5^ h, Figem Zerzupfen ohne weiteren Zusatz oder nach Beigabe eines Tropfens der oben erwähnten indifferenten Flüssigkeiten mit einem Deckgläschen ein.*) Eine dritte, namentlich von pathologischen Anatomen vielfach geübte Methode besteht darin, dafs man mit einem VALE^TI^ 'sehen Doppelmesser einen möglichst feinen Schnitt durch das Organ macht, und denselben in einer indifferenten Flüssigkeit untersucht. Man hat dabei den Vorteil, dafs man eine gröfsere Partie des Organes über- sehen kann, als dies möglich ist, wenn man nur einen kleinen Bruch- teil desselben mit der Schere abgetragen hat. Oder endlich man untersucht das Gewebe oder Organ am lebenden , durch Curare, Morphium, Chloroform, Chloral etc. vorher unbeweglich gemachten Tiere. So wichtig nun auch diese Methoden mikroskopischer Betrachtung sind — und sie sollten niemals versäumt werden — , so kann man durch dieselben doch nur zu provisorischen, nie zu definitiven Resul- taten gelangen. Die einzelnen Teile . welche ein Organ zusammen- setzen , haften in natürlichem Zustande zu fest aneinander , als dafs sie sich so leicht isolieren liefsen , bez. sind die durch das Doppel- messer angefertigten Schnitte infolge der Elastizität der frischen Ge- bilde nicht dünn oder die einzelnen Schichten des lebenden Organes nicht durchsichtig genug, um alle Details zu enthüllen. *) Wasser, destilliertes und gewöhnliches, wirkt auf frische Gebilde höchst deletär ein. Kap. T. Die Methoden der Isolation, 3 In neuerer Zeit sind Irische Gewebe oder Organe Iriufig unter- sucht worden . nachdem man sie hat (/ifricren lassen. ' ^an benutzt dazu eines der gehriiuchliclien Milvrotonie. Das frische Material, wird auf eine rauhe Mctallphittc gelegt und durch Einwirkung von Ather- diun])fen , die mit einem Spray auf dasselbe gerichtet werden , zum Gefrieren gebracht. Mit al)g('kiihltem Messer fertigt man dann mög- lichst feine Schnitte an, die man auf dem Objektträger auftauen läfst und dann in einer indiflerenten Flüssigkeit oder nach geeigneter Färbung in verdünntem Glycerin untersucht. Diese Methode ist in- dessen ziendich eingreifend, da die beim Gefrieren entstehenden Eis- krystalle häufig Zerstörungen ausgedehnter Art in den Zellen hervorrufen. Um zunächst eine ausgiebige Isolation zu ermöglichen, mufs man verschiedene Keagentien anwenden, die im folgenden Kapitel auf- gezählt werden sollen. Kap, I. Die Methoden der Isolation. Als allgemeine, nur mit einer Ausnahme giltige Regel ist anzu- sehen, dafs Organe oder Gewebe , die der Einwirkung die Isolation ermöglichender Reagentien unterworfen werden sollen, stets frisch, noch körperwarm sein müssen. Sind diese Bedingungen nicht erfüllt, ist z. B. bei Warmblütern bereits vollständige Abkühlung eingetreten oder hat bei anderen Tierformen die Tödtung längere Zeit vor der zu beginnenden Untersuchung stattgefunden, so ist eine befriedigende, gute Resultate ergebende mikroskopische Bearbeitung nicht mehr möglich. Denn nun ist bereits der Zelltod eingetreten und es haben kadaveröse Veränderungen in den Zellen Platz gegriffen, so dafs eine Erkennung der wirklich intra vitam vorhandenen Verhältnisse aus- geschlossen ist. Eine Verwertung der durch Untersuchung solcher abgestorbener Organe erhaltenen Resultate würde zu den bedenk^ liebsten Irrtümern hinführen. Eine einzige Ausnahme ist hier zuzugeben, nämlich wenn es sich um menschliche Organe handelt. Diese kommen naturgemäfs fast niemals frisch in den Besitz des Forschers; zur richtigen Würdigung der an solchen Objekten gewonnenen Resultate wird man daher stets eine Vergleichung mit ähnlichen, von höheren Säugetieren entnom- menen Organen anstellen müssen. Eine fernere, stets zu beachtende Regel, gegen welche Anfänger häufig verstofsen, ist die, dafs das zur Isolation vorzubereitende Stück und das Quantum der Isolationsfiüssigkeit in geradem Verhältnisse zu einander stehen. D. h. bei kleinen Objekten mufs wenig, bei grofsen entsprechend viel Flüssigkeit genommen werden. Tut man das nicht, nimmt man z. B. bei kleinen Objekten viel Flüssigkeit, so bekommt man Härtung statt Mazeration. Ist die Vorbereitung zur Isolation beendet, hat die betreffende Flüssigkeit lange genug eingewirkt, dann nimmt man entweder das ganze Objekt oder ein Stückchen desselben heraus und bringt es in nur einen Tropfen der verwendeten Flüssigkeit oder in einen Tropfen Wasser auf den Objektträger. Zu viel Flüssigkeit hier schadet, weil dann das aufgelegte Deckglas schwimmt und Strömungen unter dem- selben entstehen, welche die isolierten Elemente mit sich fortreifsen. Die Isolation, das Zerzupfen geschieht mit feinen, in besonderen 1* 4 I- Abschnitt. J)ic Metliotlcn der TTntorsndiunpf. Haltern steckenden Nähnadeln. l)as zu zcizuj)i'ende Objekt mufs. wie gesagt, möglichst klein sein; es wird mit der einen Nadel festgehalten, während die andere in schneller Aufeinanderfolge mit kurzen Zügen an seinem Rande zerrt und dadurch die Teile aus ihrer gegenseitigen Lagerung löst. Hat man ein Gebilde von fasriger Struktur vor sich, so zieht man dasselbe mit beiden Nadeln sorgfältig auseinander. Auch hier darf die Gröfse nicht zu beträchtlich sein, ungefähr 2 mm. nicht übersteigen, sonst ist eine ausgiebige Zerteilung nicht möglich. Von grofsem Einfiufs auf die Isolation, sowohl was die Zeitdauer, nach welcher, als auch den Grad anlangt, in welchem dieselbe möglich ist, ist die Temperatur. Im heifsen Sommer ist zuweilen schon nach kurzer, nur wenige Stunden dauernder Einwirkung des Reagens eine gute Resultate liefernde Zerzupfung ausführbar, während in der kalten Jahreszeit bei demselben Objekt und derselben Flüssigkeit oft Tage erforderlich sind. Um auf Zupfpräparate, namentlich wenn dieselben von sehr zarten Objekten angefertigt worden sind, das System des Mikroskops gut einstellen zu können, empfiehlt es sich, in das Präparat ein Haar oder eine feine Wollfaser zu bringen. Diese sucht man zuerst im mikros- kopischen Bilde zu erfassen und kann dann bequem die isolierten Elemente auffinden. Andernfalls, wenn man ein solches Hilfsmittel nicht gebraucht, kann man den Tubus leicht zu tief senken und dabei Linse und Präparat zerstören. Ich wende mich nun zu den einzelnen Isolationsflüssigkeiten. Die oberste Stufe nehmen unter denselben meines Erachtens die Verdünnungen des Alkohols , der Chromsäure und deren Salze ein. 1) ^/ä Alkohol ; llaiivier (Alcool au tiers.). Man verdünnt 1 Vo- lumen 90*^/0 Alkohol mit 2 Volumina destillierten Wassers. Die sehr kleinen Objekte kommen in die Flüssigkeit auf 24 Stunden und länger. Nach drei Tagen, wenn eine genügende Isolationsfähigkeit noch nicht vorhanden, mufs die Flüssigkeit gewechselt werden, weil sonst Fäulnis eintritt. Ist ganz vorzüglich für Epithel ien und Drüsenzelkn. 2) 7« Alkohol ; Solbrlg. Man verdünnt 1 Teil käuflichen Wein- geistes mit 5 Teilen destillierten Wassers. Schon nach 24 Stunden ist eine ausgiebige Isolation möglich. Besonders für das Nervensystem wirbelloser Tiere zu empfehlen. 3) 7^ Alkohol. Man verdünnt 1 Teil Alcohol absolutus mit 3 Teilen Aqua destillata. Ich habe diese Konzentration als ganz ausgezeichnet bei meinen Untersuchungen über das centrale Nerven- system der Muscheln befunden. Noch nach 4 — 5 Wochen, d. h. wenn die Ganglien solange in der etwa alle 5 — 6 Tage gewechselten Flüssig- keit mazeriert wurden, waren die Teile ausgezeichnet erhalten. Die Isolation ist schon nach 48 Stunden möglich. Ich kann für das Studium des Nervensystems der Evertebraten diesen ^^ Alkohol angelegentlichst empfehlen. Er ist auch für Isolation von Epitlielien geeignet. 4) Chrouissiure. Wie der Alkohol, so bewirkt auch die Olirom- säure in starken Verdünnungen leichte Isolation. Der Grad der Ver- dünnung richtet sich nach dem Objekt, um das es sich handelt. Je zellenreicher, d. h. je kompakter dasselbe ist, desto stärker mufs die Verdünnung, je zarter dasselbe, desto konzentrierter mufs die Säure sein; die Schwankung findet zwischen O,!**/,, und O.OO.^'Vo statt. Be- K:i|i. I. Diu Methoden der Isolation. 5 .stimmte Konzentrationen lassen sich daher allgemein nicht angeben, jeder Forscher nuifs den für seine Zwecke geeigneten Verdünnungs- grad sich selber ausprobieren. 5) BuCHHOLZ'sehc )l('tliO(lc. Dieser Forscher hat zur Isolation von GaugJieuzdlen hei Kocrfcbraten zunächst eine Lösung von 0,01% Chromsäure 24 — 48 Stunden einwirken lassen, dann eine solche von 0,05"/o Vi — 1 Stunde uiul erweichte schhefslich in indifferenter Flüssig- keit. Seine Resultate waren ausgezeichnet. 6) ARXOLD'scIic Methode. Diese ganz vortreffliche j\[ethode ist namentlich für Spinal- und si/iHpafJiiscJifi Gamjlien verwendbar, sowie für alle die Orc^ane, deren zellige Elemente in vieler Bindesubstanz eingebettet sind. Man legt das Objekt auf 5 — 10 Minuten in eine 0.1% Essigsäure, dann direkt für 24—48 Stunden in 0,01% Chrom- säure. Die Isolation ist jetzt sehr leicht. Man kann in Pikrokarmin oder in 0,1% Goldchloridlösung nachfärben. Namentlich mit letzterer (Reduktion in angesäuertem "Wasser im Tageslicht) erhält man sehr schöne Bilder. Zerzupfen in verdünntem Glycerin. 7) 0,01%— 0,05% Chromsäure. Organe, welche glatte Muskel- fasern enthalten, kommen auf 24 — 48 Stunden in die Lösung. Darnach ist eine ausgiebige Isolation der Muskeln möglich. Besser als die Chromsäure, weil konstanter und leichter kontro- lierbar in ihren Wirkungen sind die doppelt chromsauren Salze , das Ammonium bichromicum und namentlich das Kali bichromicum. 8) Ammonium bichromicum 0,035% — 0,1%. Zur Isolation von Epithelzellen bei Evertebmten geeignet, für Ganglienzellen nicht zu empfehlen. 9) Kali bichromicum 0,1%. Von Deiters zur Isolation der Vorderhornzellen des Fückenmarks und der Hirschgeweihzellen des Cere- hellum mit Recht sehr empfohlen. Nach dem zweiten Tage führt die Zerzupfung zu guten Resultaten. Auch für Nervenzellen von Everte- hraten kann ich diese Konzentration rühmen, doch kommt man hier mit Verdünnungen von 0.05'^ „ und 0,025% bei 8 — 24 stündiger Ein- wirkung ebenfalls zum Ziele. Nachfärben in Pikrokarmin und dann Zerzupfen in verdünntem Glycerin. 10) Kali bichromicum 0,01% — 0,005%. Deiters verwandte diese Verdünnung, um die alletfeinsten Axencglinder , die von den Protoplasmafortsätzeu entspringen, deutlich darstellen zu können. Die Dauer der Einwirkung ist durch wiederholtes Probieren festzu- stellen. Sind mehrere Tage notwendig, ehe eine Isolation möglich ist, so ist die Flüssigkeit zu wechseln. 11) Kali bichromicum 4%— 5%. Von Flemming zur Isolation von Epithelien indifferenten Charakters und von Sinneszellen für Silfs- icassermuseheln verwendet. Die Wirkung tritt frühestens nach einer "Woche ein ; eine Zerzupfung ist nicht mehr notwendig. Durch Klopfen mit der Nadel auf das Präparat, das in der Isolierungsflüssigkeit unter- sucht wird, fallen die indifferenten Epithelien ab und die Sinneszellen treten deutlich erkennbar hervor. Die OsHiiuiusäure, welche ein vorzügliches Fixirungsmittel ist, ermöglicht auch ausgezeichnete Isolationen. ß I. Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung. 12) 0,17o Osmiumsäure. Dauer der Einwirkung bis zu 24 Stunden, Abspülen in Wasser, Zerzupfen in verdünntem Glycerin oder in öO^o Lösung von essigsaurem Kali. Für die verschiedensten Organe, be- sonders epitheliale, geeignet. 13) 1% Osmiumsjiurc. Nerven von Wirbeltieren werden nach Neu- MANN einer 24 stündigen Einwirkung dieses Reagens unterworfen, kommen dann auf 24 — 48 Stunden in destilliertes AVasser. Jetzt ist eine leichte Isolation möglich. 14) 0,05% Osmiumsäure und 0,37,, Essigsäure; HERT\yiG (citiert nach Behrens), werden zu gleichen Teilen gemischt. Ver- wendbar für Äctinien; die Dauer der Einwirkung ist einige Minuten. 15) DROST'sches Gremiscli. 0,25*yo Chromsäure, 0,1% Osmium- säure, Eisessig 0,1% in Seewasser. Zur Isolation von EpitheUen nie- derer Tiere nach mehrtägigem Verweilen des Objektes in dem Gemisch sehr geeignet. Verwendet man statt See- destilliertes Wasser, so kann man auch bei Wirbeltieren gute Resultate erzielen. 16) Verdünnte Pikrinsäurelösung. 5—10 Tropfen der kalt- gesättigten Lösung auf 15 Kubikzentimeter destillierten Wassers. Nach 12—24 Stunden erhält man vom Nervensi/sfem tvirheUoser Tiere vorzügliche Präparate. Bei kürzerer Einwirkungsdauer (4 — 8 Stunden) erhält man sehr gute Isolationen von Epithel- und Drüsenzellen. Die Zerzupfung geschieht in destilliertem Wasser. 17) Jodserum; Max Schultze. Man vermischt die Amnios- fiüssigkeit von Wiederkäuerembryonen mit sehr viel Jodtinktur und filtriert. Zur Verhütung der leicht eintretenden Fäulnis giebt man einige Stückchen Kampher zu. Dieses Gemisch, das oft schon nach 24 Stunden, unter Umständen aber, die in dem zu untersuchenden Objekte liegen, auch erst nach Wochen wirkt, ist ein ausgezeichnetes Isolationsmittel für verschiedenartigste Organe. 18) Kalt gesättigte wässrige Oxalsäurelösung. Meines Wissens wurde die Oxalsäure zuerst von Max Schultze empfohlen, dann in ausgiebigster Weise von Bole angewendet. Sie ist ein vorzügliches Isolationsmittel für Epithel- und Drüsenzellen. Nach 12 — 24 stündiger Einwirkung werden die Objekte in destilliertem AVasser abgespült und in demselben mit Nadeln zerzupft. 19) HALLER'sclies (xemisch. Bei Molluslcen verwendete Bela Haller zur Isolation von Sinneszellen folgende Mischung: 1,2 Raum- teile Aqua destillata, 0,4 Raumteile Glycerin und 0,4 Raumteile kon- zentrierter Essigsäure. Schon nach halbstündiger Einwirkung erhielt er brauchbare Präparate. Vielleicht auch für Vertebraten (Schmeck- becher) geeignet. 20) 30% Salpetersäure. Von REICHERT (citiert nach Frey) zur Isolation der glatten Muskeln angegeben. Nach 24 Stunden zer- legen sich die Bündel derselben in die kontraktilen Easerzellen, nach circa 3 Tagen fallen sie bei leichtem Schütteln auseinander. 21) Chlorsaures Kali mit Salpetersäure. Diese Methode wurde von KÜHNE (citiert nach Frey) zur Isolation (}iGV quergestreiften Muskeln angegeben. Man bedeckt den Boden eines Becherglases mit krystalli- siertem Kali chloricum, befeuchtet ein wenig mit destilliertem Wasser Kiip. 1. iJic Metliudeii der Isolation. 7 und übergiefst mit dem vierfachen Volumen reiner konzentrierter Salpetersäure. Nun rührt man um, bringt einen Muskel, z. B. Frosch- muskel, auf den Boden des Glases unter die Krystalle. Meistens schon nach einer halben Stunde kann man ihn entfernen und in einem Reagensglase mit Wasser schütteln. Er zerfällt dann leicht in seine Fibrillen. Tritt der Zerfall noch nicht ein. so bringt man ihn in das Gemisch zurück und kann von 5 zu 5 Minuten von neuem das Schütteln vornehmen. 22) Selnvet'lijj:^ Säure, von Sandmann zur Isolation quergestreifter Muskrhi empfohlen. Man bringt den Muskel in ein wohlverkorktes Reagensglas mit schwefliger Säure (SO.,), je nach der Gröfse und dem ßindegewebsreichtum auf 1 — 8 Tage. Ist der Muskel zu voluminös, so zerteilt man ihn in passende Streifen parallel seiner Faserung. Nach der Behandlung mit schwefliger Säure wird der Muskel sorg- fältig ausgewaschen, und zwar in destilliertem Wasser, dann 3 — 4 mal, wobei jedesmal das Wasser zu erneuern ist, in destilliertem Wasser gekocht. Nach der Abkühlung schüttelt man ihn im Reagensglase tüchtig und nun zerfällt er in seine Fibrillen. Färbung mit Gold- chlorid ist jetzt noch möglich. Man giebt in 10 ccm. Aqua destillata 1 — 3 Tropfen einer 1",, Goldchloridlösung, läfst den Muskel darin, bis eine gelbe Färbung eintritt, wäscht aus und kocht von neuem in Wasser, das mit einem bis mehreren Tropfen Essigsäure angesäuert ist. Die Nervenendigungen sind trotz dieser eingreifenden Manipulation noch erhalten. 23) Reine Salzsäure (citiert nach Stöhr). Um Drilsenhanälchen zu isolieren, legt man kleine Stücke des betreffenden Organes in etwa 10 ccm. reiner Salzsäure. Nach 10—20 Stunden Einwirkung wird in destilliertem, häufig zu wechselndem Wasser 24 Stunden lang ausge- waschen. Leichte Isolation. Untersuchung in verdünntem Glycerin. Als eine Art Isolation kann man auch die Hiö'sche Pinselmethode und die Methode des Schütteins von Schnitten betrachten. 24) Bei der HlS'sehen Pinselmethode behandelt man mit einem feinen Kameelhaarpinsel den vom gehärteten Objekt gemachten Schnitt, der am besten in einem Tropfen Wasser auf dem Objektträger sich befindet. Man führt den Pinsel senkrecht über den an einer Seite mit einer Nadel festgehaltenen Schnitt in sanfter Bewegung hinweg, ent- fernt so alle Zellen und isoliert dadurch die bindegewebige Grund- substanz. 24a) Eine Modifikation dieser Methode ist die Schüttelmethode. Den vom gehärteten Objekte gemachten Schnitt bringt man in ein Reagensglas mit Wasser und schüttelt tüchtig und anhaltend. So entfernt man schonender als bei der vorigen Prozedur die zelligen, das Organ charakterisierenden Gebilde und isoliert die Grundsubstanz. Beide Methoden sind hauptsächlich bei den Organen verwendbar, bei denen die den physiologischen Wert bedingenden zelligen Elemente in einem bindegewebigen Stroma liegen, also bei allen echten Drüsen, allen Blutgefäfsdrüsen etc. 25) Die KÜHNE'sclie Yerdauungsmethode. Als eine Art Iso- lation ist ferner folgende, zuerst von KüiiXE und Ewald angewandte Behandlungsweise der Objekte zu betrachten (citiert nach Ortii). Dieselbe besteht in der Verwendung des Pankreasfermentes. des 8 I. Absehiiitl. Die Methoden der Untersuchung. Trijpsins. Man stellt sich dasselbe dadurch her, dafs das Pankreas eines eben geschlachteten Rindes mittelst kalten Alkohols und Äthers im Extraktionsapparate so lange behandelt wird, dafs eine weifse, leicht zu zerreibende Masse zurückbleibt. Ein Gewichtsteil derselben wird mit B — 10 Gewichtsteilen Salicylsäure von 0,1 "„ 3—4 Stunden bei 40 ^' C. behandelt, dann wird durch Leinwand und nach dem Er- kalten durch Papier filtriert. Man bringt in ein mit der so erhaltenen Flüssigkeit gefülltes Reagensglas Organteile und setzt dieselben mehrere Tage einer Temperatur von 37,5 " C. im Brütofen aus. Dann werden die Objekte in einem Reagensglase mit Wasser tüchtig ge- schüttelt und in physiologischer Kochsalzlösung (0,75%) untersucht. Statt der sauren Lösung ist unter Umständen eine alkalische er- wünscht. Dieselbe wird so hergestellt, dafs man die saure Lösung mit Soda erst neutralisiert, dann alkalisch macht. Solche alkalische Lösung schimmelt leicht und wird dadurch unbrauchbar; man setzt daher, um dies zu verhüten, soviel von einer alkoholischen 20 "/„ Thy- mollösung zu, dafs die Mischung 0,5 % Thymol enthält. So rationell die eben beschriebene Methode erscheint, so sind doch die bisher damit erzielten Resultate recht wenig Vertrauen er- weckend und reizen nicht gerade zur Nachahmung. Kap. II. Die Methoden der Fixierung und Erhärtung. Durch die Isolation werden die ein Organ oder Gewebe konsti- tuierenden Elemente unter möglichster Erhaltung ihrer natürlichen Gestalt getrennt von einander zur Erscheinung gebracht, ihr Zu- sammenhang und ihre gegenseitige Gruppierung also absichtlich zer- stört. Man kann demnach niemals den Bau eines Organes oder Ge- webes blofs durch die Isolation erkennen. Dazu kommt noch ein Moment. Die im vorhergehenden Kapitel aufgezählten Methoden müssen, sollen sie anders eine Wirkung entfalten, mehr oder minder deletär auf das zu untersuchende Objekt einwirken, sie müssen daher auch die feineren Strukturen der Zellsubstanz und des Kernes zer- stören. Um also den inneren Aufbau eines Organes und die feinere Struktur der Elemente desselben zu erforschen, mufs man nunmehr zu anderen Methoden greifen, zumal auch, wie bereits auseinander- gesetzt, Präparate von frischen Objekten keinen definifwen Aufschlufs gewähren können. Diese Methoden sind die der Fixierung und Erhärtung. So leicht der letztere Zweck, das Schnittfertigmachen, zu erreichen ist, so schwer sind die Forderungen zu erfüllen, welche man in ersterer Absicht an eine Methode stellen mufs; wir haben in der That kein Fixierungs- mittel, welches allen idealen Ansprüchen Genüge leistet. Die beim Fixleren verfolgte Absicht ist einmal, das Plasma der Zellen und Gewebe zur sofortigen Gerinnung zu bringen. Und zweitens soll diese gerinnende Eigenschaft gleichzeitig durcli alle Schichten, durch den ganzen Dickendurchmesser des zu fixierenden Objektes hin- durch sich entfalten. Dieser Anspruch ist darum nicht vollständig erfüllbar, weil jedes fixierende Reagens eben durch die von ihm be- wirkte Gerinnung sich zunächst seine Grenzen selbst setzt, über die es erst allmählich hinausdringen kann. Dies ist namentlich der Fall Kap. II. Die Midliudcii der Fixioi'iiiirf und Erliartuiifjf. 9 bei zcllenrcichcii, konipiikteu Ürgiincii. Die Folge davon ist, dafs die im Zentrum des Objektes sieb findenden Teile erst sebr viel später dem Einllufs dos Reagens unterworfen werden, als die an den Grenzen liegenden, dal's im Zentrum daber bereits Veränderungen eingetreten sein lahuien, die von der Norm bedeutend abweicben. Aus dieser ßetracbtung bcraus ergiebt sieb demnacb (lu' Ilaupt- regel, die in erster Linie zu beobacbten ist, dal's das zu fixierende Ob- jekt mögliebst klein sein (sein Volumen darf etwa l com. nicbt über- steigen) und dafs die zum Fixieren verwandte Flüssigkeit sebr reicblich vorbanden sein, das 50 — lOOfacbe des Volumen des Objektes betragen mufs. Quantität der Flüssigkeit und Dauer ibrer Einwirkung werden sieb stets nacb dem 01)jekte ricbtcn; bei zarten, leicbt permeablen GebiUlen werden also beide geringer, bei kompakten, zellenreichen beide gröfser sein müssen. Dabei ist stets darauf zu balten, dafs die Fixierungsflüssigkeit während der Dauer ihrer Einwirkung klar bleibt. Tritt Trübung ein, so ist ein Flüssigkeitswechsel vorzunehmen, der so lange zu wiederholen ist, bis keine Trübung mehr sich zeigt. Die Anforderung, dafs das zu fixierende Objekt möglichst klein gewählt werden soll, kann natürlich nicht erfüllt werden, wo es sich um die morphologische Untersuchung von Embryonen, von Gehirnen oder von ganzen Tieren handelt. Bei den ersteren Objekten wird eine absichtliche Zerkleinerung erst dann Platz greifen dürfen, wenn die Entwickelung so weit gediehen ist, dafs die Lagebeziehungen der einzelnen Teile zu einander durch Präparation mit Messer und Pin- zette klar erkannt werden können. Solange dies nicht der Fall ist, werden die Embryonen unversehrt in die Fixierungsflüssigkeit kommen müssen. Indessen sind die Gewebe in frühen embryonalen Stadien im allgemeinen sehr leicht permeabel, so dafs die Gröfse hier nicht von beträchtlichem Nachteil ist. Anders liegt die Situation bei Ge- hirnen. Ist man gezwungen, dieselben in toto zu fixieren, so mufs man unter allen Umständen auf Gewinnung feinerer histiologischer Details Verzicht leisten. Ferner ist bei jeder Fixierung in Betracht zu ziehen, dafs die au- gewandten Reagentien in mehr oder minder hohem Grade als Reize auf die Objekte wirken. Daher kontrahieren sich muskelreiche Or- gane oder Tiere, welch letztere bei zoologischen Untersuchungen oft in toto der Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit unterworfen werden müssen, bisweilen derart, dafs eine vollständige Verzerrung der äufseren Form und damit auch eine Verlagerung der inneren Teile stattfindet, wodurch selbstverständlich eine mikroskopische Analyse unmöglich gemacht wird. Um muskelreiche Organe oder Gewebe in möglichst ausgestrecktem Zustande fixieren zu können, befestigt man dieselben daher am besten mit Igelstacheln oder mit zugespitzten hölzernen Scbusternägeln auf einem Stückchen Kork und wirft dasselbe, das befestigte Objekt nach unten, in das Reagens. Ganz zu fixierende Tiere müssen vorher unbeweglich gemacht, gelähmt oder langsam ab- getödtet werden. Welches Mittel dafür verwendbar ist, richtet sich nach der Species, häufig auch nach dem Individuum. Chloral-, Morphiumlösungen, in welche die betreffenden Tiere übergeführt werden können, Chloroform, in das Wasser gebracht, in dem die Tiere sich l)efinden, Curareeinspritzungen etc. sind hier manchmal von Vorteil. Indessen lassen sich dafür keine bestimmten Regeln 10 I- Abschnitt. Die Methoden dei* Untersuchung^. erteilen ; mit Geduld ausgerüstet mufs sich Jeder das für seine Zwecke geeignete Verfahren ausprüfen. In folgendem werden eine gröfsere Anzahl Fixierungsmethoden aufgezählt werden. Da mag denn wohl der Anfänger und weniger Geübte fragen: welches der empfohlenen Fixierungsmittel soll ich ge- gebenen Falls anwenden? Meine Antwort würde lauten: alle die, welche sich bewährt haben und welche der Erfüllung der oben er- wähnten idealen Forderungen am nächsten kommen. Ich pflege stets eine gröfsere Zahl von Fixierungsmittelii für dasselbe Objekt zu be- nutzen, weil die verschiedenen verschieden einwirken. Das eine ist geeigneter für Plasmastrukturen , das andere geeigneter für Kern- strukturen, jenes erschwert die Anwendung einer Anzahl Farbstoffe, während dieses dieselbe erleichtert; und umgekehrt. Zu einem rich- tigen histiologischen Verständnis eines Organes oder Gewebes kann man meines Erachtens erst dann gelangen, wenn man verschiedene Methoden vergleichend anwendet. Auf die Fixierung folgt die Erhärtung. Diese nimmt man unter bestimmten , bei den einzelnen Methoden anzugebenden Ausnahmen stets so vor. dafs das Objekt zunächst in 70 \, dann in 80 %, endlich in 90 <>/o Alkohol gebracht wird. Soll das Objekt längere Zeit auf- bewahrt bleiben, ehe es zur Untersuchung gelangt, so geschieht dies am besten in 80 % oder 90 % Alkohol ; 70 % Alkohol, den einige Forscher vielfach anwenden, wirkt auf die Dauer zerstörend ein. Aus dem 90 % kommt das Objekt, wenn es für das Schneiden vorbereitet werden soll, in 96 ^l^^, dann in absoluten Alkohol. Die weitere Be- handlung wird in Kap. III auseinandergesetzt werden. Bei der Überführung der Objekte aus dem fixierenden in das er- härtende Reagens entfaltet der Anfänger häufig eine Sparsamkeit im Gebrauch des Alkohols, die ganz deplaciert ist. Dieselbe Regel, die bei der Fixierung gilt, die Anwendung grofser Flüssigkeitsquantitäten, greift auch hier Platz. Besonders deshalb, weil durch den Austausch des in den Geweben enthaltenen Wassers mit Alkohol letzterer in seiner Konzentration kontinuierlich geändert wird und schon nach kurzer Einwirkungsdauer keineswegs mehr erhärtende, sondern, wie alle dünnen Alkohole, häufig mazerierende Eigenschaften entwickeln kann. Also : viel Alkohol und . was aus den obigen Gründen als selbstverständlich erscheint, liäufiger AVechsel desselben, bis die Härtung beendet ist. Das alles, Fixieren wie Härten, wie überhaupt alle zur Vorbe- reitung für die endliche mikroskopische Untersuchung notwendigen Methoden kosten Zeit und Aufmerksamkeit; und wer die letztere nicht anwenden kann und die erstere nicht übrig hat, der tut besser, von mikroskopischen Arbeiten abzustehen. Verwendet man aber beide in ausgiebigem Mafse, dann wird man auch durch gute, wissenschaftliche Resultate ergebende Präparate entschädigt. Ich wende mich nun zur Beschreibung der einzelnen Methoden. 1) Alkohol absolutus. Man stellt sich denselben am besten selber dar. indem man Cuprum sulfuricum im Metalltiegel glüht, wodurch es zu einem weifsen, äufserst hygroskopischen Pulver wird. Dieses bringt man in grofser Quantität in eine Flasche und giefst 96 % Alko- hol hinzu. Das geglühte Kupfer nimmt dem Alkohl den Rest AVasser und wird dadurch grünlich. Die Alkohol-Flasche ist mit einem Kork- Kap. II. Die Methoden der Fi.xiciuiiff und Erhärtung. H Stöpsel zu versehen, da die eingeschliffenen Glasstöpsel niemals luft- dicht schliefsen. Vor dem Gebrauch ist der Alkohol durch ein doppeltes Faltentilter zu giefsen, da sonst ganz kleine Ku[)ferpartikel mit dem /u härtenden Gewebe in Berührung kommen und eine leichte Bläuung desselben hervorrufen können. Zur Fixierung ohne andere Eeagontien darf man nur den ahsolnten Alkohol verwenden. Die Wasser entziehende AV'irkung desselben tritt gegen die das Eiweifs zur Gerinnung bringende zurück, während bei Alkohol von geringerer Konzentration die erstere überwiegt. Letzterer verursacht daher ohne Anwendung von fixierenden Reagentien hochgradige Schrumpfungen. Im Alkohol absolutus bleiben die Objekte etwa 3 Tage, wobei der Alkohol mindestens täglich zu wechseln ist. Sollen sie nicht sofort verwandt werden, so sind sie nach 3 Tagen in !J0 "/o Alkohol zu über- tragen, weil sie andernfalls zu hart werden würden. Im allgemeinen ist der Alkohol kein sehr empfehlenswertes Mittel; er steht meines Erachtens jedem der später zu erwähnenden Reagen- tien entschieden nach, sowohl was die Erhaltung der Teile, wie ihre Färbbarkeit anlangt; in Alkohol fixierte Objekte nehmen z. B. Kar- min sehr schlecht an. Nur für die grofsen Verdauungsdrüsen der Wirbeltiere und für pathologisch-anatomisches Material ist er von einigem Vorteil. 2) AlliOliol-Eisessig-. Diese Methode wurde zuerst von E. ran Beneden zur Abtötung und Fixierung der Eic}' vonÄscans meyalocephala verwendet. Die in den folgenden Zeilen notierte Modifikation der- selben ist von Zacharias beschrieben. Zu 4 Raumteilen starken Alko- hols wird 1 Raumteil Eisessig gesetzt; dann werden auf je 10 ccm. dieser Mischung 2 — 3 Tropfen einer 1 ^'n Osmiumsäurelösung hinzu- gefügt. Je nacii den zu fixierenden Stadien mufs das Material ver- schieden lange in der Mischung bleiben, bis zu 20 — 25 Minuten. Beim Erwärmen auf 24^' C. genügen 10 — 15 Minuten. Dann werden die Objekte 2 — 3 Stunden lang in absolutem Alkohol gewaschen und in 70 '^'o Alkohol aufbewahrt. Färbung mit alkoliolischer Boraxkarmin- lösung (siehe Kap. V). 3) Chromsäure '/.. "/o — 1 %. Dieses Mittel ist zur Fixierung namentlich von Kernstrukturen ausgezeichnet. Man fängt im allgemeinen mit der schwachen Lösung (^3 %) an und steigt dann allmählich bis 1 <"o. Häufig genügt ein 24 Stunden langes Einlegen des natürlich sehr kleinen Objektes , denn die Chromsäure dringt schwer ein, in die ^'3 ^',0 Lösung. Nachher mufs man sorgfältig in destilliertem Wasser auswaschen, weil sonst mit dem Alkohol, der zur Nachhärtuug verwendet wird. Niederschläge entstehen. Die Härtung in Alkohol mufs allmählich durch successive Anwendung der oben erwähnten Kon- zentrationsstufen erfolgen. Der einzige Nachteil des Reagens besteht darin, dafs das Färbungsvermögen der einzelnen Gebilde durch das Chrom leidet. Für alle Organe verwendbar. 4) Chromameiseiisäure ; BABL. Zu 200 ccm. einer V3 "/o Chrom- säure kommen 4 — 5 Tropfen konzentrierter Ameisensäure. Diese Mischung ist jedesmal vor dem Gebrauche frisch zu bereiten. Die Objekte werden in kleinen Stücken auf 12-24 Stunden in die Lösung gebracht, dann in destilliertem Wasser gut ausgewaschen und langsam erhärtet. Rabl hat damit beim Studium von Zellteilunyen ausgezeich- nete Resultate erhalten. 12 1- AbscliiiitL. J>ic Jlcthodcii der [Jiitcrsuchuiif;^. 5) Cliromcssigsäiire ; Semper. Zu der etwa V5 '% Cliromsäure- lösung wird so viel Essigsäure zugesetzt, dafs die umgescliüttelte Mischung schwach säuerlich riecht. Nach verschieden langer Einwirkungsdauer Averden die Objekte in Wasser ausgewaschen und langsam in Alkohol erhärtet. 6) Cliromessig:siiure ; Flemming. 1% Chromsäure 25 ccm., 2 "/o Essigsäure 50 ccm. Aqua destillata 25 ccm. werden gemischt. Einwirkungsdauer verschieden. Auswaschen in Wasser; langsames Erhärten in Alkohol. Für alle Geivebe und Organe empfehlenswert, besonders zum Studium von Kernteilungen. 7) Chromsali)otersäuro ; Perenyi (citiert nach Fol). 4 ccm. 10 % Salpetersäure, 3 ccm. Alkoliol, 3 ccm. 0,5 'Vq Chromsäure werden gemischt. Die Objekte kommen in diese Mischung für 4 — 5 Stunden, dann in Alkohol. Soll für Amphibien- und Fischeier ein gutes Fixierungs- mittel sein. 8) MÜLLER'sche Flüssigkeit. 2 — 2,5 gr. Kali bichromicum und 1,0 gr. Natron sulfuricum werden in 100 ccm. Wasser gelöst. Dieses so vielfach für alle möglichen Objekte verwandte Reagens sollte in seinem Gebrauch allein auf das Zentralnerven s_i/stem beschränkt werden. So vorzüglich die Resultate sind, die man mittels desselben an diesen Organen erhält — für die voluminösen, in toto zu behandelnden Ge- hirne der Säugetiere ist es das einzige überhaupt anwendbare Fixie- rungsmittel — , so schlecht sind dieselben, wenn es sich um andere Organe handelt. Epithelien werden zum Theil darin mazeriert, und vor allen Dingen werden Kern- und Plasmastrukturen völlig zerstört. Ganz zu verwerfen ist die Lösung für Fixierung von Embryonen. Sie dringt viel zu langsam ein, selbst wenn man die Fixierung durch Brüttemperatur zu beschleunigen sucht; infolgedessen sind die inneren Teile fast stets in Fäulnis, ehe sie mit der Lösung in Be- rührung kommen. Die genügende Durchtränkung von Hirn und Rückenmark hängt selbstverständlich von der Masse dieser Gebilde ab; die Zeitdauer schwankt daher zwischen 8 Tagen und 2—3 Monaten; bei mensch- lichen Gehirnen vergeht oft mehr als ein Jahr. Nach dieser Zeit sind die Objekte ohne weiteres schnittfähig. Man kann aber noch nachhärten in Alkohol. Hans Virchow hat dafür empfohlen, die Präparate aus MÜJ.LER'scher Lösung nicht in Wasser auszuwaschen, sondern direkt in Alkohol von circa 96 % zu übertragen und im Dunkeln aufzubewahren. Der Alkohol mufs häufig gewechselt werden. Das Aufbewahren im Dunkeln findet statt, damit sich keine Niederschläge im Alkohol bilden, wie das unter dem Einflufs des Lichtes stets der Fall ist. 9) ERLICKl'sche Flüssigkeit. Zur Erhäi-tung des Zentralnerven- systems empfiehlt Eklicki folgende Mischung: 2,5 gr. Kali bichromi- cum und 0,5 gr. Cuprum sulfuricum werden in 100 ccm. destil- lierten Wassers gelöst. Hierin erhärtet sich Zentralnervensystem, wenn man es in den Brutofen bei 37 " C. bringt, innerhalb 8 — 10 Tagen. Die Mischung ist nicht zu empfohlen, da sie Sclirumpfungen in den Zellen hervorruft. 10) Salpetersäure — Kali iMeliromieuiii, von Bionda cmpfolden. Die frischen Objekte kommen in eine Lösung der offizinellen Salpeter- Kaji. IT. Hie Methode!» Salzsäure wird so viel 1 *7o Ohlorpalladiumlösung hinzu- gefügt, dafs 100 ccm. des Gemisches 0,001 *Vo Chlorpalladium enthalten. Stöhr rät an, in 1000 ccm. Aqua destillata 1 ccm. Chlorpalladium und 10 ccm. reiner Salzsäure zu lösen. Nachdem die Entkalkung vollendet, was durch vorsichtiges Einstechen mit einer Nadel fest- gestellt wird, wird sorgfältig ausgewaschen und langsam nachgehärtet. Die Entkalkung, der jedesmal die Fixierung und Erhärtung vor- auszugehen hat, ist eine eingreifende Prozedur schon darum, weil das Kap. ni. Dir Mctliodcii der Einbettung. 21 vorher in Alkohol bcfindliclio Objekt für längere Zeit in eine wäss- rigo Lösung übertragen werden mufs. Es ist daher gut, den Prozefs möglichst zu beschleunigen, damit das Pr;ii)arat wieder in Alkohol übergelührt werden kann; man mufs also schnell enthilh-en. 39) ORENACHEKS Eiittarbuiipllüssigkeit. Um das intensiv dunkh^ Pi}i daher Gehirn und liückenmark, ohne sie weiter einzubetten, in vollständige Sehnittreihen zerlegen, man muß es tliun, wenn man Schnitte von ihnen in Karmin färben will. Um derartige Or- gane bequem und rasch für mikroskopische Zwecke zu zerlegen, bringt man sie in das noch zu erwähnende GuDDiON'sche Mikrotom, in dessen Cylinder sie mittels folgender, von Gudden angegebener Masse be- festigt werden. 4) GUDDEN'sclie Masse. 12 Teile Stearin, 12 Teile Schweinefett und 1 Teil Wachs werden zusammen geschmolzen und heifs in den Cylinder des Mikrotoms von GuDDEN gegossen. In die heifse Masse kommt das direkt aus MÜLLEli'scher Lösung oder Kali bichromicum entnommene Präparat. Damit die Masse besser an dem Gehirn oder Rückenmark anhaftet, ist es nach dem Vorschlage von FoßEE wohl- getan, das Objekt vorher eine Zeitlang in warmem Wasser zu er- wärmen. Je nach dem Präparat ist sowohl die Temperatur der Masse wie die Wassererwärmung eine verschiedene; man kann den richtigen Grad nur durch Übung kennen lernen. Nach dem Erstarren retra- hiert sich aber die Masse meistens von dem Metallcylinder, so dafs das Präparat bei der Messerführung wackelt. Zur Verhütung dieses Übelstandes kann man, wie FOREL angiebt, zwischen den Metall- cylinder und das Präparat kleine Holzsplitter einkeilen. Auf die Dauer schaffen diese aber auch keine Hilfe, da sie bald locker werden. Besser ist es, nach Anraten desselben Autors, das Präparat mit der es fest umgebenden Einbettungsmasse aus dem Mikrotomcylinder herauszuziehen und in den letzteren entweder von neuem heifse Masse zu giefsen oder seine Wandung mit einer Mischung von Terpentin und Wachs (heifs hergestellt) zu bestreichen. Dann wird die Peripherie des Präparates rasch erwärmt und das Ganze schnell und sorgfältig in den Cylinder eingeschoben. Indessen ist diese Methode der Einbettung . die eigentlich nur eine Umschmelzung ist, nur für Gehirn und Rückenmark geeignet; für alle anderen Objekte, die, wie ich in Kap. II Nr. 8 pag. 12 aus- einandergesetzt habe, nie in MÜLEER'scher Flüssigkeit oder in einer anderen Kali bichromicum-Lösung fixiert werden sollten, ist sie meines Erachtens nicht verwertbar. Für andere Objekte müssen wir Methoden wählen, welche dieselben so hart machen, dafs die Anfertigung feinster Schnitte möglich ist. Solche Methoden sind die Einschmelzung in Paraffin und das Durchtränken mit Cello'idin. 5) Paraffineinsclimelzung'. So ohne weiteres sind die dem 90 7o Alkohol entnommenen Präparate nicht zur Einschmelzung geeignet. Alan mufs vielmehr dieselben erst völlig wasserfrei machen und dann mit einer Flüssigkeit durchtriinken. welclie sich mit Paraffin mischt. 24 !• Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung. Man bringt dalier aus dem 90"/,, die Präparate auf 24 — 48 Stunden in 96 7o und dann auf 24— 48 Stunden in absoluten Alkohol, den man sich selber in der Kap. II Nr. 1 pag. 10 beschriebenen Weise her- gestellt hat. Die Angabe der Zeitbestimmungen hat selbstverständlich nur einen relativen AVert, oft mufs man die Entwässerung viel länger dauern lassen. Man darf eben, wie schon einmal bemerkt, keinen Zeit- mangel haben und nichts überhasten. Viel schonender und dabei absolut sicher in ihrem Endeffekt kann man die Entwässerung in dem von F. E. ScilULZE angegebenen Ent- wässerungsapparat, dem sogenannten Dialysafor vornehmen. Dieser Apparat besteht aus einer Flasche mit weitem Halse und zwei inein- ander und in den Hals der Flasche zu steckenden trichterartigen Einsätzen. Auf den Boden der Flasche kommt geglühtes schwefelsaures Kupferoxyd, gefüllt wird sie mit 96"/,, Alkohol, dem das Kupfer jede Spur von Wasser entzieht, ihn also absolut macht. In den Hals der Flasche kommt der weitere der beiden trichterförmigen Einsätze, dessen eine dem Alkohol absolutus zugewandte Öffnung mit einem Blättchen dünnsten Papieres, sogenannten „NaglersPostverdrufs" verklebt ist. Dies Verkleben geschieht mit Eiweifslösung. In diesen Einsatz kommt der zweite engere, der in der gleichen Weise verschlossen ist. In den ersten Einsatz kommt etwa 90 7oj in den zweiten 70 "/o oder 80 "/„ Alkohol und in den letzteren auch das zu entwässernde Objekt. Zugedeckt wird mit einer Glasj)latte. Nun beginnen durch das Papier hindurch die Diffu- sionsströmungen in den Alkoholen der verschiedenen Grade, deren Re- sultat nach 24 Stunden das ist, dafs in allen drei ineinander steckenden Gefäfsen sich absoluter Alkohol befindet. Die Verwässerung nämlich, die durch die Diffusion der absolute Alkohol des Hauptgefäfses er- leidet, wird durch das geglühte Kupfersulfat, das Wasser begierig aufnimmt, sofort wieder paralysiert. Den Alkohol kann man dann durch Teri^entinöl , Xylol oder Chloroform ersetzen. Es geschieht dies bei Anwendung der ersteren beiden so, dafs man das Präparat, das gut entwässert sein mufs, in die Durchtränkungsflüssigkeit bringt und so lange darin läfst, bis es durchsichtig geworden ist, was 10 Stunden und mehr beansprucht. Anders verfährt man bei Gebrauch von Chloroform. Mittels einer Pipette bringt man vorsichtig auf den Boden des das im abso- luten Alkohol liegende Präparat enthaltenden Gefäfses Chloroform. Da dasselbe schwerer ist als der absolute Alkohol, so sinkt es zu Boden und Präparat und Alkohol werden dadurch in die Höhe ge- hoben, derart, dafs das Präparat an der deutlich sichtbaren Grenze beider Flüssigkeiten schwimmt. (Natürlich mufs man vom Chloro- form ein solches Quantum nehmen, dafs das Präparat, wenn es in dasselbe hineingesunken ist, vollständig davon bedeckt ist.) Jetzt beginnen innerhalb des Präparates immer an der Stelle, welche auf der schwereren Flüssigkeit aufruht, Diffusionsströmungen, wodurch der Alkohol zum Teil verdrängt wird und an seine Stelle Chloroform tritt. Infolge dieses Ersatzes des einen Reagens durch das andere sinkt das Präparat zu Boden. Die Zeit, die zur Vollendung dieses Prozesses notwendig ist, ist eine ganz unbestimmbare. Sie hängt ab von der Dichtigkeit des Präparates und von der Temperatur des Tages. Die erste Bedingung aber, dafs ein Gelingen eintritt, ist die völlige Entwässerung; man geize daher nicht zu sehr mit dem absoluten Alkohol. Man nennt diese Methode, die für andere Zwecke von Kii|i. ili. Die Mctlioden der Einbettung. 25 F. E. Scilii,/,!'; an,ccegel)en wiirrle und die ich in Neapel zuerst kennen lernte, die SiH/inu'fliO(h'. Ist das Prä])arat auf" den Boden des Glases herabj;esunken, so giefst man vorsiclitij]; beide Flüssigkeiten ab und bringt es in ein grofses Quantum reinen Chloroforms. In diesem müssen die Objekte noch längere Zeit verweilen, damit sich das ganze Gewebe mit Chloroform durchtränkt. Das dauert mindestens 24 Stunden, oft aber mehrere Tage, namentlicli wenn es sich um Gebilde handelt, die entkalkten Knoclien oder Knorpel enthalten oder die eine epidermoidale Decke l)esitzen. Gelit man hierbei zu schnell vor, so mifsglückt die Prozedur völlig, und man darf dieselbe nicht etwa durch Erwärmung im Brütofen beschleunigen, da sonst die Präparate im Paraffin bis zur Unkenntlichkeit schrumpfen. Der lange Aufent- halt in Chloroform schadet nichts , wenn vorher nur gut fixiert und genügend entwässert wurde. Auf diese Weise wird der Alkohol viel schonender verdrängt, als wenn man die Präparate direkt in Terpentin oderXylol ])ringt; die heftigsten Zerrungen und Sclirumpfungen können durch die plötzlich eingetretenen und energisch wirkenden Diffusions- strömungen in letzteren Fällen hervorgerufen werden. Die Frage, welche der drei Flüssigkeiten, ob Terpentinöl, Xylol oder Chloroform vorzuziehen ist, ist daher nach meinen Erfahrungen dahin zu beantworten, dafs das Chloroform die anderen beiden, was die Schonung der Gewebteile anlangt, bedeutend übertrifft; in folge- dessen ist die Langsamkeit, mit der das Chloroform wirkt, ganz nebensächlich. Nun kommt noch eins hinzu. Das in den Präparaten enthaltene Terpentin oder Xylol, wenn man eine dieser Flüssigkeiten angewandt hat, verdirbt, wenn das Präparat in das geschmolzene Paraffin kommt, wovon gleich die Rede sein soll , das Paraffin in der Weise, dafs der Schmelzpunkt desselben dadurch allmählich heruntergesetzt wird. Hatte man im Anfange eine Paraffinsorte von hohem Schmelzpunkt, also hartes Paraffin, so wird dasselbe, wenn man es häufig bei Prä- paraten verwendet, die mit Terpentin oder Xylol durchtränkt waren, allmählich schmierig und die Schnitte kleben infolgedessen am Messer. Dies ist aber niemals der Fall bei Chloroform, dies Reagens greift Paraffin in der beregten Richtung nicht an. Aufserdem habe ich die Er- fahrung gemacht, dafs bei Terpentin- oder Xyloldurchtränkung die Präparate brüchig werden, während ein solcher Übelstand bei Chloro- formdurchtränkung sich nicht zeigt. In reinem Chloroform sinken die Objekte nicht immer unter und werden nicht durchsichtig. In Terpentin oder Xylol bleibt das Material mindestens 10 Stun- den, manchmal auch länger, in reinem Chloroform, wie bereits be- merkt, mindestens 24 Stunden bis zu 3 oder 4 Tagen. Dann bringt man die Präparate in eine Mischung von einer der Flüssigkeiten mit Paraffin, die man so herstellt, dafs man von dem Paraffin, welches zur definitiven Einschmelzung bestimmt ist, sich so viel in eine der Flüssigkeiten schabt, dafs eine dicke Lösung entsteht. In Chloroform löst sich Paraffin nur in der Wärme, in der Kälte ist in dem Boden- teil des Gefäfses das Chloroform, darüber das Paraffin. In ein Ge- fäfs mit einer solchen Mischung werden die Präparate mit einem Hörn- oder Metallspatel auf den Boden gebracht und Ijleiben darin über Nacht, nicht zugedeckt. Den anderen Tag setzt man das die Präparate enthaltende Gefäfs und das Gefäfs, in welchem das reine 26 I- Abschnitt. Die Metiiodcn der Unterauchuii^. Paraffin sich befindet, das erstere offen, das letztere bedeckt in einen sogenannten Wärmeschrank oder auf das Wasserbad, welches von P. Mayer in Neapel angegeben wurde und durch JuNG in Heidel- berg zu beziehen ist. Man stellt die Gasflamme so niedrig ein, dafs das reine Paraffin etwa 4 — 5 Stunden Zeit zum Schmelzen braucht. Während dessen ist Terpentin, Xylol oder Chloroform völlig oder fast völlig verdunstet, so dafs man im ersteren Gefäfse fast reines Paraffin hat. Jetzt bringt man die Präparate mit einem Hornspatel oder mit einer erwärmten Pinzette aus dem ersten in das zweite, das reine Paraffin enthaltende Gefäfs und läfst sie darin, je nach ihrer Konsistenz, 1 — 3 Stunden, zarte kürzere, massige längere Zeit. Sind die Präparate mit dem reinen Paraffin vciUig durchzogen, dann mufs man sie noch einschmelzen. Man benutzt dazu entweder Metallwinkel, sogenannte Paraffinrähmchen, wie sie JuNG in Heidelberg nach den Angaben der Neapler Station liefert, oder Glaswinkel, wie sie F. E. Schulze angegeben hat, oder endlich man verfertigt sich ein Papierkästchen. Die Metallwinkel setzt man auf eine Platte von Spiegelglas, die Glaswinkel auf eine dünne Platte von Metall. Platte und Winkel, welch' letztere gut schliefsen müssen, und die man in einer der Gröfse des einzubettenden Objektes adäquaten Weise anein- ander verschiebt, d. h. der von den Winkeln begrenzte Raum mufs gröfser sein als das Objekt, befeuchtet man mit etwas Glycerin. Ein Papierkästchen stellt man sich in folgender Weise dar. Man schnei- det sich ein rechteckiges Stückchen nicht zu weichen, aber auch nicht zu harten Papiers, weil es in letzterem Falle beim Kniffen brechen würde, in Gestalt eines Rechtecks ab und knifft zuerst die beiden Langseiten etwa 1 cm, dann, nachdem man jene aufgeklappt, die bei- den Kurzseiten etwa 2 cm. ein, so dafs ein rechteckiges centrales Feld übrig bleibt, das an Gröfse das Präparat ungefähr um das Doppelte übertrifft. Dann legt man die eine Langseite in ihrem Kniff um und biegt die Ecken nach hinten so zurück, dafs die Kniffe der Lang- seite die Kniffe der Kurzseite decken. Ebenso verfährt man mit der anderen Langseite. Nun richtet man die eine Kurzseite in ihrem Kniff hoch, biegt erst auf der einen, dann auf der anderen Seite das zwischen ihr und der Langseite sich zeigende Papierohr nach aufsen um, schlägt den überstehenden Teil der Kurzseite zurück, damit die beiden Ohren festgehalten werden, und verfährt in gleicher Weise mit der anderen Kurzseite. Diese Beschreibung läfst die kleine Manipulation etwas schwieriger erscheinen, als sie in der Tat ist; hat man aber etwa zwei bis drei Versuche in der angegebenen Weise angestellt, so wird man sich mit Leichtigkeit Papierkästchen von grofser Regelmäfsigkeit und beliebigem Eaumgehalte anfertigen können. Ich ziehe die Kästchen den Winkeln vor, weil sie erstens billiger als diese , und dann , weil sie absolut dicht sind , was bei den Winkeln nicht immer der Fall ist. Die Kästchen stellt man auf eine dünne Metallplatte, auf der sich etwas geschmolzenes Paraffin befindet. Mit dem Paraffin durchtränkt sich der Boden des Kästchens, und dieses haftet dann beim Erkalten fest an der Metallplatte. In ein solches Kästchen oder in den von den Winkeln begrenzten Raum giefst man nunmehr das geschmolzene reine Paraffin (Kästchen, Winkel und Platten müssen daher die Temperatur des Paraffins haben) und bringt mit einem erwärmten Metallspntel das Priiparat hinein. Dieses wird mit heifs gemacliten Nadeln orientirt, d. h. so Kiip. 111. Die MfUioikMi der Eiiihcttitiifjr. 27 geordnet, dafs es die für die gewiinsclite Scluiittrichtiing angemessene Lagerung hat. Die üricntiening ist gleicligiltig, wenn es sich um ein in allen seinen Teilen gleicluniirsiges Organ , z. B. ein Stück Leher handelt, wichtig aher ganz insbesondere für emhryologische Präparate. Die Orientierung mufs daher sorgfältig und schnell ge- schehen, damit das Paraffin sich nicht ahkühlt. Hat man orientiert, so hebt man die Platte mit den Winkeln oder dem Kä,stchen vor- sichtig, um die Lagerung des Präparates nicht zu verändern, in die Höhe (bei dem Neai)ler Wasserbad ist dies in sehr sinnreicher und einfacher Weise vermieden) und bringt sie in eine Schüssel mit kaltem Wasser. Hier wird sie so weit eingetaucht, dafs Kästchen bezw. die Winkel bis zu ihrer halben Höhe im Wasser stehen. Man mufs nun so lange warten, bis sich auf der ganzen Oberfläche des geschmolze- neu Paraffins eine gleichmäfsige dünne Haut gebildet hat. Dann taucht man vorsichtig tiefer, bis das Wasser an einer Ecke langsam in den Raum des Kästchens oder der Winkel hineingelaufen ist. Dadurch wird die Oberfläche hart. Nun wirft man das Ganze in das kalte Wasser. Nach 10 Minuten ist die Masse so weit erstarrt, dafs man das Papierkästchen, und nur bei diesem ist die folgende Manipulation notwendig, herausnehmen und entfernen kann; den Paraffinblock legt man wieder ins Wasser zurück und beschwert ihn, damit er nicht schwimmt, mit der Platte. Es ist das darum erforderlich, weil nach zu langem Verweilen im Wasser das Papier sich nicht mehr glatt vom Paraffinblock abziehen läfst. Im allge- meinen kann man sagen, dafs zum vollständigen Hartwerden des Paraffins etwa Yj — '^U Stunde erforderlich ist; ein äufseres Kenn- zeichen dafür wird dadurch gegeben, dafs sich die Winkel leicht vom Paraffinblock und dieser leicht von der Platte lösen. Die schnelle, in den vorstehenden Zeilen geschilderte Abkühlung des Paraffins ist notwendig, weil bei langsamer Abkühlung desselben Luftblasen in ihm entstehen und es infolge davon beim Schnitt krümelt. Welche Sorte von Paraffin soll man nun wählen ? Vielfach findet man in den Lehrbüchern der Histiologie und in Handbüchern, welche der Technik gewidmet sind, die Angabe, man solle ein hartes Paraffin nehmen und dasselbe durch Zusatz von sogenanntem üüssigen Paraffinöl, von fadenziehendem Paraffin (schmilzt bei circa 40 '* C.) oder von Vaselin in seinem Schmelzpunkte so herabdrücken, dafs dieser 50" C. nicht übersteigt. Ich kann diese Angabe nicht gut begreifen. Pa- raffin von einem derartigen Schmelzpunkte schneidet sich sehr schlecht, weil es zu fett ist; die Schnitte kleben am Messer fest, reifsen infolge- dessen häufig ein und sind dann natürlich wertlos. Will man gar eine gröfsere Schnittserie anfertigen, so können diese Eigenschaften des Paraffins Einen geradezu zur Verzweiflung bringen, weil durch sie die mechanische und ermüdende Arbeit des Schneidens ungemein verlangsamt wird. Man soll von einem solchen Paraffin auch feine Schnitte herstellen können. Da fragt es sich zunächst, was versteht man unter einem feinen Schnitt? In der Histiologie ist die Mafsein- heit (his Mil'ronillliincter. ExGELilANN hat vor vielen Jahren den seit- dem allgemein acceptierten Vorschlag gemacht, 0,001 mm. als Mikro- millimeter oder 1 /< zu bezeichnen. Nun kann man von Paraffin mit 50" C. Schmelzpunkt wohl Schnitte von 10 ,// gleich 0,01 mm. an- fertigen, will man aber dünner schneiden, so gelingt das nur ausnahms- 28 I- Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung. weise. Es ist gar nicht zu leugnen, dafs Schnitte von 10 u Dicke für manche Zwecke genügen, so z. B. dann, wenn man morphologische Tendenzen verfolgt , die gegenseitige Lagerung und den Zusammen- liang verschiedener Organe untereinander studieren will an Ohjekten, wo eine makroskopische Präparation nicht möglich ist. Bei solchen Absichten könnten dünnere Schnitte unter Umständen schädlich sein, da durch sie der gesuchte und eventuell vorhandene Zusammenhang getrennt würde. Man würde sich also durch zu dünne Schnitte die geistige Rekonstruktion der morphologischen Verliältnisse sehr er- schweren. Da aber, wo es sich um feinste histiologische Details handelt, wo der innere Aufbau eines Organs genauer erkannt werden soll, wo Plasmastrukturen. Kernfiguren, Übergänge feinster Nervenfasern in Sinneszellen etc. zu eruieren sind, da reichen Schnitte von 10 /i meines Erachtens nicht mehr aus. Und zwar darum, weil man in der weitaus überwiegenden Mehrzahl der Fälle in solchen Schnitten nicht eine, sondern mehrere Zellenlagen erhält. Das aber ist die ideale Forde- rung, die der Histiolog.e an ein mikroskopisches Präparat zu stellen hat. dafs er nur eine Zellschicht, nicht weniger, aber auch nicht mehr, in demselben zu überblicken hat. Wer beispielsweise Plasma- strukturen erforschen, wer die zarten, einander durchflechtenden Stränge der Zellsubstanz in ihren Einzelheiten verfolgen will, wird sich vor einem unlösbaren Eätsel befinden, hat er im Präparate eine mehrfache Zelllage vor sich. Denn nun ist es schlechterdings unmöglich, zu entscheiden , welcher Zelllage die einzelnen Stränge angehören , ob man es mit einem wirklichen Netz zu tun hat oder ob die Zeich- nung eines solchen nur dadurch vorgetäuscht wird, dafs die Stränge der tiefer liegenden Zellen in einer anderen Richtung verlaufen, als die der höher liegenden. Wie gesagt, für solche Zwecke ist Paraffin mit einem bei .50 " C. liegenden Schmelzpunkt , weil es zu weich ist, und Schnitte von 10 ii. weil sie zu dick sind, niclit zu verwenden. Ich benutze ausschliefslich, wie ich dies in der Neapler Station zuerst ge- lernt, Paraffin von 56 — 58" C. Sclnnehpunlf. Damit lassen sich Schnitte von 5 // Dicke, also ^.>,j„ mm, sehr leicht anfertigen, die allein für histiologische Zwecke Wert haben. Dickere Schnitte mache ich für meine Untersuchungen eigentlich nie, es sei denn, dafs die Textur des betreffenden Organes eine solche ist, dafs man keinen 5 // Schnitt zu Stande bringt. Dann aber ist das höchste zulässige Dickenmafs 7.5 /( : solche Schnitte kann man von jedem Organ erhalten. Ja unter Umständen ist auch 5 n noch zu dick , man mufs unter dieses Mafs noch heruntergehen bis zu 3 n. Hat man nur ein scharfes Messer, so lassen sich derartige dünne Schnitte ganz gut herstellen, wie ich dies zu wiederholten Malen zu probieren Gelegenheit hatte. Von dem härteren Paraffin kann man also sehr feine Schnitte und natürlich auch dickere anfertigen; es ist daher dem weicheren in jeder Be- ziehung überlegen. Dem Einwände möchte ich noch begegnen, als ob der hohe Schmelz- punkt des Paraffins, also die hohe Temperatur, in die das Präparat hineinkommt, dem letzteren schädlich sein könnte. Dieser Einwand ist ganz und gar hinfällig. Ein gut fixiertes und gut und vorsichtig gehärtetes Präparat inuCs eine Temperatur von 56 ^^—58 " C. aushalten können und hält sie auch aus. Schrumjift es dennoch in dem heifsen Paraffin zusammen, so war es eben nicht sut vorbereitet. Iiattf namont- Kaj). TU. Die Mothodon der Einbettunpr. 29 lieh nit'lit laiifTC ffomij^ in absoliitcia Alkohol und nachträglich in Chloroform gelegen. Will sich der Anfänger in selbständigen mikroskopischen Ar- beiten vor Mifserfolgen und Irrtümern schützen, so wähle er nicht ein Paraffin von niedrigem, sondern ein solches von hohem Schmelzpunkt. Ein grofsor Vorteil der Paraffiumethode ist darin zu sehen, dafs trocken geschnitten wird, dafs die Arbeit also eine durchaus saubere ist. In welcher Weise man Paraffin schneidet, soll im nächsten Kapitel erörtert werden. 6) Cclloidinciiibcttiiiig:. Dieselbe ist in neuester Zeit von ScillEFFKK'DECKKK empfohlen worden und hat sich bald sehr viel Freunde erworben. jMan verfälirt dabei folgendermafsen : Das käufliche Celloidin ist meistens nicht völlig lufttrocken, infolge dessen undurchsichtig, von weifslicher Farbe. Man zerschneidet daher dasselbe in ganz kleine Partikel und läfst dieselben, vor Staub geschützt, so lange liegen, bis sie lufttrocken sind. Die vollständige Lufttrocknung erkennt man daran, dafs die Celloidinstückchen ganz hart sind, ein bräunliches Aussehen haben und durchsichtig erscheinen. Nun bringt man in ein mit einem guten Kork versehenes Glasgefäfs (eingeschlijffene Glas- stöpsel sind unter allen Umständen zu vermeiden, da sie nie genau schliefsen und da sie durch das gelöste Celloidin so fest angeheftet werden, dafs man sie nicht mehr entfernen kann) eine Mischung aus absolutem Alkohol und Äther zu gleichen Teilen und gibt so viel Celloidin hinzu, dafs daraus eine Lösung von Honigkonsistenz wird. Dazu sind oft Wochen erforderlich. Die Lösung mufs klar und durch- sichtig sein. Ist das nicht der Fall, so war entweder das Celloidin nicht lufttrocken oder der Alkohol nicht absolut. In solchem Falle schüttet man am besten die Lösung in eine offene Schale und wartet, bis Alkohol und Äther verdunstet sind und das Celloidin wieder luft- trocken ist; denn trübe Lösungen sind von Nachteil, weil sie die Orientierung des Präparates erschweren. Die oben erwähnte Celloidin- lösung von Honigkonsistenz benutzt man als Stammflüssigkeit, aus der man sich durch Verdünnung, die wiederum mittels eines Ge- misches aus Alkohol absolutus und Äther zu gleichen Teilen her- gestellt wird, zwei weitere Lösungen anfertigt, von denen die eine etwa Glycerinkonsistenz hat, die andere noch dünner ist. Das Präparat, das celloidiniert werden soll, wird zunächst in abso- lutem Alkohol entwässert und kommt dann, um etwaige letzte Spuren von Wasser noch auszutreiben, auf circa 24 Stunden in Schwefeläther. Man mufs für jedes Objekt sich selber ausprobieren, wie lange der Aufenthalt in Äther zu dauern hat; zu lange Ein- wirkung desselben macht das Präparat leicht brüchig. Aus dem Äther kommt das Präparat auf etwa 8 Tage zunächst in die dünnste Celloidinlösung, dann auf ebenso lange Zeit in die mittlere und schliefs- lich auf 4—5 Tage etwa in die dickflüssige Lösung. Nun bereitet man sich einen guten Kork, so dafs er in die Klammer des Mikrotoms pafst, bestreicht dessen eine Fläche mit dem Celloidin und bringt auf dieselbe das Präparat, das mit vielem dickflüssigen Celloidin über- gössen wird und das man mit den dabei allerdings sehr schmutzig werdenden Fingern so lange festhalten mufs , bis das Celloidin eine leichte Kruste zeigt. Dann wirft man Kork und Präparat in ein Gefäfs mit 80 "/„ Alkohol ; das Präparat natürlich nach unten. Em- pfehlenswert ist es, das Alkoholgefäfs so zu wählen, dafs sein Lumen 30 I- Abschnitt. Die Methoden der Untersucliunj^. nur wenig gröfser ist, als der Durchmesser des Präparates oder des Korkes; letzterer schwebt dann senkrecht in der Flüssigkeit. Man tut ferner gut, recht viel Alkohol /u nehmen, weil dann die Er- härtung des Celloidin schneller vor sich geht. Bis dieselbe vollendet ist, mufs der Alkohol täglich gewechselt werden; die eingetretene Erhärtung erkennt man daran, dafs das Celloidin sich auf Druck des Fingernagels nicht mehr einbiegt. Nachher kann man in 70 "/^, Alkohol aufheben. An Stelle des direkten Auftragens des Präparates kann man auch so verfahren, dafs man dickflüssiges Celloidin in ein wie beim Paraffin angegeben verfertigtes Papierkästchen giefst und dann das Präparat zugiebt, das selbstverständlich vollständig von Celloidin bedeckt sein mufs. Man wartet, bis sich eine zarte Haut gebildet hat, und legt dann das Kästchen in 80 "/o Alkohol ein. Ist das Celloidin hart geworden, dann schneidet man sich dasselbe, nach Ablösung des Papieres, dem Präparat entsprechend zurecht und klebt den so her- gestellten Celloidinblock auf Kork mit Celloidin auf und härtet nochmals. Absoluter Alkohol oder Alkohol von stärkerem Grade als 80 7o darf vor dem Schneiden nicht mit dem Celloidin in Berührung kommen, weil dieses sonst schmierig wird. Bei sehr kleinen Objekten kann man dünne Schnitte anfertigen; im allgemeinen aber ist diese Methode für histiologische Zwecke darum nicht recht geeignet, weil bei gröfseren Präparaten die Schnitte zu dick werden. Ein fernerer Nachteil ist der, dafs Celloidin fast alle Farbstoffe aufnimmt und dafs man dieselben, namentlich wenn es Plasma färbende Stoffe sind, nicht mehr entfernen kann, ohne das ganze Objekt zu zerstören. Eine Ausnahme machen nur,die WElGERx'sche Hämatoxylinfärbung und deren Modifikationen (siehe Kap. V). Man mufs daher die Objekte durchgefärbt haben, ehe man sie in Celloidin bringt, was wieder aus später zu erörternden Gründen nicht immer zweckmäfsig ist. In dieser Hinsicht steht die Celloidineinbettung der Paraffineinschmelzung nach. Ein grofser Vorteil der Methode aber besteht darin, dafs es relativ leicht ist, voluminöse Organe, wie z. B. ein Säugetiergehirn, in kurzer Zeit zu durchtränken, und ferner, dafs alle Teile eines Organes oder Organkomplexes in ihrer gegenseitigen Lagerung erhalten werden. Geschnitten werden Celloidinpräparate unter 80 '-/„ Alkohol, der in so reichlicher Menge auf das Mikrotommesser aufgetropft werden mufs, dafs die Schnitte schwimmen, und mit dem ferner das Präparat stets sehr feucht zu erhalten ist, weil sonst das Celloidin eintrocknet. Aufgehellt wird in Bergamottöl; Nelkenöl löst das Celloidin. Es finden sich in den Lehrbüchern aufser den hier erwähnten Methoden noch eine ganze Anzahl anderer Einbettungsmedien an- gegeben. Ich verzichte darauf, dieselben anzuführen; die Paraffin- und Celloidin-Technik haben alle anderen Verfahren in den Hinter- grund gedrängt. So auch die FLEMMiNG'sche Einbettung in Trans- parentseife, die der Urheber derselben, wie er mir mitzuteilen die Güte hatte, schon seit Jahren nicht mehr verwendet. Nur vor einer Methode, die auch jetzt noch vielfach benutzt wird und deren ich mich vor Jahren selber bediente, möchte ich warnen: das ist die Methode des Einlegens in Gummilösung oder in Gummiglycerin. Die dabei notwendigen Manipulationen , namentlich die Wiederauflösung des Gummi, sind für zarte Gebilde geradezu verderblich, weil Zerrungen und Zerreifsungen der verschiedensten Art dabei unvermeidlich sind. Kap. IV. Schneiden und Aufkleben. 31 Kap. IV. Schneiden und Aufkleben. Wir haben gesehen, dals das Schneiden der Objekte mit freier Hand beim Einklemmen in Leber oder Hollnndermark, wobei die andere Hand als Objekthalter t'ungiert, nur selten zu befriedigenden Resultaten führt. Nach Paraffin- und Celloidin-Einbettung ist ein solches Verfahren überhaupt unmöglich, weil man im ersteren Falle anderer Messer als der gewöhnlichen Kasiermesser bedarf und weil überliaupt diese Methode zu unsicher und zu zeitraubend ist. Man bedient sich daher zum Schneiden seit längerer Zeit beson- derer Instrumente, sogenannter Mikrotome. Den ersten Vorläufer der- selben stellt der seinerzeit von Hex.seX angegebene Querschnitter dar, der es erlaubte, unter dem Mikroskope das Objekt zu schneiden. Das Prinzip des Mikrotoms ist dann meines Wissens zuerst von His erfunden und seitdem mannigfach vervollkommnet worden, so dafs wir gegenwärtig über eine ganze Reihe verschiedener Modelle für den ge- dachten Zweck verfügen. Hier sollen nur drei Formen des Mikrotoms besprochen werden, die sich weitester Verbreitung erfreuen. Die erste Form ist das 1) (xUDDEN'sche Mikrotom. Dasselbe ist ein sogenanntes Cylin- der- oder Schraubenmikrotom. Es besteht aus einem festen Metall- cylinder, in welchem sich ein Stemi^el befindet, dessen höhere oder tiefere Stellung mittels einer Mikrometerschraube reguliert wird. Der Cylinder ist am Boden einer grofsen Wanne eingelassen. Geeignet ist das Instrument nur für Gehirn und Rückenmark, welche unter Wasser, das die Wanne des Instrumentes erfüllt, geschnitten werden und zu deren Befestigung die in Kap. III erwähnte Mischung ver- wendet wird. Als praktisch wichtig beim Gebrauche dieses Instru- mentes sind folgende Regeln zu beachten, die FOREL, ein Schüler GUDDENS, in einer Arbeit genauer angegeben, und deren Vernach- lässigung ein Mifslingeu der Präparate zur Folge hat. Die Ein- bettungsmasse dient nur als Stütze des Präjxirates im Cylinder, nicht aber der einzelnen Schnitte. Man mufs sie daher beim Beginn des Schneidens um das Präparat so weit abtragen, als es ohne Gefährdung des sicheren Haltes desselben möglich ist. An der zu schneidenden Stelle selber darf keine Masse haften, denn dieselbe würde das Messer verunreinigen, es fettig machen, würde die Sicherheit der Messer- führung beeinträchtigen und hinderte infolge dessen die Anfertigung einer lückenlosen Schnittserie. Will man das Schneiden unterbrechen, so läfst man das Wasser aus der Wanne ablaufen und übergiefst das sorgfältig abgetrocknete Präparat mit heifsgemachterGuDDEN'scher Masse. Die Schnitte schwimmen im Wasser, aus dem sie vorsichtig mittels einer befeuchteten Glasplatte oder mit einem breiten Spatel herausgenommen werden. 2) SCHANZE'selies Mikrotom. Während man mit dem Gudden'- schen Instrumente nur feucht schneiden kann, kann man mit dem SCHANZE'schen auch in Paraffin eingebettete Objekte zerlegen. Das Prinzip dieses Mikrotoms ist ein kombiniertes, es ist ein Schrauben- und Schienenmikrotom. An dem einen Ende dessell)en findet sich eine um zwei Achsen drehbare Vorrichtung, welche die Klammer für das Präparat trägt. Darunter ist eine mit einer grofsen graduierten 32 I- Abschnitt. Die Methoden der Untersuchuno;. Scheibe versehene Mikrometerschraube, durch deren Umdrehung, die man beliebig grofs machen kann, jene das Präparat tragende Vor- richtung in die Höhe gehoben wird. An einer breiten, die ganze Länge des Instrumentes einnehmenden Metallplatte, welche an einer Stelle einen Einschnitt für die Scheibe enthält, ist diese ganze Einrichtung befestigt. Auf der von derselben abgewendeten Seite der Platte, etwa in halber Höhe derselben, ist eine in einem nach oben offenen, spitzen Winkel gestellte Schiene angebracht, ebenfalls in der ganzen Länge des Instrumentes. Auf der Schiene, sich anlehnend an die Platte, befindet sich der Schlitten , welcher das Messer trägt. Indem man diesen langsam die Schiene entlang zieht, schneidet man den Teil des Präparates ab, der über das Niveau des Messers übersteht. Da- mit die Schlittenbewegung eine gleichmäfsige und sanfte ist, mufs die Schiene gut mit Knochenöl eingeölt sein. Der Nachteil des Instrumentes besteht in der Schraubeneinrich- tung, welche das Präparat bewegt; die Schraube schlottert leicht und hat vielfach sogenannte ,,todte''' Gänge. Zum Aufschmelzen der Paraftinblöcke bedient man sich am besten kleiner länglicher, in die Klammer passender und mit Paraffin durch- tränkter Holzklötzchen; mittels eines heifs gemachten Eisens wird das Präparat auf dem Klötzchen aufgeschmolzen. 3) JUNG'sclies Jlikrotom, von Tiioma zuerst angegeben. Wie beim ScnANZEs'chen wird das Messer auf einem Schlitten in einer Schienenbahn geschoben, abweichend von demselben wird aber auch der Präparatenträger auf einer Schiene mittels Mikrometerschraube vorwärts bewegt. Die allgemeine Ansicht geht wohl dahin, dafs dieses Mikrotom, namentlich in dem Neapler Modell, allen Anforderungen genügt, welche man an ein solches Instrument stellen kann. Die Be- wegung des Präparates, wie ich dies am eignen Instrumente erf)robt, ist eine absolut gleichmäfsige, ,,todte"' Gänge kommen an der vorzüg- lich gearbeiteten Mikrometerschraube nicht vor. Der Schlitten, welcher das Messer trägt, ist, im Gegensatze zum SciiAXZE'schen Instnimente, sehr schwer, so dafs er nicht durch den Widerstand des harten Pa- raffinblocks aus seiner Bahn gehoben werden kann. Aufserdem ist das Instrument mit allen Hilfsmitteln für das Schneiden (Metall- cylinder zum Aufschmelzen der Präparate, Schnittstrecker etc.) vollauf ausgestattet. Bedingung für eine gute Funktion des Mikrotoms nach SciiANZE oder Jung ist die Sauberkeit der Schlittenbahn des Messerträgers. Mau reinigt dieselbe vor dem jedesmaligen Gebrauche durch einen mit Benzin befeuchteten Lappen und ölt sie dann sehr reichlich mit Knochenöl ein. Der Schlitten mufs angestofsen mit Leichtigkeit die ganze Bahn durchgleiten. Um ferner einen guten Zustand der Messerschlittenbahn zu erhalten, soll man beim Schneiden den Schlitten stets die ganze Bahn entlang ziehen, damit die Abnutzung derselben überall eine gleichmäfsige ist. Die wichtigste Rolle beim Schneiden mittels des Mikrotoms spielt das Messer. Ist dasselbe nicht scharf genug oder schartig, so ruiniert man sich die Präparate oder bekommt keine guten Schnitte. Im letzteren Falle, wenn das Messer schartig ist, ist dasselbe an den Instrumenten- macher, aus dessen Fabrik das Mikrotom stammt, zur Reparatur zu- rückzusenden. Die sogenannten chirurgischen Instrumentenmacher ver- Kap. IV. Scliiieiilen und Aulkleljeii. 33 stehen zwar vSkalpellc, Schei-eu iiiid guwöhiiliclu! Kasiormosser /u schleit'en, Älikrotuuiinusser aber wcrdnu von ihnen meistens ruiniert. Ist das ÄFcsser hh)!"« stumpf, so ist es am besten, es selber /u sehleifen; gelingt diese Manipulation auch nicht sofort, so erspart mau sich doch •weniij;stens den Ärger, den Einem ein ruiniert .vom Instrumenten- maciier /uriickgcschicktes Instrument bereitet. Übrigens geiiört zur Erlernung der Kunst des Sclileifeiis nichts weiter als Geduld, mit der man schliefslicdi doch zum Ziele kommt. Zum Scharfmachen bei ganz stumpfem Messer benutzt mau einen Schleifstein, zum Abzielien einen sogenannten chinesischen Streicliriemen von ZiM.MEii in Berlin. Der bei dem letzteren vorhandene Stein ist niemals zu gebrauchen, weil er für Mikrotommesser zu rauh und daher gefährlich ist. Als Schleifstein dient ein sogenannter französischer oder Öl-Stein, der sehr lang und breit sein mul's; schmale und kurze Steine gewähren einen zu geringen Spielraum. Zur Befeuchtung des Steines empfiehlt Fol ein Gemisch aus 2 Teilen Glycerin und 1 Teil Alkohol. Viel besser hat sich mir für diesen Zweck das amerikanisclie Knochenöl bewährt, welches sich von dem in Deutschland verfertigten dadurch unterscheidet, dafs es ganz wasserklar ist und in der Kälte nicht flockig wird. Man führt nun das Messer so auf dem Stein, dafs man es flach auflegt und mit der Sclinekfe voran es langsam ohne jecjlichen Druck schräg vor- schiebt. Dann drelif man auf dem Bücken um und schiebt, ebenfalls mit der Schneide voran, langsam in entgegengesetzter schräger Rich- tung zurück. Diese Bewegung führt man etwa 30— 50 mal aus, wo- bei man darauf zu achten hat, dafs der Stein nicht trocken wird, sondern dafs stets eine hinreichende Quantität von Ol vorhanden ist, welche die Schneide des Messers vollständig bedecken mufs. Darnach reinigt man sorgfältig mit einem trocknen Leinwandlappen den Stein und das Messer. Jetzt wird dasselbe noch auf dem Streichriemen abgezogen, was überhaupt vor dem Gebrauche jedesmal zu geschehen hat. Man legt das Messer, genau wie auf den Stein, gleichmäfsig mit Rücken und Schneide auf und führt, zunächst auf dem roten Leder, dieses Mal aber den Bücken voran, dasselbe ohne jeden Druck schräg nach vorn, dreht auf dem Bücken um und zieht, wiederum den Rücken voran, in entgegengesetzter Richtung zurück. Auf dem roten Leder streicht man etwa 6— 8 mal, auf dem schwarzen 10 — 15 mal, auf dem weifsen 30 — 50 mal. Jetzt wischt man das Messer sorgfältig ab und prüft dessen Schärfe dadurch, dafs man ein Kopfhaar langsam über die Schneide führt. Ist das Messer gut geschhffen, so mufs es das Haar durchschneiden. Der Druck beim Abziehen auf dem Streichriemen wie beim Schleifen auf dem Schleifstein mufs darum vermieden werden, weil derselbe die Schneide abstumpft, statt sie zu schärfen. Will man nunmehr schneiden , so klemme man bei Celloidinpräparaten den Kork in die Präparatenklammer so fest ein, dafs keine Pendelung des Objektes möglich ist. Bei Paraffinpräparaten schneidet man sich den Block zurecht, zunächst als ein reguläres Oktaeder, dessen eine Fläche man entweder auf ein Holzklötzchen oder auf den mit Pa- raffin ausgegossenen Metallcylinder des JuNGs'chen Mikrotoms auf- schmilzt. Ist das geschehen, das Präparat also ganz fest, dann schneidet man sich die Seiten in beliebiger Weise zurecht, am besten derart, dafs die Oberfläche die Gestalt eines rechtwinkligen Dreiecks hat, und man richtet das Präparat so zum Messer, dafs letzteres 3 34 !• Abschnitt. Die ^[etlioden der riitersuclunifr. einer der Ktitlicteii parallel ist. Es ist stets notwciulig, eine 2 — 3 mm. breite Schiebt Paraffin um das Präparat herum stehen zu lassen,., da- mit die Schnitte glatter werden. Paraffinpräparatc haben den Übel- stand, dafs sie beim Schneiden sich rollen und dann nicht mehr aus- breiten lassen. Um dies zu vermeiden, hat man sogenannte Schnitt- strecker konstruiert, deren einfachster wohl der von P. Maykr in Neapel angegebene ist. Besitzt man keinen Schnittstrecker, so kann man sich in folgender Art behelfen. wie ich es früher tat: An einem etwa 2 cm. breiten Streifen Perganientpapier, dessen Länge beliebig gewählt werden kann, rundet man die Ecken der beiden schmalen Seiten sorgfältig ab. Kommt das Messer in das Paraffin, so hält man den Papierstreifen dicht über das Präparat und zieht das Messer durch. Man darf dabei die das Papier haltende Hand nicht bewegen, weil sonst der Schnitt beschädigt wird; auch mufs man sich hüten, mit der Hand das Messer zu drücken, weil man dadurch die Neigung des letzteren zum PräjDarate verändert und die Schnitte ungleichmäfsig ausfallen. Beobachtet man diese Kautelen, so bleibt der Schnitt unter dem Pajjierstreifen platt und kann nun mit einer feinen glatten Pinzette oder sonst einem geeigneten Instrumente ab- genommen werden. Noch einige Bemerkungen möchte ich über die Stellung, die man dem Messer beim Schneiden zu geben hat, hinzufügen. Die ratio- nellste Einstellung ist unstreitig die, wo das Messer ziemlich längs steht. Man nutzt dabei die ganze Schneide aus und durchtrennt am schonendsten das zu untersuchende Objekt. Je schräger man ein- stellt, desto mehr wird aus dem Schneiden ein Quetschen . und bei ganz querer Messerstellung wird das Objekt überhaupt nur noch durchquetscht. Bei grofsen voluminösen Objekten soll man daher stets längs einstellen. Es ist zwar manchmal langweilig, namentlich wenn man eine grofse Schnittserie anzufertigen hat, auf jeden einzel- nen Schnitt so viel Zeit anwenden zu müssen, wie zur langsamen Durchführung der Klinge und zum Abheben des Schnittes notwendig ist; indessen entschädigen die Resultate vollauf für die angewandte Mühe. Auch hat starke Schrägstellung oder gar Querstelluug des Messers den Nachteil, dafs sich feine Schnitte von 5 /< Dicke fälteln und dafs diese Fältelungen sich nicht entfernen lassen. Nur bei ganz kleinen Gegenständen kann man das Messer ohne Nachteil querstellen. Man schneidet zu dem Zwecke den Paraffin block so zu- recht, dafs die dem Messer zugekehrte und die abgekehrte Fläche einander parallel sind ; die anderen beiden Flächen sollen es auch sein, die Oberfläche mufs also ein Rechteck bilden. Jetzt bringt man mit einer erwärmten Messerklinge auf die ersten beiden Flächen, also auf die, welche dem Messer gegenüber stehen, eine ganz geringe Quantität sogenannten fadenziehenden Paraffins (schmilzt bei circa 40 ^ C). Drückt man das Messer nun langsam durch, so bleibt der Schnitt auch ohne Schnittstrecker glatt und jeder folgende klebt durch das weiche Paraffin am vorhergehenden fest, so dafs man ein langes Band aneinander gereihter Schnitte erhält. Diese „Baudwurm- methode'', wie man sie auch nennt, wurde meines Wissens zuerst von Spee angegeben. Was das Tempo anlangt, in welchem man den das Messer tragen- den Schlitten bewegt, so bin ich der Ansicht, dafs man ihn stets lang- sam führen soll, namentlich dann, wenn das Messer sehr längs gestellt Kap. TV. Sclineiden iiml Aui'kl(*l)on. 35 ist. Meinen l^^rfalirnn^fen luicli werden die Sclinitte , wenn m:in das Messer schnell durch (his Präi)arat zieht, ungleichniiirsig, während das bei langsar.iem Schneiden nicht der Fall ist. Die Schnitte sind nun gemacht und müssen, ])evor sie weiter be- handelt wc^rden und bevor die Präparation definitiv beendet ist, noch einigen Pi-o/eduren unterworfen werden. Die dünnen Paraffinschnitte kann man nicht so ohne weiteres der Einwirkung von Terpentin oder Xylol aussetzen, sie würden bei den Manipulationen zu leicht zer- reifsen, namentlicii wenn sie zu färben sind und so aus alkoholischen in wässrige Flüssigkeiten, dann wieder in alkoholische und endlich in ölige übergeführt werden müssen. Ganz abgesehen davon, dafs es ein fast aussichtsloses Beginnen wäre, dieselben, wenn sie feucht sind, in Reih und Glied zu erhalten. Man mufs die Schnitte jetzt aufkleben. a. üiEiSKRECHT-MAYER'sclieJIethodc. Diese Methode des Auf- klebens ist für durclKjefäyhte Präparate unstreitig die beste, weil ein- fachste und absolut sicher wirkende. Man macht sich eine konzen- trierte Lösung von Schellack, indem man in absoluten Alkohol so viel weifsen Schellack bringt, als sich darin lösen will. Durch den das Gefäfs verschliefsenden Kork steckt man einen feinen Glasstab. Vor dem Schneiden richtet man sich die Objektträger her, indem man die sorgfältig gereinigten über einer Spiritusflamme erwärmt, damit die an denselben haftende Feuchtigkeit entfernt wird. Täte man dies nicht, so würde der Alkohol der Schellacklösung die Feuchtigkeit begierig aufnehmen und sich trüben. Man nimmt jetzt den Glasstab mit dem Kork von der Schellackflasche ab, läfst ihn abtropfen und streicht den ganz glatt angelegten gleichmäfsig und schnell, damit der Alkohol nicht verdunstet, auf dem erwärmten Objektträger entlang. So breitet man eine dünne Schellackschiclit auf demselben aus, die infolge der schnellen Verdunstung des Alkohols bald trocken wird. Ist der Aufstrich mifsglückt, und das wird dem Anfänger bei den ersten Versuchen stets passieren, hat man zu viel Schellack genommen, oder nicht gleichmäfsig den Glasstab über den Objektträger hingeführt, oder endlich war der letztere nicht ganz trocken, so entfernt man den Schellacküberzug durch Aufspritzen von absolutem Alkohol. Der- artige Objektträger mit Schellacküberzug stellt man sich immer erst vor dem Gebrauche in der voraussichthch nötigen Zahl her. Die- jenigen, deren man nicht gleich benötigt, schützt man durch eine Glasglocke vor dem Einstauben. Nach der älteren GiESBRECHT'schen Methode verreibt man nun auf jedem Schellacküberzug in der gewünschten Ausdehnung mit dem Finger etwas Nelkenöl oder Kreosot, so dafs eine leichte Klebrigkeit der Oberfläche entsteht. Jetzt werden die Schnitte auf die Schellack- decke aufgelegt und mit einem feinen Metallschäufelchen oder noch besser und schonender mit einem feinen Hornspatel, dessen verdünntes eines Ende gegen die Fläche gebogen ist (durch das Institut von G. König sind solche Hornspatel erhältlich), leicht angedrückt. Ist der auszufüllende Raum mit Schnitten bedeckt, so bringt man den Objektträger in den Wärmeschrank oder auf das Neapler Wasserbad. Nach 10 Minuten ist das Öl verdunstet und das Paraffin gelöst, und die Schnitte können jetzt, ohne sich nur im geringsten zu verschieben, eingelegt werden in einer Weise, die in Kap. VI beschrieben werden snli. Die Löslichkeit des Schellacks in Alkohol erfordert, dafs, sollen 3* 36 I. Abschnitt. Die Methoden der iMifcisvichun^-. die aufgeklebten Sc'linitte nicht wegscliwinunen , Alkohol mit ihnen nicht mehr iu Berührung kommen darl". P. Maykk hat diese Methode iu der Art modifiziert, dafs das Bestreichen mit Nelkenöl überflüssig wird. Man legt jetzt die Schnitte ohne weiteres auf die Schellackdecke und drückt sie leicht an. Nach Beendigung der Schnittanordnung bringt man den Objektträger in ein Gefäfs, in das er gerade hineinpafst, auf dessen Boden sich eine ganz kleine Quantität von Äther befindet. Man senkt das Gefäfs so, dafs die Ätherdämpfe die Schnitte berühren, nimmt nach einigen Sekunden den Objektträger heraus und bringt ihn, wie vorher, in den Wärme- schrank oder auf das Wasserbad, Die weitere Behandlung deckt sich mit der für die erste Methode zu beschreibenden. b. Eiweifslösung. Diese unstreitig beste aller Aufklebemethoden für einzeln zu färbende Schnitte ist von P. Mayei: in Neapel, dem die moderne Technik so viel verdankt, zuerst angegeben worden. Man nimmt das AVeifse eines frisclien Hühnereies, mifst seine Quantität im Mafs- cylinder, schlägt es zu Schnee, vermischt es mit dem gleichen Volumen Glycerinum purissimum und filtriert. Zur Verhütung von Fäulnis kommen einige Stückchen Kampher in die Lösung. Will man Schnitte aufkleben, so bringt man mit einem . feinen Glasstabe ein ganz kleines Tröpfchen der Eiweifslösung auf das Deckglas (ich klebe stets auf dem Deckglase auf, weil die Nachbehandlung bequemer ist als beim Aufkleben auf den Objektträger) und verreibt es auf demselben so lange mit dem Finger, bis das Deckglas nicht mehr feucht, sondern nur noch klebrig ist. Dann legt man die Schnitte auf das Deckglas auf, drückt sie leicht an und bringt auf 10 — 15 Minuten das Ganze in den Wärmekasten oder auf das Wasserbad bei einer Temperatur von 56" C. Jetzt ist das Eiweifs geronnen und die Präparate kleben absolut fest. Ich bringe aus alter Gewohnheit das Deckglas nicht gleich warm in die das Paraffin lösende Flüssigkeit, sondern lasse erst abkühlen; doch dürfte das sofortige Einlegen des noch warmen Glases auch nicht schaden. Hat man das Eiweifs in der oben angegebenen Weise ver- rieben, dann tritt später keine oder nur minimale Mitfärbung desselben ein. Dem Anfänger wird freilich zuerst manches Präparat mifsglücken; entweder er nimmt zuviel Eiweifs und dann hat er nach dem Färben ein schmieriges Präparat, oder er nimmt zu wenig und dann schwimmen die Schnitte fort. Hier hilft erst Übung das richtige Mafs treffen. Unbrauchbar dagegen ist die Eiweifsmethode , wenn man mit Flüssigkeiten färben will, die stark alkalisch sind; dann wird das Eiweifs gelöst und die Schnitte schwimmen fort. c. KoUodiiiiimelkeniU; Schällibaiim. Man mischt 1 Raumteil Kollodium mit 3 Raumteilen Nelkenöl, streicht von dem Gemisch ein wenig auf den Objektträger, legt die Schnitte auf und bringt für 5 — 10 Minuten auf ein Wasserbad, damit das Nelkenöl verdampft. Hat man zuviel der Mischung aufgestrichen, so schwimmen beim Ab- dampfen die Schnitte fort. Nach Beendigung des Aufklebens kann nachgefärbt werden. d. 50 % Alkohol ; (laule. Man befeuchtet das Deckglas mit dem genau 50 % Alkohol, legt die Schnitte auf und läfst 24 Stunden an- trocknen. Dann zieht man das Deckglas zweimal schnell durch die Spiritusflamme und bringt auf 7« Minute iu Terpentin. Wenn die Kap. IV. Scliiicidi'ii 1111(1 Aufkleben. 37 Metliodo gelingt, kleben die Schnitte ganz fest; meistens aber schwim- men sie fort. 6. WkiCtERT'scIk» KollodiuiMiiK'thodc. Eine etwas umständliche Methode hat Wj:iui;in' angegeben, um Scbnitte von celloidiuierten Gehirnen, die mit seiner Hämatoxylinfärljung behandelt werden sollen, aneinander zu kleben und sie dadurch gleichzeitig vor dem Brüchig- werden zu srhützen. das in jenem Hämatoxylin stets eintritt. Die Methode bis zum Einlegen der Schnitte in die Färbeflüssigkeit besteht aus 4 Al)schnitten. 1 . Abschnitt. Präparation der Glasplatten. Grofse Glasplatten werden mit Kollodium überzogen, indem man auf die Mitte der wage- recht gehaltenen Platte Kollodium aufgiefst und dies gleichmäfsig nach allen Seiten laufen liU'st. Man stellt dann die Platten auf die hohe Kaute uiul läfst sie abtrocknen. 2. Abschnitt. Anfertigen der Schnittserien. Man bringt einen Schnitt auf einen Streifen Klosettpapier und legt jeden anderen Schnitt rechts daneben. Das Überführen auf das Papier geschieht so, dafs man den Streifen anspannt und unter das Messer führt, auf dem der Schnitt sich befindet. Um die Schnitte feucht zu halten , legt man den Sti'eifen jedesmal, nachdem man einen Schnitt abgenommen, in einen flachen Teller, auf dem sich mehrere Bogen Fliefspapier be- finden, die gut mit Spiritus durchfeuchtet sind. Die Oberfläche dieses Fliefspapiers darf nicht unter Spiritus stehen , da auf dieselbe der Streifen mit den Schnitten kommt. Auf jeden Streifen kommt nur eine Schnittreihe. 3. Abschnitt. Ablegen der Schnitte auf die Kollodiumplatte. Hat man eine genügende Anzahl von Schnittreihen angeordnet, so legt man jeden Klosettpapierstreifen, die Schnitte nach unten, auf die Kollodiumschicht, drückt sanft an und zieht das Papier ab. Die Schnitte haften jetzt. Überflüssigen Spiritus entfernt man durch Ab- saugen mittels 4facher Fliefspapierlage. 4. Abschnitt. Zweite Kollodiumschicht. Man giefst jetzt rasch, damit die Schnitte nicht vertrocknen, ein zweites Mal Kollodium auf die Platte, das man wie beim ersten Male sich verbreiten läfst. Will man noch nicht färben, so kommen die Platten in 80"',, Alkohol; will man aber die Farbflüssigkeit anwenden, so bringt man die Platte in dieselbe. Jetzt löst sich die Kollodiumschicht leicht al) und man hat nun einen Kollodiumlappen, mit dem man alles anfangen kann. Nach geschehener Aufhellung schneidet man mit der Schere den Lappen so zurecht, wie man ihn braucht. f. APATHY'sche Methode. Eine andere Methode zur Serienan- ordnung für Celloidinschnitte ist von APATllY angegeben. Sie ist nur für durchgefärbte Objekte geeignet. Die bereits in Bergamottöl aufgehellten Schnitte werden auf einem der Gröfse des Deckglases entsprechenden Streifen Pergamentpapier in geeigneter Weise geordnet. Man legt dann den Streifen mit den Schnitten nach unten auf den Objektträger, drückt leicht und gleichmäfsig an und zieht das Papier ab. Die Schnitte bleiben dabei auf dem Objektträger kleben. Das überflüssige Ol wird mit etwas Fliefspapier abgetrocknet und man deckt ein. Aufser den angeführten gibt es noch eine ganze Reihe anderer Methoden des Aufklebens, deren Anführung ich mir aber erspare, 38 I- Abschnitt, Die Methoden der Untersuchung. weil dieselben sich nie in weiteren Kreisen haben einfuhren können. Wer ein spezielleres Interesse daran nimmt, sei auf die BEiiRENS'schen Tabellen verwiesen. Kap. V. Die Methoden der Färbung. Je nach den Absichten, die man beim Färben des zur mikrosko- pischen Untersuchung bestimmten Materiales verfolgt, richtet sich die Methode, nach welcher die Färbung vorzunehmen ist. Kommt es blofs darauf an, die einzelnen Bestandteile des Objektes deutlicher zu machen, als sie ungefärbt sich darstellen, so genügt es, einen einzigen Farb- stoff anzuwenden, mit dem man das ganze Objekt auf einmal behandelt. Es ist dies die Methode der Durchfärhung . So verfährt mau gewöhn- lich bei Untersuchung von Embryonen, von ganzen Tieren oder von Organen, wenn es sich um morphologische Probleme handelt, wenn die innere Gestaltung des Embryo, des Tieres oder der morphologische Habitus des Organes erforscht werden sollen. Die Durchfärbung hat daher der Entwässerung und Einbettung des betreffenden Objektes voranzugehen. Will man aber die feinere Struktur der ein Organ konstituieren- den Elemente erkennen und will man die wahrscheinliche physiolo- gische Dignität der ein Tier zusammensetzenden Organsysteme fest- zustellen versuchen, dann mufs man Sclmitffärhunci vornehmen. Die Zellen von Organen verschiedener physiologischer Funktion zeigen in der Regel, wenn auch nicht immer, ein verschiedenes Verhalten gegen Farbstoffe, und aus gewissen Affinitäten beider läfst sich ein Wahr- scheinlichkeitsschlufs aufbauen. Es ist darum auch nötig, bei Schnitt- färbung sich nicht mit einem Tinktionsniittel zu begnügen, sondern deren eine gröfsere Zahl oer gleichend anzuwenden ; und zwar so- wohl solche, welche das Plasma, als auch solche, welche nur die Kerne färben. Wie Isolation und Schneiden, so ergänzen sich Durchfärben und Schnittfärl)en. Man kann aber elier die Durch- färhung als die Schnittfärbung entbehren, denn was durch jene er- reicht werden soll, die gröfsere Verdeutlichung der Teile, das wird durch diese tafsäcMich und viel ausgiebiger bewirkt. Der Vor- zug der Schnittfärbung besteht auch noch darin, dafs die dadurch erzielten Bilder klarer, übersichtlicher und, meines Bedünkens, zuver- lässiger sind, als diejenigen, welche die Durchfärbung liefert. Bei der Schnittfärbung kann man jeden Farbstoff für sich allein verwenden , wenn derselbe nur deutlich differenzierte Bilder liefert. Häufig aber ist es wünschens- und empfehlenswert, mehr als einen Farbstoff auf einmal in Gebrauch zu nehmen, um die verschiedene physiologische Wertigkeit der einzelnen Teile in ein noch helleres Licht zu setzen, als dies durch einen Farbstoff möglich ist. Man nennt das Doppelf ärhung . Bei derselben sind selbstverständlich die Tinktionsmittel so zu wählen, dafs sie sich ergänzen, dafs der eine Dinge färbt, die der andere nicht angreift, und umgekehrt. Unter Umständen kann man sogar Dreifachfärhioig anwenden. Doch wird man in der Kombination der Anzahl dor Farbstoffe nicht zu weit gehen dürfen. Man erhält bei Dreifach- und noch mehr bei Vierfachfärbung schliefslich so bunte Bilder, dafs man vor' lauter Distinktion der Färbung nichts mehr distinguieren kann. In dem Wirr- Kap. V. Die Methoden der Färbung. 39 w:irr der verschiedenen Parbonnuanccn, — denn fast jeder einzelne Farb- stoff zeigt an den Elementen , an denen er angreift, verschiedene Töne, — wird sehliefslich für das Auge kein Halt mehr sein. Solche bunten Bilder erscheinen zu unruhig und stehen meines Erachtens dann selbst hinter den nacli Durch färl)ung erhaltenen zurück. Während bei Schnittfärbung die Zeit, welche der Farbstoff zur Entfaltung seiner tinktorialen Eigenschaften braucht, selten 24 Stun- den übersteigt, sind zur Durchfärbung je nach der Besonderheit des Farbstoffes und der Natur des Objektes oft mehrere Tage erforderlich. Kann man daher in ersterem Falle ohne Bedenken wässrige Flüssig- keiten nt'hmon, so wird man in letzterem, wenn irgend möglich, nur alkoholische anwenden. Vielfach wird empfohlen , die Einwirkung gewisser Farbstoffe durch Erwärmung zu beschleunigen. Handelt es sich darum , ge- schwind ein Demonstrationsobjekt darzustellen, so wäre das allenfalls zulässig, wenngleich es mir bedenklich erscheint, dem Schüler ein Verfahren zu zeigen, das tatsächlich eine Ausnahme von der gewöhn- lichen Prozedur ist. Denn allgemein in der Wärme zu färben, davon möchte ich abraten; die Bilder, die man warm erhält, sind, wie mich meine Erfahrung lehrt, bei weitem nicht so schön und klar, als die langsam bei Tagestemperatur erzielten. Es gibt einige Methoden der Färbung, die ungemein kompliziert sind, wo man nach der Vorschrift des betreffenden Autors mit der Uhr in der Hand dasitzen mufs, um auf die Sekunde die einzelnen Manipulationen vorzunehmen; ich werde später einige solche erwähnen. Derartige Methoden verwerfe ich , nachdem ich sie geprüft, immer. Isolieren, Fixieren und Härten, Einbetten : das sind Verrichtungen, welche die ganze Aufmerksamkeit des Forschers in Anspruch nehmen und nehmen müssen, denn von ihrer sorgfältigen Ausführung hängt die Gewinnung guten Materiales ab, es sind geistkje Verrichtungen. Schneiden aber. Aufkleben, Färben und Einlegen sind mechanische Prozeduren, bei deren Ausführung man nicht mehr Zeit, als unum- gänglich nötig, aufzuwenden genötigt sein sollte. Wenn man durch die Lage der Untersuchung gezwungen ist, viele hundert Schnitte anzufertigen, wozu schon eine beträchtliche Zeit gehört, dann mufs man nicht noch nötig haben, jeden einzelnen Schnitt oder jedes Deck- glaspräparat so genau abzuwarten, wie es manche Vorschrift verlangt. Diejenigen Färbungsmethoden sind daher am besten, die am wenigsten Handreichungen benötigen, wo man einfach den Schnitt in die Farb- stoffliüssigkeit bringt und ihn, gleichgiltig ob nach einer Stunde .oder nach einem Tage, aus derselben entnehmen kann, ohne eine IJber- färbung befürchten zu müssen, die sich nur durch eingreifende Mani- pulationen redressieren läfst. Dafs das Hämatoxylin ein solcher Farbstoff ist, der einiger Abwartung bedarf, ist der einzige Nachteil, der ihm anhaftet. Objekte, die dnrchxjefärht werden sollen, kommen aus dem 80 % oder 90 " „ Alkohol, in welchem sie verweilen, in die Farbstofflösung, werden nach einiger Zeit aus derselben herausgenommen, schnittfertig gemacht und geschnitten. Bereits angefertigte und aufgeklebte Schnitte aber und man sollte Schnitte, nur wenn sie aufgeklebt sind, färben, wenn es sich nicht um Celloidiniiräparate, die vom Messer direkt in den Farbstoff 40 I. Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung. kommen, handelt — müssen vorher noch einigen Manipulationen unterzogen werden. Zunächst nuifs man das Paraffin entfernen. Die Deckgläser, auf welchen die Schnitte aufgekleht sind, kommen auf 10—15 Minuten in Terpentinöl oder auf kürzere Zeit in Xylol. Letzteres löst das Paraffin schneller als das erstore. ist aher auch hedeutend tourer. Aus dem Terpentin oder Xylol werden die Präparate in ein Uhr- schälchen mit 96 % Alkohol übergeführt. In den öligen Flüssigkeiten waren sie ganz durchsichtig geworden, im Alkohol, der dieselben aus- treibt, werden sie wieder undurchsichtig. Die Zeit, die zur Aus- treibung der das Paraffin lösenden Flüssigkeiten erforderlich ist, be- trägt etwa 5 Minuten. Dann kommen sie in rascher Reihenfolge in 80%, 70%, 50% Alkohol und endlich in den Farbstoff. Die all- mähliche Verminderung der Alkoholkonzentration ist notwendig, damit die beim Einbringen in die wässrigen Farbstofflösungen ent- stehenden Diffusionsströmungen nicht zu heftig sind. In alkoholische Farbstofflösungen werden die" Präparate direkt aus dem 96'*;, Alkohol übergeführt. Ich wende mich jetzt zu den einzelnen Farbstoffen. Zuerst soll Karmin, dann Haematoxylin , dann die Anilinstoffe und endlich die Doppel- und Mehrfachfärbungen beschrieben werden. a. Karmin. Gerlach hat diesen wertvollen Farbstoff, den vor ihm schon die Botaniker verwandten, in die histiologische Technik eingeführt. Es existiert für die Anwendung desselben eine grofse Anzahl von Vorschriften, von denen viele, z. B. Beales Karmin, Essig- karmin, meines Erachtens nur noch historischen Wert haben. Hier sollen nur die wirklich brauchbaren Erwähnung finden. 1) Aminoiiiakalisches Karmin. 1 gr. gepulverten Karmins wird in 100 ccm. destillierten Wassers durch Zusatz von einigen Tropfen Ammoniak gelöst. Nach dem Filtrieren bleibt die Flüssigkeit in einer offenen Schale so lange an der Luft stehen, bis der Ammoniakgeruch verschwunden ist, und wird dann von neuem filtriert. Präparate in dieser Lösung gefärbt, werden in Wasser, das mit etwas Essigsäure angesäuert ist, ausgewaschen. Man erhält eine sehr intensive rote Färbung, doch zeigen Zellsubstanz und Kern verschiedene Nuancen. Zur Färbung des Zentralnervensystems, sowie zur Sichtbarmachung des Achsencylinders ist es eins der besten Reagentien. Zu diesem Zwecke bringt man nach Gerlach einige Tropfen der konzentrierten Lösung in 50 ccm. Wasser, so dafs eine hell rosenrote Farbe entsteht (etwa die des sogenannten Rosenliqueurs). Darin bleiben die Schnitte 24 Stunden bis 3 und 4 Tage. Abwaschen in angesäuertem Wasser, Aufbewahrung beliebig. Schnitte, die mit Eiweifs aufgeklebt sind, schwimmen in diesem Karmin fort, weil das in ihm enthaltene Am- moniak das Eiweifs löst. 2) Litliionliarmin ; Orth. 2.5 gr. Karmin werden in 100 ccm. kalt gesättigter, wässriger Lösung von Lithium carbonicum aufgelöst. Zur Differenzierung kommen die Schnitte direkt für einige Zeit in salzsauren Alkohol (1 Teil Salzsäure auf 100 Teile 70"/,, Alkohol). Aufbewahrung beliebig. Dieser Farbstoff' ist bei Schnitten, die mit Eiweifs aufgeklebt sind, nicht zu verwenden, da er dasselbe auflöst. 3) Salzsaiires Karmin; P. Mayer. 4,0 gr. Karmin werden in Kap. V. Die iMi-tlmdoii der Färbuiifr. 41 15 ccm. Aiiua destillata und 30 Tropfen reiner Salzsäure durcli Koclien gelöst. Naeh dem Erkalten werden 95 ccni. Alkohol von 96 "/o zu- gesetzt. (Mayer empfiehlt zwar 85"/,, Alkohol zu nehmen; indessen halte ich es für richtiger, hei Farhtliissigkeiten, die wie diese zum Durchfärhen hestiinnit sind, stets 96"/,, Alkohol zu nelimen , damit die Kliissi,i,fkeit(Mi stark alkoholisch sind und so gleiclizeiti^' Wasser entziehend wirken.) Jetzt wird filtriert und mit li([U()r ammonii cau- stici vorsichtig neutralisiert. Das Material kommt auf 24 Stunden und länger in die Lösung. Will man reine Kerntinktion haben, so werden die durchgefärbten Stücke in salzsauren Alkohol von 96 "/„ (1 Salzsäure auf 1000 Alkohol) übergeführt; der Alkohol wird so lange gewechselt. l)is kein Farbstoff mehr ausgeht. AVill man aufser der Kerntinktion noch Plasmafärbung, so nimmt man zum Auswaschen reinen 96 "/„ Alkohol, der ebenfalls so lange gewechselt wird, bis er sich nicht mehr rot färbt, was oft Tage in Anspruch nimmt. Für Schnittpräparate ist dies Karmin nicht geeignet, da das Eiweifs sich sehr stark mitfärbt, für Durchfärbung vorzüglich. 4) Alkoliolisehes Boraxkarmiii; (wRENACHER. 2—3 gr. Karmin werden mit 4 gr. Borax in 100 ccm. Aqua destillata gekocht und nach dem Erkalten mit dem gleichen Volumen 96 "/„ Alkohol vermischt. Dann wird filtriert. Nur zum Durchfär))en geeignet. Die Objekte kommen auf 1—3 Tage und länger in die Lösung und dann direkt in salzsauren Alkohol (1 pro mille) von 96"/,,. Hierin bleiben sie so lange, oft Tage lang, bis kein Farbstoff mehr ausgeht. Gute Kern- und leichte Plasmafärbung. 5) Wässriges Boraxkarmin; Orenacher. 2 gr. Borax mit ^li—1 gr. Karmin in 100 ccm. Aqua destillata gekocht. Nach dem Erkalten vorsichtiges und tropfeuAveises, unter stetem Umrühren, Zu- setzen von Essigsäure, bis die Färbung des ammoniakalisclien Karmins erreicht ist. War das Karmin nach dem Kochen nicht klar gelöst, so mufs vor dem Essigsäurezusatz filtriert werden. Nach dem Essig- säurezusatz überläfst man die Lösung 24 Stunden sich selber und filtriert durch ein mehrfaches Filter. Die Filtration geht sehr lang- sam vor sich. Die Schnitte bleiben in der Farblösung 5 Minuten bis 24 Stunden. Dann werden sie flüchtig in destilliertem "Wasser ab- gespült und mit salzsaurem Alkohol (1 pro mille) von 96 "/„ so lange behandelt, bis keine Far])stoffwolken mehr aus dem Schnitt entweichen. Aus dem salzsauren kommen sie in reinen Alkoliol. Art des Ein- legens gleichgültig. Gute Kerntiktion, schwache Plasmafärbung. 6) Wässriges Alauiikarmiii; Urenacher, 3 gr. gepulverten Alauns werden mit 1 gr. Karmin in der Reibschale verrieben und dann in 100 ccm. Wasser 10—20 Minuten gekocht; nach dem Erkalten wird filtriert. Die Lösung schimmelt leicht, daher raufs man eine Spur Karbolsäure zusetzen. Die Schnitte bleiben in der Lösung 10 Mi- nuten bis 24 Stunden: Auswaschen in Wasser; Art des Aufhebens gleichgiltig. Es tritt nie Überfärbung ein. Dies Reagens ist eins der besten Kerntinktionsmittel . denn nur die Kerne sind gefärbt, und zwar violett, allenfalls noch quergestreifte Muskeln und Knochen- grundsubstanz; diese beiden rötlicli. 7) Alkolioliselios Alaunkanniii; ^lÄHRENTlIAL. Zur Verhütung der Schimmelbildung setzt Dr. v. MÄiiRKNTHAL, der mir diese Modi- 42 I- Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung?. fikation der vorigen Methode gütigst mitgeteilt hat. 7a\ 4 Volumina GREXACHER'schen Alaunkarmins 1 Volumen Alkohol von 96"',,. Es niufs wiederholt filtriert werden, weil etwas Karmin und Alaun durch den Alkoholzusatz ausfallen. Nur Schnittfärbung; Auswaschen in AVasser. 8) Alauiicoehenille; CZOKOR. 7 gr. Cochenille und 7 gr. ge- brannten Alauns werden zu einem feinen Pulver zerrieben, dann in 700 ccm. Aqua destillata gekocht und schliefslich bis 400 ccni. ein- gedickt. Sehr häufiges Filtrieren nötig. Zur Verhütung von Schimmel- bildung Zusatz einer Spur Karbolsäure. Die Lösung wird vielfach gerühmt, doch ist sie meiner Erfahrung nach sehr unzuverlässig, da trotz wiederholten Filtrierens sich Farbstoffkörnchen im Präparate niederschlagen. i'i. Hämatoxyliii. Dieser Farbstoff kommt in zwei Hauptmetho- den zur Verwendung. Erstens als eigentliches Kernfärbemittel, das auch das Plasma leicht fingiert. Die zweite Verwendungsart besteht darin, dafs das Gewebe mit Hämatoxylin überfärbt und der Farb- stoff durch ein anderes Reagens ausgezogen wird, so dafs jetzt entweder eine gleichmäfsige Färbung von Plasma und Kern eintritt, jedoch mit deutlicher und charakteristischer Nuancirung der einzelnen Elemente des gefärbten Objektes, oder dafs bei fast vollständiger Entfärbung des ganzen Schnittes ganz bestimmte Elemente allein deutlich gefärbt hervortreten. Für das Hämatoxylin als Kernfärhemittel existieren folgende Vor- schriften : 9) Alaimliämatoxylin ; Böhmer. 0,3.5 gr. Hämatoxylin werden in 10 ccm. absoluten Alkohols gelöst. Davon kommen einige Tropfen in eine Lösung von 0,1 gr. Alaun in 30 ccm. Aqua destillata, bis eine schöne violette Färbung entsteht. 10) Alaimhämatoxylin; FREY. 1 gr. Hämatoxylin wird in 30 ccm. absoluten Alkohols gelöst. Davon werden einige Tropfen in eine Lösung von 3,0 gr. Alaun in 100 ccm. Wasser gegeben, bis eine tief violette Farbe entsteht. 11) Alauiiliämatoxyliii; Delafield (citiert nach Behrens). Fälschlich GRENACHER'sches Hämatoxylin genannt. 4 gr. Hämatoxylin werden in 25 ccm. absoluten Alkohols gelöst und kommen dann in 400 ccm. einer konzentrierten wässerigen Animonalannlösung. Man läfst die Mischung 3 — 4 Tage offen am Lichte stehen, filtriert und fügt je 100 ccm. Glycerin und Methylalkohol zu. läfst einige Zeit stehen und filtriert von neuem. Zum Gebrauch wird ein Quantum davon nach Belieben mit Wasser verdünnt. Beim Studium von Zell- teilungserscheinungcn nach RABL'scher Fixierung (Kap. II Nr. 25) werden die mit diesem Hämatoxylin gefärbton Präparate in Methyl- alkohol untersucht. 12) Alaimhämatoxylin ; Renalt -FRIEDLÄNDER (citiert nach Behrens). 2 gr. Hämatoxylin, 2 gr. Alaun werden in einer Mischung von je 100 ccm. Glycerin, Aqua destillata und Alkohol gelöst. Zur Differenzierung ist ein Einlegen in salzsäurehaltigen Alkohol nötig. 13) Glycerinalauiihämatoxylin. Um die bei dem Renaut- FRlEDLÄNDER'schen Hämatoxylin nacli Behkens' Angabe iiotwendige Kap. V. Die Methoden der Färbung. 43 Naclibehaiullung in salzsaurem Alkoliol zu vermeiden, sowie ferner in der Absicht, den Alkohol hei der Zubereitung des Farbstoffes für histiologische Zwecke ganz auszuschlielsen und eine möglichst leicht herstellbare Lösung zu schaffen, stelle ich mir seit langem in folgender Weise ein Hämutoxi/lin dar: 1 gr. Hämatoxylin, 1 gr. gepulverten Alauns werden in 65 com. Aqua destillata und 35 ccm. Glycerin ge- löst. Man schüttelt im Anfang häutig um, mufs aber dann etwa 14 Tage warten , bis alles vollständig gelöst ist. Die Färbung mit dieser Mischung zeigt einen glänzenderen und leuchtenderen Ton, als er nach Anwendung von BöiiMEKS oder FuKYS Hämatoxylin erreicht wird. Ich kann daher meine Modifikation sehr empfehlen. 14) Eisessiiralaunhämatoxyliii; EHRLICH (citiert nach Behrens). 2 gr. Hämatoxylin werden in 10 ccm. Eisessig, je 10<»,,ccm. Glycerin, Alkohol absolutus und Wasser gelöst und Alaun im Überschufs hin- zugefügt. Gutes Reagens, das auch zum Durchfärben sich eignen soll. 15) Alaimhjimatoxyliu; KLEINEXBERG. Mau macht drei Lö- sungen : 1) gesättigte Lösung von krystallisiertem Chlorcalcium in 70 "o Alkohol, dazu so viel Alaun, als sich lösen will. 2) gesättigte Lösung von Alaun in 70 "„ Alkohol. Lösung 2 wird mit Lösung 1 im Verhältnis 8 : 1 gemischt. 3) Konzentrierte Lösung von Häma- toxylin entweder in Alkohol oder in der Lösung 1. Von der Häma- toxylinlösung werden einige Tropfen zu der Mischung von 1 und 2 gegeben (citiert nach Gierke. Färberei zu mikroskopischen Zwecken). Soll sich zur Durchfärbung eignen, doch müssen die Objekte ganz säurefrei sein. An diese Vorschriften- will ich einige allgemeine Bemerkungen aber ihre Amcendung knüpfen. Ob dieselben auch für Delai'IELD'- sches, REXAUT-FniEDLÄXDER'sches und KLEiXEXBERG'sches Häma- toxylin Giltigkeit haben, weifs ich nicht; ich habe über diese Rea- gentien keine Erfahrung. Nach welchem der Rezepte, die unter 9, 10, 13 und 14 erwähnt wurden, man auch eine Alaunhämatoxylin- lösung sich hergestellt hat. zuerst ist der Farbstoff hellviolett und fast ohne Wirkung auf die tierischen Gewebe. Man mufs ihn daher erst ausreifen lassen, d. h. man mufs so lange warten, bis die Mischung unter der allmählichen Einwirkung des diffusen Tageslichtes tief dunkelviolett geworden ist. ehe man sie mit Erfolg anwenden kann. Das dauert stets lange, circa 14 Tage und mehr. Ferner ist eine Bedingung für die Hämatoxyline, dafs sie in gut verkorkten Flaschen vor dem direkten Sonnenlichte möglichst geschützt aufbewahrt werden, weil sie sonst leicht verderben. Die Einwirkung der Farbstofflösung auf den Schnitt, und die in diesem Passus erwähnten Hämatoxyline sind nur zur Schnittfärhung geeignet, darf bei BüiiMEKs. Freys und meiner Vorschrift 8 Minuten nicht übersteigen, in der Regel genügen 2-5 Minuten, weil sonst Überfärbung eintritt, infolge deren nichts mehr zu erkennen ist. In Ehrlichs Hämatoxylin dagegen können die Schnitte längere Zeit, bis zu \.2 Stunde verweilen, weil in demselben die Färbung lang- samer erfolgt. Je dunkler das Hämatoxylin ist, desto schneller wirkt es im allgemeinen ein. "Wie lange man die Schnitte zu färben hat, das lernt man leicht durch Übung. Die Hämatoxyline. die nach Böhmers, Freys. Delafields oder nach meiner Vorschrift hergestellt sind, sind jedesmal vor dem Go- 44 1. Abschnitt. Die Metliodcii der TTntersuchung. brauche zu filtrieren, d. h. man giefst in ein Uhrschälchen oder eine Glasdose die zu verwendende Quantität durch ein Faltenfilter; das ist bei Ehrliohs Hämatoxylin nicht nötig. Ist die Färbung beendigt, so müssen die Präparate abgewaschen werden, was am besten in gewöhnlichem Wasser geschieht. Ich habe nämlich die Beobachtung gemaclit, dais Hämatoxylinpräparate in ge- wöhnlichem "Wasser abgewaschen eine viel klarere, distinktere und leuchtendere Färbung zeigen, als solche, die man in Aqua destillata abgespült hat. Damit Hämatoxylinfärbungen haltbar sind, ist es notwendig, dafs die zu färbenden Objekte vollständig säurefrei sind; in Schnitten, die von nicht säurefreiem Material herrühren, blafst das Hämatoxy- lin allmählich aus. Die Säuren wirken nämlich auf den Farbstoff bleichend ein, dalier mufs man auch überfärbte Schnitte in eine ganz dünne Essigsäure bringen. Man hat dabei den Grad der Entfärbung sorgfältig zu beachten; ist derselbe erreicht, so mufs wieder längere Zeit in gewöhnlichem Wasser ausgewascheii werden. Diese Nachteile, die Möglichkeit der Überfärbung und die daher notwendige Überwachung der Tinktion, die Vergänglichkeit in säure- haltigem Materiale sind indessen bei weitem überwogen durch die Schönheit und Klarheit der erhaltenen Bilder. Die Kerne wer- den intensiv dunkelblau gefärbt, während alle übrigen Teile der zu untersuchenden Gewebe ein schwaches Blau zeigen, das sich an den verschiedenen Gewebsarten in verschiedener Nuancierung zeigt. Mu- cinhaltige Drüsen, namentlich wirbelloser Tiere, zeigen eine inten- sive Bläuung, doch ist der Kern der Drüsenzellen stets deutlich zu sehen. Die zweite Veru-endungsart des Hämatoxylins ist von Heidexhain erfunden und dann in der verschiedensten Weise von verschiedenen Autoren modifiziert worden. 16) HElDENHAlN'sehe Hämatoxylinfärl>iing-. Man stellt sich eine Vg % wässerige Lösung von Hämatoxylin dar. Da dasselbe sich bei gewöhnlicher Temperatur schwer in l)lofsem destillierten Wasser löst, kann man leicht über der Flamme erwärmen. Die Lösung braucht keine Zeit zum Ausreifen und kann daher frisch verwandt werden. Bei längerem Stehen im Lichte wird sie häufig flockig und ist dann unbrauchbar. In ein nicht zu geringes Quantum dieser Lösung kommen die in verscliiedenster Weise fixierten und in Alkohol nachgehärteten Objekte auf 24—48 Stunden. Dann werden sie direkt übergeführt in ein ebenso grofses Quantum einer Vs % wässrigen Lösung des einfach chromsauren Kali, also des neutralen gelben Salzes. Alsbald nach der Überführung beginnen aus dem Präparate dunkelblau- schwarze Farbstoffwolken zu entweichen, die allmählich eine solche Inten- sität erlangen, dafs man das Präparat nicht mehr sehen kann. Man mufs daher das cliromsaure Kali melirmals wechseln. In demselben verbleiben die Objekte ebenfalls 24 — 48 Stunden, mindestens aber so lange, bis keine Farbstoffwolken mehr entweichen. Dann werden sie sehr sorgsam ausgewaschen, langsam erhärtet, entwässert und in Paraffin eingeschmolzen. So behandelte Objekte sind dunkelschwarz, die von ihnen anzufertigenden Schnitte müssen daher äufserst fein sein, mehr als 5 // Dicke dürfen sie keineswegs besitzen, weil sonst nichts zu sehen ist. Das Bild, das ein von einem derartigen Präparate Kap. V. I'iu MetlKuleu ilor Kärbunj^. 15 genuichter Schnitt darbietet, gleicht niicli Hi;iL»EMiAi\s Aufdruck einem „gut ausget'iihrten Hol/schnitte". In dünnen Schnitten hat niun ein bh'iuliclischwurzes , glcichniäfsigcb Kolorit, dus sich in feinster Nuiince an den verschiedenen Gcwebselenienten abstuft; die Kerne sind hell, ihre Strukturen deutlich zu erkennen. Bei drüsigen Organen wiibelloser Tiere erliält man ausgezeichnete Bilder, Nach Fj.i;.MiiiNCi kann man solche Schnitte in Alauncarmin mit Vorteil nachfärben. 17) ApäTIIV'scIh' Häiiiatoxyliiitarbniit;. Um den Übelstand, der der HElDKMlAlN'schen Methode dadurch anhaftet, dafs die Objekte aus d(Mn Alkohol entnommen und einer mehrtägigen Einwirkung von wässrigon Medien unterworfen werden müssen, zu l)eseitigen, hat Al'A'l'llv folgende Modifikation angegeben. Das Material kommt in eine V-, "/o ivlkoholisclie Hämatoxylinlösung (alkoholische Hämatoxylin- lösnngen müssen ausreifen) für etwa 24 Stunden. Dann werden sie für die gleiche Dauer in eine alkoholische Lösung des doppelchrom- sanren Kali übergeführt — dieses Salz hatte Hejdkxhaix zuerst an Stelle des neutralen verwandt — ; APÄTiiv stellt sich letztere so dar, dafs er einer 5 '•/„ wässrigen Lösung von Kali bichromicum etwa das doppelte Volumen starken Alkohols zusetzt. Da durch den Alkohol das Chromsalz ausfällt, so mufs die Auslaugung des Hämatoxylins im Dunkeln vorgenommen werden. Der Farbenton ist derselbe wie bei der eigentlichen HEIDENiiAlN'schen Färbung. 18) Benda'scIic Eis^'iilijimatoxyliiifärbuii^. Schnitte vom Zen- tralnervensystem (und nur für dieses Organ ist diese Modifikation des HElüEXllAix'schen Verfahrens anwendbar), die in reiner Pikrinsäure erhärtet sind , kommen zunächst auf Minuten bis Stunden in eine konzentrierte Lösung von schwefelsaurem Eisenammonium, werden dann sehr sorgfältig in destilliertem Wasser gewaschen und in eine 1 7o wässrige Hämatoxylinlösung übergeführt. Hier bleiben sie , bis sie schwarz sind , was etwa nach 10 Minuten der Fall ist. Darnach kommen sie auf etwa 5 Minuten in eine Lösung der Chromsäure von 1 : 2000. Nach gutem Auswaschen werden sie vor dem Einlegen wie alle Schnitte behandelt. Soll für Ganglienzellen von Wert sein. Farbenton wie bei der HElDENHAiN'schen Methode. 18a) BENDA'sclie Kupferliämatoxyliiifärbiiiig. Sich anlehnend an die von Weigert angegebene Kupferung von Objekten , die in MÜLLEK'scher Lösung fixiert sind, hat Benda für solches Material, das in FLEMMlNG'scher Lösung fixiert wurde, folgendes Verfahren er- sonnen: Die Schnitte kommen in eine konzentrierte wässrige Lösung von neutralem Cuprum aceticum und bleiben 24 Stunden in derselben im Brütofen bei ßrüttemperatur. Nach gutem Auswaschen werden sie in eine 1^% wässrige Hämatoxylinfärbung übergeführt, verweilen darin, bis sie schwarz geworden sind, und kommen dann zur Ent- färbung in eine Salzsäurelösung von 1:300 — 500 Wasser. Hierin bleiben sie. bis sie gelb sind, welcher Zeitpunkt sehr genau abzupassen ist. Nachher werden sie zur Neutralisierung der Säure von neuem in die Kupferlösung übertragen, bis sie bläulich sind, und sorgfältig gewaschen, Farbenton wie bei Heidenhain. Zum Studium der Spermatogenese geeignet, 19) IVElGERT'scb«' Hämatoxylinfärbung. Diese Methode ist die wertvollste Errungenschaft der letzten Zeit zur Untersuchung des 4R I. Abschnitt. Die Methoden der T'ntersiichnng. Zeiilraliieroensysiems der Wirbeltiere. Das ganze vorher iu Celloidiii ein- gebettete und auf Kork aufgeklebte Gehirn kommt aus dem Alkohol auf 24 — 72 Stunden in eine konzentrierte wässrige Lösung von Cuprura aceti- cum. Das Gefäfs, welches Präparat und Flüssigkeit enthält, wird auf die genannte Dauer der Temperatur des Brutofens unterworfen (37" — 38" C). Geglückt ist die Kupferung. wenn das Celioidin einen bläulichgrünen Farbenton hat. Nach der Kupferung wird sorgfältig in destilliertem Wasser ausgewaschen und dann in 70 "/„ oder 80 "/^, Alkohol über- führt. Die Schnitte von Gehirn und Kückenmark, und nur für diese Organe ist die Methode verwertbar, werden 24 Stunden in einer LithionhämatoxijUnlösuny gefärbt, die folgendermafsen hergestellt wurde. Hämatoxylin 1 gr. Aqua destillata 90 ccm, Alkohol absolutus 10 ccm. und kalt gesättigte wässrige Lösung von Lithion carbonicura 1 ccm. Man löst das Hämatoxylin im Wasser durch Erwärmen und fügt nach dem Erkalten den Alkohol hinzu. Das Lithion carbonicum wird erst unmittelbar vor dem Gebrauche beigemischt, weil sonst die Lösung bei längerem Stehen verderben würde; sie würde braun, statt rötlich- violett sein. Nach 24 stündigem Verweilen in der Färbeflüssigkeit werden die Schnitte in gewöhnlichem Wasser abgewaschen und werden dann in folgende Entfärbungsßnssigl-eif gebracht: Ferridcyankalium 2,5 gr. Borax 2.0 gr. Aqua destillata 100 ccm. In dieser Flüssigkeit tritt die Entfärbung und Differenzierung sehr schnell ein , in etwa 15 Minuten. Es ist aber besser, langsam zu entfärben, und man kann zu diesem Zwecke die Entfärbungsflüssigkeit mit dem gleichen, doi^pelten oder dreifachen Volumen destillierten AVassers verdünnen und so die volle Entfärbung bis zu 24 Stunden verzögern. Im all- gemeinen ist zu bemerken, dafs die Ferridcyankaliumlösung im An- fange sehr schnell wirkt, dafs aber die letzten Reste des Farbstoffes vor vollendeter Differenzierung sehr langsam entweichen. Nach be- endeter Einwirkung wird sorgsam in Wasser ausgewaschen; die weitere Behandlung cfr. das folgende Kapitel. Der Endeffekt dieser Methode ist der, dafs nur die markhaltigen Nervenfasern sich gefärbt haben, und zwar in gelungenen Präparaten dunkelblau mit einem leichten Stich in's Grünliche, alles andere ist braun oder gelbbraun. Zwar sind die Nervenzellen noch zu erkennen, indessen nur als stroh- gelbe oder braune Gebilde ; bei Anwendung schwacher Systeme aber, wie sie beim Studium des Faserverlaufes in Gehirn und Rückenmark allein gebraucht werden, treten alle Elemente gegen die Nervenfasern zurück und deren Verteilung im Gehirn und Rückenmark ist daher der Beobachtung in einer Weise zugänglich gemacht, wie bei keiner anderen Methode. Die WElGERT'sche Färbung hat daher alle früher üblichen Behandlungen, namentlich die Vergoldungen, vollständig verdrängt. Der einzige Übelstand, der dem Verfahren anhaftet, ist, dafs die Schnitte in Hämatoxylin brüchig werden. Zur Vermeidung desselben ist von dem gleichen Autor die in Kap. IV sub e beschriebene Kollo- diummethode angegeben. Um, wenn es notwendig sein sollte, noch eine Kernfärbung zu erhalten, kann man die in Ferridcyankalium entfärbten Schnitte in Alaunkarmin nachfärben. 20) PAL'selie Hämatoxylini11rl)Uiig-. Als eine Modifikation der WElGERT'schen Färbung ist die von Pal anzusehen, zu deren Aus- führung, da dieselbe mit Sekunden rechnet, es notwendig ist. die K:ip. \'. Die Mothodon der Färbung. 47 eiiizcliieii Schnitte mit Kollodium mich Weiuert (Kap. iV sub e) uiieimiiuk-r zu kleben. Die Sciinitto vom Zt'iifri(/ii('rrens//sfr)n kommen in eine '/, "'„, licil's bereitete, iräsKrn/c JlüuKifoji/liiUösirtK/, der nach dem Erkalten A//,<)hol, etwa im Verhältnis wie es Wki<;E1M' aiigegel)en, zugesetzt wird; auf je lOO ccm. werden dann noch 2 ccni. />((/( i/cxäftigfer icässrif/er Lithion cayhonicnin-Löiiumj zugeliigt. Nach der Färbung, also nach etwa 5 — 6 Stunden wird in Wasser, dem etwas Lithion carboni- cum zugesetzt ist, abgewaschen. Darauf kommen die Schnitte für 15 — 20 Sekunden in eine '/4 "/o Lösung von Kali hypermanganicum und dannn bis zur vollständigen Entfärbung des Zwischengewebes in folgende J'JiitfärbiOKjsflfissifjkeif : 1 gr. Acidum oxalicum, 1 gr. Kali sulfurosum in 200 ccm. Aqua destillata gelöst. Man kann zur Kern- tinktion in Alaunkarmin nachfärben. Die markhaltigen Nervenfasern sind hellblau und heben sich scharf von den Zellen und rot gefärbten Kernen ab. 21) KULTSCHlTZKY'sche Hämatoxyliiil'äilniug. In eine Mischung von 20 ccm. einer gesättigten Borsäurelösung und 80 ccm. destillierten Wassers giefst man 1 gr. in einer geringen Quantität absoluten Al- kohols gelösten Hämatoxylins. Die Lösung braucht 2 — 3 Wochen zum Ausreifen und ist dann erst brauchbar. Vor Anwendung tut man 2—3 Tropfen Essigsäure in ein Uhrschälchen voll dieser Lösung. Für ZentraJnervensysteni, das in MÜLLEK'scher oder ERLiCKl'sciier Flüssig- keit fixiert, in Alkohol erhärtet und in Celloidin eingebettet war. Die Schnitte bleiben in der Lösung 18 — 24 Stunden, dann Abwaschen in Alkohol. Die markhaltigen Nervenfasern sind ausschliefslich und zwar blau gefärbt, alles übrige fast farblos oder leicht gelblich. Be- dingung für das Gelingen der Färbung ist die Ansäuerung mit Essig- säure. Noch einfacher ist folgende Mischung desselben Autors, die den gleichen Effekt haben soll. 2 "/,, Essigsäure 100 ccm, Hämatoxylin, in einer keinen Quantität absoluten Alkohols gelöst, 1 gr. Diese Mischung braucht sehr lange Zeit zum Ausreifen. Darin Färben bis 24 Stunden, Auswaschen in Alkohol. Für Zentralnervensystem der Wirbeltiere. ;•. Anilinfarben. Seit Waldeyer und Frey im Jahre 1863 gleichzeitig und unabhängig voneinander das Fuchsin für histiologische Zwecke zuerst verwandten, sind eine Überfülle von Anilinstoffen von verschiedensten Forschern empfohlen worden, so dafs wir gegenwärtig daran an einem embarras de richesse leiden. Mit wenigen Ausnahmen habe ich alle geprüft, will aber in den folgenden Zeilen nur diejenigen anführen, die meines Erachtens wirklich histiologisch verwertbare Resultate geben. Manche Stoffe, die vielleicht für bakteriologische Untersuchungen von Wert sind oder bei pathologischen Präparaten brauchbare Bilder liefern, sind doch für histiologische Zwecke sensu strictiori nicht sehr geeignet. Teils darum, weil bei ihrer Anw^endung so überaus penibel verfahren werden mufs, wie z. B. bei der noch zu erwähnenden Gentianaviolettfärbung nach BizzüZZERO und VassälE, teils weil die mit einigen Farben erhaltenen Bilder nicht dauerhaft sind und in nichts die Tinktionen übertreffen, die man mit anderen haltbaren Anilinstoffen erhält. Zu den letzteren, nur wenig verwert- baren Anilinen rechne ich die grünen, zu den ersteren, den umständ- lichen, die violetten Fnrlion. Alle beide sind aber auch noch dadurch 48 i- Abschnitt. Die Methoden der l^ntei-suchung. ausgezeichnet, dai's sie weit mehr Neigung zeigen, die Hände des Arbeitenden ziemlich waschecht zu färben, als im Präparate den ge- wünschten Effekt hervorzubringen. Die Methode der Anilinfärbung ist zuerst durch E. Heiümaxn und FlemminG und durch Eiiklich gründlich ausgearbeitet worden, von den ersteren für histiologische , von dem letzteren namentlich für bakteriologische Zwecke. Das Prinzip ist kurz das der maxi- malen ÜberfärbiDKj und der darauf folgenden maximalen Entfärbung. E. Hermanis' und Flemming haben das Verfahren so entwickelt, dafs sie in alkoholischen, zum Gebrauch mit Wasser verdünnten Lösungen färbten und dann so lange in Alkohol extrahierten, bis keine Farbstoff- wolken mehr aus dem Präparat entwichen. Sie erhielten dann reine und dauerhafte Kernfärbungen, in denen die Kernstrukturen auf das deut- lichste sichtbar gemacht waren. So verfahre ich nur, wenn ich Fuchsin und Safranin verwende. Sonst aber stelle ich mir eine konzentrierte wässrige Lösung des betreffenden Farbstoffes dar, färbe in demselben 24 Stunden lang, wasche dann flüchtig in Wasser ab und ziehe nun mit Alkohol von 96 % aus, so lange noch Farbstoff* ausgeht. Der Unterschied beruht also nur darin, dafs ich rein wässrige Lösungen nehme, deren Konzentration gleichgiltig ist, denn auf eine Prise Farb- stoff mehr oder weniger kommt es tatsächlich nicht au; sonst aber ist das Vorgehen genau dasselbe, wie es im Prinzip von E. Hermann und Flemming ausgebildet worden. Die sogenannten basischen Anilinfarben, die wesentlich Kerntink- tionsmittel sind, haben noch eine Eigenschaft, die ich hier erwähnen will. Sie zeigen nämlich eine ungemeine Affinität zu Mucin. Stark mucinhaltige Organe werden in ihnen äufserst intensiv und dauerhaft gefärbt, während sie das Plasma nicht mucinhaltiger Organe ganz oder fast ganz verschonen. Sie dürften daher zur Erkennung der physiologischen Dignität mancher Drüsen, namentlich bei Evertebraten, wo das Experiment schwer ausführbar ist, von grofsem Werte sein. Wie schon im Vorwort bemerkt, beziehen sich diese Angaben nur auf die Aniline, die durch die Listitute von Dr. Grübler bezw. G. König zu erhalten sind. Namentlich ist das betreffs des Bismarck- brauns der Fall. Dieser Farbstoff, wenn ich nicht irre, aus der Berliner Anilinfabrik stammend, ist ein ganz anderer wie derjenige, der unter demselben Namen z. B. von Merk bezogen wird. Letzteres Bismarckbraun, das ich in der zoologischen Station zu Neapel kennen lernte, hat die an ersterem zu rühmenden Eigenschaften nicht. Es sollen nun zuerst die beiden meines Erachtens allein anwend- baren Plasma färbenden Anilinstoffe erwähnt werden, dann die basischen und endlich das Säurefuchsin nach der WEiGERT'schen Methode. 22) Eosiii. Färbt in konzentrierter wässriger Lösung Zellsub- stanzen, Muskeln, rote Blutkörperchen, sowie das Sekret mancher nicht mucinhaltiger Drüsen von Evertebraten tiefrot. 23) Orange (x. Färbt in gesättigter wässriger Lösung, die jedes- mal vor dem Gebrauch zu filtrieren ist, Muskeln hellgelb, Zellsub- stanzen hellorange. Orange G. in Lösung schimmelt leicht, darf daher nicht in grofsen Quantitäten vorrätig gehalten werden. Diese beiden Farbstoffe sind für sich allein nicht verwertbar, da sie eine diffuse Färbung geben, sie bilden aber für Doppelfärbungen eine ganz vorzügliche Grundlage. Die vorhergegangene Methode der Kap. V. Die Mpthodcn der Fiirbunp:. 49 Fi: 'eriins übt auf dio Kih-bharkoit im allf:j('iiioincii keinen Einflufs, nui Flkmming'scIu'. Lüsuu}.,' und Clirümsäurc hindern ein wenig daf: Ang^-eifen des Farbstoftes. Die haxisrlirii Aniliiifai'lxMi. 24) 15isinar(*kl>rauii. Tu konzentrierter wässriger Lösung wird das Präparat 24 Stunden lang gelassen, dann flüchtig in AV asser ab- gewaschen und so lange in Alkohol von 96"/,, extrahiert, bis kein Farbstoff mehr entweicht. Färbt Kerne und raucinhaltige Drüsen, namentlich mit Sekret gefüllte Becherzellen dunkelbraun. Das Plasma der Zellen wird hellbraun, ebenso Eindegewebsfibrillen, Muskeln, glatte und (luergestreifte , sowie das Plasma gewisser Drüsen von Evertebraten. die vielleicht alsEiweifsdrüsen zu betrachten sind, werden strohgelb. Einer der vorzüglichsten Farbstoffe, für dessen Anwendung die vorhergegangene Fixierungsmethode meist gleichgültig ist; nur FLEiMMlNG'sche Lösung macht ihn unwirksam, 25) Dahlia. Nach Ehrlich für Mastzellen in folgender Weise anzuwenden: Alkohol absolutus 50 ccm, Aqua destillata 100 ccm, Acetum glaciale 12Vo ccm, Dahlia bis zur Sättigung. Die Schnitte, die nur von Präparaten genommen werden dürfen, die in absolutem Alkohol fixiert waren, kommen für., mindestens 12 Stunden in die Lösung. Einlegen in Terpentin. Über diesen Farbstoff habe ich keine Erfahrung. 26) Fuelisiii; Frey. Fuchsin 0,01 gr. in Aqua destillata 15 ccm. und 20 — 25 Tropfen Alkohol absolutus gelöst, Griebt für meinen Ge- schmack keine sehr schönen Bilder. 27) Fuchsin ; E. HERMANN, von Flemming empfohlen. 0,25 gr. Fuchsin werden in 20 ccm. 96 7o Alkohol und 20 ccm. destillierten Wassers gelöst. Nach vollendeter Färbung wird so lange in Alko- hol absolutus extrahiert, bis keine Farbstoffwolken mehr entweichen. Reine Kernfärbung, 28) Verdünnte alkoliolisclie Fiicbsinlösung. In meiner Erst- lingsarbeit habe ich zur Darstellung der RANViER'schen Einschnürungen folgendes Verfahren empfohlen. 6 — 7 Tropfen einer 4 % alkoho- lischen Fuchsinlösung werden in ein Uhrschälchen mit destilliertem Wasser gegeben. Dahinein kommen die frischen Nerven auf 4 — 24 Stunden und werden dann ausgewaschen. Die RANViER'sche Ein- schnürung tritt an Zupfpräparaten als dunkelbraunroter Ring plastisch hervor, der Axencylinder ist tiefrot, der doppelte Kontur hellrosa. Ich kann auch heute noch diese Methode warm empfehlen. Die Prä- parate sind nicht haltbar. 29) OentianaTiolett. Nach Bizzozzero und Vassale verfährt man folgendermafsen : Die Objekte werden in absolutem Alkohol fixiert. Die Schnitte kommen in die EiiRLicii'sche Gentianaviolett- lösung, die nachstehende Zusammensetzung hat: Gentianaviolett 1 gr, Alkohol 15 ccm, Anilinöl 2 ccm. Aqua destillata 15 ccm. Darin verweilen die Schnitte 5 — 10 Minuten. Darauf werden sie 5 Sekun- den lang in absolutem Alkohol abgewaschen und kommen für 2 Minuten in eine Jodjodkaliumlösung: Jod 1 gr, Jodkalium 2 gr, Aqua destil- lata 300 ccm. Darauf für 20 Sekunden in absoluten Alkohol, dann für 30 Sekunden in Chromsäure 1 pro mille, dann 15 Sekunden in 4 50 !• Abschnitt. Die Methoden der Untt-rsuchunf/. absoluten Alkohol, dann 30 Sekunden in Chiunisäure 1 pro mille, dann 60 Sekunden in absoluten Alkohol und endlich Aufhellen in Nelkenöl. Man erhält reine Kerntinktion ; umständlicher al)er kann wohl eine Methode nicht sein, denn bis zum Aufhellen sind nicht weniger als 8 meist nur wenige Sekunden währende Operationen nötig... Ahnlich wie Gentianaviolett wirkt Metliijlvloleü B extra. 30) NigTOsiii. Nach SaisKEY (citiert nach Behkens) für Zentral- nervensystem in folgender Lösung brauchbar: Nigrosin 0,5 gr, Alko- hol 99 ccm , Wasser 1 — 2 ccm. Die Tinktion erfolgt in wenigen Minuten ; die Schnitte kommen nach dem Auswaschen in eine Chloral- hydratlösung oder auch in eine Lösung von Lithium carbonicum. Über diesen Farbstoff habe ich nur geringe eigne Erfahrung. 31) Safraniu. Flemming, wie ich durch diesen Forscher brief- lich belehrt wurde, nicht Pfitznee, wie BeiieenS angiebt, hat den Farbstoff zuerst empfohlen, und zwar in alkoJioliscJier Lösung, von der ein kleines Quantum zum jedesmaligen Gebrauche halb mit destillier- tem Wasser zu verdünnen ist. Die Schnitte werden nach vollendeter Färbung so lange in 96 *% Alkohol extrahiert, bis sie ein in der gewählten Farbe durchscheinendes Aussehen bekommen haben. Vorzügliches Kernfärbemittel, macht namentlich, besser als Bismarckbraun , die mitotischen Stadien sehr deutlich, zeigt aufserdem dieselbe Mucin- reaktion, wie Bismarckbraun, wenn auch nicht so prägnant. Bei einigen Autoren finde ich die Angabe, dafs Safraninpräparate in salz- saurem Alkohol ausgewaschen werden sollen. Bei meinem Safranin hat mir ein derartiges Verfahren stets die Färbung verdorben, indem nunmehr ein schmutzig violetter, statt des schönen, flammendroten Tones vorhanden war. Stets salzsauren Alkohol zur Extraktion zu verwenden, ist daher entschieden abzuraten. Überhaupt ist Safranin, soweit ich diesen Farbstoff kennen gelernt habe, äufserst säureempfind- lich, ganz im Gegensatze zu Bismarckbraun. Pikrinsalpetersäure- präparate oder Präparate aus Flemmings'cher Lösung, für welch' letztere namentlich das Safranin ganz ausgezeichnet ist, müssen absolut säurefrei sein, sonst erhält man schmierige und darum unbrauchbare Färbungen. 32) Säurefuchsiu ; Weigert. Mit dieser, jetzt wegen ihrer Um- ständlichkeit fast ganz verlassenen, Methode erhält man sehr schöne Bilder der Nervenfasern im Gehirn. Die Methode ist folgende: Die Schnitte von Gehirnen, die in MüLLER'scher Lösung fixiert und nach- her in Alkohol gehärtet waren, kommen auf Stunden oder Tage in eine gesättigte wässrige Lösung von Säurefuchsin. Dann werden sie in Wasser abgespült und kommen in eine alkoholische Kalilösung. Diese letztere stellt man sich so dar, dafs man in 100 ccm Alkohol absolutus 1 gr. Kali causticum fusum wirft, 24 Stunden wartet, bis das, was löslich ist, gelöst ist. Von dieser Stammflüssigkeit verdünnt man 10 ccm. mit 100 ccm. Alkohol absolutus. In dieser Verdünnung wird der Schnitt bewegt, wobei er sofort Farbstoff verliert; das Be- wegen wird so lange fortgesetzt, bis die graue Substanz hervortritt. Dann wird wiederholt in reinem Wasser abgewaschen, bis keine Farb- stoffwolken mehr ausgehen. Die Färbung ist gelungen, wenn die weifse Substanz rot, die graue hell ist. Nttr die Nervenfasern sind dann gefärbt. Kap. V. Die Methoden der Färbung. 51 (V. Do p pr H'ä rl) u II i;<'ii. 33) llämatoxyliii- Karmin; Stkelzoff (citieit nach Fkev). Nur geeignet für Priii)arate sich entwickelnder, vorher entkalkter Knochen. Schnitte, in Alaunhämatoxylin j,'efärht, werden in destilliertem Wasser ausgewaschen und dann in eine möglichst ammoniak;unie Karmin- lösung gebracht. Sic werden wiederum ausgewaschen und können noch- mals in dünne Alaunlösung gebracht werden, Knorpel blau, Knochen rot. Die Präparate sind nicht haltbar. 34) Pikrokarmlii; llANVlER. Der französische Histiologe hat zuerst diese Dopi)elfärbung ersonnen, die viel gelobt und angewendet wird. Ich mufs often gestehen , dafs mir die knallrote Färbung der Kerne, die jedes Ötrukturbild derselben verdeckt, nicht sehr sympathisch ist, und dafs mir ferner sowohl bei dieser wie bei den noch zu er- wähnenden Modifikationen des RANViFJt'schen Prinzipes die Doppel- färbung ziemlich problematisch erscheint. Das Pikrin entweicht meistens rapide aus dem Gewebe, mag man nun in Wasser auswaschen oder direkt in Alkohol bringen, was immer bedenklich ist, da sich dann leicht amorphe Karminniederschläge bilden. Am rationellsten ist es noch Karmiupräparate in Alkohol zu entwässern, dem eine Spur Pikrinsäure beigesetzt ist, oder in Karmin durchgefärbte Präparate mit einem Terpentin aufzuhellen, in welchem man Pikrin in beliebiger Menge gelöst hat. Die RANViER'sche Vorschrift nun lautet folgermafsen : In eine ammoniakalische Karmiulösung wird kalt gesättigte wässrige Pikrin- lösung eingetragen und das Gemisch auf % des Volumens eingedampft. Nach dem Abkühlen wird filtriert und wieder abgedampft, bis das Pikrokarmin als krystallinisches Pulver ausfällt. Mit einer 1 % wäss- rigen Lösung dieses Pulvers wird gefärbt. Die Vorbehandlung der Präparate ist gleichgiltig. 35) Pikrokarmin; Weigert (citiert nach Behrens). Zu 2 gr. Karmin kommen 4 ccm. Ammoniak; nach 24 Stunden werden 200 ccm. kalt gesättigter wässriger Pikrinlösung hinzugefügt. Nach ferneren 24 Stunden Essigsäurezusatz, bis ein stärkerer Niederschlag entsteht, dann wird Ammoniak tropfenweise zugefügt, bis die Lösung klar ist. 36) Pikrokarmin (citiert nach Stöhr). Zu 50 ccm. Aqua destillata werden 5 ccm. liquor ammonii caustici gegossen und 1 gr. besten Karmins hineingeschüttet. Das Karmin ist nach etwa 5 Minuten gelöst. Jetzt giefst man 50 ccm. gesättigter wässriger Pikrinlösung zu und läfst die Mischung 2 Tage in weit offenem Gefäfse stehen ; dann wird filtriert. Selbst reichliche Pilzentwickelung vernichtet nicht die Färbekraft des Reagens. 36a) Pikrokarmin; HOYER. 1 gr. Karmin wird in einer Mischung von circa 1 — 2 ccm. starker Ammoniaklösung und 6—8 ccm. Wasser gelöst und in einem Glaskolben im Sandbade so lange erwärmt, bis das überschüssige Ammoniak sich verflüchtigt hat. Man erkennt das Eintreten der Verflüchtigung daran, dafs in der erwärmten Flüssig- keit kleine Bläschen aufsteigen und die Farbennuance heUrot ist. Nach dem Erkalten wird filtriert. Zu dieser neutralen Karminlösung wird das 4 — 6 fache Volumen starken Alkohols zugesetzt; dadurch entsteht ein hellroter Niederschlag. Man filtriert, wäscht den auf dem Filter 4* 52 I- Abschnitt. Die Methoden der Untersuchunpr, zurückbleibenden Niederschlag und trocknet ihn zu einem Fultcr oder bereitet durch Übergiefseu mit Alkohol, in welchem etwas Glycerin und Chloral gelöst ist, eine Paste. Man löst nun, um Pikrokarmin zu erhalten, Pulver oder Paste in einer konzentrierten Solution von neutralem pikrinsauren Ammoniak. Die grofse Umständlichkeit, mit der dieses Pikrokarmin herzustellen ist, läfst es ratsam erscheinen, dasselbe durch das GRÜBLEK'sche Institut, welches es in Pulverform oder Lösung liefert, zu beziehen. 37) Pikrolithioiikarmiii ; Orth. Zu 1 Teil einer 2,5 "/^ Lithion- karminlösung, die nach der unter Nr. 2 in diesem Kap. angegebenen Vorschrift angefertigt worden, werden 2 — 3 Teile kalt gesättigter wässriger Pikrinsäurelösung hinzugefügt. Sollte eine von beiden Farbennuancen zu sehr vorwiegen, so kann man beliebig von der minder hervoi'tretenden Lösung zusetzen. Die Pikrokarmine färben die Zellkerne knallrot. Epithel- und Drüsenzellen sowie Muskeln gelb, Bindegewebe gar nicht. 38) Boraxkarmiii-Iiidigcarmin; NoRRis xiiul Shakespeare (citiert nach Behrens). Man macht durch Kochen eine Lösung von 2 gr. Karmin, 8 gr. Borax und 130 ccm. Aqua destillata, und eine zweite von 8 gr. Lidigcarmin, 8 gr. Borax und 130 ccm. Aqua destil- lata. Nach dem Erkalten filtriert man beide und mischt sie zu gleichen Teilen. Schnitte von Alkohol-, Pikrinsalpetersäure- oder Sublimat- präparaten werden 24 Stunden in der Mischung gefärbt, kommen dann direkt in kalt gesättigte Oxalsäurelösung für 15 — 20 Minuten, werden gut ausgewaschen und weiter behandelt. Vor der Oxalsäureeinwirkung dürfen die Schnitte nicht mit Wasser in Berührung kommen , weil sonst das Indigkarmin entweicht. Aus demselben Grunde darf keine dünne Oxalsäure genommen werden. Das Resultat der Färbung ist ein ganz ausgezeichnetes. Die Kerne sind tiefrot, die Bindegewebsfibrillen hellrot, das Plasma der Epethilien grünlich, und Muskeln, glatte wie quergestreifte, leuchtend blaugrün. Namentlich zur Unterscheidung von Muskelfasern und Bindegewebsfibrillen bei Wirbellosen erhält man höchst instruktive Bilder. Ich kann diese Färbungsmethode auf das angelegentlichste empfehlen. Die Mischung hält sich längere Zeit. 39) Hämatoxyliii-Safraiüii ; Rabl. Zum Studium der ZellfeilungS' figuren hat Rabl folgende FärWng empfohlen. Präparate, die in Chromameisensäure fixiert sind (cfr. Kap. II Nr. 4), färbt dieser Forscher zuerst in DELAFlELD'schem Hämotoxylin so schwach, dafs sie ohne weiteres nicht brauchbar sind. Sie werden gut in Wasser ausgewaschen und kommen in Safranin. Dieses wird so dargestellt, dafs man in überschüssiger Menge den Farbstoff in absoluten Alkohol giebt, tüchtig umrührt, abfiltriert und das Filtrat mit dergleichen Menge Wasser verdünnt — also im wesentlichen FLEiAmiXG'sche Safranin- lösung. Hierin bleiben die Präparate 24 Stunden und werden dann so lange in Alkohol absolutus extrahiert, bis kein Farbstoff mehr ent- weicht. 40) Eosin-Aiiiliiigrüii. Diese Doppelfärbung ist von Schieffer- DECKER zur Darstellung der Plasmastrukturen der Drüsenzellen em- pfohlen worden, 41) Eosiii-Hämatoxyliii; RENAUT (citiert nach Fol). Konzen- trierte wässrige Eosinlösung 30 ccm, abgestandene gesättigte Auf- Kap. V. Pie Metlioden der Färbung. 53 löisung von Hümatoxyliii in Alkohol 40 ccm, mit Kalialaun gesättigtes Glycerin 130 ccm. Die Mischung mufs 5 — 6 Wochen in einem mit durchlöchertem Paj)ier hedeckten Gefäfse stehen . bis der Alkohol verdunstet ist, dann filtriert man. Beim Gebrauch wird mit 1 — 2 Teilen reinen Glycorins verdünnt. Zur Entwässerung der Schnitte wird eosin- haltiger Alkohol genommen. 42) Eosin-irämatoxylin. Seit Jahren verfahre ich bei dieser Doppeltärl)ung folgendermafsen: Die Schnitte werden 24 Stunden lang in konzentrierter wässriger Eosinlösung gefärbt. Darauf kommen sie nach tlüchtigem Abwaschen in destilliertem Wasser für 2 — 5 Minuten in BöllMER'sches, FREY'sches oder niei)i Hämatoxylin, werden nach dieser Zeit 20—25 Minuten in geuöhnUchem Wasser gewaschen und dann in reinem 96 '"o Alkohol extrahiert , bis kein Eosin mehr ent- weicht. Hiermit habe ich nach fast jeder Fixierungsmethode, aus- genommen reine Chromsäure, ganz vorzügliche Präparate bekommen, die sich Jahre lang gehalten haben. Das Eosiu, das ich stets ver- wendete, ist sehr beständig bei dieser Methode, färbt Muskeln, Zell- plasma, gewisse Drüsensekrete bei Evertebraten intensiv rot, die Kerne sind dunkelblau. Bindegewebe graublau. Läfst man die Schnitte zu lange in der Hämatoxylinlösung, so verdrängt die Hämatoxylin- färbung etwas die des Eosins. Färbt man umgekehrt, erst mit Häma- toxylin. dann mit Eosin. so sind die Resultate sehr viel schlechter, denn nunmehr geht das Eosin nicht mehr an die Gewebteile heran und wird, wenn man reinen Alkohol nimmt, fast ganz ausgezogen. Ich kann daher nur dringend anraten , sich meines zweizeitigen Ver- fahrens zu bedienen. Mifserfolge mit demselben sind nach meinen Er- fahnmgen absolut ausgeschlossen. 43) Orange Gr-Hämatoxylin. Seit einiger Zeit habe ich diese Farbstoffkombination bei Pikrinsalpetersäure- . Pikrinschwefelsäure-, Sublimat- und Alkoholpräparateu angewendet und damit ganz aus- gezeichnete Bilder erhalten. Die Schnitte kommen für 24 Stunden in eine gesättigte wässrige Lösung von Orange G, werden nach ganz flüchtigem Abwaschen in destilliertem Wasser auf 2 — 5 Minuten in BöHMER'sches, FREY'sches oder mein Hämatoxylin übergeführt. Danach werden sie 20 — 25 Minuten in (jeiiöJinJ ichern Wasser abgewaschen und in Alkohol von 96 " „ extrahiert. Zu lange darf vor der Häma- toxylinanwendung nicht ausgewaschen werden, da sonst das Orange G fast völlig entweicht. Muskeln, glatte und quere, hellgelb; Drüsen- plasma und Drüsensekret gewisser Drüsen von Evertebraten, sowie Knochengrundsubstanz orangefarben; Bindesubstanz leicht blaugrau; Drüsenplasma mucinhaltiger Drüsen und sekretgefüllte Becherzellen, sowie Knorpelgrundsubstanz veilchenblau; Kerne dunkelblau. Die Färbung ist sehr viel zarter und distinkter als nach Eosin-Häma- toxylin . hat lange nicht das massive Aussehen wie letztere und ist für das Auge sehr sympathisch. Bei rein epithelialen Bildungen steht sie allerdings der vorigen Doppelfärbung nach. Ich kann diese Kom- bination ah ganz vorzüglich empfehlen. 6. Drei fachfjirl) uiiir eil. 44) Pikrokariniii-Hämatoxyliii; FlfmmiXG. Hautschnitte yf erden bis zu 24 Stunden in eine mittelstarke Pikrokarminlösung getan, dann für einige Stunden in DELAFiELD'sches Hämatoxylin. Nach 54 I- Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung. Waschen in Wasser Weiterbehandlung, wie sie im folgenden Kapitel beschrieben werden wird. Das Bindegewebe ist rosa, die Muskeln gelbrötlich, ebenso die Zellkörper, die Zellkerne dunkelpurpurn bis violett, die hornige Substanz des Haares pikringelb, die innere Wurzel- scheide, soweit sie vorhanden, brillant lichtblau. Blaschko hat für das gleiche Gebilde dieselbe Korabination angewandt, nur dafs er BöllMER'sches Hämatoxylin nahm. In den BLASCHKO'schen Präparaten ist das Stratum lucidum grün. 45) Orange (>-Säurefuelism-NethylgTÜii; Ehhlich-Biondi. Eine von Eiiklich angegebene Methode der Färbung mit den drei Stoffen ist von BiONDl etwas modifiziert und dann durch Heiden- HAIN bekannter geworden. Die Mischung wird hergestellt aus 100 ccm. wässriger Orange G-lösung, 20 ccm. gesättigter wässriger Säurefuchsin- lösung und 50 ccm. gesättigter wässriger Methylgrünlösung. Letztere wird unter stetem Umrühren in die Mischung der ersteren beiden eingetragen. Zum Gebrauch wird ein Quantum der Losung mit dem 60 — 100 fachen an destilliertem Wasser verdünnt; die Dauer der Ein- wirkung ist 24 Stunden. Für Sublimat-, weniger für Pikrinsalpeter- säurepräparate zu verwenden. Nach dem Färben wird flüchtig in Wasser abgewaschen und in Alkohol von 96% extrahiert, bis keine Farbstoffwolken mehr entweichen. Da es sehr schwer ist, für diese Lösung die richtigen Konzentrationen der einzelnen Bestandteile zu treffen, so tut man am besten, das EHRLiCH-BiONDi'sche Gemisch durch das GRÜBLER'sche Institut zu beziehen. Kap. VI. Das Aufheben der Präparate. Präparate, die ohne weitere Vorbereitung von frischem Materiale angefertigt und in indifferenten Flüssigkeiten untersucht wurden, sind aus leicht ersichtlichen Gründen einer dauernden Aufbewahrung nicht fähig. Das Gleiche gilt von Zupfpräparaten, die man nach kürzerem oder längerem Verweilen in einer der in Kap. I beschriebenen Isola- tionsflüssigkeiten hergestellt und keiner weiteren Nachbehandlung unterworfen hat. Nur Osmium-, Gold- und Silberpräparate und Prä- parate, die man nach der Mazeration in irgend einer Weise gefärbt hat, lassen sich aufheben. Manchmal erhalten sie sich Jahre lang gut; häufig aber gehen sie schon nach kurzer Zeit, nach einigen Mo- naten zu Grunde, Als Aufbewahrungsmittel ist am beliebtesten das 1) (rlyceriii. Gefärbte Objekte zerzupft man, nachdem sie aus- gewaschen sind, entweder in reinem oder halb mit destilliertem Wasser verdünntem Glycerin. Das reine Glycerin hat viele Nachteile. Ein- mal macht es die Präparate zu durchsichtig, so dafs namentlich feinere Strukturen dadurch verschwinden. Dann entzieht es den Geweben zu viel Wasser und bewirkt dadurch nachträglich mehr oder minder be- deutende , das Präparat wertlos machende Schrumpfungen. Endlich drittens zieht es namentlich die Anilinfarben, aber auch das Häma- toxylin sehr stark aus , so dafs Präparate , die beim Einlegen eine ziemlich intensive Tinktion zeigten, nach kurzer Zeit völlig abgeblafst sind. Viel besser ist es daher, halb mit Wasser verdünntes, statt reines Glycerin zu nehmen. K;n). \'l. iJas Auilicbeii der i'räparatc. 55 Bei der Anwendung hat man in erster Linie zu beachten, dafs man den Tropfen, in dem die Zerzuplung vorgenommen wird, nicht zu klein und nicht /u grofs nimmt. Hat man zu viel Glycerin ge- nommen, so schwimmt heim Auflegen des Deckglases das Zerzupfte nach allen Ivichtungen auseinander und das Glycerin tritt über den Rand des^^ -'•::;lases hervor, wodurch das Umranden fast zur Unmög- lichkeit wird. Hat man zu wenig genornnuMi, so treten beim Auflegen des Deckglases eine Unmenge kleinster Luftblasen im Präparate auf, welche dessen schnelles Verderben herbeiführen. Das richtige Mafs zwischen beiden Extremen zu finden ist nicht leicht, dazu bedarf es vieler Übung. 2) 50'"„ Kali aceticuin. Statt des Glycerins sollte man sich mehr der von Max Schultzk empfohlenen 50 "/<, wässrigen Lösung des Kali aceticum bedienen. Es besitzt alle Vorteile des reinen und verdümiten Glycerins. ohne an dessen Übelständen Anteil zu haben; namentlich Osmiumzupfpräparate halten sich in ihm viel besser, als in Glycerin. Anilinfarben blassen aber mit der Zeit auch aus. Präparate, die in Glycerin oder Kali aceticum zerzupft sind, sogenannte feuclite Präparate, können indessen nicht so ohne weiteres aufbewahrt werden, weil bei der geringsten Neigung, die man dem Objektträger zur Horizontalen gäbe, die Deckgläser wegschwimmen würden. Zur dauernden Aufbewahrung müssen solche Präparate noch umrandei werden. Die einfachste Methode zu diesem Behufe, wie ich sie seinerzeit durch meinen verstorbenen Lehrer Dr. Karl Saciis kennen lernte, ist die 3) Umrandung mit Wachs. Man nimmt ein dünnes Wachslicht, zündet es für einen Augenblick an, so dafs das im Dochte enthaltene Wachs schmilzt, löscht aus und fährt nun rasch mit dem noch warmen Dochte an dem Rande des Deckglases hin. Der Docht hinterläfst einen schnell erstarrenden Streifen Wachs, welcher das Deckglas an dem Objektträger befestigt, vorausgesetzt, dafs man so umrandet hat, dafs der Wachsstreifen zur Hälfte auf dem Deckglase, zur Hälfte auf dem Objektträger ruht. Man setzt die Prozedur des Anzündens, Auslöschens und Aufstreichens so lange fort, bis ein ge- nügend breiter Rahmen von Wachs das Deckglas fixiert. Solcher Art hergestellte Präparate halten sich sehr lange. 4) Asplialtlaclf. Er stellt eine Auflösung von Asphalt in Lein- und Terpentinöl dar und kommt in dieser Form im Handel vor. Trocknet schwer und wird leicht spröde, ist daher wenig empfehlenswert. 5) Masicenlacli. Er ist eine alkoholische Lösung, deren Zusammen- setzung ich nicht kenne. Er ist viel besser als Asphaltlack, da er sehr schnell hart wird, ohne zu springen. Im Handel vorrätig. 6) KRÖNIG'sche Masse. Dieselbe besteht aus weifsem Wachs 2 Teilen und Kolophonium 9 Teilen, welche in der Wärme vereinigt werden. Die nach dem Erkalten harte Masse wird mit heifsgemachter Messerklinge auf den Rand des Deckglases aufgetragen. Nächst Maskenlack eins der besten Umrandungsmittel, da es sich gut an- legt, schnell erstarrt und nicht brüchig wird. Aufser den genannten gibt es noch eine grofse Menge von söge- 56 -t- Abschnitt, Die Methoden der Untersuchung. nannten Verschlufslacken, auf deren Anführung ich aber verzichte, da dieselben allgemeinere Verwendung kaum gefunden haben. Präparate . die von gehärtetem Materiale gemacht wurden . in einer der im vorigen Kapitel angegebenen Weisen gefärbt sind und nunmehr dauernd aufbewahrt werden sollen, werden wohl nur in den allerseltensten Fällen in Glycerin oder 50"/(, Kali aceticum aufge- hoben. Zu dem Zwecke nimmt man vielmehr Kanadabalsam oder Dammarharz. Ehe sie aber mit einem von beiden Mitteln durchtränkt werden können, müssen noch einige Manipulationen mit ihnen vorgenommen werden. Schnittpräparate, die mit wässrigen oder alkoholischen Farb- stofflösungen gefärbt wurden, werden zunächst in absolutem Alkohol oder Alkohol von 96 "/o sorgfältig entwässert. Celloidinschnitte dürfen nicht zu lange in dem Alkohol weilen, weil sonst das Celloidin leicht schmierig wird. Nach der Entwässrung können sie direkt in Balsam übertragen werden. Doch ist das nicht ganz ungefährlich; denn ist auch nur eine Spur von Wasser im Präparat noch vorhanden, so dringt der Balsam nicht ein und das. .Präparat ist dann verdorben. Man mufs daher durch ein ätherisches Ol den Alkohol erst austreiben und den Schnitt durchsichtig machen. Das hierfür mit Recht belieb- teste Ol ist das 7) Nelkenöl. Man bewahrt dasselbe am besten in einer Flasche auf, in welche eine Pipette als Glasstöpsel eingeschliffen ist. Deck- gläser, auf denen Schnitte aufgeklebt sind, nimmt man aus dem Alkohol und legt sie auf ein kleines Uhrschälchen so auf, dafs die Schnitte nach oben kommen und die vier Ecken nur lose auf dem Schälchen ruhen, das ganze Deckglas also hohl liegt. Dann gibt man mit der Stöpselpipette einige Tropfen Nelkenöl auf die Schnitte. Nach kurzer Zeit sind letztere durchsichtig geworden. Man saugt dann das Ol möglichst vollständig mit der Stöpselpipette weg. trock- net noch einmal vorsichtig mit Fliefspapier ab und legt das Präpa- rat auf den Objektträger, auf den man vorher einen Tropfen Kanada- balsam oder Dammarlack getan hat. Schlägt sich, wie das zuweilen geschieht, etwas Nelkenöl auf der Oberseite des Deckglases nunmehr nieder, so wartet man. bis Balsam oder Lack trocken geworden sind, und reibt dann vorsichtig mit einem Leinwandlappen ab . auf den man eine Spur Alkohol gebracht hat. 8) Kreosot. Dieser Stoff hat vor dem Nelkenöl nur das eine vor- aus, dafs er noch wasserhaltige Schnitte aufhellt, ist aber sonst wenig empfehlenswert, da er vielfach Schrumpfungen hervorruft. 9) Bergamottöl. -Dieses sehr angnehm riechende Öl dient vor- zugsweise aio- ^4^/"//^//^«^ ?;ow Celloiditischnitten. die aus 95'^,^ oder 96% Alkohol in dasselbe übertragen werden. Nachdem man die Schnitte, die nicht aufgeklebt sind, auf den Objektträger gebracht hat, giebt man auf dieselben einen Tropfen Kanadabalsam oder Dammarlack und legt das Deckglas auf. Sehr vorteilhaft ist es, wenn man letzteres, bevor man es auflegt, ein paarmal durch die Spiritusflamme zieht, damit die an ihm haftende Feuchtigkeit entfernt wird, da dieselbe unter Umständen leicht im Präparate sich niederschlagen könnte. An Stelle von Bergamottöl hat man auch Ori(janumöl verwandt; indessen ist dasselbe nicht sehr empfehlenswert, da es sehr übel riecht und durch den Geruch leicht Kopfschmerzen hervorruft. Kap. VI. Das Aullicbeii dtr rräparale. 57 10) Xylol. Zur Aufhellung von Schnitten, die mit einer Anilin- farbe oder mit Hiimatoxyliu gefärbt sind, ziehe ich das Xylol dem Nelkenöl vor. Die Farben treten dadurch schärfer und klarer her- vor und scheinen sich besser zu halten. Man legt das Deckgläschen, welches die gut in (tbsolHfcin Alkohol entwässerten Schnitte träj,'t. in das Xylol, bringt auf den Objektträger einen Tropfen Kanada oder Dammar und deckt das Deckgläschen, nachdem die Schnitte durch- sichtig geworden, über. Das auf der Oberseite desselben vorhandene Xylol ist sehr bald verdunstet, ohne Spuren zu hinterlassen, voraus- gesetzt, dafs man vorher genügend entwässert hatte. 11) IVEIGKRT'sclio Aufhclluiis;-. Da die nach Weigekts Methode mit Kollodium aneirtaiuler geklebten Schnitte eine Entwässerung in absolutem Alkohol und eine Durchtränkung in Ol nicht vertragen, weil sich darin das Kollodium lösen würde, so bringt Weigert die Kollodiumlappen aus dem 90 " (, Alkohol in eine Mischung von 3 Volumina Xylol mit l Volumen Acidum carbolicum liquefactura. Um letzteres Reagens stets wasserfrei zu erhalten, kommt auf den Boden des Gefäfses, in dem die Mischung sich befindet, etwas ge- glühtes Cuprum sulfuricum. In der Mischung bleiben die Lappen, bis sie durchsichtig geworden sind. DurchgefHrbte Präparate, die mit der GiEöBKECHT-MAYER'schen Schellackraethode aufgeklebt sind, sind einfacher, als nachträglich gefärbte Schnitte, zu behandeln. Im Wärmekasten oder auf dem Neapler Wasserbade, wo sie sich befinden, damit die Schnitte fest anhaften, schmilzt gleichzeitig das Paraffin. Man giefst nun über den warmen Objektträger Terpentinöl, welches alles Paraffin wegnimmt, läfst ablaufen und bringt einen Tropfen Balsam auf, über den man ein Deckgläschen legt. Dasselbe mufs vorher ein Paar mal durch die Spiritusöamme gezogen werden, damit die an ihm haftende Feuch- tigkeit, welche in dem Schellack Trübungen hervorrufen könnte, schwindet. Die Deckgläser icerden so aufgelegt, dafs sie. mit einer feinen Pin- zette gefafst, zunächst nur mit einer Kante den Objektträger be- rühren, während ihre Fläche in leichter Neigung zum Objektträger zwischen den Branchen der Pinzette ruht. Indem man das Deckglas senkt und die Pinzette langsam fortzieht, bewirkt man so eine gleich- mäfsige Ausbreitung des Kanada- oder Dammartropfens und verhütet gleichzeitig den Eintritt von Luftblasen. Die zum dauernden Einschlufs bestimmten Mittel sind Kanada- balsam und Dammarlack. 12) Kauadabalsam. Man löst in einem Glasgefäfs, das mit einem ««/"geschliffnen Deckel bedeckt wird, und in dem sich ein fei- ner Grlasstab zum Auftropfen des Balsam befindet, den dickflüssigen Balsam am besten in Xylol , so dafs er ganz dünn wird und beim Herausheben des Stabes nicht mehr Faden zieht. Xylol als Lösungs- mittel ist dem Terpentin vorzuziehen, da in Terpentinljalsam difficile Farben abblassen. Dickflüssiger Terpentinbalsam ist zum Einschlufs von Knochenschliff"en empfehlenswert. Man mufs unter allen Um- ständen nur sehr wenig Balsam nehmen, nur so viel, dafs der vom Deckglase bedeckte Baum gerade ausj^efüllt ist. Nimmt man zu viel, so hat man einen doppelten Nachteil. Erstens trocknet eine solche dicke Balsamschicht sehr schwer, ist oft nach Monaten noch nicht 58 I. Abschnitt. Die Methoden der Untersuchung. fest. Und zweitens wird durch dieselbe die Beobachtung, namentlich mit starken Trockensystemen erschwert, wenn die Sclmitte nicht auf- geklebt waren (in welchem Falle zwischen ihnen und Linse nur das Deckglas ist), sondern direkt auf den Objektträger gebracht wurden. Dann hindert bei starken Systemen die Balsamschicht zuweilen die genaue Einstellung. 13) Dammarlaek. Dieses Reagens besitzt nach Flemming vor dem Kanadabalsam den Vorzug, dafs es für die Erhaltung feinerer Strukturen günstiger ist. Man bereitet sich am besten die Lösung selber; fertig gekaufter Lack wird häufig im Präparate trübe. Man löst Dammarharz, das sehr rein aussehen mufs, in einem Gemisch von Benzol und Terpentin zu gleichen Teilen in der Wärme und filtriert warm. Ist der Lack in der Flasche trotz sorgfältiger Zubereitung trübe geworden, so bringt man ihn, wie mir Professor Flemming gütigst geschrieben hat, bei 50—80° C. eine Zeitlang in den Brüt- ofen und filtriert ihn dann warm durch ein mit Chloroform benetztes Fliefspapier. Dann bleibt der Lack wieder längere Zeit klar. Kap. VII. Die Methoden der Injektion. Um die Vascularisation der einzelnen Organe genauer zu studieren, ist es notwendig, die Gefäfse dadurch sichtbar zu machen, dafs man sie mit einer farbigen, transparenten Masse erfüllt. Für diesen Zweck, die Injektion, giebt es zwei Methoden, die Einspritzung warmer und die Einspritzung kalter Flüssigkeiten, von denen die letzteren flüssig bleiben, die ersteren in der Kälte erstarren. Der modus procedendi ist dabei der, dafs man in die Hauptarterie oder in die Hauptvene eines Organes eine Kanüle einsticht und einbindet, diese dann mit einer Spritze vereinigt, deren Stempel man nun kontinuierlich, unter stets gleichem Drucke langsam vorschiebt, bis die Injektion vollendet ist, d. h. bis das betreffende Organ eine gleichmäfsige, der Farbe der Injektionsmasse entsprechende Färbung angenommen hat. Will man Arterie und Vene gleichzeitig injizieren , so hat man natürlich zwei Kanülen einzubinden, die mit zwei Spritzen in Verbindung zu setzen sind, oder kann erst die Verzweigung der Arterie, dann die der Vene mit den Injektionsmassen ausfüllen. Zur Injektion der Lymphgefäfse bedient man sich des Einstichverfahrens, Man macht dabei mit einer in die Injektionsmasse getauchten Staarnadel oder mit einer feinen, ebenfalls in die Injektionsmasse getauchten Scherenspitze einen kleinen Einstich in das Organ, schiebt in denselben, der sich als ge- färbter Punkt dokumentiert, die Kanüle vorsichtig ein und füllt so die Lymphbahnen an. Nimmt man tvarme Massen, so müssen die In- strumente die Temperatur der Massen haben und die zu injizierenden Organe in warmem Wasser liegen. Die Injektion hat selbstverständ- lich der Fixierung und Härtung voranzugehen. Von injizierten Or- ganen gemachte Schnitte kann man zur Deutlichmachung der zelligen Elemente in einem beliebigen Farbstoffe nachfärben, oder man kann das ganze injizierte OrgaTi durchfärben. Als Kanüle bedient man sich entweder der mit den käuflichen Spritzen mitgegebenen metallenen Ansätze oder feiner Glasröhren, deren eines Ende über der Stichflamme in eine kapillare Spitze aus- gezogen ist. Kap. \II. Die Metlioileii der lujekliuu. 5^ Statt (lor Spritzen, deren Stempel man mit der Hand vorschieben nuifs, wodurch zuweilen die Druckintensität geändert wird, kann man sich , namentlich bei kaltflüssif^en Massen, eines Apparates mit kon- stantem Druck bedienen. Man hat da/u zwei ffrofse Flaschen nötig, von denen jede mit einem dopi)elt durchbohrten Kork verschlossen wird. In die eine Flasche kommt die Injektionsmasse: in die eine Öffnung des zugehörigen Korkes derselben wird eine bis auf den Boden reichende, an ihrem oberen Ende rccht\viid Anwoiuliiii<>- der Methoden. 71 Eraclitoiis (Muoinsiinie. b^.KMMl.Nu'Bche Liisuiig, Pikrinsalpetersäuiu und l*ikrinosmiiiins;il|)ot('rs;iur(' (K.ip. 11 Nr. 3, 14, 20 und 21); fülcn- t'alls kann man noch, wenn es sich nur um ilic Herstellung von Ühcr- sichtshildern handelt, Mül.LKR'sche Lösung (Kap. II Nr. 8) in An- wendung nehmen. Man mufs bei Fixierung von Hautstücken auf zweii'rlei ganz hesonders achten. Erstens verkrümmen sich kleine Hautstückchen im tixierenden Reagens ganz aufserordentlich. so dafs man dann jede Möglichkeit, das Objekt richtig zu orientieren, verliert. Mehr als an jedem anderen Organe hat man daher vor dem Ein- bringen in das Reagens für eine ausreichende Befestigung auf st;irrer Unterlage zu sorgen. Zweitens durchdränkt sich die Haut sehr scliwer. man mufs daher stets viel Flüssigkeit verwenden. Der gleiche Übel- stand, das schwere Durchtränken, hat auch statt, wenn man in Paraffin einschmilzt. Ich kann für den letzteren Zweck nach meinen Erfah- rungen nur raten, die Hautstückchen, ehe sie in Chloroformparaffin kommen. 4—5 Tage in reinem Chloroform zu lassen; erst dann ist man sicher, dafs das Paraffin alle Schichten gleichmäfsig durchdringt. Will man die Fettbildung studieren, dann wird man von der Paraffin- oder Celloidinmcthode überhaupt Abstand nehmen imd die Schnitte, wie dies in Kap. III Nr. 3 angegeben wurde, feucht anfertigen müssen. Sehr empfehlenswert ist hier die Nachbehandlung des mit Flk.m.ming'- scher Lösung oder Pikrinosmiumsalpetersäure-Mischung behandelten Materiales mit rohem Holzessig nach der Methode von MÄliKENTHAL (Kap. II Nr. 16); man ist der nachträglichen Färbung der Schnitte enthoben und erhält ungemein instruktive Bilder. Zur Darstellung der Nen-e>iendi(/Mnge)i in der Haut ist die Ver- goldung anzuwenden, und zwar am zweckmäfsigsten wohl nach der FLEM.MlNü'schen Methode (Kap. II Nr. 33). Zur Sichtbarmachung des elastischen Fasernetzes ist die Versilberung frischer Hautteile vor- zunehmen. Um die Leisten der Haut zu studieren, hat BlaöCHKO einer ori- ginellen Methode sich bedient. In der Haut sogenannter faultodter Früchte lösen sich intrauterin Epidermis und Cutis voneinander, ohne dafs die Gewebselemente zerstört werden. Man reinigt die Oberhaut der Frucht und zieht dann die Haut in grofsen Lappen von der Unterlage ab. Der abgezogene Lappen wird mit der Schleim- schicbt nach oben auf einem Objektträger ausgebreitet und in halb trocknem Zustande mit BöllMER'schem Hämatoxylin (Kap. V Nr. 9) Übergossen. Nach 3 — 5 Minuten wird das Objekt abgespült und ent- weder in Glycerin untersucht oder nach Entwässerung in Alkohol, Aufhellung in Nelkenöl, in Kanadabalsam eingeschlossen, oder end- lich p.uf dem Objektträger angetrocknet. In letzterem Falle ist das Präparat nach 1 — 2 Tagen genügend trocken und kann als papier- dünne Schicht vom Objektträger abgehoben werden. Man bringt das Präparat auf einen neuen Objektträger und begiefst mit einer reichlichen Menge Kanadabalsam, der nach wenigen Tagen lufttrocken ist. Solche Präparate, die man lange aufbewahren kann, liefern be- züglich der Demonstration der Hautleisten die instruktivsten Bilder. Um die Ahsonflerungsyehikle der Haut, Haare, Nägel, Federn etc. zu untersuchen , unterwirft man sie entweder einer längeren Einwir- kung starker Säuren (Essig-, Salz-, Schwefelsäure) oder kocht sie in Alkalien (Natron-, Kalilauge). Der damit erzielte Effekt ist selbst- 72 II. Abschnitt. Die Anwendung der Methoden. verständlich ein verschiedener, worüber die Lehrbücher der Histiologie zu konsultieren sind. Um die Elemente der Haan/ch/Jde an Schnitte)! gut sichtbar zu machen, ist die Dreifachtarbung Pikrokarmin-Hämatoxylin (Kap. V Nr. 44), um die Muskelfasern der Haut deutlich hervorzuheben, ist die Doppelfärbung mit Indigkarmin-Boraxkarmin oder Orange-Häma- toxylin (Kap. V Nr. 38, 43) anzuwenden. 1. Zunge. Zur Isolation der zelligen Elemente des Geschmacksorg anes dürfte konzentrierte wässrige Oxalsäurelösung oder das HALLER'sche Ge- misch am geeignetsten sein (Kap. I Nr. 18 und 19). Zur Fixierung empfiehlt sich Chiomsäure , FLE3JMi\G'sche Lösung , Pikrinsalpeter- säure und Pikrinosmiumsalpetersäure (Kap. II Nr. 3, 14, 20, 21). Bei letzterer Methode, sowie bei Anwendung FLEiOii^G'scher Lösung liefert die Nachbehandlung mit rohem Holzessig nach MÄHEENTHAL (Kap. V Nr. 16) ausgezeichnete Bilder. Bei Fixierung und Paraffinierung von Teilen der Zunge sind genau dieselben Kautelen zu beobachten wie bei der Haut, denn auch hier durchtränken sich die Gewebs- elemente sehr schwer, sei es mit dem fixierenden Reagens, sei es mit Paraffin, während die Verkrümmung bei der Fixation in viel ge- ringerem Grade statthat. Zur Färbung von Präparaten aus Pikrin- salpetersäure kann ich die Doppelfärbung mit Orange G-Hämatoxylin (Kap. V Nr. 43) ganz besonders empfehlen: die damit erhaltenen Bilder übertreffen an Zartheit des Kolorits wie an Feinheit der Nuancen meines Erachtens alle übrigen Farbstofie bei weitem. Die Doppelfärbung mit Indigkarmin-Boraxkarmin (Kap. V Nr. 38) gibt die vorzüglichsten Bilder hinsichtlich der Muskelverteilung. m. Auge. Um Übersichtsbikler über den Bau des Sehorganes bei Vertebrafen zu empfangen . ist es gut, den ganzen Bulbus uneröffnet auf mehrere Wochen in häufig zu wechselnder MÜLLEü'scher Flüssigkeit (Kap. II Nr. 8) zu fixieren, in Alkohol nachzuhärten. mit Pikrokarmin (Kap. V Nr. 34 — 37) durchzufärben und in Celloidin (Kap. III Nr. 6j ein- zubetten. Man verzichtet dann aber auf feinere histiologische Details. Das Auge der cephaJopoden MoUusl-en kann unter gleichem Verzicht ebenso behandelt werden, die Augen der Schnecken dagegen werden durch MÜLLER'sche Lösung meist vollständig mazeriert; sie müssen vorsichtig mit dem vollständig ausgestreckten Fühler fixiert werden. Es ist aber sehr schwer, solch vollständig ausgestreckte Fühler zu erhalten, da dieselben, wenn man das Tier nicht vorher gelähmt hat. sich heftig kontrahieren, wodurch das Studium des betreffenden Or- ganes völlig unmöglich wird. Die Augen der Arthropoden dürfen eben- falls nicht mit MÜLLER'scher Flüssigkeit behandelt, sondern müssen vor der Untersuchung sorgsam fixiert werden ; bei den Tracheaten sind heifse Flüssigkeiten, bis 70 ^ C. zu l)enutzen. Bei der in den folgenden Zeilen beobachteten Einteilung will ich mich an das Auge der Vertebraten halten. a. Cornea. Die Hornhaut eines Frosches wird frisch in eine 0,5 — 1 o/o Lösung eines Eisenoxydulsalzes auf einige Zeit gebracht. IL Abschnitt. Diu Anwendung der Methoden. 73 Dann wird sie herausgenommen, durch Pinseln wird das Epithel der Vorderseite entfernt, und nun wird sie zum zweiten Male in die Eisen- salzlösung gethan, so dafs sie im ganzen in derselben 5 Minuten ver- weilt hat. Man spült sie in Wasser ab und schwenkt sie dann in einer 1 "„ L()sung von Ferridcyankalium, bis eine intensiv blaue, gleich- mäfsige Färbung eingetreten ist, was einige Minuten dauert. Nach Abspülen in Wasser zeigt sich die Grundmassc gefärbt, während die Hornhautkürporchen und -Kanäle hell geblieben sind. Eine Kern- färbung kann noch nachträglich vorgenommen werden. Diese Methode stammt von Leijek (citiert nach Fj;kv). Zur differentcn DarsteUuny der die Hornliaut zusammensetzenden Elemente emptiehlt es sich, das frische Organ in eine 1 " „ Lösung von Argentum nitricura zu bringen (Kap. TT Nr. 26) und nach erfolgter Reduktion langsam in Alkohol zu härten. Die angefertigten Schnitte kann man noch eventuell nachfärben. Man erhält die Lücken und Kanäle weifs auf braunem Grunde. Um ein positives Bild zu erlangen, d. h. schwarz gefärbte Hornhautlücken und -Kanäle auf weifsem Grunde, ist es nach SxÖHK notwendig , die versilberte Cornea vor dem Eintritt der Reduktion in eine 3"o Kochsalzlösung auf 5 Minuten zu übertragen und sie dann in destilliertem Wasser dem Sonnenlichte auszusetzen. Nachhärten in Alkohol. Um die Nenenend /(jungen in der Cornea zu sehen, ist dieselbe zu vergolden, und zwar nach der COHNHElM'schen oder RANViER'schen Methode (Kap. II Nr. 28 oder 32). ß. Iris. Um Schnitte durch die Iris anfertigen zu können, legt man die vordere Hälfte eines Bulbus ohne Linse in ein fixierendes Reagens und bettet nach erfolgter Härtung in bekannter Weise in Paraffin ein. Die Färbung kann man dazu beliebig vornehmen. y. Linse. Die Struktur der Linse wird am besten an frischen oder mit Isolationsflüssigkeiten behandelten Objekten studiert. Schnitte lassen sich durch die Linse nicht anfertigen, da das Zentrum derselben sich nicht durchtränkt. Zur Isolation ist am geeignetsten ^'3 Alkohol (Kap. I Nr. 1), dessen Einwirkung sich bis auf 48 Stunden erstrecken kann. Man zerzupft in 0.75*^,, Kochsalzlösung. Um die Linsenkapsel von der Fläche betrachten zu können, kann man mit der Pinzette von der etwa 1 Stunde in ^ y Alkohol verweilenden Linse dieselbe von der vorderen Wand abziehen und in Alaunhämatoxylin nach- färben (Kap. V Nr. 9 — 14) ; Aufheben entweder in verdünntem Glycerin oder nach der üblichen Vorbehandlung in Kanada oder Dammar. d. RETINA. Die Struktur der Betinaelemente erkennt man am klarsten an Ziqfpräparaten, zu deren Herstellung nach den klassischen Untersuchungen von Max Schultze die Mazeration in Jodserum zu empfehlen ist (Kap. I Nr. 17). Bei wirbellosen Tieren kann man zu dem gleichen Zwecke dünne Chromsäurelösungen (Kap. T Nr. 4), MÜLLER'sche Flüssigkeit fKap. II Nr. 8) oder dünne Pikrinsäure- lösung verwenden (Kap. I Nr. 16). Zur Anfertigung von Schnitten empfiehlt sich die Fixierung in Chromsäure. Osmiumsäure oder FLEMMiNG'scher Lösung (Kap. TI Nr. 3, 1 1 . 14) ; allenfalls kann man noch Pikrinsalpetersäure verwenden (Kap. II Nr. 20). Alle anderen Fixierungsmittel möchte ich widerraten. Um die Retina der Verte- braten gut fixieren zu .können , schneidet man mit einer scharfen Schere den Bulbus im Äquator durch und bringt die hintere Hälfte 74 il' Abschnitt. Die Anwendung der Methoden. in viel Flüssigkeit; die Retina herauszupräparieren und allein zu fixieren ist nicht sehr ratsam, weil bei dieser Manipulation Ver- letzungen ausgedehnten Grades oft nicht zu vermeiden sind. Man bettet daher auch zur Schonung der Netzhaut dieselbe mit Chorioidea und Sclera in Paraffin ein. Zur Fixierung von Netzhäuten nirbelloser Tiere kann man auch mit Erfolg KLioiXEXJjioiiG'sche Flüssigkeit und Sublimat verwenden (Kap. II Nr. 18 und 23). Bei Evertebraten sind die lichtempfindlichen Teile der Netzhaut von einem dichten Pigment- mantel umhüllt, den man entfernen mufs, ehe man an das Studium der betreffenden Organteile denken kann. Zur Entfärbung dient das GRENACiiEiische Gemisch, oder alkoholische Natronlauge nach meiner Angabe oder die P. MAYKi;'sche Methode (Kaj). II Nr. 39, 40, 41). Für die Erkennung der Verzweigungen der GamjUenzellen der Retina ist die GuLGl'sche Methode nach der Modifikation von FuSAKi zu empfehlen (Kap. II Nr. 27). .'. Chorioidea. Zupfpräparate von frischem Materiale zeigen die einzelnen Teile der Gefäfshaut. Zur Erkennung der Gefäfsver- teilung in derselben ist wohl die ÄLTMANN'sche Methode der Injektion mit nachfolgender Mazeration (Kap. VII Nr. 5) diejenige, welche die besten Resultate liefert. L. Sclera. Ihre Struktur erkennt man auf Schnitten, die man nach beliebiger Fixierung und nach Einschmelzung in Paraffin an- fertigt. /,. Zur Untersuchung der Tliräneiidrüsen gelten die für die grofsen Verdauungsdrüsen (Submaxillaris etc.), zur Untersuchung der Augenlider die für die Haut empfohlenen Methoden. n Ohr. Um den wichtigsten Teil des Gehörorganes , die Schnecke, an Znpfpräparcden studieren zu können, verwendet man mit Erfolg die Osmiumgoldmethode von Retzius (Kap. II Nr. 35). Zupfpräparate allein genügen aber nicht; man mufs, um namentlich über die Hör- zellen ins Klare zu kommen. Schnitte von dem Organe anfertigen. Zur Fixierung ist Chromosmiumsäure von Flescii, FLEMMiNG'sche Lösung und allenfalls noch Pikrinsalpetersäurepräparate zu verwenden (Kap. II Nr. 13, 14, 20). Vielfach wird angegeben, die Knochen- kapsel der Schnecke an einer kleinen Stelle aufzubrechen, damit die Fixierungsfiüssigkeit besser eindringen kann. Ich halte das nicht für richtig. Die Spannungsverhältnisse der CoKTl'schen Membran werden durch das Aufbrechen wesentlich verändert und man erhält dann auf dem Schnitt, wenigstens ist es mir so gegangen, dieselbe gefaltet und aus der Lage gerissen. Bei Schnecken kleiner Säugetiere, z. B. Maus, Cavia, erfolgt das Eindringen der Fixierungsflüssigkeit sehr leicht. Um bei gröfseren Säugern das Aufbrechen zu vermeiden und das Ein- dringen zu erleichtern, dürfte es sich empfehlen, die Knochenkapsel durch Abschaben mittels eines scharfen Skalpells zu verdünnen. Nach Fixierung und Erhärtung mufs das Organ entkalkt werden; die dafür gebräuchlichen Methoden sind in Kap. II unter 36, 37, 38 beschrieben. Kleinere Gehörnschnecken mit dünnen Knochenteilen, z. B. von Cavia, werden schon in der FLEMMiNO'schen Lösung, während des 24 stündigen Verweilens in derselben, hinreichend entkalkt. Vor dem Einschmelzen li. Abschuitt. Die Aiiwciiduuy der Jlctliudon. 75 in Paraffin ist die Geliörschnecke genau in der Längsaxe mit einem scharfen Rasiermesser zu halbieren. Tut man das nicht, so ist die nachherige Orientierung für die Schnittrichtung fast unmöglich. Da die Knochengrundsuhstanz sich sehr schwer mit Chloroform durch- tränkt, so müssen die Objekte in dieser Flüssigkeit mehrere Tage verweilen. Die Bo(/en(ft'hi(/e untersucht man am besten frisch nach Färbung mit Pikrokarmin (^Kap. V Nr. 34—37) und nach leichtem Zerzupfen in Glycerin. Sacculus und Utriculus fixiert man in Fi.EMMlNG'scher Lösung oder in Pikrinsalpetersäure (Kap. II Nr. 14, 20). Zur Erkennung der Nerven des Trommelfells dürfte die Flemming'- sche Methode der Vergoldung am zweckmäfsigsten sein (Kap. II Nr. 33). Die Gehörknikhekhen werden wie alle Knochen , die Ohrmuschel wird zur Untersuchung wie Haut oder Netzknorpel behandelt. 0. Nase. Um die zelligen Elemente der regio olfactoria, wie respiratoria zu isolieren, sind als die besten Reagentien das Jodserum und dünne Chrom- säure (Kap. I Nr. 17 uud 4) zu empfehlen. Aufserdem ist 0,1 % Osmium- säure (Kap. I Nr. 11) sehr geeignet. Zur Fixierung kann man Chrom- säure, FLEMMiNG'sche Lösung, Pikrinsalpetersäure, Pikrinosmium- salpetersäure (Kap. II Nr. 3, 14, 20, 21) verwenden. Bei An- wendung der Osmiumsäure enthaltenden Fixierungsmittel ist die Nachbehandlung mit rohem Holzessig nach Mährenthal (Kap. II Nr. 16) sehr angebracht; man erhält darnach ganz ausgezeichnete Bilder. Für die nach dem Fixieren und Erhärten notwendige Ent- kalkung ist eine der in Kap. II sub Nr. 36 — 38 angegebenen Methoden zu verwenden. Zur Färbung der Schnitte von Pikrinsalpetersäure- Präparaten ist besonders empfehlenswert die Doppelfärbung mittels Orange G-Hämatoxylin (Kap. V Nr. 43). tr. Pätz'sche Buchdr. (Lippert & Co,), Naumburg a,'S. i QM555 R19 Rawit" ^ ^^^W; ^^ ^^^^ ^^^ ^ ^^^^ ^^^^^ ws^ ^^^^^^ x'f ^m ^»