。

5S RNA 是 不 经 过 前 体 直接 从 基因 上 转录 出 来 的 产物 ,如 前 面 很 多 例子 所 表明 的 ,一 般 启 动 基因 都 是 在 基因 的 5 上游。 然而 用 重组 DNA 的 方法 制备 了 一 系列 不 同位 置 碱 基 缺 失 的 5S 基因 ， 然 后 再 进行 体外 转录 ， 发 现 了 一 个 十 分 奇特 的 现象 ， 即 5$ 基因 的 启 动 基因 不 在 它 的 5 端 ,而 在 基因 本 身 的 中 间 。 这 在 基因 组 织 上 是 一 个 新 的 现象 ,位 于 基因 | 本 身 中 间 的 启动 基因 如 何 控制 基因 的 转录 也 是 一 个 有 趣 的 问题 。

tRNA 基因 tRNA 是 从 tRNA BURBS. tRNA 前 体 平均 长 度 约 140 个 核 苷 酸 。 在 爪 蟾 中 有 40 种 不 同 的 tRNA, 平均 每 种 CRNA 基因 有 200 个 拷贝 ,这 2008 贝 串联 在 一 起 构成 一 个 重复 单位 。 果 蝇 中 有 75 个 RNA 基因 拷贝 在 酵母 中 约 有 320— 400 个 tRNA 基因 。 假定 酵母 的 了 RNA 种 类 也 是 40 种 ， 那 么 每 一 种 RNA 基因 约 有 8 一 10 个 拷贝 。

近年 来 分 析 了 很 多 RNA 基因 的 碱 基 顺 序 ,发现 有 二 个 特点 ,第 一 ,尽管 编码 同样 的 RNA， 如 都 是 编码 酷 氨 酸 RNA 的 基因 ,也 尽管 转录 出 的 tRNA 完全 一 样 ， 但 基因 前 后 的 碱 基 顺 序 每 个 成 员 都 不 一 样 。 第 二 ;有些 RNA 基因 有 插 人 顺序 ,而 有 些 则 没有 ,局 样 是 酷 氨 酸 RNA 基因 ,有 的 拷贝 中 有 18 ARABIA, MANE 19 HER 的 插 和 人 顺序 。 现 已 分 离 纯 化 了 一 个 剪接 酶 ， 它 能 正确 地 切除 tRNA 中 的 插 人 顺序 ,并 把 WTA RE MIEN RNA 分 子 。 前 接 酶 的 种 属 特异 性 似乎 不 是 很 专 一 。 酵母 的 带 插 人 顺序 的 tRNA 前 体 也 能 在 爪 蟾 卵 母 细胞 中 正确 地 剪接 。

以 上 是 从 DNA 顺序 组 织 角度 简单 地 讨论 了 最 终 产 物 为 RNA 的 基因 组 织 的 情况 ，

e 37 。

较为 详细 的 内 容 以 及 转录 和 加 工 问题 参阅 第 五 章 。 VOEWTARN TU Bel, ee RNA 的 基因 组 织 是 极其 复杂 的 ,没有 一 个 共同 的 规律 可 循 。 在 不 同 的 生物 体内 这 些 基 因 的 组 织 是 不 同 的 ,即使 在 同一 生物 体内 ， 编 码 同一 产物 的 基因 的 组 织 也 是 多 样 的 ,即使 是 同一 种 产物 ,有 时 也 有 细微 的 差别 。 这 些 组 织 上 的 差别 可 能 具有 功能 上 的 意义 ;但 是 我 们 对 此 知之 甚 少 。

最 终 产物 是 蛋白 质 的 基因

最 终 产 物 为 蛋白 质 的 基因 有 几 个 特点 ,分 述 如 下 :

(1) 蛋白 质 基 因 的 数目 可 能 是 单 拷贝 的 ,也 可 能 是 多 拷贝 的 。 多 拷贝 基因 的 产物 ,如 组 蛋白 , 肌 动 蛋白 , 角 蛋 白 等 ， 一 般 都 属于 需求 量 比较 大 的 蛋白 质 。 但 是 需求 量 大 的 蛋 让 质 的 基因 不 一 定 都 是 多 拷贝 的 ,例如 珠 蛋 白 基 因 ， 卵 白 蛋白 基因 都 是 单 找 贝 基因 ， 尽 管 在 红血球 中 绝 大 部 分 蛋白 质 是 血红 蛋白 ,在 鸡 卵 白 中 , 绝 大 部 分 蛋白 质 是 卵 白 蛋白 。

(2) 在 功能 上 相关 的 基因 可 以 联 在 一 起 ,也 可 能 相隔 很 远 。 以 珠 蛋 白 为 例 。 血 红 蛋 白 包 含 二 条 c 珠 蛋 白 链 , 二 条 8 珠 蛋白 链 ， 在 人 细胞 中 , o 链 和 有 链 的 基因 不 是 串联 在 一 起 ,而 且 不 在 同一 个 染色 体 上 ,前 者 位 于 染色 体 16 ,后 者 位 于 染色 体 I, c BRT HEME 链 构成 正常 成 人 的 up， 血红 蛋白 之 外 ,还 能 同 > 珠 蛋白 和 8 珠 蛋 白 构 成 ar, 和 a6 fl 红 蛋 白 。 在 胎儿 血液 中 主要 是 wy; 血红 蛋白 ,一旦 出 生 后 ,血液 中 血红 蛋白 的 类 型 就 逐步 变 成 wp, 型 ,以 及 少量 0,6, Bo Bo, 7 (包括 ^y 和 sy) 珠 蛋白 都 属于 B 类 型 。B 类 型 的 珠 蛋 白 基 因 都 串联 在 一 起 ,中 间 以 间隔 区 隔 开 。 每 种 类 型 的 珠 蛋 白 都 是 分 别 转 录 的 (图 2-20)。 1

人 Ar 8 : B

A2-20 人 B 类 型 珠 蛋白 基因 的 排列 (Kb 代表 千 碱 基 对 )( 图 中 Gr 应 为 sy,， Ar 应 为 Ar) H2B H3 HH2A Hi BS WA. G_£Vh_£$G

Al2-21 组 蛋白 基因 的 排列

图 2-21 是 组 蛋白 基因 的 组 织 ， 细 胞 核 内 组 蛋白 一 共有 五 种 ， 分 别称 为 H1, H2A, H2B、H3 和 H+, 这 五 种 蛋白 质 的 基因 串联 在 一 起 ,构成 一 个 重复 单位 。 在 海胆 中 ,这 个 重复 单位 长 约 5,400 bp， 在 整个 基因 组 中 重复 几 百 次 。 虽然 过 去 有 人 认为 组 蛋 自 基因 可 能 转录 在 一 个 mRNA 中 ,然后 分 别 翻译 出 不 同 的 组 蛋白 , 即 认 为 组 蛋白 基因 是 多 顺 反 子 的 。 但 最 近 的 实验 结果 表明 五 个 组 蛋白 基因 是 分 别 转录 出 各 自 的 mRNA, 就 是 说 组 蛋白 基因 也 是 单 顺 反 子 结构 。 途 今 为 止 在 真 核 生物 中 还 没有 发 现 一 个 蛋白 质 基因 是 多 顺 反 子 结构 的 ,这 是 真 核 生 物 和 原核 生物 蛋 白 质 基 因 结构 的 一 个 很 重要 的 区 别 。

虽然 现在 普遍 认为 真 核 细 胞 中 ,蛋白 质 基 因 组 织 中 都 是 单 顺 反 子 结构 ,也 就 是 说 一 个 基因 对 应 一 个 mRNA， 一 个 mRNA 对 应 一 条 肽 链 , 但 是 这 并 不 排除 一 个 肽 链 通过 后 加 工 可 以 生成 几 种 不 同性 质 的 蛋白 质 或 多 肽 。 例如 促 肾 上 腺 激素 -8- 脂 肪 酸 释 放 因子 前 体 的 mRNA (EM cDNA 核 背 酸 顺 序 已 完成 ， 共 /1091 核 背 酸 ) 能 翻译 成 一 条 蛋白 链 。 这

* 38 °

个 前 体 蛋白 通过 后 加 工 能 生成 促 肾 上 腺 素 、6- 脂 肪 酸 释放 因子 、 促 黑 激 素 ,8- 内 非 肽 等 不 同 的 激素 ,而 且 从 前 体 的 顺序 ， 还 能 推测 可 能 存在 的 但 目前 尚未 发 现 的 激素 。 图 2-22 就 表示 促 肾 上 腺 激素 -86- 脂 肪 酸 释放 因子 前 体 通 过 后 加 工 可 以 产生 很 多 种 激素 。

| 转录

mRNA rr 人 个 八 人 AAVU | | at

蛋白 质 前 体 。 TGSYTZRZPSIOUOOSOCZOONOOSSRTRP 二 加工

wx TION TOSS +-MSH ACTH, B-LPH TH TD GIO WR a-MSH CLIP vie Fae Ts ss B-MSH 甲 硫 脑 啡 咏

图 2-22 促 肾 士 腺 激素 -6B- 脂 肪 酸 释 放 因子 前 体 及 后 加 工 产物 ACTH, LIER; MSH， 促 黑 激 素 ; LPH, 脂肪 酸 释放 激素 ; CLIP, ER RRA PAK. 总 之 对 真 核 生 物 而 言 ,功能 上 相关 的 基因 可 能 串联 在 一 起 , 也 可 能 相隔 很 远 , 但 是 不 论 哪 种 情况 ,蛋白 质 基 因 都 是 单 顺 反 子 结构 。 (3) 很 多 蛋白 质 基 因 包 含 插 人 顺序 上 一 节 已 提 到 ,酵母 tDNA AIR rDNA SHAME. 许多 目前 研究 得 比较 多 的 蛋白 质 的 基因 都 发 现 有 插 人 顺序 (但 组 蛋白 基因 没有 插 人 顺序 ,这 一 点 已 从 核 苷 酸 顺 序 测 定 予 以 最 后 肯定 )。 由 于 基因 上 有 了 插 人 顺序 ， 使 得 编码 一 个 蛋白 质 的 DNA 顺序 在 基

图 2-23， 鸡 卵 白 蛋白 基因 中 的 插 人 顺序

带 斜 线 方 框 为 编码 蛋白 质 的 结构 基因 , 即 外 显 子 , 外 显 子 之 闻 为 插入 顺序 ， 即 内 含 子 。 图 中 有 七 个 内 含 子 和 七 个 外 显 子 加 一 个 前 导 顺 序 工 。

« SERBS 1 30 31 104 105 146

本 | 5/ 非 编码 区 插入 顺序 I 插入 顺序 Q 。 3 SERB (ll6bp) (647bp)

2-24 小 鼠 BRERA RAI B 珠 蛋白 由 146 氨基 酸 组 成 ,被 三 个 隔 开 的 外 显 子 所 编码 ? 基 因 中 除 插 和 顺序 外 ,还 转录 出 两 端的 非 编码 区 。

es 39 。

因 上 是 不 连续 的 。 已 有 几 十 种 蛋白 质 基因 含有 插 人 顺序 ,如 c\8、5 珠 蛋白 ,免疫 球 蛋白 的 重 链 和 轻 链 , 卵 白 蛋 白 ( 见 图 2-23), 溶菌 酶 ，SV40,， 腺 病毒 等 。 图 2-24 是 8 珠 蛋 自 基因 插入 顺序 的 分 布 情况 。 插 人 顺序 有 一 专 有 名 称 ， 称 为 内 含 子 ,编码 蛋白 质 顺 序 的 那 部 分 DNA 称 为 外 显 子 (也 见 第 五 章 第 165 页 )。

插入 顺序 的 生物 功能 还 很 不 清楚 。 在 产生 卵 白 蛋白 和 不 产生 和 卵 白 蛋白 的 细胞 之 间 ， 卵 白 蛋白 基因 的 插入 顺序 没有 区 别 ， 因 此 播 人 顺序 和 转录 的 效率 没有 关系 。 在 分 化 细胞 . 和 生殖 细胞 之 间 , 卵 白 蛋 白 基 因 的 插入 顺序 也 没有 区 别 ,因此 在 分 化 过 程 中 插入 顺序 没有 变化 。 但 是 在 不 同 的 个 体 中 插入 顺序 有 细微 的 差 异 。 有 些 实验 结果 说 明 ， 插 人 顺序 同 mRNA 转 录 后 的 命运 密切 有 关 ; 也 有 人 认为 插 人 顺序 是 对 生物 进化 十 分 有 利 的 基因 组 织 方式 ， 因 为 有 了 这

图 2-25 ”免疫 球 蛋 白 肽 链 的 基本 结构 种 方式 ， 基 因 很 容易 通过 重组 而 产生 带 有 新 功能 的 蛋白 质 。 免 疫 球 蛋 白 重 链 的 插 人 顺序 的 排列 方式 支持 这 个 假说 ， 因 为 免疫 球 蛋白 的 每 个 外 显 子 所 编码 的 肽 眉 实 际 上 是 一 个 独立 的 功能 单元 。

图 2-25 是 免疫 球 蛋白 的 肽 链 的 基本 结构 。 免 疫 球 蛋白 由 二 条 重 链 和 二 条 轻 链 构成 > 轻 链 和 重 链 都 可 分 成 二 部 分 ,一 部 分 是 恒定 区 ,这 个 区 域 的 氨基 酸 顺 序 在 不 同 的 抗体 中 是 不 变 的 ; 另 一 部 分 是 可 变 区 ,可 变 区 的 氮 基 酸 顺 序 随 抗体 专 一 性 而 变化 。 重 链 的 恒定 区 又 可 分 成 三 个 部 分 〈CH:、CH、CH:)， 每 个 区 域 约 由 110 个 氨基 酸 组 成 。CH' 区 域 同 轻 链 的 Cy (ial Va 和 Vi 一 起 ) 构 成 > 球 蛋白 的 Fe 部 分 , 二 条 重 链 的 CH, 和 CH; 组 成 Fe 部 分 。Fe 和 Fe 由 一 个 绞 接 区 连接 。 对 免疫 球 蛋 白 的 功能 进行 深入 研究 后 发 现 ， 这 些

区 域 各 上 自 都 有 自己 特有 的 功能 。 Vu Vi 配 信号 肽 _V; 绞 链 区 Cr

对 , 这 部 分 是 负责 同 抗原 结合 的 ; CH， 是 轻 。。 轻 细 基因 WWW 链 的 附着 ;配对 的 CH， 用 于 补体 固定 ;配对

的 CH, 负责 同 细胞 表面 相互 作用 。 还 有 一 odes ee

ANinfa sik, ARKBANDDWAX Dit 重 链 基 因 LERERZANRERMFRRD—-MR 籽 | | | | 有 意义 的 事实 ， 即 编码 每 个 功能 部 分 的 顺序 “区 8 so YY ty Ao ZoZ 都 被 一 个 播 入 顺序 分 开 。 图 2-26 1 Pape a (290bp) (39bp) (2205p) (320bp) 免疫 球 蛋 白 的 轻 链 和 重 链 的 基因 结构 。 从 图 图 2-26 免疫 球 蛋 白 重 链 和 轻 链 基 因 的 结构 中 可 以 很 铺 楚 地 看 到 每 个 外 显 子 都 编码 一 个 有 一 定 功 能 的 肽 链 。

6 珠 蛋 白 有 三 个 外 显 子 ( 见 图 2-24)， 虽 然 每 个 外 显 子 的 功能 没有 象 免疫 球 蛋 白 区 分 得 那么 明显 ， 但 是 可 以 发 现 同 血 红 素 结合 的 氮 基 酸 大 多 处 于 中 间 的 那个 外 显 子 中 。 有 的 实验 指出 , 一 个 基因 中 的 内 含 子 就 是 另 一 个 基因 的 外 显 子 ， 表 明 这 段 DNA 序列 也 有 编 码 功能 。 近 来 发 现 , 在 酵母 线粒体 中 有 一 个 内 含 子 同 时 存在 着 起 始 密码 子 和 终止 密码 子 ， 能 编码 一 个 有 235 个 氮 基 酸 的 蛋 自 质 ， 表 明 所 谓 内 含 子 其 本 身 可 能 是 一 个 独立 的 结构 基 因 。

总 结 以 上 例子 有 人 提出 ,每 个 外 显 子 实际 上 是 来 自 一 个 原始 蛋白 质 , 内 含 子 也 可 能 具 有 生物 功能 。 外 显 子 和 内 含 子 镶嵌 的 方式 可 能 是 蛋白 质 进 化 的 遗迹 ， 而 且 也 是 进一步 进 化 的 原料 。 可 能 正 因 为 有 了 插 大 顺序 这 种 基因 组 织 , 大 大 加 速 了 真 核 生 物 的 进化 。

« 40 。

CH, 2K CH, CH,

2-27 在 生殖 细胞 和 浆 细 胞 中 A, 基因 组 织 的 比较

(4) 在 一 个 生物 中 ，DNA 顺序 组 织 可 能 是 可 变 的 。 一 个 例子 是 免疫 球 蛋 蝗 fo.

”和 轧 链 的 基因 在 浆 细胞 中 ,V:〈 可 变 区 ) 和 J\ 绞 链 区 ) 是 连 在 一 起 的 , 而 在 胚胎 细胞 中 这 二

个 区 域 是 分 开 很 远 的 ; 如 图 2-27 所 示 ， 在 分 化 过 程 中 通过 基因 重组 Vi MI RRA 在 一 起 。 这 种 基因 重组 的 方式 是 产生 多 种 免疫 球 蛋白 的 机 制 之 一 。 除 了 在 免疫 反应 过 程 中 基因 有 重组 现象 外 ;在 真 核 生 物 中 也 观察 到 类 似 原 核 生物 的 基因 转移 。 五 十 年 代 早 期 ; 大 们 就 发 现 ， 某 种 可 转移 的 基因 决定 了 玉米 粒 的 色泽 和 形状 。 后 来 又 发 现 果 蝇 的 眼睛 的 颜色 取决 于 某 个 可 转移 的 多 拷贝 基因 ,因此 某 些 DNA 片段 可 以 在 染色 体 转 位 的 现象 是 肯定 的 。

现在 还 不 知道 这 种 现象 是 局 限于 某 些 生物 某 些 基 因 的 特例 ， 或 是 在 其 分 化 过 程 中 也 . 会 产生 DNA 顺序 组 织 的 变化 。 从 已 有 的 实验 结果 似乎 说 明 ; 在 细胞 分 化 过 程 中 ，DNA 顺序 组 织 的 变化 即使 存在 ,也 不 是 一 种 普遍 的 现象

《5) 在 真 核 生 物 中 ， 可 能 存在 一 种 原核 生物 中 不 存在 的 基因 表达 的 调控 单元 ， 称 为 “ 增 效 子 ” (enhancer)， 猴 病毒 40 (SV40) DNA 中 存在 二 段 顺序 和 方向 完全 一 样 的 72: 碱 基 对 的 片段 , 它 对 SV40 早期 基因 的 表达 是 必须 的 ,把 这 一 DNA 片段 和 其 他 基因 ( 比 如 有 B 珠 蛋白 基因 ) 连 在 一 起 转化 细胞 以 后 ,测定 珠 蛋 白 基 因 的 表达 效率 ， 实 验 结 果 表 明 这 72bp 片段 大 大 促进 了 珠 蛋 白 表达 ， 而 且 这 种 效应 同 72bp 片段 同 珠 蛋白 基 因 之 间 的 相对 距离 和 方向 都 没有 关系 ， 但 和 细胞 的 种 类 有 关 。 具 有 这 种 效应 的 DNA 片段 称 为 “ 增 效 子 "。 不 但 SV40 RABAT” ,其 他 一 些 肿 瘤 病 毒 中 也 有 类 似 的 增 效 子 ”， 但 碱 基 顺 序 差异 很 大 。 除 病毒 外 , 某 些 真 核 基 因 内 也 具有 这 样 类 似 的 调控 单元 。

Baz, 真 核 生物 DNA 顺序 组 织 是 很 复杂 的 ， 没 有 一 个 简单 的 规律 可 循 。 我 位 对 它 的 认识 还 处 在 初步 阶段 。 至 于 顺序 组 织 和 功能 的 关系 更 是 知之 不 多 ， 有 待 于 进一步 研究 。

三 、DNA 的 二 级 结构 DNA 双 螺 旋

DNA 的 水 溶液 是 俱 粘 稠 的 ,加 热 又 能 使 溶液 粘度 大 大 降低 , 这 说 明 DNA FRA 一 定 结构 。DNA 分 子 应 该 具有 怎样 的 结构 才能 使 它 的 溶液 有 这 种 流体 力学 性 质 呢 ? 四 十 年 代 Pauling i SRAM o 螺旋 模型 ， 同 时 人 们 已 经 知道 DNA 是 遗传 信息 的 载 体 , 那 么 DNA 应 该 具有 怎样 的 结构 才能 成 为 基因 载体 呢 ? 1953 年 Watson 和 Crick 二 人 提出 了 DNA 双 螺 旋 模 型 ， 这 个 模型 不 仅 解释 了 当时 所 知道 的 DNA 的 一 切 理化 性 质 ， 而 且 将 结构 与 功能 联系 起 来 ;大 大 推动 了 分 子 生物 学 的 发 展 , 其 历史 功绩 怎样 评价 也 不 过

e 4] e

分 。

双 螺 旋 提出 的 根据

当时 提出 DNA 双 螺 旋 结构 的 根据 主要 有 三 方面 。

第 一 ，Astbury 很 早 就 用 射线 衍射 方法 研究 DNA 纤维 的 结构 ， 后 来 Wilkins 等 人 得 到 更 加 精美 的 DNA 纤维 的 和 射线 衍射 图 ,这 些 衍 射 图 提示 DNA 分 子 可 能 具有 螺 旋 结 构 。 一 些 强 的 衍射 点 表明 DNA 分 子 中 有 3.4 人 和 34 人 的 周期 性 的 结构 。

其 次 ，Chargaff 分 析 了 大 量 不 同 来 源 的 DNA 的 碱 基 组 成 ,发 现 不 象 原来 假定 的 那 RE, DNA 是 由 等 量 的 A、G、C、T 组 成 。 相 反 ， 不 同 来 源 的 DNA, HEL 例 是 未 同 的 ,但 是 有 一 个 共同 的 规律 , 即 胸腺 喀 啶 的 摩尔 含量 等 于 腺 味 叭 的 摩尔 含量 ， 胞 喀 喧 的 摩 尔 含量 总 是 等 于 鸟 嘎 叭 的 摩尔 含量 ; 即 [A] = [T] 和 [G] = [C].

第 三 ,根据 四 种 碱 基 的 物化 数据 , 碱 基 可 以 分 成 大 小 二 种 , 嘎 叭 比 院 天 些 , 如 果 A-T 配对 或 G-C 配对 ,二 个 碱 基 对 的 几何 大 小 十 分 相近 ;同时 这 两 种 碱 基 配 对 在 化 学 EBA 理 的 ， 因 为 从 味 叭 和 喀 啶 的 氨基 和 酮 基 以 及 它们 的 键 长 键 角 来 看 ，A-T 之 间 以 及 G2C 之 间 能 形成 合适 的 氢 键 ; 从 酸 碱 滴 定 的 实验 结果 看 ， DNA 分 子 中 氨基 和 了 酮 基 可 能 是 形

图 2-28 双 螺 旋 DNA 的 分 子 模型 左 为 实心 模型 右 为 相应 的 糖 -磷酸 主 链 , 并 标明 大 沟 和 小 沟 。

RABERY o

如 果 我 们 把 DNA 想象 成 是 双 螺旋 分 子 ， 那么 以 上 的 结果 都 可 以 得 到 完满 的 解释 。 按照 这 个 假定 去 建立 DNA 分 子 模 型 ,立即 发 现 DNA 必然 是 由 二 条 链 组 成 的 右手 双 螺 旋 ( 图 .2-28)。

双 螺 旋 的 基本 特征

主 甸 脱氧 核糖 和 磷酸 基 相 互 间隔 连接 构成 DNA 的 主 链 。 从 化 学 键 的 方向 来 看 , 双 螺 旋 中 两 条 多 核 昔 酸 链 是 反 平 行 的 。 二 条 主 链 处 于 螺旋 的 外 侧 , 碱 基 处 于 螺旋 的 内 部 ,由 于 糖 和 磷酸 根 的 化 学 性 质 , 主 链 是 亲 水 性 的 。 两 条 链 形 成 右手 螺旋 ， 有 共同 的 螺旋 轴 , 螺 旋 的 直径 是 20A。

碱 基 对 由 于 几何 形状 的 限制 ， 只 能 由 喀 喧 和 味 叭 配对 才能 使 碱 基 对 合适 地 安置 在 双 螺 旋 内 。 若 二 个 喀 啶 配对 则 几何 形状 太 小 ;二 个 吐 叭 配对 则 几何 形状 又 太 大 ,为 双 螺 旋 所 容纳 不 下 。 只 有 A-T DENA G-C 碱 基 对 的 几何 形状 正 适 合 双 螺旋 的 大 小 。 这 两 种 碱 基 对 有 一 个 重要 的 特征 ,就 是 它们 具有 二 次 旋转 对 称 性 , 即 一 对 碱 基 对 旋转 180"，- 并 不 影响 双 螺 旋 的 对 称 性 ， 因 此 双 螺 旋 结 构 只 限定 了 配对 的 方式 ， 并 不 限定 碱 基 的 顺序 (图 2-29)。

2-29 DNA 双 螺 旋 中 的 碱 基 对

碱 基 环 是 一 个 共 斩 环 ,本 身 构 成 一 个 平面 分 子 。 在 双 螺 旋 中 这 个 平面 垂直 于 螺旋 轴 ， 相 邻 的 两 个 碱 基 上 下 间隔 3.4A， 每 十 对 碱 基 组 成 一 节 螺 旋 ,， 因 此 双 螺 旋 的 螺 距 是 34A。 一 条 链 中 每 个 相 邻 的 碱 基 的 方向 相差 36"。 碱 基 之 间 的 朴 水 作用 可 导致 碱 基 堆 积 ， 这 个 引力 同 碱 基 对 之 间 氢 键 一 起 稳定 了 双 螺 旋 结构 。

大 沟 和 小 沟 ， 沿 螺旋 轴 方 向 观察 ， 配 对 的 碱 基 并 不 充满 双 螺旋 的 空间 。 由 于 碱 基 对 的 方向 性 ,使 得 碱 基 对 占据 的 空间 是 不 对 称 的 ,因此 在 双 螺 旋 的 表面 形成 二 个 目下 去 的 KEKE ,一 个 糟 小 些 , 分 别称 为 大 沟 和 小 沟 。 双 螺 旋 表 面 的 沟 对 DNA 和 和 蛋白质 的 相互 识别 是 很 重要 的 ,因为 只 有 在 沟 内 才能 觉察 到 碱 基 的 顺序 , 而 在 双 螺 旋 的 表面 , 是 脱氧 核糖 和 磷酸 的 重复 结构 ,没有 信息 可 言 。

双 螺 旋 的 种 类

上 面 我 们 所 讨论 的 双 螺 旋 的 特征 是 属于 所 谓 B 型 双 螺 旋 。 这 是 DNA 钠 盐 的 纤维 在 相对 湿度 90 多 时 所 处 的 状态 。 当 外 界 条 件 变 化 时 , 双 螺 旋 的 特征 也 有 变化 ， 出 现 了 新 的 形式 。 一 般 认 为 B 型 双 螺旋 最 接近 于 DNA 分 子 的 溶液 状态 。

当 DNA 钠 盐 〈 或 钾 盐 、 铭 盐 ) 在 相对 湿度 75%}, DNA 纤维 就 处 于 A 型 的 构象 EA B 型 的 区 别 在 于 碱 基 平 面 不 是 垂直 于 螺旋 轴 ， 而 是 倾斜 20", 每 个 碱 基 升 高 2.56A，

二 个 相 邻 的 碱 基 夹 角 为 32.7"， 螺 距 是 28 A， 糖 磷酸 主 链 的 构 型 也 稍 区 别 于 B 型 (图 2- 30)。

图 2-30 A-DNA 和 B-DNA 的 比较

A 型 和 B 型 是 DNA 分 子 的 二 个 基本 的 双 螺 旋 形 式 。 在 一 些 均 聚 或 共聚 核 背 酸 中 ， 还 可 能 出 现 一 些 其 他 的 构象 形式 ， 但 它们 可 以 分 别 归 人 人 A 型 或 B 型 。 如 B' 型 可 以 在 多 KE d(A)- 多 聚 d(T) MAR dGD)- 多 聚 dC) 中 看 到 ， 它 们 的 结晶 形式 稍 区 别 于 BA DNA， 但 是 其 螺旋 常数 (4 = 3.25A, += 36°) 还 是 属于 了 B 型 的 变种 。 当 DNA 2B 盐 相对 湿度 降 到 66 匈 时 ，DNA 变 成 C 型 。 原 来 认为 C 型 和 3B 型 差别 很 大 ， 研 究 表明 并 非 如 此 。C 型 DNA +h, 碱 基 的 倾角 是 6°, 每 个 碱 基 升 高 3.31A， 二 个 相 邻 碱 基 对 的 夹 角 是 38°, 螺 距 是 31A , 这 些 数据 都 和 B 型 接近 。 近 似 于 B 型 双 螺旋 的 还 有 D 型 ,这 种 型 式 在 多 聚 d(AT)- 多 聚 d(AT), BH d(GC)- 多 聚 d(GC)、 多 聚 d(ATT)- 多 聚 d(AAD) FIZ d(AIC)-BH ICT) 等 多 聚 物 中 出 现 。 它 同 B 型 DNA 在 结构 上 的 主要 差别 在 于 每 个 碱 基 仅 升 高 3A ,倾角 增加 到 45? ,小 沟 的 宽度 明显 减 小 。 在 这 种 结构 中 ,大 分 子

© 44 。

在 外 部 不 能 从 小 沟 中 感觉 到 碱 基 顺 序 的 变化 。

属于 A 型 一 类 的 双 螺 旋 还 有 A' 型 和 A”, A’ MARES R d(CT)- 多 聚 d(A)-BR d(T) 三 股 螺旋 中 看 到 。 A” 型 只 是 在 多 聚 dCC)- 多 聚 d1)-SR AC) PHBL. HHA 型 中 它们 的 Cy 都 是 内 糖 环 构 型 ,就 是 C 和 Cy 是 在 同一 方向 ,因此 在 A 型 DNA 中 碱 基 对 在 螺旋 轴 之 前 。 表 2-3 列 出 不 同 右 旋 双 螺旋 DNA 的 结构 参数 。

表 2-3 不 同 右 旋 双 螺旋 DNA 的 结构 参数

小 沟 宽 | 大 沟 宽 | DWAR | ABR m M d D

7:5& |} 8-58 6.5 8.5 7.9 7.5 6.7 5.8

一 | 一 | 一 | 一 一 | ES | 一 -一 | 一 -一

4.2 12.6 4.4 U2e2 2.8 3

总 的 看 来 , A 型 螺旋 比 B 型 螺旋 拧 得 紧 一 些 , 碱 基 的 倾角 大 一 些 ， 大 沟 的 深度 大 大 超 过 小 沟 的 深度 。 在 了 B 型 螺旋 中 ,大 沟 的 宽度 比 小 沟 大 ,而 两 者 的 深度 相差 不 远 。

外 界 因素 明显 影响 到 DNA 的 构 型 。 前 面 已 经 提 到 ,相对 湿度 对 DNA 纤维 的 构 型 很 有 影响 ,在 90% 相对 湿度 时 DNA 呈 B 型 , 当 相 对 湿度 降 到 75 多 时 就 变 成 A 型 。 盐 的 种 类 和 浓度 对 构 型 同样 有 明显 的 影响 , 当 NaCl 浓度 较 低 时 (二 3%), 即使 相对 湿度 仍 在 92%, DNA 还 是 以 A 型 存在 ; 当 DNA 是 钠 盐 时 , A、B、C 三 种 构 型 都 可 能 出 现 ， 而 改 成 锂 盐 时 ,只 有 C 型 和 B 型 可 能 出 现 。

男 一 个 影响 螺旋 构 型 的 因素 是 DNA 的 碱 基 组 成 和 顺序 以 及 顺序 的 重复 性 , 其 中 起 主要 作用 的 是 碱 基 的 顺序 。 大 多 数 A-T 丰富 的 DNA 自然 倾向 于 形成 B 型 双 螺 旋 。 但 碱 基 顺 序 不 同 会 发 生 构 型 改变 ,如 多 聚 d[LAGT]- 多 聚 d[ACT] 虽然 也 是 A-T 丰富 的 ， 而 它 的 构 型 类 似 于 多 聚 d[G]- 多 聚 d[C]; FH d[GC]- 多 聚 d[GC] 的 构 型 不 象 它 的 组 成 类 似 物 多 聚 dLG]- 多 聚 d[C]， 而 象 它 的 顺序 类 似 物 多 聚 d[AT]- 多 聚 d[LAT]。 总 的 来 讲 , 顺 序 和 构 型 之 间 的 关系 仍 是 很 不 清楚 的 。

很 明显 构 型 的 变化 对 DNA 的 生物 功能 将 会 有 明显 的 影响 ,例如 由 于 RNA 分 子 存 在 2-=OH， 使 得 凡是 含 RNA 的 双 链 分 子 只 能 以 A 型 的 构 型 存在 。 当 RNA 聚合 酶 在 DNA 模板 上 合成 RNA 时 ，DNA 很 可 能 必须 变 成 A 型 。 另外 也 有 人 讨论 DNA 的 变 构 效应 和 长 距离 效应 。 例如 在 阿拉 伯 糖 操纵 子 中 ， 阻 遏 蛋白 作用 于 离 转录 起 始点 150bp 以 外 的 位 点 上 ,即使 距离 如 此 远 仍然 能 阻 遇 RNA 聚合 酶 的 转录 作用。 据 猜 测 可 能 阻 遏 蛋白 结合 到 DNA 分 子 上 去 以 后 改变 了 DNA 的 构 型 ,比如 说 碱 基 的 倾角 ， 这 种 效应 可 以 传 到 启动 子 上 ,使 得 转录 不 能 进行 。 又 例如 小 牛 胸腺 DNA 结合 了 一 种 抗菌 素 后 ， 即 使 结合 量 只 占 DNA 分 子 的 15% ,但 整个 分 子 同 溴 乙 锭 结合 的 能 力 都 变化 了 。 可 能 15 匈 DNA 结构 的 变化 引起 了 整个 分 子 的 构 型 的 变化 。 总 之 ， 以 上 的 迹象 都 提示 了 DNA 双 螺旋 的 构 型 不 是 僵化 不 变 的 。

， 双 螺 旋 在 溶液 中

普遍 认为 DNA 分 子 在 水 溶液 中 也 是 以 双 螺 旋 的 形式 存在 ，DNA 溶液 的 物理 化 学 : 性 质 如 变性 和 复 性 ,粘度 ` 圆 二 色 性 和 小 角度 和 光 散 射 等 结果 支持 这 个 观点 。 而 且 普 遍 认 为 在 水 溶液 中 DNA 呈现 B 型 构 型 ,对 这 个 假定 也 有 一 些 实验 支持 。

近来 有 一 些 实验 表明 在 水 溶液 中 DNA 的 构 型 可 能 稍 偏离 于 B 型 。 从 能 量 角 度 出 发 作 理 论 计 算 , 预 言 在 溶液 中 DNA 最 稳定 的 构 型 的 螺 距 应 该 是 10.5 4S bp, 而 不 是 B 型 所 规定 的 10 bpo 用 由 X174 DNA 复制 型 作 电 镜 观 察 , 也 认为 螺 距 应 该 是 10.53bp， 每 个 碱 基 升 高 2.9 人 入 , 既 区 别 于 B 型 的 3.4A ,也 区 别 于 A 型 的 2.55A。

FERRI, DNA 双 螺 旋 的 构 型 随 条 件 而 变化 。 例如 在 水 溶液 中 加 入 酒精 ， 双 螺旋 就 会 从 B 型 变 到 C 型 ,最 后 变 成 A 型 。B 型 是 极 性 溶液 中 最 稳定 的 结构 。

双 螺 旋 结 构 的 研究 动态

以 上 介绍 了 经 典 的 _DNA 双 螺 旋 模 型 的 结构 ， 概 括 地 说 这 个 模型 有 三 个 基本 特征 ; DNA 的 两 条 链 是 反 向 平行 排列 的 ; 两 条 链 的 互补 碱 基 对 之 间 以 氨 键 相 联 ; 两 条 链 单 向 地 . 按 右 旋 方 式 互相 绕 在 一 起 。 双 螺旋 结构 的 这 些 性 质 已 为 大 量 实 验 事实 所 证 明 ， 可 以 认为 是 客观 地 反映 了 DNA 的 内 在 本 质 , 因 而 是 正确 的 。 近 年 来 ， 发 现 了 DNA 帮手 双 螺 旋 构 型 ,这 是 对 DNA 双 螺 旋 结 构 的 一 个 补充 和 发 展 。 另 外 ;有些 科学 家 对 DNA 两 条 链 互 绕 成 螺旋 的 真实 性 提出 了 不 同 的 见解 。

A. Rich 等 人 用 和 射线 衍射 法 分 析 人 工 合成 的 DNA 小 片段 的 晶体 时 ， 出 乎 意料 地 发 现 d(CGCGCG) BAKA WHE. 在 这 种 双 螺 旋 中 两 条 六 核 昔 酸 分 子 链 以 反方 向 的 形式 排列 着 ,其 间 互 补 GC 碱 基 对 以 氢 键 互相 联结 ， 相 邻 碱 基 对 互相 平行 。 这 些 性 质 基 本 上 与 右 旋 DNA 一 样 , 引 人 注 意 的 双 链 的 旋转 方向 与 右 旋 相反 ， 而 且 磷 原子 联结 线 旺 RUIZ kth DNA 被 命名 为 Z-DNA (A 2-31). Ale Z-DNA 和 右 旋 B-DNA AYE 要 差异 列 于 表 2-4 中 。

Z-DNA 并 不 只 限于 GC 相间 的 DNA 顺序 中 , 很 可 能 嘎 吟 和 喀 啶 相间 排列 的 顺序 有 助 于 Z-DNA 结构 的 稳定 性 。 通 过 从 鼠 和 免 血 中 诱发 的 Z-DNA 抗体 ,已 经 发 现 天 然 DNA 中 有 的 部 分 可 以 与 Z-DNA 的 抗体 相 结合 ,因此 Z-DNA 的 确 是 DNA 的 一 种 存 在 形式 。

由 于 人 工 合成 脱氧 寡 核 音 酸 的 技术 已 日 趋 成 熟 ， 合 成 5 一 10 个 任意 指定 顺序 的 小 片 & DNA 已 不 成 问题 ( 见 第 十 章 ), 这 就 为 进一步 的 结构 分 析 提 供 足 够 的 样品 。 因此 近年 来 从 人 工 合成 的 小 片 侦 DNA 晶体 结构 分 析 获 得 了 大 量 有 关 DNA 结构 的 信息 ,从 而 证 sx A-DNA (CCGG) B-DNA (CGCGAATTCGCG) #1 Z-DNA (CGCG) 的 存在 避 有 趣 的 是 在 两 段 CGCG ,中 插入 AATT 后 的 十 二 核 昔 酸 片 段 以 B-DNA 的 形式 存在 〈 见 第 十 章 表 10-22)。 这 意味 着 一 级 结构 对 DNA 双 链 的 绕 向 及 其 空间 结构 有 一 定 影响 。

最 近 在 测定 pBR322 DNA 的 拓扑 环绕 数 时 发 现 了 另 一 个 用 经 典 的 双 螺 旋 结 构 难 以 解释 的 现象 。 在 4326 对 碱 基 组 成 的 这 种 环 状 DNA 中 , 若 按 每 10 对 碱 基 组 成 一 个 右 螺 旋 计 算 , 则 闭环 状 pBR322 DNA 的 拓扑 环绕 数 应 为 4 x 10?， 但 实际 测 得 的 数值 较 此 小 得 多 ,这 说 明 在 pBR322 DNA 中 可 能 同时 存在 着 左旋 和 右 旋 的 结构 。

e 46 。

Z-DNA

B-DNA

图 2-31 Z-DNA (左旋 ) 和 B-DNA (Ale) HAT RB

2-4 B-DNA 5 Z-DNA 的 比较

B-DNA 螺旋 方向 看 旋 每 一 转 的 核 背 酸 数目 10° BH €@ ~20A et KE BAL A Sh BE BS 3.44 Le 2) 34A 碱 基 平 面 的 倾斜 角 6° 相 邻 碱 基 对 之 间 的 转角 36° 糖苷 键 构象 d_Gr 反 = q@ Gr R = AB) HAIER BS d GpC 9.0A . dCpG 9.0A 轴 心 与 碱 基 的 关系 穿 过 碱 基 对

i ok

ie. ey 8.0A 6.9A

不 穿 过 碱 基 对

前 几 年 新 西 兰 的 几 位 科学 家 提出 可 能 存在 一 种 “ 扁 并 肩 ”的 DNA 结构 。 在 此 结构 中 ，DNA 分 子 的 两 条 链 不 象 经 典 双 螺 旋 那 样 顺 右 旋 方向 绕 在 一 起 ， 而 是 绕 了 半 周 又 BAMA, mA 2-32 右 图 所 表示 。 左 图 为 经 典 双 螺旋 DNA 模型 ， 两 条 分 子 主 链 顺 右 旋 方向 绕 在 一 起 ， 其 间 以 氢 键 维 系 ; 右 图 为 AIA” DNA 模型 ,两 条 分 子 的 主 链 间 同 样 以 氢 键 维系 ， 但 并 不 绕 在 一 起 。 他 们 认为 这 样 可 以 比较 容易 解释 DNA 的 复制 机 制 。

1953 年 Watson 和 Crick #2HIA9 DNA he ye Ri 已 经 30 年 了 ,但 DNA 的 精细 结构 究竟 如 何 ? 双 螺旋 的 绕 向 与 其 一 级 结构 关系 怎样 ? 双 螺 旋 结 构 怎 样 受 外 界 因 素 影

2-32 两 种 DNA 结构 示意 图 左 为 经 典 的 双 螺 旋 模 型 , 右 为 " 肩 并 肩 "模型 。

° 492

i? DNA 结构 在 复制 与 转录 中 的 作用 如 何 ? 等 等 ,都 需要 进行 更 为 深 人 的 研究 。 变性 和 复 性

维持 双 螺 旋 分 子 的 力

维持 双 螺 旋 分 子 的 力 有 二 种 ,一 种 是 氢 键 ,一 种 是 蕊 水 键 。

乞 键 ”和 氢 原 子 同 一 些 带电 负 性 的 原子 形成 共 价 键 时 ， 电 子 云 偏向 带电 负 性 原子 一 边 , 氢 原子 带 部 分 正 电荷 。 这 种 氢 原 子 同 另 一 个 带电 负 性 的 原子 相互 吸引 而 形成 的 氢 键 。 氢 键 的 受 体 可 以 是 带 部 分 负电 荷 的 原子 ， 也 可 以 是 带 单 位 负电 荷 的 原子 。 如 果 受 体 和 供 体 都 是 带 单位 电荷 的 原子 , 那 就 是 离子 键 了 。 离 子 键 是 氢 键 的 一 个 特例 。

在 氢 键 中 ， 氢 原子 都 是 以 共 价 键 连 在 氧 原 子 或 氮 原 子 上 。 带 电 负 性 的 受 体 大 多 也 是 氮 原 子 和 和 氧 原子 。 氢 键 的 键 能 在 3 一 7 千 卡 / 克 分 子 之 间 。 受 体 和 供 体 之 间 的 电荷 差别 愈 大 ;它们 之 间 的 键 能 也 越 大 。 氢 键 的 强度 比 共 价 键 弱 得 多 ,但 比 范 德 瓦尔 斯 力 大 得 多 。 氢 键 不 同 于 范 德 瓦 尔 斯 力 还 在 于 前 者 有 方向 性 ,后 者 没有 方向 性 , 当 氢 原子 直接 指向 受 体 原 子 时 ,其 引力 最 大 。 若 方向 偏差 一 点 , 键 能 就 小 多 了 。 氢 键 的 受 体 和 供 体 原 子 都 有 一 定 的 特点 ,因此 氢 键 的 专 一 性 比 范 德 瓦 尔 斯 力 要 强 得 多 。

有 关 DNA 双 螺 旋 中 的 碱 基 之 间 的 氧 键 前 面 已 经 讨论 过 了 。 还 要 指出 的 是 G-C 之 间 可 以 形成 三 个 氧 键 ，A-T 之 间 可 以 形成 二 个 氢 键 。 因 此 G-C 配对 的 强度 比 A-T 配 对 要 强 些 。

RR ”” 蕊 水 键 本 质 上 是 一 种 范 德 瓦 尔 斯 力 。 当 二 个 原子 彼此 接近 时 便 产 生 诱导 的 振动 电荷 ,由 于 这 种 电荷 的 分 布 而 产生 了 非特 异性 的 吸引 力 , 这 就 是 范 德 瓦尔 斯 力 。 很 明显 , 范 德 瓦尔 斯 力 没 有 分 子 的 特异 性 , 极 性 和 非 极 性 的 分 子 都 可 以 产生 。 这 种 力 同 作用 基 团 之 间 的 距离 的 六 次 方 成 反比 ， 因 此 随 着 基 团 之 间 的 距离 减 小 ， 范 德 瓦 尔 斯 力 很 快 增 加 ; 另 一 方面 , 当 距 离 太 近 时 ,由 于 外 层 电子 云 重 八 ,又 引起 了 强大 的 斥 力 。 斥 力 和 引力 达 到 平衡 的 距离 称 为 范 德 瓦 尔 斯 力 半 径 ， 一 般 在 1.2 一 2.0A 之 间 ( 表 2-5)。 范 德 瓦尔 斯 键 能 平均 在 工 干 卡 / 克 分 子 左右 ， 仅 仅 比 分 子 的 平均 热能 (在 室温 约 0.6 千 卡 / 克 分 子 ) 稍 大 一 些 。 这 意味 着 必须 使 分 子 的 几何 状态 精确 地 配合 ， 并 且 几 个 基 团 协同 作用 才能 使 范 德 瓦尔 斯 力 有 效 地 成 为 分 子 间 的 引力 。

表 2-5 范 德 瓦尔 斯 半径 原 OF 半径 (A) H 1.2 N to Oo 1 .4 P 1.9 S 1.85 甲 基 2.0 芳香 环 半 厚 7

范 德 瓦 尔 斯 力 比 氢 键 的 能 量 弱 得 多 ， 因 此 凡是 能 形成 氢 键 的 分 子 主要 是 形成 氧 键 而 不 是 形成 范 德 瓦 尔 斯 键 。 大 家 知道 ,水 分 子 之 间 能 形成 较 强 的 氢 键 ,构成 一 种 局 部 有 序 的

w 48 。

类 似 晶 格 的 结构 。 因 此 假如 一 种 不 能 同 水 形成 氢 键 的 化 合 物 (比如 葵 ) 同 水 混合 ,水 分 子 和 葵 分 子 虽 能 形成 范 德 瓦 尔 斯 力 , 但 没有 水 分 子 本 身 的 氢 键 能 量 大 ,因此 水 分 子 仍 然 自 身 维持 在 一 起 ,而 排斥 葵 分 子 的 插入 ,所 以 水 和 茶 不 能 互 溶 。 一 些 极 性 分 子 , 比 如 葡萄 糖 , 它 含有 很 多 能 形成 氢 键 的 基 团 ,因此 当 葡 萄 糖 插 和 人 到 水 的 结构 中 去 的 时 候 , 虽 然 破坏 了 水 分 子 之 间 的 氢 键 ,但 水 和 糖 之 间 可 以 形成 新 的 氨 键 。 假 如 葡萄 糖 上 一 个 氢 原 子 被 甲 基 取 代 ， 甲 基 比 氧 原子 更 严重 地 破坏 水 分 子 的 结构 ， 也 就 是 说 需要 更 多 的 能 量 才能 把 这 个 分 子 插 人 到 水 分 子 中 间 去 。 反之 ， 与 氢 原 子 相 比 ， 水 分 子 以 更 多 的 能 量 把 甲 基 推出 水 的 结构 ， 这 个 能 量 约 在 2 一 3 千 卡 / 克 分 子 左右 。 水 分 子 排斥 非 极 性 基 团 的 这 种 倾向 经 常 称 为 朴 水 键 。 这 个 名 称 可 能 不 太 恰 当 , 因 为 在 这 种 情况 下 并 没有 产生 新 类 型 的 键 , 水 分 子 仍 以 氢 键 结合 在 一 起 ， 非 极 性 键 仍 以 范 德 瓦尔 斯 力 结合 在 一 起 。 但 是 这 个 词 比 较 形 象 地 表达 了 非 极 性 分 子 有 不 愿 同 水 接触 而 自己 聚集 在 一 起 的 倾向 。 很 明显 ， 一 切 破坏 水 的 氢 键 结构 的 试剂 也 都 能 破坏 芒 水 键 。

DNA 分 子 的 碱 基 都 是 由 芳香 环 构成 的 ,有 很 强 的 臣 水 性 质 。DNA 双 螺 旋 在 水 咨 液 中 ,由 于 碱 基 有 规则 的 排列 ， 能 形成 较 强 的 蕊 水 键 。 AAMT BiB DNA 双 螺 旋 稳 定性 的 贡献 可 能 大 于 氢 键 的 贡献 。

破坏 双 螺 旋 的 条 件

上 面 讨论 了 维持 双 螺 旋 的 力 是 由 氢 键 和 芷 水 键 提供 的 ， 因 此 凡是 破坏 氧 键 和 朴 水 键 ， 的 因素 都 能 导致 双 螺旋 的 破坏 ,如 加 热 \. 极 端的 pH\ 有 机 溶剂 .尿素 酰胺 等 试剂 。 DNA 双 螺 旋 的 破坏 称 为 变性 。

DNA 的 变性 不 仅 受到 外 部 条 件 的 影响 而且 也 取决 于 DNA 分 子 本 身 的 稳定 性 , 比 如 DNA DTH G-C 含量 高 ,分 子 就 比较 稳定 。 因 为 G-C 之 间 有 三 对 氢 键 ， 而 A-T 之 间 只 有 二 对 氢 键 。 又 比如 环 状 双 键 DNA 比 相 应 的 线 状 DNA 稳定 ,因为 拓扑 学 的 原 因 , 使 得 双 螺 旋 不 容易 解 开 。

变性 现象 的 宏观 表现

双 螺 旋 DNA 分 子 具 有 一 定 的 刚性 ,而 变性 之 后 就 成 为 无 规 线 团 ， 伴 随 着 变性 过 程 DNA 深入 的 流体 力学 性 质 也 发 生变 化 。 天 然 DNA 的 发 色 基 团 藏 在 双 螺 旋 的 里 面 , 变 性 后 碱 基 都 暴露 出 来 了 ,因此 变性 过 程 也 伴随 着 DNA 光学 性 质 的 变化 。

由 于 以 上 原因 ，DNA 变性 后 表现 为 溶液 的 粘度 大 大 降低 ,沉降 速度 增加 , FORE 上 升 ; 紫 外 吸收 值 升 高 。 我 们 可 以 利用 这 些 性 质 上 跟踪 DNA 的 变性 过 程 。

利用 DNA 变性 后 的 增色 效应 跟踪 变性 过 程 是 最 方便 的 手段 。 如 果 用 升 高 温度 使 DNA 变性 ,以 温度 对 紫外 吸收 值 作 图 ,得 到 一 条 SHH. 在 一 个 相当 狭 的 范围 内 ， 增 色 效 应 是 一 个 跳跃 (图 2-33), 这 同 结晶 的 融化 现象 类 似 。 产 生 紫 外 吸收 值 跃 变 的 温度 称 A DNA 的 融 点 ， 通 常 是 以 增色 效应 达到 一 半 的 温度 作为 融 点 。 在 一 定 的 条 件 下 , BA 的 高 低 由 DNA 分 子 中 的 G-C 含量 所 决定 ， 融 点 和 G-C 的 含量 可 用 下 列 经 验 公 式 表 人 让:

%(G 十 C) 一 (T。 一 69.3) X 2.44 Tu 是 DNA 的 融 点 。 图 2-34 示 出 Ta 与 G-C 合 量 的 关系 。

e 49 «

次 2d (A-T)

DNA

1.0 60 80 100

Tey 2-33 DNA 的 变性 曲线 2-34 DNA 融 点 (Ta) 与 G-C 含量 的 关系 与 不 含 G-C 的 多 聚 d(CA-T) 比 较 。 纵 坐标 A, 0.01M PO3- 十 0.001M EDTA; 为 相对 的 260nm 吸收 值 , 横 坐标 为 温度 。 B, 0.15M NaCl + 0.015M 柠 样 酸 钠 。

融 点 不 仅 受 DNA 本 身 性 质 的 影响 ,而 且 受 溶 液 条 件 的 影响 。 例如 低 离子 浓度 溶液 中 融 点 较 低 , 融 点 范围 也 较 宽 ;离子 强度 升 高 ,转变 范围 也 变 狭 。 DNA 组 成 比较 均一 , 它 就 在 一 个 狭 的 温度 范围 内 变性 ,如 果 DNA 组 成 不 均一 ,或 者 挨 杂 其 他 DNA， 融 程 就 拉 长 了 。

变性 的 微观 机 制

从 DNA 的 变性 曲线 看 , 融 程 比较 狭 , 反 映 了 变性 过 程 是 一 个 协同 的 过 程 , 就 是 在 达 到 融 点 时 DNA 双 螺 旋 是 同时 解 开 的 。 实 际 上 由 于 DNA 分 子 的 碱 基 分 布 不 均一 ;DNA 双 螺 旋 的 融化 是 一 步 一 步 进 行 的 ,是 一 个 区 域 接着 一 个 区 域 发 生 的 ,而 不 是 协同 地 瞬时 地 ， 进行 。A-T 丰富 的 区 域 先 融化 ，G-C 丰富 的 区 域 后 融化 ,因此 在 精细 的 变性 图 上 变性 曲 线 不 是 一 条 平滑 的 S 形 曲线 ， 而 是 包含 了 很 多 肩 肥 〈shoulder)。 如 果 把 这 条 曲线 对 温度 微分 ,就 得 到 一 系列 小 的 峰 , 每 一 个 峰 代 表 一 个 小 的 融化 区 域 ， 峰 的 高 度 大 体 等 于 融化 区 的 碱 基 长 度 。 因 此 可 以 从 这 些 数据 计算 出 各 融 区 的 大 小 \G、C 含量 以 及 各 个 小 融化 区 的 排列 次 序 。

复 性 动力 学

解除 变性 条 件 以 后 ,变性 的 二 条 互补 链 可 以 重新 结合 起 来 ,恢复 成 原来 的 双 螺 旋 ， 这 个 过 程 称 为 复 性 。

很 多 因素 影响 复 性 的 速度 。 简 单 顺 序 的 DNA 分 子 , 如 多 聚 d(G)-BR d(C) 彼此 . 发 现 互补 顺序 并 不 困难 ,因此 很 快 就 复 性 了 。 假 如 是 一 个 真 核 DNA, 显然 一 些 顺 序 在 与 互补 链 相 碰 撞 之 前 ,必然 会 碰 到 很 多 非 互 补 链 , 因 此 在 同样 条 件 下 , 顺序 复杂 的 DNA 比 顺序 简单 的 DNA 所 需 的 复 性 时 间 要 长 些 。 同 一 种 DNA， 当 浓度 高 时 ， 互 补 顺序 相 碰 撞 的 机 会 增加 , 复 性 速度 也 快 。 DNA 片段 的 大 小 也 影响 复 性 的 速度 ,因为 大 的 线 状 单 链 扩散 速度 受到 妨碍 ,减少 了 发 现 互补 顺序 的 机 会 ,因此 在 复 性 实验 中 , 往往 把 DNA 用 机 械 剪 力 切 成 一 定 大 小 的 片 侦 。 温 度 也 影响 复 性 的 速度 ， 低 温 不 仅 减 少 了 互补 链 的 碚 拉 机

* i)',°

会 ， 而 且 使 已 经 误 配 的 片段 再 解 开 寻找 正确 的 互补 链 变 得 困难 。 因此 复 性 温度 不 能 过 低 ， 一 般 比 融 点 低 25%c AAR EME ARN ToREE th a Me Bl SS EA REE, — Pair 很 多 同性 电荷 的 DNA 会 相互 排斥 ,因此 在 复 性 咨 液 中 必须 有 一 定 浓度 的 盐 。 一 般 来 讲 ， 盐 浓度 高 复 性 速度 快 。

复 性 过 程 是 一 个 复杂 的 多 步骤 的 反应 过 程 。 复 性 的 第 一 步 是 当 二 条 链 相 互 碰撞 时 ， 假如 在 某 个 区 域 遇 到 正确 的 配对 ， 就 会 先 形成 一 个 双 链 核心 。 核 心 形成 后 互补 链 就 能 很 快 地 找到 同伴 ,相互 配对 ,完成 复 性 过 程 。 核 心 的 形成 是 反应 速度 的 限制 因素 。

复 性 过 程 可 以 用 二 级 反应 动力 学 公式 来 处 理 :

S+S—D S 和 S 是 DNA 互补 单 链 ,D 是 双 链 DNA。 按 二 级 反应 动力 学 公式 : ee ee

< 是 * 时 间 的 单 链 DNA 的 浓度 。 积 分 后 C 1 Ct eb Can C, EM GE DNA 的 起 始 浓度 ,以 每 升 溶液 中 核 苷 酸 的 摩尔 数 表 示 。 玉 和 KR’ 是 速率 常数 。 因为 在 一 个 指定 的 实验 中 C, 是 已 知 的 , C 的 浓度 是 可 以 测定 的 ,如 以 人 对 Cu 作 图 ，

得 到 如 图 2-35 所 示 的 曲线 ,在 曲线 的 中 点 , 即 ws Cohn = = 如 前 所 述 , 很 多 因素 会 影响 复 性 的 速度 ,但 是 我 们 如 果 把 所 有 的 可 变 因 素 , 包 括 温度 、 离 于 强度 片段 的 长 短 都 控制 起 来 ;那么 剩 下 的 唯一 可 变 因 素 就 是 顺序 的 复杂 性 。 实 验 指 出 ,速度 常数 K’ 与 DNA 中 的 复杂 性 六 成 反比 : pec N 例如 大肠 杆菌 DNA Le 2 MER DNA 分 子 大 100 倍 。 这 样 , 大 肠 杆 菌 DNA 复 性 速 度 也 比 1DNA 要 小 100 fo Ai Con 的 大 小 代表 了 基因 组 的 大 小 ， 每 个 基因组 的 顺 | 核酸 对 1 10? lot 10 108 1010

Cot (mol x #/F)

A 2-35 DNA Aye ee thee

序 都 不 一 样 ,因此 Coin 也 代表 了 DNA 顺序 的 复杂 程度 。 如 果 用 这 种 方法 测定 真 核 DNA 的 Co, 按理 它 的 Coe 数值 是 很 大 的 ， 但 是 实验 结

RAD Kf Co 作 图 并 不 是 一 条 单纯 的 S 形 曲线 ;而 可 以 看 作 几 个 $ 型 曲线 的 加 和 。 比 如 鼠 的 DNA 中 10% DNA 的 复 性 速度 甚至 比 已 知 最 小 的 病毒 DNA SHREK, 此 说 明 这 部 分 是 由 很 多 短 的 重复 顺序 所 组 成 。 对 于 真 核 生 物 DNA 顺序 的 组 织 的 知识 就 是 从 复 性 动力 学 开始 获得 的 。

应 用

在 DNA 研究 工作 中 ,很 多 手段 都 是 同 DNA 的 变性 和 复 性 有 关 的 ,前 面 已 经 提 到 了 一 些 这 方面 的 工作 。

2-36 RRMA DNA 的 部 分 变性 图 箭头 表示 重复 区 的 边界

前 面 已 经 提 到 ，DNA 变性 是 一 个 区 域 一 个 区 域 发 生 的 ，A-T 丰富 的 区 域 最 容易 变 性 ， 电 子 显 微 镜 下 确实 也 看 到 这 种 情况 。 在 一 定 的 条 件 下 ，DNA 分 子 长 链 上 容易 变性 的 部 分 呈现 一 个 个 小 泡 , 而 没有 变性 的 部 分 保持 一 条 双 链 (图 2-36)。 每 一 种 DNA 的 局 部 变性 图 谱 都 是 不 一 样 的 ， 因 此 可 以 利用 这 个 手段 识别 DNA 分 子 中 某 种 基因 的 位 置 ， 或 者 作为 一 个 参照 位 置 用 来 确定 其 他 功能 的 位 点 。

杂交 方法 广泛 应 用 于 DNA 研究 中 。 杂 交 的 基础 就 是 DNA 的 变性 和 复 性 ,因此 应 该 注意 影响 变性 和 复 性 的 各 种 因素 。 利 用 杂交 方法 可 以 求 出 特定 基因 的 频率 、, 异 源 DNA 的 相似 程度 ， 配 合 电镜 方法 可 以 了 解 基因 的 组 织 、 基 因 的 定位 。 近 几 年 发 现 真 核 DNA

° 526

中 有 插 人 顺序 最 早 就 是 借助 于 DNA 和 RNA 的 杂交 方法 。 四 、DNA 的 三 级 结构

DNA 的 三 级 结构 指 双 螺 旋 链 的 扭曲 。 超 螺旋 是 DNA 三 级 结构 的 一 种 形式 ，DNA 在 核 小 体 结构 中 的 扭曲 方式 也 是 一 种 超 螺旋 结构 。 核 小 体 可 以 组 成 更 高 层次 的 结构 ， DNA 分 子 也 将 进一步 扭曲 ,因此 DNA 三 级 结构 还 可 以 分 成 若干 层次 。

起 二

在 DNA 双 螺 旋 中 ;每 10 个 核 痛 酸 长 度 旋转 一 圈 , 这 时 双 螺 旋 处 于 能 量 最 低 的 状态 。 如 果 这 种 正常 的 双 螺 旋 DNA 额外 地 多 转 几 圈 或 少 转 几 圈 , 就 会 使 双 螺 旋 内 的 原子 偏离 正常 的 位 置 ,在 这 种 双 螺 旋 中 存在 额外 的 张力 。 如 果 双 螺旋 的 末端 是 开放 的 ,这 种 张力 可 以 通过 链 的 转动 而 释放 出 来 ，DNA 将 恢复 到 正常 的 双 螺旋 状态 。 如 果 DNA 分 子 的 二 端 是 以 某 种 方式 固定 的 ,或 者 是 环 状 分 子 ， 这 些 额 外 的 张力 就 不 能 释放 到 分 子 之 外 ,而 只 能 在 DNA 内 部 使 原子 的 位 置 重 排 , 这 样 DNA 分 子 本 身 就 会 扭曲 ,， 这 种 扭曲 就 称 为 超 BE Iie 0

为 了 说 明 超 螺旋 DNA 的 性 质 , A 们 和 常用 拓扑 学 的 研究 成 果 来 表示 两 个 互 相 绕 在 一 起 的 环 在 几何 形态 上 的 相互 关 系 。 当 两 个 连续 不 断 的 环 状 分 子 互相 绕 在 一 起 而 又 不 能 用 物理 方法 分 开 时 ， 这 种 分 子 的 性 质 就 可 以 用 拓扑 环绕 数 (区 天 ) PURE CLA 2-37). 当 两 个 环 中 的 一 个 放 在 某 一 平面 上 ， 另 一 个 环 就 要 从 这 个 平面 的 上 下 穿 过 ， 图 2-37 的 〈a)、 (b) fl (c) 分 别 表示 另 一 个 环 穿 过 平面 环 的 一 二 和 十 次 , 这 样 , 它们 的 拓扑 环 绕 数 分 别 为 1、2 和 10。 图 2-37 中 的 (d)

Al (c) 的 意义 是 完全 相同 的 ,只 是 (d) 表

示 两 个 环 分 别 围 着 一 个 公共 轴 互 相 绕 在

一 起 。 如 果 令 此 公共 轴 保 持 在 一 个 平面 os ey a ite dee 上 ， 则 绕 在 一 起 的 两 个 环 的 投影 就 一 定 结构 在 拓扑 学 上 是 相同 的 )

有 偶数 交点 ， 此 偶数 应 为 拓扑 环绕 数 的 一 倍 。 只 要 两 个 环 状 分 子 都 没有 发 生 临 时 的 或 永 入 的 断裂 ,双环 之 间 的 拓扑 环绕 数 就 是 一 个 恒定 不 变 的 整数 ,永远 不 会 发 生变 化 。 因 而 这 个 原理 适用 于 由 两 条 互补 单 链 组 成 的 环 状 DNA 分 子 。

拓扑 环绕 数 尽管 是 两 个 闭合 环 状 线段 之 间 相 互 关系 的 重要 数据 ,但 是 ,有 相同 拓扑 环 绕 数 的 闭环 物 却 可 以 有 种 种 不 同 的 空间 关系 。 图 2-38 表示 ZX 一 0 时 出 现 的 情况 ，(a) 表示 拓扑 环绕 数 为 0 的 两 个 环 平行 地 排 在 一 起 ,(b) 表 示 引 入 三 个 右 螺旋 时 ， 必 须要 同时 引入 三 个 左 螺旋 才能 保持 ZK 一 0，(c) 和 (d) 分 别 表示 在 〈b) 中 引入 的 三 个 左 螺旋 可 以

6.597 ¢

表现 为 空间 盘 绕 的 形式 ,也 可 以 表现 为 双 链 互 绕 的 形式 。 很 明显 ,在 (c) 和 (d) 中 双 链 的 公 共 轴 都 绕 着 处 于 同一 平面 上 的 超 螺旋 轴 转 了 三 次 。 一 一- 为 了 说 明 两 个 闭合 环 状 线 侦 之 间 的 上 “空间 关系 ;数学 家 已 经 证 明 ; 忌 一 尼 十

To 其 中 即 为 拓扑 环绕 数 Lk, BAM 链 环绕 数 , 又 称 全 绕 率 (total twist), 在 核酸 化 学 中 ，6 一 十 1 定义 为 双 链 向 右 SJ it 360°, + iB RHE RL BRIER (writhing cb) number)o 这 个 公式 与 常见 于 文献 的 LA

5 Tiny Ta 意义 相同 。

由 上 述 公式 可 直接 导出 了 一 < 一 8， 其 含意 为 : 拓扑 环绕 数 与 双 链 环绕 数 之 差 即 为 超 螺 旋 数 。 当 z 一 0 时 , 环 状 双 链 DNA 就 处 于 松弛 态 ; a> It, 环 状 分 子 呈 正 超 螺旋 ; 当 < 8 时 , 则 为 Ge) 负 超 螺旋 。 实 际 上 所 有 的 已 知 环 状 双 链 图 2-38 ”拓扑 环绕 数 为 .0 时 闭环 双 链 的 空间 关系 DNA 的 超 螺旋 数值 都 是 负 的 ， 即 其 拓 扑 环绕 数 总 是 小 于 双 链 环绕 数 。 以 含 5226 KERMA SV40 DNA 为 例 ， 按 B 型 DNA

双 螺 旋 模 型 ,其 pa 522, XMS r — 26) Alb oar +26 Bear

= 496. 说 明正 是 由 于 双 链 之 间 少 纸 了 26 圈 才 使 整个 DNA DFAPE—EKDA, 使 双 链 闭环 的 SV40 DNA 以 超 螺 旋 的 形式 存在 。 当 其 中 有 一 个 缺口 或 260 对 碱 基 闻 的 氢 键 遭受 破坏 ,此 张力 就 会 消失 。

超 螺旋 数目 是 以 一 个 DNA 分 子 为 单位 的 。DNA 分 子 有 大 有 小 ,比如 带 10 个 超 螺 旋 对 大 肠 杆 菌 DNA 的 性 质 可 能 影响 不 大 ,而 对 SV40 DNA 的 影响 可 能 很 明显 ,因为 前 者 分 子 量 比 后 者 大 三 个 数量 级 。 因 此 为 了 便于 比较 引信 超 螺旋 密度 这 个 概念 ， 超 蝶 许 客 度 的 定义 为 :

ogg 7 ad bape f ip , a eee IN NR yn ae, Se ES wee | EN ght: ia Mas ba % 3 LTE, La CH BS se —

0.lpm

2-39 小 Col El 质粒 三 倍 体 DNA Okb) MAR BRRBANE TDi

© 54 。

o 为 超 螺旋 密度 , 8 是 DNA 分 子 的 碱 基 对 数目 的 十 分 之 一 。 线 状 DNA 或 环 状 DNA 都 可 以 有 三 级 结构 ,但 对 于 研究 工作 利用 小 分 子 环 状 DNA 是 最 方便 的 ,因为 环 状 分 子 在 体外 容易 保留 超 螺旋 状态 。 尽管 线 状 DNA 在 体内 也 有 超

螺旋 ， 但 在 体外 我 们 没有 办 法 把 它 的 两 端 固定 ， 因 此 在 分 离 过 程 中 内 部 的 张力 都 释放 掉

了 。 以 下 提 到 的 有 关 超 螺旋 DNA 的 性 质 \ 测 定 等 内 容 都 是 用 小 分 子 环 状 DNA 作为 实

验 材料 获得 的 。 图 2-39 是 环 状 DNA 的 电子 显微镜 图 。

由 于 共 价 闭环 双 链 DNA 没有 可 以 自由 转动 的 末端 , 因此 需要 有 更 高 的 温度 ， 也 需

要 较 高 的 pH 才能 破坏 超 螺 旋 DNA 中 的 碱 基 对 。 例 如 超 螺旋 的 多 瘤 病毒 DNA 融 点 达 140?" ,而 它 的 复制 型 I DNA 的 融 点 只 有 89"。 超 螺旋 分 子 的 结构 比较 紧密 ,因此 它 的 粘 度 比 较 低 ,浮力 密度 比较 大 ,沉降 速率 比 同样 大 小 的 线 状 分 子 快 202% 。

AAR MIRC HE. AEN WE MARA DSA WA DNA 双 螺 旋 碱 基 对 之 间

的 空间 中 去 ,从 而 改变 超 螺旋 的 状态 。DNA BS TIRCRUWIA, 降低 了 8 数 ， 使 负 的 超

螺旋 减少 。 随 着 省 乙 锭 量 的 增加 , 负 超 螺旋 不 仅 可 以 完全 松 开 ,甚至 可 以 进一步 站 入 正 的

. 超 螺 旋 , 测 定 超 螺 旋 的 方法 之 一 就 是 利用 省 乙 锭 引起 超 螺旋 变化 这 一 特性 。

(a)

0 O08) ated. GIR = 82 每 个 核 苷 酸 结合 的 溴 乙 锭 分 子 数 (b) °

2-40 RCE SMA DNA 沉降 常数 的 影响 及 其 解释 (a) ORAM, 人 为 非 超 螺旋 态 。 @ 只 形成 单一 沉降 区 带 的 DNA 分 Fo Cb) 为 (a) 实 验 的 解释 。 及 螺旋 以 单一 的 连续 线 表示 。 从 A 至 王 说 明 由 于 省 乙 锭 的 结合 ,使 得 负 超 螺旋 减少 (B), 完 全 松弛 (C), 并 引进 正 超 螺旋 CD fl E),

。 55 。

上 面 已 经 提 到 , 同 松弛 形 DNA 相 比 较 ， 超 螺旋 DNA 的 沉降 常数 大 一 些 。 如 果 在 、 不 同 浓度 的 省 乙 锭 溶液 中 测定 一 个 超 螺旋 DNA 的 沉降 常数 (S) ,将 会 发 现 ;, 随 着 省 乙 锭 的 增加 S 值 先 是 下 降 ,达到 一 个 最 低 值 以 后 S 值 又 上 升 〈 图 2-40)。 S 值 最 小 的 状态 就 是 DNA 完全 松弛 的 状态 。 从 处 于 松弛 态 DNA 结合 省 乙 锭 的 数量 可 以 推算 分 子 内 包含 多 少 超 螺旋 ,因为 每 结合 一 个 省 乙 锭 能 使 双 螺 旋 解 开 26° 左右 (以 前 认为 每 结合 一 个 溃 乙 锭 能 使 双 螺旋 解 开 12°, 现在 看 来 这 个 数值 大 大 偏 低 了 ) 用 粘度 方法 可 以 代替 超 离心 的 方 法 ,原理 是 一 样 的 ,技术 上 可 能 更 方便 一 些 。 我 们 注意 到 ， 加 入 省 乙 锭 以 后 $ 值 出 现 一 个 低谷 ,这 意味 着 该 DNA 分 子 中 包含 了 负 的 超 螺 旋 ， 如 果 DNA 分 子 中 包含 的 是 正 的 超 螺旋 ,将 不 会 出 现 这 样 一 个 低谷 。 现 在 发 现 所 有 天 然 DNA 中 的 超 螺旋 都 是 负 的 。

由 于 超 螺旋 的 DNA 分 子 比较 紧密 , 在 凝 胶 电 泳 中 的 电泳 速度 比较 快 。 利 用 这 个 性 : 质 也 可 以 测定 超 螺旋 的 数目 。 用 拓扑 异 构 酶 I 温和 作用 于 超 螺旋 的 DNA， 可 以 产生 一 系列 带 有 不 同 超 螺 旋 数 目的 中 间 体 。 这 些 中 间 体 可 以 用 电泳 方法 分 开 ， 每 个 中 间 体 只 相 差 一 个 超 螺旋 数目 ,因此 只 要 计数 电泳 图 上 中 间 体 的 数目 就 可 以 知道 超 螺 旋 的 含量 。

生物 体内 的 超 螺旋

生物 体内 的 DNA 都 具有 某 种 形式 的 三 级 结构 。 比 较 小 的 双 链 环 状 DNA, Mins 和 质粒 DNA 在 体内 都 以 负 超 螺旋 的 形式 存在 。

大 肠 杆菌 DNA 是 环 状 双 链 分 子 , 整个 分 子 长 达 lmm 多 ,在 体内 压缩 成 lem 直径 的 小 体 。 大 肠 杆 菌 DNA 包含 了 几 个 独立 的 超 螺 旋 。 据 推 断 , 折 和 迭 的 大 肠 杆菌 染色 体 可 能 有 一 个 RNA 核 心 ; 核 心 外 面 是 DNA 环 ，DNA 环 的 数目 在 12 一 80 个 之 间 ， 每 个 环 都 构成 一 个 独立 的 超 螺旋 。 用 脱氧 核糖 核酸 酶 轻微 作用 ， 可 以 仅 松 弛 一 个 超

1558 螺旋 环 而 不 影响 其 他 环 的 超 螺旋 结构 ， 但 是 再 用 核糖 核酸 酶 处 理 可 以 把 所 有 的 超 螺旋 打开 ， 按 照 这 些 实验 结果 推测 大 肠 杆菌 染色 体 的 结构 如 图 2-41 所 示 。 Kye BRAM DNA 主要 存在 于 染 图 2-41 ”大肠 杆 茵 染色体 的 结构 示意 图 色 体 中 。 染 色 体 除了 包含 DNA 之 外 , 还 包含 了 组 蛋白 。 对 DNA 染色 体 复 杂 的 构 型 以 前 了 解 得 很 少 。 自从 发 现 了 核 小 体 之 后 ，DNA 在 染色 体内 的 构 型 逐步 明朗 起 来 。

染色 质 丝 在 电子 显微镜 中 呈 念 珠 状 。 一 根 长 丝 上 附着 很 多 小 球 , 小 球 的 直径 为 100 人 及 左右 ,小 球 之 间 是 一 根 细 丝 ， 小 球 和 细 丝 互相 间隔 重复 无 数 次 (图 2-42)。 每 一 个 重复 单 位 称 为 一 个 核 小 体 。 每 个 核 小 体 包含 了 200 对 碱 基 和 五 种 组 蛋白 。 在 细 丝 上 结合 有 组 蛋 白 H1, 其 他 四 种 组 蛋白 (H2A, H2B, H3 和 H4) 位 于 小 球 内 。 如 果 把 小 球 两 边 的 细 丝 用 核酸 酶 消化 掉 , 留 下 来 的 小 球 称 为 核 小 体 的 核心 。 核心 的 DNA 长 约 140 TEM, 一 段 DNA 绕 在 由 组 蛋白 H2A, H2B, H3, H4 各 二 个 组 成 的 八 聚 体 蛋 白 核心 之 外 。 从 不 同 生物 获得 的 核 小 体 DNA 长 短 有 所 区 别 ， 从 140 到 240 REM, 而 核 小 体 核 心中

« 56 «

2-42 染色 质 丝 的 电子 显微镜 图

DNA 的 长 度 几 乎 总 是 140 碱 基 对 。 从 电子 显微镜 看 ， 核 小 体 的 核心 好 象 是 一 个 圆 球体 。 用 中 子 散 射 和 和 射线 衍射 方法 : 测定 溶液 中 核 小 体 的 外 形 ,发 现 核 小 体 不 是 球形 而 是 短 粗 的 圆柱 体 ,直径 100A ,高 50A。 更 直接 的 证 据 来 自 对 核 小 体 核心 结晶 的 研究 ， 用 和 射线 衍射 配合 电子 显微镜 ， 测 定 核 小 体 核心 的 分 辩 率 可 达到 20 一 25 A 水 平 。 这 些 结果 表明 ， 核 心 是 平 盘 状 的 ， 直 径 110A ， 高 57 人 ,这 和 中 子 散 射 的 结果 是 一 致 的 。 在 这 个 分 辩 率 水 平 ， BRERA DNA 链 的 走 向 ， 但 是 从 中 子 散射 的 实验 可 以 肯定 ，DNA 双 螺 旋 是 绕 在 组 蛋白 八 聚 体 之 外 ， 因此 可

以 推测 DNA 双 螺 旋 形成 90 人 直径 的 超 螺旋 , 绕 在 蛋白 核心 之 外 , 一 共 绕 1 = 圈 , 螺 距

为 28A, 这 和 B 型 双 螺旋 可 形成 每 圈 75 一 82 碱 基 对 的 超 螺旋 的 推算 是 一 致 的 ( 见 图 2- 43)o

图 2-43 ” 核 小 体 结构 示意 图

当中 黑 点 表示 由 H2A、H2B、H3 MH, 各 二 分 子 组 成 的 八 聚 体 蛋白 核心 ,外 面 为 由 140bp 围 绕 的 DNA 分 子 ， 构成 一 个 核 小 体 核 心 。

DNA 在 米色 体内 的 高 次 结构 在 核 小 体内 DNA 被 压缩 了 7 倍 。 而 在 染色 体内

~

DNA 双 螺 旋 压 缩 了 将 近 10,000 倍 ， 那 么 核 小 体 如 何 进一步 压缩 而 构成 染色 体 呢 ? 这 方

面 还 没 定论 。 但 是 有 些 迹 象 表明 染色 体 是 多 层次 的 螺旋 结构 。

ye fa (KYW AEN 100A, 现在 可 以 肯定 ， 染 色 体 细 丝 是 由 核 小 体 串 连 而 构成 的 。 染色 体 的 粗 丝 直径 约 300A, 中 子 散 射 的 结果 提示 ， 粗 丝 是 一 种 螺 线 管 的 形式 ,外 径 300 A , 螺 距 100—110A, 中 间 有 100A 的 空洞 。 因 此 可 以 推测 粗 丝 是 由 细 丝 绕 成 的 螺旋 , 粗 丝 每 一 螺旋 包含 了 6 个 核 小 体 。 当 深 液 中 存在 镁 离子 时 ， 用 电子 显微镜 可 以 看 到 这 种 300A 的 结构 ,如 果 没 有 镁 离子 ,只 能 看 到 100A 的 细 丝 ,因此 镁 离子 对 螺 线 管 的 形成 是 重 要 的 。 另 外 组 蛋白 的 Hl 可 能 对 核 小 体 的 压缩 也 有 关 。

从 核 小 体 到 螺 线 管 ，DNA 双 螺 旋 压 缩 了 6 倍 ， 进 一 步 的 压缩 可 能 是 通过 形成 所 谓

超 螺 线 管 而 达到 的 。 有 迹象 表明 ,中 期 染色 体 是 一 个 长 的 中 空 的 圆 简直 径 约 4,.000 人。 这

AE HAE 300 人 的 螺 线 管 绕 成 的 ,压缩 比 是 40。 这 个 超 螺 线 管 称 为 单位 纤维 。 单 位 纤维 本 身 还 可 以 压缩 5 倍 。 这 样 总 的 压缩 比 是 7 X 6 X 40 X 5, 同 总 的 DNA 压缩 比 接近 (图 2-44a)o

也 有 人 认为 核 小 体 细 丝 先 形成 发 夹 形状 的 环 , 这 种 环 进一步 绕 成 一 个 螺旋 ,形成 染色

体 结构 (图 2-44b)。 vt COO Cre ph Poh

t t

980000000000000 — -esnenenesersesannener (a) (b) 图 2-44 DNA 在 染色 体 中 的 高 层次 结构

有 一 点 可 以 肯定 ， 染 色 体 看 来 是 一 层 层 螺旋 绕 起 来 的 。 DNA 双 螺 旋 就 在 这 些 有 层 次 的 结构 中 绕 缠 ,形成 有 层次 的 超 螺旋 。

DNA 超 螺旋 有 结构 上 的 作用 ， 更 可 能 有 功能 的 意义 。。 但 是 这 些 功 能 的 意义 还 有 有 待 开发 ,这 里 只 提 几 个 迹象 。

很 多 病毒 的 复制 都 要 经 过 具有 超 螺旋 的 双 链 环 状 DNA 阶段 。 例如 鸣 菌 体 %X174 是 一 个 单 链 环 状 DNA, ERIE 6X174 DNA 先 复制 成 双 链 环 状 DNA， 然 后 由 病毒 自身 编码 的 A 蛋 白 在 双 链 DNA 的 特定 位 点 上 切 一 刀 ， 使 得 %X174 DNA FER 简 复 制 的 方式 复制 出 来 。 有 趣 的 是 A 蛋白 作用 的 底 物 必须 是 具有 超 螺旋 的 闭环 双 链 的 DNA， 如 果 用 同样 闭环 双 链 DNA。 而 不 具有 超 螺旋 ,A 和 蛋白 就 不 起 作用 。

如 果 人 为 地 把 一 段 回 文 结构 的 DNA 片 朋 引入 一 个 双 链 环 状 分 子 中 , 再 向 这 个 环 状 分 子 引 入 负 的 超 螺旋 。 这 样 在 电镜 中 看 到 在 这 个 环 状 分 子 上 长 出 二 个 “触角 ”， 这 是 在 回 文 区 形成 的 发 夹 结 构 〈 图 2-45)。 因此 超 螺旋 可 能 有 助 于 正常 细胞 中 回 文 结构 从 规则 的 蝶 旋 中 突出 来 ,成 为 一 个 容易 识别 的 信号 。 图 中 所 示 的 三 个 人 工 制 造 的 闭环 DNA 中 都 有 很 长 的 回 文 结构 , 当 用 拓扑 异 构 酶 工 引入 较 多 的 超 螺旋 后 ， 整 个 分 子 由 于 超 螺旋 引起

° 58 。

2-45 带 回 文 结 构 的 超 螺 旋 DNA

的 张力 会 消失 在 回 文 结构 形成 的 发 夹 结构 中 。

超 螺 旋 可 能 对 转录 的 控制 也 有 关系 。SV40 DNA 如 果 具 有 超 螺旋 ,那么 它 在 体外 转 录 是 不 对 称 的 ;而 松弛 型 的 SV40 DNA 在 体外 转录 是 对 称 的 。

在 $X174 复制 型 DNA 上 ， 转 录 时 转录 的 RNA MH DNA 形成 一 个 R 环 ， 这 个 环 的 形成 需要 超 螺 旋 释 放 的 自由 能 。 这 样 超 螺旋 就 成 了 一 种 调控 因素 ， 因 为 在 一 个 启 动 基因 上 消耗 了 超 螺旋 的 自由 能 之 后 ,就 妨碍 了 其 他 启动 基因 的 转录 ,也 妨碍 了 DNA 的 复制 。

$$ 4 &

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* 60 。

w= RNA #4 REZ 4h El 素

核酸 是 生物 体 的 重要 高 分 子 化 合 物 , 它 储存 着 生物 体 全 部 遗传 信息 ,是 基因 表达 不 可 缺少 的 基础 物质 。 除 DNA 外 ,在 生物 体 中 还 存在 着 另 一 类 核酸 一 -RNA。RNA 有 许 多 种 ( 详 见 表 3-1 和 3-2), 它们 具有 不 同 的 生物 功能 。

表 3-1 大 肠 杆菌 中 RNA 的 含量 和 性 质

种 类 沉降 系数 分 子 量 | cme | RM 所 细胞 总 |; | 。 代谢 性 质 tRNA a 5S 3.5X10* 120 稳定 16S >.9:>¢ 10? 1542 $2% 稳定 23S 1.1X10° 2904 稳定 tRNA 4S 2.23 ralos 74—93 16% 稳定 mRNA 9E25S 2.5XTUE 08 70—3,000 ~2% 不 稳定 部 分 其 他 4.55 107 稳定 RNA 6S 184 稳定 10S 609 稳定 7.5 109 不 稳定 4.5S 前 体 130 不 稳定

Ride RNA AIAG ERS ALA RNA 分 子 的 主要 生物 功能 是 参与 蛋白 质 的 生物 合成 。 第 一 类 是 核糖 体 RNA (rRNA)， 原 核 生 物 中 有 三 种 〈5S rRNA、16S rRNA 和 23S rRNA)， 真 核 生 物 中 有 四 种 (一 般 是 5S rRNA、5.8S rRNA、18SrRNA 和 28S rRNA). 这 些 RNA 分 子 在 代谢 上 十 分 稳定 ,是 构成 生物 体内 蛋白 质 合 成 机 器 "一 一 核 糖 体 的 重要 成 分 。 第 二 类 是 转移 RNA MRNA)， 生 物体 内 存在 着 与 20 种 氨基 酸 相对 应 的 RNA 分 子 , 它 们 在 代谢 上 也 是 稳定 的 ,在 蛋白 质 生物 合成 的 过 程 中 起 着 接受 、 转 运 和 参 人 氨基 酸 的 作用 。 参 与 蛋白 质 合成 的 第 三 类 RNA 分 子 叫 做 信使 RNA (mRNA), & 的 生物 功能 是 从 DNA 上 把 遗传 密码 即 蛋白 质 中 氮 基 酸 排 列 顺序 的 信息 接受 过 来 , 并 起 着 模板 的 作用 合成 蛋白 质 。 一 般 讲 ,一 种 蛋白 质 就 有 一 种 与 之 对 应 的 mRNA 分 子 , 但 有 的 mRNA 分 子 可 翻译 出 几 种 蛋白 质 ，mRNA 在 代谢 上 是 不 稳定 的 。 rRNA、tRNA 和 mRNA 参与 蛋白 质 生物 合成 的 细节 可 参看 蛋白 质 生物 合成 一 章 。 这 几 类 RNA 都 存在 于 细胞 质 部 分 ， 它 们 行使 生物 功能 的 主要 场所 在 核糖 体 上 。 在 真 核 细 胞 的 线粒体 和 时 绿 体 里 存在 着 独立 的 蛋白 质 合 成 系统 ,也 有 这 几 类 RNA 分 子 , 但 是 其 大 小 和 结构 往往 与 细 胞 质 中 的 不 完全 相同 。 此 外 ,生物 体内 还 存在 着 多 种 具有 特定 生物 功能 的 RNA 分 子 , 例 如 ， 参 与 启动 DNA 复制 的 引物 RNA; 在 某 些 肿瘤 病毒 中 存在 着 一 些 类 似 tRNA 的 分 于 是 反 转 录 酶 的 引物 ， 参 与 DNA 的 合成 ; 在 某 些 细菌 中 有 的 RNA 分 子 作为 氨基 酸

01 。

AAS gee

3-2 真 核 生 物 中 RNA 的 存在 和 分 类

位 置 名 称 沉降 系数 分 子 量 BBR 4 mi 代谢 性 质 细胞 质 rRNA 5S 3.5 10° ~120 稳定 5.8S 5x10* 一 160 稳定 18s 6.510? ~2000 0% 稳定 28S 1.7108 ~5000 Biz tRNA 4S 2.5—3xX10* ~80 稳定 a A ee mRNA 不 稳定 细胞 核 tRNA 前 体 rRNA 前 体 45S 4.1106 41S 3.110° 32S ZL 0 11% 20S 9x10? mRNA 前 体 1X10* 一 2X107 极 不 稳定 snRNA 4—8s 80—260 稳定 线粒体 或 叶绿体 tRNA 4S(3S) rRNA 类 似 原 核 生 物 或 更 小 15% mRNA 类 似 原核 生物

* 为 哺乳 动物 肝 细 胞 中 的 含量 。

的 载体 而 参与 细胞 膜 的 合成 ,例如 表皮 葡萄 球菌 中 的 尽 NAS7 在 细胞 壁 合成 时 是 甘氨酸 的 载体 。 还 有 一 些 RNA 分 子 是 一 些 酶 活性 不 可 缺少 的 组 成 成 分 ,例如 ， 免 肌 1,，4-c- 葡 聚 糖分 支 酶 含有 31 KRY 2.5S RNA 分 子 ， 特 异性 地 作用 于 tRNA 前 体 的 RNase PHA 77 多 的 成 分 是 核糖 核酸 ( 详 见 第 五 章 )。 真 核 细 胞 的 核 内 还 存在 着 多 种 代谢 稳定 的 小 分 子 RNA (snRNA)， 其 大 小 从 4S 到 8S 不 等 ;大 约 由 80 到 260 RA MAM, HA 有 些 snRNA 在 RNA 成 熟 过 程 中 起 重要 作用 。 另外 ， 还 有 一 些 与 染色 质 结 合 的 RNA (chRNA), chRNA 的 生物 功能 目前 尚 不 十 分 清楚 , 有 关 这 方面 的 细节 可 参看 第 八 章 。

前 体 RNA ” 绝 大 多 数 RNA 分 子 都 是 在 细胞 核 内 合成 的 。 核 内 存在 着 各 种 RNA 的 前 体 , 例 如 , tRNA 前 体 、rRNA 前 体 和 mRNA 前 体 , 详 见 第 五 章 。 这 些 前 体 RNA 的 分 子 量 一 般 要 比 对 应 的 成 熟 RNA 大 得 多 ,例如 ;哺乳 动物 肝 细 胞 的 rRNA 的 前 体 是 45S 细胞 核 RNA (CnRNA)， 在 成 熟 过 程 中 产生 41S nRNA、32S nRNA 和 20S nRNA 等 中 间 物 ,最 后 成 为 28$S、5.8S 和 18S rRNA, 前 体 RNA 都 是 由 细胞 核 DNA 转录 产生 的 > 经 过 剪 切 、 装 配 和 修饰 等 一 系列 加 工 过 程 以 后 产生 成 熟 的 IRNA、rRNA 和 mRNA, x A 细胞 质 中 行使 其 生物 功能 。* 有 人 把 在 细胞 核 内 合成 后 离开 细胞 核 去 行使 生物 功能 的 RNA 分 子 称 作 迁 移 性 RNA (migrating RNA), 而 始终 存在 于 核 内 的 叫 作 非 迁 移 性 RNA (nonmigrating RNA)。 有 关 细 胞 核 内 RNA 的 细节 可 参看 第 八 章 。

病毒 RNA ”病毒 中 的 遗传 物质 有 的 是 DNA， 也 有 的 是 RNA。 绝 大 多 数 植物 病 毒 和 RNA 肿瘤 病毒 以 RNA 作为 遗传 物质 。 一 般 讲 ， 病 毒 RNA (RARE RNA 病毒 Sh, IBM RNA) 既是 遗传 信息 的 载体 ， 也 具有 mRNA 的 功能 。 类 病毒 (viroid)

es 62 «

是 高 等 植物 的 一 类 病原 体 , 它 是 一 个 没有 外 壳 蛋 白 的 游离 RNA 分 子 , 分 子 量 约 12 万 。 关 于 病毒 RNA 的 细节 也 参看 第 八 章 。

这 一 章 着 重 介绍 细胞 质 中 与 蛋白 质 生物 合成 有 关 的 RNA 的 结构 和 与 测定 RNA 一 级 结构 有 关 的 一 些 问题 。

一 、RNA 的 结构 tRNA

1965 年 _Holley 等 首先 测定 了 酵母 两 氨 酸 RNA 的 核 苷 酸 排列 顺序 以 来 , 对 各 种 不 同 来 源 的 tRNA 的 一 级 结构 进行 了 广泛 和 深入 的 研究 。 据 不 完全 统计 ,迄今 已 测定 一 级 结构 的 衣 NA 有 二 百 五 十 多 种 。 在 原核 生物 中 以 大 肠 杆 菌 tRNA 最 多 , 除 且 氨 酸 外 其 余 19 种 都 已 测定 。 在 真 核 生 物 中 ,酵母 的 二 十 种 氨基 酸 对 应 的 RNA 都 已 测定 。 根 据 目 前 已 经 测定 的 (RNA 一 级 结构 的 资料 ,经 过 归纳 和 分 析 它 们 有 以 下 共同 的 特征 :组 成 tRNA 的 核 苷 酸 通 常 为 74 一 93 个 ,其 中 大 多 数 为 76 个 ; 几乎 所 有 tRNA 都 具有 三 叶 草 式 的 二 级 结构 ( 见 图 3-1)。

OOOOOO

上 |

© | Pace 5s tad

图 3-1 tRNA ~RA WAAR RHNKE RRABRAAAM tRNA 的 次 序 ) O 〇 表示 所 有 tRNA EXMIBLRAKHREE;, 表示 所 有 RNA 在 这 个 位 置 上 都 是 固定 不 变 的 ?或 者 变 化 较 少 ; 品 表 示 并 非 所 有 (RNA 在 这 个 位 置 上 都 有 核 背 酸 存在 。 在 IRNA 中 加 入 核 背 酸 , 其 命名 法 如 下 : 以 加 人 的 核 苷 酸 前 一 个 核 背 酸 的 序号 加 冒号 后 再 编号 。 例 如 20: A 和 20: B 表示 在 第 20 位 核 背 酸 之 后 加 人 的 第 一 个 和 第 二 个 核 背 酸 。 1, 二 氢 尿 障 啶 环 (D A); II， 反 密码 子 环 ; Ul, 可 变 环 ; Iv, THC 环 (简称 工 环 )

tRNA 的 一 级 结构

不 变 和 半 不 变 的 核 昔 酸 一 从 噬菌体 细菌、 真菌、` 昆 虫 \ 植 物 \ 哺 乳 动物 (以 及 真 核 生 Aiea AAR an SAY tRNA 分 子 一 级 结构 的 资料 分 析 , 约 有 二 十 多 个 位 置 上 的 核 彰 酸 是 不 变 和 半 不 变 的 。 其 中 十 多 个 位 置 上 的 核 苷 酸 在 几乎 所 有 tRNA 中 都 是 不 变 的 ，

e。 63 。

i @-—v¥--} 72 i / 2 71 i ee i 2) Cme— 5 a ; Eucaryotes wer 4 only O-mG— 6 67, wD. @, 5 Dj grams Ouicp wis gO VY “ 1 procaryotes e—sU A . a ss 也 2 Ln @Y. 2-755 Be es 4 - nN oS 66 0 62 : 2 © 8 注 8 人 46 全 & ° @ 7 时 Gn” . we ° ’ 本 eV d @) 0 2% “Qe cept ~

3-2 tRNA 中 修饰 核 音 酸 的 分 布 修饰 成 分 符号 见 第 一 章 。 数 字 代表 在 该 部 位 出 现 特定 修饰 核 背 的 已 知 tRNA 数

(圆圈 内 的 数 为 真 核 生物 的 ;没有 圆圈 的 数字 为 原核 生物 的 O Eucaryotes: 真 核 生 物 ，Eucar.: 真 核 ; Procaryotes: 原核 生物 ，Proc.: 原 核 )

Pq 3’ CCA， 第 8 位 的 U( 或 的 衍生 物 );18 和 19 位 的 G (或 G 的 衍生 物 )，53 位 的 G, 61 位 的 C 和 58 位 的 A( 或 A 的 衍生 物 ) 等 。 所 谓 半 不 变 的 核 背 酸 则 是 那些 只 可 能 发 生 味 叭 间或 喀 啶 间 的 互 换 的 核 苷 酸 。 这 些 不 变 和 半 不 变 的 核 昔 酸 对 于 维持 tRNA 倒 世 型 的 高 级 结构 和 实现 其 生物 功能 起 着 重要 作用 ,同时 也 说 明了 tRNA 分 子 在 进化 上 的 保 守 性 。

TCG 序列 一 一 在 绝 大 多 数 tRNA 的 第 54 到 57 位 存在 着 TyCG 序列 。 该 区 域 称 为 ThC 环 。TywCG 对 于 tRNA 分 子 与 5$ rRNA 的 结合 和 tRNA 高 级 结构 的 维系 起 着 重要 作用 。 但 是 在 少数 tRNA 中 不 存在 这 一 序列 。 已 知 的 大 多 数 真 核 生 物 起 始 tRNA 上 这 一 序列 被 AyCG 或 AUCG 所 取代 。 一 些 具 有 特殊 功能 的 tRNA 分 子 , 例 如 作为 肿瘤 病毒 反 转 录 酶 的 引物 的 tRNA 分 子 , 该 处 是 ypCA，TmwCA 或 PCG; 在 表 皮 葡 萄 球菌 中 参与 细胞 壁 合 成 的 tRNASY XA UGCG 等 。

(Ei RRNA 分 子 中 含有 大 量 修饰 核 苷 酸 , 也 叫 稀有 核 苷 酸 ,迄今 已 发 现 近 七 十 种 稀有 核 苷 酸 中 近 五 十 种 存在 于 tRNA 中 ( 见 第 一 章 )。 每 个 RNA 分 于 中 少 则 合

° 64 。

有 2 个 ,多 则 含有 19 个 修饰 核 背 酸 ， 它 们 大 多 分 布 在 分 子 的 非 配对 区 。 特 别 在 反 密 码 子 3 端 邻 位 出 现 修饰 核 昔 酸 的 频率 最 高 ( 见 图 3-2)* 而 且 大 多 属于 修饰 的 叮 叭 核 彰 酸 , 这 对 于 反 密 码 子 环 三 级 结构 的 稳定 \ 反 密码 子 第 三 字母 和 mRNA 上 密码 子 第 一 字母 间 产 格 而 鹤 确 的 结合 是 重要 的 。 在 反 密 码 子 第 一 位 置 或 叫做 摆动 位 置 上 ,也 常常 是 修饰 核 背 酸 ( 见 图 3-2)e 在 密码 子 与 反 密码 子 相互 作用 时 摆动 位 置 的 配对 情况 参阅 第 七 章 。 迄 今 对 于 修 RARE RNA 分 子 存在 的 生物 学 功能 了 解 还 很 少 。

表 3-3 tRNA 二 级 结构 的 证 据

方 法 结 果 1. 紫 外 吸收 光谱 酵母 tRNA 有 50% 双 链 2. 红 外 吸收 光谱 大 肠 杆 菌 tRNAM* 配对 碱 基 占 5392 3 .旋光 色 散光 谱 酵母 IRNA4AL 双 链 占 50% 4. 核 磁 共 振 tRNAPSY 有 21 士 3 碱 基 对 5. Ft RARA RAS 能 结合 部 位 不 能 结合 部 位 ASHER URNA" ACCAon 所 有 茎 区 D 环 TR 反 密 码 子 环 可 变 环 酵母 tRNA’ ACCAou TH 反 密 码 环 DK 6. 化 学 修饰 的 研究 可 修饰 不 可 修饰 酵母 tRNAPhe CCAon 所 有 茎 区 D 环 工 环 反 密 码 子 环 可 变 环

7. 自 由 能 的 计算 及 其 分 布 的 研究 对 62 种 tRNA 的 一 级 结构 研究 结果 三 叶 草 型 二 级 结构 具有 最 低 的 自由 能

》

tRNA 的 二 级 结构

tRNA 分 子 的 三 时 草 式 二 级 结构 也 是 Holley 等 人 在 1965 年 首先 提出 的 ,当时 的 主要 依据 是 酵母 丙 氨 酸 tRNA 的 一 级 结构 信息 和 Watson-Crick 碱 基 配 对 原则 。 根 据 这 个 模型 ， 酵母 两 氨 酸 tRNA 分 子 中 有 20 到 21 对 碱 基 对 ， 即 占 该 tRNA 中 总 数 53 多 的 核 苷 酸 处 于 碱 基 配 对 之 中 。 随 后 许多 物理 和 化 学 (包括 大 量 一 级 结构 的 信息 ) 性 质 的 研究 证 明 ， 在 RN tRNA 分 子 确实 存在 着 与 三 叶 草 模 型 为 数 相当 的 碱 基 对 。 这 些 方法 包括 紫外 人 豚 收 光谱 \ 红 外 吸收 光谱 \ 旋 光 色 散 特 性 \ 核 磁 共 振 、 互 补 核 苷 酸 片 段 结合 、 化 学 试剂 修饰 和 在 多 种 状态 下 自由 能 的 计算 等 的 研究 , 见 表 3-3。tRNA 二 级 结构 模型 也 已 经 由 酵母 丙 ZAR tRNA 的 和 射线 衍射 分 析 的 结果 所 证 实 。

在 三 时 草 构 型 中 (图 3-1) tRNA 分子 一 般 可 分 为 氨基 酸 接 受 蕉 、 二 氢 尿 旷 啶 苍 (D 2). RHBFA. ToC SHH tRNA 还 有 可 变 葵 ` 二 氧 尿 罚 啶 环 (D 环 、1)、 反 密码 子 HK (I), TéC HAV) MARA). Hepes Aww A 7 对 碱 基 对 , 反 密 码 子 苓 5 对 碱 AEX, THC 25 对 碱 基 对 ; 反 密 码 子 环 7 个 核 背 酸 和 TyC 环 7 个 核 苷 酸 在 各 种 tRNA

es。 65 。

中 保持 不 变 。 由 此 可 见 ， 各 种 不 同 的 tRNA 分 子 在 长 度 上 的 变化 主要 发 生 在 三 个 区 域 。 即 D 环 和 可 变 环 的 核 昔 酸 数目 以 及 D 共 的 碱 基 对 数目 的 不 同 。 为 了 便于 研究 ， 大 们 根据 tRNA 分 子 可 变 区 域 的 特征 ,把 tRNA 分 成 三 种 类 型 : 第 一 类 tRNA，D 革 3 对 碱 基 对 ， 可 变 环 3 一 5 个 核 昔 酸 (DiV;_,); 第 二 类 RNA, DA3 HMM, BAM 13-21 个 核 oe CBsVis-siS 第 三 类 tRNA, DA 4 WARM, BAEK 3 一 6 NB BEB (DiVa za 从 已 经 测定 了 一 级 结构 的 tRNA 的 结构 类 型 来 看 ,第 三 类 结构 (D,V;-) 的 RNA AAR 数 的 50% 左右 。 刻 今 为 止 发 现 的 一 个 例外 是 哺乳 动物 线 . 粒 体 丝氨酸 RNA 只 有 .63 个 核 苷 酸 ， 呈 现 三 叶 草 式 二 级 结构 ( 见 图 3-3), 其 沉降 系数 为 3S (一 般 tRNA 为 4S), 这 .

至 o 8

G -c rs 一 结果 也 从 tRNA 基因 的 结构 分 析 得 到 进 二 步 确证 。 3 tRNA 的 三 级 结构 二 LU fA) ~ ne “Ue ae 70 年 代 以 来 RNA 立体 结构 的 研究 有 了 很 大 的 进展 。 ae 先后 有 人 利用 许多 物理 学 和 化 学 的 方法 来 测定 tRNA 等 的 立体 结构 。 这 些 方法 有 激光 拉 曼 光谱 研究 、 碱 基 特 异性 bee HAE UI FE UF SRS SE BTR TE BE EP FE

等 等 。 但 是 除了 少数 方法 能 够 提供 较 多 的 结构 信息 包括 核 RNA 2 烙 碘 酸 骨架 的 走向 外 。 其 余 方法 所 提供 的 结构 信息 是 局 部 酸 ; (); 半 不 变 核 音 酸 ; O55 ， 的 和 零碎 的 ,因而 不 能 构 画 出 tRNA 分 子 清 晰 的 三 度 空间 eee 结构 。 直 到 1973 年 一 1975 年 间 , 由 于 制备 适合 于 高 分 辩 率 X 射 线 衍 射 分 析 的 (RNA 结晶 方法 的 突破 , Kim, Rich 和 Robertus 等 大 利用 这 一 方法 ， 分 别 以 两 种 不 同 的 晶 型 ( 斜 方 晶 和 六 方 晶 ) 测 定 了 酵母 茶 丙 氨 酸 RNA 的 三 度 空 间 结构 ， 得 到 了 几乎 完全 一 致 的 结果 ,提出 了 tRNA 分子 的 倒 工 型 三 级 结构 模型 ( 见 图 3-4)。 随后 还 有 几 种 tRNA (ANBAR RNA, MEH RNA 和 大 肠 杆 蓝 精 氨 酸 RNA 等 ) 先后 用 同样 方法 测定 了 三 级 结构 。tRNA 是 三 级 结构 了 解 较 详细 的 一 种 天 然 存在 的 具有 特定 生物 功能 的 RNA 分 子 。 根据 3A 分 辩 率 的 射线 衍射 分 析 结果 ,酵母 RNA 分 子 具 有 像 字 母 工 那样 的 折 倒 , 有 下 面 这 些 特征 : 〈1) 分 子 的 全 狐 像 字母 L。 氮 基 酸 接受 共和 ToC 4 R— PMB 旋 ，PD 共 和 反 密 码 葵 形 成 另 一 个 近似 连续 的 双 螺旋 ， 这 二 个 双 螺 旋 构 成 了 像 字 母 工 的 形 状 。 工 的 一 端 是 3’ 端 CCA， 另 一 端 是 反 密 码 子 , 两 端 之 间 的 距离 约 70A。Twc KMD 环 构成 工 的 拐角 。 整 个 分 子 是 扁平 的 ,厚度 约 20 信 。 工 型 分 子 中 的 螺旋 类 似 DNA OF 中 的 A 型 结构 。(2) 分 子 中 存在 着 维系 三 级 结构 的 氢 键 。 大 多 数 维系 三 级 结构 的 氢 键 是 在 tRNA 分 子 的 许多 不 变 和 半 不 变 的 碱 基 与 构成 RNA 二 级 结构 的 碱 基 之 间 形 成 的 ( 详 见 图 3-4C)。 除 有 标准 的 Watson-Crick 配对 外 ， 还 有 许多 非 标准 的 配对 ( 见 图 3-5)。 图 3-5 中 a 和 bb 是 标准 Watson-Crick 配对 ; cy dy ay ef fey gy ix hy 和 hi 是 非 标准 配 对 。 (3) 维系 三 级 结构 的 氢 键 中 包含 有 碱 基 与 核糖 或 磷酸 之 间 形 成 的 氨 键 。 例 如 ,Aza WN, 与 Us 9 Oy»; Us; 的 Ni 与 Ax AY Os 或 磷酸 上 的 氧 形成 的 氨 键 〗 册 ss 的 Ni 5 Ass 的 磷酸 上 的 氧 之 间 形 成 的 氢 键 等 等 。 后 二 种 情况 的 氢 键 分 别 稳定 了 反 密 码 环 和 ToC 环 上 人 尖 的 弯曲 。 在 DNA 中 没有 Oy, 因而 不 能 与 之 形成 氢 键 ,这 也 许 是 DNA 分 子 往往 是 长 链 的 一 个 原

和 66 。

3! 过

分 端 pGi ° ‘ 2 & 气 基 酸 接合 此

D¥ te Ue

U (G (A s po RoucRs > fas 729

a eae 25 a8Chj 20 (GIAG SU % Sa iC “ Uy, G C

图 3-4 酵母 茶 丙 氨 酸 tRNA 的 三 级 结构 (a) 链 走向 图 ; (6) 射线 衍射 分 析 得 到 的 立体 结构 模型 ; () 分 子 中 维持 二 级 和 三 级 结构 氧 键 的 位 置 。

Blo (4) tRNA? 的 三 级 结构 具有 假 双重 对 称 性 。tRNA" 分 子 上 所 有 的 碱 基 几 乎 都 有 围绕 着 并 包含 在 二 个 螺旋 结构 之 中 的 趋势 。 约 占 分 子 409 的 结构 是 对 称 的 。 在 氨基 酸 LAA T6C 葵 与 反 密 码 子 蕉 和 反 密 码 子 环 的 一 部 分 包括 D 共 之 间 有 一 个 假 双 重 对 称 轴 ;* 即 在 三 个 螺旋 的 交接 处 的 中 心 有 一 个 双重 对 称 轴 。

tRNA 三 级 结构 的 共同 特征 一 一 酵母 茶 丙 氮 酸 tRNA 三 级 结构 中 发 现 了 许多 维持 三 级 结构 折 且 的 氢 键 大 多 数 是 由 不 变 和 半 不 变 的 碱 基 参 与 形成 的 。 因 此 目 然 可 以 推测 工 型 ADT Beha tRNA 具有 类 似 二 级 结构 特征 的 tRNA (D.V;) 所 共有 的 。 目 前 已 经 测定 了 三 级 结构 的 几 种 CRNA 包括 起 始 RNA( 大 肠 杆菌 起 始 tRNA 和 酵母 起 始 tRNA) 和 延伸 tRNA (KBAR tRNA) 等 都 具有 类 似 酵母 茶 丙 氨 酸 tRNA 那样 的 倒 志

° 67 。

型 结构 。 例 如 ,大 肠 杆菌 精 所 酸 tRNA (Di;V;) 的 X 射 线 衍射 分 析 结果 显示 , 尽管 组 成 它 的 核 苷 酸 有 四 十 二 处 与 酵母 tRNA 的 不 同 ， 它 的 二 级 结构 类 型 (DiV;,) 也 与 酵母 tRNA 〈D4V;) 不 同 , 但 其 三 级 结构 仍 具 有 工 型 的 折合 。 由 此 可 网 , 世 型 的 折 和 县 可 能 是 所 有 tRNA 包括 真 核 tRNA 和 原核 tRNA 以 及 延伸 tRNA 和 起 始 tRNA 所 共有 的 。 当 然 仔 细 观 察 已 经 得 到 的 几 种 tRNA 分 子 的 三 级 结构 模型 可 以 发 现 它们 之 间 在 精细 结构 上 还 是 有 差别 的 ， 这 包括 分 子 上 两 个 螺旋 形成 的 拐角 的 大 小 ; CCA 未 端 伸展 的 程度 ; D 环 在 分 子 上 的 松紧 程度 ; 反 密 码 子 臂 的 构象 和 反 密 码 子 环 上 的 Us 碱 基 的 方向 等 等 。

tRNA 高 级 结构 与 其 生物 功能 的 关系 一 一 1975 年 Kim 根据 酵母 tRNAP 结晶 的 射线 衍射 分 析 结 果 ,提出 了 氨 酰 tRNA 合成 酶 与 tRNA 的 对 称 辨认 假说 , 他 认为 合成 酶 辨认 tRNA 时 分 二 步 。 第 一 步 是 一 般 辨 认 ; 第 二 步 是 特异 性 辨认 。 第 一 步 是 由 合成 酶 辩 认 tRNA 分 子 的 工 型 骨架 结构 , 即 通过 与 假 双 重 对 称 分 子 上 相当 大 的 部 分 的 结合 实现 的 〈 见 图 3-6)。 这 个 假说 可 以 说 明 大 肠 杆 菌 的 氨 酰 tRNA 合成 酶 可 以 酰 化 某 些 真 核 生 物 tRNA 的 现象 ,但 目前 还 缺乏 直接 的 实验 证 据 。

tRNA 与 5S rRNA 的 相互 作用 。 原 核 生物 的 tRNA 分 子 上 的 THC 环 上 有 一 段 序列 GT¢C 与 其 同 源 的 5S rRNA 分 子 上 的 一 段 序列 GAAC 相互 补 。 已 有 证 据 表明 tRNA 与 5S rRNA 相互 作用 发 生 在 RNA 处 于 核糖 体 的 A 位 上 。 许 多 证 据 包括 tRNA 高 级 结构

se 68 。

Nu anne Oo 4H . mes nN oO 4 lo) "r+ . tS ng tee (bp) Pi eae é hed \

u69 (c) ‘ Y 1 eee H-N o----H-NN UN Ga. 人 Yr he 5 y's 1 (@) are us Nae of wl YX ak Ree N-H H miG9 wh - ony * Pia dt ae gp. AC i NH N-H i aexl FN ) bi2 3? 人 we oa G12 Va vs “ 人 人 电

3-5 MEAAAM (RNA 中 a 和 bb 为 标准 Watson-Crick 配对 ; cy dy ei fir

测定 的 结果 显示 : GTWwC 是 被 tRNA 分 子 内 的 氧 键 维系 着 的 ,或 者 具有 严格 的 碱 基 堆积 构象 , 即 它 像 tRNA 分 子 上 茎 区 的 碱 基 一 样 , 化 学 上 是 不 活 涛 的 ( 见 表 3-3)。 因此 只 有 通 过 核糖 体 或 mRNA 的 诱导 使 tRNA 发 生 构象 的 变化 才能 与 5S rRNA 相互 作用。 从 酵 BAARR tRNA 结晶 的 和 射线 衍射 结果 得 知 Gu 5 Coo 之 间 的 碱 基 对 比 正 党 的 GC 对 的 稳定 性 差 , 二 个 碱 基 不 在 同一 平面 上 ,形成 30” 的 扭 角 。5S rRNA 与 tRNA 相互 作 用 的 可 能 的 机 制 如 图 3-7 所 示 。 首先 5$S rRNA 上 的 CCGAAC 中 的 G 或 另外 一 个 G 残 基 与 Cx 形成 另 一 个 扭 角 碱 基 对 ,产生 一 个 双 碱 基 对 的 中 间 物 (图 3-7, b)， 这 个 碱 基 对 降 (KY Cso* G。 碱 基 对 的 稳定 性 ,并 最 后 打开 了 它 , 转 而 触发 了 Gy 的 解 堆 积 ， 至 少 拆 开 二 个 维持 三 级 结构 的 碱 基 对 Pss* Gis 和 Ts Ass» 可 能 还 有 Gs + Ce. 这 样 工 环 与 D 环 解 开 ( 图 3-7, ¢), GTPC 与 5S rRNA 上 的 GAAC 即 可 形成 互补 的 碱 基 对 。

在 蛋白 质 生 物 合成 中 延伸 tRNA 与 起 始 tRNA 的 重要 区 别 或 许 在 于 氮 酰 化 的 (RNAP 是 直接 进入 核糖 体 的 P 位 ， 而 氮 酰 化 的 延伸 tRNA 则 首先 进入 核糖 体 的 A 位 ， 然后 再 转移 到 P 位。 Rich 等 根据 大 肠 杆菌 tRNAM 的 和 射线 衍射 分 析 结 果 , HE SE 伸 tRNA 和 起 始 RNA 功能 上 的 不 同 所 依赖 的 结构 基础 或 许 在 于 Un 碱 基 在 反 窗 码 子 环 上 的 不 同方 向 , 即 所 谓 的 Us “转动 假说 "。 Rich 等 发 现 大 肠 杆菌 tRNAM 上 Us 的 碱 基 Re ER BETAS tRNA 的 则 在 环 内 。 尿 喀 啶 的 不 同方 位 可 能 允许 33 位 的

a = > ee ? ra ? (f,) ed N N-H r hits ) vas 218 ef = i oF (2);

2 N MEd 9 i aa 1 SS CH, c SA f oON Q ie “HN 4 ly O45 en rea N oN G22 H- yn PP tate by te iM ‘Ge ae) i 1 mye H hz co AAA eee | all cia |, oe

的 部 分 碱 基 对 和 假定 的 碱 基 对 tz、ez gy i, hy 和 h, 是 非 标准 配对 。

e 69 。

/ Gee \

氨基 酸 接 受 芭 | oe e (b) (c) so

图 3-6 tRNA 5am tRNA 合成 酶 相互 作用 的 模型 (a) tRNA 分 子 的 构象 ; (b) AM tRNA 合成 酶 的 构象 ; (c),(d) tRNA 5AM tRNA 合成 酶 相互 作用 的 可 能 的 模式 。 核糖 的 0x 与 36 位 的 磷酸 之 间 形 成 一 个 氢 键 。 这 样 36 位 的 磷酸 被 拉 向 环 的 中心， 这 与 正常 的 磷酸 所 受 的 向 外 的 力 不 同 ,于 是 形成 了 一 个 焉 斜 的 反 密 码 子 环 ,而 这 种 构象 与 酵母 tRNA! 是 不 同 的 。 这 种 构象 的 不 同 导 致 反 密码 子 碱 基 排 列 的 轻微 差别 ， 这 可 ERE 许 起 始 tRNA 首先 进入 核糖 体 P 位 的 原因 。Rich 认为 , 真 核 起 始 RNA 的 33 位 虽 是 胞 RENE XR CRA SABHA RNA 相同 的 构象 ， 其 实 核酸 酶 降解 的 研究 已 经 表明 大 肠 杆菌 起 始 RNA SAK RNA 有 相同 的 构象 。 延 伸 RNA 在 从 核糖 体 上 的 A 位 向 P 位 转移 时 会 与 核糖 体 上 的 一 个 元 件 相 互 作用 ， 结 果 反 密码 子 环 从 一 种 构象 弹 向 另 一 种 使 Us 碱 基 向 外 的 构象 。 如 果 是 这 样 的 话 , Us 可 能 在 (RNA 占据 P 位 时 起 一

CE

I

，5S rRNA

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3-7 tRNA 与 5S rRNA 相互 作用 的 一 个 假设 的 示意 图 a, tRNA 分 子 上 的 工 环 与 D 环 之 间 的 碱 基 对 ; b, WB RNA 上 的 G 残 基 Sif G.C 对 相互 作用 ; “，T 环 与 D 环 之 间 的 碱 基 对 打开 ; 4, 5S rRNA 与 tRNA 之 间 形 成 的 碱 基 对 。 种 结构 作用 。 在 mRNA 与 A 位 及 P 位 上 的 tRNA 形成 三 维 复合 物 时 ,，U: 上 的 Oy 可 能 与 在 A 位 上 的 tRNA 的 2oOH 形成 氢 键 ,同时 两 个 反 密 码 子 与 mRNA 上 两 个 相 邻 的 三 联 密码 子 相 结合 ,此 时 两 个 下 NA 分 子 上 CCA 末端 彼此 靠近 ， 造 成 肽 链 转移 的 有 利 的

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结构 。 这 个 ”转动 假说 "还 有 待 直 接 的 实验 证 实 。 tRNA 结构 的 研究 在 过 去 十 几 年 间 是 相当 活 妈 的 课题 , 近 几 年 来 人 们 又 注意 到 tRNA

前 体 一 级 结构 。tRNA 前 体 的 结构 可 为 tRNA 生物 合成 的 研究 提供 重要 的 信息 。 tRNA 的 转录 有 三 种 方式 ， 单 师 反 子 转录 、 双 (多 ) 顺 反 子 转录 和 含有 插 人 顺序 的 基因 转录 。 相

应 地 在 tRNA 生物 合成 中 也 有 三 类 不 同 的 tRNA 前 体 ( 详 见 第 五 章 )。 rRNA

rRNA 是 核糖 体 的 组 成 成 分 ( 见 表 3-4), 它们 对 于 核糖 体 的 自动 装配 和 活力 表现 起 着 重要 作用 。rRNA 结构 的 研究 无 疑 是 了 解 核糖 体 结构 与 功能 关系 的 重要 途径 之 一 。 近

表 3-4 不 同 核糖 体 中 的 rRNAx

大 亚 基 | 小 亚 基 核糖 体 源 - : K sy RNA 5 oe RNA 80S 真 核 生 物 (将 椎 动物 ) 60S 28—29s 40s 18s 5S 5.8S 80S HRA DCAMMIESR DY) 60S 25S 40s 16—18S 5s 5.88 70s 原核 生物 50S 23s 30s 16S 5S 55S 兰 柱 动物 线粒体 40S 16 一 17S 30S 12—13s

* 也 参阅 第 六 章 中 表 6-1 MR 6-2,

二 十 年来 rRNA 结构 的 研究 已 经 取得 了 很 大 的 进展 ,特别 是 近年 来 运用 快速 核 苷 酸 序 列 测定 方法 ， 不 少 过 去 难以 测定 的 高 分 子 量 的 rRNA 的 一 级 结构 得 以 前 明了。 与 此 同时 ， 综合 运用 现代 生物 、 化 学 和 物理 技术 测定 了 它们 的 二 级 结构 乃至 三 级 结构 ， 其 中 以 大 肠 杆菌 核糖 体 中 的 三 个 rRNA 一 -5S rRNA (120 个 核 苷 酸 )、16S rRNA(1542) 和 23S rRNA (2904) 的 结构 研究 最 为 详细 。 其 他 原核 生物 及 真 核 生 物 ( 包 括 真 核 细胞 器 ) rRNA WH 究 也 取得 不 少 进 展 ， 这 对 于 进一步 深入 研究 核糖 体 的 精细 结构 与 功能 的 关系 提供 了 重要 的 信息 。

小 分 子 rRNA 〈 如 5S、5.8S) 的 一 级 结构 可 以 用 经 典 的 或 直 读 的 方法 进行 测定 ( 详 见 第 三 节 )， 而 大 分 子 rRNA 则 通常 先 测定 其 基因 序列 并 辅 之 以 RNA 组 成 和 序列 分 析 等 手 眉 推导 得 到 。 通 过 电子 计算 机 处 理 可 以 排出 已 知 结构 的 rRNA 的 可 能 二 级 结构 模型 ， 然后 用 化 学 修饰 以 及 酶 解 敏 感 部 位 的 确定 予以 选择 和 校正 ; rRNA 上 功能 部 位 的 研究 也 有 助 于 其 二 级 结构 的 建立 。

由 于 rRNA 分 子 具 柔性 ， 因 此 企图 像 tRNA 那样 通过 晶体 的 X 射 线 衍 射 测定 其 三 级 结构 是 困难 的 , 虽然 最 近 根 据 小 角度 X 射线 衍射 分 析 以 及 氢 动 力学 研究 等 已 建立 了 5S rRNA 的 三 级 结构 模型 ( 见 图 3-10)。

RNA 是 单 链 结构 ， 它 不 像 DNA 那样 处 在 完全 的 螺旋 结构 之 中 ， 但 许多 分 析 方 法

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确认 RNA 中 确 也 存在 大 量 氢 键 对 ( 见 tRNA 一 节 的 表 3-3), Alt, RNA 分 子 必 RE FHSAA ATA Mo tRNA 是 这 样 ，rRNA 更 是 如 此 。 下 面 将 看 到 ，rRNA 特别 是 大 的 rRNA 分 子 中 存在 许多 由 螺旋 区 和 环 区 组 成 的 区 域 ， 每 个 区 域 大 概 是 在 结构 上 和 功能 上 . 相对 独立 的 单位 。

5S rRNA

5S rRNA 存在 于 核糖 体 大 亚 基 上 。 真 核 生 物 和 原核 生物 的 核糖 体 都 有 5S rRNA。 从 . 其 结构 特征 不 同 可 以 分 成 四 种 : 〈1) 真 核 型 (120 个 核 背 酸 , 在 高 等 植物 中 是 116 一 118 + aR); (2) 古 细菌 型 (121 个 核 昔 酸 );(3) 细 菌 型 ( 革 兰 氏 阴 性 菌 , 120 个 核 苷 酸 ) 红 47 细菌 型 ( 革 兰 氏 阳 性 菌 ,1156 RAR. AW 117 个 核 背 酸 )。

图 3-8 是 Fox 和 Woese 在 1975 年 提出 的 大 肠 杆 菌 5S rRNA 的 二 级 结构 模型; 当 时 是 根据 6 种 原核 和 4 种 真 核 生 物 的 5S rRNA 的 一 级 结构 信息 提出 来 的 。 其 后 许多 实 验 室 提 出 了 许多 模型 。 直 至 最 近 〈1982 年 ) 由 De Wachter 等 提出 的 模型 , 它 适 用 于 各 种 : 不 同 来 源 ( 包 括 原核 \ 真 核 和 真 核 细 胞 器 ) 的 5S rRNA《〈 见 图 3-9)。

图 3-8 Fox 和 Woese 提出 的 天 肠 杆菌 SS rRNA 二 级 结构 模型 图 中 阴影 部 分 是 与 50S 亚 基 上 的 蛋白 质 结合 的 部 分 。 MA 5” 端 起 每 10 MARES A @ Pride

根据 Fox 和 Woose 模型 , 大 肠 杆菌 5S rRNA 由 四 个 螺旋 区 及 其 他 单 链 部 分 构成 4 四 个 螺旋 是 : 〈1) 分 子 柄 螺旋 (1 一 10 和 110—120); 〈2) 弱 调节 螺旋 (18 一 23 和 60—65)5 《3) 共 同 臂 螺 旋 (31 一 34 和 48 一 51);5(4) 原 核 环 螺旋 (82 一 86 和 90 一 94)。 5S rRNA 的 分 子 柄 通常 由 连续 伸展 的 10 一 11 对 碱 基 对 组 成 , 它 把 分 子 的 二 端 维系 在 一 起 。 不 同 来源 的 5S rRNA 这 个 区 域 的 核 苷 酸 序列 是 易 变 化 的 , 且 常 常 含 G-U 对 ， 例 如 巨大 芽孢 杆菌 的 柄 区 有 三 个 连续 的 G-U Ho

大 肠 杆 菌 5$S rRNA 中 的 弱 调 节 螺 旋 相 当 奇 特 和 容易 发 生变 化 ,这 在 海 生 的 原核 生物 中 是 极 弱 的 ,在 非 海 生 的 原核 生物 中 有 中 等 的 稳定 性 ,而 在 真 核 生 物 中 则 相当 稳定 。 这 个 螺旋 只 有 六 对 碱 基 对 , 且 是 高 度 保守 的 ,其 末端 的 G-C 对 (在 大 肠 杆 菌 中 位 于 23 和 60) 在 所 有 5S rRNA 中 都 是 桐 同 的 。

由 31 一 34 和 48 一 51 构成 的 螺旋 叫 共 同 臂 螺旋 ,共同 劈 螺 旋 在 所 有 的 5S rRNA 中 都 含 4 对 碱 基 对 (酵母 只 有 3 对 ,是 个 例外 )。 紧 靠 着 这 个 螺旋 的 环 , 在 绝 大 多 数 原核 生物 中 都 含有 CGAAC 序列 (在 大 肠 杆菌 中 的 43 至 47 位 ), 它 是 5S rRNA 与 tRNA 分 子 上 的 不 变 序 列 GTYCG 相互 作用 的 部 位 〈 见 第 69 页 )。 这 种 相互 作用 使 5S rRNA 与 tRNA. “ 打 结 ”, 构 成 一 个 连续 的 伸展 碱 基 对 ,可 多 至 14 对 (如 果 5S rRNA 与 tRNA 间 有 五 对 碱

0. 720

基 配 对 的 话 ), 即 5S rRNA 上 4 对 ，5S rRNA 与 tRNA 间 4 一 5 8, tRNA E5 Xf, 这 种 分 子 闻 螺旋 的 形成 对 于 tRNA 上 的 TVCG 和 臂 的 几何 构象 ,进而 对 于 整个 tRNA 分 子 三 级 结构 的 影响 是 非常 大 的 。

原核 环 螺旋 一 般 有 4 对 以 上 碱 基 对 ,如 含有 G-U 对 的 话 , 碱 基 对 可 增加 ， 如 大 肠 村 AA 8 对 。 紧 靠 的 原核 环 ( 大 肠 杆菌 为 87 一 89) 有 3 个 喀 喧 或 4 个 非 配对 的 核 苷 酸 。 原 核 环 及 其 螺旋 构成 一 个 紧密 的 发 夹 。 尽管 该 处 一 级 结构 可 变 ， 但 它 总 是 有 较 多 的 G-C 对 ,因而 比较 稳定 。 大 肠 杆 菌 中 这 个 区 域 是 抗 核酸 酶 作用 的 。

在 5S rRNA 分 子 上 , 单 链 区 较 双 链 区 的 一 级 结构 保守 。 其 中 一 个 单 链 区 ，GCGCC% AUGGUAGU (在 大 肠 杆菌 中 位 于 67 一 80) 25 50S 核糖 体 亚 基 上 的 蛋白 质 如 LS, L11 和 L25 (也 见 图 3-16) 相 互 作用 的 部 位 。 这 个 序列 虽 普 遍 存 在 于 细菌 5S rRNA 中 ,但 在 真 核 生 物 中 则 找 不 到 。

大 肠 杆 菌 5$S rRNA 的 第 72 到 83 位 ; 共 12 个 核 背 本 是 与 23S rRNA 上 的 5 端 143 一 154 位 之 间 互 补 的 ,说 明 该 区 域 可 能 是 与 23S rRNA 相互 作用 的 部 位 。 因此 ， 整 个 5S rRNA 分 子 可 以 粗略 地 分 为 二 大 部 分 :一 部 分 在 识别 功能 上 ( 即 与 tRNA 相互 作用 ) 是 重要 的 , 另 一 部 分 则 在 结构 上 ( 即 与 50S 核糖 体 亚 基 相 互 作 用 ) 是 重要 的 ,而 隔 开 这 两 部 分 的 是 弱 调 节 螺 旋 ( 见 图 3-8)。 1982 年 DeWachter 等 人 提出 一 个 新 的 5S rRNA 二 级 结构 模型 , 这 个 模型 适用 于 各 种 不 同 来 源 的 近 一 百 种 5S rRNA， 表 明 它 们 是 有 共同 的 起 源 的 。 图 3-9 是 这 个 模型 的 示 意图 。 该 模型 由 以 下 几 部 分 构成 : 五 个 双 链 区 (分 别称 为 A、B、C、D ME), 一 个 多 分 支 的 环 CM) ,二 个 中 间 环 (6 和 L)7 和 二 个 发 夹 环 (CH, 和 H:)。 这 个 模型 与 上 面 介 绍 的 大 肠 杆 fA 5S rRNA 模型 基本 上 是 类 似 的 。 但 DeWachter 等 人 模型 则 把 所 有 5S rRNA 以 150 个

位 置 表示 ,以 容纳 在 进化 过 程 中 核 苷 酸 残 基 的 缺失 以 及 变异 产生 的 核 苷 酸 残 基数 的 增 减 。 此 外 ,还 有 以 下 特点 : 它 有 较 低 的 自由 能 ， 碱 基 对 占 碱 基 总 数 的 61%; 有 21 个 位 置 上 的 核 普 酸 残 基 是 保守 的 :有 24 个 位 置 具 有 保守 的 了 喀 啶 或 叮 叭 碱 ; 而 五 个 双 链 区 的 碱 基 对 数 目 和 各 个 环 区 的 核 苷 酸 数目 则 因 5S rRNA 的 来 源 不 同 而 不 同 。

A M B LF c H,

3-9 58 rRNA 共同 的 二 级 结构 模型 A 一 E: 双 链 区 ; M: SAH; I, Al I: 中 间 环 ; H, 和 H,: 发 夹 环 。

经 过 多 年 努力 已 有 三 家 实验 室 分 别 根据 小 角 X 射线 衍射 分 析 、 氢 动力 学 研究 和 特异 性 酶 解 研究 等 结果 提出 了 大 肠 杆 菌 5S rRNA 的 三 级 结构 模型 ,图 3-10 是 其 中 的 一 种 其 特征 是 除了 二 级 结构 形成 的 氢 键 以 外 (与 图 3-8 比较 )， 还 存在 着 4 对 维持 三 级 结构 的 氢

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键 (41 一 44 和 74 一 77), 以 使 5S rRNA RRA ERT BIKA 3-10),

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图 3-10 ABE 5S rRNA 的 三 级 结构 模型 (与 图 3-8 比较 )

5.8 S rRNA

真 核 生物 核糖 体 大 亚 基 RNA 的 组 成 与 原核 生物 的 最 明显 的 差别 是 含有 5.8S rRNA, 5.88 rRNA 是 在 变性 条 件 下 从 28S rRNA 上 解 离 出 来 的 〈 见 第 五 章 )o。。 已 有 十 多 种 5.8S rRNA 的 一 级 结构 被 测定 了 。 与 5S rRNA 相 比较 ，5.8S rRNA 略 大 些 , 通 常 含 有 160 个 左右 的 核 苷 酸 残 基 ; 分 子 中 含有 修饰 核 萌 酸 (如 中 和 核糖 上 甲 基 化 的 核 背 酸 等 刀 其 一 级 结 构 中 含有 原核 生物 5S rRNA 的 共同 序列 CGAAC 〈 见 图 3-11)。 可 见 它 可 能 是 真 该 生 物 蛋白 质 生 物 合成 时 参与 和 RNA 相互 作用 的 部 位 ， 起 着 原核 生物 5S rRNA 相似 的 功 能 。 不 同 来 源 的 真 核 5.8S rRNA 之 间 的 共同 性 约 为 75 多 。 5.88 rRNA 的 二 级 敌 构 已 有

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图 3-11 Novikoff 腹水 瘤 5.8S rRNA 可 能 的 二 级 结构 模型 图 中 特别 标 出 的 *vCGAAC#(103 一 107) 是 可 能 与 tRNA 中 ”GTYCG3? 相互 作用 序列

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许多 人 提出 了 许多 可 能 的 模型 ， 但 迄今 没有 定论 。 图 3-1] 显示 的 是 一 种 可 能 的 模型 ,这 个 模型 的 特点 是 含有 一 个 富有 G-C 碱 基 对 的 发 夹 环 \116 一 138)， 一 个 富有 A-U 磊 基 对 的 稳定 性 较 差 的 发 夹 环 (64 一 91) 和 二 个 近似 对 称 的 突起 (分 别 在 15 一 25 和 40 一 44)o

16S rRNA

已 有 几 种 原核 生物 (或 真 核 生 物 细胞 器 ) 的 16S rRNA 的 一 级 结构 被 盖 明 了 ，, 它们 是 大 肠 杆 菌 16S rRNA (1542 KER) SBE IEE ER (Proteus vulgaris) 16S rRNA(1544 AEB) ARR CEuglena gracilis) 时 绿 体 16S rRNA (1491 AERA (Chla- mydomonas reinhardi) 叶绿体 16S rRNA (1475 个 核 苷 酸 ) 等 。 这 些 16S rRNA 中 除 四 种 常见 核 苷 酸 外 ， 还 含有 少量 修饰 核 苷 酸 ， 如 在 大 肠 杆 菌 16S rRNA 中 有 五 种 一 mA、 mG、mC、m'C 和 Gm, AKIN 16S rRNA 具有 相似 的 二 级 结构 ;并 且 发 现 核 糖 体 小 亚 基 rRNA (包括 真 核 18S rRNA， 线 粒 体 12S rRNA) 的 二 级 结构 模式 也 是 类 似 的 《 见 后 面 图 3-13 及 正文 说 明 )。 下 面 以 大 肠 杆 菌 16S rRNA 为 例 简单 介绍 16S rRNA 的 结构 特征 。 图 3-12 是 Noller 和 Woese 提出 的 大 肠 杆 菌 16S rRNA 的 二 级 结构 模型 。

该 模型 有 下 列 特征 :

整个 分 子 被 三 个 分 子 内 的 长 距离 相互 作用 形成 的 螺旋 分 隔 成 4 个 相对 独立 的 部 分 ， 这 就 是 5 末端 区 域 (1，1 一 556) 中 心 区域 CI, 564—916), 3’ 末端 大 区 域 (II,，926 一 1391) #1 3’ 未 端 小 区 域 (IIL，1392 一 1542)o。 在 该 模型 中 约 有 46% 的 碱 基 处 在 螺旋 结构 之 中 (这 与 tRNA 有 50%.5S rRNA 有 45 多 的 双 链 区 数值 是 接近 的 )， 但 用 物理 方法 测 定 则 有 60 一 70% 双 链 结构 。 这 个 差异 表明 ,在 16S rRNA 中 肯定 也 存在 三 级 结构 , 二 级 结构 中 不 配对 区 域 之 间 可 能 包括 非 Watson-Crick 的 相互 作用 。 另 有 证 据说 明 。 5 末端 区 域 和 3 末端 大 区 域 中 的 不 配对 环 至 少 是 部 分 结构 化 了 的 。

在 大 肠 杆菌 16S_ rRNA 中 ， 许 多 螺旋 含有 G-U 对 ， 有 的 《例如 830 一 860) 含有 多 个 G-U 对 。 分 子 中 不 存在 长 的 、 连 续 的 标准 氢 键 对 ， 最 长 的 螺旋 只 有 8 对 。 这 与 16S rRNA 前 体 中 处 于 成 熟 16S rRNA 旁 侧 的 RNase II 剪 切 部 位 有 很 大 区 别 , RAR 17 个 连续 的 标准 碱 基 对 构成 。 在 16S rRNA 分 子 的 一 些 共 区 中 还 出 现 单 碱 基 突 起 ,如 Gs, Ans. Aw 和 Ar ， 至 少 其 中 二 个 (Ga 和 Aw) 被 认为 与 核糖 体 蛋 白质 的 识别 有 关 。

与 tRNA 一 样 , 16S rRNA 也 存在 着 复合 螺旋 结构 , 几 个 (多 至 5 一 6 个 ) 短 的 螺旋 处 在 一 个 复合 螺旋 之 中 ,它们 被 环 所 隔 开 。

在 16S rRNA 中 有 上 帮 处 的 核 背 酸 序列 能 与 多 于 一 处 的 分 子 的 其 余部 分 互补 , 这 种 多 相互 作用 结构 被 称 作 “ 开 关 ” 结 构 ， 例 如 在 3 末端 大 区 域 的 大 环 区 就 存在 这 种 结构 。“ 开 关 ” 结构 的 存在 是 16S rRNA 在 核糖 体 中 进行 蛋白 质 生 物 合成 的 不 同 阶段 上 发 生 构 象 变 化 的 基础 。 但 是 ， 绕 观 整个 16S rRNA 分 子 ， 其 中 并 不 存在 HA HAW, NAPE 样 的 区 域 : 一 个 碱 基 配 对 区 的 一 条 链 处 于 另 一 螺旋 的 两 条 链 之 间 ， 也 即 邻 近 螺旋 的 环 区 并 不 与 另 一 条 链 互 补 。 这 可 能 对 核糖 体 的 装配 有 重要 意义 。 因 为 没有 ` 结 ”的 结构 可 以 避 免 在 核糖 体 装 配 时 产生 中 间 物 同 分 异 构象 物 〈conformers)。 实 际 上 ,已 知 RNA【〈 包 括 5S rRNA, tRNA 和 16S rRNA) 的 结构 都 是 按照 这 个 原则 构成 的 。

假定 核 背 酸 间 的 平均 距离 为 3 人 A, 那么 图 3-12 的 16S rRNA 结构 大 小 为 300 X 450 和 A。 从 小 角度 和 X 射线 衍射 和 电镜 观察 到 ,其 大 小 分 别 为 55 X 200 X 220 AAI 80 x 190

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3-12 KBR 16S rRNA 的 二 级 结构 模型

ole 这 人 通过 测定 三 个 主要 种 系 (包括 原核 生物 果 是 它们 有 广泛 的 共同 性 的 ) 核 六 体 的 小 亚 基 cRNA 的 核 音 酸 排 列 顺 序 。 得 到 的 结 SeEE en ,例如 大 肠 杆 菌 16S rRNA (如 前 述 ) ,酵母 18SrRNA (1,789 个 eR Sai 78 BNA O31 MEAT IB) 0 se ok, BORN SE. 保守 性 意 昧 着 TRNA sity. 它们 的 二 级 结构 显得 更 为 保守 , 见 图 3-13。 这 种 广泛 的 酶 解 图 谱 看 到 ,有 一 些 很 强 的 功能 上 的 制约 。 从 多 种 来 源 的 16S rRNA 的 RN "SIH Dg SEE coat one coe

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人 线粒体 12S rRNA

3-13 ”核糖 体 小 亚 基 RNA 二 级 结构 的 比较 a, FURS 端 区 域 ; b, HORM, c, 3” 端 区 域 ( 包 括 大 区 域 和 小 区 域 )。

螺旋 区 。 在 螺旋 区 中 , 核 苷 酸 的 变化 是 相互 制约 的 , 即 其 中 一 条 链 改变 , 其 对 应 的 链 也 在 变 , 即 使 同一 种 族 也 是 如 此 。 这 些 螺旋 往往 含有 高 比例 的 非 标准 碱 基 对 如 G-U 甚至 A- G 对 。 不 同 来 源 的 16S rRNA 分 子 中 的 这 些 区 域 在 长 度 上 是 可 变 的 , 它们 中 的 一 部 分 是 SEA RRA MOL.

研究 核糖 体 上 核酸 与 蛋白 质 相 互 作用 的 方法 有 下 述 12 种 : 〈1) 蛋 白 和 核酸 结合 后 核 酸 酶 水 解 的 研究 ;2) 核 酸 片段 与 个 别 蛋白 质 结合 能 力 的 研究 ;(3) 蛋 白质 肽 链 被 裂解 成 二 PRES MH ERD AW ES 16S rRNA 结合 的 能 力 ; 〈4) 先 经 核酸 酶 作用 ， 然 后 分

° 77 。

离 和 分 析 得 到 的 RNA- 蛋 白质 络 合 物 中 的 RNA FRM SEA is (5) 交 链 分 析 , 即 先 经 紫外 光照 射 或 双 功 能 试剂 处 理 使 分 子 间 发 生 交 链 ， 然后 确定 彼此 交 链 的 蛋白 质 和 RNA 廊 眉 ;(6) 单 链 特异 性 的 试剂 处 理 , 例 如 ， 在 一 个 蛋白 质 结合 到 RNA 链 上 前 后 分 别 二 全 扎 次 基 了 柄 五 处 理 , 分 析 两 者 被 修饰 部 位 的 差异 ,从 而 判断 与 蛋白 质 作用 的 部 位 ;(7) 蛋 日 质 分 子 上 特异 性 的 氨基 酸 被 修饰 后 ,对 RNA 结合 能 力 的 影响 ;《〈8) 突 变型 的 蛋白 质 与 野生 型 的 蛋白 质 结合 RNA 能 力 的 比较 ; (9) 电子 显微镜 观察 RNA 与 蛋白 质 结合 位 点 ;10) 用 超 滤 膜 和 其 他 方法 测定 RNA 与 蛋白 质 的 结合 常数 ; (11) 物 理 技术 .例如 小 角 和 射线 衍射 、 中 子 衍 射 、 气动 力学 分 析 和 圆 二 色 性 测量 等 等 ， 能 够 推测 出 蛋白 质 结 合 到 RNA 链 上 以 后 引起 RNA 分 子 构象 的 变化 ; (12) 天 人 然 核糖 体 蛋白 质 的 董 光 分 光 光 度 研 究 ， 能 给 出 蛋白 质 结合 后 有 关 氨 基 酸 微 环境 的 变化 的 信息 。 综合 以 上 这 些 研究 得 到 的 结 采 见 表 3-5 和 图 3-14。 从 中 可 以 看 出 ;16S rRNA 链 上 的 这 些 结合 位 点 在 结构 上 是 多 种 多 样 的 ,在 长 度 上 也 是 长 短 不 一 的 ,如 S8 和 S15 的 结合 部 位 约 为 40 一 60 个 核 苷 酸 残 基 而 S4 则 大 约 有 500 个 核 苷 酸 残 基 。

表 3-5 大 肠 诗 菌 16S rRNA 的 结构 部 位 与 功能 的 关系

16 SrRNA 上 的 部 位 结合 的 蛋白 质 在 核糖 体 上 的 定位 Of 5 未 端 区 域 25—420 $4, S20 基部 与 核糖 体 上 蛋白 质 结合

5 末端 区 域 420 一 460 S4 基部 与 核糖 体 上 蛋白质 结合 中 心 区 域 560 一 890 $6,S8,S15,$18 平台 亚 基 结 合

3 未 端 大 区 域 920—1400 $7,S9,S10,S13,S19 头 部 与 IRNA 结合

3 末端 小 区 域 1400—1541 S1 和 s2 平台 亚 基 结合 ,起 始

除 与 核糖 体 上 蛋白 质 相 互 作用 外 ，16S rRNA 还 与 参与 蛋白 质 合 成 有 关 的 核 BAR 相互 作用 。168 rRNA 的 3 未 端 区 域 存在 着 一 段 序列 AcCcrccU 是 与 mRNA 的 翻译 起 始 区 相互 补 的 ( 见 第 六 章 ), 这 一 区 域 处 于 核糖 体 308 WASHS 7 GE BER Be ch , By AE SY

JP 图 3-14 大 肠 杆菌 16S rRNA 二 级 结构 在 核糖 体 30s 亚 基 上 的 定位 〈 亚 基 模 型 见 第 六 章 )

° 78 。

Sr ae bas > ”

4KASER—TS5 mRNA 结合 和 密码 子 与 反 密码 子 辨认 的 部 位 。 3 末端 小 区 域 中 二 个 不 配对 的 区 域 有 高 度 的 保守 性 ， 已 有 许多 证 据说 明 它 们 与 核糖 体 50S 亚 基 结合 有 关 。

有 的 tRNA 占据 P 位 时 ,分 子 上 的 反 密 码 子 的 了 末端 核 背 酸 能 与 16S rRNA 通过 紫 外 光照 射 局 效 地 共 价 交 链 在 一 起 。 这 个 交 链 部 位 在 16S rRNA 分 子 的 1390 一 1497,1390 一 1410 是 十 分 保守 的 ,有 可 能 这 就 是 各 种 核糖 体 小 亚 基 rRNA 起 关键 的 和 共同 的 功能 的 部 位 。 这 样 ,密码 子 和 反 密 码 子 相互 作用 点 被 置 于 3 末端 大 小 区 域 之 间 的 连接 部 位 ,而 这 个 位 置 有 人 推测 正好 在 30S 亚 基 电子 显微镜 模型 的 头 部 和 平台 的 连接 部 位 ， 这 就 是 有 可 能 在 该 模型 的 裂 锋 处 ,这 一 点 与 核糖 体 上 和 RNA 有 很 强 的 结合 力 的 蛋白 质 在 该 模型 上 的 位 置 是 一 致 的 (就 是 S2、S3、S10、S1 4 S18、S19 和 S21) ,这 些 蛋白 质 都 环绕 着 裂 锋 区， mRNA 的 结合 部 位 也 在 该 处 。

核糖 体 30S 亚 基 和 50S 亚 基 的 结合 也 有 16S rRNA 人 参与。 核酸 酶 限制 性 水 解 和 化 学 修饰 研究 显示 , 当 与 50S 亚 基 结 合 以 后 ,其 中 心 区 域 的 3 末端 大 区 域 和 3 末端 小 区 域 是 绝 对 地 抗 核酸 酶 和 p- 乙 氧 炭 基 丁 酮 醛 作用 的 。 这 些 结合 部 位 上 存在 着 起 关键 作用 的 G 残 基 。 由 此 看 来 16S rRNA 的 中 心 区 域 、3 未 端 大 区 域 和 小 区 域 在 核糖 体 行使 生物 功能 上 起 着 重要 作用 。 这 些 区 域 的 单 链 区 的 结构 显示 了 种 属 间 的 保守 性 。

18S rRNA 迄今 只 有 三 种 真 核 生物 18S rRNA 的 一 级 结构 被 确定 ,它们 是 通过 测定 基因 的 一 级

结构 并 辅 之 以 RNA 组 成 和 部 分 RNA 序列 分 析 结果 推导 出 来 的 。 前 面 已 经 提 到 , 酵母

18S rRNA 含有 1789 AHR, HAY 25 PHILA ame Bil mincpip、m7G、 mA、msA 和 各 种 .2-=0- 甲 基 核 音 屋 和 许多 假 尿 昔 酸 ; Mss 18S rRNA 含有 1,825 VEE 酸 ,其 中 有 40 个 甲 基 化 核 背 酸 和 许多 假 尿 苦 酸 。 这 两 种 rRNA 的 核 苷 酸 序列 有 70% 以 上 是 相同 的 ， 也 存在 部 分 相同 以 及 完全 不 同 的 区 域 。 几 乎 所 有 甲 基 化 的 修饰 成 分 都 处 在 结构 高 度 保守 的 区 域 。

HHH 18S rRNA 的 一 级 结构 也 进行 了 测定 ; 发现 它们 与 酵母 和 爪 蟾 有 许多 相似 性 ,特别 是 含有 修饰 成 分 的 片段 。 例 如 鼠 18S rRNA 中 的 UAmeACAAG 和 m$Am$ACCUG 片 朋 分 别 存在 于 酵母 和 爪 蟾 的 靠近 3' 末 端 区 域 ; 鼠 中 有 m’GAAU (%,C,) AG, MRA Mesh 45 BI GAAUUCCUAG 和 m7GAAUUCCCAG, JES, AUT HE AA WER 18S rRNA 中 的 修饰 成 分 比 酵 母 多 。

虽然 真 核 生 物 18S rRNA 间 有 很 强 的 保守 人 性 ,但 与 原核 生物 16S rRNA 相 比 ， 除 了 3' 未 端 处 ;二 级 结构 很 少 有 共同 序列 。 图 3-13 比较 了 三 种 不 同 来 源 ( 原 核 \ 真 核 和 真 核 细 胞 器 ) 的 核糖 体 小 亚 基 rRNA 的 二 级 结构 ,发现 它 们 是 非常 保守 的 , 即 分 开 为 几 个 区 域 都 具有 相似 的 二 级 结构 。 看 来 二 级 结构 上 的 保守 区 域 可 能 是 这 类 rRNA 行使 功能 的 关键 部 位 。

23S rRNA

1980 年 Brosius 等 利用 23S rRNA 基因 顺序 测定 方法 推导 出 大 肠 杆 菌 23S rRNA 的 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 ,整个 分 子 含 有 2904 个 核 昔 酸 。 已 经 测定 了 一 级 结构 的 还 有 玉米 叶 绿 体 23S rRNA。1981 年 有 三 家 实验 室 相继 提出 了 大 肠 杆 菌 23S rRNA 的 二 级 结构 模

» For

型 ,其 中 Noller 等 人 提出 的 模型 见 图 3-15。 整 个 分 子 被 许多 长 距离 相互 作用 的 碱 基 对 分 成 相对 独立 的 六 个 部 分 ,其 中 5 末端 与 3 末端 的 一 段 序列 〈8 核 音 酸 ) 互 补 , 构 成 一 个 闭合 环 。 中 心 环 的 四 周 呈 放射 状 。 该 模型 中 约 有 52% 的 核 苷 酸 残 基 处 于 螺旋 结构 之 中 ,螺旋 区 是 不 规则 的 ,大 体 有 下 列 三 种 情况 : 〈1) 由 标准 Watson-Crick 碱 基 对 构成 的 螺旋 ;《〈2) 由 许多 G-U 对 组 成 的 螺旋 ;(3) 含 有 特殊 的 碱 基 对 (如 A-G 对 ) 和 包含 有 碱 基 突起 的 螺 旋 。

从 图 3-15 可 以 看 到 , 像 16S rRNA 一 样 ，23S rRNA 也 不 存在 “ 打 结 ”结构 ， men “开关 ”结构 ,这 些 结构 特征 暗示 或 许 它 们 在 功能 上 是 重要 的 。

23S rRNA 分 子 上 存在 与 RNA、5S rRNA、5.8S rRNA 以 及 叶绿体 4.5S rRNA, 昆虫 2S rRNA 相互 作用 的 位 点 。 如 23S rRNA 有 一 段 顺序 (1984—2001) 与 同 源 的 tRNA 上 的 一 段 顺序 〈《G;*-D:) 互补 ; 靠近 5 末端 的 一 段 12 核 昔 酸 《143 一 154) 与 5S

ec ass< 9%, i ws "ay *. “es at ? | ee < 人 ce 和 v 0 ef. < cf. Pic er < ice Fuge 4 ge < Cee OO 2 5 ry foe a’Ecccassauce ecu “cco Ga ra ase “ac GGCEUUUUCEU CEG, cece, aS ag ssf 和 Te M gee beet in ° conte, Le ° wet 的 vte 办 ao? a yr Ge cca’ © cw ‘ ‘6 a , 6 & A vee 《wm [4 a ¥ S46 ee ude soe « te 人 Hag esc x one ¢ my tee ; we 多 o eeu, cm as 4 toe! rea aes ot § ca aie, 5 a f fete aucce ae ae we ee e-c a el . . ev we 和 sue evccuua a Ss Ar acvecss cy Nees ae Ste. 48 tes $25 ev c othe y . 和 8 af : F “4 ca aoe Be, vuscus seeco 6% 6 wee C Ce 650894 6C Ow ces ww . “Eeu-8 youre af? Cuacaay uc tad sf £:& ‘ Paes Se ms sé 5 和 es. 4 vie nace 4 twa be, Fh “ags “nae c c vc < x a ac-e ¢ c cou s 3. et Sec Se es agacacccaste™ AR % 让 tan atic See Gee Se 66eroce 区 GEE Sou Se * accuats 2 Ed 六 a eee © 7S, Ca fd accaus® a a Cou oy Oe at “c%e* 。 ca 6 oo 48 5 Ra = é G4 S Me FC, Se CU ea 5 cc AT co “vccvcc = aceuz OP - a Saga naste® = v a 6 fh acy ee a ta 《2 eaveo-c -6 6 Yoo i s CeGCgu-* < 人 a ‘au 8 WwW s ‘Ua s 5 a 下 -Ce ett, 上 ani oo aaa i baer ua Pon fost eae 1 ta J . a. a S Revie te Se es ys a “+ ofa we Seg acv65 eee tance 6 6。 WE 和 - Cay oe’ ae 50279 eye ut uas $88. S le 8 外 ccc fe 72 ee Yee, ee eee cet ~ e's m <S “u ave ao, base Ste, Senay” te tuts any * San aie i be cc 6 站 ley us! oy, sue eee a! c v ce Z a ceqse ke :ic Ce fos 7 mY. A ry *c ey . osu Gu auesae™ cactsetcscs uty Ueag a“ “fy oe ue ere ce, weg uene, ak tes ¢ yr é 加 和 ict 5 PR Vee ere s % Coeg! aa66 65 -66 EC、 Ce Ese aed 4a % C-6 . a 5 5 3 aoe GaecCuga, Coe dst 6 和 eur 本 c* 号 人 bead a ces s 6 6 ba cccee“*acut™*t et 本 ¢ geced “acu. “g “se¥ a te “ecg ne 6 cecee us wae fe A ihe -| Useracucac < 所 EC 2 . 全 A Aes Cag? 要 . s 四 coe x eccua 5-6 % ats é uv 三 apiece ig « va Ss, % a ct eas 本 vec 万 “he, eortccventua yaahee’ -ccu cc “aaueccau® aYyete’ wee ses ee eee vec % eye “COC + <oc- Sec Gec tec ves Gec,’ vea 6O6 a Ca ry ce GOu s c ein aoe 和 v Sree € v peu 8< ae 6 vec eeu ateyu . s # V6 hee al eh ’ -— 4 ww Paras wees % “, * ey

图 3-15 KAGE A 238 rRNA 的 可 能 二 级 结构 [ 左 半 有

3 80 。

JeRNA . 止 一 眉 顺 序 (72 一 83) 互 补 ;5 末端 区 域 约 有 100 核 背 酸 对 应 于 不 同 真 核 生 物 的 5.8

S cRNA. 顺序 ; 3 未 端 有 一 妥 顺序 则 对 应 于 叶绿体 核糖 体 大 亚 基 所 含有 的 不 5S ERNAili5 未 端 区 域 有 20 多 个 核 音 酸 对 应 于 某 些 昆虫 808 核 丫 体 上 的 28 CRNA 等 。 这 些 对 应 关 系 意 味 着 它们 之 间 有 功能 上 的 联系 。

原 叭 过 素 订 和 标记 核 燥 体 时 ,其 作用 位 点 在 太 位 上 飞 见 第 六 章 ) 该 化 合 物 能 与 238 rRNA 上 的 GU*CCG B% GU*UCG 相互 作用 ,前 者 位 于 23S rRNA 上 的 962 一 966, 出 现 一 次 ,后 者 位 于 2553 一 2557。2603 一 2607 和 2688 一 2692。 出 现 三 次 。 如 果 23S aie 4 BOK ED) HE Hae EDO (EH UDA BOSE EHO,

_ fof 20 RE, UBER EA 50701 LAOREET 238 rRNA KLE 丫 合 。 根 据 澳 核 酸 酶 作用 . 紫外 光照 射 和 双 功 能 试剂 交 链 的 研究 ， 指 出 23S rRNA 上 第 615 位 的 U 与 并 4 蛋白 质 上 第 35 位 的 Tye 相交 联 。 其 他 可 能 结合 部 位 见 图 3-16, 其 中 特

ste oe x iss - 要 s 4 Ht . K. wos ar ae & ec vee :让 ves at Se $35. ares weg “ve 2 aa a. 4s s a8 v . ac-C¢ .626 v v Oe ay ee * Agu a < 66u68 & C86, . St ee ASR en a ‘a u a u ccacc a 4 5 c 人 . a ¢ % a: ”ve s . § ou oS, c ce utc 0 ACE Sea: t-¢ eg: = Je rs ugc c-6 ec} c-6 cae c-G cesG as ame hag — ws va 8 SSS 及 a, neo-6 eu ¢ § (Ay Sal aoe uec- 'v vea ee Ee, ee ee tae eevee ot matte a= Me. | .UGCGS GcceGe, & Cescs es, atc ur Oo aaa teeress oY ASUA Y = Custos S6.c8 eee ae a cucetags® ,88ue ‘Cacceddy, “Sy%e” YY, Ae FOR = c cAAw asec! Soecee a ‘Sel s acu aGcusseC < “ Ytac vuccecY ek 6 ce Cea “CeuecesU 2 ce -eu a uve fe wes ue ay m eu DC Sa coc-S aas Ace” aes ata tec-m0 ous cf ec C¢ aeu GaG S26 fous id Bess, Geuce, aver S eg -U c Gec ay Sec Sey : -CC 和 5 TA ae aes vos aA ese ¥ . = . 3 cCGus ‘u ear aa teGtaso6 cn 5 i he ic we 6 < a -Geuteo Gces Gace GC. aa ny c a a “cScecces eeu oe e a0 8 G ue oahey 6 on? a 6te ct veg? Yscuead ic au a6 a as ce cacue S2SCeG, s CsMcGa a. cs Usa ete ogee 4 S core coGiu © ee at ae beste oy 如 一 直下 cose Asacieoca ， 二 作 acca® Gre sy ves oc ues “y & “hu Gap cock A aeu é Cu ay CGOcA CHG, SUGaue u 人 % saeuG | or eU 4 a gene ~~ UV yea ec hs vc er S coc a .G a cht cua cmc <6 a ct CeG hao “Gua ‘ ie cies re Accccc6GCAAGACGCA 号 et a) veueeeee oot ue igcucauaticce u GGGUGCCG UCY CC Steoeseetcere. ce < . we cocuucueccce. s é 6 & co vu a,ve t-c- 以 、 ne; Scauszé reo, £6 aSe y Gc cc 到 um CoG Acavscc Juugcouc c ure rd ¢ Gec V usa v “ues we CG, ae sor iz cee J ¢ ca uae =c- Sera" Cea yo" q ilo cal Se sic AGuaa- &ACu 一 A 让 入 2 eS “ na -6 .625 465c-56 189 en a -C-6 < 8 You Us anu So°%G cw Secs Gec 2 G=E Geb 5e Reuss Ue G-c C6 ac! oy aswel. Hate ey Z 5 a®” “autccucccccuSs, ac “cas. = a vii0ee ¢ aou uta cat SR CF (Cate scceessau vu G 四 5 aoc”. ecru y eBay ac ac® -au oacy a Re 5 OY rH c=6 én Cane ro ue C=G-t80 c aime ? vu Gec uea EC vc Cae oo Goc . ae C26 6 sss cae Sy F = ure Os ad cc ues a ofa acce ，

三 个 区 域 (1 一 1647 BHR) AF A= TE C1 048—2904)] se 81 。

别 是 L1 蛋白 质 的 结合 区 ,经 过 比较 几 种 不 同 来 源 23S rRNA 在 该 处 的 二 级 结构 ,说 明 进 _

化 上 是 保守 的 。

图 3-16 大肠 杆 菌 23S rRNA 二 级 结构 模型 上 23S rRNA 的 可 能 功能 部 位 (图 中 阴影 处 系 与 其 他 生物 大 分 子 作用 的 部 位 ) 不 同 来 源 的 23S rRNA 约 有 60—70% 的 结构 共同 性 。 大 肋 标 菌 23S rRNA 的 一 级 结构 与 酵母 21S rRNA 也 有 很 大 的 相似 性 。

26S rRNA

已 经 测定 了 一 级 结构 的 真 核 生 物 核 糖 体 大 亚 基 中 大 RNA 的 只 有 一 种 ,就 是 酵母 26 S rRNA， 它 是 由 Veldman 等 人 运用 基因 序列 测定 的 结果 并 辅 之 以 RNA 分 析 结 果 推 导 出 来 的 。 整 个 分 子 含 有 3393 个 核 背 酸 ; 其 中 G-C G4 48%; 有 43 个 甲 基 化 的 修饰 成 分 (如 mA、m'G、mCc、mU 和 ms5U 及 37 个 2-O- 甲 基 核 苷 ), 还 有 36 一 37 MER 在 26S rRNA 上 修饰 成 分 不 是 随机 分 布 的 , 常常 成 串 地 出 现 ， 而 在 分 子 的 某 些 区 域 则 几 乎 没有 修饰 成 分 ,如 5’ AR Hin 600 个 核 苷 酸 和 3 末端 350 个 核 背 酸 。 修 饰 成 分 多 出 现在 26 S rRNA 上 的 进化 保守 区 域 。

酵母 26S rRNA 与 爪 蟾 28S rRNA 相 比 较 , 在 5 末端 和 3 末端 的 序列 相同 性 较 高 ， 而 与 大 肠 杆菌 23S rRNA 相 比 ,只 有 少数 序列 相似 性 。

和 其 它 大 分 子 rRNA 相似 ,26S rRNA 整个 分 子 被 许多 长 距离 相互 作用 的 碱 基 对 构 成 的 螺旋 分 隔 成 若干 区 域 ，26S rRNA 共 分 7 个 区 域 ， 这 些 区 域 可 能 构成 分 子 的 功能 部 位 。

mRNA 1961 年 Jacob 和 Monod 提出 用 信使 RNA (mRNA) 这 个 名 称 来 命名 带 有 从 DNA

°e 82 2

’

上 得 到 信息 并 指导 蛋白 质 合成 的 一 类 RNA 分 子 。 mRNA 占 细 胞 RNA 总 量 的 3 一 5% mRNA 的 平均 分 子 量 约 500,000, 沉 降 系数 为 8$, 但 是 不 同 mRNA 在 长 度 和 分 子 ， 量 上 有 很 天 的 不 同 。 在 大 肠 杆菌 中 ，mRNA 的 平均 长 度 约 900 到 1,500 PRR IE, 可 以 编码 300 到 500 个 氨基 酸 。 部 分 真 核 mRNA 的 长 度 见 表 3-6, 其 中 大 的 mRNA 如 ” 丝 心 蛋白 mRNA 有 19,000 个 核 苷 酸 。

表 3-6 部 分 真 核 mRNA 和 它们 的 聚 腺 苷 酸 的 长 度

Sore | Gees) o Omeaze | meeKe

一 -一 一 一 -一 | dS |

鼠 胰 岛 素 354 258 序列 分 析 免 珠 蛋白 《cx)551 423 序列 分 析

(8)589 438 序列 分 析 asta A BREA 626 444 序列 分 析 . 小 鼠 珠 蛋 白 703 463( 平 均 ) 凝 胶 电 泳 40 .50 、100 小 鼠 免 疫 球 蛋白 轻 链 1,200 660 凝 胶 电 泳 200 肌 球 蛋白 重 链 6,500 5370 ERE 170 46 a-A, 晶体 1,469 520 | BEBE Bk 200 蚕丝 心 蛋 白 19,000 16,000 BEBE HE bk 100 海胆 组 蛋白 Hy 400 一 420 306 Hae BCH Dk AOR 9} BT 无 AAD MNS MAA H, a 二 有 小 鼠 胰 cc- 淀粉 酶 | 1524 DNA 序列 分 析 -一 小 鼠 唾液 腺 oe - 2a A 1,659 1533 序 殉 分 析 一 小 鼠 肝 <- 淀 粉 酶 1,773() 5 序列 分 析 = 小 鼠 肝 @- fe) AS 1,806( 次 ) - 序列 分 析 =

原核 生物 和 真 核 生 物 的 mRNA 的 结构 是 不 同 的 。 动 植物 病毒 RNA 既是 遗传 信息

的 载体 也 起 mRNA 的 作用 , 这 些 RNA 也 与 真 核 生 物 mRNA 一 样 是 单 顺 反 子 结构 的 ，

”不 过 它 先 被 翻译 成 一 个 大 的 蛋白 质 ， 然 后 再 被 水 解 成 有 生物 活性 的 肽 链 。 下 面 简 要 介绍

原核 和 真 核 生 物 mRNA 及 病毒 RNA 的 结构 。 类 病毒 虽然 不 起 mRNA 的 作用 ， 因 其 与 病毒 RNA 一 样 有 侵 染 性 , 故 在 此 一 并 讨论 。

原核 生物 mRNA 的 结构

原核 生物 mRNA 在 结构 上 十 分 相似 于 吻 菌 体 R17、MS2、Qp8 和 f2RNA。 原核 生 物 mRNA 的 典型 结构 是 多 顺 反 子 的 ， 即 一 个 操纵 子 负责 的 一 段 转录 产物 对 几 条 多 肽 链 编码 ,5 端 无 帽子 结构 ,分 子 中 一 般 没 有 修饰 核 昔 酸 。 众 所 周知 的 例子 是 大 肠 杆菌 乳糖 操 YF mRNA， 编 码 三 条 多 肽 链 ; 色 氮 酸 操纵 子 编码 五 条 多 肽 链 。 也 有 单 顺 反 子 的 细菌 mRNA, MXM aks mRNA, RRM mRNA 一 般 是 单 顺 反 子 的 。 下 面 以 噬菌体 MS2RNA 为 例 说 明 原 核 生 物 mRNA 的 结构 特点 。19756 年 Fiers 等 测定 了 叭 菌 体 MS2 RNA 全 部 3569 个 核 音 酸 的 排列 顺序 , 它 由 三 个 顺 反 子 组 成 (以 后 又 修正 为 四 个 顺 反 子 儿 见 图 3-17)。 从 图 3-17 可 见 整个 MS2 RNA 是 一 条 单 链 。 其 5 端 为 岛 背 三 磷酸 ， 由 5 端 向 3 问 顺 次 是 5 端 非 编 码 区 〈129 REAR), A 蛋白 (成 熟 蛋白 ) SE (1179 个 核 彰 酸 ) 终 止 密码 子 和 间 隅 区 《26 个 核 苷 酸 ), 外 壳 蛋 白 基因 〈390 SRR), ABBA 因 《〈225 个 核 苷 酸 )， 复 制 酶 基因 〈1635 个 核 苷 酸 ) 及 终止 密码 子 和 3 端 非 编 码 区 (174 个

。83 。

1.3 -130 1308 1335 1724 176) ; 3491 3569:

人 ou

1678 1902 图 3-17 噬菌体 MS2 RNA 的 结构 示意 图

=” —— 7 N ; / \ c \ 和 A, | \ 5 “As Re UA u U 1769 ae ) f ”CCAUUCAG.G 人 CCC A G C'G-A-A- G / i 1 .GGUAAGUCCU GGGUCGCUUE, oe OP ah a ; 1433 GT Ge CA 1408” A- = 2127 4 U ~ 一 一 VS C-G G-G f° U- A-U C-G C~-G °C G figs. | OC ae RUG tee gu Fd N U-A -2142 \ C 5 本 “om 1309 7 G {ots eee A . U- A~2182 S~ =~ 959 4-0 C-C aes G-crG 945 U~ G— 2189 PPPG 一 一 一 一 一 一 GUG]- —- — -—-— — - U c-~-—--- UAG]- 一 一 一 ~- Aug 130 3396 3569

图 3-15” 吃 菌 体 MS2 RNA 分 子 内 长 距离 相互 作用 模型

BHR). 其 中 溶菌 蛋白 基因 中 有 189 个 核 昔 酸 与 相 邻 两 个 基因 共用 。 整 个 分 子 中 无 修 WHR RR. Firs 等 人 报告 MS2 RNA 三 个 基因 的 一 级 结构 的 同时 也 提出 了 它们 的 二 级 结构 ( 见 图 3-18 和 3-19)。 图 3-18 和 3-19 分 别 是 MS2 RNA 的 长 距离 相互 作用 和 外 壳 蛋 曰 基因 的 花束 状 二 级 结构 图 。 在 MS2 RNA 分 子 上 存在 着 丰富 的 自身 回 折 所 产生 的 双 链 区 ， 几 个 起 始 密码 子 都 处 于 分 子 的 单 链 区 域 。 这 个 二 级 结构 图 主要 是 根据 Watson-

Crick 碱 基 配 对 原则 和 核酸 酶 部 分 酶 解 的 数据 确定 的 。 真 核 生 物 mRNA 的 结构

图 3-20 是 真 核 生 物 mRNA 一 级 结构 的 通 式 的 示意 图 ， 整 个 分 子 由 5 端 帽子 结构 ，

2 天 站 非 编 码 区 (不 翻译 区 ), 编 码 区 (翻译 区 ),3 端 非 编 码 区 和 .3 端 聚 腺 昔 酸 组 成 与 噬菌体 RNA 一 样 ， 真 核 mRNA 和 高 等 动 植物 病毒 RNA 也 具有 丰富 的 二

构 。 如 鸭 珠 蛋白 mRNA 用 省 乙 锭 结合 光学 性 质 的 测定 指出 ， 有 45—60% KBE BUD W 螺旋 之 中 ; 免 珠 蛋白 mRNA 热 变性 的 实验 指出 有 55—62 AK RE Pe A Ze

+ 844°

444 e 5 r: i 9 ~ ~~ . ‘oie (59 14 ao pO c~c @-c ot e~ 4 oe a—u o> 45.~¢ ie A-vU oo7 d ~¢ > © .G 一 C、 一 5~G eNNeC uv 6- vos BOA DP ' u-a 3 eS GTS SOY a or 12 an Ve Se he 人 人 AN A—uU b vv AP ee SS ' 2 G---U 中 uv eS» é SS a Gacdecucaacc® Yacucsucauuccaucc a 8-619 6 a osu 18 ory “© ucasu dtea CAAGGCGGU, A Paes te 人 [ fre No" G ee rT) CaC 一 Gm ctu. ed W” .ee “6-C G 15 »o ' 6-6 é to e SLA ot 19 cc es R U C won 20 CAAGCAACUUCc6ACGGGGuUCEUGAAUGGA 让 ye * JAAGCUGUCEEAGGAcuUAcE Moe™ 0: PARTS -ACRNACAG 党 f4 AA oN ceuaacaeA Gy WE AcSNSeece gua Ag ngs Him ve Gal HON No 4&8 P44 Pag 2, ° in %6 25 Ps eee ‘od s 7) Noo? 所 c uv 过 四 \e? Coe 2 i k or OF ENS - ~, : oy wee J 图 3-19 鸣 菌 体 MS2 RNA 分 子 中 外 壳 蛋 白 基 因 的 二 级 结构 图 〈 从 表示 RNase 三 限制 性 水 解 点 ) 总 长 500 到 5000 核 将 酸 长 度 不 定 300 到 3000 - 100 51250 3031200 5 (帽子 ) tanita y- (mA) CRA) 3° i La TTP ENE a m7G‘ ppp*Nm (Nm) AUG GRE UAA ou : fe a 核糖 体 结合 部 位

3-20 ， 真 核 生 物 mRNA 的 结构 示意 图

-近年 来 由 于 电子 计算 机 在 结构 分 析 中 的 应 用 ;已 推测 出 mRNA HEE — Bee Fal a-2i 35

原核 生物 和 真 核 生 物 mRNA 结构 的 比较

《1) 真 核 生 物 mRNA 有 帽子 结构 ,原核 生物 mRNA 无 帽子 结构 。 真 核 生物 mRNA 5 端 帽子 结构 见 表 3-7 和 图 3-22。

帽子 结构 通常 有 三 种 类 型 (mxGy pppzNp，mrG*pppyNmpNP 和 mrGypppyNmpNmp Np)» tt U2 3-7。 除 真 核 生 物 mRNA 外 ,5" 端 帽子 结构 也 是 高 等 动 植物 病毒 mRNA 所 特有 的 ,有 的 病毒 RNA 具有 特殊 的 帽子 结构 ( 详 见 后 述 )。 这 些 帽 子 结构 都 是 转录 后 早 期 加 上 去 的 ( 见 第 五 章 )。

帽子 结构 对 于 mRNA 的 翻译 活性 是 重要 的 。 它 可 使 mRNA fit 外 切 核 酸 酶 的 降解

« 85 «

XBL 818-1726

3-21 SVAOLS ARG mRNA 前 傈 的 三 级 结构 模型 (英文 字母 表示 52 个 环 区 部 位 ) 所 和 mRNA 与 核糖 体 的 结合 包括 翻译 起 始 区 的 辨认 都 是 重要 的 。 呼 肠 孤 病毒 (reovirus) 和 | 水 泡 性 口 炎 病毒 (vesicular stomatitis virus) mRNA 都 有 甲 基 化 的 KT AW, HS 端 甲 基 化 的 mRNA 比 5 端 不 带 甲 基 化 的 在 麦 胚 系统 中 合成 蛋白 质 的 速度 快 得 多 。 如 果 用 化 学 方法 除去 mG， 病 毒 RNA 和 免 珠 蛋白 mRNA 的 绝 大 部 分 模板 活性 就 消失 了 。

5“ 端 帽子 结构 与 蛋白 质 翻译 的 起 始 有 关 。 无 mG 的 呼 肠 孤 病毒 不 能 与 40S WHE 成 复合 物 , 而 有 mG 的 则 能 形成 。 合 成 的 有 WG 的 短 的 寡 聚 核 苷 酸 也 能 与 408 WEB 成 复合 物 。m?G 可 能 是 侣 成 蛋白 质 起 始 的 辨认 信号 的 一 部 分 ， 如 小 鸡 卵 白 蛋白 mRNA, 其 5 末端 的 帽子 结构 附近 区 域 能 形成 发 夹 结 构 , 见 图 3-23。 这 样 的 结构 使 5 端 帽子 结构 与 蛋白 质 合 成 的 起 始 密码 子 在 空间 上 靠近 了 ,这 种 5" 端 附近 的 发 夹 结构 在 其 他 真 核 mRNA 上 也 有 ;因此 有 人 推测 帽子 结构 与 蛋白 质 合成 的 启动 有 关 。

(2) 真 核 生 物 mRNA 一 般 都 有 HREM. We 3-6 和 图 3-20。 它 是 转录 后 早 期 由 腺 苷 酸 聚 合 酶 催化 加 上 的 ( 见 第 五 章 )。 其 长 度 一 般 为 20 一 200 KER, BH 究 发 现 ,组 蛋白 mRNA 和 真 核 生 物 病毒 'RNA 无 聚 腺 苷 酸 ,但 近年 来 的 研究 已 证 实 , 组 蛋 A mRNA 也 有 聚 腺 苷 酸 结构 ,如 两 栖 类 卵 母 细胞 组 蛋白 HS 的 mRNA ARR CR

0 CHs ce N+ HN | 人 > O 0 90 N kraiyy-0-P-0-P-0-P-07 0. 31 9 0- 90- 0- kK O O(CH;) ve Tay B _ O 2 9- 可 @ DCHy) OF p-O:--s« 1 人 ~

图 3-22” 真 核 生 物 mRNA 5' 端 帽子 结构 通 式

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3-6); 植物 病毒 如 大 麦 条 纹 花 叶 病毒 mRNA 等 也 发 现 有 3 端 聚 腺 苷 酸 。 原 核 生 物 mRNA 二 般 没有 或 仅 有 很 短 (DF 10 个 ) 聚 腺 昔 酸 结构 。 目 前 一 般 认 为 聚 腺 昔 酸 对 于 -mRNA 的 翻译 功能 并 非 必须 , 如 小 鼠 工 细胞 mRNA， 除 去 其 3 端 聚 腺 昔 酸 并 不 影响 它 的 翻译 活性 。 另 外 , 珠 蛋 白 mRNA 和 除去 聚 腺 昔 酸 的 珠 蛋 白 mRNA, 两 者 起 初 有 相 同 的 翻译 活性 , 但 是 全 部 除去 聚 腺 背 酸 的 mRNA en gay Ma G a AUG

和 少 于 20 个 腺 背 酸 残 基 的 mRNA 其 活性 很 快 就 起 妓 密码 子 降低 了 。 这 些 实验 表明 mRNA 的 降解 与 聚 腺 苷 ”图 3-23 真 核 mRNA SHEAR 酸 的 存在 与 否 以 及 其 长 度 有 关 。 但 是 聚 腺 苷 酸 是 如 何 影响 mRNA 降解 的 目前 还 不 清楚 。 Hob ARR mRNA 顺利 通过 核 模 进入 细胞 浆 的 过 程 有 关 ; BA ADA

表 3-7 细胞 内 mRNA 5' 端 结构 和 甲 基 化 核 昔 mRNA | 5 末端 结构 分 子 中 间 甲 基 化 核 背

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GrFcacnongns

HB2eararOooacd o (0 Rar, 4 ®

m’G” ppp” N’mpNp, m’G” ppp” N’mpN’’mp m°A HeLa 细胞 (N’m = m6Am,Am,Gm,Um,Cm Nm = Gm,Um,Cm)

)\R 5 ee m’G” ppp” NmpNps m’G” ppp” NmpNmp m*A(1.8m*A:1m’G) 大 鼠 肝 细胞 瘤 m’G” ppp” NmpNp; m’G” ppp” NmpNmpNp| ”msA(3msA:lm7G)

(Nm = Am,Gm,Um,Cm) & (BHK-21) m’G”’ ppp” Nmp ' m*A,m’°C

(Nm = Gm,m*Am,Um,Gm) (1.$m*%A:1m’G) 海 是 m’G” ppp’ N 未 知

7G?’ vN

粘 霉菌 ee 无 m*A

(N = A,G,Gm)

酵 Et m’G” ppp” Ap (73%) x m’G” ppp’ Gp (25%)

丝 心 蛋 白 m’G” ppp” AmpUmpCp | m*°A REA m’G™ ppp” Nmp FE mA BREA xX’ ppp” NmpNp, X” ppp” NmpNmpNp Fi

小 鼠 免 疫 球 蛋白 轻 链 m’G” ppp” N

组 蛋白 m’G”*’ ppp’ N

与 病毒 的 侵 染 性 有 关 。 (3) mRNA 分 子 的 编码 区 一 一 是 所 有 mRNA 分 子 的 主要 结构 部 分 ; 该 区 域 编码 特 定 蛋白 质 分子 。 迄 今 为 止 ,大 量 的 材料 证 明 除 某 些 已 知 线粒体 外 ;三 联 体 密码 子 在 所 有 的 生物 中 是 通用 的 ,密码 字典 是 正确 的 。 编 码 过程 和 密码 子 的 使 用 情况 详 见 第 六 ,七 两 章 。 (4) mRNA 中 的 非 编码 区 一 一 无 论 原 核 或 真 核 生 物 mRNA 都 存在 5 端 和 3 端的 两 个 非 编码 区 。 由 间隔 区 转录 得 到 的 非 编码 区 广泛 存在 于 原核 生物 mRNA He EME

= 太志

fk MS2 和 R17 RNA 的 5 未 端 非 编 码 区 129 个 核 苷 酸 中 有 三 个 AUG 和 一 个 GUG ,但 它们 都 不 起 起 始 密码 子 的 作用 ; 在 噬菌体 RI17 RNA 的 外 壳 蛋 白 和 复制 酶 基因 之 间 还 存 在 相 邻 的 终止 密码 子 UAA 和 UAG (AZ 3-24), 这 种 现象 可 能 是 噬菌体 RNA 为 了 防止 密码 子 读 过 头 而 设置 的 一 种 重复 终止 信号 ;可 以 保证 蛋白 质 合成 的 准确 终 上 。

124 129 :

Ala Asn Ser Gly Te Tyr fMet Ser Lys Thr Thr Lys GA AAC UCC GGU AUC UAC UAA UAG i CCG GCC AUU CAA ACA UGA GGA UUACCC AUG UCG AAG ACA ACA AAG

C [加 oF Se es MS? RNA ie ee SL i 3-24 R17 RNA 外 壳 蛋 白 和 复制 酶 基因 之 间 间 隔 区 的 结构

MEK RNA 的 非 编 码 区 在 结构 上 比 其 他 区 域 更 为 保守 。QpRNA 的 3 端 非 编 码 区 改变 一 个 核 苷 酸 就 会 形 失 活性 。 前 面 已 经 讲 到 原核 生物 mRNA 编码 区 的 前 端 及 非 编码 区 的 一 部 分 是 与 核糖 体 结合 的 部 位 ， 图 3-25 显示 R17 RNA 的 复制 酶 基因 起 始 区 和 间 局 区 的 一 部 分 形成 一 个 发 夹 结构 ,这 一 部 位 正 是 与 核糖 体 的 结合 点 。

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中 本- U U Ue Aly A A c*G|x in Gec GeC AeuU A UeG GeC Gec UeAdA Git A 。U | 起 始 密码 子 case Ces Cele AeU 5” see CAAACU CCAUUC'K A CGreemmest

图 3-25 RI7 RNA 中 外 壳 蛋 白 和 复制 酶 基因 之 间 间 隔 区 的 二 级 结构

大 肠 杆 菌 色 氮 酸 操 纵 子 mRNA 的 trpB 蛋白 和 trpA 蛋白 编码 区 之 间 的 间隔 区 只 ARR (UG), rp A 蛋白 的 起 始 密码 子 是 _AUG ， 这 样 就 形成 UGAUG 序列 ;前 三 个 核 音 酸 UGA 起 终止 密码 子 的 作用 ,后 三 个 核 背 酸 AUC 起 起 始 密码 子 的 作用 ， 这 种 前 后 一 个 密码 子 共用 一 个 核 苷 酸 的 现象 是 原核 生物 使 用 密码 的 一 个 特 喜 。 某 些 mRNA 的 间隔 区 存在 着 从 DNA 模板 上 调控 区 域 转录 下 来 的 序列 ， 如 大 肠 杆 菌 色 氮 酸 操 纵 子 mRNA 的 > 端 非 编码 区 存在 着 一 段 序列 是 从 所 谓 的 衰减 子 上 转录 下 来 的 ,该 < 衰减 RNAz 的 3 端 是 CUUUUUUUaa， 这 个 结构 十 分 相似 于 在 几 个 大 肠 杆菌 小 分 子 RNA ,和 它 的 噬菌体 中 发 现 的 序列 UUUUUUAoa 和 CUUUUU one 这 些 序列 被 认为 是 转录 终止 信号 的 一 部 分 ( 见 第 五 章 )。

真 核 人 生物 mRNA 的 3 端 非 编 码 区 有 一 段 共同 序列 4AAUAAA， 这 可 能 是 蛋白 质 翻 译 终 目的 协同 信号 ,也 可 能 与 mRNA 的 转录 终止 有 关 。 在 某 些 真 核 生物 mRNA AYES

es 88 e

码 区 还 发 现 有 msA 和 mC 等 修饰 核 昔 酸 ,其 确切 的 功能 还 不 请 楚 。

动 植物 病毒 RNA

病毒 RNA 包括 鸣 菌 体 RNA， 植 物 病毒 RNA, 部 分 动物 病毒 (RNA 肿瘤 病毒 ) RNA， 类 病毒 RNA 及 由 病毒 感染 寄主 后 产生 的 小 分 子 RNA So 关于 病毒 RNA 的 详细 知识 可 参看 第 八 章 。 叭 菌 体 RNA 前 面 也 已 作 了 简略 介绍 。 高 等 动 植物 病毒 "RNA 的 结构 类 似 于 真 核 生 物 的 mRNA， 即 一 般 由 5 端 帽子 结构 ( 表 3-8)，5 端 非 编 码 区 ， 编 XK, 34 端 非 编 码 区 和 3" 端 聚 腺 苷 酸 构成 。 但 有 的 没有 5 端 帽子 结构 或 3 端 聚 腺 音 酸 。 一 些 植物 病毒 RNA 有 类 似 tRNA 结构 的 3 端 , 并 能 接受 氨基 酸 ( 详 见 第 八 章 )。 与 真 核 生 物 mRNA 一 样 ,高 等 动 植物 病毒 mRNA 也 是 单 顺 反 子 结构 的 ,一 般 讲 ,一 个 真 核 病毒 mRNA 先 被 翻译 成 一 个 大 的 蛋白 质 ， 然 后 再 被 裂解 成 几 个 较 小 的 具有 生物 活性 的 蛋 日 质 。

表 3-8 动 植物 病毒 RNA 的 5 端 和 中 间 甲 基 化 的 核 昔

RNA 5” 端 帽 子 结 构 中 间 甲 基 化 核 昔

细胞 质 多 角 体 病毒 mRNA m’G” ppp” AmpGp %

IF Mii mRNA m'G” ppp’ GmpCpUp a

牛痘 病毒 mRNAs m’G*’ ppp” GmpNp 和 无 m’G” ppp” AmpNp

水 泡 性 口 炎 病毒 mRNA m'G* ppp” AmpAp 和 + m’G” ppp” AmpAmp

Sindbis 79% “26S” mRNA mG7 ppp* Np #%m’G” ppp” Ap m’C(E mSA)

劳 氏 肉瘤 病毒 35$ 病毒 RNA m’G”* ppp’ GmpCp ey

AMR RNA wy m’G” ppp” GmpCp m*A

SV40 mRNA m’G* ppp’ Amp A#lm’G” ppp’ Gmp S mA

腺 病毒 mRNA m’G” ppp” m' Amp msA

Brome mosaic 病毒 RNA4 m’G”’ ppp” GpU : =

黄瓜 花 叶 病毒 m7G ppp” Np 4

烟草 花 叶 病毒 m’G* ppp” Gp ca BwmiEH (Alfalfa mosaic) 病毒 RNA m"G ppp’ Gp Srey

AFB GK ARIA RNA 一 个 22 个 氨基 酸 的 多 肽

KA GRIR RIA (poliovirus) RNA 〈 人 参阅 第 八 章 ) 是 第 一 个 被 测定 了 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 的 病毒 RNA， 由 7,433 RRM, 具有 典型 的 高 等 动 植物 病毒 mRNA 的 特点 。 它 具有 一 个 特殊 的 通过 5 端 磷酸 根 与 一 个 小 蛋白 共 价 相连 接 的 5 端 (不 同 于 前 面 所 述 的 含 m'G 的 帽子 结构 )， 随 后 依次 是 5 端 非 编码 区 (740 个 核 昔 酸 )， 编 码 区 (6,621 个 核 背 酸 )，3 端 非 编码 区 (72 RRR) 和 3' 端 聚 腺 背 酸 。 A ARIK RAIA RNA 的 特殊 5 端 见 图 3-26, 它 含 一 条 由 22 个 氨基 酸 构 成 的 肽 链 ,通过 酷 氨 酸 上 的 羟基 与 其 5 端 朱 苷 酸 上 的 磷酸 共 价 相连 接 。 这 个 肽 段 是 由 病毒 RNA 本 身 编码 的 ( 见 表 3-9)s 该 病毒 的

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Gly uAc , 20-6 C M 5 O "y ae f E GC ? ody! 66-30 | “ire Oot -Cha UA a 他 Ke . UA : Tyr "Ta 0 OH 10 ae: Gly p-UAAAACA’ ecageueeceecuheuAcucceeyAUueceeuAGcCUUGUaceccuem al 60 70 80

1 Pro-Asn ~63-G3)- Pro~ Asn~Val=Pro~Thr=Tle ~Grg- Thr Ata Cys) Val~Gin-CODs; 10 20

3-26 AABRA BRIGG RNA 了 端的 结构 (为 RNase III 裂解 点 片段 )

5 端 非 编 码 区 构成 一 个 发 夹 结构 (由 9 一 36 核 昔 酸 构成 )， 这 个 区 域 与 调节 和 辨认 的 功能 有 关 。 而 其 蛋白 质 末 端 可 能 与 RNA 合成 的 起 始 有 关 。 虽然 RNA 上 结构 基因 的 翻译 起 始 于 大 的 阅读 框架 (其 起 始 密码 子 的 位 置 在 741)， 但 在 741 的 前 面 , 即 5 端 非 编码 区 ， 多 次 出 现 不 作 起 始 信号 的 AUG， 如 位 于 185, 237, 276, 318, 376, 387, 455 和 584。 这 # AUG 是 潜在 的 起 始点 ,有 的 后 面 紧 跟着 终止 信号 ; 其 中 185, 376 和 584 分 别 可 以 作 为 起 始 信号 而 合成 分 子 量 为 4725，8,425 和 7,187 的 三 个 肽 段 , 这 些 潜 在 的 编码 序列 的 意 MIB FE 0

23-9 FRKAARRSSARHER

ZA ih alii : 分 子 量 电荷

病毒 肽 的 编码 区 741 一 7361 246530 +44

SS |S ES |

Pl-la 744—3380 97247 +12

VP0 744—1760 37352 +3

| |

vP4 744—947 7385 +2

一 | 一 一 | 一 -一 | 一 -一 | 一 一

VP2 948 一 1760 29985 rl

a eee

VP3 1761—2474 26410 0

一 | 一 | 一 | 一 |

VPI 2475—3380 33521 +9

—— ee | EEE

P2—3b 3381—5105 64953 +16

| 一 | 一 | 一 | 一 一

P2—5b 3828—5105 48273 +15

— ———— ee 一

P2—X 4119—5105 37555 +15

P3—1b 5106—7361 84234 +16

ee SECS Ls 一

VPg* 5367—5432 2354 +4

一 一 | 一 | 一 | 一 | 一 一

P3—2 5433—7361 72132 +11

P3—4b 5979—7361 52481 +6

B3——7¢ 5433—5978 19669 +5

* 为 病毒 RNA 了 端 连接 的 小 蛋白 〈22 肽 )。

« 90 «

编码 区 是 由 2207 个 连续 的 三 联 体 密码 子 共 6621 个 核 彰 酸 构成 , 占 整个 病毒 分 子 核 苷 酸 数目 的 89 匈 , 被 翻译 产生 一 个 大 蛋白 ， 然 后 裂解 成 有 生物 功能 的 KE CWA 3-9)。 有 裂解 点 通常 位 于 谷 氨 酰 胺 和 甘 氢 ， 酸 的 连接 处 。 其 翻译 终止 信号 是 由 连续 的 二 个 终止 密码 子 构成 的 (UAG 和 UAA)。

3 端 非 编 码 区 由 72 SERA, 缺乏 在 真 核 生物 mRNA 中 存在 的 AAUAAA 顺序 。 这 个 六 核 昔 酸 的 缺乏 说 明 该 病毒 RNA 的 聚 腺 背 酸 是 由 病毒 负 链 RNA 的 5 端 聚 尿 昔 酸 转录 产生 的 。 该 病毒 RNA 的 聚 腺 彰 酸 长 度 不 是 均一 的 ， 其 平均 链 长 为 60. FARA WHE SHH RNA 合成 的 起 始 有 关 。

ShikRRAS RNA 核 背 酸 顺 序 是 用 测定 其 cDNA 顺序 的 方法 推测 得 到 的 。 最 近 报 道 用 同样 方 法 也 测 出 了 烟草 花 叶 病毒 RNA 的 全 部 核 苷 酸 排列 顺序 。

类 病毒 RNA

类 病毒 是 一 类 高 等 植物 的 病原 体 ,通常 由 200 一 400 KEM, 分 子 量 约 12 万 ,已 经 发 现 的 类 病毒 有 十 多 种 。

关于 类 病毒 的 一 般 知识 详 见 第 八 章 ， 这 里 就 类 病毒 的 结构 简介 如 下 : Diener 等 人 1967 年 发 现 马 ” 铃 暮 块 荟 纺 锤 状 病 的 病原 体 是 一 种 无 蛋白 外 壳 的 裸 露 的 RNA 分 子 (其 沉降 系数 为 10S)。 这 种 低 分 子 量 的 RNA 一 旦 进入 宿主 细胞 ， 便 在 其 中 复制 。Diener 称 这 种 具有 感染 活性 的 RNA 为 类 病毒 。 电 子 显 微 镜 观 察 马铃薯 块 苓 纺锤 状 病 类 病毒 (PSTV), 其 分 子 平均 长 度 为 50nm, 具有 近似 DNA 宽度 (20A) 的 棒状 结构 。 在 变性 条 件 下 ， 电 镜 观察 到 的 类 病毒 呈 现 网 球拍 状 ， 有 人 缺口 的 单 链 环 状 分 子 。 多 核 昔 酸 激 酶 在 [7-?P]-ATP 存在 时 不 能 标记 天 然 PSTV， 高 碘 酸 氧化 PSTV 的 实验 表明 它 没有 游离 的 3' 端 邻 位 羟基 。 这 些 结果 说 明 类 病毒 是 单 链 环 状 的 RNA 分 子 。1978 年 Gross 小 组 报道 了 由 359 个 核 背 酸 构 成 的 PSTV 的 一 级 结构 ( 见 图 3-27)。 这 个 结果 证 实 了 PSTV 是 一 个 单 链 环 状 分 子 。 整 个 分 子 具 有 高 度 的 二 级 结构 ,359 个 核 昔 酸 中 约 有 244 个 核 昔 酸 处

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图 3-27“ 马 铃 暮 块茎 纺锤 状 病 类 病毒 (PSTV) 的 结构

在 碱 基 配 对 之 中 《〈 占 68 多 )， 分 子 像 一 根 僵 直 的 棒 。 在 整个 序列 中 没有 发 现 真 核 生 物 mRNA 通常 使 用 的 起 始 密码 子 AUG, 但 GUG 却 有 七 处 。 终 止 密码 子 CUAA, UAG 和 UGA) 有 六 处 。 类 病毒 分 子 如 此 之 小 ， 以 至 于 所 带 的 信息 量 仅 够 编码 一 个 蛋白 质 。 它 进 人 寄主 以 后 如 何 复制 自己 ， 如 何 干 扰 寄主 的 正常 复制 机 制 ， 它 本 身 的 结构 的 生物 学 意义 是 什么 ， 感 染 活性 的 结构 基础 又 是 什么 ” 所 有 这 些 都 有 待 于 进一步 探讨 。 阁 今 已 经 测定 TRB RAS BA EEA. HS A, HB Cadang Cadang Jy A 等 的 类 病毒 , 它们 都 是 单 链 环 状 的 RNA 分 子 ， 其 结构 特征 与 PSTV 相同 。

=, RNA 结构 研究 有 关 的 工具 酶

核酸 一 级 结构 研究 的 发 展 历史 说 明 , 无 论 是 RNA 还 是 DNA 的 一 级 结构 的 阐明 都 离 不 开 巧 妙 地 使 用 各 种 工具 酶 。 六 十 年 代 RNA 一 级 结构 研究 所 以 取得 飞 婚 发 展 ， 重 要 条 件 之 一 是 许多 作用 于 RNA 的 工具 酶 的 相继 提纯 和 它们 的 专 一 性 的 阐明 。 一 些 重要 工 具 酶 ,例如 牛 胰 核糖 核酸 酶 (RNase A). RRS T (RNase Tu) 及 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 等 的 专 一 性 物理 化 学 性 质 和 化 学 结构 等 都 已 作 了 详细 的 研究 。 七 十 年 代 以 来 ， DNA 一 级 结构 研究 的 突破 在 很 大 程度 上 也 取决 于 大 量 有 序列 特异 性 的 限制 性 内 切 酶 的 发 现 、 提 纯 和 实际 应 用 ( 详 见 第 二 章 )e 因 而 工具 酶 的 研究 是 核酸 结构 研究 不 可 缺少 的 一 个 重要 方面 下 面 就 已 用 于 RNA 结构 分 析 的 一 些 比较 重要 的 工具 酶 作 一 简要 介绍 ( 见 表 3-10) ,内容 主要 涉及 与 结构 分 析 有 关 的 一 些 问题 。

核糖 核酸 酶 (RNase)

RNase 是 一 类 水 解 RNA 的 酶 的 通称 ， 它 们 广泛 存在 于 所 有 的 动 、 植 物 和 微生物 之 中 。 目前 已 用 于 结构 研究 的 有 RNase A, RNase T,, RNase U2, RNase Phy M 及 RNase T: 等 。 根 据 水 解 专 一 性 ，RNase 可 以 分 为 碱 基 特 异性 的 RNase 和 非特 异性 的 RNasee 上 . 面 提 及 的 前 四 种 为 碱 基 特 异性 的 RNase， 后 一 种 为 非特 异性 的 。

RNase A RNase A 是 具有 碱 基 特 异性 的 RNase， 它 专 一 性 地 水 解 RNA 链 中 的 Me eK Ae Be PoE 3 喀 啶 核 苷 酸 和 以 3 端 为 喀 啶 核 苷 酸 的 寡 核 背 酸 。 它 水 解 胞 喀 啶 核 苷 酸 键 的 速度 大 于 尿 喀 了 喧 核 苷 酸 键 的 速度 。 也 水 解 许多 碱 基 上 被 修饰 的 喀 啶 核 背 酸 〈 见 表 11)。 有 人 曾 提 出 RNase A 的 作用 机 制 , 认 为 该 酶 对 水 解 部 位 的 主要 要 求 是 : (1 喀 WE TRAY C, 为 氧 等 负电 性 原子 ;(2) Ni 必须 有 氢 质 子 。

为 了 进一步 提高 RNase A 的 碱 基 专 一 性 有 人 使 其 肽 链 第 41 位 上 的 赖 氨 酸 凑 甲 基 化 形成 羧 甲 基 RNase A (CM RNase A)， 羧 甲 基 RNase A 在 适当 条 件 下 只 水 解 胞 喀 啶 ARERR (—-CpA—) Zi Rete MRAM BER (—UpA—) 之 间 的 磷酸 二 酯 键 ; 对 一 CpG 一 和 一 UpG 一 的 水 解 极 慢 ,而 对 两 个 喀 啶 核 背 酸 之 间 的 磷酸 二 酯 键 则 不 能 水 解 。

RNase A 的 水 解 专 一 性 不 是 绝对 的 , 当 它 在 高 酶 浓度 时 也 水 解 聚 腺 ER. AE 3 腺 Bo

RNase T, — EAE — OK CE IS. A BEY SE BE 地 裂解 RNA 产生 27 DAMA 3 ' 端 为 岛 苷 酸 的 寡 核 苷 酸 。 该 酶 也 能 水 解 肌 苷 酸 (IP) 和 部

w 92 本

二 7

表 3-10 常用 工具 酶 及 其 性 质 * 名 称 底 DB 产 物 RNase T, —GpN— Gp, —Gp RNase A —PypN—< Pyp, —Pyp

RNase U, —PupN— Pup, —rap

RNase T: NN Np RNase Phy I —ApN—,—GpN— Ap,—Ap,Gp,—Gp 一 UPN 一 ?一 CPN 一 Up, 一 Up， 极 慢 产生 C>PAI-C>P

RNase Phy M 同 Bl is fal as CBR rile BE RK (Up,—Up,Ap,—Ap) —ApN—, —UpN—)

RNase M —NpN— Np

核酸 酶 P, DNA、RNA pN

BEB M DNA,RNA Np

RAS S, 单 链 DNA 或 RNA pN

we ae RE — BRS RNA,DNA pN

和 牛 脾 磷 酸 二 酯 酶 RNA,DNA Np

PNPase Pi 十 一 NPN 一 ppN**

磷酸 单 酯 酶 pNpNp 2Pi+NpN

SRERES ATP+ yoNpN— pNpN— + ADP

* Py, Pu PAIRRSEKEASLEAE. NEARER.

** PNPase 为 多 核 背 酸 磷 化 酶 , 它 磷 酸 解 RNA SAHRATOPALA_-BE-ARR—RBE_AE, 分 碱 基 上 被 修饰 的 鸟 背 酸 键 ( 见 表 3-11), 其 中 水 解 miGp 键 的 产物 是 2 、3 - 环 化 的 miGp (miG > P).

有 人 提出 RNase Ti 对 底 物 的 要 求 是 叮 叭 环 6 位 上 的 酮 基 和 7 位 上 的 三 价 氮 原 子 。 当 N-1 存在 有 一 个 质子 时 ,将 更 易 受 酶 的 攻击 。 因 此 这 些 位 点 被 认为 是 酶 的 专 一 性 结合 点 。 这 个 假说 可 以 解释 能 被 RNase T, 水 解 的 许多 修饰 核 背 酸 , 但 I-A SEALER 〈mllp) 键 不 能 被 酶 解 是 个 例外 。 表 3-11 RNase A 和 RNase T, 的 专 一 性

名 称 水 解 RNA 后 产生 的 核 苷 酸 不 能 水 解 的 核 苷 酸 键 Cp,Up,m’Cp,ac*Cp,s?Cp, m’Up(Tp), m®°CpN,m*UpN, ncp*UpN RNase A cmo’Up,mnm/’s?Up,m’S*Up,s*Up,Dp, ; op RNase T, Gp,Ip,.Xp,m'Gp,m’?Gp,m3Gp m’GpN,m'IpN, QpN, WpN

* 符号 和 结构 分 别 见 第 一 章 和 附录 一 。 RNase U 该 酶 是 从 一 种 黑 粉 菌 〈《Tszlago sphacrogena) 的 培养 液 中 提取 的 一 种 对 RRR HY RNaseo 其 水 解 专 一 性 正好 与 RNase A 互补 ,但 产物 往往 是 2，3

° 93 6

一 一 一

环 状 的 叮 叭 核 苷 酸 ,与 RNase T, FELLER, RNase U, 的 水 解 专 一 性 不 是 绝对 的 ， 其 水 解 二 核 萌 一 磷酸 的 速度 依次 是 A 一 N > G 一 N >C-N>U—-N, 在 结构 分 析 中 使 用 该 酶 时 常常 先 将 RNA 分 子 上 的 鸟 叮 叭 碱 基 用 特异 性 的 化 学 试剂 (例如 水 溶性 碳 二 亚 胺 等 ) 化 Sin, tia SAMBA RNase U, 的 攻击 。 这 样 RNase U, 只 水 解 RNA 链 上 的 腺 苷 酸 键 。 除 A 和 G 外 ,该 酶 还 能 水 解 I 和 VAAN BE ZK AR EX, PA, msiAytA、mIG 和 mG Seiko Re.

RNase T, 与 RNase T, —##, RNase T, 也 是 从 米 逆 中 制 得 的 一 种 RNase, Ait 这 是 一 种 非特 异性 的 RNaseo 它 水 解 RNA 的 最 适 pH 在 4.5, 水 解 各 种 2 ，3' 环 状 核 背 酸 的 最 适 pH 在 6.0 一 6.3; 水 解 腺 苷 酸 键 的 速度 最 快 ,2 ，3“ 环 状 腺 苷 酸 几乎 不 积累 ,显示 腺 苷 酸 特异 性 内 切 酶 的 性 质 。 水 解 各 核 背 酸 键 的 速度 依次 是 A>U>GSC, 它 能 水 解 所 有 的 修饰 核 背 酸 键 , 包 括 RNase T, 和 U: 不 能 水 解 的 m’G 等 ,但 不 能 水 解 CMC-G 和 CMC-U (〈CMC- 为 水 溶性 碳 二 亚 胺 修饰 基 团 ) 以 及 所 有 的 2 -0- 甲 基 化 的 核 苷 酸 键 。 净 物 分 子 的 构 型 对 RNase T, 的 作用 是 敏感 的 , 在 水 咨 液 中 的 聚 腺 昔 酸 与 RNA 分 子 上 的 腺 彰 酸 比较 是 抗 RNase T, 的 ,但 在 40 多 甲醇 中 对 聚 腺 苷 酸 的 水 解 速度 明显 加 快 ， 可 见 具 有 高 级 结构 的 RNA 分 子 是 抗 RNase T, 的 。

RNase Phy | [多 头 统 孢 菌 核糖 核酸 酶 I] ， 这 是 一 个 特异 性 不 强 的 RNase， 它 能 很 快 地 水 解 聚 尿 背 酸 和 聚 腺 苷 酸 , 产 生 2 ，3 环 状 单 核 背 酸 ， 然 后 很 慢 地 水 解 环 状 单 核 背 酸 成 为 3 核 萌 酸 ; 它 水 解 聚 胞 苷 酸 的 速度 极 慢 ， 且 产物 为 2，3 环 状 胞 苷 酸 。 除 CPN 以 外 所 有 的 二 核 背 酸 均 能 很 快 地 被 该 酶 水 解 。 由 于 它 水 解 胞 背 酸 键 的 速度 特别 慢 ， 人 们 已 将 它 在 结构 分 析 中 与 RNase A 相配 合 使 用 以 区 分 两 个 喀 啶 核 苷 酸 C 和 癌 ( 见 第 101 页 入

RNase phy M (多 头 线 孢 菌 核糖 核酸 酶 M) ”该 酶 的 性 质 与 RNase phy I 在 通 常 酶 解 条 件 下 完全 一 样 , 即 其 水 解 二 核 背 一 磷酸 的 速度 次 序 如 下 :UPN > APN > GpN > CpN; NpA > NPC > NPG > NPU。 因 此 UpC, UpA, ApA 和 ApC 最 易 水 解 ， 而 CpU, CpC 最 不 易 水 解 。 但 在 限制 性 条 件 下 (7M 尿素 ,50"C2，pH 5.0) 该 酶 只 水 解 UpN 和 ApNo 因而 较 之 RNase Phy 1 RAAF RNA 序列 分 析 ( 图 3-33)e -<

RNase M ZS — MAB (Aspergillus saito) 中 提取 的 非特 异性 RNase, 7K 解 RNA HEMKARARHREND KE AD>U>CSG, Ris pH 是 4.0， 其 活性 能 被 二 价 铀 离子 和 二 价 锌 离子 所 抑制 。

其 他 RNase 用 于 RNA 结构 分 析 的 RNase 还 有 RNase U,, BS RNase( 枯 草 杆 菌 RNase) 和 RNase N, (40 ##79% RNase) 等 。RNase U, 的 性 质 与 RNase T， 极 相 似 ;, 是 鸟 味 叭 特异 性 的 RNase， 其 最 适 pH 在 8.0—8.5, 可 代替 RNase T, 用 于 RNA 的 结构 分 析 。RNase N, 的 水 解 专 一 性 与 T 和 WU 相似 ,但 它 的 转 磷酸 活性 比 水 解 活性 大 得 多 ， 水 解 产物 往往 是 鸟 味 叭 2 ，3' 环 状 核 苷 酸 ， 延 长 水 解 时间 也 可 以 产生 3 SER. BS RNase 是 一 种 非特 异性 的 RNase， 它 水 解 RNA 的 产物 往往 是 2…，3“ 环 状 核 苷 酸 。

核酸 酶 (Nuclease)

这 是 一 类 既 能 水 解 RNA 也 能 水 解 DNA 的 酶 ， 其 水 解 特 性 类 似 于 磷酸 二 酯 酶 , 产 物 通 常 为 单 核 苷 酸 。 这 类 酶 已 被 用 于 结构 分 析 的 有 核酸 酶 P、 核 酸 酶 M 和 核酸 酶 Sio 核酸 酶 PR， 核酸 酶 P, 是 从 桔 青 霉 (Penicillium citrinum) 中 提取 并 提 纯 的 一 个 工

sa 94 。

具 酶 。 它 水 解 核酸 产生 5 核 苷 酸 ; 没 有 碱 基 特 异性 ; 最 适 pH 4.5 一 6.0， 最 适 温度 70°C; 降解 核酸 时 需要 锌 离子 。 这 个 酶 兼 有 3 ARATE HE. BD BRE TK 3 端 磷酸 ; 作为 3' 核 昔 酸 酶 时 它 水 解 核 糖 核 背 3' 磷 酸 的 速度 比 水 解脱 氧 核糖 核 苷 3' 磷 酸 的 速度 快 30 倍 。 由 于 它 具 有 良好 的 水 解 核酸 的 活性 ,来源 方便 ， 已 被 广泛 地 用 于 核酸 研 究 的 各 个 方面 。

核酸 酶 M ”核酸 酶 M 是 从 金黄 色 葡 萄 球菌 培养 液 中 制 得 的 一 种 核酸 酶 。 它 能 水 解 核酸 产生 RMS 它 水 解 变 性 DNA 的 速度 快 于 天 然 DNA; 能 水 解 RNA 但 不 能 水 解 核糖 核 苷 2 ，3' 环 化 磷酸 酯 ,这 说 明 它 的 水 解 机 制 不 经 过 2，3' 环 状 磷酸 的 中 间 阶 段 ;该 酶 被 带 有 了 磷酸 根 的 单 核 昔 酸 或 寡 核 苷 酸 抑制 ; 3' 磷 酸根 的 存在 却 能 促进 邻近 核 背 酸 键 的 水 解 ; 它 水 解 产 生 Ap 和 Up 的 速度 大 于 产生 Cp 和 Gp 的 速度 ;如 果 用 二 价 钢 离 子 代 蔡 二 价 钙 离 子 作 激活 剂 , 则 它 只 能 水 解 DNA 而 不 能 水 解 RNA。 由 于 它 水 解 RNA 的 产 物 与 RNase T, 的 相似 ,因此 可 替代 RNase T, 作 组 成 分 析 。

核酸 酶 S, ”核酸 酶 S, FEM — BBWAA (Aspergillus oryzae) 提 取 的 一 种 单 链 核酸 酶 。 它 只 水 解 单 链 核酸 ,不 能 水 解 天 然 的 双 链 DNA; 产物 是 5 核 苷 酸 ; 它 水 解 DNA 和 RNA 有 相同 的 最 适 pH (pH4.5); 它 的 水 解 DNA 的 活性 能 被 RNA 所 抑制 。 该 酶 已 被 广泛 地 用 于 单 链 核酸 的 检定 和 核酸 高 级 结构 的 研究 等 方面 。

外 切 核 酸 酶 (exonuclease)

外 切 核酸 酶 是 指 一 类 水 解 核酸 (包括 DNA 和 RNA) 时 是 从 核酸 分 子 的 一 端 开 始 逐 个 地 把 核 音 酸 顺 次 水 解 下 来 的 核酸 水 解 酶 。 用 于 结构 分 析 的 这 类 酶 有 蛇 毒 磷酸 二 酯 酶 ， 和 牛 脾 磷 酸 二 酯 酶 和 多 核 苷 酸 磷 酸化 酶 〈PNPase)。

RRR PKR RRM 3 端 开始 将 5 单 核 童 酸 逐 个 地 顺 次 水 解 下 来 ; 既 能 水 解 DNA 也 能 水 解 RNA ,产物 都 是 5 核 彰 酸 ; 它 水 解 变性 DNA ,也 水 解 天 然 双 链 DNA, 而 且 速 度 更 快 ;对 单 链 RNA 的 水 解 能 很 快 完成 ,对 于 水 解 双 链 RNA 虽 有 不 同 的 ”说 法 ,但 一 般 认 为 高 级 结构 对 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 的 水 解 活性 没有 明显 的 影响 ; 它 能 水 解 2-O - 甲 基 化 的 核糖 核 背 酸 键 ,但 水 解 速度 比 没 有 甲 基 化 的 慢 一 些 ， 它 还 能 水 解 一 个 或 二 个 核 彰 都 是 阿拉 伯 糖 彰 的 二 核 背 一 磷酸 ， 可 见 糖 基 的 性 质 对 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 的 水 解 活性 影响 不 大 (这 个 性 质 与 核酸 酶 M 不 同 ， 核 酸 酶 M 不 能 水 解 带 有 阿拉 伯 糖 基 的 核 背 酸 键 ); EX 稼 见 的 四 种 核 苷 酸 没 有 明显 的 碱 基 专 一 性 ， 但 对 某 些 稀有 核 苷 酸 的 水 解 速度 与 常见 核 昔 酸 的 不 同 , 它 水 解 miGpCp Lt GpCp 慢 得 多 ,水 解 Tpy 非常 慢 ,水 解 Cpy 的 速度 只 有 CPU 的 一 半 。 经 水 溶性 碳 二 亚 胺 修饰 后 的 尿 音 酸 键 则 不 能 被 蛇毒 磷酸 二 酯 酶 水 解 , 可 见 它 水 解 核酸 的 活性 也 有 一 定 的 碱 基 专 一 性 ; 它 对 被 水 解 的 核酸 的 末端 磷酸 基 有 严格 的 要 求 , 同 一 核 背 酸 片 段 如 果 5 端 带 磷 酸根 的 则 水 解 最 快 ,去 除 5 端 磷酸 根 的 则 水 解 速度 降低 10 倍 ; 如 果 3 端 带 有 磷酸 根 的 则 水 解 速度 降低 100 倍 ( 比 5 端 带 有 磷酸 根 3 端 不 带 磷 酸 FRAY UU 1,000 倍 )。 可 见 5 端的 磷酸 根 促进 水 解 ,3' 端 磷酸 根 抑制 水 解 。

AP RRA UCR LE — POMS. E 7k fe RNA 或 DNA 是 从 核酸 分 子 的 对 端 开始 逐个 顺 次 地 把 3 核 昔 酸 水 解 下 来 ; 在 pH 4.8 时 它 不 能 水 解 了 端 带 有 磷酸 根 的 tRNA， 但 它 能 很 好 地 水 解 ? 端 脱 去 磷酸 根 的 tRNA; 在 pH 6.2 时 , 它 能 够 水 解 3 端 带 有 磷酸 根 的 IRNA， 但 其 水 解 速度 低 于 脱 磷 的 CRNA, FTL 5 端 磷酸 根 的 存在 会 抑

95 。

—

制 或 降低 其 水 解 速度 ; 它 的 水 解 活性 对 底 物 的 二 级 结构 敏感 ， 它 水 解 天 然 胸 腺 DNA 的 速度 只 有 变性 DNA 的 百 分 之 四 , 双 链 DNA 片段 (20 一 50 个 碱 基 对 ) 不 能 为 该 酶 作用 ， 在 水 溶液 中 能 形成 双 链 结构 的 ,如 聚 肌 胞 苷 酸 等 完全 不 能 为 该 酶 水 解 ; 它 能 水 解 RNA 分 子 产生 2-O- 甲 基 化 的 核 苷 酸 和 许多 碱 基 上 修饰 的 核 苷 酸 ,但 不 能 水 解 2-O- 乙 酰 化 的 核 苷 酸 键 , 也 不 能 水 解 核 昔 2 ，3' 环 状 磷酸 。

SRPRARILCM PNPase 是 一 个 具有 外 切 核 酸 酶 性 质 的 核 背 酸 转移 酶 。 这 个 酶 实际 上 催化 三 个 反应 : (OU 5 核 苷 二 磷酸 为 底 物 使 其 聚合 成 多 核 苷 酸 , 同 时 释放 出 无 机 磷酸 ;(2) 以 多 核 背 酸 为 底 物 ， 在 无 机 磷酸 存在 下 使 多 核 背 酸 磷 酸 解 产 生 SRAM (为 1 的 逆反 应 ); (3) 催化 无 机 磷酸 交换 反应 。 它 在 催化 磷酸 解 多核 昔 酸 时 是 从 3 端 开 始 逐 个 顺序 地 把 核 苷 酸 水 解 下 来 ,产物 为 SRA IRR: 3" 端 磷酸 根 抑制 磷酸 解 反 应 ; 它 磷酸 解 多 核 苷 酸 链 最 后 得 到 该 多 核 萌 酸 5 端的 二 核 苷 一 磷酸 或 三 核 昔 二 磷酸 ; 它 对 底 物 无 明显 的 碱 基 专 一 性 , 既 作 用 于 RNA 也 作用 于 DNA。PNPase 曾 被 用 于 RNA 或 DNA FERNDALE RK LA +E).

其 他 有 关 的 酶

核酸 结构 分 析 中 常用 的 工具 酶 还 有 磷酸 单 酯 酶 〈(PMase) ,多 核 昔 酸 激酶 (PNKase) 和 RNA 连接 酶 等 。 3

BRR BOSH = PMase 有 非特 异性 磷酸 单 酯 酶 和 特异 性 磷酸 单 酯 酶 二 类 。 非 特异 性 磷酸 单 酯 酶 如 大 肠 杆 菌 碱 性 磷酸 酯 酶 , 它 能 够 水 解 单 核 苷 酸 或 寡 核 昔 酸 的 3 或 5 端 磷酸 单 酯 键 , 产 生 无 机 磷 。 它 也 能 水 解 核 苷 -2' 一 磷酸 单 酯 、 核 苷 二 磷酸 、 核 苷 三 磷酸 、 糖 磷 酯 、 对 硝 基 酚 磷酸 和 焦 磷 酸 等 范围 广泛 的 磷酸 单 酯 化 合 物 。 此 外 ， 它 还 能 水 解 硫 磷 酯 。 大 肠 杆菌 碱 性 磷酸 单 酯 酶 有 很 高 的 催化 活性 ， 已 被 广泛 地 用 于 核酸 研究 的 许多 方面 它 已 被 制 成 固 相 酶 ,使 用 和 除去 更 为 方便 。

非特 异性 磷酸 单 酯 酶 还 有 哺乳 动物 的 肠 粘膜 肾脏、 肝 胜 和 胎盘 的 碱 性 磷酸 酯 酶 及 许 多 其 他 来 源 的 酸性 磷酸 酯 酶 ,例如 前 列 腺 、 红 血球 肝脏、 脾脏 血清 等 来 源 。

特异 性 磷酸 单 酯 酶 与 核酸 结构 分 析 有 关 的 有 TRB RR, ENDS 异性 地 水 解 核 苷 酸 或 寡 核 昔 酸 的 5 磷酸 单 酯 键 和 3' 磷 酸 单 酯 键 ,产生 无 机 磷酸 。5' 核 苷 酸 酶 的 来 源 有 肴 椎 动物 组 织 \ 精 液 、 蛇毒 、 猪 血 和 微生物 等 许多 方面 ， 其 中 已 用 于 核酸 结构 分 析 的 有 大 肠 杆 菌 % 核 背 酸 酶 ， 蛇 毒 5 核 苷 酸 酶 等 。 它 们 的 共同 特性 是 既 水 解 核糖 核 苷 5 磷酸 也 水 解脱 氧 核糖 核 苷 的 5 磷酸。 大 肠 杆菌 5 核 苷 酸 酶 还 能 水 解 ATP, UTP, CTP, GTP 和 UDP- 葡 萄 糖 等 , 它 水 解 核糖 核 背 单 磷酸 的 相对 速度 是 : A>G>S>C>USI, 蛇毒 5' 核 背 酸 酶 水 解 核糖 单 核 昔 酸 的 相对 速度 是 : A > C >I> G>Uo。

3' 核 苷 酸 酶 有 黑 麦 草 、, 麦 苗 、 绿 豆 和 微生物 等 多 种 来 源 的 制剂 。 它 们 特异 性 地 水 解 核 苷 酸 或 寡 核 苷 酸 的 3' 磷 酸 。

多 核 苦 酸 激酶 “， T4 喉 菌 体感 染 大 肠 杆 菌 产生 的 多 核 苷 酸 激酶 能 催化 ATP 上 的 7 MERLE ARBRE RH BUR RRR REL. CHEB EAT DNA 亦 能 作用 于 RNA; 作用 于 DNA 的 速度 比 RNA #3 CES PRA Re BED 化 的 速度 取 决 于 寡 核 苷 酸 的 链 长 .组 成 及 其 糖 基 的 种 类 。 一 般 情 况 下 * 它 磷 酸化 3' 单 核 背 酸 的 速度 是 SREB 2 到 5 倍 。T4 噬菌体 感染 的 大 肠 杆菌 多 核 背 酸 激酶 伴 有 3' 核 苷 酸 酶 的 活性 ，

es 96 。

它 的 激酶 活性 的 最 适 pH 在 6.5 一 8.5， 而 7 RAN RIE pH 在 5.9， 该 酶 水 解脱 氧 核 糖 核酸 3' 磷酸 的 速度 比 水 解 核 糖 核酸 的 更 快 些 ; 已 经 有 人 从 T4 噬菌体 突变 株 感 染 的 大

| 肠 杆菌 中 制 得 了 不 含 3' 核 苷 酸 酶 活性 的 激酶 。 多 核 苷 酸 激酶 已 被 广泛 用 于 核酸 的 结构 研

究 。 RNA 连接 酶 〈 详 见 第 十 章 )。

三 、RNA 一 级 结构 测定 方法

RNA 一 级 结构 测定 方法 可 以 分 为 两 大 类 : 片段 重 伙 法 和 直接 阅读 法 。 前 者 为 经 典 方法 ,现在 仍然 在 使 用 ;后 者 是 由 DNA 顺序 分 析 衍 生 而 来 的 快速 简便 的 新 技术 ， 它 问世 仅 几 年 时 间 , 已 经 使 核酸 一 级 结构 的 研究 出 现 了 轩 新 的 局 面 。

FR BBE

重 公 法 是 测定 包括 蛋白 质 在 内 的 生物 大 分 子 一 级 结构 的 一 种 战略 ,其 原理 如 下 :RNA 分 子 分 别 被 二 种 以 上 的 具有 不 同 碱 基 专 一 性 的 核糖 核酸 酶 水 解 成 各 种 寡 核 背 酸 片段 ; 然 后 分 别 分 离 和 检定 水 解 产物 ,并 测定 它们 的 核 苷 酸 顺 序 及 其 相对 含量 ;二 种 不 同 专 一 性 的 酶 得 到 的 二 组 寡 核 背 酸 的 切 点 是 相互 重 登 的 。 利 用 这 个 原理 ， 使 用 更 多 种 专 一 性 不 同 的 酶 水 解 RNA 分 子 , 解 析 结构 的 能 力 就 更 强 。 这 就 是 片段 重 公 法 测定 一 结构 的 基本 原理 。 例如 我 们 现在 要 解析 ABCDCAD 这 个 假定 的 顺序 ,有 两 种 酶 可 供 使 用 , 一 种 专 水 解 A 和 _B; 另 一 种 专 水 解 D。 结 果 如 下 :

Ey v 7k ## A Ad BsABCDCAD = A +B+CDCA +D

水 解 D: ees = ABCD + CAD ORPRR ET AHEM AH ERA FES ABCDCAD, 因为 第 一 个 酶 解 产 物 中 有 CDCA 序 = 列 ,说 明 该 序列 在 片 眉 中 是 存在 的 ;第 二 个 酶 水 解 得 到 ABCD 和 CAD 二 个 片段 ,其 排列 有 二 种 可 能 性 ABCDCAD 和 CADABCD ， 因 为 其 中 有 CDCA 顺序 ,所 以 应 该 是 前 一 种 序列 。

重 伙 法 的 基本 实验 方法 和 技术 。

碱 基 组 成 分 析 | kee: RNA 经 碱 水 解 产生 2’ 和 3' 核 背 酸 。 注 意 下 列 核 苷 对 WARP: Dy, mA, mC, mG, mT, aC, VS BRR: 利用 非特 异性 核糖 核酸 酶 (RNase T, Bt M) 水 解 ,产物 是 3' 核 昔 酸 。 上 述 水 解 产 物 可 经 电泳 或 双向 电泳 层 析 进 行 组 成 分 析 ( 见 附录 二 )。

ADR 5 端 和 3“ 端 核 苷 酸 目前 一 般 用 同位 素 标记 的 方法 进行 测定 。 5 端 同位 HP? 标记 用 多 核 昔 酸 激酶 在 [y-?2P]-ATP 存在 下 使 RNA FBR 5 端 羟基 磷酸 化 来 实 现 。3' 端 也 可 以 用 2?P 进行 同位 素 标记 ,通过 RNA 连接 酶 催化 [2?P]-pCp 与 被 WARE 酸 之 间 的 单 加 反应 来 实现 。 末 端 同位 素 标记 的 寡 核 苷 酸 经 核酸 酶 降解 后 ， 用 测定 核 昔 酸 组 成 的 方法 确定 带 有 同位 素 [2P] 的 3' 或 5 端 。

特异 性 酶 解 和 酶 解 产物 的 分 离 ”通常 使 用 的 二 种 酶 是 RNase TI 和 RNase A, 前 者 对 鸟 背 酸 键 专 一 ， 后 者 对 喀 啶 核 昔 酸 键 专 一 。 得 到 的 全 酶 解 产物 可 通过 7M 尿素 柱 层

e 97 e

析 进 行 分 离 〈 见 图 3-28)。 中 性 尿素 柱 层 析 可 以 按 链 长 把 十 核 背 酸 以 下 的 寡 核 昔 酸 片段 分 开 。 该 法 一 般 用 于 非 放射 性 样品 的 分 离 。

© 20 40 60 60 WO i20 HO KO ISO 200 220 240 260 290 300 320 其 号

图 3-28 DEAE- 纤 维 素 柱 层 析 分 离 寡 汉 核 背 酸 混 合 物 。 洗 脱 溶剂 为 pH 6.5 碳酸 气 三 乙 胺 梯度 ,内 含 7M 尿素 。 图 中 数目 字 表示 链 长 。 ，

此 外 ， 还 可 以 用 双向 电泳 法 分 离 同位 素 标记 的 酶 解 产物 ， 有 人 把 这 种 方法 称 为 指 效 法 。 图 3-29 显示 了 用 Sanger 建立 的 双向 电泳 法 分 离 放射 性 [”P] 标 记 的 核酸 水 解 产物 的 图 谱 , 该 法 简便 易 行 ;已 广泛 地 用 于 RNA 一 级 结构 特别 是 小 分 子 RNA 的 测定 。 BAI

BEAD BS ARR FAR PA es BH Be DB HB Dk EAT

sc eo, oP sae si 7A ee) $fe u- c SA . Jes u Ay uv c U U A 2 ! 3-29 ”用 双向 电泳 法 分 离 RNA 酶 解 产物 图 3-30 ”打点 法 测定 寡 核 将 酸 (CERAM 22H CRNAS!” 的 RNase T, 全 酶 解 ) 片段 的 核 苷 酸 排列 顺序 第 一 向 : 酷 酸 纤维 素 薄 膜 电泳 。pH 3.5 (醋酸 -吡啶 ); 第 一 向 : pH 3.5 醋酸 纤维 素 电 泳 ; 第 二 向 : DEAE oR ik 5 7%o BB, 第 二 向 : 同系 层 析 。

es 98 。

Wy FARRAR HR FR] C1) SRR — wT Ree —_FEW 5 端 经 [>P] 标 记 后 ,蛇毒 磷 和 酸 二 酯 酶 部 分 酶 解 ,双向 电泳 层 析 分 析 ( 第 一 向 电泳 按 碱 基 组 成 分 离 ; 第 二 向 同系 层 析 , 按 KE), 根据 同位 素 资 点 在 图 谱 上 顺 次 排列 的 轨迹 即 可 推导 出 核 苷 酸 的 排列 顺序 (图 3-30) AWS AFA BE DNA 顺序 的 测定 ( 见 第 二 章 第 17 页 )。 (2) 高 磺 酸 氧化 法 一 “ 先 用 高 碘 酸 氧化 RNA 3’ 端 邻 位 羟基 ,然后 在 弱 碱 性 条 件 下 发 生 8 消除 反应 ,测定 8 消除 反应 产生 的 碱 基 , 即 可 知道 3 端 第 一 位 核 背 酸 。 切 除 第 一 个 RERNRREBA AE MEO 3 MR REA BO ECLA 3-31)。 由 HAAR PEARED THEN RRO, AAR SW mK 29 次 。 该 法 不 能 用 于 带 有 2'-O-FLCMERHRH ER; 高 碘 酸 对 假 尿 苷 和 二 氢 尿 苷 有 破坏 作用 ,使 用 时 要 注意 。 产 物 除 用 紫外 明 收 法 测定 碱 基 外 ,还 可 以 用 刘 望 夷 等 人 提出 的

RNA—O a N; O OH O=P-O— Ne es. a=. ) OH O=P-O 于 oth Oo OH OH

2] Z ‘i fo) Pah 党 o

: R-NH, pokey O Na 了 O- 9 OH O-P—O de lO: H CHCH | T w Oo Oo RNA-—O d ; en key! PMase ? OH 证人 9 OH O=P-O O=P-O | O N: 让 O\N:2 O- OH OH : = OH O=P-O- OR ext 第 二 轮 循环 N,

3-31 ”高 碘 酸 氧化 法 测定 寡 核 昔 酸 的 顺序

e 99 。

4

HOGA LET Ml HN RB SRA Oar EIR Sat AR, SOCEM AE natin FERS A 3-32), 检测 核 苷 腕 的 草 光 性 比 上 述 紫外 方法 灵敏 得 多 。

二 B OF RNEHNH Vo HO7,0O NalO, Ke H 2NFi2 HH ‘oes CK, Shel H 人 OH HO OH oO O 1 R O - CH 2 B UHo-P-o O.B 1.NalO, 20 B RNH.NH, 6° re a ae WA HOG HO OH pHs.5 a Ho N OH} 37'C,10 小 时 2

了 B 王 碱 基 ( 腺 嘎 哈 、 乌 呀 哈 、 胞 喀 啶 . 尿 喧 啶 ) N(CH3)2

R= O

i SO,—NHCH,C —

3-32 用 莉 光 法 检测 DNS-Gly- 核 背 逐 或 一 次 甲 基 核 昔 逐

By ge 寺

关于 直 读 法 的 原理 详 见 DNA 结构 一 章 。 利 用 特异 性 降解 或 在 控制 条 件 下 合成 得 到 的 以 RNA 分 子 中 某 种 特定 碱 基 ( 如 A) 为 未 端 (3' 端 或 ? 端 ) 的 不 同 链 长 的 寡 核 苷 酸 片 妥 混合 物 ,经 变性 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 按 链 长 分 离 , 凝 胶 电 泳 上 显示 的 各 条 带 的 链 长 就 表示 RNA 分 子 上 各 个 A 碱 基 的 位 置 。 同 样 , 亦 可 得 G\C 和 TU 接 尾 的 各 组 片 豚 ,并 定 出 它们 在

RNA 分 子 中 的 位 置 。 由 此 可 以 很 快 排出 RNA 分 子 的 核 音 酸 顺 序 ( 见 图 3-33)。 该 方法 ©

的 特点 是 简便 快速 。 根 据 阅 读 的 方法 不 同 又 可 分 为 以 下 几 种 :

利用 专 一 性 核糖 核酸 酶 控制 酶 解 的 直 读 法 Fe RNA 水 解 酶 具有 特定 的 碱 基 专 一 性 ,如 前 介绍 : RNase A 专 一 水 解 C 和 U; RNase Ti 专 一 水 解 G; RNase U, 在 适当 条 件 下 专 一 水 解 A; RNase phy 工 能 水 解 A\U 和 G;, 水 解 C 的 速度 特别 慢 ;RNase phy M 在 适当 条 件 下 专 一 水 解 A 和 TU; 葡萄 球菌 核酸 酶 在 pH7.5, 10mM Ca 条件 下 :水解 N-A 和 N-U 很 快 ;小 球菌 核酸 内 切 酶 在 7M 尿素 存在 时 能 水 解 C 一 N 键 。 如 果 RNA 分 子 的 5 端 被 ”P 标记 ,适当 选择 几 种 酶 相配 合 进 行 控制 性 水 解 。 通过 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 的 分 离 , 可 得 到 几 组 以 5 端 为 ?P 而 3" 端 为 某 一 特定 碱 基 的 片段 。 放射 自 显 影 后 即 可 阅读 顺 序 ( 见 图 3-33)。 此 方法 受 RNA 二 级 结构 影响 较 大 ,同时 也 不 能 阅读 修饰 核 背 酸 。

利用 专 一 性 化 学 降解 的 直 读 法 RNA 在 RNA 连接 酶 的 作用 下 , 在 其 3 端 接 上 3pCp 后 分 别 用 硫酸 二 甲 酯 (修饰 G)、 焦 碳酸 二 乙 酯 〈 主 要 修饰 A)、 腊 (修饰 U)、 无

es 100 。

有 4

图 3-33 酶 解 阅读 法 测定 RNA 结构 凝 胶 电泳 图

7KBECE 3M NaCl 中 主要 修饰 C) 进行 特异 性 碱 基 的 限制 修饰 (其 原理 可 参见 DNA 结 构 一 章 ) ,得 到 几 组 以 3' 端 为 ?2P 标记 ;5' 端 表示 特定 碱 基 的 片段 ,用 变性 凝 胶 电 泳 分 离 各 片 HRI. 该 方法 的 优点 是 不 受 RNA 二 级 结构 的 影响 ， 但 也 不 能 阅读 修饰 核 昔 酸 。

利用 RNA 复制 特异 性 未 端 终止 的 直 读 法 ”在 有 四 种 核 昔 三 磷酸 存在 时 ， 以 寡 聚 RAVES! WM, HRI RNA 的 RNA 聚合 酶 能 在 RNA 模板 上 合成 互补 的 RNA 链 。 如 果 在 反应 体系 中 加 入 某 种 一 定量 的 [cu-2P]-3'- 脱 氧 核 背 三 磷酸 , 则 RNA 合成 就 会 在 这 一 核 音 酸 位 置 上 终止 ， 结 果 产 生 一 系列 以 引物 为 5 端 ， 以 [?P] 标记 的 MARR 为 3' 端 的 不 同 链 长 的 RNA 片段 。 利 用 A、G、C、U 四 组 不 同 [c-?P]-3'- 脱 氧 核 背 三 磷 酸 的 反应 体系 ,经 变性 凝 胶 电 泳 分 离 , 即 可 阅读 其 核 昔 酸 顺 序 。 这 种 方法 受到 [ac-2?P]-3'- 脱氧 核 背 三 磷酸 和 依赖 于 RNA 的 RNA 聚合 酶 的 来 源 的 限制 。 另 外 ,如 果 RNA 链 上 有 稀有 核 苷 酸 ,那么 RNA 复制 就 会 受到 影响 而 不 能 阅读 出 RNA 的 全 序列 。 这 种 直 读

es。 101 。

Ba oS © 8 @ 6 @: C6 © exe. a

原 位 水 解

5 —GCGUAUCCUAGU—3’ 3-34 利用 末端 鉴定 直 读 法 测定 RNA 顺序 示意 图 9 ,同位 素 标记 ; © :放射 自 显影 斑点 。

法 目前 应 用 较 少 。 AA Kame LY RRA RNA 在 无 离子 甲 酰 胺 或 双 蒸 水 的 限制 性 水 解 条 件 下 ,从

”统计 角度 而 言 , 每 一 分 子 RNA 只 有 一 个 磷酸 二 酯 键 被 水 解 。 因 水 解 无 碱 基 专 一 性 , 得 ，

到 一 组 3 端的 片段 和 一 组 5 端的 片段 。 如 果 原 来 的 RNA 分 子 5 端 带 有 磷酸 基 团 ， 那 么 只 有 3 端的 一 组 片 眉 的 5? 端 有 游离 羟基 ,这 组 片段 经 5 端 标记 ?*? 后 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 上 按 链 长 分 离 。 切 下 凝 胶 条 带 或 转移 至 DEAE- 纤 维 素 薄 板 上 ,经 水 解 鉴定 它们 的 5 端 的 核 背 酸 ,就 可 排出 RNA 的 核 背 酸 序列 (图 3-34)。 该 方法 的 优点 是 能 克服 RNA 分 子 二 级 结构 对 测定 的 影响 也 能 测定 稀有 核 苷 酸 ,缺点 是 对 多 核 苷 酸 激酶 的 质量 要 求 很 高 , 且 操作 比较 碰 烦 。

反 转 录 成 cDNA HAR ”在 有 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 存在 时 ,用 反 转 录 酶 或 大 肠 杆菌 DNA RAMZE RNA 样板 上 反 转 录 成 DNA. 然后 用 DNA 直 读 法 测定 cDNA 的 序列 再 推导 出 RNA 的 序列 。 DNA 序列 测定 法 详 见 DNA 结构 一 章 。 目前 许多 mRNA 和 病毒 RNA 都 是 用 这 种 方法 测定 序列 的 。

* 102 +

近年 来 许多 核酸 分 子 一 级 结构 的 测定 大 都 是 用 快速 直接 阅读 法 完成 的 ， 然 而 经 典 的 片段 重 登 法 仍 不 失 其 特点 , 它 的 一 套 基本 实验 方法 ,包括 末端 分 析 、` 组 成 分 析 \ 修 饰 核 苷 酸 分 析 等 ,仍然 是 RNA 特别 是 tRNA 以 及 snRNA 顺序 测定 的 常用 方法 。

$ 4+ X mk

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¢ 103 e

Spyz DNA B&B 制 SLR RAR

在 细胞 分 裂 过 程 中 ， 亲 代 细 胞 所 含 的 遗传 信息 源源 本 本 地 传递 到 二 个 子 代 细胞 。 我 们 知道 , DNA 携带 了 细胞 的 一 切 遗 传 信息 ,因此 亲 代 DNA 也 必须 准确 地 复制 成 二 个 捞 贝 ， 分 配 到 二 个 子 代 细胞 中 去 。 研究 DNA 复制 的 目的 就 是 要 了 解 (1) 子 代 DNA 为 什 么 能 够 真实 地 获得 亲 代 DNA 的 遗传 信息 ; 〈2) 复 制 是 怎样 进行 的 ?9 〈3) 生物 体 是 怎样 对 DNA 复制 进行 调控 的 ?

对 于 前 两 个 问题 ，Watson 和 Crick 在 发 表 DNA 双 螺 旋 模 型 时 就 进行 了 探讨 。 在 DNA 双 螺 旋 模 型 中 ,G 只 能 和 C 配对,A 只 能 和 工 配对 ,因此 按 碱 基 配 对 规则 , 任意 一 条 链 的 碱 基 顺 序 可 精确 地 决定 它 的 互补 链 的 顺序 。 在 DNA 复制 时 ， 只 要 简单 地 把 DNA 双 链 拆 开 , 每 一 条 链 都 可 作为 模板 ,合成 结构 上 完全 一 样 的 二 条 DNA 双 链 (图 4-1)。

然而 ,这 样 一 个 表面 上 看 来 很 简单 的 过 程 , 并 不 象 最 初 提出 时 那样 ， 可 以 象 拉 * 拉 链 ”

EF GE $3 iil te 复制 链 Wee 图 4-1 双 螺 旋 DNA 复制 过 程

* 1046

二 祥 不 靠 任何 酶 的 帮助 而 自动 完成 。 现 在 知道 ,复制 过 程 十 分 复杂 ， 涉 及 30 多 种 酶 和 蛋

白质 的 协同 作用 。 表 4-1 列 出 部 分 与 大 肠 杆 菌 复 制 有 关 的 蛋白 质 及 其 性 质 。 其 中 大 部 分 酶 和 和 蛋白质 的 结构 和 作用 已 经 弄 清楚 ， 对 双 链 如 何 解 开 以 及 怎样 保持 复制 真实 性 也 有 了 一 定 的 了 解 ,但 仍 是 知 其 然而 不 知 其 所 以 然 。 由 于 复制 是 生命 活动 中 极为 重要 的 一 环 , 感 兴趣 的 实验 室 很 多 ,在 这 个 领域 里 进展 很 快 ,因此 我 们 只 能 把 复制 的 基本 过 程 作 一 介绍 。

表 4-1 与 大 肠 杆 菌 复制 有 关 的 蛋白 质

蛋白 质 名 称 * |OFRXIC | WERE 功 te feta te BREE SSB 4 与 单 链 结合 300 20 u i 蛋白 4 预 引发 50 0.5 n 蛋白 1 预 引发 30

on 蛋白 1 部 位 识别 ，ATPase 70 0.3 a” 蛋白 1 预 引 发 一

dnaC 1 预 引 发 100

dnaB 6 移动 启动 子 ,ATPase 20 0.3 引发 酶 1 引发 合成 50 0.2 Pol Ill 全 酶

Qa . l 一

& 1 一

6 2 een ats 0.5 8 1 300

Yr 2 20

6 1

£ 1

Pol I 1 填补 缺口 和 切 去 引物 300 10 ERB 1 RE 300 10 拓扑 异 构 酶 H 4 Si

a 2 引进 超 螺旋 250

6 2 25

rep EA 1 解 开 双 链 50 0.6 fee EAS U1 1 5000 |

dnaA 复制 起 始 200

”SSB， 单 链 结合 蛋白 ; Pol, DNA RAM; rep 蛋白 是 一 种 大 肠 杆菌 解 链 酶 。

一 、 复 制 机 制

半 保 留 复制

Watson 和 Crick 提出 的 DNA 复制 方式 可 称 为 半 保 留 的 复制 方式 ， 因 为 每 个 子 代 DNA 分 子 中 一 条 链 是 完整 的 亲 代 DNA 链 , 另 一 条 链 是 新 合成 的 链 。 在 理论 上 还 可 以 设 想 其 他 一 些 复 制 方式 。 例 如 二 个 子 代 DNA 分 子 中 一 个 分 子 完全 是 亲 代 的 分 子 , 而 另 一 个 分 子 完全 是 新 合成 的 分 子 , 这 种 方式 可 以 称 为 全 保留 的 复制 方式 ;又 比如 可 以 设想 亲 代 链 被 分 解 成 很 多 片段 ,散布 在 新 的 子 代 分 子 中 , 这 种 方式 称 为 散布 式 复制 机 制 (图 4-2)。

"105。

‘oahu nape ln Ep pss i Gul 半 保留 式 全 保留 式 ' 散布 式

4-2 复制 机 制 的 三 种 可 能 方式

生物 体内 究竟 以 什么 方式 进行 复制 ， 必 须 用 实验 来 证 明 。1958 年 Meselson 和 Stahl 设计 了 一 个 很 巧妙 的 实验 。 他 们 先 把 大 肠 杆菌 在 96.5 % 同位 素 纯度 的 “5NH4CI 培养 液 中 生长 十 五 代 , 使 所 有 的 DNA 都 被 重 的 YN 标记 。 然后 把 细胞 转 到 含 ANH4CIL 的 介质 中 培养 ,在 不 同 的 时 间 取 出 样品 ,每 个 样品 都 用 SDS Sle omi, 裂解 液 放 在 CsCl 溶液 中 以 140,000g 离心 二 十 小 时 。 离 心 结 束 , 从 管 底 到 管 口 CsCl 密度 形成 一 个 梯度 分 布 , 越 LEB. DNA 分 子 的 密度 如 果 同 某 一 层 Cl 密度 相等 时 ， 它 就 趟 上 也 不 下 ,在

a

a

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0.3

0.7

2 3.0“

2 4.1

! 0 代 和 1.9 代 混合 2

rr 。

0 代 和 4.1 代 混合

4-3 2N 标记 DNA 在 复制 时 密度 的 变化 “106。

紫外 光 下 可 以 看 到 一 条 吸收 带 。 通 常 DNA 分 子 的 密度 在 1.71g/cm' 左右。 用 SN 标记

的 DNA 密度 大 于 正常 的 DNA 密度 , 它 在 离心 管 较 低 的 部 位 形成 一 条 区 带 。 让 这 种 重

标记 DNA 在 %N 培养 液 中 生长 一 代 ,， 我 们 看 到 新 复制 的 DNA 在 密度 稍 低 的 地 方形 成 一 条 新 的 区 带 , 称 为 中 间 密 度 带 。 注 意 ,这 时 在 重 密度 区 域 的 位 置 已 没有 DNA 区 带 了 。 再 复制 一 代 ,在 .Cscl 密度 梯度 中 出 现 了 二 条 带 , 一 条 在 中 间 密 度 的 区 域 ， 另 外 一 条 在 轻 密度 的 区 域 。 当 然 重 密度 的 区 域 仍然 没有 DNA 区 带 。 随 着 在 2%N 培养 液 中 培养 的 代数 增加 ,中 密度 区 带 的 量 逐 渐 减 少 , 低 密度 区 带 的 量 逐 渐 增 加 。 但 是 并 不 出 现 具有 新 的 密度 的 区 带 ( 图 4-3)。 |

这 个 实验 结果 表明 在 体内 大 肠 杆 菌 DNA 是 以 半 保 留 的 方式 进行 复制 的 。 在 AN 培 养 的 第 一 代 DNA 中 j; 重 密度 区 带 完全 消失 , 排除 了 全 保守 的 复制 方式 ,因为 在 全 保守 复 制 方式 中 亲 代 DNA 毫 无 变化 转移 到 子 代 中 , 重 密度 的 DNA 区 带 不 会 消失 ,在 以 半 保 留 方式 复制 的 子 代 DNA 中 ;一 条 链 是 亲 代 ON 标记 的 重 链 , 另 一 条 链 是 含 YN 的 轻 链 ， 二 条 链 形成 密度 上 杂交 的 ,DNA。 因此 所 有 的 子 代 DNA 的 密度 都 比 亲 代 DNA 的 密度 小 ,但 又 比 正常 DNA 的 密度 大 ， 形 成 一 个 中 间 密 度 的 区 带 。 如 果 把 这 种 密度 上 杂交 的 分 子 在 AN 培养 液 中 再 培养 一 代 , 按 半 保 留 复制 方式 就 会 形成 “NAN 和 NIMN 二 种 分 子 ， 而 且 随 着 在 YN 中 复制 的 代数 增加 , MN“N DNA 的 相对 量 减 少 ,而 MN“N AY DNA 的 相 对 量 增加 ,但 不 会 出 现 其 他 密度 的 DNA。 实验 结果 正 符合 这 种 半 保 留 复制 的 方式 。

1963 年 Cairns 用 放射 自 显影 的 方法 阐明 大 肠 杆菌 DNA 是 一 个 环 状 分 子 ， 并 以 半 保留 方式 进行 复制 。 把 大 肠 杆 菌 放 在 含 3H 脱氧 胸 昔 培养 液 中 生长 二 代 左 右 , 然 后 用 溶菌 酶 把 细胞 壁 消化 掉 , 提 取 DNA， 十 分 小 心地 放 在 一 张 透 析 膜 上 , 再 把 膜 转移 在 显微镜 载 片上 ,上 面 覆 上 照相 乳胶 ,在 暗 处 曝光 二 个 月 。 在 这 期 间 :6 由 于 放射 性 衰变 ， 放 出 8 粒 子 , 使 乳胶 曝光 。 显 影 以 后 ,发 射 的 8 粒子 作为 黑 点 记录 下 来 (图 4-4)。 ACH WEE

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4-4 复制 中 的 大 肠 杆 菌 染 色 体 放射 自 显 影 照 片

子 能 量 很 低 , 只 能 透 过 lum 距离 , 银 粒子 的 位 置 正确 地 代表 了 : 瑟 在 染色 体 中 的 位 置 。 在 乳胶 中 黑 点 的 数目 代表 了 HE DNA 分 子 中 的 密度 。 把 显影 好 的 载 片 放 在 光学 显微镜 底下 就 可 以 观察 到 染色 体 的 形状 。 用 这 方法 Cairns 观察 到 大 肠 杆菌 DNA 是 一 个 环 状 分 子 (图 4-4 左 )。 当 DNA 复制 时 它 的 中 间 产 物 是 6 形 的 (图 4-4 A), 非 复制 的 部 分 银 粒子 的 密度 较 低 ,由 一 条 热 链 ”和 一 条 冷 链 构成。 复制 中 的 二 条 双 链 ,其 中 一 条 双 链 的 一 条 链 是 标记 的 (一 条 热 链 ” ,一 条 冷 链 ”), 另 一 条 双 链 的 二 条 链 都 标记 。 因 此 可 以 推断

*。 107。

在 DNA 复制 过 程 中 必须 经 过 链 分 离 阶段 ,复制 是 以 半 保 留 方式 进行 的 。

真 核 生 物 的 染色 体 复制 也 是 以 半 保 留 方式 进行 的 。1957 年 Taylor 把 蚕豆 苗 放 在 含 所 脱氧 胸 背 的 溶 流 中 生长 ,所 有 在 细胞 分 裂 过 程 中 合成 的 DNA 都 被 同位 素 标 记 了 ，8 个 小 时 以 后 转 到 正常 的 盗 液 中 让 它 继 续 生 长 ， 然 后 把 细胞 染色 体 放 射 自 显影 。 从 显影 图 ， 上 可 见 , 在 *H 脱 氧 胸 背 中 生长 一 代 以 后 ,每 个 中 期 染色 体 的 二 个 染色 单 体 都 是 标记 的 在 正常 介质 中 生长 一 代 以 后 ， 每 个 中 期 染色 体 有 一 个 染色 单 体 是 标记 的 ;， 另 一 个 是 非 标记 : 的 。 再 生长 一 代 后 ， 有 一 半 染 色 体 是 非 标 记 的 ， 还 有 一 半 染 色 体 中 一 半 梁 色 单 体 是 标记 的 , 另 一 半 是 非 标记 的 《图 4-5)。

第 一 次 分 裂 中 痢 第 二 次 分 裂 中 期 “第 三 次 分 裂 中 其

ou x o~ Ky 从 ~ ZA

复制 前 第 一 次 分 裂 中 期

第 三 次 分 裂 中 其 第 二 次 分 裂 中 期 第 二 次 分 裂 中 其 4-5 [H] TdR 标记 的 委 豆 染色 体 在 各 代 中 的 放射 自 显影 示意 图 小 点 表示 有 放射 性 的 部 位 * 下 图 是 上 图 的 解释 。 对 上 述 实 验 结果 最 简单 的 解释 是 复制 前 的 染色 体 是 双 元 结构 ,在 第 一 次 分 裂 中 间 ;每 - 一 个 染色 单 体 是 由 一 条 标记 的 和 一 条 非 标记 的 链 组 成 ,在 正常 培养 液 中 培养 一 代 后 ,每 一

个 中 期 染色 体 将 有 一 个 染色 单 体 中 一 条 链 是 标记 的 ， 另 一 个 染色 单 体 完全 没有 标记 。 这

个 结果 表明 在 真 核 生 物 中 染色 体 的 复制 也 是 以 半 保 留 的 方式 进行 的 ， 而 且 表 明 一 个 染色 体 中 只 含 一 个 非常 长 的 DNA 分 子 。

。108。

从 以 目的 实验 得 到 一 个 共同 的 结论 ，DNA 双 链 复制 是 以 半 保 留 方式 进行 的 ， 无 论 是 原核 还 是 真 核 生物 都 是 如 此 。

6 方式 和 滚 简 方 式

复制 时 双 链 DNA 解 成 二 股 链 分 别 进 行 ,因此 这 个 生长 点 呈现 叉子 的 形式 称 为 复制 Mo 双 链 环 状 DNA 复制 的 中 间 产 物 形 成 一 个 6 形式 。 这 是 由 Cairns 在 大 肠 杆 菌 染 色 体 的 复制 的 中 间 产 物 放射 自 显影 图 上 最 早 观 察 到 的 ， 因 此 这 种 复制 方式 称 为 Cairns 方 Kio

另 有 一 种 滚筒 式 复制 模型 ， 这 个 模型 可 以 解释 噬菌体 由 174 复制 的 中 间 过 程 ， 特 别 是 解释 单 链 的 子 代 DNA 怎样 从 双 链 的 复制 型 产生 的 。 实 验 发 现 噬菌体 $X174 初始 合成 的 单 链 产物 比 单位 长 度 要 长 得 多 ,而 且 是 和 亲 代 分 子 连 在 一 起 的 。 若 %X174 共 价 闭 环 的 双 链 复制 型 (REFI) 的 正 链 由 一 内 切 酶 切 开 一 条 链 ， 原 来 的 5 端 从 双 链 上 “和 剥 出 ， 然后 可 能 附着 在 膜 上 ， 留 下 正 链 的 3 OH 作为 引物 ， 以 负 链 作为 模板 就 可 连续 合成 比 原 长 的 度 长 达 几 倍 的 正 链 。 现 在 有 些 实 验 指出 某 些 双 链 DNA 的 合成 可 能 也 是 以 滚筒 的 形 式 进 行 的 。 当 双 链 DNA 以 这 种 方式 合成 时 ， 正 链 以 上 述 的 方式 “AM”, MAB

I 直线 双向

1 多重 起 始 双向

图 4-6 半 保 留 复制 的 几 种 方式

es 109 =

滚 出 的 正 链 为 模板 连续 合成 。 在 噬菌体 1 SHIN ABIU SKS RAK. MYR 母 细胞 中 核糖 体 RNA 基因 的 扩 增 可 能 也 是 以 这 种 方式 进行 。 但 是 总 的 来 说 这 都 是 一 ”. 些 特例 ， 绝 大 多 数 的 复制 是 以 复制 叉 的 形式 进行 的 。 图 4-6 归纳 了 上 述 几 种 复制 的 机 制 。

复制 的 起 始 和 方向

一 个 DNA 分 子 的 复制 当然 不 是 瞬时 能 完成 的 , 复制 过 程 在 空间 上 是 井然 有 序 的 复 杂 生 化 反应 历程 。 那么 从 哪 一 个 位 置 首先 开始 复制 ? ”这 个 位 置 在 DNA 分 子 上 是 任意 的 还 是 特定 的 ?

从 很 多 体系 用 不 同 的 实验 手段 所 得 出 结果 都 证 明 , 原 核 生 物 DNA 复制 都 是 在 DNA 分 子 特定 的 位 置 起 始 的 ,复制 方向 大 多 是 双向 进行 的 ,也 有 一 些 以 单 向 的 或 不 对 称 方式 进 行 的 。

用 遗传 的 方法 可 以 证 明 大 肠 杆 菌 DNA 复制 是 定点 开始 双向 进行 的 (图 4-6、IDo。 细菌 染色 体 复 制 所 需要 的 时 间 相 当 于 细胞 生长 一 代 的 时 间 ， 在 一 个 生长 的 群体 中 几乎 所 有 的 染色 体 都 在 复制 中 。 假 定 每 个 染色 体 都 在 同样 的 起 始点 ( 切 开 始 复制 ,那么 大 部 分 细 菌 将 复制 i 附近 的 基因 ， 而 远离 i 的 基因 将 复制 得 少 些 。 因 此 在 一 个 群体 中 离 1 点 越 近 的 基因 出 现 频 率 越 高 。 假 如 复制 是 单 向 进行 的 ,基因 频率 在 基因 图 上 呈 单 向 梯度 ,最 高 和 最 低频 率 的 基因 应 该 是 连锁 的 。 如 果 是 双向 复制 ， 基 因 频 率 将 以 i 为 中 心 出 现 一 个 双向 的 梯度 。 测 定 了 大 肠 杆 菌 染 色 体 上 很 多 基因 的 频率 ,发 现 以 ori A OMA PM, Ast WERK DNA 复制 是 起 始 于 oriC 基因 附近 双向 进行 的 。 大 肠 杆 菌 复 制 起 始 区 oriC 位 于 其 遗传 图 的 iv BA (83 Sit). 一 且 复 制 起 始 以 后 ， 复制 又 就 以 双 门 等 速 前 进 , 两 个 又 在 距 起 始 180° 的 trp 基因 处 (33 分 附近 ) 相 会 (图 4-7)o

(rpoD) dnaG

dnal lig nalA

图 4-7 ”大 肠 杆 菌 复制 起 始 区 在 遗传 图 上 的 位 置

* 110。

大 肠 杆 菌 和 其 他 几 种 革 兰 氏 阴性 细菌 起 始 区 的 顺序 已 经 测定 (图 4-8)， 测 定 结果 表

明 ,这 一 起 始 区 的 结构 是 很 保守 的 ,其 中 GATC 和 TTATCCACA 出 现 多 次 。 这 245 碱

基 对 能 被 细菌 酶 系 识别 。 2

”直接 的 放射 自 显影 观察 可 以 确证 复制 是 双向 的 。 利 用 大 肠 杆 菌 一 个 温度 突变 种 ， 它 在 42°C 能 使 复制 中 的 DNA 合成 完成 , 但 不 能 开始 新 的 复制 循环 ， 而 在 25°C 生长 是 正 常 的 ,因此 有 了 一 个 简单 的 手段 保证 群体 中 所 有 的 细胞 都 在 同一 时 间 开 始 复制 , 即 称 为 同 步 生长 。 细 菌 先 在 含 低 比 放射 性 的 *H 脱氧 胸 音 溶液 中 进行 标记 ,然后 在 第 一 个 复制 循环 即将 结束 、 第 三 个 循环 刚 开 始 之 前 几 分 钟 转移 到 高 比 放 射 性 的 3H 脱氧 胸 苷 溶液 培养 一 自 不 长 的 时 间 。 假 如 复制 是 单 向 的 ,起 始点 和 终止 点 应 该 是 邻近 的 ,如 果 是 双向 的 ， 则 二 个 区 域 应 该 是 分 离 的 ,实验 结果 表明 复制 是 双向 进行 的 (图 4-9)。

以 上 是 原核 生物 中 的 一 些 实验 结果 ,在 真 核 生物 中 ,实验 表明 ， 复 制 也 是 从 特定 的 位 置 起 始 , 以 双向 延伸 的 方式 进行 ,在 SV40DNA 复制 时 , 随 着 时 间 延 长, 增加 标记 的 比 强 度 ,把 复制 完成 的 DNA 分 子 分 离 出 来 ,用 限制 性 内 切 酶 消化 , 测定 每 个 片 眉 的 比 放射 性 强度 ,并 按 物 理 图 谱 排 列 起 来 ,发 现 放射 性 强度 呈 梯 度 分 布 ， 最 小 的 放射 性 区 域 是 复制 的 起 始点 ,二 边 的 放射 性 对 称 地 增强 。 用 限制 性 内 切 酶 把 SV40 DNA 切 成 线 状 ,作为 DNA 分 子 内 位 置 的 标志 , 用 电镜 也 可 观察 到 复制 眼 和 它 的 延伸 过 程 , 因 此 SV40 DNA 的 复制 也 是 从 定点 开始 ,双向 进行 的 。

用 哺乳 动物 细胞 做 材料 ,从 放射 自 显影 图 上 也 可 看 到 复制 是 双向 的 ;而 且 在 第 一 个 复 制 周 期 所 用 的 起 始点 看 来 也 用 在 第 二 个 复制 周期 中 , 这 些 材料 都 说 明 DNA 复制 是 在 特 定 的 区 域 起 始 , 向 两 个 方向 等 速 进行 的 。 ，

大 多 数 生物 体内 DNA 的 复制 都 是 以 这 种 方式 进行 的 ， 但 是 也 有 一 些 例外 的 情况 ， 例如 在 枯草 杆菌 中 ， 复 制 是 从 DNA 上 特定 的 点 开始 的 , 但 是 二 个 复制 又 的 移动 是 不 对 称 的 。 一 个 复制 又 仅 移动 染色 体 的 五 分 之 一 的 上 距离; 然后 停 下 来 等 另 一 个 复制 又 走 完 五 分 之 四 的 距离 。

用 限制 性 内 切 酶 的 切 点 作为 参考 点 ,用 电镜 观察 分 离 质 粒 ROK 的 复制 中 间 产 物 , 改 现在 复制 又 移动 不 太 远 的 复制 中 间 体 中 ,复制 又 离开 参考 点 的 距离 是 恒定 的 ,说 明 复制 的 早期 是 单 向 进行 。 然而 复制 得 更 远 的 中 间 产 物 显 示 出 第 一 个 复制 又 在 离 起 始点 20% 左 右 的 位 置 停 下 来 ,而 从 反方 向 开始 形成 第 二 个 复制 又 ;因此 质粒 ROK 的 复制 是 不 对 称 进 行 的 。

质粒 ColEI 的 复制 完全 是 单 向 进行 的 。 在 ColEI DNA 中 限制 性 内 切 酶 EcoRI 只 有 一 个 切 点 ， 这 个 切 点 可 以 作为 参考 点 。 从 体内 或 体外 合成 系统 分 离 到 的 复制 中 间 体 其 一 个 复制 又 虐 离 参考 点 约 17 一 18 % 左右 ,而 另 一 个 复制 又 的 距离 是 可 变 的 ,因此 说 明 ColFI 的 复制 起 点 是 固定 的 ,但 只 向 一 个 方向 移动 。

线粒体 DNA 的 复制 也 是 不 对 称 进行 的 ， DNA 双 链 中 一 条 链 先 复 制 ， 另 一 条 链 保 持 单 链 , 电 镜 中 呈 D 环 形状 ; 待 一 条 链 复 制 完毕 ; 另 一 条 链 才 开始 复制 ( 见 图 4-6\VY、Q 型 置换 方式 )。

从 已 研究 过 的 DNA 复制 形式 来 看 ， 复 制 是 在 _DNA ”分子 中 一 个 特定 的 位 点 开始 的 ,至 今 还 没有 例外 。 复 制 又 移动 的 方向 和 速度 是 多 种 多 样 的 ,但 主要 是 双向 等 速 方式 移 动 的 。

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4-9 -双向 复制 的 放射 自 显影 证 明

半 不 连续 复制 (Semidiscontinuous replication)

上 面 我 们 讨论 了 DNA 复制 的 一 些 基 本 机 制 ， 即 DNA 是 以 半 保 留 方式 进行 复制 的 ,复制 的 起 始点 处 在 DNA 分 子 的 特定 的 位 置 上 ,复制 又 移动 的 方式 是 多 样 的 , 但 主要 尽 对 称 方式 移动 的 。 现 在 我 们 讨论 复制 生长 点 附近 一 些 情 况 。

AA DNA 双 螺 旋 的 二 条 链 是 反 向 平行 的 ,因此 在 复制 叉 附 近 解 开 的 DNA 二 条 和 链 一 条 是 5 一 3 方向 ， 另 一 条 是 3 一 5 方向 。 由 于 模板 的 极 性 不 同 , 是 不 是 一 种 DNA R 合 酶 能 以 3 一 5 方向 延伸 ， 另 一 种 聚合 酶 可 以 5 一 3 方向 延伸 呢 ? 至 今 发 现 的 体内 所 有 DNA 育 合 酶 都 只 能 以 33 延伸， 而 且 以 后 我 们 将 讨论 到 ,由 于 复制 真实 性 的 要 求 , 也 只 能 以 5 一 3 延伸 。 如 何 解决 复制 过 程 中 二 条 不 同 极 性 的 链 同时 延伸 这 个 问题 呢 ?

1968 Fie} (Okazaki) 发 现 大 肠 杆菌 用 5H 脱氧 胸 苷 短 时 间 标 记 , 从 中 得 到 的 DNA

变性 后 用 超 离 心 方法 可 以 得 到 许多 8S—10S 的 标记 小 片段 ,这 种 小 片段 现在 常 称 为 内 崎 片段 。 标 记 时 间 延 长 , 冈 崎 片段 可 转变 为 成 熟 的 DNA 链 ; 因 此 它们 必然 是 复制 过 程 的 中 闻 产 物 。 按 照 这 个 结果 , Miki DNA 合成 至 少 在 一 条 链 上 是 不 连续 进行 的 。 以 复制 又 向 前 移动 的 方向 为 标准 ， 一 条 模板 链 是 3 一 5 方向， 称 为 前 导 链 (leading strand)。 原 则 上 在 前 导 链 上 ，DNA 合成 能 以 5 一 3' 方向 ( 指 新 合成 的 DNA ARH) BRAM 另 一 条 模板 链 上 新 生 的 DNA 也 是 从 子 一 3 合成。 但 是 相反 于 复制 又 前 进 的 方向 , 这 一 条 链 称 为 后 随 链 Clagging strand) ， 随 着 复制 叉 的 移动 ， 后 随 链 上 很 多 不 连续 的 DNA Fr 段 可 以 连接 起 来 成 为 一 条 完整 的 DNA H(A 4-10),

还 有 一 些 实验 证 明 , 复制 过 程 中 出 现 冈 崎 片段 , 例如 在 DNA 连接 酶 的 突变 株 中 积

= 下 EIS

YYY

图 4-10 ，” 半 不 连续 复制 的 示意 图 a) 前 导 链 瞎 续 合成 ; b) 后 随 链 上 不 连续 合成 ; “) 连接 成 完整 复制 链 。 累 冈 崎 片段 ,而 DNA 连接 酶 的 作用 是 在 DNA 模板 上 把 相 邻 二 个 片段 连接 起 来 。 因 此 这 个 实验 结果 表明 ,在 DNA 合成 过 程 中 确实 经 过 片段 连接 阶段 。 另 一 个 证 据 是 从 电镜 观察 得 到 的 ， 电 镜 技 术 可 以 区 别 DNA 双 链 和 单 链 , 因此 能 直接 看 到 复制 又 附近 的 一 些 情况 ,例如 在 噬菌体 T7 的 复制 中 间 物 的 电镜 照片 上 ,在 复制 又 的 一 边 是 双 链 , 另 一 边 是 单 链 ,或 一 段 很 短 的 双 链 ,这 种 情况 可 以 用 半 不 连续 复制 的 模式 来 解释 。 理论 上 ,前 导 链 DNA 合成 也 可 以 是 不 连续 的 。 由 于 .DNA 的 合成 酶 系 不 易 从 DNA 的 模板 上 解 离 , 因 此 实际 上 前 导 链 DNA 合成 总 是 连续 的 5 不 连续 的 前 导 链 DNA 合成 如 果 也 被 找到 ,也 只 能 看 作 是 这 个 一 般 规律 的 例外 情况 。 这 种 前 导 链 的 连续 复制 和 后 随 链 的 不 连续 复制 在 生物 界 是 有 普遍 性 的 ， 称 为 双 螺旋 的 半 不 连续 复制 。 有 很 多 因素 ,例如 模板 的 损伤 ， 复 制 蛋白 或 dNTP 供应 不 平衡 等 都 可 以 影响 前 导 链 的 连续 复制 ， 引 起 前 导 链 从 另 一 新 点 起 始 。

RNA 引物

目前 已 知 的 DNA 聚合 酶 都 只 能 延长 已 存在 DNA 链 ， 而 不 能 重新 合成 DNA 新 链 , 这 就 造成 了 一 个 理解 复制 机 制 的 重要 障碍 。 一 个 新 的 DNA 复制 怎样 才能 开始 ? 现 在 知道 ;在 'DNA 模板 上 先 合成 一 段 RNA 引物 ，DNA RAM RNA 引物 3 端 开始 合成 新 的 DNA 链 。 这 个 问题 开始 是 从 观察 利 福 霉 素 对 喉 菌 体 M13 复制 的 影响 得 到 局 发 的 ,因为 利 福 霉 素 是 RNA 聚合 酶 的 抑制 剂 ( 见 第 五 章 )。 为 了 证 实 RNA 是 DNA & 成 的 引物 ,用 了 不 少 实验 方法 ,从 各 个 角度 获得 证 据 :

(1) 标记 转移 ; 分 离 [c-”*P] dNTP SAW DNA 及 进行 碱 水 解 ,如 果 RNA 和 DNA 是 共 价 连接 的 , PP 应 出 现在 核糖 核 车 酸 中 。 在 一 些 体外 合成 系统 中 ,如 吻 菌 体 M13，dX 174 的 单 链 DNA 复制 成 双 链 DNA 时 发 现 是 这 种 情形 。

(2) 共 沉 降 : 在 DNA-RNA 变性 的 条 件 下 观察 标记 的 RNA BABS DNA 一 起 沉 降 。 用 鸣 菌 体 G4 做 的 实验 结果 证 明 RNA 和 DNA 是 共 价 连 在 一 起 的 。

(3) 密度 移动 : 在 用 碱 水 解 或 用 RNase 处 理 前 后 ,观察 DNA 在 CsCl 密度 梯度 离 心中 变化 的 情况 。 因为 RNA 的 密度 比 DNA 大 ， 因 此 带 有 RNA AY DNA 分 子 密度 也 要 大 些 。 体 内 合成 的 大 肠 杆菌 DNA 就 显示 这 种 密度 移动 。

(4) 在 氧 守 素 存 在 的 条 件 下 复制 出 来 的 质粒 ColEI DNA 分 子 包 含有 RNA 分 子 。

(5) RNA 共 价 连接 到 DNA Ai, PHS DNA AAS BBR a PL. Th RNA 对 碱 是 不 稳定 的 ,除去 RNA 后 产生 新 的 DNA 的 OH， 再 标记 上 去 的 磷酸 是 对

。114。

BFE Ao MK RGF ce SH RAY Dey BK MF PE

(6) 分 离 出 的 RNA 引物 经 常 只 能 杂交 到 双 链 DNA WARE, EM 2 和 TI7\I4 复制 中 可 看 到 这 种 例子 。

以 上 这 些 实验 结果 都 有 利于 说 明 RNA 引物 共 价 连 接 在 新 生 的 DNA 链 上 。 但 是 对 上 述 的 证 据 也 可 从 不 同 的 角度 提出 反对 意见 。 对 密度 迁移 实验 的 结果 现在 认为 是 不 可 靠 的 。 用 碱 处 理 在 DNA 分 子 上 产生 可 以 磷酸 化 的 S'OH 这 个 证 据 也 不 可 靠 。 因为 在 DNA 修复 系统 脱 喀 啶 的 DNA 链 对 碱 也 不 稳定 ,会 产生 5 OH 末端 。 企 图 直接 证 明 RNA 和 DNA 共 价 相连 ,困难 在 于 引物 RNA 的 量 极 微 ， 而 体内 其 他 的 RNA 极 丰 富 ， 混杂 痕迹 量 的 RNA 就 可 能 使 实验 结果 不 易 解释 。

ATRIA BHA RNA 引物 最 过 硬 的 证 明 是 用 多 瘤 病毒 完成 的 。 在 体外 核 系统 tH BRAY Pal is Hr BE 5 端 是 一 个 约 10 核 昔 酸 长 的 以 5 三 磷酸 为 结尾 的 RNA。RNA 的 顺 序 近 来 已 初步 了 解 。 表 4-2 列 出 了 几 种 生物 的 RNA 引物 长 度 及 其 主要 结构 。 RNA 5] 物 的 长 度 不 是 恒定 不 变 的 。 在 动物 细胞 中 引物 长 度 接近 10 核 背 酸 ， 第 一 个 核 音 酸 常 是 ATP， 引 物 RNA 的 起 始 和 终端 的 位 置 受 解 链 酶 〈helicase)、 引 发 酶 (primase), AAI

表 4-2 DNA 复制 时 RNA 引物 的 长 度 和 结构

基 因 组 RNA 引物 长 度 主 要 结 构

7 1 一 5 pppApCpC/A(pN)#-2 ae | ase pppApC(pN)s

大 肠 杆菌 1 一 3 ”未 测定

中 X174 i pppA.……-

SV40 一 10 pppA/G (pN)s

海胆 1 一 8 pppA/G (pN);

* C/A 表示 此 位 置 是 C 或 A, N: A 和 C 较 常见 。 序 及 其 二 级 结构 的 影响 。

引 发

DNA 复制 过 程 中 需要 合成 RNA 引物 ， 这 可 以 说 是 合成 后 随 链 的 普遍 规律 。 RNA 引物 的 合成 称 为 引发 。 引 发 是 一 个 十 分 复杂 的 过 程 s

现在 知道 大 肠 杆菌 DNA 的 复制 需要 多 种 蛋白 质 和 酶 的 协同 作用 , 其 中 的 不 少 蛋 白 质 都 与 引发 有 关 ( 见 表 4-1)。

由 于 大 肠 杆 菌 的 引发 机 制 过 于 复杂 ,人 们 首先 研究 了 大 肠 杆菌 噬菌体 的 引发 过 程 。 在 大 肠 杆 菌 中 ,噬菌体 M13 DNA 可 以 利用 细菌 本 身 的 RNA 聚合 酶 ， 首 先 在 M13 单 链 DNA 上 合成 一 小 段 RNA 引物 ,然后 在 DNA 聚合 酶 的 作用 下 , 以 M13 为 模板 延伸 新 生 的 DNA 链 ， 图 4-11 表示 M13 的 全 部 复制 过 程 。 在 有 利 福 平时 ， 这 种 单 链 MI3DNA 变 为 双 链 DNA 的 反应 就 完全 被 抑制 了 ,因为 利 福 平 可 以 抑制 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 活力 ( 见 第 五 章 )。

但 是 ,在 一 种 大 肠 杆菌 的 突变 株 中 ，M13 DNA 的 合成 不 受 利 福 平 的 抑制 。 此 外 , 单 BE X174 DNA 变 为 双 链 的 RF 型 也 完全 不 受 利 福 平 的 影响 ,因此 可 能 存在 一 种 以 前 未

4 23 <

认识 到 的 RNA 合成 系统 。 追 踪 的 结果 导致 了 引发 体 (primosome) 的 发 现 。 Cer HEHKBHA. WAP. SV40 和 淋巴 细胞 内 DNA 复制 时 都 要 靠 它 来 引发 。

图 4-12 是 由 X174 单 链 DNA 转变 为 双 链 复制 型 DNA wit. aie: I. Wal, 1, 438, Wl, HA, IV, SIA. Vy EM VI 切除 (缺口 填 满 和 连接 ), 其 中 引发 前 体 (preprimosome) 由 ny n’, n”, dna By dna C Mi 六 种 蛋白 质 组 成 ， 这 六 种 蛋白 质 都 已

5 PPP PP? PESORE BNA (-) 4 h Po \ 2 DNA RF4 allt Bg

人 了 ae DHA S PRHARA yom erp 聚合 mes 1, HER 全 图 4-11 M13 由 单 链 DNA 变 为 双 链 时 的 必要 过 程

Cr aan

三 --- 引 发 体

图 4-12 X174 DNA 由 单 链 转变 为 双 链 时 的 必要 步 遇

提纯 只 有 把 六 种 蛋白 质 合 在 一 起 并 与 引发 酶 〈primase) 进一步 组 装 成 引发 体 时 才能 发 挥 其 功效 。

引发 体 可 以 像 火 车 头 一 样 在 后 随 链 上 向 分 又 的 方向 前 进 ， 并 在 模板 上 断断续续 地 引 发 生成 后 随 链 的 引物 RNA “aE CA 4-13), dm B 蛋白 的 作用 就 在 于 识别 大 肠 杆 菌 DNA ,的 起 始 位 置 ,结合 在 两 条 链 上 并 以 5 一 3 方向 运动 (图 4-14)o

° 1166

链 的 延伸 -

前 面 讨论 DNA 复制 的 引发 机 制 时 已 经 讨论 到 DNA 链 的 延伸 问题 (图 4-12 一 图 4- 14)。 链 的 延伸 是 在 DNA 聚合 酶 催化 下 进行 的 , 它 可 以 在 引物 的 3 -OH 上 一 个 一 个 地 按 模板 要 求 延 伸 新 生 链 。 在 大 肠 杆 菌 中 发 现 有 三 个 DNA 聚合 酶 ， 按 发 现 先后 分 别 叫 Pol I, Pol I 和 Pol I, 在 体内 ，Pol II 是 延伸 DNA 的 主要 的 酶 ， 这 个 酶 的 缺陷 株

4_13 ”大肠 杆菌 双向 复制 的 示意 图

起 点 niitinnttitiittutttttu: 1) 在 起 点 解 旋 2) dnaB 蛋白 结合 5’ 3 7 =

RNA 引物

图 4-14 复制 时 两 个 分 又 的 双向 运动

e117 ¢

是 致死 的 ,而 PalI 和 Pol I 的 突变 株 则 是 能 存活 的 。 按 DNA 复制 的 速率 计算 , BR 有 Pol Il 能 满足 体内 复制 的 需要 。 关于 DNA 聚合 物 的 详细 性 质 见 第 二 节 。

链 的 终止

DNA 链 在 延长 阶段 结束 后 ,就 会 迅速 地 受到 酶 的 作用 ,切除 引物 RNA. 已 经 知道 ， RNase H 能 识别 DNA-RNA 杂交 链 并 水 解 杂 交 链 中 的 RNA。 但 RNaseH 不 能 完全 去 除 RNA， 很 可 能 在 生物 体内 引物 的 除去 要 由 DNA 聚合 酶 I 来 执行 ， 因 为 这 个 酶 具有 5 一 3 外 切 酶 的 功能 。 引 物 除去 后 所 留 下 的 空缺 靠 DNA RAMI 利用 四 种 脱氧 核 彰 三 磷酸 为 原料 按 模板 的 要 求 将 空缺 补 满 。

空缺 补 满 后 再 靠 DNA 连接 酶 将 相 邻 二 个 核 苷 酸 以 磷酸 二 reine DNA 的 复制 到 此 可 以 说 告 一 段落 。

环 状 双 链 DNA 双向 复制 中 有 一 个 问题 : 复制 在 什么 地 方 终止 ?

一 般 来 说 链 的 终止 不 需要 特定 的 信号 ， 也 不 需要 特殊 的 蛋白 质 来 参与 。 例 如 鸣 菌 体 1 就 没有 特定 的 终止 顺序 。2DNA 按 6 方式 复制 时 , 它 的 终止 点 和 起 始点 相差 180 。 如 果 删 去 一 些 非 必 需 区 域 或 者 插 人 一 些 无 关 的 片段 ， 这 就 改变 了 复制 起 始点 和 终止 点 的 相 对 距离 ,如 此 一 个 突变 株 的 终止 点 仍 在 起 始点 的 180? 位 置 ,而 不 是 在 原来 的 终止 点 上 。 这 个 实验 表明 在 ADNA 分 子 上 没有 特定 的 终止 点 。

但 是 在 不 对 称 复制 时 ， 一 个 复制 叉 怎么 会 在 复制 的 中 途 停 下 来 还 很 不 清楚 。 RK DNA 复制 是 如 何 结束 的 也 有 待 进 一 步 研究 。

复制 的 忠实 性

在 双 螺 旋 模型 提出 和 DNA 聚合 酶 I 发 现 后 ,很 多 人 认为 DNA Pr 了 ,现在 看 来 并 非 如 此 ，DNA 人 生物 体 为 什么 用 这 样 的 机 制 来 复制 DNA 呢 ? ”能 不 能 用 一 种 3' 一 5' 的 复制 酶 解决 双 螺旋 反 向 平行 问题 ? 在 生物 体内 这 个 重要 的 过 程 中 为 什么 表现 得 如 此 呆板 ,在 能 量 上 如 此 浪费 呢 》 其 实 这 一 套 复制 机 制 可 能 有 利于 复制 的 调控 和 复制 忠实 性 的 维持 ,对 前 一 点 我 们 了 解 不 多 ,对 后 二 点 人 们 已 有 初步 的 认识 ，DNA 复制 的 高 度 忠实 性 要 求生 物体 具有 如 此 的 机 制 。

大 肠 杆 菌 复制 10°—10° 碱 基 对 仅 有 一 个 误差 。 如 前 所 述 ，DNA 聚合 酶 要 求 有 引物 存在 ,而 且 引物 的 3'OH 未 端 必须 和 模板 正确 配对 。 如 果 模 板 引物 带 有 一 个 错 配 的 未 端 ， 那么 聚合 酶 将 应 用 它 的 3' 一 5' 外 切 酶 活力 切 去 错 配 的 碱 基 ， 这 个 反应 一 直 进 行 到 出 现 正 确 碱 基 配 对 的 未 端 为 止 。 如 果 聚 合 酶 有 选择 正确 碱 基 的 能 力 ,同时 又 有 独立 的 校对 功能 ， 就 可 以 保证 复制 的 高 度 忠实 性 。 从 化 学 角度 估计 碱 基 误 配 的 机 率 不 可 能 小 于 10-*， 在 这 种 情况 下 ， 至 少 要 有 一 个 校对 步骤 才能 使 误差 水 平 降 到 可 以 耐 受 的 水 平 (C107 x 107% 10"),

按照 这 个 观点 ，DNA 复制 机 制 中 的 一 些 现 条 就 都 可 以 得 到 合理 的 解释

(1) 为 什么 没有 一 个 DNA 聚合 酶 具有 开始 合成 新 的 核酸 链 的 能 力 而 必须 要 用 一 个 3' 端 配对 的 引物 来 开始 一 个 新 的 链 ?》 这 是 因为 自我 校对 的 功能 必须 要 使 DNA 聚合 酶 能 识别 未 端 是 否 正确 配对 ,而 另 一 方面 如 果 要 求 酶 在 没有 引物 的 情况 下 开始 新 链 合 成 ,而 又

¢ 118 ¢

EE RE es ee wa ee aa ea “ev Ge ee -vv

不 失去 对 碱 基 配 对 和 不 配对 的 3'OH 的 鉴别 ,这 是 目 相 矛 盾 的 。 为 了 保证 高 度 的 真实 性 ， 生物 体 就 选择 了 不 能 重新 开始 新 链 合 成 的 DNA 聚合 酶 来 复制 DNA。

(2) 为 什么 生物 体内 找 不 到 3 一 5 方向 的 聚合 酶 ? 如 果 DNA 链 是 3 一 5 AK, Il) 生长 中 的 链 5 端 带 有 活化 三 磷酸 , 这 使 得 聚合 的 误差 不 能 得 到 校正 ， 因 为 切 去 误 配 的 了 端 就 失去 进一步 合成 所 必须 的 高 能 键 , 除 非 生 物体 内 有 另 一 套 酶 系统 再 磷酸 化 5 端 ,而 这 在 能 量 利 用 上 就 不 经 济 了 。

(3) 为 什么 引物 都 是 用 RNA? 因为 RNA 引物 都 是 重新 开始 合成 的 , 它 错 配 的 可 能 性 大 ,用 RNA 做 引物 , 它 自 动 标志 这 一 般 核 彰 酸 是 必需 删 去 的 坏 拷贝 , 这 种 明显 的 区 别 在 进化 上 是 有 优越 性 的 。

小 结

|

综 上 所 述 ，DNA 的 复制 遵循 以 下 基本 法 则 :

(1) 复制 是 半 保 留 的 。

(2) 复制 起 始 于 细菌 或 病毒 的 特定 位 置 ， 真 核 生 物 有 多 处 起 始点 。 因 此 大 肠 杆 菌 复 制 一 代 约 需 20 分 钟 , 而 染色 体 DNA 比 大 肠 杆 菌 大 40 倍 的 果 蝇 只 要 3 分 钟 就 可 以 完成 其 DNA 的 复制 。

(3) 复制 可 以 是 单 向 的 ,也 可 以 是 双向 的 。 双 向 复制 的 速度 不 一 定 相同 。

(4) 复制 的 速度 取决 于 起 始 。 复 制 叉 前 进 的 速度 是 比较 恒定 的 ， 原 核 生物 每 分 钟 约 A) 10° 碱 基 对 , 真 核 生 物 在 5 X 10 一 5 X 10° 碱 基 对 。

(5) 复制 时 每 条 链 都 由 5 端 向 3 端 延 长 ,每 次 增加 一 个 核 苷 酸 。

(6) 复制 是 半 不 连续 的 。 在 前 导 链 上 是 连续 的 ， 在 后 随 链 上 是 不 连续 的 。 在 动物 细 胞 中 每 个 网 崎 片段 长 约 100 一 200 个 核 苷 酸 ， 在 原核 生物 中 每 小 段 长 约 1,000 一 2,000 个 核 苷 酸 。 这 些小 片段 再 由 DNA 连接 酶 连接 到 生长 中 的 长 链 上 去 。

@) 新 生 DNA 靠 RNA 来 起 始 。 这 一 小 段 作 为 引物 的 RNA 在 以 后 被 酶 切除 。 缺 口 由 DNA 补 满 并 与 生长 中 的 DNA 连 在 一 起 。

《8) 双向 复制 有 时 在 一 固定 的 位 置 结 束 。

(9) 即使 在 一 个 单 细 胞 中 ,复制 也 可 以 采用 不 同 的 方式 。

二 、DNA 聚合 酶 和 DNA 连接 酶

DNA 聚合 酶 是 指 以 脱氧 核 背 三 磷酸 作为 底 物 催化 合成 DNA 的 一 类 酶 ， 从 广泛 不 同 的 生物 ,包括 细菌 ,植物 ,动物 中 都 发 现 这 种 酶 , 所 有 DNA 聚合 酶 作用 方式 基本 相似 ， 它们 催化 脱氧 核 背 三 磷酸 加 到 复制 中 DNA 链 的 3 羟基 末端 。 合 成 方向 是 从 53’, KR 加 的 脱氧 核 背 酸 的 种 类 由 模板 DNA 决定 。 因此 DNA 聚合 酶 需要 的 条 件 包括 四 种 脱 氧 核 背 三 磷酸 , 镁 离子 ,模板 DNA 和 引物 。 还 没有 发 现 一 种 不 需 引 物 能 重新 合成 DNA FEA Bio

大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 1 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 1 是 1956 年 Kornberg 及 其 合作 者 发 现 的 第 一 个 DNA 聚

。 119。

ANS, Hct PR Kornberg 酶 。 在 各 种 DNA 聚合 酶 中 ,这 个 酶 是 研究 得 最 透彻 的 ， 它 的 一 些 特 点 代表 了 DNA 聚合 酶 的 基本 特点 ,以 下 对 这 个 酶 作 比较 详细 的 讨论 。

当 存 在 ATP、Mg'+ 时 ,大 肠 杆菌 的 无 细胞 提取 液 能 使 MC 脱氧 胸 背 变 成 酸 沉 淀 的 产 物 ;, 此 酸 沉 淀 物 用 脱氧 核糖 核酸 酶 作用 之 后 变 成 酸 不 沉淀 的 ,说 明 这 个 产物 具有 DNA 的 ， 性 质 。 以 后 用 标记 的 _dTTP 作为 底 物 , 以 酸 沉 淀 产 物 的 生成 作为 指标 ,已 把 DNA 聚合 BS I 纯化 到 相当 均一 的 水 平 。

用 比较 纯 的 酶 做 试验 发 现 , 为 了 得 到 比较 高 的 参 人 水 平 ， 除 了 变性 的 DNA 模板 和 Mgt 之 外 ,必须 有 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 同时 存在 ,缺少 任何 一 种 ， 参 人 的 水 平 将 大 大 降 - 低 。 脱 氧 核 苷 二 磷酸 不 能 代替 三 磷酸 , 用 纯 的 酶 制剂 可 以 计算 出 DNA .的 净 合 成 大 约 增

加 10 一 20 倍 , 因 此 90—95% BY DNA 是 新 合成 的 。 DNA 聚合 酶 I 还 包含 一 些 其 他 酶 活性 ,它们 是 整个 酶 分 子 的 组 成 部 分 。 其 中 三 个 外 切 酶 ,一 个 5 一 >3' 外 切 酶 ,一 个 3 一 5 外 切 酶 ,后 面 将 讨论 到 这 二 个 酶 活性 是 DNA 复制 过 程 中 所 必需 的 。

DNA 聚合 酶 [是 DNA 指导 的 DNA RAM. 但 是 新 合成 的 DNA 是 否 确实 是 在 模板 指导 下 进行 的 ? 下列 证 据 给 予 明确 的 回答 :

(1) 最 明确 的 证 据 是 这 个 酶 能 忠实 地 复制 噬菌体 X174DNA， Shee 核 昔 酸 连接 酶 环 化 以 后 具有 生物 感染 活力 。X174DNA 是 由 5386 个 核 昔 酸 构成 的 单 链 DNA, MER AEGAN DNA FIER DNA, CAHIR ee MH DNA。 正 链 DNA , 同 大 肠 杆菌 DNA RAH. DNA EA. AA = BR. NAD, Me* UR RRA FRE BIA (RCE, FREE HE NY | FEWER DNA, 它 的 性 质 同 天 然 的 复制 型 (REF) 完 全 一 样 。 如 果 用 S-ARAR (BrdU) 三 磷酸 代替 dTTP, 用 a-"P 代替 非 标记 的 dATP 合成 的 REF 分 子 中 的 负 链 (图 4-15A)。 因 为 含 Brd 总 的 负 链 密度 比 正 链 要 重 些 ， 并 带 有 同位 素 标记 。 在 每 个 RF 分 子 中 用 DNase 引信 一 个 切 口 , 再 热 变性 以 后 ,可 把 正 链 和 负 链 用 密度 梯度 离心 方法 分 开 。 完 全 新 合成 的 负 链 不 含 天 然 的 正 链 DNA (J 4-15B)。 这 个 DNA 能 感染 原生 质 体 , 复 制 出 新 的 病毒 颗粒 。 现在 再 用 完全 是 人 工 合成 的 带 Brd U 的 负 链 DNA 为 模板 ,用 正常 的 四 种 dNTP 合成 RF 分 子 。 分 开 正 链 负 链 之 后 ， 这 样 获得 的 正 链 具 有 天 然 _ %X174DNA 一 样 的 感染 力 。 而 且 理 化 性 质 也 完全 同 天 然 的 一 样 (图 4-15C)。 这 个 结果 表明 DNA RABE I 能 在 模板 DNA 指导 下 忠实 地 合成 新 的 .PNAs

(2) 用 DNA 聚合 酶 I 合成 的 新 DNA 样品 ,在 化 学 上 或 物理 化 学 上 的 性 质 都 同 模 板 DNA 一 样 ; 具 有 天 然 ` DNA 一 样 的 双 螺 旋 结 构 和 同样 的 分 子 融 点 ， 也 符合 AST. G=C 的 Chargaff 规则 。 用 碱 基 比 例 相差 很 大 的 DNA 作为 模板 ， 新 合成 DNA 的 碱 基 比 例 也 同 所 用 的 模板 完全 一 样 。 如 果 用 合成 的 多 聚 d(A-T) 作为 模板 ,即使 反应 混合 物 中 有 四 种 dNTP, th AA dATP 和 dTTP 参 人 到 产物 中 去 。

(3) 用 毗邻 分 析 的 方法 可 以 证 明 新 合成 的 DNA 的 顺序 同 模 板 是 完全 互补 的 DNA 聚合 酶 同 模板 和 所 有 四 种 脱氧 核糖 三 磷酸 一 起 保温 其 中 一 种 ， 璧 如 dATP 是 [c-2P] 标记 的 ,在 合成 反应 中 ,这 个 标记 的 磷酸 同 它 左边 相 邻 的 核 音 酸 (N) 结 合 。 用 脾 磷 酸 二 酯 酶 和 小 球菌 DNase 完全 水 解 以 后 产生 脱氧 核 苷 3' 磷酸 ,2?P 就 转移 到 N， 上 (N， 是 四 种 3 核 昔 酸 中 的 任何 一 种 )。 分 析 四 种 标记 的 核 苷 酸 的 含量 ,就 可 以 推 听 A 的 左 邻 d(ApA)、

”120。

fe-2P}dATP “ dCTP

dB rUTP

象 B 一 样 用 DNase 处 理 图 4-15 DNA 聚合 酶 的 实验 检查

d(CpA), d(TpA) 和 d(GpA) 在 整个 分 子 中 的 频率 ;同样 也 可 推断 其 他 各 种 二 核 背 酸 的 相对 频率 。 用 这 个 方法 可 以 证 实 新 合成 的 DNA 的 顺序 同 模板 DNA 的 顺序 是 互补 的 。

纯 的 DNA 聚合 酶 1 由 分 子 量 109,000 的 一 条 肽 链 构成 ， 每 个 大 肠 杆菌 细胞 内 大 约 @ 400 个 酶 分 子 。 用 枯草 杆菌 蛋白 酶 处 理 这 个 酶 ,获得 两 个 片 人 段 ,大 的 片段 分 子 量 76,000， 保留 聚合 酶 和 3 一 5 外 切 酶 活力 (被 叫 作 Klenow Be. S zt DNA 序列 分 析 ， 见 第 二 章 。)。 小 的 片段 分 子 量 34,000, 具有 5 一 3 外 切 酶 的 活力 。

DNA 聚合 酶 I 具有 多 种 酶 活力 。

C1) 在 引物 的 3 -OH 末端， 以 脱氧 核 背 三 磷酸 为 底 物 在 模板 指导 下 逐个 加 上 脱氧 BER. SRD HARI 1,000 个 单 核 苷 酸 。

(2) 在 没有 脱氧 核 背 三 磷酸 底 物 时 ,能 从 3 -OH 开始 以 3 一 5 方向 水 解 DNA， 产

«121 ¢

EES” 单 核 音 酸 。

(3) 从 5 一 3 方向 水 解 "DNA 链 ; 主 要 产生 5 BRM.

(4) 从 3 末端 焦 磷 酸 解 DNA 分 子 。

CS) 催化 脱氧 核糖 核 背 三 磷酸 的 末端 焦 磷 酸 同 无 机 焦 磷 酸 的 交换 反应 。

后 二 个 反应 是 聚合 反应 的 逆反 应 。 在 体内 这 二 个 反应 没有 重要 意义 。 因 为 它们 需要 高 浓度 的 无 机 焦 磷 酸 。

DNA‘ 聚合 酶 1 具有 3' 一 5 的 外 切 酶 活性 ， 这 个 外 切 酶 能 识别 和 消除 不 配对 的 引物 末端 。 当 模 板 和 引物 的 末端 错 配 时 ， 即 使 存在 四 种 脱氧 核 背 三 磷酸 ，DNA 聚合 酶 也 是 首先 除去 了 错 配 的 碱 基 , 然 后 才 进 行 聚合 反应 ,因此 3 一 5 外 切 酶 活力 能 够 校正 聚合 过 程 中 的 碱 基 错 配 。DNA 聚合 酶 I 的 3 一 5 外 切 酶 活力 是 聚合 酶 的 必要 组 成 部 分 。 如 有 果 没 有 这 种 活性 ，DNA 复制 的 忠实 性 将 大 大 降低 。 叹 菌 体 T4 的 一 种 突变 株 , 变 异 率 很 高 ， 逆转 率 也 高 ,这 说 明 DNA 复制 的 忠实 性 低 , 错 误 多 。 从 这 种 突变 株 得 到 的 T4 DNA FR 合 酶 , 3 一 5 的 外 切 酶 活力 也 低 ， 因 此 降低 了 DNA 的 复制 的 忠实 性 。 另 一 种 T4 突变 株 , 具 有 很 高 的 抗 变异 能 力 , 它 的 DNA RARE 3 一 5 外 切 酶 活力 比 野生 型 要 高 得 多 ， DNA 复制 的 真实 性 十 分 好 ,变异 率 很 低 。 这 个 实验 结果 表明 ，3 一 5 外 切 酶 的 校对 功能 对 DNA 复制 是 十 分 重要 的 。

DNA AH IBAA 5 一 3 外 切 酶 活性 ， 它 能 作用 于 DNA 的 碱 基 配 对 部 分 ， 从 5 端 释放 户 核 苷 酸 ( 图 4-16)。 它 也 能 跳 过 几 个 核 音 酸 起 作用 , 所 以 它 能 除去 紫外 光照 形 BRAY Ho PREM FE DNA 损伤 修复 中 它 也 可 能 起 重要 作用 《图 4-17)e 除去 冈 崎 片 Be 5’ 端的 RNA 引物 可 能 也 有 赖 于 这 个 外 切 酶 的 活性 。

Sat G

P

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Zz —A =t——, O

P 1P 一 一 一 一 一 一 一 ted]

Sieh ama oe en a

P 三 磷酸 位 置

an,

Al 4-16 DNA RAR I AY 5’ > 3’ 外 切 活 性

虽然 DNA 聚合 酶 1 能 延伸 DNA 链 , 图 4-18 表示 OX174 BL M13 可 以 被 Pol I 从 单 链 环 状 生 成 复制 形 产物 ， 但 是 ，DNA 聚合 酶 I 不 是 复制 大 肠 杆菌 染色 体 的 主要 聚 合 酶 ,因为 :

C1) 纯 的 酶 催化 核 苷 酸 参 人 的 速率 约 每 分 钟 1,000 个 核 昔 酸 ， 而 体内 实际 的 合成 速 率 要 比 这 个 速率 高 二 个 数量 级 。

(2) 大 肠 杆菌 有 一 种 突变 株 , 从 中 分 离 出 来 的 DNA RAM I 的 活性 是 正常 的 ， 但 染色 体 复制 是 不 正常 的 。

(3) 说 明 DNA 聚合 酶 I 不 是 大 肠 杆 菌 主要 的 复制 酶 的 最 有 力 的 证 据 是 分 离 到 一 个

“122。

4-17 DNA AREA | 工 删除 胸腺 喀 啶 双 体

突变 株 (PolA-)， 它 的 DNA RAR 1 的 活力 仅仅 是 野生 型 的 1 多 ， 但 它 的 复制 是 正常 的 。 这 个 突变 株 减低 了 冈 崎 片 眉 连 接 的 活力 ,增加 了 对 紫外 光 \ 烷 化 剂 和 离子 辐射 的 敏感 性 。 这 意味 着 DNA 聚合 酶 I 在 大 肠 杆菌 DNA 复制 中 不 是 主要 的 合成 酶 ,而 是 在 除去 RNA 引物 和 损伤 修复 中 起 作用 。

大 肠 杆菌 DNA Rss Il

纯化 的 DNA .聚合 酶 I 分 子 量 90,000 一 120,000,。 由 一 条 肽 链 构成 。 它 也 是 从 5 一 3 方向 合成 DNA， 达 到 最 大 活力 需要 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸 ，Mg“, NH+ 和 一 个 带 50 一 200 碱 基 对 缺口 的 双 链 DNA， 当 缺口 加 大 时 ,反应 速度 降低 ， 但 加 入 DNA 结合 蛋白 时 能 恢复 到 原来 的 活力 。 这 个 酶 也 需要 带 3'-OH 末端 的 引物 , 具有 3 一 5 的 外 切 酶 活性 ， 但 没有 5 一 3” 外 切 酶 活性 。 它 的 合成 速率 比 体内 的 速率 要 低 得 多 ， 带 有 这 个 酶 缺陷 的 大 肠 杆 菌 突 变 株 染色 体 的 复制 各 方面 都 正常 , 它 在 体内 的 功能 可 能 和 DNA RGM IB

* 123°

: 5 3 5) as 2 3'-> 5" x174 退火 re or —— M13 5 RAS

SS 3 5'->3’ 4 外 切 Threw eee ee

图 4-18 DNA RAB! E5|\HMEUH DNA 链 Ch Ri FAAS HD = FB HED

Wo

大 肠 杆 菌 DNA RSH Ill SHH

带 有 DNA RAMS MW 的 温度 敏感 突变 (pol C) 的 大 肠 杆 菌 在 限制 温度 是 不 能 存活 的 ,从 这 种 菌株 得 到 的 裂解 小 也 不 能 合成 DNA， 当 加 入 正常 细菌 的 DNA AAAS II 时 可 以 恢复 它 的 聚合 能 力 , 因 此 不 同 于 DNA 聚合 酶 I 和 I, RAM II 是 体内 DNA 复 制 所 必需 的 酶 。 虽然 每 个 大 肠 杆菌 只 含 10 个 DNA RAB II 分 子 ， 然 而 它 的 合成 速 率 达 到 了 体内 DNA 合成 的 速率 。 类 似 DNA RAR [, DNA RAB II 具有 3 一 5 和 5 一 3 的 外 菇 酶 活力 。

纯 的 DNA RAS II 不 能 利用 带 有 引物 的 长 的 单 链 DNA 作为 底 物 ,而 也 象 DNA 聚合 酶 贡 一样, 可 利用 带 缺 口 的 双 链 DNA 作为 底 物 ,但 是 KAD RAB I ATH 所 说 的 Pol IT) 能 利用 单 链 DNA 作为 模板 。

大 肠 杆菌 DNA RA Il 全 酶 由 多 种 亚 基 组 成 ,这 些 亚 基 很 容易 解 离 , 而 且 在 每 个 大 肠 杆菌 中 只 有 10 到 20 个 酶 分 子 ， 因 此 不 易 获 得 均一 的 纯 酶 。 仅 在 不 久 前 才 对 其 性 质 有 一 定 了 解 。 但 每 一 组 分 起 什么 作用 还 不 十 分 清楚 。 在 DNA Pol III 全 酶 中 , 由 c\ss6 三 种 亚 基 组 成 全 酶 的 核心 部 分 Pol IE) ， 但 此 核心 只 有 很 低 的 酶 促 活性 ， 加 上 + WH 后 ,组 成 的 Pol II 就 可 以 利用 长 的 单 链 DNA 为 模板 了 。 但 Pol II 在 SSB 包围 了 单 链 DNA 模板 后 就 完全 不 能 表现 出 酶 活性 来 ,因此 各 个 亚 基 都 有 一 定 用 处 。 Pol Ill, Pol II 和 Pol II* 都 是 不 完整 的 Pol III SR WR 4-3, 参 阅 表 4-1)( 第 105 页 )。 Pol I 全 酶 由 工 个 < 亚 基 、1 个 se 2 个 81 个 r\ 2 个 yY\、 1 个 5 和 1 个 6 共 九 个 亚 基 组 成

在 复制 时 DNA Rahs II 全 酶 十 分 重要 , 它 可 以 在 DNA 的 单 链 模板 上 ， 在 引物 的 3'OH 上 以 每 分 钟 约 60,000 个 核 背 酸 的 速率 逐个 延长 新 生 的 DNA 链 。 三 种 酶 的 性 质 比 较 见 表 4-4e

。124。

4-3 DNA RES Ill 全 酶 的 组 成

了 人 FH x 10° 其 他 名 称

a 140 dnaE 蛋白 ，pol CHA + 25 Poy Ul

6 10 Pol III’ Tt

83 Pol III* 到 52

6 32

dnaZ 蛋白 AF Ul, dna X BA

因子 I,dnaN A, copol III*

js= II

8 37

R44 三 种 大 肠 杆 菌 DNA 聚合 酶 性 质 的 比较

Pol I Pol II Pol III

功能 : S'>3' RA + + + 3 一 5 外 切 十 + ， 于 ->3 ”外 切 十 一 十 焦 磷 酸化 和 PPi 交换 十 十 模板 -引物 : 完整 双 链 一 一 一 有 引物 的 单 链 ~ 一 = 有 断口 的 双 链 (多 聚 dAT) ~ 一 = 有 缺口 的 双 链 或 5” 端 突出 的 单 链 : BREE <100 KER + + + MeER>100 BEE 十 二 = 分 子 量 X1000 109 120 140 每 个 菌 体 中 的 分 子 数 (估计 值 ) 400 10—20 结构 基因 polA pol B polC

真 核 生 物 中 的 DNA ROB

所 有 责 核 生物 中 的 聚合 酶 的 性 质 基本 上 同 大 肠 杆 菌 中 的 聚合 酶 相似 ， 它 的 活性 有 赖 于 模板 , 带 3-OH 的 引物 ,四 种 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 。 动 物 细胞 的 DNA 聚合 酶 活性 分 布 在 好 几 个 细胞 级 分 中 ,但 至 今 只 对 可 溶性 的 DNA 聚合 酶 研究 得 比较 多 。 DNA 聚合 酶 在 迅速 增殖 的 细胞 中 活力 最 高 。 这 个 酶 的 分 子 量 在 165,000—175,000 之 间 。 它 的 最 合适 的 底 物 是 带 缺 口 的 双 链 DNA， 但 是 带 引 物 的 变性 DNA 也 是 很 好 的 底 物 。 它 同 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 最 大 不 同 之 处 在 于 不 含 外 切 酶 活性 。

DNA 聚合 酶 p 是 一 个 小 分 子 量 (43,000) 的 聚合 酶 。 在 整个 细胞 周期 中 它 的 活力 没 有 变化 , 它 利用 DNase I 处 理 过 的 天 然 DNA 作 模 板 , 对 变性 的 DNA 几乎 没有 活力 ,这 个 酶 也 没有 外 切 酶 的 活力 。

DNA 聚合 酶 > 是 一 个 大 分 子 酶 ,在 细胞 内 含量 很 低 , 因此 不 容易 纯化 。 这 个 酶 可 以 使 用 带 缺 口 的 DNA 作为 底 物 ,但 用 多 聚 (A): BK (dT) 作为 底 物 ， 酶 活力 更 高 ， 因此 象 是 一 个 反 向 转录 酶 。

DNA RAK c 可 能 是 真 核 生 物 的 复制 酶 ,主要 的 根据 是 聚合 酶 “ 的 活性 随 细胞 周期

. 125 .

Mek EME lh, RAR HEM DNA 合成 的 周期 是 一 致 的 。 而 聚合 酶 f 的 活力 升 高 要 滞后 一 段 时 间 , 在 HeLa 细胞 中 ,聚合 酶 的 活力 从 G 期 开始 升 高 10 倍 :一 ELS 期 结束 , 酶 活力 也 降低 ,而 聚合 酶 8 在 整个 过 程 中 没有 变化 。

DNA 连接 酶

DNA 连接 酶 催化 一 个 DNA 链 的 5 磷酸 根 与 另 一 个 DNA 链 的 3 羟基 形成 磷酸 二 酯 键 ， 但 是 这 二 个 链 必需 都 与 同一 个 互补 链 结合 ， 二 个 链 必须 是 相 邻 近 的 。 连 接 所 需 的 能 量 或 来 自 NAD+ (如 大 肠 杆 菌 ) 或 ATP (如 T4 诱导 的 连接 酶 和 动物 细胞 中 的 连接 Be). T4 诱导 的 连接 酶 不 仅 能 在 模板 上 连接 DNA 和 DNA 之 间 的 切口 ， 也 能 连接 RNA—RNA, RNA—DNA, #1 DNA—RNA ZVIHIWWH. 大 肠 杆菌 连接 酶 只 能 连接 DNA 和 RNA 一 DNA 之 间 的 切口 。IT4DNA 连接 酶 不 仅 能 连接 双 链 DNA 中 的 单 链 切 口 或 双 链 的 粘性 未 端 ， 而 且 能 连接 无 单 链 粘性 未 端的 平头 双 链 DNA， 大 肠 杆 兰 连接 酶 则 不 行 。 酶 的 反应 机 制 是 ATP( 或 NAD*) 先 与 酶 连接 成 共 价 中 间 体 E-AMP。E-AMP 和 产物 形成 高 能 的 焦 磷酸 键 Ap-p-DNA， 这 个 中 间 体 和 相 邻 的 DNA 的 3 -OH 结合 成 磷酸 二 酯 键 ( 见 第 十 章 )。

DNA 连接 酶 在 DNA 复制 重组、 修复 中 的 作用 是 明显 的 ,缺陷 DNA 连接 酶 的 大 肠 杆 菌 突变 株 中 冈 崎 片段 积累 ， 对 紫外 光敏 感性 增加 ， 每 个 大 肠 杆菌 约 有 300 SERS 33 ¥ » 30°C 每 分 钟 能 连接 7,500 个 切口 而 在 实际 过 程 中 , 每 分 钟 大 约 只 有 .200 切口 需 要 连接 ,因此 连接 酶 的 含量 对 DNA 复制 而 言 是 足够 的 。

三 、DNA 双 螺 旋 的 解 开

DNA 是 双 螺 旋 ， 在 复制 中 双 螺 旋 要 解 开 ,而 螺旋 的 解 开 使 得 复制 叉 前 面 产 生 正 超 螺 旋 , 如 果 这 些 应 力 不 以 某 种 方式 释放 将 妨碍 复制 又 前 进 ; 如 果 让 这 些 超 螺旋 传 到 分 子 未 端 Ai NABH aia, DNA 分 子 必须 每 分 钟 要 转 20,000 转 左 右 。 而 且 环 状 分 子 还 不 能 以 这 个 方式 释放 正 的 超 螺旋 ， 除 非 分 子 内 有 一 个 切口 使 链 可 以 自由 转动 。 现 在 已 找 到 一 些 酶 和 蛋白 质 ， 它 们 或 者 能 使 DNA 双 链 变 得 易于 解 开 , 或 者 可 以 使 超 螺旋 分 子 松 弛 ,以 下 将 介绍 一 些 这 类 蛋 白 。

单 链 结合 蛋白 〈single-strand binding protein， 人 简称 SSB)

最 初 发 现 史 菌 体 T4 的 基因 32 蛋白 可 以 在 远 低 于 Tu 的 温度 下 使 双 链 DNA HF, 并 牢 牢 地 结合 在 单 链 DNA 上 ,后 来 发 现 多 种 生物 中 都 有 这 类 蛋白 。 在 文献 中 ， 这 类 和 蛋 白 曾 使 用 过 多 种 名 称 ; 解 旋 蛋白 Cunwinding protein)、 熔 化 蛋白 (melting protein)， 螺 旋 降 稳 蛋 白 helix destabilizing protein),

从 原核 生物 得 到 的 SSB 与 DNA 结合 时 表现 出 协同 效应 〈 图 4-19)。 比如 第 一 个 SSB 结合 到 DNA 上 去 的 能 力 为 1 第 二 个 SSB 结合 能 力 高 达 10?, 这 可 能 由 于 蛋白 质 和 蛋白 质 之 间 的 互相 作用 增强 了 结合 能 力 , 也 可 能 由 于 第 一 个 SSB 的 结合 使 DNA 链 的 结 构 发 生 了 变化 ;有 利于 后 来 的 SSB 与 DNA 相 结合 , 极 有 可 能 二 者 兼 而 有 之 。

从 真 核 生物 如 牛 、 鼠 和 人 细胞 中 得 到 的 SSB SR DNA 结合 时 没有 表现 出 协同

es {26.6

RARE me

图 4-19 原核 生物 单 链 结合 蛋白 的 协同 作用

效应 。

SSB 能 刺激 同 源 的 DNA 聚合 酶 活力 。 如 T4 的 基因 32 蛋白 能 刺激 T4DNA FR 合 酶 的 活力 ,但 不 能 刺激 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 的 活力 ,反之 亦 然 。

SSB 能 使 天 然 DNA 的 融 点 降低 ,这 可 能 不 是 它 在 体内 的 唯一 生物 功能 。 单 链 DNA 与 SSB 结合 之 后 能 抵抗 核酸 水 解 酶 的 作用 。 如 大 肠 杆菌 SSB 能 保护 单 链 DNA 不 受 脱氧 核糖 核酸 酶 .蛇毒 磷酸 二 酯 酶 、S' 核酸 酶 、 红 色 链 胞 霉 内 切 酶 以 及 DNA RA I 和 II 的 3 一 5 外 切 酶 的 降解 ， 但 对 小 球菌 核酸 酶 、 大 肠 杆菌 外 切 酶 I 仍然 敏感 ， 因 此 SSB 的 另 一 个 重要 生物 功能 可 能 就 在 于 保护 复制 中 的 DNA 单 链 部 分 不 被 核酸 酶 降解 。

真 核 生物 的 SSB 和 原核 生物 的 SSB 可 能 有 些 不 同 ， 原 核 的 SSB 同 双 链 DNA 结 合 的 能 力 很 弱 , 而 真 核 的 SSB 有 一 定 结合 能 力 ; 原 核 的 SSB 能 促使 变性 DNA 复 性 , 而 HRN SSB 没有 这 种 能 力 。 因 此 原核 SSB 的 作用 方式 是 它 先 结合 已 存在 的 单 链 区 ， 并 从 此 侵蚀 双 链 部 分 ,而 真 核 的 SSB 是 先 结合 DNA 双 链 并 使 之 融化 (图 4-20)。

二 a ar 人 白 ， co

Al4-20 BHAAER AN Rh

DNA 解 链 酶 (DNA helicase)

有 一 类 能 通过 水 解 ATP ARGS SEER IT GE DNA 的 酶 称 为 DNA 解 链 酶 。 表 4-5 列 出 了 这 些 酶 的 部 分 性 质 。 解 链 酶 分 解 ATP 的 活力 依赖 于 单 链 DNA 的 存在 。 如 果 双 链 DNA PA MEER

e127»

R45 解 链 酶 的 性 质

解 链 酶 来 源 Fmx1000) BRE | 方 向 酶 分 子 数 /细胞 功能 ABFA I 180 十 _ 53’ 600 KA ; fill ABH U = 5-53 6000 (和 Led 5 大 肠 杆菌 III + 5’ 3’ 20 未 知 大 肠 杆 菌 rep 十 3’->5’ 50 (ox174' M13) 大 肠 杆 菌 引 发 体 (n“, dna B) 十 5 一 3 20 引发 大 肠 杆 菌 rec BC 重组 大 肠 杆菌 rec A 2000 重组 T4 基因 41 5 ->3 引发 T4 dda = 6000 未 知 T7 基因 4 十 5 -3 引发 人 细胞 5 ->3 未 知

端 或 缺口 , 则 DNA 解 链 酶 可 以 首先 结合 在 这 一 部 分 ， 然 后 逐步 向 双 链 方向 移动 。 复制 时 大 部 分 DNA 解 链 酶 可 以 沿 着 后 随 链 模板 的 5 一 3' 方向 随 着 复制 叉 的 前 进而 移动 ; 只 有 rep 蛋白 是 沿 前 导 链 模板 的 3' 一 5 方向 移动 。 因此 在 复制 时 很 可 能 rep 蛋白 和 某 种

人 | wamn ns

图 4-21 解 链 蛋 白 和 rep 蛋白 的 协同 作用

DNA 解 链 酶 分 别 在 DNA 的 两 条 母 链 上 协同 作用 ， 以 解 开 双 链 DNA (图 4-21)。

已 经 发 现 ,有 些 DNA 解 链 酶 同时 还 有 引发 酶 的 功能 ， 例 如 喉 菌 体 T7 的 基因 4 蛋 白 可 以 优先 与 单 链 DNA 结合 ,并 在 母 链 的 5 一 3 方向 靠 水 解 NTP 而 移动 并 解 开 双 链 ， 直到 DNA 母 链 的 某 一 专 一 识别 位 置 , 这 时 它 就 可 以 按 模板 的 要 求 而 合成 小 片段 的 RNA 作为 后 随 链 的 引物 ,比较 多 的 引物 链 是 pppACCC 或 pppACCA (图 4-22)。

s NOP+P; ? i Coe 3 ap, / T7DNAKXAKB-—— CCCAG LLL : 2 _— a 3

4-22 17 基因 4 蛋白 的 解 链 作用 和 引发 作用

拓扑 异 构 酶 I (type [ topoisomerase， 简 称 Topo 1) 最 初 从 大 肠 杆菌 中 分 离 到 一 种 酶 叫 吕 蛋白 , 它 可 以 将 共 价 闭环 状 的 超 螺旋 DNA 变

sa 128 。

为 松弛 态 ,而 并 不 改变 其 化 学 组 成 或 结构 。 由 于 反应 的 产物 还 是 闭环 状 DNA, 因此 酶 反 应 的 机 制 只 能 是 先 切 开 双 链 DNA 中 的 一 条 链 , 使 链 的 末端 沿 螺旋 轴 按 拧 松 超 螺 旋 的 方 向 转动 ,然后 再 把 切口 封 起 来 。 后 来 发 现 这 种 酶 广泛 存在 于 各 种 生物 中 ,不 同学 者 曾 分 别 给 以 各 种 命名 :， 转轴 酶 〈swivelase) ， 松 旋 酶 Cuntwisting enzyme), DNA 松弛 酶 CDNA relaxing enzyme)， 切 割 封 口 酶 (nicking-Closing enzyme)

Topo | 酶 松弛 超 螺旋 DNA 时 不 需要 ATP， 它 可 以 催化 三 种 拓扑 转换 反应 〈 图 4- 2 3 站

图 4-23 “拓扑 异 构 酶 工 的 作用 Topo | 酶 在 复制 中 的 作用 还 不 十 分 清楚 , 某 一 大 肠 杆 菌 的 突变 株 是 没有 Topo I 酶 基 因 的 ,但 它 的 生长 速度 只 比 正 常 细菌 稍稍 慢 一 点 ,因此 它 并 不 是 细菌 生长 必 不 可 少 的 酶

拓扑 异 构 酶 IL (type II topoisomerase, (2K Topo IL)

拓扑 异 构 酶 I 又 称 DNA 旋转 酶 (DNA gyrase) 或 紧 旋 拓扑 异 构 酶 (twisting to- poisomerase)。 它 由 两 个 & 亚 基 和 两 个 8 WHAM,

拓扑 异 构 酶 工 可 以 在 水 解 ATP 的 同时 使 松弛 态 环 状 DNA 转变 为 负 超 螺旋 DNA， 其 反应 机 制 不 同 于 拓扑 异 构 酶 1, 每 次 引起 的 超 螺旋 数 变化 为 2( 见 图 4-24)。 这 种 反应 说 明 拓 扑 异 构 酶 I 每 次 能 使 DNA 的 两 条 链 同 时 切断 ,让 另 一 条 双 链 DNA Sitio, 再 将 已 切断 的 末端 重新 封 接 起 来 ,其 反应 过 程 可 参考 图 4-25。

图 4-24 拓扑 异 构 酶 U 的 符号 变换 反应

2

—__ WT IDNA RHE 图 4-25 ”拓扑 异 构 酶 U 的 作用 机 制 拓扑 异 构 酶 不 能 非常 专 一 地 识别 DNA 的 顺序 ,但 常见 的 结构 是 c’—-TATYGNTN by My! oe

pp wee) Or ov ae i, A TAY GaN A Ny NAS’,

在 加 工 过 程 中 ,两 条 链 也 不 是 平头 的 (临时 切断 处 用 箭头 表示 ), 两 条 链 之 间 相 差 四 个 核 昔 酸 。

SV40 单 体

图 4-26 Topo II 的 功能 示意 图

垂直 箭 号 表示 在 Topo II 作用 下 ,逐渐 拓扑 异 构 化 过 程 ; 横向 箭 号 表示 DNA 合成 ;最 后 得 到 二 个 分 开 的 超 螺旋 单 体 。

Topo Il 在 没有 ATP 时 ,可 使 超 螺 旋 DNA 变 为 松弛 态 。 Topo Il 广泛 存在 于 各 种 生物 中 , 其 功能 十 分 重要 ， 它 是 完成 复制 所 必须 的 一 种 酶 ，

s。 130°

至 少 可 以 使 完成 了 复制 的 两 个 子 代 环 状 双 链 DNA 互相 分 开 。 图 .4-26 表示 SV40 DNA 在 Topo I 作用 下 的 复制 与 子 代 DNA 的 分 开 。

四 、 真 核 生 物 DNA 的 复制

真 核 生 物 的 DNA 比 原核 的 大 得 多 ,而 且 都 和 组 蛋白 一 起 构成 核 小 体 。 因此 真 核 生 物 DNA 的 复制 有 一 些 原 核 生 物 所 没有 的 特点 。

核 小 体 和 染色 体

真 核 生 物 的 DNA 通常 总 与 许多 蛋白 结合 在 一 起 ,以 染色 质 的 形式 存在 于 细胞 核 中 ， 在 染色 质 中 组 蛋白 的 重量 约 占 一 半 左 右 。 组 蛋白 的 组 成 和 结构 都 是 非常 保守 的 ， 几 乎 所 有 的 真 核 生物 中 都 可 以 找到 五 种 组 蛋白 : Bl HI, H2A, H2B, H3 和 H4, 它们 在 不 同 的 生物 和 不 同 的 器 官 中 都 有 十 分 相似 的 氨基 酸 排 列 顺序 。 其 中 H4 特别 保守 , 牛 、 鼠 和 猪 的 H4 性 质 完全 相同 ,其 结构 与 殉 豆 的 H+ 相 比 也 只 有 两 个 氨基 酸 不 同 : MARAF 亮 氨 酸 所 取代 , 赖 氨 酸 为 精 氨 酸 所 取代 。

染色 质 是 由 核 小 体 串 连 而 成 的 。 在 第 二 章 已 经 介绍 过 ， 核 小 体 结构 的 发 现 是 近年 来 生物 化 学 中 很 重要 的 进展 之 一 ，A. Klug 博士 为 此 获得 了 1982 年 的 诺 贝 尔 奖 。

染色 质 中 DNA 接头 区 是 十 分 柔软 的 , 因此 可 以 人 允许 串珠 状 的 染色 质 按 某 种 方式 进 一 步 绕 。

细胞 核 内 的 染色 质 非 常 细 , 只 有 在 电子 显微镜 下 才能 看 到 。 但 是 到 了 细胞 分 裂 期 ,在 核 内 的 染色 质 会 发 生 形态 和 结构 的 重大 变化 ,形成 高 度 紧密 的 染色 体 〈 图 4-27)。 经 碱 性 染料 染色 后 ,即使 在 光学 显微镜 下 也 可 以 看 到 染色 体 的 棒状 小 体 。

os ne ee ee A ae

Al4-27 ”人 染色 体 12 的 电子 显微镜 照片 染色 体 以 两 根 平 行 的 染色 丝 〈chromonema)- 为 主体 ， 其 中 有 一 个 不 易 染 色 的 小 颗粒 叫 着 丝 点 〈centromere)。 整个 染色 体 由 一 条 连续 的 双 链 DNA 贯穿 着 , 即使 在 着 丝 点 也

不 断 。 动 物 细胞 每 条 染色 体 中 DNA 的 长 度 不 一 ， 长 的 可 达 4 厘米 左右 ,其 分 子 量 约 为 80 x 10’,

各 种 生物 的 细胞 核 中 染色 体 的 数目 是 不 同 的 。 人 的 细胞 核 中 共有 16 条 染色 体 , 其 中

两 条 是 性 染色 体 , 人 的 染色 体 DNA 长 度 约 为 1.6 厘米 到 8.2 厘米 《相当 于 分 子 量 3.2 X 10’—160 X 10’),

细胞 周期 和 复制 起 始

真 核 细 胞 的 生命 周期 可 以 分 为 四 个 时 期 : Gi. S. G. #1 M， 如 图 4-28 所 示 。 这 四 个 时 期 所 经 历 的 时 间 明 显 不 同 ,动物 细胞 组 织 培养 时 SG. 和 M 期 的 三 段 时 间 是 相对 稳定 的 。S 期 即 DNA 复制 的 时 间 约 为 7 小 时 ，G， 期 即 有 丝 分 裂 前 的 准备 期 约 为 4 小 时 ,有 丝 分 裂 过程 为 1 小 时 ,而 G. 期 所 需要 的 时 间 较 长 并 有 很 大 的 变动 范围 ， 一 般 在 12 小 时 以 上 ,但 也 有 短 的 ,例如 酵母 菌 可 以 在 1.4 小 时 内 繁殖 一 代 。

在 分 化 的 细胞 中 ，G: 期 可 以 进行 DNA 复制 前 准备 ,而 在 非 分 化 的 细胞 中 , 可 以 存 在 一 个 性 质 上 完全 不 同 的 Go 期 ， 这 时 细胞 处 于 静止 状态 ， 成 年 组 织 大 部 分 细胞 都 处 于 Gy Ho

从 Gu 转 为 G: 的 关键 反应 是 什么 目前 还 不 清楚 ,但 有 些 化 合 物 如 Ap\A《 见 第 九 章 第 五 节 ) 可 以 明显 地 促进 细胞 由 G 期 转 人 G 期 。G, 期 对 细胞 的 生长 周期 是 非常 重要 的 。

真 核 生物 染色 质 的 复制 与 原核 生物 DNA 的 复制 有 三 个 明显 的 不 同 之 处 : 〈1) 真 核 生物 每 条 染色 质 上 可 以 有 多 处 起 始点 ,而 原核 生物 总 是 只 有 一 个 起 始点 ; 〈2) 真 核 生物 的 染色 体 在 全 部 复制 完成 之 前 ， 各 个 起 始点 上 DNA 的 复制 不 能 再 开始 , 而 在 快速 生长 的

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大 es . 4 o ~ wow “ 进 和 DNA Bl

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小 时

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图 4-28 真 核 细胞 的 生长 周期 。132。

原核 生物 中 ,在 起 始点 上 可 以 连续 地 开始 新 的 DNA 复制 ; (BRAM DNA 复制 起 始 点 并 不 固定 在 某 一 DNA 顺序 处 ,在 酵母 基因 组 的 400 多 处 有 一 种 自发 复制 顺序 ars(au- tonomous replicating sequence)， 这 种 顺序 广泛 存在 于 线粒体 中 ,但 在 大 肠 杆 菌 中 却 是 找 不 到 的 。

DNA 复制 单元 或 复制 子 (DNA replication unit 或 replicon)

如 上 记述, 原核 生物 如 大 肠 杆 菌 DNA 复制 时 只 有 一 个 复制 起 始点 ,然而 在 真 核 DNA 的 复制 时 有 多 个 复制 起 始点 。 在 哺乳 动物 复制 中 的 DNA 放射 自 显影 图 上 可 以 看 到 很 多 复制 眼 , 每 个 复制 眼 都 有 独立 的 起 点 。 双 向 延长 〈 见 图 4-6 IID)。 每 一 个 这 样 的 DNA 单位 称 为 复制 单元 。 复 制 单 元 大 小 是 不 均一 的 ,大 约 15 一 300wm(45 一 900kb),， 大 多 数 在 10—100um 之 间 。 各 种 不 同 的 生物 其 复制 单元 的 大 小 有 区 别 ， 就 是 同一 种 生物 在 不 同 的 生长 条 件 下 复制 单元 的 大 小 也 有 区 别 , 同 一 个 DNA 上 不 同 的 复制 单元 大 小 也 不 均一 , 生 长 比较 快 的 细胞 ,复制 单元 也 短 一 些 。 另 外 病毒 感染 也 影响 复制 单元 大 小 ,例如 SV40 转 化 的 中 国 田 鼠 细胞 的 起 始 间 隔 就 比 未 转化 的 要 小 。 如 果 用 SV40 的 工 抗原 温度 突变 株 转 化 的 细胞 ,在 允许 温度 复制 单元 要 短 些 ， 而 在 限制 温度 复制 单元 的 大 小 恢复 到 正常 ,这 些 实验 都 指出 ， 复 制 单 元 的 大 小 受 功能 方面 的 因素 影响 。

另 一 方面 ,有些 工 作者 认为 复制 单元 的 大 小 可 能 受 染 色 体 的 结构 控制 ,在 果 蝇 的 多 线 染色 体 中 ,一 个 横 带 所 含 的 DNA 就 是 一 个 复制 单元 。

几 个 邻近 复制 单元 可 能 组 成 复制 单元 簇 ， 复 制 单元 簇 可 以 由 少 至 二 个 复制 单元 多 达 250 个 复制 单元 构成 。 复 制 单元 簇 是 受 协同 调节 的 ,不 同 的 复制 单元 往 在 开始 复制 的 时 间 上 有 先后 ， 同 一 复制 单元 簇 各 个 复制 单元 基本 是 同步 的 ， 若 用 射线 或 抑制 剂 抑制 DNA 合成 的 起 始 , 则 同一 复制 单元 簇 呈 协同 一 致 的 反应 。

染色 体 的 合成

在 真 核 生 物 DNA 复制 的 同时 组 蛋白 也 在 不 断 产生 ,因此 新 生成 的 DNA 可 以 很 快 地 与 组 蛋白 结合 在 一 起 。

在 染色 体 复制 过 程 中 亲 代 组 蛋白 是 同 新 合成 的 组 蛋白 打 乱 重新 组 合 分 配 到 子 代 中 ， 还 是 亲 代 组 蛋白 作为 一 个 整体 传 下 去 ? 用 鸡 肌 母 细胞 作为 材料 , ACH] MAR “CK 5N 氮 基 酸 标 记 染 色 体 ,从 这 种 细胞 中 分 离 核 小 体 , 每 个 核 小 体 中 的 组 蛋白 用 化 学 方法 交 AR DNA 后 分 析 交 联 的 组 蛋白 密度 , 尽管 新 合成 的 组 蛋白 仅 占 总 组 蛋白 七 分 之 一 ， 然而 所 有 新 合成 的 组 蛋白 都 含有 标记 同位 素 ， 这 表明 新 合成 的 组 蛋白 和 老 的 组 蛋白 是 不 混杂 的 。 这 个 实验 证 明 核 小 体 复 制 进程 中 , DNA 复制 是 半 保 留 的 ,而 组 蛋白 却 以 全 保留 的 方式 传 给 子 代 。

五 、DNA 复制 的 调控

分 子 生 物 学 家 们 并 不 满足 于 对 DNA 复制 过 程 的 观察 和 描述 , 而 是 希望 了 解 复 制 过 程 中 各 种 酶 和 和 蛋白质 的 作用 ，, 它们 与 DNA 的 关系 以 及 复制 是 怎样 受到 调节 和 控制 的 。 现 以 1DNA 为 例 来 说 明 原 核 生物 中 DNA 复制 是 怎样 调节 的 。

«133°

Wi ead A A 以 及 其 他 若干 种 温和 叹 菌 体 是 非常 令 人 感 兴趣 的 , 它们 的 DNA 不 但 可 以 自主 地 进行 复制 ;也 可 以 转变 为 溶 原状 态 ， 即 插 和 人 到 大 肠 杆菌 的 染色 体 中 ,从 而 与 寄主 处 于 共生 的 潜伏 状态 ,这 时 1 DNA 的 基因 都 不 积极 活动 〈 见 第 二 章 )。 因 此 这 类 温和 鸣 菌 体 成 为 我 们 了 解 原核 生物 中 DNA 复制 调控 过 程 的 良好 实验 材料 。

MRK. 是 一 个 带 有 长 尾 的 20 面体 ， 头 部 蛋白 外 壳 中 含 48Kb 长 的 一 条 DNA。 4 DNA 线 状 分 子 两 端 有 12 个 核 音 酸 长 度 的 粘性 末端 (图 4-29)。

3 ad

GCGCCCA cccGccGcTcGA 。 GGGCGGCGACCT 了 GTTAcG 5 =" .

3

粘性 末端 |

4-29 ADNA 的 粘性 未 端

Mak. 遇 到 大 肠 杆 菌 后 ,其 尾部 的 三 个 蛋白 分 子 (为 1 DNA 中 丁 基因 所 编码 ) 可 以 专 一 地 识别 寄主 的 菌 壁 。 鸣 菌 体 将 其 DNA 注 人 大 肠 杆菌 后 , 线 状 的 1 DNA 分 子 立刻 靠 粘性 末端 ,连接 酶 、 拓 扑 异 构 酶 I 以 某 种 尚 不 知道 的 机 制 很 快 地 转变 为 超 螺旋 状 态 。 这 时 寄主 就 面临 着 两 种 完全 不 同 的 命运 。 一 种 是 1 DNA EAMES, PEELE 个 有 感染 活力 的 新 病毒 ， 直 接 导 致 寄主 的 裂解 和 死亡 , 另 一 种 是 1DNA 插 人 寄主 的 “ 染 tk? DNA 中 。 两 条 道路 的 选择 取决 于 当时 寄主 和 喉 菌 体 中 的 多 种 因素 ,这 些 因素 的 微 妙 平衡 综合 在 一 起 可 以 决定 基因 采用 那 种 表达 方式 。

Jacob 等 人 首先 研究 了 复制 子 的 调制 。 所 谓 复制 子 是 遗传 上 的 一 个 复制 单元 ,其 中 有 一 个 特定 的 复制 起 始点 可 以 作为 一 个 整体 而 被 复制 。 最 简单 的 复制 子 之 一 是 只 菌 体 1 申 占 10% AJ—Be DNA, 称 为 Advo Adv 是 人 工 制造 的 环 状 DNA 〈 见 图 4-30)。 它 包括 O..Pi vc ,OgyPaycro,cll,ori,O,P 等 基因 ， 其 中 dl 不 是 自我 复制 所 必需 的 基因 , 但 PR、 O,,cro,O, Pyori 基因 都 是 必 不 可 少 的 。 它 与 转录 的 控制 基因 紧 挨 在 一 起 〈 见 第 二 章 图 2-11)。 这 是 一 个 能 自我 调控 的 复制 子 , 这 个 调控 是 通过 基因 cro 的 产物 cro 蛋白 结合 在 P,,O, 处 ,能 阻止 co 蛋白 本 身 的 产生 ,同时 也 能 调节 基因 P、O 二 个 产物 的 生成 ,因为 这 二 个 基因 也 是 从 PakOx 开始 转录 的 ,转录 本 身 也 是 复制 起 始 所 必须 的 ,起 始点 附近 没有 这 转录 起 始点 就 不 能 活化 ,有关 的 机 制 还 不 清楚 。 基 因 O 和 了 ?的 产物 是 复制 的 引发 蛋白 ， 因为 基因 co 同 基因 0 和 了 ?是 同步 转录 的 。 从 Pp 转录 一 次 , 不 仅 产生 新 的 O 和 了 蛋白

。134。

使 DNA 复制 一 次 ,而 且 产生 更 多 的 co 蛋白 ,而 cro 蛋白 浓度 增加 ,作为 一 个 阻 遇 蛋白 阻止 了 新 的 O 和 了 蛋白 的 产生 。 因 此 co 又 是 这 个 复制 子 的 自我 调节 基因 。 用 cro iia 度 敏 感 株 做 实验 ,表明 Adv 在 细胞 内 的 数目 同 cro 的 浓度 直接 有 关 ,在 限制 温度 培养 时 DNA 的 合成 速率 大 大 增加 ,这 种 情况 对 宿主 细菌 是 致死 的 , 可 能 宿主 容纳 不 了 这 么 多 质 粒 。 这 个 结果 指出 ，cero 对 Adv 在 细菌 内 的 维持 是 必要 的 。

Or Or NR

图 4-30 ADNA 的 复制 控制 区

ADNA 带 有 较 多 的 基因 ， 因 此 复制 的 调控 比较 复杂 。 现在 已 经 明确 ，2DNA 进 人 大 肠 杆 菌 后 不 久 ， 蓝 体内 就 会 出 现 若 干 种 阻 遏 蛋白 。 它们 是 d 基因 和 :cro 基因 的 产 物 , 能 作用 在 1DNA 的 Og 和 Or 位 点 上 阻止 1 DNA 的 转录 (参见 第 二 章 ), 阻 过 蛋白

复制 后 期

gamme 和 蛋白 4 recBC 核酸 酶 期

图 4-31 MAA 复制 的 方式 前 后 期 不 同

。135。

的 多 少 可 以 通过 调节 0 蛋白 的 含量 来 决定 1DNA 采用 那 一 种 复制 方式 。 在 寄主 受到 噬 菌 体 感 传 的 早期 O 蛋白 浓度 较 高 ,这 时 1 DNA 可 进行 双向 复制 。 在 后 期 0 蛋白 浓 度 较 低 因而 1 DNA 以 单 向 的 滚 环 方式 复制 (图 4-31 是 总 的 示意 图 )。 早 期 1 DNA 的 复 制 以 8 方式 进行 。 这 时 复制 需要 0 基因 和 了 基因 的 产物 , 以 及 寄主 的 蛋白 如 RNA 聚合 酶 ，dna B 蛋白 ,引发 酶 和 DNA RAK 等 。 近年 来 0 蛋白 和 了 P 蛋白 已 分 别 用 遗传 工程 技术 提纯 ,分 子 量 分 别 为 35 X 10 和 26 X 10°, 纯化 的 O 蛋 白 和 P 蛋白 加 到 oriC 酶 系统 后 ,可 以 从 一 个 1 DNA 的 起 始 区 上 引起 很 激烈 的 复制 。

在 复制 后 期 ，gam 基因 产生 的 7 蛋白 可 以 抑制 rec BC 基因 编码 的 核酸 酶 含量 ,因而 可 以 使 DNA 按 滚 环 方式 复制 DNA。 然 后 在 基因 Nol 产物 和 寄主 中 其 他 因子 的 帮助 下 ;成 熟 的 多 聚 1 DNA 可 以 和 5 种 外 壳 蛋 白 ( 分 别 由 基因 B. C. N3. D. 蕊 编码 ) 组 装 成 噬菌体 1 的 头 部 。 每 个 头 部 只 能 容纳 一 条 1 DNA 单 体 ， 多 余 的 部 分 由 基因 A 的 产物 加 工 , 切 出 带 粘 性 未 端的 单 体 ,最 后 形成 完整 的 噬菌体 1。

当 int 基因 产生 足够 的 im 蛋白 时 ， 超 螺旋 1 DNA 才 会 整合 到 寄主 DNA 中 去 。 一 旦 1 DNA 进入 溶 原状 态 , 低 水 平 的 cf 阻 歇 蛋白 就 足以 阻止 溶菌 的 发 生 , 并 保持 Gf PB 遏 蛋白 的 合成 维持 在 比较 低 的 水 平 上 。 在 溶 原状 态 时 , 1 基因 与 寄主 DNA 一 同 复制 。 只 有 在 受到 外 来 因子 如 紫外 线 照 射 、 胸 腺 喀 啶 供应 不 足 或 丝 裂 霉 素 破坏 了 阻 遏 蛋白 的 抑制 状态 时 , 1 DNA 才 会 大 量 地 增生 。

A ATA ae | T-A Rhee G= 6 Xe et, y rs My ak a rccecr 06666AT 7G 和 AAGGGAG CTCCCTA,C C= 6 A Oo kay C=G A 146 fb, = fie G=C ° Asul 和 ae Sau3A Ava} oC Gola 和 人 (921):T 5 =cATa ee aa Maar AeA _"AAAAGACACTATTACAAAAGAAAAAAGAAAAGATTATTC .CAGCCAGAAAACGACTTICTGTGGTGAAAC-3 3'-CGIACAAACCTGGTTTATIITIGTAGAGICTTACCA TITICTGTGATAATGTTTICTITY TTTTCTAATAAS, __GTCGGTCTTITCCTGORAAGACACCACTJT-5 ie i A - (B21):A bat p 7 = si =f ; it er ah OF a 7 a ty , 4 - , Tesete GAGGGAT'G Aca | AGGGGA Eccecriyc ce Ny its T T Fi 28 tig ; ¥-§ a ae TT

4-32 RRR TA A 复制 起 始点 的 顺序 和 二 级 结构

° 136。

—HADNA 进行 恶性 繁殖 ,在 早期 阶段 超 螺 旋 1 DNA MORAN ERA Et 开始 从 两 个 方向 复制 DNA。 早期 复制 所 需 的 一 切 必要 基因 都 在 起 始点 附近 2,500 碱 基 对 范围 以 内 ,其 结构 如 图 4-32 所 示 , 呈 四 时 草 形 , 并 能 为 某 种 蛋白 专 一 地 识别 。

通过 对 鸣 菌 体 和 病毒 的 研究 ,人们 现在 对 原核 生物 中 DNA 的 调控 过 程 有 了 一 些 了 解 , 当 然 原 核 生 物 DNA 复制 要 比 病毒 和 鸣 菌 体 复杂 得 多 。

原核 生物 的 生长 和 繁殖 可 以 有 不 同 的 速率 ,这 取决 于 培养 的 条 件 , 但 是 一 旦 DNA FF 始 复制 ，DNA 链 的 延伸 速率 却 是 相对 恒定 的 。 例 如 大 肠 杆菌 一 般 在 37°C 时 从 DNA 复 制 起 始 到 完成 一 般 要 40 分 钟 ,在 两 个 基因 组 之 间 形 成 膜 并 分 裂 为 两 个 子 细胞 要 20 分 钟 ， 两 者 几乎 是 恒定 不 变 的 。 细 菌 生 长 周期 中 变动 最 大 的 是 复制 的 起 始 , 新 的 DNA 可 以 在 前 一 条 链 尚 未 完成 之 前 就 又 开始 复制 的 起 始 , 也 可 以 在 细胞 分 裂 以 后 很 久 才 发 生 , 这 与 细 菌 中 各 种 激发 因子 抑制 因子 去 抑制 因子 的 复杂 相互 影响 有 关 ， 染 色 体 复制 同 细菌 的 分 裂 也 直接 有 关 , 用 和 氧 霉 素 抑制 蛋白 质 合 成 ,染色 体 复 制 不 完全 , 最 后 有 05% 是 不 复制 的 ， 而 这 些 染色 体 复制 的 完成 是 细胞 分 裂 的 信号 。

真 核 生 物 DNA 的 复制 又 比 原 核 生 物 复 杂 得 多 ,至 今 我 们 还 不 清楚 真 核 生物 中 DNA 复制 是 怎样 调控 的 ,为 什么 胚胎 细胞 会 迅速 地 生长 而 成 年 细胞 生长 很 缓慢 ;有 的 成 年 细胞 甚至 在 几 十 年 里 都 不 生长 ,什么 因素 会 使 一 个 正常 细胞 转变 为 恶性 生长 的 肿瘤 细胞 ,这些 都 是 生命 世界 向 人 类 提出 的 带 有 挑战 性 的 问题 。

近年 来 真 核 生 物 DNA 的 复制 和 基因 的 调控 正 受 到 越 来 越 大 的 重视 , 很 可 能 这 方面 的 研究 会 为 细胞 分 化 \ 再 生 、 衰 老 等 现象 提供 生物 化 学 的 说 明 ， 也 可 能 为 肿瘤 的 预防 和 治 疗 提 供 有 价值 的 线索 ,从 而 为 生物 世纪 的 来 临 铺 平 道 路 。

参 ， 4% xX ®

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°* 137 «

She 转录 与 加 工 WER RE SAR

核酸 和 蛋白 质 是 组 成 生物 体 的 两 大 类 重要 物质 ， 它 们 相互 依存 ,彼此 制约 。 1958 年 Crick 提出 的 中 心 法 则 ,提出 信息 流向 为 DNA->RNA-> 蛋白 质 , 揭 示 了 核酸 与 蛋白 质 的 内 在 关系 ,核酸 (主要 是 DNA) 是 信息 的 贮存 者 ， 而 蛋白 质 则 是 信息 的 展现 者 , 由 于 蛋白 质 的 活动 ,表现 出 生物 体 的 各 种 性 状 和 功能 。 遗 传 信息 从 DNA 经 过 RNA 传递 到 蛋白 质 , 称 为 基因 表达 ,基因 表达 的 第 一 步 , 即 信息 从 DNA 到 RNA 的 转移 ， 叫 做 转录 。 转 录 过 程 是 以 DNA 为 模板 ,在 依赖 DNA 的 RNA 聚合 酶 催化 下 ,由 四 种 核糖 核 苷 三 磷 酸 (NTP) 合成 RNA 的 过 程 :

n ATP

n. GTP DNA #&4R, Mg’t

n CTP {Kifi DNA AY RNA 聚合 酶

ine OPE

转录 是 依赖 DNA 的 或 叫 DNA 指导 的 RNA 生物 合成 , 它 不同 于 RNA 病毒 复制 时 依赖 RNA 的 RNA 生物 合成 ， 催 化 后 者 的 酶 叫 依赖 RNA 的 RNA RAR Hoe RNA 病毒 (例如 肿瘤 病毒 ) 可 把 信息 从 RNA 流向 DNA， 即 依赖 RNA 的 DNA 生物 合成 ,鉴于 它 与 “转录 ”的 对 应 关系 ,被 叫做 “ 反 转 录 ”, 它 们 的 关系 可 图 示 为 :

DNA 复制 (brs RNA 、 ) RNA 反 转 录 ( 某 些 病毒 中 )

关于 RNA 复制 和 反 转 录 将 在 第 八 章 讨论 。

近 一 ` 二 十 年 来 在 分 子 生物 学 上 有 一 个 重大 的 发 现 , 即 转录 的 原始 产物 是 没有 功能 的 RNA 分 子 , 它 必须 经 过 加 工 〈processing) 才能 得 到 成 熟 产 物 肖 原核 生物 mRNA 的 原始 转录 产物 一 般 不 需要 加 工 是 一 个 例外 )。 原 始 转 录 产 物 叫 RNA 前 体 , 加 工 过 程 中 还 可 能 产生 各 种 中 间 前 体 , 最 后 才 得 到 有 功能 的 RNA 分 子 。 因此 将 加 工 和 转录 一 起 讨论 是 必 要 的 。 和 转录 有 关 的 加 工 叫 转录 后 加 工 〈Post-transcriptional processing) 以 区 别 于 和 翻译 有 关 的 加 工 翻译 后 加 工 Cpost-translational processing)( 见 第 六 章 )。 不 同 种 类 的 RNA 前 体 的 加 工 是 很 不 一 样 的 。

RNA + 4n PPi

__ RNA 聚合 酶 (依赖 DNA 的 RNA 聚合 酶 ,转录 酶 )

转录 是 由 RNA 聚合 酶 来 完成 的 1955 年 Ochoa 等 发 现 了 多 核 彰 酸 磷酸 化 酶 (PNPase) 以 后 , 曾 一 度 认 为 RNA 生物 合成 问题 可 以 解决 了 ,但 是 在 仔细 分 析 该 酶 的 作用 特点 及 所 合成 产物 的 特性 以 后 ,许多 研究 者 对 此 发 生 了 怀疑 。 Weiss 于 1959 年 首先 在 鼠 肝 细胞 核

。138。

系统 中 观察 到 NTP 可 参 人 到 RNA 产物 中 ;其 后 不 久 , 数 家 实验 室 从 多 种 材料 报道 了 依 Ri DNA 模板 的 RNA 聚合 酶 活性 ;并 进行 了 酶 的 初步 提纯 ,发 现 合成 的 RNA 产物 与 所 加 人 的 DNA 模板 是 互补 的 。 不 同 DNA 来 源 对 合成 的 RNA 碱 基 组 成 的 影响 见 表 5-1.

#5-1 DNA 模板 与 RNA 产物 碱 基 对 应 关系

A 十 工 A+U DNA 来 源 DNA re RNA Hh Aa T2 mak 1.86 1.85 小 牛 胸腺 has 1.52 ABE 1.0 0.93

小 球菌 0.40 0.48

大 量 研究 表明 ， 原 核 细 胞 与 真 核 细 胞 的 RNA 聚合 酶 在 结构 上 、 性 质 上 是 很 不 相同 的 。

原核 生物 RNA REE

迄今 为 止 , 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 是 研究 得 比较 透彻 的 一 个 酶 。 大 肠 杆 菌 RNA KR 合 酶 全 酶 (holoenzyme) 可 用 磷酸 纤维 素 柱 层 析 分 离 为 一 个 核心 酶 (core enzyme) 和 一 个 称 为 5 的 多 肽 。 核 心 酶 又 由 4 TWH (ape) 组 成 , 亚 基 及 全 酶 的 分 子 量 见 表 5-2。 在 用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 测定 分 子 量 时 ， 各 家 报道 的 分 子 量 略 有 出 人 。 此 外 还 有 一 个 低 分 子 量 的 成 份 (9,000 一 12,000d) 存在 于 某 一 些 酶 制剂 中 〈 每 个 酶 分 子 含 0.2 一 2 个 分 子 )。 Rak T3,T7 RNA 聚合 酶 只 有 一 条 肽 链 ,分 子 量 为 110 X 10°d,

表 5-2 原核 生物 RNA 聚合 酶 亚 基 组 成

全 酶 分 子 量 WES} FBC XK10-*)

(x10-%)

酶 来 源 亚 基 结 构

454 xc:68'"0 37 150 160 70 500 aa8B'0 44 155 165 98 420 aiBB'a 45 155 155 57 436 asB8B'0 39 147 125 86

大 肠 杆菌 # 假 单 胞 菌

枯草 杆菌 Anacystis nidulans

* 大 肠 杆菌 RNA RAB <\6 和 0 亚 基 的 氨基 酸 顺 序 已 经 测 出 分 别 为 329.1342 和 613 残 基 ， 准 确 分 子 量 分 别 是 36512,150619 和 70263d。

在 RNA 聚合 酶 的 亚 基线 构 中 ，w\、8 Me 亚 基 对 酶 活性 的 重组 是 必需 的 ，w 则 是 不 必需 的 ,其 功能 尚 不 清楚 。 核 心 酶 具 催化 活性 而 5 亚 基 本 身 没 有 催化 活性 ， 其 作用 是 识别 DNA 分 子 上 RNA 合成 的 起 始 信号 。 但 5 亚 基 不 能 单独 与 DNA 结合 , 它 结合 到 核心 酶 后 可 能 引起 酶 构 型 的 变化 ,因而 改变 核心 酶 与 DNA 结合 的 特性 。 根据 单个 亚 基 或 单个 亚 基 聚 集体 的 功能 特征 \ 亚 基 的 特异 探 针 和 变异 体 混合 重组 的 研究 , 表明 fp 亚 基 是 仅 有 的 可 以 单独 与 DNA 结合 的 亚 基 , 它 参 与 RNA 聚合 酶 与 模板 反应 ,同时 68” WE 也 与 核心 酶 和 5 亚 基 结 合 以 及 转录 的 终止 有 关 。p 亚 基 具 有 利 福 霉 素 和 利 链 菌 素 〈 见 第 三 节 ) 的 结合 点 ,也 与 和 亚 基 结合 有 关 , 它 参与 RNA 链 的 引发 和 延伸 ,催化 底 物 形成

° 1396

FABIA. BCR) 也 可 与 终止 因子 CLAIM REHERM. o 亚 基 具有 与 8 的 结 合 点 ;参与 特定 的 基因 表达 ,可 能 与 酶 和 DNA 上 的 启动 区 域 的 反应 有 关 。 除了 四 个 多 肽 亚 基 外 ;大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 还 含 2 个 Za 原子 ;它们 与 6 We 联接 。 无 论 在 体外 或 体内 ，RNA 聚合 酶 通过 下 列 四 步 反 应 聚集 而 成 : 2c 一 22 2 十 86 一 >X26 a,8 十 6 一 ci66- cz66 + 0—>a,68'0

细菌 RNA RABEWIMAS TIRE PAM aw RARE, Himxkbitaeis 在 0.1M 以 上 的 离子 强度 时 以 单 体 存在 , 在 较 低 的 离子 强度 下 则 形成 二 聚 体 。 核心 酶 在 较 低 离子 强度 下 则 是 以 六 聚 以 上 的 多 聚 体形 式 存在 。 所 有 RNA 聚合 酶 都 具有 相同 的 功 能 一 一 合成 RNA， 但 还 可 能 与 转录 调节 有 关 。 如 枯草 杆菌 芽孢 化 是 与 " 因子 的 失去 和 B” 亚 基 的 修饰 联系 在 一 起 的 ， 因 而 枯草 杆菌 的 RNA 聚合 酶 突变 株 可 阻止 该 菌 的 芽 移 化 。

原核 生物 RNA 聚合 酶 能 催化 所 有 类 别 的 RNA 的 生物 合成 ,被 利 福 平等 抑制 《网 第 三 节 )。

真 核 生 物 RNA 聚合 酶

与 细菌 仅 含 一 种 类 型 的 RNA 聚合 酶 不 同 ， 在 动物 、 高 等 植物 和 真菌 的 细胞 核 中 却 有 多 种 形式 的 RNA RAB. We, 这 些 RNA RAM MR CE IAB i Stk EIT 29. AE CE EAD ROPE (o-amanitin) 的 敏 RHE WEARS KD eZ, EMR RIEL, MAW BIER 5-30

RS-3 Ree RNA RSH

RNA RAK 或 A) CR B) III( 或 c) 别名 rRNA AKG 不 均一 RN 小 分 子 RN 聚合 酶 RA 细胞 内 位 置 核 仁 核 质 核 质 转录 产物 (前 体 ) rRNA mRNA tRNA,5S rRNA — FE PE HE Ti SN * >10-°M 抑制 10-" 一 10-*M 抑制 10-: 一 10-*M 抑制

| . 〈 不 敏感 ) (re BE BUR) 《中 度 敏 感 )

* 屁 虫 和 酵母 的 RNA 聚合 酶 II 对 o- RM RB EARN AU RNA RAK I.

BRED RNA 聚合 酶 的 亚 基 情 况 相当 复杂 ， 动 植物 来 源 的 各 举 一 例 列 于 表 5-4, 从 已 经 测定 的 足 核 生物 RNA 聚合 酶 的 亚 基 组 成 分 析 , 亚 基数 从 4 一 10 个 不 等 ,有 的 多 至 14 人 外 (SDS 凝 胶 电 泳 ), 种 类 有 4 一 6' 种 ,其 中 有 二 种 为 大 亚 基 ( 分 子 量 >100 x 10°), 余 为 小 亚 基 ， 可 能 出 现 小 分 子 量 的 降解 产物 。 真 核 RNA 聚合 酶 也 紧密 结合 Zn 原子 。 从 酵母 和 胸腺 组 织 中 可 以 分 离 出 缺乏 一 种 或 二 种 小 亚 基 的 RNA RGA A, HEAR 性 ,表明 这 些 亚 基 对 催化 活性 是 不 必要 的 ， 可 能 与 转录 调节 有 关 ， 或 功能 上 类 似 于 原核 生物 的 喜 亚 基 , 虽 然 尚 无 直接 证 据说 明 趴 核 生 物 有 类 似 于 原核 的 c 亚 基 存在 。 实 验 指出 ，

.140。

RNA 聚合 酶 A 和 了 B 中 三 个 小 亚 基 的 胰 蛋 白 酶 水 解 的 肽 图 是 相似 的 ， 同 时 二 者 也 具 免 疫 相关 性 。

表 5-4 牛 胸腺 和 椰子 RNA 聚合 酶 的 亚 基 和 分 子 量

除了 上 述 细 胞 核 RNA 聚合 酶 外 ,也 分 离 出 线粒体 RNA 聚合 酶 。 叶绿体 中 也 存在 AAR. 某 些 线粒体 RNA 聚合 酶 具有 非常 简单 的 结构 ， 是 由 一 种 单一 亚 基 聚集 而 成 。 线粒体 和 时 绿 体 RNA 聚合 酶 不 同 于 真 核 细 胞 核 RNA RAM, 而 与 原核 生物 相 似 , 能 催化 所 有 类 别 RNA 的 生物 合成 。

二 、 转 录 的 机 制

”关于 转录 机 制 的 研究 是 从 大 肠 杆菌 开始 并 深入 的 ,其 它 原 核 生物 也 有 类 似 的 特性 。 虽 然 哺乳 动物 细胞 的 转录 调控 和 转录 产物 的 加 工 与 原核 生物 是 不 一 样 的 ， 但 这 两 类 生物 的 转录 过 程 却 十 分 相 象 。

在 DNA 双 链 分 子 中 ,被 转录 为 RNA 的 那 一 条 链 叫 有 意义 链 (sense strand)， 该 基 因 上 的 另 一 条 链 则 称 反 意义 链 (antisense strand)(Al 5-3)o 在 含有 许多 基因 的 DNA RHE 中 , 每 个 基因 的 有 意义 链 并 不 总 是 在 同一 条 DNA 链 上 ， 就 是 说 一 条 链 上 具有 某 些 基因 的 有 意义 链 和 另 一 些 基因 的 反 意 义 链 。 这 个 现象 的 一 些 具体 例子 已 在 第 二 章 介 绍 过 。

。141 。

转录 可 以 分 为 起 始 、RNA 链 的 延伸 和 转录 终止 三 个 步骤 。

转录 的 起 始

虽然 RNA 聚合 酶 的 核心 酶 在 DNA 模板 、 核 苷 三 磷酸 底 物 和 - Mg# 存在 下 也 可 以 合成 RNA， 但 产物 是 不 均一 的 ,没有 固定 的 起 始点 ,而 且 DNA 双 链 的 每 一 条 链 都 能 作 为 模板 。 RNA 聚合 酶 全 酶 则 能 专 一 地 与 DNA 上 RNA 合成 的 起 始 位 点 【该 位 点 被 叫 作 启 动 基因 或 启动 子 ) 结 合 , 全 酶 合成 的 RNA 链 是 均一 的 , 并 且 只 选择 一 条 DNA 链 作 模板 。 那 么 ,启动 子 究竟 具有 什么 样 的 特殊 结构 使 全 酶 能 够 识别 呢 ? 近 年 来 ;已 测定 山 相 当 多 的 启动 子 的 一 级 结构 ,这 些 结构 通常 是 用 下 述 方法 分 离 得 到 的 : 在 全 酶 与 双 链 DNA 结合 后 ,用 DNase 水 解 , 便 可 得 到 一 个 全 酶 保护 的 DNA FB. Bilan, fd. T,A2, TAs, der 和 LacUV, DNA 的 全 酶 保护 片 仆 有 41 一 44 个 碱 基 对 ， 在 一 定 条 件 下 ，RNA RABE 酶 可 以 在 被 保护 的 DNA FR ESR RNA 的 合成 ,合成 的 产物 链 长 约 17 一 20 BER, 并 且 对 应 于 各 自 的 mRNA 5 端的 起 始 顺序 。1975 年 Pribnow 比较 了 上 述 五 种 DNA 片 段 的 核 音 酸 顺 序 ， 观 察 到 有 一 个 七 个 碱 基 的 同 源 区 ， 即 TATAATG， 后 被 称 为 Pribnow 盒 , 其 中 心 是 位 于 mRNA 起 始点 前 大 约 10 个 碱 基 对 位 置 。 以 后 ，Schaller 等 人 发 现 , 若 把 被 全 酶 保护 的 DNA FES, RNA 聚合 酶 全 酶 不 能 再 重新 结合 或 者 不 能 再 选择 正 确 的 引发 点 ,对 于 这 个 现象 的 解释 是 ,在 被 保护 片段 以 外 一 定 还 有 一 些 顺 序 对 于 酶 识别 启 动 子 是 必需 的 。 从 2 和 SV40 的 研究 表明 ,启动 子 区 域 的 DNA 顺序 必需 从 mRNA 的 起 始点 向 左 延 伸 到 35 个 碱 基 对 以 远 ,而 乳糖 操纵 子 的 启动 子 区 域 必 需 从 RNA 合成 起 始 点 向 左 延 伸 到 60 个 碱 基 对 以 远 。 在 12 的 左右 启动 子 和 SV40 启动 子 的 -35 位 上 有 一 个 共同 的 顺序 ， 它 是 Hin 限制 性 内 切 酶 的 切 点 ， 用 Hn 酶 切 开 后 便 失 去 了 启动 子 活性 。 Schaller 和 Gilbert 比较 了 大 肠 杆 菌 RNA RAHN 46 个 启动 子 结构 ,把 Pribnow SHE 在 一 起 ,发 现 它们 都 存在 着 两 个 同 源 区 ， 即 位 于 -10 碱 基 对 左右 的 TATAATG 顺序 和 位 于 -35 碱 基 对 左右 的 TTGACA 顺序 (图 5-1)。 这 两 个 顺序 中 的 碱 基 在 每 一 个 启动 子 中 虽 不 尽 相 同 , 但 它们 具有 很 大 的 保守 性 。 例 如 ,在 Pribnow 盒 中 , 所 有 启动 子 都 具有 其 中 第 六 位 碱 基 T CFATAATG), TA 和 TAA 也 有 很 强 的 保守 性 。-35 碱 基 对 位 置 的 同 源 顺序 TTGACA 中 的 TTG 也 是 很 保守 的 (图 5-1)。 由 此 看 来 ， 启 动 子 结构 至 少 由 三 部 分 组 成 ,第 一 部 分 是 RNA 育 合 酶 全 酶 的 识别 信号 (-35 碱 基 对 左右 7 第 二 部 分 是 酶 的 紧 密 结合 点 (-10 碱 基 对 左右 ); 第 三 部 分 是 RNA 合成 的 引发 点 。 一 些 化 学 和 光化学 探 针 对 RNA 聚合 酶 和 启动 子 结合 的 研究 揭示 ,两 者 之 间 的 专 一 接触 点 ,主要 是 上 述 两 个 同 源 区 ， 但 也 存在 于 其 他 区 域 。 有 时 正 、 负 调节 转录 的 蛋白 结合 位 点 也 包括 在 启动 子 结构 内 (HA PAT).

— 35K “10K Seccee 工 T G A C A- coors T A oi A A (a G ae a scl 38 37 35 2Z 29 28 40 41 25 29 30 46 17

图 5-1 原核 生物 启动 子 中 -10 与 -35 区 域 的 同 源 性 比较 了 46 个 启动 子 ， 图 中 核 苷 酸 下 面 数字 表示 出 现 的 数目 。 参 阅 Ann. Rev. Genetics, 1979, 13,319—353,

关于 原核 生物 DNA 转录 的 起 始 过 程 ,根据 目前 知识 大 致 可 概括 如 下 :

©1426

(1) 核心 酶 在 c 亚 基 参与 下 与 DNA 分 子 接 触 ， 形 成 非 专 一 复合 物 , 这 样 的 复合 物 是 很 不 稳定 的 ;

(2) 起 始 识别 ,全 酶 与 启动 子 结合 生成 封闭 的 启动 子 复 合 物 〈closed promoter comp- lexz)， 这 时 酶 与 DNA 外 部 结合 ,识别 部 位 大 约 在 启动 子 的 -35 位 处 ;

(3) 活化 ,得 到 开放 的 启动 子 复合 物 〈open promoter complex), M¥TE-10 位 处 紧密 与 启动 子 结合 , 解 开 双 链 后 识别 有 意义 链 。 由 于 该 部 位 富 含 A-T 碱 基 对 ， 故 有 利于 DNA 解 链 ;

(4) 形成 三 元 起 始 复合 物 : 酶 移动 至 起 始点 ,加 入 第 一 个 核 苷 三 磷酸 得 到 (启动 子 . 全 酶 . 核 苷 三 磷酸 ) 复 合 物 , 即 开始 转录 。

差不多 所 有 情况 下 ，RNA 链 的 开头 碱 基 总 是 味 叭 , 大 多 数 大 肠 杆菌 转录 得 到 RNA 的 原始 产物 的 第 一 个 核 背 酸 是 pppG 而 $X174,T7DNA 为 模板 时 ， 更 多 的 起 始 核 昔 酸 为 pppAc

以 上 是 原核 生物 启动 子 的 情况 ,近年 来 , 对 真 核 生 物 DNA 上 启动 子 的 研究 也 发 现 ， 在 转录 起 始点 5 端 上 游 约 30 bp 处 也 存在 一 个 A-T 丰富 的 同 源 区 -TATAAA(AG)， 它 与 原核 生物 启动 子 -10bp 处 的 Pribnow 盒 很 相似 ,被 称 作 Hogness 盒 。 真 核 RNA 聚合 Be Il 42st (T) ATA M5 DNA 结合 ,然后 在 下 游 约 30bp 处 转录 mRNA 前 体 。

比较 了 珠 蛋 白 基因 5 端 上 游 的 核 昔 酸 顺 序 观察 到 有 如 图 5-2 所 示 的 规律 性 ， 从 起 始 密码 子 ATG 开始 向 左 延 伸 , 有 一 个 同 源 AC 顺序 (此 处 转录 生成 帽子 结构 ), 再 左 延 伸 出 现 一 个 ATA 的 保守 同 源 区 ,为 珠 蛋白 基因 有 效 转录 所 必需 ,缺失 ATA， 则 转录 起 始点 不 准确 ,同时 转录 效率 大 大 降低 。 此 外 ,5' 旁 侧 还 有 一 个 CCAAT 同 源 顺序 ( 见 图 5-2).

CCAAT ATA 帽子 起 始 密码 CCAAT 一 型 一 CATAAA-26_AC 一 5 _ATC CCAAT > CATAAA —26_ AC ms UE ATG

CCAAT —*4— CATAAA -2_AC-37_ATG

图 5-2 EASA 5 端 上 游 顺 序 的 同 源 性 (数字 代表 核 苷 酸 数目 )

‘

RNA 链 的 延伸

WRIA KB MARR, RNA 链 延 伸 随 之 进行 。 从 起 始 到 延伸 过 程 的 转变 ， DNA 分 子 与 酶 分 子 可 能 发 生 构象 变化 ,以 适应 延伸 过 程 的 需要 。 当 酶 从 起 始点 往 下 游 移 动 , 解 旋 也 随 酶 一 起 进行 (图 5-3)。 而 原来 部 位 则 重新 形成 完整 双 螺 旋 , 表 明 DNA 螺旋 在 酶 (核心 酶 ) 作 用 下 有 一 个 可 逆 过 程 , 同 时 酶 分 子 的 构象 也 发 生变 化 。 在 转录 起 始 阶段 ， 全 酶 与 DNA 形成 稳定 的 复合 物 , 对 连接 部 位 的 一 级 结构 有 强 的 专 一 性 ; 而 在 延伸 阶段 ， 为 了 能 沿 模板 移动 , 它 必须 放松 对 DNA 的 结合 ， 同 时 对 拷贝 每 一 个 核 苷 酸 应 具 同 等 能 力 ; 而 不 应 有 所 偏向 。RNA BARS DNA 模板 相互 作用 的 这 些 变化 , 使 得 转录 起 始 后 立即 从 酶 分 子 上 释放 亚 基 ; c 亚 基 存 在 与 否 ,引起 8 与 8 亚 基 构 象 上 的 变化 : Mo 亚 基 缔 合 时 , 6 与 8 表现 为 有 利于 专 一 与 DNA 结合 的 构象 ,而 5 释放 后 留 下 核心 酶 , 则 5 DNA 结合 不 专 一 , 失去 识别 或 优先 于 任 一 核 背 酸 顺 序 的 能 力 ， 不 能 形成 稳定 的 复合 物 。 转 录 起 始 至 延伸 的 过 程 ,包括 一 个 5 因子 的 缔 合 与 解 离 循环 ( 见 图 5-8)o

©1436

图 3-3 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 核心 酶 沿 模板 的 有 意义 链 移 动 合成 RNA

下 列 实验 证 明了 转录 的 延伸 方向 是 沿 模 板 链 ( 有 意义 链 ) 的 3 一 了 ,生成 5 一 3RNA 产物 。 在 RNA 生物 合成 系统 中 加 入 7-*P-ATP 或 y-"P-GTP, WEP 参 人 到 RNA 中 的 动力 学 表明 ,合成 早期 参 人 最 多 ,然后 随 着 时 间 延 长 而 下 降 ; 同 时 ,已 被 ?3 标记 的 RNA 总 剂量 并 不 因 反 应 液 中 加 入 大 量 非 同位 素 ATP 或 GTP 而 有 所 影响 。 At, *P 进入 RNA 是 在 合成 的 起 始 而 不 是 合成 的 最 后 。 由 于 DNA 模板 与 RNA 产物 具 反 平 行 关 系 , 所 以 转录 时 RNA RABE DNA 的 有 意义 链 3' 一 5 移动 ， 而 从 5 一 3 方向 合成 RNA。 以 jy-?P-ATP 为 底 物 合成 为 例 :

A A ON OOO LvEowint @ ko ih ashe PLE: NTP ‘ | TERE @-0-@LQh@ bon PPi

当 用 3- 脱 氧 ATP BA) RNA SEH, HE REATMEMR IE, Tk HRS TA 是 5’ > 3’, !

一 般 来 说 ，RNA #HAKWREEAN A OMERUN, AA Git ABER 37°C 时 ,延伸 速度 是 25 一 50 个 核 音 酸 / 秒 。

RNA 链 延 伸 时 所 合成 的 多 核 背 酸 链 并 不 全 保留 在 模板 上 ， 对 一 条 RNA 合成 链 而 = ,在 任何 时 候 只 有 一 个 连接 点 ,该 点 沿 DNA 链 移动 , 连续 转录 出 相同 的 RNA 产物 ,其 长 度 随 远离 起 始点 而 增加 。 图 5-4 是 两 栖 类 细胞 RNA 基因 转录 过 程 的 电镜 图 。mRNA 生物 合成 的 电镜 照片 见 图 5-21, 从 图 中 可 以 看 到 mm RNA 上 已 经 附着 许多 核糖 体 。

转录 过 程 与 复制 有 许多 相似 之 处 ,但 由 于 尚未 发 现 转录 有 像 复制 那样 的 校正 系统 /所 以 转录 较 之 复制 出 现 错误 的 频率 应 是 很 低 的 , 即 转录 应 具有 高 度 的 忠实 性 。

转 录 的 终止

在 DNA 分 子 上 有 终止 转录 的 特殊 信号 ,这 些 信 号 中 有 一 些 被 RNA 聚合 酶 自身 识 别 ,而 另 一 些 则 需要 一 个 蛋白 因子 e 的 帮助 。p 是 一 个 分 子 量 为 20 万 的 四 聚 体 ， 它 能 与 RNA 聚合 酶 结合 ,但 不 是 酶 的 组 分 。 体 外 实验 表明 , p 存在 与 否 对 RNA 链 合 成 的 长 短 甚 有 影响 ,以 fd MRK DNA 为 例 , 在 无 p 因子 时 ,合成 的 RNA 产物 为 26S, 在 合成 开 始 后 不 同时 间 加 入 2 因子 ,将 分 别 得 到 138,178 和 23SRNA, 这 说 明 模 板 上 至 少 有 三 个 为 p 识别 的 终止 信号 (图 5-5)。

9 TI44。

- J . 由 ~*~ : ¥ ’ : ER PA CHEE ei PAL) 它 it j ite i j i { at { > ' i ' iF ' tL Se 8 AVA 站 1 六 图 5-4 BR RNA 基因 转录 过 程 电镜 图 "ate wie | ‘DNA SHE | at) 0 人 全 tile CAAT IBD)

. 5-3 0 因子 对 转录 终止 的 影响 (BR DNA GSO (FRA)

”现在 已 有 许多 RNA BPM 3 端的 顺序 和 DNA OF ERIKA 了 。 虽 然 其 一 级 结构 没有 什么 共同 之 处 ， 但 发 现 终 止 区 域 在 接近 终点 的 部 位 都 有 一 个 二 元 对 称 结构 ; 亦 即 回 文 结 构 , 紧 随 着 有 数 个 工 连 在 一 起 RNA 终 直 通常 发 生 在 二 元 对 称 结构 中心 以 外 2044 个 核 音 酸 的 位 置 。 图 5-6 列 出 部 分 终止 子 反 意 义 链 的 序列 ， 具 有 了 明

145 。

WAN Zh a HME IN BER To

ac ECielc 四 四国 T EGGSHA ET arr ene w+» 'TAGAACGCTOGGTY (4) [GCOGGGOGTITI TTATT +00 ++» BACGCTOGGT (7) [KCCGGGOGTH|TITT + « +n, SS tm 4) [GCAGT] c EIGAGGCH crrrrrrr 。vw Cee ] ©) $CIGGCGGG: ATTIT.... - (4) (GAGCOGTITATT Trrcr 2 。。 Sia amare et G) ECG 可 图 5-6 部 分 操纵 子 叹 菌 体 的 终止 子 结构 特征 方 框 表 示 二 元 对 称 结构 的 碱 基 配对 部 分 ， 组 成 茎 环 结构 的 茎 ， 其 中 包括 G-T 对 ; 括 弧 内 为 构成 苍 环 结构 的 环 的 核 苷 酸 数 ; 在 所 有 例子 中 下 游 都 紧 随 数 个 工 。 摘自 Ann. Rev. Genetics, 1979, 13, 319—353,

DNA 终止 子 部 位 的 二 元 对 称 结构 可 以 解释 为 什么 RNA 聚合 酶 在 该 处 停止 延伸 : 〈1) 早 在 1966 年 Gierer 提出 ,二 元 对 称 结构 (A) 可 以 形成 十 字 结 构 (B), 同时 两 者 之 间 存 在 一 个 平衡 ;(B) 结 构 由 于 少 了 几 个 碱 基 对 ,不 如 (A) 结 构 稳 定 ， 但 (B) 形 式 结构 可 以 为 酶 蛋 折 所 识别 并 与 之 反应 ， 从 而 防 碍 RNA 聚合 酶 的 移动 ,因而 使 转录 延伸 停止 。(2) 二 元 对 称 结 构 转 录 产 生 的 RNA 部 分 可 以 形成 蕉 环 结构 ,这 样 的 结构 可 使 RNA 聚合 酶 发 生 构象 变化 ， 使 之 从 延伸 ”构象 变 为 终止 "构象 而 终止 转录 ， 图 5-7 是 RNA 聚合 酶 终止

HHaAP>O |

GTTCAGTCTGAAC mL = lt Se ee

eee eee <a Or QxwxwAO AP ee OA ©

(A) (B)

转录 的 一 个 模型 。RNA 聚合 酶 延伸 至 终止 部 位 时 ,转录 产物 仍然 与 有 意义 链 模板 氢 键 结 合 (图 5-7a); 由 于 RNA 中 蕉 的 一 半 已 游离 出 模板 ， 通 过 RNA 分 子 内 相互 作用 而 形成 ZI (图 5-7b)， 在 这 个 区 域 中 二 元 对 称 结构 的 变异 将 对 葵 环 的 形成 发 生 重要 影响 ; 蕉 环 的 生成 促使 该 处 DNA 链 退 火 恢复 螺旋 结构 ,使 蕉 环 位 于 螺旋 之 外 (图 5-7c)， 这 时 RNA 聚合 酶 就 从 “延伸 ”构象 转变 为 "终止 构象。 又 由 于 茎 环 后 一 般 为 数 个 连续 的 0， rU-dA 配对 的 RNA-DNA 杂交 体 很 不 稳定 而 释放 出 转录 产物 。 可 以 预料 ， 减 弱 蔡 环 或 加 强 苓 环 后 顺序 与 模板 的 相互 作用 都 可 能 使 转录 读 过 头 ”。

不 同 模板 终止 子 结构 或 其 生成 的 RNA 蔡 环 的 大 小 以 及 稳定 性 是 不 一 样 的。 例如 ， Mik 46S RNA 的 茎 是 很 长 的 , 且 富 含 G-C 对 ,而 依赖 于 2 的 噬菌体 1 co 基因 转录

。146 。

图 ;5-7 RNA 聚合 酶 终止 转录 模式

产物 的 末端 蕉 最 短 ,同时 最 不 稳定 。 mI up 操纵 子 终止 信号 的 研究 表明 , 在 操纵 子 最 末 一 个 结构 基因 之 后 存在 两 个 终止 信号 ,第 一 个 信号 结构 为 :

Q

a

oe o Sm 7 oe Laat 900008aGCQ00

——AGCAUUUU——

具有 通用 的 结构 特点 ,在 数 个 U 之 前 存在 葵 环 结构 ,被 认为 这 是 一 个 体内 终止 信号 。 但 如 在 体外 加 入 因子， 则 RNA 聚合 酶 在 离 第 一 个 终止 信号 下 游 250 核 昔 酸 处 终止 转录 ， 该 处 顺序 并 无 上 述 结 构 特 征 ， 但 A-U =——UUAAUUUGACUAAUUCUCAUU—., 因此 可 能 存在 另 一 未 被 认识 的 终止 机 制 。

在 依赖 2 的 终止 点 处 结构 不 够 稳定 ，RNA 聚合 酶 只 是 在 此 暂停 但 不 终止 ， 需 要 p 的 帮助 才能 停止 转录 。 p 具有 二 种 活性 : 〈1) 终 止 转录 ; 〈2) 依 赖 于 RNA 的 核 背 三 磷 酸 酶 (NTPase) 活性 。 同 时 多 种 试验 表明 ,这 二 种 活性 是 同一 蛋白 质 所 具有 ,因此 提出 一 个 终止 转录 的 模型 ; p 因子 开始 附着 在 新 生 RNA 上 , 随 之 沿 5 一 3 方向 朝 RNA HK 合 酶 移动 ，ATP 或 其 他 核 昔 三 磷酸 水 解 提供 这 种 移动 的 能 量 , 最 后 ，p 接触 到 在 依赖 2 的 终止 点 暂停 的 RNA 聚合 酶 ， 与 之 反应 , 使 新 生 的 RNA 链 释放 出 来 。 从 这 个 模型 可 以 清楚 地 看 到 ， 影 响 对 RNA WAAR RNA 移动 的 因素 将 抑制 转录 的 终止 。 在 原核 生物 中 转录 与 翻译 往往 是 偶 联 在 一 起 的 ， 翻 译 的 同时 进行 意味 着 核糖 体 遮 盖 新 生 RNA, 而 阻止 2 的 结合 ,从 而 抑制 转录 的 终止 ;翻译 一 旦 停止 ,核糖 体 与 RNA RS, Ar

.147。

出 现 裸 露 的 RNA, p 发 生 作用 而 使 转录 停止 ,这 就 是 操纵 子 末 端 终止 的 机 制 。

DNA 模板 上 终止 转录 的 信号 叫 终止 子 〈terminator)， 它 位 于 结构 基因 之 后 , 如 前 所 述 。 另 外 ， 在 某 些 操纵 子 的 结构 基因 之 前 也 存在 类 似 的 结构 区 域 ， 但 只 是 在 特殊 环境 下 才 表 现 为 终止 信号 ， 通 过 结构 的 互 变 而 行使 调节 基因 表达 的 功能 ， 这 个 部 位 叫做 衰减 子 (attenuator), Trp,Phe,Thr 和 His 等 氨基 酸 操纵 子 都 存在 衰减 子 , 其 中 以 对 trp RAT 的 研究 最 为 详细 , 详 见 本 章 第 四 节 。

图 5-8 小 结 原 核 生 物 的 转录 过 程 ;其 中 包括 许多 分 子 循环 。

图 5-8 原核 生物 转录 过 程 示意 图 EA RNA 聚合 酶 的 核心 酶 ，C 为 聚合 酶 亚 基 ，A 为 与 转录 终止 有 关 的 蛋白 因子 。

三 、 转 录 的 抑制 剂

包括 某 些 抗生素 在 内 的 转录 抑制 剂 是 研究 转录 机 制 的 常用 工具 ,同时 ,有 的 抑制 剂 也 征用 作 治 疗 疾 病 特别 是 恶性 病 的 药物 。 按 照 作 用 性 质 转录 抑制 剂 一 般 可 分 为 二 大 类 : 一 类 是 通过 与 DNA 结合 而 改变 模板 的 功能 ; 另 一 类 则 与 RNA 聚合 酶 结合 而 影响 其 活 ' 性 。

表 5-5 5 DNA 模板 结合 的 转录 抑制 剂

抑制 剂 抑制 机 制 抑制 效应 放 线 菌 素 D 插入 二 个 dG-dc 对 之 间 RNA 及 DNA 链 延 伸 SRR 通过 氢 键 与 静电 相互 作用 与 DNA 结合 DNA 与 RNA 链 生 长 BR 同上 同上 BARAK 插入 DNA 的 碱 基 对 之 间 RNA 及 DNA 链 延 伸 RY WES 插入 DNA 中 RNA 链 起 始 ，DNA 框 码 突变 RC BE 插 人 二 个 连续 的 DNA 碱 基 对 间 DNA 和 RNA 合成 HBR DNA RNA 合成 2-7, BAER DNA 及 RNA 合成

RHE DNA 及 RNA 合成

5 DNA 模板 作用 的 转录 抑制 剂

表 5-5 列 出 一 些 与 DNA 模板 作用 的 转录 抑制 剂 , 除 个 别 外 ,这 类 抑制 剂 都 与 DNA 结合 生成 非 共 价 复合 物 , 从 而 削弱 其 模板 活性 。

放 线 菌 素 D 是 一 种 广泛 使 用 和 研究 得 最 多 的 核酸 合成 抑制 剂 ， 它 含有 一 个 吟 哑 嗪 柄 (phenoxa zone) 的 平面 发 色 团 ,通过 二 个 侧 链 羧基 各 与 一 个 环 五 肽 联接 。 通 过 对 放 线 菌 素 D 与 dG 复合 物 (1: 2) 的 晶体 研究 ,提出 了 放 线 菌 素 D 与 DNA 结合 的 分 子 模型 : UO 哄 酮 环 象 一 把 刀子 插入 DNA 双 链 中 两 对 dG-dC 核 背 酸 对 之 间 ， 两 个 环 五 肽 各 位 于 吟 唾 嗪 酮 平面 的 两 侧 , 与 二 条 链 上 的 dG 的 2- 氨 基 形 成 特殊 所 键 (图 5-9)。 放 线 菌 素 D 在 低 浓 度 (mM) 时 ,对 大 肠 杆菌 RNA RRS DNA 结合 或 RNA 合成 的 起 始 影响 很 小 ;而 选择 性 地 阻止 RNA 链 的 延伸 ;在 高 浓度 〈10mM) 时 ， 它 也 抑制 RNA 合成 的 起 始 。 放 线 菌 素 D 主 要 抑制 RNA 的 生物 合成 ,对 DNA 合成 也 有 小 的 影响 。

Sar Sar

| Wy WR PEK

放 线 菌 素 D Sar 为 N- 甲 基 甘 氨 酸 即 肌 氨 酸 ，MeVal 代表 N- 甲 基 统 氨 酸 。Thr 的 羟基 与 MeVal 的 羧基 连接 ;形成 二 个 相同 的 环 五 肽 它们 分 别 位 于 吟 墅 嗪 酮 环 平面 的 两 边 ( 图 中 未 示 出 )。

5-9 放 线 菌 素 D 与 DNA 的 结合 模型

纺锤 菌 素 (netropsin) 和 远 霉 素 〈distamycin) 是 一 类 户 肽 抗生素 ， 与 双 股 DNA 特 BESS MAT. 23 dC 的 碱 基 对 形成 非常 稳定 的 复合 物 。 与 放 线 菌 素 D 的 插 人 结合 不 同 ,而 是 依赖 于 氨 键 和 静电 相互 作用 。

es 149 。

H,NCNHCH,CNH =]

| | i ae Means ne: | -consoncncg™ CH, 2 PERF 1 HCNH aga bape Ay ak ah cH, N | | - CH, \nZ \conHcH,cH.c€ | NH, CH, eA

草 环 糖苷 类 (anthracycline glycosides) 包括 道 诺 红 菌 素 (daunorubicin) 家 族 、 光 神 霉 素 (mithramycin) 和 谐 加 霉 素 (nogalamycin) 等 。 其 中 的 四 环 结构 可 插 和 人 碱 基 对 之 间 ，, 从 而 抑制 DNA 及 RNA 链 的 生长 。

后 AAAZW COCO SNF | | NO OCH; O OH H H | 一 D R=H, H@AAR /CHs , ’ = R =OH, doxorubicin adriamycin : IN pe : NH,H OH OH

*150°

Hs

NY MEAS (acridines) 染料 与 DNA 结合 能 引起 框 码 突变 ( 见 第 七 章 ), 此 外 ， 它 也 能 抑 fil RNA 链 的 起 始 以 及 质粒 复制 。 这 类 化 合 物 有 原 黄 素 (proflavine， 结构 见 第 七 章 ) 叶 啶 黄 (acriflavine) 等 。

NH, ANAS /

ks

省 乙 锭 也 能 插入 DNA 碱 基 对 之 间 , 是 检测 DNA (以 及 某 些 RNA) 的 一 个 高 敏感 度 的 莉 光 试剂 。 与 DNA 结合 后 ,抑制 DNA 与 RNA 两 者 的 生物 合成 。 相 类 似 的 抑制 剂 还 有 三 碘 丙 二 锭 〈propidium diiodide)o

NH, pan 88 NR 省 乙 锭 ，R =C,H, - Br-

H,N

fous =fiA —#, R = (CH;);—*N—CH; > 2I- re \c.H, Sr’)

黄 曲 霉 毒素 (aflatoxin) 和 2- 乙 酰 氨基 药 (2-acetyl-aminofluorecene) 作用 于 DNA, 同时 抑制 复制 与 转录 。 黄 曲霉 毒素 从 生长 在 花生 上 的 黄 曲 霉菌 〈4sbergzllaxs flavus) 中 分 离 得 到 ,2- 乙 酰 氨基 药 则 是 人 工 合成 化 合 物 ,两 者 均 为 烈性 致癌 物 ,能 诱发 肝癌 。

1 O AN Oe wes KS pe Bat BEER B 2-C MAEDA

BBX (anthramycin) 也 是 一 种 与 DNA 共 价 结合 的 抑制 剂 ， 抑 制 DNA 和 RNA 的 生物 合成 。

5 RNA 聚合 酶 作用 的 转录 抑制 剂

表 5-6 列 出 几 个 主要 的 与 RNA RAMEN RMA, AMAT HAR 录 机 制 和 RNA 聚合 酶 的 性 质 起 着 很 大 的 作用 。

#5-6 与 RNA 聚合 酶 作用 的 转录 抑制 齐

抑制 fe 月 wR ml 效应 i 与 微生物 和 线粒体 RNA ATi 6 利 福 平和 轴 张 链 苗 素 | 韭 革 从 引信 RBM DNA A, MiB | FMF RNA 链 的 起 反 码 第 一 个 弛 核 背 三 确 酸 进 人 Alem | 与 细菌 RNA RAM 6 亚 基 结 合 优先 阻 断 RNA 链 的 延伸 _ 与 哺乳 动物 细胞 核 RNA_ ARE ML 优先 -区 育 昔 碱 。 | 结合 ;不 影响 细 兽 、 线粒体 和 叶绿体 的 RNA | << SURI DL aby RN 的 会 成 。。 高 党

ARG

利 福 平 (rifampicin) 是 利 福 霉 素 的 衍生 物 , 利 福 霉 素 是 链 霉 菌 属 产生 的 一 种 抗生素 ， 它 有 效 地 对 付 抗 酸 (acid-fast) 菌 和 划 兰 氏 阳性 菌 。 利 福 平治 疗 结核 病 特别 有 效 。 利 福 平 是 细菌 RNA 聚合 酶 的 非常 有 效 的 抑制 剂 ,2X10-sM 浓 度 可 抑制 50 多 活性 。 搁 制 机 制 是 与 酶 的 8 亚 基 结合 , 而 防 碍 了 5- 顺 叭 核 背 三 磷酸 的 进入 ,结果 阻 断 RNA 链 的 起 始 。 利 福 平 并 不 影响 酶 与 DNA 的 结合 。 利 福 平 对 真 核 RNA 聚合 酶 无 作用 ， 然而 在 某 些 特 定 情况 下 , 真 核 RNA 聚合 酶 可 被 一 些 利 福 平 衍生 物 所 抑制 。

O CH, CH, CH;

ou,to | ‘| | >» iki hee CH;0 | OH ONR 2O | CH, ~ \cu,; OH OH Ve CH; | NH Sous ot 2 Siar CH; SS / 利 福 霉 素 B: R, = —OCH,COOH, R, = —Ho 利 福 平 : R, = —OH, R, = 一 CH = N—N N—CH;o

曲张 链 菌 素 (streptovaricin) 具有 与 利 福 平 同 一 专 一 性 和 作用 方式 ,来源 也 相同 。 利 链 菌 素 (streptolydigin) 与 利 福 平 不 同 , 虽 然 作 用 部 位 仍然 是 细菌 RNA 2a Bey 6 亚 基 , 但 却 优先 阻 断 RNA 链 的 延伸 。

¢ 152.

CH; CH; CH, |

CHs Oo Ne

JON unt Weep CHCONHCH, ou, 利 链 菌 素 xz- 怨 膏 草 碱 (a-amanitin) EWS Amanita phalloides 分 离 出 来 的 一 个 剧 毒物 质 二 为 一 环 八 肽 化 合 物 , 由 Gly 二 分 子 和 Le, -二 羟 He、 LI-Asn、L- 产 Pro, L-#% Trp 和 氧化 Cys 各 一 分 子 组 成 ,其 中 Trp 残 基 中 心 与 氧化 的 Cys 莹 基 相 联接 。

OH

| HC\、 /CH 一 CH2OH

CS Ver-a-ca|-sereareo -warom-oo | | | _ NH

| HS CH,

CO hag RE IE ie edt ces eee y aN co | (NOH wagte pee Se

CO—CH—NH—CO—CH—NH—CO—CH,—NH Ci $5 MR o- SAB RMHN—H Ne RECA HAMDEN Leu 代替 ， 则 产生 完 全 无 毒性 的 -Amanulline。 从 毒 麻 菇 中 也 分 离 出 几 个 毒性 七 肽 。

c- 狼 膏 划 碱 完全 阻 断 真 核 RNA 聚合 酶 I 以 及 亚 产生 的 转录 作用 ， 特 别 抑制 mRNA 的 生物 合成 ,从 而 也 抑制 了 整个 细胞 的 蛋白 质 生 物 合成 。 但 对 细菌 、 线 粒 体 和 时 KH RNA 聚合 酶 没有 影响 。

此 外 ，RNA 聚合 酶 的 非特 异 抑制 州 有 : 多 核 背 酸 、 肝 素 、 聚 乙 二 醇 磷 酸 、 核 背 三 磷 酸 类 似 物 ,如 3 -脱氧 ATP，3“- 氮 基 -3 -脱氧 ATP 和 2-O- 甲 基 ATP 等 。

、mRNA 的 转录 与 加 工

mRNA 概念 的 提出 和 mRNA 的 发 现

mRNA 概念 是 Jacob 和 Monod 于 1961 年 提出 的 。 在 这 之 前 ,已 有 许多 研究 工作 者 在 思考 基因 (DNA), RNA 与 蛋白 质 生 物 合成 之 间 的 关系 。 在 真 核 细胞 中 , 遗传 信息 贮 存 于 细胞 核 的 DNA 24, 而 蛋白 质 合 成 部 位 却 在 细胞 质 ， 那 么 在 这 两 者 之 间 必 定 有 一 个 或 一 类 化 学 中 间 物 存在 ， 它 能 把 DNA 上 的 信息 传递 蛋白 质 。 该 化 学 中 间 物 曾 被 称

©1536

He“ oe HOS (2 BR PRE (E” > Jacob 和 Monod EHRABH ABS ROL RN EL, KR 加 诱导 物 在 数 分 钟 内 诱导 酶 可 以 上 千 倍 地 增加 ,而 移 去 诱导 物 则 酶 合成 迅速 停止 。 因 此 ， 他 们 设想 这 些 大 量 的 酶 在 稳定 的 模板 上 直接 形成 是 不 可 想象 的 ， 而 必然 存在 一 个 短命 的 中 间 物 即 信使 作为 合成 酶 的 模板 ,这 个 信使 应 具有 下 列 性 质 :

(1) 信使 应 是 多 核 昔 酸 ;

(2) 信使 的 碱 基 组 成 应 该 反映 于 DNA 所 特有 的 碱 基 组 成 ;

(3) 由 于 生物 体内 蛋白 质 种 类 繁多 , 故 信使 的 大 小 应 是 很 不 均一 的 ,根据 三 个 核 背 酸 编码 一 个 氨基 酸 计 算 , 信 使 的 分 子 量 至 少 50 万 ;

(4) 信使 应 能 短暂 地 与 核糖 体 结合 ;

(5) 信使 的 合成 与 分 解 应 该 是 迅速 的 。

当时 已 经 知道 的 二 类 RNA (tRNA 于 1957 年 发 现 ，rRNA 在 1959 44} EO) MAA 有 这 些 性 质 。 第 一 ，rRNA 和 tRNA 的 碱 基 组 成 与 DNA 相差 甚大 ， 它 们 如 何 接受 来 自 DNA 的 信息 ?第 二 ，rRNA 和 tRNA 分 子 相 对 比较 均一 〈 见 第 三 章 )， 何 以 解释 生 物体 内 存在 千 差 万 异 的 蛋白 质 种 类 ? 第 三 ， 这 两 类 RNA 代谢 率 太 低 ， 不 能 说 明生 物体 具有 高 速度 合成 蛋白 质 的 能 力 ; 第 四 ， 不 同 生物 体 rRNA 以 及 tRNA 碱 基 组 成 彼 些 相 似 , 具 有 很 大 的 同 源 和 亲缘 性 ( 见 第 三 章 ), 如 果 它 们 是 蛋白 质 合成 的 模板 的 话 ， 很 难说 明 蛋白 质 的 种 族 差异 性 。 因 此 Jacob 和 Monod 认为 ,除了 rRNA 和 tRNA 以 外 ,必定 还 有 一 类 RNA 存在 , 这 类 RNA 必需 满足 上 述 要求 ， 在 蛋白 质 合 成 中 决定 氨基 酸 的 排列 顺序 ,把 从 DNA 分 子 得 到 的 信息 传递 给 蛋白 质 分 子 。 这 类 RNA 就 被 定名 为 信使 RNA (mRNA)。

mRNA 假说 提出 后 不 久 ,许多 实验 室 立 即 证 实 了 它 的 存在 。

FAWKES (A T2. T7 感染 大 肠 杆 菌 后 ， 虽 然 _RNA 总 量 没有 什么 变化 ， 但 约 有 1% RNA 是 新 合成 的 ,而 且 更 新 率 很 快 。 同 时 发 现 这 类 新 合成 的 RNA 的 碱 基 组 成 和 大 肠 杆 菌 原来 有 的 RNA 不 同 ,而 与 噬菌体 DNA 则 甚 类 似 ( 表 5-7)。

表 5-7 大 肠 杆菌 经 噬菌体 感染 后 新 生成 的 RNA 的 碱 基 组 成 9

核 酸 种 类

大 肠 杆菌 RNA

T2DNA T2 感染 后 生成 的 RNA T7DNA

T7 感染 后 生成 的 RNA

32

一 -| 一 | 一 一 | |] 一

26.6

*# 为 5- PRIME.

TEX Hot cae FA al PR AI BS EA, 加 入 “C By YP 同位 素 标 记 的 化 合 物 进 行 短 时 间 培 养 ， 经 密度 梯度 超 离 心 分 离 。 都 能 得 到 含 高 放射 性 的 新 峰 ， 它 既 不 是 4S 的 tRNA, thASE 16S A 23S 的 rRNA， 而 是 一 类 新 RNA。 同时 进一步 发 现 ， 这 个 新 的 放射 性 高 峰 可 由 于 在 非 放 射 物 中 较 长 时 间 培 养 (如 37°C 保温 15 分 钟 ) 而 消失 ， 说 明 这 类 RNA 含量 既 少 , 代谢 很 快 。 虽 然 这 类 放射 性 物质 主要 和 核糖 体 结合 在 一 起 ， 但 其

©1546

沉降 常数 不 是 rRNA， 并 且 可 用 电泳 将 其 分 离 出 来 。

1961 年 Spiegelman 发 展 了 一 种 新 的 杂交 技术 ,为 mRNA 的 存在 提供 更 有 说 服 力 的 HEH. FA “P 标 记 经 T2 叹 昔 体感 染 大 肠 杆菌 后 生成 的 RNA Bl T2 mRNA， 同 时 制备 标记 的 T2 DNA, 将 T2 mRNA 与 T2 DNA 混合 物 加 热 到 10p*C。 然 后 缓慢 冷却 到 室温 ,冷却 混合 物 进 行 密度 梯度 超 离心 ， 分 析 结 果 见 图 5-10。 *P 和 双重 标记 的 杂 交 体 的 存在 表明 ,TI2 mRNA 不 但 其 组 成 与 T2DNA 相似 ( 见 表 5-7) ,而 且 两 者 的 核 苷 酸 排列 顺序 也 有 对 应 的 互补 关系 。 ©

图 5-10 T2 鸣 菌 体感 染 大 肠 杆 菌 生成 的 RNA 与 T2 DNA 的 杂交 实验

不 入; 采用 双 标 记 法 CH 标记 DNA 链 ,，P 标记 RNA 链 ) 也 可 在 体内 找到 这 种 杂交 产物 。 用 硝 基 纤 维 过 滤 法 能 够 更 简便 而 快速 地 分 离 鉴 定 杂 交 分 子 。 这 样 ， 经 过 许多 实验 室 的 努力 ,完全 证 实 了 Jacob 和 Monod 预言 的 mRNA 的 存在 。

稍 后 ,在 真 核 生 物 中 也 发 现 mRNA。 真 核 生 物 mRNA 中 3 REA SRA RE, 为 分 离 鉴定 带 来 了 很 大 的 方便 ( 见 第 十 一 章 )。 鉴定 mRNA ‘di tacoma FAS» Fe ABA eC HARE » AZT HR RAE SO

原核 生物 mRNA 的 转录

原核 生物 mRNA 转录 有 以 下 几 个 特点 : 〈1) 多 顺 反 子 转录 ， 以 操纵 子 作为 转录 单 fr; 〈2) 转 录 与 翻译 偶 联 在 一 起 ,往往 mRNA 还 未 转录 完全 ， 和 蛋白 质 合成 就 已 开始 ; 而 且 , 翻 译 成 为 调节 转录 的 一 个 因素 ; 〈3) 除 个 别 mRNA 外 ,一 般 原 核 生物 mRNA 不 需要 ML; 〈4) 原 核 生 物 mRNA 的 寿命 比较 短 , 大 肠 杆菌 mRNA 的 半 寿 期 一 般 只 有 几 分 钟 或 者 更 短 。

I. 原核 生物 DNA 分 子 上 的 转录 信号 一 一 操纵 子 及 其 调控 区 。

在 原核 基因 组 织 中 , 几 个 相关 的 蛋白 质 或 几 个 相关 的 RNA 的 基因 常 被 组 织 为 一 个 转录 单位 。 包 括 几 个 蛋白 质 基 因 的 转录 单位 被 转录 为 一 个 多 顺 反 子 mRNA, 产物 除 编码 几 个 蛋白 质 的 序列 外 ,也 包括 位 于 分 子 两 端 或 顺 反 子 间 的 非 编 码 区 ， 非 编码 区 是 mRNA 的 结构 特征 之 一 ( 见 第 三 章 ), 它 不 翻译 ,但 转录 后 这 部 分 并 不 被 加 工 释放 。

1961 年 Jacob 和 Monod 在 提出 mRNA 概念 的 同时 ,也 提出 操纵 子 学 说 , 为 原核 生 物 转录 及 其 调控 方式 设计 了 一 个 简单 的 模型 。 虽 然 自 此 以 后 ,大 量 研究 结果 表明 ,他 们 的 模型 是 相对 简单 化 了 ， 但 所 有 原核 生物 的 基因 表达 都 可 以 用 操纵 子 作为 转录 单位 予以 描

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述 。 操 纵 子 包括 数 个 相关 的 结构 基因 及 其 调控 区 ， 是 一 个 基因 表达 的 协同 单位 。 调 控 区 - 主要 可 分 为 三 个 部 位 一 一 操纵 基因 、 局 动 子 和 降解 物 基因 活化 蛋白 (CAP) 连接 部 位 ;, 它 们 之 间 通 常 相互 重 登 。 启动 子 是 RNA 聚合 酶 的 结合 部 位 ， 结 合 后 启动 RNA Ape 纵 基 因 是 操纵 子 以 外 的 调节 基因 生成 的 阻 遏 蛋白 的 结合 部 位 ， 二 者 结合 后 ， 转 录 即 被 阻 Bt RAK Hom MEER RE, OMAR RAN“ HVAT”; CAP 由 分 子 量 为 45,000 的 两 个 亚 基 组 成 ， 也 叫 cAMP 受 体 蛋白 ，cAMP 促进 CAP 与 DNA 结合 而 加 快 转录 速度 ,可 能 是 由 于 它 们 在 结合 点 使 DNA 局 部 变性 , 增强 RNA 聚合 酶 对 启动 分 子 的 结合 而 促进 转录 。 这 叫 转录 的 正 调 节 ”。 此 外 ,在 某 些 操纵 子 的 调控 区 中 存在 衰减 子 , 这 个 部 位 不 同 于 结构 基因 下 游 的 终止 子 , 它 既是 一 个 终止 信号 ,也 是 一 个 调节 信号 。

对 二 类 操纵 子 进行 了 详细 的 研究 : 一 是 可 诱导 操纵 子 ， 另 一 为 可 阻 遏 操纵 子 。 可 诱 导 操 纵 子 指 在 正常 的 情况 下 不 表达 或 仅 在 低 水 平 上 表达 的 转录 单位 ， 如 果 环 境 发 生 某 些 : 变化 ， 则 操纵 子 开放 ， 转 录 mRNA, 从 而 合成 诱导 酶 以 适应 细胞 的 需要 。 许 多 负责 糖分 解 代谢 的 操纵 子 属 于 这 种 类 型 ， 如 乳糖 Cac) 操纵 子 、 半 乳糖 (gal) 操纵 子 和 阿拉 伯 炉 (ara) 操纵 子 等 。 可 阻 遏 操纵 子 则 主要 是 调控 氨基 酸 过 剩 的 ,氨基 酸 过 多 ， 可 以 通过 两 条 . 途径 调节 ,其 一 是 负 反 馈 以 抑制 合成 该 氨基 酸 所 需要 的 一 系列 酶 中 的 关键 酶 , 另 一 种 方式 . 是 关闭 基因 使 酶 不 能 合成 ， 显 然后 者 是 最 有 效 的 。 可 阻 遇 操纵 子 就 是 负责 氮 基 酸 合 成 代 谢 调控 的 操纵 子 , 如 色 氮 酸 (trp) 操纵 子 ` 组 氨 酸 Chis) 操纵 子 等 。

为 了 简便 ,在 下 列 分 述 的 操纵 子 中 ,统一 采用 以 下 符号 和 代号 : i, 调 节 基 因 ; py Bop 子 ; o， 操 纵 基 因 ; a， 衰 减 子 ;结构 基因 则 以 相应 大 写 符号 表示 。 候 ,RNA RAM O- 383A, CAP-cAMP (CAP 与 cAMP 的 复合 物 ); 一 一 ,mRNA; mA IAM)

lac 操纵 子 是 研究 得 最 早 而 又 最 详细 的 ,其 基因 结构 排列 在 第 二 章 已 介绍 过 了 ;图 天 11 示 出 lac 操纵 子 的 阻 遇 (正常 情况 下 ,无 诱导 物 存在 ) 和 诱导 (加 入 乳糖 或 其 类 似 物 ) 过 程 。 在 lac 操纵 子 的 调控 区 中 ,各 信号 蛋白 结合 部 位 的 核 背 酸 顺 序 已 经 测 出 ( 见 图 1 六 其 中 启动 子 的 序列 具有 通常 的 保守 序列 ( 见 第 二 节 , 转 录 的 起 始 )，CAP-c<cAMP 结合 部 位 和 操纵 基因 则 具有 紧密 的 回 文 结构 , 见 图 5-12 中 的 方 框 部 分 。 关 于 CAP-cAMP 的 结合 位 点 及 阻 遏 蛋白 与 操纵 基因 的 相互 作用 问题 ,分 别 参 见 第 九 章 和 第 十 章 。

屯 糖 复合 物

图 5-11 lac 操纵 子 的 阻 过 CA) 与 诱导 〈B)

gal 操纵 子 在 第 二 章 已 提 到 ， 它 含有 三 个 结构 基因 E、T、K 和 一 个 92 BH

* 156°

Ts

CCAGGCITTACACTTT ATGCTTCCGGCTOGTATGTIGIGIGGAATT

RNARABS

CAP—cAMP 结合

总 | 站 q 4

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ZE8 号

} 1 I CACACAGGAAAC. GTTAAAGTGTGT CCTTTGTCGA TACIGGTAC

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AGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACC

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CGAAATG

GAGTAATCCGTGGGGTC 30

CTCAATCGAGT'

és 而 8 80 100 110 120

50

40

10 20

RAW GAAAT 图 5-12 lac 操纵 子 调 控 区 的 结构 特征

长 的 调控 区 。 E、T、K 分 别 编码 三 个 酶 ， 这 些 酶 使 半 乳 糖 转变 为 G-I-P 和 UDPG。 虽然 gal 操纵 子 与 lac 操纵 子 的 表达 调控 方式 基本 相 似 , 但 体内 实验 观察 到 有 明显 的 不 同 :〈1) 虽 然 CAP-cAMP 有 明显 的 激活 效应 ,但 gal 操纵 子 AR lac 操纵 子 那样 依赖 于 降解 物 的 活化 ;(2) 当 操 纵 子 被 阻 遏 , 仍 出 现 低 基 础 的 酶 合成 ,合成 水 平 远 高 于 其 他 操纵 子 。 图 5-13 列 出 gal 操 纵 子 中 调控 区 的 排列 情况 。 当 与 半 乳 糖 代谢 有 关 的 酶 被 诱导 和 存在 CAP-cAMP 时 ， 操 纵 子 在 工 处 开始 转录 。 整 个 调控 区 位 于 左 侧 , 核 昔 酸 数目 用 负数 表示 ,启动 子 部 位 在 1 至 一 60, 再 左 侧 一 60 至 一 90 核 昔 酸 为 CAP-cAMP ;结合 部 位 ,操纵 基因 则 与 CAP-cAMP ire, 一 60 至 一 66 核 背 酸 为 阻 歇 蛋白 结合 处 。

Pr 人 P ss 一 人 mE KR — 90 — 66-60 —5§ 1 \ , ppp YWYw~rm 4-0) 人

图 5-13 gol BAF

由 于 这 样 的 结构 特点 ， 阻 遏 蛋白 的 存在 首 先 干扰 降解 物 活 化 过 程 ， 但 不 完全 破坏 RNA 聚合 酶 与 启动 子 相互 作用 ， 故 也 能 进行 低 水 平 转录 。 另外 ,在 缺乏 CAP-cAMP 的 情况 下 ， 转录 亦 能 缓慢 地 进行 ， 但 转录 的 起 始点 与 存在 CAP-cAMP 时 不 同 ， 后 者 从 1 位 开始 , 前 者 则 在 -5 位 启动 ( 见 图 5-13), 同 时 不 被 阻 遏 蛋白 所 影响 。

ara RF. “含有 三 个 结构 基因 BY A 和 了 D， 能 表达 三 个 用 于 阿拉 伯 糖 代谢 的 相关 的 酶 一 一 核 酮 糖 激酶 (B)、 阿 拉 伯 糖 异 构 酶 (A) 和 核 酮 糖 -=5- 磷 酸 差 向 异 构 酶 (D)， 催化 下 列 反 应 :

(A) (B) L- 阿 拉 伯 糖 一 ”L- 核 酮 糖 ” “ 工 - 核 酮 糖 (D) -5- 磷 酸 > AR BE 5 — 19 Da 26 BA °° 4e AO BE oe A FFE — PIA TB SK P, AUP2, (A Pl DLA SD, ERD PL BAe

° 157

"4, VEO BEE SRWRAAS, SHA CL 5-144); 有 阿拉 伯 糖 时 ，P' 转变 为 P,, 能 作为 激活 剂 与 启动 子 结合 ,实现 正 调节 ( 见 图 5-14B)。 此 外 CAP-cAMP 和 ppGpp ( 见 第 九 章 ) 也 都 能 促进 ara 操纵 子 基因 表达 ,但 结合 部 位 不 很 清楚 。

Cc B A ‘aa O RE

人

图 5-14 ara 操纵 子 的 调控 图 5-15 tp 操纵 子 的 早期 调控 模型 trp 作为 共 阻 遏 物 与 阻 过 蛋白 结合 后 抑制 转录

trp RAF PEE AIRE RANT BRAT. A5-15 是 早期 建立 的 trp 操纵 子 结构 和 调控 模型 , 它 包 括 五 个 结构 基因 以 及 5 旁 侧 的 调控 区 。 五 个 基因 产物 组 成 的 酶 系 可 以 催化 从 分 支 酸 合成 trp (图 5-15A) trp 过 剩 时 , 则 阻 遏 转录 进行 。 按 照 Jacob 和 Monod 的 操纵 子 概念 ,提出 trp 是 一 个 共 阻 过 物 (corepressor) , 当 它 与 阻 遏 蛋白 结合 后 , 即 与 操纵 基因 连结 而 阻 断 转 录 ( 图 5-15B)。 但 是 后 来 发 现 ,有些 实验 结果 并 不 能 用 上 述 模型 解释 ， 如 于 trp-tRNAT 变异 株 中 加 入 Trp 并 不 减低 trp 操纵 子 的 基因 表 达 ; 加 Trp 于 Trp 饥 狐 细胞 并 不 关闭 转录 的 起 始 , 而 只 抑制 起 始 片 仆 上 转录 的 延伸 ， 同 甜 也 有 实验 说 明 , 在 操纵 子 的 起 始 片 有 中 可 能 存在 终止 部 位 ,因为 在 trp 操纵 子 5 端 序列 产生 的 mRNA 中 ， 相 当 于 操纵 子 的 前 导 序列 140 bp 的 寡 核 背 酸 多 于 来 自 其 他 部 分 的 片 段 几 倍 。 基 于 这 些 观察 ,人 们 提出 另 一 种 调控 机 制 , 叫做 衰减 作用 (attenuation)， 即 通过 转录 的 终止 (而 不 是 转录 的 起 始 ) 对 基因 表达 进行 调控 一 一 Trp 缺少 ,转录 进行 ; ITIP 过 HK) ERK iko |

1981 年 已 全 部 测 出 trp 操纵 子 中 7,000 多 个 bp 的 排列 顺序 ， 其 中 6,800bp 构成 五 个 结构 基因 ,编码 酶 或 其 亚 基 ,催化 从 分 支 酸 经 过 五 步 反 应 合成 L-Trp( 图 5-16)o trp ® 纵 子 结构 有 以 下 几 个 特点 : 〈1) 在 结构 基因 前 有 一 段 162 核 苷 酸 的 前 导 序 列 (L)， 能 编码 出 一 个 14 肽 ,其 转录 产物 具有 一 奇特 的 二 级 结构 ,其 中 含有 被 称 作 误 减 子 (a) 的 转录 终止 的 调节 信号 ; 〈2) 启 动 子 与 操纵 基因 大 部 分 重 登 ; (3) 除 了 5 旁 侧 的 启动 子 外 ， 在 操纵 于 内 部 存在 另 一 弱 的 启动 子 (P;); (4) 结 构 基 因 之 后 出 现 二 个 终止 信号 CM’), RAF (人 t) 为 e 因子 所 识别 ( 见 第 147 页 )。trp 操纵 子 的 调控 区 排列 见 图 5-17。

rp 操纵 子 前 导 序 列 的 转录 产物 具有 下 列 奇特 的 可 变 二 级 结构 (图 5-18)， 图 中 方 框 内 为 典型 的 终止 信号 ( 见 第 二 节 )， 结 构 左 面包 括 前 导 肽 羧 端 的 6 个 氨基 酸 密 码 子 及 其 终 sk BAF CHL 1 SATE) © |

©1586

邻 氨 基

BRE wa sic HER A> GRERER A 氨基 革 申 酸 一 用 时 村 和 Gla PRPP -5- BR cr

5-16 up 操纵 子 结构 基因 排列 及 其 表达 产物 tt 表示 两 个 终止 子 其 顺序 见 第 147 页 ;数目 字 代表 从 启动 子 右 侧 起 的 核 背 酸 对 数 。

: 1 转录 起 始 转录 终止 图 5-17 up 操纵 子 的 调控 区 排列

U G A U G A C C A C A U A U C C NG U*®GA Trp G UPA : C AeU G U*A Cc ec A [ Cc ‘140 Bictec | NA UUUUUUUU EEC CN o. Cc GAC G ee ae U GeC G 1 CEG C WA G A Cc az UAAU Il

5-18 wp 操纵 子 前 导 序列 的 转录 产物 的 二 级 结构 图 在 结构 基因 前 存在 这 样 结构 的 衰减 子 可 以 解释 基因 表达 是 如 何 通过 转录 终止 进行 调 控 的 ， 由 于 原核 生物 转录 与 翻译 是 偶 联 在 一 起 的 ,这 种 情况 下 ， 若 \1)， 前 导 肽 不 被 翻译

° 159

nN, | 型 结构 稳定 ， 则 转录 在 终止 信号 ( 方 框 处 ) 停 止 ; (2) Trp 缺少 ， 则 Trp-tRNAT* 不 能 生成 ,翻译 至 Trp 密码 子 处 停止 ,这 时 ,核糖 体 使 I 型 结构 破坏 ， 从 而 不 存在 终止 信 号 结构 ,得 到 类 似 I 型 的 结构 。 RNA 聚合 酶 于 是 顺利 通过 进行 转录 以 合成 Trp; (3) Trp 过 量 , 当 然 还 要 存在 正常 量 的 tRNA™ 以 及 Trp-tRNAIe 合成 酶 ， 则 前 导 14 AR 翻译 ,这 时 ,核糖 体 破 坏 工 结构 中 左 侧 的 氢 键 配对 区 而 保留 其 终止 信号 , 故 转录 也 停止 。 三 种 情况 的 示意 图 见 图 5-19。

(1) (2) (3)

没有 翻译 ， Trp 缺少 ， 核 Trp 过 量 ,核糖

转录 在 方 糖 体 不 能 翻译 体 翻 译 前 导 肽 ，

框 处 终止 。 抽 转录 “转录 终止 。 照常 进行 。

图 5-19 大 肠 杆菌 rp 操纵 子 中 衰减 作用 模型 四 表示 核糖 体 ,核糖 体 大 小 见 第 六 章 约 能 遮盖 16-20 KR.

综 上 所 述 , 在 trp 操纵 子 的 基因 表达 中 ， 受 到 TrptRNAt? 的 影响 ,而 tRNAT? 与 Trp-tRNAT? 的 相对 浓度 则 决定 于 细胞 内 Trp BE, Trp-tRNA™? 合成 酶 的 量 和 活性 、 (RNAT? 量 、 甚 至 最 重要 的 是 细胞 内 整个 蛋白 质 合成 的 速度 。 通 过 阻 遏 作用 进行 转录 调 - 控 ( 见 图 5-15) 不 是 trp 操纵 子 的 唯一 机 制 , 而 衰减 作用 模型 (图 5-19)， 则 能 解释 许多 已 经 存在 的 实验 结果 。

his 操纵 子 它 具 有 类 似 up 操纵 子 的 调控 方式 ， 实际 上 衰减 作用 概念 最 早 是 从 沙门 氏 杆 戎 his 操纵 子 研究 中 首先 提出 的 。 在 his 缺乏 时 ，his ee 化 从 ATP 和 PRPP 合成 Hiso his 操纵 子 中 基因 排列 如 下 :

his 操纵 子 结构 基因 3 | G D [Gs B H A F I E : a ee LO

aa] py on

转录 方向

和 其 他 操纵 子 有 类 似 情 况 ，his 操纵 子 的 结构 基因 顺序 与 酶 的 作用 顺序 并 不 一 致 。his 操 纵 子 没有 一 个 专门 的 调节 基因 ， 而 是 由 第 一 个 结构 基因 G 产物 一 一 磷 栈 核糖 基 -ATP 合

his 操 纵 子

SC

25 ASE OES =) FA PRPP_ C= J -[ ts His, 合成 酶 His { —— tRNA IA tRNA 前 体 His -tRNA

图 5-20 his 操纵 子 的 负 调 控 R 是 tRNAM 结构 基因 ; UW 为 tRNA 加 工 酶 基因 ; T 为 修饰 酶 基因 ， 访 酶 催化 U>p; S 表达 产生 His-tRNA9I 合成 酶 。

* 160 »

RBA HistRNA™ 一 起 组 成 有 活性 的 阻 遏 物 进行 负 调 节 ， 因 此 所 有 有 关 形 成 His- tRNAHi 的 酶 基因 的 突变 都 直接 影响 his 操纵 子 的 表达 (图 5-20)。

his 操纵 子 的 调控 区 序列 已 经 测定 ,其 前 导 序 列 能 编码 一 个 16 肽 ,其 中 含有 连续 的 七 个 组 氨 酸 残 基 。 前 导 序 列 转录 产生 mRNA 具有 类 似 于 up 前 导 mRNA 的 可 变 二 级 结 构 。His 缺少 , 转录 通过 结构 基因 ; His 过 量 或 缺乏 对 应 于 His 密码 子 前 任 一 氨基 酸 密 OF WR tRNA, WATS mRNA 上 出 现 终止 信号 而 使 转录 在 衰减 子 处 停止 。 但 是 ， his 操纵 子 前 导 序 习 形 成 的 二 级 结构 较 up 操纵 子 复杂 ， 正 常情 况 下 出 现 四 个 长短 不 一 MARK. ; |

II. 原核 生物 转录 与 翻译 偶 联 在 一 起 ,一 般 原核 mRNA 不 需 加 工

从 拍摄 的 原核 生物 转录 过 程 的 电镜 图 (如 图 5-21)， 可 以 观察 到 在 新 生 的 mRNA 链 止 附着 许多 核糖 体 , 这 意味 着 转录 尚未 结束 而 翻译 早已 开始 ,新 生 RNA 即 为 成 熟 RNA， 而 不 必 经 过 进一步 加 工 。 而 其 他 所 有 种 类 的 细胞 质 RNA 都 是 要 进行 加 工 的 〈 见 下 文 )。

图 5-21 大 肠 杆 菌 转录 与 翻译 的 偶 联

但 是 也 有 例外 ,如 T7 DNA 由 一 个 启动 子 、5 个 结构 基因 和 一 个 终止 子 组 成 , 被 大 ita RNA 聚合 酶 全 部 转录 得 到 较 大 的 RNA 前 体 ,然后 由 加 工 酶 RNaseII 剪 切 成 五 企 成 熟 的 mRNA 分 子 。

真 核 生物 mRNA 的 转录 与 加 工

第 三 章 已 经 讨论 mRNA 的 结构 问题 。 真 核 细 胞 的 核 \ 质 分 明 , 转录 与 翻译 有 一 个 生 理 上 的 屏障 ,与 原核 细胞 有 明显 不 同 的 特点 。 关 于 mRNA 的 转录 问题 ,应 该 深 人 研究 细 息 核 才能 解决 。 由 于 真 核 细胞 及 其 DNA 的 复杂 性 ， 花 了 很 长 时 间 才 找到 了 追踪 的 线 妆 , 首 先 发 现 核 内 存在 一 类 含量 不 算 太 少 的 RNA， 分 子 很 不 均一 , 无 论 在 体内 或 体外 标 记 实 验 , 可 以 很 快 分 离 得 到 一 系列 标记 化 合 物 。 同 时 证 明了 这 些 化 合 物 不 是 rRNA (18S 和 28S) 及 其 前 体 (45S)。 这 类 RNA 就 被 称 为 不 均一 的 细胞 核 RNA(ChnRNA heteroge- Meous nuclear RNA)。hnRNA 一 般 要 比 细 胞 质 mRNA 大 ， 大 约 从 10S 到 100S。 哺 乳 动 物 hnRNA 和 链 长 在 5,000 到 50,000 核 背 酸 之 间 。 组 织 培养 的 哺乳 动物 细胞 如 世 细胞 , 每 一 细胞 约 含 2pghnRNA ,大 约 是 细胞 质 mRNA 的 四 倍 。

hnRNA 半 寿 期 变化 很 大 ,不 同 种 类 细胞 有 不 同 的 半 寿 期 。 一 般 来 说 hnRNA 半 考 期

。161。

很 短 ;, 比 细胞 质 mRNA BARE ML 细胞 hnRNA 4AIARA 04 小 时 ,而 其 细胞 质 mRNA 半 寿 期 为 1 一 10 小 时 。 海 胆 胚 胎 hnRNA 半 考 期 仅 为 7 分 钟 , 而 其 细胞 质 mRNA AAA 3 小 时 。 很 早 人 们 就 设想 hnRNA 可 能 是 mRNA 的 前 体 ,或 至 少 部 分 是 mRNA. 前 体 。 至 今 已 有 大 量 实验 证 据说 明 这 一 点 ， 而 序列 分 析 的 进展 提供 了 肯定 的 证 据 。 既然: 有 前 体 , 就 必需 经 过 加 工 才能 产生 有 功能 的 成 熟 mRNA。

真 核 生 物 RNA 包括 mRNA 的 转录 具有 与 原核 生物 明显 不 同 的 特点 。 如 转录 起 始 : 信号 有 所 不 同 ( 见 第 二 节 ); 真 核 转录 单位 往往 是 单 顺 反 子 ,不 象 原核 生物 那样 组 织 为 操纵 子 ; 大 多 数 蛋白 基因 以 及 个 别 RNA 基因 〈 如 酵母 )、rRNA RACER AAI 序 , 它 把 同一 结构 基因 分 成 数 段 , 同 时 在 许多 情况 下 , 插 人 顺序 链 长 比 结构 基因 还 长 ;5 随 之 而 来 的 是 ,加 工 过 程 更 为 复杂 等 等 。

hnRNA 是 mRNA 的 前 体

hnRNA 与 mRNA 存在 非常 密切 的 关系 ,表现 为 :

(1) 与 mRNA 相似 ,有 类 似 于 DNA 的 碱 基 组 成 ,而 与 rRNA 碱 基 组 成 很 不 相同 。. 如 HeLa 细胞 hnRNA #&% 43—45% 的 G 十 C， 非 常 类 似 于 细胞 DNA (42—47% 的 G 十 C)， 而 明显 不 同 于 rRNA (>60%K G 十 C)。 当然 亦 有 少数 情况 hnRNA 的 碱 基 组 成 与 DNA 并 不 一 样 , 在 同一 细胞 核 中 不 同 染色 体 上 ， 甚 至 同一 染色 体 不 同 部 分 上 合成 的 hnRNA 碱 基 组 成 亦 是 不 一 样 的 。

(2) hnRNA 有 与 mRNA 相同 的 5 端 hnRNA 5’ 端 具 有 m’G” ppp” NmpNP- 结 构 ， 与 细胞 质 mRNA 5’ 端 相同 。 鼠 世 细胞 hnRNA 与 mRNA 具有 十 分 相似 的 子 端 组 成 ;如 5' 端 为 m7G7ppp*m'AmpG- 的 都 占 20% 5 if 5’ via 4) m’G” ppp” UmpG-Ay AA FI) 1%

(3) hnRNA 的 合成 和 细胞 质 mRNA AR-H, 不 为 低 剂 量 放 线 菌 素 D 所 抑制 《 低 : 剂量 放 线 菌 素 D 能 选择 性 地 抑制 rRNA 的 合成 ), 但 能 为 高 剂量 放 线 菌 素 D 所 抑制 , Be BH hnRNA 与 mRNA 为 同一 类 型 RNA RABMARK, ie hnRNA. 5 mRNA 之 间 存 在 着 前 体 与 产物 关系 的 设想 。

(4) hnRNA 与 细胞 质 mRNA 存在 着 类 似 的 加 上 多 聚 A 过 程 。 大 多 数 真 核 细胞 . mRNA 中 存在 着 3 端 多 聚 A, 而 hnRNA 分 子 中 却 只 有 10-40% BASRA MAS 物 hnRNA 中 多 聚 人 长 度 平均 为 150 一 200 个 核 背 酸 , 而 其 mRNA 中 多 聚 人 长度 为 20 一 200 KB. hnRNA 和 mRNA3’ 端 多 聚 A 不 是 由 DNA 转录 的 , 而 是 转录 后 再 加 上 的 。 细 胞 核 DNA 中 并 不 含有 大 于 50 个 核 苷 酸 的 多 聚 (dA-dT) 顺序 ， 而 hnaRNA 与 mRNA 却 含有 直至 200 个 核 苷 酸 的 多 聚 人 片段 。

3'- 脱 氧 腺 背 能 抑制 rRNA 前 体 合成 和 mRNA 在 细胞 质 中 出 现 ， 但 不 影响 hnRNA 合成 。 进 一 步 研究 表明 3' 脱氧 腺 苷 能 抑制 多 聚 A 合 成 ,结果 阻止 多 聚 A 加 到 hnRNA 与 mRNA 分 子 上 。 由 于 多 聚 A 的 添加 是 mRNA 成 熟 的 重要 一 步 ， 也 是 mRNA vA Ale 质 所 必须 的 ， 所 以 上 述 结 果 并 不 影响 hnRNA 与 mRNA 是 前 体 与 产物 关系 。 细 胞 核 或 细胞 质 中 RNA 加 上 多 聚 A 的 动力 学 是 很 复杂 的 , 不 能 由 此 得 出 hnRNA 与 mRNA 之 间 存 在 着 简单 的 前 体 与 产物 关系 的 结论 。 细 胞 核 中 多 聚 A 顺序 的 消失 ， 一 部 分 是 由 于 多 聚 A 随 mRNA 进入 细胞 质 , 也 有 一 部 分 是 在 细胞 核 内 被 降解 的 。 另外 在 细胞 质 中 也 存 在 着 加 上 多 聚 A 的 作用 。

。 1626

(5) hnRNA 5 mRNA 中 存在 着 相同 的 顺序 。 若 hnRNA 是 细胞 质 mRNA 前 体 ， 那么 hnRNA 将 含有 存在 于 细胞 质 mRNA 中 的 所 有 顺序 。 不 同 细胞 hnRNA 和 细胞 质 mRNA 与 细胞 核 DNA 进行 竞争 杂交 的 实验 清楚 表明 ,在 细胞 质 mRNA 中 存在 的 顺序 都 在 hnRNA 中 ， 但 在 hnRNA 中 却 存在 着 许多 细胞 质 mRNA 中 不 存在 的 顺序 。 这 一 事实 虽 不 是 最 后 证 明 , 但 却 有 力 地 支持 haRNA 是 细胞 质 mRNA 前 体 的 想法 , 同时 也 表 明 hnRNA 的 顺序 要 比 细胞 质 mRNA 复杂 得 多 。 hnRNA 中 大 部 分 顺序 是 不 进入 细胞 质 的 。 目 前 对 留 在 细胞 核 内 的 顺序 知道 得 还 很 少 ， 至 于 为 何 选择 这 些 顺 序 留 在 细胞 核 内 则 更 不 清楚 。

大 多 数 mRNA 是 从 非 重复 顺序 DNA 转录 而 来 。hnRNA 中 重复 顺序 要 比 mRNA 多 ,这 表明 绝 大 部 分 重复 顺序 已 在 细胞 核 内 降解 。hnRNA 中 重复 顺序 大 多 在 5 端 , 而 非 重复 顺序 在 3 端 ,因此 很 可 能 mRNA 主要 从 邻近 hnRNA3' 端的 非 重复 顺序 得 来 。( 图 5-22)。

(6) 在 hnRNA 中 存在 特异 性 mRNA 顺序 。hnRNA 能 和 与 细胞 质 特 异性 mRNA 互补 的 DNA 或 RNA 进行 杂交 。 与 鸭 珠 蛋白 mRNA 互补 的 DNA 能 与 鸭 红 细胞 28- 100S hnRNA 进行 杂交 ， 这 表明 在 较 大 的 鸭 红 细胞 hoRNA 中 存在 有 珠 蛋 白 mRNA 顺 序 。 卵 清 蛋白 mRNA 顺序 亦 在 鸡 输卵管 hnRNA 中 测 到 。

在 病毒 转化 细胞 中 ，hnRNA 能 与 转化 细胞 所 用 的 病毒 DNA 或 RNA 进行 杂交 。 SV40 转化 的 细胞 中 含有 SV40DNA ， 它 与 细胞 染色 体 共 价 结合 。 通过 杂交 试验 可 以 证 明 在 转化 细胞 hnaRNA 与 多 核糖 体 RNA (主要 是 细胞 质 mRNA) 中 存在 SV40 特异 性 顺序 。 双 股 SV40DNA 分 子 量 为 3 x 10'd, 而 含有 SV40 特异 性 顺序 的 hnRNA 分 子 量 为 1.5 一 4 x 105d, SA SV40 特异 性 顺序 的 mRNA 分 子 量 为 -0.5 Xx 105d。 这 表明 SV40 转化 细胞 转录 的 RNA 要 比 单 股 SV40DNA 或 细胞 质 中 发 现 的 SV40 病毒 特异 性 mRNA 要 长 。 另 外 在 腺 病毒 与 疱疹 病毒 转化 的 细胞 中 都 已 发 现存 在 着 病毒 特异 性 顺序 的 hnRNA 与 细胞 质 mRNA。 鼠 乳腺 肿瘤 病毒 特异 性 RNA 顺序 亦 存在 于 肿瘤 细胞 hnRNA 与 细胞 质 mRNA 中 。 所 以 在 hnRNA 中 存在 着 与 正常 顺序 共 价 连结 的 病毒 特异 性 顺序 ， 这 可 能 是 病毒 转化 细胞 的 一 种 普遍 现象 。 这 一 点 尽管 还 不 能 最 终 证 明 hnRNA 是 mRNA 前 体 ,但 与 hnRNA 是 mRNA 前 体 的 想法 相符 。

(7) hnRNA 能 被 翻译 为 特定 蛋白 质 。hnRNA 能 为 核糖 体 特 异性 识别 ,表明 hnRNA 含有 与 核糖 体 特异 性 结合 位 置 。 这 种 结合 类 似 于 mRNA 与 核糖 体 结合 ， 需 要 特异 性 蛋 白 因子 (可 能 就 是 起 动因 子 ), 同 时 这 种 结合 又 为 蛋白 质 合 成 起 动 抑 制剂 所 抑制 。

hnRNA 中 存在 mRNA 顺序 的 更 为 直接 的 证 据 是 hnRNA 能 在 体外 蛋白 质 合 成 系 统 中 被 翻译 。 如 合成 珠 蛋 白细胞 ( 鼠 胚胎 肝 细 胞 与 鸡 非 成 熟 红细胞 等 ) 的 hnRNA ,在 爪 蟾 卵 母 细胞 中 与 无 细胞 蛋白 质 合成 系统 中 都 能 促进 珠 蛋 白 合成 ,而 用 脑 细胞 hoRNA 就 观察 不 到 珠 蛋 白 的 合 记 。 来 自 各 种 组 织 的 hnRNA 都 可 在 体外 蛋白 质 合成 系统 中 被 翻译 为 多 肽 ,但 翻译 产物 往往 要 比 mRNA 复杂 。 如 鸡 非 成 熟 红细胞 hnRNA 在 无 细胞 蛋白 质 合 成 系统 中 翻译 为 珠 蛋白 的 量 不 到 总 翻译 量 的 20 多 ,而 其 细胞 质 mRNA 翻译 产物 70 多 以 上 是 珠 蛋 白 。 如 用 鸡 网 织 红细胞 hnRNA 进行 体外 翻译 ， 所 产生 的 珠 蛋 白 “与 8 链 之 间 比例 亦 与 其 珠 蛋白 mRNA 翻译 产物 不 同 。 此 种 差别 不 仅 是 因为 hnRNA 种 类 复杂 ， 还 可 能 与 hnRNA 有 比 mRNA 更 为 复杂 的 二 级 与 三 级 结构 有 关 。

"163。

综 上 所 述 ，hnRNA 与 mRNA 之 间 具 有 密切 关系 ,虽然 不 能 说 全 部 ,至 少 部 分 hnRNA 是 mRNA 的 前 体 。 实 验 表 明 , 只 有 10—40% hnRNA 分 子 具 有 多 聚 A， 而 3 端的 多 聚 A 被 认为 是 mRNA 进 人 细胞质 所 必须 的 , 那么 不 具有 3’ 端 多 聚 人 的 hnRNA 分 子 是 不 是 mRNA 前 体 ? 没有 多 聚 A 的 被 严格 限制 在 核 内 的 hnRNA 功能 是 什么 ” 这 些 问 题目 前 还 不 能 得 到 满意 的 回答 。

在 分 离 纯化 hnRNA 时 遇 到 一 个 很 大 的 困难 ,就 是 hnRNA 很 易 聚 合 ,在 温和 条 件 下 hnRNA 解 聚 不 完全 ,而 在 强烈 变性 条 件 下 则 又 会 引起 hnRNA 降解 ， 因 此 要 分 离 纯化 到 完整 的 hnRNA 并 准确 地 测定 其 大 小 是 困难 的 。

hnRNA 的 分 子 结构

上 节 提 到 ，hnRNA 与 mRNA 具有 相似 的 5 帽子 结构 和 3' 多 聚 A 未 端 。 由 于 发 现 有 形成 帽子 结构 和 附加 多 聚 A 的 酶 ,( 见 “mRNA 前 体 的 加 工 ” 一 节 )， 因 此 ,hnRNA 并 不 是 转录 的 原始 产物 。 此 外 ，hnRNA 的 5 端 一 般 有 3 TRU GHEE, 每 个 长 约 30 个 核 昔 酸 ,这 些 片段 似 由 DNA 转录 而 来 。 图 5-22 是 hnRNA 的 分 子 结构 示意 图 。

mRNA 部 分

CAR Prt INEULEUE

5/

3/ :nmTCG37 x -UJ < 000. Ja Ly eet Jal .11 一 一 一 一 一 一 一 一 一 A.…A miGrppp* Nmp Np-U-+---U-U-U-UU + dsRNA dsRNA gua ， 帽子 区 i

mC Mt FS

5-22 haRNA 的 分 子 结构 示意 图

hnRNA 分 子 中 分 散 着 重复 顺序 与 非 重 复 硕 序 ,它们 的 数量 、 长 短 和 分 布 随 细胞 种 类 不 同 而 不 同 。 鼠 腹水 细胞 hnRNA 中 ,28 多 是 1,200 个 核 苷 酸 长 的 非 重复 顺序 分 散在 200 个 核 背 酸 长 的 重复 顺序 中 ,而 43% 则 是 由 900 个 核 背 酸 长 的 非 重复 顺序 分 散 于 200 TK 苷 酸 长 的 重复 有 顺序 中 。HeLa 细胞 hnRNA3”′ 端 多 聚 A 旁 有 一 非 重 复 顺 序 , 它 的 长 度 类 似 或 稍 大 于 其 mRNA 平均 长 度 。 除 这 一 特殊 区 域外 ，HeLa 细胞 hnRNA 中 非 重复 顺序 均匀 地 分 散 于 重复 顺序 之 中 。 海 胆 胚 胎 hnRNA 中 也 存在 大 量 800 个 核 昔 酸 长 的 非 重复 顺序 ,它们 分 散 于 300 RARE ES MMF ZH, hnRNA 的 主要 部 分 是 由 DNA 中 非 重复 顺序 和 重复 顺序 转录 而 来 。

hnRNA 的 另 一 特点 是 大 多 数 hnRNA 都 含有 茎 环 结构 即 dsRNA 区 ,这 种 茎 环 结构 是 由 分 子 内 碱 基 配 对 形成 的 。 这 种 葵 环 结构 并 不 多 ， 可 能 位 于 或 靠近 编码 蛋 白 质 的 非 重 复 顺 序 两 端 。 将 hnRNA 用 核酸 酶 处 理 而 后 用 羟基 础 灰 石 柱 或 纤维 素 柱 吸附 可 分 离 制 备 到 葵 环 区 。 鼠 肝 细 胞 hnRNA 中 葵 环 区 长 约 60 RAR. 鼠 腹 水 细胞 haRNA HS 环 区 长 分 别 为 10 一 20 个 与 100 FRA.

和 细胞 质 mRNA 一 样 ,在 hnRNA HIPAA N° EWR Ee

。164 。

真 核 生 物 mRNA 基因 中 的 插 人 顺序 (内 含 子 ) 被 转录 在 hnRNA 分 子 中

在 DNA 结构 一 章 曾 经 提 到 ,许多 真 核 蛋白 质 基 因 含 有 内 含 子 。 这 种 结构 基因 的 不 连续 现象 正在 越 来 越 多 地 出 现 , 看 来 这 是 真 核 生 物 所 特有 的 普遍 现象 。 除了 第 二 章 提 到 的 例子 外 ， 下 面 二 个 基因 也 是 研究 较为 详细 的 。 鸡 卵 白 蛋白 基因 含有 多 至 七 个 内 含 子 和 八 个 外 显 子 (图 5-23)。 腺 病毒 Ad2 的 Hexon 〈 一 种 主要 外 壳 蛋 百 ) mRNA 基因 在 外 显 子 间 存 在 三 个 内 含 子 , 见 图 5-24。

8 9 10 O41 2-35 2 sy eae Kb i, 和 7 Re mRNA

图 5-23 ” 鸡 卵 白 蛋白 基因 中 的 插入 顺序 部 分 黑色 为 外 显 子 ; 外 显 子 间 为 内 含 子 。

mRNA

0 2480p1!0 80503400 35000 1000 2350 图 5-24 Ad2 Hexon mRNA 基因 区 域 黑色 部 分 代表 外 显 了 于 ; 外 显 子 间 为 内 含 子 ; 图 中 数目 字 代 表 核 苷 酸 对 数 。

从 已 研究 的 蛋白 基因 中 内 含 子 情况 可 以 看 出 ， 在 一 个 基因 中 往往 有 多 个 内 含 子 ， 同 和 时， 内 合子 的 总 链 长 比 结构 基因 编码 部 分 还 要 长 ,甚至 长 得 多 。 至 于 内 含 子 的 生物 功能 ， 目前 还 是 很 不 清楚 的 ， 除 了 第 二 章 提 到 的 可 能 功能 外 ， 近 年 来 有 的 实验 指出 ， 个 别 基 因 中 的 内 含 子 是 另 一 基因 的 外 显 子 ， 表 明 这 段 DNA 序列 具有 明确 的 生物 功能 。 还 发 现 ， 在 酵母 线粒体 的 个 别 内 含 子 中 同时 存在 起 始 密码 子 和 终止 密码 子 ， 它 们 编码 一 个 235 个 氨基 酸 的 蛋白 质 , 表 明 内 含 子 本 身 可 能 是 一 个 独立 的 结构 基因 。

由 于 成 熟 mRNA 并 不 含有 这 些 内 含 子 , 因 此 有 人 曾经 提出 ,可 能 在 RNA 聚合 酶 进 FERN, MAR ERO A MAIS, AS TRRER, RAKE 设 被 否定 ， 而 代 之 以 下 述 结论 : 内 含 子 和 外 显 子 一 起 被 转录 为 原始 转录 产物 ， 然 后 加 工 为 mRNA,

hnRNA 含有 与 内 含 子 互补 顺序 是 内 含 子 与 外 显 子 一 起 被 转录 的 很 有 力 的 证 据 。8 珠 蛋白 mRNA 前 体能 与 8 珠 蛋白 基因 完全 互补 ， 实 验 是 这 样 进 行 的 : 用 同位 素 短 时 间 标 记 细 胞 核 RNA ,得 到 一 个 15S RNA , 它 具 有 与 10S 的 8 REA mRNA 相似 的 5 端 帽子 结构 和 3 端 多 聚 A 顺序 , 而 且 与 8 珠 蛋 白 基 因 的 长 度 相当 , 因此 , 一 般 认 为 15S RNA 是 1088 珠 蛋 白 mRNA 的 前 体 。 将 6 珠 蛋白 基因 片段 分 别 与 纯化 的 15S RNA 和 10S mRNA 杂交 ,在 电镜 下 观察 形成 的 R 环 (RNA 与 DNA 杂交 后 所 形成 的 环 )， 结 果 发 现 15SRNA

*。165。

与 DNA 形成 的 R 环 是 完全 互补 的 ， 而 10SmRNA 与 DNA 杂交 时 ， 则 有 DNA 球 出 现 ,说 明 15SRNA 中 含有 与 内 含 子 互补 的 顺序 ,在 10SmRNA 中 。 这 个 顺序 已 被 遇 夫 《加 A254 A B

一

5-25 15S 珠 蛋白 mRNA 前 体 (A) 和 10S HAA mRNA(B) 分 别 与 含 珠 蛋 白 基 因 的 DNA 片 女 杂交 的 电镜 示意 图 箭 号 指出 的 R 环 是 RNA-DNA 杂交 链 ， 粗 线 为 双 链 细 线 为 单 链 。

FSS, 核酸 酶 降解 技术 也 说 明了 免疫 球 蛋白 轻 链 mRNA 前 体 上 含有 与 内 含 子 互 补 的

顺序 。 将 轻 链 mRNA 在 引物 存在 下 进行 反 转 录 , 可 以 得 到 两 种 产物 ,一 种 在 不 变 区 〈C), Aik, cDNA 链 长 为 200 一 300 核 昔 酸 ; 另 一 种 含有 不 变 区 和 可 变 区 (C 十 V), 其 链 长

约 500 一 700 RHR. 用 同位 素 标 记 DNA, Ra DNA 或 RNA 杂交 。 如 果 这 些 . DNA 与 RNA 是 连续 的 ( 即 无 内 含 子 ), 那 么 杂交 体 是 完全 抗 S， 核 酸 酶 的 ; 如 果 含 有 内 含 子 的 DNA 或 RNA 与 之 杂交 ,由 于 S, 酶 是 专 一 水 解 单 链 或 错 配 对 区 的 ( 见 第 三 章 )， 因此 将 得 到 的 是 部 分 抗 S 核酸 酶 的 结果 。 FAP 标记 的 (C+ V) cDNA 与 纯化 的 轻 : 链 mRNA 杂交 后 用 S, 酶 处 理 ,， 得 到 约 700 核 昔 酸 的 标记 DNA， 说 明 是 完全 抗 S， 酶 的 ; 若 用 轻 链 mRNA 的 27S 前 体 进 行 同样 杂交 ， 酶 解 后 ， 仅 得 到 290 核 昔 酸 长 的 标记 cDNA， 表 明 是 部 分 抗 S, 酶 的 ;用 含 轻 链 基 因 的 DNA 片段 与 (V+C)cDNA #2,H% S: 酶 处 理 , 也 得 到 295 BBR S. 酶 的 EDNA。 上 述 实验 充分 说 明 , 在 免疫 球 蛋 白 轻 链 mRNA 前 体 上 含有 在 可 变 区 与 不 变 区 间 的 内 含 子 ， 同 时 该 顺序 是 与 结构 基因 同时 转录 的 。

目前 尚 没 发 现 内 含 子 不 被 转录 的 例子 ，rRNA、tRNA 基因 中 的 插 人 顺序 (如 果 存 在 的 话 ) 也 都 是 同时 转录 在 前 体 分 子 之 中 的 ( 见 下 文 )。

真 核 生 物 mRNA 基因 结构 及 上 游 的 转录 调控 部 位 如 图 5-26 所 示 (也 参阅 图 5-2)v 原始 转录 产物 中 除了 内 含 子 外 ,也 包括 两 端的 非 编码 区 。

上 游 9 端 :5“- 非 编 ; :3“- 非 编 下 游 3 端 ‘mk : : 码 区 : | ei 5! SE 3! SUM Sw mRNA 前 体

图 5-26 真 核 生 物 mRNA 基因 结构 及 上 游 调控 部 位

* 166。

mRNA 前 体 的 加 工

原始 转录 产物 通过 hnRNA 变 为 成 熟 的 mRNA ， 需 要 经 过 下 列 一 些 步骤 :

1. hnRNA 被 剪接 (splicing)， 除 去 由 内 含 子 转录 来 的 序列 , 将 含 信 息 的 结构 部 分 联 接 起 来 ;

2.5 端 帽子 的 形成 ;

3. 3 端 多 聚 A 的 附加 ;

4. 内 部 顺序 的 甲 基 化 。

关于 mRNA ARH HR

在 mRNA 的 原始 转录 产物 中 ,内 含 子 转录 顺序 是 如 何 被 剪接 的 呢 ? 目前 , 除了 个 别 报道 如 四 腊 虫 RNA 前 体 的 剪接 可 以 自我 催化 外 ( 见 下 文 ), 一 般 认 为 是 存在 一 个 剪接 酶 系 , 但 是 迄今 并 不 像 cRNA 和 tRNA 加 工 酶 那样 已 被 纯化 ; 同时 由 于 加 工 可 能 在 核 蛋白 颗粒 〈hnRNP) 内 进行 ,所 以 情况 更 为 复杂 。 后 来 发 现 有 些 由 细胞 核 小 分 子 RNA 构成 的 核 蛋白 〈snRNP) 离心 时 常 与 hnRNP 一 起 沉降 ,因而 提出 snaRNA 可 能 与 hnRNA 剪 接 有 关 。 关 于 snRNA 的 结构 与 功能 见 第 八 章 。

剪接 酶 和 snRNA 等 究竟 怎样 与 hnRNA 发 生 关 系 呢 ? 比较 了 近 四 十 个 内 含 子 与 外 显 子 联接 部 位 附近 的 核 苷 酸 序列 ,并 没有 找到 令 人 信服 的 通常 为 酶 识别 的 二 元 对 称 结构 ， 但 是 在 接头 处 都 存在 不 太 长 的 同 源 顺 序 ( 见 图 5-27)。 这 个 同 源 顺 序 正好 与 某 些 snRNA 如 UIRNA 有 约 15 对 碱 基 配 对 , 因此 推测 正 是 形成 这 样 的 特殊 高 级 结构 而 为 酶 所 剪接 。 关于 UIRNA 与 haRNA 中 内 含 子 和 外 显 子 联接 部 位 互补 可 能 方式 见 第 八 章 图 8-2,

C 1 1 0 2s 3 213099 4 的 六 work, OF a0 7 A 7,31; 4 }-} 0. 25.) 27 . 4 Set OR Sse eee GO FM26 -0 4 G Ter hee 23.0 37) 0 4 8 4 3S ee eee ee 88 Ole el ca 23 0 0 0-39. 4) Soo Tee 2GeeS 2S 22 ae LS ete e172) Oo

A~ A G6 G UA’ Ar‘@ 加 EU OO eS us us Oe. Acie G

c Ga Che cle

外 显 子 内 含 子 外 显 子 5-27 mRNA 前 体 中 内 含 子 与 外 显 子 联接 部 位 附近 的 核 苷 酸 的 分 布 几率 用 数字 表示 及 其 同 源 性

关于 mRNA 剪接 酶 的 纯化 及 其 作用 方式 目前 了 解 得 还 很 少 。

5 痪 帽子 的 形成

5 端 帽子 结构 存在 于 hnRNA 中 , 它 在 转录 的 早期 阶段 甚至 可 能 在 转录 终止 前 形成 。 帽子 结构 的 形成 与 3 taht Ms RA 和 内 含 子 的 剪 切 都 可 能 与 核 中 mRNA 前 体 转 变 为 细 胞 质 mRNA 有 关 。 关于 戴 帽 机 制 主要 来 自 对 病毒 mRNA 的 研究 结果 ， 实 验 表 明 戴 巾 有 两 种 途径 :

C1) 转录 起 始 不 久 进 行 戴 帽 一 一 从 原始 转录 产物 3 端 三 磷酸 脱 去 一 个 磷酸 ,然后 与

。 167。

GTP 反应 生成 5 ,5” 三 磷酸 联结 的 键 ， 并 释放 出 无 机 焦 磷 酸 ; 最 后 以 SREP RS (SAM) 进行 甲 基 化 产生 帽子 结构 。

pppXpYpZp:----- (Tp PPXPYpZp ls = Biet (+pi) rt, eee ppp’ XpYpZp--:-:: (+ ppi) SR ae wv iy ppp’ XpYpZp:-++:: (+S-RA SAB) SAME is oo = a jai PPpPp”XmpYPZD 〈 十 S- 腺 苷 高 半 胱 氨 酸 )

以 这 种 方式 戴 帽 的 为 呼 肠 孤 病毒 和 牛 总 病毒 RNA。 催 化 上 述 反 应 的 酶 分 别 是 :CDJRNA 三 磷酸 酶 ，(2) mRNA 鸟 背 酰 转移 酶 ,(3) mRNA ( 鸟 呀 吟 一 7) 甲 基 转移 酶 ，(4) mRNA ( 核 昔 -2") 甲 基 转 移 酶 ,也 叫 2'-0 甲 基 转 移 酶 。 这 些 酶 都 已 从 牛痘 病毒 纯化 ， 从 其 他 病毒 和 动物 组 织 中 也 测 到 或 纯化 了 这 些 酶 。 牛 斗 病 毒 中 的 酶 (2) 和 了 酶 (3) 无 论 用 亲 和 层 析 或 离子 交换 柱 层 析 都 很 难 分 开 , 纯 化 的 酶 (2 ) 分 子 量 为 127,000d, 含 二 条 链 ( 分 子 量 分 别 为 95,000d 和 31,400d)。 此 酶 专 一 底 物 是 5 端 为 二 磷酸 的 mRNA 或 多 聚 A 或 多 聚 Go (3) 的 甲 基 供 体 是 SAM, 专 一 甲 基 化 帽子 上 的 G。2'-o- 甲 基 转 移 酶 也 是 以 SAM HUE, 专 一 甲 基 化 mRNA5' 端的 第 一 个 核 苷 酸 的 核糖 2'- SIE, BSD FEY 38,000d, 以 pbN、 ppN 或 G” “pppN 结尾 的 RNA 不 能 作为 酶 的 底 物 , 而 未 端 为 mGzpppzxN 的 多 聚 及 和 多 聚 工 是 最 好 的 底 物 。

(2) 戴 帽 是 在 剪 切 后 进行 一 这 种 戴 帽 方式 以 疱疹 口 炎 病 毒 RNA 为 代表 首先 用 剪 切 酶 (可 能 是 RNaseIIT) 切 开 转 录 的 RNA 链 , 产 生 5’ 磷酸 末端 ,然后 形成 子 , 5 三 磷酸 联结 的 键 ， 并 甲 基 化 得 到 帽子 结构 。

pppNp ev ee ee pN’pN’’pN’”’p oo Pie wim RNaselll 一 一 一 一 一 :2

te G*ppp”N’pN”’pN’"+ ++ +++ (BAS ade OEE FA Lee eS RP BY A BEM mRNA 合成 、 输 送 及 在 翻译 中 的 影响 。 S- tubercidinyl homocysteine 能 有 效 地 抑制 Novikoff 肝癌 mRNA 帽子 上 的 核糖 2 = 里 基 化 和 RNA 内 部 的 A 的 6- 甲 基 化 ,但 不 影响 帽子 mG 的 生成 。 由 于 该 抑制 剂 并 不 抑制 细 胞 的 生存 ,所 以 核糖 的 2- 甲 基 化 或 链 内 部 A 的 6- 甲 基 化 被 认为 对 于 mRNA 从 细胞 核 输 送 至 细胞 质 以 及 随后 进行 翻译 是 不 必需 的 。 环 亮 氨 酸 (Cycloleucine) 是 L-Met S-PREIE 转移 酶 的 竞争 性 抑制 剂 ， 能 阻 断 肉瘤 病毒 RNA 帽子 上 的 核糖 和 链 内 部 的 甲 基 化 ， 但 不 Silat GA 7- 甲 基 化 ， 对 病毒 复制 也 无 明显 影响 ,表明 核糖 和 内 部 甲 基 化 对 于 该 病 毒 RNA 的 合成 ,加 工 和 输送 也 不 是 必需 的 。 相反 ， 腺 苷 高 半 胱 氮 酸 类 似 物 5 -脱氧 -5 一 异 丁 酰基 腺 苷 却 能 抑制 劳 氏 肉 瘤 生 长 90% 以 上 , 分 析 表 明 ，, 该 抑制 剂 可 能 抑制 mRNA ( 鸟 味 叭 -7) 甲 基 转 移 酶 ， 而 这 个 酶 对

。 168。

mRNA 合成 是 很 重要 的 。 3 端 多 聚 A 的 附加

多 聚 A 的 附加 是 在 多 聚 A 聚 合 酶 即 RNA 末端 腺 昔 酸 转移 酶 催化 下 完成 的 。 该 酶 : 以 具 3OH 的 RNA 为 受 体 ，ATP 作 供 体 ， 需 Mg? 或 Mn+, 其 他 NTP 特别 是 GTP 是 聚合 酶 的 抑制 剂 。 大 部 分 多 聚 A 聚合 酶 存在 于 细胞 核 内 ,但 在 某 些 来 源 的 细胞 质 . 中 也 发 现 有 酶 的 活性 。

SR + nATP WER MD 多 核 昔 酸 (Adm + nppi

对 腺 病毒 MRNA 的 研究 揭示 ,转录 时 RNA 聚合 酶 并 不 在 mRNA 末端 处 停止 , 因 此 ,在 附加 多 聚 人 前 需要 修剪 3 未 端 。 前 面 提 到 ，hnRNA 和 成 熟 mRNA 两 者 都 能 测 出 多 聚 A 尾 巴 。 随 着 生活 时 期 的 变化 ,多 聚 A 的 链 长 逐渐 缩短 。

序列 分 析 表 明 ,在 mRNA- 多 聚 A 接 头 附近 ,并 无 同 源 顺序 。 但 在 许多 真 核 mRNA HY 2 AEA 5! 端 起 约 13 一 20 核 背 酸 处 ,发现 一 个 同 源 区 AAUAAA, 这 被 认为 可 能 是 多 聚 A- 附加 的 识别 部 位 。

mRNA 的 内 部 甲 基 化

mRNA 内 部 甲 基 化 主要 指 msA 的 生成 。 一 些 实验 说 明 , & mA 的 顺序 在 hnRNA; 中 已 经 存在 ， 同时 在 加 工 中 被 保存 。 一 般 来 说 ，m5A 在 真 核 生物 或 病毒 mRNA 的 内 部 位 置 是 不 确切 的 ,但 在 HeLa 和 工 细胞 中 ,在 SV40 晚期 mRNA 中 分 离 到 两 个 含 mA

顺序 :Apm'ApCp 和 Gpm'ApCp。 由 于 许多 病毒 和 细胞 mRNA 并 不 存在 mA， 似乎 这

个 修饰 成 分 对 mRNA 翻译 不 是 必要 的 。

我 们 已 经 讨论 了 DNA 模板 、RNA 的 原始 转录 产物 和 mRNA 成 熟 的 各 个 步骤 。 这 些 过 程 大 多 是 在 细胞 核 内 完成 的 。 但 是 mRNA 在 细胞 内 的 状态 是 怎样 的 呢 ? 它 是 怎样 由 细胞 核 运 到 细胞 质 中 的 呢 ? 现在 了 解 到 在 真 核 生 物 中 ，mRNA 在 其 生命 的 所 有 过 程 . 中 都 是 以 核 蛋白 复合 物 形 式 存在 的 ， 这 种 复合 形式 可 能 是 一 种 调节 mRNA 由 细胞 核 向 细胞 质 运 输 的 形式 ,也 可 能 是 细胞 内 保卫 mRNA 的 一 种 方式 , 还 可 能 是 在 mRNA 的 翻 译 水 平 上 调节 蛋白质 生 物 合成 的 一 种 形式 。 这 种 mRNA 与 蛋白 质 组 成 的 复合 物 不 同 于 核糖 体 (ribosome) 〈 见 第 六 章 ) , 兽 被 称 为 信息 体 (informasome)。 信息 体 的 沉降 系数 与 其 中 RNA 的 沉降 系数 有 关 ,一 般 比 RNA 大 2 一 2.5 倍 ; 当 mRNA 分 子 不 均一 时 , 信息 体 显示 出 不 均一 的 沉降 分 布 ,但 如 仅 一 种 mRNA 存在 ,信息 体 是 均一 的 。 信 息 体 在 CsCl 中 的 沉降 密度 为 1.46g/cms 到 1.36g/cms, 介 平 蛋 白质 (1.2—1.3 gs/cm ) 和 RNA(1.9 一 2.0g/ cm ) 之 间 , 用 放射 性 尿 喀 啶 或 放射 性 氨基 酸 标 记 时 ， 信息 体 都 带 有 放射 性 , 说 明 信 息 体 含 有 -RNA 和 蛋白质 。*

实验 证 明 信 息 体 不 是 人 为 的 矫 作物 ,其 中 的 RNA 是 mRNA 〔 能 与 DNA 杂交 ，, 在 无 细胞 系统 中 被 翻译 ) ,从 不 同 来 源 的 信息 体 中 可 分 离 出 多 种 多 肽 或 蛋白 质 ， 其 中 许多 组 分 的 分 子 量 已 经 测定 。

hnRNA 也 是 以 核 蛋 白 颗 粒 形式 存在 , 即 生成 hnRNA 颗粒 ,在 这 些 颗 粒 中 约 含 20 允 RNA 和 80% 蛋白 质 。 有 人 已 经 测 出 hnRNA 颗粒 中 存在 多 聚 A 聚 合 酶 、 戴 帽 的 酶 、 核

es。 169 。

和 酸 酶 和 蛋白 激酶 等 酶 的 活性 ,甚至 认为 boRNA 剪接 酶 系 也 可 能 存在 于 hnRNP 颗粒 中 ， 这 对 于 hnRNA 加 工 的 研究 无 疑 是 很 有 意义 的 。

五 、rRNA 的 转录 与 加 工

rRNA 的 结构 与 功能 分 别 在 第 三 章 和 第 六 章 进 行 讨论 。 以 rDNA 为 模板 在 RNA 聚合 酶 ( 真 核 生 物 为 RNA 聚合 酶 ID) 催化 下 得 到 的 原始 转录 产物 是 rRNA 前 体 , 然 后 经 -过 逐步 加 工 成 为 成 熟 的 rRNA 分 子 。

rRNA 基因 (rDNA) 与 rRNA 前 体

在 细菌 基因 组 中 ,一 个 转录 单位 内 含 三 个 rRNA 基因 ,同时 插 人 多 个 RNA BAR 一 定 顺 序 排 列 在 一 起 。 构 成 大 肠 杆 菌 的 转录 单位 约 有 5,300—5,500 碱 基 对 ， 转 录 后 得 到 30S 的 rRNA 前 体 。 前 体 分 子 可 从 缺乏 RNaselll 加 工 酶 的 突变 株 中 分 离 。

BK rRNA 基因 一 般 是 中 度 重 复 顺 序 ,不 同 生物 的 拷贝 数 在 五 十 至 几 千 之 间 ， 它 们 成 往 排 列 在 一 起 。 哺 乳 动物 的 每 一 重复 单位 包括 18S.5.8S 和 28SrRNA 序列 , 彼此 被 隔 间 区 所 分 开 ， 转 录 产 生 一 个 长 的 rRNA 前 体 。 不 同 生物 的 rRNA 前 体 大 小 是 不 一 样 的 ,如 哺乳 动物 为 45S, 爪 蟾 40S, 果 蝇 38S ,酵母 37S。rDNA PHA IA CVS) 存在 情况 也 有 不 同 , 有 的 不 存在 IVS， 有 的 有 一 个 或 两 个 IVS; 个 别 基 因 内 带 有 缺口 〈gap)73; AM

表 5-8 rRNA 基因 (rDNA) 的 种 类

生物 来 源 基 A 顺序 rRNA 前 体 原核 生物 16S-tRNA-23S-5S-rRNA 30S 大 鼠 、 小 鼠 、 人 18S-5.8S-28S 45S IT 86 18S-5.8S-28S 40S Ear 18S-5.8S-2S-28S,-{jk H-28S, 38S 酵母 17S-5.8S-26S 37S SR il Bs 19S-5.8S-28S,-IVS,-28S,-IVS,-28S, 40s Po fea rh 17S-5.8S-26S,-IVS,-28S, >35S Alt} Sw 16S-5.8S-26S。- 缺 口 -26Sp

WNBA tRNA-12S-tRNA-16S-tRNA

酵母 15S-tRNA-21S,-IVS-21S,

pt ae 17S-tRNA-25S,-IVS-25S,-tRNA

EKER 16S-tRNA-23S-4.5S-5S

AR 16S-tRNA-23S-5S

Kk 16S-tRNA-7S-3S-23S,-IVS-23S,-5S

*Ivs 代表 插 人 顺序 。 摘自 Ann. Rev. Biochem., 1982, 51, 642,

体 和 叶绿体 的 rDNA 具有 与 原核 生物 类 似 的 基因 排列 ， 但 本 身 存 在 某 些 特点 《〈 见 第 人 章 )。 表 5-8 列 出 已 知 rRNA 基因 的 种 类 。 从 表 5-8 可 以 看 到 rDNA 具有 下 列 一 些 特 性 :

* 170°

C1) 基因 的 极 性 是 保守 的 : BY 16—18SRNA 在 前 体 的 5 端 ,而 23—28S RNA 在 3 端 。

(2) 原核 生物 和 叶绿体 基因 的 3 ta SS rDNA。

(3) 原核 生物 \. 叶 绿 体 和 线粒体 的 rRNA 基因 中 连 有 tRNA 基因 ,有 的 在 内 部 ， 有 的 在 两 端 。

(4) 真 核 生 物 rRNA 基因 与 5S rDNA 和 tDNA 分 离 , 代 之 以 5.8S rDNA, FFE 16 一 18S rDNA 与 26 一 28S rDNA 之 间 。 不 同 真 核 生 物 5S rDNA 虽 都 是 一 个 独立 的 转 录 单 位 ,但 分 布 却 有 不 同 ( 见 第 二 章 )。

《5) 高 等 植物 时 绿 体 基因 含 4.5S rDNA。

rDNA 经 过 转录 得 到 与 rDNA 同样 大 小 的 rRNA 前 体 , 其 中 包括 tRNA 前 体 、 间 由 区 以 及 插 人 顺序 等 。 在 正常 情况 下 , 迅速 被 加 工 为 成 熟 的 rRNA 和 tRNA ZF. 但 是 某 些 缺 乏 加 工 酶 的 变异 株 或 用 氧 霉 素 处 理 细 胞 使 蛋白 质 合成 受阻 ， 则 大 量 堆 积 核酸 原 始 前 体 或 中 间 前 体 , 这 是 研究 加 工 过程 和 加 工 酶 性 质 的 很 好 材料 ,许多 结果 就 是 通过 分 离 鉴定 中 间 前 体 而 得 到 的 。

rRNA 前 体 的 加 工

rRNA 前 体 的 加 工 也 是 在 一 系列 酶 催化 下 进行 的 。 与 rRNA 前 体 加 工 有 关 的 酶 主 要 有 二 类 :〈i) 能 使 前 体 被 剪 切 成 一 定 链 长 的 rRNA 分 子 , 这 类 RNA 加 工 酶 中 研究 得 较 多 的 有 大 肠 杆 菌 RNaseII，RNaseE ， 枯 草 杆 菌 RNaseM5 等 。 真 核 生物 也 有 类 似 的 加 工 酶 活性 。(iib) 修 饰 酶 ,催化 rRNA 中 修饰 成 分 的 形成 。rRNA( 除 5S RNA 外 ) 都 含有 修 饰 成 分 ,主要 是 核糖 2 位 的 甲 基 化 以 及 一 些 特 诛 的 修饰 碱 基 〈 如 m'ncp’> 等 见 第 一 章 )。 对 rRNA 修饰 酶 的 研究 远 没 有 tRNA 修饰 梅 的 详细 和 深 人 。

图 5-28 是 大 肠 杆 菌 RNA 加 工 变异 的 基因 图 ，RNA 加 工 基因 在 圆圈 的 内 部 , 其 中 与 rRNA 有 关 的 是 rnc(RNaseIII 基因 ) 和 rne(RNaseE 基因 ), 其 他 几 个 则 与 tRNA 加 工 有 关 ( 见 第 六 节 )。 由 于 原核 生物 的 rDNA 中 通常 插 有 rDNA， 因 此 其 原始 转录 产物 的

purC

图 5-28 大 肠 杆菌 K-12 中 RNA 加 工 变异 的 基因 图 fnc，RNaseIII; rne，RNaseE; rnd, RNaseD; rnp, RNaseP (rnpA 变异 影响 RNaseP 中 的 多 肽 组 分 ，rnpB 变异 则 影响 其 中 的 RNA 组 分 ); cca,tRNA 核 苷 酰 转移 酶 。

st

加 工 是 两 者 同时 进行 的 。

RNaseIII 是 一 个 内 切 核酸 酶 ,虽然 在 一 定 条 件 下 能 作用 于 单 链 RNA， 但 该 酶 的 识别 部 位 为 特定 的 螺旋 区 。1973 年 发 现 它 与 rRNA 前 体 加 工 有 关 ，, 它 水 解 rRNA 前 体 产生 16S 和 23S rRNA 部 分 。RNaseIII 由 两 个 相同 的 分 子 量 为 25,000 WWMM, KAS RNA 组 分 (用 于 tRNA 前 体 加 工 的 RNaseP 含 2/3 RNA， 见 第 六 节 )。 RNaselll 识别 rRNA 前 体 以 及 T7 WEES mRNA 前 体 的 位 点 已 经 确定 ,被 认为 与 RNA 双 螺旋 区 的 三 级 结构 有 关 。RNaseE 作用 于 较 大 前 体 产 生 5S RNA 前 体 ( 比 成 熟 5S RNA 在 两 端 各 长 三 个 核 昔 酸 ) ,天 然 酶 的 分 子 量 为 70,000d, 亚 基 结 构 不 详 。 RNaseE 的 识别 位 点 蔬 是 螺旋 区 域 。RNaseM5 加 工 枯草 杆菌 SS RNA 前 体 得 到 成 熟 的 5S RNA, 2 AAO 链 区 。 部 分 纯化 的 酶 由 与 8 两 个 亚 基 组 成 , p 亚 基 具 底 物 结合 能 力 ,而 “ 亚 基 为 催 楷 亚 基 。 大 肠 杆 菌 中 使 16S 和 23S rRNA 成 熟 的 酶 分 别 叫 RNase M16 和 RNase M23, 它们 都 是 内 切 核酸 酶 。

某 些 真 核 生 物 ( 如 四 膜 虫 ` 绒 泡 菌 ) rRNA 前 体 含 插 和 顺序， 通过 剪接 切除 这 些 播 大 顺序 可 能 和 mRNA 前 体 加 工 一 样 ， 也 是 在 一 个 酶 系 催化 下 完成 的 。 但 是 1982 年 Cech 研究 组 发 现 , 四 膜 虫 rRNA 前 体 含 413 个 核 昔 酸 残 基 的 插入 顺序 ， 可 以 在 完全 不 存在 蛋 白质 ( 酶 ) 条 件 下 自我 准确 地 切除 ,表明 RNA 分 子 本 身 具 有 催化 活性 (图 5-29)， 这 是 二

个 很 有 意义 的 发 现 。 了 IV: =) rRNA 前 体 5’ Up GpU

pG-OH

W, 5’ ¢

U-OH GPU

/ UpU-——>- pGpA~~ UpA H6-G

pGpA-U-OH {goo

图 5-29 RNA 的 自我 剪接 一 个 鸟 背 辅助 因子 在 插入 顺序 5 端 通过 亲 核 反应 启动 一 系列 反应 而 切除 播 人 顺序 ， 同 时 把 外 显 子 联结 起 来 。 图 中 也 表示 被 切除 的 插入 顺序 产生 第 二 次 亲 核 反应 得 到 特定 的 最 终 产 物 。

3’

成 熟 rTRNA 5/

原核 生物 rRNA 的 加 工

大 肠 杆 菌 rRNA 基因 的 原始 转录 产物 沉降 常数 为 30S(p30)， 分 子 量 2.1 x 10 d, 约 含 6,300 BHM HY pppA。 通 过 分 子 杂 交 `\ 中 间 前 体 分 离 及 其 末端 鉴定 、 酶 解 图 谱 分 析 等 技术 ,已 基本 和 弄 清 大 肠 杆菌 rRNA 前 体 的 加 工 过 程 。 表 5-9 列 出 rRNA IAS 成 熟 rRNA 某 些 性 质 的 比较 。 从 表 5-9 可 以 看 出 : (1) p30 中 有 80% 左右 的 核 音 酸 顺 序 被 加 工 为 成 熟 rRNA; (2) p16 与 ml16 及 p23 与 m23 分 别 相差 250 或 500 KM

。 172。

FR BE SE 5! 端 和 3 端 分 别 为 不 同 的 核 昔 酸 顺序 ， 说 明 要 在 两 端 同时 剪 切 或 修剪 才能 得 到 成 熟 产物 。 也 已 分 离 出 更 接近 于 16S rRNA 的 16.3S 中 间 前 体 ， 比 16S 只 多 60 PRA 酸 。(3) 分 离 出 三 种 5S rRNA 中 间 前 体 分 别 只 在 了 端 多 三 个 ,二 个 和 一 个 核 苷 酸 ， 而 3 端 完全 相同 。 在 变异 株 中 也 找到 了 更 大 的 9S 中 间 前 体 , 它 被 RNaseE 水 解 生成 5S rRNA。

表 5-9 大 肠 杆菌 rRNA 前 体 与 成 熟 rRNA*

rRNA oe. aE BRBRE 了 末端 3 末端

Ze tx LU: = pppACUG p30rRNA 6300 (ae SEE pl6rRNA 0.6xX 10° ~ 1800 PUG reeree | ewe ree CACACAoH ml6rRNA 0.55 x 10° 1542 pAAAUG erree | wee nee CUUCAon p23rRNA 1.15 x 10° ~ 3400 m23rRNA 1.1 10° 2904 PPGGU.…… p5rRNA-1 123 pAUUUG +--+. | eee eee GGCAUon p5rRNA-2 122 DUUUG…… GGCAUoH p5rRNA-3 iy LN 121 pUUG:----- GGCAUox m5rRNA 120 PUG.………。 GGCAUoy

*p 表示 前 体 ;m 代表 成 熟 RNA, 大 肠 杆菌 全 部 三 种 成 熟 rRNA 的 一 级 结构 都 已 测 出 ( 见 第 三 章 )。

KIER p30 的 半 寿 期 只 2 分 钟 ， 故 在 正常 细胞 中 迅速 被 加 工 为 成 熟 rRNA。 RNaselll 缺陷 型 可 使 p30 堆积 ， 当 用 RNaseIII 体外 作用 于 p30， 并 分 离 出 其 中 间 产 物 时 ;发 现 p16(16SrRNA 的 中 间 前 体 ) 的 5’ 端 与 p30 相同 ， 均 为 pppA， 故 确定 在 p30 中 p16 位 于 其 5 端 。p30 的 加 工 过 程 见 图 5-30, 图 中 也 包括 tRNA 的 加 工 (关于 tRNA 加 工 酶 见 第 六 节 )。

和 (17.5S) =a ' (25S) (7S) yp i: NT nei eran I Wink Eee pl16 p23 | | “- ott 1 口 1 a ie | | é 1 医 画 5 可 Cea ee ml6 mys m23 a tRNA

A 5-30 ”大肠 杆 菌 rRNA 前 体 加 工 过 程

I 表示 第 一 阶段 加 工 ， 令 为 RNaseIII MA, YH RNaseE 切 点 ;I 表示 第 二 阶段 加 工 ， 人 为 RNaseM 切 点 ; tRNA 加 工 酶 是 RNaseP 和 RNaseF， 同 时 进行 剪 切 。

在 不 存在 蛋白 质 生物 合成 条 件 下 ， 可 分 离 出 两 个 枯草 杆菌 5S RNA Bik: p5A 与 p5B， 前 者 为 179 核 昔 酸 ,后 者 140 一 150 核 童 酸 ， 它 们 都 比 成 熟 5S RNA (118 BARE) 长 数 十 个 核 苷 酸 之 多 。 由 于 p5A 与 p5B 的 核 苷 酸 序列 有 差 , 因此 它们 可 能 为 不 同 基因

。173。

的 转录 产物 。 p5A 作为 RNase M5 体外 底 物 , 要 求 有 紧密 的 螺旋 结构 ; 同时 实验 指出 ， pA 中 两 端 元 长 的 序列 对 RNase M5 与 p5A 相互 作用 关系 密切 。

原核 生物 rRNA 含有 较 多 的 甲 基 化 修饰 成 分 ,特别 是 2- 甲 基 核 糖 。 比 较 成 熟 rRNA 及 其 前 体 中 的 甲 基 化 成 分 可 看 出 ,p30 含有 23S rRNA 中 的 全 部 甲 基 化 成 分 ,但 16STRNA 中 修饰 成 分 较 少 ,人 这 表 明 在 rRNA 前 体 中 两 个 RNA 组 分 的 修饰 不 是 协同 的 ， 即 23 S rRNA 的 修饰 在 加 工 的 早期 阶段 ,而 16S rRNA 在 后 阶段 。

原核 16S rRNA 和 23S rRNA 中 修饰 成 分 见 第 二 章 ,其 中 m'Gm 看 来 是 16S rRNA 一 个 特征 成 分 。 一 般 5S RNA 中 无 修饰 成 分 ;, 故 不 存在 修饰 加 工 问题 。

真 核 生 物 rRNA 的 加 工

真 核 生物 rRNA 的 前 体 具 有 与 原核 生物 不 同 的 结构 特征 。 通常 真 核 生物 有 更 大 的 BU A, WZ 5-8 ,最 大 的 哺乳 动物 的 原始 转录 产物 为 45S(4.6 x 10'"d) ， 较 低 等 真 核 生 物 也 有 36 一 38S(2.6 一 2.8 X 105d)。 其 次 ; 真 核 生 物 5S RNA 前 体 由 独立 于 其 他 三 种 zRNA 的 基因 转录 ; 线粒体 中 未 发 现 5S RNA, ， 而 时 绿 体 的 5$S RNA 则 与 原核 生物 一 样 存 在 于 三 种 rRNA 组 成 的 前 体 之 中 ( 见 表 5-8 和 第 八 章 )。 另 外 ， 在 真 核 的 rRNA 前 体 中 含有 独 特 的 5.8S rRNA， 它 位 于 其 他 二 个 大 的 rRNA 之 间 并 为 间隔 区 所 隔 开 ,由 于 5.8S rRNA 与 28S rRNA 间 具 有 较 长 的 互补 氢 键 对 ,因而 只 在 变性 后 才 释 放出 5.8S rRNA}

从 原始 转录 产物 加 工 产生 成 熟 rRNA ， 真 核 生 物 与 原核 生物 相 比 ,过 程 更 为 复杂 , 同 时 也 可 能 存在 不 同 的 加 工 方式 。 将 正在 生长 的 哺乳 动物 细胞 置 于 CH RR MC RAR 短 时 间 (5 一 10 分 钟 ), 则 45S RNA 迅速 被 标记 ,延长 标记 时 间 ,45S RNA 放射 性 增加 ，20 分 钟 后 ,放射 性 出 现在 32S 和 18S RNA 中 ,更 长 时 间 后 ( 约 60 分 钟 )28S RNA 被 标记 这

了 18S ae 28S ——__ + 一

@

(41S)

TOS gen = Sa a a (20S) (32S) aa Sf 5 SL BA | CR ae eee

(32S) (18S) (28S) er] ee

O 四 (5.8S) (28S) HeLa 细 胞 型 器 〈5.8S) L 细胞 、 爪 蟾 型

图 5-31 AA rRNA 前 体 的 二 种 加 工 方式

sa。 174 。

表明 rRNA 前 体 加 工 是 以 特定 方式 进行 的 用“H- 尿 背 脉 冲 标记 后 给 与 放 线 菌 素 D, 由 于 阻 断 了 45S RNA 的 合成 ,因而 使 45S RNA 消失 ， 而 增加 了 32S RNA 和 18S RNA 组 分 ， 以 及 稍 后 使 28S RNA 中 的 放射 性 堆积 。 45S RNA 前 体 转变 为 28S RNA 和 18S RNA 是 一 个 多 步 加 工 过 程 , 用 育 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 可 从 细胞 核 RNA 中 分 离 出 许多 中 间 HUA ,沉降 常数 有 41S\36S\.24S 和 208 等 ,标记 动力 学 也 证 实 它 们 是 rRNA 生成 途经 中 的 真正 中 间 物 。 结 合 其 它 分 析 数 据 , 提 出 了 rRNA 前 体 可 能 存在 二 种 加 工 类 型 ( 见 图 5-=31)， 一 类 是 18S 与 28S rRNA 近乎 同时 成 熟 (HeLa 细胞 型 ), 另 一 类 则 是 18S 先 于 28S RNA HOLL 细胞 \ 爪 蟾 型 )。 图 中 也 表示 了 5.8S rRNA 的 加 工 。

一 些 真 核 生 物 rRNA 的 加 工 过 程 列 于 表 5-10。 由 于 中 间 前 体 的 不 断 发 现 ， 还 可 能 有 补充 和 修改 。

表 5-10 不 同 真 核 rRNA 前 体 加 工 过 程 的 比较

原始 转录 产物 中 fl 前 体

28 S

-二 the

20S 一 一 ~

45S

28 S

L 细胞 45S his eae 28s IN 40s 二 鼠 肝 45S —>37.5s—>36s—|__ 5858S ms Novikoff 了 5 28S 腹水 瘤 23S 一 一 18S 屁 虫 * (ee 28s 植物 ## 一 38 一 -20 一 25s oly pe AS SS 258 和 en er SUE Ts 26s

* 楼 小 体 中 的 28SRNA, * 为 某 些 屁 虫 和 植物 来 源 ? 不 同 来 源 加 工 过 程 是 不 同 的 。

对 真 核 生 物 rRNA 前 体 的 加 工 酶 的 了 解 不 如 原核 生物 , 它 大 概 由 类 似 RNaseIII 以 及 其 他 内 切 核酸 酶 所 完成 。 少 数 rRNA 前 体 〈 主 要 在 28S RNA th) 存在 插 人 顺序 ( 见 表 5-8) 对 于 四 膜 虫 rRNA 前 体 加 工 的 研究 指出 , 接 前 过程 是 在 不 存在 酶 蛋白 情况 下 自 我 完成 的 ( 见 第 172 页 ); 也 有 实验 指出 , 某 些 小 分 子 细胞 核 RNA(snRNA) 如 U3、7S-1、 8S 等 在 rRNA 前 体 加 工 中 起 作用 ( 见 第 八 章 )

真 核 生 物 rRNA 中 也 含有 较 多 的 甲 基 化 成 分 ， 其 中 核糖 的 2- 甲 基 化 占 甲 基 化 成 分 AY 80% 以 上 ,如 HeLa 细胞 28S rRNA 有 65 个 2-o- 甲 基 核 背 和 5 个 甲 基 化 碱 基 ，18S cRNA 则 含 40 个 糖 的 甲 基 和 6 个 碱 基 上 甲 基 。 用 甲 基 标 记 的 甲 硫 氮 酸 培养 HeLa 或 工

*175 。

细胞 ,早期 差不多 全 部 同位 素 集中 在 核 仁 的 45S RNA 中 ,其 后 扩散 至 32S 以 及 28S RNA, 与 用 标记 尿 苷 培养 得 到 完全 相同 的 结果 。 利用 2'- 甲 基 化 核 苷 酸 键 的 碱 稳定 性 比较 带 放射 性 的 碱 稳定 二 核 苷 酸 种 类 观察 到 ，32S RNA 中 的 与 28S RNA 相当 ，45S 的 则 等 于 288-5 18S 两 者 的 总 和 。 这 些 结果 不 仅 支持 上 述 加 工 过 程 的 确定 ,同时 指出 ,差不多 所 有 2'- 产 基 的 甲 基 化 是 在 45S RNA 前 体 阶段 进行 的 ,表明 修饰 在 剪 切 之 前 。 同 样 江 RN 中 的 亚 也 是 在 45S BR ER URE. 另外 在 酵母 17S rRNA 和 HeLa 细胞 18S rRNA 中 发 现 有 一 高 度 修饰 成 分 mincp 姬 《〈 见 第 一 章 ), 它 的 生物 合成 经 过 三 个 步 又: WO RH, Gi) 甲 基 化 和 Gi) SA 3- 氨 基 -3- 羧 两 基 。 结 果 指 出 ,第 @,.G) WHER 期 前 体 中 进行 ,第 (iii) 步 则 在 核糖 体 接近 成 熟 时 的 18S 中 间 前 体 中 反应 。17 一 18S rRNA 的 3’ 端 部 位 具有 通用 同 源 顺 序 -mSA-m$A- ,以 及 含 其 他 修饰 碱 基 如 m'5A mrG 等 ,对 于 它 们 的 修饰 过 程 了 解 很 少 。

O O O | eh Si ie HN | @) HN NH (ii) N NH | > a | er | | of \nZ% A Gee NI Rp. HBS. apy Up se Vp m'Yp 各 三 总 了 O oc he By /SHCHCH ey + é ESP so NI Rpv m'nbt?Yp

前 面 提 到 , 真 核 生 物 5S rRNA 基因 的 转录 与 其 他 rRNA 基因 (构成 45$ 的 大 前 体 ) 不 是 联 在 一 起 的 。 在 爪 蟾 的 卵 早 期 发 生 过 程 中 ,5S RNA 大 量 堆积 , 比 18S RNA 和 28S RNA 大 100 倍 。 低 浓度 放 线 菌 素 D 抑 制 世 细胞 中 核 仁 的 转录 ,但 仍 允 许 5S RNA 继续 条 成 。 与 45S RNA 前 体 不 同 ，5S RNA 却 与 tRNA 相似 ， 由 RNA RABI BE, A 5S RNA 基因 与 RNA 基因 具有 相同 的 转录 终止 信号 。 由 于 同位 素 短 时 期 标记 能 很 快 直接 进入 SS RNA, MARE 5S RNA 的 原始 转录 产物 不 需 进 一 步 加 工 。 真 核 生物 5S RNA 的 5 端 通常 为 pppPG， 也 有 pppA 末端 ,至 少 说 明 转 录 产 物 没有 前 导 顺 序 ， 不 fig ETT BS Do

核糖 体 的 生物 合成

以 上 我 们 只 是 “孤立 地 ?讨论 rRNA 的 生物 合成 问题 ,其 实 ，rRNA 的 转录 与 加 工 是 以 核 蛋白 方式 进行 的 , 即 rRNA 前 体 与 核糖 体 蛋 白质 结合 成 核 蛋 白 颗 粒 , 然后 进行 加 工 。 细 蓝 新 合成 的 核糖 体 蛋白 质 一 般 比 成 熟 的 核糖 体 蛋白 质 稍 大 一 点 ， 切 去 其 六 端 甲 酰 甲 硫 氨 酸 及 其 他 几 个 氨基 酸 后 ， 则 成 为 成 熟 的 核糖 体 蛋 白质 。 真 核 细 胞 质 的 核糖 体 蛋白 质 则

* 176°

是 在 细胞 质 中 合成 后 进入 细胞 核 ,置换 核糖 体 颗粒 上 的 核 仁 蛋 白质 ,形成 新 生 的 核糖 体 。 核糖 体 的 体内 装配 首先 由 rRNA 前 体 与 核糖 体 蛋白 质 结合 ,随后 可 能 通过 不 断 沃 加

核糖 体 蛋白 质 并 进行 rRNA 前 体 加 工 , 产 生 未 成 熟 的 核糖 休 亚 基 ， 最 后 经 过 必要 的 修饰 (包括 RNA 和 蛋白质 修饰 ) 才 成 为 活性 亚 基 ,这 个 成 熟 过 程 无 论 对 原核 生物 或 真 核 生 物 都 是 必需 的 。

大 肠 杆 菌 核糖 体 生 成 过 程 见 示意 图 5-32。 其 中 符号 p 代表 RNA 前 体 ,m 表示 成 熟 RNA, ;图 中 也 以 沉降 常数 s 示 出 成 熟 过 程 核 蛋 白 颗 粒 的 大 小 ， 但 没有 指出 rRNA 的 加 Te A ay 2:

EAR 蛋白 质 蛋白 质 PR -人 ~ 21-28S 颗 粒 一 ~ 26-28S 颗 粒 一 \ 。30S 亚 基 (P16) (P18) (m6)

Pas, ei 蛋白 质 蛋 自 质 } 一 一 30-325 ——S— 40-42S 颗 粕 一 、* .50S 亚 基 PS (P23, P5) (p23, p5) (m23,m5)

5-32 大肠 杆菌 核糖 体 的 生物 合成

真 核 生物 细胞 质 核糖 体 的 RNA 在 核 仁 中 合成 ,新 生 的 rRNA 前 体 与 核 仁 蛋白 质 形 成 蛋白 颗粒 , 核 仁 蛋 白质 然后 被 来 自 细胞 质 的 核糖 体 蛋白 质 所 置换 。 颗 粒 中 的 rRNA 前 体 经 过 逐步 加 工 , 并 进入 核 质 和 通过 核 膜 达到 细胞 质 , 这 时 可 能 也 象 原核 生物 那样 有 一 个 成 熟 过 程 ,包括 rRNA 的 最 后 加 工 和 某 些 修饰 反应 〈 但 大 部 分 修饰 是 在 更 大 前 体 水 平 上 进行 的 , 见 第 175 页 )。HeLa 细胞 核糖 体 生 物 合成 可 以 图 5-33 表示 。 圆 圈 代 表 核 蛋白 颗 粒 ， 圈 外 代表 颗粒 的 沉降 常数 , 圈 内 为 rRNA 的 沉降 常数 。

@0S fc 395 | 141S< 20S a

一 一

1 1 RE

多 核糖 体

5-33 HeLa 细胞 核糖 体 的 生物 合成

5S(?) 表示 5S RNA 的 生成 和 成 熟 过 程 不 清楚 (图 中 58S 应 为 5.8S)

真 核 细 胞 器 如 线粒体 叶绿体 具有 自己 独特 的 核糖 体 , 同 时 组 成 一 个 区 别 于 细胞 质 的 蛋白 质 生物 合成 体系 ( 见 第 八 章 )o

六 tRNA 的 转录 与 加 工

(RNA 的 结构 与 功能 已 在 第 三 章 和 第 六 章 进行 了 讨论 和 其 他 种 类 RNA —ff, tRNA

。 177。

的 生物 合成 是 以 tDNA 为 模板 ,被 RNA 聚合 酶 ( 真 核 生物 为 RNA 聚合 酶 IT) 转录 产 生 tRNA 前 体 , 然 后 经 过 加 工 得 到 成 熟 的 tRNA 分 子 。 上 节 提 到 ,一 些 RNA BRR 在 原核 生物 rRNA 基因 之 中 的 ,因而 它们 与 rRNA 一 起 转录 ,并 大 致 同时 成 熟 。

tRNA 基因 (tDNA) 与 tRNA 前 体

tRNA 的 种 类 远 较 rRNA 为 多 ,包括 同 功 受 体 在 内 一 般 原核 生物 有 三 \ 四 二 种, 而 真 核 生 物 则 有 五 ,六 十 种 或 更 多 。 在 原核 生物 中 ,一 些 tRNA 基因 是 与 rRNA 基因 联接 在 一 起 的 ,包括 间隔 区 中 的 tRNA 基因 和 末端 区 的 tRNA 基因 ( 表 5-11)。 如 大 肠 杆菌 区 12: 有 七 个 rRNA EAH, EN 16S rRNA 和 23S rRNA 基因 之 间 都 插 有 tRNA 基因 , 其 中 三 个 编码 tRNA 和 tRNA 针 *， 另 外 四 个 编码 tRNAS™; 另外 有 几 个 tRNA, do tRNA“**,, tRNAT? 和 tRNA™* 则 由 rRNA 基因 往 中 远离 启动 子 的 末端 顺序 转录 ( 表 5-11)。

表 5-11 ABA 发 12 中 和 rRNA 操纵 子 相 联 的 tRNA 基因

rRNA 操纵 子 染色 体位 置 间隔 区 tRNA 末端 区 RNA rrnA 85 tRNAILe:tRNA 名 sa rrnB 88 IRNAGD rrnC 83 tRNASD tRNA4*?,tRNAT#P : rrnD 71 RNAIe:tRNA 和 sa LIRNAThr rrnE 89 tRNASGD 44 I 一 tRNAT!© tRNAAY tRNAAsp 组 Il 一 tRNASn Glu2(1) Thr3(1) Thr4(1) 3 Gln2(2) Gly3 (B34) Tyr2(1) 了 多- a Gini (2) A reef Ile (1), <i Leu(1) AlaiB(1) Serl His, Nk Lett / ‘Vall (1) Glu2(1) Lys(2) Trp(1) Asp(1) Ilel(1) AlalB(1) Tyri(2) Thr(1) Met 公 eg.

Gly3(B> 14) >

“Asa.

Ser Asp C. M, Y (C 可 能 是 Cysy》 5-34 ”大肠 杆 菌 基 因 图 上 tRNA 基因 的 位 置 图 中 也 标明 同 功 受 体 基因 ; 括 允 内 是 基因 拷贝 数 , 贺 圈 内 数字 以 分 表示 C\E\ 玉 、 M,P 和 YY 是 未 确定 的 tRNA 基因 。

* 178。

iy, (RNA BAKRURAREE, MRSMRTRRS. KABAFRSZAALE tRNA 基因 的 已 知 位 置 见 图 5-34, 已 经 测定 了 大 肠 杆菌 中 的 约 60 个 tRNA BALAI 摆动 假说 , CNAME 61 个 密码 子 所 需要 的 二 倍 ( 参 阅 遗 传 密码 一 章 )o

1981 年 鉴定 了 一 个 大 肠 杆 菌 操纵 子 ， 其 中 含 七 个 tRNA BA: Met,-Leu-Glnl- Gln1-Metm-Gln2-Gln2《〈 基 因 图 的 15 分 处 ), 各 tRNA 基因 间 被 二 级 结构 所 隔 开 , 推 想 为 RNA 加 工 酶 的 识别 点 。

T4 Maia RNA 转录 单位 长 约 3,000 个 核 苷 酸 ， 其 中 含 一 个 蛋白 质 基 因 和 各 二 个 RNA SAR: —MEA tRNA*® 和 二 个 未 知 功能 的 稳定 RNA,B—-TEMS 一 3' 编码 七 个 tRNA: Gln-Leu-Gly-Pro-Ser-Thr-Ile( 图 5-35)。

Leu Ser me UAA UGA CAU 3

§’ «-“UUUGUUAAUAAUCCCA AAUUUCC AAUUUAAUUUACUUA AUUUUCCAAUAUUU «33! *

UGU Gln. Gly Pro Thr

图 5-35 T4 tRNA 基因 中 一 个 含 七 个 RNA LHRHRRED

由 于 加 工 紧 随 着 转录 之 后 ,转录 没有 终止 或 开始 不 久 加 工 就 已 进行 (原核 生物 rRNA 合成 也 有 类 似 情况 ,如 上 述 )， 所 以 在 野生 型 细菌 很 难 分 离 出 大 的 转录 产物 。 企图 从 T4 感染 细胞 分 离 单 一 的 多 顺 反 子 转录 产物 也 没有 成 功 。 图 5-36 示 出 双 顺 反 子 tRNA 基因 转录 与 加 工 过 程 , 一 种 为 单 顺 反 子 产物 , 另 一 种 是 双 顺 反 子 产物 ， 后 者 常 在 加 工 酶 缺陷 型 菌 中 分 离 得 到 ;两 种 产物 都 需要 进一步 加 工 才 产生 成 熟 tRNA 分 子 。

(a) kan ar ’ RNA ae 1 t wos : —5’tDNA ppp \ \ ca tRNA, =} ERNA, 终止 3/ 5/tDNA ~ PPP ppp Ppp ; ppp ~

图 5-36 (DNA 的 转录 与 加 工 关 系 示意 图 e@ 表示 RNA RAM; 个 为 RNA 加 工 酶 的 剪 切 位 置 ; 二 一 代表 前 导 顺 序 或 GK. (a) 为 单 顺 反 子 转录 产物 ; (b) 为 双 顺 反 子 转录 产物 。 目前 ,有 三 类 tRNA 前 体 已 被 分 离 纯化 ,并 对 其 加 工 过 程 进行 了 研究 。 它们 是 (i) 单 RFR DM, Gi) MS KTR BAR Gi) 在 真 核 生物 中 发 现 的 有 插 人 顺 序 的 转录 产物 。

°179«

最 早 分 离 并 测定 其 一 级 结构 的 tRNA 前 体 是 大 肠 杆菌 SUS tRNAT™ Bik, SRR 的 tRNAs 比较 (结构 见 第 六 章 ) 在 5 端 从 pppG 开始 多 了 41 RAB, 3 端 也 多 了 JL ER, 同时 前 体 中 不 存在 修饰 成 分 ,但 分 子 内 已 含有 3’-CCA 末端 。

在 缺乏 加 工 酶 RNaseP 的 变异 株 中 ， 可 分 离 出 一 些 tRNA 前 体 , 已 测定 序列 的 单 顺 反 子 前 体 有 tRNAP™, tRNAZ™ 和 tRNA“? 前 体 等 ; 这 些 前 体 也 都 在 5 端 含 附加 顺序 ， 但 3 端 是 成 熟 的 。SUftRNA5 前 体 的 结构 见 图 5-37。

AU G

a

RNaseE RNase E

ye) Zz, ~ 名 已

|

40 AGGCCAGUAAAAGCAUUACCCC

AAFANA > >

7 -GQaceaq

PP RNase P -»

QANQNAGCAACH: ra)

QAAAAY BOK ADY ao

5-37 tRNATY: 前 体 的 三 叶 草 结构 箭 号 处 表示 与 成 熟 RNALE 不 同 或 需 剪 切 部 位

从 大 肠 杆 菌 中 也 分 离 鉴 定 了 一 个 双 顺 反 子 前 体 耻 NA22"-IRNA， 除 了 在 5 和 3 Si 含 附加 顺序 外 ,两 个 tRNA 间 存 在 6 核 音 酸 的 间隔 区 (图 5-38)。 从 图 中 可 以 看 到 , 前 体

“5 -e if U -A A-U c BO. a ofS c c-6 y& » wv © C-Gc aA = cGAcu YacGGGEG 村 GUGGG 1 ig iz! gasguthces Urcgee same COanhs , eee eu G 可 A GA 人 = G -C EwE c-G G-c U-A YA 站 sien 由 A A A Pe G D G G 0G 图 5-38 大肠 杆菌 t(RNASY-tRNAT™* 双 顺 反 子 前 体 方 框 表示 需要 被 切除 部 分

se。 180°

分 子 中 已 经 存在 成 熟 tRNA 的 修饰 成 分 。 CHRAAN MAA tRNA 前 体 都 含 有 tRNA 的 3-CCA 顺序 ,但 其 他 生物 的 tRNA 前 体 链 中 ,并 不 都 含有 3 -CCA。

从 I4 喉 戎 体 的 转录 产物 中 也 已 分 离 出 单 顺 反 子 tRNA 前 体 以 及 双 顺 反 子 前 体 , 如 tRNAR-tRNAS tRNAS-tRNALe tRNATIE-tRNAIe。 在 这 些 双 体 的 tRNA 前 体 中 ,其 5 和 3 端 两 侧 均 有 长 短 不 一 的 附加 顺序 ;此 外 两 个 tRNA 之 间 也 为 数 个 或 者 一 个 核 苷 酸 所 隔 开 ; 在 T4 双 体 tRNA 中 ,有 的 tRNA 已 经 存在 3 -CCA 未 端 , 另 一 些 则 不 是 。 值 得 注意 的 是 ,在 这 些 双 体 分 子 中 含有 大 部 分 修饰 成 分 ,表明 修饰 在 剪 切 之 前 出 现 〈 图 5-39)。

pu U U ae C ccc U A | A U T oa cee (a) Gec A e-¢ 856 A。U 4U Bou C*G Dey Gec U A U。，A U eo ceG uU U A*Uc we ms2i6 us CG mal Aa? G USA GS A 入 N, AGUCC GUGCCUC ccuccGcc GGCCA A G Ce 828 610 SU § “ee sy wee o FF Oe oe) eee ere A Ry BAe ane G ,¥CAGG a aCe eS ee ee CCGGUG te G.: CAeuU Gec mcGU A。U a ces 本 Ae fi 和 G A T U A A y A G U U D CU 二 本 GGDb A Gc 号 A pA 6 A (b) Se A - Ca eee 2 帮 Bi hal Bie uh G:C A OH C*G U 人 c,6 GCC .全 A 人 AUC.G _ nC s4U <— C -GU ¢G 8 2) “iedioabe TAAGC Ce Cece anew: h GuceyAAA Gc ane oe ee eee: ‘els A Sec VGCUA AUAVUUcccAGCAGc6AGAAU cAGcCAC RN A Ca.y G A U UG A G:c -U U。G G。C C .9 , G。C A A U A A bd G A A cC 6 8 6G9

图 5-39 T4 !IRNAPco-tRNASer(a) 和 tRNAGIa-tRNALeo(b) 前 体 分 子

真 核 生 物 tRNA 基因 数目 比 原核 生物 大 得 多 ,如 大 肠 杆 菌 有 大 约 60 个 tRNA 基因 ， 酵母 则 有 320 一 400 4, RHE 750 个 ,而 爪 蟾 差不多 有 8,000 个 ， 其 中 每 种 RNA HEY 200 个 拷贝 。 真 核 生物 RNA 基因 大 概 也 是 以 匀 存 在 的 ,并且 为 间隔 区 所 分 开 。 但 目 前 分 离 得 到 的 tRNA 前 体 都 是 单 顺 反 子 的 。 用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 可 以 从 脉冲 标记 的 HeLa 细胞 ,家 凑 、 酵 母 中 分 离 出 较 多 的 介 平 4 和 58 之 间 ( 约 4.58) 的 NA 前 体 分 子 ， 这 些 分 子 与 成 熟 48 比较 ,主要 是 A 3 端 存在 附加 顺序 。5' 端 含 核 背 -5 -三 磷酸 ,表明 是 原始 转录 产物 ,同时 在 前 体 中 已 经 存在 部 分 修饰 成 分 。

1978 年 以 来 从 酵母 变异 株 中 分 离 出 含 插入 顺序 的 “RNA 前 体 ， 所 有 这 些 前 体 都 在 反 密 码 臂 处 插入 十 几 至 三 十 几 个 核 蔡 酸 ， 图 5-40 列 出 的 tRNA 前 体 中 ,tRNATe 和 RNAS" 的 插 人 顺序 部 分 还 出 现 一 个 新 的 茎 环 结构 。 在 其 他 一 些 来 源 的 真 核 tRNA 前 体

*。 181。

中 也 发 现 有 插 人 顺序 存在 ,虽然 它 不 如 mRNA 前 体 那 么 普遍 ,但 至 少 表明 ， 插 人 顺序 是 真 核 生物 与 原核 生物 区 别 的 一 个 重要 标记 。

& tRNATIYT 前 体 Aon AOH 上 tRNAPhe 前 体 ， S tRNASer 前 休 E S 2 G-c = 到 PCG Fane C+G Gee :8 U'G axe wg Gie c UA v ars ; urA uuSA US'cccceccU A, 3 yurAcacac C A G 5-0 deh A A) ae uU A cucc 4 uUVA U c CC- = G GEESE nm uc T = CUGUG y Yc G ccooS TO 二 全 一 U G GAGC Cy - eee uyc TUDAA Seg ach CQ Sy AAS Gy . C*G u 7g Ast ce 1 acu ， AT Gc A‘ UCUAU Gc ny aS, cc’ » of Ag” Pc-cgA C*G pose 2 UA A U'G fe-¢ Lau C Aon Fi a . TAG c ASU < A Ca+u AU C U G ee pe axa G.C GUC A G A UAU AT at Tee er *, 入 AU A AA cok A Fe GG 3 “uA 6 $36 % v®’© ucucc UA Ue Auyeyct*a U" * cuce GCAGG 5 ee acca @ Foes. Seed “s uye G rae AAGAGY CG G yA GAL y % UG pa MO 6 “Sy pao nee, ge aa a: ae ean, Gc 已 全 从 G-c AcG0T AUf GT AU'A: 入 i cay TrP? yt? U+A 入 U netic! maya” reso *s ua! 4RNAL™ 前 体 reg eG . u* AtU Ge" ma Ae urA SA+U 3% A+U c*Sg -GeC A+ 0 Ue A. CnC A” te. Gac U u A. ag UNA AAA AU vA

5-10 五 个 酵母 tRNA 前 体 的 二 级 结构 其 中 个 为 剪接 点 ,[ ABA tRNA 的 反 密 码 子 。

tRNA 前 体 的 加 工

tRNA 前 体 的 加 工 内 容 具有 与 其 他 种 类 RNA 的 共性 ,同时 也 有 本 身 的 特点 ,主要 和 包 括 以 下 三 个 方面 内 容 :

(1) 剪 切 、 修 剪 (trimming, clipping) 和 剪接 (splicing);

(2) 如 果 需 要 ,在 3 MEIN CCAor ;

(3) BEE Tio.

Fk 22 EE EE PEAT. ADK, tRNA 加 工 所 需 用 的 酶 比 _mRNA 或 rRNA 加 工 都 要 多 ,特别 是 多 顺 反 子 RRNA 基因 转录 产物 的 加 工 更 为 复杂 ， 往往 需要 多 个 酶 的 协同 作用 。

By tn AF WY Fo Hy HE

tRNA 剪 切 酶 是 一 类 主要 的 加 工 酶 , 属 内 切 核 酸 酶 性 质 ， 它 在 tRNA 前 体 两 旁 附 加 顺序 处 水 解 ,以 得 到 一 定 大 小 的 tRNA 分 子 。 大 肠 杆 菌 RNaseP 是 特异 剪 切 差不多 所 有 大 肠 杆 菌 及 其 吻 菌 体 tRNA 前 体 的 5 旁 侧 顺序 的 ,生成 成 熟 tRNA 的 对 末端 ， 因 此 这 个 5 -内 切 核 酸 酶 也 被 叫 作 tRNA 5’ 成 熟 酶 ， 比 较 了 几 个 tRNA 前 体 的 RNaseP 作用 位 点 指出 ， RNaseP 的 专 一 性 来 看 与 其 剪 切 点 周围 的 一 级 结构 以 至 二 级 结构 并 无 直接 关 系 。 在 体外 ,人 工 除去 tRNAs 前 体 中 前 导 顺 序 41 个 核 苷 酸 中 的 32 SRR, HAW

182。

i] RNaseP 的 作用 ; 由 于 人 工 合 成 tRNA??-tRNAS* 前 体 中 RNaseP 剪 切 点 周围 4 和 14 核 萌 酸 长 的 寡 核 昔 酸 片段 不 能 作为 RNaseP 的 底 物 , 因 此 认为 RNaseP 的 严格 的 专 一 性 可 能 与 tRNA 前 体 分 子 的 特殊 构 型 有 关 。 RNaseP 也 能 加 工 某 些 非 tRNA 前 体 分 子 ， 如 大 肠 杆 菌 4.5S RNA 前 体 , 680 吻 菌 体 编码 的 另 一 RNA。 经 过 分 析 ， 发 现 这 些 RNA 也 具有 类 似 tRNA 的 三 叶 草 结构 。3 ` 端 无 CCAoa 的 tRNA 前 体 不 能 作为 RNase P 的 交 物 ,或 不 是 好 的 底 物 。 用 化 学 方法 或 酶 法 除去 大 肠 杆 菌 RNAI” 的 3 -CCAoa 一 个 或 二 个 末端 核 昔 酸 , 即 明显 影响 它们 被 RNaseP 的 水 解 速度 。

1978 年 Altman 等 发 现 大 肠 杆菌 RNaseP 是 一 种 不 寻常 的 酶 分 子 ， 它 由 至 多 23% 和 蛋白质 和 至 少 77% RNA 所 组 成 ,沉降 密度 为 1.71g/ cms(CsCl 中 ) 和 1.55g/cm*(Cs,SO, 中 )， 是 一 个 特征 的 RNA- 和 蛋白 质 复 合 物 ， 其 中 多 肽 分 子 量 约 17,500d，RNA 分 子 量 为 120,000d,4% 360 核 背 酸 长 。 用 蛋白 水 解 酶 \ 固 定 化 RNaseA 或 依赖 Ca” 的 小 球菌 核 酸 酶 处 理 则 RNaseP 失 活 ; 拆 开 蛋 白质 和 RNA， 两 者 不 具 活 性 ,重组 则 活性 恢复 。 1980 年 分 离 得 到 的 枯草 杆菌 RNaseP 也 是 一 个 由 RNA #1 ERA RAND RNaseP 中 存在 RNA 组 分 表明 , 它 可 能 是 一 个 识别 亚 基 ,具有 仅 与 RNA 及 结构 类 似 的 RNA 相互 作用 的 特定 顺序 与 构象 。 从 其 他 许多 来 源 如 酵母 .昆虫 .哺乳 动物 中 也 都 发 现 有 类 似 RNaseP 活性 。

除了 RNaseP 作为 5 -内 切 核 酸 酶 外 ,加 工 tRNA 前 体 至 少 还 需要 一 个 3- 内 切 核酸 Cn RNaseF )， 它 从 较 大 前 体 切 下 3 端 带 aa ae 有 不 太 长 的 核 背 酸 顺 序 。 用 于 rRNA 加 工 的 插入 顺序

nnn 3’

RNase III 和 RNaseE 在 tRNA 加 工 中 可 能 | wren

也 起 作用 ,但 RNase III 对 于 体内 tRNA 成 st 1 tied 3/4 数 并 非 绝 对 需要 ,而 RNaseE 剪 切 仅 用 于 很

少数 tRNA 前 依 中 ,这 两 个 酶 的 功能 大 概 是 2', 3 KBR @ppA SEAMEN tRNA 转录 产物 转变 为 小 的 NT

产物 ,后 者 是 RNaseP 更 有 效 的 底 物 。

为 了 使 tRNA 分 子 得 到 成 熟 的 3 端 , 还 需要 有 一 个 外 切 酶 进行 修剪 , 从 3 端 逐个 切 去 附加 的 顺序 ， 以 暴露 出 IRNA3” 端 。 这 个 修剪 酶 是 RNaseD， 分 子 量 为 38,000d ,为 单 一 亚 基 的 蛋白 质 。 它 不 同 于 另 一 3 IRS RNase I[，RNaseD 具 更 为 严格 的 选择 活性 ， 因此 RNaseD 是 一 个 体内 的 3 -tRNA BA ‘Bi.

tRNA 前 体 中 插入 顺序 的 除去 ， 是 靠 一 非常 复杂 的 酶 系 来 完成 的 。 现 已 从 酵母 中 分 离 得 到 用 于 剪接 反应 的 内 切 核 酸 酶 和 RNA

连接 酶 -DA

st “pS (+18) seat —— 7]

Be

一 -一 一 由 上 一 一

成 熟 的 tRNA

图 5-41 tRNA 前 体 中 插 和 顺序 的 切除 《T /2 代表 半分 子 )

连接 酶 。 内 切 核 酸 酶 可 将 CRNA 前 体 加 工 成 带 有 2 .3’ 环 磷酸 的 5 半分 子 和 5’ 羟基 的 3’ 半分 子 , 同 时 释放 出 完整 的 插 人 顺序 。 它 是 一 种 单一 的 内 切 核酸 酶 ,可 识别 所 有 tRNA 前 体 的 共同 结构 特征 ,加 工 各 种 不 同 的 同 源 或 异 源 的 tRNA 前 体 。5 半分 子 在 2、3' 环 磷

"183。

酸 3’ 单 酯 酶 作用 下 成 带 2 磷酸 的 5 半分 子 。3 半分 子 在 激酶 作用 下 生成 带 5 磷酸 的 3 He P 43 F oRNA BET KP THM LHS HOE N 一 。 P 由 于 产物 中 2 磷酸 不 能 被 一 般 的 磷酸 单 酯 酶 除去 , 故 推测 还 存在 一 种 新 的 特异 性 的 磷酸 单 酯 酶 。 反应 机 制 如 图 5-41 Pra. WAR Zin RA, Bie ERAT A 系 。 不 过 有 证 据 表明 ,剪接 反应 的 机 制 是 多 种 多 样 的 ,可 能 有 几 种 反应 途径 。 CCA 添加 缺乏 或 具有 不 完全 的 3-CCAoa 末端 的 tRNA 是 没有 活性 的 。 有 的 tRNA 基因 中 带 有 一 CCA 模板 顺 厚 ,而 另 一 些 则 无 ， 因 此 经 过 剪 切 或 修剪 后 的 tRNA, # 3’ 端 可 能 存 在 但 也 可 能 没有 3 -CCAor, 对 于 后 者 ,需要 在 tRNA 核 童 酰 转 移 酶 催化 下 进行 末端 加 成 : fk CCAoa 未 端的 tRNA (或 tRNA 前 体 )

-_“cTT TAT? >、 带 CCA 未 端的 tRNA (或 tRNA 前 体 ) (RNA BRE BMS 7 eS a

(RNA 核 音 栈 转移 酶 广泛 分 布 于 所 有 细胞 、 细 胞 器 和 病毒 中 , 它 对 供 体 的 要 求 是 非常 专 一 的 , 除 CTP 和 ATP Sh, 其 他 NTP 不 能 作为 供 体 。 体 外 实验 表明 , 若 只 存在 一 种 供 体 (CTP 或 ATP)， 也 可 催化 下 列 反应 ;

tRNA-N 十 CTP 一 ->tRNA-C 或 RNA-CC 十 PPi tRNA-C + CTP 一 >tRNA-CC + PPi tRNA-CC 十 ATP——>tRNA-CCA 十 PPi

同时 ;在 某 些 特殊 情况 下 ;该 酶 也 能 催化 不 正常 的 合成 ,如 tRNA-N 十 ATP—->tRNA-A,tRNA-AA,tRNA-AAAo tRNA-C 十 ATP 一 >tRNA-CA:IRNA-CAA。 tRNA-CCA + CTP 一 tRNA-CCACC。

Re

RIM tRNA 分 子 中 含有 许多 修饰 成 分 ， 不 同 tRNA 所 含 修饰 成 分 种 类 和 数目 都 各 不 相同 ( 详 见 第 一 章 和 第 三 章 )。 虽 然 修饰 成 分 在 RNA 中 的 生物 功能 仍 了 解 很 少 , 但 对 其 生物 合成 已 有 不 同 程度 的 了 解 。 核 音 修 饰 问题 是 RNA 特别 是 RNA 加 工 的 主要 内 容 。tRNA 的 修饰 是 在 多 核 苷 酸 链 上 进行 的 ,由 一 类 统称 为 修饰 酶 所 催化 :

缺 修饰 成 分 的 tRNA 《或 前 体 )

ACHE (etm tRNA (或 前 体 )

(RNA 修饰 酶 具有 高 度 专 二 性 ，DNA 、rRNA (THEA BID), SRR 核 昔 都 不 能 作为 修饰 酶 的 底 物 。 由 于 tRNA 中 修饰 成 分 人 多 ,因而 修饰 酶 种 类 很 多 ， 一 般 来 说 ,每 种 修饰 核 音 都 有 催化 合成 本 身 的 修饰 酶 。

CRNA 甲 基 转 移 酶 (简称 CRNA 甲 基 化 酶 ) 是 研究 较 早 也 较 详细 的 一 类 修饰 本 它 不 同 于 前 面 的 mRNA 甲 基 转移 酶 ,与 甲 基 化 rRNA 分 子 的 酶 也 可 能 不 相同 。 近 年 来 ,由 于 酶 分 离 纯化 技术 的 进展 ,已 经 得 到 对 碱 基 以 及 排列 顺序 高 度 专 一 的 tRNA 甲 基 化 酶 ， 如 CRNA (了 腺 嘎 岭 -1) 甲 基 化 酶 催化 tRNA 中 特定 位 置 的 A -> m'A, tRNA ( 岛 呆 叭 -7) 甲

。184 。

基 化 酶 可 使 RNA 中 第 55 位 的 G 一 m?G， 其 他 如 催化 tRNA 中 生成 mG、m'G、m5C- 以 及 rT 的 酶 也 已 高 度 纯 化 。 有 的 甲 基 化 酶 则 能 同时 催化 二 种 以 上 核 背 ， 可 能 是 不 同 甲 基 化 酶 的 混合 物 。RNA 甲 基 化 酶 也 具有 严格 的 顺序 要 求 ， 如 从 酵母 分 离 得 二 个 RNA (SR4-1) 甲 基 化 酶 , 它们 能 分 别 甲 基 化 CRNA 中 的 Ge 和 G 生成 m'Gy 和 m'Gyo 从 枯草 杆菌 分 离 的 RNA( 腺 味 叭 -1) 甲 基 化 酶 能 催化 tRNA 中 的 … .YAAGGCmiG 一 > YAm'AGGCmiG; 而 鼠 肝 中 得 到 的 同一 酶 则 使 GTPCGAAU 一 GTWCGAmlAU。 差不多 所 有 tRNA 甲 基 化 酶 的 甲 基 供 体 均 为 S- 腺 苷 甲 硫 氮 酸 (SAM), ,使 用 放射 性 标记 的 SAM 进行 实验 ,可 以 简便 地 测定 甲 基 化 酶 活性 : tRNA 十 3H 或 “C-SAM 一 >H 或 “C- 甲 基 tRNA + S- 腺 背 高 半 胱 氨 酸 但 也 有 报道 ,在 某 些 革 兰 氏 阳 性 菌 中 分 离 出 RNA( 尿 喀 啶 -5) 甲 基 化 酶 ( 即 rT 甲 基 化 酶 ), 所 用 供 体 不 是 SAM， 而 是 5;,10- 甲 又 四 氧 叶酸 ， 同 时 以 FADH, 作 还 原 剂 , 反应 如 下 : tRNA(U¢C) + CH, = THF + FADH, — >tRNA(T¢C) + THF + FAD

被 广泛 进行 研究 的 tRNA 修饰 酶 还 有 : tRNA FPR CCRNAL’ HRA Re BS), PA 上 的 异 戊 烯 侧 链 的 供 体 是 人 - 异 戊 烯 焦 磷 酸 ; tRNA CA AR, 在 碳酸 氧 盐 ， 存在 下 ，Thr 进入 tRNA, PR AS 催化 yw(Y) 生 成 的 酶 ,YY 的 第 三 环 来 自 Met 中 的 3- 氮 基 -3- 羧 两 基 ; tRNA: SERB, Het tRNA 中 QQ 的 生成 , 即 Q 碱 基 的 进入 是 通过 N- 糖 背 键 断裂 进行 的 ; RNAY 合成 酶 ,至 少 有 二 个 酶 分 别 催化 反 密 码 区 上 几 的 生成 和 其 他 区 (包括 TwC 区 ) 上 几 的 生成 ,实质 上 酶 催化 异 构 化 作用 :

tRNA(5-3H-U) 一 ->tRNA(CU 一 消 ) + 3H tRNA. 硫 转 移 酶 不 止 一 种 ,催化 SU 以 及 其 他 含 硫 的 罚 喧 化合物 的 生成 , 供 体 是 Cys 或 8- 莹 基 丙 酮 酸 ;催化 tRNA 中 生成 I、D、ncpU 的 酶 活性 也 已 发 现 。 关于 tRNA 中 修饰 核 背 的 生物 合成 详 见 本 丛书 "代谢 部 分 的 核酸 代谢 一 章 。 下 面具 体 介绍 几 个 tRNA 前 体 的 加 工 过 程 。 图 5-37 是 了 NA， 前 体 的 三 叶 草 结

构 ,图 中 也 示 出 剪 切 和 修剪 部 位 和 所 需 的 加 工 酶 : RNase P、RNaseE 和 RNase D3 修饰 成 分 的 生成 包括 Us 与 U 一 SU、Gv 一 Gm、Aas at fA 生成 ms'iSA, Un 转变 为 Oy Uss 和 Us SAFER T Ad

较为 复杂 的 例子 是 前 面 提 到 T4 WR RAE CH tRNA AAA ERC A5S-35), 但 一 般 分 离 不 到 完整 的 转录 产物 ,因为 感染 后 很 快 就 出 现 剪 切 产 物 , 并 且 得 到 成 熟 下 NA。 但 在 早期 也 分 离 出 三 个 tRNA 双 顺 反 子 前 体 ( 见 第 181 页 ): tRNA?-tRNAS*, tRNAT- tRNA": 以 及 了 归 NASm-tRNAL"， 后 者 含量 很 少 , 因 为 它 被 迅速 剪 切 为 成 熟 的 tRNA 和 tRNAS” 前 体 。 一 种 解释 是 ， 在 tRNAS-tRNAL™ 双 体 中 的 tRNAIe 的 3’ 端 存在 CCAoa 末端 ( 见 图 5-39b) 而 使 RNaseP 表现 出 较 高 活性 ( 见 第 183 页 )， 而 在 tRNA? tRNASc 和 tRNAT*-tRNA"* 前 体 中 ,由 于 3 BRIE CCAoa (图 5-39a)，RNaseP 不 能 其 3 部 分 的 tRNA 的 5 端 成 熟 , 故 双 体 堆积 。 而 只 有 当 这 些 双 体 分 子 的 3 ” 端 在 tRNA 核 苷 酰 转 移 酶 催化 下 加 上 CCAoa，RNaseP 才 作 用 于 双 体 ,产生 tRNA, tRNA" 以 及

* 185

Tu

tRNA’? 前 体 和 tRNAT® 前 体 。 以 tRNA?°-<RNAS* 前 体 加 工 为 例 .

wi

0

—1tRNA?'°—CU—+tRNAS*'—GUAAon ea | 一 !RNAPr 一 CU--tRNAsee 一 Gon | CCAon 末端 —tRNA?®°—_CU—tRNAS**—G | CCAox |: ras RNase P 和

一 tRNAPco 一 CU 十 tRNAser 一 GCCAon |e 《成 熟 tRNAS**)

| 加 CCAon

RNaseP

tRNA**°—CCAoy (成 熟 IRNARco)

从 以 上 举 的 例子 可 以 看 到 ,在 加 工 过 程 中 核 背 修饰 可 能 在 剪 切 和 修剪 之 后 ,但 也 有 的 在 剪 切 和 修剪 之 前 ,没有 规律 性 。 真 核 生 物 tRNA 前 体 加 工 也 具有 类 似 情 况 。 真 核 生 物 tRNA 前 体 约 100 核 苷 酸 长 ,只 含 一 个 单一 RNA 顺序 , 同时 存在 较 少 的 修饰 成 分 ,显然 ‘EAE tDNA 的 原始 转录 产物 。 这 表明 核 背 修饰 可 能 有 先 有 后 ， 分 两 阶段 进行 。 细胞 核 原始 转录 产物 aa 核 背 修饰 (RNA 前 体 (4.5S) ay RCM “不 完全 修饰 的 tRNA 前 体 (4S) 修饰 成 熟 IRNA

含 插入 顺序 的 tRNA 前 体 的 剪接 部 位 见 图 5-40， 详 细 过 程 见 图 5-41。

i SREY

[1] Transfer RNA: Biological Aspect (eds. Soll, D., Abelson, J. N. and Schimmel, P. R.) 1980, Cold Spring Harbor Laboratory.

{2] The Enzymes (ed Boyer, P. D) 1982, Vol. XV, Nucleic Acids, Part B, 3rd ed.

[3] Gegenheimer, P. and Apirion, D. 1981, Proces$ing of Procaryotic RNA, in Microbiological Ke- views, 45, 502.

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[6] Platt, T., 1981, Cell, 24, 10.

[7] RNA Can Be A Catalyst (Research News), 1982, Science, 218, 872.

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