| re Y ™ op FA Lb ; . . cn = i PRR rs sc = = y hte ct KS Hh S F Hy te eS hd < 本 aoe > > . Se — . > he +t > = AK KR &® F HW I itt ~ |}, a — , i = 人 7 Ps : aaa : & = ——_ ¥ a = 起 ¥ i S ft : ¢ ; % 本 sd e . A j 7 ary a, ' yy = , a _ ™ _ _ opp.’ 2h De Bi ia =e fe As _ _ ‘i crn. @ 有 va 4 ae < EM hk BR Re 4 《修订 本 KABLER EWES i KRW me it 物 所 图 书馆 il Wy MN 山 A 本 书 自 1958 46 IK, a a ald oh JL AF A SE, MUMEKS HE, RH 42, MAH O+, HHMI SSH 目 、 注 解 .附录 , 内 容 比 教学 大 网 所 规定 的 要 多 一 些 , ETMAE 使 用 时 有 所 选择 。 本 书 可 供 高 等 院 校 生物 系 各 专业 及 有 关 科 学 工作 人 员 参 考 。 参加 本 书 篇 写 工作 的 是 北京 大 学 生物 学 系 生 物化 学 教研 宝 陈 同 度 、 郑 昌 学 、 王 重庆 、 朱 孔 生 等 。 生物 化 学 实验 指导 (修订 本 ) 北京 大 学 生物 学 系 生 物化 学 教研 室 钨 北京 市 书刊 出 版 业 营业 许可 证 出 字 第 2 GS 人 民 教 育 出 版 社 出 版 (北京 景山 东 街 ) 入 民 教 育 印刷 厂 印 装 新 华 书 店 北京 发 行 所 发 行 & th wm % Boe MR K—%H 13010-523 FFA 8501168 :1/ss 印张 5 1/s 字数 117,000 £0 #k92001--135200 定价 (5 ) ¥0.50 1958 年 12 月 第 1 版 1964612 月 第 2 版 196446 12 Ft MBIA 本 BBB PEALE ee eee eed 糖 的 颜色 反应 .…………………. 1 实验 一 实验 二 实验 三 5¢ i 糖 的 还 原作 用 …………………. 6 糖 胖 的 形成 .…………………… 10 血糖 的 定量 测定 …………… 13 第 二 章 脂肪 的 化 学 ……………… 了 1 SCE. KA ”实验 七 实验 八 See Iu 实验 十 中 性 脂肪 的 组 成 ……………- 19 OB $e Hs OB BE AE AO HE He AE 脑 中 磷脂 的 分 离 和 鉴定 …22 胆固醇 的 提取 和 鉴定 ……24 粗 脂肪 的 定量 测定 ………: 25 碘 值 的 测定 ………… ee eee 27 第 三 章 “ 蛋 白质 的 化 学 …………31 实在 十 二 实验 十 二 实验 十 三 实验 十 四 实验 十 五 实验 十 大 实验 十 七 RATA 实验 十 九 实验 二 十 蛋白 质 与 个 别 毛 基 酸 的 HE A HY BP ELBE ++ -42 HE A RY AR AT YL E44 蛋 自 质 等 电 点 的 测定 …49 Sorensen 氏 甲 醛 滴定 监 氮 量 的 测定 .……………. 53 _ Rit RKEEM EEA Ft BR a 0 SE 和 核酸 成 分 的 鉴定 ……58 We Be A HE EO 的 提取 和 鉴定 .…'… i es 60 酵母 核糖 核 蛋 白 的 水 解 及 核糖 核酸 成 分 的 CHOH 十 百 20 (CHOH); "5 (cHOH Ye CH,0H bu.08 葡萄 糖 葡萄 糖 腺 ia | H } . b=N_NB_OH; O_N_NH_ouH， uaog CuH_NH_NH，_ OO0 +CcH;NH2+NH; (cHOH); | (oHOH 3 ae H,0n CH,0H Ao H ON_NHE_CuH， CN_NH_GuH， 0-0 +C,H;—NH—NH,—>»C=N—NH—C,H;+H20 (cHOH ‘e (CHOH _ CH0H OoH 葡萄 糖 采 | 不同 还 原 糙 所 生成 的 胖 ， 化 学 构造 不 同 ， 晶 形 、 熔 点 和 溶解 度 亦 各 不 相同 O。 因 此 ， 成 胖 反 应 可 用 来 鉴别 各 种 还 原 糖 。 因为 第 3 到 第 6 四 个 碳 原子 构 形 相 同 , 果糖 葡萄糖 和 甘露 糖 则 均 形 成 葡 4d BEAR. eRe ets Ee, Ae wl A ET ET HR O AAR KA UMM REE, 熔点 实际 上 是 分 解 点 , he, 成 腻 反 应 不 是 鉴定 糖 的 理想 方法 。 12 第 一 章 ，” 糖 的 化 学 HN—C,H; HN—CcHs aN i 和 或 N—CeH;5 N 一 C5H5 和 4 AAA 本 大 R R AR Veal FY BE IG CBE PRY SBE AR Te], ~Mulliken° € 4p HH— 28 $8 it DREYER FP : D- 果 糖 2 分 钟 D- 葡 萄 糖 4 一 5 分 钟 D-4P FL PE 15—19 分 钟 FL FEVER Ar Sa ole Be FE eae i 30 分 钟 内 无 反应 事实 上 , 实验 条 件 不 同时 , 反应 速度 也 不 同 , 但 快慢 次 序 不 变 。 AK RAC MM, 可 参阅 参考 书目 43)。 表 1， 胖 的 晶 形 和 烤 点 名 be | PAL Wii 5 BR Be HF PEM univ | Bal Sh 4A Me ‘oh 形 长 薄片 状 黄色 和 针 状 | 长 薄片 状 | samara | 长 租 和 各 种 西 纯 状 te |. 214°C, | 204—205°¢ | 205—206°0| 200°0 |. - 167°C Fd 43 BE BFF PER 和 乳糖 用 Al. Km de. 实验 四 ”血糖 的 定量 测定 13 Set (LAE RRMER (2) KIA. 试剂 (1) RARE WE-FAPMRGNILA Yo 〈 上 比例 2:3)9; (2) 2% 4H 萄 糖 溶 液 ; (3) 2% ZESEPEPAIR; (4) 2% 和 乳糖 溶液 ; (5) 2% TEBE 溶液 。 操作 “” 取 试管 4 支 , 分别 加 大 2% 下 萄 糖 、 麦 韩 糖 、 乳糖 和 芒 糖 溶液 各 2 毫升 。 再 各 加 大 新 配制 的 盐酸 葵 肝 - 栈 酸 人 钠 混合 物 移 0.5 克 。 混 与 ， 置 沸水 浴 中 (一 定 要 孝 沸 )。 随 时 将 出 现 沉 淀 的 试管 取出 , 并 记录 时 间 。 考 20 分 钟 后 , 将 所 有 试管 取出 ;在 室温 下 慢 慢 渝 却 @。 注 意 有 无 沉 演 产生。 用 小 吸管 吸出 结晶 , 放 在 载 片上 。 用 盖 片 盖 好 后 , 在 显 微 镭 下 观察 并 给 出 沉淀 的 糙 晶 形状 和 大 小。 实验 四 血糖 的 定量 测定 了 agedorn-Jensen 二 氏 定 糖 法 正常 人 空腹 血样 的 血糖 含量 狗 为 80 一 120 HE, HERBIE 乱 , 如 患 糖尿 病 时 ， 血 糖 含 量 有 显著 变化 。 测 定 血 糖 ， 对 诊断 糖 代 谢 硅 乱 状 况 , 有 临床 价值 。 血糖 的 测定 ， 多 是 根据 糖 在 热 碱 性 溶液 中 对 某 些 高 价 离 子 的 还 原作 用 。 最 和 常用 的 有 两 价 金属 铀 离子 Qu 和 高 铁 氰 离子 He(CN)5 。Folin 和 吴 宪 二 氏 ”用 铜 作 氧 化 剂 ， 用 比 色 法 测定 生成 的 氧化 亚 钢 ， 来 计算 血糖 量 。 此 法 又 被 Somogyis32 及 Nel- sond9 改 进 。Hagedorn-Jensend7 利用 高 铁 氰 离子 来 氧化 血糖 ， ”再 用 碘 注定 法 测定 剩余 的 Fe(GCN)---， 也 可 算出 血糖 量 。 用 Ha- @ LEAT HRBERSAEH, Ak, 反应 要 在 有 酷 酸 钠 的 条 件 下 进行 。 盐 "FURS: UE 55 WB We Bin SEAT EE He I, JS AE. [CsH;NHNH3]*Cl- + CH3;COONa—NaCl-+ [CsH;NHNH3]*+-CH3COO- [CsH;NHNH3 ]*-CH;COO-—>CsH;NHNH,2+CH;000H @ 最 好 在 温水 中 保温 和 烙 晶 , 形成 的 晶体 大 而 清楚 。 14 第 一 章 ” 糖 的 化 学 gedorn—Jensen 定 糖 法 所 测 得 的 血糖 ， 不 仅 包括 葡萄 糖 ， 还 包括 血 中 一 些 其 他 还 原 物 质 如 尿酸 . 肌 酥 , 谷 胱 甘 肽 等 DO。 但 这 些 还 原 性 物质 在 血 中 含量 不 多 , 影响 不 大 。 Hagedorn-Jensen — Fe 7 BRIE, 是 一 个 微量 定 粮 法 。 其 原理 如 下 。 先 将 被 检验 血 @ 与 氨 氧 化 钙 胶 体 洲 液 共 热 ,除去 血 中 和 蛋 自 质 。 滤液 与 一 定量 过 量 的 铁 氰 化 钾 ( 红 血 盐 ) Ks[Fe(CN)e] 共 热 ， 使 部 分 的 铁 氰 化 钾 被 还 原 为 亚 铁 氰 化 钾 ( 黄 血 盐 , Ki[Fe(ON)])。 Ks[Fe(CN)e] 十 精 一 >Ki[Fe(CCON)e] 十 FENDA EF 剩余 的 Ks[Fe(CN)e] 可 用 丰 滴 定 法 测定 。 2K3Fe(CN)e 十 2KI 一 一 2K4[EFe(CN)e] 十 Le 一 反应 是 可 逆 的 。 为 了 使 此 反应 进行 完全 , 除 加 大 栈 酸 酸化 外 ， ta cf Fe(ON)5 BS +, Meme Fe 与 Ky Fe(Cn)¢ | 反应 生成 不 溶性 的 复 盐 。 2K4 Fe(CN), | +3ZnSO,—> K.Zns;| Fe( CN)ele-+3K480, SAF OAL ST GE Ae LA KoZnsl Fo(CN)o Bek SHh BF iit be 出 来 。 反应 中 生成 的 游离 碘 , 用 硫 代 硫酸 钠 滴 定 。 在 一 定 实 春 条件 下 , 还 原 糖 与 被 还 原 的 Ks[Fe(CN)e] 具 有 一 定数 量 关 系 。 BES, FAY Ka[Fe(CN)e] 就 少 ,产生 出 来 的 游离 碘 也 就 少 , 滴定 碘 的 硫 代 硫酸 钠 用 量 也 少 。 由 此 可 见 , HIE ER A 钠 用 量 成 相反 关系 。 但 这 种 关系 并 不 是 精确 的 反比 关系 。 这 可 能 、 是 因为 还 原粮 与 铁 氨 化 钾 的 反应 程度 受 这 两 种 物质 相对 淡 度 的 影 D 这 些 还 原 物 质 的 还 原作 用 相当 于 20 一 30 毫克 葡萄 精 /100 毫 升 血 液 。 Q 一 般 由 饥 俄 24 小 时 的 动物 身上 取 血 。 用 全 血 测定 血 精 。 为 防止 血 凝 和 血糖 因 酵 解 而 损失 , 可 加 入 氮 化 钠 及 草酸 钾 的 混合 物 (1:3)。 每 5 毫升 血 加 此 混合 物 20 毫 io EE Rh EY fh FE, 在 2 一 3 天 内 , 血糖 无 变化 。 KER Me Me 15 Wa], Tae FS Bote BE BA: AS RB Be ee BY FS HE FRE a ETP HK 的 (可 由 表 中 查 得 )。 因 此 , 本 实验 要 求 严 格 地 执行 操作 规程 , 如 反 应 的 温度 , 加 热 时 间 的 长 短 等 。 器 材 (1) 试 管 及 试管 架 ; (2) 0.1 毫 升 微量 吸 量 管 2 支 ; (3) ARYA SS (4) 金 属 架 ( 放 试 管 及 雏形 叛 用 ); (5) 小 玻璃 漏斗 4 个; (6)50 毫升 锥 形 狐 4 个 ; (7) 再 2.3 和 5 毫升 吸 量 管 各 工 支 ; (8) 2 毫升 微量 滴定 管 ;(9) 鹏 脂 杭 花 。 试剂 〈1) 0.45% fic SEVER; (2) O.1N St AE GHA 液 ; (3) fe s (4) 0.005 和 N FRHERR RUE SPEAR; (5) 氧 化 物 - 硫 RSE MLS; (6) 3% 醋酸 溶液 ; (7) 19% 淀粉 溶液 ( 深 于 饱和 NaCl 溶液 中 );《〈8) 0.005N trite We HER HAO. HVE WL 4 AA, BEE 1,2,38,4 OPS, 各 加 入 0.45 % fii PSEA 5 SIR OLN MAILMBK 1 SH, BS. 这 样 制备 AY eA PE AR, 可 沉 演 除去 血液 中 的 蛋白 质 呈 。 向 工 2 号 两 试管 内 ， 用 微量 吸 量 管 各 量 太 血液 01 毫升 。 仔 . 组 地 反复 吸 大 着 放 出 氧 氧化 锌 胶体 溶液 3 一 4 次 , 以 洗 奖 吸 量 管 中 残存 的 血液 。 第 3 和 4 号 两 试管 为 空白 对 照 ， 不 加 血液 。 将 上 述 4 支 试管 一 起 放 入 沸水 浴 中 加 热 4 分 钟 ( 准 确 ! )。 此 时 , BARA BAKDELIF, 洲 液 变 得 透明 @。 痊 却 后 ， 通 过 塞 有 已 湿润 过 的 小 棉花 球 的 小 漏斗 @， 将 试管 内 容 物 分 别 滤 大 标 肛 .234 号 码 的 4 个 50 22S HEIZ IAA. JAPA KP EEE 2 次 ， 每 次 用 3 毫升 。 将 洗 液 通过 棉花 球 滤 入 雏形 狐 内 , 与 滤液 合 着 。 @ MAH RA il a, 应 尽快 地 加 入 血液 样品 。 否 则 , 加 热 后 , 溶液 不 透明 。 @ BEATER RE) 滤液 也 不 透明 , 最 后 测 得 的 血糖 偏 高 , 有 时 会 高 出 很 多 。 图 WeH) 20 毫克 的 棉花 作成 棉花 球 较 合 适 , 棉花 用 量 多 , SRA. HATER 不 宜 过 紧 , 也 不 宜 过 松 。 16 第 一 章 “” 狂 的 化 学 用 微量 滴定 管 , 准确 地 在 每 个 锥 形 瓶 内 , 加 入 标准 铁 氰 化 钾 碱 _ 性 溶液 2 毫升 。 将 4 个 锥 形 瓶 同时 放 太 沸水 浴 中 者 15 分 钟 ( 必 须 准确 ) 取 HH SIE TE I, 立刻 在 水 龙头 下 渝 却 。 向 每 个 锥 形 瓶 中 添加 氧化 物 - 硫 酸 锌 -碘化钾 溶液 3 毫升 和 3% HNMR 2 AEF, WAL. EME TE RCE PEK, 由 微量 滴定 管用 0.005 丈 硫 代 硫酸 负 溶液 滴定 。 傣 北 内 黄色 变 得 很 浇 后 (不 要 过 了 交点 )， 加 工 多 淀粉 溶液 2 滴 , OB ce BL HE HG ke HERE) Ste BLOGADD, PRE nae AEs RH me MT 合成 精 值 。 两 峰值 相 减 , 即 得 100 2Ft a0 BG Oy AAA RE He Be, #2. Hagedorn-Jensen 二 氏 血 糖 换算 表 0.005N NasSs0s 用 量 (毫升 ) 和 血液 中 葡萄 糖 含 量 (毫克 1100 毫升 ) oe 0.00 | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.07 | 0.08 9.09 0.0 | 38 | 382] 379| 376] 373| s70| s67| 364| s61| 358 0.1 | 355 | 352 | 350 | 348 | 345 343 | 341 | 338 | 336 | 333 0.2 | 331 | 329 | 327 | 325 | 323 | 321 | 318 | 316 | 314 | 312 0.3 | 310 | 308 | 306 | 304 | 302 | 300 | 298 | 296 | 294 | 292 0.4 | 290 | 288 | 286 | 284. | 282 | 280 | 278 | 276 | 274 | 272 0.5 | 270 | 268 | 266 | 264 | 262 | 260 | 259 | 257 | 255 | 253 0.6 | 251 | 249 | 247 | 245 | 243 | 241 | 240 | 238 | 236 | 234 0.7 | 232 | 230 | 228 | 226 | 224 | 222 | 221 | 219 | 217 | 215 ‘ 08 | 213] 211] 209] 208| 206| 204] 202 | 200] 299]. 197 0.9 | 195| 193 | 191 | 190 | 188 | 186 | 184) 182 181 | 179 1.0 | 177 | 175 | 173 | 172 | 170 | 168 | 166 | 164 | 163 | 161 实验 四 血糖 的 定量 测定 17 1.2 | 141 | 139 | 138 | 136 | 134 | 132| 131] 129 | 127 | 125 124 | 122'| 120| 19 | a7 | 115 | 11s | | 110 | 108 106 | 104 | 102 | ior | 99] 97 | 9% | 93| 92] 9 70 | 68 | 66 | 65 | 63 | 61 | 59 | 57 | 56 | 54 34 | 32 | at | 29 | 27 | 25 | 24 | 22 | 20 | 19 Re 7 | 15 | 14 | 12 | 10 | 8 | 7 | 5 | 3| 2 参考 书目 (1) Molisch,H., Monatsh., 7, 198(1886). (2) Bredereck, H., Ber., 64, 2856(1931); 65, 1110(1932). (3) Seliwanoff, T. H., Ber., 20, 181(1887). Martin, R.W., H.Z. fiir physiol. Chem., 259, 62(1939). _ (4) Tollen, 8.B., Ber., 29, 1202(1896). (5) Bial, M., Biochem. Zeit., 3, 323(1907). (6) Fehling, H., Annalen der Chemie, 72, 106(1849). (7) Benedict, S.R., J.Biol. Chem., 3, 101(1907). (8) Benedict, S.R., J.Biol. Chem., 5, 485(1908—09). (9) Barfoed, C., Z.Anal. Chem., 12, 27(1873). (10) Tauber, H. and Kleiner, I.8., J. Biol. Chem., 99, 249(1932). (11) Fischer, E., Ber., 17, 579(1884); 20, 821(1887). _ (12) Mulliken,S.P., The Identification of Pure Organic Compounds, Vol. I, p.29, John Wiley and Sons, New York, 1%* Ed. (1914). (13) Percival, E.G. V., Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol. I, p. 23(1948). (14) Folin, O.and Wu, H. (%3E), J.Biol. Chem., 41, 367(1920). (15) Somogyi, M., J. Biol. Chem., 117, 771(1937); 160, 161(1945). 3 | +. 5 | 88 | 86 | 834 | 83 | at | 79 | 77 | 75 |. 74 | 72 4 52 | 50 | 48 | 47 | 45 | 43 | 41 | 39 | 38 | 36 对 18 第 一 章 “ 糖 的 化 学 (16) Nelson, N., J.Biol. Chem., 153, 375(1944). (17) Hagedorn, H. C. und Jensen, B. N., Biochem. Z., 135, 46 (1923). Bie BBE FEA ZR, Bh Yn Fi EL BY BS AS Le, 除了 和 蛋白 质 和 糖 之 外 , 向 有 脂肪 和 类 脂 质 。 脂 肪 是 高 级 脂肪 酸 的 甘油 三 酯 , 类 脂 质 是 在 化 学 或 物理 性 质 上 类 似 脂 肪 的 物质 。 脂肪 及 类 脂 质 总 称 为 脂肪 类 化 合 物 。 脂肪 类 化 合 物 一 般 都 深 于 脂肪 溶剂 , 如 乙醚 ,石油 醚 二硫化碳 、 气 仿 和 荃 等 ， 但 不 溶 于 水 或 微 浴 于 水 。 根据 化 学 成 分 ， 脂 肪 类 化 合 物 可 分 为 三 类 : CO) Ria ee 脂肪 ) 如 油 和 脂 ; 《2) 类 脂 质 如 磷脂 、 固 醇 酯 和 蜡 等 ; 〈3) 衍 生 脂 肪 一 一 脂肪 类 化 合 物 的 水 解 产物 , 包括 脂肪 酸 、 脂 肪 族 之 高 分 子 醇 J lel BF 脂肪 类 化 合 物 在 机 体 中 具有 重要 意义 。 芙 脂 的 卡 价 高 ， 为 生 物体 的 储 能 物质 ， 所 以 又 称 为 储 天 脂 肪 。 类 脂 质 是 构成 生物 组 胞 物质 的 重要 成 分 ， 因 此 又 称 和 结构 脂肪 。 和 神 轻 系统 、 性腺 、 精 子 和 展 上 腺 皮质 等 组 积 中 类 脂 质 的 含量 丰富 。 实验 五 “中 性 脂肪 的 组 成 sh AUG A i SS, 都 是 中 性 脂肪 , 是 高 级 脂肪 酸 与 甘油 构成 | CH.— O—C —C17Hs35 I CH — O=+0 —C17Hs35 sm 3Na0H O | CH.— O— GC —C,17Hs;5 三 硬 脂 酸 甘油 酯 20 Bo ”脂肪 的 化 学 CH,.—OH — CH —OH 十 3017HasiCOONa Wi Ha Ae SA CH,.—OH 的 甘油 酯 .在 酸 、 碱 或 酯 酶 催化 作用 下 , 7k . FA A Sy A, 氧化 钾 作 水 解 众 化 剂 时 ， 水 解 产 物 为 能 溶 于 水 的 脂肪 酸 钢 盐 或 钾 盐 ( 即 肥 时 ) 和 甘油 。 这 种 水 解 过 程 称 为 时 化 作用 。 用 无 机 酸 酸 化 里 化 液 , 则 难 深 于 水 的 高 级 脂肪 酸 分 离 析出 。 C,,H;COONa-+-HCl—>C,H;COOH | +NaCl 硬 脂 酸 全 硬 脂 酸 “Hh 5 Wt 7k Fl (An KHSO,, P.O, CaCl. 或 无 水 NaeSO,) 共 热 ， 或 单独 热 至 450°C 以 上 时 ， 则 腊 水 生成 丙烯 醋 。 丙 烯 醛 有 刺激 性 Fee, 可 供 辨 别 。 丙 烯 醛 还 可 以 还 原 银 离子 成 金属 银 们 。 CH,—OH CHO KHSO, | CH —OH Gi CH T 十 2H2O ep CH.—OH CH。 器 材 (1) 武 管 及 试管 架 ; (2)1008F-HEM; (3)10 毫 升 量 fis (KiB; 〈5) 玻 璃 漏斗 。 试剂 〈1) 提 炼 过 的 猪 油 ; 〈2)0.5X 氨 氧 化 钠 酒 精 溶液 99; (3)10% $k; (4)3X MAL Snes 〈5) 甘 油 ; 〈6) 固 体 硫酸 所 钾 ; 〈7) 无 水 酒精 ; 〈8)10 多 硝酸 银 深 液 ; (9) RAK. 操作 “〈1) 皂 化 : PRAISE HHH 0.7 克 , EF 100 毫升 雏形 瓶 中 ， 加 10 毫升 0.5X 气 氧 化 钠 酒 精 洲 液 。 瓶 口 加 软木 蹇 ， 塞 中 插 有 长 玻璃 管 作为 进 流 痊 凝 器 , 置 沸水 洽 中 加 热 二 一 1 小 时 。 渝 却 , 备用 。 2) 脂肪 酸 的 分 离 : 将 新 得 的 电化 液 在 水 浴 上 温 热 , 徐徐 滴 加 10 多 盐酸 酸化 , 随 加 随 的 ， 直 至 淡 黄 或 白色 脂肪 酸 宛 全 析出 为 止 。 RRA WR PIRES 21 Yr Fe, 过 滤 。 保 留 滤液 作 鉴 定 甘油 用 , FA 2b EE ok VE ELE 的 脂肪 酸 ， 直 至 洗涤 液 对 石 芒 武 狼 呈 中 性 反应 。 从 滤纸 上 取 少 量 脂肪 酸 溶 于 95% 酒精 中 ， 用 石 划 哉 颖 证 明 此 酒精 溶液 的 酸性 反 再 取 少 量 脂肪 酸 置 试管 中 ， 先 加 10 SIE, 再 加 3X & 氧化 销 深 液 2 一 3 滴 。 加 热 , AKI, DU, MRR SL 合成 肥 主 。 加 大 盐酸 酸化 , 则 脂肪 酸 再 度 析出 。 (3) 甘 油 的 分 离 与 鉴定 : 取 一 支 试管 , 加 大 甘油 数 滴 和 固体 硫 酸 氨 钾 少 许 ， 混 与 。 另 外 , NRE, 用 含有 数 滴 硝酸 银 溶 液 的 省 氨水 浸 湿 , 挂 在 武 管 口 上 。 人 徐徐 向 武 管 加 热 , 注意 丙烯 醛 之 特 臭 并 观察 在 狐 条 上 出 现 的 棕 黑 色 金 属 银 。 加 热 不 能 过 和 急 ， 否 则 一 部 分 KHSO, 被 甘油 还 原 ， 产 生 SO. 气体 。SOs HAR, BSE 之 特 自 不同 , 容易 干扰 武 验 。 在 水 浴 上 蒸 干 本 实验 操作 (2) 的 滤液 。 加 无 水 酒精 5 毫升 。 捍 匀 后 , 静 置 数 分 钟 。 滤 大 试管 内 , 在 水 浴 上 省 熔 滤 液 至 浆 状 。 按 照 上 法 鉴定 有 无 甘油 。 实验 六 卵黄 中 旷 磷 脂 的 提取 和 鉴定 机 体 的 各 种 租 线 和 移 胞 均 含 卵 磁 脂 。 在 卵黄 CRIA 10%%)、 神 经 、 精液、 脑 懂 骨骼 .肾上腺 、 肺 ,心肌 、 蘑 菇 和 酵母 等 租 徐 内 合 量 更 高 。 OBOE A MER, 不溶 于 不 , BAP, A, CA HALE, 但 不 溶 于 丙酮 。 利 用 后 一 性 质 可 与 中 性 脂肪 分 离 。 、 器材 〈1) 小 烧杯 ; (SUH: (3) 水 洽 钢 ; 《全 玻璃 漏斗 (5) 干 燥 试管 及 试管 架 。 试剂 〈1) 鸡 卵黄 ; 〈2)95 多 乙醇 ; (3)10 匈 所 氧化 销 ; (4) 丙 Mi 22 第 二 章 ” 脂 肪 的 化 学 操作 (1) 提 取 : 取 鸡 卵黄 狗 2 克 ， 放 大小 烧杯 内 。 TEA 15 毫升 热 的 95 多 乙醇 , 卉 同时 撮 拌 。 痊 后 ， 滤 大 于 燥 试 管内 , 如 滤液 混浊 ; 重 滤 , 直到 完全 透明 。 将 滤液 在 水 浴 上 素 干 。 (2) 三 甲 胺 起 验 : RULER BD, MARE, Jm10 % AAG SAYA HE 2 毫升 并 在 水 浴 上 加 热 。 卵 悉 脂 分 解 生成 胆 碱 , 胆 碱 在 碱 的 作用 下 , 形成 三 甲 胺 。 注 意 三 甲 胺 的 鱼 胜 味 。 (3) 另 取 一 些 旷 斐 脂 ， 溶 于 工 毫 升 乙醇 中 ， 添 加 丙酮 12 这 升 。 观 察 变化 。 实验 七 ” 脑 中 磷脂 的 分 离 和 鉴定 类 脂 是 动 植物 绷 胞 组 织 的 重要 成 分 。 某 些 植物 种 子 内 较 多 ， Shy HUE, HE, 2, EEA he, SEEN, RHR, NRE WERE, MBIT ECR, SN GEIR, ORR PGR, AB ALMA PGR, SN BEIR YA T CAE Ta WEI UA, Gee tees 解 性 质 上 的 差别 可 将 各 种 类 脂 分 离 。 磷 脂 类 都 是 很 好 的 乳化 剂 。 磷脂 可 被 碱 水 解 为 脂肪 酸 盐 、 甘油 ,磷酸 盐 及 含 氮 碱 基 。 这 些 成 分 可 以 用 适当 方法 来 分 别 鉴定 。 甘油 可 以 按照 实验 五 中 的 方法 鉴定 。 将 类 脂 质 碱 水 解 液 酸化 ， 脂 肪 酸 即 行 析出 。 磷 酸 盐 在 酸性 条 件 下 与 钥 酸 欠 作 用 生成 黄色 磷 钥 酸 钞 沉 淀 , 反应 如 下 。 HsPO,+ 12(NH,4).Mo00O,+ 21HNOs—— OO: 12Mo003 | + 21NH,NO;+12H,0 在 碱 性 溶液 中 加 热 ， NOOR A A OR =F 胺 为 碱 性 物质 , THE GE U8 PL SS HE EE HO—CH,—CH,—N=(CHs)s——> OH chk Meh eee Ae 23 “HO—CH.—CH,OH + (CHs)3N 器 材 (1S (2) bias DARE OKA HA KM; (G)Boes (COBOL, | 试剂 〈 世 乙醚 ; (2) A; (8)10% NaOH; (4) 3% HAR; (5) ~—O1MSARRSE; (6) RERRAT; (7) UR mtmes (8) Hh; (9) 707k CaCle; (10) #0 6 Beat A. 操作 ” 取 1 一 2 克 动 物 脑子 , 加 少许 用 水 洗 过 的 细 砂 粒 ， 用 力 JERR ARE Im 5 毫升 乙醚 , ARES, 充分 振 落 数 分 钟 。 放 车 10 分 钟 后 , 将 上 层 提取 小 借 大 离心 管 中 ， 残 酒 再 用 3 ZS 升 乙醚 提取 一 次 。 将 两 次 提取 液 合 并 , 溶液 如 不 清亮 , 可 以 离心 一 K. FESOCKBA PRA 0.5 SH, HHT, a 却 后 , Im Avr 05 Pel 2 毫升 , EK ARE BS 5 oy BPE OB RNG FO 磷脂 尽 可 能 完全 沉淀 出 来 。 离 心 (1500 转 / 分 钩 离 5 分 钟 )。 将 上 清 液 借入 小 次 蒸发 四 中 工 在 水 浴 上 蒸 干 (不 能 直接 用 火 加 热 ) 备 用 。 向 沉 浅 加 少许 蒸馏 水 ， 振 落 ， 观 察 胶 状 乳 化 液 的 形成 (为 什 么 ?)。 疝 乳化 液 中 加 入 4 毫升 10%NaOHO。 加 热 至 沸 , 在 管 口 挂 一 条 湿 的 红色 石 芒 试 级 观察 颜色 有 无 变化 ， 同 时 不 断 地 注意 有 无 fe WED. 水解 15 分 钟 后 , 向 水 解 液 中 加 入 省 HNO, 至 明显 酸性 @， 有 不 深 物 析出 (这 是 什么 物质 ?)。 过 滤 。 取 滤液 2 SH, ERE 加 入 0.5 毫 升 O.1M SHeR®, FEAR MAA MA. HB FA is 10% NaOH 洲 解 (不 能 溶 时 , 则 在 水 浴 上 加 热 ), 再 加 大 硝酸 酸化 , 则 脂肪 酸 再 度 析 出 。 回 蒸 发 亚 中 的 残 酒 加 入 2 毫升 氯仿 , 使 之 溶解 , 再 加 入 1.5 一 2.0 四 不 要 将 碱 沾 在 试管 口上 , 否则 妨碍 下 一 步 检验 三 甲 胺 试验。 @ 县 N9s 不 能 加 得 过 多 ,否则 影响 磷 钥 酸 化 反应 。 图 ARRAS, 最 好 用 新 配制 的 试剂 。 24 第 二 章 ”脂肪 的 化 学 毫升 栈 酸 本 及 省 HoSO: eH, 注意 颜色 变化 。 参 考 实 验 八 。 I AE I A Baia Hh, 再 加 无 水 CaCle 狗 0.1 GOFF FEA 慢 慢 加 热 。 待 熔化 后 , 注意 有 无 刺 鼻 气 味 @。 实验 八 _ 胆 固 醇 的 提取 和 鉴定 人 及 动物 的 各 种 组 胞 均 含 有 自由 存在 的 和 以 车 侣 形式 存在 的 胆固醇 。 脑 劝 、 精 液 及 皮脂 内 含量 较 多 。 胆 石 内 胆固醇 舍 量 有 时 达 90 多 。 胆 下 醇 溶 于 氧 仿 , 石 油 醚 、 葵 、 热 酒精 及 脂肪 中 。 在 无 水 条 件 下 ， 胆 固 醇 同 乙 酸 本 和 省 硫酸 作用 呈现 蓝 和 芭 色 (Liebermann-Burchard 反 应 )。 此 反应 先 出 现 和 红色 , FESR AL PIR 烷 色 。 若 胆固醇 量 不 多 ， 立 即 出 现 和 蓉 色 。 其 反应 机 人 制 可 能 是 胆 固 醇 在 省 硫酸 作用 下 先 形成 实 台 式 为 QisHsse 和 CsA ss 的 二 胆固醇 tay, BHSATK-TPRA TRA, ARAL ADR MRAD CsHli HizCs CasHiy Ne cn, cH | | | teas CH; oH, a | ine pa ath ate Va ; > Bs ae 864 SN WA A fA] Ae = A Mw & OD RHKRARLTECS, SMAWRREB ME. Q AFR RD, AH A MEH he, Ae Oe Ht anh ETT 鉴定 。 实验 九 粗 脂肪 的 定量 测定 25 质 。 胆 固 醇 也 可 用 Salkowski 氏 反 应 来 鉴定 。 在 此 鉴定 方法 中 只 用 省 硫酸 而 不 用 醋酸 酥 , 精 果 为 红色 。 其 反应 机 制 和 Liebermann -Burchard 反应 相似 。 生 成 二 固 醇 熔 合 物 的 反应 见 上 页 2。 有 人 利用 Liebermann-Burchard 反应 作 胆 固 醇 的 定量 测定 。 器 材 (1) FRR RAE: 〈2) 乳 杀 ; (3) 玻 璃 板 (10 x 10 厘米 ); 《4) 烘 箱 ; 〈5) 小 刀 ; 〈6) 木 制 小 链 ; 〈7) 吸 量 管 。 试剂 〈J) 脑 丹 ( 猪 ,更 或 白鼠 等 ); 《2) 石 膏 ; 〈3) 新 蒸 馆 的 无 IAG; 〈4) 溃 硫酸 ; (5) RARE. ”操作 GER: 注意 必须 用 干燥 器 材 。 取 脑 散 2 一 3 克 ， 加 2 一 3 倍 重 量 的 石膏 。 在 和 乳 钵 中 仔细 提 雁 后 ， 用 木 链 痊 在 玻璃 板 上 成 一 薄 层 。 在 AOC 烘箱 中 烘 于 。 用 小 刀 把 干 片 乔 到 乳 杀 内。 用 桂 搞 碎 后 ， 移 人 大 试管 。 加 氧 th 5 一 6 毫升 , 芥 小 心 振东 试管 5 一 10 分 钟 。 用 氯仿 浸 湿 的 滤纸 过 泪 。 用 滤液 做 以 下 旦 色 反应 。 (2) eA A (Salkowski 氏 反 应 )， 取 2 一 3 毫升 滤液 , MHS BHR, ARIRIEA. Hina, 观察 试 管内 上 部 (氯仿 ) 出 现 的 红色 和 下 部 出 现 的 带 攻 莹 光 的 黄 和 红色 。 《3) 酮 酸 酥 -硫酸 试验 (Liebermann-Burchard 二 氏 反 应 )， 取 2 一 3 蛙 升 滤液 ， 加 醋酸 栈 10 滴 及 省 硫酸 1 一 2 滴 。 逐 渐 混合 。 观 祭 最 初 产 生 的 和 红色 渐变 为 蓝 色 ， 最 后 呈 蓝 炮 色 。 若 溶液 中 胆固醇 量 不 多 , we BVH Slee 实验 九 ” 粗 脂肪 的 定量 测定 索 氏 (Soxhlet) 提取 法 本 法 为 重量 法 ， 用 脂肪 涂 剂 将 脂肪 提出 后 称 量 之 。 适 用 于 固 体 和 液体 样品 。 通 第 使 用 的 脂肪 溶剂 为 乙醚 或 沸点 为 35 一 45”C 的 石油 醚 。 索 氏 提 取 器 为 一 循环 提取 装置 。 用 本 法 提取 的 脂 溶性 26 BOT ARM ee 物质 为 脂肪 类 物质 混合 物 , BR “LIB HG”, 其 中 含有 脂肪 、 游 离 脂 Wire, BENG, WE, AE, OF ih, HACK AES, 称 取样 品 的 重量 视 材 料 中 脂肪 含量 而 定 。 含 量 在 10 多 以 下 者 , 可 称 取 10 一 12 克 。 含 量 在 50—60% 4, Hi nf HRM 2A—4 Fe, 有 人 用 化 学 反应 法 . 光 折 射 法 和 比重 法 等 来 测定 脂肪 含量 。 参 考 有 关 评 述 @。 BM (DRM (DKS; (3); (OMRIRM 花 ; (S)IRABUERES 〈6) 提 取 和 纸 斗 。 试剂 〈1) 样 品 ( 芝 麻 , 花生, 大豆 或 玉米 ); 〈2) 无 水 乙醚 。 表 3， 几 种 干 的 植物 种 子 和 种 仁 中 油 脂 的 百 分 含 量 FE 品 & ith & FE & | @ it rig BBE BREE 23.5—45. 0. KG Fh )1 10.0—25.0 fn] ASE Ape 40. 0—67.8 油 桐 种 仁 47.8 一 68.9 葛 太 种 籽 45. 1—58.5 玉米 谷 粒 3.0 9.0 Swe ARE 50. 772.0 未 考 谷 粒 1.6— 2.6 芝 heh FF 46.2—61.0 FGF RL 1.3— 2.4 花生 种 仁 40. 2—60. 7 Di DBP AF 0.7— 1.9 操作 Fe RR in i 100°C He PRET. Arla, PER A®. HE 确 地 称 取 一 定量 样品 , WA TEM KA PO, PE db FA BE Ws ZF, WNFCTEM A+, LAT ABER LSE i. FEARS RM MAR 氏 提 取 管 内 (图 2)。 注意 勿 使 斗 内 或 包 内 样品 高 出 提取 器 的 虹吸 部 分 。 D 样品 的 制备 十 分 重要 , 应 先 此 去 水 分 。 在 烘 干 时 机 避 驶 过 热 。 样 品 颗粒 不 能 太 大 。 研 磨 后 , 要 用 脱脂 棉 控 拭 乳 钵 ， 工 将 此 腕 脂 棉 帮 大 提 取 罗 斗 中 一 起 提取 。 还 可 FA ly Sik Go BE De PPLE, 洗 后 倒 和 提取 管 中 。 @ 样品 如 为 液体 ， 将 一 定量 体积 的 样品 滴 在 滤纸 上 。 在 60 一 80 "9 烘箱 内 烘 干 后 , 装 大 提取 器 中 提取 。 / ii PR He 27 FEARRMRREMAA, MeKS BEBE, AAEM AED EE a A, AXT@REKIG EAB OKs 为 40—50°O), 切 勿 用 火焰 直接 加 热 ， 也 不 能 用 火焰 烧 水 浴 。 忆 醚 蒸气 由 联接 管 上 升 至 汾 凝 器 , BERRI, 滴 大 提取 管 中 。 到 一 定 水 ee 平 后 , 溶 有 脂肪 之 乙醚 经 虹吸 管 流入 提取 狐 。 a KAU, 使 乙醚 每 小 时 循环 10 一 20 次 。 提取 时 间 视 样品 性 质 而 定 , 通常 需 14 一 16 小 ”联接 管 时 。 fem sca, HI PPEMIM®, 在 水 浴 上 vv 蒸 馆 回收 乙醚 (避免 火焰 ! )。 最 后 置 烘 箱 中 (100°C) 烤 至 恒 重 。 计 算 样 品 的 粗 脂肪 百 分 音量 # | 图 2， 索 氏 提 取 器 。 提取 撼 实验 十 ” 碘 值 的 测定 脂肪 中 的 不 饮 和 脂肪 酸 碳 链 上 有 不 饱和 键 ， 可 以 吸收 亢 素 (Cle, Br 或 也 )。 不 饱和 键 数目 越 多 ,吸收 的 讽 素 量 也 您 多 。 每 100 殉 脂肪 , 在 一 定 条 件 下 , 所 吸收 的 碘 的 区 数 ， 称 为 该 脂肪 之 碘 值 号。 碘 值 为 鳌 别 油脂 的 一 个 重要 常数 。 DO 一般 用 沸点 在 60`C 以 下 的 有 机 溶剂 提取 。 虽 然 经 常 使 用 乙醚 ,但 目前 便 向 于 使 用 石油 醋 ， 因 为 后 者 对 芙 脂 具 有 更 大 的 选择 性 提取 。 乙 醚 提取 的 数值 一 般 仿 高 ， 有 更 多 的 非 脂 肪 物质 也 被 提取 。 乙 醚 和 石油 醚 的 联合 提取 已 在 食品 分 析 中 广泛 采用 ， 也 有 人 使 用 乙醚 和 乙醇 的 混合 液 。 @ 提取 移 毕 后 ， 再 让 乙醚 攻 到 提取 管内 。 在 乙醚 达到 虹吸 管 高 度 前 ， 取 下 提取 A, 这 样 可 以 节省 下 一 步 操作 时 间 。 图 夏 值 是 100 克 脂肪 在 一 定 条 件 下 所 吸收 的 碘 的 克 数 。 无 花 使 用 的 是 溴 化 碘 溶液 或 气 化 碘 溶 液 , 最 后 都 以 碘 的 区 数 来 表示 碘 值 。 28 第 二 章 MV Mes 从 碘 值 可 以 知道 油脂 是 否 为 生性 油 ， 并 可 刊 断 氨 化 时 所 需 氢 量 ; 同时 可 以 用 来 计算 脂肪 或 脂肪 酸 的 定量 组 成 ”。 由 于 碘 和 脂肪 的 加 合作 用 很 慢 。 毛 或 省 和 脂肪 反应 虽 快 ， 和 但 有 取代 和 和 氧化 等 副 反 应 。 因 此 ， 普 通用 省 化 碟 (Hanus Rik) 或 氮 化 础 (Wijs Kei). ASCH Hanus RRR, Wi 的 一 部 分 与 脂肪 起 加 合作 用 后 ， 测 量 剩余 的 一 部 分 。 使 剩余 的 省 化 碘 与 碘化钾 作用 放出 碘 。 放 出 碘 的 多 少 用 硫 代 硫酸 钠 滴 定之 。 IBT7 十 开工 一 一 > 上 BT 十 To TI 十 2NaoS03s 一 一 >2NaI 十 NasoSsOa 取样 多 少 决 定 于 油脂 样品 的 础 值 。 人 参考 表 4 和 表 5。 表 4， 桩 品 的 最 适量 和 碘 值 关 邓 作用 时 间 作用 时 间 30 以 下 约 工 0 0.5 100_140 | 0.2 —0.3 1.0 30— 60 | 0.5—0.6 0.5 140160 | 0.15—0.26 1.0 60—100 | 0.3—0.4 0.5 160—210 | 0.13—0. 15 1.0 表 5. 几 种 ;油脂 的 碘 值 名 称 碘 值 - || 名 称 | jh 值 亚麻 子 油 175—210 46 A ah 85—100 fF ith 154—170 猪 油 48— 64 棉 子 油 104 一 116 后 油 25 一 AL 有 关 碘 值 测定 法 的 历史 和 近况 , 参阅 参考 书目 "。 器 材 《〈1)7300 Ae Fh wa EL TU HR NC aie Be A EY SET Hs (2) 10 毫升 量 简 ; (3)50 毫升 滴定 管 ; 〈4) 吸 量 管 。 试剂 〈1) Hanus ARs (2) 标 准 OLN WEAN Tie SA HE © Ai Hanus 法 所 得 的 碘 值 比 Wijs 法 测 得 的 低 2 一 5 多 。 但 Hanus 试剂 比 Wijs 试剂 稳定 ,所 以 采用 较 广 泛 。 - ———— Ee ee ee EE CC EEE CS 二 OE a Sebi aie a Hl ae 29 — RO; (3) 纯 四 氛 化 碳 ; 〈4) 1 She GAT HAHA Ht); 〈5)10 移 碘化钾 溶液 ; (6) 花 生 油 或 猪 油 。 操作 “准确 地 称 量 狗 0.1 TERE RW 0.5 克 猪 油 ) 2 份 。 置 于 两 个 于 燥 的 础 值 测定 着 “图 3) 内 ， 切 勿 使 油 粘 在 RSA REBEL, IIRL 5 毫升 , 轻 轻 振动 , 使 油 VARA, FAY a FF A HH Jn Hanus FH 15 Ft CHE A), 1 BE PUR TK HS, ZERIT SE, 在 玻璃 赛 5K ZTE Jn 10 % BR SPA Hee eH St PA ERR, LA 碘 的 挥发 损失 。 在 20—30°C 暗 处 放 冒 30 Bh, F# 不 时 轻 斤 。 油 吸收 的 碘 量 不 应 超过 Hanus 氏 深 液 所 ”图 3 碘 值 = 2M PO, 车 狐 内 混合 物 之 颜色 很 浅 , 表示 MEM. 油 用 量 过 多 。 改 称 较 少量 油 , 重 作 。 放置 30 分 钟 后 电 ， 立 刻 小 心地 打开 玻璃 蹇 ， 使 赛 旁 碘化钾 深 WMATA, DHER. 用 新 配制 的 10 碘化钾 10 SF AAR 水 50 毫升 把 玻璃 塞 上 的 和 泪 对 上 的 液体 冲 估 瓶 内 , HES). FON 硫 代 硫酸 钠 溶液 迅速 滴定 至 浅黄 色 。 加 入 1 hE 1 EF, 继续 IE REE RI, 用 力 振 落 @, 使 碘 由 四 氧化 碳 全 部 进入 水 溶液 内 。 再 滴 至 蓝 色 洽 失 为 止 , 即 达 滴定 攻 点 @。 FANE 2 份 空白 对 照 , 除 不 加 油 样品 外 , 其 余 操 作 同 上 。 滴 定 后 ， 15 RCE AER, 以 便 收 回 四 氧化 碳 。 计 算 碘 值 。 QD 岚 素 的 加 合 反 应 是 一 可 递 反应 , 因此 , 只 有 当 试 剂 契 对 过 量 时 , 才 使 反应 进行 较 完 全 。 @ 放置 时 间 , 一 般 规定 碘 值 在 110 以 下 者 为 30 分 钟 , yy UL bot, 加 ”用力 振 莲 是 本 滴定 成 败 的 关键 之 一 ， 否 则 容易 滴 过 头 或 不 足 。 如 果 振 GA 够 ,四 毛 化 碳 层 会 有 紫色 或 和 红色。 此 时 需 用 力 振 落 使 碘 进 入 水 层 。 ®@ ”一 些 时 间 后 , WERNER A, 否则 就 表示 滴定 过 量 。 30 ee MMe 参考 书目 (1) Witzman, E.J., J. Am.Chem.Soec., 36, 1766(1914). (2) Rapoport, S.M.und Raderecht, H. J., Physiologisch-Chemisches Praktikum, p.124—125, VeB verlag Technik, (1956). (3) Progresses in Chemistry of Fats and Other Lipids, Editors: Holman, R.T., Lundberg, W.O.and Malkin, T., Vol. V,p.4—7(1958). _ (4) 季 庄 维 耶 夫 ，A.A.， 油 脂 化 学 , 286 页 . (5) Hanus,J.，Z. Nahr. Genusmitt., 1, 913(1901). (6) Wijs, J.J., J.Soc.Chem.Ind., 17, 698(1898). (7) 如 人 3)，P. 25. (8) Leach, A.E., Food Inspection and Analysis, John Wiley and Sons Inc., New York(1920). | Boe EER tS EARE— OSM ALA BR 成 分 。 它 们 构成 人 体 及 所 有 动物 机 体 组 绪 干 物质 的 主要 部 分 ， 是 生命 现象 的 主要 承担 者 。 蛋 自 质 是 复杂 的 高 分 子 化 合 物 , 分 子 量 从 几 万 到 儿 百 万 , 溶 于 水 中 时 成 亲 水 胶体 溶液 蛋白 质 是 由 20 余 种 氨基 酸 以 肽 键 相互 联 接 而 成 的 。 在 酸 、 碱 和 特殊 的 酶 (蛋白 酶 ) 作 用 下 , 蛋白 质 水 解 而 成 Jin, WR tk, FERRITE ROR IER EARAT PASARE, 又 含有 氨基 等 酸 碱 基 团 , 因而 是 酸 碱 两 性 化 合 物 。 在 特定 的 pH 条 件 下 ,， 蛋 白质 酸性 基 团 的 解 离 度 与 碱 性 基 团 的 解 离 度 相 等 ， 分 子 成 为 带 有 正 负电 荷 相 等 的 中 性 形 式 , 在 电场 中 不 向 两 极 移动 。 此 pH 值 称 为 芯 蛋 白质 的 等 电 点 。 处 于 等 电 点 的 蛋白 质 溶液 不 稳定 , 蛋白 质 极 易 沉 淀 析出 。 RA FARR, RSA RH EMA AT Rak BEA Ay SOLE SE, 结果 氨 键 等 副 价 键 破裂 , 它 个 的 物理 化 学 性 质 和 生 物 学 活性 也 随 之 改变 。 此 现象 称 为 蛋白 质 的 变性 。 诈 多 物理 化 学 因素 可 以 改变 蛋白 质 在 水 中 的 溶解 度 ， 产 生 可 MARANA RUE. KHMER KD, HAAR 白质 。 蛋 和 白质 按 其 分 子 粗 成 可 分 为 两 大 类 : 〈1) 分 子 完全 由 氨基 酸 构成 的 简单 蛋白 质 , 如 卵 清 清 蛋白 等 ; (2) 分 子 由 简单 蛋白 质 与 非 蛋 自 质 辅 基 构 成 的 精 合 蛋白 质 , MEA, eas, 22 lk RAMS 实验 十 一 ”蛋白 质 与 个 别 氨基 酸 的 呈 色 反应 蛋白 质 所 含 的 特殊 氨基 酸 或 特殊 结构 ， 可 与 某 些 试 剂 发 生 反 应 , 生成 有 颜色 的 物质 。 这 些 反 应 非常 灵敏 , 常 作为 蛋白 质 或 所 基 酸 定性 和 定量 测定 的 根据 。 由 于 化 学 烙 构 与 氨基 酸 成 分 之 不 同 ， 一 种 蛋白 质 未 必 能 起 所 有 有 蛋白质 的 颜色 反应 。 毛 基 酸 本 身 和 具有 与 蛋白 质 同样 糙 构 的 非 蛋 白质 物质 也 呈 相 应 的 某 些 颜色 反应 。 器 材 〈1) 武 管 及 武 管 架 ; (2)10 毫 升 量 简 ; (3) 喷 雾 器 。 试剂 (DEAR; 〈2) 未 稀释 的 鸡蛋 白 溶 液 ;(3)1% 白明 胶 溶液 ; (4) RIGA; (5)1% 硫 酸 铜 溶液 (6)0.5% BE 酸 铬 溶液 ; (7) 10% 氨 氧 化 钠 深 液 ; (8) 20% SA He Sh Ie: (9)0.5% 石炭 酸 溶液 ;(10) 省 硝酸 ; (11) REM; (12) ew (经 常 混 有 乙 醛 酸 ); (13)Millon RRA; (14)1% 草 三 酮 溶液 ; (15) KEMPS 10 毫克 /毫升 ; (16) 粗 氨 酸 溶液 10 毫克 /毫升 ; (17)20%NaOH; (18) 1%o- 壮 酚 酒精 溶液 ; (19) 2 Uh me SHE We; (20) 重 氨 试 剂 和 0; (21) 1 DWH; (22) 工 聊 甘 氛 酸 溶液 ; (23)0.3% PRE ARIAR; (24)5% Wie RARE; (25) $i ALP SNA WE; (26) IE RAE BR. (A) RHR: 当 尿 素 加 热 时 , 两 分 子 尿素 缩合 放出 一 分 子 A, Tid EZ Joe WN sie WR: NH, NH. C x O C=O NE 热 、 NE .'+Neee / NEE: C=O Cc=0 NH NH, Wh ie DR EE BE Pere Yt Cul aia A Ae RAT IY AE AREA (1) 实验 十 一 “和 蛋白质 和 个 别 氨基 酸 的 呈 色 反应 33 一 一 一 一 -一 这 一 呈 色 反应 称 为 双 短 脲 反应 。 oni C=N ia gpa 2. uN N—O 2Na* aN Cu ag et CQ 一 NA Sf apa 再 = O H pre 4 By QF CEARSE PSHE? SUBMIS, ve 能 呈 双 精 脲 反应 ， 形 成 此 红色 或 蓝 紫 色 的 复合 物 (ID)。 复 合 物 (]) 的 数量 越 少 ， 颜色 越 红 。 双 熔 脲 反应 不 仅 为 含有 两 个 以 上 肽 键 的 物质 《 蛋 自 质 和 三 肽 以 上 的 多 肽 ) 所 有 ， 而 含有 一 个 肽 键 和 一 个 —CS—NH;, OH 一 NH —CRH—NH2, CH,—NH,—CHNH.— —CH,OH 或 一 CHOEOHsNHs 等 基 团 的 物质 以 及 己 二 酰 二 胺 NHe N He (0 一 G 一 0 一 0 ) 等 物质 也 有 此 反应 4 34 第 三 章 和 蛋白质 的 化 学 eh ROKER (AUERE GE) 干扰 此 反应 ， 因 为 NEHY 能 与 OutOEH)， 形成 障 蓝 色 的 铬 离子 ，Cu(NHs)ir。 多 加 一 些 NaOH 在 一 定 范围 Py, 可 以 克服 这 一 干扰 。 WH REM, 可 用 作 蛋 白质 定量 测定 。 取 少 许 尿 素 结 晶 , 放 在 干燥 就 管 中 。 用 微 火 加 热 使 尿素 熔 解 。 熔 解 的 尿素 开始 硬化 时 , 停止 加 热 。 尿 素 放 出 氨 , TE Be ER Pr J, 加 10 % 8 HE SYA ERY 1 EFEKEADES., FI 1% BERS 溶液 1 滴 , FR. MEMO, BR, 否 则 , 生成 的 蓝 色 氨 氧 化 铀 能 掩盖 粉 杠 颜色 @。 向 另 一 试管 加 蛋白 质 溶液 钓 1 毫升 和 10% 氧 氧 化 销 溶液 2 训 升 。 找 匀 。 再 加 多 硫酸 铀 溶液 两 滴 , 随 加 随 揪 。 观察 此 玫瑰 色 出 现 。 (2) 米 偷 氏 反应 : 1849 年 Millon RRB, —HRAMBH 的 省 硝酸 溶液 一 起 加 热 时 产生 颜色 ， 并 认为 是 酷 氛 酸 和 其 他 酚 类 化 合 物 发 生 此 反应 。 单 酚 衍生 物 与 米 偷 氏 试 剂 作 用 生成 粉红 色 到 瞳 红 色 , 双 酚 和 吗 | 叹 衍 生物 (如 色 氨 酸 ) 生 成 黄色 到 红色。 此 反应 的 化 学 过 程 还 未 完全 了 解 ， 最 初 产生 的 有 色 物 质 可 能 是 酚 的 亚 硝 基 衍生 物 , 经 变 位 作用 , 成 为 颜色 更 深 的 邻 醒 胀 。 最 区 具 有 稳定 红色 之 产物 , KART. BASILE RE RE”, HO— ar +HO—N=0-0HY S+H,0 苯酚 亚 确 酸 | N 一 O WE. HH D 为 了 防止 生成 蓝 色 氧 氧化 铜 , AAT RA AHO mA HT i 实验 十 一 RARATWALRHAZERM 35 Me ARZALB AAR ARA FEA TT Aw, Alt, 凡 含 有 酷 氨 酸 的 蛋白 质 均 呈 此 反应 。 Millon 氏 反 应 不 能 用 来 检查 尿 中 有 蛋白质。 尿 中 无 机 盐 可 将 试 剂 中 汞 离子 沉 演 , 使 哉 剂 失 效 。 碱 也 能 沉 演 汞 离子 , 因此 鉴定 碱 性 溶液 时 , 须 先 加 酸 酸化 。 取石 痰 酸 A) 3 滴 ， 置 于 试管 内 并 加 Millon 氏 武 剂 绝 二 5 毫升 。 小 心 加 热 , 卉 观察 颜色 变化 。 向 试管 中 加 蛋白 质 溶液 2 毫升 2 及 Millon KR FAH 0.5 SZ 升 。 因 为 试剂 中 含 汞 盐 及 硝酸 ， 蛋 白质 凝固 沉淀 。 将 试管 内 容 物 pp MAO, 沉淀 变 成 磁 和 红色。 避 有 驶 添加 过 量 的 Millon RAH, A 为 试剂 中 含有 确 酸 , 能 与 许多 蛋白 精 合 , 产生 黄色 〈 蛋 白质 黄色 反 Di), FH Millon 氏 反 应 (这 是 关键 )。 用 白明 胶 作 Millon FER Di, 如 和 明胶 很 纯 ， 则 反应 不 出 现 ， 因为 白明 胶 不 含 酷 氨 酸 。 3) 蛋白 黄色 反应 : Salkowski 在 1888 年 第 一 次 应 用 这 一 反 Mw, 它 是 含有 芳香 族 氨基 酸 ， 特 别 是 含有 酷 氨 酸 和 色 毛 酸 的 蛋 自 质 所 特有 的 呈 色 反应 。 在 此 反应 中 ， 确 酸 将 蛋白 质 分 子 中 的 葵 A, 产生 黄色 或 橙黄 色 硝 基 衍 生物 。 葵 核 上 含有 状 基 , 加 碱 则 颜色 变 深 。 alien t2 ——\\_+Na0H bf 7 Tap HO 4 Mb” +HCl 5 Si Vi + H20 NO, N—O—Na 确 基 酚 | O fH AE © KARAMATAEEEA. MISHAATRARH, 逐渐 加 热 ， 则 出 现 粉红 到 红色 (决定 于 酷 氨 酸 的 含量 )。 对 于 水 溶性 的 肘 、 且 , MERE, 表示 有 酷 氨 酸 存在 。 @ MARR, MAIR, HEELERS. 36 第 三 章 ” 和 蛋白 质 的 化 学 色 氟 酸 产生 的 红色 上 比 酷 氮 酸 更 强 ， 有 人 认为 在 反应 中 色 氨 酸 BARBRA A. BARNA A AER MEE OA BE HT AL, J A > Tek tee ie BR FU HE FB) LS ATE, BER Sa A ee iB tet AST A AE. BRA, ial atic Wy, WAG AB, 也 能 发 生 此 反应 。 取石 痰 酸 溶液 狗 1 一 2 HARE A, femmes 1 毫升 IMF CEM ), MAE. RUE ARR 1 SITAR A. WIR 5S—6 i. 6 BARE PE. zd mM, IE MERE. ) gl a HF BE SIS BA PS 性 。 黄色 变 成 橙黄 色 。 若 酸化 , REAR. | (4) CRE x be (Adamkiewiez—Hopkins—Cole RZ): 当 向 蛋 白质 溶液 中 加 入 乙 醋 酸 ( 互 二 , ee PER, URS RAR AS hy RAR, CRG LEE ERE 5 EERE MIE ROA HR, Adamkie- wicz@ 用 含有 少量 醛 杂 质 的 冰 栈 酸 , Hopkins—Cole™ Fi] JZ RE REHE 为 试剂 , Acree-Rosenheim'5 利 用 甲醛 ，Voisenet-Phodqe92) 利用 芳香 醛 -一 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲醛 二 一 进行 反应 ; =} 形成 的 有 色 产 物 的 性 质 还 不 清楚 。 但 可 能 是 醛 与 两 个 分 子 色 MRM MATE SRE LN —CH,—CH—COOH cies N Wass NH, NHg. :二 省 二 二 ys H R ”实验 十 一 “和 蛋 自 质 和 个 别 氨基 酸 的 呈 色 反应 37 - 确 酸 根 、 亚 硝酸 根 、 氛 酸根 及 过 多 的 所 离子 均 能 妨碍 此 反应 。 有 微量 硫酸 铜 或 Fer++ 离子 存在 时 由 可 以 加 强 色 毛 酸 的 阳性 反 7 ele f< DZ, Harvey, Miller #1] Robson #2 S 4 obese fa URE HI AA PR OR AE IRR CHE CREME) AT 1 EFL, URE, METIS I EM ONY 1 BEF, HEE, NEAR. HE, BEATE SLAG ALE 色 环 @。 用 和 明胶 作 忆 本 枯 区 应。 自明 腾 分 子 中 无 色 所 机， 所 以 不 此 反应 5 " (5) SEF RP BER LIN HSL Re PLEB: EARS Pe Ai We We A AOE A, Ble ERE RE FL, 分 解 形成 硫化 钠 , Jae SHARON ETE RESO ULE. Am A HOI, 则 出 现 HS RRS R—SH + 2NaOH—>R—OH + NaS +H,O NasS + Pb**—>PbS| + 2Na* PbS+ 2HCI—> PbCl, + HST EA AAA SD WEG, “Tar Wes At 强 碱 相当 稳定 , 不 产生 此 反应 。 [a BRE HH Fen 0.5 多 醋酸 谷 溶液 狗 1 BES, 然后 慢 慢 滴 加 10 驳 SALVA, 直到 产生 的 沉淀 溶解 为 止 @; Boa, 再 而 未 稀释 @ 硫酸 必须 是 纯 的 。 @ 有 时 颜色 不 易 形 成 ,所 EDU Ee HAN. @ 酷 酸 镍 先 与 NaOH 作用 形成 PbO YL 白色 沉淀 ， 它 是 两 性 物质 ， 当 加 大 过 量 的 NaOH by, 5 NaOH 发 生 反 应 , 形成 欠 酸 钠 而 溶解 。 Pb(Ac)2+2NaOH—>2NaAc+Pb(OH): | H,PbO2-+2NaOH—>NazPbO;-+ 2H,0 38 第 三 章 蛋白质 的 化 学 的 蛋白 质 溶液 数 滴 ， 再 混 匀 。 小 心 加 热 , 则 溶液 变 黑 。 小 忌 加 入 2 ze Ft HCl, 嗅 其 味 , 有 什么 物质 ? aT (6) 糖 蛋白 的 试验 (Molisch 反应 ): Molisch 反应 是 糖 的 特 SRM, BRAS ARE ARIE, TES Molisch 反应 。 反应 机 il, cf LTP YS eR. 用 2 毫升 鸡蛋 清 蛋 和 白 , 加 2 一 3 滴 1 he-RGRA MAM, a. 然后 仔 组 地 沿 管 壁 加 省 硫酸 工 毫升 ， 形 成 明显 的 界面 。 在 界面 处 HH BLED, 表示 有 糖 存在 。 《7) 偶 氮 反 应 (Ehrlich 反应 ): {RRA DSRS AH 车 合 产生 颜色 物质 。 因 此 ， 和 蛋白 质 中 酷 氨 酸 和 租 氨 酸 能 发 生 这 一 反应 。 栈 氨 酸 产生 较 不 明显 的 橙 红 色 , 而 组 氨 酸 产生 鲜红 色 产 物 。 和 组 腕 、 硫 组 氨 酸 甲 基 内 盐 (ergothioneine)、 酷 胺 、 肾 上 腺 素 和 胆 色 素 也 能 发 生 此 反应 。 偶 毛 葵 磺 酸 下 与 组 氨 酸 和 酷 氛 酸 反 应 的 产物 如 下 : HOS—C > C—CH,—CH—COOH D RA We rh et IE A 5 NaNO, 和 HOl (FAR: NH ei | 0 +NaNO,+2H0l— JJ 十 2HzO+NaOl | | yom ws 了 O O H H } "Se — ee EY DB 39 Ho-《 >》cH 一 OH-oooH HOS—€ San=y7 NH, Kappeller-Adler *tJb2E(E ST eit, 取 2 支 试 管 , Fy ID A LR TAS He FL FE PA CHEE 20 借 ) 125, MAPA HMBR AML SH, HS. MA1 SI 20% NaOH, HHA, ILA Sh, MAB ANTE Re, AEH BREW 红色。 (8) 坂 口 氏 反应 (Sakaguchi PZ): 1925 年 Sakaguchid9 观 察 到 精 毛 酸 与 oc 茜 酚 在 碱 性 次 毛 酸 钠 溶液 中 发 生 反应 , 产生 红色 _ 的 产物 。 次 溴 酸 钠 与 次 毛 酸 销 一 样 有 效 , 且 比 较 方 便 。 许 多 肌 代 化 NH 合 物 , WIC, CE ) WL BET Wee th Be A PE NH. 应 。 精 毛 酸 是 唯一 呈正 反应 的 氨基 酸 ， 反 应 灵敏 度 达 1:250,000。 反应 方程 式 如 下 ”7)@: © RARAKEATEBY-BK, GUAR, A BMHREM, WEPEAR 定 。 @ 有 人 948) 认为 ,产生 的 颜色 物质 是 : 》 O NH NH ‘ wah) oe N—C—NH—(CH,)3;—CH—COOH xf 划 《 peas 2 ooo 40 第 三 章 ”和 蛋白 质 的 化 学 / Nis Nib C=NH C 一 0 aor 、NH ame CHa in + \S—OH — CH +NH; CH, > CH CH, CH CHNH, CHNH, COOH CooH 3NaBrO 2NH; —— N2+3H.0+3NaBr Me jae AY ABT KURI SA, TEXTE, A 物质 继续 氧化 。a- 氮 基 破 裂 , 引起 颜色 消失 , 因此 过 量 的 次 溴 酸 镭 WIAA, IMA BER SK, 破坏 过 量 的 次 溴 酸 钠 , 增加 颜色 的 稳定 度 。 酷 氨 酸 、 粗 氨 酸 、 色 氨 酸 和 氨 能 减低 产生 颜色 的 强度 ， 甚 至 阻 _ JERR STE WEIR DEY DA FAG ae EEE AH SR HAI YE 量 测定 ”。 取 2 支 试管 , 分 别 加 入 工 毫升 精 氨 酸 洲 液 和 鸡蛋 自 溶液 , 各 加 20% NaOH 5 Yi, 1%a- WHAT 2 FHRARRAEM 6 滴 。 5, 放置 片刻 , FER BURA ©, (9) PEM SEE: K—-KRME—-SH 产生 的 。 在 碱 性 条 件 下 , @A—SH 的 化 合 物 如 守 胱 氨 酸 与 亚 确 基 铁 氰 化 钠 反 应 形 REEL IK, WEAR KCN RPA, BIER, 反应 式 如 下 2o)。 [Fe** (ON) sNO*]" + SH"? Belt (0 tae D 应 避 名 加 入 过 量 的 wx- 蔡 酚 和 次 溴 酸 钠 溶 液 。 前 者 过 量 , 溶液 易 呈 棕色 , 后 者 过 量 , 则 反应 物 迅速 退色 。 @ HS 也 能 发 生 反应 。 实验 十 一 “蛋白质 和 个 别 氢 基 酸 的 呈 色 反应 41 [Fe**(CN);NO*SH-]--~ 7s Fe**(CN),NO*S“]---- + H,0 OR (HUD) 在 滴 点 反应 板 上 , 混合 2 滴 0.3 70 PE ARR HK, 3 滴 10 % NaOH, 0.5 毫升 5% 亚 硝 基 铁 氰 化 钠 深 液 @。 观 察 出 现 柴 征 色 。 颜 GF Di. | (2) 1A] 3 SFB SAM, MA 3 毫升 饱和 硫酸 化 .2 一 3 滴 5% 亚 硝 基 铁 氰 化 锁 。 并 加 入 包 和 氧 氧化 乌 碱 化 。 观 察 出 现 的 此 和 红色。 《10) 章 三 酮 反应 : ”此 反应 是 所 有 氨基 酸 共 有 的 反应 。 反 应 十 分 灵敏 ，1:1500,000 的 氮 基 酸 水 溶液 即 能 发 生 反 应 。Ruhe- mann 在 1910 年 首次 用 它 求 鉴定 氨基 酸 。 反 应 在 p 互 5 一 7 溶液 中 进行 最 好 。 ABRAMS MM RMA ARTA, We AER 被 氧化 形成 CO*、NHs FIM, EDS AN ARID eR EPA; 第 二 BRIG Be 95 EG = de] 5 — ESM 37 FA Ns Hf & AE RA EIR. \| COOH | 人 OH PC H O | Pr C < + HC—NH2— | mn Cc 4 +NH3+C002+07 —C OH | 同和 Na eke R | R : i 7 . o—N=c < (ssn O ; I O QO 注意 亚 确 基 铁 氰 化 钠 有 毒 。 42 第 三 章 “蛋白质 的 化 学 且 氨 酸 与 击 三 酮 反应 产生 不 很 强 的 黄色 @。8- ARR, AA 许多 一 级 胺 都 呈正 反应 。 尿 素 . 马 尿酸 、 二 酮 吡 哎 和 肽 键 上 的 亚 氨 基 不 呈现 此 反应 。 此 反应 已 发 展 成 氨基 酸 定量 测定 法 。 我 们 可 以 用 比 色 法 测定 反应 生成 的 颜色 的 深浅 ”, 或 者 用 气量 法 ”测定 生成 的 三 氧化 碳 的 多 少 。 (1) 取 2 支 试管 , 分别 加 入 4 毫升 2 多 栈 蛋 白 溶液 和 开 /110 甘 AMMA, 再 各 加 1 毫升 01 多 苘 三 酮 溶液 ， 混 与 。 至 沸水 浴 中 加 热 3 一 5 分 钟 , Kia HN, HSL AL, ALE | (2) 在 一 块 滤 和 级 片上 滴 加 2 滴 M/10 HAR, FE 60°C HE fi PET. JA 0.1 多 苘 三 酮 酒精 溶液 喷 湿 , FRE, SH BL 红色 斑点 。 实验 十 二 ”蛋白质 的 可 逆 沉 演 与 其 他 胶体 溶液 相似 ， 蛋 白质 溶液 不 稳定 。 在 多 种 物理 的 和 化 学 的 因素 影响 下 , 蛋白 质 颗 粒 失 去 电荷 或 肌 水 , 沉淀 析 出 。 此 时 蛋 和 白质 分 子 着 未 发 生 显著 的 化 学 变化 , 将 致使 沉淀 的 因素 除去 时 ， 蛋白 质 沉淀 能 再 溶解 于 原来 的 溶剂 中 。 这 种 沉淀 反应 ， 称 为 可 逆 沉淀 反应 或 不 变性 沉淀 反应 。 CD 且 氨 酸 和 状 且 氨 酸 的 黄色 反应 产物 可 能 是 下 列 物质 (25)。 O OH | | | c=¢ HC—C | egy | Lt Ge \| H,C——-CH \| O O R hii @ ie, R=H FE i R&R, R 一 OH SoHo Raw ， 43 用 中 性 盐 盐 析 蛋 白质 和 低温 下 用 乙醇 或 丙酮 短 时 间 处 理 蛋白 质 而 使 其 沉淀 的 反应 , 均 为 可 逆 沉 淀 反应 。 器 材 〈1) 武 管 及 试管 架 ; (2) 小 漏斗。 试剂 〈1) 蛋 白质 气 化 钠 溶 液 25; (2) BARA: (3) 硫 酸 Be MIAIVA WE; (4) ERR BEE AB; (5) 气 化 钠 烙 唱 粉 末 ; (6) 1% BE 酸 ; (7)95% 乙醇 。 (1) 蛋 白质 的 盐 析 作用 :于 蛋白 质 溶液 中 ， 加 中 性 盐 至 一 定 省 度 ， 蛋 自 质 即 被 沉淀 析出 。 这 种 作用 叫做 盐 析 。 盐 析 的 机 制 不 其 明了, 可 能 因为 : (1) 蛋 白质 分 子 所 带 之 电荷 被 中 和 ; (2) 蛋 白质 分 子 被 盐 觅 去 水 化 层 。 沉 出 的 蛋白 质 化 学 性 质 未 变 ， 减 低 盐 的 省 度 时 , 仍 能 溶解 。 用 一 种 盐 来 进行 盐 析 时 , 不 同 蛋白 质 需要 的 省 度 不 同 , 这 样 可 以 进行 蛋 自 质 分 级 盐 析 , 例 如 , 向 含有 清 蛋白 和 球 蛋白 的 鸡蛋 白 溶 液 中 加 硫酸 镁 或 气 化 销 至 他 和 , Be RSE AE HAN, HIER 沉淀 析出 。 在 等 电 点 时 ， 清 蛋白 可 被 饱和 硫酸 镁 或 毛 化 钠 或 中 能 Fl ike OR BE VA ee TTL TE HT HH FREA, MEARALAB © Fn HH An GE ME KAI 5 2H, HERAZ. PERTH, MATHMRERE. BRE 内 容 物 过 滤 ， 向 滤液 中 添加 硫酸 忽 粉 末 至 全 和 ， 清 蛋白 沉淀 析 出 @。 另 取 试 管 1 支 ， 加 蛋白 质 毛 化 钠 溶 液 狗 3 SH. AREA MAAS MA, 数 分 钟 后 , MAREE. BRE 内 容 物 过 滤 。 向 滤液 内 添加 稀 醋 酸 中 滴 至 一 滴 , 使 滤液 呈 弱 酸性 ， @ 包括 各 种 wx、B 和 ?Y 球 蛋白 。 四 ”未 实 允 有 的 用 蛋白 质 氟 化 负 溶液 ， 有 的 用 蛋白 质 溶 液 , BARRA 含有 球 蛋 白 和 清 蛋 自 , 在 蛋白 质 溶液 中 球 蛋 白 已 沉淀 除去 。 @ KRR- EMME, 否则 , MRA. 44 第 三 章 蛋白质 的 化 学 有 清 蛋 白 沉淀 析出 @。 (2) 用 乙醇 沉淀 蛋白 质 :蛋白质 不 溶 于 中 性 有 机 溶剂 (甲醇 、 乙醇 ,丙酮 等 )。 因 此 , 如 果 向 蛋白 质 水 溶液 中 添加 乙醇 , 至 二 定 尖 度 时 , 则 产生 和 蛋白质 沉淀 .此 时 溶液 应 为 中 性 或 弱酸 性 。 沉 淀 不 同 蛋白 质 所 需要 的 乙醇 的 省 度 不 同 , 乙醇 能 使 蛋 自 质 胶体 颗粒 脱水 ， 因而 降低 其 在 溶液 中 的 稳定 性 。 溶 液 中 如 有 少量 申 性 盐 ( 例 如 所 化 锁 ) 沉 淀 的 形成 更 加 迅速 而 完全 。 如 将 所 得 蛋白 质 沉 省 和 乙醇 迅速 分 离 , 则 仍 能 在 水 中 溶解 .这 就 明 沉 演出 来 的 蛋白 质 性 质 未 变 ， 这 种 沉淀 是 可 敌 的 。 但 若 在 己 醇 中 放置 时 间 较 长 , 则 蛋白 质变 性 而 不 再 溶 于 水 。 在 2 支 试管 中 ， 各 加 和 2 滴 未 稀释 的 鸡蛋 自 和 荆 毫 升水， 有 沉淀 形成 (什么 物质 ?)。 加 一 滴 亿 和 硫酸 钱 ， 溶 液 变 清亮 (为 什 和 色 ?)。 各 加 工 毫 升 渝 酒精, 的 匀 ， 立 刻 在 一 管 中 加 大 10 BETTE AR HS. “BAG, 向 另 一 管 中 加 大 10 毫升 蒸馏 水 , HS. Hei 两 管 的 混浊 度 , 并 解释 之 @。 实验 十 三 ”蛋白 质 的 不 可 逆 沉 演 许多 物理 和 化 学 因素 可 使 重 白质 发 生 不 可 逆 沉 演 。 在 不 可 逆 沉淀 反应 中 , 蛋白 质 已 变性 , 不 能 再 溶解 于 原来 的 溶剂 中 。 变 性 和 蛋 白质 分 子 的 内 部 构造 发 生 改变 , 骑 露出 大 量 惜 水 基 团 , 蛋白 质变 为 恰 水 胶体 。 重 金属 盐 、 植物 碱 试 剂 , 无 机 酸 、 光 、 热 、 晨 萝 和 超声 波 均 能 使 蛋白 质 发 生 不 可 逆 沉 演 而 析出 。 器 材 (1) AR AER (2), 试剂 CAR; (20.5% 醋酸 从 溶液 ;3) 凶 和 和 D 加 醋酸 机 适量 , 否则 得 不 到 沉 演 。 另 外 加 的 氮 化 钠 量 一 定 要 达到 他 和 。 QD 卵 清 蛋 白 极 易 被 酒精 变性 。 因 此 在 本 实 又 中 即使 是 立刻 稀释 , 也 可 能 有 部 分 浅 蛋 白 变 性 而 使 溶液 混浊 。 LRt= ZAMORA Myre 45 012% 硫 酸 铀 溶液 ; (4)3 多 硝酸 银 深 液 ; (5) 0.5 % Ft RAR; 06) 知味 PRR AI; (7) 变 酸 包 和 溶液 ; (8)1% RRR; (9) WER a LR am; (10)10% 盐 酸 ; (11)5% 亚 铁 氰 化 钾 洲 液 ; (12) 省 盐酸 ; (13) 省 硝酸 ; (14) 省 硫酸 (15)152 三 毛 酷 酸 ; (16)20 色 磺 基 水 PIRI. | (1) 重 金属 盐 沉 演 蛋 白质 :蛋白 质 在 水 溶液 中 是 酸 碱 两 性 物 质 , 可 用 下 列 方 程式 表示 /H BAR H+ BA O NE At OX —=E A tt +OH- FE DPE Ye We PE A UR Oe AA. AAI A HE 55 fe TE HS fay BY) JS a A ER AMR CY Eh EVA Fk, 则 蛋白 质 沉 淀 析 出 。 在 有 机 体内 ， 和 蛋白 质 常 以 其 可 溶性 的 钠 盐 或 钾 盐 的 形式 存在 。 当 加 入 汞 、 狠 、 钢 、 馈 、 钙 等 重金 属 盐 时 ， 则 和 蛋白 质 形成 不 溶性 的 汞 、 镍 、 镍 、 铜 、 僻 等 蛋白 质 盐 。 重 金属 盐 沉 演 蛋 白 质 往 往 引 起 蛋白 质变 性 。 重金 属 盐 类 沉 证 蛋白 质 的 反应 通常 很 元 全 (特别 是 有 碱 金属 盐 类 存在 时 )。 因 此 ,在 生化 分 析 上 ， 常 用 重金 属 盐 除 去 液体 中 的 蛋白 质 ( 同 理 , 可 用 蛋白 质 解 除 重金 属 盐 食物 性 中 毒 )。 但 应 注意 ， 使 用 某 些 重金 属 盐 沉 演 蛋 白质 时 , 例如 用 酮 酸 儿 或 硫酸 铜 时 , 不 可 过 量 , 否则 引起 沉 深 的 再 溶解 C。 取 4 支 试管 , 各 加 蛋白 质 溶液 2 BIT, 然后 小 心地 分 别 滴 加 以 下 4 种 试剂 各 数 滴 。 出 第 工 试管 泣 加 -0.5 罗 醋 酸 人 铬 溶液 , 第 2 试管 滴 加 0.1 罗 硫酸 铜 浴 液 , 第 3 试管 滴 加 3 多 硝酸 银 深 液 , 第 4 试管 滴 加 0.5 罗 升 汞 溶液 (毒物 ! )。 观 罕 沉 演 的 生成 。 © 有 人 认为 ， 这 种 再 溶解 现象 是 由 于 过 量 的 金属 离子 被 蛋白 质 选 择 吸附 ， 从 而 使 蛋白 质 带 上 同 种 电荷 ， 相 互 排斥 而 溶解 。 加 大 过 量 的 NaCl 可 以 使 蛋白 质 汞 盐 沉 演 溶解 的 道理 ,同上 。 45 A Jig + He ee me ee a ee re rae — 46 第 三 章 “” 蛋 白质 的 化 学 在 第 1 和 第 2 两 个 试管 中 ， 分 别 泣 加 过 量 酯 酸 千 和 他 和 硫酸 网 溶液 , 观察 沉淀 的 溶解 。 (2) 植 物 碱 试 剂 沉淀 蛋白 质 : RR, ORM, KI-HgI、 HiFe(CN)e.KI-Bils 等 植物 碱 试剂 能 和 蛋白 质 糙 合生 成 沉淀 。 和 蛋 白质 和 植物 碱 舍 有 相似 的 含 氨基 团 ， 这 可 能 是 植物 碱 试剂 也 能 沉 淀 蛋白 质 的 原因 。 在 制 革 工 业 中 , REM, 在 医药 中 , 用 昔 味 酸 药膏 来 沉淀 伤口 外 渗 的 血浆 蛋白 。 植物 碱 试剂 沉淀 蛋白 质 作用 需 在 酸性 环境 下 进行 。 碱 性 环境 能 洲 解 沉淀 。 因 为 在 此 反应 中 ， 和 蛋白 质 以 正 离子 形式 与 就 剂 的 负 离子 发 生 反应 , 形成 不 溶性 复合 物 。 取 2 ME, A 2 毫升 蛋白 质 溶液 。 滴 加 少量 1 HE 液 使 成 酸性 。 向 一 试管 添加 包 和 又 酸 溶液 数 滴 ， 另 一 试管 添加 苦 味 酸 全 和 溶液 数 滴 。 观 察 蛋 白质 沉淀 。 另 取 工 支 试管 , HEAR 2 毫升 蛋白 质 溶液 ， 用 工 % 醋 酸 洲 液 使 成 酸性 。 滴 加 5 多 亚 铁 氰 化 钾 溶 液 。 在 每 加 一 滴 之 后 , He, 观察 蛋白 质 的 沉淀 。 再 取 一 支 试管 加 蛋白 质 洲 液 网 2 毫升 。 加 10% 盐 酸 使 呈 微 酸性 , 而 后 添加 数 滴 碘 化 钾 - 碘 化 示 溶液 。 观 察 蛋 白质 沉淀 。 (3) 用 矿 酸 沉淀 蛋白 质 :省 矿 酸 类 (HsPO; PROF) Ae OE 发 生 不 可 和 北 的 沉淀 反应 。 这 种 沉淀 作用 可 能 是 蛋白 质 颗 粒 胶水 的 千 果 。 除 硝酸 外 , 过 量 的 矿 酸 能 溶解 沉 出 的 蛋白 质 。 用 硝酸 沉淀 蛋白 质 的 反应 特别 重要 。 在 临床 珍 断 上 常用 以 检 查 尿 中 蛋白 质 。 取 3 支 试管 ， 分别 加 入 省 盐酸 、 湾 硫酸 和 省 硝酸 各 金工 毫升 。 小 心地 向 3 SCRE HHA TE AE a WAS) 工 毫升 。 观 察 两 种 液体 界面 处 有 和 白色 环 状 蛋白 质 沉 演出 现 。 小 心 振 蓝 每 个 试管 。 蛋 白质 沉淀 应 在 过 剩 的 盐酸 及 破 酸 中 深 += RAMA Mie 47 解 (有 时 盐酸 不 足 , 再 多 加 些 )。 在 含 硝酸 的 试管 中 , BRE, E 白质 沉淀 亦 不 溶解 。 ( 鸡 用 有 机 酸 沉淀 蛋白 质 : “有 机 酸 能 使 蛋白 质 沉淀 。 不 同 的 有 机 酸 对 蛋白 质 的 沉淀 效应 不 同 , 三 所 乙酸 和 磺 基 水 杨 酸 最 有 效 ， 能 将 生物 体液 中 的 蛋白 质 (例如 血清 中 的 蛋白 质 ) 完 全 除去 ， 因 而 广泛 地 被 使 用 。 如 拟 除 掉 滤 液 中 的 三 氯 醋酸， 可 将 滤液 老 沸 。 三 。 气 醋酸 分 解 成 气 仿 和 二 氧化 碳 而 挥发 。 MAE 2X, MARA RAH 2 毫升 。 分 别 滴 加 15%= 氛 醋 酸 溶液 和 20 驳 磺 基 水 杨 酸 溶液 各 数 滴 。 观 察 蛋白 质 的 沉淀 。 (5) 加 热 沉淀 蛋白 质 : ”几乎 一 切 蛋 白质 都 加 热 而 凝固 。 不 同 蛋白 质 的 凝固 温度 不 同 , 有 一 些 蛋白 质 在 50 一 55?0 AE 另 一 些 蛋 自 质 却 能 经 受 短 芹 的 孝 沸 而 不 凝固 。 ” 在 凝固 时 , 蛋 自 质变 性 , 变 成 不 可 逆 的 不 溶 状态 。 加 热 变性 蛋 白质 的 分 子 构造 发 生 改变 ， 失 去 天 然 蛋白 质 的 一 些 性 质 。 变 性 反 应 与 加 热 时 间 并 进 ， 但 随 温度 升 高 而 急剧 地 加 速 。 极 短 时 间 的 加 热 可 能 不 引起 蛋白 质 凝 固 。 。， 盐 类 的 多 少 及 氧 离 子 省 度 对 蛋白 质 加 热 凝 固有 重要 影响 。 当 蛋 和 白质 处 于 等 电 点 时 ， 加 热 凝 固 最 完全 和 最 迅速 。 少 量 盐 类 有 助 于 蛋白 质 的 加 热 凝 固 。 在 酸性 溶液 内 , BARBRA, RA, 蛋白 质 胶 粒 带 负 电荷 。 在 这 两 种 情形 下 ， 蛋 白质 溶液 加 热 不 凝固 。 蔡 同时 溶液 中 有 足 量 的 某 些 中 性 盐 , 也 能 凝固 。 取 与 支 试管 ,各 加 蛋白 质 溶液 钓 2 毫升 。 将 第 工 支 试 管 加 热 。 观察 蛋白 质 凝 固 沉淀 。 在 第 2 支 试 管内 加 入 1% 醋 酸 TIA, 蛋白 质 凝 固 沉淀 较 迅 速 和 较 完 全 。 在 第 3 支 试 管 中 加 狗 0.5 毫升 © 注意 不 要 多 加 醋酸 , 有 时 只 要 牛 滴 即 可 , 过 多 会 得 到 相反 精 果 。 = 一 CT | oe ae. i. a. & ws re > 一 一 一 ae ee 48 第 三 章 “和 蛋白 质 的 化 学 | 10 驳 醋酸 并 加 热 。 观 察 有 无 沉淀。 4 REP MAV OS 升 10 多 醋酸 和 几 滴 全 和 所 化 钠 溶 液 。 加 热 , 观察 蛋 自 质 沉淀 , HRS 第 3 RU, TE RPS, AH 0.5 BISA He 并 加 热 。 观 察 并 解释 车 果 。 分 别 用 碱 和 酸 中 和 第 友和 第 所 支 试管 的 溶液 , 精 果 沉淀 析出 , 为什么? 实验 十 四 蛋白质 等 电 点 的 测定 蛋白 质 分 子 为 两 性 电解 质 , 含有 自由 氨基 , 羧基 和 酚 基 ,=-SH 基 、 肛 基 、 咪 唑 基 等 酸 碱 基 团 。 在 酸性 溶液 中 蛋 自 质变 成 阳离子 ， 在 碱 性 溶液 中 , 游离 成 阴离子 : R—CH—COO- R—CH—COOH | +H*— | NH;* NH;* .及 一 CH 一 COO- R—CH—COO- | | +OH-—> | 十 了 oO NH? NHe (EE BST ENS, A FOE SS 等 , 成 为 中 性 颗粒 , 所 带 正 负电 荷 数目 相等 ; 在 电场 肉 , BABES 向 阴极 移动 , 也 不 向 阳极 移动 。 这 时 的 pH 值 ， 称 为 蛋白质 的 等 电 点 。 蛋 白质 等 电 点 多 接近 于 pH 7.0。 略 仿 酸 性 的 等 电 点 也 很 多 , 如 白明 胶 的 等 电 点 为 pHE47。 也 有 偏 碱 性 的 ， 妇 精 蛋白 等 电 点 为 pH 10.5 一 12.0。 在 等 电 点 时 , 蛋白 质 溶解 度 最 小 , 容易 沉淀 。 et 〈1) 武 管 及 试管 架 ; (2) 微 量 刻 度 吸 量 管 ; (3)10 毫升 刻 度 吸 量 管 。 | | 试剂 (1) OLN 酯 酸 钠 深 液 ; (2) 0.1 醋酸 ; (3) LN 醋酸; 、 (4)1 匈 白明 胶 溶 液 ; (5)95 匈 乙醇 ; (6) 酷 蛋白 - 栈 酸 销 洲 液 。 (1) 白 明胶 等 电 点 的 测定 D: ”白明 胶 易 洲 于 水 。 同 其 他 PH 比 D 在 本 实验 和 下 一 个 实验 中 , 量 取 各 种 溶液 必须 准确 。 7 ee wih<"tne «tall Sa SRT 和 蛋白质 等 电 点 的 测定 49 "Be, 在 等 电 点 时 , 适量 的 酒精 能 将 自明 胶 沉淀 析出 。 操作 WG KARAS, 按 下 表 添 加 试剂 。 试 in 剂 2 0. 1N 醋酸 钢 浴 液 ( 毫 升 ) | 2.0 2.0 0. LN eRe 0.25 0.50 INR Ne sf 76 $8 7K 3.75 3.5 1Z AWA ee RK 2.0 2.0 pH | | Ker Ss 号 码 4 5 6 2.0 2.0 2.0 2.0 4.0 —- 一 一 0.80 4.7 4.4 4.1 振 莲 混 久 各 试管 内 容 物 。 向 第 4 号 试管 内 ， 用 吸 量 管 慢 慢 滴 加 乙醇 ,直至 出 现 轻微 混浊 为 止 。 随 加 随 的 , 不 可 多 加 。 KG 8S 升 。 按 照 第 4 号 试管 的 乙醇 用 量 ， 向 其 余 5 个 试管 准确 地 添加 同 量 乙 醇 。10 分 钟 和 30 分 钟 后 ， 观 察 比较 各 管 的 混浊 度 ,， AER, - 用 一 、 士 .十 \ 十 十 十 十 十 等 符号 来 表示 各 管 的 混 浊 度 。 指 出 白明 胶 的 等 电 点 。 QMEASHE RMN: 酷 蛋 白 在 等 电 点 时 的 溶解 度 很 低 。 和 牛乳 变 酸 后 产生 的 沉淀 即 为 酪 蛋白 在 等 电 点 沉淀 析出 的 现象 。 VE WO 支 试管 并 标号 , KERR MAH, 4 D 6 7 8 9 KCI) | 3.88 7.75 8.75 8.5 an 试 剂 1 2 3 0.0LN HER ee | 1095» A O.1N 酷 酸 ab. ox. 095-0 1.0N Rem pga Samat 5 8 1 ae MA 1 Tt Rae ARR Ye eK, tie JT Be Rt 10 分 钟 之 后 各 管 的 混浊 度 ， \ t g a <= 2G 本 | m bo te is dt J. HEM IER 工作 表 。 Hiv. try, 75 ——— . ee ee ee ee a Sie o._Le 4 eee ae 50 第 三 章 RAMs 十 十 \ 十 十 十 等 符号 来 表示 各 管 的 混浊 度 。 指 出 栈 蛋 自 的 等 电 点 。 实验 十 五 ”Sorensen 氏 甲 醛 滴定 法 蛋白 质 和 氨基 酸 的 一 NHs- YY) pK 值 常 在 9.0 以 上 ， 不 能 用 一 般 酸 碱 指示 剂 ( 包 括 酚 栈 ) 作 滴定 测量 @。 但 可 用 Sorensen 氏 的 甲 醛 滴定 法 测量 “"。 用 甲醛 处 理 氨 基 酸 , 甲醛 与 氨基 车 合 ， | + R—C—NHi —R—C—NH, 十 Ht COO- COO- | 十 HCHO H H | +HCHO | R—C—NHCH,OH— R— C —N(CH,OH),.® : . COO- COO- N-#8 FF St SE N- 二 状 甲 基 氨 基本 结果 使 滴定 曲线 回 酸 性 方向 移动 。 移 动 的 多 少 决定 于 溶液 中 的 甲 醛 省 度 @。 当 滴定 终点 移 至 p 也 9 左右 时 , 即 可 用 酚 栈 作 指 示 剂 , 用 碱 来 滴定 一 NHs 上 的 互 。 如 和 蛋 昌 质 或 氨基 酸 分 子 中 的 一 NHsa- 基数 目 与 COO” 基 相等 , 甲醛 滴定 所 滴定 的 虽然 是 氨基 , 也 可 以 该 是 羧基 。 如 果 一 NHs+ JEM OOO- 基 的 数目 不 相等 , 甲醛 滴定 的 车 果 不 能 代表 羧基 。 @ 为 了 复习 酸 碱 滴定 原理 和 选择 指示 剂 原理 , 建 矿 先 作 后 边 的 甲醛 滴定 补充 实 Bio 四 BKVUAC KAP EAL, CH;—CH—COOH + H—CO=0—~CH;—-CH—COOH + H,0 / NH. H N=CH, Ba FE 4 sit HE FG aN FR SE IER, 并 没有 水 释放 出 来 。 图 “甲醛 的 省 度 很 重要 , REKLAMA, Ae ARARA PHILA, 最 好 使 甲醛 的 省 度 在 滴定 完成 时 达 6 一 9 多。 实验 十 五 Sorensen 氏 甲 醛 滴定 法 51 甲醛 滴定 法 简单 易 行 ， 但 不 能 准确 地 测定 蛋白 质 水 解 液 中 的 REE. WERERERM, RREWA1CEA. MARS 甲醛 作用 时 , 产生 不 安定 的 化 合 物 , 测定 的 精 果 略 低 。 酷 氨 酸 由 于 含有 酚 基 , 可 能 使 精 果 过 高 。 有 关 甲 醛 滴定 的 理 葵 叙述 , 见 参考 书 目 s729。 方 法 方面 一 些 问题 , 见 参考 书目 29。 器 材 (1)100 毫升 雏形 瓶 ; (2) 吸 量 管 ; (3) 滴 定 管 。 试剂 〈1) 狗 OLN 的 甘氨酸 溶液 ; (2)0.1X 氨 氧 化 钠 标准 溶 液 ; (3)0.5 多 酚 酝 酒 精 溶 液 ; (4) 中 性 甲醛 溶液 29。 YE TLS 个 标 有 号 码 的 100 毫升 锥 形 产 。 于 第 荆 、2 号 两 小 内 各 加 甘氨酸 溶液 2 毫升 ， 水 5 毫升 及 酚 酌 指示 剂 5 滴 。 于 第 3 SAMA 7 毫升 蒸馏 水 及 指示 剂 5 EMR. HS, thie 定 管 中 滴 加 OLN 氧 氧 化 钠 溶液 至 桃红 色 @O。 保 留 第 1 SORT 作 比 色 标 准 , 于 第 2、3 号 中 各 加 中 性 甲醛 洲 液 2 毫升 ,再 用 ON 氨 氧 化 钠 溶 液 滴定 至 与 标准 液 颜 色相 同 为 止 。 向 第 工 号 瓶 内 加 中 性 甲醛 ES, LOIN 氢 氧 化 钠 滴定 至 红色 ,颜色 深度 与 第 2 号 叛 相同 为 止 g。 计 算 溶 液 中 的 氨基 氨 的 毫克 数 。 PER eR KE 为 了 复习 酸 碱 滴 定 知 识 和 更 好 的 体会 甲醛 滴定 的 意义 ， 进 行 DT hers, CHK, SACRA SRE A Soap Hil ae = RPA ORE TE Ke Mt 5USHHVARARS, ADBSHMEEEM @ WEKAMGMAEREE, WRETA. ERM, MEERA 最 适宜 。 @ ” 当 溶 液 中 含有 大 量 的 铁 盐 时 , HERR. BARS PRE AL RO-XF SE AR, BUNCH SEER AYR, 其 反应 如 下 : AN H4Cl + 6CH,O=N4(CH2)6+6H20 +4HC1 ~~ een» eee a eee ae eee 5 AL ee oe Ps SC Sel Se a 52 Ho “和 蛋白质 的 化 学 地 量 大 5 毫升 01N HCL $4 Im 5 ETh A, FBIM A 2—8 Hl 0.1 % UME (BCG), MAL (PR) ARAM (PP) 的 酒精 溶液 。 用 OIN NaOH iis BKK, HIRE. 从 另 一 25 毫升 滴定 管 量 取 Sec O.1N 醋酸 3. ESET LB #250, HALE. ; 参考 酸 碱 滴定 曲线 图 , PB BER, 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 图 4， 酸 碱 滴定 曲线 。 实验 十 六 ”总 氮 量 的 测定 微量 凯 氏 (micro-Kjeldahl) 定 氮 法 天 然 有 机 物 ( 如 蛋白质 和 氨基 酸 等 化 合 物 ) 的 含 氮 总 量 通常 用 微量 凯 氏 定 氨 法 来 测定 。 方 法 的 原理 简 述 如 下 。 FHA tse Wit PR VATA IY, 天 然 的 含 所 有 机 化 合 物 分解 成 氨 , 氨 与 硫酸 Pee ee oe ma ase etsy aaa -< 到 实 中 十 大 ”总 氨 量 的 测定 53 HE Pe HE BER ER, FY EIS OL HEAT ARR AER, 可 借 硫 酸 铜 和 硫酸 钾 ( 或 硫 PRG) AMES, lc Sd a HE A Fh, 硫酸 钾 或 硫酸 钠 可 提高 消化 液 的 沸点 @。 消 化 完了 后 ， 用 强 碱 碱 化 消化 液 使 硫酸 钱 分 解 ， 放 出 氨 。 借 蒸 汽 燕 馏 法 , 将 氨 燕 入 过量 标准 无 机 酸 溶液 中 , 然后 用 标准 碱 深 液 进 行 滴定 。 以 甘氨酸 为 例 , 经 过 的 化 学 反应 如 下 。 CH.—COOH ae +3H,SO,——>2CO,+ 880,+4H.O+ NHs 2NH3-+ H.SO,-—> (NH) SO, (NH,).80,-+ 2NaOH—>?2H.0-+ Na,SO,+ 2NH3T We Se SR OR EPA Hk th A FPA, RAE BREA Ae ST, 使 溶液 中 气 离 子 省 度 减 低 。 然 后 再 用 标准 无 机 酸 滴定 , 直 奉 恢复 溶液 中 原来 馅 离子 淡 度 为 止 。 所 用 无 机 酸 的 当量 数量 即 相 当 于 未 知 物 中 毛 的 当量 数量 。 本 法 适用 范围 狗 为 0.2 一 .0 SHR, ALIKE RM HAR, RES BAC, 器 材 (1)50 EFT BL ECE 4 4h; (2)50 毫升 锥 形 瓶 5 个 ; (3) 5 毫升 微量 滴定 管 ; (4)5 毫升 吸 量 管 ; (5) 1 毫升 和 2 毫升 奥 氏 吸 量 管 ; (6)50 毫升 量 瓶 ; (7)10 毫升 量 简 ; (8) RM; (9) PLEA 架 ; (10) SLE. 试剂 〈1) 猪 血清 5; (2) RH: (3) 粉 未 硫酸 钾 - 硫 酸 Si, Ay (KoSO,:CuSO,+5H,0=5:1); (4)30% BAILS (5)2% 硼酸 ; (6) 混 合 指示 剂 26; (7)0.01N REEL: (8) 标准 硫 酸化 溶液 (0.3 毫克 所 /毫升 )。 操作 〈1) 样 品 制 备 : 取 50 毫升 量 瓶 , 用 奥 氏 吸 量 管 量 加 血清 四 “促进 剂 的 种 类 很 多 ) WA 3: 1,6: 1 we 10: 1 Wy K.SO.-CuS0,-5H,0 混 合 物 。 还 有 人 使 用 由 80 份 人 23O4，20 4 CuSO, . 5H20 与 0.3 份 SeOz( 或 0.34 份 Na2SeOs) AO MIRA MIRA, be HeClo( #9 0.032 克 / 克 促进 剂 ) 可 以 加 速 燥 氨 酸 和 粗毛 酸 的 消化 分 解 。 54 第 三 章 RAMMCS 1 毫升 。 用 蒸馏 水 稀释 到 刻度 , Se, PWR, 加 少量 氧化 钠 , URS (2) 消 化 : He Ae 4 个 50 AMLIB, 并 标号 。 向 第 2 BEBE PS, 用 奥 氏 吸 量 管 , 仔 儿 地 , 各 加 入 2 毫升 稀释 血清 溶液 。 注意 ， 将 溶液 加 到 烧瓶 底部 , 勿 使 溶液 粘 烧瓶 口 及 瓶 标 。 于 3.4 SH 中 各 加 入 2 EFT AEB A, 作为 空白 对 照 ( 用 以 测定 就 剂 中 可 能 含有 的 微量 含 氨 物 质 )。 CE AEA DLC BEI Hh Se Im Wis HE 钾 - 硫 酸 铀 混合物 狗 100 毫克 ， 再 用 量 简 加 省 硫酸 1.5 毫升 ，( 不 能 用 吸 量 管 ! )。 将 以 上 4 个 凯 FC ME BUHL TE DL ERT (LE (图 5) 上 (如 无 消化 架 在 通风 厨 内 消化 )。 用 小 火焰 加 热 老 沸 。 待 叛 内 水 汽 蒸 完 ， 硫 酸 开始 分 解放 出 SOs 白 烟 后 , 调节 火焰 保持 瓶 内 液体 轻微 沸 腹 ， 继 续 洽 化 , 直至 消化 液 几 无 颜色 为 止 (黄色 表示 消化 告 未 完全 )。 圣 部 消化 过 程 狗 需 1 一 2 DSO, HSE TR, PLA. IRF SCTE ee AE 室温 。 (3) FER: 取 50 毫升 锥 形 瓶 5 个 , 用 蒸汽 洗 潍 ( 图 .5)2 一 3 分钟 (图 6)。 痊 后 , 用 吸 量 管 各 加 入 2% MAH 5 毫升 及 混合 指示 剂 4 滴 GH) 0.05 毫升 )。 溶 液 应 呈 棕 紫色。 用 表面 由 复 盖 备 用 。 FEA MAURER (图 7)。 器 中 盛 有 用 几 滴 硫酸 酸化 过 的 菩 rk, 关闭 夹子 , 使 蒸汽 通过 反应 室 , 由 闪 凝 器 下 端 逸 去 。 在 痊 凝 器 下 端 放 一 空 烧杯 以 承接 凝聚 的 水 滴 。 这 样 用 蒸汽 洗 潍 蒸 馏 器 多 10 分 钟 后 ， 在 瀹 凝 器 下 端 放 一 司 有 硼酸 溶液 的 锥 形 产 ， 位 置 借 儿 如 图 。 痊 凝 器 顶端 应 完全 浸没 在 液体 内 。 继 续 燕 汽 洗 海 1 一 2 分 钟 。 观察 锥 形 瓶 内 溶液 是 否 变色 。 如 不 变色 , 则 证 明 燕 馏 器 内 部 干净。 向 下 移动 雏形 瓶 使 硼酸 液 面 离开 痊 凝 管 口 狗 'I 厘米 ， 继 炉 通 蒸汽 OD SARAZHABRAARHH A, 需要 消化 时 间 较 长 。 应 藤 注 意 ， 洽 化 液 变 清亮 并 不 一 定 说 明 消化 完全 。 实验 十 大 总 氮 量 的 测定 55 工分 钟 。 最 后 , FARE TRE aE OE, Reb) KI. TIFF, 准 备 下 一 步 把 消化 液 移 入 蒸 馆 锋 内 旦 。 AT ESL RAHA A Ae SIE AERA, AES WOR ETA (IA 0b, By Fe 7e a“ PF OS” ee TK BLAH, 再 PEA ZI PP OS” AD He ab SRA TE ASE FAR A ASL RIVE 3 K4EKA 25+), FEVER ARMS, # 紧 棒 状 玻 赛 。 取 另 一 含有 硼酸 溶液 -的 锥 形 瓶 , 放 在 洽 凝 器 下 , OE TE aE 顶端 完全 诅 没 在 液体 内 。 位 置 倾 科 如 图 。 ALS. SRILA. 7h Be AK BE V6. HARPER PC VEW ETE. AL7. SLCAE RE. 使 乙 慢 慢 流 入 反应 室 。 当 未 完全 流入 时 , 将 玻 塞 盖 紧 , 向 玻 杯 中 加 ® 掌握 夹子 和 玻 塞 很 重要 。 若 玻 塞 不 紧 ， 也 不 用 水 封闭 ， 则 有 毛 逸 出 的 危险 。 在 加 样 时 一 定 要 打开 夹子 , 而 且 一 定 要 在 蒸汽 发 生 后 才能 关闭 ， 否 则 就 会 发 生 样品 倒 吸 现 象 。 @ AMAT th FZ Bt Ra, 为 了 练习 蒸馏 和 滴定 操作 ， 可 用 标准 硫酸 敏 溶 MAES 2 一 3 次 。 每 毫升 标准 硫酸 饥 溶 液 含 0. 3 SUA, 每 次 用 2 毫升 试 蒸 。 ee rh. wee = ——~ FF 本 一 一 Am LS ees ee = s ee a eel a 56 第 三 章 “蛋白质 的 化 学 蒸馏水 攀 3 毫升 。 再 轻 提 棒 塞 , 使 一 个 蒸 入 水 流 叉 反应 室 , 一 中 留 在 玻 杯 中 作 水 封 。 用 煤气 灯 加 热 水 蒸 汽 发 生 器 , 沸腾 后 , 夹 紧 夹 子 开始 蒸馏 。 雏 形 瓶 中 确 酸 溶液 由 棕 紫 色 变 成 昔 丢 色 ， 自 变色 起 记 时 , FEAR 3 一 5 Ayah, BE Bh SHE TES I AE ON Pe Hk Ta BS EE HY 1 LOK, FE FAD PE GR DEWAR USEE Db, ARREPE RI — Gh, 挪 开 雏形 KR, ARGS ARTIR, HORI, BEAT, BIRR BF 凯 氏 烧瓶 中 溶液 蒸 饮 完了 后 , 一 同 滴定 。 在 一 个 蒸馏 完毕 后 , TUS, RS, 一手 捏 紧 橡 KE, 一 手轻 提 棒 状 玻 塞 , 使 偷 水 迅速 流 大 反应 室 。 因 反应 室外 壳 内 蒸汽 痊 适 ， 烙 果 反 应 室 中 的 残 液 自 动 吸入 反应 室外 沉 ， 塞 住 玻 HE, 取 燕 饮水 狗 20 毫升 加 入 小 玻 杯 , TERETE, 渝 水 再 次 由 小 玻 杯 流入 反应 室 , 又 自动 吸出 。 如 此 冲洗 3—4 Ke, 把 夹子 打开 , 排除 反 应 室外 壳 中 积 水 。 关 闭 夹 子 , ERA ILA EOD Bl, 继续 下 一 个 蒸 馈 。 (4): Aes, UW O.OLN RESCH Ie 4 fy BEL, AS ON A eH RE HE EEO, HH 血清 的 总 气量 。 实验 十 七 “ 双 智 腺 比 色 法 测定 蛋白 质 DRAKA RE RW ER AR. He RR F, HUBER Pik 5 au He RK A SS ES 液 作 比较 。 标 准 蛋 白质 溶液 可 用 血清 清 蛋白 ， 鸡 子 清 蛋 自 或 酷 蛋 白 等 配制 。 在 这 里 ,我 们 假定 ,未 知 蛋 白质 的 量 相等 时 , WR 应 生成 的 颜色 深浅 度 相 等 。 Set 〈1) 试 管 ; (2) 1 毫升 .5 毫升 吸 量 管 各 1 个 ;3) 光 电 比 D 蒸馏 和 滴定 时 , 空气 中 不 能 有 酸性 或 碱 性 蒸汽 。 SRE RERLORNESOM 57 色 计 。 试剂 (MBEAN; (2) 蛋 白质 溶液 (1 一 10 毫克 蛋白 质 /毫升 ); (3) 标 准 酪 蛋白 溶 液 , 每 毫升 含 酪 蛋白 10 25, VE 1 LO 毫升 含有 1 一 10 毫克 蛋白 质 的 溶液 中 , MA 4.0 Ht MARR. WLS. te 20—25°C F, M30 分 钟 。 在 光电 上 比 色 计 或 分 光 光 度 计 上 540—560 2 eK KR EB KR (或 透 光度 )。 取 1.0 毫升 水 或 合适 的 盐 深 液 作 空 白 试验 。 用 光电 比 色 计 测定 未 知 溶液 消光 系数 时 , 以 它 来 校正 雳 点 。 为 了 答 制 标准 曲线 , 另 取 5 个 试管 并 标号 。 分 别 量 大 0.2、0.4、 0.6, 0.8 #1 1.0 毫升 标准 酷 蛋 和 白 溶液 ， 加 水 稀释 至 工 毫 升 。 按 照 上 TEA 4 SAP RE GS, 测定 消光 系数 。 ARERR SRE AME HR. RoE ihe AY ST EIA BCE RE HE LRA. AARNE Rep REE, HEA Wy RAD, RAC Ae, 离心 后 再 测定 芒 数 。 人 BENS BAe -KESHMARAR. Ce-DEMKEYA AL Mmm. EREK RAW. RSE RAB. KARE ATR ARMA RAP BEE, WAKA fir Es Ale fi JE Si FP) 以 及 进行 旺盛 合成 作用 的 器 官 ( 造 血 秋 官 、 胰 肌 和 其 他 腺 体 组 织 ) 都 合 有 极 丰富 的 核 蛋白 。 一 些 最 简 单 的 生命 形态 如 病毒 , 就 是 核 蛋 白 。 ”，” 核 蛋 白 由 高 分 子 的 核酸 和 简单 蛋白 质 〈 往 往 是 精 蛋 白 和 粗 蛋 白 ) 粗 成 。 按 照 组 成 成 分 的 不 同 , 核酸 可 分 为 脱氧 核糖 核酸 和 核糖 核酸 , 前 者 集中 在 多 胞 棱 中 , 后 者 则 分 布 在 租 胞 质 和 核 仁 中 。 PRA FT te Hats BRL 3 一 5 磷酸 二 酯 键 连接 起 来 的 58 第 三 章 ”和 蛋白质 的 化 学 BAT RBH, FES AP AE Pie LH SE CS ARE), COE 1 WBE AAG BE ) Fe PR LIC, APR HT Oy HH AT HA ea | O HOB 6 eee te tt 0+ b= 9 eee baad HO— > —0—Pe—a O RAT FRRERMA ER 和 核酸 成 分 的 鉴定 pH 和 NaCl 省 度 对 于 核 蛋白 的 溶解 度 有 很 大 影响 。RNA 蛋 白 在 微 酸 或 微 碱 的 0.14M NaCl 溶液 中 的 溶解 度 较 高 , 在 其 等 电 点 (pH4.5) 时 , 其 溶解 度 则 显 落地 降低 。DNA 和 蛋白 在 0.14 M NaCl 的 溶解 度 仅 为 其 水 中 溶解 度 的 19, {AE 1 MNaOl 溶液 中 ,其 溶解 度 可 达 水 中 溶解 度 的 两 舍 。 利 用 RNA 蛋白 和 DNA 蛋 自 的 溶解 度 上 的 差异 ， 我 们 可 以 分 别提 取 这 两 类 核 蛋白 。 为 了 尽量 避免 枝 蛋 白 的 变性 和 降解 ， 应 在 低温 下 BETO TEM. FFF NaCl WMH 加 入 0.011 榨 檬 酸 钠 以 抑制 腕 氧 枝 糖 核酸 酶 的 作用 。 有 关 枝 蛋白 和 核酸 的 分 离 提 取 可 参阅 参考 书目 “”)。 稀 酸 可 以 催化 核 蛋白 水 解 成 核酸 和 蛋白质， 还 可 以 催化 核酸 和 和 蛋白 质 水 解 生成 它们 的 和 组 成 成 分 。 aM (Rb; DAFRAER SKB; (4) SEB 玻璃 手 匀 浆 器 ; (5) 漏 斗 ; (6) BDL; (DBF. 实验 十 七 双 和 缩 脲 比 色 法 测定 蛋白 质 59 ss AF 〈1)014MNNacl 溶液 (含有 0.01 MERRIE SN); (2) 1.0M NaCl wi; (8) 1N 盐酸 ; (4) 0.4%NaOH; (5) WH MRE A”; (6) 10% WERE; (7); (8) OLN 硝酸 银 溶液 ; (9) 10 匈 硝酸 ; (10)3.N SHB (11) Bial 氏 试 剂 9; (12) 二 葵 胺 试剂 28; (13)10% 醋酸; (14) 10% WEIS; (15) 亿 和 亚 硫 酸 氢 销 溶液 。 操作 “ 称 取 动物 (大 鼠 或 家 更 ) MMMM 2 克 , 放大 冰 浴 中 的 小 研 钵 中 研磨 成 浆 。 加 太 3 毫升 冰 痊 的 含有 0.01 MRR Sil) 0.14 M NacloO， 继 午 研 麻 3 一 5 分 钟 @。 将 匀 浆 倾 入 15 ETF Bhd, 并 用 5 毫升 伟 0.01 M 棒 檬 酸 钠 的 0.14 M NaCl 冲洗 怨 钵 。 洗 液 一 并 倒 大 离心 管 中 。 用 玻 棒 绥 慢 提 拌 3 一 5 分 钟 后 , 离心 (2000—3000 转 / 分 ) 5 一 10 分 钟 。 保 留 匀 浆 残 漆 作 DNA 蛋白 提取 实 欢 。 将 上 清 液 倒 大 另 一 离心 管 中 , 滴 加 LER LTE pH al 和 5 放大 冰 浴 中 使 RNA 蛋白 慢 慢 沉 演出 来 。 放 在 冰 水 浴 中 15 一 30 分 钟 后 ; 离心 ;这 去 上 清 液 。 保 留 RNA 蛋白 沉淀 作 水 解 实验 (为 了 fil i, 可 再 一 次 洲 于 0.14 MNaCl, i pH PLE). PELE 15—30 分 钟 MA, 进行 以 下 DNA 蛋白 提取 实验 。 向 保留 的 匀 浆 残 漂 加 2 EF 1 MNaCl, KE SG, BA 小 乳 钵 中 。 用 力 研磨 5 一 10 分 钟 (可 加 些 粗 玻璃 砂 )。 再 加 5 毫升 1 MINacl HERUA DH 85 分 钟 @。 转 人 离心 管 。 混 匀 后 , 离心 (2000—3000 转 / 分 )10 47h, FEA He, 将 上 清 液 亿 大 小 烧杯 中 ， 沿 杯 壁 慢 慢 加 大 -6 倍 体 积 的 冰 水 。 用 组 玻璃 棒 慢 慢 提 拌 溶液 ， 即 AMMAR DNA BAUME. RAMS LIK, ABLE OD 提 了 到 核 蛋 白 用 的 NaCl 溶液 和 冲 稀 用 的 蒸馏 水 都 应 读 是 冰 痊 的 ， 否 则 ， 得 不 Ama + MAKI DNA 蛋白。 @ #A-KABAATHRMBRO RRR MRSA, 不 要 麻 得 过 租 。 第 二 次 研磨 残 涯 是 为 了 分 离 腕 氧 核 糖 核 蛋 白 , LT KER, 因此 须 用 力 仔 粗 研磨。 否则 , 不 能 提出 。 60 第 三 章 ”蛋白质 的 化 学 DNA 蛋白 质 沉淀 @。 使 用 以 上 制 得 的 RNA 蛋白 和 DNA 蛋 自分 别 作 以 下 实 看。 JA 2 Ft 0.4% NaOH 溶液 溶解 RNA BAM, MO5 毫升 作 双 熔 脲 反应 。 向 其 余 15 毫 升 加 大 6 毫升 10%HsSO FLEW 水 浴 中 加 热 水 解 15—30 分 钟 。 过 滤 。 取 滤液 进行 以 下 实 欢 。 取 工 毫升 滤液 , 加 毛 水 使 成 碱 性 反应 。 再 加 入 01NAEgENO: 溶 1ST. KH A, WRAL EMER LA DIT, 碱 基 测 定 亦 可 按 下 法 进行 。 取 滤液 2 毫升 ,用 10% 醋 酸 酸化 游 液 后 疮 沸 莽 过 滤 。 在 滤液 中 加 大 工 毫升 10%CuSor 和 0.5 毫升 MALL IAA ARR, Hm, mAeSEREHE, HARE eA, WRG Ee Ste hie. Bia, 溶液 变 混 ih 另 取 滤液 2 毫升 ， 先 加 入 氨水 使 成 微 碱 性 反应 ， 再 加 大 10% HNO, 使 成 酸性 反应 。 加 大 工 毫升 3Y 钥 酸 钞 溶 液 后 ; 在 沸水 浴 中 Im#%, WEA TC HK E46 SH RITE. 另 取 工 毫升 滤液 2 份 ， 分 别 加 大 等 体积 的 地 衣 酚 试剂 和 三 苯 胺 试剂 。 在 沸水 浴 中 加 热 10 一 15 分 钟 。 比 较 工 解释 颜色 变化 。 向 DNA 蛋白 沉淀 中 加 大 1 毫升 1 NaCl Wik, AHEM. 加 入 工 毫升 二 苯胺 试剂 后 , 在 沸 冰 浴 中 加 热 10 一 45 分钟。 观察 颜 色 变 化 @。 实验 十 九 “ 脾 及 腕 氧 核糖 核 蛋 白 的 提取 和 鉴定 器 材 〈1) 小 乳 钵 ; (2) 玻 璃 粉 ; (3) 离 心机 ; (4B; (5) 10028 D MAR kM BS ee I. 如 猛然 倒 和 ， 会 把 DNA RA BRHEM . MHER DNA A A LL ER ABI, 不 必 离 心 。 @ 因为 DNA 蛋白 较 少 ， 所 以 不 用 作 水 解 。 若 量 较 多 ， 也 可 与 RNA 和 蛋 自 一 样 水 解 。 试验 十 八 肝 肪 枝 蛋 自 的 分 敲 提 到 和 核酸 成 分 的 鉴定 61 FEAR; (6) EAs (7) KISS. «RF (1) % NaCl we; (2)0.4 % NaOH WME; (3) 1% — EME a at HC, 操作 “将 动物 (大 鼠 或 家 更 ) 杀 死 , TEN HH Fake Ha 旺 称 取 和 攀 0.5 克 脾 组 织 , 置 于 用 碎 冰 转 粮 的 小 乳 杀 中。 加 0.5 TERRA BSC, 共同 研磨 。 逐 渐 分 次 加 入 15 毫 升 冰 闪 的 5%NaCl 溶 液 ， 。 随 加 随 磨 。 加 先后 ,继续 研磨 10 一 15 Sh, ARLE, BD 15 分 钟 (4000 转 /分 )。 将 离心 液 价 大 盛 有 80 一 90 毫 升 冰 痊 蒸 馈 水 的 烧杯 内 。 觅 氧 核糖 核 蛋 白 呈 纵 维 状 沉 演 析出。 以 玻璃 棒 提 拌 悬 ENE, (ERR EMRE 上。 以 上 操作 均 在 0*0 左右 进行 。 将 条 HEE Bh HLH, 溶 于 1 一 2 毫升 0.4%NaOH 溶 液 中 。 取 工 训 升 溶液 ， 加 等 体积 二 葵 胺 试剂 , 在 沸水 滩 上 加 热 10 分 钟 。 观 察 出 FAME a, - a a 实验 二 十 ， 酵 母 核 糖 核 蛋白 的 水 解 及 核糖 核酸 成 分 的 鉴定 酵母 租 胞 中 含有 丰富 的 核糖 核 蛋白 。 (A) 用 5% 硫 酸 卷 沸 时 ， 可 部 分 地 水 解 酵母 的 核 蛋白 ， 生 成 磋 酸 ,成 糖 , 碱 基 和 简单 蛋白 质 。 简 单 蛋白 质 也 发 生 部 分 水 解 。 器 材 ，(1)250 毫升 烧 狂 ; (2)40 厘米 长 的 过 流 痊 凝 器 (或 以 长 RME RE); (3) 漏 斗 ; (4) 试 管 及 试管 架 。 试剂 C1) RE ES (2) 5% 硫酸 ; (3) 10% BAIL MRR; 人 4)Benedict FERN; 〈5)1% 硫 酸 铀 溶液 ; (6) 15% Bk; (TYE Bk; (8) SAMBSEVA HE; (9) 10% IMB; (10) 0.1 硝 酸 银 溶液 ; (11) Tollen ERI; (12) HARB; (13)10% = AB. HE IHS RMB ADISST RMA, RMS 硫酸 30 一 40 毫升 。 装 上 过 流 痊 凝 器 , AMAR lb wa, 每 10 毫 AR 一- 一 ~ 中 一 一 Se 人 Bo -名 WH Hk = (P) — Ps) — (Po — Ps) = (Pi =P). BABE LIE A BH 9.5 % , WR MEI BE HED 9.84%, 将 Fi ER ATE LB BE RL 9 FLA Be 10.5 和 10.1， 即 RSE PLT FALE EB By Se, 4 i Br ALAS Wn BT Ha HB siz BES BE AT LAL A Pn i A LILA ARE ICL BE, PGW ICL. ASA BLILA AR 条 件 不 同 。 最 通用 的 测定 磷酸 的 方法 是 各 种 比 色 法 。 磷 酸 和 铺 酸 煞 反 应 生成 楼 钥 酸 。 磷 钥 酸 被 还 原 时 ， 产 生 钥 蓝 。 测 定 钥 蓝 颜色 的 强度 来 计算 磷酸 含量 的 方法 , 为 这 些 方法 的 一 种 。Fiske-Subbarow's7 用 oa-l, 2, 4 氨基 葵 酚 磺 酸 作为 还 原 剂 。 1. FOWL HY Wil ei 无 机 磷 的 测定 , 可 以 直接 在 溶液 内 进行 ,或 者 用 镁 盐 沉淀 出 来 以 后 进行 。 实验 二 十 一 “用 定 磷 法 测定 组 线 中 的 RNA 和 DNA 65 FEN BE RD It CO FEE BUH), 不 易 沉 淀 , LR A BRR CLUES (2) 1 毫升 吸 量 管 2 个 ; (3) 2 ETE 个 ; (4) 5 毫升 吸 量 管 2 个 ; (5) 恒 温水 浴 钢 。 试剂 (1) 5 硫酸 溶液 ; (2) 2.5% SHRI; (3)a-1, 2,4 。 氨基 茶 酚 磺 酸 溶液 0; (4) 标 准 磷酸 盐 (KEHsPO,) 溶液 (每 毫升 含 Be 0.05 毫克 加 入 1 一 2 潢 氯仿 防腐 )。 操作 “ 取 3 支 试管 , 分 别 标号 。 在 第 1 支 试 管内 , 加 入 无 蛋白 滤液 工 毫升 , 第 2 支 武 管内 ， 加 丰 标 准 磷酸 盐 深 液 1 毫升 , 第 3 支 试管 内 ， 加 蒸馏 水 工 毫升 作为 空白 对 照 。 然后 各 加 2.5 毫升 钥 酸 铸 - 硫 酸 混合 液 由 等 体积 2.5 狗 钥 酸 化 溶液 及 5 六 硫酸 配 成 ) 及 1:4 稀 释 的 -1 2, 4 氨基 蔡 酚 磺 酸 溶液 0.5 毫 升 。 用 水 稀释 到 10 毫 Ft. SARC 37°C 恒温 箱 内 保温 10 Fh, VR, 进行 比 色 。 2. Bee oY Wile i | FORA BERR TAC TEE UBL, AT BLE EBL 再 行 测定 。 器 材 〈1) 测 无 机 磷 所 用 之 器 材 ; (2)100 SISA 3 个 ; (3)10% NaOH wk; (4) 80% 3 溶 于 60% ips 精 的 0.5 罗 溶液 。 有 机 磷 的 无 机 化 : 取 工 毫升 无 蛋白 滤液 ， ADIL, IMA 2 毫升 5 Y 硫 酸 后 在 电炉 上 加 热 。 当 所 有 水 分 被 蒸发 后 , EE BS ar Hl, 然后 加 1 一 2 滴 30% 过 氧化 氨 溶 液 。 过 氧化 氨 须 直接 Im ASHER, 不 可 滴 在 烧 狐 的 壁 上 。 重 新 加 热 10 分 钟 。 如 果 溶 液 仍 为 棕色 ， 可 再 加 1 一 2 滴 过 氧化 氨 溶 液 ， 继 续 加 热 。 如 果 加 过 人 氧 化 氨 10 分 钟 后 , 溶液 已 透明 无 色 , IAL EEA. Ae, 加 2 一 3 毫升 水 , FEA 10 分 钟 , 使 焦 磷酸 水 解 。 将 溶液 便 和 大 10 毫升 (或 66 第 三 章 蛋白质 的 化 学 中 毫升 ) 容 量 瓶 内 (或 刻度 评 管 )。 用 蒸馏 水 冲洗 烧瓶 , 并 将 洗 液 一 坤 加 入 量 叛 内 。 混 合 后 , 用 酚 酝 作 指示 剂 加 碱 中 和 ， 最 后 , 加 水 亚 刻度 。 磷 的 比 色 测定 : 取出 1 一 2 毫升 溶液 , 加 2.5 ETT SARE 及 05 毫升 a-1, 2,4 氮 基 莹 酚 克 酸 溶液 。 用 水 稀释 至 10 毫升 。 在 37“0 下 保温 10 分 钟 , 然后 比 色 。 每 欢 都 用 标准 磷 样 唱 作 为 比 色 的 标准 , 工作 空白 对 照 。 参考 书目 (1) Sehiff,H., Ber., 29, 298(1896). (2) Masaji Tomita, H.S., Z. physiol. Chem., 201, 38(1931). (3) Millon, E., Compt. Rend., 28, 40(1849). (4) Arnow, L.E., J. Biol. 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BF, 4a 操作 ” 取 1 一 2 HIE ith, 放 和 人 干燥 洁净 的 试管 中 ， mat #9 ® SbOl;+H,0O—>sb0c! | +2HOl | @ PY SAAR Ae 7 A eB A AS Td KEY, HAL 反应 产物 的 最 天 PMC IE RE 617 毫 微米 , 维生素 Ae 在 693 AE MOK, 而 B- 胡 藏 卜 素 则 在 590 和 1020 毫 徽 米 两 处 有 最 大 吸收 光 攻 。 加 ”可 以 用 卸 化 法 除去 脂肪 类 物质 ， 用 层 析 法 除去 非 权 生 eA. ake A pe 物质 。 _ —&— a a 实验 二 十 四 AK Bi 的 颜色 反应 71 0.5 ZF; ARR 1—2 i, Ha, APRS Ath A 溶液 1 一 2 毫升 , FHS. HEBMREEHWERARULAEG, 最 后 变 为 褐 紫色 的 变化 曙 。 实验 二 十 三 “和 维生素 了 的 茶 胺 试验 HEED GCE) 为 固 醇 类 化 合 物 ， 易 溶 于 脂肪 及 脂肪 溶剂 ,不 溶 于 水 ， 对 热 比 较 稳 定 。 至 今 已 知 维 生 素 D 有 5 种 ， ZEF WU, PREAH, 鱼肝油 中 含量 更 多 。 EES D 与 SbCls 反应 呈现 深 黄 色 se， 并 在 500 MOKA .最 大 吸收 光 贰 。 灵 敏 度 达 0.27 HEA De. HEHE SR DF 2- 氛 乙醇 All Ze AAG YS WEI WL (Sobel 4) FZ BELL SbCls 反应 更 稳定 和 特 RRA, ECS SMWKARUKM., HERD MASH MARE DEG REAL, Be HEAE SK D BOLE) A BE A BS 能 完全 代替 生物 学 方法 ， 因 为 最 丰富 的 材料 中 维生素 卫 的 含量 很 少 ， 而 一 些 和 干扰 物质 的 含量 却 比 较 高 。 在 使 用 鼠 和 鸡 作 实验 动 物 的 生物 学 方法 中 , 儿 百 万 分 之 一 的 维生素 D 就 能 产生 明显 效应 。 Sobel 等 @@ 评 述 过 测定 维生素 了 D 的 各 种 方法 。 By ”试管 及 城管 架 。 试剂 〈1) 鱼 肝 油 ; (2) 葵 胺 -省 盐酸 混合 液 (15:1)。 操作 “向 试管 内 加 大 鱼肝油 狗 1 SH, 苯胺 - 溃 盐 酸 混合 液 狗 SE. KAKA. 老 沸 中 分钟 。 黄 色 和 乳 浊 液 便 先 转变 成 矢 色 (有 MAN HAGE), RAE RAL. PA, FRA RAE, FBSA 色 。 实验 二 十 四 Hts Bi 的 颜色 反应 HEAL Fe Bi (Hii HEE) 属于 水 溶性 维生素 。 因 含有 硫 @ 颜色 变化 较 迅 速 , 应 及 时 观察 。 72 RH MEK MRM KAM 及 氨基 , RAW, EEK TER ho HR, PRBFRE it GE, ZEN, ORE AIAE REY 2b ME AES Bi POR PED. HEAD By 的 化 学 测定 法 主要 有 下 列 两 种 。 (一 ) 重 氮 苯 硫酸 反应 : 此 反应 最 先 为 Pauly 在 1904 年 提 出 思 。 驾 过 一 系列 的 等 其 , 最 后 为 Kinnersley 和 Peters 所 确定 4o)， 并 得 到 发 展 江 -2。 在 有 碳酸 氨 钠 存在 情况 下 , 硫 胺 素 能 与 重 氨 共 ae EAA, I Ab tik FRE BY Ot Oe EO, AE 很 灵敏 , APSE MEL. BA TR YA SS, EE Se ER ME He HE Bide (二 ) 莹 光 反应 : 硫 腕 素 径 轻微 氧化 作用 后 , 即 生成 黄色 而 带 有 . 艺 色 莹 光 的 胱 氨 硫 腕 素 ( 硫 色素 、 硫 腕 营 )@。 溶 于 虹 本 醇 中 的 胱 氨 硫 腕 素 显 示 的 深蓝 色 莹 光 ， 在 紫外 光 下 更 为 显著 。 此 反应 很 灵 敏 并 有 高 度 特异 性 @, 可 用 以 定性 或 定量 测定 硫 胺 素 d。 在 碱 性 环境 中 , KsFe(ON)e 可 定量 地 将 共生 素 Bi 氧化 成 确 色 H CH, Cl FOF On| 1 1 | —C—CH; +3KOH + 2K3Fe(CN), H,C—C. C \ HC C—CH,—CH,0OH N NZ NH,» S74 C —CH,CH,OH SA — 中 与 蛋白 质 精 合 的 硫 腕 娄 也 能 形成 硫 色 来， 但 不 能 用 异 丁 醇 提 取 。 因 此 , Bey ERE OYE SR MER Fe AR EI EP Le @ 车 光 法 灵敏 度 极 高 , 可 测 出 0.017 fe A: He By, SMOOTH HER Bo HER 73 还 有 其 他 一 些 反 应 可 以 用 来 测定 维生素 Bi Schultz 等 利用 游离 硫 胺 素 能 促进 酵母 发 酵 这 一 性 质 作 硫 胺 素 的 微量 测定 。 在 生 rth EAA CE CRO ENESE) 形式 存在 。 因 此 , 测定 此 辅酶 的 活性 作为 定量 测定 硫 胺 素 的 方法 有 重要 意义 。 根 据 Westenbrinke 拟定 的 微量 方法 ， 可 以 测定 0.00005? 埔 凑 化 ” 酶 9。 关 于 硫 胺 素 测 定 法 的 评述 , 可 参阅 参考 书目 97。 器 材 《1) 武 管 及 试管 架 ; (2) 小 漏斗 ; (3)10 毫升 量 简 ; (4) 2 毫升 吸 量 管 ; (5) 1 毫升 吸 量 管 。 试剂 〈1) 米 糠 ; (2)0.1N 硫酸 ; (3) BARI"; (4) 碳 酸 氨 钠 碱 性 溶液 9; (5)0.2% 硫 胺 素 溶液 ; (6) 1%KsFe(CN)e 溶液 ; (7) 30% SA AL SAVE He; (8) ET BE. 操作 (1) BRO I: OKBEM 13k, RUE, MA O.1N 硫酸 5 毫升 , 并 用 力 振 落 , 以 提取 硫 胺 素 。 放 置 10 分 钟 后 , 用 滤 儿 过滤 。 取 滤液 1 毫升 ， 加 大 碳酸 氨 钠 碱 性 溶液 15 毫升 及 重 RAH 1S. HVE. 在 10 分 钟 内 观察 深 红 色 的 出 现 。 (2) BEI WM: 取 0.2% 硫 胺 素 溶液 1 一 2 毫升 , 加 大 KsFe(CN )6 溶液 2 毫升 及 80% RAIL SNA 1 BI. HARV, mA 2 SHRM, HERE. RPMS, Me LEST eae ye BID, FRITH Hts B* 的 定性 试验 维生素 B。 的 水 及 酒精 中 性 溶液 为 黄色 ， 并 具有 很 强 的 营 光 。 这 种 党 光 在 强酸 和 强 碱 中 易 破 坏 。 维 生 素 Bo 可 被 亚 硫酸 盐 还 原 RHE, 失去 营 光 。 二 氢化 物 在 空气 中 易 重 新 钙 氧 化 , Be 复 其 营 光 。 共 反应 如 下 。 D ”观察 时 ， 不 要 对 着 阳光 ， 而 要 由 光大 射 方向 观察 。 在 紫外 光 下 则 营 光 更 加 明显 。 7A 入 四 意 MR AS ME Hi KET OH OH OH CH.CH—CH—CH—CH,0H ) Ss aes coH--/% YY % 6-0 42H et ape 5 CHEN | wH | = VY Ny G7 | O OH OH OH CH,—CH—CH—CH—CH,OH ea) Neate CH,— / 器 材 ， 试 管 及 试管 架 。 试剂 〈1) 核 黄 素 深 液 (30 微克 /毫升 ); (2) 2.5% NaHSO, 溶液 (用 2% Nas0Os 作 溶剂 )。 操作 “ 取 两 支 试管 ,各 加 入 核 黄 素 溶液 1 毫升 ,观察 其 黄 称 色 要 光 。 在 一 管 中 加 入 5 一 10 滴 亚 硫酸 气 钠 溶液 , HD EE ARIE. FE 分 括 动 后 , 再 随时 比较 两 管 达 光 。 最 好 在 紫外 光 灯 下 观察 。 实验 二 十 入 ”尼克 酸 的 定性 试验 尼 死 酸 又 称 为 烟 酸 , 与 尼克 酰胺 同 为 抗 壬 皮 病 锥 生 素 (或 称 和 维 、 HERE PP)。 尼 死 酸 在 机 体内 可 转变 成 尼克 酰胺 , 后 者 是 辅酶 工 及 辅 酶 下 的 租 成 成 分 。 尼 殉 酸 为 白色 车 晶 物 质 ， 易 溶 于 水 及 乙醇 。 用 酸 水 解 尼克 酰 | 实 骏 二 十 大 “ 尼 吉 酸 的 定性 款 克 5 胺 可 得 尼 死 酸 。 fo | ‘Bia y \w7 L 尼克 酸 尼克 酰胺 在 破 性 环境 中 尼克 酸 或 尼克 酰胺 与 2.4- 二 确 基 氧 化 葵 精 合 ， 产生 秆 色 物 质 。 其 反应 机 制 可 能 如 下 : 上 Orie (-\-contt NH, NOs ， | one | Les 7 + gm NIE ti) 5 H,0,02 NH-H*Cl- | a | z = 2 NO, 门 path \/ LJ | NO, : 器 材 (DRERRER (2)/bR RM; (3) 水 浴 锅 ; (4) 璃 棒 。 试剂 “〈1) 尼 克 酸 提取 液 5; (2)1% JE TERRA; (3)1%2,4- 二 硝 基 毛 化 苯 酒 精 溶液 ; (4)1 和 氨 氧 化 钠 酒 精 溶液 。 操作 ”倾注 2 毫升 1% 尼克 酸 溶液 于 小 蒸发 了 中 ， 置 水 浴 上 FEF. MA1%2,4-— WAKA 2 毫升 ;用 玻璃 棒 使 蒸发 四 py GRAS, AERIS LAE, HORSE 10 Ah, 至 室温 后 ,加 大工 % 氧 氧化 钠 酒 精 溶液 1 毫升 。 颜 色 变 红 。 用 尼克 酸 提取 液 重 复 上 述 实 验 。 尼克 酸 与 硫 氟 化 省 (BrONS) 发 生 反 应 ， 产 生 黄 色 产 物 492。 根 据 此 颜色 反应 制订 的 定量 法 49?， 应 用 也 很 广泛 。- 76 MYR HEAL, MKB HM KAM RBRo-+t Me Be 的 鉴定 HEAL FE Be( 吡 哆 素 ) 是 与 蛋白 质 代谢 密切 相关 的 维生素 。 吡 哆 醛 、 吡 哆 醇 、 吡 哆 胺 三 种 物质 具有 同样 的 维生素 Be 生理 功能 。 CH,OH CHO "iwi | | rt yer 2OH pd i bone OH mace A304 xv HaC 人 NG js Mk aS A: Me WS RE sks We 维生素 Be 是 吡啶 衍生 物 ， 含 有 羟基 ， COMERS esa 剂 起 蓝 色 反应 “"。 有 人 利用 此 反应 作 灯 生 素 Be 的 定量 测定 。 但 反应 特异 性 不 高 ， 使 用 者 不 多 。 关 于 测定 维生素 Be 的 其 他 方法 ， 参阅 参考 书目 20。 HEAL Be MLA TER AEE, PRM ERE BIE 移 换 酶 和 SH HS RS 0 HEA IE Be 易 被 碱 和 光 破 坏 , 在 酸性 溶液 中 较 稳 定 。 器 材 〈1) 武 管 ; (2) 漏 斗 。 试剂 〈《J) 米 糠 或 酵母 提取 液 ; (20.01% HE AE HE By HMR; (3) 省 氨水 ; (4)Folin 氏 酚 试剂 Be; (5)0.1N HoSO，。 操作 HLH 工 克 米糠 置 试管 中 , 加 大 0.1 BERR 5 BEF, 用 力 振 落 。 10 分 钟 后 过 滤 。 取 工 毫升 滤液 ， 加 大 滤 所 水 1 一 2 滴 及 酚 试剂 1 HO, MH HAL, FMEA: He Be 溶液 重复 试验 。 实验 二 十 八 _ 蕉 生 素 0 的 定量 测定 维生素 CO (抗坏血酸 ) 为 具有 工 - 系 精 构 型 的 不 他 和 多 犯 化 合 D 氮 水 和 酚 坛 剂 用 量 不 能 过 多 , 否则 , 出现 白 色 沉 淀 。 四 提取 液 中 含有 共 他 酚 类 物质 , 使 颜色 过 深 。 | cd ee Ye Ae ops 7? 物 , BBP KYA MEAS SE. MEE IE C 首先 为 A. Szent-Gyorgyi 在 1928 年 分 离 出 22。0C.G. King 和 W. A. Waugh 在 1932 年 确定 它 是 Pi MLR, MEALIE C TANI, HR IB BRAS RR Chi Ae, HA, BE) AYE. AEE IE ， 氧化 剂 存在 时 ， 抗 坏 血 酸 易 被 氧化 而 破坏 。 在 中 性 和 微 酸性 环境 中 @， 抗 坏 血 酸 能 还 原 2.6- 二 氟 酚 能 酚 成 为 无 色 的 还 原型 26- 二 MW HEY. HCI RAS EY A eI a Cl | | iP? gz DAN 0" ee) | | | j HO—C Cl ry 8 on] |H* | o=¢ S=n—< 2 一 OH 一 HO—CH PL i CH,OH Cl 抗坏血酸 2, 6- =A Wh RED AL) yy, a Gl ad. eae HOC AN >—OH 0 一 C 时 Be eA Cl H | ， HOCH CH,OH BE HP 还 原型 2, 6 — Aa ES (9) @ 一般 认 为 ,在 pH1.0—3.5 12 MGR MEH. Bessey Hi Hi, pH2.0—3.0 Fe Be Be Se A Be Be Ye 78 第 四 章 “ 维 生来、 激素 及 植物 火 生 物质 利用 以 上 反应 ， 可 以 定量 滴定 抗坏血酸 2。 从 2 6-— AME 酚 标 准 溶液 的 洽 耗 量 ， 可 以 计算 被 检 物 质 中 抗坏血酸 含量 。 使 用 以 上 方法 测定 抗坏血酸 , 简便 易 行 , 但 有 下 列 缺 点 (1) 在 生物 组 和 绫 内 和 钥 线 提取 物 内 , 抗坏血酸 还 能 以 脱 氨 抗 坏 血 酸 及 精 合 抗坏血酸 的 形式 存在 。 后 二 者 同样 地 具有 共生 素 @ 的 生理 作用 , 但 不 能 将 2, 6- 二 毛 酚 能 酚 还 原 觅 色 @。 (2) 生 物 粗 绫 提 取 物 和 生物 体液 中 常 含有 其 他 还 原 性 物质 。 在 这 些 物 质 里 ， 有 的 也 可 在 同样 实验 条 件 下 使 2 6- 二 氨 酚 靛 酚 还 原 觅 色 。 (3) 在 生物 组 织 提 取 物 中 ， 常 有 色素 类 物质 存在 ， 满 定 浆 点 观 察 困难 。 THAR C 定量 测定 可 参阅 参考 书目 429。 器 材 (1)50 毫升 锥 形 瓶 ; (2) 乳 钉 ; (3)5 毫升 微量 滴定 管 ; (4)10 毫升 吸 量 管 ; (5) 量 简 ; (6)50 AE FL LIK | 试剂 (1)ERSL, HMA; (2)1 多 盐酸 ; (3)0.001 N hale 6A Eh nS He 操作 “用 分 析 天 平 准确 地 称 取 ESL HY 0.5 Be, BLE 4 3s 或 草莓 欧 2 克 。 样 品 必须 预先 用 温水 洗 去 泥土 , 并 在 空气 中 风干。 放大 乳 钵 中 ,加工 多 盐酸 5 一 10 毫升 @, 一 起 三 麻 。 帮 怪 片 刻 , 将 提 @D 此 法 是 J.Tillmans(26) 在 1927 年 首先 提出 的 。 他 观察 到 棒 檬 等 水 果 液 计 对 2, 6- 二 氛 酌 表 酚 有 很 强烈 的 还 原作 用 ， 可 以 利用 这 种 还 原 能 力 的 大 小 来 估计 水 果 液 半 的 抗 坏 血 病 活 性 。 后 来 工 .J. Harris 及 其 合作 者 利用 这 一 作用 作为 维生素 OC 的 定量 测定 (27) 。 QD 有 人 提出 ,在 测定 前 用 oS 使 腕 氨 抗 坏 血 酸 还 原 , 这 样 可 以 测 得 总 抗坏血酸 量 。 但 用 2, 4- 二 确 基 葵 肝 法 (28) 测 定 总 抗坏血酸 灶 果 更 好 。 图 “如何 从 样品 中 提取 崔 生 来 Q, 一 直 是 研究 最 多 的 一 个 问题 。 有 人 使 用 三 气 栈 酸 、 偶 磷酸 、 草 酸 、 盐 酸 等 作为 提取 剂 。 仿 磷酸 和 草酸 较 好 ， 两 者 都 可 以 精 合 除去 微量 Cu* 和 Fett++。 这 两 种 离子 能 催化 抗坏血酸 被 氧气 化 。 同 时 ,一 仿 磅 酸 能 抑制 夏 生 素 O 氧化 酶 的 酶 促 氧 化 作用 。8Scehuwarze 和 Guenther(29) 认 为 ， 1 多 盐酸 能 提出 精 合 型 检 生 素 。 在 作 一 般 植物 样品 维生素 OC 的 测定 时 , 可 以 使 用 盐酸 作 提 取 剂 。 > EE 实验 二 十 九 BLMARHER Mee 79 取 液 滤 大 50 MEF RIK, 如 是 反复 抽 提 2 一 3 次 。 最 后 用 1%% 盐 酸 稀释 滤液 到 刻度 并 混 与 。 每 欢 量 取 5 或 10 毫升 进行 滴定。 从 微量 滴定 管 中 , 以 0.001N2, 6- 二 毛 酚 靛 酚 钠 溶液 ( 蓝 色 ) 沉 sie DAL, 并 保持 中 分 钟 不 褪 (2, 6- 二 氧 酚 能 酚 在 酸性 溶液 中 BAC), ERE TI, 不 超过 2 BRO, Bie EULA, HEE WY 2, 6-— PREIS GAR EDT 1 HRA 4S. BMI ERE 1 一 4 毫升 范围 以 外 , 则 必须 纵 减 样品 用 量 或 将 提取 液 适 当 稀 释 。 “ 另 取 1%HOI5 或 10 毫升 作对 照 滴定 。 实验 二 十 九 ” 色 上 腺 素 的 提取 和 鉴定 LIRR LRA WR, Hea eee A 氨基 乙醇 邻 茶 二 酚 。 人 wo | OH BERRA Min, DATA RAL, (LAR FR, HES MA CER, 市 上 常见 的 商品 为 其 盐酸 盐 。 器 材 《〈 蕊 试管 及 试管 架 ; (2) 乳 钵 ;〈《3) 细 砂子 ; (4)50 毫升 锥 FIR; (5) 25 毫升 量 简 ; (6) 水 浴 钢 。 了 试剂 CL ar RRR EDR: (2)0.1N 盐酸 ; (3)10% Bae; (4)1% =A; (5)10% 醋酸 钠 溶液 ; (6)0.1% AiR 液 ; (7) Ehrlich 氏 重 所 试剂 ”3; (S)RAK; (9)0.2% 高 硫酸 钾 (KsSioOs) 溶 液 。 YE WMA LRM 2k, BAH, MAOINHC O 滴定 要 迅速 。 因 为 在 本 滴定 条 件 下 ， eta ercinipe yey yi ceed iggsie 和 组。 快速 滴定 可 以 避 驶 或 减少 它们 的 影响 。 80 BOT MEK, MH RM bKEDMR 5 EF AMM YD iF, WRI RR, BA 50 毫升 锥 形 瓶 中 ,再 加 . 0.1V 盐 酸 15 毫升 。 在 沸水 浴 中 者 5 分 钟 后 ， 加 10% GR SMe 7 毫升 , 再 者 1 Bh, eH, 1B OR BS CPR) PRE ETL, 用 滤液 (或 上 清 液 ) 作 下 列 试验 。 (1)Vulpian 氏 反 应 : 取 滤 液 2 毫升 ,加 10% 三 氧化 铁 深 液 2 一 3 滴 。 洲 液 呈 现 季 色 。 加 一 滴 省 氨水 ， 液 体 转变 为 红色 。 这 是 典 型 的 邻 葵 二 酚 反 应 。 (2)Comessatti 氏 反 应 : 取 滤 液 2 EF, In 10% BA Ae 1 毫升 和 0.1% 氛 化 汞 5 滴 。 的 匀 后 ， 置 水 浴 中 慢 慢 加 热 至 40 一 50 C。 观 察 玫 瑰 和 红色 的 形成 。 (3) Ehrlich 氏 反 应 : 取 滤 液 2 毫升 , 加 入 等 量 Ehrlich RRR 试剂 。 挨 匀 后 ,立即 加 入 过 量 的 省 氨水 ( 略 5 滴 )。 出 现 和 红色 。 (4) 卫 wins 氏 反 应 : 于 2 毫升 滤液 中 , 加 大 0.2 匈 高 硫酸 钾 深 液 ， 1 毫升 。 在 水 浴 中 将 溶液 徐徐 热 至 40 一 50"C。 观 察 有 无 红色 出 现 。 实验 三 十 ” 色 上 腺 素 对 血糖 含量 的 影响 崩 上 腺 素 在 糖 代谢 中 所 起 的 作用 与 胰岛素 相反 ， 能 促进 糖 元 分 解 成 葡萄 糖 。 和 给 机 体 注射 惨 上 腺 素 , 则 可 引起 高 在 糖 症 与 糖尿 ， 崩 上 腺 素 与 胰岛 素 在 糖 代 谢 上 具有 相 成 相 辅 的 调节 作用 。 器 材 《1) 刀 片 ; (2)2 或 5 毫升 注射 器 ; (3)0 毫升 微量 吸 管 ; (4) 小 烧杯 ; (5) 5 毫升 微量 滴定 管 ; Oe ccm 血 精 定量 法 所 用 的 其 他 器 材 。 试剂 CL) BAC HL AR 24 小 时 的 家 更 ; (2) 酒 精 ; (3) TH HP De til C1: 1000), Fi 0.9% SAL SPA He RRR 5 Be: (4) Hagedorn- Jensen — FR i ae Sik 2s BE FA BBR FH 操作 ” 称 量 预 先 饥 俄 24 小 时 的 家 更 体重 。 按 每 公斤 体重 注 ” 实验 三 十 一 “胰岛素 对 血糖 含量 的 影响 31 at Ede HK hil Fl (1:1000)0.37 毫升 计算 ， 算 出 稀释 惨 上 腺 素 深 液 的 注射 需要 量 。 注射 前 , 按照 实 骏 三 十 一 的 方法 取 血 工 测 定 家 更 血糖 含 it, 作 为 对 照 。 将 事先 准备 好 的 惨 上 腺 素 深 液 ， 和 给 家 更 皮下 注射 。 30 分 钟 后 , FR A PA i, 进行 血糖 测定 。 比 较 注 射 前 后 血糖 含量 的 变 化 。 实验 三 十 一 “胰岛素 对 血糖 含量 的 影响 胰岛 素 是 胰 曦 68- 细胞 所 分 沁 的 一 种 激素 。 它 的 化 学 本 质 是 蛋白 质 。 在 机 体内 胰岛 素 具有 炙 节 糖 代 谢 的 重大 作用 。 它 能 加 速 血糖 的 氧化 和 促进 糖 元 合成 。 皮 下 或 静脉 注射 胰岛 素 可 引起 血糖 降低 。 胰 岛 素 缺乏 性 糖尿 病 患者 糖 代谢 发 生 紊乱， 血糖 升 高 。 注 射 胰 锅 素 可 以 核 正 。 器 材 〈1) 刀 片 ; (2)2 或 5 毫升 注射 器 (注射 胰岛 素 用 ); (3)5 或 10 毫升 注射 器 CERN HEA); 《〈4)0.1 毫升 干燥 微量 吸 4s (5)50 毫升 烧杯 ; We pe = Ke eB 用 的 其 他 器 材 。 试剂 (1) ULAR 24 小 时 的 家 更 ; (2) 酒 精 ; 《3) 市 售 胰 饥 素 制 剂 1 SHEA 20 或 40 单位 D) ARR E SSH 1 ky Ha3 (4) 4% Fi 4 PRAHA; (5) Hagedorn-Jensen 二 氏 血 糖 定量 法 所 用 的 全 部 试剂 。 操作 ” 称 量 预先 饥饿 24 小 时 家 更 的 体重 。 按 照 每 公斤 体重 ”人 @ 胰岛 素 的 生理 单位 是 胰岛 素 注 入 事先 饥 狐 ?4 小 时 ， 体 重 为 2 公斤 的 家 更 体 内 时 ， 能 引起 闻 擎 ( 胰 蜗 素性 休克 ) 的 胰岛 素 量 。 此 时 血 中 葡萄 糖 含量 可 降低 到 此 毫 MEA. 82 RGR MEK MRR MK EDM TESS 1.5 BLL WE HED, 算出 给 家 更 注射 所 需 胰岛 素 量 。 取 4 个 试管 ,各 加 大 0.45 允 硫酸 锌 溶液 5 毫升 和 0. LN 握 氧化 SAA 1 ET. RAGA. HF bo FE, ASA ERK. Pa, roles Ale) RR PK, EPR RR ER 0.1 毫升 血液 @。 PEP TA ES oie OE BA AS AL, SANE A HS 1 BRE, 一 吸 量 管 同 样 吸取 0.1 毫升 血液 并 洗 大 第 2 号 试管 中 。 按 Hage- dorn-Jensen 二 氏 血 糖 定量 法 测定 血糖 。 第 3、4 号 两 试管 为 室 自 对 照 , 不 加 血液 。 给 家 更 皮下 注射 预先 准备 的 胰岛 素 洲 液 。 荆 小 时 后 ,， 再 由 耳 静脉 取 血 , 同上 测定 血糖 。 不 用 再 做 空白 对 照 。 为 预防 胰岛 素性 休克 ， 第 二 次 取 备 后 ， 立 即 向 家 更 皮下 注射 40 儿 葡萄 糖 溶 液 10 毫升 。 比较 注射 胰 饥 素 前 后 的 家 更 血糖 含量 。 实验 三 十 二 茵 质 的 定性 反应 用 质 广泛 分 布 于 植物 中 。 石 榴 皮 .茶叶 、 五 们 子 (没食子 ) 等 都 含有 多 量 长 质 ， 五 倍 子 中 的 含量 更 为 丰富 。 轰 质 能 轰 制 生 毛 皮 杰 成 熟 皮 , 靶 质 的 名 称 即 由 此 而 来 。 我 们 祖先 很 早 就 用 五 借 子 灶 革 ， 至 今 土 法 制 革 中 还 在 使 用 。 质 是 一 类 糖 区 ， 其 中 有 的 是 多 个 县 酸 ( 单 宁 酸 ) 分 子 与 一 个 葡萄 糖分 子 精 合 而 成 。 FERRE HF RP) Se tii 7H, D 5E EET) Re He i He EY HE HY 3 倍 。 这 样 可 以 很 快 地 引起 低 血 精 。 取 血 后 , 立 即 注射 葡 奇 糖 , 以 如 家 更 死亡 。 包 也 可 用 注射 器 直接 穿刺 心 看 取 血 。 实验 三 十 三 ” 茶 碱 的 提取 和 一 些 性 质 83 OH COT HAO ra S 7~\—on 会 hod esl gta 4 i tg | OH EER ER 器 材 = (1)ME RAR; (2)100 毫升 烧杯 ; (3) FL; (4) 漏斗 。 试剂 (DRS CPAR HAE); (21% 三 AKAM; (3)0.1 % 48 FA UR; (4)1% BER ARR; (5)1% BARAK. 操作 CUED EDS, RaSh SHAK KA DL) RAR, PEC ARREAMILAM. BAMRAR ETM 的 数目 与 位 置 。 - 取 五 倍 子 狗 5 ot, KALAMA, BAH. dk 30% Ft, ah 5 ABH, EVE. MUM 2 毫升 ; 滴 加 工 % 三 毛 化 铁 2 一 3 滴 。 颜色 怎样 ? 《2) 款 质 为 一 种 植物 碱 试 剂 ， 能 使 植物 碱 沉 淀 。 取 滤液 2 训 Ft, 滴 加 0.1% > 3 一 4 滴 。 观 察 沉 演 出现。 (3) 亩 质 能 被 重金 属 盐 沉 演 。 取 滤液 2 ST, m1 DRM 液 3 一 4 滴 , 立即 有 沉 深 形成 。 《4) 轰 质 还 能 沉 演 蛋白质。 取 工 儿 和 白 明胶 溶液 2 毫升 ， 滴 加 滤 液 2 一 3 滴 , BIA OL te HB. 实验 三 十 三 ” 茶 碱 的 提取 和 一 些 性 质 植物 碱 是 一 类 特殊 的 碱 性 含 所 有 机 化 合 物 ， 氨 常 存在 于 分 子 的 环 状 苦 构 中 。 植 物 碱 微 溶 于 水 , 但 易 溶 于 微 酸性 溶液 , 易 深 于 乙 Be, CBE, Ai, A AES A LPS. PER, RRR, PRR AMHR KI—Hel, 等 试剂 能 使 植物 碱 在 水 溶液 中 沉淀 。 因此 84 第 四 章 ”维生素 .激素 及 植物 次 生物 质 这 些 试剂 被 称 为 植物 碱 试剂 。 PLL EY OVE DR, 是 一 种 植物 碱 。 茶 碱 为 无 色 针 状 糙 唱 , 味 苦 ， 易 溶 于 热 水 。 它 的 化 学 名 称 为 1, 3,7- 三 甲 基 2 6- 二 氧 嗓 喻 ， 车 构 式 如 下 : H;C—N—C=O FM EM 3 一 5 多 。 器 材 “〈1) 武 管 及 试管 架 ; (2) 漏 斗 ; (3) 小 蒸发 由; (4)100 训 升 烧 杯 ; (5) 尖 端 较 秋 的 滴 管 ; (6) 载 玻 片 ; (7) BAB 试剂 〈1) 茶 叶 ; (2) 气 仿 ; (3) EER: (4) PERE RUTH (5) 碘 化 钾 - 碘 化 汞 溶液 c2。 操作 “ 称 取 茶叶 2 克 ， 放 入 烧 杯 内 。 加 蒸馏 水 50 ETE, ACB 30 分 钟 。 趁 热 过滤 , 将 滤液 倒 大 蒸发 阵 中 , HORE LIP FAA UG 2 毫升 溶解 蒸发 阴 内 的 干燥 物质 ， 并 将 溶液 倒 大 试管 中 。 用 蒸馏 水 反复 洗涤 试管 中 的 所 仿 溶液 ， 直 至 把 神色 物质 洗 净 为 止 。 用 水 洗涤 时 , 每 次 用 2 毫升 。 每 次 洗 完 后 , FARM EE HEA 吸出 抛弃 之 。 用 滴 管 把 气 优 溶液 小 心地 滴 到 载 玻 片上 ， 每 滴 一 滴 即 用 微 火 Be AES SEF RE WY BL TE A 茶 碱 能 升华 。 取 另 一 玻 片 放 在 载 有 茶 碱 的 玻 片 的 上 方 ,， 但 不 接触 。 用 小 火 微 微 各 热 后 ， 喜 可 发 现 上 面 的 玻璃 片 有 针 状 糙 昌 出 Bl. MRE, AMM MARL, FRE PRG 1 Tt, FAA Iv k 1 ES. RR. HA 水 的 试管 加 热 ， 有 何 变化 ? 实验 三 十 三 ” 茶 碱 的 提取 和 一 些 性 质 85 另 取 2 支 试管 ， 各 加 入 茶 碱 千 晶 数 粒 及 蒸 馆 水 2 毫升 。 于 一 试管 内 滴 加 轰 酸 饱和 溶液 , 另 一 试管 内 滴 加 碘化钾 - 碘 化 汞 溶液 各 数 滴 。 观 察 沉淀 的 形成 。 参考 书目 (1) Carr, F.H. and Price, E. A.，Biochem. J., 20, 498(1926). _ (2) Yudkin,§., Biochem. J., 35, 551(1941). (3) 食物 营养 成 份 测定 法 , 中 国医 学 科学 院 劳动 卫生 劳动 保护 及 职业 病 研究 所 营养 学 系 往 ，46 页 (1961) . ~ (4) Sebrell, W.H.and Harn, R.S., The Vitamins, Vol. I, p.87(1954) . (5) Nield, C. H., Russell, W.C.and Zimmerli, A., J. Biol. Chem., 136, 73 (1940) ; 148, 245(1943). (6) Koch, F.C. and .Hanke, M.E., Practical Methods in Biochemis- try, 6 Ed., p.418(1953). - (7) Sobel, A. E. et al., Ind. and Eng. Chem., Anal. Ed., 17, 160(1945). (8) Sebrell, W. H. and Harn, R.S., The Vitamins, Vol. 1, p. 215(1954). (9) Pauly, H., Z. Physiol. Chem., 42, 508 (1904). (10) Kinnersley, H. W.and Peters, R. A., Biochem. J., 28, p. 667 (1934). (11) Prebluda, H.T.et al., Science, 84, 488(1936); J. Biol. Chem., 127, 495 (1939). 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Chem., 147, 399(1948). Schwarze w. K.,and Guanther, E., Biochem. Z., 319, 139(1948). ‘ 第 五 章 酶 酶 (酵素 ) 是 生物 体 中 具有 催化 功能 的 和 蛋白质 , 因此 , 也 叫做 生 牧人 催化 剂 。 它 们 能 加 快 反 应 的 进程 , 但 不 参加 到 反应 的 最 和 终 产物 。 按 其 催化 功能 ， 酶 可 分 为 五 大 类 : (1) 催 化 水 解 作 用 的 酶 称 为 水 解 Big, 如 蛋白 酶 和 脂肪 酶 ; (2) 催 化 氧化 还 原作 用 的 酶 称 为 氧化 还 原 酶 , Sosa Ra oe Wits A He EEE eS (3) 催 化 分 子 分 裂 的 酶 称 为 分 裂 Pats, 如 碳酸 酬 酶 ; (4) 催 化 分 子 问 基 团 移 换 的 酶 称 为 移 换 酯 , 如 氨基 移 换 酶 ; 5) 催化 分 子 异 构 化 的 酶 称 为 异 构 酶 和 催化 分 子 内 基 团 变 位 的 变 位 酶 , 如 UDPG 刚 构 酶 和 磷酸 葡萄 糖 变 位 酶 。 一 般 来 说 ， 水 解 酶 是 在 物理 化 学 性 质 上 与 球 蛋白 相近 似 的 单 Me AR, 氧化 还 原 酶 是 烙 合 蛋白 质 。 目 前 许多 酶 已 能 制 成 晶体 。 酶 具有 高 度 特 异性 。 温 度 和 p 互 对 酶 的 活性 有 显著 影响 。 能 使 酶 活性 增加 的 一 些 物质 称 为 酶 的 激动 剂 ， 能 使 酶 活性 减低 的 一 些 物 质 称 为 酶 的 抑制 剂 。 激 动 剂 与 抑制 剂 党 表现 某 种 程度 的 特异 性 。 物质 代谢 是 生命 的 基本 特征 。 在 机 体 中 不 断 地 进行 着 的 同化 作用 和 蜡 化 作用 中 ， 有 多 种 不 同 的 化 学 变化 。 这 些 化 学 变化 绚 大 多 数 都 在 酶 的 影响 下 进行 。 工 业 部 门 中 的 食品 工业 、 发 酵 工业 、 制 约 工业 、 制 革 和 造纸 工业 等 都 和 酶 有 密切 关系 。 因 此 , 酶 的 研究 在 生物 化 学 中 占有 极 重要 的 位 置 。 实验 三 十 四 most 与 一 般 催 化 剂 比 较 ， 酶 具有 高 度 特异 性 。 有 时 一 种 酶 仅 对 一 个 底 物 起 一 定 的 催化 作用 。 特 异性 较 低 的 酶 则 能 对 一 类 化 合 物 起 88 HEM Bi 催化 作用 , 这 些 化 合 物 常 具有 相同 的 化 学 键 。 例 如 , 淀粉 酶 能 催化 ， 淀粉 水 解 , 但 不 能 催化 脂肪 水 解 ， 而 脂肪 酶 则 能 催化 脂肪 水 解 ， 而 不 能 催化 淀粉 水 解 。 虽 然 这 二 种 酶 所 催化 的 都 是 水 解 过 程 ， 但 是 它们 要 求 的 作用 底 物 不 同 ,水 解 破裂 的 化 学 键 也 不 同 。 大 多 数 酶 都 具有 立体 化 学 特异 性 。 精 氨 酸 酶 可 作为 一 个 例子 来 说 明 。 这 个 酶 能 催化 工 - 精 氨 酸 成 L-B ARRAS, (ARETE 用 于 D- 精 毛 酸 。 本 实验 以 唾液 酶 ( 含 mnelasigllnsttla ite All BE BH AY EJ 28 Bil, 来 说 明 酶 的 特异 性 。 淀粉 和 蔗糖 缺乏 自由 醛 基 ,， 无 还 原 性 ,但 在 唾液 酶 的 作用 下 ， 淀粉 很 容易 水 解 成 有 还 原 性 的 麦芽 糖 和 一 些 葡萄 糖 。 在 同样 情况 下 , 唾液 酶 不 能 催化 蔗糖 的 水 解 。 蔗 糖 酶 能 催化 蔗糖 的 水 解 ,产生 还 原 性 葡萄 糖 和 果糖, 但 不 能 催化 淀粉 的 水 解 。 器 材 〈1) 试 管 及 试管 架 ; (2) 恒 温水 浴 锅 。 试剂 〈1)2 多 芒 糖 溶液 ; 〈2) 新 配制 的 、 溶 于 0.3 色 氧化 钠 的 1 狗 淀 粉 溶液 ; (3) 稀 释 200 倍 之 新 鲜 唾 液 0; (4) 芒 糖 酶 溶液 ca 操作 (1) 淀粉 酶 的 特异 性 : 先 以 Benedict AHI HEHE 和 淀粉 是 否 含 有 还 原 性 杂质 。 取 2 Ae, 各 加 入 Benedict 氏 试 剂 2 毫升 , 再 分 别 加 叉 1% 淀粉 溶液 和 2% 蔗糖 溶 液 各 4 滴 。 混 合 均 匀 后 ， 放 在 沸水 浴 中 者 2 一 3 分 钟 。 观 察 有 无 红 黄 色 沉 淀 产生 。 纯净 的 淀粉 和 蔗糖 不 呈 阳性 反应 。 2 SCE, 向 一 试管 中 加 1% Rew 3 EFL, BRE MA 2% WE PRY ME 3 毫升 。 向 2 支 试 管 各 添加 稀释 200 Be i AE ME HE 17EFt. HA, MA 37°C 恒温 水 浴 中 。 15 分 钟 后 取出 ， 以 Benedict Q@ 不 同人 和 不 同时 刘 的 唾液 中 演 粉 酶 的 活性 不 同 , 差别 有 时 很 大 。 vo aH CAL 以 是 100—200 tf, 实验 三 十 五 ”唾液 淀粉 酶 的 激动 和 抑制 89 氏 试 剂 分 别 检查 二 管 的 内 容 物 , 并 记录 糙 朵 。 (2) 芒 糖 酶 的 特异 性 : 向 工 支 起 管 中 加 入 1 多 演 粉 溶液 3 毫 Fr, IA 1 SA PIMA 27 BRYA 3 毫升 。 再 向 2 支 试 管 中 TAN IMATE EAE A) 工 毫 升 。 瓜 匀 后 , WA 37 9 恒温 水 浴 中 保温 。10 分 钟 后 取出 , 用 Benedict 氏 试 剂 检查 2 支 试管 的 内 容 物 。 BL FE IF Fe ae 实验 三 十 五 ”唾液 淀粉 酶 的 激动 和 抑制 酶 的 活性 第 受 某 些 物 质 的 影响 , 有 些 物 质 能 增高 酶 的 活性 , 有 些 物 质 则 能 减低 酶 的 活性 。 前 者 通 笛 称 为 酶 的 激动 剂 ， 后 者 称 为 抑制 剂 。 激 动 剂 与 抑制 剂 影响 酶 作用 的 需要 量 很 小 ， 莽 角 具 有 特 异性 。 毛 化 钠 为 唾液 淀粉 酶 的 激动 剂 ， 硫 酸 铀 为 其 抑制 剂 。 激 动 剂 和 抑制 剂 的 作用 不 是 纸 对 的 , 有 些 物质 在 低 省 度 时 为 激动 剂 , 而 在 高 尖 度 时 则 为 抑制 剂 。 如 氧化 钠 达 到 夸 包 和 度 时 就 可 抑制 唾液 尝 粉 酶 的 活性 。 器 材 〈1) 试 管 及 试管 架 ; (2) 恒 温水 浴 锅 及 温度 计 。 RF 1) 01 多 淀粉 溶液 ; (2) 稀 释 100—200 倍 的 新 鲜 茬 液 ; (3)1 % SALSA YA WE; (4)0.1 多 硫酸 铜 洲 液 ; (5) 碘 化 钾 - 碘 溶液 29。 操作 “ 取 3 支 试管 ,各 加 入 3 毫升 01 多 淀粉 溶液 和 1 工 毫 升 稀 PEM, A 工 支 试管 中 加 大 1 SIF 1% 所 化 钠 溶液 ， 向 第 2 支 起 管 中 加 入 工 毫升 01%% 硫 酸 铀 溶液。 向 第 3 支 试 管 中 加 大工 毫 FH WBA ESE 的 匀 各 管内 容 物 ， 一 齐 放大 BTC 恒温 水 浴 中 保温 。 15 35h 蔗糖 酶 溶液 中 有 少量 还 原 性 杂质 。 因 此 , 在 使 用 演 粉 作 底 物 的 试验 中 ， 也 呈 现 轻 度 Benediet 反应 。: 可 以 使 用 芳 过 的 蔗糖 酶 另 做 一 个 补充 试 骏 , 证明 蔗糖 酶 溶液 中 含有 还 原 性 杂质 。 90 . iM ”本 后 , 取出 2。 闪 后， 分别 滴 人 2 一 3 ito SP YET. FR HERE 3 KA IRS, FER EZ. 实验 三 十 六 “温度 对 酶 活性 的 影响 酶 的 催化 作用 受 温 度 的 影响 。 酶 所 催化 的 化 学 反应 表现 有 最 适 温度 现象 。 在 最 适 温 度 下 ， 酶 反应 速度 最 高 。 较 高 或 较 低 的 温 度 能 使 酶 反应 速度 降低 。 大 多 数 动物 酶 的 最 适 温度 为 37—40°C, 植物 酶 的 最 适 温度 为 50 一 60?C。 温度 对 酶 催化 的 化 学 反应 过 程 具有 双重 效应 。 一 方面 ， 温 度 上 升 可 以 使 反应 加 快 ; 另 一 方面 , 加 快 酶 本 身 的 “ 热 失效 "5 在 实际 测定 任何 一 个 酶 的 最 适 温度 时 , 必须 同时 注意 时 间 因 素 , 因为 在 一 定 温度 下 , 时 间 越 长 , 温度 对 酶 的 破坏 越 大 。 酶 对 温度 的 稳定 性 与 其 存在 形式 有 关 。 有 些 酶 的 王 燥 制剂 虽 加 热 到 100°C, 其 活性 并 无 明显 改变 ， 但 在 100°C 溶液 中 却 很 快 地 完全 失去 活性 。 低温 能 降低 或 抑制 酶 的 活性 , 但 不 能 使 酶 失去 活性 。 器 材 〈1) 试 管 及 试管 架 ; (2) 恒 温水 浴 锅 及 温度 计 。 试剂 〈1) 新 配制 的 , 深 于 0.3 多 氧化 钠 的 02 多 淀粉 溶液 ; (2) 稀释 200 倍 的 唾液 ; (3) 碘 化 钾 - 碘 洲 液 293; (4)1 多 尿素 溶液 ; (5) 脲酶 提取 液 汪 3; (6)Nessler Fat FI, /操作 〈1) 温 度 对 唾液 酶 活性 的 影响 : 淀粉 和 可 溶性 淀粉 遇 碘 BE, MRK TWA), aay Be eee, ee 6. Ti AME MT ERG, 2S a SB, 在 不 同 温度 下 , Uae YB He Sk HD BE, HY la 7h RE, A SR 现 的 颜色 来 币 断 。 O 由 于 酶 的 活性 不 同 ， 保 温水 解 最 适合 的 时 间 不 同 。 ales rien 确定 保温 时 间 。 一 般 10O—15 分 钟 较 适合 。 实验 三 十 七 p 联 对 酶 活性 的 影响 9 M3 XRES INTE AIH 2 毫升 。 向 第 工 第 2 两 试管 中 ， AIAG Me 1 St, AHS 号 试管 中 添加 孝 过 的 稀释 唾液 1 毫 Ft. MAR, 将 第 工 第 3 两 试管 放大 37*C 恒温 水 浴 中 , 第 2 号 哉 管 放大 冰 水 中 。 20 分 钟 后 取出 ， 用 碘化钾 - 碘 涛 液 来 检 内 淀粉 被 唾液 酶 水 解 的 程度 。 刀 录 并 解释 精 果 。 (2) 温 度 对 脲酶 活性 的 影响 : 脲酶 催化 尿素 水 解 生成 Ns 和 CGO;，NHs 可 与 Nessler KRHA REEL, Hee 深浅 , 可 看 出 反应 的 进行 程度 。 MAE 4, 11, 第 2 和 第 3 三 个 试管 中 各 加 脲酶 提取 液 工 毫升 ， 在 第 4 号 试管 中 加 预先 着 过 的 脲酶 提取 液 工 毫升 。 将 第 2 号 试管 放 在 冰 水 里 5 分钟 ， 使 其 渝 却 。 最 后 向 和 支 试管 内 各 加 工 毫升 开 % RRM, BA, BHI 4 两 试管 放置 在 室温 下 , 第 3 号 试管 放 在 50°C 恒温 水 浴 中 , 第 2 号 武 管 仍 放 回 冰 水 中 。 10 分 钟 后 , 取出 第 2 和 第 3 两 管 , 并 用 水 管 流水 冲 痊 至 室温 。 向 4 个 试管 中 各 加 Nessler 试剂 5 滴 , AKA. MRA Me A Riz, 实验 三 十 七 ”pH 对 酶 活性 的 影响 MOISE, SAM pH 的 影响 极为 显著 。 通 常 只 在 一 定 的 pH 范围 内 , 酶 才 表 现 它 的 活性 。 一 种 酶 活 ERR pH 值 为 该 酶 的 最 适 “ pH。 低 于 或 高 于 最 适 pH 时 酶 的 活性 渐次 降低 。 应 当 指 出 , WENO BG pH se “ 底 物 性 质 和 办 冲 液 性 质 的 影响 。 图 8 KRAMER MES pH 5 eC ae Te ;, H WI Re 图 8，pH XPM 不 同 酶 的 最 适 DH ff ATA, (BG 活性 的 影响 。 ， = \ 92 BHT MM ARIE TE AT WLR te EB LY pH 似 有 一 致 关 系 。 例 如 高 等 动物 的 胃 蛋白 酶 最 适 pH 为 工 5 一 2.5, 而 胃液 的 PH 与 此 相近 。 胰 蛋 自 酶 的 最 适 p 也 为 8 堪 右 ， 而 十 二 指 肠 附 近 肠 道 的 p 也 值 近乎 中 性 ， 本 实 奏 使 用 唾液 淀粉 酶 来 说 明 DH 对 酶 活性 的 影响 。 唾 液 演 粉 酶 的 最 适 pH 网 为 6.8。 有 人 发 现 , ERRE MRM, RE pH 为 6.4 一 6.6, 而 在 酷 酸 缓冲 溶液 中 则 为 5.6。 BM (DRKERRER (DHE; (38) 2 毫升 和 5 训 升 吸 量 管 ; (4)50 毫升 雏形 瓶 ; (5) 恒 温水 浴 人 锅 。 试剂 (1) 新 配制 的 ， 溶 于 0.3%Nacl 的 0.5% te wim: (2) 稀 释 200 倍 的 新 鲜 唾 液 ; (3)0. 2M we Re — Sie Sar 1M 棒 檬 酸 溶液 ; (5) BL SRA ee, 操作 取 8 个 标 有 号 码 的 50 SIMI, HEE PH 比例 添加 0.2.M Be eR A — Sh YI Fn 0.1 M HRI, He pH 5.0—8.0 的 8 RRB IPR, HS PHEW 3 毫升 ,分 别 注 入 8 支 带 有 号 码 的 试管 中 。 随 后 于 每 个 武 管 中 , 添加 0.5 匈 淀粉 溶液 2 毫升 和 稀释 200 fF MME 2 毫升 。( 增 加 一 个 与 所 号 内 容 相同 的 试管 ， 作 为 检 验 演 粉 的 水 解 程度 )。 向 各 试管 加 大 稀释 置 液 的 时 间 间 隔 各 为 1 分 钟 。 将 各 试管 内 容 物 混 与 ， 关 依次 置 于 37°C WIE 10 分 钟 后 ( 视 酶 的 活性 而 定 ， 一 般 5 一 10 分 钟 )， 每 隔 工 分 钟 由 第 三 号 试管 之 一 , 取出 一 滴 混 合 液 ， 置 于 自 磁 板 上 ， 轴 三 水滴 而 FESR TES TOE, 检验 淀粉 的 水 解 程度 , 俊 实 验 糙 果 成 为 橙黄 色 时 (学 担 第 5 管 的 水 解 程度 是 本 实验 成 败 关键 之 一 ), RAT RE J 1 一 2 滴 碘 化 钾 - 碘 溶液 , 充分 混 与 。 加 碘化钾 溶液 时 间 问 隔 , 由 第 1 HI, 也 均 为 1 分 钟 。 根据 各 试管 内 容 物 呈现 的 颜色 ， 可 以 看 出 pH WF me ee BED Hs 活性 的 影响 。 a eS ee ee 实验 三 十 八 AG MEY ce TE Bt Be ' 98 SERS | 0.2M 磷 酸 氨 二 钠 (毫升 ) | 01M Rm (毫升 ) pH 1 5. 15 4. 85 5.0 2 6.05 3.95 5.8 3 6.61 3.39 6.2 4 7.28 2.72 6.6 5 7.72 2.28 6.8 6 8.24 1.76 7.0 7 9.08 0.92 7.4 8 9.72 0.28 8.0 实验 三 十 八 _ 脂 肪 酶 的 定性 试验 脂肪 酶 能 催化 水 解 脂肪 成 甘油 与 脂肪 酸 。 脂 肪 酸 的 生成 可 用 酸 碱 指示 剂 来 检验 。 牛乳 中 的 脂肪 分 散在 水 相 中 呈 乳 状 液 , 容易 被 脂肪 酶 水 解 。 本 实 欢 观察: (1) 胰 脂肪 酶 对 后 我 中 脂肪 的 水 解 作用 。 (2) 葛 麻子 脂肪 酶 对 草 询 油 的 水 解 作用 。 镭 离子 对 此 酶 有 激 活 作用 。 器 材 (1) RERMEB (2)10 SHE; (3) 1 毫升 和 2 毫 FERAL; (4) FL Sk Fs (5) 剪 刀 ; (6) 恒 温水 浴 钢 。 试剂 〈1) 牛 乳 ; (2) 新 鲜 猪 (或 牛 ) 胰腺 ; (3) 甘油 水 溶液 《1:3) (A)O.LN 气 氧 化 钠 深 液 ; 〈5)1% 酚 本 酒精 溶液 ; (6) Sih F. 操作 CLR Am ae, SIRNA es i MA, BY WE, PRIMER 5 oh, TFL, MMAR 10 Tt, TFA 磨 成 糊 状 。 用 浸 湿 的 麻布 将 提取 液 滤 入 试管 内 。 另 取 2 支 试管 , 各 加 2 毫升 牛乳 和 工 毫 升 胰 提取 液 。 将 一 试管 0b 2 一 3 分 钟 。 堆 后 用 自来水 冲 渝 。 向 2 支 试 管内 各 加 2 滴 工 % 94 Sh Bi ADK, FELL OLN SAAACSN Yea HP A AB Se RL ES CAS ESL AL). FAA IESE RAE, Hi 37—40°C teil 7k i +P Rid Pb Ay, DAL WS PE A ES AY ek, 并 记录 时 间 。 (2) REE iF 5 一 10 粒 , 间 去 外 皮 。 加 5 毫升 甘油 水 溶液 二 仔 MU RR, DHA 2 AE, 将 一 试管 者 沸 5 分 钟 , Aa BK Ai. JERR ETA BT | | 实验 三 十 九 “ 握 化 酶 的 定性 反应 氧化 酶 能 催化 分 子 氧 直接 氧化 底 物 。 酯 氨 酸 酶 为 生物 界 分 布 很 广 的 一 种 氧化 酶 ， 它 催化 酷 氨 酸 被 氧 所 化。 在 马 偷 昔 块 节 的 外 层 、 甜 菜 和 谷物 及 芙 菌 中 含量 都 很 高 。 酷 氨 酸 酶 特异 性 不 甚 严 格 , 能 促进 多 种 单 酚 及 多 酚 的 氧化 作用 。 在 弱 碱 性 环境 中 , 其 活性 最 强 。 酷 氨 酸 等 酚 类 衍生 物 ， 受 栈 氨 酸 酶 的 催化 氧化 先 形成 红色 色 素 , 然后 继续 氧化 生成 黑色 素 类 物质 。 一 部 分 反应 过 程 如 下 : BF nacre +40, HO—“ )—CH,—CH—COOH Ce sak ea Y RB =e 0 一 NH, LPS N’ rae = y= AR Re —-2H 一 一 0 一 -人 -一 cH， 机 | 二 = Yb Rms TRUCK B= ACM) EE Y5 从 红色 素 转 变 为 黑色 素 不 需要 酷 氨 酸 酶 。 在 没有 酷 氢 酸 酶 存 在 时 , 空气 中 的 氧 即 能 导致 这 样 的 转变 。 栈 氨 酸 酶 能 催化 仿 创 木 脂 中 的 态 创 木 酸 氧化 ， 生 成 划 色 的 臭 氧化 物 。 rok 7 -CHg etude eee YY \4 全 全 A WA | Aik I i, ar ain O CHs O-CHs PO 5 all AR 本 实验 利用 此 颜色 反应 , 作 酷 迄 酸 酶 的 定性 鉴定 。 器 材 〈1) 试 管 及 试管 架 ; (2) 乳 钵 及 杆 ; (3) 小 刀 ; (4) SNK 斗 ; (5) 恒 温水 浴 钢 。 试剂 “〈1) 生 马 锥 昔 ; (2) 深 于 0.01X 碳酸 锁 的 05 多 酷 氨 酸 VAM; 〈3) 仍 创 木 脂 酒精 溶液 ta。 操作 (1)EUAE AS Sh MEY 5 克 , 用 小 刀 去 皮 后 切 成 碎 块 。 放 不 和 乳 钵 中 , 加 燕 饮水 狗 10 毫升 , 研 碎 并 将 提取 液 过 滤 。 LH) 3 毫升 05 多 酷 氨 酸 溶 液 ， 借 大 试管 中 ,加 局 锥 鞋 提取 液 #0 1 ETE, BALA 35—40°C ZAI HRI, REDE, ize FEY 5 SWE: hh, UE PVA Wo RAL, RAL, 最 JS IB C8 (499 1-2 小 时 )。 (2) 764: 55 RSE Oe LI AAR MA, EE 现 。 在 切片 边 称 接近 表皮 处 ， 蓝 色 应 较为 显著 。 用 都 熟 的 马 铃 昔 96 第 五 章 酶 实验 四 十 “ 粗 胞 色素 和 移 胞 色素 氧化 酶 的 定性 反应 Sun 6, SK A A LC, HG ca, Lc 等 是 含有 铁 中 啉 辅 基 的 细胞 中 的 色素 。 它 们 参加 生物 氧化 作用 。 在 氧化 过 程 中 ， 它 们 分 子 中 的 铁 的 化 合 价 不 断 发 生 改 变 (Fer++=Fett)。 氧 化 型 站 胞 色素 (Fer+*+- 细 胞 色素 ) 可 以 氧化 还 原型 黄 酶 的 辅 基 (EMN 和 FAD), 而 本 身 变 成 还 原型 租 胞 色素 (Fe). ILE 氧化 酶 可 以 氧化 还 原型 多 胞 色素 ， 还 原型 租 胞 色素 氧化 酶 还 可 以 将 电子 交 和 给 氧 。 作 用 图 解 如 下 。 ik - Hy oe 2Fe** 1/20, e MN HK BS 和 细胞 色素 氧化 酶 底 物 [2H+ 2Fe** oFett+ | o-- 2H+ 二 O-- mice M4 LE WR TE AA A Ni CHE A A. 色素 A A A, 28 His PURE AS — He, SUA AA CSS A A ae 2 J dT pd | (“Nadi” Jz hi), OH NH, O One 46 | y 2970) NEAR NH» n= N= oF Es MeL P| AAA Fe Hed C8, Ss ACT Ge 3 DE 4ST, Ae 在 时 , 35 Dik 2 An td C8, He A YE, BORE, “Nadi” ie | i d+ — le a ie ee a 97 可 以 不 断 地 进行 。KOCN 抑制 细胞 色素 氧化 酶 。 am KRM, 试剂 〈1)1%o- 蔡 酚 酒精 溶液 ; (2)1% 对 葵 二 胺 水 溶液 ; (3) 0.01MKON 溶液 ( 剧 毒 ! )。 操作 “” 取 二 表面 亚 , 各 加 一 块 肝 切 片 (或 肌肉 或 马 答 蔓 切 片 )。 在 一 个 表面 亚 的 切片 上 加 几 滴 0.01MKCN 溶液 , 再 在 两 表面 正切 片上 各 加 几 滴 cx- 蔡 酚 酒精 浴 液 -对 葵 二 胶水 溶液 的 等 体积 混合 液 。 如 有 蔓 色 出 现 , 则 说 明 有 稍 胞 色素 和 细胞 色素 氧化 酶 存在。 实验 四 十 一 “琥珀 酸 有 氮 酶 活性 的 测定 以 腊 氨 方式 使 物质 氧化 的 酶 ， 称 为 腊 气 酶 。 焉 珀 酸 脱 氢 酶 是 三 羧 酸 循环 中 的 一 个 酶 , 能 促使 下 珀 酸 腊 氨 成 为 反 丁 烯 二 酸 , FE WB Fa SAR BB ES, AME ESE, ESR HE ok RA RTC AA. COOH a COOH CHe | O+ 二 MB —> HC CH, FRE || +MB-2H | CH Ht COOH | HOOC 琥珀 酸 KT Moe FE FEA SEP, Be SEAR BE SWANS 0 TR FP ES SEE TE Ve (EE at FP rE Sa a BT 9 BB, 可 以 用 来 表示 酶 的 活性 。 AB SK Nii FAR ie Be Ns lsc TOA EO, GARE, PTAA A ei i BB Vo 器 材 (AERA (2) ARE; (3) 1 毫升 和 2 训 升 吸 量 管 ;\4) 烧 杯 。 @ 如 不 用 琉 脂 , 可 以 用 液体 石 螨 封 盖 反应 液 面 , 或 使 用 hunberg 管 。 68 Bam 试剂 (1)0.01% PRR; (2)0.02M RE Mee (Fn Bl Ot A ERE PE); (3)2 0 RRA; «(4 WL Be YE 取 2 支 试管 ,各 加 0.02M HETABR MK 0.5 SF, 0.01% HAG RE ie 1 SET AN 45°C 的 2% 琼脂 洲 液 2 毫升 。 再 分 别 加 多 0.5 Ge WL Al BE PA ak YL A BE. HE Sa, FE a HI, EBB RE We, HERE RCA 37°C 7K PPR, BY OO Be Ht a ae AER et 程 和 时 间 。 实验 四 十 二 ”过 氧化 物 酶 的 定性 反应 过 氧化 物 酶 能 催化 过 氧化 氨 对 某 些 物 质 的 氧化 。 过 氧化 物 栈 的 特异 性 不 其 严格 , 各 种 多 酚 或 芳香 族 胺 均 可 在 此 酶 作用 下 , 被 过 氧化 氨 氧 化 。 伍 创 木 脂 中 的 伪 创 木 酸 可 被 氧化 成 为 艺 色 的 合 创 木 酸 呈 氧化 物 ， 焦 性 没食子 酸 ( 邻 葵 三 酚 [CeHs(OH)s]) 则 被 氧化 生 成 橙 和 红色 的 焦 没食子 橙 沉淀 。 Ai Gs ; eek i ESR S-on 一 一 Ho_ AN Ti apes =) 焦 没 食 子 本 AS tT HE i a Se LF Ht LA et (LR RR; (2) 2 和 5 毫升 吸 量 管 。 试剂 〈1)0.3%% 焦 性 没食子 酸 水 溶液 ; (2)2% 过 氧化 氨 深 液 ， (3) 白 荣 提取 液 se; (4) 熏 创 木 脂 酒精 溶液 ca， 操作 (CD 加 自 荣 提取 液 攀 5 毫升 于 就 管 内 ， ih 2 一 3 分 钟 ， 后 , 渝 却 。 取 4 支 标 有 号 码 的 试管 , 各 加 0.3-% HE EYE PERE RY 3 BE 升 。 第 工 试管 , 加 2% 过 氧化 氨 2 HE AEM 2 毫升 ， 第 2 试管 ， KROES eA a EE 99 MM ARGRK 22H. HSA, I 2% WAM 2 RARE Ri 2ST. BAM, M2% WAS 2 ARAM ARIE 液 2 毫升 。 斤 匀 后 , MRA ae eS A eA EY HB 《2) 取 城管 2 支 ， 各 加 僵 创 木 脂 溶液 及 2% WAIL ARIK 0.5 tt. Aa WMA BARGER MA AREER Li. SSFP AL Ae Ha AE ~ 实验 四 十 三 “过 氧化 氨 酶 的 定性 反应 在 生物 机 体内 ， 某 些 代 谢 物 由 于 需 氧 脱 氨 的 烙 果 而 产生 对 机 体 有 毒害 作用 的 过 氧化 气 。 过 氧化 氨 酶 能 俊 化 过 氧化 氨 分 解 成 水 和 分 子 氧 。 因 此 , 过 氧化 氨 酶 具有 保护 生物 机 体 的 作用 。 过 氧化 氨 酶 按 其 化 学 本 质 属于 复合 蛋白 , 其 辅 基 是 血色 素 。 在 催化 过 程 中 , 一 分 子 过 氧化 氨 酶 先 与 一 分 子 过 氧化 氨 精 合 。 生 成 的 中 间 产 物 记 有 过 氧化 气 酶 作用 , 也 有 过 氧化 物 酶 作用 ; 能 催化 另 一 个 过 氧化 氨 分 子 分 解 生成 水 和 氧 分 子 , 也 能 氧化 甲醇 成 为 甲醛 。 在 机 体 中 , 过 氧化 氨 的 省 度 很 低 , 过 氧化 氨 酶 可 能 主要 起 过 氧化 物 栈 的 作用 。 < (十 了 2O) HO: Fe--+ees Fe-OH HO: Fe---:-- Fe-OH | 过 氧化 气 酶 中 间 产 物 HO: Fe……: Fe-OOH a: +H;0 分 迅速 | (+40; HO- Fe--+++-Fe-OOH am HO 。He.。。。。 He- OH +Ox HO: Fe。。 Fe-OH ih AE 1S HE ET Oh HL ETRE EA, 最 适 温 度 为 O—10°C, 100 第 五 章 酶 器 材 ”试管 及 试管 架 。 试剂 〈1)2% 过 氧化 气 溶 液 ; (2) 新 鲜 猪 肝 麻 ;3) 生 马 铺 昔 。 操作 (1) 取 2 支 试 答 , 各 加 3 SH PACH 2WtALAK 液 。 向 工 支 试 管 中 加 磨 碎 的 新 鲜 猪 肝 麻 少许 , 向 另 工 支 试管 中 加 狗 等 量 的 , 考 过 的 猪 肝 糜 。 观 察 有 无 气泡 放出 , 特别 注意 肝 麻 的 周围 。 (2) 用 生 马 验 昔 和 熟 马 验 蔓 重 复 以 上 实验 。 可 用 马 铺 昔 糜 浆 ; 也 可 用 马 欠 昔 小 块 。 实验 四 十 四 黄 酶 的 定性 试 骏 HE LURE (PMN 或 FAD) 为 辅 基 的 复合 蛋 自 质 一 黄 素 蛋 白 。 某 些 黄 酶 还 含有 铁 、 铜 或 钼 。 分 子 中 核 黄 素 部 分 能 与 氢 原 子 可 逆 地 灶 合 , 从 而 起 递 毛 作用 : CH2(CHOH);CH.OH ANN YN Hse C=0 | +2H pe HO NAGA -2H : : ee ; 再 ibe NV Ny N BO’. AN AQ? = Pe i). 属于 黄 酶 的 有 : 能 使 还 原型 辅酶 (Cof.Hs 和 Coll Hy) BR AL HY 黄 酶 、 氧 化 黄 嘎 哈 成 尿酸 的 黄 嘎 喻 氧化 酶 .氨基 酸 氧 化 酶 等 。 牛 怨 中 的 黄 味 哈 氧 化 酶 能 催化 水 合 甲醛 把 氨 交 给 甲 烯 划 。 Ee ee as wa 和 Le EE EE ——S 实验 四 十 五 ”碳酸 栈 酶 的 定性 试验 101 H H-C 2CHsOHOHCOOOH 糖 元 和 乳酸 糖 元 酵 解 作用 是 糖 供给 组 织 能 量 的 一 种 代谢 过 程 。 在 有 氧 条 件 下 , 组 徐 内 糖 元 酵 解 作用 即 受 抑止 , 而 有 氧 氧 化 则 为 代谢 的 主要 涂 径 。 糖 元 可 用 淀粉 代替 。 106 BATE PLE MH JHVAS Gy 5 A AED UL A He BO AS HEE), 可 以 在 有 氧 条 件 下 , 进行 酵 解 作 用 的 实验 。 wise HO EI He UT PIG cA, a a PUES WEA 4h EAE RAY CO, TERRE SE AR, FURS HAR IETS MIZE RAE, a 5 RP A, BBA 4™ —0—CHs [3 ae Hae ae 器 材 (1) EMRE CPA); (2) 1 STH, 2 毫升 和 10 毫升 吸 量 管 ; (3) 试管 及 试管 架 ; (4) 漏 斗 ; (5)10 毫升 量 简 ; (6) 天 平 ; (7) 恒 温 箱 。 试剂 〈1) 新 鲜 肌 肉 提取 液 c93; (20.4 碳酸 氨 钠 溶液 ; (3) 4% 淀粉 溶液 ; (4) HAR; (5) 氢 氧化 人知 ; (6) 亿 和 硫酸 铜 溶液 ;(7) 省 硫酸 ; 图 9， 发酵 管 。 〈8)0.125% 白 蔡 芦 素 ( 无 水 酒精 溶液 )。 操作 “ 取 2 支 发 酵 管 , 各 加 新 鲜 肌 肉 提 取 液 8 毫升 。 另 取 1 支 发 酵 管 , 加 考 沸 过 的 肌肉 提取 液 8 毫升 。 向 第 工 发 酵 管 中 , 加 2 训 ” 升 蒸 饮水 (对 照 ); 向 第 2 和 第 3 发 酵 管 中 各 加 2 EFL SHI 液 和 6 一 8 滴 甲 葵 。 混 匀 ( 为 便于 混 久 ， 以 上 操作 可 在 3 ERED 进行 。 混 匀 后 , FEA 3 支 发 酵 管 中 )。 倾 儿 发 酵 管 ， 使 液体 充满 WE, 切 勿 使 臂 管内 含有 气泡 。 以 棉花 小 球 堵塞 管 口 ， 放 大 37°C 恒温 箱 中 保温 。 24 小 时 后 , 取出 发 酵 管 , 注意 各 管 臂 管 中 有 无 气体 ， 上 比较 并 解 释 产 气量 〇 | | QD FE A wb AY LP BE , 酵 解 酶 体系 已 被 破坏 。 发 酵 管 内 不 应 有 和 乳酸 产生 ， 甘 管 中 也 不 应 有 显著 量 的 二 氧化 碳 积累 。 在 实验 中 , MERA, KAR 生物 污染 的 新 鲜 肌 肉 提取 液 , TEE SR, 实验 四 十 九 “发酵 过 程 中 无 机 磷 的 利用 107 — ARERR MARES. 与 省 硫酸 小 心地 共 热 时 ， 乳 酸 转 变 成 乙 醛 。 己 醛 与 白 获 芦 素 发 生 反 应 ， 生 成 征 色 的 精 合 物 。 糖 、 丙酮 酸 和 甲醛 也 发 生 类 似 的 反应 2。 为 了 检定 和 乳酸, 必须 除去 溶液 中 的 糖 和 和 蛋白质。 为 此 , 取 各 发 酵 管 的 滤液 所 毫升, 分 别 放 大 3 支 试管 。 向 各 试管 内 加 硫酸 铜 溶液 工 毫 升 , RS; 再 加 所 氧化 钙 粉 未 0.5 克 ;, 用 力 振 落 。 因 皮肤 上 有 乳酸 , 振 落 时 , 勿 使 手指 接触 液体 。 放置 30 分 钟 , 并 不 时 振 落 , 使 糖 沉 演 完全。 过 滤 , 除去 沉淀 。 取 上 述 三 种 滤液 各 0.5 SH, 分别 加 大 另外 3 LR, BRE Boke 中 , 用 量 简 量 取 省 硫酸 15 毫升 , 徐徐 加 入 ,同时 不 断 地 振 菏 试管 。 此 时 ， 溶 液 应 无 色 透 明 。 如 果 省 硫酸 加 得 太 快 ， 深 液 温度 急剧 上 升 , 由 乳酸 生成 的 乙 醛 或 被 氧化 成 乙酸 ， 或 挥发 , 精 果 一 部 分 乳酸 损失 。 将 加 完 汉 硫酸 的 3 支 试管 , 一 起 放 太 沸水 浴 中 者 十 分 钟 ( 准 Bi). Mia, WBA AH, Sis RM Kw A i. HS. FRITH 20 分 钟 后 ,比较 和 记录 各 管 溶液 的 颜 色 ( 见 106 页 的 注 ), 并 解释 烙 果 。 实验 四 十 九 ABT PABA ERE EPR AAG SEER CRORE, REE AE IVE J 19 SE RAR 7 RASTA, SEM A IL PEAR, ERMA, HN CREME, A POR, PEG De ta wR HT Ai AE TOR AL IL, a LA AY EL RT 观测 。 BeMRG SARAH YF Ae CBRNE NY HE Ay, 后 者 能 被 o- 2,4 RAED MIN ROE. HNL, WHE TCL. 器 材 (1) RA (DRE RRERs (8) 1 毫升 和 5 毫升 吸 量 管 ; (4) 漏 斗 ; (5)10 毫升 刻度 离心 管 ; (6)100 RETA ARI; (7) 恒 温水 浴 钢 。 108 MAK PR a : 试剂 (1) Mt AIR"; (2) HF Ae EE; (3) HEHE (4)5% 三 氧 酷 酸 溶液 ; (5)5N We Re A 2.5 % SARS TAIRA HE; (6)a-1, 2, 4-2 Be PES we AYA, ee PRULHI 2 克 酵 母 , 置 于 和 乳 杀 内。 加 荆 克 蔗糖 ,所 毫升 水 Al 5 St MRAM, FTMES. AREER 1 SHHSMs i, RPA CAR 1). M3 毫升 三 氯 醋酸 。 的 匀 。 把 剩余 的 县 泽 液 移 人 另 一 试管 ， 并 在 37°C inka PPR, FER 30 ~ MH 1 SHAM, sem 3 K (RE 2,3 Fl 4). RRB, ERADRAAE PRAD. 取 册 后 ， 立即 加 大 3 毫升 三 气 酷 酸 溶液 。 将 4 个 试 样 分 别 过 滤 ， 了 到 滤液 各 工 训 St, AFIOSHARAAN, AMBRE, MMMM 1S Ft, BAI SHAL ASA. IM 2.5 毫升 钥 酸 化 溶液 和 0.5 这 Ft a-1,2,4- BicAM RAR, Hoa, W155 分 钟 。 比 较 SEE GME. WARM, 随 着 发 酵 过 程 的 进行 ,反应 混合 物 中 无 机 磷 含 量 逐 渐 减 少 。 实验 五 十 ”脂肪酸 的 氧化 ” 根据 8- 氧化 学 议 , 机 体 组 线 能 使 脂肪 酸 氧 化 生成 乙酰 辅酶 A。 iat CRM A A ti a ROR OR. ERA, CEC RAT I RH: SC PAAR, LAY BRE ee B-FET MR. CRC, BRET RA 酮 总称 为 酮 体 。 酮 体 为 机 体 代 谢 的 中 间 产 物 。 在 正常 情况 下 ， 基 eMedia 血 中 酮 体 含 量 境 加 ， 尿 中 也 能 出 现 酮 体 。 Ae SN FAB EE EO 与 丁 酸 保温 ， 生 成 的 丙酮 可 用 夏 优 反应 来 测定 “"。 在 碱 性 条 件 下 , 丙酮 与 碘 生 成 碘 仿 。 反 应 式 如 于 : 中 APBE Sr RE. CTR AN AY I, 去 失 氧化 脂肪 酸 的 能 力 。 | ERE we WRIA IL 1) 109 2Na0OH + I,.=-NaOlI+ Nal+H,O CH,COCH; + 3NaOI<—=CH I + CH,COONa + 2NaOH 剩余 的 碘 , AY Fas STE NaOI+ Nal +2HCl——1I,+2NaC1+H,O 工 > 十 2NaoSoOD3 运 -一 NaoS4(0)6 +2Nal AS Tein 2 AF in 45 fied ET AR BVA RE AY Oe CN eM HE, BY ST 酸 氧 化 生成 的 丙酮 量 。 器 材 《1 玻璃 四; (2) 50 ESTE IA; 《3) 试 管 及 起 管 架 ; (4)2 SEF AN 5 毫升 吸 量 管 ;\5) 漏 斗 ;06)5 毫升 微量 滴定 管 ;(7) 草 刀 和 和 钥 子 ;(8) 天 平 ; (9) 恒 温水 浴 钢 。 试剂 (1)Locke 撕 溶 液 s0; (2), M BERR Me (DEL=7.6); (3)0.5N TRY IR”; (4)15 % = AMMA TK; (5)10% BAL HE 液 ; (6)10% 盐酸 ; (7)O.1N 碘 深 液 42; (8)O.1N 硫 代 硫酸 钠 溶 We"; (9)0.1 狗 淀粉 溶液 。 操作 “用 重 物 击 紫 动 物 (家 更 、 大 和 鼠 或 豚鼠 )， 工 迅速 把 血 帮 JQ, HUH ATW, 在 玻璃 下 上 剪 成 碎 麻 。 取 50 毫升 锥 形 狐 两 个 ， 各 加 3 毫升 Locke 氏 溶 液 和 2 毫升 pH=7.6 磷酸 组 冲 液 。 在 一 锥 形 阁 内 ， 加 3 毫升 05XN TRA, 另 一 雏形 狐 作 对 照 。 WH) 0.5 HATA (ESR), ae SEB IRA, IS. 76 37°C HKSAR. | ARE ONE, 取出 锥 形 瓶 , 各 加 入 2 EPS, TEER 瓶 中 加 入 3 毫升 0.5X 丁 酸 。 BS, MB1S 分 钟 后 , 过 滤 。 另 取 PIMEIIA, SWRA 5 EFT VE MR, 5 EF OLN 碘 溶液 和 5 毫升 10% BALSA. HAR, M10 Sh, MAS BF 10% 盐 酸 , 用 0.1X HRA ERA. 滴 至 浅黄 色 时 ， 加 入 3 滴 淀 粉 深 液 作 指示 剂 。 的 匀 并 继续 滴 到 蓝 色 消失 。 衣 录 滴 定 样 唱 110 BAM Mehta $5 eh A TF te 4 Wt SN HY PEF, FEY BRE ih HP PG > ALO, 实验 五 十 一 “氨基 移 换 反 应 (一 ) 谷 丙 氨 基 移 换 酶 活性 的 测定 四 (光电 上 比 色 法 )9 氨基 移 换 酶 也 称 转氨酶 ， 为 广泛 存在 于 生物 机 体内 的 酶 。 其 作用 为 催化 o- 氨 基 酸 的 o- 氨 基 与 o- 酮 酸 的 w- 酮 基 互 换 。 因 此 ， 在 氨基 酸 的 合成 和 分 解 ， 尿 素 和 嗓 哈 的 合成 等 中 间 代 谢 过 程 中 有 重要 作用 。 转 氨 酶 的 种 类 甚 多 , 任何 一 种 氨基 酸 进行 转 氮 作用 时 ， 都 由 其 专 一 的 转氨酶 催化 。 它 们 的 最 适 pH 接近 7.4。 在 各 种 转 氧 酶 中 ， 谷 氨 酸 - 章 酰 乙 酸 转氨酶 (简称 谷 章 转氨酶 ) 及 谷 氨 酸 -丙酮 酸 转 氨 酶 (简称 谷 丙 转氨酶 ) 活 力 最 强 。 它 们 催化 的 反应 如 下 : COOH COOH COOH COOH CHe | a CHs | CH, 谷 章 转氨酶 | CH. CH 二 CH Hg C=O | HC—NH, COOH | OOH COOH COOH o- Kd Row Pe 谷 氨 酸 草 酰 乙酸 D HAG LEA OLN 硫 代 硫酸 钠 相 当 的 丙酮 量 。 再 由 样品 和 对 照 消耗 硫 代 硫酸 钠 之 差 , 计算 样品 滤液 中 的 丙酮 含量 。 Q@ 本 测定 方法 亦 可 用 于 谷 草 转氨酶 活性 测定 。 但 需 注意 以 下 三 点 : 1. 转 氨 酶 底 物 不 是 %- 酮 成 二 酸 和 丙酮 酸 , 而 是 o- 酮 成 二 酸 和 门 条 氨 酸 ， 其 配制 方法 是 取 分 析 纯 w- 酮 成 二 酸 29.2 毫克 , DL- 门 冬 氨 酸 2.66 Fe, AF MMA, 加 IN NaO 互 使 完全 溶解 。 用 1XN NaOH XK 1N HCl 居 p 互 至 7.4 后 , mR Ih He Fz 100 BEF, 最 后 加 氛 优 数 滴 防 腐 。 此 溶液 每 1.0 毫升 含 OM Xe 2.0 微克 分 子 (nm) FA AMR 200 微克 分 子 。 在 冰箱 内 可 保存 一 周 。 2. 由 于 谷 草 转氨酶 在 反应 烙 束 生 成 的 草 酰 乙酸 容 易 自 行 转变 生成 丙酮 酸 。 琴 柄 酸 的 生成 量 与 草 酰 乙 酸 的 量 有 一 定 平衡 关系 。 因 此 ， 也 可 用 测定 丙酮 酸 法 , 计算 谷 章 转氨酶 活性 。 3. 谷 草 转氨酶 活力 的 测定 受 p 也 、 温 度 、 保 温 时 间 长 短 、 样 品 新 鲜 程 度 、 溶 血 等 因 We BE Ml nt | 实 除 五 十 一 ”氨基 移 换 反应 (一 ) tii COOH COOH CH. CHs CHe CHs 谷 丙 转氨酶 | CHe a H-—C—N 2 PANO ed vie + C= oa COOH Cn 2: OOH: | COOH COOH a- 酮 戊 二 酸 RAR 谷 氨 酸 丙酮 酸 上 述 两 种 转氨酶 均 广 泛 存 在 于 机 体 组 积 内 ， 在 正常 人 血清 中 也 有 少量 。 机 体 发 生 肝炎 、 心 肌 栓 死 等 病变 时 , 血清 中 转氨酶 活力 常 显著 增加 , 所 以 在 临床 珍 断 上 转氨酶 活力 的 测定 有 重要 意义 。 测定 转氨酶 活力 的 方法 很 多 , 如 分 光 光 度 法 、 纸 上 层 析 法 及 光 电 比 色 法 等 。 普 逼 采用 的 是 光电 上 比 色 法 。 在 本 方法 中 ， 谷 两 转 氨 酶 作用 了 于 丙 氨 酸 和 wx- 酮 戊 二 酸 后 , 生成 的 丙酮 酸 与 2, 4- 二 确 基 茶 腊 作 用 生成 丙酮 酸 2, 4-— FE SE, COOH 了 N_NHAAN C=O + | | 1 sn NH? +H,0 ONA i \vo, CHs | pay AP ANO。 imine =, 4 RAR, 4-— wae oe RE 丙酮 酸 2, 4—— i BE AE Hh Jn Ah Fg 3 Be. JA PG dD, 4- fia Ze AE be 9 AE ie, 可 以 计算 酶 的 活力 。 器 材 (1) iS (2) MBB; (3) UKIAH; (4) 36 Et. 试剂 (1)0.1M 磷酸 组 冲 液 (pH7.4); (2) 丙 酮 酸 钠 标 准 溶液 (2.0 微克 分 子 /毫升 )” O; (HANA Mw”; (4)2, 4- 二 硝 SEARO”; (5)0.4N SAE, Dn Fe BP Aol Po HE Ph CY BE Ze A TBE), 则 须 重新 配制 。 112 BAT Me Ria RYE WALKERS, 第 上 号 试管 做 为 未 知 管 ， B2SM 管 做 为 空白 对 照管 。 各 加 大 谷 丙 转氨酶 底 物 05 毫升 ， 置 于 37 C TS FS 10 分 钟 , 使 管内 外 温度 平衡 。 取 血清 0.1 毫升 加 入 第 工 号 试管 内 ， 两 支 试管 再 放 太 37°C 水 浴 中 ， 继 续 保 温 60 分 钟 。 整 60 分 钟 时 ， 向 两 支 试 管内 加 大 2, 4-— EER 0.5 毫升 ， 然 后 再 向 第 2 号 试管 内 加 血清 0.1 毫升 ， 再 继续 保温 20 分 钟 。 PRUE 了 时 ， 向 两 武 管 中 各 加 入 0.4N NaOH5 毫升 。 在 室温 下 静 置 30 分 钟 后 , 用 520 毫 微米 滤 光 片 进行 比 色 测定 未 知 管 的 光 密 度 ( 在 显 色 后 30 分 钟 至 2 小 时 内 其 色 度 稳定 )。 用 光 密 度 芒 数 在 标准 曲线 上 查 出 转氨酶 活力 的 单位 数 。 计 算 每 100 毫升 血清 中 转氨酶 的 活 Fi ALR, 标准 曲线 的 给 制 : 取 6 支 试管 ， 分 别 用 0.1.2.3.4,.5 标号 。 按 平 表 所 列 的 次 序 Im & AR: at * 号 zt 齐 一 0 | 1 || 29S oe 丙酮 酸 销 标准 液 ( 毫 升 ) | 0.00 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 谷 丙 转 氨 酶 底 物 *( 毫 升 ) | 0.50 | 0.45 | 0. 40 | 0.35 | 0.30 | 0.25 Wi We Eh ws We (0. 1M, pH. 4) (5p) | 0.10 | 0. 10 | 0.10 | 0. 10 | 0. 10 | 0. 10 * TER GML, 2, 4-— SE DET 5 AA JE Oe Ae RE MN 中 的 OA RRL 5 Be Ae I, 生成 ORE. Ao, Ce RT, 须 加 入 一 定量 的 底 物 (内 含 o- 酮 戊 二 酸 ) 以 抵 销 由 x- 酮 成 二 酸 产 生 的 消光 影响 将 试管 置 于 37 水 浴 中 保温 , 平衡 管内 外 温度 。 向 各 管内 加 加 入 0.4N NaOH 5 毫升。 在 室温 下 静 置 30 分 钟 后 , 以 0 号 管 做 空 D ”在 本 实验 条 件 下 , 每 工 微克 分 子 两 酮 酸 代表 1.0 单位 酶 活力 。 实验 五 十 二 “氨基 移 换 反应 (二 ) 113 白 , 用 520 毫 微米 滤 光 片 进行 比 色 , 让 出 光 密 度 。 以 丙酮 酸 的 微克 分 子 数 为 横 坐 标 , 光 密 度 为 纵 坐 标 , 画 出 标准 曲线 。 实验 五 十 二 ”所 基 移 换 反 应 (二 ) 谷 两 氨基 移 换 酶 活性 的 测定 (HE BPE) 在 前 一 实验 中 已 提 到 , 转氨酶 活性 测定 除 光 电 比 色 法 、 分 光 光 度 法 等 以 外 , WA SELB OTK. 用 颖 (常用 滤纸 ) 作为 情 性 支持 物 的 层 析 法 叫做 纸 上 层 析 法 。 此 法 已 发 展 成 为 生物 化 学 研究 和 生产 实际 中 的 一 项 重要 而 简便 的 分 析 方 法 &9。 层 析 溶剂 是 由 有 机 溶剂 和 水 粗 成 ， 当 有 机 溶剂 和 水 部 分 互 溶 时 , 即 分 成 二 相 :一 相 是 以 水 饱和 的 有 机 溶剂 相 ,一 相 是 为 有 机 深 齐 角 和 的 水 相 。 滤 力 积 维和 水 有 着 较 强 的 亲和力 , 而 与 有 机 溶剂 则 亲 A EHS, 因此 滤 颖 可 以 看 作 是 含有 静止 水 相 的 情 性 支持 物 。 水 相 因此 称 为 静止 相 ， 有 机 相称 流动 相 。 当 有 机 相沿 猎 流 动 经 过 层 析 点 时 , 层 析 点 上 溶质 便 在 水 相 和 有 机 相 之 问 进 行 分 配 , 有 一 部 分 深 质 离开 原点 随 有 机 相 移动 , 而 进 大 无 溶质 的 区 域 , 这 时 又 重新 进行 分 配 ， 一 部 分 溶质 从 有 机 相 移入 水 相 。 当 有 机 相 不 断 流动 时 ,溶质 也 就 不 断 进 行 分 配 , 沿 着 有 机 相 流动 方向 移动 。 溶 质 中 各 种 不 同 粗 份 的 移动 速率 不 同时 , 就 可 以 彼此 分 开 。 溶 质 FE HG + sh Hy AAT LR, 值 表 示 ( 图 10): F p,— RSE Rh DT A 原点 到 溶剂 前 沿 的 距离 B 不 同 物质 在 一 定 条 件 下 ， 有 其 特异 的 R, a fa. Rs (AWK) SOREN, WHA B10. Bera, Ys FM) Ba ie 层 析 点 114 BAR MRA 统 , EP UE BCH Wi Hh, 层 析 温度 等 因素 有 关 。 本 实 三 利用 滤纸 层 析 法 检查 由 谷 氨 酸 和 丙酮 酸 在 谷 琴 转 氛 酶 的 作用 下 所 生成 的 丙 氨 酸 来 证 明 转 氨 作 用 。 器 材 〈1)50 毫升 雏形 瓶 ; (2)1 毫升 和 2 毫升 吸 量 管 ; (3) 漏 斗 ; (4) 试 管 及 试管 架 ; (5) BT) GAT; (6) TUK IA A; (7) FA 试管 (直径 20 毫米 , 长 200 EK); (8) CHM (9) RAVER CH 15 毫米 , K 150 SK); (10) HEA; CLL) RZ Ze. 试剂 CLA RBA; (2) SARA 11 2 /EF); (3)0.1 7 BERRA STA tks (4)15 % = AM; (5) 2M 1B 液 ; (6) BYE FO; (70.1% EHS MAHAR; (8) PREPS ARR (0.04%), 。 操作 “ 取 4 个 标 有 号 码 的 雏形 叛 。 在 第 工 号 和 第 4 号 两 瓶 中 加 入 谷 氨 酸 溶液 、 丙 酮 酸 钠 溶液 各 工 毫 升 和 0I 狼 碳酸 和 氨 MR 2 毫升 ,在 第 2 号 瓶 中 加 大 丙酮 酸 销 溶液 工 毫升 和 0.1 % WE SF 溶液 3 毫升 ， 在 第 3 SPAR A BAM 1 SI 01 wR STAI 3 毫升 。 最 后 在 4 POEM AMA 0.5 Ft EM — Uk UE PR YAS 将 刚 杀 死 的 大 鼠 或 更 的 肌肉 在 低温 下 研 碎 。 称 取款 份 , 每 份 各 1 Wd, 分 别 放 入 4 个 锥 形 瓶 中 并 向 第 4 号 瓶 立即 加 大 2 毫升 巧 允 三 所 醋酸 溶液 将 各 瓶 内 容 物 的 匀 后 , IE 87°C 恒温 水 浴 中 保温 ， FEM Hah, FE 1S —2 小 时 后 取出 并 向 第 12,.3 SAMA 2 毫升 15% SRM, RS. KAD 分 钟 以 沉淀 蛋白 质 。 过 滤 , 把 滤液 滤 大 试管 中 。 用 塞 塞 紧 , 放置 于 低温 处 备用 。 和 样品 可 按 下 列 两 种 方法 进行 层 析 : 实验 五 十 二 ，” 氮 基 移 换 反 应 (二 ) 115 (1) WYER CFE 15 EK, 长 160 毫米 ) 4 条 , 分 别 在 其 一 端 用 Wehbe 1 一 4 号 。 不 要 用 手 直 接 接触 纸 条 。 在 其 另 一 端 距 边 符 工 厘米 处 ， 用 谷 笔 轻 画 一 条 与 纸 边 平行 的 底线 ， 用 4 根 毛 网 管 取 以 上 4 个 管 中 的 滤液 分 别 对 号 点 在 滤纸 条 底线 的 中 心 上 ， 毛 组 管 口 轻 轻 触 到 和 纸 面 上 使 滤液 分 别 成 直径 为 2 一 3 SEK 的 贺 斑 (图 11)。 为 使 有 足够 量 PORE in FEU MC LE, 每 一 样品 应 重 Ae 复 点 3 一 4 次 ， 每 次 点 样 后 ， 待 凉 于 “或 用 吹风 机 歇 干 ) 再 点 下 —XK. 在 准备 好 的 干 大 试管 中 , MA 2 SME, HEIL AIA TE 试管 壁 上 (注意 酚 会 烧伤 皮肤 ), 并 将 管 直 立 在 架子 上 。 在 已 点 好 样 的 滤 儿 上端 打 一 孔 , 并 用 线 挂 在 大 城管 塞 的 钩子 上 。 随 后 , HE 条 移 大 大 试管 中 , 不 要 使 滤 约 浸 人 和 人 酚 深 剂 。 盖 上 塞 。 过 30 分 钟 , 再 HEAR ARE E, EAM 2-3 KA 12), ERA SEEDER EAE LE , 将 塞 盖 严 。 待 酚 溶剂 走 到 BS Ue AK Lb tim 2 EK Kb ne oES 1 一 2 小 时 ), RLHHVEBE, 在 100°C 烘箱 中 烘 10—15 分 钟 , 以 除去 酚 溶剂 。 用 喷 Fy ave TH YE A PE 0.1% EG = Aa he YR, 喷 湿 ja, MA 60°C 烘箱 中 10-15 Fh, AER 5S MTR, BRL ERR AEE 点 。 与 标准 样品 〈 标 准 谷 氮 酸 和 办 氨 酸 ， 层 析 操 作 同 样 品 ) 比较 ， 确 定 各 点 是 什么 氨 12. 试管 层 析 装 置 。 ER. 116 BAT Mea pts Ron 13, 1 号 加 有 完全 的 反应 体系 ， 2 号 缺 谷 氨 酸 ，3 号 缺 丙 酮 酸 ,4 号 酶 已 被 巧 % 三 所 醋酸 破坏 。 因 此 ， 只 有 — ite LNBS AM 和 两 氨 酸 层 析 点 。 但 由 于 肌肉 中 有 少量 游离 氨基 酸 13. Bere RAR. ‘WEA AR, 有 时 在 2, 3,4 She GHAR, 比 工 号 要 淡 得 多 。 (Dinette, kit Aer BEB SAB, 其 方法 如 下 。 两 人 合用 滤 和 狐 一 张 ( 寅 415 厘米 , 长 20 厘米 )， 在 其 一 端 距 边缘“ 1.5 厘米 处 用 倘 笔 轻 画 一 条 与 狐 边 平行 的 底线 。 在 狐 上 每 隔 2 悍 米 处 用 欠 笔 点 一 小 点 , 共 9 点 ， 点 外 夯 一 企 径 为 15 毫米 的 小 圆圈 (图 14), 依 上 法 将 样品 (每 人 4 点 ) 和 标准 丙 氨 酸 (1 点 ) 点 在 层 析 应 上 。 点 完 后 , PERE RB, HRA, a 15, BEI, 需 注意 在 两 纸 端 问 留 一 宽 血 ， oe DI es BE fol 7 Ae = OS we 二 BK — 后 放 入 层 析 罩 内 , 如 图 16。 用 被 酚 所 他 和 的 水 (平衡 溶剂 ) 在 衡 20 分 钟 (在 制备 酚 溶剂 时 ， 分 液 漏斗 的 上 层 溶液 即 为 被 酚 所 包 和 的 水 溶液 )。 平 衡 后 , MTOR 上 口 ， 用 带 小 漏斗 的 玻璃 管 “图 14， 层 析 滤 颖 及 尺寸 点 样 位 置 。 加 入 酚 溶 剂 25 毫升 于 层 析 缸 内 。 加 完 后 ， 立 即 盖 紧 塞 子 。 当 溶 剂 前 沿 行 至 距 箔 端 狗 2 厘米 处 时 ， 取 出 凉 于 ， 接 前 面 所 革 方 法 显 色 。 层 析 点 实验 五 十 三 ”氨基 酸 的 生 酮 作用 117 毛 玻璃 Bia BOR 图 415. BRB Barve. | 图 16. 钟 置 层 析 装 置 。 实验 五 十 三 ”氨基 酸 的 生 酮 作用 氨基 酸 在 组 绪 内 的 中 间 代 谢 过程 中 ， 可 转变 成 糖 和 脂肪 类 中 间 代 裔 产物 。 有 些 氨基 酸 是 “ 生 糖 ”的 , 能 转变 成 大 萄 糖 或 糖 元 ; 有 些 是 “ 生 酮 > 的, 能 转变 成 酮 体 。 酷 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、 亮 氮 酸 和 蜡 亮 氨 荚 均 为 生 酮 氨基 酸 。 将 生 酮 氨基 酸 与 肝 粗 绪 混 合 保温 , 即 可 观察 到 酮 体 的 生成 。 酮 体 中 之 丙酮 在 瞪 性 环境 中 , 能 与 碘 作 用 生成 碘 优 。 CH3;COOH3+ 31, +4NaOH——>CHI; + CHsCOONa-+ 3NalI+3H,O Fa 磺 仿 如 果 向 样品 中 加 入 一 定量 的 础 , 与 丙酮 作用 后 , 剩余 的 础 可 用 硫 代 硫 酸 钠 来 滴定 。 I, + 2Na.S2O03—— Na.8.10, + 2Nal 器 材 (1) REAM; (2) 50 毫升 雏形 瓶 ; (3) 2 毫升 和 5 VFM 量 管 ; 4) 漏斗 ;〈5) 试 管 及 试管 架 ; (6)5 毫升 微量 滴定 管 ; OMT PIER; (8) 天 平 ; (9) 恒 温水 浴 锡 。 试剂 〈1) 生 理 盐 溶液 ”3 (2)0.14 亮 所 酸 溶液 ; (3)15%= 毛 酯 酸 溶液 ; (4)10 色 氨 氧 化 钠 洲 液 ; (5)0.1 BPR HO”; (6)10% 118 BAT Met at 盐酸 ; (7) OLN Brite WER HEAR BATA; (8)0.1 多 淀粉 溶液 。 操作 击 头 杀 死 家 更 或 大 鼠 。 立 即 取出 肝 胶 , SRAM, TEAR IP BY joc WE BE 取 两 个 50 EF SET IR. TE—-HETIRA, 加 3 毫升 生理 盐 溶 液 和 3 毫升 O.1M SERRA, ADEA Im 6 毫升 生理 盐 溶液 (对 照 )。 称 取 0.5 Fe FF Aa a BE PS >, Zr Dall he A EI RA. RSE TEA 37°C 恒温 水 浴 内 保温 2 小 时 。 保温 后 , MH HBR, 415% 三 所 醋酸 溶液 2 毫升 ， 混 多 Ja, WPS 15 分 钟 . 过 滤 , 将 滤液 滤 入 试管 内 。 另 取 两 个 锥 形 狐 ,分 别 加 入 5 毫升 滤液 , 5 毫升 OLN BYR 5 EFF 10% BAIL FHS. Hi 10 分 钟 后 ， 加 入 5 毫升 10% 盐酸 和 儿 滴 01% 淀粉 溶液 ,用 OLLI 硫 代 硫酸 钠 深 液 来 滴定 剩余 碘 。 计 算 样 品 中 两 酮 含量 。 参考 书目 (1) 36apcxuii, 5. 开 ,,36apcKkHE, W.B., Conues, A.U., [paxtuxym no 6uouorHyeckoH xumuu,cTp.153 (1954). (2) Baker,S.B., Am. J. Physiol., 129, 305(1940). (3) Koch, F.C.and Hanke, M. E., Practical Methods in Biochemistry, 6% Kd., p. 215(1953). (4) Jowett, M. and Quastel, J. H., Biochem. J., 29, 2143(1935). (5) Quastel, J. H. and Wheatley, A.H.M., Biochem. J., 27, 1753 (1933). 7 (6) ®Mepaman, JI. J]1.u Conun, E.®., [Ipaxtuxkym no Onosormueckok XHMHH, CTp. 97 (1957). | (7) 临床 检验 杂志 , 第 3 期 , 总 135 一 140 A, 19604f. (8) MABE, 蛋白 质 化 学 研究 技术 , 34 页 (1962)， (9) Consden, R., Gordon, A.H.and Martin, A.J.P.，Biochem.J., 38, 224 (1944). OF Poe ”血液 定量 分 析 实验 五 十 四 血清 钾 的 测定 (Clausen, Kramer 和 Tisdall 滴定 法 ) 呈 和 常人 血清 中 每 100 EF, MSH 16 一 22 Sat, 变动 范围 不 大 。 患 肺炎 及 急性 传染 病 时 , 其 量 稍 减 。 血 球 中 之 钾 含 量 较 高 ， 每 100 SFT eI 150—250 毫克 。 因 此 , 制 取 样品 时 , 应 避免 溶血 , 血 清 也 必须 迅速 从 凝 块 中 分 出 , 否则 , 可 能 有 一 部 分 钾 从 血球 渗 人 血 清 。 符 取出 后 , 应 在 1 一 2 小 时 内 将 血清 分 出 。 血 中 的 钾 与 亚 硝 酸 外 钠 发 生 反 应 ， 生成 黄色 的 亚 硝 酸 站 钠 钙 沉 省 。 用 标准 高 锰 酸 钾 深 液 使 此 沉淀 氧化 分 解 。 剩 余 的 高 锰 酸 钾 用 过 量 的 标准 草酸 钠 浴 液 还 原 。 剩余 的 草酸 人 钠 再 用 标准 高 氮 酸 钾 反 滴 定 。 这 样 , 可 以 算出 样品 中 钾 的 含量 。 工 毫升 0.02X eee Hy 可 以 氧化 分 解 含 有 0.142 毫克 钾 的 亚 硝酸 钴 钠 钾 。 2KC1-+ NagCo(NO»)g—>K»NaCo(NO.)¢-+2NaCl 5 KgNaCo(NO2)¢+11KMnO,+14H,SO,— 15K NO;+ 5NaNOz _ + 5Co(NOs)2+3K2SO4+ 11MnSO,+ 14H,0 2KMnO,+5Na.0,0,+8HSO, —>2MnSO,+ 1000, + 8H,0+ KeSO.+ 5Na.SO, 器 材 (1125.2 毫升 和 5 毫升 吸 量 管 ; QD 毫升 刻度 离 心 管 ;(3)50 Ft FETE A; (4) KIA A; (5) 微 量 滴定 管 ; (6) 离 心机 。 试剂 CWB RRR”; (2)0.02N Bm PR”; (3) @® Hofimann ffi Jacobs x exe fe T te dt, FE ML AA Ae Sh a SPT Be PG dm A th 酸 固 醇 , FRC, RA. AMET AM. 120 第 七 章 血液 定量 分 析 0.02X Fiske SPAR”; (4)1:2 亚 硝 酸 钠 溶液 所 。 操作 “用 吸 量 管 将 工 毫升 血清 , 量 大 15 SHAME. Im 1:2 亚 硝 酸 钠 溶 液 0.5 毫升 , HS. HRS ASH, Ink MBB 4 毫 升 , 再 的 与 。 然 后 慢 慢 加 入 亚 硝酸 外 钠 试剂 2 毫升 , 静 置 80 Bh, 置 离心 机 中 ， 以 每 分 钟 1.500 转速 离心 Sao. RELA ARE 0.3 毫升 刻度 , 加 水 5 ESI, WDHB. HRA OMPED 8 分 钟 , 除去 洗 液 。 如 上 洗 三 次 至 上 层 清 液 无 色 后 , 加 2 SPH 0.02N KMnO, 及 工 毫 升 4N HSO4。 用 玻 棒 撮 与 ， 置 沸水 中 加 热狗 工分 钟 , 应 得 红色 泪 清 溶液 。 加 02 NagC.O, 溶液 2 毫升 , 还 原 过 量 的 KMnO。 过 量 的 NaxC204 以 0.02N KMnO, fie, MBA 为 滴定 疼 点 。 庆 算 每 100 毫升 血清 中 钙 的 含量 。 实验 五 十 五 ”血清 钙 的 测定 A iin # 100 2EFt RIS SO I—11 See, 儿童 血清 什 稍 高 。 手 JERE TABS, 血 中 和 辕 量 减低 , 常 在 7 EO. BR 付 甲 状 腺 后 , 动物 血 中 之 钙 量 顿 减 ; 反之 ， ee FE GG tek BY STE (MP5 BAK Da FETE Ts ER ARDS, PE BS Ao ze Ee He AMT, Je APSE MTGE MEI IE. WEAF HE 酸 后 , Airitm se rwammeo. 2KMnO,-+ 5CaC,O,+ 8H,SOx —>10C0, + 5CaSO,+ K,SO,+ 2MnSO,+8H,0 器 材 (1) 1 毫升 .2 毫升 及 5 毫升 吸 量 管 ;(2)15 ze Ft A BEES iD; (3) 50 ET HEI; (DAKAR; 〈5) 微 量 滴 定 管 ; (OB 心机 。 D 防止 溶血 , 因为 拥 在 血球 和 血清 之 问 的 分 布 很 不 均匀 。 实验 五 十 大 ” 血 中 无 机 磷 的 测定 121 试剂 〈1) 0.0LX 高 锰 酸 钾 深 液 ( 工 毫升 =0.2 EHE HH) OPC 锰 酸 钾 溶 液 不 很 稳定 ， 每 经 数 日 须 标 定 一 次 ); (2)4% MRM We; (3) 稀 氨水 〈 以 水 稀释 2 毫升 省 氨 至 100 毫 升 ); (4)1XN Bi 酸 。 操作 “用 吸 量 管 将 血清 工 毫 升 移入 15 毫升 离心 管 中 , PE 水 3 毫升 和 4% MRI. KABA, PITS, 与 。 离 心 使 章 酸 钙 沉 于 管 底 。 小 心 取出 离心 管 〈 勿 使 沉淀 振 起 )， 小 心 迅 速 价 出 上 清 液 后 ， 将 离心 管 倒 冒 滤 颖 上 。 稍 停 ， 用 滤纸 将 OEE, 再 以 稀 所 水 3 毫升 ， 沿 管 壁 冲洗 。 轻 项 管 底 , 使 大 部 分 沉 演 被 的 起 。 再 离心 5 分钟， 用 前 法 除去 上 清 液 。 小 心 用 吸 量 管 IN 硫酸 2 毫升 , 吹 太 管内 ， 使 沉淀 被 击 起 而 易于 溶解 ， 将 离心 PETWMKATH 17S, 趁 热 以 0.01XN 高 僵 酸 钾 深 液 滴定 , 至 PRALINE 工分 钟 不 褪 , 即 为 葡 点 。 HL ESR RE MLE PET RB FRAT MPRA AE 币 人 血液 中 每 100 毫升 含 无 机 磷 狗 3.5 毫 克 , BILRKRWS 5 tebe. Ae Fl eB 2 毫克 。 无 机 磷 在 血浆 及 血球 中 的 省 度 狗 略 相等 ， 磷 酸 酯 则 绝 大 部 分 在 血球 中 。 血 浆 中 有 磷酸 酶 , 当 血 液 放 置 时 , — 8 ao Ee Bs A pe ee 酸 酶 催化 水 解 , 因而 无 机 磷酸 盐 的 量 增高 。 此 种 变化 , 在 有 溶血 现 象 时 更 显著 , 所 以 测定 无 机 磷 或 磷酸 酯 , 须 用 新 鲜 样 品 。 血 液 抽出 后 , 不 可 超过 1 一 2 小 时 , 并 要 预防 溶血 @。 用 三 毛 酷 酸 沉淀 血 中 和 蛋白质， 制备 无 蛋白 血 滤液 。 无 机 碍 酸 盐 则 溶 存 于 滤液 中 。 无 机 磷 可 与 钥 酸 煞 发 生 反 应 , Ae RR SR RR, @ ”最 好 保持 在 /0 一 75`“C。 录 度 过 低 反 应 速度 慢 , 过 高 则 草酸 钙 可 能 分 解 。 @ 为 了 避 如 溶血 , 最 好 用 血清 进行 测定 , 并 在 取 血 后 立即 测定 。 122 第 七 章 血液 定量 分 析 FA Wie PBR PRD BE HE ft I Dar Fd ach DR SAR OK, HE SABE, SABER BL 分 为 (MoO*4MoOs)*.HsPO4.4Ho*O。 蓝 色相 当 稳 定 , 在 适当 条 件 下 ， 可 用 比 色 法 测量 其 深浅 度 。 在 一 定 范围 内 ， 颜 色 的 深度 和 样品 中 磷 含 量 成 正比 关系 。 器 材 (1) 0.5 毫升 .1 毫升 2 SHR 5S SHARE; (2)50 Ft HEI A; 3) 试管 ;(4) 光 电 比 色 计 (或 目 视 比 色 计 )。 试剂 2 〈1) 20% =A; (2)5% FeSOy (8) Somes We; (4) SR RRA SHS 0.0L ERE), 操作 ”用工 毫升 吸 量 管 将 工 毫 升 全 血 @( 或 血清 ) BA508 升 雏形 狐 。 加 水 6 毫升 和 20% 三 氧 醋酸 3 毫升 (如 为 休 血 ， 加 水 Le m= Re). ADB, ABS osha, ASABE MMI MIE. MIRE. RPM A. 取 试 管 2 支 , 按 下 表 配 制 : I Se a x sm 管 对 Rm 1. fave xe 5 毫升 一 2. 标准 磷酸 盐 溶液 一 .2 毫升 3. HzO 2.5 毫升 4 Ft 4. 20% = 9 BER YA ek 站 1.5 毫升 5. SHAE SRI 0.5 毫升 | 0.5 毫升 6.5ZFeSO, 2 Ft -2 毫升 将 以 上 二 管 分 别 混 与 ， 放 置 10 分 钟 后 用 光电 比 色 计 (或 目 视 KGa), white 100 毫升 全 血 中 的 磷 含 量 。 @OD Kuttmer 和 Lichtenstein(5) 用 氯 化 亚 锡 作 为 还 原 剂 , 使 灵敏 度 境 加 。 可 用 更 少 的 样品 进行 分 析 。 但 没有 Fiske #7 Subbarow 法 (6 准确 度 天。 @ 所 用 试剂 必须 和 纯 准 , FTSRRR. 图 如 使 用 加 草酸 钾 作 抗 凝 剂 , 草酸 钾 不 能 过 多 ， 否 则 不 易 显 色 。 每 毫升 样品 内 BRAS EAR SF 2 一 3 Bye. DFA IE a He 6 it He, FT Fe Fs He PR HS HH — GB th EJ 660 毫 微米 滤 光 板 )。 实验 五 十 七 fl A AB A A Te 123 实验 五 十 七 “ 血 中 胆固醇 的 测定 人 血液 每 100 毫升 狗 含 胆固醇 100 一 230 毫克 。 患 慢性 或 急 性 肾炎 及 糖尿 症 者 ， 其 血液 之 胆固醇 常 有 增加 。 串 剧 性 贫血 症 则 降低 。 腾 食 中 脂肪 高 时 , 血 中 胆固醇 含量 亦 高 , 反之 则 低 。 血液 或 血浆 烘 干 后 , 以 氯仿 浸 提 胆固醇 @。 胆固醇 与 醋酸 本 、 省 硫酸 作用 后 ， 呈 靶 色 (反应 机 制 请 参看 “类 脂 的 分 离 与 鉴定 ” 实 有 验 )。 用 比 色 计 进行 比 色 。 此 色彩 渐变 黄色 , 故 比 色 宜 迅速 。 器 材 〈1) 0.5 毫升 .2 毫升 和 10 毫升 吸 量 管 ; (2) 带 有 螺旋 洽 凝 器 的 提取 管 ; (3) 带 刻度 试管 ; (4) 光 电 比 色 计 ; (5) ISS. 试剂 〈1) 所 仿 ; 〈2) 栈 酸 酝 ; (3) 省 硫酸 ; (4 胆固醇 标准 液 (5 Ft 0.5 毫克 胆固醇 。 胆 固 醇 50 毫克 溶 于 500 毫升 氯仿 )。 操作 “用 吸 量 管 到 0.5 毫升 血液 滴 于 直径 5 一 7 厘米 的 无 脂 滤 竹 上 。 在 70*0 烤箱 内 烘 干 后 , HEMET, 悬挂 于 螺旋 渝 凝 器 下 ， MAE, 管内 盛 氯仿 8 毫升 。 置 管 于 70—80°C 水 浴 中 , 热 40 分 Sh, Mla, MA 10 毫升 , 醋酸 栈 2 毫升 和 省 硫酸 0.2 St. A 时 取 5 毫升 标准 胆固醇 溶液 ， 移 大 另 一 试管 中 , 加 氯仿 5 毫升 , 栈 MOT 2 毫升 和 省 硫酸 0.2 毫升 。 将 二 管 塞 紧 , HS, BNR 5 分 Sha, Woes Hat Ge A LLC RL) LEG, 并 计算 每 100 毫升 血液 中 胆固醇 含量 。 参考 书目 (1) Kramer, B. and Tisdall, F. F., J. Biol. Chem., 46, 339(1921). (2) Hoffmann, W.S.and Jacobs, H. R.D., J. Biol. Chem., 93, 685 (1931). (3) Clark, KE. P. and Collip, J. B., J. Biol, Chem., 63, 461(1925). OD 或 用 酒精 -乙醚 混合 液 (3:1) 抽 提 [Sachett(7]。 * 124 第 七 章 血液 定量 分 析 (4) Sendroy,J., Jr., J. Biol. Chem., 152, 539(1944). (5) Kuttner, T. and Lichtenstein, L., J. Biol. Chem., 86, 671(1930). (6) Fiske, C. H.and Subbarow, Y., J. Biol. Chem., 66, 375(1925). (7) Sachett, G.E., J. Biol. Chem., 64, 203(1925). (8) Ling, S.M., J. Biol. Chem., 76, 361(1928). BAZ ANAM 尿 的 成 分 与 体内 驳 质 代谢 有 密切 关系 。 当 代谢 不 正常 时 ， 尿 的 成 分 常 有 改变 。 因此 ， 屎 的 分 析 在 临床 生化 中 和 在 代 项 研究 中 都 很 重要 。 尿 中 成 分 , 有 的 在 收集 后 ,必须 立即 分 析 ， 有 的 可 稍 迟 。 尿 酸 及 尿素 的 测定 , 应 于 当日 进行 , 因 尿 酸 易于 沉 演 ， 尿 素 可 分 解 生成 氨 和 三 氧化 碳 。 另 外 , 肌 本 也 可 变 成 肌 酸 。 检 查 尿 中 是 否 有 糖 , 应 在 3 小 时 内 进行 。 系 统 正 规 分 析 , 应 从 24 小 时 尿 中 取样 。 RRO REVAL 24 shi IE REIS RB 0.5 一 上 0 3, BURRESS, WRI 酸 排泄 低 , 病 发 时 则 增高 。 ARES EEA RS, 尿酸 排泄 Ue ae | : Pie PF hae We 5 RSE EF, POA. HIER SE, BD 可 计算 溶液 中 尿酸 含量 "Q。 aM 〈1) 50 毫升 容量 狐 ; (2) 微 量 滴 定 管 ; (3) 1 SH108 升 吸 量 管 ; (4) 光 电 上 比 色 诗 。 试剂 (1) HESS ATION (SE); 〈2) 5% NaON 溶液 " CR 毒 ! ); (3) 标 准 尿 酸 溶液 ”2(5 SHEA 0.1 毫克 尿酸 )。 操作 “将 尿 稀 释 10 倍 至 20 们 (10 毫升 稀释 尿 狗 含 尿 酸 0.15—0.3 25g). M50 毫升 容量 瓶 , 加 稀释 尿 10 毫升 ,5% NaCN5 Ft (FY BL A), 砷 磷 锦 酸 恋 剂 ( 由 滴 管 加 入 )I 毫 升 。 轻 轻 的 动 。 @ ”因为 尿 中 含有 与 砷 磷 铝 酸 试剂 反应 产生 颜色 的 其 他 物质 测 得 车 果 一 般 仿 高 。 he. 126 BAK RhMODH 放置 5 分 钟 后 , 加 水 至 刻度 并 混 匀 。 同 时 取 尿 酸 标准 溶液 10 毫升 (含有 0.2 毫克 尿酸 ) 代 替 尿 样品 制备 比 色 标准 。 用 目 视 比 色 诗 或 光电 比 色 计 比 色 。 计 算 24 小 时 尿 中 的 尿酸 含量 。 实验 五 十 九 ”尿素 的 测定 尿素 是 哺乳 动物 、 某 些 鱼 类 和 某 些 两 栖 动物 蛋 白质 代谢 的 重 要 产物 。 人 每 天 由 尿 中 狗 排 出 10 be Dk Se AL, 排出 量 受 腾 食 中 蛋 自 质 含 量 的 影响 。 吃 高 蛋白 膳食 后 ， 排 泄 量 高 。 肾 和 肝 的 动能 状态 对 尿素 排泄 量 也 有 影响 。 肝 功能 损害 时 , 尿素 形成 受阻 碍 5 展 功 能 ”损害 时 , 则 尿素 排泄 受阻 碍 。 在 以 上 两 种 情形 下 , 尿 中 灰 素 排 出 量 在 脲酶 作用 下 尿 中 的 尿素 分 解 为 所 和 二 氧化 碳 。 氨 和 三 氧化 fide HY ici er CHAR EK, | 生成 的 化 盐 可 以 直接 用 Nessler 氏 试 剂 比 色 测定 呈 。 尿 中 尿素 排除 量 稼 以 尿素 氮 来 表示 。 NH».—CO—NH, + H2xO—>2NH3+ CO, NH,0OH+ 2(KI)eHgI,+3KOH —| oC > |t+7KI+3H,0 ; ait IPRA RE. FUR PIRSA, DEAT eB RDS RPOBA. Wa FEWER BAU, FE FARES RNS 2c fh hl (permutit) 4k PRAY RE FBR. 2844 (1) 100 SFA IM; (2) 100 SFP HEW IM; (3) 25% Fr, 10 毫升 .5 毫升 .0.5 毫升 吸 量 管 ; (4) 10 毫升 量 简 ;(5) 小 漏斗 ; (6) VERE; (7) 44979; (8) hi AKA GA; (9) 比 色 计 。 试剂 〈1) 粉 状 硅 酸 铝 钠 (permutit 粉 )60 FLA; (2) RI © Harwood 用 盐酸 滴定 尿素 分 解 生成 的 碳酸 煞 '?)。 实验 大 士 “ 尿 中 病理 成 分 的 检查 127 溶液 “3; (3) 脲 酶 洲 Pa; (4)Nessler Fem Fil; (5) ARERR © We AE SETE 天 0.5 2E5E ). fee WK 10 毫升 , HA MAA EA 100 毫升 。 向 千 的 100 ZS ISEI AH, BARR 15 Ft. WINER TAIN 27. Ws Ata, PERERA WIM, MPV MAT dati A FMS AA. TERRA act 9 ER A, TI, 将 滤液 0.5 EFL. 7K 5 SEF, ROA 5 TPR A 3 滴 量 100 SIA I, ASEH 5 ETP RIE EMR RUA RIE 0.5 毫升 PRUEWR Bc HLE RE, FR eR YS ee ES, Tl TE 50°C HINZE, 随时 的 动 。30 分 钟 后 取出 , 各 加 水 至 狗 75 毫升 。 从 量 简 中 迅速 地 一 次 加 入 Nessler tH) 10 毫升 , 斤 匀 , 再 以 水 稀释 至 100 毫升 。5 分 钟 后 比 色 。 计算 24 小 时 尿 中 排除 的 TK FR Fo 实验 六 十 ， 尿 中 病理 成 分 的 检查 正常 尿 不 含 蛋白质 和 糖 ， 其 胆 色素 和 酮 体 含量 也 很 低 。 展 星 病 患 者 尿 中 常 有 蛋白 质 。 严 重 糖 尿 病 患 者 尿 中 有 糖 ， 酮 体 含量 也 增加 。 肝 炎 病 人 和 患 胆管 堵塞 病人 尿 中 胆 色素 含量 增多 。 器 材 〈1) 试 管 ; (2) 量 简 。 试剂 (1) 98 NH,OH; (2) #8 BHM; (3) 省 硝酸 ; (4)(NH4)280O4 BA; 〈5) 亚 确 基 铁 氰 化 钠 深 液 ; (6) 蛋 白质 及 糖 定性 实验 中 之 试 剂 。 操作 (1) 蛋 白质 之 检验 : 取 5 毫 升 尿 ,， 装 大 试管 中 , 在 尿 的 Lipids, WATE, TAREE CREME SRS, Bee 中 性 或 酸性 @ NazAl,$i203 cle 2N Hyt (NH4)2A1,Si203 + 2Nat 128 BAM RMA 盐 类 溶 于 醋酸 。 加 省 醋酸 1 一 2 滴 , HOA MR, WEA 白质 。 (2) 糖 之 检验 : 应 用 精 定 性 反应 知 巷 , 检查 尿 样品 中 有 无 葡萄 糖 。 (3) 胆 色素 之 检验 : 加 3 SIAR ERE, 小 心地 加 上 3 毫升 尿 , 勿 含 二 液 混 合 。 如 有 胆 色 素 存 在 ， 其 接触 面 显 示 各 色 环 ， dn ek, WE BR, AL, TRAE (4) 酮 体 之 检验 : ED ETE RRR HH, 加 (NEH4)SO, HK, 使 AN, 再 加 3 滴 新 配制 的 亚 硝 基 铁 握 化 销 深 液 Nao[Fe(CN)sNO]。 将 省 NEH4OH 轻 轻 加 大 管内 。 接 触 面 上 如 有 和 杠 紫色 环 出 现 , 即 证 明 有 丙酮 存在 。 放 喷 中 小 时 后 , 再 行 观察 。 如 含量 况 微 , 所 需 时 间 较 长 。 参考 书目 (1) Benedict,S.R. and Franke, E., J. Biol. Chem., 52, 387(1922). (2) Harwood, J.A., Bull. Inst. Med. Lab. Technology, 15, 41 (1950). aha reeneaae 实验 室 规 则 1. 实验 预习 :在 每 次 实验 之 前 , 必须 对 实验 内 容 进 行 预习 。 预 习 应 做 到 了 解 实 验 的 目的 ,原理 和 操作 步 灵 , 懂得 每 一 操作 步 怒 的 意义 和 需 用 的 仪器 的 使 用 方法 。 这 样 , 可 以 避 胸 忙乱 和 浪费 时 间 ， 并 可 保证 实验 顺利 进行 及 获得 正确 结果 。 教 员 可 以 在 实验 开始 时 ， 抽 查 学 生 对 实验 的 预习 情况 。 只 有 达到 了 预习 的 要 求 ， 示 准 进行 实验。 2. 实验 报告 : 实验 观 察 和 精 果 , 须 随时 记录 在 实验 报告 罗 上 。 KERMA, WECRTU RR, ERT, PEK IR, 3. 整洁 : 清洁 、 整 齐 , WOM BET, MMR, RHE LAS AE, ME GAAS. RRM MR, BH 品 , 不 要 放 在 实验 台 上 , ORE. WER ER 地 上 。 实 验 完 毕 , 须 将 试剂 药品 排列 整齐 ,将 仪器 洗 准 收 起 ;着 将 桌面 抹 拭 干 次 , 方 得 离开 实验 室 。 4. 仪器 的 洗 泛 : FSBO OLS, 如 烧瓶 、 烧杯 、 试 管 等 , 用 水 和 肥 捍 或 去 污 粉 洗 剧 即 可 。 定 量 玻璃 仪器 , 如 滴定 管 和 吸 量 管 等 , 必 可 时 可 先 用 铬 酸 洗 液 涯 泡 过 夜 , 再 用 水 冲 准 ,倒置 架 上 ,使 水 自行 流出 ， 不 能 用 抹布 擦拭 里 面 。 肥 皂 与 洗 液 不 能 同时 使 用 ! 滴定 管 玻 蹇 上 如 有 凡士林 , FEAR, 先 将 凡士林 擦 去。 车 SEA: FA, 勿 用 酒精 或 乙醚 冲洗 仪器 。 铬 酸 洗 液 的 配制 方法 : 取 重 铬 酸 钾 5 克 置 于 250 毫 升 烧杯 中 ， 130 附 录 加 水 与 毫升 , HUG, RAR ESCA, (212 I AUR ERR 100 毫升 ， 随 加 随 欣 。 痊 却 后 , 储存 于 一 玻璃 广 口 瓶 内 , 盖 紧 盖子 以 防 吸水 。 5. 烟雾 和 臭 气 处 理 : ILRI, AFA AMA RRA ASK 验 , 均 应 在 通风 橱 内 进行 。 橱 门 应 紧 于 , 非 必要 时 勿 开 。 6. 氮气 处 理 : 在 生物 化 学 实验 中 ， 常 作 氮 的 定量 测定 。 含 氨 溶液 须 在 另 室 存 放 , UR Se. 7. 废物 的 处 理 : 废弃 液体 可 倒 大 水 沟 内 , 并 放水 冲 走 。 强 酸 溶 WEAR, PRGA A, DER Ae RK, SE A Dn Fatt Aa Hae TE Ui Uae BY DB AA LA 8. ARAEIT: 燃 灯 时 , SoA ERI, — Poe, — FLIER, WOFFA, 后 燃 火 柴 。 熄 灯 时 ， 关 闭 气 门 ， 火 焰 自 灭 。 灯 焰 大 小 和 火力 强 绊 ， 须 根据 实验 需要 来 届 节 。 用 大 火 焰 维 持 少量 开水 沸腾 , 显然 造成 浪费 。 9. 温 箱 和 冰箱 : 温 箱 和 冰箱 的 门 必须 严密 。 取 放 物 件 时 ， 应 随手 关门 。 在 温 箱 和 冰箱 内 存放 仪器 ,药品 , 必须 注 明 存放 人 姓名 。 10. 珍贵 仪器 : 天 平 、 比 色 计 ,离心 机 等 珍贵 仪器 , 应 重视 爱护 。 使 用 前 , 应 熟知 使 用 方法 。 若 有 问题 , 随时 请 指导 实验 人 员 解 答 。 11. 实验 动物 : 进行 实验 时 ， 不 要 戏弄 动物 。 执 行 杀 死 解剖 等 操作 , 必须 按照 规定 方法 进行 。 12. RAF: 使 用 仪器 ,药品 和 动物 , DAERAH, ABE 用 过 量 药品 和 试剂 。 不 要 在 滤纸 上 记 数 据 。 使 用 动物 时 , 同学 问 先 互相 联系 ， 一 个 动物 的 不 同 部 分 常 可 供 不 同 小 组 使 用 。 因 操作 不 仔 交 而 造成 的 实验 重复 , 也 是 浪费 。 避 驶 损伤 仪器 。 这 样 , 不 但 有 FAT I, 还 可 培养 实验 耐心 和 训练 技巧 。 13. 试剂 和 标准 溶液 : 取 用 后 , 须 立 到 将 瓶 塞 严 , 放 回 原 处 。 量 WAAR HI, 须 用 滴定 管 或 量 简 , 切 勿 使 用 吸 量 管 。 自 手 中 取出 ， 的 试剂 和 标准 溶液 , 如 未 用 尽 , WWII, VBE. 14. 碱 性 溶液 的 存 装 : 7) ir Be AE BS De A Se AACE, SACHA ACHE VES, WU OE FAG De 9 HR Ee AT, FAA bere BER. 15. 火险 : Wart, CRESS ARIA KI. AREER A PAR 体 要 使 用 水 浴 , 用 电炉 加 热 , ANAT AKI REA. SEAN) ee 火焰 加 热 。 遇 有 火险 , 先 关闭 煤气 门 , 再 用 沙土 和 灭火 器 灭火 。 若 衣服 着 火 ,* 用 水 浇 或 就 地 一 滨 。 实验 基本 操作 和 实验 室 常 误 (—) EM HRB 1. 配制 溶液 时 , WAM RRS. Rls Ti, 必须 KABERRBRA. _ 2 PEEP GE FH Ay Se REE AS AR 3. 提 棒 的 粗细 长 短 ， 必 须 与 盛 器 的 大 小 和 所 配制 溶液 的 多 少 呈 泛 当 上 比例 关系 。 不 能 用 长 粗 撮 棒 撮 拌 小 离心 管 中 的 少量 溶液 。 A. HEVEIY, 尽量 使 撮 棒 沿 着 器 壁 运动 , HABA, WOE 飞 泪 。 | 5. 借 大 液体 时 ， 必 须 沿 器 壁 慢 慢 价 大 ， 以 更 有 大 量 空气 混 太 。 倾倒 表面 张力 低 的 液体 (如 蛋白 质 溶液 ) 时 , EE 6. 振 落 溶 液 时 , 应 沿 着 圆圈 转动 盛 器 , 不 应 上 下 振 葛 。 7. 振 殉 混合 小 离心 管 中 液 体 时 ， 可 将 离心 管 握 在 手中 ， 以 手 腕 、 肘 或 屑 作 轴 来 旋转 离心 答 。 也 可 由 一 手持 离心 管 上 端 , 用 另 一 手 绰 动 离心 管 。 也 可 用 一 手 大 拇指 和 食指 持 管 的 上 端 ， 用 其 余 三 个 手指 强 动 离心 管 。 手 指 持 管 的 松紧 度 要 随 着 振动 的 幅度 变化 。 还 可 以 把 两 手掌 合 失 , KREBS, KAA. 8. FETA PIR AREY, DASE RIE oy, FAP TA EE SE, FEAST AS BHR ey 132 附 录 9. 在 分 液 漏斗 中 振 萝 液体 时 ， 应 用 一 手 在 适当 斜 度 下 倒 持 漏 斗 ,用 手心 项 住 狐 蹇 ， 并 用 另 一 手 控制 漏斗 活塞 。 一 边 振 藩 ,一边 开动 活塞 ， 使 任何 气体 随时 由 漏斗 港 出 。 LO. 研磨 配制 胶体 溶液 时 , 要 使 杆 棒 沿 着 乳 然 的 单方 向 进行 , 不 要 来 回 研磨 。 (二 ) 吹 制 玻璃 仪器 的 基本 动作 1. 许多 玻璃 仪器 均 由 玻璃 管 吹 制 而 成 。 吹 制 时 ， 堪 手 手背 向 上 , 右手 手背 向 下 , 主要 由 左手 转动 玻璃 管 , 右手 起 支架 作用 。 2. 必须 把 玻璃 烧 软 、 烧 匀 后 , 再 行 吹 拉 。 3. 吹 拉 玻 璃 要 离开 火焰 后 进行 。， A. 吹 拉 玻 璃 时 , 都 要 不 停 地 转动 , 以 抵 销 重力 影响 。 5. aS BRAM, 必须 随 吹 随 弯 。 6. 吹 时 , 要 连续 用 小 口气 , 使 薄 处 有 先 痊 却 的 机 会 。 (三 ) 实 验 室 常 埠 1. 挪动 玻璃 仪器 时 , 勿 使 手指 接触 仪器 内 避 。 2. RSA BURRS. BEG, BSA eS MIF ABLES, AINE OL AE, in ARS ”使 用 , SASS SE ADR WE : 3. 洗 净 的 仪器 要 放 在 架 上 或 于 竣 抹 布 上 六 于。 不 能 用 抹布 所 拭 , 特别 不 能 用 抹布 擦拭 仪器 内 壁 。 A. 不 用 棉花 代替 橡皮 塞 或 木 塞 塞 堵 瓶 口 或 试管 口 。 5. 不 用 力 片 复 盖 烧 杯 和 雏形 瓶 等 。 6. AS BE UE MERE ARDS Hh, DEAR He JURE PERLE 7. ASE JH Rs AAS IB, DB 8. (i GE He De PAL REDE RA bE BRAC, ANE, HUTERG 容量 仪器 使 用 法 133 KBE. 9. 药 瓶 换 装 其 他 药品 时 , 不 能 在 旧 标 签 上 写 新 药 名 称 , 也 不 能 在 签 上 上 贴 签 。 一 定 洗 去 旧 标 爸 , 换 贴 新 标签 。 10. 不 能 用 石膏 涂 封 蒸馏 装置 。 容量 仪器 使 用 法 上 容量 仪 问 有 装 量 和 印 量 两 种 。 某 些 量 狐 和 单 刻 度 微量 吸 量 管 为 装 量 仪器 。 滴 定 管 、 一 般 吸 量 管 和 量 简 等 , BARRA. Hh BEAR he. 2. 吸 量 管 有 单 刻 度 和 多 刻度 两 种 。 单 刻度 吸 量 管 亦 称 移 液 管 ， 多 刻度 吸 量 管 也 简称 为 刻度 吸 量 管 。 单 列 度 吸 量 管 有 普通 和 奥 氏 两 种 。 多 刻度 吸 量 管 有 血清 吸 量 管 和 莫 拱 吸 量 管 两 种 。 3. MAES A, FORE RS 壁 ,使 液体 自行 流出 。 流 完 后 ,使 管 尖 在 受精 器 壁 上 停留 3 一 5 秒 gh, 同时 转动 吸 量 管 。 和 遗 留 在 管 尖 内 的 少量 液体 任 其 自然 , NBEO 出 。 使 用 奥 氏 吸 量 管 时 ， 必 须 将 遗留 在 管 尖 中 的 少量 液体 吹 丰 LHR A, MULE A 0.5.1.0.2.0 和 3.0 毫升 数 种 ， 比 普通 音 刻度 吸 量 管 准 确 ， 常 作 定 量 实验 使 用 。 某 些 奥 氏 吸 量 管 带 有 玻璃 塞 。 4. 血清 吸 量 管 刻度 至 尖端 。 甸 放 总 量 时 ， 和 遗 留 在 尖端 的 少量 液体 不 须 吹出 。 莫 氏 吸 量 管 总 量 刻 度 在 尖端 以 上 。 钾 放 液体 时 ， 按照 烈度 进行 。 5. 读 吸 量 管 刻度 时 , 应 背 对 光线 , 眼睛 和 刻度 划 线 在 同一 水 下 ee 6. 容量 仪器 上 的 刻度 , 为 一 般 定 量 实验 使 用 足够 准确 , 无 须 重新 校订 。 7. 一 般 容 量 仪器 的 容积 均 在 20°C 下 核准。 使 用 时 , 如 温度 差 134 附 | OR 异 在 5 "0 以 内 , 容积 改变 不 大 , 可 以 略 去 不 计 。 分 析 天 平 的 使 用 和 保护 分 析 天 平 为 一 种 精密 仪器 ， 极 易 由 于 不 正确 的 使 用 而 遭受 损 坏 。 使 用 前 , Bee FAH, 1. 保持 硅 码 和 天 平 内 外 移 对 清洁 。 2. 每 次 使 用 前 , 检查 天 平 位 置 是 否 平衡 , 并 核对 雳 点 。 如 需 点 距离 中 点 过 远 , 必须 校正 后 再 用 。 3. 在 移动 或 更 换 盘 上 载 物 、 硅 码 和 梁 上 游 码 时 ) WEE RE 横梁 架 起 , 将 称 盘 托 稳 。 架 梁 托 盘 和 添 碱 硅 码 等 动作 必须 轻巧 , 勿 使 天 平 遭 受 任何 剧烈 振动 。 架 梁 须 做 指针 摆 到 雾 点 左右 时 进行 。 4. 称 重 时 , AHA, 再 放 梁 架 。 注 意 勿 使 天 平 摆动 幅度 过 大 。 5. 被 称 量 的 物品 必须 放 在 表面 中 上 或 称 量 狐 内 ， 不 可 直接 放 在 天 平 盘 上 。 称 量 能 腐蚀 金属 并 有 挥发 性 质 的 药品 时 ， 必 须 在 带 盖 的 称 量 产 中 称 量 。 其 他 吸水 , 吸 氧 ` 吸 二 氧化 矶 和 能 挥发 的 物质 ， 也 必须 装 在 带 盖 的 称 量 瓶 内 称 量 。 6. 称 量 液体 物品 时 , 须 特别 小 心 。 勿 滴 酒 在 天 平 内 ,天 平 盘 上 和 硅 码 上 。 7. 被 称 量 物品 和 硅 码 必须 尽量 放 在 称 盘 的 中 央 。 8. 被 称 量 的 物品 和 盛 器 的 温度 必须 和 天 平 室 的 室温 接近 。 9. 必须 用 带 有 骨 制 摄 头 的 小 摄 子 移动 夸 码 和 游 码 , 不 可 用 手 。 夸 码 上 如 有 灰 竺 ， 可 用 驼 毛 刷 轻 轻 拂 拭 。 不 能 用 抹布 和 任何 溶剂 洗刷 侍 码 。 . 10. 称 量 完 毕 后 , 支 起 天 平 横梁 , 并 将 称 盘 托 稳 。 游 码 必须 挂 起 ， ee HES Fd OS EL J A FE AS 11. 夸 码 重量 可 在 天 平 盘 上 检 数 一 次 。 放 大 夸 码 盒 中 的 空格 By > BLY EA 135 时 , 再 检 数 一 次 。 12. 离开 天 平 前 , 全 面 检查 一 逼 。 最 后 关 严 玻璃 门 并 套 上 布置 。 13. 使 用 中 如 发 生 障 碍 或 意外 ， 应 立即 通知 教员 或 实 碑 员 。 不 要 自行 检修 。 离心 机 的 使 用 欲 使 沉淀 与 母液 分 开 ， 有 过 滤 和 离心 两 种 方法 。 有 下 列 情形 者 以 离心 为 宜 。(1) 沉 演 有 粘性 ; (QUITE), 容易 透 过 滤 和 级 ; (3) 沉 演 之 量 多 而 松 ; (4) 沉 演 之 量 很 少 而 需要 定量 测量 ; (5) 母 液 粘 稠 ; (6) 母 液 量 很 少 , 分 离 时 应 减少 损失 ; (7) 沉 演 和 母液 必须 迅 RATE; 〈8) 一 般 胶体 溶液 。 宛 忆 机 有 手 的 式 和 电动 式 两 种 。 使 用 时 , 应 注意 下 列 事项 。 1. BOP EMER MM, 重量 须 相 等 。 2. 对 称 的 金属 套 管 或 金属 套 杯 和 玻璃 离心 管 或 离心 瓶 的 重量 与 式样 顷 相近 似 。 3. 套 管 或 套 杯 内 须 放 橡皮 垫 。 4. SE REA DERE DIZ MERCI, WTR 破碎 。 5. 对 称 的 金属 套 管 或 套 杯 , 连同 离心 管 或 离心 瓶 ,管内 或 瓶 内 内 容 物 和 和 绥 冲 用 水 的 总 重量 必须 相等 。 离 心 前 ， 必 须 在 普通 天 秤 上 平衡 。 如 不 相等 ， 可 调整 对 称 离心 管内 内 容 物 的 量 或 缕 冲 用 水 的 量 。 6. 离心 所 需 速 度 的 高 低 和 时 间 的 长 短 ， 以 沉淀 性 质 为 转移 。 高 速度 短 时 间 的 离心 效果 较 低 速度 长 时 间 的 离心 效果 好 。 但 不 可 无 限制 地 和 追求 速度 , FUR Ae fe 7. 如 用 电动 离心 机 , 必须 将 盖子 盖 严 。 开 动 时 , IP, 后 搂 动 电阻 , 使 速度 慢 慢 境 加 。 136 附 录 8. 在 转动 时 , 离心 机 机 身 应 稳 , 声 昔 均匀 。 否 则 ,表示 对 称 离 心 物件 重量 不 等 。 如 发 现 玻璃 离心 管 叛 破碎 , 须 立 即 停止 离心 ,小心 清除 玻璃 碎 居 。 9. 停止 离心 时 , 须 先 关 电 门 ， 然 后 将 电阻 搂 至 雳 位 (最 大 电阻 位 置 ), 使 离心 机 自行 停止 。 不 能 用 手 强制 离心 机 停止 运动 , 否则 ， Lv EME BD LEAS, 而 离心 机 也 容易 受 损伤 。 10. 勿 使 带 有 和 绥 冲 用 水 的 套 管 或 套 杯 在 离心 机 内 长 期 悬挂 。 以 驶 离心 机 件 损坏 。 光电 比 色 计 的 原理 和 使 用 以 待 测 物 已 知 省 度 的 显 色 溶 液 为 标准 ， 上 比较 未 知 尖 度 显 色 深 液 的 透 光度 来 测定 其 省 度 的 方法 为 比 色 法 。 比 色 法 的 灵敏 度 常 超 过 重量 分 析 法 和 容量 分 析 法 ， 是 生物 化 学 实验 中 常用 的 一 种 定量 分 析 方 法 。 其 操作 过 程 也 较 简 便 。 —, 简单 原理 : 有 色 溶 液 的 透 光 度 决定 于 : 1. 有 色 物 质 的 性 质 ; 2. 溶液 的 厚度 ; 3. 溶液 的 省 度 ; 4. 单 色光 的 波长 。 根据 比 耳 (Beer) 定 律 , 当 光 波 接近 于 单 色光 时 ; 其 透 光 度 为 : 和 =10rzzo (1) Io ARIE; [RMI [IEE AAT 来 代表 ); 厂 为 溶液 的 厚度 ; C WA WeN RHE; 五 为 常数 (与 溶液 性 质 有 关 )。 取 式 (1) 中 的 两 项 对 数 , 则 得 ; 光电 上 比 色 计 的 原理 和 使 用 137 log = 一 KLC 或 Joga = KLC (2) log 学 称 为 光 密 度 ， A LAD. 村 —~D=KLC (3) 从 式 (3) 中 可 以 看 出 , 在 单 色 光 的 情况 下 ， 光 密度 与 有 色 物 质 的 溃 度 成 正比 ( 当 溶 液 波 度 在 一 定 范围 内 )。 若 已 知 某 有 色 溶 液 省 HE OC, BEEN D, WIE Ce, 光 密 度 为 D。， 两 种 溶液 的 厚度 相等 , 均 为 L, 则 可 按 下 列 关系 式 求 出 待 测 液 省 度 。 D=KLC D,=KLC, log OO (4) 利用 光电 管 将 光 能 转变 成 电能 ， 根 据 电流 强度 比较 光 的 强 弱 来 设计 的 比 色 仪器 , 称 为 光电 比 色 计 . 附 图 是 单 光电 池上 比 色 计 的 示 HA, CRB, Dpaensaaner wine "ABE Fy Hea 电流 计 SS ARS SITE Hi Lit, Hacer Hse wis. ELAR PRE 样品 , FE PHS AT FICE AA. PTW AERA, 如 减低 光源 的 亮度 (用 电阻 ); 加 大 或 缩小 狂笑 ( 虹 彩 光圈 ); 或 在 光电 池 与 电 流 计 之 间 加 电阻 调节 之 。 后 者 是 最 常用 的 方法 。 用 光电 比 色 计 可 以 测 出 已 知 和 未 知 溃 度 溶液 的 光 密 度 , 然后 从 式 ( 生 中 求 出 未 知 溶液 dee BE 138 ‘ Ht 录 为 了 满足 Beer 定律 所 需 的 条 件 ， 应 当 使 用 单 色 光源 ， 实 际 上 是 使 用 某 一 定 波 长 单 色 光 的 滤 光 片 。 选 择 滤 光 片 的 原则 是 : 滤 光 片 透 光度 最 大 的 光波 是 溶液 透 光 度 最 小 (或 吸收 最 大 ) 的 光波 。 在 大 多 数 情况 下 ， 最 合适 的 滤 光 片 是 溶液 的 补 色 。 选 择 滤 光 片 时 可 BBP Reo ekKaemwe | 溶 波 的 颜色 | REF Me 400—435 | 青 柴 | fe CME BE 435 —480 | a | 黄 480 一 490 | a (6 | fff 490 一 500 Pe 称 色 带 蓝 | f 500—560 | ra | ae 560—580 | 系 色 带 黄 | 青紫 580 一 595 | 黄 | # 595—610 | HAL | GH eh 610—750 | él | ik CM = Gat RE SREB AY baeP ie ae) 品 的 581 型 光电 比 色 计 为 例 )。 | | 1. 操作 要 点 : (1) 检 查 电源 开关 是 否 断 路 , 旋转 粗 竹 调节 到 雳 位 置 ， 然 后 接 通 电源 。 (2) 选 择 合适 滤 光 片 , HAH SE (3) 转 动 电 源 开 关 至 “1”, 旋转 雳 点 届 节 器 , 使 电源 指针 指示 泛 光 为 雾 处 。 在 测定 过 程 中 雳 点 届 节 器 位 置 固定 不 变 5 (4) 在 碟 有 空白 液 和 待 测 液 (已 知 及 未 知 江 度 的 溢 液 ) 的 比 色 杯 分 别 放大 比 色 槽 内 ， 盖 上 盖子 。 将 装 有 空 自 液 的 下 色 杯 推 天 光路 中 。 . 位 置 。 光电 上 比 色 计 的 原理 和 使 用 139 (5) 将 电源 开关 搂 至 “2>， 电 源 灯 即 明 亮 。 多 数 分 钟 电流 恒 定 后 ,转动 粗 组 调节 器 ,使 电 沪指 镍 指 示 透 光度 为 100 处 ( 光 密 度 WF hb) (6) IFA PR, 将 待 测 液 的 比 色 杯 推 太 光路 中 。 此 时 电流 指针 指示 之 六 数 即 为 待 测 液 之 光 密 度 值 。 (DBR 2 一 3 HK, MELB, (8) AW SER, 将 电源 开关 搂 至 “1 处 , 再 更 换 待 测 液 。 (9) 比 色 完 毕 ， 关 闭 电 源 开 关 ， 并 恢复 粗 组 调节 BS BE (10) 测 定时 间 如 需 超过 30 分 钟 , 应 使 仪器 休息 10 分 钟 后 再 使 用 。 2. 注意 事项 : (1D 装 大 待 测 液 或 空白 液 时 ， 必 须 达 到 比 色 杯 2/3 RAH 装 上 5 一 6 毫升 )。 若 不 民 倒 出 ， 务 必用 滤纸 吸 干 比 色 杯 , HAE MEER, 才能 放 太 比 色 槽 内 。 (2) 不 要 用 手 、 滤 纸 、 毛 剧 等 氛 拭 比 色 杯 的 光滑 面 , 以 驶 损坏 和 磨 毛 。 (3) 用 完 比 色 杯 后 , 立即 用 自来水 冲洗 , FE ZR PBR VER, ve 净 后 , 可 将 比 色 杯 倒 置 晾 和 干 , Be EAE OL, FR PERE ima EE, | (4) Heth A WG IE aR PUG Wh AS FE BY AEP SE HL”, 不 用 时 , iHEFE“O" Kb, GE Ue RAEI, ZU HY, 以 保护 光电 池 。 (5) 比 色 计 不 能 随意 挪动 , 以 防止 震 坏 微 型 电流 计 。 (6) 比 色 计 内 和 王 燥 袋 (内 装 硅胶 ) 须 经 常 检 查 , 如 发 现 硅胶 变 1, 必须 更 换 ( 变 蓝 的 硅胶 轰 烘 干 至 无 色 后 , 仍 可 使 用 )。 《7) 如 较 长 时 间 使 用 比 色 计 ， 须 按 操 作 要 点 的 规定 , 给 仪器 以 适当 的 休息 。 140 Mt 录 试剂 的 配制 [1] Molisch 氏 试 剂 : 取 ax- 蔡 酚 2 克 深 于 95% 酒精 miigend 100 毫升 。 临 用 前 新 配 。 [2] Seliwanoff FEAF: APA] 葵 二 酚 0.05 克海 于 50 Ze Ft yt 盐酸 内 , 再 用 水 稀释 至 100 毫升 。 [3] Tollen Kat HI: 取 20% 间 苯 三 酚 的 上 5 多 酒精 溶液 30 毫升 , 加 省 盐酸 150 毫升 , 用 水 稀释 至 270 VIP, [4] Bial AHI: 取 1.5 克 甲 基 间 苯 二 酚 (地 衣 酚 ) AF 500 毫升 溃 盐 酸 , 并 加 大 20—30 滴 10% 三 氧化 铁 。 [5] Fehling 氏 试 剂 : 试剂 A( 硫 酸 铀 溶液 ): 将 34.5 克 硫 酸 钢 烙 唱 (COuSO4.5HsO) YET 500 SEFPAR AB AK HA 试剂 B( 酒 石 酸 钾 钠 碱 性 溶液 ): 将 125 克 所 氧化 钠 和 137 克 酒 石 酸 钾 钠 (Rochelle 盐 ) 深 于 500 Ft, REPRE IRA. 临 用 时 , 将 武 剂 A Sat BSA. [6] Benedict Feats: 将 无 水 硫酸 铜 17.4 克 溶解 于 100 毫 升 热 水 中 。 痊 后 ， 稀 程 至 150 毫升 。 取 榨 檬 酸 钢 :173 克 及 无 水 碳 酸 钠 100 克 , 加 水 600 毫升 ,加热 使 之 溶解 。 洲 液 如 不 清亮 , 过 滤 。 Marja, 稀释 至 850 毫升 .最 后 把 CuSO, vA Ve tH A PERE eG 溶液 中 。 混 匀 后 , 用 狭 口 瓶 赃 存 。 此 试剂 可 保存 很 从 。 [7] Barfoed—Tauber—Kleiner 三 氏 试 剂 : 将 酮 酸 钢 48 Frys fe 于 900 毫升 沸水 中 。 若 有 沉淀 ， 不 必 过 滤 。 在 热 溶 液 中 立即 添加 8.5 狗 乳酸 50 毫升 。 的 匀 ， 待 所 有 沉淀 几 乎 溶 尽 后 ,稀释 至 1000 毫升 , 并 过 滤 。 [8] 磷 钥 酸 试 剂 :在 烧杯 中 , 加 大 150 克 纯 的 钥 酸 和 75 克 无 水 碳酸 钠 , 逐渐 加 水 并 抬 动 ( 锡 500 毫升 )， 加 热 至 沸 ， 使 至 部 钥 酸 ~ 就 剂 的 配制 ve oh aig 溶解 , WERE WORD). FEV MA 300 “EF 85% BERR, Ar Zl, WH Fire 1,000 毫升 。 [9] thea Ht -AR MR SN A: Sas UE ch 2 ft, ARES 3 ty, TFL EE BN 4S, AEE ZED fk 2, 因此 , 5 FB FE AAR EEE REE, EL BCR 5 DL AZ TE ae ES UK HE EAT, 使 用 时 ， BEIM ATES Pe Bi A TH EW 9 WE , JE Fe HN HS HL [10] 血液 : 可 用 Francke 氏 针 刺 破 手指 ,用 0.1 毫升 吸 量 管 直接 吸取 。 如 用 动物 全 血 ， 则 必须 用 氮 化 销 作 抗 凝 剂 。 氧 化 钠 同 时 可 以 抑制 血糖 的 酵 解 。 在 一 干燥 试管 内 加 入 适量 的 氟 化 钠 粉 未 (每 毫升 血液 加 5 EK), 使 动物 血 直 接 流 大 试管 内 , 随 流 随 的， 使 与 氟 化 钠 混 合 。 放 痊 处 或 冰箱 中 保存 备用 。 [11] 0.005X 标准 铁 氰 化 钾 碱 性 溶液 :用 分 析 天 平 称 取 和 纯 铁 HUES 1.65 32. JAAR ARE 1,000 ESE AA, mI BS He a Ze HH tin FSH) eh IR AG FE EE SH 10.60 克 。 最 Jame AAR SI FUE, VARA ZEEE CURA, Fhe 在 阴暗 处 保存 。 可 保存 两 个 月 。 注意 : 纯 铁 氰 化 钾 中 不 应 含有 了 ert+ 和 Fe(ON)e- 一 - BF, 可 用 下 法 鉴定 : Fett+ atte: 取 5% 铁 氰 化 钾 深 液 5 毫升 ,加 10% 硫酸 及 亚 铁 氰 化 钾 各 一 滴 。 如 有 Fe*** #72, WBE, RE, 0018 aH A Fe(ON)5- 一 试 法 : 取 5%% 铁 氰 化 钾 溶 液 上 毫升， 加 新 配制 的 工 % 三 所 化 铁 溶液 和 1N 盐酸 各 数 滴 。 有 Fe(CN)e 一 一 存在 时 , Hl ee. RAE, 0.02 蹇 克 Fe(CN)e 一。 震 铁 氰 化 钾 不 纯 ， 可 傅 下 法 进行 重 和 结晶。 先 用 痊 燕 饮水 冲洗 铁 氰 化 钊 ， 再 用 热 水 溶解 成 他 和 溶液 。 趁 热 用 水 洗 过 的 滤纸 滤 入 蒸发 四 中 , 在 冰箱 中 放置 过 夜 , 使 之 精 晶 。 在 布 氏 漏斗 上 抽 滤 和 车 唱 ， 142 附 录 Rea UA 50°C Wea AGE, JA Be £4 Be FA it AE Js [12] 氧化 物 - 硫 酸 锌 -碘化钾 溶液 : 将 硫酸 锋 50 We AES 250 克 溶 于 水 中 ， 黎 释 到 1,000 毫升 。 使 用 时 , 再 在 每 200 EFS 液 中 溶解 碘化钾 5 oe. [13] 0.005 标准 破 代 硫酸 钠 溶液: 将 50 毫升 0 标准 硫 AC WEP SYA We ( 见 试剂 配制 法 16) HG FB BI] 1,000 SF, WE FA 新 配 。 | [14] O.5N SALSA: YH 20 Hf NaOH F 40% Frac h, FREE Sh AAC Si es HR 1 12 Hh mn A. 960 毫升 95% 酒精 中 ， 即 得 O.5.N’ sai “AC SH TA HZ [15] Hanus 氏 深 液 : W122 FEph, MA 1,500 SF He IK 内 ， 徐 徐 加 入 1,000 毫升 冰 醋 酸 (99.5 多 )， 边 加 边 揪 , 同时 略 加 温 热 , EBLE. MH, MIR 3 毫升 。 注意 : 所 用 冰 酷 酸 不 应 含有 还 原 物 质 。 取 2 毫升 冰 酷 酸 ， 如 少许 重 铬 酸 钾 及 硫酸 。 若 无 绷 色 呈现 , 则 证 明 无 还 原 物 质 存在 。 L16] 0.LN 标准 硫 代 硫酸 钠 溶液 : 将 结晶 破 代 硫酸 BH 50 Fe, 溶 在 和 经 考 沸 后 痊 却 的 蒸 饮水 中 (无 CO。 存在 )。 添 加 硼砂 7.6 Few SAL GN 1.6 克 。( 硫 代 硫酸 钠 深 液 在 pH9 一 10 Hes EE). Ft 到 2,000 毫升 后 , 可 用 标准 OLN 碘 酸 钾 深 液 按 下 法 标定 : 准确 地 量 取 0.1X 碘 酸 钾 洲 液 20 毫升 与 10 多 碘化钾 溶液 10 EFT A IN 硫酸 20 毫升 混合 。 以 12%2 淀粉 溶液 作 指 示 剂 ， 用 硫 代 ice SAYA VA WEFT be. TEE al Se PE at EEK he Ae SN VES Ue HE 后 , 用 水 稀释 至 0.1V。 K10;+5KI+3H,SO,—>3K2S0,+31_+3H,O I, + 2Na,8,03;——> 2NaI + NaeS4Og [17] RAMBM: 除去 卵黄 的 鸡蛋 白 与 19 一 20 HAH HAR 混合 后 , 通过 数 层 外 布 过 滤 。 试剂 的 配制 143 [18] Millon Raw: 40 克 深 于 比重 142 MWe 60s 升 中 , 在 水 浴 上 温 热 , 帮助 溶解 。 溶 后, 用 2 AG RUHE AR REZ. £8 澄清 后 , 取出 上 清 液 使 用 。 [19] AWM: 在 冰 痊 却 下 , 将 2 克 省 溶 于 100 毫 升 5 和 氨 氧 化 销 中 。 将 溶液 保存 在 棕色 泪 内 , PCH YO a, 两 周 内 有 效 - [20] Ehrlich KHAIF: 溶液 A: 溶解 5 克 亚 硝酸 钠 于 1000 SHEA, 溶液 B: 溶解 5 克 磺 胺 酸 (a RIED) 于 1,000 毫升 水 中 。 溶 后 , 加 入 5 ETT BRERA. 将 A 和 了 两 溶液 保存 在 密闭 狐 内 。 需 用 时 , 以 1:50 比例 配合 。 [21] 蛋白 质 氧化 钠 溶 液 : 取 3 个 鸡蛋 , 除去 卵黄 , 将 鸡蛋 清 与 700 毫 升 蒸馏 水 及 300 毫 升 他 和 食盐 水 混合 后 , HIRE OU, [22] MeL SR wba: 将 碘化钾 5 克 溶 解 于 50 毫升 车 Sak h, 加 碘 化 汞 12 克 饮 和 之 , 并 加 蒸馏水 至 100 毫升 。 [23] 酷 蛋 自 -乙酸 钠 溶液 ， 取 纯净 酷 蛋 自 0.25 克 , ET 50 毫 升 容量 瓶 内 加 太 蒸 饮水 狗 20 毫 升 , 并 准确 地 加 入 标 准 的 LN AR 化 钠 扣 毫升 。 当 酷 蛋 白 溶解 后 ， 难 确 地 加 大 标准 的 1 REM 升 , 加 水 稀释 至 50 毫升 , 充分 的 匀 。 [24] 中 性 甲醛 溶液 : 取 市 售 甲醛 溶液 燕 馆 。 取 蒸馏 液 45 ze 升 ,加 0.5% ME RH 3 毫升 , 再 加 01N 氨 氧化 销 溶 液 至 呈 浅 粉 和 红色。 使 用 前 , 重新 进行 中 和 。 [25] 猪 血清 : 取 猪 血 置 离心 管 或 离心 杯 内 。 帮 在 冰箱 中 过 夜 后 , 离心 除去 血 凝 块 。 上 层 清 液 即 为 血清 。 - [26] 混合 指示 剂 : (1) 把 溶解 于 95 色 酒精 的 0.1% UL Rev Me 10 毫升 和 溶 于 95 多 酒精 的 0.1% 甲 基 红 溶液 2 毫升 混合 而 成 。 (2) 可 用 田 氏 指示 剂 ,由 50 毫升 0.1 和 甲 烯 莫 酒 精 溶液 与 200 本 144 附 录 毫升 0.1 和 % 甲 基 红 酒精 溶液 混合 配 成 。 酸 性 为 柴 和 红色， 碱 性 为 芒 色 。 变 色 范 围 很 狭 且 灵敏 。 [27] Wei DR AH: 将 15 Ge ie Ae Fil (CuSO,-5H,0) Ail 6.0 Toys 石 酸 钾 钠 深 于 500 ZEFt ak, FEATHER ET, dA 300 毫升 10 多 SACS, ite B 1,000 毫升 。 [28] 二 葵 胺 试剂 : 将 生死 二 蔡 腕 洲 于 400 HE FR RRR, 4 加 上 11 SEFb UR wR He 1.84), CANKER AN BR SE # EE) 0 [29] SHIR SKY eR Be FE SA TEA): i BH RR BK ( (Ny) ¢Mo7Oo,- -AH0O) 2 Saves ME TE 100 毫升 10 多 硫酸 中 。 [30] a-1, 2, 4- 氮 基 蔡 酚 磺 酸 原液 : 0.25 5g a-1, 24- 氨基 蔡 酚 磺 酸 ，15 克 亚 硫酸 氨 钠 及 0.5 克 亚 硫酸 钠 深 于 100 毫升 水 中 。 在 使 用 前 , 取 1 体积 原液 , 加 4 体积 水 。 [31] FRA: FARK Re HMA 2 一 3 次 。 加 一 些 烧 娄 的 碳酸 钾 或 无 水 硫酸 钠 进 行 干燥 ， 工 在 虹 色 玻璃 烧 犹 中 蒸 fifa 0 | [32] 三 氯化镁 气 仿 包 和 溶液 : ADR RAT RARER 化 锁 , 直到 氯仿 不 再 呈 色 为 止 。 放 在 于 燥 需 内 , ARERR. FAP 燥 的 三 所 化 匀 和 精 馆 氮 优 配 置 他 和 深 液 。 [33] 重 拓 试剂 (参考 [20]): 溶液 A: 将 对 -氨基 苯 磺 酸 工 克 溶解 于 巧 毫升 省 盐酸 中 ， 然 后 加 水 稀释 至 100 毫升 。 | WEB: 将 亚 硝 酸 钠 0.5 TEAR Tk, eae 100 毫升 。 每 欢 用 前 新 配 。 od 需 用 时 , 将 溶液 B 3 毫升 加 入 溶液 A100 毫升 中 ,混合 即 得 。 [34] RRA ENDER: SAE SH 20 克 深 于 600 AEF AE ft 水 中 , 加 碳酸 氨 钠 28.8 克 。 混 与 后 , 用 水 稀释 到 1,000 毫升 。 试剂 的 配制 145 [35] 尼克 酸 提取 液 : 取 干 酵母 10 He, 于 和 怨 钵 中 研 租 ， 把 引 末 移 大 125 毫升 锥 形 瓶 内 ,加 0.1X 盐酸 50 毫升 。 将 雏形 瓶 用 手 或 放 在 电动 震 蔓 机 上 的 动 1 一 2 小 时 。 (eV RAL 过 滤 或 BE, 除去 固体 杂质 。 [36] Folin RAH: 取 10 SMEG, 2 克 磷 钥 酸 ,5 毫升 85 允 磷酸 溶液 和 75 毫升 蒸 饮 水 混合 。 加 热 昌 流 2 小 时 。 洽 后 , 加 水 稀 释 至 100 毫升 。 [37] 2, 6- 二 气 酚 能 酚 钠 溶液 : 将 50 毫克 2, 6- 二 气 酚 能 酚 洲 WEF) 200 毫 升 含有 52 毫克 碳酸 氨 负 的 热 水 中 。 沦 后 , 稀释 到 250 Ft, Fae REE, 并 放 在 冰箱 里 (3"O) 储 藏 。2, 6- 二 氛 酚 能 酚 不 甚 稳定 , 每 周 必须 重新 配制 , 每 次 使 用 前 依 下 法 标定 : 取 所 毫升 标准 抗坏血酸 溶液 加 纪 毫 升 工 % 草 酸 ， 以 2 6- 二 毛 酚 蓄 酚 滴定 呈 粉 红色 , HEI PARRA, HH, 6- 二 Tih ie AS eB UE BEE, 标准 抗坏血酸 溶液 : 溶解 100 EH MEET LMR BF 1% 草酸 中 , 然后 稀释 到 500 毫升 。 在 使 用 前 临时 配制 。 [38] 蔗糖 酶 溶液 : 取 干 酵母 100 克 , EFL, IS 饮水 及 少量 风沙。 用 力 研磨 提取 狗 工 小 时 , 再 加 燕 饮水 , 使 总 体积 #129 500 毫升 , 过 滤 。 将 滤液 保存 于 冰箱 内 备用 。 [39] 碘化钾 - 碘 溶 液 : 将 夏 化 钾 20 克 及 碘 10 克 深 于 100 2 升水 中 。 使 用 前 , 稀释 10 倍 。 [40] 脲酶 提取 液 : 取 黄 豆 粉 6 HE, In 30% 酒 精 250 毫升 ; 振 莫 10 分 钟 , UE. ARE 1 一 2 星期 。 [41] Nessler FAI: 先 将 30 克 碘 化 钾 深 于 20 毫升 蒸 馆 永 中 ， 再 加 大 22.5 teat, 并 的 动 使 之 溶解 。 溶 后 , 加 纯 汞 30 He, 继续 ish, 直至 上 清 液 失去 黄色 为 止 。 为 防止 温度 升 高 太 多 , 的 动 时 可 Avra, tH EBT. 146 附 录 将 清 液 数 滴 滴 大 工 毫 升 1 多 演 粉 溶液 中 。 检查 有 无 游离 碘 存 TE, WICH BH, 再 添加 以 上 10 色 碘 溶 液 数 滴 ， 使 清 液 与 淀粉 反 应 呈 微 蓝 色 。 最 后 稀释 成 200 毫升 。 混 匀 后 ， 将 所 得 液体 至 部 全 A 975 毫升 准确 配制 的 10 儿 氨 氧 化 钠 深 液 中 。 均 匀 混 和 ， 静 置 使 Bae : : [42] 0.05% MRAM: 准确 地 称 取 酷 氮 酸 0.1 5E, FE 200 ZEST IK P, 加 0.01.N PRAGA 150 毫升 ， 使 酷 氨 酸 溶解 。 为 了 加 快 溶解 , 可 将 量 狐 放 在 热 水 浴 中 微 热 。 痊 至 室温 后 , HB 刻度 。 每 毫升 溶液 含 0.5 SMA, [43] 您 创 木 脂 酒精 溶液 : 取 人 鳄 创 木 脂 工 克 , 溶解 于 100 毫升 95 多 酒精 中 。 [44] 2 多 琼脂 溶液 : 取 2 TERRA, 用 0.5 色 磷酸 氨 二 钾 深 液 加 ACS. PT PHB? PAR, TEVA LIAL, AAR 45°C, [45] DLA: 用 重 物 击 头 杀 死 动物 ( 鼠 或 更 ) ie MS LAB REBAR LAL, 在 低温 处 , 用 剪刀 前 成 碎 块 ， feta Se 使 用 前 制备 。 [46] 和 白茶 提取 液 : MARHH 5 克 ， 置 子 乳 外 内 麻 厅 。 加 蒸 fia 7k 15 毫升 , He Save. [47] 酸性 鸡蛋 清 蛋白 溶液 : 将 80 毫升 2% TES 20 毫升 0.03 六 盐酸 溶液 混合 均匀 。 [48] Hemet Mba, pH=40: 4% 164 SF OLN 醋酸 溶液 与 36 SF O.1LN BRARREA. [49] 新 鲜 肌 肉 提取 液 : 以 铁 锤 击 头 杀 死 动物 (KAR MR A), 将 血 放 尽 。 迅 速 取 下 背部 及 眼 部 肌肉 , BALSA, 用 剪刀 剪 碎 。 添加 和 狗 4 倍 于 肌肉 重量 的 生理 盐 溶液 。 仔 组 磨 成 匀 浆 。 30 分 钟 后 ， 用 浸 湿 的 麻布 或 4 层 纱 布 过 滤 。 将 滤液 保存 于 冰箱 内 。 提取 液 必 在 实 台 当天 配制 。 试剂 的 配制 147 [50] Locke 氏 溶 液 : 将 毛 化 钠 0.9 克 。 毛 化 钾 0.042 克 , BULB 0.024 克 , WEAR Gh 0.015 Te AIAG INE 0.1 克 溶 于 水 中 。 稀 释 至 100 毫升 。 [51] 0.5X TRAM: 取 45 毫 升 正 丁 酸 , HIN 氢 氧 化 销 中 和 至 pH=7.6, 并 稀释 至 1000 毫升 。 [52] OL 碘 溶 液 : 称 取 12.7 克 碘 和 胸 25 HOMES, 放大 1,000 BFE, 加 水 溶解 。 深 解 后 ,稀释 至 刻度 。 混 匀 。 用 标 HE ON BEATER AIRE [53] PaARME SW AR ME WE (2.0 微克 分 子 /毫升 ): 取 分 析 纯 丙酮 酸 $y 11 毫克 溶解 于 50 ESE BERR RE Th PS LIRR EAA, FB 标准 曲线 时 , 宜 当日 新 鲜 配 制 )。 | [54] 谷 两 转 氨 酶 底 物 : WD brah oA RM 29.2 毫克 , DL- 两 氨 酸 十 78 克 置 于 小 烧杯 内 , nL NaOH ff 10 IPB AWM. FIN MAUL LN 盐酸 校正 其 pH E74, MERE RAE 至 100 毫升 。 然 后 加 氟 优 数 滴 防 腐 。 在 冰箱 内 可 保存 一 周 。 此 溶 液 每 二 0 BIS oH NL— 2.0 WHAT, WAM 200 微克 分 子 。 [55] 2, 4- 二 确 基 葵 腊 溶液 :将 分 析 纯 2, 4-— ma ESE HF 19.8 毫克 称 太 200 EA-HEIZINES, 加 100 毫升 TY 盐酸 。2, 全 二 确 基 葵 UES REE, 把 雏形 瓶 放 在 上 蜡 处 不 时 的 动 。 待 至 部 溶解 后 , IRA SHU, 工 置 冰箱 中 保存 。 . [56] SAMI: 取 谷 氨 酸 147 克 ， 溶 于 100 毫升 1 铬 碳酸 氨 钾 溶液 中 。 [57] 酚 溶 剂 : 取 新 蒸馏 的 无 色 苯酚 2 份 和 蒸馏 水 1 EE 量 计 算 ), 放大 一 大 小 合适 的 分 液 漏斗 中 。 振 藩 混合, 使 成 乳 状 液 。 静 置 ?一 10 小 时 , RIED ROBE, 放出 下 层 使 用 。 [58] 亚 硝酸 外 锁 溶 液 : 将 25 Te A TAREE Co(NOs)o+8H2O 溶 于 50 毫升 水 中 , 加 12.5 RIKER, BS, BH 120 克 亚 硝酸 148 附 ® SAVE 180 EFt a CARH A 220 毫升 )。 量 取 210 毫升 与 以 上 配制 的 硝酸 钴 溶液 混合 。 用 空气 将 混合 洲 液 中 的 氧化 所 气体 吹 闪 , 放 在 冰箱 内 保存 。 临 用 前 过 让 [59] 0.2 MRSA: FERRITE HE hh Pe at 酸 负 粉末 0.67 克 ， 用 水 冲洗 和 大 500 Ft HRIRA, Waa, ez 刻度 工 混 与 。 放 在 冰箱 内 保存 。 [60] 0.02 shh SAM: 称 取 晶 体高 级 酸 钾 移 3 3.25 克 放 A 1.2K 2S KIA. ZK HK 1,000 毫升 , HE A FE REE, CZAR. BHA, Mate. 此 高 锰 酸 钾 溶 液 的 省 度 狗 为 0.1N。 准确 地 量 取 25 毫升 0.02WV 草酸 溶液 , 加 2 SIMA, 匀 后 加 热 孝 沸 。 趁 热 用 以 上 的 高 锰 酸 钾 深 液 滴定 。 算 出 高 盆 酸 钾 溶液 省 度 后 , Fr DT Ab ah AR Ok BI 0.02N。 [61] 1:2 亚 硝 酸 负 溶液 : 以 100 毫升 的 水 溶解 50 页 NaNO,, [62] 钼 酸化 溶液 : 将 25 Fe MSA SRY T 300 毫升 蒸馏 水 中 。 另 将 75 毫升 省 硫酸 加 入 有 欧 100 SEF Ze HAR, Bel Dm Be EHR. Ai Ja, M22) 200 毫升 ,最 后 将 以 上 稀 硫 酸 溶液 加 入 钥 酸 化 溶液 中 。 混 匀 后 , 存放 上 蜡 处 。 [63] 标准 磷酸 溶液 : 在 称 量 产 中 准确 地 称 取 0.0438 克 于 燥 的 磷酸 二 氨 钾 (KKH?PO4)。 用 水 冲洗 大 1,000 FRA. Yaa, 稀释 到 刻度 。 此 溶液 每 毫升 含有 0.01 Siw. [64] TRESS: We 100 克 铺 酸 钠 (NazWOQOi"2HsO) ja 1,000 毫升 烧 狐 中 ， 加 水 600 毫升 使 溶解 ， 再 加 和 纯 五 氧化 砷 50 克 ， 85 JoHgPO425 毫升 , 省 盐酸 20 毫升 。 考 诈 WAS, MAA, 稀释 7B 1,000 毫升 , 此 液 可 长 久保 存 。 [65] NaCN 溶液 : 配 成 5%NaCON, 每 100 毫升 加 省 NEHIOH 2 毫升 。 配 入 后 , 2 一 3 星期 内 可 用 , 久 则 不 能 使 用 。 注 意 NaON 为 剧 ide TH SR BFE BC il ‘ 149 毒 ! [66] ti RAR: 取 -- 500 SFI, Li7k 200 3B 300 训 FLYER Hh PERE — Sh (NasHPO,-12H.0)9 Re PERE — SN (NaH,PO,+H.0)1 克 。 如 不 清亮 ， 过 滤 ， 再 用 热 水 稀 释 至 500 毫 升 。 难 确 地 称 尿酸 200 毫克 , (1,000 毫升 量 瓶 内 ， 加 水 少许 ， 将 于 面 的 热 兢 酸 盐 溶液 倒 大 , RAZ, ERMA. WHE, In KER 1.4 毫升 , 再 加 水 到 刻度。 加 氟 仿 5 毫升 混 与 防腐 。 此 液 5 毫升 含有 1 毫克 尿酸 。 使 用 前 ， 取 此 液 10 毫升 ， 填 500 毫升 容量 pH. Imzk 400 毫升 11:9 稀 HOC1 25 毫升 ， 再 稀释 至 刻度 。 混 合 均匀 。 每 10 一 14 日 须 重新 配制 一 次 。 [67] 组 冲 溶液 : 在 100 SHAMIM, 用 75 毫升 水 溶解 精 晶 草酸 钠 15 克 , 添加 冰 栈 酸 1 毫升。 然后 稀释 至 100 毫升 。 [68] WME HE: 称 硅 酸 铝 钠 粉 3 克 以 3 狗 醋 酸 冲 洗 一 次 , 再 以 水 冲洗 两 藉 。 加 硒 刀 豆 粉 5 克 及 15% WG 100 毫升 , 轻 轻 的 落 10 一 垢 分钟。 放置 中 小 时 ， 间 或 的 落 ， 用 细 滤 狐 过 滤 。 过 滤 时 用 玻 置 将 滤器 盖 上 , 以 防 蒸发。 [69] 磷酸 盐 溶液 : 取 60 克 磷 酸 氨 二 钠 (NasHPO4.2HsO) 和 20 克 磷 酸 二 氨 钾 (KHsPO4) 溶 解 于 水 中 , 稀释 至 1,000 毫升 。 [70] 生理 盐 溶液 : 将 4 毫升 115% 氧化 钾 深 液 ，3 毫升 0.11 下 氧化 鲈 溶 液 ，! 毫升 0154 玉 硫酸 镁 溶液 和 21 毫升 OLM BBR 二 销 溶 液 (用 0.1X 盐酸 中 和 到 p 百 =7.3) BA. RA, WEE 10,000 毫升 。 检 查 并 调节 pH 到 7.3。 绥 冲 溶液 及 其 配制 弱酸 的 解 离 程度 服从 质量 作用 定律 。 醋 酸 的 解 高 关 系 如 下 ， 1.86x10- 是 酷 酸 的 解 离 常 数 。 [H*][CH,COO-]=1.86 xl0-sLOHsOOOH] 150 附 录 s_| CH;COOH | [CH;COO™ J 从 以 上 可 知 氨 离子 省 度 决 定 于 酷 酸 的 解 离 稍 数 与 酷 酸 分 子 和 酷 酸 根 离子 的 比值 。 当 增加 酷 酸 根 离 子 的 涛 度 时 , sn ABR SA, 氨 离 子 省 度 则 减少 。 因 为 栈 酸 钠 儿 乎 是 完全 解 离 的 ， 而 醋酸 解 离 度 很 小 ， 可 以 用 酯 酸 钠 的 量 代 表 深 液 中 酷 酸 根 离 子 的 量 。 毛 以 酯 酸 与 酷 酸 负 混 合 物 的 氨 离 子 涛 度 决定 于 酯 酸 与 酷 酸 钠 的 比值 : + -s [CH;COOH] [H*]=1.86 x 10 (CH,COONA! 如 果 我 们 忽略 稀释 时 对 于 醋酸 和 醋酸 钠 解 离 的 影响 ， 那 么 以 LARA, PRA ESTE, Bilin, 10 毫升 由 等 体积 0. N CH;COOH fil 0.1 NCH;COONa 混合 的 深 液 稀释 10 fa, He 离子 省 度 改变 不 大 。 | 由 弱酸 和 弱酸 强 碱 的 盐 的 混合 液 ， 称 为 缓冲 溶液 。 和 酸 或 碱 溶液 相 比 , 绥 冲 溶液 在 加 大 酸 和 碱 时 , 更 能 保持 气 离 子 省 度 。 例如 , 0.005 NCHz,COOH F0.1N CH;COOH 50.1 MCH;COONa . Ae, A iy Ue A ves i FSS FUE SIE, en FR eg PR BSI 溶液 各 加 大 一些 0.01N HCL， 第 一 溶液 的 气 离 子 省 度 的 改变 比 第 二 个 溶液 就 大 得 多 。 配制 组 冲 溶液 的 方案 很 多 , 以 下 是 配制 pDH3.72 一 5.57 fy 0.2M 醋酸 缓冲 液 、 pH5.27 一 8.04 的 区 磷酸 绥 冲 液 和 pH7.8 一 10.0 的 0.2 硼酸 缓冲 液 的 三 种 方案 。 | Fic ill TP Ves He FBS AR fc DT ER I DE HA FETE EA SNA RANE BE AE 0.2 M 醋酸 钠 溶液 (p 互 3.72 一 5.57): 1M 酯 酸 溶 液 和 不 含 碳 酸 盐 的 1M 所 氧化 钠 溶液 等 体积 混合 , 配制 0.5 M 栈 酸 钠 溶 液 , 再 稀释 到 0.2M, [H* ]=1.86 x 107 矮 冲 溶液 及 其 配制 151 按照 下 表 配 制 pH 3.72 一 5.57 的 0.2M 醋酸 缓冲 溶液 。 0.21f 0.2M _ 0.2M 0.2M ™ CH,COOH | CH;COONa 了 CH3;COOH | CH3;COONa P 90 | 3.72 40 60 | 4.80 80 4.05 30 70 4.99 1 WEAR AR TYE (DE5.29—8.04): 称 量 9.078 克 HoPO4 溶 F BA AAA, 在 1,000 SEF A AH i eB AE AENasHPO, WHE: 称 量 11.876 38 NagHPO,-2H,0 (Sirensen FE NasHPO,-2H.O) WFR K, 1 HAE SIA, 如 无 NasHPO4.2HsO， 可 将 新 车 晶 的 NagHPO,-12H.O fe Ss ia P 空气 干燥 2 一 3 星期 , 然后 使 用 。 按照 下 表 配 制 pH5.29 一 8.04 的 后 磋 酸 楼 冲 溶 液 。 M/15 M/15 M/15 M/15 KH,PO, | Na,HPO, pH KH,PO,. | NaHPo, | PH 9.75 0.25 5.29 | 5. 00 5.00 6.81 9.50 0.50 5.59 4.00 6.00 6.98 9.00 1.00 . 5.91 3.00 7.00 7.17 8.00 2.00 6.24 2.00 8.00 7.38 7.00 3.00 6.47 1.00 9.00 7.73 6.00 4.00 6.64 0.50 9.50 8.04 0.2M 硼酸 组 冲 溶液 (0H78 一 10.0): JARRE BO PAX, FFE SITE RK_L FER, BRAK 12.405 克 硼 酸 和 14.912 克 氧 化 钾 ， FRAG, BALHABIR, 工 稀 释 到 刻度 。 0.2 M 所 氧化 钠 浴 液 由 包 和 溶液 标定 配制 。 最 后 用 重 蒸馏 水 152 附 录 稀释 至 0.2M。 制 备 组 冲 浴 液 时 ， 准 确 地 量 取 50 灾 升 硼酸 - 气 化 钾 溶液 。 按 照 下 表 添 加 0.21M NaOH wy, 并 稀释 至 200 EF. M/5Na0H |p ‘M/sNeoH | pH | 0.2MNaOH | pH || 0.2MNaOH | pH 0.2MNaOH | 0.2MNa0H pH 2 Ft 毫升 毫升 2.61 7.8 12.0 8.6 39.0 9.4 3.97 8.0 16.3 8.8 36.8 9.6 5.90 8.2 21.3 9.0 40.8 9.8 850 | 84 | 26 50 8.4 26.7 “9.2 43.9 10.0 计算 公式 (这 些 计 算 公式 为 计算 实验 灶 果 时 参考 核对 使 用 ) 实 欢 八 _ 粗 脂肪 的 定量 测定 x 100 = FLAW % 式 中 : A= FEHR HR De HAG HE B= RMRR; | C= Fi in H , SIL WMA He (AR BOT TOO i 式 中 : A= FEZ AIA AY WETS HERR NIA RP IS eT B = 38 2 PE ih FA Ds 9 Bie Fie PE SVS RP eT C= 样 品 重量 ; 人 = 与 一 毫升 0 Bete HER hes A A a ye Be; 0.1 x 127 1000 实验 十 五 Sorensen FH Re (A—B) X1.4=2 毫升 被 检 液 中 氨基 氮 的 训 克 数 . [= —_—- 用 ee ee ee 计算 公式 153 th: ”4= 滴 定 被 检 液 渔 耗 的 01N 所 氧化 钠 溶液 平均 毫升 BLO; B=} EH PRISE OLN RAILS IIE: 14=1 285; 01N SALMA HRB SBA BREE ARB) OTN IE I00 -血清 含 气量 (毫克 多 ) 式 中 : 4= 滴 定 样品 用 去 的 盐酸 平均 毫升 数 ; 瑟 = 滴 定 空 白 用 去 的 盐酸 平均 毫升 数 ; C= 未 稀释 的 血清 毫升 数 ; 0.01Y 王 盐酸 的 当量 省 度 ; 14= 氮 的 原子 量 。 实验 二 十 八 _ 维 生 素 0O 定量 测定 (4 本 xpx9088x100 _100 sep ha 0 8 克 数 式 中 : ”4= 滴定 被 检 液 所 用 去 的 2,6- 二 毛 酚 靛 酚 的 平均 训 升 数 ; B= BEA EL BEM 2, 6-— LADNER EAH C= BREN BEI: D> RE FL BERRI ETE E=#BRAMEER, 1 Ft 0.001 N2, 6-— AMHR AEA 24 FT 0.088 毫克 ® 4RMEHRKY pH 接近 中 性 时 ， 所 消耗 的 氢 氧 化 钠 毫 升 数 为 加 大 甲醛 前 后 消耗 的 碱 的 总 数 。 如 果 是 滴定 酸 或 碱 水 解 液 , 显然 ， 在 加 甲醛 前 中 和 溶液 所 用 去 的 碱 或 酸 的 数量 均 不 应 计算 在 内 。 在 滴定 酸 溶液 时 , 可 先 用 碱 中 和 到 粉红 色 ， 再 用 酸 HAREM ABE, 然后 加 甲醛 再 滴 至 桃红 色 。 计 算 时 , 只 取 加 甲醛 后 用 去 的 碱 量 。 154 附 录 维生素 实 台 四 十 六 ARAM Me _S1 x Fa gd 式 中 : X= RABE EM MAR ES ee; a= 0.3 BEF baie Be ZA ARR Tes eB BY A BL; S1 = TA CFF in UE RY OE BE So= brite BAAR TA MRE HE, 样品 总 体积 为 16 毫升 , 因此 , 在 计算 酷 氨 酸 量 的 公式 中 Fe 16 ght Aaa ya (8-4) x 0.9667 x 10 AB 式 中 : X= PARSE; 妃 = 滴定 对 照 实验 所 消耗 的 0.1 六 破 代 硫 酸 钢 溶液 毫升 数 ; 4= 滴 定 样品 所 消耗 的 0.1X WEAR TEE SU RE TT A, 工 毫升 01X 破 代 硫酸 钠 相 当 于 0.9667 毫克 丙酮 。 hit tt 硫酸 钠 的 氧化 还 原 当 量 等 于 它 的 分 子 量 。 实 台 五 十 三 ”氨基 酸 的 生 酮 作用 x= (B—A) x 0.9667 x8 Basis Wat: RRR 式 中 : “ 习 = 样品 中 丙酮 的 含量 ; 妃 王 滴定 对 照 实验 所 消耗 的 0.1 BE DERE Hh ZEIT 数 ; 4= 滴 定 样品 所 消耗 的 0.1N 硫 代 硫酸 人 钢 深 液 毫 升 数 。 实验 五 十 四 iis Pe He X =[C-—(B-—A)]x0.142 A ——— ee se ar ae i 式 中 : X= Fe PSPS Ee; 4= 滴 定时 所 用 之 0.02N KMnO, 毫升 数 ; B= i FA 0.02.N Nas0204 之 毫升 数 ; C= 最 初 加 入 0.02N KMnO, Ft, 实验 五 十 五 ”血清 中 僻 的 测定 X =(A-B) x0.2x100 式 中 : XX =100 SFM Paez eH; 4= 滴 定 样品 所 使 用 的 0.0L KMnO, 毫升 数 ; 娓 = 滴定 空 白 所 使 用 的 0.0LN KMnO, 毫升 数 。 SIREN 血 中 无 机 磷 的 测定 He FUE HH Be 100 _ 4092 2) rh pe 倚 淮 涛 读数 > 0.02 xD05=I100 毫 升 全 血 ( 血 清 ) 中 磷 的 毫克 数 实 有 台 五 十 七 ” 血 中 胆固醇 测定 | He UE BE 100 _ ashe EIB 0.5 Xo = 100 Ze Ft Ae ih A HE BS By eo Bc kent BOR 未 知 液 读数 x) zs REM 10 SF fr Fe ik 1B ie BS EB 实 台 五 十 九 尿素 的 测定 _ 未 知 液 苇 数 24 小 时 尿 总 体积 ».¢ STE ET xX 0.5 eee oC a KR (GE) = RRA X) 2.14 X= 24 shy ie BR BALE (GE) 156 附录 一 些 常用 数据 表 (1) 一 些 元 素 的 原子 量 ~ i eee 8, H 1.008 se Zn 65. 38 和 : ee Ci 6.94 fh As 74.91 : g .Be 9.01 fi Se 78. 96 uw 也 10.82 um Br 79. 92 e408 12.011 Ym Rb 85. 48 R O«*éSNS 14. 008 ga Sr 87. 63 . as O 16.000 sq Mo 95. 95 ge 86 OF 19. 00 gu Pd 106.7 gy Na 22.99 i Ag 107.88 铂 Meg 24.32 $a «Ca 112.41 g2 A 26.98 锡 ,Sm 118.70 四 28.09 锁 Sb 121.76 “@ P 30.975 t% Te 127.61 “6 OU8 32. 066 a 126.91 gg oOl 35. 457 gu ，Os 132.91 钾 区 39. 10 gi Ba 137. 36 ge Oa 40.08 ss UW 183. 86 Bk Ti 47.90 Bf. Os 190, 2 foOUOC 50.95 a Pt 195.23 ge Cr 52.01 4& Au _ 197.0 ge Mn 54. 94 K He 200. 61 铁 Fe 55. 85 Pb 207. 21 gi Co 58. 94 Sib ge ”Hi 58. 71 $k gq «Ou 63. 54 钠 . U 238.07 my w& Db ~~ 53 iw) oO Nn © - © or oe ee a. — — He a FBC Ze 157 (2) is £5 tee POR A de BA HY He Be Ae HE 名 称 th + Ot me me OR i ” 酸 ae 酸 栈 。 酸 醋酸 Bok 毛 水 Zk Ge —MRK 1.1 x107 || 和 乳酸 1.55 x 10-4 二 级 解 离 1.95X IJ 酷 酸 1.86XI10-5 三 级 解 离 3.6 cd KE — Bh fie Be 1.5 x 10-6 p: 碳酸 — hie ws 3.04 10-7 二 航 解 离 | 4.9 x10 Same | 6 x10-1 硼酸 6.6 x 10-10 tt . 1.3 x10-10 棒 檬 酸 ”一 航 解 离 8 XI 二 航 解 离 | 2 xl0- = ih RS oar vt (4) 指 示 剂 将 强酸 加 到 弱酸 溶液 | BK LA ILA7]=K[HA 定 , 则 为 了 保持 平衡 , [A- 解 离 的 酸 。 若 阴离子 具 ， 后 者 的 解 离 度 减 少 。 这 很 容易 从 > ECE] Sm, TACHA Testa WBA, NB 15 a Be ge A ae ` 解 离 分 子 不 同 的 颜色 ， 则 此 时 可 以 | cs | | ' {58 观察 到 颜色 的 改变 。 这 样 的 弱酸 (或 弱 碱 ) 能 作为 指示 剂 ， 接 其 颜 色 可 确定 溶液 的 氨 离 子 尖 度 。 根据 指示 剂 解 离 常数 , 在 某 一 特定 p 了 范围 内 ， 它 的 颜色 改变 最 明显 。 我 们 常用 指示 剂 内 p 互 范围 和 颜色 的 改变 如 下 : EL Sex ann creme SRI: WESTER ST Sm ii -，， 2 称 | PK | pHem | mmme | mame ee a a MER 百里香 蓝 1.5 2+ 33 征 x Ly a 4.0 .0— 4.6 Hi i ye FA fs 4.7 .8— 5.4 黄 莫 FA tt 5.1 44— 6.0 aN 黄 4g iy 6.0 B 6.4, | # 和 He Bee 7.0 Or 768i ee Le _ Fi BL & (pK) 8.9 8.— 9.6 ne = fy Bk 9.7 8.-10.0 无 色 “粉红 ie Ze HB rar 9.+10.5 无 色 7 2 a (5) 一 些 蛋白 质 的 等 电 反 要 m | pies) & A Rm | ple) ane) 4.62 PEA 7 ae 4.64 玉米 醇 溶 蛋白 6. 和 :从 血清 球 看 白 4.8 一 6.4 RE A (KE) 5.5 ARA ph HE Se AR 5.4 Bie ie A 4.55— 4.30 if 4.17 WEA 12.0 —12.4 eaeey 6.74 蛋白 酶 <1.0 mA 1 EA 6.6 eee Lie. em ey ES 一 58.173057 171(-2)