现代 生物 技术 前 洛 Pp www.sciencep.com eS 1 s 4 上 二 一 一 一 -om | 人 ae 植物 所 图 书馆 | Wi 史册 EB. )b5 S0003774 ARE DERRA - Cn Kk DS 编著 进化 生物 技术 岂 一 两 定 向 分 子 进化 内 # ff 介 ASS BAS ST HUST BT BB ET] Sp Pad HJR BB BT HE FA OR BK 展 趋势 。 主 要 内 容 包括 定向 分 子 进 化 思想 、 概 念 和 原理 ;定向 分 子 进化 的 基 本 策略 和 方法 ;定向 分 子 进 化 的 筛选 /选择 方法 ; 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 ;蛋白 质 酶 定向 分 子 进化 ;外 显 子 改组 定向 进化 酶 ;抗体 酶 定向 分 子 进 化 ;和 蛋白质 组 、 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 。 本 书 可 供 从 事 生 物化 学 、 分 子 生 物 学 生物 工 程 学 \ 化 学 和 药学 等 相关 专业 的 科研 人 员 和 教学 工作 者 参考 ,也 适用 于 综合 性 大 学 、 医 学 和 农业 院 校 相关 学 科 的 高 年 级 本 科 生 和 研究 生 阅读 。 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 进化 生物 技术 : 酶 定向 分 子 进 化 / 张 今 编著 . 一 北京 :科学 出 版 社 ,2004 (现代 生物 技术 前 沿 ) ISBN 7-03-012639-4 1. #- Tk OD. ERATE WV .Q55 中 国 版 本 图 书馆 CPP 数据 核 字 (2003) 第 120917 号 责任 编辑 : 马 学 海 ”， 李 久 进 ” 贡 学 文 / 责 任 校 对 : 柏 连 海 / 封 面 设计 : 王 浩 排版 制作 :科学 出 版 社 编 务 公司 /责任 印 制 : 安 春 生 mek BR 出 版 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 http:// www.sciencep.com * EP HF 印刷 科学 出 版 社 发 行 各 地 新 华 书店 经 销 * 2004 4F 4555 一 版 开本 :B5(720x 1000) 2004 年 4 月 第 一 次 印刷 印张 :16 1/2 印 数 :1- 3 000 字数 :309 000 定价 :38.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 ,我 社 负责 调换 (新 欣 ) FF 酶 定向 分 子 进化 旨 在 模拟 突变 、 重 组 和 选择 的 自然 进化 机 制 ,体外 进化 新 酶 。 定 向 分 子 进 化 实质 上 是 达尔 文 进化 论 在 分 子 水 平 上 的 延伸 和 应 用 , 是 一 个 新 兴 的 技术 科学 领域 。 过 去 10 年 ,特别 是 近 两 年 ,定向 分 子 进化 在 生物 分 子 结构 与 功能 研究 方面 ,在 工业 、 农 业 和 医药 等 领域 呈现 强劲 的 发 展 势 头 。 这 表明 进化 论 不 再 仅仅 是 一 种 理论 ,而 是 逐渐 发 展 为 一 门 应 用 科学 一 一 进化 生物 技术 "。 进 化 生物 技术 关系 人 类 命运 (例如 ，HIV 是 世界 上 最 积极 进化 的 生物 体 , 如何 用 进化 生 物 技术 制服 它 ; 如 何 用 进化 生物 技术 战胜 细菌 耐 药性 ; 如 何 用 进化 生物 技术 解决 生物 品种 灭亡 等 重大 问题 ), 定向 分 子 进化 则 是 进化 生物 技术 中 的 关键 技术 。 张 今 教授 编著 的 《进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 ;一 书 对 酶 定向 分 子 进 化 原则 、 策 略 和 方法 ,现状 和 发 展 趋势 进行 了 比较 全 面 的 介绍 。 他 在 广泛 收集 国内 外 资料 的 基础 上 , 结合 自己 多 年 的 实践 经 验 , 使 本 书 内 容 具 有 新 颖 性 和 实用 性 ， 对 读者 类 有 参考 价值 和 启迪 作用 。 我 相信 《进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 ;一 书 的 出 版 将 会 推动 我 国 进化 生物 技术 的 发 展 。 = i} 3 4 34 , _s eT ESE BS Pea Tk Bee, RANE vats we h--S ,用 VAG ae ihe E + HE i wath ed RAS det, Bt et BE Rae oh ha AE a, ‘anaaehoan a Sih BE eke ee ss as Hk." A eg eee SORE FLA TEM bi RAR HOS Ah OATS Mere eve ae ys sia 5) eta EA EO ABTS PO PEG Be i ee TA eG FAA SET AR SR a KaRe-—~s : TPAC SS sah RR iy — 1 Tt Ree | PALE ea eee et cua. " | CAB a te meer of eps +: ain : : 加 AS : a a vi a 下 a : its Ae a 全 i = 人 人 > - a otis 4 2 ‘ls, oak 人 人: _ f 7 = 22-4, Geo wd 市 者 g HO 定向 分 子 进 化 (directed molecular evolution) 又 称 实 验 室 进化 (laboratory evolution ) 或 进化 生物 技术 (evolutionary biotechnology) 。 它 旨 在 体外 模拟 自然 进化 机 制 (突变 、 重组 和 选择 ) ,使 进化 过 程 朝 着 人 们 需要 的 方向 发 展 。 定 向 分 子 进 化 的 实质 是 达尔 文 进化 论 思想 在 分 子 水 平 上 的 延伸 和 应 用 ,用 进化 和 组 合 技术 研究 和 解决 复杂 生 物 学 和 化 学 问题 已 成 为 化 学 和 生物 学 迅猛 发 展 的 领域 之 一 。 定向 分 子 进化 的 思想 是 1967 年 由 Spiegelman 及 其 同事 提出 的 ,他 们 当时 和 定 辐 进化 的 目标 是 RNA (Spiegelman S et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1967, 58: 217 ~ 224). 1984 年 Eigen 和 Gardiner 提出 了 分 子 进化 的 理论 (Eigen M, Gardiner W. Pure Appl Chem, 1984, 56: 967 ~ 978) 1993 年 Amold 研究 组 首先 应 用 定向 分 子 进 化 的 原理 改进 酶 ,提出 定向 分 子 进化 的 方法 易 错 PCR (error-prone PCR, epPCR) (Chen K, Arnold F H. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 5618 ~ 5622), 1994 年 Stemmer 发 展 了 一 种 方法 , 称 之 为 DNA 改组 CDNA shuffling) ,有 力 地 推动 了 定 回 分 子 进 化 的 发 展 (Stemmer W P. Nature, 1994, 370: 389 ~ 391) 。 现 在 定向 进化 已 由 基 因 和 和 蛋白质 分 子 向 基因 组 和 和 蛋白质 组 代谢 途径 和 病毒 ,甚至 向 细胞 定向 进化 方面 努力 延伸 ,细胞 的 定向 分 化 和 定向 进化 可 能 是 生物 工程 的 未 来 。 近 10 年 ,定向 分 子 进化 在 生物 分 子 结构 与 功能 研究 方面 , 在 工业 \ 农 业 和 医 药 等 领域 已 展示 出 广阔 的 应 用 前 景 ,高 通 量 筛选 是 发 现 新 酶 的 重要 工具 。 可 以 预 见 ,在 不 久 的 将 来 ,定向 分 子 进化 的 发 展 将 使 生物 催化 剂 及 催化 过 程 以 轨 新 的 面 狐 出 现在 生命 科学 和 生物 技术 "世界 ”。 本 书 的 意图 是 向 读者 介绍 定向 分 子 进化 原理 、 策 略 \ 方 法 应 用 以 及 发 展 趋势 ， 以 期 促进 定向 分 子 进 化 在 我 国 的 发 展 。 本 书 1 ~ 7 章 围 绕 核 酸 和 和 蛋白 质 定向 分 子 进化 展开 ,第 8 章 介 绍 蛋 白质 组 、 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 定向 进化 。 本 书 编写 有 两 个 指导 原则 ,一 个 是 讨论 一 般 原 理 和 采用 特殊 实例 并 举 的 原则 ; 另 一 个 是 讨论 学 科 交叉 和 技术 集成 在 定向 分 子 进 化 领域 的 现状 。 每 章 末 所 引 参 考 文献 尽量 选择 最 近 发 表 的 文章 和 能 提供 更 广泛 的 文献 目录 的 文献 ,便于 读者 进一步 阅读 。 在 编写 过 程 中 ,力求 在 有 限 篇 幅 中 尽 可 能 介绍 基本 原理 ,同时 也 力求 最 大 限度 反映 出 近年 来 本 领域 的 进展 。 在 内 容 取舍 方面 , 既 注意 到 避免 与 相关 著作 内 容重 复 ,又 尽 可 能 自 成 系统 。 本 书 从 基因 和 蛋白质 ~ 基因 组 和 蛋白质 组 一 代谢 途径 病毒 和 细胞 ,结合 自己 的 实践 经 验 (本 课题 组 自 1990 年 至 今 主要 从 事 酶 定向 分 子 进化 方面 的 研究 工 VE) ,比较 详细 地 介绍 了 酶 定向 分 子 进 化 的 理论 和 实践 。 tive 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 由 于 本 人 学 术 水 平 有 限 ,错误 和 从 妥 之 处 在 所 难免 ,诚恳 地 希望 广大 读者 批评 指正 ,不胜 企盼 之 至 。 在 本 书 编写 过 程 中 ,美国 西南 医学 中 心 张 雷 博 士 \. 加 州 大 学 孔 祥 铎 博士 、 麻 省 理工 学 院 (MIT) 刘 文 胜 博士 提供 了 有 效 的 文献 资料 ;书稿 的 电脑 输入 \` 图 表 制 作 和 BEX HALL TIT FRE (BMA 2 章 和 第 3 章 部 分 编写 ) 和 李 宾 硕士 完成 ， 特此 致谢 ! 中 国 科学 院 院士 孙 曼 者 先 生 为 本 书 作 序 ,在 此 表示 深 深 的 谢意 ! 吉林 大 学 分 子 酶 学 工程 教育 部 重点 实验 室 x > 2003 4F 8 A 184 FF 前 言 第 1 章 定向 分 子 进化 的 思想 .概念 和 原理 PP (1) 1 {| 引 | 言 Bieia(afutelninie/eicisiatnis/ ¥ t - ed \ S o 号 三 = ol ¥ J . 3 第 1 章 ， 和 定 加 分 子 进 化 的 思想 、 概 念 和 原理 1.1 5] 言 过 去 10 年 ,定向 进化 (directed evolution) 在 生物 分 子 结构 与 功能 研究 方面 及 工 业 \ 农 业 ` 医 药 等 领域 的 应 用 呈现 出 强劲 的 发 展 势头 ]。 特 别 是 近 两 年 ,定向 进化 研究 的 论文 以 令 人 惊奇 的 数量 和 速度 增加 。 关于 生物 进化 的 新 颖 思路 可 以 追溯 到 《物种 起 源 ) 一 书 ]。 在 《物种 起 源 》 问 世 140 多 年 中 ,进化 理论 已 经 有 了 很 大 发 展 。 现 代 生 物 学 不 断 地 证 实 达 尔 文 的 惊人 想像 ,尽管 这 位 伟人 根本 不 懂 遗 传 学 和 分 子 生 物 学 。 关于 生物 进化 的 学 说 可 以 围绕 进化 动力 、 进 化 方向 、. 进 化 速度 等 3 个 方面 归纳 nF), 外 因 论 _ 布 直 学 说 `\ 莱 伊 尔 学 说 \ 新 拉 马 克 主 义 、 米 丘 林 - 李 森 科 主义 、 新 灾变 论 进化 动力 | 丰 因 论 ， 经 典 拉 马 克 主 义 、 活 力 论 、 终 极目 的 论 、 突变 论 、 某 些 现 代 分子 进 化 学 说 内 因 - 外 因 论 (遗传 突变 + 选择 ) 一 一 达尔 文学 说 、 现 代 综合 论 反问 [随机 论 芋 亿 尔 尝 说 ,分 了 进化 中 性 这 进化 方向 局 部 环境 适应 论 一 “达尔文 学说、 现代 综合 论 新 旧 拉 马 克 主 义 、 活 力 论 ` 终 极目 的 论 、 人 66 YA” 现代 环境 趋向 变化 论 渐变 一 一 莱 伊 尔 学 说 `、 达 尔 文学 说 、 现 代 综 合 论 进化 速度 人 \ 新 灾变 论 恒定 一 一 分 子 进 化 中 性 论 早期 的 进化 学 说 基本 倾向 于 决定 论 ; 近 几 十 年 的 新 学 说 基本 倾向 于 随机 论 ; 近 几 年 进化 学 说 基本 倾向 于 基因 驱动 (gene driver) 说 和 新 灾变 论 (新 决定 论 )。100 多 年 来 ,进化论 的 发 展 似乎 在 决定 论 和 随机 论 之 间 摆 动 , 达尔 文学 说 似乎 介 于 两 者 之 间 。 在 分 子 水 平 上 体外 定向 进化 生物 分 子 的 思想 是 1967 4F Spiegelman 及 其 同 事 外 提出 的 ,当时 他 们 定向 进化 的 对 象 是 RNA。1984 年 Eigen[5] 及 1993 年 Kauff- manl5] 提 出 分 子 进 化 的 理论 。1991 年 我 们 建立 了 “随机 -定位 诱 变 ” 定 向 进化 的 方 (2+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 法 5 ,又 被 称 为 REM(random and extensive mutagenesis) 法 [9,10] 。1993 年 Amold 研 究 组 [应 用 分 子 进化 的 原理 创造 性 地 改进 酶 ,提出 易 错 PCR (epPCR )。1994 年 Stemmerl2] 发 展 了 一 种 方法 , 称 之 为 DNA 改组 (DNA shuffling). 1999 年 Stemmer 等 053] 把 DNA 改组 延伸 到 组 改组 (family shuffling), 扩大 了 顺序 空间 (sequence space) ,进而 提出 分 子 育种 (molecular breeding)。1998 年 在 美国 加 利 福 尼 亚 州 召开 的 “IBC 第 二 届 工 业 酶 定向 进化 讨论 会 ,以 及 第 14 ~ 16 届 国 际 酶 工程 会 议 都 将 定 向 进化 列 为 会 议 专题 。 现 在 定向 进化 从 基因 和 蛋白质- 基因 组 和 和 蛋白质 组 一 代谢 途径 和 病毒 甚至 细胞 方向 发 展 。 定向 进化 的 实质 是 达尔 文 进化 论 在 分 子 水 平 上 的 延伸 和 应 用 忆 。 定 向 进化 (也 称 实验 室 进化 或 进化 生物 技术 或 定向 分 子 进化 ) 是 在 体外 模拟 突变 、 重 组 和 选 择 的 自然 进化 机 制 ,使 进化 朝 着 人 们 需要 的 方向 发 展 。 定 向 进化 虽然 人 工 模拟 自 然 进化 ,但 两 者 却 不 相同 : @ 进 化 动力 不 同 。 同 源 蛋 白质 的 比较 指出 ,保守 突变 是 自然 进化 的 驱动 力 44 , 而 定向 进化 中 非 保守 取代 也 可 明显 改进 蛋白 质 的 功能 55]; @ 进 化 方向 不 同 。 定 向 进化 是 人 为 制造 特殊 条 件 , 模拟 自然 进化 机 制 ,使 进化 过 程 定向 进行 ,主要 是 蛋白 质 突变 的 适应 积累 。 定 向 进化 的 “适应 度 ”(fitness， 也 称 遗传 漂移 ，drift) 主要 指 生物 分 子 的 稳定 性 和 活性 。 中 性 突变 的 组 合 可 以 产生 新 功 REWER AE AUR, 称 为 “结构 中 性 进化 ”0161(construction neutral evolution) 或 “选择 中 性 ”71(selective neutrality) 。 自 然 进化 是 机 体 的 适应 突变 (adaptive mutation) 和 中 性 突变 (neutral mutation) 的 积累 。 自 然 进 化 的 “适应 度 " 主 要 指 机 体 生 存 和 繁殖 的 能 HA. @@ 进 化 速度 不 同 。 定 向 进化 只 需 几 年 、 几 月 、 几 周 、 甚 至 几 天 的 时 间 ， 而 自 然 进化 是 自发 出 现 的 一 非常 缓慢 的 过 程 , 需 几 百 万 年 。 自 然 选 择 使 进化 向 有 利于 生物 体 适 应 生存 和 繁殖 环境 的 方向 发 展 。 环 境 和 适应 方式 的 多 样 性 决定 进化 方向 的 多 样 性 。 田 定向 进化 的 目标 往往 超越 生物 学 意义 的 要 求 ， 以 寻求 自然 环境 中 并 不 需要 的 功能 ,所 有 可 能 的 氨基 酸 顺 序 ， 即 顺序 的 多 样 性 (X 个 氨基 酸 链 长 的 蛋白 质 顺序 有 X“ 种 ) 组 成 蛋白 质 的 顺序 空间 。 所 有 可 能 的 顺序 空间 组 成 “适应 度 景观 ” (fitness landscape) 。 对 于 定向 进化 而 言 , 将 研究 每 一 个 性 质 或 性 质 组 合 的 变化 , 探 索 所 希望 的 蛋白 质 在 顺序 空间 的 可 及 性 [7 ~ 191, 1.2 体内 进化 Cl 群体 遗传 学 微分 方程 一 般 是 为 有 性 复制 物种 导出 的 ,这 种 思想 基本 上 以 重组 作为 变异 的 主要 来 源 , 突 变 则 被 认为 是 特殊 的 事件 。 在 生物 多 聚 物 进 化 设计 中 ,与 上 述 观 点 正 相反 ,突变 是 变异 的 共同 来 源 ,重组 则 是 特殊 事件 ,例如 基因 改组 。 在 排除 无 性 情况 下 ,通过 微分 适应 度 讨 论 选择 的 数学 表达 式 如 下 : 第 1 章 定向 分 子 进化 的 思想 、 概 念 和 原理 +3 Gn = Xe ar = Xe fe — uj Xi) = Xe(fe- P)sk = 12,750 (1) 式 中 , xX, RAREAWAR f. 是 适应 值 ; © 作为 群体 的 平均 适应 值 。 方 程 (1) 直 接 解 释 为 : 当 突变 体 的 友 - 更 是 正 或 它 的 适应 值 是 在 平均 值 以 上 , 即 大 > OMA dvdr 则 为 正 , 并 且 这 个 突变 体 频 率 增 加 ;相反 ,如 果 大 < 屯 ,那么 相应 突变 体 的 分 数 将 减少 ,并 且 最 终 接 近 零 ,突变 体 消 失 。 这 样 选 择 具 有 最 大 适应 值 finox = max [万 , 大 =1,2,…，, 寻 的 突变 体 ,并且 在 足够 长 时 间 之 后 ,惟有 该 突变 体 将 在 群体 中 存在 ,lim， 2 Xuw =1。 换 名 话说, 如果 时 间 相 当 长 ,所 有 不 太 适 应 的 突变 体 将 消 失 ,群体 将 变 为 均一 。 当 新 种 由 于 偶然 事件 处 于 消失 的 危险 之 中 ,选择 过 程 和 结果 只 是 由 适应 值 的 差 所 决定 :8 = fq — fimax» S 值 是 通过 选择 优势 突变 体 所 需要 的 世代 数 来 反映 (图 1.1)。 在 自然 选择 中 ,优势 突变 体 一 般 很 少 出 现 ,新 突变 体 在 可 以 被 群体 中 接收 之 前 需要 进化 上 千代 。 1 rienoe rsa S=0.1 S=0.02 优势 突变 体 分 数 0.4 0 200 400 600 800 1000 1 世代 1.1 优势 突变 体 的 选择 示意 图 曲线 表明 根据 方程 XCr) = Xo/| Xo + (1- Xo) exp( - St)},#£ N= 10 000 个 体 的 群体 中 突变 体 的 选择 和 固定 。 时 间 z 是 以 世代 数 或 复制 步骤 计 量 , 2 是 群体 中 新 突变 体 的 最 初 频率 , S=f - j 是 它 的 选择 优势 。 曲 线 表明 在 群体 中 采用 单 拷贝 的 初始 条 件 ,X=0.0001 群体 遗传 学 基本 是 Motoo Kimura 思想 的 延伸 。Kimura 指出 适应 突变 是 相当 少 的 ,大 多 数 突 变 体 在 选择 上 是 中 性 的 ,进化 的 主要 作用 是 消除 有 害 突 变 体 。 Kimura 观点 是 由 蛋白 质 和 核酸 顺序 比较 分 析 资 料 支 持 的 ,这 成 为 目前 分 子 系统 发 育 的 基础 。 基 因 型 是 稳步 地 改变 ,并 且 当 表 型 停滞 时 基因 型 也 在 稳步 地 改变 。 尽 管 分 子 资料 以 压倒 的 优势 支持 中 性 进化 ,但 是 第 一 个 直接 证 据 还 是 最 近 细 菌 进 化 ' 4' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 的 实验 : 表 型 性 质 的 改变 ,基因 组 DNA 顺序 也 继续 改变 [52 ; 当 表 型 停滞 时 ,基因 组 DNA 顺序 以 同样 速度 或 者 甚至 在 适应 周期 时 改变 更 快 2。Kimura 途径 是 以 选择 过 程 随机 描述 为 基础 的 :每 个 新 形成 的 突变 体 达 到 一 定 的 固定 的 概率 ( 随 8 值 增 加 ), 它 是 相对 于 群体 中 当时 优势 类 型 的 适应 度 。 在 中 性 情况 下 ，$8 = 0， 和 群体 通 过 随机 漫步 方式 在 顺序 空间 移动 。 随 机 漫步 使 基因 型 连续 空间 扩大 ( 它 与 顺序 空 间 概 念 相似 )。 20 世纪 90 年 代 ， 中 性 进化 的 计算 机 模拟 确定 了 Kimura 观点 。 1.3 体外 进化 1] 在 试管 中 模拟 自然 进化 的 思想 是 20 世纪 60 年 代 由 Spiegelman 及 其 同事 在 哥 伦比 亚 大 学 提出 的 由 。 他 们 的 实验 如 图 1.2 所 示 。 病 毒 RNA 分 子 被 转移 到 含有 适 于 病毒 RNA 复制 介质 (QB 复制 酶 及 核 苷 三 磷酸 单 体 ) 的 试管 中 ,产生 修饰 的 子 代 。70 次 转移 ,RNA 合成 的 速率 大 约 增加 一 个 数量 级 (图 1.2)。 这 就 是 体外 定向 进化 的 经 典 实验 。 在 Watson 和 Crick 揭示 核酸 分 子 的 结构 之 后 ,进化 的 各 种 群体 的 空间 性 质 是 清楚 的 。 顺 序 空 间 是 指 突变 或 重组 的 所 有 DNA( 或 RNA) 顺 序 的 分 离 空 间 ( 图 1.3)。 顺 序 空 间 是 以 Hamming 距离 度量 的 超 立 方 体 [2 。 顺 序 空间 有 两 个 非常 重 要 的 性 质 :@ 它 是 具有 各 种 长 度 基因 组 的 高 维 物 ,和 以 核 苷 酸度 量 ;@ 顺 序 空间 的 所 有 的 点 , 即 所 有 顺序 是 相等 的 。 关于 分 子 进化 , Eigen[24 综 合 分 子 生物 学 和 化 学 反应 动力 学 的 知识 ,提出 通过 动力 学 方程 网 络 方式 描述 复制 、 突 变 和 选择 的 模型 , 即 dX a = X;( Qufe - ©) + Da 21, je ePliXy 3k = 1,2,-",n (2) 式 中 , Ouw 表 示 I, >21, 的 概率 , Oj BEAN AEA (> i, + 1) EB; © 与 适应 度 权 重 相同 。 复 制 过 程 是 一 种 产生 正确 拷贝 产物 平行 的 各 种 反应 网 络 。 方 程 (2) 可 以 提供 一 种 研究 分 子 进 化 的 实验 方案 。 非 中 性 复制 集合 的 最 适 基因 型 称 为 主 顺 序 (master sequence)( 图 1.4)。 如 果 突 变 是 一 种 相当 复杂 的 事件 , 主 顺序 会 被 密切 相 关 或 不 相关 的 突变 体 云 (mutant cloud) 所 围绕 。 在 适当 条 件 下 , 主 顺 序 及 它 的 突变 体 云 接近 稳 态 的 基因 型 分 布 , 称 为 准 种 (quasi-species) 。 准 种 概念 的 提出 ,对 于 了 解 进化 是 重要 的 。 突变 频率 只 取决 于 由 到 到 矿 突 变 必须 交换 的 单 体 数 , 它 通过 Hamming 距离 计 算 d(I;, 到 ) ,有 d(1,,1,) O， 让 gett 1 = ¢(—*) (3) q 第 1 章 “定向 分 子 进 化 的 思想 、 概 念 和 原理 +5: 贮 液 : RNAS IAB, ATP, CTP, GTP, UTP, yt 0.015 S g E 0.01 = al Qa Ss 全 5 & 0.005 EN a. < Zi [4 0 0 100 200 300 400 tmin 图 1.2 RNA 进化 实验 图 图 上 部 分 表示 应 用 系列 转移 技术 在 试管 中 进化 RNA 分 子 。 在 一 定 的 时 间 间 隔 之 后 ,样品 被 转移 到 下 一 个 含有 新 鲜 贮 液 的 试管 中 ,补充 RNA 合成 时 所 消耗 的 材料 。 贮 液 含有 复制 所 需要 的 酶 (例如 Q8- 复 制 酶 ) 和 活化 的 单 体 (ATP，UTP， GTP 和 CTP)。 图 下 部 分 表示 RNA 合成 速率 。 它 是 通过 放射 性 GTP 移 人 新 产生 的 RNA 分 子 来 测量 。 复 制 速率 表明 逐步 增加 。 早 期 降低 是 由 于 通过 主 顺 序 首 先 形成 的 准 种 适应 度 变 低 针 式 中 ,独立 的 参数 s= (1- 4)/4 是 突变 率 和 精确 度 之 间 的 比率 。 在 这 个 模型 中 ， 突变 速率 可 以 由 3 个 量 来 表达 ,聚合 物 链 长 ,复制 的 精确 度 4( 通 常 以 p=1-4 6+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 < = eas aS ee SKK bests SITS DCD ident 2 Gb, OP, Sh A eS 45. * Eel Pp, a> Si Ste Gin, A “tie 222 cr) SCE gt Se aS a a a ae pen ab 4b, 42 4% 0%, 53 COED KER REE RE ml SSS ay ; QF ‘ 党 3 ee ae % % > 顺序 空间 表 型 空间 实际 数 图 1.3 顺序 空间 和 基因 型 - 表 型 图 解 该 图 表明 顺序 (或 基因 型 ) 空 间 到 表 型 空间 , 并 进一步 转 为 实际 数 。 第 二 图 是 适应 度 " 景 观 , 它 可 以 通过 三 维 标 绘图 来 说 明 。 两 图 通常 是 由 多 到 少 , 是 不 可 逆 的 。 顺序 和 表 型 空间 是 高 维 的 ,这 里 是 用 二 维 说 明 的 表示 ) 和 Hamming 距离 d(1;, i) 方程 (3) 可 以 为 突变 平衡 表征 的 稳 态 提供 相当 精确 的 复制 过 程 ,这 种 复制 的 最 小 精确 度 是 容易 直接 佑 计 的 。 wr —K.) ee ae Die- Xm) (4) fim 式 中 ,复制 的 最 小 精确 度 gmin 相 当 于 最 大 耐 受 突变 率 , Paa = 1 - Gin» CRM A FA 误 临 界 值 。 在 突变 速率 高 于 临界 值 时 , 准 种 被 相同 分 布 取代 。 换 名 话说 ,包括 主 顺 序 的 所 有 突变 体 以 同样 概率 出 现 。 当 复制 精确 度 太 低 时 ,对 生物 多 聚 物 来 讲 , 相 同 分 布 不 可 能 存在 。 通 过 顺序 空间 群体 的 随机 漂移 ,这 种 高 度 错 误 倾 向 再 现 现象 可 以 看 作 随 机 复制 。 准 种 的 概念 用 病毒 群体 和 计算 机 模拟 已 证 实 ! 汪 ] 。 假 定 两 个 高 适应 度 的 基因 型 ,每 个 由 特殊 的 突变 体 云 所 围绕 (图 1.4) ,基因 型 Iw 同 Jo 比较 有 较 高 的 适应 度 ， 但 是 在 具有 较 低 平均 适应 度 的 突变 体 云 中 , 准 种 可 以 看 作 是 突变 速率 己 的 函数 ， 临界 复制 精确 度 ge = 1 - Pue。 在 低 突变 速率 已 > Pu 时 ,适应 值 的 差异 决定 选择 ， 因此 具有 较 高 适应 度 的 主 顺 序 IJm 占 优势 。 然 而 ,上 述 临界 突变 率 P > Pu, 突变 回 流 到 主 顺 序 是 决定 性 的 ,然后 选择 Im。 分 子 准 种 概念 是 建立 在 变异 和 选择 基础 上 的 一 类 新 生物 技术 平台 的 基础 。 关 第 1 章 .定向 分 子 进化 的 思想 、 概 念 和 原理 +7 图 1.4 围绕 主 顺序 准 种 型 突变 体 分 布 准 种 是 一 种 在 顺序 空间 中 多 核 苷 酸 顺 序 (RNA 或 DNA) 的 有 序 分 布 。 最 适应 的 基因 型 或 主 顺 序 Im, 一 般 代表 最 高 频率 ,并 被 紧密 相关 顺序 “ 云 ” (cloud) Zé. 顺序 相关 是 以 突变 体 数 表示 。 在 点 突变 的 情况 下 ,顺序 之 间 的 距离 是 Hamming 距离 。 准 种 被 定义 为 方程 (2) 稳 定 不 变 的 解 。 复 制 错误 速率 在 最 大 值 之 下 称 为 错误 阀 , 这 样 才 有 固定 解 。 在 临界 错误 速 #2, 方程 (2) 的 固定 解 是 相同 的 , 均一 分 布 。 然 而 , 均一 分 布 在 自然 界 或 体外 从 未 实现 。 因 为 可 能 的 核 苷 酸 顺 序 (全 , 入 是 链 长 ) 超 过 个 体 数 几 个 数量 级 。 由 不 正确 复制 所 决定 的 实际 性 质 导致 随机 漂移 ,群体 通过 顺序 空间 移动 ,产生 两 类 突变 :" 云 内 "突变 (灰色 ) , 产生 早已 存在 的 突变 体 ; 云 外 "突变 (黑色 ) ,产生 新 基因 型 于 进化 生物 技术 的 结果 见 文 献 [25,26]。 进 化 设计 的 主要 思想 是 由 连续 选择 循环 组 成 的 ,每 一 循环 包括 三 相 :@ 扩 增 ;@ 多 样 化 ;@ 选 择 ( 图 1.5)。 核 酸 分 子 的 扩 增 和 多 样 化 现在 已 成 为 分 子 生 物 学 常规 的 方法 , 适 体 (aptamer) 的 产生 就 是 一 个 例子 。 配 体 进 化 设计 的 通用 的 方法 是 SELEX( 通 过 指数 富 集 配 体 的 系统 进化 ) 技 术 。 一 般 ,20 ~ 30 个 选择 循环 足以 获得 最 佳 结 合 分 子 。 在 有 利 的 情况 下 ,可 能 获得 结合 常数 在 nmol/L 范围 的 适 体 ' 癌 。 另 一 个 例子 是 核 酶 (ribozyme) ,已 经 选择 出 各 种 新 的 核 酶 ( 见 第 4 章 )。 "8 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 图 1.5 在 选择 循环 中 生物 多 聚 物 的 进化 设计 生物 分 子 的 性 质 , 例 如 与 靶 结 合 或 催化 功能 ,是 通过 选择 循环 最 佳 化 。 每 个 循环 由 三 相 组 成 :@ 扩 增 ;@ 多 样 化 ;@ 选 择 。 扩 增 和 多 样 化 由 分 子 生 物 学 方法 实现 ,例如 PCR 和 自身 持续 顺序 复 制 反应 (3SR 反应 )。 两 者 都 可 提高 突变 率 。 选 择 需要 敏感 的 方 法 ,例如 SELEX 和 化 学 标签 1.4 in silico 进化 许多 不 同 的 基因 型 可 以 给 出 同样 的 表 型 ,并且 取 决 于 条 件 , 即 基因 型 + 环境 型 = 表 型 ,不同 的 表 型 可 以 享有 同样 的 适应 值 。 一 个 以 上 顺序 可 以 导致 同样 的 结构 。 在 控制 条 件 下 中 性 进化 的 直接 证 据 是 用 大 肠 杆 菌 超过 万 代 系 列 转 移 实验 证 实 [2] 。 基于 RNA 分 子 性 质 的 模型 已 经 建立 :基因 型 是 用 RNA 顺序 表示 , 表 型 是 用 RNA 二 第 1 章 定向 分 子 进 化 的 思想 、 概 念 和 原理 + 9， 级 结构 模型 表示 。 这 样 ,最 小 自由 能 的 二 级 结构 折 琶 的 RNA 顺序 决定 RNA 基因 型 和 表 型 之 间 的 关系 。 一 般 考 察 基因 型 - 表 型 图 谱 ( 图 1.3) 可 获得 如 下 结果 :中 顺序 数 (基因 型 ) 超 过 二 级 结构 ( 表 型 ) 大 约 几 个 数量 级 ;@O 共 同 结构 少 , 稀 有 结构 多 ; OBE TAH Al BE 有 一 个 以 上 的 顺序 。 上 述 结 论 是 训 silico 进化 (主要 是 神经 网 络 法 ) 得 出 的 1。 参考 文 献 田 波 , 李 传 昭 , 孙 伦 泉 , 王 学 . 分 子 进化 工程 . 北京 :科学 出 版 社 ,1999 达尔 文 . 物种 起 源 . 周 建 人 , 叶 笃 庄 ra RE. 北京 :商务 印 书馆 ,1991 TRAY. 生物 进化 . 北京 :北京 大 学 出 版 社 ,1998 Mills D R, Peterson R L, Spiegelman S. 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J Theor Biol, 2001, 212: 35 ~ 40 第 2 章 FE oP Fae OY EAR ATK 2.1 引 言 应 用 定向 进化 和 组 合 技术 研究 和 解决 复杂 的 生物 学 和 化 学 问题 ,已 成 为 化 学 和 生物 学 中 最 活 跃 的 领域 之 一 。 定 回 分 子 进化 的 第 一 个 例子 可 追溯 到 Spiegelman 和 Eigen 及 Gardiner 等 经 典 实验 。 他 们 的 实验 证 实 进化 途径 适合 工程 生物 分 子 。 近 10 年 定向 分 子 进化 途径 的 成 功 已 使 其 成 为 进化 生物 技术 的 关键 技术 。 这 不 仅 取决 于 策略 和 方法 的 效力 ， 而 且 更 取决 于 解决 问题 的 能 力 和 范围 , 它 可 以 解决 合理 途径 所 不 能 解决 的 问题 , 因 而 应 用 面 越 来 越 广 。 我 们 可 以 把 定向 分 子 进化 看 作 突 变 加 筛选 /选择 的 重复 循环 。 定 向 分 子 进化 的 第 一 步 是 产生 多 样 性 。 随 机 突变 策略 是 产生 多 样 性 的 最 基本 的 策略 。 最 直接 的 方法 是 通过 易 错 PCR(epPCR ) 或 饱和 突变 把 随机 突变 引入 目的 基因 。 此 外 ,通过 DNA 改组 或 相关 技术 产生 附加 的 多 样 性 ,迅速 积累 有 益 突 变 。 同 源 基 因 之 间 的 改 组 ,也 称 族 改组 ,是 一 种 有 效 的 方法 ,但 是 扩展 顺序 空间 也 是 有 限 的 。 于 是 科学 家 开发 出 非 同 源 基因 之 间 产 生 符 合体 的 各 种 策略 和 方法 ,进一步 拓展 顺序 空间 ,本 章 做 了 重点 介绍 。 本 章 所 介绍 的 策略 和 方法 不 可 能 涵盖 定向 分 子 进化 的 所 有 方面 。 充其量 说 ,本 章 也 只 能 向 读者 提供 定向 分 子 进 化 策略 和 方法 的 “快照 "。 2.2 基本 策略 定向 分 子 进 化 的 基本 策略 如 图 2.1 所 示 世 。 第 一 轮 随机 突变 中 所 选择 的 突变 体 再 重复 进行 随机 突变 和 选择 ,这 样 会 积累 更 多 的 有 益 突 变 [ 图 2.1(a)]。 应 用 DNA 改组 或 其 他 方法 改进 突变 体 的 重组 , 可 使 有 益 突 变 组 合并 消除 有 害 突 变 [图 2.1(b)]。 与 单一 基因 突变 体 的 随机 突变 和 重组 [图 2.1(a)、(b)] 相 反 , 当 同 源 基 因 重组 产生 散人 合体 时 ,可 以 出 现 新 功能 [图 2.1(c)]。 与 随机 突变 不 同 , 同 源 基因 重 组 所 积累 的 氟 基 酸 改 变 主要 是 中 性 突变 ,大 部 分 形成 功能 突变 体 。 这 就 是 说 中 性 突变 的 组 合 形成 的 符合 蛋白 质 可 以 产生 新 的 功能 。 - 12+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) (b) (c) 野生 型 基因 野生 型 基因 同 源 基因 图 2.1 定向 分 子 进化 的 基本 策略 (a) 连 续 随 机 突变 继 之 筛选 出 最 佳 改进 的 单一 突变 体 ,使 每 个 循环 含 1 ~ 2 有 益 突 变 的 积累 ;(b) 随 机 突变 继 之 筛选 两 个 或 更 多 的 改进 的 突变 体重 组 ,使 有 益 突 变 组 合并 消除 有 害 突 变 ; (c) 同 源 基 因 顺 序 重组 ( 族 改组 ) 产 生 功 能 典 合 蛋白 质 , 并 且 人 允许 一 步 完成 许多 有 益 突 变 的 组 合 , 包 括 非 累 加 突变 2.3 基本 方法 2.3.1 HAs PCR Sy PCR( error-prone PCR ，epPCR ) 是 指 在 利用 Taq 酶 进行 PCR 扩 增 目的 基因 的 同时 引入 碱 基 错 配 ,导致 目的 基因 随机 突变 习 。 然 而 ,经 一 次 突变 的 基因 很 难 获 得 满意 的 结果 ,由 此 开发 出 连续 易 错 PCR(sequential error-prone PCR) 方 法 。 即 将 一 次 PCR 扩 增 得 到 的 有 益 突 变 基因 作为 下 一 次 PCR 扩 增 的 模板 ,连续 反复 地 进行 随 机 突变 ,使 每 一 次 获得 的 小 突变 累积 而 产生 重要 的 有 益 突 变 。 在 该 方法 中 ,遗传 变化 只 发 生 在 单一 分 子 内 部 , 故 属 于 无 性 进化 (asexual evo- lution) 。 它 较为 费力 、 耗 时 ,一般 适用 于 较 小 的 基因 片段 ( < 800bpp)。 此 外 ,使 用 该 方法 易 出 现 同 型 碱 基 转换 。 第 2 章 定向 分 子 进化 的 基本 策略 和 方法 + 13 - 2.3.2 DNA 改组 和 族 改 组 DNA 改组 (DNA shuffling) 又 称 有 性 PCR(sexual PCR) ,是 蛋白 质 体 外 加 速 定 向 进化 方法 8'9。 它 分 两 步 改进 蛋白 质 的 基因 :@ 单 一 基因 的 突变 ,选择 所 要 求 的 突 变 基 因 ;@ 突 变 基 因 用 DNase I Hr Beth, 4K FN PCR 体外 重组 (图 2.2)。 当 DNA 改 人 =e es ee : Raa 随机 引 动 合成 =f >” 3/ 5 用 片段 化 DNase I i — + +— = —_— —> —s —4 > > o> we + —p> i i I ai! {1 i nN i | if al 对 u 克隆 和 筛选 iE Se 图 2.2 DNA PA 它 由 两 步 重复 循环 组 成 : 随机 突变 和 突变 的 DNA 改组 。 第 一 步 (随机 突变 /筛选 ) ,由 靶 基 因 分 离 出 几 个 突变 体 。 第 二 步 , 突 变 基因 用 DNase I 片段 化 ,然后 用 没有 引物 的 PCR 组 装 ， 并 用 有 引物 的 PCR 扩 增 。 用 DNA 改组 产生 DNA 转化 受 体 (一 般 是 E. coli) ,并 选择 出 所 要 求 表 型 的 转化 株 组 用 于 一 组 同 源 基 因 时 ,这 种 技术 称 为 " 族 祖先 基因 改组 "family shuffling) (fl 2.3) , 族 改组 的 重 组 子 的 产 率 是 低 的 。 当 改组 有 80% KR 顺序 同 源 的 两 个 母体 基因 时 , 杂 合 体形 成 的 频率 少 于 1% , 低 的 原因 可 能 是 由 于 异 质 复 体形 成 的 频率 低 [ 图 2.4(a)]。 为 此 ,设计 了 两 个 改进 的 族 DNA 改组 技术 :中 单 股 (ssD- NA) 的 族 改 组 。 在 这 个 方法 中 ,制备 两 个 同 源 基 因 的 sSDNA ,其 中 一 个 是 一 个 基因 的 编 码 股 , 另 一 个 是 另 一 基因 的 非 编 码 股 。 两 个 ssDNA 分 子 用 DNase I 消 化 ,它们 的 片段 用 于 族 改 组 。 在 第 一 轮 杂 化 中 ,防止 同 源 复 体 形成 [图 2.4(b)];@ 限 制 酶 消化 DNA 片段 | 取代 随机 片段 DNA 的 改组 。 内 切 酶 消化 的 图 2.3， 族 改组 示意 图 DNA 片段 退火 可 以 高 频率 地 产生 同 源 复 体 ， 属 于 同一 基因 族 的 基因 顺序 改组 产生 蔡 合 基因 库 , 并 由 库 中 选 出 所 要 求 的 嵌 合 体 ” 14 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) 同 源 复 体形 成 5! 3’ ——— = -一 一 一 一 > 5 异 源 复 体形 成 3 3 SR 6: te (c) 异 源 复 体 形成 AD 和 > oe. 2s 8 hs weit HE 用 限制 酶 片段 化 A f 人 = < ee: ae 3 图 2.4 族 改 组 中 DNA 杂 合 和 延伸 (a) 两 族 基 因 的 DNA 股 以 空 和 实 盒 表 示 。 在 应 用 两 个 基因 的 族 改 组 中 , 发 生 两 种 类 型 的 退火 : 同 源 复 体 (来 自 同一 基因 的 股 退 火 ) 和 非 同 源 复 体 ( 来 自 两 种 不 同 基 因 的 股 退 火 )。 如 果 同 源 复 体 形成 的 频率 高 于 非 同 源 复 体 , 初始 基因 顺序 再 生 往往 优先 出 现 ,而 不 是 秀 合 基因 的 形成 。(b) 为 了 防止 在 第 一 轮 PCR 中 形成 同 源 复 体 ，ssDNA 由 两 个 基因 制备 。 这 些 ssDNA 用 DNase I 片 段 化 ,只 形成 非 同 源 复 体 分子 。(c) 用 限制 酶 分 裂 DNA 片段 的 族 改 组 中 ,形成 同 源 复 体 和 非 同 源 复 体 ,前 者 不 出 现 DNA 延伸 ,而 后 者 发 生 DNA 延伸 TE aK A DNA 片段 第 2 章 定向 分 子 进化 的 基本 策略 和 方法 «15 - 但 是 DNA 延伸 只 发 生 在 异 质 复 体 分 子 中 [图 2.4(c) ,图 2.5]。 目前 , 族 改组 是 各 种 来 源 的 同 源 基因 重组 广 为 应 用 的 技术 , 它 是 由 Stemmer DNA 改组 法 派生 。 族 改组 已 用 于 多 种 同 源 基 因 产 生 功 能 肉 合 蛋白 质 库 5]。 例 如 ， 20 个 以 上 分 离 的 人 干扰 素 -o- 基 因 的 改组 产生 舱 合 库 , 它 含 有 抗 病毒 和 抗 增殖 活性 都 提高 的 各 种 突变 体 [9 。 最 好 的 符合 体 是 来 自 6 个 母体 基因 顺序 ,其 较 之 最 好 的 | be aso U U At+X At+Y C+X C+Z | (AtX)HA+Y)t+ ++» (CHX)+ (C+Z) | 图 2.5 用 限制 酶 分 裂 DNA 片段 的 族 改组 两 个 基因 (基因 1 和 基因 2) 用 几 种 限制 酶 分 裂 (对 基因 1 是 A 和 了 B; 对 基因 2 是 X 和 YY)。 两 个 限制 的 DNA 样品 ,基因 1 的 一 个 和 基因 2 的 另 一 个 混合 ,进行 无 引物 的 PCR 反应 。 限 制 的 DNA 样品 重组 见 本 图 中 间 的 表 。 在 该 步 PCR 之 后 ,所 有 PCR 混合 物 (A+X,A+Y 等 ) 一 起 混合 ,并 进行 第 二 轮 PCR - 16+ tA tk A—— ABE I FEL 母体 抗 病毒 活性 提高 87 倍 。 连 续 几 轮 DNA AAEM A ER A, Fat ELA 185 倍 。 另 一 个 例子 是 ,26 种 枯草 杆菌 蛋白 酶 的 基因 顺序 (DNA 同 源 性 仅 为 56.4% ,而 基因 改组 要 求 70% ) 被 改组 并 对 四 种 工业 上 重要 酶 学 性 质 筛 选 !9]。 尽 管 库 中 仅 有 20% 嵌 合体 是 有 活性 的 ,但 有 的 蔡 合 体 的 酶 学 性 质 优 于 最 好 的 母体 。 此 外 , 子 代 艇 合体 呈现 各 种 性 质 的 组 合 。 例 如 热 稳 定性 和 低温 活性 ,而 任 何 母 体 都 不 具有 上 述 性 质 。 最 有 趣 的 是 ,对 某 些 进化 性 质 而 言 , 最 好 的 母体 与 最 好 的 挫 合 体 在 顺序 上 不 是 紧密 相关 的 。 这 表明 最 好 的 母体 不 一 定 是 单一 基因 进化 最 好 的 起 点 。 2.3.3 “外 显 子 改组 外 显 子 改 组 (exon shuffling) 类 似 于 DNA 改组 ,两 者 都 是 在 各 自 含 突 变 的 片段 之 间 进 行 交 换 , 前 者 尤其 适用 于 真 核 生 物 。 在 自然 界 中 ,不 同 分 子 的 内 含 子 间 发 生 同 源 重 组 ,导致 不 同 外 显 子 的 组 合 , 是 产生 新 蛋白 质 的 有 效 途径 之 一 。 与 DNA 改 组 不 同 ,外 显 子 改组 是 靠 同一 种 分 子 间 内 含 子 的 同 源 性 带动 ,而 DNA 改组 不 受 任 何 限制 ,发 生 在 整个 基因 片段 上 ( 详 见 第 6 章 )。 2.3.4 One 合成 改组 (synthetic shuffling )'7) a — FH a [BEAL AO BT HE, AR hE FY VA Ye] #8 TS ft 9 ae eB Be Ee HE PE BE 条 直接 路 线 。15 SEAT bs Se BE A RAS 2 ER AS, FL 他 定向 进化 方法 得 不 到 此 结果 。 合 成 改组 的 设计 策略 见 图 2.6。 一 一 一 “一 一 一 fore re oth A eget Fl = : Saree cece F Se Rake *R? RI S1 一 一 S2 4S 10—— hie —si4 33s 114 e—S13 —> oo aa oS" S7 一 一 一 x wax 图 2.6 FSA RE BA ZR AY KE RR 来 自 15 种 枯草 杆菌 蛋白 酶 母体 的 多 样 性 被 编码 在 全 部 30 SRP. ea 16 种 ARS IR (Fl ~ F8 和 RI ~ R8) 和 14 FET RE” BERT AR (SI ~ S14) 相 对 位 置 。 箭头 指示 5 一 3' 方 向 , 守 核 苷 酸 位 置 用 和 表示 第 2 章 ， 定 向 分 子 进 化 的 基本 策略 和 方法 + 17 - 片段 改组 的 突变 体 都 与 一 个 或 更 多 的 母 顺 序 相 关 。 相 反 , 合 成 改组 的 突变 体 倾向 于 彼此 远离 ,不 再 复 集 在 母体 周围 。 合 成 改组 使 得 突变 体 多 样 性 增加 ,是 由 于 破坏 母体 基因 中 所 表达 的 氮 基 酸 之 间 的 键 合 ,并 改变 氨基 酸 来 自 母 体 的 倾向 性 。 许多 合成 改组 产生 的 蛋白 质 20% 是 有 活性 的 ,并 具有 新 的 功能 。 合成 改组 使 现 有 蛋白 质 的 顺序 空间 扩大 。 合 成 改组 在 蛋白 质 库 的 构建 上 有 很 大 的 灵活 性 。 由 于 所 有 的 基因 是 合成 的 ,密码 子 剂量 可 以 被 改变 以 便 在 宿主 中 表 达 , 也 可 以 消除 母体 基因 中 不 同 密码 子 的 偏爱 。 对 于 低 顺 序 同 源 性 的 母体 基因 , 交 换 体 也 可 以 在 单一 氨基 酸 水 平 上 产生 。 此 外 ,合成 的 多 样 性 不 受 母 体 基 因 的 限制 ， 这 样 ,提供 了 由 顺序 数据 库 到 蛋白 质 库 的 直接 路 线 。 在 任何 已 知 蛋 白质 中 不 存在 的 变化 也 可 以 工程 到 库 中 。 因 此 合成 改组 是 产生 库 的 顺序 多 样 性 和 功能 多 样 性 最 有 效 的 方法 ,很 少 受 母体 基因 之 间 顺 序 同 源 性 的 限制 。 2.3.5 体外 随机 引发 重组 8 体外 随机 引发 重组 (random-priming in vitro recombination ,RPR ) 原 理 见 图 2.7。 它 是 以 单 链 DNA 为 模板 ,配合 一 套 随 机 序列 引物 , 先 产 生 大 量 互补 于 模板 不 同位 Se EE ee: 二 ———————— an 重新 装配 和 扩 增 / / / 3 oars Seaman 二 oa | ES ras ES! 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， cm 生 短 片段 | 重复 上 步骤 aml aa 至 全 基因 长 度 一 二 一 一 一 一 一 一 一 oem Y ' 变性 、 退 火 并 再 次 PCR a ee 提纯 并 再 扩 增 [一 页 一 CC 人 a _ WEL Wi 两 | be a 图 2.8 交错 延伸 原理 图 StEP 法 重组 发 生 在 单一 试管 中 ,不 需 分 离 亲 本 DNA 和 产生 的 重组 DNA. E 采用 的 是 变换 模板 机 制 ,这 正 是 逆转 录 病 毒 所 采用 的 进化 过 程 。 该 法 简便 上 且 有 效 ， 为 酶 定向 分 子 进化 提供 了 又 一 强 有 力 的 工具 。 ER eee ee ee et -一 第 2 章 定向 分 子 进化 的 基本 策略 和 方法 + 19 - 2.3.7 ” 酶 法 体外 随机 -定位 诱 变 20- 2 为 解决 空间 结构 未 知 酶 的 蛋白 质 工 程 问题 ,我 们 曾 以 类 胰岛 素 样 人 参 多 肽 基因 和 天 冬 氮 酸 酶 基因 为 模型 ,探索 了 一 种 酶 体外 突变 的 新 方法 , 即 酶 法 体外 随机 -定位 诱 变 (random-site-directed mutagenesis) (AJ 2.9)。 该 方法 的 内 涵 是 对 目的 基因 既 采 用 随机 突变 增加 突变 位 点 ,以 快速 产生 优质 酶 ,又 让 其 突变 受到 一 定 限制 ,以 减少 筛选 突变 体 的 工作 量 。 实 际 上 ,该 法 是 通过 控制 DNA 合成 的 底 物 种 类 和 浓度 比例 实现 碱 基 对 的 错 配 。 该 法 又 被 称 作 REM 法 (random and extensive mutagenesis) 。 HALE coli RZ1032S 加 尿 苷 培养 HEE DR ME BE 聚合 酶 + 连接 酶 4dNTPs dCTP.dGTP.dTTP soe ATIC. TIGRRT/T HAC A) 5) FB a 7 LARK 检测 正 突变 重组 子 一 > 克隆 表 达 筛选 70% ,重组 的 顺 ' 20 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 序 之 间 连 续 顺 序 10 ~ 1Sbp 长 , 仅 有 高 度 同 源 顺 序 可 以 重组 ,每 个 能 合 基因 突变 体 仅 有 1~4 交 换 体 。 此 外 , 某 些 基因 顺序 尽管 高 度 同 源 , 有 时 难于 重组 。 为 了 改进 基因 改组 实验 的 结果 ,发 展 了 一 些 非 同 源 基 因 改 组 的 方法 03,24 。 过 渡 模 板 随 机 找 合 (random chimeragenesis on transient template,，RACHITT)D4-D]， ES DNA 改组 概念 上 明显 不 同 。 它 不 包括 热 循环 、 链 转移 或 交错 延伸 反应 ,而 是 将 随机 切割 的 基因 片段 杂交 到 一 个 临时 DNA 模板 上 进行 排序 、 修 剪 、 空 隙 填补 和 连接 (图 2.10)。 其 中 的 悬垂 切割 步骤 使 短片 段 ( 比 DNase 消化 片段 还 短 ) 得 以 重 组 ,明显 提高 了 重组 频率 ;如 果 在 片段 重组 前 后 采用 易 错 PCR 还 可 引入 额外 点 突 AB, Coco 等 3] 首次 报道 此 法 改造 二 葵 并 唾 吟 单 加 氧 酶 ,产生 的 嵌 合 库 平 均 每 个 基 因 含 14 个 交换 体 ,重组 水 平 比 DNA 改组 类 方法 (1~4 个 交换 体 ) 高 出 几 倍 ;并 且 可 在 短 至 Sbp 的 序列 同一 区 内 产生 交换 体 。 这 种 高 频率 高 密度 的 交叉 水 平 是 DNA 改组 所 难以 达到 的 。 时 含 尿 喀 院 的 另 一 亲本 基因 三 二 一. 的 下 链 作为 临时 脚手架 模板 修剪 悬垂 序列 、 填 补 空隙 、 连 接 缺 刻 ， 模 板 序列 引入 子 代 媒 合体 除去 脚手架 模板 复制 双 链 DNA y 克隆 和 筛选 图 2.10 RACHITT 法 基本 程序 示意 图 2.4.2 增长 截 短 尽管 过 去 几 年 发 展 了 一 些 定向 进化 的 新 方法 ,但 都 局 限于 两 种 突变 事件 : 碱 基 取代 和 同 源 重组 。 增 长 截 短 是 通过 缓慢 的 定向 控制 DNA 的 消化 ,这 样 可 以 产生 所 有 可 能 单一 碱 基 对 缺失 的 DNA 片段 库 。 Luts 等 08] 报 道 了 构建 杂 合 酶 的 “增长 截 短 法 "(incremental truncation for the cre- ation of hybrid enzyme，ITCHY) 。 它 是 根据 在 两 个 目标 基因 片段 之 间 产 生 单 一 碱 基 对 缺失 库 的 思想 , 继 之 这 两 个 片段 库 随机 融合 (图 2.11)。 该 法 作为 模型 系统 已 成 功 地 用 于 E. coli 甘 所 酰胺 核 苷 酸 转移 酶 (PurN) 和 人 (hGART) 杂 合体 。 作 者 应 用 ITCHY 作为 起 点 , 导 和 人 u- 硫 代 核 苷 酸 类 似 物 (ao-S-dNTP) 以 产生 增长 截 短 库 (THIO- ITCHY) 。 这 个 方法 是 根据 目标 基因 PCR 扩 增 o-S-dNTP 随机 低频 植 人 ,然后 外 切 第 2 章 ”定向 分 子 进 化 的 基本 策略 和 方法 + 21 - 重 登 区 <<. DNA II he ees 用 外 切 酶 王 增 长 截 短 | . * Z SF RAS CR ET 已 上 片段 II 截 短 库 SEE HSE SR 片段 随机 融合 图 2.11 在 两 个 DNA 片 段 之 间 产 生 增长 截 短 库 一 般 图 解 Al 2.12 ” DNA 改 组 和 TITCHY 的 比较 在 N 端 有 同 源 顺 序 的 两 个 基因 顺序 (以 黑 线 示 之 ) 将 形成 各 种 杂 合 库 。DNA 改组 产生 多 个 交换 体 。 组 装 库 的 长 度 分 布 很 类 似 母 体 。N 端 (基因 A) Al C 端 (基因 B) 的 增长 截 短 , 继 之 片段 库 的 连接 , 结果 每 个 顺 序 形成 单一 交换 体 。 如 果 ITCHY 是 在 完整 的 基因 上 进行 ,融合 库 的 长 度 则 从 零 到 A+B .22 . 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 酶 处 理 ,结果 在 随机 位 点 水 解 终止 ,并 一 步 产 生 截 短 库 。ITCHY 与 DNA 改组 的 比 较 见 图 2.12。 2.4.3 非 顺 序 同 源 蛋 白质 重组 Sieber 等 :9 提出 了 非 依赖 同 源 顺序 蛋白 质 重组 ( sequence homology-independent protein recombination, SHIPREC) ( 见 图 2.13) 哺 乳 动 物 细胞 色素 P450 1A2(C 端 部 分 ) 和 可 溶性 细菌 的 P450 BM3(N 端 部 分 ) , 氮 基 酸 顺 序 同 源 性 仅 约 为 16 多。 通过 两 种 基因 随机 截 短 形成 的 二 聚 体 分 子 内 环 化 产生 骨 合 库 , 继 之 在 链 节 内 (有 限制 位 点 ) 线 性 化 并 克隆 。 为 了 选择 正确 可 读 框 可 溶性 的 表达 符合 体 TEAK RAS 素 乙 酰基 转移 酶 基因 融合 。 应 用 SHIPREC 已 得 到 两 个 嵌 合 体 ,并 表现 出 哺乳 动物 P450 1A2 催化 活性 。 作 者 指出 ,重复 SHIPREC 可 以 产生 含 多 个 交换 体 的 能 合 库 。 2.4.4 合理 设计 与 随机 组 合 克 法 不 依赖 同 源 性 的 杂 合 体 ( 包 括 整 个 结构 域 和 亚 结构 域 的 融合 ) 的 合理 设计 有 两 个 突出 的 例子 。 第 一 个 例子 ,Hopfner 等 [2 报道 了 胰 蛋 白 酶 和 因子 Xa 之 间 的 结构 转换 。 两 者 都 是 由 两 个 同 源 B 桶 结构 域 构成 , 杂 合 酶 是 将 胰 蛋 白 酶 的 N 端 融合 到 因子 Xa 的 C 端 产 生 的 。 考 虑 两 个 母体 酶 的 低 蛋 白质 顺序 同 源 性 (38% ) 和 由 两 者 贡献 的 活性 部 位 残 基 , 杂 合 酶 催化 活性 变 宽 , 底 物 专 一 性 明显 不 同 。 第 二 个 例子 ， 它 可 以 认为 是 蛋白 质 工程 的 里 程 碑 。Fersht 及 同事 52 综合 合理 设计 和 DNA 改组 ， 应 用 吧 | 唆 甘油 磷酸 合 酶 (IGPS) 的 B/a 桶 结构 作为 骨架 ,作者 工程 IGPS 的 活性 部 位 表现 出 磷酸 核糖 酰基 邻 氨基 葵 甲 酸 异 构 酶 (PRAI) 活 性 。 上 述 两 个 酶 催化 色 氢 酸 生物 合成 的 连续 步骤 ,并 且 在 结构 上 是 相关 的 。 它 们 低 的 DNA 顺序 同 源 性 (2 多 ) 不 宜 进 行 DNA 改组 。 在 初始 合理 设计 时 ,在 IGPS 骨架 上 一 系列 缺失 ` 取 代 和 点 突 变 产 生 可 溶 的 PRAI 产 物 并 对 IGPS 底 物 有 亲和力 ,但 无 催化 活性 。 在 第 二 相 中 ， 通过 DNA 改组 和 体外 选择 (应 用 已. coli 的 PRAT 缺陷 株 ), 其 中 一 个 杂 合 体 (ivePRAI) 的 活性 高 于 野生 型 6 倍 。 尽 管 同 原始 的 IGPS 有 90 多 顺序 同 源 性 ， ivePRAI 完全 丧失 它 的 IGPS 活性 (图 2.14)。 通过 综合 不 依赖 同 源 (合理 设计 ) 和 同 源 DNA 改组 ,作者 令 人 信服 地 证 实 了 新 设计 策略 的 可 行 性 ,蛋白 质 骨 架 的 初始 的 粗糙 设计 , 继 之 用 随机 诱 变 和 DNA 改组 精细 调整 可 以 成 功 地 产生 杂 合 酶 ,而 不 依赖 母体 顺序 同 源 性 。 第 2 章 定向 分 子 进化 的 基本 策略 和 方法 + 23 - ee GR i 100 1A2 BM3 ee} 35000 | 6T 100 AE) 人 2 56 100 re) 55 OO 100 -ZTE SSS 杂 合 基因 库 杂 合 蛋白 质 库 图 2.13 SHIPREC 操作 示意 图 基因 二 聚 体 是 由 蛋白质 1 的 基因 (1A2)(5' 一 3'),， 链 节 顺序 (含有 效 的 限制 位 点 ) 和 和 蛋白 质 2 的 基 因 (BM3) 组 成 。 中 二 聚 体 片段 化 (例如 ,在 Mn?* 存在 下 用 DNase 工 消化 ) 和 处 理 以 产生 平 端 ( 例 如 用 S1 核酸 酶 或 T4 聚合 酶 ); @ 由 库 中 分 离 单一 基因 长 度 的 片段 (例如 用 琼脂 糖 凝 胶 电泳 ) ; @) 单 一 基因 长 度 片 段 通过 分 子 内 平 端 连接 环 化 ;四 通过 链 节 区 限制 消化 使 环 状 DNA 线性 化 , 产 生 具 有 蛋白质 2 的 N 端 部 分 和 和 蛋白 质 1 的 C 端 部 分 嵌 合 基因 库 ; ORR HEA Re EME BI FETA RR 体 或 者 来 自 两 个 母体 中 一 个 未 端 引 物 进 行 PCR 扩 增 后 克隆 到 表达 载体 。 图 中 数字 代表 基因 长 度 的 百分数 。 关 键 步骤 是 两 个 母体 基因 融合 形成 基因 二 聚 体 - 24> 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 IGPS49 插入 (4~7) 残 基 图 2.14 IGPS 骨架 进化 的 实验 策略 OOIGPS 的 N 端 缺失 48 个 氨基 酸 产生 IGPS49;@ 相 应 于 突 环 Bal 缺失 15 个 氨基 酸 并 有 4~ 7 残 基 取代 ,产生 IGPS49LI 库 ;@Asp 引入 184 位 ,并 用 PRAI 一 致 顺序 GXGGXGQ 取代 突 环 B6a6; 轩 体外 选择 ;@@ 体 外 重组 (DNA 改组 和 StEP PCR) ,产生 ivePRAI 2.4.5 模块 组 装 In silico 进化 研究 表明 自然 界 的 蛋白 质 进化 较 之 同 源 重组 进化 的 步伐 大 。 在 Mante Carlo 模拟 中 ,片段 和 结构 域 的 非 同 源 重 组 是 产生 全 新 功能 蛋白 质 的 成 功 途 径 。 过 去 几 年 更 多 的 努力 是 进行 多 结构 域 酶 的 模块 设计 。 冬 指 结构 与 内 切 核酸 酶 . 甲 基 化 酶 和 效应 子 结构 域 ( 转 录 活 化 剂 / 抑 制剂 ) 引 起 科学 家 更 多 的 关注 ,这 是 由 于 它们 可 能 对 基因 组 研究 有 重要 影响 。 锌 指 蛋 白质 是 一 类 带 有 同 锌 连接 的 各 种 Cys/His 基 序 (motif) 的 DNA 结合 蛋白 质 。 在 金属 离子 的 结合 上 , 锌 指 结构 的 结构 域 结 合 DNA 的 大 沟 。 结 唱 学 资料 表明 锌 指 同 碱 基 三 联 体 相 互 作 用 ,和 欠 指 对 DNA 识别 顺序 可 能 通过 几 个 关键 氨基 酸 残 基 的 改变 而 变化 。 Barbas 及 其 同事 2] 应 用 鸣 菌 体 展示 技术 鉴定 整套 $'-GNN-3' 三 联 体 的 特殊 的 锌 指 结构 域 。 它 们 融合 多 个 锌 指 产生 专 一 指向 复杂 基因 组 中 惟一 的 DNA 顺序 的 结合 模块 , 即 DNA 识别 模块 。3 ~ 6 个 镑 指 结构 域 可 识别 9 ~ 18 伸展 的 核 苷 酸 顺 2H RTPA «25 - 序 ,在 低 nmol/L 范围 表现 出 的 亲和力 , 比 单一 碱 基 大 100 倍 以 上 。 Chandrasegaran 和 Smithl23] 应 用 锌 指 模块 设计 了 带 有 非 天 然 顺 序 特异 性 TS 型 限制 性 内 切 核酸 酶 (RE)。 天 然 限制 酶 的 识别 顺序 通常 限于 6 个 核 苷 酸 , 由 于 基因 组 中 多 个 识别 位 点 存在 而 产生 基因 组 DNA 多 点 分 裂 。 根 据 ISRE 的 模块 性 质 , 作 者 将 Fokl 的 FN- 内 切 核 酸 酶 结构 域 融合 到 锌 指 模块 上 ,获得 的 杂 合 体 全 QNK-EF 有 很 高 的 活性 ,并 在 接近 DNA 识别 位 点 的 多 个 位 置 分 裂 。 多 个 分 裂 产物 可 能 不 是 识别 顺序 非 专 一 性 所 致 ,而 是 锌 指 内 切 核酸 酶 缺乏 结构 刚性 的 结果 。 聚 酮 合 酶 (polyketide synthase，PKS ) 和 非 核 eaeacta Geni yiat ian peptide synthase, NRPS) fi) 4 (A AY PAE RBS TE TP FE HE — SR), «PRS 和 NRPS 是 由 它们 的 模块 结构 来 表征 ,由 多 个 模块 人 它们 本 身 是 由 不 同 催化 活性 的 结 构 域 组 成 ) 线 型 重 排 组 装 而 成 [图 2.1$(a)]。 在 PKS 和 NRPS 族 中 ,缺失 \ 添 加 或 取 代 这 些 个 别 模块 和 结构 域 可 以 机 械 地 设计 上 述 分 子 。Ranganathan 等 5 报道 定向 DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3 (a) eryA I eryAll eryA Ill ia a RN ) BAAS AB EHOEe Ce Ps pine 模块 间 链 节 =Me 或 Et OH 豆 R=H 或 Me R, oe 有 =Me 或 Et 3 图 2.15 PKS 多 模块 线 型 重 排 (a)DEBS 的 结构 。 酶 复合 物 被 分 为 3 个 亚 基 (eryvA I~ II) ,每 个 由 两 个 模块 组 成 。 此 外 ,第 一 个 亚 基 (eryA DT 携带 一 个 负载 的 结构 域 (LM) ,而 eryHI 有 一 个 释放 的 结构 域 (TE) 。 亚 基 相 互 作 用 是 非 共 价 蛋 白质 -蛋白 质 相 互 作用 , 亚 基 内 的 模块 是 共 价 连接 (模块 间 链 节 )。 对 功能 而 言 ,每 个 模块 最 少 需要 3 个 结构 域 : 一 个 酮 基 合 成 酶 (KS) ,一 个 酰基 转移 酶 (AT) 和 酰基 载体 蛋白 (ACP)。 此 外 ,B 碳 修饰 酶 , 例 如 酮 基 还 原 酶 (KR) ,脱氧 酶 (DH) 和 和 烯 酰基 还 原 酶 (ER)。(b) 通 过 杂 合 体 PKS 合成 目标 结构 的 例子 。 结构 1 是 一 个 抑制 素 族 (2) 的 生物 活性 类 似 物 (一 类 降 胆 固 醇化 合 物 )。 结 构 3 代表 eryA 模块 的 天 然 产物 ,其 是 杂 合 体 复合 物 设 计 的 起 点 。Et 一 一 乙 基 ;Me 一 一 甲 基 26> 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 设计 杂 合 体 PKS。 结 构 [ 图 2.15$(b)] 是 降低 胆固醇 的 抑制 素 (statin) 族 (2) 的 一 种 . 类 似 物 。 从 deoxyerythronotide B synthase (DEBS) 出 发 , 纳 巴 霉 素 (模块 11X12) 的 各 种 取代 的 结构 域 和 模块 导入 以 改变 原始 的 eryA Itriketide 产物 和 结构 3 到 1。 最 初 试图 用 rapPKS 模块 12 取代 eryA 工 的 完整 模块 2, 通 过 模块 间 链 接 节 区 的 融合 , 结 果 未 检 出 tiketide。 根 据 假说 ,模块 间 链 节 区 不 利于 产生 功能 杂 合 体 蛋白 质 , 作 者 用 rapPKS 的 个 别 结构 域 取 代 了 eryA I 模 块 ,产生 杂 合 体 PKS( 产 物 D) ,但 产量 低 。 Tang 等 5 报道 了 在 3 个 相关 的 PKS 工程 中 用 模块 间 链 节 出 现 了 相似 问题 。 Gokhal 等 :2 成 功 地 通过 保留 工程 分 析 和 重组 个 别 的 eryA 和 十 模块 ,在 模块 间 链 节 区 保存 母体 顺序 ,结果 形成 的 杂 合体 蛋白 质 有 完全 的 活性 。 对 于 特殊 化 合 物 的 生产 ,除了 杂 合 体 复合 物 设计 外 ,PKS 和 NRPS 复合 物 的 模 块 性 质 也 为 组 合 途径 提供 了 可 能 性 。McDaniel 等 2] 通过 DEBS 中 单一 或 多 个 酰 基 转 移 酶 (AT)、 酮 基 还 原 酶 (KR)、 脱 氢 酶 (DH) 和 烯 酰 基 还 原 酶 (ER) 结 构 域 取代 产生 60 多 种 红 霉 素 衍 生物 库 。 应 用 DEBS 作为 模型 系统 ,作者 把 3 个 亚 基 (eryA I~ II) 克 隆 到 质粒 中 ,并 在 每 个 质粒 中 交换 AT 和 此 碳 修饰 结构 域 。 经 一 系列 的 转 化 , 库 的 多 样 性 倍增 而 不 是 加 和 。PKS 和 NRPS 族 的 结构 域 和 模块 组 合成 单一 复 合 物 将 进一步 扩展 酶 合成 复合 物 的 能 力 ,但 这 只 是 代表 该 方向 的 第 一 步 [2,20。 2.4.6 任意 数量 的 碱 基 随 机 插 人 和 缺失 随机 突变 同 高 通 量 筛 选 的 组 合 是 改进 蛋白 质 功 能 或 产生 人 工 酶 的 普通 策略 。 在 体内 外 引入 随机 突变 方法 中 , 易 错 PCR 突变 是 普遍 采用 的 随机 点 突变 方法 。 然 而 易 错 PCR 方法 有 氨基 酸 倾向 性 ,因为 只 取代 三 联 体 密码 子 的 单一 碱 基 。 例 如 ， 由 AUG( 和 蛋氨酸 ) 到 UAG( AR) ERA REN. BRA REST HBRAERE 变 可 以 在 氨基 酸 水 平 上 实现 非 倾 向 性 随机 取代 ,然而 它们 不 能 在 随机 位 置 上 突变 。 一 些 合成 方法 也 只 适 于 靶 基 因 罕 范围 内 的 突变 。Murakami 等 53 提出 了 一 种 有 效 的 方法 一 一 随机 插入/ 缺失 (random insertion/deletion，RID) 突 变 。 在 随机 位 置 上 沿 着 靶 基 因 的 整个 范围 突变 ,能 够 在 随机 位 置 上 缺失 任意 数量 的 连续 碱 基 ( 直 到 16 个 碱 基 ) ,并 且 同 时 把 任意 数量 碱 基 的 特异 顺序 或 随机 顺序 插入 同 一 位 置 。 用 该 法 可 以 随机 地 取代 3 个 选择 的 碱 基 ,特异 的 密码 子 、 混 合 密码 子 或 非 天 然 氨 基 酸 的 4 个 碱 基 密 码 子 。RID 突变 的 关键 步骤 示 如 图 2.16. 至 今 ,普遍 用 易 错 PCR 引入 突变 , 继 之 DNA 改组 和 其 他 次 级 操作 。 在 PCR 方 法 中 ,只 有 单一 碱 基 突 变 , 这 限制 了 移 人 氛 基 酸 的 多 样 性 ,单一 突变 往往 不 能 导致 希望 的 氨基 酸 取代 。 在 这 方面 ,通过 RID 突变 所 产生 的 库 同 常规 技术 比较 有 更 大 的 潜力 。RID 突变 方法 可 以 用 于 (例如 丙 氨 酸 扫描 ) 研 究 蛋 白质 折 笃 或 酶 活性 的 关 键 位 置 。 同 样 ,RID 突变 可 以 把 单一 随机 氨基 酸 引 和 人 随机 位 置 , 这 是 常规 方法 难以 第 2 章 定向 分 子 进化 的 基本 策略 和 方法 + (27 - EcoRI Hind ll —— (1) 链 节 连 接 (2) Hind Hind ill EcoRI 2] 环 化 O 3 | 反 义 DNA 降 解 Ce(IV)-EDTA 随机 分 裂 Y 了 Sy a Bens s} 锚 连 接 到 二 | PCR (1) Bei V4} mn 2) 平 端 连接 Fh 中 环 化 iadII FEcoRI EcoR1/ Hindlill EcoRI Hindlill 一 一 一 一 一 一 一 一 一 -一 - .一 一 一 2.16 随机 插 人 /缺失 (RID) 突 变 一 般 图 解 它 有 8 个 主要 操作 步骤 :第 一 步 : 用 EcoRI Al Hind 消化 出 发 基因 所 得 片段 与 链 节 连 接 ; 产 物 用 Hind 亚 消 化 制 成 反 义 链 有 缺口 的 线性 ddDNA。 第 二 步 : 基 因 片 段 用 T4DNA 连接 酶 环 化 制 成 反 义 链 有 缺口 的 环 状 daDNA。 第 三 步 : 环 状 dSDNA 用 T4DNA 聚合 酶 处 理 产生 环 状 sDNA。 第 四 步 : 环 4R ssDNA Fj Ce(IV)-EDTA 复合 物 处 理 , 随 机 在 单一 位 置 分 裂 。 第 五 步 :线性 sDNA 两 端 带 有 未 知 顺序 ,分 别 连 接 到 $' 锚 位 和 3' 锚 位 。 第 六 步 : 与 两 端的 两 个 锚 位 连接 的 DNA 用 PCR 扩 增 。 第 七 步 :PCR 产物 用 Bei VI Ab FH, ca Sarthe (FE 5 端 ) 去 除 7 个 碱 基 。BciVI 处 理 也 删 去 3 端的 一 定数 量 的 碱 基 。 第 八 步 : 消化 的 产物 用 Klenow 片段 处 理 制 成 平 端 ,并 且 用 T4DNA 连接 酶 再 次 环 化 。 产 物 用 EcoRI 和 HindIIl 处 理 , 并 且 所 得 片段 克隆 到 修饰 的 pPUC18(PUM) 的 EcoRI ~ Hind 位 点 办 到 的 。 RID 突变 也 可 以 把 任意 数量 碱 基 引 入 靶 基 因 。 例 如 限制 位 点 (AGATCT) 可 以 -28 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 引入 3 个 连续 的 碱 基 。 基 本 上 不 限制 引入 目标 基因 的 碱 基数 量 。 当 用 限制 酶 BciVI 时 , 碱 基数 可 以 由 3' 端 缺失 0 ~ 6, 如 果 用 其 他 的 限制 酶 ,例如 Bsg LI, 缺失 范 围 将 延伸 到 16。 RID 突变 另 一 个 重要 的 应 用 是 随机 移 人 非 天 然 氮 基 酸 ,其 可 以 由 四 碱 基 密 码 子 编码 [22,3] , 即 GGGU,CGGU CUCU ,CCCU 和 AGGU, 它们 可 以 分 别 指定 为 不 同 的 非 天 然 氨 基 酸 。 由 于 引入 非 天 然 氮 基 酸 大 的 侧 链 基 团 , 非 天 然 突变 的 一 个 主要 问题 是 突变 体 往往 错误 折 奉 。 非 天 然 突变 体 的 RID 库 的 构建 和 罕 变 体 的 选择 将 产生 有 益 功 能 的 和 蛋白质。 总 之 ,RID 突变 发 展 了 突变 体 库 。RID 突变 也 能 够 在 目标 基因 随机 位 置 上 插 和 任何 数量 的 碱 基 或 缺失 直到 16 个 碱 基 。 该 方法 将 会 广泛 地 用 于 生命 科学 和 生 物 技 术 。 2.4.7 片段 突变 片段 突变 是 一 个 重要 的 随机 突变 方法 。 应 用 PCR 可 以 产生 基因 缺失 或 插入 。 Pikkemaat 等 [ 绚 提 出 了 体外 缺失 和 重复 的 完全 随机 的 方法 。 通 过 组 合 两 个 独立 产 生 的 一 批 DNA, 含 有 3' 或 $' 截 短 的 基因 片段 ,产生 随机 融合 库 ,结果 在 融合 点 产生 缺失 和 重复 。 通 过 控制 启动 截 短 的 水 平 , 可 以 控制 片段 突变 ,以 限制 库 的 大 小 (图 2.17)。 该 策略 同 随机 突变 和 基因 改组 的 组 合 可 能 对 定向 分 子 进 化 有 导 回 作用 。 Pikkemaat 等 用 自 养 黄 杆菌 ( Xanthobacter autotrophicus ) GJI0(Dh1A) 产 生 的 元 代 烷 脱 卤 酶 作为 模型 系统 , 当 在 1,2- 二 氯 代 乙 烷 (DCE) 上 生长 时 , 脱 卤 酶 是 细菌 代谢 途 径 中 的 关键 酶 。 它 可 以 将 氯 代 和 省 代 化 合 物 转 为 相应 的 醇 ,在 环境 保护 方面 有 重 sm 因为 其 底 物 是 环境 污染 物 。 在 该 酶 顺序 中 的 重复 和 缺失 已 知 在 适应 新 底 物 起 重要 作用 。 实 验 结果 表明 了 该 方法 的 有 效 性 ,也 表明 了 该 突变 方法 在 定向 分 子 进 化 实验 上 的 潜在 价值 。 2.4.8 Wiley A RAR ADO(assembly of designed oligonucleotide) 7 Fé #8 HEF (a BIE SA EH 酸 设计 ,控制 所 设计 的 寡 体 的 重 友 ,组 装 成 高 重组 频率 的 全 长 产物 55] 。ADO 法 使 母体 基因 自身 杂 化 减少 到 最 低 , 用 于 酶 定向 分 子 进化 明显 超过 常规 的 族 改组 。 ADO GFA Bacillus subtilis 两 种 脂肪 酶 族 基因 ( LipA 和 ZipB) 改 组 。 图 2.18 说 明 ADO 的 一 般 概念 。 根 据 顺 序 空 间 的 同 源 性 ,应 用 两 种 策略 进行 组 装 : 中 两 种 基因 A 和 B 被 匹配 重组 ;图 中 各 种 颜色 星 号 给 出 各 种 编码 氨基 酸 的 密码 子 。 在 母体 基 因 的 同样 位 置 有 两 种 颜色 星 号 寡 核 苷 酸 片段 表示 具有 简 并 性 的 合成 寡 核 苷 酸 片 第 2 章 定向 分 子 进 化 的 基本 策略 和 方法 + 29> 帽 结构 域 BAL-31 有 限 消化 让 人 — = FANco 1 34443’ -RR AEA 截 短 基因 片段 的 用 PstI 消 化 5′- 截 短 的 基因 片段 分 离 ，5' AZ! BE 因 片段 的 组 装 [ee ee 图 2.17 片段 突变 操作 的 图 解说 明 载体 首先 在 脱 卤 酶 基因 的 5' 或 3' 端 线性 化 ,外 切 核 酸 酶 作用 逐渐 去 除 剩余 的 载体 DNA, 产 生 一 批 3' 或 5' 截 短 的 基因 片段 。 在 两 端 组 装 后 ,片段 突变 库 被 连接 到 新 的 载体 上 ,并 转化 到 EL. co1i ,对 酶 活性 进行 筛选 段 。 灰 色 部 分 表示 顺序 的 保守 区 ,其 可 以 用 作 同 源 重组 的 链 节 ;@O 在 oligose 两 侧 之 间 没 有 同 源 性 。 它 可 以 在 未 知 末端 顺序 ssDNA 股 之 间 连 接 组 装 。 POAT KW Fh UA. ARE Zip4 和 LipB 的 蛋白 质 匹配 , 氮 基 酸 顺序 被 分 为 5 个 单元 。 根 据 标准 编码 剂量 ,将 氨基 酸 残 基 写 成 核 苷 酸 , 而 以 LipA 和 ZipB 的 最 初 DNA 顺序 作为 参考 。 寡 核 苷 酸 的 5 个 单元 Lipl ~ Lips 按 顺 序 设计 。 当 两 个 顺序 中 的 氨基 酸 不 同时 ,应 用 简 并 核 苷 酸 。 例 如 ,如 果 Ser 是 被 一 个 密码 子 (TCT) 在 某 一 位 置 编码 ,在 第 二 个 母体 基因 产物 Lys 是 由 另 一 个 密码 子 (AAA) 在 上 述 位 置 编码 ,那么 这 个 位 置 的 核 苷 酸 应 选择 (T/A)(C/XA)(T/AA)。 在 这 种 情况 下 ,在 这 个 位 置 编码 氨基 酸 的 核 苷 酸 将 是 WMW (4% TUB 编码 ) 。 遗 传 密码 的 简 并 性 可 以 把 额外 编码 的 氨基 酸 引入 到 既定 位 置 。 例 如 ,TA(CT/XA) 可 以 编码 出 Tyr 或 终止 密码 子 ,AC(T《A) 可 以 编码 出 Thr。 这 样 ， 额 外 "所 基 酸 提高 了 编码 的 多 样 性 。 - 30 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) (b) Al 2.18 ADO 的 一 般 概 念 片段 连接 的 两 种 可 能 策略 :(a) 两 个 基因 A 和 了 B 改 组 匹配 。 不 同 星 号 给 出 编码 各 种 氨基 酸 的 密码 子 ,而 在 母体 基因 同一 位 置 有 两 种 星 号 的 寡 核 苷 酸 片段 表示 具有 简 并 性 的 寡 核 苷 片段 。 空 心 星 号 表示 顺序 的 保守 区 , 它 可 以 作为 同 源 重 组 的 链 节 。 (b) 在 两 侧 窒 核 苷 酸 之 间 没 有 同 源 性 , 它 可 以 在 未 知 末端 顺序 SSDNA 股 之 间 连 接 组 装 片段 的 PCR 组 装 是 以 直接 方式 进行 的 ,正常 情况 下 分 两 步 。 在 PCR 反应 中 ， 合成 的 寡 核 苷 酸 片段 Lipl ~ Lips 代表 单 股 设计 合成 的 oligose。 两 侧 片段 的 方向 相 反 , 例 如 Lipl 是 5’—3’ , Lip2 是 3'—5’ ,Lip3 是 5 一 3' 等 。 加 上 dNTP, RMP MAR 合 酶 ,在 几 轮 扩 增 之 后 ,各 种 片段 彼此 连接 并 形成 双 股 DNA。 全 基因 的 扩 增 示 如 图 2.19。 全 基因 被 连接 到 高 表达 载体 pPET22b( + ) 并 转化 到 E. coli BL21(DE3). = Lipl Lip3 Lip5 aa Lip2 Lip4 pie 芒 图 2.19 设计 的 寡 核 苷 酸 组 装 过 程 ; Lipl->Lip5 代表 设计 的 守 核 苷 酸 ,箭头 表示 片段 的 方向 应 用 ADO 法 产生 3000 脂肪 酶 突变 库 , 从 中 筛选 出 内 消 旋 双 乙酸 酯 对 映 体 选 择 性 明显 提高 的 突变 体 。 ADO 法 的 主要 优点 是 母体 基因 的 自身 杂 化 最 低 或 消除 ,提高 库 的 质量 ,减少 第 2 章 定向 分 子 进化 的 基本 策略 和 方法 + 31 - 筛选 工作 量 。 这 样 ,ADO 可 以 预期 是 一 种 功能 蛋白 质 和 代谢 工程 定 癌 进化 的 一 种 积极 方法 。 2.4.9 体外 区 室 化 实验 室 定 向 进化 是 模拟 自然 进化 的 一 种 强 有 力 的 策略 。 自 然 和 定向 进化 都 需 要 基因 型 和 表 型 之 间 的 联系 。 在 体外 ,这 种 联系 通常 是 由 基因 与 蛋白 质 来 体现 ,并 通过 各 种 技术 来 完成 ,包括 叹 菌 体 、 病 毒 、 细 菌 和 酵母 展示 ,质粒 展示 ,核糖 体 展 示 和 mRNA- 肽 融合 。 这 些 展示 技术 证 明 在 结合 蛋白 质 选 择 上 是 很 成 功 的 。 相 反 , 通 过 展示 途径 ,选择 酶 的 成 功率 则 小 。 间 接 选 择 ,例如 通过 与 过 渡 态 类 似 物 或 酶 抑制 剂 结合 ,一般 很 难产 生 有 效 的 催化 剂 。 Griffiths 等 35] 根据 体外 区 室 化 (IVC) 发 展 了 一 种 酶 体外 选择 系统 。 各 种 反应 被 分 为 显微镜 区 室 ,每 个 仅 约 Sf, 形 成 油 包 水 乳 状 液 ,50nwl 反应 液 可 以 被 分 散 到 约 10°S KK SES ,可 以 选择 许多 基因 ,这 个 系统 是 高 敏感 和 经 济 的 。 作 者 以 前 用 IVC 选择 DNA 甲 基 转 移 酶 7] 和 Taq DNA 聚合 酶 的 进化 酶 [31 。 作 者 根据 产生 微 珠 库 提出 一 种 新 的 IVC 策略 ,每 个 微 珠 展示 一 个 基因 和 它 编码 的 蛋白 质 。“ 微 珠 展 示 库 ” 可 以 根据 展示 的 多 肽 的 结合 活性 来 选择 ,或 在 多 重 转换 条 件 和 选择 反应 环境 ， 对 可 溶 的 非 DNA 底 物 的 催化 进行 选择 。 定向 进化 策略 对 于 许多 非 合 理 设计 来 讲 是 成 功 的 。 现 在 研究 人 员 集 中 在 发 展 新 筛选 和 非 同 源 重 组 技术 以 及 复杂 系统 。 例 如 途径 ,病毒 ,甚至 完整 基因 组 的 定向 进化 。 由 基因 组 计划 所 获得 的 大 量 新 基因 顺序 将 为 新 生物 催化 剂 和 代谢 途径 的 定 向 进化 提供 选择 基因 的 “宝库 ”。 不 依赖 于 同 源 性 方法 的 开发 仍 处 于 早期 阶段 。 合 理 设计 虽然 取得 了 积极 的 结 果 , 但 它 取决 于 广泛 的 结构 和 功能 信息 ,因而 限制 它 的 广泛 应 用 。 不 依赖 同 源 性 方 法 将 增加 组 合 蛋白 质 库 的 多 样 性 ,将 产生 许多 有 意义 的 和 未 预料 到 的 结果 ,将 最 终 导致 成 功 地 设计 新 酶 以 及 更 好 地 了 解 酶 的 结构 与 功能 关系 。 参考 文 献 Schmidt-Dannert C. 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Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replica- tion. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 4552 ~ 4557 3 EIA FEL P/HA TT IK 3.1 5] 育 第 2 章 介绍 了 定向 分 子 进 化 的 策略 和 方法 ,核心 是 讨论 如 何 增加 多 样 性 ,拓展 顺序 空间 ,积累 有 益 突变 。 这 仅仅 是 定向 分 子 进化 的 一 个 重要 方面 。 另 一 个 重要 方面 是 在 产生 多 样 性 之 后 , 即 在 产生 各 种 突变 体 库 之 后 ;所 希望 的 酶 必须 从 库 中 分 离 出 来 ,这 可 以 通过 选择 或 筛选 操作 实现 。 选择 (selection) 和 筛选 (screening) 往 往 容 易 混 淆 。 选 择 是 利用 所 希望 的 突变 体 的 独 有 的 生存 条 件 ,模拟 达尔 文 进化 过 程 ,由 大 的 组 合 库 中 鉴定 突变 体 ; 筛选 则 是 检验 大 的 组 合 库 中 所 有 成 员 来 鉴定 突变 体 ,是 一 种 主动 的 搜索 过 程 。 选 择 / 筛 选 是 分 子 生物 学 常用 的 方法 。 图 3.1 表示 应 用 正 选 择 克 隆 载体 的 一 种 体内 选择 方法 。 它 分 为 随机 筛选 , 易 化 筛选 (facilitate screening) 和 选择 。 图 3.1 变异 克隆 的 搜索 策略 转化 后 营养 琼脂 平板 上 ”+ "表示 含有 插 人 基因 的 质粒 ;” -表示 仅 有 载体 DNA; bla 基因 编码 及 内 酰胺 酶 ,其 抗 氨 苯 青 霉 素 (Amp)。(a) 随 机 筛选 。 所 有 克隆 的 表 型 是 相同 的 。 分 离 随机 挑选 的 克隆 DNA, 分 析 所 希望 的 质粒 。(b) 易 化 筛选 。 克 隆 载体 pPUC19 携带 编码 有 久 半 乳糖 苷 酶 的 LacZ 基因 片段 ,编码 多 肽 ( 酶 的 -片段 ) 可 以 同 细胞 的 LacZ 片段 产物 结合 形成 功能 及 半 乳 糖苷 酶 ,其 分 BY 5-YR-4-A-3-05| RSE BD-RE PLB (X-gal) PAE ETE ATA WILE. TEA A X-gal 琼脂 板 上 呈 蓝 色 。 相 反 ,希望 得 到 的 克隆 是 无 色 ,这 是 由 于 克隆 的 基因 插 人 到 o- BAY aK ,因此 使 及 半 乳 糖苷 酶 活性 丧失 。 由 蓝 色 克 隆 背 景 挑选 白色 克隆 (图 中 黑 斑 ) 以 找 出 正确 基因 型 。(c) 选 择 。 正 选 择 载体 pPKBS 携带 突变 体 pheS 基因 ,编码 葵 丙 氨 酰 基 -tRNA 合成 酶 w- 亚 基 , 给 出 松弛 的 底 物 特异 性 。 在 葵 丙 氨 酸 类 似 物 对 - 氯 - 葵 丙 氨 酸 (P-CL-Phe) 的 存在 下 ,由 于 类 似 物 挫 人 和 蛋白质 造成 总 的 蛋 白质 功能 失 活 ,， 表达 突变 体 pheS 菌株 不 能 生存 。 然而 在 营养 琼脂 板 上 转化 的 细胞 可 以 形成 含有 Amp 和 P-Cl-Phe, 如 果 条 件 致 死 pheS 是 由 于 克隆 的 DNA 片段 的 插 人 ,这 样 , 在 转化 后 所 有 生长 的 克隆 都 有 正确 的 基因 型 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 + 35 ， 选择 的 优点 是 可 以 检验 更 大 的 库 。 一 般 来 讲 ,可 以 进行 选择 克隆 数 超过 先进 的 筛选 方法 5 个 数量 级 。 可 靠 的 选择 动力 是 宿主 的 生存 直接 与 要 求 的 表 型 偶 联 。 这 也 是 对 大 多 数 选择 方法 的 主要 挑战 。 尽 管 所 检验 的 殉 隆 数 低 , 但 筛选 操作 日 显 重要 。 一 个 重要 原因 是 方法 的 巨大 进步 ,现在 已 达到 自动 化 小 型 化 ,筛选 酶 的 各 种 工作 站 都 已 建立 起 来 。 根据 酶 活性 进行 筛选 (或 选择 ) 是 最 普遍 采用 的 方法 ,或 者 在 微量 滴定 板 上 直 接 检验 颜色 或 荧光 反应 产物 的 形成 ,或 者 是 固 相 检验 (例如 ,琼脂 板 或 滤 板 ) , FET 脂 板 或 滤 板 上 克隆 的 固 相 筛选 可 以 迅速 地 筛选 大 库 ,或 根据 存在 于 固 相 中 底 物 的 分 裂 或 通过 局 部 pH 变化 用 pH 指示 剂 检 验 产物 的 释放 来 鉴定 各 种 突变 体 ,通过 改 变 固 相 中 释放 产物 的 溶解 度 所 产生 的 亮 区 和 沉淀 的 发 展 ,或 监控 决定 不 浴 底 物 分 裂 的 生长 速度 等 。 目 前 大 多 数 固 相 筛选 方法 缺乏 催化 活性 的 灵敏 定量 ,因此 适合 于 第 一 轮 定向 进化 的 筛选 。 迅 速 灵 敏 的 荧光 高 通 量 数字 呈 像 筛选 已 得 到 发 展 。 如 果 适 当 的 荧光 或 生 色 底 物 是 有 效 的 话 , 数 字 呈 像 是 大 库 定 量 固 相 筛选 强 有 力 的 方 法 。 应 用 平板 阅读 器 定量 比 色 测定 或 奖 光 测定 ,直接 检验 全 细胞 或 裂解 液 或 表达 的 突变 体 酶 的 定位 和 底 物 可 及 性 的 培养 上 清 液 。 虽 然 耗 时 ,但 可 根据 进化 所 要 求 的 功能 进行 检验 。 在 某 种 情况 下 ,所 要 求 的 新 催化 活性 可 以 直接 与 表达 宿主 的 表 型 联系 起 来 ,例如 宿主 营养 缺陷 型 或 提供 抗生素 或 细胞 毒 试剂 ,通过 体内 选择 可 以 筛选 大 库 ( > 10°) , 表 3.1 列 出 筛选 酶 的 某 些 方法 。 酶 定向 分 子 进化 选择 /筛选 的 各 种 策略 和 方法 似乎 都 是 根据 表 型 和 活性 或 它 们 的 偶 联 衍生 的 , 它 贯 穿 在 本 章 所 介绍 各 种 策略 和 方法 之 中 ,因此 本 书 不 做 专题 讨 论 。 过 去 10 年 ,展示 技术 已 成 为 肽 和 蛋白 质 配 体 以 及 描述 体内 相互 作用 模型 的 主 要 工具 0 4。 鸣 菌 体 和 核糖 体 展示 系统 主要 用 于 发 现 ,而 酵母 双 杂 交 方 法 主要 用 于 体内 相互 作用 分 析 。 喉 菌 体 展 示 和 酵母 双 杂 交 系 统 需要 体内 步骤 ,因而 应 用 受到 一 定 的 限制 。 在 吹 菌 体 展 示 中 , 库 必 须 转化 到 细菌 中 ,可 能 的 独立 顺序 量 限 于 10? ~ 10"。 表 达 的 顺序 总 量 可 能 由 于 其 他 一 些 因 素 干 扰 进一步 减少 。 这 些 因素 包括 未 折叠 分 子 的 降 解 , 在 细菌 宿主 中 低 表达 ,缺乏 噬菌体 表面 的 加 工 , 在 EB. coli 氧化 的 围 膜 间隙 缺乏 折 硬 和 基因 产物 的 毒性 等 。 同 样 ,酵母 双 杂 交 系 统 需要 把 相互 作用 伴侣 克隆 到 酝 母 中 ,所 检验 的 量 局 限于 10° ~ 10"。 此 外 , 双 杂 交 途 径 , 相 互 作用 必须 发 生 在 核 内 ， 限制 更 严格 。 体 外 技术 ,例如 核糖 体 和 mRNA 展示 ,克服 了 鸣 菌 体 展示 和 双 杂 交 系统 的 许多 限制 。 该 途径 偏向 性 低 ， 由 于 不 需要 转化 步骤 ,可 能 的 独立 顺序 量 eit. - 36 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 表 3.1 筛选 酶 的 方法 举例 酶 检验 方法 蛋白 酶 学 圈 (A) 蛋白 酶 吸收 (S) 蛋白 酶 FRET(S) 蛋白 酶 FP 枯草 杆菌 蛋白 酶 吸收 (S) 蛋氨酸 氨基 肽 酶 D 丙 氨 酰 -D. 丙 氨 酸 二 肽 酶 bail 青霉素 G 酰 化 酶 颜色 (A,S) ， 青霉素 G 酰 化 酶 荧光 (S) 青霉素 G 酰 化 酶 荧光 (S) 葡萄 球菌 脂肪 酶 吸收 (S) 脂肪 酶 荧光 (S) 乡 肪 酶 (土壤 ) 学 圈 (A) pNB 酯 酶 吸收 (S) 荧光 假 单 胞 菌 酯 酶 pH 指示 剂 (A) BRA HUT EE 颜色 (A) R 内 酰胺 酶 (土壤 ) 颜色 (A) Scytalone 脱 氢 酶 pH 指示 剂 (A) 纤维 素 酶 #208, FEREK (A) 磺 基 转移 酶 吸收 (S) 硝酸 和 亚 硝 酸 还 原 酶 吸收 (S) 限制 性 内 切 酶 FCS(S) 脱 氢 酶 (土壤 ) 颜色 (A) P450 加 氧 酶 颜色 (A) 黄色 短 杆 菌 类 胡 葛 卜 素 基因 能 编码 的 酶 颜色 (A) TE: A = 琼脂 板 检验 ;S = 溶液 检验 ;FRET = 荧光 共振 能 量 转移 ;FP = 荧光 偏振 ;FCS = 荧光 关联 能 谱 法 。 总 之 ,高 通 量 筛选 是 发 现 新 酶 的 重要 工具 。 定 向 分 子 进化 的 发 展 可 以 预期 在 不 久 的 将 来 ,将 使 生物 催化 剂 及 催化 过 程 以 鼎新 的 面貌 出 现在 生命 科学 和 生物 技 术 “ 世 界 ”。 3.2 核糖 体 和 mRNA 展示 技术 Mattheakes 等 5] 首先 开发 出 核糖 体 展 示 技 术 [ 图 3.2(a)], Hanes 和 Pluck- 第 3 章 定向 分 子 进 化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 + 37 - (a) DNA 3 i @& mRNA Saat “te seat 分 解 体外 翻译 5’ | 二 WF oe 复合 物 形成 人 ) 体外 转录 DNA ——— > mRNA 5! yore Van 加 入 DNA- 补 骨 脂 素 链 节 jj DNA Tree arc . carn 体外 翻译 | 7 复合 物 形 万 SR Renee A cDNA” Sis 和 一 一 pee, cDNA 股 合成 图 3.2 体外 展示 技术 (a) 核 糖 体 展示 选择 图 解 。 编 码 目 标 蛋 白质 的 DNA 库 与 链 节 了 融合 ,其 允许 蛋白 质 折 释 而 链 节 仍 在 核糖 体 “ 隧 道中。 形成 的 融合 物 ( 其 缺乏 终止 密码 子 ) 体 外 转录 为 mRNA 并 进一步 体外 翻译 ,形成 稳定 的 mRNA, 核糖 体 和 初生 多 肽 的 三 元 复合 物 ,翻译 终止 。 这 个 复合 物 直接 在 固定 的 靶 上 进行 结合 选择 。 结 合 复合 物 中 的 mRNA FA EDTA 与 核糖 体 分 离 , 继 之 用 PCR 进行 逆转 录 反 应 产生 选择 克隆 。 然 后 分 析 这 些 克 隆 或 用 作 下 一 轮 选 择 。 (b)mRNA 展示 选择 图 解 。 编 码 目标 蛋白 质 的 DNA 库 体 外 转录 ,形成 的 mRNA 共 价 与 短 的 DNA 链 节 ( 在 它 的 3' 端 携带 味 叭 霉 素 部 位 ) 融 合 。 该 连接 可 以 通过 杂 化 实现 , 继 之 补 骨 脂 素 标 记 的 DNA 链 节 与 mRNA 光 交 联 或 通过 酶 促 连 接 反应 ,形成 的 连接 物体 外 翻译 。 在 翻译 时 ,核糖 体 完 成 RNA-DNA 连接 和 停顿 ,允许 叮 叭 部 位 与 核糖 体 A 位 结合 。 因 此 ,初生 多 肽 被 转移 到 嘲 叭 霉 素 部 位 导致 共 价 mRNA- 多 肽 融合 。 这 个 mRNA- 融 合 复合 物 随后 纯化 ,并 且 第 一 个 EDNA 股 被 合成 ,然后 结合 在 固定 化 配 基 上 进行 选择 ,并 且 洗 脱 结合 复合 物 。 继 之 PCR 产生 选择 克隆 ,然后 分 析 这 些 克隆 并 用 作 下 轮 选 择 。 图 (a) 和 (b) 中 , 黑 线 相当 于 DNA, 虚线 相当 于 mRNA。 (b) 中 星 号 代表 味 叭 霉 素 部 位 。 为 简化 起 见 ,体外 翻译 步骤 之 后 交 联 的 mRNA-DNA 杂 合 体 未 标 出 ° 38 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 thunLg He 和 Taussing.”! #t— 26 Be Ht T Be 白质 的 选择 。 核 糖 体 展 示 技 术 是 依 靠 mRNA ,核糖 体 和 初生 多 肽 的 非 共 价 三 元 复合 物 , 保 证 基因 型 和 表 型 的 偶 联 ,所 构建 的 融合 蛋白 质 中 目标 结构 域 与 C 端 链 节 融 合 ,这 样 该 结构 域 可 以 折 春 而 链 节 仍然 在 核糖 体 “ 隧 道 " 中 。 融 合 物 在 mRNA 水 平 上 缺乏 终止 密码 子 , 这 样 阻 止 mR- NA 和 多 肽 由 核糖 体 释 放 ,高 浓度 的 镁 和 低温 进一步 稳定 三 元 复合 物 。 这 个 复合 物 是 在 体外 翻译 过 程 中 形成 的 ,可 以 直接 用 于 展示 蛋白 质 的 各 种 性 质 。 Robert 和 Szostak'*! 4 S mRNA 展示 的 相关 技术 [图 3.2(b) ] , 称 为 mRNA 蛋 白质 融合 或 体外 病毒 ,这 个 方法 依靠 mRNA 与 初生 肽 共 价 偶 联 。mRNA 首先 与 携 带 味 叭 霉 素 部 位 的 短 的 DNA 链 节 共 价 连接 ,然后 这 个 库 体 外 翻译 , 像 在 核糖 体 展 示 一 样 , 当 核 糖 体 完成 RNA-DNA 连接 时 ,核糖 体 停 顿 ,并 且 味 叭 霉 素 部 位 进入 核 糖 体 的 肽 酰基 转移 酶 位 点 ,与 初生 肽 形成 共 价 链 。 这 样 ,蛋白 质 和 mRNA 偶 联 , 继 而 由 核糖 体 分 离 和 纯化 。 在 目前 方案 中 ,cDNA 股 被 合成 以 形成 RNA-DNA 杂 合 体 , 其 最 终 用 于 选择 。 mRNA 展示 方案 已 有 明显 地 改进 :功能 mRNA- 蛋 白质 融合 的 产量 与 原 方案 比 ， 大 约 提高 40 倍 ;mRNA 5 FM BA AY DNA 链 节 的 连接 也 明显 改进 。 在 新 方法 中 ,携带 补 骨 脂 素 (psoralen) 的 DNA 链 节 是 同 mRNA 的 末端 杂 化 ,并 定向 与 mRNA 光 交 联 。mRNA 展示 的 这 些 改进 打开 了 处 理 复杂 蛋白 质 库 的 一 个 窗口 。 核 糖 体 和 mRNA 展示 的 弱点 是 mRNA 对 核酸 酶 降解 敏感 。 为 了 改进 mRNA 展示 的 稳定 性 ， Kurz “$!9) 425% T FA SLR cDNA 取代 mRNA- 蛋 白质 中 的 mRNA 分 子 。 该 方法 对 于 苛刻 条 件 ( 例 如 高 温 ) 的 选择 可 能 有 特殊 的 意义 。 用 定向 进化 技术 使 蛋白 质 亲 和 性 成 熟 是 产生 选择 和 高 亲 和 性 结合 蛋白 质 的 一 个 重要 步骤 。 核 糖 体 展示 和 mRNA 展示 可 以 对 各 种 结合 的 靶 蛋 白 进行 选择 。 Irvingl10 等 报道 了 亲 和 成 熟 的 新 方法 , 即 Q8 复制 酶 移 人 核糖 体 展 示 技 术 。 这 种 策略 可 以 描述 为 连续 体外 进化 (continuous in vitro evolution，CIVE)( 图 3.3)。 从 目标 (scFv 或 V 结构 域 )DNA 模板 出 发 ,mRNA 在 免 网 织 红 细胞 偶 联 系统 中 用 T7 聚合 酶 转录 。mRNA 用 QB 酶 复制 和 突变 ,同时 翻译 和 展示 :@ 依 赖 T7DNA 聚合 酶 转录 的 模板 mRNA 编码 蛋白 质 ;@ 用 QQ 复制 酶 复制 和 突变 编码 突变 的 蛋白 质 。 在 缺乏 翻译 终止 密码 子 的 情况 下 ,稳定 的 核糖 体 三 元 复合 物 展 示 从 头 合 成 的 蛋白 质 ,并 且 对 固定 化 靶 ( 抗 原 ) 选 择 。 编 码 mRNA 是 用 模板 特异 引物 的 RT-PCR 进行 回收 。Q8 复制 酶 被 加 入 到 偶 联 转录 翻译 展示 系统 免 网 织 红 细胞 裂解 液 中 ,或 者 是 纯化 的 Q8 复制 酶 的 全 酶 或 者 是 Q8 核心 酶 (B 亚 基 )。 对 于 大 多 数 生 物 技 术 和 医学 应 用 的 蛋白 质 的 共同 的 要 求 是 它们 对 变性 剂 稳定 性 问题 。 核 糖 体 展示 是 体外 蛋白质 稳 定性 进化 的 有 效 工 具 。 进 化 的 scFv 片段 在 没有 二 硫 键 的 情况 下 是 稳定 的 。 当 二 硫 键 被 改造 , scFv 突变 体 较 相 应 的 野生 型 重 白质 更 稳定 。 应 用 热 或 蛋白 酶 作为 选择 压力 进行 体外 展示 ,特别 是 mRNA 展示 可 cm 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 39 - 以 提高 蛋白 质 的 稳定 性 。 模板 DNA 转录 RNA —s 复制 /突变 RdRp Q B ,Hepc * 全 一色 RT-PCR aS a — Poet mRNA 4 突变 体 结合 剂 的 选择 ~ mae Tine — 和 cs ae 由 ni ee 展示 或 e a 突变 展示 库 图 3.3 连续 体外 进化 (CIVE) 循 环 , 具 有 QB 复制 酶 偶 联 转录 一 翻译 系统 mRNA 是 通过 T7 聚合 酶 由 DNA 模板 转录 的 ,通过 Q8 复制 和 突变 ,翻译 并 展示 在 核糖 体 的 表面 ,然后 对 着 靶 选 择 3.3 叭 菌 体 展 示 技 术 3.3.1 MR ABATE Bee ie HY TA. 酶 展示 主要 是 在 丝 状 噬菌体 表面 或 微生物 细胞 表面 进行 ,使 在 目标 基因 和 酶 之 间 产 生物 理 连 接 ( 图 3.4)。 这 个 途径 的 明显 优点 是 展示 的 酶 接近 内 部 的 周围 环 境 , 这 样 有 效 地 同 底 物 或 其 他 靶 分 子 相互 作用 。 酶 库 筛选 有 不 同 的 方式 :中 与 过 湾 态 类 似 物 结合 的 蛋白 质 的 选择 ;@O 根 据 自 杀 抑制 剂 或 底 物 的 机 制 富 集 。Olsen 等 5 报道 应 用 生物 素 N-e- 氨 已 酰基 - 胱 胺 -N'- 戊 二 酰基 肽 加 成 化 合 物 筛选 枯草 杆菌 和 蛋白酶 库 。 展 示 功 能 酶 的 殉 隆 生物 素 化 ,并 且 可 以 由 库 中 富 集 ;GO 反应 底 物 与 噬菌体 共 价 连接 。 酶 催化 噬菌体 - 底 物 或 者 固定 化 或 者 由 固体 表面 释放 喉 菌 体 颗粒 。 这 种 策略 依靠 酶 和 底 物 邻近 偶 联 约束 叭 菌 体 。 应 用 邻近 偶 联 可 以 分 离 活性 酶 。 该 途径 是 通过 主要 外 帝 蛋 白质 基因 VII 的 非特 异 烷 基 化 把 底 物 结合 到 噬菌体 上 。 生 物 素 化 的 DNA 被 连接 到 肽 上 ,形成 具有 第 二 个 PIT 融合 肽 的 异 质 二 聚 体 超 螺旋 ,与 所 展示 的 酶 融合 是 不 同 的 [图 3.4(c)]'8)。 ”40 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) 图 3.4 WBE a AS FR as EE i eS (a) 表 达 gp AAS eB RS AAR ZEA SC EB BRAS Wy (TS) BA 5 (b) 表 达 gp A ME 菌 体 经 gp cE CHAN JEW (S). TEREHC IS , 7° By (P) 2 FF SA Sl SEG GE A A EW (c)#2i& gp - APH ME BATA gp Dik ak ,通过 与 底 物 融合 的 生物 素 标 签 与 固 相 支持 物 结合 。 在 催化 时 ,只 菌 体 由 表面 释放 出 来 。(d) 底 物 (S) 通 过 钙 调 蛋白 结合 的 肽 吸附 在 印 上 钙 调 蛋白 - 酶 的 喉 菌 体 上 。 在 催化 时 ,产物 (P) 通 过 特异 识别 与 固 相 支 持 物 结合 在 PII 融合 肽 和 底 物 之 间 的 超 螺旋 形成 导致 噬菌体 固定 在 链 霉 亲 和 素 念珠 上 。 表 达 的 活性 葡萄 球菌 核酸 酶 水 解 DNA 并 选择 性 地 由 固体 基质 释放 。 Dermatis 等 52,93] 表明 底 物 和 酶 展示 可 以 组 合 到 单一 PII 融合 形式 。 简 言 之 ， 两 侧 有 长 的 柔性 链 节 的 钙 调 蛋白 (CAM) 被 插入 在 POT 蛋白 和 酶 之 间 。 钙 调和 蛋白 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 41 结合 的 肽 - 底 物 连接 物 通过 酶 形成 产物 可 以 通过 特异 的 抗体 识别 富 集 鸣 菌 体 。 敏感 的 高 通 量 筛选 进化 酶 ,著名 的 例子 是 用 脂 质 宫 作为 分 离 区 室 ( 一 种 以 3- 杂 合 系统 为 基础 的 方法 ) ,最 终 酶 展示 在 荧光 活化 的 细胞 上 (fluorescence-activated cell sorting，FACS) 。Tawfik 和 Griffiths[14 探 索 了 反 相 胶 束 水 溶液 核心 作为 体外 酶 合成 和 产物 捕获 的 人 工区 室 。 在 这 个 系统 中 ,转录 -翻译 偶 联 的 混合 物 分 散在 油 包 水 乳 浊 液 中 ,每 个 胶 束 平均 含有 一 个 基因 。Benkovic 及 其 同事 500 描述 了 细菌 三 组 分 方 法 , 称 为 QUEST(querying for enzyme using the three-hysbrid system)。 最 初 由 Scy- talone 脱氧 酶 (SD) 证 实 ,如 图 3.5 所 示 。 在 SD 三 组 分 系统 中 ,功能 转录 活化 剂 由 两 个 分 离 的 蛋白 质 的 DNA- 结 合 结构 域 二 聚合 产生 。 在 这 种 情况 下 ,二 聚合 是 由 合成 的 小 分 子 诱导 (二 聚合 化 学 诱导 剂 CID). FE QUEST 中 ,所 设计 的 舱 合 转录 活化 剂 , 它 是 AraC 的 DNA 结合 结构 域 同 无 活性 SD 突变 体 融 合 , 产 生 AraC’ H85N- SD。 两 个 分 子 的 SD 特异 抑制 剂 连接 在 一 起 形成 CID, HAT WEAK ABE RA 图 3.5 筛选 进化 酶 的 QUEST 系统 (a) AraC’ H85N-SD 融合 蛋白 与 CID 结合 使 araBAD 操纵 子 转录 ;(b) 底 物 抑 制 CID 诱导 的 二 聚合 ; 〈c) 酶 催化 底 物 转 为 产物 ,CID 再 次 二 聚合 AraC'H85N-SD, 并 使 araBAD 转录 42> 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 酸化 ,其 本 身 在 平板 上 产生 各 种 表 型 。Scytalone 与 CID 竞争 ,并 抑制 酸化 表 型 。 如 果 SD 活性 在 细胞 内 被 抑制 , Scytalone 转化 为 产物 ,改变 底 物 与 CID 比率 。 阿拉 伯 糖 操纵 子 的 转录 一 旦 再 次 诱导 ,发 生 介质 酸化 。 酶 展示 在 微生物 的 表面 和 用 FACS 筛选 引起 人 们 极 大 关注 06-18。 流 动 细胞 计量 术 早已 用 于 单一 细胞 水 平分 析 酶 活性 和 动力 学 ,对 大 量 酶 的 检验 ,包括 酯 酶 、 蛋白 酶 .过 氧化 物 酶 脂肪 酶 和 氧化 还 原 酶 等 也 是 有 效 的 ,并 且 广 泛 用 于 研究 和 临 床 实践 。 然 而 ,流动 细胞 计量 术 作 为 定向 分 子 进 化 的 筛选 工具 ,在 底 物 设 计 上 存在 的 几 个 障碍 : 底 物 必须 能 够 渗透 到 细胞 中 ,并 酶 促 分 裂 产生 高 荧光 产物 ;此 外 ,产物 被 细胞 定量 保持 , 底 物 和 产物 都 不 影响 细胞 生存 活力 ;对 细胞 中 不 相关 酶 的 修饰 敏 感 ;或 表现 低 的 溶解 度 等 。 现 在 , 几 种 装备 可 以 容易 满足 酶 展示 在 微生物 的 表面 ， 这 样 底 物 不 再 内 在 化 ,通过 产物 保持 来 拓展 生物 表面 的 物理 化 学 性 质 ( 图 3.6)。 革 兰 氏 阴 性 菌 的 表面 有 大 量 的 负电 荷 , 聚 阴离子 底 物 用 荧光 共振 能 量 转移 (FRET) 到 E. coli 的 表面 。 底 物 的 狂 灭 剂 部 位 被 表面 展示 的 酶 分 裂 产 生 荧光 产物 , 它 经 聚 阴离子 保持 在 表面 ,荧光 量 与 底 物 转换 率 相关 。 结 合 底 物 的 突变 酶 ,不 提高 狂 灭 剂 的 荧光 强度 ,大概 由 于 狂 灭 剂 的 荧光 团 是 被 酶 活性 部 位 歼 合 。 由 于 这 些 特征 ,展示 在 表面 的 酶 与 FRET/FACS 偶 联 筛选 ,根据 Kate Km 来 鉴定 酶 。 作 者 应 用 这 种 策 略 分 离 蛋白 酶 突变 体 ,与 野生 型 比较 ,在 S1 和 S1' 亚 位 点 有 不 同 的 氨基 酸 。 流 动 细 胞 计量 术 , 特 别 是 与 细胞 表面 展示 偶 联 时 有 几 个 突出 的 优点 :@ 定 量 分 析 活 性 ; @ 同 时 可 以 测定 并 记录 多 个 参数 ; @@ 高 通 量 (10?/h) 。 荣光 共振 能 量 转移 ~~A Te 激光 激发 FI Q 急 冷 器 发 射 ai +7 聚 阳 离子 锚 3.6 依赖 FACS 酶 进化 系统 表达 高 绿色 荧光 发 射 细胞 是 通过 流动 细胞 计量 术 由 库 的 混合 物 中 进行 物理 挑选 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 ' 43 3.3.2 喉 菌 体 - 酶 当 将 酶 展示 在 喉 菌 体 表面 时 , 系 附 在 鸣 菌 体 颗 粒 上 的 功能 酶 水 平一 般 在 突变 和 选择 之 前 进行 估价 。 这 个 水 平等 于 酶 和 鸣 菌 体 浓 度 之 间 的 比率 。 纯化 的 喉 菌 体 - 酶 溶液 的 噬菌体 浓度 可 以 通过 测量 在 265nm 处 光 密 度 来 估算 。 吸收 系数 可 以 根据 喉 菌 体 的 所 有 组 成 (氨基 酸 和 核 苷 酸 ) 的 个 别 系数 计算 。g"p 是 主要 贡献 的 蛋白 质 ,吸收 系数 与 喉 菌 体 长 度 成 正比 ,噬菌体 与 本 身 的 单 股 DNA 大 小 成 正比 。 对 于 10kb 叹 菌 体 而 言 , 它 等 于 8.4x 10’L/(mol-cm) . WR AYR BE tH BT 以 通过 特殊 的 染料 和 标准 样 测定 蛋白 质 的 含量 或 DNA 的 含量 来 估算 。 上 述 方法 有 可 能 估算 过 高 ,如 果 gp 融合 蛋白 是 g p 主要 来 源 的 话 ,对 于 丝 状 鸣 菌 体 组 装 的 正确 终止 来 讲 , 将 不 是 最 佳 的 结果 。 在 上 述 条 件 下 ,可 能 产生 多 鸣 菌 体 ( 含 有 一 个 以 上 DNA 分 子 ) 。 多 叹 菌 体 对 gp 蛋白 质 突变 体 已 报道 。 感 染 颗 粒 的 浓度 通常 是 在 喉 菌 体 浓 度 的 1% 和 5% 之 间 , 这 是 丝 状 吹 菌 体 一 种 特征 ,在 低 水 平展 示 时 ,gp 融合 蛋白 一 般 不 影响 鸣 菌 体感 染 。 展示 酶 的 浓度 是 通过 测定 叭 菌 体 - 酶 溶液 的 活性 来 评价 ,前 提 是 假设 展示 的 酶 像 溶 液 中 的 自由 酶 。 酶 -gp 融合 蛋白 质 的 存在 也 可 以 通过 抗 -gp 或 抗 - 酶 抗体 的 Western blotting 分 析 来 检验 。 用 抗 -gp 检验 ,融合 和 自由 gp 蛋白 质 的 相对 强度 应 当 与 酶 和 鸣 菌 体 浓 度 之 间 的 比率 评价 展示 水 平 相 一 致 。 很 显然 , 喉 菌 体 展示 技术 需要 适当 折 释 的 蛋白 质 ,并 且 稳 定 地 与 壳 蛋 白 融 合 。 成 功 地 展示 可 能 取决 于 细菌 宿主 和 生长 条 件 。 无 效 蛋白 质 扳 是 一 个 潜在 的 问 题 ,特别 是 展示 的 蛋白 质 不 是 来 自 细菌 。 真 核 生 物 蛋 白质 一 般 难 在 细菌 中 以 活性 形式 表达 。 改 进 折 笃 效 率 的 一 种 方式 是 用 超 表 达 分 子 伴 侣 工程 宿主 。 应 用 该 途 径 ,Soderlind 等 (9 通过 GroEL 和 GroES 分 子 伴侣 蛋白 协助 在 喉 菌 体 上 改进 了 展示 抗体 片段 。 另 一 种 可 能 降低 表达 水 平 的 机 制 是 融合 蛋白 质 的 降解 ,通过 细菌 蛋白 酶 降解 融合 和 蛋白质, 不 太 稳 定 的 突变 体 在 喉 菌 体 上 展示 的 少 。 降 低 培 养 温度 似乎 是 普 ; 用 于 提高 展示 水 平 ,降低 蛋白 质 水 解 。 当 降低 感染 细菌 生长 温度 (37 记 一 23 亿 ) 时 ， TEM-1 有 内 酰胺 酶 展示 水 平 提高 5S 倍 。 在 叭 菌 体 生产 时 , 除 蛋 白质 水 解 外 ,纯化 的 喉 菌 体 由 于 蛋白 酶 的 污染 也 能 损失 它们 展示 的 和 蛋白质。 应 当 加 入 和 蛋白酶 抑制 剂 Cocktail 以 阻止 蛋白 质 水 解 ,特别 是 喉 菌 体 长 期 贮存 。 在 喉 菌 体 载体 中 ,终止 密码 子 往往 被 引入 外 源 蛋 白质 和 叭 菌 体 壳 蛋 白质 之 间 。 因此 , 当 感 染 含 有 适当 校正 基因 的 EB. coli 菌株 展示 才 是 可 能 的 。 这 个 系统 不 需要 在 选择 后 自由 酶 再 克隆 的 各 种 步骤 。 "44 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 体外 选择 的 成 功 不 仅 取决 于 功能 展示 水 平 , 而 且 原则 上 也 取决 于 起 始 库 的 质 量 和 多 样 性 。 目 1991 年 以 来 ,30 种 以 上 的 各 种 酶 已 成 功 地 在 鸣 菌 体 上 展示 。 由 于 在 丝 状 鸣 菌 体 所 表达 的 蛋白 质 在 噬菌体 组 装 之 前 必须 运输 到 胞 浆 周围 ,因此 毫 不 奇怪 ,主要 展示 的 是 天 然 分 泌 的 恒 白 质 (蛋白酶 ,细菌 细胞 外 或 胞 浆 周围 的 各 种 酶 ， 3.3.3 ”只 菌 体 - 酶 的 选择 3.3.3.1 结合 选择 喉 菌 体 - 酶 的 最 初 鉴定 是 检验 喉 菌 体 结合 折 生 酶 的 特异 抑制 剂 或 特异 的 单 克 隆 抗体 (mAb) ,通过 “生物 选 淘 ”(biopanning) 容易 做 到 (图 3.7)。 鸣 菌 体 在 固定 化 抑制 剂 (或 mAb) 存 在 下 温 育 ,用 可 溶性 抑制 剂 洗 脱 或 改变 条 件 ( 例 如 PH) 以 降低 亲 和 性 。 洗 脱 对 吸附 鸣 菌 体 数 之 间 的 比率 同 不 相关 鸣 菌 体 所 观察 到 的 背景 比较 , 推 断 噬菌体 展示 的 折 和 县 酶 。 这 个 比率 也 与 展示 水 平 相 关 。 图 3.7 丝 状 鸣 菌 体 表面 所 表达 的 酶 体外 选择 在 “生物 选 淘 " 实 验 中 ,特殊 结合 剂 可 以 由 库 中 捕获 ,并 且 它 们 的 基因 可 以 通过 感染 扩 增 a) 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 45 ， 3.3.3.2 底 物 或 产物 类 似 物 选 择 底 物 或 产物 类 似 物 抑制 剂 的 选择 已 用 于 两 种 酶 :葡萄 球菌 核酸 酶 和 谷 胱 甘 肽 转移 酶 。 葡 萄 球菌 核酸 酶 是 钙 依 赖 的 磷酸 二 酯 酶 ,催化 DNA 的 水 解 ,对 分 裂 位 点 5' 侧 胸腺 喀 喧 脱氧 核 苷 有 一 定 的 特异 性 。 叭 菌 体 展 示 葡 萄 球菌 核酸 酶 突变 体 库 是 通过 epPCR 产生 的 ,在 固定 化 底 物 类 似 物 ( 含 胸腺 喀 喧 脱氧 核 苷 或 乌 嗓 叭 核 苷 磷 酸 硫 代 寡 核 苷 酸 ) 进 行 生 物 选 淘 ( 图 3.8) , 富 集结 合剂 库 。 对 胸腺 喀 啶 脱氧 核 苷 底 物 类 似 物 1 所 选择 的 最 好 突变 体 活性 近 于 野生 型 酶 ; 乌 背 底 物 类 似 物 2 所 选择 的 突变 体 活性 低 于 野生 型 10 倍 ,这 可 能 改变 了 特异 性 。 图 3.8 用 底 物 类 似 物 选择 葡萄 球菌 核酸 酶 突变 体 BSA 一 一 牛 血 清白 蛋白 谷 胱 甘 肽 转移 酶 (GST) 是 涉及 解毒 过 程 的 酶 。 它 们 催化 有 毒化 合 物 和 谷 胱 甘 肽 (GSH) 之 间 的 结合 作为 生物 消除 的 基本 步骤 [图 3.9(a),3]。 几 种 已 知 的 GST 是 同 源 的 ,但 它们 的 比 活 性 却 不 同 。GSTA1-1 催化 谷 胱 甘 肽 3 异 毛 -2,4- 二 硝 基 葵 4 偶 联 , 这 是 亲 核 取代 反应 ,改变 对 芳香 环 上 携带 负电 荷 底 物 的 特异 性 。 在 芳香 环 亲 电 结合 部 位 中 10 个 氨基 酸 残 基 被 随机 突变 产生 叹 菌 体 GST 库 。 在 类 产物 亲 和 配 基 上 进行 生物 选 淘 , 由 库 中 选择 出 底 物 特异 性 改变 的 新 GST[ 图 3.9(b)-7]。 46> 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 也 Q oe) CO Q 8 00 + NH NO2 (bors + es ee COO o 人 一: a ® H ® NO2 eee NO? oa al Or O 8 ; : 5 | NO2 8 ce NH 日 COO AAS ® NH NO2 H3N O NO2 n (b) 日 ‘a 可 O N S NH e = COO oN S O ue HNN NH O O 9 3 7 图 3.9 底 物 或 产物 类 似 物 选 择 (a) 谷 胱 甘 肽 -S- 转 移 酶 (GST) 催 化 谷 胱 甘 肽 3 和 1- 毛 -2,4- 二 硝 基 苯 4 之 间 的 偶 联 ; (b) 用 产物 类 似 物 选 择 专 一 性 改变 的 GST 3.3.3.3 过渡 态 类 似 物 选择 根据 酶 催化 理论 , 酶 必须 与 过 渡 态 而 不 是 与 底 物 基态 形式 互补 。 根 据 这 个 理 论 , KRKuea 等 于 酶 对 底 物 和 过 渡 态 的 亲 和 常 数 的 比率 , 即 KsKTrsA( 图 3.10)。 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 47 ， K* 才 渡 态 B+ Shop, gx RUNES Cp 本 je K.T/h B.S S28. s* E+P x _ LEIS x~ _ Ells” a eee > = TE.S*] Led 5 AES” nee Ae Lees 图 3.10 证 实 酶 催化 理论 的 热力 学 循环 加 速 速率 是 与 酶 对 过 渡 态 / 底 物 的 亲和力 相关 酶 这 种 基本 识别 特征 导致 过 渡 态 类 似 物 ( 酶 的 潜在 抑制 剂 ) 的 设计 ,并 导致 它 们 作为 半 抗 原 诱导 免疫 系统 产生 赋予 催化 活性 的 抗体 (abzyme)。 对 于 一 个 完美 的 TSA 来 讲 , Ks/RrsA 可 能 等 于 Keat/ Kuncato 碳酸 本 酶 是 一 种 金属 酶 ,催化 CO, 的 水 和 , 它 也 催化 活化 的 羧 酸 酯 (例如 对 硝 基 葵 乙酸 酯 ) 的 水 解 。 该 酶 被 氨 磺 酰 抑制 ,后 者 被 认为 是 TSA。 为 了 解 蛋 白质 中 人 金 属 离子 亲 和 性 的 结构 决定 因素 ,直接 与 组 所 酸 金 属 配 基 相 互 作 用 的 3 个 氨基 酸 残 J FAB AN RE AN AY) BS) 1728 突变 体 库 取代 。 用 固定 化 氨 磺 酰 通过 它 的 氮 与 锌 配 位 结合 , 层 析 选 择 锌 离子 亲 和 性 ,选择 的 突变 体 表 明 结 合 锌 离子 与 野生 型 比较 , 亲 和 性 范围 从 相等 到 降低 100 倍 ,80 多 突变 体 有 CO,; 水 合 酶 活性 。 过 渡 态 类 似 物 的 亲 和 层 析 已 用 于 由 鸣 菌 体 展示 库 选 择 GSIA1-1 突变 体 , 亲 电 底 物 结合 部 位 中 的 4 个 残 基 随机 突变 。 通 过 GSH 和 1,3,5- 三 硝 基 苯 (TNB) 之 间 的 反应 形成 o 复合 物 作为 亲 合 配 体 ( 图 3.11)。 它 模拟 GSH RIAL DR ER 代 的 过 渡 过 态 ,但 不 产生 完全 反应 ,因为 它 没有 多 余 基 团 。 在 4 轮 生 物 选 淘 之 后 鉴定 出 几 个 突变 体 , 其 中 之 一 由 几 种 底 物 测定 催化 效率 低 于 野生 型 20 ~ 90 倍 。 of of 人 U Ow 日 Pa NO O 琼脂 糖 凝 胶 图 3.11 用 固定 化 的 过 渡 态 类 似 物 选 择 喉 菌 体 展 示 的 GST 突变 体 651 48 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 突变 体 和 野生 型 酶 对 c 复合 物 (KrsA) 亲 和 力 之 间 的 比率 与 用 1- 氯 -2,4- 二 硝 基 葵 所 测定 的 Kea/ Km 值 相同 ,与 理论 预测 一 致 。 上 述 两 个 例子 说 明了 过 湾 态 稳定 化 的 原理 成 功 地 用 于 选择 活性 突变 体 , 用 TSA 选择 似乎 能 够 富 集 活 性 突变 体 。 过 渡 态 类 似 物 选择 已 经 用 于 由 鸣 菌 体 展 示 的 抗体 库 中 选择 催化 抗体 。Baca 等 52 用 随机 突变 , 继 之 腾 酸 生 物 选 淘 , 试 图 提高 第 一 代 催 化 抗体 的 催化 活性 。 从 mAb 起 始 ,催化 不 同 氨基 酯 的 水 解 [图 3.12(a) ,10 ~ 11] ,采用 “人 源 化 ?抗体 以 改进 在 E. coli 中 表达 并 适 于 鸣 菌 体 展 示 突 变 体 的 组 合 库 进 行 生物 选 淘 [图 3.12(b)j]。 挑选 克隆 进行 顺序 分 析 和 鉴定 。 有 的 突变 体 对 腾 酸 过 渡 态 类 似 物 的 亲和力 增加 了 2~8 倍 。Fuj 这 等 52] 成功 地 应 用 TSA 的 亲 和 突 变 改 进 催化 。 用 过 渡 过 态 类 似 物 免 疫 产 生 mAb ,催化 酰 化 的 碳水 化 合 物 区 域 选 择 脱 保护 [图 3.13(a) ,13 ~ 14] ,速率 明 显 提 高 。 构 建 的 模型 指出 在 重 链 CDR3 中 6 个 氨基 酸 残 基 突 变 。 在 鸣 菌 体 展示 的 抗体 库 中 这 些 残 基 随 机 地 发 生 突变 。 从 牛 血 清白 蛋白 结合 过 渡 态 类 似 物 15 生物 选 淘 [ 图 3.13(b) ,1$] 和 124 随机 挑选 的 克隆 鉴定 出 6 个 突变 体 , Fab 片段 以 可 洲 形 式 产生 。 高 活性 的 突变 体 Rss 高 于 野生 型 mAb 12 倍 ,而 Ka 增加 9 倍 。 有 趣 的 是 ,从 起 始 mAb 到 突变 体 , Koat/ Kuncat S40 12.2 4%, Km/ Kis, te 5 Bit BA 致 。TSA 结合 的 最 佳 化 可 能 导致 Ser-His 催化 二 元 组 匹配 质量 的 某 些 损失 。 NH sa é iN? a OH 10 CH, i. cH (b) = O oO; 7D N EID (KLH}-NH ” O H KLH = “4A 12 Hi C ee7L” PA wae A 图 3.12 过渡 态 类 似 物 选择 催化 抗体 (a) 酯 酶 抗体 催化 的 反应 ;(b) 用 过 渡 态 类 似 物 的 衍生 物 进行 选择 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 49 ， AcNH 本 NA :COOH ee: he OMe os AcNH he OMe R=F 或 p-AcNH-CsH4-CH2-COO OS, O AcNH O OMe 图 3.13 用 TSA 的 亲 合 突变 改进 催化 抗体 (a) 抗体 催化 区 域 选 择 酯 水 解 ;(b) 用 衍生 的 过 渡 态 类 似 物 进行 选择 3.3.3.4 亲 和 标 记 活 性 部 位 残 基 选 择 酶 的 活性 部 位 往往 含有 侧 链 起 重要 作用 的 氨基 酸 残 基 , 通 过 对 接 活性 部 位 设 计 的 亲 和 标 记 试 剂 ,能 够 同 活性 侧 链 形成 稳定 的 共 价 键 ,以 此 由 库 中 选择 活性 酶 或 抗体 酶 。 Lamer 等 2L 轨 设计 出 一 种 试剂 ,能 够 捕获 在 它们 的 半 抗 原 结合 部 位 之 内 含有 活 性 半 胱 氨 酸 的 喉 菌 体 -抗体 。BSA- 结 合 w 蒜 乙 基 吡 啶 基 二 硫化 物 [图 3.14(a),16]。 该 反应 形成 共 价 酰基 中 间 体 ,速率 提高 超过 背景 30 倍 。 虽 然 在 酰 化 步骤 上 有 限 ,但 催化 酰 化 半 胱 氨 酸 中 间 体 的 水 解 似 乎 更 有 效 ( 相 对 硫 代 酯 自发 水 解 提高 10: 倍 )。 三 羟基 丁 醛 缩合 反应 是 通过 胺 催化 的 ,并 且 许多 醛 缩 酶 的 活性 部 位 含有 一 个 主要 的 赖 氨 酸 残 基 , 应 用 1,3- 二 酮 活性 免疫 策略 (图 3.15,18) ,Wagner 等 C9] 制 备 了 有 了 醛 缩 酶 活性 的 抗体 ,在 其 活性 部 位 有 高 活性 的 赖 氨 酸 残 基 。 - 50 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 = ee id \ 4% NH HS ae mAb prt | HS. mAb (b) 4 pik dn Oa. Swit on + \ / NH HS \ 4 17 no| X=H or HCONH + a g — OH + fof HS 图 3.14 ASP PICA EB i RE ae HE HE (a) 用 活性 部 位 亲 合 标记 试剂 选择 抗体 结合 部 位 的 活性 半 胱 氨 酸 ; (b) 选择 的 抗体 之 一 催化 硫 代 酯 水 解 3.3.3.5 自杀 底 物 选择 自杀 底 物 使 酶 不 可 逆 抑 制 , 这 是 由 于 酶 用 正常 机 制 将 底 物 转化 为 抑制 剂 。 据 此 ,Soumilon 等 ' 吕 设计 了 一 种 选择 策略 ,从 含有 无 活性 突变 体 混 合 物 中 选择 活性 Wee Bl PAS WB ARS BY) TEM-1B 内 酰胺 酶 和 无 活性 突变 体 在 动力 学 控制 下 同 生 物 素 化 的 青霉素 磺 酸 温 育 (图 3.16)。 活 性 吧 菌 体 - 酶 被 优先 标记 , 并 由 包 盖 链 霉 搞 — SSE in 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 ' 51 ， O O ina ee 人 本 一 一 一 一 O O PASTS ee @ yx O ae ng ll fy pay epee NH N 19 1, BATE Dy DAR BB A BS EBS A SR Jz J a PEE I ET EOE 图 3.15 (a) O O ®@ af Rs NH, no (_[ Xa = 21 “HO OH (b) HQ OH \ EN 下 噬菌体 -Fab 库 。 @ 2 ee -一 一 一 一 一 O ies fast 22 FR3/H 具有 糖 ern DIT 性 Fab 噬菌体 25 图 3.16 自杀 底 物 选 择 催 化 抗体 (a) 用 过 渡 态 类 似 物 通过 免疫 产生 糖苷 酶 活性 抗体 ;(b) 用 自杀 抑制 剂 衍 生物 选择 吻 菌 体 展示 的 抗体 (Fab) - 52> 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 生物 素 蛋 白 的 念珠 结合 的 混合 物 中 选择 。 在 生物 素 化 标记 之 内 或 在 展示 酶 和 gp 之 间 的 化 学 键 分 裂 ， 人 允许 回收 噬菌体 。 该 方法 适 于 由 突变 体 混 合 物 中 选择 高 活性 的 酶 。 用 这 种 策略 已 由 喉 菌 体 展示 库 中 选择 出 两 个 催化 氨 葵 青霉素 水 解 的 催化 单 链 抗 体 ，K /KR 分别 为 5200 和 320(K = 0.29/min Ail 0.018/min) . 用 过 渡 态 类 似 物 免疫 诱导 产生 糖苷 酶 活性 的 抗体 [图 3.16(a)]!52。 用 BSA- 缀 合 的 自杀 抑制 剂 (22) 选 择 [ 图 3.16(b)]: 糖 苷 键 的 分 裂 释 放 邻 位 二 氟 甲 基 - 栈 (23) , 氟 化 物 快 速 消 除 产生 非常 活泼 的 醒 甲 基 化 物 (24) ,其 同 吻 菌 体 的 蛋白 质 反 应 。 只 有 催化 糖苷 键 水 解 的 克隆 对 固定 化 BSA- 缓 合 物 是 敏感 的 。 鸣 菌 体 是 用 二 硫 代 苏 糖 醇 (DIT) 的 二 硫 桥 使 抑制 剂 与 (25) 中 的 BSA 连接 还 原 而 释放 。 在 4 轮 选 淘 之 后 所 选择 的 基因 再 克隆 ,以 便 在 及 半 乳 糖苷 酶 缺陷 株 中 表达 可 溶性 Fab 片段 。 涂 上 显 色 底 物 筛 选 活性 Fab 克隆 ,一 种 蛋白 质 已 纯化 ,其 催化 对 硝 基 茶 -及 吡 喃 半 乳 糖 FF 7K AF, Kat =0.007/min 和 K,, = 0.53mmol/EL, 相 应 速率 提高 Keat/ Kuncat = 7 x 10*. 3.3.3.6 底 物 转化 选择 过 渡 态 类 似 物 往往 不 能 足以 模拟 真正 过 渡 态 的 本 质 特征 。 对 于 许多 酶 活性 而 言 , 没 有 简单 的 过 渡 态 类 似 物 或 自杀 底 物 。 为 了 避免 这 些 限制 ,提出 了 直接 底 物 转 换 与 选择 过 程 偶 联 的 方式 , 即 直接 根据 底 物 转化 进行 选择 。 Pedersen 等 [2 提出 的 策略 如 图 3.17 所 示 ,编码 葡萄 球菌 核糖 核酸 酶 (SNase， 活性 需要 Ca2+ ) 的 基因 被 克隆 到 喉 菌 粒 上 。 为 了 在 gp 壳 蛋 白 上 展示 ,构建 了 辅助 Wet BA AS , JC EE PAD LE, PAE EAN PR EHR SNase 的 颗粒 。 制 备 的 底 物 的 绥 合 物 通过 柔性 链 节 ,一 方面 与 含有 两 个 自由 半 胱 氨 酸 的 碱 性 肽 顺序 相连 , 另 一 方面 与 生 物 素 相连 。 鸣 菌 粒 同 底 物 绥 合 物 一 起 温 育 ,允许 同 酸性 肽 相互 作用 吸附 ; Ee 粒 和 组 合 物 的 半 胱 氨 酸 之 间 形 成 二 硫 桥 以 稳定 缔 合 。 这 个 构建 物 已 表明 在 SNase FAEDTAR 4 Ca?* 而 失 活 的 条 件 下 ,与 链 霉 抗 生 物 素 蛋 白 包 盖 的 念珠 有 效 地 结合 。 加 入 可 溶性 DNase I 释 放 全 部 结合 的 吻 菌 体 ,加 入 Ca+ 释放 20 色 结合 的 喉 菌 体 。 所 构建 的 对 照 吻 菌 粒 中 SNase 用 Fab 片段 取代 ,由 SNase 和 Fab 展示 鸣 菌 粒 的 混合 物 中 ,可 以 选择 前 者 。 | Dermatis 等 52] 根 据 底 物 转 化 提出 另 一 选择 策略 (图 3.18)。 用 枯草 杆菌 蛋白 酶 突变 体 (Submnut)- 钙 调 蛋 白 (CaMJ)- 唉 菌 体 展示 枯草 杆菌 蛋白 酶 突变 体 。Submnut- CaM- 鸣 菌 体 同 以 下 3 个 肽 一 起 温 育 ,这 3 个 肽 分 别 含 有 :GDN 端 顺序 是 Submut 水 解 蛋白 质 的 产物 DYKDE;@O 底 物 N 端 有 GAAHY-DYKDE(- 表 示 分 裂 位 点 );@@ 负 对 照 。 所 有 这 些 肽 的 C 端 都 含有 钙 调 蛋白 结合 型 主 。 应 用 识别 N 端 DYKDE 顺序 的 mAb 获救 吹 菌 体 。 此 策略 获得 的 酶 不 是 完全 都 有 活性 。 用 GST-CaM- 只 菌 体 进 行 的 相似 实验 见 图 3.19。 底 物 是 结合 钙 调 蛋白 的 肽 ， 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 ' 53 图 3.17 WEAF AS SNase 的 选择 策略 DNA 底 物 - 端 生物 素 , 另 一 端 有 碱 性 肽 。 底 物 经 酸性 肽 系 在 噬菌体 上 ,用 链 霉 抗 生 物 素 蛋白 (SV) 捕 获 史 菌 体 用 其 N 端的 谷 胱 甘 肽 和 4- 氧 -3,5- 二 硝 基 苯 甲酸 -生物 素 衍 生物 帽 化 。 反 应 之 后 , 鸣 菌 体 由 复合 物 中 释放 ,得 到 改进 性 质 的 突变 酶 。 上 述 选 择 策略 的 可 能 限制 是 来 自 过 程 中 所 涉及 的 分 子 内 在 性 质 , 不 足以 把 鸣 菌 体 结合 的 底 物 转 为 产物 ,选择 的 酶 活性 不 高 。 为 了 解决 这 个 问题 , Jestin “27-8 设计 了 一 种 选择 方案 (图 3.20)。 该 反应 方案 包括 酶 促 反 应 和 化 学 反应 ,通过 酶 促 反应 的 底 物 或 产物 标记 鸣 菌 体 。 用 产物 特异 结合 剂 选择 标记 的 吻 菌 体 ,只 人 允许 回 收 产物 标记 的 噬菌体 。 DNA 聚合 酶 定向 分 子 进化 引起 人 们 极 大 的 关注 ,这 是 因为 它 在 生物 学 过 程 和 生物 技术 中 起 核心 作用 。 合 理 途 径 成 功 是 有 限 的 ,这 似乎 由 于 检验 的 聚合 酶 的 顺 序 空 间 有 限 。 定 向 分 子 进化 拓展 了 顺序 空间 ,所 希望 的 酶 更 易 获得 。 Xia 等 [2 开发 出 一 种 选择 方案 (图 3.21)。 他 们 把 DNA 聚合 酶 及 其 底 物 都 系 - 54 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 GAAHYDYKDE——=> CBD CaM Submut CaM 络 合 和 催化 GAAHY v 图 3.18 鸣 菌 体 展示 Submut 的 选择 策略 同时 展示 CaM, 并 人 允许 通过 结合 CaM(CBD) 肽 捕获 反应 的 一 种 产物 TENE Bal AS pb" 上 。p 只 定位 在 喉 菌 体 颗粒 的 一 端 ,以 便 酶 同 底 物 分 子 反应 ,这 样 保 证 基因 型 和 表 型 偶 联 。 突 变 体 的 选择 取决 于 酶 催化 标记 的 底 物 (例如 生物 素 化 )， 这 样 可 以 选择 活性 聚合 酶 的 喉 菌 体 颗粒 。Xia 等 应 用 这 个 方案 选择 具有 RNAP 活 性 的 SF DNA 聚合 酶 突变 体 。 分 离 出 的 3 个 突变 体 有 效 地 催化 底 物 INTP HBA, 其 催化 效率 接近 用 dNTP 作 底 物 的 野生 型 酶 。 根据 底 物 转化 另 一 选择 方案 是 应 用 催化 洗 脱 (图 3.22)。 该 策略 适 于 需要 辅 因 子 的 酶 , 特别 是 金属 酶 。 在 辅 因子 去 除 后 , 它们 仍 能 够 结合 底 物 。 展 示 酶 的 噬 菌 体 首先 通过 金属 提取 失 活 ， 然 后 它们 被 吸附 在 包 盖 链 霉 抗 生物 素 和 蛋白 念珠 上 , 其 生物 素 化 的 底 物 被 固定 ,， 辅 因子 的 加 入 使 活性 恢复 并 允许 叭 菌 体 洗 脱 ， 因 为 对 产 物 的 亲和力 低 于 对 底 物 的 亲和力 , 选择 效率 似乎 随 酶 在 噬菌体 上 展示 水 平 而 提高 。 第 3 章 定向 分 子 进 化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 + 355 . SH TYGlu -Cys- Gly ==> i CBD NO2 t Cl Nees Nn Bt NO? CaM 结 合 和 催化 Mau 图 3.19 GST 选 择 策略 两 种 底 物 分 别 用 CBD 和 生物 素 Bt 衍生。 含有 两 个 模块 的 产物 与 喉 菌 体 展 示 CaM 结合 ， 然后 噬菌体 用 固定 化 SV 捕获 Ce 催化 和 标记 PPi C= 一 <_ FA 3.20 WE PAR ANSE A BR (pol) AEE 引物 模板 底 物 是 用 马 来 酰 亚 胺 衍生 , BTR Ew (BATE. MERA Be RE 用 产物 标记 ,并 用 固定 化 SV 捕获 . 56 + 进化 生物 技术 一 _ 酶 定向 分 子 进 化 Yt 7n** ' EGY IAA 和 洗 脱 光 Uy ty HOGS; NHCOOH ., YY (fi SS, Wy J Lf. MGs 图 3.21 鸣 菌 体 展 示 金 属 -& 内 酰胺 酶 (Bla) 选 择 策略 24] 吻 菌 体 - 酶 通过 提取 金属 辅 因子 而 失 活 ,用 固定 化 的 青霉素 底 物 捕获 加 入 金属 辅 因子 , PAE A 3.3.3.7 蛋白 质 折 亚 检 验 [30] 蛋白 质 折 私 检验 已 用 于 可 溶性 重组 蛋 昌 质 表达 的 定向 进化 。 目 标 蛋 白 质 的 N 端 与 GFP RASTER ATTIRE. coli 细胞 的 荧光 强度 直接 与 可 溶性 蛋 白 质 折 县 的 产生 相关 。 鸣 菌 体 Fl 突变 体 基 因 V EAA, 以 及 铁 蛋 白 的 再 亚 基 在 几 轮 定向 进化 之 后 可 以 用 该 检验 方法 分 离 出 来 。 根 据 及 半 乳 糖苷 酶 的 o- 片 段 入 片段 的 结 构 互 补 的 各 种 策略 已 被 采用 。 目 标 蛋 白质 在 N 端 与 及 半 乳 糖苷 酶 的 -片段 融合 ， 只 有 可 溶性 蛋白 质 可 以 同 片段 相互 作用 形成 功能 及 半 乳 糖 背 酶 ,应 用 生 色 底 物 可 以 体内 外 检验 。 第 3 章 定向 分 子 进 化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 57 (T28) ATCCCTGGAACCTCC Ck (P50) TAGGG ( 碱 性 肽 -DNA 复 合 物 ) (T28) ATCCCTGGAACCTCC (P50) TAGGG ATP CTP, 生物 素 - UTP (728) ATCCCTGGAACCTCC (c) ni ——t-(P50) TAGGGACCU 生物 素 SV 包 盖 的 念珠 人 {T28) ATCCCTGGAACCTCC P50)TAGGGACCU、 大 SV 图 3.22 We a AE PE fF (a) EAS RRS BG AE & Fk BS PAIL; (>) AEF PRR RT ; (c) 展 示 活 性 BE AS WG A AL ALE Py EAL 5 (a) SV 珠 的 生物 素 -标签 的 噬菌体 颗粒 的 固定 化 ;(e) 通 过 DNase 1 A’) 22 fi , FB aE 10 BS RE 3.4 酵母 表面 展示 系统 .31 目前 已 报道 的 酵母 表面 展示 系统 有 两 种 ,目的 蛋白 分 别 与 或 a 凝集 素 融 合 ， 展示 于 酵母 细胞 表面 。 目的 和 蛋白- 凝集 素 表 面 展示 系统 是 将 目的 蛋 日 作为 N 端 , 与 凝集 素 C 端 部 分 融合 ,目的 蛋白 经 "凝集 素 展 示 于 酵母 细胞 表面 。w 凝集 素 共 价 连接 到 细胞 壁 的 葡 聚 糖 上 , 其 锚 定 能 力 由 蛋白质 C 端 320 个 氨基 酸 决 定 , 富 含 Ser/Thr 残 基 。 Ser/Thr 富 集 区 因 广 泛 存 在 的 O- 糖 基 化 而 拥有 一 个 杆 状 构象 ,可 作为 空间 支撑 物 。 迄今 ,已 经 有 多 个 应 用 凝集 素 的 C 端 作为 融合 蛋白 的 报道 。 第 一 个 通过 此 ' 58 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 系统 表达 的 异 源 蛋白 质 是 "- 半 乳糖 苷 酶 (图 3.23)。 -凝集 素 ACal 启动 子 650aa o- 半 乳糖 童 栈 SS Jaan F inv. 384aa a Gal-AC1 融 合 蛋 白 PGK JAF inv. 381 702aa 图 3.23 半 乳 糖苷 酶 -o BERR (c-a Gal-AC] ) AAG EE a 凝 集 素 -目的 蛋白 表面 展示 系统 是 一 种 将 目的 蛋白 作为 C 端 与 a 凝集 素 Aga2p 亚 基 的 N 端 融合 的 表面 展示 系统 (图 3.24)。 图 3.24 a 族 集 素 - 目 的 蛋白 表面 展示 系统 图 解 a 凝 集 素 通过 与 凝集 素 相 似 的 连接 锚 定 在 细胞 壁 上 。 与 凝集 素 不 同 ,a 凝 集 素 由 两 个 亚 基 的 糖 蛋白 组 成 。725 个 氨基 酸 残 基 的 Agalp 亚 基 通 过 B 葡 聚 糖 的 共 价 连接 而 锚 定 在 细胞 壁 上 ,69 个 氨基 酸 残 基 的 Aga2p 亚 基 通过 两 对 二 硫 键 与 A- galp 亚 基 相 连 。 天 然 的 凝集 素 结合 活性 部 位 在 Aga2p 的 C 端 ,因此 ,此 处 代表 了 一 个 细胞 外 大 分 子 的 可 及 性 区 域 和 展示 固定 蛋白 的 有 效 位 点 。 酵母 表面 展示 系统 的 优点 :@ 表 达 偏 差 小 ,DNA FF AY 2 FEE BY BE 第 3 章 定向 分 子 进 化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 + 59 ， 白质 的 多 样 性 所 代表 ;@D 有 定量 筛选 的 标准 ;@@ 能 很 好 地 区 分 微弱 亲和力 差别 的 突 变 体 。 酵母 表面 展示 系统 用 于 蛋白 质 亲 和 和 稳定 性 的 定向 进化 已 有 成 功 报 道 , 最 先 被 用 于 抗体 的 亲和力 成 熟 。 由 于 酵母 展示 的 蛋白 质 是 紧密 锚固 在 细胞 壁 上 ,可 以 耐 受 SDS 等 的 抽 提 。 同 时 酵母 生长 快 ,因此 在 工业 上 具有 很 好 的 应 用 前 景 。 例 如 ,将 不 同 特异 的 金属 结合 蛋白 表达 在 酵母 表面 产生 环境 净化 微生物 ,可 用 于 处 理 废 水 中 金属 离子 和 放射 性 物质 。 将 具有 催化 活性 的 酶 固定 在 酵母 细胞 壁 上 ,可 防止 酶 的 不 可 逆 抑 制 ,再 生 酶 的 活性 。 3.5 ”酵母 m 杂 交 系 统 52] 3.5.1 酵母 双 杂 交 检 验 1989 年 ,Fields 和 Songl33] 提 出 了 "酵母 双 杂 交 检 验 ”, 提 供 了 体内 检验 蛋白 质 - 蛋白 质 相互 作用 的 直接 方法 。 该 法 有 3 个 优点 :@ 简 单 、 快 速 ;@ 两 个 相互 作用 的 蛋白 质 顺序 可 以 由 编码 它们 的 质粒 DNA 顺序 直接 读 出 ;@ 它 不 依赖 相互 作用 蛋白 质 的 特性 ,所 以 普遍 适用 。 酵 母 双 杂交 (Y2H) 检 验 是 根据 真 核 生 物 转录 激活 物 可 以 分 为 功能 上 独立 的 结构 域 :DNA 结合 结构 域 (DBD) 和 转录 活化 结构 域 (AD) ,并 上 且 杂 交 的 转录 激活 物 可 以 通过 两 个 结构 域 混合 和 匹配 产生 。 它 似乎 只 需要 DNA 结合 结构 域 将 活化 结构 域 引 入 转录 起 始 位 点 附近 。 这 表明 DBD 和 AD 之 间 的 键 在 没有 破坏 活性 的 情况 下 就 可 以 产生 。 这 样 ,Y2H 检验 中 的 键 是 两 种 相互 作用 蛋 白质 之 间 的 非 共 价 键 。 如 图 3.25 所 示 ,Y2H 系统 是 由 两 种 蛋白 质 坐 合体 和 来 自转 录 激 活 物 的 结合 位 点 的 报告 基因 下 游 组 成 。 如 果 两 个 目标 和 蛋白质 (X AY) VER, EMA 聚合 形成 结合 DNA 的 蛋白 质 坐 合体 (DBD-X) 和 转录 活化 蛋白 质 坐 合体 (AD-Y)。 DBD 和 转录 AD 的 二 聚合 帮助 补充 转录 装置 ,活化 报告 基因 的 转录 。 最 初 应 用 两 种 已 知 体内 物理 联合 的 蛋白 质 :酵母 SNF1 蛋白 质 (丝氨酸 - 苏 氮 酸 蛋白 质 激酶 , 与 GalDBD 融合 ) 和 SNF 激活 物 蛋 白质 SNF4( 与 Gal4AD 融合 )。 Gal4 结合 顺序 位 于 及 半 乳 糖苷 酶 报告 基因 上 游 , 并 整合 在 酵母 染色 体 的 URA3 位 点 上 。 编 码 蛋 白质 的 质粒 转化 到 酵母 中 ,B 半 乳糖 苷 酶 合成 水 平 应 用 标准 生物 化 学 定量 检验 。 当 DBD-SNF1 和 SNF4-AD 融合 蛋白 质 一 起 引入 时 ,及 半 乳 糖苷 酶 合 成 水 平 增加 200 倍 。 通 过 比较 ,直接 的 DBD-AD 融合 蛋白 质 活化 及 半 乳 糖苷 酶 合 成 水 平 达 4000 倍 。 自 Fieds 和 Song 文章 发 表 以 来 ,酵母 双 杂 交 检 验 " 已 有 明显 的 改进 ,降低 了 假 ” 60 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (b) DBD 报告 DBD 结 合 部 位 报告 图 3.25 和 蛋白质- 蛋白 质 , 蛋 白质 -DNA, 蛋 白质 -RNA 和 蛋白质- 小 分 子 相互 作用 的 各 种 酵母 mr- 杂交 系统 (a) 在 Y2 了 系统 中 ,报告 基因 的 转录 活化 是 通过 蛋白 质 X 和 了 直接 相互 作用 活化 结构 域 (AD) 补 充 重 新 组 成 。 因 为 蛋白 质 和 与 DNA 结合 结构 域 (DBD) 融 合 ,蛋白 质 Y 与 AD 融合 。(b) 在 YI 也 检验 中 ,AD 直接 与 DBD 融合 。 该 检验 可 以 用 于 筛选 结合 特异 DNA 顺序 的 DBDs, 或 者 对 既定 DBD 体内 结合 位 点 。 (《c) 同 Y2H 比较 ,用 于 检验 RNA- 蛋 白质 相互 作用 的 Y3H 系 统 有 一 个 杂 合 RNA 分 子 的 附加 成 分 。 一 半 杂 合 RNA 是 已 知 的 RNA, 其 可 以 结合 MS2 壳 蛋 白 (MS2) ,具有 高 亲和力 。 另 一 半 RNA X, EAR Y 相互 作用 。(d)Y3H 可 以 用 于 检验 小 分 子 相互 作用 [%]。 LI 是 同 蛋 白质 X 相 互 作用 的 配 基 , Li 可 与 配 基 L2 连接 。 这 样 ,如 L2 同 立 相互 作用 ,报告 基因 的 转录 活化 将 重新 组 成 阳性 ,增加 了 转录 读 出 。 各 种 工程 的 报告 质粒 已 广泛 用 于 蛋白 质 - 蛋 白质 相互 作用 的 检验 。 现 在 Y2H 检验 已 用 于 鉴定 上 千 种 新 的 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作用 。 同 样 的 特征 使 其 成 为 筛选 CDNA 库 的 积极 方法 ,并 用 于 定向 进化 (图 3.26) ,也 在 尝试 检验 DNA- 和 蛋白 质 相 互 作 用 。 酵 母 单 杂交 (YI1H) 和 检验 RNA- 蛋 白质 ,小 分 子 -蛋白 质 相 互 作 用 的 酵母 三 杂交 可 能 有 一 系列 应 用 前 景 。m 杂 交 检 验 已 成 功 应 用 于 蛋白 质 进 13 第 3 章 定向 分 子 进 化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 61 - © 如 一 一 BANTER CO 选择 正 表 型 克隆 3.26 Y2H 检验 为 进化 蛋白 质 提供 了 简便 的 方法 如 图 所 示 ,第 一 步 携带 与 AD 融合 的 蛋白 质 基因 的 质粒 在 特异 区 域 突变 产生 蛋白质 突变 体 库 。 质 粒 被 转达 化 到 宿主 , 它 是 含有 编码 蛋白 质 -DBD 融合 以 及 报告 质粒 的 菌株 ,其 有 依赖 于 两 种 蛋白 质 相 互 作用 确定 的 模型 ,含有 相互 作用 的 细胞 变 为 蓝 色 用 于 选择 。 编 码 AD 融合 蛋白 质 的 质粒 从 这 些 蓝 色 细胞 中 分 离 。 然 后 这 些 质 粒 或 者 顺序 分 析 ,或 进行 下 几 轮 突变 和 选择 ,以 提高 蛋白 质 -蛋白 质 相互 作 用 的 亲和力 3.5.2 酵母 双 杂 交 系 统 自 1989 年 提出 Y2H 系统 以 来 ,基本 系统 已 做 了 某 些 改进 。 各 种 结合 DNA 和 活化 结构 域 已 做 了 介绍 。 具 有 各 种 细菌 耐 药 标 准 的 常规 载体 ,酵母 的 复制 起 点 和 酵母 营养 缺陷 型 标记 已 商业 化 。 普 通 酵母 遗传 标记 已 引入 Y2H 系统 ,应 用 生长 选 择 , 使 其 能 够 检验 蛋白 质 突变 体 大 库 (cal05)。 除 了 基本 激活 物 系 统 , 逆 转 和 分 离 - 杂交 系统 ,已 用 于 检验 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作用 的 破坏 。 基 于 转录 阻 过 物 系 统 已 报 道 。 本 节 也 探讨 了 Y2H 选择 出 现 的 假 阳 性 的 本 质 及 如 何 减 少 假 阳 性 , 真 核 生 物 中 转录 机 制 ,蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作用 如 何 决定 Y2H 系 统 中 转录 活化 的 水 平等 问题 。 3.5.2.1 结合 DNA 和 转录 活化 结构 域 自从 第 一 个 Y2H 系 统 报道 以 来 , 几 个 实验 室 集注 在 方法 学 的 最 佳 化 研究 ,并 已 改进 了 一 些 基 本 系统 。 最 大 的 改进 是 使 该 系统 更 适 于 直接 由 cDNA 库 检 验 蛋 和 白 质 -蛋白 质 相 互 作 用 ,这 些 变化 也 证 明 其 在 分 子 进化 应 用 的 有 效 性 。 下 面 介 绍 的 几 ”62 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 个 商业 上 有 效 的 Y2H 系 统 。 1.Gal4 系统 Fields 和 Songl33] 提 出 的 系统 是 由 Gal4 DNA 结合 结构 域 (DBD) 和 Gal4 活化 结 构 域 构成 的 。 两 个 结构 域 置 于 乙醇 脱氧 酶 启动 子 ADHI * 截 短 变 体 的 控制 之 下 ,其 是 一 个 中 等 强度 的 启动 子 。 编 码 这 些 结构 域 的 质粒 是 穿梭 载体 , 这样 可 以 在 酵母 和 E. coli 中 繁殖 。 两 个 质粒 都 含有 pBR 细菌 Ori 和 Amp&R ,以 及 高 拷贝 酵母 2 Ori 和 营养 缺陷 型 标记 TRP1 和 LEU2, 以 选择 性 的 保持 酵母 中 的 质粒 。 过 去 10 年 ,对 Gal4 系统 进行 了 一 些 修饰 ,以 使 其 适合 于 广泛 范围 的 蛋白 质 。 因为 某 些 蛋白 质 在 高 浓度 表达 时 对 酵母 细胞 有 毒性 ,于 是 用 具有 着 丝 粒 (CEN)Ori 的 质粒 代替 2。CEN Ori 保持 质粒 拷贝 数 在 1 ~ 5 个 /细胞 (2x Ori, ca60/FH ff). FA 一 种 改进 是 应 用 全 长 ADHI 启动 子 , 较 之 截 短 的 突变 体 , 它 指导 蛋白 质 更 高 表达 。 为 了 促进 各 种 蛋白 质 和 cDNA 库 的 次 克隆 ,在 Gal4 DBD 和 4D 基因 的 N 端 和 C 端 引入 多 克隆 位 点 ,允许 在 3 个 读 框 中 以 正 反 方向 实现 N 端 和 C 端 融合 。 任何 YH 筛选 的 最 后 一 步 是 分 离 编码 目标 的 质粒 ,或 者 顺序 分 析 或 者 进一步 突变 和 选择 。 在 典型 的 Y2H 实验 中 ,酵母 含有 编码 DBD 和 AD 和 蛋白质 融合 的 质 粒 , 常 常 编码 报告 基因 第 3 或 第 4 个 质粒 或 第 3 个 蛋白 质 。 这 样 ,就 会 产生 如 何 选 择 编码 进化 蛋白 质 的 质粒 的 技术 问题 。 一 种 途径 是 并 人 可 选择 的 反 向 标记 ,例如 将 URA3 并 人 所 有 质粒 ,除了 编码 选择 的 蛋白 质 突变 体 的 质粒 外 ,URA3 还 编码 乳 清 酸 核 苷 -$'- 磷 酸 脱羧 酶 。 该 酶 不 仅 是 尿 喀 啶 生物 合成 途径 中 的 一 种 主要 酶 ,而 且 也 是 非 毒 性 $- 氟 乳 清 酸 (5-FOA) 转 为 毒性 5- 氟 尿 喀 啶 (5-FU) 的 一 种 酶 。 这 样 , 含 有 URA3 标记 可 以 对 着 5-FOA 选择 。 或 者 ,该 质粒 可 以 由 酵母 分 离 出 ,并 直接 转 到 已. coi。 然 后 ,在 E. coli KC8(trp1~ il leu2~ ) 分 离 出 所 要 求 的 质粒 ,或 者 编码 进化 的 蛋白 质 突 变 体 的 质粒 工程 到 含有 惟一 抗生素 标记 ,例如 Amp® 、Kam ,Cam® 或 抗 Zeocin 基因 (Zeog) 菌 株 中 。Mumberg 等 5 为 Gal4 系统 设计 的 质粒 ,其 允许 Ori( 2p: 或 CEN) 启动 子 (ADH1, CYC1, TEF2 或 GPD) 以 及 营养 缺陷 型 标记 (HIS3,LEU2， TRP1 或 URA3 ) 进 行 交换 。 2.GAl 系统 改进 的 Gal4 系统 是 采用 GAI 启动 子 。 它 调节 酵母 中 的 启动 子 , 并 且 可 以 用 半 乳糖 诱导 高 水 平 表 达 ,完全 被 葡萄 糖 抑制 ,以 及 随 着 半 乳 糖 和 葡萄 糖 比率 变化 而 调 节 。 当 然 这 个 启动 子 不 能 用 于 Gal4 系统 ,因为 Gal4 是 GAI 启动 子 系统 的 一 部 分 。 控制 蛋白 质 融 合 的 表达 特别 适 于 分 子 进 化 。 当 早期 几 轮 选择 时 ,蛋白 质 可 以 高 水 平 表 达 。 为 了 辨别 高 活性 的 蛋白 质 突变 体 , 在 后 几 轮 选择 时 和 蛋白质 的 表达 水 平 可 能 降低 。 在 诱导 剂 缺 乏 的 情况 下 根据 活化 报告 基因 筛选 诱导 系统 ,可 迅速 检验 出 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 + 63 ， 假 阳 性 。 3.LexA 系统 在 Gal4 DBD 位 置 , 采 用 了 E. coli 的 LexAx DBD, 并 且 GAL 上 游 活化 顺序 (UAS) 用 多 拷贝 LexA 操纵 子 取 代 。 在 Gal4 AD 位 置 ,该 系统 的 Vojtek 变 体 是 采用 疱疹 单 显 性 组 合 病毒 VP16 蛋白 质 的 AD。LexA 系统 与 最 初 Gal4 Y2H 非常 相似 。 这 样 ,许多 成 分 可 以 交换 ,对 DBD 和 AD 质粒 来 讲 , Vojtek 系统 应 用 同样 的 营养 缺 陷 型 标记 ,分 别 是 TRP1 和 LEU2, 如 Gal4 系统 。 它 应 用 ADHI 启动 子 控制 LexAg 融合 蛋白 质 的 表达 ,并 且 ADH 启动 子 控制 VP16 融合 物 的 表达 ,这 些 质粒 也 有 2p Ori, 主要 差别 是 应 用 非常 强 的 VP16 活化 结构 域 。VP16 AD 同样 含有 SV40 的 工 抗 原核 定位 顺序 (NIS) ,Gal4 AD.LexAy, DBD 不 含有 NIS。 这 种 设计 使 核 中 AD 融合 蛋白 质 的 浓度 大 于 LexAo 融 合 蛋白 质 ,增加 LexAxm AD 复合 物 结 合 报告 基因 的 上 游 的 机 会 。LexA/ZVP16 系统 的 突变 体 已 经 发 展 。 3.5.2.2 报告 基因 Y2H 系统 特别 适 于 分 子 进 化 实验 ,因为 它 可 以 进行 生长 选择 。 此 外 ,应 用 生 色 报 告 基 因 ( 例 如 ZeacZ) 的 次 级 筛选 可 以 排除 假 阳性 。 在 早期 几 轮 科 选 中 ,可 以 应 用 敏感 的 报告 基因 检验 活性 的 蛋白 质 。 在 后 几 轮 ,应 用 更 多 的 选择 性 报告 基因 辨 别 高 活性 的 突变 体 。Y2H 报告 质粒 提供 3 个 控制 水 平一 一 上 游 活 化 顺序 (UAS)、 启动 子 和 报告 基因 本 身 。 报 告 质粒 的 选择 是 最 佳 敏 感度 和 可 接受 背景 之 间 的 一 种 平衡 。 | UAS 提供 第 一 个 控制 水 平 。UAS 通过 DBD 所 识别 的 DNA 区 域 ,并 且 DBD- AD 复合 物 与 UAS 的 结合 负责 转录 活化 。 已 确定 转录 活化 水 平 与 DBD 结合 位 点 数 相关 ,这样 可 以 制备 具有 1~4 串联 结合 位 点 的 一 系列 报告 基因 。 启动 子 提供 第 二 个 控制 水 平 。 应 该 强调 ,除了 活化 转录 外 ,还 存在 启动 子 顺序 支配 基础 转录 的 问题 。 报 告 的 敏感 度 可 以 通过 转录 的 基础 水 平 来 提高 。 它 也 是 最 佳 敏 感度 和 可 接受 背景 之 间 的 一 种 平衡 。 报告 质粒 的 第 3 个 成 分 是 报告 基因 本 身 。 已 发 展 了 一 些 报告 系 统 。Y2H 检验 可 以 用 比 色 测定 筛选 正 或 负 生 长 。 最 初 Y2H 系统 应 用 LacZ 基因 以 提供 蛋白 质 - 蛋白 质 相 互 作用 的 比 色 测 定 。 LacZ 基因 编码 瓦 . coli 及 半 乳 糖苷 酶 ,其 有 广泛 的 底 物 特异 性 ,可 以 分 裂 一 些 生 色 底 物 ,包括 5- 省 -4- 毛 -3- 电 | 唆 -&D- 吡 喃 半 乳 糖苷 (X- gal);, 邻 硝 基 茶 -&D- 吡 喃 半 乳 糖苷 (ONPG)。 它 们 可 以 在 平板 上 或 液体 培养 中 迅速 检 出 。 除 了 acZ , 几 个 其 他 的 比 色 测 定 报告 基因 也 是 有 效 的 。MELI Fil gusA 分 别 编码 w- 半 乳糖 苷 酶 和 及 糖苷 酸 酶 ,可 以 用 生 色 底 物 $- 溴 -4- 毛 -3- 叫 噪 -o- 半 乳糖 苷 ”64 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (X-o-gal) 和 5- 溴 -4- 毛 -3- 电 | 吕 -&D- 葡 萄 糖 醛 酸 (X-gluc) 来 检验 [5] 。 编 码 绿色 荧光 重 日 (GFP) 的 基因 已 在 Y2H 系统 作 为 比 色 测定 报告 ,并 且 可 以 不 用 加 入 任何 外 源 底 物 进行 检验 。 3.5.2.3 ”基础 双 杂 交 系 统 的 修饰 Y2H 系 统 的 修饰 使 其 可 以 检验 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作 用 的 破坏 。 应 用 反选 择 性 标记 检验 有 蛋白质- 蛋白质 相 互 作 用 的 破坏 [图 3.27(a)]。 反 向 Y2H 系统 应 用 Gal4 DBD. AD & URA3 报告 基因 。 首 先 ,蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作 用 是 根据 在 缺乏 尿 喀 喧 介质 中 生长 来 确定 。 其 次 ,破坏 相互 作用 的 分 子 可 以 根据 URA3 转录 的 破坏 (a) OAR 合 的 抑制 蛋白 质 二 聚 合 的 抑制 TetR 结 合 部 位 HIS3 4K Fi 图 3.27 “检验 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作用 破坏 的 Y2H (a) 反 向 Y2H 系 统 ,X 和 了 之 间 蛋 白质 -蛋白 质 直接 相互 作用 ,活化 UR43 转录 ,其 将 $S-FOA 转 为 毒性 化 合 物 ( 左 ); 然 而 ,如 果 X 和 立 之 间 相 互 作用 被 破坏 , VR43 转录 被 破坏 ,细胞 在 含 5-FOA 介质 中 生长 ( 右 )。(b) 在 断裂 -杂交 系统 中 ,X 和 了 之 间 的 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作 用 活化 ter 转录 ,iel 能 编码 细菌 的 结合 DNA 的 蛋白 质 TetR. TetR 依次 结合 HIS? 报告 基因 的 上 游 ,并 阻止 该 基因 的 转录 , 其 对 于 缺乏 组 氨 酸 介质 中 生长 是 主要 的 ( 左 )。 在 X 和 YY 之 间 这 种 相互 作用 的 破坏 ,通过 第 3 个 蛋白 质 乙 关闭 ter 基 因 的 转录 。 在 缺乏 TetR 的 情况 下 , HIS3 基因 不 再 被 抑制 ,允许 细胞 在 缺乏 组 氨 酸 介质 中 生长 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 ' 65 和 在 5-FOA 存在 下 生长 来 检验 。 在 断裂 -杂交 系统 中 ,蛋白 质 -蛋白 质 相互 作用 的 破坏 是 应 用 双 报 告 系统 来 检 验 [图 3.27(b)]536 。 蛋 白质 -蛋白 质 相 互 作 用 指导 E. coli Tet BSAA tet 的 转录 (TetR ,一 种 结合 DNA NAN). HISS 基因 本 身 是 在 两 个 串联 TeR BAF 控制 下 。 该 系统 是 根据 带 有 LexAx DBD 和 VP16AD 的 Vojtek 系统 。 最 初 蛋白 质 - 蛋白 质 相 互 作 用 活化 TetR 转录 ,然后 TetR 通过 基础 转录 机 制 在 物理 上 阻 断 转录 来 抑制 HS3 的 产生 。 这 样 ,在 组 氨 酸 缺乏 情况 下 根据 生长 来 选择 , 它 已 用 于 破坏 蛋 和 白质- 蛋白质 相互 作用 的 蛋白 质 的 进化 。 另 一 系统 是 研究 和 蛋白质- 蛋白质 相互 作用 抑制 转录 激活 物 系统 (图 3.28) ,所 谓 抑制 转 激 活 物 系统 (RTS) 是 根据 Gal4 Y2H 系 统 ,只 是 Gal4 AD 是 用 酵母 阻 遏 蛋白 TUPI 的 N 端 抑制 结构 域 (RD) 取 代 !7]。 该 系统 是 为 初始 负 生长 选择 设计 的 ,采用 URA3 FRE AE LacZ Wie. URA3 基因 是 在 GA 启动 子 控制 之 下 。 这 样 ,如 果 没 有 和 蛋白质 -蛋白 质 相 互 作用 发 生 , UR43 基因 被 活化 ,并 且 酵 母 对 5-FOA 敏感 。 然 而 ,如 果 Gal4 DBD 和 TUP1 RD 融合 蛋白 质 相 互 作 用 ,那么 TUPIRD 被 充实 到 G411 启动 子 ,并 且 抑 制 UR43 转录 ,允许 在 5-FOA 存在 下 生存 。 & DBD 结 合 部 人 图 3.28 抑制 转录 激活 物 系 统 该 系统 可 以 用 于 独立 活化 转录 的 各 种 蛋白 质 。 因 为 被 筛选 的 蛋白 质 AX( 活 化 的 蛋白 质 X) 有 内 在 活 化 URA3 报告 基因 转录 的 能 力 ,AX 的 表达 使 细胞 对 5-FOA 敏感 ( 左 )。TUP1 的 抑制 结构 域 (RD) 的 补充 ,通过 指导 活化 蛋白 质 AX 和 蛋白质 立 之 间 的 相互 作用 ,抑制 UR43 基因 的 转录 , 允许 细胞 在 含有 5-FOA 介质 中 生长 ( 右 ) 关于 降低 在 Y2H 检验 中 观察 到 的 假 阳 性 问题 已 进行 了 详细 地 讨论 B7]。 降 低 假 阳 性 的 关键 是 在 开始 选择 之 前 挑选 最 佳 的 Y2H 系 统 ,排除 假 阳 性 最 普通 的 方式 是 应 用 不 同 的 报告 质粒 进行 实验 ,或 二 级 筛选 。 ” 66 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 3.6 细菌 双 杂 交 (B2H) 系 统 在 细菌 中 工作 有 几 个 洪 在 的 优点 ,对 分 子 进 化 实验 来 讲 ,基本 的 优点 是 已. coli 的 转化 效率 高 于 酵母 几 个 数量 级 ,一 次 可 检验 大 约 108 蛋白 质 突变 体 ( 酵 母 是 105) 。 另 外 ,分 子 生物 学 技术 已 在 已 . co 中 最 佳 化 ,选择 时 间 缩 得。 细菌 双 杂 系统 示 如 图 3.29。 图 3.29 细菌 双 杂 交 (B2H) 系 统 (a) RM B2H 系统 。 它 是 根据 细菌 的 天 然 阻 遏 和 蛋白。 图 中 和 蛋白质 XX 是 与 434 BEA RAR LE 链 的 C 端 融合 ,其 与 434 操纵 基因 结合 。434 操纵 基因 的 存在 不 影响 RNA pol 的 结合 或 报告 基因 的 转录 ( 左 )。 如 果 蛋 白质 XX 同 蛋白 质 Y 相 互 作用 ,那么 入- 阻 过 蛋白 融合 补充 低 亲 和 力 入 操纵 基因 ,阻止 RNA pol 与 启动 子 区 域 结合 ,从 而 抑制 报告 基因 的 转录 ( 右 )。(b)AraC-LexA 系统 。 它 是 根据 抑制 DNA 结 4. AraC-2 AJ X HAIL Ara BAD 操纵 子 ( 左 ) ,串联 的 LexA 操纵 基因 工程 在 Ara BAD 操纵 子 的 转录 和 翻译 起 点 之 间 。AraC-X 和 LexA-Y 蛋白 质 的 相互 作用 引起 真实 的 DNA 结合 和 转录 抑制 ( 右 )。 (c) 细 菌 激活 物 系 统 。 和 - 阻 遇 蛋白 通过 稳定 RNA polL 启 动 子 复合 物 简 单 地 活化 转录 。 这 样 ,如果 蛋白质 X 和 立 相 互 作用 ,蛋白 质 XA 阻 遏 蛋 白 融合 和 和 蛋白质 立 与 RNA pol 的 w- 亚 基 的 N 端 结构 域 融合 ,活化 报告 基因 的 转录 | 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 67 - 许多 细菌 阻 遏 物 和 激活 物 是 二 聚 体 蛋白 质 , 在 结构 上 具有 不 同 结合 DNA 和 二 桶 化 的 结构 域 [ 图 3.29(a) ]。 和 》- 阻 遏 蛋白 C 端 二 聚 化 结构 域 可 以 用 酵母 转录 激活 物 GCN4 的 亮 氨 酸 拉链 二 聚 化 结构 域 取 代 。 该 能 合 蛋白 质 是 稳定 的 ,在 功能 上 可 以 取代 体内 入- 阻 歇 蛋白。 围绕 LexA 和 AraC 发 展 了 相似 的 系统 ,并 且 可 以 检验 均 一 和 异 质 二 聚 体 [38] 。 应 用 AraC-LexA 系统 改进 了 LacZ 抑制 的 动态 范围 [图 3.29 (b)]。 在 该 系统 中 ,3 个 串联 的 LexA 操纵 子 已 工程 在 AraCBAD 启动 子 控制 的 LacZ 报告 基因 的 转录 和 翻译 的 起 点 之 间 。AracC 的 表达 或 AraC- 融 合 蛋 白 活 化 该 启动 子 的 转录 。 如 果 LexA- 融 合 蛋 白质 表达 ,其 可 以 同 AraC- 融 合 蛋 白质 相互 作 用 ,然后 相互 作用 产生 启动 子 DNA 弯曲 。 这 个 弯曲 阻止 LacZ 基因 转录 ,大概 破 坏 RNA 聚合 酶 的 结合 或 活性 。 在 该 系统 中 , LacZ 转录 水 平 可 提高 100 倍 , 这 取决 于 蛋白 质 -蛋白 质 相互 作用 强度 。 一 个 细菌 激活 物 系 统 如 图 3.29(c)。 它 是 简单 地 把 入 操纵 子 置 于 转录 起 始 位 点 的 上 游 。 蛋 白质 -蛋白 质 相 互 作用 可 以 根据 和 X- 阻 巡 蛋 白 - 融 合 蛋白 稳定 RNA pol 同 启动 子 相互 作用 能 力 来 检验 。 在 该 系统 中 ,Gal4 同 Gall1 相互 作用 使 LacZ 转录 提高 45 倍 。 细菌 双 杂 交 系 统 的 开发 只 是 刚刚 起 步 ,难点 是 在 细胞 中 难于 表达 多 个 质粒 ,并 上 且 染 色 体 整 合 也 不 像 在 酵母 中 重要 。 因 此 ,根据 不 同 的 应 用 ,工程 含有 报告 基因 的 菌株 ,对 于 细菌 系统 将 是 特别 重要 的 。 3.7 蛋白 质 互补 检验 检验 和 蛋白质- 蛋白质 相 互 作 用 的 其 他 方法 ,一般 地 依赖 于 诱导 蛋白质 的 两 个 互 补 片段 相互 作用 ,造成 酶 活性 或 FRET 的 重建 。 根 据 两 个 蛋白 质 片段 的 一 种 主要 酶 的 重建 , 几 个 实验 室 已 设计 出 高 通 量 检 验方 法 。 很 明显 , 酶 的 选择 是 关键 。 所 需 要 的 酶 可 以 分 成 两 个 片段 , 且 必 须 不 能 自身 缔 合 ,即使 在 超 表达 的 情况 也 应 如 此 。 片段 的 二 聚合 必须 保持 适当 的 折 琶 和 功能 。 为 了 选择 和 筛选 , 酶 必须 提供 明显 的 表 型 。 一 种 这 样 的 检验 是 根据 腺 苷 酸 环 化 酶 合成 腺 苷 3 ,3'- 环 化 单 核 苷 酸 (cAMP). B. pertussis 的 腺 苷 酸 环 化 酶 可 以 分 为 两 个 功能 上 互补 的 片段 (T18 和 T25) ,根据 T18 和 T25 的 二 聚 化 检验 蛋白 质 的 二 聚 化 ,重建 腺 苷 酸 环 化 酶 活性 部 位 。 因 为 cAMP/CAP 复合 物 诱导 几 个 基因 的 转录 ,包括 Lac 操纵 子 ,应 用 及 半 乳 糖 苷 酶 平板 检验 或 在 乳糖 上 生长 来 筛选 腺 苷 酸 环 化 酶 的 活性 ,为 此 需要 敲 除 该 酶 的 菌株 。 同 样 ,围绕 及 半 乳 糖苷 酶 的 w- 亚 基 和 er 亚 基 的 二 聚 化 和 二 氧 叶酸 还 原 酶 (CDHEFR) 的 N 端 (1~105) 和 C 端 (106 ~ 186) 片 段 设计 出 新 的 系统 。 ” 68 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 3.8 酵母 n- 杂 交 系 统 的 应 用 3.8.1 和 蛋白质- 蛋白 质 相 互 作用 Y2H 检验 首先 用 于 分 子 进化 ,鉴定 具有 高 亲 和 性 结合 目标 蛋白 质 的 各 种 肽 。 由 Gal4 AD 融合 的 随机 肽 库 选 择 出 视网膜 细胞 瘤 蛋白 (Rb 蛋白 ) 肽 配 体 。 应 用 HIS3 生长 选择 , 继 之 用 LacZ 筛选 ,结合 Rb 的 7 个 肽 已 由 3x 105 转 化 体 库 中 分 离 。 Y2 了 检验 也 用 于 鉴定 肽 适 体 。 双 杂 交 实 验 不 局 限于 肽 ,也 用 于 产生 具有 新 特异 性 的 PDZ 结构 域 。B2H 检验 也 用 于 进化 抑制 蛋白 质 二 聚合 的 肽 。 3.8.2 有 蛋白质 -DNA 相互 作用 为 了 检验 DNA- 和 蛋白 质 相互 作 用 ,可 以 直接 "one-hybrid "检验 。RNA pol 检验 进 化 特异 结合 DNA 的 锌 指 突变 体 。 在 该 检验 中 ,蛋白 质 -蛋白质 相互 作用 是 根据 结 合 DNA 的 蛋白 质 和 RNA pol 的 w- 结 构 域 的 二 聚合 以 及 依赖 RNA pol 转录 活化 进 行 检验 。 为 了 读 出 蛋白 质 -DNA 相互 作用 ,3 个 串联 的 锌 指 被 融合 到 Gall, HW 亲和力 与 Gall1l 结合 ,与 RNA pol 的 -结构 域 融合 。 此 外 ,如 果 和 锌 指 以 高 亲和力 与 所 要 求 的 DNA 顺序 结合 ,它们 可 以 活化 HIS3 报告 基因 的 转录 。 3.8.3 Az AJR-RNA 相互 作用 RNA- 蛋 白质 相互 作用 的 选择 不 太 直接 ,因为 RNA- 蛋 白质 融 合 不 能 直接 在 体 内 产生 ,常规 生化 检验 困难 。 但 这 可 以 通过 第 3 种 成 分 加 入 到 双 杂 交 系 统 按 Y3H 检验 (图 3.27)。 第 3 种 成 分 是 一 种 杂交 RNA 分 子 ,一半 是 已 知 的 RNA, 它 与 已 知 的 蛋白 质 以 高 亲 和 性 结合 ; 另 一 半 是 目标 RNA 分 子 。 即 Y3H 系统 是 由 两 个 蛋白 质 赃 合体 ,一 个 RNA 舱 合 体 和 报告 基因 组 成 。 一 种 RNA Y3H 系统 可 以 检验 两 个 已 知 的 蛋白 质 -RNA 配对 之 间 的 相互 作用 。 应 用 RNA Y3H 系统 筛选 RNA 分 子 随 机 库 可 以 鉴定 未 知 的 RNA- 蛋 白质 相互 作用 。 3.8.4 蛋白质 -小 分 子 相 互 作用 小 分 子 常常 称 为 二 聚合 的 化 学 诱导 剂 (CID) , 目前 采用 了 单 聚 和 二 聚 小 分 子 。 二 聚 CID 更 像 杂 合 RNA 分 子 那样 方式 应 用 ,一 半分 子 作为 锚 , 另 一 半 不 确定 。 蛋 CY me 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 69 - 白质 -小 分 子 相互 作用 一 个 重要 的 开发 领域 是 新 的 CID 配对 。 Y3H 检验 应 当 作为 工程 新 的 小 分 子 特异 性 蛋白 质 ,B2H 检验 用 于 恒 白 质 -小 分 子 相 互 作用 ,只 有 少数 细菌 三 杂交 系统 做 了 报道 ,这 些 系统 仍然 需要 最 佳 化 。 为 了 用 于 分 子 进化 ,一 个 重要 的 步骤 是 设计 更 好 的 细菌 小 分 子 三 杂交 系统 。 双 杂 交 检 验 将 为 体内 分 子 进化 实验 提供 方便 的 工具 。 双 杂交 系统 也 是 检验 cDNA 库 和 和 蛋白 质 工程 的 有 力 工具 。 因 为 检验 是 在 体内 进行 ,编码 蛋白 质 突变 体 的 质粒 在 每 轮 选 择 后 容易 回收 ,或 者 顺序 分 析 ,或 者 进一步 突变 和 选择 。 细 菌 双 杂 交 系 统 实验 可 在 E. coli 中 进行 ,可 检验 10° 库 。 双 杂交 检验 用 于 蛋白 质 进 化 是 非 常 鼓舞 人 心 的 ,可 以 在 单 轮 选 择 中 鉴定 出 高 亲和力 结合 剂 。 三 杂交 系统 扩展 了 检 验 ,甚至 将 这 些 检验 转 为 酶 催化 检验 [3 。 3.9 IMR DME Alii 微生物 统治 生物 圈 。 据 计算 1g 土壤 含有 4000 种 不 同 的 细菌 。 目 前 估计 地 球 上 有 1 000 000 ~ 100 000 000 种 微生物 ,但 记载 的 约 $000 FF, HILAL, BRA 藏 着 巨大 遗传 信息 ;自然 界 是 新 基因 、 新 产物 和 生物 合成 途径 无 限 的 宝库 。 由 环境 样品 分 离 新 酶 经 典 或 繁琐 的 途径 是 根据 要 求 的 活性 来 富 集 和 筛选 各 种 微生物 ,然后 酶 及 其 基因 由 鉴定 的 微生物 回收 。 传 统 培养 技术 需要 将 环境 样品 中 各 种 微生物 在 适当 的 生长 介质 中 培养 ,然后 分 离 ,直到 分 离 出 个 别 的 克隆 。 用 这 种 方法 ,由 于 在 纯 培 养 中 富 集 和 分 离 微生物 的 困难 ,能 导致 环境 中 大 部 分 微生物 多 样 性 丧失 。 人 们 估计 自然 界 可 观察 到 的 超过 99 多 的 微生物 应 用 标准 技术 是 不 能 培 养 的 。 为 了 解决 这 个 问题 ,已 开发 出 一 些 方法 。 该 途径 是 应 用 一 定 环 境 中 的 微 生 物 的 遗传 多 样 性 作为 整体 以 发 现 未 知 基因 和 基因 产物 。 为 了 探索 各 种 环境 的 遗传 多 样 性 的 一 种 方法 是 由 不 能 培养 的 微生物 分 离 DNA, 继 之 用 PCR 扩 增 并 克隆 所 要 求 的 基因 。 所 用 的 各 种 引物 的 顺序 是 来 自己 知 基 因 或 蛋白 质 族 的 保守 区 ,以 微 生 物 生 态 学 研究 中 所 采用 的 16SrRNA 基因 顺序 作为 来 源 是 有 效 的 。 但 是 为 生物 技 术 目 的 ,完整 新 基因 或 基因 产物 用 PCR 鉴定 是 有 限 的 。 其 他 的 方法 是 应 用 分 离 的 环境 DNA 构建 DNA 库 , 并 且 克 隆 来 自然 样品 的 功能 基因 ,不 需要 顺序 信息 ,现存 环境 库 可 以 用 于 各 种 目标 筛选 。 该 方法 已 成 功 获得 4- 羟 基 丁 酸 脱氧 酶 [0 、 脂 肪 酶 中] 酯 酶 (92] 淀粉 酶 [81 和 几 丁 质 酶 [4] 。 构 建 环境 库 所 必需 的 步骤 及 应 用 库 鉴 定 新 基因 或 基因 产物 示 如 图 3.30。 关 键 步 又 包括 环境 DNA 的 分 离 和 纯化 ,获得 的 DNA 连接 到 载体 上 , 继 之 ,由 构建 的 环境 库 筛 选 所 需 基 因 。 样品 的 收集 是 DNA 分 离 和 分 析 的 关键 。 对 于 陆地 生态 系统 (例如 土壤 或 微 生 Ni) ,取样 不 太 困难 。 样 品 体积 小 并 立即 贮存 冰 上 或 冷冻 。 对 于 其 他 的 地 方 , 例 如 深海 沉积 和 温泉 收集 ,以 及 高 纯度 取样 的 地 方 , 需 要 对 收集 ` 贮 存 或 在 取样 处 加 “70 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 DNA 的 分 离 , 连 接 到 载体 上 环境 DNA 库 (BAC , 柯 斯 质粒 ,质粒 ) 同 源 性 表达 (根据 顺序 ) (根据 活性 ) 基因 组 片段 酶 ,代谢 产物 生物 活性 试剂 途径 基因 组 和 系统 生理 多 样 性 发 育 多 样 性 图 3.30 “环境 库 的 构建 和 筛选 工 样品 的 附加 工作 。 为 了 避免 微生物 多 样 性 的 丧失 ,样品 运输 和 贮存 必须 小 心 。 在 贮存 时 ,在 样品 冰冻 和 溶解 之 前 ,容易 造成 核酸 的 丢失 。 一 般 冰 冻 的 样品 在 2h 之 内 保持 微生物 的 最 广 谱 。 天 然 微 生物 功能 基因 的 克隆 取决 于 提取 和 纯化 的 环境 DNA 的 质量 。 在 克隆 各 步骤 过 程 中 所 需要 的 酶 促 修 饰 对 存在 于 环境 生态 系统 中 的 生命 和 非 生命 成 分 的 污染 是 敏感 的 。 例 如 土壤 DNA 的 提取 总 是 伴 有 腐殖质 ,其 干扰 限制 酶 消化 和 PCR 扩 增 ,并 降低 转化 效率 和 DNA 杂 化 的 特异 性 。 为 解决 污染 问题 ,已 开发 出 一 些 方 法 。 这 些 方法 或 者 根据 回收 或 者 依靠 微生物 细胞 分 级 和 继 之 裂解 ,或 样品 中 的 细 胞 直接 裂解 , 继 之 纯化 DNA. 直接 裂解 方法 已 得 到 很 大 发 展 , 用 高 生物 量 环境 样品 ,例如 表面 土壤 或 每 克 固 体 材料 总 细菌 量 = 108 细胞 的 污 泥 均 可 以 分 离 环 境 中 的 DNA。DNA 提取 操作 包括 高 温 去 污 剂 处 理 、 机 械 破 坏 、 冰冻 或 解冻 ,典型 的 方法 示 如 图 3.31。 这 种 方法 适 于 各 种 环境 样品 ,包括 土壤 和 沉积 物 。 由 环境 样品 提取 DNA 是 在 SDS. 十 六 烷 基 三 甲 基 胺 省 化 物 (CTAB) 和 和 蛋白 酶 K 存 在 下 用 高 盐 提 取 组 冲 液 裂解 细胞 来 完成 Oe 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 71 的 。 最 终 步骤 是 粗 提 DNA 的 纯化 和 通过 阴离子 交换 树脂 或 硅胶 层 析 去 除 共 提取 物 。 最 终 DNA 纯化 的 其 他 方法 ,例如 氯 化 饮 平衡 密度 离心 , 凝 胶 过 滤 和 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 等 。 操 作 的 主要 部 分 是 由 土壤 和 沉积 物 样品 回收 细菌 DNA, 同时 无 细胞 DNA 也 被 提取 。 直 接 裂 解 技术 较 分 级 方法 更 常用 ,因为 它 适 于 各 种 土壤 和 其 他 环 境 , 劳 动 强度 小 ,并且 DNA 收 率 高 。 由 各 种 土壤 样品 回收 DNA 的 量 ( 以 土壤 计 ) 2.5~ 26.9ug/g。 从 直接 裂解 途径 分 离 的 DNA 可 以 大 概 代表 环境 样品 的 微生物 多 样 性 ,因为 不 需要 由 环境 基质 回收 微生物 , 粘 到 颗粒 上 的 微生物 也 不 易 被 裂解 。 这 样 ,构建 的 库 可 以 包含 整个 遗传 多 样 性 。 此 外 ,分 离 的 DNA=25kb, 适 于 所 有 分 子 操作 ,例如 用 限制 酶 消化 和 连接 到 载体 上 等 。 环境 样品 | 细胞 裂解 :在 CTAB 和 和 蛋白 酶 民 存 在 下 用 高 盐 提 取 制 备 粗 DNA, 然 后 用 SDS 处 理 | 在 65 CHEF 2 ~ 3h | 氯仿 / 异 戊 醇 提 取 | 用 乙醇 沉淀 DNA | 通过 硅胶 或 阴离子 交换 柱 层 析 去 除 共 提取 物 : 3.31 通过 直接 裂解 途径 由 土壤 和 沉积 物 分 离 环 境 DNAS) 分 级 方法 涉及 在 细胞 裂解 之 前 由 环境 基质 分 离 微生物 细胞 。 该 途径 对 于 低 生 物 量 (例如 水 样 ) 或 干扰 DNA 分 离 物 质 含量 高 (例如 污水 ) 是 有 优势 的 。 一 般 由 环 境 基质 分 离 细胞 是 以 完整 样品 的 缓冲 液 匀 浆 开始 ,然后 基质 颗粒 和 其 他 碎片 用 低 速 离心 除去 , 继 之 ,未 吸附 的 微生物 细胞 通过 高 速 离 心 和 裂解 收集 。 为 了 提高 DNA 收 率 ,可 进行 多 轮 匀 浆 和 离心 。 对 单一 有 机 体 而 言 ,通过 标准 方法 分 离 DNA， 最 终 DNA 纯化 按 直接 裂解 途径 进行 ,这 样 几 乎 可 以 由 细菌 获得 完整 的 DNA, 因为 细菌 是 来 自 环境 基质 ,任何 无 细胞 DNA 或 较 大 和 较 重 的 真 核 细 胞 均 可 以 被 分 离 出 。 通 过 分 级 方法 回收 环境 DNA 似乎 不 太 容 易 被 基质 化 合 物 或 土壤 中 腐殖质 污 染 。 此 外 ,分离 的 DNA 的 平均 大 小 大 于 直接 裂解 途径 所 得 。 但 是 ,在 土壤 和 沉积 物 样品 的 情况 下 ,分 级 途径 可 以 优先 从 快速 生长 的 细菌 细胞 中 回收 DNA, 这 种 选 - 72 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 择 性 会 造成 分 离 出 的 DNA 遗传 多 样 性 的 丧失 。 在 环境 DNA 库 的 构建 中 , 忆 . coli 作为 产生 和 保持 环境 库 的 宿主 ,因为 各 种 遗 传 工 具 对 它 都 是 有 效 的 ;质粒 \、 柯 斯 质粒 、fosmid、 入 只 菌 体 和 细菌 人 工 染 色 体 (BAC) 作 为 载体 。 适 当 载 体 的 选择 取决 于 库 所 要 求 平均 插 人 DNA 的 大 小 和 拷贝 数 。 此 外 ,分 离 环境 DNA 的 质量 影响 载体 系统 的 选择 。 在 某 些 情况 下 ,经 纯化 之 后 ,环境 DNA 仍然 被 腐殖质 或 基质 污染 ,只 有 通过 质粒 载体 克隆 。 质 粒 ( 例 如 pBluescrip 或 pET) 的 另 一 优点 是 在 EL. coli 表现 出 高 拷贝 数 , 允许 根据 活性 筛选 。 这 是 非常 重要 的 ,因为 环境 基因 的 活性 表达 往往 取决 于 天 然 启 动 子 。 该 方法 局 限 于 单一 基因 或 小 操纵 子 的 筛选 ,不 能 进行 大 基因 簇 编 码 的 代谢 活性 的 筛选 。 为 了 克隆 环境 DNA 的 大 片段 ,应 用 柯 斯 质粒 、fosmid 和 BAC。 环 境 柯 斯 质粒 和 fosmid 库 的 平均 插 人 大 小 是 20~ 40kb,BAC 库 是 27 ~ 80kb( 表 3.2)。 应 用 BAC 载体 构建 的 环境 库 已 引起 人 们 的 关注 。BAC 是 修饰 质粒 ,其 包含 来 自 EL. coli uF 因子 的 复 制 起 点 。BAC 的 复制 是 被 严格 的 控制 的 ,保持 每 个 细胞 一 或 两 个 拷贝 的 复制 子 。 这 种 载体 可 稳定 的 保持 和 复制 至 600kb。 由 此 可 见 ,BAC 是 回收 大 的 环境 DNA 片 RN RRA, ERI RIK EAR AE EM ARR ASE. BAC 库 和 cosmid 库 的 缺点 是 载体 的 拷贝 数 低 。 从 环境 库 中 筛选 所 要 求 的 基因 和 基因 簇 是 鉴 定 新 的 生物 催化 剂 .天然 产 物 和 新 的 分 子 结构 的 一 种 有 效 方法 。 环 境 库 的 筛选 可 以 根据 重组 株 的 表 型 或 酶 活性 或 者 核 苷 酸 顺 序 进行 ,例如 由 286 000 克隆 分 离 出 编 码 酯 酶 的 3 个 新 基因 ( 表 3.2)。 表 3.2 根据 活性 筛选 环境 库 的 实例 DNA 来 源 载体 检验 的 EB. coli 克隆 数 Of ae 正 克隆 数 文献 土壤 质粒 286 000 酯 酶 3 [42] 土壤 质粒 930 000 eae 5 [40] 沉积 物 和 75 000 JSUT Si 9 [44] 土壤 BAC 3 648 DNase 1 [43] 土壤 BAC 3 648 抗菌 活性 1 [43] 土壤 BAC 3 648 脂肪 酶 2 [41] 土壤 BAC 3 648 淀粉 酶 8 [43] 土壤 BAC 24 576 溶血 活性 29 [43] 注 :BAC ZARA THK, —oaoerOrlhU.er‘(<23n'Y'Y’PegwO?V 第 3 章 定向 分 子 进化 的 选择 /筛选 策略 和 方法 + 73 - UuU & WOW NY 一 10 11 12 13 19 $e xX 献 沈 倍 奋 . 分 子 文库 . 北京 :科学 出 版 社 ,2001 Ri. 基因 工程 原理 . 第 二 版 (上 册 ). 北京 : 科学 出 版 社 ,2000 李 育 阳 . 基因 表达 技术 . 北京 :科学 出 版 社 ,2002 陆 德 如 , 陈 永 青 . 基因 工程 . 北京 :化 学 工业 出 版 社 ,2002 Mattheakes L C, Bhatt R R, Dower W J. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. 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Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13: 572 ~ 577 第 4 和 草 核 酶 和 脱氧 核 酶 定 癌 分 子 进化 4.1 引 言 RNA 分 子 在 现代 生物 学 中 有 着 重要 的 作用 ,特别 是 在 最 基本 和 高 度 保 守 的 细 胞 过 程 。 核 糖 体 晶 体 结构 揭示 了 RNA 在 蛋白 质 合成 的 作用 0 -59。 它 涉及 作为 DNA 复制 的 引物 ,携带 遗传 信息 到 翻译 装置 ,并 且 是 位 于 核糖 体 “ 心 脏 ? 的 催化 剂 。 当 拼接 和 编辑 时 ,RNA 指导 前 体 mRNA 的 加 工 ,并 且 调 节 细 胞 中 一 些 其 他 RNA 和 蛋白 质 事件 。 核 酶 (ribozyme) 协 助 RNA 加 工事 件 和 病毒 基因 组 的 复制 。 个 别 的 核 苷 酸 作为 重要 的 信号 分 子 , 并 且 它 们 的 辅酶 衍生 物 参 与 中 心 代谢 的 大 多 数 反应 。 尽管 RNA 只 含有 4 种 不 同 的 碱 基 , 但 RNA 可 折 丢 成 复杂 的 三 级 结构 ; 与 蛋白 质 类 似 , 催 化 广泛 的 化 学 转化 。 实 验 室 进行 的 RNA 进化 可 以 看 作为 RNA 世界 中 RNA 进化 的 一 种 模型 ,用 于 获得 许多 新 的 酶 5]。 这 些 包括 RNA 催化 核 苷 酸 的 合 成 [5 、RNA 聚合 -7 tRNA 的 氨 酰 基 化 :51 和 肽 键 的 形成 !%1。 很 可 能 RNA 能 够 支持 以 RNA 基因 组 为 基础 的 生命 ,复制 并 通过 RNA 的 催化 功能 来 保持 。 然 而 ,如 何 科 学 的 了 解 RNA 产生 代谢 的 复杂 度 、. 导致 基 因 组 和 和 蛋白质 组 产生 的 方式 , 尚 存 在 许 多 实质 性 缺口 。 RNA 是 各 种 顺序 的 多 聚 物 ,通过 模板 机 制 自身 复制 。 不 同 的 顺序 有 不 同 的 化 学 性 质 。 但 是 几乎 所 有 的 顺序 都 能 够 形成 Watson-Crick 复 体 结构 ,以 促进 新 拷贝 的 产生 。 如 果 RNA 的 构件 在 前 生命 环境 是 有 效 的 ,如 果 这 些 构 件 组 合 形成 多 核 苷 酸 ,如 果 某 些 多 核 苷 酸 开 始 自 身 复 制 , ABA RNA 可 以 被 认为 是 地 球 上 出 现 的 第 一 个 生命 形式 。 但 是 根据 目前 生命 化 学 的 知识 ,未 必 是 事实 。 核 糖 、 磷 酸 、 嗓 吟 和 前 喀 啶 完全 可 能 得 到 ,虽然 喀 啶 有 些 勉强 。 它 们 可 能 以 很 低产 率 组 合 形成 核 背 , 核 苷 酸 及 其 类 似 物 甚至 可 以 形成 多 聚 物 ( 具 有 2' ,3'-,3' ,5$'- 和 $' ,3'- 磷 酸 二 酯 键 的 混合 物 ) 糖 的 D- 立 体 异 构 体 和 -立体 异 构 体 糖苷 键 v- 差 向 异 构 体 和 及 差 向 异 构 体 和 各 种 修饰 的 糖 、 磷 酸 和 碱 基 。 了 解 依赖 RNA 的 生命 起 源 的 主要 障碍 是 确定 合理 的 机 制 。 几 种 研究 途径 或 许 有 特殊 的 条 件 导致 活化 的 ED- 核 苷 酸 的 优先 合成 ,或 这 些 单 体 优先 移 人 多 聚 物 中 。 例 如 ,由 甲醛 合成 糖 导 致 核糖 2, 4- 二 磷酸 形成 。 当 在 某 些 金属 氢 氧 化 物 存在 下 ,这 个 反应 可 以 在 近 中 性 pE 水 溶液 发 生 。 甲 醛 的 聚合 产生 2’, ，5“- 键 产物 , 而 在 白土 (montmorillonite clay) 存 在 下 主要 产生 3',$'- 键 产物 。 这 样 ,通过 一 系列 偏向 合成 ,分 级 和 其 他 的 富 集 过 程 ,形成 RNA"* 汤 ”。 第 4 章 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 77 - 另 一 个 途径 是 假设 生命 不 是 依赖 RNA 起 始 , 而 是 依赖 RNA 之 前 的 其 他 遗传 “系统 。 这 个 途径 的 研究 最 近 几 年 有 实质 性 进展 。 最 值得 注意 的 是 o-L- Fp RO BE 单元 通过 3’ ,2- 磷 酸 二 酯 键 相连 形成 的 苏 糖 核酸 (TNA)[ 图 4.1(a)] ,这 个 类 似 物 自身 同 RNA 形成 稳定 的 Watson-Crick 配对 ,从 克服 前 生命 化 学 “混沌 ”的 观点 出 发 ,TNA 较 RNA 有 更 多 的 优势 ,这 是 由 于 其 化 学 性 质 简单 。 苏 糖 是 仅 有 两 个 丁 醛 糖 (aldotetrose)( 四 碳 糖 ) 的 一 种 ,并 且 只 能 在 2 和 3' 位 连接 。 不 难 想像 “TNA 世界 ” 可 以 过 渡 到 “RNA 世界 ”。 另 一 个 具有 潜在 的 RNA 的 祖先 是 肽 核酸 (PNA)。PNA 是 通过 亚 甲 痰 酰基 把 碱 基 连 在 _ N-(2- 氨 乙 基 ) 甘 氢 酸 单元 的 类 肽 骨架 组 成 的 [图 4.1(b)). ALHHA 酸 是 由 氮 、 氨 .甲烷 和 水 在 电 火花 反应 中 合成 。PNA 自身 或 同 RNA 形成 类 Watson- Crick 复 体 结 构 。PNA 单 体 可 以 经 历 分 子 内 N- 乙 酰 转 移 反 应 以 阻止 它们 按 常 规 机 制 聚 合 。 在 RNA 之 前 两 种 其 他 的 可 能 是 甘油 衍生 的 核酸 类 似 物 [图 4.1(c)] 和 吡 喃 糖 酰基 RNA( 含 4' ,2'- 连 接 的 BD- 吡 喃 核糖 酰基 单元 )[ 图 4.1(d) ] ,但 两 者 都 没 有 充分 的 实验 支持 。 在 依赖 RNA 生命 之 前 也 可 能 就 有 复制 的 进化 多 聚 物 ,没有 达 尔 文 进化 特征 的 自身 复制 的 某 些 肽 ,甚至 小 的 有 机 化 合 物 [ 弛 。TNA,PNA 或 其 他 可 能 的 RNA 前 体 至 今 未 见报 道 。 (a) (bs) 1 (c) (d) O=p-O B 9 { o=P- B OPO O06 aia a DA B \ OSP-O B HO ONIAB fo 必 OF Low Beis O oe ° ae o=-0 bee ) 图 4.1 RNA 的 可 能 前 体 (a) 苏 糖 核酸 (TNA); (b) 肽 核酸 (PNA); (c) 甘油 衍生 核酸 (GNA) ; (d) 吡 喃 核糖 酰基 -RNA。 图 中 B 代表 碱 基 RNA 世界 的 核心 过 程 是 RNA 的 复制 , 且 由 RNA 催化 。 复 制 可 能 涉及 寡 核 苷 酸 或 大 的 亚 单位 的 连接 ,或 者 是 通过 模块 组 装 ,而 不 是 线性 模板 的 组 织 。 有 的 定向 进化 的 核 酶 是 催化 模板 指导 的 窒 核 苷 酸 3'- 羟 基 和 守 核 苷 酸 3$'- 三 磷酸 连接 。 最 好 的 研究 工作 是 类 1 连接 酶 (class 1 ligase)[0] , 见 图 4.2(a)。 它 含有 一 个 内 部 的 模板 区 ,结合 互补 RNA 底 物 ,并 且 底 物 的 3'- 羟 基 直 接 进 攻 核 酶 的 和 -三 磷酸 ,形成 3'， 3 -磷酸 二 酯 键 。 约 120 个 核 苷 酸 组 成 的 核 酶 催化 速率 接近 . 100/min, 相 对 于 未 催 -78 > 进化 生物 技术 一 酶 定向 分 子 进 化 化 反应 ,速率 提高 约 10? U.S !1 连接 酶 也 催化 NTP 的 聚合 , 按 模板 指导 方式 把 3 个 残 基 加 到 RNA 引物 的 3' 端 5 [图 4.2(b)]。 图 4.2 RNA 聚合 酶 的 核 酶 体外 进化 的 连续 相 (a) 类 1 连接 酶 的 核 酶 催化 模板 指导 RNA 引物 ( 开 线 ) 的 3“ 端 与 核 酶 的 5' 端 连接 ; (b) 类 1 连接 酶 通过 内 部 模板 指导 催化 3 个 核 苷 5 三 磷酸 (NITP) 加 到 引物 的 3 端 ; (c) 类 1 衍生 的 聚合 酶 催化 14 个 NIP 加 到 外 部 RNA 模板 上 类 1 连接 酶 作为 进一步 定向 进化 实验 的 起 点 ,结果 明显 地 提高 NTP 聚合 的 活 性 [图 4.2(c)]。 最 终 进 化 的 核 酶 含 约 200 个 核 苷 酸 ,并 且 催化 RNA 引物 在 外 部 模 “ 板 上 延伸 ,在 24h 内 连续 加 上 14 个 核 苷 酸 。 可 能 存在 许多 不 同 的 RNA 分 子 能 够 催化 模板 指导 的 NTP 的 聚合 。 由 体外 进化 获得 he FERMENT RE ,在 结构 或 顺 序 与 类 1 连接 酶 没有 明显 的 相似 性 ,但 也 催化 RNA 引物 在 外 部 RNA 模板 上 延伸 ， 它 只 加 上 一 个 或 两 个 核 苷 酸 04] 。 两 个 其 他 的 定向 进化 的 核 酶 ,LL1 和 L3 连接 酶 在 内 部 而 不 是 外 部 模板 催化 3’ ,5'- 磷 酸 二 酯 链 的 形成 05'16] 。 后 一 核 酶 只 含 3 种 核 苷 酸 ,完全 缺乏 胞 喀 啶 核 苷 酸 。 进 化 获得 的 其 他 连接 酶 还 能 催化 2 ,5'- 键 而 不 是 3"， 5'-## RNA 形成。 大 量 的 可 能 的 RNA 顺序 的 探索 可 以 预测 产生 一 些 3 ,5'- 连 接 酶 ,其 中 许多 可 以 进化 为 NTP 聚合 酶 。 对 于 含有 100 个 核 苷 酸 的 RNA 分 子 , 就 有 40( 约 10%) 种 可 能 顺序 。 通过 体外 进化 已 得 到 催化 核 苷 酸 合成 的 某 些 步骤 的 核 酶 (图 4.3) ,例如 催化 喀 喧 和 活化 核糖 形成 核 苷 酸 的 核 酶 。 在 前 生命 化 学 中 ,这 是 个 众所周知 的 难于 进 行 的 反应 ,但 用 随机 顺序 RNA 库 就 可 以 实现 该 反应 。 随 机 顺序 RNA 结合 在 5- 磷 酸 核糖 酰基 -1- 焦 磷酸 上 ,并 人 允许 同 硫 代 尿 喀 喧 反应。 进化 酶 催化 反应 的 速率 较 之 未 催化 反应 提高 107 倍 以 上 。 另 一 个 定向 进化 的 核 酶 催化 多 核 昔 酸 的 5'- 磷 酸化， 应 用 ATP 作为 磷酸 供 体 ,催化 速率 提高 约 10? 倍 [7]。 催 化 模板 指导 的 RNA 连接 的 核 酶 已 报道 08] 。 在 核 苷 酸 合成 中 有 几 个 重要 的 反应 至 今 未 用 核 酶 催化 (图 4.3) ,例如 由 简单 的 醛 形成 核糖 等 。 现 在 已 证 实 通过 体外 进化 所 获得 的 核 酶 可 以 催化 各 种 化 学 反应 ,包括 酰基 转移 09,20 、N- 烷 基 化 和 Se RE e222) 、 碳 - 碳 键 形 : 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 79 - Bt 酰胺 键 形成 和 Michael 加 成 ,但 从 未 证 实 核 酶 催化 核糖 转 为 脱氧 核糖 :< 。 HO-CHi- CH-CHO Ho 二 oskretrcoo 5 HCN H I O ‘Hs na Yo Coo /o NH2 root Bg OH OH @ HO- 0.8 OHOH HO—(POs),, R-O-(PO3),i«. 4 NTP Gr v8 | -O-(PO3),” “NDP: R-OH a oo O B oO jail OHOH NTP Je QHOH Og Py frrot-obopos OHOH -OH @ © e NMP ——ohoyoy OHOH 图 4.3 RNA 催 化 RNA 合 成 的 假说 途径 带 有 圆圈 的 字母 表示 实验 证 实 的 反应 。@) 糖 醛 和 甘油 缩合 形成 核糖 ; @ 氨基 甲 栈 基础 酸 的 氨基 甲 酰基 转移 到 天 冬 所 酸 上 , 继 之 环 化 形成 喀 啶 ; © HCN 的 五 聚合 形成 味 叭 ; @ 味 叭 或 喀 啶 (B) 加 AAR LE MAT; © 核 苷 磷酸 化 形成 核 苷 酸 ; © 通过 NTP 的 核 苷 酸 部 分 转移 核 苷 酸 的 活化 ; © KH BMF) RNA 引物 的 3' 端 (王国 ), 两 个 RNA 底 物 被 结合 在 互补 模板 的 相 邻 位 置 (未 标 出 ); @ 核 音 酸 连 续 加 入 进一步 延伸 引物 ; @ 由 烷 基 础 酸 将 磷 酰 基 转 移 到 NDP 产 生 NTP, NMP 以 相似 方式 转 为 NDP。 磷 酸 来 源 于 聚 磷酸 矿 RNA 能 够 催化 蛋白 质 合 成 的 所 有 反应 (图 4.4)。 人 信息、 转移 和 核糖 体 RNA 分 子 存 在 于 所 有 机 体 中 。RNA 指导 特殊 多 肽 顺序 的 组 装 。 在 氮 酰 基 腺 苷 酸 形成 中 氨基 酸 被 活化 , 继 之 氨基 酸 转 移 到 (RNA 的 2'/(3) 端 。 在 现代 生物 学 中 是 通过 一 组 20 种 氨 酰 基 - 录 NA 合成 酶 (和 蛋白质) 催化 的 这 些 反 应 用 定向 进化 的 核 酶 也 能 完成 。 含有 约 110 核 苷 酸 的 核 酶 催化 亮 氨 酸 或 葵 丙 氨 酸 加 到 它 特 有 的 5 端 ,形成 所 酰基 核 苷 酸 酸 酥 '”] 。 有 的 核 酶 利用 各 种 氨 酰 基 - 腺 苷 酸 底 物 催化 它 特 有 的 2"(3') 端 的 - 80> Deke WikR—_ME FI FHL H;N-CH-COO- R NTP je PP; 0 Oo + ll H,N-CH-C-0-P- 0B r 5 O OHOH ©) NMP + HsN-CH-C=0 _ HsN-CH-O-0 R R’ fe tRNA ert Pe ee R Pals 0 OO 图 4.4 RNA 催化 蛋白 质 合成 的 假设 途径 圆圈 字母 表示 反应 已 被 实验 证 实 。@ 通过 氮 酰 基 核 苷 酸 酸 酬 活 化 氨基 酸 ; © 活 化 的 氨基 酸 转移 到 RNA 的 2'(3") 端 ,在 2'- 氧 和 3'- 氧 之 间 的 半圆 指出 氨基 酸 在 这 两 个 位 置 迅速 迁移 ; © 肽 酰基 转移 结果 形成 二 肽 。 两 个 氨 酰 基 -tRNA 底 物 结合 在 互补 模板 的 相 邻 位 置 (图 中 未 标 出 ); @ 连续 的 肽 酰基 转移 反应 形成 多 肽 氨 酰 基 化 2'2. 。 另 一 核 酶 催化 (RNA 的 氨 酰 基 化 ,或 共 价 系 于 核 酶 上 或 作为 分 离 的 底 物 5] 。 蛋 白质 合成 的 最 后 步骤 涉及 沿 RNA 模板 在 相 邻 位 置 结 合 氨 酰 基 和 肽 酰基 的 寡 核 苷 酸 , 并 通过 氨基 酸 的 c 胺 进攻 肽 酰基 酯 的 普 基 形成 肽 键 。 核 糖 体 的 晶体 结构 揭示 肽 酰基 转移 酶 位 点 完全 是 由 RNA 组 成 的 3。 第 一 个 核糖 体 较 之 现 代 核 糖 体 是 更 小 ,更 简单 的 结构 ,功能 是 有 限 的 ,很 可 能 完全 是 由 RNA 组 成 的 。E 位 点 是 后 来 进化 的 。 核 糖 体 功能 中 心 的 化 学 组 成 基本 上 与 它们 的 进化 年 代 有 关 ， 越 最 近 越 含有 更 多 的 蛋白 质 。 定向 进化 也 用 于 开发 催化 肽 键 合成 的 核 酶 。 从 5' 端 带 有 苯 丙 氨 酸 的 随机 顺序 RNA 库 起 始 ,根据 能 够 同 蛋 氮 酰 基 - 腺 苷 酸 底 物 反应 形成 二 肽 进行 选择 。 有 一 种 | 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 .81 - | 进化 的 核 酶 约 含有 190 个 核 苷 酸 ,并 且 催化 速率 约 为 0.1/min。 它 接受 几 种 不 同 的 氨 酰 基 腺 苷 酸 ,优选 蛋氨酸 。 像 类 1 连接 酶 的 核 酶 进化 为 RNA 聚合 酶 一 样 ,这 个 肽 酰基 转移 酶 可 以 进化 成 连续 合成 多 个 肽 键 的 核 酶 。 RNA 有 几 个 特征 使 它 适 于 作为 简单 达尔 文体 系 的 基础 : 它 只 含有 4 种 不 同 的 单元 , 当 活 化 和 结合 到 互补 模板 上 时 容易 聚合 ; 它 是 一 种 聚 阴离子 ,不 管 顺序 如 何 ， 易 溶 于 水 , 并 形成 耐 受 顺序 变动 的 简单 二 级 结构 [2,3] 。 这 些 特征 同 DNA 和 蛋白 质 比较 ,DNA 的 较 低 的 活性 和 更 大 的 稳定 性 使 其 更 好 作为 遗传 材料 , 而 蛋白 质 的 化 学 多 样 性 ,包括 阴离子 .阳离子 和 玻 水 基 团 ,使 其 更 好 的 作为 催化 功能 的 基础 。 在 生物 学 上 发 现 的 核 酶 是 少 的 ,更 多 的 是 通过 试管 进化 得 到 的 。 人 工 构建 依 #i RNA 的 生命 是 一 个 遥远 将 来 的 事件 : 约 RNA 世界 ”的 残迹 可 能 潜在 于 某 种 特 殊 的 现代 微 环 境 之 中 。 4.2 核 Ag 1981 年 Cech 等 [535] 发 现 四 膜 虫 的 前 体 RNA 可 以 在 没有 蛋白 质 存在 的 情况 下 自身 催化 切除 内 含 子 ,完成 加 工 过 程 。 这 一 具有 催化 活性 的 RNA 的 发 现 丰 富 和 发 be 7 酶 -的 概念 ,从 此 对 具有 催化 活性 的 RNA, 即 核 酶 (ribozyme,RNAzyme, catalyt- ic RNA,RNA enzyme) 的 结构 、 催 化 机 制 以 及 应 用 的 研究 日 益 深 入 。 目前 为 止 ,在 自然 界 中 发 现 的 核 酶 根据 其 催化 的 反应 可 以 分 成 两 个 大 类 :@ 剪 切 型 核 酶 ,这 类 核 酶 催化 自身 或 者 异体 RNA 的 切割 ,相当 于 核酸 内 切 酶 ,主要 包括 锤 头 型 核 酶 ,发 夹 型 核 酶 , 本 型 肝炎 病毒 (HDV) 核 酶 ,以 及 有 蛋白质 参与 协助 完成 催化 的 RNaseP; GO 剪接 型 核 酶 ,这 类 核酸 主要 包括 组 工 内 含 子 和 组 开 内 含 子 , 实 现 mRNA 前 体 自 我 拼接 ,具有 核酸 内 切 酶 和 连接 酶 两 种 活性 。 4.2.1 FS 由 于 锤 头 型 核 酶 小 , 且 分 裂 机 制 简单 ,所 以 它 是 最 好 的 结构 研究 的 候选 者 。 Haseloff 和 Gerlachl360 提出 锤 头 型 核 酶 主要 是 由 3 个 结构 域 组 成 [如 图 4.5(a)]: 中 切割 结构 域 , 包含 GUX(X=A,U,C, 关 G) ,以 GUC 作为 切割 点 活性 最 高 ;@ 催 化 结构 域 ,如 图 所 示 , 其 中 13 个 核 苷 酸 是 绝对 保守 的 , 它 是 酶 活性 所 必需 的 序列 。 这 13 个 核 苷 酸 是 5’GAAC(N) nCUX(N) nCUGA(N) nmGA3';G@) 结 合 结构 域 , 即 核 酶 两 侧 与 靶 RNA 碱 基 配 对 区 域 。 研 究 表明 ,配对 区 长 度 为 12 碱 基 的 反应 具有 更 高 BY Kea/Km 值 。 双 螺旋 工 短 于 双 螺旋 II 的 核 酶 比 双 螺 旋 I 长 于 双 螺 旋 II 的 核 酶 切割 速率 大 1~ 2 数量 级 , 当 双 螺旋 II 长 度 为 10bp 时 , 双 螺 旋 工 的 最 佳 长 度 为 Sbpl37] 。 ” 82 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 核 酶 属于 金属 酶 ,金属 离子 为 核 酶 辅 因子 ,需要 二 价 金 属 离子 ,例如 Mg+ 。 核 酶 的 活性 形式 是 一 种 RNA 键 合金 属 氢 氧 化 物 。 所 有 锤 头 核 酶 呈 球 状 构象 ,可 以 粗略 地 看 作 y EL 4.5(b) 1), ee 和 螺旋 IE 几乎 共 轴 , 螺 旋 开 由 两 个 GA 增 长 , 道 向 Hoogsteen 碱 基 配 对 和 一 个 不 寻 HAY AU 碱 基 配对 ,直接 堆积 在 螺旋 II 上 ,形成 一 个 伪 连 续 螺旋 [ 见 图 4.5(b)]。 为 了 便于 应 用 ,一 些 科 学 家 将 锤 头 型 核 酶 [图 4.5(a)] 中 葵 - 突 环 开 删除 [图 4.5(c)] 成 为 Minizymel39] 。 动 力学 和 NMR 分 析 指 出 其 单 体 无 活性 ,而 二 聚 体 表 现 出 相当 高 的 分 裂 活 性 。 此 外 ,两 个 不 同 的 单 体 构 成 异 源 二 聚 体 , 第 二 个 底 物 的 存在 促进 二 聚 体 的 形成 ,并 且 分 裂 活性 提高 ,活性 与 第 二 个 底 物 的 浓度 成 正比 。 这 说 明 Minizyme 其 功能 单位 是 二 聚 体 Maxizyme, 其 有 两 个 底 物 结合 区 ,识别 顺序 是 不 同 EE EEE 的 。 它 可 同时 作用 在 单一 底 物 mRNA 上 的 两 个 不 同 的 靶 位 。 CARO (GUC 三 联 体 -1) 全 UACUCA oh 分 裂 位 点 2 (GUC 三 联 体 -2) (c) Al4.5 锤 头 型 核 酶 的 二 级 结构 和 空间 立体 结构 示意 图 (a) N,N' 代 表 任 意 核 苷 酸 ;X 可 以 是 ALU 或 者 C, 但 不 能 是 G; II\II 是 锤 头 结构 中 的 双 螺 旋 区 ;箭头 指向 切割 位 点 。(b) 锤 头 型 核 酶 的 立体 结构 模型 ,白色 链 是 核 酶 ,灰色 链 是 底 物 RNA 分 子 , 在 磷酸 骨架 上 结合 有 镁 离子 。 (c) 异 源 二 聚 体 Maxizyme 的 二 级 结构 。 (d) Maxizyme 切割 HIV tat mRNA (d) | | 第 4 章 “ 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 83 - Maxizyme 具有 高 活性 ,并 在 体内 外 成 功 地 分 裂 HIV-1l tat mRNA[ 图 4.5(d) ]。Max- izyme 可 以 有 效 地 用 于 失 活 有 害 基因 的 表达 。 Lott 等 [4 提出 了 锤 头 型 核 酶 催化 反应 的 两 种 可 能 的 化 学 机 制 ;* 单 金属 氢 ”氧化 物 离子 模型 ”(one-metal-hydroxide-ion) 机 制 [图 4.6(a) ] 和 ”* 双 金属 氨 氧 化 物 离 量 氧 氧化 物 作 为 广义 碱 从 2'- 羟 基 获 得 一 个 质 子 模型 “[ 图 4.6(b)]。 图 4. 6(a) 中 金 子 , 这 个 被 活化 了 的 2'- 羟 基 作 团 攻击 切割 位 点 的 磷酸 。 图 4.6(b) 中 A 位 点 的 金属 离子 作为 Lewis Rie 的 电子 ,其 极 化 并 减弱 了 O-H 键 ,使 2- 羟基 中 的 质子 更 容易 离 去 。 bes St EN Lewis 酸 接 收 9 羟基 的 电 子 , 极 化 并 减弱 了 OP 键 ,使 IE Ags 2H 3E A. HDV 中 的 核 酶 显示 了 与 以 上 不 同 的 催化 机 制 [图 4. ae P”°) 55 4 — AI, PRR EY N RS] 2’ as | Ate ann pro- ; “tos H hy tate pou Or nie* CY ‘oe A 位 点 2 Sr 从 7 5! = BGR (a) (b) N oe. C-1 NH C5 C4 NH? ALA. A a Oe, oA, O rap Oo O seo | | 一 cH, Gi che Gi HO Gi (c) 4.6 锤 头 型 核 酶 的 两 种 可 能 的 催化 机 制 以 及 HDV 核 酶 的 催化 机 制 (a) 单 金属 氨 氧 化 物 离子 模型 ; (b) 双 金属 离子 模型 ;(c)HDYV 核 酶 中 胞 喀 啶 充当 一 般 碱 进行 催化 的 反应 机 制 羟基 上 的 质子 ,活化 了 羟基 上 的 0, 这 个 O 亲 核 攻击 相 邻 的 核酸 骨架 上 的 P, 经 过 过 渡 态 形成 磷酸 内 酯 键 ,而 原来 核酸 骨架 的 磷酸 酯 键 断 裂 。 目 前 的 研究 还 没有 证 据 显 示 包括 金属 离子 在 内 的 其 他 活性 基 团 如 何 发 挥 作 用 。 ”84 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 4.2.2 发 夹 型 核 酶 4.7 是 一 个 发 夹 型 核 酶 ! 包 的 二 级 结构 模型 。50 碱 基 的 核 酶 和 14 碱 基 的 底 物 形 成 了 发 夹 状 的 二 级 结构 ,包括 4 个 螺旋 和 5 FEM. HES 和 4 在 核 酶 内 部 形成 ,螺旋 1(6 碱 基 对 ) 和 2(4 碱 基 对 ) 由 核 酶 与 底 物 共同 形成 ,实现 了 酶 与 底 物 的 结合 。 核 酶 的 识别 顺序 是 (GXCZU)NGUC, 其 中 N 代表 任何 一 种 核 苷 酸 ,这 个 顺序 位 于 螺旋 1 和 2 之 间 的 底 物 RNA 链 上 ,切割 反应 发 生 在 N 和 G 之 间 。 切割 位 点 A Y UAUAUUA oe U GUG iss é.. re n C U a nnnn nnn «=== ait G CAC RE NNNN NNN---- NNN Ribozyme A A A 螺旋 4 CAAAG ”螺旋 3 螺旋 2 AG 螺旋 1 图 4.7 发 夹 型 核 酶 的 二 级 结构 以 上 两 种 核 酶 以 及 HDV RNA, 链 孢 霉 线粒体 RNA 等 切割 底 物 RNA 后 的 产物 都 是 3' 端 的 2 ,3/- 环 碍 键 及 新 9" 端 羟基 。 4.2.3 和 蛋白 质 -RNA 复合 酶 (RNaseP) 这 类 核 酶 主要 催化 tRNA 前 体 成 熟 过程 ,例如 Altman 和 Pacel4'4] 两 个 研究 组 发 现 的 大 肠 杆菌 tRNA 5 ' 成 熟 酶 。 这 个 酶 由 和 蛋白质 和 MIRNA 两 个 组 分 构成 ,其 中 蛋 日 质 的 分 子 质 量 为 20kDa。 实 验证 明 来 自 不 同 原 核 细 胞 RNaseP 中 的 MRNA 具 有 相似 的 三 维 结构 。 与 前 面 几 种 剪 切 型 核 酶 不 同 的 是 ,RNaseP 催化 得 到 的 产物 的 3' 端 是 羟基 ,5' 端 是 磷酸 。 E. coli RNaseP 以 顺 式 分 裂 前 体 tRNA 底 物 。 通 过 缺失 tRNA 的 3 端 片 段 构 建 了 顺序 特异 的 内 切 核酸 酶 (图 4.8) ,通过 把 指导 顺序 连接 到 MRNA 的 3' 端 ,设计 出 顺序 特异 的 核 酶 (图 4.9)。 两 种 类 型 RNaseP 核 酶 : 带 有 内 部 指导 顺序 的 环 状 置换 的 E. coli RNaseP RNA 称 为 EndoP; 指 导 顺 序 共 价 系 在 RNaseP RNA 的 3 端的 E. coli RNaseP RNA, 称 之 MIGSRNA。 E. coli RNaseP 中 的 MRNA 识别 目标 主要 根据 它 的 结构 ,这 样 可 以 在 不 需要 目标 mRNA 的 特殊 顺序 的 情况 下 ,设计 核 酶 以 破坏 其 他 分 子 。MRNA 是 消除 染色 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 85 - 体 移 位 后 肿瘤 发 生 的 理想 工具 45] 。 (a) EndoP1 RNA ie 分 裂 位 点 ey =: TP292 Pre. 5'—GGGAGACCGGAAUUCGAGCUCGGUACCCAAAAL G a GCCA[6m IGGUE si ernACGCCCGUACUGAACCCG } -3/ C C A ， ol 18|-- 一 内 部 指导 顺序 PT292 反 向 引物 3 -AUIG C C G SRCCE 这 G 31%] —. pti ia’ = GCGGGy 5 AGAA cu U )c 一 GAG c—G U— A c—c cm——G Cc Cc U A G C U (b) EndoP2 RNA 分 裂 位 点 Pre.P1 RNA | 5'—GGGAGACCGGAAUUCGAGCUCGGUACCCAAAAU{G G U c “3 C c C A G G PT292 反 丫 引 物 G G U G + uGeccU 六 3'-ACUUG ; G 内 部 指导 顺序 GCGGGTU 5 5! cuvecuw aaa 局 < U C—— (了 A G Cm—«—< GC C=, 6— Cc C—; C C U A G C «) U C) Endo P3RNA AY BAT pH Pre.P1 RNA | be 5/—GGGAGACCGGAAUUCGAGCUCGGUACCCAAAAU[G G U C c C Cc A , co} lof -_— 31H PT292 反 向 引物 8 Va G ENDO 3 3' -AU “ 内 部 指导 顺序 UG-S' 图 4.8 根据 RNaseP 核 酶 ,设计 特异 顺序 EndoP 核 酶 箭头 指出 在 外 源 底 物 RNA 内 的 分 裂 位 点 ;底下 划 线 顺序 代表 PCR 正 向 和 反 向 引物 的 位 置 ;EndoP3 RNA 是 理论 上 的 核 酶 ,实验 并 未 证 实 ” 86 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 由 cs 3-NNNNNNN PUL ddl 5' - | ue oe NNNNNNNACCAC -3 phage oiT751 8H RAND 4.9 根据 RNaseP 核 酶 ,特异 顺序 MIGS 核 酶 的 设计 箭头 表示 在 外 源 底 物 RNA 内 的 分 裂 位 点 。 底 下 划 线 顺序 代表 PCR 正 向 和 反 向 引物 。 内 部 指导 顺序 用 核 苷 酸 (N) 表 示 ,并 与 分 裂 的 靶 顺 序 互 补 424 组 工 内 合子 和 继 王 内 容 于 2H 1 Al F (group I intron) #124 I AY (group I intron) ,这 类 核 酶 比较 复杂 ， 通常 包括 200 个 以 上 核 苷 酸 ,主要 催化 mRNA 前 体 的 拼接 反应 。Cech 及 其 同事 [46] 发 现 四 膜 虫 的 前 体 RNA 可 以 在 体外 无 蛋白 质 参与 下 切 掉 它 自身 413nt AF. “ 就 是 由 组 工 内 含 子 核 酶 催化 的 反应 [图 4.10(a)] ,包括 两 个 连续 的 转 酯 反应 ,并 且 5 外 显 子 AS 35a 5 外 显 子 内 含 子 soar U G GUGCG A AY 2/OH ee ; G 3 外 显 子 Ls ~ 5 外 显 子 5 外 显 子 站 3 外 显 子 5 外 显 子 3' 外 显 子 有 十 G 加 了 G G / 了 (a) (b) 图 4.10 AINS$(a)AMA DU AS SH (b) HEL noe one | 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 .87 . 需要 Mg+ 或 Mn2+ 及 鸟 昔 (或 乌 苷 酸 ) 的 参与 。 组 工 内 含 子 的 界限 可 以 简单 地 用 $ 外 显 子 (exon)3' 端 的 U 和 内 含 子 3 端的 G 来 界定 。 组 工 内 含 子 能 够 自身 剪接 是 与 它们 保守 的 二 级 和 三 级 结构 有 关 。 像 蛋白 质 酶 一 样 ,内 含 子 形成 高 级 结构 的 折 县 结果 使 关键 残 基 形 成 活性 部 位 ,在 辅助 因子 的 参与 下 实现 自身 剪接 。 除 了 剪接 之 外 ,组 工 内 含 子 还 可 催化 各 种 分 子 间 反应 , 包 括 前 切 RNA 和 DNA、RNA 聚合 、 核 苷 酰 转移 、 模 板 RNA 连接 以 及 所 酰基 酯 解 等 [p]。 与 组 工 内 含 子 一 样 ,在 体外 ,组 开 内 含 子 的 剪接 是 经 过 两 个 转 酯 化 反应 来 实现 的 ,无 蛋白 质 参 与 。 组 工 和 组 开 内 含 子 的 主要 差别 是 第 一 步 反 应 的 化 学 机 制 。 在 组 工 内 含 子 中 ,外 部 的 鸟 苷 的 3' 产 基 作 为 进攻 基 团 ,而 在 组 IAS PEA RE 的 2 羟基 起 作用 [图 4.10(b)]。 这 个 反应 的 结果 形成 一 个 带 突 环 的 内 含 子 3' 外 显 子 分 子 , 其 中 第 一 个 核 苷 酸 经 由 2 ,5'- 磷 酸 二 酯 键 与 内 含 子 的 A 相连 。 在 第 二 步 反应 中 ,5 外 显 子 的 3' 羟 基 进 攻 内 含 子 3' 外 显 子 连 接点 ,结果 是 两 个 外 显 子 相连 ， 并 释放 出 带 有 突 环 的 内 含 子 。 4.2.5 ” 环 状 核 酶 中 利用 RNA 拼接 反应 的 方法 在 体外 和 体内 产生 环 状 RNA 是 一 个 正在 发 展 的 领 域 。 这 些 方法 将 促进 环 状 RNA 的 研究 ,并且 最 终 将 实现 目标 RNA 在 体内 以 环 状 表达 。 环 状 RNA 除了 它们 在 生物 化 学 研究 中 的 价值 外 ,在 基因 表达 调节 和 治疗 领 域 都 有 潜在 的 应 用 价值 。 然 而 天 然 环 状 RNA 是 少见 的 ,它们 在 体内 的 产生 或 消亡 所 知 甚 少 。 体外 制备 环 状 RNA 的 方法 主要 有 两 种 :化 学 法 和 酶 法 。 它 们 都 需要 线性 RNA 的 合成 和 纯化 , 继 之 成 环 并 纯化 。 自 我 拼接 内 含 子 ( 组 工 或 组 贡 ) 已 用 于 外 显 子 的 环 化 。 在 体外 拼接 反应 中 外 显 子 顺序 促进 环 状 产 生 ,并 且 可 以 提供 体内 目标 顺序 环 化 的 一 般 方 法 。 这 种 方法 尤其 适 于 特殊 细胞 类 型 或 组 织 的 剪接 小 体内 含 子 (spliceosomal intron) 。 三 股 环 状 RNA 已 经 由 线性 RNA 制 成 ,调节 拼接 反应 的 核 酶 可 以 用 于 产生 环 状 的 反 式 作用 核 酶 ( trans-acting ribozyme) , 环 状 RNA 可 以 作为 反 义 RNA。 环 状 RNA 具有 各 种 优点 :@ 环 状 较 之 线性 RNA 更 稳定 ,例如 发 夹 结 构 的 环 化 可 以 阻止 分 子 间 二 聚 体 的 形成 , 环 状 RNA 抗 外 切 酶 的 降 酶 ;@ 体 内 半衰期 长 。 部 分 实验 表明 RNA 末端 的 性 质 贡献 给 稳定 性 。 一 些 资料 指出 ,在 细胞 中 和 细胞 提取 BP , 环 状 RNA 较 之 相同 或 相似 顺序 的 线性 形式 更 稳定 。 天 然 发 生 的 环 状 RNA 最 著名 的 例子 有 植物 和 酵母 中 小 的 环 状 RNA 复制 子 。 环 状 结构 最 基本 的 功能 是 提供 滚动 环 复制 的 模板 。 88 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 在 植物 中 ,病毒 卫星 RNA 和 类 病毒 RNA 是 以 环 状 形式 存在 ,RNA 是 复制 环 的 一 部 分 ,其 含有 自我 分 裂 的 顺序 ( 核 酶 ) , 它 可 以 精确 地 分 裂 复制 时 产生 的 RNA 连 环 体 。 在 烟草 环 斑 病 毒 中 发 现 的 发 夹 核 酶 ,可 以 在 体外 有 效 地 催化 正常 分 裂 反应 中 逆向 环 化 ,这 表明 同一 核 酶 可 以 兼 有 连环 体 的 分 裂 和 线性 单 体 的 环 化 。 在 体内 由 转录 表达 的 发 夹 核 酶 成 环 的 方法 也 已 描述 ,由 于 反应 的 可 逆 性 , 环 状 与 线性 处 于 平 衡 之 中 。 锤 头 核 酶 分 裂 反 应 中 逆向 调节 不 如 发 夹 核 酶 ,但 是 通过 细胞 中 的 酶 催化 连接 形成 环 状 仍 是 可 能 的 。 肝炎 8$ 病毒 (HDV) (一 种 人 类 的 病原 ) , 与 某 些 植物 致 病 RNA 有 共性 。HDV 含有 环 状 RNA 基因 组 并 在 基因 组 和 反 基 因 组 中 含 自 身分 裂 的 核 酶 。HDYV 基因 组 大 于 植物 RNA 病原 ,大 约 1700 个 核 苷 酸 ,然而 它 小 于 哺乳 动物 病毒 的 基因 组 。 应 用 HDV 作为 载体 导入 特殊 的 RNA 顺序 ,例如 反 式 作用 核 酶 是 可 行 的 。RNA 基因 组 大 概 通过 滚动 环 机 制 来 复制 。HDV RTE LA FEL AAR HB 反应 (连接 ) 在 体外 没有 证 实 , 某 些 证 据 指出 单 体 的 环 化 可 能 是 由 宿主 催化 完成 的 。 在 Saccharomyces cervisiae 中 检 出 小 的 单 股 RNA, 当 在 醋酸 钾 介 质 中 生长 时 ， 某 些 菌株 积累 了 20S RNA, 一 些 证 据 表明 这 个 单 股 RNA 可 以 环 状 形式 积累 。 与 植 物 和 HDV 不 同 , 酵 母 20S RNA 可 以 为 RNA 聚合 酶 编码 。 在 拼接 反应 中 环 状 外 显 子 的 产生 首先 是 用 组 工 内 含 子 证 实 的 , 它 可 以 提供 在 体内 外 产生 各 种 环 状 RNA 有 效 途 径 。 (1) 组 工 内 含 子 修饰 组 I 内 含 子 在 产生 环 状 外 显 子 似乎 是 很 有 效 的 。 在 3' 外 显 子 下 游 $ "拼接 位 点 的 活化 结果 在 拼接 的 3' 外 显 子 产生 环 状 形式 。 四 膜 虫 组 LA Pb a (PE) 顺 序 有 效 地 拼接 产生 环 状 外 显 子 , 含 有 3' 半 内 含 子 . 外 显 子 和 5' 半 内 含 子 [图 4.11(a)]. (2) 组 开 内 含 子 和 Pre-mRNA 剪接 小 体 如 果 顺 序 被 重 排 的 话 , 组 开 自 身 拼 接 顺 序 也 产生 环 状 外 显 子 [图 4.11(b)j]。 这 个 反应 似乎 绊 于 组 工 的 PIE 顺序 ,但 或 许 它 在 体内 更 有 效 。 Pre-mRNA 拼接 装置 可 以 开拓 成 产生 环 状 RNA 的 装置 。 剪 接 小 体内 含 子 的 拼 接 和 组 OAS FPA. 拼接 方法 产生 环 状 RNA 有 许多 优点 :@ 在 体外 产生 环 状 的 反应 简单 。 这 个 反 应 犹如 转录 。 在 某 些 情况 下 仅 涉 及 增加 Me? 浓度 ,提高 温度 ,或 者 两 者 兼 而 有 之 ; @ 环 状 RNA 容易 纯化 ;@ 具 有 在 体内 制备 环 状 的 潜力 。 它 可 以 表达 且 稳 定 的 具有 治疗 价值 的 RNA 顺序 。 a, 4 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 89 ， G 3'ss 5'ss BZ) EL | aD eal 5 — an ach 5 五 Sr ge aR = 7 前 体 3'ss | 5'ss ena nen 5! a fi - + OH 站 中 间 体 x J | | ene = \ 环 状 体 环 状 体 (a) (b) 图 4.11 A\B 由 PIE 顺 序 形成 环 状 的 机 制 (a) 组 IPIE 顺序 的 拼接 ;(b) 组 TT PIE 顺序 的 拼接 。11 内 含 子 的 5" 部 分 ;12 内 含 子 的 3' 部 分 ;E2 和 El 融合 的 外 显 子 顺序 4.3 脱氧 核 酶 脱氧 核 酶 (deoxyribozyme or DNAzyme or DNA enzyme) 或 称 催化 DNA (catalytic DNA) 是 20 世纪 90 年 代 初 才 被 人 们 所 认识 。 最 初 的 设想 是 来 自 RNA 酶 中 部 分 核 苷 酸 被 相应 的 脱氧 核 苷 酸 所 代替 后 仍 具 有 酶 活性 ,那么 在 理论 上 应 该 能 得 到 具有 酶 活性 的 DNA 分 子 。1994 年 Breaker 等 "1 通过 体外 筛选 方法 首先 得 到 了 依赖 于 Pb’* 具有 切割 RNA 分 子 功能 的 DNA 分 子 ,并 将 其 命名 为 脱氧 核 酶 。 虽然 DNA 分 子 在 自然 界 中 几乎 都 是 以 双 链 形式 存在 ,但 特殊 条 件 下 以 单 链 形 式 存 在 的 DNA 分 子 在 理论 上 应 该 可 能 出 现 与 人 工 合成 的 脱氧 核 酶 相似 的 结构 ,但 迄今 为 止 尚 未 发 现 天 然 存在 的 脱氧 核 酶 ,目前 报道 的 脱氧 核 酶 都 是 通过 体外 选择 / 筛选 得 到 的 。 由 于 脱氧 核 酶 具有 分 子 相 对 较 小 、 结 构 稳 定 、 催 化 效率 高 、 易 于 合成 和 修饰 等 优点 ,在 基因 治疗 疾病 诊断 及 分 子 生 物 学 研究 等 方面 都 有 诱 人 的 应 用 前 景 。 DNA 分 子 由 于 没有 2’ FESE , 分 子 刚性 增加 ,通常 被 视 为 不 活泼 分 子 , 适 于 携 带 \ 传 递 遗 传 信息 ,在 生物 体内 常 以 双 链 形式 存在 。 而 脱氧 核 酶 都 是 单 链 DNA 分 子 , 可 以 通过 自身 卷曲 , 折 笃 形成 特殊 的 三 维 结构 ,在 某 些 特殊 的 辅助 因子 作用 下 ， 与 底 物 结合 并 发 挥 其 催化 功能 。 脱氧 核 酶 通常 分 子 较 小 (目前 报道 最 小 的 脱氧 核 酶 仅 2$nt, 其 活性 中 心 ” 90 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 llnt)551 ,与 蛋白 质 酶 相 比分 子 多 样 性 较 差 ,人 们 也 在 考虑 将 其 他 一 些 活性 基 团 引 入 其 结构 。 比 如 将 氨基 \ 味 唑 基 等 活性 基 团 修饰 的 dATP 或 daUTP 通过 PCR 方法 引入 脱氧 核 酶 分 子 ,增加 脱氧 核 酶 分 子 多 样 性 ,以 期 得 到 高 活性 或 具有 新 功能 的 脱 氧 核 酶 :3 。 下 面 介 绍 几 种 典型 的 脱氧 核 酶 结构 。 4.3.1 10-23 结构 脱氧 核 酶 10-23 结构 脱氧 核 酶 是 Santoto 和 Joyce 等 [5 通过 体外 选择 方法 得 到 的 。 该 酶 相当 于 一 种 序列 特异 性 限制 性 内 切 核 酸 酶 ,活性 中 心 区 为 “10-23 型 主 ”(10-23 mo- tif), FA 15 个 脱氧 核糖 核 苷 酸 组 成 ,第 八 个 碱 基 可 以 是 T\C 或 A, 以 T 活 性 最 高 ,其 余 序 列 高 度 保 守 。 活 性 中 心 两 端 各 为 一 长 7~ Ont 的 臂 ,为 底 物 结合 部 位 ,可 通过 碱 基 互 补 与 底 物 RNA 特异 性 结合 ,其 序列 可 以 根据 靶 RNA 的 改变 而 灵活 变动 。 10-23 结构 脱氧 核 酶 的 技 部 位 为 9…RyY…3'(R=A 或 G,Y=U 或 C) 之 间 的 磷酸 二 酯 键 , 其 中 R 不 形成 碱 基 配对 ,Y 则 必须 与 脱氧 核 酶 形成 碱 基 配对 。5'…'Ay U …3' 和 5…'G y U…3' 相 对 易 被 切 开 [22,3]( 图 4.12)。 TX coc A A T A C Cc 10-23 DNAzyme Go ac R=A or G aie ree b 3'- Y, 4 R=A 3k G 底 物 RNA 分 裂 部 位 roxy 图 4.12 10-23 型 主 脱氧 核 酶 的 结构 4.3.2 8-17 结构 脱氧 核 酶 这 种 结构 类 似 锤 头 核 酶 且 具 有 RNA 切割 活性 的 脱氧 核 酶 , 它 也 是 Santoto 等 通过 体外 选择 方法 得 到 的 ,其 活性 中 心 为 8-17 型 主 (8-17 motif) ,包含 一 个 常 为 3 个 碱 基 对 的 葵 - 环 结构 和 一 个 4~ Sut 的 非 配对 区 。 葵 至 少 应 为 2 个 G-C 对 。 蔡 环 5'-AGC-3“ 高 度 保守 , 非 配对 区 一 般 为 5 -WCGR-3' 或 $ -WCGAA-3(W=A 或 TR =A 或 G)。 切 割 位 点 是 $-Ay G-3',A 不 与 脱氧 核 苷 酸 配对 ,G 则 必须 与 脱氧 核 苷 酸 配对 。Li 等 [5 通过 体外 选择 得 到 与 8-17 结构 类 似 但 依赖 Zn? + 结构 的 脱氧 核 酶 ,该 酶 可 切割 RNA 分 子 或 RNAZDNA 杂 合 分 子 ,切割 位 点 为 ING(IN 为 核糖 核 苷 酸 ,G 为 核糖 鸟 苷 酸 或 脱氧 核糖 鸟 苷 酸 )[54。8-17 型 主 脱氧 核 酶 结构 见 图 4.13。 nhs 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进 化 + Ol - 分 裂 位 点 底 物 RNA eae} EEE 3/- dk 8-17 DNAzyme A ee C G 图 4.13 8-17 型 主 脱 氧 核 酶 的 结构 4.3.3 手枪 型 结构 脱氧 核 酶 Carmi 等 55 报道 了 两 种 二 级 结构 呈 手 枪 状 具有 自 切割 功能 的 DNA 分 子 。1 型 (class TD) 为 69nt 单 链 DNA 分 子 ,分 子 内 形成 3 个 碱 基 配 对 区 ,其 自身 切割 活性 依 iF Cu + AGIA MAREE, TAY (class I) A 46nt, 分 子 内 有 两 个 碱 基 配对 区 ,只 依赖 于 Cu+ 。 自 身 切 割 位 点 在 第 14nt 处 (图 4.14) ,其 3' 端 约 27 个 碱 基 对 自身 切割 活 性 的 发 挥 至 关 重 要 。 若 将 Cas Ga 中 的 Css 换 为 G, 或 将 Ga 换 为 C, 均 使 活性 显著 降 低 ; 但 若 将 此 配对 位 置 对 调 为 G5 Cs , 则 仍 能 保持 一 部 分 活性 ;第 1 ~ 7nt 发 生 突 变 或 被 删除 ,其 活性 显著 下 降 。 分 列 位 点 分裂 人 ' Ta AA G 5 \GAATTCTAATACGACTCA’ “TAGG™ * SSE Ta rie A sak ranch ‘Acco® 42 Gh d 21 = TTALET Con ric! cogs he ™ 类 型 | 脱氧 核 酶 类 型 工 脱氧 核 酶 图 4.14 分 裂 DNA 的 手枪 型 脱氧 核 酶 (类 型 [类 型 OD) 4.3.4 “二 分 ?型 结构 脱氧 核 酶 “二 分 ?型 结构 脱氧 核 酶 (bipartite DNAzyme) 是 一 类 比较 特殊 的 脱氧 核 酶 ,其 活 性 中 心 20nt, 底 物 结合 区 5 ~ 8nt, 具 有 RNA 切割 活性 。 识 别 底 物 RNA TW AYA ANNN(N 为 任何 一 种 核 苷 酸 ,不 同 组 合 切 割 活 性 有 一 定 差异 )[?7] ,其 通用 结构 见 图 4.15。 92+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 分 裂 位 点 pm } 3s CO" EEEEEEET23， 3 te Gir G CT TG 图 4.15 分 裂 RNA 的 “二 分 ?型 结构 脱氧 核 酶 4.3.5 环 状 结构 脱氧 核 酶 目前 ,脱氧 核 酶 在 应 用 上 仍 存在 诸如 在 生物 体内 稳定 性 及 如 何 有 效 地 导 人 生 物体 到 达 靶 部 位 等 问题 。 我 们 将 10-23 结构 脱氧 核 酶 分 子 引 入 一 环 状 结构 ,一方 面 通过 环 状 结构 及 较 大 分 子 结构 来 提高 其 稳定 性 ,一 方面 可 使 脱氧 核 酶 能 在 生物 体内 遗传 。 我 们 以 及 内 酰胺 酶 mRNA 为 靶 位 点 ,设计 并 合成 10-23 结构 脱氧 核 酶 ,将 其 克 隆 到 鸣 菌 体 M13mp18 质粒 中 ,通过 鸣 菌 体 表 达 系 统 产生 含有 脱氧 核 酶 片段 的 单 链 环 状 DNA 分 子 (DzM13)( 图 4.16)。 体 外 实验 表明 ,DzMI13 在 某 些 二 价 金属 离子 畏 助 下 具有 特异 性 切割 RNA-DNA 和 骨 合 底 物 的 功能 ,催化 特性 与 报道 10-23 结构 脱氧 核 酶 相近 ,提示 二 者 可 能 遵循 类 似 的 催化 机 制 。 环 状 脱氧 核 酶 (DzM13) C 10-23 DNAzyme A qed — ATE TTT TTT GA CPt Peer reer: 3/s A A Dit isda AGUUCCGCUCAA B peers 分 裂 部 位 mRNA 底 物 图 4.16 单 股 环 状 脱氧 核 酶 (DzM13) 的 结构 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 93 - 实验 结果 表明 :DzM13 对 S1 核酸 酶 的 稳定 性 远 远 高 于 线 状 或 硫 代 修 饰 的 脱 氧 核 酶 。 该 环 状 结构 不 仅 使 脱氧 核 酶 稳定 性 明显 提高 ,更 值得 注意 的 是 所 构建 的 DzM13 能 在 宿主 体内 复制 并 能 连续 传代 。 这 种 构建 脱氧 核 酶 的 策略 对 脱氧 核 酶 在 实际 中 的 应 用 及 低 成 本 生产 都 具有 一 定 意义 。 4.4 核 酶 和 脱氧 核 酶 的 体外 进化 4.4.1 拓展 核酸 顺序 空间 的 新 方法 过 去 20 年 ,体外 进化 已 经 产生 了 能 够 催化 各 种 化 学 反应 的 DNA 和 RNA 分 子 (图 4.17)。 体 外 进化 DNA 和 RNA 新 方法 的 开发 拓展 了 核酸 的 顺序 空间 ,并 扩大 了 具有 化 学 功能 的 核酸 库 ,将 进一步 增加 产生 功能 分 子 的 途径 。 体外 进化 可 以 产生 最 低 生 命 形 式 所 需要 的 核酸 催化 剂 。 从 以 前 进化 的 RNA TS 11111it1ILIIIIUIIITLTTLTIT TITTV TI mmm 随机 顺序 合成 的 单 股 DNA 库 |e 转录 为 RNA | seat 单 股 DNA 或 RNA 库 a Ne Cr 活化 核 酶 受 体 或 催化 剂 打 增 双 股 DNA 核 酶 :逆转 录 , 然 后 PCR( 和 多 样 性 ) 脱氧 核 酶 :PCR( 和 多 样 性 ) 图 4.17 核酸 的 定向 进化 随机 合成 的 DNA 库 或 者 根据 结合 或 催化 活性 直接 选择 ,或 者 在 选择 前 转录 成 RNA 94+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 连接 酶 的 核 酶 出 发 ,Bittker 等 '9 进 化 一 种 依赖 RNA 的 RNA 聚合 酶 ,这 是 “RNA tit 界 " 的 一 种 关键 酶 。 当 用 RNA 引物 -模板 复合 物 和 等 摩尔 浓度 的 NTP 时 ,进化 的 核 酶 被 证 实 有 97 多 顺序 忠实 性 [@] ,24h 能 够 延伸 11 个 碱 基 。 体外 进化 RNA 和 DNA 分 子 促进 了 与 前 生命 世界 相关 的 其 他 反应 的 发 现 , 包 括 喀 喧 磷酸 核糖 化 L[@] , 寡 核 苷 酸 腺 苷 化 [4]。 虽 然 这 些 研究 证 实 核酸 是 能 够 催化 原始 生命 主要 的 反应 ,但 不 知道 体外 进化 组 装 的 生命 是 否 在 几 亿 年 前 就 存在 ,或 第 一 个 催化 剂 重新 组 装 成 现代 核酸 结构 [6G] 。 从 核 酶 和 脱氧 核 酶 体外 进化 可 以 看 出 天 然 发 生 的 RNA 催化 剂 如 何 进 化 。 Salehi-Ashtiani 和 Szostak 等 [6%] 由 随机 RNA 库 分 离 出 一 些 分裂 RNA 的 核 酶 , 发 现 ， 与 天 然 发 生 的 锤 头 核 酶 型 主 售 人 的 相似 ,这 个 发 现 指出 趋同 进化 途径 可 以 产生 在 自然 界 所 观察 到 的 有 限量 的 自我 分 裂 的 核 酶 。 体 外 进化 核 酶 也 用 于 证 实 新 RNA SEAT A ea NATE, 不 需要 无 活性 的 中 间 体 '9)。 这 些 结果 指出 既 不 是 功能 也 不 是 结构 相似 的 核酸 也 可 能 是 由 共同 的 祖先 进化 来 的 。 进化 核酸 受 体 和 催化 剂 的 新 方法 的 开发 将 提高 它们 的 应 用 潜力 和 扩展 应 用 范 围 。 例 如 代谢 组 (metabolome) 或 蛋白 质 组 (proteome) 检 验 可 能 需要 大 量 的 反复 选择 和 扩 增 循环 以 产生 组 成 适 体 (aptamer) ,这 个 过 程 的 自动 化 可 以 加 速 体外 进化 , 原 型 核酸 进化 自动 机 , 可 以 在 两 天 内 完成 8 种 12 轮 选择 。 能 够 结合 鸡 卵 清 浴 菌 酶 的 RNA 适 体 进 化 ,从 初始 随机 库 出 发 大 约 富 集 10” 倍 。 现 有 的 核酸 体外 进化 的 方法 ,包括 SELEX( 选 择 和 扩 增 重复 循环 而 没有 在 各 轮 之 间 产 生 附 加 的 突变 )[@] , 盒 式 突变 SELEX , 易 错 PCR SELEX ,每 轮 PCR 引 入 的 点 突变 频率 1% ~ 10%。SELEX 不 是 探索 核酸 的 顺序 空间 ,而 是 从 起 始 顺 序 库 富 集 活 性 分 子 。 相 反 , 易 错 PCR 是 探索 顺序 空间 。 点 突变 可 以 提高 所 要 求 的 结合 或 催化 性 质 ， 提 高 点 突变 速率 可 以 在 顺序 空间 中 接近 高 活性 的 突变 体 (图 4.18)。 除了 开发 核酸 顺序 空间 新 方法 外 ,核酸 进化 的 范围 也 随 着 附加 功能 团 的 DNA BY RNA 的 进化 而 扩展 。 这 个 途径 取决 于 DNA 和 RNA 聚合 酶 是 否 能 够 接受 修饰 核 苷 酸 ,这 方面 的 工作 已 有 报道 [G] 。 结合 凝血 酶 的 适 体 是 由 含 $- 戊 基 脱 氧 尿 喀 啶 核 苷 DNA 随机 库 进 化 的 ,这 表明 Ee we 修饰 核 苷 酸 可 以 用 于 体外 进化 。Eaton '°) RAF C5 修饰 的 RNA 库 选 择 获 得 第 一 个 催化 C-C 形成 的 催化 剂 (Diels-Alder 催化 剂 )。 这 个 进化 的 RNA 的 催化 活性 取决 于 Cu* 和 修饰 碱 基 的 存在 ,暗示 Cu?* 与 吡啶 基部 位 配 位 可 能 在 RNA 结构 或 者 在 指导 Diels-Alder 反应 起 关键 作用 。 应 用 两 个 修饰 的 核 苷 酸 同时 进化 的 例子 已 报道 。Perrin 等 "" 成 功 地 进化 了 RNase 模拟 物 , 其 包含 咪唑 修饰 的 脱氧 腺 苷 和 氨 基 修 饰 的 脱氧 尿 苷 ,这样 将 分 裂 RNA 的 蛋白 质 酶 活性 部 位 的 两 个 功能 团 引 入 核 酸 ; 另 一 个 依赖 DNA 的 RNase 模拟 物 ( 含 有 咪唑 功 能 团 的 脱氧 尿 苷 ) ,在 Zn 存在 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进 化 ，95 - 母体 顺序 固定 顺序 固定 顺序 SELEX ER 富 集 活 性 母体 顺序 易 错 PCR 同 源 重组 任意 部 位 的 交换 体 非 同 源 随机 重组 顺序 重复 顺序 改组 顺序 消除 图 4.18 核酸 进化 的 多 样 性 方法 以 母体 顺序 起 始 , 用 SELEX 富 集 活 性 母体 顺序 ;用 易 错 PCR 使 母体 顺序 产生 点 突变 ; 同 源 重组 ,例如 DNA 改组 , 允许 交换 体 只 在 同 源 区 域 之 间 产 生 ; 非 同 源 随机 重组 ， 包括 任何 顺序 之 间 的 随机 交换 ,顺序 重复 ,改组 和 消失 以 及 任意 重组 下 进化 的 模拟 物 分裂 RNA。 至 今 , 研 究 人 员 应 用 聚合 酶 已 把 20 种 以 上 功能 修饰 TK IRE A. DNA 或 RNA( 图 4.19)。DNA 聚合 酶 能 够 耐 受 C5 广泛 修饰 的 尿 苷 三 磷酸 。C5 修饰 的 脱氧 尿 苷 链 节 可 以 调节 聚合 酶 效率 。Williams 等 [7 研究 表明 Taq DNA 聚合 酶 很 好 地 耐 受 7- 脱 氮 杂 脱氧 腺 苷 类 似 物 ,可 以 未 修饰 的 dATP 相似 的 效 率 移 人 DNA, 这 个 结果 指出 7 位 对 结构 修饰 有 高 度 耐 受 性 。Famulok 等 [2 同时 完 成 了 4 个 修饰 的 dNTP 移入 79- 聚 体 DNA 中 ,结果 形成 的 修饰 DNA 股 成 功 地 转录 和 顺序 化 。 核 苷 酸 修饰 已 集中 在 尿 苷 的 C5[73] 。 应 用 T7RNA 聚 合 酶 可 以 成 功 地 将 这 些 修饰 核 苷 酸 移 人 RNA 中 ,但 比 天 然 NTP 效 率 低 。 研 究 人 员 证 实 修饰 核酸 所 催化 的 反应 不 能 用 未 修饰 核酸 代替 ,这 样 扩 大 了 功能 化 核 苷 酸 在 核酸 进化 中 的 应 用 。 目前 ,核酸 功能 化 已 集注 在 将 类 蛋白 质 功 能 团 移入 朝 核 苷 酸 中 。 例 如 , 应 用 聚合 酶 将 咪 哗 、 酚 和 一 级 胺 作为 组 氨 酸 ， 酷 氨 酸 和 赖 氨 酸 的 代理 移入 DNA 或 96+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 NH “S7NH2 A NH: AAA 站 O O Ayan = ZA wra0r 图 4.19 修饰 核 苷 酸 作为 DNA 或 RNA 聚合 酶 的 底 物 RNA. 核酸 同 蛋白 质 比 较 , 多 样 性 和 构象 是 有 限 的 。 然 而 , 试图 将 类 蛋白 基 团 加 到 核酸 碱 基 上 也 是 可 能 的 , 尤其 试图 用 修饰 核酸 模拟 天 然 蛋白 质 。 至 少 可 以 在 聚 合 酶 耐 受 的 位 置 将 非 天 然 功能 团 引入 核酸 库 。 相 反 , 如 果 把 非 天 然 功 能 团 移入 蛋 | 白质 中 将 会 破坏 蛋白 质 生物 合成 机 制 !4-?8]。 这 说 明 功 能 团 移 人 核酸 中 则 是 可 行 AY, 因此 有 很 大 的 前 景 。 在 某 种 情况 下 虽然 核酸 不 能 与 蛋白 质 催化 潜力 相 匹敌 ， 把 adhoc 功能 移 人 DNA 或 RNA 库 可 以 使 核酸 能 够 解决 蛋白 质 难以 解决 的 问题 。 例如 , 用 结合 金属 的 配 基 ( 例 如 胜 类 ) 可 以 形成 新 的 过 渡 金 属 配 位 复合 物 , 其 可 以 对 成 键 或 断 键 的 催化 进行 定向 选择 , HRS PCR 扩 增 和 多 样 化 。 此 外 , 核酸 的 构象 刚性 和 缺乏 玻 水 部 位 限制 其 结合 小 分 子 。 通 过 柔性 链 节 把 朴 水 基 团 移 人 核酸 碱 基 上 ,可 以 增加 它们 结合 小 分 子 的 能 力 ,， 并 具有 高 亲和力 和 特异 性 。 指 导体 外 进化 的 动力 是 选择 ， 而 不 是 筛选 。 105 人 金属 和 小 分 子 结合 的 核酸 库 ， 能够 立体 选择 性 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 97 - 的 催化 自然 界 没 发 现 的 化 学 反应 , 这 是 该 领域 诱 人 的 可 能 性 之 一 。 4.4.2 体外 选择 别 构 核 酶 一 般 工 程 别 构 核 酶 或 脱氧 核 酶 有 三 种 策略 :模块 合理 设计 ;体外 选择 和 组 合 设 计 ( 模 块 合理 设计 和 体外 选择 的 组 合 )[??,80] 。 典型 的 别 构 酶 包括 三 个 功能 特征 :一 个 催化 中 心 ,一 个 效应 因子 结合 中 心 和 一 个 结构 上 敏感 的 结构 。 当 效应 因子 结合 时 允许 催化 中 心 功能 的 改变 ,或 者 活化 或 者 抑制 核 酶 的 活性 。 模块 合理 设计 的 途径 已 用 于 构建 由 ATP 控制 的 几 个 自身 分 裂 的 核 酶 。 依 赖 ATP 的 别 构 核 酶 是 由 锤 头 核 酶 结构 域 与 结合 ATP 的 RNA 结构 域 构成 (图 4.20), 许多 其 他 的 别 构 核 酶 也 已 合成 。 某 些 结合 配 体 的 结构 域 结构 诱导 契合 (往往 称 适 应 结合 ) 产 生 催化 结构 域 相 应 的 结构 改变 。 通 过 合理 设计 所 产生 的 大 多 数 别 构 锤 头 核 酶 仅仅 是 动态 范围 的 一 小 部 分 。 应 用 模块 合理 设计 策略 工程 别 构 核 酶 很 可 能 不 是 产生 分 子 转换 的 最 佳 路 线 。 体外 选择 策略 成 功 地 分 离 出 许多 新 的 核 酶 和 脱氧 核 酶 。 其 中 一 个 重要 的 新 的 别 构 核 酶 是 由 RNA 随机 顺序 群体 分 离 出 来 的 。 当 效应 因子 加 入 时 ,其 催化 活性 调 节 大 约 10 000 倍 。RNA 连接 酶 核 酶 “L1" 是 在 起 始 随 机 顺序 库 选 择 产生 的 [图 4.21 (a)]。 由 于 核 酶 的 别 构 活 化 产生 连接 RNA 的 产物 ,RT-PCR 可 以 用 于 扩 增 核 酶 , 因 此 反应 中 的 寡 核 苷 酸 可 以 定量 [图 4.21(b)]。 这 样 可 以 把 依赖 RNA 的 核 酶 或 脱氧 核 酶 组 装 成 基因 芯片 ,直接 读 出 生物 样品 中 的 RNA。 别 构 核 酶 产生 的 主要 策略 是 体外 选择 和 模块 合理 设计 的 组 合 应 用 。 它 把 催化 和 受 体 两 个 模块 由 短 的 随机 顺序 桥 连 起 来 ,然后 体外 选择 ,由 可 能 的 桥 顺 序 鉴 定 出 少数 别 构 核 酶 。 这 种 策略 已 产生 一 系列 核 酶 ,例如 结合 黄 素 腺 味 叭 单 核 苷 酸 (EMN) 和 其 他 的 效应 因子 的 核 酶 。 在 某 些 情况 下 ,这些 桥 结构 域 或 通讯 模块 在 结 合 受 体 结构 域 之 后 可 以 保持 它 的 别 构 功 能 。 因 此 ,这 些小 的 桥 结 构 域 往往 起 独立 模块 的 作用 , 它 可 以 产生 新 的 别 构 核 酶 。 当 模块 构建 没有 现 有 的 受 体 或 适 体 (ap- tamer) 结 构 域 时 , 别 构 选择 (图 4.22) 也 用 于 分 离 效应 因子 调节 的 核 酶 。 环 状 单 核 苷 酸 , 抗 生 素 和 蛋白 质 效应 因子 结合 位 点 是 由 相对 大 的 随机 顺序 结构 域 附加 到 核 酶 上 ,由 于 大 量 的 可 能 顺序 组 合 附加 到 母体 核 酶 结构 域 上 ,这样 将 有 许多 不 同类 型 的 别 构 结合 位 点 出 现在 起 始 群体 中 。 目 前 别 构 选择 是 产生 和 分 离 一 些 核 酶 最 好 的 策略 。 ° 98 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) Uae ALU 3'U+GPS' C-G Iv G-C G-C G-C G-C Mors U- = eg Ab eu: GGUUGCCC Cot. bea DeGA Wt CCAGCGGG Ppp c ; I 5 适 体 结构 域 核 酶 结构 域 (b) 图 4.20 模块 合理 设计 产生 依赖 ATP 的 别 构 核 酶 (a) 构成 物 TV 上 方 的 顺序 和 二 级 结构 是 由 锤 头 核 酶 结构 域 和 结合 ATP 的 RNA 适 体 结构 域 组 成 。 两 个 结构 域 共享 苓 工 结构 单元 。(b) 依 赖 ATP 的 别 构 核 酶 的 三 维 结构 图 解 。 侧 面 观 :椭圆 形 阴影 表示 Watson-Crick 碱 基 配对 单元 ,箭头 代表 单 股 区 的 极 性 (5' 到 3') 。 空 箭头 指示 锤 头 核 酶 分 裂 的 位 点 。 上 部 观 :箭头 表示 蔡 IV AE 工 中 的 2~ 7 碱 基 对 构成 物 的 方位 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 99 - (a) ; 体外 选择 图 解 连接 一 | 效应 因子 at me 5' 3 1 一 1 Bits 起 始 群体 Pras 四 O oi Pree itil i it iit & 一 13 双 股 DNA 模 板 5 一 效应 因子 3 wy ns 连接 产物 了 Xe 效应 因子 De Ppp a Ppp a4 和 ) had ta fe Lae ya 失 活 构象 OH 活性 构象 消除 连接 反应 ， 通过 RT-PCR 可 以 RNA 模 板 未 形成 定量 连接 的 RNA 模 板 图 4.21 依赖 寡 核 苷 酸 RNA 的 连接 酶 核 酶 的 分 离 和 应 用 《al) 体 外 选择 以 RNA 构成 物 起 始 ,包括 90 核 苷 酸 随 机 顺序 结构 域 (Nw) 两 侧 有 5' 和 3' 引 物 结 合 位 点 。RNA 转录 群体 (每 个 都 带 有 5'- 端 三 磷酸 部 位 )。@ 同 DNA 效应 因子 组 合并 且 在 反 应 条 件 下 同 RNA Jie Oe KH RI JC lA] RNA 的 $' 端 连接 ;@ 分 离 无 活性 的 RNA 并 用 RT-PCR 扩 增 ,形成 双 股 DNA 模板 ;G@) 体 外 转录 产生 下 一 个 RNA 群体 。LIRNA 连接 酶 核 酶 在 五 轮 选择 扩 增 后 由 群体 分 离 。(b) LI 核 酶 的 别 构 功 能 。 左 :在 缺乏 效应 因子 寡 核 苷 酸 的 情况 下 ,LIl 核 酶 取 无 活性 结构 ,排除 RNA 连接 。 如 果 RT-PCR 引物 只 扩 增 连接 的 RNA 产 物 ,那么 可 能 没有 扩 增 信号 出 现 。 右 : 在 效应 因子 窒 核 苷 酸 的 存在 下 ，Ll 核 酶 的 活性 大 约 提高 10 000 倍 。 连 接 RNA 产物 水 平 可 以 应 用 RT-PCR 进行 扩 增 和 定量 [8 = 100 . 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 (a) 别 构 选择 图 解 AA GA U8 随机 顺序 结构 域 G-c ll he: > A» 5 GGUUGCCGS' Py Gp CCAGCGGG ppp G 5! ge [> —— S 核 酶 结构 域 @ os Pic es 分 离 分 裂 RNA — Clv = 分 离 未 -_ Clv BERNA Sy bak de (b) F Ae: cGMP-1 fi - cCMP-1 其 G cAMP-1 GAC ok C 人 2 G-C G- 本 公 U-A GU : G-C es G-C = U-A - Se J: Me J: 二 人 - » 3/ rein Uc - A 3! ene U = » 3 A cGMp © pipet fn cCMP AO 人 cAMP M ittett ' G ! A i ae G-cC G G G U €=G Gace UAG 图 4.22 RNA 转换 的 别 构 选 择 (a) 锤 头 核 酶 别 构 选择 图 解 。 选 择 构成 物 是 由 锤 头 核 酶 结构 域 和 随机 顺序 结构 域 (Nx) 组 成 。 中 在 效应 因子 缺乏 的 情况 下 进行 负 选 择 ,形成 的 产物 用 PAGE 分 离 ， 剩 下 的 未 分 型 的 核 酶 前 体 (Pre) 由 凝 胶 回 收 ; @ 在 效应 因子 存在 下 进行 正 选择 , 产物 用 PAGE 分 离 ,， 在 这 个 阶段 , 被 分 裂 的 RNA(Clyv) FABER. OFA RT-PCR 扩 增 ， 随 后 的 RNA 群体 用 体外 转录 制备 ， 并 用 PAGE 纯化 。(b) 由 别 构 选择 分 离 出 三 个 别 构 锤 头 核 酶 。 当 足够 量 的 3 ,5'- 环 状 单 核 苷 酸 存 在 下 温 育 时 ,每 个 构成 物 经 效应 因子 诱导 锤 头 分 裂 ( 箭 头 ) 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 101 - 4.4.3 核 酶 的 连续 体外 进化 在 分 子 水 平 上 研究 达尔 文 的 进化 论 为 实验 室 迅速 进化 各 种 生物 大 分 子 葛 定 了 思想 、 概 念 和 理论 基础 ,促进 了 进化 生物 技术 的 发 展 。 由 核酸 和 和 蛋白质 库 已 经 获得 结合 特殊 配 体 或 催化 特殊 化 学 转化 的 分 子 ,但 操作 通常 是 分 步 方式 进行 ,每 轮 进化 都 需要 纯化 选择 的 分 子 。 如 果 体 外 进化 能 够 以 连续 方式 进行 ,没有 任何 分 离 或 纯 化 步骤 则 为 定向 进化 提供 一 个 理想 的 模式 [82] 。 第 一 个 连续 体外 进化 实验 是 应 用 QB 叹 菌 体 基因 组 RNA, 其 作为 QB 复制 酶 的 底 物 而 涉及 一 系列 转移 ,其 中 RNA 在 NTP 存在 下 用 复制 酶 扩 增 , 复 制 混 合 物 小 部 分 转移 到 新 反应 器 允许 进一步 扩 增 ,在 几 次 转移 之 后 ,进化 的 RNA 分 子 与 起 始 RNA 比较 ,更 易 被 复制 酶 扩 增 。 等 温 (isothermal)RNA 扩 增 技术 ( 反 向 和 正 向 转录 偶 联 ) 已 用 于 鸣 菌 体 启 动 子 单元 连续 体外 进化 。 催化 RNA 连接 反应 的 RNA 分 子 连 续 体 外 进化 系统 已 经 建立 。 类 1 连接 酶 核 酶 已 作为 发 展 该 系统 的 起 点 ,该 酶 催化 3 ,5' 磷 酸 二 酯 键 的 形成 。 类 1 连接 酶 最 初 由 105 以 上 随机 顺序 库 中 分 离 出 ,并且 具 有 惟一 形成 3 ，5' 磷 酸 二 酯 键 的 型 主 。 类 1 连接 酶 所 催化 的 反应 与 聚合 酶 (蛋白 质 ) 类 似 。 类 1 连接 酶 催化 多 重 模板 指导 的 单 核 苷 酸 的 加 成 。 为 了 应 用 类 1 连接 酶 连续 体外 进化 而 采用 一 种 舱 合 DNA-RNA 底 物 , 它 含 T7RNA 聚合 酶 (T7RNAP) 启 动 子 单元 的 一 股 顺 序 ( 图 4.23)。 除 了 核 酶 和 底 物 外 ， 连续 体外 进化 反应 混合 物 中 含有 逆转 录 酶 ,用 于 启动 CDNA 合成 的 引物 、4 种 dNTP、IT7RNAP 和 4 种 NITP。 混 合 物 中 所 有 核 酶 分 子 都 被 逆转 录 。 此 外 ,逆转 录 酶 的 存在 要 求 核 酶 先进 行 连接 反应 后 被 道 转录。 在 正 向 转录 之 后 ,形成 的 子 代 RNA 立即 适时 的 起 动 另 一 轮 催化 RNA 的 连接 和 选择 扩 增 。 这 些 事件 允许 在 单一 反应 器 中 重复 发 生 。 然 后 反应 混合 物 的 一 小 部 分 转移 到 新 的 反应 器 中 进行 连续 进化 。 由 上 可 见 ,连续 体外 进化 系统 ,通过 单一 核 酶 可 以 进行 多 重 连续 反应 ,为 研究 进化 的 分 子 群 体 行为 提供 了 更 复杂 的 模型 。 类 !1 连接 酶 能 够 催化 模板 指导 的 单 核 苷 酸 加 成 作为 构建 该 系统 的 基础 。 达尔 文 进 化 的 复杂 度 使 它 难于 研究 进化 群体 的 生化 性 质 的 改变 ,这 指出 需要 简化 模型 系统 ,为 此 发 展 了 生物 大 分 子 进化 的 实验 室 系统 。 这 些 系统 或 者 涉及 功 能 分 子 分 步 进 化 ,或 者 是 功能 表达 和 选择 扩 增 一 起 发 生 在 共同 反应 器 中 的 连续 进 化 。 连 续 进 化 已 用 于 进化 连接 酶 核 酶 ,其 催化 3 个 连续 的 核 苷 酸 加 成 反应 。 为 了 选择 扩 增 ,要 求 RNA 分 子 进 行 两 个 单 核 苷 酸 加 成 反应 AR RNA 连接 。 这 个 进化 的 核 酶 像 RNA 聚合 酶 。 它 支持 RNA 复制 酶 在 RNA 世界 能 够 进行 信息 转移 的 思 想 。 不 像 以 前 描述 的 类 聚合 酶 核 酶 ,其 是 $ ->3' 方 向 操作 。 进 化 的 核 酶 加 成 单 核 - 102 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 prom(— ) Ten = 逆转 孙 酶 “， promC) . prom(+) *~ dNTPs 图 4.23 连续 体外 进化 连接 酶 的 核 酶 库 定向 结合 嵌 合 DNA-RNA 底 物 (DNA, 虚线 ;RNA, 实 线 ) ,其 含有 大 部 分 或 全 部 T7RNAP 启动 子 单元 [prom( - )]。 核 酶 需要 通过 加 入 核 苷 酸 完成 TIRNAP 启动 子 ,然后 全 长 启动 子 与 它们 特有 的 5' 端 连接 。 通 过 逆转 录 酶 将 所 有 RNA 分 子 转 为 EDNA, 给 出 完全 双 股 的 启动 子 单元 , 继 之 通过 T7RNAP 转录 产生 子 代 RNA 苷 酸 或 者 5'>3'M 3 一 方向。 那么 是 否 在 RNA 世界 中 RNA 催化 RNA 复制 是 S' 一 3 还 是 3' 一 S' 或 两 者 兼 之 ,这 是 一 个 有 待 进一步 研究 的 问题 。 4.4.4 核 蛋 白 酶 的 体外 选择 效应 因子 调节 的 核 酶 的 活化 参数 与 别 构 蛋 白质 相 类 似 。 例 如 Breaker $'°) 18 一 种 别 构 锤 头 核 酶 ,在 ATP 存在 下 被 抑制 180 倍 。Robertson 等 5 工程 一 个 效应 因子 活化 的 核 酶 (连接 酶 ) ,在 茶 碱 存在 下 被 活化 1600 倍 。 由 随机 库 选 择 出 的 别 构 域 被 附 加 到 锤 头 核 酶 上 ,这 些 结构 域 通过 环 状 核 背 单 磷酸 使 核 酶 活化 5000 倍 。 这 些 结果 指 出 用 蛋白 质 效应 因子 活化 核 酶 也 是 可 能 的 。 天 然 核 酶 的 活性 依赖 蛋白 质 。 例 如 真 细 菌 催化 tRNA 分 裂 的 RNaseP 核 酶 是 具有 和 蛋白质 (P 和 蛋白) 的 复合 物 ,实际 上 提高 其 活 性 。 同 样 ,组 工 内 含 子 ND1 完全 依赖 于 Cyt18( Neurospora crassa BAAN) ER ABE tR- NA 合成 酶 ) ,而 内 含 子 bl15 的 三 级 结构 是 由 其 同 源 蛋 白质 (CBP2) 稳 定 。 蛋 白质 往 往 作为 分 子 伴 侣 协助 RNA 23+ WT Eo Robertson 等 [8] 开 发 出 体外 选择 核 蛋白 酶 的 方法 ,并 鉴定 出 新 的 一 类 核 酶 ,其 专 一 地 通过 和 蛋白质 因子 (例如 Cy518 和 溶菌 酶 ) 活 化 几 千 倍 ,并 且 能 够 特异 地 识别 天 然 蛋 白质 结构 。 该 选择 方法 具有 普遍 性 ,可 以 高 通 量 鉴定 并 识别 蛋白 质 组 中 的 大 部 分 蛋白 质 。 为 了 鉴定 依赖 肽 和 蛋白 质 的 核 酶 ,Roberson 等 试图 用 小 分 子 效 应 因子 的 策略 来 体外 选择 依赖 蛋白 质 的 核 酶 。 然 而 , 当 结 合 肽 和 蛋白 质 的 位 点 被 加 到 LE Be 葵 C 上 时 [图 4.24(a)], 在 同 源 肽 和 蛋白质 效应 因子 存在 下 ,很 小 或 没有 调节 活 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进 化 - 103 - at 了 (a) * ‘eGeUGACCUGYAGUGCUSY yt (b) 5'GCGACTGGACATCACGAG3' /标签 5 To ak llr peed decerggde 3'C GCUGACCUGUAGUG CYC U so C—G jee G 一 C U 一 A G-c Geu3 3A A@G-] UeG U 一 A 70-G—C G-c A-U we teed 2B N50 G C-G G-C-10 mG AA 人 生物 素 (c) 标签 生物 素 人 ， cl es oN... a (et aves 后 foe G) 再 生 PCR (+) rire O8* \ 标签 生物 素 4.24 Li 连接 酶 ,LI-N50 库 和 选择 图 解 (a)Li ERM RRR MA, BPH AL BAC, 阴影 区 表示 催化 核心 和 连接 的 接合 点 。 引 物 结合 位 点 以 小 写字 母 表示 , 斜体 字 表 示 活 性 所 需要 的 寡 核 苷 酸 效 应 因子 。 黑 体 表示 连接 的 底 物 。 连接 底 物 的 “标签 ”(tag) 是 变动 的 , 这 里 是 生物 素 -(dA)>。(b)LI-N50 库 含 有 50 个 随机 顺序 位 置 并 与 核 酶 核心 部 分 的 重 至 。 葵 B 变 小 并 用 稳定 的 GNRA 四 突 环 终止 , AH US 突变 成 C( 黑 体 ) 同 G69 形 成 碱 基 对 以 增加 蔡 的 稳定 性 。(c) 选 择 图 解 。RNA 库 同 生物 素 化 的 底 物 一 起 温 育 , 并 且 活 性 突变 体 由 群体 去 除 。 余 者 再 一 次 在 靶 蛋 白质 (Cytl8 或 溶菌 酶 ) 存 在 下 同 生物 素 化 的 底 物 温 育 。 活 性 突变 体 由 群 体 中 去 除 , 并 优先 用 逆 录 PCR 扩 增 ,， 体外 转录 [4] - 104 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 性 。 同 样 , 当 将 随机 顺序 突 环 引入 荃 C 端 时 ,可 选择 出 活化 的 突变 体 。 工程 依赖 蛋白 质 的 核 酶 不 同 于 工程 依赖 小 分 子 的 核 酶 ,小 分 子 结合 在 有 限 的 别 构 位 点 上 ,但 明显 影响 核心 核 酶 的 二 级 和 三 级 结构 再 组 织 ;大 效应 因子 分 子 ( 例 | 如 蛋白 质 ) 很 可 能 与 更 大 的 位 点 结合 ,在 立体 上 可 能 抑制 催化 核心 。 因 此 ,在 选择 上 必须 包括 催化 核心 。 为 此 ,Robertson 等 根据 LI 连接 酶 (LI-N50)05] 设 计 一 个 库 ， 其 中 关键 催化 残 基 随 机 化 [图 4.24(b)]。L1-N50 库 ( 从 105 起 始 ) 对 连接 活性 经 历 正和 负重 复 选 择 [ 图 4.24(c) I. 在 天 然 核 蛋 白 中 ,蛋白质 成 分 通过 稳定 活性 RNA 构象 体 活 化 核酸 。 依 赖 蛋 白 质 的 aptazyme 可 以 固定 在 芯片 上 ,特异 地 识别 它们 的 目标 蛋白 ,可 以 开发 出 高 通 量 选 择 aptazyme, 其 允许 定量 检验 蛋白 质 组 和 代谢 组 中 的 靶 。 4.4.5 延伸 和 恒 上 质 编码 的 核 酶 体外 选择 非 天 然 氮 基 酸 移 人 蛋白 质 可 以 形成 具有 新 化 学 性 质 的 材料 [5 。Bessho 等 [86] 描述 了 特殊 选择 的 核 酶 ,可 以 把 扎 基 酸 转移 到 特异 的 CRNA 的 3' 端 (图 4.25)。 该 方法 提供 一 种 产生 所 酰基 tRNA 的 工具 ,其 载 有 非 天 然 氨基 酸 ,通过 无 细胞 翻译 可 以 最 终 移 人 蛋白质 中 ,产生 各 种 用 途 的 新 性 质 的 工程 蛋白 质 。 为 了 控制 蛋白 质 的 生物 合成 需要 特异 的 改变 遗传 编码 。 在 氮 酰 基 化 反应 中 ， 每 个 氨基 酸 结 合 在 同 源 CRNA 的 3' 端 (图 4.25) 。 每 个 tRNA 都 有 氨基 酸 特异 的 反 密码 子 , 当 氮 基 酸 结合 在 特异 的 (RNA 时 ,建立 了 编码 的 三 联 体 -氨基 酸 。 这 些 通用 的 氢 酰 基 化 反应 是 由 氮 酰 了 NA 合成 酶 催化 的 ,每 氨基 酸 对 应 一 个 酶 , 疏 NA 合成 酶 是 古代 蛋白 质 , 较 早出 现在 "RNA 世界 "过渡 到 和 蛋白质 中 的 。 由 于 mRNA 的 密码 F--tRNA 的 反 密 码 子 在 核糖 体 上 相互 作用 的 结果 ,结合 在 NA 上 的 氨基 酸 被 插 和 人 到 生长 多 肽 链 的 一 定位 置 。 氮 酰 基 化 特异 性 是 明显 的 ,一 旦 一 个 氨基 酸 被 稳定 地 结合 在 tRNA 上 , 它 的 命 运 就 已 确定 ,这 是 由 于 密码 子 - 反 密码 子 相 互 作 用 对 结合 在 tRNA 的 氨基 酸性 质 不 敏感 。 在 Bessho 等 工作 之 前 ,为 改变 氮 酰 基 化 而 发 展 了 4 个 系统 ( 表 4.1) ,依靠 所 酰基 化 方法 ,来 自 这 些 特异 的 氮 酰 基 化 系统 的 蛋白 质 可 能 是 纯 的 化 学 实体 或 密切 相关 多 肽 统计 上 的 集合 。 上 述 系统 中 的 3 个 可 以 用 于 体内 ,这样 ,细胞 实际 上 产生 含有 非 天 然 氨 基 酸 的 蛋白 质 , 即 细胞 面临 吸取 一 定 的 非 天 然 氨 基 酸 ,经 一 个 tRNA 合成 酶 作用 ,破坏 特异 的 URNA 合成 酶 的 编辑 能 力 , 由 于 氮 酰 基 化 的 错误 ,天然 机 制 被 去 除 ,并 且 产 生 的 突变 体 URNA 合成 酶 对 特殊 的 非 天 然 氨 基 酸 -RNA 是 特异 的 。 虽 然 上 述 3 个 途径 已 用 于 体内 ,它们 也 可 能 适 于 体外 制造 新 的 蛋白 质 。 第 四 个 途径 只 能 用 于 体外 ,是 用 化 学 和 酶 法 把 新 的 氮 基 酸 连 接 到 特异 的 人 NA 上 ,典型 的 例子 是 tRNA 被 指定 阅读 终止 密码 子 ( 例 如 UAG)。 B4 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 105 - 让 NA | Met -tRNA™* 5'3' e + are e en rte Phe- tRNA? 53， 5'3' eS GER BSL BA. oa NH, tRNA (b) NH tRNA Me tRNA™« 3H 2 tRN AM™et wetAwo hs 9 5 图 4.25 带 有 反 密 码 子 的 核 酶 氨 酰 基 化 tRNA 〈《a) 氢 酰基 化 的 图 解 表示 ,其 中 每 个 氨基 酸 (全 ) 与 RNA3' 端 结合 ; (b) 应 用 特异 的 核 酶 氨 酰 基 化 不 同 的 RNA。 各 种 核 酶 仅 在 反 密 码 子 突 环 上 有 区 别 许多 学 者 认为 最 早 氨 酰 基 化 是 由 核 酶 催化 的 。 每 个 核 酶 都 有 一 个 反 - 反 密码 突 环 。 这 样 , 载 有 氮 基 酸 的 核 酶 通过 反 密 码 子 - 反 - 反 密码 子 互补 碱 基 对 与 其 tRNA 杂 化 。 很 明显 , 反 密 码 子 - 反 - 反 密码 子 相 互 作 用 不 是 核 酶 的 设计 部 分 ,而 是 选择 的 结果 。 核 酶 ( 按 设计 ) 也 与 所 有 人 NA 3' 端 的 单 股 部 分 杂 化 。 这 样 ,中 NA 底 物 被 核 酶 占据 两 个 地 方 。 氮 酰基 由 核 酶 的 $-OH 转移 到 tRNA 的 3'-OH 给 出 所 要 求 的 氮 酰基 化 tRNA. 三 个 不 同 的 RNA 已 表明 特异 地 同 有 互补 反 - 反 密码 子 突 环 的 核 酶 相互 作用 ， 并 且 不 与 它们 的 反 密 码 子 - 反 - 反 密码 子 配 对 中 错 配 的 其 他 两 个 核 酶 相互 作用 。 有 趣 的 是 , 在 天 然 发 生 的 系统 中 , 许多 tRNA SAS CMI RNA 结合 。 在 其 他 的 相互 作用 中 , 同 反 密码 子 三 联 体 和 核 苷 酸 特殊 的 相互 作用 接近 tRNA 的 3' 端 。 这 样 ,模拟 天 然 合成 酶 -中 NA 相互 作用 ,Bessho 等 选择 产生 的 核 酶 ,重演 RNA-RNA ( 核 酶 -中 NA 相互 作用 )。 © 106 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 表 4.1 产生 具有 新 氨基 酸 的 蛋白 质 的 方法 氨 酰 基 化 方法 应 用 评注 文 献 作用 于 一 定 的 非 天 然 氨基 ”具有 新 化 学 性 质 的 多 肽 ， ”体内 或 体外 ,产生 “统计 上 [93] 酸 的 野生 型 或 突变 体 银 - ”作为 生物 材料 的 蛋白 质 "。 不 能 用 编辑 NA 合成 酶 功能 清除 非 天 然 氨 基 酸 ; 非 天 然 氨基 酸 大 规模 移 人 不 需要 特殊 化 学 方法 通过 破坏 tRNA 合成 酶 的 ”具有 新 化 学 性 质 的 多 肽 ， ”体内 或 体外 ,产生 “统计 上 [94] 编辑 结构 域 模糊 遗传 编码 作为 生物 材料 的 蛋白 质 "。 越 过 编辑 结 构 域 ,这样 非 天 然 氨基 酸 的 大 库 可 以 移 人 。 大 规模 移 人 非 天 然 氨基 酸 , 不 需 要 特殊 的 化 学 方法 突变 体 tRNA 合成 酶 合成 ”新 氨基 酸 单一 或 多 重 插入 体内 或 体外 同 源 蛋 白质 产 [95] 新 氨基 酸 -tRNA 到 特异 多 肽 的 特异 位 置 。 ” 物 。 需 要 部 蛋白 质 的 基因 在 确定 的 内 部 位 置 产生 具 ”或 mRNA 有 新 的 第 21 BA 有 定位 探 针 的 蛋白 质 基 酸 的 密码 子 ( 新 氢 基 酸 MANZE) 特异 tRNA HCE 新 氨基 酸 单一 或 多 重 插入 ”只 在 体外 , 基因 (或 mR- [96] 化 到 特异 多 肽 的 特异 位 置 。 “ NA) 必须 在 新 氨基 酸 引入 在 确定 的 内 部 位 置 产生 具 ”的 位 置 改变 密码 子 , 允许 有 定位 探 针 的 蛋白 质 新 的 氨基 酸 插 人 到 靶 和 蛋白 的 特异 位 置 tRNA 特异 的 核 酶 新 氨基 酸 单一 或 多 重 插 和 人 ”只 在 体外 , 核 酶 反 - 反 密码 [97] 到 特异 多 肽 的 特异 位 置 。 8 = FRE I tT 在 确定 的 内 部 位 置 产 生 具 tRNA 移 到 另 一 个 tRNA。 有 定位 探 针 的 蛋白 质 人 允许 新 氨基 酸 插 人 到 所 有 位 置 ,也 可 以 允许 单一 插 人 到 特殊 密码 子 的 位 置 Bessho 等 工作 的 缺点 是 氨 酰 基部 位 由 核 酶 的 $'-OH 转移 到 tRNA 的 3'-OH 是 固定 无 效 的 。 由 于 在 RNA 的 3' 端 的 顺 式 -二 醇 (2- 和 3'-OH) 较 之 分 离 的 5 -OH 产 生 不 太 稳 定 的 化 学 环境 。 这 样 ,所 酰基 tRNA 的 产生 需要 高 浓度 的 氢 栈 基 化 核 酶 。 同样 ,该 方法 需要 构建 荷载 的 核 酶 ,部 分 通过 化 学 方法 。Bessho 等 工作 拓展 了 和 荷载 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 107 - 具有 新 氨基 酸 tRNA 的 可 能 性 ,选择 出 对 每 个 氨基 酸 和 URNA 特异 的 核 酶 也 是 可 能 的 。 用 基本 的 核 酶 只 需要 改变 反 - 反 密码 子 顺 序 ,就 可 以 对 特殊 的 tRNA 有 特异 性 ， 不 需要 其 他 改变 。 改 变 程序 性 核 酶 的 中 NA 的 专 一 性 似乎 比 改变 氮 酰 基 tRNA 合 成 酶 的 专 一 性 在 技术 上 更 容易 。 总 之 ,通过 体外 定向 进化 可 以 产生 新 DNA 和 RNA 分 子 ; 可 以 提供 古代 RNA 进化 的 模型 ; 可 以 制造 传感器 和 催化 剂 用 于 工业 和 治疗 。 拓 展 核酸 顺序 空间 和 扩大 核酸 功能 新 方法 的 开发 将 增加 核酸 的 结构 和 功能 多 样 性 , 增加 其 应 用 范围 。 4.4.6 体外 选择 环 状 核 酶 最 近 的 研究 工作 表明 很 小 的 环 状 单 股 DNA (ssDNA ) 可 以 被 吻 菌 体 和 细菌 RNA 聚合 酶 有 效 的 转录 ,转录 是 按 滚 动 环 机 制 进行 (图 4.26). ssDNA 环 的 大 小 在 18~ 110nt, 或 直径 在 2 ~ 10nm。 这 样 的 DNA 纳米 环 可 用 于 编码 连环 体 (con- catamer) 或 自身 分 裂 产生 单 体 锤 头 核 酶 .发 严 和 肝炎 8 型 主 的 核 酶 ,但 不 能 复制 。 纳米 环 转录 起 始点 在 环 中 任何 胞 喀 喧 处 并 以 GTP 起 始 。 在 某 种 情况 下 纳米 环 的 二 级 结构 抑制 或 提高 转录 。Kool 等 !sJ 通 过 体外 选择 策略 选择 出 约 40nt 顺序 作为 DNA 纳米 环 载 体 中 的 启动 子 , 称 为 伪 启 动 子 (pseudopromoter) , 又 称 类 启动 子 结构 域 (promoter-like domain) 。 它 明显 小 于 大 肠 杆菌 中 发 现 的 单 股 启动 子 。 这 个 启动 子 可 以 用 于 起 动 DNA 纳米 环 载体 在 大 肠 杆菌 中 转录 出 活性 锤 头 核 酶 。DNA 纳米 环 载体 库 是 由 一 个 含 40nt 随机 结构 域 和 编码 锤 头 核 酶 及 其 分 裂 底 物 非 随机 结构 域 (63nt) 组 成 的 。 该 库 大 约 有 1025 不 同 的 单 股 环 状 顺 序 ( 图 4.27)。 体 外 选择 第 50 - 轮 得 到 的 最 佳 顺 序 。 滚动 环 转录 同 自 身 加 工 结合 是 核 酶 合成 的 有 效 策略 。 纳 米 环 载体 代表 了 生物 活性 RNA 传递 到 细菌 中 一 种 潜在 的 有 效 途径 。 编 码 重 复 ( 非 自 身 加 工 ) 核 酶 的 环 状 载体 可 以 产生 连环 体 核 酶 ,其 靶 顺 序 若是 HIV-1L 基因 组 , 这 将 对 艾滋 病 的 防治 具有 重要 作用 。 根据 酶 活性 部 位 柔性 的 基本 理论 sj , 考虑 RNA 柔性 比 DNA 大 ,我 们 设计 了 一 个 环 状 RNA-DNA 酶 , 它 是 由 T7 启动 子 、32ntDNA 和 13ntRNA 酶 组 成 的 [89] 。 在 上 述 工作 基础 上 ,我 们 考虑 核 酶 缺乏 多 种 催化 基 团 ,各 种 二 级 结构 相互 作用 (特别 是 玻 水 核心 ) 和 调节 结构 域 ,设计 一 个 环 状 RNA-DNA 酶 ![%]。 它 是 由 一 个 来 自 锤 头 核 酶 的 22nt 催化 结构 域 和 一 个 SSnt DNA 片段 组 成 ,后 者 含 两 个 结合 结构 域 (分 别 是 Ont 和 6nt) 和 一 个 调节 结构 域 ( 带 有 20nt 随机 顺序 的 40nt) , 见 图 4.28。 通过 体外 选择 获得 一 个 环 状 RNA-DNA 酶 (CRDE) , 较 之 锤 头 核 酶 , 它 有 较 高 的 活性 和 稳定 性 以 及 对 二 价 金属 离子 的 亲和力 。 通 过 引入 调节 结构 域 经 表 观 交替 变 位 调 …108 ”进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 合成 的 环 状 SDNA E.coli RNAP ATP,UTP,CTP,GTP 核 酶 分 裂 位 点 | meee bee. (+) 9 (+) 图 4.26 编码 发 夹 核 酶 的 环 状 DNA 滚动 环 转录 并 自身 加 工 及 连接 过 程 节 刚 性 (对 稳定 性 而 言 ) 和 柔性 (对 活性 而 言 ) 之 间 的 最 佳 平衡 ,提高 环 状 RNA-DNA 酶 对 环境 的 适应 性 。 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 - 109 - 编码 分 裂 位 点 C GA G A~ACATT CTGA GAGTTCGTCTG Are 2h Ce R 0: 68, C0 . Ac GGTAA GACT, CTC AGGCACTC Fl 4.27 103nt AR DNA 纳米 环 库 ,其 含有 40nt 随机 顺序 和 63nt 编码 锤 头 核 酶 及 其 分 裂 底 物 的 固定 顺序 N20 OH a RD 一 -一 一 -一 一 (RDII) EcoRI 人 DA KPHI 其 Ny 21-5 Rs — et | CaGUGUCACGAGU RDI (B) (RD II-RDIII) “4 DN bDNA,; cRNA 桥 连 DNA | lbDNA (ery) (RD I- RDI -RDIII) 图 4.28 4K RNA-DNA 酶 的 设计 和 构建 一 OH 代表 RDI 9 位 腺 苷 的 2'- 羟 基 , 用 于 同 RDII 的 4- 羟基 形成 2'5'- 磷 酸 二 酯 键 ;Nz 表 示 20nt 随机 顺序 :箭头 指出 环 状 RNA-DNA 酶 分 裂 位 点 ;B 表示 亲 合 选择 的 生物 素 ;aDNA 代表 辅助 DNA; bDNA 代表 结合 DNA; cRNA 代表 催化 RNA - 110 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 4.4.7 核 酶 /脱氧 核 酶 的 催化 潜能 和 进化 策略 [9 ESR RNA/DNA 已 经 显示 出 可 以 催化 许多 反应 的 能 力 , 但 毫 无 疑问 蛋白 质 酶 类 仍 是 生物 催化 剂 中 的 绝对 主力 。 目 前 已 经 获得 的 核 酶 与 蛋白 质 在 催化 反应 类 型 和 活力 上 都 相差 甚 远 (图 4.29) ,这 主要 有 两 个 方面 的 原因 。 一 方面 ,从 蛋白 质 和 核酸 本 身 的 化 学 组 成 来 看 ,蛋白 质 比 核酸 具有 更 大 的 催化 潜能 ,这 表现 在 蛋白 质 分 ， 子 中 有 许多 RNA/DNA 中 所 没有 的 共 价 催化 基 团 (如 半 胱 氨 酸 的 琉 基 、 丝 氢 酸 的 羟 基 、 组 氮 酸 的 咪唑 基 ) 以 及 酸 碱 催化 基 团 (如 氨基 羧基、 斑 基 \ 酚 羟基 及 咪唑 等 ) ; 蛋 白质 分 子 中 还 可 以 创造 出 非 极 性 的 活性 中 心 空 穴 ,在 这 里 催化 基 团 被 低 介 电 环境 所 包围 ,这 样 底 物 分 子 和 酶 的 催化 基 团 之 间 氢 键 及 静电 相互 作用 被 增强 ,有 助 于 加 速 酶 促 反 应 ;蛋白 质 的 骨架 的 刚性 比 核酸 强 , 可 以 折 友 成 更 加 紧密 稳定 的 三 级 结 构 , 有 助 于 形成 复杂 而 稳定 催化 构象 ;蛋白 质 的 组 成 元 件 有 20 种 ,同样 数量 的 元 件 , 蛋 白质 比 核酸 的 组 合 多 样 性 多 出 许多 数量 级 ,这 样 从 中 得 到 可 以 催化 某 一 反应 (a) #ERNA URNA Bigs 5! { 5 Ill E I Nef 3 aU TAT Be PRALS. A ; . ee é tei tesa C G A e 4 T 下 有 人 U 5 A U,G Car cG S 10-23 ‘i SK BS 脱氧 核 酶 (b) 5 10-23 自发 锤 头 核 酶 ”脱氧 核 酶 RNaseA 酶 ¥ 4 ' -8 -6 2 oom: = os Igk — Sia : ， 具 有 生物 学 显著 性 的 速率 增加 eee 图 4.29 具有 切割 RNA 的 核 酶 ,脱氧 核 酶 及 蛋白 质 酶 (proteinous enzyme) 的 比较 (a) 是 天 然 锤 头 核 酶 和 10-23 脱氧 核 酶 。 箭 头 表 示 酶 催化 分 裂 RNA 的 位 点 ; (b) 是 3 个 酶 按 同 一 转 酯 机 制 催化 活性 的 比较 。 横 坐标 表示 每 个 酶 催化 速率 常数 (min ' ) 的 对 数值 。 带 状 表示 3 个 酶 催化 速率 /RNA 自发 分 裂 速率 常数 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 ，111 - 的 顺序 的 可 能 性 大 大 增加 ,同时 获得 的 有 催化 能 力 的 结构 也 更 为 合理 。 另 一 方面 ， 蛋白 质 分 子 在 整个 自然 界 中 存在 ,并 经 过 了 千 百 万 年 的 进化 ,已 经 获得 十 分 复杂 的 结构 ,而 核 酶 分 子 仅仅 存在 于 实验 室 的 试管 中 , 才 经 过 短 短 几 年 \. 几 个 月 的 分 子 进 化 。 可 以 想象 ,目前 DNA/RNA 酶 与 蛋白 质 酶 如 此 大 的 差距 并 不 只 因为 它们 本 身 的 催化 潜能 ,还 有 很 大 一 部 分 原因 是 前 者 的 许多 结构 和 功能 还 远 没 有 被 开发 出 来 。 在 自然 界 中 进化 的 组 I 内 含 子 和 RNaseP 就 具有 了 复杂 结构 ,可 以 加 快 反 应 速度 达 102 倍 。 组 工 内 含 子 在 很 多 方面 可 以 和 那些 最 精密 的 蛋白 质 酶 相 比 , 它 催 化 完成 外 显 子 之 间 的 重组 ,通过 构象 的 改变 连续 完成 两 个 不 同 的 反应 ,并 使 产物 快速 释放 防 止 逆反 应 发 生 。 在 实验 中 进行 的 定向 进化 还 不 能 获得 如 此 复杂 的 (脱氧 ) 核 酶 , 因 为 目前 的 体外 选择 无 论 在 空间 上 还 是 在 时 间 上 毕竟 有 限 。 一 个 包含 220 KF RAY 核酸 分 子 , 共 有 102 种 可 能 的 顺序 。 如 果 构 建 一 个 库 , 即 使 每 种 分 子 只 有 一 个 的 话 ,那么 这 个 库 的 质量 将 大 约 为 1000kg。 实 际 上 用 于 筛选 (脱氧 ) 核 酶 大 约 只 有 102 种 分 子 ,与 整个 的 可 能 性 来 比 , 简 直 微 不 足 道 。 通 过 随机 筛选 获得 的 (脱氧 ) 核 酶 基本 上 是 以 比较 高 的 频率 出 现 的 ,这 样 才 会 被 105 大 小 的 库 所 包括 。 催 化 某 一 类 反应 需要 具有 高 度 复 杂 结 构 的 出 现 频率 很 低 的 核 酶 ,通过 在 实验 室 中 获得 的 机 会 比较 小 。 为 了 获得 催化 种 类 更 加 多 样 、 性 质 更 加 优良 的 (脱氧 ) 核 酶 ,主要 有 以 下 几 种 思 路 来 克服 由 于 核酸 本 身 以 及 筛选 条 件 造 成 的 障碍 。 (1) 引入 其 他 催化 基 团 大 多 数 (脱氧 ) 核 酶 采用 金属 离子 等 辅助 因子 作为 催化 基 团 ,为 了 增加 (脱氧 ) 核 酶 的 催化 潜能 ,人 们 设想 将 额外 的 功能 团 引 入 RNA/DNA 中 以 扩 增 它们 结构 和 功能 多 样 性 ,例如 用 氨基 酸 体外 选择 以 L-His 为 辅助 因子 催化 RNA 切割 反应 的 脱 氧 核 酶 ) 或 其 他 有 机 物 作为 辅助 因子 。 蛋 白质 酶 利用 辅酶 提供 更 多 共 价 催化 基 团 和 作为 活化 基 团 的 载体 ,同样 , 核 酶 也 可 以 用 这 些 辅助 基 团 ,或 者 更 适合 核 酶 分 子 的 一 些 辅酶 。 还 可 以 直接 将 一 些 活性 基 团 引入 到 DNA/RNA 分 子 上 ,其 中 修饰 核酸 开发 的 方法 很 有 前 途 。 例 如 对 dATP 和 dUTP 进行 化 学 修饰 ,分 别 合成 dATP 的 氨基 衍生 物 和 dUTP 咪唑 基 衍 生物 ,这些 衍生 物 可 以 被 Taq 酶 用 作 底 物 完成 PCR 反应 。 如 果 将 这 些 衍 生物 通过 PCR 代替 dATP 和 dUTP 而 引入 到 随机 DNA 分 子 库 中 ,就 可 以 因为 这 些 额外 功能 基 团 的 参与 而 增加 了 体外 筛选 出 不 同 活性 脱氧 核 酶 的 可 能 性 ,这 些 脱氧 核 酶 将 具有 更 高 的 活性 以 及 更 为 复杂 的 结构 和 功能 ,同时 可 以 抵抗 核 酸 酶 的 降解 。 这 个 方法 与 一 般 的 为 了 提高 核酸 分 子 的 稳定 性 而 进行 化 学 修饰 相 比 ,主要 的 优点 是 大 大 提高 脱氧 核 酶 的 催化 潜能 ,另外 甚至 更 重要 的 是 这 些 修 饰 基 团 的 引入 可 能 通过 PCR 来 完成 ,这 样 可 以 实现 直接 对 修饰 核酸 的 筛选 ,修饰 和 得 选 的 统一 ,使 筛选 直接 针对 修饰 核酸 本 身 进 行 , 最 大 限度 地 开发 了 修饰 核酸 的 催化 -112 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 潜能 。 一 般 的 修饰 方法 都 是 对 已 经 获得 的 核 酶 或 脱氧 核 酶 在 某 些 位 置 有 目的 的 修 饰 替 换 ,通过 人 工 的 化 学 合成 来 得 到 改造 的 核 酶 ,这 个 过 程 成 本 比较 高 ,并且 无 法 实现 大 规模 的 筛选 ,改造 后 的 核 酶 是 否 具有 活性 需要 逐一 来 检测 。 (2) 扩大 筛选 的 容量 结构 复杂 的 核 酶 需要 更 多 的 保守 顺序 来 维持 其 特殊 空间 结构 ,这样 的 核 酶 出 现 的 频率 极 低 ,一 个 很 自然 的 想法 就 是 提高 核酸 突变 库 的 大 小 来 增加 筛选 到 这 些 复杂 核 酶 的 机 会 ,关键 是 如 何 增加 突变 库 的 大 小 。 现 在 采用 的 从 一 个 随机 库 出 发 ， 每 轮 用 易 错 PCR 来 增加 突变 的 筛选 方法 在 一 定 程度 上 扩大 了 筛选 容量 。 例 如 第 一 轮 筛 选 从 一 个 102 大 小 的 N220 随机 库 开 始 , 以 后 每 一 轮 通过 易 错 PCR 在 每 个 DNA/RNA 分 子 上 引入 若干 突变 ,把 筛选 得 到 的 具有 催化 潜能 的 分 子 库 ( 假 设 为 10) 增 加 了 105 倍 ,使 每 轮 筛选 的 突变 库 都 维持 在 105 左 右 , 即 在 筛选 能 力 允 许 的 范围 内 ,又 增加 了 筛选 范围 。 那 么 经 过 4 轮 后 ,所 得 到 的 核 酶 就 相当 于 从 一 个 105 (45 = 15 + 30) 初 始 随机 库 中 筛选 得 到 的 。 当 然 经 过 几 轮 筛选 后 ,得 到 的 突变 库 内 部 分 子 之 间 ,以 及 和 前 几 轮 筛选 得 到 的 库 之 间 会 有 很 大 的 重复 ,所 以 映射 的 初始 随 机 库 的 容量 并 不 是 可 以 无 限 增加 到 包含 所 有 可 能 的 序列 。 所 得 到 的 核 酶 都 是 从 第 一 轮 筛 选 到 的 有 催化 潜能 的 分 子 进 化 而 来 的 ,是 在 这 些 分 子 结构 的 基础 上 做 进 一 步 细 致 调整 ,得 到 这 类 结构 最 优化 的 催化 分 子 。 但 第 一 轮 没 有 获得 的 一 些 种 类 的 “ 结构 就 会 被 遗漏 掉 。 所 以 首 轮 的 筛选 库 的 容量 十 分 重要 ,提高 待 筛选 的 随机 库 的 浓度 和 体积 ,或 者 增加 选择 系统 的 敏感 性 ,可 以 增加 首 轮 随机 库 的 容量 ,但 所 获得 的 库 的 增加 是 有 限 的 ,而且 实验 成 本 也 大 大 增加 。 总 之 ,很 难 或 者 是 不 可 能 ) 将 随 机 库 的 容量 增加 到 可 以 筛选 得 到 任何 复杂 核 酶 的 大 小 。 (3) 模拟 自然 进化 的 合理 性 设计 自然 界 中 ,蛋白质 酶 的 自然 进化 也 不 是 单纯 在 蛋白 质 分 子 的 随机 库 中 进行 的 ， 整个 自然 界 可 以 容纳 的 随机 库 的 大 小 与 整个 随机 库 的 可 能 性 相 比 也 是 十 分 有 限 的 。 核 酶 的 体外 选择 进化 也 可 以 通过 模拟 自然 进化 来 突破 库容 量 的 限制 。 蛋 白质 的 自然 进化 主要 在 选择 压力 下 进行 突变 ,重组 和 模块 组 装 。 对 于 前 两 种 模式 ,可 以 通过 易 错 PCR 和 DNA 改组 等 手段 进行 模拟 。 模 块 组 装 对 于 相对 分 子 质 量 大 、 结 构 和 功能 复杂 的 蛋白 质 最 为 重要 ,是 突破 了 筛选 库容 量 限 制 的 进化 方式 。 通 过 基 因 的 重复 颠倒、 插 人 、 缺 失 或 外 显 子 重组 等 ,在 分 子 内 实现 了 若干 已 经 存在 的 结构 和 功能 单元 之 间 的 组 装 , 可 以 是 来 自 同 一 分 子 内 的 模块 在 分 子 内 的 重复 . 重 排 以 及 颠倒 等 ,也 可 是 来 自 不 同 分 子 的 模块 的 重新 组 合 。 分 子 间 也 通过 相互 作用 形成 寡 REA ,甚至 更 为 复杂 的 细胞 器 (例如 核糖 体 )。 所 以 复杂 的 RNA 分 子 可 以 通过 模 拟 自 然 界 中 蛋白 质 进化 的 方式 对 筛选 获得 的 结构 和 功能 模块 进行 组 装 来 实现 。 将 这 些 模块 以 不 同方 式 结合 在 一 起 ,通过 不 同 模块 之 间 的 随机 连接 ,并 在 连接 的 部 分 插入 随机 顺序 ,构建 出 一 个 模块 组 装 的 随机 库 , 然 后 进行 筛选 ,获得 所 需要 的 模块 第 4 章 ， 核 酶 和 脱氧 核 酶 定向 分 子 进化 + 113 - 组 合 方式 。 这 种 进化 方式 归根 结 底 也 是 扩大 了 筛选 库 的 大 小 ,假如 一 个 从 10P K 小 的 随机 库 中 经 过 若干 轮 易 错 PCR 筛选 得 到 的 模块 相当 于 从 大 小 为 10 "的 库 5 个 这 样 的 模块 经 过 重组 获得 的 核 酶 ,就 相当 于 从 容量 为 10° 的 随机 库 中 筛选 得 到 的 ,更 多 模块 则 有 更 多 的 重组 可 能 ,这 样 定 向 进化 的 核 酶 的 复杂 程度 就 会 大 大 增 加 。 剪 切 型 核 酶 就 可 以 看 成 是 两 种 简单 模块 组 合 而 成 , 底 物 结合 模块 和 催化 模块 ， 通过 更 换 与 催化 模块 连接 的 底 物 结合 模块 ,可 以 对 不 同 的 底 物 进行 切割 。 对 于 俊 化 其 他 反应 类 型 的 核 酶 也 可 以 从 底 物 结合 的 aptamer 模块 ( 库 ) 与 催化 这 类 反应 的 模块 ( 库 ) 进 行 组 合 筛选 ,还 可 以 组 装 上 利用 各 种 辅助 因子 (ATP, 氨基 酸 等 ) 的 ap- tamer 模块 ( 库 ) ,以 获得 额外 的 催化 基 团 、 反 应 中 间 体 载体 或 者 能 量 等 。 另 外 也 可 以 像 蛋白 质 具 有 调控 部 位 一 样 ,设计 调控 模块 ,这 就 是 别 构 核 酶 。 已 经 设计 了 一 系 列 有 黄 素 aptamer 序列 的 别 构 锤 头 型 核 酶 , 它 包 含 特异 结合 黄 素 的 位 点 并 受到 黄 素 的 调控 。 黄 素 单 核 苷 酸 存 在 的 情况 下 ,通过 改变 核 酶 的 构象 ,提高 了 催化 效率 ,其 中 一 种 别 构 核 酶 在 黄 素 单 核 苷 酸 饱和 时 , Kes 增 加 了 10 倍 (不 知道 是 否 也 跟 FMN 提供 活性 基 团 有 关 )。 还 有 许多 相似 的 报道 ,这 些 别 构 核 酶 都 是 携带 与 活性 部 位 分 开 的 效应 因子 结合 部 位 , 配 体 与 这 个 别 构 部 位 结合 ,诱导 相 邻 核 酶 结构 域 的 构象 变 化 ,以 提高 或 抑制 催化 机 制 。 核 酶 的 体外 选择 尚 处 在 幼年 时 期 ,今后 随 着 人 们 获得 的 核 酶 种 类 、 挫 人 核 酶 中 的 活性 基 团 以 及 核 酶 可 以 利用 的 辅助 因子 的 增多 ,并 通过 对 各 种 模块 的 重组 筛选 ， 核 酶 分 子 将 在 实验 室 中 不 断 进 化 ,相信 会 出 现 更 多 种 类 、 结 构 和 功能 更 为 复杂 的 核 酶 。 核 酶 的 研究 方向 中 有 两 个 领域 值得 特别 关注 :一 个 是 蛋白 质 同 核 酶 的 相互 作 用 ; 另 一 个 是 核 酶 的 结构 生物 学 22] 。 蛋白 质 能 够 提高 或 扩展 中 心 RNA 的 活性 。 核 糖 体 和 剪接 小 体 是 最 重要 的 两 个 系统 ,也 是 最 重要 的 核 酶 领域 。 通 过 这 些 蛋 白质 的 机 制 和 结构 相互 作用 促进 RNA 催化 反应 。 核 酶 的 结构 生物 学 , 即 在 原子 水 平 上 解析 大 的 核 酶 (组 工 或 工 内 含 子 ,或 RNaseP) 是 另 一 重要 领域 。 核 酶 的 结构 生物 学 将 越 来 越 多 地 集中 在 体外 选择 的 核 酶 和 天 然 催化 核 蛋 白 颗 粒 。 它 包括 RNaseP 全 酶 ,各 种 组 工 内 含 子 -成 熟 酶 蛋白 复合 物 .剪接 小 体 的 成 分 以 及 核 蛋 白 酶 (例如 端 粒 酶 )。 这 些 将 是 核 酶 领域 今后 要 做 的 主要 工作 。 参考 文 献 1 Moore PB，Steitz T A. 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Nat Biotechnol, 2002, 20: 723 ~ 728 5.1 5 =| 虽然 酶 仅仅 是 由 20 种 天 然 氨 基 酸 组 成 的 ,但 它 涉及 生命 的 各 个 方面 。 酶 的 多 样 性 来 自 其 结构 和 功能 的 多 样 性 ,而 这 种 多 样 性 由 各 种 氨基 酸 聚 合成 不 同 的 组 成 顺序 和 长 度 来 实现 。 在 折 笃 成 复杂 的 三 维 结构 时 , 这 些 大 分 子 转 为 选择 性 和 专 一 ， 性 的 催化 剂 ,催化 各 种 化 学 反应 。 对 酶 分 子 的 研究 可 以 分 为 认识 和 改造 两 个 方面 ,前 者 是 利用 各 种 生物 化 学 . 唱 ， 体 学 .光谱 学 等 方法 对 天 然 酶 或 其 突变 体 进行 研究 ,获得 酶 分 子 特征 、 空 间 结构 、 结 构 和 功能 之 间 关 系 以 及 氨基 酸 残 基 功 能 等 方面 的 信息 ,并 以 此 为 依据 对 酶 分 子 进 行 改造 , 称 为 酶 分 子 的 合理 设计 ;与 此 相对 应 ,不 需要 准确 的 酶 分 子 结构 信息 而 通 过 随机 突变 和 筛选 等 方法 对 其 进行 改造 , 则 称 为 酶 分 子 的 非 合 理 设 计 。 非 合理 设 计 的 实用 性 较 强 ,往往 可 以 通过 随机 产生 的 突变 ,改进 酶 的 特性 。 酶 定向 分 子 进化 (directed molecular evolution) 属于 蛋白质 的 非 合 理 设计 , 它 不 需 事先 了 解 酶 的 空间 结构 和 催化 机 制 , 人 为 地 创造 特殊 的 进化 条 件 ,模拟 自然 进化 机 制 (随机 突变 、 基 因 重 组 和 自然 选择 ) ,在 体外 改造 酶 基因 ,并 定向 选择 (或 筛选 ) 出 所 需 性 质 的 突变 酶 。 天 然 酶 通常 缺乏 商业 价值 的 催化 功能 及 其 他 性 质 。 因 此 对 天 然 酶 分 子 水 平 上 的 改造 显得 十 分 重要 。 天 然 酶 在 自然 条 件 下 已 经 进化 了 千 百 万 年 ,但 是 酶 分 子 仍 然 列 藏 着 巨大 的 进化 潜力 ,这 是 酶 体外 定向 进化 的 基本 先决 条 件 。 酶 分 子 存在 着 进化 的 潜力 主要 原因 如 下 :@ 天 然 酶 在 生物 体内 存在 的 环境 与 酶 的 实际 应 用 环境 不 同 。 一 个 比较 好 的 例子 是 把 枯草 杆菌 蛋白 酶 BE 应 用 于 非 水 相 ( 二 甲 基 甲 酰胺 ， DMP) ,催化 肽 合成 反应 ,自然 生理 条 件 下 进化 得 比较 完善 的 枯草 杆菌 蛋白 酶 已 由 于 没有 接触 过 非 水 环境 ,因此 其 活力 和 稳定 性 不 适应 在 有 机 相 中 完成 催化 反应 。 这 就 为 该 酶 在 新 的 筛选 条 件 下 (有 机 相 中 ) 提 供 了 适应 该 条 件 的 进化 空间 。 包 实际 应 用 中 ,总 是 期 待 酶 的 活力 和 稳定 性 越 高 越 好 ,这 样 可 以 加 快 反应 速度 、 提 高 酶 的 利用 率 、 降 低 反 应 成 本 ,但 在 生物 体内 更 重要 的 是 各 种 生物 分 子 之 间 协 同 作 用 , 作 为 一 个 整体 去 适应 环境 。 生 物 对 环境 适应 的 进化 主要 不 是 表现 为 某 个 酶 分 子 的 活 力 和 稳定 性 的 不 断 提高 ,而 是 在 于 整体 的 适应 能 力 \ 调 控 能 力 的 增强 。 对 于 某 个 酶 分 子 来 说 ,其 活力 可 以 受到 调节 部 位 的 调节 ,含量 可 以 受到 基因 表达 的 调控 , 而 当 其 酶 活力 和 稳定 性 已 经 超过 了 满足 整个 体系 在 环境 中 生存 的 需求 时 ,它们 的 提高 第 5 章 有 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 + 119- 就 显得 没有 必要 了 , 即 失去 了 进化 的 筛选 压力 ,因而 进化 的 机 会 很 有 限 ,这 也 为 体 “外 定向 进化 留 下 了 很 大 的 进化 空间 。 包 茶 些 酶 或 蛋白 质 待 进化 的 性 质 不 是 其 在 生 物体 内 所 涉及 的 ,例如 对 蛋 白 质 药 物 改 造 消除 其 不 良 反 应 ,这 部 分 性 质 的 改善 有 着 很 大 的 进化 潜力 。 酶 定向 分 子 进化 是 从 一 个 或 多 个 已 经 存在 的 亲本 酶 (天 然 的 或 者 人 为 获得 的 ) 出 发 ,经 过 基因 的 突变 和 重组 ,构建 一 个 人 工 突 变 酶 库 ,通过 筛选 最 终 获 得 预先 期 望 的 具有 茶 些 特性 的 进化 酶 。 我 们 以 对 单一 酶 分 子 基因 进行 定向 进化 为 例 ,来 说 明 酶 分 子 定向 进化 的 基本 实验 路 线 。 在 待 进化 酶 基因 的 PCR 扩 增 反应 中 ,利用 Taq DNA 多 聚 酶 不 具有 3' 一 5 校对 功能 ,并 控制 突变 库 的 大 小 使 其 与 特定 的 筛选 容量 相 适 合 ,选择 适当 条 件 以 较 低 的 比率 向 目的 基因 中 随机 引入 突变 ,进行 正 向 突 变 间 的 随机 组 合 以 构建 突变 库 ,凭借 定向 的 选择 (或 筛选 ) 方 法 , 选 出 所 需 性 质 的 优 化 酶 ,从 而 排除 其 他 突变 体 。 也 就 是 说 ,定向 进化 的 基本 规则 是 “获取 你 所 筛选 的 突变 体 "。 简 言 之 ,定向 进化 = 随机 突变 + 正 向 重组 + 选择 (或 筛选 )。 与 自然 进化 不 同 ,前 者 是 人 为 引发 的 ,后 者 相当 于 环境 作用 于 突变 后 的 分 子 群体 ,相当 于 通过 选择 某 一 方向 的 进化 而 排除 其 他 方向 突变 的 作用 。 酶 定向 分 子 进 化 过 程 完全 是 在 人 为 控制 下 进行 的 ,是 酶 分 子 朝 向 人 们 期 望 的 特定 目标 进化 。 酶 的 功能 多 样 性 , 专 一 性 和 效率 吸引 科学 家 和 工程 师 通过 有 蛋白质 工 程 制造 生 物 催化 剂 ,以 满足 实践 需要 。 和 蛋白 质 结构 和 功能 的 设计 促进 蛋白 质 顺序 空间 的 定 回 拓展 。 天 然 蛋 白质 进化 机 制 使 蛋白 质 功 能 适应 不 断 变 化 的 环境 。 因 此 了 解 新 蛋 自 质 结 构 和 功能 出 现 的 原理 和 动力 ,可 以 提供 蛋白 质 工程 的 指南 。 本 章 重 点 讨论 天 然 重 白质 进化 的 机 制 ,进化 酶 的 结构 和 功能 以 及 定向 进化 的 应 用 。 5.22 自然 界 蛋 和 白质 进化 机 制 5.2.1 基因 复制 基因 复制 是 蛋白 质 进化 的 基本 机 制 之 一 231。 当 染 色 体 DNA 复制 或 者 减 数 分 裂 时 发 生 不 等 交换 ,可 以 产生 基因 的 复制 ,或 者 串联 重复 或 者 产生 母体 顺序 两 个 分 离 的 拷贝 (图 5.1)。 在 上 述 情况 下 ,各 种 拷贝 面临 3 种 可 能 的 结果 :@ 通 过 突变 积累 失 活 ;GO 不 受 功能 限制 ,局 部 突变 积累 导致 功能 分 化 和 新 功能 的 进化 ; @@ 两 个 基因 都 保持 野生 型 活性 。 然 而 ,蛋白 质 结构 和 功能 对 突变 非常 敏感 ,通过 随机 漂移 复制 趋 异 很 可 能 造成 酶 的 失 活 。 但 模型 研究 指出 在 两 个 基因 复制 中 互补 简 并 突变 实际 上 有 利于 宿主 。 两 个 拷贝 延长 保守 时 间 增 加 了 进化 新 功能 的 可 能 性 。 新 功能 蛋白 质 进化 的 另 一 种 观点 包括 基因 募集 (recruitment) 或 基因 分 配 。 在 这 个 模式 中 ,单一 基因 以 双 功 能 周期 性 进行 复制 ,一 个 拷贝 保持 祖先 功能 ,而 另 一 . 120 . 进化 生物 技术 一 酶 定向 分 子 进化 图 5.1 蛋白 质 进 化 时 主要 结构 再 组 织 机 制 的 图 解 个 取 新 功能 。 有 共同 祖先 的 两 种 蛋白 质 功能 趋 异 的 范例 是 组 氨 酸 生物 合成 途径 的 N-( 磷 酸 核糖 - 亚 胺 甲 基 )- 氨 基 味 唑 - 痰 酰胺 核糖 核 苷 酸 异 构 酶 (HsA) 和 咪唑 甘油 磷酸 合成 酶 (HisF) 的 Bu 桶 状 结构 。 两 酶 共同 起 源 的 假说 是 根据 顺序 比较 提出 的 ,并 且 由 广泛 结构 相似 性 鉴定 所 支持 。 5.2.2 “串联 复制 与 局 部 分 开 复 制 的 产物 相反 ,基因 的 串联 复制 是 指 基因 表达 的 两 个 或 更 多 拷 贝 的 产物 (图 5.1)。 这 样 的 多 重 性 具有 以 下 优点 :增加 稳定 性 和 新 的 协同 功能 ;在 新 的 裂 颖 处 形成 结合 位 点 ;长 的 重复 结构 (例如 纤维 蛋白 质 ) 可 产生 多 重 结合 位 点 。 串联 重复 可 以 经 历 环 状 变换 (circular permutation) 和 再 组 织 以 保持 母体 顺序 和 功能 的 完整 性 。 经 常 引用 串联 复制 的 例子 是 胰 蛋 白 酶 (天 冬 氢 酸 蛋白 酶 族 的 一 个 成 员 ) 和 胰 北 乳 蛋 白 酶 (类 胰 和 蛋白酶 族 的 代表 )。 在 结构 上 ,两 个 酶 是 由 两 个 同 源 堆积 结构 域 ( 胰 蛋白 酶 的 B 折 释 ; 胰 凝 乳 和 蛋白酶 的 B 桶 ) 组 成 ,活性 部 位 残 基 位 于 结构 域 的 界面 上 。 尽管 在 个 别 结构 域 对 之 间 存 在 广泛 的 顺序 趋 异 ,但 它们 总 的 骨架 结构 可 相互 重 倒 ， 这 表明 祖先 是 单一 结构 域 均 二 聚 体 。 同 样 ,巨细 胞 病毒 (肝炎 病毒 族 的 一 个 成 员 ) 丝氨酸 蛋白 酶 的 均 二 聚 体 B 桶 结构 ,似乎 是 现代 丝氨酸 酶 进化 的 前 体 。 串联 复制 所 产生 的 另 一 个 重要 的 结构 是 (Ba)s 桶 , 它 是 自然 界 普 遍 存 在 的 型 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 121: 主 (motif) , 约 10% 已 知 的 酶 存在 此 型 主 。 原 型 (Ba)s 桶 是 由 8 个 股 扭转 -螺旋 - 扭 转 重复 组 成 ,通过 连续 的 氢 键 网 络 形成 内 部 平行 B 折 释 和 表面 螺旋 。 前 面 提 及 的 基因 产物 HsA 和 HisF 的 多 重 顺序 匹配 指出 在 折 释 之 内 存在 内 部 重复 04。 该 资料 表明 ( 色 )s 结构 域 起 源 于 (Be)4 单元 的 串联 复制 (图 5.2) ,这 种 基因 复制 假说 的 正确 性 已 由 HisF 验证 。 将 酶 分 成 两 个 对 称 ()4 结构 域 之 后 并 在 E. coli 中 表达 ,两 个 亚 基 独立 地 折 丢 成 它 的 正确 构象 。 当 两 个 ( 色 )4 单元 共 表 达 , 自 身 缔 合成 功能 不 均 三 二 聚 体 ,其 活性 与 野生 型 相似 ,在 某 种 程序 上 支持 了 上 述 假说 。( 色 )4 桶 本 身 也 可 能 来 自 个 别 的 ( 妈 ) 单 元 。 桶 状 结构 能 耐 受 (如 ) 单 元 的 重 排 和 取代 。 基因 复制 oe Se 2 一 和 反 向 工程 5.2 (B/a)s 桶 结构 的 图 解说 明 高 度 对 称 的 结构 大 概 来 自 Ba 片段 的 多 重 基 因 复 制 。 该 假说 应 用 逆向 工程 已 检验 。 将 桶 分 成 两 半 ,产生 正确 的 折 释 片段 ,其 不 均一 二 聚 化 恢复 母体 功能 5.2.3 WIRE 蛋白 质 的 环 状 变换 造成 在 现 有 结构 框架 内 N 和 C 端 重新 定位 。 一 种 环 状 变 换 模型 指出 以 前 体 基 因 的 串联 复制 起 始 ,在 最 初 末 端 框架 内 融合 , 继 之 在 第 一 个 重 复 中 产生 新 的 起 始 密码 子 ,在 第 二 个 重复 产生 终止 部 位 。 在 DNA 甲 基 转 移 酶 中 观 察 到 按 此 模型 串联 复制 。 通过 环 状 变换 产生 桶 折 友 结构 多 样 化 ,最 初 是 在 -淀粉 酶 超 族 各 成 员 的 顺 序 匹配 中 发 现 的 。 后 来 E. coli 转 醛 醇 酶 B 的 结晶 学 资料 分 析 也 指出 该 酶 来 自 类 1 醛 缩 酶 的 环 状 变换 。 在 上 述 两 种 情况 下 ,两 个 N 端 妈 重 复 ( 加 上 淀粉 酶 的 第 三 个 亚 基 的 B 股 ) 移 到 C 端 ,功能 没有 明显 改变 。 环 状 变换 进化 的 优点 是 不 清楚 的 。 然 而 ,体外 实验 已 揭示 虽然 环 状 变换 的 蛋 FAA Ai PEAS FREI] ,但 亚 基 的 重 排 改 变 了 折 丢 途径 并 影响 蛋白 质 构象 的 稳 定性 。 从 工程 的 观点 来 看 ,这 样 的 结构 重 排 的 潜在 好 处 是 降低 结合 部 位 之 间 的 立 ' 122+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 体 干 扰 。 例 如 环 状 变换 的 白介素 4- 假 单 胞 杆菌 属 外 毒素 融合 物 , 抗 肿瘤 活性 增加 是 由 于 毒素 和 和 白介素 结合 部 位 之 间 的 立体 干扰 降低 所 致 。 5.2.4 BRA le) 08 POSE Tal WR A ESE EA EE LR, BRAM WIAA 35 A ya PE aH a — FRA ERA Wh, 2 Be tt i ee Te BY 2B FA BA BR VE FS 加 热力 学 稳定 性 ,并 且 可 以 在 蛋白 质 -蛋白 质 界面 产生 穴 和 沟 ,其 可 容纳 底 物 或 调 A 节 因 子 结合 mA 部 位 。 诊 聚合 一 种 特殊 的 情况 是 通过 3D- 结 构 域 转换 (3D-domain swapping ) 形 成 均一 二 聚 体 ,该 术语 容易 与 “结构 域 转换 ”(domain swapping ) 混 淆 。 如 图 5.3 所 示 ,后 者 是 结构 域 募 集 的 同义词 ,并 通过 为 个 别 结构 域 或 蛋白 质 内 含 子 (intein) 编 码 的 两 个 基因 片段 取代 来 工程 蛋白 质 , 涉 及 多 肽 骨架 共 价 键 的 断裂 和 重建 。 相 反 ,3D- 结 构 转换 是 相同 多 结构 域 蛋 白质 之 间 结 构 再 组 织 ,没有 共 价 键 的 断裂 。 在 这 个 过 程 中 ， 一 个 蛋白 质 的 一 部 分 与 同一 蛋白 质 的 同样 单位 转换 ,形成 互相 盘 绕 的 二 聚 体 或 高 度 有 序 的 窒 聚 体 。 天 然 发 生 的 3D- 结 构 域 转换 的 几 个 例子 已 经 由 Schlunegger 等 评 53。 交换 结构 单元 范围 从 二 级 结构 到 完整 的 结构 域 ,虽然 3D- 结 构 域 转换 的 优 点 不 完全 了 解 , 但 它 可 能 调节 以 及 增加 结构 稳定 性 。 结构 转换 «4. sl foe fie ne ; j S¢ 图 5.3 ”结构 转换 /募集 与 3D- 结 构 域 转换 之 间 差 别 的 图 解说 明 5.2.5 基因 融合 完整 的 融合 基因 产生 共 价 连接 的 多 功能 酶 复合 物 较 之 个 别 酶 之 间 非 共 价 寡 聚 合 更 具 协 调 性 。 在 生物 合成 途径 中 往往 发 现 催化 连续 步骤 的 各 种 酶 基因 融合 可 以 提供 稳定 性 ,调节 功能 , 底 物 通道 ,定向 协同 表达 , 焙 优 势 和 宿主 选择 优势 。 喀 啶 和 味 叭 生物 合成 途径 中 多 基因 融合 已 有 详细 讨论 区 ,组 氨 酸 和 芳香 族 氢 基 酸 生物 合成 途径 已 鉴定 :5 习 。 分 支 酸 是 色 氨 酸 、 栈 氨 酸 及 葵 丙 氨 酸 生物 合成 趋 异 的 关键 中 间 体 (图 5.4) ,在 EB. coli 中 ,两 个 双 功 能 复合 物 催化 分 支 酸 经 由 预 葵 酸 中 ASH 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 123 - CO3 OH 4H OPO3- ” H,c=X Te DOOR aac, +H,C HO" “SoH ~—<— : CQ5 cor OL Ik a L- 酷 氨 酸 ey 5 : OH (—) AR piece h 图 5.4 植物 和 低 等 有 机 体 中 芳香 族 氨基 酸 生物 合成 的 荆 草 酸 途 径 分 支 酸 [3,3]-c BL BH MAAR, PEP 是 指 磷酸 烯 醇 式 丙酮 酸 间 体 分 别 转化 为 酷 氨 酸 和 荃 丙 氨 酸 的 - 酮 酸 前 体 。 酷 氨 酸 前 体 是 分 支 酸 变 位 酶 (chorismate mutase，CMI) 与 预 葵 酸 脱 氢 酶 (CM-PDG) 融 合 合成 的 , 苯 丙 酮 酸 是 由 CM- 预 葵 酸 脱水 酶 复合 物 (CM-PDR) 产 生 的 。 两 个 复合 物 对 终 产物 反馈 抑制 敏感 。 在 融合 物 分 成 两 部 分 之 后 ,个 别 的 单 体 仍 保持 功能 ( 底 物 通道 目的 基因 融合 除外 )， 二 聚 体形 成 之 后 别 构 控 制 似乎 是 驱动 力 。 这 些 发 现 与 N- 乙 酰 葡 萄 糖 胺 -1- 磷 酸 尿 音 酰 转移 酶 (催化 葡萄 糖 胺 -1- 磷 酸 连续 的 乙酰 化 和 尿 苷 酰 化 酶 复合 物 ) 分 为 两 部 分 的 实验 资料 是 一 致 的 。 两 个 酶 分 裂 表 明 ,个 体 酶 的 动力 学 ` 途 径 总 通 量 和 机 体 的 表 型 均 没有 明显 影响 。 相 反 , 合 理 设计 的 及 半 乳 糖苷 酶 - 半 乳 糖 脱 氢 酶 和 半 乳 糖 脱 氢 酶 -细菌 荧光 素 酶 能 够 提高 底 物 加 工 能 力 。 5.2.6 结构 域 募集 通过 个 别 蛋 白质 亚 基 或 结构 域 再 组 织 产生 多 功能 蛋白 质 称 为 “结构 域 募集 ” - 124 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (domain recruitment) ,范围 从 简单 的 N 或 C 端 融合 到 多 重 内 部 插 人 和 可 能 的 环 状 变换 。 最 近 蛋 白质 结构 数据 库 (PDB ) 分 析 进 一 步 表 明 作 为 结构 域 改 组 的 一 种 结 果 ,结构 重 排 明显 贡献 给 功能 多 样 性 。 结 构 域 募集 和 它们 对 功能 影响 的 各 种 模型 ABEL Bo 桶 结构 为 代表 。 (1) 底 物 特异 性 糖水 解 酶 族 利 用 各 种 齐 -和 多 糖 作 为 底 物 ,它们 的 活性 部 位 定位 在 妈 桶 核心 结构 的 C 端 大 沟 中 。 族 各 成 员 之 间 的 底 物 特异 性 是 通过 附加 的 结构 域 调 节 的 ,其 有 效 地 关闭 活性 部 位 和 (对 着 底 物 ) 调 节 活 性 部 位 的 大 小 和 形状 。 在 E. coli 的 LacZ 中 已 鉴定 出 4 个 “附加 ”的 结构 域 , 围 作 中 心 Bo 桶 协调 地 结合 在 一 起 。 这 些 附 加 的 结构 域 完 全 代表 具有 不 同 结构 的 个 别 折 笃 单位 : 卷 饼 桶 状 结构 域 1; 纤 连 蛋 白 ， I 折 友 ( 结 构 域 2 和 4) 和 人 夹层 结构 域 5。 在 功能 上 ,结构 域 1 直接 参与 形成 活性 部 位 口袋 ,而 结构 域 2 和 4 作为 结构 域 链 节 正确 定位 结构 域 1 和 5。 结构 域 5 的 作 用 不 太 清 楚 , 它 似 乎 贡献 于 底 物 结合 ,也 可 能 与 碍 聚合 有 关 。 (2) 调节 作用 猪 胰 -淀粉 酶 (糖水 解 酶 族 另 一 成 员 ) 的 催化 活性 是 依赖 金属 辅 因子 。 结 合 钙 离子 的 部 位 是 位 于 反 平 行 B 折 笃 的 界面 上 , 插 和 人 桶 核心 结构 的 一 个 突 环 区 中 。 | 在 结合 钙 时 ,插入 稳定 结合 底 物 部 位 ,并且 间接 约束 活性 部 位 的 构象 。 磷酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶 的 结构 分 析 指 出 围绕 Po 桶 核心 结构 的 活性 部 位 有 40 个 螺旋 ,附加 结构 域 产生 天 冬 氢 酸 (一 种 酶 的 别 构 抑 制剂 ) 的 结合 部 位 。 该 酶 的 高 度 保守 的 C 端 延 伸 大 概 是 寡 聚 合 的 关键 。 (3) 转移 电子 Sacchromyces cerevisiae 黄 细胞 色素 b2( 依 赖 FMN 氧化 还 原 酶 超 族 的 一 个 员 ) 催 化 乳酸 到 丙酮 酸 , 继 之 结合 黄 素 使 电子 转移 到 细胞 色素 C 上 。 该 酶 与 超 族 其 他 成 员 的 区 别 是 结合 血红 素 结构 域 的 N 端 与 Ro 桶 状 结构 融合 形成 基本 的 活性 部 位 。 在 这 个 过 程 中 ,不 是 把 还 原 黄 素 氢 醒 的 电子 抛 到 分 子 氧 上 ,而 是 在 分 子 内 部 转移 到 结合 血红 素 的 结构 域 并 经 分 子 间 步 又 转移 到 细胞 色素 C 上 。 5.2.7. dpe FLA 涉及 血液 凝集 和 血 纤维 蛋白 溶解 作用 的 几 个 蛋白 酶 的 结构 分 析 揭 示 出 多 样 性 .重复 性 、 模 块 组 装 性 质 (图 5.53)。 这 些 模块 代表 独立 的 折 丢 单位 ,它们 的 协同 作用 最 终 贡献 给 蛋白 质 的 功能 和 特异 性 。 在 遗传 水 平 上 ,这 些 模 块 由 外 显 子 编码 。 在 模块 蛋白 质 进 化 过 程 中 ,新 基因 是 通过 外 显 子 复制 .缺失 和 重 排 产 生 的 。 外 显 子 BAC RA ANAS TUF (AS FHA), 蛋白 质 进 化 ,特别 是 多 细胞 发 育 都 涉及 到 了 模块 组 装 所 产生 的 各 种 蛋白 质 的 第 5 章 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 125 - 血 纤 维 蛋白 溶 酶 原 组 织 型 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 活 化 剂 sal 一 一 人 蛋白 质 C/ 因 子 X 尿 激酶 依赖 维生素 民 的 钙 结 合 模块 环 饼 状 模块 生长 因子 模块 指 状 模块 图 5.5 血液 凝聚 和 血 纤 维 蛋 白 浴 解 的 蛋白 酶 模块 进化 的 图 解说 明 图 中 指出 融合 到 共同 的 蛋白 酶 单位 的 模块 类 型 和 数量 ,产生 高 度 特异 的 水 解 酶 族 加 工 、. 外 显 子 改组 涉及 血液 凝集 ` 血 纤维 蛋白 溶解 和 补体 活化 的 调节 和 蛋 白质、 细胞 基质 的 大 多 数 成 分 、 细 胞 黏 连 蛋 白质 和 受 体 蛋 白质 的 构建 。 5.3 定向 分 子 进化 四 组合 定 癌 进化 过 去 10 年 ,科学 家 发 展 了 一 系列 模拟 自然 进化 机 制 和 过 程 的 方法 进化 现 有 的 酶 ( 见 第 2 章 ) ,组 合 进化 是 特别 活跃 的 研究 领域 。 组 合 进化 促进 了 蛋白 质 结构 与 功能 关系 的 阐明 、 功 能 与 进化 的 了 解 , 同 时 也 提供 进化 酶 。 组 合 进化 的 主要 方法 之 一 是 随机 -定位 突变 ,又 称 为 随机 广泛 突变 (random and extensive mutagenesis, REM). 126 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 5.3.1.1 LAX ARBEA REM 现 以 天 冬 氨 酸 酶 为 例 介 绍 REML7,31。REM 方法 的 基本 原理 见 第 2 A 2.9, | 它 是 通过 限制 某 特定 碱 基 ( 如 A) 的 浓度 ,使 引物 沿 模板 延伸 到 与 该 碱 基 配 对 的 碱 ， 基 前 (如 T) ,由 此 产生 长 短 不 一 的 分 子 群 。 酶 法 挫 人 另外 3 个 错 配 碱 基 ( 如 C,G， T) 引 起 点 突变 ,合成 片段 继续 延伸 ,经 连接 酶 连接 、 转 化 ` 尿 喀 喧 模板 法 筛选 得 突 变 株 。 该 法 有 效 地 避免 野生 型 再 生 ,产生 所 有 可 能 的 突变 又 不 需要 有 蛋 白 质 空 间 结 构 信息 指导 便 获 得 所 希望 的 突变 体 , 还 可 灵活 控制 基因 突变 的 随机 和 和 定位 性 ( 即 突 ARAM RAHI SE) ,从 而 控制 突变 库 的 大 小 ,也 可 控制 突变 碱 基 的 准确 变化 。 总 之 ,该 ， 法 具有 简便 灵活 、 高 效 、 耗 资 低 等 特点 。 由 突变 库 筛 选 2 株 酶 活力 约 为 E. coli AS1.881 菌株 10 倍 和 15 倍 的 工程 菌 。 在 此 基础 上 ,根据 化 学 修饰 和 顺序 同 源 性 分 | 析 , 用 Arg 取代 Lys-125(K125R) ,在 结构 没有 明显 改变 的 情况 下 ,功能 却 发 生 了 变 化 。K125R 突变 酶 最 适 pH8.5 (KR BE pH8.0), pH 稳定 范围 7.0 ~ 9.0( KAM pH7.0~8.0) , 热 稳 定性 好 于 天 然 酶 ,突变 酶 活力 提高 5 倍 。 为 了 保证 工程 菌 能 稳 定 地 遗传 ,在 工程 菌 的 质粒 中 插 人 来 自 pSC101 的 par 片段 ,从 而 获得 酶 活力 较 高 | 且 稳 定 的 工程 菌 。 该 工程 菌 培养 100 代 后 含 质粒 菌株 数 仍 在 90 多 以 上 ,并且 培 养 温度 升 高 到 40°C , 仍 不 受 明 显影 响 。 将 K125R 突变 菌株 用 琼脂 凝 胶 包 埋 法 进行 ， 固定 ,固定 菌 量 为 95% , 表 观 酶 活力 为 82 000 单位 ,半衰期 为 184d。 实 验 表明 ,le 固定 化 细胞 ,每 24h 约 得 L-KRAAM 30kg, 产 品质 量 达 1987 年 日 本 药 局 方 (第 九 版 ) 规 定 的 标准 。 5.3.1.2 oa- 天 冬 氨 酰 二 肽 酶 基因 REM 下 面 我 们 以 -天 冬 氢 酰 二 肽 酶 为 例 来 介绍 REM 法 [9,10 ,由 于 -天 冬 氨 酰 二 肽 酶 较为 特殊 ,目前 ,人 们 只 发 现 另 外 一 种 酶 与 其 有 同 源 性 ,所 以 我 们 无 法 利用 现 有 的 蛋白 质数 据 库 通过 计算 机 预测 出 该 酶 的 三 级 结构 。 幸 运 的 是 ,无 活性 "天 冬 氨 酰 二 肽 酶 突变 体 I 的 基因 (pepE 7) 顺 序 分 析 表 明 ,在 读 码 框 内 发 生 两 处 碱 基 替代， 致使 137 NASA BRASH 22 AMR , 120 位 的 氨基 酸 由 原来 的 丝氨酸 变 为 苏 氨 酸 。 突 变 酶 无 活性 可 能 是 由 于 Prol37 变 为 Serl37 的 结果 。 我 们 分 别 对 天 然 酶 、 突 变 酶 (P137S,S120T) 进 行 了 二 级 结构 分 析 ,二 级 结构 未 见 明显 改 变 。 由 于 Pro AW AE 酸 (N 上 只 有 1 个 氧 原子 ) ,到 目前 为 止 ,还 未 发 现 其 存在 于 活性 部 位 ,因此 我 们 推 测 , 双 罕 变 体 没 有 活性 可 能 与 Serl120 有 关 。 虽然 Ala 不 是 取代 任何 氨基 酸 的 最 适 候选 者 ,但 由 于 Ala 是 一 个 比较 随和- 的 氨基 酸 ,可 以 出 现在 任何 二 级 结构 中 ,以 它 替 换 其 他 氨基 酸 时 ,蛋白 质 分 子 构象 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 127 - 一 般 不 会 发 生 太 大 的 改变 ;另外 Ala 没有 催化 活性 ,如 果 某 一 氨基 酸 被 突变 成 Alla 后 活性 没有 太 大 的 改变 ,那么 这 个 残 基 不 是 酶 活性 必需 的 。 所 以 我 们 的 策略 是 用 丙 氨 酸 扫描 (alanine-scanning) 法 , 先 用 Ala 分 别 替 换 值 得 怀疑 的 氨基 酸 ,排除 一 些 突变 后 相对 来 说 不 影响 酶 活性 的 残 基 , 再 对 表现 出 重要 性 的 残 基 进 一 步 研究 。 对 Serl120 的 定位 诱 变 实验 结果 表明 ,ao- 天 冬 所 本 二 肽 酶 Ser120 变 为 Ala 或 Thr | 后 ,突变 酶 形 失 活性 ,说 明 Serl20 是 酶 活性 部 位 的 氨基 酸 残 基 , 考 虑 到 Ser 与 -天 冬 氨 酰 二 肽 酶 没有 特殊 的 匹配 关系 ,如 果 Serl20 是 结合 部 位 的 话 ,就 不 能 解释 w- 天 冬 所 酰 二 肽 酶 高 度 的 底 物 专 一 性 ,以 及 突变 后 的 活力 完全 丧失 。 因 此 可 以 得 出 结论 ,该 酶 应 属于 丝氨酸 蛋白 酶 类 。 根据 化 学 修饰 的 结果 , 精 氨 酸 和 组 氨基 对 酶 的 活性 是 必需 的 。 精 氨 酸 不 太 可 能 直接 参与 催化 功能 ,而 且 该 酶 对 Asp 带 负 电荷 的 侧 链 高 度 的 专 一 性 ,暗示 了 精 氮 酸 残 基 很 可 能 处 于 底 物 的 结合 部 位 ,所 以 我 们 选择 了 组 氨 酸 作为 突变 的 对 象 ,来 研 ” 究 哪 个 组 氨 酸 残 基 位 于 催化 部 位 。 通 过 二 级 结构 预测 , 酶 分 子 中 的 5 个 组 氨 酸 中 有 两 个 (His19、His227) 位 于 o 螺旋 中 ,所 以 我 们 优先 考虑 了 His68 , His157. His166. 定位 诱 变 的 结果 表明 ,His157 是 活性 部 位 的 氢 基 酸 残 基 。 研究 表明 ,o- 天 冬 氨 酰 二 肽 酶 属于 丝氨酸 和 蛋白酶 类 ,其 催化 部 位 的 氨基酸 残 基 包括 Serl120、His157、Glul192。 其 催化 二 肽 L-Asp-X 的 水 解 机 制 , 据 推测 应 类 似 于 其 他 丝氨酸 蛋白 酶 。 首 先 酶 与 底 物 结合 ,形成 一 个 非 共 价 的 酶 - 底 物 复合 体 , Serl20 的 羟基 氧 对 底 物 肽 键 上 的 痰 基 碳 进行 亲 核 攻击 ,形成 四 面体 中 间 体 ; His 157 和 Glu, ,起 广义 酸 碱 催 化 作用 ,催化 四 面体 分 解 ,形成 酰 化 酶 中 间 体 ,同时 放出 胺 。 水 作为 亲 核 试剂 攻击 酰 化 酶 中 间 体 ,形成 酶 - 底 物 复合 物 , 脱 酰 化 作用 生成 产物 L-Asp 和 X。 ou- 天 冬 氢 酰 二 肽 酶 的 3D 结构 已 解析 (图 5.6)[9] 。 它 是 由 两 个 混合 的 B 折 丢 形 成 “V" 形 ,两 侧 有 6 个 w 螺旋 。 活 性 部 位 含有 Ser-His-Glu 催化 三 元 组 (图 5.7)[9]。 活性 部 位 Serl20 位 于 较 大 的 B 折 丢 上 ,His157 位 于 较 小 的 折 释 上 ,Glul92 位 于 两 个 B 折 重 之 间 短 的 交叉 片段 上 。 它 是 第 一 个 催化 三 元 组 有 Glu 的 肽 键 水 解 酶 。 ae 天 冬 氮 酰 二 肽 酶 的 定向 进化 获得 一 进化 酶 , 酶 活性 比 野生 型 提高 47 倍 ,并 且 稳 定性 明显 增加 :上 00。 顺序 分 析 表 明 有 3 个 氨基 酸 取代 (Asn89His, Gln153Glu， Leu205Arg)。 从 3D 结构 模型 上 看 , Asn89His 非常 接近 活性 部 位 的 氨基 酸 残 基 ; Gin153Glu fF 7 His157 仅 有 4 个 氨基 酸 残 基 , 而 Leu205Arg 远离 活性 部 位 [图 5.8 (a) ]00。 残 基 89 定位 于 连接 第 四 个 螺旋 和 较 大 B 折 登 的 第 一 股 之 间 的 突 环 上 。 有 意义 的 是 残 基 89 是 GGXT 型 主 ( 残 基 87 ~ 90,X 是 任 一 氨基 酸 ) 中 非 保 守 氮 基 酸 , 它 是 活性 部 位 构象 的 关键 ,将 明显 影响 活性 而 不 破坏 二 级 结构 [图 5$.8(b)]。 His157 的 Nol 与 Glui92 Ay BRIE AY ARES DN His 的 Ne2 的 亲 核 性 , 它 通过 氢 键 同 Serl20 的 羟基 相互 作用 。 结 果 Serl20 侧 链 的 氧 原 子 成 为 强 有 力 的 亲 核 试剂 , 进 - 128 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 图 5.6 -天 冬 氨 酰 二 肽 酶 的 结构 (a) 带 状 图 解 ,箭头 表示 催化 三 元 组 残 基 的 侧 链 ; (b) 拓 扑 图 解 攻 底 物 状 基 碳 原 子 ,形成 四 面体 中 间 体 。His89 大 概 有 助 于 稳定 过 渡 态 的 负 碳 离子 中 间 体 (图 5.9) ,提高 进化 酶 的 Ke 并且 非 常 接近 底 物 结合 口袋 。Asn89His 可 以 引 起 底 物 的 结合 和 定位 的 微妙 变化 ,并 导致 酶 与 底 物 亲 和 性 的 提高 。Gin153 定位 在 较 小 B 折 友 的 第 一 股 未 端 , 离 活性 部 位 His 仅 4 个 残 基 ( 在 进化 酶 中 却 是 Glu153)。 这 个 取代 可 能 微妙 地 调整 His157 的 Ne2 BA FAIS Serl20 的 羟基 形成 氢 键 。 然 而 进化 酶 的 Glu153 的 羧基 大 概 同 Arg131 的 肌 基 形成 内 部 离子 对 [图 5.8(c)] ,提高 进化 酶 的 热 稳 定性 。Leu205Arsg 的 作用 难以 说 明 。 我 们 在 志 天 冬 氨 酸 酶 进化 酶 四 聚 体 和 ou- 天 冬 氨 酰 二 肽 酶 进化 酶 ( 单 体 ) 基 础 上 ,通过 体外 选择 获得 新 的 杂 合 酶 , 称 之 为 进化 型 条 合 酶 (evolved hybrid enzyme, EHE)。EHE 具有 340 匈 的 o- 天 冬 氨 酰 二 肽 酶 的 活性 和 87 多 的 -天 冬 氮 酸 酶 活性 。 在 酶 浓度 为 10- "mol/L AY , EHE 的 活性 可 逆 性 略 高 于 天 然 酶 。 该 结果 表明 由 进化 酶 构建 杂 合 酶 可 能 是 一 种 有 效 的 途径 。 — 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 - 129- 具有 保守 Besar. 图 5.7 uv 天 冬 氨 酰 二 肽 酶 的 活性 部 位 Asp-Ala 二 肽 与 活性 部 位 结合 。 底 物 的 氨基 同 Asp135 相互 作用 。PI1 侧 链 是 位 于 具有 保守 残 基 的 玻 水 口袋 中 ,P1' 侧 链 朝向 溶剂 。 只 有 在 痰 基 原子 和 活性 Ser 羟基 之 间 紧 密 的 接触 时 , 底 物 可 以 进一步 运动 到 活性 部 位 (a) Gin153Glu a ‘ = a Zz Leu20S5Arg Glul92 " His157 VY x \ 图 5.8 野生 型 -天 冬 氢 酰 二 肽 酶 突变 体 PepEM3074 的 结构 模型 (a) 突 变 位 置 (Asn89His、Gln153Glu 和 Leu205Arg) ; (b) His89 的 空间 位 置 和 活性 部 位 ;(c)Glul53 和 Argl131 的 位 置 - 130 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 Glu192 His1S7 Ser120 5.9 KA AER AREA BEALIE His89 如 何 加 速 活性 部 位 反应 速率 的 假设 说 明 5.3.2 ”模块 定向 进化 5.3.2.1 emg 模块 酶 (modular enzyme) 是 一 个 多 组 分 系统 ,其 中 单独 的 组 分 可 以 与 其 相关 系 统 中 功能 不 同 的 模块 进行 交换 。 现 在 , 酶 的 模块 性 质 已 经 成 为 分 子 酶 学 工程 的 强 有 力 的 概念 和 技术 基础 。 自然 界 中 的 模块 酶 并 不 普遍 ,然而 它 对 化 学 家 的 潜在 的 利用 价值 是 巨大 的 。 由 模块 酶 的 数量 和 多 样 性 出 发 ,使 人 们 能 够 根据 需要 设计 出 各 种 各 样 的 新 酶 。 1. 模块 酶 的 概念 所 谓 模块 酶 就 是 具有 模块 性 质 的 酶 。 对 一 个 有 模块 性 质 的 酶 而 言 , 它 最 低 必 须 有 一 个 模块 结构 。 典 型 的 是 多 结构 域 或 寡 聚 酶 中 的 各 亚 基 。 模 块 性 质 需要 满足 两 个 标准 :第 一 ,不 同 的 结构 域 有 不 同 的 功能 ;第 二 ,这 些 结构 域 可 以 重组 产生 藤 合 体 。 目 前 只 有 少数 酶 族 可 以 满足 这 两 个 标准 。 但 是 迅速 扩展 的 顺序 和 结构 数据 库 将 会 增加 模块 酶 族 的 目录 。 模 块 酶 类 似 于 模板 ,例如 ,催化 核糖 体 蛋白 质 合成 的 装 置 。 在 大 多 数 情况 下 ,虽然 单独 结构 域 或 亚 基 的 性 质 可 以 重组 成 藤 合 体 ,但 形成 的 艇 合体 与 其 母体 相 比较 存在 着 动力 学 缺陷 。 自然 界 模块 酶 有 三 种 情况 :中 酶 的 催化 和 底 物 特异 性 是 分 开 的 ; 包 在 多 底 物 酶 第 5 章 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 “131 - 中 单独 底 物 的 结合 部 位 是 模块 ;G) 按 程序 催化 的 代谢 途径 的 多 酶 系统 。 下 面 ,我 们 将 选择 实例 说 明 属 于 上 述 情况 的 每 一 种 酶 的 性 质 。 我 们 也 讨论 在 每 种 情况 工程 酶 的 机 会 ,以 及 它们 潜在 的 应 用 价值 。 作 为 一 种 参考 框架 ,我 们 指出 原型 模块 酶 - 核 糖 体 蛋白 质 生 物 合 成 装置 表现 出 所 有 三 种 类 型 模块 性 质 。 催 化 剂 ( 核 糖 体 ) 可 以 容 易 同 支配 底 物 特异 性 的 单元 (mRNA 模板 ) 分 开 。 对 于 肽 键 形成 反应 来 讲 , 两 个 乙 酰 化 转移 RNA 底 物 与 核糖 体 的 不 同位 点 (A 位 和 了 位 ) 结 合 。 这 个 模块 系统 所 催 化 的 多 步 途径 可 以 通过 密码 子 去 除 ,加 入 或 取代 而 程序 化 。 关 于 依赖 模板 的 DNA 和 RNA 聚合 酶 也 是 如 此 。 这 些 模块 特征 是 构建 实效 生物 催化 剂 惟一 成 功 的 基础 。 | 因此 ,更 好 地 了 解 模块 酶 的 化 学 和 生物 学 将 对 生物 催化 剂 的 开发 具有 重要 的 意义 。 2. 模块 酶 的 类 型 (1) 催化 与 分 子 识别 分 离 如 果 一 个 酶 的 化 学 反应 性 可 以 以 模块 方式 与 其 底 物 识别 分 离 ,那么 它 就 有 可 “能 产生 特殊 的 和 一 般 的 催化 剂 (或 一 族 催化 剂 )。 这 是 难以 办 到 的 ,原因 是 底 物 结 合 和 催化 活性 是 连 在 一 起 。 结 合 时 各 种 相互 作用 来 调整 底 物 相对 于 酶 活性 部 位 的 残 基 的 方位 ,并 且 优 先 稳 定 过 渡 态 。 对 于 部 分 底 物 结合 和 催化 未 偶 联 (模块 方式 ) 的 酶 的 开发 ,至 少 有 三 种 不 同 的 策略 。 它 们 包括 不 同 结构 域 的 催化 和 识别 功能 分 离 ; 可 变换 的 底 物 结合 口袋 的 进化 ; 一 般 底 物 中 模块 的 化 学 特征 (化 学 模块 ) 的 识 别 。 Fo 杂 限 制 性 内 切 核酸 酶 是 由 两 个 独立 的 折 笃 结构 域 组 成 , 它 可 通过 有 限 水 解 分 开 ( 图 $.10) 。 第 一 个 结构 域 结 合 一 个 GGATG DNA 识别 型 主 ,第 二 个 结构 域 催 化 DNA 股 分 裂 。 将 Fo 红 分 裂 的 结构 域 与 不 相关 的 转录 因子 的 DNA 结合 结构 域 融合 ,从 而 产生 具有 新 的 分 裂 特异 性 的 骨 合 体 。 降解 植物 细胞 壁 的 各 种 细菌 水 解 酶 也 表现 出 底 物 识别 和 催化 之 间 结 构 域 部 分 分 离 。 这 些 水 解 酶 (包括 木 聚 糖 酶 和 纤维 素 酶 ) 除 了 一 系列 结合 碳水 化 合 物 的 结构 域 (CBDs) 外 ,还 含有 一 个 或 两 个 糖苷 酶 的 催化 结构 域 。 催 化 结构 域 可 以 水 解 可 溶 TESLA RE ,但 是 它们 降解 植物 细胞 壁 中 结晶 的 糖 聚 合 物 需 要 CBD 结构 域 。CBD 的 作用 是 增加 酶 - 底 物 接触 。 结 合 纤维 素 和 木 聚 糖 的 结构 域 与 异 源 的 糖苷 酶 结构 域 融 合 能 够 代谢 结晶 的 底 物 。 在 不 同 基因 组 中 共 价 结构 域 模式 分 析 可 以 发 现 具有 独立 催化 和 结合 结构 域 的 其 他 模块 酶 。 但 是 这 类 酶 的 某 些 机 械 限 制 最 重要 的 是 通过 识别 结构 域 的 结合 不 能 确定 反应 底 物 的 方位 。 事 实 上 ,结构 域 之 间 的 链 节 必 须 是 柔性 的 ,所 以 ,通过 识别 结构 域 的 结合 不 能 妨碍 底 物 在 活性 部 位 的 正确 定位 。 结 合 底 物 的 有 效 浓度 通过 结 构 域 间 的 链 节 更 接近 催化 结构 域 ,从 而 决定 酶 的 选择 性 。 除了 基于 结构 域 的 分 离 外 ,催化 作用 也 可 通过 模块 结合 口袋 交换 (作为 活性 部 - 132 ”进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 图 5.10 Fo 红 限 制 性 内 切 核 酸 酶 的 催化 和 分 子 识别 结构 域 的 分 离 C 端 分 裂 DNA 的 结构 域 (TD) ;N 端 结合 DNA 的 结构 域 (I) ;DNA 双 螺 旋 (IT) 位 定位 在 同一 结构 域 ) 与 底 物 识别 分 离 。 四 膜 虫 组 工 核 酶 就 是 这 类 模块 性 质 的 酶 该 核 酶 内 部 的 指导 顺序 (intemal guide sequence, IGS) [Ff] RNA 底 物 形成 复合 体 , 给 分裂 的 底 物 以 定位 。 底 物 和 IGS 之 间 的 Watson-Crick 碱 基 配对 控制 底 物 的 识别 ， IGS 的 碱 基 取 代 可 以 产生 对 RNA 顺序 特异 的 核 酶 。 同 样 ,激酶 的 Src 族 提供 酶 同 非 多 聚 物 底 物 的 结合 口袋 模块 性 质 又 一 个 实例 。 在 Src 或 Fyn 激酶 的 核 苷 酸 结合 口袋 中 De-~>Gly, 这 个 突变 酶 可 以 有 效 地 利用 N°" EE ATP 作 底 物 。 具 有 转换 底 物 结合 位 点 的 艇 合 酶 往往 表现 出 新 的 底 物 亲和力 ,但 这 种 亲和力 与 底 物 转化 为 产物 的 能 力 无 关 。 酶 族 的 基因 改组 可 能 是 把 结合 口袋 模块 性 质 普遍 化 的 一 种 有 效 工 Leh 有 些 酶 的 催化 和 分 子 识别 通 过 识别 其 底 物 中 特殊 的 化 学 特征 (化 学 模块 ) 而 模 块 化 。 例 如 ,脂肪 酶 ( 直 链 碳水 化 合 物 ) 青霉素 G 酰 化 酶 ( 葵 乙 酰基 )、 丁 酰基 胆 碱 酯 酶 ( 胆 碱 )、 邻 葵 二 甲 酰胺 酶 ( 邻 葵 二 甲 酰胺 ) 和 芳香 基 乙 酰胺 酶 (乙酰 替 葵 胺 )。 这 些 酶 正在 用 于 处 理 复杂 分 子 的 保护 基 。 例 如 , Serratia marcescens 脂肪 酶 已 用 于 生产 钙 持 抗 剂 的 一 种 合成 中 间 体 一 一 diltiazem, 年 产 规模 50t. 到 目前 为 止 ,已 经 发 现 了 一 些 化 学 模块 酶 。 青 霉 素 G 酰 化 酶 (图 5.11) 和 几 个 脂肪 酶 的 结晶 结构 指出 了 它们 的 作用 模型 。 两 者 的 结构 揭示 活性 部 位 指 回 溶 剂 。 化 学 模块 酶 是 环境 污染 的 “清洁 工 ” ,例如 植物 ,根瘤 菌 和 土壤 微生物 的 芳香 基 乙 酰 胺 酶 降解 各 种 N- 乙 酰 葵 胺 衍生 的 农药 (例如 Propanil) 。 丁 酰基 胆 碱 酯 酶 存在 于 人 的 肝脏 和 血浆 中 , 它 清除 几 种 胆 碱 酯 ,并 解除 大 量 的 药物 毒性 ,包括 可 卡 因 。 涉 及 化 学 战 的 各 种 酶 可 以 在 耐 受 各 种 底 物 选 择 压 力 下 进化 ,涉及 这 些 过 程 的 酶 可 以 预 ODS —— a ee ee eee 第 5 章 ZARMEMaTHK - 133 - 5.11 青霉素 G 本 化 酶 识别 底 物 中 化 学 模块 ( 葵 乙 酰基 ) 活性 部 位 的 残 基 (D) ,结合 苯 乙 酸 的 碳 (I) 和 和 氧 原 子 (IIT) , 酶 的 部 分 溶剂 可 及 表面 (IV) ,有 序 水 分 子 (V)。(a) 苯 乙 酰基 部 位 被 酶 包围 , 酸 的 末端 氧 原子 指向 溶剂 ,青霉素 酰 化 酶 的 各 种 腕 和 乙醇 底 物 通过 末端 原子 系 在 苯 乙 酰 保护 基 上 。(b) 同一 活性 部 位 围绕 垂直 轴 旋 转 90%"。 葵 乙酸 末端 氧 原 子 通过 溶剂 可 及 表面 可 以 看 见 口 袋 。 该 图 是 用 INSIGHTI 蛋白 质数 据 库 IPNL 坐标 产生 的 期 是 发 现 新 酶 的 源泉 。 (2) 多 底 物 酶 中 分 子 识 别 特征 的 分 离 有 一 些 酶 催化 两 个 或 更 多 的 底 物 反应 。 在 第 一 个 产物 形成 之 前 ,所 有 底 物 与 酶 结合 的 反应 称 为 顺序 (sequential ) , 而 释放 一 个 或 更 多 产物 的 反应 称 为 乒乓 。 顺 序 酶 的 活性 部 位 可 以 随机 或 强制 程序 结合 底 物 。 在 乒乓 酶 或 强制 程序 中 ,两 者 的 底 物 结合 口袋 往往 重 又 或 彼此 相互 作用 。 但 是 在 随机 结合 时 , 双 底 物 酶 的 结合 口 袋 一 般 是 分 离 的 ,在 某 种 情况 下 ,它们 甚至 可 以 位 于 多 肽 骨架 的 不 同 结构 域 。 这 样 的 模块 酶 的 一 个 典型 例子 是 蛋氨酸 合成 酶 ,其 底 物 -高 半 胱 氨 酸 、. 甲 基 四 氢 叶 酸 、 销 胺 素 和 腺 苷 基 和 蛋氨酸 ,它们 结合 在 蛋白 质 的 不 同 区域 。 多 底 物 酶 的 分 子 识别 的 模 块 性 质 代 表 了 分 子 酶 学 工程 的 一 个 轩 新 的 起 点 。 顺序 和 结构 分 析 指 出 ,许多 进化 上 相关 的 双 底 物 酶 族 都 有 模块 分 子 识别 特征 。 利用 核 苷 二 磷酸 (NDP)- 糖 的 酶 ,例如 糖苷 基 转 移 酶 ,似乎 具有 这 种 性 质 。NDP- 糖 音 基 转移 酶 属于 大 的 酶 族 , 它 们 对 糖 和 糖苷 配 基 具 有 转变 的 特异 性 。 最 近 这 个 族 的 原型 结晶 结构 揭示 出 两 淤 结构 (图 5.12) 。 一 个 结构 域 与 NDP- 糖 结合 ,而 另 一 结 构 域 与 糖苷 配 基 结 合 。 两 个 结构 域 由 伸展 的 突 环 分 离 ,并 且 活 性 部 位 残 基 位 于 两 个 结构 域 的 界面 上 。 顺 序 比 较 指出 ,这 个 酶 的 超 族 大 多 数 成 员 保持 双 结 构 域 结构 并 且 活 性 部 位 残 基 定 位 在 两 个 结构 域 的 界面 上 。 双 结构 域 的 分 子 识别 特征 不 仅 独 立地 进化 ,而 且 往往 交换 而 不 破坏 活性 部 位 的 几何 形状 。 这 样 ,单独 结构 域 的 宽松 的 特异 性 与 该 酶 族 的 生物 合成 的 重要 性 一 起 成 为 结构 域 改 组 的 特别 诱 人 的 目标 。 - 134 - 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 图 5.12 ”模块 多 底 物 酶 的 分 子 识别 特征 双 结 构 域 MurG 糖 基 转移 酶 。NDP- 糖 和 糖苷 配 基 结合 结构 域 分 为 以 (D 和 ( 巧 ) 表 示 。 连接 这 两 个 结构 域 的 两 个 突 环 以 (II) 表 示 。 活 性 部 位 残 基 位 于 两 个 结构 域 的 界面 上 (3) 多 酶 体系 中 间 体 通道 PKSs 和 NRPSs 体系 还 说 明 模 块 催化 另 一 原理 ,这 对 one-pot 生物 催化 过 程 的 ， 发 展 将 具有 重要 意义 。 它 们 代表 了 一 个 高 度 进 化 的 模块 策略 一 一 由 一 个 活性 部 位 到 另 一 个 活性 部 位 中 间 体 通道 策略 。 通 道 (channeling) 可 以 定义 为 在 没有 同 整体 体液 平衡 的 情况 下 ,代谢 顺序 中 连续 的 各 种 酶 之 间 中 间 体 的 直接 转移 。 这 在 色 氢 酸 合成 酶 和 某 些 氨基 转移 酶 等 已 得 到 证 实 。 结 唱 学 已 鉴定 出 通道 宽 10 ~ 100A。 约束 吗 吕 和 所 由 一 个 反应 中 心 向 下 一 个 反应 中 心 扩散 。 对 于 需要 在 活性 部 位 之 间 转移 的 活泼 中 间 体 (例如 氨 ) ,通道 可 能 是 有 效 的 ,但 受 体 酶 对 同 源 底 物 的 特异 性 也 降低 。 多 酶 组 装 , 例如 , x- 酮 -脱氧 酶 脂肪酸 合成 酶 .PKSs 和 NRPSs 有 “摇摆 臂 ” (swinging arm)( 在 脱 氨 酶 中 有 酯 酰胺 ,在 脂肪 酸 合成 酶 .PKSs 和 NRPSs "Py BIZ 酰 筑 基 乙 胺 )。 这 些 摇摆 臂 是 柔性 的 ,长 约 10 ~ 15A, 通 道 共 价 结合 在 连续 的 活性 部 位 之 间 的 中 间 体 上 。 两 个 例子 说 明了 可 能 的 机 制 ,摇摆 可 以 同 其 他 的 结构 特征 ， 组 合 产生 代 谢 途 径 模块 。 第 一 ,为 了 将 辅助 的 催化 结构 域 嫁 接 到 核心 PKS 模块 上 。 这 不 仅 表明 模块 的 可 塑性 ,而且 也 指出 播 摆 臂 的 存在 以 提供 嫁接 新 结构 域 的 可 行 性 。 第 二 ,选择 蛋白质- 蛋白 质 相 互 作用 组 合 ,调整 摇摆 臂 的 化 学 结构 ,可 以 促 进 天 然 的 和 非 天 然 的 中 间 体 的 转移 。 由 于 摇摆 臂 的 需要 ,有 三 个 问题 值得 注意 : 中 这 些 机 制 似乎 局 限于 共 价 催化 系统 ; @ 选 择 链 节 以 指导 所 设计 的 催化 模块 之 间 的 中 间 体 ; @ 不 是 所 有 的 蛋白 质 一 蛋白 质 相 互 作 用 都 是 模板 。 例 如 ,在 PKS 模块 中 ,如 果 供 体 载体 结构 域 和 受 体 缩合 酶 之 间 的 相互 作用 对 链 转移 是 重要 的 话 ,那么 | | | 这些 性 质 将 随 模块 的 超 结构 而 变化 。 | 分子 生物 学 和 细 胞 生物 学 反复 地 证 明 , 生 物 大 分 子 的 模块 性 质 可 以 进化 和 工 | 程 。 根 据 模块 性 质 的 结构 和 机 制 的 了 解 将 会 构建 出 各 种 各 样 的 模块 酶 ,成 为 分 子 | 博学 工程 的 重要 领域 。 随 着 顺序 和 结构 数据 库 的 不 断 增长 ,模块 酶 将 迅速 地 成 为 工业 上 有 效 的 生物 催化 剂 。 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 135 - 站 5.3.2.2 人 工 模 块 的 随机 化 | L-RA Awe (EC4.3.1.1) Ae tk LRA ARAN BRA NH}. E. coli | 亚 的 工 天 冬 氨 酸 酶 是 由 4 个 相同 亚 基 组 成 ,并 呈 点 对 称 P2,2,2, 排列 , 单 亚 基 无 催 | 楷 动 能 ,每 个 亚 基 由 3 个 结构 域 组 成 (D1,D2 和 D3) 呈 “8" 形 [图 5.10(a)]。 中 央 结 和 域 (D2) 含 有 一 半 以 上 的 氨基 酸 残 基 , 它 是 天 冬 氨 酸 酶 - 富 马 酸 酶 族 最 保守 的 结构 Bh. D2 的 核心 是 由 5 个 长 螺旋 构成 ,其 轻微 村 曲 并 近 于 彼此 平行 , 它 对 于 保持 活 性 构象 至 关 重 要 。 由 于 亚 基 间 相互 作用 ,来 自 4 个 亚 基 的 Do 五 个 螺旋 束 形成 一 个 稳定 的 20 螺旋 得, 从 而 构成 四 聚 体 [图 $.13(b) ] 。 图 5.13 LRA ARB E (a) AOR (b) AY Molscript 图 解 螺旋 , 股 和 突 环 分 别 以 带 形 , 箭 状 和 线 表示 , PEL A hs HH DSR A 20 HR HEHE L- 天 冬 氢 酸 酶 是 一 个 重要 的 工业 用 酶 ,主要 用 于 合成 LAA AR. Ri 该 酶 不 肽 稳定 ,实际 应 用 受到 限制 。 作 为 四 聚 体 蛋 白质 ,L- 天 冬 氨 酸 酶 在 工业 生产 条 件 下 容易 解 离 ,伴随 其 活性 降低 。 在 0.4mol/L 盐酸 股 存 在 下 ,天 冬 氨 酸 酶 可 逆 地 解 离 成 二 聚 体 ,其 活力 为 天 然 酶 的 44% 。 荧 光 和 CD 研究 表明 ,二 聚 体 的 二 级 和 三 级 结构 仅 发 生 小 的 改变 。 这 些 结果 表明 ,二 聚 体 具 有 活性 部 位 的 空间 结构 ,但 不 像 四 聚 体 那 样 完 美 。 很 可 能 ,两 个 亚 基 的 反 向 排列 决定 在 空间 位 置 上 D1 和 DB 之 间 彼 此 接触 ,在 来 自 不 同 亚 基 的 D1 和 D3 之 间 的 界面 上 形成 活性 部 位 。 假 若 如 此 ,通过 模拟 二 聚 体 的 部 分 空间 结构 一 一 中 央 10 螺旋 束 和 上 述 的 “活性 部 位 ,我 - 136 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 们 设计 了 L- 天 冬 氢 酸 酶 的 突变 体 , 它 是 由 两 个 模块 (DID2 和 D2D3 ) 通 过 一 个 六 突 环 连接 形成 一 个 单 体 ,来 自重 复 D2 的 两 个 五 螺旋 束 彼此 相互 作用 恰 像 来 自 不 同 亚 基 ,如 果 突 环 采 取 适 当 的 构象 ,180* 扭 转 ,允许 D2D3( 或 DID2) 回 折 ,并 取代 其 他 的 亚 基 形成 10 螺旋 束 , 则 类 似 于 二 聚 体 (图 $5.14)。 如 果 D1 和 D3 域 间 接触 则 形成 一 个 潜在 的 活性 部 位 。 为 此 ,最 好 的 方法 是 D1D2 和 D2D3 之 间 的 插 人 顺序 随 机 化 , 继 之 根据 L- 天 冬 所 酸 酶 的 活性 体外 选择 。 我 们 由 组 合 库 中 得 到 了 一 个 高 活 性 的 突变 体 ( 相 对 活性 是 天 然 酶 的 21.3% )。 通 过 大 小 排 阻 色 谱 法 (size-exclusion chromatography) 测 定 分 子 质量 为 81kDa, 的 确 是 一 单 体 。 这 个 单 体 较 之 天 然 酶 具有 一 些 更 适 于 工业 应 用 的 特性 :活性 可 逆 性 高 于 天 然 酶 , 单 体 蛋 白质 避免 解 离 成 非 活 性 形式 , 即 稳定 ;如 果 作 为 医药 , 它 具 有 较 低 的 免疫 原 性 9521。 所 描述 的 方法 可 以 作 为 研究 如 何 将 寡 核 体 变 为 单 体 的 模型 系统 ,也 可 以 加 深 了 解 谊 聚 酶 的 进化 起 源 。 5.3.2.3 天然 模 块 的 随机 化 多 功能 酶 系统 中 一 个 最 活 竖 的 研究 内 容 是 通过 聚 酮 合 酶 和 非 核糖 体 肽 合 酶 合 成 各 种 有 机 化 合 物 吕 -51。 一 般 , 这 些 酶 是 由 多 亚 基 表征 ,每 个 亚 基 是 由 不 同 酶 活 性 的 结构 域 组 成 [图 5.15(a) ]。 通 过 这 些 “ 巨 酶 "(meta-enzyme) 合 成 的 天 然 化 合 物 包括 各 种 重要 的 抗生素 、 抗 真菌 ` 抗 肿瘤 和 降低 胆固醇 化 合 物 以 及 免疫 抑制 剂 等 。 根据 “ 巨 酶 "的 底 物 特异 性 和 产物 合成 的 方式 可 将 它们 分 为 3 种 类 型 。 利 用 乙 酰 辅酶 A(CoA) 单 体 的 两 个 已 知 类 型 的 聚 酮 合 酶 (PKS)( 类 型 I 和 ID) ,而 非 核糖 体 肽 合 酶 (NRPS) 用 氨基 酸 和 它们 的 类 似 物 作为 底 物 。 类 型 PKS 和 NRPS 通过 模块 组 装 ,而 类 型 芝 通过 重复 单 体 单 元 组 装 。 PKS 和 NPRS 的 模块 设计 产生 杂 合 酶 ,可 以 合成 天 然 和 非 天 然 代 谢 物 。 在 聚 酮 合成 中 有 4 个 自由 度 : 链 长 、ACP 结构 域 的 选择 ( 底 物 ) 信 碳 的 修饰 和 立体 化 学 和 形成 高 度 多 样 性 的 产物 库 。 同 样 , 在 NRPS 中 , 链 长 . 底 物 的 类 型 和 立体 化 学 ,以 及 它们 后 合成 衍生 化 水 平 可 以 产生 新 的 或 改进 性 质 大 量化 合 物 。 最 初 合 理工 程 PKS 和 NRPS 集注 在 改变 生物 合成 途径 ,结构 域 的 缺失 , 插 人 和 取代 [图 $5.15$(b)]。 虽 然 这 些 实验 提 供 了 关于 结构 域 和 模块 的 结构 与 功能 方面 有 价值 的 信息 ,但 功能 杂 合 酶 的 产生 是 困难 的 。 相 反 , 取 整个 模块 并 按 酶 复合 物 中 前 后 关系 排列 它们 ,这 是 产生 功能 杂 合 酶 比较 现实 的 路 线 , 共 价 及 非 共 价 连接 模块 之 间 的 链 节 区 是 目标 。 通 过 重建 之 间 - 多 肽 链 节 顺 序 或 之 内 -多 肽 链 节 顺 序 ,转换 6- 脱氧 红 霉 内 酯 B 合成 酶 (DEBS) 中 的 模块 位 置 , 并 引入 其 他 的 PKS 模块 ,产生 一 系 列 杂 合 酶 。 除了 完整 模块 转换 外 ,为 了 构建 各 种 化 合 物 库 还 对 每 个 模块 内 和 蛋白质 随 机 化 。 所 设计 的 类 型 I PKS 的 模块 对 于 构建 组 合 库 是 可 行 的 。 通 过 盒 式 取 代 DEBS 的 结 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 ，137 - (a) 模拟 一 个 活性 部 位 的 空间 结构 5.14 (a) 二 聚 体 和 单 体 志 -天 冬 氨 酸 酶 的 示意 图 ;(b) 二 聚 体 的 计算 机 模型 ; (c) 结构 域 重 排 的 LRA AURA RU 构 域 构 建 组 合 库 及 一 种 相对 简单 且 优 秀 的 多 质粒 途径 也 已 描述 。DEBS 的 3 个 基 因 被 克隆 在 分 离 的 质粒 载体 上 , 继 之 把 突变 引入 每 个 基因 使 其 多 样 化 ,将 它们 转化 到 异 源 的 宿主 中 ,根据 3 个 载体 随机 组 合 产生 相关 的 聚 酮 化 合 物 小 库 。 虽 然 该 结 - 138 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) (b) 基因 1 基因 2 EM Bibi ] 模块 2 ][ BERS | Bo TT PKS RPS 7% ee 取代 的 结构 域 173.174 最 小 PKS ES 合理 结构 域 交换 157-160 ”151,162.162 KR OOO OEY CD Swe 144,163-165 152 模块 3 模块 4 组 合 结构 域 / 147.1498 本 SED 基因 2 模块 交换 AT] 模块 1 | 模块 2 || 模块 3 结构 域 修饰 = 153 eae es Sen ghd 2 Se ©) 混合 PKS/NRPS 169-172 147-166-168 OOO COOS 模块 3 模块 4 图 5.15 3884 (PKS) PAE BEA AKG Be (NRPS ) 的 蛋白 质 工 程 (a) 在 两 个 系统 中 ,完整 的 合 酶 是 由 单独 的 各 种 基因 编码 的 多 亚 基 组 成 的 。 亚 基本 身分 为 各 种 模块 ,每 个 催化 一 个 酰基 构件 (对 PKS 而 言 ) 或 氨基 酸 ( 对 NRPS 而 言 ) 的 加 成 。PKS 最 小 模块 是 由 3 个 结构 域 组 成 :一 个 酮 基 合 成 酶 (KS)、 一 个 酰基 转移 酶 (AT) 和 一 个 酰基 载体 蛋白 (ACP)。 此 外 ,模块 可 以 含有 3 个 修饰 的 结构 域 以 衍生 聚 酮 链 的 碳 :一 个 酮 基 还 原 酶 (KR) 一 个 脱 氢 酶 (DH) 和 一 个 烯 醇 还 原 酶 (ER)。 整 个 复合 物 两 侧 有 负载 模块 (LM) 和 终止 模块 (TE)。NRPS 最 小 模块 是 由 一 个 腺 苷 酸化 (A) ,一 个 硫 代 化 (T) 和 一 个 缩合 (C) 结 构 域 组 成 。 肽 链 的 附加 修 饰 可 以 通过 差 向 异 构 化 引入 (E) 或 N- 甲 基 化 (NM) 结 构 域 。NRPS 中 负载 的 模块 是 由 腺 苷 酸化 / 硫 代 化 (AT) 结 构 域 组 成 ,而 合成 是 通过 硫 酯 酶 (TS) 完 成 。(b) PKS 和 NRPS 的 蛋白 质 工程 果 是 令 人 激动 的 ,但 是 该 方法 是 受 单一 宿主 细胞 可 以 存在 的 各 种 质粒 数 严重 限制 ， 三 重 转化 的 效率 是 低 的 ,质粒 稳定 性 是 主要 问题 。 重复 (类 型 IJ)PKS 工程 更 困难 ,这 是 因为 它们 在 天 然 产物 的 生物 合成 中 重复 使 用 单一 模块 。 因 此 ,只 用 该 类 型 的 PKS 所 产生 的 聚 酮 化 合 物 的 组 合 库 不 能 由 遗 传 编 码 多 样 性 构建 ,而 是 通过 最 小 PKS 组 装 。 最 小 PKS 通过 去 除 所 有 的 附属 蛋白 质 [例如 环 化 酶 . 酮 基 还 原 酶 及 各 种 芳香 族 酶 (aromatase) | ,把 功能 酶 复合 物 减 少 到 3 个 主要 的 结构 域 :一 个 酮 合成 酶 、 一 个 链 长 因子 和 一 个 酰基 载体 蛋白 质 。whiE 最 小 变 体 是 单一 酶 复合 物 , 它 可 以 合成 24 种 聚 酮 化 合 物 ; Streptomyces maritimus PKS 应 用 同样 的 自然 机 制 产 生 一 套 天 然 色 素 。 相 反 ,指导 特殊 代谢 产物 生物 合成 的 目 然 机 制 是 通过 附属 的 蛋白 质 (例如 天 然 whiE 系统 中 的 环 化 酶 ) 完 成 的 。 通 过 与 最 小 PKS 复合 物 非 共 价 结合 ,附属 的 蛋白 质 稳定 产物 - 酶 中 间 体 ,保证 形成 全 长 的 产 物 和 正确 的 环 化 。 这 样 一 种 系统 对 于 产生 聚 酮 化 合 物 库 是 有 价值 的 。 库 组 成 的 再 现 性 可 能 是 个 问题 ,这 是 因为 影响 多 样 性 产生 的 各 种 因子 是 未 知 的 ,而 且 对 库 中 目 标 产 物 的 鉴定 没有 直接 的 方法 。 因 此 ,需要 附加 的 合理 设计 来 构建 专 一 产生 所 和 希 望 化 合 物 的 杂 合体 。 第 5 章 蛋白 质 酶 定向 分 子 进 化 ，139 - 非 核糖 体 肽 合 酶 是 多 酶 复合 物 族 成 员 的 代表 。 它 们 代表 一 种 重要 的 和 通用 的 巨 合成 酶 类 ,涉及 肽 基 次 级 代谢 产物 (包括 青霉素 万古 霉 素 、 博 来 霉 素 和 环 孢 霉 素 A) 广 谱 生物 合成 。 这 些 化 合 物 的 生物 合成 不 仅仅 利用 天 然 氨基 酸 ,而 且 也 广 为 利 _ 用 D- 构 型 和 N- 甲 基 化 的 氨基 酸 以 及 羟基 酸 。 肽 骨架 结构 的 变化 形成 线性 的 , 环 状 的 和 分 支 的 环 状 分 子 ,并 且 这 些 结构 可 以 进行 酰 化 , 杂 环 化 ,还 原 和 糖 基 化 修饰 。 与 类 型 PKS 的 模块 设计 非常 相似 , 非 核糖 体 肽 合 酶 是 由 共 价 或 非 共 价 连 接 多 重 模块 线性 排列 而 成 [图 $5.1$(a)] 。 个 别 的 模块 负责 特殊 的 氮 基 酸 移 人 到 生长 的 肽 链 中 。 模 块 本 身 是 由 3 个 结构 域 组 成 的 :一 个 腺 苷 化 结构 域 (A 结构 域 ;活化 进入 的 氨基 酸 ) 一 个 硫 代 化 结构 域 (T 结构 域 ; 肽 基 载 体 蛋 白 ) 和 一 个 缩合 结构 域 (C 结 构 域 ;促进 肽 基部 位 和 活化 氨基 酸 之 间 的 反应 )。 像 PKS ,合理 设计 实验 已 集中 在 一 个 模块 内 的 个 别 结构 域 。 通过 NRPS 产生 肽 基 库 的 组 合 途 径 尚未 见报 道 。 考 虑 NRPS 与 模块 PKS 总 体 设计 非常 相似 ,人 们 可 以 想像 应 用 相似 的 方法 产生 肽 基 库 。NRPS 的 底 物 -识别 A- 结构 域 的 定位 诱 变 结果 产生 底 物 特异 性 的 改变 或 松弛 ,可 以 用 于 产生 异 源 产物 库 。 总 之 ,PKS 和 NRPS 的 结构 与 功能 的 研究 为 级 代谢 产物 的 生物 合成 提供 了 重 要 的 基础 信息 。 非 核 糖 体 肽 合 酶 是 模块 < 巨 酶 " ,其 应 用 于 多 个 载体 硫 代 模板 机 制 催化 组 装 大 量 的 生物 活性 肽 。 各 种 模块 包含 特殊 的 结构 域 ,其 催化 与 底 物 活化 修饰 和 缩合 有 关 的 特殊 反应 。 一 套 双 模 块 杂 合 NRPS 的 设计 和 构建 已 有 报道 ;通过 引入 腺 苷 酸 化 和 硫 代 化 (PCP) 结 构 域 之 间 的 融合 ,设计 并 合成 二 肽 形成 的 模板 ,已 在 体外 合成 了 预测 的 二 肽 。 人 工 NRPS 合成 二 肽 速率 与 天 然 模板 相似 ,NRPS C 端 硫 酯 酶 (TE) 结构 域 可 以 作为 肽 环 化 的 催化 剂 。 类 似 聚 酮 合 酶 组 装 中 的 环 化 酶 产生 红 霉 素 和 酮 类 抗生素 以 及 其 他 的 大 环 内 酯 !5]。 5.3.2.4 模块 募集 生物 合成 途径 的 进化 是 一 个 有 迷惑 力 的 问题 ,因为 途径 终 产物 往往 用 于 调节 途径 中 早期 的 酶 活性 。 有 几 种 理论 ,包括 退化 (retrograde) 假 说 ` 正 向 进化 、 突 变 酶 的 逐渐 积累 和 分 子 复原 等 已 经 在 某 种 程度 上 指出 生物 合成 途径 如 何 进化 。Jensen 假说 指出 新 酶 功能 是 由 催化 相似 反应 的 酶 的 复原 产生 的 525] ,支持 这 个 假说 的 是 遍 桃 酸 外 消 旋 酶 和 黏 康 酸 内 酯 化 酶 的 结构 和 活性 的 比较 。 这 两 种 酶 在 结构 上 是 同 源 的 ,并 且 两 者 都 催化 由 羧 酸 提 取 -质子 。 另 一 种 酶 , 半 乳 糖 酸 脱 氢 酶 与 扁桃 酸 外 消 旋 酶 有 明显 顺序 同 源 性 ,并 且 也 催化 由 羧 酸 提 取 w- 质 子 所 启动 的 反应 。 这 就 是 说 ， 与 底 物 专 一 性 明显 趋 异 的 一 些 同 源 酶 共存 于 一 个 细胞 之 中 。 了 解 自 然 界 如 何 募集 原始 酶 功能 并 使 它们 能 够 胜任 其 他 任务 ,可 以 用 于 设计 - 140+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 具有 新 性 质 的 酶 。 在 自然 界 ,新 基因 可 以 通过 外 显 子 改组 产生 。 这 表明 特异 功能 可 以 复原 和 同 其 他 基因 组 合 产生 新 酶 。 天 .coli 从 头 生物 合成 味 叭 的 第 三 步 是 由 甘 所 酰胺 核 苷 酸 (GAR ) 转 甲 酰 酶 催化 的 。 这 个 23kDa 酶 催化 甲 酰基 由 N- 甲 酰基 四 氢 叶 酸 转移 到 GAR 给 出 甲 酰基 -GAR APU ATR. E. coli 第 二 个 能 使 GAR 甲 BELAY BEE purT 基因 的 产物 ,其 与 purN GAR 转 甲 酰 酶 有 很 少 的 相似 性 ,类 似 的 G4 Bacillus subtilis 中 发 现 ,但 至 今 没 有 鉴定 出 真 核 生物 同 源 物 。purT GAR 转 甲 酰 酶 用 ATP 驱动 正 向 GAR 甲 酰 化 (用 甲酸 作为 甲 酰基 供 体 )。 甲 酸 被 认为 至 少 部 分 由 另 一 个 惟一 的 原核 生物 N"- 甲 酰 四 氢 叶 酸 水 解 酶 产生 的 ,该 酶 由 Puwrr 基因 编码 , 它 水 解 N"- 甲 酰 四 氧 叶酸 为 甲酸 和 四 氢 叶 酸 。 在 DNA 水平 上 ,在 purN GAR 转 甲 酰 酶 的 N 5"- 甲 酰 四 氧 叶酸 结合 结构 域 和 purU 的 C 端 区 之 间 有 大 约 60 狗 同 源 性 。 这 两 个 酶 提供 体外 分 子 募集 (molecular recruitment) 研 究 的 模型 系统 。 总 之 , 通 过 purN 的 GAR 结合 结构 域 和 purU 区 的 募集 产生 GAR 转 甲 酰 酶 活性 ,催化 N"- 甲 酰基 四 氢 叶 酸 的 结合 和 水 解 。 应 用 分 子 募集 和 外 显 子 改组 的 思想 产生 杂 合 GAR 转 甲 酰 酶 ,其 活性 是 天 然 purN GAR 转 甲 酰 酶 的 100 ~ 1000 倍 061] 。 该 工作 指出 purN GAR 转 甲 酰 酶 可 以 通过 募集 GAR 结合 结构 域 使 其 能 够 结合 和 水 解 N- 甲 酰基 四 和 氢 叶 酸 。 酶 设计 的 第 一 阶段 是 催化 结构 域 同 定位 受 体 底 物 的 结构 域 融合 产生 催化 剂 ; 第 二 阶段 可 以 把 催 化 的 残 基 工 程 到 具有 结合 活性 的 蛋白 质 中 产生 酶 ;第 三 个 阶段 ,把 结合 和 催化 的 两 种 残 基 引入 结构 框架 中 ,例如 Bu 桶 蛋白 。 5.3:3， 杂 合 酶 避 ] 5.3.3.1 杂 合 酶 的 概念 近年 来 ,有 关 杂 合 酶 (hybrid enzyme) 的 研究 日 益 受 到 重视 ,已 成 为 分 子 酶 学 工程 研究 的 重要 领域 。 虽 然 许多 文献 中 都 有 ”“ 杂 合 酶 "的 提 法 ,但 直到 目前 还 没有 一 个 统 一 而 准确 的 定义 ,如 果 给 杂 合 酶 以 定义 的 话 ,我 们 认为 应 该 从 结构 与 功能 两 个 方面 来 考虑 。 这 样 , 杂 合 酶 可 以 定义 为 不 同 酶 分 子 中 的 结构 单元 (二 级 结构 ,三 级 结构 ,功能 域 等 ) ,或 整个 酶 分 子 进行 组 合 或 交换 ,从 而 产生 具有 新 酶 活性 的 杂 合体 。 Hopfer 将 凝血 因子 的 N 末 端 亚 结构 域 与 胰 和 蛋白 酶 C 末 端的 亚 结构 域 重组 在 一 起 ,创造 出 一 个 有 新 活性 的 酶 ,这 个 酶 可 以 使 水 解 的 底 物 范围 变 宽 , 并 且 表 现 出 一 些 不 同 于 亲本 的 新 性 质 。 另 一 个 构建 杂 合 酶 的 例子 是 对 酰基 载体 蛋白 脱 氢 酶 (acyl carrier protein hydro- lase, ACP 脱氧 酶 ) 的 定向 进化 研究 。ACP 脱 氢 酶 可 以 在 一 定 链 长 度 的 脂肪 酸 的 特 定位 置 引入 双 键 ;植物 油 中 单一 不 饱和 脂肪 酸 的 高 含量 ,主要 是 由 这 些 不 同 底 物 专 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 ，141 - 一 性 的 ACP 脱氧 酶 造成 的 ,为 了 理解 ACP 脱 氢 酶 底 物 专 一 性 不 同 的 结构 基础 ,人 们 构建 了 一 系列 杂 合 酶 ,由 At-16:0-ACP Hit ABBA A?-18:0-ACP 脱氧 酶 相互 交换 一 段 顺 序 构成 。 经 过 筛选 产生 的 杂 合 酶 ,表现 出 底 物 链 长 专 一 性 或 引入 双 链 位 置 特 异性 的 改变 ,其 中 一 个 杂 合 酶 比 活性 比 野生 型 A-16:0-ACP 脱氧 酶 高 :对 16:0-ACP 比 活性 增加 2 倍 ,对 18:0-ACP 比 活性 增加 15 倍 多 。 在 许多 情况 下 , 同 源 区 域 间 残 基 或 结构 交换 而 获得 的 杂 合 酶 性 质 介 于 双亲 酶 之 间 ,活性 降低 。 相 似 性 越 低 , 杂 合 酶 活性 越 低 甚至 没有 活性 ,然而 利用 随机 突变 的 方法 可 以 恢复 杂 合 酶 的 活性 。 5.3.3.2 构建 杂 合 酶 的 方法 有 许多 方法 可 以 产生 杂 合 酶 ,如 DNA 改组 ,不 同 分 子 间 功能 域 交换 ,甚至 两 个 酶 分 子 的 融合 等 ,或 者 把 来 自 不 同 酶 分 子 的 ( 亚 ) 结 构 域 进 行 重组 成 为 一 个 新 的 单 一 结构 域 , 或 者 把 来 自 不 同 酶 的 本 身 没有 活性 的 模块 重组 起 来 ,同时 在 一 个 进化 体 系 中 筛选 ,就 有 可 能 获得 比 杂 本 催化 效率 更 高 ,或 者 衍生 出 新 功能 的 杂 合 酶 。 现 将 构建 杂 合 酶 的 方法 介绍 如 下 : (1) 基因 随机 缺失 法 我 们 利用 基因 随机 缺失 法 ,构建 了 天 冬 氨 酸 酶 和 u- 天 冬 氨 酰 二 肽 酶 的 杂 合 酶 ， 其 基本 方案 是 利用 核酸 外 切 酶 亚 将 天 冬 氢 酸 酶 基因 的 C 端 随机 缺失 一 部 分 ,将 -天 冬 氢 酰 二 肽 酶 基因 的 N 端 随机 缺失 一 部 分 ,并 构建 缺失 基因 文库 。 然 后 ,将 这 两 个 库 连 接 成 为 杂 合 基因 库 ,在 特定 的 选择 压力 下 ,从 受 体 菌 中 筛选 杂 合 酶 ,得 到 了 具有 7% 天 冬 氨 酸 酶 活力 和 26% ou- 天 冬 氢 酰 二 肽 酶 活力 的 杂 合 酶 。 这 两 个 酶 基因 序列 之 间 基 本 上 没有 同 源 性 ,而 且 在 蛋白 质 结 构 上 也 相差 较 大 。 天 冬 氨 酸 酶 是 一 个 四 亚 基 酶 ,而 -天 冬 氢 酰 二 肽 酶 是 单 链 酶 。 这 个 杂 合 酶 的 构建 表明 基因 随机 缺失 法 是 构建 无 同 源 序列 多 亚 基 酶 和 单 链 酶 的 杂 合 酶 的 有 效 方法 ,为 构建 杂 合 酶 提供 了 一 个 新 途 径 。 例 如 我 们 可 以 将 目前 采用 多 酶 处 理 的 多 步 反 应 工艺 过 程 , 利 用 杂 合 酶 将 反应 的 步骤 减少 ,甚至 变 为 一 步 反 应 ,这 样 将 会 大 大 降低 工业 成 本 。 (2) 同 源 基因 改组 同 源 基因 改组 可 以 产生 具有 新 性 质 的 杂 合 酶 ,这 是 构建 杂 合 酶 的 一 个 重要 方 法 。 经 常 采 用 同 源 扫 描 突 变 , 所 谓 同 源 扫描 突变 (homologue-scanning mutagenesis ) 是 几 个 同 源 酶 基因 应 用 POR 扩 增 ,然后 用 内 切 核酸 酶 分 裂 ,不 同 的 分 裂 产物 混合 并 一 起 退火 ,不 同 基因 的 同 源 区 组 合 ,用 Taq 聚合 酶 扩 增 ,含有 几 个 同 源 酶 的 基因 片段 组 成 新 基因 - 杂 合 基因 ,进而 克隆 和 表达 ,产生 杂 合 酶 。 (3) 非 同 源 基 因 改 组 很 多 酶 很 少 或 者 没有 DNA 的 同 源 性 ,可 能 有 蛋白 质 结构 的 同 源 性 。 构 建 这 样 - 142 ， 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 蛋白 质 结构 同 源 性 的 杂 合 酶 可 能 是 产生 杂 合 酶 另 一 重要 方法 。 非 同 源 基 因 的 改组 , 它 是 由 两 个 ITCHY be Ree, SO Se (incremental truncation for the creation of hybrid | ie ae enzymes) 库 组 成 的 :一 个 在 N 端 (A-B) 带 有 基因 ER 人: 一 个 在 本 端 (50) 带 有 基因 用 评委 人 司 下 相机 ——< ———= 的 A-B 和 了 B-A 的 各 种 DNA HERA, ENS 4 ® i 最 初 的 基因 大 小 几乎 相等 。 为 了 改组 需 用 PCR — 一 一 二 扩 增 ,两 个 库 (A-B 和 了 B-A,PCR 产物 基本 与 原 DO Eye” 基因 大 小 相同 ) 被 混合 ,用 DNase I YH 141 DNA -二 二 一 改组 (图 5.16) 该 法 较 传统 DNA 改组 产生 多 样 二 二 -FE 性 更 多 的 库 。 @| (4) 增长 缩短 法 增长 缩短 是 通过 缓慢 的 、 定 向 控制 DNA 的 消化 。 这 样 可 以 产生 所 有 可 能 单一 碱 基 对 缺失 图 5.16 非 同 源 改组 的 DNA 片段 库 。 鸭 建 (A-B) 和 (B-A) ITCHY 库 ( 见 3.13); - oa Ints 等 报道 了 构建 杂 合 酶 的 “增长 缩短 法 " 因 同 样 大 小 的 基因 ;四 两 个 TrCHY 库 的 基 (incremental truncation for the creation of hybrid 因 混合 ,用 DNase I 片 段 化 ,DNA 改 组 ;@ 通 enzyme，ITCHY)。 它 是 根据 在 两 个 目标 基因 片 过 模板 转换 组 装 随机 片段 ,筛选 段 之 间 产 生 单 一 碱 基 对 缺失 库 的 思想 , 继 之 这 两 个 片段 库 随 机 融合 (图 5.17)。 该 法 作为 模型 系统 已 成 功 地 用 于 E.coli 甘 氢 酰胺 核 苷 酸 转移 酶 (purN) 和 人 (hGART) 杂 合 作者 应 用 ITCHY 作为 起 点 , 导 和 人 w- 硫 代 核 苷 酸 类 似 物 (aS-dNTPs) 以 产生 增长 缩短 库 (THIO-ITCHY)。 这 个 方法 是 根据 目标 基因 PCR 扩 增 时 aS-dNTPs 随机 低频 植 入 ,然后 外 切 酶 处 理 , 结 果 形 成 在 随机 位 点 水 解 终止 ,并 一 步 产 生 缩短 库 。 (5) 应 用 蛋白 质 内 含 子 构建 杂 合 酶 蛋白 质 内 含 子 (intein) 是 蛋白 质 中 的 一 段 多 肽 链 , 靠 自我 剪 切 的 方式 从 前 体 蛋 白质 分 离 出 来 ,同时 两 端的 蛋白 质 外 显 子 (extein) 以 肽 键 的 方式 相连 (图 5.18) , 序 列 和 结构 分 析 比 较 表 明和 蛋白 质 内 含 子 的 N 端 大 约 有 100 个 氨基 酸 残 基 和 C 端 大 AAA 50 个 氮 基 酸 残 基 对 自我 剪接 至 关 重 要 ,其间 由 一 个 连接 区 序列 分 开 。 根据 http://www. neb. com/inteins html 数据 库 , 蛋 白质 内 含 子 有 8 个 模 体 。 其 中 ,A.B、F、G 属于 自我 剪接 模 体 [图 $.18(b)], 而 CD、.E\H 属 于 自我 前 切 模 体 。 模 体 中 没有 绝对 保守 的 氨基 酸 残 基 。 模 体 A 中 Cys/Ser/Thr( 图 5.18 中 C/S/T), 模 体 B 中 Thr” * Ser, #244 G 中 His-Asn 相对 保守 。 蛋白 质 内 含 子 自我 前 切 过 程 示 如 图 $.19。 总 反应 过 程 可 以 看 作 亲 核反应 。 蛋白 质 自 我 剪接 是 蛋白 质 在 后 翻译 水 平 上 的 加 工 过 程 , 即 蛋 白质 内 含 子 从 前 体 ee - tae 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 sak 二 一 一 一 一 ea a aay aaa cara Weald es DNAS & II 一 一 用 外 切 酶 聘 增 长 截 短 C 端 Fr Ex 1/1) BR Fe | 片段 随机 融合 图 5.17 在 两 个 DNA 片段 之 间 产 生 增 长 缩短 库 一 般 图 解 (a) Nin <— SARASL — Chr Cargo Se a ee a ae OF hae eR ee COOH | C/S/T = ammeme 1) 去 | [的 蛋白 质 内 含 子 中 (降解 ) NH, SDSL SSS 图 5.18 蛋白 质 内 含 子 的 结构 和 成 熟 《a) 原 型 结构 ,包括 内 肽 酶 顺序 之 间 的 Cargo; (b) 剪 接 蛋 白质 内 含 子 ,编码 两 个 分 离 的 转录 单位 ,蛋白 质 产 物 连接 形成 功能 蛋白 质 内 含 子 ,然后 切除 “本 43… ' 144+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 N- 蛋 白质 外 显 子 HO HL CHARGES N* Ser GD N-O 转 移 N- 和 蛋白 质 外 显 子 i eae 1 H | C- 蛋 白质 外 显 子 N Ser @) 转 酯 Asn O bie-f O N- 蛋 白质 外 显 Ser H， a LCE y N N- 蛋 白质 外 显 子 O ) 开展 了 细菌 w- 演 粉 酶 定向 进化 研究 。 他 们 对 野生 型 淀粉 液化 芽孢 杆菌 (BBA) 及 突变 体 BAAS201N 和 BAAN297D 进行 了 易 错 PCR 和 基因 改组 。 为 了 筛选 突变 体 , 他 们 开发 出 一 种 新 的 ,可 靠 的 适合 于 高 通 量 筛选 的 方法 (图 $.23、 图 $.24) 。 突 变 体 BAA42 在 pH7 有 1.50 一 .00 A 620,pH7 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 A 620,pH10 图 5.23 克隆 双向 筛选 系统 cu- 淀粉 酶 活性 是 在 pH10 和 pH7 测定 的 000 020 040 060 080 A 620pH10 A 5.24 DNA 改 组 库 的 筛选 < 一 DNA 改 组 库 ; 口 一 一 DNA 改组 库 ; 全 一 一 易 错 PCR FE BBA29 和 BAA42 是 两 个 突变 体 * 150 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 最 佳 活性 ,与 野生 型 比 ,pH 移动 1 个 单位 。BAA42 在 较 广 pH 范围 有 活性 ,在 pH10 活性 提高 5 倍 , 周 质 提取 物 的 活性 和 比 活性 分 别提 高 4 和 1.5 倍 。 另 一 突变 体 BAA29 具有 类 野生 型 pH, 而 周 质 提取 物 活性 提高 40 倍 , 比 活性 提高 9 倍 。 两 个 突 变 体 的 氢 基 酸 同 其 他 的 同 源 微生物 -淀粉 酶 的 氨基 酸 顺 序 比较 揭示 了 高 度 保 守 的 残 基 发 生 了 突变 , 即 W194R 、S197P 和 A230V( 图 5.25). 结构 域 C 结构 域 B 图 5.25 BAA 结 构 的 突变 该 结构 是 根据 BLA 同 源 模 型 化 应 用 Swiss Model Server 产生 的 5.3.6 稳定 性 和 活性 的 进化 29 用 定向 进化 改进 酶 的 稳定 性 和 活性 在 酶 工程 中 占有 重要 地 位 。 对 应 用 来 讲 ， 酶 的 稳定 性 和 活性 非常 重要 ,因此 也 是 酶 的 定向 进化 非常 重要 内 容 。 定 向 进化 已 成 功 地 提高 嗜 常温 或 嗜 冷 酶 的 热 稳 定性 或 在 最 适 温度 时 提高 其 活性 或 提高 嗜 热 酶 的 低温 活性 而 不 影响 其 热 稳 定性 。 例 如 ,将 嗜 常温 枯草 杆菌 蛋白 酶 E 进化 为 相当 于 其 嗜 热 同 源 物 的 thermitase(43 色 氨基酸 同 源 性 ) ,最 好 的 突变 体 仅 有 8 个 氨基 酸 改 变 ,最 适 温度 提高 17°C, ,在 65 世 半衰期 提高 200 倍 并 保持 活性 。 Therms thermephilus 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 ，151 - 核糖 核酸 酶 热 稳定 突变 体 在 4O TIN Keat/Km 提高 40 倍 。 超 级 热 稳 定 有 糖苷 酶 , 哮 热 吗 唆 甘 油 磷酸 合成 酶 可 以 进化 为 低温 活性 突变 体 。 然 而 低温 活性 往往 伴随 突变 体 稳 定性 明显 降低 ,这 就 引发 出 一 个 问题 ,是 否 低温 活性 和 高 温 稳定 性 不 相 容 。 研 究 表明 这 两 种 性 质 可 以 互相 单独 进化 。 酶 两 种 性 质 的 相关 性 研究 认为 可 能 是 筛选 的 结果 (仅仅 选择 一 种 性 质 )。 哮 常温 枯草 杆菌 蛋白 酶 (SSI) 的 随机 突变 产生 的 第 一 代 突变 体 同 野 生 型 比较 ,在 LOT Kea BET 2 倍 ,在 TOC AYE EHS On 1.4 倍 ; 热 稳 定性 更 高 的 突变 体 在 OTH Ky, Al 玉 ss 值 表明 ,低温 催化 转换 率 所 要 求 的 构 象 柔 性 仅 局 限于 活性 部 位 , 底 物 结合 水 平 降 低 了 ,而 总 的 稳定 性 或 柔性 不 降低 。 关 于 在 稳定 性 和 活性 中 酶 柔性 的 内 涵 用 进化 的 热 稳定 的 对 硝 基 葵 基本 酶 突变 体 已 进 行 了 详细 的 研究 [2] 。 在 嗜 冷 枯草 菌 蛋 白 酶 S41 体外 进化 过 程 中 ,应 用 提高 热 稳定 性 和 低温 活性 选择 压力 筛选 出 催化 活性 和 热 稳定 性 都 提高 的 突变 体 。 5.3.7 底 物 特异 性 的 进化 两 种 酶 如 果 有 紧密 相关 的 催化 机 制 或 结构 ,那么 ,由 一 种 酶 进化 为 另 一 种 酶 ， 即 产生 底 物 特异 性 的 新 酶 的 概率 就 可 能 高 。 例 如 脂肪 酶 和 酰胺 酶 ,两 种 酶 的 底 物 通过 Ser-His-Asp 三 元 组 转变 。 如 果 酰 胺 酶 底 物 被 脂肪 酶 接受 或 反 则 亦 然 ,产生 底 物 特异 性 的 新 酶 的 机 会 就 多 。 底 物 特异 性 定向 进化 可 分 为 以 下 3 组 (图 5.26) :不 能 转化 底 物 。 原 则 上 在 研究 的 条 件 下 酶 可 接受 底 物 ,但 由 于 立体 障碍 ,电子 效应 等 不 能 转化 底 物 。@ 可 转 化 底 物 。 底 物 转化 通常 是 由 紧密 相关 的 其 他 酶 催化 。@ 目 标 酶 活性 低 。 目 标 酶 可 以 转化 底 物 ,但 同 天 然 底 物 比 活性 低 。 组 1 Fersht 等 由 引 唆 -3- 甘 油 磷 酸 合成 酶 (IGPS) 的 (Ba)s 桶 骨架 进化 磷酸 核糖 酰基 邻 氨基 葵 甲 酸 异 构 酶 (PRAI) 活 性 [2]。 它 们 成 功 地 提供 了 酶 进化 “保守 骨架 "假说 的 典型 范例 。PRAI 的 突 环 系统 设计 到 IGPS 上 ,用 DNA shuffling 和 StEP 定向 进 化 。 活 性 突变 体 应 用 在 色 所 酸 缺 乏 情 况 下 不 生长 的 E. coli 菌株 进行 琼脂 平板 鉴 定 ,突变 体 与 PRAI 有 28 多 的 同 源 性 ,与 IGPS 有 90 多 的 同 源 性 。 基 因 改 组 把 涉及 组 氨 酸 生物 合成 的 ProFARI[L ( N'-5- 磷 酸 核糖 酰基 ) 亚 胶 甲 基 -5- 氨 基 咪 唑 -4- 羧 酰胺 核 苷 酸 异 构 酶 ] 转 为 在 色 氨 酸 生 物 合成 中 催化 同样 反应 的 具有 PRAI 活性 的 突变 体 ( 图 5.27)。 组 2 DNA 改组 已 成 功 地 把 E. coli LacZ 及 半 乳 糖苷 酶 转 为 岩 藻 糖苷 酶 和 将 环 糊 精 糖苷 转移 为 淀粉 水 解 酶 力 '%] 。 根 据 生 色 岩 薄 糖 底 物 每 轮 筛选 约 10 000 克隆 ,鉴定 出 进化 的 岩 薄 糖苷 酶 ,与 野生 型 比较 ,对 岩 藻 糖 底 物 Keat/Km 提高 10 ~ 20 倍 。 与 * 152 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) na oa GH a — mete A EL i 乙酸 OH H (b) 半 乳 糖苷 H HO O + ROH HO Y, are OH OH O-R OH lalided 葡萄 精 A R (9) Ze PLA rs CaN. it (R) Oo” ~O { 4 RCOOH RY OOP E 肪 Ho. A _0-P-x Oo 脂肪 酶 | O (很 慢 ) Oo 磷脂 1- 浴血 磷脂 脂肪 酸 图 5.26 酶 的 新 底 物 特异 性 可 能 的 底 物 (a) 各 种 酯 酶 不 作用 于 叔 醇 的 酯 (组 1);(b) 各 种 半 乳 糖苷 酶 只 接受 半 乳 糖苷 作为 底 物 ,而 不 接受 葡 糖苷 (组 2);(c) 某 些 脂肪 酶 ,例如 Rhizopus sp.，Bacilius sp. 或 Staphylococcus sp. 脂肪 酶 ,活性 明 显 低 于 磷脂 酶 A(PLAI)( 组 3) 2-O;PO O、_NHR egg >-Q3PO OH eS we NHR HO OH 5.27 ”ProFARI( 涉 及 组 氨 酸 生物 合成 ) 和 PRAIH ARAB) HU RE HE 天 然 及 半 乳 糖苷 酶 比较 ,最 终 进 化 酶 底 物 特异 性 ( 邻 - 硝 基 葵 基 岩 藻 吡 喃 糖 昔 : 邻 - 硝 基 茶 基 半 乳糖 吡 喃 糖苷 ) 提 高 1000 倍 ;同样 对 硝 基 苯酚 衍生 物 底 物 特异 性 提高 300 倍 。 定向 进化 将 环 糊 精 糖苷 转移 酶 转 为 淀粉 水 解 酶 。u- 省 粉 酶 族 或 糖苷 水 解 酶 是 一 大 族 淀粉 加 工 酶 。 催 化 结构 域 的 (Ba)s 桶 折 麦 ,催化 部 位 的 残 基 和 键 分 裂 机 制 * « 1153.5 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 是 保守 的 ,但 产物 和 反应 特异 性 是 不 同 的 。 环 糊 精 糖 苷 转移 酶 (CGTase) 是 该 族 的 一 个 成 员 ，， 其 形成 环 状 a- (1,4) BEEP HE AY) Lys232 Asp229\ 0- pe His 140 O H2N Thrl41 i ge | OH OH Phe259 HO f eee O +2 “2 ¢ on 9 Cy» Phe183 ~ x: Tyr89 on ee re Q on” me HO : cnt I / y QO . _,4-OH 2 os =4 es OH O -5 六 OH Tyr195 O HO i ees \ O 天 OS — Asni93 y180 NNH_、 / _.--H.N ep a2 8 HO Asp196 O ‘ n THO P Ie HO. y OH" oo ee wr J \ Tyrl67 ~ a7 1 RN 一 H2O @ on | ; \ Gly179N Pe Sy " Alal44 ore. 6 te HO ei, ori 8 aut 9 Asp147 图 5.28 maltononaose 底 物 和 环 状 芽孢 杆菌 CGTase 合 底 物 裂缝 之 间 相 互 作 用 图 解 箭头 指出 切割 亚 位 点 -1 和 +1 之 间 键 ;虚线 表示 氢 键 。Arg47 和 Asn94 不 与 未 分 裂 的 底 物 相 互 作用 ,但 它们 与 反应 中 间 体 相互 作用 并 产生 7Y- 环 糊 精 。Phe183 和 Phe259 与 糖 环 臣 水 堆积 - 154 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 窒 糖 (由 6 个 7 个 或 8 个 葡萄 糖 残 基 组 成 ,分 别 为 - 环 糊 精 、B 环 糊 精 和 7- 环 糊 精 )。 它 由 5 个 结构 域 (A~E) 组 成 ;结构 域 A 和 B 组 成 催化 结构 域 , 结 构 域 忆 涉 及 结合 生 淀粉 ,而 结构 域 C 和 D 功能 未 知 。 在 底 物 结合 之 后 , 穿 过 几 个 糖 结合 亚 位 点 (图 $.28 中 -7~2) ,在 亚 位 点 -1 和 +1 之 间 的 w(1,4)- 糖 苷 键 分 裂 产生 共 价 糖 苷 基 - 酶 中 间 体 ,其 结合 在 共 体 的 亚 位 点 (-1, -2, -3 等 )( 图 5$.29)。 下 一 步 反 O, a O HOPRARARA RA RAPA es 外 | TIEE Asp229 PEPER REPLY cA be A OH | se | oe | we SN CY ae， Bande 图 5.29 CGTase 催化 反应 的 图 解 在 键 分 裂 之 后 , 共 价 结合 反应 形成 酶 - 糖 基 中 间 体 。 反 应 的 第 二 步 ,反应 中 间 体 被 转移 到 受 体 分 子 。 在 环 化 反应 中 , 共 价 连接 的 寡 糖 的 未 端 OH-4 基 团 作为 受 体 ， 而 水 或 第 二 个 糖 作为 水 解 和 不 相称 反应 的 受 体 第 5 章 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 '， 155 - 应 , 受 体 分 子 结合 在 受 体 亚 位 点 + 1 并 分 裂 糖 基 - 酶 之 间 的 键 。 在 环 化 反应 中 , 共 价 结合 糖 的 非 还 原 端 作为 受 体 产生 环 糊 精 。CGTase 也 可 以 用 水 或 第 二 个 糖分 子 作为 受 体 , 分 别 产 生 水 解 或 不 相称 反应 。 水 解 和 转 糖 基 反 应 的 相对 效率 是 由 用 于 反应 的 受 体 性 质 和 受 体 亚 位 点 的 性 质 决 定 的 。CGTase 对 糖 基 受 体 明显 优先 ,这 是 由 于 其 转 糖 基 化 活性 远 高 于 水 解 活性 。 在 受 体 亚 位 点 + 2 突变 可 以 把 CGTase 变 为 淀粉 水 解 酶 ,然而 ,在 其 他 亚 位 点 突变 对 水 解 / 转 糖 基 化 比率 影响 不 大 。 为 了 解 释 转 糖 基 化 反应 的 特异 性 提出 在 受 体 亚 位 点 + 1 结合 糖 而 不 是 水 。 为 了 鉴定 限制 CGTase 水 解 活 性 和 转 糖 基 化 反应 特异 性 的 氨基 酸 残 基 ,Dijkhuizen °°! xp HAR AF 14 FA ( Bacillus circulans )251 (BC251) CGTase 随机 突变 并 选择 水 解 活 性 提高 的 突 变 体 , 明 显 提 高 CGTase 的 水 解 活性 ,并 使 其 转 为 演 粉 水 解 酶 。 在 3 轮 易 错 PCR 突 变 后 ,水解 活性 提高 90 倍 ,是 至 今 报道 最 高 活性 的 CGTase。 组 3 野生 型 已 .col 的 醛 缩 酶 几乎 不 接受 非 磷酸 D-2- 酮 基 -3- 脱 氧 和 葡萄 酸 (KDG)。 几 轮 epPCR 和 改组 鉴定 出 对 KDG 活性 明显 提高 的 突变 体 ,最 好 的 突变 体 催 化 效 率 提高 70 倍 B0 。 上 述 的 例子 证 明定 向 进化 是 改进 酶 底 物 特异 性 的 有 效 工 具 ; 它 可 以 解决 传统 筛选 和 培养 方法 存在 的 瓶颈 问题 ; (Ba)s 桶 酶 的 进化 也 证 实 定向 进化 可 以 克服 不 同 酶 之 间 的 功能 和 结构 障碍 。 5.3.8 对 映 体 选 择 性 的 进化 手 性 有 机 化 合 物 的 立体 选择 合成 具有 重要 的 科学 和 工业 意义 。“ 手 性 市 场 " 迅 速 扩展 , 仅 2000 年 手 性 药物 总 销售 额 超过 1000 亿美 元 。 目 前 ,工业 最 常用 的 方法 是 经 典 对 映 体 分 离 ,但 需要 化 学 计算 量 的 光学 活性 试剂 和 大 量 的 有 机 溶剂 。 由 于 生态 和 经 济 原因 ,不 对 称 酶 催化 预期 会 更 有 效 , 可 以 提供 活性 和 高 对 映 体 选 择 的 催 化 剂 ,催化 非 对 称 转化 ,或 者 外 消 旋 化 合 物 的 动力 学 拆 分 或 者 前 手 性 底 物 反应 。 两 种 催化 剂 一 一 过 渡 金 属 催化 剂 和 生物 催化 剂 是 有 效 的 。 非 对 称 过 渡 金 属 催化 需要 有 效 配 体 的 调节 ,这 是 一 个 困难 的 目标 。 酶 抗体 酶 和 核 酶 已 引起 人 们 的 关注 。 酶 已 用 于 某 些 手 性 中 间 体 对 映 体 选 择 的 生产 过 程 ,例如 脂肪 酶 催化 环 氧 酯 的 动力 学 拆 分 已 用 于 高 血压 治疗 药物 Diltiazem 的 生产 。 然 而 ,这 些 催 化 剂 对 映 体 选 择 性 可 能 很 弱 ,与 过 渡 金 属 催 化 中 配 体 调 节 相 似 。 定 向 进化 已 用 于 提高 对 映 体 选 择 性 。 该 思想 是 从 低 对 映 体 过 量 (ee) 或 选择 性 因子 (E) 值 的 野生 型 酶 出 发 ,以 既定 转化 (A->B) 为 目标 ,建立 突变 体 基 因 库 , 继 之 表达 和 筛选 。 ' 156 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 5.3.8.1 酶 基因 的 突变 、 表达 和 酶 分 尖 建立 定向 进化 方法 的 第 一 步 是 发 展 有 效 的 表达 系统 ,特别 是 超 表达 与 酶 分 泌 偶 联 。 一 个 突出 的 例子 是 枯草 杆菌 蛋白 酶 。 然 而 ,许多 目标 酶 不 服从 这 样 的 系统 ， 包括 假 单 孢 杆 菌 的 各 种 脂肪 酶 。 编码 细胞 外 酶 的 基因 通常 在 标准 宿主 羽 . coli 中 超 表达 ,但 是 蛋白 质 将 在 细菌 胞 质 中 形成 失 活 的 包涵 体 。 为 了 解决 这 一 问题 ,用 革 兰 氏 阴 性 菌 绿 脓 杆 菌 ( Psev- domonas aeruginosa ) 作 为 表达 和 分 沁 和 宿 主 。 该 菌株 产生 并 分 泌 各 种 胞 外 酶 ,包括 各 种 水 解 酶 和 假 单 孢 杆菌 的 各 种 酶 ,它们 折 友 和 分 泌 是 高 度 特 异 的 有 规则 的 过 程 ,至 少 已 鉴定 出 5 种 不 同 的 分 泌 途 径 , 它 们 是 由 3 ~ 20 种 不 同 蛋 白质 组 成 的 复杂 细胞 分 泌 机 构 。 构建 的 P. aeruginosa 菌株 PABST7.1 带 有 强 T7 启动 子 , 酶 基因 超 表达 。 编 码 噬菌体 T7RNA 聚合 酶 的 基因 T7pol 已 克隆 在 启动 子 之 后 ,该 启动 子 可 以 被 直接 定 位 在 T7pol 下 游 Lacl? 基因 编码 的 Lac 阻 遏 蛋白 所 抑制 。 这 些 基因 稳定 地 整合 到 脂肪 酶 缺陷 型 P. aeruginosa 菌株 PABS1 的 染色 体 上 (图 $.30) ,结果 形成 超 表达 菌 株 P. aeruginosa PABST7.1。 此 外 ,构建 的 菌株 P. aeruginosa PAFR7.7 含有 直接 捅 attL T7 pol Laclq attR fied Ss 区 Paste Peseta tet CHE | Wik Pa SRE | LipA —_———— a ee 4。 ee) PT7 yy 2 t é ss lipA < a lipA lipH > lip, x See / iS Ay is 法 ; er’ Rh | pUCPL6AN | 机 构 gem gmc 2 wr 7500bpe fen 六 LipA 一 ; 多 Namp gt Pseudomonas aeruginosa 图 5.30 Pseudomonas aeruginosa 基因 的 超 表 达 和 酶 分 泌 系 统 的 构建 含有 T7pol 基因 的 只 菌 粒 被 整合 到 脂肪 酶 缺陷 菌株 已. aeruginosa PABS1 的 染色 体 上 。 质 粒 pUCPL6AN 是 由 pUCPKS 构建 的 。T7RNA 聚合 酶 的 转录 是 通过 加 入 蜡 丙 基 -RD- 硫 代 半 乳糖 苷 诱 导 , 然后 聚合 酶 指导 脂肪 酶 操纵 子 的 转录 。 脂 肪 酶 正确 地 折 释 并 分 泌 到 细菌 培养 上 清 液 中 , 用 于 检验 脂肪 酶 的 活性 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 157 - 人 脂肪 酶 结构 基因 LipA 中 的 77pol 基因 。 两 个 菌株 很 适 于 突变 体 脂肪 酶 基因 的 超 表 达 。 应 用 该 技术 可 以 容易 把 77pol 基因 定位 到 细菌 染色 体 中 ,因此 人 允许 构建 P. aeruginosa 的 超 表 达 菌 株 以 筛选 定向 进化 的 任何 酶 。 该 系统 的 第 二 部 分 包括 质粒 pPUCPL6AN, 其 中 脂肪 酶 操纵 子 LipA/XH 被 克隆 在 T7 启动 子 之 后 (图 5.30)。 该 质粒 含有 惟一 Nhel 和 Apal 位 点 ,它们 定位 在 脂肪 酶 结构 基因 lipA 的 $- 和 3'。 当 构建 物 用 于 定向 进化 实验 时 ,可 以 克隆 任何 突变 脂 肪 酶 的 基因 (这 是 特别 重要 的 ) ,并 且 突 变 引 入 既 不 影响 信和 号 顺序 也 不 影响 3' 调 节 区 或 特异 的 脂肪 酶 的 折 笃 酶 (foldase) ,因此 ,可 以 避免 不 需要 的 突变 体 表达 。 这 个 系统 已 成 功 地 用 于 突变 体 脂 肪 酶 大 库 的 超 表 达 和 分 沁 。 5.3.8.2 脂肪 酶 突变 体 催化 手 性 酯 的 动力 学 拆 分 世 - 下 旨 肪 酶 是 有 机 化 学 最 常用 的 酶 ,催化 羧 酸 酯 水 解 或 在 有 机 溶剂 中 的 逆反 应 。 天 然 酶 的 对 映 体 选 择 性 是 弱 的 ,在 约 $0 多 转化 (8)- 酸 10 时 ,有 5%ee( 图 5$.31) 选 择 因子 EL[ 反 映 (8)- 和 (R)- 底 物 反应 的 相对 速率 ] 只 是 1.1。 R ae R ot R sds die pe. SR MAT Bi a = OH CH;3 Als Wy CH3 CH3 rac-9 (R)-10 R=n-Cx, H)7 (S)-10 5.31 外 消 旋 酯 水 解 动力 学 拆 分 当 进 行 随机 突变 时 ,首先 需要 考虑 拓展 蛋白 质 的 顺序 空间 脂肪 酶 是 由 285 个 氨基 酸 组 成 ,理论 上 有 20 守 种 不 同 的 突变 体 。 按 照 结 构 改变 的 最 小 量 , 即 每 个 酶 分 子 只 有 一 个 氨基 酸 取代 的 话 , 根 据 W = 19” x285! /[(285- M)! x MI!], 其 中 M = 每 个 酶 分 子 氨 基 酸 取代 数 (这 里 M = 1) ,突变 体 N 库 理 论 上 有 5415 成 员 。 然 而 ,由 于 遗传 编码 的 元 余 度 ,通过 epPCR 产生 库 ( 含 有 全 部 的 5415 突变 体 ) 是 不 可 能 的 。 如 果 突 变速 率 增加 至 这 样 一 种 程度 ,每 个 酶 分 子平 均 交 换 两 个 氨基 酸 (M = 2) , 那 绿 腑 杆菌 脂肪 酶 突变 体 数 通 过 上 述 算法 预计 增加 到 1.5 亿 , 即 使 应 用 目前 有 效 的 高 通 量 筛选 系统 也 很 难 检 验 。 当 M = 3 ,突变 体 数 是 520 亿 。 最 初 的 策略 是 根据 相对 低 突 变速 率 (M = 1) ,逐步 改进 对 映 体 选 择 性 。 当 产生 成 千 上 万 脂肪 酶 突变 体 (或 任何 其 他 的 酶 ) 时 ,这 个 问题 是 难以 解决 。 然 而 这 个 问 题 从 未 出 现 , 由 于 在 琼脂 板 上 所 获得 的 细菌 克隆 ,每 个 都 来 自 单一 细胞 ,这 意味 着 每 个 细菌 克隆 只 产生 一 个 突变 酶 (有 的 可 以 产生 一 个 以 上 )。 然 后 细菌 克隆 通过 克 - 158 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 隆 采 集 器 自动 收集 ,并且 在 含有 营养 汤 的 微量 脂 酸 冻 点 板 上 各 和 孔 中 生长 。 在 这 种 方式 中 ,每 个 孔 的 上 清 只 含 一 种 突变 体 。 脂肪 酶 的 定向 进化 过 程 见 第 2 章 中 图 2.1。 第 一 轮 产生 只 有 1000 突变 体 的 库 ,最 好 的 突变 体 ee =31% ,下 =2.1, 第 四 轮 ,ee=81% ,已 =11.3( 图 5$.32)。 当 进 行 随机 突变 时 ,首先 需要 考虑 开拓 和 蛋白质 的 顺序 空间 ,由 一 代 突 变 体 到 下 一 代 突 变 ee AE (£ =11;3) 0 1 2 3 4 5 突变 体 代数 图 5.32 ”提高 脂肪 酶 催化 手 性 酯 水 解 的 ee 和 五 值 体 ,在 蛋白 质 顺序 空间 可 能 有 许多 不 同 “ 途 径 ”。 这 样 ,如 自然 进化 本 身 一 样 ,有 许 多 分 枝 的 树 (图 5.33) ,需要 发 现 最 短 的 可 能 路 线 疏 上 “ee 树 ”( 或 "三 树 ")。 用 符号 表示 突变 体 的 进化 ,其 催化 带 有 相反 绝对 构 型 产物 的 形成 。 虽 然 图 中 说 明 相 当 复 杂 , 但 也 指出 对 于 给 定 的 反应 ,产生 和 发 现 高 对 映 体 选 择 的 催化 剂 不 是 惟一 的 。 这 意味 着 应 当 尽 可 能 的 获得 不 同 突变 体 的 整个 族 , 对 给 定 的 的 反应 都 具有 高 对 映 体 一 种 策略 不 仅 适 用 于 脂肪 酶 催化 的 模型 反应 9->10, 而 且 也 在 其 他 对 映 体 选 择 酶 的 进化 上 证 明 是 有 效 的 。 这 种 策略 是 首先 对 每 代 最 好 突变 体 进 行 DNA 顺序 测定 ,以 确定 对 映 体 选择 性 起 作用 的 氨基 酸 取 代 的 位 置 和 性 质 。 典 型 的 资料 如 图 5.34 所 示 。 脂 肪 酶 中 存在 着 改进 对 映 体 选 择 性 的 敏感 位 置 ( “热点 " )。epPCR Ali 和 突变 的 组 合成 为 探索 “热点 ”的 主要 方法 。 的 确 这 个 策略 导致 高 (8)- 选 择 突变 体 的 产生 (ee=88% ~91%; 巨 =20~25) ,它们 都 是 母体 野生 型 脂肪 酶 派生 的 。 为 了 进一步 开拓 和 蛋白质 顺序 空间 ,采用 了 epPCRZDNA shuffling 和 修饰 组 合 多 重 盒 式 突 变 CMCM( 图 5.35). Ja#4 DNA shuffling 的 特殊 类 型 , 它 可 以 产生 突变 基因 库 ， 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 ，159 - 野生 型 图 5.33 ”对 映 体 选 择 性 蛋白 质 顺 序 空 间 复杂 度 的 “进化 树 "简化 图 解 数字 表示 各 自 世 代 突 变 和 筛选 得 到 的 正 突 变 酶 。 下 指 稍 头 表 示 下 线 突变 体 (数字 之 外 的 少数 正 突变 体 ) 突变 体 代 数 epPCR .Nu 155 位 也 和 突变 ; 一 155 位 定位 突变 图 5.34 脂肪 酶 突变 体 催 化 酯 9 的 对 映 体 选 择 ( 氨 基 酸 用 单字 母 表示 ) 其 中 盒 是 由 随机 或 确定 顺序 组 成 ,并 且 野 生 型 被 随机 地 挫 人 。 采 用 40H4 + 38C8 两 个 突变 体 ,在 位 置 13553 和 162 饱和 , 继 之 表达 和 筛选 ,获得 的 突变 体 18, E > 51， ee> 95% ,活性 高 且 稳 定 。DNA shuffling 的 几 种 形式 相当 成 功 。 另 一 个 有 趣 的 问题 是 关于 对 映 体 选 择 性 逆向 可 能 性 。 初 步 实验 证 明 对 映 体 选 - 160 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 S155M_ L162G Sere 4s Re ei ew ae: BCR ke] xen BC ieh 重 装 ae oH @ ee ——- @&_I-j — + ke [e@exire 突变 基因 Ly * ee + 其 他 突变 体 |- 友 | (©) 155NNN) 162(NNN) 图 5.35 ”脂肪 酶 基因 的 修饰 组 合 多 重 盒 式 突变 图 解 (N 表示 任 一 氨基 酸 ) 择 性 逆向 性 是 可 能 的 (图 $5.36)。 由 图 可 见 , 在 同一 库 中 ,(8)- 及 ( 尺 )- 选 择 突变 体 共存 。 上 述 实验 不 仅 代表 对 映 体 选 择 酶 定向 进化 的 第 一 个 实例 ,而 且 也 是 对 映 体 选 择 酶 顺序 空间 开拓 的 最 全 面 研究 的 例子 。 P. aeruginosa 脂肪 酶 的 3D 结构 以 共 价 结合 抑制 剂 复合 物 形 式 被 解析 (分 辩 率 在 2.54A )。 它 有 oB 水 解 酶 折 肥 ,由 两 侧 螺旋 围绕 的 6 BORA RBA. 化 三 元 组 是 由 Ser82、Asp229 和 His251 组 成 。 含 有 His251 的 突 环 由 八 面体 配 位 的 钙 离子 所 稳定 。 无 或 有 底 物 决 定 这 个 酶 取 闭 合 或 开放 构象 ( 酶 结构 是 以 开放 构象 解析 的 )。 在 这 个 构象 中 ,可 以 鉴别 出 氧 阴离子 穴 的 位 置 以 及 可 以 容纳 脂肪 酸 链 三 个 底 物 结合 口袋 。 保 持 底 物 酰基 基 团 的 主要 力 是 范 德 华 力 相 互 作用 。 栈 基 口 袋 的 大 小 和 相互 作用 是 酶 对 映 体 优 选 的 主要 决定 子 。 野生 型 P. aeruginosa 脂肪 酶 的 3D 结构 可 以 定位 突变 酶 的 取代 位 置 和 合理 说 明 突 变 效应 (图 5.37)。 最 佳 的 脂肪 酶 突变 体 (94G12) 对 底 物 (9)(S) 对 映 体 的 选择 性 是 由 五 个 氨基 酸 取代 表征 , 即 V47G\V55G、S149G、S155SF 和 S164G, 其 中 4 个 取 代 引 入 甘氨酸 , 它 可 以 增加 脂肪 酶 的 整体 构象 柔性 。 和 柔性 是 决定 野生 型 Geotrichun candidum 和 Rhizomucor miehei 真菌 脂肪 酶 底 物 选择 性 的 重要 参数 。 然 而 ,这 些 酶 的 核心 似乎 明显 是 刚性 的 ,而 柔性 结构 域 局 限于 少数 表面 的 突 环 (此 结 果 是 分 子 动力 学 模拟 得 出 的 ) 。 这 样 的 骨架 包含 结构 保守 和 刚性 的 B 结 构 域 以 及 少数 暴露 表面 的 突 环 。 令 人 惊奇 的 是 突变 体 94G12 中 5 个 取代 的 氮 基 酸 没有 一 个 在 活性 中 心 部 位 与 结合 底 物 直接 接触 ,这 样 排除 直接 空间 影响 对 映 体 选 择 性 。 各 种 取代 直接 定位 或 紧邻 突 环 ( 突 环 涉及 酶 由 闭合 到 开放 构象 的 过 渡 )。 在 许多 其 他 的 对 映 体 选 择 的 突变 体 中 也 发 现 了 相似 的 模型 。 空 间 上 由 活性 部 位 去 除 氨 基 酸 取代 的 遥控 效应 将 影响 酶 的 活性 和 稳定 性 ,这 是 第 一 个 观察 到 影响 立体 选择 性 的 遥控 氨基 酸 取代 。 氨基 酸 Val47 和 Val55 直接 或 间接 涉及 氧 键 网 络 , 它 把 His14 固定 在 螺旋 02 和 股 人 和 螺旋 o2 之 间 的 突 环 上 。His14 本 身 是 含有 涉及 氧 阴离子 穴 形成 Met16 突 环 的 一 部 分 (一 种 过 渡 态 形成 的 结构 前 提 )。 因 此 ,取代 V47G 和 V55G 可 以 预期 增加 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 ，161 - (S) -选择 性 三 过 51 50 (ee>95%) 40 mm EF =34 30 点 突变 = Z | 20 盒 式 10 点 突变 野生 型 1 10 和 DNA 改 组 20 30 mm 万 = 30 (R) -选择 性 图 5.36 脂肪 酶 突变 体 催化 酯 9( 8) -或 (R)- 选 择 性 162 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 图 5.37 Pseudomonas aeruginosa 野生 型 脂肪 酶 和 射线 结晶 结构 图 中 标 出 对 映 体 选择 突变 体 94G12( V47G., V55G.S149G, SI55F 和 S164G) 及 结合 底 物 (8)-9 股 凤 和 螺旋 o2 之 间 区 域 的 柔性 ,同时 ,也 可 以 影响 在 催化 上 主要 的 氧 阴 离子 穴 的 ZA FEAR Serl49 Ser1$5 和 Serl64 定位 在 螺旋 id 和 ou7 之 间 的 区 域 。 它 们 的 取 代 可 以 影响 螺旋 oS 之 后 区 域 的 次 级 结构 ,不 仅仅 因为 增加 柔性 ,而 且 也 因为 丧失 Serl149 和 Ser164 侧 键 之 间 的 氢 键 。 在 突变 酶 94G12 中 ,甚至 可 以 形成 螺旋 05 对 o7 的 各 种 相对 定位 ,这 个 区 域 含 有 酶 的 底 物 结合 部 位 各 种 残 基 。 因 此 ,这 些 螺旋 的 复 位 也 影响 酶 的 底 物 结合 性 质 , 特 别 是 Leul62 侧 链 的 复位 可 能 对 酶 的 对 映 体 选 择 性 有 很 大 的 影响 ,可 能 直接 同 (8$)- 底 物 的 甲 基 相互 作用 。 此 外 , 底 物 结合 口袋 残 基 LeuS0,Thr158,Leu62 同 Met16( 涉 及 氧 阴 离子 穴 形成 ) 的 侧 链 行使 范 德 华 力 相互 作 用 。 因 此 ,这 些 残 基 位 置 的 变化 可 以 影响 氧 阴离子 穴 的 结构 ,这样 间 接地 影响 酶 的 对 上 映 体 选 择 性 。 取 代 的 SISSP 明显 的 正 效 应 是 Phe155 残 基 以 范 德 华 力 距 离 带 到 第 5 章 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 163 - 底 物 的 酰基 基 团 上 ,因此 直接 影响 酶 的 对 映 体 选 择 性 。 5.3.8.3 ”脂肪 酶 最 佳 化 的 途径 -35 一 些 有 效 的 脂肪 酶 (三 酰基 甘油 水 解 酶 ;EC3.1.1.3) 自 19 世纪 80 年 代 以 来 明 显 增加 。 这 主要 是 由 于 微生物 酶 的 基因 克隆 和 表达 取得 了 巨大 的 进步 和 日 益 增 长 的 需要 。 在 20 世纪 80 年 代 中 期 以 前 ,脂肪 酶 主要 用 于 洗衣 和 甘油 三 酯 的 修饰 。 但 广泛 研究 证 明 它 们 对 光学 纯化 合 物 的 合成 也 非常 有 效 。 表 5$.1 改进 脂肪 酶 的 策略 和 方法 它们 有 很 好 的 稳定 性 ,在 广泛 物理 化 学 方法 范围 的 有 机 溶剂 中 有 活性 ,而 固定 化 (改进 稳定 性 ) 且 不 需要 辅 因子 。 现 在 应 用 增 溶 ( 溶 于 有 机 溶剂 ) 脂肪 酶 有 效 的 拆 分 1000 多 种 化 学 衍生 (硝化 作用 ) 不 同 的 物质 。 此 外 ,以 脂肪 酶 反应 工程 方法 催化 为 基础 的 几 种 工业 过 程 水 解 对 酯 化 已 经 建立 ,根据 产品 的 价值 ， 水 活 度 控制 BASF 每 年 生产 2000t 用 于 动 酰基 载体 选择 (乙烯 基 乙酸 酯 ) 力学 拆 分 各 种 胺 ,这 是 工业 化 溶剂 (离子 液体 ) 成 功 最 突出 的 例子 。 然 而 , 酶 分 子 生物 学 方法 在 工业 过 程 中 不 总 是 有 效 的 ， 合理 蛋白 质 设计 (改变 对 映 体 选 择 性 ) 人 (改变 和 和 办 性 , 提 商 让 性) 进 。 表 5.1 指出 了 改进 脂肪 酶 的 策略 ,这些 策略 不 仅 适 用 于 脂肪 酶 ,而且 也 适用 于 其 他 酶 。 1. 物理 化 学 方法 固定 化 是 稳定 生物 催化 剂 并 简化 下 游 过 程 常 用 的 物理 化 学 方法 。 固 定 化 脂肪 酶 和 其 他 酶 的 一 些 载体 和 方法 已 发 展 , 但 是 对 于 适宜 材料 和 条 件 的 选择 仍 没有 普 遍 的 准则 ,20 世纪 80 年 代 晚 期 和 90 年 代 早 期 已 发 展 了 几 种 非常 稳定 的 固定 化 脂 肪 酶 制剂 ,例如 Novozyme(Bagsvaerd，Denmark) , Altus( Cambridge，MA，USA) 等 。 在 有 机 溶剂 反应 中 ,对 脂肪 酶 的 增 溶 作用 进行 了 广泛 的 研究 ,但 对 不 同 溶剂 的 增 溶 没有 普遍 的 方法 ,目前 尚未 见 该 研究 领域 重要 成 就 的 报道 。 2. 反应 工程 方法 反应 工程 的 应 用 可 以 在 某 种 程度 上 改进 某 种 脂肪 酶 的 应 用 特性 。 在 脂肪 酶 催 - 164 ， 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 化 反 式 酯 化 反应 中 应 用 不 同 的 酰基 供 体 , 经 常 采用 烯 醇 酯 (例如 乙烯 基 乙 酸 酯 ) , 因 为 它们 不 可 逆 并 反应 迅速 。( 下 水 常数 数据 库 ) 概 念经 常用 于 选择 适当 溶剂 (AL 剂 影响 活性 、 稳 定性 和 对 映 体 选 择 性 仍然 是 无 法 预测 的 。 最 近 的 成 就 是 发 现 酶 催化 反应 可 以 在 离子 液体 (Is) 中 进行 。lks 最 普通 是 1- T 3&-3- FA EPR ME 5 DG Se EE (| BMIM | BF, 和 六 氟 磷 酸 盐 ([BMIB | PF.) ,而 且 , Us Pe FA 1 HE Joa BY iz FA A Te] BS BS Pad, ZB SRI K-ATP A K-AAE A 统 。 成 功 应 用 这 些 溶剂 的 第 一 个 报道 是 发 现 南极 洲 假 丝 酵 母 ( Candida antarctica ) 脂肪 酶 BCCAL-B) 的 特性 与 在 醇 解 、 氨 解 和 全 水 解 中 常规 的 有 机 溶剂 相似 。 在 下 存在 下 几 个 仲 醇 拆 分 时 , CAL-B #119 24 (Ec 2 fd El ( Pseudomonas cepacia ) 5 Wi (PCL) 的 对 映 体 选 择 性 可 以 保持 或 甚至 提高 。Kragl OUP TBF ma 酶 催化 ( 表 5.2)。 报 道 葡 萄 糖 在 Ds 中 乙酰 化 有 更 多 地 选择 。 然 而 ,必须 强调 这 些 观察 不 是 生物 催化 剂 被 Us 修饰 的 结果 , 而 是 溶剂 系统 极 性 改变 的 结果 ,大 概 是 离 子 效 应 。 表 5.2 应 用 离子 液体 生物 催化 反应 实例 [5] 生物 催化 剂 IL 反应 系统 E. coli 碱 性 磷酸 酶 [ENE[NO3] 通过 对 硝 基 茶 酚 磷 酸 检验 酶 活性 和 稳定 性 鸡 卵 清 溶菌 酶 [HBNEe][NO3] 蛋白 质 复 性 红 球 菌 [BMIM][PFs]/ 绥 冲 液 ( 双 相 ) 1,3- 氰 基 葵 生 物 转化 R312 细胞 [BMIM][PF5] 红 霉 素 提取 面包 酵母 细胞 [BMIM][PF5]/ 缓 冲 液 ( 双 相 ) 酮 还 原 酵母 细胞 [BMIM][PFs]/ 绥 冲 液 ( 双 相 ) Z-RAM HE Be 嗜 热 菌 蛋 白 酶 [BMIM]|[ PF, ] 由 发 酵 液 回收 正 丁 醇 的 合成 cx- 胰 凝 乳 蛋白 酶 [OMIM ][ PFs ] N- 乙 酰 -L- 苯 丙 氨 酸 乙 酯 同 1 [ BMIM ] [ PF, ] 两 醇 转 酯 反应 o- 胰 凝 乳 和 蛋白酶 [EMIM ][ BF, ] N- 乙 酰 -L- 酷 氨 酸 乙 酯 同 1- 丙 [ EMIM][ (CF;SO,).N } [ BMIM][ BF, ] [ BMIM ][ PF; } [MTOA][ (CF;SO,).N] 醇 转 酯 反应 生物 催化 剂 及 半 乳糖 苷 酶 枯草 杆菌 蛋白 酶 甲酸 脱 氢 酶 x- 胰 凝 乳 蛋白 酶 筛选 的 8 个 脂肪 酶 和 两 个 酯 酶 CALB, PCL CALB, PCL, CRL, 猪 肝 脂 肪 酶 CALB, PCL 3 个 脂肪 酶 假 单 胞 菌 脂肪 酶 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 ，165 - IL [ BMIM ][ BF, | /22 7 (4448 ) [MMIM ][ MeSO, ]/28 Yk (44-441 ) [ MMIM ][ MeSO, ] [4-MBPy ][ BF, ] [BMIM][ (CF;SO,).N] [EMIM][ (CF;SO,)2N] [ BMIM ]| PF; ] [ BMIM ][ BF, ] 10 PAS TA) AY IL (EMIM][ PFs ] [ BMIM ][ PFs ] [EMIM][ BF, ] [BMIM]|[ (CF;SO, ).N] [ BMIM }[ PF, ] [EMIM][ (CF;SO,).N] [ BMIM ][ PF, ] [ BMIM ][ CF;SO; ] [BMIM][ BF; ] [BMIM ][ (CF;SO;).N] [BMIM][ SbF ] JLFP IL 用 碳酸 钠 水 溶液 洗 [ BMIM ]{ PF, } [BMIM][ BF; ] [BMIM][ (CF;SO,).N] [ BMIM][ PF, ] [ BMIM ][ PF, |} [ BMIM ][ BF, ] 续 表 反应 系统 水 解 活性 N- 乙 酰 乳 糖 胺 合成 NADH 再 生 N- 乙 酰 -L- 葵 两 氨 酸 乙 酯 同 1- 丁 醇 转 酯 反应 醇 解 , 氨 解 ,全 水 解 (R,S)-1- 葵 乙醇 动力 学 拆 分 仲 醇 动 力学 拆 分 通过 转 酯 合成 了 酰基 丁 酸 烯 丙 基 乙醇 动力 学 拆 分 (R,S)-1- 葵 乙醇 动力 学 拆 分 ; 及 葡萄糖 酰 化 单 酯 的 合成 (R,S)-1- 葵 乙醇 动力 学 拆 分 ; 水 活 度 和 温度 的 影响 在 减 压 下 酯 基 转 移 或 $- 葵 基 - 1- 亚 乙 基 六 胺 -3 醇 动力 学 拆 分 2- 羟 基 甲 基 1,4- 葵 两 二 哑 烷 酯 基 转 移 - 166° 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 续 表 生物 催化 剂 IL 反应 系统 CALB [EMIM][(CF3SO )2N] 在 超 临界 CO, FFE FACE [ BMIM ][ (CF;SO,).N] 动力 学 拆 分 CALB [ BMIM ][ (CF;SO,).N] 在 超 临界 CO; 存在 下 1- 辛 醇 的 酯 化 脂肪 酯 ,PFL AK [ BMIM ][ PF, ] P--F-+E #5 FE RRR oh HR [BMIM ][ BF, ] 分 BMIM, 1-butyl-3-methylimidazolium; CALB, Candida Antarctica lipase B; (CF;SO,)2N, bis (trifluoromethyl) sulfonyl amide; CRL, Candida rugosa lipase; EMIM, 1-ethyl-3-methylimidazolium; MBPy, 1-butyl-4-methylpyridini- um; MMIM, 1-methyl-3-methylimidazolium; MTBE, methyl tert-butylether; MTOA, methyl trioctylammonium; OMIM, 1-octyl-3-methylimidazolium; PCL, Pseudomonas cepacia lipase; PFL, Pseudomonas fluorescens lipase BAG ABE A BLIP Jo HP BY HE He Be Wr) 3 — SBS FEY BS BE KC BBE (ty, ) 0 水 活 度 不 仅仅 在 给 定 的 溶剂 中 保持 酶 的 催化 活性 , 而且 强 烈 影响 酰 化 迁移 有 。 这 样 ,只 有 在 小 心 控制 水 活 度 情 况 下 才能 获得 高 的 产物 收 率 。 例 如 ,脂肪 酶 催化 由 脂 肪 酸 在 Snl 位 置 交换 合成 磷脂 ,实际 上 是 通过 小 心 控制 水 活 度 实 现 的 。 3. 分 子 生 物 学 方法 (1) 合 理 蛋白 质 设 计 结晶 学 工作 者 已 经 解析 许多 脂肪 酶 的 结构 ,计算 机 模型 已 用 于 这 些 酶 的 底 物 特异 性 和 对 映 体 选 择 性 合理 设计 。 了 解 脂肪 酶 的 对 映 体 选 择 性 的 起 源 的 各 种 途 径 , 以 及 通过 合理 设计 改进 活性 和 选择 性 已 有 诸多 报道 。 根据 Pleiss 等 57 工作 表明 ,各 种 脂肪 酶 活性 部 位 有 不 同 的 型 主 (motif) 。 当 催 化 时 , 它 负责 四 面体 中 间 体 的 稳定 化 ,这 种 型 主 称 为 GX 或 GGGX 型 主 ( 所 基 酸 以 单字 母 表 示 ,X 表示 任 一 氨基 酸 ) ,并 且 定 位 在 氧 阴 离子 结合 口袋 中 。 到 目前 ,型 主 仅 以 现象 学 方式 进行 了 描述 。 某 些 研究 表明 该 型 主 也 控制 脂肪 酶 对 叔 醇 的 活性 。 已 知 含有 GGGX 型 主 的 圆柱 状 假 丝 酵母 (C. mgosa) 脂 肪 酶 (CRL) 既 作用 于 叔 醇 的 乙酸 酯 ,也 明显 作用 于 一 些 其 他 的 GGGX 型 主 水 解 酶 [3 个 乙酰 胆 碱 酯 酶 、 猪 肝 酯 酶 和 枯草 杆菌 ( Bacillus subtilis) 对 硝 基 苯 基 酯 酶 (BsubpNBE)] 水 解 4 个 模型 乙酸 酯 (中 等 对 映 体 选 择 性 ,已 =1.5~ 11)。 根 据 精确 的 计算 机 模型 预测 各 种 突变 体 对 BsubpNBE 水解 ,表明 在 (R,S)-2- 葵 基 紫 锦 黄 酮 -2- 乙 酸 酯 拆 分 中 对 映 体 选 择 性 至 少 改进 6 倍 。GX 型 主 水 解 酶 对 该 模型 化 合 物 完 全 失 活 。 (2) 定 向 进化 定向 进化 的 主要 挑战 是 由 10 ~ 128 突变 体 库 鉴定 出 所 要 求 的 突变 体 ,或 者 通 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 + 167 - 过 选择 ( 即 通过 与 生长 相关 的 检验 ) 或 用 高 通 量 技术 筛选 。 应 该 强调 的 是 一 种 方法 ”很 难产 生 最 佳 化 过 程 , 需 要 各 种 方法 的 组 合 才能 达到 最 佳 效 果 。 5.3.8.4 GABAA AER ML E. coli 产生 乙 内 酰 脲酶 对 映 体 选 择 性 转化 ,该 途径 与 (8)- 选 择 脂肪 酶 和 ( 尺 )- 选择 脂肪 酶 的 进化 相似 。 所 有 已 知 的 乙 内 栈 腺 酶 都 能 对 D-5-(2- 甲 基 硫 代 乙 基 ) 乙 内 酰 脲 (D-18)[ 导 致 W- 氨 甲 酰基 -D- 甲 硫 氢 酸 (D-19) 积 累 ] 进 行 选择 ,在 这 种 情况 下 通过 应 用 消 旋 酶 或 pH > 8 转化 是 完全 可 能 的 (图 5.38)。 L -对 映 体 5 - BAAR ABER af O O H R_ 5 OH 5 OH N- 氨 甲 酰基 氨基 酸 = OR H a— BI 图 5.38 由 消 旋 乙 内 酰 脲 生 产 蕊 氨基 酸 所 涉及 的 反应 和 酶 - 168 . 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 野生 型 乙 内 酰 脲酶 基因 通过 epPCR 连续 的 几 轮 随机 突变 , 继 之 饱和 突变 ,所 形成 的 库 通过 pH 指示 剂 检 验 进 行 筛选 引 ! 。 携 带 3 个 氨基 酸 交 换 的 突变 体 比 野 生 型 活力 提高 1.5 倍 , 并 且 产 生 N- 氨 甲 酰基 -L- 甲 硫 氮 酸 (L-19) ,在 30 多 转化 时 ,ee = 20% 。 当 相应 的 基因 同 乙 内 酰 脲 消 旋 酶 和 L-N- 氨 甲 酰基 酶 在 EB. coli 共 表 达 时 , 导 致 前 体 化 合 物 D,L-5-(2- 甲 基 硫 代 乙 基 ) 乙 内 酰 脲 转化 90% (2h 内 与 野生 型 10h 反 应 结果 相近 )。 哩 然 对 映 体 选 择 性 需要 改进 ,这 个 结果 明显 证 实 通过 单一 酶 基因 的 定向 进化 可 以 最 佳 化 多 酶 途径 ,为 改进 细胞 催化 剂 生产 手 性 化 合 物 提 供 了 依据 。 5.3.8.5 进化 酶 催化 反应 的 立体 化 学 进化 酶 催化 反应 产生 立体 异 构 体 有 两 种 方式 5 :@ 进 化 酶 , 它 接 受 非 天 然 立 体 异 构 体 作为 底 物 [图 5.39(a)] ; 改 变 成 键 步骤 的 立体 化 学 过 程 [图 5.39(b)]。 这 种 方式 可 以 由 同一 起 始 材料 制备 各 种 可 能 的 立体 异 构 体 产物 。 目 前 已 经 用 酶 催 化 P-O 键 的 形成 , 痰 基 还 原 烷 烃 的 羟基 化 。 和 定向 进化 改变 C-C 成 键 步骤 的 主体 化 学 过 程 。 该 途径 的 成 功 对 合成 化 学 家 具有 重要 的 意义 。 (a) HQ 9 野生 型 = De tre x APLz Yi Oo HOxvhey7 + en X CHO 突变 体 = Z a % a3 WS (b) HQ O 图 5.39 催化 立体 异 构 体 产物 形成 的 定向 进化 策略 (《a) 通 过 定向 进化 修饰 底 物 的 特异 性 ;(b) 通 过 定向 进化 修饰 反应 立体 化 学 过 程 醛 缩 酶 (二 磷酸 果糖 酶 ) 催 化 C-C 的 合成 ,并 用 于 复杂 分 子 的 合成 。 研 究 最 好 的 是 果糖 1,6- 二 磷酸 (FBP) 醛 缩 酶 (EC4.1.2.13) ,这 是 普遍 存在 的 糖 解 酶 ,其 催化 第 5 章 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 169 - 二 羟基 丙酮 磷酸 (DHAP) 和 甘油 醛 3- 磷 酸 (G3P) 缩 合成 果糖 1,6- 二 磷酸 。 醛 缩 酶 可 以 根据 它们 的 结构 和 反应 机 制 分 类 :类 工 醛 缩 酶 通常 是 (Bya)s 桶 亚 基 的 多 聚 体 ， 当 催 化 时 以 Schiff 碱 形 式 利 用 活性 部 位 的 赖 所 酸 残 基 , 而 类 工 醛 缩 酶 绝对 需要 Zn *, Kis PAW I BP 醛 缩 酶 也 属于 (Ba)s 桶 族 。 尽 管 对 类 0 FBP 醛 缩 酶 的 催化 机 制 有 了 一 定 的 了 解 , 但 关于 立体 化 学 控制 的 详 节 仍 然 不 清楚 。 通 过 Glul82 由 DHAP 提取 1-ProS 质子 之 后 ,形成 的 中 间 体 进攻 FBP 醛 缩 酶 中 G3P 的 Si- 面 产生 FEBP[ 图 5.40(b)]。 同 样 的 中 间 体 进攻 G3P 的 Re- 面 可 能 产生 非 对 映 异 构 体 , 塔 格 糖 1,6- 二 磷酸 (TBP)[ 图 5.40(a)]. TBP 和 FBP 都 是 由 DHAP 和 G3P 合成 的 ,它们 仅仅 在 CA 立体 化 学 不 同 。 因 此 ,所 合成 产物 的 构 型 直接 在 C-C 成 键 步骤 产生 。 (a) -+Z1--ON_DPO; /TBP - Rear HQ O ' 一 一 一 一 一 一 一 全 = NTH -OPO 全 H、oRe HO OH De D - 塔 格 糖 -1, 6 -二 磷酸 B 定向 进化 (b) 图 5.40 醛 缩 酶 催化 反应 的 立体 化 学 (a) TBP 醛 缩 酶 的 机 制 。DHAPene-diolate 是 在 由 DHAP 提取 1-ProS 质子 之 后 形成 ,并 通过 催化 锌 阳 离子 极 化 。 由 它 的 Si 面 的 活化 的 DHAPCI1 进攻 G3PCI Re 面 ,产生 38,48 产物 塔 格 糖 1,6- 二 磷酸 ， 并 且 质子 由 HB(Asp-82) 提 供 , 将 C4 Pea HSE, Sat TBP 合成。(b)FBP 醛 缩 酶 的 机 制 。 中 间 体 是 在 通过 Glu-182 由 DHAP 提取 1-ProS 质子 之 后 形成 的 。 由 它 的 Si 面 活化 的 DHAPC1 进攻 G3PCI 的 Si 面 ,并 且 质 子 由 于 B(Asp-109) 提 供 , 将 C4 普 基 转 为 羟基 ,竞争 3S,4R 产物 果糖 1,6- 二 磷 酸 的 合成 。FBP 和 TBP 在 C4 上 是 差 向 立体 异 构 体 (用 * 表示 ),R= CH(OH)CH,OP3~ 反应 的 立体 化 学 过 程 仅 仅 是 受 酶 结合 FBP 和 TBP 过 渡 态 相对 自由 能 控制 的 。 已 . co 类 TBP 醛 缩 酶 在 分 裂 方向 对 TBP 是 高 度 特异 的 ,高 于 它 的 非 对 映 体 FBP 约 300 倍 。 类 TW FBP 醛 缩 酶 的 顺序 匹配 和 突变 研究 指出 九 个 残 基 对 底 物 的 识别 有 潜在 的 影响 ,这 些 残 基 突 变 为 TBP 醛 缩 酶 的 相应 残 基 。 令 人 惊奇 的 是 尽管 FBP 活 性 丧失 ,突变 体 没有 产生 TBP 醛 缩 酶 活性 。 这 表明 更 复杂 的 取代 组 合 产生 C-C 键 形成 的 醛 缩 酶 ,把 活性 中 间 体 加 到 底 物 醛 的 非 对 映 异 构 面 上 ,而 且 是 可 逆 的 。 这 就 是 说 ,定向 进化 可 以 用 于 改变 塔 格 糖 1,6- 二 磷酸 醛 缩 酶 催化 反应 的 立体 化 学 过 程 。 在 三 轮 DNA 改组 和 筛选 之 后 ,进化 的 醛 缩 酶 对 非 天 然 底 物 果糖 1,6- 二 磷酸 的 K car/ Km 提高 80 倍 , 立 体 选 择 性 提高 100 47, °2P NMR 光谱 分 析 表 明 在 合成 方向 - 170 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 上 ,进化 的 醛 缩 酶 催化 具有 非 天 然 非 对 映 异 构 体 选择 性 的 C-C 键 形成 ,使 塔 格 糖 1,6- 二 磷酸 转换 为 非 对 映 异 构 体 果糖 1,6- 二 磷酸 。 这 证 实 定向 进化 对 复杂 的 立体 异 构 体 产物 合成 的 有 效 性 。 定向 进化 已 用 于 产生 高 活性 ,高 稳定 性 ,高 底 物 选择 性 和 高 适应 性 的 进化 酶 。 通过 定向 进化 也 可 以 获得 高 对 映 体 选 性 的 酶 ,但 需要 克服 两 个 主要 的 障碍 :中 检验 对 映 体 选 择 性 高 通 量 筛选 系统 ;@ 探 索 对 映 体 选 择 性 的 蛋白 质 顺序 空间 的 各 种 策 略 的 发 展 。 虽 然 该 领域 进展 迅速 ,但 尚 需 更 多 的 努力 ,包括 根据 选择 (而 不 是 筛选 ) ee 检验 的 方法 ,例如 应 用 叭 菌 体 展示 或 体外 选择 ,探索 蛋白 质 顺 序 空间 方法 、 利 用 新 底 物 把 一 种 酶 转 为 另 一 种 新 酶 ,例如 把 脂肪 酶 转 为 Diels-Alderase 等 。 遗传 算法 或 神经 网 络 的 应 用 将 有 助 于 拓展 蛋白 质 顺序 空间 ,有 助 于 对 映 体 选 择 的 酶 的 产生 和 发 现 ,对 映 体 选 择 酶 的 定向 进化 增加 了 酶 功能 开发 的 空间 。 这 是 由 于 对 映 体 选 择 性 是 酶 非常 敏感 的 参数 。 目 前 ,定向 进化 已 成 功 地 用 于 产生 高 对 映 体 选 择 的 酶 和 各 种 生物 技术 用 酶 。 5.3.9 (Bya)s 桶 酶 的 功能 进化 ra (Ba)s 桶 是 大 约 10 多 结构 表征 的 蛋白 质 共 同 的 折 肥 型 主 (motif) 。(Byo)s HAA 合 的 ,平行 的 B 折 和 琶 结构 是 由 8 个 平行 (Bya) 单 位 通过 氢 键 形成 圆 桶 状 核心 。 由 于 其 八重 伪 对 称 ,包装 在 桶 内 是 4 个 (Ba); 亚 结构 域 ,其 中 各 种 疏水 核心 定位 在 B 折 丢 和 两 侧 "螺旋 之 间 。 活 性 部 位 定位 在 B 股 的 C 端 。 这 样 ,围绕 活 性 部 位 的 功能 团 在 结构 上 是 独立 的 : 旧 ” 和 ”新 " 酶 在 某 些 B 股 未 端 保留 功能 团 ,而 其 他 可 以 改变 以 产生 新 的 活性 :6 。 用 此 蓝图 ,(Bya)s 桶 是 新 功能 进化 的 最 佳 候选 者 。 随 着 顺序 和 结构 数量 的 迅速 增加 ,激励 人 们 了 解 自然 进化 中 如 何 利 用 (Ba)s 桶 骨架 体外 设 计 新 反应 的 催化 剂 。 最 近 的 研究 指出 , (Ba)s 桶 蛋白 被 分 为 25 个 超 族 ,所 有 的 (Ba)s 桶 的 拓扑 结 构 是 相似 的 (闭合 圆 桶 状 结构 ) , 底 物 特异 性 的 保持 在 进化 过 程 中 不 是 重要 的 。 (Ba)s 亚 结构 域 结构 指出 (Ba)s 桶 是 由 (Ba)N 前 体 组 装 的 。 分 别 有 结 合 或 催 化 作用 的 混合 前 体 可 以 产生 超 族 的 原始 酶 。 在 这 个 过 程 后 ,功能 的 进化 可 以 通过 基因 复制 继 之 突变 产生 。 功 能 进化 的 合理 途径 涉及 编码 原始 酶 基因 的 复制 ,这 样 当 复 制 经 历 顺 序 和 功能 趋 异 进化 时 ,可 以 保持 原始 功能 。 原始 酶 和 ”新 " 酶 所 催化 的 反应 之 间 的 关系 可 以 设想 有 以 下 3 种 策略 。 1) 化 学 机 制 是 优势 。 原 始 的 机 制 可 以 用 于 催化 “新 "反应 。 最 简单 的 例子 , 原 始 和 新 酶 催化 同样 的 化 学 反应 ,但 底 物 特异 性 不 同 。 更 复杂 的 例子 ,各 种 反应 共同 使 用 结构 策略 ,以 稳定 共同 的 中 间 体 或 过 渡 态 。“ 烽 醇 酶 C 端 类 -结构 域 和 依赖 金 属 的 水 解 酶 " 超 族 提供 了 这 种 策略 的 例子 。 第 5 章 ZARMeEMaTHt - 171 ， 2) 配 基 特 异性 是 优势 。 代 谢 途 径 可 以 “线性 进化 (从 起 始 到 完成 或 反之 亦 然 ) ,这 样 原 始 酶 和 “新 ” 酶 具有 共同 底 物 /产物 。His 和 Trp 生物 合成 中 的 各 种 酶 是 这 种 策略 的 例子 。 3) 活性 部 位 结构 是 优势 。 自 然 选择 具有 功能 团 的 原始 酶 可 以 用 于 催化 机 制 不 同 的 “新 "反应 。 这 种 策略 的 第 一 个 例子 是 乳 清 酸 核 苷 $'- 单 磷酸 (OMP) 脱 羧 酶 和 3- 酮 基 -L- 古 洛 糖 酸 6- 磷 酸 脱羧 酶 (KGPDC) ,机制 不 同 的 脱羧 酶 有 同 源 顺序 和 结构 。 具有 (Ba)s 桶 折 县 的 烯 醇 酶 超 族 .酰胺 水 解 酶 超 族 、 乳 清 酸 核 苷 单 磷酸 脱羧 酶 超 族 和 醛 缩 酶 的 定向 进化 已 有 报道 ,主要 集中 在 改变 原始 酶 的 底 物 特异 性 方面 , 少 数 是 改变 催化 的 化 学 反应 。 (1) His 42 Trp 生物 合成 各 种 酶 的 进化 (B/a)s 桶 骨架 定向 进化 最 有 价值 的 报道 是 Fersht 等 工作 ( 见 第 2 章 第 4 节 )。 (2) 烯 酵 酶 超 族 的 功能 进化 烯 醇 酶 超 族 中 (Bya)s 桶 进化 潜力 也 已 探讨 。 Pserdomonas sp.P51 Fk RAR A BE 化 酶 (muconate lactonizing enzyme, MLEII), E. coli 邻 - 琥 珀 酰 葵 甲酸 合 酶 (O-suc- cinylbenzoate synthase,OSBS) 和 E. coli L-Ala-D/L-Glu # [a] 5 44 RTE BH — ASB B 股 未 端 含 Lys。 在 MLE 中 第 二 8B 股 未 端 Lys 启动 质子 传递 到 烯 醇 酸 中 间 体 上 ;在 OSBS 中 ,第 二 股 未 端 Lys 启动 质子 提取 反应 ,并 使 留 下 的 氧 氧 化 物质 子 化 ;在 差 向 异 构 酶 中 ,Lysl- 质 子 转移 的 双 一 碱 机 制 , 既 不 是 MLE 也 不 是 差 向 异 构 酶 催化 OS- BS 反应 。 然 而 ,由 于 这 些 酶 是 同 源 的 ,所 有 3 个 酶 都 是 来 自 共同 的 原始 酶 ,并 且 有 限 的 取代 就 可 以 进行 活性 互 换 。 差 向 异 构 酶 和 MLE 的 组 合 进化 ,两 者 产生 催化 OSBS 反应 的 蛋白 质 , 并 且 与 它们 的 原始 酶 不 同 。 在 设计 途径 中 ,其 中 E. coli HM SPR REA OSBS 的 结构 比较 表明 , 差 向 异 构 酶 的 第 八 B 股 未 端的 同 源 天 冬 氢 酸 用 甘 氨 取 代 , 这 样 OSBS 的 更 大 的 底 物 可 以 结合 在 活性 部 位 。 在 MLE 的 组 合 途 径 中 ,OSBS 的 活性 来 自 第 八 B 股 未 端的 谷 氢 酸 用 甘氨酸 同 源 取 代 。 两 个 进化 的 蛋白 质 有 明显 的 OSBS 活性 ,并 降低 了 原始 酶 的 活性 。 在 不 同 的 原始 酶 中 两 种 同 源 取 代 产 生 新 活性 ,这 表明 (Ba)s HTS AY HAE AT (3) 酰胺 水 解 酶 超 族 功能 进化 酰胺 水 解 酶 超 族 的 特殊 成 员 采 取 合 理 和 组 合 突变 ,提高 了 底 物 特异 性 。 例 如 ， 进化 的 磷酸 三 酯 酶 (PITE) 对 手 性 底 物 的 固有 立体 选择 性 提高 、 松 动 和 转化 。PTE 的 DNA 改组 改进 了 甲 基 对 硫 磷 催 化 活性 , 比 野 生 型 酶 增加 25 倍 。 (4) 醛 缩 酶 的 功能 进化 尽管 在 顺序 和 结构 库 中 有 大 量 的 醛 缩 酶 ,目前 它们 功能 的 进化 还 仅仅 局 限于 类 (FG AK Schiff 碱 )、2- 酮 基 -3- 脱 氧 -6- 磷 酸 葡 糖 酸 (KDPG) 醛 缩 酶 。 它 是 葡萄 糖分 解 代谢 Enter-Doudoroff 途径 中 一 种 酶 ,产生 丙酮 酸 和 D- 甘 油 醛 -3- 磷 酸 。KDPG HE - 172 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 缩 酶 具有 广 谱 底 物 特异 性 。 E. coli 醋 缩 酶 已 成 功 地 进化 ,经 易 错 PCR(epPCR ) 和 改组 ,活性 是 野生 型 600 音 。 改 变 活 性 中 心 Lys 的 突变 体 可 以 利用 葵 甲 醛 和 电子 等 排 吡 啶 羧基 醛 作为 共 底 物 (cosubstrate) , (B/a)g 桶 第 六 B 股 未 端 Lys133 同 底 物 形成 Schiff 碱 。 (Ba)s 桶 酶 是 定向 进化 的 亮点 ,从 (Ba)s 桶 出 发 ,催化 新 反应 酶 的 设计 和 发 现 将 是 可 行 的 ,不 久 的 将 来 或 许 是 常规 。 5.4 应 用 进化 策略 研究 酶 的 结构 和 功能 吕 5.4.1 应 用 进化 策略 研究 分 文 酸 变 位 酶 的 结构 和 功能 利用 定向 进化 策略 研究 酶 的 结构 和 功能 ， 最 典型 的 例子 是 分 支 酸 变 位 栈 (chorismate mutase) ， 它 催化 分 支 酸 转化 为 预 葵 酸 (图 5.41)。 不 同 来 源 的 变 位 酶 虽 然 顺 序 相似 性 小 , 却 表现 出 相似 的 动力 学 性 质 ， 但 它们 的 三 级 和 四 级 结构 是 不 同 图 5$.41 3 个 天 然 分 支 酸 变 位 酶 和 抗体 酶 的 带 状 图 解 图 中 黑色 表示 螺旋 ,灰色 表示 有 B 折 笃 , 在 每 个 活性 部 位 上 的 过 渡 态 类 似 物 抑制 剂 以 球 棒 表示 。(a) B. subtilis 的 单 功能 分 支 酸 变 位 酶 (BecCM);(b) 天 .coi 双 功 能 分 支 酸 变 位 酶 - 预 苯 酸 脱水 酶 (EcCM);(c) 酵 母 8. cerevisiae 别 构 调节 分 支 酸 变 位 酶 (ScCM) 。 色 氮 酸 (其 能 活化 酶 ) 结 合 在 二 聚 体 界面 别 构 位 点 上 。(d) 抗 体 酶 1F7 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 + 173 - 的 。 例 如 Bacillus subtilis 分 支 酸 变 位 酶 (BsCM) , E. coli (EcCM) 和 酵母 Saccjha- romyces cerevesiae(ScCM) (图 5.41). BsCM(ArOH 类 分 支 酸 变 位 酶 的 成 员 ) 是 一 对 称 的 均一 二 聚 体 ,包装 成 伪 Ba 桶 。 它 有 3 个 相同 的 活性 部 位 在 亚 基 界 面 上 [图 5.41(a)] ,相反 ,EcCM[ 图 5.41(b)] 和 ScCM[ 图 5.41(c)] 是 与 分 支 酸 变 位 酶 AroQ 类 的 成 员 无 关 。 顺 序 库 的 同 源 搜索 发 现 其 他 的 蛋白 分 属 这 些 结构 类 型 。 分 支 酸 变 位 酶 活性 的 抗体 酶 具有 典型 的 免疫 球 蛋 白 折 三 , 见 图 5.41(d)。 E. coli KA12 是 典型 的 细菌 选择 系统 (图 5.42) ,该 工程 菌 缺 失 双 功能 分 支 酸 变 位 酶 (分 支 酸 变 位 酶 - 预 葵 酸 脱 氢 酶 和 分 支 酸 变 位 酶 - 预 葵 酸 脱水 酶 )。 质 粒 pKIMP-UAUC 是 携带 缺失 分 支 酸 变 位 酶 活性 的 预 葵 酸 脱水 酶 和 预 苯 酸 脱 氢 酶 的 质 粒 。KA12/pKIMP-UAUC 细菌 是 不 能 在 缺乏 外 源 酷 氨 酸 和 葵 丙 氨 酸 情况 下 生长 。 bzra* 编 码 草 生 欧 MC Bs TARR 脱氧 酶 图 5.42 ”缺乏 内 源 分 支 酸 变 位 酶 活性 E. coli 工程 菌 选 择 系 统 编码 双 功 能 酶 (分 支 酸 变 位 酶 - 预 葵 酸 脱 氢 酶 和 分 支 酸 变 位 酶 - 预 葵 酸 脱水 酶 ) 的 基因 缺 失 。 脱 氢 酶 和 脱水 酶 的 单 功能 突变 体 是 由 质粒 pKIMP-UAUC 提供 。 来 自 随机 基因 库 的 分 支 酸 变 位 酶 是 根据 它们 能 够 补充 遗传 缺失 进行 估价 ， 并 人 允许 细胞 在 缺乏 Tyr 和 Phe 的 情况 下 生长 。 质 粒 库 和 pKIMP-UAUC 分 别 携带 Amp® 和 Cam® 基因 BsCM 是 由 127 个 氨基 酸 残 基 组 成 的 。 前 115 个 残 基 的 结构 已 确定 ,未 端 30 螺旋 接近 活性 部 位 [图 5.41(a) ]。 一 些 实验 表明 柔性 C 端 尾 可 能 在 酶 功能 上 起 作 用 。 为 了 探讨 这 个 问题 ,应 用 随机 截 短 酶 的 C 端 , 继 之 在 KA12/pKIMP-UAUC 系 统 选择 功能 克隆 。 用 部 分 随机 的 寡 核 苷 酸 进行 PCR 操作 ,构建 了 两 个 基因 库 , 其 中 相应 于 残 基 116 ~ 117 BK 111 ~ 127( 包 括 3 螺旋)BsCM 密码 子 已 随机 化 ,产生 随 机 截 短 的 蛋白 质 。 因 为 只 有 功能 基因 才能 存活 ,编码 蛋白 质 的 必需 部 分 可 以 迅速 和 直接 的 鉴定 ,这 样 可 以 发 现 决定 结构 或 机 制作 用 的 残 基 。 在 构建 和 转化 到 细菌 选择 菌株 后 ,形成 含有 104 ~ 10 成 员 的 两 个 库 。 库 中 C - 174 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 端 12 残 基 突 变 体 在 选择 介质 中 存活 。 这 个 结果 证 明 C 端 残 基 不 是 酶 活性 所 绝对 需要 的 。 甚 至 最 后 的 11 个 残 基 可 以 去 除 而 不 明显 影响 体内 酶 活性 。 相 反 , 当 最 后 17 个 残 基 突 变 时 ,大 约 有 1/4 库 能 够 在 选择 平板 上 生长 。 追 加 的 5 个 随机 氨基 酸 形成 一 个 便于 界定 的 3 螺旋 ,并且 同 蛋 白质 及 其 配 基 接 触 。 没 有 发 现 短 于 116 残 基 的 活性 酶 。 显 然 ,3io 螺 旋 中 的 残 基 不 能 去 除 。 几 个 选择 的 BsCM 突变 体 的 动力 学 特性 指出 ,C 端 尾 的 截 短 或 突变 很 少 影 响 酶 的 转换 数 ( Koa) ASR RA Bl 突变 体 的 活性 部 位 时 ,其 转化 为 预 葵 酸 的 效率 与 野生 型 BSCM 接近 。 然 而 ,Kev Km 值 实际 降 低 是 明显 的 。 该 发 现 指出 C 端 , 当 不 直接 地 涉及 结合 配 体 的 化 学 转 化 时 ,通过 底 物 和 过 渡 态 的 均匀 结合 贡献 给 酶 催化 效率 。 选择 方法 是 检验 影响 蛋白 质 结构 和 稳定 性 的 各 种 因素 的 理想 方法 。 通 过 组 合 库 和 功能 筛选 探讨 了 决定 蛋白 质 结 构 的 螺旋 间 扭 转 作 用 。 例 如 , 突变 细胞 色素 b-562 3 个 残 基 螺 旋 间 扭转 ,由 随机 库 分 离 31 个 突变 体 取 稳定 的 类 天 然 结构 。 用 突 ， 变 Rop( 一 种 二 聚 结合 RNA 四 螺旋 束 蛋 白质 ) 获 得 了 相似 的 结果 。 这 些 结果 指出 对 螺旋 间 片 段 的 顺序 或 长 度 相 对 约束 少 。 催化 活性 的 选择 (一 种 结构 完整 性 相当 敏感 的 探 针 ) , 较 之 简单 的 筛选 方法 可 能 有 更 微妙 顺序 优先 性 。 应 用 EcCM[ Al 5.41(b)] 作 为 模板 检验 上 述 观 点 。 两 个 相同 的 多 肽 由 3 个 螺旋 通过 两 个 突 环 片段 组 成 [图 5.43(a)]。L2 突 环 连接 H2 和 H3 螺旋 ,远离 活性 部 位 。 最 初 ,在 扭转 中 3 个 暴露 溶剂 的 残 基 (Ala65-His86-His67) 。 [图 $.43(b) ] 随 机 化 ,通过 体内 选择 鉴定 催化 活性 突变 体 。 实 验 指出 扭转 中 的 取 代 可 能 影响 蛋白 质 的 生产 、 稳 定性 或 催化 活性 。Ala65-His86-His67 同 Lys64 随机 组 合 , 实 验 表 明 64 位 的 随机 化 不 影响 残 基 在 相 邻 扭转 区 的 优先 性 。 当 埋藏 的 扭转 残 基 Leu68 同 Ala65-His86-His67 一 起 随机 化 ,Leu68 的 侧 链 埋藏 在 L2 和 HI ( 另 一 亚 基 的 螺旋 HI) ZIMA IFA SAAS (AL 5.43)。 顺 序 分 析 指 出 68 位 对 芷 水 的 脂肪 族 氨 基 酸 有 严格 的 要 求 。 现 有 和 蛋白 质 骨架 的 再 工程 代表 从 头 设计 功 能 酶 的 第 一 步 。 各 种 蛋白 质 寡 聚 态 的 改变 ,例如 单 体 转化 为 多 体 ,或 多 体 转 化 为 单 体 备 受 科 学 家 关注 。 这 样 的 系统 可 以 弄 清楚 多 体 蛋 白质 的 进化 起 源 。 将 寡 体 转化 催化 功能 的 单 体 是 特别 困难 的 ,例如 复杂 的 缠绕 的 均 二 聚 体 Ec- CM. Ze VERY“ BEHE AED” HA BUR HI 螺旋 (跨越 EcCM 二 聚 体 ) 可 以 改变 酶 的 四 级 结构 。 虽 然 EecCM 活性 部 位 是 由 两 个 多 肽 链 所 贡献 的 残 基 组 成 的 ,这 样 的 片段 可 以 允许 HI N 端的 一 半 自 身 回 折 , 取 代 第 二 个 肽 ,产生 单 体 和 催化 活性 的 四 螺旋 束 (图 $5.44)。 这 取决 于 突 环 长 度 和 组 成 。 和 蛋白 质 的 稳定 性 是 寡 聚 蛋白 质 进化 的 一 种 重要 驱动 力 。 突 环 的 长 度 似乎 起 更 重要 的 结构 作用 。 突 环 顺 序 可 以 改变 四 级 结 构 而 不 影响 活性 部 位 结构 是 相当 少 的 。 虽然 EeCM 均 二 聚 体 拓扑 转化 为 单 体 保 留 酶 活性 部 位 ,但 产生 不 稳定 的 蛋白 第 5 章 蛋白 质 酶 定向 分 子 进化 ，175 15.43 EcCM 的 带 状 结构 (a) 和 L2 突 环 (b) L2 的 随机 突变 继 之 体内 选择 分 支 酸 变 位 酶 活性 ,结果 表明 对 暴露 溶剂 的 扭转 残 基 顺 序 约束 少 ， PY Aa a] KER, HU, BB HARE Hh 68 位 严格 要 求 疏 水 的 脂肪 族 氨 基 酸 ° 176+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 图 5.44 二 聚 EcCM 拓扑 转化 为 单 体 柔性 突 环 (黑色 ) 插 人 到 跨越 Hl 螺旋 的 二 聚 体 中 , 允许 螺旋 的 N 端 部 分 自身 回 折 ， 取代 其 他 多 肽 形成 有 功能 的 四 螺旋 束 催化 剂 C hte 印 非 极 性 图 5.45 简单 的 双 元 模型 图 中 灰色 表示 极 性 氨基 酸 的 位 置 ; 黑 色 表 示 非 极 性 氨基 酸 的 位 置 。 据 此 模型 可 以 设计 两 性 螺旋 或 B 折 丢 第 5 章 ZARMeEMoTwet +: 177 - (a) H1 随 机 化 H2/H3 随 机 化 和 选择 86888560 一 ”一 99 DA dhn Ce | H1 活 性 突变 体 杂交 和 选择 H2/H3 活 性 突变 体 人 @ HUH2/H3 活 性 突变 体 (b) HI1 随 机 化 H2/H3 随 机 化 = ass 一 一 一 一 一 ~ 4------- IEEEEEEEEEEEE399 ay 5! (1) 获得 dsSDNA (2) 限制 性 消化 (3) 连接 一 一 shied H1 H2/H3-WT H1-WT H2/H3 AN ace 和 = ES (1) PCR | (1)PCR (2) 限制 性 消化 Se | (2) 限 制 性 消化 人) 选择 图 5.46 AroQ 分 支 酸 变 位 酶 基因 双 元 模型 库 一 般 图 解 (a) 双 阶 段 策略 。HIl 螺旋 (灰色 ) 和 H2/]H3 螺旋 (黑色 ) 分 别 随机 化 和 选择 功能 突变 体 ， 继 之 初始 库 功 能 双 元 模型 片段 组 合 和 再 选择 ,最终 构建 物 约 80 旬 随机 化 。(b) 双 元 模型 基因 由 编码 HIl 5% H2/1B 螺旋 片段 的 随机 合成 的 寡 核 苷 酸 构成 ,并 组 装 在 载体 片段 上 (黑色 )。 在 初始 步骤 中 , 随机 化 片段 同 它们 的 野生 型 H2/H3-WT 和 HI-WT( 和 白色) 组合。 应 用 图 5.42 所 示 系 统 进行 选 择 。WT- 野 生 型 MjCM “178 + 进化 生物 技术 一 Bib Fd ot FE JB PAS HE BB (02 ZI BY Bit 7k Be BE RE (AP i cE — BR AR AERA EE | 可 能 丧失 。 这 些 埋 藏 的 非 极 性 基 团 暴 露 于 溶剂 大 概 有 利于 凝聚 ,因为 高 电荷 结合 口袋 定位 在 螺旋 束 的 内 部 , 单 体 本 身 缺 乏 常规 的 朴 水 核心 (这 是 蛋白 质 折 丢 的 驱动 力 ) 。 因 此 热 稳 定性 的 二 聚 体 被 认为 是 稳定 单 体 变 位 酶 设计 的 起 点 。 通 过 消除 失 活 或 弱 活 性 克隆 已 选择 出 稳定 的 单 体 变 位 酶 。 从 原理 上 讲 , 同 样 的 进化 途径 可 以 成 功用 于 蛋白 质 设 计 。 极 性 和 非 极 性 氨基 酸 的 双 元 模型 可 能 是 蛋白 质 设 计 的 一 般 策 略 ( 图 5.45)。 它 已 成 功 地 产生 许多 天 然 蛋白 质 的 螺旋 束 。 例 如 ,用 随机 顺序 双 元 模型 单元 系统 取代 分 支 酸 变 位 酶 中 的 二 级 结构 单元 (图 5.46) ,然后 用 遗传 选择 估价 库 中 蛋白质 的 催化 活性 。 实 验 的 第 一 步 是 相应 于 HL 和 H2/H3 螺旋 的 模块 个 体 同 热 稳 定 的 MiCM' (一 种 二 聚 产 甲烷 球菌 分 支 酸 变 位 酶 的 抗 蛋 白 酶 突变 体 ) 互 补 野生 型 螺旋 片段 组 合 (图 5.46)。 在 每 个 随机 位 置 仅 有 4 个 极 性 氨基 酸 (Arg、Asp、Glu 和 Lys) 或 4 个 非 极 性 (le、 Leu Met ， 和 Phe) 。 在 初始 设计 时 保持 突 环 和 保守 的 催化 残 基 。 双 元 模型 模块 库 转化 到 分 支 酸 变 位 酶 缺陷 菌株 ,并 且 能 够 使 部 分 随机 化 的 蛋白 质 折 和 至 成 有 序 结构 。 催 化 活 性 结构 用 分 支 酸 变 位 酶 缺陷 互补 估价 ,由 HL 和 H27/H3 库 已 分 离 出 活性 酶 并 已 进 ， 行 表征 ,所 有 的 活性 酶 在 84 位 和 85 位 严格 保守 Asn-Lys 二 元 组 。 预 选 的 HI 和 H2/H3 模块 组 合 交叉 ,产生 H1/H2/H3 双 元 模型 库 ,活性 酶 约 占 1/10 000[ 图 5.46 (a)]。 选 择 的 H1/H2/H3 突变 体 之 一 的 生物 化 学 表征 确定 其 是 螺旋 均 三 聚 体 , 它 催化 分 支 酸 转 为 预 苯 酸 ,这 清楚 地 表明 双 元 模型 是 催化 剂 设计 的 有 效 途 径 。 5.4.2 应 用 进化 策略 研究 DNA 聚合 酶 的 结构 和 功能 在 一 定 的 条 件 下 ,每 种 蛋白 质 顺序 将 保持 一 个 适应 度 。 每 种 蛋白 质 的 适应 度 在 顺序 空间 中 作 图 ,三维 景观 形成 适应 度 的 峰 和 和 谷 ,最 高 峰 代 表 最 适合 的 蛋白 质 (图 5.47)。 因 此 , 酶 的 成 功 改进 可 以 看 作 通 过 突变 达到 最 高 峰 。 DNA 聚合 酶 定向 进化 的 主要 目标 是 提供 DNA 复制 时 高 度 忠实 的 结构 单元 。 聚合 的 忠实 性 取决 于 聚合 酶 活性 部 位 能 够 分 辨 互补 和 非 互补 挫 和 人 的 核 苷 三 大 酸 以 及 延伸 匹配 和 非 匹 配 的 引物 末端 。Taq DNA RARER EA 3'-5' 外 切 核酸 酶 | 或 校正 活性 ,这 使 其 成 为 研究 聚合 酶 活性 部 位 内 在 忠实 性 的 目标 。 在 催化 时 ,聚合 酶 至 少 经 历 4 种 明显 的 构象 变化 :四 与 DNA 结合 ;OdINTP 结合 ;@ 化 学 催化 ,构象 转换 ,形成 磷酸 二 酯 键 并 释放 PPi;Q@ 引 物 3 羟基 末端 转移 。 理 论 研 究 指出 多 重 构 ， 象 改 变 贡献 给 DNA 聚合 酶 催化 的 忠实 性 。DNA 聚合 酶 有 A\B 和 C 型 主 , 前 两 者 ， 有 13 个 氨基 酸 残 基 ,C 型 主 有 11 个 氨基 酸 残 基 。 在 型 主 B 的 13 个 氨基 酸 中 ,用 随机 突变 产生 5 x 104 转化 子 库 ,由 该 库 筛 选 出 67 个 活性 突变 体 , 其 中 13 个 有 延伸 活性 。 两 个 突变 体 (A664R 和 A661E) 已 纯化 , 正 向 突变 频率 提高 7 ~ 25 倍 。 这 两 第 5 章 蛋白质 酶 定向 分 子 进 化 ，179 - 局 部 最 高 峰 图 5.47 顺序 空间 的 图 解 这 种 景观 表明 一 种 酶 可 能 的 氨基 酸 顺 序 。 峰 高 表示 在 某 种 条 件 下 酶 的 适应 度 。 单 一 氨基 酸 改 变 有 局 部 最 高 峰 ; 一 组 同时 改变 可 以 搜 索 到 全 部 最 高 峰 个 残 基 接近 * 指 状 ? 亚 结构 域 的 末端 ,并 且 可 以 稳定 dNTP 结合 之 后 的 闭合 构象 ,这 样 使 DNA 合成 的 忠实 性 降低 。 已 经 筛选 出 高 保 真 的 突变 体 ,三 重 突变 体 (A661E， I665T,F667L) ,其 与 野生 型 酶 比较 ,突变 频率 降低 3 倍 。 该 突变 体 提高 了 对 A:A 错 配 的 分 辨 ,并 降低 错 配 延伸 。A661E 是 强 突 变 子 ,I665T 或 F667L 突变 作为 基因 内 校正 基因 。 由 型 主 A 随机 化 获得 了 高 和 低 忠 实 性 的 突变 体 , 低 忠实 性 突变 体 在 1164 位 有 亲 水 性 取代 。 这 个 位 置 是 能 够 耐 受 各 种 取代 ,但 仍 能 保持 野生 型 酶 活性 水 平 。 当 用 于 PCR 反应 时 ,在 1614 位 含 亲 水 残 基 的 Taq poll 突变 体 与 野生 型 酶 比 较 ,错误 速率 提高 20 倍 , 它 有 效 的 催化 转换 和 颠 换 。 除 了 提供 低 碱 基 配 对 忠实 性 外 ,I614 位 的 亲 水 取代 也 允许 突变 体 Taq poll 避 开 阻 断 模板 损伤 。I164 位 的 亲 水 取代 大 概 通过 拓宽 dNTP 结合 口袋 以 容纳 异常 碱 基 和 核 苷 酸 而 降低 忠实 性 。 这 样 的 突变 体 将 促进 PCR 方法 的 应 用 ,以 产生 各 种 各 样 的 突变 基因 。 就 Taq poll 型 主 A 和 了 B 随机 化 库 而 言 , 各 种 取代 谱 是 允许 的 ,不 丧失 催化 活 性 。 型 主 A, 只 有 13 个 残 基 之 一 (Asp610) 是 绝对 不 可 改变 ,而 型 主 B,13 个 残 基 中 有 两 个 (Arg659 和 Lys$63) 是 不 可 改变 的 。 这 些 残 基 是 活性 必需 的 。 总 之 ,随机 突 变 资 料 表 明 ,型 主 A 和 了 B 中 活性 部 位 26 个 残 基 中 3 个 是 体外 功能 绝对 需要 的 。6 个 氮 基 酸 仅仅 耐 受 保守 取代 ,所 有 其 他 的 残 基 是 高 度 可 变 的 。 这 表明 Taq 聚合 酶 - 180 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 活性 部 位 的 易 变 性 。 E. coli poll 型 主 A 突变 体 的 随机 库 中 ,所 有 残 基 都 是 可 变 的 , 突变 谱 与 Taq poll 明显 相似 。 特 别 是 D705( 催 化 上 主要 的 氨基 酸 ) 没 有 出 现在 活性 突变 体 中 。 E710 只 能 由 天 冬 氨 酸 取代 , 这 表明 在 该 位 负电 荷 的 重要 性 。 型 主 A 的 N 端 和 C 端的 单一 取代 倾向 对 DNA 聚合 酶 活性 有 相反 效应 。 型 主 A 的 N 端 突 变 产生 的 酶 活性 等 于 或 好 于 野生 型 酶 。 该 区 域 形成 反 平 行 B 折 笃 结 构 ,容纳 底 物 dNTP 的 三 磷 酸 部 位 。C 端 区 的 突变 倾向 给 出 比 野 生 型 酶 活性 低 的 突变 体 。 在 E. coli poll 和 Taq poll 之 间 的 主要 差别 是 Taq 中 大 量 的 正 电荷 取代 ,并 在 Y611 位 限于 平面 环 状 氨基 酸 。 这 些 差别 可 能 是 由 于 不 同 折 至 和 包装 约束 所 致 。 关于 DNA 聚合 酶 突变 为 有 效 的 RNA 聚合 酶 见 图 3.22。 核糖 核 苷 酸 在 细胞 内 浓度 远 高 于 脱氧 核 苷 酸 ,因此 DNA RA HSM HE 入 的 核糖 核 苷 酸 。 根 据 Tag poll 结合 dNTP 的 活性 部 位 的 晶体 结构 ,分 辨 涉及 Glu615 的 氨基 酸 侧 链 ,其 提供 移 和 人 rNTP 的 2’-OH 立体 障碍 。 无 . coli poll PHA 酸 定 位 突变 结果 提高 单 核 苷 三 磷酸 的 挫 人 ,但 突变 体 没有 聚合 酶 活性 。 大 概 由 于 中 性 残 基 的 引入 减少 了 总 的 酶 活性 。 在 型 主 A 随机 罕 变 后 选择 活性 酶 ,然后 筛选 HEME A INTP 突变 体 ,分 离 出 能 够 有 效 合成 长 RNA 的 Taq 聚合 酶 。 这 导致 提出 一 种 假说 ,164 取代 ,特别 是 牙 水 取代 ,导致 更 开放 的 活性 部 位 ,更 易 容 纳 改变 结构 的 核 苷 酸 。Ala597 和 Glu615 是 绝对 保守 的 。 自然 界 是 通过 达尔 文 进化 机 制 进 行 蛋 白质 的 设计 ,细胞 中 每 种 蛋白 质 , 从 酶 和 受 体 到 结构 蛋白 质 都 是 通过 这 种 机 制 产 生 的 。 本 节 以 分 支 酸 变 位 酶 和 DNA 聚合 酶 为 例 ,说 明 进 化 策略 可 以 成 功 地 研究 现 有 和 蛋白质 的 结构 和 功能 ,并 可 以 创造 出 新 的 蛋白 质 。 表 5$.3 列 出 进化 酶 实例 。 表 5.3 进化 酶 实例 [1 ie 进化 的 性 质 RE AL, HK BE ( B. stearothermophilus ) 提高 在 E. coli 中 表达 23 倍 氮 酰 基 -tRNA 合成 酶 提高 互 不 相关 的 校正 tRNA ABE “55 倍 化 砷 酸 盐 解 毒 途径 提高 活性 40 fi 天 冬 氨 酸 氨基 转移 酶 提高 对 有 分 支 氨基 酸 和 2- 氧 代 酸 10° 倍 的 活性 ; 提高 对 Val 的 活性 2.1x 10° f% 联 葵 二 氧 酶 提高 多 氯 代 联 茶 (PCBs) 的 活性 降解 各 种 PCBs、 多 氯 代 葵 和 甲苯 及 糖苷 酶 A 65 CRE ty. = 12min 2 酶 RRR EF BAY celB (pyrococcusfuriosus ) £. glucoronidase BPA BBE A is ( 妈 )s- 酶 IGPs!? (Bax) g-B ProFARI”” RP AER TAKA | 儿 茶 酚 -2,3- 双 氧 酶 头孢 菌 素 酶 分 支 酸 变 位 酶 (二 聚 体 ) 细胞 色素 P450BM-3 细胞 色素 P450 单 氧 酶 细胞 色素 C 过 氧化 物 酶 D-H CARRS ( Arthrobacter sp.) DNA 聚合 酶 B 脱氧 核 苷 酸 激酶 ( Drosophila melamogaster ) 酯 酶 ( Pseudomonas fluorescens ) Fip 重组 酶 真菌 过 氧化 物 酶 半 乳 糖苷 酶 谷 胱 甘 肽 转移 酶 SSH 蛋白 质 酶 定向 分 子 进化 + 181 - 进化 的 性 质 提高 20TH IEE 在 成 二 醛 处 理 后 仍 保持 功能 提高 对 cefotasime 活性 转换 为 PRAP) 活 性 有 PRAI 活 性 同时 保留 ProFARI 活 性 提高 活性 提高 内 在 的 过 氧化 物 酶 活性 提高 热 稳定 性 提高 对 moxalactam 活性 变 为 可 溶性 单 聚 体形 式 改变 底 物 专 一 性 在 没有 辅 因子 的 情况 下 提高 对 蔡 的 活性 提高 对 愈 创 木 酚 的 活性 对 映 体 选 择 性 和 提高 活性 增加 自发 突变 频率 对 核 背 类 似 物 敏感 性 提高 对 映 体 选 择 性 空间 障碍 3- 羟 基 酯 的 水 解 提高 热 稳定 性 提高 热 和 氧化 稳定 性 转 为 岩 藻 糖苷 酶 底 物 专 一 性 BER 34% 对 成 二 醛 和 甲醛 的 稳定 性 提高 32 000 倍 PRAI 活 性 高 于 野生 型 酶 6 倍 PRAI 活 性 低 于 野生 型 3 ~ 11 x 104 倍 ; ProFARI 活性 低 于 野生 型 26 倍 2.2~5 4% 由 2% He BI 58% FE SO CIATERE 13 ~ 26 1% 270 ~ 540 倍 PRAIA REAR BE HE Ms] PR BD BE A, 5 ~ 20 ff 300 倍 A L- 乙 内 酰 脲酶 ,活性 提高 5% 10 ~ 30 1% 在 AZT2) 存 在 下 转化 的 E. coli LDiam 降 低 316 倍 ;对 ddC2) 降 低 11% 2 4% 对 映 体 活 性 提高 (0% 到 25 % ee) 改进 重组 效率 热 稳 定 提高 174 倍 , 氧化 稳定 性 提高 100 1% RYT A BE A REF BS HE 提高 1000 倍 , 比 活性 提高 66 倍 对 新 的 各 种 底 物 的 活性 - 182 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 a Ag HIV wise se ie 马 心 脏 肌 红 和 蛋白 PR AD 3- 异 两 基 苹 果 酸 脱 氢 酶 (B. subtiis ) 卡 那 霉 素 核 苷 酰 转 移 酶 ( B. stearothermophilus ) FLA AB (B. strarothermophilus ) 脂肪 酶 ( Pseudomonasaeruginosa ) 脂肪 酶 ( Staphylococcushyicus , S. aureus ) 脂肪 酶 (8$. aureus ) N- 氨 基 甲 酰 酶 -D- 乙 内 酰 脲酶 融 eA OP Se FE GA Src SFG BB O° FF 3 SS ERI FA SEG SS BG 八 氧 番茄 红 素 脱氧 酶 ,番茄 红 素 SC pNB AAS 进化 的 性 质 对 核 苷 类 似 物 的 抗 性 提高 内 在 的 过 氧化 物 酶 活性 提高 对 ABTS” 和 愈 创 木 酚 的 活性 在 没有 辅 因 子 果 糖 1,6- 二 磷酸 的 情况 下 提高 活性 提高 对 映 体 选 择 性 底 物 专 一 性 (磷脂 对 短 链 脂肪 酸 酯 ) 底 物 专 一 性 (对 磷脂 的 活性 ) 融合 蛋白 的 稳定 性 对 抑制 剂 BG? 和 和 六甲 基 -V- 硝 基 - N-SEABAEMM STE Xt N- FA SL N’ - ay SE-B EB AE 内 抗 性 新 的 类 胡 葛 卜 素 途径 BER 变 化 依赖 DNA 和 DNA 聚合 酶 的 活 性 和 对 AZT 的 抗 性 25 倍 总 活性 提高 40 倍 ;对 ABTS 活 性 提高 5.4 倍 ; 对 愈 创 木 酶 提 高 2.3 倍 在 TO CIEE 3.4 倍 TE 60 ~ 65TH 1,235 200 43 ; 提高 20T 10 倍 在 对 映 体 选 择 性 提高 (2% 到 81% ,ee) 对 长 链 pPNB2?) 酯 活性 提高 3 倍 磷脂 肪 酶 绝对 活性 提高 11.6 倍 , 磷 脂肪 酶 /脂肪 酶 比例 增加 11.5 倍 D- 氨 基 酸 的 产量 增加 6 倍 BG 的 抑制 浓度 减少 到 50% 突变 频率 降低 2.7~5.5 倍 4 3,4,3',4- BARS b 素 和 torulene 在 所 有 温度 下 活性 没有 任何 降 1K, Tm 增加 14°C 靶 酶 pNB Anh 蛋白 质 水 解 酶 SS TT (B. sphaericus ) 限制 性 内 切 核酸 酶 EcoRV 丝氨酸 蛋白 质 水 解 酶 ( Lysobacter enzymogenes ) 枯草 杆菌 蛋白 酶 ( 鼠 ，Lerrrs ) 各 种 枯草 菌 蛋白 酶 枯草 杆菌 蛋白 酶 BPN' 枯草 杆菌 蛋白 酶 E 枯草 杆菌 蛋白 酶 S41 ( Psychrophilic ) Taq DNA 4 BS I T7 RNA 聚合 酶 胸腺 喀 啶 脱氧 核 苷 激酶 (HSV) Hea Ha WE We Abe SA AK EF Be R-1 或 -2 (HSV) 1) JL http: //www. che. caltech . edu : 80/groups/fha/Enzyme/ directed . html . 2) 缩写 第 5 章 和 蛋白质 酶 定向 分 子 进化 - 183 - 进化 的 性 质 提高 在 水 /有 机 溶剂 中 的 活性 提高 10 色 时 的 活性 延伸 识别 位 点 改变 专 一 性 和 提高 活性 分 泌 酶 的 表达 水 平 各 种 性 质 在 降低 温度 时 活性 提高 水 /有 机 溶剂 中 的 活性 提高 热 稳定 性 提高 热 稳定 性 提高 热 稳定 性 在 体内 E. coli DNA 聚合 酶 工 的 功 能 互补 提高 突变 频率 增加 突变 频率 提高 对 ganciclovir 或 aciclovir 敏感 性 降低 对 AZT 的 敏感 性 ABTS = 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) acid; AZT = 3’-azido-3'deoxythymidine; PRAI = phosphoribosyl anthranilate isomerase; IGPS = indoleglycerol phosphate synthase; BG = O5-benzylguanine; ddC = dideoxycytidine; pNB = para-nitroben- Zoate; 续 表 变 化 在 25% ~ 30% DMF 中 对 各 种 pNB 酯 的 活性 提高 50 ~ 150 倍 活性 提高 6 倍 ,在 70°C 18 HERE 1K 3.3 4% 识别 8bp 和 10bp 位 点 速率 提高 20 ~ 45 倍 , 选 择 性 提 高 增加 50% 活性 、\ 稳 定性 提高 在 10 并 时 活性 提高 2 倍 在 60%DMEF 中 活性 提高 170 倍 RGAE ITC, ERA 度 下 活性 均 提 高 在 65T, ty .t4 IM 50 倍 ty 234 5n 100 4% 活性 部 位 突变 体 的 活性 保留 7 ~25 三 20 倍 对 ganciclovir 敏感 性 提高 43 倍 , 对 aciclovir 敏感 性 提高 20 倍 TK-1,32 倍 ;TK-2,16 000 倍 ProFARI = N’-[ (5’-phosphoribosy] ) formimino ]-5$-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide isomerase . 15 16 17 18 19 21 22 184. - 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 参 考 xX Brakmann S, Johnsson K. 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Current opinion in chemical biology, 2003, 7: 252 ~ 264 第 6 章 外 显 子 改组 定向 进化 酶 6.1 5] 言 基因 进化 的 各 种 机 制 和 过 程 , 直 至 20 世纪 70 年 代 后 期 和 80 年 代 初 期 还 是 不 清楚 的 。20 世纪 90 年 代 初 两 个 有 利 的 条 件 促 进 了 基因 进化 机 制 和 过 程 的 研究 ， 一 是 DNA 和 蛋白质 顺 序 和 结构 数据 库 的 发 展 ;二 是 新 基因 概念 的 引入 。 目 前 , 数 据 库 储存 的 顺序 和 结构 信息 已 达 天 文 数字 ,使 人 们 能 够 比较 各 种 基因 结构 。 基 因 组 顺序 和 新 的 分 子 技术 改变 了 我 们 关于 基因 和 基因 组 组 成 的 观点 。 在 断裂 基因 (split gene) 发 现 不 久 , 人 们 就 认识 到 内 含 子 的 存在 可 以 深刻 地 影 响 蛋 白质 的 进化 。Gilbertt 指 出 内 含 子 内 的 重组 可 以 把 外 显 子 分 开 , 内 含 子 的 中 间 重 复 顺 序 可 能 是 改组 外 显 子 顺序 的 热点 。Blakeb2] 支 持 这 样 的 进化 机 制 , 他 提出 外 显 子 是 编码 蛋白 质 的 功能 单元 。 大 多 数 真 核 生 物 结构 基因 中 存在 内 含 子 ,除了 发 根 农 杆菌 (4gropacierizm rhi- zogenes ) KL. E. coli T2,T4 Fl T6 噬菌体 及 几 种 枯草 芽孢 杆菌 (Bacilis subtilus ) HMU 喉 菌 体 之 外 ,原核 生物 则 缺乏 内 含 子 。 对 此 解释 有 两 种 假说 :一 种 是 后 生 内 含 子 (intron late) 假 说 。 它 指出 原核 生物 基因 类 似 祖先 基因 ,而 内 含 子 来 自 易 位 单 元 ,后 来 插入 真 核 生物 基因 中 。 事 实 上 , 真 核 生物 基因 的 外 显 子 -内 含 子 结构 不 是 静止 的 ,是 内 含 子 不 断 地 插 人 和 消除 的 动态 过 程 。 与 此 观点 相反 ,早生 内 含 子 (in- tron early) 假 说 认为 蛋白 质 的 基因 中 存在 内 含 子 反映 了 这 些 基因 是 由 片段 组 装 的 ， 真 核 生物 基因 组 的 “基因 片段 ”组织 是 原始 形式 。 根 据 上 述 假说 , 真 核 生物 保留 内 含 子 ,增加 了 遗传 的 可 塑性 ; 另 一 方面 ,细菌 通过 消除 内 含 子 而 增加 功效 。 内 含 子 起 源 是 科学 家 们 经 常 讨论 的 课题 。 内 含 子 出 现 很 早 , 并 用 于 组 装 第 一 个 基因 ;内 含 子 出 现 较 晚 ,并 像 插 入 单元 一 样 后 来 加 上 的 ,中 断 以 前 连续 的 基因 。 Gilbert3] 分 析 了 中 心 模块 和 古代 内 含 子 进而 提出 内 含 子 起 源 的 混合 理论 : 某 些 内 含 子 是 很 古老 的 ,并 且 用 于 原始 外 显 子 改组 ,而 许多 内 含 子 是 后 来 形 失 和 加 上 的 。 关于 大 多 数 内 含 子 是 插 和 人 到 真 核 生 物 基 因 组 还 是 内 含 子 早 已 存在 于 原核 生物 和 真 核 生物 的 祖先 基因 中 ,还 是 某 些 内 含 子 是 很 古老 的 ,而 许多 内 含 子 是 后 来 丧失 和 加 上 的 ,仍然 是 一 个 争论 的 问题 。 内 含 子 本 身 也 在 进化 ,外 显 子 改组 与 内 含 子 进化 是 平行 的 。 适 合 外 显 子 改组 的 内 含 子 出 现在 进化 的 相对 后 期 阶段 ,因此 ,外 显 子 改组 可 能 在 古代 蛋白 质 构建 中 不 起 重要 作用 。 a ae st 56m Phan FOC ce AEC + «187 - 必须 强调 ,通过 外 显 子 改组 所 产生 的 大 多 数 模块 蛋白 质 对 后 生动 物 的 多 细胞 性 是 绝对 重要 的 。 例 如 ,细胞 外 间 质 成 分 的 出 现 是 与 第 一 个 多 细胞 动物 的 出 现 紧 密 相 关 的 。 细 胞 外 间 质 成 分 , 膜 结合 蛋白 质 调 节 细 胞 -细胞 和 细胞 - 间 质 相互 作用 ， 受 体 蛋 白质 调节 细胞 -细胞 通讯 (例如 受 体 酷 氢 酸 激酶 、 受 体 酷 氨 酸 磷酸 酶 ) 允 许 细 胞 以 完整 的 方式 起 作用 。 事 实 上 ,细胞 外 间 质 的 主要 成 分 细胞 黏 连 蛋 白 、 受 体 蛋 白 都 是 由 模块 构建 的 。 20 世纪 70 年 代 晚 期 证 实 外 显 子 改组 是 一 种 产生 新 基因 的 有 效 过 程 。 各 种 基 因 的 外 显 子 新 的 组 合 ,可 以 由 非 同 源 重 组 产生 并 进化 成 具有 新 功能 的 基因 ,内 含 子 将 加 速 新 组 合 和 新 蛋白 质 进化 的 速率 由 。 和 蛋白 质数 据 库 研 究 结果 表明 外 显 子 改组 是 新 基因 起 源 的 普通 机 制 。 真 核 生物 基因 的 内 含 子 -外 显 子 (intron-exon) 组 织 指出 外 显 子 新 的 重组 可 以 由 插入 的 内 含 子 顺 序 内 的 重组 产生 ,从 而 获得 具有 功能 改变 的 重 排 基因 ,基因 组 进化 的 这 种 模型 称 为 外 显 子 改组 (exon-shuffling)[2,3] 。 6.2 外 显 子 改组 的 分 子 机 制 关于 外 显 子 重组 机 制 的 研究 最 近 有 两 个 领域 的 工作 值得 关注 :非常 规 重 组 和 LINE-1(L1, long interspersed nuclear element) 单 元 调节 重组 。 所 谓 非 常规 重组 是 很 少 或 无 顺序 同 源 性 之 间 DNA 重组 。 Bloemendal 等 5 揭示 了 非常 规 重 组 导致 仓鼠 热 休 克 和 蛋白 o A- 晶 体 蛋白 基因 的 外 显 子 改 组 。 将 仓鼠 o A- 唱 体 蛋 白 基因 转 染 到 鼠 肌肉 细胞 系 中 ,鉴定 了 大 量 基 因 内 复制 的 突变 体 [ 图 6.1(a) ] ,这 些 突变 体 的 顺序 分 析 指出 , 它 是 通过 两 个 A- 晶 体 蛋白 基因 中 两 个 CCCAT 位 点 之 间 的 非常 规 重 组 产生 的 ,一 个 在 内 含 子 3, 而 另 一 个 在 外 显 子 2(a A- 唱 体 蛋 白 的 另 一 种 异 构 形式 的 内 含 子 ) ,结果 形成 内 部 复制 的 外 显 子 结构 。 已 经 证 实 3 个 一 组 顺序 CAT 是 优先 被 非常 规 重组 中 拓扑 异 构 酶 1 FT 开 缺 口 ,包含 非常 规 重 组 中 两 个 CCCAT。 这 样 一 种 特殊 的 顺序 要 求 , 可 能 暗示 低 速率 重组 , 它 不 能 解释 观察 到 的 较 高 频率 外 显 子 改组 。 另 一 种 机 制 也 能 导致 外 显 子 改组 , 称 为 L1 单元 调节 3' 转 导 [ 图 6.1(b)]。Ll 是 一 种 逆转 录 转 座 子 (retrotransposon ) ,能 逆转 录 并 在 哺乳 动物 基因 组 中 运动 。 Moran 等 9 在 转 染 实验 中 证 实 LI 由 于 其 结合 ,从 而 弱化 了 终止 信号 。LIl 可 能 以 适当 的 频率 产生 通读 转录 。L1 单元 在 哺乳 动物 基因 组 中 的 高 丰 度 (人 基因 组 约 15%) ,L1 单元 调节 3' 转 导 似乎 代表 改组 基因 组 顺序 经 常 发 生 的 一 种 机 制 。 基 因 组 分 析 揭 示 通 过 这 种 机 制 转 导 的 顺序 约 占 人 基因 组 的 1/4。LI 含有 5' 非 翻译 区 (UTR) ,两 个 非 重 秋 的 可 读 框 (ORF1 和 ORF2) ,和 一 个 在 poly(A) 尾 端的 3’ UTP. ORF1 编码 一 个 结合 RNA 的 蛋白 质 , 而 ORF2 编码 内 切 核酸 酶 (EN) ,逆转 录 酶 ° 188 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) eGcar— ate CCCAT CCCAT | CCCAT j LINE-1 单 元 通读 转录 ,逆转 录 变换 为 基因 4 的 第 二 个 内 含 子 基因 A' 的 LINE-1 单 元 和 未 转 录 外 显 子 II 可 能 退化 和 消失 图 6.1 外 显 子 改组 的 分 子 机 制 (《a) 非 常规 重组 导致 超 o A- 晶 体 蛋 白 的 外 显 子 复制 。 重 组 发 生 在 超 o A- 晶 体 蛋 白 基 因 内 含 子 1 和 11 中 同 源 顺序 CCCAT 的 两 个 非 同 源 位 点 之 间 。 拓 扑 异 构 酶 1 优选 缺口 顺序 CAT ,形成 两 个 新 功能 CC- CAT. (b)LINE-1 调节 的 3' 转 导 的 外 显 子 改组 。 为 了 说 明 转 导 过 程 ,A 和 了 B 是 两 个 假设 的 基因 。A' 是 通过 该 过 程 产生 的 新 基因 。 转 录 起 始 位 点 和 终止 信号 分 别 以 箭头 和 椭圆 形 表示 。LINE-1 转录 终止 信 号 比较 弱 ( 椭 圆 形 ) 产 生 通 读 转录 (包括 基因 B 的 外 显 子 2) (RT) 和 未 知 功能 的 富 半 胱 氨 酸 (C) 结 构 域 。L1 逆 录 转 座 子 被 认为 是 移动 的 Alu 和 加 工 的 伪 基因 (pseudogene) 。 L1 可 以 逆转 录 转 座 于 基因 中 ;L1 可 以 容易 地 由 其 3' 侧 把 DNA 转 导 到 新 基因 . ‘ | | | | 第 6 章 外 显 子 改组 定向 进化 酶 ， 189 ， 组 位 置 ;LI 调节 转 导 可 以 产生 新 基因 。 产 生 新 基因 的 机 制 包 括 点 突变 、 外 显 子 改 组 \DNA 复制 \ 不 对 称 交 换 .DNA 易 位 定位 重组 和 功能 加 工 伪 基因 形成 。L1 调节 转 导 是 一 种 基因 组 多 样 化 的 潜在 来 源 (图 6.1)。 它 通过 RNA 中 间 体 产生 ,不 需要 同 源 重组 ,并 且 人 允许 非 L1 顺序 分 散 到 新 基因 位 点 。 被 改组 的 顺序 可 能 是 启动 子 ， 增强 子 或 外 显 子 ,并 且 它 们 的 分 散 可 能 导致 新 基因 的 产生 或 改变 已 存在 的 基因 的 表达 。 由 于 L] 逆 录 移 位 往往 是 5'- 剪 切 , 某 些 传导 可 以 缺乏 L1 顺序 。 外 显 子 改组 如 何 产生 新 基因 ? 为 此 Patthy 吕 研究 了 通过 外 显 改 组 所 产生 的 上 百 个 蛋白 质 族 ( 主 要 是 哺乳 动物 基因 编码 的 ) 内 含 子 相 (intron phase)( 相 被 定义 为 内 含 子 或 在 密码 子 之 间或 密码 子 内 的 相对 位 置 ) 统 计 分 析 揭 示 出 优势 相 0。 外 显 子 和 内 含 子 相 的 关系 , 即 外 显 子 倾向 定位 于 同一 相 内 含 子 的 两 侧 , 这 种 内 含 子 相 的 非 随机 分 布 指出 真 核 生物 基 因 的 大 部 分 源 于 外 显 子 改组 ,这 就 是 说 外 显 子 改组 在 新 基因 进化 中 起 重要 作用 。 真 核 生物 的 进化 是 由 亲 代 基因 组 有 性 重组 调节 的 。 交 换 体 随机 出 现 频率 取决 于 DNA 长 度 ,由 于 外 显 子 只 占 人 基因 的 1% ,内 含 子 约 占 24%。 这 就 是 说 内 含 子 平均 长 度 远大 于 外 显 子 的 平均 长 度 , 并 且 重 组 频率 正比 于 DNA 长 度 , 所 以 大 多 数 交换 体 发 生 在 非 编码 顺序 。 此 外 ,内 含 子 含有 大 量 的 易 位 单元 和 重复 顺序 (例如 Alu 重复 一 一 能 够 被 特异 分 裂 DNA 的 酶 切割 称 为 Alu) , 它 促进 非 同 源 基因 的 错 配 和 重组 ,这 提示 内 含 子 是 遗传 重组 的 热点 ,外 显 子 改组 已 成 为 蛋白 质 进化 的 主要 因素 。 6.3 蛋白 质 结构 域 是 运动 的 功能 模块 中 结构 域 是 蛋白 质 亚 基 结构 中 的 紧密 球状 区 域 ,是 介 于 蛋白 质 二 级 与 三 级 结构 之 间 的 结构 层次 。 结 构 域 在 蛋白 质 中 呈 独 立 的 结构 单元 ,独立 的 功能 单元 和 独立 的 折 琶 单元 。 在 复杂 蛋白 质 中 ,结构 域 具有 结构 模块 (module) 和 遗传 单元 的 作用 。 结构 域 又 可 分 为 亚 结构 域 。 结构 域 广 布 于 球状 蛋白 中 , 域 间 连 接 或 松散 或 紧密 。 典 型 的 双 结构 域 蛋 白质 的 域 间 连接 呈 匀 链 (hinge) 式 。 结 合 底 物 或 辅酶 后 伴随 着 域 间 的 相对 运动 。 在 蛋 自 质 中 ,不 同 的 结构 域 具有 特定 的 功能 ,例如 结合 底 物 ,催化 反应 , 亚 基 间 相互 作用 及 活性 调节 等 。 多 结构 域 的 活性 部 位 大 都 是 位 于 两 个 或 多 个 结构 域 的 界面 之 间 。 在 催化 作用 进行 的 同时 ,必然 伴随 着 这 些 结构 域 的 相对 运动 ,结构 域 间 的 松散 连接 为 域 间 运 动 提供 了 可 能 性 ,以 调节 刚性 (对 稳定 性 而 言 ) 和 柔性 (对 活性 而 言 ) 之 间 的 最 佳 平衡 ,通过 刚性 和 柔性 之 间 的 表 观 交替 变 位 提高 酶 对 环境 的 适应 性 。 在 复 杂 和 蛋白 质 中 结构 域 往 往 以 结构 模块 方式 组 合 。 生物 进化 过 程 的 本 质 是 分 子 进化 。 蛋 白质 的 进化 ,特别 是 结构 域 的 进化 起 核 - 190 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 心 作用 。 通 过 不 同 结构 域 的 组 合 可 以 形成 功能 各 异 的 蛋白 质 分 子 。 蛋白 质 顺序 和 三 维 结构 分 析 已 经 提示 许多 蛋白 质 是 由 一 些 分 离 的 结构 域 组 成 的 。 这 些 所 谓 的 符合 蛋白 质 在 后 生动 物 中 是 特别 丰富 的 。 符 合 蛋白 质 的 个 别 结构 域 往往 涉及 特殊 功能 。 艇 合 蛋白 质 中 所 发 现 的 结构 域 在 进化 上 是 运动 的 ,这 意味 着 它们 在 进化 过 程 中 是 分 散 的 ,现在 出 现在 各 种 不 相关 的 蛋白 质 中 。 运 动 的 结构 域 是 独立 的 折 春 单元 , 主要 是 由 于 它们 插入 到 新 的 蛋白 质 环境 中 防止 错误 折 等 。 运动 的 结构 域 示 如 表 6.1。 表 6.1 运动 结构 域 与 外 显 子 结构 的 关系 结构 域 外 显 子 分 类 SAR 1-1 表皮 生长 因子 前 体 类 EGF 结构 域 1-1 TPA 1-1 因子 和 人 环 饼 结构 域 1-2-1 TPA 1) 1-4 凝血 酶 原 纤维 结合 素 1-1 纤维 结合 素 I 型 结构 域 1-1 因子 XI ( 指 状 结构 域 ) 意 TPA ] Te ee ll 纤维 结合 1-1 Ei Inge 4H Hf 1 AY 2 Fay Sah Be BRS 1-2-1 Al XII 1-1-1; 1-1; 1-0-1 纤维 结合 aed 1-1-1; 1-0-1 axonin 1-0-1; 1-1-0-1 Kallmann syndreme 蛋白 质 1-2-1 血 纤维 溶解 酶 原 PAN 结构 域 1-2-1 Prekallikrein 1-2-1 因子 XI 1-0-1 AF x Gla 结构 域 1-0-1 凝血 酶 原 1-0-1 蛋白 质 S Sushi 结构 域 rire (SCR 重复 ， 1-1 P 选 择 素 CCP 模块 ) WERE A | 第 6 章 ， 外 显 子 改组 定向 进化 酶 ，191 ， 审查 编码 符合 蛋白 的 基因 揭示 出 结构 域 与 外 显 子 结构 之 间 的 基本 关系 , 即 每 个 结构 域 倾向 于 由 同一 拼接 框 中 开始 和 终止 的 一 个 或 多 个 外 显 子 组 合 编码 。 也 就 是 说 是 肉 合 蛋白 质 似 乎 是 通过 外 显 子 改 组 由 组 合 在 一 起 的 多 个 结构 域 产 生 的 。 大 多 数 内 含 子 是 “ 假 DNA" (junk DNA) ,高 度 耐 受 缺失 和 插 人 ,中间 重 复 顺序 (例如 Al 重复) 可 以 插入 内 含 子 的 上 述 区 域 ,这 可 以 增加 错误 匹配 和 非 同 源 内 含 子 重组 的 机 会 。 前 mRNA 内 含 子 的 重要 特征 :不 同 内 含 子 的 拼接 点 是 等 价 的 ,之 间 可 交 换 , 这 对 外 显 子 改组 是 重要 的 。 模 块 蛋白 质 的 进化 分 析 表 明 外 显 子 改组 主要 在 动 物 界 。 运动 的 模块 与 蛋白 质 的 结构 域 的 区 别 是 它 的 运动 性 ;模块 是 位 于 同一 相 内 含 子 的 两 侧 以 促进 它 的 分 散 。 根 据 这 一 定义 ,如 果 同 一 相 的 内 含 子 被 插入 到 它 的 两 个 边界 上 的 话 ,任何 蛋白 质 结 构 域 都 可 以 转 为 模块 。 图 6.2 表示 结构 域 转 为 运动 的 模块 的 过 程 。 图 6.2 ”结构 域 转 为 运动 的 模块 的 不 同 阶段 图 中 指出 具有 分 泌 信 号 肽 结构 域 的 蛋白 质 的 模块 化 。 阶 段 1: 在 结构 域 的 N 端 和 C 端 边界 上 插 人 同一 相 内 含 子 ; 阶段 2: 对 称 (0-0,1-1 和 2-2) 的 原始 模块 内 部 串联 复制 ; 阶段 3: 在 含有 一 些 串 联 拷贝 (例如 多 聚 模块 蛋白 质 ) 的 基因 压缩 时 , 模块 往往 被 切割 , 这 样 提供 运动 的 模块 ， 被 切割 下 来 的 模块 可 以 插入 到 其 他 基因 中 3 个 对 称 的 模块 组 (1-1,0-0 和 2-2) 对 外 显 子 改组 来 讲 是 相等 的 ,因为 它们 同样 满足 内 含 子 重组 的 相 适 应 性 规则 ,然而 1-1 模块 却 存在 优势 。 这 种 模块 化 假说 可 分 为 三 个 不 同 的 阶段 :第 一 阶段 ,内 含 子 插 和 人 相应 蛋白 质 结 构 域 的 基因 片段 边界 上 ,内 含 子 可 以 作为 可 动 的 遗传 单元 并 转移 到 其 他 的 基因 组 位 点 ;第 二 阶段 ,插入 的 内 含 子 重组 ,串联 复制 形成 所 谓 “ 原 始 模块 *(protomodule ) ; 第 三 阶段 ,一 个 或 更 多 的 原始 模块 通过 内 含 子 重组 转移 到 不 同 的 非 同 源 基因 上 。 外 显 子 改组 是 受 拼接 框 规则 控制 的 。 内 含 子 可 以 插入 在 两 个 连续 的 密码 之 间 ” 192 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 基因 阅读 框 (定义 为 相 0 内 含 子 ) 或 一 个 密码 子 的 第 一 和 第 二 核 苷 酸 之 间 ( 定 义 为 相 1 内 含 子 ) 或 第 二 和 第 三 核 苷 酸 之 间 的 基因 阅读 框 (定义 为 相 2 内 含 子 )。 根 据 内 含 子 两 侧 的 相 , 外 显 子 可 以 分 为 9 个 不 同 的 组 (图 6.3)。 这 些 包 括 对 称 的 外 显 子 0-0,1-1 和 2-2; 非 对 称 外 显 子 0-1,0-2,1-0,1-2,2-0 和 2-1, 它 可 以 连 成 对 称 的 组 合 。 不 对 称 外 显 子 (或 外 显 子 组 ) 可 以 插入 同一 相 内 含 子 , 经 历 串 联 复制 或 缺失 干扰 阅 读 框 。 Aa FRE A6.3 ”内 含 子 和 外 显 子 类 型 _ 内 含 子 可 以 分 为 相 0, 相 1 和 相 2 内 含 子 ,这 取决 于 它们 相对 于 基因 可 读 框 的 位 置 。 外 显 子 可 以 分 为 9 种 不 同 的 类 型 ,这 取决 于 它们 位 于 内 含 子 两 侧 的 相 表 6.1 中 大 多 数量 白质 结构 域 是 由 对 称 外 显 子 或 非 对 称 外 显 子 的 对 称 组 编码 的 。 由 于 这 些 结构 域 自身 含有 功能 模块 ,可 以 在 周围 运动 。 它 们 在 蛋白 质 进化 中 起 着 支配 作用 。 值 得 强调 的 是 散 合 基因 的 原始 内 含 子 -外 显 子 组 织 可 能 通过 丢失 或 获得 内 含 子 或 通过 拼接 连续 滑动 ,在 进化 过 程 中 模糊 不 清 。 在 某 些 编码 结构 域 的 外 显 子 边界 上 缺乏 同一 相 内 含 子 可 能 是 这 些 外 显 子 已 经 历 外 显 子 改组 。 目 前 已 经 鉴定 出 60 多 种 运动 结构 域 是 由 1-1 外 显 子 (或 外 显 子 组 ) 编 码 , 而 0-0 和 2-2 是 少 数 。1-1 结构 域 占 优势 的 原因 是 不 知道 的 ,可 能 与 增加 产生 肯 合 蛋白 效率 有 关 。 大 多 数 骨 合 蛋白 是 细胞 外 或 构建 膜 蛋白 的 胞 外 部 分 ,因此 ,已 经 指出 能 合 蛋 白 在 多 细 胞 进化 中 起 重要 作用 。 6.4 外 显 子 改组 产生 模块 酶 [89] 6.4.1 血液 凝集 和 血 纤 维 溶解 的 蛋白 酶 血液 凝集 和 血 纤维 溶解 的 完整 过 程 形成 级 联 酶 促 反应 ,其 中 无 活性 的 酶 原 转 a ER 第 6 章 外 显 子 改组 定向 进化 酶 ， 193 - 为 活性 酶 。 这 些 酶 原 属于 丝 氢 酸 蛋白 酶 族 , 它 们 的 活化 伴随 着 有 限量 肽 链 的 水 解 。 血液 凝集 和 血 纤 维 溶 解 蛋 白 酶 (BCFE) 的 氢 基 酸 顺 序 同 原型 丝 氨 和 蛋白酶 例如 胰 蛋 白 酶 和 胰 凝 乳 蛋 白 酶 比较 表明 ,这 些 酶 有 延长 的 N 端 ,其 由 一 些 功能 确定 的 分 离 结构 域 组 成 (图 6.4) ,例如 底 物 识别 ,与 磷脂 膜 的 结合 ,或 同 蛋白 质 辅 因 子 相 互 作 用 。N 端 结构 域 包括 类 EGF 结构 域 `Gla Bi AFA AR I A a yh, 环 饼 结 构 域 和 苹果 状 结构 域 。 这 些 结构 域 也 存在 不 相关 的 蛋白 质 中 , 像 脱 辅 基 脂 蛋白 A 中 存在 环 饼 结构 域 , 纤 维 结合 素 工 型 和 ARM. BCFE 的 结构 域 组 织 表 明了 结构 域 与 外 显 子 结构 是 密切 相关 的 (图 6.3)。 类 EGF 结构 域 完 全 是 由 单一 外 显 子 编码 ,其 属于 1-1, 并 且 内 含 子 一 外 显 子 接合 点 定 位 在 结构 域 边界 的 3 个 氨基 酸 (C 端 或 N 端 ) 之 内 。 纤 维 结合 素 工 型 结构 域 ( 也 称 指 状 结构 域 ) 也 是 由 单一 的 1-1 外 显 子 编码 。$' 外 显 子 编码 前 肽 部 分 以 使 其 分 泌 到 细胞 质 中 。BCEFE 中 大 多 数 环 饼 状 结构 是 由 两 个 外 显 子 的 对 称 组 编码 (1-2-1)。 然 而 ,在 凝血 酶 原 中 ,第 二 个 环 饼 结构 域 是 由 单一 的 1-1 外 显 子 编码 ,显而易见 , 插 进 的 相 2 内 含 子 在 进化 过 程 中 丧失 。 编 码 血 纤 维 蛋 白 浴 酶 原 的 环 饼 结构 域 的 两 个 外 显 子 是 由 相 0 内 含 子 分 开 。 这 种 相 移 位 可 能 是 拼接 点 滑动 的 结果 。 纤 维 结合 素 0 型 结构 域 和 苹果 形 结构 域 是 完全 由 两 个 外 显 子 对 称 组 (1-2-1) 编 码 。 研 究 表明 苹 果 形 结构 域 同 血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 的 前 体 肽 (PAP) 和 少数 其 他 的 结构 域 有 明显 的 同 源 性 ,这 个 结构 域 族 称 为 PAN 模块 族 。 上 述 资 料 指出 编码 N 端 结构 域 所 有 的 外 显 子 组 是 位 于 相 1 内 含 子 的 两 侧 。 这 个 观察 对 外 显 子 改组 产生 BCFE 提供 额外 的 证 据 。 除 BCFE 外 , 几 个 其 他 的 细胞 质 蛋 白质 也 含有 运动 的 结构 域 。 例 如 ,蛋白 质 畏 因子 的 因子 V 和 VID, ENTE C 端 区 都 含有 两 个 C 结 构 域 。 这 个 结构 域 也 在 其 他 非 同 源 蛋 白质 (neuropilin 和 discoidin) 结 构 域 受 体 中 发 现 ,是 由 4 个 外 显 子 对 称 组 (1-0-0-1) 编 码 , 约 60 个 氢 基 酸 的 10 个 串联 重复 , 称 为 Sushi(SCR) 结 构 域 , 已 经 在 转 谷 酰胺 酶 因子 XO 的 B 链 中 鉴定 出 。 每 个 结构 域 是 由 单一 1-1 外 显 子 编码 。 肝 球 蛋 白 和 少数 其 他 蛋白 质 也 含有 Sushi 结构 域 , 它 是 由 两 个 外 显 子 对 称 组 编码 。 Von willebrand 因子 的 前 体 是 由 4 个 不 同 的 重复 结构 域 (A,B,C 和 D) 组 成 ,每 个 以 2~5 个 拷贝 存在 。 结 构 域 A 和 C 也 出 现在 各 种 其 他 的 符合 蛋白 质 中 ,包括 补体 因 子 、 整 合 素 、 胶 原 蛋 白 和 凝血 因子 (thrombospondin) 。 在 第 八 因子 相关 抗原 (VWEF A 子 ) 中 ,A 结 构 域 的 头 两 个 重复 是 由 单一 1-1 外 显 子 一 起 编码 ,而 第 3 个 重复 是 由 4 个 外 显 子 (1-1-1-1) 编 码 。 关 于 C 结构 域 ,结构 域 组 织 与 外 显 子 结构 之 间 没 有 明确 的 关系 。Von willebrand 因子 C 结构 域 也 在 nov 蛋白 质 和 胶原 蛋白 al (DH PR 现 , 然 而 , 它 是 由 1-1 一 个 外 显 子 编码 ( 表 6.1)。 通 过 外 显 子 改组 组 装 BCFE WEE 示 如 图 6.5。 模块 组 装 假说 的 第 一 个 证 据 是 tPA 的 一 个 区 与 纤维 结合 素 的 指 状 结构 域 同 - 194 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 | 先导 顺序 gla EGF Ht PAN fl fall Ar A At ¢ A eee SBE 4 Se tet ae, Wie a, ee, Ci ee ci . 有 eenama 0 ---…- foil B aged Re We chek cE Re SF ot hee a a A a aa ena amet: aa aa ees wee wd 0 100 200 300 400 500 606 700 800 AER 图 6.4 血液 凝集 和 血 纤 维 溶 解 的 调节 和 蛋白酶 的 结构 域 结 构 和 拼接 框图 解 英文 大 写字 母 表示 各 种 结构 域 : A, 丝氨酸 蛋白 酶 结构 域 ; B, 类 EGF 结构 域 ; C, Gla 结构 域 ; D, 前 -原先 导 顺 序 ; E, 环 饼 结构 域 ; F,PAN 结构 域 ; G, 纤 维 结合 素 贡 型 结构 域 (fnIT); 也 ,纤维 结合 素 I 型 结构 域 (f TD) 。 内 含 子 - 外 显 子 接合 点 的 位 置 以 六 形 实 线 表 示 ， 插 人 的 内 含 子 相 以 垂直 轴 表 示 | | | 第 6 章 ， 外 显 子 改组 定向 进化 酶 ”“， 195 - Hea 的 另 一 个 区 与 表皮 生长 因子 同 源 。 这 样 很 可 能 调节 血液 集 和 血 纤维 “ 自 质 水 解 的 蛋白 酶 是 外 源 模块 组 装 的 。 调 节 和 蛋白 酶 的 共同 祖先 是 与 简单 的 类 胰 蛋 “ 自 酶 相似 ,所 有 的 调节 模块 是 指 被 插入 在 信号 肽 和 祖先 蛋白 酶 原 活化 结构 域 之 间 “的 结构 。 组 装 过 程 涉及 各 种 模块 插入 、 串 联 复制 和 缺失 。 模 块 组 装 意 味 着 编码 模 块 的 基因 片段 在 进化 过 程 中 是 运动 性 的 (图 6.5)。 它 们 经 历 重 复 插 人、 串联 复制 、 交换 和 缺失 。 外 显 子 改组 可 以 认为 是 这 些 结构 域 独特 运动 性 的 机 制 。 内 含 子 应 当 位 于 这 些 运动 模块 的 边界 上 。tPA 的 嵌 合 结构 及 其 基因 的 外 显 子 -内 含 子 组 织 间 关系 提供 了 通过 外 显 子 改组 进行 模块 交换 的 明确 依据 。 P CKAKSP be CG,GpP 一 GAKP FGaKKP KKKKKP Py sper nix XK u-PA t-PA PL 图 6.5 由 模块 组 装 血 液 凝 集 和 血 纤 维 蛋 白水 解 的 蛋白 酶 的 方案 图 中 缩写 ,P 为 胰 蛋 白 酶 同 源 的 丝氨酸 蛋白 酶 的 祖先 ; GA,GB 为 A 型 和 B 型 表皮 生长 因子 模块 ; C 为 依 赖 维生素 的 钙 结 合 模块 ; K 为 环 饼 模块 ; F 为 指 状 模块 ; PT 为 凝血 酶 原 ; PC 为 蛋白 质 C; X,xX 为 因子 IX, AF X; u-PA, t-PA 为 分 别 表示 尿 激 酶 、 组 织 型 血 纤维 蛋白 溶 酶 原 激活 剂 ; PL 为 血 纤 维 蛋白 溶 酶 原 。 箭头 指示 模块 插入 , 实 圆 表示 内 部 模块 复制 运动 的 模块 可 以 为 3 种 类 型 (类 型 1-1` 类 型 0.0 ASSAY 2-2), Hei SE A EL 中 所 用 的 大 多 数 模块 属于 1-1 组 ,2-2 组 或 0-0 组 相对 少 。 由 外 显 子 改组 所 产生 的 模 块 蛋白 质 主要 是 胞 外 蛋白 质 (体液 蛋白 质 ) , 胞 外 基质 构建 和 转 膜 蛋白 质 的 胞 外 部 分 ， 后 者 适应 于 胞 外 空间 的 氧化 环境 。 许 多 模块 富 含 二 硫 键 (例如 环 饼 \ 补 体 B 模块 、 表 皮 生 长 因子 模块 \ 指 状 模块 ` 纤 维 结合 素 芝 型 模块 等 )。 然 而 ,通过 外 显 子 改组 组 装 的 所 有 蛋白 质 的 一 个 共同 的 特征 局 限于 动物 ,原核 生物 和 植物 或 真菌 则 没有 。 纵 观 模块 蛋白 质 , 模 块 类 型 都 表现 出 这 种 趋势 :这 些 模块 具有 运动 性 和 串联 复制 。 - 196 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 6.4.2 模块 交换 的 原理 模块 蛋白 质 (凝血 酶 原因 子 XAT XA C、 血 纤维 蛋白 溶 酶 原 、 尿 激酶 、 tPA、 白 细胞 介 素 w- 受 体 、 肝 球 和 蛋白、 纤维 结合 素 及 LDL- 受 体 ) 的 基因 结构 揭示 内 含 子 参与 组 装 的 某 些 特 征 。 内 含 子 定位 在 环 饼 、 生 长 因子 、 指 状 、 纤 维 结合 素 开 型 、 II 型 ,补体 B 和 LDL- 受 体 模 块 的 3 和 3" 边界 ,这 些 蛋 白质 总 是 拼接 在 相 1 可 读 框 , 即 密码 子 的 第 一 和 第 二 个 核 苷 酸 之 间 , 对 相 1 内 含 子 的 偏好 是 相当 引 人 人 注目。 因为 在 非 模 块 蛋白 质 基因 中 几乎 不 存在 对 相 1, 相 0 和 相 2 内 含 子 偏爱 问题 。 必 须 指出 相 的 分 类 是 内 含 子 相当 保守 的 特性 。 由 于 这 种 保守 的 偏爱 ,改变 相 的 分 类 是 不 大 可 能 的 事情 :内 含 子 的 两 个 拼接 接合 点 经 历 同 时 发 生 和 补偿 改变 ,避免 破坏 蛋 白质 可 读 框 。 相 1 内 含 子 是 在 各 种 模块 的 5 和 3' 边 界 上 。 模 块 改组 (通过 内 含 子 重组 发 生 模 块 的 插入 ,缺失 和 复制 ) 的 基本 步骤 是 一 个 内 含 子 的 $' 拼 接点 与 另 一 个 内 含 子 的 3' 拼 接点 连接 。 显 而 易 见 ,内 含 子 拼接 点 的 相 容 性 对 于 内 含 子 重组 的 进化 价值 是 主要 的 ; 属于 不 同 相 的 内 含 子 重组 将 移动 可 读 框 ,并 将 导致 重组 点 下 游 的 蛋白 质 信 息 的 损失 。 换 句 话说 , 它 是 外 显 子 改组 绝对 必要 的 条 件 , 当 相 同 相 内 含 子 重组 拼接 时 ,连接 点 一 定 连接 。 通 过 内 含 子 重组 、 模 块 的 插 人 、 缺 失 和 复制 可 以 满足 这 个 标准 。 模 块 在 方向 “ 上 是 对 称 的 ,模块 两 侧 的 两 个 内 含 子 是 同一 相 (图 6.6 上 部 )。 在 原理 上 ,这 些 对 称 的 模块 组 是 1-1,0-0 和 2-2, 这 取决 于 相 1,0 或 2 内 含 子 是 否 在 模块 的 两 侧 。 非 对 称 模 块 (0-1,0-2,1-2,1-0 等 ) 在 实践 上 对 模块 蛋白 质 进 化 是 无 价值 的 。 串联 复制 2 GEA} [SB "rere 一 插入 内 含 子 EEN 炒 插入 内 宕 二 外 显 子 缺失 booties 图 6.6 外 显 子 改组 中 内 含 子 相 的 意义 盒 表示 外 显 子 ( 外 显 子 组 ) , 连 线 表示 内 含 子 ,数字 表示 相 。 如 果 模 块 是 对 称 的 ( 即 当 内 含 子 在 模块 的 5 和 3' 边 界 上 是 同一 相 ) 并 且 接 受 的 也 属于 同一 相 ,那么 可 读 框 不 受 影响 (上 部 )。 然 而 非 对 称 外 显 子 的 缺失 , 复制 或 插入 ( 即 内 含 子 在 外 显 子 5 和 3' 边 界 上 是 属于 不 同 相 ) 将 破坏 可 读 框 (下 部 )091 第 6 章 ， 外 显 子 改组 定向 进化 酶 ， 197 - 1-1 模块 : 根据 上 述 分 类 , 环 饼 \ 生 长 因子 、 指 状 结构 模块 ,补体 B 模块 等 用 于 血液 凝集 , 血 纤维 蛋白 水 解 和 补体 活化 的 蛋白 酶 的 构建 ,都 是 属于 1-1 组 。 根 据 相 适应 性 规则 ,这 些 模块 插入 到 祖先 蛋白 酶 基因 中 需要 相 1 靶 内 含 子 。 这 个 靶 内 含 子 定位 于 祖先 共同 蛋白 酶 的 信号 肽 和 催化 结构 域 之 间 。 相 1 内 含 子 是 在 丝氨酸 蛋白 酶 族 所 有 成 员 的 胰 蛋白 酶 同 源 区 的 N 端 边 界 上 ,这 些 包括 简单 的 蛋白 酶 ,例如 弹性 蛋白 酶 、 胰 凝 乳 蛋白 酶 、 胰 蛋白酶 . 激 肽 释放 酶 等 。 这 个 相 1 内 含 子 是 在 它们 的 信号 肽 和 胰 和 蛋 白 酶 同 源 结 构 域 之 间 ,这 是 祖先 蛋白 酶 的 所 有 “后 代 " 的 共同 的 内 含 子 。 胰 蛋白酶 同 源 区 可 能 由 6 个 内 含 子 组 成 ,内 含 子 插入 和 去 除 结 果 形 成 目前 的 各 种 蛋白 酶 的 外 显 子 -内 含 子 结 1 1 1 | -— -+2h 1 = Cae ee | -一 -上 | 11 11 Fy 1] 11 11 ae nb ate K 一 模块 复制 tPA ara =— Stoo ieee Al6.7 ” 尿 激 酶 .tPA 和 因子 XI 通过 1-1 模块 组 装 过 程 数字 表示 参与 组 装 过 程 内 含 子 相 。S 一 信和 号 肽 结构 域 ;P 一 胰 蛋 白 酶 同 源 模块 ; G 一 生长 因子 ;K 一 环 饼 模块 ;F 一 指 状 模块 ;FEN2 一 纤维 结合 素 I 型 模块 - 198 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 构 。 祖 先 蛋白 酶 在 其 信号 肽 和 蛋白 酶 同 源 结 构 域 之 间 有 相 1 内 含 子 。1-1 相 内 含 子 | 总 是 搬 到 这 里 ,这 个 相 1 靶 内 含 子 易 接 受 进来 的 1-1。 以 尿 激 酶 , tPA 和 因子 XI EA GIF, 它们 详细 组 装 过 程 示 如 图 6.7, 由 图 可 见 ， 1-1 生长 因子 , 环 饼 、 指 状 和 纤维 结合 素 I 型 模块 的 插 和 信和 复制 被 分 开 , 最 终 导致 基 因 结 构 中 所 有 模块 间 的 内 含 子 属于 相 1 类 。 相 类 优势 是 外 显 子 改组 进化 的 必然 结 果 。 外 显 子 改组 不 仅 反 映 了 和 蛋白质 结构 域 组 织 及 其 基因 的 外 显 子 -内 含 子 组 织 之 间 的 关系 ,而 且 也 反映 了 模块 间 内 含 子 的 特征 相 偏向 。 模 块 蛋白 质 基 因 的 结构 遵循 这 些 规则 ,实际 上 是 外 显 子 改组 进化 的 证 据 。 这 个 规则 的 正确 性 是 由 几 个 蛋白 质 的 赂 合 性 质 所 证 明 。 相 适 应 性 规则 的 必然 结果 是 1-1 模块 只 能 与 其 他 1-1 模块 连接 , 而 不 能 与 0-0 或 2-2 模块 连接 。 这 样 可 以 由 1-1 模块 构建 模块 蛋白 质 复 (cluster)。 在 这 个 复 内 模块 的 交换 只 能 是 1-1 模块 ,而 不 是 2-2 或 0-0 模块 。 选 择 素 族 提供 了 这 样 一 种 关系 的 典型 ， 例子 :C 型 凝集 素 、 生 长 因子 和 补体 B 型 模块 是 由 分 离 1-1 内 含 子 编码 的 , 即 模块 间 内 含 子 是 相 1。 然 而 也 有 少数 情况 ,基因 的 结构 与 蛋白 质 的 模块 组 织 不 是 这 种 关系 。 通过 内 含 子 插 人 可 以 改变 外 显 子 -内 含 子 结构 。 内 含 子 去 除 在 改变 基因 外 显 子 - 内 含 子 结构 中 也 起 重要 的 作用 。 逆 录 移 位 是 科学 家 所 熟悉 的 机 制 , 基 因 的 内 含 子 可 以 被 消除 。 与 大 量 的 各 种 1-1 模块 相反 ,2-2 或 0-0 模块 相对 较 少 。 6.4.3 模块 交换 的 机 制 通过 内 含 子 重组 使 模块 缺失 和 复制 的 详 节 见 图 6.8。 正 常 和 非 正 常 LDL- 受 体 基 因 结 构 比 较 揭 示 了 模块 两 侧 的 内 含 子 中 间 重 复 顺 序 (Alu 重复 ) 的 功能 ,错误 匹配 和 重组 负责 个 别 模块 的 缺失 或 复制 。 例 如 ,LDL- 受 体 基因 内 含 子 1 和 3 中 Alu-Alu 重 组 是 负责 第 二 和 第 三 LDL- 受 体 模 块 的 缺失 ;内 含 子 4 和 5 中 Alu-Alu 重组 负责 缺失 编码 第 6LDL- 受 体 模 块 的 外 显 子 ; 内 含 子 1 和 8 中 Alu 重复 负责 复制 9 个 模块 (7 个 图 6.8 通过 内 含 子 重组 产生 模块 的 复制 和 缺失 内 含 子 内 的 黑 盒 代 表 中 间 重 复 顺序 (例如 Alu 重复 ) 第 6 章 ， 外 显 子 改组 定向 进化 酶 + «199 - | LDL - 受 体 模块 和 两 个 表皮 生长 因子 模块 )。 内 含 子 6 和 14 的 Alu-Alu 重组 负责 | LDL 受 体 完整 的 表皮 生长 因子 前 体 同 源 结构 域 的 缺失 。 模块 缺失 或 复制 的 机 制 与 影响 LDL- 受 体 基因 的 非 模块 部 分 Alu- 调 节 内 含 子 重组 相同 。 两 者 的 主要 区 别 是 :在 模块 蛋白 质 中 ,改变 模块 数 产生 具有 活性 的 蛋白 质 ,而 在 非 模块 蛋白 质 中 , 扳 结构 域 的 缺失 似乎 破坏 了 蛋白 质 的 完整 性 。 模块 如 何 由 一 个 基因 运动 到 另 一 个 基因 ? 一 种 似乎 有 道理 的 假设 是 与 内 含 子 重组 机 制 相 同 ,模块 串联 复制 和 缺失 也 负责 它们 的 转移 ,然而 也 有 其 他 的 可 能 性 。 筑 块 的 插入 可 能 与 内 含 子 插入 机 制 相 同 。 但 必须 强调 ,在 “内 含 子 重组 模型 ”和 “ 模 艾 改 组 逆 录 移 位 模型 "之 间 有 重要 区 别 。 第 一 种 情况 的 内 含 子 必 须 遵 守 相 适应 性 规则 ,而 第 二 种 情况 没有 这 种 要 求 。 模 块 被 插入 到 目标 基因 预先 存在 的 内 含 子 中 ， 通过 内 含 子 重组 而 复制 和 缺失 也 使 它们 由 供 体 转移 到 受 体 基因 。 对 称 模块 往往 经 历 重 复 串 联 复制 ,结果 形成 含有 一 些 串联 拷贝 的 模块 蛋白 质 。 6.5 体外 外 显 子 改组 6.5.1 策略 和 方法 外 显 子 改组 的 自然 过 程 可 以 体外 模拟 ,通过 体外 外 显 子 改组 库 和 筛选 进化 酶 。 体外 外 显 子 改组 的 策略 和 方法 示 如 图 6.9。 在 这 种 方法 中 ,应 用 舱 合 寡 核 苷 酸 扩 增 ,编码 结构 域 的 外 显 子 或 外 显 子 组 合 ,然后 这 些 PCR 片段 的 混合 物 应 用 自我 引 动 重 登 聚 合 酶 反应 组 合 组 装 成 全 长 基因 。 当 在 一 个 基因 的 外 显 子 与 另 一 个 基因 的 外 显 子 连接 时 ,发 生 重 组 。 外 显 子 改组 库 的 多 样 性 是 由 一 些 被 变换 的 模块 数 和 每 个 模块 所 用 的 同 源 物 数 决定 的 。 在 内 合 寡 核 酸 设 计 中 ,只 选择 连接 的 守 核 苷 酸 。 按 不 同 摩尔 比 混合 编码 结 构 域 的 DNA 片段 ,人 们 可 以 精确 地 控制 最 终 库 中 个 别 结构 域 的 化 学 计量 , 像 在 自然 进化 一 样 ,可 以 通过 编码 结构 域 的 外 显 子 插入 、 缺 失 或 顺序 改变 来 增加 多 样 性 。 构建 外 显 子 改组 库 有 几 种 方式 ( 表 6.2)。 高 质量 的 库 是 通过 改组 编码 结构 域 的 外 显 子 构建 的 。 这 样 只 获得 少数 的 交换 体 并 保持 大 部 分 连接 信息 。 然 而 , 另 一 种 相反 的 方式 通过 完全 变更 外 显 子 构建 蛋白 质 库 。 这 个 途径 破坏 了 所 有 的 先前 存 在 的 连接 信息 ,结果 形成 低 平均 功能 库 ,但 可 以 产生 稀有 的 高 新 组 合 。 构 建 高 功能 库 优 选 密切 相关 种 类 同 源 物 取代 一 个 或 更 多 编码 结构 域 的 外 显 子 。 例 如 ,人 的 结 构 域 可 以 用 灵长目 动物 和 其 他 哺乳 动物 同样 蛋白 质 的 同样 结构 域 取 代 。 因 子 VO 的 报道 表明 相关 种 类 的 结构 域 取代 可 以 改进 蛋白 质 功能 。 已 证 实 人 的 因子 VII 的 稳定 性 ,并且 当 Al 和 A2 结构 域 或 只 是 A2 结构 域 被 猪 的 因子 VII 相应 结构 域 取代 时 它 的 凝集 活性 增加 。 对 蛋白 质 药物 而 言 ,为 了 使 免疫 反应 减少 到 最 小 ,人 们 - 200 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 证 外 CDR 本 下 起 始 基因 编码 结构 域 的 外 显 子 扩 增 筛选 图 6.9 体外 外 显 子 改组 这 种 方式 分 3 步 : 中 编码 结构 域 的 目标 基因 的 外 显 子 (或 外 显 子 组 ) 和 相关 基因 的 同 源 物 应 用 符合 寡 核 苷 酸 扩 增 ; @ 1 中 合成 的 DNA 片段 作为 类 PCR 反应 的 引物 和 模板 , 重新 组 装 成 全 基因 ; @@ 根 据 要 求 筛选 外 显 子 改组 库 表 6.2 外 显 子 改组 库 的 类 型 不 同 种 外 显 子 改组 外 显 子 用 不 同 种 的 同样 基因 的 等 价 外 显 子 取代 同 种 外 显 子 改组 外 显 子 用 同 种 的 不 同 基因 的 同 源 外 显 子 取代 不 同 种 结构 域 改组 结构 域 用 不 同 种 的 同样 基因 编码 的 等 价 结构 域 取 代 同 种 结构 域 改组 结构 域 用 同 种 不 同 基因 编码 的 同 源 物 取代 结构 域 数 改变 蛋白 质 结构 域 的 缺失 ,复制 或 插 人 功能 同 源 物 改组 结构 域 用 功能 上 相关 的 非 同 源 结构 域 取代 从 头 蛋白 质 组 装 多 个 独立 的 结构 域 组 装 成 新 的 蛋白 质 Ot “外 显 子 改组 定向 进化 酶 ， 201 - 可 以 构建 只 含有 人 外 显 子 的 基因 库 。 保 守 的 途径 是 用 来 自 不 同人 基因 的 同 源 外 显 子 取代 一 种 人 的 外 显 子 或 外 显 子 组 ( 即 同 种 间 取 代 库 )。 这 个 途径 可 以 提高 酶 的 活 性 或 改进 酶 的 性 质 。 外 显 子 改 组 库 可 以 由 没有 顺序 或 结构 同 源 性 的 结构 域 交 换 产生 。 在 这 个 途径 中 ,改组 所 用 的 结构 域 可 以 根据 它们 的 功能 性 质 来 选择 。Langer-Safer 等 Lo 构建 了 — tPA 突变 体 , 其 中 类 -EGF 结构 域 和 纤维 结合 素 1 型 结构 域 是 用 血 纤 维 蛋白 深 酶 原 的 非 同 源 环 饼 1 结构 域 取 代 。 去 除 两 个 N 端 结构 域 反而 增加 了 该 酶 在 细胞 质 中 的 半衰期。 对 消化 血 纤 维 蛋白 的 血 纤 维 蛋白 溶 酶 的 亲 和 性 是 由 插入 的 血 纤 维 蛋白 溶 酶 的 环 饼 1 结构 域 保持 。 功能 克隆 的 分 级 将 取决 于 改组 过 程 的 保守 性 。 由 各 种 保守 水 平 、 范 围 从 同 种 (免疫 同 源 性 ) 的 同 源 物 取代 外 显 子 到 不 同 种 的 同一 基因 的 同 源 外 显 子 ,到 顺序 同 源 性 和 功能 同 源 性 产生 简单 的 相 容 拼接 框 。 合理 设计 仅 能 构建 少数 的 特殊 的 舱 合 突变 体 , 外 显 子 改组 可 以 产生 各 种 酶 的 大 库 ,由 筛选 鉴定 最 好 的 克隆 ,然后 再 经 几 轮 突变 以 达到 最 佳 化 。 6.5.2 组 合 结构 域 重 组 分 子 生物 学 方法 和 高 通 量 筛 选 的 进步 以 及 自然 界 蛋 白质 进化 中 模块 组 装 的 灵 活性 和 多 样 性 ,有 力 地 促进 了 组 合 结构 域 重 组 各 种 技术 的 发 展 , 其 中 最 好 的 是 体外 外 显 子 改组 。 关于 体外 外 显 子 改组 ,早期 集注 在 催化 RNA 库 融 合 的 自身 拼接 内 含 子 的 探索 Fil. Fisch 等 5'21 构 建 两 个 随机 30 个 碱 基 对 外 显 子 库 , 带 有 插入 Lox-Cre 重组 位 点 的 组 工 内 含 子 顺序 位 于 随机 碱 基 对 顺序 的 9 端 或 3' 端 。 第 一 个 库 是 携带 外 显 子 库 的 质粒 转化 到 E. coi ,第 二 个 库 是 通过 叹 菌 体感 染 转化 。 体 外 通过 Cre 重组 酶 重组 两 个 库 产 生 约 1.6 x 104 库 。 在 两 个 外 显 子 库 之 间 的 Lox-Cre 重组 被 相 邻 内 含 子 顺 序 切 除 ,在 融合 点 上 保留 15 个 碱 基 对 。 筛 选 肽 库 ,用 鸣 菌 体 展示 鉴定 出 几 种 顺序 ,对 各 种 驾 蛋白 质 结 合力 达 nmolL。 同 时 ,Mikheeva 和 Jarell3] 提 出 直接 通 过 工程 反 式 拼接 组 开 内 含 子 核 酶 进行 体外 外 显 子 改 组 。 这 个 方法 是 在 人 tPA 两 个 片段 组 成 的 模型 系统 进行 的 。RNA 类 似 物 是 通过 两 个 外 显 子 分 开 逆 转录 产生 的 ， 与 它们 相应 的 内 含 子 顺序 融合 。 两 个 转录 产物 混合 物 反 式 拼接 。 虽 然 连 接 效率 是 低 的 ,但 凝 胶 分 析 明 确 地 指出 产物 的 形成 。 与 以 前 的 途径 相反 ,工程 核 酶 促进 了 两 个 外 显 子 融合 。 内 含 子 催化 重组 已 由 DNA 改组 衔 生出 新 方法 04,5] 。 最 初 实验 是 用 人 sy 进 行 的 。 在 该 结构 中 有 6 个 互补 决定 区 (CDR)。DNase 工 消化 母体 基因 产生 的 片段 FAB BCH SERA PRR ,混合 物 用 PCR 扩 增 , 库 分 析 指 出 野生 型 和 突变 体 CDR 的 - 202 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 随机 混合 分 布 在 所 有 6 TSK. ATE ARAB HE TIRES RAN RIG 性 。 链 节 的 大 小 和 顺序 以 及 每 个 库 中 外 显 子 的 浓度 ,不 同 库 的 混合 比例 都 可 以 控 制 组 装 过 程 (图 6.10)。 按 序 组 装 随机 组 装 See | Ba Rte TI SE Re 2G FJ EACTV 结构 域 I Bi RS TT SR «= RIV A B® 〈 )EESRDESS 半 ETTES@ (Fn A ee Camm @® (JEESTTRER 人 Onin Bowe Cola CO Ke Om Bow ® OCD ae Cle OC: C Sa YEE s@® Cows C030 下 TS 全 CEMES6@ ORM: Daximm@® OCmmimey (ome C§xo TD TD 从 Camim@ 《JE 从 Ommim | 重组 Po EAE] EEETEEEC 7 一 工人 一 CI Be ee 7 和 图 6.10” 外 显 子 改 组 多 结构 域 酶 的 组 合 库 可 以 通过 多 个 母体 (A ~ D) 的 模块 或 结构 域 重 组 以 有 序 的 方式 产生 ,保持 母体 大 小 ( 左 图 ) 或 随机 组 装 ,允许 在 单一 步骤 中 模块 的 插 和 人 ,缺失 ,取代 或 复制 。 图 中 黑 、 白 六 角形 ， 星 和 圆 表示 互补 单元 (互补 DNA 股 或 反 式 拼接 蛋白质 内 含 子 ) 通过 反 式 拼接 蛋白 质 内 含 子 进 行 后 翻译 蛋白 质 片 段 的 重组 可 以 用 于 组 合 蛋 和 白 质 模块 13]。 在 第 一 个 蛋白 质 片段 的 C 端 和 第 二 个 蛋白 质 片段 的 N 端的 短 蛋 白质 顺序 (和 蛋白质 内 含 子 ) 翻 译 、 二 聚合 并 催化 两 个 蛋白 质 片段 之 间 肽 键 的 形成 而 同时 自身 切割 (图 6.11)。 顺 式 拼 接 蛋 白质 内 含 子 的 应 用 也 有 报道 4 ,Otomo 等 506 报道 N -片段 on He A D241 7k 5 eee — \ I | () hk EEEEEEEEEEEEEEEEE3 有 和 \ ee | (») am + 图 6.11 WuRAHREARNSTERATEARHE (a) 在 DNA 水 平 , 两 个 片段 可 以 被 分 开 的 可 读 框 编码 ,位 于 3' 延 伸 编 码 的 N- 蛋 白质 内 含 子 (N- 片 段 ) 或 5 延伸 编码 的 C- 蛋 白质 内 含 子 (C- 片 段 ) ;(b) 转 录 和 翻译 ,蛋白 质 内 含 子 结 构 域 二 聚合 ;(c) 自 身 切 割 ,N- 片 段 和 C- 片 段 融 合 第 6 章 ， 外 显 子 改 组 定向 进化 酶 + 203 - 了 用 两 个 分 开 的 反 式 拼接 蛋白 质 内 含 子 对 标签 化 的 3 个 蛋白 质 片段 的 体外 重组 、 连接 、 体 外 再 折 笃 ,正确 地 组 装 成 全 长 蛋白 质 。 6.5.3 体外 外 显 子 改组 实例 实例 1. Ba A- 晶 体 蛋 白 , 体 外 外 显 子 改组 的 产物 5] 已 知 当 质 粒 DNA 通过 哺乳 动物 细胞 时 , 转 染 的 DNA 中 所 有 突变 都 可 以 自发 地 发 生 。 因 此 , 当 基 因 转 染 到 真 核 细 胞 中 产生 畸变 (aberrant) 产 物 , 按 逻辑 应 是 不 理 或 弃 掉 。 然 而 , 转 染 和 其 他 的 重组 DNA 技术 可 以 简单 地 开发 出 正常 发 生 在 生命 有 机 体 的 突变 过 程 , 可 以 增加 我 们 对 突变 和 进化 机 制 的 了 解 。 为 了 比较 细胞 内 各 种 哺乳 动物 小 的 热 休克 蛋白质 (sHsps) 的 性 质 , 按 常规 将 相 应 的 基因 转 染 到 不 同 细 胞 系 中 。 在 6 种 已 知 的 哺乳 动物 sHsps 中 ,一 种 特殊 的 位 置 是 由 x- 晶 体 蛋白 质 占据 。o- 唱 体 蛋 白质 是 第 一 个 作为 主要 结构 的 眼球 唱 状 蛋白 质 被 发 现 的 , 它 是 以 大 的 球状 复合 物 (800kDa) 存 在 ,含有 两 种 类 型 的 亚 基 (20kDa) , a A- 唱 体 蛋白 质 和 有 8 B- 唱 体 蛋白 质 。 在 吵 齿 动物 和 某 些 其 他 哺乳 动物 中 ,存在 较 小 的 w- 唱 体 蛋 白质 亚 基 , 起 自 c A- 唱 体 蛋 白质 的 基因 转录 的 选择 拼接 。 这 个 过 程 除了 产生 正常 的 173 个 残 基 oo A- 晶 体 蛋白 质 外 ,还 有 具有 23 个 氨基 酸 残 基 插 人 的 延伸 w Ae 唱 体 蛋白 质 。 这 个 插入 是 由 外 显 子 2 编码 ,由 于 相 邻 非 一 致 GC5' 拼接 位 点 的 存在 , 它 在 80% ~ 90% mRNA 中 被 跳 读 。 像 sHsps 族 的 其 他 成 员 ,ac A- 唱 体 蛋白 质 在 体外 有 类 分 子 伴侣 活性 ,抑制 变性 蛋白 质 的 凝集 。cu- 唱 体 蛋白 质 在 体内 最 明显 的 特征 是 它们 能 够 在 不 同 的 细胞 类 型 超 表 达 的 情况 下 赋予 耐 热 性 。 aB- 唱 体 蛋 白质 除了 唱 状 体外 在 许多 组 织 中 存在 ,在 心 胜 和 条 纹 肌 更 多 ,a A- 晶体 蛋白 质 主要 局 限于 晶状体 。 为 了 测定 是 否 w A- 晶 体 蛋 白质 进化 过 程 中 在 功能 上 是 w B- 唱 体 蛋 白质 趋 异 进化 。 有 趣 的 是 c A- 唱 体 蛋 白质 在 各 种 细胞 类 型 中 表现 Ze a B- 晶 体 蛋 白质 的 正常 结构 域 。 在 肌肉 细胞 系 ( 一 个 稳定 的 转 当 细胞 系 ) 表 达 ， 除了 预期 的 A- 晶 体 蛋 白质 和 w A- 晶 体 蛋白 质 外 ,还 高 水 平 的 表达 了 两 个 免疫 学 上 交叉 到 应 的 蛋白 质 。 实 验 发 现 这 两 个 稍 大 的 蛋白 质 是 由 大 的 基因 内 复制 的 突 变 体 w A- 晶 体 蛋白 质 基 因 编码 的 ,在 两 个 CCCAT 同 源 物 非常 规 重 组 产生 的 ( 见 图 6.1)。 串 联 复 制 的 外 显 子 3 顺序 存在 这 个 基因 成 熟 mRNA 中 ,结果 在 翻译 蛋白 质 中 形成 41 个 残 基 的 重复 。 细 胞 表达 的 延伸 w A- 晶 体 蛋白 质 有 正常 的 生长 特性 ,并 且 通 常 扩散 到 细胞 质 。 突 变 体 蛋白 质 容易 移 人 正常 的 大 的 水 溶性 c A- 唱 体 蛋 白质 BAD ,这 表明 插 人 不 干扰 复合 物 的 整合 。 这 样 ,a A- 唱 体 蛋白 质 突变 体 模拟 外 显 子 复制 是 哺乳 动物 基因 组 进化 中 外 显 子 改组 的 结果 。 实例 2. 外 显 子 交换 产生 新 功能 蛋白 质 LD] 真 核 生物 基 因 外 显 子 和 内 含 子 结构 的 发 现 进一步 阑 明了 基因 的 进化 。 外 显 子 - 204 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 是 编码 蛋白 质 分 子 的 功能 单位 ,并 且 新 功能 蛋白 质 是 由 各 种 内 含 子 交换 体 产 生 的 功能 单位 组 合 选择 所 得 到 的 , 即 是 由 一 些 外 显 子 模 块 进化 来 的 。 为 了 执行 生物 荔 能 ,蛋白 质 必 须 具 一 种 稳定 的 特殊 构象 。 如 果 外 显 子 编码 结构 和 功能 单位 ,那么 ， 外 显 子 的 组 合 可 以 预期 能 够 产生 稳定 的 功能 蛋白 质 。“ 模 块 ? 结 构 作 为 一 种 紧密 的 蛋白 质 结构 单 元 ,由 残 基 的 w- 碳 原子 之 间 的 距离 鉴定 之 ,并 与 基因 的 外 显 子 区 相 适 应 。 基 因 外 显 子 区 域 和 模块 蛋白 质 结 构 之 间 的 紧密 关系 为 Black 观点 提供 了 支 f#l2] | a-FLI8 Se A ae PP AL PL EU, FE PLEO (EC2..4. 1.22) 的 一 个 调节 亚 基 , 当 其 与 半 乳 糖苷 转移 酶 结合 时 , 它 催 化 半 乳 糖 转 为 N-CM-D-ARA 4a BE (CLeNAc) ,催化 UDP- 半 乳糖 和 葡萄 糖 有 效 地 合成 半 乳 糖 。u- 乳 清 蛋 自 也 与 钙 强烈 地 结合 。o- 乳 清 蛋 白 的 一 级 和 三 级 结构 与 C- 型 溶菌 酶 同 源 ,但 功能 上 有 很 大 的 差别 。 鸡 卵 清 溶菌 酶 (EC3.2.1.17) 催 化 多 糖 中 GLcNAc 和 N- 乙 酰 -D- 胞 壁 酸 (MurNAc 之 间 的 有 1,4 糖 苷 键 水 解 。 它 的 结构 与 功能 关系 及 基因 组 织 已 前 明 。 洲 菌 酶 的 催化 部 位 定位 在 基因 的 外 显 子 2 上 (编码 残 基 是 Trp2—Ala82) ,其 包括 催化 活性 残 基 和 结合 窒 糖 底 物 环 CD\E Al 的 一 复 残 基 。 鼠 几内亚 猪 、 人 和 山羊 乳 清 蛋白 基因 与 鸡 卵 清 溶菌 酶 基因 组 织 紧 密 相 关 。o- 乳 清和 蛋白 质 和 C- 型 溶菌 酶 基 因 在 精确 的 同样 位 置 上 有 3 个 内 含 子 ,但 内 含 子 的 结构 和 4 个 外 显 子 稍 有 区 别 ( 图 6.9)。 因 此 ,两 者 非常 相似 ,它们 是 由 共同 祖先 通过 基因 复制 趋 异 进化 而 来 的 , 它 们 是 蛋白 质 结 构 与 功能 关系 进化 研究 的 工具 。 鸡 溶菌 酶 外 显 子 2 区 的 大 多 数 氨 基 酸 残 基 组 成 它 的 催化 裂 颖 。 羊 w- 乳 清 蛋白 质 的 外 显 子 区 用 鸡 溶菌 酶 的 外 显 子 区 取代 ,赋予 - 乳 清 蛋白 催化 活性 (o- 乳 清 蛋 自 在 其 天 然 结构 形式 上 是 一 个 非 酶 促 蛋 白质 )。 这 说 明 通 过 外 显 交换 可 以 产生 新 功 能 的 和 蛋白质。 目前 ,关于 外 显 子 改组 ,体内 研究 报道 较 多 ,体外 研究 报道 较 少 ,是 一 刚刚 兴起 的 研究 领域 。 和 蛋白 质数 据 库 研究 表明 外 显 子 改 组 是 新 基因 起 源 的 普遍 机 制 。 因 此 体外 模拟 体内 外 显 子 改组 将 是 定向 进化 普遍 应 用 的 方法 4 ~~! 。 参考 文 献 Gilbert W. Why genes in pieces. Nature, 1978, 271: 501 Blake C C. Exons encode protein functional units. Nature, 1979, 277: 598 Roy S W, Nasaka M, de Souza S J, et al. Centripetal modules and ancient introns. Gene, 1999, 238: 85 ~ 91 Long M. Evolution of novel genes. Current opinion in gentic development, 2001, 11: 673 ~ 680 Van Rijk A F, Van den Hurk M J, Renkema W, et al. characterists of super a A-Crystallin, a product of in vitro exon shuffling. FEBS Lett, 2000, 480: 79 ~ 83 6 Moran J V, De Berardinis R J, Kazazian Jr H H. Exon shufflig by LI retrotransposition. Science, 1999, 283: 1530 ~ 1534 Un & WO NO — 第 6 章 外 显 子 改组 定向 进化 酶 - 205 - 7 Patthy L. Genome evolution and the evolution of exon-shuffling-a review. Gene, 1999, 238: 103 ~ 114 8 Kolkman J A, Stemmer W P. Directed evolution of proteins by exon shuffling. Nat Biotechnol, 2001, 19: 423 ~ 428 9 WAM ARR. 蛋白 质 的 结构 转换 . 生物 化 学 与 生物 物理 进展 ,1999,26:9 ~ 12 10 Patthy L.(eds), Protein evolution by exon-shuffling. 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BREE RRA 酰胺 键 的 水 解 反应 外 ,还 有 酰胺 形成 、 光 诱导 裂解 和 聚合 、 酯 交换 、 内 酯 化 、 克 来 森 重 排 反 应 、 金 属 丈 合 、 环 氧化 反应 、 氧 化 还 原 反 应 、 化 学 上 不 利 的 环 化 反应 、 肽 键 形 成 反应 、 脱 羧 反 应 及 过 氧化 反应 等 。 这 些 抗体 酶 催化 的 反应 专 一 性 相当 于 或 超过 酶 反应 的 专 一 性 ,催化 速度 有 的 可 达到 酶 催化 的 水 平 。 但 一 般 来 说 ,抗体 酶 催化 反 应 的 速度 比 非 催化 反应 快 10 ~ 10° 倍 , 仍 比 酶 催化 反应 速度 慢 10° ~ 10° 倍 。 因 此 ， 开发 制备 高 活力 抗体 酶 的 方法 仍 是 科学 家 的 奋斗 目标 。 抗体 多 样 性 是 由 基因 重 排 ,突变 和 选择 /筛选 产生 的 。 体 内 迅速 进化 的 这 种 原 理 和 免疫 系统 的 结合 ,使 它们 成 为 进化 蛋白 质 设计 方 法 的 天 然 靶 。 随 着 分 子 生 物 学 方法 的 发 展 ,在 E. coli 和 酵母 中 重组 Fab 或 scFv 的 生产 ,抗体 的 临床 和 分 析 应 用 成 为 可 能 。 另 一 个 关键 的 发 现 是 噬菌体 展示 技术 的 开发 , 它 允 许 抗体 片段 展示 在 叹 菌 体 的 表面 ,由 抗体 库 中 筛选 出 所 要 求 的 抗体 。 紧 接着 发 展 了 细菌 和 酵母 表 面 展示 技术 和 体外 核糖 体 展示 技术 ,并 用 于 抗体 的 展示 。 以 合成 的 多 肽 链 一 编码 RNA 共 价 融合 为 基础 的 技术 展示 抗体 有 很 好 的 前 景 。 这 些 展示 技术 同 结合 检验 (例如 生物 素 - 链 霉 结合 素 系 统 或 抗体 的 选择 性 标记 ) 组 合 , 可 以 迅速 地 筛选 非常 大 的 天 然 的 、 合 成 的 或 工程 抗体 库 , 可 以 迅速 筛选 10? 以 上 的 结合 蛋白 质 突变 体 全 库 。 结 合 蛋白 质 的 所 有 重要 性 质 ,例如 特异 性 . 亲 和 人 性、 稳定 性 和 折 笃 都 可 以 通过 定向 进化 改进 。 ER 第 7 章 抗体 酶 定向 分 子 进化 + 207 - 7.2 抗体 酶 定向 分 子 进 化 策略 7.2.1 突变 策略 7.2.1.1 Bp RHI 用 易 错 PCR(error-prone PCR) 773, AY ZEW Be AAR AY BY 2B EA BK CDR 区 域 的 碱 基 中 ,产生 随机 点 突变 (random point mutation) , JL VEY Za Ar mE HH FEY 抗体 其 亲和力 提高 4 倍 以 上 。 但 是 ,应 用 易 错 PCR 方法 ,需要 预先 对 所 筛选 出 来 的 抗体 基因 进行 序列 分 析 之 后 再 设计 引物 。 有 一 种 称 作 CDR 巡查 (CDR walking) 的 方法 用 于 在 体外 引入 抗体 基因 突变 。 该 方法 无 需 知道 所 筛选 的 抗体 基因 序列 ， 而 只 根据 Kabat 等 所 提供 的 重 链 CDR fa, KAS PCR 诱 变 技 术 在 重 链 CDR1 的 32 位 点 和 CDR3 的 96 ~ 99 位 点 引入 碱 基 多 样 性 。 经 得 选 后 ,其 抗体 亲和力 提高 10 倍 以 上 。 7.2.1.2 KARR! 大 肠 杆菌 菌株 mutD5 ,其 DNA 聚合 酶 II 全 酶 中 的 s 亚 基 (epsilon subunit , HAW. 基 具 有 3' ~ $' 外 切 酶 校正 活性 ) 的 基因 mauD 发 生 了 突变 ,丧失 了 其 校正 功能 ,从 而 在 该 菌株 复制 时 增加 其 体内 基因 突变 频率 。 该 菌株 的 Zac 基因 内 易 发 生 单个 碱 基 取 代 , 其 中 AT->G'C-~A:T 转 换 频 率 相同 ,A.T->T'A 的 碱 基 颠 换 要 比 A.T > C-G 的 碱 基 转 换 普 遍 上 且 频 率 高 。 该 菌株 的 自然 突变 频率 比 野生 型 高 10? ~ 10° 倍 ， 其 中 在 Lac 操纵 子 区 的 +6 位 有 一 个 碱 基 A-T>G-C 转换 的 热点 ,其 突变 频率 可 高 达 1.2x 10-3。 在 应 用 体内 抗体 突变 时 ,可 将 携带 有 Fab( 或 scFv) AMER AEH A mutD5 等 高 突变 菌株 ,也 可 将 重 链 的 可 变 区 基因 或 轻 链 的 可 变 区 基因 通过 该 突变 株 , 甚 至 用 CDR 区 片段 克隆 到 该 菌株 的 高 突变 热点 。 经 过 一 代 ( 或 几 代 ) 繁 殖 后 ,从 该 菌株 提 取 并 切 下 来 抗体 基因 片段 ,再 连接 到 鸣 菌 粒 中 ,利用 鸣 菌 体 筛选 高 亲和力 抗体 。 1.2.1.3 eH 由 于 在 库容 量 不 太 大 的 情况 下 ,B 细胞 原 有 重 轻 链 组 合 容易 丢失 ,从 原始 库 中 筛选 出 来 的 抗体 亲和力 偏 低 。 所 以 ,人 们 试图 从 原始 库 中 已 筛选 出 来 的 可 变 区 基 因 再 重新 组 合 ,使 其 进一步 多 样 化 ,从 而 提高 其 亲和力 。 这 种 再 重新 配 组 的 方法 称 - 208 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 为 链 改 组 (chain shuffling)。 同 时 链 改 组 法 也 有 助 于 研究 抗体 结构 与 功能 以 及 亲 和 力 变化 之 间 的 关系 。 链 改 组 有 几 种 情况 , 重 链 不 变 `\ 改 组 轻 链 、 使 该 重 链 与 原始 库 中 所 有 的 轻 链 组 合 ,或 与 已 筛选 出 的 几 ( 或 几 十 ) 株 抗体 中 的 轻 链 组 合 ; 轻 链 不 变 改组 重 链 、 其 组 合 方式 与 以 上 轻 链 组 合 方式 相同 。 实 践 证 明 , 链 改 组 法 是 一 条 切实 可 行 的 提高 抗体 亲和力 的 途径 ,改组 轻 链 已 得 到 了 增加 亲和力 20 倍 的 抗体 ,改组 重 链 提高 亲和力 15 倍 。 7.2.2 组 合 抗体 库 策略 0 各 种 组 合 策略 已 用 于 产生 高 度 多 样 性 的 抗体 库 ,可 以 由 库 选 择 出 高 亲 和 性 和 新 特异 性 的 抗体 。 一 种 策略 是 高 度 可 变 CDR 顺序 (人 B 细胞 的 EDNA) 用 PCR 扩 增 , 并 随机 重组 到 人 免疫 球 和 蛋白 基因 单一 主 骨 架 6 个 可 变 区 ,在 细菌 中 很 好 地 表达 并 展示 在 喉 菌 体 上 。 用 该 库 已 选择 出 各 种 不 同 蛋白 质 , 肽 和 小 分 子 抗原 的 特异 scFv 抗体 。 组 合 抗体 库 (combinatorial immunoglobulin library ) 技 术 要 点 :用 逆转 录 -PCR 技 术 从 淋巴 细胞 克隆 出 抗体 轻 链 基因 组 分 (repertoire) 和 重 链 Fd 段 基因 组 分 ,将 二 者 分 别 组 建 到 表达 载体 Lc2 和 He2 中 ,得 到 的 轻 链 基因 和 Fd 段 基 因 随 机 重组 于 一 个 表达 载体 中 ,形成 组 合 抗体 库 。 所 得 到 的 抗体 库 经 体外 包装 后 感染 大 肠 杆菌 , 铺 板 培养 ,每 个 感染 了 鸣 菌 体 颗粒 的 大 肠 杆菌 细 胞 由 于 叹 菌 体 的 增殖 而 裂解 ,所 释放 的 噬菌体 再 感染 周围 的 大 肠 杆 菌 细胞 ,在 培养 下 细菌 生长 层 内 产生 鸣 菌 斑 , 同 时 表达 的 Fab 片断 也 释放 于 叹 菌 斑 内 ,将 鸣 菌 斑 转 印 到 硝酸 纤维 素 膜 上 ,可 以 用 标记 有 过 氧化 物 酶 的 抗原 筛选 得 到 产生 特异 性 抗体 的 克隆 , 获 其 Fab 段 的 基因 。 这 个 方法 较 细 胞 融合 杂交 瘤 技术 制备 单 抗 有 明显 的 优越 性 :@ 省 去 了 细胞 融合 步骤 ,省 时 省 力 , 可 避免 因 杂 交 瘤 不 稳定 而 要 反复 亚 克 隆 的 烦琐 程序 ;@O 扩 大 了 筛选 容量 。 用 杂 交 瘤 技术 一 般 筛 选 能 力 在 上 千 个 克隆 以 内 ,而 抗体 库 可 筛选 10° 以 上 个 克隆 ;G) 用 此 技术 可 直接 克隆 到 抗体 的 基因 , 既 克 服 了 杂交 瘤 分 泌 抗体 不 稳定 而 丢失 的 弱点 ， 又 便于 进一步 构建 各 种 基因 工程 抗体 ;四 用 此 法 得 到 的 抗体 可 以 在 原核 系统 表达 ， 降低 了 制备 成 本 ;@ 构 建 抗体 库 时 , 轻 链 和 重 链 可 变 区 基因 在 体外 随机 组 合 , 可 产 生体 内 不 存在 的 轻重 链 匹 配 , 有 可 能 得 到 新 的 特异 性 单 链 抗体 。 单 链 Fv 的 优点 是 ,分 子 质 量 小 (2.6kDa) , 便于 结构 分 析 , 同时 提高 了 穿 透 组 织 的 能 力 ; 此 外 单 链 Fy 大 大 降低 了 抗体 的 免疫 原 性 , 减 小 了 治疗 中 的 不 良 反 应 ;更 重要 的 是 , 单 链 Fv 可 在 E. coli 中 表达 ,为 催化 抗体 的 大 规模 应 用 黄 定 了 基础 。 第 7 章 抗体 酶 定向 分 子 进化 ，209 - 7.2.3 鸣 菌 体 抗体 库 吕 鸣 菌 体 抗 体 库 技术 为 抗体 酶 的 制备 提供 了 更 好 的 方法 。Chen 等 器 用 烷 基础 酰胺 (phosphoramidate) 作 半 抗 原 免疫 小 鼠 后 ,从 中 筛选 出 22 个 能 同 抗原 结合 的 克 隆 , 纯 化 后 发 现 其 中 的 3 个 克隆 有 催化 活性 ,表征 了 其 中 的 一 个 克隆 ,发 现 其 动力 学 行为 符合 米 氏 动力 学 (K。= 11$umol, Kea = 0.25/min)。 这 是 第 一 个 从 抗体 库 中 筛选 出 的 催化 抗体 。 虽然 用 叹 菌 体 抗体 库 技术 可 有 效 筛 选 具有 亲和力 的 抗体 ,但 仅 靠 亲 和 特 性 得 选 抗体 酶 还 有 困难 。 这 是 因为 具有 亲和力 的 抗体 并 不 都 有 催化 活性 ,实际 上 ,具有 催化 活性 的 抗体 只 占 结 合 抗体 中 的 少数 。 另 外 ,用 OE. coli 表达 的 Fab、 单 链 Fv, 其 表达 量 一 般 在 wg 代 到 mg/ 代 , 要 得 到 足够 量 的 样品 ,用 于 动力 学 分 析 也 有 困难 。 为 了 减少 筛选 工作 量 ,将 酶 的 催化 机 制 引 入 抗体 库 直 接 选 淘 ,筛选 步 又 如 图 7.1 所 示 。 第 一 步 用 一 般 洗 涤 洗 去 非特 异 结合 的 吻 菌 体 ; 第 二 步 用 pH2.2 的 盐酸 缓冲 溶液 洗 去 非 共 价 结合 的 叹 菌 体 ;第 三 步 用 20mmol DTT 洗 出 共 价 结合 的 叹 菌 体 , 用 于 进一步 扩 增 。 经 过 5 轮 盘 选 后 ,随机 挑 取 10 个 克隆 测试 ,发 现 它 能 催化 硫 酯 的 水 解 反应 。 对 其 中 的 一 个 进行 了 研究 ,发 现 它 能 催化 硫 酯 的 水 解 反应 ,反应 遵 循 简单 的 饱和 动力 学 , Ke = 0.030/min, Kp, = 100umol, O 重 链 HEH 轻 链 | DER € MS 本 7 eo Less ER、 a ES < 一 flori 非 共 价 结合 Car* CalElori 非 结 合 4 I DNVCSM 1 3445 Bh we cal AS 4 cence a — \ amet 图 7.1 用 Fab Fr BT At Ba TR RR as EE ARB AE ARM AEAA Bia DDT, 二 硫 苏 糖 醇 ; Car", 羧 葵 青 霉 素 抗 性 基因 7.2.4 合成 抗体 库 策 略 Knappik 等 5 合成 了 人 scFv 库 (2 x 10° 成 员 ) ,包括 95% 以 上 人 抗体 多 样 性 ,在 - 210 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 所 有 各 种 组 合 中 通过 组 合 7 个 重 链 和 轻 链 骨 架 的 一 致 顺序 ,然后 引入 完全 随机 的 CDR3 盒 。 为 了 增加 该 库 的 多 样 性 ,在 6 轮 易 错 PCR 之 后 进行 体外 核糖 体 展示 和 选择 ,对 牛 胰岛 素 高 亲 和 抗 体 较 之 合成 库 选 出 的 抗体 富 集 40 倍 ( Ku = 82pmol/L) . 选 出 的 scFv 有 2~ 9 点 突变 ,并 由 不 同 的 骨架 组 成 。 7.2.5 结合 荧光 素 scFv HAE 结合 获 光 素 scFv 抗体 库 的 核糖 体 展示 是 通过 一 轮 易 错 PCR 继 之 几 轮 DNA 改 组 产生 的 ,并 且 可 以 选择 出 改进 亲和力 30 倍 的 抗体 (Ku = 0.04nmolL)。 在 第 二 个 实验 中 ,在 体外 翻译 和 和 蛋白质 折 和 至 步骤 逐渐 增加 还 原 的 条 件 下 经 五 轮 选 择 产生 突 变 体 scFv (scFv 含有 两 个 保守 的 二 硫 键 ) ,不 仅 在 体外 还 原 条 件 下 更 有 效 地 折 友 ,而 且 表 明 在 E. coli 外 周 质 功 能 表达 提高 4 倍 ,并 且 可 以 在 还 原 胞 质 中 功能 表达 。 在 两 个 实验 中 ,选择 突变 体 的 累积 突变 分 布 在 整个 顺序 ,形成 选择 功能 的 各 种 顺序 。 为 了 改进 折 肢 抗 荧光 素 结合 抗体 的 稳定 性 ,最 初 是 把 它 的 结合 突 环 嫁接 到 很 好 折 友 的 人 抗体 骨架 上 [7]。 为 了 进一步 改进 它 的 稳定 性 ,在 增加 温度 或 盐酸 肌 胁 迫 的 情况 下 ,应 用 几 轮 DNA 改组 和 鸣 菌 体 展示 库 ,最 好 的 突变 体 ( 仅 两 点 突变 ) 所 表现 出 的 热力 学 稳定 性 达 4cal/mol(1cal = 4.1868J) ,其 中 一 个 定位 在 一 个 CDR ,并 且 结 合 常数 增加 20 倍 。 抗体 的 治疗 应 用 ,例如 ,癌症 的 治疗 需要 抗体 优先 不 可 逆 结合 。 哺 乳 动物 免疫 系统 通过 体 细 胞 突变 产生 高 亲 和 性 抗体 ,这 个 过 程 称 为 亲 和 性 成 熟 。 然 而 ,体外 亲 和 性 成 熟 的 遗传 上 限 阻止 具有 解 离 常 数 Ki < 0.1nmolL 抗体 的 产生 [。 通 过 体 外 进化 ,完整 的 scFv 顺序 仅仅 4 轮 易 错 PCR 和 DNA 改组 , 继 之 酵母 表面 展示 和 展 示 的 突变 体 库 最 佳 化 动力 学 筛选 ,产生 最 佳 突 变 体 ( 解 离 速 率 降 低 1000 多 倍 )。 在 各 种 选择 的 高 亲 和 人 性 突变 体 中 ,所 鉴定 的 一 些 一 致 突变 发 生 在 体 细胞 超 突 变 过 程 不 可 及 区 。 7.2.6 TI 细胞 受 体 策略 TI 细胞 受 体 (scTCR) 是 产生 多 样 性 另 一 组 免疫 结合 蛋白 质 (不 涉及 体 细胞 突 变 ) ,成 为 经 得 起 检验 的 生物 学 设计 途径 [9]。 与 scFv 抗体 比较 , 当 在 E. coli 表达 时 ,重组 scTCR 不 太 稳 定 上 且 可 溶性 差 。scTCR 随机 突变 , 继 之 酵母 表面 展示 ,选择 便于 展示 且 保 持 抗原 亲 和 性 的 突变 体 。 有 趣 的 是 ,许多 鉴定 的 突变 改变 了 oa- 链 和 B 链 界面 上 特异 可 变 位 点 的 残 基 , 这 些 残 基 是 天 然 存 在 于 许多 更 稳定 抗体 的 可 变 区 。 然 后 ,展示 的 最 好 的 3 个 突变 体 同 野生 型 scTCR 一 起 混合 并 进行 易 错 PCR ,这 样 产 生 的 库 展 示 在 酵母 表面 ,为 提高 耐 热 性 和 改进 在 酵母 中 的 分 泌 进 行 平行 第 7 章 抗体 酶 定向 分 子 进化 + 211 - FACS 筛选 。 在 3 轮 富 集 后 获得 稳定 性 明显 改进 的 克隆 ,可 以 在 OS CH (SH RE 变 体 在 45 蕊 比较) 分 记 量 增加 20 倍 (2000mg/L) 。 与 抗体 不 同 ,TCR 在 体内 亲 和 性 成 熟 过 程 中 不 经 历 体 细 胞 突变 ,报道 的 TCR 亲 和 性 (10 ~ 107L/mol) 低 于 抗体 (10; ~ 100LZmol)。 然 而 ,scTCR 的 体外 进化 可 使 亲 和 性 增加 约 100 倍 ( Ka=9nmol/L)00。 7.2.7 提高 催化 活性 策略 Takahashi 等 50 开发 出 提高 抗体 酶 催化 活性 (天 ss) 策 略 一 一 定向 进化 抗原 - 抗 体 识 别 以 改进 抗体 酶 催化 活性 的 体外 策略 。 改 进 的 突变 体 催 化 活性 提高 6~ 20 倍 (907.447). 7.3 ”抗体 酶 定向 分 子 进化 筛选 /选择 策略 7.3.1 结合 、 催 化 和 免疫 组 分 策略 [2.09] 各 种 免疫 球 蛋 白 是 免疫 系统 的 和 蛋白质。 它们 的 多 样 性 主要 在 组 成 抗原 结合 部 位 的 互补 决定 区 (CDR) ,是 B 细胞 分 化 时 基因 顺序 重组 产生 的 。 虽 然 多 样 性 在 抗 体 成 熟 时 可 以 通过 体 细 胞 随机 突变 扩 增 ,但 理论 上 总 的 有 效 多 样 性 不 大 于 10”, 因此 ,从 半 抗 原 ( 反 应 过 渡 态 类 似 物 或 反应 性 化 合 物 ) 开 始 搜索 抗体 酶 。 实 际 上 是 由 可 能 的 抗体 库 中 选择 抗体 酶 ,这样 ,选择 抗体 酶 首先 考虑 结合 能 。 抗 体 酶 是 典型 地 对 着 小 分 子 半 抗原 (化 学 反应 的 过 渡 态 类 似 物 ) 提 升 。 在 最 好 的 情况 下 ,人 们 可 以 预期 抗体 -抗原 相互 作用 全 部 有 效 的 结合 能 将 转 为 过 渡 态 稳定 化 ,以 AAC 表示 ， 它 直 接 与 过 渡 态 解 离 常数 KErs 相 关 ( 图 7.2)。 这 样 , 典 型 的 抗体 -抗原 复合 物 解 离 常数 在 nmol/L( Ku = 10- mol/L) 范 围 , 可 以 转化 为 反应 过 渡 态 的 解 离 常数 ( Kgs = 10-?mol/L)。 对 于 一 种 底 物 的 反应 ,具有 典型 的 Michaelis-Menten 常数 K,, = 107° mol/[L ,那么 特异 的 速率 加 速 可 以 预期 是 KKuneat = Km/Krs = 109, 相 应 于 降低 过 渡 态 能 量 大 约 8.4kcal/mol。 其 次 ,考虑 "抗体 催化 "反应 涉及 所 用 半 抗 原 的 实际 结 构 。 免 疫 库 的 抗体 实践 上 是 可 及 的 ,或 者 用 单 克隆 抗体 技术 ,或 者 应 用 鸣 菌 体 展 示 技术 。 在 上 述 情况 下 ,免疫 系统 在 含水 环境 通过 结合 亲和力 进行 操作 。 它 是 通过 下 水 力 驱 动 ,用 脂肪 族 或 芳香 族 取 代 。 设 计 半 抗原 最 简单 的 和 最 有 效 的 途径 是 带 有 芳香 基 并 相应 于 反应 过 渡 态 类 似 物 中 的 底 物 。 底 物 中 的 芳香 基 也 有 利于 反应 产 物 的 动力 学 分 析 ,最 常 采 用 的 是 UV 或 荧光 分 析 。 - 212 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 Ab+TS [Ab][TS’] ABT oe, Ab+TS* Arts = [AbTS"] 图 7.2 经 过 渡 态 TS* 或 抗体 过 渡 态 AbTS* ,抗体 催化 和 未 催化 底 物 S 转化 为 产物 了 抗体 的 催化 作用 是 通过 AAAG 给 出 ,其 相应 于 过 渡 态 解 离 常 数 7.3.2 理论 检验 策略 7.3.2.1 筛选 的 敏感 性 抗体 酶 经 常 以 活性 系统 开始 操作 ,其 背景 表明 反应 的 非 催化 水 平 。 抗 体 酶 的 底 物 饱和 动力 学 遵循 米 氏 方程 。 为 了 使 底 物 浓度 接近 零 ,催化 / 非 催 化 反应 比率 增 加 到 最 大 (图 7.3)。 同 时 反应 的 绝对 速率 趋向 零 。 这 样 ,抗体 催化 作用 在 最 低 可 能 的 底 物 浓度 (产物 形成 仍然 是 可 检测 ) 将 是 最 好 检验 的 。 应 用 高 底 物 浓度 对 于 饱 和 底 物 结合 部 位 可 能 是 必需 的 。 结 合 部 位 的 饱和 只 使 反应 有 意义 ,但 不 表明 任何 未 催化 成 分 。 催化 剂 检验 敏感 性 第 二 个 方面 是 涉及 检 试 溶液 中 潜在 的 有 效 催化 剂 浓度 。 在 最 适 条 件 下 , 底 物 浓度 在 Ka 以 下 观测 的 反应 速率 由 下 式 给 出 Vobs = Vuneat + Veat = Kuncat ¥ [S] + ( Keat/Km) x [Ab] [SLS Vcat/uncat = Rica Kicen) 7 Kn! x [ Ab] = [ Ab ]/Kys 考察 已 发 表 的 抗体 酶 的 资料 表明 ,许多 抗体 酶 具有 过 渡 态 解 离 常 数 Krs 大 约 是 10- 7molL, 其 相应 于 特异 的 速率 提高 , Ke Kuncar = 10? ,对 于 每 个 结合 部 位 分 子 质量 约 70kDa 抗体 ,最 低 筛 选 浓 度 ng/ml = 2mg/L 是 检验 活性 水 平 所 需要 的 。 在 杂交 瘤 细 胞 培养 中 单 克 隆 抗体 的 浓度 一 般 适 于 分 析 。 相 反 ,在 非 最 佳 条 件 下 重组 子 表达 系统 一 般 达 不 到 这 样 的 抗体 浓度 。 第 7 章 抗体 酶 定向 分 子 进化 + 213° 0 ies TOMAR) 图 7.3 催化 速率 vea, 未 催化 背景 反应 Vinca A 两 者 va 的 比率 作为 底 物 浓度 的 函数 的 对 数 表示 图 解 一 种 底 物 反应 遵守 米 氏 预 平 衡 结 合 模型 7.3.2.2 筛选 的 选择 性 筛选 的 选择 性 涉及 对 观察 所 要 求 的 催化 反应 速率 的 影响 。 给 定 的 抗体 样品 反 应 速率 超过 缺乏 抗体 的 样品 的 未 催化 反应 ,这 并 不 意味 观察 效应 实际 上 是 来 自 抗 体 的 结合 部 位 。 在 抗 抗原 抗体 的 情况 下 ,假设 催化 部 位 紧密 结合 抑制 剂 在 免疫 抗 原 情 况 中 是 有 效 的 ,观察 催化 效应 受 半 抗 原 抑 制 可 以 在 筛选 时 立即 检 试 。 这 是 确 定 催 化 作用 来 源 的 一 种 简单 的 \ 必 需 的 条 件 。 催 化 作用 也 应 当 根 据 多 重 转换 率 来 证 明 。 关 键 问题 之 一 是 遇 到 抗体 被 产物 抑制 。 有 效 催化 作用 ( 低 的 Krs) 一 般 是 通 过 观察 对 半 抗 原 高 亲和力 ( 低 Ri)。 在 许多 抗体 酶 已 观察 到 催化 效率 与 半 抗 原 结 合 之 间 的 相关 性 。 紧密 结合 半 抗 原 的 观察 进一步 证 明 抗 体 催化 作用 。 因 为 催化 活性 可 以 清楚 预 计 抗 体 的 结合 部 位 数 。 定 量 抑制 作用 可 有 效 地 排除 可 能 的 酶 污染 。 当 研究 典型 的 “自然 发 生 反应 ”(abiological reaction) AY , 酶 污染 的 危险 通常 是 低 的 。 从 酶 设计 的 观 点 来 看 这 是 最 有 趣 的 。 当 研究 典型 类 酶 反应 时 , 酶 污染 可 能 是 很 成 问题 的 。 抗 体 催化 作用 最 终 证 据 是 必须 观察 到 活性 。 7.3.2.3 筛选 实践 D4,15] 检验 的 敏感 性 和 选择 性 一 般 可 以 认为 是 发 现 抗体 酶 的 必要 参数 。 应 用 荧光 和 生 色 反应 筛选 杂交 瘤 产 生 的 抗体 ,原则 上 可 以 迅速 和 简单 地 检验 任何 数量 样品 的 催化 作用 。 ° 214+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 1. 逆 - 狄 尔 斯 - 阿 德尔 抗体 酶 双环 前 药物 1 逆 - 狄 尔 斯 - 阿 德尔 反应 (retro-Diels-Alder reaction) 释 放 硝 酰 ( 基 ) (一 种 调节 NO 的 前 体 ) 和 萄 产物 2( 图 7.4)。 这 个 反应 很 容易 根据 荧光 测定 ,因为 底 物 是 非 荧光 的 ,而 产物 2 在 蓝 区 有 强烈 荧光 。 这 种 非 生物 逆 - 狄 尔 斯 - 阿 德尔 抗 体 酶 在 pH4 ~ 10 之 间 似 乎 与 pH 无关, 并 对 缓冲 液 或 共 溶 剂 效应 完全 不 敏感 。 同 时 ,这 个 反应 有 可 测 的 自发 速率 (Ku = 10-5/Ms)。 这 样 ,该 反应 是 在 抗体 催化 的 有 效 参 数 之 内 。 最 重要 的 是 该 反应 不 被 蛋白 质 ( 例 如 清 蛋白 抗体 或 酶 ) 非 特异 催 化 ,因此 可 以 直接 在 细胞 培养 中 测定 。 逆 -德尔 斯 -阿尔 德 酶 Gaim 催化 抗体 wat O vA OH OK 从 Keat / Kuncat =103 y, ras PIX S Krs = 4x10 mol/L Se: x , ’ CH; HNO 图 7.4 抗体 催化 逆 - 狄 尔 斯 - 阿 德尔 反 通过 荧光 高 通 量 筛 选 , 能 够 和 选 14 000 以 上 杂交 瘤 细 胞 培养 样品 ,其 是 由 鼠 对 反应 的 过 渡 态 类 似 物 免疫 产生 的 ,并 分 离 出 8 个 抗体 酶 , Kcat/Kuncat = 10 ~ 10°. 这 些 速率 提高 是 在 典型 抗体 酶 范围 内 ,KaAs 范 围 在 0.1~ 0.9umol 世 之 间 。 这 种 高 通 量 筛选 甚至 弱 活性 抗体 (及 ./KE，。 = 100) 也 容易 在 细胞 培养 中 检 出 。 活 性 最 高 的 抗体 酶 已 经 进行 了 详细 地 研究 ,其 作用 机 制 根 据 X 射 线 唱 体 结构 已 确立 。 2. 新 戊 酸 酶 活性 抗体 酶 酯 酶 可 以 存在 于 细胞 培养 样品 中 ,并 可 以 观察 其 催化 作用 的 发 生 。 对 磷酸 半 抗原 3 一 5$ 免疫 ,用 荧光 底 物 6 作为 检 试 底 物 ,在 水 解 时 释放 强 荧光 7- 羟 基 香 豆 素 (图 7.5)。 虽 然 新 成 酰 氧 甲 基 (POM) 衍 生物 6 在 细胞 绕 养 中 表现 出 很 小 的 非特 异 水 解 作 用 ,但 是 它 是 潜在 的 酯 酶 底 物 。 应 用 细胞 培养 进行 第 一 轮 免疫 和 筛选 ,用 ELISA 检验 强 的 半 抗 原 结 合 , 并 通过 加 入 半 抗 原 抑 制 催化 作用 。 该 实验 产生 五 个 单 克 隆 抗体 细胞 系 ,表现 出 特异 的 半 抗 原 抑 制 水 解 。 然 而 抗体 的 纯化 表明 没有 与 蛋白 质 G 抗体 亲 和 柱 结合 ,最 大 可 能 是 由 酯 酶 污染 造成 的 。 通 过 半 抗 原 抑制 催 化 作用 更 弱 (10-5molML) ,并 且 用 ELISA 检验 半 抗 原 对 抗体 没有 强 的 亲和力 ,这 进 一 步 证 明 催化 活性 不 是 来 自 抗体 。 根据 这 些 实验 ,筛选 杂交 瘤 细 胞 培养 样品 可 以 应 用 抗体 预 纯 化 操作 (图 7.6)。 ne -一 i a 第 7 章 抗体 酶 定向 分 子 进化 - 215 - H N NH- 载 体 蛋白 eg Oe Chale RPG O O 3 (R=t-Bu) 4 (R=CH2Cl) 5 (R=Ce Hs) O YA 水 解 SS Oo >0 ZA Ox” =O) HO O O 6 7 图 7.5 抗体 催化 新 成 酸 氧 甲 基 (POMD) 酯 的 水 解 (1) 负载 细胞 培养 样品 (0.5~5ml) (2) 洗 涤 (2Xlml PBS 7.4,.Iml NaCl 160mmol/L) 5. 用 菊 光 底 物 (0.1mmolyD) 检验 :加 和 不 加 可 溶性 半 抗 原 (0.03mmolD) (3) 洗 脱 (2X0.15ml fre 5SOmmol/L_ pH2.7) (4) 中 和 (0.04ml Tris Imol/L) 图 7.6 检验 杂交 瘤 细胞 培养 样品 的 抗体 预 纯 化 操作 0.5 ~ Sml 细胞 培养 样品 中 的 免疫 球 蛋 白 通 过 很 小 量 的 蛋白 G 凝 胶 (简单 地 用 Pas- teur Pipetle 填充 ) 选 择 性 地 结合 。 凝 胶 用 中 性 缓冲 液 洗涤 ,然后 抗体 用 小 体积 的 酸 性 缓冲 液 选择 性 地 洗 脱 。 洗 脱 样品 被 中 和 ,通过 比较 半 抗 原 存在 或 缺乏 情况 下 奖 光 确 物 6 反应 速率 可 以 特异 的 检验 半 抗 原 抑制 催化 。 BA J G 预 纯化 操作 可 以 在 2h 内 手工 操作 纯化 40 个 样品 。 催 化 作用 短 选 是 在 大 约 Sml 细胞 培养 体积 的 杂交 瘤 样品 中 进行 的 。 选 择 60 个 细胞 系 ,检验 了 半 抗 原 抑制 催化 并 进一步 培养 。 所 有 的 抗体 成 功 地 两 次 亚 克 隆 。7 个 已 确定 在 表达 和 纯化 之 后 半 抗 原 抑制 催化 。 不 仅 在 第 一 次 克隆 鉴定 催化 作用 ,而 且 在 第 一 次 和 第 ' 216 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 二 次 亚 克 隆 之 后 ,催化 检 试 也 是 必需 的 。 的 确 ,来 自 初始 催化 杂交 瘤 的 亚 克 隆 常常 在 ELISA 发 现 阳性 ,但 催化 作用 却 是 阴性 ,而 其 他 ELISA 是 阴性 ,催化 作用 也 是 阴 性 。 分 离 出 的 新 戊 酸 酶 抗体 酶 是 第 一 个 能 够 水 解 新 戊 酸 酯 的 抗体 。 7.4 “抗体 酶 定向 分 子 进 化 筛选 /选择 方法 7.4.1 直接 筛选 器 在 微生物 的 自然 代谢 途径 中 , 尿 苷 酸 的 合成 是 由 乳 清 酸 磷 酸 核糖 转移 酶 (OPRTase) 及 乳 清 酸 脱羧 酶 (ODCase) 依 次 完成 。 如 果 一 个 微生物 是 ODCase 缺陷 型 , 那 它 必 须 含 尿 喀 啶 磷酸 核糖 转移 酶 (Ura-PRTase) 将 尿 喀 啶 直接 转变 成 尿 苷 酸 (UMP)。 如 果 设 计 的 抗体 酶 具有 催化 乳 清 酸 脱羧 作用 , 则 能 弥补 微生物 的 缺陷 ,在 不 含 尿 喀 啶 的 培养 基 中 也 能 生长 (图 7.7)。 为 了 获得 乳 清 酸 脱羧 抗体 ,Smiley 等 合 成 了 过 渡 态 类 似 物 半 抗 原 [ 图 7.8(b)]。 将 此 抗原 与 KLH 偶 联 后 ,免疫 小 鼠 ,构建 喉 菌 体 抗体 库 ,感染 ODCase 缺陷 型 大 肠 杆菌 后 ,在 不 含 尿 喀 啶 的 培养 基 上 生长 。 这 样 只 有 含 催化 乳 清 酸 脱 羧 的 抗体 基因 的 菌株 才能 长 出 克隆 。 结 果 从 16 000 个 转化 体 中 筛选 出 6 个 具有 催化 乳 清 酸 脱羧 的 克隆 。 他 们 把 其 中 的 1 个 单 克 隆 抗体 转变 成 单 链 抗体 ,并 在 大 肠 杆菌 中 表达 ,结果 证 明 也 有 明显 活性 。 O aC % AS oAN COO \_ODCase Ribose-5-PO, el UMP oAn-coo- 图 7.7 尿 苷 酸 (UMP) 生 物 合成 途径 上 部 途径 包含 天 然 酶 OPRTase 和 乳 清 酸 脱 羧 酸 酶 (ODCase) ; 缺少 OPRTase 和 /或 ODCase 的 突变 株 ， 在 抗体 酶 (具有 乳 清 酸 脱羧 酶 活力 ) 和 天 然 酶 Ura-PRTase 存在 下 , 仍 可 按 下 部 途径 合成 UMP 7.4.2 ”化 学 筛选 是 应 用 筛选 试剂 可 从 抗体 组 合 库 中 通过 化 学 筛选 获得 糖苷 酶 抗体 。 半 抗原 A Era oad 第 7 章 ”抗体 酶 定向 分 子 进化 + 217: (a) (b) 图 7.8 诱导 乳 清 酸 脱羧 抗体 的 半 抗 原 设计 (a) 乳 清 酸 脱羧 的 过 渡 态 ;(b) 设计 的 半 抗 原 中 糖苷 键 水 解 产 生 醒 甲 基 化 物 B, 它 能 共 价 捕获 抗体 库 中 的 具有 糖苷 酶 活力 的 Fab (图 7.9)。 算 选 出 的 Fab 能 催化 水 解 忆 - 硝 基 葵 基 及 吡 喃 半 乳 糖 糖苷 ,速度 加 强 比 (ER) 为 70 000, 而 且 经 典 的 过 渡 态 类 似 物 法 所 制备 的 最 好 的 糖苷 酶 抗体 ,其 ER 值 仅 有 100。 对 于 任何 难 解 离 的 反应 ,只 要 它 能 通过 反应 中 间 体 捕获 抗体 都 可 用 该 法 筛选 出 高 效 催化 剂 ( 见 3.3 节 )。 HO OH CHF; CHF HO O i BO: NH x | CO_ 链 节 CO- 链 节 A B 图 7.9 半 抗 原 (A) 用 于 化 学 筛选 糖苷 酶 抗体 片段 Fab; 柄 甲 基 化 物 (B) 可 捕获 并 显示 具有 催化 性 质 的 Fab 7.4.3 遗传 选择 遗传 选择 进化 酶 (改进 催化 活性 稳定 性 和 改变 专 一 性 ) 是 相当 有 效 的 。 因 此 ， 为 提高 抗体 的 催化 活性 ,开发 遗传 选择 是 相当 有 意义 的 研究 工作 。 对 遗传 选择 而 言 ,必须 确定 活性 酶 /抗体 表达 生长 优势 的 条 件 。 对 高 催化 活性 的 抗体 酶 而 言 ,这 种 条 件 的 确定 相对 容易 ,对 于 催化 活性 低 的 抗体 酶 而 言 ,确定 这 种 条 件 是 困难 的 。 然而 ,影响 细菌 生长 速度 的 其 他 因子 ,例如 毒性 差别 和 抗体 的 表达 水 平 可 以 完成 遗 传 选择 。Schultz 等 46 报道 了 抗体 酶 催化 活性 遗传 选择 的 一 种 策略 一 一 .col 生 长 优势 策略 ,生长 优势 是 催化 活性 的 直接 结果 。 开发 遗传 选择 首先 是 选择 营养 缺陷 型 宿主 和 互补 策略 。 一 种 很 好 的 选择 宿主 应 当 容 易 操 作 ,能 够 产生 活性 抗体 并 适合 各 种 底 物 范围 的 选择 。 根 据 这 些 要 求 ， Schultz 等 采用 E. coli HDU78 ,由 于 其 缺失 分 支 酸 合成 酶 基因 (aroc) 不 能 合成 分 支 &. E.coli HDU78 [hdsFmcrl3 araD139A (ara ABC-leu)7679A Lac x 74galUgalK rpsl ' 218 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 thi-aroc purF: Tn10] 是 由 菌株 MC1061 [ hdsFmerl3 araD139 A (ara ABC-leu) 7679 全 Lacx74 galUgalK rpsl thi-] 通 过 一 系列 Pl 转 导 产生 的 。 分 支 酸 是 项 草 酸 途 径 一 个 关键 中 间 体 ,并 且 主 要 的 代谢 产物 酷 氨 酸 , 共 两 氨 酸 , 色 氨 酸 ,对 氨基 葵 甲 酸 (PABA) ,对 羟基 葵 甲 酸 和 蜡 分 支 酸 的 生物 合成 是 需要 的 。 原 则 上 ,这 些 营 养 成 分 的 任何 一 种 可 以 作为 互补 的 基础 。HDU78 能 够 表达 活性 形式 的 Fab ,产量 100 ~ 200u.2/L. 开发 遗传 选择 其 次 是 挑选 选择 标记 和 反应 系统 。 以 PABA 为 基础 互补 应 当 是 相当 普遍 的 ,因为 化 学 反应 范围 (例如 水 解 、 消 除 、 氧 化 还 原 等 ) 可 以 与 营养 成 分 的 释放 偶 联 。 此 外 ,以 PABA 为 基础 的 互补 应 当 将 催化 活性 转 为 可 测 的 生长 优势 , 因 为 维持 E. coli 生长 所 需要 的 PABA 浓度 非常 低 (1 ~ 10nmolML)。 为 了 检验 抗体 催 化 互补 反应 中 PABA 的 效用 ,研究 了 醛 缩 酶 抗体 38C2。 该 抗体 酶 底 物 谱 广 ,特别 是 催化 前 体 药 物 的 活化 ,例如 ,1 经 逆 -3- 羟 基 丁 醛 逆 - 迈 克 尔 加 成 反应 顺序 (图 7.10)。 这 个 系统 对 于 PABA 释放 容易 修饰 。 9 、vOH 人 38c2 俊 化 逆 -3- 羟 基本 醛 “O 0 O AX ot NHR 一 一 一 一 一 yin e O” ~NH-R A 1 R= 阿 霉 素 z 38C2 众 化 2 R=PABA 1 SR isa cone O O 迅速 和 未 催化 COMMRREPABA =———-—- HO wae ee 图 7.10 前 药物 1 和 底 物 2 的 逆 -3- 羟 基 丁 醛 - 逆 -迈克 尔 活 化 涉及 38C2 催化 PABA 释放 的 一 种 遗传 选择 需要 底 物 2 不 被 任何 的 内 源 酶 转 化 为 PABA。 在 培养 介质 中 未 催化 反应 的 速率 足够 低 , 以 提供 可 选择 的 窗口 。 展 物 2 被 合成 (图 7.11) ,然后 在 各 种 浓度 的 PABA 或 2 存在 下 比较 HDU78 的 生长 速 率 。 为 了 测定 活性 抗体 的 表达 提供 生长 优势 并 鉴定 最 佳 生 长 条 件 , 用 表达 38C2 的 细菌 进行 一 系列 模型 选择 ,用 表达 38C2 失 活 的 突变 体 的 细菌 作为 对 照 。 3 H OR 4 R=Et b Ls eat C O O Fan vk ° O 2 H OH 图 7.11 底 物 2 的 合成 第 7 章 抗体 酶 定向 分 子 进化 + 219 - 总 之 ,Schultz 等 开发 出 以 缺乏 分 支 酸 合成 酶 活性 的 E. coli 营养 缺陷 型 的 互补 为 基础 ;抗体 酶 的 新 的 遗传 选择 系统 ,通过 一 系列 模型 选择 ,成 功 地 确立 了 抗体 酶 活性 的 表达 提供 生长 优势 的 选择 条 件 , 即 证 实生 长 优势 是 催化 活性 的 直接 结果 。 该 选择 系统 对 催化 活性 转 为 可 测 的 生长 优势 相当 敏感 。 通 过 产生 抗体 的 大 组 合 库 并 进行 重复 几 轮 选择 和 DNA 改组 ,可 以 鉴定 出 高 活性 的 醛 缩 酶 抗体 。 7.4.4 动力 学 选择 应 用 鸣 菌 体 展 示 抗 体 库 的 体外 进化 是 获得 抗体 酶 的 有 效 方法 。Takahashi 等 5 提出 了 定向 进化 抗原 -抗体 识别 以 改进 抗体 酶 催化 活性 的 体外 策略 。 在 酶 的 自然 选择 和 抗体 酶 免疫 选择 之 间 是 平行 的 。 在 免疫 反应 时 ,由 多 样 性 的 抗体 库 中 可 以 选择 出 TSA 有 亲和力 的 抗体 ,并 且 亲 和 力 通过 抗体 基因 的 超 突变 (hypermutation ) 进 一 步 最 佳 化 。 这 样 对 底 物 过 渡 态 的 进化 被 认为 是 最 大 亲和力 的 进化 。 根 据 过 渡 态 理论 ,抗体 酶 对 过 渡 态 亲和力 强 不 一 定 反 应 速度 最 大 (天 ss)。 因此 ,为 了 进化 高 催化 活性 的 抗体 酶 ,就 得 使 亲和力 的 差异 最 佳 化 。 然 而 ,为 了 最 佳 化 亲和力 差异 就 得 控制 抗体 对 底 物 的 过 渡 态 和 基态 的 识别 。 Takahashi 等 应 用 鸣 菌 体 展示 技术 ,根据 酶 的 进化 动力 学 体外 进化 抗体 酶 。 这 RE ,初始 的 抗体 酶 噬菌体 展示 库 对 着 新 设计 的 TSA 进行 选择 ,使 过 渡 态 相对 于 基 态 的 亲和力 最 佳 化 ,这 样 提供 具有 改进 反应 速度 (Ko) 的 突变 体 。 进 化 的 抗体 酶 同 初始 抗体 的 结构 和 动力 学 比较 指出 库 的 优点 超过 了 通常 的 体内 进化 ,体外 进化 对 于 产生 新 的 催化 剂 以 及 提供 检验 酶 进化 动力 学 (dymamics) 有 很 大 的 潜力 。 作为 检验 体外 定向 进化 的 模型 系统 ,Takahashi 等 选择 了 抗体 酶 ODO, 它 水 解 前 体 药 物 1 产生 氧 霉 素 2( 图 7.12)。 体 外 用 TSA3 免疫 产生 的 抗体 6D9 作为 抗体 酶 ， 其 具有 不 同 程度 的 水 解 活性 。 以 前 研究 表明 ,在 水 解 反应 中 6D9 和 其 他 的 抗体 酶 ,稳定 由 羟 阴 离子 进攻 酯 羧基 所 产生 的 过 渡 态 。6D9 的 X 射 线 结 构 分 析 和 定位 诱 变 确定 了 催化 残 基 。 应 用 动力 学 和 结构 信息 ,Takahashi 等 合理 地 设计 了 6D9 ME 菌 体 展示 库 ,对 着 新 设计 的 TSA4 选择 ,与 体内 方法 所 获得 的 初始 抗体 酶 比较 ,可 以 产生 高 活性 的 进化 抗体 酶 。 6D9 喉 菌 体 展示 库 是 通过 pComb3 系统 修饰 构建 的 ,通过 PCR ,制备 了 6D9 轻 链 库 ,其 中 国 绕 催化 His 的 6 个 氨基 酸 的 密码 子 随机 化 (图 7.13)。 为 了 相对 于 基 态 反应 的 过 渡 态 的 亲和力 最 佳 化 ,设计 了 新 的 TSA4。 在 TSA4 中 ,化合 物 3 的 三 氟 乙酰 基 用 于 免疫 , 转 为 乙酰 基 。 抗 体 酶 的 体外 进化 策略 较 之 体内 罕 出 的 优点 是 允 许 用 一 系列 相应 于 TSA 结构 的 抗原 重复 进行 选择 。 体外 进化 的 单 链 抗体 突变 体 , 具 有 最 高 单价 结合 配 体 的 亲 和 性 。 根 据 酵 母 表 面 展 示 抗 体 的 最 佳 动 力学 筛选 ,在 4 轮 亲 和 突变 和 筛选 之 后 解 离 速 率 降低 1000 售 - 220: EE DRAR——MEM OTH O NHCOCF, O OH ON NHCOCHCI, ON NHCOCHCI, 1 2 NHCOR o NHCOCF; Oo P O OH OCOCH20H O, NHCOCHCI, ON NHCOCHCI, 3:R=CF3 4: R=CH3 5 图 7.12 抗体 催化 前 体 药 物 活化 毛 霉 素 单 酯 衍生 物 (1) 被 抗体 酶 水 解 产 生 毛 霉 素 (2)。 半 抗原 3( 水 解 的 过 渡 态 类 似 物 ) 用 于 免疫 产生 抗体 酶 。 半 抗原 4( 半 抗原 3 TED) 用 于 鸣 菌 体 展 示 抗 体 酶 的 选 淘 , 底 物 5 用 于 动力 学 研究 lacZ “pelB 重 链 gplll lacZ pelB = 4 HH SL E=z Sacl Belli Xbal CDRICDR2CDR3 -" §5'-35|0 REE 24 3'- 引 物 TBeE 1247) 125) th263 “27> aifbJPTc d © 22 12801.29 130 31: sass AGA TCT AGT CAG ACC ATT GTA CAT AGT AAT GGA GAC ACG TAT TTA GAT Ro oe Trl NS eS N G DD” T* ” Ys ae NNK NNK NNK CAT NNK AAT GGA NNK NNK [SSS Xaa Xaa Xaa H Xaa N G_ Xaa Xaa 5'- 引 物 (72- 聚 体 ) 图 7.13 在 pComb3 Zi "P , MERA KJ AN 6D9 424% CDRI 库 的 构建 以 上 。 目前 ,100 多 种 抗体 临床 试用 于 癌 、 病 毒 、 自 身 免疫 和 其 他 疾病 的 治疗 。 高 亲 和 性 抗原 的 识别 是 所 有 治疗 剂 的 核心 问题 ,并 且 一 般 由 哺乳 动物 免疫 系统 体内 亲 和 性 成 熟 来 实现 。 由 于 亲 和 性 是 治疗 应 用 的 关键 ,通过 定向 进化 已 经 产生 较 高 亲 第 7 章 ”抗体 酶 定向 分 子 进 化 ，221 ， 和 性 的 抗体 。 抗 体 / 半 抗原 识别 已 经 通过 结构 、 热 力学 \ 动 力学. 计算、 光谱 和 突变 方法 进行 表征 。 7.4.5 应 用 反应 化 合 物体 外 选择 抗体 酶 :”， 酶 催化 作用 的 自然 选择 是 改进 功能 的 一 种 结果 ,从 而 提高 进化 过 程 中 机 体 的 适应 度 。 相 反 ,应 用 给 定 的 化 学 转化 反应 配 位 的 信息 ,根据 与 反应 过 渡 态 类 似 物 或 所 设计 的 带电 化 合 物 的 结合 来 选择 抗体 酶 。 如 果 在 免疫 系统 内 选择 ,可 能 将 简单 的 结合 转换 为 催化 功能 ,从 而 有 效 的 产生 抗体 酶 ,将 这 种 策略 称 为 反应 免疫 (reac- tive immunization)。 反 应 免疫 策略 为 高 效 抗体 酶 的 制备 提供 了 一 种 途径 ,用 该 途径 制备 的 抗体 酶 的 惟一 特征 是 它们 的 底 物 范围 广 。 鸣 菌 体 展 示 抗 体 库 已 成 为 鉴定 单 克隆 抗体 的 一 种 有 效 策 略 。 在 体外 应 用 鸣 菌 体 抗体 库 以 反应 化 合 物 进 行 化 学 选择 可 以 获得 抗体 酶 ,并 且 不 受 动 物 来 源 或 免疫 反应 的 限制 。 应 用 各 种 二 酮 衍生 物 的 喉 菌 体 库 筛 选 策 略 ,改变 了 醛 缩 酶 抗体 底 物 专 一 性 和 转换 率 。 应 用 该 策略 制备 的 抗体 酶 ,可 有 效 地 催化 环 已 酮 -3- 羟 基 丁 醛 28, 因 为 28 的 逆 -3- 羟 基 丁 醛 反 应 与 丙酮 -3- 羟 基 丁 醛 比较 是 相当 低 的 (图 7.14)。 鸣 菌 体 库 通 过 对 着 30- 牛 血清 白 蛋白 (BSA) 和 1- 牛 血清 白 蛋 白 选 淘 来 选择 。 由 这 种 选择 获得 的 Fab28 催化 反 式 -31` 顺 式 -31 和 顺 式 -32 的 逆 - 羟 基 丁 醛 反应 。Fab28 的 玉 s 值 超 过 母体 抗体 3 ~ 10 倍 。 此 外 ,Fab28 同 抗体 33F12 相似 的 Kes 值 催化 丙酮 -3- 羟 基 丁 醛 。 QO OH 76 a “0 Dear ey AA se 30-BSA H 1-BSA H 反 式 -31 顺 式 -31 图 7.14 构建 醛 缩 酶 抗体 的 反应 和 化 合 物 - 222: 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 7.4.6 催化 抗 -DNA 抗体 的 筛选 方法 Mouratou 等 :8 开发 一 种 抗 DNA 水 解 抗体 的 微 效 价 平板 筛选 方法 一 一 亲 和 连 接 守 核 苷 酸 核酸 酶 检验 (ALONA) 方 法 (图 7.15) ， 所 采用 的 DNA 底 物 的 3' 端 生物 (a) do 5! CDIGD -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT - 3! subBV 5’ DIG) -AAAAAAACCCCCCCATATAGCGCGTTTITTT - 3 (b) dA)a:d(Dn > ~ TITTTTTTTTITTTTTTTITTTTTTTITTTTTTTTTITMIT — #3 ′ HO -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA -OH5' dssubBy 5 CDI@ -AAAAAAACCCCCCCATATAGCGCGTITTTTT - 3’ 3’. HO -~TITTTTTGGGGGGGTATATCGCGCAAAAAAA - OHS’ 图 7.15 (a) RE DNA 底 物 的 顺序 。 底 物 的 3' 端 用 生物 素 @@ 标 记 ， 5' 端 用 地 高 辛 (DIG) 标 记 ;(b) 相 应 标记 双 股 DNA 顺序 ne | | 核酸 酶 反应 B 一 一 一 人 | 加 入 AP- 标 记 的 抗 -地 高 注 | Fab 片 段 和 pNPP 底 物 一 图 7.16_ ALONA 微 效 价 检验 的 图 解 双 标 记 的 窒 核 苷 酸 底 物 固 定 在 涂 铺 链 霉 结合 素 微 效 价 平板 上 。 反 应 允许 在 涂 铺 底 物 的 孔 中 进行 。 然 后 用 抗 地 高 辛 ELISA 定量 检验 地 高 辛 未 分 裂 的 DNA。AP 表示 碱 性 磷酸 酶 ; pNPP 表示 对 硝 基 共 磷酸 第 7 章 ， 抗体 酶 定向 分 子 进化 - 223- 素 化 (B) ,5“ 端 地 高 辛 配 基 标 记 (DIG)。 这 种 底 物 专 一 地 同 涂 铺 链 霉 亲 和 素 微 效 价 平板 孔 结合 并 发 生 反应 。 未 分 裂 的 底 物 保留 着 高 亲 和 标 记 , 然 后 用 酶 标记 的 抗 -地 高 辛 抗体 检验 ,通过 测定 S1 核酸 酶 和 DNase I 活 性 及 EDTA 对 反应 的 抑制 作用 评 估 检 验 效率 (图 7.16)。ALONA 操作 成 功 地 用 于 大 量 的 杂交 瘤 克 隆 的 筛选 。 ALONA 方 法 对 高 通 量 筛选 潜在 的 各 种 核酸 酶 和 抗体 酶 是 很 有 价值 的 。 虽 然 该 法 是 为 筛选 水 解 DNA 抗体 酶 设计 的 ,但 它 可 以 适用 于 检验 其 他 类 型 底 物 分 裂 反应 。 7.4.7 选择 性 感染 吻 菌 体 :4 PEPE HE RUE WF GA {AK (selectively infective phage) 利 用 不 具 感 染 力 的 GII 蛋白 N 端 结构 域 缺失 型 叭 菌 体 作为 抗体 库 载 体 ,将 抗原 与 鸣 菌 体 缺 失 的 GII 蛋白 N 端 结 构 域 融合 ,可 以 与 抗原 发 生 抗 原 抗体 结 合 反 应 的 喉 菌 体 抗体 因 具 有 了 缺失 的 GO 蛋白 N 端 结构 域 , 而 重新 获得 感染 力 ,通过 这 一 方法 可 选择 与 半 抗 原 结合 的 抗体 。 以 此 原理 为 基础 ,Gao 等 进一步 研究 了 将 鸣 菌 体感 染 力 恢复 与 抗体 催化 活性 直接 相 联系 的 抗体 酶 选择 方法 ,如 图 7.17。 该 方法 以 经 抗体 催化 后 可 与 抗体 共 价 结 合 , 并 可 与 GII 蛋白 结合 的 标记 基 团 的 双 功 能 化 合 物 作为 选择 底 物 , 含 催化 抗体 的 失去 感染 力 的 哈 调 体 俱 化 该 化 合 牧 水 解 并 与 之 结合 ,然后 通过 该 化 合 物 末 端 与 顺 丁 烯 二 酰 亚 胺 ， 生物 素 或 NTA NH 顺 丁 烯 二 酰 亚 胺 ， 捕获 的 噬菌体 抗体 生物 素 或 NTA | aoa’ ric MGI AN Sa 感染 噬菌体 图 7.17 用 标记 的 放 捕 剂 恢复 鸣 菌 体感 染 力 选择 亲 和 催 化 抗体 - 224+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 GI 蛋白 结合 而 使 感染 力 恢复 。 利用 已 鉴定 的 两 个 葵 酯 水 解 抗体 对 上 述 方法 进行 的 研究 发 现 ,以 共 价 机 制 水 解 葵 酯 的 抗体 PCP21H3 非 感染 鸣 菌 体 的 感染 力 可 以 得 到 有 效 恢复 ,而 不 以 共 价 机 制 催化 的 抗体 PCP2H6 鸣 菌 体 的 感染 力 不 能 恢复 ,说 明了 此 方法 具有 较 好 的 选择 性 。 研 究 还 发 现 , 该 方法 具有 很 高 的 选 出 效率 , RAS AIA 6x 10' ,因而 可 能 成 为 从 较 大 的 抗体 库 中 选择 催化 抗体 的 有 效 方法 。 aA & W 一 10 11 12 13 14 15 16 17 18 S$ #4 X 献 PRR. 酶 工程 . 北京 :化 学 工业 出 版 社 ,2002 田 波 , 李 传 昭 , 孙 仑 泉 , 王 学 . 分 子 进化 工程 . 北京 :科学 出 版 社 ,1999 沈 倍 奋 . 分 子 文库 . 北京 :科学 出 版 社 ,2001 RAD ARR. 抗体 工程 药物 . 北京 :化 学 工业 出 版 社 ,2002 Knappik A,，GeLM,，Honegger A, et al. 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A method for the detection and Screening of catalytic anti-DNA antibodies, J Immunol Methods, 2002, 269: 147 ~ 155 第 8 章 蛋白 质 组 代谢 途径 、 病 毒 和 细胞 的 定 回 进 化 8.1 引 = 20 世纪 后 50 年 的 生命 科学 基本 上 是 围绕 基因 和 蛋白质 这 条 主线 展开 的 。 基 因 组 计划 的 提出 和 实施 导致 了 基因 组 学 (genomics) 的 诞生 , 它 是 以 生物 体内 全 部 基因 为 对 象 进行 整体 性 研究 。 基 因 组 学 的 研究 已 经 取得 了 传统 分 子 生物 学 难以 取 得 的 成 就 ,生命 科学 进入 了 ”后 基因 组 时 代 ”"。 在 基因 组 学 的 推动 下 产生 了 和 蛋 昌 质 组 学 (proteomics) , 它 研究 基因 组 表达 的 全 部 蛋白 质 及 其 活动 规律 , 即 在 细胞 中 和 蛋 白质 整体 水 平 上 进行 研究 。 随 着 基因 组 学 和 蛋白 质 组 学 研究 的 深入 ,科学 家 认识 到 生命 是 一 个 复杂 的 非 线性 系统 , 它 有 自 组 织 和 自 组 装 的 特性 。 一 些 简单 的 分 子 组 装 成 生物 大 分 子 以 后 就 会 出 现 某 种 新 功能 ,这 种 功能 难以 从 形成 其 物质 基础 推 导出 。 细胞 是 生命 的 基本 单位 ,有 着 各 种 不 同 的 生命 活动 ,这 些 活 动 不 是 孤立 的 ,而 是 相关 联 和 高 度 协 调 的 ,形成 细胞 活动 的 网 络 结构 。 多 种 相互 作用 的 分 子 构成 复 合 结构 , 它 是 执行 细胞 功能 的 基本 单位 , 称 为 "模块 "(module)。 一 个 功能 模块 是 一 个 独特 的 整体 ,不 同 于 其 他 模块 。 模 块 不 是 静态 ,而 是 动态 的 ,不 同时 间 有 不 同 的 分 属 。 这 就 是 说 生命 科学 的 研究 的 趋向 似乎 是 个 体 性 一 整体 性 一 复杂 性 ,不 同时 期 都 将 产生 新 概念 ,新 方法 和 新 学 科 。 生物 进化 的 理论 指导 生命 科学 各 个 层次 的 研究 以 及 各 分 支 学 科 体 系 的 建立 。 同时 ,进化 论 也 随 着 生命 科学 各 学 科 的 发 展 而 进化 。 无 论 是 人 或 自然 ,还 是 一 种 理 论 或 学 科 本 身 ,都 处 于 不 断 的 进化 之 中 。 时 至 今日 ,进化论 不 再 仅仅 是 一 种 理论 ， 而 是 一 门 预见 性 科学 ,并 逐渐 成 为 一 门 应 用 科学 。 定向 进化 的 实质 是 达尔 文 进化 论 在 分 子 水 平 上 的 延伸 和 应 用 。 现 在 定向 进化 已 由 基因 和 有 蛋白质 分 子 向 基因 组 和 和 蛋白质 组 、 代 谢 途 径 和 病毒 甚至 向 细胞 方面 努 FASE ARB A 7 章 都 是 围绕 核酸 和 和 蛋白质 定向 进化 展开 的 。 本 章 介 绍 定向 进化 在 基因 组 学 、 蛋 白质 组 学 代谢 途径 、 病 毒 和 细胞 方面 的 应 用 ,但 是 应 该 指出 这 方面 的 工作 还 刚刚 开始 。 - 226+ 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 8.2 结构 基因 组 定向 进化 的 策略 和 方法 结构 基因 组 学 应 该 有 传递 三 维 结构 信息 的 宏伟 目标 ,然而 至 今 只 有 小 部 分 天 然 蛋 白质 适 于 结构 测定 。 这 是 因为 存在 一 些 瓶 颈 问 题 , 例 如 表达 量 少 聚集 、 错 误 折 生 、 稳 定性 差 以 及 结晶 困难 等 。 一 般 通过 它们 的 天 然 同 源 物 紧密 相关 的 可 溶性 ey Pets Be A OR RK SH] 结构 基因 组 计划 建立 了 迅速 测定 小 部 分 天 然 蛋白 质 结 构 的 可 行 性 ,但 重要 的 瓶颈 仍然 是 大 部 分 天 然 蛋 白 质 结 构 的 迅速 测定 问题 。 例 如 ,结构 基因 组 计划 集注 在 超 嗜 热 蛋 白质 ,但 是 他 们 在 E. c 吸 表达 时 , 约 50 多 的 靶 蛋 白 形 成 包涵 体 或 不 浴 性 聚集 体 。 目 前 ,解决 这 个 瓶颈 问题 的 策略 可 以 分 为 两 类 1:@ 广 泛 检 试 策略 , 即 应 用 天 然 可 溶性 蛋白 质 的 条 件 进行 广泛 检 试 ; 凶 补 偿 策略 , 即 应 用 修饰 的 蛋白 质 顺 序 ,使 其 适 于 结构 测定 并 保持 它 的 天 然 构 象 。 应 用 天 然 蛋 白质 顺序 的 优点 是 蛋 自 质 很 可 能 保持 它 的 功能 ,缺点 是 在 后 翻译 修饰 过 程 中 的 晚期 所 进行 的 表达 ,再 折 Be 溶解 ( 增 溶 ) 和 结晶 条 件 进行 搜索 、 耗 时 耗资. 并 且 只 有 少量 的 靶 蛋 白 。 相 反 ， 应 用 修饰 蛋白 质 的 优点 是 适 于 高 通 量 结构 测定 ,顺序 广泛 搜索 可 以 在 早期 阶段 进 行 , 检 出 的 可 能 性 更 大 。 对 工程 可 溶性 蛋白 质 而 言 ,依赖 GFP 体外 定向 进化 技术 可 以 简单 地 鉴定 出 高 度 可 溶 蛋 白质 的 突变 体 , 这 个 途径 的 潜在 缺点 是 所 产生 的 蛋 白质 有 时 可 能 是 非 功 能 的 。 结构 基因 组 学 提出 另 一 个 有 效 的 策略 匀 : 〇 由 蛋白 质 族 或 根据 重要 生物 化 学 功能 选 出 靶 顺 序 ;@ 这 些 刘 是 错误 折 私 或 不 溶 ,并 且 不 服从 常规 的 稳定 化 方法 , 例 如 再 折 琶 。 但 适 于 高 通 量 结构 测定 ,并 可 由 定向 进化 和 筛选 得 到 。 例 如 ,采用 GP 折 和 登 报告 的 定向 进化 改进 了 核 苷 二 磷酸 激酶 (NDP-K) 的 折 琶 和 溶解 性 ,进化 的 唱 体 含 有 6 个 点 突变 ,有 NDP-K 酶 活性 。X 射线 衍射 解析 结构 的 结果 表明 基本 上 与 紧密 相关 的 结构 同 源 物 相同 。 这 个 工作 证 实 依赖 GFP 定向 进化 途径 是 有 效 的 。 为 了 获得 可 溶 的 正确 折 麦 蛋白 质 , 常 规 途 径 包括 低温 表达 ,采用 各 种 强度 的 局 动 子 ,各 种 提高 溶解 性 的 融合 标签 EEK EUR BE, RARE 成 功 的 ,但 是 对 高 通 量 应 用 来 讲 不 是 理想 的 。 这 是 因为 :中 每 个 目标 都 要 进行 各 种 操作 ;@ 在 实现 目标 之 前 条 件 试验 是 有 限 的 ;@ 这 些 方法 不 能 用 于 修饰 蛋白 质 的 内 在 折 笃 稳定 性 和 溶解 性 ,甚至 在 最 初 表达 或 再 折 登 实验 过 程 中 以 可 浴 形 式 获 得 的 蛋白 质 组 分 ,在 随后 的 加 工 和 浓缩 时 仍然 可 能 发 生 不 可 逆 的 凝集 ,这 是 结构 基因 组 学 另 一 瓶颈 问题 。 为 了 解决 这 个 瓶颈 问题 , 另 一 种 策略 是 以 某 种 方式 改进 目标 蛋 白质 内 在 的 折 笃 ,产生 稳定 性 和 可 溶性 的 蛋白 质 。 当 结构 已 知 时 ,定位 突变 有 时 可 以 改进 蛋白 质 的 溶解 性 。 友 silico 方法 也 可 以 用 于 预测 稳定 的 突变 ,但 是 这 些 突 变 对 折 春 途径 的 潜在 有 害 效应 是 不 能 预计 的 。 根 据 功能 ,有 时 可 以 设计 出 体内 得 = a ee Agata. —————— | 1a | 第 8 章 蛋白质 组 \ 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 + 227 - 选 /选择 方法 ,应 用 高 通 量 液体 处 理 技术 ,用 细胞 裂解 液 可 以 提高 活性 筛选 。 由 于 它们 需要 目标 蛋白 质 的 结构 或 功能 信息 ,所 有 上 述 方法 都 缺乏 普遍 性 。 对 于 大 量 各 种 目标 蛋白 质 来 讲 ,不 是 所 有 和 蛋白质 的 活性 都 容易 检 出 。 因 此 设计 高 通 量 功 能 检验 可 能 是 不 实际 的 。 这 里 介绍 筛选 /选择 可 溶 蛋 白质 的 一 些 方法 ,尤其 是 适合 结构 基因 组 学 的 一 些 方法 。 最 近 发 展 的 蛋白 质 可 溶性 筛选 和 选择 方法 基本 上 可 分 为 3 类 :中 融合 报告 法 ; @ 和 宿主 细胞 应 激 反应 法 ;G) 直 接 检验 方法 。 8.2.1 融合 报告 融合 报告 法 (图 8.1) 是 一 种 检 试 蛋白 质 与 易 检 验 的 报告 蛋白 质 以 遗传 融合 形式 表达 。 检 试 蛋白 质 的 折 和 友和 可 溶性 是 通过 融合 的 报告 结构 域 活性 进行 筛选 /选择 。 (a) 4 (set 检 试 蛋白 质 是 可 溶 的 | R 是 非 功能 的 8.1 融合 可 溶性 报告 的 原理 易 测 功能 的 报告 结构 域 经 柔性 链 节 融 合 到 检 试 结构 域 。(a) 当 检 试 蛋白 质 是 可 浴 时 ,报告 结构 域 是 功能 结构 域 , 它 的 活性 可 以 检测 。(b) 当 检 试 蛋白 质 是 不 深 的 或 错误 折 释 时 ,报告 结构 域 的 功能 处 于 功能 和 非 功能 之 间 。 报 告 结构 域 可 能 部 分 具 AAW. 检 试 的 方式 只 取决 于 报告 的 功能 ,其 可 能 是 可 选择 的 标记 和 蛋白质 ， 例如 酶 或 抗菌 素 蛋白 质 , 或 可 筛选 的 标记 ,例如 酶 或 荧光 和 蛋白质。 完整 的 蛋白 质 或 蛋白 质 片段 都 可 以 用 0 (b) 检 试 蛋白 质 是 不 溶 的 8.2.1.1 绿色 荧光 蛋白 质 (GFP) 折 亚 报 告 法 5 在 该 方法 中 检 试 的 蛋白 质 的 C 端 与 GFP RRA AIA. GFP 的 荧光 产量 传导 融 合 蛋 白质 是 否 成 功 折 麦 的 信息 。 表 达 折 释 且 可 溶 的 融合 蛋白 质 的 细胞 比 缺乏 折 重 不 溶 的 融合 蛋白 质 的 细胞 荧光 强度 大 。GFP 只 是 为 了 监控 检 试 蛋白 质 的 折 丢 产 量 。 用 这 个 方法 可 以 工程 蛋白 质 的 可 溶性 [5-51。 GPP 定向 进化 过 程 大 体 如 下 :每 轮 GFP 定向 进化 是 由 两 阶段 构成 0 。 第 一 阶 - 228 - ke wRAR——BMERATHK 段 是 通过 易 错 PCR 和 DNA 改组 建立 GFP 融合 突变 体 库 ,第 二 阶段 由 突变 体 库 中 选择 E. coli 克隆 ,其 与 野生 型 相 比 ,产生 较 强 的 荧光 。GFP 融合 到 检 试 蛋白 质 C 端 作 为 上 游 蛋白 质 适 当 折 县 的 报告 。 从 选择 的 克隆 得 到 突变 体 基因 , 菊 光 提高 的 突变 体 的 基因 用 于 下 一 轮 突 变 体 库 的 制备 。 在 三 轮 正 向 进化 以 后 (没有 同 野生 型 回 交 ) ,最 终 选择 出 具有 最 大 欧 光 强度 和 浴 解 性 改进 的 蛋白 质 。 8.2.1.2 和 毛 老 素 乙 酰 转移 酶 (CAT) 融 合法 Davidson 等 :2 证 实 E. coli 在 含有 和 毛 霉 素 的 介质 中 存活 率 , 是 与 人 端 同 CAT 融合 的 检 试 蛋白 质 在 细胞 中 可 溶性 表达 呈正 相关 性 , 氧 霉 素 提供 了 选择 压力 。 Amold 等 53] 应 用 该 法 富 集 可 溶性 突变 体 库 。 8.2.1.3 ”PROSIDE 技术 蛋白 质 可 溶性 往往 高 度 依赖 于 稳定 性 和 折 和 到 。 鸣 菌 体 展示 技术 能 够 选择 稳定 性 提高 的 多 肽 。Shmid 等 0 应 用 PROSIDE 技术 选择 小 的 冷 休 克 和 蛋白质。 他们 证 实 两 种 选择 压力 (变性 剂 或 提高 温度 ) 为 蛋白 质 稳定 化 提供 两 种 不 同 的 策略 。Bak- er 等 05 设 计 了 一 种 选择 策略 以 捕 集 业 降 低 的 各 种 肽 (增加 折叠 度 )。 在 该 方法 中 ， 各 种 肽 展示 在 SH2 结构 域 允 许 的 部 位 ,依次 展示 在 噬菌体 上 。 具 有 低 灶 ( 即 稳定 和 闭合 的 N 端 和 C 端 ) 的 各 种 肽 保留 SH2 结构 域 的 功能 。 该 鸣 菌 体 库 在 磷酸 酷 氢 酸 珠 上 选 淘 以 回收 折 丢 的 肽 。 8.2.1.4 质量 控制 Barberis 等 545] 发 展 了 一 种 融合 报告 系统 ,他 们 称 为 质量 控制 (quality control) 。 采用 可 选择 的 遗传 标记 以 鉴定 可 溶性 单 链 抗体 (scFv)。 该 系统 在 酵母 中 操作 HK 用 了 经 典 的 双 杂 交 系 统 与 组 成 类 似 物 融合 。scFv 被 融合 到 可 选择 的 包含 转录 活化 结构 域 (AD) 和 来 自 Gal IP 的 肽 片段 标记 有 蛋白质。 如 果 scFv 是 稳定 的 ,并 且 是 可 溶 的 话 ,融合 的 AD-Gal I P 结构 域 可 以 同 结合 的 DNA Gal4(1 ~ 100) 片 段 结 合 , 因 此 活化 HIS3 Fl LacZ 报告 基因 的 转录 。 在 适当 菌株 背景 和 选择 介质 上 , HIS3 的 表 达 人 允许 宿主 细胞 存活 (适应 选择 ) ,而 LacZ 允许 蓝 / 白 筛选 。 这 样 ,表达 可 洲 性 sFv 细胞 将 存活 ,而 表达 不 稳定 或 不 溶 scFv 的 细胞 将 死亡 ,因为 缺乏 可 检验 标记 HIS3 的 表达 。 在 可 溶性 和 细胞 存活 之 间 有 很 好 的 相关 性 。 该 系统 是 否 适 于 结构 基因 组 学 正在 探索 中 。 第 8 章 和 蛋白质 组 、 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 ，229 - 8.2.1.5 LacZ a(B 半 乳糖 苷 酶 ao 肽 ) 补 充 可 溶性 报告 检验 LacZ a ike 100 个 氨基 酸 组 成 。LacZ a 肽 标签 与 检 试 蛋白 质 融 合 !m1。 如 果 融合 的 蛋白 质 仍 是 可 溶 的 ,并 且 标 签 物 不 被 掩蔽 的 话 ,那么 ,LacZ ao 肽 可 以 结合 失 活 的 LacZo, 恢 复 B 半 乳糖 苷 酶 活性 。 分 裂 蛋白 质 的 遗传 补充 具有 以 下 优点 :中 小 的 标签 可 以 预期 对 检 试 蛋白 质 的 折叠 和 稳定 性 影响 不 大 ;@ 由 于 补充 只 取决 于 可 溶 形式 中 标签 的 可 及 性 , 肽 标签 可 溶性 报告 对 于 监控 缓慢 和 蛋白质 凝 集 过 程 可 能 是 特别 有 效 的 ;GQLacZ a 系统 可 作为 可 选择 的 标签 ,应 用 最 低 介质 (乳糖 作为 碳 源 ) 在 适当 宿主 中 存活 。 这 可 以 选择 改进 的 可 溶性 蛋白 质 大 库 (1 x 10…”)。LacZ a HH 报告 是 否 适 于 结构 基因 组 学 仍 需 探 索 。 8.2.2 往 主 细胞 应 激 反 应 报告 Bently 等 08] 应 用 宿主 细胞 应 激 反应 报告 可 溶性 和 折 释 ,这 是 非 侵害 的 应 激 报 告 。 它 是 根据 热 休 克 启 动 子 驱动 GFP 表达 以 监控 细胞 对 各 种 刺激 的 应 激 反应 。 例如 热 休 克 、 渗 透 应 激 、 乙 醇和 诱导 。 作 者 应 用 差 式 mRNA 表达 和 DNA 基因 芯片 检验 巨 . col 细胞 对 各 种 应 激 因子 的 反应 。 当 重组 蛋白 超 表达 时 , 热 休克 反应 启动 子 fisH.clpP. ion, ompT.degP.groEL.aceA 和 ibpA 向 上 调节 。 应 用 驱动 应 激 反应 启 动 子 报告 基因 ,可 以 鉴定 强烈 影响 体内 蛋白 质 折 丢 产 量 的 沉默 突变 09]。Lesley 等 5 更 严格 地 研究 了 巨 . coli 启动 子 , 当 错误 折 和 蛋白 质 超 表达 时 ,其 是 最 强 并 特 异地 被 活化 。 含 有 E. coli ORF 的 排列 的 基因 表达 芯片 用 于 评价 EL. coli 超 表达 不 深 蛋 白质 对 可 溶 蛋白 质 的 各 种 基因 的 表达 。 当 错误 折叠 蛋白 质 表 达 时 , 某 一 基因 特异 地 活化 。 根 据 这 些 实验 ,选择 小 热 休 克 蛋 白质 ibpA 的 启动 子 控制 ZacZx 报告 基因 的 表达 ,它们 可 以 区 分 可 深部 分 可 溶 和 不 溶 聚 组 氨 酸 标签 的 重组 蛋白 质 。 8.2.3 直接 检验 Knaust 和 Nordlund!?"! 应 用 滤 板 和 斑点 印迹 发 展 了 聚 组 氨 酸 标记 的 可 溶性 蛋白 质 表 达 的 方便 筛选 方法 。 全 细胞 裂解 液 放 在 多 和 孔 滤 板 上 , 抽 真 空 。 可 溶性 组 分 通 过 滤 膜 ,并 在 多 孔 板 上 收集 。 保 留 在 滤 板 上 的 不 深部 分 应 用 变性 剂 溶解 ,并 在 第 二 个 多 孔 滤 板 收 集 。 膜 上 的 组 分 洗涤 ,用 抗 聚 组 氨 酸 抗体 探 针 并 展开 。 用 双 盲 实验 也 可 以 区 分 96 孔 板 随机 排列 的 两 种 蛋白 质 (一 种 是 可 溶 的 , 另 一 种 是 不 溶 的 )。 该 方法 的 缺点 :可 以 筛选 的 库 的 大 小 不 仅 受 有 效 的 塑料 器 严 的 限制 ,而且 抗 体 斑点 需 要 结合 ` 洗 桨 和 探 针 的 宛 长 循环 。 - 230 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 Peabody 等 [2 发展 了 一 种 改变 聚合 和 可 溶性 蛋白 质 的 筛选 方法 。 在 营养 琼脂 平板 上 生长 E. coli 克隆 表达 质粒 编码 MS2 病毒 壳 蛋 白 的 突变 体 。 该 克隆 铺 上 含 有 裂解 试剂 和 抑制 生长 的 抗生素 琼脂 层 , 可 浴 性 蛋白 质 由 克隆 扩散 到 琼脂 中 。 捕 TRE FAVA, DEAL MS2 壳 和 蛋白 抗体 探 针 ,并且 用 方便 的 ELISA 技术 检验 。 斑 点 的 直径 和 强度 与 可 溶性 蛋白 质 的 量 以 及 蛋白 质 的 扩散 速率 正 相 关 。 可 溶性 突变 体 的 二 聚 体 扩散 的 快 ,给 出 大 的 斑点 。 可 溶性 蛋白 质 同 不 溶性 突变 体 相 比 给 出 更 强 的 斑点 。 显 然 ,该 方法 也 采用 一 般 标记 物 抗 体 ( 即 聚 组 氮 酸 抗体 )。 目 前 ,用 该 法 Petri 平板 每 8cm 筛选 出 几 百 个 克隆 ,但 在 克隆 之 间 需 要 适当 空间 以 避免 个 别克 隆 fa SHES. 8.3 基因 组 改组 发 酵 占有 30 ~ 50 亿美 元 的 世界 市 场 。 通 过 单 细 胞 内 的 多 酶 催化 可 以 将 简单 的 原料 转 为 高 附加 值 产品 。 发 酵 产物 的 范围 有 高 附加 值 天 然 产品 、 蛋 白质 药物 .工业 酶 和 化 学 品 。 科 学 家 们 不 断 的 寻找 催化 路 线 , 由 可 更 新 生物 量 产生 商业 的 化 学 品 ,为 此 经 常 进 行 鉴定 或 构建 菌株 以 改进 化 学 转化 。 然 而 ,第 一 代 催化 剂 很 少 满足 商 业 化 热 行 的 标准 。 限 制 生 物 催 化 剂 应 用 的 因素 包括 低产 量 、 重 现 性 \ 效 价 \. 过 程 条 件 的 耐 受 力 ( 例 如 极端 温度 .pH 或 溶剂 或 溶质 浓度 ) 等 ,改进 上 述 情况 需 花 大 力气 。 用 细胞 将 底 物 转 为 产物 ,最 理想 的 是 使 细胞 ( 即 生物 催化 剂 ) 能 高 密度 迅速 生 长 ,能 在 最 低 生 长 情况 仍 保持 高 活力 ,能 利用 廉价 的 底 物 并 以 高 速率 分 泌 目 的 产 物 ,很 少 或 没有 其 他 的 副 产 物 等 。 为 了 达到 此 目标 ,人 们 采用 了 各 种 方法 。Pat- naikl23] 和 Zhang 等 52 ,证 实 了 组 合 方法 是 改进 细菌 表 型 的 有 效 方法 。 该 方法 涉及 完整 基因 组 改组 一 一 原生 质 体 融 合 少量 的 母体 菌株 表 型 有 明显 改进 。 在 下 述 两 种 情况 得 到 证 实 : 中 泰 乐 菌 素 (tylosin) 生 产 的 改进 。 泰 乐 菌 素 是 一 种 弗 氏 链 霉 fA ( Streptomyces fradiae ) 产 生 的 复杂 聚 酮 抗生素 。Q@ 了 乳酸 杆菌 ( Lactobacillus ) 耐酸 菌株 的 分 离 ,以 使 其 适用 于 低 pH 发 酵 生产 乳酸 。 在 上 述 两 种 情况 下 ,仅仅 几 轮 基 因 组 改组 就 可 得 到 表 型 明显 改进 的 菌株 。 虽然 随机 突变 和 选择 方法 已 成 功 地 选 出 许多 工业 菌株 ,但 是 这 些 方法 对 于 改 进 细 胞 的 表 型 是 困难 的 ,因为 表 型 是 由 分 布 于 整个 基因 组 的 一 批 基因 决定 的 ,对 其 所 知 甚 少 ,甚至 不 知 。 实 验 表明 在 组 合 途径 中 ,细胞 的 随机 突变 或 同 源 基因 改组 对 于 改进 细胞 表 型 是 有 效 的 。 组 合 途径 的 成 功 取决 于 起 始 突变 体 的 选择 ,遗传 重组 过 程 的 效率 和 选择 方法 的 灵敏 度 。Zhang 和 Patnaik 等 证 实 原生 质 体 融 合 允 许 基 因 组 发 生 重组 一 一 基因 组 改组 ,基因 组 改组 在 原理 上 是 改进 主要 的 生产 途径 和 表 型 ， 获得 的 菌株 经 济 实 用 。 基 因 组 改组 具有 很 大 的 潜力 ,特别 是 与 其 他 方法 组 合 。 该 技术 的 关键 特征 是 通过 改组 表 型 改进 的 突变 株 的 基因 组 而 形成 候选 库 ,产生 许多 SS ee es 第 8 章 蛋白质 组 \ 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 + 231 - 改进 的 细胞 。 假定 “N" 基 因 影 响 表 型 ,例如 产物 途径 ,但 我 们 不 知道 决定 细胞 最 佳 表 型 的 基 因数 和 确切 的 组 合 , 这 样 , 表 型 库 可 能 包括 细胞 含有 ”N" 基 因 所 有 可 能 的 组 合 , 即 2x+ :细胞 库 。 当 NM = 30 时 ,相当 于 十 亿 个 细胞 。 另 一 重要 考虑 是 最 终 需要 表 型 最 佳 化 。 应 当 指 出 Patnaik 等 分 离 出 的 Lactobacillus 菌株 是 耐酸 (在 pH3.8 生长 ) ,但 乳酸 的 产 率 不 如 野生 型 菌株 。 按 逻辑 来 讲 , 下 步 应 当 进 行 基因 组 改组 以 改进 耐酸 和 产 率 , 但 这 样 会 产生 两 个 表 型 选择 的 相 容 性 问题 。 图 8.2 说 明 实 际 基因 型 产生 两 个 特殊 表 型 相 容 [图 8.2(a)] 或 不 相 容 [图 8.2 (b) ] ,也 就 是 说 首先 选择 的 菌株 是 一 个 表 型 最 佳 化 的 ,然后 进行 另 一 个 表 型 的 最 佳 化 或 者 所 有 表 型 同时 最 佳 化 。 在 表 型 抵触 的 情况 下 [图 8.2(b) ] ,将 需要 确定 反映 每 个 表 型 全 部 意义 的 特殊 权重 的 组 成 表 型 ,以 指导 整个 过 程 最 佳 化 。 (a) (b) 表 型 测量 2 表 型 测量 基因 组 坐标 1 可 一 一 基因 组 坐标 2 基因 组 坐标 1 基因 组 坐标 2 8.2 在 多 目标 菌株 选择 中 , 表 型 与 基因 型 关系 图 解 《a) 在 基因 型 空间 同样 范围 内 , 表 型 1 和 2 最 大 限度 增加 ,这 样 可 能 获得 满足 两 个 标准 的 菌株 。 (b) 与 (a) 相 反 , 在 这 种 情况 下 ,需要 选择 或 者 两 个 表 型 之 一 或 者 反映 每 个 表 型 相对 重要 的 组 成 指标 通过 基因 组 改组 改进 表 型 无 疑 是 细胞 改进 的 重要 里 程 碑 ,对 应 用 来 讲 ,也 是 如 此 。 8.3.1 基因 组 改组 改进 泰 乐 菌 素 生产 菌 表 型 进化 是 一 种 遗传 变异 和 表 型 选择 的 连续 过 程 。 在 选择 的 群体 内 的 重组 ,新 的 ”突变 体 组合 , 扩 增 了 群体 的 遗传 多 样 性 ,从 而 改进 了 群体 内 个 体 的 特性 。 虽 然 经 典 育种 针对 整个 基因 组 ,但 它 只 允许 每 代 两 个 亲本 之 间 的 重组 。 相 反 ,DNA 改组 针 对 DNA 片段 并 人 允许 每 代 多 个 亲本 之 间 的 重组 ,多 亲本 复合 子 代 可 以 加 速 定向 进 - 232 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 化 。 这 样 ,经 典 育种 和 DNA 改组 的 组 合 提供 产生 “复合 子 代 ? 组 合 库 的 一 种 方法 。 Zhang 等 :24] 应 用 这 种 方法 改进 了 完整 微生物 基因 组 。 微生物 的 定向 进化 传统 上 是 通过 经 典 菌株 改进 (CSI) 的 无 性 过 程 ( 连 续 随 机 突 变 和 筛选 ) 完 成 的 , 它 指 引 商 业 微生物 的 开发 。 在 CSI 每 循环 过 程 中 ,由 改进 的 突 变 体 群 体 鉴 定 出 单个 最 优良 特性 突变 体 。 每 个 循环 所 产生 的 改进 的 突变 体 群 体 库 包含 有 益 遗 传 多 样 性 ,这 个 群体 的 改组 应 当 产 生 最 优良 特性 的 突变 体 新 的 组 合 ( 图 8.3)。Zhang 等 [ 串 选 择 改组 链 霉菌 ( Streptomyces) ,这 是 因为 它们 是 商业 抗生素 生 产 菌株 ,有 长 期 的 CSI 历 史 , 有 现成 的 有 效 重组 方法 。 无 性 循环 突变 有 性 循环 重组 Ze 7, 1 1 1 1 1 1 i] v ie agi ee NS 循环 (进化 的 时 间 ) 图 8.3 无 性 与 有 性 进化 比较 无 性 进化 是 累积 个 体 突 变 的 连续 过 程 。 最 佳 选 择 结果 只 获得 单一 突变 体 。 它 是 缓慢 的 ,只 是 群体 内 个 体 进化 ,信息 不 能 共享 ,遗传 多 样 性 丧失 ,有 害 突变 积累 。 有 性 进化 允许 群体 内 信息 共享 ,选择 群体 内 的 匹 配 强 化 了 有 益 突变 的 组 合 和 有 害 突变 的 丧失 。 这 样 ,有 性 进化 产生 的 群体 含有 适应 度 大 于 亲 代 的 个 体 虽然 在 细菌 细胞 之 间 重 组 有 各 种 方法 ,但 原生 质 体 融 合 在 Streptomyces 之 间 是 最 有 效 的 ,重组 效率 大 于 0.20。“ 复 合子 代 ”" 分 布 的 改进 可 以 由 混合 原生 质 体 群 体 的 循环 融合 (recursive fusion) 实 现 (http://www.nature.com)。 每 个 库 的 融合 是 模 拟 DNA 改组 的 每 个 循环 反应 ,并 且 循 环 融 合 应 当 产 生 和 群体 的 有 效 改组 。 为 了 检验 这 种 思想 ,通过 循环 原生 质 体 融合 改组 了 8. coelicolor 菌株 。 在 非 选择 条 件 下 4 个 菌株 的 原生 质 体 被 混合 、 融 合 和 再 生 。 再 生 原 生 质 体 的 孢子 形成 第 一 个 融合 库 (Fl). [REE Fl 群体 再 用 于 制备 原生 质 体 融合 和 再 生 ,这 个 过 程 重复 4 次 结果 形 成 F4 群体 。 单 一 融合 产生 的 双 标 记 子 代 (10 多 )、 三 标记 (0.4 多 ) 四 标记 子 代 (0.000 07 匈 ) 。 然 而 循环 融合 , 双 一 (60 匈 ) ,三 一 (17 匈 ) ,四 标记 子 代 (2.5% ) 在 复 合子 代 中 增加 40 ~ 10° 倍 。 这 样 循 环 原生 质 体 融 合成 功 地 改组 了 4 个 天 蓝 色 链 霉 FA(S. coelicolor) ARK ,并且 可 以 作为 选择 表 型 的 群体 。 弗 氏 链 霉菌 是 用 于 生产 泰 乐 菌 素 (tylosin, 一 种 复杂 的 聚 酮 抗生素 ,用 于 治疗 革 兰 氏 阳 性 菌 引起 的 感染 和 动物 生长 促进 剂 ) , 泰 乐 菌 素 生 物 合成 途径 见 图 8.4。 第 8 章 ， 蛋 白质 组 代谢 途径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 - 233 - HOH>C _O tylA, CH;_0 HOH2C 一 9 gid : A 0 TOP HO OPO mp HON OTP — 0- BH OH _ HO OH Ze yy TDP- 葡 萄 糖 bay TDP-4- 酮 -6- -1- 磷 酸 可 脱氧 葡萄 糖 tylJ CH3_O tyID CH3_-O ae O- TDP = eect TDP aa H a tS | TDP-4- 酮 -6- 脱 ， 4- 酮 还 原 酶 OH TDP-6- 脱 氧 阿 洛 糖 氧 葡萄 糖 .4- 差 ”OH tyIN /脱氧 阿 洛 糖 酰 转移 酶 OH 脱 甲 基 乳 抑 菌 素 tIC. tylK TDP—O CH 一 一 一 TS OH J 2 TDP-L-# 4 # 图 8.4， 泰 乐 菌 素 生物 合成 途径 [551 - 234 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 GS 菌株 效 价 (相对 gL) NIG | SF1 1.0+0.1 经 典 菌 基因 组 = a 株 改 进 改组 SF21 6.2+2.4 GS1 Ba en IE! Qote,106 = Gs2 62+12 22 000 1 000 1 000 Ae AR BU NTG 基因 组 改组 1 基因 组 改组 2 图 8.5 基因 组 改组 与 经 典 育 种 比较 (a) 弗 氏 链 霉 菌 生产 泰 乐 菌 素 , 经 典 菌株 与 基因 组 改组 菌株 的 比较 。SF21 是 SFI 经 20 轮 CSI 突变 和 筛选 得 到 的 。GS1 和 GS2 是 SF1 经 典 改进 菌株 的 群体 通过 两 轮 基 因 组 改组 得 到 的 。 经 典 的 途径 需要 20 年 并 近 百 万 次 筛选 , 而 基因 组 改组 只 需要 一 年 和 24 000 次 筛选 。 图 中 :HNO.: , 亚 硝酸 ;UV, 紫 外 辐射 ;NTG, 亚 硝 基 肛 ;NS, 中 性 选 择 ;GS ,基因 组 改组 。(b) SF1, SF21 在 300u1,96 孔 发 酵 产 生 泰 乐 菌 素 (点 线 标 明 SF21 产生 水 平 );NTG, 由 22000 筛选 出 11NTG 改进 的 突变 体 ; 基 因 组 改组 1,7 株 是 由 1000NTG 群体 中 筛选 鉴定 的 ;基因 组 改组 2,7 株 是 由 1000 基因 组 改组 1 筛选 鉴定 的 。 (c) SF1,SF21,GS1 和 GS2 经 250ml 摇 瓶 发 酵 产 生 的 泰 乐 菌 素 ( 相 对 值 ) 菌株 SF1 是 弗 氏 链 霉 菌 (8. jadiae ) 天 然 分 离 得 到 的 ,而 SF21 是 高 效 价 产生 泰 乐 菌 素 菌株 ( 它 是 SF1 经 20 个 CS1 循环 得 到 的 )[ 图 8.5(a)]。 应 用 基因 改组 加 速 由 SF1 产生 新 的 高 产 泰 乐 菌 素 的 菌株 。 为 了 经 基因 组 改组 产生 各 种 群体 ,应 用 亚 硝 第 8 章 AUR aa ae AA EEE ，235 - JEM (NTG) VER SF1 诱 变 剂 进行 一 轮 CSI, FH 22 000 突变 体 中 用 96 孔 板 筛选 出 11 个 菌株 (以 SF1 泰 乐 菌 素 效 价 作为 选择 标准 ) 进 一 步 进化 群体 [图 8.5(b)]。 制 备 原生 质 体 ,11 等 份 混合 ,循环 融合 。 由 改组 的 第 一 个 循环 算 选 出 1000 子 代 ,其 中 7 株 产生 的 泰 乐 菌 素 高 于 NTG 诱 变 亲 代 , 有 的 菌株 产 泰 乐 菌 素 的 水 平 可 与 SF21 相 比 [ 图 8.5(b)]。 这 ?7 株 进一步 改组 ,筛选 出 1000 子 代 。 其 中 7 株 进一步 改进 泰 乐 菌 素 效 价 ,在 高 通 量 条 件 下 产 泰 乐 菌 素 高 于 SF21[ 图 8.5(b) ] ,最 好 的 两 个 改组 菌 株 ,GS1 和 GS2 同 SFI 和 SF21 在 250ml 摇 瓶 中 比较 ,GS1 和 GS2 产 泰 乐 菌 素 高 于 SF1 9 倍 ,对 于 SF21 在 效 价 上 无 统计 差别 [图 8.5(c)]。 总 之 ,两 轮 基 因 组 改组 足以 完成 以 前 需要 20 轮 CSI 所 得 到 的 结果 ,理论 上 ,这 是 CSI 的 无 性 过 程 和 基因 组 改组 的 超 性 过 程 之 间 的 差别 。 但 实践 中 ,在 选择 的 群 体内 循环 重组 可 以 明显 增加 菌株 进化 的 速率 。 将 改组 技术 由 亚 基因 组 片段 扩展 至 整个 细胞 和 代谢 工程 ,不 需要 顺序 信息 或 高 级 的 遗传 工具 ,简单 易 行 且 有 效 。 8.3.2 ”基因 组 改组 改进 乳酸 生产 菌 表 型 Lactobacilli 生产 乳酸 菌株 。 乳 酸 是 长 期 使 用 的 食品 添加 剂 ,最 近 也 作为 其 他 化 学 品 的 重要 原料 ,例如 聚 乳酸 (PLA)、 乙 醛 、 聚 丙烯 二 醇 、 丙 烯 酸 和 2',3'- 戊 二 醇 等 。 发 酵 时 pH 对 乳酸 纯化 过 程 最 为 重要 。 虽 然 生 产 时 Lactobacillus 发 酵 保持 pH5.0~ 5.5, 但 希望 保持 乳酸 的 pKa 约 3.8 或 以 下 。 在 这 种 低 pH 情况 下 ,产物 的 实际 比例 是 以 自由 酸 形式 存在 ,并 且 可 以 由 发 酵 培 养 液 中 直接 用 有 机 溶剂 提取 纯 化 。 在 较 高 pH 时 ,乳酸 盐 是 主要 形式 ,纯化 耗 时 耗资 。 改 进 微生物 在 低 pH 生长 生产 乳酸 可 以 降低 产品 纯化 成 本 ,这 是 重要 的 商业 目标 。 通过 插入 突变 所 分 离 的 乳酸 球菌 ( Zactococws lactis ) 耐 酸 突变 株 的 特性 分 析 指 出 对 抗 低 pH 有 18 种 不 同位 点 和 多 重 保护 机 制 。 Lactobacillus 酸 适应 的 蛋白 质 分 析 鉴 定 出 63 种 不 同 的 蛋白 质 , 它 们 是 协调 诱导 产生 的 。 同 样 ,已 . coli 中 酸 反应 是 几 种 调节 剂 诱导 各 种 位 点 。 不 了 解 细菌 的 pH 耐 受 机 制 ,就 无 法 工程 pH 耐 受 性 菌 株 。 此 外 ,研究 所 用 的 Lactobacillus 菌株 是 商业 菌株 ,未 作 遗 传 学 上 鉴定 。 这 样 ， 工程 该 菌株 缺乏 更 多 的 遗传 手段 。 因 此 ,基因 组 改组 可 能 是 改进 未 鉴定 和 复杂 机 体 表 型 的 理想 策略 。 目前 ,改进 工业 微生物 的 方法 有 经 典 菌株 改进 (CSI) 的 随机 突变 和 合理 代谢 工 程 方法 。 虽 然 CSI 是 粗糙 的 ,但 时 间 和 资源 集中 。 合 理 途 径 是 信息 和 手段 集中 ,并 且 依靠 模型 (简化 的 生物 系统 )。 分 子 育种 应 用 到 微生物 育种 ,在 泰 乐 菌 素 (ty- losin) 生 产 中 已 得 到 有 效 的 证 明 。 基 因 组 改组 也 用 于 改进 Lactobacillus 菌株 的 耐酸 性 ,具体 操作 如 下 。 - 236° 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 8.3.2.1 起 始 群 体 的 选择 应 用 两 种 经 典 方法 由 野生 型 Zactobacilis(LB-WT) 产 生 耐 酸 突变 体 群 体 。 第 一 个 群体 (pop-adap) 是 通过 恒 化 器 调节 LB-WT 菌株 适应 低 pH 获得 的 (逐渐 降低 pH 直到 pH4.1, 该 pH 时 严格 地 抑制 LB-WT 生产 )。 第 二 个 群体 是 应 用 亚 硝 基 县 (NTG) 突 变 体 库 (pop-NTG) 在 pH 梯度 板 上 选择 并 富 集 野 生 型 菌株 的 耐酸 突变 体 。 pop-adap 和 pop-NTG 同 LB-WT 厌 气 培养 ,并 在 pH 梯度 板 进一步 选择 。 由 pop- adap 和 pop-NTG 分 离 出 亚 群 体 popl 和 pop2( 表 8.1) ,这 些 耐酸 群体 作为 基因 组 改 组 的 材料 。 表 8.1 菌株 的 设计 操作 菌株 分 离 的 个 体 菌株 LB-WT Cargill Dow 乳酸 产生 菌 pop-adap 适应 于 低 pH 的 LB-WT 的 群体 pop-NTG LB-WT 的 NTG 突变 体 库 popl 在 pH 梯度 板 上 富 集 pop-adap pop2 在 pH 梯度 板 上 富 集 pop-NTG Fl popl 和 pop2 之 间 一 轮 融合 之 后 产生 的 群体 F3 pop! 和 pop2 之 间 3 轮 融 合 之 后 产生 的 群体 F5 pop! 和 pop2 之 间 5 轮 融合 之 后 产生 的 群体 F5-37、42、67、 79、95 由 FS 库 选 择 出 的 克隆 进行 播 瓶 鉴 定 8.3.2.2 ”基因 组 改组 基因 组 改组 扩 增 了 遗传 多 样 性 ,新 的 群体 代表 遗传 多 样 性 组 合 库 。 改 组 两 个 pH 耐 受 群体 (popl 和 pop2) ,经 五 轮 以 库 的 方式 循环 原生 质 体 融合 ,每 轮 产生 的 原 生 质 体 样 品 保留 分 析 ,然后 作为 下 一 轮 融 合 的 原生 质 体 资源 ,形成 的 群体 应 用 酸 梯 度 板 筛选 出 改进 的 耐酸 个 体 。 新 改组 Lactobacilli 无论 在 液体 还 是 在 固体 介质 中 较 之 野生 菌株 更 耐 受 低 pH。 在 pH4.0 时 ,改组 菌株 产 乳 酸 高 于 野生 型 3 倍 以 上 。 这 说 明基 因 组 改组 可 以 广泛 地 用 于 改进 工业 微生物 的 表 型 。 第 8 章 BAMA MRE ee AEE + 237 ， 8.4 生物 合成 途径 定向 进化 转基因 作物 正 迅速 的 发 展 , 这 是 因为 它 成 本 低 方便 农民 以 及 环境 又 好 。2000 年 美国 有 25 多 的 玉米 .54% 大 豆 和 61% 的 棉花 是 转基因 作物 。 第 一 代 转 基因 , 包 括 “ 输 入 品质 ” ,减少 数量 和 降低 成 本 。 含 有 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thuringiensis ) Cry 蛋白 质 (BT) 的 作物 控制 昆虫 和 减少 杀 虫 剂 的 用 量 。BT 的 作物 的 应 用 已 经 减 少 棉花 和 玉米 生产 中 杀 虫 剂 的 用 量 。 嘉 磷 塞 (glyphosate) 是 一 种 环境 友好 的 除 劳 剂 , 它 对 哺乳 动物 `. 鸟 和 昆虫 无 毒 。 抗 glyphosate 的 大 豆 已 经 减少 了 其 他 除 劳 剂 的 用 量 。 转基因 作物 的 下 一 代 将 包括 附加 的 “输入 品质 "以 控制 植物 疾病 .昆虫 和 劳 草 ; 将 来 的 研究 将 使 作物 增加 产量 , 低 施肥 和 抗 寒 ,抗旱 以 及 抗 盐 ;也 将 效力 于 提高 农 产品 的 质量 ,提供 新 的 工业 原料 ,并 且 能 产生 治疗 作用 的 植物 。 近 20 年 ,科学 家 发 展 了 改良 作物 质量 的 许多 策略 和 方法 。 昆 虫 的 控制 ,植物 Wik ,疾病 控制 和 其 他 方面 已 经 取得 了 积极 的 成 果 。 但 还 存在 一 些 问 题 ,诸如 基 因 尚 未 充分 发 挥 功效 、 成 本 高 等 。 有 几 种 技术 可 以 用 于 改良 农产品 ,它们 包括 依据 蛋白 质 结 构 的 合理 设计 ,改进 天 然 酶 活性 的 随机 突变 和 筛选 ,特别 是 模拟 自然 过 程 的 定向 进化 已 为 植物 的 改良 做 出 了 贡献 [5] 。 8.4.1 及 葡 糖 苷 酸 酶 定向 进化 有 葡 糖 苷 酸 酶 (&glucuronidase，GUS) 广 泛 作为 植物 基因 表达 的 报告 。 酶 作为 报告 的 一 种 限制 是 当 组 织 用 成 二 醛 或 甲醛 固定 时 其 活性 开 失 。 天 . coli 及 葡 糖 苷 酸 酶 基因 组 改组 (图 8.6)!2,2] ,形成 的 突变 体 用 底 物 5- 溴 -4- 毛 -3- 叫 吃 -BD- 葡 糖苷 酸 (X-gluc) 比 色 筛 选 。 在 第 一 轮 改 组 中 ,9000 克隆 在 颜色 展开 之 前 用 0.2 色 成 二 醛 处 理 20min 后 筛选 。9 个 克隆 有 活性 ,并 超过 母体 。 在 第 二 轮 ,6000 克隆 用 1.0% 1K 二 醛 处 理 20min, 含 有 突变 酶 的 9 个 克隆 较 之 第 一 轮 盘 选 出 的 有 更 大 的 活性 。 野 生 型 母体 用 0.44 多 成 二 醛 处 理 20min 后 , 酶 活 丧 失 99.6% ,但 是 第 三 轮 DNA 改组 的 大 多 数 抗 性 酶 用 0.2% 戊 二 醛 处 理 仍 保留 78.1% 酶 活性 。 进 化 酶 已 经 表明 在 用 甲 醛 固 定 后 浸染 非洲 爪 蟾 (xenopus) 豚 是 有 效 的 。 由 于 植物 表达 内 源 久 半 乳 糖苷 酶 ，Zac2Z 不 能 用 作 报 告 基因 。 取 而 代 之 是 已. co 有 葡 糖苷 酸 基因 (gxs4 ,以 前 用 uidA ) 作 为 植物 的 报告 基因 ,已 广泛 应 用 十 年 了 。 显 色 和 荧光 GUS 底 物 已 合成 ,允许 非 放射 活 性 检验 。 在 各 种 条 件 下 GUS 是 稳定 的 和 有 活性 的 ,甚至 与 其 他 顺序 融合 时 也 是 如 此 。 然而 ,GUS 作为 报告 的 有 效 性 是 受 3 种 方式 制约 :@ 许 多 动物 系统 , 某 些 植物 - 238 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 随机 突 ax GUS 基因 苇 Q) 化 库 O 硝酸 纤维 素 | Ble ee @ ERA | See O a ac 滤 膜 放 在 有 IPTG 的 LB 平 板 上 | 诱导 GUS 表 达 ue | apie 醛 裂 解 /固定 克隆 ee a 结合 滤 膜 的 蛋白 质 同 X-gluc 和 NBT 反 应 Fl4mol/L#h il 停止 反应 图 8.6 抗 戊 二 醛 久 葡 糖 苷 酸 酶 (GUS) 的 筛选 随机 突变 尺 葡 糖苷 酸 基因 (gusA) 库 亚 克 隆 到 可 诱导 的 表达 载体 上 并 转 (BIE. coli? ,形成 的 克隆 转移 到 硝酸 纤维 滤 膜 , 其 铺 在 含有 诱导 剂 的 琼脂 糖 平板 上 ,并 在 37 CIA 10 ~ 24h, 结 合 克隆 的 滤 膜 在 含有 戊 三 醛 绥 “ 冲 液 温 育 ,然后 转移 到 含有 及 葡 糖 苷 酸 酶 ,Xgluc Al NBT 的 组 织 化 学 指 示 剂 。 在 4mol/L 盐酸 肌 中 短暂 温 育 阻止 颜色 展开 。 由 原来 的 平板 分 离 出 保持 GUS 活性 的 克隆 ,并 进行 下 一 轮 DNA 改组 以 及 植物 联合 细菌 表达 内 源 葡 糖苷 酸 酶 活性 ; 包 当 组 织 被 成 二 醛 和 甲醛 固定 时 ， GUS 活性 明显 降低 ,对 组 织 结构 的 保存 来 讲 , 保 持 活 性 的 交替 换 位 是 必要 的 ;G 上 述 考虑 严重 地 限制 GUS FAVE AE RS IR a EA 醛 失 活 酶 主要 是 由 于 同 表面 可 及 的 赖 氨 酸 残 基 形 成 Schiff 碱 。 当 通过 定位 突 变 去 除 赖 氨 酸 残 基 可 以 提供 抗 固定 剂 的 突变 酶 。 但 许多 表面 赖 氨 酸 是 功能 的 关键 FFARDWR. E. coli. 人、 鼠 ` 老 鼠 和 狗 的 同 源 物 的 顺序 是 已 知 的 。 在 EB. coli & 白质 中 的 27 个 赖 氨 酸 残 基 有 6 个 是 其 他 种 类 共有 的 ,这 可 能 是 主要 的 。 然 而 ,为 了 发 现 27 个 赖 氨 酸 残 基 的 组 合 可 能 被 改变 ,为 了 增加 对 固定 剂 的 抗 性 而 酶 没有 失 活 ,这 样 需要 构建 和 检验 大 量 的 突变 酶 ,因此 为 了 改变 GUS 的 表面 化 学 ,或 者 避免 或 者 容纳 醛 修饰 而 没有 丧失 酶 活性 ,采用 了 随机 突变 的 途径 来 改变 酶 的 底 物 特异 性 或 热 稳定 性 。 在 3 轮 突变 `.DNA 改组 和 筛选 之 后 ,分 离 出 一 个 有 8 个 氢 基 酸 改 变 的 突变 体 , 令 人 惊奇 的 是 ,已 知 成 二 醛 是 修饰 和 交 联 自由 胺 ,但 只 有 一 个 赖 氨 酸 残 基 突 变 。 一 般 地 ,氨基 酸 改 变 发 生 在 近 于 保守 的 赖 氨 酸 ,暗示 酶 的 表面 化 学 的 选 择 , 或 者 接受 或 者 避免 成 二 醛 修饰 。 实 验 结果 表明 可 能 有 多 种 路 线 ,突变 体 可 能 适 应 于 固定 或 溶剂 系统 ,最 重要 的 是 引入 氨基 酸 使 酶 具有 新 的 表面 结合 功能 。 第 8 章 蛋白质 组 \ 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 ，239 - 8.4.2 = Werk fee WES cE Ia ETL [BRR KA BA ,其 广泛 用 于 农业 。 水 解 三 嗪 的 酶 能 够 由 土壤 和 地 下 水 中 去 除 这 些 化 合 物 。 Pseudomonas 的 atzA 基因 表达 产物 水 解 三 嗪 相关 化 合 物 RI 位 的 氯 和 氟 、 不 水 解 甲 氧 基 、 硫 代 甲 基 、 氰 基 ` 释 氮 基 和 氨基 取代 基 !2J。TriA, 即 三 Fe FH Ht ZA A (melamine deaminase) 也 来 自 假 单 胞 菌 ( Pseudomonas ) ,其 与 atzA 有 9 个 氨基 酸 是 不 同 的 ,TriA 和 atzA FAYE DNA 改组 实验 的 母体 以 探索 突变 体 作 用 的 底 物 范围 。1600 突变 体 库 对 着 50 个 不 同 的 三 嗪 化 合 物 进 行 筛 选 ,包括 母体 酶 最 适 JED ,不 适 底 物 和 非 利 用 底 物 。 母 体 酶 对 其 中 7 个 三 嗪 化 合 物 活 性 很 低 ,改组 酶 库 产生 多 个 重组 酶 , 较 之 最 好 的 母体 酶 有 更 大 的 转化 速度 ,改组 库 也 含有 水 解 不 被 母 体 酶 利用 的 5 个 底 物 。 这 样 ,两 个 高 度 相关 的 天 然 基因 的 DNA 改组 产生 大 量 的 各 种 各 样 的 酶 ,其 中 能 够 降解 不 同 但 相关 的 三 嗪 化 合 物 。 这 说 明 DNA 改组 是 获得 降 解 土壤 和 地 下 水 中 杀 虫 剂 污染 物 的 新 酶 ,也 是 植物 中 产生 抗 杀 虫 剂 基因 的 有 效 途 径 。 苏 云 金 芽孢 杆菌 (Bacillus thuringiensis) Cry 蛋白 质 成 为 成 功 转 基因 抗 昆虫 而 药性 策略 的 基础 ,目前 广泛 用 于 农业 。BT 作为 转基因 杀 虫 剂 的 定向 进化 是 有 潜力 的 。 第 一 , 受 BT 影响 的 昆虫 谱 相 当 窗 。 定 向 进化 能 够 将 其 拓宽 ,这 样 减少 化 学 杀 虫 剂 在 转基因 植物 的 用 量 ; 第 二 ,在 转基因 植物 中 ,BT 蛋白 难于 高 浓度 表达 产生 农 学 上 有 关 的 表 型 ;第 三 ,定向 进化 可 以 有 效 地 增加 BT 的 特殊 活性 。 目前 BT(Cry1 AB 和 Cryl1AC) 用 于 转基因 作物 ,有 效 地 控制 几 种 棉铃 虫 属 ( He- jiotpis) 害 虫 ,而 在 Spodoptera 对 照 中 是 无 效 的 。 在 单一 基因 改组 实验 中 , CrylCA 改组 并 对 着 甜菜 夜 蛾 ( Spodoptera exigua ) 活 性 筛选 。 应 用 三 层 阶 式 筛 选 :第 一 层 采 用 高 剂量 BT, 并 且 克 隆 是 以 活性 或 无 活性 划 线 ;第 二 层 采 用 一 系列 稀释 BT。 在 每 个 样品 中 蛋白质 的 含量 非 标准 化 ,并 且 对 每 个 活性 克隆 测定 改进 的 速率 。 第 三 层 筛选 ,一 系列 稀释 重复 3 次 ,提取 物 的 蛋白 质 含量 标准 化 ,测定 昆虫 杀 死 一 半 所 需 要 的 蛋白 质 浓度 ( 即 ECx)。 由 大 约 4000 基因 突变 体 中 筛选 出 BT 突变 体 , 其 ECs 超过 母体 3.8 倍 。 在 另 一 基因 改组 实验 中 ,基因 突变 体 对 Spodopiera 活性 BT 是 CrylCA 母体 的 6.7 倍 。 其 中 最 有 趣 的 是 几 个 突变 体 对 玉米 夜 峨 .美洲 棉铃 虫 ( 瓦 . Zea) 和 Spodoptera 都 有 活性 。 这 些 突变 体 中 最 有 意义 的 是 在 控制 A. Zea 时 像 Cryl AB 一 样 有 效 ,并 且 较 之 Cryl AC 在 控制 Spodoptera 上 改进 2 FUE. ERT 作 清 楚 地 证 明 ,通过 BT 控制 昆虫 谱 可 以 用 DNA 改组 拓宽 ,这 种 技术 代表 了 控制 昆虫 下 一 代 转 基因 植物 的 新 途径 [30]。 定向 进化 允许 分 子 生 物 学 家 模拟 动物 和 植物 育种 操作 来 改进 基因 和 途径 , 定 向 进化 与 植物 和 动物 育种 有 相似 但 也 有 很 大 的 差别 。 在 常规 育种 中 ,交互 局 限于 ” 240 - 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 两 个 母体 ,而 DNA 改组 允许 同时 几 个 母体 重组 ;常规 育种 涉及 改进 的 植物 和 动物 不 敏感 选择 ,而 DNA 改组 允许 改进 的 蛋白 质 多 维 选择 。 常 规 育种 取决 于 植物 或 动 物 在 改进 条 件 下 的 生命 周期 , 需 几 个 月 或 几 年 ,而 DNA 改组 和 筛选 每 个 周期 可 以 几 周 内 完成 。 8.4.3， 类 胡萝卜 素 生 物 合成 途径 定向 进化 Bl- 鸭 类 胡萝卜 素 (carotenoid) 是 植物 和 微生物 正常 发 生 的 色素 。 它 们 的 主要 功能 是 通过 猴 炸 光敏 剂 抗 氧化 损伤 、 同 单 态 氧 相互 作用 、 并 清除 过 氧 自 由 基 , 这 样 阻止 有 害 氧 的 积累 。 这 种 保护 过 程 取 决 于 它们 的 化 学 结构 (多 烯 生 色 团 的 长 度 , 端 基 的 性 质 和 它们 含有 的 各 种 取代 成 分 )。 类 胡萝卜 素 精确 的 化 学 结构 决定 它们 的 生物 学 性 质 ,决定 它们 如 何 同 其 他 的 分 子 相互 作用 并 整合 到 膜 上 。 过 去 20 年 ,所 积累 的 证 据 表明 类 胡萝卜 素 在 防治 心血 管 病 和 瘤 起 重要 作用 。 例如 诱导 皮肤 瘤 的 老鼠 和 鼠 喂 饲 或 注射 R 胡 萝卜 素 canthaxanthin( 角 黄 素 ) 能 延 组 肿瘤 的 生长 。 在 其 他 动物 研究 中 ,已 观察 到 能 抗 其 他 类 型 的 癌 ( 例 如 唾 腺 癌 、 结 肠 MERLE). ESE LEN 600 种 以 上 天 然 发 生 的 类 胡萝卜 素 ,其 中 大 多 数 仅 以 微量 生物 合成 中 间 体 存在 ,目前 研究 方面 的 主要 限制 是 各 种 各 样 结构 的 类 胡 葛 下 素 的 供应 问题 。 类 胡萝卜 素 的 工业 应 用 包括 它们 作为 营养 添加 剂 ,医药 食品 着 色 剂 和 动物 饲 ， 料 。 类 胡萝卜 素 的 实际 销售 额 大 约 50 亿美 元 ,并 且 市 场 正在 扩大 。 至 今 ,用 于 工 业 的 大 部 分 类 胡萝卜 素 是 化 学 合成 的 ,例如 虾 青 素 (astaxanthin)、 角 黄 素 和 尺 胡 葛 素 , 也 有 天 然 提取 物 。 此 外 ,B 胡 葛 卜 素 和 虾 青 素 也 由 微生物 发 酵 生 产 ,但 市 场 份额 不 大 。 然 而 ,作为 更 复杂 的 显露 出 药物 潜力 的 类 胡萝卜 素 , 应 用 天 然 或 一 般 修 饰 微生物 发 酵 生 产 将 是 一 种 趋势。 最 近 分 子 生物 学 的 进展 已 经 提供 了 类 胡萝卜 素 生物 合成 各 种 基因 。 不 同 机 体 基因 组 合 按 着 途径 的 不 同 分 支 可 以 合成 新 的 化 合 物 。 然 而 ,这 种 工作 刚刚 启动 。 通过 基因 组 合 产生 类 胡萝卜 素 ,tetacenomicine 及 相关 抗生素 (经 由 聚 酮 途径 ) 可 能 是 一 种 有 效 途径 。 应 用 基因 重组 技术 已 在 非 胡 萝卜 素 细菌 和 酵母 成 功 地 合成 类 胡萝卜 素 。 细 菌 、 藻 类 、 真 菌 和 高 等 植物 的 胡萝卜 素 生成 基因 或 cDNA, 大 部 分 都 能 在 E. coli 中 表达 。 各 种 类 胡萝卜 素 的 结构 和 它们 的 形成 途径 示 如 图 8.7。 天 然 产物 包含 各 种 各 样 化 学 结构 和 生物 功能 ,许多 有 潜在 应 用 价值 的 化 合 物 在 天 然 资源 中 仅 以 微量 存在 ,并 且 难 以 或 不 可 能 化 学 合成 ,但 可 能 用 生物 合成 实 现 。 生 物 合成 途径 的 酶 可 以 组 合 到 天 然 和 新 代谢 产物 合成 的 新 途径 中 。 然 而 , 依 靠 自然 界 存在 的 催化 功能 ,不 受 限制 的 在 工程 有 机 体 中 合成 所 需 化 合 物 是 不 可 第 8 章 BARA Re A EE + 241 - - crtE jcrtB Sy 素 crt[ Pisa PEA aris 环 状 叶 黄 素 hahha |b gene fh Torulene 非 环 状 叶 黄 素 ARR MAAS bh 3 SE BA PE SE (If 新 的 环 状 wer 状 叶 黄 素 图 8.7 类 胡 葛 卜 素 生物 合成 途径 的 定向 进化 类 胡 葛 小 素 生 物 合成 通过 引入 两 个 生物 合成 基因 ( cnE, 4 JLE-B+ ILE BRA BEA A cB, 八 氢 番 茄 红 素 合 酶 基因 ) 被 工程 到 已. coli 中 ,首先 合成 八 氢 番 茄 红 素 。 该 途径 用 改组 的 八 氢 番 茄 红 素 脱 饱和 酶 (crt[) 基 因 库 延伸 , ZEB. coli 中 产生 完全 共 罗 的 四 氢 番 茄 红 素 的 新 途径 。 用 附加 的 进化 生物 合成 基因 延伸 这 个 途径 可 以 产生 各 种 各 样 新 的 环 状 和 非 环 状 类 胡 葛 卜 素 结构 ,例如 在 E. coli 中 通过 突变 体 环 化 酶 (crtY) 产 生 新 的 环 状 torulene 分 子 育种 的 原理 可 以 迅速 增加 天 然 产物 的 多 样 性 ,并 且 在 简单 的 机 体 , 例如 E.coli 中 实现 。 为 了 建立 新 的 生物 合成 途径 ,可 以 混合 和 匹配 不 同 来 源 的 基因 ， 甚至 不 相关 的 代谢 路 线 ,在 缺乏 酶 的 结构 或 催化 机 制 详细 信息 情况 下 ,通过 随机 诱 变 , 重 组 和 选择 产生 新 的 生物 合成 功能 。 类 胡 葛 卜 素 生 物 合成 证 实 了 分 子 育种 概念 的 正确 性 。 通 过 “育种 "生物 合成 基 因 和 进化 新 酶 功能 ,可 以 产生 各 种 各 样 类 胡萝卜 素 。 在 非 类 胡 葛 卜 素 生成 的 微 生 物 ( 例 如 五 . coi) 中 生物 合成 类 胡萝卜 素 需要 延伸 一 般 的 类 项 途径 ,该 途径 具有 牧 牛 儿 基 ( 香 叶 基 )- 牧 牛 基 二 磷酸 (GGDP) 合 酶 (crtB) 和 八 氢 番 茄 红 素 合 酶 (crtE) , 产 生 Cy HAS be /\ A EL (AM 8.7) , 继 之 用 八 氧 番茄 红 素 脱 饱和 酶 (crtD) 去 饱 和 ,并 进一步 用 (例如 环 化 酶 , 羟 化 酶 和 酮 基 酶 ) 催 化 修饰 ,结果 产生 各 种 类 胡 葛 下 素 。 至 今 , 用 基因 重组 生物 合成 类 胡萝卜 素 大 多 数 基 因 是 来 自 红 细菌 ( Rhodobac- er) 或 十 字 花 科 植 物 软 腐 细菌 (欧文 氏 菌 属 ) ( Erwinia )。 ” 242 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进 化 为 了 能 够 在 E. coli 中 合成 新 的 类 胡萝卜 素 ,对 八 氢 番 茄 红 素 脱 饱和 酶 (crtD) 和 番茄 红 素 环 化 酶 (crtY) 定 向 进化 。 这 些 酶 定位 在 类 胡 昔 小 素 生 物 合成 途径 的 重 要 分 支点 ,并 决定 产生 非 环 状 或 环 状 类 胡 划 下 素 ( 图 8.7) ,类 胡 蔓 卜 素 生物 合成 的 FE HE HEI A Ze 8.2。 表 8.2 RWS hREWMAMBK 基因 型 来 Ki 酶 底 物 产物 所 需 辅 因子 CrtE Eruinia GGPP ik Bi FPP GGPP GPP GGPP 这 Eminia, A. auranti- /)\ Ai. ie acum A Cl ad eae lag NAIK 番茄 红 素 FAD CH hR 番茄 红 素 链 孢 红 素 番茄 红 素 CnY Eruinia wig 番茄 红 素 Bij bh NADH, Y- 胡 葛 卜 素 有 胡萝卜 素 八 氨 番茄 红 素 脱 饱和 酶 ,或 者 在 八 所 番茄 红 素 中 引入 两 个 去 饱和 产生 Ce hA , 像 在 植物 和 蓝 细 菌 一 样 ;3 个 去 饱和 产生 链 孢 红 素 (neurosporene) , 像 在 红 细 菌 (Riodobacter) 一 样 ;或 4 个 去 饱和 产生 番茄 红 素 , 像 在 Erwinia 和 其 他 的 光合 成 细菌 一 样 。 粗 糙 链 孢 霉 的 脱 饱 和 酶 在 八 所 番茄 红 素 引入 5 个 双 键 以 合成 3,4- 二 氧 番茄 红 素 。 脱 饱和 酶 能 够 把 6 SOLES | A A LR PoE ESE he 3,4,3' ,4'- 四 氢 番 茄 红 素 , 鸣 夏 孢 欧文 氏 菌 ( Erwinia zwredovora ) HY /\ AF ih ZL 素 脱 饱和 酶 在 一 定 条 件 下 合成 小 量 的 3,4,3',4'- 四 氢 番 茄 红 素 。 第 一 个 目标 是 通 过 进化 一 种 有 效 的 6 步 脱 饱 和 酶 来 延伸 去 饱和 途径 以 产生 3,4,3' ,4'- 四 氧 番茄 红 素 作为 E. coli 中 主要 的 类 胡 葛 小 素 ( 图 8.7)。 为 了 在 E. coli 生物 合成 途径 中 产生 突变 酶 库 需 要 两 个 质粒 共 转 化 :产生 类 胡 萝卜 素 前 体 (作为 靶 酶 的 底 物 ) 的 基因 克隆 在 质粒 上 ;进行 定向 进化 酶 的 基因 被 死 隆 在 另 一 质粒 上 。 所 有 的 酶 都 是 在 Lac 启动 子 控制 下 表达 , 继 之 最 佳 化 SD 序列 。 欧文 氏 菌 (五 . herbicola)# 五 . uredovora 的 基因 通过 体外 DNA 改组 (CDNA shuffling ) 所 产生 的 脱 饱 和 酶 库 转 化 到 合成 八 氢 番 茄 红 素 EL. coli SM101( 携 带 有 crtE 和 crtB 的 质粒 ) ,结果 产生 114 脱 饱和 酶 。 第 8 章 蛋白质 组 代谢 途径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 ，243 - 从 红 细 菌 ( Raodobacter) 的 链 孢 红 素 或 其 他 光合 成 细菌 中 的 番茄 红 素 出 发 已 合 成 各 种 各 样 的 非 环 状 类 胡 昔 卜 素 ,进一步 脱 饱 和 ,羟基 化 和 甲 基 化 。 还 有 其 他 细 菌 ,例如 轧 winia ,由 番茄 红 素 合成 环 状 类 胡 昔 卜 素 。 这 些 修饰 表明 高 度 的 混杂 性 ， 允许 它们 相等 地 作用 在 工程 途径 中 的 链 孢 红 素 和 番茄 红 素 。 各 种 酶 或 它们 的 进化 突变 体 可 以 进一步 延伸 生 色 团 ,导致 在 E. coli 产生 新 的 类 胡 葛 小 素 。 下 面 将 讨论 通过 定向 进化 环 化 酶 产生 环 状 类 胡 昔 小 素 生 物 合成 的 新 途径 。 细菌 番茄 红 素 环 化 酶 通常 把 及 紫 罗 酮 环 引 在 番茄 红 素 的 两 端 产 生 B, BH 素 ( 图 8.7)。 然 而 ,在 工程 途径 中 , 当 链 孢 红 素 是 由 Rhodobacter 脱 饱 和 酶 三 步 脱 饱 和 产生 或 5- 胡 昔 小 素 是 由 蓝 细菌 (蓝藻 ) ( Synechoccus sp.) 脱 饱和 酶 二 步 脱 饱和 产 生 时 , 环 化 酶 不 仅 能 够 环 化 更 端 基 到 有 端 基 ,而 且 也 能 够 环 化 7,8- 二 氢 端 基 ( 图 8.7 中 类 胡 葛 小 素 结构 )。 各 个 单 环 中 间 体 的 合成 证 实 酶 分 别 作用 于 两 端 , 环 化 反 应 机 制 只 涉及 双 键 Cl-C2(C1'-C2') 和 C5-C6(C5'-C6' ) 。 因 此 在 用 114 的 进化 延伸 脱 饱和 途径 中 ,可 以 通过 DNA 改组 产生 番茄 红 素 环 化 酶 ,其 有 效 地 环 化 3,4- 二 和 氢 番茄 红 素 (3,4,3' ,4'- 四 氢 番 茄 红 素 前 体 ) 。 通过 把 基因 组 装 在 代谢 途径 和 进化 关键 酶 的 分 子 育种 是 在 E. coli 合成 新 化 合 物 的 一 种 有 效 策 略 。 定 向 进化 允许 我 们 工程 两 个 酶 的 催化 性 质 。 用 追加 生物 合 成 的 基因 并 进一步 进化 ,可 以 在 E. coli 产生 更 新 的 类 胡 昔 卡 素 。 由 于 许多 新 的 生 物 合成 途径 可 以 在 单一 分 子 育种 实验 中 产生 ,形成 的 机 体 代 表 新 生物 活性 化 合 物 的 天 然 物 库 。 最 近 开 发 的 “ 金 稻 ”(golden rice) 含 及 胡 草 仆 素 B44。 这 些 实验 指出 应 用 定向 进化 可 以 提高 类 胡 葛 卜 素 生物 合成 途径 中 特殊 酶 的 活性 并 提高 金 稻 中 及 胡 萝卜 素 的 水 平 。 8.4.4 工 - 甲 硫 氮 酸 生物 合成 途径 定向 进化 精细 化 学 品 工业 正 日 益 转向 生物 合成 路 线 ,以 满足 对 映 体 纯 药物 迅速 增长 的 需要 。 但 生物 催化 剂 与 其 他 技术 竞争 尚 有 局 限 性 ,甚至 手 性 产品 的 稍 许 修 饰 就 得 研究 新 的 生物 催化 剂 。 各 种 D- 和 工 - 氨 基 酸 的 工业 生产 的 乙 内 本 脲 过 程 已 经 建立 ,然而 这 个 过 程 不 能 用 于 产生 某 些 L- 氨 基 酸 ,例如 工 - 甲 硫 氨 酸 (L-Met) ,因为 乙 内 酰 脲酶 对 外 消 旋 乙 内 酰 腺 底 物 转化 表现 出 对 映 体 选 择 性 。 该 酶 优选 D-5-(2- 甲 基 硫 代 乙 基 ) 乙 内 栈 脲 (D-MTEH) 5:3 D-N- FE FA ii AB ( D-C-Met ) A #8 B (1 5.24) 由 于 D-C-Met 转化 为 L-Met 等 ,从 而 降低 了 L-Met 生产 能 力 ,事实 上 ,所 有 已 知 的 乙 内 酰 脲酶 在 这 个 反应 中 都 表现 出 D- 选 择 性 。 特殊 的 工业 要 求 的 酶 可 以 通过 突变 /重组 以 及 选择 或 筛选 的 重复 过 程 产生 。 进化 的 脂肪 酶 ,对 2- 甲 基 癸 酸 酯 对 映 体 选 择 性 水 解 ,最 好 突变 体 产 生 ($)- 酸 ,ee 值 » 244 + 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 > 90% (BFA HY 2% )。 这 就 是 说 ,定向 进化 可 以 改进 酶 的 天 然 对 映 体 选择 性 。 然 而 ,对 映 体 选 择 性 如 何 转化 是 不 清楚 的 。D- 选 择 性 酶 转化 为 蕊 选择 性 酶 可 能 需要 大 的 结构 改变 ,应 用 定向 进化 可 能 达 不 到 。 Arnold 2:35! 5 Arthrobacter sp. DSM9771 乙 内 酰 脲酶 转化 对 映 体 选 择 性 ， 用 保持 或 增加 全 细胞 催化 活性 生产 L- 甲 硫 氨 酸 。 这 表明 进化 的 乙 内 酰 脲酶 通过 E. coli 的 三 一 酶 途径 改进 L-Met 生产 。 这 是 通过 全 细胞 催化 剂 中 关键 酶 的 转化 对 映 体 选 择 性 和 增加 总 活性 来 实现 的 。 所 有 已 知 乙 内 酰 脲酶 对 D-5$-(2- 甲 基 硫 代 乙 基 ) 乙 内 酰 脲 (D-MTEH) 的 选择 性 超过 -对 映 体 ,结果 导致 志 -氨基 酸 中 间 体 的 积累 并 降低 生产 能 力 。 应 用 随机 突变 饱和 突变 以 及 筛选 ,使 Arthrobaeter sp. DSM9771 的 D- 选 择 性 乙 内 酰 脲酶 转 为 志 - 选 择 酶 ,并 且 总 活性 增加 5 倍 。 全 羽 . coli 细胞 表 达 的 进化 L- 乙 内 酰 脲酶 , L-N- 甲 氨 酰 化 酶 和 乙 内 酰 脲 外 消 旋 酶 在 不 到 2h 由 100mmol/L D.L-MTEH 产生 91mmol/L L-Met。 改 进 的 乙 内 酰 脲酶 生产 能 力 提高 倍 。 不 需要 中 间 体 D- 甲 氨 酰 化 , 甲 硫 氢 酸 的 积累 降低 4 倍 (与 野生 型 细胞 途径 比 较 )。 高 度 D- 选 择 的 乙 内 酰 脲酶 突变 体 也 已 发 现 。 对 映 体 选 择 酶 通过 定向 进化 迅 速 最 佳 化 并 引入 多 酶 途径 ,可 以 产生 改进 的 全 细胞 催化 剂 ,可 有 效 地 生产 手 性 化 合 物 。 代谢 途径 产生 各 种 各 样 的 化 学 结构 和 生物 活性 化 合 物 。 人 们 估计 仅 植 物 就 产 生成 千 上 万 种 相对 低 分 子 质 量 的 化 合 物 ,鉴定 的 约 50 000 种 。 因此 天 然 产物 是 发 现 新 的 有 效 化 合 物 的 巨大 宝库 。 为 了 增加 天 然 产 物 的 多 样 性 , 异 源 途径 已 被 工程 到 重组 机 体 中 ,例如 生产 小 分 FAN LE E. coi。 在 组 合生 物 合成 途径 中 ,往往 可 观察 到 次 级 代谢 各 种 酶 的 底 物 特异 性 松动 ,产生 额外 的 天 然 化 合 物 。 该 途径 对 新 聚 酮 化 合 物 合成 是 相当 有 效 的 ， 这 是 由 于 模块 聚 酮 合 酶 固有 的 生物 合成 灵活 性 所 致 。 然 而 ,对 于 许多 代谢 途径 来 讲 , 代 谢 基 因 的 组 合 组 装 却 没 有 产生 功能 途径 。 代谢 途径 的 多 样 性 指出 了 代谢 基因 高 度 进 化 的 潜力 。 事 实 上 ,增加 基因 组 顺 序 和 结构 以 及 提高 初级 和 次 级 代谢 酶 活性 是 有 效 的 方法 ,主要 是 通过 各 种 途径 中 酶 基因 的 复制 来 进化 。 例 如 ,TIM 桶 [(Bvu)s 桶 ] 折 笃 是 催化 完全 不 同 反应 的 许多 酶 族 中 所 发 现 的 最 丰富 的 型 主 , 而 且 它 们 有 一 个 共同 的 祖先 。 次 级 代谢 (包括 降解 途径 ) 的 各 种 酶 ,不 像 初级 代谢 的 大 多 数 酶 ,由 于 底 物 特异 性 的 松动 ,往往 在 催化 上 是 混杂 的 ,并 且 在 某 种 情况 下 可 以 产生 一 个 以 上 的 产物 。 次 级 代谢 的 可 塑性 是 品 质 的 选择 结果 ,增加 和 保持 化 学 多 样 性 ,而 不 增加 适应 度 成 本 。 定 向 进化 策略 与 代 谢 工 程 一 起 可 以 模拟 天 然 代谢 进化 创造 新 的 途径 ,以 产生 天 然 和 非 天 然 分 子 的 多 样 性 以 及 异种 生物 化 合 物 的 降解 。 第 8 章 BARA ee ae A EEE + 245 - 8.5 ”病毒 定向 进化 遗传 重组 是 许多 病毒 进化 的 主要 驱动 力 ,迅速 改组 的 遗传 信息 导致 具有 新 基 因 和 新 表 型 重组 子 的 产生 ,体外 DNA 改组 过 程 361 (分 子 育 种 ) 加 速 了 这 种 机 制 。 多 重 同 源 母体 顺序 平行 重组 可 以 产生 复杂 重组 子 的 多 样 库 , 由 其 中 选择 出 所 希望 的 改进 病毒 。 改组 6 种 鼠 白细胞 病毒 (MLV) 的 包 膜 顺序 , 继 之 选择 产生 具有 完全 新 的 向 性 的 做 合 中 国 田 鼠 卵 梨 (CHOKI1) 细 胞 克隆 。 所 选择 的 克隆 的 组 成 和 性 质 指 出 母体 顺序 的 这 种 特殊 排列 不 容易 通过 天 然 逆 转录 病毒 重组 完成 。 这 个 例子 证 实 分 子 育 种 在 遗传 上 可 以 提高 逆转 录 病 毒 高 度 进 化 的 潜力 ,以 获得 希望 的 表 型 。 当 信息 有 限 ,多 重复 杂 功 能 必须 同时 平 衔 时 ,分 子 育种 可 能 是 基因 治疗 \ 疫 苗 和 病毒 最 佳 化 的 一 种 有 效 工具 。 DNA 改组 可 以 有 效 的 变更 多 个 母体 的 功能 顺序 以 改进 表 型 。 通 过 体外 DNA 族 改 组 6 种 不 同 的 母体 MLV 包 膜 顺序 产生 改组 库 。 将 这 个 库 克 隆 到 感染 的 Moloney 主 链 ( 骨 架 ) 上 产生 1 x 10° 改组 包 膜 克隆 库 [ 图 8.8(a)]。 母 体 病毒 (Moloney、.292E、Friend2、Friend7、Friend9 和 Friend21) 完 全 不 感染 CHOK1 细胞 ,对 其 他 细胞 类 型 有 各 种 感染 性 。 从 转 染 293/G1 细胞 库 中 制备 库 化 的 质粒 DNA. 通过 细胞 传代 改组 CHOK1 和 Lec8 细胞 混合 库 ,选择 出 CHOKI 感染 性 细胞 [图 8.8(b)]j]。Lecg 细胞 是 CHOK1 衍生 的 突变 体 ,糖苷 化 途径 有 缺陷 。 它 们 的 亲 嗜 性 受 体 是 更 易 接 近 ,允许 通过 某 种 亲 嗜 性 MLV 感染 ,由 转 当 的 293/G1 细胞 产生 的 Friend2、Friend9 和 Moloneg MLV 是 能 够 相对 有 效 地 感染 Lec8 细胞 。Lecg8 细胞 作为 " 桥 " 或 中 间 体 细胞 , 扩 增 和 富 集 持 合 病毒 ,获得 更 低 的 感染 活性 的 CHOKI 细 胞 。 这 样 的 病毒 完成 生长 优势 ,由 于 大 量 细胞 对 感 当 有效, 然后 选择 ,作为 天 然 逆 转录 病毒 进化 的 基线 。 由 感染 的 共 培 养 细 胞 的 基因 组 DNA 所 克隆 的 原 病毒 包 膜 顺序 确定 选择 出 现 的 优势 种 。 没 有 从 母体 传代 细胞 回收 到 原 病毒 顺序 。 优 势 包 膜 顺序 是 一 个 符合 体 , 其 由 4 个 片段 组 成 。 财 合体 包 膜 顺 序 不 同 于 已 发 表 的 MLV 相关 株 ( 已 知 感 染 CHOK1)。 虽 然 3'LTR 也 被 改组 ,但 该 区 域 改 变 对 CHOKI1 感染 性 是 不 需要 的 。 肉 合 病毒 的 向 性 是 不 同 于 任何 母体 病毒 (图 8.9)。 通 过 Lec8/G1 细胞 传代 ， 获得 了 对 CHOK1 的 感染 ,而且 它 能 效 地 再 感染 新 的 Lec8 细胞 。 这 与 母体 Friend2、 Friend9 和 Moloney 病毒 相反 。 虽 然 这 些 可 以 有 效 地 感染 由 转 染 293/G1 细胞 产生 的 Lec8 细胞 ,但 当 通 过 Lec8/G1 传代 时 它们 的 子 代 却 降低 了 再 感染 新 Lecg 的 能 力 , 并 对 CHOKI1 细胞 无 感染 性 。 当 传代 的 母体 病毒 与 CHOKI/G1 和 Lec8/G1 共 培养 时 ,它们 能 迅速 地 被 稀释 掉 。 这 样 , 当 它们 通过 Lec8 传代 时 ,符合 病毒 和 母体 - 246 > 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 (a) LTR gag po env LTR No LG — — =e A B / A C DNA 片 段 化 { ae 6 Sfil 扩 增 + Noll A B 亚 克 隆 到 感染 的 = ee ey . LTR _—gag pol / AR 要 I (b) G418 抗 性 滴 度 G418 抗 性 滴 度 | OS O___. Ga ‘cams a OGD wR Soa cee fettiin a 改组 库 th AS Hi eR CHOK1(90%) G1 载 体 293 细 胞 Lec8(3% ~ 10%) 带 有 整合 新 & AGILE 图 8.8 改组 MLV 包 膜 库 的 构建 (a) 病毒 顺序 的 改组 ; (b) 传代 库 和 CHOKI 向 性 病毒 的 选择 病毒 的 感染 性 是 不 同 的 。 虽然 通过 亲 嗜 性 MLV 封闭 CHOKI 感染 可 以 通过 人 工 抑制 亲 嗜 性 受 体 的 糖 苷 化 而 解除 ,但 根本 不 明显 。 通 过 病毒 包 膜 的 设计 操作 来 完成 糖苷 化 的 母体 包 膜 不 是 有 效 的 。 通 过 Lec8 传代 的 母体 病毒 不 仅 不 能 给 予 CHOKI 感染 性 ,而且 也 导 BL Lec8 细胞 感染 性 的 丧失 。 通 过 改组 产生 新 的 散 合 包 膜 经 历 糖 苷 化 的 外 遗传 (epigenetic) 。 为 了 提高 CHOK1 细胞 的 感染 性 ,两 者 需要 给 予 新 包 膜 的 有 利 构象 ， 只 有 体内 道 转录 病 毒 重组 而 没有 体外 改组 不 可 能 产生 骨 合 包 膜 。 通过 改组 相关 天 然 病毒 的 顺序 多 样 性 可 以 构建 高 质量 库 , 可 以 容易 选择 出 性 第 8 章 蛋白质 组 \ 代 谢 途 径 、 病 毒 和 细胞 的 定向 进化 ，247 - 图 8.9 母体 和 内 合 病毒 的 不 同 向 性 由 293 产生 的 肉 合 病毒 可 以 感染 Lec8 ,但 不 能 有 效 地 感染 CHOK1。 当 通过 Lec8 传代 时 ,它们 对 CHOKI1 的 感染 性 提高 约 100 倍 。 它 们 也 可 以 有 效 地 再 感染 新 的 Lec8 细胞 。 相 反 , 当 通过 Lecg 传代 时 ,母体 病毒 降低 了 再 感染 新 Lecg 的 能 力 ， 它们 不 感染 CHOKI ,不 管 它们 如 何 传代 质 改 进 的 组 合 病毒 。 分 子 育种 可 以 扩展 顺序 空间 并 有 效 地 搜索 ,而 不 需要 更 重要 的 信息 。 预 期 分 子 育种 将 成 为 病毒 工程 的 重要 工具 。 用 于 人 的 基因 治疗 的 逆转 录 病 毒 应 是 高 纯 和 高 效 价 的 制剂 。 当 用 常规 细胞 培 养 系统 生产 逆转 录 病 毒 时 ,下 游 过 程 必须 将 产品 浓缩 至 100 倍 。 对 生产 而 言 ,逆转 录 病 毒 载体 的 纯化 和 浓缩 是 至 关 重 要 的 ,对 浓缩 的 物理 过 程 非 常 敏感 ,结果 不 能 有 效 地 生产 高 效 价 的 逆转 录 病 毒 载体 。 在 浓缩 (例如 离心 ) 过 程 中 逆转 录 病 毒 载体 的 不 稳定 性 似乎 与 病毒 包 膜 蛋白 质 的 性 质 相 关 。 由 于 用 水 疱 性 口 炎 病 毒 G 蛋白 (VSV-G) 取 代 逆 转录 包 膜 蛋白 或 “ 假 型 "允许 超 离心 浓缩 逆转 录 酶 载体 ,然而 ,G 蛋 白质 的 细胞 毒性 使 这 样 的 稳定 包装 的 细胞 系 假 型 载体 的 生产 在 技术 上 是 困难 的 ， 并 且 也 拓宽 了 载体 的 宿主 范围 ,这 可 能 对 于 某 些 应 用 来 讲 是 不 利 的 。 鼠 型 C 逆转 录 病 毒 的 包 膜 蛋白 质 是 由 SU gp” Al TMPpIE 组 成 的 ,其 分 别 调节 与 细胞 受 体 的 结合 和 同 细胞 膜 融合 。 研 究 指出 在 SU 区 释放 后 所 发 生 的 构象 变化 引发 膜 融合 。SU 和 TM 亚 基 通 过 不 稳定 的 二 硫 键 连 接 。 在 纯化 过 程 中 ,逆转 录 病 毒 的 不 稳定 性 被 认为 是 由 于 SU 结构 域 的 丧失 。 以 前 已 经 指出 在 超 离 心 的 逆转 录 病毒 的 制剂 中 SU 量 减 少 。 通 过 超 波 方 法 纯化 病毒 的 报道 指出 感染 性 丧失 , 而 在 高 压 下 加 工 没 有 逆转 录 酶 活性 ,这 表明 病毒 核心 仍然 完整 ,而 丧失 了 对 感染 所 必需 的 表面 蛋白 质 。 应 用 DNA 改组 可 以 加 速 重组 子 产 物 按 所 要 求 性 质 进 化 。 以 前 Soong 等 25] 报 道 了 通过 DNA 改组 进化 MLV 的 新 向 性 。 继 之 , Otto 等 5] 成 功 地 应 用 DNA 改组 改进 了 逆转 录 病 毒 的 稳定 性 和 加 工 产 率 。 他 们 对 6 种 亲 嗜 性 MLV 株 进 行 DNA 改 组 (图 8.10)。 被 改组 的 包 膜 区 产生 S x 105RCR 具有 复制 能 力 的 逆转 录 病 毒 重 组 子 库 。 这 个 库 进 行 浓 缩 ,在 每 个 循环 之 后 扩 增 幸存 的 病毒 ,分离 出 稳定 性 明显 改进 的 病毒 克隆 。 最 好 的 克隆 表现 出 降低 母体 病毒 效 价 (降低 30 ~ 100 倍 ) 的 条 件 下 效 ” 248 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 价 不 损失 。 这 些 抗 性 病毒 的 包 膜 在 DNA 和 和 蛋白质 顺序 上 是 不 同 的 ,都 是 来 自 多 个 母体 的 复杂 内 合 体 。 这 些 研究 表明 DNA 改组 是 改进 基因 治疗 载体 的 有 效 工 具 。 向 性 env 改组 exm 基因 基因 连 env — DNA 改 组 ee aa ag polX~ => FE 293T ”重组 子 逆 转 Se a 一 一 一 录 病 毒 库 重组 子 逆转 录 病 毒 库 选择 的 病毒 逆转 录 病 毒 效 克隆 和 分 析 扩 & 价 (+ 选择) 性 逆转 录 病 毒 业 超 离心 NM AE 一 步 选择 图 8.10 MLV 包 膜 基因 改组 实验 图 解 改组 6 种 亲 嗜 性 鼠 逆转 录 病 毒 的 包 膜 基因 ,并 连接 在 RCR 骨架 上 。 通 过 了 瞬间 转 染 产生 重组 子 逆 转录 病毒 库 ,在 浓缩 VSV-G 假 型 载体 所 用 的 条 件 下 离心 。 多 轮 离心 的 幸存 病毒 被 克隆 ,以便 进 一 步 分 析 8.6 微生物 细胞 定向 进化 -3 经 过 漫长 的 进化 ,自然 界 创造 出 大 量 的 结构 不 同和 复杂 的 生物 大 分 子 , 例 如 ， 各 种 抗生素 、 多 糖 、 蛋 白质 酶 核酸 和 其 他 的 天 然 产 物 。 许 多 次 级 代谢 产物 往往 是 由 各 种 构件 (building block) 组 合成 模块 结构 (modular structure) ,通过 模块 组 装 大 大 增加 了 生物 分 子 的 多 样 性 。 由 于 基因 操作 、 基 因 组 学 、 蛋 白质 组 学 代谢 工程 和 定 向 进化 ,工程 微生物 朝 着 新 的 非 天 然 化 合 物 生 产 方 向 发 展 。 目 前 正 试图 生产 新 的 生物 化 学 试剂 ,特别 是 集中 在 抗生素 、 类 胡萝卜 素 和 多 羟基 链 烷 酸 ( 表 8.3)。 微生物 是 各 种 化 合 物 库 源 ,也 是 能 够 生产 化 学 合成 难以 或 不 能 合成 的 各 种 化 合 物 的 工厂 。 微 生物 细胞 定向 进化 包括 组 合 各 种 途径 的 基因 的 组 合 ;各 种 多 结构 域 的 酶 衍生 新 的 模块 组 合 酶 ;定向 进化 途径 和 底 物 引导 新 构件 途径 , 见 图 8.11 所 示 。 (1) 新 基因 组 合 根据 生物 合成 途径 的 起 源 可 以 把 机 体 分 为 两 类 。 第 一 类 是 天 然 存在 (或 同 源 ) 生物 合成 途径 的 机 体 。 同 源 途 径 可 以 用 于 开发 新 化 合 物 的 起 始 材 料 。 例 如 , 聚 酮 天 然 生产 菌 ,链球 菌 属 菌 株 已 用 来 开发 新 的 聚 酮 抗生素 。 第 二 类 是 工程 (或 异 源 ) 生物 合成 途径 的 机 体 。 异 源 途 径 可 以 通过 所 要 求 的 基因 共 表 达 来 建立 。 这 些 基 因 第 8 章 BARA aR ae AAA EEL + (249 - 表 8.3 微生物 细胞 定向 进化 产生 新 化 合 物 修 饰 i Ok 文献 多 羟基 链 烷 酸 酯 (或 盐 ) 含 硫 多 羟基 链 烷 酸 酯 (或 盐 ) 前 体 加 工 [22 ~ 24] KS bR 羟 化 型 基因 组 合 [34] 新 糖 基 化 类 胡 葛 卜 素 基因 组 合 [35] PRA RAE 定向 进化 和 基因 组 合 [19] RMR 无 环 氧化 作用 的 大 环 内 酯 HAAR [8] Rl Se HE th 模块 组 合 [14] 新 大 环 内 酯 结构 模块 组 合 [15] 新 大 环 内 酯 结构 前 体 加 工 [26]、 大 环 内 酯 环 新 修饰 基因 分 裂 和 加 工 [25] 糖 基 化 基因 组 合 [11,12,36~ 40] 糖 基 化 定向 进化 [21] 非 核糖 体 肽 细菌 /真菌 NRP 杂 合 模块 组 合 [13] 新 非 蛋白 质 氨基 酸 作为 构件 基因 分 裂 和 前 体 加 工 [27] | 33 2 | 定向 | 代谢 工程 进化 筛选 和 分 析 图 8.11 工程 微生物 细胞 的 途径 ” 250 ' 进化 生物 技术 一 一 酶 定向 分 子 进化 可 以 完全 是 来 自 一 个 机 体 的 克隆 或 来 自 各 种 机 体 的 基因 组 装 成 生物 合成 途径 。 例 On, 几 个 天 然 类 胡萝卜 素 生物 合成 基因 已 经 组 合 到 非 产 生 类 胡 昔 小 素 天 .coi 合 类 胡 葛 小 素 途 径 。 微 生物 和 植物 的 基因 已 组 合 到 已. coli 中 产生 紫杉醇 生物 合成 的 中 间 体 一 一 taxadiene。 许 多 次 级 代谢 产物 的 生物 合成 基因 簇 集 在 操纵 子 中 ,大 大 促进 它们 的 克隆 。 在 一 个 机 体 中 建立 一 种 新 途径 需要 异 源 基 因 在 宿主 中 表达 ， 并 且 不 产生 有 毒 产物 ,一 般 优 选 E. coli 作为 宿主 。 (2) 途径 组 装 产生 特殊 产物 的 途径 可 以 几 种 方式 进行 操作 。 途 径 中 的 各 种 酶 可 以 修饰 。 基 因 可 以 缺失 或 插入 ,不同 途径 的 基因 组 合 可 以 组 装 成 新 途径 (组 合生 物 合成 )。 该 途径 广泛 用 于 构建 新 糖 基 的 聚 酮 抗生素 [9-101 。 (3) 模块 酶 在 一 种 途径 中 酶 活性 新 的 组 合 不 能 只 是 由 组 合 整个 基因 来 实现 。 多 结构 域 的 酶 ,具有 特异 活性 的 结构 域 可 以 交换 。 该 途径 已 用 于 聚 酮 和 非 核糖 肽 (NRP) 合 成 中 模块 酶 的 构建 [3]。 具 有 长 链 的 新 聚 酮 已 通过 在 现 有 的 PKS 中 插 人 额外 的 模块 延伸 聚 酮 合 酶 (PKS ) 获 得 。 新 的 大 环 内 酯 也 通过 杂 合 模块 系统 合成 。 杂 合 的 NRP 通过 转换 细菌 和 真菌 的 NRP 结构 域 获得 。 (4) 定向 进化 天 然 酶 通过 连续 几 轮 基 因 复 制 , 趋 异 , 突 变 , 重 组 和 选择 获得 进化 酶 。 进 化 酶 通常 保持 它们 的 化 学 性 质 , 但 获得 新 的 底 物 特异 性 。 在 生物 合成 途径 中 关键 酶 的 进化 可 以 产生 新 的 化 合 物 。 收 集 代 谢 途 径 中 各 种 酶 的 结构 与 功能 资料 将 促进 构建 新 途径 。 基因 组 改组 和 染色 体 工 程 的 新 方法 似乎 成 为 制造 和 最 佳 化 新 途径 的 重要 工 具 。 (5) 前 体 指导 生物 合成 新 化 合 物 可 以 通过 新 的 构件 移 人 生物 分 子 中 产生 ,这样 的 构件 可 以 加 入 到 机 体 生长 的 介质 中 ,机体 可 以 引入 并 代谢 它们 。 该 法 已 成 功 地 用 于 产生 新 的 多 羟基 链 烷 酸 酯 , 聚 酮 抗生素 和 NRP。 参考 文 献 Pédelacq JD，Piltcn E, Liong EC, et al. 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Current Opinion in Chemical Biology, 2003, 7: 273 ~ 278 oud -12 .2 科 院 植物 所 图 书馆 58.17435 | 000028131 区 “puree TH reTvit elle pay | ete ae (Q—1360.0101) 现代 生物 技术 前 沿 丛书 书 名 书号 ISBN 基因 免疫 的 原理 和 方法 7—03—012588—6 RNAi: 基因 沉默 指南 ，( 影 印 版 ) 7—03—012685—8 65 元 从 基因 到 基因 组 一 一 DNA 技 术 概 念 和 应 用 (影印 版 ) 7—03—012477—4 46 元 结构 生物 学 与 药学 研究 7—03—011688—7 485 生物 必 片 分 析 ( 影 印 版 ) 7—03—012247—X 80 元 DNA 芯 片 和 基因 表达 (影印 版 ) 7—03—012248—8 2955 计算 分 子 生物 学 导论 (翻译 版 ) 7—03—011493—0 36 元 植物 生物 技术 导论 (影印 版 ) 7—03—012799—4 72 元 蛋白 质 化 学 与 蛋白 质 组 学 7—03—012401—4 75 元 进化 生物 技术 一 酶 定向 分 子 进化 7—03—012639—4 ISBN 7-03-012639-4 ¥ UM 联系 电话 : 010- http://www. lifescien e-mail:info@life % ISBN 7-03-01; 6-4 定 Ht: 38. 00nqR