ISSN 0073 - 9901 MIBUAH GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENAÇÃO DOS INSTITUTOS DE PESQUISA INSTITUTO BUTANTAN SÃO PAULO, SP - BRASIL Instituto Butantan VOLUME 55, NÚMERO 1, 1993 • NESTA EDIÇÃO BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA, V. 4 cm 2 3 4 6 7 17 As "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" têm por finalidade a apresentação de trabalhos originais que contribuam para o progresso nos campos das Ciências Bio¬ lógicas, Médicas e Químicas, elaborados por especialistas nacionais e estrangeiros. São publicadas sob a orientação da Comissão Editorial, sendo que os conceitos emitidos são de inteira responsabilidade dos autores. The "MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN" are the vehicle of comunication for original papers written by national and foreign specialists who contribute to the progress oF Biological, Medicai and Chemical Sciences. They are published under lhe direction of the Editorial Board which assumes no responsability for staternents and opinions advanced by contributors. Diretor do Instituto Butantan Dr. Isaias Raw Comissão Editorial Henrique Moisés Canter — Presidente Ivan Mota — Membros Tetsuo Yamani Maria Nazareth Rabello-Gay Luciana Cezar do C. Leite Renata Lara Paes de Barros — Bibliotecária Indexado/Indexed: Biosis Data Base, Current Contents, Index Medicus. Periodicidade: iriegular Permuta/Excfiange: são feitas entre entidades governamentais, com publicações con¬ gêneres, mediante consulta prévia. Exchanges with similar publications can bo set- tled wilti acadernic and governrnental institutions thiough prior mutual arjreement. Endufoço/Addross. Instituto Butantan Biblioteca. Av. Vital Brasil, 1.500 05503 -- 900 — São Paulo, Sf^ —■ Brasil Telefone/Telephone: (01 1) 813-7222 - R. 2129 - Telex; (011) 83325 BUTA-BR Telelax: (011) 815-1505 1 SciELO Governo do Estado de São Paulo Secretaria de Estado da Saúde Coordenação dos Institutos de Pesquisa Instituto Butantan — São Paulo — SP — Brasil MEMÓRIAS DO INSTITUTO BUTANTAN Volume 55, número 1, 1993 São Paulo, SP — Brasil 1993 1 1 SciELO MEMÓRIAS do INSTITUTO BUTANTAN. (Secretaria de Estado da Saúde) São Paulo, SP — Brasil, 1918 — 1990, 52 (1—3, supl.) Em apenso, a partir de 1990, 52(3): BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA 1991, 53(1, Supl. 1,2) 1992, 54 (1,2) 1993, 55(1, ISSN 0073-9901 MIBUAH CDD 614.07205 Solicita-se permuta/Exchange desired Mem. Inst. Butantan V. 55, n. 1, 1993 SUMÁRIO/CONTENTS The envenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex influence. Efeitos do veneno do escorpião Tityus serrulatus: influência do sexo e da idade. Maria Regina L. SANDOVAL, Valquiria A.C. DORCE . Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae; Crotalinae). Influence of temperatura on digestion in Crotalus durissus terrificus (Serpen¬ tes: Viperidae: Crotalinae). Flavio FRANCINI, Carlos S. GRISOLIA, Nestor O. STANCHI, Fabio O. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxoscetes (Fleinecken & Lo- we) no estado do Paraná (Brasil). Accidents by spiders of the genus Loxosceles (Fleinecken & Lowe) in the Para¬ ná State, Brazil: epidemologic data. Lindioneza A. RIBEIRO, Vera Regina D. von EICKSTEDT, Gisélia B.G. RU- BIO, José F. KNOLSAISEN, Zuhrer HANDAR, Marlene ENTRES, Vera A. Fischer Pires de CAMPOS, Miguel Tanús JORGE. Diagnosis and treatment of acariasis in mice. Diagnóstico e tratamento de acaríase em camundongos. Fernando SOGORB S., Sueli Blanes DAMY, Ana Paula ROCHA DA SIL¬ VA, Ubimara Pereira RODRIGUES, Luziani CHAGURI. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca Ciclo ovariano de serpentes Bothrops Jararaca. Thélia R.F JANEIRO-CINOUINI, Frederico F. LEINZ, Eduardo C. FARIAS 11 19 27 33 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA Otimização do processo de purificação industrial de toxoide tetânico por gel filtração. Improvement in the industrial purification of tetanus toxoid by gel filtration. Sally M.A. PRADO, Mary D.C. VANCETTO, José M, de OLIVEIRA, Fer¬ nando FRATELLI, Sandra de J.D. MATHIAS, Hisako G. HIGASHI ... 3 Esquema de hiperimunização eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico-Crotálico. A more suitable equine hyperimmunization schedule for antivenom Bothrops- -Crotalus plasma production. Celso R CARICATI, Rosalvo GUIDOLIN, Ivone K. YAMAGUSHI, Josefina F. MORAIS, Wilmar DIAS DA SILVA, Hisako G. HIGASHI . 9 BHK cellgrowth on microcarriers in a bioreactor. Crescimento de células BHK em microcarregadores utilizando bioreactores. Ronaldo Z. MENDONÇA, Carlos A. PEREIRA . 13 1 SciELO Mem. Inst. Butantan V. 55, n. 1, p. 5-10, 1993. THE ENVENOMATION BY TITYUS SERRULATUS SCORPION VENOM IN THE RAT: AGE AND SEX INFLUENCE Maria Regina L. SANDOVAL Valquiria A.C. DORCE ABSTRACT: This study was designed in order to investigate possible differ- ences between the LD50 values obtained in adult and new-ablactate male rats and the influence of sex on the development of the lung ede¬ ma induced by Tityus serrulatus scorpion whole venom. The scorpion venom LD50 (by intravenous route) obtained in adult and new-ablactate male rats were similar. Intravenous injection of scorpion whole venom, in both male or female rats, aiso induced a similar lung edema whereas rats ovariectomized and treated with estrogen developed a more severe edema. It is suggested that estrogen treatment may facilitate the lung edema development. KEYWORDS: Scorpion venom, lung edema, LD50 in rats, ovariectomy. INTRODUCTION The scorpion Tityus serrulatus posses a powerfui venom which may cause, in human aduits, a very painfui response with more or less noticeable systemic ef- fects of transient character. Even in these cases there may not exist serious danger of death, uniess the victim is a very tiny child®. Intravenous injection of scorpion whole venom or of scorpion purified toxin (tityustoxin) in rats causes lung edema This effect is due, at least in part, to severe cardiovascular elterations and to the release of catecholamines and kinins, that increase the pulmonary vascular permeability^-’'®. Irregular and deep respi- Laboratório de Farmacologia, Instituto Butantan, Sâo Paulo, Brasil. Research supported by CNPq Correspondence: Dra. M.R.L Sandoval, Serviço de Farmacologia, Instituto Butantan. Av. Vital Brasil, 1.500 — CEP 05503-900, São Paulo, SP-Brasil. Recebido para publicação em 28.01.92 e aceito em 01.12.92. 5 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 5-10, 1993. ration, increase of bronchial secretion and tachypnea are among the more fre- quent symptoms of the poisoning ^ Apnea is one of the more frequent causes of death®. Azevedo et al^ observed that the pulmonary edema induced by tityustoxin (1.0 mg/kg) is more severe in female than in male rats; all rats that died due to the toxin effects were female and showed hemorragic lung edema. The present study was designed: (a) to observe the changes in the lung ede¬ ma caused by scorpion whole venom in male rats and in normal or ovariectomized female rats treated or not with estrogen or progesterone; (b) to determine if young rats are more susceptible to the venom lethal effects. MATERIAL AND METHODS Genetically similar adult Wistar female and male rats (180-250g, 2 or 3 months old) and nevyly-ablactated male rats were used. Upon their arrival in the laborato- ry (5 days before the beginning of the experiments), the rats were grouped, 5 per plastic cage (40x34x17 cm) with free access to food and water. The following substances were used: 17- beta- estradiol (Benzoginoestril- SARSA), progesterone (Depo-Provera — Upjon) and peanut oil. The lyophilized Tityus serrulatus scorpion venom from the Instituto Butantan, São Paulo, Brazil, was stored at -20'’C and dissolved in 0.9% NaCI, in the concentration of 6.0 mg/ml. Solutions used in the experiments were diluted immediately before the injection in the tail vein. 7. Influence of age on the lethallty induced by scorpion whole venom. Venom dose-response curves were constructed for new-ablactate and adult male rats. Different doses of venom were injected intravenousiy to six rats of each group. As control, six adult or new-ablactate rats of each group received NaCI 0.9% (1 ml/kg, i.v). The animais were observed for 24 hr. The number of animais that died was recorded. The method proposed by Litchfield and Wilcoxon^%as used to construct dose-response curves, to determine the dose causing death in 50% of the animais used (LD50) and to test for parallelism between the curves obtained. 2. Influence of sex on the scorpion venom-induced lung edema. Sixty female rats were ovariectomized at 55-60 days of age: rats were anesthe- tized with pentobarbital plus ether; an incision of 1 cm was performed bilaterally in the dorsal region of the animal body, dose to the last rib and the ovaries were removed. Starting twenty-one days after surgery, the rats were divided into three groups that were treated once a day for 5 days with 17-beta-estradiol (0.25 mg/day), progesterone (1.0 mg/day) or peanut oil (0.2 ml/day) subcutaneousiy. In the morning of the 6th day each group was divided at random in two subgroups which received intravenousiy 0.9% NaCI or 0.4 mg/kg of scorpion venom. One group of 10 normal female rats received 0.4 mg/kg of scorpion venom and another group of 11 normal female rats received 0.9% NaCI solution. And finally, one group of 10 male rats received 0.4 mg/kg of scorpion venom and another group of 9 males received 0.9% NaCI solution. Sixty minutes after the injection of scorpion venom or 0.9% NaCI solution (con¬ trol groups), the rats were anesthetized with ether and exsanguinated. The lungs were removed free from the trachea and weighed. The severity of the pulmonary edema was estimated through the lung/body Index which was calculated by mul- 6 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 5-10, 1993. tiplying the lung weight by 100 and dividing the result by the body weight^. The data obtained were subjected to the ANOVA analyses of variance followed by Dun- can's test. Significant differences were considered at the levei of p < 0,05. RESULTS 7. Influence of the age on the lethality induced by scorpion whole venom. The Table 1 shows the LD50 values obtained in the new-ablactate (0,63 mg/kg) and in the aduits (0.56 mg/kg) rats. It was not observed a significant difference between both values. Few seconds after the i.v. administration of different doses of venom, the rats started to show the symptoms of envenomation; excessive lacrimal and salivary secretions, tremors, locomotion difficulty, cyanosis, prolonged periods of apnea, muscular spasms, convulsions, and death. The appearance of symptoms was dose dependent. TABLE 1 Determination of the LD50^ of the scorpion whole venom in new-ablactate or adult male rats (i.v., 24 h observation). Group of rats LD50 (mg/kg) Slope^ LD50 ratio New-ablactates 0.63 (0.48-0.82) 1.42 (1.00-2.02) 1.125 Aduits 0.56 (0.37-0.87) 1.78 (0.86-3.67) 1 — dose causing death in 50% of the rats used. 95% confidence limits in parenthesis. 2 — Slopes of the dose-response curves. 2. Influence of sex on the scorpion venom-induced lung edema. As may be seen in Table 2, scorpion venom (0.4 mg/kg) induced a similar pul- monary edema into normal male and female rats (p > 0.05). The group of ovahec- tomized rats treated with vehicle and injected with scorpion venom did not differ from that of ovariectomized rats treated with vehicle and injected with 0.9% NaCl (p < 0.05). Table 2 aiso shows that the ovariectomized rats treated with progester- one did not present lung edema after the injection of scorpion venom (0.4 mg/kg). However, the administration of the same dose of scorpion venom to estrogen treat¬ ed ovariectomized rats induced pulmonary edema (p < 0.05) that was more in- tense than that observed in male, ovariectomized and normal female rats (p < 0.05, Table 2). Actually, 26.5 per cent of the ovariectomized rats treated with venom (plus vehicle, estrogen or progesterone) died between 10-24 minutes after ven¬ om injection i.e. before the sacrifice time. However, it was not possible to estab- lish a correlatipn between the severity of the lung edema and the period after which death occurred. 7 1 SciELO SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 5-10, 1993. TABLE 2 Lung/body index measured after the i.v. injection of scorpion whole venom (0.4 mg/kg) in normal male and female rats or ovariectomized rats treated during 5 days with vehicle (peanut oil, 0.2 ml/day), estrogen (0.25 mg/day) or progesterone (1.0 mg/day). Experimental conditions Number of rats Lung/body index (mean ± SEM) Normal male rats 0.9% NaCI 09 0.47 ± 0,02 scorpion venom 10 0.64 ± 0.05‘ Normal female rats 0.9% NaCI 11 0.47 ± 0.01 scorpion venom 10 0,61 ± 0.03* Ovariectomized rats vehicle -l- 0.9% NaCI 07 0.56 ± 0.01 vehicle -t- scorpion venom 09 0.61 ± 0.02 estrogen + 0.9% NaCI 09 0.56 ± 0.02 estrogen -i- scorpion venom 13 0.77 ± 0.05*« progesterone + 0.9% NaCI 10 0.55 ± 0.02 progesterone -E scorpion venom 12 0.57 ± 0.02 significantiy different from its respective control group (p < 0.05, ANOVA and Duncan's test). significantiy different from male, ovariectomized and normal female groüps treated with scorpion venom (p < 0.05, ANOVA and Duncan's test). DISCUSSION When inoculated by subcuteneous, intraperitoneal or intravenous route the scor¬ pion venom is rapidly absorved. Thus, the signs and symptoms of the envenom- ation are rapidly Consolidated, However, the concentration needed for obtainning the same effects by the three routes are sensibly different. For this reason the venom LD50 was determined by the intravenous route since a smaller quantity of venom was necessary to cause death. It is known that the venom quantity that the scorpion T. serrulatus can inocu- late in their victims is small. In this way, BucherI ^ reported the extraction of a maximum of 4 mg of venom per escorpion through eíectric shock. It is belived that this is the reason for the benignity the accidents in aduits. As the values of the LD50 obtained in adult male and in new-ablactate rats did not show differ- ences, it seems that the major severity observed of the accidents in children is really induced by the greater quantity of venom inoculated per kilo of weight. AIso relevant are the effects on the animal respiratory apparatus. Thus, it has been reported that injection of scorpion whole venom^iAM tityustoxln^ induced lung edema. The present study showed that the lung edema obtained in normal male and female rats, Injected with T. serrulatus scorpion venom (0.4 mg/kg i. V.) was similar. These data are in opposition to the observations of Azevedo et al The use of a purified toxin, tityustoxin, and/or the estrus cycle phase of the normal females involved in the study could be responsible for this discrepancy. cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex influence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 5-10, 1993. The presence of lung edema induced by scorpion venom was observed after the estrogen replacement in ovariectomized rats. This edema was more intense than the one devoloped by normal or ovariectomized femele and male rats. It has been aiso showm that scorpion venom administration causes an hemodynamic effect characterized by an abrupt and dramatic rise of systemic ar¬ terial pressure (afterload) due to the release of catecholamines with stimulation of alpha adrenergic receptors; this effect plays an important role in the pathogen- esis of acute pulmonary edema®. This acute arterial hypertension would evoke a left ventricular failure and pulmonary edema®. A relative and temporary my- ocardial hypoxia caused by catecholamines released by the venom toxins could aIso play a role in the ventricular failurek2, Another factor contributing to the genesis of the pulmonary edema would be an increase in the blood venous return. This would induce an increase in preload leading to pulmonary congestion®. The effect of estrogens inducing retention of sait and water^® associated with the scorpion venom effect could explain the potentiation of the lung edema ob¬ served in estrogen treated ovariectomized rats. Thus, estrogen induced hydric reten¬ tion could contribute to a ventricular overloading, causing a potentiation of the lung edema. In conclusion, the resuits of the present work show that age does not alter the LD 50 of the scorpion venom in rats but they point to the fact that estrogen can potentiate venom effects, so female rats in estrus phase appear to be more sus- ceptible to the venom. Therefore, it seems worthwhile to proceed the study of the scorpion envenomation of rats in the different phases of the physiological es¬ trus cycle. ACKNOWLEDGEMENTS The authors are indebted to Professora Zuleika P. Picarelli for her comments on the manuscript. This work was supported by grants from CNPq (Conselho Na¬ cional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). RESUMO: Este trabalho teve por objetivo determinar se há diferença entre as DL50 do veneno bruto do escorpião T. serrulatus obtidas em ratos machos adultos e recém-desmamados e se há influência do sexo no desenvolvimento do edema pulmonar induzido pelo mesmo veneno. As DL50 obtidas para ratos machos adultos e recém-desmamados foram similares. A injeção endovenosa do veneno induziu edema pulmonar semelhante em ratos machos e fêmeas normais, enquanto ratas ovariec- tomizadas e tratadas com estrógeno desenvolveram um edema pulmo¬ nar mais intenso. Os dados sugerem que o tratamento com estrógeno pode facilitar o desenvolvimento do edema pulmonar. UNITERMOS; Veneno de escorpião, edema pulmonar, DL50 em ratos, ovariectomia. REFERENCES 1. ALMEIDA, H.O., LIMA, E.G., FREIRE-MAIA, L. Mechanism of the acute pul¬ monary edema induced by intracerebroventricular injection of scorpion tox- in (tityustoxin) in the unanesthetized rat. Toxicon, v. 74, p. 435-440, 1976. 9 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 SANDOVAL, M.R.L., DORCE, V.A.C. The evenomation by Tityus serrulatus scorpion venom in the rat: age and sex jnfluence. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 5-10, 1993. 2. AZEVEDO, A.D., SILVA, A.B., CUNHA-MELO, J.R., FREIRE-MAIA, L. Cardi¬ ovascular and respiratory effects induced by a purified scorpion toxin (tityustoxin) in unanesthetized rats. Toxicon, v. 27, p. 753-759, 1983. 3. BERTKE, E.M., ATKINS, J.H. Effects of Centruroides scuipturatus venom upon rattissue: a histopathologic study. Toxicon, v. 2, p. 205-209, 1964. 4. BUCHERL, W. Escorpionismo no Brasil. Mem. Inst. Butantan, v. 34, p. 9-24, 1969. 5. _ . Venomes of Titynae. In: BETTINI, S., ed. Arthropods venoms. Berlin: Springer — Verlag, 1978. v. 74., p. 371-394. 6. _Classification, biology and venom extraction of scorpions. In: BUCHERL, W., BUCKLEY, E., ed. Venomous animais and their venoms. New York: Academic Press, 1978. v. 3, p. 317-347. 7. FREIRE-MAIA, L., CAMPOS, J.A. On the treatment of the cardiovascular manifestations of scorpion envenomation. Toxicon, v. 25, p. 125-130, 1987. 8. __Patophysiology and treatment of scorpion poisoning. In: OWN- BY, C.L., ODELL, G.V., ed. Natural toxins. Oxford: Pergamon Press, 1989. p. 139-159. 9. FREIRE-MAIA, L., ALMEIDA, H.O., CUNHA-MELO, J.R., AZEVEDO, A.D., BARROSO, J. Mechanism of the pulmonary edema induced by intravenous injection of scorpion toxin in the rat. Agents Action, v. 8, p. 113-118, 1978. 10. GUERON, M., OVSYSHCHER, I. What is the treatment for the cardiovascu¬ lar manifestations of scorpion envenomation? Toxicon, v. 25, p. 121-124, 1987. 11. LITCHFIELD, J.T., WILCOXON, F. A simplified method of evaluating dose- effect experiments. J. 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Para ei lote a 30°C, el tratamiento dei alimento hasta la deposición fue un 51% más rápido que para el iote a 25°C (15 dias contra 24 en valores promedio). A la temperatura más alta la frecuencia con que depusieron los anima- les, fue un 50% mayor que en los de temperatura baja. A menor tem¬ peratura, la tendencia a acumular excretas de diferentes ingestas (episodios alimentarios) en la misma deposición, fue mayor. A 25°C, el 67% de los restos en la deposición correspondieron a una y dos in¬ gestas distintas; el 23% restante acumuló tres, cuatro y cinco ingestas. Por otro lado, a 30°C, el 97% de las deposiciones correspondieron a una y dos ingestas, siendo el 3% restante sólo para tres ingestas. No se hallaron diferencias estadisticamente significativas, en cuanto al efecto de la temperatura sobre la digestión, entre los sexos, peso de los ejem- plares ni a diferentes edades de los mismos. Tampoco se comprobó in¬ cidência de la frecuencia de alimentación que pudiera actuar conjuntamente con la temperatura en la variación de la velocidad de digestión. Se analizó y comparó la aparición de diferentes restos óseos y faneras en las deposiciones en ambos lotes. PALABRAS CLAVE: Crotalus, digestión, temperatura, cautiverio • Laboratorio y Museo de Animales Venenosos de la Facultad de Ciências Médicas de la Universidad Nacional de La Plata. Calles 60 y 120 La Plata (19001 — Argentina. Recebido para publicação em 30.3.92 e aceito em 28.12.92. 11 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan, V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993. INTRODUCCION Numerosos trabajos apuntalan la idea que, de los factores externos que afec- tam el proceso de digestión en animales poiquilotermos, la temperatura ambien¬ te es el que tiene una influencia decisiva sobre el mismo (Para peces''^'''®; anfibios'®'^®; tortugas®; ofidios^® y saurios^^. En el caso de los reptiles, y en particular de los ofidios, la fisiologia digestiva se halla enmarcada en tomas de alimento volumetricamente importantes en rela- ción al peso dei animal y a intervalos irregulares, muchas veces con largos perío¬ dos de ayuno entre ingestas. A éstas sigue una respuesta termofílica de búsqueda de un óptimo de temperatura para la digestión, comportamiento demostrado en tortugas®, lagartos'''®, cocodrilos^ y ofidios®'"'''^'''®'''®'20'2i.22,24,25 La velocidad de digestión aumenta al aumentar la temperatura, posiblemente en correspondência con un aumento de la secreción gástrica2'i'^'26.27 Temperaturas extremas, menores de 5°C y mayores de 35°C, afectan de mo¬ do importante el proceso digestivo y pueden resultar limitantes para la supervi- vencia de los ofidios 2 °' 26 _ máxime cuando se consideran condiciones de cautividad donde la actividad termofilica se ve limitada por las dimensiones dei habitáculo. En nuestro caso se testeó la variación de la duración de la digestión en función de la temperatura dentro dei rango térmico al cual están sometidos dos animales en nuestro laboratorio. Más allá de las conclusiones estrictamente concernientes al aspecto fisiológi¬ co de la relación Temperatura/Velocidad de digestión, es de suma importância para un laboratorio productor de veneno considerar estos parâmetros en función de la disminuíción de factores de stress que pueden afectar la supervivencia de los ofidios sometidos a extracciones periódicas. MATERIAL Y MÉTODO Se trabajó con un stock de 30 ejemplares de Crotalus durissus terrificus de diferentes peso y edad durante un período de cuatro meses. El stock fue dividido en dos lotes de 15 ejemplares cada uno, sometidos a dos temperaturas: "alta” (x 30°C) y "baja" (x 25°C). El biõterio fue mantenido a una humedad ambiente promedio dei 75%, e iluminado con luz natural. Los ofidios fueron alojados en cajas individuales de 50 x 50 x 18 cm, de acríli¬ co transparente, con tapa corrediza de alambre tejido, y con un bebedoro plásti¬ co con agua en forma permanente. El piso de la caja fue cubierto con una cama de viruta de madeira de 3 cm de alto. Con respecto a la alimentación, una vez a la semana se les entregó a los ofi¬ dios ratones vivos (Mus musculus) de 25 gr de peso promedio. Por ingesta se considera todo el volumen de comida consumido en el mismo episodio alimentado. Para poder relacionar la deposición con la ingesta semanal, se ató nacimiento de la cola de los ratones una bolita plástica de 0,5 cm de di⬠metro, de diferente color para cada ingesta. De este modo pudo ser reconocida con facilidad la ingesta a que corresponde la deposición. El tiempo de digestión se consideró como el comprendido entre la alimentación y la aparición dei mar¬ cador en las heces. Durante el período de desarrollo dei presente trabajo no se efectuaron extrac¬ ciones de veneno ni otras actividades que pudieran ejercer un stress adicional a la cautividad. 12 1 SciELO FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHl, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae), Mem. Inst. Butantan, V. 55, n. 1, p, 11-17, 1993. Para el análisis de los datos se emplearon los estadísticos de correlación, error standard y análisis de varianza según Ledesma y Kohan & Carro’^. RESULTADOS A) DURACION DE LA DIGESTION EN FUNCION DE LA TEMPERATURA: el anᬠlisis de la interdependencia entre la temperatura y la duración dei trânsito digesti¬ vo, arrojó una correlación negativa de 0,86 con un error standart de 0,001. Al estudiar el efecto de la temperatura entre los lotes, se observó una diferencia es- tadisticamente significatica ( P 0,05) en el tiempo que media entre la ingesta y la deposición. Para el lote a 25°C, el valor en dias dei trânsito fue de 24,78 como promedio, mientras que para el lote a 30°C, el promedio fue de 15,86 dias (Tabla I). Relacionado con esto, cuando se analizó la frecuencia de las deposiciones en ambos lotes, se observó que, mientras el lote de temperatura baja, habiendo in¬ gerido alimento 143 veces, depuso 62 veces (0,43 deposiciones por ingesta), el lote de temperatura alta, habiendo ingerido 128 veces depuso 108 veces (0,84 deposiciones por ingesta) (Tabla I). Cuando se analizaron los colores de las marcas para estudiar las frecuencias de ingestas diferentes por deposición, para el lote de temperatura baja, el 16,32% de las veces se hallaron bolitas de un solo color (una sola ingesta), el 51% de las veces, bolitas de dos colores (dos ingestas), el 18,3%, tres colores, el 8,1% cuatro colores y el 6,3% cinco colores. Para el lote de temperatura alta, el 63,7% de las veces apareció un solo color de bolitas, el 33,3%, bolitas de dos colores y el 3% para tres colores. No se hallaron en este lote deposiciones con cuatro o cinco colores distintos juntos (Tabla I). Se analizó también la duración de la digestión de cada lote en relación al sexo, peso y edades de los ejemplares, no encontrándose diferencias estadisticamente significativas. B) INFLUENCIA DE LA PERIODICIDAD DE LA ALIMENTACIÓN SOBRE LA DU¬ RACIÓN DE LA DIGESTIÓN: se comparó la duración dei trânsito digestivo bajo condiciones de ingestas periódicas cada siete dias, con la duración de la diges¬ tión por ingestas aisladas (animales alimentados una vez depuesta la ingesta an¬ terior). Para ingestas aisladas el promedio fue de 14,36 dias para el lote de altas temperaturas y 22,8 dias para bajas. Estos valores no difieren estadisticamente de los hallados para los lotes alimentados periodicamente. C) INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA TOMA DE ALIMENTO Y RE- GURGITACION: no se observó diferencia en cuanto a la cantidad de presas acep- tadas por ingesta entre los lotes. Para ambos casos, los animales engulleron el 97% de las presas ofrecidas. A las temperaturas consideradas, no hubo casos de regurgitación. D) PRESENCIA DE RESTOS OSEOS EN LAS DEPOSICIONES: se analizaron ma¬ croscopicamente las deposiciones de los ejemplares pertenecientes a ambos lo¬ tes, no encontrándose diferencia de grado de digestión de los restos óseos hallados. En las heces de cada lote, se encontraron restos óseos en gran canti¬ dad, correspondientes a distintos tipos de huesos, desde cortos (carpo, tarso, vér¬ tebras) hasta largos (femur, tibia peroné, húmero, cúbito, radio, costillas), además de cinturas y fragmentos de craneo con mandidulas enteras con dientes en posi- 13 1 SciELO FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, F.O. Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan, V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993. ción. Los huesos presentaron distintos grados de destrucción, tanto mayor cuan- do más fino el espesor de los mismos, como por ejemplo costilias y huesos dei techo craneal. En las deposiciones de los dos lotes se encontraron, además, fa- neras (pelos y unas) en gran cantidad sin signos aparentes de acción digestiva sobre ellos.' TABELA 1 Cuadro comparativo de la influencia de la temperatura sobre algunos aspectos de la fisiológia digestiva en Crotalus durissus terrificus Duración trânsito intestinal en periodicidac 25°C X = 24,78 dias función de la temperatura bajo alimentaria 30°C X = 15,86 dias Frecuencia deposiciones por inge 25 °C N° ingestas N° deposiciones 143 62 (0,43 depos/ingesta) 'sta en función de la temperatura 30° C N° ingestas N° deposiciones 128 108 (0,84 depos/ingesta) Frecuencia aparición inges 25 °C 16,3% — 1 ingesta 51,0% - 2 " 18,3%> - 3 " 8,1% - 4 " 6,3% ~ 5 " tas distintas por deposición 30° C 63,7% — 1 ingesta 33,3% - 2 " 3,0% - 3 " DISCUSION Se observó que en Crotalus durissus terrificus, la duraclón de la digestión se encuentra en función de la temperatura. El índice de correlación marca que la interdependencia de ambas variables es importante y se presenta en proporción inversa; esto es, cuando aumenta la temperatura disminuye la duración dei trân¬ sito digestivo. Esto fue comprobado también para otras especies de ofidios como Vipera Natrix sp^^’^'^ y para otros grupos de reptiles tales como tortugas®, lagartos''®’’'^ y cocodrilos^. Al analizar el efecto de la temperatura entre los lotes, encontramos que a 30°C la digestión se halla un 56% acelerada con respecto a 25°C, guarismos concor¬ dantes con los referidos por Nailleau para verias especies de Vipera a estas mis- mas temperaturas^®. Con respecto al análisis de las deposiciones, encontramos que a medidad que aumenta la temperatura, la frecuencia con que deponen los animales es mayor. Así, a 25°C se hallaron 0,43 deyecciones por ingesta mientras que a 30°C, las deyecciones por ingesta fueron 0,84, un 51% mayor a las temperaturas altas con respecto a las bajas. Esto se determina por la cantidad de marcas de colores dife¬ rentes, indicadores de restos de ingestas distintas, en la misma deposición. A mayor tiempo de trânsito digestivo, hay una tendencia a acumular restos de ingestas 14 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinae). Mem. Inst. Butantan, V. 55, n. 1, p. 11-17, 1993. diferentes en la misma deposición. A temperatura baja el mayor porcentaje co¬ rresponde a dos ingestas, y con valores no despreciables de cuatro y cinco in- gestas en la misma deyección. Para temperatura alta, la tendencia a acumular restos de ingestas distintas es mucho menor, corroborado por el mayor porcenta¬ je que en este caso corresponde a una sola ingesta, no apareciendo nunca cua¬ tro o cinco en la misma deposición. Comparando estos valores con los bailados por Nailleau2° para varias especies dei género Vipera, se encontró que en Cro¬ talus sp sucede exactamente lo contrario. Mientras que en Crotalus sp la relación entre la frecuencia de las heces con la temperatura está en proporción directa, en Vipera sp se baila en proporción inversa. Cuando se analizó la duración de la digestión en función de la temperatura, se lo estudió tambén bajo el efecto simultâneo de otro factor, a saber, la técnica alimentaria. Para eso, se consideró la influencia de la temperatura bajo condicio¬ nes de ingestas aisladas para neutralizar el efecto que pueda ejercer una nueva presa sobre el proceso digestivo en curso. Bajo esas condiciones, la duración de la digestión para cada lote no difirió significativamente con respecto a condicio¬ nes de alimentación periódica. Esta observación contradice lo expuesto por Tbo- mas & Pougb^s quienes referien que el tiempo de defecación está influenciado por una variedad de factores, siendo la frecuencia de alimentación uno de ellos. En el análisis de la influencia de la temperatura sobre la toma de alimento y regurgitación se observó que a las temperaturas que fueron mantenidos los lotes no se producen alteraciones dei proceso fisiológico. Tampoco revelaron diferencias en el grado de digestión de las presas, tal el anᬠlisis macroscópico de los excrementos. Disminución de la' aceptación de las pre¬ sas y aún la suspención de la alimentación, o el vómito dei alimento, serían frecuentes a temperaturas más bajas (menores de 10°C) y a temperaturas más altas (mayores de 35 °C )^°'26 qyg igg utilizadas en el marco de este trabajo. En un serpentário con finalidad de productión de veneno, es importante estu- diar factores que afecten procesos fisiológicos para disminuir stress e incremen¬ tar la supervivencia de los ejemplares. Conocer la duración de la digestión a distintas temperaturas, nos permite planificar las extracciones de veneno resguar¬ dando a los animales de un pico de stress durante el transcurso de este proceso fisiológico. En trabajos anteriores realizados apuntando a maximizar la produción se estudió el efecto dei ayuno sobre las cantidades de veneno obtenidas, encon- trándose una correlación positiva'*'®. Mediante la regulación de la temperatura a la que se mantienen los animales, ese ayuno además se convierte en un modo de esperar a que el ejemplar se encuentre fuera de actividad digestiva al momen¬ to de ser manipuleado para la extracción. CONCLUSIONES La temperatura influye sobre la duración de la digestión de modo que a 30°C Crotalus durissus terrificus, digiere un 51% más rápido que a 25 °C. Por otro la¬ do se observó que a 30 °C deponen más veces con respecto a la cantidad de ingestas que a 25°C (a 30°C el doble de veces por ingesta que a 25°C). A 25°C bay una tendencia mayor a acumular excretas de ingestas diferentes en las beces que a 30°C. Del análisis de otros factores que podrían actuar concomitantemente con la temperatura, surge que la estratégia alimentaria (ofrecer presas aisladas vs perio¬ dicamente) no tiene influencia sobre la duración dei proceso. Durante un proceso 15 SciELO 10 11 12 13 14 FRANCINI, R, GRISOLIA, C.S., STANCHI, N.O., PELUSO, RO. Influencia de la temperatura sobre la digestion en Crotalus durissus terrificus (Serpentes: Viperidae: Crotalinael. Mem. Inst. Butantan, V. 55, n. 1, p, 11-17, 1993. digestivo en curso la adquisición de nuevo alimento no modifica la velocidad con que tiene lugar el mismo. En el marco dei presente trabajo, dentro dei rango térmico considerado, no ca¬ be esperar casos de regurgitación dei alimento o diferencias en el grado de di- gestión de las presas evidenciado en las deyecciones. El manejo de la temperatura en el serpentário productor de veneno, asociado a la técnica de extracción de la toxina, como es el ayuno prévio sobre los anima- les, permite garantizar una digestión completa antes de la extracción, importante ya que los ejemplares serán sometidos a un agudo pico de stress que puede, de otro modo, alterar el mencionado proceso fisiológico e insidir negativamente so¬ bre la supervivencia de los mismos. ABSTRACT: The duration of digestion under various temperatures (25°C and 30°C) was analyzed in Crotalus durissus terrificus. Treatment of the food until deposition was 51% faster in the sample at 30°C than in the one at 25°C (15 days against 24 in average values). At the highest tem- perature the deposition frequency was 50% higher than at the lowest temperatura The tendency to accumulate the excretes of the various food intake episodes was higher at the lowest temperature, At 25°C, 67% of the residues found in the deposition corresponded to one and two different food intake episodes. The remaining 23% accumulated three, four and five food intake episodes. On the other hand, at 30°C, 97% of the depositions corresponded to one and two food intake epi¬ sodes, the remaining 3% being only for three food intakes, As regards the effect of temperature on digestion, no statistically significant differ- ences were found in relation to sex, weight or age of the animais. The frequency of food intake did not show any effect on the rate digestion in conjunction with temperature. The appearance of various rest of bones, fur and nails was aiso analyzed and compared in the depositions of both samples. KEYWORDS: Crotalus, digestion, temperature, captivity REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. BRADSHAW, S.D., GANS, C., SAINT GIRONS, H. Behavioral thermoregulation in a Pygopodid lizard, Lialis burtonis. Copeia, p. 738-743, 1980. 2. DIEFENBACH, C.O. Gastric function in Caiman crocodilus (Crocodylia: Reptilia) I. Rate of gastric digestion and gastric motility as a function of temperature. Comp. Biochem. Physiol., v. 51A, p. 259-265, 1975. 3. FOX, V.M., MUSACCHIA, X.S. Notes on the pH of the digestive tract of Chrysemys picta. Copeia, p. 337-339, 1959. 4. FRANCINI, F., PELUSO, F.O., GRISOLIA, C.S. Influencia dei ayuno sobre la produc- ción de veneno en Bothrops alternatus (Ophidia: Viperidae: Crotalinael. Mem. Inst. Butantan, v. 53, n. 2, p. 205-210, 1991. 5. GATTEN, R.E. Effect of nutritional status on the prefered body temperature of the turties Pseudemys scripta and Terrapene ornata. Copeia, p. 912-917, 1974. 6. GREENWALD, O.E., KANTER, M.E. 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EPIDEMIOLOGIA DO ACIDENTE POR ARANHAS DO GÊNERO LOXOSCELES Heinecken & Lowe NO ESTADO DO PARANÁ (Brasil) Lindioneza Adriano RIBEIRO* Vera Regina D. von EICKSTEDT»* Gisélia Burigo Guimarães RÚBIO*** José Francisco KONOLSAISEN*** « «■ * Zuhrer HANDAR»*** Marlene ENTRES**** » * « « Vera A. Fischer Pires de CAMPOS***** Miguel Tanús JORGE* RESUMO: O elevado número de acidentes por aranhas do gênero Lo- xosceles que tem sido notificado ao Ministério da Saúde pelo Estado do Paraná (Brasil) motivou este estudo. Foram avaliados os registros do Centro de Epidemiologia do Paraná e do Centro de Informação Toxico- lógica de Curitiba e realizadas inspeções domiciliares em moradias de acidentados. Os 923 casos de picada atribuídos a essas aranhas em 1989 e 1990 corresponderam a 52,7% dos envenenamentos por arac¬ nídeos naquele Estado e a 77,4% dos acidentes loxoscélicos no País nos mesmos anos. Predominaram na região metropolitana de Curitiba (91%), nos meses de outubro a março (73,9%). A aranha picou princi¬ palmente os membros inferiores e superiores (72,7%). Dos pacientes, 64,8% eram do sexo feminino e 75,2% tinham entre 10 e 50 anos de idade. Em 604 casos (84,1%) dentre 718 em que o dado foi obtido, os indivíduos picados chegaram às Unidades de Saúde depois de 12 ho¬ ras do acidente. Tratamento com soro (antiveneno) foi realizado em cerca de um terço dos casos. A letalidade foi de 0,2% (2 óbitos) Loxosceles T intermedia Mello-Leitão e L. laeta (Nicolet) foram as principais espécies coletadas nos locais de acidentes. O loxoscelismo é, portanto, um pro- Trabalho apresentado no IV*^ Pan American Symposioum on Animal, Plant and Microbial Toxins and II Sympo- sium of the Brazilian Society on Toxinology, 1992, Campinas, Sâo Paulo, Brasil. ■ Hospital Vital Brazil. Instituto Butantan — CP 65 — 01059-970 — S3o Paulo — SP — Brasil. ■ * Seçao de Artrópodos Peçonhentos ■" • Centro de Epidemiologia do Paraná Centro de informações Toxicológicas do Paraná .Comissão Permanente de Coordenação e Controle de Acidentes por Animais Peçonhentos, São Paulo. Recebido para publicação em 29.12.92 e aceito em 05.4.93. 19 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe no Estado do Paraná (Brasil), Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p, 19-26, 1993. blema importante de saúde pública, sendo preocupante devido ao alto índice de acidentes e à elevada infestação intradomiciliar dessa aranha. UNITERMOS: Acidentes por aranhas, loxoscelismo, epidemiologia de aci¬ dentes aracnídicos, Loxosceles Heinecken & Lowe. INTRODUÇÃO Dos 4.636 acidentes por aranhas notificados no período 1988-1989 ao Minis¬ tério da Saúde pelas 27 unidades federadas do Brasil, 956 (20,62%) foram atri¬ buídos a aranhas do gênero Loxosceles^. Até recentemente, os dados do Hospital Vital Brazil, (Instituto Butantan), onde foi feito 0 primeiro diagnóstico clínico de loxoscelismo^, e que atende anualmente cerca de 50 casos de acidentes provocados por essas aranhas na região metro¬ politana de São Paulo A 6 ,i 2 _ constituíam a base do conhecimento desse tipo de intoxicação no País. Em 1989, Mello Guimarães et al. ® mencionaram 64 aciden¬ tes loxoscélicos atendidos de janeiro de 1987 a dezembro de 1988 no Hospital de Pronto Socorro Municipal de Porto Alegre; e em 1990 Mello da Silva et al. em um levantamento retrospectivo dos registros do Centro de Informação Toxl- cológica do Rio Grande do Sul (CT/SSMA/RS), referiram 116 casos de loxoscelis¬ mo notificados por este Estado durante 1989. Neste último trabalho é enfatizado que 72,8% dos acidentes tinham ocorrido na área metropolitana de Porto Ale¬ gre. No ano de 1985 um dos autores (VRE) recebeu do Dr, Dalton Luiz Bertoluzzi, para identificação, duas aranhas coletadas na residência de uma menina de 4 anos, que foi a óbito no Hospital São João Batista Ltda., Criciúma, SC, com insu¬ ficiência renal por picada de Loxosceles. As aranhas foram identificadas como L. laeta (Nicolet). Posteriormente, por solicitação do Centro de Informação Toxi- cológlca de Florianópolis e do Hospital Infantil de Lajes, a mesma autora identifi¬ cou outros exemplares capturados em domicílios de pacientes picados em Içara, Criciúma e Florianópolis, como Loxosceles laeta e L. intermedia Mello-Leitão. Em Lajes, aranhas do gênero Loxosceles estão sendo comumente encontradas em casas e apartamentos e têm provocado acidentes humanos freqüentes (Fenilli, R., com. pessoal). No período 1989/90 o Centro de Epidemiologia do Paraná (CEPI) notificou ao Ministério da Saúde 923 casos de loxoscelismo. Devido a esse alto índice de aci¬ dentes e à requisição de grande número de ampolas de soro para o tratamento específico, a Comissão de Coordenação e Controle dos Acidentes por Animais Peçonhentos do Estado de São Paulo solicitou a duas das autoras (LAR e VRE) parecer sobre o assunto e a Secretaria Estadual de Saúde do Paraná e o Instituto Butantan firmaram convênio para analisar o problema. Neste artigo são apresen¬ tados os primeiros resultados desse estudo. MATERIAL E MÉTODO Foram avaliadas as planilhas de notificação de acidentes por aracnídeos, ocorri¬ dos nos anos de 1989 e 1990, encaminhadas ao Ministério da Saúde pelo Centro de Epidemiologia do Paraná. Analisaram-se dados relativos às seguintes va- 20 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 19-26, 1993. riáveis referentes aos aciíjentes loxoscélicos: identificação do aracnídeo; local de ocorrência e distribuição mensal dos acidentes; idade e sexo do paciente; região anatômica picada; intervalo de tempo entre o acidente e o atendimento médico no local que realizou a notificação; tratamento instituído e evolução clínica do ca¬ so. Foram identificadas aranhas apresentadas pelos pacientes como causadoras dos acidentes ou semelhantes a elas, que se encontravam depositadas no Centro de Epidemiologia do Paraná e no Centro de Informação Toxicológica. Foram tam¬ bém analisadas amostras de exemplares capturadas pelos autores em inspeções domiciliares em Curitiba. Os locais de ocorrência de acidentes foram assinalados em um mapa da região. RESULTADOS Os 923 casos de loxoscelismo notificados ao Ministério da Saúde pelo Paraná nos anos de 1989 e 1990 corresponderam a 52,7% dos acidentes provocados por aracnídeos, no mesmo período de tempo, naquele Estado (Tabela 1) e predomina¬ ram (73,9%) nos meses de outubro a março (Fig. 1). Quinhentos e noventa e oito pacientes (64,8%) eram do sexo feminino e a maioria (75,2%) tinha entre 10 e 50 anos de idade (Tabela 2). A maioria das picadas se deu nos membros inferiores (42,9%) e superiores (29,8%) não tendo sido freqüentes nos pés/tornozelos e nas mãos (Tabela 3), co¬ mo costuma ocorrer nos acidentes por outras aranhas. Em 604 casos (65,4%), os picados chegaram às Unidades de Saúde depois de 12 horas do acidente (Tabela 4). Quanto ao tratamento, foi possível obter informação em 732 (79,3%) casos. Em 342 (46,6%) foi utilizada soroterapia específica (SAA ou SAL), os demais fo¬ ram tratados com corticosteróides (29,7%) ou apenas com medicamentos sinto¬ máticos (18,8%). Foram administradas 1794 ampolas de antiveneno nos pacientes (média de 5,2 ampolas por paciente). A letalidade foi de 0,2% (2 óbitos). Q mapeamento dos locais de ocorrência dos acidentes demonstrou que no pe¬ ríodo analisado eles predominaram (91,0%) na região metropolitana de Curitiba (83% na Capital e 8% nas cidades vizinhas) e que o loxoscelismo está dissemina¬ do em todas as zonas urbanas da Capital. A identificação das aranhas indicou que a espécie predominante é L. intermedia Mello-Leitão e que L. iaeta (Nicolet), tam¬ bém encontrada nos domicílios e áreas peridomiciliares, tem distribuição restrita. TABELA 1 Distribuição dos acidentes segundo o aracnídeo causador (Paraná, 1989 e 1990). Aracnídeo número % Aranhas Loxosceles spp. 923 52,7 Phoneutria spp. 318 18,1 Lycosa spp. 73 4,2 Caranguejeira '30 1,7 Escorpiões 85 4,8 Não identificados 298 17,0 Qutros 26 1,5 Total 1753 100,0 21 RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 19-26, 1993. Número de caeos 120 100 Ê 20 J F M A M 1989 ■ 28 29 32 24 20 N 11 6 8 27 43 68 46 1990^ 68 72 60 48 23 25 17 12 24 70 112 50 MESES Fig. 1: Distribuição mensal dos acidentes loxoscélicos no Paraná TABELA 2 Distribuição dos acidentes por Loxosceles spp. segundo a idade dos pacientes (Paraná, 1989 e 1990). Idade Número % Número médio de casos/ano idade 0-5 50 5,4 10,0 5-10 39 4,2 7,8 10 — 20 102 11,1 10,2 20 - 30 257 27,8 25,7 30 - 40 210 22,8 21,0 40 - 50 125 13,5 12,5 50 - 60 76 8,2 7,6 60 e -F 44 4,8 — Sem informação 20 2,2 — Total 923 100,0 22 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.l, p. 19-26, 1993. TABELA 3 Distribuição dos acidentes provocados por Loxosceles segundo a região anatômica picada (Paraná, 1989 e 1990). Região anatômica Número % Membros inferiores Pé/Tornozelo 57 6,2 Perna 217 23,5 Joelho/Coxa 107 11,6 Não especificado 15 1,6 Subtotal 396 42,9 Membros superiores Mão 41 4,5 Antebraço 14 1,5 Cotovelo/Braço 180 19,5 Não especificado 13 1,4 Subtotal 248 26,9 Tronco 113 12,3 Pescoço 16 1,7 Cabeça 74 8,0 Não especificada 76 8,2 Total 923 100,0 TABELA 4 Distribuição dos acidentes por Loxosceles spp . segundo o intervalo de tempo entre a picada e o atendimento médico (Paraná, 1989 e 1990). Intervalo Número % % acumulada (horas) 1 - 3 39 4,2 4,2 3-6 24 2,6 6,8 6-12 51 5,5 12,3 12-24 142 15,4 27,7 24 - 48 192 20,8 48,5 48 e -E 270 29,3 77,8 Não informado 205 22,2 100,0 Total 923 100,0 23 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n.1, p. 19-26, 1993. DISCUSSÃO A situação encontrada no Paraná, conforme dados do presente trabalho, dife¬ re da que é considerada peculiar ao loxoscelismo nas diversas partes do mundo, ou seja, ocorrência de um baixo índice de acidentes mesmo em áreas com gran¬ de densidade de aranhas^. O Paraná é o estado brasileiro que notifica o maior número de acidentes loxoscélicos e esse número vem crescendo progressivamente. No período 1988-1989 foram 595 casos, que corresponderam a 62,2% das noti¬ ficações de acidentes por Loxosceles spp. e em 1989 e 1990 o total de casos chegou a 923, perfazendo 77,4% dos acidentes no País^. Os dados atualmente disponíveis demonstram uma nítida regionalização do loxoscelismo. Ele se con¬ centra na região sul do Brasil e no Paraná constitui a forma mais importante de araneísmo, ao contrário de São Paulo, onde menos de 10% dos acidentes araneí- dicos são atribuídos a espécies de Loxosceles^'^. A prevalência dos acidentes na região metropolitana de Curitiba, a ampla disseminação da aranha e o fato de a infestação ser predominantemente intradomiciliar, como ficou evidenciado, exi¬ gem a adoção de medidas preventivas de acidentes e de controle das aranhas. E necessário diminuir os criadouros e inviabilizar a propagação dessas aranhas para outras áreas urbanizadas, do Brasil e de países limítrofes ou não, como tem ocorrido com espécies de algumas regiões do mundo. ^ também necessᬠria uma avaliação dos fatores ambientais que estão favorecendo a infestação e de aspectos biológicos da espécie L. intermedia que, conforme foi verificado, é a predominante. A distribuição mensal dos acidentes, com maior incidência nos períodos mais quentes do ano, é semelhante ao que ocorre no Estado de São Paulo®. A picada de aranhas do gênero Loxosce/es tende a ocorrer principalmente em pessoas do sexo, feminino,®, o que se deve, provavelmente, à frequência maior de acidentes nos domicílios®^'’'^®. A percentagem de picadas envolvendo pessoas desse sexo, segundo dados do presente estudo, foi ainda maior do que a relatada por outros autores®'’'*'’'®. A maioria das picadas se deu nas regiões proximais dos membros inferiores e superiores e no tronco. Diferentemente dos acidentes por Phoneutria, Lycosa ou escorpião em que predominam picadas nas mãos e pés®, as provocadas por Loxosceles são mais comuns nos braços e nas pernas®'®. A maioria dos pacientes procurou os serviços médicos que notificaram o aci¬ dente seis ou mais horas após, o que está de acordo com a literatura. Esta provi¬ dência costuma ser tardia porque, ao contrário do que ocorre com os acidentados por Phoneutria^ e Lycosa''^, a picada por Loxosceles muitas vezes não é percebi¬ da, a dor tende a iniciar-se tardiamente e a suspeita de se tratar de acidente arac- nídico pode não acontecer. Menos de 30% dos pacientes avaliados receberam soro antiaracnídico ou an- tiloxoscélico. Isto se deve, provavelmente, à conduta de não se administrar o soro em casos de atendimento tardio, recomendada pelo Centro de Informação Toxi- cológica do Paraná. A frequência com que os acidentes ocorrem no Estado do Paraná mostra a necessidade de conhecimento mais aprofundado da distribuição das espécies de Loxosceles na região, das espécies predominantes e da epidemiologia do acidente. AGRADECIMENTO Os autores agradecem o apoio do Programa Nacional de Controle de Aciden¬ tes por Animais Peçonhentos do Ministério da Saúde (Dr. Francisco Anilton Alves Araújo — Gerente-Técnico) 24 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 RIBEIRO, L.A. et al. Epidemiologia do acidente por aranhas do gênero Loxosceles Heinecken & Lowe no Estado do Paraná (Brasil). Mem. Inst. Butantan, v. 55, n,1, p. 19-26, 1993. ABSTRACT: The high number of Loxosceles bites in the State of Paraná, notified to the Ministry of Health in 1989, warrants this study. A total of 923 cases was registered in the Centro de Epidemiologia do Paraná and this number corresponded to 52.7% of the arachnidic accidents reported to the Center. Loxosceles bites were predominant in the me- tropolitan region of Curitiba (83% occurred in the capital and 8% in neighboring towns). The highest incidence was from October to March (73.9%). Most of the victims (64.8%) were females and 75.2% were between 10 and 50 years old. Spider bites were most common on the lower (42.9%) and upper (29.8%) extremities but bites on the foot/ankie and the hand were unusual (6.2% and 5.3%, respectively). More than 60% of the victims arrived at the Health Unit 12 hr after the bite. Treat- ment with specific serum was carried out in approximately one third of the patients. The lethality was 0,2% (two deaths). Identification of spi- ders at the moment of the bite or shortiy thereafter showed that Loxos¬ celes Intermedia Mello-Leitão and the cosmopolitan Loxosceles laeta (Nicolet) were the main species involved. KEYWORDS: Necrotic arachnidism, epidemiology of arachnidism, Lo¬ xosceles Heinecken & Lowe. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ALBUQUERQUE, M.J,, PIRES DE CAMPQS, V.F., RIBEIRQ, L.A., TAKAQ- KA, N.Y. Epidemiological and clinicai aspects of accidents due to spiders in São Paulo State, Brazii, in 1988. Toxicon, v. 28, p. 599, 1990. 2. ARAÚJQ, F.A.A., RESENDE, C.C. Araneísmo: análise epidemiológica. Mi¬ nistério da Saúde, Fundação Nacional da Saúde, Coordenação de Con¬ trole de Zoonoses e Animais Peçonhentos, 1991. 3. CARDQSQ, J.L.C., DE CILLQ, D.M. Primeiro diagnóstico de Loxoscelismo na casuística do Hospital Vital Brazii (HVB). Mem. Inst. Butantan, v. 52, p. 81, 1990. 4. CARDQSQ, J.L.C., FRANCA, F.Q.S., EICKSTEDT, V.R.D., BQRGES, I., NQ- GUEIRA, M.T. 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Sueli Blanes DAMY Ana Paula ROCHA DA SILVA Ubimara Pereira RODRIGUES Luziani CHAGURI ABSTRACTS: The efficacy and possible toxic effects of the five acarici- des were analysed in their control of Myobia musculi and Myocoptes musculinus, in mice colony with a 50% incidence of these parasited. The result suggest that the control can be obtained by treatment with dichiorvos at 0,007%, malathion at 2% and monossulfiram at 12,5%, with 5 immersion baths at intervala of 7 days. KEYWORDS: Dichiorvos, malathion, monossulfiram INTRODUCTION Myobia musculi and Myocoptes musculinus, arachnids of the subclass Acari, parasites of mice pertaining to the suborders Prostigmata and Astigmata respec- tively, are with frequency found in conventional colonies^'®. The pathological effects caused by these ectoparasites vary with strain, sex, age, and individual differences in sensibility, as well as with the type of mating used. Slight infestations in general are not apparent and the severe ones may cause traumatic dermatitis, alopecia, itching and increase of the mitotic activity of the dermal epithelium'’. Myocoptes musculinus affect the region of the cheek, basis of the tail, inguinal and between the auricular pinna, and may disperse over the whole back. They provoke a graying of the pelage, with a progressiva increase of the affected area, ioss of weight, emaciation, cachexia and eventually death. AH the life cycle oc- curs within the pelage and demands 14 days to complete, feeding on the dermal tissue®. From the Instituto Butantan, Biotério Central, Av. Vital Brasil, 1500, CEP 05503-900, São Paulo, Brazil. Recebido para publicação em 09.11,92 e aceito em 12.4.93 27 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 SOGORB S., F., DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.P., RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L. Diagnosis and treatment ot acariasis in mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993 The Myobia musculi are localized in the cervix, shoulder and forelegs. They create a type of itch that is considered the most specific of mice^®. All stages of the life cicie occur in the pelage, requering 23 days to complete, feeding on extracellular fluid'®'''®'''®'^® In the control of these agents, different compounds were used, specially or- ganophosphorized anticholinesterasics. The characteristic pharmacological effects of the anticholinesterasics primarily are due to the inhibition of inactivation of the acetylcholinesterasis in the centers of cholinergic transmission, occuring, in con- sequence, accumulation and supervening the actions of the endogenous acetyl- choline released as by nervous cholinergic impulses, as, in less quantity, by continuous extravation during the resting phase^^-^®. These compounds are in general liquids highly soluble in lipids, undergoing rapid absorption by nearly all ducts, inclusive the digestive tube, as \A/ell, as through the skin and the mucous membranes, after the contact with the liquid form, and through the lung after inhalation of the vapors or dust and aerosol ”'''T 2 o Elimination occurs through the urine in form of metabolic degradation products. Between the time of absorption and elimination there are variable periods during which the original compound or its metabolics continue combined with plasm and tissue proteins intervening in their metabolism hydrolytic as well as oxidative enzymes”'''3'2°. Among these anticholinesterasic organophosphorate compounds the follow- ing were used in the control of these acaridiasis: lindano [1,2,3,4,5,6 hexachlorocy- clohexane], an organochiorate that presents as characteristics a rapid distribution through the organism after absorption, concentrating itself in the adipose tissues, specially in the brain and liver'^. Diazinon [0,0 dietil 0-(2-isopropil-4 methil- 6-pirimidyl)], proportion of SULFOTEPP, that by an oxidation process, during as improper storage, produces TEPP, a compound endowed with a high toxicity^®. Malathion [0,0-dimethyl S-(ethyl 1,2-dicarboetoxi)], dithiophosphorate, shows aiso toxic impurities for several species of mammals, including man, rat and mouse. These are formed by exposition of the product to ultraviolet light or by storage at temperaturas more than 40°C. The more common impurity 0,0,S- TMP, ap- plied experimentally in mice, decreased the humoral and cell mediated immune responses. However, studies performed using concentrations of 2% and 8%, showed that the immune system of Balb/c mice, 8 weeks of age, did not change'®. It is stili observed, that Malathion is less toxic to mammals and birds than to insects, because in the superior animais its biotransformation into active Products is quicker^F Variability of reaction to a determined drug by animais of different species may be due, at least partiatly, to variations in the capacity of biotransformation. There may be differences in the degradation velocity, what brings on variations in the effect intensity, leading to a quantitatively different answer”. Dichiorvos (DDVPI [0,0-dimethyl-2,2- dichlorovinilphosphate], chlo- rophosphorate, have a pharmacological action similar to that a malathion. Toxico- logic studies using 500 mg of the product each kg of ration, suppiied "ad libitum" to mice, showed that the serie cholinesterasis levei of the animais was half the value lound in the not treated Controls, remaining low for several days^'2°. Compounds based on sulphur, as tetraethyltiuram monosulphuric acid (monosulfiram), are constituted by fine christals, containing about 36% of sul¬ phur in an organic combination, insoluble in water, however quite soluble In alco- hol and some oils, devoid of serious collateral effects\ have a keratolytic actions that constitutes the basis of its therapeutic property. In order to exert a germicidal action, it must be converted into pentatonic acid. Presumably the oxidation of sul- 28 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 SOGORB S„ R, DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.P., RODRIGUES, U.R, CHAGURI, L. Diagnosis and treatment of acariasis In mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993 phur to pentatonic acid is accompanied by microorganisms and epidermal cells when appiied over the skin’^. Therefore, considering that parasitism of the laboratory mice by M.musculinus and M.musculi, although not representing risk to the handiing individuais^, in- terfers in the reproductive process and in more extended experiments, the infesta- tions may become more intense, weakening the animais and modify potencially the resuits’®, there may occur secondary infections by microorganisms'’, besides being considered vectors of Philalitomosoides carini and of several riquetsias, the present paper had as its objective to test the efficacy of different acaricides in the control of these agents. MATERIAL AND METHODS Mice of the "swiss" variety were used, maintained in popypropylene cages with pine wood shavings, changed twice a week. All material used was sterilized by humild heat^. The animais were maintained in an acciimatized room, with a temperature of 22°C and a light/darkness cycle of '12 hours. Water and the balanced ration in form of pellets were suppiied "ad libitum”. For the ectoparasite research, the mice were sacrificed by cervical desloca- tion, placed on Petri dishes with a black paper basis, placed in an ice box for half an hour, and then exposed to a heat source, represented by an eletric light source. After a few minutes, the parasites that left the body, could be seen with the naked eye on the black paper or at the top of the hair, when examined with an entomo- logic magnifying glass (Wild - Heerbrugg M5) with a minimum of 60 augmen- tations. The following acaricides were used, diluted in water. Lindano at 2% (1*), di- azinon at 0,06% (2*), malathion at 2% (3*), dichiorvos at 0,007%’ (4*) and monosulfiram at 12,5% (5*) described in the introduction. The baths were prepared in the dilutions indicated in the introduction, and the mice were held with pincers, were totally submerged in the liquid. The intervals between baths were of 7 days, repeated for three times. The ration was removed and replaced six hours later, the drinking water through was maintained. Trademark: Rodane EC20 Diazinon Malatol 100E Nuvan 1000CE Tetmosol Rhodia - Merieu Ciba-Geigy Cyanamid Ciba-Geigy Welcome-ICI RESULTS The resuits of the 5 acaricides are represented in Table 1. The mice treated with lindano and diazinon died a few hours after the bath with the first product and up to the 5th day after the bath with Diazinon. After the resuits of Tabela 1, 3 groups were formed each with 200 couples of mice in reproduction age, and each group submitted to the treatments with the quimical products approved in the first test, and the animais were observed for 6 months (Table 2). 29 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 SOGORB S,, R, DAMY, S.B„ ROCHA DA SILVA, A.R, RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L. Diagnosis and treatment of acariasis in mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993 During the whole period of observation, 20 mice for month with 3 weeks of age were examined for the ectoparasite research, originating from each group treated with the different products. The animais were sacrificed and observed under the entomologic magnifying glass, as described under Material and Methods, no presence of ectoparasites was verified for 6 months and for more than one year no more tipical lesions appeared. TABLE 1 Activity of lindano, diazinon, malathion, dichiorvos (DDVP) and monosulfiram as acaricides in mice, examined after 3 baths, with intervals of 7 days. PRODUCT Aquous dilution No. of animais Persistency of the parasite % survival Lindano 2,000 60 0 Diazinon 0,060 60 0 Malathion 2,000 60 0/60 100 Dichiorvos 0,007 60 0/60 100 Monosulfiram 12,50 60 0/60 100 Control 60 31/60* 30/60** * parasitims by M. musculinus (52,8%) ** parasitism by M. musculi (50%) TABLE 2 Persistency of the parasitism by M.musculinus and M.musculi after the treatment with dichiorvos, malathion and monosulfiram in 200 couples of adult mice submitted to 3 baths a 7 days interval. MONTHS PRODUCT Aquous dilution 1 ° 2° 3° 4° 5“ 6° Dichiorvos 0,007% 0 0 28 16 0 0 Malathion 2,000% 0 0 0 0 0 0 Monosulfiram 12,50% 0 0 0 0 0 0 DISCUSSION The colonies of mice may contain M. musculi and M.musculinus without clini¬ cai manifestation, due to genetic factors that regulate the equilibrium of the acar- idal populations since different mouse strains show variable sensitivityT^. In the parasited animais, the hairs become opaque by functional disturbancy of the sebaceous glands. As a result of the pruritus, occur epithelial erosions through functional disturbance of sebaceous glands. 30 SOGORB S., R, DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.P., RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L Diagnosis and treatment of acariasis In mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993 Our resuits showed that the products lindano and diazinon, with the used dilu- tions, were lethal for the mice. With the first, the bathed animais died a few hours after the treatment, and with the second lot, deaths occured up to the 5th subse¬ quente day. The animais treated with dichiorvos showed a recurrence of 7% from the 3rd month on after the treatment, only the males with characteristic lesions and presence of M. musculi ln the sacrificed animais. These resuits are in accordance with the literature as for the sensibility difference betwéen sexes and the necessi- ty of a repetition of the treatment^^ The use of dichiorvos in different forms of treatment^^T^^z presented satisfac- tory resuits in the control of acarids and the treatment did not affect the size and the frequency of the hatch, as for the gestation period^. Studies done with the use of malathion in different concentration showed satis- factory resuits in the control of the mange mites, and no colateral effects and alterations of the immune System of mice^'®'’’^, and agree with the resuits ob- served in Tables 1 and 2. Monosulfiram in the indicated dilution eliminated the mites and did not cause any recurrence during the whole observation period. By owning a keratolyte, acarid and germicide action, being devoid of colateral effects^'’^ it may be selected as an inocous and efficaclous product for treatment of acaridiasis. CONCLUSIONS The ectoparasites M. musculi and M. musculinus can be controlled in mouse colonies by treatments with dichiorvos at 0,007%, malathion at 2% and monosul¬ firam at 12,5% by five immersions baths at 7 days interval. ACKNOWLEDGEMENTS Our thanks to Ms. Sibilly Heller for the translation. RESUMO: Foram analisados a eficácia e os possíveis efeitos tóxicos de 5 acaricidas, no controle de Myobia musculi e Myocoptes musculinus, em colônia de camundongos com 50% de incidência destes ectoparasi- tas. Os resultados sugerem que o controle pode ser obtido pelo tratamen¬ to com dichiorvos a 0,007%, malathion a 2% e monossulfiram a 12,5%, com 5 banhos de imersão, em intervalos de 7 dias. UNITERMOS: Dichiorvos, malathion, monossulfiram REFERENCES 1. BELDA, W. Tratamento pelo monosulfiram: nova solução para problema de escabiose. Rev. Bras. Clin. Ter., v. 8, n. 4, p. 309-312, 1965. 2. CASEBOLT, S.B. et al. Effect of dichiorvos treatment on mouse reproduc- tion. Lab. An. Sei., v. 40, n. 1, p. 65-67, 1990. 3 CONSTANTIN, M, L. Effects of insecticides on acariasis in mice. Lab. An, V. 6, p. 279-286, 1972, 4. CSIZA, C. K., MACMARTIN, D. N. Technical notes. Apparent acaridal der- matitis in C57BL/6 Nya mouse colony. Lab. An. Sei, v. 26, n. 5, p. 781-787, 1976. 31 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 SOGORB S., R, DAMY, S.B., ROCHA DA SILVA, A.R, RODRIGUES, U.P., CHAGURI, L. Diagnosis and treatment of acariasis in mice. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 27-32, 1993 5. DAMY, S. B. et al. Esterilização de materiais de biotério pelo calor úmido. Mem. Inst. Butantan, v. 52, n. 1, p. 5-10, 1990. 6. DAVIS, R. 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JANEIRO-CINQUINI* Frederico Fontoura LEINZ* Eduardo Cunha FARIAS** ABSTRACT: The reproductive cycle of Bothrops jararaca was studied through the observation of the ovarian foilicles and eggs of 111 snakes during the period of one year. Vitellogenesis was observed during Au- tumn and Winter, and ovulation probably occurred at the beginning of Spring. Pregnancy was verified from November to March. The smallest gravid female measured 76,0 cm in snout-vent length. KEYWORDS: Serpente, reprodução, ciclo ovariano. INTRODUCTION The knowledge of reproductive cycles of tropical and sub-tropical snakes is scarce, specially when compared to that of snakes from temperate regions (Shine”'’^; Kofron^). Murphy and Mitchel^ observed the reproduction of several species of the ge- nus Bothrops in captivity, and Solórzano and Cerdas’'’ described the reproduc¬ tive activity of several crotaline species in nature. According to Fitch"^, the reproductive cycle involves coordinated modifications of the morphology, physiology and behavior of the species. In the female, the main morphological changes occur within the ovaries and oviducts, where the foilicles ripen and synthesize vitellus up to the eventual ovulation. Considering the existence of only a few data on the reproductive biology of Bothrops jararaca (Sazima^), our aim is the characterization of the ovarian cycle of this species, through the observation of the growth and ripening of the ovarian foilicles and eggs. ■Laboratório de Herpetologia, Instituto Butantan. Av. Vital Brasil, 1500 - CEP 05503-900 - S. Paulo, SP - Brasil ••Departamento de Histologia e Embriologia, ICB-USP Recebido para publicação em 08.12.92 e aceito em 04.5.93. 33 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 JANEIRO-CINQUINI, T.R.F., LEINZ, F.F., FARIAS, E.C. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 33-36, 1993. MATERIAL AND METHODS Ovariesand oviductsof 111 adultfemale Bothrops jararaca írom the South and Southeast regions of Brazil were examined in the "Seção de Venenos" of the In¬ stituto Butantan during the period of one year. The female reproductive systenn was dissected and the ovarian foilicles and eggs measured with a caliper ruie "in situ". The means of the ovarian foilicle diameters were assembled into four groups: Class l-smaller than 0.5 cm in diameter; Class, II — 0.6 to 1.0 cm; Class III — 1.1 to 2.0 cm; Class IV — 2.1 to 3.0 cm. The eggs were classified only by the mean of the diameters. The presence or absence of sperm in the reproductive system of the females was determined by microscopy of the luminal content of the oviduct. RESULTS The seasonal variation of the diameters of the ovarian foilicles and eggs of the snakes Bothrops jararaca is shown in Fig. 1. Ovarian foilicles of Class I dont were founded in some exemplaries during April, July and August, but foilicles of Classes II were observed during the whole year. Ovarian foilicles of the Classes III and IV occurred during the period from April to September. They were at the stage of vitellogenesis and their maximum di¬ ameter was 3.0 cm. The presence of eggs was vehfied at the end of Spring and Summer. Of a total of 111 examined females, 45 were gravid: 18 in Springtime and 27 in Summer, in different stages of embryogenesis. The smallest gravid female measured 76.0 cm in snout-vent length. DISCUSSION The lack of data on the reproductive cycle of snakes from the tropical and sub¬ tropical regions, where the seasons are not well defined, induced many research- ers to believe in a nonexistence of a reproductive synchronism for these reptiles (Seigel and Ford'°). However, in our experience of monthly observation of ovaries and oviducts of 111 female Bothrops jararaca during one year, we verified the ex- istence of a well-defined reproductive cycle in this species. In snakes of temperate regions, foilicular growth starts at the end of Summer, is interrupted during hibernation, and returns to grow at an accelerated rate in Spring (Aldridge’; Licht^). In Bothrops jararaca, foilicles of Classes III and IV were found in Autumn and Winter, suggesting a continuous growth aiso in these seasons. In the northern hemisphere, the different phases of the reproductive cycle of most of the snakes are well defined. Ovulation and fertilization occur at the end of Spring, and births happen at the end of Summer and beginning of Autumn (Seigel and Ford'°). In the species under study, the ovulation probably occurs in the Spring, since, after this time, no mature foilicles are found within the ovary, whereas eggs are found in the oviduct. Studies of Thamnophis sirtalis parietaUs (Bona-Galo and Licht^; Licht^) sug- gested that the mating could be a stimulus to vitellogenesis and ovulation. In the specimens of Bothrops jararaca that presented Class III and Class IV foilicles, mobil spermatozoids were detected in the oviduct which was not the case in specimens with eggs and foilicles of Classes I and II. 34 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 JANEIRO-CINQUINI, T.R.F., LEINZ, F.F., FARIAS, E.C. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 33-36, 1993. IV o MONTHS Fig. 1: Seasonal change in foilicle diameter of B. Jararaca during 1985. The females of snakes from tropical regions are in an advanced State of preg- nancy in the hotter and more humid seasons of the year, the birth of youngs aiso occurring at this time. In the species under study, the presence of eggs with em- bryos at different stages of development was aIso detected in the hot and humid months. According to Shine'' and Vinegar''*, the more constant temperature of this period guarantee a normal development of the embryos. CONCLUSION 1 — In Bothrops jararaca, the reproductive period is seasonal, occurring only once per year; eggs and embryos are only observed during the hot and humid periods of the year. 35 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 JANEIRO-CINQUINI, T.R.F., LEINZ, F.F., FARIAS, E.C. Ovarian cycle of the snake Bothrops jararaca. Mem. Inst. Butantan, v. 55, n. 1, p. 33-36, 1993. RESUMO: O ciclo reprodutivo de Bothrops jararaca foi estudado através da observação dos folículos ovarianos e ovos de 111 serpentes durante o período de um ano. A vitelogênese foi observada durante o outono e inverno, ocorrendo a ovulação provavelmente no início da primavera. A prenhez foi constatada de novembro até março. A menor fêmea prenhe media 76,0 cm de comprimento rostro-anal. UNITERMOS: Serpente, reprodução, ciclo ovariano. REFERENCES 1. ALDRIDGE, R.D. 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HIGASHI. 3 Esquema de hiperimunização eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico- -Crotálico. A more suitable equine hyperimmunization schedule for antivenom Bothrops-Crotalus plasma production. Celso P CARICATI, Rosalvo GUIDOLIN, Ivone K. YAMAGUSHI, Josefina F. MORAIS, Wilmar DIAS DA SILVA, Hisako G. HIGASHI. 9 BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor. Crescimento de células BHK em microcarregadores utilizando bioreactores. Ronaldo Z. MENDONÇA, Carlos A. PEREIRA. 13 Boi. BiotecnoL, v. 4, p. 1-16, 1993. cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 Boi. Biotecnol. V. 4, p. 3-8, 1993 OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO INDUSTRIAL DÉ TOXÓIDE TETÂNICO POR GEL FILTRAÇÃO Sally Müller Affonso PRADO * Mary Dalva Caparroz VANCETTO * José Marcos de OLIVEIRA * Fernando FRATELLI * Sandra de Jesus Delgado MATHIAS * Hisako Gondo HIGASHI ** RESUMO: A metodologia industrial para obtenção de Toxóide Tetânico (T.T.) atual, consiste na pré-precipitação pelo (NH 4)2 SO 4 seguida de gel filtração em Sephadex G-50, com a qual obtém-se grau médio de pureza de 2.300 Lf/mgNP, sendo que o mínimo exigido pela O.M.S. é 1.000 Lf/mgNP. Visando basicamente a diminuição do tempo emprega¬ do no processo de purificação do T.T., utilizamos resinas cromatográfi- cas de 2“ e 3“ geração, 0 Sephacryl S-100HR e 0 Superdex 75 prep grade, respectivamente, que possibilitaram a eliminação da etapa de pré- -precipitaçâo pelo (NH 4)2 SO 4 obtendo-se resultados com grau de pu¬ reza ao redor de 3.000Lf/mgNR A atividade imunogênica destes produtos quando adsorvidos pelo Al (OHIg em concentração de 15Lf/ml foi de 4,5UI/ml em cobaios. A O.M.S. recomenda que 0 T.T. induza a forma¬ ção de no mínimo 2UI/ml nestes animais. O rendimento do processo de purificação foi de 88,46%, que é similar ao obtido no processo atual. A metodologia introduzida permitiu a diminuição do tempo empregado neste processamento assim como a possibilidade de trabalhar-se com purificação em sistema fechado (coluna cromatográfica). UNITERMOS: Purificação, toxina, toxóide tetânico, gel filtração, Sephacryl S-100HR, Superdex 75 prep grade. INTRODUÇÃO Vários métodos para purificação de toxina e anatoxina tetânica tem sido descritos^'®'^'®’^°'^' rnas poucos podem ser aplicados em escala industrial para * Seção de Vacinas Anaeróbicas do Instituto Butantan ■ ■ Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e ProduçSo do Instituto Butantan. Av. Vital Brasil, 1500 - CEP 05503-900 - S. Paulo, SP. - Brasil. Suporte Técnico: Assessoria Científica da Pharmacia - Brasil Recebido para publicação em 04.12.92 e aceito em 07.4.93. 3 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 PRADO, S.M.A, et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993. a produção de Toxóide Tetânico para uso humano. A importância desta purifica¬ ção baseia-se fundamentalmente na eliminação de substâncias alergênicas que causariam uma sensibilização no organismo receptor quando da profilaxia contra 0 tétano. A eficiência dos adjuvantes minerais utilizados nestes toxóides purificados é maior pois diminui-se o fator de competição entre proteínas específicas e não específicas na fase de adsorção^. De acordo com as Normas da Organização Mundial da Saúde (W.H.O.) as ana- toxinas tetânicas (A.T.T.), destinadas à produção de vacinas para uso humano, devem apresentar um grau de pureza igual ou maior do que 1.000Lf/mg de nitro¬ gênio protéico'^. A metodologia utilizada por nosso laboratório consiste na ultrafiltração mole¬ cular (lOKd), pré-precipitação pelo sulfato de amónio e gel filtração em Sepha- dex G-50, com a qual obtém-se grau médio de pureza de 2.300Lf/mg NP Visando basicamente a diminuição do tempo empregado np processo de purifi¬ cação do Toxóide Tetânico, nos propusemos verificar a possibilidade de eliminar a etapa de pré-precipitação pelo sulfato de amónio, substituindo-a pela gel filtra¬ ção nas resinas de 2® e 3® geração, Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep gra¬ de, respectivamente (Pharmacia LKB)^. MATERIAL E MÉTODOS OBTENÇÃO DE TOXINA TETÂNICA (T.T.): Lotes de 360 litros produzidos por processo fermentativo^ utilizando a cepa Clostridium íefan/Harvard-Caracas, desenvolvida em meio Müeller modificado por Latham^. OBTENÇÃO DE ÃNATOXINà TETÂNICà (Ã.T.T.): Ãtravés da atividade destoxificante de 10%o v/v de formalina, durante 30 dias a 37°C, sobre as T.T previamente concentradas 6 a 10 vezes por ultrafiltração molecular (lOKd) e esterilizadas por filtração através de cartuchos de 0,22u. PURIFICÃÇÃO Dà ANÃTOXINà TETÂNICA (A.T.T.): 30 litros de A.T.T. eram lavados com 60 litros de água destilada e concentra¬ dos em sistema Peilicon (Millipore) com membrana de lOKd, recolhíamos 3 amos¬ tras para proceder à purificação pelos métodos abaixo descritos; MÉTODO A: A amostra era precipitada com sulfato de amónio à 33% e ultracen- trifugada. Após a diálise e nova filtração tangencial que reduzia o volume cerca de 10 vezes, a A.T.T. era introduzida em coluha de Sephadex G-50 (Pharmacia BCP 252/60) e eluída com solução fisiológica tamponada pH 6,8”. MÉTODO B: A amostra era aplicada em uma coluna (Pharmacia XK 26/70) com Sephacryl S-100HR, equilibrada com solução fisiológica tamponada pH 7,0 com fluxo de 1,5ml / minuto. O volume de amostra aplicado correspondia a 1/3 do volume total da coluna. Absorção ultravioleta a 280nm foi empregada como indi¬ cação aproximada da concentração de proteínas. MÉTODO C: A metodologia é similar àquela utilizada no Método B, onde apenas substituiu-se a resina Sephacryl S-100HR pelo Superdex 75 prep grade. TESTE DE CONTROLE DO PROCESSAMENTO DE PURIFICAÇÃO: cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993. 7 - DETERMINAÇÃO DO LIMITE DE ELOCULAÇÁO (Lf): conforme preconizado pela W.H.0.9' 'T ' 2 - DETERMINAÇÃO DO NITROGÊNIO PROTEICO: avaliação quantitativa de ni¬ trogênio protéico e do nitrogênio não protéico pelo método Kjeldahl'^. 3 - DETERMINÃÇÃO DE EORMALDEIDO RESIDUAL: determinação quantitativa de formaldeído, em ppm. O máximo permitido é de 200 ppm'^. 4 - DETERMINAÇÃO Dà PUREZà ÃNTIGÊNIOÃ: é expressa através da relação do valor em Lf/ml e a concentração em mg de nitrogênio protéico/ml. A A.T.T. deverá ter pelo menos I.OOOLf/mg de nitrogênio protéico’^. 5 - PROVA DE TOXICIDADE ESPECIEICA: conforme preconizada pela W.H.O.''2, 6 - PROVA DE ATIVIDADE IMUNOGÊNICA: através do Método Americano (NIH)^^. RESULTADOS Os resultados cromatográficos obtidos através dos métodos A, B e C estão expressos nas Tabelas 1 e 2. As separações cromatográficas de A.T.T. pelas resinas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade encontram-se nas Fig. 1 e 2 respectivamente. Todas as amostras submetidas à Prova de Toxicidade Específica apresentaram resultados negativos,ou seja, atóxicas. A Prova de Atividade Imunogênica das A.T.T. purificadas teve resultados iguais ou maiores que 3,OUI/ml, sendo que, o título mínimo deve ser de pelo menos 2UI/mPT TABELA 1 Resultados de purificação através de gel filtração em Sephadex G-50 (método A) e em Sephacryl S-100HR (método B) A.T.T. Lf TOTAL Lf/mg N RENDIMENTO FORMALDEÍDO xlO-3 Protéico % ug/ml INICIAL 15.6 923 880 SEPHACRYL S-lOOHR ** 13.8 3000 88.5 5.8 INICIAL 10800 620 890 SEPHACRYL S-100HR ** 91.53 2755 92.6 5.4 SEPHADEX G-50 * 10320 1651 92.8 7.6 INICIAL 9900 471 640 SEPHACRYL S-100HR** 115.24 5469 99.6 2 SEPHADEX G-50 * 9200 2063 97.3 4.4 Purificação de A.T.T. pelo método A Purificação de A.T.T. pelo método B cm SciELO 10 11 12 13 14 15 PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993. TABELA 2 Resultados de purificação através de gel filtração em Sephadex G-50 (método A) e em Superdex 75 prep grade (método C) A.T.T. Lf TOTAL Lf/mg N xlO'^ Protéico RENDIMENTO % FORMALDEÍDO ug/ml INICIAL 9900 471 640 SUPERDEX 75‘* 105 2500 94 4 SEPHADEX G-50* 9200 2063 97.3 4.4 INICIAL 18750 925 900 SUPERDEX 75** 162.5 2156 97.6 5.6 SEPHADEX G-50* 14664 1677 91 11 INICIAL 18560 617 540 SUPERDEX 75** 105,3 2238 100 3.4 SEPHADEX G-50* 18048 1979 98.1 6 * Purificação de A.T.T. pelo método A ‘ * Purificação de A.T.T, pelo método C A—280nm Fig. 1: Gel filtração de ATT em Sephacryl S-100HR cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993. A metodologia industrial para obtenção de Toxóide Tetânico utilizada no Insti¬ tuto Butantan consiste basicamente em uma pré-precipitação pelo sulfato de amó¬ nio seguida de gel filtração em Sephadex G-50 com a qual obtém-se grau médio de pureza de 2.300Lf/mgNP”. O tempo empregado neste processo de purifica¬ ção é de 4 dias, sendo que 50% deste tempo consiste na precipitação pelo sulfa¬ to de amónio, ultracentrifugações e diálise. Utilizando as resinas cromatográficas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade, verificamos que foi possível eliminar o uso do sulfato de amónio, permitin¬ do a diminuição do tempo empregado neste processo assim como, a possibilida¬ de de trabalhar-se com purificação em sistema fechado (coluna cromatográfica). Pelos resultados obtidos verificamos que o grau de pureza do produto é maior quando utilizamos as resinas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade (Ta¬ belas 1 e 2), (Fig. 1 e 2) e nos permitem sugerir como método industrial prático e económico para purificação de Toxóide Tetânico. DISCUSSÃO A purificação de Toxóide Tetânico para uso humano é de grande importância, pois permite eliminar componentes inespecíficos desnecessários a imunidade con¬ tra o tétano, também é importante quando este imunógeno é associado a outras vacinas de uso freqüente na atualidade. ■AGRADECIIVIENTOS Aos funcionários da Seção de Vacinas Anaeróbicas pela colaboração no de¬ correr do desenvolvimento do presente trabalho. ABSTRACT: The use of Sephacryl-SlOOHR and Superdex 75 prep grade for preparing tetanus toxoid deleted the (NH 4)2 SO 4 precipitation step cm SciELO 10 11 12 13 14 15 PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993. A-280nm _ 4 3 2 1 0 -1 60 80 100 120 140 Numero do Tubo 40 20 0 Fig. 2: Gel filtração de ATT em Superdex 75 prep grade DISCUSSÃO A purificação de Toxóide Tetânico para uso humano é de grande importância, pois permite eliminar componentes inespecíficos desnecessários a imunidade con¬ tra 0 tétano, também é importante quando este imunógeno é associado a outras vacinas de uso freqüente na atualidade. A metodologia industrial para obtenção de Toxóide Tetânico utilizada no Insti¬ tuto Butantan consiste basicamente em uma pré-precipitação pelo sulfato de amó¬ nio seguida de gel filtração em Sephadex G-50 com a qual obtém-se grau médio de pureza de 2.300Lf/mgNP”. O tempo empregado neste processo de purifica¬ ção é de 4 dias, sendo que 50% deste tempo consiste na precipitação pelo sulfa¬ to de amónio, ultracentrifugações e diálise. Utilizando as resinas cromatográficas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade, verificamos que foi possível eliminar o uso do sulfato de amónio, permitin¬ do a diminuição do tempo empregado neste processo assim como, a possibilida¬ de de trabalhar-se com purificação em sistema fechado (coluna cromatográfica). Pelos resultados obtidos verificamos que o grau de pureza do produto é maior quando utilizamos as resinas Sephacryl S-100HR e Superdex 75 prep grade (Ta¬ belas 1 e 2), (Fig. 1 e 2) e nos permitem sugerir como método industrial prático e econômico para purificação de Toxóide Tetânico. AGRADECIMENTOS Aos funcionários da Seção de Vacinas Anaeróbicas pela colaboração no de¬ correr do desenvolvimento do presente trabalho. ABSTRACT: The use of Sephacryl-SlOOHR and Superdex 75 prep grade for preparlng tetanus toxoid deleted the (NH 4)2 ^^4 precipitation step 7 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 PRADO, S.M.A. et al. Otimização do processo de purificação industrial de toxóide tetânico por gel filtração. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 3-8, 1993. and resulted in a final preparation with a degree of purity pf about 3000Lf/mg NP. The material was very immunogenic in guinea pigs. The yield of the purification method was of 88,46% similar to the obtained by the classical industrial process. The new methodology is time saving and allowed to works in a closed system (chromatographic column). KEYWORDS: Purification, toxins, tetanus toxoids, gel filtration, Sephacryl- -S100HR, Superdex 75 prep grade. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. BIZZINI, B., TURPIN, A., BAYMOND, M. Production et purification de la to- xine tetanique. Ann. Inst. Pasteur, v. 116, p. 686-71 1, 1969. 2. GEL filtration: theory and practice. Pharmacia LKB Biotecnology. A B. S-75182. Uppsala, Sweden, 1991. 3. HERMET, P. Van. Vaccine production as a unit process. Prog. Ind. Micro- biol, V. 13, p. 248-260, 1974. 4. LARS, H. et al. 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Esta atividade botrópico- -proteolítica pode ser um dos fatores responsáveis pelas reduções pela metade, aproximadamente, seja dos títulos soroneutralizantes médios seja da porcentagem de animais que respondem ao estímulo imunogê- nico a ambos os venenos, se comparados com aqueles obtidos nos ani¬ mais inoculados com os mesmos venenos isolados e em dias diferentes. UNITERMOS: Venenos, hiperimunização botrópico-crotálico, atividade proteolítica. INTRODUÇÃO Os soros antivenenos botrópico-crotálico são de utilidade nos casos em que há dúvidas sobre o gênero ao qual pertence a serpente responsável pelo aciden¬ te. Tais dúvidas podem ocorrer ou porque a captura do ofídio não foi realizada e as lesões locais do acidente sejam bizarras ou por falta de conhecimento da pessoa que estiver socorrendo o acidentado. • Seção de Obtenção de Plasmas Hiperimunes, Instituto Butantan • • Seção de Concentração e Fracionamento de Soros, Instituto Butantan • • ■ Laboratório Especial de Imunoquimica, Instituto Butantan Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção do Instituto Butantan - Av. Vital Brasil, 1500 CEP 05503-900 - São Paulo, SP - Brasil Recebido para publicação em 28.01.93 e aceito em 03.05.93 9 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 CARICATI, C.P., GUIDOLIN, R., YAMAGUSHI, I.K., MORAIS, J.R, DIAS DA SILVA, W., HIGASHI, HG, Esquema de hiperimunizaçâo equina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico- -Crotálico. Boi. Biotecnol., v. 4, p, 9-12, 1993. A produção do antiveneno botrópico-crotálico era feita por inoculação em ca¬ valos, de mistura de venenos botrópicos e crotálicos. Os soros obtidos, via de re¬ gra, apresentavam títulos baixos de anticorpos antiveneno crotálico. 0 enrique¬ cimento desses soros com o anticrotálico exige o uso de preparações muito po¬ tentes para evitar a diluição dos anticorpos botrópicos. Tendo em vista que os ve¬ nenos botrópicos são ricos em enzimas proteolítlcas^-^, potencialmente capazes de clivar a crotoxina'* e torná-la menos imunogênica, foi delineado esquema de imunização dos cavalos, injetando-os com os venenos botrópicos e crotálicos iso¬ lados e em diferentes locais. Os respectivos títulos neutralizantes foram determi¬ nados pelo método de Vital Brasil'. Os resultados foram comparados tanto do ponto de vista de títulos quanto do de porcentagens de animais que responderam a ambos os antígenos. Todos os animais eram soroprodutores e submetidos a di¬ versas reimunizações com os venenos botrópicos e crotálicos antes destas expe¬ riências. MATERIAL E MÉTODOS CAVALOS: Aqimais de raça indefinida, pesando ao redor de 350 quilos, com qua¬ tro a oito anos de idade por ocasião do início da hiperimunizaçâo. Todos os animais eram soroprodutores e submetidos a diversas reimunizações com os venenos bo¬ trópicos e crotálicos antes destas experiências. ANTÍGENO: Venenos botrópicos — obtidos de sete espécies do gênero botrópico (B. jararaca, B. jararacussu, B. neuwiedi, B. pradoi, B. cotiara, B. alternatuse B. moo- jeni), misturados na proporção de 50% de 6. jararaca e 8,33% de cada um dos seis venenos mencionados. Os venenos, até o momento da preparação dos antí¬ genos, foram conservados em estado seco (seco a vácuo) e a 4°C. Venenos crotálicos — venenos de Crotalus durissus terrificus e de Crotalus du- rissus coilineatus, misturados na proporção de 50% de cada uma das espécies. A técnica de conservação foi a mesma descrita para os venenos botrópicos. ESOUEMAS DE REIMUNIZAÇÃO UTILIZADOS TABELA 1 Esquemas de reimunização: mg de venenos, volume de salina e de adjuvante de Freund Incompleto inoculado e espaço de tempo entre as inoculações. ESQUEMA DIA 0 11“ 12“ 13“ (M) (M) (Ml VENENO S.OmgB+S.OmgC 2.5mgB+2,5mgC 2.5mgB+2,5mgC 2,5mgB+2,5mgC E 1 SAUNA 5ml lOmI lOmI lOmI lAFII ADJUVANTE 5ml “ — “ DIA 0 7“ 14“ 16“ VENENO 5,0mgC 5,0mgB 5,0mgC 5,0mgB E2 SALINA 5ml 5ml lOmI lOmI (AFII lAFI) ADJUVANTE 5ml 5ml ~ B - botrópico - C - crotálico - M - mistura - lAFII - Adjuvante de Freund Incompleto. 10 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 CARICATI, C.P., GUIDOLIN, R., YAMAGUSHI, I.K., MORAIS, J.F., DIAS DA SILVA, W., HIGASHI, H.G. Esquema de hiperimunizaçâo eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico- -Crotálico. Boi. Biotecnol., v. 4, p. 9-12, 1993. Os antígenos foram inoculados na região dorsal dos animais e os volumes totais subdivididos em três partes e cada uma delas injetada por via subcutânea, em pontos diferentes, distando, aproximadamente, de 20cm cada ponto. Os títulos de antivenenos foram determinados 10 dias após a última inoculação em cada esquema. Os números de cavalos envolvidos nas observações foram os seguintes: esquema tradicional utilizado pelo Instituto Butantan (E 1), 250 cava¬ los; esquema proposto (E 2), 55 cavalos. Os animais foram constantemente alimentados com sete quilos diários de ra¬ ção balanceada (22% de proteína), capim verde ou feno (dependendo da época) e água "ad libitum”. SANGRIAS PARA PRODUÇÃO; O sangue foi extraído por punção da veia jugular, na proporção de 4% em relação ao peso dos animais (2% iniciais e 2% após 48 horas), e coletados em bolsas plásticas contendo 400 ml de solução anticoagu- lante isotônica (1,47% de dextrose, 4,8% de citrato de sódio e 1,47% de ácido cítrico). DOSEAMENTO: Para a determinação dos títulos soroneutralizantes (SN) dos anti¬ venenos, foi utilizado 0 método de Vital BraziP. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos com os diferentes esquemas de reimunização encontram- -se na Tab. 2. TABELA 2 Títulos SN de cavalos submetidos a diferentes esquemas de reimunização com venenos botrópicos e crotálicos. ESQUEMAS NÚMERO DE ANIMAIS títulos 'SN MÉDIOS % DE ANIMAIS COM TiTULOS SN BOTRÓPICO CROTÁLICO BOTRÓPICO CROTÁLICO SOMENTE BOTRÓPICO E 1 250 1,23 0,28 35,7 64,2 E2 55 1,87 0,57 79,2 20,8 • mg de venenos de referência IB. jararaca e C. d. íe/z/feosf neutralizados por ml de plasma. SN - Soroneutralizante. Pelo exame da Tab. 2, observa-se que E 2 proporcionou um aumento de 103,5% no título SN do antiveneno crotálico em relação ao esquema que vinha sendo apli¬ cado. Deve, ainda, ser ressaltada a porcentagem de animais que respondem a am¬ bos os estímulos imunogênicos (botrópico e crotálico), substancialmente aumentada. • Supõe-se que os resultados superiores de SN, obtidos com a fração crotálica pela aplicação do E 2, estariam ligados à ausência de atividade proteolítica dos venenos botrópicos^''’^ que poderia agir sobre o antígeno(s) crotálico quando mis¬ turados mesmo sendo o material mantido a 4°C antes da inoculação. No que diz respeito ao consumo de venenos exigido pelo E 2, nas condições destas experiências, em relação ao E 1, ele foi 20% menor. 11 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 CARICATI, C.P., GUIDOLIN, R., YAMAGUSHI, I.K„ MORAIS, J.F., DIAS DA SILVA, W., HIGASHI, H.G. Esquema de hiperimunizaçâo eqüina mais conveniente à produção de plasma antiveneno Botrópico- -Crotálico. Boi. Biotecnol., v. 4, p, 9-12, 1993. ABSTRACT: In the h.orse's mixed hyperimmunization with Bothrops Cro- fa/us Venoms it is possible that the Soíhrops venom's proteolytic action degenarates pari of the Crofa/us venom if lhey are mixed before inocu- lation, probably this proteolytic activity is one of the factors responsa- ble by seroneutralization titer reduction and animais that reply to Crotalus and Bothrops immunogenic stimulation, when compared with the re- sults obtained with the same venoms inoculated separately and in dif- ferent days. KEYWORDS: Venoms Bothrops-Crotalus hyperimmunization, proteoly¬ tic activity. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 5. 6 . BRAZIL, V. Dosagem do valor antitóxico dos serums antipeçonhentos. Trib. med. (Rio de Janeiro), v. 14, n. 3, p. 39, 1908. DEUTSCH, H.F., DINIZ, C.R. Some proteolytic activities of snakes venoms. J. biol. chem., v. 216, p. 17, 1955. FARMACOPEIA dos Estados Unidos do Brasil. 2. ed. São Paulo: Siqueira, 1959. p. 1034. IWANAGA, S., SUZUKI, T. Enzimes in snakes. In: LEE, C. Y. 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The BHK21C13 cells were shown to grow faster than VERO cells, and after 4 days of culture, about 98% of microcarriers were totally covered of BHK21C13 cells, when only about 35% of them were totally covered of VERO cells. This procedure was found to be efficlent to prepare the- se cell cultures in concentrations high enough to allow its utilization as a substract for virus growth and veterinarian or human vaccines pro- duction. KEYWORDS: BHK21C13 cells, bioreactor, microcarriers The BHK21 clone 13 (BHK21C13) cells have been used for the preparation of several different vaccines of veterinary use, such as foot and mouth disease and rabies. These cells can grow in suspension and bioreactors of large volumes have been utilized by the veterinarian vaccine manufactors for its production^^. A great diversity of cell cultures of mammalian 2 , 3 . 4 , 15,16 gvian origin^'® as well as human diploid cell”''^ and heteroploid cell lines®-'^ are currentiy used today as substract for human vaccine production. Montagnon et al 1984a and 1984b®'® developed a large-scale methodology for VERO cell culture and production of vac¬ cines in this cell line, which has been recommended by the World Health Organi- zation as a substract for human vaccine production, such as rabies and poliomielitis’®. Recentiy, Rifky, 1987'® utilized a low capacity bioreactor of 5 liters, allowing the preparation of VERO cell cultures in suspension, to vaccine production. Laboratório de Imunologia Virai Instituto Butantan — Sâo Paulo — 05503-900 — S. Paulo, SP — Brazil • To whom correspondence should be addressed Recebido para publicação em 01.03,93 e aceito em 03.05.93. 13 cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 MENDONÇA, R.Z., PEREIRA, C.A. BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor. Boi. Biotecnol., V. 4, p. 13-16, 1993. It is of great interest, the standardization of simplified methods of cell cultures to prepare vaccines for veterinarian as well as human use, suitable for developing countries where high tecnology infrastructure is still not available and where several virai diseases are usually endemic. Microcarriers (Cytodex I — Pharmacia) at a concentration of 2 mg/ml were washed three times in phosphate buffered saline (PBS) without Ca + '*’ and Mg + + and autoclaved at 120°C for 30 minutes. After cooling at room temperatura, they were incubated with 200 ml of fetal calf serum (FCS) for 30 minutes. The cells were then added and mantained at 37°C and 50 rpm. BHK21C13 cells, obtained from the Instituto Pasteur, Sâo Paulo, Brasil, ánd VERO cells obtained from the Pfizer Laboratories, São Paulo, Brasil, were cultivated in Leibovitz (L15) médium, suppiemented with 2 mM of glutamine and containing 5% fetal calf serum (FCS). A cell bank prepared with these cells was used in all the experiments. The cells were grown in monolayer cultures (Roux bottles) or in suspension, using a Ceiligen Cell Culture System (New Brunswick Scientific Co., Ltda.), with work capacity of 3.7 liters, coritaining 2mg/ml of microcarriers (Cytodex I — Pharmacia). Suspensions of 8 x 10'^ cells/ml in L15 médium, and 5% FCS, were added to the bioreactor maintained at 37°C and 50 rpm. The microcarriers were daily collected, observed at the microscope and the cells count- ed in a Neubauer chamber. Fig. 1. Kinetics of BHK21C13 and VERO cell growth (A) and attachment (B) to microcarri¬ ers in a 5 liters bioreactor. 2 mg/ml of microcarriers suspended in 3.7 liters of médium in a bioreator, were inoculated with 8 x 10'^ BHK21C13 (□) or VERO cells ( a ). The cul¬ tures were performed at 37°C and 50 rpm and different times after, samples were taken, the percents of microcarriers totally covered by cells were evaluated by microscopical ob- servation, and the number of cells, expressed as Logra of cells/ml, was obtained by count- ing the cells after separation from the microcarriers by trypsin treatment. 14 cm SciELO 10 11 12 13 14 15 16 MENDONÇA, R.Z., PEREIRA, C.A. BHK cell growth on microcarriers in a bioreactor. Boi. Biotecnol., V. 4, p. 13-16, 1993. As shown in Figure IA, the BHK21C13 cell concentration increased gradually to a peak of 1.5 x 10® cells/ml after 4 days of culture and remained high until day 7 of culture. The VERO cell growth paralleled that of BHK21C13 cells, but the cell concentration was always lower, reaching a peak of 5 x 10® cells after 6 days of culture. The data in figure 1B confirm that on figure IA, showing that after 4 days of culture about 98% of microcarriers were totally covered of BHK21C13 cells, when oniy about 35% of microcarriers were totally covered of VERO cells. A high percent (about 80%) of microcarriers totally covered of VERO cells were observed oniy after 7 days of culture. Different types of cell cultured vaccines have been padronized and used in sever- al countries^i°'''^''Ti7,i8,i9^ in order to replace those prepared in animal tissues, which often continues to be used in developing countries. Recentiy-developed vaccines can oniy be produced in cell cultures, which constitute a technology that many countries are not able to easily acquire or develop, due to high costs or lack of suitable infrastructure. With the aim to develop a methodology that permits the establishment of cell cultures, and consequentiy the production of vaccines for veterinarian or human use, we carried on the technological studies presented in this paper. We describe a methodology that permits the production of veterinarian vaccines with BHK21C13 cells, as well as human vaccines with VERO cells, in a small and simple to handie bioreactor. This methodology is suitable for countries that do not dispose of high infrastructure and where several diseases, that can be avoided by vaccination, are endemic and the need of a local production of good vaccines is important. ACKNOWLEDGEMENTS This Work was supported by grants from the European Economic Community (EEC TS2*0190-F. EDB) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de S. Paulo (FAPESP). C. A. Pereira is a recipient of CNPq research fellowship. The authors are grateful to A. C. Barbosa and M. L. Silva for their technical assistance. RESUMO: Células BHK21C13 e VERO foram cultivadas em microcarre- gadores em um bioreator de 5 litros. A concentração de células BHK21C13 aumentou gradualmente atingindo um pico de 1.5 x 10® células/ml após 4 dias de cultura, e a concentração de células VERO alcançou um pico de 5 X 10® células/ml após 6 dias de cultura. As células BFIK21C13 apre¬ sentaram um crescimento mais rápido do que o apresentado pelas célu¬ las VERO, e após 4 dias de cultura aproximadamente 98% dos microcarregadores mostraram-se totalmente cobertos de células BHK21C13, quando apenas aproximadamente 35% deles mostraram-se totalmente cobertos de células VERO. Este processo mostrou-se eficiente para o preparo destas culturas celulares em concentrações altas o sufi¬ ciente para permitir sua utilização como substrato para o crescimento de vírus e produção de vacinas para uso veterinário e humano. UNITERMOS: Células BHK21C13, bioreator, microcarregador REFERENCES 1. ARAI, Y.T., OGATA, T., OYA, A. 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Os trabalhos deverão ser redigidos em português, inglês ou francês, datilografados preferencial¬ mente em máquina elétrica, em espaço duplo em 3 (três) vias, em papel formato ofício e numera¬ dos no ângulo superior direito. 3. No preparo do original será observada, sempre que possível, a seguinte estrutura: Página de ros¬ to: título do artigo, nome(s) do(s) autorfes) e filiação científica. Texto: introdução, material e mé¬ todos, resultados, discussão, conclusões, agradecimentos e referência bibliográfica. Material de referência: resumos (em português e inglês); unitermos: palavras ou expressões que identificam o conteúdo do artigo; devem set incluídas até um limite máximo de três, em português e inglês. 4. As referências bibliográficas deverão ser ordenadas alfabeticamente e numeradas. Exemplos; Para livros: autor, título, edição, local de publicação, editor, ano, páginas. 7. BIER,0. Microbiologia e imunologia. 24. ed. São Paulo: Melhoramentos, 1985.1234p. Para artigos: autor, título do artigo, título do periódico, volume, página inicial e final, ano. 8. MACHADO, J.C., SILVEIRA F?, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão por veneno escorpiônico. Mem. Inst. Butantan, v.40/41, p. 1-9, 1976/77. As citações no texto devem ser por números-índices correspondentes às respectivas referências bibliográficas. Exemplos: ...âcyuiiuu voi iwo auiuico 5. As ilustrações (fotos, tabelas, gráficos etc.) deverão ser originais e acompanhadas de legendas explicativas. As legendas serão numeradas e reunidas em folha à parle. Os desenhos deverão ser a nanquim e as fotografias bem nítidas, trazendo no verso o nome do autor e a indicação numéri¬ ca da ordem a ser obedecida no texto. As ilustrações deverão ser organizadas de modo a permitir sua reprodução dentro da mancha da revista (22 x 12,5cm). 6. Os artigos deverão conter no máximo 6 (seis) ilustrações (branco e preto). De cada trabalho serão impressas 30 (trinta) separatas, sendo 10 para a Biblioteca do Instituto e 20 para os autores. 7. Os textos originais não serão devolvidos e os originais das ilustrações estarão à disposição dos autores. INSTRUCTIONS TO AUTHORS 1. Manuscripts subrnitted to the Editorial Board should be unpublished texts and should not be un- der consideration for publication elsowhere. Reproduction for commercial purposes is not allo- wed The Editorial Board will plan the publication of revision articles. 2. The original and hvo copies of papers should be typewritten in Portuguese, English or French, double spaced, on typmg paper (31 x 21cml. Pages should be numbered consecutively at the upper right corner. 3. The following structure should be considered in the preparation of lhe manuscript: Titie page: with article titie, name of aulhof(s), professional address Text: with introduction, material and me- thods, resuits, discussion, conclusions, acknowledgments, references, abstracts (in Portuguese and English), and keywords. A maxirnal number of 03 keywords should be included in Portuguese and English. 4. References in alphabetical order should be numbered consecutively. Examples: Books: 7. BIER, 0. Microbiologia e imunologia. 24 ed. São Paulo: Melhoramentos, 1985. 1234p. Articles: 8. MACHADO,J.C., SILVEIRA F“, J.F. Obtenção experimental da pancreatite hemorrágica aguda no cão por veneno escorpiônico Mem. Inst. Butantan. v.40/41, p. 1-9, 1976/77. Citations in the text should be identified by the reference number. Examples: ...método derivado de simplificação de armadilha de Disney' ...segunda vários autores'^''^’'* 5. Illustrations (photographs, tables, figures etc.) should be the originais and legends should be sub- mitted typewritten on a separate sheet. Line-drawings should be with China ink and photographs must be of top quality. On lhe back of each figure of photograph the name of the author(s) should be lightly written and the number indicating the sequence in the text. Illustrations should fit in a page measuring 22 x 12,5cm. 6. No more than 6 illustrations will be accepted and photographs should be black and white. Thirty reprints of each article are provided without charge, and 10 will be kept at the library. 7. Subrnitted manuscripts will not be returned to the author(s) but the original illustrations are availa- ble to author(s) by request. cm 2 3 z 5 6 11 12 13 14 15 ISSN 0073 - 9901 0 IMPRENSA OFICIAL 00 ESTADO S.A. IMESP SÂO PAULO - BRASIL 1993 GOVERNO DC tAO (■fTjTni llM Ml< HiM