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RNA Methodologies:

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分 离 与 鉴定 实验 指南 -一 RNA 研 究 方法

[ 美 ] R. E. 法 雷 尔 (Robert E. Farrell, Jr. ) 编 SAY 刘建华 金 言 SF

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生物 实验 宇 系 列

陆 终 出 版 的 书目 如 下 © RAT AS RK (2004 fF 3 月 ) 。 生 物化 学 实验 技术 (2005 年 5 月 重印 ) 。 拟 南 闪 实验 手册 LE) (2004 年 5 月 ) 。 现 代 生 物 科 学 仪器 分 析 入 门 (2005 年 6 月 重印 ) 。 转 基因 动物 技术 手册 LE) 《2004 年 10 月 ) ¢ RNAi 基因 沉默 指南 LE) 《2004 年 10 FR) 。PCR 最 新 技术 原理 、 方 法 及 应 用 《2005 年 1 月 ) 。 生 物 安 全 柜 应 用 指南 《2005 年 3 月 ) 。 分 子 生物 学 实验 参考 手册 LF] 《2005 年 6 月 ) 。DNA 分 子 标记 技术 在 植物 研究 中 的 应 用 (2005 年 6 月 ) 。 流 式 细 胞 术 原 理 与 科研 应 用 简明 手册 LE) (2005 年 7 月 ) 。 医 学 微生物 学 实验 技术 (2006 年 1 月 ) 。 小 鼠 胚 胎 操 作 实 验 手 册 【〈 第 三 版 ) LIE] 《2006 年 1 月 ) 。 植物 分 子 生物 技术 应 用 手册 (2006 年 2 FR) 。 分 子 生物 学 与 蛋白 质 化 学 实验 方法 LE) (2006 fF 2 A) © PCR RASA (Bh) (2006 年 3 月 ) 。 植物 细胞 工程 买 验 技术 (2006 年 4 月 ) 。 生 物 安全 实验 室 建 设 (2006 年 4 月 ) 。 人 肿瘤 细胞 培养 OE) (2006 年 5 月 ) 。 细 胞 生物 学 实验 技术 (2006 年 6 月 ) 。 组 织 工程 方 法 LE] (2006 年 6 月 ) 。 免 疫 组 织 化 学 实验 技术 及 应 用 (2006 年 6 月 ) EMMA RAMA (2006 年 9 月) 。 现 代 实 验 动 物 学 技术 《2007 年 1 月 ) 。 和 蛋白 质 与 蛋白 质 组 学 实验 指南 FE] (2006 年 10 月 ) 。RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法 LEI (2007 年 11 月 )

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生物 实验 室 系列

RNA 分 离 与 鉴定 实 难 指 南 一 一 RNA 研究 方法 Or 8 = hi)

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图 书 在 版 编目 (CIP) 数据

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法 / [ 美 ] 法 雷 尔 〈Farrell，R.E. Jr.) 编 ; 金 由 辛 ， 刘 建华 ， 金 言 等 译 . 一 3 版 .一 北京 : 化 学 工业 出 版 社 ，2007. 7

(生物 实验 室 系列 )

书 名 原文 : RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization, 3rd edition

ISBN 978-7-5025-9625-5

I. R= [. O#-O:-@xX)l:- OF: Tl. 核糖 核酸 -研究 方法 ，K.Q522 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 〈2007) 第 105375 号

RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization, 3rd edi- tion/by Robert E. Farrell, Jr.

ISBN 0-12-249696-5 978-0-12-249696-7

Authorized simplified Chinese translation edition jointly published by Chemical Industry Press and Elsevier (Singapore) Ltd, 3 Killiney Road, #08-01 Winsland House I, Singa- pore 239519.

981-259-639-9 978-981-259-639-0

Copyright©2007 by Elsevier (Singapore) Pte Ltd.

Copyright©2007 by Chemical Industry Press All rights reserved.

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本 书 中 文 简 体 字 翻译 版 由 化 学 工业 出 版 社 与 Elsevier (Singapore) Pte Ltd. 在 is 国内 地 合作 出 版 . 本 书 仅 限 在 中 国境 内 〈 不 包括 香港 特别 行政 区 及 台湾 地 区 ) 出 版 及 标价 销售 ， 未 经 许可 出 口 ， 视 为 违反 著作 权 法 ， 将 受 法 律 制裁 。

北京 市 版 权 局 著作 权 合同 登记 号 : 01-2006-3433

责任 编辑 : (EDO HAE 文字 编辑 : 周 fel 责任 校对 : ERI 装帧 设计 : 关 飞

出 版 发 行 : 化 学 工业 出 版 社 〈 北 京 市 东城 区 青年 湖南 街 13 号 ”邮政 编码 100011)

印 hall: 北京 永 奢 印刷 有 限 责任 公司

装 订 : 三 河 市 延 风 装 订 厂

787mmX1092mm 1/16 印张 27 好 字数 658 千 字 2008 年 1 月 北京 第 1 版 第 1 次 印刷

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参加 翻译 人 员 〈 排 名 不 分 先后 )

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qe VA th HEA Catherine Ann, Sean Patrick, Emma Catherine, Liam Michael 和

Patrick Joseph!

出 版 者 的 话

21 世纪 是 生命 科学 的 世纪 ， 这 已 成 为 人 们 的 共识 。

生命 科学 随 着 人 类 对 自身 和 自然 的 认识 、 探 索 而 萌芽 ， 随 着 人 类 生产 和 科学 实践 的 进步 而 发 展 。 现 代 生 命 科 学 包括 生物 学 、 医 学 、 农 学 等 传统 学 科 领 域 ， 以 及 生物 学 、 生 物 技术 与 环境 科学 乃至 社会 科学 等 其 他 学 科 相 互 渗透 、 交 叉 而 产生 的 新 型 学 科 体 系 。20 世纪 后 叶 现 代 生 物 科 学 尤其 是 分 子 生物 学 取得 了 一 系列 突破 性 成 就 ， 使 得 生命 科学 在 自然 科学 体系 中 的 位 置 发 生 了 革命 性 的 变化 ， 成 为 21 世纪 的 带头 学 科 。 人 们 对 生命 科学 也 寄予 了 无 限 的 期 望 ， 希望 能 够 解决 人 类 社会 所 面临 的 人 口 膨胀 、 资 源 匮乏 、 疾 病危 害 、 环 境 污染 和 生态 破坏 等 一 系列 重大 问题 。

回顾 生命 科学 的 发 展 历程 ， 实 验 技术 一 直 起 着 非常 重要 的 促进 作用 。 如 17 世纪 Leeu- wenhoek 等 人 发 明 并 应 用 显微镜 技术 ， 直 接 催生 了 “细胞 学 说 ”的 建立 和 发 展 ; 1973 年 Cohn 和 Boyer 完成 了 DNA 体外 重组 实验 ， 标 志 着 基因 工程 的 秘 始 ; 1988 4 Kary Mullis 发 HA PCR 技术 甚至 使 生命 科学 产生 了 飞跃 性 的 发 展 。 可 以 说 ， 生 命 科 学 无 时 无 刻 离 不 开 实 验 ， 实 验 是 开启 神奇 的 生命 王国 大 门 的 钥匙 。 没 有 实验 技术 的 不 断 进 步 ， 也 就 没有 生命 科学 今天 的 巨大 发 展 ; 同时 ， 生 命 科学 的 发 展 又 对 实验 技术 提出 了 更 高 的 要 求 ， 进 一 步 刺 激 了 后 者 的 不 断 进 步 。 生 命 科学 正 是 在 “实验 催生 和 验证 着 基础 理论 ， 理论 指 导 和 发 展 了 实验 技 术 ” 的 不 断 循环 中 从 必然 王国 走向 自由 王国 。

工 欲 善 其 事 ， 必 先 利 其 器 。 为 了 有 助 于 生命 科学 工作 者 更 多 地 了 解 相 关 实 验 技术 和 仪器 设备 ， 更 好 地 设计 实验 方案 ， 更 有 效 地 开展 实验 过 程 ， 更 合理 地 处 理 实 验 结果 ， 化 学 工业 出 版 社 组 织 出 版 了 “生物 实验 室 系 列 ” 图 书 。 系 列 图 书 在 整体 规划 的 基础 上 ， 本 着 “经 典 、 前 沿 、 实 用 ， 理 论 与 技术 并 重 ” 的 原则 组 织 编 写 ， 分 批 出 版 。

在 题材 上， 系列 图 书 涵盖 综合 实验 技术 和 单项 实验 技术 两 个 方面 。 其 中 综合 实验 技术 既 有 以 实验 目的 为 题 ， 如 “蛋白 质 化 学 分 析 技 术 ”， 内 容 纵 向 覆盖 多 项 实验 技术 ; 也 有 以 某 一 生命 学 科 领 域 的 综合 实验 技术 为 题 ， 如 “发 酵 工 程 实验 技术 ”“ 生 物化 学 实验 技术 ”等 。 而 单项 实验 技术 则 以 深入 介绍 某 一 专项 技术 及 其 应 用 为 主 ， 在 阐述 其 基本 原理 的 基础 上 ， 横 向 介绍 该 项 技术 在 多 个 领域 的 应 用 ， 如 “双向 电泳 技术 ”、“ 流 式 细胞 术 ” 等 。

在 内 容 上 ， 系 列 图 书 主要 有 以 下 两 个 显著 特点 。 一 是 强调 先进 性 一 一 除了 系统 介绍 常用 和 经 典 实 验 技术 以 外 ， 特 别 突出 了 当前 该 领域 实验 手段 的 新 理论 、 新 技术 、 新 发 展 ， 为 国内 专业 人 员 起 到 借鉴 和 引导 作用 。 三 是 强调 可 操作 性 一 一 对 于 每 一 项 实验 技术 ， 系 统 介绍 其 原 理 方法 、 设 备 仪器 和 实验 过 程 ， 让 读者 明了 实验 的 目的 、 方 案 设 计 以 及 具体 步骤 和 结果 处 理 ， 以 期 起 到 实验 指南 的 作用 。

本 系列 图 书 坚 持 质 量 为 先 ， 开 拓 国 内 和 国际 两 个 出 版 资源 。 一 方面 ， 约 请 国内 相关 领域 兼 具 理论 造 谢 和 丰富 实验 室 工 作 经 验 的 专家 学 者 编著 ; 另 一 方面 ， 时 刻 关 注 国际 生命 科学 前 沿 领域 和 先进 技术 的 进展 ， 及 时 引进 〈 翻 译 或 影印 ) 国外 知名 出 版 社 的 权威 力作 。

“生物 实验 室 系 列 ” 图 书 的 读者 对 象 设 定 为 国内 从 事 生 命 科 学 及 生物 技术 和 相关 领域 (如 医学 、 药 学 、 农 学 ) 的 专业 研究 人 员 ， 企 业 或 公司 的 生产 、 研 发 、 管 理 技术 人 员 ， 以 及

高 校 相 关 专 业 的 教师 、 研 究 生 等 。

我 们 殷切 希望 “生物 实验 室 系 列 ” 图 书 的 出 版 能 够 服务 于 我 国生 命 科 学 的 发 展 需要 ， 同 时 热忱 欢迎 从 事 和 关心 生命 科学 的 广大 科技 人 员 不 仅 对 已 出 版 图 书 提供 宝贵 意见 和 建议 ， 也 能 对 系列 图 书 的 后 续 题目 设计 贡献 良策 或 推荐 作者 ， 以 便 我 们 能 够 集思广益 ， 将 这 一 系列 图 书 沿 着 可 持续 发 展 的 方向 不 断 丰 富 品 种 ， 推 陈 出 新 。

谨 向 所 有 关心 和 热爱 生命 科学 ， 为 生命 科学 的 发 展 孜 孜 以 求 的 科学 工作 者 致 以 崇高 的 敬意 ! 祝愿 我 国 的 科技 事业 如 生命 之 树 根深 叶 茂 ， 欣 欣 向 荣 !

化 学 工业 出 版 社 生物 。 医 药 出 版 分 社

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1998 年 ， 中 国 科 学 院 王 应 睐 院士 、 王 德 宝 院士 、 祁 国 荣 教 授 和 我 四 人 建议 ， 由 我 、 北 京 大 学 的 朱 圣 庚 教 授 和 中 山大 学 届 良 蕉 教授 主持 了 “面向 21 世纪 的 RNA 研究” 第 109 次 香山 会 议 。 在 我 所 做 的 “20 世纪 了 NA 研究 成 果 和 21 世纪 了 RNA 研究 展望 ”的 主题 报告 中 ， 我 对 21 世纪 RNA 研究 前 景 作 了 三 条 预测 : 第 一 ， 以 RNA 为 终 产物 的 基因 组 计划 CRNA 组 计划 ) 会 很 快 起 步 ; 第 二 ， 在 下 述 方面 会 有 突破 性 进展 ，@ 新 的 RNA 基因 会 不 断 增加 ， QRNA 的 新 功能 会 不 断 被 发 现 ，@ 核 蛋白 体 催 化 功能 的 机 理 的 揭示 ，@ 图 核 蛋 白 高 级 结构 的 破解 ，@RNA 高 级 结构 的 计算 机 模拟 ; 第 三 ，RNA 研究 将 迅速 向 产业 化 发 展 ， 将 进入 实际 应 用 阶段 。 同 时 我 也 建议 我 国 开展 以 人 NA 为 终 产物 的 基因 组 计划 CRNA 组 计划 ) 等 。 此 后 ，RNA 方面 的 进展 连续 5 年 被 美国 “Science” 评 为 年 度 科 技 十 大 突破 之 一 。1999 年 和 2000 年 核糖 核酸 的 催化 功能 和 核糖 体 使 核 酶 入 选 。2001 年 ， 三 个 实验 室 同 时 发 现 小 分 子 调 # RNA (miRNA), 2001~2003 年 的 3 年 中 ， 小 分 子 RNA 的 调控 功能 、 包 括 siRNA 和 miRNA 在 内 的 小 分 子 RNA 入 选 。“Science” 评 选 出 的 -2004 年 十 大 突破 中 ， 有 一 条 是 ， 原 认为 是 基因 组 中 垃圾 的 部 分 ， 很 可 能 控制 着 基因 如 何 被 阅读 以 及 控制 基因 表达 的 时 序 和 场 所 。 这 些 垃圾 绝 大 部 分 都 是 反 转 座 元 件 ， 与 RNA 有 关 。2006 年 诺 贝尔 生理 或 医学 奖 授予 美 国 斯 坦 福 大 学 医学 院 的 安德鲁 。 菲 尔 (Andrew Fire) 和 麻 省 理工 大 学 医学 院 的 克 雷 格 。 梅 % (Craig Mello) ， 以 表彰 他 们 发 现 了 双 链 RNA 引发 基因 沉默 。 同 年 ， 小 分 子 调控 RNA 中 又 添 新 成 员 ， 这 些 新 发 现 的 调控 小 分 子 RNA， 再 次 被 列 入 “Science” 十 大 科技 突破 。 至 此 ，8 年 多 后 的 今天 ， 上 述 的 预言 都 已 变 成 现实 。 而 尚 有 大 量 未 知 的 RNA 及 其 功能 等 待人 们 去 发 现 、 研 究 。

曾几何时 ， 当 年 国内 少 有 人 涉足 RNA 研究 ， 而 现在 很 多 人 都 希望 开展 RNA 研究 。 我 于 2005 年 编著 的 《核糖 核酸 与 核糖 核酸 组 学 》 一 书 〈 科 学 出 版 社 ， 北 京 )， 在 2006 年 第 2 次 印刷 可 以 作为 一 个 证 据 。

核糖 核酸 生物 功能 的 多 样 性 ， 特 别 是 它 的 调控 功能 ， 如 核糖 核酸 可 以 在 DNA 水 平和 RNA 水 平 调控 遗传 信息 的 改变 和 阅读 ， 在 大 范围 内 调控 基因 的 表达 ， 调 控 生 物 分 化 、 发 育 、 细胞 周期 、 凋 亡 、 应 激 等 ， 正 在 促进 包括 医 、 药 、 农 等 涉及 生命 科学 各 个 分 支 的 人 员 将 RNA 技术 引进 他 们 自己 的 研究 中 。 随 着 大 量 生 物 领域 的 科研 人 员 进 入 RNA 研究 领域 ， 现 在 有 很 多 分 子 生 物 学 实验 手册 和 RNA 实验 手册 为 他 们 提供 各 种 操作 程序 。 但 很 多 实验 者 仍 然 不 时 会 遇 到 他 们 难以 理解 的 困难 。 其 原因 往往 在 于 ， 实 验 者 对 了 NA 技术 不 甚 y 了 解 ， 面 对 多 种 可 供 选 择 的 操作 程序 无 所 适 从 。 而 实验 的 失败 很 可 能 是 错 用 了 不 合适 的 程序 ， 或 操作 不 当 。RNA 操作 远 比 DNA 操作 困难 ， 原 因 在 于 组 成 RNA 的 核糖 核 昔 酸 比 组 成 DNA 的 脱氧 核糖 核 苷 酸 多 一 个 氧 原 子 ， 它 造成 RNA 的 不 稳定 性 。 而 RNA 的 完整 性 是 RNA 实验 成 功 与 否 的 关键 ,恰恰 是 这 一 点 常 被 某 些 实验 者 忽视 。Robert E. Farrell, Jr. 所 编 的 “RNA Methodologies” 一 书 ， 不 仅 提 供 了 操作 程序 ， 更 冰 明 了 一 些 实验 要 点 和 注意 事项 。 我 想 这 可 能 是 该 书 能 在 12 年 中 出 到 第 3 版 的 原因 吧 ， 这 也 是 我 们 翻译 此 书 的 原因 。 和 希望 此 书 能 帮 助 我 国 RNA 研究 工作 者 更 好 地 理解 RNA 技术 的 内 涵 ， 能 正确 地 使 用 不 同 的 实验 程序 。 和 希

望 此 书 的 出 版 能 促进 我 国 RNA 研究 的 开展 。

我 、 我 所 刘 望 下 和 陆 长 德 两 位 教授 以 及 上 海 交通 大 学 刘建华 教授 四 个 实验 室 共 20 人 ， 参与 了 此 书 的 翻译 与 校对 。 刘 望 丙 教 授 是 我 的 二 师兄 ， 从 事 RNA 研究 已 46 年 多 。 已 过 十 稀 之 年 的 他 ， 于 2005 年 获得 国家 自然 科学 奖 二 等 奖 。 他 那 种 生命 不 息 、 工 作 不 息 、 对 科研 工作 狂 而 不 舍 的 精神 值得 我 学 习 。 陆 长 德 教 授 是 与 我 同年 师 从 王 德 宝 院士 学 习 的 师兄 ， 刘 建 华 是 我 的 小 师弟 。 译 者 邹 永 水 是 我 所 的 退休 教授 ， 其 他 大 部 分 参与 人 员 是 在 学 的 研究 生 ， 他 们 都 有 繁重 的 科研 工作 ， 但 大 家 都 在 不 影响 本 职工 作 的 前 提 下 认真 地 翻译 、 校 对 ， 这 使 我 非 常 感动 。 但 我 相信 ， 这 一 工作 对 他 们 也 是 一 个 很 好 的 学 习 过 程 。 因 为 对 于 进行 了 28 年 RNA 研究 的 我 而 言 ， 同 样 感到 在 翻译 此 书 的 过 程 中 收获 颇 丰 。 此 书 翻译 过 程 中 ， 我 的 夫人 包 臣 中 和 女儿 金 言 也 付出 了 很 多 精力 ， 她 们 都 是 我 的 同行 。 在 此 ， 我 向 所 有 参与 此 书 翻译 的 人 员 表 AR HENS RR

BREW RNA 研究 能 尽快 赶 超 世 界 先进 水 平 。 也 盼望 读者 对 我 们 可 能 存在 的 翻译 失误 提供 宝贵 意见 。

金 由 辛 中 国 科学 院 上 海 生 命 科 学 研究 院 生物 化 学 与 细胞 生物 学 研究 所 2007 #2 A 28 8

前 言

为 什么 要 研究 RNA? 1993 年 “RNA Methodologies” 第 1 版 付 印 时 ， 就 提出 了 这 个 问 题 。 分 离 具 有 生物 活性 及 化 学 稳定 的 RNA， 始 终 是 分 子 生 物 学 的 核心 问题 。 尽 管 这 种 说 法 过 去 未 必 被 人 赏识 ， 在 今天 却 显 得 颇 为 恰当 。 但 是 ， 本 书 第 2 版 出 版 后 ， 很 多 方面 发 生 了 变 化 。 人 类 基因 组 计划 的 完成 ， 预 示 着 以 前 不 为 人 所 知 的 功能 基因 组 和 蛋白 质 组 的 出 现 。 现 在 研究 者 们 经 常 探讨 的 都 是 转录 组 、 蛋 白质 组 、 代 谢 组 ， 还 有 就 是 唯恐 被 我 们 忘记 了 的 基 因 组 。

很 明显 ， 对 组 织 特 异性 基因 表达 调控 的 研究 ， 是 个 聚集 了 强烈 兴趣 的 领域 ， 而 那些 昂贵 的 印 在 尼龙 滤 膜 或 玻璃 站 片上 的 微 阵 列 测 定 ， 又 给 它 加 了 一 把 火 。 但 是 ， 不 管 是 这 些 分 析 手 段 ， 还 是 基于 标准 定量 PCR 之 上 的 测试 ， 都 只 能 建立 在 从 合适 的 生物 材料 中 分 离 到 高 质量 RNA 这 一 基础 之 上 。 只 有 高 质量 的 RNA， 才 能 支持 反 转 录 或 是 其 他 研究 其 功能 的 辅助 实 验 。 同 样 在 这 儿 值 得 一 提 的 是 ， 虽 然 微 阵列 技术 在 当代 研究 工具 中 确 已 点 有 一 席 之 地 ， 但 我 们 所 说 的 那些 “已 被 仔细 检查 过 的 序列 ”， 所 指 的 都 是 已 被 克隆 的 基因 。 微 阵列 技术 并 不 能 直接 支持 对 以 前 未 被 鉴定 的 基因 、 不 同 剪接 的 转录 物 或 多 起 始 位 点 的 转录 物 的 检测 和 鉴定 。

因此 ， 作 为 基因 表达 的 一 个 参数 ， 对 了 NA 的 研究 在 很 多 实验 室 仍然 是 常用 的 。 详 细 检 查 mRNA 的 生物 合成 ， 从 RNA 复杂 性 的 精致 控制 观点 出 发 ， 为 细胞 生物 化 学 提供 了 一 个 独特 的 视角 。 结 合 那些 传统 的 实验 方法 ， 不 同 的 PCR 不 断 提 供 不 同 灵敏 度 和 分 辩 率 的 各 种 方法 ， 以 鉴定 细胞 内 的 转录 活性 。mRNA 的 生物 合成 、 成 熟 和 功能 都 受到 转录 及 转录 后 的 影响 。 它 们 一 起 构成 了 无 数 基因 的 调控 点 。 因 此 ，RNA 的 稳定 性 及 其 加 工 过 程 ， 在 细胞 中 显然 起 着 中 心 的 调控 作用 。

按照 已 有 的 科学 基础 规则 ， 对 了 NA 鉴定 的 方方面面 ， 可 以 从 始 至 终 地 组 成 一 个 连贯 的 整体 。 如 何 才 能 从 至 少 一 个 方面 对 研究 目标 的 基因 表达 调控 给 出 较为 明确 的 解释 呢 ， 从 生物 材料 中 纯化 出 高 质量 的 RNA， 就 是 其 最 为 基本 的 起 点 。 虽 然 与 更 新 、 更 灵敏 的 方法 相 比 ， 很 多 包括 Northen 分 析 在 内 的 传统 技术 ， 已 经 失去 了 往 目 的 光 辉 ， 但 是 ， 深 思 熟 虐 、 应 对 有 度 的 RNA 分 离 技术 ， 依 然 与 随后 的 分 析 和 操作 具有 同等 重要 的 地 位 。 是 否 能 从 细胞 或 组 织 中 分 离 到 RNA， 唯 有 小 心 必 恤 地 处 理 ， 才 能 支撑 后 续 的 这 些 技术 。

本 实验 指南 不 断 收 录 了 已 经 过 测试 和 优化 处 理 的 实验 室 操 作 程 序 (实验 方案 )， 主 要 涉 及 的 是 真 核 RNA 的 分 离 和 鉴定 方法 ， 而 较 少 关注 对 原核 转录 物 的 分 析 。 这 次 第 3 版 中 最 值 得 注意 的 是 ， 新 增加 了 若干 如 何 改 进 商 用 RT-PCR 的 诀 穿 ， 改 良 了 的 5'RACE、3'RACE、 Zw PCR 方法 和 优化 了 的 互补 DNA (cDNA) 合成 方法 ， 以 及 那些 富 含 信息 量 讨论 RNA Fat CRNAiDD 、 微 阵列 和 生物 信息 学 这 些 新 技术 的 章节 。 考 虑 到 目前 对 测定 细胞 内 特定 转录 物 的 绝对 丰 度 的 空前 兴趣 ， 上 述 这 些 方 法 就 显得 尤为 重要 。 显 然 ， 本 书 聚 焦 于 以 RNA 为 基 因 表达 参数 进行 的 研究 ， 并 着 重 于 这 些 技术 的 独立 运用 ， 或 是 如 何 与 其 他 试验 相 结合 ， 对 真 核 基因 表达 的 转录 和 转录 后 调控 进行 研究 。 在 此 ， 我 可 以 提供 的 最 好 的 忠告 是 : 在 实验 时 总 是 多 想 两 步 ， 再 想 想 选用 的 RNA 分 离 方法 是 不 是 会 对 后 面 的 实验 程序 和 最 终 的 数据 解释 造 成 影响 。

本 书 是 为 独立 研究 者 〈 译 者 注 : 一 般 指 课题 组 长 )、 实 验 科 学 家 、 内 科 医 生 、 兽 医师 、 实验 技术 员 、 研 究 生 以 及 其 他 任何 可 能 用 到 基础 研究 技术 的 人 员 编 写 的 。 本 书 有 意 帮 助 从 新 手 到 熟练 的 处 于 各 种 水 平 的 研究 人 员 ， 提 供 在 抉择 的 过 程 中 可 遵循 的 基本 原理 和 切实 可 行 的 权宜 之 策 。 很 多 注释 和 提示 都 是 基于 个 人 的 经 验 ， 为 如 何 更 好 地 从 生物 材料 ， 特 别 是 那些 富 含 核糖 核酸 酶 的 材料 中 得 到 RNA 而 铺路 。 研 究 起 始 时 ， 如 果 认 识 不 清楚 要 研究 什么 和 如 何 进行 研究 ， 就 会 导致 RNA 策略 设计 上 的 缺陷 ， 只 能 日 复 一 日 地 造成 生物 材料 的 浪费 。 尽 管 本 书 不 可 能 全 面 论 及 基因 表达 的 所 有 基本 原理 ， 但 如 何 正确 操作 和 试验 RNA， 确 实 是 反复 出 现 的 主题 。 本 书 也 清楚 地 论证 了 每 一 种 特定 技术 是 如 何 配合 到 核酸 研究 的 总 体 框架 中 去 的 。 虽 然 我 希望 读者 能 从 头 到 尾 研究 本 书 中 的 内 容 ， 但 也 可 以 跳跃 选择 其 中 的 一 些 实 验方 案 ， 而 不 拘泥 于 其 连贯 性 。 对 于 那些 刚 开始 从 RNA 分 析 的 观点 来 研究 细胞 生物 化 学 的 读者 而 言 ， 先 读 一 下 第 26 章 〈 一 个 RNA HH) 可 能 会 有 所 帮助 。

总 而 言 之 ， 全 书 的 所 有 章节 共同 构成 RNA 这 个 特写 。 各 章 都 各 自 提供 了 一 个 明确 的 主 题 。 插 入 流程 图 、 图 表 等 以 促进 学 习 以 及 帮助 研究 规划 和 项 目的 执行 。 研 究 者 仅 受 他 们 上 自己 灵活 性 的 限制 。

我 衷心 感谢 很 多 给 以 理性 鼓励 和 各 种 方式 支持 本 书写 作 的 同事 和 朋友 。 对 我 家 庭 的 支持 和 耐心 也 表示 公开 感谢 。

〈《 金 由 辛 译 ; 金 言 校 )

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为 什么 研究 RNA

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RNA 的 种 类 … 严谨 度 一 一 影响 核酸 结构 的 条 件

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5.2 pH 对 严谨 度 的 影响 5.3 温度 对 严谨 度 的 影响 …

5.4 甲 酰胺 对 严谨 度 的 影响 …………………

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第 2 章 本 组织

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第 4 章 核糖 核酸 酶 …

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核糖 核酸 酶 抑制 剂 的 种 类 …… .3.1 特异 性 RNase 抑制 剂 .3.2 非特 异性 RNase 抑制 剂

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4.4.2 替代 方法 一 一 用 消毒 水 冲洗

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4.4.3 过 氧化 氢 …

4.4.4 氢 氧 化 钠 和 十 二 a3

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实验 方案 : 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 的 2 参考 文献 ……:

基本 原理 pp RNA 纯化 的 目的 -

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实验 方案 : 同时 分 离 RNA 和

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实验 方案 : 原核 RNA 的 分 离

烷 基 硫酸 钠 和 乙酸 钾 试 剂 快速 分 离 RNA …

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5.9.3 实验 方案 : 酵母 RNA 的 分 离 .…… 10 纯化 RNA 的 短期 保存 和 长 期

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第 6 章 从 组 织 中 提取 RNA …

6.

6.

基本 原理 …

组 织 培养 或 组 织

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.3.1 Polytron 破碎 ………:

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4.1 新 鲜 组 织

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.4.3 固定 组 织

实验 方案 : 用 氧化 锂 -尿素 法 从 组 织 分 离 RNA =:

6 实验 方案 : 从 富 含 脂 类 的 组 织 分 离 RNA …

7 纯化 肉 合 在 多 核糖 体 的 mRNA ves

6.7.1 实验 方案 : RAS BBN

mRNA 的 提取

让

CR FE Ove Co

eS eS: 3) 2 ee .9 RNA “41h” FH 6.10 BAH -

S78 SRRHMRNANSR ……….

te

ST Ny Ie IE

.6 oligo(dT)-FAARER -

-1 BARE

3 poly(A) 的 解释 说 明 ………………

4 多 聚 腺 苷 酸化 mRNA 的 分 离 .……………

5 用 磁 珠 技术 纯化 poly(A)* RNA +++ +--+

7.5.1 实验 方案 : 用 磁 珠 纯化 poly(A)+RNA .…………

7.6.1 实验 方案 : 生理 量 的 poly(A)- RNA 纯化 pp

.7 快速 非 柱 式 纯化 poly(A)” RNA …………

7.7.1 实验 方案 : 快速 非 柱 式 纯化 poly(A)+ RNA csseesceeese tects eee eee

8 参考 文献 …

第 8 章 RNA 制 备 的 质量 控制 …

8.

1， 基 本 原理

wee wees

8.2 质量 控制 技术 1: RNA 的 电泳 8.2.1 ZB: renee 8.3 质量 控制 技术 .2: 紫外 吸收 光谱 和 吸收 峰 比 值 … 8.3.1 核酸 浓度 和 纯度 的 鉴定 .pp. 8.4 质量 控制 技术 3: RNA 样品 进行 了 下 -CR 8.5 质量 控制 技术 4: Northern 分 析 ………… 8.6 质量 控制 技术 5: RNA 样品 进行 体外 翻译 … 8.7 参考 文献 … 第 9 章 斑点 印迹 分 析 9.1 基本 原理 … 9.2 BER EWR AY HE ER AUG coe cee cor ene eee cee ene 9.3 合适 的 阴性 对 照 和 阳性 对 照 wee eee eee 9.3.1 实验 方案 : RNA 斑点 印迹 9.3.2 实验 方案 : DNA 斑点 印迹 9.4 BER EDR HE AQIS BRE ccc cee concer eee eee 9.5 参考 文献 - 第 10 章 电泳 . 10.2 PERO RGER FEAL --->-+--- eee TD

实验 方案 : poly(A) 的 标准 化 … .

10.3 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 中 RNA 样品 变性

UO ene 10.3. Z EU SS 10. 3. 4

甲醛 变性 法 …

实验 方案 ， FA PRE AB HE BR oo eee eee ZB /— WER

电泳 …

10.4 分 子 量 标准 … 10. 4. 1 10.4.2 核糖 体 RNA creese cee eee tee eee eee eee

10.5 凝 胶 染色 技术 …:

10.

10. 6

an Go SU AH oH ON

NY Da OO ee W DH

分 子 量 标准 的 正确 使 用 …

SY BR Bh wr creweewiewell SYBR 4 vis han eS GelStar

实验 方案 : 乙 二 醛 化 与 RNA

fi 证 稳 下 5 去 苔 天 可 有 补 芝 人 本

亚 甲 基 蓝 …

ss ences tag Re Se ort. actushers

90

- 92

RO. 10. 8

10.

10. 10. 9

电泳 仪器 的 维护 …

第 一 次 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 时 的 几 点 提示

81 RERRF

人

参考 文献 …

第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析 …

本 11.2

11.4

基本 原理 … 照片 文档 :es，

BET VRP ASA AL, «2-6 te a 亲人 .2.3 安全 第 一 …

.2.4 优化 电泳 图 的 一 些小 技巧 ………… .2.5 照相 技术 和 X 射线 胶片 固有 的 3 加 称 梅 起 二 本 二 11.

3.2 实践 中 需要 考虑 的 问题 … 参考 文献 …

第 12 章 Northern 印迹 分 析 .

2 2

12. 12. 12.

12.°3 12. 4

>> Ss PS 下 NY rma oO FSF WO WO KH

基本 原理 …

90 pa ee 2.1 硝酸 纤维 素 膜 .… cee cee cee cee eee eee eee

ee Wear a Oe sakes sce RRR

2.3 BEA FZ EAB vee cee eee ee eee eee

FBR AY YEAS PBL ooe eee eee eee eee cee eee Northern 转 膜 技 术 … 毛细 转 膜 法 …:

涡轮 印迹 器 cee cee eee eee ees FES ERE cere eee eee

TE FR SE BE vee ee eee eee eee HE EDGR PE vee eee eee eee es 碱 印迹 法 …

实验 方案 : 用 被 动 毛细 扩散 法 转移 RNA vee eee es

.4.8 实验 方案 : 用 涡轮 印迹 器 向 下

HER RNA - 转 膜 后 膜 的 处 理 …………:

25.1 FA BB ABHE Gh on bee cee cee cence denen .5.2 乙 二 醛 变性 系统 ere

固定 技术 :……………:

.6.2 紫外 线 照 射 交 联 .6.3 实验 方案 :

将 RNA 紫外 交 联

Si

第 13 章 “” 核酸 探 针 技术

人 Nay Wye eP see hs BS

13.3 “标记 系统 的 选择 …… 13.3.1

3s 4

FE SEF ES PRY AD BRE a de ee ced ai eee ee leeees $2.9 > Bee eR as Nd

同位 素 标 记 :pp 13.3.2 非 同 位 素 标记 ……………: TIN DNA 探 针 的 合成 ……

13:5 ee RNA AA... S

le Fata |

RNA PRET AVHRR cose eee eeees

13.5.2 RNA 探 针 的 合成 coe cre eee eee eee eee

13.6 FRET AQSTAL ee

13.7 SREP ae AMD

13.8 PY YRS HRY weve eee ceeees 13.9 Hewes 第 14 章 ” 核酸 杂交 应 用 14.1 基本 原理 …

14.2 影响 杂交 动力 学 和 特异 性 的 因素

14. 14. 14. 14. 14. 14. 14. 14. 14. 14. 14. 3 14. 3.1

IE BF vee eee PH seeeeesee cee eeees

探 针 长 度 ………

探 针 的 复杂 性 …

NI IE DY DY DY DY DY YD oo wont Don FF ww DY

杂交 温度 … 长 探 针 的 Ta it +

14.3.2 SRP RRTH Tu 值 计算 杂交 和 Northern 分 析 “pp 预 杂交 ;， WE ABAD FH nee see eee eee reese 实验 方案 : WARS (长 探 针 )

14. 4 14. 4. 1

3 4 杂交 .

.5 vile 严格 洗涤 …

ee

PEELE PEE ce sey sve von SEEDS. (GC) Se «- E... 3.

PRL ESD Ge A: Bank SES. FO > FARR RR coe ses sre see Qhe

° iT

ween

150 | Ps eat 15. FSB EOP RR ct sdnceses

15.2 WHERE

15.2.1 波 膜 的 处 理 cee cee cee cee eee cee eew eee 15.2.2 X BEAR PRE creer cee cence eee eee 15.2.3 BENT 于- -这 < 15. 2.4 曝光 时 间 … 15.2.5 增 感 屏 …… 15.2.6 ”荧光 成 像 法 -ee 15.2.7 PRR PUA …………… 15.2.8 BE FE A HURG -2- 22 eee cereee eee eee eee 15.2.9 显影 与 定 影 ee 15.2.10 放射 自 显影 : 推荐 方案 GREE 4 cil 0% 978 eee 15.3.1 生物 素 ………… eee eee 15.3.2 地 高 辛 ………- 15. 3.3 荧光 标记 的 核 苷 酸 …………… 15.3.4 直接 酶 标 法 .pp 15.3.5 化 学 发 光 检 测 法 .pp 15.3.6 显 色 检测 法 … 15.4 RF MRA BE 15.5 参考 文献 … 第 16 章 ” 核 酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA_ .…… 二 .去 …. 16.1. SEAR RBH eee eee reece eee es 16.2 BEAT cveeee cee cee eee cee cen enn ee OME A231 Se 16.4 FEAL BEM cree 16.5 可 能 的 困难 … 16.6 实验 方案 : S1l 核酸 酶 保护 分 析 法 定量 转录 产物 … 16. 7 aa RNase 保护 分 析 法 定量 转录 产物 … wr at 17 RNA SAT were eee 17.1 SEAR FB coe see eee cee cee cee cee cee eee eee eees

17.2 ”转录 速率 的 检测 …

“人 10

17.3 实验 方案 : 核 逃逸 实验 H+ mRNA 分

17. 3.1 irae 17/33

17. 3. 4

细胞 收集 及 细胞 核 的 制备 用 NP-40 缓冲 液 裂 解 细胞 细胞 核 制备 的 备 选 方案 : 从 组 织 培养 的 细胞 中 分 离 易 损 细胞 核

细胞 核 制 备 的 备 选 方案 ;: 从 完整

213

213

215

17. 3. ras Lo 3- 1758.

1%~3. 17. 4

ges

17.6

teed, 17.8 en

17. 10 第 18 章 18. 2

1822. 18. 2.

18. 3 18. 4 18.5 第 19 章 19.1 19. 2 19.3 19. 4 19.5

19. 5. LO.

19.6 INS bff 19.8 SS

TORS:

1959.

1949: 19. 10 19. 11

19. 12 19. Is

5 RE SE ARID corer eee eee eee ener eee 6 BR FE EY AWC en cee eee ee eee 7 靶 DNA 的 制备 8 ”用 于 杂交 的 RNA 的 制备 oe 9 杂交 后 的 洗 脱 和 检测 … 实验 方案 : 核 逃 逸 实验 〈 备 选 方法 ) …… 实验 方案 ,核酸 酶 保护 和 脉冲 标记 转录 法 … RNA 聚合 酶 I 、RNA 聚合 酶 开 和 RNA 聚合 酶 焉 活性 的 区 分 .………………: 提取 用 于 稳 态 分 析 的 核 RNA +--+ 实验 方案 : 直接 分 离 核 RNA oe 实验 方案 : 从 富 含 核糖 核酸 酶 的 细胞 中 制备 核 RNA” ies- 3: sain ey Sa Se ee ee CDNA ¢ A. +++ 40-86-20 os ss eat: Cee ee ee oe, CDNA: 4 BRA s+0 0+ 00+ tray aete ee 汪 、 1 第 一 链 合 成 的 注意 事项 ee 2 第 二 链 合成 的 注意 事项 .……………: PK CDNA ZBL AG RL BB ne vee cence ee eee ee ts ee ee 参考 文献 … 反 转 录 聚 合 酶 链 反应 eee 基本 原理 … 聚合 酶 链 反 应 概述 … 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 基本 方法 ……… 实验 室 设计 … 人 | INU Hp ne wns ene cen ene cee mnectinewe eos ome aie 1 SEACRR YE «~~ -<< de -aeeR. ge Me 优化 程序 .…… PCR 产物 的 分 析 RT-PCR 质量 监 扩 目 -全 相关 技术 … 1 cDNA 5 末端 快速 扩 增 PCR 2 cDNA 3 末端 快速 扩 增 PCR 3 Sis PCR 实验 方案 : cDNA B-HHAR - 实验 方案 : PCR RMP i cDNA

PCR 产物 的 克隆 - 实验 方案 : 平 未 端 PCR 产物 的 末

19. 14 19.15 19. 16

ce 实验 方案 : TA 克隆 的 连接 反应 TOPO 克隆 -

BAER: enn non cae one seve cerns

$520 TH PCR RAH - ee eee eee

20.1. BEAR BR aoe eee eee cee eee cee cee nee ene ceenee eee 20. 2 灵敏 度 指标 voce eee cee eee cee eee cee eee eee ees 20.3 定量 方法 .……………………….

20.4 - PEWS HAY or vee eee cee eee cee nee wee ees 20.5 .外 源 人 参照 物 .0 20. 6 对 照 反 应 的 规划 .5 20.7 关于 负 对 照 ………:

20.8 竞争 PCR 的 关键 因素 veer creer eee 20.9 竞争 PCR AQ BER wee eee eee eee eee es

20.10 SAH: PEF PCR ver eee eee eee eee ees 20.10.1 非 同 源 竞争 模板 的 合成 ……… 20. 10.2 第 一 链 cDNA 的 合成 20.10.3 竞争 PCR (RP HH) cee 20.10.4 竞争 PCR (次 级 扩 增 ) …………. 20. 11 关于 图 像 分 析 的 考虑 ………:

20. 12 ”竞争 PCR 的 问题 解答 +e eee eee eee eee eee

20.13 Af PCR -----

20.14 BAER cnc cee eee eee eee eee

第 21 章 转录 差 减法 ….

a1. ai. 21. 21. 21. 21.

Qn a orem DS oT

= a ee 关键 问题 ……

差 减 -校正 PCR ………

AE PCR 22 .……………………- 差 减法 的 问题 与 解决 办 法 …

参考 文献 …

第 22 章 mRNA 差异 显示 .………… Cg So SE SS Se ee 22.2 二 般 过 程 …

22.3 产物 的 多 样 性 : 预期 得 到 什么 ………: 22.4 实验 方案 ， mRNA 差异 显示 cee 22.4.1 CDNA 的 合成 [aassameaeoesaaesin。 22.4.2 通过 PCR 扩 增 cDNA 的 各 个 组 分 … 22. 4.3 PCR 产物 分 析 22.5 实验 方案 : 差异 表达 序列 的 鉴定 和 22.6 用 亲 和 俘 获 回 收 差异 表达 的 序列 …… 22.7 PCR 产物 的 克隆 29S Bs ER ei ita RR ca ee ec gate er

321

$2358 ”基因 表达 的 高 通 量 分 析

第 26 章

Py We ee Ly eee

OMe ac)

22.11 mRNA 差异 显示 的 问题 与 解决

22.12 BEIM -

23.1 FEAR HE:

23.2 微 阵列 是 什么 ……

23.3 PABEFI BEAL Z coe een cee cee een cee cee eee eee 23.4 PREF AR BEBE ZA oon eee eee cee eee eee cet eee 23.5 微 阵列 分 析 的 主要 步骤 nee eee cee cee eee 23.6 人 参 比 RNA ……

23.7 Sir Fh See

23.8 参考 文献 …

第 24 RNA 于 扰 一 一 目标 基因 的

二 -本 24.1 基本 原理 ………………: 24.2 BBE AY RNAI 术语 pp 24.3 RNAi 是 如 何 工作 的 coerce eee eee eee 24. 3. 1

24.3.2 shRNA 的 导 人 方法 cee 24.3.3 DNA 指导 的 RNAi 技术 oe 24.3.4 siRNA 导入 哺乳 动物 细胞 的

24.4 APRA SIRNA 设计 生生 下 < 24.5 FAR AIA PY AAD I] BBL --- eee eee eee cee eee eee

24.6 BMA

$238 BAA, RA. SARA

和 生物 信息 学 人 25.2 BERR 25.3 基因 组 与 基因 组 学 …………. 25.4 转录 组 与 转录 组 学 …………………. 25.5 TE Se 5 Be A one ne ee eee ceeeee 25.6 WT Be nnn one connec nse cee ene nnncee ene one 25.7 参考 文献 ……………………-

一 个 RNA 范例 ………

20 二 宝 险 了

26.2 FA RERE RD]: ee 生机 RES. Le

26.3 ”有待 进 26. 4

尾声 i a Relating en Re

REA ay 全、

358

Sp ee

附录 1 附录 2 附录 3 附录 4 附录 5 附录 6 附录 7

附录 8 附录 9

保存 完整 和 准确 的 记录 ……… 苯酚 的 制备 …

省 化 乙 锭 和 SYBR 绿 溶 液 的

处 置 ae:

用 DNase | &BR RNA 样品 中 的 DNA

用 RNase & BR DNA 样品 中 的 RNA

FH. RAZ ORK 硅烷 化 离心 管 和 玻璃 器 严 …

分 子 生 物 学 家 的 主流 工具 一 一 高

Sons 72 St iff)

附录 10

附录 11 附录 12 附录 13 附录 14 附录 15 附录 16 附录 17 附录 18

Ris He -

索引

心 法 . cee 胰 和 蛋白 酶 消化 贴 壁 细 胞 的 方法

用 盐 析 法 分 离 高 分 子 量 DNA

从 植物 组 织 中 分 离 RN 人 至 本 os

电泳 一 一 原理 、 参 数 和 安全 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 仪器 、 试 剂 和 服务 的 供应 商

ST 词 闫 ww 全

通用 缩写 商标 引用

#215 RNA 与 细 胞 主 物 子

1.1 为 付 么 研究 RNA

所 有 细胞 和 组 织 的 功能 ， 最 终 都 受到 基因 表达 的 调控 。 之 所 以 选择 研究 RNA 调控 作为 细胞 生物 化 学 的 参数 之 一 ， 其 理由 就 像 细 胞 内 RNA 群体 一 样 复 杂 多 样 。 通 常 ，RNA 的 性 状 总 是 与 具体 科学 研究 过 程 中 提出 的 转录 〈 即 基因 表达 ) 问题 联系 在 一 起 。

任何 RNA 实验 设计 的 目标 ， 通 常 涉 及 一 个 或 多 个 功能 问题 ， 下 面 列 出 了 一 些 这 类 问题 。

© 测定 细胞 转录 物 的 恒 态 丰 度 @。 因 为 RNA 很 容易 分 离 ， 所 以 恒 态 丰 度 是 最 常 被 研究 的 基因 表达 参数 。 通 过 Northern 杂交 、 核 酸 酶 保护 实验 或 PCR 相关 方法 等 测定 ， 可 以 对 RNA 表达 谱 进 行 定性 与 定量 分 析 。

Q 基因 序列 转录 或 RNA 加 工 途 径 的 速度 测定 。 这 个 可 以 用 新 生 mRNA 分 析 技 术 CK 逃逸 实验 ) 来 进行 推断 ， 至 少 可 以 进行 部 分 推 新 。 新 生 mRNA 分 析 技 术 就 是 将 放射 性 同位 素 标记 的 核糖 核 苷 酸 前 体 挫 人 新 生 转 录 物 ， 再 测定 各 种 RNA 中 挫 入 同位 素 的 比例 。 该 比例 即 对 应 于 各 种 RNA 的 丰 度 。 再 结合 Northern 杂交 的 结果 ， 就 能 推 知 对 该 序列 的 调控 是 发 生 在 转录 水 平 还 是 转录 后 事件 所 造成 的 结果 。

@ RNA 分 子 一 级 结构 的 作 图 ， 包 括 5 末端 、3 末端 、 内 售 子 的 大 小 和 位 置 。 以 前 人 们 通过 核酸 酶 保护 实验 〈 见 第 16 章 ) 来 完成 这 项 工作 ， 但 现在 基本 上 都 使 用 PCR 的 变 体 ， 如 cDNA 未 端 快速 扩 增 (5'RACE 和 3'RACE， 见 第 19 章 )。

® 在 体外 无 细胞 系统 对 纯化 了 的 mRNA 进行 翻译 。 这 样 得 到 的 多 肽 ， 可 进一步 用 于 免 疫 沉 淀 或 Western 杂交 分 析 。 体 外 翻译 至 少 代 表 了 一 种 对 特殊 转录 物 鉴定 的 方法 〈 由 于 提 供 了 翻译 所 需 的 模板 等 原材料 ， 因 此 可 以 证 明 某 个 只 是 推定 了 属性 的 转录 物 是 否 能 够 支持 预 期 序列 多 肽 的 合成 ) 。 例 如 ， 这 种 方法 可 以 用 于 证 明 ， 来 自 可 变 转录 起 始 位 点 的 两 个 转录 物 是 否 来 自 同一 个 位 点 。 体 外 转录 在 药物 设计 等 应 用 研究 中 也 是 有 用 的 。 因 为 对 一 个 蛋白 质 的 三 级 结构 、 野 生 型 或 突变 型 功能 的 了 解 可 能 会 对 其 在 功能 蛋白 质 组 领域 的 新 应 用 方面 提供 一 些 启示 。

@ cDNA 的 合成 。 可 以 以 纯化 的 mRNA 为 模板 ， 利 用 酶 法 转化 ， 将 相对 不 稳定 的 单 链 分 子 转变 成 稳定 的 单 链 cDNA 或 双 链 cDNA。 合 成 CDNA 的 理由 众多 ， 其 中 之 一 ， 就 是 因 为 用 PCR 方法 可 以 扩 增 这 些 核酸 序列 。 然 后 ， 可 以 做 的 工作 就 非常 之 多 ， 例 如 ， 定 量 或 对

@ 细胞 或 某 个 亚 细 胞 组 分 〈 如 细胞 核 或 细胞 质 ) 中 最 终 RNA 的 积累 量 被 称 为 该 RNA 的 恒 态 量 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

转录 本 作 图 ， 直 接连 接 到 测序 载体 或 表达 载体 里 ， 或 用 来 合成 整个 CDNA 文库 〈 较 正式 的 名 称 是 克隆 库 ， 可 通过 繁殖 来 长 期 保存 和 分 析 )。 一 旦 合成 了 这 样 一 个 文库 ， 就 对 细胞 裂解 或 组 织 破 坏 这 一 瞬间 的 细胞 生化 建立 了 永久 的 记录 。 就 历史 的 观点 而 言 ，cDNA 合成 无 疑 是 分 子 生物 学 实验 室 技术 上 最 重要 和 最 具 挑 战 性 的 方法 之 一 。

无 论 是 从 化 学 还 是 生物 学 的 角度 而 言 ，RNA 都 没有 DNA 稳定 ， 尤 其 是 在 较 高 温度 (>65°C) 或 是 碱 存在 的 情况 下 。 除 了 内 在 的 不 利 因素 之 外 ， 多 种 具有 核酸 内 切 活性 和 核酸 外 切 活 性 又 极 易 复 性 能 力 的 核糖 核酸 酶 ， 不 仅 对 底 物 明显 具有 普 适 性 ， 而 且 还 很 难 被 摧毁 。 因此 ， 从 富 含 核糖 核酸 酶 的 生物 材料 中 制备 RNA 是 极 具 挑 战 性 的 。 以 上 因素 要 求 使 用 未 被 核糖 核酸 酶 污染 的 试剂 快速 回收 RNA。 同 样 ， 抽 提 策 略 还 必须 考虑 ， 如 何 应 对 原本 封闭 在 细胞 器 或 是 液 泡 内 ， 而 在 抽 提 过 程 中 被 释放 出 来 的 胞 内 核糖 核酸 酶 。 对 程序 中 潜在 核糖 核酸 酶 污染 的 大 意 失察 ， 几 乎 无 一 例外 地 会 导致 RNA 降解 ， 以 臻 最 终 导致 样品 的 报废 。 至 于 到 底 选 用 哪 一 种 抽 提 步 又 ， 就 需要 研究 者 先 考虑 “纯化 结束 后 这 些 RNA 要 拿 来 做 什么 >。 前 几 步 操作 带 来 的 污染 即使 是 痕 量 的 ， 也 会 影响 到 后 续 反 应 的 效率 。 并 且 ， 由 于 paheengit 天 生 很 得， 与 RNA 相关 的 实验 最 好 就 安排 在 RNA 纯化 的 当天 进行 。

1.2 RNA 是 什么 RNA 是 一 个 长 长 的 、 无 分 支 的 、 以 磷酸 二 酯 键 连接 起 来 的 、 由 核糖 核 苷 单 磷 酸 单元 构

pee 成 的 多 聚 物 。 原 核 RNA MAK RNA 均 为 单 链 分 子 。 组 成 RNA (AIDNA) WEA RTE RHR.

要 se 核 苷 酸 由 三 个 主要 部 分 组 成 : 一 个 五 碳 糖 CRNA noo Moo, SAS BH 中 是 核糖 ，DNA 中 是 脱氧 核 精 )、 至 少 一 个 磷酸 HL alah Ta aa 基 团 和 一 个 碱 基 C11). ABS & RAE du <— RNA 合成 核 苷 ， 再 加 上 一 个 磷酸 基 团 ， 就 成 为 核 昔 酸 :，

(H) «— DNA RNA 与 DNA 的 主要 差异 是 : OBE 2 位 带

图 1.1 5/- 腺 音 三 确 酸 (ATP)。 三 个 组 成 型 羟基 (—OHD, ii DNA 中 的 五 碳 精 “〈 脱 氧 核糖 )

磷酸 基 团 a. BAY. HBR Ge) ”2 位 不 带 羟 基 ，@RNA 中 不 含 胸 腺 喀 啶 ， 取 而 代 -

的 距离 ， 由 近 到 远 编码 。 当 2'-OH 被 H 之 的 是 与 胸腺 喀 啶 很 相似 的 尿 喀 啶 9。RNA HK

取代 ， 该 分 子 即 成 为 脱氧 核 苷 酸 苷 酸 组 装 而 成 ，DNA 由 脱氧 核 苷 酸 组 装 而 成 。 因

此 ，RNA 以 其 含有 核糖 而 得 名 ， 就 如 DNA 以 其 含有 2 -脱氧 核 苷 酸 而 得 名 。 表 1.1 和 表 1.2 列 出 了 它们 的 基本 特征 和 以 组 成 成 分 的 命名 。

表 1.1 核 背 酸 结构 比较

项 目 核糖 核 苷 酸 脱氧 核糖 核 苷 酸

主要 组 成

常见 的 含 氮 碱 基 ry Wi Wie

五 碳 糖 .磷酸 基 团 FA HE 脱氧 五 碳 糖 磷酸 基 团 、 含 氮 碱 基

ARMS SR Fi PE BoE DR

ARE See 胞 喀 啶 、 胸 腺 喀 喧

@ 就 化 学 命名 而 言 ， 胸 腺 喀 啶 为 甲 基 尿 喀 啶 。

第 1 章 ， RNA 与 细胞 生物 学

表 1.2 基本 碱 基 、 核 苷 、 核 音 酸 的 命名

BH ROH = RR)

5! RS RTF = BEAR 5'- 胞 喀 啶 核 苷 三 磷酸 5 - 鸟 味 叭 核 苷 三 磷酸 5 - 尿 喀 啶 核 苷 三 磷酸

5 -脱氧 腺 味 叭 核 并 三 磷酸 5 -脱氧 胞 喀 啶 核 苷 三 磷酸 5 -脱氧 鸟 味 叭 核 苷 三 磷酸 5 -脱氧 胸腺 喀 啶 核 苷 三 磷酸

注 : 核 苷 仅 由 一 个 碱 基 和 一 个 五 碳 糖 组 成 ， 核 苷 至 少 加 一 个 大 酸 基 团 就 成 为 核 音 酸 。 含 氮 碱 基 〈 图 1. 2) 和 五 碳 糖 均 为 环形 。 为 区 分 特定 核 苷 酸 的 五 碳 糖 或 碱 基 上 的 碳 原

子 ， 使 用 了 特殊 的 编号 系统 。 碱 基 上 的 碳 和 sua co 氨 原 子 用 1、2、3 等 依次 编号 ， 而 五 碳 糖 NH, inlaid 上 的 碳 原 子 则 用 1 、2 、 m 13 a oa: tae

核 苷 三 磷酸 无 论 作为 总 体 还 是 单个 ， 都 ea — d ea 用 NTP 表示 。 在 各 种 分 子 生物 学 实验 手册 is Be a hats HH, NIP (teem Raw ATP. cTP, MEL ot LR AD GTP 和 UTP。 核 音 三 磷酸 前 加 d 后 则 表示 脱 ioe H ig

Anas ME AQ ARIEIE FRNBIE 共同 结构

氧 核 苷 酸 ， 如 dATP. dCTP, dGTP 和 dTTP. 在 实验 手册 中 ，dNTP 表示 等 摩尔 比 的 四 种 “图 1.2 核 苷 酸 以 连接 在 1' 位 的 碱 基 种 类 命名 。 脱氧 核 苷 酸 混 合 物 。 上 述 两 类 核 苷 的 三 磷酸 BWM RNA A DNA 的 核 苷 酸 用 标准 的 单字 符 表 形式 ， 可 分 别 被 RNA 聚合 酶 和 DNA 聚合 酶 示 ， 如 腺 味 叭 (A), Fee CC), See 识别 ， 因 此 在 核酸 合成 中 作为 前 体 。 紧 靠 核 人

糖 的 磷酸 基 团 为 w- 磷 酸根 ， 随 后 依次 为 丰 磷 酸根 、 六 磷酸 根 。 广 磷酸 根 距 离 核糖 最 远 〈 见 图 11). BRAM, BRERA 7 磷酸 根 被 切除 ， 产 生 的 核 苷 一 磷酸 则 挫 和 人 新生 的 多 核 苷 酸 链 。

1.3 多 核 匠 酸 的 合成

RNA 聚合 酶 负责 参与 RNA 的 合成 〈 见 第 2 章 )， 同 样 ， 任 何 一 种 DNA 聚合 酶 都 参与 DNA 的 合成 。 因 此 ， 任 何 具 聚 合 酶 活性 的 酶 都 能 以 核 苷 酸 为 前 体 合成 核酸 分 子 。 核 酸 分 子 就 是 由 核 苷 酸 以 磷酸 二 酯 键 连接 成 的 多 核 苷 酸 链 。 在 核酸 聚合 酶 催化 下 ， 新 生 核 酸 链 中 最 后 一 个 核 苷 酸 的 3 -羟基 ， 亲 水 攻击 新 挫 人 核 苷 酸 的 5 -磷酸 根 ， 就 形成 了 磷酸 二 酯 键 。

假设 细胞 内 的 生物 化 学 反应 能 支持 RNA 分 子 的 起 始 和 延伸 ， 则 在 体内 〈 和 体外 ) 必须 维持 如 下 两 个 基本 条 件 。

OD 必须 存在 一 个 模板 链 ， 可 以 指导 核 苷 酸 以 反 向 互补 的 方式 正确 挫 人 新 生 的 核酸 链 。

3.

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

配对 方式 必须 符合 夏 格 夫 法 则 ， 即 A::U 或 A::T 工 通过 两 对 氢 键 配对 ，G :::C 以 三 对 氢 键 配对 。

@ 起 始 和 延伸 时 ， 必 须 存在 一 个 游离 的 核 背 酸 3 -OH， 它 可 以 与 下 一 个 核 苷 酸 以 磷酸 二 酯 键 连接 。 因 此 体内 或 体外 的 转录 过 程 均 需要 引物 提供 游离 的 3 -OH。DNA 合成 也 需要 引物 8。 分 子 克 隆 中 所 使 用 的 大 多 数 聚 合 酶 都 需要 模板 和 引物 的 3 -OH。

多 核 背 酸 的 延伸 涉及 核 苷 单 磷酸 的 挫 入 ， 而 磷酸 二 酯 键 的 形成 伴随 着 焦 磷 酸 的 释放 。 无 论 是 RNA 还 是 DNA AM, MEM 5 向 3 延伸 合成 多 核 苷 酸 。 在 相 邻 的 核 苷 酸 间 保持 统一 的 5 一 3 连接。 延伸 常 被 归 因 于 聚合 酶 5 向 3 的 延伸 活性 。

核酸 分 子 的 组 装 方式 如 下 。

@ 分 子 的 两 个 末端 结构 截然 不 同 。 分 子 的 第 一 个 核 苷 酸 带 有 未 参与 反应 的 5-( 三 ) 磷 酸 ， 构 成 了 所 谓 的 5 末端 8。 最 后 加 上 去 的 核 苷 酸 所 带 的 3 -OH， 被 称 为 分 子 的 3 末端 。

Q 分 子 骨架 又 称 磷 酸 二 酯 键 骨 架 ， 由 交替 排列 的 五 碳 糖 和 磷酸 基 团 组 成 。 由 于 磷酸 根 的 原因 ， 致 使 分 子 带 负电 。

Q 碱 基 突 出 在 骨架 外 部 。 从 立体 化 学 角度 看 ， 骨 架 上 伸 出 的 碱 基 很 容易 与 互补 的 多 核 苷 酸 序列 形成 氢 键 〈 碱 基 对 )。 这 是 分 子 杂 交 的 核心 ， 当 然 双 链 也 就 是 如 此 形成 的 。

eh FU DAZE Tt MRS CARERS AS RS) ARE CHE. A RE A PR ED. ET AB

’ 是 扁平 的 芳香 类 分 子 〈 见 图 1. 2). RS me

的 碱 基 对 ， 主 要 由 腺 味 叭 和 胞 喀 啶 的 氨基 〈 不 偏好

，“ 亚 氨基 ) 及 乌 吧 叭 和 胸腺 喀 呈 或 尿 喀 喧 的 醒 基 《不

Wath REE) 维系 。 当 具有 亲 电 性 的 氢 原 子 被 具 亲

核 性 的 原子 如 氧 或 氨 吸 引 ， 互 补 碱 基 间 的 氧 键 就 形

成 了 。 这 些 氢 键 都 是 高 度 方向 性 的 。 由 于 碱 基 从 各 自 磷酸 二 酯 键 骨 架 上 突出 ， 这 种 方式 更 有

利于 碱 基 对 或 互补 链 间 的 杂交 以 反 平 行 方式 形成 。 因 此 ， 碱 基 配 对 的 两 条 链 中 ， 一 条 链 的 5 末端 与 其 互补 链 的 3 末端 形成 碱 基 对 CAI 1. 3) 。

基于 分 子 5 末端 和 3 末端 明显 的 结构 差异 形成 了 这 样 一 种 惯例 ， 可 以 很 明确 地 指出 具 有 任何 拓扑 性 质 的 核酸 分 子 的 位 置 ;

上 游 一 一 相对 其 他 位 置 靠近 或 处 于 分 子 5 方向 的 结构 或 特性 。

下 游 一 一 相对 其 他 位 置 靠近 或 处 于 分 子 3 方向 的 结构 或 特性 。

出 于 简洁 的 要 求 ， 上 游 和 下 游 可 以 相应 地 用 来 表示 “和 表达 的 方向 相反 ”与 “和 表达 的 方向 一 致 > 。 在 描述 双 链 分 子 的 显著 特征 ， 例 如 讨论 基因 的 表达 或 是 设计 PCR 引物 时 ， 这 种 命名 法 显得 特别 有 利 。

多 核 苷 酸 的 具体 碱 基 序列 被 称 为 RNA 的 一 级 结构 。 单 个 RNA 分 子 高 度 倾向 于 形成 分 子 内 碱 基 配 对 ， 这 又 被 称 作 二 级 结构 。 分 子 内 几 种 可 能 的 相互 作用 有 诸多 的 命名 ， 如 RNA 发 夹 结 构 、 蔡 、 内 部 环 (interior loop) 、 突 环 (bulge loop)、 多 枝 环 (multibranched loop) 和 假 结 。 更 高 层次 的 三 维 折 友 〈 也 被 称 作 三 级 结构 ) 是 对 二 级 结构 元 件 集合 的 最 好 的 描述 ， 这 种 结构 是 RNA 分 子 行使 生物 功能 所 必需 的 。tRNA 是 极 好 的 分 子 内 碱 基 配 对 案例 ， 对

© 唯一 不 需要 模板 信息 就 能 添加 核 苷 酸 的 DNA 聚合 酶 ， 就 是 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 ， 也 称 末端 转移 酶 。 此 酶 已 被 广泛 应 用 于 cDNA 的 合成 以 及 某 些 形 式 的 5'RACE。 将 在 第 18 MAD 19 章 内 讨论 这 些 特例 。 @ 真 核 生 物 mRNA 5 末端 带 特征 性 的 帽 式 结构 。 详 情 见 第 3 章 。 .* 4 J

第 1 章 RNA 与 细胞 生物 学

tRNA 的 详细 研究 ， 解 释 了 很 多 折 礁 结构 的 作用 。 很 大 程度 上 ， 许 多 RNA 的 二 级 结构 和 三 级 结构 ,都 可 能 对 非 标准 碱 基 配 对 的 形成 有 贡献 9。 大 多 数 实验 室 操作 中 ， 常 常 需要 在 实验 前 破坏 RNA 的 高 级 结构 ， 和 否则 对 RNA 相关 的 实验 会 造成 严重 的 负面 影响 ， 这 在 后 文中 会 再 讨论 到 。

1.4 RNA 的 种 类

通常 把 转录 所 得 的 RNA 分 子 称 为 转录 物 。 细 胞 内 的 转录 物 有 核糖 体 RNA (rRNA), 转移 RNA (tRNA) 、 核 不 均一 RNA (hnRNA), {Aff RNA (mRNA) 以 及 其 他 RNA。 不 同 的 RNA 由 不 同 的 RNA 聚合 酶 合成 ， 并 在 细胞 中 行使 不 同 的 功能 。 这 些 种 类 繁多 的 RNA 群体 在 细胞 中 的 丰 度 并 不 相同 。 各 种 RNA 的 丰 度 直接 与 细胞 生化 状态 有 关 。

rRNA 是 所 有 转录 物 中 丰 度 最 高 的 品种 。 原 核 细胞 中 主要 的 rRNA 品种 是 23S rRNA, 16S rRNA 和 5S rRNA。 真 核 生 物 中 主要 是 28S rRNA, 18S rRNA, 5S rRNA 和 第 四 种 核 糖 体 转录 物 5. 8S rRNA。 这 些 分 子 组 成 了 核糖 体 的 脚手架 。 当 它们 与 约 70 种 蛋白 质 结 合 后 ， 核 糖 体 就 具有 了 和 蛋白 质 翻 译 活 性 。 任 何 时 间 里 并 非 所 有 的 核糖 体 都 是 有 功能 的 。 短 暂 的 无 活性 核糖 体 库 的 存在 ， 其 本 身 就 是 基因 表达 的 调控 器 。rRNA 的 超 高 丰 度 常 使 它 成 为 电泳 的 上 样 对 照 和 外 加 的 分 子 标记 COLES 10 章 )。

tRNA 承担 将 氨基 酸 带 入 核糖 体 ， 以 供 从 无 到 有 的 蛋白质 合 成 。tRNA 携带 氮 基 酸 ， 长 度 小 于 100 碱 基 ， 主 要 在 74~95 碱 基 长 度 的 区 间 。 当 tRNA 以 其 3 末端 共 价 连接 方式 携带 氨基 酸 时 ， 它 被 称 为 氨 酰 化 的 tRNA。 在 mRNA 的 编码 区 COL 3 章 )， 每 组 3 个 核 苷 酸 组 成 一 个 密码 子 。 依 赖 于 tRNA 中 被 称 为 反 密 码 子 的 三 核 苷 酸 ， 通 过 互补 方式 识别 mRNA, 使 正确 的 氨基 酸 进入 新 生 的 多 肽 链 。 核 糖 体 上 tRNA 反 密 码 子 与 密码 子 间 的 碱 基 对 ， 支 持 了 蛋白质 的 延伸 〈 见 Lewin 的 综述 ，2004)。tRNA 的 组 成 中 ， 还 有 一 些 修饰 碱 基 ， 如 假 尿 mie OW), EME HE FAR EDS a Ik. NR AY. GUA GY, BR tR- NA 的 丰 度 不 如 rRNA 的 高 ， 但 是 小 分 子 的 tRNA 在 翻译 中 起 中 心 作 用 。

mRNA 是 所 有 转录 物 中 最 不 均一 的 RNA。 具 讽刺 意义 的 是 ， 尽 管 mRNA 的 丰 度 很 低 ， 但 它 起 着 决定 细胞 表 型 的 作用 。mRNA 通过 利用 由 大 量 rRNA 和 tRNA 组 成 的 翻译 装置 ， 单独 指导 和 蛋白质 的 合成 。 细 胞 中 不 同 mRNA 之 间 ， 它 们 各 自 的 数量 和 丰 度 变化 很 大 。 有 些 mRNA 一 个 细胞 里 有 数 百 个 拷贝 ， 而 另 一 些 mRNA 一 个 细胞 中 仅 几 个 拷贝 。 真 核 细胞 中 有 功能 的 mRNA 来 自 于 经 过 剪接 和 修饰 的 核 不 均一 RNA (ChnRNA)， 它 也 是 分 子 生 物 学 家 最 感 兴趣 的 RNA。

1.5 严 给 度 一 一 影响 核酸 结构 的 条 侍

一 个 双 链 核酸 分 子 中 的 两 个 单 链 实际 处 于 动态 变化 中 。 在 实验 室 里 一 些 变化 ， 如 两 个 单 链 核酸 分 子 在 其 互补 碱 基 间 形成 稳定 氢 键 的 能 力 ， 是 可 以 被 操作 的 。 在 实验 室 里 ， 研 究 人 员 应 该 具有 促进 或 阻止 双 链 分 子 形成 的 能 力 。 研 究 人 员 也 经 常 需要 在 一 个 实验 中 ， 使 一 个 分 子 在 单 链 形式 和 双 链 形式 间 变 化 。 分 子 生 物 学 家 已 经 接受 了 一 个 术语 “严谨 度 ”， 以 描述 给 定

© 标准 碱 基 配 对 : G-C 和 A-U; 非 标准 碱 基 配 对 : A-C, G-U, U-U, G-G, A-w, G-v, A-A-U 和 其 他 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

的 一 套 条 件 。 这 些 条 件 被 用 来 正确 操作 多 核 苷 酸 的 状态 。 严 说 度 是 一 种 可 能 性 测定 ， 即 双 链 核酸 分 子 解 聚 成 组 成 它 的 单 链 的 可 能 性 。 严 说 度 也 是 一 种 单 链 核酸 分 子 的 能 力 测定 ， 即 区 分 哪些 分 子 间 能 高 度 互补 ， 哪 些 分 子 间 较 少 互补 。 因 此 严谨 度 是 互补 核酸 分 子 在 可 能 被 认为 相 当 对 立 条 件 下 的 行为 总 和 。 实 践 中 高 严谨 度 的 条 件 ， 仅 仅 有 利于 高 度 同 源 的 核酸 分 子 间 或 者 所 谓 的 精确 配对 序列 间 的 稳定 杂交 。 如 果 一 个 系统 中 严谨 度 下 降 ， 则 非特 异 杂 交 成 比例 地 增 加 ， 即 意味 着 “ 错 配 ” 是 可 以 容忍 的 。

可 以 促进 或 阻止 核酸 杂交 的 体外 操作 因素 ， 包 括 PH、 离子 强度 、 温 度 和 甲 酰胺 Ge 1. 3)。 应 该 认 清 的 两 个 重要 事实 是 : 其 一 ， 这 些 外 在 变量 实际 上 行使 的 是 相当 于 时 间 一 样 的 功能 ;其 二 ， 由 双 链 到 单 链 或 单 链 到 双 链 ， 并 不 是 一 个 在 瞬间 就 可 以 完成 的 转换 。 核 酸 的 内 在 质量 和 分 子 长 度 〈 组 成 核 苷 酸 的 数目 ) 以 及 两 个 单 链 分 子 的 互补 程度 ， 所 有 这 些 都 影响 双 链 在 任何 给 定 严 谨 度 下 的 稳定 性 。 事 实 上 ， 对 这 些 变量 进行 的 操作 就 是 微调 核酸 分 子 在 高 度 互补 和 低 度 互补 状态 间 改 变 的 能 力 。

表 1.3 影响 核酸 结构 的 因素

低 严谨 度 高 严谨 度 | 低 严谨 度 高 严谨 度 低 盐 低温 高 温 微 酸性 pH 碱 性 pH

注 : 低 严 谨 度 环境 促进 了 双 链 分 子 的 形成 ; 而 随 着 严谨 度 的 增加 ， 双 链 分 子 更 倾向 于 解 聚 成 单 链 。 加 和 人 甲 酰胺 有 助 于 在 较 低 温度 下 维持 高 严谨 度 。

试图 用 改变 温度 的 方法 来 获得 一 个 高 严 阐 度 的 环境 ， 需 要 将 温度 提高 到 危及 RNA 或 DNA 分 子 化 学 稳定 性 的 温度 。 为 了 排除 这 一 潜在 的 严重 问题 ， 甲 酰胺 这 种 有 机 溶剂 常 被 用 于 构建 较 低 温度 下 的 高 严谨 度 ， 这 样 就 不 大 可 能 危及 核酸 分 子 的 完整 性 。 甲 酰胺 主要 是 通过 干扰 氢 键 形成 而 降低 碱 基 配 对 分 子 的 解 链 温度 (Ta )。 双 链 分 子 的 Tu 被 认为 是 最 好 的 平衡 点 ， 也 即 在 这 个 温度 下 ， 有 50 妈 的 双 链 分 子 解 聚 成 为 单 链 。 高 严谨 度 杂 交通 常 在 略 低 于 计 算 预 测 的 Ta 温度 下 进行 ， 以 保证 杂交 的 完全 。 加 入 甲 酰胺 有 效 降 低 了 进行 高 严谨 度 杂 交 所 需要 的 温度 ， 因 此 给 研究 者 对 实验 参数 的 选择 带 来 了 更 大 的 自由 度 。

为 了 调节 严谨 度 而 加 入 甲 酰胺 ， 可 能 使 得 状态 复杂 化 ; 另外 ， 也 存在 其 他 可 以 起 相同 作 用 的 简单 方法 ， 如 提高 或 降低 盐 浓度 ， 增 加 或 降低 系统 温度 。 在 核酸 混合 物 中 ， 低 严谨 度 条 “ 件 有 利于 或 促进 双 链 形成 ， 而 高 严谨 度 条 件 则 有 利于 或 促进 单 链 的 形成 。 以 下 讨论 每 个 与 严 谨 度 相关 的 变量 的 精确 贡献 。 更 多 细节 详 见 第 14 章 。

1.5.1 盐 对 严谨 度 的 影响

生理 状态 下 的 离子 强度 处 在 10~20mmol/L 之 间 。 在 实验 系统 中 ， 由 于 核酸 链 带 负 电 ， 天 然 的 静电 排斥 会 阻止 互补 链 之 间 碱 基 对 的 形成 ， 而 单价 阳离子 在 或 低 或 高 的 浓度 下 可 以 中 和 这 一 静电 排斥 。 最 常 被 用 作 抗衡 离子 的 单价 阳离子 有 Nat. KY. Lit, ENEMA HH 电 的 磷酸 二 酯 键 骨架 间 的 静电 排斥 变 小 。 在 低 浓 度 盐 或 无 盐 条 件 下 ， 静 电 排斥 得 到 加 强 ， 结 果 有 利于 双 链 分 子 的 解 聚 。 在 细胞 内 ， 带 阳离子 的 蛋白 质 至 少 部 分 中 和 了 核酸 的 负电 ， 因 此 阻止 了 不 正确 的 链 变性 。

1.5.2 pH 对 严谨 度 的 影响

pH 会 影响 核酸 分 子 的 离子 化 程度 。 在 近 中 性 的 生理 pH 条 件 下 ， 核 酸 处 于 一 定 程 度 的 °6-

第 1 章 RNA 与 细胞 生物 学

离子 化 状态 。 虽 然 此 时 的 多 核 苷 酸 分 子 带 负 电 ， 但 在 互补 的 多 核 苷 酸 之 间 仍 然 可 以 发 生 杂 交 。 而 在 稍 低 于 生理 pH 的 条 件 下 ， 偏 酸 的 环境 将 导致 核酸 ， 特 别 是 双 链 核酸 (dsDNA) 发 生 固 缩 。 但 是 ， 体 外 低 于 pH5 的 酸性 环境 就 非常 危险 ， 因 为 脱 味 叭 反应 “〈 即 降解 ) 将 快 速 发 生 。 高 于 生理 pH 的 偏 碱 性 环境 ， 会 增加 磷酸 基 团 的 解 离 ， 静 电 排斥 力 超过 双 链 分 子 的 热 动力 学 稳定 性 ， 结 果 造 成 链 的 解 聚 。 虽 然 实验 室 广 泛 使 用 NaOH 来 变性 DNA， 但 进行 RNA 实验 时 ， 切 记 RNA 分 子 对 于 碱 水 解 是 极其 敏感 的 。 不 要 将 RNA 暴露 在 强 碱 环境 (pH>8.6) 下 ， 除 非 想 破坏 它 。

1.5.3 温度 对 严谨 度 的 影响

通常 温度 的 作用 与 盐 浓 度 的 作用 相反 。 双 链 的 热 动力 稳定 性 不 仅 与 核 苷 酸 长 度 有 关 ， 也 5SEK AWM 〈G 十 C) 的 含量 有 关 ， 因 为 在 乌 叶 叭 与 胞 喀 喧 之 间 有 STAR. MER 味 叭 和 尿 喀 啶 之 间或 腺 嗓 哈 和 胸腺 喀 啶 之 间 只 有 2 个 氢 键 。 系 统 加 热 超 过 双 链 的 Th 值 时 ， 双 链 就 很 容易 发 生 解 聚 。 并 且 ， 越 短 的 核酸 分 子 对 温度 的 升 高 越 敏 感 。 任 何 一 位 分 子 生 物 学 家 都 可 以 为 下 述 事实 作证 : 小 小 的 1C 的 变化 ， 就 可 以 轻易 影响 到 朝 核 苷 酸 的 工作 性 能 。 守 BE BARA PCR 引物 工作 还 是 不 工作 ， 仅 仅 就 因为 在 计算 热 动力 学 参数 时 犯 下 的 1C 之 善 。 关 于 条 交 和 杂交 后 洗涤 的 精确 实验 条 件 可 参见 第 14 章 ， 用 作 PCR GI WN RAH 酸 将 在 第 19 章 讨论 。

1.5.4 甲 酰胺 对 严谨 度 的 影响

双 链 分 子 的 Tm 值 主 要 决定 于 碱 基 对 的 数量 和 CGC) 含量 ， 特 别 是 对 于 不 到 100 碱 基 对 的 分 子 更 是 如 此 。 在 这 样 的 系统 中 ， 双 链 分 子 的 热 稳定 性 对 系统 温度 极其 敏感 。 因 此 ， 对 于 长 探 针 可 能 需要 非常 高 的 温度 才能 维持 相应 的 严谨 度 。 通 常 计算 得 出 的 杂交 温度 〈 在 第 14 章 讨 论 ) 在 任何 环境 中 都 远 高 于 允许 碱 基 对 形成 的 温度 。 在 这 种 情况 下 ， 实 验 者 可 以 选 择 添 加 甲 酰胺 来 达到 降低 Tm 值 后 ， 依 然 维持 高 严谨 度 的 目的 。 其 净 结 果 ， 就 是 在 高 严谨 度 环境 中 ， 可 以 使 用 低 得 足以 允许 碱 基 对 形成 的 温度 。 这 既 保证 了 杂交 的 高 忠实 性 ， 又 排除 了 极端 温度 。 一 般 而 言 ， 每 增加 1 为 的 甲 酰胺 ， 可 以 使 Tu 值 下 降 0. 75°C.

16 双 链 分 子 的 类 型

除了 重组 DNA 方法 学 是 一 种 酶 学 技术 之 外 ， 另 一 个 事实 就 是 杂交 技术 是 分 子 生 物 学 家 主要 工具 之 一 。 这 里 所 说 的 杂交 技术 ， 是 指 促使 两 个 互补 单 链 核酸 分 子 形成 双 链 分 子 的 方法 。 在 体外 系统 中 ， 这 项 技术 允许 从 混合 的 DNA 或 RNA 分 子 中 鉴定 并 回收 特异 的 分 F— 这 也 是 PCR 技术 的 关键 核心 。 在 这 种 情况 下 ， 下 列 术 语 是 同义词 ， 并 且 常 常 可 以 互 换 使 用 :

FRE

碱 基 配 对

双 链 形成

退火

要 明确 认识 到 “ 双 链 分 子 的 形成 仅仅 是 碱 基 的 功能 ， 与 多 核糖 核 苷 酸 和 多 脱氧 核糖 核 苷 酸 分 子 的 骨 淤 毫 不 相干 ”是 非常 重要 的 。 正 因为 如 此 ， 分 子 生物 学 家 可 以 使 任意 两 条 互补 的

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

BH IB BET BME 1.4 中 各 种 类 型 的 双 链 。 表 1.4 各 种 类 型 的 双 链

分 子 类 型 人 (a Wt DNA dsDNA,DNA + DNA RNA: RNA DNA? RNA #4 DNA: RNA

就 热 动力 学 而 言 ，dsDNA 是 上 述 三 种 类 型 中 最 不 稳定 的 ，DNA : RNA 杂 合 物 要 相对 稳定 一 些 ， 而 最 稳定 的 是 由 两 条 互补 RNA 所 形成 的 杂 合 物 。 在 体内 系统 中 ， 尽 管 原先 认为 RNA 分 子 主要 以 单 链 形式 存在 ， 但 事实 上 RNA 分 子 中 广泛 存在 很 多 分 子 内 的 碱 基 配对 。 就 实验 操作 而 言 ， 形 成 了 双 链 RNA 分 子 即 允许 非常 严谨 的 杂交 和 洗涤 条 件 。 基 于 这 一 理 由 ， 选 择 RNA 探 针 作为 提高 实验 信 噪 比 的 方法 也 是 可 取 的 。

1.7 &B#A x &

Lewin, B. (Ed.). (2004). “Genes VIII.” Pearson Education, Upper Saddle River, NJ.

Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M. P., Zipursky, S. L., and Darnell, J. (Eds.). (2004). “Molecular Cell Biology,” Sth ed. W. H. Freeman and Co., New York.

Malacinski, G. M. (2003). “Essentials of Molecular Biology,” 4th ed. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, MA.

Weaver, R. F. (2002). “Molecular Biology,” 2nd ed. McGraw Hill Publishers, New York.

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( 金 由 辛 译 ; Sew)

第 2 章 真 枚 景 因 的 转录 与 组 织

2.1 转录 和 中 心 法 则

根据 分 子 生物 学 中 心 法 则 @， 遗 传 信息 流 从 基因 组 序列 CDNA)， 通 过 信使 RNACmRNA) 中 介 ， 最 后 到 以 功能 多 肽 形成 的 表 型 (图 2.1)。 该 法 则 适用 于 原核 细胞 和 真 核 细胞 。 自 然 界 已 观察 复制 ed 到 一 些 不 符合 中 心 法 则 的 现象 : @ 伴 随 反 转录 病毒 反 转 录 酶 的 发 现 〈 依 赖 于 RNA 的 DNA RAAB). 码

DNA

病毒 基因 组 RNA 通过 双 链 DNA 中 介 而 复制 ， 其 RR* | 转录 目的 是 将 病毒 的 序列 整合 到 宿主 的 基因 组 中 〈 溶 (构建 cDNA) 源 ) 或 进行 病毒 后 裔 的 活性 生产 〈 裂 解 途径 )，@) RNA 编辑 的 发 现 (Benne 等 ，1986; Chan 和 | sai Nishikura, 48, 1997), LA RNA 序列 的 可 变 而 蛋白 质 闻名 ， 转 录 序 列 被 改变 了 。

一 个 半 世 纪 之 前 ， 生 活 在 Brno (当时 属于 奥 CE aie: 地 利 ) 的 罗马 天 主教 牧师 备 德 尔 ， 提 出 了 基因 的 概 wo 分 子 生 物 学 中 心 法 则 。 转 录 过 程 产 念 。 基 于 他 用 更 豆 进行 多 次 遗传 杂交 的 结果 ， 备 德 。 生 mRNA， 翻 译 过 程 产 生 蛋白 质 。 复 制 ， 即 尔 知 道 ， 一 种 他 称 为 的 “因子 ”， 从 一 个 世代 传 到 DNA 被 倍增 的 过 程 ， 发 生 在 真 核 细胞 周期 的 另 一 世代 。 但 是 这 些 因 子 的 性 质 当 时 是 完全 未 知 S 期 。 互 补 DNA 在 体外 被 用 来 测定 转录 活性 的 ， 可 能 更 不 清楚 这 些 因 子 表达 的 机 理 。 特 别 是 在 近 50 年 里 ， 在 遗传 物质 的 性 质 、 细 胞 遗 传 物质 的 组 织 及 基因 表达 和 调控 方面 ， 已 经 看 到 不 平行 的 科学 调查 和 发 现 。

转录 是 从 双 链 DNA 的 特定 序列 〈 位 点 ) 合成 单 链 RNA 分 子 的 过 程 ， 这 是 被 称 为 RNA 生物 合成 的 几 个 步骤 中 的 第 一 步 。 转 录 发 生 在 真 核 细胞 的 核 内 〈 或 线粒体 、 叶 绿 体 ) 以 及 原核 细胞 共有 的 细胞 间隔 区 。 转 录 的 所 有 时 相 都 是 易 变 的 ， 并 且 可 能 是 基因 表达 调 控 的 潜在 控制 点 。 因 此 一 个 转录 单位 是 一 段 DNA 序列 ， 它 包括 适当 的 转录 起 始 和 终止 信 号 ， 并 支持 初始 RNA 转录 本 的 合成 。 转 录 过 程 的 命名 是 因为 信息 以 相同 的 语言 〈 核 酸 语言 ) 从 DNA 转移 到 RNA。 相 反 ， 翻 译 过 程 的 命名 是 因为 核酸 以 mRNA 形式 指导 从 氨基 酸 前 体 装 配 初 始 多 肽 ， 核 酸 指导 用 蛋白 质 的 语言 执行 。 核 糖 体 是 所 有 细胞 多 肽 合 成 的 细胞 器 ; 真 核 蛋 白 还 需 经 修饰 、 分 拣 、 包 装 并 通过 高 尔 基 体 到 它们 正确 的 亚 细 胞

mRNA

@ He Boe F 1957 年 在 实验 生物 学 学 会 的 讨论 会 上 提出 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

位 置 。 2.1.1 调控 元 件

转录 由 RNA 聚合 酶 催化 。 这 些 酶 识别 位 于 庞大 而 复杂 的 基因 组 DNA 中 非常 特别 而 保 守 的 启动 子 或 起 始 序列 。 局 动 子 与 基因 的 结构 部 分 结合 在 一 起 〈 图 2.2)， 并 有 几 个 可 识别 的 核 苷 酸 模块 。 这 些 序列 通常 也 被 称 为 共有 序列 。 这 一 术语 通常 用 来 表示 在 一 特殊 部 位 的 核 苷 酸 序列 模式 。 这 些 调控 元 件 的 序列 和 精确 的 几何 构象 可 以 促进 或 阻止 转录 的 进行 ， 并 可 以 各 种 不 同 的 效率 工作 。 启 动 子 元 件 位 于 转录 起 始 位 点 (transcription start site, TSS) 的 5 侧 或 上 游 ， 用 与 转录 起 始 位 点 的 实际 核 苷 酸 距 离 前 加 符号 “一 ”表示 。 第 一 个 转录 的 核 苷 酸 被 定义 为 “十 1”， 位 于 转录 起 始 位 点 3 侧 或 下 游 的 任何 其 他 位 点 ， 用 实际 核 苷 酸 距 离 前 加 符号 “十 ”表示 。 启 动 子 共 有 序列 的 知识 主要 来 自 标 准 DNA 克隆 技术 、 点 突变 、DNA 测 序 等 大 量 实验 结 果 。

2 We, SHAE

a | 表 型

细胞 功能

图 2.2 基因 编码 和 蛋白质 的 信使 RNA (mRNA) 直接 处 于 称 为 启动 子 的 调控 元 件 控制 之 下

原核 系统 中 ， 启 动 子 元 件 包括 一 10 Fee, Be TATAAT 共有 序列 组 成 的 Pribnow &. 另 一 保守 区 位 于 上 游 ， 被 称 为 一 35 序列 (TTGACA)。 在 某 些 物种 中 ， 在 更 上 游 处 有 一 富 & AT 的 结构 域 。 已 知 一 10 序列 与 一 35 序列 间 的 距离 是 很 严格 的 。 该 距离 的 变化 会 减弱 RNA 聚合 酶 与 局 动 子 的 相互 作用 。

相应 地 ， 真 核 启 动 子 是 TATA 盒 ， 以 前 称 为 Hogness &, MANHRARE AREY 核 苷 酸 和 胸腺 喀 啶 核 苷 酸 。 一 段 时 间 ， 人 们 认为 所 有 真 核 启动 子 都 表现 为 TATA 盒 。 但 事实 并 非 如 此 。 实 际 上 是 缺乏 TATA 盒 的 启动 子 具 有 称 为 下 游 启 动 子 的 元 件 〈down- stream promoter element，DPE) 。 它 大 约 位 于 转录 起 始 位 点 下 游 十 30 碱 基 处 〈 十 30)。 除 了 TATA 或 DPE 外 ， 另 一 个 启动 子 模 块 是 CAAT 盒 ， 某 些 基因 ， 但 不 是 所 有 基因 有 此 元 件 ， 它 的 命名 是 因为 序列 的 保守 性 。TATA 盒 处 于 一 30 K, CAAT 盒 位 于 三 75 区 ， CAAT 盒 位 于 更 上 游 ， 活 性 也 很 强 。 这 些 元 件 控制 RNA 聚合 酶 的 起 始 结合 ， 并 选择 转录 起 始 位 点 。 第 三 个 常见 的 启动 子 元 件 是 G Bek GCG [(GGGCGG),]。GC 盒 位 于 启动 子 区 的 一 90 区 和 一 120 区 ， 有 一 个 或 多 个 拷贝 。 另 一 个 短 的 八 核 苷 酸 元 件 ATGCAAAT Fil 它 的 反 向 互补 序列 ATTTGCAT， 是 启动 子 耦 联 序列 ， 它 影响 RNA 聚合 酶 开 的 转录 效率 。 这 些 因子 起 转录 结合 因子 和 转录 起 始 功能 。 有 趣 的 是 所 有 启动 子 中 没有 一 个 统一 的 组 分 和 组 织 。 启 动 子 的 特殊 排列 组 合 和 它们 之 间 的 距离 是 识别 转录 起 始 调控 元 件 的 依据 。 简

Sains s

#28 真 核 基因 的 转录 与 组 织

而 言 之 ， 与 原核 细胞 转录 比较 ， 真 核 转录 起 始 需要 多 种 转录 因子 与 顺 式 元 件 结合 ， 这 些 元 件 组 成 了 局 动 子 。

真 核 启动 子 并 非 单 独 工作 ， 很 多 真 核 细 胞 转录 受 增 强 子 序列 的 显著 影响 。 增 强 子 的 作用 显然 是 促进 了 转录 起 始 。 各 基因 间 增 强 子 序列 对 应 于 启动 子 的 精确 位 置 和 方向 各 不 相同 。 某 些 基因 组 序列 〈 如 免疫 球 蛋白 基因 )， 甚 至 在 基因 的 结构 部 分 有 增强 子 。 通 常 除 去 增强 子 序列 可 降低 转录 效率 。 在 基因 中 加 入 非 天 然 的 增强 子 序列 也 可 以 极 大 地 增加 转 录 效 率 。 通 常 增强 子 无 方向 性 ， 并 且 位 于 TSS 几 百 个 核 苷 酸 以 外 〈 如 果 不 说 是 在 几 千 个 核 苷 酸 以 外 的 话 )。 在 体内 ， 转 位 导致 的 启动 子 与 基因 接近 ， 可 以 造成 不 正确 的 基因 表 达 ， 通 常 可 能 是 灾难 性 的 结果 。 上 游 和 下 游 增强 子 序 列 对 启动 子 的 影响 已 被 充分 证 明 ， 而 其 作用 机 理 尚 不 清楚 。

2.1.2 DNA 模板

转录 过 程 中 ， 被 转录 基因 的 两 条 链 有 不 同 的 名 字 和 不 同 的 任务 。 实 际 起 RNA 聚合 模板 作用 的 链 称 为 模板 链 ， 另 一 条 不 起 模板 作用 的 链 称 为 编码 链 98。 发 表 基 因 序 列 时 ， 通 常 发 表 编码 链 的 序列 ， 从 5' 写 到 3"， 从 左 写 到 右 。 其 含义 是 模板 链 3 一 5 ， 反 向 平行 于 编码 链 。 模 板 链 的 命名 是 因为 核 苷 酸 插 和 人 新 生 转 录 本 的 精确 顺序 是 由 模板 链 决 定 的 。 新 生 转 录 物 与 模板 链 核 苷 酸 序列 互补 。 认 识 这 一 点 是 重要 的 ， 随 启动 子 序 列 的 位 置 改变 ， 编 码 链 和 模板 链 的 任 务 可 能 改变 。 这 种 现象 的 典型 例子 是 在 两 个 不 同 启动 子 间 体 外 克隆 一 双 链 DNA， 通 常 是 噬 菌 体 聚 合 酶 启动 子 SP6、T3 或 T7。 这 种 克隆 的 构建 常 被 用 于 大 量 体 外 转录 正义 RNA Al 义 RNA， 用 作 核 酸 探 针 〈 见 第 13 章 )。

Ze, we OG ae, AS

为 了 理解 转录 产物 的 意义 ， 首 先 需 要 了 解 基因 的 组 织 。 典 型 的 原核 基因 组 像 一 个 小 的 外 包装 ， 通 常 编码 处 于 同一 代谢 途径 的 多 种 蛋白 质 基因 ， 以 操纵 子 形式 成 能 聚 在 一 起 〈Jacob 和 Monod，1961) 。yzac 操纵 子 ， 它 的 基因 产物 参与 作为 碳 源 的 乳糖 代谢 ， 就 是 一 个 极 好 的 例子 。 其 RNA 分 子 从 一 个 操纵 子 〈 通 常 是 多 顺 反 子 ， 即 单一 的 RNA 转录 物 编码 多 个 多 肽 ) 转录 得 到 。 在 一 个 多 顺 反 子 mRNA 中 ， 每 个 多 肽 的 编码 信息 是 连 在 一 起 的 ， 即 在 编码 序列 中 没有 其 他 的 或 非 编 码 的 信息 隔断 。 这 样 的 方式 对 于 单 细 胞 生物 来 说 ， 可 以 达到 能 源 利用 效

率 的 最 大 化 。

事实 上， 原核 基因 表达 的 动力 学 是 如 此 之 快 ， 以 至 于 细菌 的 mRNA RRR. MMS 解 几乎 是 同时 进行 的 。 过 去 ， 这 种 固有 的 性 质 使 克隆 原核 mRNA 的 想法 不 能 实现 。 在 从 昔 兰 阴 性 菌 和 革 兰 阳性 菌 中 分 离 有 用 的 RNA 方面 ， 虽 然 现 在 已 经 取得 巨大 的 进步 ， 这 些 创 新 成 果 已 经 以 试剂 盒 的 形式 提供 使 用 ， 但 原核 RNA 的 分 离 有 时 仍然 是 挑战 。

与 原核 系统 相反 ， 几 乎 所 有 的 真 核 mRNA 都 是 单 顺 反 子 。 虽 然 单 个 的 多 肽 是 从 特定 的 单 顺 反 子 mRNA 分 子 翻译 而 来 ， 但 相同 的 mRNA 可 以 被 重复 翻译 ， 只 要 转录 本 仍然 具有 生

@ 编码 链 也 被 某 些 人 称 为 正义 链 ， 模 板 链 被 称 为 反 义 链 。 . 11 e

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

物 与 化 学 活性 。 为 了 发 挥 翻 译 最 大 化 的 潜力 ，mRNA 转录 本 常常 同时 与 多 个 核糖 体 结合 ， 单个 的 转录 本 被 依次 翻译 。 这 种 一 个 mRNA 与 多 个 核糖 体 的 结合 ， 称 为 多 核糖 体 . 这 种 结 构 在 原核 系统 与 真 核 系统 中 都 能 看 到 。 任 何 给 定时 间 ， 细 胞 全 部 结合 了 多 核糖 体 的 mRNA 称 为 多 核糖 体 组 分 。 多 核糖 体 组 分 的 鉴定 ， 可 以 用 来 评估 细胞 在 限定 实验 条 件 下 的 翻译 活 性 。 简 单 讲 ， 大 量 的 多 肽 分 子 可 以 从 单个 mRNA 分 子 制造 出 来 。

仔细 检查 真 核 基因 后 发 现 ， 绝 大 多 数 基因 比 直接 对 应 于 指导 多 肽 合成 所 必需 的 部 分 要 大 得 多 。 也 就 是 说 这 种 氨基 酸 序列 与 DNA 序列 在 基因 位 点 内 并 不 一 一 对 应 。 这 种 大 小 差异 也 可 以 在 成 熟 胞 质 mRNA 水 平 观 察 到 。mRNA 通常 比 编码 它 的 DNA 序列 短 得 多 。 进 二 步 审 查 ， 这 种 矛盾 可 以 在 基因 组 织 水 平 加 以 解释 ， 基 因 序 列 可 分 为 如 下 两 类 。

D 外 显 子 是 对 应 于 成 熟 胞 质 mRNA 的 DNA 区 段 。 外 显 子 可 以 有 也 可 以 没有 编码 多 肽 的 功能 。

@ 内 含 子 是 被 转录 ， 但 一 般 不 存在 于 对 应 mRNA 中 的 DNA 区 段 。 外 显 子 被 有 系统 地 从 RNA 初始 转录 本 中 剪接 除去 ， 从 而 使 邻近 内 含 子 的 外 显 子 序列 连接 起 来 。 虽 然 内 含 子 通 常 不 指导 多 肽 合成 ， 但 某 些 真 菌 线 粒 体 RNA 可 能 是 个 例外 〈 见 Tereba, 1985; Cech 和 Bass，1986 的 综述 ) 。

基因 外 显 子 和 内 含 子 的 数量 和 长 度 取决 于 其 基因 位 点 ， 并 且 是 高 度 可 变 的 。 对 每 个 位 点 的 这 种 变量 ， 在 进化 过 程 中 是 高 度 保 守 的 。 与 长 度 可 达 几 千 个 碱 基 对 的 内 含 子 相 比 ， 外 显 子 往往 较 短 ， 对 于 大 多 数 生物 ， 每 个 外 显 子 编码 少 于 100 S$ REM. ERAS, BAW 个 或 多 个 外 显 子 的 保守 序列 ， 可 被 用 来 分 离 其 他 生物 的 相关 基因 。 在 内 含 子 序列 中 未 发 现 有 显著 的 同 源 性 。 并 且 内 含 子 的 所 有 阅读 框 中 ， 常 有 多 个 终止 密码 子 。 这 并 非 完 全 出 乎 预料 ， 因为 内 含 子 的 非 编 码 功 能 有 利于 突变 的 积累 。 这 些 突变 如 果 发 生 在 外 显 子 序列 中 ， 可 能 是 致 命 的。 在 某 些 特殊 例子 中 ， 如 人 P- 干 扰 素 完 全 缺失 内 含 子 序列 (Tavernier 等 ，1981) 。 但 是 检查 内 含 子 剪接 的 连接 处 时 ， 发 现在 内 含 子 中 含有 严格 保守 的 二 核 苷 酸 共 有 序列 (Breathnach 和 Chambon, 1981; Mount，1982) 。 在 内 含 子 的 5 MAA GU FH, WAG ER; 相信 在 高 等 真 核 生 物 中 ， 这 种 现象 达 100%,

5' 一直 外 显 子 1| GU WaF AG | sree 2 | 3

直接 邻近 内 含 子 边界 二 核 苷 酸 的 核 苷 酸 同 样 是 保守 的 〈65% 一 75%)。 并 且 在 剪接 位 点 的 一 个 点 突变 ， 可 以 造成 该 位 点 的 失 活 。 这 种 现象 是 基于 辨别 外 显 子 序列 的 方法 ， 称 为 外 显 子 捕获 (Duyk 等 ，1990) 。 一 个 推测 的 含 外 显 子 的 序列 被 克隆 进 一 个 特殊 的 载体 ， 载 体 由 一 个 内 含 子 在 两 侧 各 加 上 一 个 已 知 的 外 显 子 组 成 。 克 隆 DNA 中 的 一 个 外 显 子 ， 当 它 与 载体 中 内 含 子 连接 ， 将 得 到 更 长 的 转录 物 ， 可 以 用 Northern 分 析 检 查 此 转录 物 。 某 些 例子 中 ， 剪接 位 点 的 突变 可 以 利用 另 一 个 剪接 位 点 产生 异常 的 mRNA。 新 的 剪接 位 点 通常 在 内 例子 中 〈Triesman 等 ，1982) ， 一 个 例子 就 是 B- 地 中 海 贫血 的 个 体 。 这 种 外 显 子 被 内 含 子 打上 断 的 基因 组 织 ， 可 能 在 所 有 较 高 等 的 真 核 生物 中 都 是 常见 的 ， 但 这 种 现象 不 适合 于 线粒体 或 叶 绿 体位 点 ， 也 不 适合 于 酵母 tRNA 基因 (Lewin, 2004).

ASTRA BH) 的 实际 机 制 ， 部 分 由 高 度 保 守 的 小 RNA 家 族 介 导 。 这 些 分 手 以

© 所 谓 的 描述 外 显 子 - 内 含 子 剪接 位 点 的 AG-GT 规则 ， 参 见 DNA 合成 。 初 始 转录 物 内 含 子 5 末端 被 证 明 是 GU. e 12 °

第 2 章 真 核 基因 的 转录 与 组 织

RNA- 蛋 白质 复合 物 形式 存在 ， 名 为 U1、U2、U4、U5 和 U6， 它 们 定位 于 核 内 ， 一 般 以 小 核 核 糖 核 蛋 白 体 (snRNP 或 snurps) 被 提 及 。Hamm 和 Mattaj (1990) 首先 描述 了 有 效 鉴 定 这 些 必要 的 剪接 因子 的 方法 学 。 在 真 核 生 物 的 细胞 质 中 ， 发 现 有 类 似 的 高 丰 度 小 胞 质 RNA (scRNA 或 seyrps) 。 与 snRNA 一 样 ， 已 知 scRNA 分 子 存在 于 RNA- 和 蛋白 质 复 合 物 中 。scRNA 分 子 在 调控 蛋白 质 合 成 、 蛋 白质 分 拣 和 可 能 的 mRNA 降解 中 的 作用 ， 是 一 个 很 有 兴趣 的 领域 。 另 一 类 核 仁 小 分 子 RNA (snoRNA) 与 核糖 体 RNA (rRNA) 的 生物 合成 相关 联 “〈Kass 等 ，1990) 。 某 些 内 含 子 的 切除 也 可 通过 RNA 自 剪 切 发 生 。 催 化 RNA 的 酶 一 般 被 称 为 核 酶 ， 由 Cech (1981) 首先 描述 。 大 量 使 人 着 迷 的 有 关 RNA 生物 学 的 信息 ， 在 其 他 地 方 也 有 描述 〈 综 述 : Michel 和 Ferrat，1995; Wilson 和 Szostak, 1999; Kurreck, 2003; Lewin，2004) 。

转录 的 直接 产物 是 RNA 分 子 ， 它 的 序列 与 来 自 的 DNA 序列 精确 相关 。 这 些 初 始 转录 物 仅 是 功能 RNA 的 前 体 ， 并 且 处 于 真 核 细 胞 的 核 内 。 在 核 内 ， 前 体 RNA 名 为 核 不 均一 RNA (hnRNA), hnRNA 与 特定 的 核 蛋白 形成 核 不 均一 核糖 核 蛋 白 体 “hnRNP)， 即 一 种 核 内 丰 度 很 高 的 组 分 〈 综 述 :， Dreyfuss 等 ，2002) 。 如 前 所 述 ， 因 为 mRNA 形成 并 作为 它 编码 蛋白 质 的 模板 功能 ， 内 含 子 必须 首先 被 除去 。 产 生 的 外 显 子 序列 串 ， 仅 是 RNA AZ 路 中 几 步 修饰 中 的 一 步 。 这 种 前 体 的 加 工 ， 以 及 随后 的 几 步 都 发 生 在 核 内 。 只 有 经 过 全 部 加 工 的 转录 物 ， 才 被 输出 到 细胞 质 ， 作 为 成 熟 mRNA 分 子 发 挥 功 能 。 切 除 的 内 含 子 序 列 保留 在 核 内 ， 并 被 降解 。

2.3 RNA 月 合 酶 和 转录 产物

转录 基因 的 酶 称 为 RNA 聚合 酶 ， 其 产生 的 RNA 主要 是 rRNA, tRNA 和 mRNA， 还 有 所 有 稀有 的 RNA。 真 核 基因 由 三 种 RNA 聚合 酶 中 的 一 种 催化 。 这 些 酶 属于 最 大 和 最 复 杂 的 蛋白 质 ， 与 相应 的 原核 RNA 聚合 酶 相 比 ， 它 们 由 更 多 的 亚 基 组 成 。 真 核 RNA Rei 有 RNA 聚合 酶 I 、RNA RAHI A RNA 聚合 酶 焉 。 每 一 种 酶 都 负责 不 同类 型 基因 的 转录 《 见 表 2. 1) 。 相 反 ， 原 核 细 胞 只 有 一 种 RNA 聚合 酶 ， 它 转录 所 有 三 类 主要 的 RNA。RNA 聚合 酶 只 有 在 存在 DNA 时 才 有 活性 。 它 需要 ATP. CTP, GTP 和 UTP 核 苷 酸 作 为 前 体 ， 同时 需要 Mg2+ 作为 辅助 因子 。 三 类 真 核 RNA 聚合 酶 的 转录 产物 ， 可 以 用 它们 对 二 环 八 肽 的 真菌 毒素 (cA MH?) 的 不 同 敏感 性 来 区 分 (Roeder, 1976; Marzluff 和 Huang, 1984) 。 其 应 用 见 第 17 章 。

表 2.1 真 核 RNA 聚合 酶 及 其 产物 和 对 o- 鹅 膏 曹 碱 的 敏感 性

RNA ¥4 iif I rRNA(28S,18S,5. 8S) = RNA #4 fi I pre-mRNA-> 一 一 mRNA 十 十 十 十 RNA #4 Af Ill tRNA,5S rRNA,snRNA 二

注 : mRNA 一 信使 RNA; rRNA 一 核糖 体 RNA;，snRNA 一 核 小 分 子 RNA;， tRNA 一 转移 RNA,

所 有 RNA 的 转录 都 是 5 一 3 方向 聚合 。 转 录 包 括 三 个 不 同 的 时 相 : 起 始 、 延 伸 和 终

@ A ee a Amanita phalloides 。 和 13 .

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

止 。 其 他 书籍 对 这 些 过 程 均 有 详细 描述 。 简 要 地 说 ， 起 始 包括 RNA 聚合 酶 借助 于 起 始 因 子 的 帮助 ， 与 DNA 模板 的 启动 子 结合 ， 随 后 RNA 分 子 的 第 一 个 核 苷 酸 进 入 。 延 伸 包 括 核 昔 酸 挫 人 新 生 链 ， 延 伸 蛋 白 因子 也 参与 此 过 程 。 终 止 是 RNA 合成 的 完成 ， 不 管 产物 是 理 正 确 或 提早 成 熟 ， 新 合成 的 RNA Al RNA 聚合 酶 都 要 从 模板 上 解 聚 下 来 。 终 止 与 起 始 和 延伸 一 样 ， 也 受到 小 蛋白 质 〈 终 止 因 子 ) 的 影响 。 尽 管 有 突变 ， 但 合成 的 RNA 分 子 必 须 与 编码 链 的 DNA 序列 一 致 。 对 于 真 核 细 胞 ， 转 录 产 物 的 命运 在 第 3 EEA PG

真 核 细 胞 里 ， 编 码 rRNA 基因 的 转录 由 RNA 聚合 酶 工 催化 。 高 等 真 核 生物 RNA 聚合 酶 工 转录 的 初始 产物 是 一 个 大 的 未 剪接 的 45S 的 前 体 RNA， 它 最 终 被 加 工 成 较 小 的 28S rRNA, 18S rRNA、 和 5.8S rRNA (图 2.3)。RNA 聚合 酶 亚 承 担 转录 tRNA 基因 ,5S rRNA、 一 些 重复 元 件 (Fornace 和 Mitchell, 1986; Lewin, 2004) 和 前 述 的 snRNA, sn- oRNA, scRNA 等 。

图 2.3 人 细胞 中 rRNA 的 生物 合成 。RNA 聚合 酶 工 转 录 产 物 〈45S 转录 物 ) 经 前 切 得 28S、18S 和 5.8S。5S rRNA 由 RNA 聚合 酶 亚 独 立 转录 。 部 分 引用 自 Lewin, Gene Vi 〈1997) ， 得 到 牛津 大 学 出 版 社 的 允许

典型 的 哺乳 动物 细胞 含 1X10“ 一 5X10 Pg HK RNA, HRP KBD ERA MBI MRA Ae Tee RA. A 80% ~85% WY ANd RNA 以 28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA 和 5S rRNA 形式 存在 于 核糖 体 中 ， 这 些 RNA 与 无 数 的 核糖 体 特 异 蛋白 质 形成 复合 物 (60S 和 40S 核糖 体 亚 基 )。 如 第 10 章 的 描述 ， 大 量 的 28S rRNA 和 18S rRNA 可 作为 总 细胞 RNA 或 总 细胞 质 RNA 电泳 时 的 天 然 分 子 量 标准 。 表 2.2 列 出 了 真 核 细 胞 与 原核 细胞 的 核糖 体 和 生物 功能 的 比较 。tRNA 构成 了 细胞 总 RNA 质量 的 10% ~15%, TARA mRNA 仅 占 细胞 总 RNA WN 1%~4%.

表 2.2 原核 细胞 和 真 核 细 胞 的 转录 和 翻译

项 目 原核 细胞 真 核 细胞 —SS SS eee T 基因 组 织 大 部 分 为 多 顺 反 子 ( 操 纵 子 模式 ) ,一 些 是 几乎 全 部 是 单 顺 反 子 ,叶绿体 中 发 现 多 5 单 顺 反 子 顺 反 子 位 置 单 细 胞 间隔 区 核 内 转录 | mRNA 的 半衰期 2 10h, 范 围 :1 一 24h 转录 速度 每 秒 40 BE MR 每 秒 40 BEER 转录 后 修饰 几乎 没有 广泛 ,包括 5 加 帽 、 除 去 内 含 子 .多 腺 苷 化

第 2 章 真 核 基因 的 转录 与 组 织

续 表

原核 细胞 真 核 细 胞 1. 2kb 1. 9 一 2. 2kb

= m

mRNA 的 平均 大 小 rRNA

核糖 体 亚 基

完整 的 核糖 体 70S 80S

位 置 单 细 胞 间隔 区 细胞 质

翻译 速度 每 秒 15 ASR 每 秒 5 一 8 BIER 翻译 后 修饰 几乎 没有 很 多 修饰

YE: mRNA 一 信使 RNA; rRNA 一 核糖 体 RNA,

FRE, rRNA 首先 被 认为 是 蛋白 质 合成 的 模板 。I4 噬菌体 感染 大 肠 杆 菌 的 研究 ， 第 一 次 指出 mRNA 是 独立 的 一 类 RNA， 它 在 蛋白 质 合 成 中 起 模板 作用 CVolkin 和 Astra- chan, 1956; Brenner 等 ，1961; Hall #1 Spiegelman，1961)。 后 来 ， 观 察 到 SV40 后 期 mRNA (Ghosh 等 ，1978) 和 多 瘤 病 毒 后 期 mRNA (1979) 具 多 种 5 末端 ， 这 是 第 一 次 发 BL RNA 聚合 酶 开 转 录 起 始 的 异 源 性 。

RNA 聚合 酶 [和 RNA 聚合 酶 亚 的 转录 物 相 对 来 说 不 多 样 化 ， 一 般 不 随 细 胞 功能 变化 而 变化 。 但 是 RNA 聚合 酶 开 的 转录 产物 随 细 胞 生化 状态 的 变化 而 变化 ， 这 一 点 并 不 意外 ， 因为 正 是 mRNA 的 组 成 决定 了 细胞 的 表 型 。 随 细胞 种 类 和 状态 的 不 同 ，RNA 聚合 酶 开 转 录 产物 的 差异 一 般 在 20% 一 40%， 但 其 中 成 熟 的 mRNA 仅 占 1% 一 4%。 基 于 Cot 动力 学 研 究 ， 证 明 可 以 被 转录 加 工 成 功能 mRNA 的 基因 都 位 于 基因 组 中 的 非 重复 序列 区 域 。 而 基因 组 的 大 部 分 区 域 被 认为 是 不 被 转录 的 ， 处 于 细胞 周期 某 一 点 的 细胞 ， 有 几 千 个 不 同 基因 被 转 录 。 基 于 细胞 生物 化 学 上 的 复杂 性 ，mRNA 群体 中 的 这 种 异 质 性 ， 对 于 满足 细胞 生存 的 基 本 需要 都 是 必要 的 。 有 趣 的 是 所 有 转录 的 hnRNA 中 ， 可 能 大 于 70% 的 部 分 在 核 内 被 降解 。 这 为 研究 基因 表达 转录 后 调控 提供 了 一 个 基础 。

23S、16S、5S 28S\18S、5. 8S,5S

50S,30S 60S,40S

2 i

2.4 和 参考 文献

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〈 金 由 辛 译 ;人 金 言 校 )

很 多 基因 为 组 成 型 ， 由 RNA 聚合 酶 开 转 录 。 显 然 ， 大 量 的 核 不 均一 RNA(ChnRNA) 在 核 内 被 代谢 。 真 核 细胞 中 ，mRNA 由 hnRNA 通过 一 系列 修饰 反应 而 成 熟 ， 这 包括 5 加 帽 、 甲 基 化 、 剪 接 、3 末端 加 工 以 及 常 被 聚 腺 苷 化 。 真 核 细 胞 的 细胞 质 中 ， 只 有 1% 一 3 儿 的 总 RNA 是 成 熟 的 mRNA。 根据 细胞 质 内 的 丰 度 ， 这 些 mRNA 又 可 分 为 特殊 的 mRNA 种 类 。 有 三 类 正式 的 mRNA WR: 高 丰 度 的、 中 丰 度 的 和 低 丰 度 的 。 还 有 一 类 非 正 式 的 亚 类 ， 即 超 低 丰 度 的 mRNA。

高 丰 度 的 转录 本 ， 每 个 细胞 有 几 百 个 拷贝 。 当 细胞 产生 大 量 的 特定 蛋白 质 或 高 度 分 化 的 蛋 自 质 以 执行 某 一 功能 时 ， 就 会 产生 这 类 转录 本 。 中 丰 度 的 转录 本 在 每 个 细胞 中 有 成 打 的 拷 贝 ， 很 多 看 家 基因 9 的 mRNA 处 于 这 一 数量 级 。 低 丰 度 的 mRNA 在 每 个 细胞 中 约 有 10 个 或 更 少 的 拷贝 。 很 多 老 的 、 传 统 的 技术 ， 如 Northern 分 析 〈 见 第 12 章 )， 很 难 检测 到 低 丰 度 的 mRNA。 用 茶 些 富 集 方法 以 增加 检 出 的 概率 ， 这 些 低 丰 度 mRNA 就 可 以 被 测 出 。 超 低 丰 度 的 mRNA 在 每 个 细胞 中 少 于 1 个 拷贝 ， 所 以 迫使 用 组 织 取代 细胞 株 来 观察 特殊 基因 的 转录 ， 过 去 这 类 mRNA 被 认为 是 难 克 隆基 因 。 更 重要 的 是 必须 认识 到 ， 细 胞 中 RNA Y= 度 会 有 很 大 的 变化 ， 这 种 变化 可 能 来 自 细胞 环境 的 自然 变化 或 者 实验 操作 的 原因 。

3.1 &2# MRNA 分 子 的 拓扑 结构

典型 的 人 纤维 原 细胞 约 含 1 皮 克 〈pg) 的 mRNA， 这 相当 于 由 一 组 3 万 一 4 万 个 不 同 基 因 转 录 的 10° 个 分 子 。 虽 然 这 种 mRNA 的 异 质 性 反映 了 由 这 些 mRNA 编码 的 蛋白 质 有 同等 的 多 样 性 ， 但 是 一 个 典型 的 真 核 mRNA 分 子 具 备 几 乎 所 有 mRNA 都 有 的 拓扑 学 特征 〈 图 32 Dg

3.1.1 5' het

成 熟 的 真 核 mRNA 分 子 是 由 RNA 聚合 酶 下 产生 出 来 的 单 顺 反 子 mRNA。 转 录 的 中 间 产物 一 一 前 体 hnRNA 分 子 ， 具 有 下 面 列 出 的 5 末端 结构 : 5 pppPuNNN……- 3: 第 一 个 转录 的 核 苷 酸 通 常 是 味 叭 ， 无 论 是 腺 味 叭 还 是 乌 味 叭 都 含有 完整 的 5 -三 磷酸 。

@ 看 家 基因 是 指 其 编码 的 蛋白 质 能 维持 细胞 活力 或 正常 功能 。 因 为 这 些 基 因 的 表达 通常 认为 不 随 细胞 功能 状态 改变 而 改变 ， 所 以 常 作为 各 种 定量 实验 的 内 部 参照 ， 见 第 20 章 。 ° 17°

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

终止 密码 子 UAA, UAG, UGA poly(A) Fé sway A AAAAAAAAA3/ AUG AAUAAA 起 始 密码 子 poly(A) 加 尾 信 和 号

图 3.1 典型 的 真 核 mRNA 分 子 的 拓扑 学

相 邻 的 核 苷 酸 由 磷酸 二 酯 键 以 5 -3 连接 。 转 录 起 始 后 不 久 ， 新 生 多 核 苷 酸 链 尚 不 超过 100 个 碱 基 时 ，5 ' 帽 式 结构 (Reddy 等 ，1974; Shatkin, 1976; Banerjee, 1980) 就 被 逐步 装配 (Babich 等 ，1980)。 帽 子 由 少见 的 5 -5 三 磷酸 将 第 一 个 转录 的 核 苷 酸 与 7- 碱 基 鸟 味 叭 (m’G) RRB MK. ERAN —Ti— SIKH RB MHEIKT. AmH SRR KA RMARR DH 5 末端 ， 产 生 下 述 结构 : 5'GpppPuNNN.……- 3. AR Shin RS FRA 5 -5 Fp RHE RA — TREE. 5! BAS Oia {7 BS ER -7- FA SE FE. FE a) 9 ER A: m’G(5')ppp(5') Pu 大 部 分 真 核 mRNA 接着 在 2 -O- 甲 基 转 移 酶 的 催化 下 ， 第 二 个 核 苷 酸 核 糖 的 2 - 氧 被 进 一 步 甲 基 化 。 取 决 于 不 同 的 mRNA， 最 多 有 4 个 甲 基 化 反应 发 生 。 包 括 5 SERRARU 及 倒数 第 二 个 核 苷 酸 和 第 三 个 核 苷 酸 的 碱 基 和 /或 核糖 ， 也 包括 NOFA SE AR ER RE, HY mRNA 的 加 帽 ， 发 生 在 mRNA 内 部 腺 苷 酸 的 甲 基 化 之 前 。 腺 苷 酸 甲 基 化 是 较 少 发 生 的 修 饰 ， 它 也 发 生 在 mRNA 生物 合成 过 程 的 早期 。 在 RNA 加 工 中 ，Ns- 甲 基 腺 味 叭 残 基 是 保守 的 〈Shatkin，1976; Chen-Kiang 等 ，1979) 。 甲 基 化 的 程度 是 mRNA 种 类 的 功能 。 高 等 生 物 通常 有 高 度 甲 基 化 的 帽子 。snRNA 也 有 带 多 个 甲 基 的 帽子 结构 〈Furuichi 和 Shatkin, 1989)， 帽 子 的 甲 基 供 体 是 S- 腺 苷 酰 甲 硫 氨 酸 (SAM).

5 帽子 是 伴随 细胞 内 基因 表达 转录 后 修饰 的 一 个 例子 ， 所 有 真 核 mRNA 中 都 有 它 的 存 .

在 。5 帽子 支持 翻译 的 起 始 ， 并 且 非 常 重要 ， 以 至 于 体外 转录 mRNA 时 ， 如 果 和 希望 转录 物 能 支持 编码 蛋白 质 的 合成 ， 就 必须 进行 体外 加 帽 反 应 。 翻 译 装 置 的 形成 ， 部 分 是 由 帽子 结合 蛋白 质 起 始 的 “〈 见 Shatkin 的 综述 ，1985; Dreyfuss, 1986; Lewin，2004)。 此 后 ， 在 起 始 因子 的 介 导 下 ， 核 糖 体 亚 基 结 合 上 去 。 简 而 言 之 ， 这 就 是 核糖 体 如 何 识别 将 被 翻译 转录 物 的 ，rRNA 和 tRNA 都 没有 帽子 。

帽子 显然 还 通过 对 抗 磷酸 酯 酶 和 5 > 3 核酸 外 切 酶 的 降解 方式 ， 保 证 了 转录 物 的 稳定 性 (Furuichi 4, 1977; Furuichi 和 Shatkin，1989) 。 相 反 ， 原 核 mRNA 没有 5 帽子 结构 ， 甚 至 mRNA 下 游 部 分 还 在 翻译 中 ，mRNA 就 从 5 端 被 外 切 核酸 酶 降解 。 此 外 ， 线 粒 体 和 叶 绿 体 mRNA 没有 5 帽子 。 在 真 核 细胞 中 复制 的 很 多 动物 病毒 mRNA 含有 5 帽子 ， 值 得 注意 EY) FF a IK J FR: PFI Jb

3.1.2 前 导 序 列

从 真 核 帽 子 结构 的 第 一 个 核 苷 酸 开始 ， 即 组 成 了 不 翻译 的 前 导 序 列 ， 更 正规 的 说 法 是 ° 18 -

第 3 章 fate RNA

5 非 翻 译 区 CUTR)。 虽 然 前 导 序 列 长 的 可 达 几 百 个 核 苷 酸 ， 短 的 仅 3 个 核 苷 酸 ， 但 真 核 系 统 中 ， 典 型 的 前 导 序 列 长 约 30 一 50 个 碱 基 。 这 个 长 度 可 变 的 区 段 ， 如 它 名 字 的 含义 ， 不 被 翻译 。 核 糖 体 扫描 模型 中 ，40S 亚 基 结合 到 5 帽子 上 ， 然 后 沿 前 导 序 列 移动 ， 直 到 第 一 个 AUG 密码 子 处 才 暂 停 。AUG 密码 子 是 前 导 序 列 与 编码 区 的 分 界 。 帽 子 结合 蛋白 介 导 了 5 帽子 和 40S 亚 基 的 结合 。 最 后 ， 有 功能 的 核糖 体 的 装配 ， 由 真 核 起 始 因子 Celfs) 和 其 他 mRNA 44807 (Leibold 和 Munro, 1988; Dever, 2002).

3.1.3 编码 区

编码 区 是 mRNA 的 结构 部 分 ， 它 从 第 一 个 AUG 密码 子 〈 也 称 作 起 始 密码 子 ) 开始 。 真 核 细胞 申 极 少数 的 翻译 从 非 AUG 密码 子 开 始 (Hann 等 ，1988; Florkiewcz 和 Sommer, 1989); 相反 ， 原 核 生 物 的 蛋白 质 翻 译 ， 似 乎 倾向 于 从 GUG 和 AUG the. Wot, CALE 明 ， 判 断 起 始 密码 子 需要 读 到 “好 的 上 下 文 ”*。 早 期 研究 认为 ， 核 糖 体 识 别 的 AUG 密码 子 ， 它 的 前 第 三 个 核 苷 酸 必须 是 一 个 味 叭 ， 通 常 是 A (Kozak, 1986), WEA, AUG 前 第 三 个 核 苷 酸 是 一 个 味 叭 ， 后 面 直接 跟 一 个 G， 才 是 翻译 最 和 佳 的 起 始 位 点 。 这 个 模块 被 认为 是 指 向 起 始 密码 子 的 标记 。

编码 区 开始 处 的 AUG 密码 子 ， 使 真 核 蛋 白质 氨基 端 是 甲 硫 氮 酸 ， 而 原核 蛋白 质 的 氨基 端 为 甲 酰 甲 硫 氨 酸 。 起 始 密码 子 后 的 每 三 个 核 苷 酸 ， 指 导 各 种 氢 基 酸 进 入 新 生 多 肽 。 真 核 多 肽 延伸 一 段 时 间 后 可 能 延宕 〈(Woolin 和 Walter，1988) 。 延 伸 以 这 种 方式 持续 ， 直 到 终止 (无 义 ) BF CUAA, UAG K UGA) 出 现 ， 也 无 校正 tRNA 变种 出 现 为止 。 终 止 密码 子 是 翻译 终止 的 正常 信号 。 因 此 ，mRNA 编码 区 的 5 末端 对 应 于 mRNA 翻译 产物 新 生 多 肽 的 氨基 端 ，3 末端 对 应 于 多 肽 的 羧基 端 。 典 型 的 真 核 mRNA 编码 区 在 200~1500 HARK 度 ， 但 也 有 极 短 的 和 极 长 的 mRNA 编码 区 。

3.1.4 尾部 序列

终止 密码 子 外 是 另 一 个 非 翻 译 区 ， 即 尾部 序列 或 3`UTR 区 。 这 个 序列 通常 约 50 一 150 个 碱 基 长 度 ， 但 长 达 1000 碱 基 的 UTR 曾 被 报道 。 甚 至 不 同 的 mRNA 分 子 编码 相同 的 多 肽 ， 而 其 差异 仅 在 于 3 UTR 长 度 的 不 同 〈 比 如 二 氧 叶酸 还 原 酶 mRNA)。 虽 然 3`UTR 区 的 功能 还 不 清楚 ， 但 相信 它 影响 mRNA 在 细胞 质 中 的 稳定 性 。 但 是 必须 注意 ， 很 多 3'UTR 区 内 ， 离 多 聚 腺 苷 酸 合成 起 始 位 点 30 核 苷 酸 以 内 ， 有 高 度 保守 的 AAUAAA 序列 (Proud- foot 和 Brownlee，1976 ) 。

3.1.5 BREE

大 部 分 真 核 mRNA 在 其 3 末端 有 一 特征 性 的 聚 腺 苷 酸 (Lim 和 Cannelakis, 1970; Edmonds 等 ，1971)， 这 个 结构 为 poly(A) 尾巴 。 它 的 精确 长 度 具 有 指示 细胞 中 mRNA 种 类 和 翻译 状态 的 功能 (Kuge 和 Richter, 1995; 见 Baker 的 综述 ，1997) 。hnRNA 转录 后 ， 很 快 就 被 一 类 在 细胞 核 中 的 poly(A) 多 聚 酶 家 族 中 的 一 个 酶 加 上 poly(A) 结构 。 有 趣 的 是 ， 在 发 现 3 poly(A) 以 前 ， 早 就 知道 poly(A) 聚合 酶 。 所 有 poly(A) 聚合 酶 都 表 现 出 对 ATP 非常 高 的 专 一 性 ， 它 需要 带 AMP 残 基 可 以 结合 上 去 的 3 -游离 羟基 的 多 核 mR.

具有 上 述 特 点 的 mRNA 部 分 叫 作 poly(A) mRNA。 虽 然 认 为 超过 97% HAKB mRNA

和 本 人

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

种 类 具有 poly(A)， 在 细胞 质 中 至 少 有 坊 的 mRNA 分 子 没有 poly(A) 尾 ， 其 中 主要 是 编码

组 蛋白 的 mRNA。 当 聚 腺 苷 酸化 被 抑制 时 98， 正常 的 poly(A) mRNA 就 不 能 从 hnRNA 中 产生 。 如 果 poly(A) 尾 是 mRNA 从 细胞 核 向 细胞 质 运输 必需 的 ， 那 么 没有 poly(A) 的 组 &A mRNA 就 需要 一 个 运 出 核 的 替代 方式 ， 很 可 能 是 基于 成 熟 组 和 蛋白 mRNA 特有 的 性 质 。 较 明 确 的 是 ，mRNA 通过 与 和 蛋白质 形成 核 和 蛋白 复合 物 颗 粒 而 经 核 孔 运 输 ， 一 有 旦 到 达 细 胞 质 ， mRNA 可 能 CAT REA) 开始 翻译 。

已 观察 到 很 多 mRNA 聚 腺 苷 化 的 调控 作用 ， 越 来 越 多 的 证 据 支 持 poly(A) 尾 在 稳定 细 胞 质 中 某 些 mRNA 方面 以 及 在 调控 翻译 效率 方面 起 作用 。mRNA 特殊 的 5 特征 和 3 特征 ， 可 能 至 少 部 分 地 保护 它 不 被 外 切 核 酸 酶 降解 。 另 外 ， 接 近 5 末端 和 /或 3 末端 的 序列 信息 ， 可 能 在 细胞 质 的 影响 下 ， 促 进 这 些 分 子 的 降解 (Jackson 和 Standar, 1990; Spirin, 1994; Standart 和 Jackson, 1994; Curtis 等 ，1995 ) 。

转录 显然 并 不 终止 在 聚 腺 苷 酸化 起 始 的 位 点 ， 而 是 终止 在 下 游 CBN 3 方向 ) 的 某 个 位 点 。 首 先 在 腺 病毒 系统 观察 到 这 种 现象 (Nevins 和 Darnell，1978; Fraser 等 ，1979) 。 聚 腺 苷 酸化 的 实际 起 始 位 点 ， 是 在 初始 转录 物 尾部 区 内 通过 严格 控制 的 剪 切 产 生 的 ，poly(A) 尾巴 直接 加 到 它 的 3 端 。 剪 切 和 聚 腺 苷 酸化 的 效率 ， 极 大 程度 上 取决 于 高 度 保守 的 AAUAAA 模块 ， 它 被 称 为 poly(A) 信号 。 另 一 个 在 聚 腺 苷 酸化 起 始 位 点 下 游 的 比较 保守 的 富 含 GU 的 序列 ， 这 两 个 序列 的 精确 位 置 关 系 和 序列 保守 的 程度 指导 了 hnRNA 在 AAUAAA 信和 号 下 游 剪 切 ， 并 在 剪 切 产 生 的 3 -羟基 处 聚合 poly(A)。 这 些 转录 后 修饰 至 少 是 部 分 由 小 核 核糖 核 蛋 白 体 (snRNP) 介 导 的 〈Birnstiel 等 ，1985; Berget 和 Robberson, 1986; Black 和 Steitz, 1986; Hashimoto 和 Steitz, 1986).

聚 腺 苷 酸化 信号 的 重要 性 是 很 容易 证 明 的 〈Fitzgenald 和 Shenk, 1981; Manley 等 ， 1985); 自发 的 变异 、 人 为 点 突变 和 空间 重 排 已 经 显示 严重 干扰 了 poly(A)* mRNA HH 成 。 聚 腺 苷 酸化 信号 虽然 高 度 保守 ， 但 并 非 完 全 相同 。 例 如 观察 到 聚 腺 苷 酸化 信和 号 (AUUAAA) 存在 于 鸡 溶菌 酶 mRNA (Jung 等 ，1980) 和 一 种 腺 病毒 mRNA 中 (Ahmed 等 ，1982)，AAUAUA 序列 存在 于 胰腺 -淀粉 酶 mRNA 的 稀有 种 类 中 〈Tosi 等 ，1981) 。 进而 短 寿命 mRNA 的 一 个 模块 (AUUUA) 被 发 现存 在 于 某 些 肿瘤 基因 和 细胞 因子 转录 本 . 中 (Shaw 和 Kamen，1986) 。 现 在 被 称 为 ARE ( 富 含 AU 的 元 件 ) 的 序列 ， 存 在 于 不 稳定 mRNA 中 ， 它 被 认为 促进 了 mRNA 的 降解 。 这 种 五 核 苷 酸 序列 位 于 非 翻 译 的 尾部 区 域 ， 可 能 串联 重复 几 次 。ARE sp & SWART Rk. BD poly(A) 尾巴 的 切除 ， 进 而 发 生 去 稳定 化 ， 接着 是 核酸 内 切 酶 介 导 的 mRNA 降解 。 现 在 看 来 ， 聚 腺 苷 酸化 可 能 调控 原核 mRNA 的 稳定 HE (O’Hara 等 ，1995 ) 。

虽然 聚 腺 苷 酸化 信号 的 高 度 保 守 性 质 ， 以 及 腺 苷 酸化 真 核 转录 物 的 丰 度 ， 暗 示 着 poly (A) 尾巴 在 细胞 中 的 中 心 作用 ， 但 poly(A) 的 生理 作用 以 及 poly(A) 结合 蛋白 〈polyade- nylate-binding protein，PABP)@ 的 生理 作用 还 不 清楚 。 但 是 很 明确 的 是 poly(A) 的 长 度 与 mRNA 的 稳定 性 及 其 翻译 效率 是 有 相互 关系 的 。

@ HAR (3 -脱氧 腺 苷 ) 天 然 阻 止 聚 腺 苷 酸化 的 发 生 (Zeevi 等 ，1982)， 但 并 不 干扰 转录 或 总 的 来 说 不 干扰 hnR- NA 合成 。 @ PABP 鉴定 的 方法 学 参见 Sachs Al Kornberg (1990) 及 Gorlach 等 (1994) 。

. 20 .

第 3 章 信使 RNA

3.1.6 细胞 器 mRNA

线粒体 和 叶绿体 都 有 它们 自己 的 环 状 染 色 质 ， 因 此 在 遗传 上 它们 独立 于 细胞 核 染 色 质 。 这 些 细胞 器 的 基因 组 被 分 别称 为 mtDNA 和 ctDNA。 线 粒 体 和 叶绿体 基因 编码 的 蛋白 质 都 定位 于 这 些 细胞 器 。 它 们 都 输入 核 基因 编码 的 蛋白 质 以 支持 正常 的 细胞 器 生理 活动 。

转录 和 翻译 的 机 制 是 高 度 保守 的 ， 但 不 同 细胞 器 中 不 同 的 mRNA 品种 存在 某 些 结构 差 异 。 如 线粒体 mRNA 不 存在 5 帽子 结构 。 虽 然 它 的 3 端 被 聚 腺 苷 酸化 ， 但 与 细胞 质 腺 苷 酸 化 的 转录 物 相 比 ， 它 要 短 得 多 。 更 有 甚 者 ， 线 粒 体 mRNA 通常 使 用 AUA 和 AUU 作为 起 始 密 码 子 ， 并 且 它 们 通常 都 很 靠近 5 末端 。 有 趣 的 是 ， 从 结构 角度 讲 ， 酵 母线 粒 体 的 mRNA 比 其 他 来 源 的 线粒体 mRNA 更 接近 于 细胞 质 的 mRNA。

3.2 细胞 局 内 的 稳定 性

细胞 质 中 ， 多 核糖 体 和 非 多 核糖 体形 式 的 两 种 mRNA 以 信使 核糖 核 蛋白 体 C(mRNP) 复合 物 形 式 存在 。 虽 然 大 部 分 多 核糖 体贴 在 细胞 骨架 〈Lenk 等 ，1977; Howe 和 Hershey, 1984) 上 ， 但 是 这 种 结合 和 随 之 而 来 的 翻译 并 非 绝 对 必需 。poly(A) 尾巴 和 其 长 度 显 然 起 着 稳定 mRNA 的 作用 。 使 poly(A) 缩短 可 导致 去 稳定 化 - (Decker 和 Parker, 1994; Beela- man 和 Parker，1995)。 如 酶 法 除去 蛙 卵 球 蛋白 poly(A)， 因 为 快速 降解 ，mRNA 迅速 失去 翻译 活性 (Huez 等 ，1974;， Marbaix 等 ，1975)。 研 究 已 证 明 这 种 3 ARE 的 作用 。 这 些 序 列 的 缺失 ， 大 大 降低 了 脱 腺 苷 酸 的 速度 ， 因 此 延长 了 mRNA 在 胞 质 中 的 寿命 〈Wilson 和 Treisman, 1988; Shyu 等 ，1991; Decker 和 Parker, 1993; Chen 和 Shyu，1994)。 最 后 ， 越 来 越 多 的 证 据 显示 ，5 UTR 和 3'UTR 的 长 度 及 核 苷 酸 组 成 对 于 转录 本 的 稳定 性 起 着 以 前 所 不 知道 的 作用 (SRR IL Lewin，2004) 。

3.3 @ 12 K F

历史 上 用 腺 病毒 和 SV40 进行 的 实验 (Nevins 综述 ，1983) ， 首 次 显露 出 生化 反应 与 有 生物 功能 的 mRNA 合成 联系 在 一 起 。 虽 然 人 们 曾经 相信 很 多 这 样 的 性 状 与 真 核 mRNA 的 相 同 ， 近 来 的 研究 显示 ， 由 了 NA 形成 的 二 级 结构 和 三 级 结构 ， 以 及 大 量 的 RNA 结合 蛋白 ， 都 与 转录 物 转录 后 行为 有 关 。 在 活 细胞 中 ， 可 能 的 调控 点 的 数量 是 非常 多 的 。 从 最 广义 上 讲 ， 这 些 数 量 巨 大 的 可 能 的 调控 点 可 以 归 人 四 个 主要 的 类 型 (图 3. 2): 转录 调控 ;转录 后 调控 ;翻译 调控 ;翻译 后 调控 。

在 亚 细 胞 水 平 ， 真 核 RNA 分 子 在 核 内 被 转录 和 加 工 ， 这 是 细胞 的 初始 调控 。 在 那里 ， RNA 分 子 有 了 正确 的 修饰 ， 通 过 剪接 去 掉 内 含 子 序列 ， 可 能 从 核 转运 到 胞 质 。 已 有 综述 阐 明 这 种 很 独特 的 炉 - 质 转运 机 制 的 细节 (Pinol-Roma 和 Dreyfuss, 1993; Maquat, 1997), EGR mRNA 移动 到 核 孔 并 通过 核 孔 复合 物 。 在 细胞 质 中 ， 成 熟 的 mRNA 可 能 与 翻译 装置 结合 ， 也 可 能 不 与 翻译 装置 结合 。 事 实 上， 细胞 质 RNA 的 化 学 稳定 性 本 身 就 是 基因 表达 的 一 个 调控 点 。 在 这 里 重申 这 一 点 是 重要 的 ， 虽 然 大 多 数 mRNA 进入 多 核糖 体 复 合 物 ， 但 形 成 非 翻 译 mRNA: 和 蛋白质 复合 物 是 一 个 可 能 的 翻译 调控 点 。 过 去 已 经 用 “信息 体 ” 这 个 术 语 描述 这 种 非 翻 译 胞 质 mRNA: 和 蛋白质 复 合 物 (Preobrazhensky 和 Spirin, 1978; Bag,

a

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

3.2 细胞 中 ， 基 因 表 达 受 到 很 多 关键 点 的 调控 ， 从 细胞 基因 组 编码 的 信息 开始 ， 通过 mRNA 的 生物 合成 到 作为 功能 蛋白 的 最 后 表现 。 细 节 见 正文

1991) 。 如 果 一 个 mRNA 分 子 确实 被 翻译 ， 其 初始 产物 多 肽 通常 将 经 受 各 种 翻译 后 修饰 。 最 可 能 的 是 该 多 肽 被 切除 信号 序列 。 其 他 常见 的 翻译 后 修饰 包 括 〈 但 并 不 局 限于 此 ) 剪 切 、 栈 基 化 、 甲 基 化 、 昼 成 烽 基 化 、 羧 基 化 、 糖 基 化 、 磷 酸化 、 羟 基 化 等 。

任何 影响 转录 效率 或 阻止 转录 的 变化 ， 都 被 说 成 是 作用 于 转录 水 平 〈 转 录 调 控 )。 任 何 影响 hnRNA 的 剪接 、hnRNA 分 子 稳定 性 、 核 - 质 转运 或 在 细胞 质 中 的 稳定 性 的 事件 ， 都 被 说 成 是 在 转录 后 起 作用 (转录 后 水 平 )， 这 类 事件 的 确 是 多 种 多 样 的 。 如 虽 然 组 织 培养 中 哺乳 类 细胞 多 达 半 数 的 mRNA 其 半 误 期 长 达 几 个 小 时 ， 但 是 很 多 mRNA 的 半衰期 仅 约 10min 或 更 短 ， 这 种 时 间 的 短暂 常常 是 基因 表达 的 天 然 调 节 器 。 同 样 ， 环 境 刺 激 显 然 可 以 显著 影响 特 殊 mRNA 种 类 的 稳定 性 (Buckingham 等 ，1974; Baumbach 等 ，1984; Knight 等 ，1985)。 发 生 在 翻 译 和 翻译 后 水 平 的 调控 ,通常 暗示 细胞 质 中 成 熟 mRNA 在 蛋白 质 合 成 或 合成 以 外 某 种 程度 上 受到 翻 VEEN THE.

显然 ， 细 胞 群体 的 生化 状态 是 可 以 定量 和 定性

地 定义 为 细胞 破碎 时 mRNA 复杂 性 的 函数 。 如 研究 者 可 能 希望 确定 在 模式 系统 中 ， 观 察 到 的 基因 表达 调控 是 转录 水 平 的 调控 ， 还 是 转录 后 水 平 的 事件 。 在 这 种 情况 下 ， 细 胞 破碎 和 RNA 纯化 方法 必须 允许 进行 核 内 易 检 测 基因 转录 本 的 丰 度 分 析 ， 而 不 受 细胞 质 的 影响 同样 可 以 进行 单独 细胞 质 的 分 析 。 此 外 ， 转 录 速 度 的 研究 ， 需 要 分 离 完 整 的 细胞 核 ， 完 整 的 核 才 能 支持 起 始 转录 物 的 延伸 ， 可 以 进行 同位 素 摊 和 标记 〈 见 第 17 章 )。 因 此 ，RNA 从 生物 样品 中 纯化 的 条 件 ， 必 须 能 确保 RNA 的 化 学 稳定 性 ， 并 保证 整个 过 程 中 核糖 核酸 酶 处 于 失 活 状态 。 即使 算 不 上 必需 的 话 ， 特 别 注 意 的 细节 常常 是 RNA 分 离 和 后 续 分 析 成 败 的 决定 因素 。

3.4 和 参考 文献

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第 3 章 信使 RNA

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(2a; SHFR)

« 25 。

4.1 基本 原理

RNA 本 身 不 稳定 ， 加 之 核糖 核酸 酶 (RNase) 普遍 存在 ， 使 分 离 全 长 RNA 分 子 更 为 困 难 。 核 糖 核酸 酶 是 一 个 大 家 族 ， 基 本 上 所 有 细胞 都 有 RNase。 这 些 RNase 能 够 通过 外 切 和 内 切 的 方式 降解 RNA。 对 于 科研 人 员 来 说 ，RNase 活性 有 好 处 也 有 坏处 。 如 果 想 分 离 完 整 的 RNA 分 子 ， 用 于 后 续 的 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR)、Northern 分 析 或 其 他 研究 ， RNase WAH. WRK RNA 除 掉 ，RNase 则 有 益 。

胰 脏 中 的 RNase 很 特别 ， 能 够 很 快 恢 复活 性 。 它 们 的 分 子 量 小 ， 有 4 个 二 硫 键 维持 其 三 级 结构 ， 特 别 稳 定 〈Blackburn 和 Moore，1982)。 很 多 变性 条 件 (HAM) DHA. 胰 脏 RNase 活性 能 够 迅速 恢复 (Sela 等 ，1957) 。RNase 所 需要 的 辅助 因子 很 少 ， 在 广泛 的 pH 范围 内 都 有 活性 。 很 明显 ， 研 究 人 员 从 实验 开始 ， 就 要 保证 实验 所 用 的 器 严 和 试剂 没有 RNase 的 污染 。 对 于 大 多 数 熟 悉 RNA 研究 的 分 子 生 物 学 家 来 说 ， 所 谓 的 消毒 器 亚 和 试剂 ， 就 是 说 这 些 器 下 和 试剂 没有 RNase 的 污染 。

很 多 研究 人 员 常 常 忽视 了 RNase 导致 的 样品 降解 ， 而 更 重视 研究 进度 。 这 部 分 归 因 于 现在 已 经 有 商家 提供 从 各 种 材料 方便 分 离 RNA 的 试剂 。 如 此 一 来 ， 研 究 人 员 就 能 够 省 去 很 多 传统 技术 控制 RNase 活性 所 花费 的 时 间 ， 而 控制 RNase 活性 常常 不 再 是 研究 人 员 关 心 的 重要 问题 。 这 是 一 种 很 不 好 的 学 术 态 度 。 尽 管 没 有 人 怀疑 纯化 RNA 用 的 试剂 具有 抑制 RNase 活性 的 性 质 。 但 是 分 离 试剂 除去 后 ， 关 注 RNA 分 子 的 稳定 性 却 具 有 更 大 的 重要 性 。 例如 ， 纯 化 的 RNA 样品 对 核酸 酶 的 敏感 性 不 比 将 RNA 样品 储存 在 缓冲 液 [如 TE (10mmol/L Tris，lmmol/L EDTA, pH7.5)] 或 水 中 严重 。 不 幸 的 是 ， 损 失 有 价值 样品 常 是 惨痛 的 教训 ， 应 该 在 分 离 纯 化 前 、 过 程 中 以 及 分 离 纯 化 后 ， 认 真 保 持 RNA 的 稳定 性 。 正 确 储存 已 纯化 RNA 的 方法 在 第 5 章 中 有 介绍 。

4.2 核糖 核酸 酶 活性 的 消除

控制 核糖 核酸 酶 (RNase) 活性 的 方式 ， 必 须 与 细胞 裂解 方案 兼容 。 如 果 研 究 工作 要 求

分 离 完 整 的 细胞 器 〈 尤 其 是 细胞 核 ) ， 细 胞 裂解 缓冲 液 相 对 温和 ， 人 常常 将 RNase 抑制 剂 直接

加 入 这 种 裂解 缓冲 液 中 。 例 如 分 别 考察 细胞 核 RNA 和 细胞 质 RNA， 从 而 评估 基因 调控 水

平 的 课题 。 为 此 ， 抑 制 RNase 活性 的 方法 ， 必 须 有 利于 后 续 分 离 纯化 操作 时 维持 RNA 分 子

的 完整 性 ， 有 些 分 离 操作 相当 费时 。 另 外 ， 从 纯化 后 的 RNA 制品 中 ， 除 去 用 于 抑制 RNase 26 。

第 4 章 核糖 核酸 酶

活性 的 试剂 必须 容易 ， 以 免 这 些 试 剂 干扰 后 续 的 操作 。

这 些 实际 情况 迫使 从 下 列 两 个 方面 控制 RNase 活性 。

@ 控制 外 部 RNase 活性 。 从 试验 开始 以 及 实验 进行 中 要 鉴定 并 消除 外 部 RNase 污染 。 这 些 RNase 污染 源 包 括 〈 但 不 局 限于 ) 器 焉 、 包 装 化 学 药品 的 容器 、 未 经 二 乙 基 焦 碳 酸 酯 处 理 的 水 、 族 胶 盒 、 梳 子 、 被 微生物 或 真菌 污染 的 缓冲 液 。 但 唯一 最 大 的 污染 源 是 手指 上 的 油脂 ， 它 含有 大 量 的 RNase。 因 此 ， 防 止 RNase 污染 的 首要 措施 是 操作 人 员 必 须 戴 手 套 。

@ 控制 内 源 性 RNase 活 性。 除了 偶然 的 实验 室 环 境 造 成 RNase 污染 外 ， 研 究 人 员 应 该 深刻 地 认识 到 ， 必 须 避 免 内 源 性 RNase 对 RNA 的 降解 。 正 常情 况 下 ， 细 胞 内 的 RNase 与 RNA 是 隔离 的 。 在 裂解 细胞 时 ， 被 隔离 的 RNase 将 被 释放 出 来 。 游 离 的 RNase 能 够 水 解 RNA， 因 此 要 及 时 抑制 这 些 RNase 活性 。 由 于 不 同 组 织 所 含 的 RNase 差异 很 大 ， 因 此 具体 的 抑制 RNase 活性 的 措施 取决 于 组 织 或 细胞 的 种 类 。 对 于 内 源 性 RNase 活性 水 平 的 认识 来 源 于 文献 和 个 人 经 验 。

在 所 有 情况 下 ， 尤 其 是 首次 接触 到 新 的 细胞 类 型 或 组 织 时 ， 在 保证 与 试验 方案 不 冲突 的 情况 下 ， 要 尽 最 大 努力 采取 严格 措施 控制 RNase 活性 。 否 则 就 有 RNA 样品 被 降解 的 危险 ， 获得 的 RNA 样品 被 降解 而 无 法 使 用 。 那 些 能 够 最 好 地 分 离 RNA 的 实验 室 ， 通 常 有 一 个 分 离 RNA 专用 的 试剂 库 。 这 个 库 的 试剂 只 用 于 RNA 分 离 及 其 后 续 操 作 ， 决 不 用 于 其 他 实验 。

4.3 核糖 核酸 酶 抑制 剂 的 种 类

可 以 将 控制 核糖 核酸 酶 〈RNase) 活性 的 化 合 物 分 为 两 大 类 : 特异 性 RNase 抑制 剂 和 非特 异性 RNase 抑制 剂 。 有 些 RNase 抑制 剂 能 直接 加 入 细胞 有 解 缓冲 液 和 反应 缓冲 液 中 抑 tii] RNase 活性 ， 而 另 一 些 RNase 抑制 剂 只 能 在 试剂 准备 过 程 中 使 用 。 将 RNase A、 测 试 RNA 和 RNase 抑制 剂 一 同 保 温 ， 然 后 用 琼脂 糖 凝 胶 电泳 观察 测试 RNA 的 降解 情况 ， 评 价 RNase 抑制 剂 在 特定 系统 中 的 有 效 性 〈 第 8 章 中 图 8. 1) 。 如 果 发 生 RNA 降解 ， 就 要 修改 实 验方 案 。 为 了 满足 这 些 需要 ， 生 物 技 术 公司 已 经 开发 了 很 多 RNase 抑制 剂 。 研 究 人 员 能 够 直接 从 公司 购买 这 些 试剂 。

4.3.1 特异 性 RNase 抑制 剂

4.3.1.1 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物

20 世纪 70 年 代 中 期 开发 的 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 CVDR) 是 在 细胞 温和 有 裂解 条 件 下 使 用 的 RNase 抑制 剂 。VDR 使 用 时 间 并 不 很 长 ， 主 要 有 下 列 三 个 原因 : 中 后 来 开发 出 更 强 的 RNase 抑制 剂 用 于 RNA A; 外 残留 的 痕 量 的 VDR 会 抑制 mRNA 的 体外 翻译 (Berger 和 Birkenmier, 1979; Berger 等 ，1980); @VDR 有 副作用 ， 能 抑制 反 转 录 酶 活性 。 因 此 ， 在 RT-PCR 和 很 多 相关 的 操作 中 禁止 使 用 VDR。 若 纯化 RNA 用 于 这 些 目的 ， 建 议 不 要 使 用 VDR.

VDR 是 氧 钒 离子 和 一 种 或 四 种 核糖 核 苷 形成 的 复合 物 ， 其 钒 离子 替代 了 磷酸 (Lein- hard 等 ，1971; Berger 和 Birkenmier，1979)。 这 些 复 合 物 可 以 作为 过 渡 态 类 似 物 。 缺 乏 VDR tt, RNase 能 够 裂解 RNA 的 磷酸 二 酯 键 ， 产生 二 环 过 渡 态 中 间 物 ， 后 者 在 一 个 水 分 子 攻 击 下 发 生 断 裂 。 作 为 一 种 RNA 类 似 物 ， 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 能 形成 高 度 稳 定 的 二 环 ， 使 酶 不 可 逆 地 与 这 种 复合 物 结合 。 因 此 ，VDR 是 通过 将 RNase 锁定 于 过 渡 态 假 底 物 ， 进 而

“i 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

抑制 RNase 活性 的 。VDR 能 够 与 广 谱 的 细胞 内 RNase 紧密 结合 ， 而 且 适 用 于 包括 蔗糖 梯度 离心 等 不 同 细 胞 分 级 分 离 方 法 (Benecke 等 ，1978; Nevins 和 Darnell，1978)。 简 言 之， VDR 是 通过 它 与 RNase AA] MAGA I til RNase 活性 的 。 如 果 需 要 分 离 细 胞 浆 中 的 总 RNA 《〈 而 不 是 细胞 总 RNA)， 用 于 Northern 分 析 或 核酸 酶 保护 检测 来 评估 转录 后 RNA 的 情况 ， 实 验 室 会 偶尔 使 用 VDR。 尽 管 使 用 VDR 控制 RNase 活性 价 廉 、 有 效 ， 但 是 在 PCR 实验 中 选用 VDR 是 不 合适 的 。

通常 将 VDR 制备 成 200mmolL 的 鱼 备 溶液 〈 见 本 章 实 验方 案 )。 根 据 预 测 的 RNase 水 平 ，VDR 使 用 的 终 浓 度 是 5 一 20mmolL。 已 经 证 实 这 个 浓度 可 以 抑制 细胞 内 高 水 平 的 RNase 活 性 (Berger 和 Birkenmier, 1979), VDR 抑制 胰 脏 RNase A 和 了 NaseTi 特别 有 效 ， 但 不 能 抑制 RNase H, VDR 还 能 抑制 poly(A) 聚合 酶 家 族 的 活性 ， 这 种 酶 对 进行 的 实验 可 能 无 关 。 用 VDR 抑制 了 细胞 裂解 液 的 核酸 酶 活性 后 ， 用 含有 0.1% (1lg/L)8- 羟 基 唆 啉 的 有 机 溶液 反复 抽 提 除去 VDR。8- 羟 基 唆 啉 是 RNase 的 部 分 抑制 剂 。 另 外 ， 加 入 10mol 量 的 乙 二 胺 四 乙酸 CEDTA) 也 能 除去 VDR。 但 是 研究 人 员 必 须 记 住 ， 不 到 1mol 量 的 EDTA 就 足以 解 离 VDR 复合 物 。 因 此 ， 使 用 VDR 时 不 能 使 用 含有 EDTA HRPM. 只 有 使 用 了 另 一 种 核酸 酶 抑制 剂 ， 如 葵 酚 : 氯仿 加 入 裂解 液 中 ， 才 可 以 使 用 含有 EDTA 的 缓冲 液 。

4.3.1.2 RNasin

VDR 的 优秀 替代 物 是 一 种 商品 多 肽 类 RNase 抑制 剂 ， 如 RNasin (Promega, Madison, WDI) 。 这 种 核酸 酶 抑制 剂 能 抑制 核酸 酶 活性 ， 克 服 使 用 VDR 的 问题 。 早 先 从 人 胎盘 和 鼠 肝 抽 提 这 类 和 蛋白质。 后 来 ， 用 克隆 这 种 基因 或 其 他 来 源 的 类 似 基 因 的 方法 保证 这 类 和 蛋白质 的 大 量 供应 。RNasin 相对 分 子 质 量 是 51000， 它 抑制 核酸 酶 活性 高 度 依赖 二 莹 基 苏 糖 醇 (DTT)®, RNasin 以 竞争 性 非 共 价 方式 与 核酸 酶 结合 抑制 RNase 活性 。 其 结合 常数 是 Ki = 4.4X10!4 (Blackburn 等 ，1977; Blackburn，1979)。 广 家 提供 的 非 重 组 RNasin 是 从 猪 肝 分 离 的 ， 因 此 ， 其 制品 不 存在 人 DNA 的 污染 。 这 种 RNase 抑制 剂 能 够 用 于 人 的 临床 和 诊断 。

常规 使 用 的 人 RNasin 浓度 是 250~1000U/ml, Em A ec He HH Hi] RNase A, RNase B 和 RNase C 的 活性 ， 但 不 能 抑制 RNase T,. Sl 核酸 酶 或 曲霉 菌 的 RNase (Promega f= fh in- sert) 。 更 新 的 非特 异性 RNase 抑制 剂 ， 如 SUPERase. In (Ambion, Austin TX)， 能 够 抑 制 更 为 广 谱 的 RNase 活性 。

用 RNasin 控制 核酸 酶 活性 的 主要 优点 是 它们 与 不 同 的 体外 反应 兼容 。 在 这 方面 ， 它 比 VDR 好 得 多 。RNasin 能 够 保护 合成 CDNA 的 mRNA 模板 (de Martynoff 等 ，1980); 在 体 外 转录 中 ，RNasin 能 提高 RNA 的 产量 、 维 持 RNA 分 子 的 完整 性 (Scheider 等 ，1988 ); RNasin 能 够 提高 体外 翻译 的 多 肽 产量 ， 提 高 多 聚 核 糖 体 的 活性 (Scheele 和 Blackburn, 1979). (8 FAA RNasin 时 ， 必 须 避 免 过 强 的 变性 条 件 ， 如 高 浓度 的 尿素 或 加 热 到 65C， 这 些 条 件 会 导致 RNase-RNasin 复合 物 的 解 离 ， 导 致 RNase 活性 的 恢复 。

4.3.2 非特 异性 RNase 抑制 剂 至 今 已 经 广泛 报道 了 各 种 非特 异性 RNase 抑制 剂 的 应 用 。 使 用 这 些 化 合 物 的 目的 是 抑

@@ 有 些 核 酸 酶 抑制 剂 所 需 的 DTT 浓度 很 高 ， 过 高 浓度 的 DTT 对 某 些 后 续 反 应 不 利 。 必 须 保 障 后 续 应 用 与 所 用 DTT 的 兼容 性 。

本 28 op

第 4 章 核糖 核酸 酶

制 所 有 内 源 性 RNase 活性 。 在 RNA 分 离 过 程 中 ， 这 些 化 合 物 的 使 用 能 不 同 程度 地 抑制 RNase 活性 。 尽 管 还 没有 一 种 化 合 物 在 各 种 条 件 下 能 够 取得 完全 成 功 的 效果 。 但 是 一 个 或 几 个 这 样 的 化 合 物 能 够 有 效 控 制 RNase 活性 ， 而 其 他 的 方法 达 不 到 这 个 目的 。 这 些 非 特异 性 抑制 剂 包括 肝素 (Palmitor 等 ，1970; Cox, 1979), MAAR. BA HRA AR (dextran), 阳离子 表面 活性 剂 (Dahle 和 Macfarlane, 1993). HEH (clays macaloid) 和 旺 土 (ben- tonite) 〈 综 述 见 Blumberg，1987) 。 除 了 在 生物 技术 和 药物 方面 的 应 用 外 ， 电 土 在 制 酒 业 的 应 用 可 以 追溯 到 20 世纪 30 年 代 中 期 (Saywell，1934) ， 今 天 几乎 达到 普及 的 程度 (Blade 和 Boulton，1988)。 早 期 已 经 报道 了 用 于 抑制 RNase 活性 的 黏土 的 制备 方法 〈Fraenkel- Conrat 等 ，1961; Poulson, 1973; Blumberg，1987)， 但 是 现在 用 黏土 抑制 RNase 活性 的 例子 不 多 。

也 许 在 实验 室 更 容易 获得 过 氧化 氢 稀 释 液 (3%)， 以 及 氢 氧 化 钠 〈0. 5mol/L) 和 十 二 烷 基 硫酸 钠 〈SDS) (0.1%~0.5%) 的 混合 物 。 有 些 研 究 人 员 并 不 想 在 实验 室 自制 试 剂 来 抑制 RNase 活 性， 可 以 从 三 家 直接 购买 已 经 制备 好 的 抑制 RNase 活 性 的 试剂 。 如 同 后 面 介绍 的 ， 这 些 试剂 能 够 很 好 地 消除 器 严 表 面 的 人 RNase 活 性 ， 已 被 广泛 地 用 于 RNA 制备 。

4.4 器 包 和 试剂 的 准备

如 同 前 文 所 述 ， 准 备 器 血 和 配制 试剂 、 做 RNA 实验 尤其 是 抽 提 RNA 时 ， 戴 手套 是 最 重要 的 。 手 指 上 的 油脂 物 ， 尤 其 是 实验 室 技术 人 员 手 指 的 油脂 物 ， 有 很 多 RNase， 是 RNase 污染 的 最 大 来 源 。 由 于 门 锁 、 微 量 移 液 器 、 冰 箱 门 把 手 、 电 话 话 简 也 是 潜在 的 RNase 污染 源 ， 因 此 在 进行 与 RNA 有 关 的 实验 时 ， 要 毫 不 犹豫 地 更 换 几 次 新 手套 。 原 则 是 离开 实验 台 要 脱手 套 ， 回 到 实验 台 要 戴 新 手套 。 这 要 写 进 研究 RNA 的 方法 中 。

关于 实验 室 塑料 制品 ， 选 用 那些 独立 包装 的 、 血 清 学 级 的 移 液 管 进行 RNA 实验 不 需要 预 处 理 。 三 家 已 经 盖 紧 盖子 的 、 排 列 整齐 的 聚 丙 烯 和 聚 葵 乙 炳 类 的 15ml 和 50ml 的 锥 形 离 心 管 ， 可 以 看 作 是 已 经 消毒 的 离心 管 加 以 使 用 。 一 般 来 说 ， 用 于 组 织 培养 无 菌 标准 的 塑料 制 品 ， 不 大 可 能 有 RNase《〈 除 非 后 续 操 作 污 染 )， 在 使 用 这 些 塑 料 管 进行 RNA 实验 时 仍 必须 戴 手 套 。 主 要 是 操作 和 从 一 个 袋子 取出 分 装 的 过 程 ， 使 大 包装 的 聚 丙烯 塑料 制品 成 为 潜在 的 RNase 污染 源 。 微 量 离心 管 和 聚 丙烯 微量 枪 头 ， 它 们 也 可 能 成 为 污染 源 ， 进 而 污染 储备 液 。 因此 与 RNA 样本 直接 或 间接 接触 的 任何 塑料 制品 ， 凡 能 消毒 的 都 要 消毒 。 要 戴 上 手套 将 大 包装 的 微量 离心 管 分 装 到 500ml 的 玻璃 烧杯 中 ， 用 铝 膜 包装 后 消毒 。 戴 手套 将 这 些 消毒 后 的 微量 离心 管 放 置 在 RNA 实验 专用 处 。

如 果 必 须 使 用 玻璃 器 血 ， 如 进行 有 机 溶剂 缓冲 液 抽 提 操作 ， 使 用 含 苯酚 和 和 氯仿 等 有 机 溶剂 的 混合 物 时 ， 要 独立 包装 确 硅 玻璃 移 液 管 。 反 复 使 用 的 玻璃 器 严 必 须 保存 在 RNA 实验 专用 处 ， 不 要 在 实验 室 普 遍 使 用 。 与 一 般 想 法 相反 ， 高 压 消 毒 过 程 中 的 温度 和 压力 ， 并 不 能 消除 RNase 活性。 但 在 干 热 烘箱 中 烘 烤 能 够 消除 玻璃 器 下 的 RNase。 玻 璃 器 严 要 严 格 清洗 ， 先 用 没有 RNase 污染 的 水 冲 淋 《〈 后 面 会 讨论 ) ， 然 后 在 200C 左 右 烘 烤 3 一 4h。 这 种 方法 除去 玻璃 器 血 RNase 活性 非常 有 效 。 必 须 注 意 ， 并 不 是 实验 室 所 有 的 器 具 都 能 够 耐 受 干 热 烘箱 的 烘 烤 。 如 果 特 殊 塑 料 或 其 他 材料 制品 需要 消毒 ， 在 烘 烤 前 要 检查 厂家 提供 的 书面 资料 ， 或 电话 询问 确定 这 种 材料 能 否 耐 受 高 温 烘 烤 。 最 后 ， 实 验 室 所 有 的

。 29 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

储备 液 和 实验 溶液 都 要 标 上 制备 日 期 和 预计 的 使 用 日 期 。 用 过 期 的 甚至 更 糟 的 旧 溶 液 ， 做 实验 将 导致 精 糕 结果 。 其 原因 是 该 瓶 子 中 的 微生物 产生 的 RNase 污 染 了 瓶子 中 的 溶液 。

4.4.1 二 乙 基 焦 碳 酸 酯

当心 ”二 乙 基 焦 碳 酸 酯 (DEPC) 是 致癌 物 ， 操 作 时 要 非常 仔细 。 必 须 采 取 制 造 厂家 提 出 的 所 有 安全 预防 措施 。

高 压 灭 菌 并 不 能 保证 彻底 消除 溶液 、 实 验 室 塑料 制品 和 其 他 器 械 所 污染 的 RNase 活性 。 仅 用 高 压 灭 菌 处 理 的 缓冲 液 可 能 还 有 RNase 活性 残余 。 若 不 注意 这 些 细 节 ， 获 得 的 数据 在 代表 性 和 重复 性 上 将 产生 严重 问题 。 为 避免 此 种 现象 的 发 生 ， 在 作者 看 来 ， 直 接 购买 厂家 预 先 制备 的 无 RNase 活性 的 溶液 ， 是 值得 的 投资 。 另 外 ， 实 验 室 制 备 的 储备 液 和 缓冲 液 也 可 以 直接 或 间接 用 RNase 抑制 剂 (an DEPC) 处 理 。

DEPC 是 一 个 有 效 的 非特 异性 RNase 抑制 剂 9。 它 能 够 消除 试剂 中 的 RNase 活性 。 虽 然 现 在 可 以 使 用 更 容易 、 毒 性 更 低 的 处 理 方 法 去 除 RNase 活性 〈 后 面 将 介绍 )， 但 是 历史 上 做 RNA 工作 的 人 ， 曾 经 用 DEPC db BARRE EL, BRA RNase 活性 。 在 制备 溶液 和 缓冲 液 时 ，DEPC 要 加 到 最 终 浓度 为 0.05% 〈 体 积分 数 )@8。 然 后 将 缓冲 液 置 于 摇 床 〈 例 如 Lab- Line 摇 床 ) 上 振 功 数 小 时 或 用 磁力 搅拌 器 剧烈 搅拌 20 一 30min。 这 样 处 理 后 ， 必 须 彻 底 除 去 溶液 中 剩余 的 DEPC。 常 用 的 除去 DEPC 方法 是 高 压 消 毒 。 在 高 压 消毒 的 温度 和 压力 条 件 下 ，DEPC 完全 降解 成 二 氧化 碳 和 乙醇 。 而 该 条 件 下 二 氧化 碳 和 乙醇 挥发 性 很 大 。 另 一 种 方 法 是 ， 有 些 溶液 能 够 耐 受 60C 过 夜 8@8， 在 通风 橱 中 将 瓶 盖 稍 松 的 溶液 置 于 60C 保温 过 夜 ， 这 样 也 可 以 破坏 DEPC。 用 DEPC 处 理 大 量 的 水 时 ， 在 通风 橱 中 煮沸 1h 亦 可 除去 DEPC。 DEPC 不 仅 是 致癌 剂 〈 所 以 操作 要 仔细 ，DEPC 处 理 深 液 后 剩余 的 DEPC 要 彻底 除去 )， 而 HA DEPC Xt fig ES KT PRE A TR. OB EE ee AY DEPC， 也 能 化 学 修饰 腺 味 吟 碱 基 (Henderson , 1973), Mine a RNA 的 物理 性 质 、 损 伤 其 体外 翻译 (Ehrenberg 等 ， 1974) 和 其 他 性 能 ， 包 括 印迹 分 析 和 PCR 实验 〈 个 人 观察 ) 。 这 就 是 无 人 将 DEPC 直接 加 入 细胞 悬浮 液 或 裂解 液 中 纯化 RNA 的 原因 。

用 无 污染 RNase 的 磁力 棒 迅 速 搅拌 加 热 的 溶液 能 够 彻底 除去 DEPC。 通 常情 况 下 ,高

压 消 毒 时 间 不 足够 长 时 ， 能 够 嗅 到 溶液 中 残余 DEPC 特有 的 味道 。 在 实验 室 高 压 消 毒 完 全 除去 溶液 中 的 DEPC 后 ， 通 常 溶液 在 消毒 锅 中 还 要 维持 30min 左右 。

重要 提示

D 不 要 将 DEPC 加 入 含有 和 殖 基 或 一 级 氨基 的 溶液 中 ， 因 为 这 些 基 团 能 够 与 DEPC 发 生 反 应 (Berger, 1975) 。 不 能 用 DEPC 处 理 的 最 常用 的 缓冲 液 是 Tris (三 羟 甲 基 毛 基 甲 烷 ) 缓冲 液 。 替 代 措 施 是 先 用 DEPC 处 理 水 并 用 高 压 消 毒 除去 DEPC， 然 后 用 这 样 的 水 制备 含有 Tris 的 溶液 ， 最 后 再 高 压 消毒 。

Q 有 些 缓冲 液 含 有 与 DEPC 不 兼容 的 化 学 试剂 ， 不 能 用 DEPC 处 理 去 除 RNase， 要 用 硝 基 纤 维 素 膜 过

@ 由 于 组 氨 酸 和 栈 氨 酸 残 基 的 修饰 ， 能 够 有 效 抑制 某 些 蛋白 质 的 活性 ， 多 年 前 有 人 用 DEPC 破坏 质粒 抽 提 过 程 中 的 蛋白 质 。 这 是 一 种 很 糟糕 的 技术 ， 现 在 无 人 使 用 。 @ 早先 的 报告 提议 使 用 0.1% DEPC， 但 是 使 用 0.05%DEPC 消除 RNase 污染 的 效果 与 使 用 0.1% DEPC 处 理 的 效 果 相 当 。 考 虑 到 挨 人 DEPC 需要 用 高 压 消 毒 除 去 ， 现 在 使 用 DEPC 的 浓度 为 0.05%% 。 @ 重要 事项 : 有 些 溶 液 ， 如 SDS、NP-40 或 NaOH 溶液 ， 不 能 用 高 压 消 毒 或 加 热处理 。 这 些 组 分 只 能 在 其 他 组 分 已 经 加 入 并 被 制作 成 无 RNase 污染 的 溶液 后 加 入 。 - 30 -

第 4 章 核糖 核酸 酶

滤 两 次 ， 以 除去 RNase 和 其 他 痕 量 的 蛋白 质 。

@ 电泳 器 具 ， 包 括 凝 胶 梳 子 、 制 胶 盘 和 族 胶 盒 内 部 ， 可 以 用 经 过 DEPC 处 理 并 高 压 消 毒 除去 了 DEPC 的 水 浸泡 冲洗 。 注 意 ， 绝 对 不 可 以 将 电泳 器 具 直 接 与 DEPC 溶液 接触 ， 因 为 丙烯 酸 类 塑料 化 合 物 对 DEPC 敏感 。 参 见 另 一 种 消毒 方法 “4. 4. 3 过 氧化 氢 ”。

许多 RNase， 包 括 特 别 容易 复活 的 胰 脏 RNase， 经 RNase 抑制 剂 处 理 并 除去 RNase 抑 制剂 后 核酸 酶 活性 仍 能 恢复 。 保 存 RNA 专用 的 化 学 品 和 储备 液 要 谨慎 。 简 单 的 方法 是 将 消 毒 后 的 试剂 分 装 成 适当 体积 ， 而 不 是 从 储备 液 中 反复 取出 。 分 装 后 的 每 份 溶液 要 一 次 性 使 用 。 尽 管 这 种 操作 初 看 起 来 有 些 多 余 ， 但 是 排除 了 偶然 的 RNase 污染 ， 有 利于 回收 最 高 质 量 的 RNA。 最 后 别 忘 了 化 学 固体 药品 的 称 量 要 用 没有 RNase WAR.

4.4.2 替代 方法 一 一 用 消毒 水 冲洗

还 有 一 些 原因 阻止 在 实验 室 使 用 DEPC。 有 如 下 三 个 原因 。

@® DEPC 有 毒 ， 不 适合 那些 操作 不 规范 的 实验 室 。 因 为 操作 不 当 对 健康 有 害 。

@ DEPC 很 难 从 试剂 中 除去 ， 残 余 的 DEPC 会 于 扰 后 续 的 PCR 或 其 他 反应 。DEPC 使 用 过 量 会 导致 后 续 的 PCR 反应 或 其 他 反应 失败 。 多 年 来 ， 没 有 获得 良好 结果 的 实验 室 ， 许 多 研究 人 员 承 认 他 们 使 用 了 浓度 达 0. 5% ~5 % HY DEPC。

@ Ase FMA RNase 活性 。 虽 然 这 样 的 情况 不 普遍 ， 但 是 很 走运 。

一 个 合适 的 替代 方式 ， 是 从 靠得住 的 厂家 购买 无 RNase 的 水 ， 这 样 就 无 需 自 己 用 DEPC 处 理 来 制造 无 RNase 污染 的 水 。 对 于 那些 医院 附属 的 实验 室 ， 标 有 “ 冲 淋 用 水 ”中 没有 污染 物 ， 适 用 于 RNA 工作 。 纯 化 后 的 RNA 可 以 溶 于 这 些 水 中 ， 储 存 于 一 80"C 。 这 种 水 也 适 于 无 RNase 的 储备 液 稀 释 。 尽 管 通常 使 用 买 来 的 水 比较 贵 ， 但 是 使 用 方便 ， 不 必 再 用 DEPC 处 理 。

4.4.3 过 和 氧化 氢

ZAR, LMR SAA, MER HT. mR. HK AS. is BPR RNase。 将 这 些 物品 在 3% Wat Ak AAP 2 th BE AE #8 A HRA RNase 活性 。 这 种 溶 BFE Wi BE SK EN), PARE AE EE. AK SE — A A A. BEI 20 ~ 30min 后 就 能 够 消 Be ar ML 4e Ta AY RNase 活性 。 然 后 用 大 量 的 至 少 高 温 消 毒 过 一 次 的 水 冲洗 。 不 要 使 用 标准 化 学 试剂 公司 通常 提供 的 高 浓度 的 双氧水 〈 如 30%%)。 在 这 么 高 的 浓度 下 ， 双 氧 水 很 危险 ， 对 丙烯 酸 类 凝 胶 盒 组 件 和 其 他 设施 带 来 不 可 修复 的 损伤 ， 还 会 损伤 研究 人 员 。 此 外 要 避免 使 用 陈旧 的 过 氧化 氢 溶 液 ， 因 为 这 些 溶液 可 能 不 再 是 双氧水 溶液 。

4.4.4 和 氢 氧 化 钠 和 十 二 烷 基 硫酸 钠

一 个 较 老 的 除去 实验 室 表面 RNase 活性 的 方法 ， 是 将 能 够 耐 受 的 器 具 浸 泡 在 氢 氧 化 钠 - 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS) 溶液 中 ， 或 者 用 这 种 溶液 氛 器 具 表 面 。 这 种 溶液 含有 0. Smol/L NaOH 和 0.5 为 SDS。 读 者 在 使 用 这 种 溶液 时 要 当心 。 氢 氧化 钠 - 十 二 烷 基 硫 酸 钠 溶 液 处 理 后 ， 要 深度 清洗 除去 碱 。 奋 不 清洗 干净 则 对 实验 室 其 他 研究 人 员 的 健康 有 害 ， 而 且 残 余 的 NaOH 还 会 碱 性 水 解 RNA 样品 。 即 使 用 水 冲 淋 就 能 除去 残余 的 NaOH， 但 这 个 方案 没有 使 用 双氧水 省 钱 ， 尤 其 是 当 购 买 的 溶液 是 预先 混合 的 氢 氧 化 钠 - 十 二 烷 基 硫酸 钠 溶 液 时 。

- 31 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

4.5 JWG BEE DEK)

下 面 列 出 了 常用 的 降低 或 消除 核糖 核酸 酶 活性 的 试剂 。 这 些 试剂 常常 与 RNA 分 离 缓冲 液 混 合 使 用 ， 而 不 是 单独 使 用 。 对 于 那些 富 含 核糖 核酸 酶 的 细胞 ， 甚 至 是 那些 核 糖 核酸 酶 含量 不 高 的 细胞 ， 广 泛 接受 的 能 够 获得 一 致 结果 的 方案 ， 是 在 裂解 缓冲 液 中 加 入 硫 氰 酸 县 或 盐酸 县 。 本 书 中 还 介绍 其 他 优秀 的 强 变性 方法 。 由 于 它们 具有 离 液 序 列 极 高 的 性 质 ， 这 些 缓冲 也 能 够 相当 有 效 地 破坏 很 多 组 织 和 培养 细胞 。 如 同 第 5 章 所 Dt BBS» FL ee Aa W]e To FRR EAH, A Fd KAA fe RNA 混在 一 起 。 如 同 原先 所 介绍 的 ， 缺 乏 强 变性 剂 的 裂解 缓冲 液 ， 在 使 用 前 必须 添加 核糖 核酸 酶 抑制 剂 。 多 数 生物 技术 公司 能 够 提供 一 种 或 几 种 试剂 ， 用 来 专门 除去 实验 室 台 面 和 其 他 表面 的 核糖 核酸 酶 。

4.5.1 盐酸 肌

盐酸 县 (G+ HC) 是 一 种 强 的 离子 型 蛋白 质变 性 剂 。 在 工作 浓度 4~6mol/L KER 中 ， 盐 酸 有 能 够 充分 抑制 细胞 和 整个 组 织 样 品 的 核糖 核酸 酶 活性 。 由 于 其 生物 学 上 的 破坏 特 ME, BRGERERUMRABRM (CTC) 的 缓冲 液 为 离 液 缓冲 液 。

4.5.2 硫 氰 酸 县

TAMA (GTC) 变性 蛋白 质 的 能 力 比 盐酸 股 更 强 。 从 富 含 核酸 酶 组 织 ， 尤 其 是 胰 脏 组 织 ， 分 离 RNA (Chirgwin 等 ，1979) 时 选用 GTC. LE Wi # & 4mol/L fy GTC 溶液 ， 常 与 还 原 试 剂 〈 如 8 琉 基 乙醇 ， 即 PME) 和 离子 型 去 污 剂 〈 如 十 二 烷 基 肌 酸 钠 ) 联 合 使 用 。

4.5.3 十 二 烷 基 硫酸 钠

十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS) 是 一 种 离子 型 去 污 剂 ， 用 来 迅速 破坏 生物 膜 。 由 于 SDS 能 够 迅速 破坏 组 织 结构 、 抑 制 RNase 和 脱氧 核糖 核酸 酶 (DNase) 活性 ， 因 此 SDS 是 很 多 纯化 核酸 试剂 的 关键 组 分 。 通 常 将 SDS 制备 成 10% (100g/L) 或 20%(200g/L) 的 储备 液 ， 常 用 : 的 SDS 工作 浓度 是 0.1% ~0.5%. SDS 的 纯度 能 够 显著 影响 该 变性 剂 的 功能 。 在 钾 盐 存在 下 ，SDS 容易 沉淀 。 在 高 盐 离 液 溶 液 中 SDS 的 溶解 度 很 低 ， 因 此 在 含 县 的 缓冲 液 中 不 加 SDS.

4.5.4 N- 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠

N- 十 二 烷 基 肌 氢 酸 钠 〈sarkosyl 或 sarcosyl) 与 SDS 类 似 ， 是 离子 型 去 污 剂 。 与 SDS 不 同 的 是 ，N- 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠 在 高 盐 离 液 溶液 中 有 很 好 的 溶解 性 ， 是 含有 肌 的 裂解 缓冲 液 的 首选 去 污 剂 。N- 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠 是 这 些 缓冲 液 的 常用 组 分 。N- 十 二 烷 基 肌 氮 酸 钠 能 破坏 组 织 和 细胞 的 超 微 结构 ， 抑 制 核酸 酶 活性 ， 促 进 细胞 裂解 液 的 蛋白质 和 核酸 解 聚 。

4.5.5 苯酚 : Ah: 异 戊 醇

当心 ” 菜 酚 、 氨 仿 及 其 混合 物 是 致癌 剂 ， 也 是 腐蚀 剂 。 操 作 这 些 试剂 时 要 特别 小 心 。 要 采取 生产 厂家 提出 的 所 有 安全 措施 。 5

第 4 章 PRES

有 机 溶剂 苯酚 和 和 氯仿 是 非常 有 效 的 变性 溶剂 ， 能 够 导致 蛋白 质 沉 淀 。 虽 然 不 稳定 ， 但 是 分 子 生 物 学 级 的 葵 酚 〈 经 重 蒸 除 去 杂质 )8 是 很 好 的 蛋白 质变 性 剂 。 重 蒸 后 的 苯酚 不 稳定 ， 能 被 迅速 氧化 成 葵 醒 ， 使 苯酚 溶液 变 成 粉红 色 。 醒 产生 的 自由 基 能 断裂 磷酸 二 酯 键 并 与 核酸 交 联 。 为 了 降低 葵 酚 氧化 的 速度 ， 将 8- 羟 基 唆 啉 加 入 到 终 浓 度 为 0.1% (lg/L)。 通 常用 含水 缓冲 液 饱和 后 的 葵 酚 与 等 体积 的 氯仿 混合 ， 制 备 成 苯酚 试剂 。 氧 仿 能 够 稳定 苯酚 ， 增 加 抽 提 时 有 机 相 的 密度 ， 提 高 蛋白 质 的 除去 效率 ， 也 有 利于 除去 脂 类 物质 。 用 苯酚 : 氯仿 混合 物 抽 提 获 得 的 poly(A)* mRNA 的 产量 ， 比 仅 用 苯酚 抽 提 所 获得 的 量 多 (Perry 等 ，1972) 。 通 常 还 把 异 成 醇 加 入 苯酚 : 氯仿 混合 物 中 或 氯仿 中 。 异 戊 醇 能 减少 有 机 溶剂 抽 提 时 所 产生 的 蛋白 质 泡沫 。 最 常用 的 抽 提 试剂 是 比例 为 25 : 24:1 (体积 比 ) HEM: A: RO. ee 溶剂 存在 时 ，RNase 活性 被 抑制 。

附录 3 详细 介绍 了 苯酚 的 制备 。

4.5.6 8-HEEM

8- FE AEE OR FE YB AK BR SY) BB oP SB A. BS A A OS BSA ER (Kirby, 1956). 8 REM (EAS AA EB Be AM. SILA 〈 酚 的 氧化 产物 ) 的 形 MM. S-FESLME MA YR EU HE 0.1% g/L). SREERKHMAEEM : 氯仿 呈 亮 黄色 ， 有 助 于 研究 人 员 进 行 核酸 分 离 纯化 时 区 分 有 机 相 和 水 相 。

8- 羟 基 唆 啉 也 能 莹 合 重 金属 ， 在 除去 细胞 裂解 液 的 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 时 非常 有 用 。 与 VDR 结合 后 ，8- 产 基 唆 啉 的 颜色 从 亮 黄色 转化 成 深 绿 色 。 如 果 抽 提 的 有 机 苯酚 相 仍然 是 黄 色 ， 表 明 所 有 的 VDR 已 经 除去 。 即 使 不 使 用 VDR 时 ， 在 有 机 抽 提 缓冲 液 中 加 入 8 RHE 啉 也 还 是 有 好 处 的 ， 因 为 重金 属 与 RNA 的 长 期 接触 ， 会 导致 RNA 的 降解 。 当 然 RNA 研 究 用 的 所 有 试剂 必须 用 高 纯度 的 生化 级 水 溶解 制备 。

4.5.7 AU

Th EA 10 FB VE tn HE BY UE BG BE SP A KRY OT Sl. FA CsCl 抑制 核糖 核酸 酶 的 能 力 有 限 ， 必 须 使 用 超 纯 的 无 核酸 酶 的 CsCl1。 如 果 必 要 ， 含 有 杂质 的 固体 CsCl 在 200°C HEHE 6 一 8h 能 够 除去 CsCl 中 残余 的 RNase 活性 。 由 于 使 用 更 新 的 树脂 和 /或 硅胶 滤 器 ， 核 酸 纯化 不 再 需要 使 用 密度 梯度 离心 ， 因 此 CsCl 作为 核酸 纯化 介质 的 重要 性 已 经 大 大 降低 。

4.5.8 三 毛 乙 酸 鸳

三 氟 乙 酸 饮 〈CsTFA) 是 高 度 可 溶性 盐 。 在 去 污 剂 不 存在 的 情况 下 ， 三 所 乙酸 饮 能 够 溶解 并 解 离 核酸 结合 的 和 蛋白质。 因此 CsTFA (Amersham Biosciences 公司 产品 ) 是 核糖 核 酸 酶 的 优秀 抑制 剂 。 其 应 用 使 研究 人 员 不 必用 传统 的 方法 〈 如 苯酚 : 氯仿 ， 和 蛋白酶 K) 就 能 够 去 除 蛋 白质 。 与 CsCl 比 起 来 ，CsTFA 离 液 特性 更 强 ， 抑 制 RNase 活性 的 能 力 更 强

@ 可 以 从 三 家 购买 重 蒸 苯酚 ， 这 样 就 不 需要 在 实验 室 纯化 苯酚 。 尽 管 在 25 年 前 实验 室 广泛 使 用 自己 纯化 的 苯酚 ， 但 是 苯酚 重 蒸 的 危险 大 ， 还 不 如 多 花 点 钱 直接 买 分 子 生 物 学 纯化 的 苯酚 试剂 。 在 实验 室 蒸 馅 苯酚 很 危险 ， 要 尽量 避免 。 如 果 万 不 得 已 非得 自己 在 实验 室 蒸 馏 葵 酚 ， 读 者 可 以 参照 苯酚 的 实验 室 蒸 馅 方法 (Wallace，1987)， 并 且 只 能 让 有 经 验 的 人 员 进 行 苯酚 蒸馏。

e 33 e

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

(Carter 等 ，1983)， 在 乙醇 中 的 溶解 度 更 大 ， 而 乙醇 溶解 性 大 ， 有 助 于 RNA 离心 沉淀 时 除 去 CSTFA。 由 于 CsTFA 的 密度 可 达 2.6g/ml， 在 CsTFA 中 离心 可 以 将 RNA 离心 沉淀 或 BA. Wl) CsC1， 这 种 方案 的 主要 缺点 是 要 使 用 超 离 心 ， 而 超 离心 在 目前 的 分 子 生 物 学 实验 室 使 用 率 低 。

4.5.9 和 蛋白酶 开

AAR K AAR ARR (22 AIRE). RVR TB Tritirachium album. FEY WRAP. HARB K 4 pH 4.0~12.5 都 很 稳定 ， 其 最 适 pH £ 8.0, 4 25~65° CMA MBIA 性 (Ebeling 等 ，1974) 。 尽 管 该 酶 有 两 个 Ca 结合 位 点 ， 但 是 缺乏 Ca 时 ， 该 酶 仍 能 降解 核酸 抽 提 液 中 的 和 蛋白质。 偶尔 在 EDTA FER. SAB K F 50C 保 温 能 抑制 不 稳定 的 、 依 赖 于 Mg 汪 的 RNase 活性 。

通常 将 蛋白酶 民 溶解 于 水 中 ， 制 备 成 20mg/ml 储备 液 。 这 种 储备 液 在 一 20C 可 以 稳定 保存 1 年 。 或 者 将 和 蛋白酶 民 深 于 50mmol/L Tris(pH 8.0), lmmol/L CaCl, 中 ， 于 一 4C 可 以 稳定 保存 数 月 。 在 一 些 缓冲 系统 中 ， 如 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、lmmol/L EDTA, 0.5% SDS, BAM K 工作 溶液 浓度 是 50kxg/ml。 反 应 缓冲 液 中 加 入 lmmol/L Ca2+ ， 和 蛋白 酶 K 的 活性 最 大 。

链 霉 和 蛋白酶 (pronase) 是 来 源 于 链 霉 菌 (Streptomyces griseus) HRA. FERRE 白 酶 K。 有 时 需要 用 链 霉 蛋白 酶 自 降 解 系统 消除 污染 的 核糖 核酸 酶 和 脱氧 核糖 核酸 酶 活性 。 如 果 需 要 使 用 这 个 系统 ， 只 需要 简单 地 将 链 霉 蛋白 酶 储备 液 L20mg/ml， 溶 于 10mmol/L Tris-HCI(pH 7.5), 10mmol/L NaCl] 在 37°C 保温 1h， 就 制 成 了 链 霉 蛋白 酶 自 降 解 系统 。 直接 从 厂家 购买 预先 降解 了 的 链 霉 蛋白 酶 ， 在 使 用 前 就 不 需要 额外 的 处 理 。 不 管 是 已 经 预 处 理 了 的 ， 还 是 自制 的 链 霉 蛋白 酶 储备 溶液 ， 都 要 将 溶液 分 装 后 保存 于 一 20 人 冰箱 中 。 链 霉 蛋 白 酶 的 反应 条 件 和 和 蛋白酶 K 相同 ， 只 是 该 酶 的 工作 浓度 推荐 值 是 1mg/ml FA.

4.5.10 RNAlater (RNA 保护 剂 )

从 事 RNA 研究 的 人 都 知道 RNAlater 是 一 种 专利 保护 的 水 溶液 ， 能 够 保护 细胞 、 组 织 和 器 官 的 RNA， 防 止 化 学 因素 或 RNase 导致 的 RNA 裂解 ， 有 利于 研究 人 员 处 理 生 物 材料 ， 回收 高 质量 的 RNA。RNAlater 的 化 学 特征 有 助 于 样品 ， 尤 其 是 室外 收集 的 样品 的 回收 。 RNAlater 与 植物 细胞 和 组 织 、 动 物 细胞 和 组 织 ， 以 及 大 肠 杆 菌 兼 容 性 好 。

4.6 实验 万 宗 : ZAGREBESHOSR

这 里 所 介绍 的 氧 钒 核糖 核 背 复合 物 的 合成 方案 ， 对 Leinhard 等 〈1971)、Berger 和 Birkenmier (1979) 的 合成 方案 进行 了 修改 。 在 本 实验 室 将 合成 VDR 所 需 的 所 有 试剂 ， 混 合 于 三 颈 烧 瓶 中 〈 图 4. 1) 。 三 颈 烧 瓶 置 于 油 浴 。 三 颈 用 来 放置 温度 计 和 pH 探 针 ， 并 能 滴 加 NaOH。 成 比例 放大 下 面 的 方案 ， 能 够 制备 更 多 的 VDR 。

@ 取 腺 味 叭 核 苷 、 乌 味 叭 核 苷 、 胞 喀 啶 核 苷 、 尿 喀 啶 核 苷 固体 各 0.5mmol， 混 合 后 加 人 8ml 水 。

@ 在 通风 橱 中 ， 将 核糖 核 苷 混合 物 置 于 加 热 套 、 沸 水 浴 或 油 浴 加 热 ， 直 至 所 有 固体 浴 解 。 在 熟练 人 员 指 导 下 ， 使 用 加 热 套 或 油 浴 。 不 适当 的 操作 或 操作 粗心 ， 会 引起 严重 的 、 永

。 34 。

第 4 章 核糖 核酸 酶

久 性 伤害 。

@ 在 通信 恒 流 氮气 的 情况 下 ， 当 溶液 出 现 涌 出 或 出 气泡 时 ， 加 入 lml 2mol/L VOSO, GRA).

4 AMANDLA.

@ 滴 加 10mol/L NaOH， 使 溶液 的 pH 维持 在 6.0 左右 。

© 然后 滴 加 lmol/L NaOH， 使 溶液 的 pH 达 到 7. 0。 3

注意 “在 pH 从 6.0 向 7.0 调 整 时 ， 必 须 使 用 mol/L 图 4.1 Corning HAA] (Corning,

NaOH。 因 为 该 区 间 pH 变化 速度 很 快 。 New York) 的 三 颈 烧 瓶 。 三 颈 烧 瓶 @ 在 pH7.0 时 出 现 氧 钒 离子 CN) tie. HM 易于 添加 反应 组 分 、 固 定 pH 沉淀 的 形成 ， 颜 色 也 从 亮 绿色 转化 成 特征 性 的 瞳 绿色 。 电极 和 温度 计 及 通信 氮气 ER 在 氢气 缺乏 、pH 高 于 3. 5 的 情况 下 ，4 价 的 氧 钒 离子 会 氧化 成 5 价 的 氧 钒 离子 ， 后 者 抑制 核 糖 核酸 酶 的 能 力 很 弱 。

@ 用 水 将 终 体 积 调整 到 10ml。

最 好 ”经 过 简单 离心 除去 新 合成 VDR 溶液 中 的 NazSO4 ， 或 者 在 使 用 前 离心 除去 VDR 溶液 中 的 Naz SO; 。

@ 合成 反应 的 产物 是 200mmol/L 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 储备 液 。 在 充 人 No 的 情况 下 分 装 ， 在 一 20 可 以 储存 1 一 2 个 月 ， 在 一 70 人 至 少 可 以 储存 1 年 。

4.7 &#

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(刘建华 译 ;， 人 金 由 辛 校 )

。 36 -

5.1 #A RE

根据 经 验 已 建立 了 行 之 有 效 的 RNA 分 离 方法 学 。 必 须 细 察 RNA 的 分 离 技 术 ， 并 不 断 地 对 其 进行 优化 。 用 这 些 RNA 分 离 方法 ， 通 常 能 够 获得 细胞 质 RNA、 细 胞 核 RNA 或 者 是 细胞 质 和 细胞 核 混 合 的 RNA。 通 常 将 细胞 质 和 细胞 核 混 合 的 RNA 称 为 细胞 RNA. 细胞 的 裂解 就 是 RNA 分 离 操作 的 第 一 步 。 有 裂解 细胞 的 缓冲 液 可 以 分 成 两 大 类 。 中 细胞 裂 解 缓冲 液 中 含有 苛刻 的 离 液 试剂 ， 如 肌 盐 、 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS). N-+ — be 3k ALAR 钠 〈sarcosyD) 、 尿 素 、 苯 酚 或 氧 仿 。 其 离 液 试剂 能 够 破坏 细胞 膜 和 亚 细 胞 器 官 ， 同 时 使 核 糖 核酸 酶 失 活 。 四 细胞 裂解 缓冲 液 温和 地 溶解 细胞 膜 ， 但 能 够 保持 细胞 核 的 完整 ， 如 低 渗 Nonidet P-40® (NP-40) 裂解 缓冲 液 8。 通 过 分 级 离心 ， 可 以 从 裂解 混合 物 中 除去 完整 的 细 胞 核 、 其 他 细胞 器 和 细胞 残渣 。 这 个 方案 的 可 靠 性 取决 于 裂解 缓冲 液 中 添加 的 RNase 抑制 剂 ， 以 及 在 分 离 、 储 存 RNA 时 操作 的 仔细 程度 。 值 得 注意 的 是 ， 对 已 经 建立 的 几 个 抽 提 RNA 的 基本 技术 有 各 种 各 样 的 修改 。 例 如 ， 有 些 技术 不 分 离 总 RNA， 而 是 直接 从 细胞 裂解 液 中 分 离 polyC(A)+ RNA,

细胞 裂解 后 ， 分 离 的 细胞 核 RNA 或 细胞 质 RNA 属于 稳 态 RNA。 它 代表 了 这 个 时 间 点 的 细胞 或 亚 细 胞 器 RNA 的 积累 。 特 殊 的 稳 态 RNA 丰 度 代表 了 特异 的 基因 表达 调节 。 但 是 MK RNA 分 子 的 丰 度 不 能 了 解 该 RNA 分 子 转录 合成 的 速度 ， 也 不 能 了 解 该 RNA 分 子 在 细 胞 内 的 半衰期 ， 即 稳定 性 。 这 是 仅 采 用 稳 态 RNA 进行 研究 的 主要 缺点 。 很 明显 ， 细 胞 对 环 境 变化 的 生化 应 答 ， 不 仅仅 表现 在 转录 速率 的 改变 ， 也 表现 在 前 体 RNA 的 加 工效 率 、 细 胞 核 向 细胞 质 运 输 的 效率 、 细 胞 质 RNA 的 稳定 性 、 信 使 RNA 的 翻译 效率 等 。 与 本 章 提出 的 稳 态 转录 产物 分 析 不 同 ， 转 录 速 度 研究 需要 分 离 完 整 的 细胞 核 。 对 于 那些 细胞 裂解 时 开始 转 录 的 RNA 分 子 ， 完 整 的 细胞 核能 够 继续 支持 RNA 分 子 的 延伸 ， 并 将 标记 挫 人 到 合成 的 RNA 分 子 中 。 这 类 技术 统称 为 核 逃 逸 实验 (nuclear runoff assay) (Marzluff 和 Huang, 1984)， 它 有 利于 保持 细胞 核 的 天 然 结构 ， 并 能 够 标记 转录 已 经 起 始 的 RNA 分 子 〈 见 第 17 章 核 逃逸 实验 )。

@ Nonidet P-40 是 这 个 非 离 子 型 去 污 剂 的 一 个 较 老 的 称呼 ， 现 在 没有 厂家 提供 这 个 去 污 剂 。Igepel CA-630 (Sigma Cat. [3021) 在 化 学 上 与 NP-40 不 同 ， 但 能 够 替代 NP-40。

@ 尽管 渗透 裂解 是 最 温和 的 裂解 细胞 方式 之 一 ， 但 是 如 果 细 胞 有 富 含 糖 的 细胞 壁 ， 渗 透 裂 解 的 用 处 不 大 。 有 些 细 菌 、 霉 菌 和 植物 细胞 有 这 样 的 细胞 壁 ， 必 须 用 适当 的 方法 破碎 细胞 壁 后 才 可 以 用 渗透 方法 裂解 细胞 。 网

。 37 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

5.2 RNA 纯 化 的 目的

在 RNA 分 离 策 略 的 设计 过 程 中 ， 首 先 要 确定 的 因素 是 细胞 裂解 的 方法 。 这 取决 于 研究 人 员 是 要 确定 RNA 含量 ， 还 是 RNA 的 亚 细 胞 分 布 。 同 样 重要 的 是 ， 要 确定 抑制 核糖 核酸 酶 活性 的 方法 。 例 如 研究 人 员 可 能 想 确 定 基因 表达 的 调节 是 在 转录 水 平 上 进行 ， 还 是 在 转录 后 水 平 上 进行 。 此 时 细胞 破碎 以 及 后 续 的 RNA 分 离 方法 必须 能 够 独立 分 析 细 胞 质 的 RNA 丰 度 和 细胞 核 的 RNA 丰 度 。 要 使 最 终 RNA 制剂 所 得 到 的 数据 是 有 价值 的 ，RNA 的 纯化 策 略 就 必须 满足 研究 的 特殊 目标 。

在 讨论 RNA 分 离 的 目的 之 前 ， 首 先 要 对 大 家 所 研究 的 RNA 进行 归 类 。 这 些 归 类 列 于 表 5. 1 中 。 研 究 人 员 在 拿 起 微量 移 液 器 进行 RNA 分 离 之 前 ， 首 先 要 弄 清楚 各 个 分 离 方法 所 针对 的 RNA 种 类 。

#5.1 真 核 RNA 的 亚 群

mRNA 亚 群 组 成 细胞 总 RNA 细胞 所 有 的 RNA 细胞 质 总 RNA 除了 线粒体 RNA 外 的 细胞 质 RNA 细胞 poly(A) * RNA 细胞 核 和 细胞 质 的 多 腺 苷 酸 RNA 细胞 质 poly(A)+RNA 细胞 质 的 多 腺 苷 酸 RNA poly(A)~ RNA 非 多 腺 苷 酸 RNA( 常 常 是 rRNA fl tRNA) mtRNA 线粒体 RNA

叶绿体 RNA( 仅 出 现 于 植物 ) 从 完整 细胞 核 获得 的 转录 产物 (含有 成 熟 的 和 不 成 熟 的 ) 已 经 加 工 成 熟 并 被 运输 到 细胞 质 的 poly(A) * Al poly(A) RNA

cpRNA BK RNA mRNA

目标 1: weft Aid HY AWARE AA. ANAS A TK Re TOF i Wa Fe 度 。 例 如 ， 能 够 成 功 地 裂解 组 织 培养 细胞 的 裂解 缓冲 液 可 能 完全 不 适宜 于 整个 组 织 样品 的 有 裂解。 同样 重要 的 是 ， 膜 溶解 的 方法 也 决定 了 是 否 需 要 增加 操作 从 制备 的 RNA 样品 中 去 除 DNA， 能 和 否 独立 纯化 细胞 核 RNA 和 细胞 质 RNA。 尽 管 很 容易 从 RNA 样品 中 除去 DNA， 但 是 如 果 细 胞 核 和 细胞 质 RNA 同时 纯化 ， 就 很 难 确 定 总 RNA 中 有 哪些 是 细胞 核 - 的 ， 哪 些 是 细胞 质 的 。 裂 解 方法 必须 与 RNA 纯化 后 的 应 用 兼容 。 记 住 在 设计 RNA 纯化 方案 时 ， 首 先 要 考虑 纯化 后 的 RNA 在 后 续 的 操作 中 是 否 有 用 和 纯化 RNA 能 否 解决 所 要 研究 的 问题 。

目标 2: 保证 能 够 抑制 所 有 核糖 核酸 酶 。 无 论 是 从 个 人 经 验 还 是 从 第 4 章 的 讨论 中 , A 道 在 分 离 RNA 时 必须 抑制 所 有 的 RNase 活性 。 要 抑制 的 RNase GF it Al PAY RNase, gt ILA) RNase 和 细胞 裂解 液 的 RNase 活性 。 尽 管 有 些 裂解 试剂 自身 能 够 抑制 RNase 活性 ， 但 是 其 他 的 细胞 裂解 试剂 需要 添加 额外 的 RNase 抑制 剂 来 保护 分 离 过 程 中 的 RNA 分 子 。 还 有 ， 首 先 必须 证 实 抑制 或 消除 RNase 活性 的 操作 与 裂解 缓冲 液 是 兼容 的 。

目标 3: 选择 一 种 方法 去 除 样品 蛋白 质 。 在 分 离 DNA 和 RNA 时 ， 完 全 除去 细胞 裂解 液 的 蛋白 质 非 常 重 要 。 核 酸 忠实 杂交 和 核酸 准确 定量 需要 仔细 除去 核酸 样品 中 的 蛋白 质 。 例 如 ， 残 留 的 蛋白 质 ， 尤 其 是 组 蛋白 ， 能 够 抑制 双 链 DNA MIRED. mA “AE” RNA 会 强烈 抑制 反 转 录 (第 18 章 ) AR AMBER (PCR) 扩 增 (第 19 章 )。 可 以 用 下 列 方 法 除去 蛋白 质 。

。 38 -

第 5 章 ， RNA 分 离 策略

® 用 和 蛋白酶 K 处 理 。

@ 用 有 机 溶剂 混合 物 如 苯酚 和 和 氯仿 反复 抽 提 。

@) EA BMA Be oh YR EA A

© 盐 析 除 去 蛋白 质 。

© 上 述 方法 任意 组 合 除 去 蛋白 质 。

任何 除去 蛋白 质 的 方法 都 是 控制 RNase 活性 的 有 效 手 段 。 要 记 住 ， 一 旦 蛋白 质变 性 剂 从 样品 中 除去 ，RNA 样品 对 RNase 降解 非常 敏感 。 当 RNA 简单 溶 于 无 变性 剂 的 缓冲 液 时 ， 对 核酸 酶 最 敏感 。

目标 4: 选择 核酸 浓缩 的 方法 。 多 数 RNA 纯化 的 最 后 一 步 是 核酸 浓缩 。 最 通用 的 核酸 浓缩 方法 是 用 不 同 组 合 的 盐 和 乙醇 将 核酸 进行 沉淀 〈 表 5.2)。 例 如 ， 常 加 入 0.1 FAR 3mol/L 乙酸 钠 (pH 5.2) 到 核酸 样品 中 ， 然 后 加 入 2.5 倍 体积 的 95%% 一 100%% 的 乙醇 。 核 酸 和 盐 相互 作用 ， 降 低 了 核酸 在 乙醇 和 异 丙 醇 中 的 溶解 度 ， 使 核酸 从 溶液 中 沉淀 出 来 。 而 且 不 同 盐 和 乙醇 组 合 ， 核 酸 的 沉淀 速率 依赖 于 温度 。 与 基因 组 DNA 快速 沉淀 不 同 ，RNA it 淀 慢 多 了 ， 常 需要 在 一 20 人 放置 较 长 时 间 ， 以 保障 核酸 的 充分 回收 ， 尤 其 是 后 面 介 绍 的 NP- 40 方法 。 这 种 现象 是 基因 组 大 、 结 构 复 杂 ， 则 沉淀 快 ; 而 RNA 小 、 结 构 简 单 ， 则 沉淀 慢 。 浓缩 核酸 样品 的 其 他 方法 8， 包 括 商家 提供 的 浓缩 装置 、 透 析 和 真空 浓缩 使 用 频率 低 ， 因 和 为 这 些 方法 的 成 功率 取决 于 研究 人 员 的 个 人 经 验 。 而 使 用 盐 和 乙醇 沉淀 核酸 ， 操 作 简 单 ， 成 功 率 高 ， 使 用 广泛 。 新 近 建 立 的 硅胶 纯化 核酸 的 技术 不 用 盐 或 乙醇 ， 洗 脱 下 来 的 RNA CAR 缩 ， 能 够 马上 使 用 。

表 5$.2 核酸 沉淀 品 用 盐 和 醇 的 组 合

盐 沉淀 用 量 LYE FAR KE NaAc 3mol/L,pH 5. 2 0. 1 倍 体积 300mmol/L NaCl 2mol/L 0. 1 倍 体积 200mmol/L Licl® 8mol/L 0.1 倍 体积 800mmol/L NH, Ac® 10mol/L 0. 2 倍 体积 2mol/L KAc 2. 5mol/L 0.1 倍 体积 250mmol/L Glycogen® 10mg/ml 0. 01 倍 体 积 100pg/ml 醇 加 入 盐 后 所 要 加 入 的 醇 量 Z (95% ~100%) 2. 2 一 2.5 倍 体积 异 两 醇 (100%%) 0.6~1. 0 倍 体积

© wie Af: DNA 50ng/ml; RNA 100ng/ml。 如 果 核 酸 浓度 低 于 靖 值 ， 则 沉淀 效果 不 佳 。

@ 氧化 锂 不 能 与 核酸 共 沉 淀 。 如 同 NaCl，LiCl 在 乙醇 中 的 溶解 度 很 大 。 如 果 分 离 的 RNA 要 进行 反 转 录 ， 就 不 要 用 LiCl， 和 否则 就 要 沉淀 两 次 除去 过 量 的 LiCl。

@ 选用 NH4Ac 沉 淀 cDNA。 在 这 种 溶液 中 ， 没 有 失信 的 单 核 苷 酸 不 被 沉淀 ， 因 此 简单 沉淀 能 够 除去 游离 的 核 苷 酸 。

@® 使 用 Glycogen 要 谨慎 ， 因 为 过 量 的 Glycogen 会 抑制 一 些 体外 反应 。

目标 5: 选择 合适 的 储存 条 件 保 存 纯化 的 RNA。 由 于 RNA 天 生 的 不 稳定 性 ， 储 存 方式

不 正确 将 使 纯化 的 RNA 样品 迅速 降解 。 人 们 提出 了 很 多 方案 储存 RNA AI DNA, 2 fh 的 温度 、 缓 冲 液 和 储存 形式 。 本 章 5. 10 节 对 RNA 样品 储存 进行 了 讨论 。

© 一 个 较 老 的 浓缩 核酸 的 方法 是 用 丁 醇 反复 抽 提 。 不 推荐 大 家 使 用 这 个 方法 ， 因 为 很 难 从 核酸 样品 中 彻底 除去 残余 的 丁 醇 。 。39 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

5.3 有 裂解 经 冲 液 的 组 成

每 人 都 有 一 个 自己 中 意 的 RNA 分 离 方法 ， 也 有 很 多 商家 提供 分 离 RNA 的 产品 ， 这 些 产品 对 RNA 分 离 方法 进行 了 很 多 修改 。 根 据 细 胞 破损 程度 和 核糖 核酸 酶 被 抑制 的 情况 可 以 将 这 些 方案 分 为 两 类 ， 即 温和 的 裂解 缓冲 液 和 剧烈 的 裂解 缓冲 液 。 这 两 种 方案 所 获得 的 RNA 都 可 用 于 基因 表达 研究 ， 但 是 各 自 都 有 一 定 的 局 限 性 。 如 同 后 面 的 章节 要 讨论 的 ， 要 记 住 最 重要 的 事情 是 没有 一 种 “正确 的 ”方法 适宜 于 从 细胞 或 组 织 中 抽 提 RNA， 但 是 “ 唯 一 的 ”错误 方式 是 在 操作 过 程 中 引入 核糖 核酸 酶 活性 。

5.3.1 温和 的 裂解 缓冲 液

由 非 离子 型 、 低 渗 缓 冲 液 介 导 的 细胞 裂解 不 会 损伤 大 多 数 亚 细胞 器 。 有 裂解 缓冲 液 中 含有 NP-40 (Favaloro 等 ，1980) 和 MgCl* 有 利于 细胞 质 膜 溶解 ， 但 能 够 保持 细胞 核 的 完整 性 。 因此 ， 用 含有 NP-40 的 裂解 液 起 始 细胞 有 裂解， 细胞 质 RNA 就 不 会 与 细胞 核 RNA 混合 。 在 这 种 方案 中 ， 分 级 离心 很 容易 除去 完整 的 细胞 核 、 较 大 的 细胞 器 和 细胞 残 污 。 所 获得 的 细胞 质 上 清 液 富 含 细 胞 质 RNA 和 和 蛋白 质 ， 蛋 白质 可 以 用 有 机 溶剂 混合 物 莱 酚 / 氯 仿 进 行 一 系列 抽 提 除去 。 这 种 策略 的 明显 优点 是 最 后 沉淀 回收 的 RNA 仅仅 代表 细胞 质 RNA， 在 研究 基 因 调 节 水 平方 面 可 能 有 特别 的 意义 。

这 种 方法 分 离 RNA 的 缺点 是 这 种 裂解 缓冲 液 本 身 离 液 能 力 不 够 ， 不 能 完全 抑制 或 破坏 RNase 活性 。 记 住 在 细胞 裂解 时 ， 受 隔离 的 RNase 活性 将 突然 释放 ， 即 使 努力 地 分 离 RNA， 这 些 核 糖 核酸 酶 活性 将 损伤 RNA 的 完整 性 。 因 此 ， 在 使 用 前 裂解 缓冲 液 中 必须 加 入 一 些 RNase 抑制 剂 来 控制 核糖 核酸 酶 活性 。 采 用 这 种 策略 分 离 RNA 时 ， 除 了 分 离 方法 特别 标明 外 ， 所 有 操作 在 冰 上 进行 将 非常 有 有 用。 预先 冷却 将 要 使 用 的 试剂 和 试管 也 很 有 用 。 假 如 想 利用 含 肛 溶 液 的 裂解 特性 〈 后 面 讨 论 ) ， 并 且 要 分 开 各 个 亚 细 胞 器 RNA， 一 个 值得 尝试 的 策略 是 先 用 含有 NP-40 的 缓冲 液 裂 解 细胞 ， 回 收 完整 的 细胞 核 ， 然 后 用 含 县 的 缓冲 液 裂解 细胞 核 ， 这样 可 以 用 回收 细胞 总 RNA 的 方法 来 回收 细胞 核 RNA 或 细胞 质 RNA， 这 种 方法

尤其 适合 于 细胞 核 RNA 的 分 离 。 此 处 介绍 了 含 肛 缓 冲 液 回收 RNA 的 方案 ， 第 17 章 将 详细 .

介绍 细胞 核 RNA 的 分 离 。

5.3.1.1 实验 方案 : 用 含有 NP-40 的 低 渗 裂解 缓冲 液 分 离 细 胞 质 RNA

该 方法 的 基础 是 利用 非 离 子 型 、 低 渗 缓 冲 液 溶解 细胞 质 膜 ， 但 能 保持 细胞 核 的 完整 性 @。 除 去 细胞 核 的 上 清 液 可 以 用 来 分 离 细 胞 质 RNA， 而 回收 的 完整 细胞 核 可 以 用 来 纯化 细胞 核 RNA (在 第 17 章 有 详细 介绍 ) 。 根 据 个 人 记录 ， 有 人 使 用 这 种 方法 ， 在 不 使 用 核糖 核酸 酶 抑制 剂 的 情况 下 ， 获 得 了 非常 高 质量 的 RNA。 细 胞 的 裂解 在 冰 上 进行 ,速度 要 尽 可 能 快 。 此 处 介绍 了 作者 使 用 的 一 个 改进 方法 CA 5. 1) 。 如 果 使 用 RNase 抑制 剂 ，RNase 抑 制剂 应 该 一 直 维 持 到 苯酚 /氯仿 混合 物 加 入 ， 后 者 能 够 除去 溶液 中 的 蛋白 质 。 最 后 用 广泛 使 用 的 制备 技术 ， 即 乙醇 沉淀 回收 RNA, SPRAIN SMART RNA 的 方法 相 比 ， 这 种 方法 不 需要 超 离心 ， 而 且 速 度 快 。 但 是 这 种 方法 却 比 新 近 建 立 的 酸 - 酚 法 〈 后 面 介 绍 ) 费 时 。 这 是 由 于 这 种 方法 要 求 操作 温和 ， 避 免 细 胞 核 裂 解 。 但 是 避免 细胞 核 裂 解 的 温和 操作 又

© 由 于 细胞 和 细胞 器 对 于 去 污 剂 、 盐 和 RNase 抑制 剂 的 敏感 性 不 同 ， 研 究 人 员 可 以 根据 经 验 优化 裂解 条 件 。 。40 。

#58 RNA 分 离 策略

ED kz 离心 收集 组 织 培养 细胞

细胞 沉淀 物 | 悬 序 在 裂解 缓冲 液 中 ， 离 心 去 核

水 相 弃 去 核 沉淀 物 水 相 裂 解 物 蛋白 质 界 面 上 清 液 用 有 机 溶剂 抽 提 有 机 相 盐 和 乙醇 收集 从 水 相 中 沉淀 RNA 离心 沉淀 RNA (C20C 过 夜 )

5.1 用 含有 NP-40 的 低 渗 裂解 液 制备 细胞 质 总 RNA。 尽 管 这 种 方法 适合 于 培养 细胞 ， 但 是 组 织 样本 预先 温和 和 勾 浆 处 理 后 也 可 以 用 这 种 方法 制备 细胞 质 总 RNA

在 一 定 程度 上 增加 了 RNase 降解 RNA 的 危险 性 。 尽 管用 含 且 的 缓冲 液 裂解 能 够 获得 较 高 质 量 的 RNA， 但 是 此 处 所 介绍 的 方法 分 离 的 RNA 能 够 满足 大 多 数 RNA 试验 。 这 种 方法 最 适 合 培养 细胞 ， 而 全 组 织 样 本 的 裂解 效果 比 培 养 细胞 裂解 效果 差 。 对 于 全 组 织 样本 而 言 ， 先 用 Dounce 匀 浆 器 温和 勾 浆 全 组 织 样 本 〈 要 避免 细胞 膜 的 严重 损伤 )， 然 后 用 这 种 方法 处 理 可 能 会 产生 更 好 的 效果 。

Cl) 预先 : 制备 抽 提 缓冲 液

苯酚 的 氧化 会 严重 影响 制备 RNA 的 质量 ， 因 此 分 离 RNA 前 要 制备 足 量 新 鲜 的 抽 提 组 冲 液 〈 图 5. 2) 。

四 在 60C 熔 化 重 蒸 葵 酚 〈 分 子 生 物 学 级 )， 并 用 等 体积 Tris-<SDS RRA (A BS. 2A« des

100mmol/L NaCl

lmmol/L EDTA

10mmol/L Tris, pH 8.5

B. 5% SDS®

G@ Ah: 异 戊 醇 混 合 物 (24:1) (图 5. 2B. ) 与 等 体积 Tris-SDS 饱和 的 葵 酚 混合 。 混 合 溶液 就 是 抽 提 缓冲 液 〈 图 5. 2C. ) 。

@ SDS 的 加 入 保证 有 机 溶剂 抽 提 时 能 够 高 质量 地 回收 水 相 poly(A)+RNA。 由 于 SDS 的 存在 ， 有 机 相 和 水 相 的 分 配 依赖 于 pH， 苯酚 要 用 Tris-SDS 饱和 。 在 加 入 SDS A, Tris 缓冲 液 (100mmol/L NaCl，1lmmol/L EDTA, 10mmol/L Tris, pH 8.5) 必须 经 过 高 温 灭 菌 。

。 41 °

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

ASL EN BAERS B. 24 倍 体积 氯仿 和 1 倍 Tris-SDS 组 冲 液 等 体积 体积 异 戊 醇 混 合 。 标 上

混合 。 标 上 “饱和 苯酚 ” “FG : 异 成 醇 C24:1)”

C. 等 体积 的 饱和 苯酚 (A) 和 毛 仿 : 异 戊 醇 混 合 。 标 上 “PCI25:24:1”

DAR: Ai: F KBE AWC) PMA 8-2 啉 至 终 浓 度 为 0.1%(1g/D)

E. 使 用 后 ， 剩 余 溶剂 可 在 铝 膜 包 庄 的 试剂 并 中 于 4 保存 2 个 月 图 5.2 用 于 NP-40 分 离 细胞 质 RNA 的 有 机 抽 提 试剂 的 制备 方法 。 葵 酚 用 Tris-SDS 缓冲 液 饱 和 ， 而 不 是 仅仅 用 Tris 饱和 。8- 羟 基 唑 啉 的 加 入 使 抽 提 试剂 除去 蛋白 质 的 性 能 更 佳 。 当 实验 方案 中 标明 要 使 用 苯酚 : 氯仿 : HR. SMR PAY 使 用 本 法 制备 的 含有 8- 羟 基 唆 啉 的 苯酚 : 氯仿 : eC

@ 最 后 抽 提 缓冲 液 中 加 入 8 EM BARE 0.1%. iL MAH.

例如 ，20ml 熔化 的 重 蒸 葵 酚 与 20ml Tris-SDS 缓冲 液 混合 ， 形 成 40ml Tris-SDS 饱和 的 苯酚 ， 加 入 40ml (FAKED A: FRM (24:1) 混合 物 。 所 形成 的 溶液 就 是 抽 提 缓冲 液 。 加 入 0.08g 8-FESEMEMK 〈 终 浓度 为 0.1% ， 即 1g/L) 能 够 增强 这 种 抽 提 缓冲 液 的 稳定 性 。 这 种 溶液 在 100ml 玻璃 试剂 瓶 中 在 4C 可 以 保存 6 一 8 周 。 不 使 用 时 最 好 将 瓶子 用 铝 膜 包 庄 ， 尤 其 是 在 每 天 都 要 开关 数 次 的 冰箱 中 储存 时 。

当心 ”所 有 有 机 溶剂 的 操作 必须 在 通风 橱 中 进行 ， 而 且 必 须 对 眼睛 和 皮肤 进行 适当 的 防护 。 必 须根 据 国 家 有 关 规 定 处 理 有 机 废物 。

(2) RNA 分 离

© RFE!

@ 将 组 织 培养 细胞 离心 收集 到 预先 冷却 到 45 的 合适 的 离心 管 中 。

注意 ”附录 10 介绍 了 胰 蛋 白 酶 处 理 方案 。

@ 在 冰冷 却 的 裂解 缓冲 液 中 温和 而 又 充分 地 悬浮 沉淀 细胞 。 绥 冲 液 组 成 是 :

140mmol/L NaCl

1. 5mmol/L MgCl,

10mmol/L Tris-Cl, pH 8.5

0.5% NP-40®

最 好 加 入 10mmol/L AA KRKH RAW (VDR)@

10° 个 细胞 至 少 要 用 100ml 裂解 缓冲 液 。 在 冰 上 保温 5min， 期 间 周 期 性 地 倒置 试管 有 助 于 细胞 裂解 。

注意 工 VDR 会 迅速 氧化 ， 因 此 只 在 缓冲 液 使 用 前 才 将 VDR 加 入 裂解 缓冲 液 中 。 通 常 VDR 的 制备

© 在 加 入 NP-40 之 前 ， 裂 解 缓 冲 液 要 高 压 消 毒 。 @ 参阅 第 4 章 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 合 成 、 优 点 和 缺点 。 e 42 和

#58 RNA 分 离 策略

和 储备 液 浓度 是 200mmol/L， 使 用 时 的 工作 浓度 是 5 一 20mmol/ 工 。 另 外 也 可 以 将 Promega 公司 的 RNasin 加 入 到 裂解 缓冲 液 中 ( 终 浓 度 是 250~1000U/ml) 抑制 RNase 活 性 。 此 外 ， 除 了 特别 指明 的 条 件 外 ， 含 有 RNA 的 试管 必须 放置 在 冰 上 。

注意 2 取出 lul 裂解 液 置 于 载 玻 片 上 。 在 显微镜 下 检测 细胞 的 裂解 程度 ， 检 测 裂 解 液 中 完整 细胞 Fil iF FS HH HK

四 在 4C 分 级 离心 5min， 沉 淀 细胞核 和 细胞 残 酒 。 微 量 离心 机 5000Xg Bb, MAK 用 其 他 类 型 的 离心 机 在 合适 的 离心 力 下 离心 。

注意 1 尽管 500Xg 的 离心 力 就 能 够 沉淀 细胞 核 ， 但 是 增加 离心 力 能 够 完全 除去 大 细胞 器 ， 压 紧 沉 淀 的 细胞 核 。 该 离心 能 够 除去 基因 组 DNA 和 细胞 核 hnRNA， 有 助 于 细胞 核 外 RNA 的 分 析 。

注意 2 如果 后 续 研 究 要 用 到 细胞 核 ， 例 如 分 离 hnRNA 或 基因 组 DNA, 在 500Xg 离心 收集 细胞 核 ， 根 据 需要 延长 离心 时 间 。 第 17 章 对 此 进行 了 详细 介绍 。

© 将 上 清 液 〈 细 胞 质 ) 转移 到 新 的 无 RNase 的 试管 中 ， 加 入 EDTA 到 终 浓 度 为 10mmol/L,

注意 ”通常 将 Naz-EDTA 制备 成 500mmolL 储备 液 。EDTA 的 加 入 能 够 防止 Mg2+ Sr FO BIDE 合 及 核酸 与 蛋白 质 之 间 的 聚合 。

© 加 入 等 体积 的 有 机 抽 提 液 〈 下 面 一 层 的 黄色 液体 ) 到 水 相 细 胞 质 裂 解 物 中 。 非 常 小 心地 倒置 混合 15s 或 更 长 时 间 。 样 品 在 55°C Rit 5min。

注意 工 如 果 液 体 在 微量 离心 管 中 ， 将 管 置 于 拇指 和 食指 之 间 倒置 几 次 ， 使 有 机 相 和 水 相 充 分 混合 ， 蛋白 质 充分 变性 ， 溶 液 向 外 溅 出 的 可 能 性 最 小 。

注意 2 加热 有 利于 更 彻底 地 除去 样品 中 的 蛋白 质 。 有 人 不 加 热处理 样品 ， 而 是 增加 有 机 溶剂 抽 提 次 数 。 此 处 推荐 的 方案 能 够 减少 有 机 废物 的 体积 。

注意 3 与 VDR 接触 后 ， 黄 色 的 SRRERERRR BE. KEM FSRREMRA THESES FA. RZ 8- 羟 基 唆 啉 或 VDR 时 ， 则 没有 颜色 变化 。

© 样品 在 冰 上 放置 或 冰 水 浴 5min。

注意 : ”快速 冷却 有 利于 有 机 相 和 水 相 的 分 离 及 RNA 在 水 相 的 分 配 。

@) 在 台式 离心 机 中 以 500Xg 一 2000Xg 或 者 最 大 速度 离心 ， 分 离 有 机 相 和 水 相 。

注意 ”离心 分 相 所 需 的 时 间 取决 于 试管 的 体积 和 大 小 。 通 常 最 多 只 需要 5min。 尽 管 多 数 情况 下 使 用 冷冻 离心 ， 但 是 冷冻 对 于 此 步 分 相 而 言 不 是 必需 的 。

© 仔细 地 将 上 层 水 相 转 移 到 新 的 无 RNase 的 离心 管 中 。 要 特别 小 心 ， 不 要 干扰 和 蛋白质 层 。 因 此 ， 最 好 是 留 下 几 微 升水 相 以 免 界面 的 蛋白 质 被 转移 到 新 的 离心 管 中 〈 图 5. 1) 。

@ 水 相 中 加 入 等 体积 的 新 鲜 抽 提 溶 液 ， 仔 细 倒 置 使 水 相 和 有 机 相 彻底 混合 。 在 4C， 500Xg 一 2000Xg 或 台式 离心 机 的 最 大 离心 速度 离心 ， 分 离 有 机 相 和 水 相 。 通 常 这 步 有 机 浒 剂 抽 提 不 需要 加 热 或 冷却 。

@ 仔细 取出 上 层 水 相 ， 转 移 到 无 RNase 的 新 离心 管 中 。 如 果 有 明显 的 蛋白 质 层 或 水 相 呈 云 寺 状 ， 重 复 步 骤 四 的 有 机 抽 提 直到 和 蛋白质 界 面 消失 ， 水 相 透 明 。

注意 ”如 果 大 量 细胞 溶 于 相对 小 体积 的 缓冲 液 中 ， 通 常 需要 增加 有 机 溶剂 抽 提 次 数 。

Q 最 后 ， 水 相 再 用 等 体积 氯仿 或 氯仿 : 异 戊 醇 (24:1) 抽 提 一 次 以 上 ， 倒 置 使 有 机 相 和 水 相 彻底 混合 。 离 心 30s 将 两 相 分 开 。

注意 ”由 于 苯酚 在 氯仿 中 溶解 度 高 ， 最 后 用 氯仿 抽 提 能 够 除去 水 相 残 余 的 微量 苯酚 。 在 所 有 涉及 使

。43 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

用 葵 酚 的 场合 ， 最 后 用 氯仿 抽 提 除去 水 相 残 余 苯 酚 是 一 种 标准 化 操作 。 记 住 痕 量 的 苯酚 也 会 氧化 成 醒 ， 后 会 影响 核酸 质量 。 ，

@® 将 水 相 (上 层 ) 转移 到 新 的 无 RNase 的 试管 中 ， 加 入 0.1 FAR 3mol/L 乙酸 钠 (pH 5.2) 和 2.5 倍 体积 的 冰冷 冻 的 95%% 乙 醇 。 倒 置 混 匀 。

@ 在 一 20C 放 置 过 夜 沉 淀 RNA.

注意 沉淀 核酸 时 可 以 用 不 同 的 盐 和 醇 组 合 。 在 高 浓度 醇 中 核酸 复合 物 的 溶解 度 降 低 。 这 种 沉淀 可 以 用 离心 收集 ， 干 燥 后 悬浮 于 适量 的 缓冲 液 中 。 由 于 不 同 生 物 样 本 所 含有 的 RNA 量 不 清楚 ， 在 一 20C 放 置 过 夜 沉 泻 样品， 能 保证 RNA 的 全 面 回 收 。

© 离心 沉淀 回收 RNA， 用 Corex 玻璃 离心 管 ， 在 4C、9000Xg 离 心 30min; 或 者 用 微量 离心 管 ， 在 4C 或 室温 用 台式 离心 机 以 最 大 离心 速度 离心 10min。

© 倒 去 乙醇 上 清 液 。 用 70% 一 75%% 乙 醇 洗涤 RNA 沉淀 2 一 3 次 ， 除 去 共 沉 淀 的 盐 。 在 70%% 一 75%% 乙 醇 中 ， 盐 〈 特 别 是 乙酸 钠 ) 能 够 溶解 ， 但 不 能 溶解 沉淀 的 核酸 。

@ 试管 用 空气 简单 地 干燥 。 如 果 需 要 ， 最 后 用 95% 乙 醇 洗 桨 有 利于 RNA 样品 于 燥 。 RNA 样品 最 好 以 乙醇 沉淀 的 形式 保存 在 一 70C， 或 者 定量 后 溶 于 适量 缓冲 液 中 分 装 ， 一 707C 保 存 〈 避 免 反 复 冻 融 ) 。107 个 细胞 可 以 产生 75~100pg RNA， 具 体 产 量 取决 于 细胞 种 类 。

5.3.2 离 液 裂解 缓冲 液

至 今 可 能 还 没有 什么 方案 抑制 RNase 的 效果 比 用 含 县 盐 的 缓冲 液 裂 解 细胞 抑制 核 RNase 的 效果 更 好 〈Chirgwin 等 ，1979) 。 肌 盐 缓冲 液 彻底 解除 蛋白 质 空间 结构 ， 因 此 核糖 核酸 酶 水 解 RNA 的 能 力 丧 失 。 离 子 型 变 构 剂 sarkosyl (后面 的 章节 讨论 ) AEB MRM 性 蛋白 质 的 能 力 。 在 这 种 裂解 缓冲 液 中 不 需要 添加 其 他 的 核糖 核酸 酶 抑制 剂 。 使 用 这 样 的 有 裂 解 缓冲 液 抽 提 RNA 可 以 在 室温 下 操作 。 由 于 这 些 裂解 缓冲 液 具 有 强 离散 性 〈 即 生物 学 破坏 性 )， 在 破坏 细胞 质 膜 的 同时 细胞 器 官 也 被 破坏 。 因 此 ， 细 胞 核 中 的 基因 组 DNA、 核 不 均一 RNA(ChnRNA)、 线 粒 体 DNA 和 RNA， 都 与 细胞 质 RNA 一 道 纯 化 出 来 。 需 要 除去 回收 样 品 中 的 DNA。 早 先 多 用 和 氯 化 铭 梯度 〈(Glisin 等 ，1974; Ullrich 等 ，1983) 或 三 所 乙酸 铭 梯 度 (Zarlenga 和 Gamble, 1987) 之 类 的 等 密度 离心 (背景 知识 见 Cooper，1977)。 由 于 . DNA 密度 是 1. 5 一 1. 7g/ml，RNA 的 密度 是 1. 8 一 2. 0g/ml， 可 以 用 等 密度 分 离 。 为 了 方便 读者 ， 附 录 9 介绍 了 作为 分 子 生 物 学 工具 的 离心 技术 基础 。

最 近 建 立 的 肌 - 酸 - 酚 抽 提 技 术 ， 能 差异 分 配 DNA, RNA 和 蛋白质 〈Chomczynski 和 Sacchi，1987)， 已 经 成 为 最 常用 的 快速 纯化 RNA 的 技术 。 研 究 人 员 充 分 利用 在 酸性 pH 环 境 及 有 机 溶剂 中 RNA 和 DNA 之 间 显 著 的 化 学 差异 ， 建 立 了 很 多 快速 方法 从 生物 样品 中 有 效 分 离 RNA、DNA (和 有 蛋白质 ) (Majumdar 等 ，1991; Chomczynski，1993) 。 随 后 介绍 了 一 些 这 样 的 方法 和 其 他 的 方法 。

用 离 液 试剂 分 离 RNA 的 方法 ， 其 主要 缺点 是 不 能 区 分 细胞 质 RNA 和 细胞 核 RNA。 一 且 细 胞 核 不 均一 RNA (hnRNA) 和 剪接 后 成 熟 的 mRNA 混合 ， 就 无 法 将 这 两 种 RNA 分 开 (根据 大 小 可 以 将 这 两 种 RNA 部 分 分 开 ， 但 并 不 适合 所 有 RNA).

遗 憾 的 是 ， 很 多 不 严谨 的 研究 人 员 在 使 用 股 盐 缓冲 液 抽 提 RNA 时 忽视 了 保证 缓冲 液 和 a ILC RNase 污染 的 要 求 。 尽 管 在 股 盐 缓冲 液 存在 的 情况 下 RNase 活性 被 彻底 抑制 ， 但 是 一 旦 除去 了 去 污 剂 ， 纯 化 的 RNA Xt RNase 降解 又 非常 敏感 。 因 此 ， 要 根据 第 4 章 介绍 的 指

。 44 -

第 5 章 RNA 分 离 策略

导 原 则 ， 一 直 避 免 人 Nase 对 RNA 的 破坏 。

5.4 用 含有 县 离 子 的 级 冲 液 分 高 RNA

含有 蜡 硫 氰 酸 肌 或 盐酸 肌 的 裂解 缓冲 液 能 够 重复 性 地 产生 高 质量 的 RNA。 这 归 因 于 这 种 试剂 非常 高 的 离 液 特性 ， 属 于 最 强 的 蛋白 质变 性 试剂 (Cox, 1968; Nozaki 和 Tanford, 1970; Gordon，1972) 。 从 整个 组 织 样品 中 回收 RNA 就 离 不 开 肌 盐 缓 冲 液 。 当 细胞 质 膜 被 溶解 时 ， 细 胞 核 和 其 他 细胞 器 官 也 遭 到 破坏 ， 结 果 回 收 的 核酸 包括 细胞 核 RNA、 细 胞 核 基

因 组 DNA 和 细胞 质 RNA。8 琉 基 乙 醇 〈B-ME) eA a)

的 加 大 可 能 促进 蛋白 质变 性 〈 包 括 核糖 核酸 酶 cued CELE

变性 )， 该 还 原 试剂 能 够 断裂 分 子 内 的 二 硫 键 ， a ae a. ER eo

并 需要 加 入 其 他 的 RNase 抑制 剂 。 另 一 个 常用 的 还 原 试剂 ， 即 二 琉 基 苏 糖 醇 (DTT)， 能 够 与 县 盐 反 应 ， 因 此 县 盐 缓冲 液 中 不 可 以 加 入 DTT.

目前 有 三 个 基本 方案 利用 县 盐 裂 解 缓 冲 液 分 离 裂解 液 的 RNA、DNA 和 有 蛋白质。 此 处 对 每 种 方案 列 出 了 一 个 例子 。 这 些 途 径 涉 及 所 有 细 CsTFA 梯 度 酸 - 酚 抽 提 胞 裂解 后 ， 等 密度 超 离心 或 酸 - 酚 抽 提 (图 图 5.3 用 肌 盐 缓冲 液 裂 解 细胞 后 ， 细 胞 总 5.3) 。 尽 管 常常 能 够 将 RNA 从 含 肛 的 缓冲 液 中 RNA 分 级 的 方法 : EB (CsCl) 或 三 氟 直接 沉淀 出 来 ， 但 是 用 CsCl 或 CsTFA MB CBM CCSTFA) BRL, Rae BE 能 够 获得 超 纯 RNA (尽管 繁琐 ) 。 对 于 多 数 分 子 生 物 学 应 用 而 言 ， 并 不 需要 采用 这 种 费时 的 梯度 离心 方法 纯化 RNA。

当心 “如果 你 不 熟悉 超 离 心 的 正确 操作 ， 你 一 定 要 请 求 适当 的 技术 协助 。 如 果 使 用 不 当 ， 转 头 会 致命 。

温和 NP-40 方法 有 利于 细胞 质 总 RNA 分 离 ， 但 是 用 含有 肌 盐 的 裂解 缓冲 液 回 收 的 RNA 是 细胞 总 RNA (包括 细胞 质 RNA 和 细胞 核 RNA)。 图 5.4 比较 了 细胞 质 总 RNA 和 细胞 总 RNA 的 大 小 分 布 。

a bcd

5.4 细胞 总 RNA 和 细胞 质 总 RNA 大 小 分 布 比 较 。 孔 a 和 和 孔 b: 20ug 细胞 质 总 RNA (NP-40 裂解 组 RAH. Anam: 氯仿 抽 提 除去 蛋白 质 的 RNA 样品 ) 。 孔 c AFL d: 25pg 细胞 总 RNA〈 肌 - 酸 - 酚 抽 提 获得 )。 孔 <c 和 和 孔 d 中 , 在 28S rRNA 条 带 上 面 ， 可 见 分 子 量 更 高 的 RNA， 即 hnRNA。 在 上 样 孔 c< 和 和 孔 d 中 有 明显 的 荧光 ， 提 示 有 人 少量 的 DNAS. Bik Ai A DS-24 照相 机 ， 用 Polaroid 667 MR. Ht RE Di versifield Biotech. Inc. 的 产品

e 45 °

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

5.5 肽 - 酸 - 酚 抽 提 技术

ZT), HAR RARE RNA 能 够 获得 最 高 质量 的 RNA。 含 肛 的 缓冲 液 是 最 有 效 的 离 液 缓冲 液 。 如 同 前 面 所 介绍 的 ， 离 液 缓 冲 液 能 够 迅速 彻底 地 破碎 培养 的 细胞 或 组 织 的 细胞 ， 同 时 能 够 迅速 地 消除 RNase 活性 〈 即 使 RNase 含量 非常 丰富 )。 原 先 的 方案 利 FA DNA All RNA 密度 差异 ， 用 超 离心 将 RNA 与 DNA 分 开 ， 非 常 费 力 。1987 年 Chomezyn- ski 和 Sacchi 介绍 了 一 种 纯化 完整 RNA 的 方法 ， 用 含有 蜡 硫 和 氰 酸 肌 的 裂解 缓冲 液 处 理 细 胞 ， 样品 不 用 CsCl 超 离心 。 在 这 个 方法 和 相关 的 方法 中 ， 酸 - 酚 抽 提 含 肛 盐 的 细胞 或 组 织 裂 解 液 能 够 迅速 分 离 RNA; 氯仿 的 加 入 有 利于 水 相 和 有 机 相 的 分 离 。 在 实验 室 将 水 饱和 的 茉 酚 与 酸性 乙酸 钠 溶 液 混合 就 能 够 制备 出 这 种 抽 提 用 的 酸 - 酚 ， 预 先 混 合 的 葵 酚 和 蜡 硫 氰 酸 县 单 相 溶液 〈 例 如 ，TRIzol 和 TRI 试剂 ) 可 以 从 一 些 商家 购买 。 厂 家 提供 的 这 些 试剂 对 起 初 发 表 的 实验 方案 进行 了 改进 。 相 分 离 时 ，RNA 留 在 水 相 ， 而 DNA 和 蛋白质 留 在 蛋白 质 界面 层 和 有 机 相 中 。 然 后 ， 用 异 丙 醇 沉淀 和 离心 回收 水 相 RNA 分 子 。 这 种 方法 在 1h 内 能 够 从 少 至 10° 个 细胞 或 Img 组 织 中 有 效 地 分 离 出 RNA。

5.5.1 实验 方案 : 股 - 酸 - 酚 抽 提

© 戴 手 套 !

Q 离心 收集 细胞 ， 将 105 个 细胞 悬浮 在 100 则 溶液 D 中 。

4mol/L 异 硫 氰 酸 县

25mmol/L 柠檬 酸 钠 ，pH7.0

0.5% N- 十 三 烷 基 肌 氮 酸 钠 (sarcosy]l)

100mmol/L 2-3 3 Z

FA God Bat Bas FE KO TT ER Et BN A ih A SG He EL Be KE A HT HE

注意 每 100mm 组 织 培养 四 中 直接 加 入 1. 0 一 1. 5ml 溶液 D 可 以 将 细胞 直接 裂解。 在 培养 下 或 烧 撼 中 直接 裂解 细胞 需要 的 裂解 试剂 较 多 ， 因 溶液 黏度 高 很 难 回 收 所 有 的 裂解 液 。 此 时 ， 用 无 菌 的 细胞 scraper (Corning; 货号 3010) 可 能 有 用 。 体 积 缩小 后 ， 整 个 操作 可 以 在 2. 2ml 的 微量 离心 管 中 进 行 。

G) 将 匀 浆 液 转移 到 聚 丙 烯 管 中 。 步 又 @ 使 用 的 溶液 D 裂解 缓冲 液 中 每 毫升 加 入 :

0. lm] 2mol/L 乙酸 钠 ，pH 5. 2

1. 0ml 水 饱和 的 苯酚 〈 分 子 生 物 学 级 )

0. 2ml Ath: SEDC Be 每 加 入 一 种 试剂 后 ， 盖 紧 盖 子 ， 来 回 倒置 仔细 而 又 充分 混合 。 所 有 试剂 加 入 后 剧烈 混 个 05

® 样品 在 冰 上 至 少 冷却 15min。 在 4 离心 分 相 。

© 将 含有 RNA 的 水 相 转 移 到 一 个 新 管 中 ， 加 入 0. 75 倍 体积 冰冻 的 异 丙 醇 。 一 20C 放 置 1h 以 上 沉淀 RNA.

注意 ”操作 规模 大 时 ， 使 用 有 螺旋 盖 的 玻璃 管 。 离 心 时 将 玻璃 管 置 于 适当 的 套子 中 沉淀 回收 RNA,

@ 在 4C 以 10000xg 离 心 20min， 收 集 沉 ‘an FAA him, BF.

当心 ”该 方案 中 所 有 离心 的 离心 力 不 得 超过 管 所 能 耐 受 的 最 大 离心 力 。

@ ¥f RNA GLE MIKA F 300 由 溶液 D 中 “〈 匈 wy 转移 到 1. 7ml 无 RNase 的 微量 离心 管 中 。

。46 。

#52 RNA 分 离 策略

加 入 0. 75 倍 体积 冰冻 的 异 两 醇 。 一 20 人 放置 1h 以 上 再 次 沉淀 RNA.

© 在 微量 离心 机 中 于 4C 以 12000Xg 离心 10min， 收 集 沉 淀 。 仔 细 倒 出 上 清 液 ， 丢 弃 。

@ 沉淀 用 500p1 70% 乙 醇 洗 3 一 4 次。 如 果 洗 涤 过 程 中 RNA 沉淀 没有 移动 ， 就 没 必 要 离心 。 在 空气 中 干燥 微量 离心 管 去 除 残余 的 乙醇 。

注意 如 果 需 要 ， 最 后 一 步 用 95%% 的 乙醇 洗涤 能 够 加 速 样品 的 干燥 。

@ # RNA WFR ARN TE 缓冲 液 或 者 二 乙 基 焦 碳酸 酯 (DEPC) 处 理 的 水 中 。 在 65°C 保温 10min 有 利于 RNA 溶解 ， 但 是 如 果 乙 醇 沉 淀 后 的 RNA 样品 干燥 彻底 ， 就 不 需要 fe 65°CfRifd 10min。 如 果 不 急 用 ， 可 以 直接 储存 在 乙醇 中 沉淀 的 RNA。 确 定 RNA 浓度 后 ， 将 RNA 溶液 分 装 并 储存 于 一 80C 备 用。 避免 反复 冻 融 RNA 溶液 。

5.6 @BHBBYS ba SAUL B Bi A A Fr SE Ee fA BE A ee BY Ad 2 2 分 离 RNA。 所 形成 的 亚 细 胞 组 分 混合 物 需 要 进行 生物 大 分 子 的 相互 分 离 ， 尤 其 需要 除去 RNA 制备 物 中 的 DNA。 尽 管 RNA、DNA 和 蛋白 质 密度 之 间 只 有 微小 的 差别 〈 表 5.3)， 但 是 用 密度 梯度 法 能 够 将 这 些 组 分 分 离 。

表 5.3 等 密度 离心 时 ， 生 物 大 分 子 的 密度 范围 人 Ges ee

1.5~1. 7g/ml

密度 梯度 离心 ， 更 确切 地 说 是 等 密度 离心 ， 是 生物 大 分 子 在 密度 梯度 介质 中 运动 到 介质 密度 与 这 种 生物 大 分 子 密度 相等 的 离心 技术 。 这 类 分 离 的 经 典 密 度 介 质 是 CsCl. CsTFA 和 CszSO4@ 。 这 些 分 子 将 在 介质 密度 与 其 密度 相等 的 位 置 积累 ， 悬 浮 在 那里 直到 离心 结束 。 有

些 情况 下 ，RNA 比 任何 位 置 的 介质 密度 大 ， 因 此 离心 后 RNA WEES FRB. WRT 的 密度 增加 ，RNA 就 如 同 质粒 DNA 一 样 ， 密 度 梯 度 离 心 后 形成 RNA 条 带 。

5.6.1 AW

CsCl 是 一 种 高 密度 盐 ， 超 离心 能 使 CsCl 溶液 形成 线性 梯度 。 将 均 相 溶液 〈 如 细胞 裂解 液 ) 置 于 CsCl 溶液 上 ， 超 离心 分 离 生 物 大 分 子 。 用 CsCl 进行 等 密度 离心 不 需要 制备 梯度 溶 液 。 通 常 CsCl 梯度 变化 大 ， 其 最 大 密度 超过 了 最 大 密度 的 生物 大 分 子 ， 离 心 的 结果 是 较 高 密度 的 分 子 ， 如 RNA， 将 沉淀 在 离心 管 底部 。 离 心力 、 所 有 生物 大 分 子 运 动 到 它们 的 平衡 位 置 所 需要 的 时 间 决 定 了 密度 梯度 离心 的 效果 。 而 实际 的 离心 时 间 又 取决 于 转 头 的 大 小 。 落 地 式 超 离心 进行 RNA 制备 通常 离心 过 夜 ， 而 台式 超 离 心 或 “微量 超 离心 ”( 如 Sorvall Dis- covery M150 SE, 5.5) 完成 相同 的 分 离 只 需要 3h,

5.6.1.1 实验 方案 : CsCl 梯度 离心 方法

此 处 介绍 的 RNA 分 离 方法 对 Glisin 等 (1974)、Ullrich 等 〈1977) 、Chirgwin 等

1.7~2. 0g/ml

@ 也 兽 使 用 其 他 材料 如 甘油 ficoll, metrizamide 和 蔗糖 。 主 要 由 于 这 些 材 料 价格 便宜 ， 纯 度 高 。 根 据 密 度 差 异 ， 最 好 用 一 种 饮 盐 进行 核酸 分 离 。 本

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

(1979) 分 离 RNA 方法 进行 了 修改 。

QO FB!

Qa H WAAR HM: 500X g 离心 5min 收集 细胞 。 尽 量 倒 去 上 清 液 。 用 磷酸 盐 缓 冲 生理 盐水 (PBS) CL 溶液 中 含 A 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g NazHPO,, 0. 24g KH2PO.) 洗涤 细胞 沉淀 一 次 。 尽 量 除去 PBS。 如 果 RNase 是 主要 的 问题 ， 在 4C 离 心 ， 并 用 冰冷 的 PBS 洗涤 细胞 。

Gb 针对 组 织 : 快速 收集 组 织 并 在 冰冻 的 盐 溶 液 中 切 碎 。 将 组 织 迅 速 转移 到 适当 的 已 经 盛 有 裂解 缓冲 液 的 匀 浆 器 严 中 (步骤 @) 。 如 果 组 织 在 液 氮 中 快速 冷冻 ， 在 实验 室 桌面 上 快 速 击 打 〈 通 常 组 织 块 用 铝 膜 包 庄 ) 使 之 粉碎 可 能 有 益 。 以 这 种 方式 将 粉碎 后 的 组 织 迅速 转移 到 裂解 缓冲 液 中 ， 使 之 融化 。

5.5 Sorvall Discovery M150 SE 注意 SRA 6 章 从 组 织 中 提取 RNA 的 详细 知识 。 微量 超 离心 。 较 小 半径 @ MA 5 FAR 〈 沉 淀 体积 ) HAR: 的 转 头 产生 的 离心 力 (2) RE. 6mol/L 盐酸 肛 (2K 4mol/L FRABIM) 使 等 密度 RNA 制备 能 够 在 3h 5mmol/L 柠檬 酸 钠 (pH 7.0) 或 更 短 的 时 间 内 完成 。Kendro 0.5% sarcosyl Laboratory Products 惠 赠 10mmol/L BME (用 前 加 入 )

温和 涡 旋 ， 可 能 有 助 于 沉淀 分 离 。

注意 工 CRRA. ARMA RMB eA.

注意 2 CMABMEZA, HRMBIIA MATE A CAILA. EAR, BRR RM AB) 37°C, VHB BAMA PME 至 终 浓度 为 200mmol/L， 立 即使 用 。 如 有 必要 ， 可 以 用 0. 2um 的 滤 腊

注意 3 HREM SMA MM PME RA.

由 组 织 悬 浮 液 来 回 通过 19 号 针头 ; 或 者 用 杜 恩 斯 匀 浆 器 来 回 拉 几 次 ， 手 工 匀 浆 组 织 ;

或 者 用 机 械 办 法 CU Polytron 义 浆 器 ) 在 室温 下 破碎 细胞 或 组 织 。 无 论 哪 种 情况 ,产生 的 .

剪 切 力 能 够 物理 断裂 基因 组 DNA， 阻 止 高 分 子 基因 组 DNA 产生 一 种 不 可 透 过 的 网 状 物 ， 后 者 会 阻止 RNA 沉淀 。

注意 ”为 了 获得 高 质量 RNA 的 最 大 回收 ， 该 步 要 避免 溶液 过 热 或 形成 气泡 。

© 如 果 需 要 ， 每 2. 5ml 裂解 液 加 入 lg 固体 CsCl1。 如 果 其 他 分 子 在 相同 的 密度 与 RNA 共 纯 化 ， 就 需要 照 这 种 方法 加 入 CsCl.

© ¥ 5. 7mol/L CsCl ( 溶 于 100mmol/L EDTA, pH 7.5) 转移 到 超 离心 管 中 作 为 垫底 溶液 。 垫 底 溶 液 占 整个 离心 管 体 积 的 25%% 左 右 。 离 心 管 是 纤维 素 硝 酸 酯 或 聚 异 质 同 唱 体 (polyallomer) ， 与 所 用 的 离心 管 套 、 转 头 必须 兼容 。

@) 在 氯 化 饮 垫 底 溶 液 顶 部 ， 仔 细 铺 上 组 织 或 细胞 裂解 液 ， 直 到 充满 离心 管 。 每 个 离心 管 与 其 离心 管 套子 和 盖子 一 起 称 重 。 各 个 盛 人 样品 的 离心 管 〈 包 括 离 心 管 、 离 心 管 套 子 和 盖 子 ) 之 间 的 重量 差异 不 超过 0. 05g。 照 厂家 说 明 封 闭 离心 管 。 在 放 和 人 转 头 前 ， 还 要 花 点 时 间 再 次 称 量 每 个 离心 样品 的 重量 。 如 果 不 按 照 厂家 的 规定 精确 平衡 ， 离 心 时 会 产生 灾难 性 的 后 果 。

。 48 -

#58 RNA 分 离 策略

用 水 平 式 转 头 离心 。 落 地 式 离心 机 要 离心 过 夜 ， 台 式微 量 超 离心 需要 3 一 4h。 每 个 转 头 的 指南 说 明了 纯化 RNA 所 需要 的 离心 力 。 注意 离心 过 程 中 冷却 离心 腔 将 导致 CsCl 沉淀 ， 密 度 梯 度 遭 到 破坏 。 这 类 离心 要 在 室温 下 进行 。 @ 离心 后 ， 用 无 菌 的 巴 斯 德 移 液 管 或 无 菌 的 5ml 枪 头 仔 细 吸 取 除 去 上 清 液 。 操 作 时 要 特别 仔细 ， 不 要 破坏 离心 管 底部 的 沉淀 。 许 多 研究 人 员 THRE 80%% 的 上 清 液 ， 剩 余 的 溶液 倾泻 倒 去 。 除 去 上 人 清 液 后 ， 在 RNA 沉淀 位 置 上 面 ， 切 掉 离 心 管 上 面部 分 。 可 以 用 止血 狂 夹 住 刀片 ， 在 Bunsen 灯 上 加 热 ， 然 后 在 离心 管 上 切割 。 切 割 之 后 ， 可 见 RNA 沉淀 〈 图 5.6)。

注意 ” 超 离心 后 蛋白 质 和 /或 DNA 可 能 黏附 于 离心 管 辟 ie! 如 果 不 将 离心 管 壁 切除 ,溶解 回收 的 RNA 将 被 蛋白 质 和 /或 erry DNA 污染 。 因 此 ， 将 离心 管 底部 半 透 明 的 RNA 沉淀 与 离心 管 其 (a) (b) (c) 他 部 分 切 开 ， 有 助 于 消除 蛋白 质 和 /或 DNA 对 RNA 的 污染 。 图 5.6 等 密度 梯度 离心 后 回收 RNA 四 将 RNA 沉 淀 彻 底 溶 于 最 小 量 体 积 的 下 列 缓冲 的 方法 。(a) 除去 梯度 溶液 后 RNA 沉 液 中 : 演出 现 ; (b) 刚好 在 RNA 上 方 切割 离 10mmol/L Tris, pH 7.4 心 管 ; (co) RNA 留 在 晶状体 形 的 摇篮 5mmol/L EDTA 中 。 这 种 方法 回收 RNA 能 够 避免 离心 0.1% SDS (最 好 加 入 该 组 分 ) 管 壁 上 残留 的 DNA、 蛋 白质 污染 RNA 样品

然后 将 RNA 溶液 转 和 一 个 无 菌 的 微量 离心 管 中 。 如 果 制 备 的 RNA 样品 量 大 ， 就 将 RNA 溶液 转移 到 锥 形 的 15ml 聚 丙 烯 离心 管 中 。

注意 ”这 类 纯化 所 获得 的 RNA 沉淀 常常 很 难 在 含水 的 缓冲 溶液 中 溶解 。RNA 沉淀 量 越 大 ， 沉 淀 溶 解 的 难度 就 越 大 。 将 沉淀 在 一 20C 冷 冻 ， 然 后 融化 则 有 助 于 RNA 沉淀 的 溶解 。 少 许 涡 旋 对 沉淀 溶解 也 有 一 些 帮助 。

@ 用 2 倍 体积 的 氯仿 OE 〈4 : 1， 体 积 比 ) 或 2 倍 体积 的 氯仿 : TE (4 : 1， 体 积 比 ) 抽 提 一 次 。 离 心 分 相 ， 将 水 相 转 移 到 灭 菌 后 的 微量 离心 管 中 。

@ 昌 有 机 相 再 用 等 体积 的 下 列 缓冲 液 抽 提 ::

10mmol/L Tris, pH 7. 4

5mmol/L EDTA

0.1% SDS (Ree i AKAN)

合并 水 相 。

注意 ”氯仿 抽 提 能 够 去 除 RNA 制品 中 残留 的 污染 。

® 加 入 0. 1 倍 体积 3molL 乙酸 钠 (pH 5.2) Al 2.5 倍 体积 冰冷 的 95% 乙 醇 ， 混 合 后 #£— 20°C it#E RNA 几 小 时 。 如 果 了 RNA 深 液体 积 大 ， 有 可 能 要 分 装 到 两 个 或 更 多 离心 管 中 进行 沉淀 ， 或 者 在 一 个 15ml 的 Corex 玻璃 管 中 进 行 沉 淀 。

GO EMEA DE POEM. FA 12000Xg 离心 10min (如 有 可 能 在 4C 离 心 )。 如 果 在 Corex 玻璃 管 中 沉 淀 ， 管 子 套 上 套子 后 ， 在 9000Xg 离心 20min WE.

当心 ”进行 RNA 沉 淀 时 ， 离 心力 绝对 不 能 超过 转 头 和 离心 管 所 能 耐 受 的 离心 力 。

© 仔细 倒 去 上 清 液 ， 沉 淀 至 少 用 70%% 乙 醇 洗涤 一 次 。 倒 去 70% 乙 醇 洗 液 。 如 果 需 要 ， 再 用 95 % 乙醇 洗涤 一 次 ， 能 够 加 速 样品 干燥 。 不 彻底 干燥 RNA 样品 是 明智 的 。

。49 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

© 最 好 以 乙醇 沉淀 的 方式 将 RNA 储存 于 一 80C， 或 者 将 RNA 定量 后 分 装 储 存 于 一 80C 〈 避 免 重 复 冻 融 RNA 样品 )。 每 10° 个 细胞 可 以 产生 50 一 75pg 质量 非常 高 的 RNA， 具体 的 产量 取决 于 细胞 种 类 。

5.6.2 =AZC MR?

CsTFA (Amersham Biosciences, Piscatway,; NJ) 是 等 密度 分 离 RNA #1 DNA 的 优秀 介质 。 使 用 的 方法 与 CsCl 和 CszSO4 类 似 ， 在 超 离心 时 能 够 自动 形成 密度 梯度 。 三 氟 乙 酸 阴离子 使 CsSTFA 具有 产生 特别 高 质量 核酸 制备 物 的 特性 。

D 高 密度 溶液 。CsTFA 溶解 度 很 大 ， 能 够 形成 密度 达到 2. 6g/ml 的 溶液 。 等 密度 分 离 核酸 时 ， 该 密度 比 CsCl 所 能 够 达到 的 最 大 密度 1. 7g/ml 高 很 多 。 三 氟 乙 酸 阴离子 的 存在 促 进 了 核酸 和 和 蛋白质 的 水 化 和 溶解 。 结 果 ， 三 氟 乙 酸 饮 溶 液 中 的 核酸 密度 比 CsCl 溶液 中 的 核 酸 密度 低 ， 蛋 白质 更 容易 与 核酸 解 离 。

@ 等 密度 RNA 条 带 。 由 于 RNA 的 密度 降低 ， 介 质 的 密度 又 大 ， 使 RNA 在 等 密度 时 形成 条 带 。 用 CsCl 或 CszSO4 溶液 进行 等 密度 离心 ，RNA 不 容易 形成 条 带 。 如 果 需 要 ， 和 蛋 白质 、DNA 和 了 RNA 都 能 够 在 同一 CsTFA 梯度 中 产生 条 带 (Zarlenga 和 Gamble, 1987). 另外 也 可 以 制备 出 使 RNA 沉淀 的 梯度 〈 图 5. 7)， 采 用 CsCl 梯度 的 方式 回收 RNA.

图 5.7 三 氟 乙 酸 饮 梯 度 离心 ， 用 异 硫 氰 酸 肛 抽 提 牛 肝 生物 — 有 上 蛋白 质 大 分 子 , 等 密度 梯度 离心 分 离 。 牛 肝 的 异 硫 氰 酸 肌 抽 提 物

edi: (18ml) 铺盖 在 19ml CsTFA(p=1.51g/ml) 上 面 ，125000Xg 离心 16h, “4 3.5mg 总 RNA 沉淀 于 管子 底部 (p= 1.62 ~ 1.9g/ml) 。 该 RNA ht DNA 含量 低 于 0.4% CH DNA 探 针 检测 的 结果 )。 在 原来 的 异 硫 氰 酸 肌 抽 提 液 和 三 氟 乙 酸 饮 梯 度 溶液 界面 附近 所 形成 的 条 带 是 DNA， 密 度 p=1.6g/ml, WB 一 RNA 是 蛋白 质 ， 密 度 o 王 1. 2 一 1. 5g/ml。Amersham Bioscience 惠 赠

@) 蛋白 质变 性 不 需要 变性 剂 ，CsTFA 能 溶解 蛋白 质 并 使 之 与 核酸 发 生 解 离 。 因 此 ， 用 CsTFA 超 离心 可 以 不 用 有 害 而 又 费时 的 有 机 溶剂 进行 抽 提 操作 或 者 不 用 和 蛋白酶 玉 处 理 。 不 用 苯酚 抽 提 ， 核 酸 尤 其 是 分 离 hnRNA 和 基因 组 时 ， 这 些 核酸 分 子 发 生 剪 切 或 降解 的 机 会 就 降低 了 。 而 且 ， 由 于 CsTFA 本 身 是 优秀 的 核酸 酶 抑制 剂 ，CsTFA 有 利于 完整 核酸 分 子 的 分 离 。

® 提高 纯化 RNA 的 产 率 。CsTFA 能 够 高 水 平 回收 核酸 。CsTFA 的 阴离子 有 盐 进 (salting-in) 效应 ， 而 氯 离子 和 硫酸 根 阴 离子 是 盐 出 〈salting-out) 效应 ， 盐 进 效应 减少 了 超 离 心 过 程 中 蛋白 质 沉 淀 的 机 会 ， 减 少 了 分 离 过 程 中 核酸 的 损失 。

© 极 性 溶剂 中 的 溶解 性 。 在 极 性 溶剂 中 CsSTFA 的 溶解 性 有 利于 核酸 从 CsTFA 溶液 中 回收 。 经 过 梯度 分 离 后 ， 无 需 透 析 或 抽 提 除去 盐 就 可 以 直接 进行 乙醇 沉淀 。

© 较 低 的 熔 解 温度 。 核 酸 双 链 在 CsSTFA 中 的 熔点 比 在 CsCl 中 的 熔点 低 ， 熔 点 低 有 助 于 单 链 核酸 与 双 链 核酸 的 分 离 ， 该 法 有 助 于 从 DNA: RNA 杂 合 子 回 收 完整 的 单 链 DNA Fil RNA.

—DNA

@ Amersham Bioscience 惠 赠 的 数据 和 实验 方案 。 本 50 硬

第 5 章 RNA 分 离 策略

密度 梯度 离心 法 的 缺点 是 密度 梯度 材料 〈 如 CsCl. CsTFA) 价格 昂贵 ， 超 离心 的 价格 也 昂贵 ， 离 心 时 间 长 ， 去 除 梯 度 纯化 RNA 的 杂质 工作 量 大 ， 同 时 只 能 做 几 个 样品 。 由 于 这 些 及 其 他 的 几 个 原因 ， 新 近 发 展 的 RNA 纯化 试剂 和 试剂 盒 完 全 不 需要 超 离心 。 但 是 有 些 应 用 还 需要 用 密度 梯度 离心 分 离 RNA。 由 于 这 个 原因 ， 在 此 讨论 CsC1l 方案 《前 面 介绍 的 ) 和 CsTFA FS.

5.6.2.1 实验 方案 :， CsTFA 梯度 方法

该 方法 对 Okayama 等 〈1987) 的 原始 方案 进行 了 修改 。 如 同 前 面 所 介绍 的 ，RNA 将 在 等 密度 梯度 离心 管 底部 形成 沉淀 ， 而 不 是 产生 离心 条 带 。 建 议 用 这 种 方法 制备 不 同 组织 来 源 的 总 RNA， 还 可 以 对 这 个 方法 加 以 修改 使 之 适宜 于 起 始 材料 只 有 25mg 的 小 规模 或 者 6g 的 大 规模 。CsTEFA 梯度 离心 时 不 可 以 使 用 纤维 素 硝 酸 酯 离心 管 。

(1) CsTFA 的 预先 制备

通常 CsTFA (Amersham Biosciences No. 17-0847-02) 的 密度 是 〈2. 0 士 0.05)g/ml。 在 100mmol/L EDTA(pH 7.0) 中 制备 成 (1. 51 士 0.01) g/ml 的 工作 溶液 。100ml 溶液 制备 :

Hi (> ml 的 CsTFA(o 是 产品 的 密度 )， 与 40ml 溶液 [100mmol/L Tris (pH 8.0),

100mmol/L KCl, lmmol/L EDTA] #f (so——> >) ml LHW WH KIBA. CsTFA LEK

液 的 密度 可 以 更 改 ， 以 适应 特殊 的 实验 方案 。 随 产品 送 来 的 还 有 厂家 提供 的 特定 密度 的 CsTFA 溶液 制备 的 准确 方案 。

QO RFE!

Ga 组 织 培养 物 : 在 500Xg 离心 5min 收集 细胞 。 尽 量 除去 上 清 液 。 细 胞 用 PBS (1L 溶液 含有 8. 0g NaCl, 0.2g KCI，1. 44g NazHPO,，0.24g 天 HPO4) 洗 一 次 。 尽 量 去 除 PBS 溶液 。 如 果 RNase 是 主要 问题 ， 在 4C 离 心 并 用 冰冷 的 PBS 洗涤 细胞 。

GOb 组 织 : 快速 收集 组 织 ， 在 冰冷 的 盐 溶液 中 切 碎 。 迅 速 转移 到 适当 的 已 经 盛 有 裂解 组 冲 液 的 匀 浆 器 中 〈 步 骤 @ 四 ) 。 如 果 组 织 在 液 所 中 快速 冷却 ， 在 实验 室 台 面 敲打 用 铝 膜 包 庄 的 样品 进行 粉碎 可 能 有 好 处 。 用 这 种 方式 能 够 将 样品 迅速 转移 并 在 裂解 缓冲 液 中 融化 。

注意 第 6 章 详细 介绍 了 从 组 织 中 提取 RNA 的 方法 。

@ 每 克 组 织 或 细胞 沉淀 ， 加 入 18ml 5.5mol/L FRA RMIARW 〈5. 5mol/L FRA WM, 25mmol/L 柠檬 酸 钠 ，0.5% sarcosyl, FR NaOH if pH 至 7.0， 使 用 前 加 入 200mmol/ L BME),

注意 工 异 硫 氰 酸 股 和 盐酸 肌 在 该 缓冲 液 中 可 以 替换 使 用 。

注意 2 在 加 入 8BME 之 前 ， 异 硫 氰 酸 肌 溶 液 在 4C 能 够 储存 几 天 。 在 使 用 前 ， 将 适当 体积 的 异 硫 氰 ALMA we MAF 37"C ， 冷 却 到 室温 后 ， 加 入 BME 至 200mmol/L 的 终 浓度 。 如 果 需 要 ， 经 过 0. 2um Hye 膜 过 滤 让 溶液 变 清 。

注意 3 保证 肌 盐 缓冲 液 、CsTFA 和 BME 与 超速 离心 管 兼容 。

由 用 手工 匀 浆 〈 重 复 通 过 19 号 针头 ， 或 用 Dounce 匀 浆 器 倒 腾 几 下 ) BOLD AR AT 法 《如 Polytron 33K at) 破碎 细胞 或 组 织 。 这 两 种 情况 下 ， 剪 切 力 是 断裂 基因 组 DNA 所 需 要 的 。 基 因 组 DNA 断裂 能 够 阻止 缺乏 通 透 性 的 高 分 子 DNA 网 状 物 的 生成 ， 否 则 将 阻止 RNA ive.

注意 ”为 了 回收 最 高 质量 的 RNA， 操 作 这 一 步 时 要 避免 溶液 过 热 或 形成 气泡 。

« 51 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

© 仔细 地 将 裂解 液 转移 到 锥 形 离心 管 〈 例 如 50ml) 中 。1500Xsg 离心 5min 沉淀 不 溶性 物质 。 © 避免 干扰 沉淀 ， 将 透明 的 裂解 液 转 移 到 新 的 离心 管 中 。 OQ 如 果 裂 解 液 仍然 很 黏稠 ， 重 复 经 过 19 号 针头 进一步 剪 切 DNA 直到 黏度 降低 。 通 常 重复 经 过 针头 10 一 12 次 就 足够 了 。

@@ 在 15C 以 5000xg 离 心 20min 除去 细胞 残 酒 。 回 收 离心 后 的 上 清 液 〈 特 别 小 心 别 把 UGE Beit is AD 。

Yi ALARA RS ARARE RE CERAH RAB SA,

@ 如 果 必 要 ， 用 5. 5mol/L FRARMAR GLO) 将 上 清 液体 积 调 至 所 期 待 的 上 样 体 f(a 5. 4).

表 5.4 FA CsTFA 进行 RNA 纯化 时 体积 、 管 子 、 转 头 和 速度 的 选择

Beckman 转 头

项 目

每 管 的 组 织 量 最 少 /mg 最 多 /mg #3 CsTFA/ml 每 管 样品 量 /ml 125000 X g 所 需要 的 RPM

YE: Amersham Biosciences 惠 赠 的 数据 。 附 录 9 的 附 表 9-1 和 附 表 9-2 提供 了 其 他 转 头 的 物理 性 质 。

@ 根据 样品 的 数量 和 体积 ， 选 择 合适 的 转 头 。 附 录 9 的 附 表 9-1 和 附 表 9-2 对 这 些 选 择 可 能 有 用 。 使 用 CsTFA 时 不 要 使 用 纤维 素 硝酸 酯 管 。 首 先 将 CsSTFA 溶液 灌 人 各 个 离心 管 中 ， 然 后 将 样品 加 至 CsSTFA 溶液 上 面 直至 离心 管 顶部 。

@ 用 天 平 称 量 平衡 。 各 个 样品 HET. RAEN) 要 称 量 ， 样 品 间 的 误差 要 低 于 0.05g。 然 后 将 样品 放 人 转 头 。 在 放 和 人 入 转 头 之 前 再 花 点 时 间 再 次 称 量 一 次 离心 管 是 值 得 的 。 没 有 精确 平衡 就 离心 将 造成 灾难 性 的 后 果 。

@ 在 水 平 离心 转 头 上 15C 以 125000Xg 离心 16 一 20h。 此 时 ，RNA 将 沉淀 到 离心 管 底 部 ，DNA 则 在 离心 管 2/3 处 形成 条 带 。

田 离心 之 后 ， 仔 细 吸 去 管子 中 的 大 多 数 溶 液 直至 DNA 条 带 刚 被 除去 。 如 果 DNA 条 带 不 可 见 ， 则 在 离 管 子 底部 lom 处 不 连续 吸 去 溶液 。 倾 倒 出 管 中 剩 余 的 溶液 ， 最 后 将 离心 管 倒置 于 3 一 4 张 Kimwipes 滤纸 上 5min 吸 干 残余 的 溶液 。

@ 用 无 菌 的 刀片 将 离心 管 底部 切 下 〈 见 图 5.6)， 每 边 留 下 足够 的 边 壁 使 管 底 成 为 一 个 小 杯 。

四 用 两 份 适当 体积 的 缓冲 液 LDEPC 处 理 的 水 或 pH 7.4 的 TE (10mmol/L Tris-Cl, pH 7.4; Immol/L EDTA)] 直接 在 管 底 溶解 RNA Ue.

注意 ”建议 至 少 用 两 份 小 体积 〈100 一 200rl) 的 缓冲 液 来 回收 管 底 的 RNA 沉淀 。 来 回 吸 取 / 排 出 可 能 有 利于 RNA 的 彻底 溶解 。 记 住 ， 将 RNA 尽 可 能 保持 在 高 浓度 ， 使 所 有 操作 ， 包 括 重复 沉淀 都 能 够 在 微 量 离心 管 中 完 成 。

Rit} RNA 溶液 混合 ， 涡 旋 。 在 65C 加 热 10min 后 再 次 涡 旋 。

@ 简单 离心 或 者 低速 离心 除去 不 溶性 物质 。

。 52 。

1000 19.0 18.0

第 5 章 RNA 分 离 策略

四 测定 RNA 浓度 〈 第 8 章 )。 如 果 需 要 ， 用 沉淀 RNA 的 方法 浓缩 RNA 或 更 换 绥 冲 液 。 四 分 装 后 ， 保 存 于 一 80C 备 用 。

5.7 固 时 分 高 RNA 和 DNA

还 有 一 些 值 得 注意 的 方案 用 来 从 细胞 或 组 织 中 分 离 RNA。 这 些 方案 的 操作 复杂 度 有 所 不 同 。 很 多 公司 现在 提供 能 够 从 各 种 生物 样品 分 离 RNA 的 装置 、 试 剂 、 溶 液 或 树脂 。 使 用 这 些 产 品 分 离 RNA 的 操作 简便 性 、 速 度 、 费 用 和 有 效 性 方面 是 有 差别 的 。 还 介绍 了 几 个 方 案 ， 能够 从 同一 生物 样品 中 同时 回收 RNA, DNA 和 蛋白质 (4 Majumdar 等 ，1991; Chomczynski，1993) ， 其 中 有 些 方法 能 够 从 厂家 购买 相应 的 产品 。

这 里 所 介绍 的 方法 不 需要 特殊 的 设备 ， 都 是 分 子 生 物 学 实验 室 使 用 的 设备 。 本 技术 的 核 心 是 已 介绍 过 的 酚 相 裂解 液 中 DNA Fl RNA WH fi HS pH 调节 (Chomcznski 和 Sacchi, 1987) 。 在 酸性 酚 中 抽 提 时 ， 水 相 回 收 RNA, DNA 处 于 酚 相 和 水 相 的 界面 。 当 含有 RNA 的 相 转 移 到 一 个 新 离心 管 后 ， 将 剩余 溶液 pH 调 至 碱 性 ，DNA 就 从 酚 相 和 有 机 相 - 水 相 界 面 抽 提 出 来 ， 进 入 水 相 ， 这 就 是 所 谓 的 反 相 抽 提 。 在 这 个 方案 中 ， 研 究 人 员 先 用 乙酸 钠 (pH4.9) 将 抽 提 混合 物 变 成 酸性 ， 或 者 等 体积 的 酚 : 和 氯仿 : RR (25 : 24 : 1) 抽 提 SDS/EDTA 裂解 液 (pH8.7)， 抽 提 液 的 总 pH 接近 7.6.

可 以 直接 裂解 组 织 培 养 瓶 中 的 细胞 ， 或 者 首先 离心 收集 细胞 后 再 进行 裂解 。 在 加 入 裂解 缓冲 液 之 前 ， 必 须 温 和 地 分 散 沉 淀 细胞 ， 因 为 操作 剧烈 将 剪 切 基因 组 DNA。 因 此 如 果 要 纯化 基因 组 DNA， 研 究 人 员 不 可 以 涡 旋 这 种 悬浮 液 或 裂解 液 ，DNA 断裂 片段 是 不 可 接受 的 。

5.7.1 实验 方案 : 同时 分 离 RNA DNA

OQ 戴 手 套 !

@ 预先 要 按照 图 5.2 制备 酚 : 氯仿 : 异 戊 醇 抽 提 绥 冲 液 ， 但 是 在 加 入 其 他 试剂 前 酚 必 须 用 水 饱和 2 一 3 次 。

Ga 组织 培养 物 : 用 吸取 的 方法 去 除 生 长 的 培养 基 。 用 冰冷 的 PBS (1L 溶液 中 含有 8. 0g NaCl, 0.2g KC1，1.44g NazHPO，0. 24g KH2POQ.) 洗涤 单 层 细胞 2 次 ， 每 次 5ml。 将 细胞 培养 物 在 冰 上 冷冻 15min 后 再 进行 裂解 可 能 会 有 所 帮助 。 用 吸取 的 方法 尽 可 能 去 除 PBS。 每 100mm 组 织 培养 下 (BP 4X 106~5 X 108 个 细胞 ) 加 入 2ml 冰冷 的 裂解 缓冲 液 (10mmol/L EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS)。 将 培养 焉 倾斜， 保障 所 有 细胞 都 能 接触 到 裂解 缓冲 液 。 在 冰 上 保温 3min。 温 和 而 又 彻底 地 振荡 可 能 有 利 。 从 培养 液 中 收集 的 细胞 ， 每 10° 个 细胞 使 用 200pl 裂解 缓冲 液 。

注意 ”在 冰 上 冷却 试剂 和 细胞 是 控制 RNase 活性 的 好 方法 。 但 是 研究 人 员 要 根据 经 验 确 定 裂解 前 在 冰 上 放置 15min 是 否 影响 细胞 生化 从 而 影响 实验 的 结果 。

Gb 组 织 : 分 离 的 新 鲜 组 织 (100mg) 在 冰 上 切 碎 。 每 毫克 组 织 用 250ml 裂解 缓冲 液 (10mmol/L EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS)。 在 室温 下 用 Dounce 匀 浆 器 温和 勾 浆 。 不 要 使 用 Polytron Jat 3K, AMI ZEA DNA 将 发 生前 切 。 第 6 章 讨 论 了 从 组 织 中 抽 提 的 一 些 细 节 问 题 。

e 53 e

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

© 将 裂解 液 转移 到 冰 上 已 经 预 冷却 的 15ml 的 锥 形 离心 管 中 。 若 缩小 规模 ， 锥 形 微量 离 心 管 也 适合 。 由 于 染色 质 的 释放 使 溶液 黏度 增加 。 使 用 无 菌 刮刀 有 助 于 裂解 液 定量 回收 。 此 Ab, tH AT A 1~2ml WH C1Ommol/L EDTA; 100mmol/L 乙酸 钠 ，pH 4.9) 冲 淋 平板 来 定量 回收 裂解 液 。

@ 加 入 等 体积 冰冷 的 有 机 抽 提 缓冲 液 〈 制 备 方法 见 @)。 要 保证 离心 管 和 酚 、 和 氯仿 兼容 。 © 温和 倒置 几 次 ， 将 管 中 的 溶液 混合 。 不 要 涡 旋 。 在 没有 混合 时 ， 在 冰 上 放置 能 够 显 著 提高 产量 。

© 在 适当 的 转 头 中 离心 将 水 相 和 有 机 相 分 开 。

当心 ”离心 速度 不 得 超出 转 头 所 规定 的 速度 限制 ， 或 离心 管 所 能 耐 受 的 最 大 离心 力 (g).

(1) RNA 的 回收

@ 收集 水 相 ， 并 转移 到 一 个 新 的 预 冷 后 在 冰 上 放置 的 离心 管 中 。 转 移 时 不 要 于 扰 了 和 蛋 白质 界面 层 。 从 界面 和 有 机 相 中 回收 DNA 要 等 到 RNA KAR. KR BI. BR 液 放 置 在 冰 上 ， 直 到 进行 DNA 抽 提 操作 。

@) 水 相 用 等 体积 的 、 新 鲜 的 、 冷 却 的 有 机 抽 提 缓冲 液 抽 提 “制备 见 @)。

O 同 以 前 的 方法 一 样 离心 。 仔 细 地 将 水 相 转 移 到 一 个 新 的 离心 管 中 〈 注 意 ， 不 可 扰动 水 相 和 有 机 相 之 间 的 界面 层 ) 。

@ # 4ml RNA WR. MA 500pl 冰冷 的 1ImolVL Tris-Cl (pH8.0) 和 200pl 5mol/L NaCl。 仔 细 彻 底 地 混合 。 加 入 12ml (2.5 倍 体积 ) 冰冷 的 95%% 乙 醇 ， 彻 底 混合 。 在 一 207C 放置 1h 以 上 。

四 在 适当 的 离心 管 中 ，9000Xg 离心 10min 收集 RNA 沉淀 。 最 好 在 4C 离心 。 小 心地 倒 去 上 清 液 。

® A 70%H CBRNE 2 一 3 次 。 离 心 回收 沉淀 。 仔 细 地 倒 出 上 清 液 。

@ 样品 在 空气 中 干燥 。 最 后 用 95% 乙 醇 洗 涤 沉 淀 可 能 加 速 空 气 干 燥 。

@® & RNA Wye F 200] KAA TE 缓冲 液 (10mmol/L Tris-Cl, pH 8.0; lmmol/L EDTA) 中 。 将 溶液 在 冰 上 放置 lh. REA—-T+HHROSS. TUBM—HKeAW TE - 缓冲 液 冲 淋 原 来 的 离心 管 。 冲 淋 液 与 第 一 份 溶液 合并 。

@® 4% 300p1 RNA WR, MMA 6yl 5mol/L NaCl 和 0. 8ml KANAB. WAR EM EK 置 5 一 10min。 随 后 溶液 变 成 乳白 色 ， 即 RNA 沉淀 。 这 种 沉淀 可 以 直接 进行 下 一 步 操 作 ， 也 可 以 在 三 80 人 放置 。

四 在 微量 离心 机 中 离心 10min， 最 好 在 4 离心。 仔细 地 除去 上 清 液 ， 像 第 四 步 和 第 罗 步 那 样 ， 仔 细 地 除去 多 余 的 乙醇 并 干燥 RNA。

田 将 RNA 溶 液 悬浮 在 最 小 体积 的 缓冲 液 〈 例 如 DEPC 处 理 的 水 ) 中 ,在 冰 上 放置 15min 使 样品 溶解 。 样 品 溶解 所 需要 的 时 间 取 决 于 样品 干燥 的 程度 ， 越 干燥 ，RNA 样品 溶 解 所 需要 的 时 间 越 长 ， 就 要 在 冰 上 放置 更 长 的 时 间 。

四 测定 RNA 的 浓度 。 将 水 溶液 分 装 后 置 于 一 80 保 存 。

(2) DNA 的 回收

QO 回 到 第 @ 步 保存 的 有 机 相 。 尽 量 除 去 水 相 。 如 果 需 要 ， 还 要 除去 少量 的 界面 物质 ， 从 而 消除 RNA 的 污染 。 但 是 这 种 操作 通常 并 不 是 必需 的 ， 因 为 后 续 的 操作 能 水 解 残余 的

s 54 °

第 5 章 ， RNA 分 离 策略

RNA。 另 外 ， 纯 化 的 DNA 也 可 以 在 最 后 一 步 与 RNase 保温 ， 消 除 所 有 污染 的 RNA。

@ 加 入 等 体积 1mol/L Tris 碱 深 液 到 剩余 的 有 机 相 / 界 面 中 。1lmol/L Tris ARAN pH %& 有 调 ， 大 约 10.5。 温 和 振荡 ， 彻 底 混 合 。 不 要 涡 旋 。

注意 ”该 部 分 操作 叫 反 相 抽 提 ;， 制造 强 的 碱 性 环境 有 助 于 DNA 反 抽 提 到 水 相 中 。

四 在 2000xXg 离 心 15min， 如 果 可 能 在 4C 离 心 。 水 相 与 有 机 相 分 离 。 将 上 层 的 水 相 转 移 到 一 个 新 的 离心 管 中 。

四 重复 @ 和 @ 步 的 操作 ， 但 不 要 将 水 相 混合 ， 让 它们 分 别 置 于 不 同 的 离心 管 中 。

@ 在 每 份 Tris: DNA 水 相 溶液 中 加 入 等 体积 的 氯仿 : HORE 24 : 1) ， 仔 细 而 又 彻底 地 混合 。 短 暂 离心 ， 分 相 。 记 住 没 有 葵 酚 时 ， 和 氧 仿 与 水 能 够 很 快 分 离 。 仔 细 地 将 上 层 水 相 转 移 到 一 个 新 的 离心 管 中 。

@® 加 入 0. 1 倍 体积 的 3mol/L NaAc(pH 7.0) 和 2.5 倍 体积 的 95% 乙 醇 ， 沉 淀 DNA。 先 温 和 旋转 ， 然 后 倒置 将 溶液 混合 彻底 。 不 要 涡 旋 。

注意 ”乙醇 的 加 入 能 够 引起 遗传 材料 的 快速 沉淀 ， 这 些 遗 传 材 料 呈 纤维 状 。 低 速 (500Xg) 离 ty 2 一 3min 能 够 回收 DNA。 另 外 可 以 用 硅烷 化 的 Pasteur 移 液 管 从 乙醇 溶液 中 取出 基因 组 DNA。 硅 烷 化 的 管子 能 够 最 大 限度 减少 DNA 对 玻璃 的 黏附 。

@ FA 70% CBRE DNA 3 次 ， 每 次 500xl。 将 沉淀 的 DNA 转移 到 一 个 新 的 离 心 管 中 。 在 适当 体积 的 TE 缓冲 液 (pH 8.0) 中 溶解 ， 确 定 DNA RE.

5.8 aA # €

现在 有 很 多 厂商 提供 试剂 合用 于 核酸 分 离 ， 很 少 有 研究 人 员 自 制 试 剂 分 离 核 酸 了 。 用 试 剂 盒 能 够 节约 时 间 ， 从 长 远 看 能 够 节约 成 本 。 当 然 试剂 盒 能 够 增加 产量 ， 但 是 要 肯定 这 个 试 剂 盒 不 仅 能 够 增加 所 需要 的 RNA 产量 [例如 细胞 总 RNA、poly(A) RNA]j， 同 时 要 保障 所 获得 的 RNA 能 够 用 于 后 续 的 应 用 。 更 重要 的 是 ， 要 拿 起 电话 询问 厂家 的 地 区 代表 ， 甚 至 向 国际 销售 部 索取 试用 试剂 盒 〈 即 免费 使 用 的 试剂 盒 ) 。 若 对 于 某 个 特定 的 产品 感 兴趣 ， 多 数 厂 家 将 乐于 提供 一 次 免费 使 用 品 ， 或 者 至 少 提 供 一 次 打折 产品 使 用 。

更 合乎 要 求 的 试剂 盒 是 最 小 甚至 不 使 用 有 机 溶剂 苯酚 和 和 氯仿 的 传统 使 用 剂量 。 如 果 试 剂 盒 还 要 使 用 其 他 有 毒 的 有 机 溶剂 或 者 两 种 有 毒 的 有 机 试剂 ， 试 剂 盒 已 经 将 实验 方案 进行 了 优化 使 有 机 溶剂 的 使 用 剂量 最 小 化 。 但 是 使 用 过 的 有 机 溶剂 必须 照 实验 室 有 关 规 定 处 理 。

图 5.8 核酸 分 离 的 硅胶 滤器 。 离 液 、 高 5.8.1 硅胶 技术 盐 条 件 下 ， 核 酸 与 管内 的 硅胶 结合 ， 裂 解

缓冲 液 组 分 和 其 他 细胞 大 分 子 被 洗涤 除 在 核酸 分 离 领域 的 重要 创新 之 一 是 硅胶 滤器 的 建 去 .最 后 用 低 盐 条 件 将 纯化 的 核酸 样品 洗

立 。 硅 胶 滤 器 足够 小 ， 适 宜 于 标准 的 微量 离心 机 。 这 脱出 来 。 实 验 室内 最 常用 的 滤器 类 型 是 足 些 滤器 是 玻璃 纤维 构成 的 ， 位 于 塑料 管 底部 。 能 够 将 够 小 的 、 适 宜 于 标准 的 1. 7ml 微量 离心 管 滤器 插入 标准 的 1.5ml 离心 管 中 (图 5.8)。 这 些 产 ”的 〈 图 中 显示 的 是 2. 2ml 微量 离心 管 ) 。 物 不 仅 能 够 用 来 从 生物 样品 中 纯化 RNA， 而 且 也 能 ”GenElute 系 统 : Sigma-Aldrich 惠 赠 NE

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

够 用 来 精制 不 同 操作 所 获得 的 RNA 或 DNA， 例 如 限制 性 酶 切 、 连 接 、cDNA 合成 和 PCR 扩 增 的 核酸 产物 。 有 很 多 厂家 能 够 提供 这 些 基于 硅胶 滤器 的 产品 。 硫 氰 酸 股 盐 溶液 提供 了 一 种 高 盐 浓 度 、 高 离 液 的 环境 。 此 时 ，RNA 或 DNA 与 硅胶 结合 。 经 过 一 系列 的 清洗 ， 在 非 常 低 的 盐 浓度 下 ， 纯 化 的 核酸 从 柱子 中 洗 出 。 除 了 微量 离心 机 和 微量 移 液 器 外 ， 这 些 操作 不 需要 特别 的 设备 。 核 酸 的 纯化 和 精制 最 好 能 够 在 很 短 的 时 间 内 完成 。

5.9 蔓 他 万 法

该 法 (Peppel 和 Baglioni, 1990; Salvatori 等 ，1992; Zolfaghari 等 ，1993) 用 离子 型 去 污 剂 SDS 抑制 核糖 核酸 酶 活性 。 不 用 股 盐 缓冲 液 、 葵 酚 或 等 密度 梯度 离心 ， 就 能 够 快速 地 分 离 出 细胞 总 RNA。 该 法 适宜 于 原核 细胞 和 真 核 细 胞 。 如 果 从 组 织 中 分 离 RNA， 最 好 与 某 种 形式 的 机 械 破 碎 联 合 使 用 。 所 用 的 试剂 多 数 是 分 子 生 物 学 方法 所 使 用 的 试剂 。 抽 提 量 大 时 ， 直 接 将 使 用 体积 放大 就 可 以 了 。 从 10° 个 细胞 中 能 够 分 离 出 100ng RNA。 原 始 的 方法 (Peppel 和 Baglioni，1990)， 以 及 此 处 介绍 的 修改 方法 ， 成 为 进一步 发 展 一 些 普遍 使 用 的 非 AS AY FH HEP BS RNA 的 试剂 盒 的 基础 。

5.9.1 实验 方案 : 用 十 二 烷 基 硫酸 钠 和 乙酸 钾 试 剂 快速 分 离 RNA

© RFE!

Qa 组 织 培养 物 : 从 含有 所 需 细 胞 的 组 织 培养 下 中 除去 生长 介质 ,用 PBS IL HRA 有 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g¢ Naz HPO ，0. 24g KH2PO.) 冲 淋 细 胞 ， 吸 出 PBS 并 除 去 。 用 裂解 缓冲 液 (2% SDS; 200mmol/L Tris-Cl, pH 7.5; 0.5mmol/L EDTA) 直接 裂 解 细胞 ， 每 平方 厘米 用 50pl 裂解 缓冲 液 。 温 和 振 功 培养 下 直到 细胞 彻底 裂解 。 在 使 用 前 制 备 裂 解 缓 冲 液 ， 在 室温 下 储存 。

Ob 组 织 : 快速 收集 组 织 ， 并 在 冰冷 的 盐 溶液 中 迅速 切 碎 。 快 速 转移 到 含有 有 裂解 缓冲 液 (Qa 的 匀 浆 器 中 。 如 果 组 织 在 液 氮 中 快速 冷冻 ， 用 铝 膜 包 庄 在 实验 室 台 面 敲 打击 碎 则 更 好 。 然 后 迅速 转移 到 裂解 缓冲 液 中 融化 。 每 毫克 样品 用 lml 的 裂解 缓冲 液 。 用 手工 匀 浆 (经 过 19 号 针头 反复 剪 切 ， 或 用 Dounce 匀 浆 器 ) MAP RMAR CM Polytron 匀 浆 器 )。 在 这 步 操 作 时 要 避免 溶液 过 热 或 起 泡 。

@ 将 裂解 液 转移 到 一 个 无 菌 的 微量 离心 管 〈1. 7ml 或 2. 2ml) +. HHT aA 15 一 20 次 。

® 在 步骤 @ 中 使 用 的 每 500pl 裂解 缓冲 液 中 ， 加 入 150nl 乙酸 钾 溶 液 〈50g 乙酸 钾 ， llml 乙酸 ， 加 水 至 100ml) 。 在 使 用 前 制备 该 溶液 ， 并 储存 于 一 20"C 。

© 小心 垂 直 倒 置 离心 管 15 一 20 次 保证 溶液 彻底 混合 。

© 在 冰 上 放置 至 少 3min 以 上 ， 但 是 不 要 超过 5min 。

@ 在 微量 离心 机 上 以 最 大 速度 在 室温 下 离心 5min。

小 心地 回收 上 清 液 并 将 上 清 液 转 移 到 一 个 新 的 离心 管 中 。

@ 上 清 液 用 300nl 氯仿 : HME (24 : 1， 体 积 比 ) 混合 物 抽 提 。 离 心 30s 分 相 。 在 不 于 扰 蛋 白质 界 面 的 情况 下 将 上 层 水 相 转 移 到 新 离心 管 中 ， 重 复 抽 提 。

O 将 上 层 水 相 转 移 到 已 经 在 冰 上 冷却 的 新 离心 管 中 。

@ 加 入 等 体积 〈 约 650pl) 冰冷 的 异 丙 醇 沉淀 RNA。 洲 液 在 一 20C 保 温 30min,

。 56 。

第 5 章 RNA 分 离 策略

© 室温 离心 Smin 收集 RNA 沉淀 。

®B 小 心地 除去 上 清 液 。 用 70%% 乙 醇 洗 沉淀 2 一 3 次 。 如 果 沉 淀 浮 出 ， 则 要 离心 让 RNA 沉淀 后 倒 去 乙醇 。RNA 沉淀 在 空气 中 干燥 。 最 后 一 步 用 95% 乙 醇 洗 淋 有 利于 RNA 样品 干燥 。

@ 将 RNA 尽量 溶 于 最 小 体积 TE 缓冲 液 或 DEPC 处 理 的 水 中 。 测 定 RNA 浓度 ， 然 后 分 装 并 储存 于 一 80C 备 用。

5.9.2 实验 方案 : 原核 RNA 的 分 离

这 种 快速 有 效 分 离 细 菌 RNA 的 方法 是 Peppel 和 Baglioni (1990)、Salvvatori 等 (1992) 、Zolfaghari (1993) 方法 的 修改 版 。 必 须 使 用 后 面 介 绍 的 裂解 缓冲 液 ， 不 要 使 用 标准 的 NaOH/SDS 裂解 缓冲 液 。 标 准 的 NaOH/SDS 裂解 缓冲 液 是 用 来 破碎 细菌 细胞 并 从 中 抽 提 质粒 的 ， 能 够 使 RNA 发 生 快 速 而 又 严重 的 水 解 。

© RFE!

@ 预先 : 制备 NP-40 裂解 缓冲 液 和 乙酸 钾 缓 冲 液 ， 储 存 于 4C 备 用 。 尽 管 这 些 溶液 在 架子 上 能 够 放置 几 个 月 ， 但 是 要 在 使 用 前 检查 溶液 是 否 已 经 有 微生物 污染 。

NP-40 裂解 缓冲 液 : 250mmol/L fe HF; 2Ommol/L EDTA, pH 8.0; 0.75% NP-40 (注意 : 在 其 他 两 个 组 分 混合 并 消毒 后 ， 才 能 加 入 NP-40 去 污 剂 )

乙酸 钾 缓 冲 液 〈 照 下 列 顺序 制备 ) :

在 80%% 的 终 体积 中 制备 3mol/L CARH

FA OK BS PR aly pH 至 5.5

加 水 至 终 体 积

每 100ml 溶液 中 加 100g HAMA 〈GTC) 。 仔 细 而 又 彻底 地 混合 。

@ 离心 收集 100ml 培养 液 的 细菌 细胞 。 彻 底 除 去 上 清 液 。

由 1.5ml 订 冷 的 裂解 缓冲 液 和 2ml 冰冷 的 乙酸 钾 缓 冲 液 混合 ， 在 这 种 混合 缓冲 液 中 温 和 地 悬浮 细菌 细胞 。 在 冰 上 保温 裂解 液 10min。

© 如 果 可 以 ,在 4C 离 心 (10000Xg) 10min。 要 保证 离心 管 能 够 耐 受 这 样 的 离心 力 。 将 裂解 液 分 装 到 几 个 微量 离心 管 中 离心 ， 这 样 就 可 以 在 同一 天 从 一 个 培养 物 中 获得 几 份 RNA。 这 样 操作 可 能 是 有 益 的 。

@) 将 上 清 液 转移 到 新 离心 管 中 。 注 意 不 要 将 沉淀 的 固体 转移 到 新 离心 管 中 。 为 了 避 免 带 和 固体， 将 少量 的 上 清 液 留 在 原来 管子 中 是 有 益 的 。 然 后 将 上 清 液 在 冰 上 又 放置 15min,

@ ¥F 10000 g 离心 10min。 如 果 可 能 ,在 4C 离 心 。

将 上 清 液 转 移 到 新 的 聚 丙 烯 离心 管 中 。 用 等 体积 的 氯仿 : 异 友 醇 (24 : 1) 抽 提 。 仔 细 而 又 彻底 混合 。 离 心 3min 分 相 。 如 果 水 相 和 有 机 相 界 面 的 带宽 ， 重 新 用 新 鲜 的 氯仿 : 异 SORE (24: 1) 抽 提 水 相 。

© 将 上 层 水 相 转 移 到 新 的 离心 管 中 ， 加 入 0.6 倍 体 积 冰 冷 的 异 两 醇 。 在 一 20"C 放置 20min 沉淀 RNA。

@ 于 10000Xg 离心 10min 收集 RNA。 如 果 可 能 ， 在 4 离心 。

@ 仔细 倒 出 上 清 液 。 沉 淀 用 70%% 乙 醇 〈 用 消毒 稀释 乙醇 获得 ) 洗涤 几 次 。 最 后 用 95% 或 100% 乙 醇 洗 涤 有 利于 样品 干燥 。

« 57 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

@ 样品 在 空气 中 干燥 ， 再 悬浮 于 TE 缓冲 液 或 无 菌 水 中 。 确 定 RNA 的 浓度 和 纯度 后 ， 分 装 保存 于 一 80C 。 如 果 不 立 即使 用 ， 以 乙醇 沉 演 的 形式 储存 于 一 80'YC 。

5.9.3 实验 方案 : 酵母 RNA 的 分 离

酵母 有 细胞 壁 ， 阻 止 了 从 这 些 真 核 细 胞 中 快速 回收 RNA。 有 很 多 经 典 方法 从 酵母 中 分 离 RNA。 这 些 方法 要 用 玻璃 珠 与 酵母 培养 液 涡 旋 ， 用 非 酶 学 的 方式 破坏 细胞 的 超级 结构 。 操作 繁琐 ， 在 缩小 规模 时 所 获得 的 RNA 很 少 。

此 处 介绍 的 分 离 RNA 的 方法 是 利用 苯酚 和 SDS 的 离 液 性 质 ， 将 样品 加 热 、 冷 凝 和 融化 促进 RNA 的 分 离 。 当 样品 冷凝 时 ， 茶 酚 晶 体 将 插 和 人 酵母 细胞 ， 使 细胞 释放 其 内 容 物 。 在 酸 性 条 件 下 ， 葵 酚 抽 提 使 RNA 与 DNA 分 离 。 这 是 离 液 条 件 下 进行 RNA 纯化 常用 的 技巧 。 此 处 所 介绍 的 方法 对 Schmitt (1990) 方法 进行 了 改进 ， 能 够 快速 分 离 RNA， 所 需要 的 细胞 培养 物 少 。

@O 预先 : 0. 5ml 酵母 培养 物 CE YPD 培养 基 中 培养 )@ 接种 到 15ml 管子 中 。 于 30 温和 振荡 培养 过 夜 。

注意 ”必须 用 盖子 盖 住 管子 。 盖 住 管子 能 够 阻止 溶液 的 挥发 ， 也 能 避免 微生物 的 污染 。

@Q@ 第 二 天 早晨 ， 将 培养 物 按 1 : 40 稀释 于 新 鲜 的 YPD 培养 基 中 。 继 续 培养 4h 或 者 培 养 至 对 数 生 长 期 。

@ 4 5ml 1%, Bt (500Xg) 5min 收集 酵母 细胞 。 除 去 上 清 液 。

© 将 细胞 沉淀 悬浮 于 400ml AE 缓冲 液 (50mmol/L ZRH, 10mmol/L EDTA, pH 5.2) 中 。 如 果 细 胞 不 能 迅速 彻底 悬浮 ， 加 入 更 多 的 AE 缓冲 液 。

注意 ”如 果 需 要 ， 在 使 用 AE 缓冲 液 前 将 RNase 抑制 剂 加 入 。 但 是 通常 不 需要 将 RNase 抑制 剂 加 入 AE 缓冲 液 中 。

© 将 细胞 悬浮 液 转移 到 一 个 离心 管 中 ， 加 入 40p1 10% SDS。 来 回 倒置 几 次 将 内 容 物 混 合 。 如 果 第 4 步 所 加 的 AE 缓冲 液体 积 增 大 ， 相 应 地 也 要 增加 10%SDS 的 体积 。

© 加 入 等 体积 (Alm) 已 经 用 AE 缓冲 液 饱和 的 分 子 生物 学 级 苯酚 。

重要 提示 ”不 要 调 饱 和 苯酚 的 pH。 参阅 附 录 3 的 苯酚 制备 。

© 将 样品 仔细 而 又 彻底 地 混合 后 ， 在 65°C Rid 4min。

用 乙醇 -干冰 浴 或 在 干冰 中 快速 冷却 ， 直 到 苯酚 晶体 出 现 。 如 果 没 有 乙醇 -干冰 浴 可 供 使 用 ， 在 一 20C 放 置 样品 30min 也 可 以 。

© 在 微量 离心 机 中 离心 〈12000Xg， 即 最 大 速度 ) 2min， 分 相 。

注意 ”一 般 会 出 现 大 量 的 沉淀 ， 这 些 沉 淀 含有 细胞 残 洁 ， 处 于 离心 管 底部 。

@ 仔细 地 取出 水 相 ， 不 要 干扰 蛋白 质 界面 层 或 有 机 相 。 水 相 转 移 到 一 个 新 的 离心 管 中 ， 加 入 等 体积 的 处 于 室温 的 苯酚 : 氯仿 : SE (25 : 24 : 1) 〈 如 图 5.2)。 来 回 倒 置 2 一 3 次 ， 将 洲 液 仔细 而 又 彻底 地 混合 。

QD 以 最 大 速度 离心 2min， 分 相 。

@ 酵母 基因 组 DNA 的 纯化 常常 将 酵母 细胞 与 zymolyase 一 起 保温 ， 有 裂解 细胞 壁 并 产生 原生 质 体 。 这 种 处 理会 导致 酵 母 细 胞 温和 地 裂解 ， 有 助 于 高 分 子 量 的 DNA 回收 ， 但 是 分 离 RNA 时 不 必用 zymolyase 处 理 酵 母 细胞 。 @ YPD 培养 基 FH) 含有 10g 酵母 抽 提 物 、20g BAKA 20g 葡萄 糖 ， 高 温 消 毒 。 消 毒 后 ，YPD 培养 基 呈 深 棕 色 ， 这 是 由 于 葡萄 糖 在 高 温 时 发 生 “ 焦 糖化 ”的 结果 。 。58 。

第 5 章 RNA 分 离 策略

© 仔细 回收 上 层 水 相 并 转移 到 一 个 新 的 离心 管 中 。 不 要 干扰 和 蛋白质 界面 (如果 有 ) 和 下 层 有 机 相 。

(B 水 相 溶液 用 等 体积 的 氯仿 或 氯仿 : 异 戊 醇 (24 : 1) 抽 提 一 次 。 简 单 离心 分 相 。 将 水 相 转 移 到 一 个 新 的 离心 管 中 。

@ tn A 0.1 54K FL 3mol/L NaAc (pH 5.2) 和 2.5 倍 体积 的 95% 乙醇 。 将 样品 在 一 20C 放 置 过 夜 ， 沉 淀 RNA.

© 离心 收集 沉淀 。 如 果 可 能 ， 在 4 离心 更 好 。

@ 去 除 乙 醇 溶液 。 沉 淀 用 70% 乙 醇 /30%DEPC 处 理 的 水 洗涤 3 次 ， 每 次 500x1。 沉 演 在 空气 中 干燥 ， 不 要 让 沉淀 彻底 干燥 。 最 后 用 95%% 的 乙醇 洗涤 有 助 于 样品 和 干燥。 长 期 保存 的 话 ， 将 样品 储存 于 一 80' 。

四 Kit te BY FF 25 ~ 50pl 无 菌 〈 无 RNase) 水 或 TE 缓冲 液 (10mmol/L Tris, lmmol/L EDTA, pH 7.5) #.

@® 测定 RNA 的 浓度 和 纯度 。 分 装 后 保存 于 一 80C 。 从 10ml 对 数 生 长 期 的 酵母 菌 液 中 可 获得 150ng 左右 的 总 RNA。

© 每 次 分 离 的 RNA， 都 要 用 雍 胶 电泳 检测 一 下 ， 保 证 所 分 离 的 RNA 样品 结构 完整 。

5.10 纯化 RNA 的 短期 保存 和 长 期 保存

RNA 样品 正确 的 储存 条 件 常 常 是 实验 室 里 热烈 讨论 的 课题 。 储 存 条 件 不 当 ， 仅 仅 几 个 小 时 或 几 个 月 ， 就 会 给 纯化 的 RNA 样品 带 来 深刻 的 负面 影响 。 关 键 问题 如 下 。

@ RNA 是 否 已 经 从 细胞 或 组 织 中 纯化 出 来 ?

Q 实验 室 有 没有 一 80'C 的 储存 条 件 ?

@ RNA 是 否 在 后 续 的 7~10 天 内 使 用 ?

® RNA 是 否 已 经 在 含水 的 缓冲 液 〈 无 菌 水 或 TE 缓冲 液 ) 中 重新 溶解 ?

组 织 和 细胞 收集 之 后 ， 可 以 快速 冷冻 储存 于 一 80C 或 液 氮 中 。 以 这 种 方式 储存 ， 可 以 在 1 年 后 纯化 RNA。 通 常 ， 冷 冻 材 料 在 裂解 缓冲 液 中 融化 ， 并 迅速 机 械 破 碎 。 有 些 研 究 人 员 在 肌 盐 缓冲 液 中 将 新 鲜 组 织 匀 浆 化 ， 然 后 在 一 80 冷 冻 匀 浆液 ， 以 后 进行 RNA 分 离 。 纯 化 的 RNA 以 乙醇 沉淀 的 方式 储存 于 一 80C 非 常 稳定 。 在 这 样 的 条 件 下 将 RNA 储存 几 个 月 甚 至 更 长 的 时 间 也 没有 问题 ， 因 为 RNA 的 半衰期 受 生 物 样品 来 源 @ 的 影响 。 如 果 样 品 在 下 周 内 就 要 使 用 ， 也 可 以 将 RNA 以 乙醇 沉 演 的 方式 储存 于 一 20C 。 纯 化 的 RNA 溶 于 水 相 溶液 时 〈 不 管 是 无 菌 水 还 是 TE 缓冲 液 ) 就 开始 计算 RNA 所 能 够 储存 的 时 间 。TE 缓冲 液 的 优 点 是 能 够 整合 很 多 分 离 方法 都 带 有 的 Mg:+ ， 而 较 低 的 EDTA 浓度 并 不 影响 后 续 的 PCR 操 作 。 镁 离子 和 其 他 重金 属 离子 是 非特 异性 水 解 RNA 所 必需 的 ， 因 此 歼 合 这 些 离子 是 有 益 的 。

除了 实验 方案 特别 标明 不 在 冰 上 操作 之 外 ， 必 须 在 冰 上 进行 操作 溶 于 水 或 TE 缓冲 液 的 RNA。 最 常用 的 操作 是 确定 RNA 浓度 后 ， 将 RNA 溶液 分 装 并 保存 于 一 80C。 这 样 能 够 避 免 RNA 溶液 的 反复 冻 融 。 有 些 研 究 人 员 将 RNA 酶 抑制 剂 加 入 RNA 样品 中 进行 长 期 保存 。

@@ 从 一 定 来 源 〈 例 如 植物 ) 获得 的 纯化 RNA 以 乙醇 沉淀 形式 在 一 80C 能 稳定 保存 几 年 ， 其 RNA 水 溶液 在 一 207C 也 能 保存 几 个 月 。

。 59 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

但 是 加 入 RNA 酶 抑制 剂 通常 是 不 必需 的 ， 而 且 可 能 有 副作用 。 研 究 人 员 必 须 保 证 所 加 入 的 核酸 酶 抑制 剂 不 会 干扰 后 续 的 操作 或 与 RNA 有 关 的 反应 @。

一 个 长 期 储存 RNA 的 方法 是 采用 高 度 纯 化 的 100%% 甲 酰胺 CChomcezynski, 1992) 或 厂 家 提供 的 甲 酰胺 稳定 形式 FORMAzol (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), 4 FORMAzol 中 ，RNA 能 够 稳定 2 年 ， 这 种 试剂 在 实验 室 的 使 用 非常 成 功 。RNA 洲 液 能 够 直接 用 于 变性 凝 胶 电泳 〈 第 10 章 )。 如 果 需 要 进行 CDNA 合成 或 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 CRT- PCR)， 用 4 倍 体积 的 95 加 乙醇 沉淀 能 除去 甲 酰胺 。 如 果 RNA 浓度 稀 ， 进 行 乙 醇 沉 淀 时 要 加 入 0. 2mol/L NaCl 才能 有 效 地 回收 RNA.

在 RNA 储存 方面 有 很 多 要 考虑 的 事情 。 但 是 ， 不 管 采 用 什么 形式 ， 将 纯化 RNA 储存 手 二 0 局 是 安全 的 。

oi), 2 Ae oe

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@ ARLE, RNA 曾经 保存 于 不 同 浓 度 的 SDS、VDR 和 超 纯 甲 酰胺 中 。 。 60 -

第 5 章 RNA 分离 策略

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(刘建华 译 ; SHR)

*。 61 和

6S 从 组 织 由 得 取 RNA

0.1 FARE

用 体外 模型 进行 基础 研究 和 应 用 研究 的 优点 数不胜数 。 但 是 ， 仅 仅 用 体外 实验 得 到 的 结 果 ， 几 乎 是 不 可 能 完全 而 又 准确 地 解释 体内 的 生理 现象 。 训 无 疑问 ， 用 培养 细胞 进行 研究 ， 难以 检测 那些 伴随 着 自然 现象 或 实验 操作 所 产生 的 许多 微小 和 非 微小 的 生化 变化 。 然 而 ， 与 采用 组 织 样品 甚至 整个 模式 动物 进行 的 研究 相 比 ， 用 培养 细胞 进行 的 研究 就 容易 多 了 。 与 植 物 样 品 相 反 ， 用 人 类 或 其 他 模式 兰 椎 动物 的 组 织 进行 研究 的 难度 就 更 大 。 简 单 地 说 ， 用 培养 细胞 进行 研究 有 很 多 优点 ， 也 有 很 多 不 足 。

6.2 @wMBeeka dome

从 培养 细胞 分 离 高 质量 的 RNA,， 通 常 比 从 组 织 分 离 RNA 容易 得 多 。 主 要 原因 是 从 组 cel RNA 必须 破坏 并 除去 组 织 的 三 维 结构 ， 而 从 培养 细胞 分 离 RNA 只 需 破 坏 细胞 单

。 有 裂解 缓冲 液 通常 含有 相当 苛刻 的 组 分 ， 这 些 组 分 是 组 织 裂 解 到 满意 水 平 所 必需 的 。 先 Eap 使 组 织 破碎 到 满意 的 水 平 ， 才 能 获得 足 量 的 RNA。 更 有 甚 者 ， 有 一 些 组 织 富 含 RNase， 很 难 分 离 RNA。 为 了 消除 这 个 障碍 ， 通 常 采用 剧烈 的 方

法 分 离 细 胞 总 RNA， 而 不 是 RNA WEE 〈 如 细胞 质 RNA、 细 胞 核 RNA， 无 论 是 否 打算 获得

这 些 RNA 亚 群 )。 可 喜 的 是 ， 立 刻 快 速 将 收集 的 组 织 冷冻 并 保存 于 一 80C ， 可 以 在 更 方便 的 时 间 分 离 RNA。

i piel ese 或 者 要 鉴定 实验 操作 或 其 他 行为 产生 的 组 织 特异 性 应 答 ， 或 者 要 确定 正常 组 织 的 分 子 生 理学 ， 就 必须 从 组 织 分 离 RNA。 此 外 ， eT sa RNA 的 困难 外 ， ie “病理 现象 ”稀少 ， 或 者 要 征 得 病人 同意 才能 采集 样本 ， 那 就 更 难 获得 组 织 样 品 。 从 事 人 类 样品 研究 的 工作 者 也 知道 ， 收 集 、 处 理 带 有 HIV 或 肝炎 病毒 样品 是 很 危险 的 。 这 两 类 病毒 流行 面 广 、 感 染 性 强 。 与 从 培养 细胞 分 离 RNA 相 比 ， 从 组 织 样 品 分 离 RNA, 不 仅 要 修改 RNA 的 分 离 策略 ， 而 且 样 品 的 储存 和 处 理 的 难度 大 ， 因 此 要 保证 所 有 参与 实验 人 员 的 安全 。

尽管 很 多 转化 细胞 株 已 经 失去 接触 抑制 能 力 ， 并 且 在 体外 可 以 形成 可 见 的 斑点 。 研 究 人 员 通 常 仅 用 各 个 斑点 顶部 相对 少量 的 细胞 分 离 RNA， 而 不 用 那些 堆积 在 一 起 的 大 量 细胞 。 这 样 能 够 避免 内 部 细胞 间 的 连接 和 胞 外 的 支撑 物 Cma-

trix),

e 62 .

EE

第 6 章 ， 从 组 织 中 提取 RNA

6.2.1 细胞 培养 的 优点

@ 在 细胞 总 数 相 同 的 情况 下 ， 培 养 细 胞 暴露 的 总 面积 比 组 织 样品 暴露 的 总 面积 大 得 多 。 结果 ， 培 养 细 胞 很 容易 完全 有 裂解。 相反 ， 一 些 组 织 特别 难以 破碎 ， 而 另外 一 些 组 织 又 很 难 释 WH RNA,

@ 很 多 原 代 细 胞 和 永久 细胞 系 容 易 培 养 ， 因 此 培养 这 些 细胞 所 需 费 用 低廉 。

@ 可 以 根据 需要 在 培养 物 中 繁殖 细胞 ， 但 很 难 从 动物 尤其 是 人 体 定 期 采集 组 织 样品 或 进行 活体 检测 ， 也 几乎 不 可 能 从 同一 个 器 官 中 得 到 多 种 组 织 标本 。

® 一 般 来 说 ， 从 培养 细胞 分 离 RNA 比 从 组 织 分 离 RNA 容易 得 多 。

© 通常 破碎 组 织 样品 的 方法 都 相当 激烈 ， 包 括 Polytron 破碎 和 杜 恩 斯 匀 浆 。 如 果 产 生 过 量 的 热 ， 还 会 影响 到 RNA 的 稳定 性 。

© 破碎 组 织 样品 的 机 械 剪 切 力 通常 会 破坏 与 膜 有 关 的 细胞 器 ， 包 括 细胞 核 。 因 此 ， 组 织 匀 浆 通 常会 产生 大 量 的 核 RNA、 基 因 组 DNA、 线 粒 体 和 /或 叶绿体 DNA。 在 RNA 使 用 前 ， 要 除去 这 些 成 分 。

© 一 且 从 培养 下 中 取出 ， 体 外 培养 的 细胞 很 容易 彼此 分 离 。 但 是 组 织 中 的 细胞 ， 通 过 不 同类 型 的 细胞 间 连 接 ， 与 细胞 外 基质 紧密 地 联系 在 一 起 ， 在 组 织 破碎 过 程 中 ， 细 胞 外 基质 形成 了 坚硬 的 小 碎片 ， 需 要 一 步 或 几 步 操作 来 清除 这 些 碎片 ， 使 RNA 达到 使 用 所 需 的 纯 度 。 尽 管 这些 额 外 的 步骤 没有 技术 性 的 难度 ， 但 这 些 额 外 操作 增加 了 样品 受 损 的 可 能 性 。

@ 培养 的 细胞 属于 同一 种 细胞 群 。 与 此 相反 ， 即 使 极 小 一 块 组 织 也 可 能 包含 很 多 类 型 的 细胞 ， 使 之 很 难 确定 所 观测 到 的 基因 表达 调节 来 自 哪 一 种 细胞 。

6.2.2 组 织 样品 的 优点

@ 组 织 维持 了 其 三 维 结构 。 因 此 可 以 用 制冷 器 切片 机 将 福 尔 马 林 固 定 的 组 织 切 成 薄片 ， 原 位 杂交 检测 基因 表达 。 另 一 种 更 新 的 方法 是 用 激光 捕获 技术 〈Eend , 1999; Kuecker %, 1999; Suarez-Quian 等 ，1999) 从 组 织 中 取出 非常 少量 的 特异 性 细胞 ， 并 从 中 分 B RNA,

四 :无论 是 正常 的 组 织 、 野 生 型 组 织 还 是 突变 型 组 织 ， 未 处 理 的 组 织 还 是 处 理 的 组 织 ， 组 织 的 天 然 分 子 生 理学 没有 发 生 改 变 。

@ 从 相对 少 的 组 织 样 品 (100mg AA) AW ABH eA RNA, WES.

由 从 重量 很 大 的 组 织 样品 〈 含 有 大 量 细胞 ) BORK RNA.

© 在 液 所 中 速冻 并 于 一 80C 保 存 ， 及 时 延长 保存 时 间 ， 组 织 样品 的 RNA 很 稳定 。 超 冷 冻 的 组 织 样 品 ， 可 以 分 成 更 小 的 小 块 或 者 研 成 粉末 备用 。 当 要 从 组 织 分 离 RNA 时 ， 直 接 将 这 些 组织 置 于 裂解 液 融化 ， 并 分 离 RNA， 结 果 会 很 好 。

区 研究 人 员 初 次 从 组 织 样品 中 分 离 RNA 时 ， 最 常 犯 的 一 个 错误 是 使 用 过 量 的 组 织 。 特 别 是 那些 有 从 培养 细胞 分 离 RNA 经 验 的 人 而 言 ， 更 容易 犯 这 样 的 错误 。 如 果 组 织 样品 量 超过 了 有 裂解 液 的 容量 ， 所 获得 的 RNA 纯度 和 产量 都 会 降低 。 如 果 增 加 裂解 液 的 体积 ， 可 能 要 将 匀 浆 液 分 装 数 管 ， 增 加 了 操作 难度 ， 减 少 了 同时 处 理 不 同样 品 的 数量 。 。63 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

此 处 介绍 了 色 浆 的 两 种 基本 方法 ， 哪 种 方法 合适 取决 于 组 织 破坏 的 难度 。 记 住 ， 因 为 动 物 细 胞 缺乏 细胞 壁 ， 所 以 动物 细胞 一 般 比 植物 、 细 菌 、 酵 母 细 胞 更 容易 裂解 。 要 遵循 的 一 个 规则 就 是 : 使 用 最 温和 且 最 有 效 的 方法 将 组 织 匀 浆 。 简 而 言 之 ， 匀 浆 的 原则 就 是 增加 细胞 与 裂解 液 接触 的 表面 积 ， 使 裂解 液 更 充分 裂解 细胞 。 有 些 过 度 热 情 的 研究 者 ， 采 取 机 械 力 破碎 每 一 个 单个 的 小 细胞 器 ， 这 样 会 增加 损伤 RNA 的 危险 性 ， 不 利于 RNA 下 游 分 析 。

6.3.1 Polytron 破碎

在 大 多 数 实 验 室 都 能 够 见 到 Polytron 设备 。Polytron 是 一 种 驱动 设备 的 注册 商标 名 称 (Kinematica; 经 Brinkmann 公司 销售 ) ， 这 种 设备 用 来 快速 匀 浆 各 种 大 小 体积 的 所 有 类 型 的 植物 组 织 、 动 物 组 织 或 细菌 培养 液 。 附 在 发 动 装置 上 的 是 不 锈 钢 探 头 ， 即 “ 匀 浆 器 ”。 匀 浆 器 的 一 端 是 刀 一 样 尖 锐 的 不 锈 钢 刀 矿 ， 能 有 效 地 切 碎 组 织 。 采 用 不 同 的 转速 控制 组 织 破 坏 的 程度 ， 最 大 限度 减少 泡 泊 产 生 量 和 热量 。 特 别 重要 的 是 ， 操 作 人 员 必 须 遵照 厂家 推荐 的 所 有 安全 方案 进行 操作 。 任何 错误 操作 或 意外 ， 都 可 能 导致 严重 的 和 永久 的 人 身 伤 害 。 有 其 他 的 公司 如 Omni 国际 公司 (Warrenton, VA) th

人 提供 驱动 型 匀 浆 装置 。 现 在 韦 林 搅 切 器 大 多 已 经 被 手 担 式 或 图 6.1 手 握 式 驱动 匀 浆 器 的 一 次 静 置 式 匀 浆 器 取代 。 EDK AM. ERA 尽管 这 种 不 锈 钢 匀 浆 器 经 久 耐用 ， 而 且 可 以 处 理 很 难 匀

器 末端 ， 它 可 最 低 限 度 地 减少 “” 浆 的 组 织 ， 但 是 20 世纪 90 年 代 未 Omni 国际 公司 〈 图 6.1)

处 理 不 同样 品 时 清洗 勾 浆 器 所 ”推出 了 新 一 代 一 次 性 匀 浆 器 。 当 处 理 多 种 组 织 样品 时 ， 这 种

Teens TE ee 一 次 性 匀 浆 器 只 需要 清洁 单 根 不 锈 钢 探头 ， 消 除了 样品 交叉

ra Cantina 污染 的 可 能 性 ， 有 助 于 控制 RNase 活 性 ， 从 而 有 利于 RNA

x: ak ae 的 稳定 性 。 这 类 一 次 性 匀 浆 器 已 被 广泛 使 用 ， 并 且 对 于 多 浆 软 组 织 很 成 功 。 针 对 人 体 组 织 ， 使 用 这 种 一 次 性 匀 浆 器 能 降低 传染 媒介 扩散 的 潜在 危险 。

6.3.2 杜 恩 斯 匀 奖

杜 恩 斯 义 浆 器 是 一 种 手 握 的 玻璃 器 具 ， 该 似 于 试管 〈 图 6.2)。 通 常 器 具 开 口 端 要 宽 一 些 ， 这 样 才能 使 生物 材料 进入 。 伸 进 玻璃 管 的 是 一 根 特征 性 加 柱 形 玻 璃 研 棒 。 这 种 设计 使 操作 者 能 上 下 来 回 的 腾 并 旋转 研 棒 ， 这 种 操作 使 剪 切 力 最 大 化 。 杜 恩 斯 匀 浆 实 际 上 是 一 种 液体 匀 浆 ， 因 为 当 样 品 被 挤 压 在 一 个 狭小 的 空间 里 ， 尤 其 是 匀 浆 器 管内 壁 和 人 研 棒 之 间 时 ， 才 发 生 组 织 破碎 。 一 些 物 理 〈 机 械 ) 类 型 破碎 细胞 和 /或 国 呈 守 组 织 常 需要 昂贵 的 设备 ， 杜 恩 斯 匀 浆 破碎 组 织 温 和 、 i eee 设备 便宜 。 所 以 ， 杜 恩 斯 匀 浆 器 是 一 种 分 离 完 整 细胞 图 6.? 杜 恩 斯 匀 浆 器 .这 种 手 担 式 工 核 和 其 他 细胞 器 的 理想 工具 ， 这 是 那些 剧烈 的 机 械 破 ”有 具 适用 于 多 种 类 型 组 织 的 匀 浆 。 详 细 碎 装 置 无 法 达到 的 。 资料 见 正文 。Bellco Glass 公司 提供

。 64 。

第 6 章 ， 从 组 织 中 提取 RNA

6.4 从 不 同 器 官 和 组 织 分 离 RNA 的 方法

没有 一 种 傻瓜 式 的 方法 ， 能 够 有 效 地 从 组 织 样品 分 离 RNA。 每 种 类 型 的 组 织 都 有 其 独 特 的 性 质 ， 从 一 种 组 织 分 离 RNA 的 方法 ， 只 适宜 于 这 种 组 织 。 组 织 的 重量 、 所 含 细 胞 的 类 型 、 组 织 的 年 龄 以 及 组 织 的 状态 〈 新 鲜 、 快 速 冷 冻 、 福 尔 马 林 固 定 、 动 物 或 者 植物 ) 都 是 要 考虑 的 重要 因素 。 不 管 组 织 样品 从 何 而 来 ， 在 RNA 分 离 之 前 ， 组 织 所 含 RNA 的 稳定 性 是 必须 考虑 的 关键 因素 。

从 组 织 样 品 分 离 RNA 要 遵循 的 一 个 指导 原则 是 ， 获 得 足 量 有 用 的 RNA， 不 必 将 组 织 彻底 破碎 。 有 些 过 度 热情 的 实验 人 员 〈 例 如 ， 试 图 破碎 每 一 小 团 组 织 ) 可 能 会 损伤 所 分 离 的 RNA 品质 和 产量 。 如 果 能 将 组 织 在 短期 内 有 效 地 破碎 ， 那 当然 好 。 如 果 不 能 在 短期 内 将 组 织 有 效 地 破碎 ， 温 和 地 破碎 也 能 增加 组 织 接触 裂解 液 的 表面 积 ， 从 而 分 离 到 足 量 的 RNA 用 于 印迹 分 析 、RT-PCR 或 其 他 相关 应 用 。 而 且 ， 悬 浮 于 裂解 液 的 匀 浆 液 在 室温 下 放置 时 间 过 长 也 会 损伤 竺 分离 RNA 的 品质 和 产量 9。 换 言 之 ， 时 间 就 是 一 切 。

首次 进行 从 组 织 分 离 RNA 的 人 ， 篆 犯 的 一 个 错误 是 与 组 织 样 品 的 重量 有 关 。 一 般 来 说 ， 文 献 报道 或 提供 商业 试剂 的 公司 所 介绍 的 方法 ， 适 于 从 100 一 1000mg 组 织 分 离 RNA。 如 果 没 有 将 相应 试剂 用 量 进 行 适当 的 放大 就 处 理 过 量 的 组 织 ， 所 获得 的 RNA 产量 会 下 降 。 如 果 研 究 人 员 增 加 裂解 液体 积 ， 溶 液体 积 可 能 大 到 不 能 在 一 个 管子 里 操作 ， 就 要 增加 离心 步 又 使 实验 变 得 极其 不 便 。 同 时 ， 要 将 组 织 块 切 得 很 小 ， 以 利于 组 织 块 与 裂解 缓冲 液 和 匀 浆 器 作用 。 组 织 块 过 大 ， 即 使 是 软组织 ， 也 很 难 匀 浆 。 并 且 组 织 块 常常 会 堵 塞 匀 浆 器 ， 尤 其 是 使 用 广泛 的 动力 驱动 手 握 式 义 浆 器 CAN Omni) 时 。

通常 从 组 织 分 离 RNA 的 特有 性 质 之 一 ， 是 获得 了 大 量 的 RNACRNA 产量 取决 于 组 织 重量 和 组 织 的 类 型 )。 此 时 可 能 需要 500 一 1000pl 无 菌 水 溶解 RNA。 有 些 研究 人 员 有 从 培养 细胞 分 离 RNA 的 经 验 ， 用 这 么 大 体积 的 无 菌 水 浴 解 RNA 倒 让 他 们 不 安 。 请 记 住 的 是 ， 即 使 一 小 块 组 织 都 含有 蜡 乎 寻常 多 的 细胞 ,产生 相 应 量 的 RNA。 如 果 了 RNA 溶解 不 充分 ， 电 泳 图 谱 会 出 现 拖 尾 〈 见 图 6. 3)， 表 明 RNA 需要 更 多 的 缓冲 液 浴 解 。 在 这 种 情况 下 进行 下 列 操作 是 值得 的 。 从 原 管 中 取 少量 溶液 进行 适量 稀 酸 ， 直 到 28S 和 18S 核糖 体 RNA (rRNA) 在 变性 凝 胶 电泳 时 清晰 可 见 〈 见 第 10 章 )。 用 分 光 光 度 法 确定 这 种 稀释 浴 液 的 浓度 ， 然 后 将 RNA 母液 进行 适当 稀释 获得 所 需要 的 RNA 浓度 。 分 装 后 用 乙醇 沉淀 的 形式 储存 于 一 80YC 。 由 于 从 组 织 分 离 RNA 比 从 培养 细胞 分 离 RNA 复杂 ， 在 进行 这 些 操作 过 程 中 要 采用 第 8 章 介绍 的 质量 控制 方法 。

6.4.1 新 鲜 组 织

必须 认识 到 ， 从 供 体 生 物 取出 组 织 样品 后 ，RNase 仍 会 保持 降解 RNA 的 活性 。 并 且 只 要 条 件 适合 ， 这 些 顽 固 的 RNA 酶 活性 就 会 保持 。 即 使 供 体 生 物 死亡 ， 只 要 环境 有 利于 RNase 的 复活 ，RNase 就 会 恢复 活性 状态 。 因 此 ， 必 须 迅速 破碎 组 织 样 品 和 失 活 RNase, 获得 组 织 样品 后 ， 要 马上 用 冰冷 的 磷酸 盐 缓冲 生理 盐水 (PBS) 漂洗 ， 称 重 ， 然 后 用 无

© 有 些 实验 室 收 到 组 织 样品 后 ， 马 上 将 其 悬浮 于 肌 盐 缓冲 液 中 匀 浆 ， 并 将 匀 浆 液 储存 于 一 80C 。 尽 管 有 些 实验 室 曾 经 在 后 续 匀 浆液 融化 后 不 能 有 效 地 分 离 高 质量 的 RNA。 但 是 用 这 种 方法 处 理 的 多 数组 织 ， 能 够 获得 高 质量 的 RNA。 由 于 该 方法 受到 组 织 类 型 和 操作 人 员 个 人 等 因素 的 影响 ， 用 这 种 方法 是 否 成 功 没有 统一 的 规则 。 e 65 二

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

图 6.3 未 充分 溶解 的 RNA 图 谱 。 泳 道 1 一 8: 从 人 类 不 同 组 织 分 离 的 RNA 沉淀 。 凝 胶 状 沉淀 溶 于 5000p] AR, Ze 60 温浴 10min， 冰 上 放置 2h。 用 第 10 章 介绍 的 方法 将 RNA 溶 液 上 样 甲 醛 变 PE DR AS PRE Be Hak. 。 由 于 从 组 织 中 提取 的 RNA 产量 过 大 ，500J 溶液 不 足以 完全 溶解 分 离 的 RNA， 无 法 用 分 光 光 度 计 准确 测定 RNA WE. MRNA 母液 中 取出 数 份 少量 溶液 进行 适当 稀释 直至 28S 和 18S 核糖 体 RNACrRNA) 变性 凝 胶 条 带 清晰 可 见 。 泳 道 .9~10: 适当 溶解 的 前 述 从 人 类 组 织 分 离 的 RNA 样品 。 电 泳 道 11: RNA 标准 分 子 量 标准 (Promega)

RNase 污染 的 解剖 刀片 迅速 将 组 织 切 成 小 片 。 不 重复 使 用 解剖 刀片 是 明智 的 。 虽 然 妃 片 可 以 重复 使 用 ， 但 是 采用 那些 使 用 历史 不 清楚 的 解剖 刀片 有 引入 RNase 的 危险 。 将 切 碎 的 组 织 薄 片 转移 到 裂解 缓冲 液 时 ， 要 尽量 避免 PBS 溶液 的 引入 。 如 果 有 裂解 缓冲 液 被 稀释 太 多 ， 其 破碎 组 织 结构 的 能 力 就 会 丧失 。 更 为 精 糕 的 是 裂解 缓冲 液 抑制 RNase AY HE I WSR

6.4.2 冷冻 组 织

如 果 不 能 马上 从 组 织 样品 分 离 RNA， 可 以 将 组 织 样品 冷冻 备用 。 如 果 组 织 样品 处 理 得 当 ， 即 可 马上 将 所 获 组织 在 液 所 中 快速 冷冻 898， 然后 于 一 80 上 C 或 干冰 中 保存 备用 。 从 这 些 冷 冻 组 织 分 离 足 量 高 品质 RNA 用 于 RNA 分 析 不 存在 困难 。 将 新 鲜 组 织 粉碎 后 溶 于 高 离 液 列 解 缓冲 液 中 。 如 果 组 织 块 体积 足够 小 ， 就 可 以 在 适量 的 裂解 缓冲 液 中 融化 ， 然 后 机 械 破碎 。 然而 ， 如 果 组 织 要 切片 用 于 组 织 检测 或 原 位 杂交 ， 先 用 0.T. C。 介 质 @ 包 埋 ， 然 后 在 低温 恒 温 器 中 冷冻 ， 最 后 进行 组 织 切片 。 这 样 操 作 的 效果 比 将 组 织 快速 冷冻 进行 切片 的 效果 好 。 由 于 RNA 空间 分 布 的 维持 是 开展 原 位 杂交 所 必需 的 ， 而 快速 冷冻 常常 会 破坏 一 些 组 织 的 RNA 空间 分 布 ， 因 此 用 快速 冷冻 组 织 的 切片 进行 原 位 杂交 结果 ， 其 RNA 空间 分 布 数据 不 : 可 靠 。

一 旦 组 织 冰 冻 了 ， 最 好 不 要 反复 冻 融 。 在 不 损伤 RNA 稳定 性 的 情况 下 ， 冷 冻 也 使 组 织 切割 变 得 非常 困难 。 在 作者 的 实验 室 ， 小 体积 至 中 体积 快速 冷冻 的 组 织 (0.5~2g), 两 层 厚 铝 销 ， 然 后 放 在 封口 袋 里 于 一 80C 保存 。 当 要 提取 RNA 时 ， 就 把 样品 从 超低温 冰箱 取出 ， 迅 速 置 于 实验 室 台 面 上 猛 击 8。 通 常 这 样 的 操作 能 够 很 好 地 粉碎 组 织 。 除 去 铝 销 后 ， 迅速 地 将 冷冻 组 织 碎片 转移 到 已 经 用 干冰 预 冷 过 的 称 量 盘 。 这 样 就 能 在 样品 融化 前 称 量 生物 材料 的 重量 。 在 此 ， 有 些 人 经 常 犯 的 严重 错误 ， 是 让 冰冻 组 织 融 化 后 才 加 入 裂解 组

@ 快速 冷冻 法 也 称 为 “突然 冷冻 ”(snap-freezing) 。

@ 0.T.C. 包 埋 介 质 也 称 为 Tissue-Tek O. TI. C. 组 织 包 埋 介 质 。 这 是 在 低温 恒温 器 中 制备 超 薄 切片 用 组 织 样品 的 标 准 材 料 。0O. T. C. 也 可 用 来 将 冷冻 组 织 黏 附 于 卡 盘 上 ， 卡 盘 在 适当 位 置 抓 住 冷冻 组 织 ， 把 它 推 向 保持 低温 的 刀片 。 在 冷 冻 腔 里 《一 22C)， 新 鲜 组 织 样品 在 O. T.C. 介质 中 逐步 冷却 。

@ 根据 有 关 规 定 ， 进 行 这 样 的 操作 要 戴 安 全 眼镜 、 手 套 ， 穿 长 工作 服 ， 并 且 首 先 要 保证 该 实验 室 容 许 这 样 的 操作 。 还 有 ， 人 类 样本 可 能 有 病原 体感 当 ， 必 须 在 适当 的 隔离 区 域 进行 该 操作 。 此 警告 也 适宜 于 其 他 组 织 样品 。

。66 。

第 6 章 从 组 织 中 提取 RNA

冲 液 。 由 于 裂解 缓冲 液 不 是 冰冻 的 ， 组 织 块 在 强 变 性 的 裂解 缓冲 液 中 将 迅速 融化 ， 机 械 破坏 迅速 。

6.4.3 固定 组 织

用 10%% 福 尔 马 林 缓 冲 液 或 者 4% 多 聚 甲 醛 溶液 固定 组 织 ， 是 保存 组 织 样品 的 一 种 成 熟 方 法 。 尽 管 福 尔 马 林 固 定 很 常见 ， 但 是 它 会 使 RNA 回收 和 分 析 非 常 困难 。 原 因 之 一 是 福 尔 马 林 固 定 的 组 织 在 股 盐 试剂 中 浴 解 度 很 低 。 然 而 ， 有 人 证 实用 蛋白酶 民 温 浴 的 方法 ， 是 溶解 福 尔 马 林 固 定 组 织 的 有 效 方法 〈Stanta 和 Schneider, 1991; Masuda 等 ，1991)。 它 有 助 于 RNA Al DNA 的 回收 〈Coombs 等 ，1999) 。 在 福 尔 马 林 固定 的 过 程 中 ， 单 甲醇 基 团 (—CH2OH) 加 合 到 四 种 碱 基 上 。 除 去 单 甲 醇 基 团 (—CH2OH) 后 ，RNA 分 子 能 够 用 于 PCR 扩 增 。 在 TE 缓冲 液 中 70C 温 浴 1h， 能 够 除去 RNA 的 福 尔 马 林 修 饰 基 团 〈Masuda 等 ，1999)， 从 而 改进 RNA 反 转 录 效 率 。 尽 管 近期 有 人 证 实 ， 新 的 cDNA 合成 方法 和 PCR 引物 设计 策略 ， 能 够 改进 用 福 尔 马 林 固定 RNA 作为 模板 的 RT-PCR 的 灵敏 性 (Mikhitarian 等 ，2004) 。 但 是 与 用 新 鲜 组 织 分 离 的 RNA 作为 模板 相 比 ， 用 这 些 固定 组 织 所 获 RNA 作为 模板 合成 的 cDNA 比较 小 。 一 般 来 说 ， 从 新 鲜 组 织 或 冷冻 组 织 分 离 RNA 比 从 固定 组 织 分 离 RNA 要 容 易 很 多 。

6.5 GRAS: 用 氢化 锂 -尿素 法 从 组 织 分 高 RNA

下 面 介 绍 的 方法 ， 对 Auffray 和 Rougeon (1980), Kato 等 (1987) 的 方法 进行 了 修 改 。 用 本 方法 已 经 成 功 地 从 各 种 组 织 〈 包 括 乳 房 、 胰 |

AE. APA. Bg 97) A. SEE ADA 2) 中 分 离 得 到 RNA, XPATH MD MW KE EAA RY la] A. BE 够 在 60s 内 完成 匀 浆 。 这 期 间 将 装 有 组 织 样品 和 裂解 缓冲 液 的 试管 浸没 在 冰 水 浴 〈 图 6.4)。 本 法 的 早期 版 本 包括 样品 与 蛋白 酶 K 温浴 的 步 又， 现在 已 经 删 除了 。 实 验 室 用 氧化 锂 -尿素 法 分 离 的 RNA， 与 用 县

ene RN AE tk ee 图 6.4 采用 氧化 锂 -尿素 法 匀 浆 组 织 。 在 CD) 预先 : 实验 前 ， 所 有 缓冲 液 和 试管 必须 预 冷 匀 浆 过 程 中 ， 装 有 组 织 样品 和 氧化 锂 -尿素 至 4C ， 保 证 核酸 酶 的 活性 降 至 最 低 。 LPR AS a etic Oe J 将 称 量 盘 置 于 干冰 上 放置 数 分 钟 ， 使 组 织 避免 匀 浆 所 产生 热量 的 好 办 法 。 如 正文 品 没 有 融化 就 可 以 精确 称 重 。 所 述 ， 每 次 匀 浆 时 间 很 短 ， 匀 浆 总 时 Q 将 适当 重量 的 组 织 迅 速 转移 到 预 冷 的 50ml HE 间 不 超过 60s。 在 匀 浆 间隙 锥 形 管 形 管 中 ， 加 入 10 倍 体积 的 氧化 锂 缓 冲 液 (3mol/L A 也 一 直 置 于 冰 上

化 锂 ; 6mol/L 尿素 ; 50mmol/L Tris, pH 7.4; lmmol/L EDTA; 100mmol/L Bit FE Z BE; 0.05% N-+ — be SE WLR) 注意 ”8 和 琉 基 乙 醇 在 使 用 前 加 入 。 @ 把 锥 形 管 置 于 冰 水 浴 中 ,用 Polytron 匀 浆 器 或 其 他 匀 浆 器 匀 浆 组 织 。 使 用 几 个 脉冲 匀 浆 ， 总 时 间 不 超过 60s。 注意 1 匀 浆 过 程 中 尽量 避免 起 泡 、 产 热 。 </ 65 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

注意 2 ”使 用 电动 机 驱动 的 匀 浆 器 ， 所 有 操作 必须 遵照 安全 事项 。

® 把 匀 浆 液 转移 到 预 冷 的 15ml 聚 丙 烯 锥 形 管 中 〈 每 管 溶液 体积 不 超过 12ml) 。 将 装 有 匀 浆 液 的 试管 一 20C 放 置 过 夜 。

@) 第 二 天 早晨 ， 将 装 有 勺 浆液 的 管子 置 于 预 冷 的 离心 机 转子 内 ， 以 5000Xg 于 45C 离 A» 75min,

注意 ”确认 离心 机 的 最 大 转速 和 离心 管 的 化 学 兼容 性 。

© 离心 后 ， 小 心 倒 出 上 清 液 ， 用 Kimwipe 无 侍 纸 吸 干 离心 管 的 溶液 。 检 查 是 否 有 固化 的 液体 贴 在 离心 管内 壁 。 如 果 有 ， 用 无 菌 棉签 清除 。 不 要 用 Kimwipe 无 侍 纸 把 试管 内 壁 全 清理 和 干净。 进行 这 步 操作 时 ， 离 心 管 要 一 直 放 在 冰 上 。

@ 每 管 加 入 8 一 10ml 4 AY 3mol/L AEE. ARE 30s。

注意 涡 旋 程度 要 足以 打 散 沉淀 物质 。

样品 以 5000Xg 于 4C 离 心 45min。

注意 确认 离心 机 的 最 大 转速 和 离心 管 的 化 学 兼容 性 。

@ BRERO~®.

O Bitte RMR F 2.5ml TE 缓冲 液 或 SDS 缓冲 液 [10mmol/L Tris(pH 7.5), 0.lmmol/L EDTA, 0.5% SDS] 中 。 可 用 涡 旋 悬浮 沉淀 。 如 有 必要 ， 可 用 无 菌 的 枪 头 吹 打 ， 分 散 沉 省 。

@ 加 入 150p1 5mol/L NaCl, Wa ALARA.

QO 如 果 第 @@ 步 的 材料 是 装 在 15ml RAMBRE , MASAI: 氯仿 : 异 戊 醇 混 合 液 抽 提 〈 见 后 面 的 说 明 )。 如 果 第 @@ 步 的 材料 不 是 装 在 15ml, 聚 丙烯 塑料 管 中 ， 必 须 将 其 转 到 能 与 这 些 有 机 溶剂 相 容 的 离心 管 中 。 盖 紧 塑 料 管 盖 ， 然 后 小 心 讽 旋 将 样品 混 匀 。

注意 ”修改 后 的 酚 : Ati: 异 戊 醇 混合 液 是 用 等 体积 的 Tris-SDS 缓冲 液 (100mmol/L NaCl; Immol/L EDTA; 10mmol/L Tris, pH 8.5; 0.5%SDS) 饱和 分 子 生 物 学 级 苯酚 ， 然 后 将 氯仿 : 异 两 醇 (24:1) 与 等 体积 的 Tris 饱和 的 酚 混 合 。 最 后 ， 加 入 SHEER EARKEH 0.1% 。 酚 饱和 的 操作 步骤 见 5. 2 和 附录 3。

® ¥F 4°CW 1000X g BL Feta 10min, |

@ BR KEKABARHN RABAT. DORBSARARAHHAR.

GD) 水 相 中 加 入 等 体积 酚 : 氯仿 : SOE, Zo Te RE i 。

d® 于 4C 以 1000Xg 离心 样品 10min,

@ 将 上 层 水 相 转移 到 新 的 聚 两 虹 塑 料 管 中 ， 如 果 有 蛋白 质 界面 层 存 在 ， 切 幻 转移 界 面 层 。

注意 如果 在 水 相 和 有 机 相 之 间 有 蛋白质 条 带 ， 重 复 步 骤 因 和 国 的 操作 ， 直 到 该 界面 层 消失 。

曲 最 后 用 等 体积 氯仿 或 氯仿 : 异 两 醇 (24 : 1) 抽 提 一 次 。 于 4C 以 1000Xg BDH 品 3min 。

© 将 上 层 水 相 移 至 已 经 在 冰 上 预 冷 的 不 含 RNase 的 Corexe@ 玻璃 管 中 ， 加 入 3 倍 体积 的 100% 乙 醇 。 用 Parafilm 封 好 玻璃 管 。 如 果 水 和 乙醇 不 能 很 好 地 混合 ， 仔 细 而 又 温和 地 涡

OO 玻璃 管 必 须 是 高 强度 ， 能 够 耐 受 离心 力 。 如 果 没 有 Corex 玻璃 管 ， 可 以 从 Kimble-Kontes 公司 购买 同等 质量 的 产 品 。15ml 的 玻璃 管 货 号 是 45500-15，30ml 的 玻璃 管 货 号 是 45500-30。 如 同 Corex 玻璃 管 ， 采 用 Kimble 高 强度 管 必 须 用 适当 的 橡皮 套 包 住 才能 离心 。 . 68 e

第 6 章 ， 从 组 织 中 提取 RNA

旋 几 秘 钟 ， 不 要 倒置 玻璃 管 来 混合 溶液 。

O 将 玻璃 管 置 于 一 20C 过 夜 ， 最 大 量 地 回收 RNA,

QD 将 玻璃 管 置 于 合适 的 橡皮 套 管 中 ， 置 于 预 冷 的 离心 机 转子 中 。 于 4C 以 9000Xg 离 A» 30min,

@ 离心 结束 后 ， 小 心 倒 出 上 清 液 。 小 心 别 丢失 管内 或 管 底 的 沉淀 物 。

@ FA 75% Zi: 25%% 无 RNase 的 水 洗涤 RNA 沉淀 。 用 5ml 75% ZB: 25% FE RNase 的 水 洗涤 在 15ml Corex RH BULA) RNA; 用 10ml75% 乙 醇 : 25% FG RNAse 的 水 洗涤 在 30ml Corex 3&8 Bite Wy RNA,

@® i Aly We Corex HIE. F 4°CL 9000 X g 离心 15min,

四 BRFRO~GRK, BIEVER 3 次

@ 用 5ml 无 水 乙醇 再 洗涤 RNA 沉 诈 一 次 ， 温 和 涡 旋 ， 于 4C 以 9000xg 离心 10min。

注意 ”用 无 水 乙醇 洗涤 RNA 能 加 速 干燥 ， 回 收 的 RNA 最 大 限度 地 避免 了 乙醇 污染 。 所 获得 的 高 质 it RNA 非 常 有 利于 下 游 研究 。

@ 在 空气 中 干燥 玻璃 管内 的 RNA 沉淀 。 但 要 当心 不 要 将 RNA 沉淀 干燥 得 太 彻 底 。 用 无 水 乙醇 清洗 过 的 RNA 沉淀 ， 只 需 在 空气 中 干燥 5min。 也 可 以 将 玻璃 管 以 一 定 角 度 倒置 ， 于 37C 培 养 箱 保 温 2 一 3min， 加 速 干燥 。 注 意 : 玻璃 管 必须 敞开 ， 这 样 才能 让 残余 的 乙醇 挥 发 干净 。 在 培养 箱 中 放置 时 ， 用 3 一 4 层 Kimwipes 滤纸 置 于 玻璃 管 开 口 ， 以 免 玻璃 管 开口 与 培养 箱 金属 直接 接触 。

@ 尽 可 能 用 最 少 体积 的 无 菌 水 或 TE 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH 7.5; 0. 1mmol/L EDTA) 悬浮 RNA。 根 据 组 织 样品 初始 重量 ， 和 卉 底 溶 解 RNA 可 能 需要 500~ 1000p] 或 更 大 体积 的 溶液 。

四 取 1lulRNA 溶 液 ， 用 分 光 光 度 计 测定 RNA 溶液 浓度 〈 见 第 8 章 )。 然 后 用 适量 的 RNA 溶液 上 变性 琼脂 凝 胶 ， 根 据 电 泳 结 果 判 断 分 离 RNA oe (第 10 章 )。

注意 AMER PHAM. HW RNA 没有 完全 溶解 (A 6.3).

巴 RNA 浴 液 分 装 ， 置 于 一 80C。RNA 样品 可 以 以 水 溶液 形式 保存 ， 也 可 以 用 乙醇 重 新 沉淀 的 形式 长 期 保存 。

6.6 实验 万 宗 : 从 富 含 脂 类 的 组 织 分 离 了 RNA

从 脂肪 组 织 分 离 RNA 不 难 。 使 用 肌 盐 缓冲 液 破坏 生物 组 织 的 结构 ， 很 容易 分 离 RNA。 用 这 种 方法 分 离 RNA 时 ， 最 麻烦 的 事情 可 能 是 除去 脂肪 组 织 和 其 他 组 织 〈 如 脑 组 织 ) WAKA. wa. FORA WM ERS mR 〈 或 者 氯 化 锂 -尿素 匀 浆 缓冲 液 ) 将 组 织 或 细胞 匀 浆 ， 经 过 简单 低速 离心 使 脂肪 漂浮 在 离心 管 液 面 上 层 ， 把 上 层 脂肪 吸 去 。 如 果 需 要 ， 重复 低速 离心 除去 脂肪 的 操作 。 另 一 种 方法 是 直接 将 氯仿 加 入 肛 盐 裂解 液 中 ,， 由 于 脂肪 溶 于 有 机 相 ， 除 去 有 机 相 就 可 以 除去 脂肪 。 后 面 分 离 RNA 和 普通 分 离 RNA 操作 一 样 ， 用 酸性 酚 : 氯仿 抽 提 ， 然 后 纯化 RNA。 尽 管 下 面 的 方法 〈Chomczynski 和 Sacchi 改进 法 ， 1987) 宣称 能 够 用 自制 试剂 分 离 RNA， 但 是 用 厂家 提供 的 试剂 如 TRIzol 或 TRI 分 离 RNA 可 能 更 有 信心 。

OD 戴 手 套 !

@ 在 冰 上 切 碎 新 鲜 的 组 织 〈 最 多 不 超过 100 mg)。 每 100 mg 组 织 加 入 lml 溶液 D

。 69 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

[4mol/L fi URAL; 25mmol/L 柠檬 酸 钠 ，pH 7.0; 0.5% N-+ —%ESENLA BA; 100mmol/L 2-Fi Zé CR CHART FEO) |. FEU ROR. MAS ARATE. fA op Bs a A 水 相 。 去 除 氯 仿 相 〈 下 层 ) 。 再 加 入 等 体积 新 鲜 氯 仿 ， 简 单 离 心 分 离 氯仿 相 和 水 相 。 将 上 层 水 相 转 移 到 新 的 聚 两 烦 塑 料 管 中 。

@ 第 @ 步 又 的 每 毫升 溶液 D 中 ， 加 入 0. Iml 2mol/L 柠檬 酸 钠 (pH 5.2)，1.0ml 水 饱 和 酚 〈 分 子 生 物 学 级 ) ，0. 2ml A: FRB 〈49 : 1) 。 加 入 每 一 种 试剂 后 ， 盖 上 塑料 管 盖 。 然后 小 心 倒 置 ， 彻 底 混 合 溶液 。 所 有 试剂 加 入 后 ， 再 剧烈 倒置 30s。

® 冰 上 放置 15min， 让 样品 冷却 。

© 离心 分 离 有 机 相 和 水 相 。 如 果 可 能 ， 采 用 微型 离心 管 ， 于 4C 以 12000Xg 离心 。

© 含有 RNA 的 水 相 转 移 至 新 的 离心 管 中 ， 加 入 0. 75 倍 体积 冰冷 的 异 丙 醇 ， 混 合 后 于 20C 放 置 1h 以 上 ， 沉 淀 RNA。

注意 ”制备 规模 大 时 ， 采 用 Corex 玻璃 管 。 在 沉淀 和 回收 RNA 时 ， 用 正确 的 橡皮 套 管 套 住 Corex RRS. Bebe Mee RNA,

@ ¥F 4°CVA 9000 X g Baty 10min, KE RNA Pte. J OMAAE EAM.

当心 ”在 操作 过 程 中 ， 离 心力 不 得 超过 离心 管 所 能 耐 受 的 最 大 离心 力 。

用 300u] 溶液 D〈 见 步骤 思 ) 彻底 溶解 RNA ite. AH RNA 溶液 转移 到 无 RNase 污染 的 1. 7ml 微型 离心 管 中 。

@ 加 入 0. 75 倍 体积 的 异 丙 醇 重 新 沉 淀 RNA， 于 一 20C 放 置 1h 沉淀 RNA.

@ 于 4C 以 最 大 离心 速度 离心 10min， 收 集 RNA 沉淀 ， 小 心 倾斜 倒 去 上 清 液 。

@ RNA 沉淀 用 70 为 乙醇 洗 3 一 4 次， 每 次 500k1。 如 果 在 洗涤 过 程 中 RNA 沉淀 没有 移 动 就 不 必 重 新 离心 。 离 心 管 的 RNA 沉淀 在 空气 中 干燥 ， 使 乙醇 挥发 。 用 95 儿 乙醇 洗 一 次 可 加 速 沉 淀 的 干燥 。

@ FA TE 缓冲 液 或 是 经 DEPC 处 理 的 水 重新 浴 解 RNA， 体 积 要 尽量 少 。 于 65C 温 浴 10 min 可 以 加 速 RNA 溶解 ， 但 是 如 果 乙 醇 洗 涤 后 的 RNA TERA WIE TR, MED BE 65C 温 浴 。 用 乙醇 沉淀 的 形式 保存 RNA 备用 。 确 定 RNA 浓度 后 ， 将 RNA 溶液 分 装 ， 保 存 于 一 80C 。 避 免 RNA 样品 的 反复 冻 融 。

6.7 纯化 史 合 在 多 核糖 体 的 mRNA

尽管 mRNA 是 检测 基因 表达 的 一 个 优秀 指标 ， 但 是 必须 开展 多 方面 的 检测 才能 充分 评 价 细胞 内 基因 表达 的 生物 化 学 。 标 准 的 RNA 分 离 技术 ， 即 使 与 PCR 相 结合 ， 也 只 能 揭示 细胞 裂解 时 刻 一 些 RNA 的 稳 态 含量 ， 并 不 能 反映 mRNA 的 翻译 水 平 。

为 了 更 清楚 地 不 止 从 一 个 方面 来 确定 基因 表达 调控 ， 收 集 并 分 析 那 些 已 经 进入 翻译 机 制 [ 即 核糖 体 〈 多 核糖 体 部 分 )] 的 mRNA 能 相对 精确 地 反映 基因 表达 过 程 中 能 够 进行 翻译 的 et i PA ob eS KR RK AY mRNA， 可 以 在 翻译 水 平 研究 基因 表达 。 简 而 言

， 分 析 从 细胞 或 组 织 分 离 的 与 多 核糖 体 结 合 的 mRNA 能 够 确定 哪 种 mRNA 被 翻译 ， 以 及 mRNA 的 翻译 效率 。

早 在 20 世纪 70 年 代 初 期 ， 文 献 中 就 有 用 免疫 沉 演 法 特异 沉淀 核糖 体 的 报道 〈Palacios 等 ，1972; Schlechter, 1973; Palmiter，1974)。 几 年 后 ， 亲 和 柱 技术 的 应 用 改进 了 核糖 体 免疫 沉淀 法 〈Schultz 等 ，1977) 。 在 利用 这 种 方法 有 效 地 富 集 核糖 体 结合 mRNA 的 研究 实

* 了。

C—O

第 6 章 ， 从 组 织 中 提取 RNA

例 中 ， 更 为 显著 的 例子 是 利用 表 位 特异 性 的 单 克 隆 抗体 分 离 出 编码 人 类 白细胞 抗原 (HLA)-DR 相 溶性 抗原 重 链 的 mRNA (Shapiro 和 Young, 1981; Korman 等 ，1982)。 紧 接着 用 多 价 血清 成 功 地 分 离 出 鼠 肝 编码 胱 硫 醚 合成 酶 的 mRNA (Kraus 和 Rosenberg, 1982) 和 牛 肾脏 细胞 编码 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 的 mRNA (Russell 等 ，1983)。 总 的 来 说 ， 由 于 免疫 用 抗原 被 糖 基 化 或 者 被 加 工 为 成 熟 的 形式 ， 与 正在 翻译 的 新 生 蛋 白质 的 性 质 不 同 ， 所 以 用 抗体 免疫 沉淀 多 聚 核糖 体 难 度 大 ， 成 功 的 实例 不 多 。

现在 基本 上 所 有 实验 室 都 使 用 PCR 技术 ， 人 们 不 再 喜欢 用 免疫 沉淀 法 富 集 特异 的 mRNA. 利用 网 络 数据 库 协 助 引 物 设计 ， 降 低 了 PCR 扩 增 的 非特 异性 。 现 在 的 标准 方法 是 ， 将 所 有 的 多 核糖 体 沉 淀 下 来 ， 从 而 捕获 到 正在 活 牙 地 翻译 的 mRNA， 然后 除去 核糖 体 和 翻译 辅助 因子 。 纯 化 的 核糖 体 mRNA， 可 以 用 作 反 转录 合成 制备 芯片 分 析 的 探 针 CGR 23 章 )， 可 以 用 基因 特异 引物 PCR 进行 检测 ， 或 者 用 通用 引物 构建 CDNA 文库 。

6.7.1 实验 方案 : RA SABAH mRNA 的 提取

OMFS! 整个 操作 必须 遵循 无 RNase HERA.

@a 组 织 样品 : 各 个 样品 的 原始 质量 肯定 是 不 一 样 的 ， 这 取决 于 组 织 的 可 利用 性 。 每 训 克 组 织 样品 要 使 用 10pl 的 匀 浆 缓冲 液 (25mmol/L NaCl; 5mmol/L MgCl; 25mmol/L Tris, pH7.5; 2.0% Triton X; lmg/ml 肝素 ) 。 在 冰 上 ， 用 合适 大 小 的 配 有 松弛 的 研 棒 的 杜 恩 斯 匀 浆 器 匀 浆 组 织 。 然 后 进行 第 @ 步 操作 。

Qb 培养 细胞 : 常规 方法 收集 细胞 〈 见 附录 10) 。 很 重要 的 操作 是 用 冰冷 的 PBS 缓冲 液 洗涤 单 层 培养 细胞 ， 并 用 使 用 过 的 细胞 培养 液 抑制 胰 和 蛋白酶 的 活性 。 每 105 个 细胞 用 10nml AY 2 AR BE th YR (© 25mmol/L NaCl; 5mmol/L MgCl ，25mmol/L Tris, pH7.5; 2.0% Triton X; lmg/ml 肝素 )， 所 有 离心 都 在 4C 进 行 。

注意 工 如 第 4 章 所 叙 ， 终 浓度 为 200U/ml 的 RNasin 可 替代 肝素 ， 用 于 抑制 RNase 活性 。

注意 2 在 整个 分 离 过 程 中 ， 为 了 维持 核糖 体 的 整体 性 ， 在 收集 细胞 之 前 15min 内 ， 加 入 环 已 亚 胺 至 100kg/ml， 防 止 mRNA 捕获 之 前 多 聚 核糖 体 的 解体 。

@ 将 匀 浆 液 转移 到 合适 的 无 RNase 活性 的 离心 管 中 。 若 匀 浆 液体 积 大 ， 将 匀 浆 液 转移 到 Corex 玻璃 管 中 ， 别 忘 了 在 离心 时 要 将 Corex 玻璃 管 置 于 合适 的 橡皮 套 管 中 。 若 匀 浆 液体 积 小 ， 用 无 RNase 污染 的 微型 离心 管 。 无 论 大 体积 还 是 小 体积 ， 都 是 在 预 冷 的 转子 中 于 4°C 以 9000 X g 离心 Smin,

© 离心 样品 时 ， 将 50ml 无 菌 锥 形 管 置 于 冰 上 预 冷 。

@ 第 凶 步 离心 之 后 ， 小 心地 将 上 清 液 倒 至 预 冷 的 离心 管 中 。 根 据 匀 浆液 的 原始 体积 ， 有 时 可 能 要 将 上 清 液 分 装 至 两 个 离心 管 ， 以 便 能 够 装 人 后 续 操 作 步 又 的 试剂 。

© 加 入 1.2 倍 体积 的 匀 浆 缓冲 液 (25mmol/L NaCl; 200mmol/L MgCl; 25mmol/L Tris, pH7.5; 2.0% Triton X; lmg/ml 肝素 或 200U/ml RNasin). PK 2h。

© 冰 浴 后 ， 在 15ml 硅烷 化 的 无 菌 的 Corex 玻璃 管 中 加 入 3.5ml BRYA pK (25mmol/L NaCl; 200mmol/L MsgClz;， 25mmol/L Tris, pH7.5; lmol/L fe ##), Ja tn ABO KIRA RW 10ml。

注意 硅烷 化 方法 见 附录 8。

@) 在 预 冷 的 离心 机 转子 中 ， 于 4C 以 9000Xg 离心 15min。

oon).

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

@ 小 心 倾 斜 倒 去 上 清 液 ， 注 意 不 要 丢失 多 聚 核糖 体 沉 淀 。

@ 用 1ml HEPES-SDS 缓冲 液 (0. lmol/L NaAc; 10mmol/L HEPES, pH7.5; 0.5% SDS) 重新 悬浮 多 聚 核糖 体 沉 淀 。 如 果 需 要 可 以 增加 缓冲 液体 积 ， 彻 底 溶解 多 聚 核糖 体

@ 如 果 第 @ 步 得 到 的 多 聚 核糖 体 体 积 不 超过 1ml1， 将 多 聚 核 糖 体 溶液 全 部 转移 到 一 个 2.2ml 微型 离心 管 中 。 如 果 第 四 步 得 到 的 多 聚 核糖 体 体积 超过 1ml， 将 多 聚 核 糖 体 溶液 分 两 管 转移 到 2 个 2. 2ml 微型 离心 管 中 。

四 每 管 中 加 入 等 体积 的 酚 : 氯仿 : 异 戊 醇 (25 : 24 : 1) 。 盖 紧 管 盖 ， 小 心 混合 。 然 后 以 10000 X g 离心 5min 使 溶液 分 相 。

注意 ”如 果 抽 提 中 使 用 的 离心 管 比 较 大 ， 注 意 不 要 超过 该 离心 管 所 能 耐 受 的 最 大 离心 力 。

QO 将 上 层 水 相 移 至 新 的 离心 管 中 ， 重 复 第 四 步 操 作 。

@ 罗 将 上 层 水 相 移 至 新 的 离心 管 中 ， 加 入 等 体积 的 氯仿 或 氯仿 : HAR (24:1) 进行 抽 提 。 于 4C 以 10000Xrfg 离心 1Imin， 使 溶液 分 相 。

© 将 水 相 转 移 至 能 够 耐 受 9000X g 离心 力 的 体积 更 大 的 离心 管 中 ， 如 硅烷 化 的 Corex 玻璃 管 。 如 果 第 @@ 步 操作 所 获 液体 分 成 数 份 ， 此 时 可 以 将 相同 样品 混合 。

@® 加 入 0. 08 倍 体 积 3mol/L NaAc(pH5. 2) 和 2 倍 体积 的 100%% 乙 醇 。 混 合 后 ， 于 一 20 人 放置 2h 以 上 ， 沉 演 RNA。 为 了 最 大 限度 地 回收 RNA,， 将 该 溶液 于 一 20C 放 置 wk.

@ ¥F 4°CVW 9000 X g Bay 20min, WE RNA,

曲 小 心地 倒 去 乙醇 ， 当 心 不 要 倒 掉 管内 或 管 底 的 RNA 沉淀 。

@ FA 75% ZR (100% 乙醇 用 DEPC 处 理 的 水 稀释 ) 洗涤 RNA 沉淀 2 次 。

@ 用 100%% 乙 醇 再 洗涤 RNA 沉淀 一 次 ， 能 够 加 速 RNA 沉淀 在 空气 中 的 干燥 。 不 要 让 RNA 沉淀 彻底 干燥 。

@ 将 RNA 沉 淀 溶解 于 最 小 体积 的 无 菌 水 。 温 和 涡 旋 有 助 于 RNA 的 溶解 。 如 有 必要 ， 在 65C 温 浴 2min 加 速 RNA 溶解 ， 然 后 再 温和 涡 旋 。

@ 如 果 深 液体 积 小 ， 于 4C 以 12000Xg 离心 15min。 如 果 使 用 Corex 玻璃 管 ， 则 于 4C 以 9000Xg 离心 30min, ;

四 将 含有 纯化 RNA 的 上 清 液 转 移 到 一 个 新 的 管子 中 。 用 第 8 章 所 介绍 的 方法 检测 RNA 溶液 的 含量 和 纯度 。 将 RNA 溶液 分 装 ， 于 一 80C 保存。

6.8 实地 采集 生物 样品

RNAlater (Ambion) 是 一 个 非常 重要 的 化 合 物 ， 该 化 合 物 给 组 织 样品 保存 方式 带 来 了 革命 性 的 进步 ， 使 所 保存 的 样品 能 够 在 日 后 的 任何 时 间 和 地 点 进行 RNA 分 析 。 这 种 产品 是 特殊 的 水 溶液 。 从 事 RNA 研究 工作 的 人 都 知道 ， 该 化 合 物 能 够 阻止 生物 组 织 或 器 官 内 RNA 的 降解 ， 将 生物 组 织 和 器 官 内 的 RNA 保存 到 研究 人 员 认 为 方便 的 时 间 和 地 点 ， 再 从 生物 材料 中 分 离 出 高 质量 的 RNA。RNAlater 的 化 学 特征 有 利于 生物 样品 的 采集 ， 尤 其 是 在 野外 工作 场所 采集 样品 。 另 外 ， 尽 管 生物 材料 可 以 在 液 氮 中 快速 冷冻 ， 但 是 一 般 来 说 运输 一 个 即使 是 很 小 的 液 氮 瓶 也 是 不 现实 的 ， 尤 其 是 研究 人 员 计 划 在 野外 工作 几 天 的 情况 下 用 液 氮 快速 冷冻 生物 样品 就 更 不 现实 。

*。 72 。

第 6 章 ， 从 组 织 中 提取 RNA

6.9 RNA“ 洒 化 ”万 法

不 论 是 从 新 鲜 的 、 冷 冻 的 、 还 是 固定 的 组 织 分 离 RNA， 所 分 离 的 RNA 总 含有 少量 残 留 蛋白 质 ， 以 及 作为 分 离 操 作 组 分 的 化 合 物 污染 。 这 些 污 染 物 会 对 后 续 的 RNA 应 用 产生 负面 影响 。 如 果 电 泳 图 谱 表 明 新 近 分 离 的 RNA 纯度 好 ， 但 用 于 反 转 录 合 成 DNA 或 杂交 实验 的 效果 很 差 ， 就 要 进行 RNA“ 净 化 >。RNA 净化 的 方式 很 多 。 例 如 ， 增 加 溶解 RNA 的 无 菌 水 或 TE 缓冲 液体 积 ， 然 后 用 本 章 和 第 5 章 所 介绍 的 方法 用 等 体积 的 酚 : 氯仿 : 异 OBR (25: 24: 1) 抽 提 。 将 RNA 溶 液 和 有 机 溶剂 混合 后 的 总 体积 控制 在 1. 5ml 以 内 是 明智 的 ， 这 样 抽 提 操作 可 在 一 个 1500 岂 的 微型 离心 管 中 进 行 。 离 心 后 ， 在 有 机 相 和 水 相 之 间 出 现 一 条 白色 的 条 带 ， 表 明 RNA 溶液 还 有 和 蛋白质 污染 。 水 相 再 次 用 等 体积 的 酚 : A 仿 : SM 〈25 : 24 : 1) 抽 提 ， 直 至 有 机 相 和 水 相 之 间 和 白色 条 带 消 失 〈 即 所 有 蛋白质 都 被 去 除 ) 为 止 。 最 后 用 等 体积 的 氯仿 或 氯仿 : HAR (24:1) 抽 提 上 层 水 相 一 次 ， 去 除 水 相 残余 的 苯酚 ， 因 为 后 者 会 氧化 成 有 害 的 柄 。 接 下 来 ， 重 新 沉淀 RNA， 检 测 沉 淀 RNA 的 质量 。

另外 ， 还 有 一 些 硅 胶 离 心 柱 可 用 于 RNA 净化 。 这 种 柱子 内 的 硅胶 在 高 盐 的 离 液 条 件 下 与 RNA 结合 。 几 乎 所 有 分 子 生 物 学 试剂 供应 商都 能 提供 这 样 的 柱子 。 柱 层 析 将 RNA 与 所 有 其 他 化 学 品 或 化 合 物 分 开 ; 然后 用 低 盐 的 缓冲 液 或 无 菌 水 将 纯化 RNA 从 柱 中 洗 出 。 尽 管 要 用 硫 氰 酸 县 作为 离 液 剂 ， 但 是 这 种 方法 速度 快 ， 而 且 不 用 任何 有 机 溶剂 。

RNA“ 净 化 ”也 意味 着 除去 了 RNA 溶液 的 基因 组 DNA 或 线粒体 DNA 污染 。 前 面 提 到 ， 进 行 RNA 分 离 用 到 更 为 剧烈 的 破坏 所 有 器 官 的 方式 ， 这 样 DNA 也 会 释放 到 勾 浆 液 中 。 如 同 附 录 5 所 介绍 的 ， 大 多 数 实验 室 用 DNase | MAA BH RNA 溶液 ， 从 而 消除 RNA 溶液 的 DNA 污染 。 这 样 处 理 后 ， 研 究 人 员 不 用 担心 PCR 过 程 中 基因 组 DNA 和 cDNA 之 间 竞 争 ， 也 不 用 担心 印迹 分 析 中 污染 DNA 会 产生 杂 带 。

最 后 ， 应 该 认识 到 有 些 组 织 ， 有 过 量 的 天 然 化 合 物 可 能 与 RNA 共 纯 化 。 明 显 的 例子 是 AAW RS RNA 共 纯 化 ， 以 及 脂肪 组 织 的 脂 类 与 RNA 共 纯 化 。 前 一 种 情况 下 ， 加 入 3 倍 体积 的 4mol/L 乙酸 钠 LpH 7.0 (不 是 5.2)]， 于 一 20C 放 置 过 夜 沉 淀 RNA， 而 糖 原则 滞留 在 溶液 中 〈Sambrook 等 ，1989) 。 根 据 离心 管 大 小 ， 于 4C 在 8000Xg 以 上 离心 15min 收集 RNA, Ab, Hf 4mol/ 氧化 锂 加 入 含有 糖 原 污 染 的 沉淀 RNA 中 并 分 散 沉 淀 团 块 ， 然 后 根据 离心 管 大 小 ， 以 3000Xg 一 5000Xg 离心 10min 收集 RNA, th ABBR RNA WRB 原 污 染 (Puissant 和 Houdebine，1990) 。 在 后 一 种 情况 下 ， 用 前 面 已 经 详细 介绍 的 方法 除 去 过 量 的 脂 类 。

经 验 : 要 留心 各 种 分 离 RNA 操作 的 细节 ， 才 可 能 获得 质量 最 高 的 RNA。 尽 可 能 减少 操作 的 次 数 ， 将 偶尔 引入 RNase 的 风险 降 至 最 低 ， 从 而 有 助 于 RNA 的 最 大 稳定 性 ， 是 进行 RNA 分 离 的 明智 之 举 。

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EEE —_—

第 6 章 ， 从 组 织 中 提取 RNA

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(eH LA; SH FR)

- 75°

f7S =RRSE RNA 的 分 离

7.1 £44 8

为 什么 要 纯化 信使 RNA (mRNA)? 为 了 充分 地 回答 这 个 问题 ， 必 须 对 转录 的 各 样 产物 及 其 数量 做 出 统计 学 考虑 。 根 据 细 胞 内 一 种 RNA 的 平均 拷贝 数 将 真 核 mRNA 分 成 高 丰 度 mRNA、 中 丰 度 mRNA 和 低 丰 度 mRNA,

高 丰 度 mRNA 指 一 个 细胞 浆 中 有 数 百 个 拷贝 的 mRNA。 如 果 高 度 分 化 的 细胞 执行 某 种 特定 的 功能 或 者 产生 大 量 的 特定 蛋白 质 ， 那 么 有 理由 推定 该 细胞 转录 了 相应 的 高 水 平 信使 RNA8@。 例 如 ， 人 们 用 网 状 细胞 和 输卵管 细胞 分 别克 隆 B- 球 蛋白 (Efstratiadis 等 ， 1976) 和 卵 清 蛋 白 (Buell 等 ，1978) 。 中 丰 度 mRNA 指 一 个 细胞 浆 中 含有 几 十 个 拷贝 的 mRNA。 许 多 标准 的 看 家 基因 (lM, ABA. PALABA. GAPDH) 的 mRNA 属于 中 丰 度 mRNA， 常 作为 RNA 分 析 的 对 照 或 参照 。 低 丰 度 mRNA 指 一 个 细胞 浆 中 仅 有 14 个 拷贝 或 更 少 拷贝 的 mRNA (Williams，1981)， 这 就 是 所 谓 的 稀有 mRNA。 采 用 超级 灵敏 的 检测 技术 ， 如 聚合 酶 链 反 应 (PCR)， 大 大 促进 了 这 些 稀 有 mRNA 的 检测 。 估 计 至 少 302%% 的 细胞 mRNA 属于 低 丰 度 mRNA。 而 且 ， 将 那些 低 于 1 个 拷贝 /细胞 的 mRNA 定义 为 非常 低 丰 度 mRNA， 这 意味 着 必须 在 一 个 混合 的 细胞 群 中 才能 检测 到 这 些 非 常 低 丰 度 mRNA。

纯化 mRNA 的 目的 是 增加 一 个 生物 样品 中 某 种 、 几 种 或 所 有 mRNA 在 统计 学 上 的 代表

性 。 各 种 纯化 策略 的 本 质 都 是 富 集 RNA 样品 。 普 通 的 富 集 技 术 包括 在 细胞 裂解 前 处 理 生 物 材料 ， 以 便 反 复 诱 导 或 积累 细胞 中 某 种 类 型 的 基因 转录 产物 ; 也 可 以 对 以 前 已 经 纯化 的 RNA 样品 进行 适当 处 理 达 到 特定 RNA 富 集 的 目的 。 对 样品 进行 富 集 有 利于 mRNA 研究 ， 原因 如 下 〈 但 不 仅 限 于 这 些 ): Ow T Northern 分 析 、S1 核酸 酶 分 析 或 核糖 核酸 酶 保护 分 析 等 特定 基因 转录 产物 检测 所 必需 的 RNA 量 ， 同 时 增加 了 检测 的 灵敏 度 ，@ 有 利于 将 mRNA 转化 成 互补 DNA (cDNA)@8。 增 加 统计 意义 上 的 代表 性 可 以 提高 那些 不 易 检 测 的 稀 有 mRNA 分 子 的 印迹 检测 、 文 库 筛 选 或 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 CRT-RNA) 的 成 功率 。 然 而 ， 必须 清楚 ， 如 果 优 化 使 用 的 试剂 和 技术 ， 相 关 的 试验 可 能 不 用 纯化 的 mRNA (而 采用 总 RNA)， 尽 管 人 们 和 希望 采用 纯化 的 mRNA.

@@ 应 该 注意 其 他 非 mRNA 的 转录 产物 属于 细胞 内 高 丰 度 RNA, DORE RRR RNA (rRNA) 和 转移 RNA (tRNA). @@ 高 丰 度 mRNA 可 能 是 多 拷贝 基因 〈 如 基因 重复 ) 的 转录 产物 ， 这 是 细胞 需要 大 量 某 种 基因 产物 时 所 采用 的 一 种 策略 。 @ cDNA 合成 可 以 用 于 传统 的 文库 构建 、PCR 定量 转录 产物 、 微 阵 探 针 合 成 ， 或 者 其 他 相关 的 目的 。 . 76 *

SL ——

第 7 章 多 聚 腺 苷 酸 RNA 的 分 离

7.2 BRRBHE

人 们 知道 poly(A) 尾巴 已 经 有 好 几 年 了 。RNA 的 poly(A) 尾巴 是 一 串 腺 味 吟 核 苷 酸 。 大 多 数 〈 但 不 是 所 有 的 ) 真 核 mRNA 分 子 的 3 末端 有 poly(A 尾巴 。 多 聚 腺 苷 酸化 的 过 程 就 是 把 poly(A) 尾巴 添加 到 mRNA 3 ' 末端。 多 聚 腺 苷 酸化 与 转录 终止 不 直接 偶 联 (Dar- nell, 1979; Maney，1988)， 而 是 由 细胞 核 内 一 个 酶 系 〈Moore 和 Sharp, 1985) 催化 完 成 ， 这 类 酶 统称 为 polyC(A) 聚合 酶 。 因 此 ， 体 内 多 聚 腺 苷 酸化 不 是 转录 的 一 个 部 分 ， 而 是 一 个 转录 后 的 调节 事件 ， 其 速度 很 快 (Nevins 和 Darnell, 1978).

poly(A) 尾巴 的 长 度 是 可 变 的 ， 即 使 从 相同 基因 位 点 转录 合成 的 RNA 分 子 ， 其 poly(A) 尾巴 长 度 也 不 相同 。 哺 乳 动 物 poly(A) 尾巴 长 度 可 以 在 50~300 核 苷 酸 范 围 内 变化 ， 但 是 典型 的 poly(A) 尾巴 长 度 有 200~250 RHR. BK. WA poly(A) 尾巴 的 RNA 分 子 统称 为 poly(A)+mRNA， 准 确 地 说 是 mRNA HAAR MRL. RE poly(A) 尾巴 的 准确 功能 还 不 清 楚 ， 但 是 人 们 认为 poly(A) 尾巴 能 够 : 中 促进 成 熟 mRNA 运 出 细胞 核 〈 细 胞 核 质 运输 ); Oia 节 mRNA 在 细胞 质 中 的 稳定 性 和 功能 (综述 见 Ross，1995) ， 而 细胞 质 是 mRNA 翻译 的 场所 。 下 面 的 观察 资料 支持 上 面 假设 的 poly(A) 尾巴 功能 : 中 抑制 核 RNA 的 多 聚 腺 苷 酸化 的 腺 苷 类 似 物 3'-Hi ABR EF (cordycepin) 能 够 降低 已 转录 的 、 非 多 聚 腺 苷 酸化 的 序列 在 细胞 质 的 水 平 ; @mRNA 分 子 的 半衰期 可 以 根据 其 poly(A) 尾巴 的 长 度 预测 。 在 体内 ，poly(A) 特征 和 poly (A) 结合 蛋白 (PABP) 密切 相关 。 每 10 一 20 个 碱 基 长 度 的 poly(A) 尾巴 能 化 学 定量 地 结合 一 个 PABP 〈 综 述 见 Kramer，1996)， 在 细胞 核 内 和 细胞 质 内 也 观察 到 这 种 化 学 定量 结合 。po- ly(A) 尾巴 和 PABP 之 间 的 相互 作用 有 利于 mRNA 抵抗 3 一 5 核酸 酶 的 攻击 。 当 然 ， 大 多 数 RNA 分 离 方 法 都 会 使 PABP 及 其 他 蛋白 质 与 结合 的 RNA 分 离 。

3'-poly(A) 尾巴 的 产生 实际 上 是 两 种 酶 活性 连续 作用 的 结果 ， 即 前 体 RNAChnRNA) 先 发 生 裂解 ， 然 后 进行 多 聚 腺 苷 酸化 。 很 清楚 ， 最 初 的 RNA 转录 产物 除了 多 聚 腺 苷 酸 信和 号 外 还 有 数 以 千 计 的 核 苷 酸 (Nevins 和 Darnell, 1978; Ziff，1980)。 前 体 RNA 分 子 不 是 由 核酸 外 切 酶 从 3 末端 逐步 降解 ， 而 是 经 核酸 内 切 酶 消化 形成 了 poly(A) 尾巴 添加 的 精确 位 点 (Nevins 和 Darnell，1978) 。 裂 解 后 ， 依 次 添加 腺 苷 酸 残 基 ， 最 终 形成 poly(A) 尾巴 。

在 多 聚 腺 苷 酸化 之 前 进行 的 剪接 不 是 偶然 事件 。 剪 接 的 效率 和 剪接 地 点 都 被 多 聚 腺 苷 酸化 信和 号 精确 调控 。 在 更 高 级 的 真 核 生 物 中 ， 事 实 上 所 有 多 聚 腺 苷 酸化 的 mRNA 分 子 都 有 高 度 保 守 的 6 个 核 背 酸 模块 5 …AAUAAA…3' ， 或 者 是 与 该 模块 密切 相关 的 变异 序列 。 这 个 模块 典 型 地 位 于 多 聚 腺 苷 酸化 起 始 位 点 上 游 30 个 核 苷 酸 以 内 (Proudfoot 和 Brownlee，1976)。 为 了 有 效 地 剪接 和 多 聚 腺 苷 酸化 ， 还 需要 第 二 个 元 件 ， 即 下 游 富 含 GU HE (Gil 和 Proudfoot, 1984; McDevitt 等 ，1984; Sadofsky 和 Alwine, 1984; Cole 和 Stacy, 1985; Conway 和 Wickens, 1985)。 这 个 富 含 GU 的 序列 比 AAUAAA 模块 还 要 保守 ， 位 于 内 切 酶 酶 切 位 点 下 游 大 约 有 10 一 40 个 核 苷 酸 区 域 。 剪 接 和 后 续 的 多 聚 腺 苷 酸化 是 通过 核酸 内 切 酶 组 分 、 一 个 GU 丰富 区 结 合 因 子 和 poly(A) 聚合 酶 构成 的 异 源 多 聚 体 复 合 物 的 形成 来 完成 的 〈Takagaki 等 ，1988) 。

7.3 poly(A) 的 解释 说 明

也 许 本 章 最 重要 的 内 容 是 阑 明 针对 poly(A) 尾巴 亲 和 层 析 纯 化 mRNA。 尽 管 多 数 真 核 mRNA 已 经 被 多 聚 腺 苷 酸化 ， 但 是 还 有 一 小 部 分 mRNA 没有 被 多 聚 腺 苷 酸化 。 因 此 ， 分 离 。 Jy -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

poly(A)” mRNA 会 漏 掉 非 多 聚 腺 苷 酸化 的 mRNA 分 子 ， 后 者 在 特定 的 相关 研究 中 可 能 很 有 意义 。

实例 1: Northern 分 析 poly(A)* mRNA 不 能 定性 和 定量 测定 细胞 内 或 细胞 质 poly CA) mRNA 〈 如 组 蛋白 mRNA)。 如 果 同 一 位 点 的 转录 产物 经 过 选择 性 转录 后 加 工 ， 产 生 了 多 聚 腺 苷 酸化 的 和 非 多 聚 腺 苷 酸化 的 转录 产物 ， 这 种 情况 就 更 加 复杂 。

读者 要 当心 ， 那 些 声 称 通过 poly(A) 尾巴 筛选 “总 mRNA” 的 试剂 盒 将 不 能 产生 poly (A) mRNA。 而 且 由 于 poly(A) 尾巴 是 在 细胞 核 内 添加 的 ， 毫 无 疑问 从 整个 细胞 裂解 物 筛 选 的 poly(A)* mRNA 包括 多 聚 腺 苷 酸化 的 细胞 质 RNACmRNA) 和 多 聚 腺 苷 酸化 的 细胞 核 RNA(ChnRNA)。 这 两 种 RNA 的 混合 物 不 能 作为 有 功能 的 mRNA 〈 即 能 被 翻译 的 ) 的 代表 。 记 住 有 大 量 的 hnRNA 从 来 就 不 能 被 加 工 成 成 熟 的 细胞 质 mRNA， 最 终 在 核 内 降解 。 为 了 将 注意 力 更 集中 于 细胞 产生 的 poly(A) mRNA， 可 以 用 低 渗 的 NP-40 缓冲 液 处 理 细 胞 〈 第 5 章 ) ， 除 去 完整 的 细胞 核 ， 从 细胞 液 分 离 多 聚 腺 苷 酸化 RNA。 另 外 ， 为 了 确定 那些 能 被 翻译 的 mRNA， 可 以 制备 艇 合 了 mRNA 的 多 核糖 体 〈 第 6 章 )， 然 后 用 乙 二 胺 四 乙酸 (EDTA) 处 理 ， 释 放 RNA, EDTA fEBRBA Mg:+* ， 导 致 核糖 体 解 离 成 单个 的 亚 基 ， 同 时 释放 正在 翻译 的 RNA (Aziz 和 Munro, 1986; Meyuhas 等 ，1987; 综述 见 Pierandrei-Amaldi 和 Amaldi，1994) 。 这 种 方法 和 更 新 的 策略 (Meyuhas 等 ，1996) 对 于 有 活性 mRNA 的 识别 是 非常 有 用 的 。

实例 2: 合成 cDNA 以 及 用 这 些 cDNA 构建 文库 的 经 典 途 径 都 是 从 poly(A)+ mRNA 分 离开 始 的 。 为 了 起 始 mRNA 转化 成 第 一 条 cDNA 链 ，oligo(dT) 引物 与 poly(A) * mRNA 模板 退火 ， 在 合适 的 方向 上 提供 3'" -OH 基 团 。 这 类 引物 是 各 类 聚合 酶 活性 所 必 需 的 。 此 时 反 转 录 酶 @ 合 成 第 一 条 cDNA 链 。 这 种 方法 总 的 结果 是 从 mRNA 3' 未 端 合成 cDNA。 科 学 家 应 该 意识 到 通过 这 种 方式 制备 的 CDNA 文库 不 包括 相应 的 poly(A) ~ mRNA 克隆 。 为 了 克服 用 oligo(dT) 引物 合成 cDNA 文库 的 潜在 缺点 ， 很 多 更 新 的 文库 采用 随机 引物 合成 第 一 条 cDNA 链 。 有 时 在 同一 个 反应 管 里 同时 用 随机 引物 和 oligo (dT) 合成 第 一 条 cDNA 链 ， 这 种 方法 现在 是 作者 实验 室 进 行 反 转录 合成 第 三 条 cDNA 链 的 标准 操作 。 简 而 言 之 ， 一 些 序列 随机 的 六 聚 体 或 九 聚 体 与 热 变 性 的 RNA 退火 。 退 火 可 以 有 效 产生 多 个 引物 的 3 -OH， 这 些 引 物 的 3'-OH 同时 引导 反 转 录 酶 进行 DNA BE 伸 。 这 些 引物 不 受 RNA 分 子 3 末端 有 无 poly(A)+ 尾巴 影响 。 除 非 添 加 了 oligo(dT) 引物 ， 否 则 ， 用 这 种 方式 合成 的 CDNA 就 没有 与 poly(A) 尾巴 相应 的 序列 。 通 常用 随 机 引物 可 以 合成 更 多 序列 全 长 的 cDNA， 因 此 有 利于 用 经 典 的 或 现代 的 方法 分 析 mR- NA。 如 果 用 几 年 前 构建 的 文库 进行 筛选 ， 了 解 文库 构建 时 所 采用 的 cDNA 合成 引物 可 能 有 助 于 实验 结果 的 解释 9。

总 的 来 说 ， 用 poly(A)- RNA 有 优点 也 有 缺点 〈 表 7.1)。 必 须根 据 研 究 所 需 达 到 的 灵敏 度 、 能 够 获得 的 细胞 数量 或 组 织 的 重量 ， 权 衡 利弊 ， 确 定 是 采用 poly(A) * RNA 还 是 总 RNA。 多 数 情况 下 ， 应 用 细胞 总 RNA 试 一 试 ， 然 后 确定 是 否 需 要 纯化 poly (A)+ mRNA,

@ 反 转 录 酶 是 依赖 RNA M DNAKAAR. HACER 18 章 重点 讨论 。 @ 一 些 极端 的 例子 是 在 CDNA 合成 之 前 用 poly(A) 聚合 酶 处 理 总 RNA， 使 所 有 RNA 多 聚 腺 苷 酸化 ! 该 操作 既 不 必需 ， 也 不 推荐 。 * 78 大

第 7 章 SREB RNA 的 分 离

表 7.1 poly(A)+ 纯 化 的 优点 和 缺点

优点

poly(A)+ 纯 化 增加 了 mRNA 在 总 RNA 中 的 比例 ;

poly(A)+ 纯 化 最 大 限度 地 减少 了 rRNA 和 tRNA 的 干扰 ; poly(A)+ 纯 化 增加 了 检测 的 灵敏 度 ;

目前 poly(A) 的 捕获 方法 不 需 再 次 沉淀 样品 就 能 显著 地 浓缩 样品 ;

纯化 的 .poly(A)+ mRNA 可 以 直接 使 用

收集 和 沉淀 的 polyC(A)-RNA 可 以 作为 优秀 的 阴性 对 照 ,尤其 是 印迹 分 析 的 阴性 对 照

缺点

poly(A) 的 分 离 丢 失 了 poly(A)” mRNAs;

在 纯化 过 程 中 poly(A)+ RNA 的 损失 可 能 更 加 降低 了 稀有 mRNA 的 比例 ,尤其 是 用 总 RNA 分 离 poly(A) * RNA; 受 细 胞 裂解 方法 的 影响 ,分离 的 poly(A) + mRNA 也 可 能 含有 多 聚 腺 苷 酸化 的 hnRNA;

oligo(dT) 基 质 价 格 昂贵 ;

即使 过 去 5 年 内 用 poly(A)+ mRNA 克隆 和 RT-PCR 改进 了 效果 ,但 是 用 poly(A) * mRNA 可 能 并 不 是 必需 的

tt: mRNA 一 信使 RNA; rRNA 一 核糖 体 RNA;RT-PCR 一 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 ; tRNA 一 转移 RNA。

7.4 多 用 腺 基 酸 化 mRNA OSS

mRNA 分 子 多 种 多 样 ， 而 且 mRNA 只 占 细 胞 总 RNA 重量 的 一 小 部 分 ， 用 微量 组 织 样 品 或 细胞 常常 不 能 采用 经 典 途 径 〈 如 琼脂 糖 凝 胶 电泳 或 芒 糖 密度 梯度 离心 ) 进行 mRNA 层 析 。 与 此 相反 的 极端 情况 是 ， 如 果 检 测 和 生物 物理 研究 需要 大 量 材料 也 不 能 用 凝 胶 纯化 RNA。 但 是 ， 柱 层 析 分 离 水 平 可 以 达到 毫克 数量 级 。

ALY MASE RR PR te RNA 分 离 多 聚 腺 苷 酸化 RNA， 可 以 利用 腺 味 哈 和 胸腺 喀 喧 之 间 的 自然 结合 力 氢 键 从 细胞 质 RNA 或 细胞 总 RNA 分 离 相 当 少 的 poly(A)+ mRNA。 这 种 方 式 进 行 的 分 离 是 一 个 很 好 的 亲 和 层 析 实 例 〈 即 基于 生物 活性 或 结构 进行 的 分 离 或 层 析 ) 。 此 时 的 生物 结构 是 poly(A) 尾巴 。 过 去 曾经 利用 不 同 的 oligo(CdT)- 纤 维 素 亲 和 纯化 poly(A)* mRNA, PPA ER ER i AR [oligo(CdT)] 的 5 -磷酸 与 纤维 素 珠 共 价 交 联 (Aviv 和 Leader，1972) 。 因 此 ，poly(A) 尾巴 和 oligo(dT) 形成 氨 键 ， 使 poly(A)+ mRNA 保留 在 固 相 基质 上 。 尽 管 现 在 使 用 oligo(CdT)- 纤 维 素 分 离 poly(A)+ mRNA 的 人 不 多 ， 但 是 还 有 一 些 广 家 能 够 提供 结合 容量 和 纯化 能 力 不 同 的 各 种 型 号 的 oligo(CdT)- 纤 维 素 。 也 许可 以 用 Gilham (1964) 当初 所 介绍 的 方法 合成 oligo(CdT)- 纤 维 素 ， 但 风险 很 大 。 虽 然 已 经 证 明 用 oligoCdT)- 纤 维 素 能 相当 有 效 地 分 离 poly(A)- mRNA,， 但 是 人 们 更 乐于 采用 后 来 介绍 的 新 方法 。 这 些 新 方法 所 需 生 物 样 品 量 很 少 。

虽然 分 离 poly(A) mRNA 的 机 制 发 生 了 改变 ， 但 是 这 些 分 离 poly(A)+ mRNA 的 方法 仍然 是 亲 和 分 离 。 这 些 方法 简化 了 以 前 繁琐 的 曾经 被 称 为 “过 oligo(dT) ” Cami Ait 论 ) 的 操作 。 这 些 较 新 的 方法 如 下 。

D 直接 在 微型 离心 管 中 将 oligo(dT)- 纤 维 素 和 总 RNA 混合 ， 不 需要 等 oligo(dT)- 纤 维 素 装 柱 后 才 加 入 总 RNA,

G@ HAAS oligo(dT) 共 价 结合 的 磁 珠 。 溶 液 杂 交 后 ， 用 磁铁 捕获 杂交 的 核酸 。

G@) 利用 生物 素 和 生物 素 亲 和 素 的 天 然 亲 和 力 : 生物 素 与 核酸 或 其 他 各 种 分 子 共 价 结合 不 改变 这 些 分 子 的 生物 活性 。 生 物 素 与 链 霉 亲 和 素 的 结合 力 很 大 ， 达 到 Kd 王 10-5mol/L。 如 此 强 的 结合 力 使 很 多 应 用 都 有 了 可 能 性 。 其 中 一 种 应 用 是 生物 素 标记 的 oligo(dT) 分 子 和 poly

。 79 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

(A)* mRNA 碱 基 配对 后 ， 与 链 霉 亲 和 素 形成 复合 物 沉 演 。 另 外 一 种 应 用 是 用 链 霉 亲 和 素 交 联 的 磁 珠 回收 poly(A) mRNA。 洗 脱 体积 小 、 操 作 方 便 、 不 需要 进行 核酸 沉淀 。 可 以 利用 的 RNA 纯化 试剂 盒 本 质 上 都 采用 了 这 个 方法 ， 只 是 在 有 些 地 方 对 该 方法 进行 了 一 定 的 修改 。

由 将 RNA 样 品 过 polyCU) 琼脂 糖 柱 ， 能 够 促进 柱 的 基质 与 RNA 样品 中 所 有 的 poly (A)* mRNA 之 间 形 成 A : U AB.

不 管 采用 什么 方案 亲 和 纯 化 poly(A)* mRNA， 最 重要 的 是 操作 体积 尽 可 能 最 小 ， 即 尽 可 能 使 样品 的 浓度 处 于 最 浓 状 态 。

很 清楚 ， 纯 化 poly(A) mRNA 的 各 种 亲 和 技 术 ， 其 共同 点 是 在 高 离子 强度 的 缓冲 液 里 poly(A)’ mRNA 与 亲 和 基 质 退 火 后 结合 。 这 一 点 对 于 消除 目标 RNA 和 基质 交 联 的 胸 苷 酸 残 基 之 间 的 静电 斥 力 是 必需 的 。 在 高 盐 条 件 下 ， 单 价 的 阳离子 能 抵消 多 聚 核 苷 酸 磷 酸 二 酯 骨 架 的 负离子 。 在 低 盐 环 境 中 ， 静 电 斥 力 足 以 阻止 碱 基 之 间 的 配对 ， 从 而 能 够 以 这 种 方式 纯 化 poly(A)* mRNA,

随 着 盐 离子 浓度 增加 ，oligo(CdT) 基质 的 结合 能 力也 提高 〈 直 到 500mmol/L NaCl, KCl1 或 LiCD)@8。 在 同等 浓度 时 ，KC1 或 LiCl 促进 基质 结合 能 力 的 作用 比 NaCl 的 促进 作用 显著 (Mercer 和 Naora，1975) 。 必 须 注 意 ， 虽 然 盐 浓 度 提 高 能 够 促进 基质 结合 RNA 的 能 力 ， 但 是 也 增强 了 核酸 与 基质 的 非特 异性 杂交 。 用 盐 离 子 浓度 不 太 高 的 缓冲 液 冲 洗 ， 除 去 没有 杂交 的 非 poly(A)* RNA; 然后 用 非常 低 的 盐 离 子 浓 度 的 缓冲 液 将 杂交 的 poly (A) mRNA 洗 脱 回收 。 除 去 单价 阳离子 能 够 重 构 核酸 之 间 的 静电 斥 力 ， 加 速 杂 交 RNA 与 基质 的 解 离 。 这 种 方式 分 离 的 poly(A) * RNA 和 poly(A)” RNA 都 可 以 用 盐 和 乙醇 进行 DL¥E. poly(A)” RNA 是 很 好 的 杂交 分 析 和 cDNA 合成 的 阴性 对 照 〈 分 别 在 第 14 章 和 第 18 章 进 行 介绍 ) 。

7.5 用 磁 珠 技术 纯化 poly(A)- RNA

与 各 种 配 基 共 价 交 联 的 是 铁 珠 ， 已 经 成 为 从 各 种 复杂 的 混合 物 分 离 不 同化 合 物 的 宝贵 工 具 。 这 些 配 基 包 括 抗体 和 窒 胸 苷 酸 。 抗 体 用 来 识别 并 结合 细胞 表面 的 抗原 ， 而 寡 胸 苷 酸 用 来

回收 多 聚 腺 苷 酸化 RNA。 有 几 家 公司 生产 磁 珠 类 产品 ， 其 中 Dynabeads olido(dT) 是 Dynal

公司 的 产品 (Dynal, Inc. , Lake Success, NY). Dynabeads 是 超 磁 珠 ， 直 径 2.8ym, AAR 苯 乙 烯 包 庄 着 氧化 铁 〈Fez O; ) 颗粒 。 在 磁场 中 这 些 颗粒 会 形成 磁极 。 通 过 5' 连 接 基 团 将 ,25 个 核 苷 酸 长 的 寡 聚 脱氧 胸 苷 酸 共 价 交 联 于 磁 珠 表面 。 在 高 离子 强度 条 件 下 ， 将 磁 珠 加 到 总 RNA 混合 物 中 有 利于 多 聚 腺 苷 酸化 RNA 和 连接 在 磁 珠 上 的 olido(dT) 引物 之 间 的 杂交 (图 7. 1) 。 杂 交 动 力学 与 在 溶液 状态 的 游离 分 子 一 样 ，5min 内 完成 杂交 。 将 样品 管 靠近 磁 铁 ， 富 集 磁 珠 和 杂交 了 的 poly(A)* RNA (图 7.2)。 接 着 的 标准 组 合 模式 是 提高 温度 和 采 用 极 低 盐 离子 浓度 缓冲 液 洗 涤 和 洗 脱 。 用 磁 珠 捕获 法 分 离 多 聚 腺 苷 酸化 RNA 不 需要 传统 的 亲 和 柱 层 析 ， 使 核酸 层 析 分 离 达 到 了 新 水 平 。 这 个 技术 最 主要 的 优势 是 分 离 速度 快 ， 能 够 获 得 纯 的 、 高 浓度 的 完整 poly(A)+RNA。 这 种 方法 不 需要 重新 沉淀 浓缩 polyC(A)+RNA。 而 重新 沉淀 常常 会 进一步 损失 独特 的 或 低 丰 度 的 poly(A)+ RNA。 磁 珠 的 平均 结合 容量 是 每 毫 克 磁 珠 可 结合 2ug poly(A)* RNA. FARA KAMEN poly(A) * RNA 可 以 直接 用 于 cDNA

O 见 生产 厂 的 包装 ， 上 面 有 每 个 等 级 的 详细 介绍 和 许多 朝 核 苷 酸 〈dT) 分 离 基质 。 。80 -

第 7 章 多 聚 腺 背 酸 RNA 的 分 离

总 RNA

高 盐 环境 J tD-YA |

TELTLEOEET LeT Z,AAAAAAAAAA RNAS’

I % poly(A) RNA == I 低 盐 环境 3; AAAAAAAAAA RNAS’

由 洗 脱 poly(A)+mRNA

PCR 和 其 他 应 用

图 7.1 用 磁 珠 分 离 polyC(A)* RNA 的 技术 。 在 微型 离心 管 中 ， 将 早先 纯化 的 RNA 或 整个 细胞 裂解 液 与 oligoCdT) 交 联 的 磁 珠 在 高 盐 条 件 下 混合 。 在 poly(A) 尾巴 和 守 聚 胸 苷 酸 退 火 后 ， 离 心 管 紧 靠 磁铁 将 多 聚 腺 苷 酸化 mRNA 捕获 到 离心 管 壁 。

WEA SEAR A Rte RNA 后 ， 用 体积 非常 少 的 低 盐 缓冲 液 或 无 菌 水 将 纯化 mRNA 洗 脱 。 这 个 方法 与 任何 方法 分 离 的 动 植 物 RNA 兼容

文库 构建 、 核 酸 酶 保护 分 析 、 引 物 延 伸 、RT_PCR 扩 增 、 体 外 翻译 、RNA 印迹 等 。

下 面 介绍 Dynabeads 分 离 多 聚 腺 苷 酸 化 RNA 的 操作 步 又。 起 始 的 生物 样品 材料 是 : 四 以 前 已 纯化 的 总 RNA (细胞 或 总 细 胞 质 的 总 RNA);， 四 培养 基 上 生长 的 培养 细 胞 或 固体 组 织 。 多 数 情况 下 起 始 的 生物 样 品 材料 的 量 有 限 ， 认 识 这 一 点 很 重要 。 因 此 ， 说 慎 起 见 ， 可 能 会 将 磁 珠 直接 加 入 整 个 细胞 裂解 液 或 组 织 匀 浆 液 直接 获得 poly 调控 票 砍 看 款 地 日 人 全 二 训 全 全民 的 oOAG 入 局 ， IO 脱氧 胸 昔 酸 识别 和 捕获 的 是 具有 poly(A) 结构 的 mRNA 和 hnRNA， 而 不 能 捕获 没有 poly(A) 结构 的 mRNA。 成 功 使 用 该 技术 的 关键 有 两 点 ， @ 在 进行 下 一 步 操作 之 前 必须 彻底 除去 盛 有 了 磁 珠 的 离心 管 中 所 有 的 缓冲 液 ，@ 只 有 在 离心 管 靠 近 磁 铁 时 才能 除去 装 有 磁 珠 的 管 中 的 液体 。

最 后 提醒 大 家 注意 ， 还 可 以 采用 不 同 厂家 提供 的 poly(A)+ RNA 分 离 方法 ， 包 括 基于 磁性 的 分 离 产 品 和 柱子 离心 分 离 的 产品 ， 这 些 产品 都 是 针对 poly (A) 尾巴 进行 分 离 的 。

7.5.1 实验 方案 9: 用 磁 珠 纯化 poly(A)+ RNA

(1) 从 总 RNA 47% poly(A)* RNA ® 75pg B RNA 预计 含有 1~4yg poly(A)* mRNA, #4 RNA 游 解 于 100pn1 AG

© 部 分 采用 Dynal 公司 的 资料 (Lake Success, NY). 。81 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

RNase 的 水 或 TIE 缓冲 液 中 。 如 果 了 RNA 样品 的 浓度 低 于 75pg/100x1， 加 入 等 体积 的 2 勾结 合 缓冲 液 (mol/L LiCl; 20mmol/L Tris-Cl, pH7.5; 2mmol/L EDTA),

@ ££ 65°C HH RNA WH 2min,

注意 ”破坏 RNA 的 二 级 结构 ， 使 poly(A 尾巴 更 容易 与 基质 的 碱 基 进行 配对 ， 可 以 改进 杂交 的 效果 。

@ 当 样 品 加 热 变性 时 ， 从 重 悬 的 储备 液 8” 中 取出 lmg Dynabeads oligo(dT)25 〈 通 常 200pl) 并 转移 到 不 含有 RNase 的 微型 离心 管 中 。 将 离心 管 置 于 磁铁 架 。30s 后 ， 在 离心 管 依然 置 于 磁铁 架 时 用 微型 移 液 管 彻 底 除 去 上 清 液 。

由 将 100pl 2X 结 合 缓冲 液 加 入 到 含有 磁 珠 的 微型 离心 管 中 。 同 样 ， 在 离心 管 置 于 磁铁 架 时 彻底 除去 上 清 液 。

@ 从 磁铁 架 取出 离心 管 ， 放 在 微型 离心 管 架 上 。 将 100kl 2X 结 合 缓冲 液 加 入 到 磁 珠 中 ， 轻 轻 弹 动 将 磁 珠 重 悬 。 如 果 了 NA 样品 在 第 中 步 开 始 时 已 经 在 结合 缓冲 液 中 稀释 ， 这 一 步 就 不 必 加 结合 缓 训 液 。

© 将 热 变 性 RNA 加 入 磁 珠 悬浮 液 中 ， 温 和 混合 。 在 室温 下 杂交 5min。 然 后 进行 mRNA 回收 。

(2) 直接 从 培养 细胞 分 离 boly(A)+RNA

D 按 常 规 收 集 细 胞 (105 一 107 就 足够 了 ) 。 用 冰冷 的 磷酸 盐 缓 冲 液 (137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 4. 3mmol/L Naz HPO, « 7H20, 1.4mmol/L KH2PO,) YR. BAe 移 到 微型 离心 管 中 ， 温 和 离心 〈200Xg) 沉淀 细胞 。

Q 将 沉淀 细胞 重 悬 于 100pl 裂解 缓冲 液 (10mmol/L Tris-Cl, pH 7.5; 0. 14mol/L NaCl; 5mmol/L KCl; 1% TritonX-100 或 NP-40) 中 ， 在 冰 上 放置 lmin。 如 果 需 要 ， 可 以 将 RNase 抑制 剂 加 入 裂解 缓冲 液 中 。

注意 ”也 可 以 用 其 他 常用 的 RNA 裂解 缓冲 液 代 替 。 例 如 从 固体 组 织 中 分 离 polyCA)+ 时 采用 其 他 组 THR

@ 离心 样品 30s。

© 将 上 清 液 转移 到 微型 离心 管 中 ， 置 于 冰 上 。

© 从 重 悬 的 储存 液 中 吸取 适当 体积 的 Dynabeads oligoCdT)， 转 移 到 无 RNase 的 微型 离 心 管 中 。 每 105 个 细胞 取 400pg 磁 珠 。 然 后 将 离心 管 置 于 磁铁 架 上 。30s 后 ， 用 微型 吸 液 器 将 离心 管 中 的 上 清 液 彻底 除去 。

© 将 100pl 2 义 结合 缓冲 液 加 入 含有 磁 珠 的 离心 管 中 。 在 离心 管 置 于 磁铁 架 上 的 情况 下 再 一 次 将 离心 管 里 的 上 清 液 彻底 除去 。

@O 从 磁铁 架 上 取出 离心 管 ， 用 100ul 2 勾结 合 缓冲 液 (20mmol/L Tris-Cl, pH 7.5; Imol/L LiCl; 2mmol/L EDTA; 0.4%% 一 1%% 十 二 烷 基 硫酸 钠 ) 重新 悬浮 磁 珠 。 接 着 ， 将 这 些 重 悬 的 磁 珠 转移 到 含有 细胞 裂解 液 的 离心 管 中 (来源 于 第 由 步 操 作 ) 。

温和 混合 ， 在 室温 下 杂交 5min。 然 后 进行 mRNA 回收 。

(3) 直接 从 固体 组 织 中 分 离 poly(A)+ RNA

本 方法 有 利于 直接 从 组 织 分 离 poly(A)+RNA。 利 用 这 个 方法 已 成 功 地 从 各 种 动 植物 组

© 倒置 和 弹 动 使 离心 管内 Dynabeads 储存 溶液 充分 悬浮 。 不 要 来 回 吸取 或 涡 旋 ， 因 为 这 些 操 作 会 导致 oligo(dT) 从 磁 珠 上 脱落 ， 严 重 降低 磁 珠 的 效用 。 。 82 -

第 7 章 多 聚 腺 苷 酸 RNA 的 分 离

织 分 离 boly(A)+RNA。

@ 碾 磨 已 经 在 液 氮 中 冷冻 的 组 织 〈0. 1g)。

@ 将 冷冻 的 粉末 转移 到 含有 lml 裂解 /结合 缓冲 液 (100mmol/L Tris-Cl, pH 8; 500mmol/L LiCl; 10mmol/L EDTA, pH 8; 1%LiDS 或 SDS; 5mmol/L = Si 3 Fh HE) AY aR ase

@ 彻底 匀 浆 样品 ， 当 心 不 要 产生 过 多 热量 或 起 泡 。

当心 如 果 使 用 电动 机 驱动 的 匀 浆 器 ， 必 须 采 取 厂 家 推荐 的 所 有 安全 措施 。

© 将 裂解 物 离心 30s。 将 填 清 液 转移 到 微型 离心 管 中 ， 然 后 准备 Dynabeads。

© 从 重 悬 储存 液 中 吸取 1. 5mg Dynabeads oligo(dT)25, iH # FE 300w1， 加 入 无 RNase 的 离心 管 中 。 将 离心 管 置 于 磁铁 架 上 ， 放 置 30s。 然 后 用 微型 吸 液 器 彻底 除去 离心 管 中 的 上 MK.

@ 150pl 裂解 /结合 缓冲 液 〈100mmolL Tris-Cl, pH 8; 500mmol/L LiCl; 10mmol/L EDTA, pH 8; 1%LiDS SDS; 5mmol/L 二 琉 基 苏 糖 醇 ) 加 入 含有 磁 珠 的 离 心 管 中 。 在 离心 管 置 于 磁铁 架 时 再 一 次 用 微型 吸 液 器 彻底 除去 离心 管 中 的 上 清 液 。

@ 从 磁铁 架 取 出 离心 管 ， 置 于 离心 管 架 上 。 用 150pwl 裂解 /结合 缓冲 液 重 悬 磁 珠 ， 然 后 HE EER FE ES ES OE PRA SABA SR RRND EP.

温和 混合 ， 于 室温 杂交 5min。 然 后 进行 mRNA 回收 操作 。

(4) mRNA 回收

© 将 含有 Dynabeads fl RNA 的 离心 管 置 于 磁铁 架 30s 以 上 ， 吸 出 所 有 的 上 清 液 并 转移 到 新 离心 管 中 ， 让 这 些 上 清 液 和 Dynabeads 重新 杂交 ， 以 确保 最 大 量 地 回收 poly(A)* mRNA。 如 果 没 有 必要 用 Dynabeads 重新 杂交 ， 就 可 以 将 上 清 液 简单 标记 为 poly(A) RNA 保存 ， 用 作 阴 性 对 照 。

@O) 将 离心 管 从 磁铁 架 取 出 。 用 200nl 洗涤 缓冲 液 CO. 15mol/L LiCl; 10mmol/L Tris- Cl, pH7.5; lmmol/L EDTA) 洗涤 磁 珠 。 再 将 离心 管 放 人 磁铁 架 ， 吸 去 所 有 的 洗涤 缓冲 液 。 重 复 洗涤 -去 上 清 液 操作 。

注意 ”必须 彻底 吸 去 所 有 的 上 清 液 ， 尤 其 是 在 操作 体积 很 小 的 时 候 ， 这 样 才 能 最 大 限度 回收 富 集 的 poly(A)+RNA。

@ 从 磁铁 架 取出 离心 管 ， 将 所 需 量 的 洗 脱 缓冲 液 LTE 缓冲 液 (pH 7.5) 或 无 菌 水 ] 加 入 结合 有 poly(A)* RNA 的 Dynabeads 中 。 根 据 开 始 使 用 Dynabeads 的 剂量 确定 洗 脱 组 冲 液体 积 ， 每 1Img Dynabeads 可 能 至 少 需 5pl 的 洗 脱 缓冲 液 。65C 加 热 2min 有 利于 poly (A)* RNA 与 Dynabeads 快速 而 彻底 地 分 离 。 迅 速 将 离心 管 置 于 磁铁 架 ，30s 后 ， 将 上 清 液 转移 到 另 一 个 微型 离心 管 中 并 将 该 离心 管 标记 为 poly(A) ”RNA。

® 洗 脱 的 RNA 可 以 马上 使 用 ， 也 可 以 分 装 成 合适 体积 保存 于 一 80C 和 备用。 有些 研 究 人 员 喜 欢 将 RNase 抑制 剂 加 入 RNA 溶液 中 。 但 是 对 于 除 RNase 操作 出 色 的 研究 人 员 而 言 ， 添加 RNase 抑制 剂 是 不 需要 的 。

7.6 oligo(dT)-4 @ € 4 Z #4

对 本 技术 早先 改进 的 方式 之 一 是 将 oligoCdT)- 纤 维 素 填 人 lml 结核 菌 素 注射 器 。 洗 出 液 直接 流 过 紫外 (UV) 吸收 检测 器 ， 如 ISCO UA-6 (ISCO, Inc. ，Lincoln，NE)， 该 装 。83 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

置 普 遍 用 于 蛋白 质 层 析 (图 7.3)。 随 着 RNA 从 桂子 中 流出 并 经 过 光学 检测 元 件 〈 图 7.4)，UV 光 吸 收 和 流出 液 的 RNA 浓 度 被 检测 仪 的 记录 笔记 下 。 虽 然 这 种 方法 比 这 里 介绍 的 其 他 方法 费时 ， 但 是 本 方法 可 以 很 直接 观 察 到 poly(A)* RNA 和 poly(A)” RNA 吸收 谱 的 大 小 。 除了 峰值 大 小 外 ， 洗 脱 图 谱 〈 图 7.5) 的 形状 是 RNA 质 量 和 完整 性 及 纤维 素 柱 层 析 洗 脱 效率 的 重要 指标 之 一 。 但 是 ， 本 技术 有 两 个 主要 缺点 : 中 即使 流速 缓慢 ， 从 柱 子 洗 脱 出 来 的 RNA 浴 液体 积 还 是 比较 大 ,不 利于 后 续 的 RNA 浓 缩 9，@ 不 能 检测 光 密 度 (OD) 低 于 0.1 的 图 7. 3 UA-6 紫外 吸收 检测 器 。 核酸 溶液 ， 因 此 本 技术 不 适 于 总 RNA 低 于 100~150pg ISCO, Inc. 提供 的 样品 。

吸光 率 检测 记录 仪

Ng 4H Iml = 注射 器 | | 2 三 & 二 wae 纯化 的

poly(A) RNA

7.4 纯化 大 量 poly(A)* RNA 的 方法 。oligo(dT)- 纤 维 素 装 人 lml 注射 器 中 ， 流 速 由 柱子 下 面 的 活塞 控制 。 活 塞 经 高 温 消毒 除去 了 RNase。 活 塞 下 的 针头 与 管子 结合 ， 将 洗 出 液 引入 紫外 〈UV) 检测 器 。 紫 外 检测 器 能 测定 核酸 溶液 在 254nm 波长 的 吸收 值 。 装 在 检测 器 上 的 记录 笔 偏 离 的 幅度 记录 流 过 紫外 检测 器 的 核酸 溶液 浓度 ， 每 个 样品 结合 和 洗 脱 的 情况 记录 在 图 表 纸 上 ， 即 层 析 图 谱 。 用 一 系列 试管 收集 流出 检测 器 的 洗 脱 液 。 通 常 将 收集 管 置 于 冰冻 桶 中 。 研 究 人 员 可 以 根据 图 表 记录 器 的 记录 笔 移动 确定 收集 洗 脱 液 的 准确 时 间

7.6.1 实验 方案 : 生理 量 的 poly(A)+ 了 RNA 纯化

O 戴 手 套 !

Q 根据 厂家 的 说 明 书 准备 oligo(dT)- 纤 维 素 。 典 型 的 操作 是 ， 用 3 一 5ml 洗 脱 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH7.4; 0.05% SDS®) 或 DEPC 处 理 的 水 悬浮 10mg oligo(dT)-F 4EX

注意 1g oligo(dT) -F#H XW WAFS 20~50 OD & poly(A)+ RNA, BiAMAA RRR F oligo(dT)-

@ WR RNA WERE TE KE. HAIMA RA RNA 协助 沉淀 。 但 是 这 样 操作 首先 与 mRNA 纯化 的 总 目 标 相 抵触 。 把 核酸 样品 维持 在 高 浓度 状态 是 明显 的 优势 。

@ 在 有 些 情 况 下 ， 将 SDS 加 入 洗 脱 缓冲 液 和 结合 缓冲 液 可 能 是 不 合适 的 ， 因 为 SDS 可 能 会 沉淀 ， 从 而 堵塞 层 析 柱 (尤其 是 在 有 空调 的 实验 室 !) 。 此 外 ， 残 留 的 SDS 会 使 后 续 操 作 的 酶 失 活 。 除 RNase 操作 出 色 就 不 需要 添加 SDS,

. 84 .

第 7 章 多 聚 腺 苷 酸 RNA 的 分 离

纤维 素 精 化 的 程度 。 假 定 总 RNA 样品 有 “ES RAR RICK, WAS RAR RE RNA BS 3 一 5 倍 的 oligoCdT)- 纤 维 素 结 合 polyC(A)+ RNA。 维 持 这 样 的 参数 是 很 明智 的 ， 因 为 oligo(CdT)- 纤 维 素 体积 过 大 可 能 会 改变 RNA 洗 脱 的 特点 ， 而 且 会 加 大 实验 成 本 [现在 每 克 oligo(dT)- 纤 维 素 的 售 价 是 150 美元 ]。oligo (CdT)- 纤 维 素 是 不 溶 的 ， 不 要 剧烈 搅拌 ， 也 不 要 振荡 ;而 应 该 温和 地 弹 动 或 翻转 oligo(dT)- 纤 维 素 管 ， 使 oligo(dT)- 纤 维 素 重 新 悬浮 。 如 果 起 始 的 总 RNA BK (如 10mg RNA) 可 以 使 用 含有 lml oligo(CdT)- 纤 维 素 的 大 孔径 层 析 柱 。

@ 用 消 过 毒 的 聚 酯 碎 末 填 人 lml 结核 菌 素 注 射 器 的 底部 。 注 意 只 需要 用 最 少量 的 聚 酯 碎 末 置 于 注射 器 简 的 底部 阻止 oligo(CdT)- 纤 维 素 的 流失 。 要 避免 聚 酯 碎 末 堵塞 注射 器 的 颈 部 。 也 可 改 为 将 聚 酯 碎 末 向 下 推 到 近 针 简 底 部 即 止 。

注意 ”大 多 数 嗜好 品 商店 都 有 聚 酯 碎 末 出 售 。 与 玻璃 纤维 相 比 ， 聚 酯 碎 末 易 操作 。 能 用 高 温 消毒 聚 酯 碎 末 (15min) 。 操 作 时 要 戴 手 套 。

® 用 9ine@ 的 无 核糖 核酸 酶 的 巴 斯 德 吸 液 管 将 oligo(CdT)- 纤 维 素 上 样 到 注射 器 。 让 oligo (CdT)- 纤 维 素 自 动 沉淀 于 聚 酯 碎 末 的 顶部 。oligo(CdT)- 纤 维 素 和 聚 酯 碎 末 的 总 体积 不 要 超 过 0. 1ml。

© 当 oligo(dT)- 纤 维 素 沉 淀 之 后 , 用 2 一 3ml 的 结合 缓冲 液 (500mmolL NaCl; 10mmol/L Tris, pH7.4; 0.05% SDS) 平衡 层 析 柱 ， 保 证 压 紧 oligo(CdT)- 纤 维 素 柱 。

© 将 注射 器 底部 装 上 无 菌 的 活塞 ， 用 该 活塞 调控 液体 流 过 层 析 柱 的 速度 。 重 新 用 结合 缓冲 液 淋 洗 层 析 柱 ， 保 证 聚 酯 碎 末 或 聚 酯 碎 示 上面 的 oligoCdT)- 纤 维 素 没 有 气泡 。

注意 ”到 丙 烯 树脂 活塞 能 高 温 消 毒 和 重新 使 用 ， 因 此 这 种 活塞 很 有 用 。 在 装 层 析 柱 时 ， 最 好 将 活塞 置 于 注射 器 底部 并 将 活塞 调 至 开放 状态 ， 这 样 就 不 会 于 扰 oligo(dT)- 纤 维 素 。

© 小 心地 将 无 菌 的 19 号 针头 或 钝 针头 装 在 活塞 底部 。 用 结合 缓冲 液 淋 洗 层 析 柱 ， 保 证 塞 子 中 或 塞 子 上 面 没有 气泡 存在 。

层 析 柱 的 流出 管 与 紫外 检测 器 [如 ISCO UA-6(ISCO，Inc. , Lincoln, NE)] 相连 。 该 检测 器 有 254nm 或 280nm 的 滤 光 片 。 连 接管 无 RNase， 适 合 19 号 针头 和 紫外 检测 器 流入 口 。 样 品 从 样品 池 底 部 流入 ， 项 部 流出 。 采 用 这 种 方式 ， 系 统 的 流速 仅 取 决 于 流体 静态 FEA.

注意 LH-CEREEHRRART. BRR ASD ml. poly(A) 尾巴 和 纤维 素 的 oligo 《dT)- 碱 基 配 对 需要 相对 慢 的 液体 流速 。 反 复 开 关 活塞 是 不 可 取 的 ， 因 为 反复 开关 活塞 会 扰动 oligo(dT)- 纤 维 素 。 流 出 的 oligo(CdT)- 纤 维 素 会 阻塞 检测 器 的 样品 池 ， 导 致 有 用 材料 的 流失 。 不 管 采用 什么 层 析 方 法 ， 柱子 流速 均匀 才能 达到 理想 的 分 离 效果 。

@g) 连续 用 结合 缓冲 液 淋 洗 层 析 柱 ， 直 到 流出 液 成 为 检测 基线 。 在 作者 实验 室 ， 通 常 将 灵敏 度 设 为 0.1 OD。 检 测 含量 只 有 10~200pg S RAR BE RNA 的 层 析 柱 流出 液 ， 灵 敏 度 必须 设置 在 这 个 水 平 。 检 测 所 需 的 灵敏 度 由 样品 的 RNA 含量 决定 。

注意 ”建议 将 记录 笔 的 基线 设置 在 记录 纸 的 10% 处 ， 因 为 结合 和 洗 脱 缓冲 液 折 射 系 数 的 差异 会 造成 基线 的 波动 。

@ 4 RNA #F 500~ 1000p] 结合 缓冲 液 中 。 将 RNA 溶液 加 到 层 析 柱 上 [每 克 oligo 《dT)- 纤 维 素 上 样 量 达 50mg RNA]j。 在 层 析 柱 缓冲 液 的 弯 月 面 降 至 层 析 柱 的 oligoCdT)- 纤 维 素 基 面 时 ， 即 层 析 柱 内 缓冲 液 几 近 流 干 时 ,将 RNA 溶液 吸入 无 菌 的 巴 斯 德 移 液 管 ， 并 将

@ lin=0. 0254m,

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

RNA 洲 液 仔细 地 加 到 oligo(CdT)- 纤 维 素 基 面 。 让 液体 流出 使 RNA 溶液 进入 层 析 柱 床 。 然 后 用 大 量 的 结合 缓冲 液 淋 洗 层 析 柱 。 千 万 不 能 让 层 析 柱 里 的 缓冲 液 流 干 。

建议 ”将 样品 在 65C 加 热 5min 后 ， 马 上 在 冰 上 快速 冷却 。 然 后 将 RNA 溶液 加 到 层 析 柱 上 。 加 热 处 理 能 够 破坏 RNA 的 二 级 结构 ， 有 助 于 RNA 的 poly(A) 尾巴 与 纤维 素 的 oligo(dT) 配对 。 如 果 有 RNA 二 级 结构 存在 ，poly(A) 尾巴 可 能 无 法 与 olijgo(dT)- 纤 维 素 结合 。

@ 随 着 非 poly(A)RNA 流出 层 析 柱 ， 检 测 器 的 记录 笔会 发 生 巨大 偏 移 [图 7.5(a)]。 继续 用 结合 缓冲 液 淋 洗 层 析 柱 。

图 7.5 与 oligo(dT)- 纤 维 素 poly(A)+RNA 结合 和 洗 脱 图

一 谱 。 洗 脱 液 直接 通过 ISCO UA-6(UV) 检测 器 。 灵 人 敏 度 设置 成 0.1 OD， 这 个 灵敏 度 是 检测 低 于 100kg poly(A)* mRNA 的 洗

— 脱 液 所 必需 的 。 (a) 将 溶 于 结合 缓冲 液 〈 高 盐 ) 的 细胞 质 总 RNA(150pg) 上 样 ， 用 结合 缓冲 液 连续 冲洗 柱子 ， 直 到 流出 液

215s 的 检测 数据 回 到 基线 ， 表 明 已 经 洗 去 所 有 的 非 poly(A) RNA, (b) 用 洗 脱 缓冲 液 〈 低 盐 ) 洗 脱 poly(A)* RNA。 降 解 的 RNA

(a) (b) 产生 的 洗 脱 峰 较 宽 ， 不 能 产生 明显 的 峰 形

建议 ”收集 流出 液 并 将 流出 液 再 一 次 加 到 层 析 柱 上 ， 可 以 最 大 限度 地 捕获 poly(A)+ RNA, HFA 些 polyCA)+ RNA 在 第 一 次 过 柱 时 会 流出 oligoCdT)- 纤 维 素 柱 ， 这 样 操作 可 能 有 利 。

@ 继续 用 结合 缓冲 液 淋 洗 层 析 柱 ， 直 至 检测 器 记录 笔 的 位 置 重 新 回 到 基线 。 如 果 需 要 回收 poly(A)” RNA, 应 当 把 含有 poly(A)” RNA 流出 液 收 集 到 冰 上 冷冻 的 试管 中 。

注意 工 AW poly(A)” RNA eile. AE RNA 分 子 量 标准 或 者 Northern 分 析 、 核 酸 酶 保护 分 析 以 及 PCR 类 分 析 的 阴性 对 照 。

注意 2 当 上 样 到 层 析 柱 的 RNA 溶液 含有 前 面 进 行 RNA 沉淀 所 带 和 的 大 量 盐 和 /或 基因 组 DNA 时 ， 层 析 柱 流速 会 显著 降低 。 流 速 显著 降低 表明 层 析 柱 堵 塞 ， 必 须 消 除 堵 塞 。 流 速 降低 也 可 能 是 层 析 柱 内 的 气泡 造成 的 。 在 活塞 置 于 开放 状态 时 赶 出 气泡 或 残 洒 ， 然 后 重新 调节 流速 ， 就 能 解决 这 些 问题 。 在 更 多 极端 的 例子 中 ， 玻 通 层 析 柱 ， 可 能 要 打 散 oligo(dT)- 纤 维 素 床 。 与 普通 凝 胶 过 滤 不 同 ， 亲 和 层 析 不 受 层 析 柱 形状 影响 。 因 此 打 散 oligo(dT)- 纤 维 素 床 通常 不 会 降低 柱 层 析 的 分 辩 率 。 一 旦 oligo(dT)- 纤 维 素 颗 粒 沉淀 回 到 原来 的 位 置 ， 就 可 继续 层 析 。 只 有 用 洗 脱 缓冲 液 除 去 电荷 相反 的 离子 ， 才 能 将 poly(A)* RNA 从 oligo (dT)- 纤 维 素 中 洗 脱出 来 。

B 将 第 @ 步 制备 的 洗 脱 缓冲 液 预 热 到 45C ， 洗 脱 层 析 柱 回收 poly(A)- RNA。 应 该 将 poly(A) ”RNA 洗 脱 液 回收 到 置 于 冰 桶 的 Corex 玻璃 离心 管 或 其 他 合适 的 试管 中 。 这 些 离心 管 或 试管 没有 RNase 活性 。

注意 ” 预 热 洗 脱 缓冲 液 能 大 大 促进 用 最 小 体积 的 洗 脱 缓冲 液 快速 洗 脱 poly(A)+ RNA; 大 们 喜欢 将 核酸 溶液 尽量 制备 成 高 浓度 。

@) FAO. 1 F548 FAW) 3mol/L CRA (pH 5.2) 和 .2.5 倍 体 积 95%% 的 冷 乙 醇 ， 于 一 207C 重新 沉淀 RNA。 每 107 个 细胞 可 以 回收 1 一 5pg poly(A)* mRNA,

注意 “如果 产 出 低 或 洗 脱 的 RNA 溶 液 浓度 低 ， 加 入 糖 原 可 能 有 助 于 RNA 的 重新 沉淀 。 每 毫升 poly (A)+RNA 洗 脱 液 加 入 10pl 的 10mg/ml 糖 原 溶液 ， 然 后 加 入 0. 1 倍 体 积 的 3mol/L 乙酸 钠 (pH 5.2) 和

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第 7 章 ， 多 聚 腺 苷 酸 RNA 的 分 离

2. 5 倍 体 积 95 儿 的 冷 乙醇 ， 在 一 20C 放 置 4h 以 上 。

@® FA 2~3ml 0. lmol/L NaOH 洗 洗 oligoCdT)- 纤 维 素 柱 ， 然 后 用 结合 缓冲 液 重新 平 衔 、 再 生 oligo(CdT)- 纤 维 素 。Parafilm 封口 膜 密 封 的 柱子 可 以 在 4C 保 存 于 100 一 200pl 缓冲 液 中 。 记 住 在 室温 下 保存 会 使 细菌 在 纤维 素 中 生长 。

7.7 (Ak 42 X@@ poly(A)* RNA

不 用 传统 的 柱 层 析 也 能 分 离 poly(A)+RNA。 事 实 上 ， 必 须 与 亲 和 柱 层 析 不 同 才能 完成 相对 量 少 的 起 始 RNA (典型 的 是 少 于 200kg 总 RNA) 的 分 离 。 除 了 柱 制备 和 柱 层 析 的 工作 量 大 之 外 ， 柱 层 析 最 主要 的 缺点 是 柱 层 析 难 免 会 造成 RNA HH, UZ poly(A)*RNA 占 总 RNA 的 比例 非常 少 。 如 果 产 量 极 少 或 RNA BRAM. AURA HF CON tRNA 或 糖 原 ) 则 不 可 能 沉淀 纯化 的 RNA。 但 添加 载体 的 策略 与 纯化 poly(A)* RNA WP) RAH. A 过 量 的 糖 原 与 一 些 后 续 的 RNA 应 用 相抵 触 。

另 一 种 能 够 进行 poly(A)+RNA 纯化 的 基质 是 oligo(CdT)- 微 唱 纤 维 素 (Monomer Sci- ences, Inc. , New Market，AL) 。 每 克 oligo(dT)- 微 晶 纤 维 素 通常 能 结合 100 OD (Asx6o 单 位 ) 以 上 的 poly(A) RNA。 而 标准 条 件 下 每 克 oligoCdT)- 纤 维 素 典 型 的 结合 能 力 在 50 一 80 OD。oligo(CdT)- 纤 维 素 的 实际 结合 能 力 取决 于 生产 厂商 、 产 品级 别 和 结合 缓 神 液 的 单价 阳 离子 特征 。 单 价 阳 离子 是 Lit 时 ，oligo(CdT)- 纤 维 素 结合 poly(A)+ RNA 的 容量 比 结合 缓冲 液 的 单价 阳离子 是 KK- 或 Na 的 大 。 用 传统 的 高 盐 离 子 缓冲 液 悬 浮 oligoCdT)- 纤 维 素 ， 然 后 离心 收集 olijgo(CdT)- 纤 维 素 。 如 此 反复 操作 ， 分 离 poly(A)- RNA 的 效果 最 好 。 这 样 能 避免 柱 层 析 经 常 发 生 的 流速 过 慢 现 象 。 应 该 注意 ， 建 议 不 用 oligo(CdT)- 微 唱 纤 维 素 进 行 柱 层 析 ， 除非 是 厂家 用 oligoGdT)- 微 唱 纤 维 素 预 先 充 填 的 层 析 柱 。 如 果 按 比例 减 小 ， 可 以 在 微型 离心 管 中 完 成 polyC(A)+ RNA 的 分 离 。 因 此 ， 能 用 很 小 体积 的 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 poly(A) * RNA, 所 获得 的 RNA 溶 液 不 必 添 加 额外 的 载体 就 能 直接 用 盐 和 乙醇 沉淀 洗 脱 的 RNA 分 子 。

作者 对 一 种 oligo(CdT)- 微 晶 纤 维 素 分 离 RNA 方法 进行 了 修改 ， 下 面 介 绍 这 个 修改 后 的 方法 。 虽 然 标 准 的 oligo(CdT)- 纤 维 素 层 析 也 采用 类 似 的 方法 ， 但 是 oligo(CdT)- 纤 维 素 〈 微 晶 级 ) 层 析 回收 poly(A)* RNA 容量 最 大 。 注 意 ， 在 所 有 操作 中 必须 严格 控制 RNase 活性 ， 高 质 高 量 地 回收 poly(A)+RNA。

7.7.1 实验 方案 : 快速 非 柱 式 纯化 poly(A)+RNA

OQ 戴 手 套 !

@ 称 取 适 量 的 oligo(dT)- 微 晶 纤 维 素 。 每 150ug 总 RNA 需要 100mg (FH) 的 oligo (CdT)- 微 唱 纤 维 素 。 将 oligo(CdT)- 微 晶 纤 维 素 置 于 无 核酸 酶 污染 的 微型 离心 管 中 。

注意 必须 在 无 RNase 的 条 件 下 称 量 oligo(dT)- 微 晶 纤 维 素 。 虽 然 高 压 灭 菌 或 烘 干 的 钢 铂 没有 RNase 活性 ， 但 是 温和 地 殴 动 试剂 瓶 底部 ， 让 oligo(CdT)- 微 晶 纤 维 素 从 试剂 瓶 内 移出 进行 称 量 要 好 得 多 。

@ 将 500ul 44 A Bh YK (500mmol/L LiCl; 100mmol/L Tris-Cl, pH 7.5; 1mmol/L EDTA; 最 好 还 有 0.05% SDS) 加 入 oligo(dT) -fk MAHA PS, 3 AF 4ES 5min 。

© BOCA EWM oligo(dT)-thimA 4A. BoA 200X g, 30s 内 完成 。 在 不 干 扰 oligo(dT )- jh an ZF EA LE A ROL. FA RS ERO Ach FY ks APE Re 备用 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

© 在 另 一 个 离心 管 中 ，DEPC 处 理 的 水 溶解 RNA， 终 体积 100nl。 在 65 加 热 5min。

注意 ”在 本 实验 方法 和 其 他 相关 的 实验 方法 中 ，RNA 溶液 必须 加 热 变 性 ,使 poly(A) 结构 能 更 有 效 地 与 纤维 素 的 oligoCdT)- 碱 基 配 对 。

© 将 等 体积 的 结合 缓冲 液 加 入 热 变性 RNA 溶液 中 ,使 RNA 溶液 降 至 室温 。 将 RNA 溶液 加 入 第 由 步 制 备 的 oligo(CdT)- 微 唱 纤 维 素 中 。

@) 将 离心 管 置 于 微型 离心 管 架 上 ， 在 室温 下 放置 5min。 在 此 期 间 ， 用 手 温 和 地 揪 动 离 ty 1~2 *K.,

1500X g 离心 5min 〈 如 果 可 能 ， 在 4C 离 心 )。 仔 细 地 将 上 清 液 转移 到 一 个 干净 的 离 心 管 中 ， 标 上 “poly(A)-RNA。” 将 该 离心 管 置 于 冰 上 。

注意 工 ”如果 结 合 缓冲 液 含有 SDS， 最 好 在 室温 下 离心 。 离 心 温度 不 得 低 于 15C， 香 则 会 发 生 SDS 沉淀 。

注意 2 在 各 种 实验 中 用 poly(A)” RNA 作为 阴性 对 照 是 很 有 用 的 。poly(A)- RNA 也 可 以 作为 载 体 RNA。

© 用 结合 缓冲 液 洗涤 oligo(dT)- 微 晶 纤 维 素 5 次 ， 每 次 500nl。 每 次 洗涤 后 ， 在 1500 5 离心 ， 除 去 上 清 液 。

@ 用 洗 脱 缓冲 液 (10mmol/L Tris-Cl, pH7.5; lmmol/L EDTA; 0.05% SDS) 从 oligoCdT)- 微 晶 纤 维 素 洗 出 poly(A)+RNA， 一 至 几 次 ， 每 次 50k1。 也 可 以 用 DEPC 处 理 的 水 洗 脱 poly(A)* RNA,

注意 ”所 需 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 次 数 取 决 于 纤维 素 所 结合 的 poly(A)+ RNA 量 和 每 次 洗 脱 所 用 的 缓冲 液 体积 。 第 一 次 洗 脱 溶液 含有 大 多 数 poly(A)+ RNA, BRL. RHA AR) th A Bh MEM poly (CA)+RNA 很 有 用 。 应 该 在 一 个 或 多 个 微型 离心 管 中 重 新 沉淀 RNA。 加 入 0.1 倍 体积 3mol/L NaAc (pH5. 2) 和 2.5 倍 体积 95%% 冷 乙醇 ， 然 后 将 RNA 溶液 置 于 干冰 20min K—20C 4h 以 上 重新 沉淀 RNA.

@ 在 RNA 沉 淀 和 离心 后 ， 仔 细 地 倒 出 乙醇 上 清 液 。 用 70%% 乙 醇 用 无 菌 水 配制 ) BE 涤 RNA 沉淀 2~3 次 ， 每 次 500xl。 最 后 用 95%% 乙 醇 洗 涤 可 能 有 利于 RNA 沉淀 在 空气 中 王 燥 。 用 最 小 体积 的 TE 缓冲 液 (pH 7.5) 或 无 菌 水 重 悬 RNA。

@ 四 按照 第 8 章 介绍 的 方法 测定 poly(A)” RNA 溶液 的 Azeo。

田 将 RNA 溶 液 分 装 ， 保 存 于 一 80C 备 用 。

7.8 和 参考 文献

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第 7 章 多 聚 腺 背 酸 RNA 的 分 离

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(刘建华 郑 艳 译 ; SH FAR)

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SE RNA BWR SE il

8.1 £A FE

用 纯化 的 RNA 样品 进行 后 续 研 究 必 须 评价 其 质量 。 尤 其 重要 的 是 ， 要 肯定 mRNA 组 分 的 完整 性 。 由 于 纯化 RNA 的 后 续 应 用 费用 高 、 工 作 量 大 ， 因 此 在 确定 mRNA 完整 性 时 要 特别 慎重 。 这 样 才 能 使 后 续 的 RNA 应 用 试验 能 产生 最 好 的 结果 。 如 同人 们 不 能 用 腐烂 的 木头 建造 房子 那样 ， 研 究 人 员 也 不 能 用 含量 无 法 检测 的 或 者 降解 了 的 RNA 进行 后 续 研 究 。

有 多 种 方法 检测 纯化 RNA 的 完整 性 和 RNA 的 总 体质 量 。 有 些 检测 方法 ， 可 以 用 作 RNA 后 续 应 用 的 阳性 对 照 。 在 下 面 所 要 介绍 的 方法 中 ，RNA 纯化 后 要 立即 检测 其 电泳 图 谱 《质量 控制 技术 1) 。 而 且 ， 如 果 已 经 将 RNA 保存 了 一 段 时 间 ， 使 用 前 要 重新 检测 RNA 的 电泳 图 谱 。 用 试剂 盒 纯化 的 或 者 已 经 保存 几 个 月 《〈 即 使 在 一 80C 保存) 的 RNA， 即 使 以 前 电泳 鉴定 合格 的 RNA， 其 质量 也 不 一 定 有 保障 。

8.2 质量 控制 技术 1 RNA 的 电 沪 检 测

总 的 来 说 ，RNA 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 是 判断 RNA 质量 最 好 的 检测 方法 。 附 录 13 和 第 10 章 分 别 介绍 了 电泳 的 参数 和 操作 方法 。 有 生物 活性 的 整 分 子 RNA， 变 性 后 的 电泳 条 带 独 特 。 RNA 变性 容易 ， 只 需 在 上 样 前 将 RNA 样品 简单 加 热 。

28S 核糖 体 RNA(CrRNA) 和 18S rRNA 的 奖 光 比值 ， 是 判断 RNA 样品 可 用 性 的 最 好 指标 。 对 哺乳 动物 RNA 而 言 ， 该 荧光 比值 至 少 是 2 : 1。 如 果 荧 光 比 值 达到 甚至 超过 2.5: 1 就 更 好 。 根 据 作 者 个 人 和 其 他 研究 人 员 的 经 验 ，28S rRNA 和 18S rRNA 的 荧光 比值 越 小 ， 样 品 的 代表 性 就 越 差 ， 实 验 结果 的 可 重 现 性 就 越 低 。 可 以 仅 用 “目测 ”的 方法 估计 28S rRNA 和 18S rRNA 凝 胶 条 带 的 荧光 比值 ， 但 如 果 需 要 ， 用 成 像 分 析 软 件 确定 28S rRNA 和 18S rRNA 的 荧光 比 值 。 对 高 等 真 核 生 物 而 言 ，28S rRNA 和 18S rRNA 的 效 光 比值 越 大 越 好 。 但 要 记 住 电泳 图 谱 其 他 特征 也 很 重要 。

最 好 的 RNACeRNA) 样品 ， 其 电泳 图 谱 的 28S rRNA 和 18S rRNA 条 带 之 间 、 条 带 上 方 和 条 带 下 方 几乎 没有 弥散 。 电 泳 时 转移 RNACtRNA) 和 低 分 子 量 的 5S rRNA 和 5.8S rRNA 处 于 凝 胶 的 前 端 。 在 染色 后 这 些小 分 子 RNA 条 带 处 于 溴 酚 蓝 附 近 ， 其 位 置 与 溴 酚 蓝 很 难 分 开 。 如 果 28S rRNA 和 18S rRNA 的 电泳 条 带 不 清晰 ， 说 明 RNA 样品 有 核酸 酶 污染 ， 尤 其 是 凝 胶 的 下 半 部 ， 即 分 子 量 低 于 18S rRNA 的 区 域 ， 出 现 条 带 弥散 现象 。 如 果 整 块 凝 胶 上 都 有 严 重 的 弥散 现象 ， 说 明 RNA 样品 已 经 发 生 有 限 的 降解 。 但 是 ， 凝 胶 电泳 条 带 严重 弥散 也 可 能

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第 8 章 RNA 制 备 的 质量 控制

是 上 样 前 RNA 变性 不 充分 ， 还 有 就 是 RNA 二 级 结构 的 存在 。 而 且 ， 作 者 还 注意 到 没有 完 全 溶解 的 RNA 电泳 时 ， 会 出 现 第 6 章 描述 的 特征 性 拖 尾 现象 。 虽 然 前 面 说 过 ， 核 酸 储存 液 浓度 越 高 越 好 ， 但 必须 确定 RNA 或 DNA 已 经 被 彻底 溶解 。 只 有 这 样 ， 每 次 从 核酸 储存 液 取出 的 适量 液体 才 有 代表 性 。 含 有 去 污 剂 和 过 量 盐 的 核酸 样品 ， 电 泳 时 也 会 出 现 RNA 条 带 弥散 。 有 时 候 这些 组 分 会 阻止 RNA 分 子 进 入 凝 胶 。 如 果 经 常 出 现 这 种 现象 ， 用 N- 十 二 烷 基 肌 氮 酸 钠 (sarkosyl) 可 以 缓解 变性 剂 造成 的 问题 。 如 果 操 作 不 仔细 没有 除去 DNA®, Ja 者 将 与 RNA FYE CANS 5 章 和 附录 5 所 描述 的 ) ， 这 些 污染 DNA 将 对 后 续 的 RNA 应 用 产生 严重 影响 。

Northern 分 析 最 好 添加 甲醛 和 甲 酰胺 。 甲 醛 和 甲 酰胺 使 在 非 变性 条 件 下 电泳 的 核糖 体 RNA 条 带 非常 明显 。 必 须 注意 ， 添 加 50%% 甲 酰胺 或 2mol/L 尿素 有 利于 样品 变性 ， 使 益 胶 电 泳 图 谱 清晰 可 辨 。 而 没有 添加 变性 剂 的 凝 胶 电 泳 图 谱 模糊 难 辨 。 肉 眼 观测 含量 丰富 HY) 28S rRNA ffl 18S rRNA 条 带 ， 可 以 确定 RNA 样品 的 完整 性 CA 8.1).

28S Bo 18S

(a) (b)

Al 8.1 RNA 样 品 完整 性 检测 Ca) 从 Swiss 鼠 313 成 纤维 细胞 分 离 的 RNA,， 在 微型 琼脂 糖 凝 胶 (7cmX8cm) 电泳 的 图 谱 。 每 个 样品 槽 上 样 5wg 纯化 RNA, BeBe ze 1. 2 办 琼脂 糖 -甲醛 凝 胶 ， 电 沪 条 件 是 电压 50V， 电 泳 1. 5h。 电 泳 后 用 SYBR 绿 工 娄 色 凝 胶 。 在 泳 道 1~6, 28S 和 18S 的 核糖 体 RNACrRNA) 条 带 清晰 ，28S rRNA 荧光 强 说 明 RNA 样品 是 完整 的 。(b) 人 成 纤维 细胞 RNA， 在 微型 琼脂 糖 凝 胶 〈6cmX9cm) 电泳 的 图 谱 。 泳 道 1 是 RNA 分 子 量 标准 ， 泳 道 2~5 是 四 份 来 源 不 同 的 人 成 纤维 细胞 RNA 样品 。 凝 胶 是 1. 2 儿 琼 脂 糖 -甲醛 凝 胶 。 电 泳 条 件 是 电压 50V， 电 泳 1. 5h。 电 泳 后 用 省 化 乙 锭 染色 凝 胶 。 泳 道 2 一 5 显示 样品 的 降解 程度 逐步 加 大 ， 最 可 能 是 分 离 RNA 时 有 RNase 污染 。 这 是 应 该 避免 的

用 省 化 乙 锭 或 SYBR RY Abt, RNA 族 胶 电泳 图 谱 上 ， 加 样 孔 内 和 紧 挨 着 的 下 方 ， 出 现 的 荧光 是 污染 的 基因 组 DNA (图 8.2)。 出 现 这 种 现象 时 ， 明 智 的 做 法 是 在 定量 分 析 RNA 样品 前 ， 确 定 这 种 现象 是 否 因 DNA 含量 过 高 引起 的 。 当 然 ， 没 有 出 现 高 分 子 量 荧光 条 带 ， 并 不 意味 着 RNA 样品 没有 DNA 污染 ， 有 可 能 是 DNA 的 含量 低 于 检测 水 平 。 由 于 污染 DNA 也 可 以 作为 模板 ， 因 此 污染 DNA 对 大 多 数 基 于 RNA 的 聚合 酶 链 反 应 有 严重 的 负面 影响 。 唯 一 可 靠 的 消除 RNA 样品 中 污染 DNA 的 方法 ， 是 用 不 含 RNase 的 DNase 处 理 样品 。 同 时 要 有 相应 的 对 照 证 明 DNA 被 彻底 除去 ， 例 如 第 19 章 介 绍 的 不 加 反 转 录 酶 的 聚

@ 从 RNA 样 品 除去 DNA 的 方法 包括 完整 细胞 核 差 异 离心 ， 用 不 含 RNase 的 DNase 工 处 理 核酸 样品 ， 用 酸 - 醇 反 复 抽 提 ，RNA 的 等 密度 离心 ， 或 者 将 以 上 方法 结合 使 用 。 。 91 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

合 酶 链 反 应 ， 除 非 有 DNA 存在 ， 否 则 不 会 产生 PCR AW. 8.2.1 实验 方案

用 标准 的 、 非 变性 的 1. 2%% 琼 脂 糖 凝 胶 “〈 胶 面积 : 7cm X 8cm) 电泳 可 以 确定 RNA 的 完整 性 。 电 泳 前 加 热 变 性 RNA, 迅速 加 样 电泳 以 消除 二 级 结构 的 影响 。

D 琼脂 糖 悬 浮 于 1XTAE 缓冲 液 ?， 融 化 制 成 1.2 近 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 。 当 凝 胶 冷却 到 65C 时 倒 胶 。

注意 “如果 需要 ， 可 以 将 溴 化 乙 锭 直接 加 入 融化 的 凝 胶 至 终 浓 度 为 0. 5ng/ml。 这 样 ， 电 泳 结 束 后 能 直接 检测 凝 胶 。SYBR 绿 在 电泳 前 不

ATLA ABER, ZI SYBR 绿 会 造成 核酸 条 带宽 ， 不 清晰 。 只 有 在 电 汪 1. FABRE peg 4 cypR pay ea pe

ee ee © 在 凝 胶 凝 固 的 过 程 中 ， 用 10 pl 无 菌 水 或 TE 缓冲 液 稀释 eae: 1~5yg RNA.

注意 如果 加 热 难以 使 RNA 变性 ,那么 每 10kl RNA 溶液 加 入 2.5ml 甲醛 37%) 和 5. 0pl 甲 酰胺 。 使 用 甲醛 和 甲 酰胺 时 ， 要 根据 厂商 提供 的 安全 资料 (MSDS) 在 通风 橱 中 小 心 操作 。 此 外 ， 也 可 以 将 甲 酰胺 或 2mol/L 尿素 单独 加 入 RNA 样品 中 。

@ 在 65C 加 热 RNA 浴 液 5min， 简 单 离心 将 样品 甩 到 离心 管 底部 。

® MA lxl 10X 上 样 缓冲 液 (50% Hh, Immol/L EDTA, 0.25% 溴 酚 蓝 )， 然 后 加 样 到 凝 胶 上 。

注意 工 如 果 在 RNA 样品 中 加 入 了 甲醛 和 甲 酰胺 ， 就 用 2pl 上 样 缓冲 液 。

注意 2 ”不必 使 用 分 子 量 标准 ; 本 实验 只 是 快速 检测 RNA 分 子 是 否 完整 。

@ 用 75 一 100V 电压 电泳 至 染料 在 效 胶 内 泳 动 2 一 3cm。 要 观测 凝 胶 内 样品 分 离 的 情况 就 得 电泳 这 么 长 的 时 间 。 不 过 ， 电 泳 更 长 的 时 间 能 够 提高 凝 胶 的 分 辩 率 。

© 除非 将 染料 直接 加 入 琼脂 糖 ， 否 则 就 要 用 省 化 乙 锭 〈0.5pg/ml) 水 溶液 染 凝 胶 10min。 或 者 用 SYBR & II 4 HERE 25 一 30min。 照 通常 的 做 法 检测 RNA 样品 是 否 降 解 和 . 有 无 DNA 污染 。

注意 1 省 化 乙 锭 是 突变 剂 ， 必 须 小 心 操作 ， 适 当 处 理 〈 附 录 4) 。

注意 2 ”使 用 紫外 线 透射 仪 或 便携 紫外 灯 (UV) 时 ， 要 保护 眼睛 和 皮肤 免 受 紫外 线 伤害 。

@) 若 检测 RNA 样品 质量 ， 用 紫外 可 见 光 成 像 系 统 拍照 存档 〈 第 11 章 ) 作为 后 续 RNA 使 用 的 参考 ， 这 点 极其 重要 。

8.2 RNA 样品 用 SYBR

8.3 质量 控制 技术 2: SARI KEMBEAzAG

用 吸收 光谱 确定 样品 的 RNA 含量 ， 工 作 量 最 小 。 用 UV 吸收 光谱 能 直接 测定 核酸 的 浓 度 和 纯度 ， 间 接 计算 生物 材料 的 核酸 总 量 ， 甚 至 一 个 细胞 的 RNA 总 量 〈 如 果 知 道 分 离 起 始

@ 每 升 50XTAE 缓冲 液 含 有 242g Tris 碱 ; 100ml 0.5mol/L Naz-EDTA, pH 8.0; 57. 1ml KARR. BE KA. Me 化 琼脂 糖 用 1XTAE 绥 冲 液 ， 电 泳 缓 冲 液 也 是 1XTAE。 全

第 8 章 RNA 制 备 的 质量 控制

时 大 致 的 细胞 数量 )。 此 外 ， 纯 化 的 核酸 样品 在 230 一 320nm 之 间 有 特征 性 吸收 谱 “〈 图 8.3)。 偏 离 了 标准 曲线 的 形状 ， 即 峰 位 的 偶 离 ， 表 明 样 品 有 污染 。 由 于 实际 投入 的 RNA 量 与 大 多 数 后 续 的 RNA 应 用 密切 相关 ， 因 此 绝对 不 能 忽视 RNA 样品 UV 吸收 光谱 的 重 要 性 。

8.3.1 核酸 浓度 和 纯度 的 鉴定

核酸 操作 的 成 功率 ， 严 重 依赖 于 反应 中 的 核酸 量 和 纯度 。 研 究 某 一 基因 表达 的 上 游 或 下 图 8.3 纯化 RNA 典型 的 紫外 《〈UV) 吸收 光谱 。 游 调 节 时 ， 必 须 建 立 样品 数据 标准 化 的 基础 。 纯化 DNA 的 紫外 吸收 光谱 与 此 类 似 。 注 意 低 于 普 先 要 标准 化 加 天 RNA WE. 然后 ， 酶 /引物 /，，260"m 的 吸收 详 是 咎 上 借 斜 的 自 线 ， 而 高 于 RNA 模板 的 比值 要 固定 [该 比值 是 RNA 高 效 aly ee 反 转 录 成 互补 DNACCDNA) 的 关键 ]。 因 此 ， 必 须知 道 模 板 的 精确 浓度 。 纯 化 RNA 或 DNA 样品 时 ， 记 录 至 少 要 包括 样品 的 浓度 、 纯 度 和 完整 性 。

8.3.1.1 Moe HHH

利用 核酸 吸收 紫外 线 和 260nm 吸收 值 最 大 的 特性 ， 确 定 DNA 和 RNA 样品 的 浓度 和 纯 度 。 根 据 260nm 波长 的 吸收 值 ， 直 接 计算 样品 的 核酸 浓度 :

[RNA ]pg/ml= Azgo X 稀 释 倍 数 X40.0 KP Asz6o 260nm 的 吸收 值 〈 光 密度 ); 稀释 倍数 一 一 稀释 因子 〈 通 常 是 200 一 500) ; 40. 0 一 一 RNA 的 平均 吸收 系数 。 同样 ， 也 可 以 用 相似 的 方法 确定 DNA 样品 浓度 : [DNA ]pg/ml= Azgo X Fe REFER X 50. 0 式 中 Asz6o 260nm 的 吸收 值 〈 光 密度 ) ; 稀释 倍数 一 一 稀释 因子 GH HE 200~500); 50. 0 一 一 双 链 DNA- 的 平均 吸收 系数 。

WER, Ei RNA 和 DNA 浓度 计算 公式 所 得 数据 的 单位 是 wg/ml。 对 分 子 生 物 学 RAG, UREA ILA pe/pl 表示 比较 方便 ， 进 行 样品 稀释 的 数学 计算 简单 。 记 住 上 述 公 式 所 得 数据 要 除 以 1000， 就 是 浓度 单位 为 pe/pl 的 数据 。

为 了 更 精确 地 确定 核酸 浓度 ， 若 已 知 分 子 的 〈G 十 C) 含量 ， 就 可 以 用 Beer 法 则 @ 计 算 特定 RNA 或 DNA 的 吸收 系数 。 在 大 多 数 情况 下 ， 分 子 生 物 学 将 40.0 和 50.0 分 别 作 为 RNA 和 DNA 的 平均 吸收 系数 。 由 于 胸腺 喀 喧 和 尿 喀 啶 的 吸收 系数 不 同 ，DNA 污染 了 的 RNA 样品 或 RNA 污染 了 的 DNA 样品 ， 用 紫外 吸收 光谱 计算 样品 的 浓度 ， 就 会 偏 高 或 偏 低 。 用 40ug/ml RNase 于 37C 处 理 DNA 样品 30min， 然 后 重新 沉淀 DNA， 可 以 彻底 除去

@ 根据 Bouguer-Beer 法 则 GH PMH Beer 法 则 ) ，A=spc，A 是 吸收 值 ; es 是 摩尔 吸收 系数 ; 0 是 光 径 长 度 ; c EMR 光 物 质 的 浓度 ， 例 如 腺 味 叭 核 苷 、 胞 喀 啶 核 苷 、 鸟 味 叭 核 苷 、 胸 腺 喀 啶 核 苷 和 屎 喀 啶 核 苷 。 BSH M AAAI eA, 因为 Aror=Ali 十 A: 十 As 十 …， 可 以 计算 出 核酸 混合 物 的 吸收 系数 。 例 如 ， 人 类 RNA 吸收 系数 的 精确 值 是 44. 19 。 站 93 e

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

DNA 样品 中 的 RNA。 此 外 ， 如 果 污 染 了 RNA，DNA 分 子 的 电泳 迁移 率 通 常会 增加 ， 这 样 会 使 DNA 片段 长 度 的 估计 偏 低 。 同 样 ， 用 没有 RNase 污染 的 DNase 处 理 RNA 样品 ， 能 够 彻底 除去 RNA 样品 中 污染 的 DNA 分 子 。

最 好 将 核酸 样品 按照 (1 : 200)~(1 : 500) 稀释 ， 然 后 用 酸 洗 过 的 石英 比 色 严 @ 测 定 核 酸 溶液 的 紫外 吸收 。 现 在 广 商 提供 新 一 代 一 次 性 使 用 的 塑料 比 色 焉 ， 可 以 用 这 种 比 色 严 测 定 核酸 样品 的 紫外 吸收 。 由 于 有 些 塑料 比 色 严 不 是 紫外 级 的 ， 因 此 定购 前 要 仔细 阅读 塑料 比 色 ML AY 7" tia ST AA 。

许多 更 新 的 分 光 光 度 计 有 能 够 测量 少 至 lL 样品 的 比 色 焉 。 尽 管 大 家 都 喜欢 ， 但 这 样 的 设备 非常 昂贵 ， 超 出 了 经 费 并 不 宽裕 实验 室 的 支配 能 力 。 如 果 需 要 ， 用 1 一 5mmol/L 磷酸 组 冲 液 (Naz HPO4) Bk TE 缓冲 液 稀释 核酸 样品 〈 不 要 用 水 稀释 )， 并 用 相同 的 缓冲 液 将 分 光 光度 计 调 零 。 e

过 去 几 年 有 人 对 Azeo/Azso 的 比值 作为 核酸 纯度 指标 提出 质疑 CGlasel, 1995; Huberman, 1995; Manchester, 1995; Manchester，1996) Wilfinger 等 (1997) 证 实 稀释 剂 的 pH 会 影响 核酸 Azxio/Azso 的 比值 ，pH 在 7.5 一 8.5 之 间 用 Azxio/Asso 的 比值 检测 核酸 纯度 最 可 靠 。 现 在 大 家 常用 缓冲 液 〈 如 磷酸 ) 将 DNA 和 RNA 样品 稀释 ， 使 溶液 的 pH 处 于 这 个 范围 。 记 住 生物 化 学 级 的 水 ， 其 pH 6. 0 左右， 有 微弱 酸性 ， 不 是 精确 测定 核酸 浓度 的 最 好 溶剂 。

用 这 种 方式 测定 核酸 浓度 时 ， 必 有 需 使 用 样品 量 至 少 要 达到 分 光 光 度 计 制 造 商 所 推荐 的 最 低 吸 收 值 。 例 如 ， 一 些 老式 分 光 光 度 计 在 吸收 值 COD) 低 于 0. 1 时 是 不 可 靠 的 。 如 果 使 用 体积 较 大 的 比 色 下 ， 尽 管 使 用 测量 必需 的 最 小 体积 ， 也 避免 不 了 样品 稀释 。 这 种 稀释 常常 造 成 样品 稀释 过 度 而 无 法 测量 。 尽 管 价 格 昂贵 ， 最 好 还 是 购买 体积 小 的 石英 比 色 中。 同样 重要 的 是 ， 必 须 清楚 溶液 的 吸收 值 体 现 样 品 的 核酸 总 量 ， 而 不 是 某 一 种 核酸 组 分 〈 如 总 细胞 RNA 混合 物 中 的 mRNA) 的 单独 贡献 。

用 Axzio 测 定 核 酸 样品 浓度 ， 不 能 了 解 样 品 的 质量 和 纯度 。 如 果 盐 过 量 、 有 有 蛋 白质 污 染 和 /或 有 机 溶剂 过 量 ， 紫 外 吸收 值 偏离 明显 。 因 此 ， 用 Azso/Azsgo 和 Azio/Azso 的 比值 ， 能 合 理 判 断 样品 的 纯度 。 纯 RNA 样品 的 Azxio/Aszso 的 比值 是 2.0 士 0.1， 纯 DNA 样品 的 Azso/ Aszso 的 比值 为 1. 8 士 0.1。 不 管 是 RNA 还 是 DNA，Aszio/Azso 的 比值 应 大 于 2.0 但 水 于 2. 4. Asz6o/Azso 的 比值 不 在 这 个 范围 的 说 明 样 品 有 污染 ， 必 须 采 取 一 些 纠正 措施 。 通 常 Azso/Azso 数值 低 ， 表 明 分 离 的 RNA 有 和 蛋白质 污 染 。Aszso/Azso 数 值 低 则 可 能 有 股 盐 〈 来 自 细 胞 裂解 组 冲 液 ) Bk BRAC ATS He. WER 〈 来 自 细胞 裂解 缓冲 液 ) 或 8 琉 基 乙醇 污染 的 问题 ， 比 大 多 数 人 想象 的 要 严重 得 多 。 除 去 过 量 肛 盐 的 方法 ， 是 用 乙酸 钠 和 乙醇 重新 沉 演 RNA， 然 后 用 70%% 乙 醇 清 洗 沉 淀 2 一 3 次 。 如 果 Azso/Aszso 的 比值 大 于 2.4， 采 用 这 种 方法 重新 沉淀 RNA 样品 。 如 果 是 植物 RNA， 低 Azio/Azso 的 比值 可 能 表明 有 多 聚 糖 的 污染 。

RNA 分 离 时 另 一 个 经 常 碰 到 的 问题 ， 是 看 百 质 寺 陈 不 条 厌 ”蛋白质 的 存在 会 增加 样品 在 280nm 波长 的 吸收 值 ，Azeo/Azso 的 比值 降低 ， 是 样品 纯度 有 问题 的 可 靠 指标 。 者 蛋白 质 抽 提 不 彻底 ， 必 须 将 样品 CDNA 或 RNA) YF 100~200ul 消毒 了 的 缓冲 液 〈 不 含 核 酸 酶 ) 中 ， 用 等 体积 的 葵 酚 : 氯仿 : 异 戊 醇 (25 : 24 : 1) 抽 提 一 次 ， 再 用 等 体积 的 氯仿 或 者 氯仿 : 异 MORE (24:1) 抽 提 一 次 。 如 果 在 下 层 有 机 相 和 上 层 水 相 之 间 有 和 蛋白 质 层 存在 ， 无 论 这 层 蛋

© 将 石英 比 色 正在 铬 酸 中 浸泡 ， 再 用 不 含 核酸 酶 的 消毒 水 彻底 冲 淋 ， 能 有 效 地 清洗 石英 比 色 到 。 操 作 铬 酸 时 要 极其 小 心 。

。 94 -

第 8 章 RNA 制 备 的 质量 控制

白质 多 小 ， 都 清楚 表明 样品 有 蛋白 质 污染 。 若 RNA 样品 体积 大 ， 可 以 重新 沉淀 提高 核酸 浓 度 。 但 是 ， 这 样 操作 是 有 代价 的 ， 反 复 沉 淀 会 损伤 样品 的 稳定 性 和 回收 率 ， 还 有 引入 核酸 酶 污染 的 风险 。 如 果 增 加 抽 提 次 数 是 必需 的 ， 而 且 能 够 消除 后 续 RNA 应 用 所 碰 到 的 问题 ， 那 么 在 RNA 分 离 过 程 中 多 做 一 次 去 除 蛋 白质 污染 的 苯酚 : 氯仿 抽 提 是 值得 的 。RNA 沉淀 用 70%% 一 75%% 乙 醇 洗 桨 ， 用 前 面 介绍 的 方法 测定 核酸 浓度 。

尽管 特定 样品 的 Azso/Azso 和 Axzso/Azso 数 值 是 核酸 样品 质量 的 优秀 指标 ， 但 是 核酸 样品 的 紫外 吸收 谱 通常 是 230 一 320nm 之 间 的 紫外 吸收 光谱 也 非常 重要 。 核 酸 纯 品 的 紫外 吸收 光谱 是 偏 斜 的 钟 形 曲线 CAL 8. 3) ， 最 大 吸收 峰 接 近 260nm。320nm 的 紫外 线 吸收 值 是 0， 即 吸收 光谱 曲线 回 到 基线 。 波 长 小 于 230nm 的 紫外 吸收 特性 对 于 测定 核酸 浓度 和 纯度 几乎 没有 意义 。 高 质量 的 核酸 样品 的 紫外 吸收 光谱 ， 其 波长 低 于 260nm 区 域 是 上 升 的 斜 线 ， 波 长 高 于 260nm 区 域 是 下 降 的 斜 线 。 如 果 只 测定 260~280nm 之 间 的 紫外 吸收 光谱 ， 就 很 难 观 察 到 这 一 特征 。

做 这 些 初步 分 析 确 定 核酸 质量 的 理由 是 非常 明显 的 。 不 用 紫外 分 光 光 度 计 很 难 确定 样品 的 核酸 量 ， 也 无 法 比较 不 同样 品 的 核酸 含量 。 不 测定 Azio/Aszso 的 比值 ， 就 不 能 迅速 确定 核 酸 样品 有 无 其 他 物质 污染 。 如 果 不 扫描 230~320nm 之 间 的 紫外 吸收 ， 就 不 知道 吸收 光谱 曲 线 的 形状 。 常 常 注意 到 ， 污 染 物 除了 改变 260nm 和 280nm 紫外 吸收 值 外 ， 还 会 改变 230~ 320nm 之 间 的 紫外 吸收 曲线 的 形状 特征 。 例 如 ， 过 量 的 盐 〈 核 酸 共 沉 淀 )- 会 掩盖 240~ 260nm 之 间 的 紫外 吸收 光谱 的 正 向 倾斜 特征 。 离 心 后 迅速 用 70%% 一 75%% 乙 醇 洗 涤 核 酸 沉 演 《如 同一 些 实验 方法 所 建议 的 ) 可 以 去 除 大 部 分 盐 9。 前 面 步骤 用 这 些 盐 促 进 核酸 沉淀 。 有 时 人 们 用 透析 方法 除去 核酸 样品 中 过 量 的 盐 。 没 有 ae 3 A>, (adie AG 波长 扫描 设备 ， 就 不 能 迅速 确定 样品 是 否 含有 过 量 盐 ， 也 不 知道 过 量 盐 对 RNA 后 续 应 用 的 不 利 影响 。

8.3.1.2 2 光度 计 测 定 充 法

若 没有 价格 昂贵 的 分 光 光 度 计 ， 或 者 样品 的 核 酸 含量 太 少 ， 至 少 还 有 三 种 不 够 精细 的 方法 可 以 用 来 测定 样品 中 核酸 的 浓度 。

凝 胶 电泳 后 ， 将 待 测 核酸 的 荧光 强度 与 含量 已 知 核酸 的 荧光 强度 比较 ， 用 分 子 生 物 学 实验 室 流 图 8.4 与 标准 质量 的 DNA 稀释 溶液 比较 ， 行 的 图 像 分 析 软 件 确定 核酸 含量 。 可 以 从 广 商 购买 ”确定 待 测 核酸 样品 的 浓度 。 用 2. SO BRAS RE 含量 已 知 的 核酸 作为 标准 。 常 用 的 标准 是 @X174 胶 进行 电泳 。1 是 Wl 浓度 未 知 的 核酸 溶液 ; 2 DNA 或 XDNA。 将 这 些 DNA 标准 稀释 后 ， 与 浓度 是 ] 浓 度 未 知 的 核酸 溶液 ; 3、4 和 5 分 别 是 待 测 的 RNA 或 DNA 一 道 在 同一 凝 胶 上 电泳 CA 100ng、200ng 和 400ng 的 @X174 DNA; 6 是 8.4) 。 用 图 像 分 析 软件 确定 各 泳 道 每 个 条 带 以 及 拖 st pina aent no ais

; 可 Ps Ps Ps p. 150bp 尾 的 像素 ， 将 浓度 未 知 样品 的 像素 值 与 浓度 已 知 样 23% 7, oe See 品 的 像素 值 比较 。 在 本 实验 室 ， 判 断 CDNA 合成 的 效率 时 ， 通 常用 这 种 方法 确定 核酸 浓度 。 这 种 方法 确定 核酸 浓度 速度 快 ， 结 果 比 较 准确 。 尤 其 是 采用 SYBR 绿 、Gel Star 和 SYBR 金 等 超 敏 物质 染色 凝 胶 ， 测 定 结果 相当 准确 。 第 11 章 详细 介绍 了 图 像 分 析 。 @O 必 一 个 确定 核酸 浓度 的 方法 ， 需 要 将 少量 的 核酸 样品 固定 于 特定 膜 上 ， 然 后 进行 发

@ FH 70% 乙醇 清 洗 特别 容易 除去 乙酸 钠 (NaAc) 。 。 95 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

色 检 测 。 可 以 用 DNA Dipsticks (Invitrogen, Carlsbac, CA; item K5632-01) 有 效 定 量 低 至 lng 的 含量 很 少 的 RNA、 诊 核 苷 酸 、 单 链 DNA 或 双 链 DNA 溶液 。 简 要 来 说 ， 首 先 将 核 酸 样品 稀释 液 点 样 于 膜 上 ， 然 后 进行 一 系列 洗涤 ， 与 发 色 底 物 一 起 保温 。 与 试剂 盒 提 供 的 标 准 颜 色 深 度 比 较 ， 确 定 核酸 浓度 。 由 于 结合 机 理 独 特 〈 不 结合 单 核 苷 酸 )、 膜 容量 大 ， 因 此 用 DNA Dipsticks 定量 稀释 的 PCR 扩 增 模板 、 监 测 反 应 过 程 等 都 非常 方便 。

@) 第 三 种 方法 是 简单 的 肉眼 观测 。 将 浓度 已 知 的 核酸 溶液 和 浓度 未 知 的 核酸 样品 上 样 于 含有 荧光 染料 的 琼脂 糖 凝 胶 ， 然 后 电泳 。 在 紫外 线 照 身上， 染料 发 出 的 荧光 强度 与 核酸 含 量 成 正比 。 比 较 含 量 已 知 标准 品 和 含量 未 知 的 待 测 样品 的 获 光 强度 ， 就 可 以 粗略 估计 含量 未 知 样品 的 核酸 浓度 。 该 实验 需要 制备 含有 0. Spg/ml 溴 化 乙 锭 或 1XSYBR 绿 @ 的 琼脂 糖 凝 胶 。 最 好 只 取 Syl 稀释 的 标准 样品 溶液 和 待 测 样品 溶液 ， 这 样 可 以 避免 样品 扩散 。 如 果 上 样 溶液 发 生 扩 散 ， 就 很 难 定量 。 样 品 完全 进入 琉 脂 糖 凝 胶 后 ， 用 紫外 线 透射 仪 或 便携 式 紫 外 灯 观察 ， 评 估 溴 化 乙 锭 的 荧光 强度 。 也 可 以 采用 另 一 种 方法 大 致 估计 核酸 样品 的 浓度 。 取 不 超 过 Syl 稀释 后 的 待 测 核酸 样品 与 等 体积 的 1xg/ml 省 化 乙 锭 溶液 或 1XSYBR 绿 溶 液 混合 ， 然 后 上 样 到 塑料 槽 ， 用 紫外 线 照 射 ， 其 获 光 强度 与 浓度 已 知 的 DNA 标准 比较 〈Wienand 等 ， 1978) 。 尽 管 这 种 方法 已 经 过 时 ， 但 在 经 费 紧 张 时 可 以 用 这 种 方法 作为 教学 工具 。

当心 ”与 紫外 线 透 射 仪 一 样 ， 便 携 式 紫外 灯 对 操作 人 员 也 会 造成 严重 伤害 。 在 紫外 照 射 的 情况 下 工作 时 ， 一 定 要 佩戴 合适 的 防护 眼罩 及 遮 住 裸 露 的 皮肤 。

8.4 质量 控制 技术 3: RNA 4 & (#& RT-PCR

PCR 已 经 成 为 分 子 生物 学 家 的 主流 技术 ， 获 得 了 广泛 的 应 用 。 训 无 疑问 ， 它 彻底 音 新 了 大 多 数 细胞 生物 学 问题 的 研究 方法 。 因 此 ， 各 实验 室 都 用 引物 和 长 期 优化 的 反应 条 件 ， 经 PCR 扩 增 转录 产物 或 达到 其 他 目标 8。 如 果 用 刚 制备 的 RNA 样品 或 以 前 好 用 的 RNA 样品 不 能 获得 产物 ， 那 是 令 人 灰心 的 。 本 实验 室 应 付 这 种 局 面 的 标准 做 法 ， 是 用 针对 其 他 目标 的 引物 进行 扩 增 。 而 这 个 目标 对 特定 来 源 的 RNA 样品 而 言 ， 只 要 样品 干净 、RNA 分 子 完整 就 能 够 获得 扩 增 产物 。 可 以 用 这 样 的 引物 〈 如 扩 增 Bf- 肌 动 蛋白 或 GAPDH 的 引物 ) 测试

RNA 样品 。 结 果 可 以 证 明 这 样 的 RNA 样品 是 否 有 质量 问题 。 如 果 用 对 照 引 物 能 够 获得

PCR 产物 ， 但 是 用 于 试验 的 引物 不 能 产生 PCR 产物 ， 就 要 更 加 理性 地 分 析 失 败 的 原因 。 总 而 言 之 ， 用 量 足 的 RNA 模板 不 能 获得 PCR 产物 说 明 RNA 样品 太 差 ， 不 能 进行 反 转 录 或 扩 增 。 用 对 照 引物 可 以 证 实 RNA 样品 质量 是 否 合格 。

8.5 质量 控制 技术 4: Northern 分 析

Northern 分 析 是 有 用 的 实验 工具 。 可 以 用 Northern 分 析 了 解 任何 一 种 RNA 样品 的 特 性 ， 并 进行 半 定 量 测 定 。 作 为 质量 控制 工具 的 Northern 分 析 ， 人 们 用 标记 的 oligo(dT) 或

@ 省 化 乙 锭 /琼脂 糖 凝 胶 制 备 。 先 制备 1 为 的 琼脂 糖水 溶液 ， 当 溶液 冷却 到 55C 时 ， 加 入 省 化 乙 锭 储备 液 〈10mg/ ml) 至 终 浓 度 为 0. 5pg/ml。 仔 细 旋 转 烧 瓶 混合 琼脂 糖 溶液 ， 避 兔 吸入 水 蒸气 。 可 以 将 融化 的 琼脂 糖 /省 化 乙 锭 混合 物 倒 人 100mm Petri 培养 下 中 凝固 。 用 1X SYBR 绿 蔡 代 溴 化 乙 锭 ， 采 用 相同 的 方法 制备 SYBR 绿 凝 胶 板 。

@ 第 19 一 22 章 详 细 介绍 了 基于 RNA 的 PCR 技术 [ 即 反 转录 聚合 酶 链 反 应 CRT-PCR) J.

。 96 。

第 8 章 RNA 人 制备 的 质量 控制

poly(T) 探 针 ， 与 总 RNA BK poly(A) * RNA 严格 杂交 ， 然 后 放射 性 成 像 或 化 学 发 光 成 像 显 示 poly(A)+ RNA 组 分 的 大 小 分 布 。 随 后 用 更 严格 的 条 件 ， 从 印迹 膜 上 洗 去 polyCT) 探 针 ， 所 以 同一 个 印迹 膜 能 再 一 次 与 基因 特异 性 探 针 杂交 。 另 外 ， 如 果 RNA 样品 量 太 少 ， 不 能 用 传统 方法 〈 如 第 7 章 介 绍 的 亲 和 分 离 ) 富 集 时 ， 电 泳 前 用 标记 的 poly(T) 探 针 检测 少量 纯 44 RNA, jie RNA Fim AY poly(A)” RNA 含量 。 第 10 章 详细 介绍 了 这 种 方法 。 当 然 ， 也 可 以 用 基因 特异 性 探 针 检测 某 一 基因 转录 产物 的 含量 ， 而 不 是 用 poly(I) 探 针 检测 所 有 po- ly(A)* RNA 含量 。 质 量 控制 的 目的 只 是 证 明 RNA 样品 适 于 后 续 应 用 。

8.6 质量 控制 技术 S$: RNAABZ EGA

生物 学 完整 的 mRNA 能 翻译 该 mRNA 编码 的 多 肽 。 将 mRNA 微量 注射 到 合适 的 细胞 (如 爪 蟾 卵 母 细胞 ) ， 或 者 将 mRNA 加 入 无 细胞 翻译 系统 〈 如 网 质 红 细胞 裂解 液 或 麦 豚 抽 提 液 ) ， 能 够 确定 mRNA 的 翻译 能 力 。mRNA 翻译 能 够 产生 特定 的 、 可 重复 的 蛋白 质 条 带 。 该 技术 就 是 体外 翻译 技术 。 如 果 有 合适 的 抗体 ， 体 外 翻译 常常 与 免疫 沉淀 联 用 。 尽 管 该 技术 在 特定 领域 是 有 用 的 质量 控制 技术 ， 但 是 ， 体 外 翻译 技术 难度 高 ， 从 而 很 少 使 用 。 大 多 数 常 规 的 RNA 应 用 不 必 采 用 体外 翻译 检测 RNA 样品 的 质量 。

8.7 和 参考 文献

Glasel, J. A. (1995). Validity of nucleic acid monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques 18, 62.

Huberman, J. A. (1995). Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240nm as well as at 260 and 280nm. BioTechniques 18, 636.

Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. Bio Techniques 19, 208.

Manchester, K. L. (1996). Use of UV methods for the measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques 20, 968.

Wienand, U., Schwarz, Z., and Felix, G. (1978). Electrophoretic elution of nucleic acids from gels adapted for subsequent biological tests: Application for analysis of mRNAs from maize endosperm. FEBS Lett. 98, 319.

Wilfinger, W. W., Mackey, K., and Chomczyski, P. (1997). Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Bio Techniques 22, 474.

(eH 周 立 强 译 ; SHFR)

。 97 -

SIE PRED Wasi

91 基本 原理

从 培养 细胞 和 生物 组 织 分 离 高 质量 的 RNA 仅仅 是 基因 表达 研究 的 第 一 步 〈 尽 管 是 最 关 键 的 一 步 )。 后 续 的 Northern 印迹 分 析 、 核 酸 酶 保护 分 析 、 互 补 DNA (cDNA) 文库 构建 、 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 等 研究 所 需 的 时 间 长 、 费 用 高 。 首 次 评价 一 个 新 型 的 模 式 生 物 、 细 胞 、 组 织 或 实验 方案 时 ， 用 斑点 印迹 分 析 检 测 该 系统 的 目标 mRNA 可 能 是 值得 的 。 研 究 人 员 可 以 用 这 种 简单 分 析 技 术 对 样品 生化 组 分 做 出 “初步 ”的 判断 。 此 外 ， 用 斑点 印迹 方法 可 以 确定 纯化 的 RNA、 基 因 组 DNA， 甚 至 cDNA 能 否 进行 杂交 以 及 这 些 样 品 能 否 用 于 后 续 的 鉴定 。

斑点 印迹 ， 以 及 与 它 非常 相近 的 方法 即 狭 颖 印迹 能 快速 检测 细胞 裂解 液 或 纯化 RNA 样 品 中 特定 RNA 序列 的 相对 含量 。 不 需要 电泳 就 可 以 了 解 这 方面 的 信息 。 从 斑点 印迹 结果 能 够 估计 样品 中 目标 RNA 的 含量 ， 知 道 这 一 点 非常 重要 。 后 续 的 实验 设计 肯定 会 涉及 更 为 精 细 的 分 析 方 法 ， 包 括 cDNA 合成 或 者 用 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 进行 扩 增 。

斑点 印迹 时 ， 在 多 孔 斑点 印迹 装置 (图 9. 1) 或 狭 缝 印迹 装置 (图 9. 2) 用 真空 过 滤 方 st RNA 样品 直接 加 样 到 膜 上 ， 然 后 将 RNA 分 子 固定 于 过 滤 膜 表面 。 按 膜 的 垂直 或 水 平 方向 排列 稀释 的 样品 〈 图 9. 3) ， 这 样 排列 易于 用 图 像 分 析 软 件 〈 第 11 章 ) 定量 。 已 经 用

图 9.1 微型 多 孔 斑 点 印迹 装置 。 用 真空 图 9.2 微型 狭 颖 印迹 装置 工 。 用

直接 将 样品 稀释 液 加 在 过 滤 膜 的 表面 。 根 据 真空 直接 将 样品 稀释 液 加 在 过 滤 脐 印迹 装置 模式 ， 样 品 点 面积 是 12. 5mm2 或 的 表面 。 样 品 狭 颖 面积 是 6mm2 。 2mm’, Schleicher&-Schuell Bioscience Hf it Schleicher& Schuell Bioscience 惠 赠

. 98 .

SIS 斑点 印迹 分 析

时 间 /h 0 @ 2444 6 ba 0) 12"? on aS Uae 60

-ACTH | | :ACT LI414

图 9.3 狭 缝 印迹 自 显影 图 谱 。 肾 上 腺 皮质 激素 (ACTH) 处 理 ， 短 期 内 导致 牛 肾 上 腺 皮质 细胞 P-450sccmRNA 浓度 的 增加 。 在 图 谱 所 指 的 时 间 收 获 细 胞 并 抽 提 RNA。 用 微型 狭 颖 印迹 装置 (CSchleicher& Schuell) 将 RNA 上 样 到 硝酸 纤维 素 膜 上 ， 每 份 样品 用 20mg RNA。 然 后 与 以 pBSCC-2 质粒 为 模板 的 缺口 翻译 产物 杂交 。 最 低 一 排 的 三 个 样品 与 第 二 排 同 样 位 置 的 三 个 样品 相同 。 本 照片 由 Dr. Maliyakal John 惠 赠 。John M. E. ，John M.C., Ashley P. ，MacDonald R. J. ，Simpson E. R. 和 Waterman M. R. (1984). Identification and characterization of cDNA clones specific for cholesterol side-chain

cleavage cytochrome P-450. Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 5628-5632

射线 片 记录 的 各 个 斑点 或 狭 缝 ， 其 信号 强 弱 反映 了 RNA 样品 的 杂交 程度 。 简 而 言 之 ， 斑 点 印迹 杂交 是 无 需 凝 胶 电 泳 的 杂交 技术 。

斑点 印迹 适 于 各 种 核酸 分 子 检测 ， 包 括 poly(A) RNA、 细 胞 或 细胞 质 的 总 RNA、 基 因 组 DNA、cDNA、PCR 产物 ， 甚 至 春 核 苷 酸 片段 。 目 前 常用 斑点 印迹 筛选 和 鉴别 克隆 的 差异 表达 。 这 些 基因 可 能 是 用 不 同类 型 的 差异 杂交 分 离 出 来 的 。 如 果 需 要 稀释 ， 尤 其 是 进行 滴 度 检测 ， 最 好 将 各 个 稀释 度 的 斑点 按 几 何 排列 。 斑 点 印迹 装置 清洗 容易 。 如 果 使 用 得 当 ， 斑点 印迹 装置 可 以 使 用 多 年 。

9.2 BEPEOES HHS.

斑点 印迹 技术 最 明显 的 优点 之 一 是 能 够 快速 制备 杂交 用 的 核酸 样品 不 需要 凝 胶 电 泳 ， 将 变性 核酸 样品 直接 加 到 杂交 膜 上 。 抽 提 制 备 的 纯化 RNA 或 部 分 纯化 的 细胞 裂解 液 都 可 以 用 斑点 印迹 检测 。 偶 尔 将 部 分 纯化 的 细胞 裂解 液 印迹 称 为 细胞 斑点 印迹 或 快速 印迹 (Costanzi 和 Gillespie，1987) 。 而 且 ， 斑 点 印迹 模式 对 于 一 个 样品 不 同 稀释 液 检测 非常 理 想 。 该 方法 速度 快 ， 能 同时 处 理 多 个 样品 。 用 这 种 方法 可 以 迅速 了 解 一 个 或 多 个 样品 的 细胞 生化 情况 。 斑 点 印迹 模式 在 检测 基因 表达 的 时 间 过 程 或 实验 操作 对 基因 表达 的 影响 方面 也 非 常 有 用 。 人 们 也 许 会 将 斑点 印迹 看 作 从 不 同 组 织 、 不 同 生物 或 完全 不 同 的 动物 或 植物 获取 RNA 的 理想 方法 。 斑 点 印迹 结果 可 以 作为 后 续 实 验 的 基础 。

多 孔 面 板 是 斑点 印迹 或 狭 颖 印迹 装置 的 核心 ， 非 常 适 于 快速 制备 印迹 相同 的 滤 膜 。 除 了 整个 操作 必须 避免 RNase 活性 外 ， 斑 点 印迹 没有 什么 技巧 ,非常 容 易 。 如 果 斑 点 杂交 采用 尼龙 膜 ， 可 以 将 探 针 从 杂交 后 的 尼龙 膜 赶 出 。 这 样 ， 又 可 以 用 这 张 尼龙 膜 与 新 探 针 杂交 。 如 AX 射线 片 不 理想 〈 用 放射 性 同位 素 标记 探 针 )， 可 以 从 膜 上 前 下 斑点 ， 置 于 闪烁 液 中 用 Cerenkov 计数 ， 该 数据 (cpm) 可 以 补充 放射 自 显影 数据 。

当然 也 可 以 进行 反 式 斑点 印迹 检测 。 反 式 斑点 印迹 是 将 没有 标记 的 探 针 〈 冷 ) 点 样 于波

98)

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

膜 上 ， 然 后 与 标记 了 NA 杂交 ， 如 细胞 核 竞 争 检 测 。 这 种 模式 能 同时 检测 多 个 基因 的 表达 。 第 17 章 详 细 介 绍 了 这 种 检测 方法 。

斑点 印迹 模式 是 几何 排列 杂交 结果 的 完美 方式 。 在 本 实验 室 ， 用 斑点 印迹 检测 不 同时 间 点 的 基因 表达 情况 。 这 种 方法 进行 种 类 检测 也 非常 理想 ， 检 测 结果 用 阳性 或 阴性 表示 ， 如 样 品 是 否 与 探 针 杂 交 。 检 测 结果 易于 用 标准 的 图 像 分 析 软 件 包 分 析 。

斑点 印迹 的 缺点 与 操作 过 程 紧密 相关 。 由 于 斑点 印迹 不 需要 进行 凝 胶 电 泳 ， 而 直接 将 核 酸 样品 点 在 膜 上 ， 斑 点 印迹 只 能 产生 定量 数据 ;信号 强度 只 与 目标 基因 转录 产物 的 量 有 关 ， 无 法 确定 该 基因 转录 产物 的 分 子 量 。 而 且 只 用 该 方法 无 法 判断 有 多 少 大 小 不 同 的 转录 产物 能 够 与 探 针 杂 交 。 如 果 探 针 与 核糖 体 RNA (rRNA) 有 很 弱 的 亲和力 ， 斑 点 杂交 就 很 成 问题 (因为 样品 含有 大 量 rRNA) 。 杂 交 背 景 高 就 需要 理想 的 阳性 对 照 和 阴性 对 照 。 所 有 用 尼龙 膜 、 硝 酸 纤 维 素 膜 或 PVDF 膜 进 行 的 核酸 检测 ， 都 会 因 核 酸 样 品 是 物理 固定 于 膜 的 表面 ， 使 一 些 分 子 不 能 进行 核酸 杂交 ， 不 利于 定量 检测 。

9.3 合适 的 阳性 对 照 和 阳性 对 照

最 好 将 斑点 印迹 和 狭 颖 印迹 的 定量 结果 看 作 是 半 定 量 的 。 这 种 分 析 的 最 主要 缺点 是 缺乏 凝 胶 电泳 具备 的 定性 检测 。 为 了 使 检测 结果 真实 可 靠 ， 斑 点 印迹 分 析 必 须 有 理想 的 阳性 对 照 和 阴性 对 照 ， 保 证 杂交 的 特异 性 ， 排 除 探 针 与 膜 的 非特 异性 结合 。 例 如 ， 印 迹 时 将 不 同 浓度 的 rRNA 或 tRNA 溶液 置 于 没有 使 用 的 孔 ， 能 够 显示 样品 的 非 poly(A)? RNA, RHE rRNA， 与 探 针 的 交叉 杂交 程度 。 而 且 ， 如 果 在 杂交 时 和 杂交 后 所 采用 的 条 件 足 够 严格 ， Hind 酶 切 的 ADNA 和 Hae 酶 切 的 @X174 DNA (琼脂 糖 凝 胶 电 泳 的 分 子 量 标准 ) 就 不 能 与 探 针 杂 交 产 生 可 观测 的 杂交 信号 。 如 果 没 有 这 些 常用 的 DNA 分 子 量 标准 或 RNA 标准 ， 可 以 采用 与 探 针 无 关 的 任何 DNA， 包 括 以 前 已 经 鉴定 的 没 用 的 PCR 产物 。 至 少 还 有 一 个 上 样 孔 只 加 缓冲 液 ， 检 测 缓冲 液 产 生 的 杂交 信号 可 能 也 是 有 用 的 。 阳 性 对 照 可 以 包括 与 目标 RNA 相同 的 cDNA “与 探 针 配对 ) 稀释 溶液 。 阳 性 对 照 在 膜 上 产生 的 信号 强度 取决 于 浴 液 的 稀释 程度 8。 而 且 ， 好 的 阳性 对 照 总 是 与 预期 一 致 一 一 相同 剂量 阳性 对 照 目 标 将 产生 相同 强度 的 信号 。 如 果 首 次 使 用 这 种 印迹 分 析 或 用 于 一 个 新 系统 ， 强 烈 建 议 采用 不 同 浓度 的 阳性 对 照 并 确定 印迹 检测 的 线性 范围 。 例 如 ， 如 果 杂 交 信 号 强 到 无 法 用 X 射线 自 显影 准确 测量 ， 印迹 检测 就 没有 用 处 。 记 住 各 种 胶片 的 线性 范围 是 非常 狭窄 的 。

究竟 用 斑点 印迹 还 是 用 狭 颖 印迹 ， 这 就 要 考虑 样品 所 需 点 样 的 面积 。 因 为 样品 浓缩 在 一 个 更 小 的 表面 〈 点 的 面积 是 2mm2 ， 狭 颖 的 面积 是 6mm2 ， 斑 点 是 12. 5mm2 )， 狭 颖 印迹 装 置 能 产生 更 好 的 信 品 比 。 因 此 检测 量 少 的 RNA 或 丰 度 低 的 RNA， 用 狭 颖 印迹 定量 更 好 。 但 是 客观 地 说 ， 由 于 这 种 检测 本 身 敏 感度 低 ， 不 同 的 印迹 方式 所 获得 的 结果 没有 太 大 的 差 异 。 斑 点 印迹 数据 是 高 级 定量 检测 的 基础 。

9.3.1 实验 方案 9@8: RNA 斑点 印迹 O MFE! 与 RNA 样品 接触 前 ， 所 有 试剂 必须 没有 核酸 酶 活性 。

@ 由 于 阳性 对 照会 产生 非常 强 的 杂交 信号， 所 以 最 好 把 阳性 对 照 核酸 稀释 后 上 样 到 杂交 膜 上 。 而 且 ， 过 强 的 杂交 信 号 会 掩盖 周围 的 信号 ， 最 好 不 要 把 测试 样品 置 于 阳性 对 照 周围 。 @ 所 采用 的 方法 ， 部 分 来 源 于 Schleicher&Schuell (1995). 。 100 -

第 9 章 斑点 印迹 分 析

Q 根据 本 书 或 其 他 书籍 所 提供 的 方法 纯化 RNA。RNA 应 当 溶 于 无 菌 水 或 TE 缓冲 液 (10mmol/L Tris-HCl; lmmol/L EDTA, pH 7.5) 中 。 每 个 斑点 或 狭 颖 上 样 体 积 100 一 200x1， 含 有 1 一 10ug RNA。 只 稀释 那些 本 试验 必须 用 的 RNA。 记 住 RNA 储存 液 越 浓 越 好 ， 一 80C 保 存 备 用 。

@ 每 100kl RNA 稀释 液 加 入 6Opl 20 义 柠檬 酸 钠 生 理 盐水 (SSC) 缓冲 液 和 40pl 37% 甲醛 储备 液 9。60C 温浴 15min， 使 核酸 变性 。

注意 ”此 时 要 将 印迹 装置 组 装 好 ， 使 变性 好 的 核酸 样品 能 够 迅速 上 样 到 杂交 膜 上 。

@ RNA 变性 后 ， 在 灭 菌 水 中 预 湿 尼龙 膜 或 其 他 类 型 的 膜 smin。 操 作 时 必须 戴 手 套 ， 并 采用 最 少 的 膜 。 使 用 前 用 6 X SSC 缓冲 液 平衡 膜 和 两 张 吸水 纸 (Schleicher& Schuell, 1995, #GB003 或 其 他 替代 物 ) 。

注意 ”所 需 的 离子 强度 取决 于 膜 表 面 的 电荷 和 化 学 组 成 。 记 住 ， 使 用 前 必须 按照 厂家 指示 平衡 杂 交 膜 。

© 将 缓冲 液 饱和 的 GB003 吸水 纸 置 于 膜 支 持 面 板 上 。 将 尼龙 膜 置 于 吸水 纸 的 上 面 ， 然 BAR mR TRL. PRE. BRIER. 形 圈 与 膜 直 接 接 触 ， 孔 面 朝 上 。

© 用 低 真 空 抽 斑点 印迹 装置 ， 保 证 除去 膜 上 残余 缓冲 液 。 每 个 孔 用 500nl 6 X SSC 清洗 。

© 各 和 孔 加 入 100 一 400nl 核酸 溶液 。 如 果 需 要 ， 用 6 < SSC

© 当 所 有 的 样品 吸 过 尼龙 膜 后 ， 每 个 孔 用 300wl 6XSSC 洗 一 次 。 当 所 有 的 清洗 液 吸 过 膜 后 ， 解 除 真 空 并 从 印迹 装置 取出 膜 。

© 根据 三 家 指导 ， 将 RNA 分 子 固定 在 膜 上 。 通 常用 紫外 照射 交 联 固定 〈 见 第 12 章 的 固定 技术 ) 。 如 果 不 马 上 使 用 ， 就 将 膜 保 存在 凉爽 、 干 燥 、 避 光 的 地 方 。

@ 预 杂 交 封 闭 、 探 针 杂 交 和 杂交 后 严格 清洗 〈 具 体操 作 在 第 14 章 介 绍 ) 。

@@ 用 适当 的 方法 检测 ， 具 体 方法 取决 于 探 针 标记 CA 15 章 加 以 讨论

9.3.2 实验 方案 8: DNA 斑点 印迹

丙 点 印迹 分 析 核 酸 速 度 快 ， 这 套 技 术 也 适用 于 DNA 鉴定 。DNA 斑点 印迹 与 前 面 介 绍 的 RNA SERED. MEA KS HE DNA 的 变性 方法 不 同 。 前 面 提 到 的 RNA 斑点 印迹 应 注意 的 事项 同样 适宜 于 DNA 斑点 印迹 。

© MFE! 与 DNA 样品 接触 前 ， 要 保证 所 有 试剂 没有 核酸 酶 活性 。

GO 用 普遍 使 用 的 方法 纯化 基因 组 DNA 或 合成 的 cDNA。 大 多 数 常 规 检测 使 用 的 基因 组 DNA 储存 液 浓 度 是 1. 0mg/ml。DNA 应 溶 于 pH 8.0 的 TE 缓 冲 液 〈10mmol/L Tris-HCl; lmmol/LEDTA，PpH 8.0) 中 。 用 真空 将 含有 5 一 10wg H DNA WH (100~200nl) AMAR 点 或 狭 颖 的 上 样 也 中。 根据 需要 用 TE 缓冲 液 或 无 菌 水 稀释 DNA 样品 。

注意 ”检测 单 拷贝 序列 时 ， 可 能 需要 在 每 个 孔 里 加 入 更 多 的 DNA。

@ 每 100nl WF TE 缓冲 液 的 DNA Wk. MA 10ul 2mol/L NaOH，37C 温 浴 10min。 然后 加 入 40pl 20 久 SSC。 如 果 不 立 即 上 样 到 杂交 膜 上 ， 需 要 将 DNA 混合 液 置 于 冰 上 。 也 可

@@ 每 次 使 用 前 ， 甲 醛 (HCHO) 必须 是 刚刚 去 除 蚁 酸 后 去 离子 化 的 ，pH 高 于 4.0。 使 用 前 ， 甲 酰胺 (HCONH:) 也 必须 去 离子 化 。 甲 醛 和 甲 酰胺 都 有 毒 ， 必 须根 据 厂 家 提供 的 安全 方法 (MSDS) 小 心 操作 。 @@ 所 采用 的 方法 ， 部 分 来 源 于 Schleicher&Schuell (1995) 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

以 不 加 20XSSC， 而 加 入 等 体积 的 2mol/L NH4Ac (pH 7.0), 将 DNA 溶 液 于 冰 上 放置 。

注意 1 在 这 个 时 候 应 当 将 斑点 印迹 装置 组 装 起 来 ， 这 样 可 以 马上 将 变性 后 的 DNA 样品 加 在 杂交 膜 上 。

注意 2 ”最 好 尽快 将 变性 后 的 样品 加 在 杂交 膜 上 ， 从 而 避免 变性 后 的 单 链 分 子 重新 退火 。

由 在 DNA 变 性 时 ， 用 无 菌 水 预 湿 尼龙 膜 或 其 他 杂交 膜 5min。 操 作 时 要 戴 手 套 ， 使 用 的 杂交 膜 面积 要 尽量 小 。 使 用 前 用 6XSSC 缓冲 液 平 衔 杂 交 膜 和 两 张 吸水 纸 〈Schleicher& Schuell # GB003 或 其 他 替代 物 ) 。

注意 ”所 需 离子 强度 取决 于 膜 的 化 学 成 分 和 表面 电荷 。 最 好 照 厂家 的 操作 手册 平衡 杂交 膜 。

© 把 缓冲 液 饱和 的 GB003 吸水 纸 置 于 斑点 印迹 装置 的 膜 支 持 面 板 上 。 把 尼龙 膜 置 于 吸 水 纸 上 ， 再 将 样品 面板 置 于 膜 上 ， 并 用 夹子 固定 。 组 装 正确 时 ，9O 形 圈 和 膜 直 接 接触 ， 并 且 上 样 孔 面 朝 上 。

© 采用 低 真 空 排出 斑点 印迹 装置 中 杂交 膜 上 残余 的 缓冲 液 。 每 个 上 样 孔 用 500pl 6 X SSC 溶液 清洗 一 次 。

@ HfL EF 100~400n] DNA HR. WIR. DNA 溶液 用 6XSSC HF.

@ 当 所 有 的 DNA 溶液 流 过 尼龙 膜 后 ， 各 孔 用 300n1 6X SSC 清洗 。 当 清洗 液 流 过 杂交 膜 后 ， 解 除 真空 并 从 斑点 印迹 装置 取出 杂交 膜 。

@ 根据 厂家 的 指导 将 DNA 固定 于 杂交 膜 上 ， 常 用 紫外 照射 交 联 的 方法 进行 DNA 固定 COL 12 章 的 固定 技术 ) 。 如 果 不 立 即使 用 ， 杂 交 膜 应 该 保存 在 凉爽 、 干 燥 、 避 光 的 地 方 。

@ 预 杂交 封闭 、 探 针 杂 交 和 杂交 后 严格 清洗 〈 具 体操 作 在 第 14 章 介绍 ) 。

@ 用 适当 的 方法 检测 ， 具 体 方 法 取决 于 探 针 标记 〈 第 15 章 加 以 讨论 ) 。

9.4 斑点 印迹 数据 的 局 限 性

斑点 印迹 数据 的 最 大 局 限 是 : 中 没有 进行 凝 胶 电 泳 ， 不 能 进行 定性 检测 ， 包 受 检 测 模式 的 影响 ， 灵 人 敏 度 不 如 基因 表达 检测 的 其 他 标准 方法 。 研 究 人 员 还 要 敏锐 地 意识 到 ， 高 浓度 核

酸 溶液 ， 包 括 悬 浮 在 高 盐 缓冲 液 中 的 核酸 溶液 ， 上 样 到 斑点 印迹 装置 时 很 容易 堵塞 杂交 膜 。

而 且 负载 过 量 的 样品 孔 ， 会 造成 “点 饱和 ”， 此 时 上 样 的 核酸 量 可 能 超过 了 膜 的 最 大 容量 ， 或 者 使 用 了 能 降低 膜 结合 能 力 的 试剂 稀释 核酸 浴 液 。

尽管 是 半 定 量 ， 但 是 斑点 印迹 还 是 有 一 个 较 窗 的 线性 范围 。 因 为 斑点 印迹 操作 时 核酸 浴 液 的 上 样 量 很 容易 超过 膜 的 结合 容量 ， 加 之 X 射线 胶片 线性 范围 狭窄 ， 导 致 斑点 印迹 线性 范围 狭窄。 信和 号 强度 大 的 样品 很 容易 弄 坏 胶片 ， 使 斑点 之 间 完 全 模糊 。 记 住 图 像 分 析 软 件 只 能 分 析 提 供 的 图 像 ， 所 以 应 尽 可 能 减少 这 些 不 确定 性 。 基 于 这 些 原 因 ， 至 少 在 首次 分 析 没 有 鉴定 过 的 生物 材料 时 ， 强 烈 建 议 要 稀释 各 个 样品 ， 以 确定 各 样品 的 动力 学 范围 。 放 射 目 显影 或 化 学 发 光 检 测 后 ， 如 果 图 片 各 点 需要 用 数字 表示 的 话 ， 割 下 每 个 样品 点 测定 其 cpm 值 。 尽管 这 样 获 得 的 额外 数据 可 能 很 有 用 ， 但 是 切割 后 的 膜 不 能 重复 使 用 。 正 如 以 前 所 述 ， 没 有 一 种 方法 能 够 检测 膜 上 特定 点 交叉 杂交 。 精 巧 设 计 的 阴性 对 照 和 阳性 对 照 能 增加 检测 的 说 服 力 ， 但 是 这 些 对 照 只 能 提供 检测 忠实 性 的 间接 证 据 。

最 后 ， 因 为 合成 EDNA、RT-PCR、 凝 胶 电泳 和 核酸 印迹 等 相对 容易 ， 现 在 开始 研究 用 斑点 印迹 可 能 不 再 是 最 好 的 选择 。 斑 点 印迹 是 一 种 “图 形 ” 实 验 : 一 组 表示 杂交 样品 的 点 看

*。 102 。

BIS 斑点 印迹 分 析

起 来 很 漂亮 ， 但 实际 上 是 在 构筑 数据 。 如 果 需 要 排列 成 几何 图 形 进行 检测 ， 就 把 样品 按 顺序 点 样 ， 然 后 杂交 检测 。 如 果 需 要 更 准确 定量 ， 则 要 选择 其 他 检测 方法 。

95 和 参考 文献

Costanzi, C., and Gillespie, D. (1987). Fast blots: Immobilization of DNA and RNA from cells. In “Guide to Molecular Cloning Techniques” (S. L. Berger and A. R. Kimmel, Eds.). Academic Press, San Diego, CA.

Schleicher and Schuell. (1995). Nucleic acid dot/slot-blots onto s&s transfer media. Jn “Blotting, Hybridization, and Detection,” 6th ed. pp 20-22 Schleicher & Schuell, Keene, NH.

(刘建华 ， 周 立 强 译 ; SHR)

。 103 。

当心 ”电泳 所 用 的 高 压 电 对 身体 会 有 潜在 的 伤害 。 使 用 这 些 电泳 仪器 时 应 当 非 常 小 心 。

10.1 基本 原 和 理

众多 离散 基因 与 复合 基因 的 表达 ， 以 及 机 制 不 同 的 调节 ， 构 成 了 和 谐 的 细胞 生化 反应 过 程 。 研 究 突出 转录 事件 的 一 个 基本 方法 ， 就 是 以 信使 RNACmRNA) 及 其 前 体 核 不 均一 RNAChnRNA) 作为 基因 表达 参数 进行 研究 。 这 种 方法 的 前 提 是 建立 在 这 样 的 基础 之 上 ， 即 某 种 特定 RNA 的 丰 度 变化 ， 可 以 反映 细胞 周期 中 的 重要 生化 事件 。

该 方法 的 核心 是 核 苷 酸 探 针 能 够 高 度 严 格 地 区 分 外 源 RNA 分 子 混 合 物 中 的 不 同 个 体 。 可 以 建立 起 促进 目的 mRNA 与 互补 核酸 探 针 杂交 的 条 件 ， 对 目的 RNA 进行 快速 的 定性 与 定量 分 析 。

电泳 是 一 种 常规 的 实验 方法 。 电 场 中 ， 带 电 分 子 根据 其 不 同 的 分 子 量 分 开 。Northern DT. Sl 核酸 酶 保护 分 析 以 及 其 他 各 种 形式 的 定量 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 〈RT-PCR) 分 析 ， 都 要 使 用 电泳 的 方法 来 检验 稳 态 RNA® 分 子 的 大 小 及 丰 度 。 电 泳 是 一 种 通用 的 方法 ， 以 任 何方 法 提纯 的 RNA 样品 ， 都 可 以 通过 电泳 来 分 离 (RNA 提纯 方法 见 第 5 章 、 第 6 章 )。 例 如 ， 在 被 称 作 Northern 印迹 的 分 析 中 ， 无 论 是 全 细胞 RNA 样品 、 全 细胞 质 RNA 样品 ， 还 是 poly(A)* RNA 或 是 poly(A) RNA 样品 ， 都 需要 通过 电泳 进行 分 离 。 然 后 再 转移 并 固 定 到 尼龙 膜 或 硝酸 纤维 素 膜 等 膜 的 表面 (Alwine 等 ，1977，1979)。 这 些 带 有 印迹 的 膜 ， 将 和 与 某 种 目的 RNA 互补 的 探 针 进行 杂交 。 与 Southern 分 析 (Southern, 1975) 的 差异 ， 就 是 研究 对 象 的 区 别 。 同 样 要 经 过 电泳 分 离 、 转 膜 和 杂交 的 Southern 分 析 ， 针 对 的 是 DNA 样 品 。 电 泳 至 今 仍 是 按 分 子 大 小 区 分 RNA 的 一 种 好 方法 ， 除 非 涉 及 大 量 RNA 分 子 的 分 析 ， 如 生物 物理 研究 才 会 受到 限制 。

10.2 GRO 46

电泳 或 任何 并 行 分 析 ， 在 准备 RNA 样品 前 ， 要 确保 RNA 的 标准 化 。 也 就 是 说 每 个 沪 道中 样品 的 量 应 当 相同 。 然 而 ， 样 品 的 标准 化 到 底 指 的 是 哪些 方面 ? 总 细胞 RNA、 总 细胞

© 稳 态 产物 RNA， 是 细胞 或 亚 细 胞 部 分 ， 如 细胞 核 或 细胞 质 内 ， 最 终 累 积 的 所 有 的 RNA。 只 研究 稳 态 RNA 并 不 能 反映 出 转录 速度 或 转录 本 周转 速度 这 些 参数 。 详 见 第 17 章 。 。 104 -

第 10 章 电 ik

质 RNA 以 及 poly(A)+ mRNA 的 标准 化 方法 相同 吗 ? 标准 化 必须 能 够 提供 一 个 合理 恰当 的 依据 ， 使 每 次 电泳 样品 的 信号 强度 都 有 可 比 性 ; 能 够 根据 已 有 的 阳性 对 照 和 阴性 对 照 ， 阐 明 样品 信号 的 意义 。

在 核 苷 酸 电泳 样品 的 标准 化 过 程 中 ， 要 注意 以 下 三 点 。

@ 以 核 苷 酸 样 品 总 质量 作为 标准 。 也 就 是 说 ， 以 浓度 最 低 的 样品 作为 基准 ， 其 他 样品 都 要 稀释 到 这 一 样品 的 浓度 。

@ 电泳 及 染色 后 目测 RNA 样品 条 带 。 确 认 每 个 样品 都 是 完整 的 ， 且 不 同样 品 的 核糖 体 RNA(CrRNA) 丰 度 一 致 。 要 注意 的 是 ， 按 中 进行 的 标准 化 操作 ， 如 在 各 个 泳 道中 上 有 等 量 的 RNA， 并 不 能 解决 所 有 问题 。 注 意 这 一 点 是 重要 的 ， 即 与 转录 对 照相 比 ，rRNA 是 更 好 的 上 样 量 的 对 照 。

@ 对 “看 家 基因 ” (这 个 基因 的 表达 不 受 实 验 刺 激 及 操作 的 影响 RNA 进行 杂交 来 验 证 标准 化 。 通 常 选用 的 看 家 基因 有 PALABRA 〈B-actin)、 纤 连 蛋 白 、 组 蛋白 、GAPDH 以 及 转 铁 蛋 白 受 体 mRNA。 甚 至 有 人 会 用 tRNA 来 进行 标准 化 。 读 者 应 当 注意 的 是 ， 由 于 不 同 细胞 对 外 界 刺激 的 反应 不 同 ， 因 此 某 种 情况 下 用 来 进行 校准 的 转录 本 可 能 不 会 适用 于 其 他 情况 。 用 作 校 准 的 转录 本 ， 因 为 实验 刺激 ， 在 转录 或 者 转录 后 发 生 任何 细微 的 改变 ， 都 会 造 成 对 细胞 内 生化 过 程 认识 上 的 变化 。 这 些 对 基因 表达 的 评估 将 在 第 13 章 内 部 对 照 部 分 论 及 。

用 分 光 光 度 法 来 检测 每 个 RNA 样品 的 浓度 ， 使 每 个 泳 道 的 RNA 质量 (ug) (Argo) 相 同 ， 是 使 用 最 广泛 的 标准 化 方法 。 在 有 poly(A)* RNA 时 ， 每 个 泳 道上 2 一 5pg 样品 即 足以 ih RAKE mRNA. RZ, BUN BONA 15 ~ 20pg 的 总 RNA 或 总 细胞 质 RNA。 某 些 特殊 系统 里 ，poly(A)+RNA BUR, WHEE ASN oligo(dT) HE 析 时 ， 则 可 用 总 RNA 来 进行 检测 FFA. RR poly(A)? 纯化 得 到 的 mRNA Fein, FE 往 含 有 其 他 非 poly(A) 污染 。 用 总 RNA 来 进行 电泳 检测 的 其 他 理由 ， 是 因为 研究 的 目的 RNA 丰 度 足够 高 ， 不 用 进行 polyCA) 富 集 就 能 检测 出 来 。 最 后 ， 因 为 任何 一 种 分 离 方 法 的 效率 都 不 会 高 达 100% ， 用 于 纯化 poly(A) 的 步骤 实际 上 会 降低 低 丰 度 和 极 低 丰 度 mRNA 的 量 。

核糖 体 RNA(CrRNA) 是 总 细胞 RNA 和 总 细胞 质 RNA 的 主要 成 分 ， 占 到 样品 总 量 的 80% 一 85% 。 它 的 含量 远 高 于 mRNA 的 含量 (2% 一 3%)。 因 此 即使 mRNA 含量 有 很 大 变 化 也 不 易 在 紫外 分 光 光 度 计 下 检测 出 来 。 但 是 ， 精 确 的 样品 标准 化 方法 需要 确保 特定 mRNA 丰 度 变化 能 够 真实 反映 该 RNA 转录 或 转录 后 的 调节 情况 〈 相 对 于 所 有 RNA 的 转 录 )， 且 这 些 检测 到 的 变化 是 有 意义 的 。 这 也 是 所 有 基于 组 分 含量 的 标准 化 方法 需要 考虑 的 。

为 了 更 好 地 痔 述 要 考虑 到 的 各 个 方面 问题 ， 现 在 以 poly(A)* RNA 为 例 。 尽 管 存在 第 7 章 poly(A) 部 分 中 详细 列举 的 种 种 不 足 ， 但 是 ， 在 每 个 泳 道中 加 入 等 量 的 poly(A)- RNA (484 hnRNA fl mRNA), ， 仍 不 失 为 一 种 可 接受 的 标准 化 样品 的 方法 。 而 这 一 点 也 不 总 是 能 够 实现 。 若 是 可 利用 的 RNA、 细 胞 或 是 组 织 太 少 ， 不 能 进行 poly(A)+ RNA 富 集 ， 还 可 以 用 另 一 种 方法 来 进行 校准 ， 即 用 合成 的 poly(T) 标记 探 针 来 进行 标准 化 〈Fornace 和 Mitch- ell, 1986; Hollander 和 Fornace, 1990; Farrell 和 Greene，1992) 。 用 合成 cDNA 方法 制 备 的 探 针 可 用 于 估 测 样本 中 所 有 poly(A) 组 分 。 以 下 是 这 一 高 超 技术 的 过 程 : 进行 标准 化 校准 时 ， 取 少量 总 RNA (500 ng 或 更 少 ) 进行 狭 颖 印迹 或 斑点 印迹 分 析 。 检 测 到 的 poly CT) 探 针 杂交 结果 就 反映 了 样品 中 的 poly(A)* 含量 (A 10.1)。 样 本 与 样本 之 间 可 以 通过 比较 杂交 信号 的 强度 来 校准 总 RNA 量 ， 以 使 每 个 泳 道中 的 poly(A) 相等 。 这 一 校准 方法

。 105 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

a b = d J j 250 == re = & -_-_> 2 125 gee”. “ati di ir, * 和 SS < 3 ‘ " ES 5 ws ait 名 62 Ce -_ ms a : sd 3] — * — . = 2 a 2 = Es ae pes 党 =. 31 — mgs ad F 5 a 3 = me oe . es aes e 4 ea 5. 1

10. 1 用 狭 颖 印迹 杂交 校准 样品 总 细胞 质 RNA 中 的 poly(A)”。 用 磷酸 缓冲 液 对 500ng(A 260 ) 样品 连续 进行 2 倍 稀释 。 每 狭 矣 上 样 100k1， 与 ?了 标记 的 poly(T) 探 针 杂交 。 用 这 种 方法 来 证 明 ， 未 经 oligo(dT) 处 理 的 等 质量 总 RNA 样品 中 ， 含 有 等 量 的 poly(A)” mRNA, 放射 自 显影 后 扫描 光度 测定 的 结果 表明 ， 尽 管 各 狭 颖 中 含有 的 总 RNA 量 相同 ，

但 是 这 些 样 品 中 所 含 的 polyC(A)- 有 2 一 4 倍 量 上 的 差异

也 适用 于 其 他 需要 精确 校准 的 分 析 方 法 。 这 种 方法 相当 于 用 UV 分 光 光 度 计 对 纯化 后 的 poly CA) RNA 进行 标准 化 处 理 。 假 如 不 能 正确 地 按照 poly(A) ~ RNA 的 量 来 进行 标准 化 处 理 ， 就 会 导致 由 于 每 个 泳 道中 加 入 不 同 poly(A) 量 而 造成 实验 观测 的 误差 。

关于 几 种 样品 的 标准 化 问题 ， 需 要 记 住 的 最 重要 的 一 点 是 ，RNA 电泳 与 Northern 分 析 虽然 是 古老 的 传统 技术 ， 但 是 它们 已 经 非常 接近 于 作为 基因 表达 参数 的 RNA 测量 方法 中 灵 敏 度 指标 的 下 限 。RNA 电泳 是 Northern 分 析 的 初始 步 又 ， 应 当 能 够 粗略 估计 出 细胞 中 的 转 录 情 况 ; 对 基因 表达 精确 分 析 的 需求 ， 则 要 求 研究 者 使 用 极其 灵敏 的 RT-PCR 技术 。

10.2.1 实验 方案 : poly(A) 的 标准 化

(1) 样品 的 准备 @ 50mmol/L, pH6. 8 磷酸 钠 缓 冲 液 (50mmol/L Na,H,PO,) 置 冰 上 待 用 《该 缓冲 液 由 单 碱 盐 和 二 碱 盐 混合 制备 ， 见 表 10. 1) He 500ng(Axzio)RNA， 用 该 缓冲 液 稀 释 到 200p1,

表 10.1 Na,H,PO, 缓冲 液 的 配制

Na: HPO, /ml ugh wep NaH>PO, /ml Na, HPO, /ml 6.5 5.7

NaH? PO, /ml

CO” BSS 2 Se ee ee SCO OND Fw DM HE OC ©

SoS GM O61 OC Ors <i ce

TE: 这 些 是 配制 特定 PH 值 的 磷酸 钠 缓 冲 液 时 200mmol/L NaH2PO, 与 NazHPO, 的 理论 比例 。 需 要 测定 NaH2PO, 与 Naz HPO, 混合 稀释 后 的 pH 值 ， 通 常 需要 微量 地 调节 pH 值 。 详 见 正 文部 分 。 @O 用 狭 颖 印迹 杂交 或 者 斑点 印迹 杂交 时 (Schleicher 和 Schuell Biosciences)， 尼 龙 膜 先 用 无 核酸 酶 的 水 湿润 ， 再 用 磷酸 钠 绥 冲 液 平衡 。 每 个 样品 取 一 半 (100p1= 250ng) 点 样 到 *。 106 -

第 10 章 电 ik

膜 上 。

注意 ”将 样品 集中 于 较 小 的 上 样 面积 可 得 到 较 好 的 定量 数据 。 因 此 ， 与 斑点 印迹 杂交 相 比 ， 狭 缝 印 迹 杂 交 更 好 。

@ 在 剩 下 的 100xl RNA 样品 中 ， 加 入 100pl 磷酸 钠 缓 冲 液 ， 使 其 稀释 两 倍 。 用 印迹 法 通常 进行 五 轮 两 倍 稀释 的 样品 量 就 足以 对 样品 进行 精确 的 校准 。

® 用 300pl 的 磷酸 钠 缓 冲 液 洗 孔 两 次 。

© 可 用 商品 化 的 poly(A) 稀释 后 作为 阳性 对 照 使 用 ， 稀 释 多 轮 的 商品 化 的 poly(A) 可 以 作为 估计 样品 中 poly(A)- 绝 对 量 的 标准 。 稀 释 同 样 倍数 的 tRNA 可 用 来 做 阴性 对 照 。

© 按照 厂商 说 明 固 定 RNA， 最 好 用 紫外 照射 交 联 法 。 进 行 下 一 步 预 杂交 或 是 将 其 存放 于 干 冷 的 地 方 。

(2) 预 杂 交 方 法 1

@a. Church 印迹 法 (Church 和 Gilbert, 1984): 滤 膜 在 预 杂 交 液 (1% BSA，1lmmol/L EDTA，0. 5mol/L Na,H,PO,, 7% SDS, pH7.2) , 65°C¥E@A 20min. MARRN Re/)\ FABRA 100pl/cm?, HEA RO.

(3) 预 杂 交 方 法 2

Ob. 将 滤 膜 浸 在 5 X SSPE 中 至 少 15min 后 ， 按 至 少 100pl/cm2 的 量 加 入 预 杂交 液 (5XSSPE, 5XDenhardt 溶液 ，0.1% SDS, 100pg/pl 变性 的 甸 精 DNA, 50% AY ARERR). 42°C MA 2 一 3h。

注意 ”因为 SSPE 中 的 磷酸 基 团 与 核酸 中 的 磷酸 二 酯 键 很 相似 ， 并 且 能 帮助 对 滤 膜 的 封闭 ， 所 以 预 杂交 液 中 用 SSPE 代替 SSC 会 得 到 较 低 的 背景 值 。 另 外 ， 用 杂交 炉 〈Lab-Line) 会 得 到 较 好 的 数值 。

(4) poly(T) 探 针 的 合成

对 poly(A) 模板 进行 反 转 录 得 到 的 第 一 链 cDNA ， 可 作为 实验 中 所 需 的 poly(T) 探 针 。 典 型 的 反 转 录 体 系 (100pl) 含有 以 下 组 分 : 250ng/pl poly(A); 2mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 (DTT); 50mmol/L Tris-Cl, pH8.3; 40mmol/L KCl; 10mmol/L MgCl; 0.5U/pl RNa- sin(Promega); lImmol/L dTTP; 0. 05yg/pl AY dTiz~is BK HM; 100nCila** P| TTP (3000Ci/mmol)®; 5U/pl AMV 反 转 录 酶 。 尽 管用 dTTP 而 不 是 dNTP 的 混合 液 可 以 得 到 特异 性 很 高 的 cDNA,， 但 是 任何 一 种 cDNA 合成 试剂 盒 都 可 用 来 进行 上 述 反 应 。 探 针 长 度 约 为 200 一 300bp。 另 外 ， 非 同位 素 标记 的 poly(T) 探 针 可 用 第 13 章 中 的 方法 合成 。

© 42C 保 温 1. 5h。

d0 用 100mmol/L NaOH 与 10mmol/L EDTA 的 混合 液 终止 反应 。 将 样品 在 65 它 保温 20min 以 水 解 其 中 的 poly(A) RR.

注意 该 方法 与 从 cDNA 经 典 合成 方法 中 除去 模板 RNA 的 步骤 相同 。

@ 室温 下 用 pH7.5,. 100mmol/L Tris-Cl 中 和 碱 性 的 反应 混合 物 15min,

OQ 需要 将 标记 的 探 针 与 未 挫 人 的 放射 性 核 苷 酸 及 其 他 反应 组 分 分 开 。 可 用 离心 柱 层 析 进行 纯化 (Sambrook 和 Russel，2001) ， 如 将 样品 过 Sephadex G-25 柱 (Amersham Biosci- ences), ， 也 可 以 用 其 他 商品 化 的 浓缩 纯化 试剂 盒 来 分 离 。 暂 未 使 用 的 探 针 〈 及 含有 杂交 缓冲 液 的 探 针 ) 应 在 适当 屏蔽 下 于 一 20C 保 存 ， 在 这 样 的 温度 下 可 以 存放 4 一 6 周 。

@ 虽然 检测 需要 的 时 间 较 长 ， 但 也 可 以 用 250nCiL35S]TTP 5 -(oS) 来 标记 探 针 。1Ci=37GBq。 。 107 ，

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

(5) 杂交

BO 弃 去 原 有 的 预 杂交 液 ， 换 上 用 量 不 超过 100p)/cm’ 的 新 鲜 的 预 杂 交 液 。 加 入 浓度 为 100ng/ml 或 1X105cpmy/ml AY poly(T) 探 针 。

© 44C 温 和 振荡 3 一 4h。

(6) AAC WR

© 杂交 结束 后 移 去 探 针 溶液 。 可 以 冷冻 保存 使 用 过 的 探 针 溶液 ， 并 再 次 用 于 以 后 的 杂 交 分 析 。 如 果 使 用 了 Church 缓冲 液 来 进行 预 杂交 或 杂交 〈 预 杂 交 方 法 1) ， 则 用 200mmol/L NaCl 在 室温 下 洗涤 滤 膜 两 次 ， 每 次 10min; 然后 44°C 洗涤 30min; 最 后 ， 用 75mmol/L NaCl 室温 洗涤 5min。 如 果 杂 交 使 用 的 是 含有 SSPE 的 缓冲 液 〈 预 杂交 方法 2)， 则 用 2x SSPE, 0.1% SDS 在 室温 洗涤 两 次 ， 每 次 10min; 再 用 0.1XSSPE、0.1% SDS Bumpy 37°C VER LIK, FEY 10min。 为 了 保证 洗涤 能 充分 有 效 ， 每 次 洗涤 至 少 使 用 100ml 缓冲 液 。

© 除去 滤 膜 上 过 量 的 洗涤 缓冲 液 。 将 滤 膜 探 针 面向 上 放 在 Whatman 3mm 滤纸 上 20 一 30s, Fe Ue AR TE.

@ 用 保鲜 膜 包 好 湿 的 滤 膜 ， 即 可 进行 放射 自 显影 98。 如 果 用 上 增 感 屏 ， 这 类 杂交 只 需 在 一 70C 下 曝光 过 夜 便 能 得 到 很 强 的 信号。

注意 AGM. AWWA Cerenkov 计数 来 对 各 个 稀释 样品 定量 : 从 膜 上 前 下 每 个 稀释 组 分 〈 也 就 是 说 每 个 斑点 或 狭 颖 ) ， 直 接 加 入 闪烁 液 进行 检测 。

曲 每 个 poly(A) 的 含量 可 由 poly(T) 杂交 程度 定 出 ， 这 样 全 细胞 RNA 或 全 细胞 质 RNA 的 量 即 可 根据 一 个 参 比 样品 而 进行 标准 化 校准 。 许 多 情况 下 参 比 样品 会 是 一 个 对 照 或 者 未 经 处 理 的 样品 。 这 样 标准 化 的 RNA 样品 即 可 用 于 电泳 。

10.3 ep HBM EK RNAS £47 H

体内 的 mRNA 分 子 ， 本 质 上 是 以 单 链 多 核 苷 酸 形式 与 细胞 质 蛋 白质 结合 ， 组 成 信使 核糖 核 重 白 体 (mRNP) 颗粒 。 这 些 mRNP 被 认为 是 细胞 内 mRNA 的 天 然 存在 形式 ， 展 示 了 重要 的 二 级 结构 。 这 是 RNA- 蛋 白质 之 间 的 相互 作用 和 互补 序列 之 间 碱 基 配 对 形成 的 结果 。 事 实 上 ， 现 在 认为 所 有 RNA 分 子 中 都 含有 短 的 双 链 螺旋 区 域 ， 除 了 标准 的 A::U 和 G:::C 配 对 . 之 外 ， 还 有 较 弱 的 G :: U 配 对 。 通 常 这 些 分 子 间 和 分 子 内 的 相互 作用 程度 ， 被 认为 调节 了 转 录 本 在 细胞 质 中 的 可 翻译 性 (综述 见 Lewin，2004)。 并 且 ， 有 不 断 增加 的 证 据 表 明 ， 在 mRNA 的 近 5 端 或 是 中 部 暂时 形成 的 双 链 区 域 ， 会 严重 影响 mRNA 的 可 翻译 性 。 本 质 上 ， 这 也 是 反 义 核 酸 和 RNA 干扰 (RNAi) 技术 的 作用 基础 。 无 论 是 阻止 mRNA 5 末端 与 翻译 机 峰 的 相互 作用 ， 或 是 单纯 地 剪 切 mRNA， 都 造成 mRNA 不 能 被 翻译 。

分 子 构 象 是 控制 核酸 在 电场 内 迁移 的 参数 之 一 ， 二 级 结构 或 是 RNA 发 夹 结 构 会 影响 原 本 基于 分 子 量 的 电泳 分 离 。 有 些 RNA 分 子 ， 如 tRNA 就 是 一 个 主要 的 例子 ， 它 含有 许多 自 身 互 补 的 序列 ， 整 个 分 子 作为 一 个 整体 呈现 出 极 有 特征 性 的 、 很 容易 识别 的 、 并 拥有 惊人 稳 定性 的 三 级 结构 。 因 此 ， 分 子 内 碱 基 配 对 程度 不 同 的 同 种 RNA， 向 正极 迁移 的 速度 是 不 同 的 。 这 就 造成 不 同 RNA 转录 本 在 电泳 时 表现 为 拖 尾 。 为 了 克服 这 个 问题 ，RNA 样品 通常 会 在 变性 条 件 下 电泳 ， 仅 仅 加 热 是 无 法 解决 二 级 结构 问题 的 。 成 功 的 RNA 电泳 需要 两 个 条

© 检测 方法 与 化 学 发 光 法 不 同 。 见 第 15 章 。 。 108 。

第 10 章 ” 电 ik

44: ORNA 在 上 样 之 前 已 经 变性 ; @ 电 泳 过程 中 的 条 件 可 支持 并 维持 RNA 已 变性 的 状态 5 如 果 没 有 其 他 问题 ， 记 住 了 ， 制 备 尽 可 能 薄 的 凝 胶 和 在 低 电 压 下 电泳 ， 可 以 得 到 最 好 的 电 访 结果 。

选择 何 种 变性 系统 主要 取决 于 实验 的 目的 。 总 的 来 说 ， 凝 胶 和 变性 剂 的 选择 ， 是 一 个 需 分 离 RNA 分 子 大 小 的 函数 ， 并 且 受 到 实验 目的 不 同 的 影响 ， 如 为 了 制备 还 是 严格 分 析 RNA 的 本 质 。 小 分 子 核酸 〈 小 于 500 碱 基 或 碱 基 对 ) 最 好 用 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 3% ~ 20%) (Maniatis 等 ，1975) 。 通 常 Sl 核酸 酶 保护 实验 (Berk 和 Sharp, 1977; Favaloro 等 ，1980; Sharp 等 ，1980) 、RNase 保护 实验 (Zinn 等 ，1983; Melton 等 ，1984) 和 DNA 测序 需要 这 样 的 操作 。 但 是 ，Northern 分 析 的 研究 对 象 ， 是 数 千 种 分 子 量 各 不 相同 的 转录 本 混合 样 品 。 此 时 ，1.0%% 一 1.2%% 的 变性 琼脂 糖 凝 胶 ， 能 够 达到 在 电泳 分 辩 率 及 转 膜 〈 印 迹 ) 效率 之 间 的 最 佳 平 衡 。

在 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 中 ， 最 常用 的 RNA 变性 剂 有 甲醛 @ (Boedtker，1971; Lehrach 等 ， 1977; Rave 等 ，1979) #12 —#/— AW (DMSO) (Bantle 4, 1976; McMaster 和 Carmichael, 1977; Thomas，1980) 。 历 史上 最 早 用 于 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 的 RNA 48 PE FA] HERA SE (methylmercuric hydroxide) 系统 。 具 有 讽刺 意味 的 是 ， 尽 管 它 是 到 目前 为 止 最 有 效 的 变性 剂 (Gruenwedel 和 Davidson，1966)， 却 也 是 迄今 毒性 最 高 的 一 个 。 由 于 凑 基 甲 FER ECE 〈 毒 性 综述 见 Junghans, 1983) 问题 ， 目 前 已 不 再 使 用 它 。 现 在 ， 就 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 而 言 ， 成 功 使 用 的 RNA 变性 剂 是 甲 酰胺 8 (Spohr 等 ，1976) 和 尿素 (Reijnders 等 ， 1973) 。 每 种 变性 系统 都 有 各 自 独 特 的 性 质 、 安 全 要 求 和 优 缺 点 。 本 章 讨论 了 甲醛 和 乙 二 醛 / 二 甲 基 亚 砚 系 统 。 因 为 使 用 羟基 甲 基 素 的 难度 和 对 健康 的 危害 ， 所 以 并 不 推荐 使 用 它 ， 因 此 这 里 也 不 再 讨论 它 的 使 用 方法 。

10.3.1 甲醛 变性 法

甲醛 和 甲 酰 胺 是 常用 的 RNA 变性 剂 。 它 们 不 仅 是 致癌 剂 而 且 还 是 致 畸 剂 ， 因 此 应 该 在 通风 橱 中 进行 操作 ， 并 且 孕 妇 应 该 避免 使 用 。 为 了 确保 RNA 的 泳 动 仅 与 它 的 分 子 量 相 关 ， RNA 样品 在 电泳 前 必须 用 甲醛 和 甲 酰胺 联合 变性 ， 而 且 电 泳 时 凝 胶 内 需要 有 甲醛 来 维持 变 性 的 状态 。 甲 醛 的 储存 浓度 通常 为 37% (12. 3mol/L), FF BA 10%% 一 15%% 的 甲醇 作为 防腐 剂 。 甲 醛 在 次 棕色 的 瓶 中 于 室温 下 保存 ， 应 避免 阳光 直射 。 甲 醛 与 空气 接触 后 会 被 氧化 ， 因 此 每 次 使 用 前 都 应 检测 PH 值 ; 由 于 pH FF 4, RNA 会 大 量 降解 ， 所 以 用 于 RNA 的 甲 醛 ， 其 pH 值 必须 大 于 4.0。 可 像 甲 酰胺 那样 ， 对 甲醛 进行 去 离子 化 处 理 ， 以 提高 其 pH 值 《附录 7)。 和 杂交 步骤 前 ， 很 难 从 RNA 中 完全 除去 变性 剂 乙 二 醛 ， 这 可 能 是 很 多 实验 室 里 ， 甲醛 变性 系统 比 乙 二 醛 系统 具有 更 高 灵敏 度 的 原因 。 大 多 数 实验 室 都 选用 甲醛 变性 系统 来 进 行 RNA 电泳 。

甲醛 凝 胶 的 电泳 缓冲 液 是 1XMOPS， 通 常 配 制 成 10X 储 备 液 (400mmol/L MOPS®, pH7.0; 100mmol/L NaAc; 10mmol/L EDTA，pH8.0)， 在 高 压 灭 菌 后 呈 淡 黄色 。 与 以 往 观点 不 同 的 是 ， 将 MOPS 缓冲 液 高 压 灭 菌 ， 并 不 影响 它 作为 电泳 缓冲 液 的 功能 。 或 者 ， 也

@ 管 告 : 甲醛 是 一 种 致癌 剂 和 致 畸 剂 。 @ 警告: 甲 酰 胺 是 一 种 致癌 剂 和 致 畸 剂 。 @® MOPS 为 3-C(N- 吗 啉 代 )- 两 磺 酸 [3-(N-morpholino) propane sulfonic acid],

“fi99 -

RNA 分 了 实验 指南 一 _RNA 研究 方法

r 素 膜 将 MOPS 缓冲 液 过 滤 两 次 ， 以 除去 其 中 的 核酸 酶 活性 ， 延 长 其 储存 期 。 胶 的 硬度 ， 较 其 他 琼脂 糖 凝 胶 低 ， 而 且 更 易 滑 落 。 转 移 该 凝 胶 时 最 好 用 抹 刀 把 凝 胶 托 起 。 本 章 10. 8 节 的 内 容 ， 对 初次 进行 RNA 电泳 的 人 会 有 帮助 。

10.3.2 头 验方 案 : 甲醛 变性 胶

© RFE!

@ 配制 200ml] 的 琼脂 糖 凝 胶 溶 液 〈 足 够 配制 两 块 12cmX14cm 的 凝 胶 )。 将 2.4g 琼脂 糖 粉 与 170ml 蒸馏 水 置 于 锥 形 瓶 ， 用 热 盘 或 微波 炉 加 热 使 其 溶化 。 轻 轻 旋转 摇动 锥 形 瓶 ， 确保 琼脂 糖 完 全 溶解 ， 不 溶 的 琼脂 糖 会 旦 “ 鱼 眼 ” 状 。 温 度 降 到 55 一 60C 时 ， 加 入 预 热 的 20ml 10XMOPS 与 10ml 甲醛 (37%%)。 这 样 得 到 的 是 1XMOPS、0. 6mol/L FAR, 1.2%89 琼脂 糖 凝 胶 。 在 倒 胶 制 板 前 ， 琼 脂 糖 溶 液 于 55 一 60C 温 育 ， 注 意 在 锥 形 瓶 上 盖 上 瓶 盖 以 防 止 甲 醛 的 挥发 。

注意 ”以 前 一 些 旧 的 操作 手 则 中 ， 建 议 使 用 终 浓 度 为 2. 2mol/L 过 高 浓度 的 甲醛 。 目 前 很 多 操作 者 都 使 用 不 超过 0. 6mol/L 的 甲醛 ， 如 有 需要 也 可 降 到 0. 22mol/L。

@ 用 第 @ 步 中 配制 的 溶液 来 灌注 厚度 为 0.5 一 0. 75cm 的 胶 。 在 通风 橱 中 倒 胶 ， 以 尽 可 能 减少 甲醛 挥发 到 室内 。 凝 胶 越 薄 ，RNA 的 分 离 效 果 越 好 。

© 将 要 电泳 的 样品 ， 按 照 以 下 方案 在 灭 菌 过 的 小 离心 管 中 混 合

4.7p1 RNA (RA 20g)

2. Onl 5X MOPS 缓冲 液

3. 3ul 甲醛

10. Ol 甲 酰胺

用 枪 充分 混合 后 离心 ， 将 这 些 组 分 甩 到 管 底 。

注意 1 每 个 孔 中 RNA 的 上 样 量 不 要 超过 20kg， 超 过 此 上 样 量 可 能 会 引起 样品 丢失 ， 并 降低 分 状 率 。 如 果 目 的 RNA 的 丰 度 极 低 ， 则 每 个 孔 中 需要 加 入 4~5ye 的 poly(A)+ RNA,

注意 2 ”使 用 新 鲜 去 离子 化 的 甲醛 和 甲 酰 胺 。

© 按照 第 由 步 中 的 方法 准备 4 一 5pwg 的 标准 分 子 量 RNA,

注意 ”这 些 用 作 标准 的 RNA， 是 体内 转录 而 来 的 单 链 分 子 ， 使 用 前 也 需要 变性 。

© 将 所 有 的 样品 及 标准 分 子 量 RNA 55C 加 热 15min 或 65C 加 热 10min 变性 。

© 在 RNA 保温 变性 过 程 中 ， 一 旦 凝 胶 凝 固 即将 其 转移 浸没 在 1XMOPS 电泳 缓冲 液 中 。

注意 ”要 用 最 少量 的 电泳 缓冲 液 覆 盖 琼 脂 糖 凝 胶 。 轻 轻 地 将 梳子 垂直 向 上 拔 出 。 在 拔 梳 子 之 前 ， 就 把 胶 浸入 到 缓冲 液 中 可 润滑 加 样 孔 ， 减 少 梳子 拔 出 时 的 真空 作用 。 假 如 没有 将 缓冲 液 覆盖 在 胶 上 ， 拔 梳子 时 过 大 的 气压 可 能 会 使 加 样 孔 底部 受 损 。

变性 后 在 样品 中 加 入 2p] 10X 上 样 缓冲 液 (50% 甘 油 ; lmmolML EDTA, pH8.0; 0. 25% 溴 酚 蓝 @) ， 充 分 混合 ， 离 心 后 立即 上 样 。

注意 ”样品 变性 保温 过 程 中 ,会 有 部 分 样品 残留 在 离心 管 的 内 壁 ， 所 以 加 上 样 缓冲 液 之 前 应 先 将 样 品 离心 一 下 。

@ 上 样 缓冲 液 中 ， 也 可 以 用 终 浓 度 为 0.25 妈 的 二 甲 茉 胺 作 指 示 剂 。 但 电泳 后 ， 二 甲 茉 胺 会 干扰 对 RNA 和 DNA 的 观察 ， 特 别 是 当 目 的 条 带 就 在 二 甲苯 胺 位 置 时 ， 该 现象 更 明显 ， 因 此 不 推荐 使 用 。

”110 -

第 10 章 HB ik

@ 两 电极 之 间 的 最 大 电压 降 为 5V/cm。 省 酚 蓝 迁移 到 离 凝 胶 末 端 1 一 2cm 时 即 可 停止 电泳 。

注意 ”推测 未 知 分 子 量 的 RNA 样品 时 ， 就 应 当 电泳 到 这 个 位 置 。 在 后 续 的 实验 中 ， 根 据 经 验 估计 何 时 停止 电泳 ， 只 要 不 使 目的 RNA 跑 出 凝 胶 即 可 。

@ 电泳 结束 后 ， 凝 胶 可 以 用 0. 5wg/ml 省 化 乙 锭 的 水 溶液 或 1x MOPS 溶液 ;或 1X SYBR 4 [| #) 1X TAE st 1X TBE 溶液; 或 1XSYBR 金 的 1XTAE 或 1XTBE 溶 液 染色 ， 观测 凝 胶 内 的 RNA 分 子 。 染 色 技术 及 方法 选择 将 在 本 章 后 面 详细 阑 明 。

注意 ”用 溴 化 乙 锭 染色 甲醛 变性 胶 时 ， 通 常会 有 很 高 的 背景 ， 甚 至 到 RNA 条 带 模糊 的 地 步 。 这 是 因为 凝 胶 内 含有 甲醛 。 凝 胶 会 呈 亮 橙色 或 粉色 ， 凝 胶 中 所 有 的 核酸 因此 变 得 模糊 不 清 。 可 以 用 DEPC 处 理 的 蒸馏 水 或 5XSSC 脱色 2 一 3 次 ， 每 次 10min 以 去 除 甲 醛 。

QD) 不 管用 什么 方法 染 胶 ， 都 需要 将 凝 胶 浸 在 SX SSC 或 蒸馏 水 中 ， 以 去 除 其 中 的 甲醛 。 通常 把 凝 胶 浸 泡 在 新 鲜 的 缓冲 液 或 蒸馏 水 中 20 一 30min， 期 间 换 几 次 缓冲 液 即 可 充分 去 除 凝 胶 里 的 甲醛 。 或 者 可 以 把 凝 胶 浸 泡 在 300ml 蒸馏 水 中 ，4C 存 放 过 夜 。

CD 这 样 的 凝 胶 就 可 以 拍照 保存 。

10.3.3 乙 二 醛 / 二 甲 基 亚 砚 变 性 法

另 一 种 常规 变性 方法 ， 是 将 RNA 样品 与 1mol/L 乙 二 醛 和 50% (体积 分 数 ) DMSO 的 混合 物 50°C Hei 1h (Bantle 等 1976; McMaster 和 Carmichael，1977) 。 乙 二 醛 化 〈Salo- maa, 1956) 会 在 岛 苷 残 基 上 增加 一 个 环 ， 在 空间 上 干扰 G :::C 碱 基 配对 《〈Hutton 和 Wetmur，1973)。 高 浓度 的 乙 二 醛 可 与 RNA fl DNA 中 的 所 有 碱 基 作 用 (Nakaya 等 ， 1968); 但 是 乌 苷 酸 - 乙 二 醛 的 加 成 物 是 其 中 最 稳定 的 (Shapiro F, 1970; Broude 和 Bu- dowsky，1971)。 这 种 RNA 处 理 方法 排除 了 甲醛 (HARARE ASR) 对 身体 的 潜在 危 害 。 但 与 甲醛 系统 不 同 ， 不 需要 将 乙 二 醛 加 到 凝 胶 中 。 通 常 在 电泳 前 ，RNA 样品 中 加 入 乙 — RHE RNA BH. BAZ BH RNA 变性 的 效果 较 好 ， 但 是 乙 二 醛 的 准备 、 样 品 的 变性 及 Northern 滤 膜 的 处 理 都 很 麻烦 ， 所 以 大 多 数 工 作者 仍 采用 甲醛 变性 系统 。

乙 二 醛 的 氧化 速度 很 快 ， 因 此 在 使 用 前 ， 需 要 将 乙 二 醛 储备 液 40% CH, 6mol/L) 去 离子 化 ， 并 将 pH 值 调 到 中 性 。 假 如 不 做 去 离子 化 处 理 ， 乙 二 醛 的 氧化 产物 乙 二 酸 会 使 RNA 降解 为 片段 。 为 了 使 用 方便 ， 可 将 去 离子 化 的 乙 二 醛 分 装 于 密闭 小 管 中 一 20C 存放 。 融化 了 的 去 离子 化 乙 二 醛 ， 只 能 使 用 一 次 ， 没 用 完 的 部 分 应 当 丢 弃 。

乙 二 醛 化 的 DNA 与 RNA 分 子 ， 它 们 的 电泳 速度 相当 〈(McMaster 和 Carmichael, 1977); 因此 ， 已 知 分 子 量 的 小 分 子 DNA AT AEA A RNA 的 标准 分 子 量 对 照 。 例 如 ， 三 种 限制 性 内 切 酶 CPse TL . Poul, Hind Ill) 消化 长 度 为 4361bp 的 质粒 PBR322， 可 以 产生 三 个 长 度 为 779bp、1545bp 和 2037 bp 的 双 链 片段 。 在 没有 合适 的 RNA 分 子 量 标准 时 ， 这 些 用 乙 二 醛 处 理 过 的 片段 就 非常 有 用 。 并 且 ， 如 果 目 标 探 针 被 克隆 到 pBR322 或 其 他 与 pBR322 同 源 的 载体 里 ， 这 些 消化 制备 的 片段 就 可 作为 目标 片段 与 探 针 杂交 ， 在 放射 自 显 影 时 产生 永久 的 标准 分 子 量 影像 9。 同 样 的 方法 ， 也 可 用 于 Southern 杂交 ， 并 且 可 以 用 任何 其

© 当 用 质粒 片段 作为 分 子 量 标准 时 ， 杂 交 后 从 放射 自 显影 或 者 化 学 发 光 法 测 得 的 信号 都 非常 强 。 这 样 标准 分 子 量 的 信号 就 会 影响 相 邻 泳 道 的 信号 ， 可 能 会 模糊 目的 条 带 。 如 果 希 望 照片 上 有 标准 分 子 量 泳 道 出 现 ， 通 常 建议 上 样 量 不 超过

25ng,

° TIT -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

他 已 知 DNA 序列 的 质粒 制备 分 子 量 标准 。

与 甲醛 变性 的 样品 相 比 ， 乙 二 醛 化 的 核酸 样品 电泳 速度 较 慢 ， 但 条 带 更 锐利 。 乙 二 醛 变 性 胶 最 大 的 缺点 是 ， 标 准 电泳 缓冲 液 (10mmol/L 的 磷酸 钠 ，pH7.0) 的 缓冲 能 力 较 弱 。 因 此 为 了 防止 形成 pH 梯度 ， 分 离 RNA 样品 时 ， 乙 二 醛 变性 胶 的 电泳 速度 应 当 比 甲醛 变性 胶 We. TEAR RAB. BAN pH7. 0 时 缓冲 液 中 的 离子 强度 较 低 ， 因 此 不 需要 往 凝 胶 中 加 入 变性 剂 就 能 够 维持 乙 二 醛 的 最 大 变性 效果 。 磷 酸 钠 缓冲 液 不 能 抵抗 溶液 pH 值 的 快速 改变 ， 所 以 电泳 时 需要 保证 缓冲 液 的 持续 循环 来 维持 pH. ALA bDH 大 于 8.0 时 ， 乙 三 醛 就 会 与 RNA (和 DNA) 解 离 (Thomas，1980)， 并 且 RNA 样品 对 碱 敏 感 ， 易 于 水 解 ， 因此 上 述 做 法 就 很 必要 。 购 买 电 泳 槽 时 ， 可 以 方便 地 选择 很 多 有 缓冲 液 进出 口 的 、 能 支持 组 冲 液 循环 的 产品 。 假 如 配置 无 法 支持 缓冲 液 循环 ， 尽 管 操 作 非 常 麻烦 ， 也 必须 每 隔 30min 切断 电源 更 换 一 次 缓冲 液 。 另 外 ， 也 可 以 用 1XMOPS 缓冲 液 代 替 磷 酸 钠 缓 训 液 来 进行 电 泳 ， 这 样 可 以 降低 乙 二 醛 变性 胶 对 缓冲 液 循环 的 要 求 。 本 章 10.8 节 的 内 容 ， 对 初次 进行 RNA 电泳 的 人 会 有 帮助 。

10.3.4 实验 方案 : 乙 二 醛 化 与 RNA 电泳

(1) 前 期 准备 : 磷酸 钠 缓冲 液 的 配制

将 NaH2PO. (〈 单 碱 盐 ) 与 Naz HPO4 〈 二 碱 盐 ) 储备 液 ， 按 照 合 适 的 比例 混合 以 配制 特定 pH 值 的 磷酸 钠 缓冲 液 〈 表 10. 1) 。 磷 酸 钠 缓 冲 液 的 化 学 成 分 可 用 NazHzPO4 来 表示 ， 说 明 该 混合 液 是 由 单 碱 盐 及 二 碱 盐 混合 而 成 的 。

配制 0.2mol/ 工 的 NaHzPO4 与 NazHPO4 的 储备 溶液 ， 高 压 灭 菌 或 者 过 滤 灭 菌 。 根 据 表 10. 1 中 比例 混合 两 种 盐 配 制 特 定 pH 值 的 缓冲 液 ， 再 加 入 90 妈 体积 的 水 稀释 溶液 到 相应 浓度 。 最 后 校正 溶液 的 pH 值 。 通 常 按 照 以 下 方法 来 微量 调节 溶液 pH (A: NaH2PO, 可 降 低 pH 值 ，Nas HPO4 可 以 提高 pH (A. TER: 要 用 稀释 到 终 浓 度 的 磷酸 盐 溶液 来 调节 pH 值 而 不 是 用 0. 2mol/L 的 储备 溶液 来 调节 pH 值 。 最 后 加 水 定 容 。

(2) 凝 胶 与 样品 制备

戴 手 套 !

Q 将 琼脂 糖 溶解 于 10mmol/L NazH,PO (pH7.0) 中 ( 终 浓度 为 1.2%%)。

G@) 当 琼 脂 糖 溶液 冷却 到 55~60°C Wt, AE CHE TE Be Al eK 12cm X 14cm 大 小 的 胶 。

注意 “省 化 乙 啶 会 与 乙 二 醛 反 应 ， 不 能 将 该 染料 加 到 乙 二 醛 凝 胶 中 。 同 样 ，SYBR 绿 与 SYBR 金 也 不 能 加 到 胶 中 。

® 在 无 菌 的 微量 离心 管 中 ， 加 入 下 列 物 质 进 行 RNA 样品 的 变性 :

3. 7pl RNA 〈 每 个 泳 道 最 多 10pg)

2. 7pl 6mol/L 的 乙 二 醛 〈 去 离子 的 )

8. Onl DMSO. 〔〈 分 子 生 物 学 纯度 )

1. 641 100mmol/L Na,H,PO,, pH7. 0

这 样 比例 产生 的 溶液 终 浓 度 为 1Imol/L Z RE. 50% DMSO, 10mmol/L NazH,PO4 。

© 盖 上 微量 离心 管 管 盖 ，50C 保 温 1h。

© 等 凝 胶 凝 固 后 将 其 浸入 到 电泳 缓冲 液 中 (10mmol/L Na,H,PO,, pH7.0). # RNA 样品 乙 二 醛 化 的 同时 进行 该 操作 。

注意 “要 用 最 少量 的 电泳 缓冲 液 覆 盖 琼 脂 糖 凝 胶 。 轻 轻 地 将 梳子 垂直 向 上 拔 出 。 在 拔 梳 子 之 前 就 把

- 112+

| 4

第 10 章 电 ik

凝 胶 浸 和 缓冲 液 中 润滑 加 样 孔 ， 减 少 梳 子 拔 出 时 造成 的 真空 。 假 如 没有 将 缓冲 液 覆盖 在 胶 上 ， 拔 梳子 时 过 大 的 气压 会 使 加 样 孔 的 底部 受 损 。

@ 第 @ 步 保温 结束 ， 等 样品 温度 降 到 20C 后 ， 加 入 2xl 10X 上 样 缓冲 液 (50% 甘油 ; Immol/L EDTA, pH8.0; 0. 25% 溴 酚 蓝 )。 微 量 离心 管 离心 2 一 3s， 将 样品 集中 到 管 底部 。

@ 立即 上 样 。

© 电泳 时 两 极 之 间 的 最 大 电压 降 为 5V/Vcm。 当 指示 剂 省 酚 蓝 移动 到 80% 时 可 停止 电泳 。

注意 “推测 未 知 分 子 大 小 的 RNA 样品 时 ， 就 应 当 电泳 到 这 个 位 置 。 在 后 续 的 实验 中 ,根据 经 验 估 计 ， 只 要 目的 RNA 不 跑 出 胶 即 可 。

@ 尽管 不 推荐 ， 但 是 电泳 结束 后 可 直接 把 凝 胶 转 膜 ， 用 于 Northern 印迹 而 不 需要 染 色 。 可 用 0. Sug/ml 的 省 化 乙 锭 “〈 溶 于 100mmoLL WARE) 或 2XSYBR AT G&F 1x TBE 缓冲 液 ) Bese.

注意 1 检测 者 应 当 考 虑 到 乙 二 醛 与 省 化 乙 锭 间 的 潜在 作用 会 改变 它们 的 光学 性 质 ， 并 降低 转移 效率 。

注意 2 也 可 用 30kg/ml ORE CAF DEPC 处 理 过 的 10mmol/L 磷酸 钠 ，pH7.0) (BREE at SYBR 绿 染 料 。 因 为 听 啶 橙 会 产生 很 高 的 背景 ， 所 以 这 种 染色 方法 也 不 推荐 。 使 用 该 方法 时 可 将 凝 胶 放 HEBER 〈 搞 瓷 能 够 吸收 串 啶 栖 ) 中 ， 室 温 下 脱色 1h (McMaster 和 Carmichael，1977) 。 用 热 水 冲 洗 挤 瓷 盘 10~15min 可 以 除去 吸附 的 叫 啶 橙 。 使 用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 时 ， 可 以 在 室温 下 避 光 脱色 2h 或 者 4C 脱色 过 夜 。 叫 啶 橙 也 是 一 种 致癌 物质 ， 与 DNA 有 结合 能 力 ， 操 作 时 要 小 心 。

@ 乙 二 醛 化 的 RNA， 可 以 直接 从 琼脂 糖 凝 胶 转 移 到 尼龙 膜 或 硝酸 纤维 素 膜 上 ， 不 需要 脱 乙 二 醛 处 理 。 转 膜 后 的 预 杂交 过 程 中 ， 乙 二 醛 会 与 RNA 样品 分 离 OLB 14 章 ) 。

注意 “不 要 将 凝 胶 浸泡 在 碱 性 溶液 中 去 除 乙 二 醛 。 碱 性 环境 不 仅 会 降低 转移 效率 ， 而 且 会 降解 RNA， 直 至 杂交 可 检测 水 平 以 下 。

10.4 D+ 4

精确 测量 某 种 RNA 分 子 的 大 小 ， 与 推测 其 他 大 分 子 物 质 的 分 子 量 有 相当 的 重要 性 。 尽 管 DNA 5 RNA 都 是 核酸 ， 但 由 于 内 在 化 学 结构 的 不 同 ， 同 样 长 度 的 RNA 分 子 要 比 双 链 DNA 分 子 移动 得 快 9。 这 种 差异 在 甲醛 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 中 很 明显 (Wicks，1986)。RNA 胶 中 最 好 不 要 用 常规 的 入 喉 菌 体 DNA (Hind 焉 消化 ) 与 ®X174 DNA (Hae 焉 消化 ) 基因 组 标准 ， 而 是 选用 RNA 分 子 量 标准 。 只 有 在 乙 二 醛 处 理 下 ，RNA 与 DNA 才 会 有 相同 的 电泳 速度 (McMaster 和 Carmichael, 1977); 并 且 只 有 DNA 样品 与 细胞 质 内 大 部 分 RNA 分 子 的 分 子 量 范围 相当 时 ， 才 可 以 用 作 分 子 量 标准 。

制备 RNA 电泳 的 分 子 量 标准 并 不 困难 ， 即 使 在 小 型 实验 室 中 也 很 容易 实现 。 以 下 是 佑 测 目的 RNA 分 子 量 的 两 种 基本 方法 。

D 外 源 分 子 量 标准 : 是 可 在 同一 块 凝 腕 上 ， 单 独 上 样 的 已 知 分 子 量 的 核 苷 酸 分 子 。 这 些 标 准 样品 基本 上 都 是 商品 化 的 。RNA 的 分 子 量 标 准 通常 含有 5 一 10 条 体外 转录 的 单 链 RNA 分 子 。 用 变性 样品 的 方法 来 变性 这 些 单 链 RNA 分 子 量 标准 。 这 些 分 子 量 标准 与 样品

@ 确实 有 人 用 双 链 DNA 作为 鉴定 RNA 分 子 大 小 的 标准 ， 尤 其 是 小 于 400bp FY) BE * 113 =

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

RNA 一 样 对 RNase 很 敏感 ， 操 作 时 应 当 尽 量 小 心 。

在 乙 二 醛 系统 中 ， 还 可 以 将 4361bp 的 pBR322 质粒 三 酶 切 (Pst 1. Pou 1. Hind I) 产物 ， 乙 二 醛 化 后 作为 分 子 量 标准 。 产 物 为 779bp、1545bp、2037bp 的 三 个 片段 。

@ 内 源 分 子 量 标准 : 是 实验 样品 中 所 含 的 已 知 分 子 量 大 小 的 RNA 分 子 ， 通 常 是 大 亚 基 rRNA、 小 亚 基 rRNA。 这些 分 子 量 标准 本 身 就 是 样品 的 一 部 分 ， 因 此 在 准备 电泳 样品 时 就

许多 物种 的 rRNA 它们 的 分 子 量 都 是 已 知 的 ， 所 以 至 少 可 以 以 它们 在 凝 胶 上 的 位 置 作 为 参考 。 尽 管用 标准 分 子 量 的 RNA 混合 物 会 得 到 更 精确 的 结果 ， 但 是 28S rRNA 与 18S rRNA@ (单独 使 用 或 与 RNA 分 子 量 标准 联合 使 用 ) 几乎 是 通用 的 。 根 据 裂 解 方法 的 不 同 ， 即使 是 变性 恰当 的 RNA 样品 ， 电 泳 后 染色 也 可 能 显示 出 具有 更 大 分 子 量 的 第 3 个 条 带 。 这 个 较为 模糊 的 条 带 是 45S rRNA， 是 28S rRNA 与 18S rRNA 的 核 前 体 〈 第 2 章 ， 图 2.3)， 它们 聚 集 在 细胞 质 部 分 ， 与 过 剩 的 蛋白 质 相互 作用 ， 形 成 有 功能 的 核糖 体 。

10. 4.1 分 子 量 标准 的 正确 使 用

无 论 是 外 源 还 是 内 源 的 分 子 量 标准 ， 都 可 以 作为 确认 样品 RNA 分 子 量 的 标准 。 但 两 者 都 有 各 自 的 优 缺 点 。 对 于 外 源 分 子 量 标准 要 注意 以 下 事项 。

D 分 子 量 标准 的 用 量 。

GO 分 子 量 标准 在 凝 胶 中 的 位 置 。

G@) 分 子 量 标准 的 大 小 范围 。

由 分 子 量 标准 的 观测 方法 〈 染 色 、 末 端 标记 还 是 通过 杂交 检测 ) 。

几 种 商标 的 预制 RNA 分 子 量 标准 具有 一 个 特点 : 体外 转录 中 ， 合 成 转录 本 的 DNA 模板 并 不 是 总 能 完全 去 除 干净 。 另 外 ， 许 多 模板 与 常用 于 分 子 殉 隆 的 质粒 载体 同 源 性 很 低 。 对 于 这 类 载体 来 源 的 探 针 ， 可 能 的 解决 办 法 只 有 使 用 标记 的 并 且 用 作 和 杂交 的 不 是 从 载体 上 切 下 的 核酸 探 针 ;， 或 者 使 用 虽然 从 载体 上 剪 切 下 来 ， 但 两 端 带 有 载体 序列 的 探 针 。 虽然 工作 者 很 期 待 探 针 序列 能 够 有 很 高 的 杂交 特异 性 ， 但 载体 与 分 子 量 标准 中 残余 模板 间 发 生 的 杂交 是 不 可 避免 的 。 因 为 这 种 杂交 的 配对 非常 好 ， 亚 纳 克 级 的 模板 就 足以 产生 很 强 的 杂交 信号 8。 随 之 带 来 两 个 负面 影响 : 中 很 强 的 检测 信号 会 覆盖 或 者 模糊 相 邻 条 带

的 杂交 信号 ;@ 分 子 量 标准 泳 道中 ， 会 出 现 以 前 看 不 到 的 某 些 异常 的 条 带 ， 这 会 给 分 子 量 的 确定 带 来 很 大 的 麻烦 。 所 以 ， 如 果 有 理由 相信 ， 可 能 产生 很 强 的 信号 时 ， 明 智 的 做 法 是 ， 在 分 子 量 标准 与 实验 样品 的 泳 道 间 空 一 个 泳 道 ， 并 使 用 纳 克 级 的 分 子 量 标准 。 画 外 ， 如 果 是 凝 胶 染 色 后 检测 ， 每 个 泳 道 就 需要 加 入 2ng 的 分 子 量 标准 ， 这 个 量 所 产生 的 信和 号 才能 拍照 。

如 果 样 品 中 不 含 载体 序列 ， 或 者 克隆 到 载体 上 的 探 针 不 与 分 子 量 标准 中 的 组 分 杂交 ， 每 个 泳 道中 可 以 上 4 一 5pg 的 样品 量 ， 这 样 就 足以 产生 拍照 存档 需要 的 信号 强度 。 当 样品 中 含 有 载体 序列 时 ，15ng 的 分 子 量 标准 就 可 以 有 效 地 与 互补 的 载体 序列 杂交 ， 并 检测 到 非常 锐 利 的 条 带 。

@ 在 原核 生物 中 ， 对 应 于 真 核 28S rRNA 与 18S rRNA 的 是 23S rRNA 与 16S rRNA。 @ 假如 没有 载体 序列 ， 或 者 样品 中 含有 的 不 是 完全 相关 的 载体 序列 ， 就 不 会 发 生 交叉 杂交 的 现象 。 把 pBR322 相 关 的 载体 加 到 pBR322 三 酶 切 消 化 后 的 产物 中 会 产生 很 强 的 杂交 信号。

"114 。

第 10 章 电 ik

分 子 量 标准 的 质量 ， 即 它 在 凝 胶 中 的 位 置 ， 就 是 一 个 非常 重要 的 参数 。 样 品 通常 以 不 对 称 方式 上 样 ， 第 一 次 做 电泳 实验 时 更 应 该 如 此 。 得 到 了 明显 的 条 带 ， 但 却 不 知道 每 个 条 带 代 表 哪些 物质 是 很 令 人 温 丧 的 。 实 验 者 在 转移 凝 胶 时 ， 凝 胶 被 翻转 倒置 了 ;， 转移 到 滤 膜 后 ， 无 法 判断 凝 胶原 来 的 方向 ， 使 实验 结果 更 加 复杂 化 。 另 外 ， 在 X 射 线 显影 的 过 程 中 ， 翻 转 胶 也 有 可 能 会 对 结果 产生 影响 。 假 如 分 子 量 标准 是 在 凝 胶 的 中 央 ， 它 两 边 样品 的 差异 也 会 不 明显 。 所 以 不 对 称 上 样 至 少 可 以 消除 这 些 方面 的 影 响 。 在 笔者 实验 室 中 ， 分 子 量 标准 通常 上 在 最 后 一 个 泳 道 ， 也 就 是 说 凝 胶 右 上 方 最 后 一 个 〈 泳 道 图 图 10.2， 加 样 的 标准 总 法 。 10. 2). 实验 者 应 当 在 凝 胶 的 正 前 方 加 样 孔 的 对 AAA RNABEADERBK. BE BRAS ORME 一 系列 跨度 很 大 的 已 知 分 子 量 的 RNA 样品 (500~10000bp 是 好 的 起 始 范围 ) 来 判断 新 系统 中 RNA 分 子 的 大 小 。 定 出 实验 样品 的 大 概 范围 之 后 ， 就 可 以 选择 非常 大 的 或 非常 小 的 分 子 量 标准 来 精确 判断 特定 种 类 RNA 分 子 的 大 小 。

10.4.2 #8 RNA

真 核 生 物 的 核糖 体 含 有 大 小 亚 基 两 个 主要 成 分 。 大 的 称 为 60S WHE, NMA 40S 亚 BE; “S” {KH Svedberg 单位 ， 即 描述 大 分 子 沉 降 速度 的 一 个 生化 术语 。 每 个 亚 基 都 含有 一 种 特定 的 rRNA 以 及 一 组 蛋白 质 。 在 RNA 抽 提 过 程 中 ， 约 有 70 种 蛋白 质 会 与 rRNA 分 离 并 被 去 除 ， 得 到 的 rRNA 将 与 其 他 RNA 一 起 被 继续 纯化 。28S rRNA 与 18S rRNA 分 别 是 由 60S 亚 基 和 40S 亚 基 去 蛋白 质 产 生 的 。 更 小 的 5S rRNA 和 5. 8S rRNA 也 是 真 核 生物 核 糖 体 的 组 成 成 分 ， 在 去 蛋白 质 的 过 程 中 ， 它 们 也 会 从 核糖 体内 部 释放 出 来 。

大 量 的 rRNA 可 作为 内 参照 。

@ 可 作为 分 子 量 标准 。

@ 可 通过 目测 判断 样品 的 完整 性 。

@ 为 每 个 泳 道 中 总 RNA 的 上 样 量 相 同 提供 证 据 。 可 由 显 像 密度 计 分 析 或 图 像 分 析 软 件 操作 得 出 这 些 结 论 。 以 前 的 方法 可 参考 Bonini 和 Hofmann (1991), Correa-Rotter 等 (1992) 。

因为 rRNA 是 最 主要 的 转录 产物 〈 占 到 总 细胞 RNA 的 80% 一 85%)， 因 此 等 量 的 总 细 胞 RNA 或 总 细胞 质 RNA 电泳 后 ， 必 然 产 生 明 显 的 、 极 易 观 察 的 两 条 带 ， 即 28S rRNA 和 18S rRNA。 这 些 条 带 的 存在 就 可 以 证 实 样品 的 完整 性 ， 也 就 是 说 样品 没有 降解 。 在 高 等 哺 乳 动物 的 RNA 中 ，28S rRNA 的 含量 是 18S rRNA 的 2 倍 ; 并 不 是 所 有 的 真 核 生物 都 是 这 样 ， 随 着 进化 等 级 的 降低 ， 这 个 比例 会 逐渐 趋向 于 1 (图 10.3).

除了 28S rRNA 和 18S rRNA 的 条 带 ， 还 应 当 在 两 种 rRNA 稍 高 、 之 间或 稍 下 的 位 置 ， 有 一 条 浅 的 弥散 的 条 带 。 这 是 细胞 mRNA 组 分 的 正常 现象 。 其 原因 是 胞 质 mRNA 的 异 源 性 很 高 ， 并 且 它 在 总 细胞 RNA 中 含量 不 超过 3%。 为 了 达到 大 分 子 量 RNA 的 最 高 分 辩 率 ， 可 以 延长 电泳 时 间 ， 直 至 5S rRNA、5. 8S rRNA 和 tRNA 电泳 到 凝 胶 的 边缘 并 进入 缓冲 液 。

。 115 +

Manta § 汪汪 ES

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

Tues 25 345 4-1 SG: 9 Nk B12

10.3 不 同 种 类 真 核 生 物 RNA 表达 谱 的 比较 。 在 1.2%% 的 琼脂 糖 变 性 胶 上 分 离 纯化 的 RNA: CHO-K1 细胞 〈 泳 道 1~4 5 7~10); BA (S.uvarum) 的 RNA 样 品 (〈 泳 道 5 和 11)。( 泳 道 1) 非 离子 溶解 法 制备 的 总 细胞 质 RNA 一 一 尽管 样品 过 多 ， 但 质量 很 好 。( 泳 道 2) 盐酸 肌 - 酸 -苯酚 法 抽 提 的 总 细胞 RNA 一 一 质量 较 好 ， 但 有 大 分 子 hnRNA. ( 泳 道 3) poly(A)* RNA 一 一 样品 全 部 降解 了 。( 泳 道 4) poly(A)” RNA 一 一 质量 很 好 。 ( 泳 道 5) 用 酸 -苯酚 法 抽 提 的 酵母 总 RNA 好 。( 泳 道 6) 空白 。( 泳 道 7) 非 离 子 溶解 法 制备 的 总 细胞 质 RNA 一 一 质量 很 差 ， 说 明 样 品 降解 了 。 ( 泳 道 8) 盐酸 肌 - 酸 -苯酚 法 抽 提 的 总 细胞 RNA 一 一 质量 较 好 ， 但 有 大 分 子 hnRNA, ( 泳 道 9) poly (A)+RNA 一 一 质量 很 好 ， 注 意 痕 量 28S rRNA 和 18S rRNA， 它 证 实 了 样品 的 完整 性 。 ( 泳 道 10) poly(A)” RNA 一 一 质量 很 好 。( 泳 道 11) 用 酸 -苯酚 法 抽 提 的 总 酵母 RNA 一 一 质量 很 好 。( 泳 道 12) Promega 公司 的 单 链 RNA 分 子 量 标准 。 从 图 中 可 以 看 出 酵母 28S rRNA 移动 速度 比 CHO-K1 WER 〈 泳 道 5 和 11)， 泳 道 2、4、8、10 中 还 有 hnRNA 及 前 体 45S rRNA

因为 5S rRNA、5. 8S rRNA 太 小 ， 它 们 经 常 与 tRNA 一 起 跑 到 凝 胶 的 最 前 端 〈300 一 400bp 的 范围 )， 所 以 它们 不 能 作为 细胞 质 RNA 的 分 子 量 标准 。 因 此 上 述 做 法 是 可 行 的 。 但 这 种 方法 肯定 不 会 被 推荐 用 于 评估 新 的 体系 。 稍 后 ， 实 验 者 就 可 以 知道 ， 延 长 电泳 时 间 能 和 否 提高 样品 的 分 辩 率 。

来 自 绿色 组 织 的 植物 RNA， 其 电泳 图 谱 与 动物 细胞 RNA 的 不 同 。 植 物 细 胞 电泳 图 中 除了 有 大 小 rRNA 外， 经 染色 还 可 以 看 到 大 量 其 他 的 条 带 。 它 们 是 叶绿体 的 转录 产 物 〈 图 10. 4) 。 这 些 条 带 的 存在 是 样品 完整 性 的 指标 。 只 要 在 泳 道 的 下 半 部 分 有 少量 或 没有 弥散 的 条 带 ， 该 RNA 样品 在 以 后 的 各 种 应 用 中 可 能 都 会 表现 良好 。 虽 然 传说 某 些 植物 的 转录 产物 很 稳定 ， 但 保存 时 间 超 过 6 个 月 的 RNA 样品 最 好 要 进行 电泳 以 确保 其 完整 性 。

用 oligo(dT) 纯化 的 poly(A)+ RNA 样品 ， 通 常 都 有 微量 的 rRNA 遗留 下 来 ， 它 们 的 条 带 密 度 能 够 〈 比 较 深 时 ) 或 不 能 够 〈 很 浅 时 ) 判断 样品 的 大 小 。 看 到 rRNA 的 事实 是 样品 完整 性 最 有 力 的 证 据 。 在 回收 polyC(A)+ mRNA 时 ， 通 常会 犯 这 样 的 错误 ， 丢 弃 主要 由 rRNA Ail tRNA AKA poly(A) -组 分 。 若 回收 该 组 分 并 与 其 他 样品 一 起 电泳 ， 其 中 的 rRNA 可 作为 合适 的 分 子 量 标准 以 及 很 好 的 阴性 对 照 。 该 对 照 缺 少 poly(A)” mRNA， 使 得 其 他 泳 道中 的 杂交 信号 并 不 是 人 为 的 或 非特 异性 杂交 的 结果 。 当 目的 RNA 位 于 非常 靠近 28S rRNA, 18S rRNA 的 位 置 时 ， 这 样 的 对 照 就 特别 重要 。 在 作者 实 验 室 里 ， 通 常 按照 全 细胞 RNA、poly(A)+ RNA 45 poly(A)” RNA 的 顺序 来 上 样 电 泳 〈 图 10.5).

= 116 -

图 10.4 #446 (Morning Glory) 与 番薯 植物 (Ipomoea sp.) 总 细胞 质 RNA 的 表达 谱 。 组 织 中 分 出 的 10ug RNA 样品 50V 电泳 3h。 凝 胶 用 SYBR 金 染 色 30min。 泳 道 1: 第 一 叶 “〈 诱 导 后 )。 泳 道 2: 第 一 叶 “〔〈 无 性 繁殖 的 ) tik 3: 第 一 叶 (诱导 后 ) 。 泳 道 4: 子叶 〈 诱 导 后 ) 。 泳 道 5: 根部 (诱导 后 ) 。 泳 道 6: 第 一 叶 〈 无 性 繁殖 的 ) hia 7: 根部 “〈 无 性 繁殖 的 )。 泳 道 8: RNA 分 子 量 标 准 (Promega) 。 泳 道 1~4 和 6 中 除了 含有 28S rRNA 和 18S rRNA 外 ,还 含有 大 量 的 叶绿体 转录 产物 一 一 气 生 组 织 ， 这 也 是 植物 RNA 的 共有 特 征 。 相 比 之 下 ， 根 部 的 RNA 样品 〈 泳 道 5 和 27) 只 含有 28S rRNA 和 18S rRNA。 值 得 注意 的 是 这 些 RNA 样 品 已 在 一 80C 保 存 16 年 ， 这 些 高 质量

图 10.5 总 细胞 RNA、poly(A)+RNA 与 poly(A)” RNA 的 比较 。CHO-K1 细胞 ( 泳 道 1~4) 和 酵母 〈S. uvarum; 泳 道 5) 的 RNA 样品 在 1.2 狼 的 琼脂 糖 变性 胶 上 电 泳 。 泳 道 1: 非 和 细胞 质 RNA 一 一 质量 很 差 。 泳 道 2: 盐酸 肌 - 酸 -苯酚 法 抽 提 到 的 全 细胞 RNA—— Jim 量 好 ， 但 有 大 分 子 的 hnRNA。 泳 道 3 poly(A) ”RNA 一 一 质量 好 ， 含 有 微量 的 rRNA。 泳 道 4，poly(A)-”RNA 一 一 质量 好 。 泳 道 5: 总 酵母 RNA 一 一 质量 好 。 泳 道 6: RNA 分 子 量 标 准 (Promega) 。 酵 母 28S rRNA 比 哺乳 动物 的 小 ， 因 而 它 的 泳 动 距 离 比 CHO-K1 的 28S 转录 本 的 大

RNA 可 以 成 功 地 用 于 转录 起 始 位 点 的 作 图 研究

品 只 要 稍 有 降解 就 不 能 显示 28S rRNA、18S rRNA 以 及 稍稍 模糊 的 mRNA 的 这 种 信 号 特征 。 模 糊 的 样品 会 覆盖 略 低 于 完整 样品 中 18S rRNA 条 带 位置 的 整个 区 域 ASH, A 8.1) 。 偶 尔 实验 者 会 观测 到 ， 一 致 浓密 的 雾 状 物 覆 盖 了 整个 泳 道 。 在 弥散 物 中 ，28S rRNA 与 18S rRNA 的 条 带 通常 可 以 看 到 ， 虽 然 在 弥散 物 的 后 面 ， 但 它们 似乎 处 于 泳 道 的 正确 位 置 。RNA 样品 的 条 带 出 现 这 样 的 现象 有 以 下 三 种 原因 : @ORNA 没有 很 好 变性 ; @ 样 品 没 有 完全 溶解 于 缓冲 液 ，@ 溶 解 后 的 RNA 样品 浓度 过 高 。RNA 样品 不 能 完全 变性 是 最 常 发 生 的 ， 样 品 不 完全 溶解 或 者 浓度 过 高 也 常 有 可 能 。 特 别 是 当 大 量 纯 RNA 样品 沉淀 后 ， 没 有 浒 解 在 足够 量 的 蒸馏 水 或 缓冲 液 中 以 配置 5xg/pl 的 溶液 。 或 者 是 少量 或 中 等 量 的 RNA 样品 ， 风干 或 旋转 蒸发 干燥 后 ， 却 没有 重新 浴 解 @。 另外 ， 可 以 根据 加 样 孔 的 特征 来 检验 已 加 入 加 样 孔 的 RNA。 加 样 孔 内 发 出 荧光 信号， 说 明 样 品 中 含有 基因 组 DNA. RNA 分 离 过 程 中 的 剪 切 力 使 染色 体 DNA 成 大 片段 。 在 电泳 过 程 中 ， 这 些 大 片段 不 能 进入 电泳 胶 。 而 且 ， 紫 外 分 光 光 度 法 不 能 区 分 纯 的 RNA 样品 与

@ 可 以 在 65C 加 热 15min、 加 入 更 多 的 水 、 或 两 者 合用 ， 帮 助 “ 难 以 控制 的 RNA” 溶 解 。 为 了 维持 样品 的 完整 以 及 成 功 地 用 于 后 续 反 应 ， 要 确保 不 重复 加 热 样 品 。 无 论 采 用 何 种 途径 ， 明 智 的 做 法 是 ， 首 先 用 小 量 RNA 做 预 试验 ， 而 不 是 冒险 地 投入 全 部 样品 。

17 -°

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

DNA 污染 的 样品 。 因 而 根据 Azeo 的 测量 值 来 进行 定量 就 不 准确 了 ， 因 为 基因 组 DNASE 品 提供 了 质量 。 当 凝 胶 上 的 行为 显示 样品 纯度 不 理想 时 ， 明 智 的 做 法 是 ， 在 使 用 有 疑问 样品 进行 任何 后 续 实 验 以 前 ， 确 定 问题 的 程度 ， 测 定 剩余 样品 的 质量 。 如 果 DNA 污染 是 长 期 的 问题 ， 则 可 用 附录 5 中 的 方法 ， 加 DNase 工 〈 不 含 RNase) 保温 消化 来 解决 这 个 问题 。 就 这 一 点 来 说 ， 必 须 清 楚 ， 进 行 一 次 凝 胶 电 泳 ， 即 使 是 迷你 凝 胶 电 泳 ， 也 是 判断 RNA 样品 完 整 性 和 实用 性 的 唯一 最 好 的 方法 。

商品 化 的 分 子 量 标准 可 以 与 rRNA 内 部 分 子 量 标准 联合 使 用 。 根 据 28S rRNA 与 18S rRNA 的 已 有 知识 ， 需 要 做 的 只 是 测量 出 它们 各 自 电泳 移动 的 距离 。 记 住 划 一 条 直线 只 需要 两 个 点 ， 就 可 以 做 出 一 条 合理 的 分 子 量 标准 曲线 。 这 些 工 作 通 常 由 图 像 分 析 软 件 完成 ， 这 些 软件 能 够 瞬时 测量 分 析 ， 用 宝丽来 相机 拍摄 凝 胶 照 片 ， 或 者 用 摄像 机 拍摄 湿 染 色 凝 胶 。 在 任何 情 况 下 都 需要 有 照片 文档 ， 即 使 是 初步 数据 。 假 如 没有 图 像 分 析 软 件 ， 则 可 在 胶 上 放置 一 个 荧 光标 尺 进 行 测 量 ， 必 须 在 每 块 凝 胶 上 放置 标尺 。 为 产生 (如 SYBR 绿 、SYBR 金 、 溴 化 乙 锭 ) 图 像 而 使 用 的 紫外 线 ， 也 可 以 使 荧光 标尺 出 现在 照片 上 (第 5 章 ， 图 5.4)。

核糖 体 RNA 分 子 用 作 分 子 量 标准 ， 完 全 是 根据 文献 报道 或 者 以 往 经 验 测 定 所 得 到 的 有 关 rRNA 的 知识 。 在 不 知道 所 研究 生物 品种 rRNA 的 分 子 量 的 情况 下 ， 进 行 这 种 测量 是 很 不 明智 的 。 不 同 生物 来 源 的 rRNA， 其 分 子 量 的 差异 非常 大 ， 即 使 在 哺乳 动物 间 也 是 如 此 ， 特 别 是 28S rRNA, 而 18S rRNA 间 的 差异 就 小 得 多 。 总 的 来 说 ， 不 同 来 源 的 18S rRNA 间 的 变化 在 1. 7~1. 9kb 范围 内 ，28S rRNA 的 变化 在 4. 6 一 5. 2kb 之 间 @。 作 为 补充 的 工具 一 一 示 踪 染料 ， 通常 是 溴 酚 蓝 ， 其 位 置 可 以 作为 样品 电泳 位 置 的 指标 。 电 泳 时 ， 溴 酚 蓝 通常 在 样品 的 前 沿 。 在 1. 2%% 的 琼脂 糖 凝 胶 电泳 中 ， 另 外 一 种 染料 二 甲 茉 青 则 在 18S rRNA 的 后 面 。 由 于 二 甲苯 青 与 18S rRNA 以 及 500 一 600bp 的 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 产物 共 泳 动 ， 常 常 模 糊 了 目的 产 物 条 带 的 荧光 ， 所 以 本 实验 室 通常 不 用 这 种 染料 。 用 二 甲 茉 青 染 料 不 能 带 来 任何 实际 的 好 处 ， 只 会 增加 定量 的 麻烦 ， 当 然 不 受 欢 迎 。

第 一 次 用 Northern 分 析 法 鉴定 样品 时 ， 明 智 的 做 法 是 让 溴 酚 蓝 走 到 凝 胶 全 长 3/4 的 位 置 处 。 这 样 ， 在 中 等 大 小 (12cmX1l4cm) 的 凝 胶 中 ，RNA 样品 就 会 分 离 得 很 好 ， 而 且 可 确 保 小 的 目的 RNA 没有 跑 出 凝 胶 ， 简 化 了 杂交 种 属 分 子 大 小 的 精确 测定 。

测定 时 ， 从 内 源 、 外 源 两 种 分 子 量 标准 得 出 分 子 量 ， 这 就 提高 了 数据 的 可 靠 性 ， 特 别 是 . 目的 RNA 分 子 过 大 或 过 小 的 时 候 。 基 于 两 个 基本 原理 〈 这 是 确实 的 ) 。 第 一 ， 分 子 在 凝 胶 中 的 对 数 分 离 在 整个 凝 胶 长 度 范围 中 并 不 是 完全 线性 化 的 。 过 大 或 者 过 小 的 分 子 不 在 线性 范 围 内 ， 却 仍然 根据 处 于 凝 胶 线性 范围 内 的 分 子 量 标准 来 确定 它们 的 分 子 量 ， 当 然 其 结果 有 可 能 是 不 准确 的 。 使 用 多 个 外 源 分 子 量 标准 时 ， 既 可 保证 至 少 有 一 个 标准 会 与 目的 RNA 电泳 到 相近 的 位 置 。 假 如 样品 RNA 不 在 凝 胶 的 线性 范围 内 ， 那 么 作为 分 子 量 标准 的 某 些 分 子 可 能 同样 电泳 出 这 个 线性 范围 。 这 样 参 照 得 出 的 分 子 量 差错 会 比较 少 。 第 二 ， 在 Northern 转 移 的 过 程 中 ， 实 验 者 应 当 尽 量 避 免 样品 不 稳定 转 印 。 例 如 ， 凝 胶 和 滤 膜 中 间 的 气泡 ， 或 者 凝 胶 与 吸水 材料 间 的 气泡 ， 会 大 大 降低 气泡 附近 样品 的 转移 效率 。 一 种 模式 中 ， 据 称 几 个 样品 表现 出 一 个 目的 基因 的 几 种 不 同调 制 。 事 实 上 ， 样 品 的 信号 调制 也 有 可 能 是 不 均匀 转移 的 原 因 一 一 潜在 的 目的 序列 分 子 仍 会 留 在 凝 胶 中 。 以 下 方法 可 以 帮助 评估 转移 效率 的 高 低 。

© 印迹 结束 后 ， 用 省 化 乙 锭 、SYBR 绿 等 再 次 染 凝 胶 ， 观 测 残 留 的 RNA， 尤 其 是 核糖 .

@ 人 28SrRNA 和 18S rRNA 的 分 子 质量 分 别 是 5025bp 和 1868bp。 * 118 +

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第 10 章 电 ik

体 RNA (应 当 没 有 ) 。

@ 用 亚 甲 基 蓝 染料 可 逆 性 地 染 滤 膜 ， 直 接 找 出 18S rRNA 和 28S rRNA 条 带 的 位 置 ， 这 样 做 可 以 检测 转移 效率 。

@ 假如 凝 胶 是 在 转移 前 染色 的 ， 而 且 凝 胶 中 仍然 有 少量 的 溴 化 乙 狂 或 SYBR 绿 染 料 ， 并 与 样品 结合 ， 滤 膜 就 可 以 放 在 紫外 线 发 射 仪 上 ， 也 可 用 手提 紫外 灯 从 上 方 低 光 密度 照射 滤 膜 ， 直 接 观 测 滤 膜 上 的 rRNA 样品 。

记 住 ， 核 糖 体 RNA 是 很 好 的 凝 胶 加 样 量 对 照 及 转移 对 照 。

最 后 ， 也 可 根据 login RNA 分 子 量 对 分 子 从 起 点 〈 加 样 孔 ) 泳 动 到 终点 的 距离 作 图 的 方 法 绘制 分 子 量 的 校准 曲线 。 这 样 绘制 的 曲线 ， 可 用 来 确定 凝 胶 上 直接 观察 到 的 RNA 分 子 的 大 小 ， 或 者 也 可 确定 随后 的 核酸 杂交 产物 的 大 小 。 分 子 量 的 测定 是 现在 所 有 图 像 分 析 软 件 和 工作 站 的 特色 。 也 可 用 一 对 数据 、 一 把 直 尺 和 半 对 数 纸 ， 手 工 绘制 合理 的 校准 曲线 。

10.5 @RAS}SRA

10.5.1 RUCK

Wik ZA (EtBr, EB) 是 一 种 广泛 使 用 的 染料 ， 它 使 得 琼脂 糖 凝 腕 上 的 核酸 可 以 被 看 到 。 它 是 结构 上 与 碘 化 propidium AYFEMERAA. REACH DNA 的 结合 没有 外 观 上 的 序 列 特异 性 ; 每 4 一 5bp， 就 会 与 一 个 省 化 乙 锭 分 子 结 合 (Waring，1965) 。 作 为 现实 的 染 核酸 的 替代 方法 ， 自 SYBR 绿 与 SYBR 金 染 料 出 现 之 后 ， 省 化 乙 锭 就 不 再 是 首选 的 染料 了 。 此 外 ， 染 料 用 在 哪个 步骤 也 是 很 有 争议 的 。 不 仅 可 以 将 溴 化 乙 锭 加 到 族 胶 中 ， 或 者 在 电泳 结束 后 用 省 化 乙 锭 染色 ; 而 且 可 以 在 上 样 之 前 直接 把 省 化 乙 锭 加 到 RNA 样品 中 ， 而 别 的 凝 胶 中 不 加 染料 。 这 样 降低 了 省 化 乙 锭 废弃 物产 生 的 数量 ， 而 且 只 有 在 上 样 泳 道中 才 会 发 出 荧光 信 号 。 简 而 言 之 ， 用 不 含 核酸 酶 的 水 配制 1xg/ml 的 溴 化 乙 锭 储备 溶液 ， 取 2pl 的 溴 化 乙 锭 储 备 液 加 到 18pml 热 变 性 的 RNA 样品 中 ， 充 分 混合 后 就 可 以 上 样 。

在 选择 使 用 溴 化 乙 锭 染料 前 ， 实 验 者 应 当 衡 量 使 用 省 化 乙 锭 的 4 个 主要 缺点 。

@ 省 化 乙 锭 是 很 强 的 诱 变 剂 (MacGregor 和 Johnson, 1977; Fukunaga 等 ，1984) 。 在 配制 省 化 乙 锭 的 储存 溶液 或 稀释 液 和 操作 时 必须 非常 小 心 。 因 此 ， 污 染 的 缓冲 液 与 实验 设备 应 当 作 为 有 毒 废 弃 物 处 理 ， 溴 化 乙 锭 也 应 该 使 其 失 活 后 按 合适 的 方式 丢弃 〈 附 录 4; Lunn 和 Sansone, 1987, 1990).

@ Hieww 1H FE HE MM BY HE BE PA EE EE A BE ah. AB EK RY ok BEE EK 152%% 左 右 。 尽 管 它 不 会 严重 延缓 研究 者 的 进程 ， 但 也 不 能 以 此 为 理由 来 增强 电泳 电压 。 记 住 ， 在 较 低 电压 下 进行 电泳 ， 被 证 明 可 以 提高 凝 胶 的 分 辩 率 。

@ 长 期 暴露 于 普通 光照 下 ， 特 别 是 暴露 于 紫外 线 下 ， 会 造成 RNA 的 缺口 ， 给 RNA 操 作 带 来 困难 。 更 有 甚 者 ， 溴 化 乙 锭 的 光 褪 色 是 非常 迅速 的 ， 给 观察 和 定量 判断 增加 了 困难 。

© 族 胶 中 的 省 化 乙 锭 会 降低 样品 的 转移 效率 。 用 传统 的 转移 方法 ， 如 被 动 毛细 扩散 法 《第 12 章 )， 会 使 转移 时 间 的 延长 变 得 难以 接受 。 虽 然 凝 胶 中 即使 残存 微量 的 省 化 乙 锭 也 会 降低 转移 效率 ， 但 将 凝 胶 脱 色 仍 会 有 助 于 转移 。

@ 在 化 学 上 ,省 化 乙 锭 是 2,7- 二 氨基 -10- 乙 基 -9- 菲 啶 的 省 化 物 。 ”119 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

将 省 化 乙 锭 加 到 样品 中 进行 电泳 的 唯一 好 处 在 于 能 够 切断 电源 观测 电泳 的 进度 。 凝 胶 置 于 托 盘 中 后 ， 用 紫外 线 发 射 器 或 者 手提 紫外 线 光 源 粗 照射 就 可 以 直接 观察 结果 〈 记 住 对 眼睛 和 皮肤 的 防护 ) 。 假 如 需要 将 样品 间距 离 拉 得 更 大 ， 则 可 以 把 凝 胶 放 回 电泳 槽 接 上 电源 继续 电泳 一 段 时 间 。

考虑 上 述 因 素 后 仍然 选择 使 用 省 化 乙 狂 染料 ， 则 下 面 的 建议 将 会 很 有 用 处 。

D 接触 泛 化 乙 锭 污染 的 溶液 、 微 量 注射 器 枪 头等 时 ， 应 一 直 戴 着 手套 。 在 笔者 实验 室 里 ， 将 省 化 乙 锭 污染 的 微量 注射 器 枪 头 先 放 进 15ml 的 锥 形 管 中 ， 再 丢弃 到 放置 有 毒 废弃 物 的 容器 中 。

© 通常 用 水 配制 10mg/ml HRC ER, DARA Re Bia CR. BAR 化 乙 锭 储备 液 的 微量 离心 管 必 须 放 在 小 的 储存 盒 中 4C TRE

@ 在 凝 胶 、 电 泳 缓冲 液 及 染色 缓冲 液 电泳 结 束 后 使 用 ) 中 的 溴 化 乙 锭 终 浓度 不 要 超 过 0. 5wg/ml。

© 只 有 在 电泳 完全 结束 后 ， 仅 染色 分 子 量 标准 的 泳 道 。 为 了 做 到 这 一 点 ， 用 剃 为 片 仔 细 地 把 分 子 量 标准 的 泳 道 直接 从 整 块 凝 胶 上 割 下 来 。 凝 胶 染 色 拍 照 后 ，Northern 转 印 过 程 中 ， 将 分 子 量 标准 和 其 他 样品 依次 排列 。 这 样 做 的 缺点 是 只 有 将 膜 染 色 才 能 评估 样品 的 完整 性 。 如 果 需 要 ， 可 以 把 Northern 转 印 过 程 中 已 印迹 有 RNA 的 尼龙 膜 剪 开 ， 这 样 可 以 增 大 分 子 量 标准 与 其 他 样品 间 的 距离 。

@ 省 化 乙 锭 的 热 稳定 性 很 低 ， 所 以 如 果 直 接 将 省 化 乙 锭 加 到 凝 胶 中 使 用 的 话 ， 要 等 琼 Fa Ba AY Yk BE Be FI) 60C 时 才能 加 入 溴 化 乙 锭 。 这 种 情况 下 ， 电 泳 缓冲 液 中 也 应 当 加 省 化 乙 锭 ， 否则 电泳 时 凝 胶 下 方 的 省 化 乙 锭 会 跑 到 缓冲 液 中 〈 图 10.6) 。 电 泳 结束 后 ， 不 要 忘记 ， 要 正 确 处理 残 留 的 电泳 缓冲 液 。

10.6 将 省 化 乙 锭 〈EtBr) 直接 加 入 琼脂 糖 凝 胶 的 影响 。 当 样品 向 阳极 泳 动 时 ， 溴 化 乙 锭 向 阴极 移动 。 照 片 显 示 了 省 化 乙 锭 从 凝 胶 下 部 移出 的 影响 。 电 泳 继续 时 间 越 长 ， 更 多 的 溴 化 乙 锭 移出 凝 胶 ， 如 果 染 料 的 前 沿 走 过 了 样品 区 ， 将 失去 某 些 荧光 强度 ， 造 成 对 样品 质量 的 低估 。

含 500 bp PCR 产物 的 凝 胶 〈 泳 道 2 和 4)， 被 前 切 成 273 bp 和 227 bp 两 个 诊断 片段 ( 泳 道 3 和 5)， 样 品 两 侧 为 PCR 分 子 量 标准 〈 泳 道 1 和 6) (Promega)

© 不 要 在 乙 二 醛 凝 胶 中 加 入 省 化 乙 锭 ， 因 为 二 者 之 间 会 发 生 反应 。 CD) 单独 把 省 化 乙 锭 加 到 样品 中 而 不 是 加 到 融化 的 琼脂 糖 凝 胶 中 ， 这 样 肯 定 能 够 降低 染 料 的 使 用 量 。 然 而 除非 脱色 去 除 凝 胶 中 的 溴 化 乙 锭 ， 否 则 它 肯 定 是 转 印 过程 中 的 障碍 。 甲醛 凝 胶 中 加 入 省 化 乙 锭 会 有 很 大 的 麻烦 ， 因 为 甲醛 凝 胶 用 溴 化 乙 锭 染色 后 育 景 很 高 。 这 样 的 凝 胶 需 要 充分 脱色 ， 才 能 观察 到 rRNA 的 条 带 。 @ 可 用 染色 缓冲 液 来 做 凝 胶 脱色 缓冲 液 ， 如 电泳 缓冲 液 、 蒸 馏 水 或 Northern 转 印 缓冲 ¢ 120°:

第 10 章 电 ik

液 都 可 以 用 Cun 5 X SSPE). @ 确保 染色 缓冲 液 和 脱色 缓冲 液 都 至 少 经 过 高 压 灭 菌 除 去 残余 的 核糖 核酸 酶 。 否 则 ， 样品 可 能 会 被 部 分 降解 。

10.5.2 SYBR 绿

SYBR #1 AISYBRAT (FRE) 是 广泛 使 用 的 新 的 花 青 素 类 核酸 染料 ， 它 们 可 分 别 用 于 凝 胶 中 DNA Al RNA 的 可 视 化 。 通 常 可 以 购买 该 染料 的 10000 X DMSO fig FER. Ih 用 前 ， 可 将 其 稀释 成 1X Tris 缓冲 液 ， 也 可 以 黎 释 成 1XTBE、1XTAE 或 者 TE 的 缓冲 液 。 不 推 荐 用 水 稀释 SYBR 绿 ， 因 为 在 pH8. 0 左右 的 Tris 缓冲 液 中 才 会 有 最 佳 的 荧光 信号 。 与 省 化 乙 锭 不 一 样 ， 凝 胶 中 存在 甲醛 对 背景 没有 负面 影响 ， SYBR 绿 只 有 与 样品 结合 后 才 会 发 获 光 。

尽管 SYBR 绿 有 许多 明显 的 优点 〈 表 10.2), 但 一 定 不 要 把 它 加 到 凝 胶 中 。 与 电泳 结束 后 再 染 色 的 条 带 相 比 ， 电 泳 时 样品 就 含有 SYBR 绿 ， 所 图 10.7 制备 凝 胶 前 将 SYBR 绿 加 入 琼脂 糖 的 有 泳 道 几乎 所 有 分 子 量 的 核酸 的 条 带 成 波浪 形 、 影响 。 几 乎 所 有 分 子 量 的 DNA 或 RNA 都 产 不 规则 形 〈 图 10.7)。 这 样 就 使 质量 与 分 子 大 小 ”生变 形 的 条 带 ， 干 扰 了 质量 和 分 子 量 测定 。 的 测定 变 得 极其 困难 。 笔 者 实验 室 对 不 同 浓度 的 TR. Bae A SYBR 绿 或 SYBR 金 SYBR 绿 ， 包 括 高 于 或 低 于 推荐 浓度 的 都 进行 过 ase ar CoRR 凝 胶 内 试验 ， 但 没有 得 到 满意 的 结果 。 虽 然 在 本 实验 室 里 ，SYBR 绿 @ 的 应 用 已 经 非常 成 功 ， 但 也 只 能 在 电泳 结束 后 再 染色 。SYBR 绿 与 凝 胶 内 的 各 种 酶 处 理 都 能 兼容 ， 但 如 需要 的 话 ， 可 以 用 常规 的 乙醇 沉淀 将 其 去 除 。

表 10.2 RUZ HEM SYBR 染料 的 比较

EB

10mg/ml 水 10000 X DMSO

工作 浓度 与 核酸 的 亲和力 ELH I A BEBE 凝 胶 的 背景 激发 光

0. 5 一 1. Opg/ml 水

中 到 高

1X Tris 缓冲 液 (pH7 一 8) 或 1XTAE、1XTBE、TE 中 到 高

必须 避免 ,总 是 电泳 后 染色

低 到 无

300nm

颜色 粉红 /橙色 绿色 (CSYBR 绿 ) 或 金色 获 光 (SYBR 金 )

激发 诱导 染料 漂白 是 不 是

滤 色 片 15 号 深 黄 15 号 深 黄 60ng DNA(SYBR 4 I ),2ng RNA(SYBR 4¥ I), 25pg © 5 测 | ) ， “CD Ha

pee pet EL) sPOCeE CCD HAWOL) | DNACSYBR @slns RNACSYERAM

诱 变性 2 高 te EB 低 , 但 必须 同样 小 心 操作

@ 蛋白 质 的 相关 染料 : SYPROMA SYPRO A ECRRS SWZ K AER.

¢ 121 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

续 表 a =| EB SYBR

废弃 物 的 处 置 2 活性 痰 过 滤 活性 痰 过 滤

费用 低 于 中 等 水 平 高 于 中 等 水 平 染色 时 间 5 一 10min 25~30min

® 外 照明 可 以 提高 SYBR 绿 的 检测 极限 (Haugland, 1996). FA CCD 照相 机 或 激光 成 像 系统 代替 黑白 照片 ， 也 可 提 高 检测 极限 。

@ 虽然 SYBR 绿 工 已 经 显示 其 诱 变性 比 EB 小 〈Singer 等 ，1999)， 但 是 到 本 书写 作 时 ，SYBR RIM SYBR EHF 变性 实验 尚未 进行 。 聪 明 的 做 法 是 小 心 操作 所 有 结合 染料 的 DNA。 假 设 它们 全 都 有 造成 伤害 的 诱 变性 。

@ 抽 提 装置 (Schleicher 和 Schuell, Cat. No. 448031) 是 处 理 大 体积 EB (和 SYBR 绿 ) 废弃 物 的 最 好 和 最 经 济 的 装 置 。 处 理 过 的 滤液 可 倒 人 下 水 道 。 滤 芯 根 据 内 部 方针 处 置 。 详 细 说 明 参 见 附录 4。

10.5.3 SYBR 金

SYBR 金 是 目前 最 灵敏 的 核酸 染料 。 它 是 一 种 蓝 色素 染料 ， 能 够 用 于 观察 琼脂 糖 凝 胶 或 者 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 中 的 单 链 RNA、 双 链 RNA、 单 链 DNA 或 双 链 DNA， 它 的 灵敏 度 与 银 染 的 灵敏 度 相 当 。 在 笔者 实验 室 中 ，SYBR 金 与 标准 的 302nm 的 紫外 发 光 器 或 激光 扫描 装置 联合 使 用 。 与 SYBR 绿 相似 ，SYBR 金 染 色 后 凝 胶 也 没有 背景 。 常 规 做 法 是 ， 不 同 浓度 的 琼 脂 糖 凝 胶 都 在 染 液 中 染色 30min 左右 [在 柔和 的 光线 下 ， 用 旧 纸 盒 盖 住 胶 缓慢 振 功 〈 约 50r/min)]。 这 样 染 色 的 DNA 与 RNA 都 为 金色 荧光 条 带 。 与 SYBR 绿 一 样 ，SYBR 金 也 是 以 10000 X DMSO 储存 液 提 供 ， 使 用 时 可 以 用 1xXxTris 或 1XTAE 或 1XTBE 稀 释 储存 液 至 1 义 使 用 液 。 与 前 面 SYBR 绿 部 分 讲 到 的 相同 原因 ，SYBR 金 也 不 能 加 到 凝 胶 中 使 用 。 为 方便 起 见 ， 适 合 于 SYBR 绿 染 色 的 凝 胶 的 光 文 件 系统 ， 同 样 可 以 用 来 拍 SYBR 金 染 色 的 BE MB

10.5.4 GelStar

GelStar (Cambrex BioScience) 是 一 种 能 发 出 荧光 信和 号 的 核酸 染料 ， 与 上 述 的 SYBR % 料 相 同 ， 与 传统 的 省 化 乙 锭 染料 相 比 它 有 很 多 优势 。 虽 然 该 产物 的 实验 数据 说 明 它 可 以 在 电 泳 前 加 入 凝 胶 ， 或 者 电泳 结束 后 用 它 染 色 。 但 在 笔者 的 实验 室 ， 通 常 都 是 在 电泳 结束 后 再 染 色 。GelStar 可 以 染色 单 链 或 双 链 的 RNA 和 DNA， 而 且 与 同一 凝 胶 用 省 化 乙 锭 染色 比较 ， 它 的 灵敏 度 要 高 很 多 。 提 供 的 GelStar 是 DMSO 10000 iH], Hi FF) pH7.0~8.5 之 间 的 Tris 缓冲 液 中 ， 效 果 最 佳 。GelStar 的 操作 与 其 他 DNA 染料 的 操作 一 样 ， 都 要 非常 小 心 ， 而 且 需 通过 活性 炭 滤 器 排放 废弃 物 〈 附 录 4) 。

10.5.5 银 染

银 染 是 一 种 非常 灵敏 的 检测 方法 。 它 可 以 检测 聚 丙 烽 酰 胺 凝 胶 中 少量 的 蛋白 质 和 小 分 子 核 苷 酸 。 一 般 而 言 ， 对 很 多 蛋白 质 染 色 时 ， 该 方法 比 考 马 斯 亮 蓝 的 灵敏 度 高 100 倍 ;， 对 多 核 苷 酸 染 色 时 ， 它 的 灵敏 度 比 溴 化 乙 锭 的 高 几 倍 。 它 的 优点 在 于 不 需要 特殊 仪器 就 可 以 直接 观 Be; 而 且 用 它 染色 的 凝 胶 ， 几 乎 没有 背景 。 一 般 不 推荐 进行 琼脂 糖 凝 胶 银 染 ， 因 为 在 这 种 凝 胶 内 ， 它 的 灵敏 度 会 大 大 下 降 。 简 单 地 说 ， 用 酸 固定 后 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 就 会 被 可 溶性 的 银 离子 (Ag’) 覆盖 ， 随 后 被 还 原 成 金属 银 。 只 要 非 可 溶性 的 金属 银 开 始 沉积 ， 就 会 引发 更 。 122 -

第 10 章 电 ik

多 金属 银 自 催 化 聚集 ， 样 品 的 可 视 化 终于 出 现 。 三 家 提供 的 试剂 盒 中 ， 有 所 有 可 以 直接 使 用 的 银 染 所 需 试 剂 。

10.5.6 AY Rete

fi HE BE Le KR FT LS — BP SY) BR eA — BS BEY EE Cacridine or- ange) Yet (McMaster 和 Carmichael, 1977; Carmichael 和 McMaster, 1980). JA BE 它 通 常 与 乙 二 醛 化 的 RNA 联合 使 用 ， 也 可 作为 细胞 化 学 染料 (Kasten, 1967), ABER 可 以 用 于 细胞 周期 与 凋 亡 的 研究 。 叫 啶 橙 对 核酸 的 转 膜 效 率 的 抑制 作用 没有 涡 化 乙 锭 强 。

叫 啶 橙 能 显示 两 种 颜色 的 光 : @ 它 与 单 链 核酸 分 子 的 磷酸 基 团 静电 结合 后 ， 会 在 650nm 处 发 射 红 色 荧 光 (Bradley 和 Wolf，1959);，@ 它 插入 到 双 螺 旋 结 构 的 分 子 中 ， 会 在 525nm 处 发 射 绿色 荧光 (Lerman，1961，1963) 。 因 此 在 同一 块 凝 胶 中 ， 单 链 核酸 分 子 呈 现 橘红 色 ， 而 双 链 DNA 分 子 或 未 变性 RNA 分 子 呈 现 绿色 。 因 为 该 染料 这 种 特定 的 多 功能 性 ， 实验 者 在 进行 后 续 实 验 前 ， 也 可 以 观察 到 未 变性 RNA 和 部 分 复 性 RNA FF. MY WE ER 凝 胶 有 很 高 的 背景 ， 需 要 花费 百倍 的 努力 进行 不 切实 际 的 脱色 过 程 ， 因 而 它 的 应 用 不 是 很 wee

琼脂 糖 凝 胶 染 色 是 把 胶 浸 泡 于 30wg/ml PY We REAY 10mmol/L, pH7. 0 磷酸 钠 缓冲 液 中 30min。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 也 可 以 浸泡 15min RA. AS RAVER AMEN aA 景 ， 把 凝 胶 放 在 10mmol/L 的 磷酸 钠 缓 冲 液 中 浸泡 1 一 2h 进行 脱色 。 已 有 建议 ， 用 热 水 冲洗 乙 二 醛 染 色 的 凝 胶 20min， 可 有 助 于 脱色 作用 。 在 紫外 灯 下 可 以 容易 地 检测 到 0. OS pg 的 双 链 核 酸 及 0. lug 的 单 链 核 酸 。 乙 二 醛 和 叫 啶 橙 染 色 的 其 他 应 用 另 有 详 述 (Broude 和 Bu- dowsky, 1971; Carmichael 和 McMaster, 1980; Sambrook 和 Russel，2001) 。

10.5.7 亚 甲 基 蓝

在 过 去 的 4 年 中 ， 亚 甲 基 蓝 (methylene blue) 广泛 应 用 于 某 些 “ 低 端 科技 ”领域 中 的 琼脂 糖 凝 胶 染 色 。 虽 然 这 种 染料 能 够 与 DNA 和 RNA 结合 ， 但 是 凝 胶 的 背景 很 高 ， 而 且 亚 甲 基 蓝 的 灵敏 度 也 非常 低 。 即 使 经 过 长 时 间 脱 色 ， 因 为 不 能 显示 出 凝 胶 上 的 条 带 ， 试 图 用 亚 甲 基 蓝 对 DNA 或 RNA 进行 染色 基本 上 用 处 不 大 。 在 那些 禁止 使 用 毒性 物质 〈 省 化 乙 锭 或 SYBR) 或 是 觉得 它们 过 于 昂贵 的 中 学 实验 室 ， 适 合 选用 亚 甲 基 蓝 。 在 一 个 上 样 孔 中 上 有 大 量 DNA 样品 时 ， 也 可 以 用 亚 甲 基 蓝 染色 。 但 它 仍 非 主 流产 品 。 若 干 公司 都 有 基于 亚 甲 基 蓝 的 染料 出 售 ， 的 确 有 很 多 衡 生产 品 的 染色 效果 比 亚 甲 基 蓝 好 许多 ,但 SYBR 绿 与 SYBR 金 的 灵敏 度 是 最 高 的 。

1988 年 ，Herrin 与 Schmidt 报道 了 一 种 新 的 用 涡 化 乙 锭 或 者 SYBR 染 凝 胶 上 核酸 的 技 术 。 该 技术 把 RNA 样品 转 印 到 尼龙 或 者 聚 偏 二 氟 乙 烯 (PVDF) 滤 膜 上 ， 然 后 在 杂交 前 用 亚 甲 基 蓝 以 可 逆 方 式 使 核酸 染色 。 该 方法 有 以 下 的 优点 。

@ 可 以 直接 观察 到 膜 上 的 RNA。rRNA 及 其 他 分 子 量 标准 在 膜 上 的 位 置 都 是 一 目 TR.

Q wy Ze He El ew ii AS A Fe EY Fi RE BE. CRE AT DA PR UE fe BY FR EC

@ AU, BRBRARE 〈 尤 其 澳 化 乙 锭 ) 会 有 助 于 提高 转移 效率 。

由 亚 甲 基 蓝 染料 对 健康 没有 潜在 的 危害 ， 实 验 结 束 后 的 处 理工 作 也 比 溴 化 乙 锭 等 染料 容易 得 多 。

。 123 >

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

该 技术 也 有 很 多 不 足 之 处 如 下 。 J 亚 甲 基 蓝 染色 的 背景 很 高 ， 因 而 其 灵敏 度 不 如 其 他 染料 。 Q 如 果 电 泳 样品 已 经 降解 或 者 其 纯度 不 够 ， 也 只 有 费时 费 钱 地 完成 转 印 之 后 才能

知道 。 © 亚 甲 基 蓝 染色 后 就 很 难 将 它 从 滤 膜 中 完全 去 除 。

简单 地 说 ， 在 滤 膜 染色 前 ， 应 当 用 校正 过 的 光源 照射 ， 使 RNA 紫外 交 联 到 尼龙 膜 上 。 也 可 在 染色 后 将 RNA 印迹 到 滤 膜 上 。 把 滤 膜 放 在 PH5.5、0. 02%% 亚 甲 基 蓝 、0. 3mol/L Z 酸 钠 的 混合 液 中 3min 后 ， 滤 膜 上 的 RNA 就 可 直接 看 到 。 如 果 RNA 样品 已 经 交 联 于 滤 膜 上 ， 用 1XSSPE 洗涤 滤 膜 15min 或 者 用 20% 乙 醇 、80% 水 的 溶液 浸泡 滤 膜 3 一 5min， 就 可 以 很 容易 地 去 除 多 余 的 染料 。 如 滤 膜 未 经 烘 烤 使 RNA 固定 就 染色 的 话 ， 当 杂交 前 用 0. 2 x SSPE, 0.1% SDS 室温 下 温和 洗涤 滤 膜 15min， 并 温和 地 摇动 ， 染 料 就 会 直接 从 RNA PH 去 。 在 当前 的 实验 室 中 ， 滤 膜 的 亚 甲 基 蓝 染色 虽然 不 是 很 现实 ， 但 却 是 很 有 趣 的 方法 。

10.6 电泳 过 程 中 的 安全 问题

选择 电泳 设备 时 ， 安 全 是 要 考虑 的 首要 问题 。 电 泳 进 行 中 或 者 电源 通电 后 ， 千 万 不 要 碰 触 凝 胶 、 电 泳 槽 及 电源 。 也 绝 不 要 试图 改装 电泳 开 和 电源 ， 任 何 一 个 差错 都 会 给 操作 者 和 实 验 室 其 他 工作 人 员 带 来 严重 的 危害 。 设 计 严 谨 的 电泳 系统 能 保证 在 通电 时 无 法 打开 电泳 槽 的 盖子 。 在 另 一 些 设计 中 ， 在 可 以 接触 到 电泳 槽 内 壁 之 前 ， 移 开 电 泳 槽 盖 时 ， 电 路 就 被 切断 。 这 样 的 设计 允许 在 电泳 过 程 中 对 凝 胶 进 行 检 查 并 保证 了 这 一 操作 的 安全 性 。 此 后 ， 必 须 把 电 泳 槽 盖 放 回 原 处 才能 使 电泳 继续 进行 。 当 需要 离 电 访 模 很 近 检 查 系 统 时 ， 最 好 把 电泳 仪 与 电 泳 槽 之 间 的 导线 取 下 。 最 新 的 电泳 仪 都 配备 了 两 套 电泳 槽 以 及 相应 的 导线 。 只 有 在 电泳 槽 的 两 根 导线 都 连接 好 之 后 才 可 以 打开 电源 ; 试图 接 上 第 二 套 电 泳 模 前， 务必 切断 电源 ， 接 好 所 有 接头 之 后 再 打开 电源 。 无 论 要 取 下 哪 段 导线 ， 都 要 先 关 上 电源 。 最 后 ， 千 万 不 要 同时 接触 两 根 导线 ， 这 样 可 能 会 构成 回路 而 造成 人 员 和 触电 和 死 亡 。

10.7 电 泊 侈 器 的 维护

电泳 是 分 子 生 物 学 实验 室 的 常规 操作 。 一 套 高 质量 的 电源 与 电泳 槽 往往 价值 几 千 美 元 ， 即使 不 考虑 其 危险 性 ， 缺 乏 维护 所 带 来 的 损失 也 是 让 人 痛心 的 。 对 电泳 器 械 进 行 基 本 的 预防 性 维护 ， 其 成 本 不 高 ， 而 且 也 符合 要 求 。 电 泳 的 所 有 相关 仪器 ， 包 括 电泳 槽 与 电泳 仪 的 维 护 ， 都 应 严格 按照 推荐 方法 进行 。

电泳 槽 与 电泳 仪 的 正确 使 用 与 维护 非常 重要 ， 但 常 被 忽视 。 它们 涉及 实验 室 的 安全 问题 。 显 然 操 作者 应 当 按 程序 检查 电线 、 接 口 以 及 电极 ， 以 防 生命 危险 。 所 有 的 电泳 仪 都 应 当 根 据 厂 家 的 安全 警告 与 合适 的 接地 插座 连接 。 绝 大 多 数 电泳 仪 都 设计 为 室内 使 用 ， 所 以 绝 不 能 潮湿 。 一 旦 电源 被 弄 湿 ， 即 刻 拔 下 插头 ， 将 其 完全 防 干 。 并 在 再 次 使 用 前 与 制造 商 联系 。

最 常见 的 问题 可 能 就 是 在 电源 线 、 电 极 以 及 插头 处 有 裸露 的 铜 导 线 ， 这 可 能 引发 产 重 的 电击 事件 。 制 造 商 或 分 销 商 往往 提供 电源 线 可 供 更 换 ， 价 格 也 很 低廉 ， 因 此 购买 设备 时 大 可 多 买 一 些 作 为 备份 。 另 外 ， 实 验 室内 部 应 每 周 或 每 两 周一 次 安排 对 所 有 电源 线 、 绝 缘 体 、 电

。 124 ，

第 10 章 电 ik

极 、 连 接 螺母 以 及 垫 片 进行 常规 检查 。 电 泳 器 械 维 护 的 详细 方法 可 参见 Landers (1990). 所 有 的 服务 问题 应 当 与 专业 人 员 联 系 。

10.8 Z4-LEGBIERBRCKMWON SHS

10.8.1 基本 术语

HERG (casting tray): 电泳 槽 中 灌 制 琼脂 糖 凝 胶 的 那 部 分 。 根 据 体 系 不 同 ， 灌 胶 盒 可 以 是 固定 的 也 可 以 是 移动 的 。 灌 胶 盒 两 端 必须 用 胶带 或 是 橡胶 垫 封 住 ， 直 至 凝 胶 凝 固 。

HUKAS (BERG) (gel box): 装 有 电极 ， 进 行 电泳 分 离 的 部 分 。

上 样 缓冲 液 〈loading buffer): 用 甘油 或 蔗糖 配置 的 高 密度 试剂 ， 电 泳 前 加 入 样品 以 提 高 样品 的 密度 。 它 可 以 帮助 实验 者 把 样品 加 到 已 浸 在 缓冲 液 内 的 凝 胶 中 。 上 样 缓冲 液 中 通常 含有 可 指示 电泳 行进 的 有 色 染 料 ， 如 溴 酚 蓝 和 /或 二 甲 茉 蓝 。 上 样 缓冲 液 也 可 称 作 样品 缓冲 mm “BRIT”.

电源 (power supply): fer ERA kU eM e. PAR i ba, 上 安全 盖 ， 接 通电 源 与 电泳 槽 ， 然 后 将 电源 的 插头 插入 揪 座 ， 最 后 才能 打开 开关 。 电 源 有 很 大 的 潜在 危害 ， 初 次 电泳 的 人 应 当 疝 经 验 丰富 的 同 实验 室 成 员 学 习 。

电泳 缓冲 液 〈running buffer) : 是 用 来 导 通 电流 的 电解 液 ， 它 还 可 以 使 涛 在 其 中 的 胶 散 热 。 电 泳 时 电泳 缓冲 液 起 缓冲 pH 及 离子 浓度 的 作用 。

10.8.2 注意 事项

© 在 配置 凝 胶 时 ， 核 糖 核酸 酶 (RNase) 可 能 会 污染 电泳 仪器 ， 特 别 是 梳 齿 部 分 。 虽 然 可 用 某 些 变性 剂 抑制 核糖 核酸 酶 的 活性 ， 但 它们 会 转移 到 或 干扰 后 续 的 实验 组 分 。 如 果 没 有 其 他 情况 ， 梳 子 必 须 被 浸泡 在 3% AY HzO， 或 是 0.5% SDS, 50mmol/L EDTA 浴 液 中 ， 再 在 使 用 前 用 大 量 的 无 菌 水 进行 冲洗 。 不 要 使 用 DEPC 或 者 30%% 的 HzOs ， 它 们 不 仅 对 电泳 槽 有 损害 ， 对 使 用 者 也 可 能 造成 危害 。

@ 商品 化 的 电泳 槽 灌 胶 盒 是 多 种 多 样 的 。 不 少 电 泳 槽 的 灌 胶 盒 两 端 都 配 有 橡胶 垫 ， 在 灌 胶 时 就 不 再 需要 封闭 灌 胶 盒 两 端的 缺口 〈 见 附录 13， 附 图 13-1) 。 不 论 是 什么 形式 的 灌 胶 盒 ， 灌 胶 时 ， 都 应 确保 两 端 已 经 封闭 ， 这 样 可 以 避免 漏 胶 。

@ 用 微波 炉 加 热 琼 脂 糖 时 ， 要 防止 过 热 引起 琼脂 糖 沸 腾 溢 出 。 沸 腾 的 琼脂 糖 会 引发 严 重 烫伤 。 把 称 量 好 的 琼脂 粉 先 在 电泳 缓冲 液 中 溶解 5 一 10min， 可 降低 沸腾 溢出 的 可 能 性 。 但 操作 时 仍 需 说 慎 ， 沸 腾 溢 出 与 意外 溢出 仍然 可 能 发 生 。

© 溶化 的 琼脂 糖 是 澄清 的 ， 在 灌 胶 盒 里 冷却 的 过 程 中 会 逐步 变 得 不 透明 。 在 胶 完 全 凝 固 之 前 不 要 移动 灌 胶 盒 。

© — ACHE TEE BEA 0.5~0. 75cm 的 琼脂 糖 凝 胶 。 为 了 适应 较 大 体积 的 样品 ， 可 改 用 梳 齿 较 宽 的 梳子 来 增 大 孔 的 容积 。 标 准 的 梳 齿 大 小 为 lmm、1. 5mm 和 2mm, — BRIE 过 0.75cm， 样 品 的 转移 效率 就 会 降低 ， 需 要 更 长 的 时 间 才 能 使 样品 充分 转移 到 膜 上 ;此 外 ， 对 凝 胶 进 行 染 色 与 脱色 也 比较 麻烦 。

© 灌 胶 前 应 确保 灌 胶 盒 放置 在 水 平面 上 。

@ 最 佳 的 灌 胶 方 式 是 在 梳 齿 插 和 人 之 前 ， 把 琼脂 糖 溶 液 缓慢 而 匀速 地 倒 和 人 灌 胶 盒 中 部 ，

。125 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

直至 整个 灌 胶 盒 的 表面 被 覆盖 时 就 可 以 停止 ， 然 后 立即 插 上 梳子 。 另 外 ， 可 以 在 灌 胶 盒 的 侧面 做 个 永久 标记 来 指示 应 当 灌 多 少 的 琼脂 糖 凝 胶 ， 这样 可 以 统一 整个 实验 室 配 置 凝 胶 的 方式 ， 也 可 以 保证 每 次 所 配 凝 胶 的 厚度 一 致 。 按 照 这 些 步骤 的 次 序 ， 会 得 到 均一 的 没有 气泡 的 凝 胶 。 假 如 仍然 有 气泡 ， 则 可 用 灭 菌 枪 头 的 尖 部 把 气泡 挑 出 或 者 赶 到 边缘 。

@ 应 当 在 通风 橱 中 配制 含有 变性 剂 的 琼脂 糖 凝 腕 和 灌 胶 ， 这 样 可 减少 接触 以 及 可 能 带 来 的 健康 隐患 。

@ 应 给 予 充 分 时 间 ， 使 凝 胶 凝 固 。 拔 梳 齿 前 把 凝 胶 浸 没 在 电泳 缓冲 液 中 ， 这 样 可 以 减 少 拔 梳 齿 时 大 气压 力 造成 的 影响 ， 降 低 上 样 孔 底部 被 破坏 的 可 能 性 。 假 如 加 样 孔 被 破坏 却 未 被 察 党 ，RNA 样品 在 上 样 后 就 可 能 漏 掉 。

@ 如 果 拔 梳 齿 时 经 常会 损坏 加 样 孔 的 底部 ， 可 以 把 凝 胶 浸 没 在 电泳 缓冲 液 中 数 分 钟 ， 润滑 梳 齿 并 使 其 松动 。

@ 用 最 小 体积 的 电泳 缓冲 液 完全 覆盖 凝 胶 。 因 为 电流 倾向 于 走 电 阻 最 小 的 路 径 , 也 就 是 说 倾向 于 绕 过 而 非 穿 过 凝 胶 。 所 以 过 多 的 缓冲 液 可 以 降低 电泳 速度 。 另 外 要 记得 检查 边缘 处 的 凝 胶 ， 族 胶 与 盒子 的 边缘 结合 处 会 产生 倾斜 的 截面 ， 如 果 这 些 部 分 没有 完全 浸没 在 缓冲 液 中 则 不 能 很 好 散热 ， 累 积 的 高 温 效应 就 会 融化 部 分 琼脂 糖 凝 胶 。 另 外 ， 尽 量 避 免 在 外 侧 泳 道上 样 ， 因 为 凝 胶 的 厚度 不 均一 ， 外 侧 泳 道 样 品 的 迁移 率 会 不 一 致 (边缘 效应 ) 。

Q 尽量 减少 上 样 体 积 。 本 章 中 也 提 到 小 的 上 样 体积 会 使 RNA 样品 集中 在 很 小 的 范围 ， 从 而 增 大 分 辩 率 。

@ 思 所 有 的 上 样 缓冲 液 中 ， 都 含有 甘油 或 蔗糖 之 类 的 高 密度 物质 ， 可 以 增加 变性 RNA 样品 的 密 度 ， 使 之 沉 入 加 样 孔 。 因 此 ， 实 验 者 只 要 穿 过 加 样 孔 上 方 的 电泳 缓冲 液 ， 仔 细 地 把 样品 加 到 上 样 孔 中 就 可 以 了 (图 10. 8) 。 可 在 电泳 槽 上 样 孔 下 方 放 一

图 10.8 ”微量 移 液 器 枪 头 将 样品 加 入 琼 Ce

液 。 也 就 是 说 ， 不 混合 或 不 混用 不 同 的 上 样 缓冲

液 。 原 因 是 与 其 他 样品 相 比 ， 含 有 高 盐 的 RNA 样品 在 效 胶 中 迁移 速度 较 慢 。 这 也 是 为 什么 第 5 章 提 到 的 要 用 大 量 的 70%% 乙醇 洗涤 RNA 沉淀 的 理由 。 盐 会 大 幅度 改变 核酸 在 凝 胶 中 的 移动 速率 〈 图 10. 9) 。

© 吸取 了 样品 的 枪 头 ， 项 部 如 有 空气 ， 在 准备 将 样品 加 入 凝 胶 的 加 样 孔 前 ， 一 定 要 去 除 空 气 。 避 免 在 加 样品 前 把 气体 注入 加 样 孔 ， 这 会 造成 样品 损失 。

图 如 果 上 样 时 ， 样 品 从 加 样 孔 中 漂 起 ， 则 表明 之 前 沉 演 或 者 洗涤 步骤 中 的 乙醇 没 有 去 除 干 净 而 被 重 溶 在 蒸馏 水 或 TE 缓冲 液 中 。 这 就 需要 重新 沉淀 样品 ，70 为 的 乙醇 洗 涤 后 充分 干燥 以 除去 残留 乙醇 。 只 要 RNA 样品 中 含有 稀释 了 的 乙醇 ， 就 很 难 在 凝 胶 上 上 样 。

@@ 上 样 后 就 不 要 再 移动 电泳 槽 的 位 置 ， 这 样 会 晃动 缓冲 液 ， 因 而 会 使 样品 从 孔 中 洲 出 。

四 所 有 样品 都 加 完 之 后 ， 要 确保 电泳 槽 的 盖子 已 经 盖 好 ， 以 防 发 生 偶 然 的 触电 事故 。 确定 使 用 的 是 配套 的 电泳 仪 和 电泳 槽 ， 接 上 导线 ， 然 后 再 打开 电源 。 按 凝 胶 总 长 度 计算 的 最 。 126 ，

第 10 章 电

10.9 盐 对 RNA 电 泳 的 影响 。 同 一 批 细胞 培养 物 同 时 分 离 的 几 个 RNA 样品 在 纯化 结束 时 ， 用 不 同体 积 的 70%% 乙 醇 洗 涤 。 预 期 各 个 样品 的 28S rRNA 和 18S rRNA 的 迁移 率 应 该 一 致 。 但 是 泳 道 4 和 6 的 迁移 率 明 显 与 泳 道 1、2、3 和 5 不 同 ， 这 与 其 个 体 离子 强度 微 环 境 直 接 相 关 。 只 要 必要 ， 纯 化 的 RNA 可 以 再 次 沉淀 并 进一步 用 70%% 乙 醇 洗涤

大 电压 为 5V/cm。 由 于 凝 胶 在 电泳 槽 中 的 摆 放 方向 并 不 国定 ， 所 以 要 确保 电泳 时 带 有 纯 负 电荷 的 RNA 是 从 负极 移 向 正极 。

CD 观察 凝 胶 或 终止 电泳 时 应 先 关 掉 电源 再 操作 电泳 槽 和 电泳 仪 。 另 外 ， 一 次 只 能 取 下 一 根 导线 ， 绝 对 不 能 同时 操作 两 根 导线 。

QO 绝 不 要 在 电源 接 通 后 上 样 ， 即 使 电压 很 小 。 很 遗憾 的 是 某 个 实验 室 的 科学 家 曾经 说 “在 低 电 压 下 上 样 ” 能 够 改善 她 的 实验 结果 。 这 种 危险 的 操作 在 任何 情况 下 都 不 推荐 A A

10.9 和 参考 文献

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(fe SALW, SHFR)

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Eee

11 照 乒 文档 和 图 像 分 析

11.1 基本 原理

精确 地 保存 实验 记录 和 结论 数据 是 非常 必要 的 。 电 泳 凝 胶 包 含 了 对 实验 结果 做 出 精确 解 释 的 关键 信息 ， 这 些 数据 常常 暗示 了 后 续 实 验 应 如 何 去 做 ， 后 续 实 验 可 以 对 所 做 的 科学 试验 作 什 么 更 次 入 的 解释 。 电 泳 获得 的 信息 对 实验 的 分 析 和 对 后 续 实 验 的 设计 都 是 非常 有 价值 的 。 然 而 ， 凝 胶 只 能 保存 很 短 的 时 间 ， 并 且 用 来 显示 核酸 的 染料 甚至 会 扩散 得 更 快 。 这 就 要 求 用 照相 的 方法 来 记录 电泳 结果 ， 以 及 记录 任何 通过 杂交 获得 的 X 射线 胶片 的 结果 〈 通 过 化 学 发 光 和 放射 自 显影 法 ) 。 为 了 稳定 地 长 时 间 保 存 数 据 以 便于 进一步 分 析 、 做 小 范围 的 介 绍 或 发 表 在 杂志 上 ， 照 相 法 是 唯一 可 行 的 方法 。

在 分 子 生 物 学 研究 中 ， 为 了 记录 并 分 析 各 种 类 型 的 图 像 ， 很 多 不 同类 型 的 图 像 分 析 系 统 已 经 应 用 并 得 到 广泛 认可 。 这 些 系统 主要 可 以 分 为 两 大 类 : 巴 在 热 敏 纸 或 胶片 《人造 偏振 片 ) 上 显影 的 传统 照片 ; 思 数 字 图 像 ， 凝 胶 或 X 射 线 的 数字 图 像 中 ， 所 包含 的 信息 的 分 析 和 储存 依赖 电脑 和 /或 磁盘 。 这 两 种 方法 各 有 优 缺 点 ， 将 在 后 文中 进行 介绍 。 截 止 到 写 这 本 书 的 时 候 ， 大 多 数 分 子 生物 学 实验 室 都 装备 了 至 少 一 种 数字 成 像 分 析 系 统 。 尖 端的 图 像 分 析 系统 价值 成 王 上 万 美元 。 大 多 数 普通 实验 室 ， 都 可 以 通过 在 凝 胶 上 方 简单 装备 数码 相机 和 合 适 的 图 像 滤 光 片 以 及 对 使 用 者 适当 的 防护 装置 ， 来 获得 电子 照片 文档 。

11.2 照片 文档

传统 意义 上 说 的 照片 文件 ， 是 指 研究 者 在 凝 胶 电泳 并 染色 以 后 人 工 获 得 的 图 像 。 过 去 ， 这 通常 是 通过 宝丽来 (Polaroid) 即时 成 像 产 品 实现 的 。 传 统 的 照片 文档 系统 ， 主 要 有 广泛 运用 的 宝丽来 DS-34 手提 式 照 相机 CAL 11. 1) 和 老式 的 宝丽来 MP-4 十 多 功能 系统 。 实 践 证 明 ，DS-34 系统 成 本 低廉 且 用 途 广泛 。 无 论 用 这 两 种 设备 中 的 哪 一 种 ， 研 究 者 都 能 获得 凝 胶 的 图 像 ， 将 图 像 贴 到 实验 记录 本 上 ， 然 后 给 图 像 加 上 合适 的 注释 。 与 宝丽来 即时 成 像 系 统 相 比 ， 新 式 设 备 已 经 开发 出 来 并 装备 到 了 大 多 数 实 验 室 。 新 式 的 数字 成 像 系 统 通 常会 配备 打印 设备 ， 使 研究 人 员 可 以 获得 一 份 完整 的 纸 质 图 像 。 通 过 这 些 系统 ， 照 片 进行 了 数字 化 ， 而 且 照片 可 以 打印 在 纸 上 ， 如 老式 的 传真 纸 一 样 的 热 敏 纸 ， 或 者 通过 激光 打印 机 打印 在 普通 纸 上 。 在 早期 ， 尽 管 经 过 了 许多 改进 ， 热 敏 印刷 仍然 缺少 足够 的 清晰 度 。 现 在 ， 很 多 实验 室 都 使 用 高 光泽 度 的 热 敏 纸 来 保存 有 用 的 电泳 图 像 。 尽 管 需要 相当 的 预先 投资 ， 但 是 这 些 图 像 系 | - 130 -

第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析

统 能 够 在 操作 时 提供 更 快 的 速度 ， 并 使 处 理 数 据 的 效率 提高 ， 或 者 以 * .tif 的 格式 作为 email 附件 发 送出 去 ， 或 者 直接 将 图 像 导 入 Word 文 档 ， 以 便于 与 远程 交流 合作 。 宝 丽 来 照片 也 能 够 根据 需要 进行 扫描 、 数 字 化 、 分 析 、 分 类 以 及 归档 。 并 且 传 统 的 照片 比 打印 在 热 敏 纸 上 的 照片 有 更 长 的 寿命 。 不 管 选用 哪 种 方法 打印 ， 每 个 图 像 在 实验 记录 本 上 的 备份 都 是 最 为 重要 的 。 电 脑 是 很 便利 的 ， 但 是 也 会 经 常 出 问题 。 因此 对 电泳 图 像 的 拷贝 存储 ， 并 打印 出 一 张 图 像 ， 也 是 非常 必要 的 。 此 外 ， 从 节省 时 间 的 角 度 看 ， 打 开 实 验 记 录 本 看 一 副 图 像 ， 无 论 如 何 都 比 完成 如 下 这 些 步骤 要 快捷 方便 得 多 。@ 等 待 打 开 电 脑 ;@ 登 录 进 入 操作 系统 ; @ 打 开 一 个 处 理 图 像 的 软件 ， 轿 找到 图 像 储存 的 位 置 ; 回 如 果 需 要 的 话 ， 打 印 出 一 幅 图 像 。

实际 教训 : 图 像 分 析 软 件 是 一 个 非常 有 效 并 且 节 省 时 间 的 工具 ， 但 是 保存 一 份 凝 胶 图 像 的 硬 找 贝 复印 件 也 同样 是 很 重要 的 。 在 实验 室 中 ,数字 图 像 不 仅 要 保存 并 归档 到 电脑 硬盘 上 ， 而 且 应 该 在 生成 图 像 的 当天 就 打印 出 一 份 复印 件 贴 在 实验 记录 中 。

11.2.1 样本 可 视 化

传统 的 通过 标准 宝丽来 胶片 获得 的 黑白 或 彩色 的 图 像 ， 有 些 是 有 底片 的 ， 有 些 是 没有 底片 的 。 现 在 ， 实 验 室 可 以 通过 使 用 一 个 CCD 〈 电 和 荷 耦 联 设备 ) 照相 机 直接 从 湿润 的 凝 胶 上 捕获 视 频 图 像 ， 也 可 以 使 用 像 STORM 860 荧光 成 像 仪 (Amersham Biosciences) 这 样 的 激光 扫描 仪 来 扫描 以 前 生成 的 图 像 。 为 了 显示 出 核酸 ， 凝 胶 可 以 使 用 SYBR 绿 、SYBR 金 、 省 化 乙 锭 等 染料 染色 ， 然 后 将 凝 胶 放置 到 紫外 激发 光 上 ， 就 可 以 照相 (图 11. 2) 或 者 通过 扫描 获得 图 像 。 在 有 些 情 况 下 ， 反 射 照明 〈 也 就 是 紫外 激发 光 从 凝 胶 的 上 方 照 下 ) 可 以 提高 显 像 的 灵敏 度 。DNA a RNA 在 凝 胶 中 的 分 布 ， 通 过 数字 图 像 捕 获 系统 或 只 是 简单 地 按 下 宝丽来 照相 机 上 的 快门 记录 下 来 。 然 后 ， 通 过 对 图 像 进行 分 析 ， 得 出 核酸 的 量 、 分 子 量 以 及 胶 上 条 带 的 相对 丰 度 和 比率 。 数 字 成 像 系 统一 般 为 手动 聚焦 并 且 包 含 缩放 功能 ， 使 研究 者 能 够 将 整个 凝 胶 的 图 像 显示 出 来 ， 或 者 只 是 选取 凝 胶 上 感 兴 趣 的 某 些 位 置 成 像 。 宝 丽 来 成 像 系 统 能 够 使 用 不 同 的 胶片 ， 并 且 有 一 个 咕 光 罩 能 够 调整 以 便 从 多 个 角度 拍照 。 这 就 更 容易 使 照相 机 维持 在 正确 的 焦 、

距 ， 并 获得 清晰 的 电泳 图 。 sreearemen 所 有 的 图 像 分析 系 统 都 能 够 调节 快门 速度 和 光圈 大 图 11 2 雍 觅 下 方 的 皮 外 线 允 江 直 接 “小 以 控制 曝光 量 。 如 果 使 用 者 不 能 确定 系统 的 参数 是 否 检查 凝 胶 上 的 核酸 。 该 照相 机 也 适合 “正确 ， 开 始 时 可 以 使 用 在 //8 光圈 下 曝光 0. 5s 来 获得 拍摄 平稳 放置 、 紫 外 光 上 方 照射 的 “EB 染色 凝 胶 的 图 像 ， 如 果 需 要 的 话 可 以 再 进行 修正 。 凝 胶 。 多 美妙 的 宝丽来 照相 机 对 于 SYBR 绿 和 SYBR 金 染色 的 凝 胶 ， 则 可 以 选择 用 .131 .

图 11.1 宝丽来 DS34 手 提 式 照相 机 。 嘱 光 单 可 适合 各 种 大 小 的 凝 胶 ， 并 使 照相 机 迅速 聚焦 。 内 置 镜片 保证 准确 的 放大 倍数 和 焦点 距离

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

0. 5s 快门 和 f/5. 6 光圈 拍照 。 当 然 ， 拍 照 条 件 的 设 定 主要 还 是 依靠 经 验 ， 并 且 与 核酸 的 分 子 量 、 染 色 时 间 、 脱 色 、 背 景 荧 光 的 大 小 以 及 是 紫外 线 上 方 照 射 还 是 紫外 线 下 方 照 射 等 诸多 因素 直接 相关 。 多 数 图 像 分 析 系 统 具 有 图 像 整 合 功能 ， 这 种 功能 能 够 提高 对 低 亮度 条 带 的 灵 敏 度 。 在 获得 图 像 的 同时 就 可 以 整合 图 像 ， 然 后 根据 操作 者 的 需要 ， 进 行 多 层 图 像 的 整合 。 为 了 更 好 地 理解 整合 的 概念 ， 先 在 低 光 照 条 件 下 获得 一 张 图 像 〈 这 种 条 件 下 图 像 的 许多 细节 都 难以 捕获 ) ， 同 时 获得 该 图 像 无 数 透明 的 层次 ; 然后 将 这 些 透 明 的 层次 ， 一 层 层 礁 放 到 最 初 的 图 像 上 ， 这 就 是 整合 。 通 过 这 种 方法 ， 图 像 中 原本 模糊 的 细节 就 可 以 变 得 清晰 。 操 作者 可 以 不 停 琶 加 新 的 透明 层 直 至 得 到 足够 清晰 的 图 像 。 尽 管 这 是 提高 图 像 效 果 的 一 个 很 好 的 方 法 ， 但 是 随 着 不 断 琶 加 新 的 透明 层 ， 图 像 的 背景 也 会 加 深 。 所 以 ， 整 合 是 一 个 很 有 用 的 方 法 ， 但 必须 适度 使 用 。

笔者 经 过 多 次 观察 ， 发 现 一 个 经 常 犯 的 错误 : 将 两 个 具有 不 同 整 合 度 的 不 同 图 像 直 接 进 行 比较 ， 然 后 得 出 分 布 在 两 个 不 同 凝 胶 上 PCR 产物 的 相对 丰 度 。 如 果 一 个 图 像 进行 了 20 层 的 整合 ， 而 另 一 个 图 像 只 进行 了 5 层 的 整合 ， 那 么 两 块 胶 之 间 直 接 相 互 比较 是 完全 错误 的 。 只 有 在 同一 块 胶 上 的 电泳 条 带 才 可 以 直接 互相 对 比 ， 以 定量 或 标准 化 。 用 分 子 量 标记 ， 分 别 将 每 块 胶 上 的 条 带 标准 化 ， 然 后 相互 比较 是 一 种 常用 于 不 同 胶 上 的 条 带 之 间 相 互 比较 的 方 法 ， 但 是 可 信和 度 不 如 同一 块 胶 上 的 条 带 比较 。

11.2.2 色彩 过 滤

除非 条 带 在 凝 胶 图 像 上 非常 明显 ， 否 则 图 像 不 能 传达 详细 的 有 用 信息 。 因 为 多 数 的 电泳 照片 都 是 黑白 胶片 或 灰 度 图 像 分 析 ， 所 以 适当 的 对 照 是 很 必要 的 。 然 而 需要 注意 的 是 ， SYBR 绿 或 SYBR 金 染色 的 彩色 电泳 图 像 是 非常 好 的 。 在 忽略 照相 镜头 或 使 用 的 胶片 差异 时 ， 色 彩 过 滤 能 够 提高 细节 ， 并 使 得 电泳 条 带 更 加 清晰 锐利 。

滤 色 器 能 够 吸收 和 它 互 补 的 颜色 并 传递 它 自身 的 颜色 ， 操 作者 可 以 调控 图 像 中 色彩 的 相对 亮度 以 显示 类 似 黑 白 照 片 的 图 像 。 比 如 ， 红 色 的 滤 色 器 会 使 蓝 色 和 绿色 变 瞳 ， 而 使 红色 变 得 相 对 明亮 。 下 面 举 了 一 个 有 效 的 方法 ， 记 忆 颜 色 之 间 的 互补 性 以 及 如 何 选择 正确 的 滤 色 器 。

“Red Cadillac by General Motors” (通用 汽车 公司 生产 红色 的 卡 迪 拉克 )

更 确切 地 说 :

Red Cadillac: Red and Cyan 〈 红 色 和 青色 )

by: Blue and Yellow (〈 蓝 色 和 黄色 )

General Motors: Green and Magenta 〈 绿 色 和 洋红 色 )

表 11.1 列 出 了 常用 的 一 些 核酸 和 和 蛋白质 凝 胶 电泳 染料 8， 相对 应 地 能 得 到 最 好 效果 的 滤 色 器 以 及 合适 的 光圈 和 快门 速度 。 因 为 滤 色 器 吸光 ， 故 有 必要 确保 对 凝 胶 进行 合适 的 光 照 。 也 就 是 说 ， 使 用 单一 形式 的 下 光源 照射 。 透 射 仪 中 烧 坏 的 紫外 灯泡 需要 专业 人 员 尽 快 更 换 。 在 某 些 情况 下 ， 操 作者 可 能 需要 增加 曝光 时 间或 使 用 更 大 的 光圈 或 两 者 同时 增加 来 补偿 由 滤 色 器 产生 的 影响 。 此 外 ， 由 于 紫外 线 光 源 @ 输 出 的 是 比较 低 亮 度 的 光 ， 所 以 高 速 胶 片 相当 适合 这 种 照明 下 的 拍摄 。 在 每 次 不 同 的 运用 中 ， 需 要 根据 经 验 进 行 调 节 以 获得 精确 的 参数 。

@ 针对 叫 啶 橙 染料 和 彩色 照片 ， 使 用 108 型 宝丽来 彩色 胶片 和 黄色 滤 色 器 ; 针对 黑白 照片 ， 使 用 105 型 或 107 型 宝 丽 来 胶片 和 红色 滤 色 器 。 @ 注意 : 尽管 UV 光源 发 出 的 光一 般 比较 弱 ， 但 是 如 果 没有 保护 措施 的 话 ， 它 发 出 的 短波 辐射 和 中 波 辐射 能 够 快速 导 致 没有 保护 的 眼睛 和 皮肤 的 永久 性 损伤 。 操作 时 一 定 要 戴 UV 级 的 保护 眼镜 ， 并 避免 皮肤 暴露 在 紫外 线 下 。 - 132 +

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第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析

表 11.1 常见 的 电泳 染料 和 对 应 的 滤 色 器

光源 (波长 ) ye 滤 色 器 快门 速度 @/s UV® (302nm) WALZ BE 22 SURG am 15 SRB f/8 1/4

UV(302nm) SYBR 绿 ,SYBR &

料 13 (400~ 700nm) 考 马 斯 亮 蓝 ue

H36(400~700nm) ELISA®

JO ELISA 一 酶 联 免疫 吸附 测定 法 。

QUV 一 此 外线 。

@ 根据 宝丽来 667 型 和 57 型 胶片 〈ISO 3000) 。 如 果 使 用 低 感 光度 胶片 ， 则 需要 更 长 的 曝光 时 间或 更 大 的 光圈 。 尽管 是 否 需要 整合 以 及 整合 的 有 效 性 依赖 于 经 验 ， 电 子 影 片 捕获 设备 也 同样 使 用 了 滤 光 装置 。

11.2.3 安全 第 一

紫外 线 透 射 仪 CUV transilluminator) 和 手持 紫外 灯 都 是 危险 的 强 紫 外 辐射 源 。 暴 露 在 这 些 实 验 仪器 的 紫外 灯 〈 通 常 发 射出 302nm 或 312nm 的 紫外 线 ， 有 时 候 也 有 254nm 或 其 他 紫外 波长 的 紫外 线 ) 照射 下 ， 会 对 眼角 膜 、 视 网 膜 以 及 眼睛 的 其 他 结构 和 皮肤 造成 严重 的 伤 害 。 因 为 这 种 伤害 是 可 积累 的 ， 因 此 ， 不 管 是 从 短期 还 是 长 期 来 看 ， 少 量 的 紫外 灯 照 射 就 能 带 来 灾难 性 的 后 果 。 必 须 确 保 每 次 操作 都 戴 上 手套 、 眼 罩 或 面 曾 ， 即 使 是 在 使 用 有 保护 罩 的 紫外 线 透 射 仪 时 ， 也 是 如 此 。 因 为 尽管 紫外 线 透射 仪 的 保护 罩 通 常情 况 下 能 够 阻挡 多 数 的 紫 外 线 照射 ， 但 同时 也 会 有 少量 的 紫外 线 透 过 。 而 且 ， 裂 缝 、 摆 放 不 适当 和 遮光 章 挡 不 住 的 部 分 ， 都 会 使 紫外 线 照 射 到 人 体 ， 造 成 潜在 的 健康 和 安全 隐患 。

当 族 胶 铺 在 紫外 线 透射 仪 上 拍照 时 ， 雍 胶 通常 会 完全 笼罩 在 手持 照相 机 的 遮光 罩 下 面 。 紫外 灯 应 该 在 照相 之 前 迅速 打开 ， 并 在 拍 好 照片 之 后 迅速 关闭 ， 甚 至 是 要 在 曝光 的 胶片 从 照 相机 中 取出 前 就 要 关闭 紫外 灯 。 因 为 经 常会 筷 记 关闭 紫外 灯 ， 这 样 操作 者 和 同 实验 室 的 其 他 人 员 就 会 长 时 间 暴 露 在 紫外 线 照 射 下 造成 伤害 。 这 种 事情 经 常 发 生 ， 尤 其 是 在 室内 的 灯 开 着 的 时 候 。 无 论 透射 仪表 面 暴露 部 分 面积 多 小 ， 都 会 给 操作 者 带 来 很 大 的 伤害 。 所 以 要 时 刻 保 证 在 整个 透射 仪 的 表面 覆盖 保护 畦 。 另 外 ， 透 射 仪表 面 也 会 在 短 时 间 内 很 快 变 热 ， 所 以 也 应 适当 保护 。 还 需要 注意 的 是 ， 并 不 是 所 有 安全 玻璃 挡 板 都 是 可 防 紫 外 等 级 的 ， 因 此 无 论 出 于 什么 目的 使 用 紫外 透射 仪 ， 无 论 使 用 多 长 时 间 ， 使 用 合适 的 安全 防护 设备 都 是 非常 必要 的 。 最 后 ， 应 当 避 免 与 带 有 染料 的 凝 胶 直 接 接触 。 因 为 能 够 与 DNA 或 RNA 结合 的 染料 通常 都 有 明显 的 导致 基因 突变 的 能 力 。 在 获得 照片 文件 的 同时 ， 不 能 错误 估计 或 低估 了 这 个 过 程 中 所 潜在 的 危险 因素 。

幸运 的 是 ， 现 在 出 售 的 多 数 图 像 分 析 工 作 站 都 有 相关 的 设计 ， 以 保证 紫外 线 透射 仪 完 全 内 置 于 工作 站 内 ， 并 且 在 遮光 门 没 有 完全 关闭 的 情况 下 ， 紫 外 灯 也 不 会 打开 。 这 种 巧妙 的 设 计 ， 避 免 了 紫外 线 直 接 对 操作 者 的 照射 。

11.2.4 优化 电泳 图 的 一 些小 技巧

O 图 像 尺 寸 最 大 化 。 在 使 用 DS-34 照相 机 时 ， 一 定 确 保 选 择 与 凝 胶 大 小 最 为 接近 的 遮 XS, WREAK AIEEE (4 15cmX15cm) 拍摄 比较 小 的 胶 〈 如 7cmX8cm)， 得 到 的 图 。133 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

像 就 会 在 整 张 照 片 中 间 只 有 邮票 一 般 大 小 ， 而 周围 都 是 空 的 背景 。 一 个 与 凝 胶 大 小 合适 的 照 片 ， 可 以 在 灵敏 度 和 分 辨 率 等 各 方面 都 提供 最 好 的 细节 。 为 便于 图 像 分 析 ， 可 以 将 目的 条 带 放大 到 最 好 的 分 辨 率 。

@O) 使 用 紫外 灯 时 选择 光敏 感 程度 高 的 胶片 。 只 要 有 可 能 ， 就 使 用 ISO 3000 的 胶片 ， 如 宝丽来 667 型 和 57 型 胶片 ， 这 两 种 胶片 都 适用 于 大 多 数 常规 的 应 用 。 高 感光 度 的 胶片 能 够 得 到 更 加 锐利 的 条 带 ， 可 以 使 用 更 短 的 上 曝光 时 间 进 行 曝光 。 这 同时 也 可 以 让 使 用 旧式 紫外 成 像 系 统 的 操作 者 更 少 地 暴 露 在 紫外 灯 下 以 减少 伤害 。 对 于 省 化 乙 锭 染色 的 凝 胶 ， 在 紫外 灯 照 射 下 会 比较 快 褪 去 欧 光 颜色 ， 所 以 更 短 的 曝光 时 间 还 有 利于 获得 更 多 的 效 胶 图 像 。 更 短 的 曝 光 时 间 还 能 避免 凝 胶 中 DNA BK RNA 由 于 长 时 间 紫 外 照射 导致 的 磷酸 二 酯 键 的 断裂 。 如 果 凝 胶 中 的 条 带 需 要 回收 做 克隆 或 进一步 操作 的 话 ， 这 个 因素 就 非常 需要 注意 了 。 即 使 少量 的 紫外 照射 也 会 导致 DNA 或 RNA 磷酸 二 酯 键 的 断裂 ， 所 以 要 确保 有 足够 的 量 用 于 Northern 或 Southern 转 膜 。 过 多 的 断裂 将 会 导致 无 法 进行 接 下 来 的 核酸 杂交 等 步 又。

@ 保持 照相 机 滚 轴 的 清洁 。 为 了 避免 图 像 上 有 污点 或 其 他 操作 过 程 中 产生 的 缺陷 ， 需 要 使 用 温水 和 棉签 或 探 镜 纸 (Kimwipes) 定期 清洁 DS-34 照相 机 滚 轴 。 当 照片 上 出 现 了 三 个 或 四 个 污点 甚至 成 片 的 污点 时 ， 清 洗 滚 轴 就 非常 必要 了 (图 11.3)。 这 些 污点 一 般 是 当 胶 片 从 照相 机 中 取出 时 ， 用 力 不 平 导 致 在 滚 轴 上 产生 残留 碎片 造成 的 。

®D 保持 紫外 线 透 射 仪表 面 的 清洁 。 拍 完 照片 后 凝 胶 应 该 立即 从 透射 仪表 面 移 走 。 如 果 不 立 刻 移 走 的 话 ， 经 常会 把 胶 遗 忘 在 那里 很 长 时 间 。 这 样 凝 胶 就 会 变 干 ， 并 且 粘 在 透射 仪 的 表面 。 另 外 ， 和 遗留 在 透射 仪 上 干 胶 内 的 溴 化 乙 锭 或 其 他 荧光 燃料 ， 在 以 后 拍照 时 会 产生 背景 污点 。 最 好 能 够 在 每 次 使 用 后 ， 使 用 棉签 茧 上 去 离子 水 或 70 狼 酒精 清 洗 透射 仪 的 表面 ， 并 立即 使 用 控 镜 纸 控 干 。 在 拍摄 凝 胶 图 像 时 ， 没 有 什么 比 干 净 的 背景 更 重 By. © 按照 胶片 显影 指导 的 条 件 进 行 显 影 。 要 密切 注意 每 种 不 同类 型 胶片 推荐 使 用 的 显影 程序 、 调 试 时 间 和 温度 。 胶 片 显 影 不 足 或 过 度 显 影 都 是 经 常 出 现 的 问题 。 并 且 通 常会 导致 图 像 质量 的 下 降 。 总 的 来 说 ， 最 常用 的 黑白 胶片 需要 在 从 相机 中 取出 后 显影 30s。 过 度 显影 将 会 提高 图 像 的 对 比 度 ， 这 种 影响 是 好 是 坏 主 要 取决 于 凝 胶 上 各 个 不 同 条 带 的 深浅 。 当 对 比 度 增加 的 时 候 ， 最 亮 的 条 带 会 更 加 突出 〈 图 11.4)。 然 而 ， 最 弱 的 条 带 则 会 更 弱 ， 甚 至 变 得 和 背景 相同 以 至 于 观察 者 看 不 出 相应 的 条 带 。

11.3 宝丽来 相机 脏 滚 轴 的 影响 。 注 意 照 片 最 右 端 边 缘 的 三 个 很 大 的 和 白 点

图 11.4 过 度 显 影 的 宝丽来 电泳 图 。a. 正确 的 显影 时 间 ; b. 过 度 显影 导致 低 亮度 条 带 的 缺失 。 134 -

第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析

@ 数码 相机 设置 的 标准 化 。 为 了 保持 一 致 性 ， 需 要 特别 注意 光圈 大 小 、 整 合 层 数 以 及 快门 速度 的 设 定 。 在 同一 个 实验 室 ， 这 些 设 定 需要 保持 一 致 性 ， 这 样 一 些 不 同 实 验 的 图 像 之 间 相 互 对 比 才 有 意义 。

© 避免 极端 温度 。 宝 丽 来 胶片 理想 的 显影 温度 是 室温 ， 一 般 21 一 24C 。 如 果实 验 室 温 度 偏 高 或 偏 低 ， 或 胶片 在 使 用 前 在 冰箱 中 冷藏 ， 那 么 就 有 必要 对 显影 时 间或 曝光 时 间 做 适当 的 调整 。 按 胶片 的 使 用 说 明 调 整 。

@ 使 用 比较 小 的 光圈 。 较 小 的 光圈 可 以 获得 较 大 的 景深 ， 并 且 获 得 的 图 像 更 加 锐利 。 Hie Lik, MAM F/16 的 小 光圈 开始 调节 ， 逐 渐 增 大 光圈 直到 最 合适 大 小 。 通 常情 况 下 ， 省 化 乙 锭 染色 的 凝 胶 ， 需 要 在 £/8 大 小 的 光圈 下 曝光 1/4s， 获 取 合 适 的 图 像 ， 而 SYBR # 色 的 凝 胶 ， 则 在 £/5. 6 大 小 的 光圈 下 曝光 1/4s 或 1/2s$， 根 据 需要 而 定 。

@ 尽量 减少 相机 的 抖动 。 在 使 用 感光 度 低 的 胶卷 获取 省 化 乙 锭 染色 ， 尤 其 是 SYBR 绿 或 SYBR 金 染色 的 凝 胶 图 像 时 ， 常 需要 较 长 的 曝光 时 间 。 为 了 尽量 减少 相机 的 抖动 ， 一 般 使 用 快门 释放 绳 代替 手枪 握 把 式 的 快门 释放 按钮 ， 这 对 于 手提 式 DS-34 相机 是 很 容易 更 换 的 。 当 然 使 用 感光 度 高 的 胶片 更 好 〈 人 参见 第 四 条 ) 。 对 于 图 像 分 析 工 作 站 来 说 ， 相 机 的 拌 动 通常 不 需要 考虑 。

@ 排除 环境 光源 的 于 扰 。 如 果 使 用 的 是 手提 照相 机 ， 一 定 要 确保 照相 机 的 遮光 置 直接 放置 在 光合 上， 这 样 可 以 避免 背景 光 到 达 感 光 胶 片 。 在 使 用 这 种 照相 机 时 ， 通 常 不 需要 关闭 房间 内 的 光源 。 但 是 ， 必 须 保 证 在 获得 凝 胶 图 像 后 立刻 关闭 紫外 线 透 射 仪 。 如 果 使 用 的 是 图 像 分 析 工 作 站 ， 大 多 数 情况 下 ， 紫 外 线 透射 仪 在 安全 门 没 有 完全 关闭 并 且 紧 锁 的 时 候 ， 是 不 会 打开 的 。 这 保护 操作 者 避免 遭 到 紫外 线 的 照射 ， 同 时 也 避免 了 环境 光源 对 感光 胶片 的 干扰 。

@ 使 用 正确 的 滤 色 器 。 将 滤 色 器 作为 照片 文件 系统 的 一 个 组 成 部 分 。 对 颜色 的 过 滤 ， 能 够 增加 电泳 图 像 的 对 比 度 。 理 想 情 况 下 ， 操 作者 应 该 尽 可 能 使 用 旋 和 人 式 的 玻璃 滤 色 器 。 有 时 候 ， 酮 酸 盐 滤 色 需 会 扭曲 光路 ， 因 此 应 当 尽 量 避 免 使 用 。 ，

四 避免 弄 模 糊 镜头 。 注 意 透 射 仪 打 开 的 总 时 间 。 因 为 透射 仪 的 表面 会 在 打开 后 短 时 间 内 变 热 ， 凝 胶 内 的 液体 就 会 挥发 ， 然 后 聚集 在 照相 机 遮光 晶 或 图 像 分 析 工 作 站 内 的 镜头 上 。 这 就 使 得 镜头 上 蒙 上 一 层 雾 ， 严 重 影响 获得 照片 的 质量 。 使 用 掠 镜 纸 控 干 镜头 ， 可 以 轻易 地 避免 这 种 情况 的 发 生 。

@ 正确 地 获取 胶片 。 曝 光 好 的 照片 直接 从 照相 机 中 取出 ， 取 出 的 时 候 动 作 要 慢 ， 并 且 要 平缓 地 从 垂直 于 操作 者 的 方向 取出 ， 而 不 能 向 上 或 向 下 从 照相 机 中 取出 胶片 。 建 议 操 作者 以 “Pol-ar-oid” 的 节奏 将 胶片 取出 。 到 了 推荐 的 显影 时 间 ， 将 胶片 炎 翻转 ， 抓 住 胶片 上 印 有 数字 的 角 ， 将 胶片 从 充满 显影 剂 的 胶片 炎 上 拉 下 。 包 括 667 型 在 内 的 一 些 胶 片 ， 不 需要 任 何 类 型 的 涂 层 ， 胶 片 一 开始 有 可 能 会 轻微 拱 起 ， 但 4 一 5min 之 内 就 会 变 平 。 不 要 触摸 底片 或 者 底片 依附 的 薄片 ， 因 为 这 两 者 都 含有 皮肤 不 应 接触 的 碱 类 物质 。

最 后 ， 对 于 新 手 来 说 ， 需 要 熟 记 以 下 两 点 。

© BAEWA “BL 1, 2. 4, 8. 16. 32 和 642 SRARITREHAE. “B” eA 只 要 操作 者 按 着 快门 不 松手 ， 就 会 一 直 曝 光 。 数 字 则 代表 快门 速度 的 倒数 〈 如 2 代表 1/2s, 4 则 代表 1/4s) 。

@ 术语 光圈 设 定 和 /stop 两 者 是 可 以 互 换 的 。 它 们 表示 镜头 快门 张 开 的 大 小 。 显 然 ， 这 个 参数 是 指 能 够 进入 镜头 并 且 使 胶片 曝光 的 进 光 量 的 多 少 。J/stop 刻度 标的 数字 ， 与 快

。 135 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

门 刻 度 一 样 也 是 相反 的 。 也 就 是 说 数字 越 小 ， 表 示 光 圈 越 大 。 11.2.5 照相 技术 和 和 射线 胶片 固有 的 局 限 性

照相 系统 中 ， 记 录 图 像 的 方法 是 一 种 能 量 转换 的 过 程 。 它 利用 元 化 银 唱 体 对 光子 的 敏感 性 来 记录 光源 或 物体 发 射 和 反射 光子 的 水 平 。 当 光子 的 能 量 水 平 足够 时 ， 贞 化 银 唱 体 吸收 光 子 后 ， 变 形 形 成 潜在 的 图 像 位 置 。 在 这 个 位 置 ， 唱 体 中 银 和 卤 素 之 间 的 化 学 键 断 裂 ， 产 生 自 由 元 素 和 金属 银 。 如 果 在 短 时 间 内 郊 化 银 接受 的 光子 能 量 太 多 ， 元 化 银 唱 体 将 没有 足够 的 反 应 速度 来 正确 记录 这 一 事件 。 同 样 ， 如 果 郊 化 银 唱 体 在 长 时 间 内 接受 的 光子 能 量 太 少 ， 那 么 此 时 卤化 银 的 反应 和 在 正常 情况 下 的 反应 也 不 同 ， 也 不 能 正确 记录 事件 。

在 某 个 临界 点 ， 唱 体 接 受 足 够 的 能 量 可 以 使 胶片 上 的 金属 银 达 到 饱和 。 超 过 这 一 临界 点 的 曝光 量 就 不 能 再 记录 信息 ， 从 而 使 特征 性 的 图 像 保持 在 同一 曝光 水 平 上 。 对 宝丽来 胶片 而 言 ， 这 种 饱和 水 平 与 被 称 作 D-Min 的 最 低 密 度 相 关 。 当 晶体 达到 对 光子 能 量 如 此 低 的 吸收 水 平时 ， 它 将 不 能 够 生成 潜在 的 图 像 ， 就 像 胶 片上 从 没有 吸收 到 光子 能 量 一 样 ， 这 就 产生 了 对 最 大 密度 也 就 是 D-Max 的 统一 反映 。 在 D-Min 和 D-Max 之 间 的 范围 ， 银 晶体 能 够 以 非 线 性 的 方式 记录 高 光 和 阴影 的 细节 。 因 为 这 个 范围 内 晶体 接近 线性 变化 以 记录 对 能 量 的 吸收 。 胶片 能 够 对 高 光 和 阴影 区 域 进行 有 效 记 录 的 范围 称 为 胶片 的 动态 范围 。 尽 管理 想 状 态 下 ， 人 们 和 希望 胶片 和 光子 源 有 相同 的 范围 ， 这 样 系统 就 能 够 记录 逼真 的 图 像 。 但 是 通常 情况 下 ， 光 子 范围 要 大 于 胶片 的 动态 范围 。 在 这 种 情况 下 ， 图 像 系 统 的 操作 者 就 必须 选择 哪个 范围 是 最 为 重要 的 。 操 作者 通过 调整 系统 的 曝光 ， 决 定 要 记录 图 片 的 范围 ， 同 时 也 会 损失 掉 胶 片 动态 范围 以 外 的 高 光 和 阴影 部 分 。 在 分 子 生 物 学 实验 室 ， 最 强 的 和 最 弱 的 条 带 常 常 都 需要 显示 在 图 像 上 ， 这 时 可 以 使 用 不 同 光圈 值 对 同一 块 胶 曝 光 2 一 3 次 ， 以 获得 一 张 图 像 上 尽 可 能 多 的 有 用 数据 。

11.3 数字 图 像 分 析

有 许多 传统 的 用 来 解读 凝 胶 电 泳 图 像 〈 电 泳 图 ) 的 方法 ， 现 在 都 已 经 不 再 使 用 ， 如 视觉 观察 和 密度 计量 学 方法 。 有 很 多 计算 机 软 、 硬 件 能 够 快速 、 可 重复 地 进行 图 像 分 析 - 很 多 测量 方法 都 已 实现 自动 化 ,包括 测算 分 子 量 、 浓 度 、 相 对 丰 度 和 综合 光 密 度 〈IOD) 等 。 同 时 计算 机 还 可 以 作为 分 类 存储 图 像 的 手段 。 图 像 分 析 系 统 通常 是 一 个 完整 的 设备 齐全 的 系统 。FOTO/Analyst Archiver Eclipse 工作 站 〈 图 11. 5) 就 是 一 个 很 好 的 例子 。 图 像 分 析 软 件 则 可 以 单独 购买 并 且 使 用 在 已 有 的 仪器 上 。 在 所 有 的 图 像 分 析 软 件 中 ，Gel-Pro 分 析 器 (Media Cybernetics) 是 杰出 的 代表 (图 11.6)。 这 个 软 件 使 用 简单 的 操作 即 得 到 想 要 的 信息 ， 而 不 需要 使 用 者 有 很 高 的 电脑 水 平 。 该 软件 还 有 自动 化 识 别 泳 道 、 寻 找 条 带 以 及 操作 者 自 定 义 宏 等 诸多 功

— a - 能 。 尽 管 操 作 需 要 有 限 的 输入 ， 但 是 可 以 完全 不 图 11.5”FOTO/Analyst Archiver Eclipse 工作 ”要 去 管 所 有 的 自动 化 功能 ， 计 算 机 有 很 大 的 机 站 。FOTODYNE 授权 (www. fotodyne. com) BPE.

。 136 。

第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析

Pa

1D-Gel

图 11.6 使 用 Gel-Pro Se ae aie 图 像 由 Meida Cybernetics 免费 提供 (www. mediacy. com)

有 意义 的 图 像 分 析 ， 要 求 能 够 理解 基本 的 术语 ， 以 及 知道 与 分 析 凝 胶 和 文档 数据 有 关 方 法 的 优 缺 点 。 因 此 ， 下 面 将 对 这 种 方法 和 实践 中 需要 注意 的 事项 做 一 个 小 结 。 图 像 是 物体 得 以 可 视 化 的 表现 。 图 像 处 理 利用 图 像 内 的 信息 使 图 像 更 加 有 用 。 数 字 图 像

处 理 是 使 用 电脑 进行 图 像 处 理 的 一 种 特殊 类 型 。 简单 地 说 ， 图 像 分 析 可 以 定义 为 对 图 像 进行 描 述 和 定量 。

数字 化 处 理 法 利用 水 平方 向 和 坚 直 方向 的 线 将 图 像 分 成 许多 小 格子 。 每 一 个 格子 叫 作 一 个 “图 像 元 素 ” 或 像素 〈 图 11.7)。 在 电脑 中 ， 图 像 通过 数字 化 栅 格 或 位 图 表现 。 一 个 像素 通 常 只 占 一 张 图 像 的 很 小 一 部 分 区 域 。 通 和 常 只 有 1/300in? (lin? = 6.4516 X 10-4m2 ) 或 更 少 。 在 位 图 上 ， 每 一 个 像素 可 以 根据 它 在 位 图 中 的 位 置 表示 ， 也 就 是 它 的 横 坐 标 〈z 轴 ) 和 纵 坐

像素 0, 0

像素 18, 22

图 11.7 像素 位 图 。Media Cybernetics 授权

标 〈y 轴 ) 的 数值 。 按 照 惯例 ， 像 素 通常 从 位 图 的 左上 方 作为 起 点 0，0“〈 行 0， 列 0)。

一 个 图 像 〈 如 一 张 电泳 照片 ) 数字 化 后 ，

它 将 以 栅 格 的 形式 进行 分 析 。 也 就 是 说 ， 图 像 中 的 每 一 个 像素 都 是 独立 的 样本 ， 并 且 每 一

个 像素 的 亮度 都 是 独立 定量 的 。

单个 像素 亮度 的 测量 数值 〈 通 常 是 整数 ) 代表 了 图 像 中 那个 位 置 的 亮度 和 上 暗 度 。 这 个 值

作为 代表 图 像 位 图 中 对 应 的 像素 储存 在 电脑 中 。 值 可 以 通过 仪器 选择 并 且 固 定 下 来 。 总 的 来 说 ，

空间 分 辩 率 。

sm SEO 位 图 的 像素 宽度 和 高 度 就 是 通常 称 作 的

依赖 于 硬件 测量 的 能 力 和 图 像 的 复杂 性 ，1 一 32 比特 中 任何 一 个 位 置 都 有 可 能 用 于 存储

¢ 137 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

每 一 个 像素 的 值 。 只 包含 黑白 信息 简单 图 像 的 像素 值 用 单独 比特 代表 : 0= 黑 ，1 王 白 。 对 应 的 ， 类 似 于 照片 的 图 像 包 含 了 更 多 的 信息 ， 就 需要 用 24 比特 来 代表 所 有 真 彩色 图 像 中 可 能 出 现 的 颜色 。 在 一 个 图 像 中 ， 使 用 比特 数 来 代表 像素 的 数值 ， 它 涉及 像素 的 位 深 或 每 个 像素 的 比特 数 (BPP), BPP 的 数量 决定 了 图 像 的 等 级 。

尽管 比特 数 显示 出 一 个 图 像 能 够 处 理 的 单一 颜色 数 ， 但 是 它 却 不 能 显示 出 图 像 中 存在 什 么 颜色 。 对 颜色 的 解释 是 由 位 深 (bit depth) 和 图 像 等 级 决定 的 。 图 像 等 级 包括 : 灰 度 色 标 8; 灰 度 色 标 12; 灰 度 色 标 16.

灰 度 色 标 像素 值 代表 从 全 白 到 全 黑 的 灰 度 或 亮度 的 等 级 。 这 种 等 级 有 时 候 称 为 “ 单 色

en PT TettiLtet Ll 和 ae is i ee it Tt 5 (monochrome) ” , 在 一 个 8 比特 的 灰 度 色 标 图 Seseeesnecnsneeecceenseecesesses (th, (iy 0 的 像素 是 全 黑 的 ， 而 值 为 255 的 ROGERNORRSE 像素 则 是 全 白 的 〈 图 11.8)。 一 个 值 为 127 的

”像素 则 是 恰好 在 全 黑 和 全 和 白 中 间 的 灰色 〈 半 灰 色 )。 而 值 为 64 的 像素 则 是 一 个 恰好 处 于 全 黑 和 半 灰 色 中 间 的 颜色 。 尽 管 比 特 深度 为 2、4、6、12、16 和 32 的 灰 度 色 标 值 都 存在 ，8 BPP 灰 度 色 标 图 像 则 是 最 为 常用 的 。 这 是 因为 : D1BPP 的 大 小 使 得 它 便于 使 用 电脑 处 理 ; @ 因 为 它 有 256 种 不 同 的 灰 度 级 别 ， 使 得 它 能 够 忠实 地 表现 出 任何 灰 度 图 像 e。

提高 凝 胶 图 像 质量 以 获得 最 多 的 有 用 信息 ， 通 常 是 很 必要 的 。 尽 管 有 很 多 方法 可 以 提高 图 像 质量 ， 但 调整 亮度 、 对 比 度 和 灰 度 校正 是 分 析 数 字 图 像 时 最 常用 的 方法 。

亮度 是 用 来 描述 图 像 光 的 总 量 参数 。 当 亮度 增加 时 ， 图 像 中 每 一 个 像素 的 值 都 会 增加 ， 即 每 一 个 像素 值 都 更 加 接近 255; 或 者 说 每 一 个 像素 更 加 接近 白色 。 同 理 ， 当 亮度 降低 时 ， 图 像 中 每 一 个 像素 的 值 都 会 减少 ， 即 每 一 个 像素 值 都 更 加 接近 0; 或 者 说 每 一 个 像素 更 加 接 近 黑 色 。

对 比 度 是 用 来 表示 图 像 中 最 亮 和 最 暗部 分 间 差 别 等 级 的 参数 。 如 果 一 张 图 像 只 含有 灰 色 ， 或 者 说 图 像 中 每 一 个 像素 的 值 都 在 一 个 很 狭小 的 范围 内 ， 那 么 这 张 图 像 的 对 比 度 就 低 。 例如 ， 一 张 图 像 中 所 有 像素 值 都 在 100 一 140 之 间 ， 55, 那 这 张 图 像 对 比 度 就 比较 低 。 如 果 一 张 图 像 包含 从 全 黑 到 全 白 的 所 有 像素 值 ， 那 它 就 有 比较 高 的 对 比 度 。 图 像 使 用 的 总 的 强度 表 称 为 它 的 动态 范围 《dy- namic range) 。 具 有 高 对 比 度 的 图 像 也 就 具有 宽 的 动 态 范围 。

灰 度 校正 是 提高 对 比 度 的 一 种 特殊 形式 ， 它 可 以 提高 图 像 中 特别 亮 或 特别 暗 区 域 的 对 比 度 。 它 通 | AEP BI. CE BAIA. esc 原始 像素 什 9) 对 比 度 调 节 ， 而 不 影响 图 像 中 的 高 光 (255) 和 阴影 图 11.9 7y 校 正 曲线 。 该 曲线 对

像素 (O~255) 的 影响 (0) 。 灰 度 校正 可 以 用 于 改善 图 像 的 表现 ， 或 者 补偿 | 不 同 的 输入 输出 设备 导致 的 同一 幅 图 像 的 不 同 。 灰 度 校 正 包 括 将 标准 的 非 线性 的 y 曲线 应 用 于 强度 标 〈 图 11. 9) 。7y 一 1 表示 对 图 像 没 有 影响 的 标准 曲线 。 增 加 y 值 O>1) 可 以 使 图 像 国 变 亮 ， 并 增加 暗部 区 域 的 对 比 度 。 降 低 y (Y<1) 值 会 导致 图 像 整体 变 暗 并 增加 高 光 区 的 对 国

ee oe oe oe

Y BOER RFA

@ 人 了 眼 只 能 分 辨 出 小 于 200 灰 度 等 级 的 图 像 。 。 138 -

第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析

Lt BE Fa — BR FF HABE HBR i SE HBR PE: BE PT HE BE COD, BY 4d 36 76 BED 分 析 是 一 类 普遍 的 图 像 处理 方 法 。 它 是 通过 测量 穿 透 光 的 总 量 ， 来 测定 材料 中 某 一 物质 总 含量 的 一 种 普遍 使 用 的 方法 。 因 为 分 光 光 度 分 析 是 测量 透 过 物质 的 光 的 总 量 ， 所 以 这 种 方法 只 有 在 分 析 光 源 从 物质 后 面 发 出 的 光照 射 获得 的 图 像 林 有 意义 。 总 的 来 说 ， 图 像 上 的 条 带 或 其 他 元 素 的 OD 值 与 透 过 物质 内 部 的 光 呈 现 指 数 式 衰 减 。 可 以 通过 公式 表 示 为 :

一 二 logLintensityCz,y) 一 blackj 0 incldent 一 black

AH OD(Cz,y) 一 一 表示 像素 (z,y) 的 分 光 光 度 ， 即 光 密 度 ; intensity(Zzyy) 一 一 表示 像素 (zy,y) HEE; black 一 一 指 没有 光 透 过 物质 时 产生 的 亮度 ; incident 一 一 指 拍照 的 激发 光 所 产生 的 亮度 。

不 能 透 过 光 的 物体 有 一 个 无 限 大 的 OD， 而 所 有 光 都 能 透 过 的 物体 有 一 个 值 为 0 的 OD, 因此 ，OD 标 与 强度 标 反 向 相关 。 也 就 是 说 ， 在 OD 标 上 ， 暗 的 像素 的 OD 值 很 高 ， 而 亮 的 像素 的 OD 值 则 比较 低 。

IOD 是 指使 用 者 定义 的 图 的 某 一 区 域内 ， 所 有 像素 的 像素 值 减 去 背景 值 的 总 和 。 在 一 个 特定 区 域内 ， 增 加 条 带 的 大 小 或 增加 某 个 斑点 的 亮度 都 会 使 IOD 值 增高 。 在 比较 没有 分 子 量 标准 的 图 像 上 不 同 条 带 之 间 亮 度 时 ，IOD 是 一 个 非常 有 用 的 参数 。

11.3.1 图 像 格 式

数字 图 像 可 以 储存 在 电脑 的 硬盘 、 软 盘 或 CD 上 。 在 需要 时 可 以 调 出 来 做 进一步 研究 。 因为 数字 图 像 可 能 会 占据 硬盘 上 很 大 的 空间 ， 通 党 可 以 在 不 损坏 所 需 数据 的 情况 下 ， 对 图 像 做 尽 可 能 多 的 裁减 。 一 旦 图 像 存储 到 硬盘 上 ， 它 就 已 经 具备 了 特定 的 格式 。 这 些 格 式 ， 通 常 ”由 于 它 所 支持 的 图 像 数 据 的 类 型 不 同 ， 以 及 储存 图 像 所 需要 的 压缩 程度 不 同 而 变化 。 凝 胶 图 像 通常 以 TIFF 格式 (*.tif) (tagged image file format， 标 签 图 像 文 本 格式 ; tagged information field format， 标 签 信息 文本 格式 ) 保存 。 常 用 于 图 像 存储 其 他 图 像 格 式 有 : BMP (bitmap, {i 图 )、JPEG Goint photographic experts group， 联 合照 相 专 家 组 )、GIFE (graphics interchange format， 图 形 交 换 格式 ) 等 。 一 旦 存储 在 硬盘 上 ， 这 些 图 像 就 可 以 像 其 他 文件 一 样 有 可 恢复 性 ， 并 可 以 传输 到 网 络 或 通过 电子 邮件 传递 。

11.3.2 实践 中 需要 考虑 的 问题

多 数 科 学 工作 者 们 首先 要 考虑 的 问题 是 凝 胶 成 像 系统 以 及 软件 的 花费 问题 。 毫 不 奇怪 ， 不 同 版 本 、 不 同 功能 、 不 同 的 系统 要 求 以 及 系统 运行 所 需 的 硬件 设施 的 仪器 的 价格 会 有 很 大 的 差别 。 如 前 面 所 建议 的 ， 许 多 设备 齐全 并 且 拥 有 非常 多 功能 的 系统 都 是 很 好 的 选择 。 这 些 系统 很 多 都 非常 昂贵 ， 并 且 常 常 超 出 实验 室 的 预算 。 最 好 的 方法 是 ， 系 或 部 门 能 够 买 一 台 这 种 仪器 让 大 家 共享 。 其 他 的 一 些 数 字 成 像 分 析 产 品 可 以 直接 用 于 实验 室 已 有 的 电脑 上 。 除 了 购买 图 像 分 析 软 件 的 花费 外 ， 还 需要 投资 购买 一 些 图 像 捕获 设备 ， 如 用 来 扫描 宝丽来 照片 或 其 他 图 像 的 扫描 仪 、CCD 照相 机 或 图 像 采 集 卡 〈frame grabber) 。 总 的 来 说 ， 图 像 分 析 软 件 的 优点 足以 与 它 的 价格 相 匹 配 〈 表 11. 2) 。

- 139 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

表 11.2 图 像 分 析 软 件 的 优点

行使 标准 的 用 户 化 的 测量 方法

使 实验 室 图 像 分 析 自 动 化 并 且 标 准 统 一

节省 时 间 ,增加 处 理 图 像 的 效率

提供 可 再 生 的 图 像 分 析

提供 亮度 和 背景 校准

补偿 不 单一 的 图 像 背景

计算 每 个 条 带 的 IOD,、 相 对 丰 度 .同一 泳 道上 条 带 的 质量 分 布 , 取 代 了 旧 的 显 像 密 度 计量 容易 出 现 的 错误 可 以 将 图 像 存 储 到 Excel 等 常用 的 软件 内

可 以 通过 e-mail LA TIFF 格式 发 送 图 像

将 数字 图 像 导入 Word 文档 或 Power Point 文档 也 非常 容易

@ 图 像 分 析 的 这 一 方面 特别 重要 ， 因 为 大 多 数 人 倾向 于 高 估 凝 胶 和 放射 自 显影 胶片 上 条 带 的 光 密 度 积分 。

使 用 图 像 分 析 软 件 的 一 个 主要 优点 是 可 以 使 枯燥 并 耗 时 的 操作 实现 自动 化 。 即 从 凝 胶 图 像 上 寻找 条 带 位 置 以 及 分 子 质量 分 布 ， 计 算 通 常 使 用 诸如 手工 绘 出 校准 曲线 ， 以 及 决定 分 子 质量 的 密度 计量 学 等 一 些 陈 旧 的 方法 。 数 字 图 像 分 析 能 够 减少 实验 室内 的 错误 ， 并 且 能 够 明 显 提高 需要 处 理 大 量 图 像 的 实验 室 的 工作 效率 。 此 外 ， 较 好 质量 的 图 像 分 析 软 件 与 凝 胶 图 像 和 X 射线 胶片 以 及 发 光 测 试 方法 获得 的 图 像 有 完全 的 兼容 性 。 它 还 完全 能 够 以 斑点 印迹 的 形式 分 析 条 带 和 信号。 除了 经 典 的 凝 胶 图 像 分 析 方 法 外 ， 与 芯片 分 析 “〈 第 23 章 ) 以 及 其 他 一 些 有 效 的 应 用 有 关 的 新 版 本 图 像 分 析 软 件 也 已 广泛 应 用 。

很 多 人 都 误 以 为 图 像 分 析 软 件 具 有 改善 图 像 质量 的 能 力 。 使 用 者 必须 意识 到 ， 如 果 扫 描 的 是 一 张 画 质 很 差 的 凝 胶 图 像 ， 图 像 分 析 软 件 得 到 的 也 将 是 一 个 画 质 差 的 图 像 。 如 果 凝 胶 的 电泳 没有 进行 足够 的 时 间 ， 图 像 分 析 软 件 也 无 法 进一步 分 析 电 泳 上 的 条 带 。 图 像 分析 软 件 对 图 像 有 效 分 析 的 前 提 是 使 用 者 必须 提供 质量 好 的 图 像 。

背景 校正 是 一 个 极 具 争议 的 领域 ， 尤 其 是 在 对 条 带 或 整个 泳 道 进行 高 精度 定量 时 。 这 是 图 像 分 析 的 一 个 重要 方面 ， 但 其 本 身 具 有 内 在 的 难点 。 主 要 是 因为 每 块 凝 胶 或 每 张 图 像 上 ， 每 个 位 置 的 背景 都 不 是 相同 的 ， 而 是 每 块 凝 胶 都 存在 从 左 到 右 或 者 自 上 而 下 的 背景 梯度 。 同 样 的 ， 有 三 种 主要 的 解决 途径 。

D 检查 图 像 中 许多 小 的 区 域 ， 然 后 只 处 理 “ 本 地 的 ”背景 〈 即 所 谓 目 的 区 域 )。

@ 在 图 像 的 几 个 中 间 位 置 放 上 指针 ， 测 定 这 些 位置 的 背景 作为 样本 ， 然 后 进行 综合 的 背景 扣除 。

© 在 图 像 上 许多 不 同 的 点 上 放置 指针 ， 然 后 减 去 图 像 上 与 之 最 接近 的 泳 道上 的 背景 。

在 这 三 种 方法 中 ， 第 三 种 方法 可 以 提供 最 好 的 精度 和 通用 性 。

由 于 凝 胶 成 像 有 以 上 所 提 到 的 种 种 固有 的 局 限 性 ， 所 以 研究 者 在 处 理 时 ， 也 需要 考虑 不 要 混 清 了 同一 凝 胶 上 不 同 条 带 的 真实 量 的 差别 。 记 住 255 是 像素 的 最 大 可 能 值 ， 如 果 一 张 图 像 中 含有 255 的 像素 值 ， 就 说 这 张 图 像 达到 了 饱和 。 尽 管 低 于 255 的 像素 值 在 增加 曝光 量 的 时 候 也 会 增加 其 像素 值 ， 但 最 终 会 达到 饱和 。 因 为 更 长 的 曝光 时 间 也 不 可 能 导致 像素 值 超过 255。 计 算 包 含 饱和 像素 的 条 带 ， 与 计算 没有 饱和 像素 的 条 带 相 比 ， 通 常会 使 计算 值 低 于 实 际 值 。 因 此 在 计算 包含 饱和 像素 时 的 定量 方法 ， 也 需要 折 中 处 理 。 最 新 一 代 的 数字 图 像 分 析 系统 会 在 有 些 图 像 或 所 有 图 像 都 进入 到 饱和 范围 时 提醒 操作 者 ， 从 而 使 操作 者 调整 图 像 亮 度 ， 以 避免 “饱和 导致 的 错误 统计 ”。

。 140 。

|

第 11 章 照片 文档 和 图 像 分 析

11.4 & 4X“

Baxes, G. A. (1988). “Digital Image Processing-A Practical Primer,’ Cascade Press, Denver, CO.

Baxes, G. A. (1994). “Digital Image Processing-Principles and Applications.” John Wiley & Sons, New York.

Castleman, K. R. (1996). “Digital Image Processing.” Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ.

Chellappa, R. (1992). “Digital Image Processing.” IEEE Computer Society Press, Los Alamitos, CA.

Gonzalez, R. C., and Wirtz, P. (1987). “Digital Image Processing.” Addison-Wesley, Reading, PA.

_ Media Cybernetics. (1996). In “Gel-Pro Analyzer Reference Guide,” 2nd ed. Media Cybernetics, Silver Spring, MD.

Pratt, W. K. (1991). “Digital Image Processing,” 2nd ed. John Wiley & Sons, New York.

Russ, J. C. (1995). “The Image Processing Handbook.” CRC Press, Boca Raton, FL.

(ALM; HLH)

- 141 -

#2128 Northern 印迹 分 析

12.1 基本 原理

RNA 的 Northern 分 析 技 术 (Alwine 等 ，1977，1979) 问世 至 今 ， 已 经 发 展 出 了 很 多 种 变化 形式 。Northern 分 析 的 核心 ， 就 是 将 凝 胶 上 经 电泳 分 离 后 的 RNA 分 子 转移 或 印迹 (blotting) 到 膜 上 ， 以 便 固 定 以 及 与 特定 的 一 个 或 若干 个 探 针 杂交 。 因 为 转移 到 膜 上 的 RNA 谱 带 与 电泳 分 离 的 谱 带 完全 一 致 ， 所 以 Northern 分 析 的 杂交 信和 号 可 以 给 出 所 研究 样品 表达 模式 的 定性 或 半 定 量 信息 。 另 外 ， 在 RNA MBER ESI LA, RNA 富 集 到 膜 上 相对 较 小 的 区 域 ， 有 助 于 提高 检测 的 灵敏 度 。Northern 分 析 适 用 于 从 组 织 样品 或 培养 细胞 得 到 的 RNA， 也 仍 将 是 评估 mRNA 长 度 的 常用 技术 。 现在 有 多 种 提取 RNA、 制 备 变性 琼脂 糖 凝 胶 、 进 行 变 性 凝 胶 电 泳 以 及 将 核酸 从 胶 内 转 移 到 膜 上 的 方法 。 研 究 者 必须 从 以 下 几 方 面 考虑 ， 在 实验 前 选择 好 方法 。 这 些 因 素 包 括 : 所 用 膜 的 种 类 、 固 定 的 方法 、 探 针 的 类 型 、 探 针 标 记 的 方式 、 杂 交 液 配方 以 及 检测 方法 。 显 然 ， 要 做 的 选择 不 少 ， 而 且 为 了 避免 实验 过 程 中 出 现 意外 情况 ， 在 动手 前 列 出 每 个 步骤 会 颇 有 益处 。Northern 的 优化 来 自 经 验 ， 而 且 往 往 需 要 在 全 过 程 的 某 些 步骤 做 些 改变 。 当 一 个 实验 室 确立 了 优化 的 步骤 ， 许 多 技术 困难 以 及 与 重复 性 有 关 的 问题 就 解决 了 。 那么 Northern 分 析 都 有 哪些 内 容 呢 ? 大 体 上 是 RNA 电泳 ， 接 着 转移 并 固定 到 膜 上 ， 然后 与 标记 的 DNA 或 RNA 探 针 杂 交 ， 最 后 就 是 检测 和 分 析 杂 交 的 结果 。 “Northern” ix 术语 是 一 种 幽默 ， 因 为 最 初 DNA 电泳 和 印迹 技术 被 称 作 “Southern”， 得 名 来 自 于 技术 发 明 人 E. M. Southern 〈Southern，1975) 。 在 前 面 章节 中 已 经 描述 了 RNA 的 提取 、 定 量 和 电 泳 的 方法 。 本 章 着 眼 于 怎样 选择 滤 膜 和 转移 技巧 ， 以 及 在 膜 上 固定 核酸 的 方法 。 后 面 的 章节 ~ 讲述 杂交 和 检测 的 方法 。

12.2 滤 膜 的 选取

用 Northern 分 析 技 术 研 究 RNA 需要 做 出 的 一 个 重要 决定 就 是 选取 一 个 固体 支撑 物 ，

以 便 通过 电泳 分 析 的 RNA 在 杂交 前 转移 过 去 。 这 个 选择 取决 于 对 以 下 问题 的 认 知 : 不 同 的

支撑 物 在 核酸 结合 能 力 、 适 用 的 转移 方案 以 及 固定 方法 上 表现 出 很 大 的 差异 。 还 要 考虑 到 换

针 检 测 的 手段 〈 如 放射 自 显 影 或 化 学 发 光 )， 因 为 有 些 滤 膜 不 适合 用 非 同 位 素 的 检测 手段 。

此 外 ， 固 定 于 滤 膜 上 的 RNA 往往 意味 着 消耗 大 量 体 力 的 努力 工作 。 许 多 研究 者 布 望 用 一 系 。 142 -

#128 Northern 印迹 分 析

列 的 探 针 来 反复 杂交 这 些 RNA。 这 就 要 求 在 检测 之 后 ， 把 杂交 上 的 探 针 稳 底 洗 脱 ， 有 些 核 酸 印迹 膜 比 其 他 种 类 的 膜 更 经 得 起 这 种 洗 脱 。 这 里 给 出 了 处理 核 酸 滤 膜 的 一 般 原 则 ， 关 于 核 酸 滤 膜 合 理 的 详细 处 理 建 议 ， 常 由 滤纸 制造 商 提供 。

市 场 上 可 以 买 到 预先 裁 好 的 与 实验 室 所 用 凝 胶 大 小 相配 的 核酸 印迹 膜 ， 更 常见 的 是 可 以 方便 地 裁 成 各 种 尺寸 的 3m 长 的 滤 膜 卷 。 所 有 的 滤 膜 都 是 以 三 明治 方式 夹 在 两 张 起 保护 作用 的 衬 纸 之 间 。 衬 纸 上 通 常 印 着 生产 厂家 和 滤 膜 的 商品 名 ， 中 间 没 有 任何 标记 的 那 层 是 滤 膜 。 一 定 要 避免 裸 手 碰 触 滤 膜 ， 因 为 手 上 的 油脂 会 妨碍 滤 膜 正常 润 湿 〈 后 面 会 讲 到 )， 降 低 膜 对 核酸 的 结合 能 力 ， 以 及 给 系统 导 和 核糖 核酸 酶 (RNase) 污染 。 应 该 戴 手 套 或 用 无 RNase 的 杀 子 从 角 上 拿 取 滤 膜 。 做 核酸 印迹 的 实验 室 应 该 购置 无 粉 手套 ， 因 为 手套 上 的 粉尘 会 在 杂 交 检 测 时 导致 背景 模糊 。 滤 膜 应 该 储存 在 阴 膏 干燥 的 地 方 ， 避 光 保 存 。 使 用 前 须 避 免 冷 藏 、 冷冻 或 受热 。 恰 当 保 存 的 滤 膜 可 以 稳定 保存 很 多 个 月 。

12.2.1 硝酸 纤维 素 膜

最 早 的 RNA 印迹 技术 ， 使 用 重 氮 茶 氧 甲 基 纤 维 素 (DBM 纤维 素 ) 膜 来 固定 核酸 〈Al- wine 等 ，1977) 。 很 快 就 发 展 成 使 用 分 子 生 物 学 的 经 典 用 膜 一 一 硝酸 纤维 素 膜 。 使 核酸 固定 到 硝酸 纤维 素 膜 的 化 学 基础 是 玻 水 本 性 。 所 需 的 最 严格 的 参数 就 是 需要 高 离子 强度 的 转移 组 冲 液 ， 以 提高 单 链 分 子 (RNA 或 变性 DNA) 的 结合 能 力 。 通 常 印迹 用 的 硝酸 纤维 素 膜 是 0. 45pm 和 孔径， 当然 也 有 用 0. 22um 孔径 的 ， 特 别 是 在 做 分 子 量 较 小 的 核酸 时 。 尽 管 目 前 许 多 实验 室 仍 在 使 用 硝酸 纤维 素 膜 进行 核酸 印迹 分 析 。 但 这 种 膜 的 特性 使 得 人 们 要 求 使 用 别 的 更 合意 的 膜 。

J 硝酸 纤维 素 膜 结合 核酸 的 能 力 相 对 较 低 〈 大 约 80~100pg/cm?) 。

@ 对 低 分 子 量 的 核酸 分 子 〈 比 如 少 于 1000 碱 基 长 度 ) 结合 能 力 非 常 差 ， 大 多 数 PCR 产物 不 能 有 效 印迹 。

QO) 硝酸 纤维 素 膜 有 微弱 的 净 负 电荷 ， 导 致 需 用 较 高 离子 强度 的 转移 缓冲 液 ， 通 常 是 20XSSC 或 20XSSPE 缓冲 液 9。

® 需要 在 真空 炉 里 于 80C 烘 烤 硝酸 纤维 素 膜 固定 核酸 。 烘 烤 时 真空 炉 必 不 可 少 ， 因 为 潮湿 会 干扰 固定 过 程 。

@) 固定 核酸 所 必需 的 烘 烤 过 程 会 使 硝酸 纤维 素 膜 变 脆 。 这 样 后 面 的 膜 操 作 就 需要 极度 小 心 ， 因 而 使 操作 显得 十 分 困难 。

© 烘 烤 后 的 膜 ， 很 不 牢固 ， 也 导致 重复 杂交 不 大 可 能 。

@) 硝酸 纤维 素 膜 在 使 用 非 同位 素 方法 时 背景 过 深 。

这 种 脆弱 的 特性 ， 推 动人 们 发 展 增强 型 的 硝酸 纤维 素 膜 ， 比 如 Optitrans 膜 (Schleicher 和 Schuell，1987)。 这 种 膜 拥有 一 层 高 聚 物 背 衬 ， 同 时 保留 了 硝酸 纤维 素 膜 的 各 种 特性 ， 因 而 它 比 普通 硝酸 纤维 素 膜 结实 很 多 ， 可 以 经 受 得 起 更 剧烈 的 操作 。

12.2.2 Exe J He HR es A TS WR AF AE FRAY LE AS A Por a OM BS Te HE. ELE AC LK BR EI a BRE

@ SSC, saline sodium citrate, #f RAR AYE PEER 7K. 20 SSC: 3mol/L NaCl, 0. 3mol/L tf ee ARGH. pH7.0. SSPE, saline sodium phosphate-EDTA, ®@% &@ #4-EDTA 生理 盐水 。20 X SSPE: 3mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH»PO, - HoO, 0.02mol/L EDTA, pH7. 4.

- 143 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

中 已 经 取代 了 硝酸 纤维 素 膜 。 尼 龙 膜 的 最 突出 优点 ， 也 许 就 是 它 良 好 的 拉 伸 强度 。 这 使 得 膜 操作 更 加 自如 ， 膜 的 重复 杂交 也 得 以 实现 。 有 多 种 商品 名 的 尼龙 膜 在 分 子 生 物 学 实验 室 广泛 使 用 。 它 们 分 为 两 类 : 一 类 是 表面 电荷 中 性 的 尼龙 膜 ， 旧 称 尼 龙 66; 另 一 类 是 因 表 面 氨 基 而 带 有 净 正 电 和 荷 的 膜 。 后 者 也 常 被 称 作 电荷 修饰 膜 ， 写 作 nylon( 十 )。 与 硝酸 纤维 素 膜 一 样 ， 许 多 印迹 用 尼龙 膜 是 0. 45m 孔径 ， 同 时 也 有 0. 22m 孔径 的 。 尼 龙 膜 ， 尤 其 是 nylon (+) 膜 ， 非 常 适 合 使 用 化 学 发 光 技 术 。 与 硝酸 纤维 素 膜 相 比 ， 尼 龙 膜 结合 核酸 的 能 力 有 很 大 提高 ， 有 时 结合 核酸 的 量 高 达 400 一 500ng/cm” ， 这 取决 于 膜 生 产 商 以 及 研究 者 所 用 的 转 移 缓冲 液 组 分 。 尼 龙 膜 对 较 小 的 核酸 分 子 (500bp) 也 有 特别 的 吸附 力 ， 这 样 就 可 以 对 小 分 子 ， 包 括 PCR 产物 做 常规 的 印迹 。 与 硝酸 纤维 素 膜 相 比 ， 尼 龙 膜 所 用 的 转移 缓冲 液 ， 其 离 子 强度 一 般 较 低 ， 经 常 低 至 5XSSC 或 5XSSPE。 尽 管 nylon( 十 ) 所 带 的 正 电 荷 会 增加 目标 RNA 与 膜 的 静电 吸附 ， 在 预 杂 交 和 杂交 时 《〈 如 有 可 能 ) 如 经 充分 封闭 ， 一 般 会 得 到 背景 干 净 的 信号 。 然 而 ， 封 闭 或 预 杂交 处 理 不 好 会 导致 过 高 背景 ， 因 为 带 正 电荷 的 膜 与 具有 负电 荷 磷酸 骨架 的 探 针 间 有 非特 异 吸 附 。

尼龙 膜 的 使 用 使 研究 者 有 更 大 的 操作 自由 。 可 以 使 用 烘 烤 或 紫外 灯 照 射 固定 核酸 。 烘 烤 尼龙 膜 也 不 需要 真空 炉 ， 任 何 一 种 可 以 维持 65 ~ 70°CUA EE 1.0~1. 5h 的 仪器 都 可 以 。 最 棒 的 是 ， 烘 烤 后 的 尼龙 膜 不 会 变 脆 。 在 耐 受 重复 杂交 方面 ， 尼 龙 膜 比 硝酸 纤维 素 膜 好 得 多 。 最 后 ， 据 报道 ， 撕 裂 的 尼龙 膜 可 以 用 高 温 金 属 工 具 ， 如 接种 环 或 电 烙 铁 修 复 (Pitas，1989) 。 在 笔者 实验 室 ， 撕 裂 一 点 的 尼龙 膜 一 般 不 会 增加 背景 ， 将 撕 裂 的 两 边 仔细 对 好 ， 再 用 塑料 纸 包 住 ， 压 出 来 的 X 射线 片上 将 看 不 出 裂纹 。

12.2.3 BROAZ eB

聚 偏 二 氟 乙 烯 膜 (PVDF 膜 ) 是 含 氟 的 有 机 聚合 物 ， 一 直 是 Western 杂交 偏好 使 用 的 膜 。 现 有 报道 ， 这 种 膜 可 用 于 Northern 分 析 和 Southern 分 析 。 以 各 种 商品 名 市 售 的 PVDF 膜 相 当 结 实 ， 化 学 稳定 性 好 。 这 种 膜 平 均 孔 径 0. 45pm。 紫 外 线 照 射 或 烘 烤 “〈 无 需 真空 炉 )， 可 使 核酸 不 可 逆 交 联 到 PVDF FRE. PVDF 膜 也 适用 于 多 种 非 同位 素 方法 。

12.3 膜 的 准备 和 取 用

如 前 所 述 ， 不 管 选 用 哪 种 滤 膜 ， 都 需要 戴 手 套 后 才能 取 滤 膜 。 用 锋利 的 剪刀 或 手术 万 将 膜 裁 成 合适 尺寸 〈 一 般 与 电泳 凝 胶 的 大 小 相对 应 )， 裁 好 后 应 保留 两 面 的 衬 纸 以 便 拿 取 。 剩 下 的 滤 膜 应 该 马上 放 回 储存 处 ， 以 免 意外 溅 脏 或 被 RNase 或 DNase 污染 。 一 般 而 言 ， 滤 腊 需要 在 盛 有 干净 无 菌 水 的 托盘 中 预先 浸 湿 5min， 然 后 再 用 所 选 的 高 盐 转 移 缓冲 液 快 速 平 衡 。 笔者 实验 室 会 备 有 一 些 专用 于 Northern 膜 的 托盘 。 这 些 托盘 只 能 戴 手 套 取 用 ， 并 用 双氧水 洗刷 几 分钟 ， 再 用 灭 菌 水 冲洗 后 才能 使 用 。 正 确 浸 湿 膜 的 方法 ， 是 使 膜 浮 于 水 面 上 《〈 强 烈 推 荐 高 压 灭 菌 水 或 DEPC 处 理 水 )。 可 以 看 到 膜 与 水 面 接触 瞬间 立即 从 白色 变 成 灰色 。 强烈 推 荐 使 用 这 种 方法 ， 因 为 它 可 以 立即 发 现 膜 上 任何 的 机 械 损 伤 ， 或 被 裸露 的 手 碰 到 及 因 不当 保 存 而 损坏 的 区 域 ， 这 些 区 域 会 出 现 模 糊 或 不 均匀 润 湿 现 象 。 用 别 的 方法 浸 湿 膜 改 伯 会 忽略 这 些 区 域 。 当 确认 膜 没 有 问题 后 ， 再 晃动 托盘 ， 使 膜 沉 和 溶液， 并 浸泡 至 少 2min。

滤 膜 浸 湿 后 转移 到 盛 有 转移 缓冲 液 的 托盘 里 快速 平衡 30s 就 足够 了 ， 当 然 在 使 用 前 也 可 以 一 直 浸 泡 在 转移 缓冲 液 内 。 值 得 注意 的 是 浸 湿 的 顺序 远 比 时 间 长 短 更 重要 : 首先 是 水 ， 然

。 144 -

#128 Northern 印迹 分 析

后 才 是 高 盐 的 转移 缓冲 液 。 此 后 ， 就 可 以 直接 用 于 转 膜 。

12.4 Northern $4 p@ 46 A

= Be TEM Ee GE RNA 的 不 同 手段 ， 可 有 多 种 方式 将 电泳 分 离 的 RNA ABE IBC HE 移 到 固体 支撑 物 上 。 应 该 记 住 ， 不 管 选用 哪 种 技术 ， 全 长 的 RNA 必须 在 干净 的 电泳 槽 电 泳 ， 并 使 用 合适 的 凝 胶 以 达到 最 好 的 分 辩 率 。 否 则 所 得 结果 将 不 太 理想 。 这 里 所 述 的 转移 技 术 一 般 同时 适用 于 Northern 分 析 和 Southern 分 析 。

12.4.1 毛细 转 膜 法

所 需 仪 器 最 少 的 方法 是 传统 的 被 动 毛 细 转 膜 法 ， 经 典 的 Southern 分 析 技术 (Southern, 1975) 也 使 用 这 种 方法 。 它 也 是 最 省 钱 而 又 最 费时 的 方法 。 简 单 地 说 就 是 用 一 受 吸 水 材料 ， 如 纸巾 或 印迹 纸 ， 将 池子 里 的 转移 缓冲 液 通过 凝 胶 吸 到 干 的 纸巾 上 。 这 样 ， 随 着 转移 缓冲 液 不 断 穿 过 膜 被 吸 到 纸巾 堆 的 过 程 ，RNA 样品 就 会 从 凝 胶 里 洗 脱 出 来 ， 并 被 杂交 膜 捕 获 。 按 传统 的 做 法 ， 典 型 的 毛细 转 膜 装 置 需要 把 印迹 膜 放 在 凝 胶 上 方 ， 如 图 12. 1 所 示 。 这 种 转 膜 方法 通常 有 两 个 缺点 : 中 转移 效率 差 ， 尤 其 是 大 分 子 ; 四 转移 耗费 太 多 时 间 。 转 移 效率 差 通

常 与 下 列 几 点 有 关 。

S0ug

纸巾 堆

Whatman 4 ee

wh a eee

so

图 12.1 将 RNA 从 变性 琼脂 糖 凝 胶 转 移 到 滤 膜 的 典型 装置 。(a) 侧 视 图 。 将 凝 胶 倒 扣 以 减 少 转 膜 时 间 ， 并 得 到 更 高 的 分 辨 率 。 因 为 RNA 分 子 不 必 一 路 穿 过 整个 凝 胶 才 能 到 达 滤 膜 。 (b) 上 视图 。 把 Parafilm 膜 头 尾 相交 地 搭 在 吸水 的 大 滤纸 上 ， 再 放 凝 胶 〈 不 能 把 Parafilm 膜 放 在 凝 胶 上 )。 先 在 凝 胶 四 周 把 Parafilm 膜 摆 好 ， 然 后 再 铺 上 杂交 膜 和 其 他 东西

© RUE.

@ BER PHAR ME at 1.2%.

@ FEIN RBA SIRE. MIA TE AVE BLE CTL — FAB HE AR EIR EZ HE 染色 的 好 方法 )。

由 转 膜 前 ， 没 有 充分 浸泡 凝 胶 以 除去 甲醛 。

@) 没有 用 紫外 照射 凝 胶 ， 打 断 磷酸 骨架 以 加 速 转移 。

@) 转移 时 间 不 足 。 大 多 数 毛 细 转 膜 法 需要 16h 或 更 多 ， 也 就 是 说 ， 需 要 过 夜 。

。 145 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

ere Zo _ ae Li yh GB002 纸 4 琼脂 糖 凝 胶 有 杂交 膜 tae GB002 纸 ” GB002 纸 GB004 纸 堆 VA ZL mei FF * 预先 用 转移 缓冲 液 湿润

图 12.2 涡轮 印迹 器 转移 法 。 目 的 就 是 翻转 毛细 转 膜 装置 。 由 于 利用 了 重力 因素 ， 高 盐 转移 缓冲 液 快 速 向 下 移动 从 而 加 速 了 转 膜 ， 并 提高 了 转移 效率 。 吸 水 纸 在 底下 而 缓冲

@ RNA 在 开始 转移 时 就 降解 了 了， 这样 的 话 ， 转 膜 再 有 效 也 无 法 得 到 杂交 信和 号 。

@ 上 面 所 列 情况 的 组 合 。

其 他 快速 高 效 的 转移 技术 已 经 出 现 并 得 到 广 泛 应 用 ， 下 面 讲 述 其 中 的 一 些 技术 。

涡轮 印迹 器

涡轮 印迹 器 (TurboBlotter ) (Schleicher &. Schuell, Keene, NH) [In] F #AR ABE CA 12.2) 利用 了 重力 作用 ， 与 日 有 的 向 上 毛细 转 膜 法 相 比 ， 可 以 在 很 短 时 间 内 GRA RE 4h) 实现 高 效 转 膜 。 笔者 实验 室 观察 到 ， 使 用 涡轮 印迹 器 时 ， 绝 大 多 数 核酸 分 子 在 头 1h 内 就 从 凝 胶 中 转移 出 来 。 预 先 裁 好 与 标准 斥 才 凝 胶 相 配 的 滤 膜 和 印迹 纸 。 这 个 方法 也 无 需 在 吸水 材料 上 压 上 重 物 ， 避 免 把 凝 胶 压 实 压 垮 。 这 个 方法 也 无 需 任 何 贵 重 仪器 ， 比 如 下 面 提 到 的 真空 印迹 装置 或 电 转 移 仪 器 。 装 起 来

12. 4. 2

液 在 项 上 ， 基 本 上 是 图 12. 1 显示 的 倒 过 来 放置 的 经 典 毛 细 转 膜 装 置 。 经 Schlercher 和 Schuell 惠 许

真空 印迹 系统 使 用 负 压 加 速 转 移 过 程 ， 也 被 称 为 真空 协助 的 毛细 转移 法 ， 实 际 上 在 此 过 程 中 ， 核 酸 样品 与 转移 缓冲 液 一 道 从 凝 胶 中 被 吸出 来 。 因 厂家 不 同 ， 也 有 若干 种 真空 印迹 仪 器 可 供 选 择 。 真 空 印 迹 的 优点 是 ， 其 转 膜 的 时 间 (30~60min) 比 传统 毛细 转 膜 快 很 多 Ct 夜 )。 人 快速 转 膜 过 程 在 一 定 程度 上 减少 了 核酸 分 子 在 印迹 过 程 中 的 弥散 ， 减 少 了 原本 在 凝 胶 上 很 清晰 的 条 带 的 扩散 。 然 而 ， 人 们 必须 非常 小 心 ， 不 要 对 凝 胶 加 太 大 的 压力 [30 一 50mbar (lbar=10°Pa) 真空 度 比 较 合 适 ]， 因 为 凝 胶 破 裂 后 这 个 实验 就 全 毁 了 。 真 空 印迹 可 以 用 于 将 核酸 从 天 脂 糖 凝 胶 内 快速 转移 (Medveczky 等 ，1987; Olszewska 和 Jones, 1988); 也 可 以 用 于 将 蛋白 质 从 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 内 转移 ， 但 电 转 印迹 法 (下 面 将 讨论 ) 会 有 更 好 的 效果 。

12.4.4 正 压 转 膜 法

与 真空 印迹 相反 ， 正 压 转 膜 是 将 核酸 分 子 从 凝 胶 里 推出 来 。PosiBlot 装置 〈Stratagene， La Jolla, CA) 利用 正 压 力 驱 动 缓冲 液 流 过 凝 胶 ， 从 而 在 极 短 时 间 内 〈 可 短 至 15min) 将 去 味 叭 化 的 RNA 或 DNA 转移 到 膜 上 ， 这 比 传统 毛细 转 膜 法 快 很 多 。 与 真空 印迹 一 样 ， 加 快 了 的 转 腊 过程 ， 减 少 了 核酸 分 子 的 扩散 ， 电 泳 条 带 保持 清晰 。 正 压 转 膜 大 大 减轻 了 族 胶 破裂 造成 的 问题 ， 而 这 在 真空 印迹 时 ， 时 有 发 生 。

12.4.5 电 转 印迹 法

电 转 印迹 是 另 一 种 完全 不 同 的 转移 方法 。 电 转 印 迹 广泛 用 于 从 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 中 转移 重 白质 。 从 琼脂 糖 凝 胶 中 转移 核酸 时 ， 这 种 方法 用 得 较 少 。 电 泳 转 移 是 此 类 技术 的 一 种 形式 ， 。 146 ，

也 极其 简单 ， 笔 者 实验 室 的 最 快 记 录 是 58s。 12.4.3 ”真空 印迹 法

#128 Northern 印迹 分 析

它 是 将 凝 胶 和 膜 贴 在 一 起 放 人 特制 的 盒子 里 ， 然 后 再 装 和 人 盛 有 电泳 缓冲 液 的 容器 中 ， 即 所 谓 亿 式 电 转 装置 。 对 凝 胶 施 加 一 个 与 初始 电泳 方向 垂直 的 电压 ， 样 品 就 从 凝 胶 里 迁移 出 来 并 结 合 到 滤 膜 上 。 它 其 实 就 是 标准 Western 印迹 所 用 的 转 膜 方法 。 半 干 式 电 转 法 是 此 种 技术 的 另 一 形式 ， 只 需要 很 少 的 缓冲 液 来 饱和 滤 膜 和 印迹 膜 ， 让 凝 胶 和 仪器 直接 接触 。 它 的 优势 在 于 转移 只 需 低 电压 和 低 电流 ， 摆 脱 了 对 高 电流 电源 的 依赖 。 有 很 多 种 商业 化 的 电 转 装置 可 供 选择 〈 例 如 Amersham Biosciences 公司 提供 的 Hoefer 产品 系列 ) 。 电 转 印 迹 的 速度 直接 跟 电流 大 小 相关 。 研 究 者 应 遵照 厂商 说 明 书 操作 ， 使 用 电源 或 其 他 高 电压 的 仪器 时 应 当 非 常 小 心 。 尼龙 膜 或 硝酸 纤维 素 膜 都 可 以 用 于 电 转 印迹 ;研究 者 须 听 取 厂 商 的 推荐 。 电 转 时 会 产生 相当 多 的 热量 ， 很 多 操作 手册 都 强烈 建议 在 电泳 前 冷却 电泳 缓冲 液 ， 并 在 电泳 时 控制 温度 。 Arnheim 与 Southern (1977) 以 及 Bittner 与 他 的 同事 (1980) 对 此 有 过 总 结 。

12.4.6 碱 印迹 法

核酸 的 碱 印迹 法 本 质 上 是 毛细 转移 法 的 一 个 分 支 。 与 毛细 转移 法 相 比 ， 两 者 之 间 的 主要 区 别 是 核酸 变性 的 方法 有 差异 。 传 统 的 毛细 印迹 操作 使 用 高 盐 缓 冲 液 L155 ~~ 20) X SSC 或 SSPE] 把 RNA 或 预先 碱 变性 的 DNA 从 凝 胶 中 转移 到 膜 上 〈 多 数 情况 下 推荐 正 电 荷 修饰 的 尼龙 膜 ) 。 碱 法 印迹 DNA 时 ， 变 性 和 转移 是 在 0. 4mol/L NaOH 条 件 下 同时 进行 的 ， 随 后 将 其 固定 到 尼龙 膜 上 。 而 做 Northern 转移 时 ， 有 限度 的 碱 裂解 可 促进 RNA 从 凝 胶 中 转 到 固 体 支 持 物 上 ， 但 是 必须 非常 小 心 以 免 RNA 完全 降解 。 有 些 膜 经 碱 法 转移 后 ， 无 需 固 定 步 又 ， 这 要 看 所 用 的 具体 参数 。 而 且 考 虑 到 核酸 探 针 与 RNA 的 非特 异性 结合 ， 用 碱 法 转移 时 转移 缓冲 液 的 具体 成 分 和 转移 时 间 对 信 品 比 影响 极 大 。 更 详细 的 内 容 可 参考 Reed 与 Mann (1985), Li“ (1987) 以 及 Low 与 Rausch (1994),

12. 4.7 ”实验 方案 : 用 被 动 毛细 扩散 法 转移 RNA

注意 ”需要 时 参见 图 12. 1 。

@ 整个 过 程 中 均 需 戴 手 套 。 应 极力 避免 任何 核酸 酶 的 污染 。 应 当 牢 记 了 RNA 分 子 处 于 核 酸 酶 降解 的 威胁 之 中 ， 除 非 它们 已 经 通过 烘 烤 或 交 联 固定 到 滤 膜 〈 比 如 尼龙 膜 ) 上 以 后 。

@ Al EtBr 染色 的 或 含有 甲醛 的 凝 胶 ， 应 当 在 无 菌 水 或 缓冲 液 内 浸泡 2 一 3 次 后 ， 才 能 进行 转 膜 。 这 步 做 不 好 会 导致 转移 效率 极 差 、 样 品 丢失 并 妨害 杂交 的 效率 。

注意 ”将 凝 胶 从 一 种 溶液 转移 到 另 一 种 溶液 时 ， 用 宽 铲 最 方便 。 含 甲醛 的 凝 胶 特别 滑 ， 须 小 心 操作 。

@a. 甲醛 凝 胶 : 把 凝 胶 浸 泡 于 过 量 的 5XSSC 或 无 菌 水 里 ， 以 除去 甲醛 。 没 染色 的 凝 胶 浸泡 3 次 ， 每 次 10min 即 可 脱 去 甲醛 。 若 凝 胶 内 有 省 化 乙 锭 ， 溴 化 乙 锭 也 会 同时 被 洗 出 来 。 甲醛 凝 胶 中 为 拍照 而 染色 的 省 化 乙 锭 会 给 杂交 结果 带 来 高 的 荧光 背景 ， 需 要 通过 浸泡 除去 。 彻底 脱色 需要 两 个 多 小 时 甚至 更 多 ， 但 这 不 是 必需 的 。 在 笔者 实验 室 ， 有 时 将 甲醛 凝 胶 放 在 过 量 的 缓冲 液 内 4C 过 夜 脱色 。 用 SYBR 绿 或 SYBR 金 染 色 的 凝 胶 无 需 脱 色 。 当 然 ， 把 凝 胶 浸泡 在 水 中 或 5XSSC 中 可 以 加 快 甲 醛 的 去 除 。

可 选 ， 但 不 推荐 : 把 凝 胶 在 50mmol/L NaOH, 10mmol/L NaCl 中 浸泡 10min， 然 后 在 100mmol/L Tris(pH7.5) 中 浸泡 30min， 最 后 在 10XSSC 中 浸泡 30min。 这 样 会 造成 RNA 骨架 部 分 碱 裂 解 ， 可 以 帮助 大 的 RNA 分 子 从 凝 胶 内 转 出 ， 但 通常 却 不 是 必需 的 。 而 且 ， RNA 在 NaOH 溶液 中 存放 太 久 就 无 法 与 任何 探 针 杂交 了 。 随 机 打 断 RNA 骨架 可 以 提高 转

。 147 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

移 效 率 ， 这 可 以 用 紫外 线 透 射 仪 ， 或 者 更 简单 一 点 ， 用 定量 的 紫外 线 光 源 照 射 凝 胶 来 实现 。

@Qb. 乙 二 醛 凝 胶 : 染色 “〈 需 要 的 话 脱色 ) 照相 后 可 立即 转移 。 因 为 转移 后 的 预 杂 交 洗 涤 过 程 可 以 去 除 乙 二 醛 。

@) 修 去 凝 胶 的 左边 、 右 边 (上 下 不 动 )， 目 标 泳 道 两 边 各 留 约 lcm 宽 。

® 按照 凝 胶 的 大 小 裁 一 片 滤 膜 。 决 不 能 用 裸露 的 手 拿 膜 。 多 数 滤 膜 沾 到 手指 上 的 油脂 后 ， 其 结合 核酸 的 能 力 会 下 降 。 为 了 前 取 与 凝 胶 同 大 小 的 滤 膜 ， 可 以 将 一 个 干 的 、 王 净 的 制 胶 板 直接 放 在 滤 膜 的 衬 纸 上 ， 用 铅笔 描 出 制 胶 板 的 轮廓 。 制 胶 板 可 以 当 作 模子 ， 这 样 不 用 尺 子 ， 所 有 的 材料 GEAR. Whatman 滤纸 以 及 吸水 纸巾 ) 都 可 以 照 它 的 样子 裁 得 与 凝 胶 相 同 的 尺寸 。 在 凝 胶 脱色 或 浸泡 在 缓冲 液 里 的 时 候 可 以 做 这 件 事 。 经 费 宽 余 的 实验 室 可 以 购买 各 种 尺寸 的 合适 的 印迹 材料 。

@ 依照 广 商 说 明 书 准备 好 滤 膜 。 通 常 让 尼龙 膜 或 硝酸 纤维 素 膜 先 漂浮 在 无 RNase 的 水 中 ， 然 后 沉 和 水 中 至 少 2min。 旧 的 或 脏 的 滤 膜 不 能 均匀 润 湿 ， 漂 在 水 面 上 时 呈现 不 规则 的 水 痕 。 这 种 滤 膜 应 扔 掉 。

© YR 2min 后 ， 放 和 人 转移 缓冲 液 〈 尼 龙 膜 用 5XSSC 或 5XSSPE) 平衡 30s 或 更 长 时 间 。 滤 膜 可 以 放 在 转移 缓冲 液 中 直到 使 用 。

@ 剪 一 张 Whatman 3mm 滤纸 〈 或 类 似 滤 纸 )， 滤 纸 比 凝 胶 宽 约 2cm， 长 约 15cm。 此 即 滤纸 桥 。 它 是 凝 胶 与 缓冲 液 池 之 间 的 中 介 。 若 滤纸 桥 太 长 以 后 还 能 修 短 。

将 滤纸 桥 在 转移 缓冲 液 里 浸 10s， 在 一 个 大 烘 烤 严 〈 或 类 似 器 具 ) 中 放 一 块 厚 有 机 玻 璃 ， 然 后 把 滤纸 桥 搭 在 有 机 玻璃 上 。

© 往 大 烘 烤 严 注 入 足 量 转移 缓冲 液 ， 让 滤纸 桥 两 端 都 有 至 少 3 一 4cm 浸 人 缓冲 液 里 。

@ 滤纸 桥 下 面 的 气泡 ， 可 以 用 无 菌 移 液 管 轻 轻 赶 出 去 。 有 气泡 的 地 方 转移 效率 较 差 。

@ 把 凝 胶 点 样 孔 朝 下 置 于 滤纸 桥 的 中 间 ， 赶 走 凝 胶 与 滤纸 间 的 所 有 气泡 。 用 Parafilm 膜 盖 住 凝 胶 四 周 的 区 域 ， 以 免 转移 过 程 中 系统 发 生 短路 @。

@ 四 把 滤 膜 仔细 铺 在 凝 胶 上 并 赶 走 膜 下 所 有 气泡 。

@ BY 2 一 3 张 与 凝 胶 同 大 的 Whatman 3mm 滤纸 〈 或 类 似 的 纸 ) 。 将 至 少 一 张 滤纸 用 转 移 缓冲 液 浸 透 。

ZB 临 用 前 ， 浸 湿 至 少 其 中 一 张 滤纸 。 将 挨 着 凝 胶 的 那 片 滤纸 预先 浸 湿 会 有 效 地 推动 毛细 效应 。-

@ 把 浸 湿 的 Whatman 3mm 滤纸 铺 在 杂交 膜 上 并 赶 走 气泡 。 上 面 再 铺 干 的 滤纸 。

© 裁 一 又 与 凝 胶 尺 寸 相同 的 吸水 纸 〈 压 实 了 约 5 一 6cm iB), KYW SER. HS 吸水 纸 探 在 Whatman 3mm 滤纸 上 。 最 后 用 一 个 500g 的 重 物 或 课本 放 在 上 头 压 实 整 个 装置 。

注意 ”不 要 用 有 折 痕 的 〈 如 卷 成 C 形 ) 的 吸水 纸 ， 折 痕 所 对 应 的 凝 胶 区 域 ， 转 移 肯 定 不 充分 。 要 是 别 无 选择 ， 可 以 将 吸水 纸 重新 摆 放 ， 不 让 折 痕 排 齐 对 着 凝 胶 的 任何 地 方 。 必 须要 求 毛 细作 用 均匀 。 使 用 预 先 裁 切 的 印迹 纸 ， 如 GB002 和 GB004 (Schleicher & Schuell) 可 以 替代 吸水 纸 。

@ 转移 数 小 时 ， 可 能 的 话 转移 过 夜 。

@@ 转 膜 结束 时 ， 移 去 上 面 的 滤纸 和 吸水 纸 。 然 后 用 杀 子 或 戴 手 套 的 手 从 凝 胶 上 小 心 揭 下 滤 膜 。 剪 去 一 角 使 之 不 对 称 并 记录 方向 ， 这 对 准确 解释 杂交 数据 是 必需 的 。

@ 有 时 向 上 吸水 的 纸巾 混 了 之 后 会 搭 到 凝 胶 下 面 ， 当 滤纸 比 凝 胶 略 大 的 时 候 更 可 能 发 生 。 倘 若 上 面 的 吸水 纸 挨 到 凝 胶 周围 的 滤纸 桥 ， 它 们 就 从 凝 胶 的 四 周 而 不 是 通过 凝 胶 吸 缓冲 液 。 通 过 凝 胶 的 转移 缓冲 液 变 少 ， 转 移 速 度 下 降 。 为 避免 因此 带 来 的 困难 ， 有 些 人 切 掉 点 样 孔 ， 这 是 不 必要 的 。 沿 着 凝 胶 四 周 盖 上 封口 膜 ， 可 以 避免 纸巾 与 滤纸 桥 的 直接 接触 。

。 148 -

$128 Northern 印迹 分 析

四 按 厂 家 的 建议 冲洗 转 膜 后 的 滤 膜 。 一 般 是 用 没 用 过 的 转移 缓冲 液 〈 比 如 5XSSC 或 5X SSPE) YEHK 30s.

注意 ” 转 膜 后 的 简单 冲洗 可 以 去 除 膜 上 可 能 沾 有 的 残留 凝 胶 或 其 他 物品 的 碎片 ， 这 些 碎 片 可 能 会 影 响 样 品 的 固定 条 交 的 特异 性 ， 或 增加 背景 。

CD 尼龙 膜 应 该 在 湿润 时 照 紫 外 线 ， 但 也 不 能 透 湿 ;硝酸 纤维 素 膜 应 该 在 空气 中 陈 干 ， 然后 尽快 烘 烤 。

12.4.8 实验 方案 : 用 涡轮 印迹 器 向 下 转移 RNA

注意 ， 参见 图 12. 2。

DO 整个 过 程 中 操作 者 必须 戴 手 套 。 应 极力 避免 任何 核酸 酶 的 污染 。 应 当 牢 记 RNA 分 子 在 通过 烘 烤 或 交 联 固定 到 滤 膜 〈 硝 酸 纤维 素 膜 、 尼 龙 膜 等 ) 前 ， 它 都 处 于 核酸 酶 降解 的 威胁 中

@ 用 省 化 乙 锭 染色 或 含有 甲醛 的 凝 胶 ， 应 当 在 无 菌 水 或 缓冲 液 内 浸泡 2 一 3 Ka, AE 进行 转 膜 。 这 步 操 作 不 好 ， 会 导致 转移 效率 极 差 、 样 品 丢 失 并 妨害 杂交 的 效率 。

注意 宽 铲 最 适合 于 将 凝 胶 从 一 种 溶液 转移 到 另 一 种 溶液 。 含 甲醛 的 凝 胶 特别 滑 ， 须 小 心 操作 。

Qa. 甲醛 凝 胶 : 把 凝 胶 浸 泡 于 过 量 的 5XSSC 或 无 菌 水 里 以 除去 甲醛 。 没 染色 的 凝 胶 浸 泡 3 次 ;每 次 10min 可 脱 去 甲醛 。 者 凝 胶 内 有 省 化 乙 锭 也 同时 会 被 洗 去 。 甲 醛 凝 胶 中 为 拍照 而 染色 的 溴 化 乙 锭 会 带 来 高 的 荧光 背景 ， 需 要 通过 浸泡 除去 。 彻 底 脱 色 需 要 两 个 多 小 时 甚至 更 多 ， 但 这 不 是 必需 的 。 在 笔者 实验 室 ， 有 时 将 甲醛 凝 胶 放 在 过 量 的 缓冲 液 内 4C 过 夜 以 脱 色 。 用 SYBR 绿 或 SYBR 金 染 色 的 凝 胶 无 需 脱 色 ， 虽 然 把 凝 胶 浸 泡 在 水 中 或 5XSSC 中 可 以 有 利于 甲醛 的 去 除 。

可 选 ， 但 不 推荐 : 把 凝 胶 在 50mmol/L NaOH, 10mmol/L NaCl 中 浸泡 10min， 然 后 在 100mmol/L Tris (pH7.5) 中 浸泡 30min， 最 后 在 10 X SSC 中 浸泡 30min。 这 样 会 造成 RNA 骨架 部 分 碱 裂 解 。 这 样 可 以 帮助 大 的 RNA 分 子 从 凝 胶 内 出 来 ， 但 通常 却 不 是 必需 的 。 而 且 ，RNA 在 NaOH 溶液 中 放 太 和 久 ， 就 无 法 与 任何 探 针 杂 交 。 随 机 打 断 RNA 骨架 以 提高 转 移 效率 ， 这 可 以 用 紫外 线 透 射 仪 ， 或 者 更 简单 一 点 ， 用 定量 的 紫外 线 光 源 照射 凝 胶 来 实现 。

@Qb. 乙 二 醛 凝 胶 : Re GRANDE) 照相 后 可 立即 转 膜 。 乙 二 醛 将 在 转 膜 后 的 预

@ 尽 可 能 选用 与 电泳 凝 胶 同 样 太 二 的 预 裁 的 印迹 膜 。 如 果 凝 胶 稍 大 ， 可 以 在 安装 涡轮 印迹 器 时 修 去 多 余 的 凝 胶 。 倘 若 凝 胶 比 印迹 纸 小 ， 空 出 来 的 印迹 纸 要 在 随后 的 步骤 中 用 封口 膜 遮 住 。

由 按照 凝 胶 的 大 小 裁 一 片 滤 膜 。 决 不 能 用 裸露 的 手 抓 膜 。 多 数 滤 膜 沾 到 手指 上 的 油脂 后 ， 其 结合 核酸 的 能 力 会 下 降 。 为 了 前 取 与 凝 胶 同 大 小 的 滤 膜 ， 可 以 将 一 个 干 的 、 于 净 的 制 胶 板 直接 放 在 滤 膜 的 衬 纸 上 ， 用 铅笔 描 出 制 胶 板 的 轮廓 。 制 胶 板 可 以 当 作 模子 ， 这 样 不 用 尺 子 ， 所 有 的 材料 〈 滤 膜 、Whatman 滤纸 以 及 吸水 纸巾 ) 都 可 以 照 它 的 样子 裁 切 。 在 凝 胶 脱 色 或 浸泡 在 缓冲 液 里 的 时 候 可 以 做 这 件 事 。 经 费 宽 余 的 实验 室 可 以 购买 各 种 预 裁 的 尺寸 合适 的 印迹 材料 。

© 依照 广 商 的 说 明 书 准备 好 滤 膜 。 通 常 把 尼龙 膜 〈 或 硝酸 纤维 素 膜 ) 先 漂浮 在 无 RNase 的 水 中 ， 然 后 沉 和 水 中 至 少 2min。 旧 的 或 /和 脏 的 滤 膜 不 能 均匀 润 湿 ， 漂 在 水 面 上 时

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ee

alia linia

军 现 不 规则 的 水 痕 。 这 种 滤 膜 应 扔 掉 。

© WAM ED 2min 后 ， 放 人 转移 缓冲 液 〈 尼 龙 膜 用 5XSSC Bt 5 X SSPE) 平衡 30s 或 更 长 时 间 。 滤 膜 可 以 放 在 转移 缓冲 液 中 直到 使 用 。

© 将 转移 装置 的 底层 托盘 放 在 实验 台 上 ， 一 定 要 摆 水 平 。

在 托盘 里 摆 放 20 JB FAY GB004 EWA.

© 在 GB004 印迹 纸 上 再 铺 4 层 干 的 GB002 印迹 纸 。

@ 拿 一 张 GB002 印迹 纸 ， 用 转移 缓冲 液 浸 湿 后 ， 铺 在 前 述 的 纸 堆 上 。 用 一 根 无 菌 的 5ml 移 液 管 将 它 轻 轻 展 平 ， 赶 走 下 面 所 有 气泡 。 不 能 太 用 力 。

@ 将 平衡 好 的 杂交 膜 铺 在 上 面 。

四 仔细 地 把 琼脂 糖 凝 胶 放 在 杂交 膜 上 面 ， 切 去 所 有 超出 膜 面 积 的 凝 胶 和 没 用 过 的 泳 道 的 凝 胶 。 一 旦 凝 胶 和 杂交 膜 接 触 后 就 不 要 再 移动 凝 胶 。 如 果 凝 胶 小 于 杂交 膜 ， 则 杂交 膜 露出 的 部 分 要 用 Parafilm 膜 封 住 凝 胶 四 周 的 区 域 ， 以 免 转移 过 程 中 发 生 短路 。

四 用 一 根 灭 菌 的 5ml 移 液 管 轻 轻 推 平 凝 胶 ， 确 保 凝 胶 与 杂交 膜 之 间 没 有 气泡 。

) 用 转移 缓冲 液 浸 湿 3 张 GB002 印迹 纸 ， 小 心地 将 它们 铺 在 项 上 。

® 用 一 根 灭 菌 的 5ml 移 液 管 赶 走 气泡 。

© 把 转移 装置 的 缓冲 液 托 盘 安 放 在 底层 托盘 上 ， 以 环形 的 对 齐 按钮 确保 摆 放 正确 。

QD 往 上 面 缓冲 液 托盘 注入 转移 缓冲 液 。 别 溅 到 两 层 托 盘 间 的 印迹 纸 和 族 胶 上 。

@ 用 转移 缓冲 液 浸 湿 滤纸 桥 。 用 它 连 通 缓冲 液 托盘 和 凝 胶 所 在 的 纸 堆 启动 转 腊 : FE UE LAFF bs BS AR HE a Hh 5c a FE EAL. PA ig OP IN Pt A RE

@ Am Tee EAC CURA WIE) 或 用 Parafilm 膜 封 住 。 强 烈 建议 这 样 做 ， 以 避免 蒸发 以 及 盐 的 析出 。

OO 继续 转 膜 ， 直 至 转移 缓冲 液 全 部 被 吸 干 ， 这 一 般 需要 3 一 4h。 据 测定 ， 常 规 印 迹 时 ， 绝 大 部 分 样品 在 转 膜 的 第 一 个 小 时 就 已 经 从 凝 胶 内 转 出 “〈 数 据 未 显示 ) 。

Q@ 转 膜 结束 后 ， 移 去 并 扔 掉 凝 胶 上 面 吸 饱 水 的 滤纸 桥 和 印迹 纸 。 随 后 小 心地 用 狠 子 或 戴 手 套 的 手 把 杂 交 膜 从 凝 胶 上 揭 下 来 。 剪 去 一 角 使 之 不 对 称 并 记录 方向 ， 这 对 准确 解释 杂交 数据 是 必需 的 。

2 按 厂 家 的 建议 冲洗 转 膜 后 的 滤 膜 。 一 般 用 新 鲜 的 转移 缓冲 液 (比如 5XSSC BE 5X. SSPE) 洗 膜 30s。

注意 ” 转 膜 后 的 简单 冲洗 可 以 去 除 膜 上 可 能 沾 有 的 残 凝 胶 或 其 他 物品 的 碎片 ， 这 些 碎 片 可 能 会 影响 样品 的 固定 和 杂交 的 特异 性 ， 或 增加 背景 。

@ 尼龙 膜 应 该 在 湿润 时 照 紫外 线 ， 但 也 不 能 透 湿 ;硝酸 纤维 素 膜 应 该 在 空气 申 虹 和 干 ， 然后 尽快 烘 烤 。

12.5 转 腊 后 膜 的 处 理

12. 5.1 ARERR

滤 腊 在 杂交 前 可 以 放心 保存 一 段 时 间 ， 但 还 是 有 必要 尽 可 能 快 地 将 转 膜 后 的 膜 上 样品 国 定 在 膜 上 上。 固定 之 后 的 RNA 样品 才 稳定 了 ， 再 不 tH RNase 的 降解 。 固定 后 ， 波 膜 可 以 马上 用 于 杂交 也 可 以 存储 数 月 。 滤 膜 晾 王后 ， 夹 在 Whatman 3mm 滤纸 间 ， 放 置 在 干燥 避 光 处 备

* 150 -

#128 Northern 印迹 分 析

用 。 在 准备 印迹 而 进行 脱色 的 过 程 中 ， 肇 胶 内 的 甲醛 可 能 已 经 去 除 于 净 了 。 12.$.2” 乙 二 醛 变性 系统

在 电泳 前 用 于 变性 RNA 的 乙 二 醛 ， 此 时 必须 从 杂交 膜 上 除去 。

选项 1: 滤 膜 晾 干 后 按 厂 家 的 说 明 书 烘 烤 ， 这 样 可 以 在 破坏 部 分 乙 二 醛 的 同时 固定 RNA。 要 去 除 残 留 的 乙 二 醛 ， 可 以 将 膜 浸泡 于 200ml 预 热 到 90°C 的 20mmol/L Tris (pH8.0) 中 ， 然 后 快速 冷却 到 室温 。

选项 2: 固定 之 后 ， 用 65 的 20mmol/L Tris(pH8. 0) YE 15min， 可 以 将 RNA 中 的 乙 二 醛 去 掉 。

12.6 @ z 4 #

FS Jae AR EAE RNA 或 DNA 充分 固定 ， 这 与 保证 转移 完全 是 同等 重要 的 。 研 究 者 必须 认识 到 ， 核 酸 分 子 尤其 是 RNA 分 子 ， 在 固定 到 基质 上 之 前 是 不 安全 的 ， 它 会 受到 核酸 酶 或 自然 生物 降解 的 威胁 。 样 品 不 能 充分 固定 就 不 可 避免 地 在 预 杂交 、 和 杂交 、 杂 交 后 洗涤 或 检测 过 程 中 丢失 。 报 道 过 的 核酸 固定 方法 有 不 少 ， 它 们 各 有 各 的 优 缺 点 和 适用 范围 。 笔 者 实 验 室 几乎 只 用 尼龙 膜 ， 因 为 它 有 极 大 的 灵活 性 。 任 何 情况 下 ， 对 具体 的 膜 ， 遵 从 厂家 的 推荐 总 是 很 明智 的 。 这 里 只 给 出 一 些 总 的 原则 。

12.6.1 烘 烤

经 典 的 核酸 固定 技术 须 使 用 真空 炉 烘 烤 ， 以 使 样品 结合 到 硝酸 纤维 素 膜 上 。 核 酸 与 基质 相互 作用 的 真正 原理 还 不 清楚 ， 人 们 认为 应 该 是 下 水 作用 。 这 种 方法 尽管 有 很 多 缺点 却 沿用 至 今 。 硝 酸 纤维 素 膜 经 转 膜 洗 桨 后 彻底 防 王 ， 然 后 在 抽 真 空 的 条 件 下 于 80°C HERG 2h。 操 作 硝酸 纤维 素 膜 时 ， 真 空 炉 是 必 不 可 少 的 ， 因 为 水 汽 会 干扰 固定 过 程 。 烘 烤 肯定 可 以 固定 核 酸 ， 但 这 种 固定 却 不 是 完全 不 可 道 的 过 程 ， 在 几 次 反复 杂交 之 后 ， 部 分 样品 会 从 膜 的 表面 脱 落 ， 导 致 所 有 随后 的 检测 定量 不 准 。

用 尼龙 膜 时 ， 可 以 通过 烘 烤 或 紫外 照射 固定 核酸 样品 。 烘 烤 过 程 需要 1 一 1. 5h， 而 温度 只 需 达 到 65C 。 尽 管 使 用 真空 炉 可 以 加 快 干 燥 过 程 ， 并 能 提高 核酸 在 膜 上 的 结合 ， 烘 烤 尼 龙 膜 无 需 真空 纺 。 有 些 实验 方案 认为 潮湿 的 尼龙 膜 即 可 直接 烘 烤 。

12.6.2 紫外 线 照 射 交 联

更 可 靠 的 固定 方法 是 使 用 定量 的 紫外 线 光 源 有 效 地 把 核酸 9 交 联 到 尼龙 膜 上 〈Church 和 Cilbert，1984， 开 handjian，1987) 。 应 当 避 免 对 硝酸 纤维 素 膜 进行 紫外 线 交 联 ， 因 为 这 种 膜 通过 紫外 线 照射 交 联 固定 的 核酸 ， 跟 尼龙 膜 没 法 比 。 更 重要 的 是 ， 这 种 膜 过 度 照 射 后 起 火 的 危险 性 很 大 。 千 万 别 这 人 么 做 。

自从 Church 和 Gilbert (1984) 将 此 方法 用 于 基因 组 测序 以 来 ， 紫 外 照射 固定 核酸 于 腊 上 的 方法 一 直 用 得 很 好 。 短 波长 或 中 波长 的 紫外 线 〈 分 别 是 254nm 和 302nm) 可 以 激发 胸

@ 除了 交 联 的 功能 ， 紫 外 照射 琼脂 糖 凝 胶 是 随机 打 断 RNA 和 DNA 磷酸 二 酯 键 骨 架 的 一 种 替代 方案 。 它 可 取代 稀 NaOH 溶液 浸泡 凝 胶 ， 以 部 分 裂解 核酸 ， 而 且 重复 性 更 好 。 核 酸 上 的 随机 切口 可 以 促进 核酸 从 凝 胶 到 膜 的 印迹 。

- 151 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

ARE OE ALR ME OE CELA REA IE) 到 高 反应 活性 状态 ， 并 与 尼龙 膜 表 面 氨 基 形 成 共 价 键 。 多 种 尼龙 基质 都 有 表面 氨基 (Saito 等 ，1981) 。 用 湿 的 尼龙 膜 进行 此 外 交 联 效率 更 高 ， 一 般 总 能 量 仅 需 120000wJ/cm2 ， 作 为 对 比 ， 了 晾 干 的 膜 需要 将 近 160000 p.J /cm? 能 量 。

与 烘 烤 相 比 ， 这 种 方法 固定 于 基质 上 的 核酸 更 稳定 ， 这 也 是 一 个 重要 的 好 处 。 许 多 实验 室 报道 说 ， 紫 外 交 联 比 烘 烤 更 灵敏 。 而 且 交 联 看 起 来 比 烘 烤 固定 得 更 持久 。 对 于 打算 对 同一 张 膜 反 复杂 交 的 研究 者 而 言 这 一 点 尤为 重要 。 反 复 、 严 格 洗 脱 杂 交 膜 上 的 探 针 往往 导致 目标 分 子 从 烘 烤 固定 的 膜 上 掉 下 来 。

为 实现 核酸 的 固定 已 经 发 展 出 很 多 方法 。 最 简单 明了 的 方法 当然 是 定量 紫外 线 光 源 〈 比 如 Stratalinker，Stratagene，La Jolla，CA)。 这 种 仪器 有 自动 交 联 功能 ， 预 设 了 120000pJ/ em? 的 能 量 输出 。 这 对 于 湿润 的 膜 正 合适 。 当 然 也 能 够 输出 任何 想 要 的 能 量 。 倘 若 没有 定量 紫外 线 光 源 ， 一 个 标准 实验 用 的 紫外 线 透射 仪 也 可 以 ， 不 过 因为 缺乏 校正 设备 ， 慌 怕 需要 多 次 试验 并 有 错误 。 大 多 数 分子 生 物 学 实验 室 用 的 紫外 线 透 射 仪 的 波长 不 是 302nm 〈 中 波长 ) 就 是 254nm 〈 短 波长)。 相 对 于 254nm 的 紫外 灯 ， 强 烈 推荐 用 302nm 紫外 灯 进 行 交 联 实验 。 短波 长 过 量 照射 后 ， 导 致 印迹 的 核酸 损失 很 多 ， 所 以 会 降低 灵 人 敏 度 。 湿 润 的 膜 可 以 直接 摆 在 紫外 线 透 射 仪表 面 进行 照射 。

12.6.3 实验 方案 : 将 RNA 紫外 交 联 于 尼龙 膜 上

© Northern 转 膜 后 ， 按 以 前 所 述 的 方法 冲洗 滤 膜 ， 将 已 带 有 RNA 的 滤 膜 放 在 1~2 层 Whatman 滤纸 上 吸 干 过 多 的 液体 。 不 要 让 膜 完 全 干燥 ， 最 好 在 滤 膜 还 有 些 湿润 的 时 候 进 行 紫外 照射 。

G@) 将 紫外 线 透射 仪表 面 氛 干 净 ， 将 滤 膜 的 正面 (有 样品 的 一 面 ) 朝 下 放 在 透射 仪表 面 。

当心 千 万 适当 保护 好 眼睛 ， 倘 著 没 有 正确 防护 ， 眼 睛 和 皮肤 会 受到 严重 的 永 失 性 损伤 。

@) 合适 的 曝光 时 间 与 波长 及 仪器 的 使 用 年 限 有 关 。 发 射 302nm 的 仪器 ， 通 常 曝 光 lmin 已 足够 。 而 254nm 的 仪器 ， 不 到 lmin 交 联 就 完成 了 。

注意 工 这 些 只 是 大 体 原则 。 每 个 仪器 的 具体 参数 要 靠 实验 摸索

注意 2 笔者 实验 室 是 先 照射 估算 时 间 的 一 半 ， 将 膜 旋转 90" 后 ， 再 照射 剩 下 的 时 间 “《 和 转动 膜 的 时 候 ， 别 忘记 关 紫 外 灯 ) 。 建 议 旋转 是 考虑 到 透射 仪 内 的 灯 管 是 平行 排列 的 。 老 的 仪器 中 有 些 籽 管 可 能 已 经 坏 了 。 这 要 看 具体 的 仪器 ， 而 不 是 必须 要 做 的 .

@ 将 交 联 后 的 膜 夹 在 两 张 Whatman 3mm 滤纸 中 ， 保 存 于 避 光 、 干 燥 的 地 方 备 用 。

在 多 数 方案 里 ， 费 时 不 超过 1min 的 紫外 线 交 联 已 经 取代 了 在 真空 炉 里 烤 2n。 除 了 用 于 区 联 ， 定 量 紫 外 线 光 源 还 可 以 用 来 随机 打 断 染色 的 RNA 或 DNA HERE. DIR HESE SRE RE

12.7 国定 后 腊 的 处 理 竺 脆 和 固定 完成 之 后 ，Northern 分 析 的 时 间 表 就 轻松 多 了 。 应 该 非常 清楚 ， 从 细胞 列 解 开 始 ， 直 到 这 一 刻 ， 各 种 涉及 不 稳定 RNA 的 操作 ， 包 括 poly(A)+ 纯化 《有 必要 的 话 外 测定 浓度 和 纯度 、 电 泳 、 印 迹 、 核 酸 酶 保护 分 析 (第 16 章 ) 和 反 转 录 成 互补 DNACEDNA)

(第 18 章 ) 等 ， 都 必须 围绕 着 RNA 分 离 的 具体 日 期 尽快 进行 。 一 旦 样品 固定 到 固体 支持 物 ( 滤 膜 上 ， 就 可 以 保存 数 月 直到 方便 进行 杂交 或 再 杂交 实验

和 aaa

#128 Northern 印迹 分 析

应 该 记 取 的 重要 事情 是 : 没有 杂交 的 膜 需要 干燥 保存 或 放 真 空 干燥 器 以 免 受潮 或 微生物 侵蚀 。 已 经 杂交 的 或 要 再 次 杂交 的 膜 ， 在 完成 杂交 检测 后 ， 应 该 尽快 用 高 严谨 的 条 件 洗 掉 旧 的 探 针 。 旧 的 探 针 尚 未 洗 掉 前 ， 别 让 滤 膜 干 透 。 探 针 洗 净 后 的 膜 应 该 保持 湿润 ， 用 塑料 包 起 来 。 膜 一 旦 干 后 ， 想 洗 掉 上 面 杂 交 的 探 针 就 极为 困难 了 。

12.8 424 & #&

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(KARE; SH FR)

¢ 153 -

第 13 章 meme RM

13.1 £AABE

分 子 生 物 学 的 核心 ， 就 是 两 条 互补 的 核酸 链 通过 碱 基 配对 形成 双 链 结构 。 这 一 过 程 叫 作 杂交 (hybridization) 。 在 任何 一 次 杂交 实验 中 ， 两 条 核酸 链 分 别 具 有 不 同 的 名 字 。 在 经 典 分 子 生 物 学 技术 中 ， 例 如 Northern 分 析 和 Southern 分 析 中 ， 用 于 杂交 的 互补 双 链 ， 其 中 一 条 链 叫 作 靶 〈target) ， 这 条 链 通常 是 固定 在 滤 膜 上 ， 如 前 面 章节 所 述 ; 另 一 条 链 叫 作 探 针 (probe) ， 携 带 着 可 以 通过 实验 探测 到 的 某 种 标记 物 。 探 针 通 常 溶解 在 具有 特定 pH 和 离子 强度 的 溶液 〈 杂 交 液 ) 中 ， 在 杂交 液 中 与 互补 链 进行 碱 基 配 对 ， 这 些 互补 链 固 定 在 滤 膜 的 表 面 。 这 种 杂交 方式 叫 作 混 合 相 杂 交 (mixed-phase hybridization), MUKA Be Mes 光 ， 探 针 在 滤 膜 表面 得 以 定位 和 定量 ， 实 验 到 此 完成 。

杂交 还 可 以 以 另 一 种 方式 进行 : 杂交 的 两 条 链 都 可 以 自由 移动 ， 探 针 链 和 靶 链 碱 基 的 配 对 由 随机 碰撞 动力 学 驱动 。 因 为 任何 一 条 链 都 没有 固定 在 滤 膜 上 ， 杂 交 完 成 的 速度 要 远 快 于 在 混合 相 杂 交 中 所 看 到 的 。 没 有 滤 膜 的 存在 也 提高 了 实验 的 灵敏 度 ， 其 系数 至 少 为 10。 例 如 ， 核 酸 酶 保护 实验 〈 见 第 16 BE). RAMEE RI (PCR) 〈 见 第 19 章 ) 都 是 在 溶液 中 进行 的 杂交 技术 。

对 于 特定 的 实验 选择 最 合适 的 探 针 种 类 ， 像 选择 合适 的 定位 和 定量 杂交 反应 方法 一 样 重 要 。 在 理想 的 情况 下 ， 需 要 探 针 和 杂交 反应 中 所 有 与 之 互补 的 序列 进行 杂交 。 由 于 核酸 探 针 的 超 强 分 辨 能力， 使 它 应 用 极 广 。 下面 就 是 核酸 探 针 的 部 分 应 用 。

D) 基因 表达 变化 的 定量 或 定性 分 析 。

Q 基因 扩 增 或 缺失 。

G@) FEA HH

由 染色 体 转 位 。

© 点 突变 。

© 细胞 中 存在 的 新 的 遗传 序列 〈 病 原 体 ) 。

此 外 ， 用 于 PCR 的 寡 核 苷 酸 引 物 通常 可 以 与 经 典 分 子 生 物 学 技术 中 的 核酸 探 针 换 用 。

如 前 所 述 ， 核 酸 探 针 是 带 有 某 种 标记 Cabel) 或 标记 物 (tag) ARERR. peice oF 究 者 在 整个 实验 中 对 探 针 进行 跟踪 ， 而 且 标记 至 少 提供 了 半 定 量 的 检测 方法 。 从 历史 上 来 看 ， 探 针 的 合成 《例如 标记 的 挫 人 ) 和 检测 完全 依赖 于 高 效 的 放射 性 标记 的 挫 入 ， 以 及 接 下 来 的 放射 目 显影 检测 技术 。 主 要 的 方法 是 放射 标记 的 dNTP 前 体 的 摊 入 。 但 是 ， 现 在 新 的 + 154 -

第 13 章 “ 核酸 探 针 技术

研究 面临 更 迫切 的 问题 是 : 什么 情况 下 使 用 化 学 荧光 的 非 同 位 素 标记 和 检测 方案 来 替代 同位 素 标记 和 放射 自 显影 ?

一 个 并 不 直接 的 回答 是 : 通常 情况 下 都 可 以 ， 主 要 依赖 于 实验 所 需要 的 精确 性 和 灵敏 度 。 大 多 数 情况 下 ， 非 同位 素 方法 几乎 和 所 有 涉及 把 样品 固定 到 滤 膜 〈 非 硝酸 纤维 素 膜 ) 的 分 子 生 物 学 操作 相 兼 容 。 这 些 应 用 有 Northern 分 析 、Southern 分 析 、Western 分 析 、 斑 点 杂交 和 条 带 杂 交 分 析 、 菌 落 杂交 、 叭 菌 斑 筛选 ， 以 及 并 不 基于 滤 膜 的 原 位 Cin situ) 杂交 。 笔者 常常 提 及 的 经 验 估 计 法 是 :“ 通 过 放射 自 显影 的 方法 ， 在 3 天 之 内 所 压 胶片 上 能 看 到 条 HP AS, 那么 你 用 化 学 荧光 的 方法 替代 就 是 可 能 的 ， 而 且 不 失灵 敏 度 和 分 辨 率 。 如 果 放 射 自 显 影 需 要 3 天 以 上 的 时 间 ， 非 同位 素 方 法 就 不 能 与 其 兼容 了 。?”

一 些 并 非 基 于 滤 膜 的 技术 ， 包 括 高 灵敏 度 的 核酸 酶 保护 实验 和 核 逃 逸 实验 ， 用 放射 性 标 记 可 以 达到 最 好 的 效果 。 在 很 多 情况 下 ， 基 于 PCR 的 技术 革新 已 经 替代 了 部 分 旧 技 术 。

13.2 探 针 的 分 类

核酸 探 针 可 以 是 均一 化 的 ， 也 可 以 是 非 均一 化 的 。 这 些 探 针 既 可 以 是 DNA 分 子 ， 也 可 以 fe RNA 分子 。 在 同一 条 交 溶 液 中 ， 如 果 所 有 的 探 针 都 是 相同 的 ， 这 个 探 针 就 被 称 作 均 一 的 。 例如 ， 在 一 个 实验 中 ， 在 所 给 的 样品 中 检测 常见 的 cos 的 转录 产物 ， 每 一 个 探 针 分 子 都 是 带 标记 的 人 类 c fos 癌 基 因 的 互补 DNA 序列 (cDNA)。 非 均一 探 针 是 指 包 含 了 两 种 或 两 种 以 上 序列 的 核酸 探 针 ， 这 些 探 针 可 以 是 很 相近 的 核酸 序列 ， 也 可 以 是 完全 不 同 的 核酸 序列 。 例 如 ， 在 构建 差异 表达 库 的 过 程 中 ， 其 目标 就 是 通过 和 另 一 类 细胞 对 比 的 方法 ， 除 去 所 有 共同 表达 的 基因 ， 找 出 那些 在 特定 细胞 中 特异 表达 的 mRNA。 因 此 ， 在 杂交 过 程 中 ， 探 针 可 能 由 几 千 种 不 同 的 序列 组 成 。 另 一 个 例子 是 ， 几 种 不 同 的 寡 核 苷 酸 序列 同时 存在 于 同一 杂交 反应 中 ， 这 是 由 于 研 究 者 不 清楚 和 目的 靶 分 子 有 关 的 基因 序列 。 当 准备 采用 非 均一 探 针 去 杂交 时 ， 应 当 避 免 选 用 那些 已 知 具 有 中 度 和 高 度 重复 序列 的 靶 基 因 Cl Alx) ， 这 样 不 至 于 产生 大 量 的 干扰 的 杂交 信和 号 。

13.3 标记 系统 的 选择

在 选择 标记 系统 时 ， 有 以 下 关键 的 几 点 需要 考虑 。

@ 要 达到 的 灵敏 度 和 分 辩 率 。

@ 标记 挫 入 的 方法 。

@ 标记 后 探 针 的 稳定 性 。

® 杂交 的 类 型 。

@ 期 望 的 检测 方法 。

标记 核酸 有 三 种 基本 方法 可 供 选 择 : @ 放 射 性 标记 ; 四 半 抗 原 标记 [如 生物 素 、 荧 光 素 (FL) 、 地 高 辛 〈DIG)]， 支 持 化 学 发 光 、 化 学 荧光 或 发 色 技 术 等 非 同位 素 检测 方式 ，@ 直 接 的 酶 标记 。 在 大 多 数 情况 下 ， 这 些 技术 在 用 来 标记 包括 DNA. RNA 和 朝 核 苷 酸 的 应 用 中 是 通用 的 。 这 些 操作 技术 的 方法 、 优 点 和 缺点 将 在 本 节 中 详 述 。 此 外 ， 对 于 合成 核酸 探 针 来 说 ， 多 种 系统 已 商业 化 ; 而 且 ， 为 了 达到 最 优 的 灵敏 度 和 分 辩 率 ， 每 种 系统 都 有 一 套 自己 的 检测 方法 。

@ 放射 自 显影 需 使 用 增 感 屏 ， 在 一 80C 进行 。 ¢ 155 =

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

根据 标记 在 核酸 探 针 分 子 上 的 位 置 ， 探 针 还 可 进一步 细 分 为 亚 类 ， 这 种 分 类 一 目 了 然 地 让 人 看 出 所 用 标记 技术 的 功能 。 探 针 的 标记 有 未 端 标记 和 连续 标记 ， 每 一 种 下 面 有 举例 。 未 端 标记 探 针 是 指 将 标记 加 到 探 针 的 5 末端 (例如 通过 激酶 反应 ) 或 3 末端 (例如 通过 末端 转移 酶 @8) 。 连 续 标 记 是 指 沿 着 分 子 骨架 以 规律 的 间隔 进行 标记 。 连 续 标 记 的 探 针 的 例子 有 随机 引物 法 、PCR、 体外 转录 或 补 骨 脂 素 - 生 物 素 〈psoralen-biotin) 交 联 法 ， 但 不 限于 此 。 是 选择 未 端 标记 还 是 选择 连续 标记 取决 于 以 下 几 点 。

@ 探 针 是 DNA 还 是 RNA。

Q 探 针 是 双 链 还 是 单 链 。

@ 如 果 是 双 链 ， 探 针 的 5 末端 和 3' 末 端 是 止 进 还 是 突出 。

® 标记 挫 入 的 水 平 直接 与 所 需 的 灵敏 度 水 平 相关 ) 。

© 所 要 标记 探 针 的 长 度 。

© 如 果 是 双 链 ， 探 针 是 线性 的 还 是 闭合 的 环 状 结构 〈 如 质粒 )。

这 些 因素 的 权衡 考虑 将 在 下 面 详细 讨论 。

13.3.1 同位 素 标记

当心 ”使 用 和 存储 放射 性 材料 时 ， 应 当 按 照 同位 素 常 识 和 操作 规则 去 做 。 无 论 是 什么 同位 素 或 是 它 有 多 少 比 活力 ， 在 任何 时 刻 都 必须 穿 实 验 服 ， 戴 一 次 性 手套 ， 眼 睛 佩戴 防护 镜 ， 以 及 接受 适当 的 培训 。 不 论 是 使 用 还 是 靠近 同位 素 ， 必 须 严 格 坚 持 部 门 的 和 制度 的 管 理 ， 包 括 同位 素 的 防护 、 操 作 、 处 理 实 验 室 安 全 ; 而 且 ， 其 他 危险 材料 也 应 当 如 此 管理 。 在 任何 时 候 ， 放 射 性 安全 办 公 室 都 应 当 考虑 到 特殊 的 应 用 和 广泛 适用 的 规定 。

在 很 多 应 用 中 ， 同 位 素 都 有 极 高 的 灵敏 度 ， 以 及 在 各 种 标记 技术 中 的 通用 性 。 但 同位 素 标记 也 有 一 些 固 有 的 缺点 ， 包 括 同 位 素 的 半 训 期 8 问题 ， 对 健康 潜在 的 危害 ， 放 射 性 污染 ， 昂贵 的 价格 ， 同 位 素 垃圾 处 理 的 高 成 本 ， 探 针 的 稳定 性 和 标记 的 有 效 性 ， 以 及 相对 较 长 的 检 测 时 间 。

表 13.1 ”>P 衰变 数据

衰变 时 间 / 天 0.0 0.5 1.0 ES) 2.0 VARS, 3. 0 Sud 4.0 4.5 0 1. 000 0. 976 0. 953 0. 930 0. 908 0. 886 0. 865 0. 844 0. 824 0. 804 5 0. 785 0. 766 0. 748 0. 730 0. 712 0. 695 0. 678 0. 662 0. 646 0. 631 10 0. 616 0. 601 0. 587 0.573 0. 559 0. 545 0. 532 0. 520 0. 507 0. 495 15 0. 483 0. 472 0. 460 0. 449 0. 438 0. 428 0. 418 0. 408 0. 398 0. 388 20 0. 379 0. 370 0. 361 0. 353 0. 344 0. 336 0. 328 0. 320 0. 312 0. 305 25 0. 297 0. 290 0. 283 0. 277 0. 270 0. 264 0. 257 0: 250 0. 245 0. 239 30 0. 233 0. 228 0. 222 0. 217 0. 212 0. 207 0. 202 0. 197 0. 192 0. 188 35 0. 183 0.179 0.174 0. 170 0. 166 0. 162 0. 158 O.16o 0.151 0. 147 40 0. 144 0. 140 0. 137 0. 134 0. 130 0. 127 0. 124 0.121 0.118 0. 116 45 0; Lis 0. 110 0. 107 0. 105 0. 102 0. 100 0. 098 0. 095 0. 093 0. 091 50 0. 088 0. 086 0. 084 0. 082 0. 080 0. 078 0. 077 0. 075 0.073 0. 071 55 0. 069 0. 068 0. 066 0. 065 0. 063 0. 062 0. 060 0. 059 0. 057 0. 056 60 0. 054 0. 053 0. 052 0. 051 0. 049 0. 048 0. 047 0. 046 0. 045 0. 044

TE: 物理 半 训 期 和 14. 29 天 。

@ A Mai AG AT RTE @ 为 了 方便 读者 ， 常 用 同位 素 半衰期 数据 见 表 13. 1 一 表 1: 。156 -

3.4 (数据 由 PerkinElmer Life Sciences 惠 赠 ) 。

第 13 章 ， 核酸 探 针 技术

表 13.2 33P 衰变 数据

衰变 时 间 / 天 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1. 000 0. 973 0. 947 0. 921 0. 897 0. 872 0. 849 0. 826 0. 804 0. 782 10 0. 761 0. 741 0. 721 0. 701 0. 683 0. 664 0. 646 0. 629 0. 612 0.595 20 0.579 0. 564 0. 549 0. 534 0. 520 0. 506 0. 492 0. 479 0. 466 0. 453 30 0. 441 0. 429 0. 418 0. 406 0. 395 0. 385 0. 374 0. 364 0. 355 0. 345 40 0. 336 0. 327 0. 318 0. 309 0. 301 0. 293 0. 285 0. 277 0. 270 0. 263 50 0. 256 0. 249 0. 242 0. 236 0. 229 0. 223 0. 217 0. 211 0. 205 0. 200 60 0. 195 0. 189 0. 184 0.179 0.174 0.170 0. 165 0. 161 0. 156 0. 152 70 0. 148 0.144 0. 140 0. 136 0. 133 0. 129 0. 126 0. 122 0. 119 0. 116 80 05113 0. 110 0. 107 0. 104 0. 101 0. 098 0. 096 0. 093 0. 091 0. 088 90 0. 086 0. 084 0. 081 0. 079 0.077 0.075 0. 073 0. 071 0. 069 0. 067 100 0. 065 0. 064 0. 062 0. 060 0. 059 0. 057 0. 055 0. 054 0. 053 0. 051 110 0. 050 0. 048 0. 047 0. 046 0. 045 0. 043 0. 042 0. 041 0. 040 0. 039 120 0. 038 0. 037 0. 036 0. 035 0. 034 0. 033 0. 032 0. 031 0. 030 0. 030 TE: 物理 半衰期 二 25.4 天 。 表 13.3 ”“S 衰变 数据 衰变 时 间 / 天 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 0 1. 000 0. 976 0. 954 0. 931 0. 909 0. 888 0. 867 0. 847 0. 827 0. 807 30 0. 788 0. 770 0. 752 0. 734 OPT 0. 700 0. 683 0. 667 0. 652 0. 636 60 0. 621 0. 607 0. 592 0.579 0. 565 0. 552 0. 539 0. 526 0.514 0. 502 90 0. 490 0. 478 0. 467 0. 456 0. 445 0. 435 0. 425 0.415 0. 405 0. 395 120 0. 386 0. 377 0. 368 0. 359 0. 351 0. 343 0. 335 0. 327 0. 319 0. 312 150 0. 304 0. 297 0. 290 0. 283 0. 277 0. 270 0. 264 0. 258 0. 252 0. 246 180 0. 240 0. 234 0. 229 0. 223 0. 218 0. 213 0. 208 0. 203 0. 198 0. 194 210 0. 189 0. 185 0. 180 0. 176 0.172 0. 168 0. 164 0. 160 0. 156 0. 153 240 0. 149 0. 146 0. 142 0. 139 0. 136 0. 132 0. 129 0. 126 0. 123 0. 120 270 0. 118 0.115 0.112 0. 109 0. 107 0. 104 0. 102 0. 099 0. 097 0. 095 300 0. 093 0. 090 0. 088 0. 086 0. 084 0. 082 0. 080 0. 078 0. 077 0. 075 330 0. 073 0.071 0. 070 0. 068 0. 066 0. 065 0. 063 0. 062 0. 060 0. 059 360 0. 058 0. 056 0. 055 0. 054 0. 052 0.051 0. 050 0. 049 0. 048 0. 046 TE: WRK RH 87.4 K. 表 13.4 *HRERE 衰变 时 间 / 月 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll 0 1. 000 0.995 0. 991 0. 986 0. 981 0. 977 0. 972 0. 968 0. 963 0. 959 0.954 0.950 1 0.945 0. 941 0. 936 0.°932 0. 928 0. 923 “3L9 0. 915 0. 910 0. 906 0.902 0.898 2 0. 893 0. 889 0. 885 0. 881 0. 877 0. 873 0. 869 0. 865 0. 860 0. 856 0.852 0.848 3 0. 844 0. 841 0. 837 0. 833 0. 829 0. 825 0. 821 0. 817 0. 813 0. 810 0.806 0.802 1 0. 798 0. 794 0. 791 0. 787 0. 783 0. 780 0. 776 0.772 0. 769 0. 765 0.762 0.758 5 0. 754 0. 751 0. 747 0. 744 0. 740 OWT 0. 733 0. 730 0. 727 0. 723 0.720 0.716 6 0. 713 0. 710 0. 706 0. 703 0. 700 0. 697 0. 693 0. 690 0. 687 0. 684 0.680 0.677 7 0. 674 0. 671 0. 668 0. 665 0. 661 0. 658 0. 655 0. 652 0. 649 0. 646 0.643 0. 640 8 0. 637 0. 634 0. 631 0. 628 0. 625 0. 622 0. 619 0. 616 0. 614 0. 611 0.608 0.605 9 0. 602 0. 599 0. 597 0. 594 0. 591 0. 588 0. 585 0. 583 0. 580 0.577 0.575 0.572 10 0. 569 0. 567 0. 564 0. 561 0. 559 0. 556 0. 553 0. 551 0. 548 0. 546 0.543 0. 541 11 0. 538 0. 535 0. 533 0. 530 0. 528 0. 526 0. 523 0. 521 0. 518 0. 516 0.513— 0.511 12 0. 509 0. 506 0. 504 0. 501 0. 499 0. 497 0. 494 0. 492 0. 490 0. 487 0.485 0. 483

= ol ~

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

标记 核酸 探 针 最 常用 的 同位 素 有 ?2 P、3? H AMOS, SP 也 偶尔 使 用 。 同 位 素 标记 在 核 背 三 磷酸 前 体 一 定 的 位 置 (ce 或 >)。 这 样 ， 通 过 酶 的 作用 将 核 苷 酸 中 带 有 同位 素 的 部 分 转移 到 需 要 标记 的 分 子 上 。 操 作 方式 和 检测 方法 决定 着 同位 素 的 选择 。 例 如 ，2 了 标记 的 探 针 发 出 的 长 程 B 粒 子 ， 使 这 种 标记 可 以 用 来 在 X 射线 胶片 上 记录 杂交 事件 ;然而 ， 由 于 同样 的 原因 ， 在 解剖 学 上 将 P 标记 的 探 针 用 于 RNA 靶 的 原 位 杂交 ， 其 分 辨 率 就 不 足 ， 也 就 是 说 不 能 反 Bae RNA 在 组 织 或 细胞 上 的 精确 位 置 ， 需 要 使 用 其 他 的 标记 和 检测 系统 。

» SP 的 应 用 减轻 了 ?P 所 产生 的 危险 。3?P 标记 的 核 苷 酸 在 常见 的 分 子 生 物 学 应 用 中 可 以 作为 一 个 选择 ， 特 别 是 DNA 测序 中 〈Zagursky 等 ，1991)。33P 的 半衰期 是 25.4 天 ， 其 粒子 的 最 大 能 量 是 Emax =0. 25MeV， KAA? PC Emax =1.71MeV) 的 1779 NEN Life Sci- ence Products 公司 〈 现 隶属 PerkinElmer) 表示 ,33P 可 以 在 实验 台 上 以 普通 的 放射 性 安全 标 准 进行 操作 ， 而 不 必 像 操作 3?P 那样 需要 特殊 的 防护 。

13. 3. 1. 1 如 何 将 降解 问题 减 到 最 低

核 苷 酸 的 保存 期 限 依 赖 于 两 个 因素 : 放射 性 同位 素 的 半衰期 和 它 的 生物 学 球 训 期 。 虽然 同位 素 半衰期 是 固定 的 ， 但 生物 降解 率 却 因 对 材料 的 操作 及 温度 而 变化 。 放射 性 标 记 核 背 三 磷酸 的 存储 位 置 〈 在 冰箱 中 还 是 室温 下 ) 可 以 改变 它 的 训 变 率 和 生物 降解 率 。 降解 产物 主要 包括 核 苷 单 磷酸 和 无 机 焦 磷酸 ， 核 苷 二 磷酸 也 可 能 存在 。 核 苷 酸 应 当 在 二 冰 中 运输 ， 存 储 温度 要 低 于 一 20C ， 条 件 许可 的 话 ， 最 好 存储 在 一 80'C ， 不 提倡 存储 在 Te Fa UK AP 。

下 面 列 出 部 分 降低 放射 性 化 学 品 降解 问题 的 建议 。 有 关 放 射 性 化 学 品 的 安全 操作 和 使 用 的 更 完全 的 细节 ， 可 以 参阅 PerkinElmer Life Sciences 的 《研究 用 放射 性 材料 安全 操作 指 南 》， 可 以 在 线 阅 读 〈www. perkinelmer. comyjifesciences)， 本 章 所 列 出 的 下 列 几 点 就 是 从 该 参考 书 中 摘 取 的 @。

D 拿 到 同位 素 化 学 品 后 尽快 使 用 。 延长 存储 时 间 会 导致 额外 的 原子 核 训 变 。 增 加 训 变 次 数 ， 就 导致 同位 素 化 学 品 的 大 量 降 解 。 即使 是 同位 素 化 学 品 没 有 开封 ， 存 储 在 最 理想 的 条 件 下 ， 这 种 降解 也 会 发 生 。

@O) 适当 地 存储 样品 。 每 一 个 产品 都 有 技术 资料 卡片 ， 上 面 有 对 这 个 产品 的 存储 条 件 的 描述 ， 对 此 要 多 加 注意 。 ;

@ 当 打开 一 个 盛 有 放射 性 化 学 品 的 包装 后 ， 要 按照 技术 资料 卡片 上 的 说 明 行事 。 存 储 条 件 也 需 参 考 这 些 说 明 。

由 存储 在 水 溶液 中 的 3 H 标记 放射 性 化 学 品 ， 以 及 535S、125] 和 ”了 标记 的 生化 试剂 应 当 在 室温 下 解冻 ， 直 至 融化 。 1 AS? P 标记 的 核 苷 酸 不 在 此 例 ， 应 当 快 速 解冻 。 在 低温 下 存 储 的 放射 性 化 学 品 需要 缓慢 解冻 ， 建议 放 在 冰箱 中 或 冰 上 。

@ 放射 性 化 学 品 不 能 长 时 间 室 温 放 置 ， 因为 这 样 会 急剧 加 速 它 的 降解 速度 。

@ 尽量 减少 原始 存储 容器 的 开启 次 数 ， 每 次 使 用 后 应 当 立 即 重新 封 好 。 如 果 某 种 化 合 物 需 要 使 用 很 多 次 ， 将 需要 的 用 量 分 装 在 独立 的 小 管子 中 。 每 次 使 用 这 些 溶液 时 ， 就 人 六 引 人 一 些 杂质 ， 特 别 是 氧气 和 水 。

@ 当 从 原始 容器 中 分 装 放射 性 化 学 品 时 ， 使 用 干净 的 注射 器 和 枪 头 ， 因为 很 多 生物 学

@ ©P BiH th PerkinElmer Life Sciences aM @ 数据 的 使 用 得 到 了 授权 - 158 ,;

第 13 章 ，” 核酸 探 针 技术

实验 中 所 用 到 的 缓冲 液 和 盐 对 放射 性 化 学 品 是 有 害 的 。 13.3.1.2 mae He 在 标 度 日 期 之 前 的 任何 一 天 ，32P 标记 核 苷 酸 的 比 放射 性 可 以 通过 以 下 公式 计算 出 来 SA cal.

SA(Ci/mmol) ~ Df+SA cal. (—Df)/9120 xP SA cal. 标 度 日 期 的 比 放 射 性 ; D 太一 一 训 变 因子 ， 由 衰变 图 表 中 所 得 ; 它 是 当前 放射 性 的 分 数 ， 当 前 放射 性 是 指标 度 日 期 的 放射 性 ;

9120 一 一 无 稳定 同位 素 载体 稀释 的 ?>P 的 理论 比 放 射 性 。 在 标 度 日 期 之 后 的 任何 一 天 ，? 了 P 标记 的 核 苷 酸 的 比 放 射 性 可 以 通过 下 面 公 式 计 算 出 来 :

路 Df SA(Ci/mmol) = —>—~"5 = ay

SA cal. 9120 13.3.2 非 同 位 素 标 记

为 了 尽量 减少 放射 性 同位 素 的 使 用 ， 以 及 放射 性 同位 素 本 身 在 实验 室 中 所 产生 的 危险 ， 发 展 出 了 各 种 非 同 位 素 标 记 和 检测 方法 。 得 益 于 在 过 去 5 年 中 的 种 种 精妙 改进 ， 有 多 种 系统 可 以 在 根本 不 用 放射 性 同位 素 的 情况 下 ， 实 现 极 低下 限 的 检测 。 在 很 多 情况 下 ， 非 同位 素 标 记 所 达到 的 灵敏 度 和 3 P 是 相当 的 ， 这 在 很 大 程度 上 依赖 于 操作 者 的 耐心 。 比 较 而 言 ， 各 种 非 同位 素 标记 和 检测 系统 提供 了 相似 的 灵敏 度 和 分 辨 率 ， 但 它们 又 有 很 明显 的 不 同 ， 这 在 于 : 中 从 使 用 者 角度 看 ， 它 们 相对 复杂 ; @ 多 个 步骤 必须 由 使 用 者 亲自 操作 ， 特 别 是 系统 中 和 检测 组 分 有 关 的 步骤 。 常 用 的 非 同位 素 标记 法 有 生物 素 标记 、DIG tric. FL 标记 和 直接 的 酶 标记 。 生 物 素 、DIG 和 FL 标记 可 通过 显 色 反应 和 化 学 发 光 的 方法 检测 。 在 大 多 数 显 色 反应 检测 技术 中 ， 由 于 化 学 荧光 技术 本 身 难 度 高 ， 这 类 检测 方法 没有 得 到 广泛 的 使 用 。 然 而 在 如 今 的 分 子 生 物 学 实验 室 中 ， 利 用 化 学 发 光 和 一 些 显 色 反应 检测 技术 ， 高 效 非 同位 素 标记 法 已 成 为 实验 室 的 常用 技术 。 尽 管 抛 弃 使 用 放射 活性 探 针 的 想法 是 令 人 向 往 的， 但 研究 者 必 须 意识 到 ， 和 “ 热 ” 探 针 使 用 方法 相 比较 ， 非 同位 素 标记 技术 其 探 针 纯化 和 检测 方法 可 能 是 完全 不 同 的 。 用 过 ?了 的 人 会 注意 到 ， 非 同位 素 标记 最 大 的 变化 就 是 大 量 的 时 间 都 被 用 到 检 测 步 又 上 了 。 通 常情 况 下 ， 多 步骤 的 洗涤 条 交 后 的 封 团 是 必需 的 。 而 且 ， 一 旦 使 用 了 化 学 发 光 底 物 ， 就 绝对 不 能 再 用 更 严格 的 条 件 去 洗涤 滤 膜 ， 除 非 完 全 重复 杂交 后 洗涤 、 封 团 这 一 系列 过 程 。 但 是 ， 从 安全 和 经 济 的 角度 来 看 ， 抛 弃 使 用 同位 素 所 得 到 的 好 处 ， 远 远 超 过 了 这 种 复杂 检测 方法 所 带 来 的 不 便 。

13.3.2.1 £m#

生物 素 是 一 种 小 的 水 溶性 的 维生素 ， 它 可 以 很 容易 地 共 价 连接 到 多 种 生物 大 分 子 上 。 探 针 的 生物 素 标记 可 以 通过 多 种 方法 完成 。

© 酶 促 法 ， 使 用 生物 素 化 的 核 苷 酸 。

@ 光化学 法 ， 使 用 具有 光 活 性 的 生物 素 或 补 骨 脂 素 - 生 物 素 。

G) 化 学 方法 ， 在 合成 朝 核 苷 酸 的 过 程 中 完成 。

FRR SER 5 端 标记 生物 素 是 最 容易 最 有 效 的 标记 方法 ， 但 从 检测 的 角度 来 看 ， 生 物 素 标记 在 探 针 的 哪 一 部 分 确实 无 关 紧 要 。 生 物 素 标记 几乎 从 不 影响 探 针 的 生物 学 活性 ， 而

。159 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

且 在 生物 素 标记 的 核 苷 酸 中 ， 如 Bio-11-dUTPe@ (图 13. 1) ， 生 物 素 和 探 针 骨 织 之 间 的 连接 臂 有 效 地 降低 了 空间 阻碍 作用 。 生 物 素 标记 的 探 针 在 一 20C 下 至 少 可 以 保存 1 年 。

P§13.1 4YR-11-dUTP(Bio-11-dUTP)

极 少 分 子 能 像 链 霉 亲 和 素 (streptavidin) 那样 与 生物 素 有 很 强 的 自然 的 亲和力 (Ka= 10-15L/mol) 。 链 霉 亲 和 素 是 一 个 四 聚 体 蛋白 (M, 60000), MEER (Streptomyces avi- dizii) 中 分 得 ， 具 有 四 个 生物 素 结 合 位 点 。 和 普通 亲 和 素 RAW) 不 同 ， 链 霉 亲 和 素 的 等 离子 点 为 中 性 ， 在 生理 pH 值 下 ， 带 电 基 团 极 少 ， 不 含 糖 基 。 这 些 特 性 降低 于 非特 异性 结合 和 背景 问题 ， 从 而 提高 了 灵敏 度 。 在 多 种 核酸 杂交 检测 和 相关 技术 中 ， 生 物 素 - 链 霉 亲 和 素 的 操作 已 经 得 到 应 用 (Leary 4, 1983; Wilchek 和 Bayer, 1984; Hoffman 和 Finn, 1985)。 因 此 ， 在 基于 生物 素 标记 的 检测 系统 中 ， 最 初 几 步 中 就 有 一 步 是 生物 素 和 制备 好 的 链 霉 亲 和 素 结合 。 在 大 多 数 系统 中 ， 链 霉 亲 和 素 是 经 过 修饰 的 ， 通 常 是 连接 在 碱 性 磷酸 酶 (alkaline phosphatase, AP) 上 的 ; 但 在 其 他 一 些 系统 中 ， 链 霉 亲 和 素 连接 的 是 关 根 过 氧化 物 酶 Chorseradish peroxides，HRP)。 通 过 AP 或 HRP 接触 特殊 的 底 物 ， 杂 交 得 以 定位 和 定量 ; 这 些 可 以 通过 X 射线 胶片 捕获 发 射 的 光子 〈 化 学 发 光 ) 或 在 滤 膜 上 色素 沉积 来 完成 〈 显 色 反 应 法 检测 ) 。

13.3.2.2 地 高 辛

Hh (DIG) (Roche Applied Science) 是 一 种 来 源 于 植物 洋 地 黄 属 (Digitalis) KE 醇 类 半 抗 原 ， 与 强 心 剂 药物 洋 地 黄 (Digitalis purbpurea ， 紫 花 洋 地 黄 ) 来 源 相 同 。 它 被 广 泛 应 用 于 核酸 标记 ， 并 支持 显 色 反 应 检测 和 化 学 发 光 检 测 (Martin 等 ，1990) 。DNA 探 针 是 通过 酶 标记 的 ， 用 DIG-dUTP (DIG-11-dUTP; 图 13.2) 以 随机 引物 法 合成 ， RNA 探 针 是 用 DIG-11-dUTP 以 体外 转录 法 合成 。 这 些 核 苷 酸 通 过 一 个 支撑 臂 连接 DIG, DIG 标记 的 分 子 作 和 杂交 探 针 ， 与 其 他 任何 一 类 探 针 基本 一 样 。 寡 核 苷 酸 还 可 以 在 合成 的 过 程 中 用 DIG 标记 ， 这 样 就 可 以 排除 那些 不 合格 的 和 效率 低下 的 标记 反应 。 像 生物 素 标记 一 样 ，DIG 标 记 并 不 干扰 探 针 的 生物 学 活性 ， 而 且 这 样 标记 的 探 针 在 一 20C 至 少 可 以 稳定 保存 1 年 。DIG 标记 的 探 针 在 杂交 后 可 以 直接 在 滤 膜 上 通过 化 学 发 光 或 不 溶性 色素 沉淀 物 形 成 的 方式 来 检测 。

杂交 后 经 过 严格 洗涤 步骤 ， 接 着 用 抗体 连接 物 (anti-DIG-AP) 连接 ，DIG 标记 的 探 针 通过 酶 联 免疫 检测 法 检测 。 如 同 生物 素 检测 系统 一 样 ， 光子 发 射 或 沉淀 形成 的 发 生 是 由 碱 性

@ 是 一 种 常用 的 非 同位 素 标 记 核 苷 酸 ， 作 为 dUTP 的 类 似 物 使 用 。Bio-1l-dUTP 表示 它 的 核 苷 酸 前 体 是 UTP, JE 生物 素 化 的 dUIP， 在 核 苷 单 磷酸 11 位 原子 上 连接 一 个 生物 素 ， 生 物 素 成 为 了 探 针 的 一 部 分 。 支 持 这 种 类 型 标记 的 技术 有 切口 平移 法 〈nick translation) 、 随 机 引物 法 和 PCR, RNA 探 针 可 以 使 用 Bio-11-UTP、DIG-11_UTP (DIG 标记 的 ) 或 FL-11-UTP (FL 标记 的 )

* 160 -

第 13 章 ， 核酸 探 针 技术

X4L 广 OH

图 13.2 地 高 辛 -11-dUTP(DIG-11-dUTP)

磷酸 酶 介 导 的 底 物 去 磷酸 化 所 引起 的 ， 这 可 用 多 种 手段 检测 ， 包 括 比 色 法 或 化 学 发 光 法 。 同 样 也 可 使 用 关 根 过 氧化 物 酶 标记 的 抗体 。

2.2 eGR

几 年 之 前 ， 还 只 有 荧光 素 fluorescein, FL) 标记 的 荧光 标记 核 苷 酸 可 以 应 用 于 DNA B RNA Git. FL-12-dUTP (Al 13.3) Fa Ftpid DNA ff, FL-12-UTP 用 于 标记 了 NA 探 针 。 用 这 种 荧光 素 标记 的 核 苷 酸 标 记 探 针 ， 与 生物 素 标 记 的 和 DIC 标记 的 核 苷 酸 所 采用 的 方法 大 致 相同 ， 也 可 以 在 寡 核 苷 酸 引物 合成 的 过 程 中 直接 挫 人 。 杂 交 之 后 ， 用 高 亲 和 性 抗 FL 抗体 对 探 针 进行 定位 ， 连 接 AP 或 HRP 的 抗体 可 以 通过 化 学 发 光 法 或 显 色 反应 法 检测 。 抗原 〈 即 荧光 素 ) 本 身 的 荧光 也 可 以 用 来 监测 荧光 素 抄 人 探 针 的 情况 ， 这 样 就 可 以 估计 标记 反应 的 效率 。

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图 13.3 ”荧光 素 -12-dUTP(CFL-12-dUTP)

在 FL 标记 和 检测 系统 中 ， 虽 然 某 些 商 家 仍 在 提供 前 面 所 述 的 传统 方法 和 试剂 使 用 。 但 应 该 注意 到 ， 新 一 代 菊 光标 记 物 和 挫 人 这 些 标记 物 的 方法 已 经 被 开发 出 来 ， 并 得 到 了 广泛 的 应 用 。 目 前 比较 常用 的 荧光 染料 有 Cy3 和 Cy5。 简 单 地 说 ， 这 些 染 料 标记 DNA 探 针 有 两 种 方式 : 一 种 是 直接 标记 ， 用 Cy3 或 Cy5 mice MRM, TRAM PABBA; 另 一 种 是 间接 的 标记 方式 ， 在 DNA 探 针 合成 过 程 中 ， 摊 人 氮 基 烯 丙 基 dUTPCaminoallyl-dUTP) ak aa de hi A 基 dCTP(aminoallyl-dCTP), 27 2 WORF Cy3 或 Cy5 连接 到 探 针 上 。 现 在 ， 这 些 荧 光 及 其 他 荧光 试剂 标记 的 核 苷 酸 通 常用 来 合成 CDNA 进行 微 阵列 分 析 〈 参 见 第 23 BE),

13.4 DNA 44%

DNA 探 针 种 类 极 多 。 下 面 列 举 的 DNA 探 针 ， 包 括 事 先 克隆 好 的 双 链 cDNA、 基因 组 DNA 序列 、 在 标记 的 dNTP, WRB HIRE FEL mRNA 混合 物 为 模板 合成 的 。161 .

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

第 一 链 cDNA 和 PCR 产物 。

@ WH cDNA 和 基因 组 DNA， 在 标记 完成 后 作为 探 针 使 用 之 前 ， 需 要 变性 产生 相应 的 单 链 。 每 种 标记 技术 的 产物 都 要 求 这 么 做 。 各 种 DNA 探 针 ， 包 括 一 些 已 经 标记 好 的 ， 儿 乎 在 每 个 大 的 生物 技术 产品 供应 商都 可 买 到 。 和 RNA 探 针 相 比较 ，DNA 探 针 的 一 个 缺点 就 是 热 动力 学 稳定 性 较 低 〈 参 见 第 1 章 和 第 14 章 关 于 严谨 性 的 论述 ) ， 但 对 于 实验 结果 来 讲 ， 这 种 影响 常常 是 可 以 忽略 的 。

@ 第 一 链 cDNA， 可 以 在 标记 好 的 dNTP 存在 的 条 件 下 ， 从 mRNA 合成 《或 从 由 此 富 集 的 相关 组 分 合成 ) 。 这 样 将 会 产生 非 均 一 探 针 ， 这 种 探 针 可 以 直接 用 来 杂交 。 一 些 序列 特 异 存在 于 两 种 或 多 种 RNA 群 之 中 的 一 种 ， 用 异 源 探 针 确定 其 是 否 存在 则 特别 有 用 。 出 于 读 者 方便 的 考虑 ， 有 关 差 减 杂 交 的 讨论 将 写 在 第 21 章 ， 因 为 研究 者 已 经 普遍 对 这 种 方法 有 所 了 解 。

@ HRTREATA RA HE DNA。 在 PCR 方法 发 明之 前 , “oligos” 作 为 标准 的 杂 交 探 针 已 经 使 用 很 多 年 了 。 所 以 ，PCR 扩 增 目的 片段 所 用 的 引物 ， 有 可 能 很 容易 地 被 单独 FAVE ARMENIA ZR CHR ET. BERT IRA ON “KK” SRAM “i” BRA, “KR” RAB 100 *VA LAY DRE, “I” SEEK — BUR 30 SORAE. TERA TET, DERE A AW 5e 全 控制 它 的 序列 ， 因 为 寡 核 苷 酸 的 序列 是 定制 的 。 使 用 寡 核 苷 酸 的 主要 缺点 和 它 的 主要 优点 是 相同 的 : 因为 研究 者 决定 着 寡 核 苷 酸 的 序列 ， 所 以 就 必须 知道 选择 什么 样 的 序列 。 以 寡 核 苷 酸 探 针 进行 实验 时 ， 短 链 寡 核 苷 酸 的 灵活 性 和 操作 自由 度 最 大 。 窒 核 苷 酸 序列 信息 可 以 来 源 于 以 前 保存 的 核酸 序列 数据 库 ， 对 同 种 或 不 同 种 生物 相关 基因 的 核 苷 酸 序列 的 了 解 ， 或 知 道 目的 基因 所 编码 的 蛋白 质 氢 基 酸 序列 。 与 后 述 方法 有 关 的 一 个 问题 ， 是 遗传 密码 的 简 并 性 ， 即 一 些 氨基 酸 具 有 多 种 密码 子 。 根 据 氨基 酸 序列 设计 窒 核 苷 酸 探 针 时 ， 一 个 方法 就 是 找 到 一 段 多 肽 ， 其 中 的 氨基 酸 只 有 一 个 或 两 个 可 能 的 密码 子 。 具 有 单 密 码 子 的 氨基 酸 有 甲 硫 氢 BABAR: 具有 双 密 码 子 的 氮 基 酸 包括 谷 氨 酸 、 谷 所 酰胺 、 天 冬 氨 酸 、 天 冬 酰胺 、 葵 两 氮 酸 、 酯 氨 酸 、 组 氨 酸 、 半 胱 氨 酸 和 赖 氨 酸 。 而 且 ， 研 究 者 还 要 知道 相对 于 其 他 物种 ， 特 定 物 种 对 某 个 密码 子 的 偶 好 性 。 当 一 条 具有 确定 序列 的 朝 核 苷 酸 探 针 信号 太 弱 时 ， 这 可 能 需要 同 时 使 用 多 条 寡 核 苷 酸 序列 ， 研 究 者 可 以 选择 只 用 一 条 窒 核 苷 酸 ， 通 过 降低 杂交 温度 和 洗涤 温 度 来 弥补 信号 ， 虽 然 严谨 性 降低 了 。 虽 然 这 种 方法 降低 了 正确 互补 序列 的 比例 ， 而 且 可 能 增 加 部 分 非特 异性 杂交 ， 但 重点 在 于 真正 的 杂交 事件 不 会 检测 不 到 。 关 于 核酸 探 针 的 杂交 细节 请 参考 第 14 章 。

® 任何 PCR 产物 都 可 以 用 作 探 针 。 标 记 的 挫 人 可 以 在 PCR 进行 中 用 半 抗 原 标 记 的 核 HR TE AED AB PCR 产物 中 ; 或 者 借助 于 引物 ， 那 些 用 于 扩 增 模板 的 引物 的 SG 已 经 做 好 标记 。

13.4.1 DNA 探 针 的 合成

前 面 已 经 闹 述 过 多 种 标记 DNA 的 方法 学 。 简 单 地 说 ， 这 些 方法 是 用 于 产生 未 端 标记 世 连续 标记 的 探 针 。 大 多 数 酶 介 导 的 标记 技术 依赖 于 聚合 酶 的 活性 ， 聚 合 酶 将 带 有 标记 的 核 昔 酸 挫 人 到 产物 中 去 。 而且，Taqd DNA 聚合 酶 或 其 他 热 稳定 DNA 聚合 酶 的 使 用 ， 使 得 标记 反应 可 以 通过 PCR 反应 在 高 温 下 进行 ， 从 而 减少 了 探 针 合成 过 程 中 由 聚合 酶 引起 的 价 然 的 氮 突 变 。 当 然 ， 必 须 考虑 Tag 本 身 的 误 配 率 。 使 用 校正 酶 和 第 19 章 所 描述 的 混合 酶 也 许 会 有 所 帮助 。

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第 13 章 BMRA

下 面 是 一 些 更 常用 技术 的 简单 叙述 。 所 有 这 些 标记 反应 都 已 经 商业 化 ， 可 以 买 到 相关 的 试剂 盒 ， 试 剂 盒 中 包括 所 有 必需 的 试剂 ， 但 不 包括 放射 性 标记 所 需 的 同位 素 。 总 的 来 说 ， 大 多 数 用 于 产生 放射 性 标记 探 针 的 系统 也 可 以 作为 非 同 位 素 标记 系统 。 使 用 放射 性 同位 素 标记 时 ， 一 定 要 弄 清 同 位 素 原 子 在 核 苷 酸 前 体 中 的 位 置 〈 例 如 a 标记 或 y Mic).

13. 4.1.1 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 法 @

PCR 是 一 种 很 好 的 探 针 合成 方法 ， 仅 仅 需 要 极 少 量 的 模板 。 在 合适 的 放射 性 同位 素 标 记 的 或 半 抗 原 标记 的 核 苷 酸 前 体 存 在 的 情况 下 ，PCR 产物 在 合成 时 就 被 标记 好 。 还 有 一 种 方法 ， 引 物 在 合成 时 就 做 好 非 同位 素 标记 ，PCR 反应 混合 物 中 就 不 需要 再 加 入 标记 好 的 核 苷 酸 前 体 。

PCR 作为 一 种 标记 方法 具有 几 个 优点 : 快速 、 多 用 途 、 反 应 效率 高 和 普遍 性 〈 因 为 现 在 大 多 数 实验 室 都 会 用 到 PCR) 。 此 外 ， 从 微量 模板 合成 的 探 针 分 子 具 有 相同 的 长 度 。 由 于 PCR 方法 制 得 的 探 针 可 以 被 连续 地 标记 ， 因 此 ， 这 种 探 针 标记 的 程度 很 高 。 关 于 PCR 反应 人 参数 的 详细 讨论 及 其 他 的 相关 策略 ， 请 参考 Dieffenbach 和 Dveksler (2003), Innis 等 (1999), McPherson 和 Hames (1995), Sambrook 和 Russell (2001) 。

13. 4.1.2 随机 引物 法

随机 引物 法 是 一 种 引物 延伸 反应 ， 在 反应 过 程 中 ， 一 些 混合 的 短 寡 核 苷 酸 序列 作为 引物 会 和 热 变性 的 双 链 模板 进行 退火 (Feinberg 和 Vogelsteinmi，1983，1984)。 退 火 的 引物 最 终 会 成 为 探 针 的 一 部 分 ， 因 为 DNA 聚合 酶 工 的 Klenow 片段 会 从 引物 的 3 端 进 行 延 伸 并 挫 人 标记 物 。 随 机 引物 在 线性 DNA 分 子 存在 下 能 够 很 好 地 工作 ; 如 果 试 图 标记 共 价 闭合 的 超 螺 We DNA 分 子 ， 则 会 导致 探 针 特异 性 反应 的 降低 ， 线 性 DNA 分 子 的 探 针 特异 性 反应 是 共 价 闭合 超 螺 旋 DNA 分 子 的 探 针 特异 性 反应 的 20 一 30 倍 。 在 标记 反应 中 ，200 一 2000bp KEE DNA 分 子 是 随机 引物 法 最 好 的 模板 ， 尽 管 模板 的 长 度 并 不 是 决定 性 的 因素 。 当 用 ?了 标记 时 ， 如 果 用 2. 5 一 10ng 的 起 始 模板 量 ， 随 机 引物 法 大 约会 产生 比 活 力 为 〈1 一 3) X109cpmy/ Ag 的 探 针 。 标 记 反 应 通常 需要 10 一 30min。

13.4.1.3 切口 平移 法

切口 平移 法 (Rigby 等 ，1977) 是 最 老 的 探 针 标记 方法 之 一 。 这 种 方法 需要 使 用 稀 释 的 DNase | 7E DNA 双 链 骨架 上 切 出 随机 切口 。 极 低 浓 度 时 ， 这 种 酶 在 模板 上 切 出 4 一 5 个 切 口 ， 产 生 了 一 个 自由 的 3- 羟基。 每 个 切口 的 3 - 产 基 都 可 以 作为 一 个 引物 。 接 下 来 ，DNase 工会 在 探 针 分 子 一 端 以 5 一 3 方向 切除 原 有 的 核酸 〈 外 切 酶 活性 )， 并 且 用 5'>3’DNA 聚合 酶 活性 代 之 以 标记 好 的 dNTP 前 体 。 切 口 平移 法 对 于 线性 的 和 闭合 环 状 的 DNA 分 子 都 具有 较 高 的 效率 ， 标 记 反 应 约 需要 lh, FAY P 标记 时 ， 切 口 平 移 法 会 产生 比 活 力 大 约 为 〈3 一 5) x 108 cpm/pg 的 探 针 。

13.4.1.4 .5 末端 标记

与 连续 标记 的 探 针 不 同 ， 另 一 种 替代 方案 就 是 在 DNA 分 子 的 5 末端 加 上 一 个 放射 性 磷 同位 素 。 这 种 5 末端 标记 的 方法 俗称 激酶 反应 ， 它 特异 地 将 ATP (AEE dATP) 上 的 7-BR 酸 基 团 转移 到 经 过 去 磷酸 化 的 DNA 分 子 的 5 -OH 上 《和 正 向 反应 )。 这 种 标记 反应 是 由 工 4

@ PCR 方法 受 专利 保护 ， 属 于 Roche Molecular Systems, Inc. 和 下. Hoffmann-LaRoche Ltd。 专 利 保 护 下 ，PCR 的 使 用 是 受 限 的 。PCR 必须 在 经 授权 的 热 循 环 仪 上 使 用 。 关 于 特殊 的 细节 请 联系 Director of Licensing, Applied Biosys-

tems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404,

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

多 聚 核 苷 酸 激酶 催化 ， 是 一 种 很 好 的 标记 短 寡 核 苷 酸 的 方法 。 在 实验 室 中 ， 做 这 种 标记 实验 常 犯 的 共同 错误 就 是 购买 标记 的 核 苷 酸 〈 用 于 连续 标记 和 3 ' 端 标记 的 探 针 )， 而 不 是 Y 标 记 的 ATP.

正 向 激酶 反应 的 效率 远 高 于 逆向 的 磷 交 换 反 应 的 效率 ， 磷 交换 反应 指 的 是 替换 5 端 磷 酸 。 虽 然 RNA 也 能 被 磷酸 化 ， 但 它 的 效率 很 低 ， 以 至 于 可 以 忽略 不 计 。 典 型 的 DNA 激酶 反应 需要 30min， 它 以 产生 极 高 比 放射 性 (SA) 的 探 针 而 广 受 青睐 。 最 后 ， 各 种 用 于 5 端 修饰 的 非 同位 素 标 记 试 剂 盒 可 以 从 一 些 商 家 买 到 。

13.4.1.5 3’ Rssapis

以 3 末端 标记 方式 进行 探 针 合成 ， 包 括 使 核 苷 酸 加 到 DNA 或 RNA 的 3 末端 。 催 化 DNA 3 末端 标记 最 常用 的 酶 是 脱氧 核 苷 酸 末 端 转 移 酶 或 普通 的 末端 转移 酶 。 标 记 是 在 单 链 或 双 链 DNA 分 子 的 3-OH 末端 加 上 dNTP; 双 链 的 平 末端 和 3 末端 突出 的 DNA 片段 标记 效率 最 好 。 由 于 不 需要 模板 链 ， 任 何 一 种 dNTP (或 dNTP 混合 物 ) 都 可 以 作为 3 末端 的 标记 核 苷 酸 ; 因 此 ， 末 端 转移 酶 可 以 认为 是 非 模板 依赖 的 聚合 酶 。 这 种 类 型 的 标记 导致 3 末端 的 突出 ， 通 常 只 多 出 来 5 个 或 6 个 核 苷 酸 。 这 些 不 平 的 末端 可 以 根据 需要 用 DNA 聚合 酶 [的 Klenow 片段 补 平 ， 以 用 于 平 末端 连接 ， 只 是 这 种 方法 有 可 能 使 标记 损失 。 了 zz DNA 聚合 酶 像 其 他 没有 校正 功能 的 聚合 酶 一 样 ， 也 有 末端 转移 酶 的 活性 ; SATA, Tag DNA 聚合 酶 会 在 它 合成 的 每 二 条 多 聚 核 苷 酸 链 的 3 末端 加 一 个 多 余 的 核 苷 酸 ， 这 个 核 苷 酸 通常 是 “A”。 因 此 ， 用 Taq DNA 桶 合 酶 做 PCR 时 ， 其 双 链 产物 每 一 条 链 的 3 末端 都 会 有 一 个 多 余 的 核 苷 酸 “A”。

当 标记 短 寡 核 苷 酸 时 ， 这 种 标记 方法 的 缺点 就 显现 出 来 了 。 附 加 的 核 苷 酸 改变 了 分 子 的 长 度 ， 这 可 能 会 改变 守 核 苷 酸 的 特异 性 和 热 动力 学 特性 。 如 果 要 通过 3 端 加 尾 的 方式 标记 一 段 赛 核 苷 酸 ， 强 烈 建议 使 用 dATP， 因 为 A :: 工 碱 基 对 的 热 稳定 性 要 比 G :::C 碱 基于 的 热 稳 定性 低 。

13.4.1.6 直接 的 酶 标记

前 面 讲 到 的 每 一 种 标记 DNA 的 技术 ， 都 可 以 使 已 标记 核 苷 酸 替 换 或 附加 到 探 针 上 。 相 对 于 这 些 不 错 的 技术 ， 一 种 新 的 支持 化 学 发 光 检 测 的 探 针 标 记 技 术 被 开发 出 来 ， 成 为 一 个 可 行 的 替代 方案 。 这 种 方法 叫 作 直接 的 酶 标记 ~CECL System; Amersham Biosciences, Piscat- away，NJ)， 它 通过 戊 二 醛 直 接 将 酶 交 联 到 热 变 性 的 DNA 骨架 上 ， 这 种 酶 可 以 产生 化 学 发 Hes 这 种 方法 具有 极 高 的 标记 效率 ， 只 需要 20min 就 可 以 完成 对 探 针 的 标记 。 此 外 ， 也 不 需要 后 续 的 步骤 来 除去 没有 挫 人 的 标记 物 。 简 单 地 说 ， 双 链 DNA 先 煮 沸 5min， 然 后 在 冰 上 迅速 冷却 ， 以 最 大 程度 地 减少 复 性 ;然后 戊 二 醛 将 修饰 的 HRP 连接 到 单 链 DNA 上。 因为 标记 完成 的 探 针 不 能 再 煮沸 ， 而 且 变 性 的 DNA 在 相对 较 短 的 时 间 内 会 重新 配对 ， 所 以 ， 应 当 只 标记 所 需要 量 的 控 针 。 而 且 标记 好 后 ， 应 立即 将 探 针 加 入 到 杂交 混合 液 中 。 因 为 在 整个 杂交 和 后 续 的 洗涤 步骤 〈 参 见 第 14 章 ) 中 ， 酶 是 一 直 存 在 的 ， 其 严 前 度 的 调整 必须 通过 离 于 强度 的 调节 和 去 稳定 剂 〈 如 SDS 和 尿素 ) 的 使 用 来 完成 ， 而 不 能 升 高 温度

13.5 反 义 RNA #4

RNA 探 针 作为 杂交 工具 仍然 很 常用 ， 因 为 它们 具有 几 个 重要 的 优点 。 这 些 探 针 是 通 芝 体外 转录 的 方式 合成 ， 而 且 几 乎 在 所 有 的 应 用 中 都 可 以 EA DNA 探 针 。 在 转录 模板 的 结构 中 ， 用 来 转录 的 cDNA 两 端 连 接 了 两 个 不 同 来 源 的 喉 菌 体 RNA 聚合 酶 启动 子 。 这 两 个 启动 * 164 -

eS ee en ee eee

子 位 于 多 克隆 限制 性 内 切 酶 位 点 的 两 侧 ， 而 且 在 相反 的 方向 。 最 常见 的 结构 是 SPO A T7 或 工 3 噬菌体 RNA RAAB OS CA 13.4)。 在 转录 反应 启动 之 前 ， 转 录 片 段 通过 适当 的 限制 性 内 切 酶 线性 化 ， 这 可 以 以 最 大 的 效率 转录 出 具有 相同 长 度 和 连续 标记 的 探 针 CA 13.5).

从 同一 个 模板 结构 的 正义 链 和 反 义 链 转录 出 的 产物 ， 是 构成 所 需要 的 RNA 探 针 的 不 可 或 缺 的 部 分 。 反 义 RNA 和 mRNA 是 互补 的 ， 因 此 可 以 和 mRNA 进行 碱 基 配 对 。 在 转录 研究 中 ， 反 义 RNA 除了 可 以 用 作 探 针 外 ， 还 可 以 在 翻译 水 平抑 制 基因 表达 ， 这 是 由 于 形成 了 不 能 翻译 的 Wet RNA 结构 一 一 这 是 RNA 王 扰 (CRNAi) 的

第 13 章 “核酸 探 针 技术

DNA 插 入 序列

图 13.4 在 支持 体外 转录 的 质粒 结构 中 ， 典 型 的 双 RNA 聚合 酶 启动 子 的 转录 方向 。 转 录 模 板 位 于 两 个 启动 子 之 间 ， 模 板 通常 是 cDNA。 起 始 转录 之 前 ， 质 粒 结构 进行 线性 化

核心 。 很 早 以 前 ， 实 验 显 示 ， 反 义 RNA 在 体外 哺乳 动物 系统 中 可 以 调控 基因 表达 〈Nishik- rua 和 Murray，1987) ， 同 样 的 结果 也 发 生 在 吹 菌 体 、 细 菌 和 植物 (Green 等 ，1986) 以 及

其 他 动物 〈(Knecht 和 Loomis, 1987) 中 。

cDNA 插入 序列

Ease Scope TESS

正义 链 RNA 转 录 产 物

一 一

质粒 载体

将 载体 线性 化 \

体外 转录

-一 二 RUHERNAH REY 被 称 为 CRNA

图 13.5 体外 转录 之 前 ， 模 板 必须 线性 化 ， 这 有 利于 提高 转录 效率 ， 可 以 转录 出 大 量 的 具有 相同 长 度 的 探 针 。 请 注意 ， 启 动 子 的 位 置 决 定 了 转录 产物 是 正义 RNA (sense RNA) 还 是 反 义 RNA (antisense RNA)。 如 果 捅 人 的 cDNA HF i 是 不 知道 的 ,那么 就 必须 弄 清 哪 个 启动 子 转 录 哪 种 产物

例如 ， 某 个 研究 者 想 确定 哪 种 细胞 正在 合成 N-myc mRNA,， 由 此 描绘 出 病 鼠 小 脑 的 组 织 病理 学 特征 。 这 种 检测 要 准备 一 个 组 织 切片 进行 原 位 杂交 @。 因 为 在 这 个 研究 中 其 目标 是

O 对 原 位 杂交 的 很 好 探讨 ， 请 参考 Chesselet (1990), Wilkinson (1992) 和 Nuovo (1994),

。 165 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

mRNA， 所 以 需要 使 用 反 义 RNA 做 探 针 。 当 反 义 RNA 和 mRNA 杂交 时 ， 会 具有 较 高 的 热 动力 学 稳定 性 ， 这 就 允许 在 严谨 的 条 件 下 进行 分 析 。 正 义 RNA 探 针 〈 和 这 个 mRNA 具有 相同 序列 的 探 针 ) 也 需要 转录 出 来 ， 作 为 负 对 照 来 估计 非特 异性 杂交 的 程度 。 一 种 方法 是 ， 在 DIG 标记 的 UTP (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 或 FL 标记 的 UTP (Am- ersham Biosciences, Piscataway, NJ) 存在 的 条 件 下 ， 将 正义 人 RNA 探 针 和 反 义 RNA 探 针 合成 出 来 ， 接 下 来 通过 显 色 反 应 法 来 检测 。 色 素 沉淀 的 分 布 通过 光学 显微镜 来 检测 FP AN BW. FIRM RNA 在 组 织 切 片上 的 分 布 后 ， 就 可 以 用 反 义 RNA 通过 Northern 印迹 结合 化 学 发 光 检 测 来 共同 确定 N-myc mRNA 的 定性 信息 。

13.5.1 RNA 探 针 的 特点

@ RNA 探 针 是 单 链 的 。 这 种 探 针 在 使 用 前 不 需要 煮沸 ， 但 稍微 加 热 一 下 可 以 打 乱 可 能 形成 的 分 子 内 碱 基 配对 。

@ PRA RNA 探 针 分 子 都 可 以 用 来 杂交 。 因 为 它们 是 单 链 的 ， 所 以 不 会 像 DNA 那样 发 生 复 性 反应 而 降低 探 针 的 有 效 浓度 ， 虽 然 也 可 能 发 生 分 子 内 碱 基 配 对 。

@ RNA 探 针 在 转录 时 是 连续 标记 的 ， 因 此 生成 的 探 针 挨 人 了 大 量 的 标记 物 。

图 45 DNA 探 针 相 比较 ，RNA 探 针 在 与 DNA 或 RNA 靶 分 子 杂 交 时 ， 显 示 出 了 更 高 的 热 动力 学 稳定 性 。 |

@ RNA 探 针 是 通过 体外 转录 的 方法 从 同一 模板 合成 ， 因 此 所 有 的 探 针 分 子 的 长 度 是 一 样 的 。

© 一 次 体外 转录 反应 就 可 以 合成 大 量 RAN 探 针 @ 。

@ 构建 转录 模板 时 ， 待 转录 的 CDNA 两 端 一 般 都 有 高 效 的 喉 菌 体 RNA 聚合 酶 启动 子 。 或 者 使 用 一 个 好 的 载体 ， 在 它 的 多 克隆 位 点 两 端 各 有 一 个 转录 方向 相反 的 RAN RAB 子 。 这 样 根 据 需要 ， 正 义 RNA 探 针 和 反 义 RNA 探 针 都 可 以 转录 出 来 。 最 常用 的 是 SE6 和 T7 或 工 3 MAA RNA 聚合 酶 启动 子 。

@ 实验 显示 ，SP6 Al T7 sk T3 噬菌体 RNA 聚合 酶 启动 子 并 不 被 交叉 识别 。 因 此 ， 转 录 反 应 从 其 中 一 个 启动 子 开始 时 ， 另 一 个 启动 子 不 会 启动 相反 方向 的 转录 。

@ 用 来 合成 RNA 探 针 的 质粒 ， 在 开始 体外 转录 之 前 一 定 要 将 其 线性 化 。

人 和 处 理 其 他 RNA 一 样 ， 体 外 转录 RNA 探 针 一 定 要 用 无 RNase 的 试剂 ， 否 则 会 导致 转录 探 针 的 迅速 降解 。

@@ RNA 探 针 经 常会 产生 不 能 接受 的 高 亮度 背景 ， 因 此 当 杂 交 完 成 后 ， 通 常会 用 RNase A 和 有 RNase Ti 将 所 有 探 针 消化 掉 。 这 是 为 了 除去 所 有 没有 形成 双 链 的 探 针 。

@ 放射 性 同位 素 标记 的 RNA 探 针 比 活力 极 高 ， 导 致 它们 在 长 时 间 储 存 时 会 因 放射 照射 而 降解 。

13.5.2 RNA 探 针 的 合成

和 各 种 DNA 探 针 的 合成 方法 相 比 较 ， 标 记 的 RNA 探 针 只 有 一 种 可 靠 的 合成 方法 ， 那 就 是 体外 转录 。 因 为 RNA 容易 降解 ， 而 且 对 RNase 的 作用 很 敏感， 所 以 处 理 RNA 探 针 时 ， 必 须 像 处 理 其 他 RNA 时 那样 小 心 下 面 简 单 地 介绍 了 一 下 RNA 的 标记 技术 。RNRA 体

@ 有 文章 (Krieg 和 Melton, 1987) 报道 ， - 166 -

通过 降低 标准 的 反应 温度 ， 可 以 提高 全 长 转录 产物 的 比例

第 13 章 “核酸 探 针 技术

外 转录 系统 已 经 有 了 试剂 盒 ， 从 很 多 商家 都 可 以 买 到 ， 而 且 除 了 同位 素 外 ， 所 有 必需 试剂 都 已 包括 在 内 。 这 些 系统 在 没有 同位 素 时 也 可 以 很 好 地 工作 。

13.5.2.1 体外 转录

合成 RNA 探 针 时 ， 体 外 转录 是 唯一 可 靠 的 方法 。 大 量具 有 相同 长 度 的 高 效 标记 探 针 可 以 从 连接 有 RNA 启动 子 的 DNA 序列 中 转录 出 来 。 有 一 个 很 好 的 方法 ， 就 是 将 需要 转录 的 DNA 序列 克隆 到 具有 相反 转录 方向 的 两 个 启动 子 之 间 。 这 样 就 可 以 将 DNA 的 两 条 链 都 转 录 出 来 ， 产 生 正 义 RNA 和 反 义 RNA 用 作 杂 交 反 应 。 现 在 已 有 多 种 有 用 的 RNA 探 针 克隆 载体 (Promega，Madison，WI) ， 在 进行 RNA 探 针 体外 转录 实验 时 ， 通 常 是 非常 好 用 的 。

正如 在 体内 时 一 样 ，RNA 探 针 的 体外 转录 是 由 NTP 前 体 的 聚合 完成 的 。 转 录 产 物 的 延长 是 通过 核 苷 单 磷酸 添加 到 探 针 初生 产物 的 骨架 上 来 完成 的 。 和 所 有 的 连续 标记 探 针 一 样 ，RNA 探 针 标记 所 需要 的 [3PJjUTP 同位 素 是 标记 在 vc 位 上 。 因 为 探 针 的 标记 是 在 合成 时 完成 ， 所 以 标记 挫 入 的 水 平 非常 高 。

100 S252) 15 Re RID

另 一 种 方法 不 是 通过 体外 转录 产生 连续 标记 的 RNA 探 针 ， 而 是 在 探 针 分 子 的 5 末端 标 记 上 一 个 放射 性 同位 素 磷 。5 末端 标记 法 俗称 激酶 反应 。 就 是 特异 地 将 ATP 上 的 六 磷 转 移 到 RNA 或 DNA 的 5-OH 上 “ 正 向 反应 )。 相 对 于 替换 5 末端 磷酸 的 交换 反应 来 说 ， 正 向 的 激酶 反应 具有 更 高 的 效率 。 这 一 反应 由 T4 多 聚 核 苷 酸 激酶 来 催化 。 用 这 个 方法 标记 DNA 比 标记 RNA 效率 更 高 ， 这 也 是 它 不 常用 作 标 记 RNA 的 一 个 原因 。

想 通过 此 法 标记 的 实验 室 常 犯 的 共同 错误 就 是 购买 o 标记 的 核 背 酸 〈 用 作 连 续 标 记 和 3’ 末端 标记 ) ， 而 不 是 所 需要 的 y 标记 ATP.

村 宛

RNA 也 可 以 用 poly(A) 聚合 酶 进行 3 末端 标记 。 这 个 酶 在 生物 体内 催化 细胞 核 内 hnRNA 的 多 聚 腺 苷 化 ,把 AMP BA 3 末端。 同位素 需要 a 标记 的 ATP 前 体 。 除 了 在 RNA 探 针 合成 反应 中 的 用 处 ，poly(A) 聚合 酶 还 参与 无 poly(A) 的 mRNA 或 其 他 RNA WA RR. Wt oligo(dT) 引物 介 导 的 cDNA 人 合成。 虽然 这 种 标记 方法 也 可 以 ， 但 在 实际 上 它 只 是 合成 探 针 时 的 最 后 选择 。

13.6 探 针 的 纯化

和 大 多 数 标记 技术 一 样 ， 没 有 挫 和 的 标记 物 必 须 从 标记 好 的 探 针 中 分 离 出 来 。 特 别 是 使 用 同位 素 时 ， 如 果 没 有 做 好 这 一 步 ， 通 常会 导致 背景 高 到 无 法 接受 的 程度 。 有 三 种 基本 的 方 法 可 以 纯化 探 针 。 为 了 获得 最 佳 结 果 ， 必 须 按 照 标 记 系 统 附 带 的 商家 建议 去 做 。

第 一 种 方法 是 用 乙醇 沉淀 探 针 ， 这 种 情况 下 ， 没 有 挫 人 的 标记 物 仍 然 留 在 上 清 液 中 。 这 是 一 种 有 效 的 纯化 长 探 针 的 方法 ， 但 沉淀 短 的 守 核 苷 酸 就 比较 困难 ， 特 别 是 核酸 量 很 少 的 时 候 。 沉 淀 探 针 要 同时 加 入 盐 和 乙醇 〈 参 见 第 5 章 ， 表 5. 2)， 一 般 加 入 0. 1 倍 体积 的 3mol/L 乙酸 钠 和 2. 5 倍 体积 的 95% 乙 醇 。

第 二 种 常用 的 探 针 纯化 方法 就 是 凝 胶 过 滤 ， 或 其 修改 方案 。 一 个 流行 的 方法 是 制作 或 购 买 离心 分 离 柱 (Sambrook 和 Russell，2001)， 其 中 含有 lml 用 注射 器 压 紧 的 交 联 葡 聚 糖 (Sephadex) (Amersham Biosciences), Sephadex G-50 用 来 纯化 长 的 探 针 ，Sephadex G-25 用 来 纯化 短 的 寡 核 苷 酸 。 离 心 柱 层 析 法 〈spun-column chromatography) 是 一 种 广 受 褒 奖 的

。 167 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

凝 胶 过 滤 方 法 ， 只 需 在 1000Xg 一 1200Xg& 的 离心 力 下 离心 约 4min Ba; 探 针 很 快 被 洗 脱 出 来 ， 而 没有 挫 入 的 核 苷 酸 则 留 在 柱子 内 。 这 种 方法 往往 可 除去 超过 95%% 的 未 挫 人 标记 物 。 凝 胶 过 滤 纯 化 探 针 在 各 种 标记 方法 中 都 被 广泛 使 用 ， 包 括 同位 素 和 非 同位 素 的 。

第 三 种 常用 的 探 针 纯化 方法 ， 包 括 使 用 各 种 浓缩 材料 或 吸附 材料 纯化 探 针 。 这 些 材 料 有 Elutip-d 微 过 滤 柱 (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Ultrafree WAS (Ultrafree filtration units) 和 Centricon 系列 (Centricon devices) (Millipore, Billerica, MA), 574% 统 的 柱 层 析 和 乙醇 沉淀 法 相 比较 ， 这 类 探 针 纯化 方法 具有 快速 、 方 便 的 优点 。 因 为 这 些 材料 是 一 次 性 的 ， 所 以 将 放射 标记 废物 的 污染 降 到 了 最 低 。

13.7 44666

只 有 保持 足够 剩余 放射 活性 的 同位 素 标记 探 针 才 是 有 用 的 。 一 般 来 说 ， 放 射 标记 的 探 针 在 标记 后 应 尽 可 能 立即 使 用 。 探 针 的 放射 性 分 解 作用 ， 特 别 是 那些 具有 极 高 比 活力 的 探 针 ， 随 着 探 针 保存 时 间 的 延长 ， 问 题 益 发 严重 。 使 用 前 ， 探 针 要 保存 在 一 20C 或 一 80C， 避 免 反 复 冻 融 。

非 同 位 素 标记 的 探 针 需要 根据 标记 后 储存 和 操作 的 建议 来 进行 。 生 物 素 标记 的 探 针 \ 地 高 辛 标记 的 探 针 和 荧光 素 标记 的 探 针 ， 可 在 一 20C 下 保存 1 年 以 上 。 在 一 些 实验 室 ， 花 三 整 天 的 时 间 合 成 非 同 位 素 标记 的 探 针 ， 以 供 后 面 数 周 甚 至 数 月 之 用 。 一 旦 需要 做 杂交 实验 ， 马 上 就 有 探 针 可 用 。 除 非 即 将 需要 使 用 探 针 ， 和 否则 不 要 将 其 变性 。

13.8 ABA BH

不 同 研究 者 的 技术 不 一 致 以 及 日 常 操作 误差 ， 常 常 导致 科研 工作 中 的 错误 。 这 些 错 误 在 每 个 层面 上 都 会 发 生 ， 从 个 人 的 实验 技术 到 数据 分 析 。 为 了 至 少 在 一 个 方面 排除 转录 分 析 中 发 生 错误 的 可 能 性 ， 一 个 通用 的 方法 就 是 测定 内 源 参 照 物 (internal control) 或 内 源 标准 (endogenous standard) ， 它 们 的 表达 情况 不 会 因 实验 操作 的 不 同 而 变化 。 它 们 通常 被 称 为 参 HA (reference) 或 看 家 基因 (housekeeping genes) 。 这 些 看 家 基因 的 转录 产物 ， 可 以 使 两 个 或 两 个 以 上 的 样品 标准 化 〈 有 意义 的 比较 ); 在 目的 基因 分 析 之 前 或 之 后 ， 在 同 三 个 印迹 腊 上 或 同一 样品 系列 中 ， 要 对 看 家 基因 进行 分 析 。 因为 Northern 分 析 法 的 原理 所 致 ， 使 得 这 种 技术 普遍 缺乏 灵敏 度 ， 因 而 需要 多 做 重复 。 通 过 核酸 酶 保护 实验 (参见 第 16 Be). 把 转录 聚合 酶 链 反应 〈RT-PCR) 〈 参 见 第 19 章 ) 和 其 他 的 定量 PCR 技术 (参见 第 20 B) 都 可 以 获得 很 高 灵敏 度 的 数据 。 无 论 使 用 什么 方法 ， 看 家 基因 的 分 析 是 必要 的 。

然而 ， 很 多 通用 的 组 成 型 表达 的 看 家 基因 本 身受 细胞 类 型 的 影响 而 改变 ， 自然 也 没有 哪 一 种 内 部 对 照 可 以 适合 所 有 情况 。 下 面 列 出 了 部 分 常用 的 参照 基因

J 有 肌 动 蛋白 〈B-actin) 是 一 种 中 等 丰 度 的 、 组 成 型 表达 的 转录 产物 , LAR 所 有 类 型 的 细胞 中 都 有 表达 (Kinoshita 等 ，1992) 。 它 是 历史 上 第 一 个 用 作对 照 的 转 逐 产物 ， 现 在 仍然 经 常 使 用 。 但 是 ， 很 多 文章 显示 这 个 基因 的 表达 会 根据 不 同 的 外 部 刺激 和

内 部 状态 而 发 生变 化 〈Leof 等 ，1986; de Leeuw 等 ，1989; Dodge 4, 1990; Solomon 等 ， 1991; Spanakis, 1993)

OQ HTWME-3-HF MI LE (GAPDH) 具有 中 等 丰 度 的 转录 产物 ， 编码 了 糖 酵 解 途径 中 。168 -

第 13 章 BMRA

的 一 个 关键 酶 。GAPDH 表达 的 转录 产物 作为 参照 基因 使 用 很 广 ， 包 括 本 实验 室 也 在 使 用 。 和 B-actin 的 情况 一 样 ，GAPDH 基因 的 表达 也 容易 受到 各 种 外 部 条 件 的 影响 (Alexander 等 ，1990; Mansur 等 ，1993; Bhatia 等 ，1994) 。

@ 亲 环 蛋白 〈cyclophilin) 是 一 种 参与 肽 键 异 构 化 的 蛋白 质 ， 其 基因 具有 高 度 的 保守 性 ， 在 细胞 质 中 它 的 RNA 转录 产物 为 中 等 丰 度 。 虽 然 其 转录 产物 用 作对 照 ， 但 也 发 现 了 亲 HEA mRNA 表达 的 变化 (Danielson 等 ，1988; Haendler 和 Hofer, 1995).

@ 组 蛋白 〈histones) 是 核 小 体 〈nucleosome) 形成 所 必需 的 一 类 家 族 蛋 白 。 它 具有 高 丰 度 的 转录 产物 ， 经 常 作 为 看 家 基因 被 检测 (Robert 等 ，2002) 。

@ 其 他 的 基因 ， 包 括 纤 粘连 蛋白 “〈 高 丰 度 转录 产物 ， 存 在 于 细胞 外 基质 )、 转 铁 蛋 白 受 体 〈 中 低 丰 度 表 达 ， 铁 的 摄取 )、 泛 肽 〈 一 种 小 蛋白 质 ， 介 导 其 他 蛋白 质 经 由 蛋白 酶 体 降解 )、 核 纤 层 蛋白 和 微 管 蛋 白 〈 高 丰 度 转 录 产 物 ， 微 管 的 构成 单元 ) 的 mRNA 被 广泛 用 作对 照 。 这 些 基因 表达 的 和 蛋白质 产物 ， 在 细胞 中 都 有 其 特定 的 功能 。 虽 然 总 是 有 些 例 外 ， 但 总 的 来 说 ， 这 些 基因 的 表达 在 mRNA 水 平 波动 的 可 能 性 较 小 。 但 是 ， 第 一 件 事 是 要 进 行 检测 。

© 28S rRNA 和 18S rRNA 是 核糖 体 基 因 转录 后 调节 的 产物 ， 含 量 极 丰 ， 其 转录 产物 几 乎 恒定 不 变 ， 经 常用 作 内 源 参 照 物 (de Leeuw 等 ，1989; Bonini 和 Hofmann，1991)。 这 些 转录 产物 是 成 熟 的 核糖 体 的 必需 成 分 。 笔 者 认为 ，28S rRNA 和 18S rRNA 作为 电泳 加 样 量 的 对 照 ， 比 作为 基因 的 表达 对 照 更 好 ， 因 为 它们 是 RNA 聚合 酶 工 的 产物 ， 而 mRNA 和 它 的 未 剪接 前 体 hnRNA 是 由 RNA 聚合 酶 下 转录 出 来 的 。 这 些 RNA 聚合 酶 对 不 同 的 生物 异 源 物 (xenobiotics) 具有 不 同 的 敏感 性 。 所 以 ， 在 实验 操作 过 程 中 ， 很 可 能 会 引起 RNA 聚合 酶 开 转 录 的 完全 抑制 ， 然 而 RNA 聚合 酶 和 RNA 聚合 酶 于 可 能 继续 以 接近 正常 的 水 平 进 行 转录 。 当 然 ， 相 反 的 情况 也 是 有 可 能 发 生 的 。

@ 线粒体 16S rRNA， 中 等 丰 度 ， 存 在 于 线粒体 中 。 与 细胞 质 中 的 16S rRNA 相 比 ， 较 少 用 作 内 源 参 照 物 。 这 些 线粒体 基因 的 表达 受 实验 操作 影响 的 程度 远 远 低 于 位 于 细胞 核 中 的 tRNA 基因 (Tepper 等 ，1992)， 但 它 是 核糖 体 基 因 产 物 而 不 是 mRNA,， 所 以 也 应 当 考虑 第 @ 条 所 提 到 的 问题 。

@ 转移 RNA (tRNA) 有 多 种 高 丰 度 转录 产物 ， 在 翻译 过 程 中 ， 它 们 将 氨基 酸 转 运 到 核糖 体 。 有 时 会 用 tRNA 特异 性 探 针 测量 tRNA 的 总 量 ， 作 为 加 样 量 的 对 照 。tRNA 是 由 RNA 聚合 酶 芽 转 录 出 来 的 ， 所 以 更 适合 用 作 加 样 量 的 对 照 ， 而 不 是 基因 表达 的 对 照 ， 理 由 同 第 @9 条 所 述 。

人 为 加 入 一 定量 的 体外 转录 的 RNA 样品 作对 照 ， 可 能 也 很 有 用 。 这 种 人 工 转录 产物 ， 通常 和 至 少 一 种 实验 要 分 析 的 转录 产物 有 关 ， 然 而 是 截 短 的 ， 所 以 它 可 以 为 探 针 所 识别 ， 与 目的 转录 本 有 着 相似 的 热 稳 定性 ; 而 且 它 在 电泳 结果 上 显示 出 不 同 的 条 带 ， 这 将 确保 对 照 和 目的 片段 可 以 分 开 。 沿 着 相同 的 思路 ， 如 果 RNA 在 下 游 应 用 中 被 用 来 做 RT-PCR 的 话 ， 导 和信 一 个 真正 的 RNA 样品 “〈 例 如 免 球 蛋白 mRNA) 可 能 是 特别 有 用 的 。 思 路 是 这 样 的 ， 免 球 蛋白 转录 产物 会 被 反 转 录 出 来 ， 并 通过 PCR 进行 扩 增 ， 在 理想 情况 下 ， 其 反 转 录 和 扩 增 效 率 与 样品 中 其 他 RNA 是 相同 的 。 因 为 加 入 到 每 份 样品 中 的 球 蛋 白 mRNA 的 精确 含量 是 已 知 的 ， 所 以 通过 比较 球 和 蛋白 特 异 的 PCR 扩 增 产物 ， 就 可 以 对 每 一 份 实验 样品 进行 标准 化 ，

© 原 书 为 “@”， 译 者 认为 有 误 ， 改 为 “@”。 译 者 注 - 169 。

RNA 分 敲 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

并 进而 推 知 每 管 中 反 转录 反应 的 效率 。 诸 如 此 类 的 方法 ， 常 常 可 以 发 现 由 于 实验 操作 的 原因 引起 实验 结果 的 波动 ， 此外， 通过 添加 不 同 浓度 的 外 源 RNA 到 不 同 的 样品 中 ， 火 们 可 以 勾 画 出 对 照 条 带 亮度 与 加 入 量 之 间 的 相关 标准 曲线 ， 用 于 与 目的 条 带 亮 度 相 比较 。 关 于 这 种 方 法 在 RT-PCR 定量 上 应 用 的 细节 ， 请 参考 第 19 章 和 第 20 章 。

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〈 郭 立 涛 译 ;， 陈 祥 龙 校 )

人

S48 GHAXWA

14.1 #ABE

1961 年 Marmur 和 Doty 第 一 次 具体 描述 了 核酸 杂交 的 过 程 ， 而 其 调控 的 参数 成 为 分 子 生物 学 研究 中 最 复杂 最 难以 理解 的 部 分 。 分 子 杂 交 的 核心 ， 就 是 两 个 互补 的 守 核 苷 酸 以 反 向 碱 基 配 对 的 方式 形成 双 链 分 子 。 这 种 现象 也 称 为 双 螺旋 形成 。

在 有 利于 核酸 杂交 的 条 件 下 ， 参 与 构成 双 螺 旋 的 链 有 它们 特定 的 名 称 。 探 针 链 ， 正 如 其 名 字 所 暗示 的 一 样 ， 它 们 通常 能 够 携带 某 类 标记 ， 因 而 可 以 在 杂交 结束 后 对 探 针 进行 定位 和 定量 分 析 。 另 一 条 链 通常 称 为 靶 链 ， 要 么 固 相 化 于 固 相 支持 物 ， 以 利于 以 滤 膜 为 基础 的 分 析 “〈 如 North- ern 分 析 或 斑点 印迹 分 析 ); 要 么 重 悬 于 缓冲 液 中 ， 自 由 参与 液 相 杂交 CUS] 核酸 酶 分 析 )。

举例 : 一 个 组 织 样 品 抽 提 的 总 RNA 中 含有 上 千 种 不 同 的 mRNA。 特定 的 研究 目标 可 能 是 确定 活体 解剖 得 到 的 细胞 中 的 omy 转录 本 。 为 了 解决 此 问题 ， 需 要 一 个 合适 的 互补 的 探 针 ， 也 就 是 说 ， 一 个 只 能 和 cmyc 转录 本 杂交 的 探 针 。 此 探 针 可 以 是 一 段 CDNA 序列 、 一 段 基因 组 序列 、 一 段 反 义 RNA FRI — TEKH R. cmyc 特异 的 探 针 可 以 用 2P 标记 ， 以 利于 放射 自 显 影 检测 ;或 用 第 13 章 介 绍 的 任何 一 项 支持 化 学 发 光 检 测 的 探 针 标记 技术 ， 如 用 半 抗 原 Chapten) 标记 探 针 或 直接 用 酶 标记 探 针 。 如 果 杂 交 严 谨 度 足够 的 话 ，czzayc 探 针 分 子 就 只 能 和 互补 的 c-myc 转录 本 杂交 ， 而 相应 的 该 转录 本 是 此 特定 探 针 的 靶 序 列 。 正 确 操作 时 ， 探 针 物 质 的 量 (mol) 大 大 过 量 ， 所 有 互补 的 靶 链 可 以 和 探 针 全 部 互补 配对 号 同样 可 以 研究 其 他 基因 的 表达 情况 ， 所 需要 的 只 是 不 同 的 目的 基因 的 探 针 。 实 际 操作 中 ， 通 常 采 取 的 策略 就 是 将 含有 RNA 样品 的 滤 膜 多 次 杂交 : 经 过 第 一 轮 杂 交 和 检测 ， 通 过 严格 的 洗涤 去 除 探 针 ， 然 后 同一 张 滤 膜 用 完全 不 同 的 、 可 检测 另 一 种 mRNA 的 探 针 杂交 。

杂交 结束 后 ， 严 格 洗涤 滤 膜 去 除 没有 结合 的 剩余 探 针 。 杂 交 的 量 级 计算 方式 和 实验 初期 使 用 的 探 针 标记 方法 一 样 ， 要 么 通过 放射 自 显影 ， 要 么 通过 化 学 发 光 技术 。 而 且 为 了 在 和 射线 胶片 上 永久 记录 分 子 量 标准 的 位 置 ， 实 验 者 可 能 希望 制备 能 和 分 子 量 标准 杂交 的 少量 探 针 ， 因 为 这 样 可 以 更 好 地 检测 目的 核酸 。 该 方法 避免 了 猜测 相对 于 实验 样品 的 分 子 量 标准 的 相对 位 置 。

14.2 影响 参 交 动力 学 和 特 导 人 性 的 因素

最 早 的 Southern 印迹 (Southern, 1975) 描述 了 DNA 探 针 和 其 相应 的 DNA aE Fe Dl AY 杂交 过 程 。 由 此 得 到 的 DNA : DNA 双 螺 旋 分 子 ， 在 热力 学 方面 没有 由 RNA $a RNA & 。 172+

第 14 章 “核酸 杂交 应 用

针 单 独 或 同时 参与 杂交 得 到 的 DNA :RNA 及 RNA : RNA 双 螺 旋 分 子 稳定 。 关 键 在 于 杂交 时 和 杂交 后 的 洗涤 的 严谨 度 ， 其 严谨 度 要 根据 探 针 和 靶 分 子 之 间 形 成 的 双 螺 旋 体 CDNA : DNA/DNA : RNA/RNA: RNA) 的 化 学 性 质 来 调整 。

举例 : 一 个 研究 者 要 用 人 类 互补 DNA(CcDNA) 探 针 检测 斑马 库 。 由 于 序列 之 间 的 差异 性 ， 斑 马 基因 组 中 可 能 不 存在 人 类 的 有 关 基 因 。 或 者 斑马 基因 组 中 存在 人 类 保守 度 低 的 基因 序列 ， 但 是 因为 序列 差异 大 ， 用 于 人 类 基因 的 探 针 在 严格 的 杂交 条 件 下 也 许 不 能 和 部 分 子 杂 交 。 要 鉴定 斑马 基因 组 序列 中 是 否 存在 与 人 类 cDNA 探 针 互补 的 序列 ， 又 或 者 是 通过 Northern 分 析 或 Southern 分 析 进 一 步 鉴 定 这 些 相 关 序 列 ， 那 么 就 必须 降低 杂交 条 件 的 严谨 度 ， 如 在 后 面 章节 所 描述 的 ， 需 要 依据 部 分 互补 的 原理 来 杂交 。

影响 探 针 杂 交 的 速度 、 特 异性 、 保 真 度 和 有 效 利 用 率 的 因素 ， 包 括 以 下 几 点 : 温度 、 离 子 强度 〈 主 要 是 Na+ ) pH, ALAA COP RR). Re SRY Mime (G+C) 含 量 、 探 针 长 度 、 探 针 浓 度 、 探 针 的 复杂 度 〈 杂 交 中 不 同 探 针 序列 的 总 体 长 度 ) 、 探 针 与 靶 序 列 之 间 的 互补 程度 、 错 配 率 和 体系 的 黏稠 度 等 。 影 响 杂 交 的 因素 很 多 ， 并 不 局 限于 以 上 这 些 因素 。 认 识 这 一 点 是 重要 的 ， 每 个 变量 的 影响 也 取决 于 单 链 探 针 与 靶 分 子 所 处 的 状态 : OF 液 杂交 ， 探 针 与 半 分 子 在 特异 杂交 混合 液 中 随机 移动 ， 如 核酸 酶 保护 实验 和 聚合 酶 链 反 应 CPCR);，@ 固 相 杂 交 ， 驾 序列 固 相 化 在 固 相 支 持 物 上 ， 如 Northern 印迹 。

14.2.1 #8E

在 促进 或 阻止 杂交 的 所 有 变量 中 ， 体 系 的 温度 可 能 是 最 常 考虑 也 是 最 易 操 作 的 变量 。 通 过 计算 得 到 的 解 链 温度 (Tu )， 不 仅 可 以 衡量 杂交 物 的 稳定 性 ， 还 可 以 预测 杂交 到 何 种 程 度 。 在 分 子 杂 交 中 ， 常 认为 Ta 是 一 个 平衡 点 。Ta 是 指 50%% 的 分 子 杂交 ， 余 下 50 儿 的 分 子 仍 解 离 成 单 链 组 分 时 的 温度 。 也 就 是 说 在 Ta 时 ， 每 形成 一 个 新 的 双 链 ， 另 一 个 双 链 正在 解 离 。 监 测 这 种 现象 的 一 个 最 常用 的 指标 ， 就 是 DNA 在 260nm 波长 处 的 紫外 吸光 值 变 化 。 当 WHE DNA 开始 变性 成 其 单 链 组 分 时 ， 伴 随 着 吸光 值 的 增加 ， 并 与 解 链 程度 有 一 定 的 比例 关 系 ， 称 为 增色 效应 。 这 种 检测 通常 可 以 鉴定 双 链 分 子 的 热力 学 稳定 性 。

对 于 长 探 针 而 言 ， 杂 交 的 最 大 速率 是 在 低 于 计算 得 到 的 Tn 值 15 一 20C 温 度 下 观测 到 的 。 盐 溶液 中 ， 相 应 的 杂交 温度 大 约 在 60 一 65'"C 。 后 面 会 叙 及 甲 酰胺 加 入 对 该 参数 的 影响 。 用 针对 一 种 核酸 的 探 针 去 杂交 另 一 种 核酸 时 ， 如 两 者 的 解 链 温度 相差 1C ， 那 么 相应 地 两 种 核酸 序列 的 差异 也 相差 1% (Bonner 等 ，1973) 。 甲 酰胺 的 加 入 ， 通 常会 在 不 改变 其 严 谭 度 的 情况 下 ， 大 幅度 降低 杂交 温度 。

最 后 ， 因 为 在 探 针 的 Tn 时 ， 只 有 502% 的 分 子 形成 双 链 ， 而 研究 者 显然 并 不 希望 仅 50%% 的 靶 分 子 杂 交 。 所 以 实际 操作 中 的 杂交 温度 通常 至 少 低 于 Ta 值 5C ， 可 能 更 低 。 如 果 有 理由 认为 探 针 与 靶 序列 不 严格 配对 的 话 ， 这 样 做 特别 正确 。 研 究 者 想 要 的 是 与 探 针 完全 配 对 。 但 实际 情况 是 ， 在 洗涤 步 又， 即 在 杂交 过 程 后 ， 开 始 检测 前 ， 研 究 者 过 度 控 制 了 严谨 度 。 因 此 ， 在 某 些 情况 下 ， 在 室温 下 进行 杂交 是 极其 有 效 的 ;只 要 滤 膜 在 探 针 检测 前 正确 洗 涤 ， 相 对 低温 度 的 杂交 对 结果 不 会 产生 负面 影响 。

14.2.2 离子 强度

增加 或 减少 杂交 缓冲 液 中 的 盐 浓度 ， 将 会 大 大 影响 实验 的 严谨 度 。 通 常 杂 交 速 度 随 着 盐 浓度 的 增加 而 增加 ，1. 2mol/L NaCl 时 杂交 速度 趋 于 稳定 ; 盐 浓度 每 变化 10 倍 ， 核 酸 双 链 - 173 +

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

的 Tm 值 大 约 变化 16°C (Britten 和 Davidson, 1985). 而 且 由 于 二 价 阳离子 在 低 浓 度 时 比 一 . 价 阳 离子 具 更 大 的 影响 力 ， 所 以 避免 使 用 乙烯 - 双 〈 氧 乙烯 ) 四 乙酸 [ethylene -bis《〈《oxyeth- ylenenitrilo) tetraacetic acid， EGTA] 类 的 鳌 合 试剂 ， 最 好 使 用 乙 二 胺 四 乙酸 (EDTA) 。 经 典 的 杂交 缓冲 液 中 ， 离 子 强度 一 般 为 0. 1 一 1. Omol/L Na 。

14.2.3 pH

环境 的 pH 也 是 广泛 影响 双 链 分 子 稳定 性 的 因素 之 一 。 许 多 杂交 反应 都 是 在 接近 中 性 pH 的 环境 下 进行 ， 因 为 碱 性 缓冲 液 会 促进 双 链 解 聚 ， 而 高 酸性 缓冲 液 能 使 探 针 和 加 分 子 脱 Mi, He. pH 是 核酸 杂交 中 最 少 调整 的 一 个 变量 。

14.2.4 RHKE

根据 表达 公式 D=500/L, HREM KE BUT Ta 的 计算 〈 双 螺旋 体 的 稳定 性 )。 式 tH, DAS HSE Tm 值 的 减少 〈 摄 氏 度 ); 工 指 的 是 实际 参与 双 链 形成 的 碱 基 数目 〈Britten 和 Da- vidson，1985) ， 也 就 是 探 针 的 长 度 。 探 针 越 短 ， 杂 交 越 容易 迅速 发 生 ， 探 针 越 有 识别 力 ， 如 短 的 寡 核 苷 酸 可 以 区 别 仅 一 个 碱 基 差 异 的 靶 序 列 。 作 为 常规 ， 探 针 越 短 ， 其 他 变量 越 有 影响 力 。

14.2.5 探 针 浓度

研究 者 对 于 加 入 杂交 缓冲 液 中 的 探 针 数量 ， 也 经 过 慎重 的 考虑 。 简 而 言 之 ， 就 是 随 着 控 针 浓度 的 增加 ， 正 向 杂交 动力 学 也 随 之 增加 。 因 此 ， 探 针 浓度 越 高 ， 越 能 加 速 杂 交 过 程 ， 这 样 就 减少 了 饱和 所 有 靶 序 列 所 需 的 时 间 。 这 点 在 寡 核 苷 酸 作为 探 针 时 尤其 如 此 。 不 过 ， 过 量 的 探 针 也 会 导致 非特 异性 杂交 一 一 想象 一 下 PCR 中 ， 引 物 过 多 时 会 发 生 什 么 样 的 事 。

为 了 得 到 合适 的 探 针 浓度 ， 必 须 考虑 两 个 变量 : 四 检测 方法 ， 也 就 是 说 ， 同 位 素 或 非 同 位 素 探 针 ;，@@ 靶 的 丰 度 ， 如 单 拷贝 基因 或 低 丰 度 转 录 本 。 所 需 探 针 的 数量 必须 依据 表 |14.1 的 方针 、 探 针 的 质量 或 探 针 的 特异 性 〈 如 果 是 同位 素 标记 的 话 )。 如 果 使 用 过 多 的 探 针 守 在 杂交 后 洗涤 过 程 中 ， 实 验 的 严谨 度 就 比较 容易 操作 。

表 14.1 推荐 使 用 的 核酸 探 针 浓度

ge 探 针 质量 /(ng/ml) 探 针 活性 /(cpm/ml) 同位 素 标记 单 拷贝 基因 或 低 丰 度 转录 物 20 一 50 | 108 多 拷贝 基因 或 高 丰 度 转录 物 5 一 20 105 WAT TR Ft | 1~5 >104 非 同位 素 标记 单 拷 贝 基因 或 低 丰 度 转 录 物 50 一 75 没有 应 用 多 拷贝 基因 或 高 丰 度 转录 物 20 一 50 没有 应 用 HERAT RR FT 5~10 没有 应 用

TE: 这 里 的 数值 是 指 每 毫升 的 杂交 液 。 探 针 浓 度 由 实际 加 入 量 或 标记 挫 人 来 表示 。 尽 管 非 同 位 素 标记 探 针 的 敏感 度 经 常 可 以 与 同位 素 标记 相 比 较 ， 但 是 前 者 在 每 毫升 的 杂交 液 中 加 入 的 探 针 量 通常 更 大 。

14.2.6 (G+C) 合 量 组 分 分 子 的 碱 基 复 杂 性 大 大 影响 杂 合 物 分 子 的 稳定 性 。 由 于 鸟 嘎 叭 〈G) 和 胞 喀 啶 “〈C)

间 可 形成 三 个 氢 键 ， 富 仿 GC 的 双 链 在 热力 学 上 比 富 含 腺 味 叭 - 尿 喀 啶 CAT) 的 双 链 稳定 ， . 174 .

第 14 章 “核酸 杂交 应 用

因为 后 者 只 能 形成 两 个 氢 键 。 探 针 长 度 越 短 ，(G 十 C) 含量 越 显 得 重要 。 如 下 列 公 式 强 调 了

在 杂交 和 PCR 实验 中 设计 窒 核 苷 酸 探 针 时 ，(G 二 C) 含量 在 双 链 稳定 性 方面 的 重要 性 。 Tm=0. 41X(G+C)8H+4+69. 3

45 OM Ge SWE SE SE A Hf ER SE AY oP Ee (Matmur 和 Doty,

1961).

式 中 (G+C) 含量

14.2.7

许多 推荐 的 杂交 条 件 ， 包 括 商用 滤 膜 和 分 子 生 物 学 试剂 盒 推荐 的 条 件 ， 都 可 获得 完美 或 接近 完美 的 探 针 与 靶 序 列 间 的 配对 。 已 证 实 完全 配对 的 探 针 在 严格 的 杂交 条 件 下 ， 与 靶 分 子 可 以 迅速 形成 双 链 。 错 配 指 的 是 ， 探 针 上 茶 位 碱 基 不 能 与 靶 分 子 上 相应 碱 基 配 对 形成 氢 键 。 也 就 是 说 ， 探 针 上 的 大 部 分 或 全 部 其 他 碱 基 都 能 和 靶 分 子 配对 。 错 配 可 能 是 待 研究 生物 体 的 点 突变 ， 也 可 能 是 自然 发 生 的 多 态 现象 ， 又 或 者 是 探 针 设计 中 的 错误 。 错 配 会 阻碍 杂交 速 度 ， 而 且 在 足够 高 的 温度 下 ， 错 配 会 阻止 杂交 的 进行 。 探 针 长 度 越 长 〈 长 于 1lkb)， 在 标准 杂交 条 件 @ 下 ， 错 配 的 效果 一 般 不 太 引 人 注意 。 探 针 长 度 越 短 ， 尤 其 当 窒 核 苷 酸 作为 探 针 或 引物 时 ， 错 配 导 致 的 杂交 结果 越 显 著 。 一 般 通 过 降低 杂交 温度 来 降低 杂交 的 严谨 度 ， 从 而 促 进 错 配 探 针 与 靶 序 列 之 间 的 和 杂交。 杂交 温度 越 低 于 探 针 的 Tm 值 ， 探 针 与 靶 序 列 之 间 的 错 配 越 可 以 容忍 。 但 是 序列 依赖 的 温度 低 到 一 定 程度 时 ， 随 机 杂交 的 可 能 性 也 增 大 。

14.2.8 探 针 的 复杂 性

对 杂交 而 言 ， 探 针 的 复杂 度 ， 指 的 是 在 杂交 中 能 和 互补 靶 序 列 碱 基 配 对 的 不 同 探 针 序列 的 长 度 。 在 许多 情况 下 ， 只 使 用 一 种 类 型 的 探 针 〈 比 如，Northern 分 析 时 只 用 czzyc RET 来 检测 细胞 内 c-myc mRNA 的 丰 度 )。 然 而 使 用 简 并 寡 核 苷 酸 探 针 时 ， 该 探 针 里 含有 不 止 一 种 的 探 针 序 列 〈 可 能 是 因为 靶 序 列 不 明确 )， 探 针 越 是 复杂 ， 正 确 的 守 核 苷 酸 探 针 浓 度 越 小 ， 杂交 动力 学 也 随 之 变 慢 。 对 于 这 种 情况 ， 可 以 把 Tan 相近 的 探 针 序列 归 为 一 类 ， 然 后 进行 多 次 杂交 ， 在 适合 一 个 特定 库 或 批 次 里 的 探 针 的 温度 下 进行 严格 洗涤 。

14.2.9 Hitt

黏 性 对 核酸 杂交 影响 的 最 初 研 究 表明 (Subirana 和 Doty, 1966; Thrower 和 Peacocke, 1968; Chang 等 ，1974) ， 当 黏度 〈 因 蔗糖 和 乙 二 醇 的 存在 ) 增加 时 ， 复 性 速度 变 慢 。 许 多 较 老 的 杂交 缓冲 液 成 分 中 的 一 个 普通 成 分 一 一 阴离子 葡萄 糖 硫酸 盐 Wahl 等 ，1979;， Led- erman，1981)， 也 会 增加 环境 的 黏度 。 杂 交 速 度 的 增 大 ， 是 因为 葡萄 糖 硫酸 盐 占 据 了 杂交 缓冲 液 的 较 大 部 分 物理 空间 ， 迫 使 探 针 占据 一 个 较 小 的 体积 ， 从 而 增 大 了 探 针 的 有 效 浓 度 。 在 众多 的 杂交 方案 中 ， 加 入 Denhardt WR? (Denhart, 1966) 也 会 产生 类 似 的 现象 。 该 洲 液 是 葡萄 糖 硫酸 盐 较 好 的 替代 品 ， 因 为 它 能 减轻 许多 杂交 方案 中 葡萄 糖 硫酸 盐 的 加 入 所 引起 的 相关 严重 的 环境 问题 。

@ 标准 杂交 条 件 可 由 各 式 各 样 的 用 于 不 同 目的 的 预 杂 交 或 多 种 杂交 缓冲 液 中 的 部 分 组 成 ， 而 且 经 常 需要 孵育 过 夜 。 “标准 ”是 指 探 针 长 度 的 影响 并 不 是 一 个 主要 的 变量 ， 以 及 因为 错 配 而 杂交 速度 的 降低 可 被 相对 长 时 间 的 杂交 所 抵消 。 探 针 的 长 度 缩短 ， 杂 交 条 件 就 会 变 得 没有 那么 “典型 ”了 。

@ 100XDenhardt 溶液 : 2% Ficoll 400 (RPK), 2% 聚 乙烯 吡咯 烷 酮 (PVP), 2%BSA 〈 见 组 分 V) 。

o 175: 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

14.2.10 甲 酰胺

甲 酰 胺 〈HCONH2: ) 由 于 它 可 以 干扰 氢 键 的 形成 ， 因 而 它 可 以 降低 双 链 分 子 的 稳定 性 。 因此 ， 甲 酰胺 的 加 入 会 以 线性 方式 降低 Ta 值 (和 杂交 温度 ) 。 每 加 入 1 多 的 甲 酰胺 ，Tm 降 {KA 0.75~1.0°., i 〈G 十 C) 含量 、 水 合作 用 和 螺旋 形成 ， 每 加 入 lmol RR. Tm 减少 2.4~2.9°C (Blake 和 Delcourt，1996) 。 因 此 ， 一 般 都 是 在 42°C & 50% FA BERR AY FAR 缓冲 液 中 进行 杂交 实验 ; 这 对 于 一 个 典型 的 探 针 而 言 ， 大 约 是 在 Ta 一 20C 的 温度 下 进行 杂 交 ， 这 样 有 利于 探 针 与 靶 分 子 间 最 大 程度 地 配对 ， 而 不 需要 改变 杂交 的 严谨 度 。 在 含有 甲 酰 胺 的 缓冲 液 中 进行 RNA 分 析 ， 也 能 够 增加 探 针 分 子 的 有 效 寿命 ， 因 为 后 者 具有 热 不 稳 定性 。

此 外 ， 读 者 应 该 注意 到 ， 现 在 已 经 有 一 种 新 的 不 含 甲 酰胺 的 杂交 缓冲 液 ， 这 种 缓冲 液 可 以 大 大 加 快 正 向 杂交 的 动力 学 。 而 且 ， 许 多 的 预备 试剂 中 含有 表面 活性 剂 ， 这 种 试剂 可 以 阻 止 探 针 和 滤 腊 结合， 这样 就 减少 了 背景 杂交 。 尽 管 这 些 性 质 使 得 这 些 杂 交 试 剂 令 人 满意 ， 但 它们 比较 昂贵， 而 且 有 专利 方面 的 限制 。

143 42 8B

许多 应 用 中 ， 至 少 有 几 百 个 碱 基 长 度 的 核酸 探 针 在 42°C 的 常用 杂交 液 中 进行 杂交 ， 这 种 杂交 液 一 般 含有 50 为 的 甲 酰胺 。 如 果 需 要 更 确切 的 杂交 条 件 或 进行 经 验 测定 时 ， 可 能 首 先 需要 得 到 双 链 的 Tm 值 ， 然 后 在 一 适宜 的 温度 下 进行 杂交 。 以 下 公式 中 ， 有 显著 作用 的 参 数 以 前 已 讨论 过 。

14.3.1 RHA Tn 值 计 算

热力 学 稳定 性 可 以 用 以 下 公式 来 表示 。 双 链 DNA (DNA: DNA) 分 子 (Bolton 和 MaCarthy, 1962): Tm =81. 5°C +16. 6log[ Nat ]+41 xX a Ce et —0. 163% FA RE ARS —500/L DNA : RNA 杂交 分 子 〈Casey 和 Davidson, 1977): Ta 三 79.8C 十 18.5 log[LNa+ ]+58. 4X (G+O)Fa+H1ise L(G+C)& # }? —0. 5 x FA BERR —820/L WH RNA (RNA: RNA) 4} (Bodkin 和 Knudson, 1985). Tm =79. 8°C+18.5 log Nat ]+58. 4X (G+ Cyaan ae L(G+C) & & |? —0. 35 FA BERR & Ht — 820/L 式 中 JTJm 一 一 双 链 分 子 的 解 链 温度 ; (GEC) 含量 一 一 鸟 味 叭 十 胞 喀 啶 含量 的 百分比 ，moli LNa- ] 一 一 钠 离子 的 浓度 ，mol/L; L 一 一 参与 实际 杂交 的 碱 基 的 数目 。

14.3.2 袁 核 背 酸 探 针 的 Tu 值 计算 MPR, HUNK CA 13 章 ) ， 寡 聚 体 的 T. 值 可 以 很 快 地 估算 出 来 ， 每 个 腺

嗓 哈 和 胸腺 喀 啶 乘 以 25C ， 而 乌 味 叭 和 胞 喀 啶 则 乘 以 4C (Itakura 等 ，1984) 。 。176 -

/ 第 14 章 “核酸 杂交 应 用

Tm=4C(G+C)+2C(A+T)

DAVIE), RPKARARMRRHR (11 一 27 碱 基 长 ) 探 针 ， 并 在 含有 任何 有 机 溶 剂 的 1ImolML Nat (6XSSC) 杂交 缓冲 液 中 才能 成 立 。 正 像 定 义 所 说 的 ， 在 Tm 温度 时 ， 只 有 SOMME Res 因此 ， 低 于 Ta 值 5@ 的 温度 ， 有 利于 短 寡 核 苷 酸 的 非常 严格 的 杂交 。 在 Ta 一 5 时， 所 有 完全 配对 的 双 链 都 将 形成 。 必 须 认 识 到 ， 窒 核 苷 酸 探 针 设计 中 ， 探 针 序列 中 可 能 会 有 一 些 错 配 。 如 果 寡 核 苷 酸 探 针 不 是 完全 配对 ， 那 就 不 得 不 降低 杂交 的 严谨 度 以 容忍 错 配 的 发 生 。 如 果 发 生 多 于 一 个 以 上 的 错 配 ， 那 就 必须 降低 杂交 的 温度 。

WMFKARARM 〈14 一 70 碱 基 )，Tu 值 可 以 通过 以 下 公式 计算 (Sambrook 和 Russell, 2001) 。

Tm =81. 5—16. 6CoglNay .])+41X (G+C)#B—600/N 式 中 。”N 一 一 能 够 与 靶 序列 完全 配对 的 寡 核 苷 酸 的 长 度 。 这 些 应 用 于 寡 核 苷 酸 设 计 的 基本 原理 ， 同 样 适 用 于 PCR 引物 设计 “〈 后 者 将 在 第 19 章 论述 )。

14.4 4 2 ¢ Northern > 45

核酸 探 针 与 靶 序 列 的 杂交 有 三 个 主要 部 分 : MARR (也 称 为 封闭 ) ， 杂 交 和 杂交 后 洗涤 (也 称 为 严格 洗涤 ) 。 杂 交 结 果 的 检测 ， 即 第 15 章 的 主题 ， 则 是 完全 不 同 的 事情 。

对 于 普遍 使 用 的 探 针 而 言 ， 其 杂交 条 件 已 经 成 熟 ， 而 且 已 经 商业 化 。 商 家 推荐 了 多 种 通 用 杂交 缓冲 液 和 杂交 条 件 ， 而 且 声 称 “ 每 次 都 可 以 产生 完美 的 印迹 ”。 虽 然 这 是 事实 ， 人 们 可 有 一 定 准 确 性 地 预测 某 些 核酸 家 族 的 动力 学 行为 ， 但 在 细 调 杂交 条 件 方面 ， 直 接 影 响 杂 交 物 形成 参数 的 知识 ， 其 价值 是 无 法 估量 的 。 因 为 这 点 在 使 用 与 靶 不 完全 互补 的 探 针 或 在 系统 发 生 研究 中 ， 使 用 核酸 探 针 来 检测 斑点 和 文库 时 尤为 重要 。 值 得 注意 的 是 ， 当 需要 调整 杂交 的 特异 性 时 ， 人 们 经 常 调整 温度 和 盐 浓度 这 两 个 变量 。

14.4.1 PAR: 滤 膜 处 理

正如 第 12 章 中 讨论 过 的 ， 核 酸 样 品 必须 在 转 膜 之 后 立刻 固定 在 滤 腊 上。 这样 滤 膜 可 以 保存 相当 长 的 时 间 。 杂 交 前 ， 滤 膜 要 经 过 预 杂 交 : @ 在 一 个 类 似 或 相同 的 实际 杂交 液 中 平衡 滤 膜 ，@ 完 全 封闭 滤纸 。 封 闭 (Meinkoth 和 Wahl, 1984) HHH BADR TBM CF i) DNA 覆盖 滤 膜 上 没有 被 实验 RNA 样品 占据 的 任何 部 位 。 这 些 DNA 来 自 与 RNA 样品 的 生物 起 源 不 相关 的 种 属 ， 通 常 选 择 钾 精 DNA 或 小 牛 胸腺 DNA@。 封 闭 滤 膜 的 新 方法 中 ， 尤其 封闭 尼龙 膜 时 ， 使 用 更 多 的 是 酷 蛋 白 或 其 他 和 蛋白质， 而 不 是 异 源 DNA。 通 常 ， 用 蛋白 质 封 闭 所 需 的 时 间 比 用 异 源 DNA 封闭 所 耗费 的 时 间 短 。 它 适合 于 同位 素 和 非 同 位 素 监 测 系 统 ， 产 生 明 显 低 背景 的 信 品 比 。 因 此 预 杂 交 很 重要 ， 因 为 在 实际 杂交 过 程 中 ， 探 针 分 子 不 可 能 以 非特 异性 的 方式 固定 在 滤 膜 的 表面 ， 这 样 会 产生 相当 高 的 背景 信号 。

现在 已 经 有 很 多 预 杂 交 液 配方 ， 它 们 的 确切 组 成 是 一 种 功能 的 滤 膜 和 用 在 特定 实验 中 的 探 针 。 这 里 推荐 的 是 在 笔者 的 实验 室 和 其 他 实验 室 里 应 用 得 比较 成 功 的 配方 。

@ 异 源 DNA 作为 载体 和 滤 膜 封闭 液 ， 以 10mg/ml 的 浓度 存储 于 水 中 。 者 沸 DNA， 然 后 持续 穿 过 18 号 针 使 之 剪 切 化 。 异 源 DNA 的 储备 液 保存 在 20C 。 使 用 前 ， 取 适量 体积 后 ， 必 须 热 水 煮沸 变性 10min,

“177 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

14.4.2 实验 方案 : 预 杂 交 KR)

@ 将 滤 膜 在 5XSSC 或 5XSSPE 中 浸 湿 2 一 3min。

注意 SSPE 缓冲 液 比 SSC 好 一 些 ， 尤 其 在 甲 酰胺 存在 的 情况 下 〈Meinkoth 和 Wahl, 1984), AA SSPE 中 的 磷酸 盐 实 际 上 模拟 了 核酸 的 磷酸 二 酯 骨架 ， 有 利于 封闭 滤 膜 ， 从 而 能 在 检测 阶段 改进 背景 信号 。 这 种 策略 尤其 适合 固 相 化 在 尼龙 〈 十 ) 滤 膜 上 的 RNA 样品 ， 因 为 核酸 探 针 的 磷酸 二 酯 骨架 带 负 电荷 ， 正 好 可 以 和 尼龙 膜 的 正 电荷 中 和 。20XSSPE: 3mol/L NaCl, 200mmol/L NaH2PO,, 20mmol/L EDIA， 调 整 pH 至 7.4。20XSSC: 3mol/L NaCl，0. 3mol/L 柠檬 酸 钠 ， 调 整 pH 至 7. 0。

@ WEAR 42°C HEM HAY (250~1000pl/cm?) 预 杂交 缓冲 液 中 预 杂 交 3 一 4h， 该 缓冲 液 中 含有 5XSSPE、5XDenhardt 溶液 、0.1% SDS、100wg/ml Here nN HEAR DNA 和 50% WA 离子 甲 酰胺 。 以 下 是 按 顺序 配制 预 杂 交 液 组 分 的 流程 。

a. FA ARERR AFA 45°C,

b. 在 单独 的 试剂 瓶 中 混 匀 SSPE, Denhardt 溶液 和 SDS, RAMBLE 45°C. SDS 粉末 随 着 其 他 组 分 的 加 入 逐渐 溶解 成 液体 状 。

c. 在 干净 的 聚 丙 烯 或 玻璃 试剂 瓶 中 ， 将 所 需 的 甸 精 DNA 溶 于 无 菌 水 ， 无 菌 水 的 体积 为 满足 预 杂 交 液 终 体 积 所 需 加 入 的 水 体积 。 者 沸 该 混合 物 5 一 7min。

d. 小 心地 将 煮沸 的 链 精 DNA 加 入 SSPE、Denhardt 溶液 和 SDS 的 混合 物 中 ， 然 后 将 整 个 混合 物 直 接 加 到 预 热 的 甲 酰胺 中 。 小 心 旋转 混 匀 。42C 存 储 该 缓冲 液 直至 使 用 。

以 这 种 方式 配制 预 杂 交 绥 冲 液 的 原因 是 为 了 避免 变性 甸 ? 精 DNA 的 复 性 。 因 为 更 常用 的 小 体积 高 浓度 DNA 储存 液 揪 在 冰 里 的 方式 ， 可 能 会 导致 DNA 的 复 性 。 尤 其 在 其 他 组 分 都 事先 预 热 过 的 情况 下 ， 快 速 加 入 甲 酰胺 能 有 效 地 减缓 复 性 的 速度 。 混 匀 后 ， 该 混合 物 可 以 立刻 投入 使 用 。 一 般 而 言 ，100ml 的 缓冲 液 可 用 于 2 次 印迹 的 预 杂 交 ， 还 可 留 25ml 用 于 杂交 实验 。

注意 工 常规 的 预 杂 交 和 杂交 最 好 在 平底 的 塑料 容器 中 进行 ， 而 且 表 面积 仅 稍 大 于 滤 膜 面积 为 宜 。 几 种 Rubbermaid HR WHAM Nalgene 的 多 用 途 盒 就 不 错 。 确 保 容 器 配备 一 个 完全 合适 的 盖子 以 防止 蒸 发 。 这 种 方法 排除 了 气泡 进入 隔 热 塑 料 袋 的 可 能 性 ， 而 且 避 免 了 高 比 活性 杂交 缓冲 液 在 杂交 结束 后 溢出 。

注意 2 把 杂交 瓶 放置 在 一 个 轻柔 移动 (30~50r/min) MEAL, KMABRGR AR (Lab ©

Line)， 这 样 可 以 使 得 缓冲 液 平稳 地 浸润 滤 膜 的 整个 表面 ， 从 而 得 到 比较 好 的 数据 。

注意 3 过量 缓冲 液 下 的 预 杂交 有 利于 降低 探 针 〈 加 入 之 后 ) 和 滤 膜 之 间 的 相互 作用 。 封 闭 后 ,如 和 人 探 针 前 ， 可 以 相应 减少 杂交 缓冲 液 的 体积 ， 以 维持 较 高 的 探 针 浓度 。

@g) 预 杂 交 结 束 后 ， 倒 出 预 杂 交 缓 冲 液 ， 加 入 新 的 杂交 缓冲 液 〈 理 想 的 体积 100xl/cm2)。 许多 情况 下 ， 预 杂交 缓冲 液 和 杂交 缓冲 液 是 相同 的 〈 见 准备 工作 的 第 @@ 步 ) 。

14.4.3 Et Bett

双 链 探 针 使 用 前 需要 先 变性 。 一 般 可 通过 煮沸 探 针 或 提高 pH 的 方法 达到 探 针 变性 的 目 的 。 因 为 在 非 同位 素 体系 中 ， 标 记 方 法 涉及 许多 变量 ， 所 以 最 好 遵照 厂商 说 明 书 进行 探 针 的 变性 。 如 直接 酶 标记 的 情况 下 ， 探 针 已 经 是 单 链 了 ， 所 以 无 需 再 进行 处 理 ，

当心 同位素 标记 的 探 针 不 应 该 煮沸 变性 ， 因为 会 产生 放射 性 的 蒸汽 。 所 以 替代 方法 是 ， 在 探 针 GARR 50~100p1) 中 加 入 0.1 体积 的 1nolL NaOH, 37°C #F 10min & FE 温 放置 30min。 这 样 ， 只 要 探 针 的 总 体积 不 超过 150nl (假设 杂交 缓冲 液 的 最 小 体积 为 5ml) ， 探 针 就 可 以 直接 加 入 杂交 缓冲 液 ， 而 不 需要 进行 中 和 。，

。178 -

/ 第 14 章 ， 核酸 杂交 应 用

14. 4.4 杂交

@ 杂交 缓冲 液 中 加 入 探 针 ， 然 后 42 杂交 12 一 16h UK). Mim RAR mT.

注意 工 检测 稀有 mRNA 或 单 拷贝 基因 时 ， 每 毫升 杂交 缓冲 液 中 要 有 5 一 20ng REM 1 一 5) X 105cpmyml 的 探 针 。

注意 2 ”如 果 探 针 的 质量 很 低 ， 提 高 甸 精 DNA 的 浓度 ， 这 样 可 以 改善 杂交 动力 学 。

注意 3 可 以 加 入 和 分 子 量 标准 配对 的 25ng 探 针 ， 这 样 在 同一 张 胶片 上 就 会 同时 存在 分 子 量 标准 和 实验 样品 的 直观 记录 。

14.4.5 杂交 后 严格 洗涤

根据 探 针 的 特性 和 杂交 产物 的 稳定 性 ， 研 究 者 可 能 会 针对 每 一 种 探 针 调整 杂交 后 洗涤 的 条 件 。 值 得 注意 的 是 ， 杂 交 后 洗涤 的 过 程 中 ,严格 度 是 离子 强度 、 温 度 和 时 间 的 综合 体现 。 因此 通过 升 高 温度 或 降低 盐 浓度 来 缩短 洗涤 时 间 的 方式 不 太 妥 当 。

© 杂交 结束 后 ， 倒 掉 杂 交 缓 冲 液 ， 洗 膜 以 除去 所 有 未 参与 杂交 产物 形成 的 多 余 探 针 aT.

a. im FAW 2XSSPE, 0.1% SDS 洗 膜 30s， 去 除 杂 交 瓶 和 滤 膜 上 的 大 部 分 探 针 。

b. 室温 下 用 200 一 300ml 的 2XSSPE、0.1% SDS 洗 膜 15min， 两 次 。

c. 37°C FA 200~300ml fy 0. 1 X SSPE, 0.1% SDS YEAR 15min， 两 次 。

注意 如果 背景 太 高 ， 最 后 一 次 洗涤 改 用 42~50C 的 0.1XSSPE、0.1%SDS 洗 膜 ， 可 能 会 有 效 。 对 于 每 种 新 的 探 针 ， 洗 涤 条 件 需要 按照 经 验 事先 进行 优化 。

© 用 2XSSPE 简单 洗 膜 ， 然 后 把 滤 膜 放置 在 一 片 Whatman 纸 上 ， 放 置 足够 长 的 时 间 以 确保 滤 膜 表 面 过 多 的 缓冲 液 呈 点 状 分 布 。

BERR 千 万 不 要 让 滤 膜 干 透 ， 选 择 化 学 发 光 法 作为 检测 手段 时 尤其 如 此 。

Oa 如 果 选 择 化 学 发 光 法 或 发 色 检 测 技术 检测 时 ， 可 以 直接 把 滤 膜 放 进 检测 缓冲 液 中 ， 然后 按照 该 体系 的 厂商 说 明 书 进行 操作 。

Ob 如 果 使 用 同位 素 ， 则 滤 膜 用 保鲜 膜 包 庄 后 ， 进 行 放 射 自 显影 (第 15 章 将 论述 ) 。

注意 ”如 果 放 射 自 显影 之 后 还 要 去 除 第 一 种 探 针 ， 再 与 另 一 种 探 针 杂 交 ， 请 确保 滤 膜 的 湿润 。

14.5 和 参考 文献

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Bodkin, D. K., and Knudson, D. L. (1985). Assessment of sequence relatedness of double- stranded RNA genes by RNA-RNA blot hybridization. J. Virol. Methods 10, 45.

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- 179 >

RNA 分 高 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

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〈 黄 冰 译 ; Wk RAR)

。 180 -

第 1S 齐 tt Wm

15.1 £A RE

实验 最 终结 果 的 可 靠 性 取决 于 实验 每 一 步 的 可 靠 性 。 其 中 ， 在 整个 实验 过 程 中 确保 每 一 步 核 酸 样品 的 完整 性 就 极其 重要 。 此 外 ， 设 计 与 探 针 标记 方式 相 适 用 的 系统 来 检测 杂交 过 程 也 极 甚 重要。 标记 及 检测 方法 的 选择 主要 取决 于 所 需要 达到 的 灵敏 度 及 分 辨 率 。 由 于 非 同 位 素 检测 方法 的 极 大 改进 ， 特 别 是 化 学 发 光 技 术 的 改进 ， 目 前 出 现 的 一 个 比较 现实 的 问题 是 ， 是 否 还 需要 使 用 放射 性 方法 。

非 同位 素 标记 方法 和 化 学 发 光 检 测 方法 自 出 现 后 就 成 为 理想 的 放射 标记 的 核酸 探 针 的 替 代 方 法 而 应 用 于 印迹 分 析 及 原 位 杂交 。 如 同 第 13 章 所 述 ， 目 前 已 有 许多 种 非 同 位 素 标记 探 针 的 方法 ， 而 且 这 些 方法 已 经 很 常见 。 由 于 这 些 新 标记 方法 的 出 现 ， 许 多 实验 室 已 减少 了 或 停止 了 同位 素 的 使 用 。 现 在 已 证 实 化 学 发 光 检 测 方法 是 一 种 能 克服 显 色 检测 法 相关 的 许多 党 见 缺 点 的 优越 的 检测 方法 。 鉴 于 化 学 发 光 检 测 法 的 实用 性 ， 随 着 人 们 习惯 的 逐渐 改变 ， 这 种 方法 得 到 越 来 越 广泛 的 应 用 。

不 仅 是 核酸 探 针 的 标记 及 检测 方法 〈 包 括 用 抗体 识别 半 抗 原 在 内 ) SHAH. ， 分 子 生 物 学 家 所 采用 的 技术 也 多 种 多 样 。 但 每 个 实验 〈 包 括 杂 交 在 内 ) 的 最 终 目标 有 两 个 。

© 确定 探 针 在 滤纸 上 的 位 置 ， 或 在 分 析 过 程 中 确保 探 针 与 目标 分 子 稳定 配对 。

Q 杂交 于 条 带 上 的 探 针 或 杂交 于 组 织 特异 区 域 的 目标 分 子 上 的 探 针 的 定量 。

总 的 来 说 ， 有 两 种 标准 的 检测 策略 : 放射 性 同位 素 技 术 和 非 同 位 素 技术 。 同 位 素 方法 包 括 放射 性 标记 及 放射 自 显影 检测 〈 见 后 述 ) 和 /或 Cerenkov 计数 。 非 同位 素 方法 已 日 渐 成 熟 ， 可 用 于 滤 膜 检测 、 微 量 滴 定 板 检测 、 直 接 从 凝 胶 中 检测 、 直 接 用 视频 捕捉 以 及 用 其 他 方 法 检测 。 有 四 种 标准 的 非 同 位 素 检测 方法 。

化 学 发 光 法 : 酶 促 反 应 产生 的 可 见 光 ， 常 用 X 射线 胶片 记录 。

G@ RIE: 某 些 化 合 物 受 一 定 波长 的 光 激 发 后 会 发 荧光 ， 常 用 荧光 成 像 系 统 记 录 。

OQ 化 学 菊 光 法 : 酶 促 反 应 将 荧光 底 物 转变 成 能 产生 荧光 的 产物 ， 常 用 荧光 成 像 系 统 记 录 。

由 显 色 检 测 法 : 酶 促 反 应 形成 有 颜色 的 沉淀 直接 沉积 在 滤 膜 或 组 织 上 ， 有 色 沉 淀 物 显 示 了 目标 分 子 的 分 布 。

早期 非 同位 素 标记 及 检测 方法 中 ， 通 常用 生物 素 标记 核酸 。 杂 交 结 果 通 过 链 霉 亲 和 素 - 碱 性 磷酸 酶 检测 系统 来 检测 ， 这 种 系统 将 无 色 底 物 通 过 酶 促 反 应 转变 为 不 溶 的 有 色 沉 淀 。 这 种 方法 通常 叫 作 显 色 反应 检测 法 或 比 色 检测 法 。 此 方法 并 没有 得 到 广泛 应 用 ， 因 为 它 的 一 个

。 181 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

严重 的 缺点 是 ， 与 放射 自 显影 相 比 灵敏 度 较 差 。 但 是 ， 现 在 许多 原先 为 显 色 反应 检测 法 而 设 计 的 方法 ， 已 经 被 改进 为 适用 于 化 学 发 光 法 来 检测 。 在 许多 情况 下 ， 适 用 于 化 学 发 光 检测 法 的 探 针 合成 标记 方法 ， 与 显 色 检测 法 中 的 探 针 标记 方法 是 相同 的 。 这 些 技术 的 差异 在 于 杂交 后 滤 膜 的 处 理 方式 一 一 除 检测 试剂 外 ， 洗 膜 严 谨 度 也 可 能 不 同 。 不 论 化 学 发 光 检测 法 中 使 用 哪 种 技术 ， 发 射出 的 可 见 光 都 用 X 射线 胶片 记录 。

15.2 £446 & #°

放射 自 显影 是 一 种 简单 而 灵敏 的 光化学 技术 ， 用 于 记录 样本 内 放射 性 标记 化 合 物 的 空间 分 布 。 在 核酸 研究 中 ， 放 射 性 标记 的 探 针 可 以 固 相 化 到 固体 支持 物 上 ， 并 与 溶液 中 或 原 位 的 目标 分 子 进 行 杂 交 。 将 感光 乳剂 与 放射 源 直 接 接触 ， 可 以 捕获 电离 辐射 和 光子 ， 从 而 较 长 期 地 记录 不 稳定 放射 性 核 的 衰变 过 程 。 根 据 放 射 性 样品 的 种 类 、 用 于 成 像 的 感光 乳剂 的 类 型 和 结果 的 检 验方 法 ， 放 射 自 显影 大 致 可 以 分 为 两 类 ， 即 通常 所 指 的 整体 放射 自 显影 和 显 微 放 射 自 显影 。

在 分 子 生 物 学 领域 ， 放 射 自 显影 最 常用 于 杂交 后 的 核酸 定量 分 析 。 当 放射 自 显影 和 电泳 技术 联合 使 用 ， 所 得 到 的 图 像 还 可 以 做 定性 分 析 。 例 如 ， 用 Northern 印迹 分 析 基 因 表 达 情 况 〈 整 体 放 射 自 显影 ) 时 ， 根 据 杂 交 膜 上 的 放射 性 同位 素 的 位 置 及 辐射 强度 ， 可 以 估算 出 与 特异 探 针 配对 的 目标 RNA 分 子 的 大 小 及 数量 。 而 在 显 微 放 射 自 显影 中 ， 样 品 通常 是 被 感光 乳剂 包 被 的 较 大 样本 的 一 个 蒲 的 切片 。 这 项 技术 也 就 是 所 谓 的 原 位 放射 自 显影 ， 通 常 是 直接 在 显微镜 用 的 载 玻 片 上 操作 。 由 于 天 然 细 胞 的 几何 形状 得 以 保持 ， 放 射 性 标记 物 在 细胞 内 的 分 布 可 以 用 光学 显微镜 或 电子 显微镜 轻易 观察 到 〈 如 计算 颗粒 数 ) 。

在 整体 放射 自 显影 过 程 中 ， 一 张 高 感光 度 的 医用 X 射线 胶片 ， 直 接 与 塑料 薄膜 包 庄 的 杂交 膜 直接 接触 ， 这 就 是 通常 所 说 的 直接 曝光 。 在 某 些 实验 中 ， 如 核酸 酶 保护 实验 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 或 琼脂 糖 凝 胶 中 的 放射 性 同位 素 可 以 直接 检测 。 感 光 胶 片 的 基质 是 一 层 柔 韧 的 聚 酯 LKodak 公司 用 于 放射 自 显影 的 胶片 厚 约 0. 007in(lin=0.0254m)]， 基 质 的 一 侧 或 两 侧 包 被 感光 乳剂 。 对 射线 及 光线 敏感 的 乳剂 ， 包 含 卤 化 银 〈 溴 化 银 、 氯 化 银 或 卤化 银 混合 物 ) Hh 体 ， 光 子 及 电离 辐射 的 能 量 就 释放 到 卤 化 银 晶 体 上 。 在 胶片 曝光 过 程 中 ， 能 量 被 感光 乳剂 中 的 贞 化 银 颗 粒 吸收 后 释放 出 电子 ， 最 终 导致 形成 带 负 电荷 的 “斑点 ”>， 也 即 晶 格 申 的 下 竟 ， 这 些 “ 斑 点 ”吸附 带 正 电 荷 的 银 离 子 从 而 形成 金属 银 原 子 。X 射线 胶片 曝光 后 ， 形 成 所 谓 的 不 可 见 的 潜 影 ， 用 合适 的 显影 液 浸泡 后 ， 就 可 以 形成 可 见 的 图 像 。 潜 影 只 是 含有 可 显影 的 银 颗粒 ， 在 有 安全 光线 的 暗室 里 是 看 不 见 的 ， 而 且 这 时 感光 乳剂 还 完全 是 光敏 感 的 。 可 以 通过 胶片 预 内 〈 见 后 述 》 和 低温 曝光 来 增强 潜 影 的 形成 。 洪 影 一 旦 形成 后 ， 在 长 时 间 的 曝 过 程 中 并 不 稳定 ， 这 种 不 稳定 会 因为 氧 的 存在 及 胶片 的 湿度 而 加 剧 。 最 终 显影 出 的 图 像 可 以 直接 通过 视觉 观察 来 分 析 ， 如 果 需 要 更 高 的 精确 度 ， 则 可 以 通过 数字 成 像 分 析 。 整 个 的 显影 步 又 KLAN 15.1,

放射 自 显影 的 胶片 ， 可 以 用 手工 或 机 器 来 冲洗 。 不 管用 哪 种 方式 ， 胶片 的 处 理 过 程 都 相 le], BUS. BER. EM. MA ROE, CBA, 胶片 感光 乳剂 中 曝光 的 卤化 银 颗 粒 还 原 成 金属 银 原 子 ， 从 而 增强 了 潜 影 的 形成 。 完成 显影 所 需 的 时 间 取 决 于 胶片 曝光 的 程度 、

@ 部 分 改编 自 Eastman Kodak 公司 @ 对 于 手工 冲洗 X 射线 胶片 而 言 ，Kodak D-76, D-19 和 GBX 显影 液 以 及 标准 的 Kodak 定 影 液 效果 都 很 好 . 182 -

第 15 章 “检测 原理

显影 液 的 温度 、 显 影 液 的 新 旧 程 度 及 实验

员 对 背景 深浅 的 接受 程度 。 应 当 尽 可 能 使 hee 胶片 曝光 显影 过 程 的 参数 标准 化 ， 以 使 从 不 同 胶片

所 冲洗 出 的 图 像 具有 可 比 性 。 J 将 胶片 浸入 化 学 “终止 液 ” 中 ， 可 以 终 显影 二 止 显影 过 程 。 目 前 可 以 买 到 多 种 终止 液 ， 终 J 止 液 也 很 容易 配制 ， 即 1% 的 乙酸 溶液 。 在 ai 恰当 的 时 间 终 止 显 色 反应 非常 重要 ， 因 为 过 度 的 显影 ， 会 使 任何 曝光 在 胶片 上 的 图 像 变 I

得 模糊 不 清 。 值 得 注意 的 是 ， 当 胶片 从 显影 HEE EAL 盘 中 取出 时 ， 仍 沾 有 显影 液 ， 直 到 中 和 前 显 plats Tes

色 过 程 仍 在 进行 。 如 果 没 有 合适 的 终止 液 ，

可 以 将 显影 后 的 胶片 立刻 放 入 水 中 以 稀释 并 洗 去 残存 的 定 影 试剂 洗 去 残余 的 显影 液 。 上 述 操作 不 仅 可 以 终止 1

显影 过 程 ， 还 有 利于 延长 定 影 液 的 使 用 帮 eg

fr. FEB AEP, DOR aE

解 未 曝光 的 卤化 银 。 最 后 ， 在 室温 下 将 胶片 浸入 水 中 彻底 清洗 ， 以 除去 胶片 冲洗 过 程 中 产生 的 副 产 物 。 当 胶片 晾 干 后 ， 一 张 比较 稳 定 的 照片 就 洗 好 了 。

如 果 手 工 冲洗 胶片 ， 每 张 胶片 的 显影 、 清 洗 和 定 影 时 间 必 须 相 同 。 如 果 没 有 这 样 的 监 控 ， 就 很 难 判断 最 终 的 数据 差异 有 多 大 程度 是 由 实验 操作 引起 ， 多 大 程度 是 由 胶片 冲洗 造成 的 。 手 工 冲洗 胶片 的 优点 是 ,实验 者 可 以 延长 显影 时 间 以 增强 较 弱 的 条 带 信号 ;实验 者 也 可 以 减少 显影 时 间 来 降低 背景 或 减少 某 些 信号 特别 强 的 条 带 的 过 度 显 影 。 机 器 冲洗 胶片 的 优点 是 胶片 都 是 按照 统一 的 标准 来 冲洗 ， 但 这 样 实验 者 会 比较 被 动 。

放射 自 显影 曝光 的 机 制 [参见 Bonner 的 综述 〈1987)] 和 感光 乳剂 的 选择 ， 取 决 于 同位 素 放射 光谱 的 能 量 、 所 需要 的 图 像 质量 和 体系 中 挫 入 的 放射 剂量 。 曝 光 时 间 及 曝光 方法 的 确 定 并 没有 严格 的 规则 可 循 ， 这 些 参数 必须 在 每 次 实验 中 根据 经 验 来 确定 。

15.2.1 滤 膜 的 处 理

图 15.1 X 射 线 胶 片 显 影 步 又。 虽然 胶片 的 选择 取 决 于 实际 应 用 〈 放 射 自 显影 或 化 学 发 光 法 )，X 射 线 胶 片 的 冲洗 过 程 都 是 相同 的

用 于 Northern 印迹 、 斑 点 印迹 和 类 似 技术 的 滤 膜 ， 在 最 后 一 次 严谨 洗涤 后 不 能 完全 干 燥 。 滤 膜 应 放 在 Whatman 3mm 滤纸 或 相应 装置 上 ， 然 后 包 在 塑料 纸 中 做 印迹 。 滤 膜 保 持 湿 润 状态 有 利于 放射 自 显影 后 通过 高 严谨 度 洗涤 除去 杂交 的 探 针 。 这 样 ， 一 张 滤 膜 就 可 以 用 其 他 目的 探 针 杂交 多 次 。 从 完全 干燥 的 滤 膜 上 除去 探 针 ， 要 比 从 湿润 的 滤 膜 上 清除 换 针 难得 多 ， 有 时 几乎 不 可 能 被 除去 。 千 万 不 要 将 湿润 的 滤 膜 直接 与 X 射线 胶片 接触 ， 这 样 会 使 滤 膜 和 胶片 粘 在 一 起 ， 从 而 导致 滤 膜 和 胶片 的 毁坏 。

15.2.2 X 射 线 胶 片

X 射线 胶片 的 选择 取决 于 标记 所 使 用 的 是 高 能 放射 源 还 是 低能 放射 源 以 及 所 要 达到 的 分 状 率 高 低 。 最 常用 于 放射 自 显影 及 化 学 发 光 法 的 X 射线 胶片 是 Kodak XOMAT AR(XAR), 。 183 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

X-OMAT LSCXLS) 和 BioMax 的 系列 胶片 。 未 开封 的 X 射线 胶片 应 当 存储 于 50 一 70F@， 并 要 有 防 射线 穿 透 的 防护 。 开 封 后 建议 保存 在 30% 一 50%% 的 相对 湿度 条 件 下 。 过 期 的 胶片 应 垂直 坚 立 存放 ， 而 不 要 水 平 堆 释 存放 。

XAR 胶片 具有 极 大 的 灵敏 度 ， 适用 于 大 多 数 的 放射 自 显影 操作 。 该 胶片 在 透明 基质 的 两 侧 都 有 感光 乳剂 包 被 。 放射 自 显影 最 终 是 在 灰色 胶片 上 显 出 黑色 图 像 。XAR 胶片 有 两 种 规格 ， DXAR-5 胶片 ， 有 一 种 分 隔 式 的 包装 可 选 ， 这 种 包装 可 以 在 运输 过 程 中 保护 每 一 张 胶片 ， 而 且 能 避免 在 胶片 抽出 盒子 过 程 中 产生 静电 而 使 胶片 曝光 ;名 XAR-2 胶片 ， 这 种 胶 片 每 一 张 都 包装 在 一 个 密封 的 封 袋 中 。

XLS 胶片 比 XAR 胶片 有 更 好 的 清晰 度 ， 背 景 更 清晰 。 该 胶片 也 是 双 层 感光 乳剂 ， 基 质 呈 蓝 色 。 这 种 胶片 是 一 种 比较 经 济 的 选择 ， 当 不 需要 达到 BioMax 或 XAR 的 最 好 效果 时 。 该 胶片 是 在 蓝 色 背 景 下 显 出 黑色 图 像 。 虽 然 这 种 胶片 所 显现 的 杂交 信和 号 较为 清晰 ， 但 其 平均 曝光 时 间 是 XAR 胶片 的 2 倍 。 因 此 ， 可 以 先 用 XAR 胶片 做 首次 曝光 ， 然 后 再 用 XLS 蓝 色 胶片 做 最 终 的 曝光 。

BioMax 胶片 是 最 新 一 代 的 可 用 于 放射 自 显影 和 化 学 发 光 法 的 X 射 线 胶 片 。BioMax MS 是 _. 款 适用 于 放射 自 显影 的 高 性 能 的 通用 胶片 。BioMax MR 则 是 适用 于 低能 B 放 射 源 如 255S、23P 和 14C 的 具有 最 高 分 辩 率 的 胶片 。 而 BioMax Light 是 为 化 学 发 光 等 方法 设计 的 具有 最 高 灵敏 度 的 胶片 。 本 实验 室 一 直 使 用 BioMax 胶片 ， 这 种 胶片 的 一 个 明显 优点 ， 是 它 的 片 基 背 景 是 透 明 的 而 不 像 XAR 的 灰色 。 透 明 的 背景 使 得 胶片 上 极其 微弱 的 条 带 都 清晰 可 见 ， 因 而 更 适用 于 目前 的 扫描 及 数字 成 像 分 析 方 法 。

图 15. 2 列 出 了 适用 于 放射 自 显 影 及 化 学 发 光 法 中 不 同 灵 敏 度 及 分 辩 率 需要 的 胶片 类 型 。

高 灵敏 度 最 大 灵敏 度 |< > 高 分 养 率 < 一 > | 最 大 分 辩 率

- BioMax MS 放射 自 显影 BioMax MS 或 BioMax MR X-OMAT AR BioMax Light 化 学 发 光 法 BioMax Light BioMax Light X-OMAT AR

图 15.2 适用 于 不 同 灵 人 敏 度 及 分 辩 率 要 求 的 X 射 线 胶片 。 详 细 介 绍 见 正文 。 本 图 刊登 经 由 Kodak 公司 允许

15.2.3 安全 灯

虽然 未 显影 的 X 射线 胶片 在 定 影 之 前 一 直 对 光敏 感 ， 但 在 暗室 里 可 以 容许 有 低 强度 光 照 以 便于 胶片 的 移动 和 快速 处 理 。 安 全 灯 一 般 是 用 15W 的 普通 灯泡 外 包 滤 膜 ， 滤 膜 的 颜色 要 使 透 过 的 光线 不 会 使 胶片 曝光 。 由 于 化 学 发 光 法 及 放射 自 显 影 通常 所 使 用 的 胶片 三 般 对 蓝 - 绿 光敏 感 ， 暗 室 中 一 般 使 用 红色 的 GBX-2 安全 灯 滤 膜 8。 所 谓 安全 灯 其 实 也 不 是 非常 安 全 ， 因 为 长 时 间 在 安全 灯 下 照射 会 使 冲洗 出 的 胶片 变 模糊 。 理 想 情况 下 ， 胶 片 与 安全 灯 的 臣

@ 摄氏 温度 (C) 与 华氏 温度 〈 下 ) 的 换算 公式 为 : 三 2 Kit} —32) @ 一 款 价 廉 物 美的 适 于 快速 建立 简易 暗室 的 安全 灯 是 GBX-2, Kodak No. 141 6627。 其 特点 是 小 巧 ， 便 于 携带 ， 经 久 耐用 。 。184 -

FISH MMR

离 不 要 小 于 4ftCft=0. 3048m) 。 需 要 注意 的 是 安全 灯 滤 膜 会 随 着 使 用 过 程 变 长 而 褪色 ， 因 此 应 当 定 期 检测 。 检 测 方法 很 简单 ， 即 在 安全 灯 打 开 和 关闭 的 情况 下 各 冲洗 一 张 未 曝光 的 胶 片 ， 安 全 灯 打 开 时 冲洗 出 的 胶片 如 果 变 模糊 则 表明 需要 更 换 安 全 灯 滤 膜 了 。

此 外 ， 保 护 胶 片 免 受 安全 灯 之 外 的 其 他 杂 散 光 的 照射 也 很 重要 。 虽 然 从 经 济 角度 而 言 ， 任何 一 个 房间 都 可 以 用 作 暗 室 来 冲洗 胶片 ， 但 重要 的 是 必须 确保 不 会 有 从 门下 、 窗 户 边 沿 、 墙 上 及 屋顶 的 孔洞 或 屋内 放置 的 仪器 的 指示 灯 〈 如 电脑 的 显示 器 ) 而 来 的 光线 。

15.2.4 曝光 时 间

一 个 放射 源 的 曝光 次 数 只 取决 于 它 的 半衰期 长 短 。 对 于 高 能 量 的 放射 源 ， 可 以 用 Geiger 计数 探测 器 靠近 膜 来 探测 放射 性 的 强度 。 很 显然 ， 一 个 高 达 3000cpm 的 放射 源 ， 与 一 个 比 背景 环境 只 高 出 几 个 读数 的 放射 源 相 比 ， 只 需要 极 短 的 曝光 时 间 。 遇 到 缺乏 明显 信号 的 情况 时 不 要 立刻 灰心 丧气 ， 对 放射 自 显影 来 说 ， 检 测 一 个 单 拷贝 基因 或 黎 少 mRNA 的 杂交 信和 号 ， 通常 都 需要 3 天 或 更 长 的 曝光 时 间 才 能 观测 到 信和 号 。

一 般 可 以 先 用 XAR 胶片 于 室温 下 曝光 过 夜 ， 来 估计 背景 及 膜 上 非特 异 的 杂交 信号 。 随 后 的 曝光 方案 可 以 参照 上 述 曝 光 的 结果 。 对 于 放射 强度 低 的 膜 ， 可 以 通过 使 用 增 感 屏 来 缩短 曝光 时 间 ; 如 果 直 接 对 凝 胶 上 的 放射 源 曝光 ， 可 以 使 用 荧光 摄影 术 。 与 直接 曝光 的 放射 自 显 影 不 同 的 是 ， 这 两 种 信号 增强 技术 都 是 温度 依赖 的 。 而 单独 低温 并 不 能 促进 直接 曝光 时 图 像 的 形成 过 程 。

15.2.5 tome

FEW A abet REP. 1 FR BE AT DAS oT ST AY Re. Se a — BP CL CW RARE DN ARB TEM. TERA Be. Ae AAS SR EE SR 钙 包 被 的 增 感 屏 ， 如 DuPont Cronex Lightning Plus Intensifying Screen@， 这 种 屏 非 常 适用 于 超过 1 天 的 曝光 过 程 。 有 机 荧光 物质 能 将 电离 辐射 转变 为 紫外 线 或 蓝光 ， 这 种 增 感 屏 能 发 Hit. Wr AeA Ss) 很 低 ， 因 此 非常 适用 于 标准 的 放射 自 显影 。 在 用 于 曝光 之 前 ， 有 必要 将 增 感 屏 在 暗 处 放置 几 小 时 或 过 夜 ， 因 为 没有 暗 适应 的 增 感 屏 的 “余辉 ”效应 会 使 冲洗 出 的 胶片 变 模糊 。 与 双 面 都 包 被 感光 乳剂 的 X 射线 胶片 不 同 ， 增 感 屏 只 有 一 面包 被 了 荧光 物质 ， 因 此 必须 按 正 确 方 向 放置 。 钨 酸 钙 包 被 的 一 面 呈 和 白色， 没有 包 被 的 另 一 面 呈 灰白 色 。 在 笔者 的 实验 室 中 ， 为 避免 在 暗室 中 和 弄 错 了 增 感 屏 的 方向 ， 在 增 感 屏 没 有 包 被 荧光 物质 的 一 侧 的 边缘 粘 上 厚 条 带 ， 这 样 在 暗室 中 就 可 以 通过 触摸 确保 将 增 感 屏 包 被 有 荧光 物质 的 一 面 对 着 杂交 膜 。 低 温 〈 一 80C) 下 进行 放射 自 显影 ， 有 利于 发 挥 出 增 感 屏 的 最 大 能 量 转换 效率 ， 因为 低温 时 胶片 对 弱 光 的 反应 性 大 大 增强 。 要 注意 的 是 胶片 感光 范围 要 与 增 感 屏 的 发 射 光 谱 相 匹 配 。 使 用 增 感 屏 曝光 的 强度 要 明显 强 于 不 用 增 感 屏 的 曝光 强度 。 增 感 屏 可 以 用 于 增强 对 高 能 B We Me Con Ca MP) WR y HA BHM Cn 1) (Laskey 和 Mills, 1977; Swanstrom 和 Shank, 1978) 的 检测 MPH LS AMC 则 无 效 。

不 管 增 感 屏 在 曝光 过 程 中 将 被 用 作 何 种 用 途 ， 它 在 曝光 暗盒 中 的 正确 放置 位 置 是 非常 关

@ 此 外 ,还 可 以 选用 稀土 元 素 氧 化 物 制作 的 增 感 屏 ， 如 DuPont Cronex Quanta 焉 也 很 常用 。 @ 在 放射 自 显影 中 ，?P 主要 用 于 DNA 测序 ， 它 与 3S 和 ?2P 一 样 ， 不 需要 使 用 增 感 犀 。 详 见 参考 文献 Zangursky 等 (1991),

¢ 185 ，

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

键 的。 胶片 应 放置 于 样本 和 增 感 屏 之 间 ， 这 样 胶片 不 仅 能 被 同位 素 的 电离 辐射 直接 曝光 ;还 能 “感受 ”到 增 感 屏 发 出 的 光 。 如 果 需 要 使 用 第 二 块 增 感 屏 ， 应 放置 在 样本 后 面 。 不 要 将 胶 片 放 在 两 块 增 感 屏 之 间 ， 而 将 样本 放 在 外 边 ， 这 样 会 降低 图 像 的 锐 度 〈 锐 度 高 则 敏感 度 高 ) 。 其 实 即 使 只 使 用 一 块 增 感 屏 ， 图 像 的 锐 度 也 会 有 所 下 降 ， 这 是 由 于 B 粒子 从 放射 源 出 来 后 穿 过 胶片 到 增 感 屏 时 发 生 散射 而 导致 的 。 其 实 ， 暗 盒 内 的 B 粒子 在 撞击 增 感 屏 时 是 相当 活 唉 的 。 仅 仅 对 8 能 量 源 直 接 曝光 时 ， 这 种 额外 扩散 的 能 量 会 造成 胶片 上 更 广泛 区 域 的 曝光 。 总 而 言 之 ， 增 感 屏 可 以 增加 敏感 度 从 而 缩短 曝光 时 间 ， 但 它 也 会 降低 分 辨 率 。

15.2.6 荧光 成 像 法

荧光 成 像 法 是 一 种 图 像 强 化 的 方法 ， 其 原理 是 利用 同位 素 衰变 粒子 与 一 种 称 为 得 石 的 复 合 物 相 互 作 用 ， 从 而 将 同位 素 衰变 过 程 释放 的 能 量 转变 为 光 ， 然 后 使 X 射线 胶片 曝光 。 与 增 感 屏 相 比 ， 荧 光 成 像 术 是 一 种 图 像 强 化 过 程 ， 主 要 在 使 用 低能 的 放射 源 为 标记 物 时 应 用 ， 如 3H (Randerath, 1970; Bonner 和 Laskey, 1974). RHMRREAKRHA MEARE ， 胺 凝 胶 ) 浸渍 在 荧光 成 像 溶 液 〈 闪 烁 液 ) 中 ， 然 后 将 凝 胶 取出 干燥 后 再 进行 放射 自 显 影 检 测 。 市 场 上 可 以 买 到 的 闪烁 液 ， 有 2,5 AAEM HIRAM CA) PPO) 或 水 杨 酸 钠 。 虽 然 闪烁 剂 浸渍 不 能 改进 对 2”P 或 到 II 的 检测 效果 ， 但 可 以 增强 对 C 和 5 S 的 检测 ， 而 且 几 乎 总 是 用 于 * H 的 检测 。 因 此 ， 奖 光 成 像 法 与 增 感 屏 的 信号 放大 作用 不 同 ， 后 者 可 被 视 为 一 种 外 部 的 莉 石 。 被 闪烁 液 浸渍 过 的 样本 应 在 一 80C 用 预 闪 过 的 胶片 (Kodak X-OMAT AR) 曝光 以 确保 胶片 的 曝光 反应 是 线性 的 。 荧 光 成 像 法 一 般 不 常用 于 常规 的 分 子 生 物 学 实验 中 。

15.2.7 胶片 预 闪

为 了 增加 胶片 对 弱 光 的 敏感 性 及 胶片 的 线性 曝光 反应 ， 在 曝光 前 可 以 选择 对 胶片 进行 预 闪 或 增 敏 处 理 。 当 胶片 对 短暂 的 儿 发 光 曝 光 时 ， 胶 片 被 激发 ， 即 启动 了 洪 影 的 形成 过 程 。 然 后 来 自 内 烁 液 或 增 感 屏 的 光子 促使 潜 影 形成 。 胶 片 预 闪 特别 适用 于 荧光 成 像 法 或 使 用 增 感 屏 来 促进 图 像 的 形成 。 预 闪 对 于 单 靠 电离 辐射 形成 潜 影 的 过 程 并 没有 什么 作用 。 此 外 ， 预 闪 还 可 以 用 在 化 学 发 光 法 中 ， 增 加 X 射线 胶片 的 敏感 性 。

15.2.8 暗盒 的 规格

在 放射 自 显 影 曝光 过 程 中 ， 选 择 一 个 合适 的 不 透 光 的 暗盒 ， 是 决定 成 败 的 最 基 末 的 要 求 。Sigma 公司 的 由 乙烯 树脂 覆盖 的 曝光 暗盒 (Sigma No. E8635) 虽然 不 是 非常 精细 ， 但 价格 便宜 而 且 用 途 广 泛 。 使 用 时 建议 将 暗盒 放置 于 两 块 lcm 厚 的 树脂 玻璃 之 间 ， 以 阻 断 高 能 B 粒 子 可 能 对 实验 员 和 附近 人 员 造 成 的 身体 伤害 。 此 外 较为 常用 的 是 一 种 重量 上 比较 轻 、 由 乙 炳 树脂 包 被 的 铝 制 作 而 且 内 部 固定 有 增 感 屏 的 较 好 的 暗盒 。 盒 内 的 聚氨酯 热 片 有 助 于 维 持 胶片 与 膜 持续 而 均衡 的 接触 。 此 外 还 有 由 不 锈 钢 制作 的 暗盒 。 另 外 还 有 一 类 真空 曝光 暗 盒 ， 适 用 于 曝光 过 程 不 能 有 氧 及 湿 气 存在 的 情况 。 实验 室 在 选用 暗盒 时 必须 要 确定 曝光 装置 要 适合 各 种 需要 ， 不 管 是 放射 自 显 影 还 是 化 学 发 光 。 在 准备 曝光 装置 时 ， 极 为 重要 的 一 点 是 ， 滤 膜 在 暗盒 内 必须 固定 不 动 ， 在 曝光 过 程 中 ， 滤 膜 的 任何 哪怕 是 极 微小 的 移 位 都 将 使 最 上 的 图 像 失真 。 一 个 比较 简单 的 方法 是 将 塑料 纸 包 庄 的 滤 膜 固定 在 一 张 裁剪 成 暗盒 大 小 的 Whatman 滤纸 上 。 不 要 在 增 感 屏 上 直接 粘贴 东西 。

+ 186 -

第 1 章 ”检测 原理

15.2.9 显影 与 定 影

曝光 后 的 胶片 依次 经 过 显影 液 、 显 影 终 止 液 、 定 影 液 及 最 终 的 仔细 清洗 等 处 理 过 程 后 ， 上 面 的 不 可 见 的 潜 影 才 会 转变 成 可 见 的 放射 自 显影 图 像 。 对 于 任何 一 种 X 射线 胶片 ， 制 造 厂家 都 会 推荐 与 之 相 适用 的 显影 液 及 定 影 液 。 胶 片 可 以 在 暗室 里 用 手工 冲洗 而 不 需要 用 任何 仪器 。 此 外 如 果 有 胶片 冲洗 机 器 ， 可 以 用 机 器 自动 冲洗 胶片 。 如 果 曝 光 是 在 一 80YC 进行 的 ， 则 需要 等 到 胶片 温度 升 到 室温 后 再 打开 暗盒 冲洗 胶片 ， 否 则 ， 图 像 的 质量 及 实验 的 可 重复 性 可 能 会 比较 差 。 如 果 手 工 冲洗 胶片 ， 胶 片 应 当 用 流水 〈16 一 24C) 清洗 15min WE Ra BR 干 ， 这 样 得 到 质量 最 好 的 图 像 。

15.2.10 ”放射 自 显影 : 推荐 方案

当心 ”对 于 所 有 涉及 同位 素 的 实验 ， 必须 严 格 遵照 要 求 正 确 存 放 放 射 性 物质 ; 遵守 所 有 安全 规范 ， 以 减 小 对 实验 员 健 康 的 危害 。 带 有 放射 性 滤 膜 的 操作 ， 最 好 应 在 树脂 玻璃 的 防 护 下 进行 。

为 了 获得 有 意义 的 数据 ， 有 必要 使 曝光 时 间 及 显影 时 间 标 准 化 。 对 同一 个 印迹 样本 ， 用 较 短 时 间 曝 光 或 用 较 长 时 间 曝 光 以 及 采用 不 同 的 冲洗 方法 ， 都 会 导致 所 得 的 结果 完全 不 同 。

(1) 部 分 工 : 开始 曝光

© 做 完 杂 交 后 的 所 有 严谨 洗涤 过 程 〈 第 14 章 ) 后 ， 将 杂交 膜 放 于 一 张 略 大 于 What- man 3mm 滤纸 上 ， 吸 去 残留 在 膜 上 的 缓冲 液 。

Q 用 塑料 纸 包 庄 已 经 探 针 杂 交 的 膜 ， 小 心 避免 在 膜 的 边缘 产生 皱 裙 。 包 庄 膜 的 塑料 纸 多 折 故 几 次 ， 以 确保 不 会 在 曝光 时 将 X 射线 胶片 弄 湿 ，

注意 ”潮湿 的 杂交 膜 直接 与 X 射线 胶 片 接触 会 导致 两 者 的 紧密 粘连 。 两 者 一 旦 粘 在 一 起 就 分 不 开 ， 最 终 导致 杂交 膜 与 胶片 全 部 作废 ， 实 验 失 败 。

@ 在 塑料 纸 包 庄 好 的 杂交 膜 上 方 10 一 15cm 处 ， 手 持 一 盖 格 (Geiger) 计数 探测 器 ， 检 测 放射 性 的 强 弱 以 估计 放射 自 显 影 所 需 的 时 间 。 用 Northern 技术 检测 稀有 的 mRNA 以 及 用 Southern 技术 检测 单 拷贝 基因 时 ， 杂 交 膜 上 探测 到 的 “嘎嘎 ”计数 声 ， 通 常 比 从 背景 探测 到 的 计数 声 多 不 了 多 少 。 如 果 探 针 中 迭 有 与 分 子 量 标记 互补 的 探 针 时 ， 那 么 最 后 在 膜 的 分 子 量 标记 区 往往 能 探测 到 更 强 的 信号 。 在 膜 表 面 探测 到 大 片 的 高 强度 信号 意味 着 背景 比较 高 。

由 REI (hig GBX-2 BRIT, Kodak No. 141 6627) 下 ， 将 塑料 纸 包 庄 的 杂交 膜 、 一 张 XAR-5 胶片 和 一 张 增 感 屏 一 起 放 和 暗盒。 于 一 80C 存 放 过 夜 。

(2) BSP I: 胶片 显影

@ 曝光 结束 后 ， 从 一 80C 冰 箱 拿 出 暗盒 使 其 温度 上 升 到 室温 。 如 果 使 用 自动 X 射线 胶 片 冲洗 机 ， 在 安全 灯 下 打开 暗盒 拿 出 胶片 ， 按 照 机 器 的 使 用 说 明 操作 ， 然 后 从 第 四 步 开 始 操 作 。 如 果 是 手工 冲洗 胶片 ， 按 照 第 @ 一 罗 步 的 说 明 来 操作 。

© 显影 液 9 应 事先 配制 好 并 存储 于 密封 的 避 光 瓶 中 ， 因 为 显影 液 对 光敏 感 ， 见 光 会 很 快 氧化 。Kodak 公司 推荐 使 用 Kodak GBX 显影 液 @。 在 笔者 的 实验 室 也 经 常 使 用 Kodak D-76

© 注意 : 避免 皮肤 接触 到 显影 液 、 终 止 液 和 定 影 液 ， 操 作 以 上 这 些 溶 液 及 其 他 所 有 化 学 物质 时 ， 注 意 佩 戴 眼 睛 保护 装置 。 @ GBX 显影 液 和 固定 液 有 成 对 的 包装 可 供 购 买 〈( 例 如 Sigma No. Z35，414-7) 。

。 187 ，

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

显影 液 〈Kodak No. 146 4809) 。 在 托盘 中 倒 人 足 量 的 显影 液 浸没 胶片 。 刚 从 存储 瓶 中 倒 出 的 显影 液 应 当 是 无 色 透 明 的 。 随 着 使 用 次 数 的 增多 ， 显 影 液 被 氧化 而 呈 黄 色 。 略 微 变 黄 的 显 影 液 虽然 不 是 很 理想 ， 但 是 只 要 显影 液 还 是 透明 的 就 仍然 能 用 ， 但 即使 此 时 冲洗 出 的 胶片 质 量 还 凑合 ， 使 用 这 种 显影 液 仍 应 当 作为 最 后 的 候选 方案 。 变 成 暗 黄色 或 棕色 的 显影 液 已 完全 失效 ， 必 须 立 即 倒 掉 。

© 准备 第 二 个 托盘 ， 里 面倒 人 某 种 终止 液 或 水 。

@ 准备 第 三 个 托盘 ， 里 面倒 人 定 影 液 (Kodak No. 197 1753) 。 与 显影 液 一 样 二 定 影 液 也 需要 事先 配制 并 保存 于 密封 的 避 光 瓶 中 。 盘 中 倒 人 的 定 影 液 也 要 能 没 过 胶片 。

@@ 记 住 暗室 中 各 种 物品 的 摆 放 位 置 ， 然 后 关 灯 。 和 否则 在 黑暗 中 到 处 摸索 是 不 利于 操 作 的 。

@ 打开 安全 灯 ， 关 闭 照 明灯 。 戴 好 手套 ， 打 开 暗 盒 ， 移 动 胶片 前 ， 在 胶片 的 一 角 折 一 下 以 便于 以 后 能 判别 胶片 的 方向 。 不 要 扔 掉 或 者 改变 杂交 膜 的 相对 位 置 ， 并 确保 塑料 纸 包 庄 的 杂交 膜 没有 粘 在 胶片 上 《〈 这 种 情况 时 有 发 生 )。

@ 将 胶片 浸入 显影 液 中 ， 不 要 将 胶片 只 是 漂浮 在 显影 液 表面 。 开 始 显影 计时 ， 并 轻 轻 摇动 显影 托盘 。 曝 光 的 胶片 通常 在 60s 内 开始 显 出 条 带 ， 但 有 时 要 长 达 2.5min 才 显 出 条 带 。 当 条 带 开 始 出 现时 记录 下 所 需 的 时 间 ， 用 作 以 后 冲洗 胶片 的 参考 。 这 样 可 以 确定 标准 的 显影 时 间 ， 这 对 于 分 析 不 同 批 次 的 实验 结果 而 言 是 非常 有 意义 的 。

四 显影 结束 后 ， 立 刻 将 胶片 从 显影 液 中 取出 并 浸入 终止 液 中 漂洗 20 一 30s。

GD 将 胶片 转移 到 第 三 个 托盘 中 ， 浸 入 定 影 液 中 。 轻 轻 摇动 托盘 ， 片 刻 后 可 以 观察 到 胶 片 变 透明 。 通 常 在 5min 之 内 胶片 变 得 完全 透明 ， 此 时 定 影 过 程 结 束 。 有 时 定 影 过 程 需要 延 长 至 5~10min,

D 定 影 结 束 后 ， 可 以 打开 照明 灯 。 小 心地 将 胶片 转 到 盛 有 温水 的 水 槽 中 ， 用 流水 漂洗 15min 以 上 ， 将 残留 的 化 学 物质 清除 和 干净。 这样 清 洗 有 助 于 获得 高 质量 的 胶片 。 将 胶片 挂 起 来 晾 干 。

GD 如 果 首 次 曝光 洗 出 的 胶片 很 干净 则 表明 背景 很 好 。 然 后 可 以 接着 进行 第 二 次 上 曝光， 于 一 80 人 放置 3 天。 重复 上 述 步 又 冲 洗 胶片 。 如 果 首 次 曝光 后 冲洗 出 的 胶片 背景 很 高 ， 没 什 么 明显 条 带 ， 而 且 在 胶片 上 显 出 杂交 膜 的 轮廓 ， 此 时 可 以 考虑 将 杂交 膜 从 塑料 纸 中 取出 ， 重 : 新 进行 最 严谨 的 洗涤 9。 更 为 严谨 的 洗涤 方式 为 : 将 杂交 膜 在 0. 1X SSPE, 0.1% SDS 溶液 中 于 55 一 60C 洗 10 一 15min。 然 后 重新 包 庄 杂交 膜 曝 光 。

(0 按照 生产 膜 的 三 家 说 明 ， 除 去 杂交 膜 上 的 探 针 ， 然 后 保存 。

15.3 大 同位 素 万 法

非 同位 素 方法 的 核酸 探 针 合成 和 杂交 后 检测 的 核心 是 在 探 针 中 挫 人 标记。 这 种 标记 随后 会 定位 到 杂交 膜 上 ， 并 具有 可 重复 的 分 辩 率 和 灵敏 度 。 非 同位 素 的 方法 有 ，@ 化 学 发 光 法 ， 即 通过 酶 促 反应 促使 合适 的 底 物 发 光 ;， 四 显 色 检测 法 ， 即 通过 酶 促 反应 直接 在 膜 上 形成 有 各 的 沉淀 物质 。 在 化 学 发 光 法 中 ， 发 出 的 光 可 用 X 射线 胶片 来 记录 ， 其 所 需 的 虽 光 时 间 比 族

@ 如 果 使 用 化 学 发 光 法 ， 严 谦 洗涤 过 后 需要 再 次 对 杂交 膜 进 行 封闭 ， 随后 进行 其 的 结合 及 加 入 合适 底 物 反应 发 光 。 工 作 量 比较 大 ， 因 此 建议 第 os 188 *

也 步骤 ， 如 半 抗 原 的 识别 、 酶 标 物 次 严谨 洗涤 膜 时 尽量 充分 些 ， 以 避免 重 洗 。

第 15 章 检测 原理

射 自 显影 要 短 得 多 。 在 显 色 检测 法 中 ， 通 过 直接 检测 杂交 膜 表 面 的 沉淀 物 来 分 析 实 验 结果 。 化 学 发 光 法 和 显 色 检 测 法 的 优点 是 不 用 接触 放射 性 材料 及 不 存在 同位 素 垃 圾 的 处 理 等 问题 。 而 且 检 测 时 间 从 几 小 时 或 几 天 减少 到 几 分钟 。

许多 生物 试剂 及 产品 的 生产 厂商 已 经 研发 出 许多 基于 化 学 发 光 的 非 同位 素 标记 与 检测 系 统 。 总 的 来 说 ， 非 同位 素 检测 方法 的 原理 主要 是 依次 将 一 系列 试剂 如 生物 素 (Bio) 、 地 高 辛 (DIG), KIER (FL) 或 酶 直接 连接 到 探 针 上 形成 “分 子 三 明治 ”， 例 如 增强 型 化 学 发 光 (ECL) 系统 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ) 。 而 且 ， 在 非 同位 素 方法 中 ， 杂 交 膜 需 要 进行 严谨 洗 桨 和 非 严谨 洗涤 ， 后 者 用 中 高 浓度 的 SDS 溶液 ， 最 后 一 次 洗涤 要 在 干净 的 容器 中 进行 ， 以 确保 没有 残留 物 抑 制 检 测 反 应 所 用 的 酶 的 活力 〈 见 后 文 详 述 ) 。

15.3.1 生物 素

生物 素 是 一 种 水 溶性 的 小 分 子 维生素 ， 很 容易 连接 到 许多 生物 分 子 上 。 核 酸 探 针 的 生物 素 化 有 以 下 几 种 方式 。

@ 生物 素 化 的 核 苷 酸 。 实 际 上 ， 所 有 传统 的 酶 促 探 针 合 成 法 ， 包 括 随机 引物 法 、 缺 口 平移 法 和 聚合 酶 链 反 应 〈PCR)， 都 可 以 用 生物 素 化 的 核 苷 酸 来 进行 。 例 如 作为 dTTP 的 类 似 物 的 Bio-11-dUTP®, AiA Bio 表明 该 核 苷 酸 是 生物 素 化 的 ， 而 且 生 物 素 分 子 与 核 苷 酸 分 子 间 有 11 个 原子 的 连接 臂 相 连 。 此 外 还 可 以 用 Bio-21-dUTP 标记 DNA。 与 此 类 似 ，Bio- 16-UTP® 和 Bio-21-UTP 可 以 标记 RNA。 一 般 来 说 ， 连 接 臂 越 长 ， 检 测 反 应 中 生物 素 越 容 易 与 链 霉 亲 和 素 相互 作用 。 但 相 比 而 言 ， 连 接 臂 越 得， 在 缺口 平移 、 随 机 引物 法 及 PCR 中 ， 生物 素 化 的 核 苷 酸 的 挫 人 效率 越 高 。Bio-11-dUTP 是 权衡 标记 挫 入 效率 和 检测 灵敏 度 的 最 佳 选择 ， 因 此 被 广泛 用 于 非 同 位 素 DNA 探 针 的 合成 。

@O 生物 素 化 的 引物 。 最 简单 的 生物 素 化 方法 是 在 寡 核 苷 酸 合成 过 程 中 进行 的 ， 这 种 生 物 素 化 的 寡 核 苷 酸 可 以 直接 用 作 探 针 或 用 于 PCR。 现 在 倾向 于 直接 订购 5” 端 生物 素 化 标记 好 的 寡 核 苷 酸 。 这 样 就 不 用 再 担心 在 检测 过 程 中 标记 挫 人 效率 的 问题 。 朝 核 苷 酸 生 物 素 化 标 记 的 额外 费用 可 以 很 容易 地 通过 标记 的 高 效率 和 方便 性 得 以 平衡 。

@ 光 激 活 的 乙酸 生物 素 @ (Forster 等 ，1985; McInnes 等 ，1987;，Denman 和 Miller, 1989) 。 这 种 材料 是 一 种 芳 基 霉 氮 化 的 生物 素 衍 生物 ， 可 用 于 标记 单 链 或 双 链 的 DNA 或 RNA。 标 记 反 应 由 可 见 光 催化 ， 只 需 20~30min 便 可 以 完成 。 平 均 每 50 一 100 RH RP 挫 人 一 个 生物 素 分 子 ， 因 此 不 能 用 于 标记 朝 核 苷 酸 。 用 这 种 方法 标记 的 探 针 与 用 其 他 生物 素 化 方法 标记 核酸 分 子 一 样 稳定 。

由 生物 素 化 的 补 骨 脂 素 〈Cimino 等 ，1985; Wassarman，1993) 。 补 骨 脂 素 及 其 衍生 物 是 平面 三 环 化 合 物 ， 在 320 一 400nm 光照 下 可 以 戏 和 人 双 链 核酸 。 这 些 分 子 可 以 共 价 交 联 到 核 苷 酸 的 碱 基 上 ， 特 别 是 与 胸腺 喀 啶 脱氧 核 苷 交 联 ， 因 此 其 标记 效率 比 光 激 活 的 生物 素 高 得 多 。 稍 差 一 些 的 是 单 链 分 子 如 窒 核 苷 酸 也 能 被 修饰 。 生 物 素 化 的 补 骨 脂 素 衍 生物 (Schleicher & Schuell, Keene, NH) 对 核酸 杂交 中 所 用 的 生物 素 化 探 针 的 合成 非常 有 用 。 用 正 丁 醇 抽 提 可 以 容易 地 将

@ Biotin-11-2 -deoxyuridine-5 -triphosphate，tetralithium salt (生物 素 -11-2“- 脱 氧 尿 苷 酸 -5 -三 磷酸 四 锂 盐 ) 。

@ Biotin-16-2'-uridine-5'-triphosphate (生物 素 -16-2“- 尿 苷 酸 -5'- 三 磷酸 盐 ) 。

© 光 激 活 的 乙酸 生物 素 : N-(5- 释 氮 -2- 硝 基 葵 基 )-N'-(3- 生 物 素 化 氨 两 基 )-N'- 甲 基 -1,3- 二 氨基 丙烷 。Pierce Biotech- nology, Rockford, IL 有 售 。

° 189 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

未 失信 的 生物 素 化 的 补 骨 脂 素 除 去 。

标记 后 的 生物 素 化 探 针 可 以 在 一 20C 稳 定 保存 一 年 ， 可 分 装 成 小 份 冻 存 。 用 前 取出 一 份 探 针 融化 ， 如 果 是 双 链 探 针 则 在 沸水 浴 中 者 过 后 立即 放 于 冰 上 冷却 ， 然后 加 入 到 杂交 缓冲 液 中 。 生 物 素 化 探 针 可 以 用 于 显 色 检 测 法 和 化 学 发 光 法 。

生物 素 分 子 与 链 霉 亲 和 素 分 子 间 有 极 高 的 亲和力 〈Kd 王 10 .5L/mol)。 链 霉 亲 和 素 是 一 种 从 链 霉 菌 中 分 离 出 的 四 聚 体 蛋白 CM, 60000)， 其 上 有 四 个 生物 素 结合 位 点 。 与 亲 和 素 (从 鸡蛋 中 提取 ) 不 同 的 是 ， 链 霉 亲 和 素 的 等 电 点 呈 中 性 ， 在 生理 pH 条件 下 带电 基 团 不 多 ， 而 且 没有 糖 链 修 饰 。 这 些 特 性 有 利于 减少 非特 异 吸附 ， 降 低 背 景 ， 从 而 提高 检测 灵敏 度 。 近 年 来 已 有 许多 关于 生物 素 - 链 霉 亲 和 素 及 相关 技术 应 用 于 核酸 杂交 的 报道 《〈 典 型 的 应 用 实例 见 Leary 等 ，1983; Wilchek 和 Bayer, 1984; Hofman 和 Finn, 1985), 并 且 应 用 的 多 样 性 在 不 断 增 加 。 生 物 素 检测 系统 的 第 一 步 是 生物 素 与 链 霉 亲 和 素 的 结合 。 TEMAS, HER 亲 和 素 是 经 过 修饰 的 ， 如 连接 有 AP 或 辣 根 过 氧化 物 酶 CARP). AP 可 以 将 相应 的 确 物 去 磷酸 化 而 发 光 〈 如 底 物 为 二 氧 环 已 烷 ) 或 形成 有 色 沉 淀 〈 如 BCIP 和 NBT)9。HRP 在 有 过 氧化 氨 〈HzO;) 存在 时 可 以 引发 化 学 反应 导致 发 光 [如 由 发 光 氨 〈luminol) 介 导 ] 或 形成 A five (Uh 4 毛 -1- 蔡 酚 介 导 ) 。

15.3.2 ihe

地 高 辛 (DIG) 是 从 植物 洋 地 黄 中 提取 的 ， 洋 地 黄 还 是 一 种 强 心 药 的 原料 。DIG(Roche Applied Science，Indianapolis，IN) 广泛 用 于 合成 非 同位 素 标记 的 探 针 ， 是 生物 素 化 以 外 的 另 一 种 标记 方法 。 与 生物 素 相 同 ，DIG 标记 的 探 针 也 可 以 适用 于 显 色 检 测 法 和 化 学 发 光 法 。 用 随机 引物 法 合成 DNA 探 针 时 ， 使 用 DIG-11-dUTP 时 的 合成 效率 最 高 。 用 体外 转录 法 合成 RNA 探 针 时 可 以 使 用 DIG-11-UTP。 类 固 醇 类 半 抗 原 DIG 通过 一 个 连接 臂 连接 到 核 苷 酸 上 ， 或 者 在 窒 核 苷 酸 引 物 合成 时 在 5 ” 端 加 上 DIG 标记 。 这 种 DIG 标记 的 寡 核 苷 酸 可 以 BA PCR 产物 ， 也 可 以 直接 用 作 核 酸 杂 交 探 针 。 不 论 何 种 方式 ， 最 终 标 记 了 DIG 的 分 子 可 以 按 其 他 探 针 一 样 的 方式 用 作 杂 交 探 针 。DIG 标记 可 以 通过 化 学 发 光 法 或 直接 在 杂交 膜 或 组 织 切片 上 形成 不 溶 的 有 色 沉 深 来 进行 杂交 后 的 检测 。

杂交 后 严谨 洗涤 杂交 膜 ， 然 后 用 酶 联 免疫 检测 法 检测 DIG 标记 的 探 针 ， 也 就 是 用 连接 有 酶 的 抗体 〈 例 如 anti-DIG-AP 或 anti-DIG-HRP) 来 检测 。 与 生物 素 系统 的 检测 原理 类 似 ， 在 化 学 发 光 法 或 显 色 检测 法 中 ， 光 的 发 射 或 沉淀 的 形成 是 通过 酶 切割 相应 的 底 物 而 导致 的 。

15.3.3 荧光 标记 的 核 背 酸

如 第 13 章 所 述 ， 最 常用 的 荧光 探 针 是 用 Cy3 或 Cy5 标记 的 ， 而 不 是 以 往 的 用 LE 标记 的 核 苷 酸 (FL-12-dUTP fil FL-12-UTP) 挫 入 标记。 使 用 这 种 传统 的 荧光 标记 法 时 ， 其 控 针 检 测 及 信号 产生 的 机 制 与 DIG 标记 的 探 针 是 相似 的 。 杂 交 后 ， 用 抗 FL 的 高 亲和力 抗体 对 探 针 定 位 ， 然 后 通过 与 抗体 交 联 的 AP 或 HRP 进行 化 学 发 光 或 显 色 来 检测 。

就 直接 检测 杂交 膜 上 的 FL 探 针 而 言 ， 由 于 FL 的 荧光 猴 灭 率 较 高 且 荧 光 强 度 受 pH fA 的 影响 ， 因 此 对 这 种 艾 光 团 的 定量 测定 存在 问题 。 虽 然 新 的 一 些 仪器 及 染料 克服 了 这 种 方法 内 在 的 一 些 缺 陷 ， 但 FL 探 针 的 检测 最 好 还 是 使 用 酶 联 的 抗 FL 抗体 。

@ BCIP, 5--4-M-3-"JMR BEARER; NBT， 氨 蓝 四 只 *， 190 ，

第 1S 章 检测 原理

15.3.4 直接 酶 标 法

ECL 系统 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 的 特点 是 修饰 过 的 HRP 通过 成 二 醛 连接 臂 直接 连接 到 探 针 分 子 上 ， 因 此 该 酶 在 整个 杂交 及 随后 的 严谨 洗涤 过 程 中 都 存在 。 这 种 标记 及 检测 过 程 不 需要 任何 半 抗 原 的 识别 过 程 ， 因 此 可 以 立刻 使 用 化 学 发 光 底 物 。 该 法 是 最 为 快速 的 标记 及 检测 方法 之 一 ， 得 到 了 广泛 的 使 用 。

15.3.5 化 学 发 光 检 测 法

化 学 发 光 法 就 是 利用 氧化 反应 或 水 解 反 应 ， 将 化 学 能 转变 为 可 见 光 。 简 而 言 之 ， 化 学 发 光 法 就 是 通过 化 学 反应 来 发 光 。 这 种 技术 提供 了 一 种 放射 性 同位 素 、 荧 光 技 术 及 显 色 检 测 法 以 外 的 敏感 度 高 而 且 性 价 比 好 的 选择 〈 见 表 15.1)。 目 前 ， 这 种 技术 已 应 用 于 许多 传统 的 分 子 生 物 学 方法 ， 包 括 Northern 印迹 技术 、Southern MwA. BRA (plaque lifts) 检 测 和 原 位 克隆 杂交 。 虽 然 这 些 方法 的 基本 原理 基本 相同 ， 但 基于 化 学 发 光 法 进行 杂交 检测 的 试剂 盒 还 是 有 所 不 同 ， 主 要 是 系统 的 复杂 性 程度 不 一 样 ， 即 所 需 试剂 的 数量 及 产生 信和 号 所 需 操作 步骤 的 繁 简 程度 不 一 样 。

表 15.1 化 学 发 光 检 测 法 与 放射 自 显影 同 位 素 衰变 检测 法 的 比较

检 测 参 数 化 学 发 光 检 测 法 放射 自 显影 同位 素 衰变 检测 法 灵敏 度 高 到 极 高 极 高

分 辩 率 条 带 非常 锐利 清晰 双重 条 带 往 往 难以 分 辨 曝光 时 间 几 分 钟 到 几 小 时 几 天 到 几 周

检测 X 射线 胶 片 X 射线 胶片

对 健康 的 危害 相对 较 低 非常 高

标记 后 探 针 稳定 性 可 以 稳定 存放 1 年 由 半衰期 而 定

杂交 后 膜 的 处 理 曝光 前 用 检测 缓冲 液 处 理 曝光 前 不 需要 用 缓冲 液 处 理

探 针 的 标记 及 化 学 发 光 法 检测 决 不 能 影响 核酸 杂交 的 参数 ， 这 点 对 放射 性 标记 的 探 针 也 是 同样 重要 的 。 实 际 上 ， 许 多 适用 于 化 学 发 光 法 检测 的 标记 技术 也 适用 于 显 色 检 测 法 。 这 两 种 检测 系统 的 不 同 点 在 于 底 物 ， 这 些 底 物 在 激活 试剂 的 存在 下 会 变 得 不 稳定 。 检测 化 学 发 光 的 机 制 与 放射 自 显 影 中 检测 同位 素 误 变 的 机 制 相 似 。 发 出 的 相当 强 的 光 ， 可 以 在 较 短 的 时 间 内 “〈 与 放射 自 显影 曝光 所 需 时 间 相 比 ) 在 X 射 线 胶 片上 产生 一 个 可 定 量 的 图 像 。

15.3.5.1 化 学 发 光 法 的 底 物

大 多 数 化 学 发 光 检 测 体系 可 以 分 为 两 类 : 使 用 AP 的 和 使 用 过 氧化 物 酶 的 9。AP 体系 里 通常 使 用 的 底 物 是 1, 2- 二 氧 环 已 烷 了 衍生 物 ， 包 括 Lumigen PPD® (Lumigen, Inc. , Southfield, MI), CSPD 和 CDP Star (Applied Biosystems, Foster City，CA)。 其 他 的 AP KD (E$ERR-AWCEERTED) 也 相继 研发 出 来 ， 这 些 获 得 专利 的 1,2- 二 氧 环 已 烷 试 剂 在 小 牛 肠 AP (Bronstein 和 McGrath, 1989) 的 催化 下 能 迅速 转变 为 发 光 的 产物 。 最 终 发 出 的 蓝光 (~470nm) 强度 与 AP 的 量 成 正比 〈 图 15.3)。Applied Biosystems 还 提供 一 种 化 学 发 光 增 强 剂 ， 这 些 试 剂 适用 于 许多 分 子 生 物 学 实验 。

@ 8 半 乳 糖 昔 酶 和 荧光 素 酶 虽然 通常 只 用 于 报告 基因 检测 ， 但 也 适用 于 化 学 发 光 检测 法 。 @ 从 化 学 上 看 ，Lumigen PPD 是 4- 甲 氧 基 -4-(3- 磷 酸 葵 基 ) WH (1,2- 二 环 氧 已 烷 -3,2 -金刚 烷 ) 磷酸 氢 二 钠 盐 。 。 191 ，

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

°° och, OCH; OCH, > 碱 性 磷酸 酶 (AP) — fe 9 O Cl OPO;

lp hv CSPD® CS9D

图 15.3 碱 性 磷酸 酶 催化 二 氧 环 已 烷 底 物 去 磷酸 化 ， 而 形成 亚 稳 态 的 酚 盐 阴离子 ， 后 者 分 解 时 发 出 约 480nm 的 光 。 发 出 的 光 不 断 增强 到 一 定 的 强度 为 止

三 种 传统 的 适用 于 AP 系统 内 含 Lumigen PPD 的 试剂 为 : 中 LumirPhos 530， 内 带 一 种 荧光 增强 剂 ， 发 光波 长 可 达 530nm; @Lumi-Phos 480, AA RIC RA, HA Lumi- Phos 530 相同 ; @Lumi-Phos Plus， 内 含 荧 光 增 强 剂 ， 可 以 增加 化 学 发 光 的 敏感 性 ， 发 光波 长 为 470nm。 近 年 来 ， 又 出 现 一 种 新 的 9，10- 二 氨 听 啶 底 物 ， 即 Lumigen APS-5 (Lumi- gen，JInc) 。 这 种 底 物 具 有 极 高 的 敏感 性 ， 对 低 至 10- ?mol 的 AP 都 可 检测 到 ， 而 且 发 光 时 间 持 入， 使 得 检测 过 程 不 用 太 急 促 。 此 外 ， 一 种 产生 高 强度 橙 红 色光 的 试剂 Lumi-Phos CCD 已 被 研发 出 来 ， 这 种 试剂 使 用 电荷 耦合 器 件 (CCD) 相机 来 检测 信和 号 。

过 氧化 物 酶 系统 所 用 的 底 物 为 HzO: 。 其 中 包含 的 化 学 反应 过 程 为 : HzOs 的 还 原 反 应 产 RA HAE CO, ) 和 和 氢气 〈Hs )， 这 些 产 物 接着 促 发 了 环 酰 腓 发 光 所 @ (Matthews 等 ，1985;

Thorpe 和 Kricka, 1986) 或 其 他 多 种 相关 底 物 的 氧化 发 光 反 应 。 在 基于 发 光 氢 的 化 学 反应 中 ， NH HRP oe +Nz+ 可 见 光 ”伴随 发 光 的 氧化 反应 产物 是 3-2 ESB A —

NH, O NH O 盐 和 氮气 CN.) (图 15.4)。 探 针 的 杂交 位 置 及 杂交 量 通常 通过 X 射线 胶片 曝光 记录 ， 这 点 与 放射 自 显影 相似 。 新 的 基于 过 氧化 物 酶 的 化 学 发 光 检 测试 剂 有 Lumigen PS-atto, Lumigen PS-2 和 Lumigen PS-3 (Lumigen, Ine. )

化 学 发 光 检 测 杂交 信和 号 一 般 是 一 系列 复杂 操作 的 最 后 一 步 。 这 些 操作 包括 探 针 标记 、 杂 交 膜 的 封闭 、 杂 交 后 的 洗 膜 、 杂 交 膜 的 第 三 次 封闭 、 半 抗原 识别 结合 、 重 复 洗 膜 和 酶 促 降解 相应 的 底 物 。 如 前 所 述 ， 化 学 发 光 的 检测 机 制 是 要 形成 “分 子 三 明治 ”。 例 如 ， 生 物 素 化 的 探 针 分 子 通过 与 链 霉 亲 和 素 -AP 或 链 霉 亲 和 素 - ARP 反应 来 定位 。DIG 标记 的 探 针 则 是 通过 抗 DIG 的 酶 联 抗体 来 定位 。 用 于 检测 FL 标记 探 针 的 抗 FL 的 抗体 也 是 酶 联 抗体 。 然 后 通过 与 相应 底 物 旷 育 而 发 出 可 见 光 。 为 了 记录 发 光 的 位 置 及 强度 ， 与 底 物 孵 育 过 的 膜 立即 用 塑料 膜 包 庄 ， 然 后 对 X 射线 胶片 曝光 ， 这 与 整体 放射 自 显影 非常 相似 《〈 详 见 放 射 自 显影 部 分 )。 由 于 没有 使 用 同位 素 ， 因 此 所 得 图 像 最 好 称 为 化 学 发 光 图 ， 而 非 放射 自 显影 图 。

作为 一 项 检测 技术 ， 化 学 发 光 法 最 常见 的 问题 是 有 时 背景 较 高 或 是 完全 没 信和 导 。 造 成 这 样 的 结果 通常 是 因为 : 四 杂交 后 以 及 检测 过 程 中 没有 洗 干 净 杂 交 膜 ，@ 在 加 酶 联检 测试 剂 之 前 ， 膜 没有 封闭 好 ，@@ 检 测 过 程 开始 后 ， 膜 被 晾 二 过 ;@ 轩 佩戴 了 带 滑石 粉 的 乳 WEF GENT X 射线 胶片 的 处 理 也 不 利 ) 。 在 笔者 的 实验 室 ， 杂交 后 严谨 洗 膜 、 严 格 遵照

O

BIA 3- 氨 基 邻 葵 二 甲酸 盐

图 15.4 PRR ACR CHRP) 在 有 HzO 和 发 光 氨 的 存在 下 发 生 反应 产生 可 见 光 。 在 几 分 钟 内 发 出 的 光 的 强度 达到 高 峰 ， 随 后 急剧 减弱

@ 5- 氨 基 -2,3- 二 氧 -1 ,4- 邻 茉 二 亚 甲 基 二 氮 陆 图 二 酮 。 “192 。

第 1S 章 ，” 检 测 原 理

厂家 推荐 的 检测 操作 程序 ， 以 及 使 用 无 滑石 粉 手 套 后 显著 提高 了 曝光 质量 ， 高 敏感 度 具 有 很 好 的 重复 性 。

15.3.6 显 色 检测 法

许多 于 20 世纪 80 年 代 中 期 出 现 的 显 色 检测 系统 都 因 这 样 或 那样 的 原因 而 没 能 得 到 广 泛 应 用 。 随 着 一 些 改进 的 固 相 “〈 核 酸 固 相 化 到 膜 上 ) 化 学 发 光 检 测 方法 的 出 现 ， 显 色 检 测 系统 已 渐渐 被 冷落 。 一 个 值得 注目 的 例外 是 DIG 标记 系统 ， 如 以 前 人 们 所 熟知 的 Gen- ius 试剂 盒 〈Roche Applied Science，Indianapolis，IN)， 在 原 位 杂交 的 非 同 位 素 检测 方法 中 独树一帜 。

在 显 色 检测 法 及 化 学 发 光 法 的 操作 过 程 中 ， 在 加 酶 促 底 物 前 ， 所 加 的 试剂 通常 是 相似 的 。 基 于 AP 的 显 色 检测 法 中 ， 最 后 一 步 通常 是 由 酶 催化 BCIP 去 磷酸 化 ， 产 物 随 后 与 NBT 反应 形成 蓝 紫 色 的 沉淀 直接 沉积 在 杂交 膜 上 。 该 反应 只 在 存在 酶 的 位 置 发 生 ， 也 即 杂 交 的 位 置 。 因 为 没有 放射 自 显影 或 化 学 发 光 过 程 发 生 ， 不 需要 进行 胶片 曝光 。 显 色 检 测 过 程 一 般 需 要 长 达 数 小 时 才能 完成 。 有 报道 表明 某 些 显 色 检 测 系 统 敏 感度 低 的 原因 是 膜 上 沉积 的 有 色 沉 淀 抑制 了 AP 的 活性 所 致 (Pitta 等 ，1990) 。 由 这 种 原因 导致 的 酶 活性 抑制 会 立即 影响 到 定 量 分 析 ， 最 终 得 到 的 数据 不 可 靠 而 且说 明 不 了 任何 问题 。 基 于 HRP 的 显 色 检测 过 程 ， 其 最 后 步骤 是 利用 HzO* 和 4- 氧 -1- 蔡 酚 或 TMB®,

下 面 的 轶 事 就 说 明了 显 色 检 测 法 与 化 学 发 光 法 的 相似 性 : 在 笔者 的 实验 室 ， 有 一 次 原 打 算 用 显 色 检测 法 来 检测 集落 转移 的 膜 ， 操 作 到 最 后 一 步 ， 最 后 一 刻 突 然 决 定 改 加 化 学 发 光 底 物 〈HzO MAIER) 而 不 是 原 定 的 HzO* 和 4- 毛 -1- 蔡 酚 。 这 最 后 一 刻 的 改变 并 没有 对 筛选 结果 产生 负面 影响 ， 反 之 成 功 地 从 库 中 鉴定 出 了 所 要 的 克隆 。 虽 然 这 种 非 标准 的 操作 方法 不 值得 推荐 ， 但 这 个 事例 恰恰 说 明了 这 两 种 方法 的 相似 性 。

对 于 用 显 色 反应 检测 过 的 杂交 膜 ， 如 果 需 要 再 次 用 探 针 杂交 ， 必 须 进 行 严格 的 洗 膜 以 去 除 沉 积 的 有 色 沉 淀 以 及 探 针 。 每 一 种 滤 膜 及 非 同 位 素 检测 系统 都 有 相应 的 洗 膜 方案 ， 用 于 指 导 清 除 以 前 杂交 到 膜 上 的 探 针 ， 为 下 一 次 杂交 做 好 准备 。

15.4 数字 成 像 系 统

目前 ， 用 数字 成 像 系 统 分 析 数 据 已 成 为 许多 分 子 生物 学 实验 室 的 常规 手段 。 它 为 图 像 分 析 的 敏锐 性 和 精确 性 提供 了 一 个 新 的 尺度 。 用 软件 和 数字 成 像 系 统 分 析 图 像 需 要 较 大 的 投 资 ， 虽 然 还 需要 升级 和 售后 服务 ， 但 这 样 的 花费 是 一 次 性 的 。 如 果实 验 室 或 研究 所 里 没有 后 文 所 述 的 一 些 高 端 仪器 ， 可 以 进行 一 个 临时 的 电子 转换 步骤 ， 即 将 X 射线 胶片 或 凝 胶 图 像 转 拍 为 数字 图 像 ， 然 后 用 独立 的 图 像 分 析 软 件 如 Gel-Pro (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) 客观 地 测量 条 带 的 分 子 量 和 强 弱 。

现在 许多 商家 提供 数字 成 像 系统 ， 其 中 包括 著名 的 Archiver Eclipse 工作 站 (FOTO- DYNE， 参 见 第 11 章 中 图 11. 5) 。 目 前 可 购 得 的 这 些 系统 功能 齐全 ， 从 扫描 湿 胶 、 处 理 图 像 到 完全 取代 XX 射 线 胶 片 。 有 些 系统 可 以 直接 从 凝 胶 及 印迹 膜 上 捕获 图 像 ， 完 全 不 需要 胶片 ， 然后 进行 电子 分 析 并 存档 。

@ TMB: 3,3 ,5,5“ -四 甲 基 对 二 氮 基 联 苯 。 。 193 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

磷 屏 成 像 仪 是 一 种 成 熟 的 敏感 度 很 高 的 成 像 设 备 ， 其 主要 功能 就 是 从 凝 胶 及 印迹 上 获取 数字 图 像 。 第 一 台 仪器 于 20 世纪 80 年 代 后 期 上 市 ， 由 当时 的 Molecular Dynamics 公 司 生产 ， 原 先是 为 定量 分 析 凝 胶 上 的 放射 活性 而 设计 的 。 现 今 两 个 比较 熟知 且 口 碑 良 好 的 磷 屏 成 像 仪 是 Typhoon 和 Storm (Amersham Biosciences) 。 这 些 磷 屏 成 像 仪 可 以 定量 分 析 荧 光 《例如 省 化 乙 锭 、SYBR 绿 、SYBR 金 )、 化 学 发 光 和 放射 性 训 变 《具体 功能 由 仪 器 型 号 而 定 ) 。 现 在 有 些 系统 还 可 以 分 析 考 马 斯 亮 蓝 和 银 染 的 凝 胶 。 其 应 用 已 扩展 到 微 阵 列 技术 领域 。

磷 屏 成 像 仪 的 图 像 捕 获 方式 比较 独特 ， 该 仪器 有 许多 优点 。 首 先 ， 不 需要 用 文 射线 胶 片 。 如 在 印迹 分 析 时 ， 在 一 块 可 重复 使 用 的 屏 上 产生 图 像 。 这 种 屏 在 正确 维护 下 可 以 无 限 次 地 使 用 。 它 的 曝光 时 间 是 X 射线 胶片 的 1/10。 磷 屏 成 像 检 测 技术 完全 适用 于 对 核酸 、 和 蛋 昌 质 及 任何 带 有 荧光 或 放射 性 标记 的 大 分 子 的 定性 分 析 和 定量 分 析 。 其 最 大 的 优点 是 敏感 性 极 高 ， 是 射线 胶片 的 5 一 10 倍 。 而 且 ， 不 用 X 射线 胶片 也 意味 着 克服 了 胶片 成 像 的 固有 缺 点 二 ”线性 范围 窗 。 磷 屏 成 像 仪 能 达到 5 logs 的 线性 范围 ， 从 而 其 定量 分 析 结 果 能 较真 实地 反应 样品 间 的 差异 。 |

由 于 磷 屏 成 像 仪 的 普及 性 问题 ， 许 多 院 系 或 研究 所 只 有 一 台 仪 器 ， 使 用 者 经 常 需要 预约 登记 才能 使 用 仪器 。 进 行 高 通 量 实验 的 实验 室 ， 或 者 有 多 个 研究 生 的 实验 室 ， 仪 器 的 使 用 时 段 往往 只 限于 早上 的 短 短 几 小 时 。

1

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第 15 章 检测 原理

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CREF; RRA)

* 195 -

第 16 章 极 酸 酯 保护 法 定量 测 下 待定 的 mRNA

16.1 &AA EB

稀有 或 低 丰 度 转录 产物 的 研究 是 分 子 生物 学 实验 室 中 一 项 频繁 而 重复 的 工作 。Northern 分 析 最 多 只 是 半 定 量 的 方法 ， 尽 管 在 转录 产物 丰 度 不 低 于 检测 水 平时 ， 通 常 这 种 方法 确实 能 提供 转录 产物 的 信息 ， 包 括 天 然 大 小 、 自 特定 位 点 转录 的 不 同 转录 产物 的 数量 等 。Northern

ace ig anr ;

总 细胞 RNA 或 带 多 聚 放射 性 标记 的 反 义 腺 嗓 叭 尾巴 的 RNA NY at RNA 或 DNA 探 针 高 严 衣 的 溶液 杂交

TO > 上 wnat 好 br S1 核 酸 酶 消化 所 | 有 未 杂交 的 核酸 分 子

A ”被 保 护 的 片 自

|

电泳 及 放射 自 显影

图 16.1 用 SI] 核酸 酶 定量 分 析 特 异 的 RNA。 纯 化 的 RNA 和 一 个 标记 的 探 针 序列 在 溶液 中 杂交 形成 热 稳定 的 杂交 分 子 。 用 单 链 特异 的 S1 核酸 酶 消化 掉 所 有 没有 参与 形成 杂交 分 子 的 RNA 和 探 针 ， 随 后 电泳 分 析 未 被 消化 的 杂交 分 子 。 把 凝 胶 直 接 放射 自 显影 ， 就 可 以 根据 结果 推 知 被 保护 片段 的 大 小 和 丰 度 。 泳 道 1; 未 消化 的 探 针 。 泳 道 2 和 泳 道 3 天 验 样 品 。 泳 道 4: 分 子 量 标准 。 196 。

第 16 章 ”核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

分 析 的 灵敏 度 和 分 辩 率 常 受 限于 多 种 因素 ， 如 在 凝 胶 上 不 能 加 大 量 的 RNA Fan. MOREE 到 印迹 膜 的 低 效 率 和 非特 异 交叉 杂交 。 非 特异 交叉 杂交 可 发 生 在 探 针 与 具有 一 定 同 源 性 的 转 录 产 物 之 间 ， 以 及 膜 上 的 靶 序 列 与 随 探 针 带 来 的 载体 序列 之 间 等 。 而 且 ， 一 个 根本 的 缺点 是 膜 杂 交 不 能 保证 完全 的 杂交 ， 因 为 一 部 分 膜 上 结合 的 靶 序 列 不 能 完全 接触 到 探 针 。 不 管 从 理 论 还 是 从 实践 来 讲 ， 完 全 的 杂交 即使 可 能 ， 要 实现 也 是 很 困难 的 。

克服 Northern 印迹 这 些 缺 点 的 一 个 基本 办 法 ， 就 是 一 般 所 提 到 的 核酸 酶 保护 实验 。 核 酸 酶 保护 实验 是 定量 特异 转录 产物 非常 灵敏 和 精确 的 方法 。 在 这 种 方法 中 ， 探 针 和 靶 RNA 间 的 杂交 双 链 是 在 高 严谨 度 条 件 下 以 溶液 杂交 的 方式 进行 的 。 研 究 者 可 以 选择 全 细胞 RNA, 全 细胞 质 RNA、poly(CA)+ mRNA 或 其 他 RNA 作为 起 始 的 靶 材 料 。 增 强 这 些 方法 的 灵敏 度 常常 不 需要 富 集 poly(A)+ mRNA。 杂 交 反 应 产物 随后 用 一 种 单 链 特异 的 核酸 酶 消化 ， 这 种 核酸 酶 一 般 没 有 双 链 分 子 (如 DNA : RNA 或 RNA :RNA 杂 合 体 ) 的 亲和力 。 因 此 ， 任 何 ABA WENT. HE RNA 分 子 都 被 降解 ， 最 终 被 保护 的 片段 可 以 用 乙醇 沉淀 回收 。 通 过 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 、 放 射 自 显影 CR 16. 1 和 图 16. 2) 或 磷 屏 定量 等 方法 ， 杂 交 分 子 的 大 小 和 数量 能 被 推断 出 来 。 这 个 技术 的 一 些 改变 方案 中 ， 测 定 未 降解 分 子 的 数量 可 用 液 闪 计数 法 代替 。

凭借 探 针 和 部 溶液 杂交 的 优势 ， 以 及 随后 其 他 所 有 未 参与 双 链 形成 的 序列 的 降解 ， 信 噪

AT gen 了 5 Fi oii tom {7 * ar i 全 细胞 RNA 或 带 多 聚 放射 性 标记 的 反 义

ARIS Fe BARNA % ZL RNA 或 DNA 探 针 高 严谨 的 溶液 杂交

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JE 形成 杂交 分 子 y * 了 AT

RNase 消 化 所 有 未 杂交 的 核酸 分 子 | 序 被 保护 的 片段 电泳 及 放射 自 显影

图 16.2 RNase 保护 分 析 。 纯 化 的 RNA 和 一 个 标记 的 反 义 RNA 探 针 序列 在 溶液 中 杂交 形成 热 稳 定 杂交 分 子 。 用 RNase 混合 物 消 化 掉 所 有 保持 单 链 的 分 子 。 把 凝 胶 直 接 放射 自 显影 ， 就 可 以 根据 结果 推 知 被 保护 片段 的 大 小 和 丰 度 。 泳 道 1: 未 消化 的 探 针 。 泳 道 2 和 泳 道 3; 实验 样品 。 泳 道 4: 分 子 量 标准 。 实 验 的 一 般 流 程 同 S1 核酸 酶 保护 分 析 “2797 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

比 得 以 增强 ， 这 种 增强 常常 是 非常 显著 的 。 用 高 比 放射 性 〈 比 放 ) 的 探 针 经 过 3 天 压 片 曝 光 ， 研 究 者 可 以 预期 获得 相对 于 传统 印迹 分 析 至 少 高 10 倍 的 灵敏 度 ， 并 可 高 重复 性 地 检测 少 至 5fg 的 靶 RNA@。 而 且 ， 通 过 激酶 反应 可 以 挫 人 5 高 比 放射 性 〈 比 放 ) 标记 的 探 针 (>109cpm/ug)， 这 种 高 比 放 射 性 〈 比 放 ) 探 针 可 以 精确 地 测定 转录 产物 的 5 末端 《Boor- stein 和 Cralg，1989 ) 。 核酸 酶 保护 分 析 过 去 也 被 用 来 测定 外 显 子 的 边界 (Weaver 和 Weiss- man，1979)。 所 有 能 被 标准 Northern 分 析 所 定量 研究 的 转录 产物 ， 都 能 用 更 灵敏 的 核酸 酶 保护 分 析 轻 易 地 检测 出 来 。 分 析 来 自 不 同样 本 的 少量 RNA 时 ， 核 酸 酶 保护 分 析 就 显得 尤为 便利 。 最 后 ， 核 酸 酶 保护 分 析 是 一 个 广泛 接受 的 可 信 的 独立 方法 ， 它 能 验证 反 转 录 育 合 酶 链 反应 (RT-PCR) 的 结果 ， 比 如 鉴定 一 个 假想 的 转录 起 始 位 点 、 转 录 产 物 丰 度 的 改变 等 。

16.2 基本 万 法

多 种 核酸 酶 和 方法 被 用 于 定量 和 鉴别 特异 的 转录 产物 ， 并 比 Northern 分 析 获 得 更 多 的 信息 。 不 同方 法 的 选择 主要 取决 于 特定 研究 所 要 解答 的 问题 。 可 用 的 酶 有 核酸 酶 SI (An- do, 1966; Vogt，1973) 、 绿 豆 核酸 酶 (Kowalski 等 ，1976) #AIAK MAEVE (Chase 和 Rich- ardson，1974a，1974b) 。 不 同 的 方法 包括 以 RNase A 和 RNase Ti 组 合 为 特征 的 RNase 保 护 分 析 (Zinn 等 ，1983; Melton 等 ，1984; Lee 和 Costlow，1987) 、 引 物 延 伸 (McKnight 和 Kingsbury, 1982; Jones 等 ，1985; Kingston, 1988) 和 核 逃 逸 实 验 。 很 大 程度 上 ， 娶 合 酶 链 反 应 已 经 代替 了 这 些 技术 ， 然 而 ，S1 核酸 酶 保护 分 析 和 RNase 保护 分 析 CRPA) 仍 然 是 流行 的 可 信 的 技术 。 其 关键 的 好 处 是 它们 不 需要 反 转 录 步 又 〈 详 见 第 18 章 和 第 19 章 ) 。

当 第 一 次 被 提出 时 ， 核 酸 酶 保护 的 基本 方法 描述 了 直接 针对 靶 RNA 的 双 链 DNA 探 针 及 Sl 核酸 酶 消化 未 保护 的 序列 (Berk 和 Sharp，1977，1978) 。 该 方法 扩展 到 使 用 RNA 探 针 也 已 很 长 时 间 了 。 使 用 双 链 DNA 探 针 时 极其 重要 的 一 点 是 ， 杂 交 过 程 中 要 抑制 探 针 的 复 性 ， 因 而 要 求 凭 借 经 验 决 定 合适 的 杂交 温度 。 杂 交 常 常 在 含有 高 浓度 甲 酰胺 的 缓冲 液 中 进行 。 此 时 ， 杂

交 速度 大 约 为 在 简单 水 溶液 中 的 二 (Casey 和 Davidson，1977)。 然 而 ， 保 持 小 的 杂交 体积 和 高

的 核酸 浓度 ， 仍 能 使 杂交 在 几 个 小 时 内 完成 。 更 重要 的 是 ， 甲 酰胺 环境 倾向 于 产生 很 低 的 背 景 ， 因 为 它 能 更 有 效 地 促进 RNA : DNA 双 链 的 形成 ， 而 非 互补 DNA 链 的 复 性 。

因为 双 链 探 针 存 在 潜在 的 复 性 可 能 ， 所 以 单 链 探 针 的 使 用 毫 无 疑问 更 受 欢 迎 。 此 外 ， 杂 交 温 度 须 略 低 于 形成 杂 合 分 子 所 预期 的 解 链 温 度 〈Tn ) 。 因 为 理论 DNA + DNA, RNA? DNA fil RNA : RNA 分 子 中 的 单 链 区 域 〈 错 配 和 悬垂 ) 会 被 选择 性 除去 ， 所 以 如 果 形 成 非 最 运 的 探 针 和 靶 分 子 间 的 杂交 分 子 ， 就 会 无 法 鉴定 出 “杂交 窗口 ?>， 从 而 产生 误导 的 信息 。

S1 核酸 酶 是 从 丝 状 真菌 Aspergillus oryzae 中 分 离 得 到 的 一 种 天 然 存在 的 糖 蛋白 。 它 是 进行 这 类 分 析 的 最 廉价 的 酶 ， 在 RNA 图 谱 分 析 中 能 与 绿豆 核酸 酶 互 换 使 用 。S1 核酸 酶 是 一 种 锌 依赖 ”的 酶 〈Ando，1966; Vogt，1973) ， 对 单 链 或 不 完全 配对 的 多 聚 核酸 结构 具有 很 高 的 特异 性 。 任 何 单 链 的 DNA 或 RNA 区 域 能 被 以 外 切 和 内 切 的 方式 降解 ， 产 生 5/- 单 核 苷 酸 和 5 - 寡 核 华 酸 。 其 活性 定义 为 1 个 单位 酶 量 ， 在 37C 条 件 下 ，lmin 内 生成 1wg BRAT

@ 放射 自 显影 被 认为 是 最 灵敏 的 方法 ， 但 也 有 报道 用 化 学 发 光 的 核酸 酶 保护 实验 可 检测 少 至 30fg 的 RNA。 @ Co“ 也 可 作为 有 效 的 辅助 因子 (Vogt，1973)，

。 198 。

第 16 章 ”核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

性 脱氧 核糖 核酸 。 它 降解 DNA 的 速度 比 降解 RNA 的 速度 快 5 倍 。pH4. 5 左右 和 相对 高 的 离子 强度 @ 时 ， 它 表现 出 最 佳 的 核酸 酶 活力 ， 而 在 pH7. 2 时 基本 无 活力 (Linn 和 Roberts, 1982), Sl 核酸 酶 也 表现 出 热 稳 定性 的 特征 (Ando，1966)， 尽 管 在 很 多 应 用 中 ， 温 浴 常 被 控制 在 较 低 的 温度 (37°C). MA. Sl 核酸 酶 能 抵抗 包括 甲 酰 胺 、SDS 和 尿素 等 变性 剂 (Vogt, 1973; Hofstetter 等 ，1976) ， 这 些 特性 增加 了 S1 核酸 酶 的 可 用 性 。

尽管 具备 这 些 特 征 的 酶 拥有 很 多 优势 。 但 在 使 用 Sl 核酸 酶 时 也 有 一 些 潜在 的 困难 。S1 核酸 酶 是 一 个 很 剧烈 的 酶 @。 因 此 ， 很 多 研究 者 更 喜欢 用 了 PA 而 非 Sl 核酸 酶 保护 分 析 。 实 验方 案 部 分 是 最 有 可 能 需要 优化 的 一 步 。 任 何 时 候 ， 典 型 的 使 用 范围 在 100 一 200U/ml 反应 体积 内 。 根 据 不 同 供应 商 ，S1 核酸 酶 的 浓度 在 每 微 升 20 一 500U 不 等 。 过 量 的 酶 活力 会 导 致 杂 合 分 子 的 不 稳定 和 快速 降解 ， 天 然 不 稳定 的 富 含 AT 和 AU 的 区 域 也 特别 容易 受 S1 核 酸 酶 的 攻击 。 如 果 存 在 切口 的 话 ， 也 会 在 非 预 期 的 低 分 子 区 段 产生 条 带 。 如 果 出 现 这 种 情 况 ， 解 决 的 办 法 是 降低 酶 的 用 量 。 而 且 ， 因 为 酶 的 最 高 活力 需要 低 的 pH 值 ， 而 在 这 种 环境 下 长 时 间 温 浴 会 导致 双 链 DNA 脱 味 叭 化 。

核糖 核酸 酶 保护 分 析 (RPA) 的 基本 方法 〈 见 图 16.2) 与 S1 核酸 酶 分 析 〈 见 图 16. 1) 的 完全 相同 : 用 于 溶液 杂交 的 是 一 个 互补 于 所 要 研究 RNA 转录 产物 的 探 针 ， 杂 交 后 ， 降 解 过 量 探 针 和 所 有 未 被 保护 的 RNA。 从 分 子 机制 的 角度 看 ， 应 当 注 意 的 是 ,在 S1 核酸 酶 分 析 中 ，NA 或 RNA 探 针 都 可 以 使 用 ， 因 为 SI 核酸 酶 是 单 链 特异 的 酶 ， 它 并 不 在 意 底 物 是 DNA 8 RNA. #2 16.1 HRS Sl 核酸 酶 和 了 RNase 保护 分 析 这 两 种 很 相近 的 技术 。 在 RPA 中 ， 是 用 RNase A 和 RNase Ti 的 混合 物 来 进行 消化 ， 这 就 要 求 使 用 反 义 RNA 探 针 。RNase A 是 单 链 RNA 的 内 切 核糖 核酸 酶 ， 特 异 的 切 点 在 喀 啶 CHEE ARE) RO ARAN 3 侧 (Py/pN) 。 最 终 降 解 产物 都 是 喀 啶 3- 磷酸， 即 所 有 分 子 都 带 有 3 -磷酸 基 团 的 喀 啶 结 RNase Ti 也 是 一 个 单 链 特异 的 内 切 核糖 核酸 酶 ， 切 割 鸟 味 叭 3 端的 磷酸 二 酯 键 (GpPN)， 如 同 RNase A 一 样 ， 产 生 3 -磷酸 结尾 的 寡 核 苷 酸 。 这 两 个 酶 的 一 些 性 质 总 结 在 表 16. 2 中 。

表 16.1 Si BABA RNase 保护 分 析 的 比较

Si 核酸 酶 保护 分 析 | RNase 保护 分 析 | 。 项 目 | SI 核酸 酶 保护 分 析

RNA RNA 背景 低 到 中 等 DNA 或 RNA RNA 可 控 性 很 难 Sl 核酸 酶 RNase A+RNase Ti | 平均 灵敏 度 极限 100fg

RNase 保护 分 析

表 16.2 RNase A 和 RNase T 的 比较

典型 的 储存 浓度 ik ©

2mg/ml Mise RNA

HE 4d F AYERS CC A UD 5 WR 叭 3 端的 磷酸 二 酯 键 (Py/pN) ; 产 生 3 -磷酸 基 团

A) FAY He ee EK EF Rs WE DY 10U/pl 单 链 RNA Wm We 3' 端 的 磷酸 二 酯 键 (GPN) ; 产 生 3 -磷酸 基 团

© 当 用 过 量 的 酶 消化 过 长 时 间 ， 也 会 进攻 双 链 RNA。

RNase A

Aspergillus oryzae ; 克隆 的 基因 在 Esche- richia coli 中 表达

RNase T)

@ 某 些 应 用 中 ， 使 用 高 浓度 酶 。 此 时 需 增 加 实验 溶液 的 离子 强度 ， 以 限制 双 链 DNA 分 子 产生 缺口 ， 使 用 高 浓度 酶 时 ， 常 观察 到 这 种 缺口 。200mmol/L NaCl (Vogt, 1973) 和 比 最 适 pH 稍 高 的 pH 值 ， 可 抑制 双 链 DNA 上 缺口 的 形成 。

@ Sl 核酸 酶 的 剧烈 降解 特性 部 分 源 自 mRNA 不 能 全 部 转化 成 双 链 互补 DNA(CcDNA)。Gubler 和 Hoffman (1983) 建立 的 广 为 流 行 的 方法 大 大 改进 了 cDNA 合成 的 效率 。 在 此 以 前 ， 分 子 生 物 学 不 能 制备 全 长 的 cDNA。 这 就 是 在 PCR 出 现 以 前 的 日 子 里 ， 是 怎样 合成 cDNA 的 。

“997。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

从 策略 的 角度 来 看 ， 把 核酸 酶 保护 反应 多 元 化 ， 即 在 一 个 反应 试管 中 使 用 多 个 探 针 ， 是 很 流行 的 做 法 。 这 种 想法 就 是 ， 只 要 探 针 呈现 相似 的 热力 学 行为 ， 并 且 被 保护 的 片段 大 小 不 同 ， 它 们 就 可 以 同时 分 析 ， 从 而 产生 不 同 大 小 的 条 带 对 应 于 每 一 个 被 保护 的 片段 ， 所 有 条 带 出 现在 凝 胶 上 的 单一 泳 道 〈 图 16. 3).

i=

€

KX em = R ak 探 针 保护 SKE (nt) 由 及 = = at zz 片段 (nb c-myc (381) 249 = .. $2 B-actin (334) 一 -_ c-myc (326)

me | p53 (265)

P| B-actin (245) Jun B (228) a Egrl (220) Ras( 180)

cyclophilin(165) : Jun B (146)

上 cyclophilin(103)

16.3 10pg 的 不 同 组 织 的 总 RNA 和 各 50000cpm 的 七 个 不 同 探 针 杂交 过 夜 。 经 核酸 酶 消化 ， 产物 在 6 办 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 上 电泳 分 离 后 ， 一 80C 样 片 曝 光 4h 检测 杂交 水 平 。 用 Ambion 的 MAXscript 试剂 盒 和 [o-32P] UTP (800Ci/mmol, 10mCi/ml) 在 5 岂 的 反应 体系 中 标记 探 针 ， 杂 交 前 纯化 。 通 过 加 入 合适 量 的 非 放 射 性 UTP. ¥% cyclophilin 和

Gactin 的 比 放射 性 〈 比 放 ) 分 别 降低 至 原来 的 志和 让

16.3 探 针 选择

很 多 与 误 杂 交 和 控 针 复 性 所 产生 的 问题 ， 可 通过 使 用 单 链 核酸 探 针 得 以 避免 。 利 用 高 效 、 低 成 本 的 完整 体外 转录 系统 ， 可 以 迅速 得 到 大 量 特定 序列 的 高 比 放 单 链 探 针 。 这 是 现在 最 常用 的 制备 单 链 探 针 的 方法 〈 用 于 核酸 酶 保护 分 析 )。 可 供 选择 的 方法 还 包括 赛 核 苷 酸 的 合成 、 老 旧 的 克隆 到 M13 载体 的 方法 和 不 对 称 的 PCR， 但 这 些 方法 用 得 比较 少 。 在 使 用 单 链 探 针 的 时 候 ， 探 针 的 复 性 就 不 再 成 为 问题 了 ， 但 在 非 严谨 和 半 严 谨 的 条 件 下 分 子 内 的 碱 基 配对 仍然 存在 。

来 自 于 体外 转录 的 单 链 探 针 几乎 总 是 混 有 至 少 是 少量 的 用 于 转录 的 模板 DNA。 当 存在 DNA 模板 和 临近 的 载体 序列 时 ， 它 们 都 可 能 与 探 针 杂交 并 保护 全 长 的 探 针 不 被 S1 核酸 酶 降 解 ， 由 此 造成 人 为 带 入 的 杂交 ， 它 们 都 可 能 在 放射 自 显影 时 被 看 到 。 而 且 ， 这 种 情况 下 ， 会 大 大 降低 参与 形成 RNA + RNA 或 DNA : RNA 杂 合 物 的 自由 探 针 的 浓度 。 尽 管 高 严 谭 度 的 杂交 溶液 能 够 在 一 定 程度 上 减弱 这 些 现象 ， 但 并 不 能 完全 消除 它们 ， 除 非 除去 探 针 中 的 载体 序列 。 可 以 通过 电泳 或 DNase I 工 消化 、 乙 醇 沉 淀 这 种 理想 的 方法 来 除去 模板 。 最 后 ， 如 果 不 能 保持 大 大 过 量 的 探 针 的 话 ， 这 种 检测 的 灵敏 度 将 很 难 实现 。

Northern 分 析 和 核酸 酶 保护 分 析 的 另 一 个 主要 不 同 是 ， 电 泳 和 放射 自 显影 后 观察 到 指 条 带 的 分 布 位 置 不 同 。 在 经 典 的 Northern 分 析 中 ， 观 察 到 的 信号 代表 了 转录 产物 的 天 然 大

小 。 比 如 ， 人 类 癌 基 因 cmyc 的 主 要 转 录 产 物 mRNA 的 长 度 是 2. 4kb。 同 样 地 ， 这 个 转录 * 200 -

第 16 章 核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

产物 预期 出 现在 高 丰 度 的 两 个 核糖 体 RNA (rRNA) 中 间 ， 略 高 于 18S rRNA 的 位 置 。 相 反 ， 核 酸 酶 保护 产生 的 杂交 分 子 仅 和 探 针 一 样 长 。 如 果 探 针 和 驾 分 子 上 没有 直接 参与 杂交 分 子 形成 的 核 苷 酸 都 被 消化 的 话 ， 杂 交 分 子 常会 比 探 针 更 短 〈 图 16.4)。 因 此 ， 核 酸 酶 保护 分 析 比 Northern 更 能 容忍 RNA 样品 的 部 分 降解 ， 因 为 只 要 靶 分 子 上 探 针 所 识别 的 部 分 是 完 整 而 无 损 的 就 可 以 了 ;， 而 一 个 转录 产物 上 的 单个 切 点 就 可 以 导致 这 个 分 子 不 能 被 标准 的 Northern 分 析 检 测 到 。 在 一 个 计划 周全 的 实验 中 ， 检 测 到 的 核酸 酶 消化 后 的 杂交 分 子 的 长 BE BRP WHE) 应 该 短 于 未 杂交 或 复 性 的 〈 探 针 和 模板 ) 分 子 。 在 标准 的 实验 条 件 下 ， 电泳 能 够 轻易 区 分 核酸 酶 处 理 后 的 分 子 量 差异 小 至 10 办 的 不 同 分 子 。

纯化 的 RNA 样 品 用 紫外 吸收 和 一 siamese CN

校正 定量 RNA ROOT

|

了 RY = i \\ ”在 溶液 中 杂交 is = a it

ee | St 本 化 1， 被 保护 的 片段 * | Re he a i 和 标记 的 探 针 杂 交 { 放射 自 显影 SA

= 推断 被 保护 片段 的 小 和 转录 产物 丰 度 推断 转录 产物 的 丰 度

图 16.4 Sl 核酸 酶 保护 分 析 和 传统 的 Northern 分 析 定 量 特异 的 RNA 转录 产物 的 比较

探 针 标记 的 方式 是 需要 严格 考虑 的 ， 尤 其 当 试图 第 一 次 鉴定 一 转录 产物 时 。 末 端 标记 的 探 针 〈5 或 3 ) 绝 非 首 选 ， 应 当 避 免 ， 尤 其 当 首 次 用 于 鉴定 使 用 的 探 针 。 如 果 带 有 标记 的 核 苷 酸 不 能 直接 参与 杂交 分 子 的 形成 ， 那 么 标记 就 会 被 消化 掉 ， 使 得 杂交 分 子 无 法 被 探测 到 。 使 用 连续 标记 的 探 针 〈 沿 着 整个 分 子 被 标记 的 探 针 ) 可 以 很 快 减轻 这 个 问题 。 长 度 在 150 一 450 个 碱 基 的 探 针 效 果 最 好 。

正如 前 面 指出 的 ， 单 链 探 针 能 够 很 容易 地 通过 体外 转录 得 到 。 要 记 住 的 是 : 对 RNA HK 针 的 操作 需要 很 好 的 无 RNase 的 技术 ; 探 针 极 高 比 放 的 放射 性 会 使 得 探 针 被 辐射 裂解 92。 不

@ 辐射 裂解 是 放射 性 标记 分 子 被 它 自 己 携带 的 标记 物 辐 射 降解 的 现象 。 使 用 非常 高 的 比 放 射 性 标记 探 针 〈 盖 1 10"cpm/pg) 时 ， 并 且 在 使 用 前 储存 数 天 时 常会 发 生 这 种 现象 。 。 201 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

完整 的 探 针 片段 会 产生 增强 的 背景 和 非特 异性 的 杂交 。 强 烈 建议 研究 者 在 每 次 使 用 前 都 要 用 凝 胶 检查 一 下 探 针 的 完整 性 〈 不 管 标 记 与 否 ) 。 |

16.4 £¢e #&

探 针 类 型 和 标记 方法 建立 后 ， 根 据 经 验 决 定 随后 的 杂交 参数 ， 将 有 助 于 保持 大 多 数 定 量 核酸 酶 保护 分 析 的 保 真 度 。 为 了 使 核酸 酶 保护 分 析 更 易 达 到 最 高 的 可 重复 的 灵敏 度 和 分 辩 率 ， 给 出 了 下 面 的 一 些 建议 。 但 因为 核酸 酶 保护 分 析 的 试剂 很 容易 以 试剂 盒 的 形式 获得 ， 所 以 这 里 所 列 的 有 些 优 化 步骤 并 不 是 必须 的 。 如 果 需 要 调整 的 话 ， 一 个 优化 的 流程 常常 也 只 需 要 一 次 。 然 而 对 于 每 一 个 新 的 探 针 ， 调 整 反应 常常 是 需要 的 。

© 检测 某 RNA 群体 中 特定 mRNA 量 的 最 精确 的 方法 ， 是 用 一 大 大 过 量 的 单 链 探 针 ， 在 溶液 中 滴定 它 ， 测 试 相 同 量 探 针 和 一 系列 不 同 量 的 特定 RNA 样品 的 杂交 反应 。 如 果 探 针 是 过 量 存在 的 话 ， 那 么 改变 靶 RNA 的 起 始 量 应 当 会 同比 例 地 改变 信号 值 。

© 靶 与 探 针 杂 合 物 的 稳定 形成 肯定 是 有 利 的 。 缺 少 特 定 探 针 在 核酸 酶 保护 分 析 实 验 中 表现 行为 的 详细 信息 时 ， 首 先 尝试 在 50 杂交 。 然 后 ， 在 不 同 温度 〈 士 5C、 主 10C 及 更 大 范围 ) 重复 检测 ， 以 确定 对 于 各 个 探 针 的 合适 的 严谨 度 。 杂 交 温 度 应 该 足够 高 到 能 容许 杂交 分 子 的 形成 ， 但 又 不 会 引起 杂交 分 子 的 解 离 一 一 即 调整 杂交 温度 到 低 于 Ta 值 5C。 精 确 的 温度 估算 也 依赖 于 探 针 本 身 的 特性 ， 记 住 双 链 RNA 分 子 比 DNA: RNA 杂 合 体 更 具有 热 稳 定 。 因 而 同样 的 检测 用 RNA 探 针 能 比 DNA 探 针 经 受 更 高 严谨 度 的 杂交 条 件 〈 第 14 章 ) 。

G@) 关于 探 针 的 稳定 性 ， 应 该 小 心 富 含 AU 的 区 域 。 这 些 区 域内 在 的 不 稳定 性 会 导致 不 完全 的 杂交 ， 从 而 会 极 大 地 降低 信号 。 一 定 程度 上 ， 可 以 通过 降低 杂交 缓冲 液 中 的 甲 酰胺 浓 度 来 减轻 这 个 困难 ， 尽 管 这 样 会 牺牲 一 定 的 探 针 特异 性 。 有 报道 说 ， 杂 交 后 ， 在 准备 消化 前 ， 将 反应 物 放 在 稀释 的 杂交 混合 物 中 15 人 温浴 30min， 能 使 富 含 AU 的 区 域 更 完全 地 退 火 而 不 会 产生 非特 异 杂 交 。 但 在 这 种 条 件 下 ， 这 种 做 法 会 伴随 杂交 体积 的 增 大 。 温 浴 后 ， 核 酸 酶 消化 照常 进行 。

DQ 必须 使 杂交 平衡 趋 于 完全 。 正 如 实验 方案 〈 见 后 述 ) 里 所 建议 的 ， 任 何 时 候 保 持 杂 交 反 应 中 核酸 浓度 尽 可 能 高 是 很 有 帮助 的 。 可 以 通过 加 入 载体 RNA (如 廉价 的 酵母 RNA、 tRNA 等 ) 来 实现 。 在 特定 的 时 间 间 隔 ， 取 一 小 份 反应 产物 进行 S1 核酸 酶 消化 ， 可 以 经 验 性 地 确定 杂交 反应 进行 的 情况 。 当 杂交 信号 强度 不 再 增强 的 时 候 ， 说 明 杂 交 反 应 已 经 达到 完全 。

© 正式 的 核酸 酶 消化 必须 以 可 控 的 方式 有 效 地 进行 。 对 于 S1 核酸 酶 分 析 ， 这 是 尤其 重 要 的 考虑 因素 。S] 核酸 酶 是 一 个 很 剧烈 的 酶 ;但 幸运 的 是 ， 现 在 不 同 批 次 之 间 的 活性 差异 与 儿 年 前 相 比 已 不 再 是 个 问题 了 。 如 果实 验 的 这 部 分 出 现 问题 的 话 ， 改 变 Sl 核酸 酶 的 量 ， 使 探 针 能 被 完全 降解 而 不 影响 杂交 信和 号。 如 果 不 清楚 所 准备 的 S1 核酸 酶 的 活性 水 平 ， 那 委 在 对 有 价值 的 实验 样品 进行 S1 核酸 酶 分 析 前 ， 先 进行 活力 滴定 的 预 实验 是 有 帮助 的 。 如 同 大 多 数 分 子 生物 学 的 酶 一 样 ，S1 核酸 酶 保存 在 含有 50%% 甘 油 的 合适 的 储存 缓冲 液 中 ， 并 且 附带 10 关 反应 缓冲 液 。 典 型 的 1X 反 应 缓冲 液 包 含 50ommol/L 乙酸 钠 (pH4.5)、280mmol/ L NaCl, 4mmol/L ZnSO MI 5% Hh, BENE TE 37 避 进行 。 冻 干 的 RNase 不 同 于 买 来 可 立即 用 的 RNase 混合 物 ， 它 一 般 需 要 先 滴定 并 优化 其 用 量 。

©) 核酸 酶 保护 定量 转录 产物 的 一 个 最 常见 的 问题 是 与 使 用 反 义 转录 产物 有 关 。 体 外 转 。 202 -

第 16 章 ”核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

录 合 成 的 探 针 一 般 都 是 设计 的 相对 较 短 的 反 义 转录 产物 。 问 题 是 并 非 所 有 反 义 转录 产物 都 是 全 长 的 。 因 此 ， 混 合 的 非 均一 长 度 的 探 针 会 产生 小 于 预期 的 杂交 分 子 ， 放 射 自 显影 时 会 出 现 明显 的 多 于 一 条 的 条 带 。 新 转录 出 来 的 CRNA 在 用 作 探 针 前 先进 行 凝 胶 纯 化 ， 能 在 一 定 程 度 上 减轻 这 一 问题 。 而 且 实验 刚 开 始 时 ， 实 验 样品 的 相 邻 泳 道 单独 电泳 一 份 未 消化 的 探 针 来 确定 全 长 探 针 的 位 置 是 一 个 明智 的 做 法 。

16.5 可 能 的 困难

核酸 酶 保护 分 析 法 建立 后 的 几 年 里 ， 尽 管 S1 核酸 酶 的 活性 比较 剧烈 ， 它 仍 比 RNase 保 护 分 析 更 容易 控制 ， 后 者 由 于 产生 高 背景 而 饱 受 诉 病 。 产 生 这 种 现象 的 一 个 原因 是 ， 当 时 实 验 所 用 到 的 各 种 成 分 都 是 自己 生产 的 ， 没 有 很 好 的 质量 控制 来 保证 每 种 成 分 与 其 他 成 分 一 起 使 用 时 表现 良好 。 然 而 现在 大 多 数 研 究 者 宁愿 花 钱 去 买 一 个 完整 的 系统 ， 这 些 系统 都 是 经 过 测试 确保 在 正确 使 用 时 能 有 最 佳 的 表现 。

但 是 现在 伴随 这 些 实验 的 困难 仍然 存在 ， 通 稼 会 遇 到 下 面 罗 列 的 一 个 或 多 个 。

@ 过 高 的 背景 。 当 使 用 新 的 探 针 或 一 套 新 的 试剂 时 ， 这 个 问题 可 能 会 更 严重 。 过 高 的 背景 看 起 来 就 像 整 条 泳 道 的 长 长 的 拖 尾 ， 这 常常 是 因为 不 完全 消化 引起 的 。 但 是 ， 在 凝 胶 边 缘 观 察 到 远 高 于 对 应 于 被 保护 片段 条 带 所 在 位 置 的 背景 污点 却 是 正常 的 。 导 致 背景 升 高 的 常 见 错误 ， 是 在 RNA 高 温 退 火 “〈 见 后 述 ) 后 ， 在 杂交 温度 下 温浴 过 长 的 时 间 。 过 长 的 温浴 时 间 使 一 些 RNA 分 子 有 机 会 重新 形成 一 定 程 度 的 二 级 结构 ， 或 使 分 子 间 及 和 非特 异 靶 序列 之 间 形 成 碱 基 配 对 。 高 效 处 理 样 品 是 这 一 步 的 要 点 。

此 外 ， 实 验 使 用 部 分 降解 的 RNA 会 降低 探 针 的 识别 能 力 。 偶 尔 也 会 看 到 来 自 破碎 的 (由 于 辐射 裂解 或 核酸 酶 降解 ) 不 新 鲜 的 探 针 的 “噪声 ”。 偶 尔 会 发 现 ， 泳 道 拖 尾 也 可 能 是 由 于 杂交 混合 物 中 加 入 了 大 大 过 量 的 探 针 〈 相 对 于 正常 量 而 言 )。 此 外 ， 假 设 酶 确实 把 未 杂交 的 探 针 降解 了 ， 那么 这 些 额外 的 放射 性 “游离 核 酸 的 形式 ) 时 营 会 在 凝 胶 的 边缘 折射 出 很 大 的 污点 。

最 后 ， 研 究 者 可 以 检查 Sl1 核酸 酶 的 活力 以 确保 是 否 和 厂商 说 明 书 一 致 ， 保 质 期 也 要 检 理 ， 还 要 确定 实验 用 的 RNA 的 完整 性 是 否 有 损 。

G@) 无 信号 。 导 致 核酸 酶 保护 分 析 无 信号 的 一 般 原因 有 如 下 6 个 。

a. 探 针 没有 标记 到 足够 高 的 比 放射 性 。 此 外 ， 在 末端 标记 时 ， 带 有 标记 物 的 核 苷 酸 有 可 能 被 核酸 酶 降解 。 虽 然 连 续 标记 的 探 针 不 太 可 能 会 出 现 这 种 情况 ， 但 也 要 小 心 ， 除 非 绝对 确信 标记 的 核 苷 酸 参 与 了 杂交 分 子 的 形成 。

b. 实验 用 的 RNA 可 能 已 经 降解 了 。 尽 管 核 酸 酶 保护 分 析 更 能 容忍 RNA 样品 的 部 分 降 解 ， 但 是 降解 不 能 出 现在 与 探 针 互 补 的 区 域 。 在 对 RNA 样品 作 任 何 处 理 前 ， 必 须要 确定 它 的 完整 性 。

c. 对 于 所 用 的 探 针 可 能 使 用 了 过 高 严谨 度 的 杂交 条 件 。 调 整 的 首选 方法 是 大 大 地 降低 杂交 温度 以 确定 杂交 到 底 能 和 否 进 行 。 然 后 渐渐 提高 温度 直到 确定 最 理想 的 条 件 〈 见 “16.4 优化 建议 ”部 分 ) 。

d. 沉淀 CRNA 样品 、 探 针 、 载 体 RNA) 可 能 没有 完全 重新 溶解 ， 因 而 一 些 或 大 部 分 样品 不 能 参与 杂交 反应 。 实 验 刚 开始 时 ， 保 持 沉 淀 微微 湿润 ， 有 助 于 沉淀 完全 溶 于 杂交 缓冲 液 中 。 在 一 些 极端 情况 下 ， 核 酸 沉 淀 可 能 在 沉淀 后 的 乙醇 洗涤 过 程 中 丢失 。

。 203 ，

RNA 研究 方法

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南

e 待 研究 的 细胞 不 表达 特定 的 目的 mRNA。 如 果 有 合适 的 引物 ， 值 得 先 用 PCR 检测 一 下 ， 这 可 以 使 研究 者 知道 转录 产物 到 底 是 否 存在 。 尽 管 S1 核酸 酶 保护 分 析 前 富 集 具有 多 聚 腺 苷 酸 尾巴 的 mRNA 会 有 少许 帮助 ， 但 也 存在 潜在 的 负面 作用 一 一 由 于 这 种 富 集 过程 先 天 的 低 效 率 ， 会 进一步 减少 目的 低 丰 度 mRNA， 还 将 不 具 多 聚 腺 苷 酸 尾巴 的 RNA 种 类 排除 在 分 析 之 外 。 此 外 ， 研 究 者 可 能 知道 的 另 一 个 可 选 的 方法 ， 是 诱导 或 重复 诱导 目的 特定 基因 。 RNA 样品 的 杂交 能 力 可 以 用 不 同 探 针 来 测试 ， 最 好 是 针对 相当 高 丰 度 的 看 家 基因 。 通 过 这 样 的 测试 可 以 确定 RNA 样品 至 少 有 无 杂交 的 能 力 。

f. 粗心 地 使 用 了 一 个 正义 的 而 非 反 义 的 探 针 。

OQ 背景 很 好 ， 但 有 太 多 条 带 。 如 果 这 是 实验 的 唯一 困难 ， 那 么 优化 它 就 只 需要 很 小 的 一 点 调整 。 出 现 多 条 明确 的 条 带 ， 可 能 缘 自 于 在 杂交 反应 中 有 和 探 针 同 源 的 DNA。 来 自 于 体外 转录 的 反 义 分 子 常常 带 有 质粒 模板 序列 。 载 体 或 模板 序列 是 很 大 的 ， 并 且 为 了 体外 转录 都 已 线性 化 ， 所 以 它 的 条 带 一 般 位 于 紧 靠 加 样 孔 的 地 方 。 因 而 在 进行 核酸 酶 保护 实验 之 前 ， 用 DNase 工 消 化 破坏 模板 ， 明 显 比 其 他 实验 更 重要 ，RT-PCR EBSD. Wb, FEC Ho PE 度 足够 宽松 ， 能 容许 探 针 和 一 些 相关 的 转录 产物 杂交 ， 这 些 相关 的 mRNA 也 许 是 同一 个 基 因 家 族 的 不 同 成 员 。 如 果 有 这 样 的 相关 分 子 ， 可 以 看 到 相当 有 趣 的 (或 者 是 糟糕 的 ) 条 带 谱 型 出 现 ， 谱 型 的 特征 依赖 于 同 源 物 的 相似 程度 及 错 配 的 数目 和 分 布 。 要 探究 这 种 可 能 性 ， 可 以 将 杂交 温度 从 出 现 多 个 条 带 的 温度 提高 5C 。 这 个 程序 上 的 简单 改变 ， 可 以 使 错 配 杂交 分 子 不 稳定 ， 进 而 降低 或 消除 这 些 杂 带 。 最 后 ， 当 S1 核酸 酶 分 析 时 ， 用 变性 双 链 DNA TERR 针 ， 由 于 探 针 的 复 性 ， 也 会 出 现 多 个 条 带 。 因 为 这 个 原因 ， 很 多 研究 者 更 喜欢 用 RNA 探 针 来 检测 靶 RNA 序列 。

16.6 实验 万 宗 : S1 核酸 酶 保护 分 析 法 定量 蒜 录 产物

要 记 住 的 最 重要 一 点 是 ， 进 行 S1 核酸 酶 分 析 的 方法 不 是 一 成 不 变 的 。 这 里 给 出 的 是 ， 在 Quarless 和 Heinrich (1986) 的 方法 基础 上 改动 和 修改 的 一 个 方法 。 用 这 个 方法 可 以 检 WW > SILA koe Cig) 的 特定 mRNA， 相 当 于 100ug 总 RNA 中 具有 多 聚 腺 苷 酸 尾巴 的 mRNA 的 2X10-5%。

J 戴 上 手套 。 整 个 实验 中 都 要 使 用 无 RNase 的 材料 、 试 剂 和 技术 。 纯 化 的 RNA 总 是 很 容易 被 RNase 降解 。

注意 ”在 开始 这 个 实验 前 一 定 要 检查 RNA 样品 的 浓度 、 纯度 和 完整 性 。

@Q 在 一 个 微量 离心 管 中 ， 混 合 20 一 30pg 的 细胞 RNA 和 足够 量 的 载体 RNA@， 使 总 量 达到 100ng. HMAKA 1X 10% cpm 的 探 针 。 用 二 乙 基 焦 碳酸 酯 (DEPC) 处 理 的 水 把 反应 体 积 调整 到 100pw1。 一 定 要 准备 一 个 只 含有 载体 RNA 和 探 针 的 负 对 照 ， 负 对 照应 该 没有 被 保 护 的 片段 。

注意 工 尽管 一 些 研究 者 用 多 至 50kg 的 RNA 起 始 ， 但 常常 从 10pg 的 总 细胞 RNA 或 总 细胞 质 RNA 起 始 就 足以 定量 很 多 mRNA 了 。 本 方法 所 用 的 S1 核酸 酶 的 量 足以 消化 掉 留 在 反应 体系 中 的 所 有 未 杂 交 的 RNA ALE ET.

注意 2 要 严格 确保 探 针 在 摩尔 比 上 至 少 5 一 10 倍 的 过 量 。 大 多 数 情 况 下 ， 加 入 1X1loscpm 的 探 针

@ 用 作 载体 的 酵母 RNA 储存 液 用 0, 1mol/L NaAc, pHS5. . 204

2 的 缓冲 液 配置 成 mg/ml AAR BE. WA FEF — 20°C .

] | |

第 16 章 ， 核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

就 可 以 达到 这 个 要 求 。

@ MA pl pH5. 2, 3mol/L 乙酸 钠 和 250p1 冰冷 的 95%% 的 乙醇 共 沉 淀 样品 、 载 体 和 探 针 。 一 20 人 放置 过 夜 。

注意 ” 没 加 入 探 针 的 实验 RNA 和 载体 共 沉 淀 后 ， 可 以 在 杂交 缓冲 液 里 一 80YC 保存 近 1 周 。

Q@ 离心 收集 沉淀 。 弃 上 清 液 ， 沉 淀 用 70%% 乙 醇 〈 含 30%DEPC 处 理 的 水 ) WER. FS 醇 〈 放 射 性 废 液 ) ， 倒 置 离心 管 晾 干 沉淀 。 作 为 可 选项 目 ， 用 95 加 乙醇 再 洗 一 次 沉淀 ， 可 以 加 速 沉 淀 的 了 晾 干 。 用 乙醇 保持 RNA 沉淀 微微 湿润 。

注意 不 要 使 用 真空 泵 抽 王 或 使 沉淀 完全 干燥 。 这 样 的 话 ，RNA 将 会 极 难 溶解 。

© 沉淀 重新 溶 于 20nl Sl 杂交 缓冲 液 中 (80% 新 鲜 的 去 离子 甲 酰胺 :40mmol/L PIPES, pH6.4; 400mmol/L NaCl; lmmol/L EDTA，pH8.0)。 上 下 吹 吸 样品 至 少 20 次 ， 确保 完全 溶解 。

注意 工 如 有 必要 ， 溶 解 沉淀 的 杂交 缓冲 液体 积 可 以 增加 到 30pl,

注意 2 杂交 缓冲 液 可 以 事先 准备 ， 分 成 每 份 Iml， 保 存 于 一 80'C 。

注意 3 如 果实 验 RNA 和 载体 是 事先 混合 而 没有 加 入 探 针 〈 不 推荐 ) ， 先 把 探 针 加 到 沉淀 里 ， 然 后 再 加 入 杂交 缓冲 液 到 终 体 积 20ml。

注意 4 检测 低 丰 度 mRNA 时 ， 有 必要 使 RNA 浓度 接近 溶解 的 极限 (Smg/ml=100pg/20ul), VI 尽 可 能 地 促进 杂交 。

HERS 杂交 缓冲 液 含 80%% 新 鲜 的 去 离子 甲 酰胺 是 标准 形式 。 如 果 用 DNA 作 探 针 ， 杂 交 分 子 的 热 动力 稳定 性 不 如 cRNA 探 针 ， 这 时 可 以 用 少 至 40% 一 50%% 甲 酰胺 代替 。 记 住 严 谨 度 可 以 通过 温度 、 盐 离子 强度 、pH 值 和 甲 酰胺 的 浓度 来 调节 。

@ 85C 水 浴 加 热 RNA 样品 10min， 使 其 完全 变性 。

注意 ”必须 要 确保 样品 完全 变性 ， 因 为 RNA 的 二 级 结构 会 影响 杂交 分 子 的 形成 。

@) 快速 离心 5s 将 杂交 混合 物 收 集 到 管 底 。 把 离心 管 立 刻 置 于 预 热 好 的 50C 或 其 他 事先 确定 温度 的 水 浴 保 温 3h。

HBR1 杂 交 温 度 是 直接 根据 所 用 探 针 的 类 型 (RNA RDNA), RHMWKEM (G+C) 含量 的 不 同 而 改变 的 ， 必 须 靠 经 验 确定 。 本 方法 里 ， 典 型 的 温度 范围 是 45 一 60C 。 在 缺少 特定 探 针 的 经 验 或 信息 时 ， 首 先 从 50C 开 始 尝试 。

注意 盐 “如果 反 应 体系 中 没有 加 入 载体 RNA 〈 见 步骤 @@) ， 有 必要 大 大 延长 杂交 的 时 间 ， 这 意味 着 要 达到 较 高 的 杂交 效率 可 能 需要 温浴 过 夜 。

用 160nl DEPC 处 理 的 水 稀释 反应 混合 物 。 加 入 20wl 10 久 的 随 S1 核酸 酶 买 来 的 反应 缓冲 液 。 如 果 没 有 预制 的 缓冲 液 ， 那 么 就 配制 普通 的 10X 缓 冲 液 (500mmol/L 乙酸 钠 ， pH4.5; 2.8mol/L NaCl; 40mmol/L ZnSO,®; 50% HY).

@ 加 入 足够 的 S1 核酸 酶 到 酶 的 终 浓度 为 200 一 400U/ml。 实 际 需 要 的 体积 会 随 不 同 的 三 家 和 不 同 的 批 次 而 改变 。

注意 1 200mwl 的 消化 体系 中 ， 不 要 超过 10pl 的 S1 核酸 酶 ， 因 为 过 高 浓度 的 甘油 会 抑制 酶 的 活性 。 如 果 不 得 已 的 话 ， 加 入 少 一 点 的 核酸 酶 单位 ， 延 长 消化 时 间 来 达到 完全 消化 。

注意 2 实验 的 这 一 部 分 比 起 其 他 部 分 ， 更 有 可 能 需要 优化 。 记 住 杂 交 分 子 中 富 含 AU 的 区 域 是 比

@ 如 提供 的 酶 被 保存 在 含 ZnCls 的 储备 液 里 ， 氯 化 锌 必须 被 S1 核酸 酶 消化 缓冲 液 中 的 ZnSO4 代替 。 - 205 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

较 脆 弱 的 。 如 果 存 在 切口 的 话 ， 也 会 出 现 明 显 的 非 预期 的 低 分 子 量 条 带 。 如 果 出 现 这 种 情况 ,调整 的 方法 是 降低 酶 的 使 用 量 。

O 短暂 离心 将 所 有 液体 收集 到 管 底 ，37C 温浴 1h。

@@ 用 等 体积 的 酚 : 氯仿 : 异 两 醇 (25 : 24 : 1) 或 酚 : 氯仿 (1 : 1) 混合 物 抽 提 反应 物 。 最 高 速 离心 2min 分 层 。

® 小 心地 把 水 相 (上 层 ) 转移 到 一 个 新 的 离心 管 中 。 加 入 1 由 20mg/ml 的 糖 原 〈 糖 原 终 浓 度 为 100pg/ml). PMA 2.5 倍 体积 95%% 的 乙醇 ， 沉淀 在 核酸 酶 消化 反应 中 被 保护 的 杂 分 村 、

® 将 离心 管 在 干冰 上 放置 15min 或 一 20C 2h。

@ 离心 收集 沉淀 。 小 心 奔 上 清 液 风干 沉淀 。 也 可 以 用 真空 泵 稍微 抽 干 ， 但 一 定 不 能 使 沉淀 过 于。

@® FA Spl TE Rep C1Ommol/L Tris; lmmol/L EDTA, pH8. 0) BUTI.

@® DNA Spl 2>< FA ER ERR RK (50% FREAK. 2X TBE 缓冲 液 ，0. 2% 1 Bt HE). 95°C HHA 3min， 然 后 置 冰 上 2min, fA 1X TBE® EKA PRK, 5% ~6% WR ie BE AK / 8mol/L 尿素 凝 胶 上 电泳 ， 常 压 250V 电泳 直到 染料 接近 凝 胶 底 部 。

可 选 方案 : 样品 中 加 入 等 体积 2X 上 样 缓冲 液 (125mmolL Tris，pH6. 8; 10% Him; 0.2%% 溴 酚 蓝 ) 。5% 一 6%% 非 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ， 或 根据 预期 被 保护 片段 的 大 小 使 用 合 iG He PAY BERK CSE 13， 附 表 13-1) 。 用 1XTBEe@ 作 电泳 缓冲 液 。 常 压 250V 电泳 直到 染料 前 沿 到 达 或 接近 凝 胶 的 底部 。

@ 电泳 结束 后 ， 抽 和 干 胶 ， 一 70C 用 增 感 屏 进 行 放 射 自 显影 CLS 15 BE). 作为 可 选 ， 当 使 用 的 是 高 比 放 探 针 时 ， 可 以 把 凝 胶 用 塑料 纸 包 庄 后 ， 在 上 面 覆盖 一 一 张 柯 这 的 属 各 进行 下 射 自 显影 。

16.7 实验 方案 : RNase 保护 分 析 法 定量 转录 上 产物

如 前 面 方法 所 指出 的 ， 用 RNase 保护 分 析 转 录 产 物 也 没有 一 成 不 变 的 规则 。 指 导 原 则 是 高 严谨 度 的 杂交 条 件 。 与 用 DNA 探 针 的 S1 核酸 酶 保护 实验 相 比 ， 使 用 RNA 探 针 的 RPA 提供 更 强 的 靶 分 子 热 稳 定性 和 更 强 的 识别 能 力 。 这 里 给 出 的 操作 程序 是 修改 版 立 二 ， 事实 上 所 有 的 东西 都 可 以 以 试剂 盒 的 形式 买 到 。 经 过 优化 ， 本 操作 程序 的 灵敏 度 可 达到 0. lpg 或 更 高 。 尽 管 非 放射 性 的 替代 标记 和 检测 方法 也 有 ， 但 放射 sitllinhatiece 敏 度 和 分 辩 率 的 方法 。

D 戴 上 手套 。 整 个 实验 中 都 要 使 用 无 RNase WHR. DIMER. SLAY RNA 和 来 自体 外 转录 的 RNA 探 针 总 是 很 容易 被 RNase 降解 。

Q 按照 不 同 的 体外 转录 系统 (如 Roche Applied Science 或 Promega) 或 其 他 所 摘 述 的 系统 〈 如 Gilman, 1987; Sambrook 和 Russell, 2001)， 克 隆 探 针 的 序列 到 一 个 噬菌体 的 启 动 子 下 游 。 准 备 和 纯化 反 义 的 RNA 探 针 。

QD 用 本 书 介绍 的 任何 一 种 方法 ， 分 离 纯化 所 要 研究 的 细胞 RNA 或 组 织 RNA。

注意 ”在 开始 这 个 实验 前 一 定 要 检查 RNA 样品 的 浓度 、 纯 度 和 完整 性 。

@ 1X TBE 缓冲 液 : 50mmol/L Tris; 50mmol/L MAR; 1mmol/L EDTA，pH8. 0。 *。 206 -

第 16 章 ，” 核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

® 在 一 个 微量 离心 管 中 ， 混 合 20~30ng 的 细胞 RNA 和 足够 量 的 载体 RNA， 使 总 量 达 到 100xg。 加 入 大 约 1X10scpm WERE. AA DEPC 处 理 的 水 把 反应 体积 调整 到 100x1。 一 定 要 准备 一 个 只 含 载体 RNA 和 探 针 的 负 对 照 ， 负 对 照应 该 没有 被 保护 的 片段 。

注意 工 ”尽管 一 些 研究 者 用 多 至 50pg 的 RNA 起 始 ， 但 常常 从 10pg 的 总 细胞 RNA 或 总 细胞 质 RNA 起 始 ， 就 足以 定量 很 多 mRNA 了 。 本 方法 所 用 的 RNase 的 量 足 以 消化 反应 体系 中 所 有 未 杂交 的 RNA 和 探 针 。

注意 2 要 严格 确保 探 针 至 少 5 一 10 倍 的 过 量 。 大 多 数 情况 下 ， 加 入 1X10scpm 的 探 针 就 可 以 达到 这 个 要 求 。

© MMA 11pl pH5. 2, 3mol/L 乙酸 钠 和 250pl 冰冷 的 95%% 的 乙醇 共 沉 淀 样品 、 载 体 和 探 &t, —20CKEBUK.

HB 没 加 入 探 针 的 实验 RNA MRAM. AERC hE — 80°C 保存 近 1 周 。

© 离心 收集 沉淀 。 弃 上 清 液 ， 沉 淀 用 70% CB 〈 含 30%DEPC 处 理 的 水 ) HER. FS 醇 〈 放 射 性 废 液 )， 倒 置 离心 管 晾 干 沉淀 。 作 为 可 选项 目 ， 用 95 儿 乙醇 再 洗 一 次 沉淀 ， 可 以 加 速 沉 淀 的 晾 干 。 用 乙醇 保持 RNA 沉淀 微微 湿润 。

注意 “不 要 使 用 真空 泵 抽 干 或 使 沉淀 完全 干燥 。 这 样 的 话 ，RNA 将 会 极其 难 溶 。

© 把 沉淀 重新 溶 于 20wl RPA 杂交 缓冲 液 中 〈80%% 新 鲜 的 去 离子 甲 酰胺 40mmol/L PIPES, pH6.4; 400mmol/L NaCl; Immol/LEDTA，pH8.0)。 上 下 吹 吸 样品 至 少 20 次 ， 确保 完全 溶解 。

FER 1 如 有 必要 ， 溶解 沉淀 的 杂交 缓冲 液体 积 可 以 增加 到 30nl。

注意 2 ”杂交 缓冲 液 可 以 事先 准备 ， 分 成 每 份 Iml， 保 存在 一 80'C 。

注意 3 如 果实 验 RNA 和 载体 是 事先 混合 的 而 没有 加 入 探 针 〈 不 推荐 )， 先 把 探 针 加 到 沉淀 里 ， 然 后 再 加 入 杂交 缓冲 液 到 终 体积 20nl。

注意 4 ”要 检测 低 丰 度 的 mRNA 时 ， 有 必要 使 RNA 浓度 接近 溶解 的 极限 〈5mg/ml 一 100kg/20pl)， 以 尽 可 能 地 促进 杂交 。

EBS ”杂交 缓冲 液 含 80%% 新 鲜 的 去 离子 甲 酰胺 是 标准 形式 。 记 住 严 谨 度 可 以 通过 温度 、 盐 离子 强 BE. pH 值 和 甲 酰胺 的 浓度 来 调节 。

85C 加 热 RNA 样品 10min， 使 其 完全 变性 。

注意 ”必须 要 确保 样品 完全 变性 ， 因 为 RNA 的 二 级 结构 会 影响 杂交 分 子 的 形成 。

@ 快速 离心 5s 将 杂交 混合 物 收集 到 管 底 。 把 离心 管 立刻 置 于 预 热 好 的 50 它 或 其 他 事先 确定 温度 的 水 浴 保 温 3h。

注意 工 ”杂交 温度 是 直接 根据 所 用 探 针 的 长 度 和 (G+C) 含量 的 不 同 而 改变 的 ， 必 须 靠 经 验 确定 。 本 方法 里 ， 典 型 的 温度 范围 是 45 一 60 。 在 缺少 特定 探 针 的 经 验 或 信息 时 ， 首 先 从 55C 开 始 尝试 。

注意 2 如果 反应 体系 中 没有 加 入 载体 RNA 〈( 见 步骤 四 ) ， 有 必要 大 大 延长 杂交 的 时 间 ， 这 意味 着 要 达到 较 高 的 杂交 效率 可 能 需要 温浴 过 夜 。

@ 杂交 结束 后 ， 加 入 240pl 无 菌 水 稀释 反应 混合 物 。 再 加 入 30pl 10 X RNase 缓冲 液 (100mmol/L Tris, pH7.5; 3mol/L NaAc; 50mmol/L EDTA, pH8.0)。 随 后 加 入 5yl 2mg/ml RNase A All 5ul 10OU/pl RNase T).

注意 1 如 果 在 第 @ 步 用 多 于 20pl 的 RPA 杂交 缓冲 液 ， 一 定 要 按 比例 增加 水 和 10 X RNase 缓冲 液 。207 .

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

的 体积 。

注意 2 RNase A 的 终 浓度 应 该 近似 50pg/ml, RNase Ti 为 200Uyml。

OD 短暂 离心 将 所 有 液体 收集 到 管 底 ，37 尼 温浴 1h。

© 用 等 体积 的 酚 : 氯仿 : 异 两 醇 (25 : 24 : 1) 或 酚 : Af (1: 1) 混合 物 抽 提 反应 物 。 最 高 速 离心 2min 分 层 。

QB 小 心地 把 水 相 CED 转移 到 新 的 离心 管 中 。 加 入 1pl 20mg/ml 的 糖 原 〈 糖 原 终 浓 BE) 100pg/ml). AMA 2. 5 倍 体积 的 95%% 的 乙醇 沉淀 杂交 分 子 。

@ 将 离心 管 在 干冰 上 放置 15min 或 一 20 人 2h。

® 离心 收集 沉淀 。 小 心 弃 上 清 液 风干 沉淀 。 也 可 以 用 真空 泵 稍微 抽 于 ， 但 一 定 不 能 使 沉淀 过 于。

® Fl Sul TE 42P¥ (10mmolML Tris; lmmol/L EDTA, pH8. 0) 悬 起 沉淀 。

图 加 入 5il2X 甲 酰胺 上 样 缓冲 液 (50% 甲 酰胺 ，2XTBE 缓冲 液 ，0.2 为 溴 酚 蓝 )。 95°C ind 3min， 然 后 置 冰 上 2min。 用 1XTBEe@ 作 电 泳 缓 冲 液 ， 在 5% ~6% AYR A Ms BERK / 8mol/L 尿素 凝 胶 上 电泳 ， 常 压 250V 电泳 直到 染料 接近 凝 胶 的 底部 。

可 选 方案 ;样品 中 加 入 2X 上 样 缓冲 液 (125mmol/L Tris, pH6.8; 10% 甘 油 ; 0.2% 省 酚 蓝 ) 。5% 一 6%% 的 非 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 ， 或 根据 预期 被 保护 片段 的 大 小 使 用 合适 比例 的 凝 胶 电 泳 〈 附 录 13， 附 表 13-1) 。 用 1XTBE 作 电 泳 缓冲 液 。 常 压 250V BRE AIR 料 前 沿 到 达 或 接近 凝 胶 的 底部 。

® 电泳 结束 后 ， 抽 王 胶 ， 在 一 70C 用 增 感 屏 进行 放射 自 显影 〈 见 第 15 章 )。 作 为 可 选 ， 当 使 用 高 比 放 探 针 时 ， 可 以 把 凝 胶 用 塑料 纸 包 庄 后 ， 在 上 面 覆 盖 一 张 柯达 的 底片 进行 放射 自 显影 。

16.8 和

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第 16 章 ”核酸 酶 保护 法 定量 测定 特定 的 mRNA

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(RRA; 李洋 校 )

“209 。

第 17 章 MWRNAWM

17.1 基本 原理

核 RNA 的 分 析 分 为 两 个 方面 。 首 先 ， 对 不 同位 点 转录 效率 的 分 析 可 以 为 在 既定 条 件 下 一 个 模型 系统 中 基因 行为 的 假设 论证 提供 关键 证 据 。 为 此 ， 一 种 叫 作 核 逃 逸 实验 的 方法 可 用 来 检测 基因 的 转录 效率 。 第 二 ， 核 逃逸 分 析 的 定量 可 以 由 稳 态 核 RNA 的 Northern 分 析 检 测 提供 。 它 也 是 研究 核 不 均一 RNA (hnRNA) 加 工 途径 的 极 有 价值 的 工具 。 表 17. 1 中 列 出 了 传统 Northern 分 析 、 核 酸 酶 保护 法 、 核 逃逸 实验 和 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 〈RT-PCR) 的 比较 。

表 17.1 传统 Northern 分 析 、 核 酸 酶 保护 法 、 核 逃逸 实验 和 RT-PCR 的 比较

为 RNA 分 析 提 供 定 性 | 比 Northern 分 析 的 灵敏 | 检测 转录 的 相对 比率 ; 合理 设计 能 达到 无 与 伦比 的 度 高 很 多 ; 保持 了 染色 质 的 天 然 几 | 灵敏 度 ; 何 构 型 ; 提供 无 与 伦比 的 解析 度 ; 允许 同时 研究 多 个 基因 ;| 取代 很 多 经 典 技术 ; 结合 Northern 分 析 数 | RNA 用 量 最 小 ; fit) RNA; 据 , 能 用 于 检测 基因 的 转录 | 十 分 迅速 的 技术 ; RNA 在 膜 上 相对 稳定 ; 溶液 杂交 比 膜 杂交 更 加 | 或 转录 后 调控 满足 研究 产 出 率 能 够 监测 样品 的 完整 性 | 量化 ; 能 够 用 于 稳 态 或 转录 效 率 检 测

是 灵敏 度 最 差 的 方法 ; 被 保护 的 片段 比 原始 片 | 核 的 分 离 要 求 很 多 技巧 ;| “与 其 他 方法 相 比 ,对 精确 的 变性 剂 有 毒害 ; 段 小 ; 探 针 复杂 度 非常 高 ; 反应 成 分 和 条 件 更 加 敏感 ; 需要 大 量 RNA 操作 ; 核酸 酶 ,尤其 是 SI 核酸 | 在 杂交 中 ,没有 标记 的 内 | 对 污染 物 , 龙 其 是 基因 组 耗费 时 间 多 ; 酶 ,难以 控制 ; 源 RNA 能 与 标记 了 的 |DNA, 极 其 敏感 ; RNA 酶 的 降解 机 会 | 精确 的 杂交 参数 比 其 他 |RNA 竞争 ; 必须 注意 遗留 物 污染 ;

很 多 ; 方法 敏感 ; 在 标记 过 程 中 ,方法 的 原 | ”优化 可 能 会 耗 时 耗 财 只 能 检测 稳 态 RNA 如 果 发 生 三 次 退火 . 双 链 | 理 是 支持 转录 延伸 而 不 是

探 针 可 能 损害 定量 效果 “| 起 始

17.2 REx OED

对 关键 调节 分 子 的 调控 是 细胞 应 对 内 外 刺激 的 一 种 整体 细胞 应 答 。 定 量 测定 基因 表达 的

变化 和 阑 明 目的 基因 在 哪个 水 平 上 受到 调节 ， 是 分 析 一 个 生物 模式 体系 的 基本 目的 。 虽 然 潜 *。 210 。

第 17 章 核 RNA 分 析

在 的 调节 层次 是 无 限 的 ， 但 大 体 上 可 以 分 为 转录 水 平 调控 或 某 种 转录 后 事件 的 调控 。 对 这 些 系统 的 初步 分 析 通 常 涉及 分 离 、 杂 交 、 随 后 用 Northern 分 析 检 测 特定 的 RNA、 核 酸 酶 保护 以 及 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 等 相关 技术 〈 分 别 见 第 12 章 、 第 16 章 、 第 19 章 和 第 20 章 )。 虽然 这 些 方法 可 以 在 稳 态 水 平 的 信息 方面 ( 即 RNA 最 终 在 细胞 质 或 细胞 核 或 两 者 中 的 积 BZ) 提供 很 好 的 定性 和 定量 数据 ， 但 是 从 整个 细胞 裂解 物 中 制备 的 RNA 既 不 能 提供 关于 目 的 RNA 转录 速率 信息 ， 也 不 能 提供 该 RNA 分 子 在 细胞 内 的 区 域 划 分 〈 细 胞 核 或 细胞 质 ) 方面 的 信息 。 对 于 阐明 基因 调控 水 平 来 说 ， 这 方 面 的 细胞 生物 化 学 知识 是 必要 的 ， 因 为 很 多 信使 RNA (mRNA) 的 半 训 期 比 其 他 信使 RNA 长 很 多， 而 且 很 多 mRNA 的 半衰期 会 因 异 生化 合 物 治 疗 或 环境 刺激 应 答 而 发 生 剧 烈 变化 。

多 种 因素 会 影响 成 熟 mRNA 分 子 在 细胞 质 中 的 含量 和 可 翻译 性 ， 其 中 包括 〈 但 不 局 限于 ) 调 控 因 子 及 反 式 和 顺 式 作用 的 序列 。 转 录 效 率 、 转 录 速 率 、 前 体 hnRNA 分 子 的 剪接 效率 、 核 质 转运 以 及 mRNA 对 蛋白 质 翻 译 体系 的 可 及 性 ， 是 一 些 潜在 的 基因 调控 水 平 。 这 些 调控 最 终 控 制 着 表 型

的 显现 〈 图 17. 1) 。 | 针对 这 些 问 题 ， 有 两 种 基本 方法 被 用 于 研究 翻译 后 修饰 真 核 细 胞 特定 基因 的 转录 机 制 与 后 续 初 级 转录 产

物 的 加 工 。 其 中 一 种 方法 是 ， 在 完整 的 细胞 核 中 ， pues 标记 的 前 体 核 糖 核 苷 酸 挫 人 分 离 细胞 核 时 已 经 在 内 源 染色 质 上 起 始 转录 的 RNA 转录 本 ， 以 此 来 衡 量 转录 的 比率 。 因 而 ， 在 内 源 染 色 质 上 的 转录 延 “图 17.1 信使 RNA (mRNA) 的 生物 合 伸 产 生 了 标记 了 的 核 RNA 。 这 些 标记 了 的 核 RNA 成。 由 RNA 聚合 酶 下 转录 基因 产生 核 不 接 下 来 被 纯化 ， 并 与 互补 的 固定 在 膜 上 的 靶 DNA RNA ChaRNA), Bl mRNA BU EER (Marzluff, 1978; Marzluff 和 Huang, 1984; Ka-

antic 它 在 何 处 实施 影响 。 细 胞 核 或 细胞 裂解 仅 nazawa 等 ，2000)， 它 是 一 种 非常 灵敏 的 测定 动物 产生 那些 已 经 积累 的 转录 物 ， 为 了 估 测 转 和 植物 细胞 中 转录 速率 的 方法 。 转 录 速 率 代表 着 录 愧 合成 的 比率 ， 可 以 进行 梳 沈 遂 实 验 细胞 状态 的 功能 〈 图 17. 2) 。 另 一 种 方法 是 用 特定 的 克隆 了 的 DNA 片段 作为 转录 模板 (Manley, 1984; Kramer 等 ，1987)， 它 被 用 来 剖析 为 保证 完整 的 细胞 抽 提 物 在 体外 忠实 转录 所 必需 的 因子 和 序列 。

核 逃 逸 实验 的 主要 优点 是 标记 的 同时 维持 着 转录 工厂 的 天 然 几 何 构 型 。 然 而 ， 由 于 核 逃 逸 实验 产生 的 是 没有 经 过 剪接 的 前 体 RNA， 这 些 RNA 分 子 在 转录 后 的 命运 并 不 清楚 。 核 逃逸 实 验 所 使 用 的 体系 和 反应 条 件 能 促进 已 经 起 始 了 的 转录 本 的 延伸 ， 但 是 并 不 认为 它 能 文 持 新 的 起 始 事件 @。 任 何 特定 RNA 种 类 的 标记 程度 〈 它 代表 特定 基因 组 序列 的 相对 转录 速率 ) 可 以 通

@ 数量 巨大 的 没有 标记 的 内 源 核 RNA 能 够 竞争 性 地 干扰 新 合成 的 RNA 的 检测 。 这 是 该 方法 不 支持 核 生 物化 学 的 一 方 面 。 转 录 起 始 的 定量 在 别处 已 有 详 述 (Marzluff 和 Huang, 1984, pp. 103-119) 。

* 219 -

RNA 分 高 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

收获 的 细胞 核

准备 实验 用 杂 fo ( 冷 的 变性 cDNA) |

|

纯化 核 RNA _—— 摊 和 人 人 cpm 标准 化

图 17.2 核 逃逸 实验 。 所 有 基因 的 相对 转录 比率 可 以 通过 将 完整 的 细胞 核 与 一 种 含有 放射 性 标记 的 UTP 的 核 苷 三 磷酸 (NTP) 混合 剂 共 孵 育 而 测定

过 与 放射 自 显影 相 耦 联 的 Cerenkov 计数 来 估计 。 另 外 ， 如 果 挨 和 的 是 非 同位 素 标记 物 ， 可 用 显 色 或 化 学 发 光 的 方法 来 检测 。 在 既定 的 实验 条 件 下 ， 这 些 数据 与 参与 转录 某 一 特定 基因 的 RNA 桶 合 酶 分 子 的 数量 直接 相关 ， 并 且 间 接 与 目的 基因 相关 联 的 调控 序列 的 转录 效率 相关 。 与 细胞 质 RNA 组 分 的 Northern 印迹 分 析 法 〈 见 “17. 3.2 用 NP-408 缓冲 液 裂解 细胞 ”>》” 联 用 时 ， 核 逃逸 实验 得 到 的 数据 可 用 来 评估 所 观察 到 的 基因 调节 来 自 哪 方面 的 变化 一 FE RA 控 ) 、 剪 接 、 核 质 转运 或 是 mRNA 稳定 性 〈 转 录 后 调控 ) 。

核 逃逸 实验 允许 同时 检测 多 个 特定 基因 组 位 点 的 转录 活性 ， 假 定 所 有 位 点 在 分 离 核 中 以 等 同 于 完整 细胞 中 的 相对 数量 进行 转录 。 这 是 该 技术 最 主要 的 优点 。 因 为 一 个 “ 典 型 ”的 真 核 细 胞 在 细胞 周期 的 任何 指定 时 间 点 活 姥 地 转录 着 数 以 千 计 的 不 同 基因 标 记 了 的 RNA (在 本 方法 中 作为 异 质 探 针 ) 有 非常 大 的 复杂 度 8; 在 此 实验 中 转录 出 的 目的 RNA 序列 的 浓度 可 能 仅 是 大 量 探 针 中 很 小 的 一 部 分 。 尽 管 如 此 ， 由 于 以 下 原因 这 种 方法 的 灵 人 敏 度 非常 高 。

D 标记 的 RNA 是 单 链 〈 双 链 探 针 的 复 性 会 减少 探 针 在 杂交 溶液 中 的 有 效 浓 度 )。

@ 延伸 过 程 中 RNA 被 连续 标记 产生 极 高 的 特异 活性 “与 未 端 标记 的 探 针 相 比 ， 第 13 BE).

@ 与 RNA:DNA 和 DNA:DNA 杂 合体 相 比 ，RNA : RNA 杂 合 体 增 强 了 热力 学 稳定 性 ， 人 允许 非常 严谨 的 杂交 后 洗涤 ， 从 而 增加 了 信 噪 比 。 |

核 逃 逸 实验 由 几 个 不 同 的 阶段 组 成 ， 每 个 阶段 有 不 同 的 目的 。

D 分 离 细胞 核 。 目 的 在 于 分 离 可 以 支持 转录 延伸 的 完整 的 核 。

@ 在 存在 标记 了 的 核 苷 三 磷酸 (NTP) 前 体 的 情况 下 延伸 转录 物 。 目 的 是 标记 初始 转 录 物 的 同时 维持 转录 装置 的 几何 构 型 。

QO 回收 标记 了 的 转录 物 。 目 的 是 从 新 标记 的 RNA 中 去 除 蛋白 质 和 DNA.

由 用 标记 了 的 RNA 与 特异 的 固定 在 膜 上 的 靶 DNA 杂交 。 目 的 是 仅 使 对 应 于 互补

@ 诺 万 洗涤 剂 PP40 (Nonidet P-40), 目前 的 商品 名 是 Igepal CA-630, @ 复杂 度 是 指 作为 探 针 的 不 同 RNA 序列 的 总 长 。 ° 22 -

第 17 章 核 RNA 分析

DNA (cDNA) 的 标记 转录 物 参 与 杂交 。 能 同时 检测 的 基因 数目 没有 限制 。 © 用 放射 自 显影 和 /或 Cerenkov 计数 来 定量 。 目 的 是 估计 目的 基因 的 相对 转录 速率 。 杂 交 信 号 与 目的 RNA 在 所 有 转录 的 RNA 库 中 的 量 相 关 。 表 17. 2 是 报告 这 些 数 据 的 一 个 典型 示例 。

表 17.2 细胞 癌 基 因 对 细胞 形状 的 依赖 性

相对 转录 比率

CUA-1 形态 依赖

HT-1080 非 形态 依赖 HT-IFN® 形态 依赖

注 : 数值 反映 扁平 细胞 中 基因 特异 的 核 转录 物 的 丰 度 除 以 培养 在 醇 溶 性 聚合 体 多 LHEMA] 上 的 圆 细 胞 中 转录 物 的 丰 度 。 丰 度 水 平 来 自 核 逃逸 放射 自 显影 的 图 像 分 析 (Farrell 和 Greene，1992) 。

核 逃逸 实验 成 功 度 几乎 完全 依赖 于 从 完整 细胞 中 分 离 细胞 核 及 前 体 UTP 放射 性 标记 的 速度 。 最 关键 的 参数 是 在 标记 前 制备 细胞 核 。 在 标记 步 之 前 ， 对 细胞 核 处 理 方 面 的 经 验 不 足 通常 直接 导致 不 能 得 到 高 比 活性 的 RNA 探 针 。 从 体外 培养 的 细胞 〈Marzluff 等 ，1973， 1974) 或 〈 如 果 绝 对 必要 ) 从 组 织 (Ernest 等 ，1976) 中 分 离 细胞 核 的 过 程 中 ， 还 必须 保 持 RNA 聚合 酶 的 活性 和 核 结 构 。 文 献 中 记载 的 大 多 数 方案 仅 是 在 标记 后 纯化 RNA WHER 有 所 不 同 。 分 离 内 源 染 色 质 并 使 之 保持 RNA 聚合 酶 活性 的 方法 文献 中 也 有 记载 〈 最 初 描述 于 Marzluff 和 Huang, 1975),

总 的 来 说 ， 细 胞 核 的 分 离 是 通过 完整 细胞 在 低 渗 裂 解 缓冲 液 中 孵育 ， 该 裂解 缓冲 液 的 特 点 是 含有 温和 非 离子 去 垢 剂 NP-40 (Price 和 Penman, 1972; Greenberg, 1988); 或 在 含有 Triton X-100 等 渗 芒 糖 缓冲 液 (Marzluff 等 ，1973，1974) “PRA; RAE AK MM AK (Gurney 和 Foster, 1977; Lund 和 Paine, 1990) 而 获得 。 然 后 细胞 核 可 以 立即 用 于 标记 ， 或 置 于 细胞 冻 存 安庆 中 在 液 所 8 或 一 80 冻 存 几 个 月 ， 标 记 能 力 不 会 有 明显 下 降 。 不 要 将 微 量 离心 管 放 置 在 液 所 中 。

0. 92

17.3 实验 方案 : BEAK IB? CHE mRNA 分 析 技 术 )

17.3.1 细胞 收集 及 细胞 核 的 制备

在 笔者 的 实验 室 里 ， 起 始 标记 反应 前 ， 将 细胞 尽 可 能 保持 于 低温 下 ， 这 样 可 获得 最 佳 的 标记 效果 。 用 2 或 3 个 大 托盘 〈 如 那些 经 常用 于 瓶子 高 压 灭 菌 的 ) 盛 满 冰 ， 本 方案 前 三 个 步 又 中 可 以 将 组 织 培养 四 直接 放置 于 冰 上 。 这 样 排除 了 必须 在 冷冻 室 里 工作 的 不 适 。 此 外 ， 将 细胞 培养 在 100mm 或 150mm 培养 四 中 而 不 是 培养 在 组 织 培养 瓶 中 ， 可 以 大 大 加 快 从 培养 严 中 收获 细胞 的 速度 。

d 将 细胞 培养 液 从 培养 有 贴 壁 细 胞 的 培养 下 中 吸 去 。

@ 分 离 细 胞 核 的 非 水 相 方法 包括 组 织 或 细胞 的 冻 干 ， 例 如 在 甘油 溶液 中 将 干粉 匀 浆 ， 然 后 在 非 水 缓冲 液 中 沉淀 细胞 K. @ 若 不 熟悉 液 氨 、 液 氮 真 空 瓶 以 及 试管 冻 融 的 安全 操作 方法 ， 应 该 寻求 有 这 方面 经 验 的 人 的 指导 。 这 对 实验 室 每 个 人 的 安全 是 必需 的 。 © 在 这 里 列举 的 方案 是 对 Groudine 等 (1981) 、Nevins (1987) # Greenberg (1988) 方法 的 改进 。 * 213 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

注意 虽然 在 一 个 标记 反应 中 可 能 只 用 5X105 个 细胞 核 ， 但 较为 明智 的 是 用 〈3 一 5)X10 个 细胞 核 起 始 以 达到 高 效 标记 。 核 标记 必须 要 达到 足够 的 每 分 钟 计 数 (cpm)， 以 利于 杂交 时 测量 RNA 样品 。 可 以 用 血细胞 计 很 方便 地 对 细胞 核 和 细胞 进行 计数 。

@ 用 10 一 15ml 冰冷 的 磷酸 盐 缓 冲 生理 盐水 (PBS) 洗涤 单 层 细胞 一 次 。 倒 掉 大 部 分 PBS， 留 下 约 1ml 在 组 织 培养 的 容器 中 。

@ 用 无 菌 细胞 刊 子 或 橡皮 滴 管 温和 而 迅速 地 刊 取 收获 细胞 。

注意 工 细胞 可 以 用 胰 蛋 白 酶 消化 来 收获 8。 但 笔者 历经 曲折 最 终 认识 到 ， 这 个 方法 中 过 度 胰 蛋 白 酶 消化 会 大 大 降低 标记 效率 。

注意 2 虽然 在 “ 半 转 化 ”细胞 群体 中 hnRNA 的 合成 好 像 没 有 受到 细胞 形状 扭曲 的 影响 ， 这 种 细胞 形状 的 扭曲 毫 无 疑问 会 伴随 胰 和 蛋白酶 的 消化 〈(Ben-Zerev 等 ，1980) 而 产生 。 对 二 倍 体 细 胞 而 言 ， 即 使 是 微小 的 形态 变化 也 会 使 其 RNA 合成 显示 出 较 强烈 的 形态 反应 (Benecke 等 ，1978;， Wittelsberger 等 ，1981) 。 由 于 这 个 原因 ， 从 放置 在 冰 上 的 培养 四 中 刊 下 细胞 是 最 不 可 能 导致 细胞 形状 扭曲 的 方法 ， 因 而 强烈 推荐 。

注意 3 置 预 冷 转 子 中 ，4C 500X¢ 离心 5min 收集 悬浮 细胞 ， 弃 上 清 液 。 用 10ml 冰 预 冷 的 1 久 PBS 重 悬 细胞 ， 再 按 上 述 步骤 收集 。 尽 可 能 完全 地 去 除 上 清 液 ， 然 后 接 步骤 @。

© 将 细胞 转移 至 预 冷 的 离心 管 〈 如 一 个 15ml 或 30ml 无 核酸 酶 的 Corex 玻璃 管 ) 4°C, 500X g 离心 5min 收集 细胞 。 尽 可 能 完全 地 去 除 上 清 液 。

注意 1 转移 装 有 细胞 和 /或 细胞 核 的 试管 时 ， 进 离心 机 前 和 出 离心 机 后 都 要 将 试管 冒 于 冰 桶 中 。

注意 2 当 置 人 离心 机 转子 的 时 候 ， 要 保证 用 合适 的 橡皮 套 支撑 玻璃 管 。

17.3.2 用 NP-40 缓冲 液 裂 解 细胞

© 重 悬 细胞 前 ， 非 常温 和 地 振荡 5s 使 细胞 团 块 松散 。 缓 慢 加 入 NP-40 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH 7.4; 10mmol/L NaCl; 5mmol/L MgClh; 0.5% NP-40), [aati #0 fei. UKE 5min。

注意 这 个 技术 要 避免 形成 细胞 团 块 。

@ 4°C, 500X g 离心 5min 收集 细胞 。

注意 ”如果 需要 ， 细 胞 质 RNA 可 以 从 细胞 质 上 清 液 中 纯化 出 来 用 于 Northern 分 析 。 将 上 清 液 置 于 冰 上 ， 然 后 继续 处 理 细胞 核 。

@ 按照 步骤 @ 所 述 ， 用 4ml NP-40 缓冲 液 重 悬 细胞 核 团 块 。4\C 、500Xg 离心 收集 细胞 核 。

小 心 倒 出 并 舍弃 上 清 液 。 用 200 一 300pwl 甘油 储存 缓冲 液 (50mmol/L Tris, pH 8.0; 30% 甘油 ; 2mmol/L MgCl; 0. Immol/L 乙 二 胺 四 乙酸 ) AEH MEMO. AKA 立即 用 于 标记 或 者 置 于 密封 的 细胞 冻 存 安庆 中 于 液 氮 或 一 80OC 保存 几 个 月

17.3.3 细胞 核 制 备 的 备 选 方案 : 从 组 织 培养 的 细胞 中 分 离 易 损 细胞 核 @

在 这 个 方法 中 ， 用 等 渗 芯 糖 缓冲 液 裂解 细胞 ， 然 后 吸入 一 个 黏稠 的 蓄 精 缓冲 当中 来 制备 细胞 核 。 这 种 方法 通过 阻止 细胞 核 捷 击 到 离心 管 底部 来 保持 细胞 核 的 完整 性 ， 记 住 不 同 细胞 类 型 的 细胞 核 密度 不 同 ， 对 特定 细胞 类 型 必须 要 优化 条 件 以 便 能 纯化 到 细胞 核 ， 同 前 述 方

@ 胰 和 蛋白 酶 消化 的 方案 见 附录 10。 @ 由 Marzluff 和 Huang (1984) 的 方法 修改 而 来 。 .214 -

第 17 章 核 RNA 分析

案 ， 当 细胞 培养 在 100mm 或 150mm 的 组 织 培养 下 中 而 不 是 培养 在 组 织 培养 瓶 中 时 ， 将 大 大 加 快 从 组 织 培养 下 中 收获 细胞 的 速度 。

@ 将 细胞 培养 基 从 长 有 贴 壁 细胞 的 培养 下 中 倒 出 ， 侈 弃 。

注意 用 (3 一 5)X107 细胞 核 起 始 产生 足够 的 cpm， 以 利于 杂交 时 测量 RNA 样品 。 用 血细胞 计 很 方便 地 对 细胞 核 和 细胞 进行 计数 。

@ 用 15ml 冰冷 的 磷酸 盐 缓 冲 生 理 盐 水 (PBS) 洗涤 单 层 细胞 一 次 。 倒 掉 大 部 分 PBS， 留 下 约 1ml CARA A at.

G@) 用 无 菌 细胞 刮 子 或 橡皮 滴 管 温和 而 迅速 地 刮 取 收 获 细胞 。

HB 1 细 胞 可 以 用 胰 蛋 白 酶 消化 来 收获 @。 但 是 过 度 的 胰 蛋 白 酶 消化 会 大 大 降低 标记 效率 。

注意 2 虽然 在 “ 半 转 化 ”细胞 群体 中 hnRNA 的 合成 好 像 没 有 受到 细胞 形状 扭曲 的 影响 ， 这 种 细胞 形状 的 扭曲 毫 无 疑问 会 伴随 胰 蛋 白 酶 的 消化 (Ben-Ze’ev 等 ，1980) 而 产生 。 对 三 倍 体 细胞 而 言 ， 即 使 是 微小 的 形态 变化 也 会 使 其 RNA 合成 显示 出 较 强 烈 的 形态 反应 〈Benecke 等 ，1978;， Wittelsberger 等 ，1981)。 由 于 这 个 原因 ， 从 放置 在 冰 上 的 培养 四 中 刮 下 细胞 是 最 不 可 能 导致 天 然 细 胞 形状 扭曲 的 方法 ， 因 而 强烈 推荐 。

注意 3 在 室温 下 500Xg 离 心 5min 收集 悬浮 细胞 。 弃 上 清 液 。 可 选 : 用 一 份 冰冷 的 PBS 洗涤 细胞 团 块 一 次 ， 并 按 先 前 所 述 收集 。 尽 可 能 完全 地 去 除 上 清 液 ， 然 后 接 步骤 @ 。

® 将 细胞 转移 至 一 个 合适 的 离心 管 〈 如 15ml 或 30ml 无 核酸 酶 的 Corex KBE), Bi 下 500Xg 离心 5min 收集 细胞 。 尽 可 能 完全 地 去 除 上 清 液

HB 1 转移 装 有 细胞 和 /或 细胞 核 的 试管 时 ， 进 离心 机 前 和 出 离心 机 后 都 要 将 试管 置 于 冰 桶 中 。

注意 2 当 置 和 离心 机 转子 的 时 候 ， 要 保证 用 合适 的 橡皮 套 支 撑 玻璃 管 。

@ 以 1X10" 个 细胞 /ml 的 密度 用 预 冷 的 缓冲 液 工 [0. 32mol/L FERF; Smmol/L CaCl ; 3mmol/L 乙酸 镁 ; 0.lmmol/L EDTA; 0.1% Triton X-100;，lmmol/L = 3 St ip HF HE (DTT); 10mmol/L Tris, pH 8.0] 重 悬 细胞 。

HER APT AC A HE. (LE EET FEM DTT 和 Triton X-100。

© 在 杜 恩 斯 匀 浆 器 中 匀 浆 细胞 ， 用 紧密 结合 的 桂 最 多 匀 浆 10 次 。

注意 ”通常 导致 标记 挫 人 低 的 原因 是 使 用 结合 不 紧密 的 杆 ， 从 而 不 能 释放 大 量 的 细胞 核 。

OO 无 RNA 酶 的 离心 管 底部 1/3 放置 缓冲 液 工 (2mol/L 蔗糖 ;3mmol/L 乙酸 镁 ; 1mmol/L DTT; 10mmol/L Tris, pH 8.0) 做 缓冲 垫 。 确 保 所 使 用 的 离心 管 能 够 经 受 超 离 心 。 用 适量 的 缓冲 液 开 稀释 匀 浆 物 使 得 体积 足够 充满 离心 管 剩 余 的 2/3 体积 。 小 心地 将 得 到 的 混合 物 铺 到 缓冲 垫上 。

4C、30000Xg 离心 45min 收集 细胞 核 。

@ 以 108 个 细胞 核 /ml 的 密度 用 储存 缓冲 液 〈40%% 甘 油 ，5mmol/L 乙酸 镁 ; 0. IlImmol/L EDTA; 5mmol/L DTT; 50mmol/L Tris, pH 8.0) 重 悬 细胞 核 团 块 。

QO 立即 将 细胞 核 封 存 于 细胞 冻 存 安 阁 管 中 于 液 氮 或 一 80Y7C 保存 几 个 月 。 和 否则， 立即 开 始 标记 方案 。

17.3.4 细胞 核 制 备 的 备 选 方案 : 从 完整 组 织 中 分 离 细 胞 核 @ 按照 标准 方法 获得 组 织 。 迅 速 切 碎 组 织 并 用 冰冷 的 0.14mmol/L NaCl, 10mmol/L

@ 胰 和 蛋白 酶 消化 的 方案 见 附 录 10。 @ 从 Derman 等 (1981) Marzluff 和 Huang (1984) 的 方法 修改 而 来 。

e 215 =

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

Tris (pH 8.0) 溶液 洗涤 。

@ 在 冰冷 的 裂解 缓冲 液 (0. 32mol/L HK HF; Smmol/L CaClz; 3mmol/L GRE; 0. mmol/L EDTA; 0.1% Triton X-100; Immol/L DTT; 10mmol/L Tris, pH 8.0) #4) 浆 切 碎 的 组 织 。 每 克 组 织 加 5ml 裂解 缓冲 液 。

@ 迅速 将 匀 浆 用 几 层 灭 菌 纱布 过 滤 。 这 会 有 助 于 去 除 结 直 缔 组 织 和 其 他 碎片 。

® 杜 恩 斯 匀 浆 器 中 用 一 个 紧密 结合 的 杆 匀 浆 10 一 20 次 。 取 Syl 匀 浆 液 于 显微镜 载 玻 片 上 ， 盖 上 盖 玻 片 ， 用 显微镜 观察 细胞 裂解 的 程度 。

© 在 匀 浆 液 中 加 入 1 一 2 体积 预 冷 的 〈2.0molL HAM; 3mmol/L GRE; 0. 1mmol/L EDTA; lmmol/L DTT; 10mmol/L isis pH 8.0) Am. RNase 的 离心 管 底部 1/3 部 分 由 上 述 相同 缓冲 液 组 成 缓冲 垫 。 把 上 述 得 到 的 混合 物 铺 到 该 缓冲 热土 。 确保 所 使 用 的 离心 管 能 够 经 受 超 离心 。

© 4°C, 30000 g 离心 45min 收集 细胞 核 。

@ VA 108 个 细胞 核 /ml 的 密度 用 甘油 储存 缓冲 液 (25% 甘油 ;5mmolL GBR; 0. lmmol/L EDTA; 5mmol/L DTT; 50mmol/L Tris, pH 8.0) 重 悬 细胞 核 团 块 。

立即 将 细胞 核 封 存 于 细胞 冻 存 安放 中 于 液 氮 或 一 80C 保存 几 个 月 。 和 否则， 立即 开始 标记 方案 。

17.3.5 转录 物 的 标记

注意 在 融化 细胞 核 之 前 配制 好 2 义 反 应 缓冲 液 非常 重要 。 即 使 让 融化 了 的 细胞 核 待 在 冰 上 几 分 钟 也 会 使 标记 效率 大 大 降低 。

® 配制 2 反应 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH 8.0; 5mmol/L MgClz ;， 300mmol/L KCl; lmmol/L ATP; lmmol/L CTP; lmmol/L GTP; 5mmol/L DTT).

注意 ”理想 情况 下 ， 应 该 从 任意 一 个 零售 商 那里 买 到 一 种 NTP 储存 液 ， 然 后 在 使 用 之 前 加 到 反应 冲 液 中 。 如 果 需 要 ， 用 足够 的 0. 5mmol/L EDTA 溶解 ， 使 其 终 浓 度 达到 100mmol/L; 调整 pH (AB 7.0~ 8.0。 制 备 单独 的 NTP 储存 液 。 将 核 苷 酸 储存 液 分 装 并 保存 于 一 20C ， 一 份 只 冻 融 一 次 。NTP 的 最 小 浓度 是 50pmol/L， 通 常 工作 浓度 在 0.5 一 1. Ommol/L 范围 内 。

@ 每 200pl 细胞 核 加 入 200p) 2 反应 缓冲 液 。 如 果 细 胞 核 在 使 用 之 前 是 冻 住 的 ， 加 大 200pl 2 关 反 应 缓冲 液 到 200pl 融化 的 细胞 核 中 。

注意 1 在 本 实验 室 中 ， 最 佳 标记 效 率 是 在 装 有 冻 着 的 细胞 核 的 安 亲 中 加 入 200pl 2 尖 反 应 缓冲 液 时 观察 到 的 ， 细 胞 核 直 接 在 2 关 反 应 缓冲 液 中 融化 。 不 要 在 细胞 核 融化 后 洗涤 ， 而 且 一 份 只 能 融化 一 次 。

注意 2 如 果 融 化 了 的 细胞 核 显 得 黏稠 不 要 过 度 惊慌 。 虽 然 冻 融 以 后 的 细胞 核 会 有 一 定 裂 解 ， 但 转 录 复 合 物 仍然 完好 而 且 能 够 支持 已 经 起 始 了 的 转录 物 的 延伸 以 及 标记 物 的 挫 人 〈〔(Marziuff 和 Huang, 1975; Nevins，1987)。 当 然 ， 为 了 减少 细胞 核 的 损伤 ， 在 标记 之 前 的 每 一 步 都 应 当 小 心 权 翼 。

@ 立即 加 入 10wl [e-32P] UTP 800 Ci/mmol, 10mCi/ml, ARK 26°C HEF 30min， 同 时

注意 1 标记 可 直接 在 冷冻 的 安 阁 中 进行 。 此 外 ， 新 制备 的 细胞 核 最 好 在 一 圆锥 形 的 聚 丙烯 试管 中 标记 ， 这 样 可 以 降低 此 方法 必然 产生 的 放射 性 照射 到 最 小 程度 。

@ 确切 的 芯 精 浓度 因 所 研究 的 细胞 类 型 的 不 同 而 异 ， 在 使 用 有 价值 的 起 始 材料 之 前 ， 应 该 根据 经 验 测定 好 ; 通常 范 ff Jt 1. 8 一 2. 2mol/L

* 216 ，

第 17 章 ， 核 RNA 分 析

注意 2 在 本 实验 室 ， 重 复 性 最 好 的 标记 挨 人 是 标记 反应 在 一 个 温 控 轨 道 平 台 (Lab-Line Instru- ments) 上 以 30~50r/min 摇摆 时 观察 到 的 。 注意 3 标记 的 凶 育 温度 可 以 在 25 一 37 人 范围 内 变动 。 在 25 人 孵育 可 以 延长 到 1h， 而 37'C 孵育

0. 5h 以 上 不 会 增加 标记 的 程度 和 已 起 始 转录 物 的 延伸 。 此 外 ， 一 些 方法 推荐 细胞 核 和 标记 物 在 37? 的 孵育 时 间 短 至 15min (Nevins，1987) 。

17.3.6 标记 转录 物 的 回收

@ 在 一 个 单独 的 无 RNA 酶 的 试管 中 ， 把 lml 高 盐 缓 冲 液 〈500mmolL NaCl; 50mmol/L MgCl; 2.5mmol/L CaClz; 10mmol/L Tris, pH 7.4) 和 50n 1mg/ml 的 无 RNase 的 DNase 工 在 使 用 前 混合 。750pwl 的 混合 物 加 入 到 每 个 装 有 标记 好 细胞 核 的 试管 中 。

注意 工 高 盐 缓冲 液 使 标记 反应 终止 ， 并 且 破 坏 所 有 余下 的 完整 细胞 核 。 细 胞 核 的 破裂 大 大 增加 了 溶液 的 黏稠 性 ， 因 为 染色 质 被 释放 出 来 。 用 硅烷 化 的 @ 无 RNase 的 巴 斯 德 吸管 〈 微 量 吸管 ) 或 一 个 安装 在 lml 结核 菌 素 注 射 器 上 的 25 号 针头 来 剪 切 DNA 几 次 。

注意 2 DNase 工 的 活性 要 求 溶液 中 含有 CaCh.

@ 37°C F KIRA W 5min。

EB FAA DNase I 短 暂 处 理 的 目的 是 使 基因 组 DNA 部 分 片段 化 而 不 是 完全 降解 ， 这 样 溶液 在 物理 上 会 更 好 操作 ， 而 且 在 以 后 的 纯化 步骤 中 不 大 会 黏着 标记 好 的 RNA 分 子 。 部 分 降解 的 DNA 在 接 下 来 的 步 又 中 将 被 除去 。

@ MA 200pl 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS)/Tris 缓冲 液 (5% SDS; 500mmol/L Tris, pH 7.4; 125mmol/L EDTA) 和 15pwl 20mg/ml fh) ABE K. 42°C HR 30min 以 保证 大 部 分 蛋 白质 被 水 解 。

四 用 1.25ml 茶 酚 : 氯仿 : 异 戊 醇 (25 : 24:1) 抽 提 每 个 样品 。800Xg 离心 8 一 10min 以 分 离 液 相 。

© 将 上 层 水 相 转 移 至 一 个 新 的 试管 ， 然 后 按 顺 序 加 入 : 2ml 无 菌 〈 无 核酸 酶 ) 的 水 、 3ml & 10% TCA® 的 60mmol/L 焦 磷 酸 钠 、15pl 10mg/ml 载体 RNA (如 廉价 的 酵母 RNA)。 冰 浴 45min。

注意 ;， 这些 步 骤 将 沉淀 标记 好 的 RNA.

© 用 Millipore Sampling Manifold (Millipore, Billerica, MA), AMHR PAA ie 层 ， 将 沉淀 过 滤 到 Whatman GF/A 玻璃 纤维 滤 膜 上 。 每 张 膜 用 10ml 5% TCA, 30mmol/L 焦 磷 酸 钠 洗涤 2 次 。

注意 SM TCA 沉降 步骤 和 过 滤 步 骤 通 常会 导致 难以 接受 的 高 背景 的 出 现 ， 在 杂交 后 即使 用 最 严格 的 洗 脱 也 难以 去 除 这 种 背景 。 这 是 本 方法 定量 的 关键 步骤 。

© 将 每 张 膜 转移 到 一 个 玻璃 闪烁 管 中 ， 加 入 1.5ml DNase 工 缓冲 液 [20mmol/L HEPES (自由 酸 )，pH 7.5; 5mmol/L MgCh; 2.5mmol/L CaCl], tA 50ul 1mg/ml 无 RNase 的 DNase [ , 37°C ## FF 30min,

加 入 40pl 500mmol/L EDTA (pH 8.0) fl 70p1 20% SDS 以 终止 消化 。

@ 加 热 样品 至 60 并 保温 10min， 从 每 张 滤纸 上 洗 脱 纯化 了 的 RNA。 小 心地 把 上 清 液

O 玻璃 器 严 的 硅烷 化 参见 附录 8. @ TCA: 三 氯 乙酸 。

° 217 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

转移 到 一 个 新 的 试管 中 。 @ 1. 5ml 洗 脱 缓冲 液 (1% SDS; 10mmol/L Tris, pH 7.9; 5mmol/L EDTA) 加 六 装

有 滤 膜 的 玻璃 闪烁 管 中 ， 重 复 洗 脱 步骤 。65C 加 热 10min， 然 后 小 心地 回收 上 清 液 并 与 从 第 @@ 步 得 到 的 最 初 的 上 清 液 合并 。

@@ 用 等 体积 的 苯酚 : 氯仿 : 异 戊 醇 (25 : 24 : 1) 抽 提 所 得 到 的 RNA 一 次 ， 接 下 来 用 等 体积 的 氯仿 抽 提 一 次 。

注意 ”两 种 情况 下 ，RNA 都 会 分 离 到 水 相 CLE).

四 将 水 相 〈 约 3ml) 转移 到 一 个 硅烷 化 @ 的 无 RNase 的 Corex 玻璃 管 〈 或 等 价 物 ) 中 。 加 入 650wl 1mol/L NaOH， 在 冰 上 孵育 不 超过 3min。

注意 ”有限 的 RNA 水 解 往往 会 提高 杂交 效率 〈Jelinek F, 1974). HAA 3min 则 有 碱 水 解 作 用 降解 RNA 的 风险 。 然 而 ， 有 限 的 水 解 作 用 可 以 降低 高 分 子 量 RNA 自 杂 交 的 可 能 性 ， 有 益 于 正 向 的 分 子 间 的 杂交 动力 学 。 如 果 需 要 ， 这 个 步骤 以 及 接 下 来 的 中 和 步骤 可 以 一 起 省 略 。

® wA 1.5ml lmol/L HEPES (自由 酸 )，pH 7.4 以 中 和 反应 。

国 加 入 0.1 体 积 3molL 乙酸 钠 (pH 5.2) ( 约 500xl) 和 .2.5 体积 冰冷 的 9%5 儿 乙醇 ( 约 15ml) 沉淀 RNA。 一 20C 保 存 过 夜 。

17.3.7 靶 DNA 的 制备

® 目的 基因 的 DNA 序列 可 以 用 PCR 扩 增 或 者 从 克隆 有 该 序列 的 质粒 中 切 下 的 方法 制 备 。 在 后 一 种 方法 中 ， 所 用 的 限制 性 内 切 酶 只 会 切 载体 而 不 能 切 DNA 插 人 片段 。 将 这 些 靶 DNA 固定 在 尼龙 膜 上 就 不 再 歼 述 ; 然而 ， 靶 DNA 至 少 应 该 有 1. 0kb 以 保证 在 硝酸 纤维 素 上 的 固定 量 。 应 该 避免 使 用 硝酸 纤维 素 ， 因 为 它 的 结合 能 力 很 差 。

@ 加 入 0. 1 体积 的 1mol/L NaOH 使 线性 的 靶 DNA 变性 。 室 温 孵 育 30min BY 37°C IRF 10min,

@ MA 10 倍 体积 的 冰冷 的 6XSSC 缓冲 液 ， 中 和 混合 物 的 碱 性 pH fA.

® 做 印迹 前 ， 将 变性 的 DNA 一 直 放 置 在 冰 上 ， 但 不 要 超过 15 一 20min。 最 好 在 加 大 6X SSC 后 15min 之 内 完成 杂交 ， 以 避免 已 变性 样品 重新 退火 。

@ 组 装 Minifold | (斑点 印迹 ) 或 Minifold I ( 狭 颖 印迹 ) 42 B (Schleicher & Schuell，Inc. )， 然 后 开始 使 用 低 真空 〈 第 9 章 )。 以 100 一 200pl 的 体积 吸取 2 一 5ng 或 者 其 他 预先 测定 的 质量 ) 已 变性 的 DNA 加 到 每 个 孔 。 缓 冲 液 透 过 膜 后 ， 用 300pl 6 x SSC YE RET FL.

a. 通常 这 个 量 的 DNA 对 大 多 数 基因 来 说 是 过 量 的 ， 那 些 极为 丰富 的 序列 如 核糖 体 RNA (rRNA) 和 小 核 RNA (snRNA) 例外 。 靶 DNA 是 否 过 量 可 以 由 以 下 方法 测定 。

i. 变化 加 入 RNA 的 量 ， 杂 交 信 和 号 应 该 和 加 入 RNA 的 量 成 比例 。

li. 变化 在 滤 膜 上 的 靶 DNA 量 ， 如 果 DNA 过 量 ， 则 对 杂交 的 RNA 的 量 应 该 没有 任何 影响 。

ii. 把 没有 结合 到 靶 DNA 或 滤 膜 上 的 RNA 再 杂交 一 遍 ， 应 该 没有 这 样 的 杂交 出 现 。

b. 记 住 硝酸 纤维 素 的 DNA 结合 容量 仅 是 80ng/cm2 。 特 别 是 当 克隆 到 质粒 中 的 靶 DNA 没有 被 切 下 ， 意 味 着 线性 载体 和 插入 片段 都 要 被 印迹 上 ， 用 尼龙 膜 可 能 更 好 。 很 多 尼龙 膜 的 核酸 结合 能 力 大 于 400ng/cm2 。 当 使 用 了 各 种 不 同 大 小 的 载体 或 各 种 大 小 的 DNA 插入 片段

@ 玻璃 器 亚 的 硅烷 化 参见 附录 8 *。218 。

#178 核 RNA 分 析

克隆 到 了 相同 的 载体 当中 这 就 尤其 重要 ， 因 为 每 个 孔 必 须 加 入 同等 质量 的 DNA 插 人 片段 《而 不 是 载体 和 插入 片段 合 起 来 的 质量 )。 这 种 标准 化 的 方式 是 必须 的 ， 以 保证 所 观察 到 的 杂 交 信 号 的 变化 真实 反应 不 同 的 转录 比率 。 可 以 在 还 没有 把 样品 加 到 印迹 导管 孔 之 前 加 入 适量 线性 化 的 非 重 组 载体 DNA 〈 没 有 插入 片段 的 载体 ) 或 者 其 他 载体 DNA 到 每 一 个 样品 ， 通 过 这 种 方法 来 实现 对 靶 DNA 样品 质量 的 标准 化 。

c. 因为 核 逃逸 实验 能 够 同时 检测 多 种 基因 的 转录 程度 ， 一 种 有 价值 的 印迹 策略 是 在 同 一 印迹 管 的 垂直 柱 上 处 理 不 同 目的 基因 的 对 应 靶 DNA 序列 。 不 要 蕊 记 包括 一 个 对 应 于 “看 家 ”功能 基因 的 DNA， 也 就 是 这 个 基因 ， 它 的 表达 水 平 在 规定 的 实验 条 件 下 不 应 该 变化 。 因此 ， 滤 膜 可 以 切 成 窗 条 ， 并 且 在 最 小 体积 的 杂交 缓冲 液 中 与 极为 混杂 的 RNA 探 针 杂 交 。

d. 在 组 装 斑点 印迹 装置 之 前 记 住 要 在 无 核酸 酶 的 水 中 5min 然后 再 在 6X SSC 中 至 少 几 秒 预 湿 滤 膜 。

e. 与 斑点 印迹 装置 (12.5mm2 ) 相 比 ， 狭 颖 印迹 装置 会 使 样品 集中 于 更 小 的 区 域 (6mm2)。 因 此 ， 狭 缝 印迹 所 得 到 的 数据 比 斑点 印迹 更 容易 量化 ， 因 为 狭 颖 的 形状 使 图 像 分 析 软 件 更 易 量 化 。

f. 记 住 在 每 张 用 来 杂交 的 滤 膜 条 中 都 包括 一 个 合适 的 阴性 对 照 〈 如 一 个 非 重组 载体 ) 和 阳性 对 照 《如果 可 能 的 话 ) 。

g. 为 了 显示 这 个 方法 的 线性 关系 ， 建 议 至 少 做 三 个 滤 膜 条 ， 在 这 些 滤 膜 上 已 经 固定 了 靶 DNA 样品 。 然 后 基于 测定 到 的 比 放射 性 〈cpm)， 把 由 核 逃 移 所 产生 的 异 质 的 标记 RNA 做 多 轮 两 倍 稀释 。 然 后 用 这 些 稀 释 产物 与 单独 的 载 有 目的 DNA 的 滤 膜 杂交 。 杂 交 检 测 所 得 到 的 信号 强度 ， 应 该 反映 出 经 过 两 倍 稀释 后 的 标记 了 的 RNA 的 量 。

© 按照 生产 商 的 说 明 书 ， 将 靶 DNA 固定 在 滤 膜 上 以 备 下 一 步 杂交 之 用 。 通 常用 一 个 校 准 了 的 紫外 〈UV) 光源 将 DNA 交 联 到 尼龙 膜 上 。 而 硝酸 纤维 素 是 在 真空 中 80C 烘 烤 2h 固 定 核酸 。 尼 龙 膜 也 可 以 用 烘 烤 的 方法 代替 ， 在 低 到 65C 的 温度 烘 烤 不 到 1h 〈 不 需要 在 真空 中 )。 滤 膜 可 以 立即 使 用 或 储存 在 一 个 低温 干燥 的 地 方 待 用 。 将 核酸 固定 到 固体 支持 物 上 的 详细 论述 见 第 12 章 。

17.3.8 用 于 杂交 的 RNA 的 制备

® 4C、10000Xg 离心 30min 回收 沉淀 的 RNA。 小 心地 将 尽 可 能 多 的 乙醇 倒 人 放射 性 RMD. BAM PA 70% 乙 醇 (用 DEPC 处 理 过 的 水 稀释 95%% 的 乙醇 ) 洗涤 一 次 。 离 心 《如 果 需 要 )， 然 后 把 用 于 洗涤 的 乙醇 尽 可 能 倒 掉 。 人 允许 短暂 了 晾 干 试管 。

@ 用 lmlTESe 溶 液 (10mmol/L TES, pH 7.4; 10mmol/L EDTA; 0.2% SDS) 重 悬 RNA 团 块 。 室 温 下 在 一 个 轨道 平台 上 以 100r/min 的 速度 振荡 样品 以 重新 溶解 RNA。

@ 从 每 个 样品 中 取 Syl 进行 lmin 计数 以 检测 cpm/ml。 以 cpm/ml 为 准 通 过 加 入 TES 溶液 将 样品 均一 化 ， 为 每 个 杂交 提供 几乎 相等 的 计数 。 通 常 ，cpmy/ml 值 平均 为 每 5X107 核 中 约 107 cpm/ml,

注意 FA cpm 标准 化 样品 是 基于 这 样 的 假设 ，RNA 合成 的 总 体 水 平 作为 细胞 状态 的 一 个 函数 没有 改变 ， 只 是 特定 的 基因 上 调 或 下 调 了 。 研 究 者 必须 赁 经 验 来 衡量 这 个 假设 对 每 一 组 新 的 细胞 状态 条 件 是 否 合理 。 并 且 保 证 实验 起 始 于 相同 数量 的 细胞 核 。

@ TES: N-tris (Fe FASE) 甲 基 -2- 氨 基 乙 烷 硫酸 。 ° 219 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

@ 把 载 有 固 相 化 靶 DNA 序列 的 滤 膜 切 成 条 。 使 每 一 条 滤 膜 都 载 有 一 组 将 要 与 标记 RNA 探 针 杂 交 的 靶 DNA. ig

© 杂交 直接 在 干净 的 5ml 闪烁 管 中 进 行 时 ， 其 效率 和 重复 性 最 高 。 可 按 如 下 操作 进行 : 把 载 有 DNA 的 滤 膜 条 卷 起 来 ， 小 心地 推 到 一 个 闪烁 管 的 底部 ， 使 滤 膜 固定 DNA 的 一 面 朝 向 管子 的 中 心 。

注意 于 ”这 种 杂交 方式 可 以 使 所 需 探 针 量 最 小 化 ， 并 保持 最 大 的 探 针 浓度 。 而 且 ， 这 种 方法 会 使 在 塑料 袋 中 杂交 必然 造成 的 放射 性 污染 最 少 化 。

注意 2 为 了 保证 闪烁 管 是 无 RNase 的 ， 强 烈 建议 那些 管子 用 HzO: 浸泡 至 少 20min， 然 后 用 灭 菌 水 彻底 冲洗 。

© fA lml TES/NaCl (10mmol/L TES, pH 7. 4; 10mmol/L EDTA; 0.2% SDS; 600mmol/L NaCl) 与 lml RNA 溶液 混合 。 把 得 到 的 2ml RNA Het IMD AH DNA 滤 膜 条 的 闪烁 管 中 ， 盖 紧 管 盖 ， 然 后 在 65C 杂 交 24 一 36h。 确 保管 中 的 滤 膜 完全 浸没 在 杂交 液 中 。

注意 “在 本 实验 室 ， 最 高 效 的 杂交 方法 是 将 单个 的 闪烁 管 插 入 到 一 次 性 聚 茉 乙 烯 架 上 ， 这 种 架子 经 常用 于 装载 15ml 离心 管 。 然 后 把 架子 放 到 65"C 预 热 的 轨道 摇 床 孵育 器 的 平台 上 ， 在 整个 杂交 过 程 中 都 组 慢 摇 动 (50~70r/min).

17.3.9 杂交 后 的 洗 脱 和 检测

@ 杂交 结束 时 ， 用 预 热 到 65C 的 2XSSC 以 过 量 体 积 批量 洗涤 滤 膜 1h。

将 滤 膜 放 入 装 有 8ml 2XSSC Fil 121 10mg/ml RNase A 的 单独 玻璃 闪烁 管 中 。 另 外 ， 也 可 以 用 含有 RNase A (0. 5pg/ml) 与 RNase Ti (5U/ml) A§ 2X SSC 消化 非特 异 的 RNA AF. 37° CHA 30min， 不 需要 摇动 。

注意 典型 的 RNase A 储存 液 是 2mg/ml，RNase Ti 是 5000U/ml。

© 在 37C 以 过 量 体 积 的 2xSSC 批量 洗涤 滤 膜 1h。 短 暂 沥 干 滤 膜 ， 保证 它们 没有 完全 干燥 。 将 湿 的 滤 膜 放置 在 塑料 包装 膜 上 ， 然 后 固定 于 固体 支持 物 如 Whatman 3mm 纸 或 一 片 硬 纸板 上 。 然 后 进行 放射 自 显 影 〈 见 第 15 章 ) 。

注意 ”使 用 图 像 分 析 软 件 很 容易 量化 自 显影 胶片 上 的 信号 强度 ， 但 首先 要 确保 所 观察 到 的 信号 是 在 胶片 的 线性 范围 之 内 ， 这 可 以 很 容易 地 通过 变换 曝光 时 间 来 曝光 几 张 胶片 而 做 到 。

四 放射 自 显影 后 ， 可 以 从 结合 在 膜 上 的 DNA 上 把 杂交 的 RNA Ret Ve PH, AA 0. 4mol/L NaOH 42C 洗 膜 30min， 接 着 用 1XSSC、0.5% SDS 65°C YEE 60min。 这 种 方法 可 以 去 除 所 有 杂交 上 的 RNA， 使 得 下 一 轮 杂 交 效 率 不 会 受到 影响 。

WD 如 果 滤 膜 不 再 用 于 下 一 轮 杂 交 ， 可 以 从 滤 膜 条 切 下 合适 的 样品 ， 然 后 直接 在 闪烁 液 中 计数 ， 精 确定 量 所 观察 到 的 放射 自 显影 信和 号

17.4 实验 万 家 : BCHEER ( 备 选 方法 ) 传统 的 核 逃逸 实验 操作 麻烦 而 且 耗 费 人 力 ， 已 有 一 种 简化 的 版 本 (Celano &, 1989b), 本 文 提供 一 个 该 简化 版 的 修订 本 。 在 这 个 方法 中 ， 标 记 了 的 RNA 转录 物 用 酸 -苯酚 - 硫 氰 酸

县 抽 提 (Chomczynski 和 Sacchi, 1987; 见 第 5 章 ) 纯化 。 这 项 技术 的 主要 优点 是 标记 后 的 。220 。

第 17 章 核 RNA 分析

RNA 可 以 立即 迅速 地 被 纯化 出 来 ， 使 用 股 缓 冲 液 而 不 用 TCA 沉降 的 好 处 有 很 多 。 在 整个 操作 过 程 中 要 保证 始终 戴 着 手套 并 且 遵 守 良 好 的 无 RNase 的 技术 规范 。

@) 按 前 述 方法 或 其 他 方法 〈deBustros 等 ，1986; Celano 等 ，1989a) 分 离 细 胞 核 。

@ 把 分 离 得 到 的 细胞 核 〈 最 多 5X107) 用 160ml 核 储 存 缓冲 液 〈40%% 甘 油 ;，50mmol/L Tris, pH 8.3; 5mmol/L MgCl ; 0. 1mmol/L EDTA) 收集 到 无 菌 的 2. 2ml 微量 离心 管 中 。 然后 在 乙醇 -干冰 浴 中 冷冻 细胞 核 后 一 80 储存 ， 可 保存 1 年 。 不 要 将 这 种 类 型 的 管子 储存 .于 液 氮 中 。 作 为 可 选 方案 ， 整 份 细胞 核 可 以 储存 在 细胞 冻 存 安庆 中 ， 密 封 ， 储 存 于 液 氮 中 可 保存 1 年 。

@ 在 冰 上 融化 冻 着 的 整 份 细胞 核 。 每 200pl 细胞 核 中 加 入 25 由 10 Xx 2 (40mmol/L ATP, GTP, CTP; 5mmol/L DTT; 50mmol/L MgCl,; 800mmol/L KCl) 和 20pl [o-32P] UTP (200pCi; 3000Ci/mmol), 26°C 8 FF 15min,

由 裂解 细胞 核 后 ， 加 入 12wl 20mmol/L CaCl, 和 121 10mg/ml 7 RNase AY DNase [ 消化 DNA。26 人 孵育 5min。

© 加 入 30pl 10XSET (5% SDS; 50mmol/L EDTA; 10mmol/L Tris, pH 7.4) 和 71 10 mg/ml 载体 RNA 〈 如 廉价 的 酵母 RNA)。 加 入 3p] 10mg/ml 蛋白 酶 K 对 肽 进行 水 ff. 37°C BF im 30min,

© 用 一 个 安装 在 1ml 结核 菌 素 注 射 器 上 的 25 号 针头 小 心地 重复 吸取 裂解 液 以 前 切 基因 组 DNA。

© 将 下 述 溶 液 加 到 装 有 标记 好 的 核 RNA 的 每 一 个 管 中 〈 加 入 后 混 匀 )， 从 样品 中 抽 #2 RNA,

500u1 GTC (4mol/L FMRI; 25mmol/L FF RRA. pH 7.0; 0.5% N- 十 二 烷 基 肌 BBA; 0. lmol/L 2-7, 3EZ MB)

80ul 乙酸 钠 (2mol/L, pH 4. 8)

800p1 7k tf AIA

160pl 氯仿 : HRB 〈49 1)

在 冰 上 孵育 样品 至 少 15min。

注意 ， 如 果 需 要 ， 用 于 RNA 分 离 的 商品 化 试剂 〈 如 TRI 试剂 ) 可 以 替代 这 一 步 。 按 照 产品 说 明 书 直接 从 这 一 步 高 效 分离 RNA。

12000Xg 微量 离心 10min， 如 果 可 能 在 4 离心 。

© 将 上 层 水 相 转移 到 一 个 新 的 微量 离心 管 中 ， 小 心 避 兔 取 到 界面 上 的 沉淀 。 加 入 等 体 积 的 异 两 醇 到 水 相 以 沉淀 RNA。 将 样品 在 一 80C 保 存 至 少 1h 或 一 20C 过 夜 。

@ 12000X g 微量 离心 10min， 以 收集 沉淀 的 RNA。 如 果 可 能 在 4 离心 。

注意 ”推荐 用 300 AMIR MBO) 重新 溶解 RNA 团 块 并 且 转 移 到 一 个 1. 7ml 微量 离心 管 中 。 如 前 所 述 ， 加 入 300pl 异 丙 醇 后 ， 离 心 收集 沉淀 。

@ 用 70% 乙 醇 〈 用 DEPC 处 理 过 的 水 稀释 95%% 的 乙醇 ) 洗涤 沉淀 2 一 3 次 ， 然 后 在 空 气 中 短暂 了 晾 干 。 如 果 需 要 ， 最 后 一 次 用 95%% 的 乙醇 洗涤 将 会 加 速 晾 二 过程。 不 管 在 哪 种 情 况 下 ， 都 不 要 让 RNA 完全 干燥 。 将 RNA 沉淀 溶解 在 250 ~ 500u1 10mmol/L Tris (pH 7.2), Immol/L EDTA, 0.1% SDS 溶液 中 。

@ 取 2yl 用 来 计数 检测 RNA 探 针 的 放射 活性 。 当 用 5X107 个 细胞 起 始 时 ， 总 的 预期 活性 大 约 是 1X107cpm。

+ 221 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

® 按 前 述 方法 或 其 他 方法 (deBustros #, 1986; Celano 等 ，1989a)， 用 标记 好 的 _RNA 588 DNA 序列 进行 杂交 。

17.5 实验 方案 : CREEP fo KH tH RE

核 逃 逸 实验 的 原理 是 在 分 离 的 细胞 核 中 将 标记 摊 和 人 到 新 生 的 转录 物 中 。 脉 冲 标 记 方 法 则 明显 不 同 ， 它 是 用 (CH) - 尿 喀 啶 脉冲 标记 细胞 5min (Nevins 和 Darnell, 1978). PERE 够 高 的 转录 效率 ， 以 获得 有 意义 的 标记 挫 人 。 这 显然 不 适用 于 单 拷贝 基因 或 其 他 以 相对 较 低 的 转录 效率 进行 转录 的 基因 。 已 经 可 以 用 核酸 酶 保护 法 和 细胞 核 RNA 的 脉冲 标记 联 用 的 方 法 来 部 分 克服 上 述 问题 以 及 其 他 在 制备 可 产生 有 意义 标记 摊 入 的 细胞 核 时 存在 的 内 在 困难 (Greene 和 Pearson，1994) 。

这 项 技术 涉及 脉冲 标记 培养 的 细胞 10min， 接 着 分 离 RNA， 用 冷 的 〈 即 没有 标记 的 ) 基因 特异 性 序列 在 溶液 中 杂交 ， 最 后 用 S1 RRB. Axe. eA cDNA 探 针 能 产生 比赛 核 苷 酸 探 针 可 信和 度 明 显要 高 的 数据 。 沉 淀 抗 核 酸 酶 降解 的 杂交 物 ， 由 摊 入 的 标 记 推 断 相 对 转录 比率 ， 用 Cerenkov 计数 检测 。 与 大 多 数 转 录 检 测 方法 相 比 ， 本 方案 获得 的 资料 具有 下 述 优点 ， 在 转录 物 标记 过 程 中 维持 了 天 然 细 胞 核 的 构 型 ， 以 及 标记 过 程 中 保持 细 胞 的 构 型 。 标 记过 程 结 束 时 ， 从 细胞 中 分 离 出 可 用 于 杂交 分 析 的 RNA。 简 而 言 之 ， 这 是 一 种 快速 、 高 定量 方法 。 而 且 ， 由 于 不 需要 用 X 射线 胶片 ， 使 用 闪烁 计数 的 方法 ， 克 服 了 放 射 自 显影 的 内 在 缺陷 〈 长 曝光 时 间 ， 胶 片 的 非 线性 )。 因 此 ， 这 种 方法 能 够 检测 转录 活性 的 微妙 变化 ， 这 些微 妙 变化 可 能 在 更 传统 的 核 逃 逸 实验 中 是 检测 不 到 的 。

用 直接 加 入 生长 介质 组 织 培养 管 的 方法 ， 加 入 25xCiyml[L3H]- 尿 喀 啶 《〈 比 活性 27.1Ci/mmol), ， 标 记 生 长 在 组 织 培养 液 中 的 细胞 。

注意 包括 所 有 对 照 ， 需 要 107 个 细胞 的 RNA (ERO).

当心 ”在 标记 阶段 结束 时 ， 一 定 要 根据 部 门 的 指导 ， 安 全 地 处 理 放射 性 组 织 培养 基 和 RNA 分 离 副 产 物 。

@ 收集 细胞 ， 用 冰冷 的 PBS 洗涤 细胞 沉淀 物 。 所 有 的 后 续 离 心 都 在 4C 进 行 。

@ 在 1.8ml NP-40 裂解 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH7.4; 10mmol/L NaCl; 3mmol/L MgCl; 0.5%NP-40) 中 重 悬 细胞 〈 多 至 107), HEM HSE SK PAY 2. 2ml 微量 离心 管 中 。 冰 上 孵育 3min。

@ 4°C 4000 X g 离心 Smin 收集 细胞 核 。

@) 小 心地 除去 并 弃 掉 上 清 液 。 在 800nl SDS 绥 冲 液 (0.5% SDS; Immol/L CaCl，，; 5mmol/L MgClz; 20mmol/L HEPES, pH7. 5) 中 重 悬 细胞 核 。

© MA 50U AF RNA 酶 的 DNase I , 37°CREF 15min,

© 将 细胞 核 裂 解 物 分 到 2 个 微量 离心 管 中 ， 然后 小 心地 用 等 体积 的 酚 : 氯仿 : 异 戊 醇 (25 : 24: 1) 提取 各 管 。

离心 分 离 各 相 。 小 心地 将 上 层 水 相 转 移 到 新 离心 管 中 。

田 加 入 0.1 体 积 的 3molL 乙酸 钠 (pH5.2) 和 2.5 体积 的 95% 乙 醇 沉 淀 RNA, — 20°C 保存 几 小 时 至 过 夜 。

OD 小 心地 用 70%% 乙 醇 〈 用 无 菌 水 稀释 95% 乙 醇 ) 洗涤 样品 一 次 ， 如 果 需 要 ， 再 离心 二 次 。 短 时 间 风 干 样品 ， 但 不 使 其 完全 干燥 。

- 222.

第 17 章 核 RNA 分 析

@@ 在 125nl Sl 杂交 缓冲 液 (40% HB FH BH; 40mmol/L PIPES，PpH6. 4; 400mmol/L NaCl; lmmol/L EDTA, pH8.0) 中 重 悬 RNA 沉淀 物 。 重 复 吹 吸 以 确保 RNA 重新 溶解 。 这 是 一 个 很 重要 的 步 又。 不 要 剧烈 振荡 。

注意 1 将 RNA 沉 淀 物 溶解 在 足够 的 杂交 缓冲 液 中 ， 使 各 杂交 反应 达到 20nl。

注意 2 各 样品 均 为 一 式 两 份 ， 不 要 忘记 对 照 反应 。 合 适 的 对 照 包 括 : 四 没有 探 针 和 没有 Sl KRM 的 管 ，@ 没 有 探 针 ， 有 250U SI 核酸 酶 的 管 ， @ 有 探 针 但 没有 Sl 核酸 酶 的 管 。

® 加 热 各 重 悬 的 RNA 样品 至 50C 2min,

® 向 样品 中 加 入 冷 的 变性 探 针 〈 未 标记 ) 至 终 浓 度 为 25ng/pl 或 0. Sug 探 针 /20pl 杂交 反应 液 。

注意 ”一定 要 用 线性 化 的 变性 的 DNA。 可 将 双 链 探 针 煮沸 10min 使 其 变性 ， 然 后 置 于 冰 中 ， 直 到 使 用 。 或 者 可 将 RNA- 探 针 混 合 物 加 热 到 65 ，10min， 以 保证 在 杂交 起 始 时 所 有 的 反应 物 都 是 变性 的 。

@ 在 实验 确定 好 的 温度 下 杂交 过 夜 。 参 见 第 14 章 中 关于 优化 的 建议 。 如 果 不 确 定 起 始 温度 ， 就 在 37C 杂 交 。

© 在 杂交 阶段 结束 时 ， 向 各 样品 中 加 入 :

160w1 2 Sl 核酸 酶 缓冲 液 (0.5mol/L NaCl; 0. 1mol/L 乙酸 钠 ，pH5. 5; 9mmol/L ZnSO, )

142p1 7k

6ul Awe Ay HER DNA (10mg/ml; [最 终 ]js*0. 02ng/ml)

12yl S1 核酸 酶 (25U/pl; [HRRIL1U/pd

32°C HR F 1h.

注意 “一定 要 准备 一 个 未 加 入 任何 S1 核酸 酶 的 对 照 。 这 将 提供 该 系统 的 总 计数 。

© 向 各 样品 中 加 入 80pl 终止 缓冲 液 (3mol/L GMA, pHs. 2; 20mmol/L. EDTA, pH8.0; 40ug/ml 载体 RNA)。

OQ 各 管 中 加 入 1. 0ml 冰冷 的 95%% 乙 醇 。 上 下 颠倒 以 彻底 混合 ， 然 后 冰 上 孵育 20min.

(8 用 Millipore Sampling Manifold (4 Wf th #* A HB 2 wt we; Millipore, Billerica, MA) #4 GF/F 玻璃 纤维 滤 膜 上 收集 沉淀 物 。

四 用 500pl 冷 的 70%% 乙 醇 洗 涤 各 滤纸 两 次 。

@ 将 滤 膜 转移 到 闪烁 管 中 ， 加 入 合适 体积 的 闪烁 液 。 对 样品 进行 液 闪 计数 ， 计 数 5min， 重 复 3 次 。 各 滤 膜 上 保留 的 活性 直接 与 探 针 和 靶 RNA 的 杂交 程度 成 比例 ， 因 此 与 相 对 合成 速率 成 比例 。

17.6 RNA ¥ 2], RNA ¥ Sl fe RNA ¥ SB i242HED

可 用 核 逃 逸 实验 同时 评价 几 个 基因 组 序列 的 相对 转录 活性 。 在 真 核 细胞 中 ， 转 录 产 物 是 三 种 RNA 聚合 酶 共同 作用 的 结果 。 用 来 自 一 种 毒性 很 强 的 蘑菇 (Amanita phalloides) 的 真菌 环 化 八 肽 〈c- 悉 膏 草 碱 ) 可 区 分 这 些 酶 的 活性 。 这 种 毒素 结合 于 RNA RAM. FHA 三 种 真 核 RNA 聚合 酶 对 该 毒素 的 敏感 性 不 同 (Roeder, 1976). Wye BEA 0. Olug/ml 时 ， RNA 聚合 酶 开 的 活性 降低 50% (Roeder, 1976), RNA AAS MM tL Xt oH A Be BRAY HD HIE

HE ABER, {EL BES Bi) Fe] E50 % AA i TR VE i BE 25pg/ml 的 浓度 。 相 反 ，RNA 聚合 酶 Xt a HB « 223 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

膏 曹 碱 不 敏感 。 虽 然 - 牲 膏 草 碱 毒性 极 强 ， 操 作 时 必须 十 分 小 心 ， 但 它 是 测定 各 种 聚合 酶 的 RNA 合成 量 的 一 种 很 有 用 的 工具 。 在 一 种 或 多 种 标记 反应 中 加 入 w- 鳌 襄 草 碱 是 一 个 重要 并 且 非 常 好 的 阴性 对 照 ， 它 证 明 印迹 杂交 是 可 信 的 而 不 是 人 为 的 假象 。 在 用 斑点 印迹 进行 定量 杂交 时 ， 这 种 阴性 对 照 尤 其 有 用 。

从 培养 细胞 中 分 离 出 的 细胞 核 中 ，RNA 聚合 酶 I 、RNA RAMI. RNA RQ Ae MM At 观察 到 的 总 RNA Saw aA. HAW 50%~70%, 20%~40%MA 10%. WHERE ASHRAM a. CEMA MRA, co BAR RU RMR RAMA, 37 样 就 可 对 三 种 RNA 聚合 酶 的 贡献 进行 更 清楚 的 测定 。

@ 标记 反应 中 未 加 入 a FS DK

@ 标记 反应 中 加 入 lwg/ml a KH i.

@ 标记 反应 中 加 入 100wg/ml o- KS HK

加 入 细胞 核 后 ， 将 反应 混合 物 在 冰 上 短暂 和 孵育， 然后 转 到 进行 标记 反应 的 温度 。

反应 四 和 四 转录 产物 总 量 的 差 值 代表 RNA 聚合 酶 开 的 活性 。 反 应 @ 和 名 转 录 产 物 总 量 的 差 值 代表 RNA 聚合 酶 焉 的 活性 。 反 应 图 的 活性 是 来 自 RNA 聚合 酶 工 的 活性 。 这 些 直 ao 鹅 膏 草 碱 毒性 引起 的 差异 ， 可 用 斑点 印迹 分 析 〈 第 9 章 )、 在 变性 琼脂 糖 凝 腕 上 分 离 转录 产 物 、 或 用 10% 变 性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ; 通过 使 凝 胶 放 射 自 显影 ， 可 看 到 所 有 转录 产物 的 大 小 分 布 。

此 外 ,， 还 可 用 蔗糖 密度 梯度 离心 来 测定 转录 物 的 大 小 分 布 〈Marzlufft 和 Huang, 1984) 。 这 种 方法 比 简单 的 凝 胶 电 泳 更 费时 间 ， 并 且 需 要 专门 的 设备 。 操 作 如 下 。

OO 将 RNA 样 品 溶解 在 含 Immol/L EDTA, pH7.5 #) 0.1% SDS 洲 液 中 ; 将 0.5ml 此 溶液 加 入 17ml 10% ~40% (100 一 400g/L) FE RRR EE, i RE RE BE EE OO. 1molL NaCl, Immol/L EDTA, 0.1%SDS 和 10mmol/L Tris 配制 ，pH7. 5。 该 梯度 必须 在 适 于 超 离心 的 管 中 制 备 。

@ 在 合适 的 转子 中 以 90000Xg 转速 离心 16h。 用 此 处 限定 的 参数 能 够 检测 出 4S 一 45S 的 所 有 RNA，28S RNA 沉降 在 梯度 的 下 60% Ab.

@ 然后 ， 用 254nm 处 的 紫外 吸收 将 这 些 梯度 分 级 〈 例 如 用 ISCO. UA-6 pg 集 器 ) ， 取 10nl 各 组 分 检测 TCA 可 沉淀 计数 来 测定 各 组 分 中 的 放射 活性 。

17.7 提取 用 于 稳 太 分 析 的 核 RNA

核 逃 逸 实验 是 在 标记 的 NTP 前 体 存在 下 ， 测 定 新 延伸 合成 出 的 多 聚 核糖 核 苷 酸 ， 因 和 而 可 用 于 测定 各 基因 的 转录 速率 。 此 外 ， 用 Northern 分 析 研 究 核 RNA 对 于 理解 初级 转录 物 的 加 工 是 非常 重要 的 。 在 这 两 种 类 型 的 试验 中 ， 从 杂交 信和 号 强度 可 得 出 定量 数据 。 很 多 方法 可 用 来 检测 杂交 信号 。 为 了 评价 标记 核 转录 物 的 总 体 大 小 分 布 ， 可 取 一 份 反应 混合 物 通过 伴 有 凝 胶 内 放射 自 显影 的 小 凝 胶 电泳 来 研究 。

或 者 可 将 靶 DNA 消化 、 电 泳 、 在 滤 膜 上 Southern 印迹 ， 然 后 与 异 源 的 标记 核 RNA 群体 杂交 。 然 而 该 技术 的 一 个 重要 缺陷 是 缺少 核 RNA 分 子 自身 的 信息 ， 因 为 电泳 的 是 DNA 片段 而 非 RNA 片段 。 在 极端 的 情况 下 ， 全 长 hnRNA 分 子 的 大 量 降解 可 导致 产生 的 寡 核 糖 核 昔 酸 与 靶 DNA 分 子 非特 异性 杂交 ， 而 全 长 的 未 降解 的 hnRNA 不 能 与 和 靶 DNA 分 子 正常 杂交 。 高 严 灌 度 的 洗涤 ， 并 结合 RNase 消化 非特 异性 RNA 分 子 ， 可 降低 由 上 述 现象 导致 的 背景 ，

* 224 -

第 17 章 核 RNA 分 析

基因 表达 研究 中 ，RNA 的 代谢 周转 是 个 重要 的 指标 ， 特 别 是 试图 在 转录 后 水 平 阐明 基 因 表 达 调 控 时 ， 核 RNA 的 Northern 分 析 是 该 研究 中 必需 的 部 分 。 成 功 的 核 RNA Northern 分 析 基 于 分 离 条 带 的 信号 强度 ， 可 获得 定量 数据 ， 并 且 还 能 提供 单独 用 斑点 印迹 不 能 得 到 的 定性 分 析 结 果 。 出 现 可 重 现 的 条 带 模式 ， 则 强烈 证 实 初 级 RNA 转录 物 的 存在 ， 这 样 做 证 明 了 核 逃 逸 实验 的 可 靠 性 。 放 射 自 显影 图 上 的 一 系列 条 带 是 与 编码 〈 与 外 显 子 相关 ) 序列 的 剪 接 和 伴随 的 非 编码 〈 与 内 含 子 相 关 ) 序列 的 去 除 相 关 的 。

Northern 杂交 分 析 中 核 RNA 的 分 离 ， 开 始 于 如 前 所 述 从 全 细胞 或 组 织 样品 中 制备 细胞 核 。 质 量 最 高 的 RNA 总 是 来 自 最 有 利 的 提取 方法 ， 即 缩短 从 细胞 破碎 到 RNA 在 滤 膜 上 固 定 的 时 间 间 隔 。 可 使 用 基于 股 盐 的 技术 抑制 细胞 中 RNase YR HE (Chirgwin 等 ，1979; Chomczynski 和 Sacchi，1987) 。 一 且 将 细胞 核 从 细胞 质 中 分 离 出 来 ， 就 可 选用 从 完整 细胞 中 分 离 RNA 的 方法 ， 从 细胞 核 中 纯化 RNA。 在 核 RNA 分 离 过程 中 也 必须 控制 核酸 酶 ， 用 有 机 溶剂 抽 提 可 得 到 令 人 满意 的 结果 。 很 多 分 离 核 RNA 的 实验 方案 都 推荐 在 酚 存 在 的 情况 下 加 热 样品 ， 同 时 剧烈 振荡 以 前 切 基因 组 物质 。

17.8 $3844: 直接 分 高 核 RNA

下 述 方法 是 改进 了 的 Soeiro 和 Darnell (1969) 法 ， 其 中 ， 用 热 酚 提取 RNA 保持 不 变 。

@ 冰 上 融 解 冰冻 的 细胞 核 ，4C、750Xg 离心 3min。 如 果 以 新 鲜 制 备 的 细胞 核 为 起 始 AB, MET FRO.

@ 用 1lml 冰冷 的 改进 的 RSB/K 缓冲 液 (10mmolL Tris, pH7.9; 10mmol/L NaCl; 10mmol/L MgClz; 100mmol/L KCl) 洗涤 细胞 核 沉 演 。 转 移 细 胞 核 到 不 含 RNase 的 聚 乙烯 管 中 。

注意 如果 按 比例 缩小 提取 液 的 体积 ， 可 在 2. 2ml 的 微量 离心 管 中 分 离 RNA。 一 般 最 好 使 核酸 保持 在 浓缩 状态 ， 在 尽 可 能 小 的 体积 下 进行 操作 。

@ AMAR (HSB) (10mmol/L Tris, pH 7.4; 500mmol/L NaCl; 50mmol/L MgClz; 2mmol/L CaCl.) 重 悬 细胞 核 沉 演 物 ， 浓 度 为 1~5) x10" 个 细胞 核 /ml， 高 盐 组 冲 液 中 加 入 了 不 含 RNase 的 DNase 工 至 终 浓度 为 50 U/ml,

EH HSB 可 提前 配制 ， 但 是 无 RNase 的 DNase | HATE ARIA MA.

® 室温 ， 上 下 吹 吸 该 混合 物 30s。 这 对 于 裂解 液 的 均一 性 是 必需 的 。

注意 ”用 DNase 工 短暂 处 理 的 目的 是 部 分 断裂 而 不 是 完全 降解 基因 组 DNA。 黏 性 的 降低 使 得 操作 更 容易 。 该 方法 的 后 续 步 骤 中 将 选择 性 去 除 DNA,

© 加 入 等 体积 的 SDS 提取 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH7.4; 20mmol/L EDTA; 1% SDS).

© 加 入 等 体积 的 NETS 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH7.4; 100mmol/L NaCl; 10mmol/L EDTA; 0.2% SDS) 饱和 的 酚 。

注意 酚 饱 和 的 注意 事项 参见 附录 3。

@ 加 入 等 体积 的 氯仿 或 氯仿 : SE 〈49 : 1) 的 混合 物 。 小 心地 彻底 混合 。

INFAZ 55°C, 10min, fA KE.

@ vk ER UK AKA H Smin, 2500Xg 离心 3min 以 分 离 各 相 。

« 225 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

GD 小 心地 沿 管 侧 滑动 硅烷 化 的 无 菌 巴 斯 德 移 液 管 或 微量 离心 机 〈 微 量 移 液 器 ) 的 枪 头 ， 通过 液 相 和 中 间 层 ， 从 管 的 底层 将 有 机 相 吸 上 来 并 弃 去 。 使 液 相 和 中 间 相 保留 在 管 中 ， 重 复 步骤 @ 和 步骤 。

注意 工 当 制 备 少 量 的 核 RNA 时 ， 有 可 能 因 染 色 质 吸附 而 损失 RNA， 此 时 该 方法 尤其 重要 。

注意 2 ”关于 玻璃 器 严 硅 烷 化 的 说 明 参 见 附录 8。

@ 2500X g 离心 3min 分 离 各 相 。

四 小 心地 回收 水 相 ， 注 意 不 要 干扰 下 层 有 机 相 以 及 中 间 层 〈 如 果 存 在 的 话 )。 在 水 相 中 加 入 等 体积 的 氯仿 ， 小 心地 彻底 混合 。 短 暂 离心 分 离 各 相 。

® 将 水 相 转移 到 新 管 。 加 入 2. 5 ARRAN 95% CBB FT — 20°C HR RNA.

四 4C 离 心 收集 沉淀 物 。 用 70%% 乙 醇 〈 用 无 菌 水 稀释 INCE) 至 少 洗涤 一 次 以 除 去 过 量 的 盐 。 如 第 8 章 所 述 测定 产 量 并 进行 质量 控制 检测 。

17.9 GRAF: 从 富 售 核糖 核酸 酶 的 细胞 中 制备 核 耻 NA

下 述 方法 是 改进 了 的 Chomczynski 和 Sacchi (1987) 法 。 这 是 基于 RNA 分 离 产 品 TRI 试剂 和 TRIzol 的 方法 。 不 想 自己 制备 试剂 的 ， 可 放心 地 用 下 述 实验 方案 取代 上 述 两 种 产品 。

D 如 前 所 述 制 备 细胞 核 ， 可 提前 制备 细胞 核 并 冷冻 储存 。 冷 冻 的 细胞 核 需 在 冰 上 解冻 3~5min,

@ MA GTC 溶液 D (mol/L HAMM; 25mmol/L 柠檬 酸 钠 ，pH7.0; 0.5% N-+— Ge Fe VLA RA; 100mmol/L 2-H EZ BE) 裂解 完整 的 细胞 核 。 每 2X106 个 细胞 核 使 用 100pl 溶液 。

注意 该 方法 以 下 步骤 中 所 示 的 体积 是 假设 溶液 D 的 起 始 体积 为 Iml。 对 于 按 比例 放大 的 提取 液体 积 ， 需 要 适当 增加 所 有 其 他 溶剂 的 体积 。 如 果 所 用 溶液 D 少 于 800wl， 所 有 的 提取 均 可 在 2. 2ml 的 离心 管 中 进行 。

G@) 将 组 织 匀 浆 ， 转 移 到 一 次 性 聚 乙烯 管 中 〈15ml 管 效果 最 好 ) ， 按 顺序 加 入

0. lml 2mol/L 乙酸 钠 ，pPH5. 2

1. Oml 水 饱和 酚 〈 分 子 生 物 学 级 别 )

0. 2ml 氯仿 + FRR 〈49 : 1)

加 入 试剂 后 ， 盖 上 管 盖 ， 小 心地 颠倒 ， 彻 底 混合 。 所 有 试剂 都 加 入 后 ， 剧 烈 振 葛 管

F 10s.

® 冰 上 使 样品 至 少 冷却 15min， 然 后 4 人 离心 分 离 各 相 。

TERR Corning 聚 乙烯 管 可 承受 的 最 大 重力 加 速度 是 6000Xg。 使 用 前 一 定 要 检查 制造 商 的 离心 力 速 率 说 明 。

@ RAK COA RNA) 转移 到 新 管 中 ， 与 0. 75 体积 〈 约 lml) SARIS. —20°H# 存 至 少 1h 以 沉淀 RNA,

注意 沉淀 RNA 的 管子 应 该 可 承受 下 一 步 所 需 的 10000Xg 离心 。 如 果 体 积 太 大 不 能 装 到 工 个 或 几 个 微量 离心 管 中 ， 则 改 用 用 酸 洗涤 过 的 Corex 玻璃 管 和 合适 的 橡皮 热 ，

© 4C、10000Xg 离心 20min 收集 沉淀 。 小 心地 倒 出 并 弃 掉 上 清 液 。

注意 关于 该 步骤 中 离心 管 的 选择 参见 步骤 器 。226 -

第 17 章 核 RNA 分析

@ ¥ RNA 沉淀 物 完 全 溶解 在 200n1 溶液 D〈 见 步骤 @) 中 ， 然 后 转移 到 不 含 RNA fH 的 1. 5ml 微量 离心 管 中 。

加 入 0.75 体积 的 冰冷 的 异 丙 醇 ， 一 20C 下 放置 1h 以 重新 沉淀 RNA.

© 在 微量 离心 管 中 于 4C 以 最 高 速 离心 10min 收集 沉淀 。 小 心地 倒 出 并 弃 掉 上 清 液 。

@ 用 70%% 乙 醇 洗 涤 沉 淀 ， 再 次 离心 。 可 再 用 95 儿 乙醇 洗涤 沉淀 一 次 以 加 速 其 在 空气 中 的 干燥 。 不 要 使 样品 完全 干燥 。

加 将 潮湿 的 RNA 沉淀 重新 溶 于 50pl TE 缓冲 液 (pH7.5) 或 50pl 无 菌 水 中 。65'C MF 育 10min 有 助 于 溶解 。 测 定 样 品 浓度 〈 第 8 章 ); RNA 分 装 并 存储 于 一 80C， 避 免 反 复

17.10 &2 #4 & #&

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(FFE; RRR)

+ 228 -

=188 cDNA sft

18.1 基本 原理

RNA 是 细胞 中 易于 得 到 的 一 类 分 子 。 前 几 章 里 已 经 前 述 了 很 多 裂解 各 种 来 源 生物 体 的 组 织 及 细胞 的 有 效 方法 。 这 些 是 提纯 RNA 首要 的 并 且 必 要 的 步 又。 如果 对 后 面 的 操作 给 以 足够 的 小 心 ， 所 提取 的 RNA 应 该 能 满足 一 般 用 于 研究 基因 在 转录 水 平 上 的 实验 。 也 因此 ， 基因 表达 的 研究 需要 RNA 水 平 上 的 分 析 数 据 。

经 典 的 Northern 杂交 、 核 酸 酶 保护 实验 、 新 生 mRNA 分 析 技 术 〈 核 逃逸 实验 ) 都 是 用 互补 的 RNA 或 DNA 探 针 来 分 析 目 的 RNA 的 丰 度 。 然 而 必须 强调 的 是 ， 这 些 检测 方法 都 存在 一 个 灵敏 度 问 题 ， 这 一 问题 主要 是 RNA 自身 的 两 个 特性 导致 的 : 中 不 稳定 性 ; 四 单个 RNA 分 子 不 能 被 直接 扩 增 来 增强 信号 。 因 此 ， 为 方便 分 析 ，RNA 通常 先 反 转录 为 互补 DNACcDNA)。 而 扩 增 DNA 的 技术 目前 已 经 很 成 熟 ， 人 们 经 常 以 天 文 倍数 扩 增 基因 组 和 cDNA。 此 外 ， 一 个 主要 的 便利 之 处 在 于 cDNA 比 它 的 模板 RNA 要 稳定 得 多 。 这 样 可 以 运用 一 系列 技术 大 规模 地 对 基因 进行 短期 或 长 期 的 分 析 。 因 此 ， 合 成 CDNA 的 最 大 用 处 ， 在 于 它 能 够 对 细胞 内 基因 转录 活跃 位 点 的 产物 CAI RNA 分 子 ) 作 永 久 性 的 保存 。

18.2 cDNA Sree

cDNA 合成 是 分 子 生 物 学 最 基本 、 最 核心 、 同 时 也 是 具有 挑战 性 的 化 学 合成 技术 。 这 类 合成 并 非 是 结构 性 的 ， 因 为 从 序列 组 成 上 来 说 ，cDNA 和 基因 组 是 一 样 的 ， 有 可 用 的 单 链 和 双 链 两 种 形式 。 尽 管 经 典 的 cDNA 扩 增 方法 已 经 让 位 于 PCR RA ABER). (ARE BE 的 EDNA 合成 机 理 对 于 正确 理解 生物 学 技术 以 及 分 析 实 验 数 据 都 是 很 有 帮助 的 。 下 面 就 对 葛 定 了 当代 生物 学 基础 的 CDNA 合成 技术 作 一 个 总 结 性 的 回顾 。

cDNA 是 以 RNA 为 模板 ， 在 酶 催化 作用 下 体外 合成 的 产物 。 在 开始 的 一 段 时 间 内 它 是 条 单 链 。 高 质量 的 RNA 是 合成 EDNA 的 必要 条 件 。 一 般 来 说 ， 一 些 常规 的 RNA 分 析 只 需 要 几 微 克 量 的 RNA， 一 些 新 的 技术 所 需要 的 RNA 起 始 量 甚 至 可 以 更 少 。 最 初 ， 人 们 总 是 选择 含有 poly(A) ”的 RNA 作为 合成 cDNA 的 模板 ; 现在 实验 室 比较 常见 的 是 直接 抽 提 总 RNA 或 细胞 质 RNA 作为 模板 ， 而 不 再 纯化 含有 poly(CA) AY RNA. Ha PCR 技术 的 成 熟 运用 ， 以 poly(A) “RNA 作为 模板 合成 CDNA 是 没有 必要 且 不 值得 推荐 的 了 ， 因 为 这 种 方 法 在 操作 过 程 中 会 损失 低 丰 度 的 转录 本 ， 达 不 到 分 析 的 要 求 。 不 过 ， 在 某 些 特殊 的 实验 中 ，

。 229 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

以 poly(A)+ RNA 作为 模板 合成 EDNA 也 是 可 以 的 。

对 于 研究 者 来 说 ， 合 成 cDNA 在 研究 基因 表达 和 结构 、 开 发 核酸 探 针 以 及 表达 体内 难 以 纯化 的 蛋白 质 等 方面 存在 很 多 的 优势 。 第 一 ，RNA 是 单 链 ， 并 且 自 然 状 态 下 是 很 不 稳定 的 分 子 。 而 转化 为 稳定 的 双 链 cDNA 后 ， 序 列 信息 就 可 以 长 期 保存 。 第 二 ， 现 代 分 于 生 物 学 已 开发 出 大 量 可 供 选 择 的 载体 和 对 应 的 条 主 。 今 成 并 克隆 目的 cDNA 使 得 进 一 一 步 亚 克隆 等 操作 变 得 得 心 应 手 。 简 单 地 说 ， 若 在 某 一 样品 中 回收 扩 增 的 大 量 cDNA, 并 使 之 连接 进入 合适 的 载体 ， 然 后 转化 到 对 应 的 细菌 或 连接 到 病毒 载体 序列 ， 便 构 建 了 cDNA 文库 。cDNA 文库 就 是 对 某 一 细胞 样品 在 某 个 时 刻 基因 表达 情况 的 记录 档案 。 第 三 ， 长 短 不 一 的 cDNA 分 子 可 以 通过 杂交 方法 来 筛选 比较 复杂 的 基因 组 DNA 库 ， 如 确定 外 显 子 、 内 含 子 、 编 码 基 加 以 及 5" 非 编 码 区 域 和 3' 非 编码 区 域 。 第 四 ， 如 上 所 述 ，cDNA 文库 可 以 长 期 保存 某 一 时 刻 细 胞 内 基因 的 表达 情况 ， 只 有 那些 在 这 一 时 刻 存在 转录 活性 并 产生 mRNA 转录 本 的 基因 位 点 AA cDNA 合成 。 相 比 cDNA 文库 而 言 ， 从 基因 组 中 克隆 出 的 DNA 序列 则 无 任何 关于 基因 表达 转录 状态 的 信息 。

cDNA 直接 由 RNA 作为 模板 经 过 反 转 录 而 来 。 因 此 ， 合 成 后 的 DNA 就 直接 反映 了 合 成 前 细胞 内 的 RNA 状况 。 特 定 生物 体内 所 有 有 核 细 胞 都 有 相同 的 遗传 物质 。 比 如 说 ， 若 对 同一 动物 肝 组 织 和 脾 组 织 的 基因 组 DNA 进行 分 析 ， 会 得 到 几乎 相同 的 数据 结果 。 而 由 于 各 种 基因 表达 水 平 以 及 相互 作用 的 差异 性 ， 这 两 种 细胞 在 表 型 和 生理 特性 上 才 呈 现 出 明显 的 不 同 。 尽 管 由 于 一 些 用 于 维持 自身 生存 基因 的 表达 ， 不 同类 型 的 组 织 或 两 个 细胞 之 间 的 cDNA 文库 有 相同 的 部 分 ， 但 就 某 一 生物 体 来 说 ， 它 的 某 个 时 期 特定 样品 中 cDNA 文库 的 组 成 是 独一无二 的 。 而 且 ， 必 须 意 识 到 ， 一 个 细胞 的 RNA 组 成 会 随 着 实验 环境 的 变化 ， 甚 至 细胞 周期 的 变化 而 发 生变 化 。 这 样 特定 的 样品 不 同时 间 所 构建 的 cDNA RAAT AH. 上 所 述 ， 从 特定 生物 体 不 同 组 织 来 源 的 细胞 构建 的 CDNA 文库 之 间 有 很 大 的 不 同 。 而 基因 组 DNA 基本 上 没有 什么 变化 。

cDNA 的 合成 是 分 步 进行 的 ， 抽 提出 高 质量 的 RNA 是 合成 EDNA 的 前 提 。 表 18.1 & 示 的 是 以 前 合成 EDNA 所 涉及 的 以 及 目前 合成 CDNA 常用 的 酶 。 由 于 cDNA 合成 反应 对 条 件 的 高 敏感 性 ， 建 议 在 第 一 次 做 时 使 用 试剂 盒 。 否 则 的 话 ， 可 能 会 因为 摸索 条 件 而 浪费 大 量 AMAR, BRATS RAR RNR E, SX Be ONS 易于 操作 的 。 从 每 一 个 反应 的 成 本 来 说 ， 用 试剂 盒 cDNA 也 是 最 经 济 有 效 的 。 并 且 这 些 试剂 盒 的 反应 体系 可 以 得 到 大 量 的 cDNA。 sr eke a lie, Pt St he 理 ， 并 为 研究 者 提供 备用 的 实验 方案 。

表 18.1 合成 cDNA 常用 的 酶

cDNA 合成 中 的 作用

5 一 3“ 聚 合 反 转 录 酶 (依赖 于 RNA 的 DNA sabia 将 RNA 转变 成 cDNA 聚合 酶 ) RNase 再 活性 (小 ) 底 物 包括 mRNA, hnRNA, tRNA, rRNA 病毒 RNA 5'->3! 聚 合 酶 活性 第 二 链 cDNA 的 合成 (5 3 核酸 外 切 酶 DNA 聚合 酶 I (Kornberg 酶 ) 5 一 3 核酸 外 切 酶 活性 活性 用 于 去 除 有 缺口 mRNA; Gubler 和 Hoffman,1983) DNA 聚合 酶 [ (Klenow 片段 ) SA 第 二 链 DNA 的 合成 经典 cDNA 合 — win Se aes Ree | 成 法 ) RNase H _ YI) RNA = DNA 杂 合体 中 mRNA 的 | ”切割 活性 为 第 二 链 CDNA 合成 提供 大 量 + 230 -

第 18 章 cDNA 合成

续 表 © oe A cDNA 合成 中 的 作用 Si 核酸 本 单 链 特异 性 核酸 酶 (CDNA 和 RNA) 经 典 合成 法 中 去 除 葵 环 ( 该 酶 特异 针对 单 链 结构 ) T4 DNA 连接 酶 连接 黏 性 未 端 或 平 未 端 mee” GE ee 5'~3' 聚 合 酶 活性 dscDNA 的 平 末端 化 ;其 外 切 酶 活性 是 T4 DNA 聚合 酶 3' 一 5/' 核 酸 外 切 酶 活性 DNA 3% 4 Bi I A 200 ff cDNA 限制 位 点 的 甲 基 化 ;保护 CDNA DNA 甲 基 化 酶 (EcoRI 甲 基 化 酶 ) | REACT TE 不 被 EcoRI 酶 切

依赖 Coz+ 时 ,在 平 末端 上 加 核 苷 酸 ; 依 #i Mn2+ 时 ,在 凸 出 的 3-OH Ein TER 反 转 录 酶 活性 高 温 下 第 一 链 合成 (Mn2+ 依赖 性 ); 第 二 5'~>3' 聚 合 酶 活性 链 合成 与 PCR 扩 增 (Mg2+ 依赖 性 ) gece Se 反 转 录 酶 活性 低 反 转录 酶 活性 (第 一 链 合成 ) ;第 二 链

— 5'>3/ RA MPR HE 合成 与 PCR 扩 增

O 有 些 酶 是 经 典 方法 合成 cDNA 时 所 用 的 酶 ， 有 些 是 用 于 在 一 个 管子 中 完成 RT-PCR 的 反 转 录 酶 ， 有 些 在 第 19 章 讨论 。

末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 5 一 3 聚合 酶 活性

嗜 热 菌 聚合 酶 (Tih polymerase)

18.2.1 ”第 一 链 合成 的 注意 事项

体内 与 体外 合成 核酸 都 有 两 个 必需 的 条 件 。 第 一 ， 需 要 模板 ， 它 根据 Chargaff’s 规则 ( 见 第 1 章 ) 指导 互补 链 的 从 头 合成 。 对 于 cDNA 来 说 ， 模 板 是 mRNA。 第 二 ， 有 提供 3!- OH 的 引物 。3 -OH 基 团 对 于 所 有 使 单个 核 昔 酸 连接 在 一 起 及 支持 链 延 伸 的 DNA 聚合 酶 和 RNA 聚合 酶 来 说 ， 是 非常 重要 的 。 记 住 ， 多 核 苷 酸 延伸 的 方向 是 5 -~3'， 并 且 自 始 至 终 是 双 链 形成 。 合 成 的 单 链 必须 以 反 平行 的 方式 与 模板 链 配对 。 因 此 ， 若 要 合成 出 全 长 的 cD- NA， 引 物 必须 要 与 mRNA 的 3 末端 互补 。

cDNA 是 分 步 合成 的 。 每 次 一 条 链 以 总 RNA 或 poly (A)+ RNA 为 模板 〈 见 第 5 一 7 章 ) 。 接 着 高 温 变性 去 除 RNA 的 二 级 结构 ， 小 段 poly(T)9 引物 ， 也 就 是 常 说 的 oligo (dT)， 退 火 后 结合 到 RNA 3 端 poly(A) 尾巴 上 。 因 为 引物 与 RNA 模板 间 的 反 平 行 碱 基 配 对 ， 所 以 引物 可 提供 3 端的 一 OH， 支 持 互补 于 RNA 模板 的 分 子 〈 此 后 称 为 第 一 链 CDNA) 沿 5 一 3 方向 合成 〈 图 18. 1).

54

¥fi TE oligo(dT) 图 18. 1

oligo(dT) 引物 的 5 末端 可 以 附加 一 悬挂 序列 〈 悬 挂 序列 内 含有 一 些 限 制 性 内 切 酶 的 酶 切 位 点 ) 或 用 于 定向 克隆 @ 的 有 用 序列 。 这 些 附 加 的 序列 称 为 接头 〈 图 18. 2) 。

@ FRA TR. @ 定向 克隆 是 指 将 外 源 DNA 方向 性 地 插 人 到 载体 中 克隆 扩 增 。 尽 管 可 以 灵活 使 用 ， 但 研究 者 若 想 要 将 DNA 表达 成 蛋白 质 (CDNA-~RNA~~ 蛋 白质 ) ， 一 般 都 应 该 定向 克隆 。 <

。 23 和。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

' 5! _—— as

O 带 有 接头 的 锚 定 oligo(dT) 18. 2

任何 引物 起 始 合成 的 方法 都 需要 模板 与 引物 支持 第 一 链 cDNA MAK. ££ oligo(dT) 方面 的 主要 改进 ， 就 是 创新 性 地 使 用 等 摩尔 混合 的 锚 定 oligo(dT) 51%, Hitisty T,.V, HP V= A, C, G. Au. $3] wD EB 5! TTTTTTTTITITA, 5’ TTTTTTITITTIC A S'TTTTTTTTTTTIG. 319 〈V)3/ 示 端的 锚 定 核 苷 酸 迫 使 引物 与 poly(A) 尾 5 最 末端 碱 基 配 对 。 引 物 以 这 种 方式 启动 的 结果 ， 是 使 更 有 代表 性 的 cDNA 被 合成 ， 这 些 cDNA 包含 每 种 模板 mRNA 分 子 的 大 量 编码 部 分 。 这 些 引 物 的 工作 是 非常 惊人 的 。

认识 这 一 点 极其 重要 ， 按 照 上 面 的 引物 设计 ， 产 生 的 cDNA 2X poly(A)? BY cD- NA， 而 不 是 总 cDNA。 因 为 并 不 是 所 有 的 mRNA 都 被 腺 苷 酸化 8。 为 解决 这 个 问题 ， 随 机 六 核 苷 酸 或 其 他 寡 聚 物 可 以 用 来 引发 第 一 链 cDNA 的 合成 。 这 些 朝 聚 物 从 模板 的 内 部 而 不 是 从 模板 的 3 末端 引发 反 转 录 (图 18. 3) 。

TREETTTTTTRREE 3" HO HO HO 各 种 随机 引物 图 18. 3

有 的 poly(A) 尾 可 长 至 200~250 核 苷 酸 ， 随 机 引物 排除 了 cDNA ARM poly(A) 尾 3 最 远 端 区 起 始 的 可 能 性 。 这 种 情况 下 ，cDNA 第 一 链 5' 未 端 相当 明显 的 二 部 分 可 能 由 和 哉 多 工 组 成 。 同 时 对 于 5 端 二 级 结构 明显 的 mRNA， 随 机 引物 也 能 非常 好 地 工作 。， 总 之， 与 {MH oligo(dT) 引物 合成 的 cDNA 相 比 ， 利 用 随机 引物 合成 的 cDNA， 通 常 更 长 并 更 具有 代 表 性 。

在 笔者 的 实验 室 ， 通 常 将 锚 定 oligo(dT) 引物 和 随机 引物 混合 用 于 同一 反应 管 ， 可 发 生 更 有 效 的 CDNA 合成 。 这 样 既 能 消除 poly(A)~ 转录 物 被 排除 在 外 的 担心 ， 又 能 扩 增 出 更 长 的 片段 ， 其 中 很 多 是 接近 全 长 的 cDNA。 合成 第 一 链 的 条 件 参数 一 般 不 需要 改变 ， 唯 二 的 差异 是 同时 使 用 推荐 量 一 半 的 每 种 引物 。 现 在 这 是 研究 者 的 标准 操作 程序 ， 在 分 析 低 丰 度 基

@ 采用 这 种 方法 合成 EDNA， 引 物 与 mRNA 3' 末 端 配对 。 因 此 以 这 种 方式 构建 的 CDNA 库 不 包含 对 应 的 poly CA) ~ mRNA。 科 学 家 必须 意识 到 ， 这 些 库 是 处 于 循环 中 。 虽 然 不 经 常 ， 但 这 些 库 会 周期 地 面 对 如 一 80C 冰 箱 清理 和 重新 整 亚 这 样 的 情况 。 当 第 选 可 能 是 几 年 前 合成 的 库 时 ， 引 发 CDNA 合成 的 方法 的 知识 可 以 影响 实验 结果 的 解释 .考虑 到 oligo CdT) 引物 构建 的 EDNA 库 的 缺点 ， 很 多 更 新 的 库 在 构建 时 使 用 随机 引物 合成 第 一 链 CDNA, 在 笔者 实验 室 合 成 EDNA 时 ， 在 同一 反应 管 中 加 入 随机 引物 和 oligo(dT)

¢ 232 。

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第 18 章 cDNA 合成

因 时 ， 它 特别 有 价值 (Bassett 4, 2000; Bassett 等 ，2004) 。 如 果 使 用 总 RNA， 有 些 研 究 人 员 偏 向 于 只 使 用 oligoCdT)， 阻 止 任何 非 mRNA 反 转 录 成 cDNA。 笔者 的 观点 是 ， 通 党 oligo(dT) 和 随机 引物 一 起 可 以 得 到 非常 满意 的 结果 。 如 果 打 算 用 cDNA 进行 PCR 或 任何 下 游 工 作 ， 只 要 引物 设计 正确 ， 用 总 RNA 和 两 种 引物 是 不 成 问题 的 。

合成 EDNA 第 一 链 所 需 的 酶 命名 为 “依赖 于 RNA 的 DNA 聚合 酶 ”， 通 常 称 为 反 转 录 酶 ， 简 称 “RT”。 过 去 几 年 中 ， 选 择 哪 种 反 转 录 酶 已 成 为 一 件 很 复杂 的 事情 ， 需 要 预先 计 划 。 有 多 种 反 转 录 酶 和 说 明 可 供 使 用 。

AMV, 3€ 8 28 bit ae FH LI Hs 。

MMLV， 来 自 莫 洛 尼 鼠 白血病 病毒 。

改造 的 RNase 百 fi.

rTth, HAMAR! (Mn2+ 依赖 性 ) 。

经 典 的 反 转 录 酶 有 AMV 和 MMLV。 很 多 研究 者 喜欢 用 AMV， 因 为 它 的 反应 性 好 ， 在 50 它 或 更 高 温度 下 有 活性 ， 更 适宜 于 反 转 录 一 些 较 短 的 模板 。 很 不 幸 ， 一 些 AMYV 反 转 录 酶 制剂 有 很 高 的 RNase H 活性 ， 会 降解 反 转 录 前 DNA 引物 与 RNA 模板 退火 形成 的 RNA : DNA 杂 合 体 中 的 RNA A, ARG MRM. HMA DNA 引物 结合 不 稳定 ， 使 cDNA 合成 量 大 大 减少 。 相 反 ， 通 常 MMLYV 反 转 录 酶 的 人 RNase 再 活性 低 得 多 ， 因 此 适宜 于 长 片段 的 扩 增 ， 通 常 在 37 一 40C 间 使 用 。 笔 者 实验 室 常规 使 用 AMV 反 转 录 酶 (Promega and Roche Applied Science varieties) 非常 成 功 。

在 实验 室 ， 如 果 反 转录 仍然 是 个 头痛 的 问题 ， 下 面 六 点 建议 也 许可 以 参考 借鉴 。

@O 必须 检查 RNA 的 完整 性 。 必 须 有 证 据 表 明 ，cDNA 合成 反应 中 使 用 的 RNA 是 完整 的 。 并 不 需要 精心 制作 的 电泳 装置 ， 所 需要 做 的 是 ， 进 行 迷 你 凝 胶 电 泳 ， 随 后 染色 检测 rRNA 的 存在 和 条 带 的 弥散 程度 〈 第 8 章 )。 特 别 是 对 于 以 前 提纯 的 存放 很 久 的 RNA 来 说 ， 这 是 个 简单 有 价值 的 实验 。

@ 正如 很 多 酶 那样 ， 反 转录 酶 的 一 些 制剂 可 能 污染 了 背景 值 的 RNase 百 活性 。 分 子 生 物 学 家 把 它 看 作 污 染 活性 。RNase H 的 作用 是 使 DNA : RNA 双 链 中 的 RNA 链 形成 缺口 。 在 cDNA 合成 反应 过 程 中 ，DNA 引物 与 RNA 模板 退火 形成 的 杂 合 链 就 是 RNase H 攻击 的 目标 。 因 为 引物 不 能 再 与 完整 的 mRNA 结合 ， 其 结果 就 是 引物 不 能 延伸 。 如 果 反 转录 开始 J, RNase HGHEDAPREK cDNA 的 合成 ， 因 为 生长 中 的 杂 合 物 分 子 也 是 可 能 的 底 物 。 因为 全 长 和 总 产 率 可 能 受到 负面 影响 ， 所 以 保证 使 用 RNase 了 -的 反 转 录 酶 是 明智 的 。 研 发 水 平 上 ， 通 过 引入 突变 或 完全 除去 RNase H 活性 对 应 的 催化 结构 域 ， 显 著 抑 制 或 完全 消除 J RNase 互 的 活性 。 这 些 酶 的 例子 有 ，Promega 公司 的 突变 和 缺失 修饰 的 MMLYV 反 转 录 酶 ， 著 名 的 Superscript [| (Invitrogen) 和 BD PowerScript (BD Biosciences) ， 其 他 销售 商 也 有 类 似 的 产品 。

@ 考虑 在 第 一 链 合成 反应 混合 物 中 加 入 明胶 。 明 胶 通 常 是 CDNA 合成 试剂 盒 的 组 成 分 ， 它 的 作用 是 稳定 反 转 录 酶 并 改进 其 反应 效率 。 使 用 明胶 时 ， 最 终 浓 度 为 10kg/ml。

由 增强 型 的 反 转 录 酶 可 以 在 50C 以 上 进行 反 转 录 反 应 。 很 多 非凡 的 酶 ， 现 在 可 以 在 高 温 下 进行 cDNA 人 合成。 高温 不 仅 可 以 提高 cDNA 合成 的 保 真 度 ， 还 可 以 非常 有 效 地 破

@ RF Taq 聚合 酶 也 有 Mn 依赖 性 的 反 转 录 酶 活性 ， 但 相 比 rTth 要 弱 很 多 。 因 此 ，rTth 仍 是 一 个 受 欢迎 的 反 转 。 233 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

坏 RNA 的 二 级 结构 ， 已 经 很 清楚 RNA 二 级 结构 在 缩短 第 一 链 CDNA 产物 长 度 方 面 的 fe FA. © 如 果 cDNA 将 被 用 于 反 转 录 聚 合 酶 链 反应 CRT-PCR, 见 第 19 章 )， 可 以 考虑 很 普 及 的 一 管 、 一 反应 的 缓冲 液 系 统 。 热 稳定 rTth 酶 依赖 于 Mn2+ 的 反 转 录 酶 活性 ， 结 合 创新 的 缓冲 液 系统 ， 使 得 CDNA 合成 以 及 此 后 PCR 扩 增 的 整个 过 程 仅 需要 准备 一 个 反应 管 ， 然 后 封 管 ， 直 到 cDNA Ah, 扩 增 和 进行 分 析 前 都 不 需要 打开 试管 。rT 碎 聚合 酶 的 选择 取决 于 支持 第 一 链 合成 的 引物 类 型 [基因 特异 性 引物 大 大 优 于 oligo(dI) 或 随机 引物 ]】 和 必须 保持 的 序列 保 真 度 〈Mn 元 素 有 副作用 )。 © 反 转 录 酶 和 RNasin (RNase 抑制 剂 ， 在 第 4 章 讨论 过 ) 总 是 保存 在 甘油 储存 缓冲 液 中 ， 一 定 不 能 多 次 冻 融 。 其 他 试剂 在 一 20C 是 长 期 稳定 的 。 对 于 要 做 多 次 cDNA 合成 反应 的 研究 者 来 说 ， 准 备 cDNA 混合 工作 液 非常 有 好 处 。 这 也 相当 于 同时 做 多 个 PCR 时 准备 PCR 工作 混合 液 。 将 PCR 必需 的 所 有 组 分 〈 缺 一 种 ) 混合 成 大 体积 ， SRG FLAY HO, 避免 了 操作 过 程 中 因 微 量 注射 器 导入 的 程序 误差 。 | tt FEAR AEE ee ROR DL, A A EC PRES pH. GPS. OPP). BE wha HEAT RAB RE 10 x SS — ae Be Oh a a SX Fi — ae Be (如 MMLV a AMV) 。 工 作 浓 度 一 般 应 该 被 稀释 成 1X 。 反 应 温度 应 该 视 不 同 的 酶 而 定 。 然后 研究 者 必须 再 加 引物 、RNase 抑制 剂 保 护 反 转录 前 的 RNA; 同时 加 入 等 物质 的 量 浓 度 的 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (以 后 以 dNTP 表示 ) 。 第 一 链 合成 CDNA 反应 时 间 一 般 为 10min 一 1h。 实 际 上 cDNA 第 一 链 合成 所 需 的 组 分 与 后 面 PCR 扩 增 所 需 的 组 分 是 一 . 致 的 。 典型 的 由 AMY 催化 的 cDNA 第 一 链 合成 的 反应 条 件 如 下 : 10mmol/L Tris, pH 8.3; 50mmol/L KCl; 5mmol/L MgClz; lmmolL dNTP; 3. Ong 引物 Loligo(dT) 5 BAPL A 体 的 混合 物 ]，20U RNasin; 20U AMV ie # A; 50~1000ng RNA; 总 体积 为 20pl。 比 较 方 便 的 是 ， 所 需 的 第 一 链 合成 缓冲 液 是 购买 反 转 录 酶 时 附加 的 ， 这 样 就 减少 了 或 者 不 再 需 要 优化 反应 条 件 了 。 下 面 是 如 何 做 CDNA 第 一 链 合成 加 样 的 例子 。 注 意 反 应 分 成 两 步 ， 首 先 使 mRNA 变性 ， 而 不 影响 RNasin 和 反 转 录 酶 的 活性 。 就 如 所 有 RNA 操作 一 样 ， 必 须 整个 过 程 中 都 使 用 无 核酸 酶 技术 。 et fa @ 准备 混合 反应 液 1 。

每 个 反应 的 量 @ 每 个 反应 的 量 @@

水 dNTP( 10mmol/L) Lyl 随机 引物 (2. Ope/pld @ % Sul KARIM 1 加 到 反应 管 中 。

@ til 2n1 RNA® (50~1000ng; 保证 每 个 管内 有 相同 的 量 )。

oligo(dT)1iz~18(1.0pg/ AD) 共计 ul

@ 笔者 实验 室 大 规模 实验 时 ， 制 备 1 一 2ml DNARA LEM 〈 除 反 转 录 酶 和 RNasin 外 )， 储 存 于 二 20C 。 研 究 人 @ 如 果 为 多 个 反应 配置 混合 反应 液 ,注意 每 个 反应 的 体积 乘 以 需要 的 总 反应 数目 加 1 的 计算 值 。 这 是 标准 程序 ,为 了 保证 有 足够 的 混合 反应 液 应 付 微量 注射 器 可 能 发 生 误 差 的 情况 。 同 样 的 程序 也 适用 于 第 二 链 合成 和 PCR 反应 所 用 的 混合 反应 液 ( 第 19 HE). @ 不 要 将 RNA 直接 加 到 混合 反应 液 中 ， 待 混合 反应 液 分 装 好 后 ， 再 将 单个 RNA 样品 加 到 各 管 中 。 + 234 -

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第 18 章 cDNA 合成

® MF 70°C MFA Smin, MK ERA 2min。 这 一 步骤 的 目的 是 RNA 变性 。 @ 准备 混合 反应 液 2。

汪汪 分 每 个 反应 的 量 a 每 个 反应 的 量 水 适量 AMV 反 转 录 酶 (20U/Pl) Lyl 10X 第 一 链 缓冲 液 2pl 共计 10pl

RNasin(20p/pl) Iyl

© 将 10nl 的 混合 反应 液 2 加 到 变性 RNA 的 管 中 。

@ 25C 温 育 5min。

注意 短 时 间 低 温 钱 育 ，@D 有 助 于 引物 与 模板 退火 ; @ 使 反 转 录 酶 在 下 面 的 步骤 中 有 更 好 的 热 稳定 性 ， 而 使 随机 引物 和 /或 oligo(dT) 延伸 反应 更 顺利 。 这 通常 会 得 到 更 长 的 cDNA 产物 。

@ 37 或 42C 温 育 60min， 如 果 用 的 是 热 稳 定 酶 或 是 增强 型 酶 ， 可 以 50C 有 旷 育 50min。

注意 ”很 多 反 转 录 酶 都 可 以 在 高 温 下 合成 EDNA。 很 多 供应 商 处 有 各 种 选择 。

© 样品 在 99C 加 热 5min 灭 活 反 转录 酶 。 不 进行 此 处 理 将 会 对 后 面 的 PCR 操作 有 可 重 复 的 有 害 影 响 。

@ 现在 新 合成 的 第 一 链 cDNA 已 可 用 于 几 种 下 游 的 实验 分 析 。 若 要 了 解 RT-PCR 的 具 体 细 节 ， 读 者 可 以 直接 参考 第 19 章 。 若 为 了 建 库 而 合成 第 二 链 cDNA， 读 者 可 参考 用 户 手 册 ， 下 一 节 提 供 第 二 链 cDNA 合成 的 标准 实验 方案 。

18.2.2 第 二 链 合 成 的 注意 事项

克隆 cDNA 中 的 很 多 进展 都 属于 支持 第 二 链 cDNA 合成 的 各 种 策略 。 有 趣 的 是 ，cDNA 第 一 链 的 合成 原理 与 早期 技术 所 使 用 的 方法 近乎 相同 。 早 期 技术 的 方法 是 ， 在 第 一 链 合成 完 毕 后 ， 碱 水 解 原 始 的 mRNA 模板 ， 利 用 第 一 链 3 末端 暂时 形成 的 发 夹 作为 引物 ， 以 第 一 链 cDNA 作为 模板 ， 支 持 第 二 链 cDNA 的 合成 。 合 成 的 双 链 分 子 由 一 单 链 的 发 夹 连接 。 需 要 S1 核酸 酶 消化 〈 第 16 章 ) 以 去 除 发 夹 ， 使 其 能 进行 随后 的 载体 插入 〈Efstratiadis 等 ， 1976) 。 依 据 今 天 的 标准 ， 这 是 原始 的 方法 。 它 导致 对 应 于 原 mRNA 5 端 序 列 的 丧失 ， 而 且 使 EDNA 暴露 在 S1 核酸 酶 的 降解 活性 之 下 ， 而 Sl 核酸 酶 极 具 攻击 性 ， 常 常 不 可 控制 。

随后 ，Okayama 和 Berg(1982) 发 展 了 一 种 新 的 方法 ， 用 带 oligoCdT) 尾 的 载体 ， 而 不 是 用 oligoCdT)iz~is， 起 始 第 一 链 的 合成 。 产 生 的 RNA : DNA 是 由 连接 接头 〈linker) 连 接 而 环 化 的 分 子 。 该 技术 的 真正 创新 之 处 ， 包 括 使 用 RNase 了 和 DNA 聚合 酶 工 的 混合 物 。 在 第 一 链 cDNA 合成 后 ， 去 除 mRNA 模板 ， 以 支持 第 二 链 cDNA 的 合成 。 在 这 一 途径 中 ， RNase 再 使 RNA 产 生 缺 口 ， 并 利用 DNA 聚合 酶 工 内 在 的 5 一 3 外 切 酶 活性 降解 mRNA。 同时 ，DNA 聚合 酶 (Klenow 片段 ， Kornberg 酶 的 一 个 蛋白 质 水 解 片段 ， 即 DNA pol I) 的 5 >3' 聚合 酶 活性 ， 使 用 被 剪 切 RNA 的 3 -OH 作 引 物 ， 合 成 第 二 链 cDNA。 最 后 ， 因 为 DNA 聚合 酶 不 能 黏合 由 RNase H 产生 的 缺口 ， 因 此 由 T4 DNA 连接 酶 修复 第 二 链 cDNA 骨架 ， 大 大 增加 双 链 核酸 在 后 面 克隆 步骤 中 的 稳定 性 〈 图 18.4)。 这 方面 的 主要 进展 是 Gubler 和 Hoffman(1983) 的 方法 。 该 方法 再 次 使 用 oligo(dT)i is 起 始 第 一 链 CDNA WF 成 ， 接 着 用 Okayama 和 Berg 的 RNase H、DNA 聚合 酶 I 和 DNA 连接 酶 鸡尾酒 合成 第 二 链 cDNA,

Gubler 和 Hoffman 阐述 的 方法 仍 是 cDNA 合成 的 标准 方法 。 因 为 分 子 的 每 个 末端 不 可

“235 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

县 DNA GMB

[ox], oN 1,

图 18.4 sae

避免 地 会 出 现 降 解 ， 因 此 这 一 方法 合成 的 cDNA 相对 于 原 mRNA 模板 偏 短 。 以 这 种 方式 合 成 cDNA 不 能 制备 正确 的 平 未 端 。 因 此 双 链 cDNA 需要 在 T4 DNA 8 en 时 间 温 浴 ， 以 磨 平 末 端 ， 帮 助 它 连接 到 载体 中 去 。

第 一 链 cDNA、 第 二 链 cDNA 合成 完成 后 ， 合 成 分 子 的 未 端 被 修饰 ， 而 产生 类 似 手 适合 克隆 载体 未 端 结构 的 黏 性 末端 ， 这 些 载体 有 质粒 、 黏 粒 、 噬 菌 体 、 噬 菌 粒 等 。 如 果 CDNA 由 含有 稀有 限制 酶 酶 切 位 点 的 接头 引发 合成 ， 然 后 这 些 序列 被 剪 切 以 构建 “ 黏 性 未 端 风 这 将 提高 连接 效率 。 最 近 ， Sa eee ERE TN Ne ple, 2001; Ohara #, 2002; Invitrogen Gateway Technology) 。

如 果 不 用 接头 介 导 的 CDNA 合成 方法 ， See HEAR 《Ge 连接 产生 ， eee ee (图 18.5),

平 未 端 双 链 cDNA

大人 时 性 下 这 图 18.5

ORTEGA Clinker) 和 接头 (adapters) Hh, EA — HA KAKA A H BLE EAE MEME, ate ROR 法 Chomopolymerically tailing) 。 这 种 方法 曾 在 文献 上 报道 过 ， 虽 然 很 少 。 这 种 方法 用 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶 (未 端 转 移 酶 ， 短 片段 ) 加 dGTP， 使 EDNA 双 链 加 尾 。 同 样 用 未 端 脱 氧 核 背 酸 转移 酶 给 载体 加 尾 ， 但 使 用 dCTP。 两 者 退火 互补 ， 形成 互补 的 poly(dC) 和 poly(dG) 片段 ， 然 后 经 DNA 连接 酶 连接 在 - aes

- 236 。

Eee he

第 18 章 cDNA 合成

在 上 面 的 例子 中 ， 新 添加 的 限制 酶 酶 切 位 点 用 相应 的 酶 酶 切 之 后 ， 会 产生 黏 性 末端 9。 若 需 要 定向 克隆 @， 则 可 能 也 需要 如 前 面 所 述 ， 使 用 接头 来 实现 。

需要 在 设计 酶 切 位 点 时 注意 所 含 序列 的 接头 方向 。 实 际 上 ， 一 般 CDNA 合成 和 克隆 系 统 都 为 使 用 者 提供 连接 接头 和 /或 接头 以 方便 连接 选择 的 载体 。 使 用 PCR 时 ， 设 计 的 引物 末 端 必须 与 对 应 的 区 隆 策略 相符 合 。

18.3 核定 cDNA 合成 的 效率

为 定量 检测 反 转 录 的 效率 ， 以 及 作为 不 同样 品 标准 化 的 依据 ， 实 验 者 可 以 考虑 用 [ce- ?了 ] dCTP 或 [e*H] dCTP 示 踪 第 一 链 反 应 。 测 得 的 标记 挫 人 量 正 比 于 新 合成 的 cDNA 的 量 。 可 以 通过 一 份 第 一 链 cDNA、 第 二 链 cDNA 电泳 ， 加 上 凝 胶 的 直接 放射 自 显影 ， 评 估 放 射 性 同位 素 标 记 的 cDNA 的 质量 和 大 小 分 布 。 理 想 状 态 时 ， 曝 光一 定 会 显示 凝 胶 上 端 呈 现 很 多 弥散 的 条 带 ， 条 带 越 接近 加 样 孔 越 好 。 虽 然 非常 麻烦 ， 但 还 有 另外 一 种 可 能 的 方法 。 电 泳 分 离 cDNA Ja, FA SYBR 绿 染 色 ， 用 图 像 分 析 软 件 定量 和 比较 凝 胶 上 样品 CDNA 电泳 弥散 条 带 结 果 。 是 否 进行 碱 变 性 凝 胶 电 泳 取决 于 实验 者 的 爱好 。 研 究 者 也 可 以 选取 一 部 分 cDNA 反应 产物 ， 用 0. 1 体积 的 0. ImolL NaOH 变性 ， 然 后 用 1. 2% 的 非 变性 琼脂 糖 凝 胶 电泳 。

18.4 人 迫 接 的 注意 事项

在 每 一 个 连接 反应 中 ， 载 体 和 揪 人 片段 的 分 子 摩 尔 比 为 1:1 时 ， 可 获得 最 大 的 连接 效 率 。 克 隆 建 库 时 ， 载 体 与 插入 片段 若 接近 于 1 : 1， 克 隆 会 非常 完全 。 如 果 只 是 要 克隆 某 一 类 型 的 分 子 ， 而 不 是 建 库 时 ， 连 接 效率 则 不 需 考 虑 太 多 。 转 化 细菌 并 将 其 涂 布 于 选择 性 培养 ZE (AN 50ng/ml 氮 共 西林 或 12. 5ug/ ml 四环素) 后 ， 即 使 只 出 现 一 个 克隆 ， 并 发 现 它 含有 目的 片段 插入 ， 实 验 便 是 成 功 的 。 因 为 假 阳 性 确实 存在 ， 所 以 最 好 至 少 有 几 个 候选 克隆 供 是 否 存 在 重组 载体 的 检测 。 教 训 是 ， 简 单 的 克隆 实验 中 ， 载 体 和 插 人 片段 的 分 子 摩尔 比 是 否 是 1 : 1 并 不 是 鉴定 的 参数 。

若 感 觉 产生 的 重组 克隆 有 问题 时 ， 可 以 计算 可 能 达到 的 程度 、 参 与 反应 末端 皮 摩 尔 Cpmol) 分 子 数 ， 然 后 增加 或 减少 某 一 种 成 分 的 质量 ， 使 载体 与 插入 片段 的 末端 比例 达到 1 : 1， 通 过 计算 完成 连接 优化 。 研 究 者 必须 计算 插 和 片段 和 载体 两 者 的 末端 皮 摩 尔 分 子 数 ， 然后 在 连接 反应 中 使 它们 达到 平衡 。

_ pg DNAX2X10° FE BIE IK St F B= WE DNA 寺 下 天 人

式 中 “末端 皮 摩 尔 分 子 数 一 一 可 参与 连接 反应 的 末端 分 子 数 〈 无 论 是 插入 片段 或 是 载体 ) ; Ag DNA 一 一 载体 或 插入 片段 的 质量 ; 660 一 一 每 个 碱 基 对 的 平均 分 子 量 ; 碱 基数 一 一 载体 或 插 和 人 片段 的 长 度 ;

@ 使 用 限制 酶 产生 黏 性 末端 时 ， 同 样 在 内 部 的 识别 位 点 剪 切 ，cDNA 长 度 会 缩短 。 为 排除 这 一 问题 ， 一 个 策略 是 ， 在 连接 接头 连接 和 用 限制 酶 消化 前 ， 使 CDNA 甲 基 化 〈 如 用 Eco RI 甲 基 化 酶 ) 。 在 此 例子 中 ，Eco RI 甲 基 化 酶 处 理 后 的 EDNA， 即 使 其 内 部 有 Eco R 工 酶 切 位 点 ， 也 不 能 被 EcoRI US. @ WH cDNA 两 端 不 同 的 限制 酶 位 点 允许 插 和 人 片段 以 希望 的 方向 连接 。 这 一 策略 常用 于 cDNA 将 被 表达 的 情况 。 ¢ 237 =

RNA 研究 方法

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南

2X106 一 一 xg(10-5) 与 pmol(12-") 的 转换 因 于 。 按 每 个 分 子 有 两 个 末端 可 以 连接 计算 。 例如 ， 打 算 作为 插入 片段 的 575ng 的 DNA， 长 852bp， 约 有 2. 045pmol Ai:

0.575wg X 2X 10° 未 端 皮 摩尔 分 子 数 一 一 ttECE6I

若 要 做 克隆 ， 这 个 DNA 作为 插入 片段 ， 研 究 者 同样 需要 计算 载体 的 末端 皮 摩 尔 分 子 数 ， 使 连接 反应 中 两 者 的 浓度 相同 。

如 果 准 备 克 隆 的 是 长 度 单一 的 插入 片段 ， 这 种 计算 简单 而 直接 。 但 若 要 克隆 的 插 人 片段 是 cDNA 混合 物 时 ， 情 况 就 非常 复杂 ， 因 为 这 些 cDNA 的 长 度 非常 不 均一 ， 并 且 某 些 cD- NA 的 丰 度 比 其 他 的 高 。 这 时 候 最 值得 做 的 策略 是 改变 插入 片段 对 载体 的 比例 ， 进 行 一 系列 Hie AI, Int 0255-14 0.5) 120.75, 121, 1% 1e25s 1? 15,14 AR 和 反应 结束 后 ， 将 连接 产物 转化 进 E. coli 感受 态 细胞 2， 最 常用 化 学 转化 方法 制备 理想 的 感受 态 细 胞 ， 也 可 以 直接 从 公司 购买 (如 Promega).

18.5 424 % #

Bassett, C. L., Nickerson, M. L., Cohen, R. A., and Rajeevan, M. S. (2000). Alternative transcription initiation and novel post-transcriptional processing of a leucine-rich repeat receptor-like kinase gene that responds to short-day photoperiodic floral induc- tion in morning glory (Ipomoea nil). Plant Mol. Biol. 43, 43.

Bassett, C. L., Nickerson, M. L., Farrell, R. E., Jr., and Harrison, M. (2004). Multiple transcripts of a leucine-rich repeat receptor kinase from morning glory originate from different TATA boxes in a tissue-specific manner. Molec. Gen. Genomics 271(6), 752.

Efstratiadis, A., Kafatos, F.C., Maxam, A. M., and Maniatis, T. (1976). Enzymatic in vitro synthesis of globin genes. Cell 7, 279.

Gubler, U., and Hoffman, B. J. (1983). A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25, 263.

Ohara O., Nagase, T., Mitsui, G., Kohga, H., Kikuno, R., Hiraoka, S., Takahashi, Y., Kitajima, S., Saga, Y., and Koseki, H. (2002). Characterization of size-fractionated cDNA libraries generated by the in vitro recombination-assisted method. DNA Res. 9(2), 47.

Ohara, O., and Temple, G. (2001). Directional cDNA library construction assisted by the in vitro recombination reaction. Nucleic Acids Res. 29, e22.

Okayama, H., and Berg, P. (1982). High efficiency cloning of full-length cDNA. Mol. Cell. Biol. 2, 161.

(HARE; SH KLAR)

@ 与 用 质粒 构建 cDNA 库 比较 ， 用 流行 的 mR AR 8 eH EY CDNA. FE JE RH «La 菌 班 非常 小 ， 所 以 可 以 以 比 相应 细菌 转化 高 得 多 的 密度 涂 布 CDNA 库 。 筛 选 哈 菌 体 库 时 ， 假 阳性 率 也 低 得 多 , Be 落 杂 交 有 更 好 的 灵敏 度 和 分 辨 率 。 噬 菌 体 库 筛选 后 ， 研 究 者 通常 进行 亚 克 降 实验 (将 插入 片段 从 一 种 载体 转 人 另 一 种 载 体 )。 很 多 推定 的 阳性 克隆 被 再 次 鉴定 。 这 些 后 续 的 操作 必须 进一步 鉴定 载体 携带 的 插入 片段 ， 用 质粒 工作 会 方便 很 多 。

。 238 -

Re ，

第 19 章 RERRSHERW

19.1 BARE

Zs], RAMEE RN (PCR) 的 技术 革命 向 和 的 影响 ， 而 且 还 影响 到 了 实验 过 程 中 一 个 最 基本 的 应 该 怎样 着 手 解 决 这 个 实验 问 题 。 反 转录 聚合 酶 链 反 应 (RT-PCR)， 即 先 由 任何 一 种 反 转 录 酶 CRT) 催化 核糖 核酸 (RNA) 分 子 合成 与 之 互补 的 DNA (cDNA) 序列 ， 接 着 再 经 过 标准 的 聚合 酶 链 反 应 (PCR) PIKE CDNA. HFRS CRT) 在 cDNA 第 一 链 合 成 过 程 中 起 着 重要 的 作用 ， 因 此 这 一 方法 在 研究 基因 表达 的 过 程 中 被 普遍 称 为 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 〈RT-PCR) 。 最 初 这 一 方法 被 称 为 核糖 核酸 聚合 酶 链 反 应 (RNA PCR)， 这 似乎 有 点 用 词 不 当 。 正 是 由 于 PCR 的 快速 性 与 有 效 性 ，RT-PCR 成 了 合成 和 分 析 cDNA 的 首选 方法 。

与 以 往 分 析 RNA 的 方法 相 比 ，RT-PCR 的 方法 在 分 析 基 因 表 达 量 上 是 十 分 有 效 的 。 细 胞 裂解 液 中 存在 的 转录 本 必定 能 通过 反 转 录 与 PCR 扩 增 出 产物 ， 而 没有 转录 的 基因 在 反应 体系 里 不 能 提供 反 转 录 的 模板 ， 也 就 没有 产物 的 产生 。 由 于 PCR 的 灵敏 度 很 高 ，RT-PCR 是 目前 对 表达 量 极 低 的 转录 本 进行 检测 和 定量 时 经 常 使 用 的 方法 。

19.2 聚合 酷 链 反应 概 太

PCR 技术 的 广泛 应 用 ， 无 疑 对 所 有 生命 科学 的 基础 研究 领域 都 产生 了 巨大 的 影响 。 古 老 的 劳动 力 密集 型 的 分 子 生 物 学 方法 (大约 1985 年 ) 已 经 逐渐 退出 了 历史 的 舞台 。 取 而 代 之 的 是 更 快 更 精确 的 被 形象 地 称 为 “引物 介 导 ， 酶 促 扩 增 的 特定 基因 组 序列 或 CDNA 序列 ” 的 方法 (Saiki 等 ，1985; Mullis 等 ，1986; Mullis 和 Faloona，1987) 。 极 微量 的 模板 在 几 个 小 时 内 就 可 扩 增 数 百 万 倍 。PCR 技术 在 用 了 NA 作为 基因 表达 参数 的 各 个 领域 ， 如 传染 病 的 研究 、 基 因 突 变 、 法 医 鉴 定 、 基 因 家 族 成 员 相 关 性 、 组 织 和 细胞 的 转录 活性 等 ， 都 显示 了 巨大 的 应 用 潜力 。 当 然 ， 并 非 要 将 以 往 的 经 典 方法 完全 人 铭 弃 ， 因 为 PCR 技术 也 有 如 下 一 些 不 可 避免 的 缺点 。

D 要 想 反 应 正确 地 进行 ， 研 究 人 员 必 须 选 择 适 当 的 引物 序列 。

@ 与 模板 配对 的 引物 ， 在 3 末端 不 能 有 错 配 。

@ PCR 方法 专利 所 有 权 目 前 由 Roche Molecular Systems, Inc. 和 F. Hoffmann-LaRoche Ltd. 所 有 。 要 在 专利 许可 范 围 内 使 用 PCR。PCR 应 使 用 被 授权 的 热 循 环 仪 。 需 要 详细 的 询问 ， 请 联系 the Director of Licensing，Applied Biosystems， 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404,

¢ 239 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

@ 参加 反应 的 模板 〈 如 靶 标 )， 必须 经 过 纯化 以 利于 引物 的 退火 和 随后 的 延伸 反应 。

图 反应 体系 中 的 诸多 组 分 要 经 过 优化 ， 直到 能 够 得 出 明确 的 产物 。

© PCR 产物 的 长 度 通常 比 原来 的 模板 长 度 短 。 在 RT-PCR 过 程 中 ， 产 物 可 以 经 过 纯化 作为 RNA 印迹 《〈Northern 印迹 ) 分 析 的 探 针 来 确定 mRNA 模板 的 真正 长 度 ， 这 至 少 是 一 种 确定 PCR 产物 的 方法 。

笔者 认为 对 于 屡次 遇 到 困难 的 研究 人 员 ， 不 管 是 新 手 还 是 老练 的 分 子 生 物 学 家 ， 千 万 不 要 把 PCR 技术 当 作 一 项 可 以 医治 百 病 的 良药 。 另 外 ， 即使 已 经 精通 了 基本 的 核酸 分 离 、 处 理 和 储存 的 方法 ， 也 不 要 据 弃 其 他 实验 方法 而 只 专注 于 PCR 技术 。 有 很 多 学 习 分 子 生 物 学 的 学 生 ， 误 认为 PCR 可 以 解决 实验 中 遇 到 的 一 切 问 题 ， 其 实 这 是 十 分 错误 的 想法 。

关于 PCR 的 原理 ， 陈 述 和 讨论 的 文章 非常 之 多 ， 不 能 一 一 列举 。 如 果 想 要 系统 地 了 解 ， 读者 可 以 参阅 综述 (Dieffenbach 和 Dveksler, 2003; Innis 等 ，1999; McPherson 和 Hames, 1995; Sellner 和 Turbett, 1998). Jb. 读者 可 以 通过 下 面 对 PCR 的 概述 ， 进行 简要 的 了 解 。

首先 ，PCR 反应 的 进行 依赖 于 体系 中 的 引物 。 准 确 说 什么 是 引物 呢 ? 在 本 文中 ， 引 物 就 是 一 段 短 小 的 单 链 DNA 序列 ， 也 就 是 通常 所 说 的 寡 核 苷 酸 ， 是 由 研究 人 员 确 定 的 人 工 合 成 的 特异 序列 。 合 成 引物 的 标准 如 下 。

@ 引物 长 度 通 常 小 于 30 个 碱 基 ， 实 验 中 常用 的 引物 一 般 为 20 一 25 个 碱 基 长 。

@ 引物 是 单 链 的 。

@ 引物 3' 未 端 必须 为 羟基 ， 这 样 才 可 以 通过 DNA 聚合 酶 在 其 上 加 上 其 他 核 昔 酸 。 5 末 端 没 有 特殊 的 要 求 ， 可 以 有 任何 修饰 。

® 引物 3 未 端的 最 后 两 个 碱 基 必须 与 模板 完全 配对 ， 而 5 末端 可 以 不 与 模板 配对 。

© 引物 必须 与 作为 模板 的 基因 组 DNA 或 cDNA 有 一 定 程度 的 互补 配对 。

要 想 通过 PCR 扩 增 一 段 DNA 序列 ， 就 需要 一 对 引物 。 这 对 引物 要 设计 成 与 热 变性 模 板 的 两 条 链 分 别 互补 配对 。 而 且 它 们 的 3 末端 是 朝向 对 方 的 。 这 样 经 PCR 得 出 的 产物 就 是 这 两 条 引物 5 末端 之 间 的 序列 。 如 下 所 示 :

meet Fi tere Late Ter Cases: 3 5!

=| 3 MER) i) ia ll ee

预期 的 PCR 产 物

两 条 引物 的 物质 的 量 浓度 必须 相等 ， 这 样 模板 的 两 条 链 才能 对 称 地 进行 扩 增 ， 因 此 这 种 PCR 也 被 称 为 “对 称 性 PCR"。 如 果 两 条 引物 的 浓度 不 同 ， 这 种 非 对 称 性 的 反应 将 使 模板 的 一 条 链 得 到 扩 增 。 通 过 合成 引物 的 不 同 ，PCR 反应 可 以 有 对 称 性 PCR (Saiki 等 ，1985) 和 非 对 称 性 PCR (Gyllensten 和 Erlich, 1988); 还 可 以 有 其 他 各 种 不 同 的 扩 增 形式 ， 如 反 相 PCR (Ochman 等 ，1988;，Triglia 等 ，1988) 、RT-PCR 及 cDNA 未 端 快速 扩 增 [ 即 通常 所 说 的 互补 DNAS! 未 端 快速 扩 增 和 3 末端 快速 扩 增 CRACE)] (Frohman 等 ，1988; Froh- man, 1995).

+ 240 -

第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反应

PCR 反应 由 很 多 循环 组 成 ， 每 个 循环 都 分 为 三 步 ， 这 三 步 之 间 的 温度 有 显著 的 变化 。 通 过 25 一 30 个 这 样 的 循环 ， 模 板 分 子 就 可 以 得 到 扩 增 〈 表 19. 1) 。 每 个 循环 中 的 三 步 具 体 如 下 。

表 19.1 PCR 理论 上 的 指数 扩 增

a ee) a

2 2 19 524288 1048576 2097152 4194304 8388608 16777216 33554432 67108864 134217728 268435456 536870912 1073741824 2147483648 4294967296 8589934592 17179869184 34359738368

以 2 为 底 的 指数 (2?)

人 Seo AN DHF wD | S

1024 2048 4096 8192 16384 32768 65536 131072 262144

注 : 多 个 循环 PCRPMHMICRABA 2", RE n RHCTCKMNRAR. AXMHE, HFS WAdINIPHIRH. & 次 样品 热 变 性 (92~95°C) 对 聚合 酶 带 来 的 累计 负面 影响 以 及 其 他 各 种 因素 的 影响 ， 模 板 的 实际 扩 增 量 并 没有 这 人 么 多 。 产物 的 累积 在 初期 的 几 个 循环 里 是 按照 指数 增长 的 ， 然 后 在 随后 的 循环 里 就 进入 了 所 谓 的 “平台 期 ”>。 这 时 虽然 聚合 酶 还 有 活性 ， 产 物 却 并 非 以 指数 增长 的 形式 累积 。

D 热 变性 。 这 一 步 的 目的 是 高 温 使 模板 分 子 的 双 链 得 到 解 离 变 成 单 链 ， 同 时 也 可 以 使 引物 内 或 引物 之 间 可 能 形成 的 二 级 结构 解 开 ”。 这 对 下 一 步 模板 与 引物 的 退火 是 必需 的 。 要 想得到 PCR 产物 ， 完 全 的 热 变性 是 不 可 或 缺 的 。 热 变性 如 下 所 示 :

模板 5! 3! 3! 5!

| ms 5! 3 srr 45171 ‘ 引物 2~-LLLH :一 一 :

热 变性 所 需 的 温度 和 时 间 取 决 于 模板 分 子 的 配对 性 及 (G+C) 含量 。 因 此 ， 对 模板 性 质 了 解 越 多 ， 就 越 容 易 对 以 后 的 反应 进行 优化 。 通 常 基因 组 DNA 样品 需要 延长 热 变 性 的 时 间 来 确保 双 链 的 完全 解 离 。 以 基因 组 DNA 为 模板 进行 PCR 的 失败 ， 通 常 都 是 由 于 在 开始 的 时 候 模板 没有 完全 热 变性 ， 从 而 大 大 影响 了 其 后 循环 的 效果 所 致 。 一 般 常 用 的 短线 性 DNA 的 起 始 热 变 性 温度 为 94C ， 时 间 为 1Imin; 对 于 复杂 的 基因 组 DNA 需要 10min,

G@ 引物 退火 。 这 一 步 的 目的 是 使 引物 与 模板 在 互补 配对 的 位 置 杂 交 ， 从 而 为 下 一 步 的 DNA 合成 提供 3 末端 的 羟基 (3 -OH) 。 当 引物 与 模板 退火 时 ， 引 物 的 5 末端 就 确定 了 第 一

© 如 何 防止 引物 分 子 内 及 分 子 间 的 碱 基 配对 ， 请 参阅 19. 5 引物 设计 一 节 中 的 建议 。 。 241 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

轮 循 环 完成 后 〈(RT-PCR 是 第 二 轮 循 环 完成 后 ) 的 PCR WAKA. EB AMT, Rh 管 中 的 温度 不 应 超过 任何 一 个 引物 的 解 链 温 度 (Tu 值 )。 因 此 ， 虽 有 特例 ， 退 火 温度 通常 都 设 定 在 比 所 用 引物 最 低 计算 Te 值 低 1 一 2 为 宜 。 引 物 退 火 如 下 所 示 :

F 3' age ES

此 外 ,模板 与 引物 互补 配对 的 序列 必须 完全 变性 ， 和 否则 引物 退火 将 无 法 进行 9。 因此， 退火 温度 是 PCR 过 程 中 变化 性 最 强 的 ， 并 且 直 接 取决 于 引物 的 序列 。 常 用 的 退火 温度 为 50~68°C, ， 反 应 时 间 为 2min。

© 引物 延伸 。 这 一 步 的 目的 是 从 引物 配对 的 位 置 沿 着 模板 分 子 进行 延伸 反应 ， 合 成 PCR 产物 。 这 是 PCR 产物 合成 的 核心 步骤 。 这 一 步 的 进行 需要 至 少 一 种 热 稳定 性 的 DNA 聚合 酶 ， 如 Tag (Thermus aquaticus) 或 Tth (Thermus thermophilus), fé % TES WY it 度 下 进行 延伸 反应 。 这 些 酶 可 以 承受 热 变 性 过 程 中 的 高 温 以 及 在 引物 延伸 过 程 中 一 般 为 68 一 72C 的 温度 。 引 物 延 伸 如 下 所 示 :

|

预期 的 PCR 产 物

在 前 两 轮 的 循环 中 ， 引 物 延 伸 反应 会 超出 另 一 链 引 物 5 末端 规定 的 范围 ， 从 而 产生 PCR“ 长 产物 ”和 “中 间 产 物 ”。 在 第 三 轮 循 环 中 ， 反 应 又 会 产生 “ 短 产 物 ”， 即 预期 的 产物 以 指数 级 累积 。 中 间 产 物 在 整个 反应 过 程 中 都 会 产生 ， 但 只 以 算术 数 级 累积 ， 在 整个 产物 量 中 微乎其微 〈 表 19. 2) 。 但 是 非特 异性 产物 的 量 却 不 容 忽视 。 此 外 ， 热 稳定 性 的 聚合 酶 在 高 温 下 很 少 会 出 错 ， 但 是 并 不 是 所 有 的 热 稳 定性 酶 都 有 校对 活性 。 由 于 Taq RA BAR 出 错 率 ， 许 多 新 的 实验 流程 推荐 用 混合 酶 (如 在 同样 条 件 下 起 作用 的 两 种 热 稳定 性 的 聚合 RE) 来 提高 产物 的 量 并 确保 扩 增 过 程 中 的 精确 度 。

#192 PCR 的 产物 量 的 分 布 每 种 类 型 产物 的 相对 量

长 产物 (不 变 ) ] FF fia] 7 Yy (2n— 2) | 短 产 物 (2* 一 27) — 7 前 十 一

循环 数 (>) |

@ 参阅 19.6 优化 程序 一 节 中 的 建议 。242 。

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第 19 章 ， 反 转录 事 合 酶 链 反应

续 表 每 种 类 型 产物 的 相对 量 循环 数 (7) 6 2 64 7 2 128 8 a 256 9 2 512 10 2 1004 1024 ual 2 2026 2048 12 Z 4072 4096 13 2 8166 8192 14 2 16356 16384 15 2 32738 32768 16 2 65504 65536 17 2 131038 131072 18 2 262108 262144 19 2 524250 524288 20 次 1048536 1048576 21 2 2097110 2097152 22 2 4194260 4194304 23 2 8388562 8388608 24 2 16777168 16777216 25 2 33554382 33554432 26 2 67108812 67108864 27 2 134217674 134217728 28 2 268435400 268435456 29 4 536870854 536870912 30 2 1073741764 1073741824

TE: 在 典型 的 对 称 反 应 中 ，PCR 产物 的 累积 主要 分 为 三 种 形式 ， 即 长 产物 、 中 间 产 物 和 短 产物 。 从 表 中 总 量 一 栏 可 以 看 出 反应 产物 是 以 指数 级 快速 累积 的 ， 而 其 中 绝 大 多 数 是 短 产 物 。 中 间 产 物 是 以 算术 数 级 逐渐 累积 的 。PCR 产物 在 反 应 结束 时 的 量 直 接 取决 于 实际 的 扩 增 效率 ， 这 个 效率 通常 达 不 到 表 中 所 列 出 的 100% 。

总 而 言 之 ，PCR 基本 就 是 重复 以 上 介绍 的 三 步 : 变性 、 退 火 和 延伸 。 虽 然 PCR 产物 的 ， 量 在 前 几 轮 循环 并 不 是 很 多 ， 但 经 过 20 轮 或 更 多 轮 的 循环 ， 就 可 以 得 到 大 量 的 可 以 用 于 其 他 实验 的 产物 。 不 管 以 PCR 为 基础 的 技术 被 冠 以 何 名 ， 其 实 根本 上 都 是 这 几 步 的 重复 。

19.3 及 转 录 轰 合 酷 链 有 反应 基本 万 法

以 基因 组 DNA 或 载体 DNA 为 模板 ， 进 行 PCR 扩 增 的 过 程 是 十 分 简单 的 。 同 样 的 原理 也 可 以 应 用 于 RNA 的 扩 增 ， 只 需要 在 PCR 前 加 上 一 步 ， 即 将 RNA 模板 变 为 cDNA 即 可 。 为 了 更 清楚 理解 基因 调控 所 设计 的 任何 实验 ， 都 是 十 分 的 复杂 。 因 为 这 种 复杂 性 ， 从 而 控制 RT-PCR 成 功 与 否 的 条 件 ， 比 分 子 生物 学 的 其 他 所 有 技术 都 要 繁杂 得 多 ， 因 此 就 需要 结合 实 践 经 验 仔细 地 预先 计划 好 各 个 实验 条 件 。

传统 cDNA 的 合成 就 是 全 长 或 是 所 需 长 度 cDNA 分 子 的 合成 。 这 个 目的 能 和 否 实 现 ， 直 接 与 RNA 的 起 始 数 量 与 质量 、cDNA 第 一 链 的 合成 所 用 的 方法 及 引物 延伸 反应 通过 RNA 二 级 结构 和 发 夹 结构 向 前 行进 的 能 力 有 关 。 由 于 PCR 卓越 的 灵敏 性 和 扩 增 能 力 ， 对 于 PCR 的 扩 增 能 力 与 识别 能 力 来 讲 ， 起 始 RNA 的 量 并 不 显得 十 分 重要 。 而 与 之 相 比 ， 传 统 的 克隆

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

方法 要 有 足够 的 起 始 RNA 的 量 ， 这 是 不 可 或 缺 的 条 件 。 另 外 ， 由 于 PCR 的 引物 “ 框 出 ” 了 扩 增 的 区 段 ， 所 以 这 种 克隆 方法 比 传统 的 CDNA 合成 技术 和 Northern 杂交 分 析 更 难 区 分 部 分 降解 的 RNA。

显而易见 ，RT-PCR 是 一 个 两 步 的 反应 。 首 先 ， 纯 化 的 RNA 由 反 转 录 酶 CMMLV, AMV, Superscript 或 Mn2+ 依赖 的 rTeh) 催化 ， 通 过 正确 的 引物 进行 反 转 录 反 应 "。RT- PCR 应 该 在 一 个 反应 管 中 进行 ， 还 是 应 该 分 别 在 两 个 反应 管 中 进 行 ， 不 同 的 实验 室 有 不 同 的 做 法 ， 并 没有 定论 。 最 新 的 改革 建立 了 通常 所 说 的 单 管 RT-PCR 方法 。 简 单 地 说 ， 单 管 PCR 反应 体系 中 包含 了 RNA 模板 反 转 录 所 需 的 ， 以 及 其 产物 cDNA PCR 扩 增 所 需 的 所 有 的 反应 组 分 。 这 种 方法 最 大 优点 就 是 只 要 加 好 反应 组 分 ， 并 盖 上 反应 管 的 盖子 后 ， 直 到 对 PCR 产物 进行 电泳 或 使 用 其 他 方法 鉴定 时 ， 都 不 需要 打开 反应 管 的 盖子 。 在 实时 定量 PCR 时 ， 甚 至 不 需要 用 电泳 进行 定量 。

另 一 种 单 管 RT-PCR 的 方法 ， 是 使 Tad 聚合 酶 与 抗 Tad 的 抗体 结合 保持 失 活 的 状态 ， 反 转 录 反 应 照常 进行 。 当 反应 体系 加 热 到 95C 时 ， 反 转录 酶 和 抗体 均 变 性 失 活 ， 就 释放 出 了 有 活性 的 Tad RAM. PCR 反应 就 可 以 顺利 地 进行 了 。 还 有 一 种 方法 ， 就 是 用 同时 可 以 催化 两 个 反应 的 酶 (如 rTth) ， 既 可 以 进行 反 转 录 反 应 ， 又 可 以 在 含有 二 价 锰 离 子 的 N- 二 ( 羟 乙 基 ) 甘氨酸 缓冲 液 中 进行 PCR 扩 增 反应 。 再 有 一 种 方式 ， 含 有 和 氯 化 钊 和 硫酸 贸 的 缓冲 体系 ， 可 在 退火 温度 和 二 价 镁 离子 浓度 的 动力 学 范围 外 也 保证 很 高 的 特异 性 ， 从 而 可 以 减少 对 优化 的 需要 。 使 用 更 好 的 仪器 、 现 在 很 多 研究 人 员 对 反应 有 更 好 的 理解 以 及 其 他 的 一 些 改 革 ， 所 有 这 些 改 进 大 大 减少 了 起 始 RNA 的 用 量 ， 有 时 低 至 亚 纳 克 级 。 这 种 数量 级 的 RNA 需求 量 ， 使 研究 人 员 使 用 单个 细胞 进行 PCR 具有 非常 现实 的 可 能 性 。

如 果 在 实验 中 遇 到 了 RT-PCR 特异 性 的 问题 ， 就 可 以 参考 以 下 的 方法 。 最 好 可 以 使 用 热 启 动 的 模式 。 另 外 ， 使 用 降落 PCR (touchdown PCR) 方法 可 以 大 幅度 地 提高 反应 的 特 异性 。 简 而 言 之 ， 降 落 PCR 开始 使 用 的 退火 温度 比 引 物 的 Tu 值 稍 高 ， 随 着 反应 的 进行 ， 每 一 轮 的 退火 温度 都 降低 一 个 定量 ， 通 常设 定 为 0.5"C ， 直 到 反应 的 退火 温度 降低 到 比 所 有 引物 最 低 的 Tm 值 低 5C 为 止 。 这 样 反应 的 结果 ， 在 最 初 的 几 个 循环 里 没有 非特 异性 产物 产 生 ， 当 反应 温度 降低 到 引物 的 退火 发 生 时 ， 引 物 将 只 与 完全 配对 的 序列 相互 作用 。 当 反应 达 到 最 低 退 火 温 度 时 ， 预 期 的 特异 性 产物 的 量 已 大 大 超过 了 在 最 后 几 轮 反应 中 形成 的 非特 异性 产物 。 这 种 方法 能 够 使 容易 产生 非特 异性 产物 的 引物 反应 得 到 很 高 的 特异 性 〈 图 19.1).

在 非 单 管 RT-PCR 反应 体系 中 ， 通 常 第 一 链 反应 的 产物 是 RNA + DNA RAK, EH 二 个 反应 中 ，PCR 原理 使 最 初 的 RNA 模板 被 取代 ， 并 且 合 成 和 扩 增 第 二 链 。 在 PCR 第 一 轮 循环 开始 的 时 候 ， 热 变性 和 PCR 反应 缓冲 液 所 提供 的 类 似 于 碱 性 的 环境 使 RNA : DNA 链 变 性 ，RNA 发 生 碱 水 解 @8。 这 样 就 可 以 使 序列 特异 性 的 引物 在 第 一 轮 循环 里 可 以 与 模板 进行 退火 。 当 然 ， 由 于 这 时 只 合成 了 DNA 的 一 条 链 ， 只 有 一 条 引物 可 以 找到 与 立 配 对 的

@ cDNA 第 一 链 的 合成 过 程 中 可 以 使 用 传统 的 下 游 引物 ， 如 oligo(dT),。 is 、 随 机 引物 或 基因 特异 性 引 和 暂 。 反 应 产 物 是 稳定 的 单 链 cDNA 分 子 ， 可 以 作为 下 一 步 PCR 扩 增 的 模板 ，

@ 人 IECR 与 传统 的 SDNA 合成 方法 相 比 有 许多 优点 ， 最 值得 一 提 的 是 它 的 高 速 与 灵敏 性 。 不 同 于 现在 仍然 常用 的

RNase 吾 介 导 的 第 二 链 cDNA 合成 法 (Gubler 和 Hoffman，1983)， 起 始 RNA 模板 的 碱 水 解 和 直接 合成 第 三 链 CDNA 省 去 了 各 种 沉淀 步骤 和 其 他 复杂 的 处 理 过 程 。 通 过 合成 非 特异 性 引物 ， 如 oligo(dT) 和 混合 的 随机 六 核 苷 酸 或 nonomers， FU POR 的 方法 可 以 合成 整个 文库 ， 文 库 可 保存 多 年 用 于 逐渐 或 完全 鉴定 其 特征 相反 ， 一 个 适当 长 度 的 序列 特异 性 引物 就 可 以 通过 入 增 得 到 单一 的 PCR 产物 ， 这 种 方法 叫 作 锚 定 PCR。 这 一 方法 将 在 本 章 的 后 文 做 详细 的 描述 。

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第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反应

1 4

19.1 降落 PCR。 即 使 温度 接近 Tu 值 ， 引 物 有 时 也 会 与 模板 有 非特 异性 的 相互 作用 。 通 过 从 高 于 Tu 值 的 起 始 温度 逐渐 降低 退火 温度 ， 只 有 完全 配对 的 引物 : 模板 双 链 才 可 以 稳定 存在 并 得 到 扩 增 。(a) 五 个 cDNA 第 一 链 样品 〈1 一 5 泳 道 ) 57 亿 退火 进行 的 PCR。 理 论 上 ， 这 些 引物 可 以 产生 单一 的 365bp 的 PCR 产物 ， 如 箭头 所 示 。 但 是 非特 异性 产物 清晰 可 见 。 第 6 泳 道 为 PCR 的 分 子 量 标准 。 (b) 六 个 cDNA 第 一 链 样品 〈1 一 6 泳 道 ) 进行 逐渐 降温 的 PCR。 退 火 温度 从 65°C BEB 55C， 每 个 循环 降低 0.5C， 然 后 再 进行 15 轮 循环 。 在 1 一 6 泳 道 中 的 预期 位 置 都 观察 到 单一 的 产物 。 第 7 泳 道 是 空白 ， 第 8 泳 道 为 分 子 量 标准 。(a) 和 (b) 中 的 PCR 产物 的 长 度 是 相同 的 ， 但 不 是 同一 块 凝 胶 上 电泳 的 结果

模板 。 第 一 轮 循环 的 引物 延伸 反应 产生 了 cDNA 的 第 二 链 。 第 一 轮 循环 完成 后 ， 新 合成 的 cDNA 双 链 将 以 对 称 的 形式 进行 扩 增 《〈 图 19. 2). PTPCR 标 准 方法

用 与 适当 的 引物 退火

忆 县 te RG VITITIT 5! 3/4 cDNA 第 一 链 VTTITITT PCR 降 解 了 mRNA, 合成 cDNA

| > 第 二 链 并 且 扩 增 靶 区 域 站

= = a ee was Se eae Ee

Ena de ieee roc eee eT Tre) | :rn

图 19.2 RT-PCR, mRNA 通过 反 转 录 酶 的 作用 生成 CNDA 第 一 链 。 随 之 mRNA 模板 被 降解 。PCR 第 一 轮 循环 合成 了 cDNA 第 二 链 ， 从 第 二 轮 循环 开始 ， cDNA 双 链 得 到 扩 增 。 反 应 中 可 以 选择 多 种 不 同 的 引物 进行 扩 增

在 PCR 技术 发 明 以 前 ， 完 成 第 一 链 合成 后 ，cDNA 第 二 链 的 合成 由 外 加 的 DNA 聚合 酶 起 始 ， 通 常 不 除去 或 灭 活 反 转录 酶 。 这 一 点 十 分 有 用 ， 因 为 DNA 聚合 酶 和 反 转 录 酶 共同 作 用 可 以 增强 解 开 二 级 结构 的 能 力 ， 二 级 结构 影响 被 合成 双 链 cDNA 的 长 度 。 但 是 ， 现 在 除 了 Mn2+ 依赖 的 rTzA 和 Tag 活性 外 ， 反 应 时 都 要 将 AMV 和 MMLV 反 转 录 酶 进行 热 失 活 ， 否则 将 影响 随后 的 反应 〈Kawasaki，1990) 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

有 人 可 能 会 认为 ， 通 过 RT-PCR 检测 转录 产物 就 像 基 因 组 DNA 的 扩 增 一 样 简 单 ， 因 为 即使 低 含 量 的 mRNA 在 细胞 中 都 有 许多 拷贝 数 。 实 际 上 并 不 是 这 样 ， 因 为 在 反应 过 程 中 起 决定 作用 的 是 反 转 录 酶 。 由 于 反 转 录 酶 对 于 不 同样 品 进行 反 转录 的 能 力 变 化 很 大 ， 甚至 是 来 自 于 同一 份 反应 混合 物 ，RT-PCR 反应 样品 的 标准 化 仍然 十 分 重要 。 因 此 ，cDNA 第 一 链 合 成 的 效率 是 RT-PCR 成 功 与 否 最 重要 的 决定 因素 。

19.4 实验 室 设 计

与 非 RT-PCR 的 正常 危机 相 比 ， 由 于 RT-PCR 增加 了 步 又， 来自 储备 液 及 下 游 的 反应 给 扩 增 子 (amplicon) 污染 的 机 会 大 大 增加 了 。 要 解决 这 些 问 题 ， 如 果 研 究 人 员 的 实验 室 为 样品 准备 和 PCR 扩 增 分 别 设 计 了 指定 的 区 域 ， 那 么 在 做 RT 反应 时 就 一 定 要 在 样品 准备 区 域 ， 而 不 能 在 PCR 扩 增 区 域 。 每 个 区 域 都 应 该 配备 专用 的 一 套 微量 移 液 器 、 实验 服 及 其 他 设备 。 除 了 反应 管 及 实验 中 将 用 到 的 溶液 ， 任何 东西 都 不 能 从 一 个 实验 区 域 移动 到 另 一 个 实 验 区 域 。 典 型 的 实验 室 设 置 如 图 19. 3 所 示 。 虽 然 为 每 一 个 过 程 都 准备 一 个 单独 的 房间 是 不 太 实际 的 ， 但 是 最 好 还 是 将 实验 室 设 计 成 如 图 19. 3 那样 ， 实 验 区 域 间 只 能 单 向 移动 。 如 采 实验 室 的 空间 十 分 狭小 ,那么 最 明智 的 做 法 就 是 将 其 他 三 个 区 域 与 凝 胶 电 泳 和 PCR 产物 分 析 区 域 尽量 分 开 。 如 果 发 生 交 叉 污 染 ， 则 实验 室 的 工作 将 停滞 不 前 。

二 要 有 2 i z EER os Hee

图 19. 3 进行 PCR 时 工作 区 域 或 实验 室 空 间 的 最 佳 安 排 。 试 剂 、 模 板 和 其 他 材 料 只 能 以 箭头 方向 移动 ， 而 绝对 不 能 返回 到 前 一 区 域 。 同 时 ， 每 一 个 区 域 都 要 配备 一 套 微 量 移 液 器 及 实验 服 ， 并 且 不 能 从 一 个 区 域 移动 到 另 一 个 区 域 。 反 应 储备 液 和 样品 管 的 单方 向 移动 是 避免 污染 的 关键

19.5 引物 设计

要 想 成 功 地 进行 一 个 PCR， 就 需要 一 对 正确 设计 的 引物 。 反 应 中 的 两 个 引物 所 使 用 的 术语 比较 混乱 。 为 了 明确 区 分 这 些 术语 ， 每 个 引物 的 不 同 命名 在 表 19. 3 中 列 出 。 例 如 ， 下 游 引 物 就 是 距离 mRNA 模板 3 末端 最 近 的 与 模板 配对 的 引物 ， 参 与 了 cDNA 第 一 链 的 合 成 。 下 游 引 物 在 其 他 命名 法 中 也 被 称 为 3 引物。 上游 引 物 与 新 合成 的 CDNA 第 一 链 互补 配 对 ， 并 且 靠 近 起 始 mRNA 模板 5 末端 。 如 下 所 示 :

mRNA 35-

AAAAAAAAAAA 3 F 游 引物 在 其 他 命名 法 中 上 游 引 物 也 被 称 为 5 引物 。 通 常 引物 设计 直接 依据 已 经 公布 的 DNA 序 列 ， 如 基因 组 DNA, cDNA 或 基因 间 区 域 。 在 合适 的 反应 条 件 下 ， 自 然 界 的 任何 一 段 核酸 序列 都 可 以 通过 使 用 正确 设计 的 引物 而 得 到 扩 增 。 按 照 惯 例 ， 公 布 的 DNA 序列 只 列 出 。246 -

第 19 章 ， 反 转录 聚合 酶 链 反应

DNA 的 一 条 链 即 编码 链 ， 书 写 时 从 5 端 到 3 端 。 当 研究 人 员 要 为 一 段 已 知 序 列 设计 引物 时 ， 就 必须 明了 还 有 另 一 条 链 的 存在 ， 并 且 与 给 出 的 序列 是 反 向 互补 配对 的 。 要 为 已 公布 的 序列 设计 引物 ， 并 保证 提取 方向 的 正确 与 序列 的 正确 ， 就 需要 遵守 以 下 最 基本 的 原则 。

表 19.3 基本 引物 命名 原则

3 引物 (3" primer) 下 游 引 物 (downstream primer) 反 向 引物 (Creverse primer)

反 义 引 物 (Cantisense primer) (一 ) 引 物

Crick

5'3| (5' primer) 上 游 引物 Cupstream primer) 正 向 引物 (forward primer) 正义 引物 (sense primer)

(十 ) 引 物

Watson

注 : 左边 列 出 的 术语 均 可 以 用 来 描述 与 mRNA5 末端 相关 的 引物 。 同 样 ， 右 边 列 出 的 术语 均 可 以 用 来 描述 参与 扩 增 的 靠近 mRNA3 未 端的 引物 。 也 可 以 使 用 更 正式 的 用 法 将 引物 称 作 寡 核 苷 酸 链 或 寡 核 背 酸 〈oligos) 。

D 上 游 引物 的 序列 与 公布 的 编码 链 的 序列 相同 。

Q 下 游 引 物 的 序列 与 公布 的 编码 链 的 序列 反 向 互补 配对 。

为 了 确保 选择 了 正确 的 引物 序列 ， 初 学 者 最 好 写 下 发 表 序 列 的 两 条 链 ， 并 标明 方向 。 确 保 设计 的 两 条 引物 分 别 与 两 条 链 反 向 互补 配对 ， 并 且 两 条 引物 的 3 -羟基 末端 相互 指向 对 方 ， 从 而 框 出 需要 扩 增 的 序列 。

类 似 的 原则 也 用 于 RT-PCR 引物 的 设计 : 如 果 已 知 一 段 mRNA 序列 ， 其 序列 与 将 其 转 录 出 来 的 DNA 编码 链 的 序列 是 相同 的 ， 只 是 由 尿 苷 代替 了 胸 苷 。 因 此 ， 如 果 RT-PCR 的 下 游 引物 不 选择 oligoCdT) ， 而 选择 使 用 特异 性 引物 时 ， 应 选择 RNA poly(A) 尾巴 起 始 位 置 上 游 的 一 段 与 RNA 反 向 互补 的 序列 。 上 游 引 物 的 序列 除了 由 胸 苷 代替 了 尿 苷 外 ， 其 他 与 靶 mRNA 的 序列 相同 。 另 一 点 特别 值得 注意 的 是 ， 所 有 引物 序列 的 书写 方向 都 是 从 5 端 到 3 端 ， 这 一 点 对 于 上 游 引 物 和 下 游 引物 同样 适用 。 如 果 引 物 序 列 的 次 序 写 错 了 ， 所 得 的 引物 将 不 起 作用 ， 全 部 过 错 都 出 在 写 序列 的 人 。

例如 ， 已 知 mRNA 的 序列 如 下 :

GAGCCGCACA CCUGGGAUCC GAUAAGAACA CGGAGCGAUU AUUUUAUCUA GCUAUGCUUA GAGAGAUGAC CGAGUAGCGA CUAUUUUACC AGCUUUUUUG CGCGAUCGAC CGAUCGACGA AACAACAACA CCCGCAACAG CACGCGAGCG AGACGAGAUU CUACUAUGGG UAAGUAGAAC CCCAGACGAU CACUCGCUAA CGCUAUCGAG CUAGUAGGAU GCGUGUGCGC UCGCUGCUAG CGCUCGAGGC UAAGUAGAAC CCCAGACGAU AGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA

设计 一 对 引物 ， 长 20 个 碱 基 ， 能 够 产生 一 段 PCR 产物 包括 了 mRNA 的 6~190 的 核 FF AR.

解答 : 5/3| WFR 5’ GCA CAC CTG GGA TCC GAT AA 3'S| WFR «5' ATC GTC TGG GGT TCT ACT TA

为 便于 阅读 序列 ， 通 常 将 核 苷 酸 写 为 3 个 一 组 。

碍 核 苷 酸 引 物 序 列 的 信息 能 够 从 已 公布 的 序列 数据 库 中 得 到 ， 也 可 以 来 自 于 相同 或 不 同 物种 的 相关 基因 的 序列 ， 还 可 以 从 目的 基因 编码 蛋白 质 的 氨基 酸 序 列 中 得 到 。 用 最 后 一 种 方 法 就 遇 到 了 一 个 问题 : 基因 编码 的 兼并 性 ， 即 某 些 氨基 酸 有 多 个 密码 子 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

当 基 于 已 知 肽 段 序列 的 信息 设计 引物 时 ， 一 种 策略 是 检查 此 肽 段 是 否 有 这 样 的 氨基 酸 焦 存在 ， 即 编码 篮 中 的 氨基 酸 只 有 1 个 或 2 个 密码 子 。 单 密码 子 的 氨基 酸 有 甲 硫 氨 酸 〈Met， M) 和 色 氢 酸 (Trp，W)。 但 是 5 个 或 6 个 单 密码 子 氨基 酸 相 连 是 十 分 少见 的 ， 并 且 即 使 有 ， 它 的 基因 也 可 能 早已 被 克隆 了 。 其 他 氨基 酸 都 有 两 个 或 两 个 以 上 的 密码 子 〈 表 19.4). 在 多 密码 子 的 情况 下 ， 研 究 人 员 必 须 了 解 在 特定 的 物种 中 对 于 不 同 密码 子 使 用 的 偏好 性 。 没 有 直接 的 核酸 序列 信息 ， 要 想 设计 确定 的 序列 作为 引物 或 探 针 的 可 能 性 很 小 。 首 为 普遍 的 指 导 原 则 ， 应 尽量 避免 使 用 有 6 个 密码 子 的 氨基 酸 (包括 精 氨 酸 、 亮 氨 酸 和 丝氨酸 )。 如 果 可 能 的 话 ， 多 合成 一 些 3 引物 和 5 引物 ， 并 且 在 PCR 过 程 中 尝试 使 用 不 同 的 组 合 来 进行 验证 。

表 19.4 兼并 引物 设计 密码 子 使 用 表

ATG AUG Met 1 M TGG UGG 1 WwW KA RE MK AAT AAC AAU AAC 2 N 天 冬 氨 酸 GAT GAC GAU GAC 2 D 半 胱 氨 酸 TGT TGC UGU UGC 2 c 谷 氨 酰 胺 CAA CAG CAA CAG 2 Q BAR GAA GAG GAA GAG 2 E 组 氨 酸 CAT CAC CAU CAC 2 H RAM AAA AAG AAA AAG 2 K AR TUT Tre UUU UUC 2 F MAR TAT TAC UAU UAC 2 ¥ Fe AR ATA ATC AUA AUC 3 1 ATT AUU Si AR GTA GTC GUA GUC Vv GTG GTT GUG GUU ; Ai AB CCA CCC CCA GCC P Cag CCT CCG CCU I BR ACA ACC ACA ACC ae ACG ACT ACG ACU AAR GCA GCC GCA GCC A GCG GCT GCG GCU 甘氨酸 GGA GGC GGA GGC ee 3GG GGT GGG GGU fi Am AGA AGG AGA AGG me: CGA CGC CGA CGC CGG CGT CGG CGU EAR CTA'CTC CUA‘CUCG . L CTG CTT CUG CUU TA TTG UUA UUG 丝氨酸 TCA TCC UCA UCC S TCG TCT UCG UCC AGT AGC AGU AGC 无 义 密码 子 TAA TAG UAA( 赭 石 )

TGA UAG( $8 #4) UGA( 了 乳白 )

再 并 引物 是 一 些 相似 的 引物 分 子 的 混合 物 ， 这 些 分 子 至 少 在 一 个 位 点 上 是 未 同 的 ， 简 并

引物 在 研究 未 确定 的 序列 如 模板 类 似 物 及 进化 过 程 中 的 保守 序列 的 特征 时 是 十 分 有 用 的 写 使 。248 -

第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反 应

用 简 并 引物 有 利于 一 系列 相关 序列 的 退火 和 扩 增 ， 随 着 反应 循环 具体 条 件 的 不 同 ， 这 些 序列 的 特征 也 有 很 大 的 差异 。 例 如 引物 : 5'GGN CCG TCR TCR AAW GTC ARG TA, KEW 23 个 核 苷 酸 ， 由 于 在 3 位 、9 位 、12 位 、15 位 和 20 位 上 有 变化 的 核 苷 酸 ， 这 一 引物 有 64 倍 的 简 并 率 。 引 物 的 简 并 率 是 每 个 位 点 的 简 并 数 的 乘积 〈 表 19. 5) 。 这 就 是 说 上 述 所 示 的 引 物 实际 上 包含 了 64 种 不 同 的 分 子 ， 可 以 与 64 种 碱 基 改 变 的 形式 互补 配对 。 由 于 某 些 基因 在 大 多 数 生物 体 中 都 有 高 度 保守 的 区 域 ， 简 并 引物 将 有 助 于 从 特定 物种 的 基因 组 中 钓 出 特异 序 列 。 但 是 随 着 引物 简 并 性 的 增加 ， 特 异性 就 降低 了 。 但 是 至 少 想 要 得 到 的 序列 也 在 产物 当 中 。 减 少 引 物 简 并 率 的 一 种 方法 是 在 引物 中 挫 人 次 黄 苷 。 次 黄 苷 是 一 种 嗓 吟 核 苷 、 可 以 与 腺 苷 、 胞 苷 、 乌 苷 形成 碱 基 配 对 ， 它 与 胸 苷 的 作用 较 弱 。 因 此 ， 在 设计 引物 时 ， 在 不 确定 的 位 置 上 由 次 黄 苷 代替 ， 将 显著 地 降低 简 并 率 。 当 已 知 一 蛋白 质 基 因 的 氮 基 酸 序列 ， 并 想 回 漳 得 到 相应 的 基因 序列 时 ， 也 可 以 使 用 简 并 引物 。 在 订购 合成 引物 时 ， 可 以 使 用 表 19.5 中 列 出 的 简 并 引物 的 标准 符号 。

表 19.5 引物 设计 所 用 核 背 酸 的 标准 缩写

ARF A A 1 hel G C 1 +f G G 1 ie 工 0 1 RR U U 1 Ke I I 1 RS A/G R 2 We EK EF C/T Y 2 腺 苷 , 胞 苷 A/C M 2 Sf. Mt ， G/T K 2 腺 苷 , 胸 苷 A/T WwW 2 WF. SF C/G S 2 AF. SF. A C/G/T B 3 ARE. SF Matt A/G/T D 3 Ae EF . MEP. Ha er A/C/T H 3 腺 苷 , 胞 苷 , 鸟 苷 A/C/G Vv 3 任意 核 苷 酸 A/C/G/T N 4

TE: 表 中 列 出 了 某 些 特殊 核 苷 酸 的 习惯 缩写 及 合成 PCR Sit aes S| yt Ie eT AR a AY fi FE

“多 重 ”PCR 是 用 几 套 引物 同时 扩 增 出 一 段 或 几 段 靶 序 列 的 过 程 ， 其 中 的 引物 不 必 简 并 化 。 但 是 将 反应 温度 设 定 在 符合 所 有 引物 的 Tm 值 的 范围 内 是 十 分 重要 的 。 一 种 解决 的 方法 是 设计 几 对 引物 ， 它 们 的 Tm 值 均 相 同 。 当 然 ， 也 可 以 只 设计 一 条 你 认为 最 好 的 引物 ， 使 用 一 种 低 严 谨 度 的 方法 ， 如 降低 杂交 温度 。 虽 然 第 一 种 方法 减少 了 参与 完全 配对 的 引物 的 浓 度 ， 而 第 二 种 方法 可 能 带 来 非特 异性 的 配对 ， 但 是 靶 序 列 得 到 了 扩 增 ， 虽 然 会 产生 假 阳 性 ， 但 在 以 后 的 序列 分 析 中 可 以 被 剔除 。 在 低 严 说 度 的 情况 下 ， 引 物 的 所 有 碱 基 并 非 都 与 模板 互 相配 对 。 低 温 时 很 容易 形成 错 配 及 单个 碱 基 与 模板 非 氢 键 结合 ， 但 是 这 并 不 影响 引物 退火 和 随后 延伸 反应 的 进行 。 不 过 如 果 错 配 有 可 能 发 生 ， 最 好 将 反应 最 初 几 轮 循环 的 退火 温度 比 原 来 的 降低 S~ 10°C 。 这 一 策略 可 以 使 在 大 量 错 配 存在 时 ， 引 物 也 可 以 稳定 地 与 模板 结合 并 延 伸 ， 从 而 使 PCR 成 功 地 进行 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

19.5.1 基本 标准

以 下 是 合成 PCR 引物 时 需要 注意 的 几 点 。 但 是 要 谭 记 ， 不 论 在 设计 引物 时 考虑 得 多 人 么 周公， 只 有 在 反应 中 得 到 验证 起 作用 的 引物 才 是 真正 好 的 引物 。

CD 通常 引物 与 模板 碱 基 配 对 的 区 域 长 20 一 25 个 碱 基 。 可 以 使 用 更 长 的 引物 ， 但 是 随 着 长 度 的 增加 ， 引 物 的 热 动力 学 行为 就 更 加 难以 预测 。 如 果 使 用 更 短 的 引物 ， 则 可 能 产生 非特 异性 退火 ， 这 是 由 于 随 着 引物 的 变 短 ， 特 异性 减 小 了 。 在 一 定 程度 上 上， 引物 的 最 小 长 度 是 物 种 特异 性 的 。 确 定 引物 的 最 小 长 度 而 同时 又 能 保证 引物 的 特异 性 ， 可 以 采用 以 下 一 个 指数 规则 :

4x >Y 式 中 “4 一 一 组 成 引物 的 核 苷 酸 种 类 的 数量 ;

X 一 一 引物 的 长 度 ;

Y 一 一 需 设 计 引 物 的 物种 的 基因 组 大 小 。

例如 ， 大 类 的 基因 组 二 倍 体 大 约 有 6. 6X10?bp〈 大 约 等 于 每 个 细胞 6pg DNA), At, 4X>6.6X 10°, FRE X 从 理论 上 为 17 个 碱 基 长 度 的 引物 ， 即 寡 聚 17 核 苷 酸 就 可 以 扩 增 葛 序列 得 到 唯一 的 DNA 序列 ， 并 可 以 避免 其 他 无 关 序 列 的 和 干扰。 但 是 ， 毕 竟 6. 6 X 10° bp 的 FARE. SRL, B17 核 苷 酸 仍然 处 于 灰色 区 域 ， 可 能 产生 灵敏 度 的 问题 。 因 此 ， 最 好 设计 更 长 一 些 的 引物 。

@ 在 PCR 中 ,引物 之 间 的 Tn 值 相配 ， 比 长 度 和 序列 的 相符 要 重要 得 多 。Tn 值 的 少 许 变化 ， 尤 其 是 针对 较 短 的 引物 ， 可 能 会 严重 影响 反应 产物 的 特异 性 和 产量 。

@) 3' 末 端的 错 配 将 是 致命 的 。3' 末 端 最 后 一 个 核 苷 酸 及 倒数 第 二 个 核 苷 酸 的 错 配 将 使 引 物 延 伸 不 能 顺利 进行 。 聚 合 酶 需要 与 模板 完全 配对 的 3' -羟基 作为 添加 核 苷 酸 的 底 物 。 如果 设计 引物 时 有 误 ， 通 常 无 法 得 知 其 3' 末 端 是 否 与 模板 配对 ， 这 时 最 好 选择 基因 的 其 他 位 置 作为 靶 ， 通 常 只 需 向 原来 引物 靶 向 位 点 的 5' 或 3' 挪 动 几 个 碱 基 即 可 。

® 如 果 研 究 人 员 想 在 PCR 产物 一 端 或 两 端 添加 新 的 序列 ， 就 可 以 在 引物 中 端 的 外 侧 带 一 段 突出 的 序列 。 外 加 的 序列 通常 为 DNA 测序 引物 、RNA 转录 启动 子 、 限 制 性 酶 切 位 点 ， 以 及 一 些 用 于 PCR 产物 的 识别 和 下 一 步 扩 增 时 所 用 的 序列 ， 如 竞争 PCR 〈 见 第 20 章 ) 。

© 每 个 引物 的 序列 都 应 检查 是 否 有 反 向 重复 带 来 的 分 子 内 互补 现象 。 如 果 有 这 种 现象 ， 引物 将 产生 自身 的 碱 基 配 对 。 引 物 形 成 发 夹 结构 使 游离 引物 的 浓度 显著 降低 ， 从 而 极 大 地 降 低 了 产物 量 。 这 并 不 仅仅 是 识别 的 问题 。 由 于 守 核 苷 酸 的 杂交 是 十 分 迅速 的 ， 引 物 将 优先 与 空间 距离 最 近 的 互补 序列 进行 碱 基 配对 。 如 果 引 物 的 5 末端 与 3' 未 端 互 补 ， 它 们 之 间 的 杂 交 就 会 发 生 ;， 问题 的 严重 程度 取决 于 退火 温度 的 高 低 。 同 时 分 子 内 的 碱 基 配 对 可 导致 正确 模 板 上 的 错误 位 置 发 生 非特 异性 的 碱 基 配 对 。 这 就 使 部 分 引物 的 5 未 端 和 3’ Rae 游离 的 核 苷 酸 。 这 样 会 引发 “PCR 引起 的 插入 ”并 产生 不 同 的 产物 。 幸 运 的 是 ;网 正 提供 了 很 多 免费 的 软件 可 以 帮助 分 析 引 物 的 序列 。 最 简单 的 方法 就 是 到 某 个 搜索 引擎 搜索 免费 的 引物 鉴定 工具 。 输 入 “引物 分 析 ” 或 其 他 相关 的 关键 词 ， 就 可 以 找到 很 多 网 站 ， 它 们 提供 引 物 Tm 值 计 算 、 分 子 量 、 发 夹 形成 倾向 、 引 物 间 相 互 作 用 可 能 性 等 的 服务 。 有趣 的 是 六 用 相 同 的 引物 序列 ， 在 不 同 网 站 上 分 析 的 结果 不 尽 相 同 。 最 好 的 验证 方法 就 是 看 设计 的 引物 能 香 在 热 循环 仪 中 工作 。

© 每 对 引物 在 合成 前 ， 都 应 检查 它们 3' 末 端 附 近 的 序列 之 间 有 没有 互补 ,引物 之 间 了 碱

*。 250 -

#$19S RHERRARERW

基 配 对 将 生成 引物 二 聚 体 ， 这 就 使 预期 的 PCR 产物 量 大 大 减少 。 如 下 所 示 :

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引物 二 聚 体 预期 的 PCR 产 物

当 引 物 的 3 末端 富 含 GC 时 ， 引 物 二 聚 体 最 易 形 成 。 如 果 经 过 检查 能 够 形成 引物 二 聚 体 ， 那 么 改变 一 个 或 两 个 引物 1 一 2 个 核 苷 酸 的 长 度 ， 就 可 以 解决 这 一 问题 。

@ 设计 引物 时 〈G 十 C) 含量 应 在 平均 范围 内 。 例 如 ， 人 类 基因 组 的 〈G 十 C) 含量 大 致 为 41%%。 在 本 实验 室 ， 所 设计 引物 的 平均 (G+C) 含量 为 40%% 一 50%% 。 这 一 参数 是 很 重 要 的 ， 因 为 乌 苷 和 胞 苷 配对 形成 3 TSAR. MPA CARA 2 个 氢 键 。 两 条 引物 的 (G+O) 含量 均 在 平均 范围 内 ， 就 可 以 避免 其 中 一 条 引物 比 另 一 条 引物 与 模板 更 有 效 地 结合 。

设计 引物 时 应 平均 分 配 各 种 核 苷 酸 。 不 要 不 成 比例 地 在 引物 的 一 端 集中 多 个 鸟 苷 或 胞 苷 ， 而 在 另 一 端 集中 多 个 腺 苷 或 胸 苷 。 这 样 可 以 避免 引物 与 模板 退火 时 ， 其 一 端 与 模板 碱 基 配 对 的 效率 与 另 一 端的 产生 很 大 差异 。

@ 避免 使 用 重复 序列 。 例 如 ,，5 ATG ATG ATG ATG ATG ATG， 将 产生 特异 性 问题 。

@ 引物 3 末端 的 最 后 5 个 核 苷 酸 中 ， 鸟 苷 和 胞 苷 的 数目 不 要 超过 2 个 。

@ 引物 3 末端 有 一 个 鸟 苷 或 胞 昔 通常 可 以 提高 PCR 的 反应 效率 。

i9.5:2. T.. 值

每 个 引物 的 单独 特征 是 十 分 重要 的 ， 而 多 个 引物 在 反应 管 中 的 共同 作用 也 是 同等 重要 的 。 设 计 引 物 最 重要 的 一 点 ， 就 是 要 在 模板 的 特异 性 、 引 物 与 模板 碱 基 配 对 时 的 热 动力 稳定 性 及 两 条 引物 共同 作用 进行 RT-PCR 反应 的 能 力 之 间 达 到 适当 的 平衡 。 一 条 引物 在 与 其 他 引物 协作 时 的 行为 可 以 用 它 的 Ta 值 来 描述 。Tnm 值 是 指引 物 与 模板 50% 发 生 了 退火 ， 而 50 为 还 未 退火 时 的 温度 。 因 此 ，Tm 值 是 引物 与 模板 碱 基 配 对 时 ， 引 物 与 模板 结合 与 解 离 的 平衡 温度 。

Tm 值 与 引物 的 长 度 、 碱 基 组 成 及 溶液 中 钠 离子 (Nat) 浓度 有 关 。 一 种 快速 计算 引物 Tm 值 的 方法 ， 就 是 每 个 腺 味 叭 和 胸腺 喀 啶 乘 以 2C， 每 个 鸟 味 叭 和 胞 喀 啶 乘 以 4C 。

了 二 2 人 GATE4aekGaacC)

这 种 方法 仅 适 用 于 寡 聚 11 一 28 核 苷 酸 的 引物 。 当 计算 所 得 的 温度 超过 68C ， 这 种 算法 就 不 适用 了 。 这 种 方法 广泛 用 于 估算 引物 对 中 每 一 条 引物 的 To 值 。 如 果 引 物 是 公司 合成 的 ， 通 常 就 会 提供 氧化 钠 浓 度 分 别 为 lmol/L 和 50mmol/L 时 的 Ta 值 。 这 就 使 研究 人 员 能 够 在 PCR 中 灵活 地 使 用 ， 并 且 可 以 将 这 些 引物 作为 筛选 文库 及 Southern 印迹 等 类 似 实验 的 杂交 探 针 。 设 计 引 物 时 ， 最 好 依据 引物 的 Tn 值 而 不 是 长 度 进行 搭配 。 设 计 的 引物 在 正式 送

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

出 合成 之 前 ， 应 按照 上 述 所 述 的 原则 ， 对 引物 的 序列 进行 全 面 检测 ， 以 预测 它们 可 能 的 行为 。

Tm 值 是 一 个 退火 平衡 点 ， 但 是 很 显然 ， 更 希望 引物 与 模板 完全 配对 ， 而 非 仅仅 50% fe 对 。 因 此 ， 了 解 了 每 个 引物 的 Tu 值 ， 就 可 以 计算 出 PCR 循环 中 第 二 步 的 退火 温度 《Ta)。 要 想 使 引物 退火 的 特异 性 最 高 ， 就 可 以 设 定 退火 温度 比 Tm 值 低 几 度 ， 如 Ta 一 Im 一 5C。 如 果 比 Tm 值 低 5C 不 能 产生 正确 的 产物 ， 则 可 以 将 退火 温度 设 为 Tm 一 10C 重 新 进行 实验 。 如 果 引 物 与 模板 之 间 存 在 一 个 或 多 个 错 配 ， 就 要 大 大 降低 退火 温度 。 虽 然 低 温 下 可 以 忍受 错 配 的 发 生 ， 要 牢 牢记 住 ， 退 火 温度 越 低 ， 非 特异 性 引物 也 越 多 。

19.6 @ #2 %

目前 PCRRACAR—EMEB REDE AS BAT OTE DSW. BH fa}, PCR 技术 使 细胞 生物 学 问题 的 解决 方法 和 遵循 的 原则 得 到 了 很 大 的 改进 。PCR 的 广泛 应 用 来 源 于 其 很 好 的 重复 性 。 但 是 ， 这 是 与 反应 的 优化 紧密 相关 的 。 当 使 用 一 对 新 的 引物 时 ， 就 需要 对 反应 的 过 程 进行 优化 。

PCR 过 程 中 存在 很 多 潜在 的 困难 ， 有 些 是 显而易见 的 ， 而 有 些 却 是 隐藏 的 问题 。 下 面 将 列 出 其 中 的 一 些 注 意 事项 。 简 单 地 讲 ，PCR 的 效率 和 特异 性 与 参加 反应 的 每 个 成 分 都 AK.

O 总 混合 物 。 样 品 准备 的 标准 方法 是 ， 除 一 种 反应 组 分 以 外 的 所 有 扩 增 所 需 的 组 分 ， 事先 在 一 个 大 的 反应 管 中 混 合 。 然 后 将 这 种 总 混合 物 分 装 于 每 个 反应 管 中 ， 再 加 入 剩余 的 一 种 反应 组 分 。 总 混合 物 的 使 用 消除 了 吸取 溶液 过 程 中 引起 的 误差 ， 从 而 减 小 了 管 与 管 之 间 的 差异 。 典 型 的 PCR 反应 体系 包括 10mmol/L Tris-Cl, pH 8.3 (20°C); 1. 5mmol/L MgCh ; 50mmol/L KCl; 200umol/L dNTP; 0.5pmol/L 的 每 种 引物 ; 每 100nl 体系 加 入 2.5U Tag FEE Bie A 10° ~10° 拷贝 数 〈 过 lwg) 的 模板 。 每 个 组 分 都 是 可 以 变化 的 ， 但 这 里 列 出 的 参数 是 最 适 的 起 始 量 。

二 价 阳离子 。 在 使 用 没有 加 MgCl 的 10XPCR 反应 液 时 ， 应 注意 一 定 要 外 加 三 定 浓 度 的 镁 离子 。 大 量 二 价 镁 离子 与 dNTP 和 模板 〈 磷 酸 二 酯 键 骨 架 上 的 负电 荷 ) 结 侣 ， 从 而 大 大 提高 了 反应 的 效率 和 特异 性 。

@ 模板 的 质量 。PCR 扩 增 的 是 位 于 引物 之 间 的 DNA 片段 。 因 此 ， 与 分 子 生 物 学 的 其 他 经 典 方 法 相 比 ，PCR 方法 对 部 分 降解 的 DNA 和 RNA 模板 并 不 敏感 。 但 是 降解 严重 的 模 板 也 是 不 能 够 扩 增 的 ， 所 以 在 PCR 进行 前 ， 最 好 电泳 检测 一 下 模板 的 质量 。

® 引物 。PCR 所 需 的 引物 终 浓 度 一 般 为 0. 1~1. 0kmol/L， 使 用 更 高 浓度 的 引物 将 柄 所 得 的 产物 量 急剧 减少 。 如 果 新 合成 的 引物 在 退火 温度 接近 Tu 值 的 情况 下 没有 产物 生成 ， 那 么 就 降低 退火 温度 再 进行 反应 ;如 果 这 样 仍旧 不 能 反应 ， 则 应 马上 放弃 这 对 引物 ， 重 新 选择 引物 序列 。 引 物 合成 的 定购 没有 量 的 限制 ， 合 成 的 引物 是 以 冻 干 的 状态 运输 的 。 第 二 次 使 用 时 ， 要 加 入 灭 菌 水 或 TE 溶液 (10mmol/L Tris. pH 8.0; 0.lmmol/L EDTA) 进行 溶解 。 PR Vea > HEE Fb CE Faz S| RE. OR ES eb RP RS OE ADI 物 量 是 准确 的 。 通 过 实验 准确 确定 引物 的 浓度 是 进行 对 称 性 PCR 的 关键 。 使 用 非 等 量 的 正 游 引 物 和 下 游 引 物 将 导致 错误 产物 的 合成 。

关于 引物 的 纯度 ， 直 觉 是 引物 的 纯度 越 高 ， 反 应 的 效率 和 特异 性 就 越 好 。 引 物 最 基本 的 。 252 -

第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反应

纯化 就 是 合成 过 程 中 保护 基 的 去 除 。 总 是 有 末端 缺失 的 引物 分 子 会 影响 全 长 分 子 ， 这 些 分 子 可 能 会 对 产物 的 生成 产生 严重 的 影响 。 厂 商 提 供 的 引物 纯化 方法 有 几 个 等 级 ， 因 此 ， 虽 然 在 合成 引物 的 费用 当中 包括 了 某 些 纯化 方法 的 费用 ， 但 是 要 想得到 更 好 的 纯化 引物 ， 就 需要 文 付 额外 的 费用 。 常 用 的 引物 纯化 方法 有 : 脱盐 ， 柱 纯化 ， 反 相 高 压 液 相 色谱 CHPLO), & 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 (PAGE) 及 凝 胶 过 滤 。

a. 脱盐 的 费用 通常 包括 在 引物 合成 的 费用 中 。 脱 盐 的 目的 是 除去 残留 的 化 学 物质 或 有 机 物 。 它 们 来 自 引物 合成 的 过 程 中 ， 如 脱离 合成 柱 、 去 除 保 护 基 团 等 。 对 于 小 于 35 个 碱 基 的 引物 ， 脱 盐 处 理 就 可 以 满足 PCR 的 要 求 。 对 于 大 于 35 个 碱 基 的 引物 ， 或 者 对 引物 的 纯度 有 更 高 要 求 时 ， 就 需要 进一步 的 纯化 。

b. 柱 纯化 是 一 种 快速 的 方法 ， 其 所 得 的 引物 纯度 与 HPLC 纯化 的 相近 。 这 种 方法 的 原 理 是 全 长 引物 在 5 末端 有 DMT 基 团 〈 二 甲 氧 三 葵 甲 基 ) ， 而 末端 短缺 的 引物 分 子 没有 这 一 基 团 ， 因 此 它们 之 间 的 玻 水 性 不 同 。 柱 纯化 适用 于 大 于 50 个 碱 基 的 引物 的 纯化 。 用 柱 纯 化 或 HPLC 纯化 的 引物 ， 可 以 提高 定量 分 析 、 克 隆 及 位 点 特异 性 突变 反应 的 效率 。

c. 通过 反 相 HPLC 纯化 的 引物 纯度 通常 可 以 超过 95% 。 纯 化 的 原理 与 柱 纯 化 的 相同 。 HPLC 可 以 用 于 纯化 大 量 〈 如 大 于 lxmol) 的 引物 ， 但 是 不 适用 于 大 于 50 个 碱 基 的 引物 。 由 于 增加 了 纯化 的 步骤 ， 定 购 HPLC 纯化 的 引物 ， 厂 商 需 要 额外 的 1 一 2 天 时 间 才 能 出 货 。

d. PAGE 纯化 是 终极 的 纯化 方法 。 使 用 这 种 方法 纯化 的 引物 纯度 一 般 可 以 达到 99% 。 由 于 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 可 以 区 分 无 论 是 长 度 还 是 序列 的 单一 碱 基 差异 的 分 子 ， 长 度 在 50 一 100 个 碱 基 之 间 的 引物 均 可 以 使 用 这 种 方法 进行 纯化 。 因 为 要 从 凝 胶 中 回收 引物 ， 所 以 PAGE 纯化 得 到 的 引物 量 比 较 少 。 这 种 方法 也 需要 额外 的 1 一 2 天 时 间 。

e. 凝 胶 过 滤 的 方法 ， 由 于 去 除了 合成 引物 及 纯化 过 程 中 存在 的 痕 量化 学 物质 ， 消 除了 可 能 的 细胞 毒性 ， 当 寡 核 苷 酸 计 划 用 于 与 细胞 有 关 的 体内 实验 或 反 义 检测 等 实验 时 ， 强 力 推 荐 这 种 纯化 方法 。 这 一 方法 可 以 单独 使 用 也 可 以 结合 以 上 几 种 方法 共同 使 用 。 单 独 使 用 时 ， 凝 胶 过 滤 可 以 除去 引物 中 的 无 机 盐 类 、 反 应 残余 的 化 学 物质 和 极 短 的 末端 缺失 序列 ， 之 后 就 可 以 将 引物 冻 于 ， 重 新 溶解 在 适合 的 缓冲 液 中 并 定量 。

@ 反应 组 分 。 用 旧 的 模板 和 新 的 PCR 试剂 盒 前 ， 应 该 测试 一 下 其 中 的 组 分 。 许 多 PCR 试剂 盒 都 含有 供 测 试 的 模板 和 引物 ， 可 用 来 验证 反应 体系 是 否 有 作用 。 存 在 问题 的 反应 组 分 与 引物 设计 有 误 及 降解 的 模板 一 样 ， 都 可 能 使 反应 不 能 产生 产物 。 此 外 ， 以 下 几 种 物质 都 可 以 抑制 PCR 的 进行 : 苯酚 、 和 氯仿 、 硫 氰 酸 县 、 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS) 、N- 十 二 烷 基 肌 氮 酸 A. BR. CB. RHR. EDTA 及 矿物 油 。

© 样品 准备 区 。 最 好 有 足够 大 的 实验 室 空 间 使 模板 的 准备 、 反 应 体系 的 准备 及 PCR 循 环 区 域 分开 在 不 同 的 房间 ， 但 在 小 型 的 实验 室 里 是 难以 实现 的 。 因 此 ， 为 了 减 小 污染 发 生 的 危险 (PCR 的 遗留 物 ) ， 最 好 在 实验 室 至 少 为 模板 的 准备 、 试 剂 准 备 和 PCR 循环 划 出 特定 的 区 域 。 并 且 研 究 者 还 必须 十 分 注意 哪些 管子 是 可 以 移动 到 哪些 区 域 以 及 移动 的 方向 。 通 常 应 该 设计 四 个 区 域 ， 分 别 进行 样品 的 准备 、 反 应 及 结果 的 分 析 。 样 品 的 移动 也 应 该 从 最 清洁 或 纯度 最 高 的 区 域 〈 反 应 体系 准备 区 ) 到 纯度 较 低 的 区 域 模板 准备 区 ) 最 后 再 到 纯度 最 低 最 脏 的 区 域 〈 热 循环 仪 的 放置 区 域 和 凝 胶 电 泳 分 析 区 域 ) 。

按 图 19. 3 所 示 的 流程 ， 单 方向 移动 PCR 样品 可 以 减 小 污染 的 发 生 。 研 究 人 员 必 须 注意 一 些 实验 设备 ， 如 微量 离心 机 、 微 量 移 液 器 ， 甚 至 是 实验 服 都 不 应 该 随便 移动 位 置 。 不 管 是 DNA 还 是 RNA 作为 模板 ， 在 PCR 中 若 不 注意 这 些 问 题 ， 就 可 能 由 于 污染 而 影响 最 终 的 实

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

验 结果 。

@ 阳性 对 照 。 由 于 阳性 对 照 可 能 会 污染 反应 储备 液 ， 并 对 下 游 的 各 种 反应 产生 极 大 的 影响 ， 因 此 应 尽量 减少 阳性 对 照 的 数量 。 阳性 对 照 的 结果 最 好 与 反应 产物 的 夫 本 未 同 这 样 如 果 阳 性 对 照 的 模板 污染 了 储备 液 或 其 他 反应 组 分 ， 则 通过 观察 电泳 的 结果 是 否 有 分 开 的 两

条 带 就 可 以 判断 了 。 阴性 对 照 。 每 一 个 反应 和 电泳 时 ， 都 应 至 少 有 一 个 阴性 对 照 。 阴 性 对 照 的 选取 要 根 据 实验 所 需 。

© 气 溶 胶 的 污染 。 为 了 防止 微量 移 液 器 引起 的 污染 ， 应 尽量 使 用 容积 式 枪 头 (positive displacement micropipette tips) (图 19. 4) 。 当然 也 可 以 使 用 带 滤芯 的 枪 头 防止 气 溢 胶 的 污 染 。 带 有 模板 的 气 溶胶 很 容易 进入 反应 储备 液 中 ， 而 一 些 非 预 期 的 反应 产物 的 产生 可 能 就 是 由 于 使 用 了 已 经 污染 了 的 溶液 和 微量 移 液 器 造成 的 。 因 此 应 经 常 注意 正确 地 吸取 溶液 。

图 19.4 PCR 使 用 的 枪 头 。(a) 标准 的 带 滤芯 的 枪 头 〈Rainin) ， “pribwese toe 胶 污 染 微 量 移 液 器 。(b) AFH (Tri-Continent Scientific) 。 这 种 微量 注 射 器 式 的 枪 头 可 以 防止 气 溶 胶 的 形成 。 不 管 使 用 何 种 方法 ， 减 小 气 溶 胶 的 形成 是 必需 的 。 否 则 微量 移 液 器 的 污染 将 造成 大 面积 的 污染 发 生

O 热 循环 仪 。PCR 的 优化 和 下 一 步 实验 的 进行 ， 都 应 该 在 同一 台 热 循环 仪 中 进行 。 由 于 在 不 同 的 仪器 中 反应 的 效率 差别 很 大 ， 在 旧 的 仪器 上 优化 了 的 反应 ， 在 新 的 仪器 上 可 能 会 产生 完全 不 同 的 PCR 产物 。 事 实 上 ， 这 一 新 的 条 带 可 能 在 使 用 旧 的 仪器 时 也 是 存在 的 ， 但 是 量 比 较 低 ， 电 泳 时 观察 不 到 。 如 果 发 现 所 有 的 反应 突然 都 不 能 进行 了 ， 应 检查 一 下 是 否 其 他 人 无 意 中 改变 了 事先 设 定 的 PCR 程序 ， 对 已 经 优化 好 的 循环 参数 进行 修改 对 反应 是 不 利 的 。

@ 循环 参数 的 设 定 。 除 了 一 些 特殊 的 反应 ， 包 括 长 距离 PCR， 循 环 的 每 一 步 《〈 热 变性 、 退火 、 延 伸 ) 的 时 间 都 应 该 尽 可 能 短 。 新 式 的 热 循环 仪 在 不 同 的 温度 间 变 化 很 快 ， 短 的 循环 有 利于 反应 的 高 重复 性 。 如 果 反 应 的 退火 温度 高 于 65" ， 使 用 两 个 温度 的 循环 比 通常 的 三 步 循 环 法 更 好 。 把 温度 设 定 在 68~72°C 之 间 ， 这 样 就 可 以 把 退火 和 延伸 组 合成 一 步 。 例 如 ， 热 循 环 的 程序 可 以 设 定 为 :

起 始 模板 的 解 链 94°C 2min

变性 94°C 15s

退火 /延伸 94°C (70) 15s S01 int 保存 4°C co

这 可 能 是 因为 ， 与 短 引 物 比 较 ， 具 有 较 高 Tu AMOK IID SMR YER. Bob. 常 在 PCR 中 所 用 的 热 稳定 酶 在 ethic 的 聚合 酶 活性 最 高 。 四 灰暗 啶 -N- 糖 苷 酶 (UNG)。 这 种 酶 可 以 成 功 地 抑制 有 遗留 污染 的 模板 简单 地 讲 ，

PCR 反应 体系 中 含有 dUTP， 可 以 作为 dTTP 的 类 似 物 。 扩 增 出 的 PCR Py ep ae PR : 254 -

第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反应

而 不 是 胸腺 喀 啶 是 很 正常 的 。 在 扩 增 前 ，UNG 就 可 以 将 以 前 反应 中 生成 的 含有 尿 喀 啶 的 遗 留 模 板 切 断 。 新 的 含有 胸腺 喀 啶 的 模板 不 是 UNG 的 底 物 ， 因 此 不 会 受到 这 个 酶 的 影响 。 dUTP 的 存在 对 PCR 的 特异 性 和 效率 没有 影响 ， 而 UNG 在 下 一 步 的 热 变性 中 会 被 破坏 。

思 热 启 动 PCR。PCR 是 在 室温 或 冰 上 准备 好 ， 然 后 升温 到 94C 起 始 循环 的 ， 因 此 反应 体系 在 升温 到 94" 的 过 程 中 一 定 会 经 过 72'C 。 由 于 72C 是 引物 延伸 “〈 至 少 对 Taq 聚合 酶 而 言 ) 的 最 适 温度 ， 即 使 引物 与 模板 上 的 某 些 位 置 不 完全 配对 〈 这 些 位 置 在 严谨 条 件 下 不 会 产 生 配 对 )， 也 会 有 非特 异性 的 PCR 产物 生成 。 为 了 防止 这 种 情况 的 发 生 ， 采 用 了 许多 策略 来 抑制 在 第 一 轮 循环 开始 前 产物 的 合成 ， 这 时 引物 和 模板 都 未 完全 变性 。 以 往 所 用 的 方法 有 使 用 抗体 来 抑制 聚合 酶 的 活性 直到 抗体 发 生 热 变性 ， 例 如 TaqStart 抗体 (Clontech) 和 Jump- Start Taq(CSigma) 。 其 他 方法 有 使 用 螨 将 反应 组 分 分 开 ， 例 如 使 用 AmpliWax (Perkin El- mer)， 直 到 加 热 使 旺 熔化 ， 反 应 组 分 混合 从 而 使 PCR 开始 进行 。 现 在 许多 公司 都 有 它们 自 已 的 热 启动 方法 ， 大 多 数 是 以 抗体 为 基础 的 。 另 外 ， 可 以 将 一 种 重要 的 反应 组 分 预 热 到 75 人 再 加 入 到 反应 体系 当中 去 。 虽 然 这 种 方法 看 似 经 济 实用 ， 但 是 并 非 热 启动 反应 的 好 方 法 。 研 究 人 员 可 能 会 因为 触摸 到 热 循 环 仪 上 加 热 块 或 热 的 反应 管 而 被 烫伤 。 许 多 研究 人 员 都 愿意 选用 热 稳 定 酶 或 混 有 抗体 的 热 稳定 酶 。 这 种 抗体 可 以 在 模板 完全 变性 前 抑制 聚合 酶 的 活 性 。 热 启动 技术 的 应 用 对 于 任何 以 RIT-PCR 为 基础 的 实验 都 是 十 分 重要 的 ， 并 且 是 使 用 “困难 模板 ”进行 反应 成 功 的 关键 。

@ 酶 的 混合 物 。 在 典型 的 cDNA 合成 过 程 中 ， 遇 到 的 许多 传统 问题 延续 到 了 RT-PCR 的 领域 。 目 前 盛行 的 一 种 解决 方法 ， 就 是 将 不 同 热 稳 定 酶 进行 混合 ， 即 成 为 酶 的 混合 物 。 酶 的 混合 物 在 合成 基因 组 全 长 的 PCR 产物 时 获得 了 巨大 的 成 功 。 这 种 被 称 为 长 距离 PCR 的 方 法 ， 在 设计 之 初 就 是 为 了 扩 增 出 基因 组 全 长 的 PCR 产物 ， 一 般 为 大 于 4kb。 本 实验 室 经 常 使 用 这 种 非常 有 效 的 技术 ， 来 扩 增 那些 极 低 表达 量 的 mRNA、 细胞 质 中 较 长 的 mRNA 和 更 长 的 未 剪接 的 核 不 均一 RNA (hnRNA) 的 cDNA。 典型 的 酶 混合 物 包 括 Taq 聚合 酶 和 其 他 的 热 稳 定 酶 ， 如 Pwo. Tag 聚合 酶 具有 高 效 的 5 > 聚合 酶 活性 〈 前 行 活 性 )， 但 是 这 种 酶 在 95 的 半衰期 大 约 是 40min， 而 且 也 没有 3 5 核酸 外 切 酶 活性 〈 校 对 活性 )。 因 此 ， 如 果 Taq 聚合 酶 或 其 他 没有 校对 活性 的 酶 出 现 了 错误 ， 那 么 这 个 错误 将 稳定 地 挫 人 到 PCR 产 物 中 去 。 另 一 些 热 稳定 酶 ， 如 来 自 于 球菌 (Pyrococcus) 的 酶 ， 具 有 很 强 的 热 稳定 性 并 且 有 校对 能 力 。Taa 聚合 酶 与 其 中 的 一 种 酶 混合 于 经 修饰 的 缓冲 液 〈 通 常 为 铵 盐 缓 冲 液 )》 中 ， 共 同 作 用 比 单独 使 用 任何 一 种 酶 都 能 获得 更 高 的 效率 和 扩 增 的 保 真 度 。 此 外 ， 当 循环 数 超过 30 达到 35 或 40 AMA, Tag 聚合 酶 已 经 被 耗 尽 ， 由 于 第 二 种 酶 或 多 或 少 地 接替 了 其 位 置 ， 因此 这 时 PCR 产物 仍 可 以 积累 。 这 种 方法 尤其 适用 于 检测 丰 度 极 低 的 转录 产物 。 表 19.6 中 列 出 了 常用 的 PCR 酶 的 热 稳 定性 。 大 部 分 公司 都 有 各 种 酶 的 混合 物 出 售 。

表 19.6 PCR 中 所 选用 的 酶 的 热 稳 定性 ~ se 期

Taq Thermus aquaticus 95°C 40min

fig Thermus flavus 95°C 40min 没有 Tth Thermus thermophilus 95°C 20min 没有 Tli Thermococcus litoralis 100°C 2h A P fu Pyrococcus furiosus 100°C 2h 有 Pwo Pyrococcus woesei 100°C 2h 有 Deep VentR Pyrococcus GB-D 95° 23h A Vent Thermococcus litoralis 95°C 6. 7h 有 Stoffel fragment Thermus aquaticus 95°C 80min tA

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

® 优化 试剂 盒 。 可 以 购买 某 些 商业 化 的 试剂 盒 ， 这 些 试剂 盒 通 常 包 括 已 知 的 可 以 增强 PCR 的 化 合 物 。 例 如 Sigma No. OPT2， 这 一 系统 含有 一 些 10X 缓 冲 液 和 7 种 已 知 的 可 以 增强 PCR 的 辅助 物 , 大 肠 杆菌 单 链 结合 蛋白 〈Chou，1992)、 甲 酰胺 (Sarkar $, 1990), MME (Olive 等，1989) 、 牛 血清 白 蛋 白 CBSA) (Paabo 等 ，1988)、 二 甲 基 亚 硕 CWinship, 1989; Cheng 等 ，1994) 、 甜 菜 碱 (Rees 等 ，1993; Henke 等 ，1997)、 甘 油 〈Cheng 等 ，1994)。 表 19.7 总 结 了 这 些 辅助 物 对 PCR 的 影响 。 要 对 特定 的 模板 和 引物 进行 优化 ， 首 先 就 要 选择 一 种 最 合适 的 10X 缓 冲 液 ， 使 能 得 到 足够 量 的 产物 而 没有 非特 异 产 物 的 生成 ， 然 后 再 每 次 加 大 一 种 辅助 物 对 反应 进行 修饰 。 看 新 使 用 的 反应 条 件 是 否 是 节省 时 间 和 人 金钱 的 最 佳 策 略 。 表 19.7 ”辅助 物 对 PCR 的 增强 作用 PCR 辅助 物 工作 浓度 E. We Bi AR Be 15~30mmol/L | 影响 模板 和 引物 的 变性 和 退火

减少 富 含 GC 区 域

牛 血清 白 蛋白 (BSA)( 非 乙酰 化 的 形式 ) 稳定 Taq 酶 和 其 他 种 类 的 酶

二 甲 基 亚 硕 (DMSO) 减少 模板 脱 叮 哈 化 ,有 利于 双 链 的 解 离 甲 酰 胺 1. 25% ~10. 0% 增加 富 含 GC 的 模板 的 特异 性

甘油 15%~20% 增强 Tag 酶 的 稳定 性 ,降低 模板 的 Tm 值 大 肠 杆 菌 单 链 结合 蛋白 (SSBP) 加 速 引物 的 退火 ,抑制 错 配 引物 的 延伸

C6) 避免 使 用 矿物 油 覆 盖 在 反应 体系 上 。 矿 物 油 不 仅 很 脏 ， 而 且 它 将 极 大 地 降低 反应 活 性 和 重复 性 。 因 此 在 进行 PCR 时 ， 最 好 使 用 带 热 盖 的 热 循环 仪 ， 尽 量 避 免 使 用 矿物 油 。

19.7 PCR 产物 的 分 析

由 于 琼脂 糖 凝 胶 制 备 很 方便 ， 而 且 1 %% 一 3% 的 凝 胶 适 用 于 快速 分 析 任 何 长 度 的 PCR 产 物 ， 因 此 分 析 PCR 产物 通常 选用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 的 方法 。 这 种 凝 胶 经 熔化 并 冷却 到 大 约 55C 后 ， 可 以 在 凝 胶 溶 液 中 加 入 溴 化 乙 锭 。 另 外 ， 凝 胶 也 可 以 在 电泳 后 使 用 SYBR SR, 灵敏 度 将 更 高 。

大 多 数 公司 都 有 各 种 琼脂 糖 出 售 ， 可 供 选 择 的 有 标准 的 琼脂 糖 或 低 熔 点 的 琼脂 糖 ， 还 有 各 种 等 级 的 琼脂 糖 ， 可 专门 用 于 分 离 低 分 子 量 PCR 产物 等 。 在 本 实验 室 ， 通常 使 用 SeaKem GTG (Cambrex)， 用 1X Tris- 乙 酸 盐 -EDTA(CTAE) 配制 成 2.5% 二 3.0%% 的 溶液 。 这 种 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 可 以 用 于 检测 200 ~~ 1000bp 的 PCR 产物 。 用 微波 炉 加 热 高 浓度 的 琼 脂 糖 凝 胶 时 要 十 分 注意 ， 因 为 不 管 是 在 微波 炉 里 正在 加 热 的 ， 还 是 刚 加 热 好 的 凝 胶 ， 都 特别 容易 沸腾 。 为 了 减少 过 沸腾 ， 加 热 前 最 好 将 琼脂 糖 加 入 TAE 缓冲 液 中 放置 5~10imn 远 。 这 样 可 以 使 琼脂 糖 颗粒 吸水 膨胀 ， 然 后 再 小 心地 将 琼脂 糖 加 热 者 沸 。 当 制备 高 浓度 的 凝 胶 时 ， 要

特别 小 心 防止 沸腾 的 凝 胶 溅 出 造成 伤害 ， 并 且 避 免 在 烧瓶 或 广 口上 瓶 中 煮沸 大 量 的 凝 胶 二 在 使 用 电炉 加 热 时 应 尤其 注意 。

19.8 RT-PCR 质量 监控 点

当 准 备 使 用 某 核 酸 样品 进行 PCR 时 ， 经 常会 遇 到 的 最 大 问题 就 是 模板 的 完整 性 ， 这 二 问题 在 使 用 RNA 作为 模板 时 就 出 现 了 新 的 意义 。 对 于 那些 研究 基因 表达 的 实验 室 来 说 ， 通 。 256 -

FIVE 反 转 录 聚 合 酶 链 反应

过 PCR 技术 扩 增 某 个 转录 产物 所 使 用 的 引物 和 参数 都 是 很 久 以 前 就 进行 优化 了 的 89。 使 用 新 准备 的 RNA 样品 或 以 前 曾经 可 行 的 RNA 样品 进行 实验 而 未 能 得 到 产物 ， 这 是 十 分 令 人 头疼 的 事情 。 则 需要 结合 上 文 所 述 的 优化 策略 注意 以 下 几 点 。

© 使 用 前 ， 电 泳 检测 RNA 的 质量 。 小 型 的 凝 胶 电 泳 就 可 以 清楚 地 显示 出 18S 和 28S 核 糖 体 RNA (rRNA)。 在 水 溶液 中 而 不 是 在 乙醇 沉淀 中 保存 的 RNA 降解 非常 迅速 。 当 样品 多 次 反复 冻 融 时 ， 这 种 情况 将 急剧 恶化 。 在 本 实验 室 ， 以 前 纯化 的 RNA 在 65C 加 热 5min， 然后 进行 小 型 凝 胶 电 泳 〈1. 2%% 琼 脂 糖 ，1XTAE 中 ; 非 变性 );， 这 一 步 的 目的 是 验证 RNA 的 完整 性 〈 无 需 杂 交 )。 如 果 18S rRNA 和 28S rRNA 条 带 的 亮度 相当 ， 就 可 以 放心 地 使 AY

@ 在 反应 体系 中 只 加 入 一 对 引物 ， 但 不 加 模板 ， 进 行 检测 。 这 一 步 可 以 确定 反应 储备 液 是 否 被 污染 ， 以 及 是 否 有 引物 二 聚 体 的 生成 。

@ 在 反应 体系 中 只 加 入 模板 和 一 条 引物 进行 检测 。 这 是 确定 引物 不 会 发 生 自 身 引 导 ， 并 且 是 检测 引物 配对 特异 性 的 唯一 方法 。 图 19. 5 显示 了 对 新 合成 的 一 对 引物 进行 这 一 质量 监控 实验 的 精确 结果 。

be 2 3. 4 GOO7ESORLOL2SIG 14: 15) 16

图 19.5 引物 自身 引导 的 检测 。 对 两 条 新 合成 的 引物 分 别 测定 它们 的 自身 引导 作用 。 第 2 一 6 泳 道 : 将 100ng 的 来 自 于 五 个 不 同样 品 的 第 一 链 CDNA 加 入 到 只 有 5 引物 的 PCR 反应 体系 中 。 第 10 一 14 泳 道 : 将 100ng 的 同样 来 自 于 五 个 不 同样 品 的 第 一 链 CDNA 加 入 到 只 有 3 引物 的 PCR 反应 体系 中 。 第 7 泳 道 和 第 15 泳 道 为 阴性 对 照 〈 未 加 引物 )， 第 8 泳 道 为 空白 ， 第 9 泳 道 为 阳性 对 照 , 第 1 泳 道 和 第 16 泳 道 为 PCR 的 分 子 量 标准 。 在 只 有 5 引物 的 反应 体系 中 产生 了 大 HH) PCR 产物 ， 说 明 5 引物 具有 自身 引导 的 作用 ， 因 此 5 引物 需要 重新 设计

由 进行 第 一 链 合成 反应 时 ， 在 反应 体系 中 不 加 反 转 录 酶 来 检测 每 一 种 RNA 样品 。 然 后 ， 使 用 管 中 的 样品 作为 模板 进行 PCR。 这 一 样品 被 称 为 “无 RT 对 照 ” 或 “RT- 减 ”对 照 ， 它 应 该 没有 产物 的 生成 。 当 RNA 样品 中 没有 反 转 录 酶 时 ， 并 且 确 定 在 吸取 溶液 时 没有 带 人 和 人 污染， 如 果 这 时 有 条 带 产 生 ， 那 么 就 一 定 是 RNA 样品 中 含有 基因 组 DNA 的 污染 。 大 多 数 实验 室 在 进行 RT-PCR 时 ， 在 分 离 出 RNA 样品 时 就 进行 DNase 处 理 〈 附 录 5)， 然 后 再 进行 RT- 对 照 实验 。

© 用 并 非 有 直接 实验 目的 的 引物 去 检测 难以 检测 的 RNA。 从 特定 生物 材料 中 分 离 得 到 的 完整 的 纯 RNA， 都 可 以 通过 反应 产生 PCR 产物 。 这 可 以 通过 使 用 常用 的 引物 ， 如 BAL

@ 5 RT-PCR 相关 的 技术 将 在 第 20 一 22 章 作 详细 的 介绍 。 。 257 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

看 白 、 组 蛋白 或 GAPDH， 来 确定 有 问题 的 RNA 样品 是 否 可 以 用 来 扩 增 出 产物 s :如果 对 时 引物 的 PCR 产物 非常 明显 ， 而 实验 引物 未 能 产生 PCR 产物 ， 那 原因 就 比较 好 分 析 了 。 没有 信号 就 意味 着 没有 转录 产物 ， 或 者 RNA 样品 量 太 少 ， 不 能 产生 扩 增 反 应 。 后 一 种 情况 可 以 通过 使 用 对 照 引 物 进行 扩 增 来 排除 。

© 确认 不 正常 的 条 带 是 否 为 不 对 称 扩 增 的 产物 。 电 泳 检测 时 可 能 出 现 非 预期 的 条 带 ， 其 长 度 大 约 为 预期 产物 的 一 半 。 这 通常 是 由 于 一 条 链 的 优先 扩 增 造成 的 。 这 种 情况 的 发 生 ， 就 是 由 于 一 种 引物 的 物质 的 量 超过 了 另 一 种 引物 ， 并 且 事实 上 这 种 情况 经 常 发 生 。 这 一 门 是 非常 容易 解决 。 只 要 重新 用 分 光 光 度 计 检查 一 下 引物 的 浓度 。 在 随后 的 实验 中 ， 使 用 稀 厅 为 相同 浓度 的 引物 就 可 以 了 。 这 样 ， 由 于 上 述 原因 产生 的 不 正常 的 条 带 就 会 消失 。

四 明智 地 选择 阳性 对 照 模板 。 阳 性 对 照 的 产物 必须 很 容易 地 与 实验 样品 的 产物 明显 分 开 。 如 果 阳 性 对 照 污 染 了 反应 的 储备 液 ， 实 验 室 的 所 有 工作 都 将 停止 。

19.9 相关 技术

19.9.1 cDNA 5 末端 快速 扩 增 PCR

传统 cDNA 合成 方法 的 一 大 关键 障碍 ， 就 是 未 能 得 到 对 应 于 mRNA 5 末端 序列 的 cDNA 分 子 。 产 生 这 种 问题 的 部 分 原因 ， 是 以 前 合成 EDNA 第 一 链 时 的 反 转 录 过 程 和 PCR 引物 设计 原理 的 限制 。 缺 失 了 5' 未 端 序列 ， 就 不 能 克隆 出 全 长 序列 或 者 确定 出 转录 起 始 位 点 〈TSS) 的 准确 位 置 。 于 是 发 展 出 了 一 种 被 称 为 RACE (cDNA 末端 快速 扩 增 ) 的 方法 (Frohman 等 ，1988)， 主 要 用 于 当 只 知道 转录 产物 的 部 分 序列 时 克隆 其 5 末端 (5 RACE) 、3/ 末 端 (3'RACE) 及 全 长 cDNA 分 子 的 序列 。

5'RACE 有 两 种 策略 。 较 老 的 方法 同样 包括 使 用 下 游 引 物 进行 EDNA 第 一 链 的 合成 ， 所 用 的 引物 可 以 是 oligoCdT)， 也 可 以 是 与 转录 产物 5 末端 区 域 配对 的 基因 特异 性 引物 。 引 物 的 3 未 端 一 定 要 有 游离 的 羟基 才能 起 始 反 转录 反应 的 进行 。 然 后 由 一 种 特定 的 末端 脱氧 核 糖 核 苷 酸 转 移 酶 给 新 合成 的 CDNA 第 一 链 加 尾 ， 即 在 酶 作用 下 在 cDNA 的 3 末端 加 上 已 知 的 核 苷 酸 。 未 端 脱氧 核糖 核 苷 酸 转移 酶 通常 被 称 为 “未 端 转移 酶 ">， 它 能 够 在 DNA 单 链 、 平头 双 链 或 3' 凸 出 双 链 的 3' 末 端 以 非 模板 依赖 方式 加 上 核 昔 酸 ， 如 图 19. 6 所 示 。 以 这 种 方 式 加 上 的 核 苷 酸 被 称 为 锚 定 序列 9。 添加 一 种 类 型 的 核 苷 酸 通 常 被 称 为 同 聚 物 加 尾 反应 ; 此 ，poly(G) 的 锚 定 序 列 可 以 与 poly(C) 的 锚 定 引 物 〈 作 为 上 游 引 物 ) 退火 来 进行 PCR.

DNA 模 板 iD ct nh A a a nae 3 5! dGTP | 未 端 转移 本 TOOECEEEEEETE ET 让 的 人 图 19.6 末端 脱氧 核糖 核 苷 酸 转移 酶 的 作用 。 这 种 特殊 的 酶 也 被 称 为 未 端 转 移 酶 ， 能 够 以 非 模板 依赖 的 方式 在 平 端的 或 凸 出 的 DNA 3’ 末端 加 上 核 苷 酸 。 这 种 活性 应 用 于 许多 PCR 和 克隆 的 方法

@ 以 前 这 种 方法 也 被 称 为 锚 定 PCR (Loh 等 ，1989) 或 单 向 PCR, 。 258 。

第 19 章 反 转 录 聚 合 酶 链 反应

FE, poly(A) 的 锚 定 序列 可 以 与 poly(T) 的 锚 定 引物 退火 。 使 用 这 种 方法 ，PCR 扩 增 就 只 需要 一 条 而 不 是 两 条 基因 特异 性 的 引物 〈 作 为 下 游 引 物 )。 但 是 ， 这 一 方法 最 主要 的 局 限 性 就 是 任何 通过 反 转 录 反 应 生成 的 cDNA 第 一 链 都 可 以 作为 同 聚 物 加 尾 反 应 的 底 物 ， 即 使 是 反 转 录 不 完全 5 末端 缺失 的 cDNA 也 可 以 参加 反应 。 因 此 ， 根 据 下 游 引物 位 置 的 不 同 ， 经 常会 出 现 大 量 的 假 阳性 现象 。

”克隆 转录 产物 5 末端 的 新 的 更 好 的 方法 就 是 RNA 连接 酶 介 导 的 RACE (RLM-RACE) (Maruyama 和 Sugano，1994; Shaefer，1995) 。 这 种 方法 彻底 解决 了 上 述 问题 ， 只 能 检测 到 拥有 完整 5 末端 的 CDNA 分 子 ， 末 端 缺失 的 CDNA 及 部 分 降解 的 转录 产物 延伸 得 到 的 cDNA 都 没有 作用 。 简 要 地 讲 ， 这 种 方法 就 是 在 反 转 录 前 只 在 全 长 未 降解 的 mRNA 的 5 末 端 通过 T4 RNA 连接 酶 加 上 一 段 已 知 序列 的 寡 聚 RNA.

RLM-RACE 过 程 在 图 19. 7 中 列 出 。 经 过 电泳 检测 确认 RNA 样品 的 质量 很 高 后 ， 在 RNA 样品 中 加 入 牛 碱 性 磷酸 酯 酶 (calf intestinal phosphatase, CIP) 去 除 暴 露 在 外 的 5 - 磷 酸 基 团 。CIP 的 作用 不 影响 5 帽子 结构 ， 因 此 那些 已 经 去 掉 了 5 末端 的 帽子 结构 和 部 分 降解 了 的 mRNA 分 子 就 发 生 了 去 磷酸 化 反应 。 结 果 那 些 已 被 破坏 了 的 非 全 长 的 转录 产物 的 5 末

5’ ™G pppN

使 用 锚 定 引物 和 基因 特异 性 引物 进行 扩 增

图 19.7 RLM-RACE 过 程 。 这 一 反应 原理 适用 于 带 5 帽子 的 完整 mRNA 分 子 的 克隆 。 RPA RMA, FER RAT. FF ERE AR AGAR (CIP) 脱 去 部 分 降解 mRNA 5 -磷酸 ， 用 烟草 酸 焦 磷酸 酶 (TAP) 脱 去 全 长 mRNA 的 帽子 ， 露 出 连接 反 应 所 需 的 5 -磷酸 基 团 ; 然后 再 与 RNA 接头 进行 连接 。 非 mRNA、 断 裂 的 mRNA

和 反 转 录 延 伸 未 能 到 达 RNA 接头 的 cDNA 第 一 链 分 子 都 不 能 扩 增 。 RLM-RACE 是 检测 转录 起 始 位 点 非常 有 效 的 工具

° 250" «

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

端 就 变 为 了 羟基 。 此 后 ， 烟 草酸 焦 磷 酸 酶 (tobacco acid pyrophosphatase, TAP) 的 作用 从 5 帽子 上 除去 带 有 o BEAN BENG KE. 这 时 只 有 全 长 mRNA 的 5 末端 有 一 个 磷酸 基 团 可 以 作为 T4 RNA 连接 酶 的 底 物 。 然 后 在 脱 掉 帽 子 的 mRNA 上 连接 上 一 个 RNA 锚 定 序列 (作为 接头 ) 。 部 分 降解 的 和 在 反应 开始 时 就 已 经 脱 掉 帽 子 的 分 子 不 能 参加 反应 ， 因为 这 些 分 子 的 5 未 端 为 羟基 而 不 是 磷酸 基 团 。 连 接 有 锚 定 序列 的 RNA 就 可 以 进行 反 转 录 反 应 。 虽 然 所 有 的 RNA 分 子 都 可 以 与 下 游 引物 退火 进行 反 转 录 反 应 ， 但 是 ， 只 有 能 与 锚 定 序列 特异 性 的 上 游 引物 配对 的 cDNA 才能 够 扩 增 出 产物 。RLM-RACE 方法 还 有 一 个 优点 ， 就 是 可 以 使 用 梨 式 锚 定 引 物 。 这 一 引物 的 设计 可 以 严格 遵循 平均 分 配 碱 基 种 类 、(G 十 C) 含量 的 平均 化 这 些 引物 设计 的 基本 原则 。 而 同 聚 加 尾 的 cDNA fie S| WAY (GTO) SH, BAH 100%, 要 么 是 0% 。 在 本 实验 室 最 近 的 研究 当中 ， 使 用 RLM-RACE 方法 在 一 个 基因 座 中 发 现 了 众 多 的 转录 起 始 位 点 (Bassett 等 ，2004) 。

19.9.2 cDNA 3“ 末 端 快 速 扩 增 PCR

转录 产物 的 3' 未 端 序列 的 克隆 (3'RACE) 通常 没有 5'RACE 那么 困难 。3 RACE 的 标

准 方法 是 使 用 下 游 引 物 进 行 mRNA 第 一 链 的 合成 ， 所 用 引物 的 一 般 结构 如 下 : 5/- 锚 定 序列 -TuV-OH 3’

© 锚 定 序列 是 位 于 oligo(dT) 5 端的 一 段 特 定 的 序列 。

@ Trike Ri PEA oligo(dT) 的 最 短 长 度 〈 可 以 增加 长 度 ) 。

@ 引物 3 末端 的 V 是 一 个 锚 定 核 苷 酸 ， 指 腺 苷 、 胞 苷 或 乌 苷 〈 见 表 19. 5) 。

这 一 结构 就 能 够 将 引物 引导 到 poly(A) 尾 的 5 端 ， 从 而 能 够 反 转 录 到 mRNA 的 编码 区 。 也 可 以 将 下 游 引 物 设 计 成 5 - 锚 定 序列 -TVN-OH 3’, 46 3 末端 有 两 个 锚 定 核 苷 酸 以 增 加 稳定 性 。cDNA 合成 后 ， 可 以 使 用 与 锚 定 序 列 配对 的 锚 定 引物 〈 作 为 下 游 引 物 ) 和 基因 特 异性 引物 〈 作 为 上 游 引 物 ) BE CDNA 的 扩 增 〈 如 图 19. 8) 。 虽 然 也 可 以 使 用 oligo(dT) 作

a 与 合适 的 引物 退火

Me we a 使 用 适当 的 引物 进行 PCR

带 有 mRNA3 人 序列 的 PCR 产 物 图 19.8 3RACE。 通 常 使 用 这 种 方法 来 扩 增 mRNA 3' 末 端 序列 。 这 种 方法 比 传统 的 5 RACE 方法 或 RLM-RACE 方 法 简单 得 多 。 使 用 5' 示 端 有 一 段 接头 的 锚 定 oligo(dT) 引物 ， 可 以 使 引物 定位 在 poly(A) 尾 的 5 端 ， 并 且 在 cDNA

第 一 链 的 5 端 加 上 一 段 新 的 序列 ， 可 以 与 特定 的 3 引物 退火 * 260 -

第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反应

4 3' RACE 的 下 游 引 物 ， 但 是 根据 经 验 ， 尽 量 不 要 使 用 富 含 AT 的 序列 作为 引物 ， 而 oligo (dT) & (A+T) @BIKBTS 100%.

19.9.3 Sst PCR

通常 未 能 产生 PCR 产物 的 原因 ， 可 能 是 由 于 模板 的 丰 度 极 低 ， 或 者 更 为 普遍 的 是 模板 不 纯 。 一 种 解决 的 方法 就 是 将 反应 后 没有 产生 PCR 产物 的 溶液 按 1 : 100 稀释 到 新 的 反应 混 合 物 中 ， 再 进行 30 轮 循环 。 但 是 与 简单 的 增加 反应 循环 数 相 比 ， 一 种 包括 两 套 引物 被 称 为 Rist PCR 的 方法 应 用 得 更 为 广泛 ， 并 能 得 到 更 好 的 结果 ， 当 模板 的 纯度 有 问题 时 ， 表 现 尤 为 明显 。

在 梨 式 PCR 方法 中 ， 两 套 引 物 中 的 一 套 引 物 〈 内 部 引物 ) 被 设计 为 与 另 一 套 引 物 Ob 部 引物 ) 的 扩 增 区 域内 的 序列 碱 基 配 对 ， 这 些 引物 的 相对 位 置 如 图 19. 9 所 示 。 样 品 首先 使 用 外 部 引物 扩 增 30 个 循环 ， 反 应 后 的 溶液 〈 可 以 稀释 ) 使 用 内 部 引物 再 进行 25 一 30 轮 的 扩 增 。 如 果 引 物 设 计 得 当 ， 巢 式 PCR 通常 都 能 够 得 出 令 人 满意 的 结果 。 在 设计 引物 时 ， 要 根 据 前 文 所 述 的 引物 合成 原则 对 四 条 引物 进行 仔细 检查 。

上 游 引物 下 游 引物 Shek 内 部 模板 5’ ， 3" : — —— | 内 部 外 部 外 部 引物 本 内 部 引物 | PCR 产 物 的 产物

图 19.9 Sask PCR。 当 了 PCR 中 遇 到 产物 纯度 问题 时 ， 通 常 需要 设计 两 套 基 因 特 异 性 的 引物 。 起 初 的 PCR 扩 增 反应 使 用 外 部 引物 。 接 着 使 用 位 于 外 部 引物 识别 区 域 以 内 的 内 部 引物 和 第 一 步 反 应 产物 的 稀释 溶液 进行 第 二 次 扩 增 。 这 种 方法 减少 了 第 一 步 反 应 中 产生 的 非特 异性 产物 的 扩 增 ， 从 而 大 大 增强 了 反应 的 特异 性

19.10 实验 万 地 : CDNA 第 一 链 的 合成

实验 前 ， 先 进行 小 型 凝 胶 电泳 检测 RNA 模板 的 质量 。 © 制备 总 混合 液 1。

分 水 oligoCdT)1?~18(1. Ong/pD Ll dNTP(10mmol/L) 总 体积 8ul 随机 引物 (2. Opg/pl)@

@ 将 总 混合 液 1 分 装 至 每 个 反应 管 ， 每 管 8 。 @ MA 2p] RNA 样品 8 (50~1000ng; 确保 每 管 中 加 入 的 量 都 一 致 ) 。

@ 如 果 为 多 个 反应 配制 总 混合 液 ,应 比 所 需 的 总 混合 液 多 配制 一 份 , 因 为 在 吸取 溶液 时 可 能 会 产生 微小 的 误差 。 这 种 标准 的 操作 ,确保 有 足够 体积 的 总 混合 液 。 在 准备 PCR 总 混合 液 时 也 应 遵循 这 一 原则 。

@ 此 外 , 终 浓 度 为 lsmol/IL( 需 加 入 的 体积 是 可 变 的 ?的 基因 特异 性 引物 代替 oligo(CdT) 和 /或 随机 引物 。

@ 不 要 将 RNA 直接 加 入 到 总 混合 液 中 。 将 总 混合 液 等 分 后 再 分 别 加 入 RNA 样品 。

。261 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

® RW EE 70°C HH Smin, RNA 变性 完成 后 ， 将 样品 置 冰 上 至 少 2min。 © 当 RNA MABE HO), tlt ARGH 2.

每 份 | 组 分

AMV 反 转 录 酶 (20U/pl) 总 体积

© 在 变性 的 RNA 样品 管 中 加 入 总 混合 液 2， 每 管 10ml。

(2 水 洽 '5min。

注意 短暂 的 室温 水 浴 的 目的 是 ，@ 以 利于 模板 与 引物 的 退火 @ 使 反 转 录 酶 获得 从 随机 引物 和 /或 oligo(dT) 上 延伸 的 机 会 ， 以 便 在 下 一 步 水 浴 温 度 升 高 时 能 够 有 更 高 的 热 稳 定性 。 这 样 通常 可 以 获得 更 长 的 cDNA 分 子 。

如 果 使 用 的 是 热 稳定 的 或 增强 的 反 转 录 酶 ，50C 水 浴 50min。 否 则 ， 将 样品 在 37°C BK 42°C 7K YG 60min,

ER ”许多 种 类 的 反 转 录 酶 都 可 以 在 高 温 条 件 下 进行 CDNA 第 一 链 的 合成 。 许多 公司 都 有 多 种 现货 可 以 选择 。

@g 将 样品 加 热 到 95C 放 置 5min， 破 坏 反 转 录 酶 。 反 转录 酶 若 没有 灭 活 ， 会 对 接 下 来 的 PCR 过 程 产生 持续 性 的 影响 。

© 新 合成 的 cDNA 第 一 链 应 置 冰 上 ， 这 时 就 可 以 准备 进行 RT-PCR 了 。 另 外 ，cDNA 在 使 用 前 也 可 以 在 一 207C 保存 。

10 X i — tt B op KO RNasin(20U/pl)

19.11 ¢$244: PCR ££ 4 te CDNA

DO 从 获得 许可 的 公司 购买 PCR 试剂 ， 用 它们 制备 PCR 总 混合 液 。 通常 要 制备 50pl 反 应 体系 : 取 Spl 10XPCR 缓冲 液 无 Mg2+ );， 3pl 25mmol/L MgCl 〈 在 优化 时 是 可 恋 的 )， 终 浓 度 为 0. 1umolL 的 上 游 引物 〈 体 积 可 变 ); 终 浓度 为 0. Ipmol/L 的 下 游 引 物 〈 体 积 可 变 ); 0. Sul Tag DNA 聚合 酶 〈 每 个 反应 1. 0 一 2. 5U); 加 水 至 48 yl,

注意 1 如 果 每 个 反应 扩 增 的 序列 不 同 ， 则 不 要 在 总 混合 液 中 加 入 引物 ， 而 应 在 每 个 反应 管 中 直 接 加 入 相应 的 引物 。 如 果 所 有 样品 都 使 用 同一 种 cDNA， 可 以 直接 将 其 加 入 到 PCR MBAR

注意 2 不 要 将 所 有 的 CDNA 都 加 入 到 总 混合 物 中 去 。 至 少 保留 一 些 cDNA 溶液 ， 以 后 可 能 会 使 用 相同 的 模板 、 不 同 的 引物 来 进行 PCR。 即 使 目前 不 用 ， 将 来 也 有 可 能 有 用 。

GO 将 总 混合 液 分 装 到 一 定数 量 的 反应 管 中 ， 每 管 4811。

@ 在 每 个 反应 管 中 加 入 2ul 相应 的 CDNA 第 一 链 的 产物 。

却 如 使 用 没有 热 盖 的 热 循环 仪 时 ， 则 在 每 个 反应 管 中 加 入 30] 的 矿物 油 覆 盖 反 应 液 。 使 用 有 热 盖 的 热 循环 仪 则 无 需 加 矿物 油 。

注意 使 用 矿物 油 会 影响 反应 的 重复 性 ，

© 使 用 以 下 的 通用 循环 程序 。 这 些 参数 已 经 在 Applied Biosystems 9700 型 热 循环 仪 上

@ 型 的 10 义 第 一 链 缓 冲 液 ;:100mmol/L Tris, pH 8. 3;500mmol/L KCli40mmol/L MegCl 。 这 二 缓冲 流通 党 随 反 埋 录 酶 一 起 提供 .

2 -

第 19 章 ，” 反 转录 聚合 酶 链 反应

优化 过 了 。 这 些 循环 参数 ， 在 使 用 新 引物 、 更 换 反 应 液 的 成 分 及 热 循 环 仪 的 型 号 时 ， 都 要 重 新 进行 优化 。

起 始 模板 的 解 链 94°C 2min

循环 变性 94°C 30s 退火 @ 55°C 30s fo 轮 循 环 延伸 13 1min

最 终 的 延伸 tae 5min

保存 4C 直 到 即将 使 用

© 取出 能 被 总 体积 整除 的 数量 的 反应 液 〈50nwl 反应 体系 取出 Su), ， 在 小 型 电泳 装置 上 电泳 检测 产物 的 长 度 和 种 类 。PCR 产物 的 分 析 如 本 章 前 文 所 述 ， 通 常 使 用 配制 在 1XTAE 缓冲 液 中 的 2% ~3.% AY BRA Be BE RE

19.12 PCR 产物 的 克隆

大 多 数 情况 下 ，PCR 技术 扩 增 和 再 扩 增 DNA 序列 的 能 力 取代 了 传统 的 载体 -插入 片段 连接 的 方法 。 毕 竟 ， 如 果 想 得 到 更 多 的 相同 产物 ， 只 需要 使 用 相同 的 引物 进行 再 PCR Bay, 克隆 PCR 产物 是 为 了 : 中 有 利于 测序 ，@ 有 利于 体外 转录 ;四 分 离 混 合 的 PCR 产物 ， 由 使 重组 蛋白 得 到 表达 。 其 中 ， 测 序 和 体外 转录 也 可 以 不 经 克隆 ; 使 用 经 修饰 的 含有 适当 5 启 动 子 序列 的 上 游 引物 和 下 游 引 物 ， 对 PCR 产物 进行 重新 扩 增 ， 就 无 需 使 用 载体 了 。PCR 产 物 可 以 直接 从 琼脂 糖 凝 胶 或 反应 管 中 纯 化 出 来 。 许 多 试剂 盒 都 可 以 用 于 PCR 产物 的 纯化 ， 这 些 试剂 盒 的 操作 都 十 分 简单 。 大 致 的 过 程 如 下 : 将 目的 条 带 从 凝 胶 上 切 下 来 ， 所 得 胶 块 在 iAP (GTC) 溶液 中 溶化 ;或 者 直接 在 PCR 后 的 反应 管 中 加 入 异 硫 氰 酸 肛 ， 产 生 一 个 高 离 液 、 高 盐 的 环境 。 在 这 种 条 件 下 ，PCR 产物 可 以 与 硅胶 质 结合 〈Vogelstein 和 Gillespie，1979) 。 然 后 洗 掉 残 留 的 反应 组 分 ， 包 括 引 物 和 深化 的 琼脂 糖 凝 胶 等 。 纯 化 的 DNA 可 以 在 低 盐 浓度 条 件 下 ， 用 TE (10mmol/L Tris, pH7.5; 0.lmmol/L EDTA) 或 水 从 硅胶 质 上 洗 脱 下 来 。

Qn RY i ETT ERE. ALP TT EB] EGE FE. Tag DNA 聚合 酶 有 一 非常 有 用 的 特点 ， 就 是 在 合成 产物 每 条 链 的 3 末端 各 加 上 一 个 核 苷 酸 ， 这 个 核 苷 酸 通 常 为 A。 这 就 为 一 种 被 称 为 TA 克隆 的 简便 方法 提供 了 基础 。 末 端 带 有 A 突出 的 Tag 酶 产物 ， 可 以 与 两 条 链 的 3 末端 abi AT 突出 的 载体 退火 ， 然 后 进行 连接 反应 〈 如 图 19. 10) 。 可 以 从 公司 购买 ， 也 可 以 自 已 制备 这 种 载体 。 它 应 含有 选择 性 标记 (如 Amp’, Tet’ 或 Kanr)， 并 可 以 用 于 蓝 / 白 斑 筛 选 的 lacZ 基因 。

使 用 A 加 尾 的 产物 进行 克隆 有 如 下 优点 。

使 用 A 加 尾 的 产物 进行 克隆 ， 在 克隆 前 无 需 知 道 PCR 产物 的 序列 。

@ 使 用 这 种 产物 ， 无 需 再 合成 带 有 5 突出 的 限制 性 酶 切 位 点 或 其 他 序列 的 引物 。

@ PCR 产物 的 纯化 虽然 不 是 必需 的 ， 但 是 相当 有 益 。

@ 合适 的 退火 温度 (T,) RRIMAHBRERY TT. 值 。 请 参考 合成 引物 的 厂商 提供 的 引物 说 明 页 。 如 果 不 确 定 如 何 着 手 ， 就 使 用 T.=Ta 一 5C 。 而 且 ，Tan 值 可 以 通过 公式 Tu=2C(AT+TT) 二 4C(G 十 C) 快速 地 估算 。 另 外 ，Ap- plied Biosystems 9700 型 热 循环 仪 具 有 内 置 的 Tn 值 计 算 功 能 。

* 263 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

末端 有 A 突 出 的 插入 片段 _A

A

T T

末端 有 T 突 出 的 载体

图 19. 10 TA 克隆 。 使 用 Tag 聚合 酶 扩 增 得 到 的 PCR 产物 ， 它 每 条 链 的 3 末端 都 有 一 个 核 苷 酸 突出 ， 一 般 为 腺 苷 。 这 就 非常 有 利于 与 末端 有 一 个 胸 苷 突出 的 线性 载体 进行 连接 。 这 种 载体 是 十 分 常见 的 。 总 的 来 说 ，PCR 产物 的 克隆 ， 可 以 用 于 DNA 测序 、

转化 原核 细胞 、 转 染 真 核 细胞 研究 其 表达 以 及 将 多 种 PCR 产物 彼此 分 开

® 大 多 数 工 加 尾 的 克隆 载体 都 含有 lacZ 基因 ， 可 以 进行 蓝 / 白 斑 筛 选 。

© 使 用 半 磷 酸化 的 PCR 产物 〈 其 中 一 条 引物 5 端 磷酸 化 ) 时 ， 可 以 进行 定向 克隆 。

© 载体 的 克隆 位 点 通常 位 于 多 连接 区 域 ， 以 利于 使 用 限制 性 内 切 酶 将 其 切除 。

连接 反应 需要 在 T4 DNA 连接 酶 的 作用 下 进行 几 个 小 时 。 注 意 PCR 使 用 具有 .3 一 5 核 酸 外 切 酶 活性 〈 校 对 活性 ) 的 热 稳 定 酶 产生 平 末端 PCR 产物 ， 除 非 另 外 加 尾 ， 否 则 不 能 用 FTA 克隆 。 这 一 问题 很 好 解决 ， 只 要 对 原来 的 PCR 产物 进行 纯化 ， 除 去 带 有 校对 活性 的 酶 〈 酚 : 氯仿 抽 提 或 者 使 用 PCR 产物 纯化 试剂 盒 ) ， 然 后 在 平 末端 PCR 产物 中 加 入 Taq ¥ 合 酶 ， 于 72C 温 育 10min， 再 进行 一 次 纯化 。 如 果 没 有 进行 第 二 步 纯 化 ， 将 降低 下 三 步 的 连 接 反应 的 效率 。

19.13 $254: FKBPCRAMHKBHA

® 纯化 上 一 步 反 应 的 PCR 产物 〈 可 使 用 PCR Pure Kit, Roche), Q) 制备 加 尾 反 应 液 :

平 末端 PCR 产物 10. Onl 水 7. Opl 10 关 反应 缓冲 液 (Mg2+ ) 2. Onl 10mmol/L dNTP 混合 物 0. Syl Taq 聚合 酶 0. Syl

@ FEF 72°CHF 15min. ® 按照 第 四 步 操作 ， 纯 化 加 尾 的 PCR 产物 。 @) 纯化 的 PCR 产物 一 20 它 保存 。

19.14 $2474: TA 克隆 的 过 接 反 启

为 了 增加 克隆 效率 ， 每 个 PCR 产物 可 以 做 2 一 3 个 连接 反应 ， 载 体 和 插入 片段 的 比例 可 影响 连接 的 效率 。 注意 此 处 只 建议 第 一 次 使 用 者 进行 多 个 连接 反应 。 当 只 需要 一 种 插 人 片段 时 ， 不 需要 大 量 的 转化 株 产 生 ， 因 此 通常 只 要 进行 一 个 连接 反应 就 可 以 了 。

© 按照 如 下 所 述 制 备 连接 反应 。 注 意 应 最 后 加 酶 。 载 体 与 插入 片段 的 比例 可 以 由 研究 。264 -

第 19 章 “” 反 转录 聚合 酶 链 反应

T4 DNA 连接 酶

lul 10ng 0. Ll 补 齐 至 yl Lpl 10ng 1. Opl 补 齐 至 yl 1 各 10ng 2. Ol 补 齐 至 Oyl

@ 加 入 连接 酶 后 ， 用 微量 移 液 器 的 枪 头 轻 轻 吹 吸 反 应 液 使 之 混 匀 。

@ 于 16C 温 育 至 少 3h。

注意 “为 经 过 转化 和 铺 板 得 到 大 量 克隆 ， 连 接 反应 通常 反应 过 夜 。

四 在 冰 上 融化 于 一 80C 冻 存 的 感受 态 细 胞 。

注意 ”感受 态 细胞 应 事先 买好 或 制备 好 。 确 保 所 用 菌株 可 以 使 用 蓝 / 白 斑 筛选 系统 ，JM109 菌株 的 大 肠 杆菌 感受 态 细胞 (Promega) 符合 所 需要 求 。

@ 吸取 20pl 感受 态 细胞 加 入 预 冷 的 微量 离心 管 中 。

© 每 管 加 入 1pl 连接 反应 液 ， 用 枪 头 轻 轻 吹 吸 混 匀 。

G@ 将 反应 管 放 入 冰 浴 20min,

将 反应 管 于 42 水 浴 恰 好 45s， 不 要 摇动 管子 。

注意 ”在 所 有 步骤 中 热 激 是 最 重要 的 一 步 ， 经 常 决定 了 转化 的 成 败 。 不 要 使 用 比 这 里 推荐 的 更 高 的 温度 和 更 长 的 时 间 。

@ 马上 将 管子 置 冰 上 2min。

@ 加 入 4000p] 室温 的 LB 培养 基 或 SOC 培养 基 @ 。

@ 37°CH ARF (200r/min),

四 R10~100pl 转化 反应 液 ， 加 到 含有 相应 抗生素 的 LB 琼脂 平板 上 。 剩 余 没 有 使 用 的 转化 反应 液 于 4C 保 存 。

@ 用 无 菌 玻璃 三 角 棒 将 转化 反应 液 尽量 均匀 涂 布 在 培养 基 表 面 。

@ 罗 平板 向 上 放置 至 少 5min， 使 溶液 充分 被 琼脂 吸收 。

© 倒置 平板 37C 培 养 过 夜 。

© 第 二 天 早上 ， 尽 早 将 平板 从 培养 箱 中 取出 ， 这 样 可 以 减少 卫星 菌落 的 形成 。

四 要 检测 平板 上 的 菌落 是 否 为 转化 株 ， 使 用 无 菌 的 牙签 8 挑 取 要 检测 菌落 的 一 部 分 ， 直 接 将 这 部 分 活 菌 接种 到 100n1 PCR 反应 混合 物 中 : 10.0pl 10 X PCR 反应 缓冲 液 〈 含 Mg?*); 2p1 10mmol/L dNTP; 0. 5ymol/L 下 游 引 物 〈 体 积 可 变 ); 0.5pmolL 上 游 引物 (体积 可 变 );， 1lpl Tag 聚合 酶 ， 加 水 至 98ml。

注意 1 PCR 的 加 热 步骤 将 使 加 入 反应 液 中 细菌 细胞 解 离 ， 可 以 使 引物 与 质粒 上 的 模板 〈 如 插入 片 段 ) 识别 配对 。

注意 2 不 要 加 入 太 多 的 菌 体 。 否 则 扩 增 反应 会 被 抑制 。 只 要 用 牙签 接触 一 下 菌落 表面 就 足够 。

8 如 果 需 要 的 话 ， 使 用 矿物 油 覆 盖 在 反应 表面 。 使 用 与 生成 PCR 产物 同样 的 扩 增 参数

Lpl

@ LBS (Ft): 10g RAM, Sg 酵母 提取 物 ，10g NaCl; MIEKA. SOC HHH (EH): 20g RAM, Se 酵母 提取 物 ，0. 6g NaCl, 0.19g KCl, 2g MgCl, 2.5g Mg SO 3. 6g 葡萄 糖 ;， 高 压 灭 菌 。

@ 大 量 的 报道 发 现 ， 某 些 品牌 的 木 制 牙 签 中 含有 PCR 抑制 剂 。 在 使 用 木质 牙签 挑 取 克隆 之 前 最 好 先 对 其 进行 反应 抑制 检测 。 既 简单 又 好 的 解决 办 法 就 是 使 用 塑料 牙签 或 灭 菌 的 一 次 性 接种 环 。

¢ 265 。

RNA 研究 方法

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南

进行 扩 增 反应 。

@ 扩 增 完成 后 ， 取 一 定量 的 反应 液 〈 如 10pl) EFT Sa EE IB HK 含有 插 人 片段 的 菌落 可 以 扩 增 出 与 克隆 前 PCR 产物 大 小 相同 的 片段 。

® 回 到 可 以 生成 PCR 产物 的 原始 菌落 ， 将 剩余 的 菌落 重新 划一 个 平板 并 且 为 长 期 保存 制备 甘油 菌 。

19.15 TOPO % f

TOPO 克隆 的 方法 CInvitrogen) 是 另 一 种 新 颖 的 广泛 应 用 的 克隆 PCR 产物 或 双 和 链 DNA 的 方法 。TOPO 克隆 的 关键 是 使 用 了 Vaccinia 病毒 的 拓扑 异 构 酶 工 。 该 酶 既 可 以 作为 序列 特异 性 的 限制 性 酶 (CCCTT) ， 又 可 以 作为 连接 酶 。 这 种 方法 十 分 快捷 有 效 ， 通 常 具 要 在 室温 花 5min， 就 可 以 获得 大 于 95% WH MMR. TOPO 克隆 的 方法 适用 于 TA 克隆 、 平 未 端 克隆 及 定向 克隆 。 针 对 于 不 同 的 克隆 要 求 ， 有 多 种 TOPO 载体 可 以 选用 。IOPO 载体 已 经 线性 化 ， 并 且 拓 扑 异 构 酶 [也 已 经 通过 3'- 磷 酸 酷 氨 酸 键 固 定 了 (Shuman, 1994); 这 种 载体 被 称 为 “活化 的 ”载体 ， 并 且 不 会 自 连 。 要 想 成 功 地 与 TOPO 载体 相连 接 ，DNA if 入 片段 就 需要 有 游离 的 5 末端 羟基 ， 即 生成 PCR 产物 的 引物 不 能 有 5 -磷酸 基 团 。 如 果 要 克 隆 的 EDNA、 基 因 组 DNA 或 限制 性 酶 切片 段 的 5 末端 有 磷酸 基 团 ， 就 必须 先进 行 脱 磷酸 ， 这 一 步 是 很 容易 操作 的 。 使 用 TOPO 载体 进行 连接 的 温 育 时 间 通 常 很 得， 按照 要 求 只 需要 5min。 在 进行 连接 反应 时 ， 拓 扑 异 构 酶 [就 从 重组 质粒 上 脱离 下 来 。 细 菌 转 化 的 过 程 按 通 常 的 操作 不 变 。

了 .06 一 大

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第 19 章 ” 反 转录 聚合 酶 链 反应

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(FE; SHER) * 267 -

S208 ESB PCR RIL

20.1 基本 原理

作为 一 种 被 广泛 使 用 的 分 子 技术 ，PCRe@ 自 诞生 以 来 便 给 生物 技术 的 各 个 领域 带 来 了 革 新 。 简 而 言 之 ，PCR 扩 增 是 在 引物 介 导 下 ， 通 过 酶 催化 作用 ， 对 特定 基因 组 DNA 或 cDNA 序列 进行 扩 增 。 不 断 地 重复 进行 样品 变性 、 引 物 退 火 和 引物 延伸 ， 超 过 25 一 30 个 循环 ， 将 导致 丢 分 子 的 数量 以 指数 倍增 。 在 此 ， 强 烈 建议 那些 还 不 熟悉 基于 RNA 的 PCR 扩 增 机 制 的 读者 ， 在 完整 读 完 第 19 章 后 ， 再 阅读 本 章 。

无 论 是 出 于 克隆 目的 还 是 为 了 间接 测定 转录 丰 度 ， 历 史上 合成 cDNA 最 大 的 困难 有 : @ 无 法 生成 接近 全 长 具有 代表 性 的 CDNA 分 子 ; @ 反 转录 过 程 本 身 效率 低 。 如 今 ， 克 服 这 些 困难 直接 得 益 于 : CRNA 模板 的 质量 ; QRNA 模板 的 数量 ;GDcDNA 合成 方法 本 身 的 改 HE (FES 18 章 有 详细 的 讨论 ) 。

PCR 技术 能 提供 无 与 伦比 的 扩 增 优势 ， 其 他 传统 克隆 方法 对 RNA 分 子 纯度 和 完整 度 的 要 求 较为 严格 ， 但 PCR 所 需 的 RNA 样品 量 和 纯度 要 求 都 比较 低 。PCR 能 有 这 一 优势 ， 是 因为 PCR 引物 只 对 模板 的 一 部 分 进行 扩 增 。 与 传统 的 cDNA 合成 或 Northern 分 析 相 比 ， PCR 扩 增 对 部 分 降解 的 RNA 具有 更 高 的 耐 受 性 。 尽 管 如 此 ， 就 定量 而 言 ， 起 始 RNA 样品 量 的 多 少 和 整体 扩 增 效率 仍然 是 PCR 扩 增 的 关键 参数 。

如 今 ， 基 于 PCR 技术 转录 测定 实验 灵敏 度 是 非常 出 众 的 。 每 个 月 都 会 有 创新 ， 或 是 改 进 灵 人 敏 度 极限 的 新 方法 见 诸 报道 。 但 是 ， 无 论 如 何 改进 也 不 能 达到 绝对 的 定量 。 人 为 造成 的 错误 无 论 多 么 微小 ， 总 会 给 绝对 精确 度 带 来 种 种 挫败 性 的 变数 。

20.2 R&B 36 tH. 本 书 中 罗列 了 数 种 分 离 RNA 及 其 后 续 鉴 定 的 方法 。 就 某 个 具体 实验 的 整体 可 靠 度 和 灵 敏 度 而 言 ， 应 该 明确 的 是 ， 这 些 方法 都 各 有 利 静 。 相对 丰 度 常用 来 描述 一 组 实验 样品 的 RNA 水 平 ， 其 含义 是 ， 确 定 样本 中 某 三 不 为 对 昭 (或 称 基线 ) 并 赋予 数值 1 0， 其 他 样品 则 通过 与 其 比较 而 获得 数值 。 但 要 注意 的 是 ， 测 得 的 相对 丰 度 与 测定 方法 的 相对 灵敏 度 直接 相关 。 对 相同 实验 样品 ， 采 用 不 同 的 测定 方法 往往

@ PCR 技术 现在 是 Roche Molecular Systems, Inc. 455 F. Hoffmann-LaRoche Ltd. 所 拥有 的 专利 ， 需 要 经 过 他 们 的 有 限 专利 授权 方 可 使 用 。PCR 必须 使 用 经 授权 的 热 循环 仪 进行 。 欲 知 更 多 信 息 可 与 Applied Biosystems 专利 许可 主管 ，850

Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404 KFA.

° 268 -

第 20 章 定量 PCR 技术

会 得 到 有 巨大 差别 的 结果 。 下 面 列 出 了 几 种 常用 转录 测定 方法 的 相对 灵敏 度 ， 称 为 RNA 灵敏 度 指标 CRNA sensi- tivity index) 。 这 些 实验 按照 它们 的 灵敏 度 高 低 简要 地 竖 排 如 下 。 灵 人 敏 度 指标 综合 了 三 个 因 素 : 技术 的 内 在 难度 、 可 重复 性 和 目前 能 达到 的 灵敏 度 平 均 水 平 。 以 下 按 排名 ， 列 出 了 几 种 可 用 于 转录 定量 的 标准 实验 。

人 实时 PCR Greal-time PCR) | 竞争 PCR(competitive PCR) 半 定 量 PCR(semi-quantitative PCR) 核 逃 逸 实验 Cnuclear runoff assay) 核糖 核酸 酶 保护 实验 (RNase protection assay)

Sl 核酸 酶 保护 实验 (S1 nuclease protection assay) Northern 分 析 (Northern analysis) 斑点 印迹 分 析 (dot blot analysis)

本 书 前 面 各 部 分 的 讨论 已 经 阑 明了， 并非 灵敏 度 指标 排名 靠 后 的 实验 方法 就 不 能 提供 有 效 信息 这 一 事实 。 例 如 ， 经 典 的 转录 分 析 技 术 一 一 Northern 分 析 ， 可 以 提供 由 某 指 定 基 因 座 编码 合成 的 mRNA 的 天 然 长 度 ， 这 一 结果 是 其 他 灵敏 度 指标 排名 靠 前 的 方法 所 无 法 获 得 的 。

20.3 定量 万 法

所 有 定量 的 方法 都 是 为 了 对 转录 本 进行 定量 或 是 为 了 确认 基因 拷贝 数 而 发 展 起 来 的 。 本 章 着 重 讨论 的 是 对 转录 本 进行 定量 的 方法 。 由 于 样品 与 样品 间 cDNA 合成 效率 的 差异 RNA 的 定量 就 一 直 是 一 项 有 挑战 性 的 工作 。 在 很 多 事例 中 ，cDNA 合成 效率 的 差异 是 由 样品 中 的 化 学 残留 物 ， 如 乙醇 、 异 丙 醇 或 是 从 生物 材料 中 分 离 RNA 过 程 中 残留 的 苯酚 造成 的 。 起 初 ， 研 究 者 们 试图 利用 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 来 测定 转录 本 的 丰 度 ， 因 为 他 们 认 识 到 PCR 终 产物 数量 依赖 于 反 转 录 酶 CRT) 的 效率 和 PCR 所 选择 的 热 稳 定 酶 的 效率 。 由 于 一 种 技术 的 总 体 效 率 是 相关 各 步骤 效率 的 综合 效应 ， 因 此 ， 任 何 一 种 可 靠 的 定量 方法 必须 将 这 两 种 酶 促 反 应 的 相对 效率 计算 在 内 。 要 记 住 “灵敏 度 指标 ”也 是 因 人 而 异 的 。 目 前 有 两 种 被 广泛 认为 灵敏 度 最 高 的 定量 技术 ， 即 竞争 PCR 和 实时 PCR。 有 趣 的 是 ， 虽 然 这 两 种 方 法 都 是 独立 的 实验 ， 但 也 可 以 将 二 者 结合 起 来 对 转录 丰 度 进行 精确 定量 。

实验 中 进行 标准 化 处 理 是 为 了 能 更 好 地 比较 各 个 样本 ， 这 一 操作 在 研究 的 极 早 期 就 已 开 始 了 。 就 RT 的 反应 产物 而 言 ， 过 去 对 cDNA 样品 进行 的 标准 化 处 理 一 般 基 于 反应 输入 的 样 品 量 〈 质 量 )， 通 常 是 : ORR MRE CDNA Hi: ORF Azio 测 定 ; 图 基于 少 量 〈cpm) 同位 素 示 踪 ， 在 cDNA 中 挫 和 少量 同位 素 。 尽 管 以 上 这 些 方法 可 以 让 研究 者 在 细 胞 生化 水 平 上 有 较为 合理 精确 的 认识 ， 但 现在 出 现 了 一 种 更 为 可 靠 的 标准 化 操作 ， 即 测量 一 些 对 照 序列 或 参照 序列 ， 比 较 它 们 与 研究 目标 序列 在 反应 中 的 行为 。 在 实验 中 增加 这 样 一 个 对 照 是 至 关 重 要 的 ， 因 为 cDNA 合成 的 本 性 多 变 ， 通 常 其 反应 效率 的 范围 是 10% 一 90%% 。

由 于 PCR 是 个 指数 增长 的 过 程 ， 因 此 模板 的 扩 增 程度 可 用 以 下 方程 描述 :

¢ 269 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

N=No(1+ef f)” hep ND EE No 起 始 模板 数 ; e 一 一 反应 效率 ; -一 一 完成 的 循环 数 。

要 特别 注意 的 是 ， 这 个 数学 模型 可 以 用 来 估计 给 定 反应 管 中 PCR 扩 增 的 潜力 。 由 于 每 个 已 完成 的 循环 都 会 使 每 个 进行 中 的 “变性 一 退火 一 延伸 ” 扩 增 循环 的 效率 发 生 改变 。 在 理 想 条件 下 ， 恰 当 安 排 实验 ，PCR 扩 增 应 该 对 实验 模板 和 对 照 模板 产生 同样 的 影响 。

20.4 内 源 和 参照 物

技术 不 稳定 和 研究 者 日 常 的 结果 差异 ， 常 常 是 从 实验 室 技术 到 数据 分 析 ， 几 乎 发 生 在 每 个 科学 研究 层次 的 误差 所 造成 的 。 为 了 至 少 阑 明 这 一 潜在 问题 的 一 个 方面 ， 常 用 的 方法 是 ， 测定 一 个 称 为 参照 基因 或 看 家 基因 的 内 源 参 照 物 或 内 源 性 标准 的 表达 ， 这 类 基因 的 表达 是 与 基础 细胞 代谢 相关 联 的 。 总 的 指导 思想 ， 就 是 要 确认 那些 基因 的 表达 不 会 改变 ， 或 是 至 少 在 实验 条 件 下 被 调控 的 程度 是 最 小 的 。

利用 看 家 基因 的 转录 物 ， 可 以 对 两 个 或 更 多 样品 进行 标准 化 处 理 ; 在 检测 目的 基因 之 前 或 之 后 ， 在 同一 张 膜 上 或 同一 个 样品 系列 里 可 以 测 得 看 家 基因 。 就 这 点 而 言 ， 需 要 重申 的 事 实 是 ， 由 于 技术 机 制 所 限 ，Northern 分 析 普 遍 存 在 灵敏 度 低下 的 问题 。 为 了 达到 更 高 的 灵 敏 度 ， 可 以 选用 核酸 酶 保护 实验 (第 16 章 ) 和 以 RT-PCR 为 基础 的 方法 (第 19 章 ) 。 无 论 用 哪 种 方法 ， 测 定 看 家 基因 都 是 必要 的 。 除 此 之 外 ， 有 些 研 究 者 为 了 能 对 反 转 录 效 率 和 PCR 终 产 物 进行 精确 定量 ， 喜 欢 在 RNA 样品 中 摊 和 已 知 数量 的 外 源 参 照 模板 〈 在 后 面 论 及 )。 但 是 要 注意 的 是 ， 尽 管 挫 人 法 可 以 对 某 种 特定 的 目标 转录 本 进行 精确 定量 ， 但 是 对 确 认 细胞 的 整体 转录 状态 并 没有 帮助 。

研究 者 应 该 知道 ， 至 今 并 不 存在 一 个 可 以 适用 于 任何 系统 、 任 何 条 件 的 全 能 性 对 照 “《 参 比 ) 基因 。 这 是 一 个 生物 事实 。 即 使 是 常 被 用 作对 照 的 组 成 型 看 家 基因 ， 在 细胞 中 的 表达 常 常 也 是 有 差别 的 。 这 在 恶性 疾病 相关 的 RNA 测试 中 尤为 明显 。 基 于 这 个 自然 规律 ， 没 有 二 个 内 参照 是 适用 于 所 有 条 件 的 。 幸 运 的 是 化 上 小 小 代价 ， 总 能 在 单个 模型 系统 里 确认 出 1 之 2 个 可 用 的 内 参照 。 为 了 保证 结果 精确 可 信 ， 较 为 明智 的 做 法 是 在 测定 时 至 少 选用 两 不 不 同 的 内 参照 基因 。 但 是 ， 一 个 大 问题 是 ， 灵 敏 的 PCR 显示 在 实验 刺激 下 ， 这 些 曾 被 认为 是 相 对 稳定 的 序列 ， 在 转录 丰 度 上 可 能 会 有 很 大 的 改变 ， 因 此 需要 赁 经 验 考 虑 它们 的 适合 度 .

下 述 基因 是 一 些 报道 中 常见 的 参照 基因 。 为 了 结果 的 可 靠 性 ， 尽 管 下 列 所 述 趟 可 能 毫 无 遗漏 ， 但 是 确实 突出 了 那些 最 常 被 考虑 用 作对 照 的 基因 。 某 个 基因 的 转录 本 是 否 合适 用 作 内 参照 转录 本 ， 这 完全 取决 于 在 研究 条 件 下 该 研究 系统 内 的 生化 状况 。 尽 管 没有 哪 种 基因 的 表 达 可 能 在 任何 条 件 下 都 维持 不 变 ， 那 些 在 改变 的 实验 条 件 下 表达 差异 最 小 的 就 是 作为 内 参照 最 好 的 选择 。

© 有 B- 肌 动 蛋白 〈B-actin) 是 一 个 组 成 型 表达 、 中 等 丰 度 的 转录 本 ;几乎 在 所 有 细胞 类 型 中 都 发 现 了 它 的 异 构 体 (Kinoshita, 1992), B-actin 也 是 历史 上 第 一 个 被 用 作 内 参照 的 基 因 ， 至 今 仍 常 被 使 用 。 但 是 ， 大 量 报道 反复 证 明了 p-actin 在 若干 外 界 刺激 和 细胞 质 刺 激 下

表达 有 所 改变 《Leof F, 1986; de Leeuw 等 ，1989; Dodge %&, 1990; Solomon 等 , 1991; + 270 -

$208 定量 PCR 技术

Spanakis, 1993).

@ 甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 «Cglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), '?& 丰 度 的 糖 酵 解 关键 酶 。GAPDH 的 转录 本 被 广泛 用 作 参 比 基 因 或 对 照 。 像 fp-actin 的 情况 一 样 ，GAPDH 的 表达 也 在 若干 实验 条 件 下 有 所 改变 (Alexander 等 ，1990; Mansur 等 ， 1993; Bhatia #, 1994; Lau 等 ，2000) 。

@ 亲 环 蛋白 (cyclophilin) 是 一 种 参与 肽 键 异 构 化 的 蛋白 质 ， 其 基因 高 度 保守 ， 其 RNA 在 细胞 质 内 中 等 丰 度 表达 。 亲 环 蛋 白 A 又 称 肽 基 且 氨 酸 异 构 酶 。 尽 管 通常 用 作对 照 转 录 本 ， 也 已 证 明 亲 环 蛋 白 mRNA 的 表达 差异 (Danielson 等 ，1988; Haendler 和 Hofer, 1995; Feroze-Merzoug 等 ，2002) 。

四 AGA (histones) 是 核 小 体形 成 所 必需 的 一 类 家 族 蛋 白 。 其 转录 本 是 丰富 的 ， 通 常 作为 看 家 基因 被 检测 «(Farrell 和 Greene, 1993; Robert 等 ，2002) 。

© 次 黄 味 叭 - 鸟 苷 磷酸 核糖 基 转 移 酶 (hypoxanthine-guanosine phosphoribosyl transfer- ase，HPRT 或 HGPRT)， 因 其 在 细胞 中 回收 核 苷 酸 再 利用 的 能 力 而 闻名 。HPRT 为 组 成 型 ， 以 极 低 水 平 表 达 〈Pernas-Alonso 等 ，1999) 。 但 是 HPRT 水 平 是 有 波动 的 ， 尤 其 是 在 增殖 细胞 中 表达 会 被 上 调 (Steen 等 ，1990) 。

© 二 氧 叶酸 还 原 酶 (dihydrofolate reductase, DHFR) 是 合成 味 哈 、 胸 苷 酸 和 甘氨酸 所 需 的 酶 ， 同样 ， 它 的 表达 是 细胞 生长 所 必需 的 。DHFR 作为 看 家 基因 和 参 比 基因 被 广泛 引用 (Linton 等 ，1989; Horikoshi 4, 1992; Oleary 等 ，1994; Balajee 等 ，1999)

@ 26S 蛋白酶 体 (26S proteosome) 由 几 个 亚 基 组 成 ， 负 责 真 核 细 胞 的 蛋白 质 裂 解 [ 泛 肽 -蛋白酶 体 途 径 〈ubiquitin-proteosome pathway)]。 针 对 26S 蛋白 酶 体 的 某 个 亚 基 设计 的 引物 和 探 针 在 若 于 转录 测定 实验 中 被 用 作对 照 (Bassett 等 ，2004; 综述 见 Voges 等 ， 1999).

@ 其 他 的 基因 ， 包 括 纤 粘连 蛋白 〈fibronectin， 丰 富 的 转录 本 ， 存 在 于 细胞 外 基质 )、 FERRE ASK (transferrin receptor， 中 低 丰 度 表 达 ， 摄 铁 )、 泛 肽 “〈ubiquitin， 一 种 小 蛋白 质 ， 介 导 其 他 蛋白 质 经 由 蛋白 酶 体 降解 )、 核 纤 层 蛋白 〈lamin)、 微 管 蛋白 (tubulin, BRK 微 管 ) 和 胆 色 素 原 脱 氮 酶 Cporphobilinogen deaminase, PBGD; 位 于 细胞 质 ， 负 责 亚 铁血 红 素 生物 合成 的 酶 ;Chretien 等 ，1988) 的 mRNA 被 广泛 用 作对 照 。 这 些 基 因 表 达 的 蛋白 质 产 物 ， 在 细胞 中 都 有 其 特定 的 功能 。 虽 然 总 是 有 些 例 外 ， 但 总 的 来 说 ， 这 些 基 因 的 表达 在 mRNA 水 平 波动 的 可 能 性 较 小 。 但 是 ， 第 一 件 事 是 要 进行 检测 。

@ 28S rRNA 和 18S rRNA 是 核糖 体 基因 转录 后 调节 的 产物 ， 高 丰 度 ， 其 转录 产物 几 乎 恒定 不 变 ， 经 常用 作 内 源 参 照 物 (de Leeuw 等 ，1989; Bonini 和 Hofmann, 1991), # 转录 本 是 成 熟 核 糖 体 的 重要 组 成 成 分 。 笔 者 认为 ， 将 28S rRNA 和 18S rRNA 用 作 电 泳 加 样 量 对 照 ， 比 把 它们 当 作 基因 表达 对 照 更 为 恰当 。 因 为 28S rRNA 和 18S rRNA 是 RNA 聚合 酶 工 的 产物 ;而 mRNA 和 未 剪接 前 体 hnRNA 则 是 RNA 聚合 酶 开 转 录 合 成 的 。 这 些 RNA 聚合 酶 对 不 同 的 生物 异 源 物 具 有 不 同 的 敏感 性 。 因 此 有 可 能 某 种 实验 操作 在 完全 抑 fil RNA 聚合 酶 下 转录 活力 时 ，RNA 聚合 酶 [和 了 RNA 聚合 酶 亚 的 活力 丝毫 未 受 影 响 ， 反 之 亦 然 。

@ 线粒体 16S rRNA， 中 等 丰 度 ， 位 于 线粒体 内 。 与 细胞 质 中 的 16S rRNA 相 比 ， 很 少 用 作 内 源 参照 物 。 尽 管 它 们 是 rRNA 而 非 mRNA， 同 样 具 有 第 @@ 点 所 谈 到 的 问题 。 有 报道 称 ， 实 验 操作 对 这 些 由 线粒体 编码 的 基因 表达 所 造成 的 影响 ， 远 低 于 那些 定位 在 细胞 核 内 的

* 271 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

rRNA 基因 (Tepper 等 ，1992) 。

@ tRNA 中 包含 大 量 在 翻译 过 程 中 负责 把 氨基 酸 转运 到 核糖 体 上 的 高 丰 度 转录 本 。 有 时 会 用 tRNA 特异 性 探 针 来 检测 tRNA 的 总 量 ， 作 为 加 样 量 的 对 照 。tRNA 由 了 RNA 聚合 酶 贡 转 录 合 成 ， 因 此 更 适合 作为 加 样 量 的 对 照 ， 而 不 是 作为 基因 表达 的 对 照 ， 理 由 同 第 @ 点 所 述 。

20.5 外 源 和 参照 物

确定 基因 表达 差异 的 必要 性 是 无 可 置疑 的 。 将 已 知 数量 的 外 源 转录 本 迭 和 人 RNA 样品 内 ， 可 能 会 对 精确 测定 样品 真实 的 转录 丰 度 有 很 大 帮助 。 外 源 转 录 本 可 以 由 体外 转录 得 到 (Krieg 和 Melton，1987) ， 也 可 以 如 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 (ribulose biphosphate carboxyl- ase; Smith 等 ，2003) 那样 购买 获得 。 这 是 外 源 参 照 的 一 个 例子 。 根 据 具 体 的 研究 计划 ， 选用 的 外 参照 模板 可 以 与 研究 目标 转录 本 毫 不 相干 。 就 这 一 点 而 言 ， 在 动物 RNA BA 物 转录 本 可 能 是 特别 有 效 的 策略 ， 例 如 与 光合 途径 相关 的 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 在 动物 系统 里 完全 不 可 能 存在 。 采 用 这 类 对 照 时 ， 在 裂解 缓冲 液 内 直接 加 入 1 一 5ng 核 酮 糖 三 磷酸 羧 化 酶 mRNA 就 和 动物 来 源 的 目标 mRNA 一 起 被 纯化 和 反 转 录 。 因 此 ， 在 整个 分 离 过 程 中 ， 内 源 转录 本 和 外 源 转 录 本 就 完全 暴露 在 同样 的 化 学 环境 和 物理 操作 之 下 。

还 有 另 一 种 做 法 。 如 果 和 至 少 一 个 目标 转录 本 相关 ， 那 么 外 源 转录 本 就 应 该 是 一 个 目标 转录 本 的 截 短 版 本 ， 这 样 : 中 它 可 以 和 目标 转录 本 一 起 被 引物 和 /或 探 针 识别 ， 并 拥有 和 目 标 转录 本 相似 的 热 动力 稳定 性 ; @ 在 电泳 中 表现 为 一 条 独立 的 条 带 ， 可 以 和 目标 转录 本 充分 分 开 。 这 类 与 目标 转录 本 相似 的 转录 模板 有 时 被 称 为 “仿制 品 ”， 因 为 它们 模拟 了 真实 模板 的 特性 并 同样 被 扩 增 。 沿 用 这 一 逻辑 ， 在 RNA 样本 中 挫 入 一 个 随后 可 以 用 作 RT-PCR 的 真 实 转 录 本 ， 如 免 球 蛋白 mRNA,， 也 会 非常 有 用 。 这 样 〈 外 源 的 ) 免 球 蛋 自 转录 本 将 和 样本 中 原 有 的 其 他 转录 本 一 起 ， 以 同样 的 效率 进行 反 转 录 和 PCR 扩 增 。 由 于 在 各 个 样品 中 挫 信 的 免 球 蛋白 mRNA 的 量 是 已 知 的 ， 因 此 球 蛋 白 特 异性 PCR 产物 的 数量 就 可 以 作为 标准 化 处 理 的 基础 ， 也 可 以 作为 比较 各 管 反 转录 效率 的 一 个 指标 。 诸 如 此 类 的 操作 通常 是 ， 尤 其 是 追 求实 验 数据 重复 性 时 鉴别 数据 变异 原因 的 有 效 标志 。 此 外 ， 通 过 在 样品 中 挫 人 不同 数量 的 外 参照 ， 就 可 以 建立 一 个 标准 曲线 ， 借 着 比较 标准 实验 条 带 质量 和 观察 到 的 实验 条 带 强度 来 定 量 测定 实验 数据 。

1989 年 ，Wang 等 人 首次 提出 了 使 用 外 源 转录 本 作为 对 照 ， 平 行 于 实验 转录 本 进行 反 转 录 和 PCR 扩 增 。 他 们 描述 的 载体 pPAW108 (由 American Type Culture Collection, Manas- sas, VA 提供 ) 包含 有 12 个 不 同 靶 基因 序列 ， 可 以 被 55 和 3 引物 识别 。 简 而 言 之 ， 就 是 把 这 些 基因 的 序列 串联 在 一 起 ， 构 建 在 T7 RNA 聚合 酶 启动 子 的 5 未 端 和 二 个 编码 了 poly (A) 尾巴 序列 之 间 。 这 就 为 生产 大 量 互补 RNA (cRNA) 打 好 了 基础 。 由 于 新 合成 的 cRNA 可 以 用 亲 和 层 析 〈 第 7 章 ) 纯化 ， 并 用 分 光 光 度 法 进行 定量 〈 第 8 章 )， 因 此 它 的 浓 度 是 精确 可 知 的 。 如 果 在 反 转 录 前 就 挫 人 到 实验 用 RNA 中 ， 那么 cRNA 就 可 用 作 内 标 。 cRNA 与 目标 RNA 处 于 同样 的 物理 和 化 学 环境 中 ， 这 样 就 把 看 家 基因 和 目标 转录 本 之 间 、 不 同样 本 之 间 的 反 转 录 及 PCR 的 效率 差异 降 到 了 最 小 @

@ 也 可 以 利用 标准 CRNA 来 提高 Northern 分 析 的 定量 范围 〈《Wang 等 se 272 «

» 1993),

第 20 章 定量 PCR 技术

要 特别 注意 的 是 CRNA 既 可 以 是 “正义 ”的 也 可 以 是 “ 反 义 ” 的 ， 其 中 前 者 的 行为 和 天 然 mRNA 基本 一 致 ， 而 后 者 则 和 天 然 mRNA 互补 。 由 于 反 义 转录 本 可 以 和 mRNA 结合 形 成 热 动 力学 极为 稳定 的 双 链 ， 在 核酸 酶 保护 等 实验 中 具有 应 用 价值 ， 在 前 面 的 章节 里 曾 被 称 作 极 好 的 探 针 。 但 是 在 定量 的 情况 下 ， 目 的 cRNA 是 体外 转录 中 产生 的 正义 形式 ， 因 为 只 有 正义 的 cRNA 才能 在 CDNA 合成 和 PCR 中 成 为 比 天 然 mRNA 小 的 竞争 分 子 。 为 了 使 cRNA 扩 增 产物 能 明确 地 和 mRNA 扩 增 产物 区 别 开 ， 最 好 能 在 体外 构建 体 中 增加 或 删 去 一 些 碱 基 ， 这 样 虽然 二 者 非常 相似 但 可 以 用 电泳 把 它们 区 别 开 。 另 一 种 做 法 是 ， 在 构建 体 中 引 入 一 个 限制 性 内 切 酶 酶 切 位 点 ， 这 样 虽然 参 比 模板 的 大 小 和 实验 目标 一 样 ， 但 在 PCR 后 对 产物 进行 酶 切 即 可 把 它们 区 别 开 来 。 无 论 采 用 哪 种 做 法 ， 由 于 这 两 种 模板 使 用 了 相同 的 引物 对 ， 扩 增 中 就 都 得 以 扩 增 ;和 标准 曲线 比较 后 就 可 以 得 出 这 两 者 的 含量 ， 计 算 方 法 在 后 文 将 会 论 及 。 进 行 以 上 的 操作 可 以 克服 “试管 效应 ”。

必须 注意 的 是 ， 与 实验 样品 一 起 制备 和 测定 标准 CRNA 是 个 相当 麻烦 的 过 程 。 许 多 操 作 并 不 需要 测定 转录 本 的 真实 数量 或 拷贝 数 。 前 面 论 述 的 种 种 方法 或 后 面 将 要 论述 的 实时 PCR， 通 常 得 到 的 都 是 相对 丰 度 。

20.6 对照 反 应 的 规划

用 于 对 照 和 目标 转录 本 的 引物 有 若干 种 方式 。 昌 然 不 可 能 毫 无 遗漏 ， 但 是 下 面 将 把 历史 上 的 种 种 变化 一 一 加 以 评价 。

© RFS RRA cDNA 置 于 另 一 个 反应 管 ， 加 入 第 二 套 引 物 。 这 是 早期 使 用 PCR 对 转录 本 进行 定量 的 做 法 。 这 种 操作 可 能 带 来 的 严重 问题 如 下 。

a 第 二 套 引 物 的 热 动 力学 性 质 可 能 与 第 一 套 引物 的 有 所 差别 ， 这 样 会 导致 二 者 的 扩 增 效率 不 同 。

b. 只 有 对 照 基因 和 目标 基因 的 mRNA 水 平 相近 时 ， 用 这 种 方式 定量 才 是 有 意义 的 。

c. 看 家 基因 的 mRNA 水 平 在 细胞 周期 进程 中 往往 是 不 稳定 的 。

d. 对 照 mRNA 和 目标 mRNA 必须 在 指数 扩 增 时 被 检测 。

e. 对 照 和 目标 样品 在 不 同 的 反应 管 中 进 行 反应 ， 可 能 引入 反应 管 之 间 的 差别 。

@ 在 同一 个 反应 管 中 加 入 第 二 套 引 物 (Murphy 等 ，1990; Gaudette 和 Crain，1991) 。 这 也 被 称 作 “多 重 ”PCR， 或 者 简称 为 “多 重 技术 (multiplexing)”。 尽 管 比 第 一 种 方法 有 所 改进 ， 但 由 于 以 下 原因 仍 可 能 导致 显著 的 误差 。

a 第 二 套 引 物 的 热 动力 学 性 质 可 能 与 第 一 套 引 物 的 有 所 差别 ， 这 样 会 导致 二 者 的 扩 增 效率 不 同 。

b. 只 有 对 照 基因 和 目标 基因 的 mRNA 水 平 相近 时 ， 用 这 种 方式 定量 才 是 有 意义 的 。

c. 看 家 基因 的 mRNA 水 平 在 细胞 周期 进程 中 往往 是 不 稳定 的 。

d. 对 照 mRNA 和 目标 mRNA 必须 在 指数 扩 增 时 被 检测 。

但 至 少 ， 这 两 套 引 物 在 一 个 反应 管 里 了 !

G@) 竞争 PCR， 加 入 外 源 的 能 被 同一 套 引 物 识别 的 内 参照 一 一 也 就 是 说 目标 CDNA 和 引 入 的 竞争 模板 一 起 竞争 同样 的 引物 (Becker-André 和 Hahlbrock, 1989; Becker-André, 1991; Gilliand 等 ，1990; Li 等 ，1991) 和 其 他 反应 组 分 。 这 种 方法 一 度 是 定量 的 黄金 方 法 ， 但 现在 已 被 实时 PCR 取代 了 。

。 273 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

#4 PCR 有 两 种 方法 。 一 种 方法 是 人 工 制备 转录 本 〈cRNA)， 精确 定量 后 挫 人 到 实验 目标 RNA W (Wang %, 1989; Ikonen 等 ，1992; Vanden Heuvel #, 1993). HF H#G 入 的 人 工 转录 本 获得 了 和 实验 目标 RNA 一 样 的 物理 环境 ; 并 且 挫 入 的 数量 精确 可 知 ， 再 和 建立 的 标准 曲线 进行 比较 〈 图 20. 1)， 就 可 以 通过 测定 由 人 工 转录 本 反 转 录 的 CDNA 的 量 来 确定 反 转 录 反 应 的 进行 程度 。 体 外 人 工 转录 RNA 的 传统 做 法 是 把 它 的 DNA 模板 和 合适 的 转录 启动 子 连接 在 一 起 〈 图 20.2); 或 者 可 以 在 待 转录 DNA 序列 的 5 端 接 上 噬菌体 RNA 聚合 酶 启动 子 序列 〈 图 20. 3) 构建 转录 所 需 的 模板 ， 再 用 PCR 扩 增 来 进行 制备 〈Vanden Heuvel 等 ，1993) 。 无 论 采 用 哪 种 设计 方法 ， 最 好 记得 在 表达 的 对 照 转录 本 内 删除 二 段 序列 或 是 增加 一 个 插 人 人 片段。 因此， 对 照 转 录 本 因为 和 目标 转录 本 共享 了 PCR 引物 识别 序列 ， 而 成 为 后 者 的 同 源 竞争 物 ， 它 们 具有 同样 的 反 转 录 效 率 和 PCR 扩 增 效率 ， 全 汪汪 生生 人 凭借 各 自 不 同 的 分 子 量 大 小 被 区 别 开 来 。

cDNA 分 子 数

待 测 RNA/ng

50 cpm 500cpm 3000 cpm 50000 cpm

BAM BUTE 图 20.1 利用 标准 曲线 内 捅 转录 本 丰 度 。 对 该 操作 的 原始 描述 (Wang $F, 1989) , FA? P 标记 的 引物 进行 PCR。 电 泳 示 踪 后 切 下 条 带 并 用 Cerenkov 计数 计算 摊 人 率 。 国 表示 样品 中 待 测 细 胞 RNA WME. AR 示 挨 和 反应 管 中 竞 争 RNA 分 子 的 数量 。 相 同 的 同位 素 挨 人 量 ， 表 示 相等 的 待 测 转录 本 分 子 数 量 。 因 此 结果 就 表示 为 某 生物 来 源 每 lng RK lug RNA 内 ， 所 含 的 某 目标 转录 本 的 分 子 数 ( 按 同 时 扩 增 的 CRNA 计算 得 出 )

图 20.2 体外 转录 模板 的 构建 。 在 转录 启动 子 T7、SP6 或 T3 (可 以 一 个 或 几 个 ) 附近 插入 模板 DNA， 就 能 合成 大 量 长 度 统一 的 单 链 RNA 分 子 (载体 在 转录 前 必 入 线 性 化 )。 将 这 些 转录 本 摊 人 实验 样品 ， 就 可 以 确定 反 转录 和 PCR 扩 增 的 效率 。 该 转录 本 也 可 用 作 核酸 探 针 ， 使 用 细节 见 第 13 章 和 第 14 章 。 274 -

第 20 章 定量 PCR 技术

反 义 转录 本 RNA 一 人 AAAAAA

图 20.3 用 PCR 合成 转录 模板 。 体 外 转录 可 用 来 制备 反 义 cRNA 序列 。 制 备 转录 模板 所 使 用 的 引物 对 中 ， 一 个 为 5 加 上 T7 启动 子 的 引物 ， 另 一 个 为 5 加 上 oligo(dT) 的 引物 。 加 oligo(dT) BAMA poly(A) 尾 所 必需 的 ，

而 poly (A) 尾 又 是 支持 某 些 反 转 录 所 需要 的 条 件 。 其 他 类 似 的 策略 还 有 用 杂交 探 针 来 合成 反 义 CRNA 分 子

竞争 PCR 的 另 一 种 方法 是 构建 仅 有 引物 识别 序列 相同 的 非 同 源 模板 。 合 成 5 部 分 为 序 列 〈 基 因 ) 特异 而 3 为 竞争 DNA 特异 的 引物 ， 利 用 PCR 可 将 引物 识别 序列 添加 到 竞争 DNA 的 末端 〈 图 20. 4) 。 用 这 种 方法 构建 模板 后 ， 竞 争 DNA 和 相应 的 CDNA 使 用 同一 对 引 物 进行 扩 增 。 通 常 在 PCR 产物 长 度 小 于 300bp 时 ， 用 非 同 源 竞争 序列 测定 基因 特异 的 cDNA 丰 度 。 随 着 模板 长 度 的 增加 ， 序 列 对 PCR 扩 增 效率 造成 的 影响 也 会 相应 增加 。 如 果 定量 时 挫 人 的 是 cDNA 而 非 RNA,， 那 么 就 不 能 把 反 转 录 效 率 估 计 在 内 。 根 据 所 做 实验 的 需 要 ， 这 一 点 可 能 重要 也 可 能 不 重要 。

5 组 成 型 5 引物 \ 二 一

组 成 型 3 引物 PCR | 5 用 5 和 3 用 5 和 3 引物 扩 增 | 基因 特异 引物 扩 增 II II IT

纯化 ; 计算 得 率 | Al HET ie SH

iy

图 20.4 非 同 源 竞 争 DNA 模板 的 构建 。 合 成 引物 的 上 游 和 下 游 都 含有 5 基因 特异 序 列 ， 这 些 基因 特异 序列 在 PCR 扩 增 后 就 变 成 竞争 模板 的 一 部 分 。 这 种 添加 序 列 的 方法 ， 和 利用 PCR 在 产物 末端 添加 限制 性 内 切 酶 位 点 或 其 他 序列 是 一 样 的 。 随 后 的 竞争 PCR 中 ， 使 用 较 短 的 只 覆盖 了 基因 特异 序列 部 分 的 引物 ， 就 能 同时 扩 增 竞争 模板 和 目标 cDNA。 人 它们 各 自 的 扩 增 程度 为 反应 管内 它们 的 摩尔 比 的 函数

® 实时 PCR。 后 面 将 详细 讨论 的 实时 PCR 是 一 种 非常 灵敏 的 、 在 动力 学 很 广 的 范围 内 对 转录 本 相当 准确 的 荧光 定量 方法 。 前 面 讨 论 的 对 照 引 物 和 外 源 cRNA 模板 经 修改 后 被 用 。 275 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

于 实时 PCR 实验 ， 其 实验 事例 ， 见 Fronhoffs 等 的 报道 (2002).

20.7 关于 负 对 照

负 对 照 的 重要 性 足以 和 正 对 照 、 质 量 控制 、 上 样 量 对 照 以 及 酶 反应 效率 对 照 等 相 比拟 。 这 些 反应 的 设计 ， 都 是 为 了 确保 所 有 观测 到 的 PCR 产物 都 是 真实 可 信 的 ， 而 非 因为 加 样 的 KARP MF (amplicon) 污染 造成 的 。 现 在 许多 实验 室 日 常 使 用 的 便携 式 PCR 工作 站 看 上 去 就 像 一 个 微型 桌面 生物 安全 橱 。 典 型 的 工作 站 通过 HEPA@ 过 滤 空 气 建立 一 个 无 菌 的 加 样 环境 ， 而 内 装 的 紫外 灯 可 交 联 加 样 区 游离 的 扩 增 子 。 许 多 有 更 多 功能 的 工作 站 还 具有 热 塑 结 构 ， 在 做 同位 素 实验 时 保护 用 户 不 受 2P 的 辐射 。

在 所 有 重要 的 PCR 对 照 反应 中 不 含 反 转 录 酶 CRT) 的 对 照 是 必须 做 的 。 准 备 一 个 反应 管 ， 加 入 所 有 cDNA 合成 所 需 的 成 分 (RNA、 核 苷 酸 、 引 物 等 )， 但 不 加 反 转 录 酶 。 由 于 在 无 反 转 录 酶 的 条 件 下 无 法 合成 EDNA， 所 以 从 RT- 反应 管 中 扩 增 出 的 任何 产物 都 是 基因 组 DNA 污染 的 结果 。 因 此 习惯 上 是 在 所 有 RNA 样品 中 都 加 入 不 含 RNase ff) DNase | ， 在 进行 RT-PCR 前 除去 内 源 性 DNA 模板 。 这 是 自 该 技术 诞生 以 来 就 存在 的 标准 操作 。

最 近 有 人 提议 ，RT-PCR 的 操作 可 以 简化 成 在 第 一 链 合 成 之 后 才 在 样品 中 加 入 DNase TI 。 之 所 以 产生 这 个 构思 ， 是 因为 DNase 工 无 法 降解 mRNA : cDNA 杂交 双 链 ， 系 统 中 只 有 基因 组 DNA 和 非 CDNA 会 被 降解 去 除 (Flohr 等 ，2003) 。 简 而 言 之 ，MMLV 在 37C F 反应 50min FM cDNA 后 ，50C 加 热 15min 使 酶 失 活 。 要 小 心 不 要 超过 这 个 温度 ， 因 为 较 高 温度 下 mRNA : cDNA 杂交 双 链 有 可 能 解 离 ， 释 放出 的 可 能 被 核酸 酶 降解 的 第 一 链 cDNA 可 能 发 生 分 子 内 碱 基 配 对 (暂时 性 的 双 链 区 ) 。37C 下 cDNA : mRNA 杂交 双 链 最 多 与 10U DNase I (Rift 2h， 然 后 使 用 标准 硅 藻 土 技术 彻底 清除 DNase I 。 虽 然 DNase 工 可 以 切割 DNA : RNA 和 单 链 DNA， 但 是 其 活力 远 低 于 它 对 双 链 DNA 的 降解 。 这 个 操作 不 适合 胆 小 的 人 选用 。

20.8 竞争 PCR 的 关键 因素

56H PCR 就 像 它 的 名 字 显 示 的 一 样 ， 即 两 种 模板 在 反应 中 竞争 进行 扩 增 的 一 种 PCR FB HK (Diviacco 等 ，1992; Siebert 和 Larrick，1992，1993) 。 这 只 有 在 目标 CDNA 和 竞争 模板 拥有 相同 的 引物 识别 序列 时 才 可 能 发 生 。 引 入 的 竞争 模板 可 以 是 前 面 讨论 过 的 CRNA, 以 是 反 转 录 后 得 到 的 双 链 CDNA,

一 个 “或 两 个 ) 模板 在 特定 反应 管 中 的 成 功 扩 增 ， 都 是 它们 摩尔 比 的 函数 ， 尽 管 存在 两 个 模板 都 得 以 扩 增 的 可 能 ， 而 其 中 占 多 数 的 分 子 在 损害 其 他 模板 利益 的 情况 下 产生 更 多 的 产 物 。 因 此 有 如 下 推论 ， 在 两 种 分 子 等 摩尔 时 它们 应 有 相同 的 扩 增 效率 。 这 项 定量 技术 的 好 处 在 于 ， 为 了 测定 样品 内 未 知 含量 的 CDNA, 只 要 不 断 稀释 竞争 模板 直到 找到 等 摩尔 的 那个 浓 度 就 可 以 测 出 未 知 CDNA 的 含量 〈 图 20. 5) 。 就 这 样 简单 而 直接 ， 为 了 方便 读者 ， 标 准 RT- PCR 和 竞争 PCR 的 优点 和 缺点 在 表 20. 1 和 表 20. 2 中 被 逐一 进行 比较 。

@ HEPA 过 滤器 :高 效 空气 粒子 过 滤器 。 > 276 -

第 20 章 定量 PCR 技术

RNA | 到 转录 cDNA

- VEOUUG

cDNA 50ng 50ng SOng S0ng 50ng 50ng 竞争 模板 ”100amol 10amol lamol 0.lamol 0.0lamol 0.001amol

电泳 ha.

2 3 4 5 6 分 子 量 标准

一

竞争 模板

基因 特异 PCR 产 物

20.5 使 用 竞争 PCR 对 转录 本 定量 。 在 合理 设计 下 ， 待 测 CDNA 和 竞争 模板 一 起 扩 增 后 电泳 表现 为 两 条 独立 的 条 带 。 在 各 反应 管 中 待 测 CDNA 和 竞争 模板 使 用 的 引物 和 物理 参数 都 是 相同 的 。 用 目测 法 或 数字 图 像 分 析 软 件 确 认 电 泳 条 带 强度 相等 ， 即 反应 起 始 时 三 者 数量 相等 的 反应 。 用 TOD, / IOD 竞 争 模板 一 1. 0 的 相关 泳 道 中 竞争 模板 的 质量 可 以 快速 测定 处 于 同一 反应 管内 的 试验 模板 的 丰 度 1. 0 时 的 值 ， 从 而 快速 获得 这 一 反应 管内 挫 人 的 竞争 模板

表 20.1 标准 RT-PCR 定量 的 优点 和 缺点

优点

。 设计 简单

。 反应 快速

。 反应 可 有 多 种 用 途

。 可 检测 丰 度 很 低 的 mRNA

。 所 需 的 细胞 数 或 组 织 量 很 少

© poly(A) > iii ie BE AS Zi th AS HE FE

。 扩 增 中 平台 效应 带 来 的 问题 可 由 在 反应 管 中 添 加 外 源 对 照 或 /和 内 源 对 照 解决

。 实验 避免 了 杂交 分 析 的 经 典 难点

。 数据 可 重复 缺点 。 反 转 录 反 应 是 造成 样本 间 差 异 最 主要 的 因素 。 由 于 PCR 是 一 种 指数 扩 增 ,定量 比较 困难 。 不 使 用 参照 转录 本 很 难 解决 平台 期 带 来 的 问题 © 加 样 的 微小 差别 会 导致 产物 输出 量 的 巨大 差别 。 反应 对 污染 敏感 ,尤其 是 基因 组 DNA 的 污染 。 有 时 数据 的 可 重复 性 很 成 问题

表 20.2 ”竞争 PCR 的 优点 和 缺点

一 套 引 物 适 用 于 竞争 模板 和 实验 目标 模板

体外 转录 制备 的 CRNA 对 照 转录 本 是 反 转 录 效 率 的 有 效 指标 反应 管 中 对 竞争 模板 和 cDNA 造成 影响 的 物理 参数 一 臻

PCR 的 平台 效应 对 竞争 模板 和 cDNA 的 影响 相同

通过 两 种 产物 的 比例 进行 定量 ,因此 需要 限制 PCR 在 指数 扩 增 期 。 数据 高 度 可 重复

。 产物 可 用 电泳 轻易 分 开

。 产 物 可 用 SYBR 人 金 轻 易 定 量

。 不 需 使 用 同位 素

本 ae “9

27

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

续 表

。 为 正确 确认 目标 模板 和 竞争 模板 的 比例 ,需要 做 若干 稀释 梯度

。 必需 耗费 大 量 反 应 管

。 针 对 每 个 目标 模板 都 需要 制备 对 应 的 竞争 模板

。 为 构建 竞争 模板 必须 合成 另 一 套 引物

。 使 用 非 同 源 DNA 竞争 模板 时 不 能 显示 反 转 录 的 反应 效率

。 把 竞争 模板 作为 定量 工具 前 ,必须 先 确认 非 同 源 竞 争 模板 的 扩 增 效率 和 目标 模板 的 相等 。 PCR 扩 增 后 的 操作 费时 费力

下 面 是 设计 竞争 PCR 时 需要 重点 考虑 的 问题 。

(1) 必须 知道 竞争 模板 的 量

可 以 用 反 转 录 、PCR 或 RT-PCR 方法 合成 竟 争 模板 ， 然 后 ， 模 板 必须 经 过 纯化 并 对 它 的 浓度 进行 定量 。 定 量 的 方法 可 以 用 紫外 吸收 〈 第 8 章 )， 也 可 以 用 数字 图 像 分 析 “〈 第 11 章 ) 。 通 常 需要 合成 1 一 3wg 竞争 模板 ， 就 像 其 他 要 求 合 成 的 反应 那样 。 为 了 达到 最 大 精确 度 ， 必 须知 道 竟 争 模板 的 确切 核 苷 酸 数 ， 然 后 用 微 摩尔 (umol) 表示 新 合成 的 竞争 模板 浓度 。 在 使 用 同 源 RNA 竞争 转录 本 时 ， 通 常 在 100ng 细胞 RNA PBA th RE 1 一 10000fg 的 竞争 RNA。 非 同 源 竞 争 模板 常 重 新 稀释 至 浓度 为 埃 摩尔 〈amol) 级 @ 的 储备 液 ， 并 用 确切 分 子 数 来 表示 它们 的 挫 和 人 量 。 出 于 定量 的 目的 ， 在 保证 加 入 样本 量 不 变 的 同时 ， 进 一 步 稀 释 并 加 入 竞争 模板 。 只 要 目标 模板 和 竞争 模板 的 数量 一 致 ， 它 们 的 产物 量 也 应 该 相同 。

表 20.3 单位 分 析

10° 摩尔 6. 02 X 1023

10-3 摩 尔 6. 02 X 107 p> PORE AR 10~§ AE AK 6. 02X10!” n* 纳 摩尔 10-? 摩 尔 6. 02X10" p，, 皮 摩尔 10-12 摩 尔 6. 02X101 f, 法 摩尔 10-15 摩 尔 6. 02 X 108

10-18 摩 尔 6. 02X 105

10~ 2! RE AR 6. 02 X 10? 注 ， 通常 PCR 竞争 模板 的 储备 液 和 工作 液 浓度 都 很 低 ， 研 究 者 较 偏爱 用 amol 表示 模板 浓度 。 如 Lamol PCR 产物 大 约 有 600000 个 分 子 。 《2) 驶 争 模板 和 目标 模板 的 扩 增 必须 一 臻 选用 的 引物 必须 可 以 同时 识别 竞争 模板 和 目标 模板 并 有 同样 的 扩 增 效率 。 为 达到 这 一 目 的 ， 研 究 者 在 DNA 分 子 的 末端 添加 与 引物 互补 的 序列 构建 出 竞争 模板 。 竞 争 模板 应 与 目标 模板 尽量 同 源 ， 在 实验 结束 时 才能 做 出 尽 可 能 准确 的 比较 。 因 此 ， 无 可 争辩 的 是 ， 观 察 到 的 扩 增 差异 就 是 一 个 序列 的 扩 增 比 另 一 个 序列 更 优先 的 缘故 。 通 常用 一 套 特 定 的 引物 在 cDNA 中 和 侧 症 地 创建 一 个 插 人 或 缺失 ， 就 构建 成 了 非常 有 用 的 同 源 竞争 模板 。 这 样 制备 的 竞争 模板 与 目标 模板 相 比 不 是 小 一 点 就 是 大 一 点 ， 在 电泳 上 很 容易 分 辨 。 有 些 场合 不 容易 得 到 同 源 竟 @ 为 不 常 进行 如 此 低 浓度 操作 的 研究 者 考虑 ， 表 20. 3 列 出 了 涉及 的 一 些 单位 。 - 278 .

第 20 章 定量 PCR 技术

争 模板 序列 时 ， 使 用 非 同 源 竞争 模板 〈 即 与 研究 用 的 实验 cDNA 无 关 的 序列 ) 也 可 以 很 好 地 进行 竞争 PCR 实验 ， 只 需要 如 下 条 件 。

a. 竞争 模板 的 序列 是 已 知 的 。

b. 竞争 模板 含有 正常 的 〈G 十 C) 含量 。

c. 竞争 模板 没有 富 含 AT 或 GC 的 区 域 。

d. 竞争 模板 的 大 小 是 实验 cDNA KEE) + 200bp.

(3) 目标 模板 和 竞争 模板 的 反 转 录 效 率 必须 相同

为 了 从 RNA 的 PCR 实验 得 出 相关 的 数据 ， 必 须 分 析 反 转录 和 PCR 两 者 的 效率 影响 因 素 。 目 标 模板 与 竞争 模板 共 扩 增 ， 发 生 了 PCR 的 效率 问题 : 凡是 对 cDNA 有 影响 的 因素 也 存在 于 竞争 模板 。 但 是 ， 在 转录 后 再 将 竞争 模板 加 入 cDNA 中 就 没有 出 现 相 关 的 反 转 录 效 率 问 题 ， 而 这 在 cDNA 合成 中 是 最 常见 的 问题 。 在 反 转 录 之 前 用 一 种 体外 生成 的 转录 本 抑 fill AY RNA 样品 ， 根 据 每 一 管 的 反 转 录 效 率 作 标 准 曲 线 。 为 了 作 标 准 曲 线 ， 必 须 设 计 对 照 转录 本 ， 使 它 能 被 反 转 录 的 引物 识别 ， 例 如 poly(A) ALLAH oligo(dT) 识别 。

(4) 必须 尽量 减少 异 二 聚 体 的 形成

FORE PCR 的 产物 ， 在 竞争 模板 和 目标 cDNA 之 间 相 互 杂 交 而 成 〈 即 重组 ) 。 当 竞争 模板 是 野生 型 cDNA 的 缺失 或 插入 形式 时 ， 蜡 二 聚 体 的 形成 特别 普遍 。 这 些 异 二 聚 体 很 容易 被 确认 ， 因 为 与 目标 cDNA 和 竞争 模板 相 比 ， 它 们 的 分 子 量 比较 高 。PCR 的 循环 次 RRS, HORA MRA AERA. FER AY PCR 循环 中 形成 的 异 二 聚 体 特别 环 手 ， 因 为 这 些 分 子 下 一 步 不 能 变性 (Ruano 和 Kidd, 1992; Jensen 和 Straus，1993) 。 显 然 ， 异 二 聚 体 的 形成 影响 了 PCR 精确 定量 的 能 力 。 减 少 PCR 的 循环 次 数 可 以 减少 异 二 聚 体 的 形成 ， 从 而 降低 它们 带 来 麻烦 的 可 能 性 和 严重 性 。

(5) 检测 方法 必须 优化 @

竞争 PCR 的 优点 之 一 是 不 必用 同位 素 标记 产物 。 和 常规 操作 PCR 的 循环 数 是 25 一 30 轮 ， 可 以 顺利 地 合成 足 量 产物 用 于 简单 的 凝 胶 染 色 。 在 这 点 上 ，SYBR 绿 (Schneeberger 等 ，1995) 和 SYBR 金 比 较 好 ， 因 为 与 省 化 乙 锭 相 比 ， 在 直接 目测 凝 胶 、 光 记录 (pho- todocumenting) 和 数码 摄像 时 它们 可 以 在 最 低 限 度 的 背景 上 明显 增强 灵敏 度 。DiCesare 等 (DiCesare 等 ，1993; Wages 等 ，1993; Wilkinson}, 1995; Blok 等 ，1997) 也 描述 了 与 电化 学 发 光 相 关联 的 竞争 PCR。 为 了 尽量 减少 异 二 聚 体 的 形成 ， 会 减少 PCR 的 循环 次 数 ， 但 不 必 担 心 积 累 产 物 中 痕 量 异 二 聚 体 的 检测 问题 ， 因 为 SYBR 金 可 以 让 用 省 化 乙 锭 染色 不 可 能 看 见 的 低 丰 度 的 条 带 也 清晰 可 见 。 而 且 ， 在 条 带 含量 足以 用 溴 化 乙 锭 染色 可 见 的 情况 下 也 不 推荐 使 用 省 化 乙 锭 ， 因 为 使 用 这 种 染料 通常 会 产生 高 背景 ， 大 大 地 降低 了 竞 争 PCR 的 定量 准确 性 。 与 PCR 循环 中 产物 积累 的 检测 一 样 ， 在 实时 PCR 实验 中 检测 是 自 动 进行 的 。

总 之 ， 竞 争 PCR 是 一 种 极其 灵敏 的 模板 定量 方法 。 比 较 所 有 以 PCR 为 基础 的 实验 ， Northern 分 析 和 核酸 酶 保护 实验 的 数据 是 缺乏 灵敏 性 的 ， 而 竞争 PCR 的 优化 反应 灵敏 性 是 前 所 未 有 的 。 使 用 模拟 目标 模板 的 内 源 竞 争 物 ， 不 需要 测定 PCR 何 时 加 入 对 数 扩 增 期 on 果 cDNA 没有 进入 对 数 扩 增 ， 那 么 竞争 模板 也 不 会 进入 对 数 扩 增 。 该 方法 的 缺点 〈 实 际 上 仅 是 一 些小 麻烦 ) 是 : 中 每 个 样品 都 需要 连续 稀释 ， 必 须 与 竞争 模板 标定 ; @ 必 须 合 成 两 套

@ 高 度 灵 敏 的 竞争 PCR 或 实时 PCR 都 不 需要 用 同位 素 。 。 279 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

引物 ， 一 套 合 成 的 引物 对 用 于 合成 竞争 模板 ， 而 另 一 套 基因 特异 的 引物 对 才 是 用 于 竞争 PCR 的 。

20.9 竞争 PCR 的 主要 步 强

(1) 制备 PCR 竞争 模板 @ 非 同 源 竞争 模板 。 设 计 合 成 基因 特异 的 引物 〈 所 需 的 两 套 ) 。 先 用 引物 进行 第 一 次 PCR 扩 增 ， 随 后 用 基因 特异 引物 进行 第 二 次 扩 增 。 尝 试用 25 聚 一 30 聚 的 基因 特异 引物 ，Tm BH 60C. 这 将 有 利于 cDNA 扩 增 时 有 较 高 的 产 出 和 较 好 的 忠实 度 。 Mie 仆仆 站 和 和 人 则 (第 19 章 ) 。 。 竞争 模板 的 长 度 通常 为 200 一 700bp。 。 竞争 模板 最 多 比 目 标 模板 大 〈 或 小 ) 200bp。 。 纯 化 竞争 产物 ;确定 浓度 〈 分 光 光 度 法 或 与 已 知 标准 量 比较 ， th @Xx174/ Hoe ; 见 第 8 章 )。 。 使 用 前 新 鲜 配 制 滴定 储备 液 ， BEE WEEE <A Q) 体外 转录 制备 同 源 竞争 模板 。 靠近 噬菌体 RNA 聚合 酶 启动 子 (如 T7、SP6 或 T3) 处 连接 插入 cDNA. 。 体外 转录 ， 纯 化 转录 本 ， 定 量 。 。 一 80C 保 存 ， 使 用 时 取出 。 (2) 分 离 高 质量 RNA 。 使 用 好 的 无 RNase 技术 。 。 对 细胞 或 组 织 使 用 适合 的 抽 提 方法 。 。 优先 使 用 硅 藻 土 纯 化 或 股 - 酸 -苯酚 纯化 法 。 。 用 无 人 Nase 的 DNase 处 理 样品 。 。 用 DEPC 处 理 过 的 水 配制 70% 乙醇， 用 来 洗涤 RNA 沉淀 〈 阳 离子 盐 会 定量 结 dNTP 而 影响 PCR). 。 用 合适 的 方式 储存 纯化 的 RNA (一 80C 保 存 乙 醇 沉 淀 ) 。 。 如 果 在 液态 缓冲 液 内 ， 分 装 保存 于 一 80YC 。 (3) @mM cDNA 。 选用 了 人 Nase H™ 反 转 录 酶 。 。 合成 并 纯化 第 一 链 cDNA。 。 —20°CEKRF cDNA ， 用 时 取出 。 。 不 要 使 用 Mn? > 依赖 的 反 转 录 酶 。 (4) 进行 初级 竞争 PCR 扩 增 (A 20. 6) 。 将 竞争 模板 每 次 以 10 倍 逐 级 稀释 。 © IN Hh PEM BE RY PCR 竞争 模板 和 第 一 链 cDNA 一 起 加 入 反应 管 。 © PCR 扩 增 ， 电 泳 分 析 扩 增产 物 。 © 测定 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 。 尽 管 图 像 分 析 软 件 会 更 精确 ， 但 通常 这 一 步 用 目测 即 可 。 。280 -

二

$208 定量 PCR 技术

图 20.6” 初 步 定 量 用 的 10 倍 稀释 梯度 。 小 鼠 # 肌 动 蛋白 cDNA 和 非 同 源 竞争 模板 的 共 扩 增 。 制备 竞争 模板 〈540bp) 的 方法 是 如 前 所 述 的 合成 引物 法 。 及 肌 动 蛋白 (365bp) cDNA 是 使 用 oligo(dT) 和 AMV 反 转 录 合 成 的 。PCR 扩 增 25 个 循环 后 ， 所 有 6 个 样品 与 分 子 量 标准 对 照 (Sigma) 一 起 经 2. 5 为 琼脂 糖 凝 胶 〈 用 1XTAE 缓 冲 液 配制 ) 电泳 分 离 。

电泳 后 琼脂 糖 凝 胶 在 1 X TAE 缓冲 液 稀 释 的 SYBR 金 溶液 中 染色 ， 经 宝丽来 667 型 底片 摄影 。10 倍 梯度 稀释 系列 反映 了 样品 的 基本 特征 ， 由 此 可 以 估计 样品 中 有 肌 动 蛋白 cDNA 的 含量 。 各 样本 中 竞争 模板 的 含量 分 别 为 : 泳 道 1，10. 0amol; 泳 道 2，1. 0amol; 泳 道 3、0. lamol; 泳 道 4，0. 01amol; 泳 道 5，0. 00lamol;

泳 道 6，0. 0001amol。 最 符合 lODe gs /IODs sag =1.0 的 是 泳 道 2

(5) 进行 次 级 竞争 PCRPM (A 20.7)

图 20.7 进一步 定量 用 的 2 倍 稀 杰 梯 度 。 除 加 入 各 管 的 竞争 模板 量 不 同 之 外 ， 所 有 反应 和 分 析 的 方法 与 图 20. 6 描述 的 一 致 。 初 级 扩 增 结果 显示 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 为 1. 0amol。 因此 这 步 扩 增 从 10amol 开始 逐 级 2 倍 稀释 : 泳 道 1，10amol; 泳 道 2，5amol; 泳 道 3， 2.5amol; 泳 道 4，1. 25amol; 泳 道 5，0. 625amol; 泳 道 6，0. 3125amol。 碰 巧 最 符合 的 又

是 泳 道 2， 表 明 样 品 中 含有 的 B 肌 动 蛋白 cDNA KAA Samol 或 接近 120000 个 分 子

。 从 储备 液 开 始 配制 一 系列 2 倍 稀释 的 竞争 模板 ， 储 备 液 浓度 是 最 终 稀 释 液 浓度 的 10 倍 以 上 ， 而 最 终 稀释 液 的 浓度 接近 于 目标 cDNA 初级 扩 增 物 的 浓度 。

。 取 各 个 2 倍 稀释 的 PCR 竞争 模板 和 第 一 链 CDNA 一 起 加 入 反应 管 中 。

。 PCR 扩 增 ， 电 泳 分 析 扩 增产 物 。

。 测定 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 。 尽 管 图 像 分 析 软 件 会 更 精确 ， 但 通常 这 一 步 用 目测 即 可 。

。 预期 能 检测 到 基因 表达 高 低 〈 转 录 本 丰 度 ) 为 2 倍 的 改变 ， 当 然 分 辨 率 也 是 2 倍 。

20.10 $2474: 竞争 PCR

BER HE AE Ra FEA S| etl AE Te WR SE HR. I Ba BA cDNA 样 品 进 行 竞争 PCR 扩 增 。 如 果 使 用 了 体外 转录 的 人 造 对 照 转 录 本 ， 则 目标 RNA 和 对 照 RNA 应 加 入 同一 个 反应 管 中 进 行 反 转录 反应 。

。 281 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

20.10.1 非 同 源 竞争 模板 的 合成

不 同 的 PCR 竞争 模板 是 使 用 各 自 特 有 的 合成 引物 在 不 同 反应 管内 制备 的 。 一 旦 合成 完 毕 ， 产 物 的 一 部 分 就 被 用 作 再 扩 增 的 模板 。 注 意 PCR 程序 可 能 在 不 同 的 热 循环 仪 上 有 所 不 同 。

ORF. 10 PCR 缓冲 液 Syl 25mmol/L MgCl, 3yl 10mmol/L dNTP lyl 竞争 模板 Xl EWE AA Ing) 10pmol/L 5 合成 引物 | 10pmol/L 3' 合 成 引物 Dl 灭 菌 水 (36.5—X) pl Taq 聚合 酶 0. Spl

@ 如 果 需 要 ， 在 反应 液 上 覆盖 矿物 油 。 比 较 理 想 的 是 使 用 带 热 盖 的 热 循 环 仪 ， 这 样 就 可 以 省 去 此 步骤 。 无 论 加 还 是 不 加 矿物 油 ， 用 离心 机 短暂 离心 样品 。 @ 进行 PCR 循环 。

起 始 的 解 链 94°C 3min

扩 增 94°C 1min 人 人 ma 个 循环 126 lmin

最 后 的 延伸 72 已 10min

保存 4C

注意 1 不 同 引物 的 退火 温度 不 同 。

注意 2 ”由 于 合成 引物 的 5 端 有 外 加 的 悬垂 部 分 ， 可 能 需要 把 退火 温度 设 得 比 Ta 值 低 几 度 让 引物 能 更 好 地 退火 。

@ 用 水 1: 500 稀 杰 第 @ 步 得 到 的 PCR 产物 ， 取 其 中 部 分 再 次 扩 增 。 保 留 二 些 未 稀释 的 PCR 产物 作为 下 一 次 扩 增 电 泳 的 对 照 。

OKRA.

10 PCR 缓冲 液 Syl 25mmol/L MgCl, 3yl 10mmol/L dNTP lpl HOA th 2. Syl 10umol/L 5'cDNA 引物 2ul 10umol/L 3’cDNA 引物 2ul KK vi 7k 34yl Taq 聚合 0. Syl

——— a KR SU a LULU @ 如 果 需 要 ， 在 反应 液 上 覆盖 矿物 油 。 无 论 加 还 是 不 加 矿物 油 ， 用 离心 机 短暂 离心 样品 。 @ 进行 PCR 循环 。 < 262 。

第 20 章 定量 PCR 技术

起 始 的 解 链 94°C 3min

扩 增 94°C lmin xe ye 个 循环 (Pn lmin

最 后 的 延伸 12 10min

停放 4°C

HB 1 不 同 引物 的 退火 温度 不 同 。

注意 2 如果 扩 增 20 个 循环 后 产物 还 是 很 少 ， 再 加 5 MAK.

取 第 @ 步 所 得 的 部 分 产物 和 第 由 步 保 留 的 未 稀释 部 分 一 起 电泳 ， 染 色 后 拍照 。

© 第 @@ 步 所 得 的 PCR 产物 就 是 竞争 DNA 模板 ， 必 须 纯 化 去 除 其 中 的 原 反 应 成 分 。 最 有 效 的 纯化 方法 是 使 用 硅 藻 土 层 析 的 快速 清除 试剂 盒 ， 如 PCR Pure Kit (Roche),

@ 用 Axeo 或 图 像 分 析 测 定 竞 争 模板 的 浓度 和 产量 〈 第 11 章 )。 一 20 人 保存 竞争 模板 。

QD 取 部 分 模板 在 使 用 前 现 配 成 100amol/ pl 的 竞争 模板 储存 液 。 黎 释 最 好 用 10pg/ml 糖 原 ， 如 有 必要 则 使 用 PCR AY TE Bey (10mmol/L Tris, pH7.5; 0. 1lmmol/L EDTA). 稀释 的 竞争 模板 溶液 配 好 立即 使 用 ， 实 验 完毕 如 有 剩余 则 弃 去 不 要 。

20. 10.2 第 一 链 cDNA 的 合成 @ 确保 能 足以 合成 第 一 链 CDNA 的 高 质量 RNA。 进 行 小 块 凝 胶 电泳 ， 观 察 核 糖 体 28S

RNA 和 18S RNA， 确 保 18S RNA 下 面 拖 尾 最 少 。 见 第 5 章 和 第 6 章 的 纯化 选择 。 ® 制备 cDNA 混合 物 。

[ 终 浓度 ] DEPC 处 理 的 水 3yl = 25mmol/L MgCl> 4ul 5mmol/L 10X mh @ oe 1x 10mmol/L dNTP 2ul lmmol/L oligo(dT) @ 2ul 2. 5umol/L RNasin 1yl 2.5U/pl 将 混合 液 置 于 冰 上 。

@ 取 灭 菌 的 微型 离心 管 加 入 500ng RNA (2yl; 250ng/pl). 3p] RA RARMENI ZK. 65°C 加 热 2min,

© 将 所 有 cDNA 混合 物 〈 第 @ 步 制备 的 ) 转移 到 含有 热 变性 RNA 的 反应 管内 。

© 室温 静 置 3min 让 引物 退火 。

© 加 入 1ml 反 转录 酶 ;轻柔 吸 打 混合 液 使 混合 均匀 ， 禁 止 涡 旋 。

@ 42C 保 温 30~60min (AMV), BK 37°C{Ri 30 一 60min (MMLYV),

95°C IFA 5min 使 酶 灭 活 ， 置 冰 上 保存 至 下 一 步 操作 。

20. 10.3 ”竞争 PCR (初级 扩 增 )

初级 扩 增 的 目的 是 为 了 确认 目标 cDNA 的 近似 含量 。 由 于 反应 体系 内 原始 转录 本 丰 度

© 10X 第 一 链 缓 冲 液 :100mmol/L Tris,pH8. 3;500mmol/L KCI。 各 大 生物 制品 供应 商都 供应 合成 第 一 链 cDNA 所 需 的 整个 系统 。 @ 可 以 用 1lpg 随机 引物 代替 oligo(CdT) ,或 添加 随机 引物 与 olijgo(dT) 协 同 进行 CDNA 合成 。

- 283 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

HUAI] cDNA 在 量 上 有 巨大 的 差别 ， 基 本 上 初级 扩 增 只 需 进 行 一 次 。 在 初步 确认 了 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 稀释 度 后 ， 再 进一步 2 倍 逐 级 稀释 竞争 模板 以 细 化 目标 模板 的 浓度 区 间 。 当 然 ， 如 果 因 实验 条 件 的 改变 造成 了 mRNA 丰 度 上 的 巨大 变化 ， 就 需要 重新 进行 10 倍 稀释 梯度 的 操作 。

D 为 每 个 需要 测定 的 样本 准备 13 个 反应 的 PCR 总 混合 液 〈12 个 反应 和 工 个 富余 的 ) ( 见 表 20. 4).

表 20.4 PCR 总 混合 液

PCR 总 混合 液 每 50 岂 反应 6 个 反应 ( 当 7) 12 +2 he (X13)

10X PCR 缓冲 液 lmmol/L 35. Onl 65. Oul 25mmol/L MgCl, 1. 5mmol/L 21. Onl 39. Ol 灭 菌 水 三 241. 5yl 448. 5yl 10mmol/L dNTP 0. 2mmol/L “7. Opl 13. Oul 5'cDNA 4] 9 (20umol/L) 0. 4umol/L 7. Opl 13. Oul 3'cDNA 引物 (20pmol/L) 0. 4umol/L 7. Opl 13. Ol cDNA® 可 变 14. Opl 26. Onl Taq 4 BE? 2.5U/ 反 应 3. Syl 6. Spl (SU/pD war 总 体积 322. Onl 598. Ol

@ 只 有 热 启动 PCR Mt AERA WEAN A cDNA, @S/U a mT HE CE RU A REBT RIES. EAE AE 成 ， 就 相当 于 在 竞争 PCR 系统 内 又 加 入 了 一 个 竞争 物 。 在 没有 热 启 动 时 ， 最 好 在 第 @ 步 加 入 竞争 模板 后 再 加 入 cDNA.

© 其 他 热 稳定 酶 ， 尤 其 是 使 用 热 启动 配方 的 酶 ， 可 能 会 得 到 比 只 用 Tad 聚合 酶 更 好 的 结果 。

@ He 6 + PCR Bip Pi~Ps.

@ 为 制备 10 倍 稀释 梯度 的 竞争 模板 ， 用 TE 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH7. 5; 0. 1mmol/L EDTA) 配制 浓度 为 10wg/ml 的 超 纯 糖 原 溶 液 ， 以 上 6 管 每 管 分 别 加 入 Ol.

® 指定 竞争 模板 储存 液 〈100amol/m) 为 P， 按 下 列 操作 10 倍 梯度 稀释 竞争 模板 。

[ 终 浓度 ] 10amol/pl

P, 加 ipl Pi ,混合 1. Oamol/pl Ps 加 1pl Po ,混合 107! amol/yl Py 加 pl Ps ,混合 10~?amol/pl

加 Ipl Py ,混合 10~%amol/pl

加 1pl Ps ,混合 10~‘amol/pl

© 再 取 6 + PCR 管 标号 。

@ 各 管 中 加 入 :

2pl 新 鲜 配 制 的 稀释 液 CP) 一 Pe)

48pl PCR HIRAM? CHO)

50pl 总 体积

@ 短暂 离心 ， 使 所 有 反应 液 沉 降 到 管 底 。

@ 另 一 种 做 法 是 用 随机 引物 (lug) 代替 oligo(dT), 或 添加 随机 引物 与 oligo(dT) 协同 进行 CDNA 合成 。 * 284 -

第 20 章 定量 PCR 技术

进行 热 循环 。

起 始 的 解 链 94°C 3min

扩 增 94°C cal KC [min >25 个 循环 Tae iar

最 后 的 延伸 Ge 5min

保存 4°C

注意 ”退火 温度 是 由 引物 决定 的 。

© 准备 2.5%% 的 琼脂 糖 凝 胶 ， 用 1XTBE 或 1XTAE 缓 冲 液 配制 。

OFT 10 加 到 新 反应 管 中 。 如 果 反 应 液 面 上 覆盖 了 矿物 油 〈 老 式 热 循 环 仪 )， 在 转移 到 新 反应 管 前 用 纸 〈Kimwipe) 擦 一 下 枪 头 的 外 侧 。 加 入 1. Onl 10x EF 缓冲 液 。

@ 上 样 ， 电 泳 。 不 要 忘 了 加 分 子 量 标准 作为 对 照 。

注意 工 胶 跑 得 越 慢 分 辩 率 越 高 。 并 且 ， 琼 脂 糖 浓 度 可 根据 需要 增加 或 降低 。

注意 2 常用 的 分 子 量 标准 对 照 是 Promega 公司 的 No.G3161: 1000bp、750bp、500bp、300bp、 150bp 和 50bp。

@ 电泳 后 ,用 1XTBE 或 1xTAE 组 冲 液 配制 1XSYBR 绿 工 染色 。 在 紫外 灯 下 〈 在 紫 外 线 照 射 下 注意 保护 眼睛 和 皮肤 ) 检查 电泳 凝 胶 并 拍照 。

® 确定 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 。 通 常 目测 已 足以 对 这 一 系列 10 倍 稀释 梯度 做 出 判断 ， 但 是 图 像 分 析 软 件 可 提供 更 精确 的 每 个 条 带 的 综合 光 密 度 〈integrated optical density，IOD) 和 每 对 条 带 之 间 的 比例 。

20. 10.4 竞争 PCR (次 级 扩 增 )

一 且 确 认 了 竞争 模板 产物 与 目标 cDNA 最 接近 的 稀释 倍数 ， 则 该 倍数 的 10 倍 即 被 用 作 次 级 扩 增 中 2 倍 梯 度 稀释 的 起 始 浓度 。 在 次 级 扩 增 反应 里 2 倍 稀释 梯度 是 为 了 能 对 目标 样本 内 基因 特异 性 CDNA 的 数量 测定 进行 微调 。 出 于 对 稳定 性 和 重复 性 的 考虑 ， 使 用 和 初级 扩 增 时 同样 体积 的 PCR 总 混合 液 。 总 混合 液 应 该 放置 在 冰 上 ;如果 是 预先 准备 好 的 ， 则 应 该 在 加 入 Tag 聚合 酶 或 其 他 聚合 酶 之 前 将 总 混合 液 冻 存 。

® 6 + PCR Ftp_t Si~Se.

Q 为 制备 2 倍 稀释 梯度 的 竞争 模板 ， 以 上 6 管 中 分 别 加 入 Spl 浓度 为 1l0pg/ml 的 超 纯 糖 原 LAA PCR TE 缓冲 液 (10mmol/L Tris, pH8.0; 0. 1mmol/L EDTA) 配制 ]。

@ 从 10 倍 于 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 〈10z ， 指 定 为 管 P.) Wem. FE 列 操 作 以 2 倍 为 梯度 稀释 竞争 模板 。

fh FE Tr xX [ 终 浓度 ]

Si 加 Spl P, 混 合 51077! amol/pl S2 加 Spl Si ,混合 2.5 X 107-1 amol/pl Ss 加 Spl So ,混合 1. 25X107~!amol/pl Si 加 Spl Ss ,混合 6.25X10z 2amol/pl Ss 加 Spl Sa ,混合 3. 125 X 107-2 amol/pl 36 加 Spl Ss ,混合 1.56 X 107-2 amol/pl

° 285 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

® 再 取 6 个 PCR 管 标号 。

Os Pima:

2yl 刚 配 好 的 稀释 液 (S 一 Se )

481 PCR 总 混合 液 @ [ 见 20. 10. 3 竞争 PCR MARTH) BOF]

50pl 总 体积 © 短暂 离心 ， 使 所 有 反应 液 沉 降 到 管 底 。 @ 进行 热 循 环 。 起 始 的 解 链 94°C 3min 扩 增 94°C lmin 2. @C- inh 个 循环 (Ge 2min 最 后 的 延伸 rz 5min 保存 4°C

ER 确保 使 用 的 参数 与 10 倍 稀释 梯度 时 所 用 的 完全 一 致 ， 包 括 使 用 的 退火 温度 。

@ 准备 2. 5%% 的 琼脂 糖 凝 胺 ,用 1XTBE 或 1XTAE 缓冲 液 配制 。 选用 初级 扩 增 分 析 所 用 的 同样 的 琼脂 糖 和 电泳 参数 。

@ 每 管 中 取 lol 加 到 新 反应 管 中 。 如 果 反 应 液 面 上 覆盖 了 矿物 油 〈 老 式 热 循 环 仪 ) ， 在 转移 到 新 反应 管 前 先 用 纸 (Kimwipe) 氛 一 下 枪 头 的 外 侧 。 加 1. Spl 10 ER 缓冲 液 。

加 上 样 ， 电泳 。 不 要 忘 了 加 分 子 量 标准 作为 对 照 。

@ 电泳 后 ,用 1XTBE 或 1XTAE 缓冲 液 配制 1XSYBR 绿 工 染色 。 在 楷 外 灯 下 《在 此 外 线 照射 下 注意 保护 眼睛 和 皮肤 ) 检查 电泳 凝 胶 并 拍照 。

加 确定 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 。 由 于 这 一 系列 样品 的 稀释 梯度 仅 为 2 倍 ， 因 此 可 以 利用 图 像 分 析 软件 判断 最 接近 目标 cDNA 的 竞争 模板 浓度 ， 即 IODga /IOD eg aie =1 £8 那个 样品 。

20.11 关于 图 像 分 析 的 考 卡

就 凝 胶 所 得 的 结果 进行 竞争 PCR 分 析 的 能 力 依赖 于 最 初 凝 胶 电 泳 的 效果 和 图 像 的 质量 。 正如 第 11 章 所 述 ， 不 少 研究 者 错误 地 认为 昂贵 的 图 像 分 析 系统 可 以 弥补 质量 差 的 凝 胶 电 沪 和 低 质 量 的 图 像 。 但 事实 上 ， 凝 胶 分 析 的 精确 度 和 可 重复 性 从 一 开始 就 与 凝 胶 电 泳 和 /或 昭 片 有 直接 关系 ; 在 相当 大 程度 上 ， 对 图 像 分 析 进行 优化 选择 的 重要 性 不 亚 于 对 PCR 或 其 他 反应 的 优化 过 程 。 建 议 读者 们 重 温 第 11 章 数字 图 像 分 析 优化 的 相关 建议 。

至 于 竞争 PCR， 从 EB 染色 的 凝 胶 内 获取 数据 并 不 是 件 容易 的 事 。 这 是 因为 EB 染色 会 导致 凝 胶 内 的 较 高 背景 。 用 染料 SYBR 绿 或 SYBR 黄 显然 就 要 好 得 多 - 无 论 是 进行 目测 分 仿 还 是 数字 图 像 分 析 ， 较 好 的 凝 胶 质量 无 终 有 助 于 得 到 更 高 的 精确 度 。 如 果 需 要 的 话 ， 在 PCR 中 还 可 以 添加 放射 性 标记 的 dNTP， 这 样 就 可 以 用 放射 自 显影 和 液 闪 计数 来 进行 测定 。 其 实 ， 此 类 实验 并 不 需要 进行 放射 性 标记 ， 放射 性 标记 常 带 来 一 些 副作用 ， 因 此 ， 不 推荐 这

@ 另 -种 做 法 是 用 随机 引物 (lug) pL oligo(dT), 或 添加 随机 引物 与 oligo(dT) 协同 进行 cDNA 合成 。 > 286 -

第 20 章 定量 PCR 技术 种 做 法 。

20.12 竞争 PCR 的 问题 解答

PCR 对 各 反应 组 成 物 的 精确 浓度 无 疑 是 非常 灵敏 的 。 所 以 在 定量 实验 中 如 何 精确 吸取 组 分 为 cDNA 合成 反应 和 PCR 配制 总 混合 液 就 至 关 重 要 。 以 下 列 出 的 条 件 是 关系 到 减少 影 响 因 素 ， 最 大 程度 提高 可 重复 性 和 产量 。

(1) 不 可 变更 的 条 件 (Cnon-negotiables)

© 高 质量 的 RNA

。 用 好 的 无 RNase 技术 。

。 FA Git i OR AM a Hh Pe HT SS pe EH HK 。

。 用 酸性 酚 抽 提 。

© 用 县 盐 缓冲 液 两 次 沉淀 。

。 用 无 RNase 的 DNase 处 理 样 品 。

。 用 DEPC 处 理 的 水 配制 的 70%% 乙 醇 彻 底 冲洗 RNA 沉淀 @。

。 妥善 储存 纯化 好 的 RNA。

@ cDNA 反 转 录 和 随后 的 PCR

。 每 个 cDNA 反应 使 用 等 量 的 RNA (200 一 500ng) 。

。 使 用 缺乏 内 源 RNase 百 活 性 的 酶 更 好 。

。 避免 依赖 Min? > 的 反 转 录 反 应 。

。 保证 使 用 cDNA 反应 总 混合 液 。

。 保证 使 用 PCR 总 混合 液 。

(2) 常见 问题

一 条 或 数 条 泳 道 拖 尾

© 优化 Mn2 半 浓度 〈 通 常 做 一 个 递减 0. 1mmol/L 的 梯度 ) 。

。 减少 循环 数 。

。 减少 反应 内 的 酶 量 。

。 使 用 热 启 动 PCR,

@ 没有 产物

。 检查 RNA。

。 加 一 种 RNase 抑制 剂 (4 RNasin) 。

。 检查 反 转 录 和 PCR 的 反应 组 分 ， 尤 其 是 酶 。

。 检查 反应 所 用 的 各 个 组 分 。

。 检查 PCR 循环 参数 。

@ 产量 低下

。 检查 样品 均 质 化 或 裂解 是 否 完全 。

。 检查 最 终 得 到 的 RNA 沉淀 是 否 溶解 充分 。

。 测定 Azxso/Asxso 是 否 小 于 1.65 (说明 有 蛋白质 或 其 他 杂质 污染 ) 。

© 阳离子 盐 会 定量 地 与 dNTP 结合 ， 破 坏 cDNA 合成 和 PCR, * 287 ，

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

。 检查 RNA 降解 状况 。

© 获得 的 组 织 没有 立刻 处 理 或 冷冻 。

。 纯 化 的 RNA 储存 在 一 20"C 而 非 一 807C 。

© 液 相 溶剂 或 所 用 反应 管 不 是 无 RNase 的 。

图 DNA 污 染

。 如 果 样 品 未 经 DNase 处 理 就 可 能 发 生 DNA 污染 。

。 确保 加 上 RT- 对 照 以 证 实 是 否 有 DNA 污染 。

© 数据 不 重复

。 使 用 薄 壁 管 〈2001wl LHRH); 如 果 选 用 了 厚 壁 管 ， 那 么 就 延长 循环 参数 。

。 考虑 使 用 热 启 动 PCR 〈 见 第 19 章 )。

。 每 种 细胞 类 型 准备 一 大 管 反应 总 混合 液 ， 然 后 分 装 到 各 反应 管 。

。 选用 Tan 更 接近 的 上 游 和 下 游 引 物 对 。

。 考 虑 选用 为 长 程 PCR 设计 的 〈 如 AccuTaq L. A. Sigma 产品 ) 混合 酶 (如 Tac 十 校对 酶 ) 。 这 些 酶 协同 作用 下 能 产生 更 多 产物 和 更 高 忠实 度 。

。 考虑 去 除 矿 物 油 ， 使 用 有 热 盖 的 PCR 热 循 环 仪 。

。 是 否 用 同样 方法 但 这 次 没有 抽 提 出 RNA。

。 是 否 同 一 天 使 用 同样 方法 但 这 次 没有 抽 提 出 RNA.

。 是 否 同一 操作 者 抽 提 但 这 次 没有 抽 提 出 RNA.

。 检查 细胞 或 组 织 生长 的 状态 。 细胞 处 于 不 同 的 细胞 周期 或 是 组 织 来 源 于 不 同 生 化 背 景 的 个 体 ， 结 果 可 能 不 重复 。

。 检查 是 否 用 了 不 同 的 反应 总 混合 液 。

。 确认 最 近 是 否 校 正 过 微量 移 液 器 。

。 优化 并 在 热 循环 仪 上 进行 反应 〈 而 非 同一 型 号 ) 。

。 购买 预制 胶 。 琼 脂 糖 和 聚 丙 烯 酰胺 的 预制 胶 都 有 供应 。

(3) 常规 建议

© 变性 温度 尽 可 能 低 (90~92°C),

。 降低 延伸 温度 到 68°C 。

。 每 个 循环 延长 延伸 时 间 (5 一 20s/ 循 环 ) 。

。 磨 大 微量 移 液 技术 ， 这 对 实验 的 重复 非常 重要 。 固 定时 间 校 正 微量 移 液 器 。

。 确保 各 样品 中 加 入 的 RNA 量 是 一 致 的 。 竞 争 PCR 对 加 入 的 RNA (在 cDNA 合成 时 ) 和 cDNA (在 PCR 扩 增 时 ) 量 极为 敏感 。 就 像 绝 大 多 数 RT-PCR 的 “ 少 即 是 多 ” 即 在 反应 中 过 量 的 模板 通常 会 对 产量 有 副作用 。 混 合 PCR 反应 液 时 ， 可 以 在 吸取 组 分 后 ， 先 掠 国 拭 微量 移 液 器 枪 头 的 外 表面 ， 再 分 装 和 反应 管内 。 这 样 可 避免 将 枪 头 外 表面 的 液 滴 带 人 反应 而 造成 意外 的 影响 。 区

。 遵守 标准 方法 防止 引入 污染 ， 包 括 带 滤芯 的 移 液 枪 头 或 容积 起 枪 头 (positive dis- placement micropipettors) 。

”学 虑 使 用 硅烷 化 处 理 的 微型 离心 管 〈 见 附录 8) 。 因 为 CDNA 和 PCR 产物 在 扩 增 前 都 是 皮 克 (pe) 级 的 《或 更 少 )， 而 这 类 反应 管 可 将 各 种 操作 的 损失 降 至 最 小 。 用 超 纯 的 糖 原 对 微量 模板 进行 稀释 也 是 很 有 利 的 。

。288 -

$208 定量 PCR 技术

20. 13 ”实时 PCR

现在 广为人知 的 实时 PCR (real-time PCR, RT-PCR) (Higuchi 等 ，1992; Higuchi 等 ，1993) 对 基因 和 转录 本 进行 定量 ， 是 一 个 重大 突破 。 这 项 利用 荧光 技术 的 方法 ， 在 PCR 累积 过 程 中 对 产物 进行 定量 ， 并 不 需要 在 固定 循环 数 的 扩 增 结束 之 后 再 用 电泳 对 产物 的 量 和 种 类 进行 鉴定 ， 即 终点 实验 。 最 近 ， 许 多 科学 文献 将 实时 PCR MLE “HM RT- PCR”。 但 是 RT-PCR 事实 上 直接 指 代 的 是 cDNA 的 合成 和 随后 的 扩 增 ， 可 能 根本 不 涉及 实 时 PCR 的 应 用 ， 因 此 ， 这 种 命名 常常 带 来 混乱 。 就 像 本 文 对 实时 PCR 的 描述 那样 ， 指 出 所 进行 的 分 子 技术 则 不 会 给 读者 带 来 理解 上 的 问题 。

实时 PCR 需要 某 种 荧光 标记 试剂 ， 一 台 带 有 荧光 激发 设备 的 热 循环 仪 ， 通 常 和 光纤 系 统 相 连 的 灵敏 的 冷却 电离 耦合 (charge-coupled device, CCD) 相机 ， 以 及 控制 以 上 设备 的 电脑 。 简 而 言 之 ， 就 是 根据 PCR 过 程 中 菊 光 增长 水 平 来 推测 转录 本 的 丰 度 ;， 因此， 这些 数 据 和 用 于 精确 定量 的 标准 曲线 相关 。 如 果 与 看 家 基因 GAPDH 或 HPRT 比较 得 到 的 相对 丰 度 仍 不 能 满足 研究 者 的 需要 ， 在 希望 能 确切 知道 某 种 mRNA 的 拷贝 数 时 ， 那 么 如 前 所 述 ， 可 以 将 CRNA 参照 和 实时 PCR 联 用 。 在 检测 cDNA 合成 或 CDNA 扩 增 时 是 否 有 抑制 剂 这 些 对 照 也 很 有 价值 。 总 的 来 说 ， 这 一 方法 超常 的 灵敏 度 已 被 广泛 接受 ， 因 为 它 甚至 能 检测 单个 细胞 (Smith 等 ，2000) 或 是 单个 基因 的 单个 拷贝 (Wettwer 等 ，1997) 。

实时 PCR 操作 在 检测 转录 本 丰 度 方面 有 如 下 若干 优 于 传统 方法 之 处 。

@ 与 竞争 PCR 相 比 更 节省 时 间 。

G@ 更 快速 和 更 高 通 量 。

@) 广泛 的 定量 动力 学 范围 ， 通 常 为 6 一 8 个 数量 级 。

© 大 部 分 为 自动 化 过 程 。

@ 反应 管 为 封闭 系统 ， 从 而 降低 了 样品 间 污 染 、 实 验 室 扩 增 子 污染 和 由 样品 操作 引入 的 可 变 因 素 。

© 没有 PCR 后 的 样品 操作 。

@ 附带 进行 精确 分 析 的 软件 。

常规 的 熔点 曲线 分 析 可 以 区 分 PCR 产物 和 引物 二 聚 体 。

@ 可 以 在 cDNA 进行 PCR 扩 增 的 指数 期 判定 起 始 的 RNA 模板 数 。

初次 发 表 的 实时 PCR 操作 利用 了 省 化 乙 锭 CEB) WRIA. AW EBA VHA PCR 产物 的 双 链 ， 和 产物 成 比例 地 结合 并 发 出 荧光 ， 这 被 称 为 嵌 合 法 Cintercalator-based detec- tion)。 尽 管 和 传统 的 PCR iA AB LEA See, (RA WPT RORY Re SPCR 中 的 特异 产 物 ， 也 包含 了 非特 异 产物 。 只 要 是 做 过 EB 染 凝 胶 的 人 都 知道 ，EB 造成 的 凝 胶 内 部 荧光 背 景 始 终 是 个 大 问题 。 于 是 ， 用 仅 与 双 链 DNA ( 即 PCR 产物 ) 结合 才 发 射 荧光 的 SYBR 绿 工 代替 EB， 这 个 问题 也 因此 有 所 改善 。 尽 管 如 此 ， 非 特异 产物 的 荧光 发 射 〈 假 阳性 ) 依然 存 在 ， 任 何 合成 的 双 链 产物 ， 无 论 是 特异 的 还 是 非特 异 的 ， 都 能 导致 荧光 信号 的 增加 。

为 了 解决 这 个 内 在 问题 ， 后 来 又 改进 并 发 展 出 了 探 针 法 〈probe-based detection), ih 合法 相 比 ， 利 用 探 针 法 得 到 的 分 辩 率 更 高 。 这 种 新 方法 最 初 被 称 作 荧光 生成 5 -核酸 酶 实验 (fluorogenic 5 -nuclease assay)®, iit Wp ic 4 It Ye BAY HE KA MRR ET (Lee 等 ，1993;

@ 不 要 将 此 命名 与 第 16 章 谈 到 的 核酸 酶 保护 实验 混 消 。 。 289 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

Livak 等 ，1995) ， 使 之 可 以 和 模板 旁 侧 序列 的 5 端 和 3 端 引物 之 间 的 区 域 结合 ， 在 探 针 的 5/ 端 标记 荧光 报告 基 团 ， 常 用 的 有 6- 羧 基 荧 光 素 (6-carboxyfluorescein, 6-FAM); 在 探 针 的 3" 端 或 者 临近 区 域 标记 荧光 狂 灭 基 团 6- 羧 基 - 四 甲 基 - 罗 丹 明 (TAMRAI*” )。 由 于 单个 探 针 内 荧光 报告 基 团 和 狐 灭 基 团 的 空间 定位 接近 ， 所 以 抑制 了 报告 基 团 的 F6rster 共振 能 量 转 移 (Forster resonance energy transfer), Forster 共振 能 量 转 移 又 称 获 光 共 振 能 量 转 移 〈flu- orescence resonance energy transfer), ， 简 称 为 FRET (Frster，1946，1948) 。 由 于 设计 探 针 时 使 其 Tu。 温度 高 于 引物 温度 ， 探 针 与 模板 的 退火 就 比 引物 对 相应 位 点 的 退火 更 快 。 在

5 引物 探 针 jae OH—® 5) 模板 与 基因 持 异 的 报告 基因 探 针 退火 3 引物 SEE © —Q » TTT SS SL TIPE HAIE), Tagre ae) 5 一 ~ 3 RIM IRS sii tui 换 和 降解 a a Se @ ce) A im -本 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 —-_§ RELA SHRBANGS, 即 可 检测 荧光

图 20.8 实时 PCR. (a) 含有 荧光 报告 基 团 (F) ARIE REA (Q) 的 荧光 探 针 和 模板 退火 。 只 要 保持 了 探 针 的 完整 性 ， 报 告 染 料 的 菊 光 就 被 附近 的 狐 灭 染料 所 狂 灭 。 〈b) 在 PCR fe, Taq 聚合 酶 的 5 3) 核酸 外 切 酶 活性 造成 探 针 的 置换 ， 并 将 探 针 切割 降解 。 (co) 一 且 与 狂 灭 染料 分 离 ， 报 告 染 料 的 荧光 CREM RA) 即 被 实时 测量 。 荧 光 的 发 射 和 PCR 产物 的 产生 直接 相关 。 然 后 ，PCR 引物 继续 延伸 并 通过 暴露 出 的 区 域 形 成 完整 的 产物

68~72C 之 间 上 游 引物 延伸 时 ， 伴 随 Taq 聚 合 酶 的 5 3 核酸 外 切 酶 活性 遂 取 代 并 切割 了 与 靶 链 结合 的 寡 核 苷 酸 探 针 。 如 此 这 样 ， 所 谓 的 荧光 报告 基 团 从 探 针 中 被 释放 出 来 ， 不 再 受 荧光 狂 灭 基 团 的 影响 ， 在 热 循环 仪 各 孔 上 方 的 激光 激发 下 发 射出 荧光 。 探 针 原先 结合 抑制 了 部 分 模板 ， 随 后 探 针 被 取代 ， Taq) 5 一 3 聚合 酶 活性 因此 通过 这 部 分 模 板 继续 合成 ， 最 终 产 生 PCR 产物 《图 20.8)。 随 着 这 一 过 程 的 不 断 重 复 ， 从 探 针 荧光 儿 灭 基 团 附近 释放 出 来 的 5 荧光 报告 基 团 逐 渐 增 多 ， 光 纤 -CCD 系统 就 可 以 检测 到 愈 来 愈 多 的 荧光 信号 。 这 一 实验 目前 被 广泛 称 作 TaqMan Xe, Wa, WABI HK 检测 探 针 取 代 过 程 中 释放 的 5 未 端 标记 3 P, 并 以 此 为 反应 结束 时 的 检测 指标 ;而 在 本 书 纂 写 期 间 市 面 上 最 新 版 的 实时 PCR 热 循 环 仪 装 备 了 若干 检测 通道 ， 可 以 让 研究 者 胸 有 成 竹 地 进行 多 重 反应 。 由 于 多 重 反 应 内 加 入 了 若干 种 引物 对 和 探 针 ， 完 成 三 套 反应 所 需 的 时 间 大 大 减少 ， 相 应 的 生产 率 则 惊人 地 增长 。

关于 数据 分 析 ， 实 时 PCR 的 分 析 软 件 可 计算 阔 值 循环 数 (threshold cycle, Cr).

装 值 循环 数 即 样品 发 射 的 荧光 达到 10 倍 于 基线 (或 是 其 他 指定 的 倍数 ) 的 循环 数 ， 在 实时 PCR 起 始 时 ， 保 证 产物 累积 和 模板 起 始 量 呈 线性 关系 非常 重要 。 反 应 起 始 时 的 模板 量 越 多 就 越 容易 《〈 快 ) 检测 到 明显 的 荧光 增强 CA 20. 9) 。 如 果实 验 使 用 的 是 Roche 光 循 环 仪式 图 20. 10) 或 是 Perkin-Elmer ABI PRISM7700HT 测序 检测 仪 来 检测 荧光 信号 ， 那 委 在 反应 绪 束 时 无 需 对 样品 进行 任何 操作 。 这 些 数 据 随后 会 与 标准 曲线 〈 图 20. 11) 比较 ， 从 而 得 出 对

起 始 模板 的 精确 定量 . 由 于 几 个 显而易见 的 理由 ， 实 时 PCR 系统 显得 特别 有 诱惑 力 。 由 于 定量 行为 和 基于 志 脑 的 自动 操作 联系 在 一 起 ， 在 各 个 连续 循环 中 收集 数据 并 立刻 分 析 。 该 操作 将 此 类 实验 的 动

力学 线性 范围 拓展 到 对 数 为 7 的 范围 - 290 -

由 于 进行 实验 的 反应 管 到 结束 时 也 不 需 打开 ， 理 论 上

第 20 章 定量 PCR 技术

RT-PCR 扩 增 图

循环 数 图 20.9 实时 PCR 在 各 个 循环 结束 时 测量 PCR 产物 的 量 ， 对 循环 数 函 数 作 图 。 重 要 参数 阔 值 循环 数 即 Cr ， 表 明 产 物 数 量 已 累积 到 预 SKE. eM (SERA DNA 或 cDNA) HARD. Cr 就 越 高 (AAI Applied Biosystems, Inc. 的 K. J. Livak 博士 提供 )

20. 10” 光 循环 仪 实 时 PCR 系统 〈 由 Roche Applied Science 提供 )

减少 了 扩 增 子 污 染 和 实验 室 污 染 的 可 能 性 。 更 有 甚 者 ， 由 于 有 若干 种 报告 荧光 标记 物 可 供 选 用 ， 进 行 多 重 反 应 也 成 为 可 能 。 这 种 方法 的 缺点 是 购买 此 类 仪器 通常 需要 5 万 美元 或 更 多 ， 合成 针对 各 目标 基因 所 需 的 、 带 有 不 同 荧光 基 团 标记 的 寡 核 苷 酸 探 针 也 颇 为 昂贵 。 无 论 如 何 要 强调 的 是 ， 虽 然 实时 PCR 能 同时 检测 若干 基因 ， 但 想 检 测 更 多 基因 的 话 ， 这 就 不 是 一 种 合适 的 选择 了 。 通 常 ， 研 究 者 先 用 第 23 章 描述 的 芯片 技术 预 筛 选 基因 的 差异 表达 。 然 后 ， 在 确认 了 上 调 序 列 和 下 调 序 列 之 后 ， 再 用 实时 PCR 来 确证 那些 推定 的 基因 调控 。

显然 ， 实 时 PCR 有 很 广泛 的 潜在 用 途 ， 包 括 检 测 病原 体 、 分 子 诊 断 、 突 变 检 测 、 检 测 可 变 剪接 、 对 存档 很 久 的 组 织 样品 进行 分 析 、 长 期 的 室内 研究 和 在 要 求 高 通 量 的 实验 室内 使 用 。 在 世界 范围 的 合作 研究 基础 上 ， 有 关 的 实验 室 必须 将 所 有 实验 操作 步骤 标准 化 ， 并 确立 几 种 对 照 或 参照 RNA 用 以 进行 定量 分 析 。 大 多 数 主要 的 生物 技术 供应 商都 提供 几 种 不 同 组 织 来 源 的 细胞 系 和 不 同 丰 度 RNA 转录 本 的 集合 〈 讨 论 见 第 7 章 ) 作为 参照 RNA。 由 于 每 一 批号 的 参照 RNA 都 是 由 大 规模 工业 化 制 得 的 ， 因 此 ， 在 相当 长 时 间 内 可 以 购 得 同一 批号

« 291 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

RT-PCR 标 准 曲线

R2=0.9968

oe fERR 图 20. 11 如果 需要 确定 绝对 数量 〈 某 种 程度 而 言 用 词 不 当 )， 那么 就 按 常用 方法 制备 已 知 模板 量 的 梯度 稀释 并 测量 、 制 作 标准 曲线 。 但 是 ， 如 果实 验 最 终 要 求 的 是 相对 丰 度 ,那么 实时 PCR 就 应 将 目标 基因 的 累积 产物 与 对 照 基 因 或 看 家 基因 (如 GAPDH 或 B 肌 动 蛋白 ) 的 产物 直接 进行 比较 。 在 标准 曲线 分 析 的 基础 上 ， 模 板 的 起 始 拷贝 数 与 阔 值 循环 数 (Cr) 呈 函 数 关 系 ARB Applied Biosystems, Inc. 的 K. J. Livak 博士 提供 )

的 RNA， 不 同 地 域 的 用 户 也 很 容易 买 到 同样 的 对 照 材 料 。 更 有 甚 者 ， 一 些 供应 商 还 提供 热 启动 配方 的 实时 PCR 总 混合 液 Cal Sigma 公司 的 Jump Start).

20.14 参考

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Applic. 4, 363.

(254%; WAR)

« 295 -

第 21 章 RE Mis

21.1 基本 原理

决定 细胞 和 组 织 分 化 ， 直 至 赋予 生物 体 各 种 表 型 的 基因 表达 ， 在 转录 水 平 微妙 有 序 地 进 行 ， 犹 如 一 曲 优美 的 交响 乐 。 比 较 两 个 或 更 多 位 置 相近 的 不 同 细胞 类 型 中 ， 确 定 哪 些 基 因 都 相同 地 表达 了 ， 而 哪些 基因 表达 是 不 同 的 ， 这 是 许多 分 子 生 物 学 家 长 期 追求 的 目标 。

文献 中 不 断 提 到 ， 把 RNA 作为 基因 表达 的 最 佳 指标 。 在 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 这 一 现 在 分 子 生物 学 家 所 用 的 主流 工具 出 现 以 前 ， 一 种 通常 称 为 差 减 杂交 的 方法 及 各 种 类 似 的 方法 可 用 来 去 除 两 组 mRNA 和 cDNA 中 的 相同 序列 (Sargent 和 Dawid, 1983; Hedrick 等 ， 1984; Fornace 和 Mitchell, 1986; Sargent, 1987; Orr 等 ，1992; Lisitsyn 等 ，1993; Zhang 等 ，1995)。 不 同 的 表达 产物 使 用 物理 方法 分 离开 来 ， 包 括 羟基 础 灰 石 8 层 析 〈Ber- nardi, 1971; Sargent，1987)、 生 物 素 标记 结合 链 霉 亲 和 素 俘获 和 修饰 的 琼脂 糖 层 析 (Welcher 等 ，1986) 、 基 于 PCR 的 磁 珠 俘获 方法 (Sharma 等 ，1993) 、 生 物 素 标 记 结 合 磁 珠 分 离 8 (Rodriguez 和 Chader, 1992; Lambert 和 Williamson, 1993; Lopez-Ferndndez 和 del Mazo, 1993; Coche 等 ，1994) 、 生 物 素 标记 结合 酚 抽 提 (Travis 和 Sutcliffe, 1988), 完整 基因 库 的 交叉 杂交 (Kulesh 等 ，1987; Cochran 等 ，1987) 和 不 对 称 PCR (Houge, 1993) 等 。 有 趣 的 是 ， 有 时 这 些 方法 及 其 修改 方法 实际 上 在 某 些 方面 又 回 到 了 原来 的 方法 。 一 般 而 言 ， 每 一 方法 都 有 它 的 不 足 之 处 ， 表 现在 效率 或 灵敏 度 等 方面 。 目 前 还 没有 一 种 方法 单独 在 细胞 裂解 时 能 很 好 地 显示 其 基因 的 表达 状况 。

“ 差 减 ” 和 “ 差 减 杂 交 ” 这 两 个 术语 代表 一 个 整体 的 概念 ， 即 相对 于 一 种 特异 的 上 调 或 下 调 的 转录 序列 ， 以 此 来 确定 是 否 有 基因 表达 的 调节 控制 。 这 也 是 本 书 其 他 章节 中 讨论 到 的 许多 技术 的 基础 。 然 而 ， 差 减 杂 交 方 法 与 用 抗体 进行 的 特异 的 和 非特 异 的 多 聚 体 的 免疫 沉淀 (第 6 章 ) 是 完全 不 同 的 。 建 立 于 核酸 基础 之 上 的 差 减法 一 一 核酸 差 减 法 吸引 人 之 处 在 于 其 结果 是 得 到 一 套 与 细胞 表 型 变化 部 分 相关 或 完全 相关 的 序列 。

如 图 21. 1 所 示 ， 用 物理 差 减 法 从 不 同 的 转录 分 子 中 减 去 一 套 共同 的 序列 ， 得 到 差异 表

@ 羟基 础 灰 石 { (Cas(PO,);OH].) 是 磷酸 钙 的 不 溶解 结晶 。 历史 上 被 用 于 各 种 大 分 子 GRR) 的 纯化 。 这 种 介质 的 独特 性 质 可 以 使 单 链 核酸 与 双 链 核酸 (cDNA : mRNA 和 DNA : DNA) 分 开 。 简 而 言 之 ， 在 极 低 浓度 磷酸 盐 缓 冲 液 中 单 链 核酸 和 双 链 核酸 都 能 吸附 在 柱 上 。 增 加 磁 酸 盐 浓 度 时 ， 低 盐 条 件 〈0. 12mol/L Na,H,PO,, pH 6.8) 可 以 洗 下 单 链 核酸 ， 双 链 核酸 则 需 高 盐 条 件 〈 直 至 0. 48mol/L Na,H,PO,, pH 6. 8) 才能 洗 下 。 在 60 人 时 可 以 分 得 最 清楚 。 羟 基 磷 灰 石 也 成 功 地 应 用 于 超 螺旋 DNA 与 线形 分 子 的 分 离 。

@ 2A 7 章 poly(A) mRNA 的 磁 珠 纯化 。 其 基本 过 程 可 以 经 过 其 中 任 一 步 修改 后 用 于 许多 不 同 大 分 子 的 纯化 。

+ 296 -

第 21 章 转录 差 减 法

1 2 3 4. 5 | lye Ab ss pao. B B 第 一 链 cDNA $B“ 4B mRNA:cDNA : 本 受 调控 的 转录 物 (生物 素 化 ) 双 链 B (生物 素 化 ) 四 | 同性 捕获 Le | 和

用 链 霉 亲 和 素 直接 沉淀 21.1 差 减 杂交 鉴定 差异 表达 序列 的 总 体 策略 。 状 态 A 的 mRNA 被 反 转 录 成 第 一 链 CDNA. 用 Bio-21-dUTP 摊 人 法 或 光 生 物 素 化 法 ， 使 这 个 过 程 中 的 翻译 本 ， 即 cDNA 生物 素 化 。 然后 第 一 链 CDNA 被 用 作 状 态 A 细胞 和 状态 B 细胞 正常 转录 mRNA 的 探 针 。 生 成 的 RNA : cDNA 杂 合体 被 用 物理 方法 分 离 去 除 。 同 样 的 方法 可 以 用 于 整个 文库 的 筛选

达 的 分 子 的 结果 。 这 些 分 子 ， 适 用 于 克隆 、 限 制 性 酶 切 图 谱 分 析 、 测 序 和 表达 研究 。 虽 然 这 些 方法 用 得 很 多 ， 通 常 它 适 于 筛选 那些 中 等 到 高 丰 度 表 达 的 差异 序列 ， 而 对 那些 从 抑制 状态 重新 恢复 表达 的 序列 未 必 适 用 。 将 差 减 杂 交 与 PCR 联合 使 用 ， 则 表达 丰 度 非常 低 的 上 调 或 下 调 的 mRNA 也 能 被 检测 出 来 。

一 个 实验 就 能 区 分 共有 的 表达 序列 与 受 条 件 调节 的 表达 序列 ， 这 是 非常 吸引 人 的 。 下 面 是 一 些 近年 来 很 多 人 在 做 的 比较 实验 。

@ 休止 细胞 与 衰老 细胞 的 比较 。

@ 前 体 细胞 与 终极 分 化 细胞 的 比较 。

@@ 受 感染 细胞 与 未 受 感染 细胞 的 比较 。

@ 将 某 些 能 进行 渗透 调节 的 鱼 从 盐水 移 到 淡水 中 其 肾脏 结构 的 改变 。

© 良性 肿瘤 与 实体 瘤 的 比较 。

© 双 倍 体 细胞 与 建立 的 细胞 株 的 比较 。

@ 苹果 与 橘子 〈 或 桃子 ) 的 比较 。

然后 ， 比 较 实 验 可 以 在 任何 两 组 群体 之 间 以 任何 原因 进行 ， 其 结果 是 获得 细胞 从 状态 A 到 状态 B 时 与 变化 相关 的 调节 序列 。

21.2 关键 问题

不 管 具 体 的 方法 ， 一 个 从 事 分 化 表达 工作 的 研究 者 ， 首 先 应 该 清楚 地 懂得 一 些 对 于 所 有 的 操作 程序 都 用 得 到 的 术语 和 概念 。 © 实验 组 〈tester) WA AMAL 〈target)， 其 中 包括 要 研究 的 被 诱导 的 那些 序列 。 驱 动 组 (driver) 是 对 照 的 或 参考 的 序列 ， 不 包含 那些 被 诱导 的 在 实验 结束 时 被 查询 的 序列 。 。 297 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

Q 为 了 理解 一 个 细胞 在 应 答 一 个 特别 的 实验 处 理 过 程 中 的 生化 改变 ， 通 常 需 要 做 第 二 次 差 减 实验 ， 此 时 ， 对 调 实验 组 和 驱动 组 。 换 名 话说， 在 正 向 差 减 中 ， 从 A 组 得 到 的 cDNA 是 实验 组 ， 而 B 组 cDNA (或 mRNA) 是 驱动 组 。 然 而 ， 在 反 向 差 减 中 ， 从 也 组 得 到 的 cDNA 是 实验 组 ,而 A 组 cDNA (或 mRNA) 是 驱动 组 。 这 样 有 利于 鉴定 在 设计 的 实验 条 件 下 诱导 的 和 抑制 的 序列 。

@ 差 减 杂交 实验 的 实际 操作 过 程 中 ， 驱 动 组 的 摩尔 分 子 数 量 总 是 多 于 实验 组 的 。 这 样 可 以 确保 第 一 轮 杂 交 的 动力 学 要 求 ， 使 杂交 能 够 完全 去 除 两 组 共有 的 序列 。 在 几 小 时 后 向 杂 交 液 中 补 加 新 鲜 的 驱动 组 样品 常常 是 有 帮助 的 。 驱 动 组 比 实验 组 样品 至 少 要 过 量 10 倍 ， 通 常 两 者 使 用 量 之 比 为 30 : 1， 甚 至 更 多 。

® 如 果 操 作 得 当 ， 通 过 差 减 杂交 ， 实 验 组 中 任何 不 能 与 驱动 组 互补 的 序列 都 能 增多 。

©) 差 减 法 的 总 效率 依赖 于 正 向 杂交 动力 学 的 效率 和 在 整个 过 程 中 严格 地 维持 此 效率 。 这 两 点 依赖 于 盐 浓 度 、 杂 交 温 度 、 杂 交 时 间 和 驱动 组 样品 的 持续 过 量 存在 。

© 通常 假定 PCR 有 效 ， 合 成 第 一 链 cDNA 的 PCR 引物 设计 合理 ， 并 且 掌 握 好 核酸 化 - 学 知识 ， 对 有 效 差 减 实 验 而 言 ， 就 不 一 定 需要 选择 RNA 的 大 小 和 poly(A)” 了。

@ 如 果 用 生物 素 标记 cDNA 或 RNA 也 被 称 为 是 差 减 杂交 设计 一 部 分 的 话 ， 那 么 可 以 在 体外 转录 中 使 用 生物 素 标记 的 核糖 核 苷 三 磷酸 ， 在 随机 引物 、 缺 口 平 移 、PCR 中 使 用 生 物 素 化 的 脱氧 核 苷 酸 ， 或 者 在 非 酶 标记 中 使 用 光 活 性 的 生物 素 。 单 独 生 物 素 标记 的 随机 引物 加 PCR 的 方法 在 每 一 条 链 中 生物 素 挫 人 量 太 少 ， 而 与 生物 素 标记 的 脱氧 核糖 核 苷 三 磷酸 一 起 用 于 PCR 的 标记 ， 可 以 得 到 足够 的 标记 量 。

@ 通常 在 驱动 组 样品 过 量 的 情况 下 ， 杂 交 时 间 越 长 ， 除 去 两 组 样品 中 相同 序列 的 效率 就 越 高 。 因 而 有 利于 富 集 单一 的 、 诱 导 的 序列 。

© PCR 差 减 分 析 的 优点 ， 还 在 于 其 片段 可 以 如 第 19 章 所 述 用 于 TA 克隆 或 TOPO 克隆 。

@ 所 有 差异 表达 的 克隆 必须 用 第 二 种 甚至 第 三 种 方法 进行 筛选 ， 进 一 步 肯定 实验 结果 的 正确 性 。 这 些 方法 包括 Northern 分 析 〈 第 12 章 ) 、 核 酸 酶 保护 分 析 G16 章 )、 其 他 定 Ht PCR 方法 CH 20 章 、 第 22 章 、 第 23 章 ) 、 修 饰 的 Southern 分 析 (Thomas 等 ，1994) 等 。 要 明白 ， 单 从 差 减 得 到 的 序列 并 不 能 肯定 就 是 差异 表达 的 目标 基因 。

@ 不 立即 使 用 的 CDNA 以 乙醇 沉淀 的 形式 储存 在 一 80C， 或 以 水 溶液 冰冻 储存 在 一 80C。 在 第 二 条 差 减 CDNA 链 合成 后 分 装 存储 是 明智 的 ， 避 免 反 复 冻 融 。

21.3 差 减 -校正 PCR

大 多 数 鉴定 差异 表达 基因 的 新 方法 都 是 以 PCR 为 基础 的 。 特 别 是 核酸 差 减 倡 联 校正 PCR (Siebert 等 ，1995) 的 方法 ， 已 经 成 为 分 离 差 异 表 达 mRNA 的 常用 方法 。 它 的 特点 是 VA PCR 为 基础 的 分 析 ， 支 持 这 一 分 析 的 单一 接头 的 设计 是 这 一 系统 (PCR- 筛 选 EDNA 差 减 AG; BD Biosciences) 的 关键 。 从 图 21. 2 可 以 看 到 ， 这 个 分 析 体系 的 结构 有 利于 使 差异 表 达 的 序列 标准 化 ， 也 即 通过 这 个 分 析 体 系 ， 不 论 在 原始 生物 材料 中 丰 度 如 何 ， 得 到 的 所 有 差 异 表 达 的 序列 浓度 都 差不多 。 这 对 于 鉴定 差异 表达 序列 而 言 是 很 理想 的 ， 因 为 经 常 得 到 丰 度 高 的 序列 而 很 难得 到 表达 低 的 甚至 未 表达 的 CDNA, 因此 ， 从 标准 化 的 亚 cDNA 库 中 测定 100 个 克隆 的 序列 ， 可 以 得 到 更 完全 的 上 调和 下 调 的 序列 变化 结果 ， 与 细胞 内 那些 保留 相对 - 298 -

第 21 章 ”转录 差 减法

cDNA 合成 Rsa | Wifi 接头 连接 用 两 种 不 同 的 接头 分 别 与 实验 组 和 驱动 组 实验 组 和 驱动 组 的 双 用 关 分 别 ， 第 一 次 杂交 的 双 链 <DNA 从 各 自 链 cDNA 分 别 用 Rsa 酶 解 | 思 中 | 实验 组 酶 解 片段 连接 ， 得 | 思 中 | 达到 杂交 动力 学 平衡 ， 使

到 两 组 实验 组 的 亚 群 ;而 差异 表达 的 序列 得 到 富 集

的 mRNA 样品 制备 得 到 短 的 平头 片段 驱动 组 样品 无 接头

第 二 次 杂交 第 二 次 PCR 扩 增 第 二 次 PCR 扩 增 ee 中 | 从 差异 表达 的 序列 产生 用 || 抑制 PCR， 仅 仅 使 差异 | | 降低 本 底 ， 进 一 步 富 集 于 PCR 扩 增 的 模板 表达 的 序列 得 到 指数 扩 增

差异 表达 的 序列

图 21.2 BD Biosciences Clontech 公司 的 PCR-ifiit cDNA 差 减 系统 (Bois: 637401) 的 概要

丰 度 的 亚 cDNA 库 相 比 有 利得 多 了 。

在 实际 应 用 中 ，PCR- 筛 选 方法 取得 了 很 好 的 结果 。 虽 然 它 在 技术 上 比 其 他 几 种 方法 更 具 竞争 力 ， 而 差 减 -校正 PCR 对 大 大 富 集 低 丰 度 转录 本 有 利 ， 从 而 比 差异 显示 能 产生 更 完全 的 基因 表达 情况 。 可 以 期 待 在 丰 度 上 差 5 倍 的 任何 序列 能 够 容易 地 通过 差 减 而 得 到 它们 的 序 列 ， 但 是 比 驱动 组 样品 小 到 1. 5 倍 的 基因 ， 用 PCR- 筛 选 方法 仍 有 困难 。

在 图 21. 3 中 ， 简 单 解 释 了 一 种 涉及 两 个 实验 组 样品 ， 用 两 种 接头 分 别 建 立 两 组 亚 样品

接头 1 5 'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3’ 3’ GGCCCGTCCA 5’ T7 启 动 子

(a) 5' CTAATACGACTCACTATAGGGC 3! << PCR 引 物 1

巢 式 PCR 引 物 1 wars 3 TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3’

接头 2R

5’ CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3’ 3'GCCGGCTCCA 5’

T7 局 动 子

(b) 5! CTAATACGACTCACTATAGGGC 3’ <a PCRS| 771

梨 式 PCR 引 物 2R Id> 5 AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3’

引物 1 巢 式 引物 1 =P 2ZZv>

i831

< 1 巢 式 引物 2R 引物 1

21.3 通过 接头 连接 ， 制 备用 于 杂交 和 PCR 的 实验 组 cDNA。 在 进行 正 向 差 减 和 反 向 差 减 时 ， 每 一 个 实验 组 cDNA 必须 如 图 所 示 连 接 上 合 适 的 接头 〈BD Biosciences Clontech 惠 赠 )

(c)

¢ 299 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

组 的 做 法 。 而 驱动 组 仍然 不 连接 接头 。 由 于 实验 组 cDNA 是 经 限制 性 酶 Rea TABI, Rea T 识别 4 个 碱 基 对 的 序列 ， 产 生 的 是 平头 ， 因 此 有 利于 接头 的 连接 。 这 个 方案 的 特点 是 技 六 5 无 磷酸 基 团 .因此 ， 夯 sDNA 是 磷酸 的 供 体 ， @ 接 头 中 只 有 一 条 链 与 每 一 条 cDNA BE 接 ，@@ 接 头 中 相同 序列 的 部 分 ， 在 补 齐 反应 后 有 利于 引物 的 配对 和 后 续 的 上 CR。

应 用 两 次 杂交 和 两 套 实验 组 样品 适当 混合 的 差 减 结果 〈 图 21. 4)， 从 差异 表达 的 序列 三 生出 模板 进行 cDNA 扩 增 。 然 后 ， 用 梨 式 引物 进行 第 一 组 和 第 二 组 扩 增 ， 并 且 依 靠 PCR Be 正 现象 ， 得 到 的 产物 是 富 集 了 的 相同 量 的 差 减 序列 〈 图 21. 5) 。 经 富 集 的 差异 表达 序列 进行 克隆 ， 继 而 证 实 其 差 减 状 态 ， 并 测序 CA 21. 6) 。 保 证 在 第 二 次 PCR PS AT 这 对 于 去 除 小 片段 垃圾 并 得 到 适量 的 对 鉴定 有 用 的 较 大 的 cDNA 是 绝对 需要 的 。 在 笔者 实 验 室 ， 用 第 一 次 PCR 扩 增 产物 克隆 差 减 PCR 产物 时 ， 只 能 得 到 小 的 DNA 片段 ， 而 未 能 区 隆 到 有 意义 的 大 片段 。

带 接头 1 的 实验 组 cDNA 驱动 组 cDNA( 过 量 ) 带 接头 2R 的 实验 组 cDNA ———

———— Se | 第 一 次 杂交 一 一 一 一

第 二 次 杂交 : 混合 反应 物 ， 加 新 的 变性 的 驱动 组 样品 ; 退火

5 <_—_———3 e 指数 扩 增 ，( 昌 然 e 分 子 两 个 未 端 各 有 一 条 引物 结合 Jos 序列 实际 上 所 有 在 两 端的 较 短 的 同 源 序列 不 能 校正 PCR 作 用 一 除了 非常 短 的 分 子 。 详 见 校正 PCR 的 附注 ) 21.4 差 减 -校正 过 程 显 示 反 应 中 各 种 EDNA (实验 组 与 驱动 组 ) 如 何

相互 作用 。BD Biosciences Clontech 惠 赠 (PCR-Siv cDNA 差 减 系统 ) 在 差 减 -校正 PCR 方法 中 杂交 是 重要 的 ， 并 分 为 两 次 ; 第 一 次 杂交 时 间 为 6 一 12h， 第 二

次 杂交 可 以 过 夜 。 第 一 次 杂交 超过 12h， 单 链 的 实验 组 分 子 可 能 在 分 子 内 或 分 子 间 形 成 碱 基 - 300 ，

第 21 章 ”转录 差 减法

68 C 退 火

_ 一 接头 引物 DNAG AK

无 引物 结合 : 7 = 盘 形 结构 校正 PCR

21.5 校正 PCR。PCR 过 程 中 因 非 特异 扩 增 形成 盘 形 结构 而 受到 有 效 抑 制 ， 而 由 不 同 接头 开始 的 双 链 DNA 的 特异 扩 增 能 够 顺利 进行 。BD Biosciences Clontech 惠 赠

图 21.6 差 减 -校正 PCR 的 典型 结果 。 六 个 RNA 样品 在 精确 控制 的 条 件 下 进行 差异 表达 检测 。 对 被 测 样品 如 “A” 反 应 、“B” 反 应 和 “C” 反 应 进行 配对 ， 然 后 进行 正 向 (A—F 等 ) 差 减 和 反 向 〈A 一 R 等 ) 差 减 。 差 减 的 产物 经 PCRPW. HR EB—A

泳 道中 的 条 带 是 差异 表达 的 序列 ， 接 着 克隆 ， 测 序 ， 并 在 进一步 的 实验 中 验证 其 差异 表达 。 泳 道 1，A 正 向 ; 泳 道 2，A 反 向 ; 泳 道 3，B 正 向 ; 泳 道 4， 分 子 量 标准 ; 泳 道 5，B 反 向 ; 泳 道 6，C 正 向 ; 泳 道 7，C 反 上 向

配对 ， 从 而 影响 第 二 次 杂交 时 双 链 分 子 的 形成 。

差 减 -校正 PCR 过 程 临 结束 时 ， 差 减 的 CDNA 被 连接 进 质 粒 ， 再 转化 大 肠 杆菌 。 做 好 这 一 步 ， 对 得 到 个 别 的 CDNA 也 是 重要 的 。 和 否则 ， 对 后 面 的 进一步 分 析 不 利 ， 因 为 质粒 制备 、 测序 都 是 费时 和 费 钱 的 。 可 以 用 一 个 初步 快速 的 筛选 方法 确定 差异 状态 ， 包 括 原 位 杂交 。 先 用 一 份 标记 的 实验 组 探 针 进行 原 位 杂交 ， 再 以 一 份 标记 的 驱动 组 探 针 对 复制 - 涂 板 克 隆 进 行 筛选 。 如 果 殉 隆 相 对 较 少 〈 过 500)， 一 个 有 效 的 途径 是 用 灭 菌 牙 签 挑 取 克隆 并 转 到 96 FLAK EL, BPP SE 200p] 灭 菌 的 含 10%% 甘 油 及 适当 抗生素 的 LB 培养 液 。37C 培 养 过 夜 后 ， 用 一 个 复制 - 涂 板 工 具 〈 图 21. 7) 将 样品 接种 到 新 鲜 琼 脂 糖 平板 上 ， 这 些 克 隆 在 相应 的 位 置 上 生长 ， 可 以 很 容易 地 跟踪 每 一 个 克隆 并 与 原先 的 孔 对 应 。 此 外 ， 在 复制 板 上 生长 的 死 隆 通 常 大 于 一 般 在 标准 涂 板 上 生长 的 克隆 。 这 些 较 大 的 区 隆 在 杂交 时 对 探 针 产生 明确 的 信号 。 那 些 由 实验 组 探 针 而 不 是 驱动 组 探 针 显示 的 克隆 ， 即 是 预期 的 差异 表达 克隆 。 此 时 ， 可 以 将 各 个 克隆 制备 成 质粒 并 测序 。 如 果 克 隆 是 生长 在 含有 甘油 培养 基 的 96 FL RE, HE AT DA A

。 301 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 二 RNA 研究 方法

图 21.7 细菌 克隆 复制 - 涂 板 工具 。 精 确 配合 96 孔 板 的 带 48 齿 的 不 锈 钢 又 子 ， 择 人 96

孔 板 上 已 经 生长 有 个 别克 隆 的 48 TILA 〈 通 常 每 孔 200uD. MRAM EAB. ENB 1.5% 的 琼脂 糖 平板 上 (含有 适当 的 抗生素 ) 培养 。 克 隆 在 平板 上 长 成 非常 规则 的 几何 形状 ， 具 有 相当 大 的 可 用 于 杂交 的 区 域 。 依 靠 几何 形状 和 强 的 杂交 信和 号， 很 容易 从 96 孔 板 上 获得 阳性 克隆 。96 孔 板 也 有 利于 克隆 的 构建 和 储存

膜 封 起 来 并 存储 在 一 80C 。 较 长 一 段 时 间 后 克隆 仍 具 有 活力 。 虽然 差 减 -校正 PCR 方法 需要 熟练 的 技能 ， 与 其 他 方法 相 比 也 相对 费时 间 ， 但 其 优点 也 是 非常 突出 的 。

21.4 # PCRER

目前 ， 最 常用 的 富 集 诱 导 序 列 的 方法 都 是 以 杂交 为 基础 ， 其 关键 是 除去 两 种 细胞 之 间 的 共同 序列 。 这 些 方法 中 不 少 又 是 与 以 PCR 为 基础 的 扩 增 联合 进行 的 。 如 前 所 述 ， 通 过 限制 非 目的 序列 的 扩 增 ， 而 进一步 富 集 诱导 的 序列 。 另 一 个 可 以 得 到 相同 实验 结果 的 方法 ， 虽 然 在 捕捉 诱导 序列 的 方法 上 不 同 ， 但 也 是 以 杂交 为 基础 的 。 最 后 ，PCR 也 可 以 用 于 扩 增 的 目 的 。 其 他 方法 如 随机 引物 法 ， 也 可 用 于 制备 差 减 EDNA， 并 进行 克隆 ， 也 可 用 于 建立 差 减 cDNA 库 或 直接 用 作 异 源 核酸 探 针 。

通过 比较 两 种 细胞 来 鉴定 差异 表达 序列 而 非 PCR 的 一 个 直接 方法 ， 是 利用 生物 素 与 链 霉 亲 和 素 之 间 很 强 的 亲和力 ， 然 后 用 很 简单 的 酚 / 氯 仿 抽 提 来 实现 〈 图 21.8)。 简 要 的 过 程 是 : 用 光 活 化 生物 素 标记 过 量 的 驱动 组 mRNA， 然 后 与 实验 组 的 CDNA 杂交 。 杂 交 后 的 样 品 中 带 生 物 素 的 分 子 包括 未 杂交 的 过 剩 的 mRNA 和 杂交 的 CDNA : mRNA 杂 合 双 链 ， 然 后 与 链 霉 亲 和 素 结合 ， 并 用 有 机 溶剂 酚 /氯仿 抽 提 除去 。 诱 导出 的 cDNA 则 留 在 水 相 中 ， 随 后 用 乙醇 沉淀 纯化 。

光 活 化 生物 素 标 记 是 极为 简单 的 经 常 使 用 的 方法 。 将 光 活 化 生物 素 与 要 标记 的 样品 (DNA, RNA KE AUR) 混合 ， 并 用 高 功率 白光 灯 (理想 的 波长 在 350~370nm) 进行 照射 即 可 。 生 物 素 标记 的 RNA 应 当 是 新 鲜 标 记 的 并 且 随 后 立即 使 用 ， 而 生物 素 标记 的 DNA 或 蛋白 质 样 品 则 很 稳定 ， 可 以 在 一 20C 储存 数 月 。 光 活化 生物 素 标记 是 非常 可 靠 的 标记 方法 ， 在 经 常 使 用 的 情况 下 ， 每 2 一 3 个 月 标记 一 次 就 可 以 了 。

杂交 通常 在 非常 严 谦 的 条 件 下 进行 24h， 有 时 长 达 48h。 杂 交 结 束 后 样品 要 很 快 稀释 以 防止 出 现任 何不 正确 的 杂交 。 加 入 链 霉 亲 和 素 ， 由 于 它 与 生物 素 的 高 亲 和 性 ， 因 而 可 以 结合 所 有 生物 素 标 记 的 未 杂交 的 驱动 组 mRNA 以 及 杂交 中 形成 的 cDNA : mRNA # ARE. B /氯仿 抽 提 去 除 生 物 素 与 链 霉 亲 和 素 结合 的 复合 物 ， 最 后 ， 通 过 乙醇 沉淀 得 到 诱导 的 特异 表 达 的 cDNA。

， 302 -

第 21 章 转录 差 减法

( 非 诱导 的 mRNA)

实验 组

(诱导 的 mRNA) 含 差异 表达 序列

含 差异 表达 序列

| 反 转 录 | 生物 素 标记

(实验 组 cDNA | 生物 素 标记 的 驱动 组 mRNA

\ 高 严谨 度 的 杂交 yh

cDNA:mRNA 杂 合 双 链 (生物 素 标记 )

过 量 的 驱动 组 mRNA( 生 物 素 标记 ) 诱导 的 cDNA( 无 生物 素 标记 )

加 链 霉 亲 和 素 ; 酚 / 氧 仿 抽 提

cDNA:mRNA 杂 合 双 链 (生物 素 标记 ) Sy gel eee salle

图 21.8 (8 AA AE Rb ic BY SK oh 2 FF cats Be Bi / SA SH EK EIT Ze Dh ARC

诱导 的 cDNA( 无 生物 素 标 记 ) “可 用 于 进一步 研究 ”

21.5 关 减 法 的 问题 与 解决 办 法

(1) 必须 做 到 的

© 高 质量 RNA

。 使 用 质量 好 的 无 RNase 技术 。

。 FA a RAM BK Eb RA HE Hy BS ER op RE

。 用 酸性 酚 抽 提 。

。 用 股 盐 缓冲 液 进行 二 次 沉淀 。

。 样品 用 无 RNase 的 DNase 处 理 。

。 用 DEPC 处 理 的 水 配制 70% 乙 醇 ， 用 此 70%% 乙 醇 充 分 洗涤 RNA 沉淀 ， 以 去 除 过 量 Here.

。 恰当 储存 纯化 的 RNA@。

@ 反 转 录 成 cDNA 及 PCR

。 每 个 cDNA 反应 要 用 相同 的 RNA 量 (200~300ng).,

。 重申 要 使 用 无 内 源 RNase H 活性 的 酶 制剂 。

。 避免 使 用 依赖 Mn2 + 的 反 转 录 酶 。

© NP-40 裂解 液 也 可 以 用 ， 但 要 制备 重复 性 好 的 纯 RNA 需要 更 熟练 的 技能 。 @@ 阳离子 会 定量 地 结合 dNTP， 可 对 cDNA 合成 或 PCR 造成 极 大 影响 。 @O 差 减 杂交 法 比 其 他 许多 应 用 PCR 的 方法 更 不 能 容忍 部 分 降解 的 mRNA。

。 303 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

。 使 用 cDNA 反应 总 混合 液 。 。 使 用 PCR 总 混合 液 。 。 使 用 热 启 动 PCR 方法 ， 理 想 的 是 使 用 混合 酶 以 保证 反应 的 高 反应 性 、 高 专 一 性 、 高 保 真 性 和 可 重复 性 。 (2) 一 般 问 题 @ 一 条 或 几 条 泳 道 严重 拖 尾 优化 Mg?* 浓度 〈 一 般 不 需要 ) 。 © yR/Z> PCR 循环 数 。 。 减少 反应 中 的 酶 量 。 。 稍稍 增加 退火 温度 。 @ 无 产物 。 检查 起 始 RNA 的 完整 性 。 。 在 cDNA 合成 反应 中 加 RNA 酶 抑制 剂 (RNasin) 。 。 分 析 RT 和 PCR 的 组 分 ， 特 别 是 酶 的 质量 。 。 做 必需 的 对 照 反 应 。 。 核 对 反应 中 的 每 一 个 组 分 ， 并 确认 所 有 组 分 已 经 充分 混合 。 检查 PCR 的 反应 参数 。 @ 低产 率 © 样品 匀 浆 或 裂解 不 完全 是 可 能 的 原因 。 。 检查 最 终 的 RNA 沉淀 是 否 溶解 完全 。 © Yl) Azxio/Azso ， 如 比值 小 于 1. 65 表明 有 蛋白质 或 其 他 杂质 污染 。 。 检查 RNA 的 降解 。 从 动物 取出 的 组 织 样 品 没 有 立即 处 理 或 冰冻 。 纯化 的 RNA 储存 在 一 20C ， 而 不 是 在 一 80'C 。 。 水 溶液 与 反应 管 没 有 经 过 消除 RNase 的 处 理 。 图 DNA 污 染 。 如 果 样 品 没有 经 DNase 处 理 则 会 受到 DNA 的 污染 。 © 数据 重复 性 不 好 。 使 用 薄 壁 200n1 反应 管 反 应 ， 调 整 PCR 的 反应 参数 。 。 采用 热 启 动 PCR 〈 见 第 19 章 ) 。 。 对 每 一 个 细胞 样品 配制 单个 、 大 体积 的 反应 总 混合 物 ， 再 分 到 各 个 反应 管 中 。， 。 使 正 向 引物 、 反 向 引物 配对 的 Tn 更 加 接近 。 。 使 用 能 合成 长 PCR 产物 的 酶 (Tag t+ Pwo) 。 。 不 用 矿物 油 ， 而 采用 有 热 盖 的 热 循环 仪 。 。 用 不 同方 法 抽 提 的 RNA 会 出 现 这 种 情况 。 。 不 是 同一 天 抽 提 的 RNA 可 能 出 现 这 种 情况 。 。 检查 细胞 或 组 织 的 状态 。 如 果 细 胞 处 于 不 同 的 细胞 周期 或 者 是 从 不 同 状 态 下 分 离 的 组 织 ， 数 据 可 能 重复 性 差 。 。 优化 热 循环 反应 ， 并 在 同一 个 热 循 环 仪 上 进行 反应 〈 不 仅仅 是 同样 型 号 的 仪器 )。 (3) 一 般 建议 «+ 304 -

第 21 章 转录 差 减法

。 变性 步骤 时 间 愈 短 愈 好 。

© 变性 温度 最 好 低 至 90~92°C 。

。 延伸 温度 可 以 降 到 68°C 。

。 每 个 循环 的 时 间 可 适当 加 长 〈5 一 20s/ 循 环 ) 。

。 精确 取样 对 于 结果 的 重 现 性 是 至 关 重 要 的 ， 在 实验 开始 时 及 一 段 间 隔 后 应 对 微量 取 样 器 重新 校正 。 准 备 备用 取样 器 ， 在 取样 过 程 中 更 换取 样 器 可 避免 带 人 气 溶 胶 污 染 。

。 在 细胞 培养 液 中 加 入 亚 细 胞 毒 浓 度 (10 ng/ml) 的 环 已 酰 亚 胺 〈 放 线 菌 酮 ) ， 培 养 4~6h 后 裂解 细胞 ， 丰 度 很 低 的 mRNA 可 被 高 度 诱导 。 此 时 ， 和 蛋白质 翻译 过 程 受 抑制 ， 成 熟 mRNA 在 细胞 质 中 积累 。 然 而 ， 对 有 些 细 胞 特别 是 正常 的 二 倍 体 细 胞 ， 这 种 处 理 是 不 能 忍受 的 。

。 与 许多 PCR 的 技术 不 同 ， 转 录 差 减 过 程 对 于 起 始 材 料 的 质量 要 求 特 别 高 。 质 量 最 好 的 RNA 通常 用 含 肌 的 缓冲 液 提 取 。

。 使 用 含有 必 备 引物 的 试剂 盒 可 以 不 必 订 购 或 自己 制备 引物 。

© 对 微量 离心 管 进行 硅 烷 化 ， 不 论 对 于 DNA 还 是 mRNA 都 可 以 减少 其 在 管 壁 的 疏水 黏附 而 减少 损失 。 这 种 做 法 在 处 理 非 常 少量 的 、 不 易 再 得 到 的 样品 时 尤其 有 好 处 〈 见 附录 8 的 操作 步骤 ) 。

21.6 和 参考 文献

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

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(EKREF; WAR BER)

* 306 -

第 22 章 mRNA ESE

22.1 基本 原理

如 何 能 够 获得 克隆 并 鉴定 两 个 或 更 多 样品 之 间 差 异 表 达 的 基因 ， 无 疑 是 科学 研究 中 十 分 重要 的 问题 。 由 于 细胞 表 型 是 基因 表达 调控 的 最 终 表 现 ， 因 此 关注 一 个 细胞 的 mRNA 表达 谱 ， 以 及 在 不 同 实验 条 件 下 其 复杂 性 和 组 成 的 相应 变化 ， 是 合乎 逻辑 的 。

前 面 章节 中 讨论 到 ， 转 录 差 减 和 校正 PCR 作为 一 种 已 经 十 分 成 熟 的 方法 ， 能 够 通过 与 对 照 或 基本 条 件 下 的 样品 比较 ， 得 到 在 一 定 条 件 下 的 一 组 样品 转录 产物 的 表达 差异 。 这 一 章 的 关注 点 ， 是 用 另 一 途径 来 实现 相同 的 目的 。 简 而 言 之 ， 这 一 方法 就 是 将 互补 DNA (cDNA) 的 合成 与 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 为 基础 的 扩 增 相 结合 ， 使 用 大 量 的 短 引 物 组 合 ， 通过 在 聚 两 烽 酰 胺 凝 胶 电泳 (PAGE) 中 的 条 带 比较 ， 来 鉴定 出 一 组 或 更 多 实验 样品 中 组 分 的 差别 。 当 使 用 相同 的 引物 组 时 ， 从 相同 组 分 的 RNA 扩 增 出 的 PCR 产物 在 凝 胶 电 泳 的 相 邻 泳 道中 将 得 到 相同 大 小 的 条 带 。 更 为 重要 的 是 ， 这 一 方法 能 够 清晰 地 辨认 出 在 相 邻 泳 道 中 同一 位 置 上 缺失 或 丰 度 不 同 的 条 带 。

这 个 方法 在 此 后 又 不 断 有 所 改变 ， 并 有 一 些 不 同 的 命名 。 其 中 最 科学 描述 这 一 方法 的 术 语 ， 可 能 就 是 mRNA 差异 显示 (Liang 和 Pardee，1992) ， 也 就 是 本 章 的 标题 。 然 而 ， 用 得 更 多 的 且 被 立即 认同 的 是 “差异 显示 PCR”， 可 以 简称 为 DDPCR® 或 更 繁琐 的 DDRTPCR (Bauer 等 ，1993) 。 另 一 个 名 称 ， 侧 重 描述 这 个 策略 在 引物 上 微妙 的 设计 特点 ， 称 为 RNA EOC A RNA 任意 引发 PCR (RNA arbitrarily primed PCR, RAP-PCR) (Welsh 等 ， 1992; McClelland 和 Welsh，1994)。 虽 然 这 些 技术 方法 都 略 有 不 同 ， 并 且 对 于 得 到 的 转录 产物 的 复杂 性 进行 分 析 ， 其 结果 的 完整 性 和 复杂 的 程度 也 有 些 差别 ， 但 所 得 的 基本 结果 都 是 相同 的 。 而 有 些 方法 则 是 原先 技术 的 改进 (Liang 等 ，1992; Liang 等 ，1993; Mon 等 ， 1994; Liang 等 ，1995，Zhao 等 ，1995) 。 本 章 中 为 简单 起 见 ， 将 这 一 方法 称 为 差异 显示 FCR CDDPCR).

22.2 —-RO DDPCR 最 重要 的 是 依靠 PCR 的 速度 、 特 异性 和 灵敏 度 ， 通 过 PCR 从 细胞 产生 的 一 系

@ mRNA 差异 显示 过 程 专利 权 属 于 GenHunter 公司 (Nashvillte，TN) 。 同 时 ，GenHunter 公司 也 是 唯一 授权 可 以 出 售 差异 显示 PCR 试剂 盒 的 公司 。 请 访问 www. genhunter. com 以 获得 更 多 的 信息 。 © 当 使 用 缩写 时 注意 使 用 大 写字 母 ， 另 一 缩写 ddPCR 则 用 于 代表 双 脱 氧 测 序 PCR, * 307 。

RNA 分 高 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

列 不 同 的 转录 产物 中 扩 增 出 CDNA 来 。 其 他 过 程 是 简单 的 ， 从 纯化 的 RNA 合成 cDNA， 以 及 cDNA 第 一 链 产物 的 扩 增 。 与 传统 的 CDNA 合成 不 同 的 是 ，DDPCR 对 每 一 个 样品 要 进行 JLA cDNA 的 合成 反应 。 每 一 反应 是 由 一 组 特定 的 下 游 引 物 和 上 游 引 物 的 组 合 来 进行 的 ， 任何 二 个 反应 管 中 所 有 PCR 产物 中 只 有 一 组 产物 得 到 扩 增 。 简 而 言 之 ，DDPCR 是 一 种 卓 越 超群 的 多 重 的 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 法 。 随 后 ， 反 应 产物 通过 电泳 分 析 与 其 他 样品 直接 进行 比较 〈 例 如 ， 对 照 组 与 处 理 组 ) 。 总 之 ， 这 些 步骤 组 成 了 一 个 可 以 同时 检查 所 有 转录 序列 的 规范 的 方法 。DDPCR 的 主要 步骤 如 下 。

@ RNA 分 离 。 用 DDPCR 鉴定 调控 的 序列 ， 首 先 需要 分 离 高 质量 的 RNA. WH DDPCR 方法 时 ， 使 用 肌 盐 -酸性 酚 抽 提 纯化 RNA 是 一 种 广泛 应 用 的 较 好 的 方法 。 研 究 者 可 以 参考 第 5 章 、 第 6 章 的 步骤， 或 者 使 用 商品 化 的 含 肌 试 剂 来 完成 RNA 的 分 离 。DDPCR 方法 的 优点 和 缺点 见 表 22. 1。 其 优点 是 只 需要 加 入 少量 RNA。 然 而 ， 最 好 是 由 同一 研究 者 在 同一 天 从 同一 材料 一 次 性 纯化 较 大 量 的 RNA， 并 以 乙醇 沉淀 的 形式 储存 ， 这 样 可 以 真正 确保 有 较 多 量 相 同 的 模板 ， 当 需要 重复 实验 时 可 以 得 到 有 重复 性 的 数据 。 此 外 ， 选 择 poly (A)+RNA 是 不 必需 的 ， 也 不 推荐 如 此 做 ， 原 因 有 以 下 四 个 。

a. 选择 poly(A)+RNA 对 于 cDNA 第 一 链 的 合成 没有 特异 性 。 <

b. 选择 poly(A)* RNA 可 能 实际 上 会 丢失 某 些 模 板 ， 因 而 不 能 代表 那些 丰 度 低 的 〈 称 少 ) 的 转录 物 。

c. 样品 可 能 会 有 poly(dT) 污染 。

d. poly(A)* RNA 选择 的 另 一 个 问题 是 ， 可 能 引入 RNase 的 污染 ， 因而 降低 样品 的 可 FATE.

S

表 22.1 差异 显示 PCR 方法 的 优点 和 缺点 优点 。 反应 快速 简单 。 对 检 出 专 一 的 转录 产物 非常 灵 人 敏 。 这 一 方法 是 通用 的 . 半 定 量 的 © 这 是 鉴定 差异 基因 表达 的 一 种 系统 方法 © 不 需要 也 不 推荐 用 poly(A)+ RNA 。 同时 显示 了 上 调和 下 调 的 基因 。 需要 微克 级 的 RNA( 通 常 少 于 3pg) 。 数据 有 可 重复 性 缺点 。 由 于 低 严 说 度 而 产生 高 的 假 阳 性 率 ( 达 20% ~ 40%) 。 需要 极 高 纯度 的 RNA © 反应 对 污染 尤其 是 基因 组 DNA 污染 非常 敏感 。 再 扩 增 后 仍 能 观察 到 假 阳 性 © 已 知 序 列 在 电泳 凝 胶 上 的 位 置 不 能 预料 。 PCR 产物 未 进一步 确认 ,用 作 探 针 还 需 最 佳 化 © 对 于 一 对 样品 要 进行 完全 的 对 比分 析 , 需 要 进行 大 量 的 PCR 。 需要 许多 PCR 试剂 。 纯化 的 cDNA 经 常 有 无 关 的 CDNA 序列 的 污染 。 转录 产物 3 端 对 应 的 序列 都 能 被 扩 增 “此 技术 对 模板 的 质量 等 影响 因素 高 度 敏感 ,这 些 对 于 标准 PCR 并 不 是 主要 问题 © 数据 的 重复 性 有 时 会 出 现 问题 - 308 -

第 22 章 mRNA 差异 显示

最 后 极 重要 的 是 ， 需 要 用 DNase 处 理 ， 以 除去 样品 中 所 有 痕 量 的 基因 组 DNA。 引 物 能 够 与 任何 互补 的 DNA 或 RNA 进行 碱 基 互补 配对 。DNA 去 除 的 效率 可 以 通过 无 反 转 录 的 对 照 反应 来 验证 。 这 将 在 后 面 讨论 。

@ cDNA 下游 引物 的 设计 。 用 于 DDPCR 分 析 的 cDNA 合成 的 标准 步骤 是 ， 对 每 一 份 RNA 样品 进行 几 个 cDNA 合成 反应 。 在 任 一 反应 管 中 ， 仅 将 所 有 可 能 的 mRNA 中 的 一 部 分 反 转 录 成 cDNA。 这样， 每 一 个 反 转 录 反 应 将 产生 几 个 亚 组 的 cDNA， 在 电泳 中 表现 为 多 个 离散 的 条 带 ， 而 不 是 连续 弥散 的 一 片 。 使 用 有 以 下 通用 结构 的 下 游 锚 定 引物 就 可 以 得 到 上 述 结果 。

TTC TETTTITV 或 SEETTTTTTTRWV 2 VHA, CRG.

3 '- 核 苷 酸 的 兼并 可 以 确保 所 有 可 能 的 MRNA 被 反 转 录 ; 此 外 ，3 - 核 苷 酸 的 锚 定 确 保 引 物 与 poly(A)+ 尾 的 最 5 端 配对 。 这 样 在 实际 的 CDNA 合成 反应 中 就 不 会 在 反 转 录 poly(A) 尾 上 花费 宝贵 的 时 间 ， 如 用 一 条 oligo(dT) 作 引 物 (5'TTTTTTTTTTTTT), EUS poly(A) 尾 的 任何 部 位 配对 ， 有 时 甚至 离 转录 产物 的 编码 部 分 几 百 个 核 苷 Rix.

有 两 种 常用 的 适合 于 设计 下 游 引 物 的 方法 。 一 组 cDNA 产生 的 基础 是 下 游 引 物 识 别 位 于 mRNA 的 poly(A) 尾 前 面 的 一 个 或 两 个 碱 基 。 第 一 种 方法 是 下 游 引 物 的 通用 结构 为 标准 的 oligo(dT) 的 3 端 加 一 个 附加 的 核 苷 酸 (Liang 等 ，1994)， 例 如 Tr VCS! TITTTTTTTTTTV， 其 中 V=A、C 或 G)。 这 样 对 应 三 个 下 游 引 物 的 不 同 的 反 转 录 反 应 将 产生 三 组 不 同 的 CDNA, 每 一 组 约 含 有 全 部 可 能 的 CDNA 的 1/3。 单 核 苷 酸 锁定 方法 的 优 点 是 这 些 引 物 可 以 简化 鉴定 的 过 程 。 第 二 种 方法 中 下 游 引 物 的 通用 结构 是 TiVV (5 TTTTTTTTTTTVV， 其 中 V=A、C 或 G)。 下 游 引 物 的 3 末端 有 两 个 兼并 核 苷 酸 ， 这 样 引物 就 可 以 与 3 末端 为 3 ACA),BB (其 中 B 是 互补 于 V 的 ) 的 RNA 转录 产物 进行 退火 并 合成 EDNA。 许 多 经 常 使 用 DDPCR 方法 的 研究 者 认为 ， 使 用 3 端 有 两 个 兼并 核 苷 酸 的 下 游 引物 ， 得 到 的 PCR 产物 更 具有 代表 性 ， 即 反映 了 所 有 mRNA 的 全 部 状态 ， 并 且 这 一 方法 的 重复 性 也 很 好 。

所 有 二 核 背 酸 组 合共 有 42 种 可 能 性 ， 也 就 是 16 种 ， 在 引物 3 端的 排列 有 :

AAT) DBA In Weak Th RAL AG CER AGG Te AG’ &'€Gi44 GG wee ADR ICR 7 BGl awe

立即 可 以 去 除 末 端 为 TT 的 引物 ， 由 于 这 一 引物 没有 专 一 性 ， 任 何 有 poly(A) BN RNA 都 可 以 与 此 引物 配对 ， 并 反 转 录 产 生 不 适 于 这 一 方法 的 连续 弥散 的 cDNA@。 另 外 3- 端 为 TA、TC 或 TG 的 三 个 引物 也 可 以 去 除 ， 实 际 上 它们 与 在 3 端 只 有 一 个 兼并 核 苷 酸 的 引物 Tul 结构 相同 。 最 后 ， 许 多 研究 者 报道 了 3 端 为 AT、CT 或 GT 的 下 游 引 物 在 使 用

@ 引物 TiiTT 就 是 oligo (dT)， 可 以 在 使 用 PCR 建 库 的 过 程 中 用 来 产生 cDNA， 要 想 通 过 PCR 扩 增 得 到 库 就 需要 精心 选择 上 游 引 物 。

。 309 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

时 会 产生 许多 低 分 子 量 的 弥散 。 这 可 能 是 因为 这 些 引 物 在 某 种 程度 上 容易 引起 错误 引导 ”。 同时 ， 含 有 以 下 序列 的 mRNA 也 将 被 反 转 录 成 为 EDNA 第 一 链 。 5'...ACAAAAAAAAAAAAAAAAAA3 5! ++» AGAAAAAAAAAAAAAAAAAAS' 5! «+» AUAAAAAAAAAAAAAAAAAAS’ 由 于 这 个 原因 带 有 AT 、CT at GT 的 引物 可 用 或 可 不 用 ， 这 取决 于 使 用 者 的 经 验 。 因 此 在 设 计 二 个 实验 时 ， 研 究 者 应 当 计划 用 以 下 两 组 引物 组 进行 9 个 或 12 个 不 同 cDNA 合成 反应 。

AA CA GA AA CA GA AC CC GC 或 AC CC GC AG CG GG AG CG GG

er GT GT 笔者 实验 室 成 功 地 应 用 了 以 下 9 AR ES: 5'TTTTTTTTTTTAA 5/ TLEPLETEAT MC 5’ TLTETFEITTTIITAG 5S TTTEET PT TRrCA TTT ot reer bec STREET TLE rece STTTTTISULTIGA SSTTTTUT PTT TIrGe Sar LITILi rT ba 'Ge

如 果 经 过 仔细 的 分 析 ， 需 要 使 用 带 3' 端 AT. CT 或 GT 二 核 苷 酸 的 下 游 引 物 ， 当 然 也 可 以 加 进 引 物 中 去 。 此 外 ， 也 可 以 在 下 游 引 物 的 5' 端 设计 带 有 某 些 类 型 的 锚 定 序列 《启动 子 序列 、 限 制 性 酶 切 位 点 、 其 他 克隆 位 点 ) ， 以 使 DDPCR 产物 在 合成 后 更 易 进 一 步 操作 。

@ cDNA 合成 。 在 mRNA 差异 显示 中 ， 对 RNA 的 首次 酶 处 理 就 是 用 反 转 录 酶 进行 的 第 一 条 cDNA 链 的 合成 。 这 个 反应 可 以 用 任何 一 种 广泛 应 用 的 CDNA 合成 体系 。 为 方便 研 究 人 员 的 使 用 ， 第 一 链 合成 试剂 作为 整个 系统 的 一 部 分 ， 可 以 从 GenHunter 购买 。 由 于 RNA 固有 的 不 稳定 性 ， 每 次 cDNA 合成 仅 使 用 少量 RNA。 并 且 根 据 这 一 反应 的 特性 ， 应 4 (di FA RNase 了 -的 反 转 录 酶 〈 详 见 第 18 章 ) 。 此 外 ， 在 进行 DDPCR 时 ， 应 当 避 免 使 用 被 用 得 愈 来 愈 多 ， 并 且 在 许多 其 他 应 用 中 表现 极 好 的 一 步 法 RT-PCR 系统 。 最 重要 的 一 点 是 能 够 合成 最 长 的 cDNA。 如 果 合 成 第 一 链 的 效率 不 高 ， 则 较 短 的 第 一 链 产物 可 能 不 能 与 上 游 引物 进行 碱 基 配 对 ， 因 而 这 些 序列 将 得 不 到 PCR 扩 增 。

图 上游 引物 设计 。 上 游 引物 的 设计 不 像 下 游 引物 那么 有 明显 的 结构 特点 。 笔 者 实验 室 使 用 了 24 个 半 随 机 的 10 聚 体 作 为 上 游 引 物 进 行 差异 显示 并 取得 了 成 功 ， 最 近 报 道 使 用 13 聚 体 的 上 游 引物 可 取得 更 好 的 重复 性 。 对 于 上 游 引 物 ， 笔 者 认为 更 应 当 称 为 是 “ 半 特 异 ?” 的 ， 由 于 它 并 不 是 有 效 的、 必需 的 或 完全 的 ， 即 并 没有 使 用 Uo RRA Cot 10 聚 体 ) 或 413 种 组 合 〈 对 13 聚 体 ) 作为 上 游 引物 。 最 初 的 文献 在 “材料 与 方法 ”中 ， 充 斥 着 放弃 无 用 引

@ 引物 除了 3 端 核 苷 酸 外 ， 其 他 地 方 的 错 配 还 是 可 以 容忍 的 。cDNA 的 合成 、PCR 及 其 他 分 子 生 物 学 技术 ， 都 需要 3 末端 与 带 有 3 -OH 底 物 的 核 苷 酸 与 模板 碱 基 配对

- 310 +

第 22 章 mRNA 差异 显示

物 的 教训 “…… 合 理 设计 上 游 引物 ……” 等 ， 这 意味 着 上 游 引 物 既 不 是 随机 选择 的 ， 也 不 是 兼并 序列 的 大 杂烩 。 实 际 上 最 经 常 使 用 的 引物 是 有 平均 的 〈G 十 C) A GbR 50%) AA 会 形成 引物 分 子 内 配对 及 引物 间 二 聚 体 。 在 相对 不 严谨 的 引物 退火 条 件 下 ， 实 际 上 上 游 引物 中 仅 有 ?7 一 8 个 碱 基 与 模板 配对 。 虽 然 开 始 时 这 种 相对 不 严谨 的 配对 不 太 稳定 ， 但 仍 是 DDPCR 的 必要 步骤 ， 目 的 就 是 使 自然 界 产生 的 任何 信息 都 能 够 得 到 扩 增 。

下 面 是 一 些 合理 设 计 的 上 游 引 物 的 例子 :

5'GATCATAGCC 5'GATCCAGTAC 5 AAACTCCGTC

5'GATCATGGTC ，

5'GTTTTCGCAG 5'GATCTGACAC 5'TGGATTGGTC 5'GGAACCAATC 5'GATCAATCGC 5'TACAACGAGG 5'GATCTCAGAC 5'GATCACGTAC

5'CTGCTTGATG 5'GATCGCATTG 5'TGGTAAAGGG 5'TTTTGGCTCC 5'TACCTAAGCG 5'GATCTAACCG 5'TCGGTCATAG 5’'GATCTGACTG 5'TCGATACAGG 5'GATCAAGTCC 5'GGTACTAAGG SLL LALCC

这 些 上 游 引 物 可 以 用 于 cDNA 第 二 链 的 合成 ， 并 可 以 与 下 游 引 物 共 同 作 用 进行 对 称 PCR 使 EDNA 得 到 扩 增 。

© 第 一 轮 PCR 扩 增 。 如 前 所 述 ， 这 一 步 将 有 大 量 的 PCR 要 进行 ， 如 9 个 下 游 引 物 义 24 个 上 游 引物 义 2 种 不 同 的 CDNA 库 。 其 实 同时 进行 所 有 反应 是 不 必要 的 ， 最 好 是 将 9 个 cDNA 合成 反应 中 的 8 个 储存 在 一 80C， 一 次 仅 使 用 一 个 进行 PCR 扩 增 。 如 果 在 DDPCR 的 第 一 个 样品 中 已 出 现 目的 条 带 ， 可 以 对 这 些 条 带 进 一 步 探 索 ， 剩 下 的 cDNA 合成 反应 可 以 在 以 后 再 研究 。

a. 反应 情况 。DDPCR 的 循环 情况 与 标准 的 对 称 PCR 扩 增 在 循环 数 和 退火 温度 上 有 所 不 同 ，DDPCR 往往 需要 进行 40 个 循环 ， 然 后 于 72°C 进行 引物 延伸 5 一 10min。 当 需要 扩 增 丰 度 非常 低 的 RNA (第 7 章 )， 为 了 使 其 达到 可 检测 的 水 平 ， 就 需要 增加 循环 数 。 在 进行 DDPCR 时 ， 要 根据 每 个 反应 管 中 的 上 游 引 物 和 下 游 引 物 来 确定 反应 的 参数 ;， 同 时， 还 要 顾 及 反应 中 错 配 的 容忍 度 ， 并 保证 所 有 的 cDNA 第 一 链 都 能 够 进行 PCR 扩 增 。 此 外 ， 并 不 是 所 有 的 设备 都 适 于 进行 DDPCR。 循 环 参数 的 设 定 往往 需要 进行 摸索 ， 并 且 对 于 每 一 台 不 同 的 热 循环 仪 都 要 通过 经 验 判 断 设 定 反 应 的 参数 。 以 下 循环 的 程序 可 供 参 考 :

起 始 的 解 链 94°C 3min 94°C 20s 循环 参数 40°C ws 个 循环 72°C 30s 最 终 的 延伸 72°C 5min 保存 4°C

b. 矿物 油 。 在 进行 DDPCR 时 ， 要 避免 使 用 老式 的 使 用 矿物 油 的 热 循环 仪 。 在 此 大 力 推荐 使 用 有 热 盖 的 热 循 环 仪 ， 如 PE/Applied Biosystems Model 9700 或 其 他 已 授权 的 热 循环 。311 >

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

仪 e， 进 行 这 二 反应。 矿物 油 的 使 用 常常 使 条 带 数 量 减 少 并 明显 影响 条 带 模 式 的 重复 性 元 这 对 于 本 技术 而 言 是 灾难 性 的 结果 。 如 果 在 实验 室 中 没有 带 热 盖 的 热 循 环 仪 ， 最 好 到 其 他 处 异 用 此 仪器 进行 实验 。

。 混 含 酶 。 一 种 被 称 为 长 距离 PCR 的 强 有 力 的 技术 ， 发 展 了 结合 两 种 酶 的 活性 来 产生

非常 长 的 并 具有 很 高 保 真性 的 PCR 产物 。 笔 者 实验 室 在 DDPCR 中 很 成 功 地 应 用 了 此 技术 。 虽然 在 差异 显示 中 应 用 这 些 酶 并 非 要 产生 和 基因 组 那样 长 的 PCR 产物 ， 但 两 个 不 同 的 热 稳 定 酶 协同 工作 的 效率 可 以 使 相对 丰 度 非常 低 的 mRNA 得 到 扩 增 〈 和 否则 这 些 序列 可 能 不 能 被 检测 到 ) 。 简 而 言 之 ， 混 合 酶 通常 由 Taq 聚合 酶 与 某 些 其 他 热 稳定 聚合 酶 组 成 。 可 以 使 用 多 种 不 同 的 酶 组 合 ， 一 个 常用 的 例子 是 Taq 聚合 酶 与 Pwo 聚合 酶 的 组 合 〈 表 22. 2) 。Tad RAB 缺少 校对 活性 〈3'->5/ 核 酸 外 切 酶 ) 并 能 产生 长 度 达 2 一 3kb 的 PCR 产物 ， 它 是 高 度 进 行 性 HON. Pwo 聚合 酶 有 校对 活性 ， 可 以 使 Tag 聚合 酶 出 错 的 频率 减少 为 原来 的 几 分 之 一 。 两 个 酶 在 一 个 反应 管内 作用 ， 可 以 克服 由 Taq 聚合 酶 单独 使 用 时 对 PCR 产物 长 度 的 限制 ， 同 时 又 具有 高 的 保 真 性 。 因 为 Pwo 聚合 酶 有 更 高 的 稳定 性 ， 它 可 以 在 Taq 聚合 酶 热 失 活 后 继 续 合 成 产物 。 这 样 就 可 以 使 稀少 的 在 可 检测 水 平 以 下 的 cDNA 得 到 扩 增 。 而 且 由 于 混合 酶 的 校对 功能 ， 从 测序 得 到 的 数据 也 更 加 可 靠 。

表 22.2 热 稳定 混合 酶 的 协同 作用

项 目 半衰期 95°C 45min 5!» 3! EMI HE 十 十 十 4. 5'—> 3 核酸 外 切 酶 活性 页 ar 3 一 5 核酸 外 切 酶 活性 (校对 活性 ) 一 十

来 源 Thermus aquaticus Pyrococcus woesei

d. 恰当 的 对 照 。 确 定数 据 的 可 靠 性 是 极为 重要 的 ， 对 于 一 个 像 DDPCR 这 样 可 能 产生 错误 的 技术 ， 设 置 合适 的 对 照 更 有 必要 。

第 一 ， 只 要 是 进行 RNA 的 反 转 录 反 应 ， 就 应 该 同时 进行 无 反 转 录 酶 CRT) 的 对 照 反 应 。 没 有 产物 产生 ， 表 明 在 制备 RNA 的 过 程 中 没有 基因 组 DNA 污染 。 如 果 在 对 照 反 应 中 有 PCR 产物 ， 研 究 者 必须 在 进行 下 一 步 反 应 前 用 DNase (无 RNase 的 DNase 工 入 处 理 样 品 。 根 据 获 得 RNA 的 不 同方 法 ， 在 分 离 过 程 中 使 用 DNase 自动 地 处 理 所 有 的 RNA 样品 ， 这 与 抽 提 得 到 RNA 后 再 用 DNase 处 理 样品 并 进行 沉淀 相 比 ， 可 以 节省 大 量 的 时 间 。 研 究 者 应 当 假 定 所 有 RNA 样品 都 含有 基因 组 DNA 污染 ， 即 使 是 经 氯 化 饮 密度 梯度 离心 纯化 得 到 的 样品 也 是 如 此 ， 都 要 用 无 RNase ft) DNase | 处 理 ，

第 二 ， 进 行 一 个 只 用 一 条 引物 的 对 照 反应 ， 确 定 引物 不 会 自 引 发 反应 。 另 一 个 有 用 的 方 法 是 用 激酶 标记 下 游 引 物 的 5 端 ， 这 样 ， 只 有 由 上 游 引 物 和 一 个 标记 的 下 游 引物 产生 的 产 物 可 以 从 放射 自 显影 中 看 到 ， 而 由 上 游 引物 单独 产生 的 PCR 产物 是 观察 不 到 的 。

第 三 ， 一 个 简单 的 确定 差异 扩 增 产物 真实 性 的 方法 ， 是 对 同样 的 样品 用 两 个 浓度 进行 析 。 在 同一 RNA 样品 的 两 个 浓度 的 反应 中 都 有 的 条 带 ， 而 在 各 种 浓度 的 其 他 样品 中 都 没有

@ 要 索取 已 授权 的 热 循环 仪 的 产品 目录 ， 可 以 与 以 下 地 址 联系 PE/Applied Biosystems，Director of Licensing，850

Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404, 电话 : 650-570-6667.

¢ 312 。

第 22 章 ” mRNA 差异 显示

的 条 带 是 真正 的 阳性 结果 ， 可 以 用 于 进一步 的 研究 。 这 个 步骤 可 以 避免 花 许 多 时 间 来 研究 是 否 是 人 为 的 假 阳 性 结果 〈 即 由 取样 或 电泳 上 样 误差 造成 的 信号 强度 的 差别 ) 。

第 四 ， 可 以 鉴定 在 同一 块 凝 胶 上 进行 电泳 的 一 组 反应 的 内 部 标记 “〈 即 那些 在 每 次 实验 中 都 在 凝 胶 同 一 位 置 出 现 的 丰 度 极 高 的 序列 ) 。 电 泳 凝 胶 用 X 射线 片 曝 光 很 短 时 间 ， 仅 使 信号 强 的 条 带 显 影 而 信号 弱 的 条 带 不 显影 。 这 是 一 种 得 到 一 个 反应 的 “指纹 图 谱 ” 的 好 方法 ， 也 是 一 种 检查 一 组 样品 分 析 效 率 的 方法 ， 因 为 这 些 丰 度 高 的 “路 标 ” 序 列 在 每 次 重复 实验 中 都 应 显现 @8。 从 这 一 水 平 上 讲 ，DDPCR 至 少 是 半 定 量 的 8@8， 反 映 了 RNA 起 始 样品 的 复杂 人 性: 电泳 上 信号 的 强度 与 合成 PCR 产物 所 需 模板 的 丰 度 成 正比 。

e. 预 实 验 。 一 般 而 言 ，DDPCR 本 身 有 不 少 困 难 ， 因 而 最 好 能 够 做 一 个 预 实验 ， 或 至 少 进行 一 组 预 反 应 ， 然 后 再 对 不 能 替代 的 样品 进行 大 量 的 实验 。 一 个 经 常 考虑 的 关键 问题 是 反 应 的 重复 性 。 由 于 反应 结果 与 引物 的 性 质 有 关 ， 热 启动 PCR 是 有 帮助 的 。

© 第 一 轮 PCR 产物 的 分 析 。 在 DDPCR 过 程 中 ， 第 一 轮 PCR 结果 出 来 时 是 令 人 激动 的 时 刻 ， 即 将 可 以 看 到 与 基因 调节 有 关 的 甚至 可 能 发 现 以 前 从 未 观察 到 的 序列 。 对 结果 的 观察 方面 ， 虽 然 其 他 方法 也 可 以 令 人 满意 地 观察 到 种 种 PCR 产物 ， 但 是 放射 自 显影 还 是 一 种 最 为 合适 的 方法 ， 它 可 以 清晰 地 显示 出 你 想 看 到 的 结果 。 下 面 列 出 的 是 一 些 用 于 观察 DDPCR 产物 的 方法 ， 其 灵敏 度 从 高 到 低 : 荧光 标记 @ [35S]dATP，[33P]jdATP， 银 染 ，SYBR 绿 1, RAE.

荧光 标记 的 灵敏 度 与 23S ASP 放射 性 标记 相同 ， 由 于 其 在 工作 时 危害 性 更 小 ， 因 而 应 当 优 先 考 虑 。 银 染 虽 然 其 灵敏 度 不 如 本 文大 力 推荐 的 放射 性 标记 的 方法 ， 但 也 被 成 功 地 应 用 于 DDPCR 中 鉴定 调节 的 序列 «(Lohman 等 , 1995) 。 染 料 SYBR 绿 工 可 以 方便 地 用 于 显示 高 丰 度 和 中 丰 度 的 产物 ， 有 时 也 能 观察 到 表达 的 差别 。 溴 化 乙 锭 仅 可 以 用 来 显示 反应 正常 进 行 ， 因 此 可 以 先 用 少量 样品 进行 3% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 用 染料 SYBR 绿 或 省 化 乙 锭 染色 初步 确定 后 ， 再 将 DDPCR 产物 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 进行 电泳 分 析 。

文献 报道 ， 除 了 普遍 使 用 变性 胶 〈6%% 丙 烯 酰胺 ，8. 3mol/L RB) 分 析 DDPCR 产物 外 ， 非 变性 胶 也 得 到 了 成 功 的 应 用 。 如 果 确 有 需要 ，DDPCR 后 可 以 先进 行 真 空 离心 浓缩 不 超过 10min， 再 上 样 电泳 ， 这 种 处 理 对 灵敏 度 和 条 带 清晰 程度 影响 不 大 。 但 是 要 尽量 避免 使 用 这 种 真空 浓缩 的 方法 ， 因 为 它 会 导致 不 同样 品 之 间 体 积 的 差异 。 如 果 用 非 变 性 胶 不 能 产生 容易 辨别 的 条 带 ， 可 以 再 进行 标准 的 DNA 测序 胶 电 泳 。 通 常 电泳 采用 恒定 功率 50W 的 条 件 ， 直 到 溴 酚 蓝 到 达 胶 的 底部 。 然 后 将 凝 胶 在 Whatman 滤纸 上 进行 真空 干燥 (80°C, 2h), 并 用 太 射 线 片 曝 光 过 夜 。 至 于 回收 目的 条 带 ， 最 佳 的 策略 是 同时 压 两 张 X 射 线 片 ， 第 一 张 作为 实验 记录 保留 ， 第 二 张 片 子 覆 盖 到 重新 浸润 准备 回收 的 胶 上 用 于 条 带 的 回收 。 为 确保 回 收 的 片段 无 误 ， 回 收 后 的 胶 再 抽 王 进行 第 三 次 曝光 来 确定 DNA 条 带 确 已 被 切除 。 最 后 ， 从 非 变性 胶 中 回收 CDNA 进行 再 扩 增 就 很 容易 了 。 从 变性 胶 中 回收 的 CDNA 要 透析 过 夜 以 除 去 尿素 ， 再 经 过 乙醇 沉淀 ， 才 可 以 用 于 再 扩 增 ;而 从 非 变 性 胶 回 收 的 凝 胶 条 带 可 以 直接 用 于 PCR 再 扩 增 。

@ 这 与 2D 族 胶 电泳 的 肽 图 中 的 内 部 标记 相似 。

@ 在 定量 方面 DDPCR 是 有 局 限 的 ， 因 此 对 于 由 这 一 技术 得 到 的 数据 ， 最 好 现实 些 认为 它 是 半 定 量 的 。 其 后 的 分 析 ， 包括 核酸 酶 保护 〈 第 16 章 ) 和 竞争 PCR (第 20 章 ) 则 是 更 加 定量 地 测定 基因 表达 的 变化 。

加 区 光 差 异 显 示 (FDD) KAA (RNAspectra kits) 可 以 从 GenHunter 公司 购买 。

。 313 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

人

@ 第 二 轮 PCR 扩 增 一 一 再 扩 增 。 在 确认 差异 表达 的 DNA 已 经 从 第 一 轮 凝 胶 上 回收 后 ， 就 需要 进行 再 扩 增 以 进行 进一步 的 鉴定 。 第 二 轮 PCR 的 循环 参数 应 与 第 一 轮 的 相同 矿物 的 大 小 可 以 用 琼脂 糖 凝 胶 (2% ~3%) 电泳 鉴定 。

聚 丙烯 酰胺 凝 胶 切片 通常 置 于 100pl 灭 菌 水 中 30 ~ 6Omin, ik BERET) AS a AE BA DNA 被 浸出 ， 上 述 浸 胶 的 水 溶液 可 以 用 于 第 二 轮 PCR， 作 为 再 扩 增 的 模板 。 如 果 在 打 HET 有 问题 出 现 ， 可 尝试 减少 浸泡 胶 条 的 水 用 量 并 在 90'C 保温 10min。 虽 然 有 些 操作 步骤 建议 在 水 中 煮沸 胶 条 ， 但 这 种 操作 常常 使 实际 可 用 模板 量 比 在 90C 保温 10min 的 大 大 减少 。 也 可 以 增加 引物 浓度 2 一 5 倍 ， 或 者 将 胶 条 粉碎 以 助 于 回收 目的 DNA。 此 外 ， 用 不 受 调节 变化 的 cDNA 进行 再 扩 增 的 练习 ， 有 利于 使 再 扩 增 系统 流程 化 。

22.3 产物 的 多 样 性 : 预期 得 到 什么

表 型 改变 无 疑 涉 及 一 些 基因 ， 其 中 有 些 一 定 是 差异 表达 的 。DDPCR 的 主要 优点 是 能 同 时 显示 细胞 在 裂解 时 的 所 有 转录 产物 。PCR 的 快速 和 灵敏 性 有 利于 在 较 短 时 间 内 检测 出 直 度 非常 低 的 转录 产物 。 这 里 最 重要 的 一 点 是 ， 虽 然 研究 者 在 进行 随后 鉴定 以 前 对 基因 差异 表 达 的 序列 毫 无 所 知 ， 但 基因 表达 的 差别 的 确 可 以 以 PCR 产物 的 形式 表现 出 来 。

典型 的 DDPCR 可 产生 大 小 在 50 一 800bp 的 有 用 的 产物 ， 有 时 也 会 得 到 超过 1lkb 的 序 列 ， 在 凝 胶 电 泳 时 ，DDPCR 产物 就 可 以 显现 出 它们 的 丰 度 ， 可 能 为 高 丰 度 的 、 低 丰 度 的 或 位 于 中 间 不 同 程度 的 丰 度 。 当 溴 酚 蓝 从 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 顶部 泳 动 到 底部 ， 没 有 摊 人 的 核 音 酸 已 电泳 出 胶 ， 大 小 在 700~800bp 的 产物 通常 能 够 分 开 ， 而 产物 大 于 800bp 的 信号 则 有 压 缩 。 有 时 将 上 样 量 加 倍 ， 可 以 使 大 分 子 量 的 产物 看 得 更 清楚 ， 这 一 方法 在 DNA 测序 中 十 分 常用 。 这 尤其 适用 于 用 混合 酶 扩 增 的 PCR 产物 。

要 明确 显示 得 到 的 数据 中 的 最 有 意义 的 结果 ， 就 要 将 使 用 相同 下 游 引物 得 到 的 PCR 产 物 在 同一 块 凝 胶 上 进行 电泳 。 状 态 A 的 PCR 产物 与 状态 B 的 PCR 产物 在 电泳 时 应 按照 上 游 引物 的 使 用 顺序 排列 在 邻近 泳 道中 。 表 22. 3 显示 了 上 样 时 排列 的 一 个 例子 。 这 样 的 排列 就 可 以 直接 在 胶 上 并 排 地 比较 每 一 对 反应 的 产物 。 当 细胞 在 状态 A 和 状态 B 中 表达 相同 的 转录 产物 时 ， 在 相 邻 的 两 个 泳 道中 就 可 以 观察 到 相同 分 子 量 的 产物 〈 图 22. 1); 而 在 相 邻 的 泳 道 没 有 出 现 相 应 的 条 带 ， 则 可 能 是 差异 表达 的 基因 序列 〈 图 22. 2) 。 使 用 DNA 测序 的 48 孔 梳 齿 ， 可 以 方便 地 将 使 用 同一 下 游 引物 的 所 有 上 游 引 物 组 合 的 样品 上 样 在 同一 块 凝 胶 上 《〈 即 2 种 细胞 样品 X1 个 下 游 引物 X24 个 上 游 引物 ) 。 第 一 轮 PCR 扩 增 是 为 了 显示 出 调节 的 序列 ， 因 此 在 分 析 产 物 时 不 需要 加 入 分 子 量 标记 。 在 第 二 轮 筛 选中 才 需 要 标准 的 分 子 量 标记 。

表 22.3 差异 显示 PCR 的 上 样 策略

EREIITEEFITINRENESYIIECIEEIT

状态 A 状态 A 4 状态 B 状态 A 状态 B

相同 的 策略

aon 证 Nw -— an >

3 3

Hi ATA) 3 Maal 24: fh) PCR 产物 上 样 在 相 邻 的 瀛 道中 ， 这 样 就 可 以 并 排 地 直接 比较 它们 cDNA 扩 增 产物 之 间 的 关 异 。 邻 近 沪 道中 相同 分 子 量 的 条 带 ， 对 应 于 在 两 种 细胞 类 型 中 都 转录 的 序列 。 邻 近 泳 道中 某 条 带 在 强度 上 有 差别 及 在 其

中 一 条 泳 道中 完全 缺失 则 表示 特异 基因 的 差异 调节 。 标 准 大 小 的 DNA 测序 胶 具有 极 好 的 分 辨 率 ， 并 且 48 孔 杭 此 允许 两 种 细胞 样品 、 同 一 下 游 引 物 的 所 有 上 游 引 物 组 合 的 样品 能 够 全 部 上 样 到 一 块 凝 胶 上 。

*。 314 。

第 22 章 ， mRNA 差异 显示

态 ooo 态 B

i “ 切割 差异 表达 的 条 带 2 nmr

mRNA 3 uv 4 AAII I= 5

1 1 2 2 cDNA 3 3 4 4 5 使 用 不 同 的 上 游 引 物 | (10 聚 体 ) 进 行 PCR. 1 JCCCOCOCCCOCCCCX 1 2 2 PCR 产 物 CCCCccccceccx 3 4 eccocccccccx 4

图 22.1 mRNA 差异 显示 的 一 般 方法 。 当 使 用 相同 的 引物 组 合 时 ， 两 种 细胞 都 产生 的 转录 产物 得 到 相同 的 PCR 产物 ， 仅 在 一 个 样品 中 出 现 的 PCR 产物 说 明 此 相应 基因 是 差异 转录 的

22.2 信使 RNA (mRNA) 差异 显示 。 第 一 轮 扩 增 的 差异 显示 PCR (DDPCR) 产物 经 电泳 和 自 显影 后 的 典型 结果 。 在 邻近 泳 道中 相同 的 条 带 表 示 都 转录 的 基因 。 仅 在 一 个 泳 道中 显示 出 来 的 条 带 很 可 能 是 差异 表达 的 序列 ， 因 而 可 以 作为 进一步 研究 的 对 象 。 值 得 注意 的 是 ， 每 对 不 同 的 产物 信号 强度 还 直接 反映 了 相应 转录 产物 的 相对 丰 度

用 于 差异 显示 的 RNA 通常 是 用 县 盐 - 酸 性 酚 抽 提 制 备 的 。 对 于 从 各 种 生物 材料 中 制备 RNA,， 该 方法 是 非常 合适 的 。 然 而 用 这 种 试剂 从 细胞 质 中 得 到 的 mRNA 中 混 有 未 经 剪接 的 hnRNA。 因 此 ，PCR 产物 测序 结果 显示 的 既 有 外 显 子 序列 也 有 内 含 子 序列 。 而 且 ， 相 应 于 同一 转录 产物 的 两 个 不 同 大 小 的 CDNA 会 在 同一 块 胶 上 显示 出 来 。 这 是 由 于 一 个 特定 转录 本 的 所 有 分 子 都 可 以 经 相同 的 下 游 引 物 反 转录 后 产生 cDNA。 两 个 或 多 个 上 游 引 物 〈 在 不 同

反应 管 中 ) 可 以 在 cDNA 上 找到 各 自 的 互补 位 点 而 支持 PCR 扩 增 。 虽 然 这 会 有 点 令 人 浊

丧 ， 但 是 这 一 现象 正好 显示 了 此 方法 可 以 使 任何 转录 产物 都 得 到 最 大 可 能 的 扩 增 。 ”315 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

22.4 €$2%24: mRNA Z $ 2S.

进行 mRNA 差异 显示 的 实验 方案 有 很 多 种 ， 它 们 都 有 其 自己 的 策略 。GenHunter DDPCR 产品 也 称 RNAimage 系统 ， 含 有 必要 的 引物 和 进行 实验 所 需 的 试剂 。 下 列 方法 是 基 于 使 用 如 上 所 述 DDPCR 下 游 引 物 和 上 游 引物 的 方法 ， 它 是 系统 的 和 详尽 的 方法 ， 研 究 者 可 以 在 整个 流程 中 几 个 点 上 暂时 中 止 工 作 ， 而 不 会 降低 灵敏 度 和 分 辩 率 。

22.4.1 cDNA 的 合成

DO 确保 用 于 合成 cDNA 第 一 链 的 RNA 是 高 质量 的 。 这 可 以 用 一 个 小 型 的 凝 胶 电 泳 来 检查 ， 胶 上 应 当 能 清晰 看 到 28S 和 18S 核糖 体 RNA (rRNA) 的 条 带 ， 在 18SrRNA FHA 少量 弥散 。 在 进行 反应 前 ， 用 无 菌 水 将 RNA 溶解 并 稀释 到 浓度 为 100ng/ul， 置 于 冰 上 。 最 好 在 使 用 前 再 将 RNA 从 乙醇 沉淀 中 重新 溶解 。

@ 制备 cDNA 合成 总 混合 液 〈 足 够 做 18 个 反应 的 ):

38. Onl 10 义 第 一 链 合成 缓冲 液 (100mmol/L Tris, 500mmol/L KCl, pH 8. 3)

76. Onl 25mmol/L MgCl,

9. 5yl 10mmol/L dNTP 混合 液 19.0npl RNA 酶 抑制 剂 (SOU/pD 13.3p1 ok

15.2pl AMV 反 转 录 酶

置 冰 上 。

注意 ”所 需 体积 取决 于 所 用 下 游 引 物 的 数量 和 每 个 反应 的 重复 数量 ， 可 相应 增 减 。

@) 将 一 组 用 于 反 转 录 的 微量 离心 管 标 上 样品 名 。 为 方便 可 将 A 细胞 的 RNA 样品 标 为 Al 一 A9,，B 细胞 的 RNA 样品 标 为 Bl 一 B9。 每 管 加 3. Onl 25umol/L 的 下 游 引 物 储存 液 〈 每 管 只 加 一 种 引物 ) 。

由 在 Al 一 A9 管 中 各 加 入 3. Onl (300ng) A 细胞 样品 RNA, 在 B1 一 B9 管 中 各 加 入 3. Oul (300ng) B 细胞 样品 RNA,

© 每 管 中 各 加 入 5. Onl DEPC 处 理 的 水 。

© 70C 水 浴 10min， 立 即 置 冰 上 。

O 短暂 离心 ， 将 样品 集中 到 管 底 。

每 管 各 加 入 9. 0pl cDNA 合成 总 混合 液 〈 第 @ 步 )。

© 42C 保 温 lh SA cDNA.

ERK MMLV 反 转 录 酶 适用 于 合成 较 长 的 cDNA。 如 使 用 MMLV 酶 ，37"C 保温 Lh (应 使 用 MMLYV 第 一 链 反应 缓冲 液 ) 。

@ 95C 加 热 5min 使 反 转 录 酶 失 活 ， 马上 使 用 的 cDNA 样品 可 以 置 冰 上 保存 。 其 他 cDNA 样品 离心 集中 到 管 底 并 储存 于 一 80C ,

注意 ， 未 加 热 使 反 转 录 酶 失 活 将 影响 后 续 的 实验 结果 ， 新 合成 的 CDNA 储存 不 当 将 影响 其 稳定 性 。 22.4.2 通过 PCR 扩 增 cDNA 的 各 个 组 分

在 CDNA 合成 结束 后 ， 样 品 可 以 直接 用 于 PCR 扩 增 。 对 应 于 一 条 下 游 引 物 有 许多 上 游 。 316 。

第 22 章 mRNA 差异 显示

引物 要 进行 PCR 扩 增 反应 ， 因 此 同时 对 一 条 以 上 的 下 游 引物 进行 操作 是 不 合理 的 。 从 合成 的 cDNA 反应 中 选取 一 个 ， 并 将 其 他 样品 冻 存 起 来 。 再 次 扩 增 时 正确 吸取 溶液 的 体积 是 十 分 重要 的 。 如 果 选 用 放射 自 显影 作为 检测 的 方法 ， 在 反应 总 混合 液 中 必须 包括 Le? P| dCTP(10mCi/ml) 或 [a-*°S]dATP.

@ 配制 如 下 DDPCR 反应 总 混合 液 〈 足 够 进行 48 个 反应 ) :

100.01 10XPCR 缓冲 液 (无 MgCl: )

120. Ol 25mmol/L MgCl,

5. Onl [35S ]dATP(10 mCi/ml) 10. Ol 500umol/L dNTP 10. Onl Taq RG

361.0n1 = DEPC 处 理 的 水

注意 工 ”应 该 先 配制 一 个 大 体积 的 不 含 Tad 聚合 酶 和 放射 性 标记 化 合 物 的 总 混合 液 。 其 体积 可 以 根 据 cDNA 合成 反应 的 数量 按 比 例 进行 调整 。 这 一 总 混合 液 应 适当 分 管 并 储存 在 一 20YC 。

注意 2 反应 的 最 佳 MgCl, 浓度 为 mmol/L。

注意 3 要 扩 增 大 于 450bp 的 PCR 产物 ，dNTP 浓度 可 以 从 5umol/L 增加 到 15pmol/L.

@ 加 入 108] 下游 引物 〈 与 前 面 的 cDNA 合成 反应 使 用 相同 的 引物 ) 到 反应 总 混合 液 中 。

G@) 将 反应 总 混合 液 分 装 到 两 个 不 同 的 反应 管 中 ， 一 份 用 于 A 细胞 的 EDNA， 另 一 份 用 于 也 细胞 的 cDNA,

图 向 上 述 反应 总 混合 液 中 分 别 加 入 A Aah A BAHAY CDNA 合成 反应 液 ， 使 预 混 合 液 分 别 含有 A 细胞 和 也 细胞 的 cDNA.

© 在 24 个 微量 反应 管 中 各 加 入 15pl LRO~OABAN A、B 预 混 合 液 。

© 每 个 反应 管 中 加 入 Syl 上 游 引物 〈 每 管 只 加 一 种 上 游 引物 ) 。

OQ 短暂 离心 ， 将 所 有 组 分 集中 到 管 底 。

如 果 使 用 无 热 盖 的 热 循 环 仪 〈 不 推荐 使 用 ) ， 每 个 反应 中 加 入 20nl 矿物 油 覆 盖 样 品 。 否则 跳 过 此 步 。

@) PHAR: 94°C 3min 94°C 30s 40°C asf 个 循环 Tae 60s 726 5min 4°C co

22.4.3 PCR 产物 分 析

毫 无 疑问 ， 对 PCR 产物 最 佳 的 分 析 方法 ， 就 是 使 用 PAGE 的 方法 。 但 不 一 定 要 进行 变 PEAR TA Ms RR BEI CTR) 电泳 ， 在 大 多 数 情况 下 非 变性 胶 也 可 以 使 用 。 C1) 可 选 步骤 : 初步 分 析 要 确定 一 组 DDPCR 样品 的 相对 效率 ， 则 可 以 从 每 一 个 反应 中 取 一 些 样 品 在 1 X Tris- 确 - 317 «

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

酸 盐 -EDTA (TBE) 缓冲 液 或 1 X Tris- 乙 酸 盐 - EDTA(TAE) 缓冲 液 中 进行 3% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 然后 用 SYBR 绿 、SYBR 金 或 省 化 乙 锭 染色 。 用 100V 电泳 20min, M Ee Be hiv He WA B] DDPCR 产物 (Al 22. 3) 。 如 果 观 察 不 到 任何 东西 就 意味 着 反应 效率 很 低 ， 并 且 需 要 曝光 较 长 时 间 才 能 看 到 条 带 。 用 荧光 染料 染色 虽然 是 一 种 灵敏 度 不 高 的 方 法 ， 但 是 反应 成 功 时 往往 可 以 显示 出 来 。

@ 将 3.0g 琼脂 糖 加 入 105 ml 1XTAE 组 冲 液 图 22.3 差异 显示 PCR。 产 物 在 第 一 轮 扩 增 中 溶化 ， 可 制 成 两 块 12cmX 14cm 的 凝 胶 ， 每 块 含 后 电泳 并 用 EB 染色 。 取 6 个 样品 进行 3% 两 排 上 样 孔 。

琼脂 糖 凝 胶 〈 其 中 含 1kg/ ml EB) 电泳。 这 当心 ”这 种 高 浓度 的 琼脂 糖 凝 胶 很 易 过 热 并 一 分 析 可 用 于 初步 判定 反应 的 效率 。 值得。 全景 洲 ， 处 理 时 要 小 心 。 注意 的 是 即使 使 用 这 种 不 灵敏 的 方法 ，

Q 高 浓度 凝 胶 凝 聚 很 快 ， 因 此 凝 胶 煮 沸 后 使 其 冷却 时 不 要 等 太 久 。 如 果 使 用 省 化 乙 锭 染色 ， 则 直接 在 热 的 凝 胶 中 加 入 20p] 10mg/ml EB 并 制 胶 。 如 果 使 用 SYBR 金 或 SYBR 绿 工 ， 则 不 加 入 染料 先 制 胶 ， 电 泳 后 再 进行 SYBR A.

@ 每 个 DDPCR BP Spl 的 样品 ， 加 入 1ml 凝 胶 上 样 缓冲 液 。 为 吸取 方便 ， 在 加 入 凝 胶 上 样 缓冲 液 后 每 5pl DDPCR 样品 可 以 加 入 5~10pl 7k.

@ 100V 电压 下 电泳 ， 直 到 染料 进 胶 2~3cm,

© 含有 EB 的 凝 胶 电 泳 后 可 以 直接 在 紫外 灯 下 观察 。 使 用 SYBR RI AY, HERE RE 浸没 于 2XSYBR 绿 工 的 1XTAE 缓冲 液 中 ，15min 后 观察 。 浸 泡 的 时 间 长 可 增强 微弱 条 带 的 着 色 。 然 后 进行 拍照 。

当心 ”使 用 紫外 灯 、 致 畸变 的 荧光 染料 及 放射 性 物质 都 要 按 规 定 注 意 安全 。

(2) 非 变性 聚 两 炳 酰胺 凝 胶 电泳

制备 非 变 性 的 和 变性 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 需 要 有 经 验 ， 因 为 丙烯 酰胺 单 体 有 一 定 的 神经 毒 性 。 除 非 你 的 实验 室 可 以 正确 处 理 这 种 试剂 ， 和 否则 最 好 还 是 购买 预制 好 的 凝 胶 ， 它 含有 所 有 的 成 分 并 有 适用 于 各 种 电泳 装置 的 规格 。 常 规 使 用 的 是 6% 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 ， 在 1XTBE 组 冲 液 中 电泳 。

非 变 性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 在 分 析 DDPCR 产物 时 通常 表现 很 好 。 如 果 在 泳 道中 一 直 出 现 弥 散 现 象 ， 则 可 改 用 变性 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 。

O 带好 手套 。 小 心 拆 开 预 制 胶 ， 用 薰 饮水 冲洗 加 样 孔 。 应 始终 带 着 手套 ， 不 要 以 为 已 聚合 的 胶 对 健康 无 害 。

Q) 装 好 电泳 装置 ， 将 凝 胶 装 入 。

@ 预 电 泳 20~30min,

® 将 一 半 DDPCR 反应 物 Opel) 转 到 新 的 离心 管 ， 加 10nl 非 变 性 凝 胺 上 样 缓冲 液 (0.2% Mik; 10mmol/L EDTA, pH8.0; 20% Ficoll) ， 剩 余 的 10 pl 样品 储存 在 一 80C 备用 。

@ 与 上 样 缓冲 液 混合 后 ， 每 个 样品 取 Spl 上 样 到 凝 胶 加 样 孔 中 。

© 人 恒 功 率 不 超过 50 一 60W 进行 电泳 ， 直 到 溴 酚 蓝 泳 动 到 凝 胶 底 部 。

。 318 .

仍 可 以 观察 到 某 些 样品 间 的 差别

第 22 章 mRNA 差异 显示

@ 从 电泳 槽 小 心 取出 凝 胶 。 将 凝 胶 放 到 一 张 Whatman 滤纸 上 ，80C 抽 王 2h。 不 要 用 甲醇 -醋酸 固定 凝 胶 。

当心 牢记 DDPCR 含有 放射 性 ， 会 污染 凝 胶 盒 和 电泳 缓冲 液 。 要 按 放 射 性 处 理 要 求 小 心 处 理 污染 的 设备 和 试剂 。

放射 自 显影 ， 至 少 过 夜 。

注意 ”最 好 压 两 张 X 射 线 片 ， 即 使 第 一 张 在 切割 条 带 的 过 程 中 损坏 ， 仍 然 还 有 第 二 张 可 以 保留 。

© 冲洗 片子 ， 检 查 是 否 有 差异 表达 的 序列 存在 。

注意 ”在 此 技术 中 ， 分 析 数 据 和 对 目的 条 带 的 鉴定 是 费时 的 一 个 部 分 。 一 些 高 质量 的 图 像 分 析 软 件 可 以 对 凝 胶 的 图 像 进行 数字 化 处 理 ， 并 挑选 出 那些 清楚 地 存在 于 一 个 样品 而 在 另 一 个 样品 中 缺少 的 条 带 ， 并 且 还 能 区 分 一 对 条 带 中 的 一 个 与 另 一 个 在 量 上 的 差别 ， 例 如 存在 5 倍 或 更 多 的 诱导 或 抑制 。

22.5 FRA: EF EaLGZWHOE £ ho H #

正如 前 文 所 建议 的 ， 使 用 非 变性 胶 分 析 DDPCR 的 结果 要 比 传统 的 变性 胶 好 。 由 于 变性 胶 的 分 辨 效率 极 高 ， 在 非 变 性 胶 上 的 一 条 条 带 ， 往 往 在 变性 胶 上 出 现 两 条 甚至 更 多 的 条 带 。 原因 包括 : ODNA 链 的 解 开 ;，@) Taa 聚合 酶 在 PCR 产物 的 3 端 加 上 一 个 核 苷 酸 GEA A)98。 因 此 ， 自 显影 的 复杂 性 给 回收 条 带 带 来 了 困难 。

© 依据 自 显 影 在 滤纸 〈 胶 ) 上 切割 目的 条 带 ， 分 别 放 人 不 同 的 离心 管 中 ， 加 入 100nl 灭 菌 水 。

@ 室温 放置 30min 后 ，90C 加 热 10min， 然 后 离心 使 胶 与 滤纸 集中 到 管 底 。

G@) 小 心 将 上 清 液 转移 到 新 的 离心 管 中 ， 其 中 含有 浸 洗 出 的 DNA。

@ 使 用 与 得 到 这 条 条 带 的 第 一 轮 扩 增 中 相同 的 上 游 引 物 和 下 游 引 物 再 扩 增 。

25.0ul ”浸出 的 DNA (第 @@ 步 的 上 清 液 )

5. Onl 10X PCR 缓冲 液 〈 无 MgCl. )

6. Onl 25mmol/L MgCl,

5. Onl 500unmol/L dNTP

5. Onl 2umol/L 下 游 引物 OK 25mol/L 储备 液 稀释 )

5. Onl 2umol/L -上游 引物

1. Opl Taq RAH (SU/pD

注意 ” 重 扩 增 遇 到 困难 时 可 将 MgCl, 浓度 调整 到 1. 5mmol/L， 两 种 引物 浓度 增加 到 lpmol/L, IFA 循环 数 增加 到 40 个 循环 。

@@ 使 用 最 初生 成 起 始 产物 所 用 的 相同 条 件 再 扩 增 浸出 的 DNA。

起 始 的 解 链 94°C 3min

循环 参数 94°C aon) 40°C 60s $30 个 循环 126 60s)

最 终 的 延伸 TAC 5min

保存 4c

@ 当 单独 使 用 具有 校对 活性 的 热 稳定 聚合 酶 ， 或 与 Tad 聚合 酶 共同 使 用 时 ， 不 会 在 3 末端 加 上 多 余 的 单个 核 苷 酸 。 “3349 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

© 在 第 二 轮 扩 增 结束 后 ， 取 出 10ml 样品 与 2 风 上 样 缓冲 液 混合 ， 在 2.5% BRAG BE BE Ie (1XTBE 或 1XTAE) 上 与 分 子 量 标准 (il Promega PCR Marker, Cat. No. G-3161) 同时 电泳 。 @ 用 SYBR 绿 或 EB 染色 并 拍照 。

22.6 用 永和 爷 效 回收 差 导 表达 的 序列

鉴定 了 差异 调节 的 基因 ， 虽 然 是 十 分 重要 的 结果 ， 但 经 过 了 扩 增 与 再 扩 增 得 到 的 DDPCR 产物 并 不 一 定 是 同一 种 产物 。 例 如 在 进行 Northern 分 析 时 ， 如 果 将 一 个 未 纯化 的 DDPCR 产物 用 作 核 酸 探 针 ， 能 够 检测 出 多 个 条 带 并 不 罕见 。 即 使 是 再 扩 增 后 单一 的 条 带 也 常常 “隐藏 ”着 两 种 或 更 多 的 不 同 的 cDNA (Callard 等 , 1994) 。 它 们 之 间 仅 仅 末端 序列 即 引 物 识别 的 序列 是 相同 的 。 除 非 将 这 些 产 物 分 离开 来 ， 否 则 不 能 确保 随后 得 到 的 数据 的 可 靠 性 。

在 进行 Northern 分 析 时 ， 探 针 序列 碱 基 配对 于 支持 最 初 反 转录 cDNA 的 全 长 RNA。 如 果 探 针 不 止 一 个 ， 则 每 一 个 探 针 将 与 各 自 的 全 长 RNA 杂交 。 更 有 甚 者 ， 在 对 DDPCR 产物 进行 验证 时 ， 如 果 在 Northern 分 析 中 使 用 细胞 总 RNA 作为 靶 材料 ， 就 可 以 观察 到 同一 转 录 产 物 未 剪接 的 、 前 体形 式 的 多 条 条 带 。

分 离 DDPCR 产物 有 两 种 标准 的 方法 。 首 先 ， 如 后 面 将 讨论 的 ， 研 究 者 可 以 直接 将 序列 克隆 到 一 个 适用 于 下 游 实 验 的 载体 中 。 直 接连 接 虽 然 看 似 简单 ， 但 也 不 失 为 一 个 好 方法 。 然 而 ， 在 某 些 情况 下 也 可 以 使 用 DDPCR 条 带 〈 含 一 个 或 几 个 序列 ) 作 探 针 进 行 Northern 分 析 。 简 单 地 说 ， 取 相同 的 或 至 少 相 近 量 的 用 于 进行 DDPCR 实验 的 RNA 进行 标准 的 变性 电 泳 ， 随 后 印迹 到 一 张 尼龙 膜 上 〈 如 第 12 章 所 述 ) 。DDPCR 再 扩 增 的 产物 进行 标记 《放射 性 标记 或 化 学 荧光 标记 ) 并 用 作 Northern 分 析 的 探 针 。 这 一 方法 是 基于 DDPCR 产生 的 cDNA 两 条 链 中 的 一 条 可 以 与 最 初 产生 cDNA 的 RNA 碱 基 配 对 。 如 果 有 不 止 一 条 cDNA, E114 分 别 与 各 自 相 应 的 RNA 转录 物 碱 基 配 对 。 在 检测 时 ， 杂 交 信 和 号 将 显示 出 杂交 探 针 的 位 置 。 此 外 ， 在 一 条 泳 道上 得 到 一 定 强度 的 信号 (如 状态 A RNA)， 而 在 邻近 泳 道 〈 如 状态 B RNA) 无 杂交 信号 ， 则 它 确 实 是 差异 调节 序列 非常 有 力 的 证 据 。

使 用 这 一 方法 是 省 时 的 ， 然 而 许多 通过 PCR 获得 的 cDNA， 其 RNA 转录 产物 的 量 大 都 处 于 以 传统 的 Northern 分 析 方 法 可 检 出 的 水 平 之 下 ， 即 使 经 过 poly(A)+ 选 择 也 是 如 此 。

因此 ， 如 何 分 离 或 俘获 得 到 的 不 同 CDNA 呢 ? 对 Northern 分 析 中 显现 的 信号 ， 根 据 X 射线 片上 的 位 置 将 含有 杂交 到 cDNA 条 带 的 尼龙 膜 的 相应 区 域 切 下 ， 回 收 每 条 可 见 条 带 。 这 一 小 片 尼龙 膜 含有 固定 化 的 RNA 和 通过 氢 键 结合 的 cDNA 探 针 ， 将 此 尼龙 膜 放 人 离心 管 ， 加 100ml 灭 菌 水 ，95C 加 热 5min， 在 此 条 件 下 cDNA 将 从 滤纸 上 被 洗 脱 下 来 。 管 中 的 水 可 以 用 来 制备 PCR 混合 物 ， 从 其 中 可 以 得 到 , @ 丢 失 的 那 条 链 ， 即 可 以 合成 cDNA 的 第 二 链 ; 包 可 以 扩 增 得 到 单一 的 产物 用 于 进一步 鉴定 。 这 一 方法 被 称 为 亲 和 俘 获 ， 也 被 称 为 反 向 Northern 印迹 (Zhang 等， 1996) 。 这 一 方法 不 仅 可 以 从 混合 物 中 分 离 特 定 长 度 的 序列 ， 也 可 用 于 确定 纯化 cDNA 的 不 同 状 态 。

22.7 PCR 产物 的 克隆

任何 其 他 克隆 PCR 产物 的 方法 ， 在 这 里 通常 也 同样 适用 。 将 片段 插 人 一 个 载体 ， 是 另 一 种 可 以 将 DDPCR 产生 的 混合 CDNA (同样 大 小 、 不 同 序列 ) 分 开 的 一 种 方法 。 现 在 最 党 "320 。

第 22 章 mRNA 差异 显示

用 的 一 种 克隆 方法 是 TA 克隆 ， 在 此 方法 中 以 A 为 尾巴 的 PCR 产物 可 以 与 以 工 为 尾巴 的 载 体 相 连接 ;， 另 一 种 是 TOPO 克隆 ， 利 用 DNA 拓扑 异 构 酶 工 的 “再 结合 ”活性 ， 人 快速 将 PCR 片段 与 载体 相连 接 〈 第 19 HE).

PCR 产物 的 克隆 虽然 不 是 绝对 必要 的 ， 但 有 利于 测序 和 扩 增 这 些 殉 隆 。 由 于 有 时 不 目 一 个 片段 被 连 人 载体 ， 经 转化 后 涂 布 在 选择 性 培养 基 上 ， 随 后 挑 出 的 单个 细菌 菌落 只 含有 一 个 插入 片段 。 为 了 鉴定 一 个 菌落 是 否 确 为 转化 子 ， 可 用 灭 菌 牙签 随机 挑选 10 个 〈 根 据 自 己 情况 可 变 ) 菌落 接种 到 新 鲜 的 琼脂 平板 上 保存 菌 种 ， 并 加 到 PCR 反应 混合 液 中 ， 这 一 反应 混合 液 中 含有 产生 DDPCR 产物 时 所 用 的 相同 的 上 游 引 物 和 下 游 引 物 。 在 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析 时 ， 应 当 产 生 一 条 与 插入 片段 相同 大 小 的 条 带 。

22.8 差 导 表 达 的 验证

在 DDPCR 进行 完 所 有 引物 的 组 合 后 ， 可 以 进行 第 二 次 反应 ， 这 次 反应 使 用 的 是 那些 在 第 一 次 反应 中 显示 出 差别 的 引物 对 。 这 种 方法 在 某 种 程度 上 有 利于 消除 假 阳 性 。 当 然 ， 应 当 尽 可 能 与 第 一 次 反应 的 实验 条 件 一 致 ， 从 而 使 实验 能 够 得 到 可 重复 性 的 结果 。 然 而 人 们 不 能 期 望 两 次 实验 的 结果 会 完全 重 现 ， 那 是 因为 : 四 对 于 细胞 培养 条 件 不 可 能 完全 重复 〈 基 因 的 表达 依赖 于 细胞 密度 、 细 胞 分 裂 代 数 、 培 养 基 等 ); @ 来 源 于 不 同 病 人 的 组 织 样本 是 完全 不 同 的 生化 组 织 ， 虽 然 有 许多 相似 性 ， 但 仍 有 许多 不 同 。 为 了 使 对 同一 样本 的 不 同 反应 得 到 最 大 的 重复 性 ， 研 究 者 应 当 在 最 初 分 离 RNA 的 过 程 中 就 将 RNA 分 为 几 管 ， 从 而 使 RNA it 淀 在 几 个 管 之 中 ， 只 取 其 中 一 管 进行 离心 并 用 作 合 成 cDNA 的 模板 。 在 完成 所 有 DDPCR 的 步骤 后 ， 研 究 者 可 以 另 取 一 份 由 同一 个 人 在 同一 天 分 离 的 RNA 样品 ， 能 够 精确 地 代表 细胞 相同 的 生化 状态 。

目前 有 四 种 可 靠 的 方法 ， 可 用 来 判断 使 用 差异 表达 法 得 到 的 差异 表达 序列 是 否 在 细胞 内 真 的 有 变化 ， 即 Northern 分 析 〈 第 12 章 ) 、 核 糖 核酸 酶 保护 分 析 (RPA) (第 16 BE). KU 逸 实验 〈 第 17 章 ) 和 单 链 构象 多 态 性 (SSCP) (Orita 等 ，1989) 。SSCP 是 一 种 简单 的 技 术 ， 其 原理 是 单 链 DNA 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 中 的 泳 动 依赖 于 分 子 的 核 苷 酸 组 成 ， 有 关 此 方法 的 综述 和 实验 流程 抑 Fujita #l Silver (1995),

22.9 进一步 的 鉴定

Northern 分 析 、 核 糖 核酸 酶 保护 分 析 (RPA) 和 核 逃 逸 实验 ， 可 被 用 于 进一步 鉴定 一 个 已 经 纯化 的 CDNA 基因 的 转录 情况 。 这 些 方法 虽然 从 观察 基因 表达 的 角度 上 讲 是 极 佳 的 ， 但 对 鉴定 基因 却 无 能 为 力 。 对 一 个 已 知 的 DNA 序列 ， 鉴 定 其 克隆 也 就 是 轻而易举 的 事 了 。 考虑 到 DDPCR 产生 的 序列 相对 比较 短 ， 因 而 花费 大 量 的 时 间 和 精力 去 建立 限制 性 图 谱 也 许 是 不 太 值 得 的 ， 克 隆 测 序 后 即 可 得 知 其 限制 性 酶 切 位 点 的 分 布 。

用 于 DDPCR 的 引物 对 于 标准 的 测序 而 言 太 短 了 。 为 了 方便 对 DDPCR 的 产物 进行 测 序 ， 可 以 在 再 扩 增 时 使 用 加 长 的 引物 。 在 引物 的 5 端 可 加 上 T3 或 SP6 等 测序 启动 子 序列 ， 或 者 在 引物 上 设计 一 个 限制 性 酶 切 位 点 也 是 特别 方便 的 。 这 样 用 于 再 扩 增 的 引物 将 是 A 和 B ， 而 不 是 原来 的 A 和 B 了，DDPCR 产物 将 可 以 直接 用 于 测序 (Reeves “, 1995; Wang 和 Feuerstein, 1995),

- 321 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

差异 调节 序列 的 分 离 为 更 清楚 地 了 解 细胞 中 基因 的 调控 提供 了 很 玫 分 离 的 DNA 序列 可 以 重复 再 扩 增 ， 作为 核酸 探 针 其 来 源 将 不 受 限 制 ， 合 成 探 针 时 需要 加 入 [ce-32P] dNTP， 通 常 仅 进行 15 个 循环 ， 结束 后 再 在 72 延伸 5min 即 可 。 探 针 序 列 可 用 于 对 以 前 尚未 测定 的 RNA 样品 进行 基因 表达 分 析 或 从 库 中 筛选 更 多 的 基因 及 旁 侧 的 调节 元 件 ;，

22.10 £¥ £508

事实 上 只 要 实验 操作 能 够 引起 细胞 的 生化 改变 ， 这 一 模型 就 适用 于 应 用 DDPCR 技术 进 行 研究 。mRNA 差异 显示 能 够 对 不 同 来 源 的 mRNA 进行 并 排比 较 ， 并 能 成 功 地 鉴定 出 土 调 和 下 调 的 基因 。 下 面 列 出 一 些 用 于 研究 基因 调控 的 例子 〈 当 然 不 仅 限 于 这 些 研 究 ) 。

CD 培养 细胞 中 药理 浓度 的 生长 因子 或 药物 的 影响 。

Q@ 静止 细胞 、 衰 老 细胞 及 对 数 生长 期 的 培养 细胞 的 比较 。 |

@ 蔬菜 水 果 中 基因 功能 随 季节 的 变化 。

® 对 外 源 基 因 转 染 的 应 答 。

© 用 于 诊断 的 新 指标 。

© 分 化 过 程 中 功能 的 研究 。

O 分 离 多 基因 家 族 的 新 成 员 。

@ 辨别 转录 调控 与 转录 后 调控 序列 CRA RNA 制备 方法 参见 第 3 BPA 3.2).

差异 显示 方法 有 代表 性 的 研究 应 用 可 参见 Sager (1993), Zimmerman 和 Schultz (1994), Zhang 等 (1996 ) 。

22.11 mRNA 差 导 显 朱 的 向 题 与 解决 万 法

许多 使 用 DDPCR 方法 的 研究 者 ， 都 发 现 这 一 方法 的 主要 缺陷 是 反应 的 重复 性 差 以 及 有 许多 种 可 能 的 解释 。 这 个 方法 的 特点 就 是 对 引物 的 质量 非常 敏感 。 只 有 经 过 HPLC 纯化 的 引物 才能 很 好 地 参与 反应 。 由 于 需要 进行 质量 控制 ， 对 于 第 一 次 使 用 这 一 方法 的 研究 者 ， 建 议 购买 DDPCR 的 试剂 盒 ， 因 为 要 合成 优化 的 均一 的 高 质量 引物 并 非 一 般 设 备 条 件 能 够 达到 。

这 一 方法 的 另 一 个 特点 就 是 DDPCR 对 反应 的 所 有 成 分 的 浓度 都 非常 灵敏 ， 因 此 在 合成 cDNA 和 进行 PCR 时 ， 准 确 取 样 并 使 用 反应 总 混合 液 是 十 分 关键 的 。 se， 利于 减少 问题 的 出 现 ， 并 最 大 程度 地 提高 实验 的 重复 性 和 效率 。

(1) 必须 做 到 的

® 高 质量 RNA

。 使 用 好 的 无 RNA BERR

© 使 用 硫 氰 酸 肌 或 盐酸 县 作为 裂解 缓冲 液 。

。 用 酸性 酚 抽 提 .。

@ 也 可 以 使 用 NEF-40 裂解 液 ， 但 使 用 这 种 方法 纯化 的 RNA 来 进行 DDPCR， 要 想得到 重复 性 好 的 数据 就 需要 更 熟练 的 技能 .

. 322 *

第 22 章 ， mRNA 差异 显示

。 用 股 盐 缓冲 液 进行 二 次 沉淀 。

。 样品 用 无 RNase 的 DNase 工 处 理 。

。 使 用 由 DEPC 处 理 的 水 配制 的 70%% 乙 醇 充 分 洗涤 RNA 沉淀 ， 以 去 除 盐 分 8。 。 人 恰当 储存 纯化 的 RNA.e @ 反 转 录 生 成 cDNA 以 及 PCR

。 每 个 cDNA 反应 使 用 相同 的 RNA 量 (200~300ng).

。 使 用 无 内 源 RNase 互 活性 的 酶 将 对 反应 有 帮助 。

。 避免 使 用 依赖 Mn? * 的 反 转 录 酶 。

。 永远 使 用 cDNA 反应 总 混合 液 。

。 永远 使 用 PCR 反应 总 混合 液 。

(2) 常 遇 到 的 问题 © 有 一 条 或 几 条 泳 道 出 现 严重 弥散 现象

。 优化 Mg2# 浓 度 〈 通 常 降 低 浓 度 ) ， 每 次 降低 0. Immol/L。

。 减少 PCR 循环 数 到 30 个 循环 。

。 减少 反应 中 酶 的 使 用 量 。

。 稍稍 增加 退火 温度 。

注意 ”在 某 些 情况 下 ，1 一 5 次 循环 使 用 40 退火 ，6 一 40 次 循环 使 用 45\C 退 火 可 减少 弥散 现象 。 但

是 这 样 操作 可 能 减少 条 带 数量 多 达 25% ~30%,

@ 无 产物 产生

。 检查 RNA。

。 加 入 RNA 酶 抑制 剂 〈 如 RNasin),

。 检验 RT 和 PCR 的 组 分 ， 特 别 是 酶 。

。 核对 反应 中 的 每 一 个 组 分 ， 并 确认 所 有 组 分 已 经 充分 混合 。

。 检查 PCR 循环 参数 。 @ 低产 率

© 样品 匀 浆 或 裂解 不 完全 。

。 检查 RNA 沉淀 是 否 完全 溶解 。

© 测定 Azso/Azse ， 如 比值 小 于 二 65 表明 有 蛋白 质 或 其 他 物质 的 污染 。 。 检查 RNA 是 否 降 解 。

© 从 动物 中 取出 的 组 织 样品 没有 立即 处 理 或 冰冻 。

。 纯化 的 RNA 储存 在 一 20C， 而 不 是 在 一 80TC 。

。 所 使 用 的 水 溶液 与 反应 管 不 是 无 RNase 的 。

@ DNA 污 染

© 如 果 样 品 没 有 经 DNase 处 理 则 可 能 会 有 DNA 污染 。

@ 数据 重复 性 不 好

。 使 用 2007l 薄 壁 反应 管 ， 如 使 用 厚 壁 的 反应 管 则 需要 调整 PCR 循环 参数 。 。 采用 热 启动 PCR ( 见 第 19 章 )。

© 含有 阳离子 的 盐 可 以 大 量 地 与 dNTP 结合 ， 从 而 破坏 DNA 的 合成 及 PCR 的 进行 。 @ DDPCR 方法 对 于 部 分 降解 的 RNA 的 耐 受 性 ， 比 其 他 以 PCR 为 基础 的 方法 更 差 。

° 323 。

RNA 分 高 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

。 对 每 一 个 细胞 样品 配制 单个 、 大 体积 的 总 混合 物 ， 再 等 分 到 各 反应 管 。

。 使 一 对 上 游 引 物 和 下 游 引 物 Tn 尽量 接近 。

。 使 用 能 够 合成 长 PCR 产物 的 酶 〈 如 Tagt+ Pwo).

。 不 要 使 用 矿物 油 ， 使 用 有 热 盖 的 热 循环 仪 。

。 抽 提 RNA 使 用 不 同 的 方法 会 出 现 这 种 情况 。

。 不 是 同一 天 抽 提 的 RNA 可 能 出 现 这 种 情况 。

© 检查 细胞 或 组 织 的 状态 。 如 果 细 胞 和 组 织 处 于 不 同 状态 〈 细 胞 周期 的 不 同时 相 、 组 织 从 不 同 个 体 分 离 、 对 数 晚 期 相对 于 对 数 早 期 、 静 止 相对 于 衰老 )， 数 据 的 重复 性 就 会 差 。

。 如 果 使 用 不 同 的 引物 对 或 错 用 了 引物 对 都 将 导致 这 一 问题 。

。 检查 是 否 使 用 了 不 同 的 反应 总 混合 液 。

。 在 同一 台 热 循环 仪 上 进行 反应 的 优化 和 运行 〈 不 仅仅 是 同样 型 号 的 仪器 ) 。

(3) 综合 建议

。 变性 步骤 时 间 愈 短 愈 好 。

。 变性 温度 最 好 低 至 90~92°C.

。 延伸 温度 可 以 降 到 68'C 。

。 在 每 个 循环 中 的 延伸 时 间 可 适当 加 长 〈5 一 20s/ 循 环 ) 。

。 精确 取样 对 于 重复 结果 是 至 关 重 要 的 ， 在 开始 实验 时 及 每 隔 一 段 时 间 应 对 微量 取样 器 重新 校 定 。 准 备 备用 取样 器 ， 在 取样 过 程 中 更 换取 样 器 可 避免 带 入 污染 。

。 mRNA 差异 显示 技术 对 于 RNA 的 实际 用 量 是 非常 灵敏 的 。 对 于 大 多 数 RT-PCR 讲 “ 少 就 是 多 "， 在 反应 中 加 入 过 量 的 起 始 材料 ， 结 果 是 适得其反 的 〈 最 佳 量 是 200 一 300ng 的 RNA) 。

。 与 许多 PCR 相关 的 技术 不 同 ，mRNA 差异 显示 对 于 起 始 材料 的 质量 要 求 特别 高 。 采 FA MS Be ob EY RNA 质量 最 好 。

。 购买 含有 已 选择 好 的 引物 的 试剂 盒 ， 尽 量 不 要 订购 或 自己 制备 引物 。

。 使 用 硅烷 化 的 微量 离心 答 有 利于 在 各 种 操作 中 减少 损失 。 因为 cDNA 和 了 CR 产物 在 再 扩 增 前 只 有 皮 克 级 〈 甚 至 更 少 ) 的 量 〈 具 体操 作 见 附录 8) 。

22.12 & 4

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- 324 .

第 22 章 mRNA 差异 显示

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(Ki; 李 伟 校 )

“25。

第 23 章 坚 因 表达 的 高 通 量 分 而

23.1 基本 原理

许多 研究 者 一 向 渴望 能 有 快速 筛选 大 量 样品 、 同 时 分 析 尽 可 能 多 的 基因 表达 的 方法 。 然 而 ， 原 来 的 方法 包括 RNA 印迹 、 核 糖 核酸 酶 保护 分 析 以 及 反 转 录 聚 合 酶 链 反 应 〈RTI- PCR)， 固 然 有 其 价值 ， 却 是 低 通 量 的 方法 。 随 着 以 微 阵 列 为 基础 的 筛选 法 的 出 现 汪 许多 实 验 室 普 遍 开展 大 批量 表达 研究 。 这 些 研究 提供 了 大 量 关 于 细胞 功能 以 及 随 着 细胞 变化 而 发 生 的 功能 改变 的 信息 。 最 初 科学 界 是 带 着 疑问 接受 微 阵列 的 。 如 今 ， 微 阵列 则 普遍 作为 两 个 或 多 个 样品 平行 比较 ， 作 为 高 通 量 筛选 CTS) 的 有 效 手 段 。 随 着 以 微 阵 列 为 基础 的 分 析 变 得 错综复杂 和 自动 化 ， 其 效能 将 进一步 增强 。

23.2 REM AH ZS

微 阵 列 ， 简 而 言 之 为 阵列 或 生物 芯片 ， 是 在 常见 的 lin X 3in(lin=0. 0254m) 盖 玻 片 或 在 较 大 的 尼龙 滤 膜 上 永久 性 地 印 制 非常 大 量 的 单个 基因 序列 (Fodor 等 ，1991; Fodor 等 ， 1993)。 微 阵列 原先 是 为 了 分 析 不 同 生物 样品 中 信使 RNACmRNA) 的 表达 而 开发 的 〈Sche- na 等 ，1995)。 它 现在 也 被 用 来 分 析 基 因 的 拷贝 数 (Pollack 等 ，1999) 。 当 前 ， 也 开发 了 以 微 阵列 为 基础 的 其 他 技术 ， 例 如 蛋白 质 微 阵 列 (Fodor 等 ，1993; WL Haab, 2000 综述 ) GH 第 称 为 蛋白 质 生 物 芯 片 ) 和 抗体 (Ab) 微 阵 列 。

现在 ， 有 3 种 微 阵列 的 基本 格式 或 平台 ， 即 短 的 〈25 核 苷 酸 ) BERATED, AH DNA (cDNA) 微 阵 列 和 较 长 的 寡 核 苷 酸 (60~70 RFR) 微 阵 列 。 许 多 人 认为 较 长 的 究 核 苷 酸 平台 是 比较 好 的 ， 因 其 灵敏 度 比 25 核 苷 酸 的 更 高 ， 还 可 人 允许 一 些 错 配 ， 而 且 点 与 点 之 间 的 序列 Tm 值 一 致 。 微 阵列 超过 70 个 碱 基 长 度 ， 其 灵敏 度 并 不 增加 ， 却 要 增加 核 苷 酸 合成 的 成 本 。 况 且 ， 随 着 赛 核 苷 酸 长 度 的 增加 ， 发 生 差错 碱 基 的 概率 也 增加 《〈 见 Barrett 和 Kawasaki，2003 综述 ) 。

DNA 沉积 在 微 阵列 表面 的 作用 称 为 印 制 。 早 期 只 能 在 实验 室内 制作 微 阵列 。 如 今 ， 微 阵列 可 以 定制 或 实验 室 制造 ， 实 验 室 内 制作 主要 需 关注 质量 控制 (QC) PAR, BRERA 阵列 可 在 微 阵列 表面 直接 合成 ， 或 者 在 他 处 合成 而 后 沉积 在 微 阵 列表 面 。 特 别 要 注意 使 用 费 钱 又 费力 的 PCR 产生 的 cDNA 印 制 到 微 阵列 时 ， 同 源 序列 间 的 交叉 杂交 是 个 严重 的 问题 。 用 在 较 好 的 微 阵 列 上 的 基因 序列 选 自 公 共 数 据 库 ， 例 如 ， RefSeq, Ensembl, RIKEN 和 HUCO。 这 些 数据 库 经 常 在 不 断 更 新 。 印 上 的 序列 常 是 人 们 熟知 的 、 性 质 了 解 得 充分 的 序

。 326 -

第 23 章 基因 表达 的 高 通 量 分 析

列 ， 也 包含 有 功能 不 明 的 DNA 序列 。

在 单一 微 阵 列 上 印 制 的 基因 序列 可 数 以 千 计 ， 完 成 制造 微 阵 列 的 过 程 需要 专门 的 自 动 化 设备 和 其 他 革新 性 技术 。 几 种 合成 微 阵 列 的 方法 有 赖 于 所 用 DNA 的 特性 。 因 为 购买 微 阵 列 的 费用 高 ， 条 件 好 的 实验 室 常 选择 自己 制备 微 阵列 。 人 们 很 容易 从 销售 渠道 买 到 已 经 包 被 的 载 玻 片 〈 常 是 多 聚 赖 所 酸 或 氨基 硅烷 包 被 )。 许 多 销售 商 也 卖 cDNA MEK 酸 序列 ， 供 应 实验 室 制 造 微 阵 列 。 这 样 可 以 节省 实验 室 购买 即 用 型 微 阵 列 的 额外 费用 。 玻璃 微 阵 列 只 可 用 一 次 ， 而 尼龙 的 微 阵 列 可 以 反复 使 用 。 在 作者 的 实验 室 ， 成 功 地 反复 使 用 ?2P 和 化 学 发 光 法 测试 尼龙 的 微 阵 列 。 然 而 若 将 荧光 法 用 于 玻璃 微 阵列 ， 分 辨 率 最 佳 。 简 而 言 之 ， 微 阵列 表现 出 收集 大 量 细胞 生化 的 定性 和 半 定 量 信息 的 能 力 。 微 阵列 正 迅 速成 为 研究 手段 的 主流 。 这 并 未 超出 人 们 的 预料 ， 因 为 人 类 基因 组 计划 的 完成 获得 了 相当 大 量 的 信息 。

过 去 ， 每 个 微 阵 列 印 上 代表 单一 组 织 的 序列 。 然 而 ， 现 在 多 组 织 微 阵列 已 经 普及 。 这 就 有 利于 几 个 组 织 的 同时 分 析 。 这 个 方法 类 似 于 普及 的 、 有 多 家 生物 技术 供应 商 销售 的 RNA 印迹 (Northern 印迹 ) : 几 个 组 织 的 RNA 印迹 准备 用 于 核酸 杂交 。 某 种 意义 上 ， 多 组 织 的 微 阵列 是 一 种 高 技术 、 高 通 量 的 原 位 杂交 。 它 赋予 鉴定 组 织 样 品 架构 内 细胞 类 型 的 基因 表达 能 力 。

已 有 几 种 微 阵 列 ， 如 癌 阵 列 〈 有 时 指 一 组 癌 试 验 系列 )。 这 些 专 门 的 微 阵 列 和 广 范围 序 列 印 制 的 微 阵列 一 样 ， 其 设计 目的 是 使 研究 者 可 在 尽 可 能 大 的 范围 内 设计 实验 。

微 阵 列 是 用 两 个 不 同 来 源 的 样品 〈 处 理 样 品 和 对 照样 品 ) 标记 的 cDNA 在 一 个 体积 非 常 小 的 杂交 缓冲 液 中 进行 探测 。 最 常见 的 携带 荧光 染料 标记 的 CDNA 探 针 ， 分 别 含 cy3- 脱 氧 尿 喀 啶 -5 -三 磷酸 (Cy3) 和 cy5- 脱 氧 尿 喀 啶 -5 -三 磷酸 CCy5) (Amersham 生物 科学 公司 产品 ) 。 用 激光 扫描 时 ， 它 们 分 别 是 绿色 和 红色 荧光 染料 标记 物 。 例 如 ， 对 照 组 cDNA 用 Cy3 标记 ， 而 处 理 的 或 样品 组 cDNA 用 Cy5 标记 。 这 些 探 针 混 合用 于 微 阵 列 上 作 共 杂交 。 如 果 Cy3 标记 的 cDNA 和 Cy5 标记 的 cDNA 杂交 到 微 阵 列 的 同一 个 点 ， 将 同时 发 出 黄色 欧 光 。 于 是 ， 微 阵列 上 各 个 点 来 自 2 种 染料 的 荧光 的 比 ， 将 提供 有 关 特 定 转录 产物 丰 度 的 信 息 。 作 为 变通 ， 玻 璃 微 阵 列 可 用 ?3P 标记 的 cDNA 探 针 ， 而 尼龙 微 阵列 可 用 ?2 P 或 3P 标记 的 cDNA 探 针 。 然 而 ， 唯 有 用 获 光 染料 标记 才能 进行 颜色 的 检测 。

23.3 BGI HEE Z

在 微 阵 列 上 显现 基因 的 表达 ， 最 直观 明显 的 优点 是 ， 能 够 在 单个 杂交 实验 中 分 析 大 量 的 基因 。 就 是 说 所 有 的 基因 都 在 微 阵列 上 。 也 就 是 说 ， 快 速 分 析 成 千 个 基因 的 结果 ， 使 得 微 阵 列 的 数据 正 被 用 作 确 定 特定 的 与 各 种 疾病 发 生发 展 相 关 的 基因 。 精 心 设计 的 微 阵 列 实验 能 提 供 有 关 基 因 家 族 的 行为 问题 ， 或 可 能 阐明 有 关 诸 如 发 病 途 径 的 基因 种 类 问题 。 微 阵列 提供 了 一 个 大 批量 比较 不 同 种 类 基因 的 手段 〈 图 23. 1 ) 。

其 他 更 为 传统 的 分 子 生物 学 方法 也 能 同时 提供 分 析 所 有 上 调和 下 调 序 列 的 机 会 〈 表 23. 1) 。 然 而 ， 微 阵列 显著 的 优点 是 能 处 理 数 量 庞大 的 数据 ， 数 据 处 理 和 存档 具有 高 速度 和 高 效率 以 及 具有 直接 鉴定 表达 有 波动 基因 的 功能 。 和 差异 显示 不 同 ， 用 于 微 阵列 分 析 的 差异 表达 的 序列 不 需要 克隆 与 测序 。 因 为 微 阵 列 上 的 序列 已 经 检定 ， 每 一 点 都 精确 地 对 应 于 已 知 的 序列 。

¢ 327 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

吕 分 离 RNA RNA 样 品 2 评估 纯度 与 完整 性

Ca | | | | cos =) D>

防止 降解 cDNA 标记 挫 入 荧光 染料

杂交 到 微 阵列

@OOO800O eoele! Jolexole) | 杂交 微 阵列 上 一 种 序列 可 以 杂交 一 图 像 分 析 软 件 种 或 两 种 探 针 ， 或 都 不 杂交 结果 分 析 Cy5 探 针 = 红 色

Cy3 探 针 = 绿 色 两 种 探 针 = 黄 色 无 探 针 = 无 色

图 23. 1 微 阵列 分 析 的 主要 步 又。 互补 DNA (cDNA) WAR. RIC AUER LA. 结合 荧光 检测 或 放射 自 显影 图 像 分 析 ， 提 供 大 量 有 关 所 研究 样品 中 基因 表达 的 信息 “|

表 23.1 微 阵 列 、 实 时 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 和 差 减 杂交 法 的 比较

发 现 新 基因 能 ,是 差 减 杂 交 法 的 一 个 目标

并 排比 较 2 个 细胞 群 不 容易 是

因 序列

检测 选项 ”放射 自 显影 或 荧光 检测 荧光 检测 放射 自 显影 或 化 学 发 光 检测 定性 有 限 的 有 限 的 有 限 的

需要 昂贵 的 芯片 或 滤 膜 微 | 需要 实时 PCR WL tie

设备 aN PRES SH 阵列 ,需要 分 析 软件 探 针 或 SYBR 绿 ,需要 分 析 软 件 | ， 不 需 专门 的 设备

© 任意 单位 。

@ cRNA， 即 互补 RNA。

如 何 比较 微 阵列 和 cDNA 文库 呢 ? 微 阵列 为 发 生 任何 类 型 生理 或 生化 变化 的 细胞 或 组 织 提 供 有 关 基 因 的 简单 印象 。 它 更 像 汇 拢 一 种 生物 的 EDNA。 如 前 所 述 ， 微 阵列 的 序列 与 可 能 的 生 理学 意义 的 关系 大 多 已 得 到 确定 。 然 而 注意 到 这 一 点 是 重要 的 ，cDNA 文库 极 可 能 含有 微 阵 列

上 没有 的 序列 。 那 些 序列 可 能 正好 代表 着 未 知 基 因 或 是 已 有 描述 而 功能 未 知 的 基因 。 328 。

第 23 章 ” 基 因 表 达 的 高 通 量 分 析

微 阵 列 技术 和 分 子 生 物 学 家 使 用 的 大 多 数 其 他 当代 技术 是 互补 和 兼容 的 。 这 些 技术 包括 实时 PCR, RNA Fit (RNAi) 和 转基因 研究 。 微 阵列 技术 并 不 取代 其 他 和 久 享 盛誉 的 分 子 生物 学 方法 ， 而 是 完善 了 科学 研究 的 手段 。

23.4 微 降 列 不 能 做 什么

微 阵列 肯定 是 方便 的 高 通 量 分 析 手 段 ， 而 不 是 为 了 分 析 一 个 或 者 不 多 的 几 个 基因 的 手 段 ， 阵 列 技术 更 是 全 球 通行 的 方法 。 重 要 的 是 认识 该 方法 和 所 有 其 他 方法 一 样 ， 有 其 固有 的 局 限 性 。 首 先 ， 微 阵列 只 能 分 析 实 际 上 已 经 印 制 在 微 阵列 上 的 基因 的 序列 。 同 样 ， 微 阵列 并 不 是 发 现 新 基因 的 工具 。 微 阵列 分 析 与 差 减 杂 交 的 差别 ， 在 于 后 者 使 得 基因 呈 差 异 表达 ， 而 且 不 受 预先 设 定 的 可 分 析 基 因 的 限制 。

微 阵 列 最 多 只 能 半 定 量 。 如 果 微 阵列 的 数据 表明 基因 表达 有 差异 ， 则 随后 在 研究 所 需 的 条 件 下 ， 对 这 些 基因 的 行为 通过 实时 PCR 作 新 的 全 面 的 定量 分 析 。 微 阵列 局 限于 它 所 能 提 供 的 定性 信息 。 在 微 阵 列表 面 只 有 cDNA HERE EN ERR. ERAT AR 记 的 探 针 分 子 。 因 此 ， 来 自 微 阵列 基因 序列 的 正信 号 表明 有 一 个 特定 基因 位 点 的 转录 ， 虽 然 微 阵列 可 能 还 不 能 识别 可 变 剪接 或 多 起 点 转录 。 全 长 转录 产物 的 大 小 只 能 通过 RNA 印迹 分 析 来 阐明 。 不 同 起 点 的 转录 可 通过 核酸 酶 保护 或 互补 DNA 5 端 快速 扩 增 〈5 RACE) 检测 。 但 是 不 能 保证 微 阵 列 分 析 能 用 于 这 种 检测 。 此 外 ， 由 于 微 阵 列 的 费用 非常 高 ， 也 许 平 行 分 析 不 可 行 ， 可 能 在 许多 情况 下 样品 只 能 分 析 1 次 。

具 讽 刺 意 味 的 是 ， 偶 尔 数 据 分 析 的 含糊 不 清 是 源 于 微 阵列 突然 得 出 如 此 多 的 数据 。 同 样 ， 直 接 平行 地 比较 也 并 不 总 是 清楚 肯定 的 。 大 多 数 用 户 认 同 微 阵 列 的 数据 并 非 完美 无 瑕 。 妇 外 ， 微 阵列 自身 不 能 排除 遇 到 污染 物 或 者 实验 室 技术 不 良 引 起 的 干扰 。 数 据 重 复 性 不 好 的 问题 也 可 能 源 于 支原体 复合 污染 。 这 也 是 细胞 生物 学 家 多 年 以 来 需 面 对 的 难题 ， 如 果 从 被 污 染 的 细胞 培养 物 中 分 离 RNA， 其 结果 将 改变 微 阵 列 数 据 〈Miller 等 ，2003) 。

有 限量 的 RNA 起 始 材 料 排 除了 样品 实际 使 用 微 阵列 分 析 的 可 能 性 。 的 确 ,， 尤其 是 用 激 光 捕 所、 细胞 分 选 或 在 显微镜 下 分 离 组 织 得 到 的 少数 细胞 更 是 如 此 。 在 这 些 情况 下 ， 在 尝试 合成 探 针 之 前 ， 常 用 的 一 个 方法 是 将 RNA 线性 扩 增 8。 有 一 种 途径 ， 用 含 T7 或 SP6 启动 子 的 下 游 引 物 使 RNA 转化 成 EDNA。 这 将 使 得 CDNA 可 以 在 体外 进行 转录 ， 从 而 产生 更 多 的 能 转化 成 cDNA 的 RNA。 这 种 途径 可 有 效 地 标记 而 不 至 于 扭曲 样品 中 各 种 转录 产物 的 天 然 丰 度 关系 。

23.5 微 阵 列 分 析 的 主要 步 强 下 面 叙 述 典型 微 阵 列 分 析 〈 见 图 23. 2) 的 基本 实施 步骤 。 图 23. 2 展示 一 典型 实例 。 记 住 ， 探 针 标记 方法 、 检 测 方法 、 对 照 RNA 以 及 其 他 参数 会 因 各 家 实验 室 的 选择 而 有 改变 。 D 获得 DNA 分 析 的 微 阵 列 。 如 前 所 述 ， 可 从 很 多 供应 商 那 里 得 到 可 直接 使 用 的 微 阵

@ PCR 是 导致 模板 序列 指数 扩 增 的 过 程 ， 因 此 会 扭曲 高 度 复杂 的 研究 样品 的 真实 差别 。 相 反 ， 体 外 转录 时 ，mRNA 先 转化 成 cDNA 后 ， 体 外 再 次 转录 ， 则 能 达到 RNA 线性 扩 增 。 于 是 ， 为 保留 转录 组 分 的 真实 丰 度 的 差别 ， 即 使 需要 经 过 2 轮 或 多 轮转 录 来 产生 适当 质量 的 标记 用 RNA， 也 是 值得 的 。

。 329 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

谷 胱 甘 肽 -M ”肿瘤 坏死 因子 受 体 -1 SRL 肿瘤 坏死 因子 受 体 -1 (b) " Leak 了 =.= = * 7¥ mS > - = yas ‘’ - —— ou

# mn <* ww 2 or a ye orn 二 [aas y - & &,. N- 钙 黏着 蛋白 IGFBP 4 角 蛋 白 14 波形 蛋白 和 N- 钙 黏着 蛋白 IGFBP4 角 蛋 白 14 ”波形 蛋白

图 23.2 ”小 鼠 间 皮 瘤 细 胞 系 差异 表达 。 两 片 滤 膜 表示 正常 细胞 Ca) 和 肿瘤 细胞 Cb). fe 互补 DNACcDNA) 探 针 是 由 正常 和 肿瘤 信使 RNAC(mRNA) 在 ?P 存 在 下 合成 的 。 杂交 后 严格 洗涤 ， 经 过 磷 屏 曝光 成 像 ， 数 字 影 像 分 析 。 滤 膜 上 的 靶 基因 印迹 成 对 ，

cDNA 丰 度 与 信号 强度 直接 相关 。 差 异 基因 表达 随后 用 RNA 印迹 验证 。 承蒙 布朗 大 学 病理 与 实验 医学 系 A. Kane 博士 提供 此 图

列 ， 以 及 可 直接 用 于 印 制 的 预 处 理 载 片 。 当 然 ， 研 究 者 可 能 受 限 于 所 研究 的 生物 材料 ， 尚 无 商品 化 的 微 阵 列 ， 所 以 ， 须 在 实验 室 自己 打印 。

© 分 离 高 质量 的 RNA。 分 离 高 质量 RNA 的 方法 与 评估 已 在 第 5 一 8 章 叙 述 。 一 般 而 言 ， 作 为 微 阵列 分 析 用 的 RNA， 其 Azxto/Azso 应 大 于 1.8.

@ cDNA 的 合成 。 通 常 ， 由 于 RNA 固有 的 化 学 不 稳定 性 ， 如 同 用 于 其 他 类 型 实验 ， 样 品 中 的 mRNA 〈( 即 “未 知 样品 ") 须 转化 成 EDNA。 然 而 ， 已 被 反复 证 明 ， 使 用 携带 荧光 标 记 核 并 酸 Cn dCTP) 时 ，RNA 反 转 录 效 率 很 差 ， 并 且 倾向 于 Cy3 的 挫 人 。 间 接 荧 光标 记 方法 的 发 展 解决 了 这 个 问题 。 这 个 方法 采用 dUTP 的 衍生 物 5-(3- 氨 丙烯 基 )-2'- 脱 氧 尿 苷 -5 - 三 磷酸 。 即 人 们 通常 所 知 的 所 丙烯 基 标记 法 。 支 持 cDNA 合成 的 核 苷 酸 混合 物 含 dATP, dCTP, dGTP 和 氨 两 烯 基 -dUTP。 比 较 而 言 ， 这 种 高 反应 性 核 苷 酸 通 过 反 转 录 酶 的 挫 人 ， 已 表明 是 十 分 有 效 的 〈Hughes 等 ，2001)。 样 品 反 转 录 以 后 ， 荧 光 染 料 在 随后 的 反应 中 与 纯化 的 cDNA 连接 。 标 记 效 率 和 标记 挫 人 程度 常 通过 散射 作 图 法 评定 ， 散射 图 越 密集 ， 则 用 于 微 阵 列 分 析 的 探 针 越 是 刚 标记 的 。

由 获 光 染料 的 连接 。 在 氨 丙 烯 基 标 记 反 应 后 ， 挫 人 到 新 合成 cDNA 中 的 氮 丙 烯 基 暴 露 et iccteen. mun 4y BU AE ti AS AA as Be KF RR 上 。 这 就 是 已 知 的 偶 联 反应 ， 它 使 染料 直接 与 CDNA 连接 。

© Cy 标记 探 针 的 纯化 。 这 个 非常 重要 的 步骤 旨 在 从 新 标记 的 探 针 介质 中 清除 未 反应 的 染料 。 如 果 此 步骤 中 染料 清除 得 不 彻底 ， 微 阵列 分 析 的 背景 将 非常 高 。 这 就 是 为 什么 有 时 看 起 来 微 阵列 分 析 数 据 的 重复 性 和 cDNA 质量 及 标记 效率 并 不 总 是 一 致 的 一 个 原因 。 首 先 ， 高 质量 的 CDNA 来 自 高 质量 的 RNA。 其 次 ， 清 洗 探 针 ， 即 除去 未 摊 入 的 标记 物 和 反应 中 的 其 他 化 学 物质 ， 必 须 非常 小 心 。

© 微 阵列 杂交 。cDNA 探 针 直接 暴露 在 阵列 上 。 维 持 最 小 体积 的 杂交 缓冲 液体 积 有 利于 提高 探 针 的 有 效 浓度 和 有 利于 杂交 动力 学 。 杂 交 反 应 的 实施 是 在 规定 的 严格 的 条 件 下 进行 的 。

G@ 从 微 阵列 或 滤 膜 收 集 数据 。 使 用 荧光 探 针 的 情况 下 ， 可 以 扫描 杂交 的 微 阵 列 来 显现

。330 -

第 23 章 基因 表达 的 高 通 量 分 析

影像 。 此 后 ， 用 微 阵 列 专 门 的 影像 分 析 软 件 系 统 “ 管 理 ” 图 像 。 震 用 放射 性 同位 素 探 针 ， 和 党 规 用 胶片 捕捉 影像 。 确定 数据 与 生物 学 意义 的 关联 性 。 这 取决 于 用 户 。

23.6 和 参 比 RNA

通用 参 比 RNA (universal reference RNA，URR) 普遍 用 于 微 阵 列 试验 。 使 用 通用 参 KE RNA 是 很 平常 的 ， 特 别 是 在 对 照 组 RNA 不 是 立刻 显而易见 的 或 者 不 是 容易 得 到 时 ， 如 在 疾病 进行 期 研究 中 那样 。 通 用 参 比 RNA 是 质量 非常 高 的 RNA。 它 是 合并 不 同 来 源 的 ， 代表 了 : @ 不 同 组 织 ， 有 些 是 难以 得 到 的 ; @ 不 同 丰 度 的 RNA 种 类 。 这 些 或 其 他 市 售 的 参 比 RNA 必须 通过 严格 的 质量 控制 (QC) 实验 。 通 常 要 保证 Arco /A2 KF 1.8， 要 证 明 是 不 含 基因 组 DNA 的 制剂 ， 要 经 电泳 证 明 28S rRNA : 18S rRNA 的 荧光 比值 至 少 达 到 2 : 1。 严 谨 度 水 平 上 的 质量 控制 对 于 最 适 化 分 析 是 绝对 需要 的 。 而 且 可 能 对 分 析 的 标准 化 是 更 重要 的 。 通 用 参 比 RNA 的 功能 性 描述 是 大 家 知道 的 基因 的 覆盖 度 ， 即 与 其 杂交 的 微 阵 列 序 列 数 。 基 因 覆 盖 度 对 于 在 基因 间 进 行 比较 研究 的 目的 是 重要 的 。 典 型 的 覆盖 范围 在 86%~99%,

进行 微 阵 列 实验 有 如 下 2 种 方式 。

@ 成 对 的 设计 。 样 品 1 和 样品 2 标记 后 与 同一 微 阵 列 杂 交 。 例 如 用 Cy3 〈 绿 色 ) 标记 样品 1， 用 Cy5 (红色 ) 标记 样品 2， 然 后 两 者 与 同一 微 阵列 杂交 。 如 果 有 4 个 样品 ， 研 究 者 必须 进行 总 计 6 次 的 和 杂交， 包括 所 有 的 组 合 。

样品 1 十 样品 2 样品 2 十 样品 3 样品 1 十 样品 3 样品 2 十 样品 4 样品 1 十 样品 4 样品 3 十 样品 4

进行 样品 1/ 样品 2 的 比值 分 析 。 当 然 ， 对 所 有 6 个 微 阵列 做 同样 的 分 析 处 理 。

@ 通用 参 比 RNA 的 设计 。 这 种 途径 减少 了 所 需 杂 交 的 数量 ， 因 为 每 一 个 标记 样品 〈 用 Cy3 标记 )〈 在 这 里 是 样品 1 一 样品 4) 分 别 与 通用 参 比 RNA“〈 用 Cy5 tric) 一 起 与 微 阵 列 杂交 。 这 种 方式 只 需要 4 次 杂交 。 比 值 分 析 为 样品 1/ URR, 样品 2/ URR, 样品 3/ URR, 样品 4/ URR。 通 用 参 比 RNA 设计 的 优点 主要 是 单个 样品 可 以 直接 比较 。 因 为 每 个 样品 都 有 对 应 的 单个 共同 对 照 ， 但 是 用 户 常 常 必 须 与 实验 室 里 其 他 实验 作 交 叉 对 比 9。 在 能 得 到 通 用 参 比 RNA 之 前 ， 各 实验 室 有 其 专用 的 方案 ， 研 究 者 常常 不 能 直接 比较 微 阵 列 的 分 析 数 据 。 由 于 通用 参 比 RNA 是 按 工业 规模 制造 的 ， 量 非常 大 的 小 包装 同属 一 批 ， 可 供 长 期 研究 之 需 ， 而 且 同 时 适 于 地 理 上 相距 甚 远 的 合作 实验 室 使 用 。

23.7 B 用

微 阵列 技术 商品 化 的 发 展 来 自生 物化 学 和 半导体 工业 的 联姻 。 因 为 该 工业 对 科学 界 所 固 有 的 价值 ， 卖 主 的 数量 从 一 个 〈Affymetrix) 增加 到 包括 Agilent. Amersham 在 内 的 若干

@ 在 比较 密切 相关 的 若干 套数 据 时 ， 这 里 极力 推荐 使 用 同一 批 微 阵列 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

个 ， 以 至 难以 计数 。 简 而 言 之 ， 任何 研究 基因 表达 的 人 都 可 以 利用 微 阵列 技 全 的 名 十， 因为 它 提 供 基 因 表 达 的 全 貌 ， 至 少 是 印迹 在 滤 膜 或 芯片 上 的 序列 的 缩影 。 不 幸 的 是 ,芯片 的 复制 是 非常 昂贵 的 ， 并 且 数 据点 的 缺失 常常 使 得 统计 成 了 问题 。 与 微 阵列 相关 的 检测 也 有 其 上 限 和 下 限 。 目 前 实时 PCR 是 唯一 的 方法 ， 它 可 以 非常 准确 地 量化 微 阵列 数据 给 出 的 大 范围 动 态 过 程 中 的 基因 表达 变化 。 实 时 PCR 也 是 目前 唯一 能 验证 微 阵列 数据 的 方法 。 实时 PCR 能 准确 地 揭示 由 微 阵 列 找到 的 变化 基因 的 调节 幅度 ， 即 基 因 在 多 大 程度 上 受到 调节 。 因 此 ， 这 两 种 方法 互补 性 很 强 。

显然 ， 对 疾病 过 程 、 发 育 现象 、 功 能 性 基因 组 学 的 所 有 领域 及 细胞 对 药物 应 答 进 行 基础 研究 或 发 展 研究 的 实验 室 ， 都 会 对 微 阵列 技术 有 极 大 的 兴趣 。 一 二 种 微 阵列 可 能 很 快 将 投入 临床 使 用 。

重要 的 是 要 记 住 ，RNA 往往 不 能 提供 〈 翻 译 、 表 达 的 ) Sh. SARABRAARE, 以 及 经 翻译 后 修饰 ， 功 能 蛋白 质 的 生产 。 同 样 ， 蛋 白质 芯片 的 开发 被 用 来 发 现 细胞 生产 什么 蛋白 质 ， 以 及 这 些 蛋 白质 在 做 什么 。 抗 体 (Ab) 微 阵列 构成 类 似 的 方法 ， 它 用 于 数 以 百 计 的 蛋白 质 的 同时 表达 分 析 。 这 就 是 人 们 所 知道 的 表达 谱 。 与 DNA 微 阵 列 类 似 ， 抗 体 微 阵列 产生 的 数据 与 样品 中 特殊 蛋白 质 的 相对 水 平 有 关 ， 而 不 仅仅 只 是 回答 其 有 或 无 。 这 些 抗体 微 阵列 由 双 份 印迹 在 微 阵列 上 的 各 种 单 克隆 抗体 组 成 。 选 用 的 抗体 应 能 代表 一 个 特定 的 项 目 ， 例如 肿瘤 。 并 且 这 些 抗 体 通常 应 能 用 来 表示 许多 在 整个 细胞 内 不 同 定位 的 蛋 自 质 。 目前 报道 的 方法 灵敏 度 常 常 达到 10pg/ml 水 平 。

2 8 -区

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(AB RAKE; 陆 长 德 校 ) 。 332 -

246 RNA 干 机 一 一 目标 蛙 因 的 沉 昧

24.1 基本 原理

在 20 世纪 80 年 代 中 期 ， 一 系列 关于 体外 DNA 合成 新 方法 的 文章 相继 发 表 (Saiki 等 ， 1985; Mullis 等 , 1986; Mullis 和 Faloona，1987) 。 哩 然 这 种 现在 被 称 为 聚合 酶 链 反 应 〈pol- ymerase chain reaction, PCR) 方法 的 本 质 并 非 新 创 ， 即 一 贯 广 为 用 作 作 图 和 探 针 标记 的 引 物 延 伸 反 应 ， 但 PCR 的 新 型 引物 延伸 技术 给 羽翼 渐 成 的 生物 工程 学 带 来 了 产业 革新 。PCR 技术 改变 了 一 切 ， 对 生命 科学 研究 以 及 其 他 更 为 广阔 的 领域 的 各 个 方面 起 到 了 正面 推动 作 有 用。 法医学、 基础 研究 和 应 用 研究 、 传 染病 的 诊断 以 及 亲子 鉴定 能 达到 今天 精确 、 灵 敏 、 完 善 的 水 平 ， 都 应 归功 于 PCR 技术 。 现 在 ， 另 一 项 非凡 的 技术 诞生 了 。 它 就 是 利用 双 链 RNA (dsRNA) 抑制 特定 内 源 基 因 表 达 的 RNA 干扰 8 (RNA interference, RNAi) 技术 。RNAi FRA Be) EZR (Caenorhabditis elegans) (Fire 等 ，1998) 系统 中 获得 成 功 ， 随 后 又 发 展 到 人 和 其 他 哺乳 动物 细胞 系统 (Hammond 等 ，2000; Elbashir 等 ，2001a) 。 自 诞生 以 来 ， RNAi 在 方法 学 上 的 改进 已 显示 出 它 给 研究 带 来 了 和 PCR 一 样 深 远 的 影响 。RNAi 技术 又 常 Bi Pi VE EA ek BR 〈gene knockdown)， 其 他 相关 的 名 词 还 有 转录 后 基因 沉默 〈postrtranscrip- tional gene silencing) (植物 )、 共 阻 遇 (cosuppression) 〈 旧 有 名 词 ， 植 物 ) 和 压抑 〈quel- ling) (BRA).

AKEES +P KRW RNAi 时 ， 这 个 自然 现象 曾 一 度 被 引 为 怪谈 (Napoli ¥, 1990; van der Krol 等 ，1990) 。 现 在 已 知 在 许多 物种 中 都 存在 RNAi 机 制 ， 是 生物 体 用 以 抵抗 病毒 和 转 座 子 以 及 可 能 损坏 宿主 基因 组 引起 灾害 的 外 来 人 侵 分 子 的 一 种 手段 。 值 得 注意 的 是 ， “dsRNA 一 旦 进入 细胞 就 立即 被 破坏 ”， 这 种 用 来 保护 真 核 细 胞 基因 组 完整 性 的 方法 在 进化 上 是 高 度 保 守 的 。RNAIi 在 自然 条 件 下 参与 的 过 程 ， 包 括 野生 型 mRNA 及 突变 型 mRNA 的 降解 作用 ， 生 物体 发 育 过 程 中 的 翻译 调控 ， 当 然 还 包括 其 他 在 细胞 中 未 被 揭示 的 调控 机 制 。 目前 有 证 据 暗 示 RNAi 可 能 与 DNA 甲 基 化 有 关 (Wessenegger 等 ，1994; Llave 等 ，2000 Merrett 等 ，2000; Pélissier 和 Wessenegger, 2000).

利用 RNAi 对 细胞 或 生物 体内 基因 表达 的 影响 进行 研究 ， 通 常 被 称 作 反 向 遗传 学 〈re- verse genetics) 。 它 的 目标 是 确认 某 一 和 蛋白质 在 细胞 内 不 表达 时 所 造成 的 后 果 。 这 对 发 育 生 物 学 、 传 染病 的 治疗 以 及 其 他 由 于 蛋白 质 不 当 表 达 所 引起 的 疾病 治疗 中 都 有 意义 深远 的 作

@ RNA 干 扰 是 经 专利 注册 的 操作 。 该 操作 的 商业 应 用 需 获 得 华盛顿 卡耐基 研究 所 的 许可 。 联 系 方式 为 : 管理 与 财 务 主 管 ，Carnegie Institution of Washington, 1530 P Street，N. W. , Washington, DC 20005, 电话 为 202-939-1118。

° 333 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

FA. RNAi 的 主要 优势 在 于 可 以 长 时 间 地 一 次 就 一 个 基因 进行 研究 。

RNAi 现在 已 成 为 基础 研究 和 应 用 研究 的 主流 技术 ， 并 给 功能 基因 组 学 研究 带 来 了 音 命 。 作 为 真 核 细 胞 所 特有 的 现象 ，RNAi 现在 已 成 为 研究 动物 、 植 物 和 真菌 的 基因 表达 调控 的 优先 手段 。 由 于 RNAi 技术 在 培养 细胞 和 体内 模型 中 均 有 效 ， 其 研究 应 用 范围 极 太 ”因此 越 来 越 受到 欢迎 。 与 培育 基因 散 除 动物 相 比 ,RNAi 技术 是 研究 目标 基因 功能 更 为 快捷 经 济 的 方法 。 并 且 ，RNAIi 在 沉默 目标 基因 方面 表现 出 的 精确 性 ， 也 使 之 成 为 研究 开发 救生 药物 的 极 好 的 研究 平台 。 芯 片 技术 能 帮助 把 上 调 或 下 调 的 基因 和 某 种 机 能 失调 联系 起 来 ，RNAi 则 阐述 了 其 中 的 因果 关系 。RNAi 技术 是 如 此 的 意义 重大 ， 以 至 于 2002 年 被 享有 声誉 的 期 刊 Science® 评 为 “年 度 科技 突 破 ”。 不 出 所 料 的 是 ， 后 来 针对 此 项 技术 的 市 场 需 求 突 增 ， 多 家 专门 提供 相应 支持 服务 和 预制 高 效 短 干 扰 RNA (short interfering RNA, siRNA) 324 tf 酸 之 类 试剂 的 公司 成 立 了 。

24.2 € 26 RNAi 4

antisense RNA: JX RNA, 43 mRNA 序列 互补 和 可 与 之 碱 基 配 对 的 单 链 RNA Ot 总 的 来 说 ， 反 义 RNA 的 稳定 性 比 dsRNA 差 。

argonaute: 一 个 高 度 保守 的 蛋白 质 家 族 。 它 通过 和 Dicer 以 及 “RNA 诱导 沉默 复合 物 ” (RNA-induced silencing complex, RISC) 相互 结合 参与 RNAi 过 程 。 有 报道 指出 ， 不 同 ar- gonaute 蛋白 质 组 合 可 能 通过 不 同 的 途径 对 RNAi 起 促进 作用 。 并 且 argonaute 在 细胞 中 也 可 能 有 其 他 作用 〈Carmell 4, 2002).

Dicer: 三 型 双 链 特异 核酸 酶 。 负 责 将 内 源 或 外 源 长 链 dsRNA 切割 成 21~23bp 的 片段 CSiRNA)。 这 些 siRNA 片段 随后 和 RISC 结合 ， 如 果 设 计 合 理 ， 并 和 目标 mRNA “〈 待 沉默 mRNA) 的 互补 序列 杂交 。 天 然 和 重组 Dicer 都 有 商业 制品 。Dicer 可 以 把 长 双 链 RNA (dsRNA) 和 短发 夹 RNA (shRNA) fil TM siRNA。 它 也 可 以 把 某 些 shRNA WT mh miRNA,

dsRNA (double-stranded RNA): 双 链 RNA。 包 含有 碱 基 配 对 的 正义 RNA ARM RNA 的 核酸 ， 会 被 Dicer WHIM siRNA,

ddRNAi (DNA-directed RNA interference); DNA 指导 的 RNA 干扰 。 利 用 RNA 聚合 酶 隆 户 动 子 在 哺乳 动物 细胞 中 产生 SIRNA 的 方法 。 这 种 方法 产生 的 SIRNA 在 结构 和 功能 上 与 体外 合成 的 siRNA 一 致 。

dsRNAi (double-stranded RNA interference); 双 链 RNA 干扰 利用 dsRNA 通过 RNAi 途径 进行 的 基因 沉默 。

miRNA (microRNA): ft RNA。 单 链 约 21nt 长 的 RNA， 通 过 错 配 而 非 降解 mRNA 《虽然 后 者 也 有 可 能 ) 的 方式 阻碍 特定 的 mRNA 翻译 (translational repression, MiPEREIE). miRNA 在 发 育 和 细胞 分 化 进程 中 对 基因 表达 进行 重要 的 短暂 调控 。miRNA 是 由 Dicer 对 长 度 为 70 一 90nt 的 〈 发 夹 ) 前 体 加 工 而 来 。

PTGS (post-transcriptional gene silencing) : 转录 后 基因 沉默 。 用 来 描述 基因 表达 抑制 的 一 个 术语 ， 尤 其 用 于 描述 植物 中 细胞 已 表达 某 一 转录 本 后 由 于 多 种 因素 导致 的 该 基因 表达

$24 RNA 干扰 一 一 目标 基因 的 沉默

抑制 。 目 前 文献 中 出 现 的 PIGS 对 许多 研究 者 而 言 已 经 成 为 RNAi 的 同义词 。

RISC (RNA-induced silencing complex): RNA 诱导 沉默 复合 物 。 一 个 含有 某 些 argo- naute 蛋白 质 的 多 种 蛋白 质 所 构成 的 复合 物 ， 负 责 与 Dicer 催化 产生 的 siRNA 片段 结合 。 siRNA 双 链 中 的 一 个 链 随后 被 用 来 和 靶 RNA (mRNA, J RNAS) 进行 碱 基 配 对 ， 以 此 作为 降解 的 标志 。

RNAi (RNA interference) : RNA 于 扰 。 一 种 自然 产生 的 由 SiRNA 介 导 的 基因 沉默 机 fil. KA EMA, RNAi 就 是 由 dsRNA 所 诱导 的 PTGS.

shRNA (short hairpin RNA) : 短发 夹 RNA。 拥 有 正义 结构 域 (domains) 和 反 义 结 构 域 ， 便 于 形成 分 子 内 碱 基 配对 的 单 链 RNA 分 子 。 配 对 后 所 形成 的 双 链 分 子 类 似 于 典型 tRNA 的 一 个 臂 ， 有 一 个 8 碱 基 的 单 链 环 与 正义 序列 和 反 义 序 列 所 构成 的 荃 相 连 。shRNA 是 Dicer 的 底 物 ， 会 被 Dicer WEAK.

siRNA (short interfering RNA): 短 干 扰 RNA。 短 片段 的 长 度 为 21 一 23bp 的 双 链 RNA 分 子 ，3 端 有 2 个 核 苷 酸 〈 单 链 ) 突出 。

U6: 人 源 的 RNA 聚合 酶 焉 启动 子 。 该 启动 子 常 被 装配 在 转录 载体 内 用 于 已 知 shRNA 的 体内 合成 。

24.3 RNAI 是 如 何 工 作 的

RNAi 是 一 种 由 dsRNA 诱发 的 内 源 性 催化 途径 。 在 细胞 被 dsRNA 病毒 感染 ， 或 是 人 为 导 和 人 了 诱导 同 源 转录 本 降解 的 dsRNA 时 ， 这 种 途径 可 在 细胞 内 自发 产生 。RNAi 所 产生 的 净 结 果 ， 就 是 由 破坏 mRNA 所 导致 的 特定 基因 的 降解 。

在 近 5 末端 或 是 mRNA 的 全 长 序列 内 形成 双 链 结构 可 以 抑制 翻译 的 发 生 。 这 一 观点 并 非 新 知 。 早 在 20 世纪 70 年 代 晚 期 ， 小 片段 反 义 DNA 就 被 用 来 抑制 基因 的 表达 〈Zamecnik 和 iStephensen，1978) 。 在 体外 的 哺乳 动物 系统 中 ， 反 义 RNA 也 显示 了 调控 基因 表达 的 能 力 (Nishikura 和 Murray, 1987); 在 噬菌体 、 细 菌 和 植物 中 (Green 等 ，1986) 以 及 动物 中 (Knecht 和 Loomis, 1987) 也 有 同样 的 调控 作用 发 生 。 以 前 曾 一 度 有 过 将 反 义 RNA 用 作 治 疗 药 物 的 构想 ， 但 是 由 于 反 义 RNA 在 低 浓 度 时 无 法 发 挥 作 用 ， 而 高 浓度 的 反 义 RNA 又 可 能 具有 细胞 毒性 而 中 断 。 在 体外 使 用 反 义 RNA 抑制 基因 表达 若干 年 以 后 ， 正 义 RNA 被 证 明 具 有 同样 良好 的 特异 基因 表达 抑制 作用 (Guo 和 Kemphues，1995)。 但 是 ， 随 后 有 证 据 表 明 (Fire 等 ，1998) ， 双 链 RNA 的 效率 要 高 于 单独 使 用 正义 RNA 或 是 反 义 RNA. 由 正义 RNA 所 引起 的 基因 沉默 是 因为 与 其 中 污染 的 反 义 人 RNA 形成 了 少量 的 双 链 RNA。 现 在 人 们 知道 双 链 RNA 具有 极 强 的 下 调 互补 基因 的 能 力 。

诱导 dsRNA 的 途径 有 好 几 种 ， 每 种 又 有 几 种 排列 。RNAi 基本 是 两 步 反 应 历程 〈 图 24.1), RNAi 第 一 步 所 涉及 的 主导 催化 酶 ， 是 被 称 作 Dicer 的 三 型 双 链 特 异 核酸 酶 。 这 个 广 泛 存 在 于 真 核 蛋 白质 组 内 的 核酸 酶 ， 参 与 将 长 链 dsRNA 消化 成 长 度 为 21 一 23bp、 两 条 链 的 3 侧 各 有 两 个 核酸 突出 为 特征 的 siRNA (Zamore 等 ,2000) 。 此 外 ，sSiRNA 带 5 -磷酸 与 3-- OH 末端 。Dicer 由 氨基 端 螺旋 结构 域 、 两 个 一 前 一 后 的 RNase 下 结构 域 和 PAZ 结构 域 (来 自 PIWI 蛋白 、argonaute 蛋白 和 zwille 蛋白 的 名 字 ) 组 成 。 它 特异 识别 3 悬垂 和 双 链 RNA 结合 结构 域 (dsRNA-binding domain) 的 羧基 末端 。 长 双 链 RNA 可 以 被 导入 细胞 ， BA Dicer 的 底 物 。 另 外 ， 重 组 Dicer 可 用 于 体外 产生 siRNA， 然 后 这 些小 分 子 用 转 染 的 方

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

24.1 _ RNAi 过程 中 的 主要 步骤 。 各 种 来 源 和 各 种 结构 的 双 链 RNA 被 Dicer 剪 切 成 siRNA。 后 者 转 而 成 为 多 组 分 的 RNA 诱导 沉默 复合 物 (RISC) 的 一 部 分 。 BASS mRNA 的 破坏 并 伴随 着 造成 基因 表达 下 调

法 导入 细胞 。 第 二 步 ， 不 管 何 种 来 源 的 siRNA 成 为 多 组 分 含 核 酸 酶 的 RISC 驳 一 部 分 。 RISC 的 精确 组 成 和 作用 还 不 清楚 。 虽 然 已 知 RISC 组 成 中 含有 argonaute HA. ME argo- naute 蛋白 和 Dicer 中 发 现 的 高 度 保守 的 PAZ 结构 域 、 仅 存 于 argonaute 蛋白 中 的 PIWI 结 构 域 ， 但 它 的 功能 尚 不 清楚 。RISC 的 一 个 部 分 是 ATP 依赖 的 解 旋 酶 ， 它 使 双 链 的 siRNA 解 旋 。 任何 SIRNA 中 的 反 义 组 分 可 以 碱 基 配 对 于 mRNA， 并 使 之 沉默 。siRNA 的 反 义 组 分 与 对 应 的 mRNA 形成 双 链 ， 并 使 mRNA BRR. RISC 在 短暂 形成 的 双 链 区 中 央 剪 切 mRNA (Elbashir 等 ,2001b) 。 然 后 ，mRNA 进一步 降解 ， 阻 止 mRNA 与 细胞 翻译 机 器 间 的 任何 相 互 作用 。

RNAi 引发 基因 沉默 有 三 种 主要 方法 : OsiRNA; OshRNA; @ddRNAi。 每 种 方法 都 有 其 优点 和 缺点 〈 表 24. 1) 。 很 难 讲 哪 种 方法 优 于 其 他 方法 ， 因 为 RNAi 太 新 了 。 最 好 的 做 法 是 ， 在 同一 实验 中 使 用 多 种 方法 ， 然 后 决定 哪 一 种 方法 对 该 实验 最 合适 。 每 种 途径 都 可 以 有 多 种 改变 ， 虽 然 它 们 全 都 是 最 终 剪 切 靶 向 的 特异 MRNA.

表 24.1 RNAi 中 ，siRNA 5 shRNA 的 比较

昂贵 比 shRNA 容易 设计 体外 转录 或 体内 生产

经 济 比 siRNA 较 难 设计 主要 通过 表达 ,但 也 可 化 学 合成 或 体外 转录

毒性 是 一 问题 ,特别 在 哺乳 细胞 或 神经 元 中 毒性 通常 不 是 问题 抑制 效率 可 维持 5 一 7 天 可 以 用 来 获得 稳定 细胞 株 开始 到 结束 的 时 间 较 短 需要 高 纯度 聚焦 于 短期 作用 持续 基因 表达 抑制

开始 到 结束 要 更 多 的 时 间

聚焦 于 长 期 作用

24.3.1 siRNA 的 导入 途径

可 以 用 合适 的 转录 载体 (Brummelkamp 等 ，2002) 导入 细胞 制造 siRNA， 或 者 用 纯化 的 siRNA 转 染 细胞 导入 siRNA。 在 前 一 种 场合 ， 长 的 dsRNA 用 阳离子 脂 质 体 或 菠 脑 二 苹 了

第 24 RNA 干扰 一 一 目标 基因 的 沉默

包 庄 后 导入 细胞 (Gruber 等 ，2004) ， 或 者 用 先前 转 染 基因 的 〈 十 ) 链 和 【一 ) 链 在 体内 转 录 。 在 细胞 中 ， 当 长 的 完全 配对 的 dsRNA 为 Dicer 作用 ,产生 特征 性 的 21 ~ 23bp 的 siRNA; 这 种 长 度 的 siRNA 无 处 不 在 。 这 提示 除了 如 前 面 叙 述 的 之 外 ， 任 何 26nt 或 更 长 的 dsRNA 最 可 能 诱导 成 RNAi (Parrish 等 ，2000) 。

dsRNA 的 长 度 在 涉及 哺乳 动物 细胞 的 实验 中 极其 重要 ， 大 于 30bp 的 dsRNA 很 可 能 诱 导 一 种 干扰 素 应 答 ， 结 果 导 致 细胞 凋 亡 。 在 较 低 等 的 真 核 细胞 和 植物 中 证 明了 RNAIi 的 功效 之 后 ， 随 后 证 明了 借 着 将 体外 产生 的 siRNA 转 染 到 哺乳 动物 细胞 中 ， 而 不 是 把 长 链 dsRNA 导入 细胞 ， 可 以 绕 过 于 扰 素 应 答 (Elbashir 等 ，2001a; Elbashir 等 ，2001b) 。 已 经 证 明 导 入 体外 合成 的 短 至 19bp 的 siRNA 可 以 诱导 RNAi。

另 一 个 策略 是 体外 合成 500 一 750bp 的 dsRNA， 然 后 用 Dicer 预先 消化 ， 从 而 创建 一 个 21~23bp 的 siRNA FE (图 24.2)。 然 后 siRNA 库 可 以 转 染 细胞 诱导 RNAi。 为 了 提供 广泛 覆盖 整个 mRNA 而 需要 一 个 复杂 的 siRNA 库 时 ， 特 别 是 当 需 要 沉默 一 个 基因 的 精确 的 siR- NA 序列 还 不 清楚 时 ， 这 个 体外 方法 特别 有 用 。

T7 启 动 子 \ 需 沉 默 基因 两 片段

PCR 加 启动 子 | \T7 启 动 子 .

正义 (+)RNA 反 义 C)RNA

| mm mm Dicer

TI TI TI “TMM siRNA 库 TI

图 24.2 HM siRNA 库 的 体外 合成 。 通 过 PCR 加 上 T7 转录 启动 子 〈 见 第 19 章 ) 。 因 为 转录 物 模 板 的 两 端 均 有 T7 转录 启动 子 ， 故 PCR 产物 可 用 于 体外 转录 获得 正义 RNA 和 反 义 RNA。 几 小 时 退火 ，Dicer 处 理 得 siRNA FE. Mia siRNA 按 常规 可 以 与 RISC 作用

24.3.2 shRNA 的 导入 方法

shRNA (Paddison 等 ,2002; Yu 等 ,2002) 是 一 种 用 来 抑制 基因 表达 的 dsRNA 分 子 或 siRNA 的 替代 物 。shRNA 是 单 链 RNA， 它 借 着 反 向 重复 序列 的 特点 ， 在 分 子 内 碱 基 配 对 。 shRNA 一 般 在 体外 CP 24. 3) 或 者 通过 使 用 转录 载体 在 体内 〈 见 后 面 的 ddRNAi) 生成 。 一 且 形 成 ，shRNA 分 子 就 被 Dicer 加 工 ， 随 后 能 够 引起 基因 沉默 ， 与 使 用 siRNA 的 情况 非 AW. shRNA 分 子 是 特征 性 的 ， 它 的 组 成 是 : 在 沉默 mRNA 时 完全 相同 的 21 一 29 个 碱 基 组 成 的 正义 (+) 部 分 ， 一 个 8 碱 基 的 单 链 环 ， 一 个 与 正义 序列 精确 互补 的 反 义 序列 。 siRNA 也 是 特征 性 的 ， 它 在 3 端 有 一 个 UU 二 核 苷 酸 末 端 悬垂 〈 图 24.4) 。 像 SRNA 一 样 ， shRNA 可 通过 脂 质 体 而 导入 哺乳 动物 细胞 中 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

T7 启 动 子 序列 + ， .被 沉默 的 基因 序列 部 分

(708 FRR) | 退火 oo i aaa PCRIN LARD AOFESI, T7 启 动 子 扩 增 模板 、

转录 物 含 反 向 重复 序列 体外 转录 shRNA 自 发 形成 shRNA

wm) mm) ,mma “SO G

TOM. siRNA “Tu

图 24.3 体外 产生 shRNA 的 方法 。 用 PCR 构建 转录 模板 。 与 图 24. 2 不 同 ， 只 在 一 端 加 T7 启动 子 。 被 构建 的 模板 含 反 向 重复 序列 ， 它 们 由 正义 域 和 反 义 域 组 成 。 转 录 物 形成 的 结构 能 快速 形成 SHRNA 分 子 。 该 分 子 随 后 被 Dicer 剪 切 成 可 诱导 RNAi AY siRNA FE

a

5'-GGACAGAAGUUAAGACGAGCAUU-3’

a m4 3'-UUCCUGUCUUCAAUUCUGCUCGU-S’

oe’ G C 5'-GGACAGAAGUUAAGACGAGCA

e 3'-UUCCUGUCUUCAAUUCUGCUCGU G

G

A A

图 24.4 比较 siRNA fl shRNA 的 结构 。(a) siRNA 分 子 由 两 个 互补 的 RNA 分 子 组 成 ， 其 特征 为 二 核 苷 酸 悬 垂 于 每 条 链 的 3 端 。(b) shRNA 由 一 条 单 链 分 子 组 成 。 分 子 内 的 正义 域 和 反 义 域 使 其 快速 形成 发 夹 样 结构 。 折 县 的 分 子 有 一 个 8 碱 基 的 单 链 环 和 类 似 于 SIRNA 分 子 的 3'UU 悬垂 。 环 与 正义 域 和 反 义 域 相连 接 ， 并 被 随后 的 Dicer 解除 ，shRNA 成 为 了 siRNA。 注 意 两 种 分 子

可 以 沉默 同一 个 mRNA， 因 为 它们 相应 的 双 链 区 有 完全 相同 的 碱 基 序列

24.3.3 DNA 指导 的 RNAi 技术

诱导 RNA 介 导 的 基因 沉默 ， 还 有 另 一 种 方法 叫 作 ddRNAi。 与 外 源 dsRNA 转 染 对 比 ， 这 种 方法 是 用 来 生成 siRNA 的 体内 技术 。

重要 的 是 要 注意 到 ， 细 胞 内 生成 的 dsRNA 不 诱导 哺乳 动物 细胞 内 干扰 素 的 应 答 。 而 长 链 dsRNA 从 外 部 进入 细胞 时 会 诱导 干扰 素 应 答 。 在 ddRNAi 情况 中 ， 细 胞 内 的 Dicer 负责 siRNA 分 子 的 合成 ， 最 终 导致 基因 沉默 。 含 dd RNAi 的 转录 载体 可 以 用 任何 标准 的 转 桨 术 导 和 细胞。 这 种 方法 的 优点 是 节省 费用 ， 长 期 干扰 ， 并 且 能 够 通过 可 诱导 的 启动 子 随意 开 关 RNAi 的 历程 。 许 多 大 众 化 的 转录 载体 (如 Benitec; Brisbane, Australia) 都 含有 反 向 重

复 序列 ， 以 便 新 转录 的 RNA 形成 发 夹 结构 ， 它 可 作为 Dicer 的 底 物 被 加 工 成 siRNA (A 24.5),

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第 24 RNA 干扰 一 一 目标 基因 的 沉 鸭

ull) shRNA Dior ki 加 工 "TOMI. siRNA 诱导 RNAi ni

24.5 产生 shRNA 的 体内 转录 模板 。 构 建 的 模板 在 U6 启动 子 操纵 下 CRNA 聚合 酶 亚 )。 注意 : 正义 域 和 反 义 域 的 方向 是 相互 面 对 的 ， 被 一 编码 单 链 环 的 短 区 段 分 开 。 产物 shRNA 转录 物 是 Dicer 的 底 物 Dicer 转变 shRNA 成 siRNA 并 诱导 RNAi 途径

24.3.4 siRNA 导入 哺乳 动物 细胞 的 技术

很 清楚 有 许多 方法 可 以 用 RNAi 来 抑制 基因 表达 。 往 往 选 择 哪 一 种 方法 是 根据 传输 方法 决定 的 。 例 如 ， 如 果 一 种 特定 的 细胞 不 能 有 效 地 转 染 ， 那 么 在 体内 生成 shRNA 就 成 问题 。

任何 长 度 的 dsRNA 都 能 在 体外 生成 ， 并 且 用 转 染 技术 传输 到 细胞 中 。 同 样 siRNA 和 shRNA 也 能 用 这 种 方法 传输 。 而 哺乳 动物 细胞 的 问题 是 任何 长 度 大 于 30bp 的 dsRNA 都 会 引发 细胞 的 王 扰 素 介 导 应 答 (Martinand 等 ，1998) ， 但 是 这 对 其 他 类 型 细胞 来 说 不 是 问题 。 为 了 排除 这 个 困难 ，shRNA 可 以 在 体内 生成 ， 因 为 在 细胞 内 生成 的 dsRNA 不 会 引起 干扰 素 应 答 。 大 多 数 体内 转录 策略 涉及 设计 一 个 反 向 重复 序列 ， 结 果 使 得 单 链 转录 物 一 旦 形成 就 会 迅速 在 细胞 内 折 友 和 启动 RNAi 途径。 基因 沉默 的 有 效 性 最 终 必须 用 Western 分 析 、 其 他 免疫 学 技术 和 /或 RT-PCR 证 实 。

24.4 % &@ SIRNA 设计

毫 无 疑问 ， 功 能 性 基因 组 学 已 经 极度 依赖 于 RNAi RA. RNAi 已 经 成 为 用 来 检查 体内 和 体外 基因 功能 的 主要 方法 ， 而 RNAi 的 成 功 取决 于 dsRNA 的 正确 设计 。 现 在 人 类 基因 组 序列 已 经 完成 ， 在 RNA 朝 核 苷 酸 设计 过 程 中 生物 信息 学 是 不 可 缺少 的 。 在 人 类 细胞 中 一 个 错 配 就 会 影响 RNAi， 而 一 个 以 上 的 错 配 就 会 抑制 RNAi, ABLES RNAi 相关 产品 的 公司 ， 一 般 都 会 提供 免费 的 可 进入 网 络 的 设计 工具 CE 24. 2) 。

表 24.2 HEH SIRNA 设计 工具

Promega www. promega. com/siRNADesigner

Qiagen www. qiagen. com/siRNA

Dharmacon www. dharmacon. com/siDesign

Ambion http: //ambion. com/techlib/misc/siRNA_ tools. html Oligo Engine www. oligoengine. com

Whitehead Institute http: //jura. wi. mit. edu/siRNAext

YE: siRNA—#i Fit RNA, - 339 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

裂解 。

有 效 的 siRNA 是 21 一 23nt 的 带 有 对 称 的 UU3' 悬 垂 的 双 链 。 在 设计 siRNA 时 有 一 些 基 本 的 规则 应 当 遵守 ， 而 且 大 多 数 涉及 RNAi 技术 的 公司 都 有 专利 性 的 算法 ， 可 以 使 沉默 基因 的 有 效 性 最 大 化 。 某 些 基 本 的 siRNA 设计 原理 是 直观 的 ， 并 且 有 设计 PCR FARAH BIN ie 准 指南 提示 。 有 一 篇 siRNA 设计 基础 的 综述 ( 非 正 式 名 称 为 Tuschl’s 规则 ) CH www. rockefeller. edu/labheads/tuschl/siRNA. html). 这 些 规 则 包括 : 限制 (G+O) 含量 为 50% 或 更 少 ， 鉴 定 列 出 的 靶 至 少 要 有 3 个 或 4 个 碱 基 不 同 于 基因 组 中 任何 其 他 相似 大 小 序列 〈 二 般 是 21 个 碱 基 的 序列 ) ， 以 及 因为 siRNA 的 不 可 预知 性 ， 每 个 靶 要 设计 几 个 不 同 的 siRNA。 就 像 PCR 引物 一 样 ， 应 当 避 开 可 能 形成 不 希望 得 到 的 二 级 结构 的 区 域 。siRNA 应 当 有 对 称 的 UU3' BE, mRNA 中 的 靶 位 置 应 当 是 AA 开始 的 。 在 计划 设计 体外 或 体内 ddRNAi 时 ， 重 要 的 是 要 避免 含有 连续 的 4 个 或 4 个 以 上 相同 碱 基 ， 因为 这 样 会 引起 从 常用 的 人 类 U6 启动 子 (Paul 等 , 2002) 起 始 的 转录 过 早 终止 。 在 相关 ddRNAi 方法 中 ， 用 4 一 5 AS Wi EF (EE RF AE

因为 抑制 比率 随 转录 物 不 同 而 变化 ， 因 此 ， 针 对 mRNA 的 不 同 区 域 实验 3 个 或 者 更 多 个 shRNA， 查 找到 至 少 一 个 高 度 抑 制 靶 基因 表达 (> 90%) 的 序列 ， 以 确保 基因 沉默 。 这 既 不 是 不 正常 的 也 不 是 没有 理由 的 做 法 。 另 一 种 策略 是 合成 大 量 的 dsRNA Wate) 12 7B mRNA。 这 可 以 用 长 双 链 RNA 开始 做 ， 例 如 ， 一 个 转录 物 的 完全 编码 区 ， 然 后 用 Dicer 加 工 成 能 够 黏合 在 几乎 全 长 的 转录 物 上 的 siRNA.

24.5 体外 和 体内 的 问题

尽管 在 植物 、 动 物 和 真菌 界 广泛 存在 RNAi 机 制 ， 具 讽刺 意味 的 是 ， 至 今 人 们 对 这 个 利 用 dsRNA 进行 强大 调控 的 机 制 依然 所 知 甚 少 。 虽 然 在 一 个 真 核 生 物 与 另 一 个 真 核 生 物 的 RNAi 过 程 之 间 确 实 存在 一 些 相 同 之 处 ， 但 是 目前 的 证 据 越 来 越 清晰 地 显示 出 其 中 存在 微妙 的 差别 。RNAi 还 处 于 初级 阶段 ， 而 且 ， 这 种 技术 的 每 一 个 新 发 展 ， 都 需要 小 心 评 估计 划 用 来 作为 模型 的 系统 。 表 24. 3 中 列 出 了 与 这 种 技术 使 用 相关 的 优点 和 缺点 。 当 前 ，RNAIi 作为 一 种 工具 还 很 不 完善 ， 但 是 用 它 来 研究 基因 功能 肯定 是 吸引 人 的 。

表 24.3 RNAi 的 优点 和 缺点

RNA #2 tt DNA BRP

每 次 检测 一 个 基因 的 功能

对 目的 基因 有 高 度 专 一 性 需要 较 多 的 技术 训练

是 研究 基因 功能 及 研究 什么 基因 参与 什么 途径 的 系统 | ， 大 于 30bp 的 dsRNA 在 哺乳 动物 细胞 中 上 调和 干扰 素 响应 FB 基因 ,导致 调 亡

进化 上 高 度 保守 的 过 程 ,降解 mRNA 比 核 酶 更 有 效 某 些 细胞 ,特别 是 神经 元 ,倾向 于 抗 RNAi

LE LY SE BEE WE HE ; 有 时 重复 性 是 个 问题

。340 -

第 24 章 RNA 干扰 一 一 目标 基因 的 沉默

续 表 优 点 ik 点 沦 怎么 合理 设计 ,其 些 SIRNA 容易 导入 哺乳 动物 细胞 无 论 4 么 合理 设计 , 某 些 si 就 是 无 效 , 要 求 用 实验 误差 途径 非常 符合 药 靶 鉴定 缺失 合适 的 阳性 对 照 和 阴性 对 照 更 有 利 的 是 ,dsRNA 在 低 浓 度 时 , 比 反 义 寡 聚 物 有 效 因为 实验 方案 的 多 变 , 实 验 室 间 的 比较 有 困难 合成 的 RNAi FER AE HF BH CARER RAR AP! HPLC 纯 化 、 质 谱 等 )

注 : dsRNA 一 双 链 RNA;， HPLC 一 高 压 液 相 色 谱 ; mRNA 一 信使 RNA; RNAi—RNA FH; siRNA 一 短 干 扰 RNA.

诱导 RNAi 的 细胞 类 型 决定 了 dsRNA 可 用 的 长 度 。 在 哺乳 动物 细胞 中 ， 大 于 30bp 的 dsRNA 诱导 干扰 素 应 答 SSAC. iii) 30bp 的 dsRNA 则 显著 诱导 RNAi。 因 此 ， 一 个 基本 差异 是 : SIRNA 是 在 体外 制备 的 ， 然 后 转 染 到 哺乳 动物 细胞 中 ， 而 长 dsRNA 可 以 直 接 导 入 非 哺乳 动物 细胞 中 ， 细 胞 内 的 Dicer 将 负责 SIRNA 的 生成 。

其 他 影响 总 的 RNAi 效率 的 因素 包括 : 靶 mRNA 和 编码 蛋白 质 两 者 的 丰 度 和 稳定 性 ， 剪 切 靶 mRNA 的 精确 区 域 ， 以 及 dsRNA 导入 细胞 的 转 染 效率 。 人 们 也 知道 siRNA 和 mRNA 间 的 碱 基 对 必须 100%% 互 补 ， 因 为 在 哺乳 动物 细胞 中 这 些 分 子 之 间 的 错 配 会 明显 降低 RNAi 的 作用 ， 推 测 也 降低 了 干扰 素 应 答 。 用 poly I: C“〈 一 种 用 来 诱导 干扰 素 强制 应 答 @ 而 合成 的 双 链 多 聚 RNA) 数 年 前 就 已 经 清楚 地 证 明了 这 一 点 。

最 理性 设计 的 siRNA 也 可 能 是 无 效 的 ， 这 可 能 是 由 于 可 变 剪 接 。 可 变 剪 接 如 果 不 是 全 部 ， 也 至 少 是 大 部 分 高 等 真 核 生 物 mRNA 的 特征 。 例 如 ， 如 果 一 个 siRNA 被 导向 一 个 mR- NA 成 熟 期 间 将 被 剪接 除去 的 外 显 子 (图 24.6)， 则 那个 特定 的 SIRNA 将 不 能 引起 基因 沉默 。

ASE pe 内 合子 2

amet TTT

siRNA 诱 导 的 沉默 ? 转录 物 ! | 外 显 子 2 是 转录 物 ? 是 转录 物 3 不 是 图 24. 6 不同 的 剪接 可 以 影响 RNAi 的 成 功 。 对 于 很 多 基因 mRNA 生物 合成 来 说 ， hnRNA 的 可 变 剪接 是 正常 的 过 程 。 如 果 siRNA 靶 向 的 外 显 子 被 从 mRNA 前 体 中 剪接 除去 ， 因 为 siRNA 无 能 力 与 模板 结合 ， 因 此 RNAi 将 不 能 被 诱导 。 为 什么 很 多 设计 很 好 的 siRNA 无 法 抑制 某 些 基因 的 表达 ， 可 变 剪接 可 能 是 主要 原因

为 了 改善 RNAi 的 效率 ， 合 成 dsRNA 时 使 用 2'-F-CTP 和 2'-F-UTP (和 氛 位 于 通常 为 氧 占有 的 2 位 上 )， 结 果 大 大 稳定 了 RNA， 使 得 RNA 能 抗 通常 在 人 细胞 中 和 人 手 上 发 现 的 很 多 核酸 酶 〈Capodici 等 ，2002 ) 。

@ Ampligen (Hemispherx Biopharma; Philadelphia, PA) 是 基于 双 链 RNA 诱导 干扰 响应 能 力 的 实验 药物 。 但 是 ， 它 不 同 于 poly 1: C, Ampligen 是 含有 错 配 的 同 聚 双 链 类 似 物 [poly(TD)-poly(C-U)](Strayer 等 ,1982)。Ampligen 目前 在 临床 试验 阶段 。 细 节 可 访问 www. hemispherx. net,

。 341 °

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

比 起 细菌 转化 来 ， 真 核 细胞 的 转 染 是 更 大 的 挑战 。 一 些 哺乳 动物 细胞 似乎 反抗 转 染 。 人 们 尽 最 大 的 努力 ， 得 到 的 转 染 效率 还 是 很 低 。 经 典 的 磷酸 钙 转 染 伴随 着 某 些 毒性 。 几 年 前 因 为 发 展 了 脂 质 体 输送 载体 ， 这 个 困难 得 到 了 缓解 ， 但 还 是 有 很 多 困难 ， 包 括 siRNA WHA, 持续 性 等 。 特 别 是 培养 的 神经 元 和 原 代 细胞 ， 因 为 不 清楚 的 原因 ， 对 转 染 有 天 然 的 回复 能 力 。 有 趣 的 是 ， 某 些 情况 下 ， 与 双 链 质 粒 DNA 相 比 ， 似 乎 siRNA 可 以 更 有 效 地 被 某 些 细 胞 吸收 〈Krichevsky il Kosik, 2002). 对 于 那些 无 法 使 用 这 类 方法 〈 转 人 双 链 质粒 DNA) 分 析 的 细胞 类 型 而 言 ， 上 述 现象 (siRNA 可 以 更 有 效 地 被 某 些 细胞 吸收 ) 的 发 现 ， 为 人 们 打开 了 整体 性 深入 分 析 细 胞 中 基因 表达 的 大 门 。 同 时 ， 如 何 提高 包括 质粒 、dsRNA、 SiRNA 以 及 很 多 其 他 可 能 有 用 的 化 合 物 导 和 时 的 转 染 效率 ， 研究 人 员 现 在 也 正在 探索 转 染 的

新 方法 (Weil 等 ，2002) 。 RNAi 研究 方面 另 一 个 主要 问题 是 RNAi 抑制 作用 的 时 间 进 程 。 例 如 ， 在 培养 细胞 中 恒

定 表达 siRNA 的 载体 可 用 于 治疗 特殊 的 遗传 疾病 ,不 管 这 种 疾病 的 起 源 《〈 天 生 的 ， 遂 导 的 ) 。 在 体外 ， 这 一 系统 可 用 来 分 析 长 期 的 基因 沉默 ， 以 及 分 析 细 胞 和 组 织 水 平 的 任何 副 作用 。

24.6 和 参考 文献

Brummelkamp, T. R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296, 550.

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

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RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide ea as Cell 101, 25. (23%; Ow FR

“at

‘TT

S255 BAA. Cra. SERA 和 和 主 物 信息 字

25.1 AAR

人 类 基因 组 计划 已 圆满 完成 。 它 揭示 了 细胞 遗传 图 谱 的 结构 和 组 织 方式 。 测 定 人 类 基因 组 序列 带 来 的 好 处 之 ， 是 让 人 们 首次 看 到 了 人 类 基因 组 的 超 结构 、 序 列 以 及 结构 上 和 其 他 物种 之 间 存 在 的 关联 。 过 去 ， 当 突变 引起 疾病 的 发 生 、 发 展 时 ， 图 位 克隆 (positional clo- ning， 也 就 是 通过 在 遗传 图 谱 上 确定 其 位 置 的 方法 来 鉴定 基因 ) 就 是 不 多 的 几 种 不 其 精确 的 手段 之 一 。 由 于 正常 人 和 携带 / 患 病 个 体 的 DNA 在 经 过 一 种 或 几 种 限制 性 内 切 酶 切割 后 ， 可 能 产生 不 同 的 酶 切片 段 。 限 制 酶 切片 段 长 度 多 态 性 (RFLP) 常 被 用 来 检 出 遗传 紊乱 高 发 的 人 群 8@。 借 助 于 基于 PCR 的 自动 检测 方法 ， 目 前 细菌 、 病 毒 、 酵 母 、 植 物 和 动物 的 全 基 因 组 已 被 成 功 测序 ， 而 科学 界 也 直接 进入 了 后 基因 组 时 代 。

以 前 未 被 完善 定义 的 基因 组 功能 学 科 “〈 如 编码 RNA 和 和 蛋白质) ， 现 在 正 引 起 研究 者 日 益 增 长 的 兴趣 ， 如 果 不 说 成 是 狂热 的 话 。 而 新 出 现 的 学 科 和 亚 学 科 又 需要 新 的 名 称 。 目 前 ， 最 流行 的 做 法 th hn AE, 是 在 表示 相关 遗传 信息 或 是 分 析 方法 的 名 词 后 面 直 接 录 |] 一 才能 基因 组 学 加 上 “组 学 "， 即 “-omics” 的 后 缀 。 尽 管 这 种 做 法 可 能 望 文生 义 、 合 理 地 猜 出 该 学 科 的 相关 内 容 。 但 为 了 — (_ same ) 读者 的 便利 ， 还 是 在 此 列 出 几 个 简要 的 工作 定义 。 生 物 信息 学 是 一 个 独特 地 混合 了 基础 生物 、 遗 传 和 信息 aad 科学 的 学 科 。 因 为 涉及 如 何 使 用 数字 技术 来 分 析 DNA FNM. RNA DNA UC RF BUF (aomenem| —> (em) 关 信息 ， 生 物 信息 学 在 诸多 “组 学 ”学 科 内 显得 稍 有 251 “组 学 "， 基 因 表达 不 同 功能 不 同 。 由 于 超级 计算 机 的 出 现 ， 人 们 期 待 计算 机 模拟 性 组 分 之 间 的 关系 。DNA 所 编码 的 信息 蛋白 质 组 学 (in silico proteomics) 能 日 渐 成 为 预测 新 在 所 有 水 平 并 然 有 序 地 表达 ， 就 导致 生 及 段 折 梧 和 功能 的 研究 工具 。 而 遗传 组 学 、 转 录 组 | TAR REI 学 和 蛋白质 组 学 之 间 正 如 分 子 生 物 学 的 中 心 法则 UN aa DNA-~RNA-> 蛋 白质 描述 的 那样 ， 相 互 间 存在 着 紧密 的 联系 〈 见 第 2 章 ) 。

要 牢记 的 是 ，DNA 序列 信息 只 是 整个 故事 的 一 部 分 。 因 为 并 非 所 有 的 基因 组 DNA 都

@ 并 非 所 有 遗传 疾病 都 有 RFLP.

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

具有 功能 上 的 “作用 ”。 再 回忆 一 下 ， 虽 然 RNA 是 检测 到 基因 表达 的 一 个 参数 ， 但 是 RNA 同样 不 能 表述 整个 故事 ， 因 为 核 内 hnRNA 会 快速 代谢 ， 细 胞 质 内 的 mRNA 也 未 必 都 能 被 翻译 。 由 于 基因 组 总 是 稳定 的 ， 而 细胞 内 的 RNA 和 和 蛋白质 却 并 非 如 此 ， 所 以 研究 RNA 和 蛋白 质 这 两 个 水 平 上 的 表达 数据 ， 以 获得 特定 条 件 下 更 完整 的 细胞 生理 认 知 是 很 有 必要 的 (AM 25.1).

25.2 €Z24A4

accession number: 编号 。 核 酸 序列 GER4A DNA 或 cDNA) 或 氨基 酸 序列 〈 和 蛋白 质 ) 的 数字 标识 。 该 编号 相当 于 电子 分 类 卡片 目录 ， 它 有 利于 数据 库 的 检索 。

bioinformatics: 生物 信息 学 。 计 算 机 、 信息 技术 以 及 生物 工程 学 手段 的 结合 ， 使 用 户 可 以 对 庞大 的 核酸 和 蛋白 质 序列 信息 进行 分 类 和 归档 。 生 物 信 息 学 也 扩展 到 了 图 像 信 息 学 的 领域 9 ， 定 量 解 释 复 合 胶 及 芯片 图 像 ， 并 进行 归档 。

genome: 基因 组 。 细 胞 内 染色 体 DNA 的 整体 ， 被 称 为 基因 组 。 在 某 些 操作 中 ”需要 区 分 细胞 核 基 因 组 和 线粒体 基因 组 。

genomics: 基因 组 学 。 对 基因 结构 和 组 织 的 研究 。 基 因 组 学 的 研究 与 DNA 序列 数据 的 获得 密切 相关 。

chemical genomics: 化 学 基因 组 学 。 用 有 机 化 合 物 对 基因 组 进行 化 学 操作 ， 以 信号 途径 被 扰乱 的 细胞 为 材料 ， 研 究 该 处 理 带 来 的 影响 。

functional genomics: 功能 基因 组 学 。 对 细胞 内 RNA 水 平 的 研究 和 对 细胞 因 外 界 改 变 而 在 RNA 水 平 进 行 调控 的 研究 。 狭 义 而 言 就 是 对 基因 表达 的 研究 。

metabolome: 代谢 组 。 一 个 细胞 或 其 他 特定 生物 样品 内 所 有 的 化 学 成 分 ， 即 所 有 的 代谢 物 。

metabolomics: 代谢 组 学 。 化 合 物 的 代谢 谱 。 研 究 各 种 蛋白 质 对 代谢 水 平 造成 的 影响 。 此 类 研究 常常 能 揭示 洪 在 的 基因 功能 。

proteome: 和 蛋 昌 质 组 。 某 一 特定 时 间 内 一 个 细胞 所 产生 的 所 有 的 蛋白 质 ; 从 全 细胞 抽 提 物 中 纯化 翻译 产物 的 全 体 集 合 。

proteomics: 蛋白 质 组 学 。 对 特定 生化 条 件 下 细胞 内 和 蛋白质 组 分 的 研究 。 研 究 目标 包括 : 结构 、 功 能 、 表 达 蛋 白质 的 分 布 ， 以 及 自然 或 人 为 刺激 下 蛋白 质 类 别 如 何 进行 变化 。 通 过 研 究 正 常 /疾病 不 同 状态 下 细胞 内 的 蛋白 质 功 能 及 丰 度 ， 蛋 白质 组 学 建立 了 一 种 将 蛋 自 质 功 能 及 丰 度 和 基因 组 功能 联系 起 来 的 系统 手段 。 它 有 利于 同时 揭示 多 种 蛋白 质 的 功能 。 目 前 已 成 为 新 药 研发 的 主要 技术 平台 。

transcriptome: 转录 组 。 某 一 特定 条 件 下 某 一 特定 细胞 所 产生 的 所 有 MRNA,

transcriptomics: 转录 组 学 。 对 生物 体 所 有 转录 本 的 研究 ， 以 及 对 细胞 内 环境 改变 时 这 些 mRNA 分 子 的 表达 如 何 改变 进行 的 所 有 研究 。

25.3 基因 组 与 基因 组 学 对 香 一 基因 测序 会 生成 许多 信息 ， 而 对 若干 目的 相关 基因 测序 就 会 生成 更 大 量 的 信

@ IQBase (Media Cybernetics; www. mediacy. com) 是 就 该 项 操作 性 能 极 好 的 软件 。 .346 -

第 25 章 基因组、 转录 组 、 蛋 白质 组 和 生物 信息 学

息 。 要 不 是 使 用 了 强大 高 速 的 计算 机 和 杰出 的 软件 可 以 从 数据 库 中 查找 出 目标 信息 ， 整 个 基因 组 测序 所 产生 的 巨大 信息 量 肯 定 不 可 能 存在 一 种 组 织 、 分 析 、 归 档 的 方法 可 以 让 研究 者 轻易 进行 查询 。 生 物 信息 学 的 功能 之 一 ， 数 据 控 掘 (data mining)， 就 是 有 机 地 将 信息 科学 和 生物 学 结合 在 一 起 。 精 通 这 些 领 域 的 学 生 ， 可 以 期 待 在 未 来 几 年 中 拥有 很 好 的 职业 前 景 。

基因 组 学 的 目标 之 一 是 阐明 分 布 着 离散 基因 的 精确 DNA 图 谱 。 一 种 基本 的 研究 方法 就 是 检查 测 得 序列 中 的 开放 阅读 框 (open reading frame，ORF) 。 开 放 阅 读 框 是 一 长 段 未 被 终 止 密码 子 打 断 的 核酸 ， 真 正 的 开放 阅读 框 包括 起 始 密码 子 (ATG， 也 可 能 是 GTG， 但 出 现 频率 较 少 ) 和 一 个 终止 密码 子 (TAA, TAG 或 TGA)。 在 真 核 细 胞 内 ， 开 放 阅 读 框 可 能 被 打 断 成 外 显 子 编码 区 和 内 含 子 非 编码 区 ， 这 点 根据 高 度 保守 的 5GT 和 3 AG 剪接 位 点 可 以 很 容易 识别 出 来 。 打 断 的 基因 ， 即 包含 了 外 显 子 和 内 含 子 序列 的 基因 ， 只 存在 于 真 核 细胞 内 。 因 此 相 比 之 下 不 含 内 含 子 的 原核 细胞 拥有 更 经 济 的 遗传 信息 。 某 些 噬菌体 〈 病 毒 ) 如 惠 X1749， 甚 至 在 同一 区 段 DNA 上 使 用 两 套 不 同 的 阅读 框 ， 重 释 编 码 了 两 个 基因 。 这 并 不 是 一 个 完全 出 乎 预料 的 发 现 ， 因 为 : 四 虽然 这 一 病毒 的 基因 组 很 小 〈 只 有 5375nt)， 却 必须 制造 所 有 指导 病毒 传代 合成 所 必需 的 蛋白 质 ; @ 总 的 来 说 经 历 了 无 数 次 复制 的 病毒 ， 它 们 的 基因 组 早已 优化 ， 实 现 了 效率 的 最 大 化 。

对 大 规模 测序 项 目 来 说 ， 因 为 最 大 插 和 人 片段 的 大 小 不 能 超过 50000bp， 传 统 的 吹 菌 粒 和 黏 端 质粒 显得 能 力 不 足 。 而 采用 可 以 承载 数 十 万 核 苷 酸 的 特殊 载体 如 YAC (yeast artificial chromosome， 酵 母 人 工 染 色 体 ) 和 BAC (bacterial artificial chromosome， 细 菌 人 工 染 色 体 )， 则 可 以 对 复杂 基因 组 进行 有 效 作 图 。 使 用 BAC 或 YAC， 不 但 允许 对 从 启动 子 旁 侧 序 列 到 调控 元 件 的 整个 基因 进行 测序 ， 而 且 有 助 于 确认 遗传 位 点 之 间 的 连锁 关系 。 由 于 着 重 于 基因 组 的 结构 和 组 织 ， 以 上 方法 都 隶属 于 结构 基因 组 学 的 范畴 。 与 之 不 同 的 功能 基因 组 学 则 更 注重 于 基因 表达 的 模式 ， 即 基因 组 的 特殊 组 成 。

25.4 转录 组 与 转录 组 学

一 个 细胞 所 产生 的 所 有 mRNA 就 是 它 所 具有 的 转录 组 。 就 广义 来 说 ， 本 书 列 举 的 大 量 分 离 定性 RNA 的 方法 ， 就 是 在 讨论 如 何 确认 转录 组 的 性 质 。 目 前 ， 芯 片 分 析 〈 第 23 章 ) 常 被 用 来 检测 特定 实验 条 件 下 基因 的 表达 模式 ， 以 及 在 实验 刺激 下 基因 的 表达 改变 。 人 们 可 以 把 芯片 技术 想象 为 一 种 精细 化 的 点 杂交 分 析 一 一 由 细胞 裂解 这 一 刻 表 达 的 mRNA 直接 制 备 的 cDNA， 与 固定 在 固 相 支持 层 上 的 cDNA 或 寡 核 苷 酸 进行 杂交 的 技术 。

作为 mRNA 表达 的 镜像 ，cDNA 测序 所 得 的 数据 也 就 反映 了 mRNA 的 复杂 度 和 精确 序 列 。 反映 表达 的 数据 之 一 是 表达 序列 标签 (expressed sequence tag, EST). EST 是 源 自 细 胞 培养 物 、 组 织 材 料 或 CDNA 文库 〈 差 减 或 其 他 处 理 之 后 的 ) 或 是 其 他 生物 来 源 〈Adams 等 ，1991) 的 部 分 cDNA 克隆 序列 。 另 一 种 方法 是 20 世纪 90 年 代 发 展 出 来 的 基因 表达 系列 分 析 (〈serial analysis of gene expression, SAGE; Velculescu 等 ，1995) ， 针 对 细胞 内 mR- NA 合成 的 极 短 cDNA 分 子 (9~10bp) 进行 分 析 。 作 为 标签 的 这 些 cDNA， 每 一 个 分 子 代 表 了 某 个 特定 转录 本 的 特定 位 置 。 这 些 标签 在 连接 形成 多 联 体 以 后 很 容易 测序 。 某 一 特定 标

© 根据 历史 记录 ，@X174 是 最 早 完成 测序 的 基因 组 (1977). J 347 .

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

签 出 现 的 频率 就 代表 了 相应 mRNA AYE. SAGE 是 一 种 高 通 量 的 研究 基因 表达 的 方法 ; 而 传统 的 EST 分 析 则 需要 对 明显 要 长 得 多 的 DNA 进行 测序 。 总 的 来 说 ，EST 分 析 和 SAGE 都 提供 了 涉及 多 种 物种 基因 表达 的 大 量 信息 ， 为 若干 高 端 数据 库 的 发 展 黄 定 了 基础 。 这 些 对 基因 表达 谱 的 描述 表明 ， 许多 基因 可 以 产生 一 个 以 上 的 转录 本 ， 通 过 可 变 剪 接 或 是 转 录 起 始 位 点 (transcription start site, TSS) 的 选择 ， 每 种 不 同 的 转录 本 随 之 可 以 生成 几 种 蛋白 质 异 构 体 。

25.5 £€ORDSL.EORDG

45 DNA 或 是 RNA 相 比 ， 蛋 白质 相对 要 复杂 得 多 。 目 前 的 看 法 普遍 认为 ， 人 类 基因 组 大 约 共 有 35000 个 基因 ， 最 终 共 编 码 了 500000~1000000 个 蛋白 质 。 确 实 如 此 ;因为 翻译 后 共 价 修饰 和 加 工 过 程 ， 通 常 伴随 着 天 然 蛋 白质 的 整个 成 熟 过 程 。 翻 译 后 加 工事 件 包 括 糖 基 化 、 乙 酰 化 、 异 成 二 烯 化 、 磷 酸化 、 蛋 白质 裂解 过 程 和 复杂 的 蛋白 质 -蛋白 质 相 互 作用 。 和 蛋 白质 组 是 动态 的 ， 尤 其 是 在 真 核 细胞 里 。 这 使 得 对 它 的 检测 过 程 更 为 复杂 。 因 此 ， 蛋 白质 组 学 的 研究 ， 对 识别 基因 功能 非常 重要 。 并 且 ， 现 在 的 蛋白 质 组 学 已 不 再 是 一 次 分 析 一 个 蛋白 质 ， 而 是 发 展 到 对 细胞 或 组 织 总 体 蛋白 质 的 表达 模式 进行 分 析 。 蛋 白质 信息 学 已 经 成 为 生物 信息 学 中 一 个 专门 的 亚 分 科 。

细胞 类 型 〈 原 核 、 植 物 、 动 物 或 酵母 ) 决定 了 抽 提 蛋白质 时 裂解 细胞 的 方式 : LR 解 、 酶 消化 裂解 、 匀 浆 、 去 垢 剂 处 理 或 研磨 。 所 有 以 上 技术 早已 被 详细 描述 ， 在 购买 各 种 蛋 白质 纯化 试剂 或 试剂 盒 时 ， 生 物 技术 供应 商会 提供 相应 的 简要 操作 指南 。

1975 年 提出 的 双向 (2D) BER HL YK (Klose, 1975; O’Farrell, 1975) 是 初步 扫描 蛋 自 质 组 的 工具 之 一 。 首 先 按 等 电 点 Ol. HARA BAH pH) 分 离 蛋白 质 。 经 第 一 向 分 离 之 后 的 样品 再 进行 垂直 电泳 。 在 第 二 向 中 按 大 小 分 离 。 双 向 电泳 可 以 同时 分 离 数 千 种 蛋 自 质 ， 每 种 蛋白 质 显 示 为 不 同 的 点 。 双 向 凝 胶 就 像 是 样品 的 指纹 ， 各 点 的 大 小 和 相应 蛋白 质 的 丰 度 成 正比 。 与 RNA 一 样 ， 细 胞 内 各 种 蛋白 质 的 丰 度 不 同 。 因 此 ， 对 双向 凝 胶 电 泳 中 相 久 的 两 点 如 何 保证 避免 超 高 丰 度 蛋白 质 对 低 丰 度 蛋白 质 的 屏蔽 就 很 重要 。 为 了 提高 对 蛋白 质 组 的 分 辨 率 ， 目 前 有 几 种 策略 可 将 全 细胞 裂解 物 分 部 分 离 〈Corthals 等 ，2000; Zuo 和 Speicher，2000) 。 这 些 广泛 被 采用 的 方法 都 基于 分 部 分 离 的 策略 来 简化 对 样品 的 分 析 。 有 专门 用 于 分 析 双 向 凝 胶 电 泳 图 像 的 软件 ， 可 自动 识别 和 对 所 分 离 的 点 进行 定量 。 这 一 图 橡 信 息 学 方法 ， 就 提供 了 对 图 像 进行 电子 归档 的 方法 。

此 后 ， 回 收 双 向 凝 胶 电 泳 上 各 个 点 的 特定 蛋白 质 。 用 蛋白 质 裂 解 酶 消化 这 些 点 里 的 蛋 自 质 ， 就 产生 了 许多 较 小 的 、 可 用 质谱 鉴定 的 肽 段 ， 也 就 是 常见 的 基质 辅助 激光 解吸 电离 飞行 时 间 (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight, MALDI) 分 析 。 自 20 世纪 80 年 代 发 展 起 来 之 后 ，MALDI 就 成 了 蛋白 质 组 学 的 重要 工具 。 因 为 DNA 编码 了 所 有 可 能 存在 的 蛋白 质 ， 人 们 就 能 将 MALDI 鉴定 出 的 氨基 酸 序列 与 已 知 遗传 位 点 的 核 昔 酸 序列 进行 比 对 。 但 是 ， 确 认 编码 了 某 蛋 白质 的 基因 物理 图 谱 并 不 代表 就 了 解 了 它 的 功能 。 蛋 白质 动能 的 阐明 通常 是 非常 困难 的 ， 因 为 某 特定 蛋白 质 可 能 与 其 他 蛋白 质 协 同 发 挥 作用 ， 它 也 可 能 只 是 一 个 巨大 的 蛋白 质 复合 物 的 一 个 组 分 。

目前 用 来 鉴定 蛋白 质 功能 的 策略 有 几 种 ， 如 酵母 双 杂 交 、 各 种 免疫 亲 和 捕 获 技 术 、 核 磁 共振 〈NMR)、 结 晶 、 毛 细 管 电泳 、 高 压 液 相 色谱 (HPLC) 以 及 新 兴 的 检测 蛋白 质 - 蛋 白质

:8

第 25 章 基因组、 转录 组 、 蛋 和 白质 组 和 生物 信息 学

和 蛋白质- 脂 类 相互 作用 的 蛋白 质 芯片 〈 也 被 称 为 蛋白 质 微 阵列 ) 。 现 在 正在 制备 的 还 有 ， 含 数 百 种 代表 一 系列 生物 功能 的 单 克 隆 抗体 的 抗体 芯片 。 其 中 一 些 有 主题 的 芯片 专 一 针对 不 同 的 感染 疾病 、 肿 瘤 和 细胞 凋 亡 。 一 种 检测 蛋白 质 表达 常用 的 做 法 是 ， 用 Cy3 和 Cyd 标记 某 生物 来 源 的 蛋白 质 ， 再 将 标记 蛋白 质 与 抗体 芯片 杂交 。 更 为 传统 的 蛋 昌 质 组 学 研 究 手段 有 不 同 的 转录 -翻译 系统 ， 如 麦 胚 抽 提 物 、 免 网 织 红 细胞 裂解 物 、 犬 胰 微 粒 体 膜 和 蛋白 酶 。

虽然 蛋白 质 组 学 数据 库 的 数量 增长 很 快 ， 但 与 GenBank 和 其 他 公共 数据 库 不 同 的 是 ， 访问 某 些 私有 的 蛋白 质 组 学 数据 库 时 ， 需 要 经 过 许可 和 /或 交付 访问 费用 。 这 些 费 用 用 于 数 据 库 的 日 常 维护 和 发 展 。 对 和 蛋白质 组 学 这 一 行 的 新 手 来 说 ， 推 荐 的 专业 机 构 有 蛋白质 组 协会 (the Proteome Society; www. proteome. org), 3¢ Al #iK th H ACHE PP (the Microarray Gene Expression Data Society; www. mged. org) 和 人 类 和 蛋白 质 组 组 织 (the Human Pro- teome Organization; www. hupo. org) 。 此 外 ， 和 蛋白质 的 翻译 后 修饰 及 其 研究 方法 也 因此 受 到 高 度 重 视 (Hames 和 Higgins, 1999; Liebler, 2001; Kannicht, 2002),

在 此 值得 一 提 的 是 ， 不 同 氨基 酸 序列 、 不 同 翻译 后 修饰 的 多 肽 ， 与 DNA 和 RNA HK 苷 酸 一 样 可 以 定制 。 这 些 定制 合成 的 多 肽 可 以 用 来 在 免疫 学 应 用 于 对 抗原 决定 簇 作 图 ， 鉴 定 新 药 的 活性 肽 段 ， 鉴 定 酶 的 底 物 和 抑制 物 ， 鉴 别 蛋白 质 -蛋白 质 的 相互 作用 ， 鉴 别 蛋 白质 - 核 酸 的 相互 作用 ， 为 疫苗 研究 发 展 新 的 抗体 。

研究 细胞 、 血 液 或 其 他 体液 内 重要 成 分 组 成 的 代谢 组 学 是 蛋白 质 组 学 的 合理 延伸 。 与 蛋 白质 组 学 不 同 ， 代 谢 组 学 所 关注 的 是 细胞 内 各 种 蛋白 质 引起 的 变化 。 这 些 变化 直接 和 蛋白 质 的 翻译 后 修饰 及 微 环 境 相 关 。 人 代谢 组 学 产生 于 30 多 年 之 前 ， 现 在 因 日 益 增 长 大 量 的 蛋白 质 - 序列 数据 而 复兴 。 代 谢 组 学 有 助 于 评估 药物 的 毒性 、 潜 在 副作用 和 整体 安全 性 。 用 于 代谢 组 研究 的 方法 有 NMR 、 质 谱 分析 、 各 种 传统 的 液 相 色谱 和 气相 色谱 技术 。

25.6 生物 信息 学

核酸 和 蛋白质 序 列 的 海量 数据 每 天 都 在 增加 ， 其 中 的 绝 大 多 数 会 进入 公用 数据 库 。 为 使 这 些 数据 能 被 任何 人 所 用 ， 同 时 能 提供 支持 对 数据 库 的 询问 和 搜索 的 软件 ， 特 此 成 立 了 美国 国家 生物 技术 信息 中 心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI; Be- thesda， 马 里 兰州 ) 。 欧 洲 分 子 生 物 学 试验 室 (European Molecular Biology Laboratory, EM- BL; 德国 ,海德堡 ) 和 日 本 DNA 数据 库 (DNA Data Bank of Japan, DDBJ; Mishima, H AS) 与 NCBI 共 同 协作 为 世界 各 地 的 研究 者 们 提供 了 对 海量 数据 @ 的 访问 途径 。 此 外 ， 用 户 还 可 以 便捷 地 访问 一 些 专业 化 数据 库 ， 如 加 注 的 蛋白 质 序列 库 基 因 组 研究 所 〈The In- stitute for Genome Research, TIGR) 和 Swiss-Prot。 表 25. 1 中 罗列 了 一 些 重 要 的 生物 信息 学 网 站 。

在 NCBI 的 主页 上 就 可 以 搜索 到 特异 的 DNA 序列 〈Entrez) 、 目 标 基 因 所 在 的 染色 体位 置 〈《Human Map Viewer) 和 特定 基因 的 相关 科学 文献 (PubMed) 。 另 外 ， 还 提供 了 一 些 读 者 应 该 了 解 和 熟悉 的 软件 工具 。

@ 截至 2004 年 5 A, GenBank 数据 库 包 含 了 366 亿 碱 基 对 的 序列 数据 ， 代 表 了 大 约 3 千 万 个 不 同 的 序列 。 访 问 www. ncbi. nih. gov/genbank/genbankstats. html1， 可 以 了 解 当今 最 新 的 数据 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

#25.1 重要 的 生物 信息 学 网 站

NCBI www. ncbi. nlm. nih. gov

EMBL www. embl. org

DDBJ www. ddbj. nig. ac. jp

TIGR www. tigr. org

Swiss-Prot http: //us. expasy. org/sprot Codon utilization tables http://www. kazusa. or. jp/codon/

来 自 于 基因 组 测序 、cDNA 测序 和 蛋白 质 测序 的 信息 与 日 俱 增 ， 对 希望 使 用 这 些 信息 的 研究 者 而 言 ， 不 瘟 为 令 人 生 旦 的 挑战 一 一 怎样 才能 对 含有 数 以 亿 计 的 碱 基 序列 的 信息 数据 库 有 效 地 进行 搜索 并 获得 特定 的 情报 ?” 为 此 很 多 程序 应 运 而 生 ， 而 问题 因此 也 被 简化 为 对 DNA 序列 或 蛋白 质 序列 进行 搜索 和 鉴定 。 其 中 最 有 名 的 就 是 被 称 作 BLAST 的 基本 局 部 比 对 搜索 工具 (Basic Local Alignment Search Tool) 。 这 是 一 个 功能 强大 而 多 样 的 软件 ， 能 够 从 数据 库 中 搜索 出 与 输入 序列 一 致 的 核酸 序列 或 蛋白 质 序列 ， 同 时 显示 两 个 序列 的 比 对 结 果 。 另 一 个 受 欢 迎 的 软件 是 GRAIL (compbio. ornl. gov/public/tools) ， 它 能 从 用 户 提 供 的 DNA 序列 中 鉴别 出 完整 的 基因 、 外 显 子 及 其 他 特征 。

BLAST 可 在 网 上 直接 使 用 (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)。 其 他 不 少 网 站 也 给 出 J BLAST 的 链接 。 用 BLAST 进行 搜索 的 过 程 很 简单 ， 最 直接 的 方法 就 是 选择 核酸 对 核酸 的 BLAST (blastn)。 用 户 需要 输入 搜索 字符 串 ， 也 就 是 希望 研究 的 核酸 序列 。 输 入 字符 串 既 可 以 手动 输入 ， 也 可 以 通过 拷贝 和 粘贴 来 实现 。 手 动 输入 时 因为 大 写 的 C 和 G 可 能 发 生 混 消 ， 所 以 可 以 选择 在 搜索 框 中 输入 小 写 的 a、g、c、t 碱 基 序列 。 用 户 可 以 搜索 未 知 序 列 的 全 部 或 是 部 分 ， 后 者 可 通过 在 “FROM” 和 “TO” 窗 口中 输入 起 始 和 终止 核酸 位 置 来 完 成 。 用 户 可 以 选择 搜索 使 用 的 数据 库 ， 但 是 对 于 新 用 户 而 言 ， 除 非 有 特殊 需要 ， 否 则 最 好 还 是 使 用 缺 省 设置 的 非 宛 余 核酸 库 “nr”， 这 样 可 以 执行 最 完整 的 搜索 8。 最 后 ， 点 击 BLAST 图 标 即 开始 搜索 。 由 于 若干 可 变 因素 ， 搜索 可 能 需要 几 秒 到 几 小 时 来 完成 。BLAST 会 估计 搜索 所 需 的 时 间 并 给 出 一 个 RID 号 〈 询 问号 )， 这 是 一 个 重要 的 数据 传输 索引 号 。 接 着 ， 用 户 可 以 点 击 “Format” 键 ， 进 而 打开 显示 BLAST 搜索 结果 的 窗口 。 在 最 终 的 搜索 结果 中 ， 每 个 序列 都 配 有 两 个 数值 ， 一 个 是 S 〈 位 值 )， 反映 了 用 户 提供 的 序列 和 从 数据 库 中 搜索 得 到 的 一 致 序列 之 间 吻 合 数 的 统计 值 ， 另 一 个 是 已 〈 期 望 值 )， 它 反映 了 找寻 到 同样 S 值 序列 的 可 能 性 。 所 以 ， 对 任何 BLAST 搜索 ， 得 到 的 SARA E 值 越 小 (应 远 低 于 1.0)， 说 明 序列 的 吻合 度 越 高 。

用 户 可 以 随时 登陆 前 面 提 到 的 网 站 ， 用 各 种 信息 工具 进行 练习 ， 来 熟悉 如 何 正确 有 效 地 使 用 BLAST。 用 已 知 的 序列 进行 第 一 次 实践 是 比较 方便 的 方式 ， 如 自己 试验 室 中 研究 的 基 因 有 关 的 序列 ， 或 者 用 来 扩 增 这 个 基因 某 一 区 段 的 PCR 引物 序列 。 或 者 为 了 熟悉 搜索 过 程 ，

也 可 以 自己 编造 一 段 序列 。

如 果 没有 可 以 用 来 搜索 的 DNA 序列 ，NCBI 网 站 也 提供 了 其 他 扩展 资源 。 其 中 令 人 印象 深刻 的 是 NCBI 不 但 给 出 了 与 发 病 或 疾病 进程 相关 的 基因 ， 甚 至 显示 了 详细 的 遗传 连 锁 图 。 另 外 ， 还 可 以 找到 一 - 些 检查 蛋白 质 序列 的 工具 和 基于 X 射线 晶体 学 数据 的 蛋白 质

三 维 结构 。 这 些 资源 大 多 数 是 :免费 开放 的 。 访 问 这 个 网 站 探索 各 种 可 能 ， 对 研究 绝对 是

@ 一 些 生物 物种 的 EST 或 其 他 特定 的 数据 也 可 供 挑选 。 - 350 -

第 25 章 ， 基因组、 转录 组 、 蛋 和 白质 组 和 生物 信息 学

直人

Adams, M. D., Kelley, J. M., Gocayne, J. D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M. H., Xiao, H., Merril, C. R., Wu, A., Olde, B., Moreno, R. F., Kerlavage, A. R., McCombie, W. R.., and Venter, J. C. (1991). Complementary DNA sequencing: Expressed sequence tags and human genome project. Science 252, 1651.

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(Set; 金 由 辛 校 )

al 人 。

第 26 章 一 个 RNA 6

前 面 章节 谈 到 的 实验 方案 ， 描 述 了 从 不 同 生 物 来 源 的 材料 中 如 何 有 效 分 离 RNA 的 种 种 方法 。 明 智 地 将 这 些 技术 加 以 组 合并 付 诸 应 用 ， 就 可 以 系统 地 认识 转录 产物 在 基因 表达 调控 中 所 起 的 作用 。 检 测 特殊 信使 RNA (mRNA) 的 水 平 作为 基因 表达 的 一 个 参数 ， 在 任何 一 个 实验 模型 中 都 是 极为 可 取 的 。 而 在 此 基础 上 ， 再 使 用 Western 分 析 等 免疫 化 学 实验 方法 对 蛋白 质 的 表达 进行 检测 ， 则 可 更 完整 地 阐述 就 实验 探讨 条 件 下 的 基因 调控 。 一 个 典型 的 基 FRNA 的 实验 设计 ， 包 括 获 得 稳定 的 RNA，( 也 许 需 要 ) 测定 对 照 组 和 实验 组 细胞 的 转录 速率 。 利 用 这 些 手 段 就 可 以 判定 ， 实 验 所 观测 到 的 某 一 〈 些 ) mRNA 的 改变 是 转录 水 平 发 生 了 变化 ， 还 是 转录 后 事件 所 造成 的 变化 。

研究 者 可 以 对 细胞 质 RNA 进行 Northern 分 析 ， 直接 检测 整体 转录 本 或 部 分 转录 本 。 而 分 别 对 细胞 核 RNA 和 细胞 质 RNA 进行 研究 ， 则 可 以 确认 基因 表达 的 调控 是 发 生 在 转录 水 平 ， 还 是 发 生 在 转录 后 水 平 。 经 典 的 Northern 分 析 有 它 的 局 限 性 ， 用 物理 方法 将 靶 RNA 固定 在 尼龙 膜 之 类 的 支持 物 上 ， 这 就 阻碍 了 RNA 分 子 与 核酸 探 针 之 间 的 全 面 接触 。 但 是 ， Northern 分 析 本 喘 就 能 揭示 mRNA 的 长 度 ， 检 测 RNA 在 细胞 中 被 表达 时 的 天 然 全 长 。 而 所 有 其 他 用 于 RNA 分 析 的 方法 ， 无 论 听 上 去 有 多 高 的 技术 含量 ， 都 只 对 转录 本 全 长 的 一 部 BY UETT I dT.

更 全 面 的 转录 本 量化 分 析 的 方法 ， 有 以 S1 核酸 酶 和 了 RNase 保护 实验 为 代表 的 液 相 杂 交 ， 此 外 当然 还 有 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 。 由 于 这 些 技术 的 灵敏 度 都 有 很 大 提高 ， 因 此 不 再 必须 对 poly(A) AY RNA 进行 纯化 。PCR 技术 的 出 现 ， 使 得 不 再 需要 对 天 然 产 物 进 行 富 集 处 理 ， 甚 至 富 集 也 无 法 再 满足 实验 的 需要 。 尽 管 如 此 ， 对 poly(A)+ 和 poly(A)~ hy RNA # 行 地 进行 分 析 ， 依 然 是 对 所 研究 的 mRNA 进行 富 集 极 好 的 方法 。 这 些 实验 的 结果 常 通过 放 射 自 显影 、 化 学 发 光 或 Cerenkov 计数 法 加 以 定量 ， 并 可 进一步 与 数据 图 形 分 析 相 结合 。 由 于 RNA 的 特性 是 最 常 被 用 来 评估 基因 表达 的 方法 ， 人 们 总 是 希望 能 获得 更 高 的 灵敏 度 。 在 过 去 的 15 年 中 ，PCR 技术 已 极 大 地 推动 了 对 细胞 生物 化 学 的 探查 深度 。 而 对 此 项 技术 的 车 二 改变， 则 使 之 具有 持续 的 越 来 越 广 的 应 用 前 景 。

通 稼 文献 报道 在 提 及 转录 诱导 或 阻 巡 时 用 术语 “相对 丰 度 ”来 表达 ， 即 比较 测 得 的 对 照 组 及 实验 组 细胞 中 某 特定 RNA 种 类 含量 后 的 相对 数值 。 例 如 ， 可 能 会 出 现 这 样 的 报道 声称 在 茶 个 新 获得 的 细胞 系 中 ， 与 处 于 指数 生长 并 且 未 汇聚 的 同类 细胞 中 肿瘤 基因 omy 的 丰 度

相 比 ， 接 触 抑制 导致 me 的 丰 度 下 降 了 上 。 因 此 ， 可 以 在 不 清楚 某 一 转录 本 在 细胞 中 的 绝

对 数量 时 ， 作 给 出 该 转录 本 增多 或 是 减少 的 陈述 。 如 果 愿 意 ， 该 样本 的 确切 数量 也 可 以 通过 ”352 -

第 26 章 一 个 RNA 范例

和 已 知 数量 的 起 始 物 质 相 比 的 实时 PCR 精确 测 得 。

模式 系统 的 分 子 研 究 不 必 停 止 在 对 转录 的 特性 分 析 上 。 在 分 析 了 转录 产物 的 即时 状况 ， 或 是 用 核 逃逸 实验 测定 了 不 同 基因 的 转录 速率 以 后 ， 研 究 者 可 能 会 希望 研究 导致 那些 观察 到 的 差异 的 分 子 基 础 。 毕 竟 ， 基 因 表 达 只 是 RNA 生物 发 生 的 一 个 部 分 。 在 基因 组 组 织 的 这 个 层次 上 ， 对 mRNA 的 调控 可 能 是 “〈 至 少 部 分 而 言 ) 基因 重 排 的 结果 。 导 致 转录 本 量 上 变化 的 影响 因素 极 有 可 能 就 是 某 一 位 点 的 编码 部 分 内 发 生 的 错误 ， 或 是 影响 了 基因 表达 的 侧 辟 序 列 。 随 后 的 研究 可 以 利用 Southern 分 析 法 来 研究 此 类 结构 上 的 变化 。 由 于 人 类 等 物种 的 基 因 组 全 序列 已 测定 ， 生 物 信息 学 方面 的 工作 有 助 于 对 这 一 类 型 的 调控 进行 分 析 。

同样 ， 在 细胞 水 平 上 基因 的 表达 最 终 以 功能 性 多 肽 的 形式 告终 。 为 了 对 实验 系统 给 出 一 个 更 为 清晰 的 定义 ， 对 基因 表达 的 翻译 调控 和 翻译 后 调控 进行 定性 也 是 有 帮助 的 。 尽 管 一 种 或 另 一 种 mRNA 的 出 现 就 提示 它们 会 被 翻译 ， 但 由 实验 所 引入 的 细胞 生物 学 变化 可 能 会 危 及 这 一 mRNA 转运 到 翻译 机 器 的 过 程 ， 因 此 随后 应 该 用 Western 分 析 来 验证 。 作 为 West- ern 分 析 的 补充 ， 近 年 来 出 现 的 新 技术 一 一 RNA 干扰 (RNAi) ， 完 全 可 以 用 来 对 此 类 问题 进行 研究 。 大 家 一 定 还 记得 ， 通 常 与 真 核 基因 表达 有 关 的 翻译 后 修饰 ， 也 可 能 被 某 特殊 实验 条 件 所 定义 的 参数 改变 。 所 有 新 兴 的 蛋白 质 组 研究 方法 ， 都 有 助 于 研究 者 对 蛋白质 的 成 熟 以 及 最 终 基 因 的 功能 有 更 清晰 的 认识 。 因 此 ， 从 若干 方面 进行 细胞 生物 学 鉴定 是 较为 适宜 的 。

26.1 和 典型 实验

并 没有 什么 所 谓 的 典型 实验 。 在 为 某 个 特定 问题 耗费 不 计 其 数 的 工作 时 间 、 成 千 上 万 的 美元 ， 投 入 各 种 各 样 昂 贵 的 试剂 盒 以 及 种 种 高 科技 手段 之 前 ， 对 新 系统 作 一 个 简单 的 起 始 定 性 总 是 个 聪明 的 做 法 〈 图 26. 1) 。 需 要 一 些 “ 快 而 低廉 ”的 方法 直接 对 讨论 模型 的 功能 进行 评估 。 例 如 ， 为 了 分 析 数 量 众多 或 是 采集 自若 干 时 间 点 的 样本 ， 只 要 转录 本 足够 多 ， 那 么 仅 用 斑点 印迹 这 么 简单 的 方法 就 能 很 容易 地 达到 目的 。 虽 然 与 经 电泳 分 离 后 的 RNA 相 比 ， 使 用 斑点 印迹 会 损失 一 些 RNA 性 质 上 的 认识 。 近 年 来 人 们 对 极 低 丰 度 转录 本 产生 了 巨大 的 研 究 兴 趣 ， 如 果 在 实验 中 未 能 检测 到 已 确认 为 cDNA 的 序列 转录 ， 那 么 就 有 必要 对 原 有 的 实 验 设 计 进 行 修改 。 实 验 中 潜在 的 改动 包括 : 中 换 一 种 RNA 纯化 的 方法 ; 四 换 一 种 生物 材

确定 某 一 研究 中 待 前 述 的 问题 ， 选 择 恰当 的 实验 体系 选择 纯化 RNA 的 方法

进行 初步 分 析 以 确认 在 该 实验 系统 中 目的 基因 是 否 表达 一 具体 方法 的 选择 由 研究 类 型 决定

决定 下 一 步 操作

图 26.1 初步 分 析 以 决定 选 定 的 实验 系统 是 否 合适 。 机 构 内 现 有 的 装备 、 技术 以 及 待 解决 问题 的 本 质 决 定 了 什么 才 是 最 为 合理 的 “ 快 而 低廉 ” 手段 。 初 步 分 析 能 给 出 的 最 重要 的 信息 也 许 就 是 判断 研究 者 是 否 能 从 这 一 生物 来 源 得 到 足以 支持 预计 实验 所 需 充足 的 高 质量 RNA ¢ 353 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

料 ; @@ 选 用 更 敏感 的 实验 方法 ; 图 用 化 学 药品 或 生理 刺激 诱导 目的 基因 的 表达 。

由 于 许多 转录 的 RNA 在 细胞 核 内 便 已 降解 ， 如 核 不 均一 RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnRNA) 不 再 会 成 熟 并 以 mRNA 的 形式 出 现在 细胞 质 中 。 因 此 在 最 初 的 定性 实验 中 ， 对 总 细胞 RNA 和 总 细胞 质 RNA 都 进行 分 析 是 非常 有 益 的 。 并 且 ， 如 果 某 一 探 针 可 以 与 总 细胞 RNA 而 非 细 胞 质 RNA 杂交 ， 这 就 暗示 有 某 种 转录 后 调控 机 制 在 发 挥 作用 。 在 最 初评 估 给 出 了 振奋 人 心 的 数据 之 后 ， 再 对 此 系统 进行 更 为 细致 的 分 析 是 比较 合适 的 做 法 。

尽管 有 其 他 灵敏 度 高 得 多 的 定量 方法 ， 几 乎 没有 研究 者 会 为 了 定量 来 使 用 Northern 技 术 ， 历 史 悠 久 的 Northern 分 析 仍 是 一 个 用 于 检测 转录 本 大 小 的 方法 《图 26.2)。 通 过 Northern 分 析 ， 可 以 了 解 转录 本 的 大 小 及 其 丰 度 。 既 可 以 证 明 所 选用 探 针 的 特异 性 ， 又 可 以 在 大 小 及 丰 度 上 和 已 发 表 数据 〈 如 果 有 的 话 ) 作 直 接 比 较 。 但 是 研究 者 们 必须 注意 ， 标 准 的 印迹 分 析 无 法 检测 到 大 量 正在 被 研究 着 的 基因 ;， 低 丰 度 和 极 低 丰 度 的 转录 本 仍 常常 低 于 Northern 分 析 的 检测 水 平 。 在 进行 Northern 分 析 的 同时 进行 PCR 分 析 ， 以 评价 前 者 数据 的 可 信和 度 ， 这 才 是 明智 之 举 。 这 样 的 操作 将 证 明 在 印迹 法 无 法 检测 到 信号 的 时 候 ， 样 本 中 的 RNA 仍 可 以 被 检测 到 〈 在 质量 足够 高 的 条 件 下 )。

纯化 细胞 质 、 全 细胞 、 细 胞 核 或 poly(A) mRNA 跑 胶 ， 光 文件

PCR 扩 增 、 克 隆 和 测序

对 含量 及 质量 进行 评估 决定 下 一 步 操作

图 26.2 Northern 分 析 可 用 于 测定 天 然 转 录 本 的 大 小 及 寻找 同一 基因 的 多 个 转录 本 (multiple transcripts) 。 通 常 建议 对 同一 RNA 样品 做 一 些 基于 PCR 技术 的 平行 实验 。 这 种 策略 在 转录 本 丰 度 低 于 Northern 分 析 的 检测 水 平时 将 带 来 巨大 的 帮助

如 前 所 述 ， 检 测 转录 本 的 更 为 灵敏 的 定量 方法 是 那些 基于 液 相 杂交 的 技术 ， 如 核酸 酶 保 护 实验 、 各 种 芯片 和 基于 PCR 技术 的 实验 〈 图 26. 3) 。 比 较 深 思 熟 虑 的 做 法 还 包括 设计 一 个 或 几 个 测定 对 照 组 及 测定 实验 组 细胞 中 转录 速度 的 实验 ， 如 核 逃 逸 实验 。 把 转录 速度 与 Northern 分 析 以 及 RT-PCR 的 结果 一 起 衡量 可 以 得 出 结论 。 数 据 显示 的 基因 表达 变化 也 可 能 是 来 自 结构 变化 、 来 自 位 点 重 排 或 来 自 侧 贾 的 调控 元 件 影响 的 结果 。 这 些 可 能 性 可 以 用 Southern 分 析 来 验证 。

PCR 技术 一 直 因 其 高 灵敏 度 和 分 辩 率 而 受到 极 高 的 评价 。 事 实 上 在 任何 实验 背景 下 ， 插 借 这 一 革命 性 的 手段 对 cDNA 和 基因 组 DNA 序列 进行 扩 增 都 是 检测 转录 最 为 可 靠 的 方法 之 一 。PCR 确实 需要 知道 转录 本 或 特定 基因 的 序列 以 期 设计 出 有 效 的 引物 序列 ， 而 本 书 所 提供 的 若干 策略 和 网 上 的 大 量 生物 信 息 学 工具 都 可 胜任 这 个 要 求 。 尽 管 在 测定 基因 表达 时 RT-PCR 可 以 作为 一 个 独立 指标 ， 但 是 用 一 些 先前 所 述 的 更 为 经 典 的 方法 来 确证 一 下 不 失 为 明智 之 举 。 。354 -

第 26 章 一 个 RNA 范例

较 高 灵敏 度 的 实验

核酸 酶 保护 实验 最 高 灵敏 度 的 实验

RI-PCR( 所 有 形式 )

决定 下 一 步 操作

图 26.3 与 基于 滤 膜 为 基础 的 实验 CM Northern 分 析 ) HU. BRA 护 实验 和 核 逃 逸 实验 的 灵敏 度 更 高 。 为 了 追求 实验 范围 、 灵 敏 度 和 分 辨 率 的 最 大 化 ， 以 及 考虑 到 技术 之 间 的 互补 ， 芯 片 筛选 、 实 时 PCR 和 阻 遏 基因 表达 的 RNA 干扰 技术 都 是 极 完美 艺术 级 的 方法

基因 表达 的 全 面 分 析 功能 基因 组

26.2 灵 教 度 的 问题

本 实验 指南 列举 了 一 系列 RNA 纯化 及 定性 的 方法 论 。 需 要 注意 的 是 这 些 方 法 各 有 利 闲 ， 因 此 有 必要 讨论 一 下 具体 方法 的 可 靠 性 和 灵敏 度 。

通常 以 相对 丰 度 的 形式 来 表述 源 自 同一 实验 系列 样本 的 RNA 水 平 ， 这 也 就 是 说 其 中 的 对 照 或 是 基线 组 被 人 为 地 指定 为 数值 1， 以 此 作为 其 他 实验 样本 的 比较 依据 。 需 要 注意 的 是 测 得 的 相对 丰 度 直接 影响 到 随后 实验 的 相对 灵敏 度 : 为 求 相 同 目的 对 同一 组 样品 使 用 不 同 的 测试 方法 ， 其 结果 也 往往 会 有 大 得 难以 想象 的 差别 。

第 20 章 的 RNA 灵敏 度 指 标 中 从 最 高 的 实时 PCR 到 最 低 的 斑点 印迹 ， 列 出 了 几 种 常用 转录 实验 方法 的 相对 灵敏 度 。 但 即使 是 灵敏 度 较 低 的 实验 技术 也 能 提供 有 用 的 信息 。 比 如 ， 传统 的 转录 测试 技术 Northern 分 析 可 以 显示 在 特定 位 点 产生 的 mRNA 的 天 然 大 小 ， 而 这 一 数据 是 那些 具有 更 高 灵敏 度 的 方法 所 不 能 提供 的 。

26.3 有 待 进行 的

只 有 在 观察 到 上 调 或 是 被 阻 遏 的 基础 上 ， 才 能 决定 是 否 要 对 关注 的 那些 RNA 投入 更 多 的 实验 资源 ， 是 否 值得 对 这 些 “ 现 象 ”进行 更 深入 的 分 析 。 就 这 一 点 而 言 ， 由 RNA 不 稳定 性 造成 的 习惯 ， 实 验 室 往往 倾向 于 新 合成 相应 的 EDNA， 或 是 翻 出 以 前 就 有 的 cDNA 文库 。 得 到 特定 基因 的 CDNA 不 仅 以 后 可 以 作为 序列 探 针 使 用 ， 而 且 在 许多 推荐 进行 的 实验 中 也 用 得 到 (这些 都 将 在 本 章 逐 一 提 及 )。 此 外 ， 由 于 cDNA 克隆 极 易 测序 ， 任 何人 都 可 以 利用 网 上 的 生物 信息 学 资源 轻松 鉴定 出 该 基因 的 来 源 。

如 果 已 经 有 了 合适 的 cDNA 文库 ， 那 么 目的 cDNA 就 很 可 能 藏身 其 中 ， 这 可 以 让 研究

。 355 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

者 节省 大 量 的 时 间 和 金钱。 但 是 ， 研 究 者 们 必须 提防 那些 古老 的 文库 ， 介 于 20 世纪 80 年 代 早期 至 90 年 代 中 期 构建 的 文库 ， 由 于 严重 缺乏 较 长 序列 的 克隆 ， 不 如 近年 来 构建 的 文库 那 样 富有 代表 性 。 造 成 这 种 局 面 的 原因 主要 有 两 个 。 第 一 ， 早 期 的 文库 通常 是 用 oligo(dT) 作 引 物 ， 以 poly(A)+ mRNA 为 模板 合成 的 。 使 用 这 种 引物 模式 往往 造成 第 一 链 cDNA 的 合 成 效率 低下 ， 这 就 显著 缩短 了 cDNA 分 子 的 长 度 并 减少 了 cDNA WARE TE. — BARD T HK 针 检 测 的 区 域 ， 显 然 杂 交 反 应 就 不 会 有 信和 号 显示 。 甚 至 会 有 更 为 极端 的 例子 ， 比 如 文库 中 可 能 就 根本 不 包括 若干 种 mRNA。 第 二 ， 用 oligo(dT) 作 引 物 构建 的 文库 ， 只 能 代表 部 分 的 RNA 构成 ， 这 是 因为 该 文库 不 能 反应 poly(A)” mRNA 的 组 成 。 更 为 合理 的 做 法 如 第 18 章 所 述 ， 在 用 oligo(dT) 作 引 物 合成 第 一 链 CDNA 的 同时 添加 随机 引物 使 反应 完全 。 事 实 上 ， 仅 用 PCR 方法 即 可 完成 构建 整个 文库 的 要 求 。

筛选 文库 的 工作 可 以 用 传统 方法 完成 。 比 如 先 将 文库 铺 板 ， 然 后 再 用 核酸 探 针 或 是 抗体 (如 果 条 件 允 许 ) 进行 平板 筛选 实验 〈plaque screening assay)。 在 掌握 一 些 序列 相关 情况 时 ， 比 如 已 有 一 些 对 同一 基因 家 族 其 他 成 员 的 研究 或 是 基于 对 其 他 物种 内 同一 基因 的 了 解 ， 也 可 以 尝试 着 合成 引物 ， 用 PCR 的 方法 从 文库 中 筛 出 目的 基因 。 如 果 传 统 的 文库 筛选 和 /或 PCR 的 方法 都 不 能 成 功 地 从 文库 中 得 到 特定 基因 ， 那 么 可 以 重新 设计 探 针 、 引 物 ， 或 是 干 脆 构 建 一 个 新 的 CDNA 文库 。 一 个 cDNA 文库 的 用 途 和 意义 就 在 于 它 是 一 个 可 以 永久 保存 的 代表 着 细胞 在 裂解 那 一 瞬间 的 生化 记录 。

无 论 是 从 文库 或 其 他 途径 ， 一 旦 得 到 了 cDNA 序列 就 可 以 扩 增 作为 探 针 ， 用 于 North:- ern 或 Southern 分 析 、 核 酸 酶 保护 实验 、DNA 测序 及 其 他 很 多 实验 。 由 于 大 量 真 核 生物 基 因 组 处 在 转录 沉默 的 状态 ， 因 此 对 cDNA 进行 测序 就 是 一 种 确认 离散 位 点 和 度量 遗传 表达 的 惠 而 不 费 的 方法 。 新 发 现 的 cDNA 序列 不 断 地 增补 到 GenBank， 而 其 相关 信息 又 可 用 来 设计 PCR 引物 ， 这 极 大 地 促进 了 寻求 对 应 基因 组 DNA 等 更 深入 的 探索 。 除 此 之 外 ， 要 针 对 研究 中 所 提出 的 特定 问题 来 设计 实验 。 由 于 基因 表达 是 个 多 重 性 的 现象 ， 之 后 的 研究 可 能 涉及 以 下 列 出 的 这 些 领 域 (当然 不 仅 限 于 这 些 领 域 ) 。

D 确认 特定 实验 条 件 下 某 基 因 的 转录 起 始 位 点 (transcription start site, TSS). —

@ FFA RNA 干扰 技术 探索 某 基 因 的 确切 功能 。

G@) 针对 某 基 因 设 计 可 用 于 诊断 的 PCR 引物 。

由 从 基因 组 文库 中 搜集 DNA 片段 以 重 现 整 个 基因 。

@) 确认 该 研究 位 点 的 外 显 子 -内 含 子 的 结构 。

© 确定 hnRNA 的 剪接 模式 。

D DEAT Bie Be BE Mir SE AL DNA 足迹 实验 ， 分 析 该 位 点 侧翼 序列 中 潜在 的 调控 序列 和 蛋白 质 结合 位 点 。

@) 对 疑似 调控 序列 进行 点 突变 分 析 。

QD 进行 原 位 杂交 或 原 位 PCR， 确 认 表 达 该 目标 基因 的 细胞 的 组 织 分 布 。

QD 确认 该 基因 和 蛋白质 产物 在 细胞 内 的 分 布 情况 。

DD 为 临床 及 生物 物理 研究 ， 在 原核 和 真 核 蛋白 质 表达 系统 中 高 水 平 表达 该 基因 产物 。

吗 以 过 量 表达 的 方法 研究 该 基因 在 细胞 或 器 官 中 非 正常 表达 所 造成 的 影响 。

3) 使 用 报告 基因 对 推测 的 调控 元 件 进行 研究

OD 在 未 分 化 细胞 中 对 该 基因 进行 同 源 重组 ， 以 检查 该 位 点 在 发 育 和 分 化 中 的 作用 。

CD) 负责 地 构建 转基因 动物 ， 以 期 在 体内 产生 救生 药物 。

。 356 -

第 26 章 一 个 RNA 范例

26.4 HHILEZKEY

在 这 到 处 都 是 技术 的 年 代 ， 利 用 生物 信息 学 、email 以 及 所 有 网 上 能 找到 的 工具 ， 人 们 无 需 离 开 桌 前 就 可 以 轻易 地 搜索 文献 进行 大 量 的 背景 阅读 。PubMed 是 一 个 可 以 快速 获得 大 量 科技 文献 的 途径 ， 接 通 美 国 国家 生物 技术 信息 中 心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 网 站 (www. ncbi. nlm. nih. gov) 或 是 直接 在 浏览 器 中 键 人 www. pubmed. com 都 可 以 得 到 PubMed 的 资源 。

在 一 些 独特 的 基于 互联 网 的 BBS 上 ， 遇 到 难题 的 科学 家 们 可 以 贴 出 问题 以 期 得 到 读者 的 回答 。 但 是 ， 千 万 不 要 过 于 相信 你 看 到 的 东西 ， 尤 其 是 在 互联 网 上 。 定 期 访问 这 类 提问 回 答 式 的 网 站 ， 和 常 能 发 现 问题 总 是 不 成 比例 地 被 某 一 些 人 回答 了 ， 这 使 笔者 对 这 些 显然 是 有 大 把 空闲 时 间 的 人 的 观点 颇 为 怀疑 。

拨打 免费 电话 可 以 联系 到 大 多 数 生 物 技 术 公 司 的 技术 服务 部 门 ， 附 录 15 中 就 列 出 了 许 多 公司 的 联系 方式 。 你 可 以 尽量 利用 他 们 的 技术 服务 ， 在 产品 不 能 像 广告 所 说 的 那样 工作 时 要 求 替 换 。 并 且 ， 在 首次 购买 某 个 新 的 试剂 〈 盒 ) 时 ， 不 要 耻 于 与 公司 沟通 要 求 一 个 大 大 的 折扣 ， 因 为 这 能 使 实验 室 有 机 会 用 最 小 的 代价 尝试 一 些 新 的 东西 。 所 有 的 供应 商都 明白 ， 如 果 这 个 试剂 盒 的 效果 很 好 ， 显 然 以 后 客户 仍然 会 购买 这 个 试剂 盒 及 其 相关 的 产品 。 要 有 礼 有 节 。

更 让 人 愉快 的 是 大 多 数 供 应 商都 在 网 站 上 给 出 了 实验 流程 和 用 户 指 南 ， 基 本 都 是 . pdf 格式 。 那 些 靠 着 邮递 或 是 FAX 眼 巴巴 地 等 用 户 指南 的 日 子 一 去 不 复 返 了 。 考 虑 到 只 有 需要 的 恰当 的 产品 才能 提高 实验 室 的 产 出 ， 打 印 一 份 用 户 指 南 放 在 桌子 上 是 很 容易 事 。

”为 了 兴建 新 实验 室 ， 或 是 为 了 扩展 原 有 实验 室 的 操作 ， 甚 而 只 是 为 了 想 知 道 哪 一 个 供应 商 能 提供 什么 样 的 产品 ， 有 两 个 网 络 资源 都 是 很 好 的 。 一 个 是 www. biosupply. net， 你 几乎 能 在 这 儿 找 到 所 有 你 想 要 的 东西 。 尽 管 付 了 提名 费 的 公司 会 被 列 为 “重要 公司 ”， 但 是 只 要 有 这 个 产品 凡是 在 Biosupplynet 上 注册 过 的 供应 商都 会 被 列 出 。 另 一 个 颇 有 价值 的 网 络 资源 是 Linscott 免疫 和 生物 试剂 目录 Cwww. linscottsdirectory. com) 。 虽 然 使 用 这 两 个 收录 全 面 的 推荐 网 站 可 能 更 省 时 省 力 ， 当 然 你 也 可 以 在 搜索 引擎 里 键入 目的 产品 名 称 进行 查询 。

最 后 ， 有 些 公 司 致力 于 生物 技术 的 培训 。 这 些 公司 专门 从 事实 验 室 密集 性 操作 〈hands- on) 训练 。 大 多 数 此 类 研讨 会 由 那些 在 实验 桌 前 工作 、 拥 有 博士 资格 的 科学 家 负责 。 某 些 研讨 会 只 关注 某 一 特定 的 主题 ， 而 另 一 些 研 讨 会 则 就 众多 技术 进行 广泛 讨论 。 要 特别 指出 的 是 ，www. DNAtech. com 上 通常 会 列 出 一 些 杰 出 的 定期 召开 的 研讨 会 。

(QS; SHFR)

¢ 357 。

BBOACS

针对 各 种 各 样 的 研究 问题 ， 目 前 分 子 生 物 学 其 实 只 拥有 二 十 多 种 革新 性 的 标准 反应 。 其 中 大 部 分 都 已 在 本 书 中 一 一 论 及 。 掌 握 了 这 些 技术 ， 在 研究 中 可 发 挥 的 潜力 是 巨大 的 。 分 子 生物 学 并 不 只 是 应 用 试剂 盒 ， 而 是 要 计划 和 决定 如 何 最 好 地 利用 和 掌握 这 些 工 具 来 完成 预定 的 目标 。 深 思 熟 虑 设计 的 研究 策略 ， 以 合理 的 次 序 应 用 正确 的 技术 ， 最 终 将 决定 性 地 影响 研 究 结果 。 关 于 这 点 ， 请 记 住 笔者 所 说 的 分 子 生 物 学 的 5R 原则 : RR (rapid)、 有 代表 性 (representative) 、 可 重复 (reproducible), FG RNase 污染 (RNase-free) 、 可 信 (reliable).

@ 不 要 用 有 粉末 的 手套 。 粉 末 会 抑制 PCR， 增 加 膜 上 核酸 杂交 实验 的 背景 ， 引 起 混乱 。

@ 仔细 阅读 标签 。 就 像 人 们 不 愿意 服用 不 当 的 药物 一 样 ， 用 错 试剂 会 立刻 终结 你 的 实 验 。 所 以 ， 最 好 重复 阅读 标签 加 以 确认 。

G@) 准备 常用 缓冲 液 的 配方 卡片 。 在 试剂 短缺 或 是 必须 在 实验 中 间 快 速配 制 该 缓冲 液 时 ， 手边 备 有 这 样 一 张 卡片 就 可 以 节省 大 量 时 间 。

® 检测 制备 核酸 是 否 完整 ， 最 简单 的 方法 就 是 凝 胶 电 泳 。 取 少许 样品 做 一 个 微型 凝 胶 分 析 〈 如 7cmX8cm) 就 能 评估 该 样品 在 后 续 实 验 中 是 否 可 用 。 在 实验 过 程 中 可 用 系列 取样 来 检测 RNA 是 否 发 生 降 解 ， 变 性 是 否 完全 ， 是 否 有 效 地 反 转 录 成 cDNA 等 。

© 加 入 样品 后 ， 如 果 含 溴 酚 蓝 的 上 样 缓冲 液 从 蓝 色 变 成 了 绿色 ， 也 就 是 说 反应 管内 的 PH 发 生 了 很 大 改变 ， 样 品 的 完整 性 就 非常 可 疑 。

© 使 用 甲醛 作为 RNA 的 变性 剂 ， 千 万 要 注意 如 果 甲 醛 的 pH 小 于 4.0 时 ，RNA 会 快 速 降 解 。 记 住 在 每 次 使 用 甲醛 或 甲 酰胺 时 ， 取 出 要 用 的 部 分 进行 去 离子 处 理 〈 见 附录 7)。

© WEF FAW (DMSO) 和 乙 二 醚 作为 RNA 变性 剂 ， 尤 其 在 做 班 点 印迹 时 ， 记 住 DMSO 会 溶解 硝酸 纤维 素 膜 。

沉淀 下 来 的 RNA 对 管 壁 的 附着 不 如 DNA 那样 牢固 。 所 以 在 倒 去 上 清 液 时 ， 一 定 要 看 清楚 ， 保 证 RNA 不 被 倒 掉 。 也 可 以 将 上 清 液 收集 在 另 一 个 新 的 反应 管 里 ， 这 样 即使 RNA 沉淀 滑 出 试管 也 不 会 造成 丢失 。

D 吸取 微 升 级 的 溶液 后 ， 先 将 各 种 试剂 加 在 反应 管 接 近 底 部 而 非 管 底 的 内 壁 ， 再 短暂 离心 使 其 混合 。 这 样 ， 如 可 以 避免 因 毛 细作 用 而 引起 的 体积 误差 ， 也 容易 确认 是 否 确实 加 入 了 这 么 小 体积 的 溶液 。

QO 实验 室 所 有 母液 和 工作 溶液 的 标签 上 ， 除 标明 配制 日 期 外 ， 还 应 标明 过 期 日 期 。 使 用 前 务必 检查 是 否 过 期 。 使 用 过 期 溶液 的 严重 后 果 是 ， 会 在 无 意 中 引 入 由 生长 在 瓶 内 的 微 生

。358 。

尾 Fs

物 所 释放 的 RNase.

@ RNA 制备 过 程 中 除非 实验 方法 特别 注 明 ， 务 必 将 含有 样品 的 反应 管 放 置 在 冰 上 。 阅 读 实验 方法 确认 下 一 个 步骤 时 ， 要 记 住 先 把 样品 放 在 冰 上 。 连 续 抽 提 时 先 将 反应 管 预 冷 ， 也 会 很 有 帮助 。 记 住 低 温 可 部 分 抑制 核酸 酶 的 活性 。

QO 用 合理 的 方法 保存 核酸 ， 尤 其 是 RNA， 尽 量 保证 核酸 的 高 浓度 。 这 样 有 利于 进行 紫 外 分 光 光 度 测 定 和 以 后 的 稀释 。 并 且 因 为 管 底部 形状 各 异 ， 与 2. 2ml 管 或 更 大 的 Corex 管 相 比 ， 更 容易 从 1. 7ml 反应 管 中 用 最 小 体积 回收 小 量 的 RNA。

四 用 70% 乙 醇 清 洗 以 去 除 核酸 沉淀 中 的 盐 。 由 于 核酸 分 子 可 与 盐 形成 凝聚 物 ， 明 显 降 低 了 它们 在 乙醇 里 的 溶解 度 ， 因 此 这 一 步 清洗 是 相当 必要 的 。 管 底部 的 沉 汪 包 含 了 盐 和 核 酸 ， 用 70%% 乙 醇 既 可 除去 大 部 分 的 盐 又 不 足以 溶解 其 中 的 核酸 。 如 此 洗涤 2 一 3 次 之 后 ， 再 用 95%% 乙 醇 清洗 可 加 快 沉 淀 的 干燥 速度 。

@ 除非 实验 方法 特别 注 明 ， 不 要 使 核酸 沉淀 完全 和 干燥。 与 完全 干燥 的 核酸 样品 相 比 ， 略 含 乙醇 的 RNA 和 DNA 沉淀 更 容易 溶解 。

© 购买 重 蒸 过 的 葵 酚 (分子 生物 学 级 别 )。 茶 酚 的 重 蒸 过 程 很 危险 ， 而 高 级 别 的 重 蒸 茶 酚 可 从 很 多 供应 商 处 购 得 。 实 验 室 的 标准 程序 ， 就 是 到 货 后 将 苯酚 融 解 ， 分 装 成 25ml 的 小 份 ， 置 于 一 20 人 保存 直至 使 用 〈 附 录 3)。 这 样 可 以 避免 茶 酚 的 重复 冻 融 ， 而 有 利于 实验 。

© 在 用 有 机 溶剂 去 除 蛋 白质 抽 提 核 酸 的 过 程 中 ， 不 触及 中 间 层 的 蛋白 质 而 定量 回收 水 相 部 分 RNA 通常 是 比较 困难 的 。 在 取出 大 部 分 样品 之 后 ， 为 了 能 最 大 限度 回收 水 相 ， 可 以 将 反应 管 45 角 倾 斜 ， 使 剩余 的 水 相 部 分 靠近 管 壁 形成 液 泡 〈 图 1) 。 将 枪 头 沿 着 反应 管内 壁 滑动 并 刺 液 泡 ， 小 心 不 要 触及 中 间 层 的 蛋白 质 和 有 机 相 ， 吸 取 剩 余 的 水 相 部 分 。

图 1 有 机 溶剂 抽 提 时 定量 回收 水 相 材料 的 技术 。 注 意 对 眼睛 和 皮肤 进行 适当 防护

到 六 ”如 此 对 含有 有 机 溶剂 的 反应 管 进行 操作 需要 特别 小 心 。 应 该 对 眼睛 和 皮肤 进行 适当 防护 。

@ 用 苯酚 纯化 核酸 时 ， 最 后 需要 用 氯仿 或 氯仿 / 异 戊 醇 (24:1) 混合 物 再 进行 一 次 抽 提 。 由 于 苯酚 在 氯仿 中 的 溶解 度 极 高 ， 即 使 是 痕 量 的 残余 苯酚 ， 在 最 后 一 次 氯仿 抽 提 中 也 可 以 去 除 和 干净 。 需 要 进行 这 一 步 抽 提 ， 是 因为 葵 酚 的 氧化 产物 〈 苯 柄 ) 会 影响 核酸 样品 的 完 整 性 。

@ 使 用 有 机 溶剂 时 不 要 选用 聚 苯 乙 烯 制品 〈 如 离心 管 、 血 清 用 枪 头 )， 因 为 它们 会 溶 于 苯酚 或 氯仿 ， 很 难 从 样品 中 除去 。

© 检查 8- 葬 基 乙醇 和 超速 离心 管 的 塑料 类 型 是 否 兼容 。

© 通常 在 缓冲 液 内 加 入 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS) 以 控制 核酸 酶 的 活力 。 因 为 SDS 会 在 低温 下 析出 ， 许 多 操作 中 不 使 用 SDS 可 能 更 好 (SDS 钠 盐 尤 其 难 溶 );， 并 且 对 后 续 操 作 而

。 359 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

言 ， 痕 量 的 SDS 也 可 能 抑制 所 要 进行 的 反应 。 其 他 类 型 的 RNase 抑制 剂 如 RNasin FY fe 为 SDS 的 替代 物 。

@ 在 准备 含有 乙 三 胺 四 乙酸 (EDTA) 的 缓冲 液 或 试剂 时 ， 注 意 使 用 三 钠 盐 CNaz- EDTA) 而 非 四 钠 盐 (Nai-EDTA)。 因 为 很 多 分 子 生 物 学 中 的 酶 对 盐 浓度 非常 敏感 ， 扬 以 这 一 点 非常 重要 。 与 Naz-EDTA 相 比 , 用 Nai-EDTA 配制 的 缓冲 液 显 得 碱 性 更 大 ， 用 HCl 调节 pH 至 7 一 8， 将 使 NaCl 的 浓度 增高 ， 可 能 对 实验 结果 造成 负面 影响 。

@ 除了 RNase 与 RNA 的 纯化 有 关 之 外 ， 要 注意 重金 属 的 长 期 存在 也 会 导致 RNA 的 降 解 。 在 怀疑 发 生 这 种 问题 时 ， 可 以 用 Chelex (Bio-Rad) 过 滤 缓 冲 液 。 此 外 ， 使 用 8-FR EME 啉 〈 重 金属 的 鳌 合 剂 ) 也 可 以 部 分 抑制 RNase， 优 化 RNA 纯化 的 效率 。

四 使 用 特定 的 离心 管 离心 收集 核酸 沉淀 时 ， 注 意 不 要 超过 该 离心 管 的 推荐 转速 〈g) 。 在 按 比 例 放 大 或 缩小 RNA 纯化 规模 时 ， 因 为 方法 中 对 转速 Cg) 有 明确 要 求 ， 罗 其 需要 注 意 这 点 。 较 小 规模 操作 时 ， 基 本 都 使 用 聚 丙烯 微量 离心 管 ， 较 大 规模 操作 时 ， 可 选用 经 恰当 处 理 无 核酸 酶 污染 的 Corex 玻璃 管 ， 它 们 都 能 够 承受 沉淀 RNA 所 需 的 离心 力 。

四 没有 什么 统一 的 最 佳 储 存 条 件 。 不 同 用 途 对 RNA 或 DNA 的 质量 要 求 各 不 相同 。 在 不 清楚 适合 条 件 时 ， 纯 化 了 的 RNA 最 好 以 沉淀 状态 储存 在 一 80C 。 在 紫外 分 析 和 决定 样品 命运 之 前 ， 就 将 样品 溶解 在 缓冲 液 中 是 很 不 明智 的 。 重 复 冻 融会 显著 降低 样品 的 可 使 用 性 。 如 果 必 须 储 存 重 新 溶解 的 样品 ， 最 好 分 装 后 一 80C 储藏 。

@) 如 果 测 得 的 Azxso/Azso 低 于 1.65， 这 通常 表明 样品 有 蛋白 质 污染 ， 因 为 蛋白 质 的 最 大 光 吸 收 在 280nm。 这 也 可 能 是 残余 的 苯酚 造成 的 ， 可 以 再 用 氯仿 抽 提 一 次 ; RNA 沉淀 溶解 不 完全 时 也 可 能 导致 这 种 情况 发 生 。

2 从 含有 DNA 的 裂解 液 中 回收 RNA Bt, pH 低 于 6.0 的 有 机 溶剂 抽 提 会 驱使 DNA 停 留 在 水 相 - 有 机 相 的 界面 。 用 这 种 方法 纯化 的 RNA 几乎 肯定 是 含有 基因 组 DNA 的 。 用 DNase 工 处 理 样品 是 必要 的 步 又， 尤其 是 将 要 用 作 PCR 相关 操作 的 时 候 。

@ 和 通常 看 法 不 同 的 是 ， 在 一 个 杂交 盒 内 同时 进行 几 张 膜 的 杂交 并 没有 什么 不 妥 。 只 要 有 足够 多 的 缓冲 液 能 保证 膜 与 膜 不 贴 在 一 起 ， 并 且 每 张 膜 都 能 在 杂交 盒 内 随 着 播 床 的 节奏 自如 摇动 (水平 摇 床 是 一 个 不 错 的 选择 ) ， 两 张 或 多 张 膜 是 不 会 互相 影响 的 。

四 准备 用 X 射线 片 记 录放 射 自 显影 和 化 学 发 光 前 ， 先 确认 其 线性 范围 。 做 斑点 印迹 时 ， 每 个 样品 多 做 几 个 稀释 梯度 ， 这 样 ， 解 释 数 据 时 就 能 更 精确 。 可 以 通过 改变 曝光 时 间 来 改善 与 底片 曝光 的 线性 范围 ， 并 可 凸现 样品 之 间 的 差别 。

四 为 了 永久 记录 分 子 量 标准 在 X 射线 片上 的 位 置 ， 可 以 标记 少量 分 子 量 标准 的 探 针 与 之 进行 杂交 。 这 样 就 不 用 花 时 间 去 猜测 分 子 量 标准 和 样品 之 间 的 相对 位 置 。

GO 所 有 化 学 制品 都 是 有 潜在 毒性 的 。 个 人 应 接受 实验 室 技 术 和 安全 操作 培训 ; 与 分 子 生物 学 相关 的 许多 常规 操作 都 有 内 在 的 危险 性 ， 所 以 要 遵守 试剂 或 设备 制造 商 提供 的 安全 操 作 、 控 制 ， 以 及 个 人 安全 保护 建议 。

GD 保存 好 危险 化 学 试剂 附带 的 材料 安全 数据 表 Cmaterial safety data sheet, MSDS). 让 实验 室 所 有 成 员 熟 悉 这 些 成 分 的 潜在 危险 。 这 些 数据 单 上 也 描述 了 万 一 事故 发 生 时 如 何 进 行 恰当 急救 的 方法 。

OD 每 次 打开 新 包装 时 ， 要 检查 酶 和 其 他 反应 成 分 。 没 有 活性 的 酶 只 能 造成 一 个 后 果 ， 没有 结果 !

BD 为 多 个 反应 配制 总 反应 液 时 ， 再 额外 多 配 一 个 反应 体积 。 以 防 万 二 微量 移 液 器 有 小

。 360 -

尾声

小 误差 ， 这 是 能 确保 有 足够 总 反应 液 的 标准 做 法 。 这 种 操作 适用 于 cDNA 总 反应 液 〈 第 一 链 和 第 二 链 ) 和 PCR 总 反应 液 的 配制 。

@) fi cDNA 和 了 PCR 相关 实验 时 ， 要 养 成 制备 总 反应 液 的 习惯 。 这 在 做 差异 显示 PCR 和 定量 分 析 时 显得 尤为 重要 。 即 使 是 最 细微 的 如 微 升 反应 体积 或 是 纳 摩 尔 浓 度 上 的 差别 ， 都 会 对 最 终结 果 的 精确 度 造 成 巨大 的 负面 影响 。

国 确认 酶 的 终 浓 度 。 分 子 生 物 学 使 用 的 酶 通常 储存 在 60%% 甘油 里 。 一 个 反应 所 使 用 的 酶 体积 应 不 超过 总 体积 的 5% 。 超 过 这 一 比例 ， 酶 就 不 能 发 挥 最 佳作 用 。

@) 使 用 REDTaq (Sigma) 时 ， 要 确保 : 酶 确实 加 入 反应 管 中 了 ;， 确认 酶 与 反应 液 混 合 WAT .

GC) 使 用 带 有 热 盖 的 PCR 仪 来 优化 PCR 比较 容易 ， 因 为 可 以 用 小 反应 体积 ， 省 略 了 加 矿物 油 的 步骤 ， 可 以 做 很 多 个 样品 。 并 且 ， 许 多 研究 者 声称 加 了 矿物 油 的 反应 体积 还 是 会 明 显 减少 。

G8 不 要 把 微量 离心 管 储 存在 液 氮 里 。

@ 绝对 不 要 用 嘴 来 使 用 移 液 管 ， 要 戴 防 护 镜 。

© 在 实验 室 要 注意 恰当 穿戴 ， 不 穿 有 和 孔 的 牛仔 ， 不 披 散 长 发 ， 不 面部 穿刺 ， 不 穿 拖 娃 ， 不 穿 露 脚趾 的 鞋 。 并 且 穿 工作 服 。

(QFE; 刘 望 表 校 )

。 361 。

附录 1 保存 完整 和 准确 的 记录

保存 完整 和 准确 的 实验 记录 是 十 分 必要 的 。

保持 良好 记录 的 技巧 ， 比 科学 研究 中 任何 其 他 方面 对 研究 的 影响 都 更 加 巨大 。 念 许多 研 究 生 都 大 为 惊讶 的 是 ， 实 验 室 里 的 一 些 结果 往往 得 益 于 那些 失败 实验 的 记录 ， 当 时 它们 很 好 地 记录 了 与 研究 相关 的 事件 。 准 确 而 有 价值 的 记录 ， 不 但 是 连续 工作 的 重要 组 成 部 分 ， 而 且 也 是 已 完成 工作 的 唯一 证 据 ， 以 及 显示 数据 每 一 个 部 分 产生 次 序 的 唯一 场所 。

对 于 开始 研究 实践 的 学 生 ， 他 们 的 大 学 生 时 期 比 他 们 的 研究 生 时 期 明显 重要 。 平 时 ， 实 验 室 研究 最 初 可 能 涉及 的 东西 ， 是 一 些 令 人 生 厌 的 零碎 小 工作 ， 往 往 最 先 摆 在 学 生 们 面前 的 是 必须 做 好 记录 。 虽 然 实验 室 高 级 管理 者 的 要 求 当时 看 起 来 似乎 没有 什么 意义 ， 但 是 ， 总 有 一 天 那些 看 来 无 用 的 信息 一 定 会 被 用 到 的 。 笔 者 的 意见 是 ， 记 录 很 多 比 让 任何 事情 留待 想象 要 好 得 多 。

实验 室 领 导 者 的 责任 是 修正 带 进 实验 室 的 坏 习 惯 ， 防 止 实验 室 新 成 员 带 进 任何 有 关 记 录 的 坏 习惯 以 及 低劣 的 实验 室 技术 。 下 面 列 出 了 人 们 在 研究 工作 中 应 当 遵循 的 规则 。 它 不 包括 所 有 的 细则 ， 应 当 修正 以 适合 委托 人 和 实验 室 成 员 的 要 求 。

O 实验 一 开始 ， 就 要 记录 每 个 正在 进行 实验 的 各 个 方面 的 情况 。 不 要 依赖 记忆 数据 ， 也 不 要 等 到 一 天 结束 后 才 记 录 每 一 件 事 。

@ 不 要 将 实验 过 程 和 数据 写 在 小 纸 片 上 。 所 有 这 类 “固定 ”的 纸 片 往往 会 放 错 地 方 或 者 丢失 。 这 类 数据 也 可 能 会 被 错 放 到 记录 本 的 其 他 部 位 。

@ 如 果 可 能 ， 实 验 室 的 记录 应 当 保存 在 计算 机 里 ， 而 且 数据 应 当 每 天 输入 。

© 记录 清晰 是 极其 重要 的 。 如 果 读 者 单 靠 记 录 本 不 能 准确 理解 和 重复 实验 过 程 ， 即 使 用 标点 符号 修饰 的 复杂 句 型 来 记录 实验 过 程 也 是 无 益 的 。

@ 不 要 担心 那些 没有 达到 或 没有 全 部 达到 预期 结果 的 实验 。 但 是 ， 必 须 把 实验 中 每 一 件 事 都 记录 下 来 。 往 往 可 以 通过 详细 排查 失败 的 原因 收集 到 有 用 的 信息 。 就 像 生活 中 随处 可 遇 到 的 一 样 ， 在 实验 室 也 可 以 从 错误 中 学 习 。

© 专业 实验 室 的 记录 本 是 装订 成 册 并 且 每 一 页 都 编码 的 。

@ 在 记录 实验 程序 和 数据 时 ， 日 期 书写 在 每 一 页 的 上 方 。

@ 在 每 一 个 新 的 实验 开始 时 写 几 句 话 ， 为 实验 提供 合理 的 诠释 和 确实 的 参考 ， 或 者 提 醒 要 注意 到 对 新 实验 有 用 的 以 前 的 实验 或 样品 。

@ 要 记录 每 一 种 新 试剂 、 试 剂 盒 或 其 他 化 学 品 的 批号 ， 这 些 对 正在 进行 的 研究 有 用 。 现在 许多 供应 商都 提供 公司 产品 相关 数据 的 说 明 书 ， 这 些 纸 片 很 容易 粘贴 在 记录 本 的 当前 页 *，362 -

附 录

上 作 进 一 步 参 考 用 。 有 效 期 也 应 当 记 录 下 来 。

@ 实验 室 的 记录 应 当 结 合计 划 定 期 评审 ， 检 查 这些 记 录 的 完整 性 及 易 理 解 性 。 如 果 需 要 ， 可 以 进一步 提出 如 何 改 善 记录 的 建议 。

@ 如 果 数 据 用 手记 录 在 实验 室 记 录 本 上 ， 只 能 用 黑 墨 水 。 这 是 行业 标准 。 最 近 流 行 莹 光 笔 和 彩色 油 质 墨水 ， 它 们 难以 阅读 并 且 很 不 专业 ， 应 当 避 免 。

© 如 果 手 写 体 较 差 ， 应 当 用 印刷 体 书写 。

图 决 不 可 以 在 实验 室 记 录 本 上 使 用 修正 液 或 者 橡皮 抹 去 字句 。 如 果 需 要 更 改 ， 记 录 者 应 当 在 不 正确 的 字句 处 画 线 并 签名 ， 简 要 写 明 变更 的 结果 。

D 决 不 可 以 从 记录 本 上 撕毁 和 转移 记录 纸 。

@ 田 对 于 有 激情 的 研究 者 而 言 ， 没 有 任何 一 条 是 可 以 替代 的 。

附录 2 储 存 滚

(1) AE 缓冲 液 50mmol/L 乙酸 钠 10mmol/L EDTA 调节 pH 25.3; 高 压 灭 菌 (2) 青霉素 (1000X) 100mg/ml 水 溶液 过 滤 除 菌 〈0. 22xm) ; 428, RAFF —20°C (3) 变性 缓冲 液 〈 用 于 DNA 印迹 法 ) 0. 5mol/L NaOH 1. 5mol/L NaCl 当心 不 要 高 压 灭 菌 。 (4) Denhardt 洲 液 (50X) 1% 牛 血清 白 蛋 白 (BSA) 1% Ficoll 1% FZ Heit oS GEA] (PVP) 过 滤 除 菌 〈0. 22um); 248, RAFF —20°C (5) DEPC- 水 〈 二 乙 基 焦 碳酸 酯 处 理 的 水 ) TL “7k” i (6) DNA (5¢ YR) 10mg/ml 水 溶液 煮沸 并 用 18 号 注射 针头 前 切 分 装 并 保存 于 一 20YC 使 用 前 再 煮沸 (7) Naz-EDTA (500mmol/L) ( 乙 二 胺 四 乙酸 二 钠 盐 ) {KF pH7. 5 时 不 能 溶解 用 10mol/L NaOH 或 者 NaOH 颗粒 调节 至 最 终 pH 为 8.0 高 压 灭 菌 ， 保存 于 室温 (8) Wk « 363 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

10mg/ml 溶 于 无 菌 水 中 当心 BARD. 用 铝 箱 包 庄 保存 于 4C (9) GTC 〈 亦 称 为 溶液 D) Ci ARNO 4mol/L Mi HAR A 5mmol/L te Ri, pH 7.0 0.5% N-+— ese WAR . fe 分 装 ， 置 于 铝 销 包 庄 的 瓶 中 ，4'C 保存 使 用 前 加 入 100mmol/L 8ME 当心 ”是 极 强 的 破 膜 试 剂 。 (10) 杂交 缓冲 液 根据 需要 有 多 种 不 同 配方 详情 参见 第 14 章 (11) LB (Lauria-Bertani) 培养 基 每 升 : 10g REAM

5g 酵母 抽 提 物

10g 氧化 钠 用 1molL NaCl 调节 pH 至 7.4 高 压 灭 菌 ， 用 无 菌 技 术 分 装 (12) 上 样 缓冲 液 0x) 50%% 甘 油 10mmol/L EDTA，pH8.0 0.25% 溴 酚 蓝 有 许多 不 同 的 配方 分 装 ， 每 个 包装 1ml, 保存 于 一 207C (13) MOPSL3-(CN- 吗 啉 代 )- 丙 磺 酸 ] 缓 冲 液 (10X) 200mmol/L MOPS, pH7. 0 50mmol/L 乙酸 钠 10mmol/L Naz-EDTA，PpPH8.0 过 滤 除 菌 或 者 高 压 灭 菌 ; 室温 保存 (14) NaCl (饱和 ) (Ube) 用 足 量 的 NaCl 制 成 6mol/L 的 水 溶液 需要 时 高 压 灭 菌 (15) NaOH (10mol/L) 将 40g NaOH 颗粒 加 入 60ml 7k 加 水 至 100ml Si 产 热 剧烈 ; 即使 冷却 后 也 不 要 高 压 灭 菌 ; 是 腐蚀 性 极 强 的 碱 。 (16) 中 和 缓冲 液 〈 用 于 DNA 印迹 法 ) 0. 5mol/L Tris, pH8. 0

- 364 -

We c

A ied (3

1. 5mol/L NaCl fra Se EY fey He OK Bad BC a UE BR (17) NP-40 裂解 缓冲 液 140mmol/L NaCl 1. 5mmol/L MgCl: 10mmol/L Tris, pH 8.5 0.5% NP-40 可 选择 : 在 使 用 前 加 RNase 抑制 剂 (18) PBS (phosphate buffered saline， 磷 酸 盐 缓 冲 生 理 盐水 ， 无 Ca2+ /Mg2+ ) 每 升 : 8g NaCl 0. 2g KCl 1. 44g Naz HPO, 0. 24g KH2 PO, 分 装 并 高 压 灭 菌 (19) AM 〈 饱 和 ) 说 明和 方案 见 附录 3 (20) 磷酸 盐 缓冲 液 (10mmol/L, NazHzPO4,pH7.0) (电泳 缓冲 液 ) 每 升 :， 39ml lmol/L NaHPO， 61ml 1mol/L Naz HPO, 检查 pH Hal 3 AAR BL 分 装 并 高 压 灭 菌 (21) SDS (10%) 〈 十 二 烷 基 硫酸 钠 ) 将 10g SDS 加 入 80ml 无 菌 水 中 当心 ”不 要 吸入 SDS 粉末 。 加 水 至 100ml 室温 保存 不 要 高 压 灭 菌 (22) SSC (20X) (saline sodium citrate， 柠 檬 酸 钠 生 理 盐水 ) 3mol/L NaCl 0. 3mol/L 柠檬 酸 钠 用 lmol/L HCl 调节 pH # 7.0 高 压 灭 菌 ， 室 温 保存 (23) SSPE (20X) (saline sodium phosphate-EDTA， 磷 酸 钠 -EDTA 生理 盐水 ) 3mol/L NaCl 0. 2mol/L NaH2PQ,; * H2O 0. 02mol/L Naz-EDTA vi pH 4 7.4 (24) TAE (50X) (Tris- 乙 酸 盐 -EDTA)

”365 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法 tan 9) oe 1g este Or

每 升 : 242g Tris 碱 100ml 0. 5mol/L Naz-EDTA, pH8. 0 57. lml KAR 〈 小 心 操作 ) 高 压 灭 菌 ， 工作 浓度 为 1X 工 AE (25) TBE (20X) (Tris- 硼 酸 盐 -EDTA) 每 升 : 121g Tris 碱 61. 7g 硼酸 钠 7. 44g Naz-EDTA 高 压 灭 菌 ， 工作 浓度 为 1X 工 BE (26) TE 缓冲 液 〈 商 用 ) 10mmol/L Tris, pH7. 5 lmmol/L EDTA 高 压 灭 菌 ;， 室温 保存 调节 pH 2 8.0 用 于 DNA 保存 (27) TE pw CLE) 10mmol/L Tris, pH7. 5 0. lmmol/L EDTA 高 压 灭 菌 ; 室温 保存 调节 pH 至 8.0 用 于 DNA 保存 (28) TE-9 缓冲 液 500mmol/L Tris, pH9. 0 20mmol/L EDTA 10mmoal/L NaCl 高 压 灭 菌 ; 室温 保存 (29) WAR (1000x) YF 70%2H, 12. 5mg/ml Ain 过 滤 除 菌 (0. 22ym) 9) Be Tt Be» TRAE F — 20°C (30) Tris (1mol/L) 称 出 足 量 的 Tris 用 于 制备 lmol/L 储备 液 ， 用 2/3 左右 体积 的 水 溶解 调节 至 要 求 的 PH， 加 水 至 终 体积 注意 Tris MA Tris-Cl 的 pH 调节 不 同 。 需要 时 高 压 灭 菌 (31) Tris/SDS 缓冲 液 100mmol/L NaCl Immol/L EDTA 10mmol/L Tris, pH8.5 高 压 灭 菌 ; 然后 加 0.5% SDS 保存 于 室温 (32) 7K (DEPC 处 理 ; 无 RNase) ° 366 。

附 录

实验 室 级 别 的 水 〈 去 离子 /蒸馏 ) 中 加 入 DEPC 至 终 浓 度 为 0.05% 一 0.1% OKRA BO). PETE PURE He tie HE BU) A Be He HE GT a FE a LE RPE 30min 以 上 ， 高 压 灭 菌 以 破坏 DEPC, 当心 DEPC 是 致癌 物质 。 注 意 厂 家 推荐 的 安全 说 明 。 不 要 把 DEPC 加 到 任何 含 氨基 的 溶液 中 。 详 情 见 第 4 章 。 (33) YPD 培养 基 〈 酵 母 培 养 基 ) 每 升 : 10g 酵母 抽 提 物 20g HA KK 20g 葡萄 糖 分 装 并 高 压 灭 菌

附录 3 末 酚 的 制备

当心 ”苯酚 和 和 氨 仿 都 是 挥发 性 的 、 腐 蚀 性 的 试剂 。 在 处 理 使 用 这 类 有 机 溶剂 时 必须 注 意 安全 ， 要 使 用 一 次 性 手套 、 防 护 眼 镜 以 及 通风 橱 。

苯酚 在 所 有 分 子 生 物 学 应 用 前 都 必须 纯化 或 重 蒸 。 很 容易 从 所 有 主要 的 分 子 生 物 学 试剂 供 货 商 那里 以 非常 合理 的 价格 购 得 重 蒸 苯酚 。 在 实验 室 里 重 蒸 苯酚 是 一 个 非常 危险 的 程序 ， 应 当 由 有 经 验 的 实验 人 员 来 完成 。 即 使 那样 ， 这 将 是 非常 使 人 气 包 的 工作 。 有 关 实 验 室 中 蒸 馏 茶 酚 的 详情 可 以 在 别处 找到 (Wallace，1987) 。

在 本 实验 室 ， 标 准 程序 是 购买 分 子 级 〈 即 重 蒸 的 ) 的 苯酚 ， 分 装 成 合适 大 小 的 包装 ， 用 铝 箱包 庄 ， 冷 冻 保 存 ; 每 一 份 葵 酚 必须 直到 首次 使 用 前 再 进行 饱和 。

苯酚 光敏 性 很 强 并 且 能 迅速 氧化 。 氧 化 产物 称 葵 醒 。 它 形成 游离 基 ， 能 打 断 磷酸 二 酯 键 并 和 核酸 交 联 。 茶 醒 通 常 可 以 使 酚 试 剂 产生 浅 桃 红色 ， 可 根据 颜色 来 检查 它 的 存在 。 为 了 降 低 葵 酚 氧 化 的 速率 , 可 以 在 缓冲 液 饮 和 的 苯酚 中 加 入 8- 羟 基 唆 啉 〈 见 第 5 章 )。 此 外 ， 在 有 机 抽 提 缓冲 液 的 制备 中 加 入 等 体积 的 氯仿 ， 可 以 稳定 苯酚 ， 加 大 混合 物 密 度 ， 改 善 从 样品 中 去 除 蛋白 质 的 有 效 性 ， 并 且 可 以 在 RNA 制备 中 促进 脂肪 的 去 除 。 往往 会 在 氯仿 或 苯酚 -氯仿 混合 物 中 添加 异 戊 醇 ， 异 戊 醇 通常 可 以 减少 在 大 多 数 抽 提 过 程 中 伴随 产生 的 蛋白 质 泡 沫 。 按 此 方法 制备 的 饱和 苯酚 试剂 称 为 抽 提 缓冲 液 。 通 常 ， 有 机 抽 提 缓冲 液 的 组 成 是 苯酚 : 氯仿 : 异 成 醇 (25 : 24:1),

举例 : 购买 的 重 蒸 葵 酚 通常 是 500g/ 瓶 。 实 验 室 收 到 葵 酚 后 ， 在 通风 橱 内 65C 水 浴 融 化 。 然 后 用 消毒 的 玻璃 移 液 管 把 最 多 25ml 的 葵 酚 转移 到 50ml AREA RA CRA REE REZ MS) 中 或 者 100ml RR GSMA 50ml EH) 中 。 然 后 ， 分 成 若干 份 ， 密 封 ， 用 铝 稍 包 庄 ， 保 存 于 一 207C 。 这 样 可 避免 不 用 的 苯酚 被 反复 冻 融 。 制 备 使 用 的 苯酚 试剂 时 ， 取 一 份 苯酚 一 次 融化 ， 然 后 可 按 这 里 描述 的 方法 或 者 按 规范 的 制备 程序 饱和 葵 酚 。 如 果 要 制备 50ml 抽 提 缓冲 液 ， 那 么 取 12. 5ml 融化 的 苯酚 放 人 50ml 的 管 中 ， 进 一 步 操 作 并 冷冻 保存 。

为 了 制备 抽 提 缓冲 液 ， 融 化 茉 酚 , 加 入 等 体积 的 Tris 缓冲 液 〈 见 后 述 ) 饱和 ， 管 中 的 体积 大 约 是 25ml。 通 常 接 下 来 加 入 等 体积 〈25ml) 氯仿 : RM (24 : 1) 混合 物 。 这 样 将 得 到 50ml 饱和 的 抽 提 缓冲 液 ， 它 适合 于 许多 应 用 。 这 时 ， 可 加 入 SHE, RUE HK 0.1% (1g/L); 抽 提 缓冲 液 就 这 样 可 以 使 用 了 。 这 个 基本 策略 可 以 用 于 任何 体积 抽 提 缓冲 液 的 制备 。 为 了 方便 起 见 ， 可 以 从 Sigma 公司 购买 到 饱和 葵 酚 和 现成 的 抽 提 缓冲 液 〈 货 号 分 别 是 Cat. Nos. P-4557 和 P-3803) 。

。 367 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

3.1 茶 酚 的 饱和

苯酚 的 饱和 有 两 种 标准 方法 ,每 一 种 方法 的 标题 下 又 有 若干 种 改良 的 方法 。 这 些 方法 中 的 一 种 是 Tris 饱和 ， 实 验 室 里 用 它 来 制备 并 保持 已 知 pH 的 饱和 葵 酚 储备 液 ,或 者 将 它 用 于 某 个 特定 的 方案 ， 在 使 用 前 制备 一 种 具有 特定 pH 的 含 葵 酚 的 抽 提 缓冲 液 。 这 里 特别 要 注意 到 ， 苯 酚 氧 化 的 速率 随 着 pH 的 增高 而 增高 。 所 以 ，pH 大 于 8.0 的 苯酚 缓冲 液 应 当 在 每 次 使 用 前 新 鲜 制 备 。 酸 性 pH 平衡 的 也 和 葵 酚 缓冲 液 ， 如 果 用 铝 稍 包 庄 并 4C 保 存 ， 可 以 认为 I~ 周 内 是 稳定 的 。 另 一 种 方法 是 水 饱和 ，, CAS MAD WH ele pH 要 求 不 严格 的 场合 。 一 般 情 况 下 葵 酚 决 不 能 用 水 饱和 ，, 除非 是 特定 方案 的 特殊 需要 。 用 水 饱和 时 ， 通 常 将 葵 酚 与 一 定 体积 的 适当 的 缓冲 液 〈 例 如 乙酸 钠 ，pH 4.5; Chomczynski 和 Sacchi, 1987; 见 第 5 章 ) 混合 达到 有 机 相 的 最 终 pH 值 。 明 智 的 做 法 是 仅仅 制备 特定 实验 需要 量 的 抽 提 缓冲 液 ， 剩 余 的 缓冲 液 ， 按 照 实 验 室 关于 有 机 垃圾 的 处 置办 法 处 理 。

饱和 苯酚 的 pH 选择 主要 取决 于 分 离 的 是 DNA BERNA, 极其 重要 的 原则 是 ， 在 葵 栈 裂解 物 中 ， 核 酸 在 水 相 和 有 机 相 中 的 分 配 完 全 是 pH 依赖 的 。 在 酸性 pH AT, RA@ RNA 保 留 在 水 相 ; 而 在 碱 性 pH 时 ，RNA 和 DNA 两 者 都 保留 在 水 相 (Brawerman 等 ，1972) 。 如 pH 小 于 5.5 时 ，DNA 选择 性 地 保留 在 有 机 相 和 界面 ， 而 RNA 可 以 从 水 相 有 效 回收 。 这 种 方法 的 一 个 关键 性 的 优点 是 ， 酸 性 pH 时 核酸 酶 的 活性 下 降 。 另 外 ， 如 果 DNA 是 抽 提 的 靶 YF. WATER RAY pH 调节 到 7.5 以 上 ， 这 是 工业 标准 。 此 外 ， 接 近 中 性 pH FG, 可 以 非常 有 效 地 、 安 全 地 防止 样品 的 过 度 脱 味 叭 作用 。

有 机 溶剂 平衡 到 合适 的 pH， 也 直接 与 茶 酚 是 单独 使 用 还 是 与 氯仿 和 /或 异 戊 醇 结 合 有 关 。 例 如 ， 用 酸性 pH 的 葵 酚 抽 提 裂解 液 ， 会 引起 RNA (和 DNA， 如 果 存 在 ) 脱 味 吟 ， 还 有 poly(A) mRNA 可 能 会 损失 在 有 机 相 。 在 裂解 缓冲 液 和 /或 抽 提 缓冲 液 中 分 别 加 入 SDS 或 氯仿 ， 或 者 两 者 同时 加 入 ， 即 可 以 避免 这 种 现象 发 生 。

3.2 程序 1: Tris 饱和

当心 ” 全 过 程 必 须 戴 手套 和 防护 眼镜 。

在 65C 水 浴 中 完全 融化 适量 的 重 蒸 苯酚 。

@ 加 入 等 体积 的 lmol/L Tris, pH 8.0 (或 者 按照 实际 要 求 的 pH) 。 另 一 种 可 选择 的 方 法 是 ， 葵 酚 用 TE 缓冲 液 (10mmol/ML Tris, pH 8.0;，lmmol/L EDTA) 或 者 Tris-SDS 缓冲 液 〈100mmol/L NaCl; Immol/L EDTA; 10mmol/L Tris-Cl, pH 8.5; 0.5% SDS) 平衡 ， 无 论 如 何 ， 都 是 用 等 体积 的 缓冲 液 饱 和 。

G@) 小 心 混合 ， 让 两 相 完 全 分 离 。 可 以 用 台式 离心 机 简单 离心 以 加 速 两 相 的 分 离 ，

由 观察 底层 的 酚 相 确认 它 是 无 色 的 。 任何 着 色 的 苯酚 ， 特 别 是 略 带 桃红 色 的 ， 是 因为 有 葵 醒 存在 而 应 当 丢 弃 。 酚 相 的 体积 应 当 大 于 上 层 水 相 ， 因 为 水 相 中 的 某 些 成 分 优先 吸收 到 酚 相 中 了 。

@ 移出 并 弃 去 上 层 水 相 ， 保 留 酚 相 ， 加 入 等 体积 的 100mmol/L Tris 或 者 其 他 Tris 组 冲 液 ， 调 节 pH 与 步骤 @D 中 的 相同 。

@ 小 心 混合 ， 让 两 相 完 全 分 离 。 可 以 用 台式 离心 机 简单 离心 以 加 速 两 相 的 分 离 。

O 移出 大 部 分 上 层 水 相 并 测量 它 的 PH。 如 果 水 溶液 的 pH 大 于 7.5， 认 为 苯酚 已 经 Tris HA, WOR. WR pH 小 于 7.5, HERS MERO.

- 368 -

Mt 录

饱和 苯酚 用 铝 稍 包 庄 保存 于 4"C 。 如 果 需 要 ， 可 以 与 等 体积 的 氯仿 : BME (24 : 1) 和 0.1% (lg/L) 8- 产 基 唆 啉 混合 。

3.3 程序 2: 水 饱和

当心 ”全 过 程 必须 戴 手 套 和 防护 眼镜 。

@ 在 65C 水 浴 中 完全 融化 适量 的 重 蒸 苯酚 。

@ 加 入 等 体积 的 消毒 蒸馏 水 。

@ 在 使 用 前 让 两 相 完 全 分 离 。 可 以 用 台式 离心 机 简单 离心 ， 以 加 速 两 相 的 分 离 。

由 弃 去 上 层 水 相 或 者 与 苯酚 一 起 保留 在 管 中 以 作为 饱和 的 证 据 。

© 饱和 苯酚 用 铝 稍 包 庄 保 存 于 4C 。 如 果 需 要 ， 可 以 与 等 体积 的 氯仿 : ME (24 : 1) 和 0.1% (1g/L) 8- 羟 基 唆 啉 混合 。

3.4 参考 文献

Brawerman, G., Mendecki, J., and Lee, S. Y. (1972). A procedure for the isolation of mam- malian messenger ribonucleic acid. Biochemistry 11, 637.

Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156.

Wallace, D. M. (1987). Large- and small-scale phenol extractions. Methods Enzymol. 152, 33.

附录 4 BEC HEA SYBR 绿 溶液 的 处 置

常用 于 凝 胶 中 核酸 染色 的 省 化 乙 锭 CEtBr), SYBR 绿 和 类 似 的 染料 都 是 极 强 的 诱 变 剂 (MacGregor 和 Johnson，1977) 。 作 为 插入 试剂 和 与 核酸 结合 的 染料 ， 它 们 应 当 作 为 毒性 废 FORKS; 适当 的 处 理 涉 及 防止 环境 污染 。 只 有 在 适当 的 处 理 后 ， 沾 染 省 化 乙 锭 和 SYBR 绿 的 污 物 才 能 放心 地 装 钒 处置。

很 多 常见 的 出 版 物 都 详细 描述 了 省 化 乙 锭 废弃 物 的 处 理 方法 (Lunn 和 Sansone, 1987, 1990; Bensaude，1988) 。 现 在 已 不 推荐 在 省 化 乙 锭 废弃 物 中 加 漂白 粉 的 曾 广泛 使 用 的 处 理 方法 ， 因 为 这 种 方法 虽然 降低 了 省 化 乙 锭 的 诱 变性 ， 但 将 这 种 染料 转变 成 了 另 一 种 诱 变 剂 (Quillardet 和 Hofnung，1988) 。 作 为 替代 方法 ， 必 须 接受 下 述 任何 一 种 方案 作为 实验 室 处 FIR CHEM SYBR 绿 的 标准 方案 。 它 们 处 理 的 工作 浓度 为 : 省 化 乙 锭 0.5 一 1. Ong/ml,

附 图 4-1 从 电泳 和 染色 缓冲 液 中 除去 省 化 乙 锭 和 SYBR 绿 的 抽 提 器 过 滤 装 置 。 照 片 由 Schleicher & Schuell Bioscience 公司 提供 。 369 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

抽 提 器 除去 了 99% 的 省 化 乙 久

未 处 理 的 缓冲 液

残存 EtBr 谊 度 /(ng/ml)

8 过 滤 体 积 代 附 图 4-2 含 500ng/ml 溴 化 乙 锭 缓冲 液 成 功 滤 过 抽 提 器 的 体积 CL). 滤液 中 残存 省 化 乙 锭 的 浓度 用 荧光 分 光 光 度 计 测 定 。 数 据 由 Schleicher & Schuell Bioscience 公司 提供

SYBR 绿 1X 一 4X 。 超 过 此 浓度 的 染料 ， 可 以 稀释 后 用 下 述 方案 处 理 。

4.1 AR1

该 方案 是 用 抽 提 器 (Schleicher 和 Schuell; Cat. No. 448031) 处 理 桨 凝 胶 废 液 ， 一 步 除 去 溴 化 乙 锭 和 SYBR 绿 的 方案 WA 4-1) 。 该 装置 一 次 可 以 过 滤 10L 含 省 化 乙 锭 的 电泳 组 冲 液 ， 去 除 率 大 于 99%% 〈 附 图 4-2)。 抽 提 器 内 充填 活性 炭 ， 可 根据 厂家 的 说 明 使 用 。 过 波 后 的 废 液 可 以 安全 地 排 人 下 水 道 。 这 是 一 种 处 理 此 类 废弃 物 的 昂贵 而 有 效 的 方法 ， 在 分 子 生 物 学 实验 室 中 使 用 很 广泛 。

4.2 辅助 方案

过 滤 后 废 液 中 残存 省 化 乙 锭 的 定量 检测 步骤 〈(Menozzi 等 ，1990) 如 下 。

D 用 工作 缓冲 液 或 染色 缓冲 液 配制 100wg/ml AY HEY DNA 溶液 。 配 制 用 于 作 标 准 曲 线 的 0 一 500ng/ml 浓度 范围 的 省 化 乙 锭 稀释 液 。

@ 在 lml 一 份 的 过 滤 后 废 液 中 加 入 链 精 DNA， 使 其 最 终 浓 度 达 100ug/ml。

@) 用 荧光 计 测 定 标准 溶液 和 未 知 溶液 的 荧光 读数 〈 激 发 波长 为 526nm， 发 射 波长 为 585mm) 。 绘 制 标准 曲线 ， 从 标准 曲线 上 读 出 未 知 溶液 的 省 化 乙 锭 浓度 。 当 省 化 乙 锭 浓度 低 至 4 ng/ml 时 ， 该 测定 通常 也 是 线性 的 (r=0. 999).

4.3 方案 2

含 工作 浓度 的 省 化 乙 锭 、SYBR 绿 和 其 他 相关 染料 的 溶液 中 ， 每 100ml 溶液 加 3g Am- berlite® XAD-16 (Sigma Cat. No. XAD-16)， 可 以 去 污染 (Joshua, 1986; Lunn 和 San- sone, 1987), XP ARE— PER FM RA WIR. MWA FE lal KHRHE 12~16h, # 后 用 Whatman 1 号 或 相当 型 号 的 滤纸 过 波 。 包括 树脂 在 内 的 固体 过 滤 废 弃 物 均 需 作为 有 毒 物 处 理 ， 并 按 实验 室内 部 规定 处 置 。 过 滤 后 的 溶液 可 以 排放 。

4.4 方案 3

每 100ml 含 工 作 浓度 的 省 化 乙 锭 、SYBR 绿 的 溶液 中 ， 加 入 100 mg 活性 炭 (Sigma 一

Anberlit 树脂 由 Rohm and Hass, Inc. (Philadelphia, PA) 生产 。

° 370 .

Mt 录

Cat. No. C-2889) (Bensaude，1988) 。 混 合 物 在 室温 下 间歇 振 摇 1h， 然 后 用 Whatman 1 号 或 相当 型 号 的 滤纸 过 滤 。 包 括 活 性 炭 在 内 的 固体 过 滤 废 弃 物 均 需 作为 有 毒物 处 理 ， 并 按 实验 室内 部 规定 (policy) 处 置 。 过 滤 后 的 溶液 可 以 排放 。

4.5 参考 文献

Bensaude, O. (1988). Ethidium bromide and safety—readers suggest alternative solutions. [Letter]. Trends Genet. 4, 89.

Joshua, H. (1986). Quantitative absorption of ethidium bromide solutions from aqueous solutions by macroreticular resins. Bio Techniques 4, 207.

Lunn, G., and Sansone, E. B. (1987). Ethidium bromide: Destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162, 453.

Lunn, G., and Sansone, E, B. (1990). Degradation of ethidium bromide in alcohols. BioTechniques 8, 372.

MacGregor, J. T., and Johnson, I. J. (1977). In vitro metabolic activation of ethidium bro- mide and other phenanthridium compounds: mutagenic activity in Salmonella typhimurium. Mutat. Res. 48, 103.

Menozzi, F. D., Michel, A., Pora, H., and Miller, A. O. A. (1990). Absorption method for rapid decontamination of solutions of ethidium bromide and propidium iodide. Chromatographia 29, 167.

Quillardet, P, and Hofnung, M. (1988). Ethidium bromide and safety—readers suggest alternative solutions. Trends Genet. 4, 89.

附录 S$ J DNase 工 去 除 RNA 样品 中 的 DNA

在 不 少 场合 ， 往 往 必 须 纯 化 污染 有 DNA 的 RNA Fah, FES ZEA PCR 应 用 而 制备 RNA 时 。 虽 然 过 去 已 经 用 等 密度 离心 法 来 粗略 地 分 离 污染 的 样品 ， 但 是 这 种 方法 耗 时 ， 需 要 昂贵 的 高 度 专 一 的 设备 ， 产 率 不 高 ， 而 且 当 样品 中 DNA 和 RNA 的 总 量 不 到 毫克 级 时 ， 它 不 是 一 种 很 好 的 方法 。 此外， 用 一 种 很 古老 的 pH 技巧 来 分 离 RNA 和 DNA 的 大 众 化 的 酸 性 茉 酚 法 ， 虽 然 它 很 有 效 ， 但 是 还 不 足以 确保 水 相 中 只 有 RNA (第 5 章 )， 而 且 在 微量 移 液 管 密切 接近 有 机 相 时 极 有 可 能 带 出 DNA. 这 就 会 给 以 RNA 为 基础 的 实验 在 定量 方面 带 来 明 显 的 影响 。 在 RNA 和 DNA 两 者 共存 时 ， 探 针 和 引物 往往 很 难 区 分 RNA 靶 目标 和 DNA 部 目标 。 在 这 些 场合 下 ， 用 去 核酸 酶 的 脱氧 核糖 核酸 酶 I (RNase-free DNase [| ) 简单 地 温 育 就 可 以 借 着 核酸 酶 的 消化 作用 消除 DNA, 然后 RNA 溶液 可 以 直接 使 用 ， 也 可 以 用 葵 酚 : 氧 仿 抽 提 和 /或 用 标准 的 盐 加 乙醇 沉淀 浓缩 〈 第 5 章 )， 或 者 用 其 他 方法 纯化 。DNase 工 处 理 的 方法 不 仅 限 于 制备 无 DNA To AY RNA, 还 包括 在 体外 转录 反应 、DNA 探 针 的 缺口 平移 ， 以 及 用 DNase 工 足迹 方法 研究 DNA- 和 蛋白 质 相互 作用 等 场合 中 用 来 降解 DNA 模板 分 子 。

商品 化 的 无 RNase 的 DNase 工 制剂 , 例如 RQ 1 (Promega) ， 都 是 用 很 多 方法 中 的 任何 一 种 进行 标准 的 纯化 ， 除 去 所 有 可 检 出 的 痕 量 RNase， 并 且 制 造 商 保证 产品 不 含有 内 在 的 RNase 活性 。 这 些 制 备 方法 在 实验 室 是 非常 方便 的 ， 也 优 于 购买 的 费用 。 但 是 因为 DNase | 的 不 稳定 性 ， 在 实验 室 制备 无 RNase 的 DNase 工 也 没有 简单 易 行 有 效 的 方法 。

5.1 实验 方案

J 在 怀疑 污染 有 DNA 的 RNA 样品 中 加 入 无 RNase 的 DNase 工 ， 直 至 终 浓 度 约 为 1U/pg 核酸 。 - 371 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

注意 了 DNase [在 由 40mmol/L Tris-Cl (pH 7.9), Immol/L CaCl 和 5mmol/L MgSO 组 成 的 工作 组 冲 液 中 表现 出 最 佳 活性 。 这 种 缓冲 液 或 类 似 的 配制 液 通常 以 10 关 反应 应 缓冲 液 的 稀释 液 与 购买 的 酶 一 起 提供 。

注意 2 无 RNase 的 DNase 工 的 活性 通常 以 单位 〈units) 表述 ， 这 里 1U DNase 工 可 以 在 37° 10min 降解 lpg DNA， 反 应 体积 通常 为 20 一 50nl。 记 住 在 含有 EDTA, SDS 以 及 其 他 变性 剂 的 缓冲 液 中 ， 或 者 加 热 超过 37°C, DNase 工 可 以 强烈 被 抑制 。

@ 混合 物 37C 保 温 15 一 30min。 如 果 需 要 ， 保 温 lh 也 是 可 以 的 。

@ 样品 加 热 到 65°C 保温 10min 终止 反应 。 另 一 种 方法 是 加 入 EDTA 至 终 浓度 为 2mmol/L, 也 能 终止 DNase 工 的 酶 活性 。

注意 在 反 转 录 PCR (RT-PCR) 中 不 推荐 用 EDTA 终止 反应 。 通 常会 与 这 种 酶 一 起 提供 一 种 停止 反应 的 缓冲 液 (EGTA).

图 在 变性 条 件 下 电泳 一 份 样品 ， 估 量 样品 中 DNA 消化 的 程度 和 RNA 的 完整 性 。

@ 此 时 RNA 可 以 直接 用 于 RT-PCR.

附录 6 J RNase 去 除 DNA 样品 中 的 RNA

在 某 些 场合 ， 例 如 分 离 高 分 子 量 的 基因 组 DNA (附录 11) 时 ， 实 验 设计 可 能 需要 在 不 损伤 DNA 完整 性 的 前 提 下 去 除 所 有 污染 的 RNA。 这 些 场合 中 , 在 RNase 储备 液 使 用 前 ， 必须 清除 储备 液 中 所 有 内 在 的 DNase 活性 。 如 附录 5 中 指出 的 那样 ， 可 以 用 等 密度 离心 法 简 单 分 离 污染 的 样品 , 但 是 这 种 方法 耗 时 ， 需 要 晶 贵 的 高 度 专 一 的 设备 ， 而 且 对 于 总 量 低 于 毫 克 级 的 DNA 和 RNA 样品 ， 它 不 是 一 种 很 好 的 方法 。 此 时 , 用 无 DNase 的 RNase 简单 温 育 就 可 以 完成 此 任务 。 经 制造 商 鉴定 ， 商 品 去 DNase 的 RNase 不 含 内 在 的 DNase 活性 。 RNase 的 粗 制 品 如 果 不 进 行 专门 处 理 , 也 可 能 含有 一 定量 的 DNase (Gillespie 和 Spiegelman, 1965), .

4M DNase 中 清除 RNase 活性 不 同 , 在 大 多 数 分 子 生物 学 实验 室 里 都 能 制备 去 DNase 的 RNase。 最 大 众 化 的 RNase 是 RNase A fil RNase Ti 。 下 列 程序 仅仅 是 自制 版 本 的 制备 法 。 商品 RNase 是 可 以 直接 使 用 的 。

6.1 实验 方案 : 从 RNase 中 清除 DNase 活性

© 用 无 菌 水 或 TE 缓冲 液 (10mmolL Tris-Cl; lmmol/L EDTA, pH8.0) 配制 RNase A, RNase Ti， 或 者 两 者 混合 的 10mgy/ml 的 储备 液 。

@ 加 热 RNase 储备 液 至 接近 沸点 〈90C) 10min。 冰 浴 冷 却 并 分 装 冻 存 。

注意 ”虽然 有 些 RNase 制剂 在 煮沸 处 理 后 仍 可 保存 显著 的 RNase 活性 ， 但 不 鼓励 在 这 个 特殊 情况 下 使 用 该 方法 ; 90C 时 DNase 活性 将 迅速 清除 而 对 试剂 中 的 RNase 活性 没有 损害 。

6.2 实验 方案 : RNA 的 消化

D 将 无 DNase 的 RNase 加 入 样品 中 至 终 浓度 为 10wgy/ml。 @O 37 保温 10~30min, @ 用 等 体积 的 苯酚 : 氯仿 (1 : 1) 或 苯酚 : 氯仿 : 异 丙 醇 (25 : 24 : 1) HAE RNase 的 消化 作用 。 ® 用 盐 和 乙醇 沉淀 浓缩 DNA， 或 者 直接 用 于 限制 性 内 切 酶 的 消化 反应 、PCR 等 。 © 将 基因 组 DNA 置 4C 保 存 , 质粒 DNA 可 以 在 一 20 长 期 保存 。 。 372 。

6.3 参考 文献

Gillespie, D., and Spiegelman, S. (1965). A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. J. Mol. Biol. 12, 829.

Le ee ee

VFB ot FE SE AB es AF REA OE A AT A. 因此 在 用 于 杂交 和 核酸 变性 时 ， 为 了 达到 最 佳 效果 ， 使 用 前 必须 去 离子 化 。 这 里 介绍 两 个 常用 的 去 离子 化 方法 。

常用 的 分 子 生物 学 试剂 的 去 离子 化 ， 只 要 在 试剂 中 加 入 少量 混合 床 树脂 (Sigma; Cata- log No. M-8032) 就 可 以 做 到 。 这 种 混合 的 阴离子 和 阳离子 交换 树脂 是 强酸 性 和 强 碱 性 的 ， 可 促使 去 离子 化 加 速 进 行 。50ml 欲 去 离子 化 的 试剂 中 加 入 Se 混合 床 树脂 ,旋转 混合 2 一 3min。 当 树脂 的 容量 达到 时 , 它 的 颜色 就 会 从 蓝 色 变 成 金色 。 去 离子 化 应 当 在 30min 内 完成 ， 而 且 也 可 能 需要 多 加 一 份 的 树脂 。 用 过 滤 或 离心 来 去 除 树脂 。 去 离子 的 乙 二 醛 分 成 春 干 份 ， BARAT — 20°C; 去 离子 的 甲 酰胺 和 甲醛 应 当 在 去 离子 化 后 尽快 使 用 。 每 份 去 离子 试剂 一 经 打开 ， 用 后 应 当 丢 奔 ， 不 得 再 用 。

另 一 种 可 选择 的 方法 是 ， 甲 酰胺 、 甲 醛 和 乙 二 醛 液 也 可 以 用 AG 501-X8 混合 床 树脂 (Bio-Rad), AG 501-X8 树脂 是 1: 1 AY AG 1-X8 树 脂 -COH ) 和 AG 50W-X8 树脂 CH) 的 混合 物 。 推 荐 每 leg 欲 去 离子 化 的 试剂 加 入 AG 501-X8 树脂 1g。 去 离子 化 需要 1h 左右 , 混 合 物 可 以 保留 过 夜 。 然 后 过 滤 去 除 树 脂 ， 去 离子 的 试剂 如 上 所 述 保存 备用 。Bio-Rad 的 AG 501-X8 树脂 不 管 有 没有 连接 染料 都 是 有 效 的 ， 在 去 离子 化 过 程 进行 时 它 会 显示 颜色 变化 。

附录 8 ”硅烷 化 离心 管 和 玻璃 句 幅

由 于 核酸 固有 的 黏 性 ， 为 了 得 到 最 大 的 样品 回收 率 ， 经 常 需 要 硅烷 化 玻璃 器 血 〈 和 在 有 LEAS AM RAE). Bld. HEGEL Corex 或 Pyrex 玻璃 试管 和 微量 离心 管 ， 可 以 在 大 规 模 分 离 核酸 以 及 cDNA 的 许多 下 游 操 作 中 ,使 RNA 的 损失 降 到 最 小 ， 但 不 可 避免 RNA 总 会 有 一 些 损失 。 在 处 理 小 量 样品 时 硅烷 化 特别 有 用 。

8.1 实验 方案

Sigmacote (Sigma; Cat. No. SL-2) 是 一 种 非常 有 用 的 硅烷 化 试剂 ， 它 能 迅速 硅烷 化 玻 璃 器 亚 和 一 定 类 型 的 塑料 器 血 。Sigmacote 是 一 种 特殊 的 硅 酮 已 烷 溶 液 ， 在 它 接触 的 表面 可 以 形成 一 层 紧密 的 、 极 薄 的 下 水 薄膜 。

J 保证 按照 制造 商 的 关于 Sigmacote 安全 使 用 说 明 操作 。

@ 用 Sigmacote 注 满 覆盖 管子 ， 但 要 避免 浸染 外 面 , 因为 如 果 管 子 外面 硅 烷 化 了 ， 试 管 将 变 得 非常 光滑 ， 在 它 上 面 很 难 书 写 。

@ HES Sigmacote 并 让 管子 空气 干燥 , 一 般 需 要 5 一 10min 完成 。 干 燥 的 表面 基本 上 是 中 性 的 。

注意 ” 避 湿 条 件 下 ，Sigmacote 可 以 重复 使 用 。

附录 9 分 子 生 物 学 家 的 主流 工具 一 一 离心 法

离心 法 是 一 种 分 离 技术 ， 它 所 依据 的 是 这 样 的 事实 一 一 做 圆周 运动 的 物体 受 一 种 方向 向 *。 373 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

外 的 离心 力 的 支配 。 这 种 力 的 大 小 通常 用 地 球 重 力 的 术语 表示 [相关 的 离心 力 CRCEF) 或 者 g 的 倍数 ], 它 是 旋转 半径 和 角速度 的 直接 函数 。 离 心 法 是 一 种 不 可 缺少 的 分 离 方法 ， 它 根据 物体 的 大 小 和 密度 从 溶液 中 分 离 细 胞 、 细 胞 器 和 大 分 子 〈 也 包括 质粒 等 )。 因 此 ， 这 类 设备 .在 许多 实验 室 里 一 直 在 使 用 。 然 而 ， 不 恰当 的 操作 和 保养 ， 可 以 引起 永久 性 损害 或 者 更 糟糕 的 后 果 。 特别 在 使 用 超速 离心 机 时 ， 使 用 者 的 责任 是 ， 保 证 离心 机 和 离心 转 头 一 定 要 在 机 器 设计 的 范围 内 操作 。 这 也 包括 转 头 的 减速 ， 要 按照 购买 时 附 有 的 手册 上 纪 述 的 方法 进行 PRE

9.1 离心 机 的 类 型

(1) 台式 临床 用 离心 机

。 一 般 在 室温 下 操作 ， 转 速 在 3000r/min 以 下 。 (2) 高 速 离心 机

。 通常 在 冷冻 情况 下 操作 ， 转 速 在 20000~25000r/min 之 间 。 (3) 台式 微量 离心 机 (Microfuges)

。 转速 至 14000r/min (12000Xg)。

。 有 些 时 候 提 供 冷 冻 。

。 对 小 体积 的 核酸 样品 是 不 可 缺少 的 。

(4) 超速 离心 机

。 转速 至 500000Xg (75000r/min, r=8cm), 。 可 以 细 分 亚 细 胞 器 。

。 可 以 严格 地 按照 密度 细 分 不 同 的 分 子 。

。 有 很 宽 的 有 效 温 度 范 围 。

。 真空 操作 。

9.2 转 头 离心 机 的 设计 ， 专 门 满足 了 分 离 要求 的 特殊 需要 。 离 心 参数 包括 温度 、RCF、 样 品 体 积 、 运 作 持 续 时 间 、 梯 度 状 态 〈 例 如 线性 或 者 分 阶段 )、 选 择 差 式 还 是 密度 梯度 分 离 、 转 头

的 类 型 。 固 定 角度 转 头 〈 附 图 9-1), 它 让 放 在 里 面 的 样品 在 离心 期 间 保 持 固定 角度 。 相 反 ， 翻转 式 (swinging-bucket) 转 头 〈 附 图 9-2), 它 让 放 有 样品 的 离心 管 架 或 桶 向 外 摆动 到 与 旋

附 图 9-1 固定 角度 转 头 。 样 品 在 离心 期 间 保持 附 图 9-2 ”翻转 式 转 头 。 持 有 样品 的 离 固定 的 角度 。 由 Sorvall 公司 提供 心 管 架 向 外 摆动 到 与 旋转 轴线 成 90* 的 位 置 。 由 Sorvall 公司 提供 + 374 。

附 ” 录

转轴 线 成 90 的 位 置 。 垂 直 转 头 在 整个 离心 过 程 中 都 保持 样品 管 直立 ， 平 行 于 旋转 轴线 。 选 择 固 定 角 度 转 头 、 翻 转 式 转 头 还 是 垂直 转 头 ,完全 取决 于 设计 方案 。 固 定 角度 转 头 适用 于 各 种 不 同 的 离心 技术 ， 而 翻转 式 转 头 和 垂直 转 头 则 对 梯度 分 离 有 效 。

比较 各 种 转 头 性 能 的 有 用 方法 ， 是 比较 它们 各 自 的 站 因子 或 & 因 子 。 实 际 应 用 中 这 个 数 值 用 来 比较 转 头 之 间 的 效率 。 在 颗粒 的 沉降 系数 已 知 时 , & 因 子 可 估计 沉淀 所 需 时 间 ,A 因 子 表明 了 把 颗粒 带 移动 到 离心 管 的 底部 需要 的 时 间 。 简 而 言 之 , 因子 越 低 转 头 的 效率 越 高 。 附 表 9-1 和 附 表 9-2 中 提供 了 几 种 常用 转 头 的 特征 。

附 表 9-1 Sorvall 公司 制备 型 翻转 式 超 速 离 心 转 头 的 技术 规格

SLA BABE | wk RCF/X¢ 管 数 X 额定 体积 | BEFORE /r* min /ml

258826

RP55-S

$55-S 258826 J TH-660 488576 121.5 AH-650 296005 106.0 TH-641 287660 SIR

SureSpin 630(17ml) 166880 166. 0 SureSpin 630(36ml) 166880 166.0 AH-629(17ml) 155846 165.0 AH-629(20ml) 121464 129.3 AH-629(36ml) 151243 161.0

注 :Kendro Laboratory Products (www. sorvall. com) 提供 的 数据 。RCF ,相关 的 离心 力 。

附 表 9-2 Beckman 公司 制备 型 翻转 式 超速 离心 转 头 的 技术 规格

转 头 半径 (rmax)

/mm

最 高 速度 了 RCF RX | 额定 转 头 容量 名 放任 入 /r* min! 定 体积 /ml

421000 89.0

SW 60Ti 485000 ] 120.3 SW 55Ti 368000 0 109. 0 SW 50.1 30000 99.7 LOvess SW 41Ti 288000 67.0 152.0 SW 40Ti 285000 66.7 158. 8 SW 30.1 124000 79.3 123.0 SW 30 124000 79. 3 123. 0 SW 28.1 150000 72.9 ili he SW 28 141000 75. 3 161.0 SW,.25n2 107000 66.7 152°3 90400 2 129.2

YE : Beckman Coulter Co. (www. beckman. com) 提供 的 数据 。RCF 一 相关 的 离心 力 。

9.3 应 用 9

在 分 子 生物 学 实验 室 ， 分 离 RNA 过 程 中 有 几 个 步骤 要 用 到 离心 分 离 技术 , 包括 细胞 裂 解 获得 完整 细胞 的 沉淀 ,在 核酸 抽 提 过 程 中 使 两 相 分 离 , 在 等 密度 分 离 期 间 形 成 梯度 ， 以 及 盐 与 乙醇 沉淀 浓缩 核酸 。

© 部 分 来 自 于 Griffith (1986) 。 。 375 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

9.4 差 式 离心

差 式 离心 是 分 离 样品 最 简单 、 最 直接 的 离心 技术 。 在 这 种 方法 中 ， 含 均一 样品 混合 物 的 离心 管 进行 简单 的 离心 〈 一 般 不 到 30min) 。 运作 结束 时 , 管 底 的 沉淀 含有 离心 期 间 的 全 部 沉 淀 物 质 。 应 当 清 楚 ， 沉 淀 可 能 污染 有 开始 就 在 管 底 或 接近 管 底 的 物质 。 含 有 非 沉 淀 物 质 的 十 清 液 一 般 被 倒 去 ; 在 沉淀 非常 坚实 的 情况 下 ， 可 以 用 吸 气 装置 仔细 地 除去 。 必 须 进 一 步 分 离 时 , 将 上 清 液 装 入 新 的 离心 管 中 离 心 。 与 第 一 次 的 离心 相 比 ， 第 二 次 离心 需要 更 长 的 时 间或 更 高 的 速度 ， 结 果 产 生 新 的 沉淀 和 上 清 液 。

9.5 密度 梯度 离心 -沉降 速度

一 种 比较 复杂 的 制备 技术 是 密度 梯度 离心 , 样品 颗粒 通过 一 个 密度 梯度 而 达到 分 离 目 的 。 梯 度 的 密度 是 ， 最 小 的 在 管子 的 顶部 ,密度 向 管 底 逐步 增加 。 一 种 密度 梯度 离 尼 ， 即 熟 知 的 沉降 速度 离心 或 速率 区 带 离 心 , 样品 被 铺 在 梯度 的 顶部 。 在 离心 力 的 作用 下 ， 样 品 中 的 颗粒 开始 通过 不 连续 的 梯度 区 带 向 下 移动 ; 区 带 的 移动 速度 受 区 带 中 各 颗粒 的 沉降 速度 支 配 。 这 类 分 离 的 特征 是 ， 与 浮力 密度 离心 相 比 ， 离 心 梯 度 相 对 平缓 、 速 度 低 、 时 间 短 。 成 功 的 沉降 速度 离心 需要 下 列 条 件 。

@ 样品 颗粒 的 密度 必须 比 全 部 梯度 中 各 点 的 密度 都 大 。

Q 在 任何 被 分 离 物 质 〈 特 别 是 密度 最 大 的 区 带 ) 到 达 管 底 之 前 ， 必 须 终 业 离心 。，

举例 : — FRAN — fi) RNA 样品 可 以 通过 芒 糖 梯度 离心 分 出 大 小 组 分 《Benecke 等 ， 1978; Nevins 和 Darnell，1978) 。 典 型 的 蔗糖 梯度 ， 平缓 的 在 5% ~ 20%, BEUK AY ZE 5% ~ 40%; 在 5%% 一 40%% 梯 度 黏 度 较 高 的 场合 ， 可 以 提高 离心 速度 来 改善 分 辨 率 。 按 照 这 里 定义 WER. RNA 分 子 可 以 根据 它们 的 沉降 速度 移动 通过 梯度 。 离 心 结 束 时 ，RNA 根据 分 子 大 小 ， 分 布 在 整个 梯度 中 。 作为 一 种 富 集 方法 ， 从 梯度 中 分 出 的 各 个 RNA 组 分 作 进 三 步 鉴 定 。

9.6 密度 梯度 离心 -等 密度 技术

另 一 种 密度 梯度 分 离 类 型 ， 称 为 等 密度 、 浮 力 密度 或 密度 平衡 离心 。 其 中 ， 样 品 颗粒 通 过 梯度 移动 到 达 与 颗粒 密度 相等 的 梯度 密度 处 ， 而 且 相 同 密度 的 颗粒 悬浮 在 那里 形成 条 带 。 与 沉降 速度 离心 不 同 ， 延 长 离心 时 间 不 会 导致 样品 继续 通过 梯度 向 下 迁移 。 梯 度 必 须 非 常 陡 峭 ,最 重要 的 是 它 必须 超过 目的 颗粒 的 密度 。 注 意 样 品 中 非常 紧密 的 组 分 可 能 形成 沉淀 ， 而 其 他 组 分 则 仅仅 迁移 到 与 它们 等 密度 的 位 置 。 通 常用 于 这 类 分 离 的 物质 包括 CsCl. Cs2SOu 和 CsTFA。 历 史上 曾 用 于 经 典 的 半 保 守 复 制 研究 的 氯 化 饮 〈Meselson 等 ，1957; Meselson 和 Stahl, 1958)， 通 党 被 用 于 构建 密度 范围 直到 1. 8g/cms 的 梯度 。CszSO4 和 CsTFA 可 以 用 来 形成 比 CsCl 梯度 更 陡峭 的 梯度 ， 两 者 的 梯度 可 相差 1 倍 ; 前 者 更 适宜 用 来 分 离 各 种 不 同 浮力 密度 的 DNA.

浮力 密度 的 梯度 不 需要 制作 。 例 如 ， 在 一 些 应 用 中 ，CsCl 被 直接 加 到 核酸 混合 物 中 (染色 体 DNA, RNA, & AUR. JR, DNA). AA HRA BEA. BRR OM, 在 离心 力作 用 下 ， 造 成 梯度 物质 的 重新 分 布 。 在 超速 离心 的 速度 下 ， 大 分 子 形成 等 密度 条 带 之 前 ， 这 种 自身 形成 的 梯度 一 般 需要 几 个 小 时 。 但 是 ， 用 微量 超速 离心 机 可 以 明显 缩短 离心 时 间 。 在 运转 期 间 产生 的 线性 梯度 中 ， 样 品 的 组 分 根据 它们 的 密度 或 者 沉降 或 者 悬浮 在 它们 的 等 密度 区 域 。

- 376 -

9.7 参考 文献

Benecke, B. J., Ben-Ze’ev, A., and Penman, S. (1978). The control of mRNA production, translation, and turnover in suspended and reattached anchorage-dependent fibro- blasts. Cell 14, 931.

Griffith, O. M. (1986). “Techniques of Preparative, Zonal, and Continuous Flow Ultracentrifugation.” Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA.

Meselson, M., and Stahl, F. W. (1958). The replication of DNA in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. 44, 671.

Meselson, M., Stahl, F. W., and Vinograd, J. (1957). Equilibrium sedimentation of macro- molecules in density gradients. Proc. Natl. Acad. Sci. 43, 581.

Nevins, J. R., and Darnell, J. E. (1978). Steps in the processing of Ad2 mRNA: Poly (A)* nuclear sequences are conserved and poly(A)* addition precedes splicing. Ce// 15, 1477.

附录 LO JAG SE PTS Ae 2a HD 125

从 生物 材料 中 制备 核酸 ， 始 于 细胞 有 裂解 或 组 织 破碎 。 前 一 种 情况 下 ， 可 以 直接 把 裂解 组 冲 液 加 到 含有 生长 细胞 的 培养 瓶 或 培养 四 中 。 然 而 ， 这 种 方法 往往 需要 大 体积 的 裂解 缓冲 液 ， 这 对 在 分 离 管 中 从 组 织 培养 物 中 收集 和 裂解 细胞 来 说 体积 过 大 了 .。 在 悬浮 培养 时 ， 可 以 简单 地 离心 培养 液 收 集 细 胞 。 对 贴 壁 细胞 ， 在 制备 RNA 或 者 DNA 分 离 时 本 实验 室 常规 使 用 下 列 方法 。

10.1 实验 方案

中 从 组 织 培养 器 严 中 轻 轻 倒 出 生长 培养 液 并 保存 。 通 常 可 以 很 方便 地 直接 倒 进 一 个 15ml 或 50ml 圆锥 形 管 子 里 。

包 用 1 磷酸 盐 缓冲 生理 盐水 (PBS)、 无 钙 镁 的 缓冲 液 CCMF-PBS) 洗 细胞 单 层 2 次 。 倒 掉 PBS.

注意 1XPBS( 每 升 )=8g NaCl, 0. 23 KCl, 1. 15g Na, HPO, 和 0. 2g KH PO, 。 如 果 需 要 ， 可 以 制 成 PBS 的 浓 储 备 液 ， 使 用 前 用 无 菌 水 稀释 。

@ 在 每 个 1-75 BAF PIA 2ml 1X 胰 蛋白 酶 -EDTA。 轻 缓 揪 动 30 一 60s。 抽 提 时 间 取 决 于 细胞 的 类 型 、 混 合 程度 和 胰 和 蛋白酶 的 温度 。 在 细胞 开始 分 离 前 必须 去 除 组织 培 养 HP AY BR aE A BB .

注意 10X 胰 蛋白 酶 -EDTA=0.5%% 胰 蛋白 酶 ，0.2%EDTA， 通 常 是 购买 的 。 用 1XPBS 稀释 10 胰 蛋 白 酶 -EDTA 储备 液 。 或 者 ， 可 以 购买 1X 胰 蛋 白 酶 -EDTA 直接 使 用 。

® 倒 去 胰 和 蛋白酶 。 观 察 细 胞 形态 变 圆 的 情况 〈 圆 化 ) 。

注意 ”在 没有 组 织 培养 显微镜 时 ， 拿 着 培养 瓶 到 窗口 或 者 对 着 实验 室 的 光源 也 可 以 估计 细胞 的 圆 化 。 因 为 细胞 一 变 圆 折射 率 @ 就 会 发 生变 化 , 瓶 内 细胞 附着 的 那 边 显 出 云雾 状 。 它 的 范围 取决 于 培养 瓶 中 细 胞 成 圆 的 程度 和 细胞 的 密度 。 极 其 重要 的 是 培养 物 不 能 过 度 胰 蛋白 酶 消化 , 因为 这 样 可 能 导致 早熟 的 细胞 裂解 而 明显 损失 RNA 和 DNA,

O 对 着 手掌 打击 培养 瓶 ， 从 基底 层 逐 出 细胞 。 如 果 细 胞 没有 完全 分 离 ， 在 手掌 里 温 热 培养 瓶 或 者 在 37°C Hild 60s。 再 打击 培养 瓶 确保 分 离 。

@ 折射 率 是 光线 从 空气 通过 另 一 种 介质 〈 这 里 是 细胞 质 ) 时 弯曲 的 角度 。 ”377 =

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

注意 ”完全 逐 出 细胞 必须 打击 培养 瓶 3 一 4 次 以 上 。 如 果 还 有 些 细胞 仍然 附着 在 壁 上 ， 需 要 让 它们 与 胰 蛋 白 酶 接触 时 间 长 一 点 。 只 有 用 PBS 洗 过 后 细胞 培养 物 才能 再 次 用 胰 蛋 白 酶 消化 。 而 且 ， 如 果 必 须 再 次 用 胰 蛋 白 酶 消化 ， 一 定 保留 第 一 次 胰 蛋 白 酶 处 理 后 加 入 的 培养 介质 (上 清 液 )， 因 为 可 能 大 量 细胞 已 经 脱 落 。 悬 浮 的 细胞 应 当 保存 在 冰 上 直到 细胞 群体 被 胰 蛋 白 酶 消化 为 止 。 然 后 细胞 可 以 倒 人 普通 管子 中 。

© 细胞 从 瓶 壁 分 离 后 ， 立 即 在 培养 瓶 中 加 入 5ml 步骤 四 保存 的 培养 液 ， 以 钝 化 残留 的 胰 和 蛋白 酶 。

注意 有些 细 胞 培养 物 对 胰 蛋 白 酶 极度 敏感 。 在 这 些 场合 ， 细 胞 分 离 后 加 入 一 种 胰 蛋 白 酶 专 一 的 抑 制剂 使 胰 蛋 白 酶 失 活 。 如 果 是 分 离 的 细胞 再 次 悬浮 在 无 血清 培养 基 中 也 是 可 以 的 。 可 以 参考 本 书 提供 的 细 胞 株 和 培养 基 配制 的 信息 。

© 将 悬浮 液 转移 到 一 个 合适 的 离心 管 中 ，150Xg 一 200Xg 离心 3 一 5min。

Q@ 离心 后 要 尽 可 能 完全 地 去 除 上 清 液 。 为 了 确保 裂解 缓冲 液 的 关键 成 分 不 被 稀释 或 因 为 与 残留 的 培养 基 相 互 作 用 而 发 生变 化 , 这 一 点 是 非常 必要 的 。 如 果 细 胞 培养 基 的 去 除 有 问 题 ， 必 须 用 PBS 洗 细胞 沉淀 物 ， 然 后 再 重复 步骤 四 和 步骤 @@) 。

@ 为 了 促进 细胞 在 裂解 缓冲 液 或 其 他 试剂 中 的 悬浮 ， 步 骤 @ 已 去 除 上 清 液 之 后 ， 在 加 入 有 裂解 缓冲 液 之 前 ， 轻 扣 装 有 细胞 的 管子 是 非常 有 效 的 。 在 本 实验 室 , 在 加 入 裂解 缓冲 液 后 ， 立 即将 装 有 细胞 的 管子 沿 着 微量 离心 管 架 拖拉 2 一 3 次 以 帮助 细胞 沉淀 的 破碎 。

附录 11 用 盐 析 法 分 离 高 分 子 量 DNA

Miller 等 人 (1988) 建立 了 不 用 有 毒 有 机 溶剂 来 分 离 高 分 子 量 (CHMW) DNA 的 方法 ， 下 面 是 这 个 方法 的 改良 方法 。 其 他 方法 都 说 明了 HMW DNA 的 回收 率 , 包括 透析 〈Long- mire 等 ，1987) 和 使 用 过 滤器 (Leadon 和 Cerutti，1982) 。 生 物 工程 产品 销售 商 提供 的 用 途 很 广 的 一 些 试剂 盒 ， 都 是 以 这 些 方法 和 这 里 要 叙述 的 方法 为 依据 的 。

这 个 方法 相对 简单 ， 涉 及 细胞 蛋白 质 的 盐 析 。 它 开始 用 蛋白 酶 民 水 解 多 肽 , 接着 用 饱和 NaCl 溶液 沉淀 蛋白 质 ;随后 去 蛋白 质 的 基因 组 DNA， 用 标准 的 盐 及 乙醇 沉淀 回收 ;该 方法 已 经 成 功 地 从 有 核 的 血细胞 中 分 离 得 DNA (Miller 等 ,1988) 。 本 实验 室 也 成 功 地 用 此 方法 分 离 得 DNA， 所 用 样品 是 各 种 胰 蛋 白 酶 消化 的 间 叶 起 源 的 细胞 (Farrell，1991 一 2004; 未 发 表 )。 本 实验 室 得 到 的 基因 组 DNA 通常 比 用 苯酚 : 氯仿 纯化 得 到 的 平均 要 高 10 站 一 15%。 用 紫外 分 光 光 度 计 扫描 并 检查 Arco /Acso (第 8 章 ) ， 表 明 该 方法 所 得 DNA HAE SEB: 氧 仿 蛋 白质 抽 提 技术 所 得 的 相 比 是 一 致 的 。-

11.1 实验 方案

D 收获 细胞 于 一 个 15ml 的 离心 管 中 ，200Xg 离心 5min。 每 管 中 使 用 约 〈1 一 2) 汉 107 个 细胞 。

@ 倒 去 上 清 液 。 在 总 体积 为 4.5 ml 的 TE-9 裂解 缓冲 液 (500mmol/L Tris-Cl, pH 9.0; 20mmol/L EDTA; 10mmol/L NaCl) 中 彻底 悬浮 细胞 沉淀 〈 直 至 2X107 AAA).

选择 方案 : 用 PBS® 洗 沉淀 ， 并 且 在 加 裂解 缓冲 液 之 前 再 离心 一 次 ，

注意 1 这 种 裂解 缓冲 液 的 碱 性 pH 是 符合 需要 的 ， 因 为 它 将 诱导 样品 中 RNA 的 部 分 水 解 。 但 是 还

@ 1X PBS(# Ft) =8g NaCl，0. 2g KCI，1. 15g NazHPO 0.2g KH2PO, 。 如 果 需 要 ， 可 以 制备 法 的 储备 液 ， 使 用 前 用 无 菌 水 稀释 。

aa 378 。

不 足以 引起 双 链 DNA 的 严重 变性 〈 第 1 章 )。

注意 2 ”对 少数 没有 起 始 细胞 数目 的 ， 所 有 试剂 的 体积 都 应 当 按 比例 缩减 。

@ 裂解 液 中 加 入 500n1 10 色 的 SDS。 反 转 试管 激烈 混合 。

@® 再 加 入 125wl 20mg/ml Hh BARK ( 终 浓 度 为 0.5mg/ml)， 反 转 试管 激烈 混合 。 48°C 保温 4 一 20h。

注意 “加 入 蛋白 酶 K 是 必要 的 ， 至 少 可 以 部 分 水 解 核 小 体 蛋白 。 如 果 不 除去 ， 组 蛋白 和 其 他 核 蛋白 将 会 与 DNA 一 起 纯化 ， 继 而 干扰 DNA 的 内 切 酶 消化 和 其 他 下 游 应 用 。

© 保温 结束 ， 准 确 加 入 1. 5ml 饱和 NaCl WR (4 6mol/L). MARE 15s。 试 管 放置 1 一 2min 观察 裂解 液 的 状况 。 进 行 到 适当 时 候 ， 多 肽 沉淀 将 使 裂解 液 变 得 非常 模糊 混浊 ， 并 一 直 保 持 这 种 状况 。

注意 ”加 入 一 份 饱和 NaCl 溶液 ， 就 可 以 使 多 肽 盐 析 出 来 。 实 质 上 这 是 一 种 脱水 技术 。 如 果 在 激烈 振 摇 试管 后 1Imin 内 裂解 液 澄清 了 ， 则 盐 析 不 彻底 。 如 果 需 要 ， 再 加 一 份 200ml 的 饱和 NaCl 溶液 , tHE. H+ 观察 裂解 液 的 状况 。 如 果 需 要 ， 再 重复 加 入 饱和 NaCl 溶液 直到 裂解 液 保持 混浊 状态 。 但 是 不 能 过 度 使 用 饱 Al NaCl 溶液 , 因为 到 某 一 点 有 固体 NaCl 析出 溶液 时 ， 将 导致 DNA 得 率 明 显 下 降 。

© Wyk 1000X g~1500X g 离心 10min。 注 意 离心 力 不 要 超过 推荐 的 最 大 值 。

G@ 将 上 清 液 倒 人 一 个 新 的 15ml 管子 中 ， 借 着 SDS 起 泡 捕 集 残 留 的 和 蛋白质。 再 离 心 10min,

将 上 清 液 〈 含 有 DNA) 倒 人 一 个 新 的 50ml 圆锥 形 离 心 管 中 , 如 果 有 的 话 , 小 心 避 免 蛋白 质 沉 淀 破 碎 。 弃 去 蛋白 质 沉 淀 。

© 在 装 上 清 液 的 管 中 加 入 2 倍 体积 的 室温 95%% 乙 醇 。 使 离心 管 旋转 或 者 轻 缓 地 反 转 直 到 可 以 看 到 DNA 沉淀 。

注意 ”这 里 推荐 室温 乙醇 是 因为 这 时 只 有 DNA 会 很 快 沉淀 出 来 ; 冰冷 的 乙醇 会 让 一 些 残存 的 RNA 也 沉淀 出 来 。

@ 用 硅烷 化 的 巴 斯 德 移 液 管 〈Sigmacote 是 非常 有 用 的 ; 见 附录 8) 回收 DNA。 要 确保 DNA 不 被 吸 到 移 液 管 中 超 出 硅烷 化 的 部 分 。 另 一 种 办 法 是 ， DNA 沉淀 500Xg 离心 Imin 收 集 。 这 两 种 方法 得 到 的 DNA 都 进一步 转移 到 一 个 微量 离心 管 中 。

HB 某 些 场合 ， 巴 斯 德 移 液 管 的 尖端 可 以 加 热 并 弯曲 〈 在 本 生 灯 的 火焰 上 ) 成 钩 形 并 用 来 钓 出 溶 液 中 的 DNA. 因为 DNA 会 牢固 地 黏着 在 未 处 理 的 玻璃 表面 , 所 以 硅烷 化 是 必需 的 。

@ 用 500pl 一 份 的 70%% 乙 醇 洗 DNA 3 次 ， 洗 去 残留 的 盐 。 最 后 用 95%% 乙 醇 洗 ， 这 将 加 i DNA 沉淀 的 干燥 。 不 要 让 DNA 完全 干燥 。

@ 在 使 用 DNA 之 前 , 包括 测定 浓度 和 纯度 之 前 , 用 100 一 200nl TE 缓冲 液 (10mmol/ L Tris-Cl, pH7.5; lmmol/LEDTA) 完全 溶解 DNA。 洲 解 的 基因 组 DNA 样品 可 以 长 时 间 保存 在 45C 。

注意 1 45 一 50C 保 温 样品 有 助 于 DNA 的 溶解 .如 果 37 尼 保温 可 能 促进 DNase HE. EA NES, 纯化 了 的 基因 组 DNA 样品 是 4C 过 夜 溶解 。

注意 2 除了 紫外 分 析 之 外 , 样品 的 完整 性 应 当 用 电泳 评估 ,250 一 500ng 样品 用 A Hind [tree te) 型 凝 胶 上 电泳 。

@ 如 果 需 要 ， 样 品 可 以 用 无 DNase 的 RNase 处 理 并 且 再 沉淀 DNA. ERR hy) RNA,

@ 纯化 的 DNA 4°C fRFF. RAT BES Ha HE PF ah AY SE EE

。 379 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

11.2 参考 文献

Leadon, S. A., and Cerutti, P A. (1982). A rapid and mild procedure for the isolation of DNA from mammalian cells. Anal. Biochem. 120, 282.

Longmire, J., Albright, K., Lewis, A., Meincke, L., and Hildebrand, C. (1987). A rapid and simple method for the isolation of high molecular weight cellular and chromosome-spe- cific DNA in solution with the use of organic solvents. Nucleic Acids Res. 15, 859.

Miller, S. A., Dykes, D. D., and Polesky, H. F. (1988). A simple salting out procedure for extracting DNA from nucleated cells. Nucleic Acids Res. 16, 1215.

附录 12 ”从 植物 组 织 中 分 离 RNA

从 植物 中 制备 的 mRNA 与 从 动物 中 制备 的 mRNA 有 很 多 共同 之 处 。 并 且 在 许多 场合 ， 证 实 植物 来 源 的 mRNA 在 多 种 条 件 下 具有 明显 的 稳定 性 。 虽 然 属 于 植物 基因 表达 研究 的 细 节 涉及 本 书 许多 主要 的 研究 项 目 , 但 是 从 植物 中 分 离 RNA 的 技术 是 本 书 范围 之 外 的 。 照 此 ， 读者 可 以 参阅 下 列 参考 资料 :

Ainsworth, C. (1994). Isolation of RNA from flora tissue of Rumex acetosa. Plant Mol.

Biol. Rep. 12, 198.

Chang, S., Puryear, J., and Cairney, J. (1993). A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol. Biol. Rep. 11, 113.

Graham, G. C. (1993). A method for extractions of total RNA from Pinus radiata and other conifers. Plant Mol. Biol. Rep. 11, 32.

Green, M. J., Thompson, D. A., and MacKenzie, D. J. (1999). Easy and efficient DNA extraction from woody plants for the detection of phytoplasmas by polymerase chain reaction. Plant Dis. 83, 482-485

Lewinsohn, E., Steele, C. L., and Croteau, R. (1994). Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 20.

Logemann, J., Schell, J., and Willmitzer, L. (1987). Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16.

Lopez-Gomez, R., and Gomez-Lim, M. A. (1992). A method for extracting intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. Hort. Sci. 27, 440.

Mitra, D., and Kootstra, A. (1993). Isolation of RNA from apple skin. Plant Mol. Biol. Rep. 11, 326.

Palmiter, R. D. (1974). Magnesium precipitation of ribonucleoprotein complexes: Expedient techniques for the isolation of undegraded polysomes and messenger ribonu- cleic acid. Biochemistry 13, 3606.

Soni, R., and Murray, J. A. H. (1994). Isolation of intact DNA and RNA from plant tis- sues. Anal. Biochem. 218, 474.

Strommer, J., Gregerson, R., and Vayada, M. (1993). Isolation and characterization of plant mRNA. Jn “Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (B. R. Glick and J. E. Thompson, Eds.). CRC Press, Boca Raton, FL.

Wallace, D. M. (1987). Precipitation of nucleic acids. Methods Enzymol. 152, 41.

Wan, C. Y., and Wilkens, T. A. (1994). A modified hot borate method significantly enhances the yield of high quality RNA from cotton. Anal. Biochem. 223, 7.

附录 13 ”电泳 一 一 原理 、 参 数 和 安全

电泳 是 在 电场 中 迅速 分 辨 带电 荷 的 生物 大 分 子 〈 包 括 蛋 白质 、 核 酸 和 碳水 化 合 物 ) 的 一 - 380 -

附 ”” 录

种 技术 。 由 于 蛋白 质 的 两 性 性 质 ， 由 环境 的 pH REEMA; 与 此 不 同 ， 在 电泳 使 用 的 任何 pH 环境 里 ， 核 酸 都 表现 为 净 的 负电 和 荷 。 实 际 上 ， 核 酸 的 电泳 图 谱 已 经 成 为 一 种 标准 工 具 ， 用 来 定性 和 定量 地 表示 样品 的 特征 ， 以 及 测定 样品 的 纯度 。 与 其 他 麻 频 的 方法 〈 如 密度 梯度 离心 ) 相 比较 ， 电 泳 是 高 效 快速 的 ， 它 可 提供 高 分 辩 率 。 而 密度 梯度 离心 ， 可 以 为 了 除 印迹 分 析 外 的 多 种 目的 ， 按 分 子 大 小 分 离 RNA 人 分子。 核酸 可 以 借助 凝 胶 染 色 而 直接 观察 ， 这 就 能 够 目 视 检查 分 离 过 程 ; 它 也 为 样品 完整 性 提供 了 可 靠 的 评估 方法 。 并 且 在 大 多 数 情况 下 ， 研 究 者 都 能 够 以 各 种 方法 回收 特定 的 条 带 用 于 随后 的 鉴定 。 电 泳 也 是 一 种 用 来 浓缩 RNA 和 DNA 之 类 物质 的 有 力 技 术 。 控 制 电泳 的 参数 ， 使 相同 大 小 的 分 子 一 起 移动 。

历史 上 ,这 种 技术 的 最 早 应 用 涉及 蔗糖 中 的 大 分 子 色 谱 。 方 法 学 方面 的 改进 ， 使 电泳 扩 展 到 淀粉 凝 腕 ， 最 后 发 展 了 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 访 。 这 种 凝 胶 的 结构 影响 着 目标 分 子 的 迁移 特 征 。 人们 很 快 认 识 到 ， 大 孔 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 是 高 分 子 量 核酸 有 效 电泳 所 必需 的 。 开 始 使 用 Me RE IE AR BY FR PS a EE 〈2.5%)， 然 而 浓度 如 此 低 的 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 ， 它 的 不 稳定 性 和 不 可 靠 性 妨碍 了 其 广泛 应 用 。 后 来 ， 琼 脂 糖 〈 一 种 从 海藻 中 提出 的 线性 多 聚 糖 ) NERA 酰胺 凝 胶 中 (Peacock 和 Dingman, 1968; Dahlberg 等 ,1969) ， 增 加 了 族 胶 的 物理 强度 。 现 在 用 于 核酸 分 离 的 琼脂 糖 凝 胶 和 聚 丙 炳 酰 胺 凝 胶 都 能 获得 令 人 满意 的 结果 。 使 用 哪 一 种 凝 胶 取决 于 样品 分 子 量 的 大 小 范围 。 目 前 用 于 核酸 电泳 的 两 种 标准 基质 是 琼脂 糖 凝 腕 和 聚 丙 烯 酰 ARCHES. i HE FEE HEAR EF ET RNA 电泳 。 少 数 情况 下 ，RNA 可 以 用 双向 电泳 鉴定 〈 有 KEI NL DeWachter 等 ，1990 ) 。

13.1 理论 描述 9

下 列 等 式 描 述 了 带电 分 子 在 蔗糖 中 的 理论 行为 ; 实际 上 ， 这 里 描述 的 其 他 参数 也 包括 了 凝 胶 基 质 中 带电 分 子 的 确切 行为 。 下 面 无 意 在 电学 方面 展开 ， 但 是 对 理解 什么 是 电泳 和 怎么 做 电泳 来 说 ， 了 解 一 些 基 础 知识 是 很 必要 的 。

当 一 个 分 子 置 于 电场 中 时 ， 施 加 在 它 上 面 的 力 (FE) 取决 于 分 子 的 净 电 荷 (9) 和 它 所 在 电场 的 强度 CE/d). PU:

Eq

Mig

Gis gai,

式 中 “下 一 一 电极 之 间 的 电位 差 ; d 一 一 电极 之 间 的 距离 。 现实 中 ， 一 种 摩 掠 力 即 阻力 与 分 子 向 电极 迁移 的 方向 相反 。 这 个 摩擦 力 CF) 取决 于 分 子 的 大 小 和 形状 〈 半 径 ，”) 以 及 它 通 过 的 介质 的 黏度 〈7); 赤 是 分 子 移动 的 速度 。 F=6xrqu (13-2) 合并 式 (13-1) 和 式 (13-2) ， 得 到 :

Eq _. 了 二 6rr7 (13-3)

用 代数 重新 整理 等 式 得 到 分 子 在 电场 中 移动 的 速度 为 : pte x d6xrn

经 验 1: 从 式 (13-1) 一 式 (13-4) 可 知 分 子 的 移动 速度 与 电场 强度 和 净 电 荷 成 正比 ， 而 与

(13-4)

@ 部 分 改编 自 Hoefer Pharmacia Biotech, - 381 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

分 子 的 大 小 和 溶液 黏度 〈 胶 的 硬度 ) 成 反比 。 有 关 电 学 上 两 个 参数 的 知识 ， 是 理解 电泳 机 制 的 基础 。 首 先是 欧姆 定律 ， 电 流 TI， 安 培 ) 与 电压 〈 正 ， 伏 特 ) 成 正比 ， 而 与 电阻 CR, Rea) 成 反比 。 所 以 : I=E/R (13-5) 第 二 个 是 功率 (CP, RED). POPU ie. CHE CE, REP) A CU, BH) 的 乘积 ， 可 以 表达 为 : P=EI (13-6) 从 式 (13-5) BS) EW IR FRA, Wst3-6) 可 以 表达 为 : P=[?R (13-7) 电泳 时 ， 总 有 一 个 参数 保持 稳定 ， 电 压 、 电 流 或 者 功率 。 电 泳 期 间 ， BIS BEES. 温度 波动 等 ， 电 阻 增 大 造成 如 下 不 同 结果 。 © 选择 恒 电流 时 ， 速 度 与 电流 成 正比 ， 产 生 热 而 分 子 移动 速度 保持 恒定 。 @ 选择 恒 电 压 时 ， 带 电 分 子 的 移动 速度 减 小 ， 但 是 电泳 过 程 中 产 热 量 并 不 增加 。 @ 选择 恒 功 率 时 ， 带 电 分 子 的 移动 速度 减 小 ， 但 是 电泳 过 程 中 没有 相关 的 产 热 变化 。 经 验 2: 温度 调节 是 在 整个 电泳 过 程 中 都 需要 关注 的 ， 特 别 是 在 进行 琼脂 糖 凝 胶 电泳 时 。 过 度 发 热 将 会 使 凝 胶 基 质 在 非常 短 的 时 间 里 融化 ， 所 以 维持 恒定 的 温度 是 非常 重 要 的 。 让 电流 从 阴极 流向 阳极 的 反应 如 下 :

阴极 反应 2e- +2H,O—»20H- +H, HA+OH-—=A- +H,0

阳极 反应 H,O—»2H+ ++0,+2e Hs A- ——

这 些 反应 HET RE NC RH, BOR TEBE EE AL, 每 产 生 lmol 氢气 ， 就 会 产生 0. 5mol 氧气 。 直 接 观察 阳极 ， 能 够 看 到 产生 的 气泡 大 约 是 阴极 产 生 的 一 半 。 虽 然 这 不 一 定 是 确定 电极 是 否 正确 连接 的 最 好 办 法 ， 但 肯定 是 一 个 表明 电流 在 流 动 的 简单 办 法 和 标志 。

13.2 典型 的 电泳 分 离

RNA 电泳 可 以 用 几 种 方法 中 的 任意 一 种 ， 这 些 方法 都 有 几 个 共同 的 特点 。 开 型 的 做 法 ， RNA 在 一 个 相对 小 的 体积 〈20ml 或 更 小 ) 里 变性 ， 上 样 于 水 平 琼脂 糖 凝 胶 块 的 孔 内 ， 并 且 插 经 验 决定 电 沪 时间。 当然， 支配 大 分 子 的 参数 在 这 儿 也 是 适用 的 。 有 几 个 因子 影响 核酸 电 泳 迁 移 率 (Rodbard 和 Chambach, 1970); 实验 室 电 泳装 置 一 且 确 定 了 最 适 参 数 ， 建 立 标准 的 实验 格式 ， 对 数据 的 重复 性 很 可 能 有 好 处 。

13.3 基质 的 选择

与 琼脂 糖 凝 胶 相 比 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 显示 了 大 得 多 的 张力 强度 ， 而 且 有 较 强 的 分 辩 能 Fa + 但 是 琼脂 糖 凝 胶 允 许 研究 者 在 很 大 的 分 子 量 范围 内 分 离 核酸 分 子 〈 附 表 13-1), BTR 脂 粳 凝 胶 的 网 孔 比较 大 ， 人 允许 有 效 分 离 像 核酸 、 大 蛋白质 甚至 蛋白 质 复合 物 这 样 的 巨大 分 子 。 相 比 之 下 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 是 小 网 孔 的 ， 能 够 用 来 分 离 小 于 平均 分 子 量 的 蛋白 质 和 赛 核 。382 -

a

HR. REAR RMT RAB. BERR, CAS PERE 77 BERGE. BRAG BE BEB 可 以 用 来 电泳 小 至 150 个 碱 基 到 大 至 50000 个 碱 基 〈50kb) 的 核酸 分 子 ， 取 决 于 琼脂 糖 的 浓 度 和 精确 的 电场 性 质 〈 恒 定 电 场 或 者 脉冲 电场 )。 相 比 之 下 ， 聚 丙 炳 酰 胺 凝 胶 常 规 用 来 分 离 分 子 小 至 5 一 10 个 碱 基 、 大 到 500 一 600 个 碱 基 的 核酸 。 在 考虑 用 聚 丙 焕 酰 胺 凝 胶 对 仅 相 差 一 个 碱 基 的 核酸 分 子 测 序 时 ， 就 可 以 理解 该 凝 胶 的 分 辩 能 力 了 。

附 表 13-1 核酸 电泳 中 ， 琼 脂 糖 凝 胶 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 有 效 范围 9

1000~ 20000® 600~ 10000 500~9000 300~ 6000 200~3000

琼脂 糖 2

100~1500 80~500 60~ 400 40~ 200 25~150 6~100

丙烯 酰胺 @

© 表 中 的 数据 部 分 来 自 Sambrook 和 Russell (2001), Ogden 和 Adams (1987), Farrell (1993). @ 由 3%% 琼 脂 糖 组 成 的 琼脂 糖 凝 胶 ， 可 以 用 来 观察 PCR 产物 (100~500bp).

@ 可 以 用 脉冲 电场 电泳 ， 有 效 分 辨 比较 大 的 DNA 分 子 。

@ 凝 胶 的 组 成 : 丙烯 酰胺 : N,N“- 亚 甲 基 双 丙烯 酰胺 王 19 : 1。

当心 单 体 丙 烽 酰 胺 ， 即 非 聚合 形式 的 丙烯 酰胺 ， 是 一 种 很 强 的 神经 毒素 ， 在 制备 凝 胶 和 操作 丙烯 酰胺 时 应 当 找 有 经 验 的 人 帮助 。

现在 可 以 很 方便 地 从 许多 供应 商 处 买 到 预制 胶 ， 而 且 有 现货 供应 大 部 分 各 式 各 样 的 标准 电泳 槽 。 另 外 ， 琼 脂 糖 基本 是 无 毒 的 ， 电 泳 时 用 它 操 作 、 制 胶 和 丢 奔 都 简单 易 行 。

聚 丙 炳 酰 胺 凝 胶 可 以 被 制 成 各 种 各 样 的 形状 ， 但 是 琼脂 糖 凝 胶 传 统 上 是 以 水 平板 状 灌注 制 胶 和 电泳 的 。 这 种 构 型 是 合适 的 ， 因 为 琼脂 糖 凝 胶 完 全 被 它 下 方 的 灌注 盘 支 撑 着 。 有 些 垂 直 的 装置 适应 了 琼脂 糖 凝 胶 较 软 的 特性 ， 包 括 一 块 磨砂 玻璃 板 ， 凝 胶 可 以 附着 在 上 面 。 聚 丙 烽 酰 胺 凝 胶 借 着 它 具 有 大 得 多 的 物理 强度 ， 在 垂直 的 装置 中 几乎 都 可 以 电泳 。 可 以 灌注 成 板 状 或 者 圆柱 状 ， 而 且 通 常 固定 在 两 个 各 有 一 电极 的 缓冲 液 槽 之 间 ， 以 致 两 个 缓冲 液 槽 之 间 只 有 通过 凝 胶 才 能 接 通 电流 。 相 反 ， 水 平 放 置 的 琼脂 糖 凝 胶 完全 是 浸泡 在 电解 缓冲 液 中 的 ， 组 冲 液 的 体积 要 尽 可 能 小 ， 但 是 必须 完全 覆盖 住 凝 胶 。 在 室温 下 或 者 电压 相当 低 时 跑 胶 ， 这 有 助 于 适度 散热 。

当 实 验 设计 需要 在 电泳 后 将 RNA 印迹 或 转移 出 凝 胶 时 ， 例 如 传统 的 Northern 分 析 ， 选择 琼脂 糖 作为 基质 ，RNA (Southern 分 析 的 DNA) 可 以 从 中 完全 印迹 。 此 外 ， 许 多 与 制 备 型 琼脂 糖 凝 胶 电泳 有 关 的 经 典 问题 ， 即 污染 物 从 琼脂 糖 凝 胶 中 一 起 共 洗 脱 ， 以 及 洗 脱 中 的 困难 ， 广 泛 使 用 极 高 纯度 的 熔点 低 的 琼脂 糖 可 避免 这 些 问 题 。

13.4 琼脂 糖 的 纯度

屯 脂 糖 是 来 自 琼脂 的 一 种 高 度 纯化 的 多 糖 。 就 像 商业 上 可 以 得 到 的 所 有 分 子 生物 学 983

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

试剂 二 样 ， 琼 脂 糖 有 几 个 等 级 ， 它 们 中 有 许多 至 少 含 有 痕 量 丙酮 酸 盐 和 硫酸 盐 阴 离子 (它们 可 能 产生 电 渗 ) 。 应 当 使 用 的 是 ， 已 证 明 其 仅 含 低 量 污染 物 〈 包 括 多 糖 和 盐 ) UR 完全 没有 核酸 酶 活性 的 高 质量 的 分 子 生物 学 级 别 的 琼脂 糖 。 上 述 污染 物 可 能 干扰 以 后 从 凝 胶 中 回收 核酸 〈 特 别 是 DNA) 的 处 理 。 高 纯度 级 别 的 琼脂 糖 ， 例 如 SeaKem 和 NuSieve (Cambrex Bio Science) ， 它 们 没有 核酸 酶 活性 和 上 面 提 及 的 大 多 数 污染 物 。 用 于 特殊 应 用 的 、 特 殊 的 低 熔 点 琼脂 糖 即 低 凝 胶 化 温度 的 琼脂 糖 ， 也 有 现货 供应 。 读 者 可 以 参考 出 版 物 (DNA 分 离 与 分 析 的 指南 全 集 》 (Your Complete Guide for DNA Separation and Analysis) , 由 Cambrex (800-341-1574; formerly FMC BioProducts) 出 版 的 这 本 指南 ， 是 一 本 优秀 的 实验 室 手 册 。

13.5 琼脂 糖 浓 度

琼脂 糖 的 浓度 〈 凝 胶 的 硬度 ) 极 大 地 影响 着 迁移 的 速度 ; 任何 一 个 一 定 大 小 分 子 的 迁移 率 都 会 因 琼脂 糖 浓 度 的 变化 而 不 同 。 这 是 因为 琼脂 糖 凝 胶 的 网 孔 大 小 取决 于 凝 胶 中 琼脂 糖 的 ， 浓度 。 在 凝 胶 的 几乎 全 长 范围 内 ， 迁 移 速度 都 是 线性 的 ， 非 常 大 或 非常 小 的 分 子 可 能 在 凝 胶 的 线性 范围 之 外 。 如 果 发 生 这 种 情况 ， 明 显 的 误差 可 能 出 自 于 ， 根 据 与 在 凝 胶 线 性 范围 内 的 分 子 量 标准 比较 评估 分 子 大 小 的 做 法 。 此 外 ， 在 染料 的 前 面 〈 就 是 所 谓 凝 胶 的 “前 沿 ” 经 常 可 以 看 到 一 定量 弥散 的 低 分 子 量 物质 ， 在 低 于 1%% 的 琼脂 糖 凝 胶 中 特别 要 注意 这 一 点 。 通 常 琼脂 糖 凝 胶 的 工作 浓度 在 0. 6 加 一 1.5 狼 。 但 是 在 特殊 情况 下 ， 也 可 以 用 更 高 或 更 低 的 浓 度 〈 如 用 3 奴 的 琼脂 糖 凝 胶 分 析 PCR 产物 ) 。

13.6 RA MRA RE

AR VAS Me HC aE We He HE CB BEBE AS & AD TK SRE. TERETE a RB TA as BB 单 体 ” 依 靠 交 联 剂 聚合 成 长 链 。 实 际 上 交 联 剂 也 一 起 支持 着 它 的 网 络 结构 。 最 常用 的 交 联 剂 是 N,N - 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 ， 简 称 bis。 其 他 交 联 剂 也 偶尔 用 之 ， 它 们 的 特殊 性 质 有 助 于 到 琴 烽 酰 胺 的 溶解 。 可 以 预先 决定 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 网 孔 的 大 小 : @ 调 节 丙 烯 酰胺 的 总 百分数 ; 包 改 变 加 入 的 交 联 剂 数量 ， 加 入 交 联 剂 的 目的 是 诱导 丙烯 酰胺 的 聚合 。 在 研究 材料 分 子 量 范 围 很 宽 的 时 候 ， 研 究 者 可 以 制备 一 种 网 孔 梯 度 凝 胶 ， 其 中 较 大 的 网 孔 在 胶 的 上 部 而 不 是 底 部 。 因 此 ， 在 电泳 过 程 中 凝 胶 变 得 更 加 有 限制 。

13.7 样品 的 分 子 量 范 围 。

核酸 分 子 迁 移 的 速度 与 构成 分 子 的 碱 基数 (对 双 链 DNA 或 DNA : RNA 杂交 链 而 言 是 碱 基 对 ) 的 logio Mik. MI, ATMA, BRAM (或 拖拉 系数 ) 就 越 大 ， 即 分 子 表现 为 被 拖 过 基质 几何 形状 的 网 孔 〈Helling 等 ,1974) 。 用 至 少 2 个 标准 分 子 量 核酸 ， 分 别 以 它 们 的 logie 核 苷 酸 数 对 它们 的 迁移 距离 cm) [ 即 离 原 点 〈 上 样 孔 ) 的 距离 ] 作 图 ， 就 很 容 易 地 构建 电泳 分 离 RNA 的 标准 曲线 。 常 规 是 应 用 图 像 分 析 软 件 作 图 。

13.8 核酸 的 构 型

DNA 的 迁移 率 很 大 程度 上 受 分 子 拓扑 影响 CH, Sambrook 和 Russell, 2001), RNA 的

@ PETS Hi OE He Sk — BP AE 6 th BS EW Fae HB HE FFD STAT By Pe BL ak Ho EE . 384 .

Mt 录

电泳 行为 也 受 二 级 结构 的 影响 和 被 改变 ， 例 如 非 变性 RNA AAW BRN RR. AS a te 同类 RNA 共 迁 移 ，RNA 的 电泳 常规 是 在 变性 条 件 下 进行 的 〈 第 10 章 )。

13.9 电压

有 效 的 散热 直接 与 凝 胶 的 分 辨 能 力 有 关 。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 时 ， 必 须 确定 所 用 电压 不 会 引 起 凝 胶 过 热 。 在 比较 低 的 电压 下 电泳 时 ， 凝 胶 可 以 直接 冷却 ， 这 是 电泳 槽 结构 的 直接 功能 。 例如 ， 垂 直 型 凝 胶 的 散热 比 水 平 式 的 快 得 多 。 此 外 ， 带 有 铝 制 衬 垫 的 电泳 槽 ， 导 热 要 比 相当 厚度 的 玻璃 快 许多 倍 。 在 一 些 场合 ， 可 能 需要 在 电泳 槽 周围 不 断 地 双 水 冷却 以 保持 足够 低 的 温度 和 得 到 平整 而 高 分 辨 的 条 带 。 这 样 设计 的 装置 一 般 都 配备 有 管道 。 凝 胶 在 过 高 电压 下 电 泳 ， 分 辩 率 将 出 现 明 显 的 下 降 ， 而且 如 果 系统 变 得 太 热 ， 凝 胶 就 会 融化 。 琢 脂 糖 凝 胶 决 不 能 在 两 个 电极 之 间 以 高 于 5V/cm 电泳 ; 当然 ， 凝 胶 可 以 在 很 低 的 电压 下 电泳 。 一 般 胶 跑 得 越 慢 ， 分 辩 率 就 越 好 (2~10kb 的 范围 ) 。 如 果 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 保持 在 这 些 参数 内 ， 就 不 需要 冷却 系统 了 。

13.10 RUC

当心 ”省 化 乙 狂 是 一 种 强烈 的 致 突变 剂 。 操 作 和 处 理 它 时 都 必须 十 分 当心 ， 并 且 要 按 照 制造 商 的 指南 做 。 处 置 详 情 见 附录 4。

天 然 DNA 以 双 链 形式 存在 ， 并 且 在 电泳 期 间 ， 它 的 迁移 深 受 溴 化 乙 锭 的 影响 。 与 DNA Ala], RNA 的 结构 不 会 因为 琼脂 糖 凝 胶 和 电泳 缓冲 液 中 加 入 省 化 乙 锭 而 受到 本 质 性 的 影响 。 使 用 时 ， 溴 化 乙 锭 〈10mg/ml 的 储备 液 ) 经 常 被 稀释 到 终 浓 度 为 0.5pg/ml。 这 种 染 料 能 减 慢 样品 迁移 速度 15% 左 右 。 电 泳 结束 后 ， 族 胶 的 染色 和 脱色 一 般 都 很 容易 并 且 不 至 于 忙乱 。 事 实 上 担心 的 是 ， 省 化 乙 锭 在 Northern 印迹 和 Southern 印迹 期 间 可 以 分 别 干 扰 RNA fl DNA 的 转移 效率 。 如 果 在 制 胶 时 直接 将 省 化 乙 锭 加 入 凝 胶 ， 要 确定 把 它 也 加 到 电 泳 缓冲 液 中 ， 和 否则 因此 将 耗 尽 凝 胶 中 的 染料 。 其 原因 是 ，RNA 电泳 时 样品 是 从 负极 向 正极 移动 ， 而 省 化 乙 锭 是 从 正极 向 负极 移动 。 但 是 ， 如 果 电 泳 时 间 短 ， 例 如 ， 检 查 大 小 、 质 量 或 者 完整 性 时 ， 把 省 化 乙 锭 加 到 电泳 缓冲 液 中 不 是 必需 的 。 问 题 只 是 发 生 在 电泳 时 ， 核 酸 和 省 化 乙 锭 互相 向 相反 的 电极 迁移 。 关 于 省 化 乙 锭 优点 和 缺点 及 其 他 染料 更 全 面 的 讨论 见 第 1m.

13.11 SYBR &

当心 SYBR 绿 虽 然 不 像 澳 化 乙 丛 那样 具有 和 致 突变 性 ， 但 是 应 当 像 对 待 所 有 核酸 结合 染料 一 样 ， 小 心 处 理 。 要 按照 制造 商 的 指南 ， 十 分 小 心地 处 理 和 处 置 它 。 处 置 详情 见 附 录 4。

三 个 新 的 相关 染料 ， 即 SYBR &I. SYBRATALSYBR 金 “〈 分 子 探 针 )， 已 经 在 核酸 电泳 中 广泛 使 用 。 与 省 化 乙 锭 相 比 ，SYBR 染料 具有 明显 的 优点 ， 例 如 高 灵敏 度 、 低 背景 和 较 小 的 致 突变 性 ; 这 些 差异 在 第 10 章 有 更 详尽 的 讨论 。

制 胶 时 把 任何 SYBR 染料 加 到 融化 的 胶 中 都 是 不 合适 的 ， 因 为 染料 对 RNA 和 DNA 的 迁移 模式 有 负面 影响 。 在 有 SYBR 绿 时 ， 凝 胶 电泳 显示 出 模糊 的 条 带 ， 高 度 不 规则 ， 并 且 常常 不 能 与 附近 的 其 他 条 带 分 开 。 这 种 现象 似乎 发 生 在 所 有 浓度 的 SYBR 绿 和 所 有 电压 情 况 下 。 在 笔者 实验 室 ， 样 品 先 电泳 ， 然 后 用 SYBR 绿 工 或 者 SYBR 金 染 色 。 电 泳 以 后 再 染

。 385 .

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

色 ， 效 果 非 常 好 。 13. 12 ” 碱 基 组 分 和 温度

与 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 不 一 样 ， 核 酸 在 琼脂 糖 凝 胶 中 的 迁移 不 受 它们 的 碱 基 组 分 影响 。 此 外 ， 核 酸 在 琼脂 糖 凝 胶 中 的 电泳 行为 ， 在 4C 到 室温 之 间 没 有 可 估量 的 变化 。 但 是 凝 胶 过 热 还 是 很 令 人 担心 的 事 。 核 酸 样品 常规 在 室温 下 进行 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 。

13.13 电场 方向

常规 电泳 都 是 在 一 定 方向 的 电场 中 分 离 核酸 分 子 。 使 用 脉冲 电场 进行 凝 胶 电 泳 ， 已 经 克 服 了 过 去 经 典 电泳 方法 对 分 子 大 小 的 限制 (Schwartz 等 ，1982) 。 这 种 技术 迫使 DNA 分 子 周期 性 地 适应 从 一 个 电场 方向 转向 另 一 个 方向 。 这 种 方法 是 高 效 的 ， 分 离 0. 1 一 10MP 的 DNA 分 子 ， 甚 至 完整 的 染色 体 都 是 可 重复 的 。 和 一 般 不 能 用 于 RNA 电泳 ， 因 为 天 然 RNA 是 很 小 的 分 子 。

13.14 电泳 模 的 类 型

历史 上 琼脂 糖 凝 胶 要 铸 型 并 且 是 水 平 式 平板 电泳 ， 这 是 因为 琼脂 糖 凝 胶 的 张力 强度 很 低 。 水 平 配置 使 凝 胶 置 于 完全 支持 之 中 ， 这 样 可 以 用 浓度 低 的 凝 胶 很 方便 地 有 效 分 离 范围 很 宽 的 核酸 样品 。 虽 然 不 同 设计 和 不 同 规格 的 电泳 槽 到 处 都 可 以 购买 到 ， 毫 无 疑问 值得 买 坚固 耐用 的 电泳 槽 ， 这 样 的 电泳 槽 可 以 经 得 起 正常 实验 室 几 年 的 磨损 。 琼 脂 糖 不 像 单 体 丙烯 酰胺 那样 有 毒性 ， 很 容易 在 工作 台 上 〈 如 果 要 加 毒性 变性 剂 则 在 通风 橱 中 进 和 ss 及 进行 电泳 。

实际 中 ， 凝 胶 淮 注 盘 的 开口 端 必 须 密封 并 保留 融化 的 琼脂 糖 直到 固化 为 止 。 有 些 较 新 的 设计 加 入 了 与 结构 连 在 一 起 的 橡胶 垫圈 ， 当 灌注 盘 与 电泳 方向 成 99"， 插 进 电泳 槽 中 则 它 就 被 密封 了 〈 附 图 13-1) 。 这 种 设计 不 需要 用 胶带 贴 边 ， 并 且 也 排除 了 老式 灌注 盘 常 有 的 渗 漏 现象 。

附 图 13-1 带 有 垫圈 的 中 号 电泳 槽 。 注 意 凝 胶 浇 铸 灌 注 盘 和 梳子 的 定位 。 在 琼脂 糖 固化 后 ， 灌注 盘旋 转 90`， 梳 子 形成 的 孔 在 电场 方向 。Owl Separation Systems Hi

比较 好 的 电泳 凝 胶 盒 具有 各 种 各 样 的 梳子 ， 它 们 可 以 用 来 制 成 不 同 尺 寸 不 同 数目 的 于 样 孔 。 一 般 梳 齿 是 Imm、1. 5mm、2mm 或 3mm 厚 ， 每 块 胶 能 够 产生 10 一 20 个 孔 。 也 可 以 根 据 需 要 购买 带 有 缓冲 液 出 口 或 者 带 有 能 够 调节 缓冲 液 流 通 循环 端口 的 电泳 凝 胶 盒 : 例如 ， 用 *， 386 -

Mt Ar 受

磷酸 盐 或 者 其 他 不 能 抵抗 pH 变化 的 缓冲 液 ， 就 像 电泳 乙 醛 酸化 RNA (第 10 章 ) 那样 ， 避 免 形成 pH 梯度 是 关键 。

13.15 电泳 的 安全 问题

安全 性 也 必须 是 涉及 电泳 装置 选择 的 因素 。 在 电泳 时 或 者 电源 已 插 在 插座 上 时 ， 千 万 不 要 接触 凝 胶 、 电 泳 槽 或 电源 。 不 应 当 企图 修改 电泳 槽 或 者 电源 的 设计 ， 任 何 改变 对 操作 者 和 实验 室 的 同事 都 会 带 来 重大 的 风险 。 设 计 良 好 的 系统 在 有 电流 时 ， 不 可 能 打开 或 移动 盖子 。 有 些 设计 ， 盖 子 是 可 滑 出 的 ， 可 以 在 盖子 接近 电泳 槽 的 内 部 前 断 开 电流 。 这 就 允许 安全 地 检 查 电泳 过 程 了 。 若 要 恢复 电流 和 继续 电泳 ， 盖 子 必 须 复位 。 在 接近 电泳 槽 检查 系统 时 ， 可 以 机 敏 地 从 电源 和 凝 胶 盒 处 断 开导 线 接头 。 许 多 较 新 型 的 电源 配置 了 可 接纳 两 套 凝 胶 盒 的 导线 接头 。 在 用 导线 接头 连接 电源 和 凝 胶 盒 之 前 ， 必 须 确 定 电源 是 断 开 的 ;把 第 二 套 导线 接头 ( 另 一 个 凝 胶 盒 ) 连接 到 已 经 在 运行 的 电源 之 前 ， 必 须 关 闭 电源 。 当 所 有 的 连接 都 恰当 地 完 成 后 ， 电 源 才 能 够 再 打开 。 当 要 断 开 任何 导线 接头 之 前 ， 必 须 确认 电源 是 关闭 的 。 决 不 要 同 时 拿 着 两 个 导线 接头 ， 这 样 可 能 造成 环 路 而 触电 。

13. 16 电泳 装置 的 维护

在 大 多 数 分 子 生 物 学 实验 室 ， 电 泳 也 许 是 每 天 的 例行公事 。 因 为 优质 的 电泳 槛 和 电源 可 能 需要 投入 几 千 美元 ， 也 因为 有 潜在 的 危险 ， 所 以 决 不 可 以 忽视 对 仪器 的 保养 。 电 泳 仪器 的 基本 维护 是 经 济 有 效 的 和 强制 性 的 。

电泳 的 电泳 槽 和 电源 的 合理 维护 及 使 用 是 一 件 重要 的 事情 ， 但 是 部 分 实验 室 经 常 忽 略 这 一 点 。 很 清楚 ， 操 作者 的 责任 是 必须 按 一 个 固定 的 程序 检查 电线 、 连 接 处 和 电极 ， 以 防止 发 生 潜在 威胁 生命 的 伤害 。

可 能 最 常见 的 问题 ， 是 电源 的 接头 、 电 极 的 绝缘 导线 接头 和 电 插 头 处 裸露 的 铜 导线 暴 雷 在 外 。 这 种 状况 具有 严重 的 电击 休克 危险 。 通 常 以 一 定 的 花费 从 制造 商 或 者 经 销 商 处 可 以 购 买 到 置换 用 的 绝缘 导线 ， 而 在 仪器 最 初 购 买 时 预定 一 些 附 件 是 最 值得 的 。 此 外 ， 所 有 电源 绝 缘 导 线 、 绝 缘 座 、 电 极 、 连 接 螺旋 套 和 密封 垫圈 ， 实 验 室 都 应 当 规定 每 周 或 者 每 两 周 检 查 一 次 。 关 于 电泳 仪器 维护 的 详细 制度 见 Landers (1990),

13.17 ”参考 文献

Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., and Peacock, A. C. (1969). Electrophoretic characteri- zation of bacterial polysomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol. Biol. 41, 139.

DeWachter, R., Maniloff, J., and Fiers, W. (1990). Two-dimensional get electrophoresis of nucleic acids. Jn “Gel Electrophoresis of Nucleic Acids—A Practical Approach” (D. Rickwood and B. D. Hames, Eds.). IRL Press, Washington, DC. pp. 151-200.

Farrell, R. E., Jr. (1993). “RNA Methodologies. A Laboratory Guide for Isolation and Characterization.” Academic Press, San Diego, CA.

Helling, R. B., Goodman, H. M., and Boyer, H. W. (1974). Analysis of R. EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophore- sis. J. Virol. 14, 1235.

Landers, T. (1990). Electrophoresis apparatus maintenance. Focus 12(2), 54.

Ogden, R. C., and Adams, D. A. (1987). Electrophoresis in agarose and acrylamide gels.

。 387 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

Methods Enzymol. 152, 61. Peacock, A. C., and Dingman, C. W. (1968). Molecular weight estimation and separation

of ribonucleic acid by electrophoresis in agarose- -acrylamide composite gels.

Biochemistry 7, 688. Rodbard, D., and Chambach, A. (1970). Unified theory for gel cero and gel fil-

tration. Proc. Natl. Acad. Sci. 65, 970. Sambrook, J., and Russell, D. W. (Eds.). (2001). “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. — Schwartz, D. C., Saffran, W., Welsh, J., Haas, R., Goldenberg, M., and Cantor, C. R. (1982). New techniques for purifying large DNAs and studying their Seat and packaging. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47, 189.

附录 14 A Va Te PDE Hee Oak We FEL dak

当心 LA AMMRE AER ROHBZA, CREAZMNKRKAK, HERA TY 远 不 要 认为 聚合 的 丙烯 酰胺 对 健康 就 不 具 危 险 。 如 果 你 不 熟悉 安全 制备 和 使 用 聚 两 粳 酰 胺 凝 胶 的 方法 ， 请 找 有 此 技术 的 人 员 协 助 。 欣 慰 的 是 现在 大 多 数 实验 室 都 购买 预制 的 聚 琴师 酰胺 凝 胶 而 不 必 使 用 有 毒 的 前 体 了 。

丙烯 酰胺 单 体 聚 合生 成 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 8@8， 是 由 线性 链 状 分 子 以 及 与 这 些 链 状 分 子 交 联 的 N,N“- 亚 甲 基 双 丙烯 酰胺 Chis) 组 成 的 。 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 中 ， 核 酸 分 子 的 筛 分 直接 与 丙烯 酰胺 的 浓度 以 及 丙烯 酰胺 与 N,N“- 亚 甲 基 双 丙烯 酰胺 的 比例 有 关 。

因为 氧气 抑制 聚合 反应 ， 所 以 单 体 的 混合 物 必 须 除 去 空气 。 可 以 在 混合 物 中 通 人 惰性 气 体 ， 或 用 真空 泵 抽 和 气 。

灌 凝 胶 时 ， 不 是 灌 入 管 中 就 是 制 成 平板 ， 凝 胶 的 顶部 都 会 形成 新 月 面 。 如 果 忽略 了 这 一 点 ， 凝 胶 不 平整 的 顶部 会 引起 条 带 变形 。 为 了 消除 新 月 面 ， 聚 合 之 前 ， 在 凝 胶 混合 物 的 表面 小 心地 加 一 薄 层 水 或 水 饱和 的 正 丁 醇 。 聚 合 完成 后 ， 让 水 或 丁 醇 流出 ， 凝 胶 的 上 部 就 留 下 了 一 个 平整 的 表面 。 这 层 水 或 正 丁 醇 不 仅 消 除了 新 月 面 ， 而 且 隔 绝 了 凝 胶 表面 与 抑制 聚合 反应 的 氧气 间 的 接触 。

可 以 用 两 种 方法 预测 凝 胶 孔 径 的 大 小 。 一 种 方法 是 调节 丙烯 酰胺 的 总 百分比 ， 即 丙烯 酰 胺 单 体 和 交 联 剂 质量 的 总 和 ， 以 名 工 表 示 。 例 如 ，20%T 的 胶 含 有 20% (200g/L) 的 丙烯 酰胺 加 bis。%% 工 增加 ， 则 和 孔径 减 小 。

男 一 种 调节 孔径 的 方法 是 改变 交 联 剂 的 量 ， 以 单 体 和 交 联 剂 总 量 的 百分比 表示 ， 即 为 C。 例 如 ，20%T 5%Cos 的 凝 胶 含 有 20% 〈200g/L) 的 丙烯 酰胺 加 bis. Tn A bis SA 酰胺 总 质量 的 5 为 。 发 现任 意 的 %% 工 配 以 5 上 的 交 联 剂 ， 都 会 形成 最 小 孔径 的 胶 。 高 于 和 低 于 5 为 时 ， 和 孔径 都 会 增 大 。 待 研究 材料 的 分 子 量 范 围 很 宽 时 ， 研 究 者 可 以 制备 一 种 梯度 胶 。 梯度 胶 中 ， 项 部 的 孔径 比 底部 的 大 ， 电泳 过 程 中 ， 凝 胶 的 限制 性 较 大 。

聚 丙 炳 酰胺 凝 胶 的 聚合 有 化 学 方法 和 光化学 方法 。 最 常用 的 化 学 方法 中 ， 过 硫酸 铵 和 TEMED (CN,N,N ,N- 四 甲 基 乙 二 胺 ) 分 别 用 作 起 始 剂 和 催化 剂 。 在 光化学 方法 中 ， 使 用 核 黄 素 和 TEMED。 用 荧光 光源 的 长 波长 紫外 线 照 射 凝 胶 混 合 物 起 始 光化学 反应 。 光 化 学 聚

© 得 到 Hoefer Pharmacia Biotech 人 允许 并 改编 。 - 388 -

A |

FABRE FE RIE «A A ST a 1 I BY al. AR TTI ik A F RNA 的 测量 。

聚合 反应 会 产 热 。 如 果 产 热 太 厉害 ， 未 聚合 的 凝 胶 会 形成 对 流 ， 导 致 雍 胶 结构 的 不 一 致 性 。 为 了 防止 过 度 发 热 ， 起 始 剂 和 催化 剂 的 浓度 应 当 调 节 到 在 20 一 60min 内 完成 聚合 。

14.1 分 析 型 凝 胶 电 泳

常规 用 于 RNA 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 的 两 种 变性 剂 是 甲 酰胺 〈 终 浓度 98%) 和 尿素 〈 终 浓度 7mol/L)， 它 们 的 选择 主要 取决 于 样品 中 分 子 量 的 大 小 。 分 子 量 小 于 200 TRAN. Al 含 尿 素 的 凝 胶 最 好 。 而 若 要 准确 地 测定 200 一 1000 个 核 苷 分 子 的 长 度 则 必须 使 用 含 甲 酰胺 的 凝 胶 。

平板 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 是 灌注 在 两 片 干净 的 玻璃 板 之 间 的 ， 玻 璃 板 之 间 用 垫 片 〈 厚 度 1 一 2mm) 隔 开 。 用 垂直 装置 进行 核酸 电泳 时 ， 在 玻璃 板 两 侧 冷却 胶 ， 其 好 处 在 于 通常 可 以 消 除 因 热 变形 而 造成 的 “微笑 型 条 带 ”。 从 凝 胶 里 回收 核酸 时 需要 接着 电泳 ， 凝 胶 的 厚度 最 好 薄 至 0. 5mm。 就 琼脂 糖 凝 胶 而 言 ， 包 括 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 ， 最 普通 的 程序 是 电泳 后 要 使 样品 AA. PAK ARIE EL MERE RA SYBR 染料 染色 ， 可 以 目测 电泳 后 核酸 样 品 的 分 布 状态 。 放 射 性 标记 的 核酸 电泳 后 ， 可 以 用 另 一 种 方法 一 一 放射 自 显影 法 可 以 使 凝 胶 中 的 分 子 定位 。 与 标准 的 印迹 分 析 不 同 〈 例 如 Northern 印迹 ) ， 在 这 些 条 件 下 放射 自 显影 不 需要 凝 胶 转 移 ， 因 为 电泳 前 已 经 标记 和 /或 杂交 了 ， 例 如 ，S1 核酸 酶 保护 实验 和 RNase 保 护 实 验 。 关 于 桶 丙烯 酰胺 凝 胶 制 备 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 机 制 的 详尽 讨论 ， 读 者 可 以 参考 Berger 和 Kimmel (1987), Sambrook 和 Russell (2001) 。

14.2 参考 文献

Berger, S. L., and Kimmel, A. R. (1987). “Guide to Molecular Cloning Techniques.” Academic Press, San Diego, CA.

Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001). “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

附录 15 WAS. iAH FS By HE

Ambion, Inc. Applied Biosystems

2130 Woodward 850 Lincoln Centre Drive

Austin, TX 78744 :

800-888-8804 Foster City, CA 94404

www.ambion.com « 800-345-5224 www.appliedbiosystems.com

Amersham Biosciences

Corporation BD Biosciences 800 Centennial Avenue 2350 Qume Drive P.O. Box 1327 San Jose, CA 95131 Piscataway, NJ 08855 877-232-8995 800-526-3593 www. bdbiosciences.com

www.amershambiosciences.com - 389 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南

RNA 研究 方法

Beckman Coulter, Inc. 4300 N. Harbor Boulevard

Box 3100

Fullerton, CA 92834 800-742-2345 www.beckman.com

Bellco Glass, Inc. 340 Edrudo Road Vineland, NJ 08360 800-257-7043 www.belcoglass.com

Bio-Rad Laboratories 3300 Regatta Hercules, CA 94547 800-424-6723 www.bio-rad.com

Brinkmann Instruments, Inc.

One Cantiague Road P.O. Box 1019

~ Westbury, NY 11590-0207

800-645-3050 www.brinkmann.com

Calbiochem P.O. 12087

La Jolla, CA 92039-2087

800-854-3417

www.emdbiosciences.com

Cambrex Bio Science

191 Thomaston Street

Rockland, ME 04841 800-341-1574 www.cambrex.com

Clontech Laboratories BD Biosciences Clontech 1020 E. Meadow Circle Palo Alto, CA 94303-4230

800-662-2566 www.clontech.com

Cole-Parmer Instrument

Company 625 E. Bunker Court Vernon Hill, IL 60021 800-323-4340 www.coleparmer.com

* 390 -

Dharmacon

2650 Crescent Drive, #100 Lafayette, CO 80026 800-235-9880 www.dharmacon.com

Diversified Biotech, Inc. 1208 V.F.W. Parkway Boston, MA 02132 800-796-9199 www.divbio.com

DNA Diagnostics

P.O. Box 4544

Crofton, MD 21114-4544 703-495-9090 www.DNAdiagnosticsinc.com

Dynal Biotech, Inc.

9099 North Deerbrook Trail Brown Deer, WI 53223 800-558-4511 www.dynalbiotech.com

Eastman Kodak Co. 343 State Street Rochester, NY 14652 800-225-5352 www.kodak.com

Exon-Intron, Inc.

Specialists in Biotech Education P.O. Box 395

Loganville, PA 17342 800-407-6546 www.DNAtech.com

FOTODYNE, Inc.

950 Walnut Ridge Drive Hartland, WI 53029 800-362-3686 www.fotodyne.com

GenHunter

624 Grassmere Park Drive Suite 17

Nashville, TN 37211 800-311-8260 www.genhunter.com

Invitrogen Corporation 1600 Faraday Avenue Carlsbad, CA 92008 800-955-6288 www.invitrogen.com

ISCO, Inc.

P.O. Box 82531

Lincoln, NE 68505-0347 800-228-4250 http://ISCO.com

Kendro Laboratory Products 308 Ridgefield Court Asheville, NC 28806 800-522-7746 www.sorvall.com

Kimble-Kontes

1022 Spruce Street Vineland, NJ 08360 888-546-2531 www.kimble-kontes.com

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.

2 Cessna Court

Gaithersburg, MD 20879

800-638-3167

www.kpl.com

Lofstrand Laboratories, Ltd. 7961 Cessna Avenue Gaithersburg, MD 20879 800-541-0362 www.lofstrand.com

Lumigen, Inc.

22900 W. Eight Mile Road Southfield, MI 48034 248-351-5600 www.lumigen.com

Matrix Technologies Corporation

22 Friars Drive

Hudson, NH 03051

800-345-0206

www.matrixtechcorp.com

Media Cybernetics, Inc. 8484 Georgia Avenue Suite 200

Silver Spring, MD 20910 800-992-4256 www.mediacy.com

Millipore Corporation 290 Concord Road Billerica, MA 01821 800-645-5476 www.millipore.com

Monomer Sciences, Inc. Nature’s Way

P.O. Box 520

New Market, AL 35761 www.monomer.com

Molecular Probes, Inc. P.O. Box 22010

Eugene, OR 97402-0414 800-438-2209 www.probes.com

Nalge Nunc International 75 Panorama Creek Drive Rochester, NY 14625 800-625-4327 www.nalgenunc.com

Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc.

549 Albany Street

Boston, MA 02118

800-762-4000

www.perkinelmer.com

New England Biolabs 32 Tozer Road Beverly, MA 01915 800-632-5227 www.neb.com

Nikon Instrument Group 1300 Walt Whitman Road Melville, NY 11747 800-526-4566 www.nikonusa.com

。 391 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

¢ 362 -

Omni International

4257 Aiken Drive, Suite D PO. Box 861455 Warrenton, VA 20187 800-776-4431 www.omni-inc.com

Owl Separation Systems 55 Heritage Avenue Portsmouth, NH 03801 800-242-5560 www.owlsci.com

Pierce Biotechnology, Inc. P.O. Box 117

Rockford, IL 61105 800-874-3723 www.piercenet.com

Polaroid Corporation 575 Technology Square Cambridge, MA 02139 800-225-1618 www.polaroid.com

Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711 800-356-9526 www.promega.com

Qbiogene

2251 Rutherford Road Carlsbad, CA 92008 800-697-1111 www.qbiogene.com

Roche Applied Science

9115 Hague Road

P.O. Box 50414

Indianapolis, IN 46250 800-262-1640 www.roche-applied-science.com

Rohm & Haas Co.

100 Independence Mall, West Philadelphia, PA 19106 800-221-8992

www.rohmhaas.com

Schleicher & Schuell Bioscience

10 Optical Avenue

Keene, NH 03431

800-245-4024

www.s-and-s.com

Sigma-Aldrich

3050 Spruce Street

St. Louis, MO 63160 800-521-8956 www.sigmaaldrich.com

Stratagene Cloning Systems 11011 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037 800-424-5444 www.stratagene.com

Tri-Continent Scientific, Inc. 12555 Loma Rica Drive Grass Valley, CA 95945 800-937-4738 www.tricontinent.com

VWR Scientific

200 Center Square Road Bridgeport, NJ 08014 800-932-5000 WWW.Vvwrsp.com

Whatman, Inc.

9 Bridewell Place Clifton, NJ 07014 800-631-7290 www.whatman.com

Worthington Biochemical Corporation

730 Vassar Avenue

Lakewood, NJ 08701

800-445-9603

www.worthington-biochem.com

Zeiss, Inc.

One Zeiss Drive Thornwood, NY 10594 800-233-2343

Www.zeiss.com

附录 16 SI i

附录 17

A (adenine)

amol (Cattomole)

ARE (adenine/uracil-rich element)

BMP (bit map)

C (cytosine)

cRNA [complementary (antisense) RNA ]

cpRNA (chloroplast RNA)

ctRNA (countertranscript RNA)

DNA (deoxyribonucleic acid)

dNTP (a cocktail of nucleotides containing equimolar amounts of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)

fg (femtogram)

G (guanine)

GIF (graphics interchange format)

h (hour)

hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)

JPEG (joint photographic experts group)

¥

w

E

|B

TT

G

Ik M

=e k

a h

ae da

分 d

厘 C

= m

微 有

纳 [ 诺 ] n

RLF J P

KLEE J f

by FE a

KLE z 么 [ 科 托 ]

wi Fl 4a 5

Fig OE

JR RETR, 10-18 mol

aE Fm ERPS / Be MB ME TO

位 图

胞 喀 喧

Ath (RX) RNA

叶绿体 RNA

反 转 录 RNA

脱氧 核糖 核酸

含有 等 摩尔 dATP、dCTP、 dGTP, dTTP HRA

乙 二 胺 四 乙酸

OPeD

鸟 味 叭

图 像 可 交换 文件 格式

小 时

核 不 均一 RNA

(“ 联 合 图 像 专家 组 ”创建 的 ) 图 像 文本 格式 名 . 393 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

pg (microgram) 微克 (10-°g)

pl (microliter) Ft (10° L)

min (minutes) at

mol (mole) 摩尔

mRNA (messenger RNA) 信使 RNA

MSDS (material safety data sheet) 材料 安全 数据 表

NaAc (sodium acetate) 乙酸 钠

NTP (a cocktail of nucleotides containing 含有 等 摩尔 ATP. CTP, equimolar amounts of ATP, CTP, GTP, UTP) GTP, UTPHKHEAD

nt (nucleotide) KH

OD (optical density) 光 密 度

PCI [phenol : chloroform : isoamylalcohol 苯酚 : A: 异 戊 醇 -(25 24: 1)

(25? 24: 1)]

PCR (polymerase chain reaction) Ey a EZ

pg (picogram) ar

Pu [purine (adenine, guanine) | mm (Ree, Sew)

Py [pyrimidine (cytosine, thymine, uracil) ] WME CARL PAE OE, FA) AR SE, SR TE REE )

q. s. (quantum sufficiat, quantum sufficit, quantum 足 量 satis)

rDNA (recombinant DNA) 重组 DNA

RNA (ribonucleic acid) 核糖 核酸

RNase (ribonuclease) 核糖 核酸 酶

RPA (ribonuclease protection assay) 核糖 核酸 酶 保护 试验

rRNA (ribosomal RNA) 核糖 体 核 糖 核酸

s, sec (second) Re

SAM (S-adenosyl-methionine) S- 腺 苷 甲 硫 氮 酸

T (thymine) Fa) FR Pa BE

TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 3,3',5,5'-PU PSX — SRK

tRNA (transfer RNA) 转移 核糖 核酸

U (uracil) BR Oe We

1° (primary) 一 级

2° (secondary) =

3° (tertiary) 三 级

附录 18 商标 引用

AccuTaq LAIM 是 Sigma-Aldrich 公司 注册 商标 。 Amerlite@ 是 Rohm Hass 公司 注册 商标 。 Amplifluor@ 是 Intergen 公司 注册 商标 。 Ampligen@ 是 Hemispherx Biopharma 公司 注册 商标 。 AmpliTaq@ 是 Roche Molecular Biosystems, Inc. 公司 注册 商标 。 AmpliWax@ 是 Roche Molecular Biosystems, Inc. 公司 注册 商标 。 Blast@ 是 National Library of Medicine 公司 注册 商标 。 Centricon 是 Millipore 公司 注册 商标 。 CDP Star@ 是 Appllied Biosystems 公司 注册 商 标 。

。394 -

Corex® # Corning, Inc 公司 注册 商标 。 Coomassie 是 Imperial Chemical Industries, Inc. CSPD® # Appllied Biosystems 公司 注册 商标 。 Cy3® # Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。 Cy5® & Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。 Deep Vent® # New England BioLabs 公司 注册 商标 。

DNA Distick™ Invitrogen Corporation 公司 注册 商标 。

Dynabeads® { Dynal Biotech, ASA 公司 注册 商标 。

ECL™ # Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

E-Gel® © Invitrogen Corporation 公司 注册 商标 。

Elutip-d® # Schleicher & Schuell Bioscience 公司 注册 商标 。

Eppendorf® £ Eppendorf-NetherHinz GmbH 公司 注册 商标

ExpandIM 是 Roche Applied Science 公司 注册 商标 。

Extractor@ 是 Schleicher & Schuell Bioscience 公司 注册 商标 。

Ficoll® 4 Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

FORMAzol® 是 Molecular Research Center, Inc. 公司 注册 商标 。

Gel-Pro@ 是 Media Cybernetics，Inc. 公司 注册 商标 。

Gelstar® # FMC Corporation 公司 注册 商标 。

GenBank® # United States Department of Health and Human Services 公司 注册 商标 。 GeneAmp® # Roche Molecular Systems 公司 注册 商标 。

Hybond® & Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

Hyperfilm™ 4 Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

Igepal® # ISP technologies, Inc. 公司 注册 商标 。

JumpStar™ Sigma Aldrich Corporation 公司 注册 商标 。

Kimwipes® # Kimberly-Clark Corporation 公司 注册 商标 。

Lab-Line™ Lab-Line Instruments, Inc. 公司 注册 商标 。

Lumiphos® # Lumigen, Inc 公司 注册 商标 。

Minifold® # Schleicher & Schuell Bioscience 公司 注册 商标 。

Nalgene® { Nalge Nunc International Corporation 公司 注册 商标 。

Nonidet P-40® Shell International Petroleum Company Ltd. 公司 注册 商标 。 Nytran® 2 Schleicher & Schuell Bioscience 公司 注册 商标 。

Optitran® & Schleicher & Schuell Bioscience 公司 注册 商标 。

Parafilm® 是 American Can Company 公司 注册 商标 。

pBluescript® 是 Stratagene 公司 注册 商标 。

pGEM® 是 the Promega Corporation 公司 注册 商标 。

PlexiglassIM 是 Rohm and Haas Co. 公司 注册 商标 。

Polaroid@ 是 Polaroid Corporation 公司 注册 商标 。

Polytron® 是 Kinematica AG Company 公司 注册 商标 。

Posiblot® 是 Stratagene 公司 注册 商标 。

Pronase® 是 Calbiochem-Novabiochem Corp. 公司 注册 商标 。

PYREX® 是 Corning，Inc 公司 注册 商标 。

RedTaqIY 是 Sigma-Aldrich Corporation 公司 注册 商标 。

Riboprobe@ 是 Promega Corporation 公司 注册 商标 。

RNAquard® 是 Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

Y 司 注册 商标 。

&

° 395 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

FE ee a.

RNA/azer® § Ambion, Inc. 公司 注册 商标 。 RNasin® Promega Corporation 公司 注册 商标 。 Rubbermaid 是 Newell Rubberr Corporation 公司 注册 商标 。

SaranWrapIM 是 S. C. Johnson 公司 注册 商标 。

SeaKem GTG@ 是 Cambrex Bio Science 公司 注册 商标 。

SephadexTM 是 Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

Sepharose™ 42 Amersham Biosciences 公司 注册 商标 。

Speed Vac® Savant Instruments, Inc. 公司 注册 商标 。

Sigmacote® # Sigma-Aldrich Company 公司 注册 商标 。

Stratalinker® # Stratagene 公司 注册 商标 。

Subtractor® 是 Invitrogen Corporation 公司 注册 商标 。

SUPERase。InIM 是 Ambion，Inc. 公司 注册 商标 。

Super Scripf™ 是 Invitrogen Corporation 公司 注册 商标 。

SYBR@ 是 Molecular Probes，Inc. 公司 注册 商标 。

SYPRO® Molecular Probes, Inc. 公司 注册 商标 。

TAMRA™ £ Perkin Elmer 公司 注册 商标 。

Triton® # Union Carbide Chemical Plastics Co. , Inc. 公司 注册 商标 。

TaqMan® # Applied Biosystems 公司 注册 商标 。

TaqStarf!™ 4 Clontech Laboratories, Inc. 公司 注册 商标 。

Teflon® # E. I. DuPont de Nemours & Co. , Inc. 公司 注册 商标 。

Tissue-Tek® 是 Sakura-Finetek 公司 注册 商标 。

TRI Reagent@ 是 Molecular Research Center, Inc. 公司 注册 商标 。 TRIzol® Molecular Research Center, Inc. 公司 注册 商标 。 real TurbBlotter™ Schleicher & Schuell Bioscience 公司 注册 商标 。

Tween® # ICI Americas, Inc. 公司 注册 商标 。 Ultrafree® {2 Millipore Vorporation 公司 注册 商标 。 Vent® f2 New England BioLabs 公司 注册 商标 。 Whatman® f Whatman, Ltd. 公司 注册 商标 。 Ziplot® S.C. Johnson Son, Inc. 公司 注册 商标 。

《附录 部 分 ， 包 慧 中 译 ; 金 由 辛 校 )

jest)

- 396 -

本 语 &

abundance 丰 度 ”细胞 内 某 一 种 RNA 或 一 类 RNA 分 子 所 占 比例 的 表述 。 某 一 特殊 种 类 的 mRNA 在 不 同样 品 中 的 相对 数量 ， 通 常用 相对 丰 度 表述 。

accession number 收录 号 ”GenBank 给 核酸 序列 (基因组 DNA BK cDNA) 或 氨基 酸 序列 CRAM) 指 定 的 数字 标识 。 该 收录 号 相当 于 一 个 检索 数据 库 时 使 用 的 电子 分 类 卡片 目录 。

acetylation 乙酰 化 ”在 分 子 上 导入 一 个 乙酰 基 团 〈 一 COCHs )。

adduct 加 成 化 合 物 “一 种 化 学 加 成 反应 的 产物 。

adenine 腺 味 叭 ”一 种 通常 在 DNA 中 与 胸腺 喀 啶 配对， 而 在 RNA 中 与 尿 喀 喧 配对 的 嗓 叭 碱 基 。

adenosine REBBH, RE —MAARERHEE.

affinity chromatography #MER 一 种 根据 生物 活性 或 生物 结构 ， 对 分 子 进行 物质 分 离 的 方法 。 如 利用 oligo (dT) 与 某 些 真 核 RNA 的 poly (A) 尾部 的 碱 基 配对 ， 以 及 用 镍 柱 捕 获 带 有 赛 聚 组 蛋白 的 融合 盘 国 有

alkylation 烷 基 化 ”对 分 子 增 加 含 碳 基 团 的 修饰 。 核 酸 的 烷 基 化 修饰 常 是 基因 突变 的 成 因 。

allele 等 位 基因 ”一 个 基因 所 具有 的 两 个 或 几 个 可 替代 形式 中 的 一 个 形式 。

Alu repeat sequence 4I 重复 序列 ” 数 十 万 个 序列 中 的 一 个 ， 长 度 大 约 为 300bp， 广 泛 存 在 于 整个 基因 组 中 。 这 些 重复 序列 因 含 有 限制 性 核酸 内 切 酶 Ale 的 酶 切 位 点 〈AGCT) 而 得 名 。

a-amanitin o- BBR, BBA ”一 种 二 环 八 肽 毒素 ,来源 于 强 毒 茧 区 Amanita phalloides, 该 真菌 产物 对 真 核 RNA 聚合 酶 有 不 同 的 抑制 效率 ， 其 中 对 RNA 聚合 酶 开 的 抑制 最 强 。

amber codon 琥珀 密码 子 “ 即 翻译 终止 密码 子 UAG。

amino acids MBM 和 蛋白质 的 组 成 单位 。

ampliTaq 微生物 Thermus aquaticus 中 天 然 存 在 的 热 稳定 DNA 聚合 酶 的 重组 表达 产物 。

anneal 退火 多 聚 核 苷 的 碱 基 互 补 配对 形成 双 链 分 子 的 过 程 。

antigen 抗原 可 以 引起 抗体 合成 或 引起 免疫 反应 的 任何 分 子 或 分 子 中 的 部 分 。

antiparallel 反 平 行 ”两 条 互补 的 多 聚 核 苷 酸 相 互 配 对 的 方式 ; 两 个 相关 分 子 的 5 端 和 3 ' 端 相反 ， 一 链 的 5 端 与 另 一 链 的 3 端 结 合 配对 。 双 链 DNA (DNA: DNA)、 双 链 RNA (RNA: RNA) 以 及 DNA- RNA 杂 合 双 链 CDNA : RNA) 都 是 以 反 平 行 的 方式 进行 碱 基 配 对 的 。

antisense RNA [也 写作 (一 )RNAj] RMX RNA 任何 与 天 然 产 生 的 mRNA 序列 反 向 互补 的 RNA 分 子 。 反 义 RNA 可 在 膜 上 或 是 原 位 与 mRNA 分 子 杂 交 ， 生 成 极为 稳定 的 双 链 RNA。

AOI (area of interest) ”关切 区 在 一 个 图 像 中 被 定义 的 一 组 毗连 的 像素 ， 它 们 可 以 排列 成 任意 的 多 边 形 ， 用 来 与 该 图 像 中 的 其 他 区 域 相 区 别 。

argonaute ”一 个 蛋白 质 家 族 。 是 RNA 诱导 沉默 复合 物 (RNA-induced silencing complex, RISC) 的 组 成 成 分 之 一 。 它 们 通过 RNA 干扰 CRNAi) 介 导 mRNA 降解 。

array PEF 见 微 阵 列 (microarray) 。

attenuation ”衰减 ” 某 些 原核 操纵 子 调 控 转 录 终 止 的 方法 。

。 397 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

autoradiograph (也 称 作 autoradiogram) 放射 自 显影 图 把 目标 物 紧 贴 在 照相 软片 或 感光 乳剂 上 ， 就 可 以 得 到 一 个 记录 有 目标 物 GRA) 放射 空间 分 布 的， 被 称 作 放射 自 显影 图 的 相片 。

autoradiography 放射 自 显影 在 X 射 线 片 或 其 他 照相 感光 乳剂 上 记录 标记 分 子 放射 性 衰变 信和 号 的 过 程 。

autosomes “ 常 染 色 体 “除去 性 染色 体 之 外 的 所 有 染色 体 。 人 类 的 第 1 对 一 第 22 对 染色 体 为 常 染色 体 。

bacteriophage “噬菌体 ”一 种 感染 细菌 并 以 其 为 宿主 进行 繁殖 的 病毒 ， 通 常用 于 克隆 。 噬 菌 体 中 ， 和 鸣 菌 体 及 其 衍生 病毒 被 研究 得 最 为 广泛 具体 。

base pairing “” 碱 基 配 对 即 在 两 个 核酸 分 子 含 氮 碱 基 间 形成 氢 键 的 过 程 。

B particle 8 粒子 ”放射 性 衰变 过 程 中 ， 从 原子 核 释 放出 的 带 有 单个 电荷 的 基本 粒子 。 带 一 个 负电 荷 的 B 粒 子 为 一 个 电子 ， 带 一 个 正 电荷 的 B 粒 子 为 一 个 正 电 子 。

betaine HHH ”PCR 的 一 种 化 学 添加 物 ， 可 以 减少 富 含 GC 区 域 的 二 级 结构 形成 ， 帮 助 DNA 扩 增 。 标准 储备 液 浓度 为 5mol/L。

bioinformatics ”生物 信息 学 ”综合 了 计算 机 、 信 息 技 术 以 及 生物 工程 学 的 手段 ， 使 用 户 可 以 对 庞大 的 核酸 与 蛋白 质 序列 信息 进行 分 类 和 归档 。

biotechnology 生物 工程 学 (人 参见 遗传 工程 ) 利用 微生物 、 植 物 和 动物 细胞 ， 生 产 有 价值 的 产品 ， 如 食物 、 药 品 及 其 他 化 合 物 。

biotin FMR 一 种 小 分 子 维生素 ， 可 用 于 标记 核酸 等 多 种 目标 ， 包 括 用 非 放 射 性 化 学 发 光 和 显 色 技 术 进 行 杂 交 等 。

bit 比特 ， 位 ”计算 机 所 能 识别 的 最 小 信息 单位 。 一 个 像素 由 一 个 或 多 个 计算 机 位 表述 。 描 述 每 个 像 素 的 位 数 大 小 ， 直 接 决定 了 可 显示 图 像 的 彩色 和 灰 度数 值 。

bit depth 比特 数 ， 位 深 用 于 描述 一 个 像素 值 所 使 用 的 位 数 , 也 称 为 像素 深度 (pixel depth 和 每 像 素 比 特 (bits per pixel, BPP).

bitmap 位 图 用 于 表示 一 幅 图 像 的 二 维 阵列 。 该 阵列 的 每 一 单元 都 包含 有 一 个 描述 图 像 颜色 样本 的 数值 。

BLAST (basic local alignment search tool) ”常用 的 著名 生物 信息 学 资源 。 研 究 者 可 在 互联 网 上 使 用 BLAST 对 GenBank 内 的 核酸 /蛋白 质 序列 进行 搜索 查询 。

BMP (bit map) 一 种 数字 图 形 文件 的 格式 。

BPP (bits per pixel) 描述 图 像 的 位 深 。 二 阶 图 像 仅 1BPP， 而 真 彩色 为 24BPP。

brightness 亮度 即 图 像 中 白色 所 占 的 多 少 。 图 像 越 亮 就 包含 更 多 的 白 点 。 随 着 亮度 的 增加 ， 图 像 中 的 各 种 颜色 都 向 白色 转变 。

buoyant density 浮力 密度 ”在 标准 溶液 里 某 物 质 漂浮 能 力 的 大 小 。 如 由 于 RNA 和 DNA 的 浮力 密度 不 同 ， 因 此 可 在 毛 化 饮 或 三 氟 乙 酸 饮 中 把 它们 分 开 。

CAAT box 位 于 真 核 基 因 转 录 起 始 位 点 上 游 大 约 75bp 处 的 保守 序列 ， 是 真 核 启动 子 的 二 部 分 。

cap 帽子 真 核 mRNA 5 末端 结构 ， 由 起 始 两 个 核 苷 间 的 倒 接 (5'-5') 组 成 。 细 胞 核 内 mRNA 转录 完毕 ， 就 有 酶 促 反 应 ， 在 核 不 均一 RNA (hnRNA) 的 5" 端 进行 修饰 ， 形 成 5 帽子 结构 ;帽子 结构 又 所 揪 帽子 0 〈 此 结构 仅 限于 某 些 病毒 mRNA) 、 帽 子 1 ( 含 1 个 甲 基 基 团 ， 是 最 常见 的 形式 ) 和 帽子 2 ( 含 2 不 甲 基 基 团 ， 观 察 到 的 普遍 性 低 于 帽子 1) ，

cDNA 见 互补 DNA (complementary DNA),

cesium chloride (CsCl) $40 $8 FA FF EBB AE 4) KAO EE. CoCl 常用 于 沉淀 RNA, CH 他 应 用 中 也 被 用 于 质粒 DNA 的 纯化 。

cesium trifluoroacetate (CsTFA) ， 三 毛 乙 酸 钨 ”用 于 密度 梯度 分 离 核 酸 的 高 密度 盐 。CsTEFA 可 以 形成 比 CsCl 更 大 的 密度 梯度 ， 因 此 RNA 可 以 在 CsTFA 中 形成 条 带 或 被 沉降 下 来 。

chaotropic 离 液 的 生物 分 裂 的 。 离 液 裂解 缓冲 液 破坏 细胞 和 亚 细 胞 膜 结 构 ， 并 接触 性 破坏 酶 的 活性 。

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术 语 表

chemiluminiscence 化 学 发 光一 种 非 放 射 性 杂交 检测 技术 。 化 学 发 光 就 是 化 学 反应 所 造成 的 可 见 光 。

chromatid 染色 单 体 有 丝 分 裂 中 期 的 染色 体 中 清晰 可 见 的 两 个 独立 的 亚 单位 之 一 。 染 色 单 体 通常 由 中 心 粒 偶 联 ， 到 有 丝 分 裂 的 后 期 分 开 。

chromatin 染色 质 “细胞 间 期 ， 细 胞 核 内 基因 组 DNA 和 和 蛋 自 质 构 成 的 复合 物 。 在 有 丝 分 裂 过 程 中 ， Ue (6 Jaa Tl 4 A AY BET ae A

chromosome jumping 染色 体 跳 跃 — PPAR WF AKA (chromosome walking) 的 技术 。 但 是 由 于 脉冲 凝 胶 电 泳 纯 化 的 DNA 片段 非常 大 (KF 100kb) ， 出 于 亚 克 隆 的 目的 从 这 样 的 DNA 一 端 开始 移动 ， 与 其 说 是 “步行 ”不 如 称 为 “跳跃 ”来 得 更 为 恰当 。 参 见 染 色 体 步行 。

chromosome walking 染色 体 步 行 ”系统 地 分 离 一 系列 包含 有 重 堆 DNA 片段 的 克隆 ， 这 些 DNA 片段 可 综合 成 某 一 特异 基因 组 区 域 。 首 先 ， 用 序列 特异 性 的 探 针 确认 某 个 特殊 位 点 。 然 后 ， 一 旦 从 文库 中 回收 了 这 一 克隆 ， 染 色 体 步行 就 不 断 地 重复 亚 克 隆 和 对 文库 的 再 杂交 。 分 别 使 用 前 一 次 从 文库 中 回收 得 到 的 克 隆 的 3 末端 和 5 末端 作为 下 一 次 杂交 所 用 的 探 针 。 这 样 ， 凭 借 得 到 的 该 系列 重 亚 的 克隆 ， 就 能 对 特定 基因 座 的 内 部 、 上 游 和 下 游 进行 基因 座 性 质 分 析 。 这 一 手段 可 以 用 来 朝向 或 背离 目标 基因 座 进 行 “ 步 行 ”扫描 。

cistron MRF BAA DNA 区 域 或 特异 序列 。 顺 反 子 是 一 个 以 前 的 专用 名 词 ， 现 在 常 定义 为 基因 。

clone (名 词 ) 克隆 一 组 遗传 一 致 的 细胞 或 分 子 。

clone (动词 ) 克隆 即 为 了 特性 分 析 、 储 存 或 更 进一步 的 扩 增 ， 对 某 特定 的 核酸 序列 或 细胞 进行 一 系 列 分 离 并 扩 增 的 操作 。

clone Bank 克隆 银行 ”一 个 旧 有 和 名词， 即 现在 的 cDNA 文库 和 基因 组 文库 。

coding strand 编码 链 ” 双 链 DNA 中 与 产物 RNA 序列 一 致 的 那 一 条 链 〈 除 胸腺 喀 啶 代替 尿 喀 啶 外 ) 。

codon 密码 子 在 mRNA 编码 区 发 现 的 三 联 核 苷 。 核 苷 的 确切 顺序 决定 了 新 生 肽 段 中 氨基 酸 的 种 类 和 位 置 。 标 点 符号 〈 起 始 和 终止 ) 也 是 密码 子 特异 的 。

competitive PCR 3% PCR 一 种 非常 灵敏 的 定量 转录 丰 度 的 方法 。 在 同一 个 反应 管 中 ， 加 入 可 与 实 验 样 本 竞争 引物 和 dNTP 的 DNA 序 列 ， 通 过 改变 DNA 竞争 物 (LH DNA 类 似 物 ) 的 量 ， 就 可 以 找到 一 个 与 目标 DNA 等 量 的 类 似 物 稀释 浓度 ， 进 而 可 以 极为 精确 地 定量 。

complementary DNA (cDNA) 互补 DNA (cDNA) 体外 反 转 录 酶 以 RNA 为 模板 合成 的 DNA。 就 特 定 实验 的 要 求 不 同 ， 可 以 是 单 链 或 双 链 的 形式 。 就 细胞 生物 学 而 言 ， 合 成 的 EDNA 既是 一 个 永久 性 的 生化 记录 ， 也 为 该 记录 的 扩 增 提供 了 可 能 。

compression 压缩 ”一 种 数学 技术 ， 可 以 将 图 形 储 存在 较 小 的 记忆 体 (memory) 中 。 图 形 内 部 表述 的 宛 余 部 分 被 确认 并 给 以 编码 ， 这 些 元 余 的 数据 就 用 此 编码 代替 。

consensus sequence 共有 序列 ”在 对 多 个 分 子 进行 检查 和 序列 比 对 之 后 得 到 的 核 苷 酸 或 氨基 酸 类 似 序 列 ; 本 质 上 就 是 几 个 类 似 分 子 的 共性 部 分 。 如 果 发 现 的 一 致 序列 中 有 单个 核 苷 酸 或 氨基 酸 残 基 的 不 同 ， 通 常 这 种 序列 的 模糊 性 会 用 百分比 特别 指出 〈Aso 表 示 在 这 个 位 点 出 现 A 的 比例 是 90%)， 或 是 直接 在 序列 中 将 这 一 置换 列 出 (ATCG C/A TGTAT) 。

conserved sequence ”保守 序列 ”在 物种 间 没 有 差别 或 仅 有 微小 差别 的 DNA 序列 。

constitutive gene expression 组 成 型 基因 表达 即 RNA 聚合 酶 与 基因 的 启动 子 序列 的 结合 不 受 其 他 因 素 调控 。 组 成 型 表达 的 基因 通常 维持 在 低 水 平 的 基线 表达 ， 有 时 也 被 称 为 看 家 基因 。

contrast ”对比度 图 像 的 锐利 程度 。 对 比 度 越 高 ， 则 白 / 黑 的 差别 以 及 彩色 的 跨度 就 越 大 。 增 加 对 比 度 ， 导 致 图 像 中 所 有 颜色 及 灰 度 之 间 的 差别 更 为 明显 。

countertranscript RNA (ctRNA) 反 向 转录 RNA 反 义 RNA 的 另 一 个 称呼 。 通 常 在 原核 基因 表达 的 文 章 中 会 讨论 到 ctRNA。

Curie (Ci) AB 放射 性 的 基本 度量 单位 。1Ci 等 于 3.7 久 10!Bq〈 即 每 秒 衰变 数 ) 。

cycloheximide ” 放 线 菌 酮 “一 种 抑制 真 核 细胞 蛋白 质 合 成 的 药物 ， 对 原核 细胞 的 蛋白 质 合 成 没有 影响 。

cytidine JOMRKE. HH SAM MME MAMA.

cytogenetics ”细胞 遗传 学 ”这 一 遗传 学 分 支 主要 研究 染色 体 的 结构 和 行为 。

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

cytoplasm “细胞质 ”细胞 内 介 于 细胞 膜 与 核 膜 之 间 的 部 分 。

cytosine ， 胞 喀 啶 ”一 个 通常 在 DNA 中 与 鸟 味 叭 配对 的 喀 啶 碱 基 。

degenerate codon 简 并 密码 子 ”编码 同 一 氨基 酸 的 两 个 或 几 个 密码 子 中 的 一 个 。

denaturation (of nucleic acids) (MR) 变性 DNA 或 RNA 从 双 链 转变 成 单 链 的 过 程 。 这 意味 着 一 个 双 链 分 子 解 离 成 两 个 单 链 分 子 ， 或 者 是 分 子 内 的 碱 基 配 对 消失 。

deoxyribonucleic acid (DNA) “脱氧 核 糖 核酸 DNA 聚合 酶 催化 形成 的 脱氧 核糖 核 苷 单 磷酸 的 多 聚 物 。 在 体内 由 复制 过 程 生 成 ， 在 体外 可 由 PCR 等 方法 合成 。

diethyl pyrocarbonate (DEPC) 二 乙 基 焦 碳酸 酯 ”用 于 清除 核酸 酶 活性 的 化 学 试剂 。DEPC ARM 用 ， 需 小 心 操作 。 由 于 大 多 数 供应 商都 提供 不 含 核酸 酶 的 水 和 试剂 ， 因 此 可 以 避免 DEPC 的 使 用 。

differential display PCR (DDPCR) 差异 显示 PCR 是 鉴定 两 个 或 多 个 RNA 族群 中 特异 转录 表达 序列 的 一 种 方法 。DDPCR 建立 在 PCR 技术 基础 之 上 。 首 先 在 PCR 系统 中 加 入 大 量 较 短 的 引物 ， 以 保证 所 有 表 达 的 RNA 都 以 cDNA 的 形式 得 到 扩 增 ;再 通过 电泳 比较 各 个 样本 的 扩 增 产物 。 如 果 几 个 生物 样本 都 出 现 了 同一 分 子 量 的 扩 增 产物 ， 这 说 明 它 们 都 表达 了 某 个 转录 本 ; MREAHAKERASRAE, BARRA 一 个 泳 道 会 出 现 条 带 。

differentiation 分化” 指 细胞 发 育 过 程 中 发 生生 化 和 结构 变化 ,由 此 产生 结构 和 功能 特 化 的 细胞 。

dimethyl sulfoxide (DMSO) 二 甲 基 亚 砚 ”在 电泳 前 与 乙 二 醛 联 用 导致 RNA 变性 的 试剂 。DMSO 也 可 用 来 降低 DNA 二 联 体 的 Ta。。(melting temperature， 解 链 温 度 ) ， 支 持 长 距离 的 PCR 。

diploid 二 售 体 “与 单 倍 体 〈 每 一 型 染色 体 出 现 1 次 ) 和 三 倍 体 〈 每 一 型 染色 体 出 现 3 次 ) 相 比 ， 含 有 两 套 完 整 染 色 体 的 细胞 称 为 二 倍 体 〈 每 一 型 染色 体 出 现 2 次 )。

directional cloning 定向 克隆 通过 用 限制 性 内 切 酶 在 cDNA 或 基因 组 DNA 两 端 引 入 不 同 的 末端 ， 将 DNA 分 子 单 向 插 和 人 载体 的 技术 。

DNA polymerase [| DNARGAI 一 种 原核 酶 ， 能 够 以 DNA 为 模板 合成 DNA。 天 然 的 DNA RFS 酶 工 又 称 全 酶 或 Kornberg 酶 ， 具 有 3 种 截然 不 同 的 活性 : 5'->3' 聚 合 酶 活性 ;5'->3' 核 酸 外 切 酶 活性 和 3 一 5 核酸 外 切 酶 活性 。 见 Klenow 片段 。

dot blot 斑点 印迹 ”对 样品 中 特定 RNA 或 DNA 序列 定量 的 膜 印迹 技术 。 通 过 一 台 歧 管 真空 抽 滤 ， 通 常 样品 在 滤 膜 上 点 样 成 斑点 状 [ 见 狭 颖 印迹 (slot blot)] 。 斑 点 印迹 没有 与 电泳 相关 的 定性 组 分 。

downstream 下 游 在 参考 点 3 方向 的 序列 〈 向 表达 方向 延伸 的 部 分 )。 如 起 始 密码 子 位 手 真 核 mR- NA 5 帽子 结构 的 下 游 。

duplex 二 联 体 ”通过 碱 基 互补 配对 形成 的 多 核 音 酸 双 链 分 子 或 双 链 部 分 。

electropherogram “电泳 图 谱 ~ ”显示 DNA 测序 反应 结果 的 图 谱 。

electrophoresis, ”电泳 ”一 种 色谱 技术 ， 大 分 子 〈 如 蛋白 质 或 核酸 ) 在 通过 介质 时 ， 按 各 自 所 带电 荷 被 分 离 。

electrophoretogram 电泳 图 凝 胶 电泳 照片 ， 反 映 了 电泳 后 大 分 子 在 凝 胶 中 的 空间 分 布 。

ELISA 酶 联 免疫 吸附 测定 法 “ 见 enzyme-linked immunosorbent assay。

enhancer element 增强 子 元 件 一 种 短 的 DNA 调控 序列 ， 它 能 够 增强 某 些 真 核 启动 子 的 效率 ， 引 起 转录 上 调 。 增 强 子 元 件 的 增强 作用 ， 与 它 相 对 目标 启动 子 的 方向 、 距 离 无 关 。

enrichment BS 任何 可 以 提高 一 种 或 若干 种 RNA 亚 群 在 细胞 合成 的 总 RNA 中 所 十 比例 的 方法 。 MEAG poly(A)” RNA 就 富 集 了 mRNA。 其 中 一 种 富 集 方法 ， 就 是 在 细胞 裂解 之 前 超 诱导 一 种 或 几 种 RNA。 如 对 休眠 细胞 加 以 血清 刺激 ， 即 诱导 〈 富 集 ) 了 细胞 重新 进入 细胞 周期 时 表达 的 增殖 特异 性 RNA,

enzyme-linked immunosorbent assay 酶 联 免疫 吸附 测定 法 通过 酶 促 反 应 ,测定 抗 体 - 抗 原 复合 体 的 方法 ，

ethidium bromide (EtBr) 省 化 乙 锭 -种 可 平面 插入 核酸 〈 包 括 DNA 和 RNA) 的 染料 ， 在 紫外 线 照射 下 发 出 橘红 的 荧光 。 因 此 ，EtBr 染色 的 凝 胶 可 拍照 留待 以 后 的 查询 。EtBr 的 标准 储备 液 浓度 为 10mg/ ml， 标 准 染 色 浓 度 为 0.5 一 1pg/ml。

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术 语 表

exon 外 显 子 ” 真 核 基 因 提 供 的 成 熟 mRNA 分 子 的 部 分 。 外 显 子 可 以 被 翻译 也 可 以 不 被 翻译 。

expressed sequence tag (EST) ”表达 序列 标签 ” 选 定 cDNA 克隆 的 部 分 序列 。 数 不 胜 数 的 数据 库 收藏 了 大 量 可 用 于 基因 鉴定 的 序列 数据 。

file format 文件 格式 ”根据 图 像 的 种 类 、 压 缩 类 型 和 中 间 色 模式 ， 把 图 像 储 存在 盘 上 的 方法 ， 如 TIFF, BMP, JPEG #1 GIF.

formaldehyde FARE ”常用 的 RNA SHEA. Ai CE RP) DRE. RE — BP BAT HA A HA 怀孕 女性 应 避免 使 用 。

formamide FARRER ”常用 的 化 学 溶剂 ， 用 来 降低 双 链 二 联 体 的 解 链 温 度 (Tm) 的 变性 剂 。 常 添加 在 低 于 所 需 温 度 的 杂交 反应 中 以 保持 严谨 度 。 在 电泳 前 常 和 甲醛 一 起 使 用 使 RNA 变性 。 甲 酰胺 是 一 种 致癌 剂 和 致 畸 剂 ， 怀 孕 女 性 应 避免 使 用 。

fosmid 《因子 的 装配 型 质粒 〈cosmid) 。 一 般 质 粒 可 携带 的 DNA 插入 片段 上 限 为 10kb DNA, MA 与 质粒 类 似 的 cosmid 和 fosmid 则 可 以 携带 大 小 约 45 一 50kb 的 DNA。 由 于 后 者 的 体积 庞大 ， 单 个 细菌 内 仅 可 以 获得 1 个 fosmid 并 进行 复制 ， 因 此 就 克隆 载体 而 言 质粒 更 受 欢 迎 。

frame grabber 取 帧 器 , 帧 捕获 器 ”一 种 计算 机 硬件 ， 揪 在 计算 机 插 槽 后 可 以 直接 将 摄像 机 内 的 图 像 导 人 图 形 分 析 软 件 。

functional genomics 功能 基因 组 学 ”研究 细胞 内 RNA 的 水 平 ， 以 及 外 界 改 变 时 细胞 如 何 调控 RNA 的 水 平 “ 简 而 言 之 ， 就 是 研究 基因 的 表达 ) 。

gamma (y) 伽 马 因 子 ” 调 节 图 像 深 色 区 域 对 比 度 的 、 非 线性 对 数 对 比 度 校 正 因子 。

gene BA 遗传 单位 。 一 个 基因 就 是 一 段 编 码 指导 多 肽 合成 的 染色 体 DNA 序列 。

genetic engineering (recombinant technology, rDNA. gene cloning, gene splicing) 遗传 工程 〈 重 组 技 A, BA DNA, ARE. SAH) 将 某 一 物种 的 基因 或 基因 片段 转 人 其 他 物种 的 技术 。 遗 传 工 程 现 在 已 成 长 为 一 个 完整 而 具有 深远 潜力 的 产业 。 见 biotechnology,

genome BAA ”细胞 内 染色 体 DNA 的 整体 。 某 些 操作 中 需要 区 分 细胞 核 基因 组 DNA 和 线粒体 基因 组 DNA。

genomic DNA 基因 组 DNA 即 染色 体 DNA。 线 粒 体 基 因 组 表示 为 mtDNA， 叶 绿 体 基因 组 表示 为 cp- DNA,

genomics 基因 组 学 ”研究 基因 结构 和 组 织 的 学 科 。 基 因 组 学 与 DNA 测序 数据 密切 相关 。

genotype BAD 存在 于 某 一 细胞 或 生物 的 基因 及 等 位 基因 的 总 体 。

GIF (graphics interchange format) 图 像 可 交换 文件 格式 ”一 种 基于 位 图 的 256 色 图 像 格式 。 公 司 商 标 、 艺 术 线 条 及 其 他 相关 应 用 的 数字 图 形 通常 以 GIF 格式 储存 。

glyoxal 乙 二 醛 试剂， 电泳 前 常用 作 使 RNA 变性 ， 常 与 DMSO 联 用 。

gray level 灰 度 在 黑白 图 像 中 赋予 单个 像素 表示 亮度 的 数值 。 位 深 8 位 时 灰 度 的 数值 范围 为 0 一 255， 相应 地 表示 从 黑 到 灰 到 白 的 渐变 。

guanine SEM FLUE AC AY mE.

guanosine SERRE. SH SASEAMENERE.

haploid SR 具有 一 组 完整 染色 体 〈 在 配子 中 ,每 一 型 染色 体 出 现 1 次 ) 的 细胞 。 参 见 二 倍 体 (diploid) 和 三 倍 体 〈triploid) 。

hapten 半 抗 原 ”本身 不 是 抗原 ， 在 与 较 大 的 抗原 分 子 〈 通 常 为 蛋白 质 ) 偶 联 后 ， 可 以 具有 抗原 性 质 的 一 类 小 分 子 。

heterogeneous nuclear RNA (hnRNA) 核 不 均一 RNA mRNA 前 体 ; 真 核 细 胞 RNA BABS I HRN 初始 产物 。

histones 组 蛋白 辅助 染色 质 组 建成 可 识别 染色 体 的 DNA 结合 蛋白 。 组 蛋白 是 所 有 真 核 基 因 中 最 保 守 的 蛋白质 之

Hogness box (TATA box) Hogness 盒 (TATA 盒 ) 保守 的 富 含 AT 的 模 体 ， 位 于 真 核 基因 转录 起 始

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RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 RNA 研究 方法

位 点 的 上 游 25bp 处， 是 RNA 聚合 酶 识别 真 核 启 动 子 的 一 部 分 。

holoenzyme 全 酶 ”完整 的 酶 〈 相 对 于 切割 产物 而 言 ) 。

housekeeping gene “看 家 基因 “在 所 有 细胞 内 持续 表达 〈 至 少 理论 上 是 始终 持续 表达 ) 的 基因 ”其 产物 是 维持 细胞 生存 所 必需 的 。 由 于 它们 的 表达 ， 似 乎 是 恒定 的 ， 所 以 常用 测定 看 家 基因 的 转录 表达 来 证 明 实 验 操 作 背 景 下 ， 细 胞 内 的 基因 表达 没有 发 生 整 体 变化 。

hybridization 杂交 两 个 核酸 分 子 间 氢 键 的 形成 ， 它 显示 互补 的 程度 。 杂 交 的 专 一 性 直接 与 杂交 过 程 中 系统 的 严谨 度 相关 。

hydrogen bonding 氢 键 结合 ” 带 有 正 电荷 的 氢 原 子 与 带 有 负电 荷 的 原子 (如 氧 、 氮 ) 之 间 高 度 定向 的 吸引 作用 。 互 补 碱 基 在 核酸 杂交 时 以 氢 键 形式 结合 。 见 碱 基 配 对 Chase pairing) 。

hyperpolymer 超 多 聚 体 ”标记 探 针 分 子 的 总 体 ， 它 们 不 仅 与 靶 序 列 杂 交 ， 还 与 其 他 探 针 的 重 杰 序 列 相互 杂交 ， 结 果 导 致 半 序 列 上 标记 分 子 拖 尾 的 现象 。 当 标记 过 程 中 发 生 了 新 生 核 酸 链 骨 架 断 裂 〈 如 切口 平 移 时 ) 或 者 引物 合成 时 骨架 末端 封闭 失败 〈 引 物 延 伸 实 验 时 ) ， 就 会 发 生 这 种 情况 。 超 多 聚 化 造成 了 信号 扩 增 ， 因 此 可 以 在 放射 自 显影 时 缩短 曝光 时 间 ， 但 这 样 会 在 分 辩 率 上 略 有 损失 。

image 图像 图 像 分 析 软 件 所 分 析 的 对 象 。 图 像 也 可 以 指 被 扫描 输入 图 像 分 析 软 件 的 艺术 品 、 绘 画 或 照片 原件 。

image analysis 图 像 分 析 一 种 对 目标 数字 成 像 、 储 存 并 自动 对 图 像 中 的 不 同 目标 如 凝 胶 上 的 电泳 条 带 ) 进行 参数 〈 如 分 子 量 、 质 量 、 相 对 丰 度 、 光 密度 等 ) 测定 的 电子 手段 。

image class 图 像 类 图 像 的 种 类 ， 由 图 像 的 位 深 决 定 。

inosine (1) KR ORK) 苷 ， 肌 苷 ”含有 次 黄 味 叭 碱 基 的 核 苷 。 有 时 次 黄 味 叭 核 苷 被 用 于 合成 “ 简 并 ”或 “猜测 体 ”(guess-mer) HYAMS.

in silico 在 计算 机 通过 计算 机 得 到 的 。 如 用 生物 信息 学 软件 预测 转录 起 始 位 点 。

intron ASF ”一 个 基因 中 打 断 编码 序列 Chat) HRA DNA 序列 。 内 含 子 会 被 转录 并 出 现在 核 不 均一 RNA (hnRNA) 中 ， 在 随后 的 RNA 成 熟 过 程 中 会 被 系统 性 切除 。

ionizing radiation 电离 辐射 ”从 原子 或 分 子 中 释放 出 电子 并 导致 离子 生成 的 任何 辐射 。 电 离 辐 射 包 括 ac、B 和 7 辐射 三 种 。

isoprenylation ” 异 戊 二 烯 化 ” 脂 质 基 团 和 半 胱 氨 酸 残 基 之 间 的 连接 ， 是 一 种 蛋白 质 翻 译 后 修饰 。

isotope 同位素， 有 相同 原子 序数 和 不 同 原子 量 的 原子 。 9

JPEG (joint photographic experts group) 合 图 像 专家 组 ”一 种 广 为 运 用 的 把 彩色 图 像 和 照片 数字 化 的 电子 压缩 方法 。 :

Klenow fragment (Klenow enzyme) Klenow 片段 〈Klenow 酶 ) 大 肠 杆菌 DNA 聚合 酶 工 的 大 片段 ， 用 枯草 杆菌 蛋白 酶 消化 DNA 聚合 酶 工 制 备 ， 也 可 以 用 克隆 方法 制备 。Klenow 片段 具有 5 一 3 聚合 酶 活性 和 3 一 5 核酸 外 切 酶 活性 ， 而 没有 全 酶 具有 的 5 一 3 核酸 外 切 酶 活性 ， 见 DNA 聚合 酶 工 。

leader sequence 前导 序列 ”成熟 mRNA 中 位 于 起 始 密码 子 5" 端 不 被 翻译 的 部 分 。

library 文库 包含 有 研究 目标 序列 的 、 可 以 部 分 或 全 部 代表 某 个 特定 生物 材料 内 基因 组 DNA 或 cD- NA 复杂 性 的 克隆 集合 。 文 库 的 构建 方式 ， 是 在 恰当 的 载体 内 插 信 cDNA 或 基因 组 DNA 序列 。 可 以 用 核酸 杂交 来 筛选 和 回收 目的 克隆 。 如 果 构 建文 库 使 用 的 是 表达 载体 ， 那 么 也 可 以 用 抗体 识别 来 进行 得 选 。

ligase ERM 能 把 核酸 分 子 连接 起 来 的 酶 。 可 以 把 连接 酶 看 作 “ 分 子 黏 胶 ”( 如 DNA 连接 酶 九 把 功能 与 之 相反 的 限制 性 核酸 内 切 酶 看 作 “ 分 子 前 刀 ”。

ligase chain reaction (LCR) 连接 酶 链 反应 一 种 DNA 扩 增 技术 ， 常 用 来 鉴定 点 突变 。 尽 管 PCR 扩 增 的 效率 更 高 ，LCR 的 鉴别 能 力 则 更 胜 一 筹 ， 用 LCR 扩 增 产物 可 以 兼顾 扩 增 效率 和 有 效 识别 碱 基 细 微 改变 这 两 个 需求 。

locus (复数 是 loci) 基因 座 茶 个 基因 及 其 等 位 基因 在 染色 体 上 的 确切 定位 。

marker 标记 指 在 实验 中 任何 目标 等 位 基因 的 泛称 。 此 外 marker 也 表示 为 分 子 量 标准 。

meiosis MEXR ”产生 单 倍 体 配子 〈 性 细胞 ) AAR}

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7 ii at

melting temperature 解 链 温度 Jl Tn.

Mendel (Father Gregor Mendel) 和 孟 德尔 (HBB + 和 孟 德尔 神父 ) F 1865 年 首次 提出 基因 概念 的 天 主 教 牧师 ， 公 认 的 经 典 遗 传 学 之 父 ， 以 备 德 尔 遗 传 法 则 闻名 。

messenger RNA (mRNA) 信使 RNA RNA 聚 合 酶 下 转录 合成 的 成 熟 产物 。 在 真 核 细 胞 中 ，mRNA 由 hnRNA 加 工 而 来 ， 在 和 和 蛋白质 翻译 机 器 结合 后 ， 能 够 指导 合成 其 编码 的 多 肽 。

metabolomics 代谢 组 学 ”鉴定 样品 或 者 动物 、 植 物 、 酵 母 和 微生物 的 单个 细胞 中 所 含 的 低 分 子 量化 合 物 的 种 类 、 数 目 和 数量 的 科学 。 代 谢 组 学 (和 最 近 定 义 的 代谢 组 学 ) 研究 使 用 的 方法 包括 核磁 共振 CNMR)、 气 相 色谱 、 液 相 色 谱 、 双 向 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (2D-PAGE) 和 质谱 。

metabonomics 代谢 组 学 ” 特 指 人 和 其 他 高 等 动物 中 的 代谢 物 组 学 。

methylmercuric hydroxide (methyl mercury) FPRPRAAUH (HSER) 在 电泳 或 其 他 层 析 前 ， 用 来 使 RNA 变性 的 剧 毒 试 剂 。 在 有 其 他 选择 的 情况 下 ， 应 尽量 避免 使 用 甲 基 素 。

microarray 微 阵列 有 上 万 个 不 同 DNA 片段 印迹 的 玻璃 片 或 尼龙 膜 ， 可 对 基因 表达 进行 高 通 量 分 析 。

mismatch 错 配 ” 双 链 分 子 中 有 一 个 或 多 个 核 苷 酸 不 能 碱 基 配 对 。 因 此 为 了 容忍 错 配 ， 退 火 温 度 应 适 当 低 于 解 链 温 度 (CT): 在 解 链 温 度 时 只 有 完全 匹配 的 双 链 分 子 是 稳定 的 。 错 配 发 生 的 位 置 及 其 周边 序列 给 PCR 的 引物 退火 步骤 带 来 很 多 变数 。

mitosis AAR ” 体 细 胞 的 细胞 分 裂 。 有 丝 分 裂 是 从 一 个 母 细胞 产生 遗传 一 致 的 二 倍 体 拷 贝 〈 子 细 胞 ) 的 过 程 。

monocistronic #IRRFR 即 仅 编码 一 个 肽 段 的 mRNA 分子 。

MOPS 3-(N- 吗 啉 代 )- 丙 磺 酸 RNA 族 胶 电 泳 缓冲 系统 内 的 关键 组 分 ， 与 甲醛 联 用 。10 X MOPS= 200mmol/L MOPS, pH 7.0; 50mmol/L NaAc，10mmol/L Naz-EDTA, pH 8. 0。

MSDS (material safety data sheet) 材料 安全 数据 表 描述 某 物 质 物 理性 质 和 化 学 性 质 的 文件 ， 其 中 还 包括 对 该 物质 正确 的 操作 、 储 存 、 防 泄漏 和 销毁 方法 ， 以 及 不 慎 暴 露 和 摄取 后 所 需 的 毒性 数据 和 急救 信 息 。MSDS 应 妥善 收藏 在 实验 室 随 时 可 取 的 地 方 。

multiplex PCR 多 元 PCR 在 一 个 PCR 反应 管 中 同 时 扩 增 两 个 〈 以 上 ) RPI ERE.

normalization 标准 化 ”为 了 使 一 系列 滤 膜 或 一 张 滤 膜 上 的 样本 有 可 比 性 所 进行 的 操作 。

Northern analysis (Northern blotting) Northern 分 析 (Northern 印迹 ) ”把 经 过 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 的 RNA 转移 到 滤纸 并 固定 杂交 的 技术 。Northern 印迹 能 对 目的 基因 的 表达 进行 定性 及 定量 分 析 。

nuclear runoff assay “ 核 逃逸 实验 ”一 种 对 细胞 核 内 转录 进程 中 产生 的 新 生 RNA 进行 标记 的 方法 。 目 的 RNA 的 转录 速率 可 通过 检测 标记 挫 和 的 程度 测定 。 与 稳 态 RNA (steady-state RNA) 比较 。

nuclease protection assay ”核酸 酶 保护 实验 ”对 转录 本 丰 度 进行 定位 和 定量 的 方法 。 大 体 步 又 如 下 : 探 针 和 目的 RNA 在 溶液 中 杂交 ;， 随后 加 入 核酸 酶 完全 或 部 分 消化 其 中 不 能 参与 形成 双 链 的 分 子 ， 相 对 而 言 ， 被 锁定 的 双 链 核酸 分 子 在 这 个 过 程 中 较为 安全 ;最 后 通过 电泳 或 沉淀 其 中 未 降解 的 RNA : RNA 5K RNA: DNA 进行 定量 分 析 。

nucleoside 核 苷 ”一 个 连 有 含 氮 碱 基 《〈 腺 味 哈 、 胞 喀 啶 、 鸟 嘎 哈 、 胸 腺 喀 啶 或 尿 喀 啶 ) 的 五 碳 糖 〈 核 糖 或 脱氧 核糖 ) 。

nucleotide KERB 含有 一 个 五 碳 糖 〈 核 糖 或 脱氧 核糖 ) 、 一 个 含 氮 碱 基 〈 腺 味 哈 、 胞 喀 啶 、 乌 味 叭 、 胸腺 喀 啶 或 尿 喀 喧 ) 和 一 个 磷酸 基 团 的 分 子 。 核 苷 酸 是 组 成 DNA 和 RNA 的 构件 。

nuclide HR 有 相同 原子 序数 和 不 同 原 子 量 的 原子 。

ochre codon 赭石 密码 子 即 UAA 终 止 密码 子 。

oligonucleotide “ 嘉 核 背 酸 ”人工 合成 的 短片 段 单 链 DNA OH. AWA RKRRET RSID. BAH 酸 也 可 以 指 RNA 短片 段 。

opal codon 乳白 密码 子 即 UGA 终 止 密码 子 。

ortholog 直 向 同 源 基因 在 某 一 物种 及 其 他 物种 内 发 挥 同 样 功能 的 基因 。 对 直 向 同 源 基 因 的 鉴定 在 某

> 403 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

种 程度 上 揭示 了 这 些 物种 间 的 进化 亲缘 关系 。

palindromic sequence ” 回 文 序列 “一 小 段 双 链 DNA 序列 ， 其 两 条 子 链 的 5 -~3 序列 相同 。

PC] 实验 室 标准 符号 。 代 表 苯 酚 : 氯仿 : HRM (25 : 24 : 1) 的 混合 物 。

PCR 见 聚 合 酶 链 反应 。

pentose KH, HRB ”核糖 或 脱氧 核糖 , 戊 糖 是 核 苷 酸 的 组 分 。

pharmacogenomics ”药物 遗传 学 该 学 科 侧 重 研究 基因 组 各 个 部 分 的 相互 作用 以 及 病人 对 药物 的 反应 。 药物 基因 组 学 这 个 术语 比 药物 遗传 学 使 用 得 更 为 广泛 。 后 者 侧重 研究 个 别 基 因 对 药物 的 反应 药物 基因 组 学 关注 为 个 别人 创立 的 药物 与 其 细胞 途径 之 间 的 相互 作用 。

parmacokinitics “药物 动力 学 ”研究 体内 特定 时 段 内 药物 的 吸收 、 加 工 以 及 清除 的 过 程 。

phosphate-buffered saline (PBS) “磷酸 盐 缓冲 生理 盐水 ”一 种 常用 于 洗涤 单 细 胞 层 上 残留 培养 液 的 等 渗 盐 溶液 。5XPBS( 每 升 )=40g NaCl, 1.0g KCI，5.75g Naz HPO4，1g KHzPO4; 高 压 灭 菌 5 使 用 前 用 灭 菌 水 在 无 菌 条 件 下 稀释 至 1X 。

phosphorimaging ”磷酸 化 成 像 ”用 以 测定 放射 性 衰减 和 电子 分 析 的 过 程 。 与 X 射 线 片 相 比 ， 磷 酸化 成 像 仪 能 提供 更 多 的 线性 应 答 。 磷 酸化 成 像 仪 还 能 测定 化 学 发 光 产 生 的 发 射 光 。

photodocumentation 光 文 件 〈 记 录 ) 一 种 在 电泳 或 者 用 标记 探 针 杂交 后 立即 保存 凝 胶 图 像 的 方法 。 支持 光 文 件 〈 记 录 ) 的 媒体 包括 一 次 性 成 像 照片 、X 射线 片 、 热 敏 纸 (thermal paper) 以 及 数字 储存 见 图 像 分 析 〈image analysis) 。

photon 光子 一 种 没有 质量 但 是 能 转移 电磁 能 量 的 粒子 。

pixel RH 照片 元 素 ; 数字 成 像 的 合成 单元 。 一 个 图 像 被 分 成 水 平 的 栅 格 或 列 阵 ， 通 称 为 位 图 。 每 一 个 像素 分 配 一 个 工 和 yy 坐标 ， 描 述 它 在 整个 图 像 中 的 贡献

plasmid 质粒 一 种 共 价 键 封闭 的 环 状 双 链 DNA 分 子 。 它 在 原核 细胞 中 能 自动 复制 〈 真 核 细 胞 质粒 也 已 发 展 起 来 ) 。 质 粒 能 接受 通常 小 于 10kb 的 外 源 DNA 僚 和 人 入 ， 并 且 常 常 含 有 各 种 供 选择 的 标记 及 三 些 辅助 序列 用 来 鉴定 嵌入 的 DNA.

poly(A)* tail poly(A)” B 由 核 内 的 聚 腺 苷 酸 多 聚 酶 催化 ,在 mRNA3 ' 端 加 上 的 一 小 段 腺 寿 残 基 。 这 种 poly(A) 二 尾 的 添加 包括 初始 转录 物 3 端的 剪 切 和 随后 的 聚 腺 苷 酸化 。

polyadenylation signal ” 聚 腺 苷 酸化 信号 ”一 个 高 度 保 守 的 6 碱 基 模 体 (AAUAAA)， He ML ne 化 的 效率 。 真 核 mRNA 分 子 3 端 腺 苷 酸 聚 合 前 的 剪接 过 程 受到 “〈 至 少 是 部 分 受到 ) 聚 腺 苷 酸化 信和 号 的 控 制 。 在 天 然 转录 物 上 ，AAUAAA 功能 性 地 与 下 游 富 含 GU 和 U 的 区 域 连接 。

polycistronic ”多 顺 反 子 ”该 术语 是 指 含 有 一 种 以 上 多 肽 编码 区 的 mRNA,

polymerase chain reaction (PCR) 聚合 酶 链 反 应 ”这 是 一 种 由 引物 介 导 ， 扩 增 微 量 特异 基因 组 或 ecD:- NA 序列 系统 的 酶 反应 过 程 。 在 过 去 10 年 中 ， 这 种 技术 已 经 使 分 子 生 物 学 发 生 了 革命 性 变化 : 该 技术 具有 非常 灵敏 的 优点 ,并且 可 以 迅速 完成 。 使 用 这 一 技术 ， 一 个 研究 人 员 能 从 极 不 均一 的 样品 库 中 分 离 并 扩 增 到 目标 序列 。

polymorphism 多 态 性 从 属于 变化 的 遗传 特征 。

polysome 多 核糖 体 ”一 种 同时 被 几 个 核糖 体 翻译 着 的 mRNA,

post-transcriptional regulation ”转录 后 调控 ”所 有 发 生 在 转录 后 的 事件 ， 它 影响 到 此 后 任何 与 该 基因 最 终 表达 有 关 的 步骤 。 通 常 指 转 录 终 止 到 翻译 机 器 装配 前 的 所 有 事件 :

post-translational regulation ”翻译 后 调控 ”发 生 在 初始 多 肽 合成 以 后 的 任何 事件 ， 它 影响 到 此 后 任何 与 该 基因 最 终 表 达 有 关 的 步骤 。 通 常 指 多 肽 修饰 的 效率 ， 包 括 但 不 限于 肽 的 糖 基 化 、 甲 基 化 和 羟基 化 等 。

precursor RNA RNA 前 体 参见 核 不 均一 RNA (hnRNA) 或 mRNA 前 体 〈prermRNA) 。 一 种 未 经 前 WN RNA 分 子 ， 转 录 的 初始 产物 。

pribnow box 普 里 布 诺 盒 即 共有 序列 TATAATG， 原 核 细 胞 基因 转录 启动 子 的 一 部 分 。 位 于 细菌 基 因 转 录 起 始 位 点 上 游 约 10bp 处 。

primer 引物 一 种 短 的 核酸 小 分 子 ， 根 据 与 互补 序列 碱 基 配 对 的 原理 设计 ， 具 有 一 自由 的 3-OH，

« 45 -

* ii vat

可 进行 多 种 依赖 引物 扩展 的 反应 。

probe #it 通常 是 标记 的 核酸 (DNA 或 RNA) 分 子 。 常 常用 它 与 文库 中 的 互补 序列 或 核酸 存在 的 复杂 的 目标 序列 进行 杂交 , 如 Northern 分 析 、Southern 分 析 或 核酸 酶 保护 实验 等 。

processivity 延伸 性 一 种 酶 (如 DNA 聚合 酶 ) 从 DNA 模板 解 离 下 来 之 前 ， 结 合 在 其 底 物 上 有 效 产 生长 产物 〈 互 补 链 ) 的 能 力 。

promoter 启动 子 ”在 转录 开始 时 ，RNA 聚合 酶 和 其 他 起 始 蛋白 质 结合 的 特殊 位 点 的 一 段 DNA 序列 。

proteome 蛋白质 组 ”细胞 在 特定 时 间 产 生 所 有 和 蛋白质 的 集合 ， 典 型 的 蛋白 质 组 图 谱 是 通过 双向 (2D) 电泳 和 其 他 识别 、 定 量 及 鉴定 翻译 产物 的 技术 来 制作 和 评估 的 。

proteomics 蛋 自 质 组 学 ”研究 蛋白 质 的 表达 ; 特别 是 研究 在 特定 生化 条 件 下 ， 一 种 细胞 的 蛋白 质 组 分 以 及 不 同类 别 蛋 白质 在 应 答 天 然 和 人 为 刺激 时 是 如 何 变化 的 。 这 个 方法 可 以 很 方便 地 同时 对 多 种 蛋白 质 的 功能 特征 进行 研究 。 蛋 白质 组 学 构建 了 一 套 系 统 的 研究 方法 ， 用 于 研究 正常 和 病态 细胞 内 蛋白质 的 功能 和 具 基 因 组 功能 的 丰 度 间 的 相关 性 。

purine RM REKRASRBR NSA LAD ARE.

pyrimidine MERE ff ME AREY oO EY EE

quinone 42M. 醒 苯酚 的 氧化 产物 。 由 于 柄 能 与 核酸 交 联 并 断裂 磷酸 二 酯 键 ， 在 RNA 制备 过 程 中 醒 会 影响 RNA 的 质量 。 制 备 RNA 时 应 重 蒸 和 使 用 新 鲜 的 茶 酚 以 避免 醒 的 影响 。

q-s. #27 (quantum satis) 的 缩写 。 含意 是 “ 足 量 ”。 在 实验 方案 或 程序 中 ， 它 的 含意 是 研究 者 要 加 足够 的 水 到 反应 管 中 以 达到 特定 的 终 体 积 。

RACE (rapid amplification of CDNA ends) cDNA 末端 快速 扩 增 ”这 种 极其 有 用 的 技术 有 两 种 主要 形 式 : 5RACE 和 3RACE。 它 们 分 别克 隆 转 录 体 的 5 末端 和 3 末端 。

radiochemical 放射 性 化 学 试剂 ”一 种 含有 一 个 或 多 个 放射 性 原子 的 化 学 试剂 。

radiolysis ”辐射 裂解 ” 当 用 比 放 射 性 非常 高 的 放射 性 同位 素 标记 时 ，DNA 或 RNA 探 针 发 生 的 物理 断 裂 。 其 裂解 程度 与 探 针 标记 的 时 间 成 函数 关系 。

radionuclide 放射 性 核 素 一 种 自动 误 变 ， 并 由 此 产生 放射 性 的 不 稳定 同位 素 的 化 学 元 素 。

rea-time PCR 实时 PCR 一 种 实时 测量 每 一 轮 PCR 累积 的 产物 ， 而 不 是 测量 反应 结束 后 终 产物 的 方 法 。 普 遍 认 为 这 种 方法 是 一 种 重要 的 定量 PCR 实验 法 。

renaturaton (also reannealing) SM 〈 亦 称 重 退火 ) 变性 后 互补 的 DNA 或 RNA 链 重新 结合 。

restriction endonuclease 限制 性 内 切 酶 ”一 种 DNA 修饰 酶 ， 它 可 以 在 预期 的 位 点 切断 双 链 DNA 分 子 。 这 种 酶 被 认为 是 一 种 “分 子 剪 刀 ”。 它 一 般 在 底 物 DNA 回 文 的 4 个 、6 个 或 8 个 碱 基 序 列 处 切断 磷酸 二 酯 键 。

retrovirus RRBs ”一 种 以 RNA 为 基因 组 的 病毒 。 它 通过 反 转 录 将 遗传 物质 变 为 双 链 DNA 进行 繁殖 。

reverse transcriptase (RT) RRB IDK RNA 的 DNA 聚合 酶 。 是 一 种 反 转 录 病 毒 酶 。 这 种 酶 以 RNA 为 模板 合成 互补 DNA (cDNA) 分 子 。 现 在 有 许多 类 型 的 反 转 录 酶 可 以 使 用 ， 包括 常用 的 AMV (来 源 : SRRMAW RE) 和 MMLYV (来 源 : 莫 洛 尼 鼠 白血病 病毒 ) 等 各 种 反 转 录 酶 。 近 期 ， 还 有 许 多 没有 RNase H 活性 的 反 转 录 酶 可 以 用 来 合成 特定 的 cDNA。 有 些 热 稳定 的 反 转 录 酶 可 以 用 于 PCR 实验 。 如 发 现 嗜 热 真 细菌 (Thermus thermophilus) 中 含有 一 种 在 高 温 下 依赖 Mn2* 的 反 转 录 酶 ， 它 已 成 功 地 在 试 SPAT RRR A ABER CRT-PCR),

ribonuclease (RNase) 核糖 核酸 酶 ”一 类 很 难 灭 活 的 酶 家 族 。 它 们 能 迅速 降解 RNA DF. Alt. — 切 涉 及 RNA 操作 的 过 程 中 都 必须 注意 控制 这 种 酶 的 活性 。

ribonuclease A (RNase A) 核糖 核酸 酶 A 一 种 专 一 的 单 链 核糖 核酸 内 切 酶 。 它 水 解 RNA 分 子 中 喀 喧 RHR (Py/pN) 3 端的 磷酸 二 酯 键 ， 得 到 3 -磷酸 喀 啶 核 苷 酸 。

ribonuclease H (RNase H) 核糖 核酸 酶 了 一 种 直接 水 解 RNA : DNA 杂 合 链 中 RNA HAA.

ribonuclease T; (RNase Ti) 核糖 核酸 酶 Ti 一 种 专 一 的 单 链 核糖 核酸 内 切 酶 。 这 种 酶 专 一 水 解 RNA

“和

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

4) Fh HM (GpN) 3 端的 磷酸 二 酯 键 ， 与 核糖 核酸 酶 A 类 似 ， 生成 带 3 -磷酸 的 寡 核 苷 酸 。 ribonucleic acid (RNA) 核糖 核酸 ”由 RNA 聚合 酶 合成 的 核糖 核 苷 酸 的 多 聚 体 。RNA 是 转录 产物 。 ribosomal RNA (rRNA) 核糖 体 RNA 细胞 中 RNA 的 主要 组 成 部 分 。rRNA 含量 丰富 ， 可 以 用 来 鉴

定 样品 的 完整 性 、 质 量 以 及 可 能 的 功用 。 因 为 它 的 组 成 比较 简单 ， 也 可 以 在 RNA 电泳 中 作为 分 子 量 的 标

准 参照 物 。 ribotyping ”核糖 核酸 分 类 VW 限制 酶 切片 段 长 度 多 态 性 (restriction fragment length polymorphism,

RFLP) 为 依据 的 一 种 技术 。 根据 有 机 体 rRNA 基因 结构 特异 性 的 差异 来 鉴定 细胞 和 微生物 。 ribozyme “ 核 酶 ”具有 酶 催化 活性 的 RNA 分 子 。

RISC (RNA-induced silencing complex) RNA 诱导 沉默 复合 物 一 种 含 核糖 核酸 内 切 酶 的 复合 物 ， 它 通过 裂解 专 一 的 信使 RNA (mRNA) 分 子 而 介 导 RNA Fit. RLM-RACE (RNA ligase-mediated RACE) RNA 连接 酶 介 导 的 RACE 是 快速 扩 增 cDNA 末端 的 一

种 形式 。 一 寡 核 糖 核 苷 酸 片段 连接 到 全 长 的 mRNA 分 子 上 ， 然 后 反 转 录 为 DNA. 这 种 方法 有 一 个 优点 ，

就 是 它 仅 产 生 一 种 精确 5 端 转录 体 的 克隆 。

RNAi RNA 干扰 ”转录 后 基因 沉默 ;降解 mRNA 分 子 ， 因 而 抑制 其 蛋白 质 的 翻译 。 RNA polymerse RNA 聚合 酶 ”以 DNA 为 模板 ， 通 过 转录 过 程 合成 RNA 分 子 的 酶 。 SI nuclease SI 核酸 酶 ” 专 一 水 解 杂 交 双 链 中 单 链 区 的 酶 ， 它 需要 锌 离子 、 酸 性 PH,， 尚 不 知 它 对 核 苷

酸 序 列 有 无 选择 性 。

SAGE (serial analysis of gene expression) ”基因 表达 系列 分 析 通过 已 连接 在 一 起 的 cDNA 小 片段 序

列 的 测定 ， 评 估 特 定 实验 条 件 下 多 个 基因 转录 活性 的 生物 信息 学 工具 。 saline sodium citrate (SSC) 柠檬 酸 钠 生 理 盐水 ”经 常用 于 核酸 杂交 实验 的 盐 溶 液 。 它 也 是 各 种 杂交 实

验 用 的 缓冲 液 以 及 杂交 后 的 洗涤 液 的 主要 组 分 。20 X SSC= 3mol/L NaCl, 0. 3mol/L 柠檬 酸 钠 ， 调 pH

ET Ue saline sodium phosphate-EDTA (SSPE) 磷酸 钠 -EDTA 生理 盐水 ”经 常用 于 核酸 杂交 实验 的 盐 溶液 。 它

也 是 各 种 杂交 缓冲 液 以 及 杂交 后 的 滤 膜 洗涤 液 的 主要 组 分 。 这 种 缓冲 液 中 ， 磷 酸 盐 与 核酸 的 磷酸 三 酯 相

似 ， 因 此 在 Northern 杂交 和 Southern 杂交 的 膜 上 可 以 增强 封闭 、 降 低 背 景 和 提供 较 高 的 信 噪 比 。20 义

SSPE=3mol/L NaCl, 0. 2mol/L NaH2PQ, » H2O, 0.02mol/L Naz-EDTA, #§ pH # 7.4, KR. sense RNA[(+)RNA] TEX RNA 与 天 然 mRNA 有 完全 相同 核 苷 酸 序 列 的 RNA。 反 义 RNA 可 以 与

mRNA 在 滤 膜 上 或 原 位 进行 杂交 ,正义 RNA 仅 在 Southern 分 析 中 作为 探 针 。 此 外 ,正义 RNA 三 般 用 于 评

估 非 专 一 性 杂交 程度 的 负 对 照 实验 。

Sevag RB Mii HMM 〈24 : 1) 混合 物 的 一 个 旧名 称 ， 参 见 Sevag MG, et al. J Biol Chem,

1938，124: 425-436 。 slot blot 狭 缝 印迹 对 样品 中 特定 RNA 或 DNA 序列 定量 的 膜 印迹 技术 。 通 过 一 台 歧 管 真 空 质 滤 ，

通常 样品 在 滤 膜 上 点 样 成 条 带 形 【 见 斑点 印迹 (dot blot)]。 狭 缝 印迹 没有 与 电泳 相关 的 定性 组 分 。 sodium dodecyl sulfate (SDS) 十 二 烷 基 硫酸 钠 一般 用 于 破碎 生物 膜 并 抑制 RNase 活性 的 离子 去

垢 剂 。

Southern analysis Southern 分 析 〈 也 称 Southern 印迹 ) 将 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 上 分 离 的 DNA 转移 到 滤 膜

上 ， 然 后 固定 和 杂交 的 技术 。 从 Southern 分 析 获 得 的 信息 可 用 来 定性 或 定量 评估 特殊 基因 或 其 他 位 点 的

组 织 。

Spatial resolution 空间 分 辨 率 用 双向 (长 和 宽 ) 像素 网 格 定义 的 图 像 属 性 。

specific activity 比 放射 性 每 单位 质量 放射 性 物质 的 放射 活性 。 最 常用 的 表示 方法 为 居 里 / 毫 摩尔 (Ci/mmol) 。

SSC 参见 柠檬 酸 钠 生 理 盐水 。

SSPE 参见 磷酸 钠 -EDTA 生理 盐水 。

steady-state RNA 稳 态 RNA 细胞 或 细胞 质 内 最 后 积累 的 RNA。 例如 ， 一 种 特定 mRNA 稳 态 量 的 测 - 406 o

术 语 表

定 并 不 需要 与 它 的 转录 速率 联系 。 与 核 逃 逸 实验 (nuclear runoff assay) 比较 。

Stoffel fragment (AmpliTaq DNA polymerase) Stoffel 片段 ”一 种 热 稳 定 的 重组 DNA 聚合 酶 。 它 比 全 长 AmpliTaq 聚合 酶 少 289 个 氨基 酸 ， 而 且 更 加 对 热 稳定 。 其 酶 活性 对 镁 离子 浓度 需要 的 范围 更 宽 , FF AR 少 5 一 3' 核 酸 外 切 酶 活性 。 它 通常 被 用 于 PCR。

stringency 严谨 性 对 双 链 核酸 解 聚 为 单 链 核酸 可 能 性 的 估量 。 它 也 可 以 评估 单 链 核酸 分 子 与 其 他 分 子 间 有 较 高 程度 或 较 低 程度 互补 的 可 能 性 。 严 说 性 条 件 高 ， 有 利于 高 度 互补 核酸 之 间 的 稳定 杂交 。 严 说 性 条 件 低 ， 则 有 利于 非特 异性 杂交 比例 的 增加 。

structural gene 结构 基因 与 核糖 体 RNA (rRNA) 和 转移 核糖 核酸 (RNA) 相反 ， 编 码 信 使 RNA (mRNA) 的 基因 称 为 结构 基因 。 结 构 基 因 通 常 由 独特 的 或 适度 重复 基因 构成 ， 如 Co 动力 学 所 展示 的 那样 。

SYBR Green, SYBR Gold SYBR 绿 ，SYBR 金 ” 是 用 来 染色 核酸 的 染料 家 族 的 新 成 员 。 一 般 在 二 甲 基 Wi (DMSO) 中 配制 成 10000 关 的 储备 液 。 用 Tris 缓冲 液 将 SYBR 染料 稀 释 为 使 用 浓度 。 例 如 ，1X Tris- 乙酸 盐 -EDTA (TAE), 与 省 化 乙 锭 相 比 ， 使 用 SYBR 染料 的 优点 是 极 大 地 减少 了 背景 荧光 , 灵敏 度 更 高 ， 降低 了 致 突变 性 。SYBR 绿 和 SYBR 金 用 于 染 DNA, 而 SYBR 绿 正 用 于 染 RNA.

systems biology ”系统 生物 学 ”整合 不 同 种 类 的 生物 学 信息 (DNA, RNA 和 蛋白质) ， 以 帮助 理解 各 类 生物 大 分 子 各 组 分 间 的 相互 关系 ,以 及 它们 如 何 影响 细胞 和 整个 有 机 体 的 学 科 。

TAE buffer TAE 缓冲 液 ” 参 见 Tris- 乙 酸 盐 -EDTA 缓冲 液 。

TAP (tobacco acid pyrophosphatase) “烟草 酸性 焦 磷 酸 酶 ”这 种 酶 可 以 除去 真 核 细 胞 mRNA 的 5 端 帆 式 结构 。 该 酶 广泛 应 用 于 RNA 连接 酶 介 导 的 CDNA 末端 快速 扩 增 〈RLM-RACE)。

Taq DNA polymerase Tag DNA BAR —FH Mit (Thermus aquaticus) 分 离 出 来 的 耐 热 DNA ¥ 合 酶 。Tad 聚合 酶 是 几 种 能 用 于 进行 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 的 聚合 酶 中 的 一 种 。

target 靶 序 列 ”与 一 核酸 探 针 序列 互补 的 单 链 DNA 或 RNA 序列 ， 称 为 靶 序 列 。 这 种 靶 序 列 可 以 固定 在 一 种 固 相 载 体 上 ， 也 可 以 在 溶液 中 进行 杂交 。

TBE buffer TBE 缓冲 液 ” 人 参见 Tris- 硼 酸 盐 -EDTA 缓冲 液 。

TEMED (N,N,N’,N'-tetramethylethylene diamine) N,N,N ,N -四 甲 基 乙 二 胺 这 种 季 铵 在 制备 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 时 用 作 丙 烯 酰胺 单 体 聚合 的 催化 剂 。

template ”模板 合成 另 一 种 大 分 子 的 大 分 子 信息 蓝图 。 复 制 、 转 录 以 及 聚合 酶 链 反应 (PCR) 等 所 有 聚合 反应 都 需要 模板 。 它 可 以 指导 新 生 链 中 核 苷 酸 的 精确 序列 。 缺 少 模板 ， 引 物 扩 增 类 的 反应 则 不 能 进行 。

thermal cycler 热 循 环 仪 ” 完 成 聚合 酶 链 反 应 (PCR) 的 仪器 。

thymidine 胸腺 喀 了 啶 核 背 ”含有 胸腺 喀 喧 碱 基 的 一 种 核 苷 。

thymine 胸腺 喀 啶 ”通常 与 腺 味 叭 配 对 的 喀 啶 碱 基 。

TIFF (tagged image file format) 目标 图 像 文 本 格式 ”用 于 储存 图 像 的 软件 文本 。

Tn 解 链 温度 ”在 此 温度 下 ，50 办 的 双 链 解 聚 为 单 链 。 为 了 促进 双 链 的 形成 ， 杂 交 实 验 一 般 在 低 于 双 链 的 Tu 的 条 件 下 进行 。 温度 越 低 ， 形 成 双 链 的 可 能 性 就 越 大 , 当然 ， 包 括 错 配 的 可 能 性 也 越 大 。

trailer sequence ”尾部 序列 ”位 于 mRNA3 端的 不 翻译 序列 。 在 poly(A)+ mRNA 中 ， 尾 部 序列 位 于 编 码 区 和 poly(A) 尾巴 之 间 。

transcription 转录 RNA RAMU DNA 为 模板 合成 RNA 分 子 的 过 程 。

transcription elongation ”转录 延伸 RNA 合 成 三 步 曲 的 第 二 步 。 其 特征 为 在 新 生 链 的 3 端 以 共 价 键 的 形式 加 上 核 苷 酸 。 当 聚合 酶 沿 模板 移动 时 ， 新 合成 的 RNA 链 被 DNA 置换 ，DNA 模板 经 退火 而 恢复 成 双 链 。

transcription initiation 转录 起 始 RNA 合成 三 步 曲 的 第 一 步 。 转 录 起 始 步骤 从 RNA 聚合 酶 与 双 链 DNA 结合 而 开始 ， 接 着 模板 局 部 展开 呈 单 链 状 。

transcription termination 转录 终止 RNA 人 合成 三 步 曲 的 第 三 步 ， 也 是 转录 的 最 后 一 步 。 这 一 步 涉 及 桶 合 酶 识别 一 个 部 位 ， 超 过 这 一 部 位 ，RNA 链 上 不 再 添加 核 苷 酸 。RNA 链 加 上 最 后 一 个 核 苷 酸 后 ，RNA 链

。407 。

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

Al RNA 聚合 酶 都 从 DNA 模板 上 解 离 下 来 。

transcriptome “转录 组 “特定 细胞 在 特定 环境 下 产生 的 一 整套 信使 RNA (mRNA) 分 子 。

transcriptomics ”转录 组 学 ”对 一 组 织 所 有 转录 物 的 全 面 分 析 ， 以 及 当 内 部 条 件 变 化 后 这 些 mRNA 表 达 的 变化 。

transfection 转 染 ”将 核酸 导 和 人 真 核 细胞 , 常用 的 是 化 学 方法 。 转 染 可 分 为 暂时 性 的 ， 即 细胞 最 终 恢复 到 转 染 前 的 表 型 ; 或 者 是 稳定 型 的 , 即 转 染 的 DNA 整合 到 寄主 细胞 的 染色 体 中 。 真 核 细胞 的 稳定 转 染 是 很 少见 的 。

transfer RNA (tRNA) 转移 核糖 核酸 ”细胞 内 含量 比较 丰富 的 RNA. 在 蛋白 质 合成 中 ， 它 携带 氨基 酸 到 核糖 体 的 氨 酰 化 tRNA 位 ( 即 A 位 )。 细 胞 内 tRNA 的 总 含量 偶尔 被 作为 细胞 转录 水 平 的 指标 进行 测 定 ， 作 为 看 家 转录 指标 ， 以 显示 特殊 的 实验 操作 是 否 引 起 细胞 全 部 转录 水 平 的 改变 。

translation MiZ ”以 RNA 模板 中 的 编码 信息 合成 多 肽 的 过 程 。 随 着 mRNA 被 核糖 体 解读 ， 翻 译 发 eT.

translation elongation ”翻译 延伸 ”蛋白 质 合 成 三 步 曲 的 第 二 步 。 延 伸 这 一 步 包括 蛋白 质 中 所 有 肽 键 的 合成 , 即 活 化 的 氨基 酸 逐 个 加 到 新 生 肽 链 的 羧基 端 。

translation initiation ”翻译 起 始 ”蛋白 质 合成 三 步 曲 的 第 一 步 。 起 始 涉及 mRNA 与 核 六 体 的 结 a. x — SE BT AY A AE A a, ER SS AER. KERN BE EY N 端 。

translation termination ”翻译 终止 ”蛋白 质 合成 三 步 曲 的 第 三 步 ， 也 是 最 后 一 步 。 这 一 步 涉 及 完成 的 多 肽 链 和 指导 合成 的 mRNA 二 者 从 核糖 体 上 释放 出 来 。

triploid 三 倍 体 有 三 套 完 整 染色 体 〈 每 一 型 染色 体 出 现 3 次 )。 参 见 二 倍 体 〈diploid) 和 单 倍 体 (haploid) 。

Tris-acetat-EDTA buffer (TAE buffer) Tris- 乙 酸 盐 -EDTA 缓冲 液 ”常用 的 DNA 电泳 缓 神 液 。50 藉 TAE (每 升 ) 一 242g Tris 碱 ; 100ml 0. 5mol/L Naz-EDTA，pH8. 0; 57. lml KEM; KA. MFA RE 1X TAE。

Tris-borate-EDTA buffer (TBE buffer) Tris- 硼 酸 盐 -EDTA 缓冲 液 ” 常 用 的 DNA 电泳 缓冲 液 。 特 别 适 用 于 低 分 子 量 的 DNA。20XTBE( 每 升 ) 王 121g Tris 碱 ; 61.7g 硼酸 钠 ; 7. 44g Naz-EDTA。 使 用 浓度 是 1X TBE.

tRNA 参见 转移 核糖 核酸 (transfer RNA),

Tth DNA polymerase Tth DNA RAB CAFR rTth) 是 重组 的 Thermus thermophilus DNA 聚合 酶 。 这 种 酶 也 表现 依赖 RNA 的 DNA 聚合 酶 活性 〈 即 反 转 录 酶 活性 )， 需 要 锰 离 子 。 它 可 以 在 高 温 下 合成 DNA, 接着 可 以 进行 标准 的 依赖 镁 离子 的 PCR 扩 增 反应 。

upstream 上游 某 一 指定 位 点 的 5 方向 〈 与 表达 方向 相反 的 ) 的 序列 ， 如 真 核 细胞 mRNA5' 端 巾 式 结构 位 于 起 始 密码 子 的 上 游 。

uracil FROME 通常 与 腺 味 叭 配对 的 喀 啶 碱 基 。

uridine 尿 喀 啶 核 ， 尿 苷 ”一 种 含有 尿 喀 啶 的 核 苷 。

vanadyl ribonucleoside complexes (VDR 或 VRC) 氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 ”一 种 RNase 抑 制剂 。 经 常 加 入 温和 的 RNA 裂解 缓冲 液 中 用 以 抑制 RNase 活性 。 这 种 复合 物 发 挥 RNA 类 似 物 的 功能 。

vector 载体 一 种 核酸 分 子 , 如 质粒 、 叭 菌 体 或 类 鸣 菌 体质 粒 等 ， 其 中 连接 有 另 一 个 核酸 分 子 “〈 即 所 谓 插 入 序列 或 外 源 DNA) 。 含有 一 段 序列 的 载体 可 以 在 适当 的 寄主 细胞 内 与 其 携带 的 DNA 一 起 增殖 。

Western analysis (Western bloting) Western 分 析 (Western 印迹 ) 将 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 所 得 的 蛋 白质 图 谱 转移 到 滤 膜 上 进行 抗原 -抗体 识别 鉴定 的 一 种 技术 。Western 分 析 得 到 的 信息 用 来 定性 和 定量 评估 特定 多 肽 的 状态 。

xenobiotic ” 异 生 素 ， 生 物 异 源 物 “一 种 细胞 或 有 机 体内 没有 的 化 学 制品 。

(CUBR SSF; ahPp 金 由 辛 校 )

- 408 -

斑点 印迹 Fil PH Pre

宝丽来 DS-34 手提 式 照相 机

曝光 时 间 背景 校正 苯酚 编号 编码 链 编码 区 丙烯 酰胺 IK FH te UL 补 骨 脂 素

参 比 RNA 差 减 -校正 PCR 差 减 杂 交

差 减 杂 交

差异 显示 PCR

超 磁 珠

§ist PCR

巢 式 引物 AK AA EA AER 初级 扩 增

113,

33, 41, 42, 359,

298,

296, 307, 308,

123 BYAL|

=I

磁 珠

次 黄 嗓 叭 - 鸟 苷 磷酸 核糖 基 转 移 酶

次 级 扩 增 错 配

代谢 组 代谢 组 学 单 管 RT-PCR

单 链 构象 多 态 性

蛋白 酶 K

蛋白 质 微 阵列

蛋白 质 组

和 蛋白质 组 学

等 密度 离心

地 高 辛

第 一 链 cDNA

点 饱和

电压

电泳

FB ok AS

电泳 缓冲 液

电泳 仪

电源

电 转 印迹 法 影

杜 恩 斯 匀 浆 器

短发 夹 RNA

短 干 扰 RNA

对 比 度

对 称 性 PCR

多 和 孔 面 板

“4%” PCR

160,

124, 125,

190

386

- 409 -

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

核 不 均一 RNA 354 下 核酸 酶 保护 实验 1 2,5- FE BE mE 186 | 核酸 探 针 av — An ie 271 | Rew 2 = Bie Dh HE BE 28 | 核糖 核酸 酶 26 1,2- 二 氧 环 已 烷 衍 生物 191 | 核糖 核酸 酶 保护 分 析 199，321 二 乙 基 焦 碳酸 酯 30 | 核糖 体 70 核糖 体 RNA AY SLO 核 逃逸 实验 1, 37, 211, 2139 Geese 翻译 15 | .和 恒 态 丰 度 1 反 式 斑点 印迹 99 | 烘 烤 151 反 相 抽 提 55 | 4bar AEH ee 反 义 RNA 165，334 | 化 学 发 光 检测 法 191 IRE RAR BBE JZ NM 239 | 化 学 基因 组 学 346 KER 230 | 化 学 荧光 法 181 防护 眼 单 96 | 灰 度 色 标 138 放射 自 显影 182 | 灰 度 校正 138 非 对 称 性 PCR 240 | 混合 相 杂 交 154 5 非 翻 译 区 18 分 子 量 标准 113 J 分 子 生物 学 中 心 法 则 9 | 及 肌 动 蛋白 168，270 酚 / 氯 仿 抽 提 法 302 | 基本 局 部 比 对 搜索 工具 ‘eee 负 对 昭 276 | 基因 表达 系列 分 析 1 G 基因 组 346 基因 组 DNA 162 甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 168, 271 | 基因 组 学 346 高 丰 度 mRNA 76 | 基质 辅助 激光 解吸 电离 飞行 时 间 分 析 348 功能 基因 组 学 346 | 甲醛 91，109，373 共有 序列 10 甲醛 变性 胶 , APO 有 - 酸 - 酚 抽 提 46 | 甲醛 变性 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 66 AV - POR - Poa th HE He AR 44 甲醛 变性 系统 150 FL ths eh PA 45 甲 酰 胺 7, 91, 109, TOURES HRT 162 | 兼并 引物 248 PH IB a 125 | 碱 印迹 法 147 光 活 化 生物 素 标记 302 | 降落 PCR 244 光 循 环 仪 实 时 PCR 系统 290 胶片 130 硅胶 离心 柱 73 | 胶片 预 闪 186 硅胶 滤器 55 | WEA RNA ‘i BB 硅烷 化 71, 373 | 解 链 温度 6,1 ALA 31 | #4 PCR 273, 283 过 氧化 物 酶 系统 192 | 聚 丙烯 树 脂 活塞 85 H 聚合 酶 链 反应 163，239 聚 偶 二 氟 乙 烯 腊 144 核 RNA 38 | WARE 19

.410 -

FR Bis FEAR

PR A ty Be 冷冻 组 织 冷却 电离 耦合 离心 柱 层 析 法 离子 强度 链 霉 蛋白 酶 链 霉 亲 和 素 亮度 磷 屏 成 像 仪 Bi. FA A 滤 腊

滤 色 器

氯仿

氯 化 锂 -尿素 法 At

脉冲 标记 转录 法 毛细 转 膜 法

5 帽子

美国 国家 生物 技术 信息 中 心 密度 分 析

密度 梯度 离心

密码 子

模板 扩 增 程度

模板 链

5 末端

3 "末端 标记

5 末端 标记 末端 脱氧 核 苷 酸 转移 酶

内 含 子 内 源 标准

105,

143,

85

347 168 149 311 246

32 183 132

33

67

Ame

内 源 分 子 量 标准 尼龙 腊

黏度

黏 性

黏 性 末端 Sm

尿 喀 喧

BR ME Bie - N-BE A 尿素

Bee ABC a UE BER

欧洲 分 子 生物 学 试验 室

平板 筛选 实验

气 溶 胶 启动 子 起 始 密码 子 前 导 序 列 8- 羟 基 唆 啉 切口 平移 法 亲 和 俘 获 亲 环 蛋白 AA 清洗 滚 轴 琼脂 糖

热 变性

热 敏 纸

热 启动 PCR 热 循环 仪

日 本 DNA 数据 库

三 氟 乙 酸 饮 三 氟 乙 酸 饮 梯 度 离心 三 型 双 链 特异 核酸 酶 上 样 缓冲 液

ea

168,

引

270 114 143

356

254 10 19 18

33, 42

169,

163 320 271

31 134 383

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 一 RNA 研究 方法

人

生物 素 79, 159, 189 生物 信息 学 346 N- 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠 32 十 二 烷 基 硫酸 钠 31，32 实时 PCR 275，289，290 嗜 热 菌 聚合 酶 231 手持 紫外 灯 133 手套 29 手 担 式 驱动 匀 浆 器 64 数字 图 像 130 双 链 cDNA 162 双 链 RNA 334 We RNA 干扰 334 双氧水 31 水 杨 酸 钠 186 随机 引物 法 163 6- 羧 基 荧 光 素 290 Ay 探 针 154 探 针 长 度 174 探 针 浓度 174 体外 翻译 1, 97 体外 转录 167 体外 转录 模板 275 同位 素 标 记 156 图 位 克隆 345 图 像 分 析 软 件 131，140 He Fe 65 脱氧 核糖 核 苷 酸 2 W 外 显 子 12 外 显 子 捕获 12 外 源 参 照 物 272 外 源 分 子 量 标准 113 微 RNA 334 微量 移 液 器 枪 头 126 微型 多 孔 斑点 印迹 装置 | 98 ht FY PK Se EY ak He I 98 微 阵 列 326 微 阵 列 分 析 327 尾部 序列 19 温度 173

。412 +

ais Hie a 涡轮 印迹 器 BR

细胞 培养

细胞 质 poly (A)* RNA 细胞 质 总 RNA

细胞 总 RNA KBE EN Ob ARS

pe He Eh BS 显 色 检测 法

显影

线粒体 16S rRNA

5“- 腺 背 三 磷酸

Aig GR MS

相对 丰 度

硝酸 纤维 素 膜

小 鼠 间 皮 瘤 细 胞 系 差异 表达 校正 PCR

新 鲜 组 织

Fis) FR Pa Wie

1

RL Z KE

亚 甲 基 蓝

亚 甲 基 蓝 染料 烟草 酸 焦 磷 酸 酶 严谨 度

盐酸 股

盐 析 法

氧 钒 核糖 核 苷 复合 物 胰 有 蛋白 酶

胰 有 蛋白 酶 消化 乙醇 沉淀 探 针 了

乙 二 醛 变性 系统

乙 二 醛 /二 甲 基 亚 硕 乙 二 醛 / 二 甲 基 亚 砚 变 性 法 CZ — Bt 乙酸 钾 绥 冲 液

乙酸 生物 素

FF Ait. A A A

LT 146, 149 185

169, 271

314 92 ’ 119, ‘ 369, 385

128

4 要 260 hes

FR BE 33 银 染 122 引物 退火 241 引物 延伸 242 印 制 326 荧光 成 像 术 186 荧光 法 181 荧光 生成 5 -核酸 酶 实验 289 荧光 素 161 有 机 溶剂 抽 提 359 预 杂交 177, 178 杂交 154, 302 Z 增 感 屏 185 增强 子 11 iE 133 真空 印迹 法 146 正 压 转 膜 法 146 直接 酶 标 法 191 植物 RNA 116 转录 9, 14 转录 调控 22 转录 后 基因 沉默 334 转录 后 水 平 22 转录 起 始 位 点 10 转录 速率 211 转录 物 5 转录 组 346 转录 组 学 346 转移 RNA 169 锥 形 离 心 管 29 紫外 线 透 射 仪 133 紫外 线 照射 交 联 151 组 蛋白 169, 271 组 织 样品 63 其 他 AMV 反 转 录 酶 316 AP 体系 191 argonaute 334 BioMax 胶片 184 BLAST 350 5, b, 289

cDNA 229 cDNA 合成 229 cDNA 末端 快速 扩 增 258 Centricon 系列 168 Church 印迹 法 107 cpRNA 38 CsCl 梯度 离心 方法 47 CsTFA 50 DBM 纤维 素 143 DDBJ 349 DDPCR 307 ddRNAi 334 ddRNAi 338 DEPC 30 Dicer 334 DIG 标记 系统 193 ADNA 95 DNA 斑点 印迹 101 DNA 甲 基 化 酶 231 DNA 聚合 酶 230 dsRNA 3384330337 dsRNAi 334 DTT 28 Dynabeads 80, 81 EB 染色 286 ECL 系统 191 EcoRI 甲 基 化 酶 231 Elutip-d 微 过 滤 柱 168 EMBL 349 FOTO/Analyst Archiver Eclipse 工作 站 136 Forster 共振 能 量 转 移 290 G& 10 GC & 10 (G-+C)! FB 174 Gel-Pro 分 析 器 136, 137 GelStar 122 Genius 试剂 盒 193 GRAIL 350 hnRNA 354 Hogness & 10 Klenow 片段 230 Kornberg fff 230 Lumi-Phos 480 192 Lumi-Phos 530 192

RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研究 方法

Lumi-Phos Plus 192 RNA 聚合 酶 [ 13 MALDI 348 | RNA 聚合 酶 下 13 miRNA 334 RNA 灵敏 度 指标 269 mRNA 38 | RNA 琼脂 糖 凝 胶 电泳 90 mRNA 差异 显示 307 | RNA 探 针 166 mtRNA 38 RNA 诱导 沉默 复合 物 335 NCBI 349 | rRNA 105, 115 Northern 分 析 91, 96, 142, 321 | RT-PCR 96, 239, 245 NP-40 40. | 26S 和 蛋白酶 体 271 oligo(dT )~ fit in AF HER 87 | Sl 核酸 酶 198, 231 oligo(dT)-# 4 84 | Sl 核酸 酶 保护 分 析 201, 204 oligo(dT)-4 4E RK 86 SAGE 347 Optitrans 膜 143 Sephadex G-25 柱 107 O.T.C. 介质 66 | shRNA 335, 337, 338, 340 pAW108 272 | 18S rRNA 90, 115, 169, 271 PCR 163, 239, 273 | 28SrRNA 90, 115, 169, 271 pH 174 | SSC 178 poly (A)~ RNA 38, 88 | SSCP 321 poly(A) 尾巴 19,77 | SSPE _ 107, 178 Polytron 破碎 64 | STORM 860 荧光 成 像 仪 131 PosiBlot 装置 146 | SYBR¢& 122 Pribnow & 10 | SYBR & 121, 369, 385 PTGS 334 | Tm fA Wi 4250 PVDF 腊 144 | Taq RAB 2315) BIB. Aa Pwo 聚合 酶 312 | TA RK k 7) 268 3'RACE 260 TATA € . 10 RACE 258 | T4 DNA AB 4 288 RISC 335 | tRNA i272 RLM-RACE 259 | U6 335 RNAi 333, 335 | UA-6 紫外 吸收 检测 器 83 RNAlater 34, 72 Ultrafree 过 滤 组 合 168 RNase 26 UNG 254 RNase H 230 3'UTR K 19 RNase 保护 分 析 197，206 | VDR 27, 34 RNasin 28 Western SS RNA 斑点 印迹 100 XAR 胶片 184 RNA 电泳 112 | ®X174 DNA 95 RNA 干扰 165, 333, 335 | XLS BH 184 RNA“ 净 化 ” 73 | 和 射线 胶片 183 RNA 聚合 酶 [ 13 | X 射 线 胶片 显影 182

。 414 -

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RNA 操 作 ， 远 比 DNA 操 作 困难 ， 原 因 在 卑 组 成 RNA 的 核糖 核 苷 酸 比 组 成 DNA 的 脱氧 核糖 核 昔 酸 多 一 个 氧 原 子 ， 它 造成 RNA 的 不 稳定 性 。 而 RNA 的 完整 性 是 RNA 实 验 成 功 与 否 的 关键 ae > - ee E Farrell, Jr 所 著 的 《 RNA 分 离 与 鉴定 实验 指南 一 -RNA 研 究 方法 > — 好 就 好 在 不 仅 提 供 了 操作 程序 ， 更 阐明 了 一 些 实验 要 点 和 注意 事 项 ~… 此 书 能 帮助 我 国 RNA 研 究 工 作者 更 好 地 理解 RNA 技 术 的 内 涵 ， 能 正确 地 使 用 不 同 的 实验 程序 。 希 望 此 书 的 出 版 能 促进 我 国 RNA 研 究 工 作 的 开展 。

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RNA 的 分 离 与 鉴定 构成 了 分 子 生物 学 的 核心 领域 之 一 。 本 指南 收录 并 详细 介绍 许多 经 过 实验 验证 并 优化 的 实验 方案 ， 用 于 RNA 的 分 离 与 鉴定 ， 注 重 盖 述 这些 研 究 方法 如 何 应 用 到 基因 表达 的 转录 及 转录 后 调控 等 研究 工作 之 中 。 实 验 指南 第 三 版 经 过 国内 有 从 事 RNA 技 术 研 究 多 年 的 专家 翻译 为 中 文 ， 体 现 了 下 列 特色 :

国 与 第 二 版 相 比 ， 新 增 RNA 分 离 、 高 通 量 方法 、 生 物 信息 学 和 RNAi 等 内 容 ; 图 详细 解释 了 RNA 处 理 、 储 存 和 操作 的 实验 细节 ; 国 扩充 了 RT-PCR、RACE 等 内 容 ;

图 针对 问题 的 处 理 建 议 ， 贯 穿 于 全 书 。

分 子 生物 学 、 遗 传 学 、 细 胞 生物 学 、 发 育 生 物 学 等 领域 的 专家 学 者 、 研 究 生 、 高 年 级 本 科 生 ， 医 学 基础 、 农业 生物 技术 等 领域 从 事 RNA 工 作 的 相关 研究 者 ， 会 从 书 中 获取 他 们 急需 的 RNA 实 验 技术 细节 ， 进 而 判断 实验 中 出 现 问题 的 原因 ， 并 采取 合理 的 解决 办 法 。

本 中 文 版 仅 限 在 中 国 大 陆 境 内 销售 ， 禁 止 出 口 ISBN 978-7-5025-9625- 5 |

ark 本 书 译 自 原版 RNA Methodologies: 人 ae Se A Laboratory Guide for Isolation 六 区 a and Characterization, }f (Elsevier . 2 销售 分 类 建议 生物 / 生物 技术

TZ 权 出 版 定价 : 63.00 元 6259" 7