= HEE SERS AG ik {EAD #2 al (AIPA = te nee F es i ..) ae . pad , eee oe RS hee : z ' *. 5. &* k “ i = ee . ae Se 5 人 . i ‘ Ph ,. 4 和 an ' = bad oa « . ‘ se gl nee, glint Dh ce . ; ‘2 m ° be tT i : 4 t ‘ ay 0 Sy ik . 5 fa 7 . > vi 大 ; } ; ty ; ; 有 4 ; . ‘ via 7 ; ” «ie 如 re ‘ . - * a : $ . ; f Py * . . , + : a * a’ J 了 1 . - é e _ ty ER - Ae in TE AY fe (4) PL. Fe Ss OS JEOEOEOEOEOSEOEOSOEBOEOEOEOEOEOSEOSEOEOEOEOSOSOEOSOSOS: > Fa YA 1 AS 8 介 ABEIM. 阿 什 沃 恩 主编 的 《生物 学 研究 概 说 》 丛 书 之 一 。 书 中 引用 原核 生物 和 真 核 生 物 的 各 种 例子 来 说 明 酶 活性 控制 的 基本 原理 。 主要 前 述 细菌 的 生物 合成 途径 的 调节 、 酶 激活 作用 、/ 血 凝 机 理 、 补 体 系统 、 糖 原 代 谢 的 调节 、 激 素 作 用 的 分 子 基 础 和 酶 活性 的 共 价 修饰 调 节 等 等 。 可 供 生物 化 学 、 生 理学 等 领域 的 科技 工作 者 、 大 专 院 校 有 关 专业 师 生 和 研究 生 参 考 。 P. Cohen Outline Studies in Biology CONTROL OF ENZYME ACTIVITY Chapman and Hall 1976 。 生 物 学 研究 概 说 。 酶 活性 的 控制 [ 英 ] P。 科 恩 著 pa eS SR BE 责任 编辑 RHR 休学 入 版 和 福 ; 出 版 北京 朝阳 门 内 大 街 137 号 #O4E he Aly EN 新 华 书 店 北京 发 行 所 发 行 ” 各 地 新 华 书 店 经 售 1982 年 11 月 第 一 版 开本 : 787X1092 14 1982 年 11 月 第 一 次 印刷 Asks 344 印 数 : 0001 一 5,700 字数 :78 ,000 统一 书号 : 13031 - 2039 RUBS: 2786 . 13 一 10 定价 ，0.58 元 =| 录 a 生物 合成 的 调节 … 限制 性 蛋白 水 解 对 生物 学 功能 的 起 始 作 用 糖 原 代 谢 的 调节 及 激素 作用 的 分 子 学 基础 | 修饰 对 酶 活性 的 控制 … AAR fg AAS YY PE JB cee ere cee eee eee eee eee eee ceeeee eee ene ees 终 产 物 的 抑制 作用 对 区 商 气 基 酸 和 核 首 酸 “624 a Tl - . q * -. ) ,二 < - ‘ 和 < ‘ Wan , . ‘ ~ 4 he » ' 本 v a . = . 7 : 3 t » ， 站 « , i ‘ , , 8 . 二。 7 r ’ ~~ “ a ° \" 二 去 . : ra y ery & * r- ‘ s we 4 加 | 而 i J wee os > ae 四 [5 ~ - ae a T on a | « 和 -* ey f “ » 4 +f , , eenae. et J bee ‘ “ 7 YY ‘ - 6 j s ’ : 下 ‘ nly -, 和 7 ” a s ek Oa ， 要、 Ce Ae “ " ¥ - r d , a" “bse . \ J A * . ’ - ' P . \ - 人 4 . ly » ees 。 5 ' ‘ ‘ ine “ ‘ ; " ¢ ‘ ¢ 。 > the ‘ - - Seg “¥ S49 & | x b f. ‘ 下 * 4 s f ‘ c . y 1 了 A 区 ‘ \ 四 ° ， - > : % ‘ x ' 第 一 章 绪 F 本 织 中 酶 活性 调节 的 主要 目标 ， 就 是 阐明 机 下 一 个 在 活 细 胞 中 所 发 生 的 酶 促 反应 数目 非常 之 多 的 印象 。 这 些 图 表 还 提示 了 一 个 很 重要 的 问题 ， 即 有 机 体 如何 利 用 各 种 途径 ， 将 代谢 物 以 适当 的 量 、 适 当 的 时 间 、 消 耗 最 小 的 能 量 而 递送 到 适当 的 地 方 。 现 在 已 经 清楚 ， 对 代谢 的 关键 地 方 ， 赋 与 某 些 具有 特殊 性 质 的 酶 ， 是 完成 这 种 调节 的 主要 方 式 。 很 显然 ， 形 成 代谢 途径 最 终 产 物 的 速度 ， 只 能 通过 改变 代谢 途径 中 限 速 酶 的 活性 来 控制 。 这 可 以 通过 增加 和 减少 酶 分 子 数量 〈 诱 导 和 阻 过 ) ， 或 是 改变 原先 存在 的 酶 分 子 的 活 性 来 达到 。 本 书 仅 讨 论 后 一 种 作用 方式 。 研究 酶 调节 的 主要 目标 有 两 个 ; (a) 鉴定 在 代谢 途径 中 将 反应 速度 限制 于 某 一 特定 代 谢 活 性 状态 的 酶 。 Cb) 确定 调节 体内 限 速 酶 活性 的 机 理 ， 并 搞 清 这 种 控 制 如 何 与 细胞 整合 代谢 相关 联 。 本 书 主要 讨论 的 是 上 述 目标 的 第 二 项 内 容 。 这 套 丛 书 的 另 一 册 ， 将 更 详细 地 论述 鉴定 限 速 步骤 所 用 的 方法 52) 。 就 本 论题 的 实质 而 言 ， 酶 活性 控制 的 内 容 ， 应 包括 在 整 个 生物 化 学 中 。 因 此 必须 先 有 一 个 前 提 ， 即 本 书 的 读者 对 各 种 代谢 途径 及 它们 相互 间 是 什么 关系 ， 有 广泛 的 了 解 ， 并 且 or 5\-« 对 和 蛋白质 化 学 和 酶 动力 学 的 基本 概念 ， 也 有 所 了 解 。 本 书 讨论 这 个 论题 所 采用 的 酶 系统 ， 是 从 广泛 的 生物 系 统 中 挑选 出 来 的 。 试 图 在 一 定 的 深度 来 讨论 这 些 问题 ， 同 时 也 对 一 些 近代 所 用 的 研究 技术 的 限度 及 今后 继续 进行 研究 可 能 采用 的 方法 作 了 简 述 。 读 者 可 能 从 第 一 次 阅读 中 感到 最 突 出 的 特点 是 ， 有 机 体 选 择 用 以 控制 酶 活性 的 机 理 是 各 式 各 样 的 。 还 好 随 着 书 中 内 容 的 进展 ， 将 会 展现 一 些 更 为 总 括 性 的 论题 ， 并 在 每 章 末 尾 作 一 些 简短 摘要 ， 以 使 读者 对 该 问题 的 现状 有 一 个 总 括 的 轮廓 。 S$ = 文 献 [1] Helmreich,E.and Cori，C.F.(1966)，Adv.EA2Z. Reg.,3,91-107, [2] Denton,R. and Pogson, C.I. (1976), Metabolic Regulation, Chapman and Hall, London. 第 二 章 ， 终 产物 的 抑制 作用 对 细菌 氨基 BAERS MS Mae 象 大肠 杆 菌 这 样 的 细菌 ， 只 给 含有 碳 、 氨 、 氮 、 氧 和 硫 的 最 低 生 长 条 件 的 培养 基 ， 就 能 合成 多 种 多 样 的 代谢 物 ， 其 中 包括 制造 蛋白 质 所 需要 的 全 部 20 种 氨基 酸 及 用 于 合成 RNA 和 DNA WEARER. HR, BSED 〈 如 哺乳 动物 ) fe 乏 很 多 种 催化 这 些 反 应 的 酶 ， 而 这 些 化 合 物 却 常 是 人 们 饮食 中 的 必需 营养 物 。 人 们 认为 ， 由 于 需要 消耗 大 量 的 碳 、 氮 和 能 量 去 合成 氨基 酸 、 核 苷 酸 以 及 这 些 生 物 合成 反应 所 需 的 全 部 酶 〈 仅 氨基 酸 的 生物 合成 就 有 100 多 种 ) ， 细 菌 的 这 种 极 端 多 样 性 ， 起 到 了 平衡 的 作用 。 所 以 毫 不 奇怪 ， 当 五 十 年 代 中 期 基本 弄 清 有 关 代谢 途径 后 ， 人 们 就 把 注意 力 集中 到 这 些 反应 究竟 是 如 何 调节 而 得 以 能 最 有 效 地 应 用 可 利用 的 营养 物 方面 。 确 实 ， 用 以 阐明 这 些 代谢 途径 的 一 系列 的 同位 素 和 突 变种 的 研究 ， 本 身 就 提供 了 关于 这 些 调节 究竟 是 怎样 产生 的 最 初 的 一 些 线索 。 在 这 样 的 一 组 实验 中 ， 将 在 葡萄 糖 - 盐 培 养 基 中 指数 生长 的 大 肠 杆 菌 培养 物 离心 ， 再 悬浮 于 同样 的 培养 基 中 ， 不 过 用 放射 性 4C- 葡 萄 糖 代替 培养 基 中 未 标记 的 葡萄 糖 。 然 后 继续 保温 培育 一 小 时 ， 在 这 段 时 间 里 细菌 的 数量 大 约 增加 了 一 倍 。 在 对 数 生 长 的 情况 下 ,细菌 活跃 地 合成 蛋白 质 ,并 含有 整套 合成 每 种 氨基 酸 的 酶 。 这 时 如 果 分 析 一 下 细菌 蛋白 质 ， 那么 正如 所 料 ， 每 种 氨基 酸 结合 的 放射 性 约 等 于 总 细菌 蛋 白 质 的 相对 含量 。 然 而 ， 如 果 再 改 用 非 标记 的 氨基 酸 〈 例 如 用 天 -了 I 一 异 亮 氨 酸 ) 去 补充 培养 基 ， 那么 挨 入 和 蛋白质 异 亮 氨 RR 基 的 放射 性 将 下 降 95 儿 以 上 ， 用 其 它 氨基 酸 实 验 ， 也 得 到 类 似 的 结果 。 这 个 实验 表明 ， 加 入 的 氨基 酸 被 优先 利用 了 ， 还 说 明 ， 加 入 的 氨基 酸 以 某 种 方式 抑制 了 蛋白 质 从 前 体 分 子 的 合成 。 2.1 工 - 异 亮 氮 酸 生物 合成 的 控制 图 2.1 列 出 了 I- 异 亮 氨 酸 的 代谢 途径 ， 列举 了 在 结构 上 与 - 异 亮 氮 酸 有 关 的 氨基 酸 一 -及 氨 酸 的 合成 路 线 。 上 面 介绍 的 实验 表明 ， 在 生长 培养 基 中 有 LAREN, 阻止 了 细胞 内 工 - 异 亮 氨 酸 的 形成 。 而 且 如 果 将 异 亮 氨 酸 加 到 不 能 独自 制造 L- 苏 氨 酸 的 细菌 突变 种 的 培养 基 中 ， 就 会 减少 为 达到 最 适 生长 速度 所 需要 的 LAR BO. Ke 明 工 - 异 亮 氨 酸 的 生物 合成 ， 不 仅 需 要 L- 苏 氨 酸 ， 而 且 L-# 亮 氨 酸 还 以 某 种 方式 降低 了 一 种 或 多 种 可 将 工 - 苏 氨 酸 转化 为 工 - 异 亮 氨 酸 的 酶 活力 。 因 为 在 这 个 顺序 中 被 苏 氨 酸 脱 氢 酶 催化 的 第 一 步 是 不 可 闭 的 “〈 图 2.1) ， 所 以 工 - 异 亮 氨 栈 不 丙酮 酸 一 >a- 乙 酰 乳 酸 一 >o,B- 二 羟基 一 >o- 酮 异 戊 酸 一 > 顷 氨 酸 : FRR 2 5 丁 责 酸 一 > 乙酰 羟基 丁 一 >a,B- 二 郑 基 B-- >a- 责 -B- 甲 基 一 > 异 亮 氢 酸 甲 基 友 酸 RB 酸 a8 图 2.1 形成 工 - 异 亮 氨 酸 和 L-MARHEWDARRE. M: 1 一 一 苏 氨 酸 脱 氨 酶 ; 2 一 一 乙酰 羟 酸 合成 酶 ; 3 一 一 乙 酰 产 酸 异 构 体 还 原 酶 ! 4 一 一 二 送 酸 脱水 酶 ;5 一 一 转 AMBURARKkLMAARRWREAH BMAR-A AMR 氮 基 丁 酸 转氨酶 (2)。 可 能 使 代谢 途径 道 转 ， 而 发 生 从 工 - 异 亮 氮 酸 再 返回 到 L- 苏 氨 酸 的 作用 。 在 体外 工 - 异 亮 氨 酸 可 抑制 苏 氨 酸 脱 氨 酶 9 ， 这 一 发 现 是 搞 清 酶 控制 机 理 的 一 个 重要 标志 。 这 个 抑制 作用 是 非常 专 一 的 ， 如 - 亮 氨 酸 的 抑制 作用 比 I- 异 亮 氮 酸 要 小 100 倍 ， 而 L-MARA D- 异 亮 氨 酸 则 什么 抑制 作用 都 没有 。 此 外 ， 在 体外 代谢 途径 中 的 其 它 酶 ， 都 不 被 L- RAB 抑 制 。 人 们 不 必 过 多 地 化 费 精 力 ， 就 能 立即 提出 一 个 非常 简明 但 又 有 吸 引力 的 、 用 以 解释 L- 异 亮 氨 酸 和 其 它 氨基 酸 是 怎样 调 节 它 “ 们 自身 生物 合成 的 作用 机 理 。 如 果 这 种 机 理发 生 在 完整 细胞 中 ， 那 么 增加 工 - 异 亮 氮 酸 的 浓度 ， 会 抑制 代谢 途径 中 的 第 一 个 酶 一 苏 氨 酸 脱 氨 酶 ， 而 且 由 于 阻 允 了 整个 代谢 途径 的 代谢 流程 ， 就 减少 了 新 的 L- 异 亮 氨 酸 的 生物 合成 。 反 过 来 ， 如 果 工 - 异 亮 氨 酸 的 水 平 下 降 了 ， 那 么 因为 作用 完全 是 Wt 的 ， 它 从 L- 苏 氨 酸 产生 的 量 将 自动 地 增加 。 人 们 发 现 ， L- 异 亮 氮 酸 对 苏 氨 酸 脱 氨 酶 的 抑制 是 竞争 性 的 ， 在 这 方面 为 了 达到 半 最 大 激活 作用 ， 必 须 增 加 L- He 氨 酸 的 浓度 ,不 过 这 个 作用 的 动力 学 是 复杂 的 。 如 果 以 工 - 苏 氨 酸 脱 氨 作 用 的 初速 度 对 没有 工 - 异 亮 氨 酸 存在 时 的 L- 苏 氢 酸 浓度 作 图 ,得 到 的 是 一 条 S 形 的 曲线 ,而 不 是 一 个 简单 的 双 曲线 函数 5 .如 果 再 以 L- 苏 氨 酸 脱 氨 作 用 对 在 固定 L- 苏 氨 酸 浓度 时 的 工 - 异 亮 氨 酸 浓度 作 图 ,也 得 到 类 似 的 结果 (图 2.2)。 在 明显 的 抑制 作用 发 生前 ， L- 异 亮 氨 酸 必须 增加 到 某 一 闪 限 水 平 以 上 。 这 种 异常 的 动力 学 行为 是 怎样 产生 的 ， 将 在 第 六 章 中 加 以 讨论 ， 但 在 这 里 已 充分 地 注意 到 ， 曲 线 的 形状 显示 出 酶 活性 对 终 产 物 的 抑制 作用 更 加 敏感 ， 并 已 超过 了 那 种 如 果 酶 只 显示 出 简单 的 米 - 曼 氏 动力 学 抑制 作用 所 应 有 的 工 - 异 亮 氨 酸 的 特殊 范围 。 这 就 提出 ， 在 体外 观察 到 的 e 8 e 苏 氨 酸 脱 氨 酶 复杂 的 动力 学 ， 可 能 有 生理 学 上 的 重要 性 ， 这 0:1 pai *: L-3 32 (mM) 图 2.2 KBHAKIHHRERD, L-FEARM 工 - 苏 氨 酸 脱 氨 酶 活性 的 影响 。 测 定 中 L-H 氨 酸 的 浓度 为 0.02M( 鲜 ) 或 0.04M(O 〇 ) ©), 种 反应 动力 学 使 得 代谢 途径 中 工 - 苏 氨 酸 和 工 - 异 亮 氨 酸 浓度 波动 的 调节 更 加 敏感 。 2.2 DAA AML FARA BLE As 变 构 理论 把 苏 氨 酸 脱 氨 酶 加 热 后， 虽然 在 没有 L-Fe CA 酸 时 所 测 得 的 活力 仍 是 一 样 的 ， 但 已 失去 了 它 对 工 - 异 亮 氮 酸 抑制 - 的 敏感 性 〈 图 2.3) 。 苏 氮 酸 脱 氨 酶 这 种 脱 敏 作用 是 一 个 重 Ia 不 从 es 55°C 加 热 的 时 间 ( 分 ) 图 2.3” 加 热 而 致 的 苏 氨 酸 脱 氨 酶 的 脱 敏 作 用 。 酶 的 活性 是 在 有 (@) 或 没有 (O) 0.01M 工 - 异 亮 氨 酸 时 ， 用 0.02M L-# ABW EH. 要 的 发 现 ， 因 为 它 暗示 着 L- 异 亮 氨 酸 和 L- 苏 氨 酸 必 定 是 与 酶 的 不 同 部 位 结合 的 。 因 此 L- 异 亮 氨 酸 可 能 只 是 间 接地 影响 了 -L- 苏 氨 酸 与 酶 的 结合 。 在 经 典 的 综述 中 , Monod Changeux 和 Jacob55 描述 的 苏 氨 酸 脱 氨 酶 及 其 它 酶 受到 代谢 性 控制 这 个 熟知 的 特点 时 ， 引 用 了 变 构 效 应 物 这 个 术语 来 描 述 象 L- 异 亮 氨 酸 这 样 的 调节 分 子 ， 它 能 抑制 或 激活 某 一 种 酶 。 下 面 这 一 段 是 从 他 们 文章 中 摘录 的 一 节 , 它 精辟 地 论述 了 变 构 效 应 物 的 完整 概念 。“ 变 构 效 应 物 能 与 变 构 部 位 发 生 专 一 性 地 和 可 着 性 地 结合 。 酶 变 构 效应 物 复合 物 的 形成 ， 并 不 激活 涉及 效应 物 本 身 的 反应 ， 但 据 认为 可 以 引起 蛋白 质 分 子 结构 断然 不 同 的 可 着 的 交 变 作 用 ， 即 变 构 转变 ， 这 种 交 变 作用 改变 了 活性 部 位 的 性 质 ， 从 而 改变 了 一 种 或 几 种 蛋白 质 生 物 活性 所 特有 的 动力 学 参数 。 在 此 描述 中 暗示 的 一 个 最 基本 的 然而 否定 的 假定 是 由 于 变 构 “效应 物 的 结合 部 位 完全 不 同 于 活性 部 位 ， 并 且 由 于 它 不 参与 任 一 阶段 的 蛋白 质 激活 反应 ， 所 以 变 构 效应 物 不 要 求 与 任何 一 种 底 物 本 身 有 什么 特殊 的 化 学 上 的 或 代谢 上 的 关系 。 因 此 任何 变 构 效应 的 专 一 性 和 它 的 实际 表现 ， 只 是 由 于 蛋白 质 分 子 本 身 的 特殊 结构 所 造成 的 ， 从 而 使 得 它 经 历 由 变 构 效 应 物 的 结合 而 触发 的 独特 的 可 道 的 构象 变化 。 底 物 与 变 构 效 应 物 之 间 这 种 没有 任何 固有 的 专 一 性 的 化 学 类 似 性 或 反应 性 要 求 ， 似 乎 是 生物 学 上 极为 重要 的 事实 。?” 2.3 体内 工 - 苏 氨 酸 脱 氮 酶 活性 的 调节 根据 体外 观察 的 工 - 异 亮 氨 酸 对 L- 苏 氨 酸 脱 氨 酶 的 专 一 性 抑制 作用 ， 可 以 提出 但 不 能 证 明 ， 当 把 L- 亮 氨 酸 加 入 培养 基 后 ， 它 是 怎样 进一步 阻止 L- 异 亮 氨 酸 生物 合成 的 。 在 体内 这 种 作用 的 重要 性 最 令 人 信服 的 证 据 ， 是 来 自 对 细菌 突变 种 行为 的 研究 ， 这 种 突变 种 的 行为 是 可 以 合成 一 种 改变 THD; ARAM. “EX -~- 异 亮 氮 酸 的 抑制 作用 失去 敏 感 性 ;以 致 这 些 细菌 产生 过 量 的 L- 异 亮 氨 酸 ， 这 种 氨基 酸 可 大 量 地 排 到 培养 基 中 5 。 “虽然 LS AUR I lT AO, URGE 明 ， 在 L- 苏 氨 酸 浓度 低 时 ， 由 于 苏 氨 酸 脱 氨 酶 活力 失去 了 与 I 苏 氨 酸 浓度 的 S 形 曲 线 的 关系 ， 所 以 项 氨 酸 也 可 以 激活 苏 DANE 《图 2.4) 。 图 2.1 有 关 部 分 可 以 说 明 这 种 效 应 的 可 能 作用 。 在 L-SRIGAR DO A 工 - 顷 氨 酸 生物 合成 途径 中 共同 涉及 到 的 三 种 酶 ， 其 相互 关系 是 非常 密切 的 。 因 此 ;在 _ 工 - 苏 氨 酸 浓度 受到 限制 的 情况 下 ， 通 过 OL SUR I He 用 ， 会 增加 工 - 异 亮 氨 酸 的 合成 ， 从 而 有 助 于 平衡 L- RD 和 工 - 异 亮 氨 酸 的 生物 合成 。 然 而 在 体内 是 否 有 这 样 的 平行 途径 的 刺激 作用 ， 尚 未 得 到 证 实 。 比 活性 “lea “0 L- 苏 氨 酸 (mM) 图 2.4 存在 (@) 或 不 存在 (O) 5.0mMEL- 顷 氮 酸 时 ， 以 苏 氨 酸 脱 氨 酶 的 活性 对 苏 氨 酸 的 浓度 所 作 的 图 482。 | 2.4 工 - 赖 氨 酸 、L- 甲 硫 氨 酸 、 工 - 苏 氨 酸 和 L- 异 亮 氨 酸 生物 合成 的 控制 一 看 图 2.5 就 知道 ， 从 工 - 苏 氨 酸 生物 合成 L- 异 亮 氨 酸 的 途径 ， 相 对 来 讲 是 简单 的 。 虽 然 直到 现在 人 们 仍 把 它 作为 一 个 独立 的 代谢 通路 来 考虑 ， 但 事实 上 它 只 不 过 是 更 为 广阔 的 台 成 途径 的 一 个 分 支 ， 它 终止 于 4 种 氨基 酸 一 一 I- 赖 气 酸 、 L- 甲 硫 氨 酸 、L- 苏 氨 酸 和 L- 异 亮 氨 酸 〈 它 们 共同 的 前 身 为 1 mae ERE RAL 磷酸 13 re 1 --- $5 2-4 a ea | 二 所 路演 | aaah “丁丁 酸 本 i 1 FRR 1 高 丝氨酸 ， i ee he we ee ee |+% pul i Liem | L-Poee | 工 - 异 亮 氨 酸 2.5 ”从 世 - 天 冬 氨 酸 生物 合成 的 工 - 赖 氨 酸 、 工 - 甲 硫 氨 酸 、 工 - 苏 氨 酸 和 工 - 异 亮 氨 酸 。 虚 线 表示 终 产 物 的 抑制 作 用 。 多 箭头 表示 同 功 酶 。1 一 一 天 冬 氨 酸 激酶 ;2 一 一 KAYERAM, 3 一 一 高 丝氨酸 脱 气 酶 ; 《4 一 一 高 毕 氨 酸 激酶 ，5 一 ARMA MM, 6—3t 珀 酰 高 丝氨酸 合成 酶 ，7 一 苏 氨 酸 脱 氨 酶 。 L- 天 冬 氮 酸 ) 的 合成 。 这 种 情况 就 提出 了 更 加 复杂 的 代谢 控制 的 问题 。 例如 ， 如 果 途 径 中 最 初 的 一 个 酶 ， 象 天 冬 氮 酸 激酶 ， 恰 好 被 4 种 氨基 酸 的 终 产 物 之 一 有 效 地 抑制 了 ， 那 么 ， 供 给 合成 其 它 三 种 基本 代谢 物 的 中 间 体 也 将 匮乏 ， 这 对 于 细菌 就 引起 了 严重 的 问题 。 因 此 ， 代 谢 途 径 的 结构 本 身 就 启示 我 们 ， 似 乎 必需 有 一 个 更 加 合理 的 控制 机 理 。 2.5 大 肠 杆 菌 K12 中 不 同调 节 特 性 的 天 冬 氮 酸 激酶 的 同 功 酶 先前 介绍 的 苏 氨 酸 脱 氨 酶 的 一 个 类 似 实 验 揭示 出 ， L- 赖 氨 酸 和 L- 苏 氨 酸 是 仅 有 的 可 以 明显 抑制 细菌 提取 物 中 天 冬 氮 酸 激酶 活性 的 两 种 氢 基 酸 。 然 而 ， 无 论 其 中 哪 一 种 氨基 酸 ， 它 们 的 抑制 作用 都 决 不 超过 40 一 50 匈 ， 但 是 抑制 效应 是 有 相 加 性 的 ， 因 此 当 两 种 氨基 酸 都 过 量 存在 时 ， 抑 制作 用 便 几乎 是 完全 的 〈 图 2.6) 。 用 标准 蛋白 纯化 技术 把 天 冬 氨 酸 激酶 的 活性 分 成 两 个 组 份 后 ， 这 个 难以 理解 的 现象 就 得 到 了 9 9 e 解释 。 第 一 种 组 份 能 被 L- 苏 氨 酸 完全 抑制 ， 但 不 受 L-MA 酸 的 影响 ， 而 第 二 种 组 份 能 被 L- 赖 氨 酸 完全 抑制 ， 却 又 不 受 L- 苏 氮 酸 的 影响 5 。 在 - 赖 氨 酸 过 量 存在 时 ， 可 减少 天 冬 氮 酰 磷 酸 的 产生 ， 但 还 不 致 减 少 到 不 能 生物 合成 L- 苏 氨 酸 的 地 步 ， 反 之 亦 然 。 不 过 为 了 使 控制 有 效 ， 无 疑 地 需要 以 相 加 性 的 方法 ， 来 保证 图 2.6 工 - 苏 氨 酸 (thr) 和 工 - 赖 所 “在 L- 赖 氨 酸 过 量 存在 时 ， 已 Sanh ese at, BUT UR CORRS Be my ©? 。 产生 I 工 - 苏 氨 酸 ， 也 保证 当 L- 苏 氨 酸 过 量 存在 时 ， 减少 了 的 天 冬 氨 酰 磷酸 被 导 疝 产生 L- 赖 氨 酸 。 这 就 导致 发 现 ， 在 代谢 分 支 上 使 之 产生 工 - 赖 氨 酸 的 第 一 个 酶 一 二 氢 吡 啶 羧 酸 合成 酶 ， 可 专 一 性 地 被 Li 氨 酸 抑制 :0 ， 而 在 代谢 分 支 上 使 之 产生 基 苏 氨 酸 的 第 一 个 酶 一 一 高 丝氨酸 脱氧 酶 ， 可 专 一 性 地 被 工 - 苏 氨 酸 抑制 号” 。 这 两 种 继 发 性 控制 ， 应 保证 或 是 直 - 赖 氨 酸 或 是 - 苏 氨 酸 过 量 存在 时 ， 减 少 了 的 天 冬 氨 栈 磷酸 都 可 被 引 疝 L- 赖 所 酸 或 是 L- 苏 氨 酸 〈 图 2.5)。 高 丝氨酸 是 L-FPRARUR 工 - 苏 氨 酸 生物 合成 的 中 间 体 〈 图 2.5)。 如 果 仅 仅 存 在 高 丝氨酸 脱氧 酶 这 一 种 酶 的 话 ， 当 工 - 苏 氨 酸 过 量 时 ， 它 可 被 完全 抑制 ，L- 甲 硫 氨 酸 也 应 该 被 完全 抑制 ， 除 非 另 有 其 它 的 控制 机 制 。 这 就 使 以 后 发 现 ， 大 肠 杆菌 K12 还 存在 着 第 三 种 天 冬 氨 酸 激酶 及 第 二 种 高 丝 氨 酸 脱氧 酶 。 这 两 种 酶 活性 都 不 会 被 L- 赖 氨 酸 、 EL- 苏 氨 酸 或 L- 甲 硫 氨 酸 抑制 ， 尽 管 它们 的 合成 可 受到 工 - 甲 硫 氮 酸 的 强 FRAG. ROR, ORE EMR i] L- 甲 硫 氨 酸 的 条 件 下 进 行 * 10 。 Sy a ER EE, 抑制 剂 浓度 (mM) 研究 ， 这 种 限制 L-PPT DA 2S 突变 种 获 得 ， 此 突变 种 在 上 述 两 种 酶 活性 被 抑制 到 很 容易 测定 出 来 之 前 ， 本 身 不 能 生成 L-ARARO?. BL RAR L-gy 酸 过 量 存在 时 ， 这 两 种 酶 活性 就 可 以 使 L- 甲 硫 氨 酸 的 生物 合成 继续 进行 。 因而 既然 存在 两 种 高 丝氨酸 脱氧 酶 ， 就 意味 着 还 需要 另 外 一 种 作用 机 理 ,来 保证 在 工 - 苏 氨 酸 过 量 时 ， 减 少 了 的 高 丝 氨 酸 被 导向 产生 工 - 甲 硫 氨 酸 ， 而 不 产生 LRM, REID 然 。 通 过 I- 苏 氨 酸 对 高 丝氨酸 激酶 的 抑制 作用 < ， 及 通过 工 - 甲 硫 氨 酸 对 O -琥珀 酰 高 丝氨酸 合成 酶 的 抑制 作用 5 , 就 可 以 达到 这 一 点 ， 这 些 都 在 体外 得 到 证 实 。 在 体内 的 这 些 控制 作用 中 ， 其 中 一 部 分 控制 作用 〈 不 是 全 部 ) 的 重要 性 ， 已 通过 利用 细菌 突变 种 ， 采 用 类 似 前 面 曾 介绍 的 对 苏 氨 酸 脱 氮 酶 所 用 的 方法 ( 见 2.3 节 ) 得 到 了 证 实 。 大 肠 杆 菌 以 共同 的 前 体 DAHP 生物 合成 三 种 芳 族 氨基 酸 ， 似 乎 都 是 通过 极 类 似 的 方式 调节 的 (A 2.7) 。 有 三 种 i Per fee ee eee 3! i CR RE NS ES, RE Sete EK 71 PEP+ E4P = nahi 分 支 酸 Br FAA. ee L-5 和 5 丙酮 酸 Paes (Bae 3 1 磷酸 核糖 基 | lee Ov : 1 2a] | eee | 吗 | 嗓 甘 油 磷 酸 1 | 1 | + Ril LIL- 色 氮 酸 1 ee Sa 上 -LI- 酷 氨 酸 图 2.7 “和 芳 族 氨基 酸 的 生物 合成 。 He RA et 用 。 多 箭头 表示 同 功 酶 。 3, 脱氧 -D- 阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸 -7- 磷 酸 (AHP) 2 UB 2 一 一 分 支 酸 F 成 酶 ; SB aE ~5- 磷 酸 核 糖 基 焦 磷酸 (PRPP) 转 磷酸 核糖 基 酶 。 PEP 一 一 磷酸 烯 醇 丙酮 酸 ; 卫 4P 一 一 示例 糖 -4- 磷 酸 。 e ll 。 DAHP 合成 酶 ， 一 种 可 被 L- 苯 丙 氨 酸 抑制 :一 种 可 被 Ls 氨 酸 抑制 ， 第 三 种 不 受 反馈 抑制 ， 但 其 合成 可 被 Le AM 抑制 cs 。 在 色 氨 酸 合成 途径 分 支 以 后 的 合成 顺序 中 ， 有 两 个 分 支 酸 变 位 酶 ， 一 个 可 被 工 - 苯 丙 所 酸 抑制 《分 支 酸 变 位 酶 P) ， 另 一 个 可 被 L- 酷 氨 酸 抑制 (分 支 酸 变 位 酶 卫 )5@ 。 这 些 例子 表明 ， 用 两 种 或 多 种 酶 催化 同一 生化 反应 〈 称 作 同 功 酶 ) ， 是 细菌 调节 分 支 代 谢 途 径 的 共同 方式 。 2.6 双 功 能 性 的 天 冬 氨 酸 激酶 -高 丝 氨 酸 脱 氢 酶 ， 多 功能 性 酶 和 多 酶 复合 体 对 能 将 大 量 工 - 苏 氨 酸 排 入 生长 培养 基 的 细菌 突 变种 进 行 分 析 后 ， 出 乎 意外 的 发 现 ， 对 苏 氨 酸 敏感 的 天 冬 氨 酸 激酶 和 对 苏 氨 酸 敏 感 的 高 丝氨酸 脱 氢 酶 ， 都 对 L- 苏 氨 酸 的 抑制 作用 部 分 和 完全 失去 敏感 2 。 单 一 种 的 突变 性 变化 ， 却 以 同样 方式 影响 了 两 种 酶 的 活性 ， 这 就 有 力 地 表明 ， 这 两 种 酶 至 少 是 共享 有 一 条 多 肽 链 。 这 个 设想 由 动力 学 研究 作 了 补 充 , 动 力学 研究 表明 ,在 体外 ,天 冬 氮 酸 激酶 的 底 物 L-KAA 酸 和 ATP， 能 抑制 高 丝氨酸 脱氧 酶 的 活性 ， 而 高 丝氨酸 脱氧 了 酶 反应 的 产物 NADP 和 高 丝氨酸 ， 又 抑制 天 冬 氮 酸 激酶 的 活 性 。 另 外 ， 高 丝氨酸 脱氧 酶 的 底 物 NADPH, RP AMA 酸 敏 感 的 天 冬 氢 酸 激酶 免 受热 变性 作用 ， 但 对 赖 氨 酸 敏感 的 天 冬 氢 酸 激酶 的 热 变 性 作用 则 和 否 。 通 过 若 于 纯化 步骤 以 共 纯 这 两 种 酶 ， 其 最 后 产物 被 认为 是 一 种 称 作 天 冬 氨 酸 激酶 工 - 高 丝氨酸 脱氧 酶 I 的 均一 蛋白 质 ， 这 就 最 终 证 明 : 这 两 种 酶 含有 同样 的 蛋白 质 。 现 已 发 现 ， 这 个 分 子 量 为 340,000 道 尔 顿 的 蛋白 质 ， 是 由 4 个 相同 的 亚 基 以 非 共 价 键 力 结合 而 成 的 G2。 所 以 产生 这 种 同一 性 的 原因 ， 必 定 是 因为 两 种 不 同 e 12 e 的 催化 活性 是 在 同一 条 多 肽 链 上 的 缘故 。 有 二 个 类 似 的 分 析 表 明 ， 由 于 LP RAR 过 制 了 天 冬 氨 酸 激酶 和 高 丝氨酸 脱 氢 酶 的 活性 ， 这 些 活性 也 是 在 单条 的 称 作 天 冬 氨 酸 激酶 工 -高 丝氨酸 脱 氢 酶 工 的 蛋白 质 土星 现 出 来 的 。 对 赖 氨 酸 敏感 的 天 冬 氨 酸 激酶 ， 可 称 作 天 冬 ARO, 当 将 天 冬 氨 酸 激酶 A 1 与 胰 凝 乳 EO 酶 保温 培育 时 ,天 冬 氨 酸 激酶 的 活性 遭 到 破坏 ,而 高 丝氨酸 脱 氢 酶 的 活性 则 不 受 - 苏 氨 酸 的 抑制 。 已 分 离 得 到 一 个 分 子 量 “为 55,000 道 尔 顿 的 片段 ， 此 片段 含有 脱 敏 化 的 高 丝氨酸 脱 氢 酶 的 活性 ， 用 末端 基 团 分 析 表 明 ,此 片段 相当 于 多 肽 链 的 -C- 未 端 部 分 。 以 后 又 得 到 另 一 个 天 冬 氨 酸 激酶 I - 高 丝氨酸 脱 Se I 的 突变 种 ， 这 个 突变 种 具有 对 L- 苏 氨 酸 抑制 作用 敏 感 的 正常 的 天 冬 氨 酸 激酶 活性 ， 但 却 没 有 高 丝氨酸 脱氧 酶 的 活性 。 后 来 分 离 出 来 这 种 突变 种 蛋白 质 ， 并 表明 它 的 分 子 量 为 47,000 道 尔 顿 ， 相 当 于 肽 链 的 N 末 端 部 分 。 这 种 突变 属于 “赭石 2 型 突变 ,未 成 熟 的 链 端 , 负 有 缩短 了 的 多 肽 链 ls'19 。 对 这 些 片段 的 分 离 和 分 析 证 明 ， 这 两 种 酶 活性 是 在 单条 多 肽 链 的 不 同 区 段 上 《图 2.8》 。 因 为 这 两 个 片段 仍 保 留 2 pigtail AK 86000 HD ee 的 的 RE 47000AK (2) . . 55000 HD HARM-MARM-COOH (3) | 图 2.8 大 肠 杆菌 K12 的 天 冬 氨 酸 激酶 I - HARM AM I 的 结构 。1 一 一 天 然 酶 ;2 一 一 具有 天 冬 氨 酸 激酶 (AK) 活 性 的 “赭石 ”突变 种 的 人 -末端 片段 ;3 一 一 具有 高 丝氨酸 脱 氢 酶 (HD) 活性 的 、 胰 北 乳 蛋白 酶 消化 形成 的 C- 末 端 片段 。 了 对 底 物 亲和力 未 发 生 改变 的 两 种 酶 活性 中 的 任何 一 种 ， 所 以 多 肽 链 必定 是 折 肢 成 两 个 明显 不 同 的 球形 区 域 ， 当 这 两 个 区 域 彼 此 分 开 时 ， 每 一 部 分 仍 保留 它 们 自己 的 独 有 活性 。 目前 已 经 介绍 了 不 少 双 功 能 的 和 多 功能 的 蛋 和 白质， 其 中 两 种 或 多 种 酶 活性 处 于 单条 多 肽 链 上 。 这 些 酶 包括 色 氨 酸 生 物 合 成 中 最 初 的 两 个 酶 (图 2.7) ， 邻 氨基 葵 甲 酸 合成 酶 和 ” 邻 氮 基 葵 甲 酸 -PRPP- 磷 酸 核糖 转移 酶 01 ， 及 大 肠 杆 菌 的 依赖 于 DNA 的 DNA ARCO, ， 在 真 核 细胞 中 的 两 个 例子 是 脂肪 酸 合成 酶 复合 物 C 2 和 糖 原 脱 支 酶 4 。 能 取得 这 些 酶 进展 的 一 种 可 能 方法 是 基因 的 融合 。 用 岂 伤寒 杆菌 (S.t?7phimurium) 通过 把 组 氨 酸 操纵 子 的 第 2 和 第 3 个 基因 〈 正 常情 况 为 两 种 单独 的 蛋白 质 ， 即 组 氨 醇 脱 氢 酶 和 咪唑 -乙酰 -磷酸 -氨基 -转移 酶 编码 ) 相 融 合 的 实验 来 完成 这 项 研究 。 融 合 是 通过 诱导 靠近 顺 反 子 之 间 区 域 的 两 个 连续 的 、 可 以 除去 正常 存在 于 两 个 基因 间 的 链 终 止 密码 子 的 移 码 突变 来 完成 的 。 结 果 两 种 酶 就 被 作为 一 条 单条 的 多 肽 链 而 合 成 ， 通 过 保持 两 种 催化 活性 的 重要 部 分 的 方式 而 折 玛 ?5 。 在 好 几 个 酶 由 非 共 价 键 相互 连结 成 的 多 功能 性 酶 或 多 酶 复合 体 中 ， 各 种 活性 在 功能 上 密切 相关 ， 并 确实 常常 催化 一 系列 直接 联系 的 反应 。 这 种 情形 有 两 个 明显 的 优 氮 : Ca) 使 反应 顺序 局 限于 细胞 的 一 个 特定 部 位 ， 以 致 一 个 反应 形成 的 产物 ， 以 较 高 的 浓度 〈 要 比如 果 这 种 酶 被 任意 分 散在 整个 细胞 时 的 浓度 高 得 多 ) 被 反应 顺序 的 下 一 个 酶 利 用 。 (b ) 由 于 一 个 反应 的 产物 能 直接 被 导向 下 一 个 酶 反 应 ， 而 不 能 从 复合 体 表 面 释 放出 来 ， 那 末 以 其 它 方式 可 能 产 生 的 不 必要 的 副 反 应 就 会 减少 到 最 低 限 度 。 方 族 氨基 酸 生物 合成 中 的 分 支 酸 变 位 酶 系统 CA 2.7) ， 相 当 细 致 地 说 明了 e 14 e 这 二 点 。 分 支 酸 变 位 酶 -P 〈 可 被 葵 丙 氨 酸 抑制 ) 与 催 化 形 “成 苯 丙 氨 酸 的 预 葵 脱 水 酶 复合 ， 而 分 支 酸 变 位 酶 -T (可 被 栈 ARM) 则 与 催化 形成 酷 氟 酸 的 预 葵 脱 氧 酶 复合 c!9) 。 这 就 使 人 们 推测 ， 可 能 实际 上 存在 着 两 个 预 葵 库 ， 一 个 专 一 性 地 导向 茶 丙 氨 酸 ， 另 一 个 则 专 一 性 的 导向 栈 氨 酸 。 遗憾 的 是 ， 上 述 状态 更 难于 理解 两 种 双 功 能 性 的 天 冬 氨 酸 激酶 -高 丝氨酸 脱 氢 酶 的 情形 ,因为 这 两 种 酶 是 反应 途径 中 的 第 一 和 第 三 个 酶 ， 彼 此 并 不 紧 接 (图 2.5) 。 没 有 证 据说 明 第 二 个 酶 一 -天 冬 氨 酸 半 醛 脱 氢 酶 “看 来 只 有 一 种 类 型 ) 是 连接 这 两 个 双 功 能 酶 的 ct 。 现 就 天 冬 氨 酸 激酶 I- 高 丝 ” 氨 酸 脱氧 酶 I 而 论 ， 如 果 一 个 单独 的 、 对 L- 苏 氨 酸 抑制 敏 感 的 天 冬 氨 酸 激酶 的 基因 ， 为 高 丝氨酸 脱 氢 酶 编码 的 基因 了 融 合 了 ， 那 么 只 要 有 极 小 的 突变 性 变化 ， 就 会 引起 两 个 球形 区 域 间 的 相互 作用 ,形成 一 个 这 样 的 结构 ,使 苏 氨 酸 同等 地 抑制 了 高 丝氨酸 脱氧 酶 和 天 冬 氨 酸 激酶 。 这 种 情况 的 价值 可 能 在 于 具有 选择 性 的 优点 ctsal 。 这 个 论证 不 能 用 于 不 受 反 馈 控制 的 天 冬 氨 酸 激酶 工 -高 丝氨酸 脱氧 酶 T。 然 而 ,在 所 有 双 功 能 酶 中 ， 它 的 两 种 酶 活性 一 定 是 以 等 克 分 子 合成 的 ， 所 以 键 合 就 成 为 控制 两 种 酶 活性 合成 的 一 个 简单 的 方式 。 2.7 各 种 细菌 的 天 冬 氨 酸 激酶 的 调节 ; 控制 机 理 的 进化 在 大 肠 杆 菌 和 鼠 伤寒 杆菌 中 ， 天 冬 氨 酸 激酶 I -高 丝 氨 酸 脱氧 酶 工 是 在 单条 多 肽 链 上 。 而 在 其 它 细 菌 中 ， 如 固氮 落 类 和 假 单 钨 菌 属 ， 这 两 种 酶 就 成 为 两 个 独立 的 、 每 个 都 可 被 L- 苏 氨 酸 抑制 的 蛋白 质 。 在 多 粘 芽 胞 杆菌 和 枯草 杆 菌 中 ， 似乎 就 单 是 一 种 天 冬 氨 酸 激酶 ， 它 既 不 受 L- 苏 氨 酸 的 抑 e 15 。 制 ， 也 不 受 L- 赖 氨 酸 的 抑制 ， 但 工 - 苏 氨 酸 和 LM — 起 ,就 可 产生 一 种 对 酶 活性 几乎 是 完全 的 抑制 作用 (多 价 反馈 抑制 作用 ) 。 在 红色 红 螺 菌 中 , 似乎 只 有 一 种 能 被 工 -= KAM 完全 抑制 的 天 冬 氮 酸 激酶 。 但 是 ,不 存在 L- 苏 氨 酸 时 ，I=- 甲 硫 氨 酸 和 世 - 异 亮 氨 酸 也 能 激活 这 些 酶 ， 而 L- 异 亮 氨 酸 则 能 有 效 地 逆转 L- 苏 氨 酸 的 抑制 作用 。 这 种 细菌 的 苏 氨 酸 脱氧 酶 对 L- 异 亮 氮 酸 的 抑制 并 不 敏感 。 因为 在 这 种 有 机 体 中 ， “ 工 - 赖 氨 酸 对 天 冬 氨 酸 激酶 的 活性 似乎 没有 影响 ， 所 以 异 亮 氨 酸 / 苏 氨 酸 比例 的 增加 ， 似 乎 就 成 为 加 速生 产 为 工 - 赖 氨 酸 和 L- 甲 硫 氮 酸 生 物 合成 所 需要 的 共同 中 间 体 的 信号 292? 。 虽然 还 未 能 象 对 大 肠 杆菌 K12 系 统 中 那样 ， 对 上 述 的 一 些 细菌 中 的 这 些 酶 作出 全 面 的 鉴定 ,不 过 有 一 点 是 很 清楚 的 ， 那 就 是 各 种 不 同 的 细菌 可 以 采用 很 不 相同 的 方式 ， 来 解决 特 定 代谢 途径 的 调节 问题 。 一 个 极为 重要 的 普遍 规律 是 : 尽管 各 种 有 机 体 之 间 ， 有 机 体 与 另 一 种 有 机 体 之 间 ， 而 且 在 哺乳 动物 中 ， 同 一 种 动物 条 内 前 一 类 细胞 与 另 一 类 细胞 之 间 ， 代 谢 途 径 的 各 个 步骤 是 基本 相同 的 ， 然 而 对 这 些 途 径 的 调节 却 可 以 是 截然 不 同 的 。 天 冬 氨 酸 激酶 系统 例证 了 令 人 注意 的 代 谢 控制 机 理发 展 领域 ， 它 无 疑 会 在 代谢 途径 本 身 进化 许 入 以 后 ， 得 到 进一步 的 演 发 。 2.8 大 肠 杆菌 中 喀 喧 生物 合成 的 控制 UTP( 尿 昔 三 磷酸 ) 和 CTP WHERE) 的 生物 合成 ， 是 有 关 酶 活性 控制 理论 发 展 中 具有 重要 意义 的 另 一 个 代谢 途 径 。 图 2.9 概括 了 该 代谢 途径 的 各 个 步骤 和 主要 的 变 构 效 应 。 图 2.10 示 出 卡 及 代谢 途径 调节 中 天 冬 氮 酸 转 氮 甲 酰 酶 ee 16 。 一 one 精 氨 酸 。 MAB ls eunmby-7m 22 a a a Fanny? =‘, —eume®-uopSute ei GMP - AMP 图 2.9 大 肠 杆 菌 中 喀 啶 生物 合成 的 调节 。 6 磷酸 @I 天 冬 氨 酸 清 酸 1 ATP a C+) 变 构 激 活 剂 ，〈- ) 变 构 抑 制剂 8。 一 一 用 ATP 作 底 物 的 反应 ; 1—APRH 酸 合成 酶 ! ”2 一 一 天 冬 氨 酸 转 氨 甲 酰 酶 ? 3 一 一 二 氢 乳 清 酸 M, 4——CTPA RM, 5—N-ZMSGARARMB. CIPT 以 是 CTP 合 成 酶 的 激活 剂 ， 也 可 以 是 它 的 抑制 剂 〈 见 正文 ) 。 (ATC Be) 原始 研究 中 的 一 个 实验 ”” 。 在 此 实验 中 ， 采 用 TRE AFAR OR MP RRA ATC 酶 后 面 的 酶 ， 见 图 2.9) 的 大 肠 杆 菌 突变 种 。 结 果 ， 突 变种 能 催化 ATC 酶 的 反应 ， 但 它 的 生长 仍 需要 尿 喀 喧 。 就 在 生长 培养 基 中 的 尿 喀 喧 耗 尽 之 前 ， 将 突变 种 培养 物 分 成 两 部 分 ， 一 部 分 供 以 过 量 的 尿 喀 了 喧 。 另 一 部 分 则 由 于 断绝 了 尿 喀 啶 ， 生 长 立 即 停止 ， 并 且 氮 甲 酰 天 冬 氢 BARRE BER, DYNA 积累 的 量 可 高 达 细 菌 于 重 的 50% . INA RR Ee BY PE 少 蓄积 的 氮 甲 酰 天 冬 氮 酸 ， 面 给予 过 量 尿 喀 啶 的 那 一 部 分 ， 在 未 出 现 断 绝 尿 喀 啶 之 前 ， 从 不 蓄积 氨 甲 酰 天 冬 氨 酸 。 这 表明 ATC 酶 的 活力 在 体内 可 受到 尿 喀 啶 或 是 从 它 衍 生出 来 的 代谢 物 的 抑制 ， 并 得 以 发 现 ，CTP 是 ATC 酶 在 体外 的 强 反 馈 抑 制剂 。CMP 的 抑制 作用 较 弱 ，UTP Al UMP 则 几乎 完全 没有 抑制 作用 "282?) 。 已 用 缺乏 CTP 合成 酶 的 突 变种 证 明了 体内 的 CTP 抑 制作 用 的 重要 性 〈 图 2.9) 。 这 种 突变 种 能 按照 喀 啶 代谢 途径 制造 UTP， 但 为 了 制造 CTP, fe = MASE EE. SRA HERA, Aah 内 UTP 的 量 可 上 升 10 倍 ， 并 且 尿 喀 啶 核 昔 被 排 到 培养 基 中 ， “这 说 明 ， 尽 管 有 大 量 的 UTP 存 在 ， 这 种 喀 啶 的 代谢 却 不 受 控 制 。 当 有 胞 喀 啶 核 音 存在 时 ， 由 于 产生 了 CTP， 就 不 会 过 量 产生 UTP 了 "so30D 。 在 体外 ，ATP 是 ATC 酶 的 激活 剂 “? 。 若 以 ATC 酶 的 活性 作为 天 冬 氨 酸 的 函数 作 图 ， 便 得 到 一 个 S 形 曲线 。CTP 可 以 与 天 冬 氮 酸 相 竞争 ， 使 S 形 曲线 向 右 改 变 ， 使 曲线 的 S 形 弯 度 加 大 (图 2.11) 。ATP 则 可 使 曲线 向 左 改 变 ， 使 曲线 的 S 形 弯 度 减 小 。 并 且 还 可 括 抗 CTP 的 抑制 作用 。 因 为 ,为 了 中 ATC 酶 活性 所 0 5 Oe 6 ew KZA (mM) 图 2.11 ATP 和 CTP 对 ATC 酶 活性 的 影响 。 测 定 是 在 3.6mM 氨 甲 酰 磷酸 PH7.0 时 进行 的 28) 。 RNA 的 合成 不 致 受到 限制 ,四 种 核 音 三 磷酸 , 即 ATP、GTP、 CTP、UTP， 必 须 大 致 等 量 存在 ， 所 以 当 L- 天 冬 氨 酸 的 量 减 少时 ， 激 活 ATC 酶 ， 可 能 有 助 于 刺激 UTP 和 CTP 的 合成 ， 从 而 平衡 了 嗓 叭 和 喀 啶 的 生物 合成 。ATP 和 CTP 对 ATC Agi e 18 。 性 的 影响 ， 与 LAR RA L— FE RT A I A HE 的 影响 是 相似 的 〈 图 2.2; 2.4). 平衡 UTP、CTP、ATP 和 GTP 产 生 量 的 另 一 些 机 理 ， 可 能 发 生 在 CTP 合 成 酶 的 水 平 上 (2.9) 。CTP 合成 酶 的 活 性 需要 有 变 构 激活 剂 GTP SO”? 。 当 CTP 浓度 高 时 ，CTP 可 能 是 通过 与 底 物 UTP 的 竞争 而 抑制 CTP 合 成 酶 ， 但 当 UTP 浓度 低 时 ，CTP 则 可 能 是 通过 代替 GTP 而 激活 CTP AM. ATP 也 是 CTP 合成 酶 和 喀 喧 代谢 途径 另外 三 种 酶 的 底 物 《图 2 的 . “在 ATC 酶 之 前 的 氨 甲 酰 磷 酸 合成 酶 〈 图 2.9) ， 也 受 嗓 吟 和 喀 啶 核 背 酸 二 者 的 控制 43334'35 。 它 受到 UMP 以 及 UDP 和 UTP 的 强烈 抑制 ， 但 却 能 被 味 叭 核 苷 酸 ， 如 IMP CK 酸 ) 、GMP 和 AMP 所 激活 。 在 大 肠 杆 菌 中 ， 氨 甲 酰 磷酸 的 另 一 个 用 途 ， 是 在 直 - 精 氮 酸 生物 合成 途径 中 从 鸟 氢 酸 形成 Ime CA 2.9) 。 当 精 氮 酸 过 量 时 ， 由 于 精 氮 酸 发 挥 了 对 N- 乙 酰 拭 - 谷 氮 酸 合成 酶 【 它 是 导致 鸟 氨 酸 产生 的 途径 上 的 第 一 个 酶 (2.9) 的 专 一 性 抑制 作用 ， 鸟 氮 酸 便 不 能 产 He 036) 。 当 精 氨 酸 可 被 生长 所 利用 时 , 氮 甲 酰 磷酸 便 只 用 于 喀 了 喧 的 生物 合成 ， 因 此 氨 甲 酰 磷酸 合成 酶 (而 不 是 ATC 酶 ) 就 变 为 喀 啶 途径 中 的 第 一 个 酶 。 鉴 于 尿 喀 啶 核 苷 酸 (在 体外 ,特别 是 UMP) 的 专 一 性 抑制 作用 ， 于 是 提出 当 精 氮 酸 过 量 时 ， 喀 了 喧 核 苷 酸 生 物 合成 的 初级 控制 ， 可 能 是 通过 甲 酰 磷 酸 合成 酶 起 作用 , 而 不 是 ATC 酶 。 然 而 , 当 精 氮 酸 的 量 有 限时 ， 鸟 氮 酸 浓度 便 上 升 。 因 为 鸟 氨 酸 就 是 氨 甲 酰 磷酸 合成 酶 的 变 构 激 活 剂 ， 并 可 以 逆转 UMP 的 抑制 作用 5? ， 所 以 在 精 氮 酸 受到 限制 的 情况 下 ， 喀 啶 生物 合成 的 初级 控制 又 恢复 到 由 ATC 酶 起 作用 了 。 这 样 就 引出 了 一 个 很 有 益 的 代谢 调节 原理 。 虽 然 代谢 途径 必 是 受到 限 速 酶 的 调节 ， 但 这 限 速 步骤 可 能 会 因 细 e 19 e 胞 代谢 状态 而 有 所 不 同 。 以 CTP 而 不 是 以 UTP 作 为 ATC 酶 的 反馈 抑制 剂 ， 起 初 认 为 似乎 有 些 奇 怪 , 因 为 如 果 CTP 过 量 ,而 尿 喀 啶 核 苷 库 受 到 限 制 ， 那 么 ATC 酶 将 被 抑制 ， 从 而 就 不 能 向 细胞 提供 UITP。 除 非 有 大 致 等 量 的 UTP 存 在 ， 否 则 CTP 不 能 被 结合 进 RNA， 生 长 就 会 停止 ?8 。 然 而 在 详细 分 析 了 CTP 对 ATC 酶 的 抑制 作 用 后 表明 ， 在 体外 给 以 过 量 的 氮 甲 酰 磷酸 ，CTP 的 抑制 作用 ”就 不 完全 ， 从 不 超过 85 匈 ?8 。 因 为 缺乏 UMP 和 UTP 的 细 菌 ， 应 具有 高 水 平 的 氮 甲 酰 磷酸 〈 所 甲 酰 磷 酸 合成 酶 未 被 抑 制 ) ， 所 以 ， 尽 管 存在 非常 过 量 的 CTP， 中 间 产 物 还 是 缓慢 而 连续 点 滴 地 产生 UTP。 目 前 还 没有 证 据 认 为 存在 一 个 不 被 CIP 抑 制 而 在 尿 喀 啶 核 苷 库 控 制 下 的 第 二 个 ATC 酶 。 这 个 例 子 清 楚 地 说 明 为 什么 定量 分 析 变 梅 效应 剂 的 作用 ， 可 以 确切 地 了 解体 内 控制 机 理 是 如 何 起 作用 的 。 2.9 ATC 酶 的 结构 ; 单一 的 酶 可 分 离 为 催化 亚 基 和 调节 亚 基 在 经 典 实 验 中 ，Gerhart 和 Schachman53772 可 将 ATEC jig (沉降 系数 是 11.7S) 分 成 沉降 系数 分 别 为 5.8S 和 2.8S 两 个 较 小 的 亚 基 。5.8S 组 分 具有 催化 活性 ， 但 不 被 CTP Mil, 2.8S 组 分 无 催化 活性 ， 但 却 具 有 与 CTP 和 ATP 相 结 合 的 部 位 。 再 者 ， 如 果 把 2.8S 加 到 5.8S 组 分 中 ，5.8S 组 分 就 恢复 了 对 CTP 抑制 作用 的 敏感 性 。 所 以 称 5.8S 组 分 为 催化 亚 基 (C)， 称 2.8S 组 分 为 调节 亚 基 〈(R)。 因 为 活性 部 位 和 变 构 部 位 实际 上 是 位 于 不 同 的 多 肽 链 上 ， 这 就 完全 证 明了 活性 部 位 和 变 构 部 位 是 不 同 的 ， 从 而 有 力 地 支持 了 变 构 的 观点 。 它 意 味 着 ,CTP 的 结合 引起 结构 改变 ,必定 抑制 酶 的 催化 作用 ， 这 e 20 ee UC 种 改变 通过 天 然 酶 中 连接 两 个 多 肽 链 的 亚 基 接 触 ， 从 R 亚 基 著 到 C 亚 基 " 有 关 这 个 发 现 的 含意 ， 将 在 第 六 章 中 加 以 讨 论 。 天 然 的 ATC 酶 具有 ReCe BWC? ， 亚 基 的 排列 如 图 2.12 所 示 ， 是 按 Ds-32 对 称 形 排 FAY 9? 。 不 过 需要 强调 的 是 ， 对 催化 作用 来 说 存在 着 不 同 的 亚 基 ， 并 不 是 普 过 规 律 ， 事 实 上 相对 来 讲 倒是 个 军 见 的 现象 。 苏 氨 酸 胶 氮 酶 和 天 冬 氮 酸 激酶 [ -高 丝 氮 酸 脱 氢 酶 I， 各 自 都 是 由 四 个 相同 的 亚 基 组 成 ， 所 以 在 ”图 ?.12 ATC 酶 中 亚 基 的 排 列 。 这 些 酶 中 ， 变 构 部 位 和 活性 Pac RE c -一 部 位 是 位 于 同样 的 多 肽 链 上 。 2.10 fi =o Ca) 终 产物 对 代谢 途径 中 第 一 个 酶 的 反馈 抑制 作用 ， 是 调节 细菌 生物 合成 途径 的 共同 机 理 。 这 种 调节 机 理 使 碳 、 氮 和 能 的 需要 量 降 到 最 低 限 度 ， 并 保证 整个 代谢 途径 对 终 产 物 的 变化 发 生 反 应 。Atkinson 5401 提出 ， 引 起 对 反应 后 一 步 又 进行 控制 的 另 一 重要 原因 是 ， 所 调节 的 那 一 步骤 〈 就 是 该 控制 要 调节 的 步骤 ) 前 的 中 间 产 物 的 浓度 明显 地 增加 了 。 每 一 个 细胞 中 存在 着 数 千 种 聚合 电解 质 和 小 代谢 物 ， 于 是 提出 了 溶解 度 这 一 重大 的 问题 ， 并 且 为 了 能 对 反应 顺序 中 那个 首 先进 行 的 步骤 上 定点 控制 ， 维 持 低 的 代谢 物 浓 度 可 能 是 一 个 有 力 的 使 人 信服 的 原因 。 e 2]1 。 Cb) 痢 明 这 些 调节 机 理 的 两 个 特别 强 有 力 的 研究 ”就 deyangnyhascism 了 为 所 行 的 分 析 。 对 由 体外 进行 的 酶 学 和 蛋白质 化 学 的 分 析 所 得 上 (在 体内 实际 上 是 起 作用 的 ) 来 说 ， 这 些 突变 种 的 研究 是 很 关键 的 。 (c ) 分 支 途径 的 存在 及 各 途径 之 间 功 能 上 的 相互 依 赖 ， 需 要 有 另 一 些 对 终 产物 抑制 的 基本 形式 进行 的 附加 控 制 。 这 些 调 节 机 理 及 这 些 控 制 中 所 涉及 的 酶 结构 ， 是 完全 不 - 同 的 。 S$ 考 文 献 C1) Abelson, P.H.(1954), J.Biol. Chem., 206, 335-343. C23 Umbarger, H.E.(1969),Curr. Tops.Cell.Reg., 1,57-76. [3 ] Umbarger, H. E. (1955), In Amino Acid Metabolism 442- 451,(Eds)McElroy and Glass, Johns Hopkins Press, Baltim- ore. C4) Umbarger,H.E.(1956), Science, 123, 848-848. C5) Changeux,J.P. (1963). Cold.Spring. Harb. Symp. Quant. Biol., 26, 313-318. C6) Monod, J., Changeux, J.P. and Jacob,F. (1963). J.Mol. Biol., 6, 306-329. C7) Changeux, J.P. (1963),Cold. Paring: Harb. Symp. Quant. Biol., 28, 497-504. [8 ] Freundlich, M. and Umbarger, H. E. (1963), Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol., 28, 505-511. [9 ] Stadtman, E.R.,Cohen,G. N., Le Bras, G.and Robichon- Szulmayster, H.(1961), J. Biol. Chem. ,236,2033-2038. [10] Yugari, Y.and Gilvary, C.(1962), Biochem. Biophys. Acta, 62, 612-614. (11) Cohen,G.N.(1969),Curr.Tops.Cell. Reg., 1, 183-231. (12) Patte, J.C.,Le Bras,G. and Cohen, G.N. (1967), Biochem. Biophys. Acta, 136, 245-257. [13] Wormser, E. H. and Pardee, A.B.(1958), Arch. Biochem. Biophys., 78, 416-432. C14) Rowbury.R.J.(1962), Biochem. J., 82,,24P. (15) Brown, K.D.and Day,C.H.(1963), Biochem. Biophys.Acta, ° 22 © 77, 170-172. (16) Cotton, R.G.H. and Gibson, F.(1965), Biochem. Biophys. Acta, 100, 76-88. (17) Falcoz-Kelly,F., Janin,J.,Saari, J.C., Veron, M., Truffa- Bachi, P. and Cohen, G. N. (1972), Eur. J. Biochem., 28, 505-519. C18} Veron,M.and Cohen,G.N.(1974),In Metabolic Interconv- ersions of Enzymes 1973, 335-347. Eds. Fischer, E.R., Krebs, E.G., Neurath, H. and Stadtman, E. R., Springer- Verlag, Heidelberg. [19] Veron, M.and Cohen,G.N.(1972),Eur.J. Biochem., 28, 520- 527. (203 Truffa-Bachi, P.and Cohen, G.N.(1973), Ann. Rev. Bioch- _em., 42,113-134. (21) Klenow, H.,Overgaard-Hansen, K.and Patkar, S.A.(1971), Eur .J.Biochem.,22, 371-381. (223 Schweizer, E., Holzner,U., Meyer, K.H., Tauro, P.and Schweizer, M. (1974), In Comparative Biochemistry and Physiology of Transport, 219-244. (Eds) Bolis, L.,° Bloch, K.,Luria,S.E.and Lynen,F.,North Holland Publishing Co. (23) Lornitzo,F.A., Qureshi, A.A.and Porter, J. W. (1975), J. Biol. Chem., 250,4520-4529. (24) Taylor, C.,Cox,A.J.,Kernohan,J. C. and Cohen,P. (1975), Eur.J.Biochem., 51, 105-115. (25) Yourno,J., Kohno,T.and Roth,J.R. (1970), Nature, 228,820- 824. (26) Datta, P.and Gest,H.(1964),Nature,203, 1259-1261. (27) Paulus,H.and Gray,E.(1964),J.Biol.Chem. ,239, 4008-4009. (28) Gerhart, J.C. (1970),Curr.Tops.Cell.Reg., 2,276-325. (29) Gerhart,J.C.and Pardee, A.B. (1962),J.Biol.Chem., 237,891- 896. (303 Neuhard,J.(1968), J.Bacteriol., 96, 1519-1527. (31) O* Donovan,G.A.and Neuhard,J.(1970), Bact. Reviews, 34, 278-343. (32) Long,C.W.and Pardee,A.B.(1967),J.Biol.Chem., 242,4705- 4721. (33) Pierard, A.(1966),Science 154, 1572-1573. (34) Anderson,P.M.and Meister, A.(1966), Biochemistry,5,3164- 3169. (35) Ahmed,A.and Ingraham,J.L. (1969), J. Biol. Chem.., 244, 4033-4038. e 23 «6 (36) Vyas,S., and Maas,W.K.(1963), Arch. Biochem. Biophys. , 100,542-546. (37) Gerhart, J.C.and Schachman,H.K. (1965), Biochemistry 4, 1054-1062. fr } (38) Rosenbusch, J.P.and Weber,K.(1971), J.Biol. Chem.,246, 1644-1657. (39) Warren, S.G., Edwards, B.F.P.,Evans, D.R., Wiley, D. C.and Lipscomb, W.N.(1973), Proc. Nat. Acad. Sci., 70, 1117-1121. - (40) Atkinson, D.E. (1970),Current Topics in Cellular Regula- tion, 1,29=43. @ 24 @ Poe PRBS Ake Ey 学 功能 的 起 始 作 用 3.1 小 肠 的 酶 原 激 活 作用 胰 酶 原 的 激活 作用 列 为 已 搞 清 了 它 的 醇 调节 概念 的 第 一 个 系 统 。 早 在 本 世纪 初 就 已 经 知道 ， 在 小 肠 中 ， 刚 分 泌 出 膝 的 胰 液 ， 只 有 当 它 与 肠 激 酶 这 个 因子 接触 后 ， 才 能 够 消化 蛋 白质 。 随 后 的 进展 分 两 个 阶段 。 在 二 十 世纪 三 十 年 代 ， 经 改 进 后 的 蛋白 质 分 级 分 离 技术 ， 可 以 使 好 几 种 酶 与 其 无 活性 的 前 身 彼此 完全 分 离开 来 ， 从 而 可 以 系统 地 描述 激活 作用 的 基 本 概况 GD 。 在 二 十 世纪 五 十 年 代 ， 由 于 一 些 更 加 成 熟 的 分 离 技术 的 问世 ， 以 及 一 些 解决 蛋白 质 一 级 及 三 级 结构 方法 的 发 现 ， 这 才 有 可 能 对 伴随 着 需要 起 始 激活 作用 的 分 子 细节 过 程 进行 分 析 。 3.1.1 胰 蛋 白 酶 及 其 专 一 性 激活 的 胰 液 含 有 7 种 不 同 的 蛋白 酶 (图 3.1) 。 包 括 三 种 类 型 的 肽 链 内 切 酶 一 一 胰 蛋 白 酶 (T) ， 胰 凝 乳 蛋白 酶 (ChT)A、B 、C 和 弹性 蛋白 酶 〈(E)， 两 种 类 型 的 肽 链 端 解 酶 一 一 羧 肽 酶 A(CpA) 和 羧 肽 酶 B(CpB)。 因 为 这 些 肽 链 内 切 酶 具有 彼此 相互 补充 的 特性 ， 因 此 ， 它 们 的 结合 作用 将 使 在 胃 里 已 被 蛋白 酶 部 份 水 解 的 食物 蛋白 质 更 广泛 地 碎 分 。 肽 链 端 解 酶 (CPPA 和 CpB) 催化 从 肽 链 C- 末 端 继续 释放 出 氨基 酸 ，CpB 切除 由 胰 和 蛋白 酶 作用 所 产生 的 肽 的 _C- 末 端的 精 氢 ° 25 «¢ 酸 和 赖 氨 酸 ，CpA 则 切除 由 胰 凝 乳 蛋白 酶 和 弹性 蛋白 酶 消化 而 产生 的 肽 的 C- 未 端的 氨基 酸 ， 或 者 是 已 被 CpB 作 用 过 的 胰 蛋白 酶 的 肽 的 C- 未 端的 氨基 酸 。 进 一 步 的 消化 作用 则 由 从 肠 细胞 分 泌 到 小 肠 中 的 各 种 肽 酶 去 完成 。 专 一 性 地 水 解 x- AMA REO, By MB -x 和 x [REA BE TEA. SARE sk Y ty ERK”. TERETE DIK BERD N- 未 端 连续 释放 RIL S >, : Zam 类 型 ， 专 一 性 被 断 开 的 肽 刍 胰 蛋 白 酶 Bk Be A U0 # HA M- x 精 氨 酸 - x 胰 凝 乳 蛋 白 Ke 8 BAM-x, #HAM-x, 酶 A、B、 色 氨 酸 - x， 亮 氢 酸 -X， C 组 氨 酸 -x | MEA kee 宽 wRR-x, AMR-x, | 甘氨酸 - x ， 丝 氨 酸 - x Bk Me A 肽 链 端 解 酶 很 宽 x-MAR, x-#RAR, x - 色 氨 酸 ，xX- 亮 氨 酸 ， x - 异 亮 氨 酸 ，X- 甲 硫 氨 酸 ，x- 组 氨 酸 ，X- 丙 氨 RW, x-MAR, x-HA 酸 次 肽 酶 也 Bk ED 7 x - 赖 氨 酸 ，X- 精 氨 酸 图 3.1 胰 和 蛋白 酶 的 专 一 性 。 有 3.1.2 胰 脏 酶 原 的 分 泌 和 激活 素 和 肠 促 胰 液 肽 毛刺 激 。 七 种 蛋 自 酶 都 是 被 合成 为 无 活性 的 前 体 ， 称 为 酶 原 ;这 七 种 酶 是 胰 蛋 白 酶 原 (Tg),` 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 (ChTg)A、B、 C， 弹 性 蛋白 酶 原 (ProE) 以 及 羧 肽 蛋白 酶 原 A 和 了 B (ProCpA 和 ProCpB) 。 它 们 存在 于 外 分 泌 性 胰 脏 腺 泡 细 胞 的 球形 酶 原 颗粒 〈 此 颗粒 通过 膜 与 其 它 细胞 组 分 隔 开 ) 之 中 。 以 胞 吐 的 方式 〈 这 是 一 种 与 春 噬 作用 完全 相反 的 过 程 , 在 这 一 过 程 中 ， 酶 原 颗粒 膜 与 腺 泡 细胞 外 层 膜 相 融 合 ) 分 泌 于 十 二 指 肠 。 分 泌 可 被 支配 胰 脏 的 迷走 神经 及 肽 激素 类 一 一 Wa fe We Re py ie We 这 两 种 肽 激素 在 小 肠 上 部 的 肠 细 胞 中 侣 成 ， 分 泌 到 血液 循环 ， 再 从 血液 循环 移入 胰 脏 。 肠 促 胰 酶 素 刺激 分 泌 少 量 富 含 酶 前 体 的 胰 液 ， 而 肠 促 胰 液 肽 则 刺激 富 含 HCO3s- 离 子 、 但 含 酶 原 很 少 的 胰 液 不 断 地 流动 。 由 于 胰 蛋白 酶 在 最 适 pH (接近 8.0) 时 有 一 个 相当 陡 的 pH- 活 性 峰 , 因此,HCOs:- 离 子 是 胃 的 酸性 内 容 物 的 重要 缓冲 剂 。 最 强 的 肠 促 胰 酶 素 分 泌 刺 激 剂 是 某 些 L- 氨基 酸 和 长 链 脂 肪 酸 ， 而 酸 本 身 就 是 最 有 效 的 肠 促 胰 液 歇 的 刺激 HL CO 肠 激 酶 (Ek) 是 在 小 肠 刷 状 缘 细 胞 中 合成 的 一 种 蛋 白水 解 酶 。 由 于 Ek 存在 于 小 肠 中 ， 于 是 通过 始 动 胰 蛋 白 酶 原 癌 胰 和 蛋白 酶 转化 司 ”而 开始 了 酶 原 激 活 的 过 程 “CA 3.2) 。 一 些 缺 乏 肠 激 酶 活性 的 患者 可 发 生 严 重 的 肠 紊乱 ， 这 就 证 实 了 Ek 在 体内 的 重要 作用 "5 。 一 但 Ek | ProCpB Tg es 一 一 一 全 ProE—— © E ChTgA,B—PCHTA,B PR CpB ChTgC ——s ChTC 一 一 oT CpA 图 3.2 BR AE as Da BE BY BY AEF o- 22.8 may, REABRAREAwBHSLRSKa set, A 为 胰 和 蛋白 酶 可 以 催化 它 自 己 从 胰 蛋 白 酶 原 的 形成 〈 图 3.3) 。 胰 蛋 白 酶 也 可 以 催化 弹性 蛋白 酶 fp Cb, RRAE 白 酶 原 [ly3ey3d6] 和 ProCpB ‘£7783 的 激 活 。 ERA, Pro- CpA 是 以 与 胰 凝 乳 RHACN EE) P 蛋白酶 原形 成 的 复 图 3.3， 胰 蛋白 酶 对 胰 蛋 白 酶 原 的 自身 催化 激活 。 ”合体 而 存在 的 。 此 圆 图 〈 〇 ) 为 通过 实验 得 到 的 点 ， ZR 复合 体 的 激活 机 理 为 单纯 自身 催化 反应 的 理论 曲线 CD 。 可 能 是 ， 通 过 胰 蛋 白 酶 而 形成 胰 凝 乳 蛋白 酶 C， 而 后 胰 凝 乳 蛋白 酶 C 又 激活 PircCpA。 但 是 ， 如 果 ProCpA- 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 C 复 合体 解 离 了 ， 那 么 胰 和 蛋白酶 独自 就 可 以 催化 ProCpA WIS. 每 种 酶 原 只 要 断 开 一 个 肽 键 就 可 以 被 激活 〈 图 3.4 )。 肠 激酶 断 开 胰 和 蛋白 酶 原 中 敏感 的 赖 氨 酸 6- 顷 氮 酸 7 肽 键 ， 要 比 断 开 等 量 的 胰 蛋 白 酶 快 2000 倍 ， 这 可 能 是 因为 肠 激酶 能 识 别 特 殊 的 〈 天 冬 氮 酸 ) AMIR IOC? 。 ATE A BRT 胰 蛋 白 酶 原 的 自身 催化 性 激活 ， 可 能 仍 具有 生理 学 意义 ， 因 为 与 胰 蛋 白 酶 相 比 ， 小 肠 中 只 存在 微量 的 肠 激酶 。 肠 激酶 并 不 激活 其 它 任何 酶 原 。 虽然 通过 胰 和 蛋白酶 断 开 精 氮 酸 15- 异 亮 氮 酸 16 的 单一 键 ， 就 可 以 促 发 胰 饰 乳 蛋白 酶 的 充分 活性 ， 然 后 另外 一 些 肽 键 ( 亮 氨 酸 13- 丝 氨 酸 14, RAR 146-FAR 147 和 天 冬 酰胺 148- 两 氨 酸 149) 为 胰 凝 乳 蛋 白 酶 自身 催化 所 断 开 ， 但 活 性 却 没 有 任何 进一步 的 改变 。 两 个 二 肽 一 一 丝氨酸 - 精 氨 酸 和 苏 e 28 e 胰 蛋 白 酶 活性 S S RO oO HTS 4ChTg-A ” &ChTg-B #ChTg-C 3% Pro-E 牛 CpB 牛 CDA 激 活 ik W-RA-RR-RA-KA-BUR HA B-MAR- 4: i-I-3k-RZ-RA-KA-KA-WBRAR-BAB- ‘4 E-H- a -J- RIE- HK -S-- 天 冬 酰 胺 - 丝 两 - 精 土 异 亮 - 顷 - TI .ee 精 鞋 苏 - 苏 - .………X 卫 两 - 精 芋 丝 - 苏 - 天 冬 酰 胺 - - ——_—=CpAa |——CpAs A3.4 胰 脏 酶 原 的 激活 。 以 箭头 表示 激活 过 程 中 被 断 开 的 肽 键 (32,3,6,7;8,9,1D 。 氨 酸 -天 冬 酰胺 可 被 释放 出 来 ， 但 胰 凝 乳 蛋白 酶 A 的 三 条 多 肽 链 不 会 解 开 ， 因 为 它们 是 由 二 硫 键 交 联 在 一 起 的 “3 。 ie EFL ARE CX ProCpA 的 激活 ， 包 括 断 开 一 个 肽 键 ， 从 芳 端 失去 50 一 60 个 氨基 酸 ， 以 及 产生 一 个 称 为 Cpa, 的 形式 。 胰 蛋白 酶 对 ProCpA 的 激活 也 主要 是 产生 CpA。， 但 有 可 察觉 量 的 CpAs (〈 它 少 两 个 氨基 酸 ) 存在 〈 图 3.4)。 从 胰 凝 乳 蛋 白 酶 C 和 胰 和 蛋白 酶 的 不 同 专 一 性 来 看 ， 它 们 都 形 e 29 。 成 CDA。 是 令 人 惊奇 的 (B3.D . Ri, WNKABAAB 前 面 那个 残 基 的 性 质 还 不 了 解 69 1 。 尽 管 CpB 和 CpA 分 子 ， 量 几乎 一 样 ， 都 是 35,000 ARMM, {A ProCpB 似乎 比 ProCpA 要 大 些 〈57,000 对 41,000 道 尔 顿 ) 。 被 胰 蛋 白 酶 断 开 一 个 精 氮 酸 - 苏 氨 酸 键 ,而 分 子 大 小 并 无 明显 的 减少 ， 但 可 迅速 激发 CpB 的 最 大 的 活性 ， 达 60 一 70 狗 。 最 大 活性 的 激 发 ， 随 分 子 减 少 到 35,000 道 尔 顿 而 变 得 缓慢 ， 并 可 能 包括 另 — SK ERSTE S78, AK 弹性 蛋白 酶 原 、ProCpA 和 ProCpB 的 激活 肽 的 结构 问题 ， 还 未 得 到 解决 。 据 推测 , 戏 和 蛋白酶 类 之 所 以 合成 为 酶 原 的 形式 ,主要 是 防 止 在 蛋白 酶 被 贮 入 酶 原 颗 粒 前 降解 其 它 的 胰 脏 和 蛋白质， 以 及 防止 在 酶 分 刻 出 来 之 前 在 酶 原 颗 粒 内 相互 消化 。 专 一 性 分 泌 颗粒 的 用 处 在 于 使 分 泌 的 控制 更 容易 些 ， 而 且 也 可 阻止 酶 原 被 在 腺 泡 细 胞 内 颗粒 之 外 的 其 他 蛋白 酶 所 激活 。 还 有 另 一 种 蛋白 质 分 泌 到 胰 液 中 , 它 是 胰 蛋 白 酶 的 专 一 性 抑制 剂 台 :2 。 在 胰 液 的 蛋白 质 组 分 中 ， 胰 蛋白 酶 抑制 剂 只 含 2 匈 ， 比 胰 蛋 白 酶 原 的 浓度 要 低 得 多 "53 。 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 功能 可 能 是 . 为 了 防止 胰 和 蛋白 酶 原 被 酶 原 颗 粒 中 可 能 存在 的 一 些微 量 胰 重 白 酶 自身 催化 激活 ， 这 样 就 可 保证 只 在 胰 液 与 肠 激 酶 相遇 时 ， 才 发 生 酶 原 的 激活 作用 。 _ 胰 脏 酶 原 的 激活 作用 ， 是 利用 酶 调节 作为 放大 初 刺激 效 应 手段 的 一 个 例子 。 每 个 肠 激酶 分 子 可 使 许多 胰 和 蛋白 酶 原 分 子 转变 成 胰 蛋 白 酶 ， 而 每 个 胰 蛋 白 酶 分 子 又 促 发 产生 更 多 的 胰 蛋 白 酶 分 子 ; 每 个 胰 蛋 白 酶 分 子 可 激活 另外 一 些 酶 原 ; 而 每 个 被 激活 了 的 蛋白 酶 分 子 又 可 水 解 很 多 肽 键 。 可 在 本 章 的 后 面部 分 及 第 四 、 五 章 中 看 到 这 种 现象 的 另外 一 些 例子 。 每 个 激活 部 位 都 位 于 靠近 各 蛋白 质 的 氨基 末端 ， 并 且 只 须 断 开 一 个 肽 键 就 可 以 促 发 活性 ， 这 是 生物 经 济 学 方面 的 典型 例子 。 e 30 。 酶 原 的 天 然 构 型 显然 能 使 胰 蛋 白 酶 首先 断 开 一 个 特别 的 精 氨 酸 -和 键 或 赖 氨 酸 -X 键 ， 但 是 如 果 酶 原 处 于 变性 状态 ， 那 么 这 种 构 型 又 可 防止 胰 蛋 白 酶 切断 很 多 其 它 易 受 影响 的 敏感 的 键 。 一 般 并 不 认为 人 胰 脏 每 天 可 分 泌 约 100 克 水 解 酶 ,实际 上 这 比 英 国人 平均 每 日 饮食 摄 入 的 蛋白 质 的 量 稍 高 了 些 “ 。 所 以 ， 严 密 控 制 过 程 的 一 方面 就 在 于 这 些 蛋 白 酶 必须 易 受 蛋 白水 解 ， 以 便 最 终 相互 降 解 为 可 被 重 吸收 的 氨基 酸 组 分 。 本 ae - 3.1.3 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 转 化 为 胰 凝 乳 蛋 白 酶 ， 应 用 和 射线 晶体 衍射 方法 已 经 解决 了 胰 凝 乳 蛋 白 酶 和 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 的 三 级 结构 ， 分 辩 力 可 达 2.5 A S10, ERE 乳 蛋白 酶 中 起 催化 作用 的 主要 残 基 是 丝氨酸 195。 丝 氮 酸 195 是 以 氢 键 与 组 氨 酸 57 相 连结 ， 而 其 后 ， 组 氨 酸 57 又 以 氢 键 与 天 冬 氨 酸 102 相 连接 (图 3.5)。 人 们 把 这 一 组 氢 键 称 做 电荷 交 HAR 193 re 6 组 氨 酸 57 FAR 16 AR AE 102 图 3.5” 胰 凝 乳 蛋白 酶 活性 中 心 的 某 些 重要 氨基 酸 的 构象 。 从 分 子 的 外 表 向 内 部 看 。 〇 一 一 碳 原子 ;四 一 - 氮 RY; @—ARFC, RAS, HP, HH ta ABS mA KZ AB 102 EAE Hi zk 性 环境 ， 转 移 到 丝氨酸 的 氧 上 。 这 个 氧 原子 的 负电 性 增加 ， 就 使 在 正常 状态 下 无 活性 的 丝氨酸 羟基 具有 强大 的 亲 核 能 e $31 e 力 ， 这 种 能 力 可 以 对 所 水 解 的 肽 键 的 痰 基 碳 起 动 亲 核 性 攻 7°, 4R, AMARA RULE. RE UR T 丝氨酸 195 的 重要 性 ， 因 为 它 能 与 二 异 丙 基 所 磷酸 (DFP) 迅 速 反应 而 形成 一 个 完全 没有 活性 的 共 价 衍生 物 5cs) 。 JREA 酶 、 弹 性 和 蛋白酶、 甚至 肠 激 酶 Go ， 也 都 能 被 DFP 失 活 。 这 种 现象 的 意义 将 在 下 面 讨论 。 胰 凝 乳 和 蛋白酶 原 和 胰 凝 乳 蛋 白 酶 总 的 扳 都 非常 相似 ， 对 二 者 的 结构 进行 了 比较 之 后 提出 ， 通 过 激活 作用 ， 链 上 只 发 生 几 点 有 意义 的 变动 。 最 感到 惊奇 的 发 现 是 : ARRAS 激活 的 酶 中 ， 丝 氨 酸 195、 组 氨 酸 57 和 天 冬 氨 酸 102 的 位 置 ， 实际 上 没有 改变 54 。 纵 然 丝氨酸 195 与 DFP 或 与 氰 酸 盐 的 反 应 要 比 与 激活 的 酶 的 反应 慢 得 多 (2 ， 但 就 这 三 种 酶 位 置 没 有 变化 这 一 点 ， 与 所 观察 到 的 丝氨酸 195 在 酶 原 中 具有 特殊 的 反应 性 是 一 致 的 。 从 酶 激活 的 观点 来 看 ， 下 面 这 些 变化 似乎 是 具有 决定 性 的 。 被 胰 蛋 白 酶 断 开 的 键 所 产生 的 异 亮 氮 酸 16 的 自由 x- 氛 基 (图 3.4) 塞 在 分 子 内 ， 在 分 子 内 与 天 冬 氨 酸 194 形 成 离子 对 (图 3.5) , GRABARICMMAR 17 的 侧 链 就 被 掩蔽 起 来 了 ， 并 且 天 冬 氮 酸 194 不 再 象 在 酶 原 中 那样 与 组 氮 酸 40 有 氢 键 连接 。 甘 氨 酸 193 与 组 氮 酸 40 形 成 了 一 个 新 的 氨 键 。 精 氮 酸 145 从 表面 移 到 内 部 ， 在 那里 它 可 以 和 天 冬 氮 酸 194 的 羧 基 侧 链 相互 作用 。 甲 硫 氨 酸 192 则 从 内 部 移 到 酶 原 中 原来 为 精 AMR 145 所 占有 的 表面 位 置 上 。 这 些 变化 形成 了 四 个 新 的 专 一 性 决定 子 ( 这 在 酶 原 中 是 没有 的 ,而 且 也 是 胰 凝 乳 蛋 白 酶 所 匮 以 识别 它 的 多 肽 底 物 的 九 个 因素 之 外 的 ) 。 曾 有 人 估计 ， 这 可 能 说 明 为 什么 胰 凝 乳 蛋 白 酶 的 活性 要 比 胰 凝 乳 蛋 自 酶 原 大 104 一 105 倍 53?) 。 男 一 方面 ， 这 个 理论 不 能 解释 为 什么 在 Map, ARH 〈 它 不 与 专 一 性 的 “ 止 穴 ”相互 作用 ) 2 ° 32 » A R195 2A EACH PEF BES 30 一 40 FRCP, MARAT 细微 的 “电荷 替换 系统 ”的 重新 组 合 ， 但 在 现行 可 能 的 分 辩 率 上 仍 不 能 测定 出 来 。 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 转变 成 胰 凝 乳 蛋 白 酶 ， 很 能 说 明 变 构 转 变 时 可 能 发 生 的 那 种 结构 的 改变 〈 第 二 章 ) 。 在 活性 中 心 能 自由 移动 的 表面 部 位 上 肽 键 发 生 断 裂 〈 类 似 于 一 个 变 构 效 应 物 的 结合 ) ， 这 就 起 始 了 结构 的 改变 ， 这 一 改变 可 导致 形 成 底 物 结合 止 穴 处 。 就 整体 结构 来 说 ， 结 构 没有 显著 的 变 化 ， 这 230 个 氨基 酸 中 只 有 几 个 位 置 的 氮 基 酸 稍 微 变化 ， 就 足以 完成 这 种 转变 了 。 虽然 胰 和 蛋白酶 原 和 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 的 激活 肽 彼此 并 不 十 分 相似 〈 图 3.4) ， 但 胰 和 蛋白 酶 、 弹 性 蛋白 酶 和 胰 凝 乳 蛋 白 酶 A 和 B ， 每 一 种 大 约 都 含有 230 FAR, Mm AM A DFP 专 一 性 地 抑制 。 胰 凝 乳 蛋白 酶 A 与 B 之 间 ， 整 个 氨基 酸 顺 序 有 78 驳 是 相同 的 ， 而 任何 其 它 成 对 的 酶 之 间 仅 有 40 一 50 % FE AA TAI AY 8D 1) 。 主 要 氨基 酸 附 近 的 氨基 酸 顺 序 也 非常 相 似 〈 图 3.6》 。 胰 蛋白 酶 所 "0 MHRA MOO? 的 三 级 结构 显示 出 ， 它 们 整个 分 子 的 折 码 方式 与 胰 凝 乳 蛋白 酶 A 一 样 ， 并 且 电 荷 传递 系统 (A 3.5) 也 是 一 样 的 ， 这 表示 各 种 酶 具 有 共同 的 催化 机 理 。 至 于 各 种 酶 有 不 同 的 专 一 性 这 一 点 ， 只 能 用 在 底 物 结合 四 穴 处 有 几 个 特殊 的 替换 来 解释 cra 1 。 很 明显 ， 四 种 酶 显然 是 衍生 于 共同 起 源 的 基因 ， 并 且 成 为 在 结 构 上 与 丝氨酸 蛋白 酶 有 关系 的 较 广 泛 的 族 系 的 成 员 〈 图 3.6， 3.2, 3.397) 。 这 些 分 析 还 指出 ， 相 对 地 讲 ， 演 发 不 同 的 底 物 专 一 性 比 产生 新 的 催化 作用 机 制 要 简单 得 多 。 结 果 和 弄 清楚 了 ， 这 可 能 是 酶 进化 的 一 般 规律 。 尽 管 胰 和 蛋白 酶 原 和 弹性 蛋 自 酶 原 的 三 级 结构 还 未 解决 ， 但 在 激活 酶 中 ，N 末 端 异 亮 氨 酸 16 或 顷 氮 酸 16 与 天 冬 氨 酸 194 之 间 存 在 同样 的 离子 对 ， 显 © 33 。 酶 A B 和 参考 文献 牛 胰 凝 乳 蛋 “ 异 亮 - 顷 - 天 冬 ” 色 - 顷 - 颁 - 苏 -两 - ” 半 胱 - 甲 硫 - 甘 -天 [3b] 冬 - 丝 - 甘 - 甘 -及 白 酶 A、B 酰胺 - 甘 两 -组 - 半 胱 - 甘 。 - 亮 牛 胰 和 蛋白酶“ 异 亮 - 纺 - 甘 - -BI-B--W- ” 半 胱 - 谷 氨 栈 胺 - 甘 [3b] -天 冬 - 丝 - 甘 - 甘 tf 两 -组 - 半 胱 - 色 = - 5-3 EME S S-S-H- ©-S-PA-K- EM-AABR-H [3b] -天 冬 - 丝 - 甘 - 甘 本 -两 -组 - 半 胱 - 统 -及 - 亮 AMEE 。 异 亮 - 顷 - 谷 - ” 色 - 顷 - 亮 - 苏 -两 - ” 半 胱 - 谷 - 甘 - 天 冬 - PD oH -Ht- fi - tt A-A--R- OW 4 Xa 因子 “ 异 亮 - 顷 - 甘 - -BA-FE-HK-- | 半 胱 - 谷 氨 酰胺 - 甘 6329 -天 冬 - 丝 - 甘 - 革 tt 两 -组 - 半 胱 - 亮 I-28 牛 ITXc 因 子 -Bi-H-# 半 胱 - 谷 氨 酰胺 - 甘 [533 天 冬 - 丝 - 甘 - 甘 - - 4 b acai 异 亮 - 半 胱 - 甘 - 赖 -天 冬 - [34] 丝 - 甘 - 谷 -- 甘 - 精 图 3.6 哺乳 动物 丝氨酸 蛋白 酶 之 间 序 列 的 同 源 性 。 残 基 号 码 是 指 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 。A 一 一 氨基 末端 序列 ， 也 、C 一 一 电荷 替换 系统 残 基 周 围 的 序列 。 示 了 这 两 个 酶 的 激活 机 理 基 本 上 是 类 似 的 。 羧 肽 酶 A 和 B 这 两 个 同 功 酶 的 氨基 酸 序列 ， 有 51 驳 是 相 同 的 扩 ?。 已 经 解决 了 分 辩 率 为 2 A RKB A O° (不 是 羧 肽 酶 B ) 的 三 级 结构 ， 但 酶 原 的 构象 和 因 激 活 而 发 生 的 结 ALE, MARA. 3.1.4 尚未 解决 的 问题 尽管 现在 对 胰 脏 的 蛋白 酶 及 其 前 体 的 结构 已 了 解 得 非 第 at FFA MARRIES A, SECA MSF, RIE e 34 e g i 分 析 表 明 ， 实 际 上 是 通过 肠 激酶 、 肠 促 胰 液 肽 及 肠 促 胰 酶 素 ”发挥 控制 作用 。 正 是 由 于 1902 年 发 现 了 肠 促 胰 液 肽 ca ， 这 ， 。 才 导 致 引用 激素 这 个 术语 来 描述 影响 细胞 代谢 的 分 子 ， 以 有 别 在 细胞 中 被 合成 的 分 子 。 然 而 促进 这 些 激素 外 吐 作用 的 机 理 ， 甚 至 外 时 作 用 时 所 发 生 的 分 子 变化 ， 都 不 清 ECP. A 关 激 素 作用 机 理 的 一 些 晚近 看 法 ， 将 在 第 四 章 中 讨论 。 究 况 是 肠 激酶 的 分 泌 受到 控制 ， 还 是 肠 激酶 (和 其 它 肠 肽 酶 ) 被 合成 为 酶 原 ， 都 还 不 清楚 。 胰 脏 分 泌 各 种 各 样 的 其 它 水 解 酶 ， 它 们 降解 核酸 〈 核 精 核酸 酶 和 脱氧 核糖 核酸 酶 ) 、 碳 水 化 合 物 co- 淀粉 酶 ) 和 脂 肪 (各 种 脂 酶 ) 。 究 竟 这 些 水 解 酶 是 和 和 蛋白酶 一 样 被 一 些 相 同 的 酶 原 颗粒 所 分 泌 呢 ? 还 是 所 有 的 蛋白 酶 确实 只 被 一 种 类 - 型 的 酶 原 旺 粒 分 泌 呢 ? 这 就 提出 一 个 问题 : 各 种 胰 脏 水 解 酶 的 选择 性 分 泌 是 否 可 能 。 有 一 个 肯定 的 证 据 就 是 ， 长 期 改变 饮食 ， 就 能 影响 所 分 泌 的 胰 胜 水 解 酶 的 比例 。 不 过 这 也 可 能 只 是 反映 在 酶 合成 水 平 上 受到 控制 ， 并 不 是 分 泌 速度 有 什么 不 同 C4b Mer EEE, A — Ap MNES] — BENRMG A, 22 DIRBIR Ch 130 个 氨基 酸 组 成 ) 的 形式 分 泌 的 ， 并 且 可 被 胰 蛋 白 酶 将 N 末 端的 一 个 精 氨 酸 -再 氨 酸 键 切 掉 7 个 残 基 而 被 激活 OP. 然 还 未 发 现 过 其 它 水 解 酶 的 前 体 ， 但 对 很 多 关于 酶 原形 成 的 理论 上 的 推论 (3.1.2 节 ) 同样 适用 ， 可 能 只 有 找到 了 制 备 能 使 所 有 的 胰 及 蛋白 酶 都 完全 失 活 的 提取 物 的 方法 后 ， 才 可 能 发 现 这 些 酶 的 酶 原 ， 因 为 在 酶 原 的 性 质 方面 ， 显 然 是 它 们 对 蛋白 水 解 激活 作用 非常 敏感 。 换 言 之 ， 其 它 一 些 水 解 酶 可 能 也 以 酶 原 的 形式 合成 出 来 ， 不 过 在 分 泌 出 来 以 前 ， 它 们 囊 入 酶 原 显 粒 期 间 就 转变 成 活化 形 了 。 Soe i eI A 基础 当 组 织 中 的 血管 受到 损伤 时 ， 有 三 种 因素 可 以 使 失血 减 到 最 少 ， 即 在 受伤 部 位 的 血管 收缩 、 血 小 板 凝 集 及 血液 温 块 * 尽 管 人 们 对 血 凝 的 控制 机 理 远 没有 完全 了 解 ,但 过 去 五 年 中 ， 对 这 方面 的 研究 己 有 了 特别 显著 的 进展 ， 似 乎 是 处 于 指 数 增长 的 状态 。 这 是 基于 这 样 的 事实 ， 即 所 有 的 因子 “其 让 有 些 仅 微量 存在 ) 只 是 最 近 才 获得 高 度 纯化 的 未 降解 的 形 式 ， 而 且 彼此 可 以 完全 分 离开 。 这 也 使 得 人 们 能 够 明确 地 研 究 它 们 的 相互 作用 以 及 激活 机 理 。 最 近 有 两 篇 关于 这 个 问题 的 卓越 评论 ct25 ， 本 节 的 目的 ， 就 是 概略 地 介绍 有 关 通 过 限制 性 蛋白 水 解 进行 酶 调节 的 这 一 经 和 系统 的 近代 观点 。 在 体外 已 观察 到 两 种 不 同 的 血 凝 机 理 ， 称 作 内 源 性 途径 和 外 源 性 途径 〈 图 3.7，3.8) 。 内 源 性 系统 只 利用 在 血浆 中 存在 的 因子 ， 而 外 源 性 系统 既 利 用 存在 于 血浆 的 因子 ， 也 利 用 组 织 提取 物 中 的 因子 。 尽 管 在 体外 这 两 种 途径 可 以 分 开 ， 但 根据 铅 乏 这 些 因子 的 患 出 血 症 的 患者 来 判断 ， 在 体内 这 两 种 机 理 都 是 重要 的 cz 。 这 些 遗 传 突变 种 ， 对 于 鉴定 和 确定 这 些 调节 途径 的 步 又 ， 是 非常 有 价值 的 。 这 两 种 途径 可 能 是 相互 起 作用 的 ， 但 在 体内 根据 各 自 所 占 优势 的 特殊 情况 ， 作 用 程度 有 所 不 同 。 内 源 性 途径 中 ， 很 多 凝集 因子 以 分 段 作用 的 方式 相互 作 用 ， 最 后 使 得 纤维 蛋白 原 转变 为 纤维 蛋白 。 纤 维 蛋白 的 头 尾 相 接 ， 并 且 例 聚 形成 一 个 不 淤 性 纤维 蛋白 凝 块 ， 这 个 凝 块 被 因子 XIa HE. CLT AED, 该 酶 催化 一 个 纤 维 蛋白 分 子 上 的 谷 氨 酰 胺 侧 链 与 另 一 个 纤维 蛋白 分 子 上 的 丈 氨 酸 侧 链 之 间 形 成 “。〈Y- 谷 氨 酰 ) 赖 氨 酸 的 交 联 。 e 36 e 1 胶原 激 肽 释放 酶 ? 2 BARK <«-------------- 4 P. | {pS Re s+e 本 Ayx 因子 XI | Af vil 因子 VIIa | | 因子 Xi 因子 xl。 ”前 激 肽 ” 激 肽 pipe a | Cat+ 释放 酶 Reichs a 组 织 因 子 因子 wx， 因子 Mi--, ------4 | BFVloc MARF -cd*PU 4.0 aiid 因子 X 因子 Xa Aa a Ee ca ';PL| BSF NIN’ pA vi 始 血 凝 作 用 的 可 能 机 理 。 缩 写字 同 A 3.7 1 1 图 3.8 通过 外 源 性 系统 而 起 | 因子 X - PAF vui'-ca’ PL] : : (25; 26; 273, 因子 x AF te 2 =- == 2" aA ca PL | AV’ 因子 内 源 性 途径 是 pe tH 扩大 现象 的 典型 例 ae F (3.1 节 ) ， 并 凝血 酶 原 “凝血 酶 sn 能 部 分 地 解释 在 短 和 暂 的 延缓 期 之 后 ， 纤维 蛋白 原 纤维 蛋白 f ca Ar ee， ， 非常 突然 地 形成 纤 ae hes se een TALL. AR 图 3.7 哺乳 动物 血浆 内 源 性 系统 中 血族 刀 始 作 ”而 有 两 种 也 能 增进 Fl 9 EBLE OS), PL—— Bhs a 反应 速度 的 附加 因 -一 凝血 因子 的 活化 形 。 sais se wae RRBAF Xa 和 所 形成 的 凝血 酶 而 对 因子 看 和 因子 了 产生 反馈 激活 〈 图 3.7) ， 二 是 在 磷脂 表面 上 许多 因子 的 反应 ， 这 种 反应 可 以 增加 它们 的 有 效 浓度 (3.2.2 节 ) 。 外 源 性 途 径 设置 了 好 几 个 凝血 因子 的 旁 路 ， 并 在 因子 X 的 水 平 上 与 内 源 性 途径 相遇 。 在 此 以 后 ， 两 个 途径 就 相同 了 。 所 以 ， 在 体 6 37 e 内 ， 因 子 X 可 被 两 个 不 同 的 凝血 因子 所 激活 。 因子 下 、 页 、、X 、 克 和 凝血 酶 原 ， 都 是 无 活性 的 蛋 白水 解 酶 的 前 体 ， 当 供 以 适当 的 辅助 因子 时 ， 这 些 因子 都 可 催化 激活 顺序 中 下 一 个 因子 。 因 子 又 下 是 转 谷 氨 酸 酰胺 酶 的 前 体 ， 而 因子 看 、V 和 纤维 蛋白 原 , 可 能 还 有 组 织 因 子 ,都 不 是 酶 的 前 体 。 尽 管 这 样 ， 它 们 还 都 可 以 被 限制 性 蛋白 水 解 ， 转化 成 具有 活性 或 活性 更 高 的 蛋白 质 。 3.2.1 内 源 性 和 外 源 性 途径 在 体外 ， 内 源 性 途径 是 由 因子 存 与 表面 接触 而 被 始 动 的 。 这 个 表面 通常 就 是 反应 试管 的 玻璃 管 壁 ， 而 在 体内 ， 很 可 能 是 围绕 着 受伤 血管 管 壁 的 纤维 蛋白 ， 如 胶原 或 弹性 蛋 白 。 表 面 接触 促使 因子 下 转变 为 激活 形 的 因子 驳 as ， 不 过 在 试管 内 这 个 转变 发 生得 非常 慢 。 近 来 已 证 明 ， 在 体外 ， 因 子 Ma 通过 限制 性 蛋白 水 解 ， 使 前 激 肽 释放 酶 转变 成 激 肽 释放 酶 。 激 肽 释放 酶 是 血浆 中 的 一 种 蛋白 酶 ， 认 为 其 功能 之 一 是 从 一 种 称 为 激 肽 原 的 和 蛋白质 生成 具有 9 个 残 基 的 肽 一 一 舒缓 激 肽 。 舒 绥 激 肽 可 增进 血管 壁 的 千张, 从 而 促进 了 血管 舒张 。 在 体外 也 证 明 激 捧 释放 酶 可 将 因子 下 转变 为 因子 观 a 7? 这 就 提出 一 旦 形成 了 头 一 个 极 微量 驳 a, 就 扩大 了 因子 焉 激活 的 可 能 机 理 〈 图 3.7) 。 不 过 对 血 凝 顺序 中 的 这 些 早期 阶段 了 解 得 还 很 少 。 缺 乏 因子 鸡 的 人 ， 人 往往 是 在 偶然 情况 下 以 及 在 没有 严重 的 失血 情况 下 被 发 现 的 ， 而 确实 ， 最 初 哈 格 曼 查 明 因 子 殉 缺损 的 人 是 死 于 肺 血 栓 821! 很 有 可 能 还 有 另 一 些 激活 因子 亚 的 机 理 ， 或 者 还 存在 另 一 个 尚 不 能 确定 的 、 能 将 AF REAAF Ma HAF. Af Ma WAST K RPRAAFT Ka, MAF Ka 本 身 不 能 激活 因子 X， 必 须 先 与 因子 桓 形成 复合 物 。 晚 近 的 证 据 指 ee 38 e H, RIERA FS WHE RAT’ ,否则 它 难以 促进 〈 或 可 能 -完全 不 会 ) 因子 Ka 催化 激活 因 了 于 X。 这 种 催化 激活 作用 在 体外 可 由 凝血 酶 来 完成 ,或 被 因子 又 a 更 有 效 地 完成 (5351。 然 而 这 就 提出 了 因子 Xa ABEL A AT. PP OT 能 性 是 某 些 因子 Xa 可 通过 外 源 性 途径 形成 〈 图 3.8) ， 它 们 异常 紧密 地 将 内 源 人 性 和 外 源 性 途径 联接 起 来 。 此 外 ， 尚 未 鉴 定 出 另 一 种 血浆 蛋白 酶 ， 它 可 以 在 体内 始 动因 子 覃 转变 成 因 子 而 “。 因 子 丰 和 因子 而 “可 以 认为 通过 类 似 ATC 酶 (第 二 章 ) 作为 因子 a 的 调节 亚 基 。 缺乏 功能 性 因子 班 的 病人 ， 患 有 众所周知 的 血 友 病 。 这 是 最 普通 的 凝血 障碍 性 疾病 ， 每 10,000 个 新 生 儿 中 可 有 1 名 "2 。 由 于 血 友 病 的 基因 存在 于 和 染色体 上 ， 所 以 一 般 女 性 只 是 这 种 病 的 携带 者 ， 而 绝 大 多 数 的 血 友 病 患者 是 男性 。 最 著名 的 血 友 病 携带 者 ,， 就 是 维多利亚 女王 。, 她 的 第 五 个 儿 F Leopold， 患 有 血 友 病 ， 在 31 岁 时 ， 头 部 受到 轻 击 ， 致 使 发 生 脑 出 壬 而 死去 。 维 多 利 亚 女 王 的 女儿 中 ， 有 两 个 也 是 血 友 病 携带 者 ， 并 且 把 疾病 带 到 欧洲 另 一 个 王室 〈 沙 皇 俄国 ) 家 族 ， 这 对 俄国 沙皇 继承 王位 的 问题 特别 重要 ， 因 为 维 多 利 亚 女 王 的 女儿 Alice 与 沙皇 尼 古 拉 二 世 结 婚 后 的 独生子 ， 也 AMAIA, 144 PETE T ap OP, AfXa AAT V 催化 凝血 酶 原 转变 为 凝血 酶 ， 与 因子 X 被 因子 a- 因 子 看 “复合 体 的 激活 非常 相似 ,其 中 因子 了 起 着 和 因子 看 “一 样 的 作用 。 然 而 和 因子 奋 的 作用 不 一 样 ,尽管 因子 V 的 活力 由 于 转变 成 因子 V “而 显著 增加 ,但 因子 Y 似乎 是 可 以 促进 因子 Xa 催化 形成 凝血 酶 。 在 体外 ， 这 个 反应 是 被 凝血 酶 、 也 或 许 是 被 因子 Xa 催化 的 。 外 源 性 系统 使 因子 又 转变 为 因子 Xa 的 机 理 仍 不 十 分 清 楚 。 最 近 已 经 明白 ， 因 子 区 可 以 被 转变 成 蛋白 水 解 酶 因子 e 39 e Wa fh, ASX MAS Xa 的 转变 仍然 需要 组 织 因子 ?7 。 组 织 因 子 可 能 是 起 着 与 因子 V “和 因子 碍 “ 相 类 似 的 作用 。 在 体外 ， 因 子 下 可 被 因子 Xa 非 常 有 效 地 转变 为 因子 而 as。 然而 在 体内 是 什么 因子 始 动 因子 殉 的 激活 ， 尽 管 最 近 有 天 提出 是 激 肽 释放 酶 ， 但 仍 是 一 个 未 解决 的 问题 扩 。 Alf Ka-AF 看 “或 因子 而 a- 组 织 因子 使 因子 X 转变 为 因子 Xa ,以 及 因子 Xa- 因 子 V 使 凝血 酶 原 转变 为 凝血 酶 的 过 程 中 ， 绝 对 需要 Ca 及 磷脂 ， 而 因子 页 a 使 因子 区 转变 为 Ka 的 过 程 ， 则 需要 有 Ca “。 关 于 这 些 需要 ， 最 近 已 提出 一 个 精辟 的 分 子 解 释 ， 将 在 3.2.3 节 中 介绍 。 3.2.2 血小板 在 血液 凝固 中 的 作用 4 和 2 血小板 的 重要 性 远 不 止 它 在 损伤 部 位 所 起 的 凝集 作用 。 凝集 作用 可 以 引起 血小板 中 释放 出 各 种 化 合 物 。 这 些 化 合 物 包括 刺激 收缩 血管 的 5- 产 色 胺 激素 及 在 凝集 过 程 中 好 几 个 步 又 都 需要 的 磷脂 。 血 小 板 还 分 泌 一 种 特殊 类 型 的 因子 XE， 这 种 类 型 的 因子 XE， 在 体外 由 于 凝血 酶 的 作用 而 转变 成 因子 XIa ,其 转变 速度 比 血浆 中 的 因子 XE 的 要 快 得 多 。 还 有 报道 说 , 血小板 释放 一 种 能 将 因子 转变 为 因子 区 a 的 因子 ， 因 而 ALT AFM RAF Wn BRO 。 如 果 这 个 报道 属实 的 话 ， 则 这 将 是 始 动 内 源 性 系统 的 一 个 极其 重要 的 机 理 。 由 于 凝血 隆 始 动 了 血小板 的 凝集 作用 ， 那 么 显然 ， 血 小 板 功能 和 血液 凝固 之 间 的 相互 关系 是 相当 复杂 的 。 似 乎 血小板 还 能 汪 放 一 些 尚未 被 鉴定 的 其 它 调节 血 凝 的 因子 。 3.2.3 凝血 因子 激活 的 分 子 变 化 过 程 蛋白 水 解 酶 一 一 因子 观 a 因子 鼠 a、 因 子 区 a、 因 了 于 而 a、 因子 Xa 和 凝血 酶 ， 都 能 被 DFP “与 一 个 特殊 的 丝氨酸 残 基 e 40 o 作用 ) 抑制 。 上 述 丝氨酸 周围 的 氨基 酸 序列 与 因子 Ka, wl 子 Xa 及 凝血 酶 的 其 它 活性 部 位 的 氨基 酸 序列 彼此 几乎 一 样 ， 与 胰 脏 肽 链 内 切 酶 也 几乎 一 样 。 而 且 ， 酶 原 激 活 时 所 产生 的 N 示 端 序 列 ， 也 类 似 于 胰 脏 蛋白 酶 (图 3.6) 。 这 些 结果 与 凝血 酶 ct2 和 因子 X ac?22 的 全 部 氨基 酸 序列 联 在 一 起 提示 ， 这 些 活 化 状态 的 血 凝 因子 〈 在 肝脏 中 合成 ) 和 胰 脏 蛋白 酶 ， 都 是 由 同一 祖先 蛋白 质 进 化 来 的 ， 并 以 同样 的 催化 机 理 而 发 挥 作 用 。 还 提示 ， 每 种 酶 原 中 的 敏感 键 ， 一 旦 被 切 开 ， 那 么 导致 产生 活性 的 结构 转变 ， 可 能 也 非常 相似 。 因子 Ka 或 因子 而 a 催化 因子 又 向 因子 又 a 的 转变 中 ， 涉 及 到 断 开 同样 的 精 氮 酸 - 异 亮 氨 酸 键 的 这 一 过 程 C55? 。 因子 刀 a 催 化 因子 转变 为 因子 Ka 中 ， 则 涉及 到 起 初 断 开 并 不 产 生 激活 作用 的 精 氨 酸 - 丙 氨 酸 键 ， 继 而 再 断 开 具有 激活 作 用 的 精 氨 酸 - 须 氨 酸 键 这 两 种 过 程 。 凝 血 酶 原 转变 成 凝 血 酶 ， 起 初 则 需要 断 开 但 不 产生 激活 作用 的 精 氨 酸 - 苏 氨 酸 键 ， 其 后 再 断 开具 有 激活 作用 的 精 氨 酸 - 异 亮 氨 酸 键 这 两 个 过 程 。 当 纤 维 蛋 自 原 向 纤维 蛋白 转变 时 ， 凝 血 酶 断 开 四 个 精 氨 酸 - 甘氨酸 键 ， 而 在 因子 X 丰 向 因子 XHa 转变 中 ， 凝 血 酶 则 断 开 一 个 精 氨 酸 -甘氨酸 键 。 所 以 ,各 种 激活 作用 只 通过 切断 很 少 几 个 肽 键 就 可 以 完成 。 这 类 酶 的 专 一 性 与 胰 蛋 白 酶 都 非常 相 似 ， 而 且 胰 蛋 据 酶 也 确实 能 够 模拟 因子 Ka MAX LE 用 。 然 而 ， 北 血 因子 是 一 些 专 一 性 特别 强 的 蛋白 酶 ， 它 能 只 切断 一 种 或 两 种 蛋白 质 中 一 个 或 两 个 键 。 其 原因 可 能 是 由 于 这 个 酶 识别 较 长 的 氨基 酸 序列 的 能 力 ， 胜 过 识别 只 有 精 氢 酸 -X 单一 键 的 能 力 ， 就 像 肠 激酶 的 情况 那样 。 因 此 ,凝血 酶 原 的 两 个 因子 Xa 敏感 的 键 ， 都 连接 着 同样 的 异 亮 氨 酸 - 谷 氨 酸 -甘氨酸 - 精 氨 酸 序列 ， 这 一 点 是 很 有 意义 的 5a6) 。 凝血 酶 原 是 四 种 凝血 因子 GFK. WRX) 之 一 ， 这 全 41 @ 四 种 因子 在 其 生物 合成 时 均 需 要 维生素 KK 79, 缺乏 维生素 K 的 动物 ， 则 合成 一 种 异常 的 凝血 酶 原 ， 尽 管 在 体外 这 种 凝 血 酶 原 可 被 胰 蛋 白 酶 激活 ， 而 表明 其 活性 中 心 并 未 损害 ， 可 是 在 体内 ， 它 不 能 结合 Ca+'+， 也 不 能 被 激活 。 现 已 发 现 ， 正常 的 凝血 酶 原 含 有 一 种 氨基 酸 一 一 Y- 羧 基 谷 氮 酸 (Gla), 而 以 前 在 和 蛋白质 N 末 端的 7 和 8、15 和 17、20 和 21.26 和 27、 307133598939) 位 置 上 ， 却 从 来 没有 发 现 过 它 。 在 缺乏 维生素 K 的 动物 中 ， 这 些 残 基 就 是 谷 氮 酸 。 这 样 上 述 异 常 的 钙 结 合 就 得 到 解释 : Ca ”应 与 两 个 邻近 的 Gla 残 基 非 常 紧密 地 结 合 ， 就 像 Ca 和 乙 二 胺 四 乙酸 (EDFA) 相 结合 那样 。 磷 脂 键 通过 已 经 与 Gla 结 合 的 Ca ， 而 与 凝血 酶 原 结 合 ， 这 就 可 使 因子 Xa- 因 子 V “复合 物 与 凝血 酶 原 结 合 ， 并 且 始 动 激活 作 用 。 因 为 因子 X 在 与 凝血 酶 原 相 类 似 的 位 置 上 有 邻近 的 “ 谷 氨 酸 ” 残 基 5% ， 所 以 也 就 像 因 子 区 的 情况 一 样 久 2， 人 似乎 这 些 残 基 也 是 Gla， 并 且 似 乎 这 些 酶 原 以 与 凝血 酶 原 完全 类 似 的 机 理发 生 激活 作用 。 这 些 结果 为 维生素 民 的 功能 提供 了 令 人 振奋 的 线索 ， 它 对 将 谷 氮 酸 转变 成 Y- 羧 基 谷 氨 酸 的 酶 系 统 的 活性 ， 可 能 是 很 重要 的 。 3.3 补体 系统 的 激活 OA 当 哺 乳 动物 被 外 来 的 有 机 体 (如 入 侵 的 细菌 ) 感染 时 ， 它 的 第 一 步 反 应 就 是 产生 特异 的 抗体 ， 它 能 与 入 侵 细 胞 形成 一 个 免疫 复合 体 。 第 二 步 反 应 就 涉及 到 补体 ， 补 体 是 一 组 血浆 蛋白 质 ， 它 首先 能 识别 免疫 复合 体 ， 而 后 能 使 入 侵 细胞 发 生 结构 性 损伤 。 第 三 步 是 血浆 中 的 白细胞 、 单 核 细 胞 和 巨 史 细 胞 吞噬 已 受 损 的 入 侵 细 胞 。 在 经 典 的 补体 途径 中 (图 3.9) ， 补 体 成 份 Clr*Cls 和 C2 是 蛋白 酶 的 前 体 ， 而 e 42 。， EXEL. UV ee aay a é re 站 TEST DR 二 pa 补体 成 份 c3、C4 和 C5 则 可 被 限制 性 蛋白 水 解 ， 转 变 成 为 功能 性 衍生 物 。 当 C1 复 合体 识别 入 侵 细 胞 和 IgG 或 IgM 免疫 球 蛋白 的 免疫 复合 体 时 ， 就 开始 一 系列 的 过 程 。 这 一 识别 可 受到 能 与 抗体 专 一 性 结合 的 C1q 的 影响 。 曾 有 人 假定 ,这 些 相 互 作 用 可 BCG WAM, AMS RCI ROA, HE Clr 转变 成 蛋白 酶 CI1-。 然 后 C1- 断 开 Cls 中 一 个 肽 键 ， 使 它 转变 为 HAM Cle. Cle 可 被 DFP 抑制 ， 而 修饰 了 的 丝氨酸 周围 的 氨基 酸 序 列表 明 它 是 丝氨酸 蛋白 酶 类 中 的 另 一 个 成 员 〈 图 ast) e 图 3.9 经 典 的 补体 系统 的 图 解 。Qg、T 和 SS 指 的 是 C1 复 合体 的 亚 基 ，a、b 分 别 表示 为 修饰 因子 的 信和 C 末 端 片 段 ， 横 线 表示 和 蛋白酶 以 ?2) 。 然后 C1z 断 开 C2 和 C4 的 肽 键 。C4、C4b 的 C 末 端 片 段 ， 就 能 与 入 侵 细 胞 膜 上 的 另 一 部 位 结合 。C2、C2a HINA WHE, RATES Cl 复合 后 才 可 变 成 蛋白 酶 。 然 后 C2-- Cib 复合 体 断 开 C3。 这 样 Ac2--C4b-C3b 复合 体 就 能 断 开 C5。C5b 有 能力 触发 在 膜 第 3 个 位 置 上 形成 的 其 余 所 有 的 补体 成 份 的 复合 体 ， 而 并 不 发 生 蛋 白水 解 。 将 C5b-9 复 合体 e 43 。 嵌入 膜 中 ， 在 某 些 方面 破坏 了 膜 的 规则 结构 ， 而 使 膜 易于 泄 漏 。 E C2a-C4b Fil C2-—-C4b-C3b 复合 体 ， 是 高 度 专 一 化 的 蛋 白 酶 的 例子 。 现 已 知道 的 唯一 的 底 物 ， 在 C2--C4b 是 C3, 在 C2--C4b- C3b 是 C5。 所 以 C2- 就 是 一 种 能 通过 C4b 和 C3b 两 个 调节 亚 基 的 存在 ， 来 测定 其 专 一 性 的 蛋白 酶 的 突出 例 子 。 C3b 和 C4b 与 细胞 膜 结合 ， 似 乎 也 促进 白细胞 、 单 核 细 胞 和 巨 鸣 细 胞 吞噬 具有 补体 的 颗粒 。 另 外 ， 在 补体 系统 中 (图 3.9) 不 直接 利用 C3 和 C5 片 侦 ， 本 身 就 有 几 种 生物 学 作 用 ， 例 如 ， 它 们 可 以 刺激 白细胞 的 向 化 性 移动 。 血浆 中 存在 第 二 个 补体 系统 ， 它 在 _C3 水 平 上 汇 入 经 典 途径 。 这 个 系统 识别 包含 IgA 免疫 球 蛋白 在 内 的 一 些 免疫 复 合体 。 3.4 J 结 “限制 性 蛋白 水 解 作 用 ， 是 一 个 具有 高 度 专 一 性 的 不 可 逆 过 程 ， 它 可 以 通过 将 前 体 蛋 白质 转变 成 具有 生物 活性 的 形 式 ， 而 起 始 生 理 功 能 "2 它 是 用 以 调节 真 核 细胞 许多 过 程 的 机 制 ， 不 仅 包括 消化 、 血 液 凝 固 和 防御 ， 而 且 包 括 许多 肽 激素 的 作用 49? 2 Fi BA RY He OA? 大 多 数 作为 前 体形 式 合成 的 酶 是 蛋白 酶 。 不 过 有 三 种 酶 例外 ， 即 胰 磷 脂 酶 A、 因 子 XIa 和 聚 乙 酰 氮 基 葡萄 糖 合成 酶 5 ， 后 者 在 出 芽 醇 母 中 ， 则 形成 N- 乙 酰 葡 糖 胺 聚合 物 。 哺乳 动物 酶 的 遗传 变异 体 〈 它 常 是 病人 患 特殊 遗传 疾病 的 起 因 ) ， 在 建立 体内 的 限制 性 蛋白 水 解 途径 方面 是 很 有 价 值 的 ， 就 像 在 第 二 章 讨论 的 细菌 酶 的 情况 一 样 。 e 44 e 鉴于 在 血 凝 作用 和 补体 领域 研究 方面 的 主要 进展 、 发 现 被 合成 为 没有 活性 前 体 的 蛋白 质数 目 迅 速 不 断 的 增多 。 加 之 有 关 在 真 核 细 胞 蛋白 质 和 酶 转换 的 调节 中 和 蛋白酶 所 起 的 作用 的 最 新 研究 ， 通 过 限制 性 蛋白 水 解 作用 对 酶 活性 进行 控制 似 乎 将 成 为 下 一 个 十 年 的 主要 发 展 领域 。 参考 X 献 C1) Northrop,J.H.,Kunitz, M. and Herriott, R .M. (1948), In Crystalline Enzymes,Columbia University Press, New York. C 2) Sjostr6m,H. and Noren, O.(1974),Biochem. Biophys. Acta, 359,177-185. ' [3 ] The Enzymes III(3rd Edition), (Ed.) Boyer, P.D. Academic Press, London. (a)Delange,R. J.and Smith,E.L. 81-118; (b) Hartley, B.S. and Shotton, D.M. 323-373;(c)Kraut, J. 165- 183;(d)Blow,D.M. 185-212; (e)Hartsuck,J.and Lipscomb, W.N.1-56; (f) Magnusson, F.,277-321. (4) Gastrointestinal Physiology-MTP International Review of Scienice(1974), Butterworths, London and University Park Press, Baltimore. (Edts.)Jacobson,E.D. and Shanbour, L.L. (a)Johnson,L.R.,1-43;(b)Preshaw, R.M. 265-291. C5] Hadorn,B.,Tarlow,M. J., Lloyd, J. K. and Wolff, O. H. (1969), The Lancet, pp. 812-813. C6) Neurath,H.,Walsh,K.A.and Gertler, A.(1974),in Metabolic ; Interconversions of Enzymes(1973), (Eds.) Fischer, E. H., Krebs,E.G., Neurath,H.and Stadtman, E. R. pp. 301-312, q Springer-Verlag, Heidelberg. C7) Wintersberger.E.,Cox,D.J.and Neurath, H. (1962), Bioche- : mistry, 1,1069-1078. ; C8) Cox, D.J.,Wintersberger, #. and Neurath, H. (1962), Bioc- hemistry,1, 1079-1082. C9) Uren, J.R.and Neurath, H. (1972), Biochemistry, 11,4483- 4492, (10) Maroux,S., Baratti, J. and Desnuelle, P. (1971), J. Biol. Chem., 246, 5031-5039. : (11) Titani, K., Ericsson, L. H., Walsh, K. A. and Neurath, H.(1975),Proc.Nat.Acad.Sci., 72, 1666-1670. (12) Ruhimann, A., Kukla, D., Schwager, P., Bartels, K. e 45 。 = ————————— and Huber, R.(1973),J.Mol. Biol., 77, 417-436. (13) Keller,P.J. and Allan,B.J. (1967), J.Biol. Chem., 242, 281-287. (14) Bartley,W.,Burt, L.M. and Banks, P.(1971), The Bioche- mistry of the Tissues, pp. 155-161, John Wiley and Son, London. . (15) Sigler, P.B., Blow,D.M., Matthews, B.W.and Henderson, R.(1968),J. Mol. Biol.,35, 143-164. (16) Freer, S.T., Kraut, J.,Robertus, J.D., Wright, H.T. and Xuong, Ng.H.(1970), Biochemistry, 9, 1997-2009. (17) Fritz and Tschesche(Eds. ),(1970), Proceedings of the Inte- rnational Research Conference on Proteinase Inhibitors, Shotton, D.,pp. 47-55, Walter de Greyter, Berlin and New York. (18) Naughton, M.A., Sanger, F., Hartley, B.S. and Shaw, D.C.(1960), Biochem. J., 77,149-162. (19) Wright,H.T.(1973),J.Mol.Biol., 79, 1-11 and 13-23. (20) Stround, R.M., Kay,L.M.and Dickerson, R. E. (1974) ,J. Mol. Biol., 83, 185-208. (21) Bayliss,W. M. and Starling, E. H. (1902),J. Physiol., 28, 325—3536 [22] Douglass, W.W.(1974), Biochem. Soc. Symp., 51,1-28. (23) De Haas, G.H., Slotboom,A.J., Bonsen, ‘P: P.-'N., Van Deenen, L.L.M.,Maraux, S., Puigserver, A.and Desnuel- le, P.(1970), Biochem. Biophys. Acta,221,31-53. (24] Davie, E. W. and Kirby, E.P. (1973), Curr. Top. Cell. Reg., 7; 51-86, (25) Davie, E.W. and Fujikawa, K.(1975),Ann. Rev. Biochem: , 44,799-829, (26) Gjonnaess, H.(1972),Thromb. Diath. Haemorrh., 28, 182= 193, 194-205. (27) Radcliffe, R.and Nemerson, Y.(1975), J.Biol. Chem.,250, 388-395. (28) Ratnoff, O.D.(1973), In ‘The Molecular Basic of Inheri- ted Disease’pp. 1670-1709, (eds.) Stanbury,J.B., Wynga- arden, J. B. and Fredrickson, D. S.; McGraw-Hill, New York. (29) Weiss.A.S., Gallin, J.I.and Kaplan, A.P. (1974), J. Clin Invest... 53,. 622-633. (30) McKusick, V.A.(1965), Scientific American, 213,88-95. (31) Schiffman,S.,Rapaport, S.I.and Chang, M, M. Y. (1978), e 46 。 Brit.J.Haematol., 24,633=642. (32) Titani, K., Fujikawa, K.,Enfield, D. L.; Ericsson, L. H.->» Walsh, K-A. and Neurath.H.(1975), Proc. Nat.Acad. Sci.» 72, 3082-3086. (33) Enfield, D.L., Ericsson, L.H., Fujikawa, K., Titani,K., Walsh, K.A. and Neurath, H. (1974), FEBS. Letters, 47> 132-135. (34) Fothergill, J.E., University of Aberdeen, (Personal Com= munication). (35) Fujikawa, K.,Coan, M.H.; Legaz, (1974), Biochemistry; 13, 5290-5299. (36) Sottrup-Jensen, L.,Zajdel, M., Claeys, H.,Petersen, T.E. and Magnusson. S.(1975),Proc.Nat. Acad. Sci.» 72; 2577- 2581. | (37) Stenflo,J.(1974)>J Biol .Chem. »249,5527-5535- (38) Stenflo,J., Fernlund,P., Egan, w., Roepstorff, P. (1974), Proc.Nat. Acad. Sci.» 71, 2739-2733. (39) Morris, H.R., Thompson, M.R. and Dell, A.(1975), Bio- chem. Biophys. Res.Commun.,62, 856-861. [40] Enfield, D.L., Ericsson, L.H., Walsh, K.A., Neurath, H.and Titani, K.(1975),Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 16-19. (41) Fujikawa; K., Coan. M.H.; Enfield, D. L.; Titani, K.>, Ericsson, L.H.and Davie, E.W.(1974), Proc. Nat. Acad. Sci., 71; 427-430. (42) Muller-Eberhard, H. J. (1975), Ann. Rev. Biochem., 44, 697-724. (43) Tager, H. S. and Steiner, D. F. (1974), Ann. Rev. Bio- chem., 509-538- (44) Bornstein, P. (1974), Ann.Rev.Biochem., 43; 567-603. (45) Cabib, E.and Farkas, V.(1971),Proc. Nat. Acad. Sci.,68, 2052-2056. M.E. and Davie, E.W. e 47 。 et RRR Re 素 作 用 的 分 子 学 基础 4.1 糖 原 的 生物 学 重要 性 ， 科 里 (Cori) 循环 糖 原 代谢 是 可 论证 的 ， 比 其 它 已 知 的 代谢 控制 系统 更 有 助 于 了 解 酶 调节 作用 的 生物 化 学 途径 。 人 们 正 是 用 这 样 一 个 系统 作为 描述 酶 活性 受 变 构 效应 物 (由 AMP 激活 磷酸 化 酶 ) 控制 的 第 一 个 例子 52;， 也 正 是 通过 这 样 一 个 系统 发 现 了 可 逆 性 共 价 改 变 〈( 磷 酸化 ) 对 酶 的 调节 作用 护 BAR 谢 中 另外 一 些 首先 值得 注意 的 问题 是 UDPG 的 鉴定 ， CF 致 发 现 了 很 多 利用 这 个 核 背 二 磷酸 的 糖 衍 生物 的 合成 途 42°) (EL.F.Leloir，1970 年 诺 贝 尔 奖 金 获 得 者 ) ;还 导致 发 现 了 cAMP , cAMP 开辟 了 激素 作用 的 分 子 基 础 的 整个 领 ih 42 (下 .W.Sutherland，1971 年 诺 贝 尔 奖 金 获 得 者 ) 。 糖 原 是 哺乳 动物 细胞 中 糖 类 的 基本 贮存 形式 。 从 量 上 讲 ， 至 少 有 95 多 的 聚合 物 贮存 于 骨骼 肌 及 肝脏 中 ， 在 那里 充 分 发 挥 着 各 不 相同 的 作用 。 在 骨骼 肌 中 ， 糖 原 通 过 无 氧 糖 原 酵 解 作用 转变 为 乳酸 ， 以 提供 为 维持 肌肉 收缩 所 需要 的 大 量 的 ATP。 肌 肉 中 的 糖 原 分 解 由 于 缺乏 葡萄 糖 -6- 酸 酶 而 不 会 导致 明显 的 葡萄 糖 生 成 ， 并 且 因 为 还 缺少 将 丙酮 酸 恢 复 为 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 所 必须 的 两 种 酶 一 一 丙酮 酸 羧 化 酶 和 磷酸 和 烯 醇 丙 酮 酸 羧基 激酶 ， 因 此 糖 原 转变 为 乳酸 是 单 回 的 。 当 肌肉 收缩 时 ， 产 生 的 大 量 乳 酸 扩散 到 血 流 中 ， 然 后 再 返回 到 有 导 ee 48 。 COED UCM, RRR , MER — 转化 成 血糖 。 因 此 ， 肝 糖 原 在 控制 血糖 浓度 方面 就 具有 重要 由 的 作用 。 当 然 这 种 调节 对 于 象 脑 这 样 的 组 织 是 密切 有 关 的 ， ， 对 脑 来 说 几乎 完全 依赖 葡萄 糖 作 为 能 量 来 源 。 肌 糖 原 转 变 成 乳酸 ， 转 变 成 肝 糖 原 ， 再 转变 成 血糖 (其 中 某 些 被 利用 于 再 合成 肌 糖 原 ) 。 由 于 是 Cori 发 现 的 ， 因 而 被 命名 为 科 里 循 HS? (C.F.Cori 和 G.T.Cori,1947 年 诺 贝 尔 奖 金 获得 者 ) (图 4.17 。 图 4.1 科 里 循环 。 酶 : 1 一 一 磷酸 化 酶 ，2 一 -UDPG KB 酸化 酶 ; 3 一 一 糖 原 合成 酶 ; 4 一 一 磷酸 葡 糖 变 位 酶 ; 5 一 一 葡萄 精 -6- 磷 酸 酶 ， 6 一 一己 精 激 酶 。 糖 原 分 支 酶 和 脱 支 酶 被 省 略 。 糖 原 的 动员 受 四 种 激素 的 影响 : C1) 肾上腺 通 质 释放 的 儿 茶 酚 胺 肾上腺 素 ， 促 进 肌肉 中 的 糖 原 转化 成 乳酸 ， 以 及 促进 肝脏 中 的 糖 原 转 化 成 葡萄 糖 。 e 49 。 (2) QRHARH RAW LARK. KEPRERR, 促进 肝脏 中 的 糖 原 分 解 ， 但 在 骨骼 肌 则 和 否 ， 因 为 骨骼 肌 不 受 交感 神经 支配 。 C3) BRE o -细胞 分 泌 的 肽 激素 胰 高 血糖 素 ， 可 促 动 肝 脏 糖 原 分 解 ， 但 对 肌肉 就 没有 作用 。 (4 )》 胰 脏 B- 细 胞 分 泌 的 肽 激素 一 “胰岛素 ， 可 加 未 葡萄 糖 转 运 到 肌肉 ， 并 加 快 肌肉 和 肝脏 中 糖 原 合成 的 速率 。 胰岛 素 不 影响 血糖 向 肝 细 胞 的 转运 ， 因 为 甚至 在 缺乏 激素 时 ， 血 糖 也 是 可 以 自由 透 过 肝 细胞 的 。 胰 高 血糖 素 和 崩 上 腺 素 也 可 促进 肝脏 的 乳酸 转变 为 葡萄 糖 ， 而 胰岛 素 则 抑制 这 个 过 程 。 所 以 就 是 以 儿 茶 酚 胺 和 胰 高 血糖 素 为 一 方 而 胰岛 素 为 另 一 方 ， 依 靠 它们 之 间 的 平衡 ， 就 能 精确 地 调节 血液 中 的 葡 BABE 本 章 论 及 两 个 生理 学 问题 : 第 一 ， 糖 原 分 解 的 速率 如 何 与 肌肉 起 动 收 缩 同 步 化 ? 第 二 ， 什 么 是 激素 控制 糖 原 代谢 的 机 理 ? 4.2 骨骼 肌 的 糖 原 分 解 ， AMP 和 磷酸 化 作用 对 磷酸 化 酶 的 调节 5 糖 原 分 解 的 限 速 酶 是 磷酸 化 酶 〈 图 4.1) ， 该 酶 催化 把 a-1，4 连 接 的 葡萄 糖 基 连 续 磷 酸 解 为 葡萄 糖 -1- 磷酸 盐 (CGIP)。 早 在 1938 年 ， 科 里 就 已 经 将 磷酸 化 酶 分 离 为 a 和 两 种 形式 后 。 磷 酸化 酶 b 的 活性 完全 依赖 AMP， 而 磷酸 化 酶 a 无 需 AMP 就 能 显 出 几乎 完全 的 活性 。 据 推测 ， 磷 酸化 Ma 必定 含有 结合 得 很 紧 的 AMP ， 而 且 在 肌肉 中 还 发 现 另 一 个 可 把 磷酸 化 酶 a 转变 成 b 的 酶 〈 称 作 辅 基 移 除 酶 或 PR- 酶 ) ， 此 酶 可 除去 被 结合 的 AMP (7 。 然 而 ， 这 个 推测 过 去 « §0 。 a a es bl 本 ad hf aa) ee on =! a 一 一 直 未 能 得 到 证 实 ， 过 了 近 20 年 才 发 现 了 其 反应 的 真实 性 质 。1956 年 Krebs 和 Fischer522 证 明 ， 磷 酸化 酶 b 可 以 由 需 要 Mg-ATP 的 磷酸 化 酶 激酶 来 催化 , 通过 蛋白 质 磷 酸化 作用 而 转变 成 磷酸 化 酶 a 。 因 而 ， 把 磷酸 化 酶 a 恢复 到 磷酸 化 酶 b 的 就 是 磷酸 释放 酶 (或 简称 PR,phosphate releasing)， 现 在 称 作 磷酸 化 酶 磷酸 酶 。 磷酸 化 酶 b 是 一 个 由 两 个 相同 的 100,000 道 尔 顿 亚 基 组 RA RCO, HF ATP 的 Tr- 磷 酰基 转移 到 了 位 于 NA 端 第 14 个 残 基 独 特 的 丝氨酸 羟基 上 ， 从 而 转化 为 磷酸 化 酶 a (图 4.2) 。 磷 酸化 酶 a 的 分 子 量 是 磷酸 化 酶 b 的 两 倍 “〈 前 者 为 400,000 道 尔 顿 ， 后 者 为 200,000 道 尔 顿 ) ， 最 初 曾 有 人 认 为 这 种 分 子 量 的 加 售 作用 ， 是 激活 过 程 整合 作用 的 一 部 份 ， 以 致 磷酸 化 酶 磷酸 酶 曾 一 度 被 称 作 为 磷酸 化 酶 破裂 酶 【简称 PR! (phosphorylase rupturing)]。 不 过 ， 通 过 能 够 同时 检 测 酶 活性 和 分 子 大 小 的 改变 的 荧光 技术 ， 证 明 二 聚 化 作用 开 始 得 慢 ， 比 激活 作用 迟 几 分 钟 。 从 而 说 明 在 体内 未 必 有 什么 TK AR ©? 。 ”在 体外 试验 中 , 当 底 物 无 机 磷酸 盐 (Pi) 的 浓度 增加 时 ， N- 乙 酰 -ser-arg-Dro-Leu-ser-asp-gln-glu-lys-arg- lys-gin-ile-ser-val-arg-gly-leu 8 图 4.2 ， 免 骨骼 肌 磷 酸化 酶 a 的 末端 氨基 酸 序列 (8 。 AMP 的 K， 降 低 ， 反 之 ， 当 AMP 浓度 增加 时 ，P;， 的 K。 降 低 5o) 。 所 以 磷酸 化 酶 b 的 活性 既 与 P;， 又 与 AMP 的 WELK, CHASES AMP 浓度 的 关系 呈 S ， 形 曲线 的 时 候 。 由 于 AMP 对 磷酸 化 酶 b 的 激活 作用 可 被 ATP 和 和 葡萄糖-6- 磷 酸 (G6P) 所 持 抗 ， 所 以 体内 磷酸 化 酶 b e 51 e ATE HERR UN Bh bk AMP +P, /ATP + G6P C1? gyag 数 。 AA EDA EMA ES, SE AMP 时 ， 磷 酸化 Be a 才 具 有 充分 的 活性 。 如 果 P ;浓度 从 10mM 降 到 lmM， 则 ” 磷酸 化 酶 a 也 就 变 为 完全 依赖 于 AMP 了 ， 特 别 是 在 生理 性 miBE (37) 的 情况 下 更 是 如 此 “…。 此 外 ， 体外 磷酸 化 酶 a 的 AMP K, He BEB LRG b HK, 1K50—1004%, Aisy 3 a WL 中 AMP 的 浓度 大 约 是 0.05mM ( 见 4.5 节 ) ， 这 一 浓度 低 于 磷酸 化 酶 的 浓度 (0.lmM) , 暗示 着 在 体内 AMP 将 优先 与 磷酸 化 酶 a 结合 。 这 些 发 现 有 力 地 说 明 ， 在 体外 试验 并 模拟 体内 的 pH 值 、 离 子 组 成 、 温 度 和 代谢 物 浓 度 ， 对 研究 酶 活性 的 控制 是 多 人 么 重要 。 在 酶 学 中 的 常规 测定 条 件 下 ， 即 在 最 适 pH 时 ， 饱和 底 物 浓度 及 25 或 307 的 温度 ， 测 得 的 结果 可 能 会 是 一 个 非常 令 人 迷惑 不 解 的 酶 动力 学 特性 。 本 章 的 其 它 小 节 将 另 有 解释 这 一 问题 的 例子 。 4.3 肌肉 收缩 的 控制 cla,14,15a,0 为 了 充分 了 解 糖 原 分 解 和 肌肉 收缩 的 相互 关系 。 有 必要 概述 有 关 肌 肉 收缩 过 程 的 近代 观点 。 骨骼 肌纤维 由 两 种 有 规则 排列 的 称 作 和 A 丝 和 I 丝 所 组 成 (图 4.3) 。 肌 肉 收缩 就 是 工 丝 《主要 由 肌 动 蛋白 组 成 ) 滑 过 A 丝 〈 主 要 由 肌 球 蛋白 组 成 ) 的 过 程 ， 这 样 就 缩短 了 纤维 的 总 长 度 〈 虽 然 体 积 不 变 ) ， 并 且 产 生 了 张力 。 哺乳 动物 骨 骨 肌 肌 球 蛋白 具有 HLa2Lb， 结构 ， 其 中 两 条 相同 的 ^ 重 ?H 链 的 分 子 量 大 约 是 200,000 道 尔 顿 “〈 实 际 上 它 古 所 有 已 知 多 肽 链 中 最 长 者 ) ， 两 条 “ig” 链 La 和 Lb 的 分 © 52 e 是 子 量 接近 20,000 道 尔 顿 。 在 电子 显微镜 下 ， 可 以 看 到 每 个 肌 Wey eee 图 4.3 AMAZAL AHS. COMNTHAME. MM» 、 节 是 肌 原 纤维 的 重 覆 单位 ， 数 千 个 肌 小 节 组 成 一 个 肌肉 纤维 。M 线 是 在 显微镜 下 看 到 A 丝 上 的 交叉 线 纹 。(b) 肌 原 纤维 的 纵 诈 面 。 黑 点 表示 工 丝 ， 圆 围 表示 人 A 丝 ，A 丝 上 有 肌 球 蛋白 的 横 桥 突起 (13?14) 。 球 蛋白 分 子 呈 双 螺 旋 棒 ， 它 的 末端 是 两 个 称 作 横 桥 的 球状 头 。“ 轻 2” 链 独占 头 部 区 域 。 肌 球 蛋 白 分子 在 A 丝 中 与 横 桥 突起 以 有 序 的 螺旋 方式 包 庄 在 一 起 ' (图 4.4) 。 这 些 横 桥 具 有 ATP 酶 的 活性 ， 所 以 肌 球 蛋白 实际 上 是 一 个 酶 。 当 肌 肉 Ka NA ARE Aa, BET MARA SURE 白 的 头 部 区 域 相 互 作用 ， 并 同时 被 肌 动 球 蛋 白 ATP 酶 激活 100 倍 或 更 多 。 据 认 肌 动 蛋白 和 肌 球 蛋白 的 键 合 是 产生 力 的 机 制 ，ATP 的 水 解 则 为 完成 机 械 功 提供 了 能 量 。 肌 动 蛋白 的 单 体 是 一 个 球形 蛋白 质 〈 分 子 量 为 45,000 道 尔 顿 ) ,在 工 丝 中 , 它 聚 合成 双 股 螺旋 形 排列 。 I 丝 还 含有 另 外 两 种 蛋白 质 ， 肌 钙 蛋 白 和 纤维 状 蛋白 质 原 肌 球 蛋 白 。 肌 和 钙 蛋白 是 三 个 亚 基 的 复合 物 ， 即 TN-T (分子量 为 37,000 道 A e 53 e Od Rena —___@ hha 丝 nm- 一 一 429& 一 一 = 9-029 +5 ee Oo p Gt Bae (1 丝 -一 385 和 一 一 > 图 4.4 AZMI AME. (2) 单个 肌 球 蛋 自分 子 ! (b) 一 RAL, 每 一 个 横 桥 与 前 一 个 横 桥 处 旺 120* 旋 转 。6 个 横 桥 组 成 一 个 长 达 429 埃 的 完整 周期 ;(c) 一 条 工 丝 ; 一 个 肌 钙 蛋白 分 子 与 每 个 第 7 位 的 肌 动 蛋白 单 体 相连 接 。 每 个 肌 钙 蛋白 分 子 可 能 含有 相等 数量 的 TN- T (@) TN-I (@) 和 TN-C (@ 单位 。 黑 线 表 示 原 肌 球 蛋白 ， 它 横 卧 在 肌 动 蛋白 丝 状 纤维 上 的 每 道 沟 中 (15a)。 顿 ) 、TN-I (分 子 量 为 23,000 道 尔 顿 ) 和 TN-C (分 子 量 为 19,000 道 尔 顿 ) 。 在 肌肉 静 息 时 ， 原 肌 球 蛋白 和 TN-I 似 平 是 阻止 肌 动 蛋白 与 肌 球 蛋白 相互 作用 ， 并 因此 而 激活 肌 球 蛋 白 的 ATP 酶 的 两 种 组 份 。 在 肌肉 静 息 时 ， 由 于 主动 转运 的 机 理 ， 肌 肉 细 胞 中 所 有 的 Catt 都 保留 在 围绕 着 肌 球 纤 维 、 称 作 肌 浆 网 的 膜 系统 中 。 随 着 神经 的 兴奋 ， 由 于 某 些 尚 不 清 楚 的 作用 机 理 ， 使 肌 浆 网 变 成 可 以 让 Ca 二 通过 ， 并 且 肌 网 胞 浆 中 的 Ca 一 浓度 从 低 于 0.1uM 升 高 到 约 10uM, Cat 与 TN-C 结合 ， 这 种 结合 作用 抵 销 了 原 肌 球 蛋白 TN-I 对 肌 动 BREA ATP 酶 的 抑制 作用 ， 于 是 ATP 被 水 解 ， 并 始 动 肌 向 收缩 。TN-=-T 所 起 的 作用 还 不 完全 清楚 ， 不 过 它 可 与 原 肌 球 e 54 。 i ie ¥i ” RAMEN, HANTERRRA PSE BM CoH oY 敏感 性 方面 ，TN-T 是 很 必要 的 。 当 神经 兴奋 停止 ，Ca 十 迅 PEI VL, Wate IE To 所 以 可 以 认为 ， 可 收缩 的 蛋白 质 象 一 个 由 9 种 亚 基 组 成 ， 的 相当 复杂 的 酶 。 它 有 一 个 催化 亚 基 ( 不 是 肌 球 蛋白 的 “ 重 ” 链 就 是 它 的 一 个 “ 轻 2> 链 ) 和 很 多 调节 亚 基 , 其 中 之 一 TN-C， 可 与 变 构 的 激活 剂 Ca 二 结合 。 与 Ca 二 的 结合 触发 了 一 系列 恋 构 性 转换 ， 从 而 导致 激活 ATP 酶 ， 并 使 肌 小 节 的 KEES 短 了 20 一 50 匈 。Cat 的 浓度 是 通过 作用 于 肌 浆 网 的 神经 冲 动 而 自身 控制 的 。 4.4 糖 原 分 解 和 肌肉 收缩 的 同步 化 ; C…' 对 磷酸 化 酶 激酶 的 激活 ce,15c19 由 于 肌 动 球 蛋 白 ATP 酶 的 活性 能 在 几 毫 秘 钟 内 增加 100 倍 以 上 ， 使 肌肉 呈 最 大 的 张力 ， 并 且 在 静 上 息 肌 肉 中 的 ATP ( 约 7mM) 只 够 支持 肌肉 作 少 于 1 秘 钟 的 强力 收缩 ， 因 此 ， 当 ATP 水 解 以 后 ,必需 有 一 个 有 效 的 再 生 ATP 的 机 制 。 所 贮存 FY) Woe PR WL (25mM) HY I OL SEL Sh, 但 是 若 超 出 这 个 时 间 ， 就 只 能 靠 由 糖 原 转 变 成 乳酸 而 从 ADP 再 生 ATP。 所 以 当 了 解 到 在 起 动 收缩 的 几 秒 钟 内 糖 原 分 解 率 能 比 肌肉 送 姑 时 的 基本 糖 原 分 解 率 增 加 数 百倍 时 ， 也 就 不 足 为 奇 了 。 这 自然 地 意味 着 磷酸 化 酶 活性 的 相应 增加 ， 从 前 面 的 讨 论 来 看 ， 理 论 上 讲 ， 这 种 活性 的 增加 或 是 由 于 磷酸 化 作用 ， 或 是 由 于 代谢 物 浓度 的 改变 。 现在 已 完全 证 实 ， 磷 酸化 酶 几乎 全 是 以 b 形式 存在 于 静 息 肌肉 中 。 当 给 予 固定 延续 时 间 和 固定 频率 的 电 震 ， 使 离 体 蛙 肌 肉 收 缩 时 ， 就 可 促进 癌 磷 酸化 酶 a 形式 的 转变 。 任 何 刺 e 55 e 激 频 率 都 可 使 磷酸 化 酶 a 达到 稳定 态 的 水 平 ， 这 可 能 反映 了 ” 磷酸 化 酶 激酶 和 磷酸 化 酶 磷酸 酶 的 相对 活 性 (图 4.5) 。 用 增加 频率 刺激 的 办 法 ， 可 使 磷酸 化 酶 a 水 平 的 增加 加 快 ， 达 ” 到 稳定 态 所 需 的 时 间 减 少 。 在 可 使 肌肉 强直 收缩 的 频率 刺激 ” 下 ， 只 需 不 到 一 秘 钟 的 时 间 就 可 达到 磷酸 化 酶 a 稳定 水 平 的 70% 〈 图 4.6) 。 还 发 现 ， 增 加 刺激 频率 ， 糖 原 分 解 的 速率 也 增加 ， 在 每 秒 钟 仅 0.8 次 刺激 下 ， 糖 原 分 解 率 就 可 超过 基 本 速率 的 100 倍 , 那 时 磷酸 化 酶 a 的 稳定 状态 水 平 大 约 是 10 匈 (图 4.6) 9% 。 根 据 这 些 结果 提出 ， 在 肌肉 收缩 与 糖 原 分 解 的 同步 化 中 ， 磷 酸化 酶 a 的 出 现 可 能 是 一 个 重要 的 因素 。 这 些 结果 还 提出 了 关于 电 刺 激 是 怎样 推动 癌 a 形式 转变 的 问 题 。 活性 比 士 AMP 5S 4 °8°12..146: @ . 电 市 来 (次 1 和) peor ra) 图 4.5 电 刺 激 对 离 体 蛙 颖 区 图 4.6 ”强直 收缩 对 原 位 小 肌 磷 酸化 酶 a 水 平 的 鼠 妊 股 肌 中 磷酸 化 Vid, ERR HBR 酶 3 的 影响 : O— 两 次 时 ， 达 到 稳定 态 正常 小 鼠 〈 品 系 c- 所 需 时 间 的 一 半 是 30 57);@—_ x Zk 秒 ， 每 秒 钟 电 震 6 次 乏 磷 酸化 酶 激酶 的 Bt, W107, 异常 小 鼠 ( 品 系 I)。 如 果 在 静 息 时 磷酸 化 酶 处 于 b 的 形式 ， 那 么 在 这 些 情 襄 « 56 e » YY 0 a 上 下 , 杰 酸 化 酶 激酶 必定 也 是 无 活性 的 ,而 收缩 可 使 它 转变 成 活 性 的 形式 。Ca+t+ 显 然 是 一 个 激活 剂 ,因为 发 现 与 Cartr 保 温 培 。 育 后 ， 肌 肉 提取 物 中 的 磷酸 化 酶 激酶 活性 可 增加 50 倍 。 其 后 又 发 现 激活 作用 还 需要 另 一 个 称 作 KAF “〈 激 酶 激活 因子 ) ”的 蛋白 质 参与 ， 而 后 终于 明确 了 KAF 就 是 需 Ca” 的 蛋 日 Be. KAF 对 磷酸 化 酶 激酶 的 激活 作用 与 前 面 (第 三 章 ) 讲 过 的 酶 原 激 活 作 用 一 样 。 不 过 可 以 认为 有 两 种 原因 使 得 当 肌 肉 收缩 时 ，KAE 在 调节 磷酸 化 酶 激酶 的 活性 方面 几乎 不 起 作 用 。 第 一 ,激活 作用 是 不 可 逆 的 ， 当 收缩 停止 ， 几 秘 钟 内 磷酸 AGH a 仍然 被 重新 恢复 成 磷酸 化 酶 DVO, BE, Cat HK, 大 约 是 1.0mM， 这 比 起 动 收 缩 的 浓度 要 高 1000 倍 。 由 于 相当 专 一 的 Ca 一 玫 合 剂 EGTA 的 问世 和 完全 无 Cat 试剂 的 应 用 ,得 以 发 现 Ca** FER IRA 度 时 的 二 级 可 逆 效 应 。 已 发 现 磷 酸 化 酶 激酶 的 活性 完全 依赖 于 Ca， Ka 为 0.1 一 1.0kM， 与 肌肉 起 动 收 缩 时 的 Ka. 非 常 相 似 。 在 体外 ,磷酸 图 4.7 AGM b Ie] a 的 转变 可 被 加 入 肌 浆 网 制剂 所 阻 断 ,， 但 只 要 再 加 入 Ca 辣 ， 转变 又 重新 开始 (图 4.7) ,这 就 有 力 地 证 明了 肌肉 中 自然 存在 的 Ca 一 整合 剂 ， 能 成 功 地 觉 争 已 与 磷酸 化 酶 激酶 紧密 结合 的 Ca…。 表 明 在 体内 这 个 过 程 很 可 能 是 可 逆 的 。 所 以 ,在 磷酸 化 酶 a 的 产生 与 肌肉 收缩 的 同时 发 生 中 ，Ca 起 到 重要 的 作 用 ， 证 据 是 很 充分 的 bd 有益 的 教训 是 : 这 个 机 理 过 去 几 年 未 被 发 现 ， 部 分 原因 是 由 于 被 KAF 激活 的 问题 ， 部 份 RAM 由 于 体外 试验 时 污染 了 玻璃 器 血 和 一 般 试 剂 的 痕 量 钙 ， 其 量 ° §7 。 o QD & PLM < 的 形式 ， Cat++ 的 时 间 (21) 。 | 已 经 大 大 超过 了 足以 完全 激活 磷酸 化 酶 激酶 所 需 的 Ca, 分 离 酶 时 ， 内 源 性 蛋白 酶 可 改变 酶 的 调节 特性 ， 这 是 一 个 经 和 常 碰 到 的 、 如 同 酶 脱 敏 那样 的 实验 问题 〈 第 二 章 ) 。 4.5 AMP 的 作用 ;， 体内 代谢 物 水 平 的 测定 正在 收缩 的 肌肉 中 ATP、AMP 和 了 ; 的 稳定 态 浓度 ， 理 论 上 讲 应 该 是 如 图 4.8 中 所 示 的 8 个 反应 的 函数 。 尽管 反 应 2 可 缓冲 ATP 水 平 ， 但 肌肉 收缩 〈 反 应 1) 将 使 ATP 息 ATP—>ADP+P; (1) 肌 酸 -P+ADPs 肌 酸 +ATP (2) 2ADP2=AMP+ATP _ (3) 糖 原 an + 了 Pi< 糖 原 n=1+GLP 《4) G3P +NAD+P;=1,3DPG +NADH+H+ (5) AMP=IMP +NH; (6) 天 冬 氨 酸 + GTP +IMP 一 > 腺 昔 酸 琥珀 酸 +GDP +P; (7) 腺 苷 酸 琥珀 酸 一 >AMP+ 延 胡 索 酸 (8 ) 图 4.8 测定 肌肉 中 ATP、 AMP 和 P; 水 平 的 各 种 反应 。 ff: 1 一 一 肌 动 球 蛋白 ATP 酶 ;2 一 一 肌 酸 激酶 ， 3 一 一 腺 苷 酸 激酶 ; 4 一 一 磷酸 化 酶 ; 5 一 一 甘油 醛 -3- 磷 酸 (G3P) Aw, 6 一 AMP 脱 氨 酶 ;7 一 一 腺 苷 酸 琥 珀 酸 合成 酶 5 8 一 一 腺 背 酸 琥珀 酸 酶 。 于 减少 ，P; 趋 于 增加 。 糖 原 分 解 不 仅 能 再 生 ATP ， 而 且 还 通过 反应 4 和 5 消耗 Pi。 通 过 反应 1 和 3，AMP 应 与 ATP 呈 相 反 的 关系 。 所 以 AMP 对 磷酸 化 酶 的 激活 作用 ， 对 于 加 速 ATP (这 个 ATP 可 以 看 作 是 糖 原 分 解 途径 的 终 产 物 ) 的 形成 完全 是 一 个 合理 的 机 制 。 的 确 ， 由 于 肌肉 中 ATP 的 浓 度 比 AMP 大 得 多 〈 见 下 文 ) ， 因 此 如 果 反 应 3 达到 平衡 ， 则 ATP 的 变化 就 应 引起 AMP 有 百分数 较 大 的 变化 。 然 而 这 ss 58 。 种 论证 只 是 理论 上 的 ， 还 不 能 证 实 肌肉 收缩 AMP 在 加 速 v” 糖 原 分 解 中 发 挥 的 作用 。 在 试图 评价 体内 变 构 效 应 物 的 重要 性 时 ， 由 于 哺乳 动物 ”系统 不 同 于 细菌 的 〈 第 二 章 ) ， 因 此 通常 不 用 这 样 一 个 合适 的 细菌 突变 种 “〈 它 具有 对 某 一 效应 物 的 敏感 性 有 了 改变 的 ” 酶 )。 因 此 ,进一步 的 发 展 取决 于 能 测定 代谢 活性 不 同 状态 时 ”的 有 关 代 谢 物 的 浓度 。 遗 憾 的 是 ， 这 种 测定 存在 很 多 困难 及 意 想 不 到 的 问题 ， 这 些 问 题 已 在 本 丛书 的 另 一 卷 中 作 了 充分 的 讨论 包 3 。 主 要 问题 在 于 ， 现 有 的 测定 方法 只 能 测定 整个 肌肉 中 代谢 物 的 平均 浓度 。 因 为 哺乳 动物 的 肌肉 是 由 上 千 条 肌肉 纤维 和 好 些 类 型 的 纤维 组 成 ， 每 一 条 纤维 含有 很 多 亚 细 胞 器 ， 所 以 测 得 的 浓度 值 只 能 是 相当 粗略 的 平均 值 ， 这 个 值 和 位 于 肌肉 胞 浆 中 的 可 利用 的 磷酸 化 酶 的 浓度 没有 什么 相似 之 处 。 如 果 至 今 为 止 所 得 到 的 大 多 数 的 可 靠 数值 是 能 够 被 接受 的 话 ， 那 么 它们 仍然 可 以 用 来 试图 评价 前 面 讨 论 中 所 提出 来 的 两 个 主要 问题 : Ca) 为 什么 在 项 息 的 肌肉 中 磷酸 化 酶 b 没有 活性 Vb 于 最 大 潜在 活性 的 0.1 匈 )? (b) AMP 在 肌肉 收缩 激活 磷酸 化 酶 a 的 过 程 中 起 作用 吗 ? 已 测 得 哺乳 动物 静 息 时 骨骼 肌 中 Pi;、ATP、AMP 和 G6P 的 浓度 分 别 是 5 一 10mM、7.5mM、0.05mM 和 0.3mM (1923- 2 。 利 用 在 体外 测 得 的 磷酸 化 酶 b 的 动力 学 特性 5:to%) ， 可 以 估计 这 些 情 况 下 的 磷酸 化 酶 b 约 为 潜在 活性 的 5 匈 ， 这 大 约 比 静 息 肌肉 的 糖 原 分 解 的 速率 大 100 售 。 当 试图 估计 AMP 在 肌肉 收缩 过 程 中 的 可 能 作用 时 ， 也 出 现 类 似 的 矛盾 。AMP 和 ATP 在 肌肉 收缩 时 的 浓度 与 肌肉 9 59 。 静 息 时 的 浓度 没有 什么 明显 变化 ， 而 且 了 Pi 的 浓度 约 仅 增加 Da ARO 20 3 。 虽 然 这 个 结果 显然 可 作为 反 证 ,证 明 肌肉 收 缩 时 AMP XP; 在 调节 磷酸 化 酶 活性 方面 起 作用 ， 但 是 另 有 一 些 证 明 却 使 这 个 看 法 站 不 住 脚 。 Ht, MRP, 的 浓度 经 常 至 少 保持 5mM，AMP 至 少 保 持 0.05mM， 那 么 根据 体外 磷酸 化 酶 a 的 动力 学 特性 ， 磷酸 he a 的 活性 应 该 始终 是 处 于 最 大 的 状态 。 然 而 ， 当 用 肾 上 RARER ULAR, BERR a 的 水 平 可 提高 50 匈 ， 但 糖 原 分 解 的 速率 仅 增加 10 倍 ， 说 明 磷 酸化 酶 a 是 在 它 的 潜在 活性 只 有 1% 时 就 开始 作用 了 。 相 反 ， 当 以 一 个 只 能 将 磷 酸化 酶 a 的 稳定 态 提高 10 匈 的 频率 电 刺 激 肌肉 时 ， 糖 原 分 解 的 速度 却 增加 了 100 倍 “〈 图 4.5539? 06 ) 。 因 为 P 和 AMP 是 这 个 酶 仅 有 的 已 知 的 激活 剂 ， 所 以 这 就 再 一 次 地 提出 ， 肌 肉 在 静 息 时 ， 这 些 对 磷酸 化 酶 有 价值 的 一 种 或 两 种 代谢 物 的 浓度 ， 要 比 整 个 肌肉 所 测 得 的 平均 浓度 低 得 多 。 它 还 提示 ， 当 肌 肉 收缩 时 ， 无 论 是 AMP 还 是 P; ， 这 两 种 代谢 物 的 浓 度 必 定 会 显著 升 高 。 有 人 利用 一 种 完全 缺乏 磷酸 化 酶 激酶 活性 、 并 且 不 能 将 磷酸 化 酶 b 转变 成 磷酸 化 酶 a 的 品系 的 小 鼠 ， 做 了 另 一 个 与 这 个 问题 有 关 的 重要 实验 (图 4.6)。 结 果 看 到 它 与 正常 小 鼠 不 同 ， 使 肌肉 产生 强直 收缩 的 频率 刺激 并 不 立即 起 始 糖 原 分 解 。 然 而 经 过 一 个 短暂 的 几 秘 钟 的 延缓 期 之 后 ， 便 迅速 发 生 糖 原 分 解 作 用 ， 其 速度 大 约 是 正常 小 鼠 最 大 速率 的 50 驳 〈 图 4.9) 。 从 这 个 结果 可 以 得 出 四 点 推论 : (1) 如 果 向 磷酸 化 酶 a 的 转变 未 能 发 生 ， 则 体内 磷酸 化 酶 b 便 可 被 (假定 是 被 AMP ) 激 活 。 (2) 所 以 ,在 工 系 小 鼠 肌 肉 收缩 后 几 秒 钟 内 ， 必 然 会 发 生 AMP 和 (或 ) Pi 的 显著 增加 。 e 60 。 east Sa G6P 的 增加 乳酸 的 增加 (u/M/g) (u/M/g) Cs; 1 Cs7 1 0.5 0.04 0.0 . 1.0 0.06 0.0 2.0 0.10 0.0 0.5 0.2 4.0 0.15 0.04 1.0 0.7 6.0 0.23 0.06 3.1 1.1 8.0 0.41 0.07 5.6 1.4 10.0 0.50 0.19 6.0 3el 12.0 0.52 0.26 6.3 4.0 图 4.,9 RAMRMUERIER)R (C-57K) MHRA CI 系 ) 所 形成 的 '.G6P MAR, (3) 工 系 小 鼠 起 始 糖 原 分 解 前 的 延缓 时 间 ， 可 以 代表 反应 1 一 3 (图 4.8) P; 和 AMP 的 浓度 升 高 到 可 激活 磷酸 化 酶 b 所 需要 的 时 间 。 (4) 在 正常 小 鼠 中 没有 这 种 时 汗 ， 这 就 有 力 地 支持 了 这 个 说 法 ， 即 在 正常 骨骼 肌 中 磷酸 化 酶 a 的 出 现 起 始 了 糖 原 分 解 。 它 证 实 了 体内 磷酸 化 酶 a 被 激活 所 需要 的 AMP+ 了 Pi/ ATP+G6P 的 比值 比 磷 酸化 酶 b 所 需要 的 为 低 。 I 系 小 鼠 似乎 也 很 正常 ， 例 如 ， 游 泳 的 时 间 能 象 正常 小 鼠 一 样 长 。 对 小 鼠 来 说 ， 在 实验 室 条 件 下 立即 降解 糖 原 的 能 力 及 略 快 的 始 动 速率 ， 并 不 特别 重要 ， 但 在 野外 情况 下 ， 为 了 捕食 和 逃避 捕食 者 ， 必 须 在 这 方面 具有 强 的 选择 性 优势 才 行 。 简 而 言 之 ， 对 静 息 和 收缩 的 肌肉 中 代谢 物 浓度 的 测定 数 值 ， 目 前 仍 未 能 阐明 为 什么 磷酸 化 酶 b 在 静 息 肌肉 中 完全 没 有 活性 ， 或 者 为 什么 在 体内 不 同 的 代谢 情况 下 ， 磷 酸化 酶 a 的 活性 可 有 50 儿 或 50 儿 以 上 的 变化 。 由 于 整个 肌肉 中 代谢 物 ° 61 e 浓度 是 个 很 粗略 的 平均 值 ， 以 致 在 某 些 情况 下 必然 会 妨碍 对 在 浓度 方面 有 明显 变化 的 代谢 物 的 测定 。 这 对 各 种 细胞 内 组 份 中 存在 的 象 ATP、.AMP AP; 这 些 代谢 物 来 说 ， 很 可 能 确 SMO? 。 另 一 方面 ， 测 定局 限 在 肌 浆 中 的 糖 原 、G6P 和 乳酸 这 些 代谢 物 ， 对 于 研究 体内 糖 原 分 解 的 控制 是 有 价值 的 。 4.6 磷酸 化 酶 磷酸 酶 的 调节 磷酸 化 酶 磷酸 酶 可 彼 AMP 抑制 (K,;<0.01mM) ， 在 体外 也 可 被 Pi; HC? , 因而 这 些 抑制 剂 在 决定 体内 磷酸 化 酶 a 稳定 态 水 平方 面 也 起 到 一 定 的 作用 。 然 而 ， 分 析 体 内 磷酸 化 酶 磷酸 酶 的 调节 ， 在 技术 上 是 非常 困难 的 ， 还 未 曾 做 过 探讨 。 已 经 完成 的 几 个 实验 指出 ， 当 撤除 电 刺 激 或 激素 刺 BWA» JL ABER a 就 可 以 重新 转变 成 磷酸 化 酶 b 0, 乳酸 的 形成 也 相应 地 下 降 ， 这 就 再 次 说 明 ， 在 决定 肌肉 收缩 时 的 糖 原 分 解 的 速率 方面 ， 磷 酸化 酶 a 起 着 重要 的 VE FA AMP 的 抑制 作用 是 由 于 AMP 与 磷酸 化 酶 a 结 合 引起 的 ， 而 不 是 由 于 与 磷酸 化 酶 磷酸 酶 结合 引起 的 眠 2 。 这 是 一 种 在 以 往 的 这 类 研究 中 未 碰 到 过 的 调节 方式 ， 在 这 里 变 构 效应 物 通过 改变 底 物 的 构象 而 抑制 了 酶 。 所 以 AMP 不 仅 直 接 激 活 了 磷酸 化 酶 ， 而 且 也 影响 了 磷酸 化 酶 a 稳定 状态 的 水 乎 。 这 类 调节 可 见于 许多 靠 可 逆 的 共 价 改变 而 被 调节 的 酶 ， 并 且 这 类 调节 主要 优点 在 于 ， 它 能 在 两 个 不 同 的 水 平 上 发 挥 调节 作 用 ， 而 致 扩大 任何 调节 性 代谢 物 的 效应 。 不 过 磷酸 化 酶 激酶 的 活性 不 受 AMP 的 影响 。 e 62 ® 4.7 激素 对 糖 原 分 解 的 控制 ， 4.7.1 环 腺 苷 酸 的 发 现 5 尽管 早 在 本 世纪 20 年 代 就 已 证 明 ， 肾 上 腺 素 对 肝脏 和 肌 My he RE p> ATP—>#3’ 5’ -AMP 图 4.11 pane His +PP; (1) BAS EA 3’ 55AMP—>5/- ae 的 假设 模 (2) 图 4.10 cAMPR#HWEREH BRAK HRM. Re: C1 IMA RAL fe; C2 IcAMPRR —=B. POM RS} HEAT RULE FA EC BN 95046, eR EB (或 其 它 各 种 激素 作用 机 理 方面 的 知识 ， 几 乎 没有 什么 进展 。 原 因 是 除了 完整 动物 以 外 没有 任何 系统 能 证 明 激素 的 效应 。 但 是 Earl Sutherland 于 1950 年 证 明 ， 如 果 将 肝 切 片 与 肾上腺 素 或 胰 高 血糖 素 共 同 保温 培育 ， 便 可 以 刺激 猪 原 分 解 ， 后 来 又 证 明 ， 还 可 增高 磷酸 化 酶 的 活性 。 尽 管 这 是 第 一 次 得 以 证 明 激素 能 够 影响 一 种 专 一 酶 的 活性 ， 然 而 ， 当 把 肝 切片 制 成 匀 e 63 。 ae 浆 后 ， 它 仍然 失去 了 对 激素 的 反应 。 由 于 发 现 了 磷酸 化 酶 活 性 变化 的 化 学 性 质 ， 这 才 搞 清 ATP 和 Mg 十 对 激活 作用 是 必 需 的 ， 并 且 确 实 是 , 当 加 进 这 些 成 份 后 ,就 恢复 了 对 激素 的 敏 感性 。 证 明 在 破碎 细胞 的 制剂 中 能 重 现 激素 刺激 的 效应 ， 是 一 个 重要 的 突破 ， 并 且 承 认 对 激素 的 这 种 反应 可 分 成 两 个 阶 段 。 第 一 阶段 ， 激 素 作 用 于 膜 的 部 份 ， 产 生 一 个 小 的 耐 热 因 Fs 第 二 阶段 ， 这 个 因子 可 代替 激素 并 提高 磷酸 化 酶 a 的 比 例 。 已 鉴定 这 个 因子 为 cAMP (不 要 与 AMP 混淆) ， 并 表 明 它 是 从 ATP 通过 与 结合 在 膜 上 的 腺 苷 酸 环 化 酶 的 作用 而 生成 的 ， 它 可 被 cAMP 磷酸 二 酯 酶 水 解 “〈 图 4.10) 。 关于 腺 苷 酸 环 化 酶 系统 的 假说 ， 以 图 4.11 作 图 示 说 明 。 按照 这 个 理论 ， 激 素 与 位 于 细胞 膜 外 部 表面 特殊 位 置 上 称 为 受 体 的 相互 作用 。 受 体 与 位 于 膜 内 表面 上 的 腺 苷 酸 环 化 酶 偶 联 ， 这 样 肾上腺 素 和 胰 高 血糖 素 结 合 ， 就 使 腺 苷 酸 环 化 酶 激 活 和 细胞 内 cAMP 的 形成 增多 。 所 以 现行 的 观点 就 把 受 体 - 腺 苷 酸 环 化 酶 系统 和 变 构 酶 等 同 起 来 ， 该 变 构 酶 至 少 由 两 种 类 型 的 亚 基 组 成 ， 除 了 它 是 一 种 按 固定 方向 横 跨 膜 而 排列 的 自 蛋 白 复合 体外 ， 颇 象 天 冬 氨 酸 转 氨 甲 酰 酶 GOD) 。 激 素 是 变 构 的 激活 剂 ， 受 体 是 调节 亚 基 ， 腺 苷 酸 环 化 酶 则 是 催 化 亚 基 。 目前 这 一 模型 (特别 是 在 肌肉 方面 ) 的 证 据 只 是 间接 的 。 可 以 从 肝 和 其 它 组 织 〈 其 中 腺 苷 酸 环 化 酶 可 迅速 对 激素 产生 反应 ) 得 到 浆 膜 制剂 ,这 就 表明 , 与 激素 结合 的 部 位 存在 于 这 些 靶 细胞 的 外 部 膜 上 。 利 用 完整 的 鸟 红 细胞 所 做 的 三 个 实验 ， 取得 了 支持 前 面 所 提出 的 复合 体 在 驱 中 方向 的 最 有 力 的 证 ff C43 ， C1) 将 ATP 加 入 悬浮 有 细胞 的 培养 基 中 ， 细 胞 便 不 9 64 。 | 能 从 ATP 形成 cAMP, (2) 在 肾上腺 素 的 作用 下 ，cAMP 是 在 细胞 内 形成 ， 而 不 是 在 细胞 外 形成 的 。 C3) 在 完整 的 细胞 中 ， 腺 苷 酸 环 化 酶 的 活性 不 会 被 胰 蛋白 酶 破坏 ， 但 当 细胞 被 深 解 后 ， 酶 活性 便 迅 速 被 破坏 。 尽管 人 们 党 得 受 体 和 腺 苷 酸 环 化 酶 是 各 不 相同 的 蛋白 质 ， 但 试图 证 明 这 种 看 法 的 尝试 都 失败 了 ， 因 为 用 去 污 剂 将 膜 上 的 腺 苷 酸 环 化 酶 溶解 出 来 时 ， 常 常 破坏 了 酶 对 激素 的 敏 感性 。 新 近 认 为 : 某 些 磷 脂 可 以 恢复 已 被 溶解 了 的 、 不 含 去 污 剂 的 心肌 腺 苷 酸 环 化 酶 制剂 对 胰 高 血糖 素 的 反应 性 人 35 ， 并 且 也 提出 了 证 据 ， 证 明 在 这 组 织 中 的 主要 胰 高 血糖 素 结合 部 份 ， 可 以 从 腺 苷 酸 环 化 酶 分 离 出 来 。 然 而 并 没有 进行 一 些 关键 性 的 实验 ， 这 些 实验 涉及 ， 重 新 加 入 胰 高 血糖 素 结合 和 白质， 可 抑制 腺 昔 酸 环 化 酶 ， 而 重新 加 入 激素 ， 则 随 之 就 发 生 无 活性 的 复合 体 被 重新 激活 。 只 有 完成 了 这 种 实验 ， 才 能 证 明 胰 高 血糖 素 结 合 蛋白 质 并 不 是 受 体 ， 很 清楚 ， 利 用 这 种 结合 的 研究 来 鉴定 受 体 ， 亦 是 不 可 靠 的 535") 。 胰 高 血糖 素 不 影响 骨骼 肌 糖 原 分 解 这 一 点 ， 可 用 这 个 十 分 简单 的 理论 来 解释 : 即 不 是 因为 缺乏 胰 高 血糖 素 的 受 体 ， 就 是 因为 在 这 个 组 织 中 没有 腺 背 酸 环 化 酶 偶 联 。 在 肝 细 胞 或 脂肪 细胞 中 ， 有 两 种 以 上 不 同 的 激素 ， 都 能 刺激 腺 昔 酸 环 化 酶 ， 其 效应 并 不 是 相 加 的 ， 这 瞳 示 每 种 激素 可 激活 相同 的 腺 FARE ee 4? 。 4.1.2 ROP cAMP 的 作用 虽然 cAMP 是 在 研究 肝脏 中 糖 原 分 解 的 激素 控制 过 程 中 BRAN, WHEN VE PLEA See Edwin Krebs 及 其 同事 们 作 了 关于 骨骼 肌 的 系统 分 析 后 才 得 以 解释 的 5 。 ss 65 e 已 发 现 部 份 纯化 的 肌肉 磷酸 化 酶 激酶 ,在 pH6.8 时 7 接近 100 50 活性 (%) 60 68 6 & pH 图 4.12 肌肉 磷酸 化 酶 激酶 5 Mg++-ATP 和 cAMP 保温 培育 前 〈 〇 ) 和 保温 培 Bla (@) 的 pH- 活性 曲线 。 全 部 测 定 均 在 人 饱和 Catt 的 情 襄 下 进行 生理 性 pH) 的 活性 比 在 pH8.2 时 的 低 得 多 。 事 先 与 Mg**-ATP 保温 培育 , 就 可 以 使 酶 从 活性 很 弱 的 b 型 转 变 成 激活 的 a 型 , 它 在 DiH6.8 时 具有 25 一 50 REDE AY IE 力 ， 而 在 pH8.2 时 ,， 活 性 只 略 有 增加 。 加 入 cAMP 可 激 发 而 转变 成 a 型 (4.12), 应 用 分 离 出 高 纯度 的 磷 酸化 酶 激酶 ， 就 显而易见 蛋 日 质 发 生 了 磷酸 化 ,而且 cAMP 可 以 刺激 这 个 反应 。 其 后 又 进行 子 关键 性 的 观 察 ， 发 现在 刺激 活性 达到 最 大 的 浓度 时 52?2， 并 未 见 到 SAMP 和 磷酸 化 酶 激酶 结合 。 这 意味 着 CAMP fy B Mp] FY 仅仅 是 间接 的 ， 并 暗示 了 还 存在 着 另 一 种 酶 CHB BS 4 a kg 激酶 ) ， 它 能 将 磷酸 化 酶 激酶 b 转变 为 磷酸 化 酶 激酶 a 。 磷酸 化 酶 激酶 激酶 让 命 名 为 依赖 AMP 的 蛋白 质 激酶 (cAMP-PrK)， 因 为 现在 已 知 此 酶 的 专 一 性 要 比 最 初 那 个 名 称 表 示 的 专 一 性 更 广 一 些 (4.10 节 ) 。 这 个 酶 是 由 与 CAMP 结合 的 调节 亚 基 (R) 和 带 有 活性 部 位 的 催化 亚 基 (Cy) 组 成 的 。 CAMP 的 激活 作用 ， 可 相应 发 生 RoC, BA fk 0281 的 解 离 , 尽 管 还 不 知道 这 种 解 离 是 否 先 于 激活 作用 。 R2C2 + 2cAMP 一 一 > (CAMP):R2z+2C 无 活性 (b). es 66 。 有 活性 (a) 4.13 所 示 的 途径 刺激 糖 原 分 解 。 这 个 假设 为 下 列 证 据 所 支持 ， 当 肾上腺 素 缺 乏 时 ， 体内 磷酸 化 酶 激酶 具有 较 低 的 pH6.8/8.2 活 性 比 ， 这 是 脱 磷酸 化 的 b 型 的 特点 。 静 脉 内 注射 肾上腺 素 ，30 秘 内 就 使 AMP 水 平 增加 3 一 44%, 磷酸 化 酶 激酶 的 pH6.8/8.2 活性 比 突然 上 升 ， 并 且 升 高 了 磷酸 化 酶 a 的 水 平 G34331 。 此 外 ， 体 外 实验 时 ， 磷 酸化 酶 激酶 的 激 活 可 相应 产生 同一 部 位 的 磷 酸化 作用 (被 cAMP-PrK 磷 酸化 7 OH, v。 质 ， 它 可 通过 与 酶 的 催化 亚 、 骨骼 肌 中 有 一 种 蛋白 ” 基 结 合 而 专 一 性 地 抑制 cAMP-PIrK535) 。 这 种 抑制 剂 重 白质 的 功能 ， 可 能 是 在 eS UF _EWRSEAR PEE MAE tay 由 于 发 现 了 ecAMP_PrK， 于 是 提出 肾上腺 素 可 通过 图 BERK $ ¢ ATP-© cAMP ' Frkb —> PrKa Phy te PhKa Phy Pha #3 — GIP 图 4.13 肾上腺 素 对 肌肉 糖 原 分 解 的 刺激 。 AC 一 一 腺 苷 酸 环 化 酶 ， cAMP——¥# ik # BR; 的 蛋白 质 激 酶 ; ~ PhK 一 一 磷酸 化 酶 激酶 ; Ph 一 一 磷酸 化 酶 ; b 一 一 无 活性 或 活性 很 低 的 形式 ; a 一 一 激 Fe. APRETR 酸化 酶 磷酸 酶 ， 磷 酸 化 酶 激酶 磷酸 酶 和 环 核 背 酸 磷酸 二 酯 酶 等 。 ccAMP-PIK 的 活性 失 活 “ ,并 且 还 可 解释 为 什么 在 缺乏 激 ， 素 时 磷酸 化 酶 激酶 几乎 全 是 b 型 cx0 。 抑制 剂 的 存在 应 该 产 生 国 效应 〈 表 示 CAMP -PrK 的 活性 对 CAMP 水 平 的 很 小 变 化 都 非常 敏感 ) 。 认 为 这 个 抑制 剂 所 起 的 作用 与 胰 脏 的 胰 蛋 白 酶 抑制 剂 的 作用 相 类 似 〈 第 三 章 ) 。 磷酸 化 酶 激酶 是 单个 酶 中 同时 具备 糖 原 分 解 的 神经 性 和 激素 性 控制 〈 通 过 Ca 和 磷酸 化 作用 ) 的 关键 。 在 缺乏 肾 上 腺 素 的 情况 下 ， 当 肌肉 受到 强直 刺激 时 ，cAMP 的 水 平 并 无 变化 ， 而 且 磷 酸化 酶 激酶 仍 保持 b 型 7 ?3。 在 这 些 情 况 下 ， 磷 酸化 酶 b 只 有 通过 Cat 的 介 导 才能 迅速 转变 为 a 型 (图 4.6) 。 给 予 肾 上 腺 素 ， 可 促使 磷酸 化 酶 激酶 向 a 型 转 化 ， 在 有 Ca** 存在 时 ， a 型 的 活性 是 b 型 的 50 税 ， 但 是 仍 绝对 需要 有 Ca 一 (5 。 不 过 有 一 些 证 据 证 明 a 型 Ca WK, 比 b 型 的 要 低 祁 2 。 无 论 怎样 ， 强 直 收 缩 和 给 予 大 剂量 肾 上 腺 紊 可 以 说 是 两 种 不 同 的 极端 ， 在 正常 生理 条 件 下 ， 磷 酸化 酶 激酶 活性 的 调节 似乎 取决 于 cAMP 和 Cat** 极 微小 的 变 小 ， 而 并 不 是 取决 于 cAMP 或 者 Ca 共 在 某 一 方面 发 生 的 ( 通 过 实验 可 以 产生 的 ) ABER ARES. 4.7.3 依赖 AMP 的 蛋白 质 激酶 对 磷酸 化 酶 激酶 Bt $23 Hel] C15 © 934369 C) cAMP. Prk ea-PHKP ATRMg” bain CAMB Prk jects soe : me a b- ARMg" 图 4.14 通过 多 部 位 磷酸 化 作用 对 磷酸 化 Bai THEW MRE WC, PhKP 一 一 磷酸 化 酶 激酶 磷酸 酶 ; xc\B 一 一 磷酸 化 的 a-Mp- WH, 其 它 符号 与 图 4.13 同 。 e 68 。 : . 和 人 . Fy a ey ee 让 得 酸化 酶 激酶 由 ac. BY3 个 亚 基 组 成 , 它 的 结构 是 (apY)4。 CAMP-PIrK 对 它 的 调节 作用 比 图 4.13 中 所 示 的 更 为 复 杂 ， 图 4.14 概 括 了 新 近 的 看 法 。 磷 酸化 作用 发 生 在 两 个 不 同 的 残 HEL, Foe B- 亚 基 的 快速 磷酸 化 作用 ， 其 后 为 %- 亚 基 的 组 慢 磷酸 化 作用 ， 活 性 的 变化 与 B- 亚 基 的 可 逆 性 磷酸 化 作用 有 关 。o- 亚 基 的 磷酸 化 作用 不 直接 影响 酶 活性 ， 但 可 以 大 大 增强 B- 亚 基 脱 磷酸 化 的 能 力 。 下 列 发 现 指出 了 体内 这 个 机 ，， ARE. 即 如 果 给 予 肾上腺 素 ， 那 么 体内 c- 和 pB- 亚 基 都 可 以 被 迅速 磅 酸化 ， 并 且 在 骨骼 肌 中 存在 着 两 种 不 同 的 分 Ba AEA, co BBW: BLE HF 这 些 实验 使 人 们 认为 CAMP-PrK 具有 双重 作用 。 它 可 通过 始 动 B- 亚 基 的 碍 酸化 作用 来 激活 此 酶 ， 并 且 可 通过 o- 亚 基 的 继 发 的 酸 化 作用 ， 来 决定 开始 失 活 的 时 间 。 这 些 反 应 的 不 同 速率 就 创建 了 一 个 短暂 的 时 期 ， 在 这 个 时 期 cAMP- Prk 和 B -磷酸 化 酶 激酶 斐 酸 酶 将 不 竞争 ， 这 就 延迟 了 磷酸 化 酶 激酶 的 激活 ， 促 进 刘 酸 化 酶 b 转变 成 a 。 碍 酸化 酶 激酶 的 失 活 速率 将 取决 于 cAMP-PrK 和 具有 相反 功能 的 两 种 确 酸 酶 的 相对 活性 。B - RN acim ih whe 0s ls ica R. 不 过 这 些 控制 的 性 质 是 什么 还 未 搞 清 。 尽 管 对 这 个 系统 还 不 十 分 了 解 ， 但 是 可 以 看 出 具有 两 点 普遍 意义 ， 第 一 ， 在 体内 存在 着 通过 多 部 位 磷酸 化 作用 的 酶 调节 作用 ， 并 且 可 能 是 一 个 没有 例外 的 规律 “””。 继 发 性 磷酸 化 作用 能 大 大 提高 酶 的 调节 潜力 ， 这 不 仅 是 由 于 它 以 不 同 于 初始 磷酸 化 作用 的 方式 影响 了 酶 的 动力 学 参数 ， 而 且 也 由 于 允许 进一步 相互 转变 的 酶 进入 使 它们 本 身 可 能 处 于 单独 控制 之 下 的 系统 。 第 二 ， 存 在 着 一 种 终止 激素 刺激 反应 的 机 理 ， 这 些 机 理 与 起 动 这 些 反 e 69 e 应 的 机 理 一 样 ， 令 人 迷惑 不 解 。 4.8 糖 原 合 成 的 调节 自 本 世纪 三 十 年 代 发 现 磷酸 化 酶 起 ， 直 到 1957 年 ， 一 直 认为 磷酸 化 酶 不 但 能 催化 糖 原 分 解 , 而且 还 能 催化 糖 原 合 成 ， 因为 未 曾 发 现 其 它 的 合成 途径 。 然 而 令 人 费解 的 是 ， 在 体内 BER GMS a 的 形成 常常 是 伴随 着 糖 原 分 解 ， 而 从 不 伴随 糖 原 的 合成 。 UDPG'5 和 另 一 个 合成 途径 的 发 现 (图 4.1) ， 澄清 了 这 个 问题 ， 后 来 ， 由 于 发 现 完 全 缺乏 磷酸 化 酶 活性 的 病人 (McArdies 疾病 ) 糖 原水 平 有 所 提高 ， 这 才 确 立 了 磷 酸化 酶 在 生理 学 上 的 重要 性 。 54 J. Larner 和 他 的 同事 们 证 明 ， 糖 原 合成 酶 〈 糖 原 合成 中 的 限 速 酶 ) 是 受 磷 酸化 - 脱 磷 酸化 作用 机 理 调节 的 。 磷 酸化 的 b 型 活性 很 低 ， 但 能 被 变 构 效应 物 G6P 完全 激活 。 而 脱 磷酸 化 的 a 型 ， 不 需 GOP 就 几乎 具有 充分 的 活性 8) 。 G6P 对 b 型 的 激活 ， 可 被 ATP AP, Pit, a 型 也 受 到 ATP 的 强烈 抑制 ， 但 低 浓 度 的 G6P 就 可 道 转 这 种 抑制 作 用 。 所 以 ， 磷 酸化 - 脱 磷酸 化 作用 就 在 两 种 类 型 之 间 (这 两 种 类 型 的 酶 对 变 构 效应 物 G6P、ATP 和 了 Pi 的 敏感 性 各 不 相 同 ) 相互 转化 糖 原 合成 酶 9) 。 然 而 ， 据 认为 在 代谢 物 浓度 : 下 ， 遂 息 肌 肉 中 b 型 几乎 都 无 活性 ， 而 a 型 则 几乎 具有 完全 的 活性 。 已 表明 在 体外 糖 原 合成 酶 a 转变 成 b 是 受 cAMP 刺激 的 ， 并 且 由 于 发 现 了 cAMP-PIK， 这 就 清楚 了 这 个 酶 不 但 能 催化 磷酸 化 酶 激酶 的 激活 ,也 能 催化 糖 原 合成 酶 的 失 活 AO? 。 于 是 这 就 提出 了 在 糖 原 代 谢 的 各 种 蛋白 质 磷 酸 酶 之 间 可 能 存 在 同一 性 问题 ， 并 且 近 来 的 证 据 认 为 ”8B 磷 酸化 酶 激酶 磷酸 e 70 e BRB RG, ER Fe RT Ah J — 3 上 且 与 称 作 蛋 白 磷酸 酶 的 是 同一 种 蛋白 质 (文献 [41]; 图 4.15) 。 性 根据 这 些 同一 性 以 及 G6P FP, 对 糖 原 合成 酶 和 磷酸 化 酶 活 性 具有 相反 的 影响 而 提出 ， 当 起 始 糖 原 分 解 时 ， 糖 原 合成 就 ”可 能 被 阻 ， 反 之 也 一 样 。 然 而 , 糖 原 合成 酶 的 活性 不 受 AMP 或 Cat 的 影响 ， 磷 酸化 酶 激酶 不 催化 糖 原 合成 酶 a 向 b 的 性 转化 ， 而 且 对 完整 肌肉 进行 的 研究 表明 情况 更 为 复杂 。 cl-PhKP 、 © PrP a Pn oy ~ a, a cst GE PrK G AM Sby GS3 se 人 csb。， 图 4.15 和 蛋白质 激酶 和 糖 原 代谢 蛋白 质 磷 酸 酶 之 间 的 相互 关 系 。GS 一 一 糖 原 合成 酶 ; PrP 蛋白 质 磷酸 酶 。 其 它 缩 写 符 号 与 图 4.13、4.14 相 同人 41) 。 尽管 磷酸 化 酶 和 磷酸 化 酶 激酶 完全 被 脱 磷酸 化 了 ， 但 靛 息 肌 肉 中 的 糖 原 合成 酶 的 主要 形式 具有 磷酸 化 b 型 的 动力 学 特性 对 2 。 当 使 肌肉 作 短 暂 的 强直 收缩 时 ， 一 秒 钟 内 磷酸 化 酶 就 会 向 a 型 转变 ， 糖 原水 平 下 降 ， 但 并 不 发 生 进 一 步 向 糖 原 合 成 酶 b 的 转变 〈 图 4.16) 。 反 之 ， 合 成 酶 b 的 比例 开 始 下 降 。 当 强直 刺激 一 停止 ， 几 秘 钟 内 磷酸 化 酶 a 就 会 重新 | 转变 成 b ， 不 过 向 合成 酶 a 的 转变 持续 5 分 钟 。 然 后 接着 在 30 一 60 分 钟 内 发 生 合成 酶 a 重新 转变 成 b ， 糖 原 含 量 逐 渐 增 ， 合 成 酶 b 和 糖 原 终 于 恢复 到 肌肉 静 息 时 的 水 平 。 整 个 恢 e ?1 。 复 时 期 磷酸 化 酶 和 磷酸 化 酶 激酶 完全 保持 脱 磷酸 化 的 b 型 。 这 些 观察 清楚 地 表明 ， 当 肌肉 收缩 和 松弛 时 ， 磷 酸化 酶 b 和 a 及 合成 酶 b 和 a 的 相互 转化 ， 不 是 以 同样 的 速度 或 在 同一 个 时 期 发 生 的 。 其 原因 可 能 有 两 个 。 第 一 个 原因 是 由 于 新 近 发 现 的 第 二 个 称 作 GSK-2 的 糖 原 合 成 酶 激酶 与 cAMP-PrK All, 它 可 将 糖 原 合 成 酶 刺激 后 的 时 间 ( 分 ) a 转 变 成 b。 GSK -2 图 4.16 AAG ES A TOR -” 不 会 被 cAMP 所 激 emcee ee cum «| ata EAL ai 〇 O-O 〇 -事先 以 肾上腺 素 处 质 所 抑制 。 它 磷酸 sai’ : 人 化 的 部 位 与 cAME- 和 于 AMP (磷酸 化 酶 ) 的 活 Prk 标记 的 部 位 性 比 确定 的 。 不 同 ， 并 可 产生 一 个 具有 不 同 的 G6P 的 Ka 的 糖 原 合成 酶 的 形式 忆 ) 。 由 cAMP- PIK 和 GSK-2 产生 的 两 种 形式 ， 分 别称 作 bl 和 bz (文献 [43] ; 图 4.15) 。GSK-2 的 存在 似乎 可 以 解释 为 什么 在 缺 乏 磷 酸化 酶 或 磷酸 化 酶 激酶 的 磷酸 化 作用 时 ， 静 息 肌 肉 中 糖 原 合成 酶 a 能 够 转变 成 b (图 4.16) 。 第 二 个 原因 是 与 蛋白 质 磷酸 酶 活性 的 调节 有 关 。 虽 然 似 乎 所 有 使 糖 原 分 解 失 活 和 激活 糖 原 合成 的 脱 磷 酸化 作用 都 由 单个 酶 来 完成 ， 但 是 通过 每 种 底 物 构象 的 选择 性 改变 ， 仍 然 有 独立 调节 每 种 活性 的 充分 机 会 。 因 此 磷酸 化 酶 磷酸 酶 可 通过 AMP 与 磷酸 化 酶 a 结合 而 被 抑制 (4.6 节 )，B- 磷 酸化 酶 激酶 磷酸 酶 可 通过 磷酸 化 酶 激酶 的 w- 亚 基 的 磷酸 化 作用 而 e 72 e 被 激活 (4.7. 357)» MBER A ke ER PR ig MO ER 与 糖 原 合 成 酶 的 结合 而 被 抑制 "9 。 最 后 述 及 的 那个 作用 可 能 是 一 个 反馈 控制 ， 通 过 这 一 控制 ， 糖 原 就 能 确定 糖 原 合 成 酶 活性 的 水 平 图 4.16) 。 另 一 方面 ， 直 接 与 蛋白 质 磷 酸 酶 相 互 作用 的 代谢 物 ， 可 能 同时 影响 所 有 的 酶 活性 。 目 前 许多 实 验 室 都 在 紧张 地 研究 ， 以 探索 这 些 因素 。 多 功能 性 蛋白 质 磷 酸化 酶 显然 能 适合 各 种 活性 的 独立 的 以 及 同步 的 调节 。 肌肉 强直 收缩 时 糖 原 分 解 的 速率 比 静 息 肌 肉 中 糖 原 合成 | 的 速率 要 快 好 几 百倍 ?5 ， 这 就 可 以 解释 为 什么 在 这 里 糖 原 合成 酶 的 同步 抑制 就 不 那么 重要 了 〈 图 4.16) 。 当 肌肉 收缩 | 终止 后 ， 用 这 种 方式 保证 糖 原 迅速 地 再 合成 ， 对 控制 糖 原 合 成 酶 可 能 更 为 重要 。 糖 原 分 解 和 糖 原 合成 的 同步 控制 ， 比 肌 ， 肉 强直 收缩 时 糖 原 分 解 略 有 加 速 的 情况 似乎 是 更 重要 ， 因 为 在 这 种 情况 下 与 糖 原 合 成 的 竞争 就 可 能 变 得 有 一 定 的 意义 了 。 在 静 息 肌肉 中 ， 当 存在 明 上 腺 素 时 ， 可 以 发 生 这 种 情况 (4.5 节 ) 。 在 这 些 情况 下 发 生 的 糖 原 合成 酶 同步 抑 制 (A 4.16) ， 应 防止 糖 原 合成 受到 肾上腺 素 对 糖 原 分 解 的 适度 刺 激 的 于 扰 。 尽 管 这 一 点 尚未 得 到 证 实 ， 但 可 以 预言 ， 肾 上 腺 素 引 起 的 失 活 ， 是 通过 cAMP-PrK 催化 的 磷酸 化 作用 加 上 GSK-2 催化 的 磷酸 化 作用 所 介 导 的 。 4.9 肝脏 糖 原 代 谢 的 激素 性 控制 o- 和 8B- 肾 上 腺 素 能 受 体 根据 经 典 的 药理 学 理论 ， 已 知 对 于 明 上 腺 素 的 反应 可 分 成 两 大 类 : a 效应 和 8 效应 。 典 型 的 呈 肾 上 腺 素 能 效应 有 血 管 收缩 或 眼睛 瞳孔 放大 ,而 典型 的 B- 肾 上 腺 素 能 效应 , 则 为 血 管 等 张 和 心 率 加 快 。 从 交感 神经 末梢 释放 出 来 的 去 甲 肯 上 肿 ° °73.°9 素 ， 是 引起 v- 肾 上 腺 素 能 效应 最 为 有 效 ， 而 对 产生 B- 肾 上 腺 素 能 效应 最 无 效 的 儿 茶 酚 胺 。 儿 茶 酚 胺 的 类 似 物 异 丙 基 肾 上 腺 素 〈 图 4.17) ,在 刺激 B- 肾 上 腺 素 能 反应 中 最 有 效 ， 而 在 诱导 o- 明 上 腺 素 能 反应 中 最 无 效 。 肾 上 腺 素 本 身 能 中 度 地 引起 这 两 种 效应 。 激 活 腺 苷 酸 环 化 酶 的 ， 只 表现 出 B- 肾 上 腺 素 能 效应 。o- 肾 上 腺 素 能 效应 不 仅 不 引起 腺 背 酸 环 化 酶 的 激活 作用 ， 而 且 在 许多 情况 下 使 得 cAMP 水 平 降低 司 2 。 CH3 Ji V7 sar ae Gi + —CH,—N 7 Na Hb HO pac 去 甲 肾 上 腺 素 CHs is CH, xs at p am te 4 ts ae, \ sii a \cu, 全 H HO 异 丙 基 肾 上 腺 素 图 4.17 ”一些 外 茶 酚 胶 的 结构 。 尽管 cAMP 是 在 研究 肾上腺 素 和 胰 高 血糖 素 对 肝脏 糖 原 分 解 的 影响 时 被 发 现 的 ， 但 近来 通过 对 灌流 大 鼠 肝 及 系统 的 研究 认为 ， 肾 上 腺 素 和 去 甲 肾 上 腺 素 刺 激 糖 原 分 解 和 糖 原 异 生 的 作用 ,至 少 部 份 地 是 由 于 .ac- 肾 上 腺 素 能 的 效应 〈 而 这 个 效应 并 不 涉及 CAMP 水 平 的 改变 ) 78°, 尽管 它 伴随 有 BR 酸化 酶 a 和 糖 原 合 成 酶 b 的 比例 增加 ， 但 肾 土 腺 素 能 效应 的 机 理 仍 不 清楚 。 去 甲 肾上腺 素 的 作用 和 肾上腺 素 的 作用 和 相 等 ， 肝 脏 糖 原 分 解 的 这 种 神经 性 控制 ， 在 生理 学 上 似乎 是 最 重要 的 。 正 常 循环 的 肾上腺 素 水 平 〈0.001 一 0.01kM) 对 肝 eo 74.0 。 脏 精 原 分 解 几 乎 没有 影响 ， 并 且 肾 上 腺 素 的 作用 可 能 仅 限于 «PAHS. ; 尽管 胰 高 血糖 素 对 肝脏 糖 原 分 解 的 刺激 作用 可 能 是 通过 cAMP 来 完成 的 , 但 图 4.13 中 给 出 的 作用 机 理 仍 未 被 确认 。 无 论 是 在 体内 或 在 体外 ， cAMP-PIK 对 肝脏 磷酸 化 酶 激酶 的 激活 作用 都 未 能 证 实 ， 并 且 通 过 cAMP 形成 磷酸 化 酶 a 还 存在 着 另外 的 机 理 〈 磷 酸化 酶 磷酸 酶 的 抑制 作用 ? ) 。 胰 岛 素 可 降低 先前 被 胰 高 血糖 素 提高 了 的 CAMP 水 平 ， 这 至 少 可 能 成 为 该 激素 刺激 肝脏 糖 原 合 成 的 部 份 基础 〈 再 参见 4.1145) . 虽然 胰 高 血糖 素 与 胰岛 素 的 比例 和 儿 茶 酚 胺 的 存在 ， 在 血液 葡萄 糖水 平 的 调节 中 都 是 关键 因素 ， 但 葡萄 糖 本 身 可 能 也 是 一 个 重要 的 反馈 调节 剂 。 肝 细胞 与 肌肉 细胞 不 同 ， 它 能 让 葡萄 糖 自 由 渗透 ， 因 而 葡萄 糖 是 磷酸 化 酶 位 酸 酶 和 糖 原 合 ”成 酶 磷酸 酶 的 激活 剂 。 葡 萄 糖 〈 还 有 胰 高 血糖 素 ) 可 刺激 胰 ECAR, MAAR 〈 如 糖 皮质 激素 ) 还 刺 BE RUA? 。 尽 管 发 现 了 cAMP ， 但 肝脏 糖 代谢 的 控 制 在 分 子 水 平 上 的 过 程 ， 仍 是 复杂 而 又 缺乏 了 解 的 。 4.10 激素 作用 的 分 子 基 础 现 已 证 明 ， 很 多 激素 都 能 在 体内 影响 腺 音 酸 环 化 酶 的 活 性 及 cAMP 的 水 平 c9 ， 这 就 使 人 们 对 cAMP 作为 一 般 激素 作用 的 介 体 的 作用 发 生 了 广泛 的 兴趣 因为 ecAMP-PrK 在 肴 椎 动物 组 织 中 是 仅 有 的 能 以 高 度 亲 和 力 与 cAMP 结合 的 蛋白 质 〈 除 CAMP 磷酸 二 酯 酶 以 外 ) ,因此 人 们 推测 cAMP 的 很 多 效应 或 所 有 效应 都 是 通过 这 个 酶 (ecAMP-PrK) 介 导 的 。 在 各 种 组 织 中 ， 甚 至 在 糖 原 代谢 重要 性 较 小 的 组 织 中 ， ° 75 这 个 酶 的 活性 都 非常 相似 ， 这 一 点 支持 了 那 种 认为 cAMP- Prk 作用 比较 广泛 的 意见 5 。 图 4.18 表 示 的 是 激素 通过 cAMP 而 发 生 作 用 的 假设 机 理 552。 这 个 假设 的 优点 在 于 ， 被 蛋白 质 磷酸 化 作用 所 始 动 的 变 构 转 变 ， 能 以 各 种 方式 影响 生物 学 功能 ， 这 就 为 很 多 激素 各 式 各 样 的 作用 ， 作 了 简单 而 统一 的 解释 。 如 果 这 个 理论 是 正确 的 ， 那 么 在 膜 运送 和 分 泌 过 程 中 、 在 肌肉 收缩 和 和 蛋白质 合成 中 以 及 在 中 间 代 谢 中 的 许多 蛋白 质 ， 必 定 是 cAMP-PIK 的 细胞 内 底 物 。 下 面 列 出 蛋白 质 能 被 确定 为 cAMP-PIK 的 生理 性 底 物 所 必须 具备 的 四 个 基本 2 ft. 353 。 激素 Y cAMP 的 产生 Y Ft A BE + 磷酸 化 蛋白 质 〈 修 饰 了 的 功能 ) Y 生理 学 变化 图 4.18 关于 通过 cAMP 的 作用 对 细胞 功能 的 激素 调节 的 假 HUD, C1) 在 体外 ，cAMP-PrK 应 能 催化 依赖 于 时 间 的 蛋 白质 活性 的 改变 。 C2) 活性 的 改变 应 伴随 有 蛋白 质 的 磷酸 化 作用 ， 并 且 可 被 蛋白 质 磷酸 酶 的 作用 所 逆转 。 C3) 在 体内 的 激素 反应 中 应 能 发 生 可 逆 性 蛋白 质 活性 的 改变 。- C4) 在 体内 的 激素 反应 中 ， 应 能 发 生 和 蛋 昌 质 的 磷酸 化 Se 作用， 在 体外 ， 于 同样 部 位 被 cAMP-PrK 磷酸 化 。 “虽然 只 有 了 磷酸 化 酶 激酶 符合 上 述 四 条 标准 ， 但 目前 只 有 五 种 酶 被 认为 可 能 是 cAMP-PrK 的 生理 性 底 物 ( 图 4.19) 。 在 脂肪 组 织 中 。 甘 油 三 酯 脂 酶 的 激活 作用 将 促进 被 儿 茶 酚 胺 币 激 而 加 速 的 脂肪 酸 的 生成 速率 。 肾 上 腺 皮质 中 胆固醇 酯 酶 的 激活 作用 ， 有 助 于 为 ACTH 刺激 而 加 速 的 类 固 醇 激素 的 生成 速率 。 肝 脏 丙 酮 酸 激酶 的 失 活 ， 可 能 构成 胰 高 血糖 素 激 精 原生 成 的 基础 。 不 过 已 观察 到 ， 在 体外 随 着 与 472 就 丙酮 酸 激酶 而 论 ， 也 不 完全 符合 标准 〈3.) 和 C4) -48 。 从 在 肌肉 糖 原 代 谢 方面 的 经 验 来 判断 ， 仍 包 涵 着 许多 意外 的 情况 ! x cAMP-PrkK 磷酸 化 酶 oe, ee a= Big “丙酮 酸 激 胆 激酶 酶 b 肌肉 ) CHL A) (脂肪 细胞 ) 〈 肝 ) 图 4.19 在 体内 ， 可 能 是 cAMP-PrK 的 生理 性 底 物 的 酶 。a 一 一 激活 作用 ， b 一 一 失 活 作用 。 可 能 激素 的 多 数 作用 是 影响 蛋白 质 组 份 不 是 酶 的 那些 过 程 。 它 们 包括 对 肌肉 收缩 力 、 分 泌 作 用 、 膜 的 运送 和 渗透 竹 等 的 影响 。 尽 管 蛋白 质 磷酸 化 作用 可 能 是 这 些 过 程 的 激素 性 调节 的 基础 ， 但 由 于 对 这 些 过 程 本 身 的 分 子 特性 缺乏 了 解 ， 从 而 妨碍 了 它 的 进展 。 9 77 。， 4.11 胰岛素 和 糖尿 病 虽然 胰岛 素 降低 肝脏 的 先 为 胰 高 血糖 素 和 儿 茶 酚 胺 提 高 了 的 cAMP 水 平 ， 并 且 这 可 说 明 若 不 是 全 部 也 大 部 分 是 肝脏 胰岛 素 的 效应 “9 ， 但 还 证 明 ， 胰 岛 素 不 直接 对 腺 昔 酸 环 化 酶 或 cAMP 磷酸 二 脂 酶 制剂 作用 。 所 以 胰岛 素 降低 肝 WE cAMP 水 平 的 作用 ， 可 能 是 继 发 于 这 种 激素 的 原 发 作用 所 致 。 有 关 这 些 情 况 ， 还 得 靠 骨 骼 肌 方 面 的 大 量 研究 资料 来 “ 证 明 。 在 缺乏 肾上腺 素 时 ， 胰 岛 素 能 刺激 肌肉 中 的 葡萄 糖 摄取 及 糖 原 沉积 ， 而 cAMP 也 并 没有 任何 明显 减少 。 胰 岛 素 还 能 提高 糖 原 合成 酶 a 的 比例 ， 这 就 说 明了 胰岛 素 对 糖 原 合 成 的 刺激 作用 "ss 22 。 根 据 以 前 的 讨论 (4.8 节 ) , BR 合成 酶 a 水 平 的 提高 ， 可 能 起 因 于 糖 原 合成 酶 碍 酸 酶 活性 的 提 高 ;起 因 于 某 一 不 涉及 CAMP 降低 的 机 理 所 引 起 的 cAME - PrK 基础 活性 降低 ， 或 是 起 因 于 第 二 个 糖 原 合成 酶 激酶 的 抑 制作 用 。 还 不 知道 这 些 可 能 性 中 哪 一 个 是 正确 的 ， 但 是 如 果 不 涉及 CAMP 的 话 , 那么 似乎 需要 假设 存在 着 胰岛 素 的 第 二 信使 ,因为 就 象 肾上腺 素 和 胰 高 血糖 素 一 样 , 它 似乎 是 与 半 细 _ 胞 外 膜 上 的 特殊 受 体 相互 作用 ， 并 且 可 能 并 不 进入 代谢 活性 为 它 所 调节 的 那些 细胞 的 内 部 。 西 欧 和 北美 的 人 民 中 约 有 2 多 ( 约 一 千 万 人 口 ) 患 有 糖尿 病 , 该 病 的 特点 是 失去 了 胰岛 素 降 低 血 糖水 平 的 能 力 。 尽 管 患者 可 由 于 胰 脏 B 细 胞 功能 的 一 些 障碍 而 使 血液 循环 中 常常 侧 乏 胰岛 素 ， 但 多 数 病例 的 胰岛 素 水 平 是 正常 的 ， 或 高 于 正常 值 。 这 些 病例 或 者 是 由 于 胰岛 素 不 能 与 它 的 受 体 相 互 作用 ， 或 者 是 由 于 细胞 内 胰岛 素 影响 中 间 代 谢 的 机 理 存在 缺陷 。 不 过 很 多 与 这 一 疾病 有 关 的 代谢 性 ¢ 78 @ 障碍 ， 可 能 就 是 由 于 cAMP 过 量 产生 而 引起 的 结果 , 例如 因 甘油 三 酯 脂肪 的 过 度 动 员 而 产生 的 酮 酸 毒 症 ) 。 4.12 摘 要 磷酸 化 酶 、 磷 酸化 酶 激酶 和 糖 原 合成 酶 是 值得 注意 的 一 组 酶 ， 这 些 酶 说 明 它们 相互 之 间 在 酶 调节 方面 的 很 多 复杂 性 ;虽然 这 些 酶 是 表明 可 逆 的 磷酸 化 作用 进行 调节 的 头 三 个 酶 ， 但 是 以 这 种 方式 来 控制 的 酶 的 数目 正在 迅速 增多 。 线 粒 体 丙酮 酸 赔 氢 酶 就 是 一 个 很 有 代表 性 的 例子 cz*2, 近来 又 增 加 了 两 个 肝脏 酶 ， 脂 肪 酸 合成 酶 cs 和 磷酸 果糖 激 酶 ， 它 们 -也 都 是 aAMP-PrK 的 底 物 (图 4.19) 。 通过 可 逆 的 共 价 修饰 《如 磷酸 化 作用 ) 对 酶 活性 的 控 制 ， 可 具有 多 种 功能 | (a) 它 能 改变 酶 的 动力 学 特性 和 变 构 特 性 。 Cb) 它 必 然 要 把 两 个 互 变 酶 引入 它们 本 身 就 要 受到 控 | 制 机理 支 配 的 一 种 系统 。 因 为 任何 一 个 蛋白 质 的 表面 积 都 是 有 限 的 ， 因 此 不 可 能 把 所 需要 的 某 种 酶 〈 它 在 代谢 中 占有 重 | 要 位 置 ) 的 控制 都 集中 到 一 个 分 子 里 。 Co) 能够 通过 多 部 位 磷酸 化 作用 或 通过 序列 连结 两 种 上 或 多 种 磷酸 化 - 脱 磷酸 化 作用 而 进一步 增加 酶 调节 的 可 能 性 。 这 后 一 种 现象 本 身 就 具有 好 儿 种 作用 。 第 一 ， 按 照 与 凝血 作 用 相 类 似 的 方式 ， 这 一 系列 的 反应 可 以 将 起 始 刺 激 〈 肾 上 腺 素 ) 的 微小 变化 加 以 放大 〈 第 三 章 ) 。 第 二 ， 如 果 序 列 中 两 | 种 或 多 种 酶 分 别 被 同样 的 变 构 效 应 物 调 节 ， 那 么 就 达到 进 一 步 放大 的 作用 〈 见 第 五 章 ) 。 第 三 ， 以 浓度 差别 很 大 而 存在 | 的 各 种 酶 的 键 合 ， 能 使 序列 中 的 终端 酶 被 浓度 相差 很 大 的 各 ”种 代谢 物 所 调节 。 因 此 ， 磷 酸化 酶 (平均 细胞 内 浓度 为 e 79 « 0.1mM) 不 可 能 直接 为 cAMP (0.001mM) 激活 。 Cd) 磷酸 化 作用 是 对 来 自 细胞 外 部 的 刺激 而 使 细胞 内 部 代谢 过 程 发 生效 应 的 附加 作用 。 就 象限 制 性 蛋白 水 解 那样 ， 由 于 磷酸 化 作用 共 价 修饰 酶 : 的 结构 ,所 以 在 通过 使 相互 转化 的 两 种 酶 失 活 的 情况 下 ,从 组 织 中 将 酶 抽 提 出 来 ， 就 可 能 测定 体内 酶 的 磷酸 化 作用 程度 。 在 既 缺 乏 共 价 修饰 又 缺乏 对 变 构 效应 物 改变 了 敏感 性 的 突变 型 酶 时 ， 根 据 对 分 离 的 酶 进行 研究 所 提出 的 控制 机 理 来 确定 对 完整 细胞 是 否 重 要 ， 则 是 很 困难 的 。 哺乳 动物 代谢 的 极端 复杂 性 ， 使 第 二 章 讨论 的 变 构 调节 的 一 般 原理 变 得 模糊 了 。 虽 然 可 以 把 ATP 当 作 糖 原 分 解 的 终 产物 ， 但 是 Cat Bt. cAMP 和 AMP 却 发 挥 着 许多 重要 的 控制 作用 。G6P 对 糖 原 合成 酶 的 激活 ， 可 以 看 作 是 “前 ti” 激活 〈 其 中 代谢 途径 中 先 产生 的 代谢 物 ， 对 该 代谢 途径 需要 增加 活性 的 下 一 个 酶 发 出 信号 ) 。 关于 激素 作用 的 分 子 学 基础 的 研究 仍 处 于 “幼年 2 阶段 ， 它 是 代谢 控制 研究 的 主要 课题 。 胰 岛 素 作 用 的 分 子 学 基础 ， 可 能 是 有 关 糖 类 代谢 的 激素 调节 中 尚未 解决 的 主要 间 题 。 有 关 类 固 醇 激素 在 代谢 中 的 作用 ， 将 在 本 丛书 另 一 册 中 讨 EPS 参考 文 献 [CT 了 Cori GT. ‘Colowick, S. P. and. COLIROUC seen Biol. Chem., 123,381-389. [2 ] Krebs, E.G. and Fischer, E.H.(1956), Biochim. Biophys. Acta., 20, 150-157. (3) Leloir, L. F, and Cardini, C. E. (1957), J. Amer. Chem. Soc., 79, 6340-6341. (4) Robison, G. A., Butcher, R. W. and Sutherland, E. W. (1971), Cyclic AMP, Academic Press, New York and « 80 。 London. (5) Cori,C.F.(1931), Physiological Reviews, 11, 143-275. (6) Fischer, E.H., Heilmeyer, L. M. G. and eae ang: RH; (1971),Curr. Tops.Cell.Reg., 4, 211-251. (7) Cori, G.T. and Green, A.A. 人 DR BIO CU 515 31-38. (8) Titani, K., Cohen, P., Walsh, K. A. and Neurath, H. (1975),FEBS Letters, 55, 120-123. (9) Birkett, D.J., Radda, G. K. and Salmon,. A. G. (1970), FEBS Letters, 11, 295-297. . C10) Helmreich, E. and Cori, C. F. (1964), Proc. Nat. Acad. Sci., 51,°131-135. (11) Morgan, H. E. and Parmeggiani, A.(1964), J.Biol.Chem., 239, 2440-2445. (12) Lowry, O.H., Schultz, D.W. and Passoneau, J.V.(1964), J.Biol. Chem., 2,39,1947-1953. (13) Ebashi, S., Endo, M. and Ohtsuki, 1.(1969), Quart. Rev. Biophys., 2351-2384. ; (14) Harrington, W. F.(1972), In Current Topics in Bioche- mistry, pp. 135-185, Academic Press, New York and Lo- ndon. (15) Biochem. Soc. Symp(1974), Calcium and Cell Regulation, 39,(a)Perry,S.V. 115-132; (b)Ashley, C.C. and Caldwell, P.C., 29-50; (c)Cohen,P. 51-73. (16) Krebs, E.G. (1972), Curr.Tops. Cell. Reg., .5, 99-133. (17) Danforth, W.H. and Helmreich, E.(1964), J. Biol. Chem. 239; 3133-3138. (18) Danforth, W.H. and Lyon,J B. (1964), J. Biol. Chem., 239, 4047-4050. £19) Helmreich, F. and Cori, C.F. (1966), Adv. Enzyme Reg., 3, 91-107. (20) Danforth, W. H., Helmreich, E. and Cori, C. F. (1962), Troc.Nat. Acad.Sci., 48, 1191-1199. (21) Brostrom,C.O., Hunkeler, F. L. and Krebs, E.G. = peal Biol. Chem, 246, 1961—1967. (22) Denton, D.and. Pogson, C., (1976), Metabolic Regulation, Chapman and Hall, London. (23) Marquez-Julio, A. and French, I. W. (1967), Can. J.Bio- chem., 45, 1323-1327. (24) Wilson, J.E., Sacktor, B.and Tiekert, C.G. (1967), Arch. es 81 。 Biochem. Biophys., 120, 542-546. (25) Piras, R. and Staneloni, R.(1969), Biochemistry, 8,2153- 2160. (26) Karpatkin, S., Helmreich, E.and Cori, C.F.(1964),J.Biol. Chem., 239, 3139-3145. (27) Metabolic. Imterconversions of Enzymes 1973, (1974); Springer-Verlag, Heidelberg; (a)Gratecos,D.,Detwiler, T., and Fischer, E.H. 43-52;(b) Reed, L. J., Pettit, F.H., Roche, T.E., Butterworth, P. J., Barrera, C.R., and Tsai, C.S., 99-106. (28) Advances in Cyclic Nucleotide Research (1975), 5:(a) Levey, G.S., Fletcher, M. A. and Klein, I. 53-65; (b) Cuatracasas, P.79-104; (c) Beavo, J.A., Bechtel, P. J.and Krebs, E.G. 241-251; (d)Exton,J.H.and Harper,S.C.519-530. (29) Delange, R.J., Kemp, R.G., Riley, W.D., Cooper, R.A. and Krebs, E.G.(1968).J.Biol. Chem., 243, 2200-2208. (30) Walsh, D.A., Perkins, J.P., Ho,E. S. and Krebs, E. G. (1971),J.Biol. Chem., 246, 1968-1976. (31) Posner, J.B., Stern, R. and Krebs, E.G. (1965), J. Biol. Chem., 240 982-985. (32) Drummond,G.I.,Harwood,J. P.and Powell, C. A. (1969), J. Biol.Chem., 244,4235-4240. (33) Mayer, S.E. and Stull, J.T.(1971),Ann.N. Y. Acad. Sci., 185, 433-448. (34) Yeaman, S.J.and Cohen, P.(1975),Eur.J. Biochem.,51, 93-104. (35) Walsh,D.A-.and Ashby, C.D.(1973),Rec.Prog. Horm.Res., 29, 329-359. (36) Antoniw,J.F.and Cohen,P.(1976), Biochem. Soc.Trans., 3, 83-84. (37) Cohen, P.(1976), Trends in Biochemical Sciences,1,38—40. (38) Larner, J., Villar—Palasi, C., Goldberg, N.D., Bishop, J.S., Huijing, F., Wenger, J.I., Sasko, H. and Brown, N. D. (1968), Adv.Enz.Reg.,6, 409-423. (39) Piras, R., Rothman,L.B.and Cabib, E. (1968), Biochemistry, 7,56-66. (40) Soderling, T. R., Hickinbottom, J. P., Reimann, E. M., Hunkeler, F.L., Walsh, D. A. and Krebs, E. G.(1970), J. Biol. Chem., 245, 6617-6628. (41) Cohen, P.,Antoniw, J.F., Nimmo, H. G. and Proud, C.G. (1975), Biochem. Soc. Trans., 3, 849-854. *« $2 « | [42] Danforth, W. H. (1965).J.Biol. Chem., 240, 588-593. (43) Nimmo, H.G., Proud, C.G.andCohen, P.(1976), Eur. Ji Biochem..in press. (44) Sokal, J.E., Sarcione, E. J. and Henderson, A. M. (1964), Endocrinology, 74, 930-938. (45) Hers, H.G.,Stalmans, W., De Wulf, H., Laloux, M. and Hue, L. (1974),In Metabolic Interconversions of Enzymes 1973, 89-98, Springer-Verlag, Heidelberg. (46) Huttenen, J. K., Steinberg, D.and Meyer,S.E.(1970), Proc. Nat. Acad. Sci., 67, 290-295. (47) Trzeciak, W. H. and Boyd, G.S. (1974),Eur. J. Biochem., 46, 201-207. [48] Ljungstrom, O., Hjelmquist, G.and Engstrom, L.(1974), Biochem. Biophys. Acta., 358, 289-298. (49) Qureshi, A. A., Jenik, R. A., Kim,M., Lornitzo, F. A. and Porter, J. W. (1975), Biochem. Biophys. Res. Commun., 66, 344-351. (50) Brand, I. A. and Soling, H. D. (1975), FEBS Letters, 57, 163-168. (51) Malkinson, A. M. (1975), Hormone Action, Chapman and Hall, London. e 83 °@ tee BRB ES 7k ee LER 以 外 的 共 价 修饰 对 酶 活性 的 控制 5.1 大 肠 杆 菌 谷 氨 栈 胺 合成 酶 活性 的 调节 5.1.1 反馈 抑制 作用 谷 氨 栈 胺 在 微生物 的 氮 代 谢 中 甚 为 重要 ， 因 为 它 的 酰胺 基 (并 非 其 氨 ) 是 合成 色 氮 酸 、AMP、CTP、 氮 基 葡 糖 -6- 磷 酸 、 组 氨 酸 和 所 甲 酰 磷 酸 时 较 好 的 氮 供 体 。 此 外 ， 通 过 特殊 转氨酶 的 作用 ， 其 ax- 氨基 可 以 作为 合成 甘氨酸 和 丙 氨 酸 时 的 氮 源 。 导 致 广泛 合成 种 种 代谢 物 的 高 度 分 支 途径 中 的 第 一 个 酶 一 一 谷 氨 酰胺 合成 酶 ， 应 是 代谢 控制 的 最 初 靶 子 。 不 过 ， 由 Earl Stadtman 及 其 同事 们 所 解释 的 机 理 异 常 复杂 , 这 是 完全 料想 不 到 的 。 大 肠 杆菌 正好 具有 单一 的 谷 氮 酰胺 合成 酶 ， 已 证 明 在 体 外 这 个 酶 可 被 8 种 谷 氮 酰胺 的 终 产物 所 抑制 〈 图 5.1) ， 虽 然 曾 试验 了 50 一 60 种 其 它 的 代谢 物 ， 但 都 没有 这 种 抑制 作 FAS), 尽管 任何 一 种 终 产物 甚至 在 饱和 浓度 时 也 只 能 达到 部 份 抑制 的 作用 ， 但 各 种 抑制 剂 的 作用 是 可 以 相 加 的 ， 以 致 当 全 部 8 种 终 产物 都 过 量 存在 时 ， 可 以 观察 到 近乎 完全 的 抑 制作 用 。 对 这 种 被 称 为 累加 的 反馈 抑制 的 现象 ， 可 以 作 三 种 推理 : 每 种 抑制 剂 都 与 酶 上 各 自 的 部 位 结合 ;所 有 的 抑制 剂 能 够 同时 与 酶 结合 ， 以 及 任何 一 种 抑制 剂 的 结合 并 不 会 改变 © 84-49 是 由 12 个 相同 的 亚 基 〈 分 子 - 其它 抑制 剂 与 酶 的 结合 。 这 些 理论 已 在 AMP 5 HARA 例 oc— Hil X — its Sy NADP 9 谷 氨 酸 ATP ADP+Pi 0 OMe fh 5s HOUCHCH,CH CH, jo keep oa FF Bc CH20P. 0, 0 GASP OH NH, NH> COOH ON | 中 CH AMP | 2 HC wy GH Oe ie 核 灶 5p 图 5.1 谷 氨 酰胺 的 代谢 命运 。 来 自 谷 氨 栈 腕 的 氨 原 子 ， 用 下 面 划 有 短线 的 斜 粗 体 字 表示 2) 。 (a) FARA Ms (b) 谷 氨 栈 胶合 成 酶 。 子 中 通过 直接 结合 的 研究 加 以 证 实 汪 2， 研究 表明 , 谷 氨 酰胺 合成 酶 能 与 12 个 分 子 的 反馈 调节 剂 结合 。 这 点 与 这 个 酶 量 为 50,000 道 尔 顿 ) 组 成 的 结构 相 一 致 ， 这 些 亚 基 排 列 MBit BBE ENA 图 5.2 大肠 杆 菌 的 谷 氨 酰 胺 形 〈 图 5.2)， 从 亚 基 的 相对 合成 酶 的 亚 基 排列 广 适度 大 小 来 看 ， 必 然 存在 很 32,4, 多 不 同 的 结合 部 位 ， 这 一 点 是 相当 明显 的 。 与 天 冬 氮 酸 激酶 相似 BoE) ， 累 加 抑制 作用 GR 它们 是 有 效 的 话 ) 必然 是 能 通过 该 分 支 途 径 的 最 终 产物 继 发 性 控制 每 个 分 支 途 径 的 第 一 步 反 应 而 补充 的 。 这 些 已 为 许多 例子 所 证 实 ， 并 已 在 第 二 章 的 色 氨 酸 和 CTP 中 讨论 过 了 。 5.1.2 谷 氢 酰胺 合成 酶 的 腺 苷 酰 化 作用 本 世纪 六 十 年 代 中 期 ， 就 有 两 个 实验 结果 表明 ， 必 定 还 存在 另 一 种 调节 谷 氮 酰 腕 合成 酶 活性 的 机 理 。 德 国 的 Helmut Holtzer555 证 明 ， 如 果 将 大 肠 杆 菌 置 于 除了 NH2z 以 外 的 氮 源 培养 基 上 生长 的 话 ， 那 么 细菌 中 就 保持 高 水 乎 的 谷 氢 酰胺 合成 酶 活性 。 但 是 ,如 果 将 NHI 盐 加 到 培养 基 中 , 则 在 一 分 钟 内 谷 氮 酰胺 合成 酶 的 活性 就 下 降 10 倍 ， 这 并 非 由 于 酶 的 合成 受到 阻 遇 ， 因 为 产生 一 代 细 胞 的 时 间 需 要 50 分 钟 。 所 以 NH; 必定 是 促使 先 它 而 存在 的 谷 氨 酰 胺 合成 酶 分 子 失 活 。 这 个 效应 对 NH; 是 专 一 的 ， 但 在 体外 NHI 离子 本 身 却 是 一 个 底 物 而 不 是 一 个 抑制 剂 。 为 了 探索 在 上 述 影响 中 是 什么 因子 在 起 作用 而 发 现 有 一 种 酶 ， 如 果 补 充 加 入 ATP、Mg ”和 和 谷 氮 酰胺 , 它 就 能 在 体外 催化 谷 氮 酰胺 合成 酶 失 活 。 于 是 作 这 样 的 假设 是 合理 的 ， 即 在 耗 去 x- 酮 成 二 酸 和 谷 氮 酸 (图 5.1) 的 基础 上 ，NH: 促 使 细胞 内 谷 氮 酰 胺 浓度 增加 ， 于 是 激活 这 个 酶 ， 从 而 使 谷 氮 酰 胺 合成 酶 失 活 。 在 这 同时 ， 美 国 的 Earl Stadtman WAH, MERE 不 同和 条件 下 的 大 肠 杆 菌 分 离 得 到 的 谷 所 酰胺 合成 酶 ， 不 仅 酶 的 专 一 活性 各 不 相同 ， 而 且 它 们 的 Me+ 专 一 性 及 对 反馈 抑 制剂 的 反应 52?;6 也 不 相同 。 于 是 他 证 明了 ， 这 些 各 种 不 同 形式 的 谷 氮 酰胺 合成 酶 共 价 结合 腺 彰 酸 (AMP) 的 量 不 同 。 很 明显 ， 这 两 个 实验 室 在 研究 相同 的 效应 ， 而 且 Holtzer 的 ee 86 e 灭 活 蛋白 就 是 一 种 腺 苷 酰 转移 酶 〈 称 作 AT AB), JERBREL AMP 与 谷 氨 酰 胺 合成 酶 12 个 亚 基 的 每 一 个 单独 的 酷 氨 酰基 共 价 连 接 (图 5.3) HP, 脱 腺 苷 酷 的 谷 CE) 十 12ATPMS 、 NRF BEA A cp. 氨 酰 胺 合成 酶 酰胺 合成 酶 +12pp; (5.1) 完全 脱 腺 昔 酰 的 酶 (Eo) 转 化 成 完全 腺 童 酰 的 酶 (Etz)， 能 将 从 一 个 具有 活性 的 、 依 赖 Meth. BAR pH 为 7.6 的 谷 氮 酰胺 合成 酶 转变 成 活性 较 低 、 人 依赖 Mn、 最 适 pH 为 6.5 的 谷 氨 酰胺 合成 酶 “3 。 依 赖 Mg 十 的 Eo 酶 对 丙 氮 酸 、 HARA AMP 的 抑制 作用 敏感 ， 而 依赖 Mn 一 的 Ei. Be, 却 对 组 氨 酸 、 色 氮 酸 和 CTP 的 抑制 作用 最 敏感 "2 。 Me* 和 Mn* 在 谷 氮 酰胺 合成 酶 中 的 假设 功能 ， 就 象 其 它 需 要 ATP 的 酶 (分 别 形 成 Mg 盖 -ATP 和 Mn-ATP 复合 asp — leu - tyr —-asp— leu - pro - pro- glu- | 0 | O-P-m# A5.3 谷 氨 酰胺 合成 酶 腺 苷 酰 作 用 部 位 上 的 氨基 酸 序列 (3)。 物 ) 那 样 ,已 被 下 列 情 况 所 证 明 : 为 达到 最 适 活 性 ， 要 求 等 浓 度 的 Mn** 和 ATP。 因 为 大 肠 杆菌 在 无 Mn++ 的 合成 培养 基 中 也 生长 得 很 好 ,而 且 细胞 内 Mn 十 的 浓度 仅 在 uM 的 数量 级 ， 而 Mg 一 和 ATP 的 浓度 则 在 mM 的 数量 级 ， 所 以 看 来 可 能 只 有 与 Mg 结合 的 活性 才 具 有 生理 学 意义 。 这 就 可 以 把 Eo 向 Ex. 的 转变 看 作 是 对 丙 氨 酸 、 甘 氨 酸 和 ATP 的 抑制 作用 敏感 的 有 活性 的 酶 转变 为 无 活性 的 酶 。 ar GT? 2 ”然而 ,关于 Eo 向 Ei? 的 转变 ,仅仅 发 生 于 极端 的 条 件 下 ， 即 在 缺 NHi 的 培养 基 上 生长 的 细胞 与 富 含 NHz+ 的 培养 基 接 触 时 。 通 常 谷 氮 栈 胺 合成 酶 存在 于 腺 苷 酰 作用 的 中 间 状 态 。 这 就 提出 了 混杂 分 子 其 中 只 有 12 个 亚 基 的 某 几 个 被 腺 昔 栈 te) 存在 的 可 能 性 及 其 作用 的 问题 。 对 于 谷 氨 酰胺 合成 酶 的 可 能 的 类 型 数目 方面 ， 不 仅 要 记 住 每 个 分 子 中 腺 昔 酰 基 的 数目 ， 而 且 还 要 记 住 这 些 腺 背 酰 基 的 彼此 相关 的 位 置 ,在 两 个 六 面体 内 它们 的 类 型 可 有 382 个 !- 图 5.4 表示 具有 不 同 特性 的 混杂 分 子 确实 存在 。 谷 氮 酰 胶合 成 酶 的 特异 性 与 腺 背 栈 化 状态 不 呈 线 性 函数 KA, SBE 向 Eo 或 是 趋向 En 状态 时 ， 酶 活 性 便 发 生 较 明 显 的 变化 。 部 份 腺 苷 酰 化 制剂 的 另外 一 些 动 力学 参数 ， 以 及 他 们 对 抗 变 性 的 作用 ,都 与 Bo 和 En OS 量 混合 物 有 所 不 同 ca 。 比 活性 ‘Mg?t Oh Bie Skis 10. AZ 图 5.4 腺 苷 酰 化 作用 状态 与 谷 氨 酰 胺 合成 酶 比 活性 之 间 的 相 互 关 系 。 (O—O) Mg++ 结 合 的 活性 〈 鳃 一 一 人 @@) Mn++ 结 合 的 活性 ;(x 一 一 X) 以 各 种 比例 混合 Eo ME12 得 到 的 Mg++ 结合 的 活性 (19) 。 任何 亚 基 的 活性 都 明显 地 受到 邻近 亚 基 腺 童 酰 化 状态 的 影 响 ， 关 于 这 种 情况 推测 也 和 对 ATC 酶 的 假定 一 样 (第 二 ° 88 e BE) ， 可 能 是 通过 传递 到 亚 基 接触 点 的 变 构 性 转变 而 发 生 的 。 最 初 的 谷 氨 酰 胺 合成 酶 的 制剂 〈 它 能 显示 出 对 全 部 8 种 反馈 抑制 剂 的 累 加 反馈 抑制 作用 ， 并 且 也 可 以 显示 出 对 低 浓 度 调 节 剂 的 抑制 作用 比 E 和 El 的 要 更 敏感 ) 多 半 是 属于 部 Oy Hie EE BE AG AY BD 。 也 有 人 报道 ， 在 磷酸 化 酶 b 和 a 相互 转化 过 程 中 ， 可 以 形成 具有 不 同性 质 的 部 份 磷酸 化 的 中 间 体 ， 于 是 提出 ， 这 种 复杂 的 混杂 物 可 能 是 一 种 以 共 价 修饰 进行 了 酶 调节 的 普遍 现 象 C#4)\ 5.1.3 可 逆 的 尿 苷 酰 化 作用 对 腺 昔 酰 化 及 脱 腺 苷 酰 化 的 控制 将 大 肠 杆 菌 从 富 含 NHz 的 培养 基 中 转移 到 含 NHIi a 的 培养 基 中 时 ， 谷 所 酰胺 合成 酶 迅速 复活 ， 这 证 明 腺 苷 酰 化 作用 是 可 逆 的 “2 。 这 就 使 人 们 把 注意 力 集中 在 关于 脱 腺 昔 酰 化 作用 的 控制 问题 上 ,从 而 得 到 下 面 一 些 值得 注意 的 结果 : Ca) 脱 腺 昔 酰 化 作用 是 通过 酷 氨 酰 -O-AMP 键 的 磷 酸化 裂解 进行 的 习 ?) 。 Eli2(AMP) + 12P ;一 >Eo+12ADP (5.2) Cb) 脱 腺 苷 酰 化 作用 需要 称 为 PI 和 Pi 的 这 两 种 不 同 的 蛋白 质 忆 4 。 (Cc) 和 蛋白质 Pi 与 AT 酶 是 相同 的 。 因 此 同一 种 酶 既 可 催化 腺 苷 酰 化 作用 ， 又 可 催化 脱 腺 苷 酰 化 作用 避 5) 。 (d) AT 酶 (分子量 为 130,000 道 尔 顿 ) 是 由 分 子 量 分 别 为 70,000 和 60,000 道 尔 顿 的 两 个 不 同 的 亚 基 组 成 的 。 前 者 还 能 催化 腺 萌 酰 化 作用 ， 但 是 要 证 明 脱 腺 苷 酰 化 的 活性 ， 则 必须 用 完整 的 AT 酶 复合 物 5!6?2) 。 Ce) BAMP, 有 两 种 形式 ， 称 作 Pi 一 A 和 Pi 一 D。 ee 89 。 当 不 存在 谷 氨 酰胺 和 Py 时 ， 体 外 的 腺 苷 酰 化 活性 是 很 低 的 。 用 谷 氨 酰 胺 刺激 ， 活 性 可 提高 10 倍 ; 用 Pr 一 A 刺激 ，- 可 提高 30 倍 ;而 若 二 者 联合 使 用 ， 则 活性 可 提高 40 倍 。 被 Pi 一 A 激活 而 产生 的 腺 苷 酰 化 作用 ， 对 o- 酮 成 二 酸 的 抑 制 作用 非常 敏感 。Pi 一 A 不 影响 脱 腺 音 酰 化 作用 的 速率 。Pi 一 D 只 是 在 有 谷 氢 酰胺 存在 时 才 可 刺激 腺 苷 酰 化 作用 。 但 是 就 象 需 要 ATP 和 wo- 酮 成 二 酸 一 样 ， 脱 腺 苷 酰 化 作用 绝对 需要 Pi —p 618) 。 Cf) Pi 一 A 向 Pr 一 D 转 化 ， 需 要 UTP. BFR 及 ATP 或 o- 酮 戌 二 酸 。ATP 和 oa- 酮 成 二 酸 都 存在 时 ， 可 刺 激 反 应 而 再 提高 2 一 3 倍 .Pi 一 D 的 形成 可 被 谷 所 酰胺 及 了 Pi 抑 人 制 中 ?全 天 Cg) BAR Py (分 子 量 为 4,4000 道 尔 顿 ) 是 由 4 个 相同 的 、 分 子 量 为 11,000 道 尔 顿 的 亚 基 组 成 。Pi 一 A 癌 Pi 一 D 转 化 ， 就 是 在 被 专 一 的 尿 苷 酰 转移 酶 (UT 酶 ) 催 化 下 司 ” ， UMP 与 存在 于 每 个 亚 基 上 的 两 个 酷 氨 酰 残 基 之 一 产生 共 价 P,;—A+4UTP ae —P,;—D(UMP) + 4pp; (5.3) Ch) BUR BLL(E ERASER CORRE) 俊 化 的 。 这 个 酶 可 在 有 Mn 十 离子 存在 时 单独 发 生 作 用 ,也 可 以 在 有 o- 酮 成 二 酸 或 是 有 ATP 存在 时 与 镁 发 生 作 用 。 当 ATP 和 o= 酮 戌 二 酸 都 存在 时 ， 可 刺激 Mg 十 连接 的 UR MEA 性 进 =H Fei 2 To". P,;—D(UMP) +4H;OUR 酶 "Me Pi 一 A+4UMP aga 所 有 这 些 发 现 的 净 结 果 ， 如 图 5.5 中 所 示 ， 谷 氢 酰 胺 合 成 酶 是 被 两 个 相反 方 癌 的 级 联系 统 调节 的 。 90 e T,|-RPPRA+N+H+ thr -leu-—his—ala- asp -ala-—ile- x (R- PPRA) - arg 图 5.6 ARBRE Tr 失 活 的 机 理 及 ADP- 核 糖 基 化 部 位 主 的 氨基 酸 序 例 。N 一 一 烟 酰 腕 ， 有 一 一 核糖 P 一 一 磷酸 (lsb,28) 。 毒素 底 物 的 蛋白 质 。Ti 的 ADP- 核 糖 基 化 看 来 破坏 了 与 RNA 部 份 的 结合 能 力 。Ti - RPPRA (RAW 4AGTP, ##H Tri- RPPRA-GTP 也 仍 可 以 结合 核 蛋白 体 。 白喉 毒素 合成 后 ， 并 没有 酶 促 活性 ， 它 必须 首先 经 过 蛋 白 酶 切断 ， 再 用 硫 醇 还 原 它 的 二 硫 键 ， 才 表现 出 活性 。 图 5.7 示 出 了 胰 和 蛋白 酶 对 白喉 毒素 的 激活 机 理 。 胰 蛋白 酶 在 三 个 紧 挨 着 的 精 氨 酸 残 基 “〈 氮 基 末 端的 189.191 和 192) Ab“ PR” 分 子 。 然 后 经 过 还 原作 用 产生 一 个 具有 酶 促 活 性 的 入 末端 的 A 片 段 和 一 个 没有 活性 的 C 末 端的 B 片段 > 不 过 当 把 它们 加 到 培养 细胞 中 ， 那 么 与 完整 的 或 是 有 切口 的 毒素 相反 ， 无 论 AW RMB HH RBRA BH. e 95 e 人 们 已 经 分 离 出 了 许多 突变 种 毒素 ， 它 们 没有 毒性 ， 它 sess 63, 000 A 无 活性 有 毒性 = P74, 00 sc_S s— —. es i. 有 活性 无 毒性 O4, oS WIT tH ee L WRB We cca cone 000 C 分 子 量 39, 000 无 活性 有 毒性 ”无 活性 无 者 性 图 5.7 ” 胰 蛋 白 酶 激活 白喉 毒素 的 机 理 (29 。 们 或 是 缺少 分 子 的 A 部 分 ， 或 是 缺少 分 子 的 B 部 分 。 在 有 胰 蛋白 酶 与 硫 醇 存 在 的 情况 下 ， 如 果 把 一 个 缺少 A 部 分 的 没有 毒性 的 突变 种 蛋白 质 ， 加 到 缺少 B 部 分 的 没有 毒性 的 突变 种 蛋白 质 中 ， 然 后 通过 透析 除去 硫 醇 ， 并 使 二 硫 键 重新 氧化 ， 这 样 就 产生 了 毒性 。 这 些 “ 杂 交 ” 实 验 很 清楚 地 证 明 ， 对 于 毒性 来 讲 了 B 部 分 是 不 可 缺少 的 ， 而 且 毒 性 也 有 赖 于 ADP- 核 糖 基 化 作用 的 存在 。 人 们 发 现 那 种 含有 无 活性 的 A 片 段 的 无 毒 突变 种 毒素 ， 在 细胞 培养 中 是 天 然 毒 素 作 用 的 竞争 性 抑制 剂 ， 所 以 认为 毒素 是 与 细胞 表面 上 的 一 个 特殊 受 体 部 位 相 结 合 的 。 于 是 人 们 就 提出 关于 毒素 作用 的 假设 ;完整 的 或 “有 切 口 2” 的 毒素 与 靶 细 胞 外 膜 上 一 个 或 几 个 特殊 部 位 相互 作用 ， 这 种 特殊 部 位 可 能 与 B 片 段 的 某 些 部 分 有 关 。 然 后 毒素 按照 一 种 至 今 人 们 尚 不 清楚 的 机 理 穿 过 细胞 膜 。 毒 素 在 体内 能 通 PMR B=) 或 细胞 内 的 蛋白 酶 而 被 切 开 。 假 设 二 硫 键 的 还 原 是 利用 谷 胱 甘 肽 在 细胞 内 发 生 的 ， 那 么 细胞 中 硫 醇 4 的 浓度 (2mM) 是 足够 完成 这 个 反应 的 。 它 释放 出 A 片 段 ， 然后 催化 Tr 失 活 。 在 体内 各 种 器 官 中 停止 蛋白 质 合 成 ， 于 是 致使 器 官 受到 损害 。 所 以 看 来 这 个 过 程 包括 限制 性 蛋白 水 ° 96 。 甫 与 ADP- 核 糖 基 化 作用 这 两 种 类 型 的 共 价 修饰 。 近来 研究 表明 ， 从 一 种 训 无 关系 的 细菌 了 .aerwginosa 分 离 出 的 毒素 ， 能 正确 地 催化 和 白喉 毒素 相同 的 反应 5292 。 由 于 这 种 毒素 可 以 引起 很 不 相同 的 临床 症状 ， 例 如 它 引 起 狗 和 猴子 低 血 压 性 休克 ， 所 以 它 的 细胞 专 一 性 必定 与 白喉 毒素 不 同 。 一 种 毒素 在 体内 的 稳定 性 ， 对 于 决定 它 的 毒性 来 讲 也 必 然 是 一 个 很 重要 的 因素 。 另 一 种 唯一 对 其 作用 机 理 完全 了 解 的 细菌 毒素 ， 就 是 引起 霍乱 的 蛋白 质 。 这 种 蛋白 质 似乎 是 腺 苷 酸 环 化 酶 的 专 一 性 激活 剂 “ 第 四 章 ) 。cAMP 的 显著 提高 ， 可 破坏 肠 细胞 保 持 水 份 的 能 力 ， 导 致 由 于 脱水 而 死亡 。 最 近 关 于 需要 NAD+ RGEC, EA ADP- 核糖 基 化 作用 也 可 能 是 这 种 毒素 作用 的 基础 。 白喉 杆菌 只 有 当 它 们 被 某 些 唆 菌 体感 染 后 才 产 生 毒素 ; 并 且 现 已 清楚 白喉 毒 素 的 结构 基因 是 起 源 于 叭 菌 体 基因 组 。 虽然 下 面 一 节 将 表明 ADP- 核 糖 基 化 是 唆 菌 体 用 以 使 它们 寄 生 的 细菌 功能 失 活 的 一 个 共同 机 理 ， 但 这 个 引 人 注 目的 发 现 的 含意 ， 则 在 别处 加 以 讨论 26 。 5.2.2 Wee T 4 感染 引起 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 的 失 活 WEP TA 侵入 大 肠 杆 菌 细胞 后 ， 几 分 钟 内 细菌 细胞 就 从 转录 宿主 的 基因 组 改变 为 转录 噬菌体 T4 的 基因 ， 但 是 大 肠 杆 菌 的 RNA 聚合 酶 也 照例 转录 叭 菌 体 基因 。 这 些 变化 似 乎 是 这 通过 这 两 种 不 同 的 称 作 转 变 作用 和 修饰 作用 的 ADP 核糖 基 化 作用 来 完成 的 c32 。 转变 作用 是 由 存在 于 T4“ 头 ”部 的 ADP- 核 糖 基 转 移 酶 催化 的 〈 它 与 TADNA 一 起 注入 细菌 ) 。 这 就 导致 聚合 本 (BB/ 0,0 结构 ) 上 的 专 一 性 精 氨 酸 残 基 ADP- 核 糖 基 化 。o sa 97 e 和 a 亚 基 以 及 较 少 程度 的 B 和 有 亚 基 发 生 转 变 了 。 大 们 认 为 ， 这 种 键 合 的 稳定 性 是 由 于 在 ADP- 核 糖 基 和 精 氮 酸 股 基 之 间 形 成 了 N- 糖 背 键 。 转 变 作用 是 在 感染 后 一 分 钟 内 发 生 KW, (Ho 亚 基 的 转变 不 超过 50 胸 。 然 而 感染 儿 分 钟 后 ，B 、 BA o 亚 基 的 转变 就 道 转 了 。 由 于 史 菌 体 在 缺乏 ADP- 核 糖 基 转 移 酶 的 突变 种 中 仍然 可 以 增殖 ， 所 以 转变 作用 的 确切 作 用 是 什么 ， 尚 不 清楚 532 。 修饰 作用 是 在 转变 作用 后 的 几 分 钟 内 发 生 的 ， 并 依赖 于 感染 细胞 内 的 蛋白 质 合成 。 它 可 使 o= 亚 基 上 的 专 一 性 精 氮 PR EPA EE pS? 。 修 饰 作用 可 使 wx 亚 基 上 的 专 一 性 精 氮 酸 残 基 完 全 ADP- 核 糖 基 化 "1。 这 就 阻碍 了 聚合 酶 转录 大 肠 杆 菌 基 因 组 ， 而 不 阻碍 转录 T4 基因 ,从 而 证 明 ， 对 于 聚合 酶 与 大 肠 杆 菌 基因 组 上 的 启动 子 部 位 相互 作用 来 BE, o- MEE AAO? 。 初步 证 据 认 为 ， 在 转变 作用 和 修 饰 作用 过 程 中 ,o- 亚 基 上 的 同一 个 残 基 被 ADP- 核糖 基 化 了 。 不 过 ， 这 两 种 反应 是 被 不 同 的 酶 所 催化 的 ,因为 alt” 和 mod 的 突变 是 发 生 在 鸣 菌 体 基 因 组 的 不 同 部 位 3] 。 Aime RA T4 相反 ， 鸣 菌 体 T7 可 为 蛋白 质 激酶 编码 ,此 蛋白 质 激酶 是 催化 苏 氨 酸 残 基 (这 些 残 基 存 在 于 很 多 大 肠 杆 AeA tk, ih RNA RARE B’ WIE) 广泛 的 磷酸 化 作 用 5 。 这 可 能 是 阻止 同时 发 生 宿 主 合成 RNA 的 基础 (因为 在 激酶 突变 体 中 并 不 阻止 RNA 合成 )。 与 喉 菌 体 T4 A, T7 可 以 为 本 身 的 RNA RAMA, RARE T7 诱导 的 体内 磷酸 化 作用 的 不 可 疼 性 ， 反映 出 细菌 中 缺 乏 . 蛋白 质 激 酶 和 蛋白 质 磷酸 酶 (5.1 节 ) 。 5.2.3 真 核 细 胞 的 ADP- 核 糖 基 化 作用 肝脏 腺 粒 体 具有 一 个 可 以 催化 依赖 于 NAD -的 将 ADP- ° 98 ， 核糖 转移 到 专 一 性 受 体 蛋 白质 上 的 系统 35 。 与 白喉 毒素 或 吹 菌 体 催化 ADP- 核 糖 基 化 作用 不 同 ,这 个 反应 需要 Mg 二 这 种 修饰 作用 在 细胞 生长 与 NAD+/NADH 水 平 相互 联系 中 的 可 能 作用 ， 是 一 个 有 待 进一步 研究 的 问题 。 ”人 们 已 从 肝脏 细胞 核 中 分 离 出 经 一 个 “或 多 个 ) 磷酸 丝 氨 酸 残 基 与 组 蛋白 Hi 共 价 连接 的 多 聚 -ADP- 核 糖 "9 。 这 种 作用 以 及 其 它 一 些 染色 体 蛋白 质 的 共 价 修饰 (磷酸 化 ， 乙 酰 化 和 甲 基 化 ) 的 作用 都 还 不 清楚 。 还 没有 发 现 酶 通过 可 道 的 乙酰 化 或 甲 基 化 进行 调节 的 实例 。 很 多 在 细胞 内 的 蛋白 质 包括 酶 ， 是 在 它们 的 N- 端 被 乙酰 化 的 。 不 过 这 些 几 乎 都 是 不 可 道 的 转录 后 修饰 ， 其 可 能 的 作用 在 于 保护 蛋白 质 免 受 EA 基 肽 酶 的 降解 。 S$ 4 MXM 献 C1) Woolfolk, C. A. and Stadtman, E. R. (1964). Biochem; Biophys. Res. Commun., 17, 313-319;(1967), Arch. Bio- chem. Biophys., 118, 736-755. (2) Stadtman,E.R., Shapiro, B.M., Kingdon, H.S., Woolfo-— Ik, C.A. and Hubbard, J.S.(1968), Adv.Enz.Reg., 6, 257- 289. (3) Shapiro, B.M. and Stadtman,E.R.(1970), Ann. Rev. Mic- robiol., 24, 501-524. (4) Valentine, R.C., Shapiro, B. M. and Stadtman, E.R. (1968), Biochemistry, 7, 2143-2152. (5) Holtzer,H., Mecke, D., Wulff,K.Liess,K-and Heilmeyer, L. (1967), Adv.Enz. Reg., 5, 211-225. C6) Kingdon, H.S. and Stadtman, E.R.(1967), Biochem- Biophys. Res. Commun., 27 470-473. (7) Shapiro, B. M., Kingdon, H.S. and Stadtman, E. R. (1967),Proc. Nat.Acad. Sci., 58, 642-649. [8 ] Kingdon, H.S., Shapiro, B.M. and Stadtman,E.R. (1967), 58, 1703-1710. | C9) Wulff, K., Mecke, D. and Holtzer, H. (1967), Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 740-745. e 99 e ~ (10) Stadtman, E. R., Ginsburg, A., Ciardi, J.E., Heh, J., Hennig, S.B. and Shapiro, B.M. (1970), Adv. Enz.Reg .; 8, 99-118. (11) Ciardi, J. E., Cimino, F. and Stadtman, E. R.(1973),Bio- chemistry, 12,4321-4330. (i2} Hurd, S.S., Teller, D.C. and Fischer, E.H. (1966), Bio- chem. Biophys. Res. Commun., 24 79-84. C13) Anderson, W. B. and Stadtman, E. R. (1970), Biochem. Biophys. Res.Commun., 41, 704-709. (14) Shapiro, B.M.(1969), Biochemistry, 8, 659-670. (15) Anderson, W.B., Hennig, S.B., Ginsburg, A. and Stad- tman, E.R.(1970), Proc. Nat. Acad. Sci., 67 1417-1424. [16] Hennig, S. B., Anderson, W.B. and Ginsburg, A. (1970), Proc. Nat. Acad. Sci.,67, 1761-1768 (17) Ebner, E., Wolf, D., Gancedo, C., Elsasser, S..and Holtzer, H.(1970), European J. Biochem., 14, 535-544. (18) Metabolic Interconversions of Enzymes 1971, (1972), (Eds) Helmreich, E., Holtzer, H. and Wieland, O., Springer- Verlag, Heidelberg.(a) Stadtman, E. R., Brown, M., Se- gal, A., Anderson, W. A., Hennig, S. B., Ginsberg, A. and Mangum, J. H. 231-244; (b) Honjo, T., Ueda, K., Tanabe, T. and Hayaishi, O.193-207. (19) Brown, M. S., Segal, A. and Stadtman, E. R. (1971), Proc. Nat. Acad. Sci., 68, 2949-2953. (20) Mangum, J.H., Magni,G. and Stadtman, E.R. (1973),Arch. Biochem. Biophys., 158, 514-525. (21) Adler, S. P., Purich, D. and Stadtman, E.R.(1975),J. Biol. Chem .;250, 6264-6272. (22) Metabolic Interconversions of Enzymes 1973,(1974), (Eds) Fischer, E.H., Krebs, E.G., Neurath, H.and Stadtman,.E. R., Springer-Verlag, Heidelberg. (a)Adler,S. P., Mangum, J.H., Magni, G.and Stadtman, E.R.221-233; (b) Goff, C.G. 235-244. (233 Segal, A., Brown, M.S.and Stadtman,E. R. (1974), Arch. Biochem .Biophys., 161, 319-327. (24) Schutt, H. and Holtzer,H. (1972),Eur.J.Biochem.,26,68-72. (25) Hubbard, J.S. and Stadtman, E. R. (1967),J.Bacteriol.,94, 1007-1015. ‘ (26) Collier, R.J. (1975), Bacteriol.Rev., 39,54-85. [27]. Strauss,N.and Hendee,E.D.(1959),J.Exp.Med.,109,145-163. (28) Robinson, E. A., Henriksen, O. and Maxwell,E. S. (1974), es 100 » J. Biol. Chem., 249, 5088-5093. (29) Iglewski. B.H. and Kabat, D. (1975), Proc. Nat.Acad.Sci., 72,2284-2288. [30] Gill, D.M. (1975),Proc. Nat. Acad. Sci., 72,2064-2068. (31) Rohrer, H.,Zillig, W. and Mailhammer, R. (1975), Eur. J. Biochem., 60, 227-238. (32) Mailhammer, R.,Reiness, G.,Ponta, H., Yang, H.L.,Sch weiger, M., Zillig, W. and Zubay,G.(1976), In Metabolic Interconversions of Enzymes 1975, (Ed)Shaltiel,S., Springer- Verlag Heidelberg, in press. (33) Horvitz, H. R. (1974),J. Mol.Biol.,90,727-750. (34) Zillig, W., Fujiki, H.,Blum, W., Janekovic, D..Schweiger, M..Rahmsdorf,H.,Ponta,H.and Hirsch-Kauffman,M.(1975), : Proc.Nat.Acad.Sci., 72, 2506-2510. (35) Kun, E.,Zimber, P. H.,Chang,A.C.Y., Puschendorf,B.and Grunicke,H. (1975),Proc.Nat. Acad.Sci., 72,1436-1440. (36) Smith,J. A. and Stocken,L.A. (1975),Biochem. J.» 147: 523-529. . ] 1 7 “ 4 3 - ; } + ¢ 101 2 第 六 章 “” 变 构 转 变 的 性 质 在 撰写 本 书 时 ,对 于 第 二 、 四 ,五 章 所 描述 的 经 典 的 变 构 酶 结构 ,了 解 的 还 很 少 。 已 经 发 表 的 仅仅 是 有 关 ATC 酶 调节 亚 基 的 完整 的 一 级 结构 ， 而 且 其 中 有 好 几 种 酶 还 没有 得 到 结 晶 。 虽 然 ATC 酶 和 磷酸 化 酶 的 三 级 结构 已 解决 到 6A 42 ， 但 是 ， 在 这 种 分 辨 率 上 ， 只 能 确定 酶 的 整个 形状 ， 而 对 酶 结 构 的 细节 还 不 能 了 解 。 用 高 分 辨 率 解 决 这 两 种 酶 的 结构 ， 可 能 还 需要 一 些 时 间 ， 同 时 还 需要 更 长 的 时 间 ， 才 能 弄 清 伴随 变 构 效应 物 结合 而 引起 的 酶 构象 变化 的 细节 。 由 于 这 个 缘 故 ， 关 于 变 构 转变 性 质 的 近代 概念 ， 很 大 程度 依靠 从 一 个 酶 ( 胰 凝 乳 蛋 白 酶 ) 、 一 个 非 酶 蛋白 质 〈 和 血红蛋白) 和 一 些 理 论 的 概念 而 得 到 的 一 些 有 关 结 构 的 知识 。 象 第 三 章 讨 论 过 的 ， 关 于 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 癌 胰 凝 乳 和 蛋白 酶 转变 ， 可 以 代表 在 变 构 转变 时 发 生 的 那 种 变化 。 然 而 ， 按 照 原来 的 定义 〈 第 二 章 ) 严格 来 讲 ， 这 种 转变 并 非 变 构 转 变 ， 因 为 它 的 转变 既 不 是 被 结合 变 构 效 应 物 过 程 所 触发 ， 并 且 这 种 转变 还 是 不 可 逆 的 ;而 且 胰 凝 乳 蛋白 酶 也 不 显 出 一 个 S 形 饱 和 曲线 〈 这 种 曲线 在 一 些 变 构 酶 ， 当 以 酶 活性 对 庶 物 浓度 作 图 时 可 以 观察 到 ) 。 我 们 的 很 多 关于 S 形 效 应 来 源 的 看 法 ， 是 从 对 血红 蛋白 的 研究 推导 而 来 的 。 血 红 蛋 白 具 有 a8. 结构 , 两 类 亚 基 每 个 分 子 量 接近 16,000 道 尔 顿 ， 每 个 都 含有 一 个 血红 素 基 团 。 每 -个 血红 素 的 铁 原子 结合 一 个 氧 分 子 ， 因 此 ， 当 血红 蛋白 进行 充分 氧 合作 用 时 ， 总 共 可 结合 4 个 氧 分 子 。 携 氧 和 脱氧 血红 * 102 s yey it? tres 蛋白 具有 相似 的 但 又 不 同 的 三 级 结构 。 在 对 二 个 结构 作 一 比 较 后 可 以 认为 ， 当 与 氧 结合 时 ， 铁 原子 移 到 血红 素 环 的 平 面 。 由 于 铁 原子 牢固 地 连接 于 入 亚 基 特 殊 的 组 氨 酸 残 基 上 ， 所 以 这 就 触发 了 每 个 亚 基 结构 上 一 系列 的 各 自 并 不 连续 的 变化 ， 以 及 触发 了 亚 基 彼 此 相互 位 置 的 重新 排列 ca'9 。 60 多 年 前 就 知道 ， 当 以 血红 蛋白 的 氧 合作 用 对 氧 分 压 作 图 时 ， 得 到 一 条 大 弯 度 的 S 形 曲线 。 对 这 条 曲线 的 形状 进行 了 分 析 以 后 提出 ， 如 果 第 一 个 氧 分 子 与 四 个 血红 素 基 团 中 的 任何 一 个 结合 相对 困难 的 话 ， 就 会 出 现 S 形 的 特征 ， 而 一 且 第 一 个 氧 分 子 结合 成 功 ， 那 么 氧 分 子 的 进一步 结合 就 比较 容 易 进 行 了 。 由 于 血红 素 基 团 距 离 太 远 不 能 直接 相互 影响 ， 并 且 氧 合 血 红 蛋 白 和 脱氧 合 血红 蛋白 的 构 型 不 同 ， 于 是 提出 对 第 一 个 氧 分 子 与 血红 蛋白 结合 的 约束 ， 可 能 与 脱氧 血红 蛋白 的 特殊 构 型 有 关 。 这 种 观念 后 来 发 展 成 为 两 种 能 够 从 理论 上 说 明 蛋 白质 和 酶 的 S 形 效应 的 数学 模式 。 有 关 每 种 数学 模式 的 详细 情况 ， 读者 可 参考 原著 556 及 两 篇 优秀 的 评论 ca。 在 Koshland 的 模式 中 5 ， 氧 分 子 与 第 一 个 亚 基 相 结 合 ， 引 起 亚 基 发 生 结构 改变 。 这 种 改变 通过 将 两 个 多 肽 链 连 接 在 一 起 的 亚 基 接触 而 转移 到 邻近 的 亚 基 上 。 第 二 个 亚 基 所 引起 的 结构 改变 使 得 它 更 易于 与 氧 结合 。 然 后 又 影响 第 三 个 亚 基 的 构象 ， 依 比 类 推 。 在 Monod 的 模式 中 c92 ， 假定 血红 蛋白 是 以 两 种 构象 状 态 的 平衡 混合 物 而 预先 存在 ， 一 种 是 以 低 亲 合力 与 氧 结合 的 “紧张 》 态 或 称 了 态 ， 另 一 种 是 以 高 亲 合 力 与 氧 结合 的 “ 松 弛 ” 态 或 称 R 态 。 无 氧 时 ,血红 蛋白 主要 是 T 态 ,而 当 加 入 氧 后 ， 氧 优先 与 R 态 的 血红 蛋白 结合 ， 于 是 平衡 朝向 R 态 方向 改变 ， 并 且 使 与 氧 结合 的 部 位 有 更 高 的 亲 合力 。 氧 的 多 结合 es 108 e Mire, URTERRAZAM EAA, FT SHR 血红 蛋白 结构 的 X- 射 线 结晶 学 分 析 ， 未 能 区 分 两 种 假 说 。 结 唱 作 用 就 是 使 分 子 冻 结 成 为 一 个 特殊 构 型 的 过 程 ， 已 经 证 明 部 份 氧 合 分 子 的 构象 分 析 是 不 可 能 的 居 2 。 Monod 模式 和 Koshland 模式 的 区 别 在 于 : 在 Monod 模 式 中 ， 假 定 蛋 白质 在 无 氧 时 存在 两 种 构象 ， 并 且 根 据 所 有 亚 基 的 构象 同时 改变 的 “协调 一 致 ”的 机 理 ， 发 生 由 工 态 向 R 态 的 转变 ;而 在 Koshland 模 式 中 ， 构 象 变化 是 通过 许多 不 同 的 步骤 而 “ 序 贯 地 ? 发生 的 。 但 是 这 两 种 模式 都 要 求 蛋 和 白质 具有 下 列 结构 上 的 特征 ， 即 蛋白 质 至 少 具 有 两 种 构象 ， 必 须 具备 可 与 氧 结合 的 多 种 部 位 (因此 要 具有 多 种 亚 基 )， 并 且 加 入 氧 后 一 定 能 促使 其 向 具有 高 亲 合 力 结合 氧 的 形式 转变 。 通过 对 这 两 种 理论 所 作 的 这 种 简单 的 定性 说 明 ， 显 然 可 以 认为 ， 发 生 S 形 反应 的 机 理 与 变 构 转 变 非 常 相 似 。 通 过 类 似 CTP 抑制 ATC 酶 (第 二 章 ) 或 cAMP 激 活 cAMP-PrK (3 四 章 ) 的 机 理 ， 氧 在 一 个 部 位 上 的 结合 ， 可 能 影响 氧 在 远离 部 位 上 的 结合 。 而 且 血 红 和 蛋白 的 氧 合作 用 曲线 完全 类 似 于 以 酶 活性 对 底 物 浓度 作 图 得 到 的 S 形 曲线 (图 2.4,2.11， 2.15) .用 这 两 种 模式 可 以 简单 地 解释 很 多 变 构 效 应 物 的 作 用 机 理 。 按 照 Monod 的 说 法 ， 变 构 抑制 物 常 常 通 过 使 平衡 移 向 工 态 而 起 作用 ， 将 SS 形 饱 和 曲线 向 右 移 而 使 曲线 更 具 S HK CM CTP 对 ATC 酶 的 影响 ， 图 2.11) 。 相 反 地 ， 变 构 激 活 剂 会 促使 R 态 形成 ， 使 S 形 饱和 曲线 向 左 移动 ， 使 曲线 更 呈 双 曲线 形 〈 如 须 氮 酸 对 苏 氨 酸 脱 氮 酶 的 作用 ,图 2.4 或 ATP 对 ATC 酶 的 作用 ， 图 2.117 。 昌 然 这 而 种 理论 都 要 求 酶 由 两 种 或 多 种 亚 基 组 成 | 但 有 必要 强调 指出 ， 尽管 大 多 数 细胞 内 的 酶 具有 这 种 结构 ， 但 只 * 104 。 y of ha es ee ee ee ed 有 极 少数 的 酶 显示 出 $S 形 动力 学 性 质 ， 或 是 可 被 变 构 效应 物 所 调节 。 通 过 探讨 哺乳 动物 中 转变 肌肉 的 糖 原 和 葡萄 糖 为 乳 酸 的 酶 ， 就 能 恰当 地 说 明 这 一 点 〈 图 6.1) 。 从 图 6.1 中 可 以 看 到 14 种 酶 中 有 10 种 是 由 两 个 或 多 个 亚 基 组 成 ， 可 是 只 有 两 种 呈现 S 形 动力 学 特征 ， 或 可 被 变 构 效应 物 调节 。 而 且 4 种 没有 亚 基 结 构 的 单 体 酶 之 一 〈 己 糖 激酶 ) ， 是 被 变 构 效 应 物 (G6P) 所 调节 。G6P 对 葡萄 糖 来 说 是 非 竞争 性 抑制 物 ， 而 对 第 二 个 底 物 ATP 来 说 ， 它 是 竞争 性 抑制 物 "" " 。 RASH vy x 亚 基 的 酶 分 子 量 x10-3 数目 变 构 调节 作用 己 糖 激酶 96 1 有 (G6P-) . 磷酸 化 酶 100 2 有 (AMP+,ATP-， G6P-) 脱 支 酶 160 1 于 葡 糖 磷酸 变 位 酶 62 1 无 己 糖 磷酸 异 构 酶 65 2 无 磷酸 果糖 激酶 。 85 4 有 (Pi+,AMP+,FDP+， NH3+*,ATP ,柠檬 酸 -) 醛 缩 酶 40 4 无 两 糖 磷酸 异 构 酶 | on 2 无 G3P tA 36 4 无 磷酸 甘油 酸 激酶 45 1 无 磷酸 甘油 酸 变 位 酶 26 2 无 烯 醇 酶 41 4 无 丙酮 酸 激酶 57 4 无 4 无 乳酸 脱 氢 酶 35 *。 见 文献 [8 ] . C+) 一 一 激活 ! (-) 一 -抑制 。 图 6.1 哺乳 动物 肌肉 糖 酵 解 酶 的 性 质 。 效应 ,并 且 变 构 转变 必定 是 在 单个 亚 基 内 介 导 的 ,就 像 胰 凝 乳 蛋白 酶 原 - 胰 凝 乳 蛋 白 酶 的 转变 一 样 。 显 然 , S 形 特性 并 不 是 © 105 。 AS Hy CN. Dy Pe rill TE TEAS TERRA Fo | 除了 Koshland 和 Monod 的 模式 外 ,也 可 能 用 不 要 求 酶 具有 多 种 与 廉 物 结合 部 位 的 各 种 动力 学 模式 来 解释 S 形 现 RO, 于 是 ， 可 从 这 些 模式 看 出 ， 单 体 酶 也 可 能 显示 其 酶 活性 对 底 物 浓度 的 S 形 依赖 关系 。 鉴 于 各 种 不 同 的 酶 利用 的 控制 机 理 表现 明显 多 样 性 ， 所 以 看 来 完全 有 可 能 调节 酶 已 同 样 演 发 出 一 套 多 种 多 样 的 产生 S 形 曲线 效应 的 机 理 ， 并 且 ， 在 更 详细 地 分 析 了 各 种 酶 的 结构 后 ， 就 可 以 发 现 能 解释 所 有 可 能 的 理论 的 实例 。 在 第 二 章 中 已 指出 ，S 形 反 应 反映 了 酶 活性 对 底 物 或 效 应 物 在 一 特定 的 浓度 范围 的 波动 更 为 敏感 。 然 而 事实 上 在 体 内 唯一 能 证 明 S 形 效 应 的 蛋白 质 就 是 血红 和 蛋白， 因为 在 完整 的 红细胞 中 ， 可 以 很 容易 发 生 伴随 着 氧 合作 用 的 特有 光谱 改 变 。 本 书 重 点 阐述 了 通过 对 纯化 酶 的 详细 分 析 而 显示 出 来 的 酶 控制 机 理 的 多 样 性 ， 以 及 与 确定 这 些 控制 机 理 在 生理 学 上 的 重要 性 有 关 的 实验 性 问题 。 例 如 ， 试 图 和 决定 在 肌肉 细胞 内 实际 上 是 否 发 生 AMP 对 磷酸 化 酶 的 激活 ， 比 研究 哪 一 个 理论 模式 能 最 好 地 冰 明 酶 活性 对 AMP 浓度 的 S 形 依赖 关系 ， 似 乎 更 加 具有 生物 学 上 的 意义 。 然 而 很 多 大 学 的 标 准 “ 生 物化 学 ” 教科书， 强调 了 这 些 理论 模式 ， 实 际 上 排挤 了 其 它 方面 的 酶 调节 作用 。 和 希望 本 书 能 有 助 于 弥补 一 点 这 方 面 的 不 足 。 。 106 。 * TREE FL PLING i, 全. 参考 文 献 [1] Warren, G.G.,Edwards, B. F.P.,Evans, D.R, Wiley, D.C. and Lipscomb, W.N. (1973), Proc. Nat. Acad. Sci., 70, TigT-1121. (2) Johnson, L. N.,Madsen,N.B., Mosley, J. and Wilson, K.S. (1974),J. Mol., Biol.,90, 703-717. | [3 ] Perutz, M. F. (1970),Nature, 228, 726-734; 237, 495-499. (4) Benesch, R. Benesch, R. E. and Bauer,C.(1975)In The Red Blood Cell, (Ed) Surgenor,D., Academic Press, London and New York, pp. 825-839. (5) Koshland,D.E., Nemethy, G.and Filmer, D.(1966), Biochem- istry, 5, 365-385. / (6) Monod, J., Wyman, J. and Changeux, J.P. (1965),J.Mol. Biol., 12, 88-118. C7] Koshland, D..W. (1969), Curr. Top. Cell. Reg., 1,1-27. [8 ] Newsholme, E. A. and Start, C. (1973), Regulation in .Metabolism, Chapter 2, John Wiley and Sons, London. £9) Colowick, S.P. (1973),In The Enzymes (3rd Edtn.)IX, 1-14. (Ed) Boyer, P.D., Academic Press, London. ° 107 。， 斗 院 植物 所 图 书馆 ww 5 二 > Tt 人 L 5 SE Se i + 上 :一 AY Aa 本 ce a 从 和 Jk 单 AS 借 了 Pid Minds et 5 ta aye | 借 出 日 期 st se eccecsstbeccvensereesecereseces er TE vs 本 社 书号 ， 2786-13 科技 新 书目 : 35-.