SPT 21 世 纪 高 等 院 校 教材 生命 科学 类 人 on www.sciencep.com | 多 二 Pe CaTE qe tant Ge ’ . 中 有 ie ee | Ee ; p* EP ys el, (9 ae - 5 7 Ph uphitag Heel GF. crime pa ey he d a yO 2 a he 中 科 院 植物 所 图 书馆 th UNUM ihe 21 EER RE EH) 生物 化 学 实验 方法 和 技术 aR ERG ah ek mh pv A 4 fi tt 《生物 化 学 实验 方法 和 技术 不 同 于 以 前 传统 的 生物 化 学 实验 指导 书 的 编写 模式 。 全 书 分 为 上 中 、 下 三 篇 。 上 篇 为 生物 化 学 实验 方法 和 技术 原 理 , 分 为 生化 分 离 方法 .生化 分 析 方 法 、 生 化 制备 方法 、 生 化 代谢 研究 方法 等 4 章 。 中 篇 为 生物 化 学 实验 ,设计 了 基础 训练 .基本 实验 、 重 点 实验 、 综 合 实 i LS 5 个 单元 , 共 45 个 实验 。 下 篇 为 附录 ,选择 了 重点 知识 、 重 点 数据 和 重要 资料 共 17 项 。 本 书 可 供 生物 技术 生物 工程 .生物 科学 及 农林 院 校 的 农学 、 植 保 \ 农 化 、 园 艺 、 林 学 等 专业 的 学 生 及 与 生物 科学 相关 的 科技 人 员 使 用 。 图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据 生物 化 学 实验 方法 和 技术 / 陈 簿 茎 主编 .一 北京 :科学 出 版 社 ,2002.8 (21 世纪 高 等 院 校 教材 (生命 科学 类 )) ISBN 7-03-010685-7 l.4- OD. RR: 0. 生物 化 学 -实验 -高 等 学 校 - 教 材 KK .Q5-33 中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (2002) 第 054198 号 责任 编辑 : 霍 春 雁 李 锋 / 责 任 校 对 : 陈 玉 凤 责任 印 制 : 刘 士 平 eae eB wR HM 北京 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 :100717 http:/www.sciencep.com Ree PAH RRA) 印 刷 科学 出 版 社 发 行 各 地 新 华 书店 经 销 2002 年 8 月 第 一 版 开本 :B5 (720x1000) 2003 年 2 月 第 二 次 印刷 印张 :17 插页 :1 印 数 :8 001 一 12 000 字数 :324 000 定价 :21.00 元 (如 有 印 装 质量 问题 ,我 社 负 责 调 换 ( 环 伟 ) = 编 编 者 审 校 本 书 编著 人 员 PRA (西北 农林 科技 大 学 ) ( 按 姓氏 笔画 为 序 ) 马 静 芳 (甘肃 农业 大 学 ) 文 建 雷 (西北 农 林 科技 大 学 ) 项 普遍 (西北 农林 科技 大 学 ) 刘 卫 群 (河南 农业 大 学 ) 刘 香 利 (西北 农林 科技 大 学 ) 张大 鹏 (西北 农林 科技 大 学 ) ME (西北 农林 科技 大 学 ) 陈 ， 鹏 (西北 农林 科技 大 学 ) 范 三 红 (西北 农林 科技 大 学 ) Bede (MK ER) 孟 ， 玲 (沈阳 化 工学 院 ) AMA (西北 农林 科技 大 学 ) 胡 景 江 (西北 农林 科技 大 学 ) 高 ， 玲 (莱阳 农学 院 ) 郭 红 祥 (河南 农业 大 学 ) AB A (RMR EB) RAB RRA : = rah aap ahaa 有 rere £%. is Paige: Pe bash am. 中 eieicene ot a8 RS ‘ape code SEE AST fa ree 4Anm)RAE ig 中 前 近 几 年 来 ,我 国 高 等 教育 改革 步伐 加 快 。 不 少 院 校 组 建 了 生命 科学 学 院 或 生 物 学 院 , 相继 建立 了 生物 技术 生物 工 程 . 生 物 科 学 等 新 专业 。 生 物化 学 是 这 些 专 业 的 重要 基础 课 , 受到 各 院 校 的 高 度 重视 。 如 何 改革 生物 化 学 教学 , 进一步 提高 教 学 质量 , 促进 生命 科学 新 专业 的 成 熟 与 发 展 , 有 两 个 问题 吸 待 解决 ,一 是 实现 生物 化 学 理论 课 教 学 与 实验 技术 课 教学 的 分 离 , 真正 加 强 实验 课 教学 ;二 是 编写 一 部 适 合生 命 科 学 各 新 专业 需要 又 兼顾 农林 学 科 各 相关 专业 使 用 的 新 型 技术 课 教材 。 本 书 就 是 在 这 种 形势 下 , 经 几 所 院 校 全 体 编者 共同 努力 完成 的 。 这 本 《生物 化 学 实验 方法 和 技术 不 同 于 以 前 传统 的 生物 化 学 实验 指导 书 的 编 写 模 式 。 全 书 分 为 上 中、 下 三 篇 。 上 篇 为 生物 化 学 实验 方法 和 技术 原理 , 分 生化 分 离 方法 、 生 化 分 析 方 法 、 生 化 制备 方法 生化 代谢 研究 方法 等 4 章 , 把 现代 生物 化 学 技术 的 精华 系统 扼要 地 介绍 给 读者 。 中 篇 为 生物 化 学 实验 , 设计 了 基础 训练 、 基 本 实验 、 重 点 实验 、 综 合 实验 选择 实验 等 5$ 个 单元 , 共计 45 个 实验 。 实 验 内 容 层 次 分 明 , 相对 独立 ,由浅 入 深 , 循序 渐进 , 着 眼 于 学 生 的 能 力 素质 培养 。 由 于 安排 了 难 易 程 度 不 一 的 选择 实验 单元 ,加 大 了 各 院 校 的 选择 余地 , 兼顾 了 学 生 知 识 面 的 开 拓 。 经 过 讲授 和 操作 , 学生 将 受到 系统 的 生化 实验 方法 和 技术 的 基本 训练 , 他 们 获 得 的 实验 知识 和 实验 技能 系统 新 颖 、 实 用 , 对 将 来 从 事 科 学 研究 具有 黄 基 作用 。 下 篇 为 精 编 的 附录 ,内 容 广泛 , 实用 性 强 , 使 本 书 具 有 部 分 工具 书 的 属性 , 值得 读者 收 藏 , 随时 查阅 。 本 书 融 入 编者 多 年 教学 和 科研 的 经 验 ,是 对 所 有 参 编 院 校 历 届 版 本 生化 实验 教材 的 继承 和 发 展 。 ARS EH PRE HEE Se, 负责 制定 编写 大 纲 , 对 全 书 进 行 统 稿 、 修 改 ,并 承担 了 上 篇 全 部 、 中 篇 的 实验 5$.8、9、17、 35、 36、37、38、44、45, 下 篇 附录 1 一 13、15 的 全 部 内 容 , 附录 16 的 大 部 分 内 容 , 实验 16,18~20,27,.28 及 附录 14 部 分 内 容 的 编写 。 陈 鹏 承担 了 实验 11.16、18\19、 27、30 一 32 和 附录 9、16 的 编写 。 胡 景 江 、 文 建 雷 承担 SLR 1.2.4.7 的 全 部 内 容 和 附录 16 部 分 内 容 的 编写 。 实 验 12、20 SKA Sa 写 。 范 三 红 编 写实 验 22、 上 篇 凝 胶 成 像 技术 部 分 , 并 为 全 书 绘制 了 大 部 分 择 图 。 实验 28 由 巩 普遍 编写 。 赵 丽 莉 编写 了 实验 6 和 附录 16 部 分 内 容 。 刘 香 利 编 写 了 实验 21。 刘 卫 群 、 郭 红 祥 编写 实验 41 一 43。 马 静 芳 编写 实验 13、33、34。 高 玲 、 易 晓 华 编写 实验 3`.14、 23、 25、. 29.40。 备 玲 编写 实验 10、.15、 24、26、39。 在 编写 过 程 中 ,参阅 了 众多 书籍 和 资料 , 在 参考 文献 中 恕 未 能 全 部 列 出 。 李 品 愈 教 授 在 百 忙 之 中 精心 审 校 全 部 书稿 , 提出 许多 宝贵 意见 。 西 北 农林 科技 大 学 教 材 科 薛 辉 、 陈 俊 峰 同志 为 本 书 的 出 版 做 了 周密 安排 并 给 予 热情 支持 。 科 学 出 版 社 李 锋 、 霍 春 雁 编 辑 为 本 书 的 出 版 和 润色 付出 了 辛勤 劳动 。 在 此 一 并 表示 衷心 地 感 谢 。 从 决定 编写 本 书 开始 到 书稿 完成 ,仅仅 4 个 月 时 间 。 虽 然 有 陈 毓 荃 主编 的 《 生 物化 学 实验 方法 和 技术 》( 世 界 图 书 出 版 公司 , 1999) 为 蓝本 , 但 新 增 内 容 很 多 , 时间 显得 过 于 仓促 , 错误 及 不 当 之 处 在 所 难免 , 敬 请 读者 批评 指正 。 谨 以 此 书 敬 献 给 我 国 农业 生化 葛 基 者 之 一 净 隆 飞 教授 。 编 者 2002 年 6 月 30 日 于 杨凌 ik = 上 篇 ”生物 化 学 实验 方法 和 技术 原理 be 5 Wisi PRE a Ra AG RE 让 放流 时 就 寺 放款 和 a a Ti i 3 air Hac ld GR OR SiG ener seed nee Sd pease eos vessel) 第 二 节 层 析 技术 pp 录 eR. ©, a, Ee oe oe So Soe ee eee cea oe Ee ee ee OE eee ee ee eee ok oo) eee ee ee ag oe eee eee nes | EES fy Se = BEDS BG REE RE AR ik ne eee ee cee cee eee cee cee cee eaten eee ceeaeeuneeee cee ees De PERE OBES SERIE es nretenennenns cis idiicsiesiee Fi SDS BR Fa SBE IRE BE BE DK cece eee cee cee cesses cesses cee aee eee ceesneeeeaenens OF Pe CURE TE GMS Miia cscs Boegeep me. gE oe She Da ME BRE EBS: 实验 十 四 实验 十 五 第 三 单元 BA 实验 十 六 实验 十 七 实验 十 八 实验 十 九 实验 二 十 实验 二 十 一 实验 二 十 二 实验 二 十 三 实验 二 十 四 实验 二 十 五 实验 二 十 六 第 四 单元 ”综合 实验 二 十 七 实验 二 十 八 实验 二 十 九 第 五 单元 ”选择 实验 三 十 实验 三 十 一 实验 三 十 二 实验 三 十 三 实验 三 十 四 实验 三 十 五 实验 三 十 六 实验 三 十 七 实验 三 十 八 实验 三 十 九 粉 酶 活力 测定 - SK, 值 测定 - eee 1 EK AAO ERR NI 蛋白 质 的 两 性 性 质 及 等 电 点 的 测定 - 蛋白 质 含量 测定 ( 考 马 斯 亮 蓝 G-250 法 ) - 还 原粮 和 总 六 含量 的 测定 (3, 5 二 硝 基 水 杨 酸 比 色 法 ) 丙酮 酸 含量 的 测定 … ai eR LAR SH (2, 6 — ALT KEE) 实验 … 原 单 核 苷 酸 的 离子 交换 柱 层 析 分 离 … 连续 帝 度 梯度 电泳 法 测定 蛋白 质 的 分 闻 质 量 及 纯度 忆 过 氧化 物 酶 同 工 酶 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 圆 盘 电 泳 … 双 癌 免疫 扩散 试验 … 脂肪 含量 的 测定 及 高 级 脂肪 酸 组 苍 分 析 ( 气 相 色谱 法 ) ~ eee eee eee 质粒 DNA 的 提取 、 酶 切 及 电泳 鉴定 wee eee eee cee eee eee eee eens 高 等 植物 DNA 的 提取 和 纯度 鉴定 酵母 蛋白 质 和 RNA anetiee- eR BB 2 酵母 RNA 的 提 制 ( 浓 盐 法 ) … 多 酚 氧 化 酶 的 制备 和 化 学 性 质 .…. HERE 系统 分 析 … 果实 六 划 看 白 酶 的 动力 学 测定 ..。 sig... 2 BE GR LS RE)» 重 白质 含量 测定 (Folia -BHYE) ~ nannies a i: ae ee oe 162 * 142 二 142 。 162 还 原 糖 含量 的 测定 (Somogyi-Nelson 比 色 法 ) sees eee eee eee ee 可 溶性 总 糖 的 测定 【 草 酮 比 色 法 ) 和 可 溶性 总 糖 的 测定 (地 衣 酚 -硫酸 法 ) eee eee eee eee cece 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 的 测定 〈 双 波长 法 ) pp 果 胶 质 含量 测定 (重量 法 ) 一 1398i 中 性 蛋白 酶 活性 的 测定 有 64 166 168 171 174 *-- 175 179 180 183 HEE Wigs 27 RE Te BS eK 4 BS REP BR ooo nee cee eee cee eee cee tee eee eee eee en 质 膜 透 性 与 抗旱 性 鉴定 〈 连 续 升温 电导 法 ) ee 实验 四 十 一 实验 四 十 二 实验 四 十 三 实验 四 十 四 实验 四 十 五 下 篇 附 录 一 实验 室 安全 及 防护 知识 ……………………: oh pion Carbide SHES Sire 渗透 范 00s 000 ccc sce cco 400 we 和 四 四 SF RE ASO A, Amicon FG a8 5 AR BIR AB FOB BT HS RAD AHR «eee eee 7<, Amicon 圆 形 超 滤 膜 的 流速 … ask — 的 常用 表 - . 调整 硫酸 贸 溶 液 饱和 度 计 算 表 (25 和 下 ) cen cee cee cee cee cence cee ceeceeceecneeee 2. 调整 硫酸 铵 溶液 饱和 度 计算 表 (OYC )… In a lamb SS << 八 、 as DY 王 . Ate ERB (0.05mol/L, pH1.0~2.2,25T) pp . 甘氨酸 -盐酸 缓冲 液 (0.05mol/L, pH2.2~3.6,25T ) vives . 邻 苯 二 甲酸 氢 钾 -盐酸 缓冲 液 (0.05mol/L, pH2.2~4.0,25T ) . 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓 冲 液 (0.1moML，pH3.0 一 6.2) verereree ester sete . 乙酸 -乙酸 钠 缓冲 液 (0.2mol/L, pH3.7~5.8, 18) cercee eer eeeeee ees . 二 甲 基 戊 二 酸 - 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 (0.05SmolL，pH3.2 一 7.6) see . 丁 二 酸 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05mol/L, pH3.8~6.0, 25T ) sree . 邻 苯 二 甲酸 氢 钾 - 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 (pH4.1~5.9, 25) vvreer eee ereees 10. 磷酸 氢 二 钠 -磷酸 二 氢 钠 缓冲 液 (0.2moML，pH5.8 一 8.0，25ST ) 11. 磷酸 二 氢 钾 - SMALE (pH5.8~8.0) -- 12. Tris-HCl 缓冲 液 (0.05mol/L, pH7~9) … 13. FLW SEER (pHO.8~9.6, 18) ccreeecer eee cee eee cee tenets eneees 14. 2,4,6 -三 甲 基 吡 啶 -盐酸 缓冲 液 (pH6.4~8.3) 16. HHA Wb Be rp HR (pH8.1~10.7, 25C ) ey ee ee eR ee ee ‘vi 18. BEAR BAe RS BE (0.1mol/L, pH9.2~10.8) 本 19. 硼酸 -氧化 钾 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.1moVL，pH8.0 一 10.2) s-r+e++++ 20. 二 乙醇 胺 -盐酸 缓冲 液 (0.05mol/L, pH8.0~10.0, 25) creer 21. 硼砂 - 氨 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05Smol/L 硼酸 根 ,pH9.3 一 10.1) … 22. ERA — W-S Ak (0.025mol/L, pH11.0~11.9, 25T ) 23. site ein (0.05mol/L, pH12.0~13.0, 25T) 24. 广 范围 缓 冲 液 (pH2.6~12.0, 18T) … 25. 离子 强度 恒定 的 缓冲 液 (pH2.0~12.0)- 26. 酸度 计 标准 缓冲 溶液 的 配制 … 1. Sephadex G 9 RISC RRERE REN . 琼脂 糖 凝 胶 的 数据 ， . SAR BE ERE Bio-Gel A 型 的 数据 … . Bio-Gel P 型 凝 胶 的 数据 - ea . BOHR AE Z. li HEME Bio-Beads S-X 型 的 数据 … . 制备 级 Superdex BERET RA RG … Oo mAN NHN FW NY Sepa G ASAE ERE EB 机 . Superose 的 数据 os 229 ~ 220 sins 930) 2 DD. Zr PUREE I ERY ICHE AE nee decrees ec cacene sce eeecen cence sen eee aes 十 、 凝 胶 过 滤 用 标准 蛋白 - 1. 凝 胶 过 滤 用 低 分 子 质 量 标准 的 组 成 ， 2. 凝 胶 过 滤 用 高 分 子 质量 标准 的 组 成 RT AE TERRE Bo oo sen screenees asi sanaacees den ces susane dacienen (=) 糖 蛋 日 染色 …… (四 ) 脂 和 蛋白 染色 Hale dew esinpewRnee FES Bie 8 OR UEO Reel AROORMlehaleopiacic be Sele es ese 而 4 本 本本 下 有 PS fal TR Saeed esc tesce 十 五 、 实 验 误 差 与 提高 实验 准确 度 的 方法 2 “3 ER 7, eis Be EE ice, A seeeeeees 23] 231 sass 39 ws Dee 了 Zao “< 2 253 235 eee 235 235 “« @o0 2o7 … 238 - 239 cove 239 … 245 (—) 实验 误差 aoa b SWigb dine Cole sine s sos aes/pb s palabeoc we Gab cho die Seb dhl Git 2a s Seen eee (四 ) 722 型 光栅 分 光 光 度 计 (7) 自动 部 分 收集 器 pp * vill ° es eo 4 Hy FASCIS Fy KAIRIE 第 一 章 “” 生物 化 学 分 离 方法 细胞 是 生物 体 的 基本 结构 单位 。 细 胞 体积 虽 小 , 其 内 含 物 成 分 却 极为 复杂 。 进行 细胞 成 分 的 生化 分 析 或 从 细胞 中 制备 所 需 的 生化 物质 , 一 般 是 先 用 适当 的 方 法 破碎 细胞 , 并 用 相应 的 溶剂 提取 。 细 胞 一 旦 破裂 ,各 种 组 成 成 分 就 高 度 混 合 在 一 起 。 从 细胞 提取 物 中 要 获得 某 类 或 某 种 特定 成 分 , 必须 采用 各 种 有 效 的 生物 化 学 分 离 方法 。 其 中 最 重要 的 方法 是 离心 技术 、 层 析 技 术 \ 电 泳 技术 和 膜 分 离 技术 。 第 一 节 ”离心 技术 当 物 体 围绕 一 中 心 轴 做 圆周 运动 时 , 运动 物体 就 受到 离心 力 的 作用 。 旋 转速 度 越 高 ,运动 物体 所 受到 的 离心 力 越 大 。 如 果 装 悬 浮 液 或 高 分 子 溶 液 的 容器 进 行 高 速水 平 旋转 , 强大 的 离心 力作 用 于 溶剂 中 的 悬浮 颗粒 或 高 分 子 , 会 使 其 沿 着 离 心力 的 方向 运动 而 逐渐 背离 中 心 轴 。 在 相同 转速 条 件 下 , 容器 中 不 同 大 小 的 悬浮 颗粒 或 高 分 子 溶 质 会 以 不 同 的 速率 沉降 。 经 过 一 定时 间 的 离心 操作 ,就 有 可 能 实 现 不 同 悬 浮 颗 粒 或 高 分 子 溶 质 的 有 效 分离 。 在 生命 科学 研究 中 广泛 使 用 的 离心 机 , 就 是 基于 上 述 基 本 原理 设计 的 。 一 、 离 心 沉降 速率 影响 因素 盛 有 某 种 悬浮 物 液 体 的 容器 项 置 时 , 在 重力 场 作用 下 悬浮 颗粒 会 逐渐 沉降 下 来 。 假 设 悬 译 颗粒 具有 刚性 球状 ,在 其 自然 沉降 过 程 中 同时 受到 摩擦 力 Fi 和 浮 力 F, 的 双重 作用 : Fy = 6nqr, So (die 4) F, = (pp — Pm) Vg (1-2) (1- 1) 式 中 ，7 一 溶剂 介质 的 黏度 系数 ; rp 一 悬浮 颗粒 的 半径 ; 对 一 悬浮 颗粒 的 沉降 速率 , 即 单位 时 间 内 沉降 的 距离 。 (1 - 2) 式 中 ，pe 一 悬浮 颗粒 的 密度 ; pw 一 溶剂 介质 的 密度 ; V 一 悬浮 颗粒 的 体积 ; &g 一 重力 加 速度 。 当 悬 浮 颗 粒 呈 匀速 沉降 时 , Fi = 因此 ， 6xqr, = ms = (pp = pm) Ve ki 3) 由 于 球形 颗粒 体积 OV = 人 rr3， 代入 (1-3) 式 得 一 一 = =A di 97 (1-4) 以 上 讨论 的 是 悬浮 颗粒 在 重力 场 中 的 自然 沉降 现象 。 如 果 该 颗粒 的 沉降 是 在 强大 的 离心 力 场 中 发 生 , 颗粒 受到 的 离心 加 速度 wr 代替 (1-4) 式 中 的 g, 其 沉降 —~ = 4-5) (1- 5) 式 仅 适 用 于 球形 颗粒 。 对 非 球形 颗粒 来 说 , 沉降 过 程 中 沉降 运动 的 颗 粒 与 悬浮 介质 之 间 的 摩 氛 系 数 太 不 同 于 球状 颗粒 状况 下 的 摩擦 系数 万 , (1- 5) 式 经 校正 可 得 一 般 状 况 下 的 沉降 速率 ie Z7sEp。 Pm) ‘wr al dt” 9 f/ fo) Me §) 从 (1- 6) 式 可 以 看 出 ,悬浮 液 中 颗粒 在 离心 力 场 中 的 沉 沉降 速率 科 主 要 受 以 下 因素 影响 :颗粒 半径 > , 的 大 小 、 颗 粒 形状 (影响 摩擦 系数 让、 颗粒 eae 的 密 度 差 (o, - ，) 一 定 温度 条 件 下 悬浮 介质 的 黏度 系数 及 离心 加 速度 wzr 。 在 确定 的 离心 操作 中 , 沉 沉降 速率 下 实际 上 主要 取决 于 悬浮 颗粒 所 受到 的 离心 FAK, 即 与 离心 机 旋转 的 角速度 平方 值 w”? 人 线 的 距离 ~ 成 正比 。 习惯 上 以 相对 离心 力 RCF 即 离心 加 速度 w?> 与 重力 加 速度 g 的 比值 表示 沉 降 颗粒 在 离心 力 场 中 所 受到 的 离心 作用 : 27 RCF = 24 £ 其 大 小 用 重力 加 速度 g 值 的 倍数 来 表示 ,如 10 000 g, 50000 g 等 。 (1-7) 式 中 的 角速度 w 不 便 测 量 , 而 角速度 w 与 离心 机 转速 2 (单位 :min) 之 间 有 如 下 关系 : (二 过 9 人 mT? n 7 30 RCF= wr = Ae n/30)? + r 8 2 2 oh 人 9002 = 1 19 x10 ~ 2 r 这 样 ,当知 道 了 离心 机 转速 ”及 转 头 半径 ~ 后 , 就 很 容易 计算 出 相对 离心 力 RCF。 需 要 指出 的 是 ,大 多 数 离心 机 转 头 说 明 上 标示 2 个 半径 参数 , 即 最 大 半径 与 最 小 半径 , 其 最 大 半径 一 般 指 从 离心 管 底 到 旋转 轴 中 心 的 距离 。 而 科技 文献 作者 所 列 离心 力 一 般 为 平均 离心 力 ,表示 离心 管 中 溶 液 中 心 位 点 到 旋转 轴 之 间 的 离心 力 。 二 、 沉 降 系 数 当 一 个 已 知 大 小 和 密度 的 颗粒 悬浮 在 一 种 已 知 密度 和 黏度 系数 的 液体 中 进行 离心 沉降 时 , 它 的 re\ps\pm\7 和 上 刀 广 将 是 个 定 值 , (1 - 6) 式 表示 的 沉降 速率 全 将 与 wzr 成 正比 , (1 - 6) 式 可 改写 成 ; SS 用人， G17 8) (1 -8) 式 中 比例 常数 S 称 为 沉降 系数 , 表示 单位 离心 力 场 下 的 沉降 速率 即 通 过 单位 离心 力 场所 需要 的 时 间 , 因此 其 单位 为 秒 。1S 单位 等 于 1x 10-8 未 知 的 细胞 器 、 亚 细胞 器 ,生物 高 分 子 常用 S 值 粗略 表示 其 大 小 , 如 70S ORE 16S rRNA 等 。 沉降 系数 S 是 一 个 实验 值 。(1 -8) 式 可 改写 成 ， Sear ae 对 上 式 进行 定 积分 ， s| “de 三 i e 得 : 本 r2 S(t2 - t1) = er In In = ona (1-0) 将 自然 对 数 改 为 常用 对 数 , 得: S = 2.303 + Tee (1-10) 由 于 = AEB RAC -10) 式 ,得 : log(r2/r,) n* » (#2 — t,) 在 (1-11) 式 中 ，rtr2? 一 分 别 为 离心 测定 起 始 与 终止 时 颗粒 与 转轴 中 心 的 距离 ; to 一 一 为 消逝 时 间 , 即 测定 终止 与 起 始 时 的 时 间 差 ( 秒 ); 7 一 离心 机 转速 。 根据 (1-11) 式 ,通过 离心 操作 可 以 测 得 某 种 悬浮 颗粒 或 生物 高 分 子 的 沉降 系 数 。 当 同一 物质 被 悬浮 或 溶解 在 不 同 溶剂 中 , 或 在 不 同 温度 条 件 下 进行 测定 , 会 得 到 不 同 的 结果 。 通 常 ,在 任何 条 件 下 测 得 的 沉降 系数 都 可 换算 成 标准 状态 (20Y ， 纯 水 ) 下 的 S 值 (So,w)。 其 换算 公式 如 下 : 11, m{ Pp — 020,w Soo = (Stzm) * aes 和 (1-12) 式 中 , Sr 一 样品 在 m 溶剂 中 温度 为 工时 测 得 的 沉降 系数 ; 7T,n 一 溶剂 m 在 工 温 度 时 的 黏度 系数 ; 720.w 一 纯 水 在 20 时 的 黏度 系数 ; ov 一 样品 的 密度 ; of ua 一 溶剂 m 在 工 温 度 时 的 密度 ; ozo,w 一 207 时 纯 水 的 密度 。 在 生物 化 学 研究 中 , 沉降 系数 S 有 两 个 重要 用 途 : 1. 预计 沉降 时 间 对 已 知 S 值 的 物质 ,根据 (1 - 9) 式 可 预先 计算 出 在 离心 管 中 完 成 沉降 所 需要 的 时 间 : S = 2.1x10°- (1-11) (1-12) 2. 测定 物质 分 子 质量 由 测 得 的 某 物 质 的 沉降 系数 , 根据 Svedberg 公式 可 计算 出 其 分 子 质量 : 闪 RTSyo0, w _ Dag), — Ve) (1-13) 式 中 ，R 一 气体 常数 , 等 于 1.987 K/BB; T 一 热力 学 温度 ; Soo, .一 标准 状况 下 粒子 的 沉降 系数 ; D9, ,一 理想 状态 ( 即 以 20°C 的 水 为 介质 ) 时 粒子 的 扩散 系数 ; V 一 微分 比 容 , 等 于 溶质 粒子 密度 的 倒数 ; o 一 溶剂 密度 。 全 3 三 、 离 心 设备 离心 机 是 生命 科学 研究 中 的 一 种 基本 设备 , 一 般 由 离心 机 主机 、 转 头 、 离 心 管 三 部 分 组 成 。 根 据 性 能 , 离心 机 分 为 三 种 类 型 , 即 低速 离心 机 (转速 在 2 000 一 6 000 min 之 间 , 最 大 RCF 可 达 6 000 g)、 高 速 离心 机 (转速 在 18 000 一 25 000 r/min 之 间 , 最 大 RCF 达 60 000 g)、 超速 离心 机 (转速 在 40 000 ~ 100 000 r/min 之 间 , 最 大 RCF 达 803 000 g)。 超 速 离心 机 按 性 能 又 分 为 分 析 型 、 制 备 型 和 分 析 制备 型 三 类 。 做 为 生化 分 离 手段 ,最 常 使 用 的 是 制备 型 超速 离心 机 和 高 速 离心 机 。 转 头 是 离心 机 的 重要 组 成 部 分 , 一 般 有 数 十 种 不 同 容量 和 性 能 的 转 头 供用 户 选择 。 按 旋转 时 离心 管 中 心 线 与 离心 机 转轴 间 的 夹 角 大 小 , 离心 机 转 头 主要 有 角 度 转 头 ( 角 度 在 14" 一 40" 之 间 )、 垂 直 转 头 ( 角 度 为 0) 水 平 转 头 (角度 为 90") 三 类 。 高 速 离心 机 和 超速 离心 机 的 每 个 转 头 都 规定 了 一 定 的 使 用 限度 , 即 运 转 次 数 (与 转 速 无 关 ) 和 运转 时 间 ( 最 大 速度 下 )。 如 果 转 头 使 用 达到 了 规定 极限 还 要 使 用 , 其 最 大 额定 速度 值 应 降低 10% , 方 可 保证 安全 。 在 管理 方面 , 每 个 转 头 必须 单独 建立 档案 , 记录 使 用 的 次 数 和 在 最 大 转速 下 使 用 的 时 间 。 另 外 , 转 头 上 标定 的 最 大 额定 转速 是 有 条 件 的 , 实际 使 用 时 应 遵守 规定 。 离心 管 及 其 管 帽 是 转 头 的 重要 附件 。 制 造 离 心 管 的 材料 主要 有 特种 玻璃 、 塑 料 和 不 锈 钢 三 类 。 应 根据 材质 性 质 及 离心 实验 要 求 选 用 。 四 、 制 备 超 离心 法 制备 超 离 心 法 可 用 来 分 离 细胞 、 亚 细胞 结构 或 生物 高 分 子 。 根 据 分 离 的 原理 不 同 , 制 备 超 离心 法 又 可 分 为 差 速 离心 法 和 密度 梯度 离心 法 两 类 操作 方法 。 1. 差 速 离心 法 差 速 离心 法 又 叫 分 级 分 离 法 。 装 有 不 均一 粒子 的 离心 管 在 离心 机 中 高 速 旋 转 时 ,大 小 ` 密 度 不 同 的 粒子 将 以 各 自 的 沉降 速率 移 向 离心 管 底 部 。 如 果 设 计 一 定 的 转速 和 离心 时 间 , 沉降 速率 最 大 的 组 分 将 首先 沉淀 在 离心 管 底部 , 沉降 速率 中 等 及 较 小 的 组 分 继续 留 在 上 清 液 中 。 将 上 清 液 转移 至 另 一 离心 管 中 , 提高 转速 并 掌握 一 定 的 离心 时 间 , 就 可 获得 沉降 速率 中 等 的 组 分 。 如 此 分 次 操作 , 就 可 在 不 同 转速 及 时 间 组 合 条 件 下 , 实现 沉降 速率 不 同 的 各 个 组 分 的 分 离 (图 1.1)。 用 差 速 离心 法 分 离 到 的 某 一 组 分 , 其 实 并 不 十 分 均一 , 沉淀 中 往往 混 有 部 分 沉 降 速 率 稍 小 一 些 的 组 分 。 此 时 , 可 在 沉淀 中 添加 相同 介质 令 沉 淀 悬 浮 , 再 用 较 低 转 速 离心 , 获得 较 纯 的 沉淀 而 洗 去 大 部 分 杂质 。 如 此 反复 采用 高 速 、 低 速 离心 操作 ， 即 可 获得 较 纯 的 组 分 。 CoS | 小 CRESS | | BASS | || 山 tl 沉淀 2 图 1.1 差 速 离心 的 操作 步骤 差 速 离心 法 是 基于 不 同 组 分 沉降 速率 不 同 而 实现 混合 物 分 离 的 方法 , PRE 较 简 单 。 但 差 速 离心 的 效率 低 , 费时 间 。 得 到 的 组 分 不 太 均 一 , 悬浮 洗涤 方法 虽然 可 以 提高 分 离 组 分 的 纯度 , 但 会 降低 其 回收 率 , 当 组 分 差异 过 小 时 , 多 次 洗涤 、 分 离 也 将 无 济 于 事 。 此 时 , 就 需要 考虑 换 用 分 辩 率 更 高 的 离心 方法 。 2. 密度 梯度 离心 法 离心 操作 如 果 在 一 种 连续 密度 梯度 介质 中 进行 , 这 类 离心 方法 就 是 密度 梯度 离心 。 它 比 差 速 离心 法 复杂 , 但 具有 很 好 的 分 辨 能力。 密度 梯度 离心 可 以 同时 使 样品 中 几 个 或 全 部 组 分 分 离 , 这 更 是 差 速 离心 法 所 不 及 的 。 根 据 操作 方法 的 不 同 ， 密度 梯度 离心 法 又 可 分 为 速率 区 带 离 心 和 等 密度 梯度 离心 两 种 。 (1) 速 率 区 带 离心 首先 在 离心 管 中 灌 装 好 预制 的 一 种 正 密 度 梯 度 介 质 液 , 在 其 表面 小 心 铺 上 一 层 样品 溶液 (图 1.2)。 离 心 期 间 , 样品 中 各 组 分 会 按照 它们 各 自 的 沉降 速率 沉降 ， 被 分 离 成 一 系列 的 样品 组 分 区 带 , 故 称 速率 区 带 离心 。 图 1.2 颗粒 在 水 平 转 头 中 的 速率 区 带 分 离 二 or 心 管 ;2. 把 样品 加 在 梯度 液 的 顶部 ;3. 在 离心 力 的 作用 下 颗粒 根据 各 自 的 质量 按 不 同 的 速度 移动 预制 密度 梯度 介质 的 作用 有 两 个 , 一 是 支撑 样品 , 二 是 防止 离心 过 程 中 产生 的 对 流 对 已 形成 区 带 的 破坏 作用 。 但 是 样品 液 的 密度 一 定 要 大 于 密度 梯度 介质 的 最 大 密度 , 否则 就 不 能 使 样品 各 组 分 得 到 有 效 分 离 。 也 正 因 如 此 , 速率 区 带 离心 时 间 不 能 过 长 , 必须 在 沉降 速率 最 大 的 样品 区 带 沉降 到 离心 管 底部 之 前 就 停止 离心 。 不 然 ,样品 中 所 有 的 组 分 都 将 共 沉 下 来 , 不 能 达到 分 离 的 目的 。 ， 速率 区 带 离心 法 依据 样品 中 各 组 分 沉降 速率 的 差别 而 使 其 互相 分 离 。 离 心 过 程 中 ,各 组 分 的 移动 是 相互 独立 的 。 因 此 , S 值 相差 很 小 的 组 分 也 能 得 到 很 好 的 分 离 ,这 是 差 速 离心 法 做 不 到 的 。 但 速率 区 带 离心 不 适 于 大 量 制备 实验 。 (2) 苇 密度 梯度 离心 如 果 离 心 管 中 介 质 的 密度 梯度 范围 包括 待 分 离 样品 中 所 有 组 分 的 密度 , 离心 过 程 中 各 组 分 将 逐步 移 至 与 它 本 身 密 度 相 同 的 地 方形 成 区 带 (图 1.3), 这 种 分 离 方法 称 为 等 密度 梯度 离心 。 在 等 密度 梯度 离心 中 , 组 分 的 分 离 完全 取决 于 组 分 之 间 的 密度 差 。 离 心 时 间 的 延长 或 转速 提高 不 会 破坏 已 经 形成 的 样品 区 带 ,也 不 会 发 生 共 沉 现象 。 作为 分 离 方 法 , 离心 技术 在 生物 化 学 研究 中 得 到 广泛 应 用 。 和 欲 深 入 了 解 本 领 域 知识 , 熟练 操作 离心 机 , 可 进一步 阅读 有 关 专 著 , 接受 专门 培训 。 图 1.3 等 密度 梯度 离心 时 颗粒 的 分 离 1. 样 品 和 梯度 的 均匀 混合 液 ;2. 在 离心 力作 用 下 , 梯度 重 新 分 配 ,样品 区 带 呈 现在 各 自 的 等 密度 处 BT) 层 析 技术 层 析 技 术 是 一 类 物理 分 离 方法 ,根据 待 分 离 混合 物 中 各 组 分 物理 化 学 性 质 的 差别 , 使 各 组 分 以 不 同 程度 分 布 在 固定 相 和 流动 相 两 相 中 , 由 于 各 组 分 随 流 动 相 前 进 的 速度 不 同 , 从 而 得 到 有 效 分 离 。 按照 操作 形式 的 不 同 , 层 析 技 术 可 分 为 纸 层 析 、 薄 层 层 析 和 柱 层 析 三 类 。 尽 管 各 种 层 析 在 原理 和 操作 上 有 所 不 同 ,但 其 基本 操作 步骤 都 包括 选择 适当 吸附 剂 、 加 样 \ 展 开 、 检 出 鉴定 四 个 环节 。 本 节 重 点 介绍 生物 化 学 分 离 中 常用 的 几 种 层 析 方 法 。 一 、 薄 层 层 析 薄 层 层 析 是 在 玻璃 板 上 涂 布 一 层 支持 剂 , 待 分 离 样品 点 在 薄 层 板 一 端 , 然后 让 推动 剂 从 上 流 过 , 从 而 使 各 组 分 得 到 分 离 的 物理 方法 。 常 用 的 支持 剂 有 :硅胶 G、 硅胶 GF、 氧 化 铝 、 纤 维 素 、 硅 藻 土 .硅胶 G 硅 菠 土 纤维 素 G\DEAE -纤维 素 、 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 等 。 使 用 的 支持 剂 种 类 不 同 , 其 分 离 原 理 也 不 尽 相 同 , 有 分 配 层 析 、 吸 附 层 析 、 离 子 交 换 层 析 、 凝 胶 层 析 等 多 种 。 推 动 剂 和 显 色 剂 种 类 很 多 , 本 书 附录 十 一 十 三 十 三 可 供 读者 参考 选用 。 薄 层 层 析 设备 简单 , 操作 简便 , 快速 灵敏 。 改 变 薄 层 厚 度 , 既 能 做 分 析 鉴 定 , 又 «= 0” 能 做 少量 制备 。 配 合 薄 层 扫描 仪 ,可 以 同时 做 到 定性 定量 分 析 , 在 生物 化 学 、 植 物 化 学 等 领域 是 一 类 广泛 应 用 的 物质 分 离 方法 。 二 、 聚 酰胺 薄膜 层 析 用 于 层 析 的 聚 酰 腕 有 两 类 , 一 类 是 锦纶 66( 尼 龙 ), 另 一 类 是 锦纶 6。 在 这 两 类 材质 中 , 都 含有 大 量 酰 胺 基 团 , 故 统称 聚 酰胺 。 聚 酰胺 以 其 一 CO 一 或 一 NH 一 与 极 性 化 合 物 的 一 OH 或 一 O 之 间 形 成 氢 键 ,从 而 发 生 吸 附 作 用 。 不 同 物质 与 聚 酰胺 之 间 形 成 氢 键 的 能 力 不 同 。 在 聚 酰胺 薄膜 上 做 层 析 分 离 时 , 流动 相 从 薄膜 表面 流 过 ,被 分 离 物 质 在 溶剂 和 薄膜 之 间 按 分 配 系数 的 大 小 , 发 生 不 同 速率 的 吸附 与 解吸 过 程 ,从 而 使 混合 物 得 到 有 序 的 分 离 。 聚 酰胺 薄膜 对 极 性 化 合 物 有 特异 的 分 辨 能 力 , 灵敏 度 高 ,操作 方便 , 速度 快 , FF 点 不 扩散 。 有 荧光 的 物质 可 用 紫外 灯 检 出 ,不 必 喷 显 色 剂 显 色 。 聚 酰胺 薄膜 可 用 来 分 离 多 种 化 合 物 。 在 蛋白 质 或 肽 的 N 末端 残 基 分 析 中 是 个 理想 方法 , HT PEE 基 酸 的 分 析 可 达 10 ?一 10 -1 mol/L KF. = BRIT 凝 胶 层 析 又 称 凝 胶 过 滤 , 是 一 种 柱 层 析 方法 。 层 析 柱 中 装着 水 不 溶 凝 胶 , 常用 的 材料 有 交 联 葡 聚 糖 (sephadex) 交 联 琼脂 糖 (sepharose CL)、 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 (biogel P) 琼脂 糖 (biogel A)、 多 孔 玻璃 (bio glass) A Z. fs ( bio-beads) #, 详情 请 参阅 本 书 附 录 九 。 这 些 材料 制 成 凝 胶 颗 粒 , 颗粒 内 部 形成 多 孔 的 三 维 网 状 结构 。 这 些 凝 胶 材 料 是 高 度 亲 水 的 , 在 水 溶液 里 吸水 显著 膨胀 。 当 在 胶 床 表面 加 上 分 子 大 小 不 同 的 样品 混合 物 并 用 洗 脱 液 洗 脱 时 , 直径 小 于 网 孔 直 径 的 自由 通 透 小 分 子 可 以 进入 胶 粒 内 部 , 需 层 层 扩散 , 流 过 很 长 路 程 才能 出 柱 ;而 直径 大 于 网 孔 直径 受 排 阻 的 大 分 子 不 能 进入 胶 粒 内 部 , 沿 着 胶 粒 之 间 的 间隙 向 下 流动 ,所 经 路 程 短 , 最 先 流出 。 通 透 性 居中 的 分 子 则 后 于 大 分 子 而 先 于 小 分 子 流 出 。 从 而 按 由 大 到 小 的 顺序 实现 大 中 小 分 子 的 分 离 ( 图 1.4)。 凝 胶 层 析 操 作 条 件 温 和 , 适 于 分 离 不 稳定 的 化 合 物 。 凝 胶 材 料 本 身 不 带电 荷 ， 不 会 与 被 分 离 物质 相互 作用 , 因而 溶质 的 回收 率 接近 100% 。 分 离 效 果 好 , 重 现 性 强 ,完成 一 次 分 离 需 时 较 短 。 每 个 样品 洗 脱 完毕 , 柱 已 再 生 , 可 反复 使 用 。 样 品 的 用 量 范围 宽广 ,从 分 析 量 到 试验 工厂 量 均 适 合 。 现 已 广泛 用 于 生化 物质 的 分 离 、 脱 盐 、 制 备 、 分 子 质量 测 定 等 。 -一 一 一 一 二 ~ nye. 凝 胶 颗 粒 内 部 \ (a) (b) RES 大 蛋白质 小 蛋白 质 分 级 次 序 (c) 图 1.4 BeBe VE (a) 图 解 表示 凝 胶 颗 粒 表面 有 给 定 大 小 范围 的 网 孔 ; (b) 层 析 过 程 中 不 同 大 小 分 子 逐步 分 离 ;(c) 分 级 分 离 结果 四 、 离 子 交 换 层 本 在 含有 可 与 周围 介质 进行 离子 交换 的 基质 上 进行 化 合 物 分离 的 方法 叫 离子 交 换 层 析 。 离 子 交 换 层 析 是 根据 物质 的 酸 碱 性 \ 极 性 和 分 子 大 小 的 差异 而 预 以 分 离 的 柱 层 析 技术 。 可 用 于 离子 交换 层 析 的 介质 材料 很 多 ,应 用 最 普遍 的 是 离子 交换 树脂 , 这 是 人 工 合 成 的 难 溶 于 一 般 溶剂 的 高 分 子 聚 合 物 , 可 分 为 阳离子 交换 树脂 和 阴离子 交换 树脂 两 类 。 带 有 酸性 可 电离 基 团 的 以 一 SO3H Rm, 称 为 阳离子 交换 树脂 。 带 有 碱 性 可 电离 基 团 的 以 R4NOH 表示 , 称 为 阴离子 交换 树脂 。 另外 , 把 纤维 素 上 少量 羟基 用 弱电 离 基 团 取代 制 成 的 纤维 素 衍 生物 , 在 生化 分 离 方面 更 为 常用 。 它 具有 松散 的 亲 水 性 网 络 , 有 较 大 的 表面 积 ,对 生物 高 分 子 有 较 好 的 通 透 性 。 由 于 羟基 被 取代 的 百分比 较 低 , 离子 交换 纤维 素 的 电荷 密度 比 树 脂 低 得 多 , 所 以 洗 脱 条 件 温 和 , 回收 率 高 。 常 见 的 阴离子 交换 纤维 素 有 磺 酸 甲 基 纤 维 素 (SMC) 、 羧 甲 基 纤 维 素 (CMC)、 磷 酸 基 纤 维 素 (PC) 等 ,阳离子 交换 纤维 素 有 二 乙 基 胺 乙 基 纤维 素 (DEAEC) 三 乙 基 腕 乙 基 纤 维 素 (TEAEC) 等 。 根据 离子 交换 层 析 原理 设计 的 氢 基 酸 自 动 分 析 仪 在 生化 分 离 中 是 非常 有 用 的 LA. 五 、 亲 和 层 析 亲 和 层 析 是 利用 某 些 生物 分 子 之 间 专 一 可 逆 结 合 特性 的 分 离 方 法 。 其 基本 操 作 过 程 如 下 : 1) 寻 找 能 被 分 离 分 子 ( 称 配 体 ) 识 别 和 可 逆 结 合 的 专 一 性 物质 一 一 配 基 。 2) 把 配 基 共 价 结合 到 层 析 介 质 ( 载 体 ) 上 , 即 把 配 基 固 定 化 。 3) 把 载体 - 配 基 复 合 物 灌 装 在 层 析 柱 内 做 成 亲 和 柱 。 4) 上 样 亲生 洗涤 杂质 -一 洗 脱 收集 亲 和 分 子 ( 配 体 ) 王 亲 和 柱 再 生 (图 1.5)。 在 亲 和 层 析 中 可 用 琼脂 糖 、. 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 和 受 控 多 孔 玻璃 球 做 层 析 介质 , 以 琼脂 糖 最 为 常用 , 它 是 琼脂 脱胶 产物 ,是 由 ED - 半 乳 糖 - 3, 6 -脱水 半 乳 糖 广 组 成 的 链 状 高 聚 物 。 用 琼脂 糖 做 载体 , 非特 异性 吸附 低 , 与 被 分 离 分 子 作用 微弱 。 多 和 孔 结构 具有 很 好 的 液体 流动 性 。 在 较 宽 的 pH 离子 强度 和 变性 剂 浓度 范围 内 具有 化 学 和 机 械 稳定 性 。 根 据 需要 对 其 进行 不 同 程度 活化 处 理 , 可 以 很 好 地 与 配 基 共 价 结合 。 配 基 是 发 生 亲 和 反应 的 功能 部 位 , 也 是 载体 和 被 亲 和 分 子 之 间 的 桥梁 。 配 基 本 身 必 须 具 备 两 个 基 团 , 一 个 能 与 载体 共 价 结合 , 一 个 能 与 被 亲 和 分 子 结合 。 可 作 配 基 使 用 的 物质 有 酶 底 物 的 类 似 物 、 效 应 物 \ 酶 的 辅助 因子 。 在 有 些 情 况 下 , 只 要 * 3 « BOAT iil] MATTE, th ay a EEE. ARAM YR, Je EB ay 设法 做 配 基 使 用 , 如 固定 化 抗体 可 分 离 抗原 , 固定 化 抗原 可 分 离 抗体 , Te aE A SER 脱氧 胸腺 喀 啶 核 苷 酸 (oligo dT) 可 以 亲 和 分 离 mRNA 等 。 洗 脱 A280 换 用 洗 脱 液 收集 管 编号 图 1.5 亲 和 层 析 操 作 过 程 和 亲 和 层 析 图 谱 全 一 一 酶 @ REA OME © 固 相 载 体 配 基 的 固定 化 方法 有 多 种 ,包括 载体 结合 法 、 物 理 吸 附 法 、 交 联 法 和 包 埋 法 等 四 类 。 亲 和 层 析 中 党 用 小 分 子 化 合 物 作 配 基 去 亲 和 吸 附 与 其 相配 的 大 分 子 物 质 。 但 固定 配 基 的 时 候 ,往往 占据 了 配 基 小 分 子 表面 的 部 分 位 置 , 由 于 载体 的 空间 位 阻 效应 可 能 影响 配 基 和 亲 和 分 子 的 密切 吻合 , 会 发 生 所 谓 的 无 效 吸附 。 此 外 , 琼脂 糖 活化 后 需要 与 配 基 的 游离 氨基 相连 , 如 果 小 分 子 配 基 本 身 是 不 具有 氨基 的 化 合 物 ， 偶 联 就 不 能 实现 。 为 了 解决 这 两 个 问题 , 可 以 在 琼脂 糖 载体 与 配 基 之 间接 入 不 同 长 度 的 化 合 物 接 臂 。 亲 和 层 析 是 利用 配 基 \ 配 体 之 间 专 一 可 逆 结 合 性 质 进行 物质 分 离 的 方法 ,因此 其 专 一 性 选择 性 是 极 高 的 ,往往 通过 一 次 亲 和 操 作 , 就 可 把 目的 物 从 混合 物 中 分 离 出 来 , 对 含量 甚 微 的 组 分 分 离 具有 特殊 的 效果 。 -14- 相 色谱 at sag aes PY 气相 色谱 是 柱 色 谱 的 一 种 。 气 相 色谱 仪 的 结构 见 图 1.6。 层 析 柱 是 其 核心 部 分 , 有 填充 柱 和 毛细 管 柱 两 类 , 以 前 者 较为 常用 。 在 填充 柱 里 装 有 层 析 介 质 俗 称 担 体 , 它 可 以 是 一 种 固体 吸附 剂 , 也 可 以 是 表面 涂 有 耐 高 温 液 体 ( 称 固定 液 ) 的 物质 构 成 的 固定 相 。 在 柱子 进口 端 注 入 待 分 离 样 品 (气体 或 液体 ), 在 载 气 ( 称 流动 相 , 常 用 氮气 、 氨 气 、 氨 气 等 惰性 气体 ) 推 动 下 , 样品 进入 层 析 柱 , 在 一 定 高 温 条 件 下 , 样品 中 各 种 组 分 气 化 并 以 不 同 的 速率 前 进 , 从 而 逐渐 分 离开 来 。 不 容易 被 担 体 吸附 或 在 固定 相 里 分 配 系数 小 的 组 分 , 在 柱 中 停留 的 时 间 较 短 首先 从 柱 后 流出 , 而 容易 被 吸附 或 在 固定 相 中 分 配 系数 大 的 组 分 , 在 柱 中 保留 时 间 较 长 而 后 从 柱 中 流出 。 不 同时 间 流 出 的 不 同 组 分 被 柱 后 检测 器 检 出 , 检 出 信号 经 放大 后 由 数据 处 理 机 记录 下 各 组 分 出 峰 图 谱 。 根 据 各 组 分 的 保留 时 间 与 标准 物质 比较 , 实现 定性 分 析 。 根 据 归 一 化 法 内 标 法 、 外 标 法 、 和 至 加 法 ,对 各 组 分 可 以 进行 定量 分 析 。 气 化 室 1 样品 样品 气 化 室 2 温度 控制 器 图 1.6 气相 色谱 仪 结 构 简 图 各 种 气体 ,有 挥发 性 的 物质 或 经 过 衍生 处 理 在 一 定 温 度 条 件 下 可 气 化 的 组 分 ， 原则 上 都 可 以 用 气相 色谱 分 离 ` 分析。 由 于 以 惰性 气体 作为 流动 相 , 其 黏度 系数 小 ,样品 在 气相 与 固定 相 之 间 的 传 质 速 率 高 , 容易 达到 平衡 ,分 离 速度 快 。 增 加 层 析 柱 的 长 度 , 能 显著 提高 分 辨 率 。 和 气体 组 分 的 检 出 比 液 体 容 易 , 氨 火焰 离子 化 检测 fit (FID) . 火焰 光度 检测 器 (FPD)、 电 子 捕 获 检测 器 (ECD)、 化 学 发 光 检 测 器 (CLD) 等 多 种 柱 后 检测 器 的 使 用 , 实现 了 组 分 检 出 的 高 度 自 动 化 。 因 此 ,气相 色谱 早已 成 为 物质 分 离 的 现代 方法 。 把 气相 色谱 仪 作为 分 离 工 具 , 与 红外 、 紫 外 、 质 谱 仪 等 联 本 “* 合 使 用 , 在 生物 物质 的 研究 中 发 挥 了 越 来 越 大 的 作用 。 七 、 高 效 液 相 色谱 高 效 液 相 色谱 是 另 一 种 柱 色谱 , 由 于 它 上 具有 气相 色谱 的 所 有 优点 , 又 不 要 求 样 品 是 可 挥发 物质 , 凡是 能 用 一 定 的 溶剂 溶解 的 组 分 原则 上 都 可 以 用 高 效 液 相 色谱 来 分 离 , 在 完成 柱 后 检测 的 同时 , 样品 可 用 部 分 收集 器 回收 ,因此 , 高 效 液 相 色 谱 在 生化 研究 中 成 为 倍 受 欢迎 的 分 离 方 法 。 高 效 液 相 色谱 仪 一 般 由 溶剂 槽 高压 友 ( 有 一 元 、 二 元 ` 四 元 等 多 种 类 型 )、 分 析 柱 、 进 样 器 (手动 或 自动 两 类 )、 检 测 器 (常见 的 有 紫外 检测 器 、 折 光 检 测 器 、 荧 光 检 iW ASS) 数据 处 理 机 或 色谱 工作 站 等 组 成 , 其 结构 如 图 1.7 所 示 。 wares | wee 图 1.7 高 效 液 相 色谱 仪 结构 简 图 高 效 液 相 色谱 仪 的 核心 部 件 是 耐 高 压 的 细 目 柱 。 柱 中 装 有 粒 径 极 小 的 担 体 ， 它 上 具有 实心 的 内 核 和 多 和 孔 的 外 壳 , 在 薄 壳 中 涂 有 固定 液 。 当 样品 进入 分 析 杜 后 , 其 中 的 各 种 组 分 随 流 动 相 前 进 的 速率 不 同 , 从 而 实现 有 效 的 分 离 。 柱 中 担 体 有 不 同 的 类 型 , 分离 的 原理 视 担 体 种 类 不 同 而 分 为 液 - 液 分 配 层 析 、 液 - 固 吸附 层 析 、 离 子 Sota Bi 凝 胶 渗 透 层 析 等 多 种 。 它 可 以 完成 定性 、 定 量 分 析 , 还 可 以 用 制备 型 色 谱 做 一 定量 的 制备 。 与 气相 色谱 相配 合 , 可 以 完成 绝 大 多 数 生 物 物 质 的 分 离 、 分 折 。 第 三 节 ”电泳 技术 带电 粒子 在 电场 的 作用 下 , 向 着 与 其 电 性 相反 的 电极 移动 的 现象 称 为 电泳。 在 一 定 条 件 下 , 混合 物 中 各 组 分 的 大 小 、 所 带电 荷 等 不 同 ,在 同一 电场 中 经 过 一 段 时 间 的 泳 动 ,就 可 能 实现 组 分 间 的 有 效 分 离 , 这 就 是 生化 分 离 中 常用 的 电泳 技术 。 a 16° — Ma] FE Dk BAY SEBS FA] 3 若 将 带 静 电荷 Q 的 离子 置 于 电场 中 , 它 受 到 的 电荷 引力 Fe 为 : Fa, = EQ (315 £) (3-1)? E 为 电场 强度 , 单位 为 V/cm, 表示 电场 中 单位 距离 上 的 电位 差 。 如 果 这 种 情况 发 生 在 真空 中 , 带电 粒子 会 朝 着 电极 加 速 前 进 并 且 最 后 篆 击 电 极 。 但 在 溶液 中 , 加 速 运动 的 带电 粒子 与 溶液 之 间 存 在 阻力 Fig HY Fm 5 Fay 相对 抗 , MARSA TG RR. HG Stokes 公式 ,运动 的 球形 粒子 在 溶液 中 受到 阻力 Fm 为 : Fm = 6xrqv (3-2) (3-2) 式 中 ，r 一 球形 粒子 的 半径 ; 7 一 溶液 的 黏度 系数 ; 一 带电 粒子 运动 速度 。 在 溶液 中 , 当 Fai = Fm BY, EQ = 6xryu 整理 后 得 : ricaioe (3 -3) Turn 由 (3-3) 式 可 知 ,相同 带电 粒子 在 不 同 强度 的 电场 里 泳 动 速度 是 不 同 的 。 为 了 便于 比较 , 常用 迁移 率 ( 或 称 泳 动 度 ) 代 替 泳 动 速度 表示 粒子 的 泳 动情 况 。 迁 移 率 为 带电 粒子 在 单位 电场 强度 下 的 泳 动 速度 。 若 以 m 表示 迁移 率 ,在 (3 -3) 式 两 VI [a] TR A Fe Sy oR EOE, 则 得 Shee (3-4) ary 由 于 蛋白 质 、 氨 基 酸 等 的 电离 度 c 受 溶 液 pH 值 影响 , 所 以 常用 迁移 率 m Fl 当时 条 件 下 电离 度 c 的 乘积 即 有 效 迁 移 率 U 表示 泳 动情 况 : BF * ix oe #F( 3-4) m TAIRA (3 - 5) RE: ia mig (3-6) Try 由 (3-6) 式 可 以 看 出 , 影响 分 子 带 电量 QR Bo AA OA pH. 响 溶液 黏度 系数 的 因素 如 温度 、 分 子 的 半径 ~ 等 , 都 会 影响 有 效 迁 移 率 。 因 此 , 电 泳 应 尽 可 能 在 恒温 条 件 下 进行 ,并 选用 一 定 pH 的 缓冲 液 。 所 选用 的 pH 以 能 扩大 各 种 被 分 离 组 分 所 带电 荷 量 的 差异 为 好 , 以 利于 各 种 成 分 的 分 离 。 除 以 上 因素 影响 电泳 结果 外 , 还 有 离子 强度 、. 电 渗 现 象 也 对 电泳 构成 影响 。 一 * a7 * 般 最 适 的 离子 强度 在 0.02 ~0.20 mol/L 之 间 。 离 子 强度 过 小 会 降低 溶质 的 溶解 度 , 离子 强度 过 大 会 降低 被 分 离 组 分 的 泳 动 速度 并 增加 电泳 过 程 中 的 发 热量 , 使 区 带 扩 散 变 形 。 如 果 电 泳 不 是 在 溶液 中 而 是 在 支持 介质 中 进行 ,还 要 注意 选用 无 电 渗 或 低 电 渗 物 质 作 支持 体 。 所 谓 电 渗 是 指 在 电场 中 , 液体 对 于 固体 支持 物 的 相对 移动 。 电 渗 液 流 往往 破坏 电泳 中 已 形成 的 区 带 , 使 其 扩散 变形 。 综 上 所 述 可 知 , 电泳 受 粒 子 本 身 大 小 形状、 所 带电 量 溶液 黏度 温度 .pH 值 、 电 渗 及 离子 强度 等 多 种 因素 的 影响 。 当 电泳 结果 从 佳 时 , 应 检查 或 重新 设计 实验 条 件 以 便 改 进 。 RE ALK SC FEST IR BR ES RUE FE BER ST it Ea at aK ET AE Dt FS. Fe FAY ok STRIP Wa SE BE BR A Ses eH aE HB A Dik HS PE 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 是 目前 应 用 最 广泛 的 电泳 支持 介质 。 其 机 械 强度 高 ,弹性 好 ， 透明 , 化 学 性 质 稳 定 , 属 非 离子 型 化 合 物 , 没有 吸附 和 电 渗 作用 。 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 是 由 丙烯 酰胺 (acrylamide， 缩 写 Acr) 和 甲 叉 双 丙 烦 酰 胺 (和 N， N’- methylene bisacrylamide， 缩 写 Bis) 在 催化 剂 作 用 下 合成 的 。 凝 胶 的 物理 性 质 用 凝 胶 浓 度 ( 工 ) 和 交 联 度 (C ) 两 个 参数 进行 描述 : Acr(g) + Bis(g) V (ml) Bis(g) Acr(g) + Bis(g) BEBE SLAB K |) ESE 5S BE BC PE A) 2), 浓度 越 大 , 孔径 越 小 。 凝 胶 浓度 过 大 ， 胶 硬 而 脆 , ADT. UREA), 凝 胶 稀 软 , 不 易 操作 。 通 常 把 7.5% BY BER A ts 准 凝 胶 。 当 在 标准 凝 胶 上 分 离 效 果 不 理想 时 , 可 以 调整 凝 胶 浓度 。 当 凝 胶 浓度 确 定之 后 , 交 联 度 为 5% 时 , 凝 胶 具 有 最 小 孔径 。 如 果 用 聚 丙 烦 酰胺 凝 胶 分 离 大 分 子 核酸 , 通常 要 用 大 孔 胶 。 为 了 提高 其 机 械 强 度 , 最 好 加 入 0.5% 琼 脂 糖 或 在 大 胶 中 加 20% 芒 糖 。 由 单 体 聚 合成 聚 丙 烽 酰 胺 凝 胶 的 反应 靠 催 化 剂 系统 提供 的 自由 基 局 动 。 最 常 用 的 聚合 催化 系统 有 两 种 : (1) 过 硫酸 铵 - TEMED 化 学 聚合 催化 系统 在 此 系统 中 ,四 甲 基 乙 二 胺 (N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine, 缩写 TEMED) 称 为 加 速 剂 , 它 能 以 自由 基 的 形式 存在 。 微 量 TEMED 的 加 入 , 可 使 过 fi RK (ammonium persulfate, 缩写 APS, PKA S| KF) EMA He: SO 一 2SO4 ° Te HE ee EA PAE BY S| Ac DS a BE RE ES BR Be A FA SOAS es FE BY 30 HR BY -* 18 - TUM) = x 100 C(%) = x 100 形成 有 一 定 平均 孔径 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 。 (2) 核 黄 素 - TEMED 光 聚 合 催化 系统 在 此 系统 中 , 核 黄 素 经 紫外 线 光 解 形成 无 色 基 , 再 被 痕 量 氧 氧化 形成 自由 基 ， 引发 聚合 反应 。TEMED 的 存在 , 可 以 加 速 聚合 。 本 催化 系统 主要 用 于 大 和 孔 浓 缩 胶 的 配制 。 琼脂 糖 是 一 种 直 链 多 糖 , 在 水 洽 中 加 热 溶 解 ,冷凝 后 靠 糖 链 间 氢 键 作 用 形成 凝 胶 。 调 整 琼脂 糖 浓 度 , 可 获得 不 同 孔 径 的 凝 胶 , 用 作 电 泳 支持 介质 。 由 于 琼脂 糖 具 有 亲 水 性 及 不 含 带 电荷 的 基 团 ,因此 很 少 引起 敏感 的 生化 物质 的 变性 和 吸附 , 是 分 离 生物 高 分 子 尤其 是 核酸 的 优良 电泳 介质 。 用 琼脂 糖 配制 电泳 凝 胶 , 只 需 将 琼脂 糖 在 缓冲 液 中 加 热 溶 化 , 在 将 要 凝固 前 倒 入 电泳 槽 中 即 可 , 十 分 方便 。 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 浓 度 一 般 取 2.4% 一 20% ,在 此 范围 内 可 分 离 1.0 x 10° ~ 3.3X102Da 分 子 质量 的 生物 大 分 子 。 琼 脂 糖 浓度 0.1% ~2.5%, 其 分 离 的 分 子 质 量 范 围 为 5Sx108 一 5x104Da。 在 以 上 范围 内 ， estuagwgefeasgk 与 分 子 质量 的 对 数 (logM) 呈 线性 关系 。 三 、 聚 丙 烽 酰胺 凝 胶 盘 状 电泳 将 丙烯 酰胺 、 甲 又 双 丙 烯 酰胺 、 组 冲 液 和 催化 剂 等 溶液 按 一 定 比例 加 到 用 琼脂 封 了 底 的 玻 管 中 , 聚合 后 得 到 圆柱 胶 。 柱 胶 胶 面 之 上 加 上 待 分 离 的 样品 , 接 入 直流 电源 电路 中 , 经 过 一 定时 间 的 电泳 ;样品 中 各 组 分 在 柱 胶 中 得 到 分 离 ,分布 在 不 同 层次 上 。 电 泳 结束 后 将 胶 条 和 剥 出 , 经 染色 、 脱 色 处 理 , 从 胶 条 侧面 可 见 到 一 个 一 个 的 组 分 条 带 , 与 多 个 圆 盘 和 迭 加 在 一 起 相似 , 故 将 在 柱 胶 中 进行 的 电泳 分 离 技术 称 为 BE TA es BZ BE PBS EK HTK 实际 操作 时 , 在 玻 管 中 分 两 次 灌 胶 。 先 灌 下 层 的 分 离 胶 , 待 其 聚合 后 再 灌 上 层 的 浓缩 胶 。 这 样 制 得 的 凝 胶 柱 实际 上 是 个 不 连续 体系 。 利 用 该 体系 中 凝 胶 孔 径 的 不 连续 性 、 缓 冲 液 离子 成 分 的 不 连续 性 .pH 的 不 连续 性 及 电位 梯度 的 不 连续 性 , 先 使 进入 柱 胶 的 样品 在 洲 缩 胶 中 逐 崭 浓缩 .在 上 下 胶 层 界面 上 最 终 被 压缩 成 很 薄 的 样品 区 带 , 进入 分 离 胶 后 再 进行 组 分 的 分 离 ,形成 最 终 的 分 离 区 带 。 根 据 分 离 胶 缓 冲 液 pH 值 高 低 , 有 3 种 操作 系统 ,分别 为 碱 性 系统 、 酸 性 系统 和 中 性 系统 , 其 中 以 碱 性 系统 最 为 常用 。 碱 性 系统 柱 胶 的 上 层 胶 为 浓缩 胶 , 由 下 =3%,C=2% 的 单 体 溶液 和 pH 6.7 的 Tris-HCl 缓冲 液 组 成 ,经 催化 聚合 而 成 的 大 孔径 凝 胶 。 它 承载 样品 并 使 样品 在 进入 分 离 胶 之 前 被 浓缩 成 薄 层 , 从 而 提高 了 电泳 分 离 的 分 辩 率 。 下 层 胶 为 分 离 胶 ,由 T=7.3%，C=2.5% 的 单 体 溶 液 和 pH 8.9 的 Tris-HCl 缓冲 液 经 过 硫酸 铵 催化 聚合 而 成 的 小 孔径 凝 胶 。 被 浓缩 的 样品 进入 分 离 胶 后 ,在 电荷 效应 和 分 子 筛 效应 共同 作用 下 得 到 分 离 。 在 浓缩 胶 中 , 除了 有 电荷 效应 和 分 子 得 效应 外 , 还 存在 着 一 种 特殊 的 浓缩 效 应 。 该 效应 是 多 种 不 连续 性 综合 作用 产生 的 。 首先 , 浓缩 胶 和 分 离 胶 的 孔径 是 不 同 的 。 样 品 在 大 孔 的 浓缩 胶 中 电泳 时 受到 的 阻力 小 , 泳 动 速度 快 。 到 达 分 离 胶 界面 时 , 凝 胶 孔 径 突 然 变 小 , 样品 分 子 前 进 受 到 的 阻力 增 大 , 泳 动 速度 减 慢 , 在 界面 处 发 生 聚 集 而 使 样品 受到 浓缩 。 另外 , 在 碱 性 系统 中 , 电极 缓冲 液 pH 为 8.3, 浓缩 胶 pH 为 6.7, BK pH 为 8.9, 电极 缓冲 液 由 Tris-Gly(HCI) 组 成 , 而 凝 胶 缓 冲 液 均 由 Tris-HCI 组 成 。 强 电解 质 HCI 分 布 在 整个 系统 中 , 由 于 其 解 离 度 在 上 述 各 pH 条 件 下 约 等 于 1, 所 以 几乎 完全 解 离 , HCL 有 效 迁 移 率 几乎 等 于 其 离子 迁移 率 。 只 存在 于 电极 缓冲 液 中 的 甘 氨 酸 (pI=6.0), 在 pH8.3 的 电极 缓冲 液 中 大 量 解 离 , 电 泳 开 始 后 , 甘氨酸 一 旦 进 入 pH6.7 的 浓缩 胶 , 其 解 离 度 即 大 幅度 下 降 , 结果 只 有 0.1% 一 1% 的 极 少 部 分 分 子 解 离 成 Gly ,其 有 效 迁 移 率 极 低 。 一 般 蛋 白质 在 pH 6.7 条 件 下 也 解 离 成 带 负 电荷 的 离子 。 这 三 种 负离子 在 电场 作用 下 都 向 正极 移动 。 由 于 它们 的 解 离 程度 各 不 相同 ,所 以 它们 的 有 效 迁 移 率 有 如 下 顺序 : 1712ClIQcCl > Mpap > 712GQG 式 中 CLP、G 分 别 代表 和 毛根 、 蛋 白质 和 甘氨酸 根 。 根 据 有 效 迁 移 率 的 大 小 , 最 A Cl 称 为 快 离子 或 前 导 离子 , REM Gly 称 为 慢 离子 或 后 随 离 子 。 蛋 白质 介 于 快 、 慢 离子 之 间 。 为 了 保持 溶液 的 电 中 性 及 一 定 的 pH 值 , 加 入 与 快 、 慢 离子 电 性 相反 的 Tris 作 缓冲 配对 离子 , 它 分布 在 整个 系统 中 。 电泳 开始 前 ,整个 系统 中 都 有 快 离子 ,只 有 电极 缓冲 液 中 含有 慢 离 子 。 电 泳 开 ta, 快 离子 很 快 超 过 蛋白 质 跑 到 最 前 面 , 在 快 离子 和 慢 离子 之 间 形 成 一 个 离子 较 少 的 低 离子 浓度 区 即 低 电 导 区 。 因 为 串联 回路 中 各 处 电流 密度 是 相等 的 , 故 在 低 电导 区 自动 形成 一 个 高 电位 梯度 。 这 个 次 生 电 位 梯度 使 蛋白 质 和 慢 离子 尾随 在 快 离子 之 后 加 速 前 进 。 当 电位 梯度 和 迁移 率 的 乘积 彼此 相等 时 , 三 种 离子 的 移动 速 度 相等 。 在 此 稳定 状态 建立 之 后 , 在 快 离子 和 慢 离子 之 间 形 成 一 个 稳定 而 又 不 断 向 阳极 移动 的 界面 。 有 效 迁 移 率 居中 的 蛋白 质 就 聚集 在 这 个 移动 的 界面 附近 , 被 浓缩 成 一 个 狭 罕 的 中 间 层 。 所 以 , 浓缩 效应 是 系统 四 种 不 连续 性 综合 作用 的 结果 。 这 种 效应 只 存在 于 浓缩 胶 中 。 甘 氨 酸 一 旦 进入 pH 8.9 的 分 离 胶 , 由 于 其 pK = 9.7, 甘氨酸 迅速 大 量 解 离 , 很 快 赶 上 并 超过 蛋白 质 。 这 样 , 在 浓缩 胶 中 形成 的 高 电 位 梯度 随 着 甘氨酸 进入 分 离 胶 而 彻底 消失 , 分 离 胶 中 蛋白 质 在 外 加 的 均一 电位 梯 度 和 pH 条 件 下 ,人 靠 分 子 筛 效应 和 电荷 效应 进行 分 离 。 分 离 胶 和 连续 体系 中 都 不 存在 浓缩 效应 , 这 也 正 是 不 连续 系统 在 设计 上 的 独特 之 处 。 、 连 续 密 度 梯度 电泳 如 果 合 成 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 从 上 至 下 是 一 个 正 的 线性 梯度 凝 胶 , TE BE BE TH 。， 20 - 部 的 样品 在 电场 中 向 着 凝 胶 浓 度 逐 渐 增 高 的 方向 即 孔径 逐渐 减 小 的 方向 迁移 。 随 着 电泳 的 继续 进行 , 蛋白 质 受 到 孔径 的 阻力 越 来 越 大 。 电 泳 开 始 时 , 样品 在 凝 胶 中 的 迁移 速度 主要 受 两 个 因素 的 影响 :一 是 样品 本 身 的 电荷 密度 , 二 是 样品 分 子 的 大 小 。 当 迁移 所 受到 的 阻力 大 到 足以 使 样品 分 子 完 全 停止 前 进 时 , 那些 跑 得 较 慢 的 低 电 荷 密度 的 样品 分 子 将 " 赶 上 "与 它 大 小 相同 但 具有 较 高 电荷 密度 的 分 子 并 停留 下 来 形成 区 带 。 因 此 , 在 梯度 凝 胶 电 泳 中 , 样品 的 最 终 迁 移 位 置 仅 取决 于 分 子 自身 的 大 小 , 而 与 样品 分 子 的 电荷 密度 无 关 。 样 品 混合 物 中 分 子 质 量 大 小 不 同 的 组 分 ， 电泳 之 后 将 依 分 子 质量 大 小 停留 在 不 同 的 凝 胶 孔 径 层 次 中 形成 相应 的 区 带 。 由 此 看 出 , 在 梯度 凝 胶 电 泳 中 , 分 子 筛 效应 体现 得 更 为 突出 。 由 于 相对 迁移 率 与 分 子 质 量 的 对 数 在 一 定 范围 内 成 线性 关系 , 故 可 以 用 来 测定 蛋白 质 的 分 子 质 量 , 但 仅 适 于 球状 蛋白 质 , 上 且 电 泳 要 有 足够 高 的 伏特 小 时 (一 般 不 低 于 2 000 伏特 小 时 )。 连续 密度 梯度 电泳 具有 如 下 优点 : (1) 具 有 使 样品 中 各 个 组 分 浓缩 的 作用 。 seats i 6% 上 样 ,不 会 影响 最 终 分 离 效 果 。 (2) 可 提供 更 清晰 的 谱 带 , 适 于 纯度 鉴定 。 (3) 可 在 一 张 胶片 上 同时 测定 分 子 质量 分 布 范 围 相 当 大 的 多 种 时 白质 的 分 子 质量 。 (4) 可 以 测定 天 然 状 态 蛋 白质 的 分 子 质量 , 这 对 研究 寡 聚 蛋白 是 相当 有 用 的 。 五 、SDS - 聚 丙 烦 酰胺 凝 胶 电 沪 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 中 , 蛋白 质 的 迁移 率 取 决 于 它 所 带 净 电荷 的 多 少 、 分 子 的 大 小 和 形状 。 如 果 用 还 原 剂 ( 如 琉 基 乙醇 或 二 硫 苏 糖 醇 等 ) 和 十 二 烷 基 硫酸 钠 (缩写 SDS) 加 热处理 蛋白 质 样品 , 蛋白 质 分 子 中 的 二 硫 键 将 被 还 原 ,并 且 1 g BA 质 可 定量 结合 1.4 g SDS, 亚 基 的 构象 呈 长 椭圆 棒状 。 由 于 与 蛋白 质 结合 的 SDS 呈 解 离 状 态 , 使 蛋白 质 亚 基带 上 大 量 负 电荷 , 其 数值 大 大 超过 蛋白 质 原 有 的 电荷 量 ,掩盖 了 不 同 亚 基 闻 原 有 的 电荷 差异 。 各 种 蛋白质 - SDS 复合 物 具 有 相同 的 电 荷 密度 ,电泳 时 纯粹 按 亚 基 大 小 靠 凝 胶 的 分 子 筛 效应 进行 分 离 。 有 效 迁 移 率 与 分 子 质量 的 对 数 成 很 好 的 线性 关系 。 所 以 , SDS - 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 不 仅 是 一 种 好 的 蛋白 质 分 离 方法 ,也 是 一 种 十 分 有 用 的 测定 蛋白 质 分 子 质量 的 方法 。 应 该 注意 的 是 , SDS - 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 法 测 得 的 是 蛋白 质 亚 基 的 分 子 质量 。 对 守 聚 蛋白 来 说 ,为 了 正确 反映 其 完整 的 分 子 结构 , 还 应 用 连续 密度 梯度 电泳 或 凝 胶 过 滤 等 方 法 测定 天 然 构象 状态 下 的 分 子 质 量 及 分 子 中 肽 链 ( 亚 基 ) 的 数目 。 - 21° 7S. SEHR AR HA Uk BE A es FC BoE BSP A — PR Xt SP A I eK AS, 在 电场 的 作用 下 会 自发 形成 一 个 连续 的 pH 梯度 。 蛋 白质 样品 在 电泳 中 被 分 离 , 运动 到 等 电 点 胶 层 时 就 失去 所 带电 荷 而 稳定 停留 在 该 处 , 样品 中 不 同 生 特质 组 分 等 电 点 不 同 , 因而 在 等 电 聚焦 电泳 中 得 到 有 效 分离 。 在 等 电 聚 焦 电 泳 中 , 利用 各 和 蛋白质 组 分 等 电 点 的 差异 ， 并 不 利用 凝 胶 的 分 子 得 作用 。 它 的 分 辨 力 高 , 可 分 离 等 电 点 相差 0.01 一 0.02 pH 单位 的 蛋白 质 , 可 用 来 准确 测定 蛋 日 质 的 等 电 点 , 精确 度 可 达 0.01 pH 单位 。 6, OUT] Bee IBS HL Yak 先 将 混合 物 在 一 个 直径 1 mm FY) BRA EBC PET SLR RK FR AR J PE 胶 条 小 心地 从 毛细 管 中 取出 , 然后 放 到 另 一 平板 凝 胶 的 顶部 (垂直 板 ) 或 一 端 (水 平 MR), 再 让 胶 条 中 已 经 分 离 的 组 分 在 平板 胶 中 走 SDS - 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 。 由 于 蛋白 质 的 等 电 点 和 分 子 质量 之 间 没 有 什么 必然 的 联系 , 因此 , 经 过 双向 电泳 可 将 数 二 种 蛋白 质 分 开 , 显示 出 极 高 的 分 辩 力 。 八 、 毛 细 管 电泳 毛细 管 电泳 是 较 新 的 电泳 方法 。 首 批 毛 细 管 电泳 仪 于 20 世纪 80 FAIA th, 至 今 不 过 十 几 年 历史 。 其 仪器 组 成 见 图 1.8。 图 1.8 毛细 管 电泳 仪 示意 图 1. 高 压 电 源 ;2. 毛细 管 ;3. 检测 窗口 ;4. 光源 ;5. 光电 倍增 管 ;6. 进口 缓冲 溶液 /样品 ;7. 出 口 缓冲 溶液 ;8. 用 于 仪器 控制 和 数据 收集 与 处 理 的 计算 机 毛细 管 电泳 是 在 内 径 仅 75wm 的 毛细 管内 进行 样品 分 离 的 新 方法 , 毛细 管内 可 以 是 凝 胶 如 聚 丙烯 酰胺 ,也 可 以 是 溶液 。 毛 细 管 两 端 分 别 浸 入 正 、 负 两 极 电 极 缓 e 29。 冲 液 中 , 样品 自 正 极 进 入 毛细 管 ,在 30kV 高 压 电 源 作 用 下 , 发 生 各 组 分 的 分 离 。 当 某 一 组 分 泳 动 到 负极 上 方 时 , 灵敏 的 检测 器 会 检测 出 它 的 出 现 , 在 微机 上 显示 出 其 图 谱 , 并 于 电泳 后 打印 出 结果 。 关于 物质 在 毛细 管 中 分 离 的 原理 , 可 作 如 下 说 明 。 毛 细 管 的 一 端 为 正极 (+ )， 另 一 端 为 负极 ( - ), 样品 中 的 正 离子 会 在 电场 力 的 作用 下 从 正极 向 负极 运动 。 毛 细 管 管 壁 的 材质 是 玻璃 的 , 硅 酸 是 其 主要 成 分 , 它 可 以 发 生 如 下 的 解 离 : H,SiO;=— HSiO; + H* 结果 使 管 壁 带 有 一 定 的 负电 荷 (HSiO; 存在 所 致 ) 。 由 于 静电 感应 , 管 中 缓 冲 液 中 的 正 离子 和 偶 极 分 子 水 的 正极 趋向 管 壁 , 从 而 形成 一 个 双 电 层 。 双 电 层 中 的 正 离 子 及 定向 排列 的 水 分 子 在 电场 力 和 毛细 张力 的 共同 作用 下 , 向 负极 定向 移动 ,形成 电 渗 流 , 其 方向 与 电场 力 方向 一 致 。 不 同 组 分 受到 的 作用 力 是 有 差别 的 , 正 离子 受 到 相同 方向 的 电场 力 和 电 渗 流 的 推动 , 前 进 速率 最 快 ;负离子 受到 两 种 力 的 作用 但 方向 相反 , 电 渗 流 的 作用 大 于 电场 力 ,所 以 负离子 也 是 向 负极 运动 但 运动 速率 最 慢 。 不 带电 荷 的 组 分 虽然 不 受 电场 力作 用 , 但 强大 的 电 渗流 推动 着 它 从 正极 癌 负 极 运动 。 所 以 ,在 毛细 管 中 的 样品 中 各 种 组 分 , 不 管 是 否 带 有 电荷 , 也 不 管 带 何 种 电荷 ,都 会 从 正极 向 负极 运动 ,迁移 速率 按 由 大 到 小 的 排序 是 : 正 离子 > 中 性 分 子 > 负离子 。 经 过 一 定时 间 的 电泳 ,各 种 组 分 会 实现 有 效 的 分 离 。 如 果 把 单位 电场 强度 下 离子 在 一 定 的 温度 下 在 介质 中 迁移 的 速率 称 作 消 度 的 话 ,那么 毛细 管 电泳 实质 上 是 以 高 压 电场 为 驱动 力 ,以 毛细 管 为 分 离 通道 , 依据 样品 中 各 组 分 之 间 消 度 和 分 配 行为 上 的 差异 而 实现 分 离 的 一 类 液 相 分 离 技术 , 兼 有 电泳 和 高 效 液 相 色谱 两 类 分 离 技术 的 原理 。 毛 细 管 电泳 和 一 般 电泳 的 区 别 是 可 以 分 离 各 种 成 分 (带电 与 不 带电 ), 同时 , 在 普通 电泳 中 起 破坏 作用 的 电 渗 流 在 毛细 管 电泳 中 却 变 成 了 有 效 的 驱动 力 之 一 。 毛 细 管 电泳 与 高 效 液 相 色谱 的 区 别 在 于 用 高 压 电源 取代 了 高 压 泵 ,改善 了 流动 相 在 毛细 管 中 的 流 型 ， aaseoyosg 使 得 各 组 分 峰 宽 变 罕 (近似 谱 线 ), 提高 了 分 辩 率 。 毛细 管 电泳 具有 高 灵敏 度 \ 高 分 辩 率 \ 高 速度 的 特点 , 节省 样品 和 试剂 消耗 ,是 一 种 极 有 前 景 的 分 离 、 分 析 方 法 。 九 、 电 泳 新 技术 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 通常 只 能 分 离 分 子 大 小 在 50 kb 以 下 的 DNA 片段 、 病 毒 和 质 粒 。 为 了 分 离 数 百 万 碱 基 的 核酸 大 分 子 , 1984 年 Carle 和 Olsen 设计 了 一 种 正 交 交 变 电场 凝 胶 电 泳 (orthogonal-field-alternation-gel electrophoresis， 缩 写 OFAGE), 见 图 1.9。 在 凝 胶 的 对 角 线 上 安置 了 互相 垂直 的 两 组 电极 , 交替 改变 电场 的 方向 ， 点 在 凝 胶 上 的 DNA 样品 大 分 子 随 着 脉冲 电场 方向 的 改变 , 周期 性 地 改变 分 子 构 象 和 迁移 方向 , 但 总 的 迁移 方向 是 直线 前 进 的 。 在 这 种 正 交 交 变 脉冲 电场 里 ， 23 . x DNA 分 子 松弛 、 变 形 所 需 时 间 与 其 分 子 质 量 成 正 出 了 比 ,因此 ,在 相同 的 电泳 时 间 里 , 小 分 子 DNA 比 大 分 子 DNA 有 更 多 的 有 效 迁 移 时 间 , 迁移 距离 大 ， Lg °* 跑 在 大 分 子 DNA 前 边 。 当 经 过 足够 长 的 时 间 电 泳 , 大 、 小 不 同 的 DNA 分 子 就 会 得 到 有 效 的 分 离 ; wie 1986 年 Caale 等 人 又 进一步 报道 , 用 周期 反 转 Ls FH 3% HE WS HA ik ( field-inversion gel electrophoresis, "Bi 缩写 FIGE ) 也 能 将 DNA 大 分 子 分 开 。 将 普通 电 站 泳 仪 稍 加 改装 , 只 要 周期 改变 电泳 仪 电源 的 正 负电 图 1.9 正 交 交 变 电 场 凝 胶 极 , 就 能 进行 FIGE, 但 正 向 电泳 时 间 必 须 大 于 反 电泳 示意 图 向 电泳 时 间 , 或 正 向 电泳 电压 要 高 于 反 向 电泳 电 黑 点 分 别 表示 水 平和 垂直 的 电极 。 凝 压 , 才 能 保证 样品 中 各 DNA 分 子 单 方向 前 进 。 胶 板 以 45 角 放 电泳 槽 .中 央 箭头 表示 后 来 ,用 OFAGE 和 FIGE 双向 电泳 , 把 酵母 DNA 从 点 样 孔 移动 的 方向 17 条 染色 体 DNA 在 同一 块 凝 胶 板 上 完全 分 离 , 这 是 染色 体 DNA 分 子 研 究 的 一 大 突破 。 十 、 电 泳 相 关 技 术 1. 凝 胶 干 燥 技 术 电泳 之 后 ,经 染色 、 脱 色 的 聚 丙 炳 酰 胺 凝 胶 胶片 , 需 做 干燥 处 理 , 才 便于 保存 或 进一步 扫描 。 现 在 有 专用 的 凝 胶 干 燥 仪 , 在 减 压 的 条 件 下 快速 脱 去 湿 胶 中 的 水 分 。 如 果 一 次 处 理 的 胶片 数量 有 限 , 手工 干燥 处 理 也 是 很 实用 的 。 准 备 两 块 面积 稍 大 于 凝 胶 板 的 玻璃 ,冲洗 干净 。 把 预先 裁 好 的 玻璃 纸 在 水 中 浸透 后 平 铺 在 第 一 块 玻 璃 板 上 (玻璃 纸 面积 要 大 于 玻璃 板 ); 用 玻璃 棒 赶 掉 玻 璃 纸 与 玻璃 板 之 间 可 能 存在 的 气泡 。 把 脱 过 色 的 电泳 凝 胶片 平 铺 在 这 张 玻璃 纸 上 。 再 将 另 一 张 在 水 中 浸透 的 豆 璃 纸 盖 在 凝 胶 表 面 ,用 玻璃 棒 赶 掉 夹 层 中 可 能 存在 的 气泡 。 然 后 把 多 余 的 玻璃 纸 四 边 趁 湿 反 贴 到 玻璃 板 背 面 , 顺手 把 它 放 置 到 另 一 块 玻璃 板 上 , RAL, 借助 琉璃 和 胶片 的 自重 , 把 玻璃 纸 四 边 压 实 密封 起 来 。 置 室内 阴干 (2 一 3 天 ), Wei 光 直 射 ,也 不 要 放 在 窗口 等 空气 过 于 对 流 的 地 方 。 待 凝 胶 充 分 干燥 后 , 取 下 胶片 ， 用 刀片 或 剪刀 切除 多 余 的 玻璃 纸 边 , 做 好 标记 , 夹 在 厚 书 中 可 以 长 期 保存 。 其 平整 透明 程度 ,往往 比 凝 胶 干 燥 仪 处 理 的 效果 还 好 。 2. 凝 胶 扫描 技术 电泳 结果 除了 用 照相 记录 以 外 , 现在 可 借助 薄 层 扫描 仪 对 电泳 图 谱 进 行 扫描 处 理 , 更 便于 定性 定量 分 析 。 在 一 个 坐标 系 里 , 以 迁移 距离 为 横 坐 标 , 以 吸光 度 为 纵 坐标 , 通过 扫描 仪 处 理 原 来 的 电泳 条 带 图 谱 并 转换 成 峰 图 。 根 据 各 峰 与 迁移 距 “1 离 的 对 应 关系 , 极 易 比较 出 各 个 样品 间 的 差异 , 完成 定性 分 析 。 比 较 相 同 迁 移 距离 的 峰 面 积 或 比较 不 同 峰 的 积分 面积 , 可 以 进行 定量 分 析 , 并 找 出 许多 内 在 的 联系 。 这 种 方法 在 遗传 分 析 ` 杂 交 优 势 预测 、 抗 性 分 析 等 许多 领域 , 都 得 到 很 好 的 应 用 。 3. 凝 胶 成 像 技 术 随 着 计算 机 技术 的 迅猛 发 展 ,利用 计算 机 采集 存储 和 分 析 实 验 数据 是 近 几 年 仪器 设备 发 展 的 总 趋势 。 数 码 成 像 技 术 已 应 用 于 生物 学 研究 的 各 个 方面 ,典型 的 如 : 凝 胶 成 像 系 统 、 显 微 数 码 摄像 系统 、 菌 落 计数 系统 、 细 胞 图 像 处 理 系统 、 基 因 芯 片 数 据 分 析 系 统 等 。 这 些 数码 成 像 系统 在 原理 上 是 类 似 的 , 都 是 将 实验 结果 通过 一 定 方式 转化 成 计算 机 图 像 , 然后 对 这 些 图 像 进行 处 理 、 识 别 、 分 析 。 摄像 头 、 数 码 相 机 、 扫 描 仪 计算 机 图 像 1.10 北 胶 成 像 系 统 原理 示意 图 凝 胶 成 像 系 统 是 生物 化 学 和 分 子 生物 学 实验 中 最 常用 的 数码 成 像 系统 之 一 ， 广泛 应 用 于 曙 白 和 核酸 电泳 结果 的 分 析 。 有 助 于 研究 人 员 正 确 \ 迅 速 地 得 到 电泳 结果 照片 和 分 析 结 果 , 使 研究 人 员 摆 脱 采用 传统 照相 机 方式 记录 电泳 结果 的 繁琐 操作 过 程 。 其 原理 如 图 1.10 所 示 。 基 本 操作 过 程 可 分 为 三 个 步骤 , 第 一 步 , 数据 采集 存储 。 第 二 步 , 图 像 处理 、 分 析 。 第 三 步 , 结果 输出 。 凝 胶 成 像 系 统 的 关键 过 程 : 1 (1) 数据 采集 数据 采集 过 程 实际 上 是 将 光 信 号 转变 为 数字 信和 号 的 过 程 , 该 过 程 是 通过 摄像 头 、 数 码 相 机 或 扫描 仪 来 完成 的 。 对 于 蛋白 电泳 结果 , 通常 用 白光 透射 或 反射 , A 后 通过 数码 设备 采集 数据 ;在 采集 核酸 电泳 结果 时 , 通常 用 紫外 光 透 射 ,并 在 镜头 前 加 滤 光 片 ,然后 通过 数码 设备 采集 数据 。 摄 像 头 具有 反应 速度 快 的 特点 , 但 分 辩 BUR, 一 般 只 有 570 线 。 数 码 相 机 数据 采集 速度 较 慢 , 但 获得 的 图 像 的 分 辨 率 较 高 ;扫描 仪 可 获得 更 高 分 辩 率 的 图 像 , 但 其 采集 速度 最 慢 。 数 据 采集 是 凝 胶 成 像 的 关键 步 又, 数据 采集 的 质量 直接 影响 到 后 续 的 图 像 处理 和 分 析 。 采 集 到 的 数据 可 以 存储 成 不 同 格式 的 图 像 文件 , 常用 的 文件 格式 有 BMP、TIF、JPG 等 。JPG 是 一 种 有 损 图 像 质量 的 图 像 压 缩 格式 ,使 用 此 格式 时 应 注意 设置 图 像 的 质量 。 当 电泳 的 结果 保存 为 计算 机 图 像 后 , 就 可 以 利用 计算 机 程序 对 其 进行 处 理 、 分 析 、 发 掘 。 (2) 图 像 处 理 、 分 析 和 标注 1) 图 像 处 理 对 图 像 进 行 分 析 是 我 们 的 目的 ,为 了 达到 分 析 的 目的 , 一 般 先 对 图 像 进行 适当 的 处 理 以 利于 分 析 。 图 像 有 彩色 图 和 灰 度 图 之 分 , 对 于 凝 胶 成 像 系 统 来 说 , 首先 要 将 彩色 图 像 转 变 成 灰 度 图 像 , 灰 度 图 有 利于 对 图 像 进行 分 析 比 较 。 其 次 是 对 图 形 进行 旋转 ` 尺寸 改变、 亮度 对 比 度 调 节 等 。 这 些 过 程 和 通用 的 图 像 处 理 软件 是 完全 一 致 的 (如 Photoshop )。 2) 图 像 分 析 对 于 电泳 结果 的 分 析 , 首先 是 利用 计算 机 程序 自动 识别 图 像 中 所 有 的 可 能 的 条 带 。 然 而 这 种 识别 并 不 是 一 个 完全 自动 的 过 程 , 需要 人 工 的 干预 ,上 且 结果 会 受到 一 些 因素 的 影响 。 图 像 的 质量 会 严重 影响 识别 的 结果 , 因而 一 般 要 对 图 像 进 行 预 处 理 。 首 先 要 进行 倾斜 校正 ， 有 一 些 软件 可 自动 完成 此 过 程 。 为 了 提高 识别 的 正 确 率 , 通常 要 首先 进行 泳 道 定 义 。 设 置 条 带 识 别 的 域 值 是 影响 识别 结果 的 重要 因 素 , 域 值 越 高 , 识别 的 条 带 越 少 ; 域 值 越 低 , 识别 的 条 带 越 多 。 A. 分 子 质量 分 析 目的 条 带 分 子 质量 的 计算 依赖 于 标准 样品 。 在 电泳 点 样 时 , 一 般 要 在 样品 沪 道 旁 侧 泳 道 加 上 标准 样品 , 当 电 泳 结 果 采 集 到 计算 机 时 , 标准 样品 条 带 会 和 样品 条 带 一 起 形成 计算 机 图 像 。 设 置 标准 样品 所 在 泳 道 , 并 定义 标准 样品 泳 道 各 个 条 带 对 应 的 分 子 质量 大 小 (核酸 电泳 结果 可 定义 为 核酸 链 的 长 度 )。 然 后 计算 机 会 自动 计算 出 样品 泳 道中 各 个 条 带 的 分 子 质量 大 小 。 分 析 的 基本 流程 如 下 : 图 像 校 正 一 泳 道 定 义 一 条 带 识 别 一 指定 标准 样品 泳 道 -> 计算 分 子 质 量 B. 密度 扫描 对 电泳 结果 中 各 种 不 同 条 带 进行 相对 定量 时 , 会 用 到 密度 扫描 功能 。 当 图 像 处 理 成 灰 度 图 像 时 , 图 像 中 各 个 条 带 颜 色 的 深浅 和 条 带 的 密度 在 一 定 范 围 内 成 正 比 。 当 泳 道 指定 后 , 计算 机 会 自动 扫描 出 泳 道中 各 个 条 带 的 密度 , 结果 以 峰值 图 给 过 二 出 。 根 据 峰值 图 进行 积分 , 可 计算 出 各 个 条 带 的 相对 量 。 在 进行 条 带 扫 描 时 , 图 像 的 倾斜 校正 非常 关键 。 3) 图 像 标注 凝 胶 成 像 系 统一 般 都 会 提供 图 像 标 注 和 图 像 管理 功能 。 图 像 标注 功能 的 作用 主要 是 为 了 方便 研究 者 将 实验 的 一 些 信息 直接 标注 在 图 像 上 , 如 实验 的 日 期 、 各 个 泳 道 的 样品 特征 关键 条 带 的 分 子 质量 以 及 一 些 重 要 的 分 析 结 果 等 。 图 像 管 理 功 能 主要 是 为 了 方便 用 户 对 实验 结果 进行 管理 和 查询 。 (3) 结果 输出 结果 的 输出 包括 两 个 方面 ,一 是 图 像 的 输出 , 二 是 分 析 结 果 的 输出 。 图 像 的 输 出 效果 依赖 于 图 像 本 身 质量 和 输出 设备 的 质量 。 一 般 来 说 , 摄像 头 数据 采集 获得 的 图 像 分 辩 率 较 低 , 输出 结果 不 理想 , 数码 相机 和 扫描 仪 采 集 的 图 像 的 分 辩 率 较 高 可 获得 较 高 质量 的 输出 结果 。 输 出 时 打印 机 的 质量 也 会 严重 影响 输出 质量 , BE HK 得 高 质量 的 输出 图 像 一 般 需 要 专门 的 照片 级 的 喷 墨 打印 机 或 激光 打印 机 , 而 且 需 要 专门 的 照片 输出 打印 纸 。 分 析 结 果 的 输出 主要 涉及 凝 胶 成 像 系 统 和 其 他 数据 分 析 和 编辑 软件 之 间 数 据 的 交换 , 通常 凝 胶 成 像 系统 可 将 分 析 结 果 保 存 为 Excel 或 Word 格式 ,以 便 对 结果 进行 进一步 的 分 析 和 编辑 。 总 而 言 之 , 凝 胶 成 像 系 统 是 一 种 发 展 中 的 电泳 相关 技术 , 不 同 公司 的 产品 千 差 万 别 , 但 其 基本 的 原理 和 基本 的 功能 大 同 小 异 。 随 着 时 代 的 发 展 这 种 技术 将 会 日 趋 完善 。 4. 凝 胶印 迹 技术 1975 年 苏格兰 爱丁堡 大 学 的 下 . M. Southern 创立 了 印迹 技术 , 巧妙 地 把 凝 胶 电泳 \ 固 定 化 技术 和 分 子 杂 交融 合 在 一 起 , 完成 了 对 目的 DNA 片段 的 灵敏 检测 。 后 经 多 人 发 展 这 一 方法 ,广泛 用 于 DNA、RNA、 和 蛋白 质 及 双向 电泳 的 分 子 检测 , 形 成 了 Southern blotting，Northern blotting，Western blotting 和 Eastern blotting 技 术 。 目 前 , 这 一 技术 在 分 子 生 物 学 .基因 工 程 等 领域 发 挥 了 重要 作用 , 是 一 种 高 选 择 性 高 灵敏 度 的 分 子 检 测 方法 。 电泳 之 后 ,样品 混合 物 中 的 各 种 分 子 在 凝 胶 中 实现 了 分 离 。 如 果 把 一 张 固定 化 纸 贴 在 胶 面 上 , 再 利用 一 定 的 动力 (毛细 作用 、 接 触 扩 散 或 电动 力 等 ) 使 凝 胶 上 的 区 带 转 移 到 固定 化 纸 上 被 固定 , 最 后 用 特异 性 探 针 检 出 所 需 功能 分 子 。 在 进行 印迹 转移 之 前 ,通常 对 电泳 胶片 要 先 做 平衡 处 理 , 以 防 因 离 子 强 度 的 改 变 造成 区 带 的 变形 。 印 迹 操作 可 以 采取 普通 的 毛细 作用 印迹 ,也 可 以 用 电 印 迹 。 印迹 之 后 ,要 用 一 定 的 试剂 对 固定 化 纸 上 条 带 以 外 的 活性 基 团 进行 封闭 处 理 ( 称 为 FER), 以 降低 染色 造成 的 背景 值 , 提高 检 出 灵敏 度 。 最 后 利用 蛋白 质 的 生物 活性 或 核酸 的 可 杂交 性 , 检 出 特定 的 功能 条 带 。 由 于 采用 了 分 子 探 针 或 特殊 标记 (如 荧 光 、 放 射 性 同位 素 \ 酶 等 ), 检 出 灵敏 度 可 达 1 pg~1 ng. -27- BOT 膜 分 离 技术 用 人 工 合成 的 某 种 材料 作为 两 相 之 间 的 不 连续 区 间 实 现 不 同 物质 分 离 的 技术 叫 膜 分 离 。 膜 的 作用 是 分 隔 两 相 界 面 , 并 以 特定 的 形式 限制 和 传递 各 种 化 学 物质 。 它 可 以 是 均 相 的 或 非 均 相 的 , 对 称 型 的 或 非 对 称 型 的 , 中 性 的 或 荷 电 性 的 , 固体 的 或 液体 的 。 其 厚度 可 以 从 几 微 米 到 几 守 米 。 膜 分 离 操作 简单 , 效率 较 高 , 没有 相 变 , 节省 能 耗 , 特别 适合 处 理 热 敏 性 物质 。 一 、 膜 的 分 类 根据 膜 的 物理 结构 和 化 学 性 质 , 可 将 膜 分 为 以 下 几 类 : 1) 对 称 膜 。 对 称 膜 是 结构 与 方向 无 关 的 膜 , 这 类 膜 或 者 是 具有 不 规则 的 孔 结构 ， 或 者 所 有 的 孔 具 有 确定 的 直径 。 厚 度 0.2 mm. 2) 非 对 称 膜 。 非 对 称 膜 有 一 个 很 薄 的 (0.2pm) 但 比较 致密 的 分 离 层 和 一 个 较 厚 的 (0.2 mm) 多 孔 支 撑 层 。 两 层 材质 相同 , 所 起 作用 不 同 。 3) 复合 膜 。 这 种 膜 的 选择 性 膜 层 (活性 膜 层 ) 沉 积 于 具有 微 孔 的 底 膜 (支撑 层 ) 表 ，” 面 上 ,但 表层 与 底层 的 材质 不 同 。 复 合 膜 的 性 能 受 上 下 两 层 材料 的 影响 。 4) 荷 电 膜 。 即 离子 交换 膜 , 是 一 种 对 称 膜 , 溶 胀 胶 ( 膜 质 ) 带 有 固定 的 电荷 , 带 有 正 电荷 的 膜 称 为 阴离子 交换 膜 , 从 周围 流体 中 吸引 阴离子 。 带 有 负电 和 荷 的 膜 称 为 阳离子 交换 膜 ,从 周围 流体 中 吸引 阳离子 。 阳 离子 交换 膜 一 般 比 阴离子 交换 膜 5) WR. 6) FLAK. FLA 0.05~20um WAR. 7) 动态 膜 。 在 多 孔 介 质 ( 如 陶 磁 管 ) 上 沉积 一 层 颗 粒 物 ( 如 氧化 钳 ) 作 为 有 选择 作 用 的 膜 , 此 沉积 层 与 溶液 处 于 动态 平衡 , 但 很 不 稳定 。 根据 制 膜 材 料 的 不 同 ,还 可 将 膜 作 如 下 分 类 : 1) 改 性 天 然 物 膜 。 醋 酸 纤 维 素 、 丙酮 - 丁 酸 纤维 素 再 生 纤 维 素 、 硝 酸 纤维 素 等 。 2) ABP OAR FEA (RFT FER RE) RSE KE RM, ERG 1D) FE AK FER FR BRS BE ZR A Hr 3) FPR BR. FE HB AR A. & FL 1 BS. ZrO, (A116 ) RA i ZrO, HRA. 在 这 些 材 料 中 , WA CESS ER AR YF “128. « 二 、 膜 的 性 能 由 于 造 膜 材 料 , 造 膜 方法 和 膜 结构 的 不 同 , 膜 的 性 能 有 很 大 的 差异 。 通 常用 以 下 参数 描述 膜 的 性 能 。 1. 孔道 特征 孔道 特征 包括 孔径 、 孔 径 分 布 和 孔隙 度 , 是 膜 的 重要 性 质 。 膜 的 孔径 有 最 大 孔 径 和 平均 孔径 。 和 孔径 分 布 是 指 膜 中 一 定 大 小 的 孔 的 体积 占 整 个 孔 体积 的 百分数 ， 孔径 分 布 罕 的 膜 比 孔径 分 布 宽 的 膜 要 好 。 和 孔隙 度 是 指 整个 膜 中 孔 所 占 的 体积 百 分 数 。 2. 水 通 量 水 通 量 为 每 单位 时 间 内 通过 单位 膜 面积 的 水 体积 流量 , 也 叫 透 水 率 。 在 实际 使 用 中 ,水 通 量 将 很 快 降低 , 如 处 理 蛋 白质 溶液 时 ,水 通 量 通常 为 纯 水 的 10%。 各 种 膜 的 水 通 量 虽 然 有 所 区 别 , 由 于 溶质 分 子 的 沉积 ,这 种 区 别 会 变 得 不 明显 。 3. 截留 率 和 截断 分 子 质量 截留 率 是 指 对 一 定 相 对 分 子 质 量 的 物质 , 膜 能 截留 的 程度 , 定义 为 : 人 /让 式 中 ，Cp 一 某 一 瞬间 透 过 液 浓度 (kmol/m ) ; Cn 一 截留 液 浓 度 (kmolm ) 。 如 果 8=1, 则 Cp=0, 表 示 溶 质 全 部 被 截留 ;如 果 9$=0, 则 Cp= Cp, 表示 溶 质 能 自由 通 透 。 100 1000 10 000 100 000 相对 分 子 质量 图 1.11 截断 曲线 用 已 知 相对 分 子 质量 的 各 种 物质 进行 试验 , 测定 其 截留 率 , 得 到 的 截留 率 与 相 对 分 子 质 量 之 间 的 关系 称 为 截断 曲线 , 如 图 1.11 所 示 。 较 好 的 膜 应 该 有 陡 直 的 截断 曲线 , 可 使 不 同 分 子 质量 的 溶质 完全 分 离 。 截断 分 子 质量 定义 为 相当 于 一 定 截 留 率 (通常 为 90% 或 93% ) 的 相对 分 子 质 量 。 显 然 ,截留 率 越 高 、 截 断 分 子 质量 的 范围 越 窜 的 膜 越 好 。 另外 , 膜 的 性 能 参数 还 有 抗 压 能 力 、.pH 适用 范围 .对 热 和 溶剂 的 稳定 性 、 毒 性 等 。 本 书 附录 二 三、 四 \ 五 .六 给 出 了 某 些 商品 膜 的 重要 数据 。 三 、 膜 的 使 用 寿命 膜 的 使 用 寿命 受 许多 因素 影响 , 除了 贮存 条 件 外 , 还 受 下 列 因素 的 影响 。 1. 膜 的 压 密 作用 在 压力 作用 下 , 膜 的 水 通 量 随 运行 时 间 的 延长 而 逐渐 降低 , 这 是 由 于 膜 体 受 压 变 密 所 致 。 引 起 压 密 的 主要 因素 是 操作 压力 和 温度 , 压力 ` 温 度 越 高 , 压 密 作 用 越 大 。 为 了 克服 或 减轻 压 密 作用 , 可 控制 操作 压力 和 进 料 温度 (207 A). SRR 根本 的 措施 是 改进 膜 的 结构 , 使 其 抗 压 密 性 增强 。 2. 膜 的 水 解 作用 醋酸 纤维 素 是 酯 类 化 合 物 , 比较 容易 水 解 。 为 延长 膜 的 使 用 寿命 , 可 控制 进 液 pH 和 温度 。 3. 膜 的 浓 差 极 化 浓 差 极 化 现象 是 随 着 运行 时 间 的 延长 而 产生 的 一 种 必然 现象 , 虽然 不 能 完全 消除 , 但 操作 得 当 , 可 以 有 所 减弱 , 如 提高 进 液 流速 ,采用 消 流 促进 器 或 采用 浅 道 流 动 系统 等 。 4. 膜 污 染 膜 面 沉 积 附着 层 或 固体 堵塞 膜 孔 , 都 能 造成 膜 污染 , 它 不 仅 使 膜 的 渗透 通 量 下 降 , 而 且 使 膜 发 生 劣化 或 报废 。 最 好 对 料 液 进行 适当 的 预 处 理 , 并 改变 操作 条 件 ， 以 防止 可 能 的 膜 污 染 。 一 旦 发 生 了 膜 污染 ,常用 物理 或 化 学 清洗 方法 进行 处 理 。 四 、 膜 的 分 离 技术 1. 渗透 和 透析 渗透 是 溶剂 跨 膜 扩 散 的 过 程 , 在 膜 两 侧 渗 透 压 差 的 推动 下 , 溶剂 从 渗透 压 较 小 « 90) « 的 一 侧 穿 过 膜 流 向 渗透 压 较 大 的 另 一 侧 。 透 析 是 利用 膜 两 侧 溶质 浓度 差 从 溶液 中 分 离 出 小 分 子 物 质 而 截留 大 分 子 物 质 的 过 程 。 一 般 来 说 , 透析 过 程 中 同时 存在 着 渗透 作用 , 只 是 溶剂 的 运动 方向 与 小 分 子 运 动 的 方向 相反 。 渗 透 的 结果 使 原 溶 液 的 浓度 降低 , 即 削弱 了 透析 过 程 赖 以 进行 的 推动 力 。 这 是 透析 操作 中 需要 集中 考 虑 的 关键 问题 。 如 果 能 不 断 除去 扩散 出 来 的 小 分 子 , 就 有 可 能 彻底 分 离 大 小 不 同 分 子 的 混合 物 。 透析 是 利用 半 透 膜 进行 的 一 种 选择 性 扩散 操作 , 简单 易 行 。 把 料 液 盛 于 透析 SA, 袋 内 留 有 挤 去 空气 的 空余 部 分 , 以 防 由 于 溶剂 渗入 造成 料 液 体积 增加 而 引起 透析 袋 胀 破 。 把 透析 袋 置 于 透析 外 液 之 中 。 为 了 获得 较 快 的 透析 速度 , 常常 采取 一 些 措施 保持 膜 两 侧 浓度 差 具 有 最 大 值 , 如 经 常 更 换 透 析 外 液 , 或 对 流水 做 透析 。 连续 搅动 外 液 , 或 在 透析 袋 内 放置 一 些 玻璃 珠 搅动 内 液 ,或 在 真空 系统 里 做 减 压 透 BT, 都 能 有 效 地 加 快 透析 速度 。 但 是 透析 外 液 尽 量 不 用 纯 水 , 常 使 用 一 定 pH 的 低 盐 缓 冲 液 , 这 样 可 以 避免 袋 内 料 液 pH 的 变化 和 过 分 地 稀释 。 选用 透析 速度 快 而 通 透 界限 又 明确 的 透析 袋 , 可 以 收 到 良好 的 透析 效果 。 Union Carbide 各 种 型 号 的 透析 管 、Spectro por 再 生 纤 维 素 膜 透 析 袋 、 新 型 纤维 素 酯 膜 透 析 袋 的 数据 参见 本 书 附录 二 三、 四 。 2. 反 渗 透 和 超 滤 、 微 过 滤 反 渗 透 和 超 滤 、 微 过 滤 均 属 加 压 膜 分 离 技术 , 其 区 别 是 膜 的 孔径 、 膜 两 侧 压力 大 小 不 同 。 如 果 在 渗透 装置 的 膜 两 侧 造成 一 个 压力 差 并 使 其 大 于 溶液 的 渗透 压 (通常 为 1 一 8 MPa) ,就 会 发 生 溶剂 倒流 , 使 得 浓度 较 高 的 溶液 进一步 浓缩 , 这 叫 反 渗透 。 膜 的 平均 孔径 <10 和 A ,截留 的 是 溶液 中 的 溶质 和 悬浮 物质 , 透 过 的 是 溶剂 ， 因此 反 渗 透 可 用 于 污水 处 理 海水 淡化 和 纯 水 制造 。 膜 的 平均 孔径 为 10 一 100 和 A , 压力 差 为 0.1 一 0.6 MPa 时 , 它 只 截留 大 分 子 而 允许 水 和 盐 类 物质 透 过 , 这 种 操作 叫 超 滤 或 透 滤 , 可 以 脱盐 并 获得 浓缩 的 大 分 子 溶 液 。 当 膜 的 平均 孔径 为 S00A 一 14pm, RAH 0.1MPa 时 , 可 以 除去 溶液 中 的 较 大 颗粒 、 细 菌 菌 体 等 而 获得 比较 澄清 的 溶液 ,这 叫 微 过 滤 或 微 孔 过 滤 。Amicon 超 滤 膜 数据 见 本 书 附录 五 六 。 3. 电 渗 析 在 电场 中 交替 装配 阴离子 和 阳离子 交换 膜 ,形成 一 个 个 隔 室 , 使 溶液 中 的 离子 有 选择 地 分 离 或 富 集 , 这 就 是 电 渗 析 , 它 使 离子 与 非 离子 化 合 物 分 离 。 4. 纳米 过 滤 纳米 过 滤 介 于 超 滤 和 反 渗 透 之 间 , 它 也 以 压力 差 为 推动 力 , 但 所 需 外 加 压力 比 。 31 . 反 渗 透 低 得 多 , 能 从 溶液 中 分 离 出 300 一 1000 相对 分 子 质 量 的 物质 而 允许 盐 类 透 出 , 是 集 浓缩 与 透析 为 一 体 的 节能 膜 分 离 方 法 , 已 在 许多 工业 中 得 到 有 效 的 应 用 。 参考 文 献 B. D. 哈密 斯 , D. 利克 伍德 . 蛋白 质 的 凝 胶 电 泳 实践 方法 . RI, 程 桂 芳 译 . 北京 :科学 出 版 社 ,1994 Prat. 生物 化 学 研究 技术 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1995 冯 万 祥 , 赵 伯 龙 . 生化 技术 . 长 沙 :湖南 科学 技术 出 版 社 , 1995 陶 宗 晋 . 离心 沉降 分 析 技 术 . 北京 :科学 出 版 社 , 1983 汪 家 政 , 范 明 . 蛋白 质 技术 手 册 . 北京 :科学 出 版 社 ,2000 EF. 膜 分 离 技术 及 其 应 用 . 北京 :科学 出 版 社 , 1994 RIGA, 潘 华 珍 , RA. 生物 化 学 与 分 子 生 物 学 实验 常用 数据 手册 . 北京 :科学 出 版 社 ,2000 叶 正 祥 . 生物 大 分 子 离心 分 离 技术 . 长 沙 :湖南 科学 技术 出 版 社 , 1990 中 山大 学 生物 系 生 化 微生物 学 教研 室 . 生化 技术 导论 . 北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1978 3 第 二 章 “ 生 物化 学 分 析 方 法 生物 化 学 分 析 的 直接 目的 是 测定 一 定 供 试 样本 中 某 类 或 某 种 生化 物质 的 含量 或 活性 。 由 于 细胞 的 组 成 极其 复杂 , 各 类 生化 物质 含量 有 很 大 变化 , 稳定 性 各 不 相 同 , 某 种 成 分 的 存在 可 能 对 其 他 成 分 的 测定 工作 构成 干扰 , 因此 , 生物 化 学 分 析 本 身 就 是 一 件 难 度 很 大 的 事情 。 对 于 同一 种 生化 物质 ,同时 有 多 种 分 析 方 法 可 供 选 择 , 但 任何 分 析 方 法 ,都 有 各 自 的 优 缺 点 和 一 定 的 适用 条 件 。 如 何 进行 生物 化 学 分 析 涉 及 问题 很 多 。 生 物化 学 以 生物 高 分 子 为 主要 研究 对 象 ,本章 结 合 它 们 的 测定 问题 做 些 方法 学 方面 的 讨论 。 第 一 他 ”重量 法 重量 法 是 一 种 经 典 的 分 析 方 法 , 但 在 生物 化 学 分 析 中 , 它 又 有 不 同 的 特点 。 原 则 上 讲 , 通过 一 定 的 方法 和 程序 , 从 供 试 样本 中 提取 、 纯 化 出 某 一 类 或 某 一 种 成 分 ， 求 出 其 在 样本 中 所 占 比 例 , 就 属于 重量 分 析 。 由 于 细胞 中 生化 物质 种 类 很 多 , 性质 各 异 ,有 的 可 以 用 重量 法 分 析 如 脂 类 物质 , 而 有 的 就 不 能 用 重量 法 分 析 如 含量 甚 微 ,性 质 易 变 的 成 分 。 就 是 含量 较 多 的 重 白质 ,一 般 也 不 宜 用 重量 法 测定 , 其 原因 有 两 方面 :一 是 蛋白 质 的 绝对 纯化 难以 做 到 , 纯化 过 程 中 的 损失 不 容 忽 略 ; 二 是 蛋 白质 所 含 结 合 水 数量 不 易 确 定 。 下 面 以 粗 脂肪 的 定量 测定 为 例 , 说 明 一 下 重量 法 的 应 用 。 脂 质 是 不 溶 于 水 而 溶 于 脂 溶 性 溶剂 的 一 大 类 物质 ,包括 中 性 脂肪 ( 油 和 脂肪 )、 类 脂 ( 棍 脂 `、 固 醇和 螨 ) 以 及 它们 的 水 解 产物 (脂肪 酸 、 高 级 脂肪 醇 )。 利 用 脂 溶性 溶 剂 从 样本 中 把 脂 类 物质 抽 提 出 来 , 蒸 去 溶剂 , 根据 制 得 的 油 重 就 可 计算 出 样本 的 含 油 量 。 由 于 制备 物 是 各 种 脂 质 的 混合 物 , 故 称 粗 脂肪 。 油料 作物 种 子 粗 脂肪 含量 测定 方法 :选取 有 代表 性 的 种 子 , 拣 出 杂质 , 按 四 分 法 缩减 取样 。 试 样 选 出 和 制备 完毕 立即 混合 均匀 , RAB OER. RET 如 芝麻 油菜 籽 等 ,取样 量 不 少 于 25 g。 大 粒 种 子 如 大 豆花 生 仁 等 取样 量 不 少 于 30 go KPA 105+2CHF 1 h 后 粉碎 ,并 过 40 Ai, HEC ADA RA WE, air To TH ONE AER BOE Te) SS, PEE AND 50 g, 通 籽 剥 壳 , 分 别 Prt, 计算 出 仁 率 , 再 将 籽 仁 切 碎 。 称 取 备用 试 样 2 一 4 g 两 份 (含油 0.7 一 1 g), 精 确 至 0.001 g, MF 105+2TH 箱 中 干燥 1 h 取出 , 放 入 干燥 器 内 冷却 至 室温 。 同 时 另 测试 样 的 水 分 。 将 试 样 放 入 研 钵 内 研 细 , 必要 时 可 加 石英 砂 助 研 。 用 角 勺 将 研 细 的 试 样 移入 干燥 的 滤纸 简 tees 内 , Hic >t Abe AS ti BE PR PPK A fA LE RE a, 一 并 投入 滤纸 简 内 (大 豆 已 预先 烘 烤 粉 碎 , 可 直接 称 样 装 简 ), 在 试 样 表层 复 以 脱脂 棉 , 然后 将 滤纸 简 放 入 索 氏 抽 提 器 的 抽 提 管内 (无 滤纸 简 时 也 可 使 用 滤纸 包 )。 在 装 有 2 一 3 粒 浮石 并 已 烘 至 恒 重 的 洁净 的 抽 提 瓶 内 , 加 入 瓶 体 约 1/2 的 无 水 Ze (SIE Ce BK 30 ~ 60°C 沸 程 的 石油 醚 ), 把 抽 提 器 各 部 分 连接 起 来 , 通 入 冷却 水 , FEARS EGET HAE. VAT KARE, 使 冷凝 下 滴 的 乙醚 为 180 滴 /min 即 每 秒 3 滴 。 抽 提 时 间 一 般 需 8 一 10 h, 含油 量 高 的 作物 种 子 应 延长 抽 提 时 间 , 至 抽 提 管内 的 乙醚 用 滤纸 试验 无 油 迹 时 停止 。 抽 提 完毕 后 从 抽 提 管 中 取 出 滤纸 简 。 将 承接 烧瓶 与 蒸馏 装置 连接 好 , FE TKI LAB HA CR. RP TSE, 在 沸水 洽 上 莹 去 残余 的 乙 栈 。 然 后 将 盛 有 粗 脂 肪 的 抽 提 瓶 放 入 105 + 2°C 烘箱 中 , BE 1 h, 取出 存放 于 干燥 器 中 冷却 至 室 温 ( 约 1 h) 后 称 重 , 精确 至 0.001 g。 再 烘 30 min, 冷却 后 称 重 , BSH. MR 增加 的 重量 即 为 粗 脂肪 重量 。 抽 出 的 油 应 是 清亮 的 , 否则 应 重 做 。 结 果 计 算 ; 相 脂肪 (% , 干 基 ) = pe Ce PR * 100 带 壳 油 料 种 子 粗 脂肪 (% ) = 种 仁 粗 脂 肪 (% ) x 出 仁 率 平行 测定 的 结果 用 算术 平均 值 表 示 , 保留 小 数 后 2 位 。 平 行 测定 结果 的 相对 误差 ,大 豆 不 得 大 于 2% , 油料 作物 种 子 不 得 大 于 1%. 除了 脂 类 可 用 重量 法 测定 外 , 棉花 、 麻 类 、 饲 料 、 食 品 中 的 纤维 素 , 通常 也 用 重 量 法 测定 。 现 在 有 了 半自动 的 纤维 分 析 仪 ,同时 可 处 理 6 个 样品 , 分 析 效 率 可 以 大 幅度 提高 。 第 二 节 ”化 学 法 一 种 物质 如 果 能 和 另 一 种 物质 发 生化 学 反应 , 原则 上 讲 就 可 以 根据 这 个 化 学 反应 建立 一 个 相应 的 化 学 分 析 方法 , 在 此 等 物质 的 量规 则 起 着 根本 的 指导 作用 。 所 谓 等 物质 的 量规 则 是 指 在 化 学 反应 中 , 消耗 了 的 两 反应 物 的 物质 的 量 相等 % 用 公式 表示 即 ; 7B 三 nT iF 4) 或 GO, Vis CAVA (2-2) (2-1) 式 中 ，za\znr 分 别 表示 相互 反应 的 物质 B 和 物质 T 的 物质 的 量 , 它们 可 由 下 式 求 出 或 表示 : = CV. 2 3) (2-3)X 4, m 为 该 物质 的 质量 , M 为 该 物质 的 摩尔 质量 , C 为 该 物质 的 量 浓度 ， 5 于 全 下 - a V 为 该 物质 的 耗 用 体积 。 根据 上 述 3 个 公式 ,就 可 以 很 容易 地 对 酸 碱 滴定 、 氧 化 还 原 滴定 、 络 合 滴定 和 沉淀 滴定 进行 计算 。 下 面 以 蛋白 质 凯 氏 定 氮 法 测定 为 例 , 说 明 一 下 化 学 分 析 在 生 化 分 析 中 的 应 用 。 每 一 种 蛋白 质 都 有 其 恒定 的 含 氮 量 。 各 种 蛋白 质 含 所 量变 幅 在 14% 一 18% 之 间 , 平均 为 16% 。 当 样品 在 浓 硫 酸 中 加 热 时 , 样品 中 蛋白 质 的 氮 变 成 铵 盐 状 态 。 在 强 碱 条 件 下 将 氨 蒸 出 ,用 加 有 混合 指示 剂 的 硼酸 吸收 燕 出 的 氨 。 以 标准 硫酸 滴 定 硼 酸 吸收 的 氨 , 恢复 硼酸 吸收 氨 之 前 原 有 的 氢 离 子 浓度 。 根 据 标准 酸 消耗 量 , 即 可 求 出 蛋白 质 的 含 氮 量 , 再 乘 以 16% 的 倒数 6.25, 可 求 出 样品 中 香 白 质 的 含量 。 凯 氏 法 中 有 关 反 应 如 下 : i=j ALM Fim + YW H,SO, rrr (NH, )2SO,4 + 2NaOH —~2NH,OH + NazSO4 ——->(NH,),SO, + H3PO, + CO, * + SO, + SO," NH,OH —>H,0+ NH,‘ NH, + HBO; —>(NH,)H,BO; 2(NH,) HBO; + HSO, —>(NH,)2SO, + 2H;BO; 结果 计算 : 样品 的 蛋白 质 含 量 % = 和 x 100 AP, Vs 一 滴定 样品 用 去 标准 硫酸 的 体积 (ml) ; Vcrk 一 滴定 空白 用 去 标准 硫酸 的 体积 (ml) ; Cliso,— 方 HSO4 AY tt Ye BE (mol/L) ; W—tfim #(g) ° 第 三 节 ”分光 光度 法 分 光 光 度 法 是 利用 物质 所 特有 的 吸收 光谱 来 测定 其 含量 的 一 项 技术 。 朗 伯 - 比尔 定律 是 利用 分 光 光 度 计 进 行 比 色 分 析 的 基本 依据 , 其 数学 表达 式 为 : 也 =e (3-1) (3-1) MAL, SE HEH TL — AC I AS I BT SE BT SHREK 吸光 介质 的 厚度 的 增加 呈 指 数 减少 。 AIC T 代替 透射 光 与 入 射 光 比 值 I/To, 则 TS tf (32) HE (3 -2) 式 两 侧 同 时 取 负 对 数 5 35. =|lgT = ecl &-lgeT=A, A 称 为 吸光 度 ,那么 A = ecl (as) (3-3) 是 朗 伯 -比尔 定律 的 实用 形式 , 它 表 示 吸 光 溶 液 厚 度 ( 光 径 7) 一 定时， 吸光 度 (A ) 与 溶液 浓度 (C ) 成 正比 。 如 果 作 出 标准 物 吸光 度 (A ) 对 浓度 (C) 的 标 准 曲线 , 借助 标准 曲线 就 很 容易 通过 测定 吸光 度 求 得 同类 物质 未 知 溶液 的 浓度 。 式 中 es 称 为 摩尔 消光 系数 , 是 光 径 7: 为 1 cmiKE C 为 1 moVL 时 的 吸光 度 , EH 单位 为 L/mol'cm。 由 于 分 光 光 度 法 具有 灵敏 度 高 , 操作 简便 、 精 确 、 快 速 , 对 于 复杂 的 组 分 系统 ， 勿 需 分 离 即 可 检测 出 其 中 所 含 的 微量 组 分 的 特点 ,因此 分 光 光 度 法 早已 成 为 生物 化 学 研究 中 广泛 使 用 的 分 析 方 法 。 许 多 生化 物质 本 身 不 具 颜 色 , 但 通过 一 些 灵 敏 的 显 色 反应 , 可 以 方便 地 对 该 物质 进行 定量 测定 。 利 用 某 些 物质 如 和 蛋白质、 核酸 等 在 紫外 光 区 域 的 吸收 也 符合 朗 伯 -比尔 定律 ,不 需 显 色 便 可 进行 比 色 测定 或 流动 比 色 测 定 ,因此 更 受 生 化 工作 者 欢迎 。 为 了 获得 吸光 度 与 浓度 之 间 的 线性 关系 , 在 利用 分 光 光 度 法 进行 测定 时 应 该 注意 : 1) 分 光 光 度 计 应 有 很 好 的 分 光 或 滤 光 性 能 , 这 是 因为 朗 伯 -比尔 定律 只 适用 单 色 2) 吸 光度 值 应 控制 在 0.05 一 1.0 范围 之 内 , 否则 应 适当 稀释 溶液 或 换 用 光 径 更 小 的 比 色 杯 。 3) 正 确 选 用 参 比 溶液 。 当 显 色 剂 及 其 他 试剂 均 无 色 , 而 被 测 溶液 中 又 无 其 他 离子 时 , 可 用 蒜 馏 水 作 参 比 溶液 。 如 显 色 剂 本 身 具 有 颜色 , 则 用 显 色 剂 作 对 照 。 如 显 色 剂 本 身 无 色 , 而 被 测 溶液 中 有 其 他 有 色 离 子 时 , 则 用 不 加 显 色 剂 的 被 测 溶 液 作 对 照 。 还 原 糖 的 测定 是 生化 分 析 中 经 常 做 的 项 目 , 最 方便 的 方法 就 是 分 光 光 度 法 。 在 碱 性 条 件 下 , 显 色 剂 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 与 还 原 糖 共 热 后 被 还 原 成 棕 红 色 氨 基 化 合 物 , 在 一 定 范围 (50 一 100wg) 内 还 原 糖 的 量 与 显 色 后 溶液 的 颜色 强度 呈 比 例 关 系 , 因此 利用 分 光 光 度 法 可 测定 样品 中 还 原 糖 的 含量 。 SOT 酶 法 酶 是 生物 细胞 产生 的 以 蛋白 质 为 主要 成 分 的 生物 催化 剂 。 酶 促 反 应 具有 高 度 的 专 一 性 , 包括 底 物 专 一 性 ( 即 酶 只 作用 于 某 一 种 或 某 一 类 物质 ) 和 反应 专 一 性 ( 即 酶 只 能 催化 一 定 的 反应 )。 酶 的 这 种 选择 性 及 其 在 很 低 的 浓度 下 都 有 很 高 催化 效 率 的 能 力 , 使 得 酶 法 分 析 大 有 用 途 , 早已 用 来 对 底 物 激活 剂 、 抑 制剂 以 及 酶 本 身 进 行 测定 。 . 36 . Eee re_a_— Se es es as - 2 SS Oe 工 酶 法 分 析 最 主要 的 优点 在 于 选择 性 强 , 不 受 体系 中 共存 物质 干扰 ;灵敏 度 高 ， 可 测定 到 10-8 g 这 样 微 量 的 物质 。 随 着 多 种 酶 试剂 的 商品 化 和 固 相 酶 的 出 现 , 以 及 快速 而 准确 的 酶 法 分 析 自 动 化 系统 的 进展 , 酶 法 分 析 日 益 得 到 广泛 应 用 。 酶 的 种 类 及 酶 反应 类 型 很 多 , 其 具体 反应 过 程 各 不 相同 , 但 酶 法 分 析 的 测定 方 法 概括 起 来 有 两 大 类 , 即 化 学 方法 和 仪器 方法 。 一 、 化 学 方法 为 了 跟踪 一 个 酶 反应 的 进程 , 必须 检测 其 中 某 一 反应 物 或 反应 产物 的 浓度 随 时 间 而 变化 的 程度 。 在 化 学 方法 中 ,反应 的 跟踪 是 通过 定时 地 从 反应 混合 物 中 取 出 一 定 样品 , 测定 其 中 某 一 反应 物 或 产物 的 变化 值 。 取 样 后 可 用 下 列 方法 之 一 来 终止 酶 反应 : 1) 加 入 一 种 能 与 底 物 结合 的 化 合 物 或 酶 的 抑制 剂 。 2) 使 样品 突然 冷却 , 钝 化 酶 的 活性 。 3) 将 样品 迅速 置 入 沸水 浴 中 使 酶 失 活 。 4) 凡 对 pH 敏感 酶 , 可 利用 突然 加 入 酸 或 碱 来 改变 pH, 终止 酶 活性 。 =. (MATTIE 如 果 不 取样 就 能 连续 地 检测 化 学 反应 , 那 当 然 是 更 理想 的 。 应 运 而 生 的 各 种 仪器 方法 ,就 具有 这 种 特点 。 仪 器 方法 大 致 有 两 类 :一 类 是 跟踪 某 些 反应 物 的 消失 或 反应 产物 的 出 现 , 直接 利用 它 的 理化 性 质 加 以 检测 ; 另 一 类 是 使 用 偶 联 反应 体 系 , 进行 间接 检测 。 和 常用 的 仪器 方法 有 测 压 法 、 分 光 光 度 法 、 旋 光 测 定 法 ` 电 化 学 法 、 荧 光 法 和 放射 化 学 法 。 Ba ”色谱 法 色谱 法 是 用 来 分 离 混合 物 中 各 种 组 分 的 方法 。 色 谱系 统 包括 两 相 :固定 相 和 流动 相 。 当 以 流动 相 流 过 加 有 样品 的 固定 相 时 , 由 于 各 组 分 在 两 相 之 间 的 浓度 比 例 不 同 , 就 会 以 不 同 速度 移动 而 互相 分 离开 来 。 固 定 相 可 以 是 固体 ,也 可 以 是 被 固 体 或 凝 胶 所 支持 的 液体 。 固 定 相 可 以 装 入 柱 中 、 展 成 薄 层 或 涂 成 薄膜 , 称 为 “色谱 床 "。 流 动 相 可 以 是 气体 ,也 可 以 是 液体 , 前 者 称 为 气相 色谱 , 后 者 称 为 液 相 色谱 。 色谱 法 的 基本 作用 是 实现 混合 物 中 各 组 分 的 有 效 分 离 , 完成 定性 分 析 。 纸 色 谱 法 、 薄 层 色 谱 法 、 薄 膜 色谱 法 都 能 胜任 定性 分 析 , 但 要 实现 高 分 辩 力 的 分 离 或 准 确 进行 各 组 分 的 定量 分 析 , 它们 就 不 能 满足 需要 了 。 尽 管 可 以 采用 洗 脱 比 色 或 用 薄 层 扫描 仪 处理 显 色 后 的 图 谱 , 但 最 多 能 做 到 半 定 量 。 随 着 离子 交换 色谱 仪 (如 氨 二 时 基 酸 自动 分 析 仪 )\ 高 效 液 相 色谱 仪 `. 气 相 色谱 仪 和 毛细 管 电泳 仪 的 出 现 及 逐渐 完 善 ,生化 物质 的 分 离 和 定量 分 析 可 以 在 很 短 时 间 内 准确 完成 。 离子 交换 色谱 法 主要 用 来 分 离 极 性 较 强 电离 度 大 的 混合 物 。 氨 基 酸 分 析 仪 是 用 离子 交换 色谱 法 分 析 氨 基 酸 组 分 及 含量 的 专用 液 相 色 谱 仪 。 在 酸性 条 件 下 ， 氨基 酸 多 元 混合 物 首 先 与 离子 交换 树脂 上 的 钠 离 子 发 生 交换 而 被 结合 。 然 后 用 不 同 pH 的 洗 脱 液 分 段 洗 脱 , 酸性 `. 中 性 和 碱 性 氨基 酸 顺 次 流出 , 而 且 每 种 氨基 酸 在 固定 条 件 下 洗 脱 时 间 是 固定 的 。 流 出 的 氨基 酸 在 混合 室内 与 曹 三 酮 混合 , 流 经 加 热 的 反应 螺旋 管 时 充分 反应 显 色 , 再 流 经 专用 分 光 光 度 计 比 色 , 在 记录 仪 上 绘 出 各 种 氨基 酸 出 峰 图 谱 , 积分 仪 打印 出 分 析 结 果 , 可 以 同时 做 出 定性 定量 分 析 。 第 六 节 ”主要 生物 物质 分 析 生物 材料 中 有 机 化 合 物种 类 很 多 , 本 节 主 要 讨论 碳水 化 合 物 、 核 酸 、 蛋 白质 的 定量 分 析 。 一 、 碳 水 化 合 物 分 析 碳水 化 合 物 又 称 糖 类 物质 ,是 多 羟基 醛 、 多 羟基 酮 及 其 缩聚 物 和 某 些 衍生 物 的 总 称 。 在 人 类 食物 或 饲料 成 分 中 , 碳水 化 合 物 量 通常 以 总 碳水 化 合 物 来 表示 : 总 碳水 化 合 物 (% ) = 100 - (水 分 + 粗 蛋 白 + 粗 脂肪 + 粗 灰分 )(% ) 现代 营养 学 将 总 碳水 化 合 物 分 为 两 类 , 即 有 效 碳 水 化 合 物 和 无 效 碳 水 化 合 物 (又 称 膳 食 纤 维 )。 前 者 包括 单 糖 、 低 聚 糖 、 糊 精 、 演 粉 和 糖 原 等 ,后 者 包括 果 胶 、 半 纤维 素 、 纤 维 素 和 木质 素 等 。 对 生物 材料 的 碳水 化 合 物 的 分 析 , 可 以 做 总 碳水 化 合 物 的 测定 , 但 更 多 的 研究 需要 明确 测定 各 类 碳水 化 合 物 的 含量 , 如 演 粉 ` 纤 维 素 等 。 根据 糖 的 组 成 , 可 将 碳水 化 合 物 分 为 三 类 即 单 糖 \ 双 糖 和 多 糖 。 而 根据 糖 在 水 或 乙醇 溶液 中 的 溶解 度 大 小 , 碳水 化 合 物 可 分 为 两 类 , 即 可 浴 性 糖 ( 包 括 还 原 性 单 糖 、 双 糖 和 非 还 原 性 双 糖 、 守 糖 ) 和 不 溶性 糖 (包括 半 纤 维 素 、 纤 维 素 、 淀 粉 . 果 胶 、 多 缩 成 糖 等 )。 经 典 的 组 分 分 析 是 将 具有 同一 作用 机 能 的 物质 一 起 进行 定量 的 方法 , 如 还 原 糖 ` 可 溶性 糖 等 。 其 分 析 结 果 虽 然 难 以 赋 预 明确 的 含义 (如 可 溶性 糖 总 量 中 到 底 含 有 哪些 糖 ), 但 在 实践 上 较为 实用 , 仍 是 目前 使 用 较 多 的 分 析 方 法 。 碳水 化 合 物 的 测定 有 物理 方法 和 化 学 方法 , 但 以 化 学 分 析 法 更 为 常用 。 在 化 学 分 析 法 中 , 还 原 糖 的 测定 是 最 基本 的 , 因为 非 还 原 糖 及 多 糖 等 的 分 析 , 是 经 过 水 解 将 其 转化 为 还 原 糖 来 测定 并 以 还 原 糖 来 表示 其 含量 的 。 38 1. TSH ME (1) 可 溶性 糖 的 提取 与 澄清 可 溶性 糖 易 溶 于 水 和 乙醇 溶液 。 水 果 、 蔬 菜 等 样品 可 用 水 直接 提取 , SEMA 葡 糖 较 多 的 样品 需 用 80% 乙醇 溶液 提取 。 用 水 提取 可 溶性 糖 时 , 先 将 样品 研 成 糊 状 或 粉 状 , 加 一 定量 蒸馏 水 , 在 70 一 80°C 7K EDA 1 小时。 为 防止 多 糖 被 酶 解 , 可 加 入 少量 氯 化 季 (HgClbp )。 样 品 含 有 机 酸 较 多 时 , 应 先 调 节 pH 至 中 性 再 加 热 提 取 , 可 避免 低 聚 糖 被 有 机 酸 部 分 水 解 。 最 后 用 水 定 容 至 一 定 体积 ,过 滤 , 取 滤 液 测 糖 。 当 用 80% 乙醇 提取 可 溶性 糖 时 , 回流 提取 3 次 ,每 次 30 分 钟 。 合 并 提取 液 ， 蒸 去 乙醇 ,以 水 定 容 至 一 定 体积 , 测 糖 。 为 了 除去 蛋白 质 等 干扰 物质 , 可 用 10% 的 中 性 醋酸 铅 处 理 可 溶性 糖 提 取 液 ， 冷却 后 过 滤 。 用 饱和 硫酸 钠 沉 淀 滤液 中 多 余 的 铅 ,过 滤 后 定 容 至 一 定 体 积 , 再 进行 糖 的 测定 。 (2) 原 还 糖 的 测定 方法 一 “3,5 -二 硝 基 水 杨 酸 (DNS) 比 色 法 原理 :在 碱 性 溶液 中 ,3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 与 还 原 糖 共 热 后 被 还 原 成 棕 红 色 氮 基 化 合 物 , 在 一 定 范围 内 还 原 糖 的 量 与 反应 液 的 颜色 强度 呈正 比 ,利用 比 色 法 可 测 定 样品 中 还 原 糖 含量 ( 详 见 实验 十 三 )。 方法 二 ”Somogyi-Nelson 比 色 法 原理 :还 原 糖 将 铜 试剂 还 原生 成 氧化 亚 铜 ,在 浓 硫 酸 存在 下 与 砷 钼 酸 生 成 蓝 色 溶液 ,在 560 nm 下 的 消光 值 与 还 原 糖 含量 呈 比 例 关 系 , 故 可 用 比 色 法 测定 样品 中 还 原 糖 含量 ( 详 见 实验 三 十 三 )。 还 原 糖 的 测定 还 有 Lane-Eynon( 即 斐 林 试剂 热 滴定 ) 法 、Shaffer-Somogyi Mi 法 等 多 种 方法 。 非 还 原 糖 经 酸 水 解 后 , 也 可 用 上 述 方法 测定 。 但 在 水 解 过 程 中 有 水 分 子 挫 入 ,应 从 测定 总 量 中 扣除 挫 入 的 水 量 , 蔗糖 乘 以 0.95, 其 他 多 糖 乘 以 0.9。 (3) 可 溶性 糖 总 量 的 测定 方法 一 ”着 酮 比 色 法 原理 : 糖 类 遇 浓 硫 酸 脱水 生成 糠 醛 及 其 衍生 物 , 可 与 草 酮 试剂 缩合 产生 蓝 绿色 物质 ,于 620 nm 处 有 最 大 吸收 , 显 色 深 浅 与 糖 含 量 呈 线性 关系 ( 详 见 实验 三 十 四 )。 方法 二 ”地衣 酚 - 硫 酸 比 色 法 原理 : 糖 经 无 机 酸 处 理 脱 水 产生 糠 醛 或 其 衍生 物 ,能 与 地 衣 酚 缩合 生成 有 色 物 质 ,溶液 颜色 深浅 与 糖 含量 成 正比 ,在 505 nm 比 色 可 测定 样品 中 的 糖 含量 。 "。， 39 - 2. 淀粉 的 测定 淀粉 是 植物 种 子 中 最 重要 的 贮藏 性 多 糖 。 玉 米 、 小 米 \ 大米 约 含 淀 粉 70% , 干 EN BEA 36% 一 47% 。 蔬 菜 的 淀粉 含量 悬殊 较 大 , SRBAW 14.7%, 叶 菜 类 少 于 0.2% MANERA SEM 8.8%, 而 其 他 水 果 几 乎 不 含 淀 粉 。 淀粉 是 由 葡萄 糖 聚 合成 的 高 分 子 化 合 物 , 有 直 链 淀粉 和 支 链 淀 粉 两 类 。 它 们 的 性 质 因 结构 差异 而 有 所 不 同 。 直 链 淀粉 不 溶 于 冷水 ,能 溶 于 热 水 。 直 链 淀 粉 分 子 在 溶液 中 经 缓慢 冷却 后 , FA 易 发 生 凝 沉 现象 。 直 链 淀粉 可 与 碘 生 成 络 合 物 , 呈现 深蓝 色 。 支 链 淀粉 只 能 在 加 热 及 加 压 的 条 件 下 才能 溶解 于 水 。 静 置 冷却 后 , 不 易 出 现 凝 沉 现 象 。 支 链 淀粉 与 碘 不 能 形成 稳定 的 络 合 物 , 遇 碘 呈现 较 浅 的 蓝 紫 色 。 淀粉 可 直接 被 酸 水 解 生成 葡萄 糖 ;或 被 酶 水 解 生成 麦芽 糖 和 糊 精 , 再 经 酸 水 解 生成 葡萄 糖 , 这 是 淀粉 经 酶 或 酸 水 解 后 测定 还 原 糖 计算 淀粉 含量 的 理论 基础 。 另 外 , 淀粉 经 分 散 和 酸 解 后 具有 一 定 的 旋光 性 , 是 旋光 法 测定 淀粉 含量 的 基础 。 由 于 半 纤 维 素 也 容易 被 酸 水 解 产 生还 原 糖 ,所 以 用 直接 水 解法 测定 淀粉 , 会 使 测定 结果 偏 高 。 方法 一 ”CaCbP-HAcO 浸 提 -旋光 法 原理 :淀粉 可 用 CaCb-HAcO( 比 重 1.3，pH 2.3) 为 分 散 和 液化 剂 , EER 度 和 加 热 条 例 下 , 使 淀粉 溶解 和 部 分 酸 解 , 生成 具有 一 定 旋光 性 的 水 解 产 物 , 用 旋 光 计 测定 之 。 用 此 法 时 , 各 种 淀粉 的 水 解 产物 的 比 旋 指 定 为 203。 淀粉 . % = 一 “ 义 ]00 _ x 100 m X 1 X203 式 中 ，v 一 旋光 角度 的 读数 ; /一 旋光 管 长 (dm) ; m — FF tin Jon Ht (2) ; 203—te tr HY HL HE . 方法 二 ” 演 粉 糖化 酶 - 酸 水 解法 原理 :样品 经 脱脂 、 脱 (可 溶性 ) 糖 后 ,加 入 演 粉 酶 糖化 ,冷却 后 用 中 性 醋酸 铅 除 蛋白 , 糖化 液 ( 含 糊 精 和 麦芽 糖 ) 再 用 盐酸 水 解 ,淀粉 最 终 转化 为 和 葡萄糖, 测定 还 原 糖 的 量 ,结果 有 两 种 表示 方法 : \ 丰 还 原 糖 (mg) x 样 液 总 体积 还 原 糖 , % = 样品 质量 (mg)X 测 定 取 用 体积 x100 或 淀粉 , % = 还 原 糖 (% ) X0.9 以 上 两 种 方法 测 得 的 是 样品 中 淀粉 的 总 量 。 如 果 要 了 解 样 品 中 直 链 淀粉 和 支 链 淀 粉 各 自 的 含量 , 可 用 双 波 长 比 色 法 测定 ( 详 见 实 验 三 十 六 )。 。 40 - 3. 粗 纤 维 的 测定 粗 纤维 的 概念 是 比较 粗放 的 ,对 于 植物 性 饲料 或 食品 , 粗 纤维 包括 纤维 素 、 半 纤维 素 \、 木 质 素 、 果 胶 物质 等 多 种 化 学 成 分 。 其 含量 高 低 有 助 于 饲料 或 食品 的 营养 价值 评定 。 粗 纤维 的 测定 传统 上 多 用 酸 碱 洗 涤 法 , 由 于 其 流程 较 长 .测定 结果 偏 低 (木质 素 溶解 所 致 ) ,现在 已 为 Van Soest 的 酸 洗涤 剂 法 (ADF) 取 代 。 原理 :植物 样品 用 2% 的 CTAB( 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 贸 ) 的 0.5 mol/L H,SO, 溶液 ( 酸 洗涤 剂 ) 者 沸 1 小 时 , 除去 易 水 解 的 蛋白 质 、 多 糖 、 核 酸 等 组 分 , 过 滤 , VES 酸 液 后 烘 干 ( 含 纤维 素 及 木质 素 ), 由 残渣 重 计算 酸性 洗涤 剂 纤维 % , 本 法 适用 于 谷 物 及 其 加 工 品 \ 饲 料 、. 牧 草 、 果 蔬 等 植物 葵 杆 . 叶 、 果 实 以 及 测定 粗 脂 肪 后 的 任何 样 品 中 粗 纤 维 的 测定 。 详 见 实 验 三 十 七 。 4. 果 胶 物质 的 测定 果 胶 物质 是 一 群 复杂 的 胶 态 的 碳水 化 合 物 衍 生物 。 在 未 成 熟 果 实 中 , 呈 不 溶 于 水 的 原 果 胶 存在 。 随 着 果实 的 成 熟 , 原 果 胶 转 化 为 水 溶性 的 果 胶 酸 和 果 胶 酯 酸 ， 二 者 的 区 别 是 多 聚 半 乳糖 醛 酸 的 羧基 甲 基 化 程度 不 同 。 方法 一 “重量 法 将 果 胶 质 从 样品 中 提取 出 来 (分 总 果 胶 物质 和 水 溶性 果 胶 物质 两 部 分 ), 加 入 氧化 钙 生 成 不 溶 于 水 的 果 胶 酸 钙 , 测 其 重量 后 换算 成 果 胶 质 的 质量 。 有 两 种 表示 方法 : 一 2 m X Vi 0.9233 x 一 x V FameM,% = 2-2233 x (my — mJ XV ig m X Vi FRAT, m1 — FARBER ES + 玻璃 砂 必 漏斗 质量 (g) ; m 9 — BRS WD oS Ds EE EE (gx) 5 Vi— KF AAR (ml) ; V 一 提取 液 总 体积 (ml) ; 妈 一 样品 质量 (g); 0.9233 一 由 果 胶 酸 钙 (CiyHzOi6Ca) 换 算 成 果 胶 酸 的 系数 。 本 法 操作 详 见 实验 三 十 八 。 方法 二 “ 比 色 法 原理 : 果 胶 物质 水 解 后 生成 半 乳 糖 醛 酸 , 在 强酸 中 与 咏 只 产生 缩合 反应 , 对 其 紫红 色 溶 液 进行 比 色 定量 。 样 品 中 的 果 胶 物质 以 半 乳 糖 醛 酸 表示 。 - 41- 二 、 核 酸 分 析 核酸 分 DNA 和 RNA 两 类 , 由 于 结构 和 组 成 不 同 , 产 生 了 性 质 上 的 部 分 差异 。 这 种 差异 在 核酸 的 定量 分 析 中 是 非常 有 用 的 。 核酸 的 定量 分 析 有 两 种 情况 , 一 种 是 测定 一 定量 生物 材料 中 DNA、RNA 的 含 量 , 另 一 种 是 对 核酸 制备 物 中 DNA、RNA 的 含量 和 纯度 进行 测定 。 在 生物 材料 中 , 各 种 有 机 成 分 混合 存在 , 核酸 往往 还 和 蛋白 质 等 结合 成 复合 物 。 当 破碎 了 细胞 之 后 , 必须 要 通过 多 步 程 序 , 去 除 干 扰 核酸 分 析 的 杂质 , 再 根据 RNA 和 DNA 对 碱 、 酸 稳定 性 的 差异 , 分 别 抽 提 出 RNA 和 DNA 的 水 解 产 物 ( 单 核 苷 酸 ), 最 后 利用 紫外 吸收 法 、 定 磷 法 或 定 糖 法 分 别 进行 定量 测定 。 对 不 同 的 生物 材料 , 可 选用 适当 的 方法 对 细胞 进行 破碎 。 破 碎 工 作 应 尽 可 能 在 低温 条 件 下 进行 ,防止 核酸 酶 对 核酸 的 水 解 ,所 有 试剂 一 般 需 预 冷 。 样品 的 处 理 过 程 主要 是 去 除 杂质 。 在 此 期 间 , 要 用 多 种 试剂 悬浮 沉淀 、 离 心 。 除了 在 低温 条 件 下 操作 之 外 ,每 次 悬浮 沉淀 要 充分 , 避免 沉淀 的 损失 。 每 次 离心 时 lB] RF 10 分 钟 。 首先 用 乙醇 洗 去 糖 类 物质 , 再 用 稀 的 高 氯 酸 洗 去 无 机 磷酸 。 对 含 脂 类 较 多 的 样品 , 接 下 来 要 用 醇 醚 混合 液 脱 脂 。 对 低 脂 样品 , 此 步 可 以 省 略 , 或 在 最 后 采用 抗 于 扰 力 强 的 测定 方法 。 脱 过 脂 的 样品 沉淀 ( 含 RNA+DNA), 可 选择 两 种 不 同 的 水 解 方法 处 理 。 一 是 用 5% 的 高 氧 酸 在 90 人 CC 水解 15 分 钟 , 抽出 总 核酸 ;二 是 先 用 0.3 mol/L 的 氢 氧 化 钾 水 解 RNA, 下 余 沉 淀 再 用 酸 水解 DNA, 第 二 种 方法 分 别 获 得 RNA 和 DNA 两 种 水 解 液 。 最 后 再 利用 核酸 的 碱 基部 分 、 磷 酸 部 分 或 糖 的 特异 性 质 , 对 两 类 核酸 进行 定量 。 核酸 的 定量 方法 有 3 类 : (1) % Phe 天 然 核 酸 分 子 中 , AES PoE PF ESE DEB, TE 240 ~ 280 nm 段 有 极 大 吸收 。 纯 核酸 的 紫外 吸收 高 峰 在 260 nm, 吸收 低谷 在 230 nm。 在 一 定 限 度 内 (10~20pg/ ml), Azeo 值 与 核酸 浓度 成 正比 ,但 RNA 和 DNA 的 比 消光 系数 不 同 : RNA(1pg/ml) HY Ago = 0.022 DNA(1pg/ml) MH Ago = 0.020 因此 ,根据 样品 的 Azo, 可 以 定量 测定 核酸 (天 然 大 分 子 )。 在 上 述 核酸 分 离 程序 中 , 实际 上 制 得 的 是 单 核 苷 酸 溶液 , 对 于 RNA 来 说 , Acco HoH 1.1~1.5 4, DNA Aio 增 加 1.3 一 1.4 倍 。 所 以 , 在 分 析 计 算 时 不 能 简单 的 利用 高 分 子 核 酸 的 比 消光 系数 ,应 该 在 做 样品 的 同时 ,做 RNA 和 DNA 标 样 的 水 解 ,分 别 测 出 各 自 的 比 消光 系数 , 再 行 计 算 。 = 40.* (2) AR 从 原理 上 讲 , 两 类 核酸 分 别 抽 提 出 来 之 后 , 再 进行 消化 , 将 核 苷 酸 中 的 磷 基 释 放出 来 做 成 无 机 磷酸 , 进行 定 磷 。 再 根据 核酸 的 含 磷 量 确定 的 关系 , 即 RNA = 9.5%,DNAE=9.9% ,可 以 计算 出 样品 中 核酸 的 含量 。 (3) 定 糖 法 RNA 的 测定 “RNA 含有 核糖 , 可 选用 以 下 任 一 方法 。 方法 一 “地衣 酚 法 在 RNA 提取 液 中 加 入 地 衣 酚 试剂 ,沸水 浴 中 者 沸 20 SP BP, PO AE HE SR AY 合 物 , 测 As7xo。 本 方法 特异 性 强 ,DNA 的 显 色 度 为 RNA 的 十 分 之 一 , 蛋白 质 影 响 较 小 。 适 用 于 RNA 碱 解 液 。 AEX WREKRE ERRBRMK PIAA ER. AR, AHN, CARAT RR te AR, MiB — PER (A SRB), OANA, 37°C 下 反应 1 小 时 , 生 BO EA ARR, WW Asso。 本 方法 抗 干扰 力 强 ,几乎 不 受 DNA( 至 1 mg) 的 影响 。 适 于 全 核酸 抽 提 液 中 RNA 的 定量 。 DNA 的 测定 ( 定 脱 氧 核糖 ) DNA 中 含有 2’ -脱氧 核糖 , 可 选用 以 下 任 一 方 %. 方法 一 ”二 苯胺 法 在 DNA 抽出 液 中 加 入 三 苯胺 试剂 , 30 放置 16 一 20 小 时 , 测 Asoo。 本 方法 灵 敏 度 较 低 。 AEX WY #£ DNA HEM FOIA 0.04% 5) RAK KER BRA 10 分 钟 ,冷却 后 AAGER 3 次 。 离 心 后 取 上 层 黄色 水 层 , 测 Aioo。 本 方法 比 二 苯胺 法 灵敏 , 而 且 不 受 RNA 共存 的 影响 。 AK= WHA 在 核酸 酸 解 液 中 ,加 入 $S% 三 氯 乙酸 , N-BHEAER, 煮沸 20 分 钟 ,冷却 后 加 乙 BOG ka, 离心 , FELASA, 取水 层 溶 液 3.0 ml, 加 2 mol/L AALH 1.0 ml 显 色 , 定 容 至 5.0 ml, 测 Asso。 此 法 专 一 性 强 ,各 1 mg 的 核糖 、RNA 水 解 物 及 蛋白 质 共 存 时 均 无 干扰 。 并 且 不 经 脱脂 程序 ,对 DNA 定量 也 无 影响 。 对 于 纯 的 核酸 制备 物 , 存在 如 下 数量 关系 , S0prg/ml 的 双 链 DNA, 37pg/ml 的 单 链 DNA, 40pg/ml 的 单 链 RNA, 20wg/ml AY BERR ARE Ao =1, 据 此 用 紫外 吸收 法 来 计算 核酸 样品 的 浓度 (>0.25pg/ml)。 分 光 光 度 法 不 但 能 测定 核酸 的 浓度 , 还 可 以 通过 测定 Azso/A2so 比 值 估计 核酸 的 纯度 。DNA 的 比值 为 1.8,RNA 的 比值 为 2.0。 酶 、 蛋 白质 的 存在 会 导致 Azso/ Azso 比 值 降 低 。 若 DNA 的 Azso/Azso >1.8, 说 明 制 剂 中 存在 RNA, 需要 考虑 用 RNA 酶 处 理 样品 , 提高 DNA 纯度 。 - 4B - 当 核 酸 溶液 浓度 <0.2Snug/ml 时 , 核酸 的 定量 需要 使 用 灵敏 度 更 高 的 荧光 光 度 法 (灵敏 度 可 达 1 一 5$ ng). DNA 本 身 并 不 产生 荧光 , (AE RIE RAR CE (ethidium bromide, EB) i A Ba 2é-F fl Z lal Ja, DNA 样品 在 紫外 线 (254 nm) 照 射 下 激发 ,可 以 发 出 红色 荧光 , 其 荧光 强度 与 核酸 含量 成 正比 。 使 用 一 系列 已 知 的 不 同 DNA 洲 液 作 标准 对 照 , 可 以 比较 出 被 测 DNA 溶液 的 浓度 。RNA 也 可 用 荧光 光度 法 测定 浓度 ,但 应 使 用 RNA 或 单 链 DNA 作 标 准 对 照 , RNA 的 最 低 检 出 量 为 0.$wg ZEA, KK DNA 检 出 下 限 低 得 多 。 =. BAMA 蛋白 质 的 定量 分 析 是 经 常 做 的 生化 测定 项 目 , 一 般 来 说 , 不 能 采取 单 离 称 量 法 ,这 是 因为 很 难 确 定 蛋 白质 的 结合 水 量 , 其 纯化 流程 很 长 , 操作 中 引 六 的 误差 不 可 忽视 。 在 生物 化 学 研究 中 , 蛋白 质 的 定量 方法 主要 有 两 类 , 一 是 基于 蛋白 质 含 所 量 稳定 的 凯 氏 定 氮 法 ,二 是 比 色 法 ,包括 双 缩 逐 法 、Lowry 法 、 紫 外 法 和 色素 结合 法 。 AKE— ARE 原理 :各 种 蛋白 质 含 氨 量 虽 有 一 定 差异 , 但 变 幅 不 大 (14% ~18%), 平均 含 氨 量 为 16% 。 当 样品 与 浓 硫 酸 共 热 时 ( 需 使 用 催化 剂 ), HAT PH ARE MK 盐 。 在 强 碱 性 条 件 下 将 氨 蒸 出 ,用 加 有 混合 指示 剂 的 硼酸 吸收 之 。 用 标准 酸 滴定 被 硼酸 吸收 的 氨 , 恢复 硼酸 吸收 氨 之 前 原 有 的 氢 离 子 浓 度 作 为 终点 。 根 据 标准 酸 消耗 量 , 即 可 求 出 样品 中 有 蛋白质 的 含量 。 凯 氏 法 适用 于 各 种 生物 样品 , 固体 、 液 体 均 可 。 灵 敏 度 高 , 重 现 性 好 。 是 蛋白 质 定 量 分 析 的 标准 方法 , 随 着 自动 定 氮 仪 的 问 世 , 分 析 工 作 已 实现 自动 化 。 见 实验 二 十 七 中 工 。 方法 二 WHAM 原理 :在 碱 性 溶液 中 蛋白 质 的 肽 键 与 Cu 作用 (4:1) 生 成 紫红 色 络 合 物 , 颜色 深浅 与 蛋白 质 含量 成 正比 , 故 可 用 比 色 法 测定 蛋白 质 含量 。 双 缩 脲 法 主要 的 缺点 是 灵敏 度 稍 低 , 蛋白 质 浓度 过 低 时 有 一 定 误差 。 当 有 是 量 样品 时 , 双 缩 逐 法 还 是 可 以 使 用 的 比较 稳定 的 方法 。 详 见 实验 三 十 。 方法 三 六 Folia = 酚 法 原理 :Folin - 酚 法 又 叫 Lowry 法 ,是 一 个 包含 双 缩 腺 反应 的 复合 方法 。 在 碱 性 条 件 下 , 蛋白 质 与 Cu 作用 生成 蛋白 质 - 铜 复合 物 , 再 利用 复合 物 中 蛋白 质 的 芳香 族 氨基 酸 Tyr 的 酚 羟 基 还 原 磷 钼 酸 - 磷 钨 酸 试剂 , 生成 蓝 色 物 质 。 在 一 定 条 件 下 ， 蓝 色 深浅 与 蛋白 质 含量 成 正比 ,可 用 比 色 法 测定 。 本 方法 操作 简单 , 迅速 ,灵敏度 高 , 易 受 多 种 因素 干扰 。 详 见 实验 三 十 一 。 方法 四 “紫外 法 原理 :本 法 依据 蛋白 质 溶液 在 280 nm 下 有 最 大 吸收 值 (主要 是 Tyr 残 基 的 贡 。 44- 献 ) 进 行 比 色 测 定 。 当 有 核酸 共存 时 , 可 以 分 别 测定 Azso, Acco, 再 按 下 式 计 算 , 即 可 消除 核酸 干扰 ; 蛋白 质 浓度 (mg/ml) = 1.45Adrg9 — 0.74Ar60 本 方法 灵敏 度 较 高 ,无 需 损 耗 样品 , 在 柱 层 析 中 适 于 做 流动 比 色 , 跟踪 蛋白 质 组 分 的 洗 脱 。 详 见 实验 三 十 二 。 方法 五 ”色素 结合 原理 : 考 马 斯 亮 蓝 G- 250 在 游离 状态 下 呈 红 色 , 当 它 与 蛋白 质 结 合 后 变 为 青 色 。 蛋 白质 含量 在 0 一 1000 pe THA, RAR ARAA DWE 595 nm 下 的 光 吸 收 与 蛋白 质 含量 成 正比 , 故 可 用 比 色 法 测定 。 详 见 实验 十 二 。 参考 文献 RRR, BER. 生物 物质 常用 化 学 分 析 方 法 . 北京 :科学 出 版 社 , 1982 Pree. 生物 化 学 研究 技术 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1995 G. G. 吉尔 鲍 特 . 酶 法 分 析 . 缪 辉 南 译 . 北京 :科学 出 版 社 , 1977 张 树 政 . 酶 学 研究 技术 . 北京 科学 出 版 社 , 1987 5 到， Poe EMS has 第 一 他” 生物 化 学 制备 方法 的 特点 从 生物 材料 中 获得 某 一 组 分 的 方法 称 为 生物 化 学 制备 。 它 是 生化 工程 及 生化 制药 工业 的 基础 。 生化 物质 在 生物 体内 具有 多 种 生理 活性 , 这 些 活 性 的 产生 与 其 结构 有 着 密切 的 关系 。 化 学 中 已 经 十 分 成 熟 的 制备 方法 如 蒸馏 熔炼 等 ,对 生化 物质 的 制备 已 完 全 不 适用 。 客 观 的 需要 推动 了 生化 制备 技术 的 建立 与 发 展 。 与 一 般 化 学 制备 相 比 ,生化 制备 技术 有 以 下 几 个 特点 : 1) 生 物 材料 组 成 非常 复杂 , 其 中 往往 包括 数 百 种 甚至 数 千 种 化 合 物 。 在 分 离 制 备 过 程 中 , 这 些 化 合 物 仍 在 发 生变 化 。 2) 有 些 组 分 含量 甚 微 ,如 激素 抗体 等 , 需要 用 大 量 材料 才能 获得 少量 制备 物 。 3) 许 多 具有 生物 活性 的 成 分 一 旦 离开 了 活体 , 很 易 变 性 失 活 , 这 是 生化 制备 中 最 困 难 的 地 方 。 在 生物 高 分 子 制备 中 , 为 了 最 大 限度 地 保持 其 活性 , 往往 要 选择 十 分 温和 的 条 件 如 pH 离子 强度 , 并 尽 可 能 在 较 低 温度 和 洁净 环境 下 进行 。 4) 生 化 制备 一 般 都 在 溶液 中 进行 ,影响 因素 很 多 ,方法 经 验 性 较 强 。 为 了 提高 制备 批 次 之 间 的 重 现 性 , 必须 严格 规定 材料 \ 方 法 ` 条 件 和 试剂 。 5) 制 备 物 均一 性 的 证 明 与 化 学 上 纯度 的 概念 并 不 完全 相同 。 由 于 生物 分 子 对 环境 反应 十 分 敏感 ,结构 与 功能 关系 比较 复杂 , 故 对 其 均一 性 的 评定 常常 是 有 条 件 的 ,或 者 通过 不 同 角度 的 测定 , 才能 给 出 相对 均一 的 结论 。 由 于 生化 制备 的 上 述 特点 , 现行 的 生化 制备 技术 大 都 根据 混合 物 中 不 同 组 分 分 配 率 的 差别 , 把 它们 分 配 于 可 用 机 械 方 法 分 离 的 两 相 中 , 通过 分 液 、. 过滤 、 离 心 等 预 以 分 离 ; 或 者 将 混合 物 置 于 某 一 物 相 (大 多 数 是 液 相 ) 中 , 外 加 一 定 的 作用 力 如 层 析 、 离 心 . 电 泳 ` 超 滤 等 , 使 各 组 分 分 配 于 不 同 的 区 域 , 从 而 达到 分 离 的 目的 。- 第 二 节 ”溶剂 提取 法 利用 溶剂 的 溶解 作用 把 所 需 成 分 从 细胞 中 转移 出 来 的 操作 叫 溶剂 提取 , 这 是 生化 制备 的 最 基本 技术 。 凡 能 影响 物质 溶解 度 的 因素 均 能 影响 提取 效率 , 大 致 涉 及 溶剂 本 身 及 提取 操作 方法 和 条 件 两 个 方面 。 最 主要 的 包括 以 下 因素 : 。 46 + 1. 溶剂 的 性 质 一 种 物质 溶解 度 的 大 小 与 溶剂 的 性 质 密 切 相 关 。 物 质 溶 解 性 质 有 三 个 最 主要 的 规律 1) 极 性 物质 易 溶 于 极 性 溶剂 中 , 非 极 性 物质 易 溶 于 非 极 性 溶剂 中 。 但 也 有 例外 , 如 糖 类 虽 是 非 极 性 物质 , (HAD TAS ARS RE REA), 也 易 溶 于 水 。 2) 酸 碱 物质 易于 互 溶 , 即 酸性 物质 易 溶 于 碱 性 溶剂 中 , 碱 性 物质 易 溶 于 酸性 溶剂 电 。 3) 降 低 溶 剂 的 介 电 常 数 , 可 降低 溶质 的 溶解 度 。 在 做 溶剂 提取 时 , 溶剂 的 性 质 是 首先 要 考虑 的 。 单 从 极 性 的 大 小 来 看 , 常用 溶 剂 大 致 有 如 下 排序 : 水 > 醇 类 > 酮 类 > 酚 类 > 芳 胺 类 > AR I IEA ~ BE > 醚 类 > 不 饱和 烃 类 PEAR > HAIER 2. BF RE 离子 强度 是 影响 物质 溶解 度 的 主要 因素 之 一 , 但 离子 强度 对 不 同 物 质 溶 解 度 的 影响 不 同 。 如 高 离子 强度 可 使 DNA 蛋白 质 复合 物 溶解 度 增加 , 而 低 离子 强度 下 就 能 溶解 RNA 蛋白 质 复合 物 。 在 核酸 制备 和 分 析 中 都 利用 这 一 差别 实现 两 类 核酸 的 分 离 。 再 例如 稀 盐 溶液 可 使 绝 大 多 数 球 重 白 和 酶 的 溶解 度 增 加 , — 盐 溶液 而 不 用 纯 水 来 提取 和 蛋白质 。 在 此 条 件 下 , 稀 盐 溶液 还 有 稳定 提取 物 生 理 活 性 的 作用 。 3. pH 值 溶剂 pH 对 生化 物质 的 提取 有 两 方面 的 影响 , 一 是 影响 生物 高 分 子 的 结构 与 活性 , 通常 控制 在 pH6 一 8 左右 。 二 是 通过 影响 溶质 的 解 离 状态 而 改变 其 溶解 度 。 一 般 来 说 , 非 解 离 的 分 子 状 态 易 溶 于 有 机 溶剂 , 而 离子 状态 的 物质 都 易 深 于 水 。 对 于 酸性 或 碱 性 物质 , 可 利用 一 定 pH 的 水 溶液 溶 提出 来 , 再 改变 溶液 pH 抑制 其 解 离 ,使 其 呈 分 子 状 态 , 再 转 溶 于 有 机 溶剂 。 这 样 , 对 其 进一步 分 离 纯化 十 分 有 利 。 然而 像 氨基 酸 这 样 的 两 性 物质 ,除了 在 等 电 点 时 溶解 度 最 低 外 , 在 任何 pH 条 件 下 都 呈 离 子 状 态 , 所 以 一 般 不 用 有 机 溶剂 提取 氨基 酸 ( 乙 醇 例外 )。 4. 温度 温度 的 升 高 可 增加 物质 的 溶解 度 。 对 热 比较 稳定 的 生化 物质 例如 中 草药 的 有 效 成 分 可 用 加 热 的 方法 进行 提取 , 但 对 绝 大 多 数 生物 高 分 子 来 说 , 一 般 尽 可 能 在 低 温 下 提取 , 以 便 最 大 程度 地 保持 其 生物 活性 。 ra 。 5. 去 垢 剂 EPH EA AA HR KE MAA KEN DIR, 有 阳离子 型 、 阴 离子 型 和 中 性 等 三 类 去 垢 剂 。 去 垢 剂 一 般 具 有 乳化 、 分 散 利 增 溶 三 种 作用 。 常 用 的 中 性 去 垢 i] Tween, Triton X-100, Lubrol W 4718 FARRER, 而 阴离子 型 去 垢 剂 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS) 和 常用 于 核酸 提取 。 溶剂 提取 的 具体 操作 方法 视 材 料 和 被 提取 成 分 的 性 质 而 定 ,常用 的 有 浸渍 法 、 渗 渡 法 .前 者 法 、 回 流 提 取 法 和 连续 提取 法 。 SH Mie PES WLP PAS Jt ee YH ND HE, 可 以 通过 使 用 沉 演 剂 或 改 变 溶液 的 条 件 来 实现 。 制 备 沉淀 可 收 到 浓缩 或 部 分 纯化 的 效果 , 沉淀 物 也 便于 保 存 或 进一步 处 理 。 一 : 盐 析 法 一 般 地 说 ,所 有 固体 溶质 都 可 以 在 溶液 中 加 入 中 性 盐 而 沉 演 析出 。 这 一 过 程 称 为 盐 析 。 在 蛋白 质 研 究 领域 盐 析 应 用 最 为 普遍 。 中 性 盐 的 加 入 可 以 中 和 和 蛋白质 分 子 表面 的 电荷 , 破坏 其 表层 水 化 膜 , 从 而 使 蛋白 质 分 子 易 于 聚集 而 沉淀 析出 。 影 响 蛋 白质 盐 析 的 因素 主要 有 : 1. 蛋白 质 浓度 蛋白 质 浓 度 过 高 或 过 低 , 都 不 太 适 合 做 盐 析 。 过 少时 易 发 生 共 沉 作 用 ,过 黎 时 回收 率 太 低 , 一 般 蛋 白质 浓度 取 2.5% 一 3.0% 较 为 合适 , 否则 应 适当 稀释 或 浓缩 。 2. 离子 强度 离子 强度 大 小 对 蛋白 质 的 溶解 度 起 着 决定 性 的 影响 , 一 般 来 说 , 离子 强度 越 高 , 蛋白 质 溶解 度 越 低 , 盐 析 越 易 发 生 。 为 了 防止 蛋白 质 的 共 沉 作 用 , 盐 析 时 并 非 离子 强度 越 高 越 好 。 不 同 蛋白 质 发 生 盐 析 时 所 需要 的 离子 强度 不 同 , 据 此 , 可 以 用 不 同 离子 强度 的 分 步 盐 析 , 对 混合 物 中 各 组 分 进行 分 离 或 部 分 纯化 。 3. pH 值 溶液 的 pH 值 影响 蛋白 质 解 离 状 况 和 溶解 度 大 小 。 如 果 调 整 溶液 pH 值 在 蛋 白质 等 电 点 附近 , 则 盐 析 效果 最 好 。 。 48 。 4. 温度 盐 析 可 使 蛋白 质 沉 演 下 来 ,但 并 不 会 使 蛋白 质变 性 。 为 了 盐 析 完全 和 防止 蛋 白质 变性 , 一 般 最 好 在 室温 或 0 一 4 下 进行 。 可 用 于 盐 析 的 中 性 盐 种 类 很 多 , 但 最 常用 的 首 推 硫酸 铵 。 这 是 因为 硫酸 锭 溶 解 度 大 , 受 温度 变化 影响 较 小 。 用 于 盐 析 的 硫酸 贸 应 该 有 较 高 的 纯度 。 盐 析 时 硫 酸 铵 的 浓度 以 饱和 溶液 的 百分数 来 表示 。 调 整 溶液 硫酸 匀 饱 和 度 既 可 加 入 固体 盐 , 也 可 滴 加 饱和 溶液 ,但 不 管 采用 哪 种 方式 ,都 要 注意 : 1) 根 据 溶液 温度 , 查 表 计 算 该 温度 条 件 下 硫酸 铵 加 入 量 , 避免 错误 , 见 本 书 附 录 七 。 2) 加 盐 时 要 分 次 缓慢 加 入 , 同时 适当 搅拌 ,以免 造成 局 部 过 浓 , 影响 分 离 效 果 。 3) 盐 析 后 一 般 放 置 0.5 一 1 h, 待 沉 演 完全 后 再 分 离 , 可 提高 回收 率 。 二 、 有 机 溶剂 沉 省 法 有 机 溶剂 可 以 降低 溶液 的 介 电 常 数 , 可 以 破坏 溶质 分 子 表 面 的 水 膜 , 从 而 引起 溶质 分 子 的 聚集 沉 汪 ,是 另 一 类 常用 的 沉淀 方法 。 由 于 不 同 溶 质 的 沉淀 要 求 不 同 浓度 的 有 机 溶剂 ,因此 可 用 有 机 溶剂 进行 分 步 沉 淀 。 使 用 的 有 机 溶剂 必须 能 和 水 混 溶 。 乙 醇 常用 来 沉淀 核酸 、 糖 类 `、 氨 基 酸 和 核 苷 酸 。 有 机 溶剂 沉淀 法 分 辨 能 力 比 盐 析 法 高 , 沉淀 不 需 脱 盐 , 过 滤 也 比较 容易 , 但 容易 使 酶 失 活 。 在 低温 下 操作 可 使 这 一 缺点 得 到 改善 。 三 、 非 离子 多 聚 物 沉 省 法 有 些 非 离子 型 多 聚 物 如 聚 乙 二 醇 、 王 葵 乙 烯 化 氧 、 葡 聚 糖 、 右 旋 糖 本 硫酸 钠 等 ， 具有 很 强 的 亲 水 性 和 较 大 的 溶解 度 。 在 溶液 中 其 分 子 通过 空间 位 置 排斥 作用 ,能 使 其 他 溶质 包括 生物 高 分 子 、 病 毒 和 细菌 等 聚集 沉降 下 来 。 此 法 操作 条 件 比 较 温 A, 不易 引起 生物 高 分 子 的 变性 , 沉淀 效能 高 , 在 细菌 、 病 毒 、 核 酸 `、 蛋 白质 和 酶 的 分 离 中 经 常 使 用 。 BOW 次 缩 与 干燥 从 黎 溶 液 中 除去 水 或 溶剂 使 之 变 为 高 浓度 的 溶液 称 为 浓缩 。 溶 液 浓缩 后 便于 结晶 、 沉 淀 或 和 干燥。 车 发 、 离 子 交 换 法 、 吸 附 法 、 沉 淀 法 、 莹 取 法 \ 亲 和 层 析 法 等 都 能 收 到 不 同 程度 的 浓缩 效果 。 在 实验 室 条 件 下 , 还 可 用 亲 水 吸附 剂 如 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 进 行 吸收 涤 缩 , 或 将 稀 溶 液 装 在 透析 袋 内 对 高 渗 溶 液 进 行 高 渗透 析 。 在 商品 化 的 Centricon 微型 浓缩 器 上 , 通过 离心 超 滤 可 使 2 ml 蛋白 质 溶液 在 30 min AKG - 49 - 250 wl UF. We 48 a Centricon-3, 10, 30 和 100 分 别 能 截留 平均 分 子 质量 为 3kDa, 10kDa, 30kDa 和 100kDa 的 蛋白 质 组 分 ( 见 图 3.1)。 在 工业 上 一 般 用 真空 浓 缩 缸 进行 料 液 的 浓缩 , 兼 能 回收 溶剂 重复 使 用 。 干燥 是 将 潮湿 的 固体 、 襄 状 物 ` 浓 缩 液 或 溶液 中 的 溶剂 除 尽 的 过 程 。 由 于 水 的 沸点 较 高 ,汽化 潜 热 较 大 , 因此 含水 物质 的 和 干燥 比较 困难 , 耗 能 较 多 。 对 生物 高 分 子 制备 物 来 说 ， 高 温 干 燥 是 不 可 取 的 , 在 生化 制备 中 最 重要 WRI RS TRAIT. BET JR BY Yak As PBR, 在 一 定 真 空 度 条 件 下 ,水 分 可 以 在 较 低 温度 下 除去 而 又 能 使 生化 物质 保持 活性 。 冰 冻 干 燥 是 将 溶液 或 混 悬 液 速 冻 成 固 态 , 然后 在 高 真空 度 下 使 冰 升 华 , 留 下 干 物 质 。 样 品 不 起 泡 , 不 暴 沸 , 干 物 不 沾 壁 , 结构 ls Pt Aallicdh Codiridos Bits, 易 溶 于 水 , FT RAED en A 浓缩 系统 浓缩 蛋白 质 溶液 质 \ 酶 核酸 抗生素 激素 等 。 在 工业 上 压力 喷雾 干燥 或 离心 喷雾 干燥 具有 更 大 的 实用 性 , 高 速 喷 出 的 筋 滴 和 热风 接触 时 间 很 短 ， 可 以 迅速 干燥 而 活性 成 分 又 不 被 破坏 。 SAD Mila Raa ais FE it (KE & HX (supercritical fluid extraction, SFE)2Vi 20 年 发 展 起 来 的 高 新 技术 , 以 超 临 界 状态 的 流体 (多 用 CO.) RHE SCY A LI A, 从 材料 中 把 所 需 成 分 节 取 出 来 并 实现 分 离 。SFE 具有 以 下 突出 的 特点 : 1) 所 萃取 出 来 的 产物 是 纯 天 然 的 ,没有 有 机 溶剂 对 产品 和 环境 的 污染 。 2) 25 RGR ER. 3) KKBAMABEEZH DRYER. 4) 运 转 费 用 低廉 。 由 于 以 上 特点 , 它 特 别 适 合 从 生物 材料 中 制备 各 种 天 然 产 物 , 在 医药 工业 、 食 品 工业 、 植 物化 工 等 领域 有 广阔 应 用 前 景 。 众所周知 , 物质 有 气体 液体 固体 三 种 聚集 状态 , 除 特 殊 情 况 外 , 三 种 聚集 状 态 在 一 定 条 件 下 可 以 相互 转化 ,物质 三 态 之 间 的 根本 差别 是 能 量 水 平 不 同 。 气体 被 压缩 ,放出 一 定 的 热量 , 有 可 能 被 液化 。 该 过 程 可 用 图 3.2 说 明 。 从 图 3.2 可 以 看 到 ,在 OC 时 , 随 着 压力 提高 ,CO; 的 比 容 下 降 即 密度 增加 , 到 达 C 点 后 CO, 气体 开始 液化 。 由 于 在 一 定 温度 下 有 一 定 的 饱和 蒸气 压 , 从 C 点 向 左 ,在 压力 基本 不 变 的 情况 下 ,气体 CO, 连续 液化 , 而 体积 大 幅度 缩小 。 图 3.2 中 。 50 . 储 液 帆 OC 等 温 线 上 出 现 CB 段 平 直 部 分 。 当 达到 B 点 时 ,所 有 的 CO, 气体 全 部 液化 。 由 于 液体 可 压缩 性 减 小 , 此 后 液体 CO, 微小 的 比 容 增加 都 需要 增加 很 大 外 加 压力 ， 同时 等 温 线 陡 度 急剧 上 升 。 压力 〈 大 气压 ) 0 0.002 0.01 0.02 0.03 KA (Ft / 58) 图 3.2 CO, 的 V( 比 容 )- P( 压 力 ) 等 温 线 图 10C 、207 等 温 线 变化 与 0Y 等 温 线 相似 ,都 有 一 个 液化 段 的 平 直 曲 线 分 别 为 CB、CB“。 但 温度 越 高 , 该 平 直线 段 越 短 即 CB>C'B' >C’B’. FE 31 CAEP, 当 外 加 压力 达到 72.9 大 气压 时 ,气体 CO, 瞬间 全 部 液化 。 此 后 等 温 线 陡然 上 升 , 液化 段 平 直线 段 缩短 至 一 点 (K 点 )。CO,; 瞬间 全 部 液化 时 即 K 点 所 对 应 的 温度 和 压力 称 为 CO; 的 临界 温度 和 临界 压力 , 此 时 的 CO, 达到 或 处 于 临界 状态 。 当 压力 超过 72.9 大 气压 时 CO, 成 为 超 临界 流体 。 但 是 在 31T 以 上 ,不 管 外 加 压力 多 大 , 都 不 能 使 CO, 液化 。 物 质 的 临界 状态 是 一 种 特殊 状态 , 在 “a8: 此 状态 下 ,气体 和 液体 的 区 别 消失 , 其 比 容 (L/g) 相 等 ,界面 消失 , 液体 的 气 化 热 、 内 聚 力 、 表 面 张力 等 于 0, 流体 的 密度 与 液体 密度 相等 , 而 其 黏度 与 气体 相同 , 溶质 在 其 中 的 扩散 速度 为 在 液体 中 扩散 速度 的 100 倍 。 因 此 , mB FP i AS AEE RGR ERS AAT. TT AiR a RK, KE HBR, 从 技术 上 来 说 , 获得 尽 可 能 高 的 压力 ,加 大 超 临 界 流体 的 密度 , RE BR AE 取 时 的 温度 和 压力 , 可 相应 改变 萃取 能 力 , 因而 提高 蔗 取 选择 性 , 利于 成 分 的 分 离 。 虽然 多 种 气体 都 能 成 为 超 临界 流体 , 但 超 临界 CO, 流体 具有 最 强 的 优势 , 这 主要 表现 在 : 1)CO, 价格 低廉 , 稳定 无 毒 , 没有 污染 , 可 循环 使 用 , 降低 生产 成 本 。 2) 临 界 温度 为 31Y , 接近 常温 ,在 生产 上 可 以 节约 能 耗 ,避免 热 敏 性 物质 破坏 , 能 有 效 防 止 氧化 和 副 反 应 ,具有 保鲜 作用 。 3)CO, 黏度 低 , 扩散 能 力 强 , 茶 取 效率 高 。 4) 在 较 低 温度 下 也 有 极 高 的 挥发 性 , DMRS ERTS, MA eA REPRE 5)CO, 不 自燃 , 不 助燃 , 安全 可 靠 。 6) 操 作 条 件 如 温度 、 压 力 \ 改 性 剂 可 任意 改变 , 提高 蘑 取 选择 性 。 我 国 从 20 世纪 80 FRA FH RMA TARAS, RECA 0.5~ 300L ARAL APP in, IZA EB RB aS A. PA ERA, 超 导 、 半 导体 陶瓷 \ 石油 、 环 保 等 多 种 领域 。 ANT BRS 溶剂 提取 是 生化 制备 的 最 基本 技术 , 但 它 缺 乏 严 格 的 选择 性 , 得 到 的 提取 液 往 往 是 多 种 成 分 的 液体 混合 物 。 该 液体 混合 物 中 某 个 组 分 或 各 个 组 分 的 进一步 分 离 , 需要 用 到 液 - 液 萃取 或 称 溶 剂 萃取 。 将 选 定 的 溶剂 加 到 混合 液 中 , 因 混 合 液 中 各 组 分 在 溶剂 中 的 溶解 度 各 不 相同 ， 从 而 达到 混合 物 分 离 的 目的 。 萃 取 所 使 用 的 溶剂 可 以 是 某 一 种 溶剂 , 也 可 以 是 某 些 溶剂 的 混合 溶剂 。 利 用 溶剂 对 欲 分 离 的 组 分 具有 较 大 的 溶解 能 力 ， 溶质 通过 扩 散 作 用 转移 到 溶剂 中 , 这 种 过 程 称 为 物理 萃取 。 通常 ,混合 液 中 被 萃取 的 物质 称 为 溶质 , 其 余部 分 称 为 原 溶剂 , 而 加 入 的 第 三 组 分 称 为 溶剂 或 萃取 剂 。 所 选 萃取 剂 的 基本 条 件 应 对 混合 液 中 的 溶质 有 尽 可 能 大 的 溶解 度 而 与 原 溶 剂 则 互 不 相 溶 或 部 分 互 溶 。 因 此 , 当 溶 剂 与 混合 液 混合 后 成 为 两 相 , 其 中 一 个 以 革 取 剂 为 主 ( 溶 有 溶质 ) 的 称 为 鞭 取 相 , 另 一 个 以 原 溶剂 为 主 ( 即 溶剂 含量 较 低 的 ) 称 为 萃 余 相 。 设 法 除去 蘑 取 相 中 的 溶剂 后 得 到 的 液体 为 位 取 液 。 同样 , 除去 萃 余 相 中 的 溶剂 后 的 液体 称 为 萃 余 液 。 萃取 操作 的 完整 过 程 包括 料 液 与 溶剂 的 混合 接触 ;萃取 相 和 蔗 余 相 的 分 离 ; 从 两 相 中 分 别 回收 溶剂 得 到 产品 等 三 步 。 混 合 、 分 离 步骤 在 一 定 萃取 设备 中 进行 ,为 « 579i sR GAS A BR AE , 希望 萃取 设备 能 使 溶剂 与 料 液 间 充分 接触 , 通常 是 使 一 相 尽 可 能 地 分 散在 另 一 相 中 , 造成 巨大 的 相 界面 。 但 是 又 不 能 过 度 分 散 而 乳化 ,形成 很 难 分 离 的 稳定 乳 浊 液 。 萃 取 中 两 相 的 分 离 不 完全 , 往往 是 分 离 效果 变 差 的 重要 原因 。 当 混合 液 中 各 组 分 沸点 相近 , 甚至 互相 重 友 或 各 组 分 的 相对 挥发 度 接近 于 1; 或 混合 液 是 恒 沸 物 ;或 要 从 稀 水 溶液 中 回收 沸点 比 水 高 的 有 机 物 ; 特 别 是 热 敏 性 混 合 物 的 分 离 , WRK ABSA ORAS, SAE LATE. 第 七 他 固体 生化 制品 分 晶体 和 无 定型 的 物质 两 种 类 型 。 晶 体 的 物质 构成 单位 (原子 、 分 子 或 离子 ) 的 排列 方式 是 规则 的 。 溶 质 从 溶液 中 析出 形成 品 形 物质 的 过 程 称 为 结晶 。 结 晶 是 同类 分 子 或 离子 的 规则 排列 , 具有 高 度 的 选择 性 , 因此 结晶 操作 可 使 物质 得 到 高 度 纯化 。 通常 以 溶质 的 溶解 度 作为 该 溶质 饱和 浓度 的 量度 。 溶 解 度 通常 以 100 g 溶剂 中 所 含 溶质 的 克 数 来 表示 。 在 不 饱和 溶液 中 添加 相同 固体 溶质 , 溶质 可 进一步 溶 解 ;饱和 溶液 中 溶质 与 溶液 处 于 平衡 状态 , 溶质 既 无 溶解 也 无 结晶 ;如 溶液 状态 已 过 饱和 , 超过 饱和 点 的 溶质 迟早 要 从 溶液 中 沉 演 出 来 。 所 以 , 要 使 溶质 从 溶液 中 结 晶 出 来 , 必须 首先 使 溶液 成 为 过 饱和 状态 ,过 饱和 度 是 固 相 形成 、 结 唱 产 生 的 推动 力 。 过 饱和 度 S(% ) 可 用 下 式 表 示 : 3 x 100 式 中 ，C 一 过 饱和 溶液 的 浓度 ; C 一 饱和 溶液 的 浓度 。 从 溶液 中 得 到 结晶 ,全 过 程 分 两 个 阶段 。 首 先 形成 细微 的 唱 核 , 然后 再 生长 成 具有 一 定 大 小 形态 的 晶体 。 为 了 进行 结晶 过 程 , 可 以 用 以 下 方法 使 溶液 达到 过 饱和 状态 : 1) 溶 液 冷 却 ; 2) 部 分 溶剂 汽化 ; 3) 汽 化 浓缩 与 冷却 并 用 ; 4) 添 加 唱 种 。 溶质 从 液 相 中 析出 时 ,不 同 的 环境 条 件 可 以 得 到 不 同 的 唱 形 , 甚至 以 无 定型 形 态 析 出 。 对 相等 的 结晶 产量 , 若 在 结晶 过 程 中 晶 核 形成 速率 远大 于 晶体 的 成 长 速 率 , 则 产品 中 晶体 细小 而 多 。 反 之 结晶 大 而 少 。 若 两 个 速率 彼此 接近 , 则 产品 中 晶 体 的 大 小 参差 不 一 。 通 常 根据 经 验 , 控制 两 个 速率 , 以 有 效 地 控制 产品 中 晶体 的 大 小 。 « Ss « 参考 文 献 PIL. 植物 化 工 工艺 学 . 西安 :西北 大 学 出 版 社 , 1995 Pei Zt. 生物 化 学 研究 技术 . 北京 :中 国 农 业 出 版 社 , 1995 冯 万 祥 , 赵 伯 龙 . 生化 技术 . 长 沙 :湖南 科学 技术 出 版 社 , 1989 毛 忠 贵 . 生物 工业 下 游 技 术 . 北京 :中 国 轻工业 出 版 社 , 1999 苏 拔 贤 . 生物 化 学 制备 技术 . 北京 :科学 出 版 社 ,1986 ESE, FHA. 发 酵 工厂 二 氧化 碳 的 回收 和 应 用 . 北京 :中 国 轻 工业 出 版 社 , 1996 « 54 - et Eee aT ETE 新 陈 代谢 是 生物 的 基本 特征 之 一 。 它 包括 同化 作用 和 异化 作用 两 个 方面 。 生 物 从 环境 中 取得 物质 , 转化 为 体内 的 新 的 物质 , 这 个 过 程 称 为 同化 作用 。 生 物体 内 的 旧 有 物质 , 转化 为 环境 中 的 物质 , 这 个 过 程 称 为 异化 作用 。 在 同化 和 异化 过 程 中 ,伴随 着 物质 代谢 同时 进行 着 能 量 转换 , 即 生 物体 内 机 械 能 、 化 学 能 、 热 能 以 及 光电 等 能 量 的 相互 转化 、 释 放 与 利用 。 生 物体 内 的 同化 作用 和 异化 作用 , 都 不 是 一 下 子 完成 的 , 它们 都 是 由 一 连 串 的 酶 促 反 应 构成 的 , 称 为 中 间 人 代谢。 代谢 研 究 实 际 上 就 是 研究 新 陈 代谢 的 化 学 途径 ,包括 每 个 中 间 代 谢 反应 及 它们 之 间 的 相互 联 系 和 相互 制约 , 找 出 其 中 的 固有 规律 。 要 完成 生物 的 代谢 研究 , 就 需要 采取 一 些 特 殊 的 研究 方法 。 至 于 研究 材料 可 以 是 完整 的 生物 , 也 可 以 是 生物 的 某 一 器 官 、 组 织 切片 组 织 义 浆 或 抽 提 出 的 酶 等 。 本 章 略 举 一 些 常用 的 代谢 研究 方法 。 1. 饲养 动物 研究 维生素 缺乏 症 或 维生素 的 功能 , 可 以 用 饲 喂 动物 的 方法 。 饲 喂 缺 乏 某 种 维生素 的 饲料 , 若干 天 后 观察 发 生 的 病变 , 然后 在 饲料 中 加 入 这 种 维生素 , 观察 症 状 是 否 减退 , 从 而 确证 这 种 维生素 的 功能 。 2. 测定 呼吸 商 (R. Q.) 应 用 这 种 方法 可 判断 体内 能 量 的 来 源 。 多 种 有 机 物 都 可 做 为 呼吸 底 物 使 用 ， 但 由 于 各 种 物质 中 所 含 C.H.O 比例 不 同 , 因此 释放 出 CO, 的 量 与 耗 O; 的 比例 也 不 相同 , 这 个 比例 称 为 呼吸 商 。 CO, 产生 量 (L) MFR = "ORE HE CL) 糖 的 呼吸 商 为 1, 脂肪 的 呼吸 商 为 0.70, 蛋白 质 的 呼吸 商 为 0.80。 正 常人 的 能 量 来 自 混 合 食物 ,呼吸 商 约 为 0.8$ 一 0.90。 糖 尿 病 患者 , 不 能 很 好 地 利用 葡萄 糖 ,能量 来 源 偏重 于 脂肪 ,呼吸 商 接近 0.70。 长 期 饥饿 情况 下 , 人 体能 量 大 部 分 来 自 机 体 本 身 的 脂肪 和 蛋白质 , 呼吸 商 接近 0.80。 呼吸 商 测定 方法 也 适用 于 各 种 耗 氧 反应 , 常用 来 研究 微生物 代谢 和 各 种 酶 反 应 。 3. 观察 先天 性 代谢 疾病 患者 的 不 正常 代谢 情况 先天 性 代谢 疾病 患者 , 体内 某 些 生化 反应 受阻 ,造成 某 些 代谢 中 间 产 物 的 积累 ~ §5 ° 和 排泄 。 根 据 查 到 的 不 正常 排泄 物 , 可 以 推测 哪 一 个 生化 反应 中 断 , 从 而 了 解 正 常 的 代谢 过 程 。 葵 丙 氨 酸 是 人 的 必需 氨基 酸 , 由 它 可 以 转变 成 酷 氨 酸 , 后 者 再 经 酷 氨 酸 酶 的 作 用 生成 3,4 -二 羟 葵 丙 氨 酸 (DOPA)。DOPA 再 继续 被 氧化 生成 黑色 素 。 有 些 先天 性 代谢 疾病 患者 由 于 体内 葵 丙 氨 酸 和 酷 氨 酸 代谢 发 生 障碍 , A AR Pd TE, BL ATE HOR TE BA (CHE 4. 应 用 微生物 的 生化 突变 型 把 野生 型 微生物 用 物理 或 化 学 因素 处 理 , 可 获得 一 系列 营养 缺陷 型 的 突变 型 ， 在 其 培养 基 中 , 只 有 加 入 某 一 物质 才能 生长 。 根 据 各 种 突变 型 所 表现 的 营养 需要 以 及 积累 的 中 间 产 物种 类 , 就 可 以 推测 某 些 物质 的 生物 化 学 合成 过 程 。 如 甲 硫 氢 酸 的 生物 合成 就 是 这 样 发 现 的 。 在 实践 上 , 微生物 的 营养 缺陷 型 也 用 手 发 酵 工 业 生产 某 些 生化 产品 , 如 氨基 酸 等 。 5. 切除 器 官 如 用 切除 动物 胰 脏 来 研究 糖尿 病 , 切除 肝脏 研究 含 所 化 合 物 的 代谢 , 这 个 方法 在 内 分 泌 研 究 上 应 用 特别 多 , 例如 切除 脑 下 垂体 ` 吧 上 腺 、 性 腺 等 。 6. 应 用 器 官 或 组 织 作 离 体 试验 用 血液 或 其 他 液体 灌注 一 个 活 的 吉 官 , 把 要 研究 的 某 一 物质 加 入 到 灌注 液 中 ， 观察 该 物质 所 起 的 变化 。 例 如 将 丙 氨 酸 灌注 入 肝 , 丙酮 酸 的 量 增 加 ,说明 肝 细胞 有 脱 氨 基 的 作用 。 应 用 组 织 切 片 、 组 织 匀 浆 、 组 织 抽 提 液 等 都 可 以 作为 酶 的 来 源 , 观察 它们 是 否 可 以 催化 茶 种 特殊 反应 , 便 可 以 推测 其 代谢 过 程 。 组 织 培养 把 细胞 或 组 织 接 在 含 一 定 成 分 的 合成 培养 基 上 令 其 生长 繁殖 而 得 到 纯 的 无 性 繁殖 系 , 可 以 进行 生物 化 学 或 遗传 学 等 方面 的 研究 。 8. 抑制 酶 活力 在 正常 细胞 的 环境 中 加 入 某 种 专 一 性 的 酶 抑制 剂 , 使 中 间 产 物 积累 起 来 , 便于 进行 分 析 。 例 如 在 糖 酵 解 研究 中 , 把 1, 6 -二 磷酸 果糖 和 酵母 提取 液 以 及 碘 乙酸 (磷酸 丙 糖 脱 氢 酶 的 抑制 剂 ) 一 起 保温 , 可 以 分 离 出 3 -磷酸 甘油 醛 和 磷酸 二 羟 丙 酮 , 这 就 证 实 了 1,6 -二 磷酸 果糖 的 裂解 产物 为 两 个 三 碳 糖 。 在 呼吸 链 的 研究 中 , 利用 阻 断 剂 可 以 确定 ATP 的 生成 部 位 , 也 是 应 用 类 似 原 理 。 - 56° 9. 分 部 离心 技术 的 应 用 应 用 分 部 离心 技术 , 可 以 将 各 种 细胞 器 分 开 , 用 各 个 不 同 的 分 部 来 研究 其 中 所 进行 的 代谢 作用 。 10. 葵 环 化 合 物 示 踪 法 利用 苯 甲酸 和 苯 乙 酸 不 能 被 动物 进一步 分 解 的 原理 , 以 葵 代 奇数 脂肪 酸 和 葵 代 偶 数 脂肪 酸 饲 喂 动物 , 结果 发 现在 前 一 种 情况 下 , 代谢 剩余 物 葵 甲 酸 与 甘氨酸 结 合成 马 尿酸 被 排出 体外 , 而 在 后 一 种 情况 下 代谢 剩余 物 葵 乙酸 与 甘氨酸 结合 成 苯 乙 尿 酸 被 排出 体外 。 从 而 提出 了 脂肪 酸 B -氧化 学 说 。 11. 放射 性 同位 素 示 踪 法 用 半衰期 确定 的 放射 性 同位 素 如 "HI “Ce “Ps Is3、 Su6 等 标记 某 些 化 合 “ 物 , 追 踪 放 射 性 向 哪些 化 合 物 上 转移 , 确定 反应 的 途径 和 机 理 。 由 于 放射 性 同位 素 的 分 析 方 法 更 为 灵敏 而 又 方便 , 故 广 泛 用 于 中 间 代 谢 研究 。 但 在 应 用 放射 性 同位 素 作 示 踪 研究 时 , 不 可 应 用 放射 性 过 强 的 化 合 物 , 否则 易 对 机 体 造 成 损伤 或 使 代谢 行为 改变 。 应 选择 半衰期 适当 的 放射 性 同位 素 , 半衰期 太 短 的 不 太 适 用 。 此 外 , 还 必须 注意 所 用 的 同位 素 不 能 与 周围 分 布 较 广 的 同位 素 之 间 发 生 交换 。 参考 文献 沈 仁 权 , 顾 其 敏 , 李 游 党 等 . 基础 生物 化 学 . 上 海 : 上 海 科 学 技术 出 版 社 , 1980 沈 同 , Eis, BES. 生物 化 学 . 北京 :高 等 教育 出 版 社 ,1990( 二 版 ) oy) 。 et rt. FOF PO IETS GIA oP HE SR 1 下 二 . 1. REM PF , US Ee 1 RG iis a | CAs ea wee aS ay. } as : Ip F<) nt ee x rie ee Bs RA OEE IP 过 人 “a Xe ee eS Reh ery sme ¥ “ea Ta aR iam . War ee 9 IR OL Helen as bs 六 JW he S f Ria z hae? Pan ied 时 过 加 a 7S pe att om", nea een Hino mye OA ws ao Seta. wey ee : 10h 上 a ete ed 7 Wat. he tha ee ites MD) arn : aa le am i ea (iL teehs , ea x fa 4 Wiel | i} f TSE eB canadian ee es le es O00 SE AS PE 1 = 3 78. I ‘$e ; * | iv % ‘ f , iwi) % me em 是 4 a iy neni: 4 4 = 1 和 Reed 了 ee magn em sw bE ee OO mean) 一 相逢 而 wT os ae 5 Wie it 8 ua SRR RH eereeer ae. | gene chante Ate mea Hem OY, 了 re 一， 生物 化 学 实验 第 一 单元 ”基础 训练 实验 一 ”生化 实验 要 求 及 基本 实验 设备 识 知 一 \ 生 化 实验 要 求 生化 实验 是 生物 化 学 教学 的 重要 组 成 部 分 。 通 过 实验 课 教 学 , 使 学 生 验 证 、 巩 固 、 扩 充 基 础 理论 ,学 习 必 要 的 基本 知识 , 提高 实验 的 基本 技能 , 掌握 生化 核心 技 术 , 培养 学 生发 现 问题 分析 问 题 和 解决 问题 的 能 力 , 为 将 来 从 事 科 学 研究 葛 定 良 好 的 基础 。 为 了 达到 上 述 目的 , 提出 生化 实验 总 体 要 求 : 按 时 出 席 , 注意 安全 , 保持 整洁 , 规范 操作 , 如 实 记载 ,及 时 总 结 。 二 、 生 化 实验 记录 (1) 实验 前 必须 认真 预习 , 弄 清 目的 原理 和 操作 方法 , 写 出 扼要 的 预习 报告 ， 操作 时 作为 提示 和 参考 。 (2) 准备 好 便于 保存 的 记录 本 。 实 验 中 观察 到 的 现象 结果 和 测试 的 数据 及 时 、 如 实地 记载 到 记录 本 上 。 (3) 详细 记录 实验 条 件 ,如 材料 的 名 称 和 来 源 , 仪器 的 名 称 \ 生 产 厂家 、 规 格 、 型 号 , 化 学 试剂 的 规格 \ 浓 度 .pH 值 等 。 (4) 一 律 用 钢笔 或 圆珠笔 记录 , 不 得 涂 控 修改 ,有 笔 误 处 可 划 去 重 记 。 (5) 如 果 怀 疑 观测 结果 或 记录 不 完整 , 必须 重 做 实验 。 三 、 生 化 实验 报告 实验 结束 后 要 及 时 整理 实验 数据 ,总 结实 验 结果 , 写 出 实验 报告 。 生 化 实验 报 告 书写 格式 : 实验 编号 、 名 称 实验 者 姓名 实验 年 月 日 —.AW = JR 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 四 、 操 作 步 又 五 、 结 果 处 理 A tte 实验 报告 要 求 书写 工整 、 层 次 清楚 表达 准 确 、 图 表 完 整 、 结 论 恰 当 。 能 为 他 人 - Gl 或 自己 今后 重复 相同 实验 作为 参考 。 四 、 基 本 实验 设备 识 知 1. 设备 类 (1) 加 热 设 备 主要 有 电炉 、 封闭 电炉 、 电热 套 等 直接 加 热 设 备 , 电热 恒温 水 浴 、 恒 温 培 养 箱 、 恒温 干燥 箱 等 恒温 设备 。 (2) 制冷 设备 主要 有 液 氮 饶 冷柜 、 电 冰箱 、 低 温 冰 箱 和 制冷 循环 和 泵 , 可 以 提供 速冻 、 冷 藏 或 降温 功能 。 (3) 粉碎 设备 干燥 的 固体 样品 可 用 粉碎 机 或 样品 磨 粉碎 , 果实 和 动 植物 组 织 等 含水 量 较 多 的 样品 可 用 组 织 的 碎 机 勾 浆 , 菌 体 很 小 又 有 细胞 壁 , 需 用 玻璃 匀 浆 器 、 细 菌 磨 或 超 声波 处 理 。 (4) 振荡 设备 液体 的 混 匀 可 采用 康 氏 (往复 式 ) 振 荡 机 、 回 旋 振 划 机 、 旋 涡 混 匀 器 或 小 型 电动 搅拌 器 等 , 菌 体 培养 .电泳 胶片 脱色 等 有 各 种 摇 床 可 供 选 用 。 (5) 离心 设备 从 悬浮 液 中 分 离 沉 省 或 从 溶液 中 分 离 生 物 高 分 子 需 采 用 离心 机 , 根据 转速 不 同 有 普通 离心 机 、 高 速 离心 机 和 超速 离心 机 。 (6) 压力 设备 实验 室 常 用 各 种 高 压气 体 钢 瓶 给 气相 色谱 仪 、. 氨 基 酸 自动 分 析 仪 及 超 滤 装置 等 提供 正 压 力 , 而 真空 泵 、 射 水 泵 、 循 环 水 泵 等 可 使 密闭 系统 获得 负 压 。 2. MH (1) &2FRE 1) 称 量 仪器 有 电子 顶 载 天 平和 电子 分 析 天 平 。 2) 光谱 仪器 有 可 见 光 分 光 光 度 计 (如 721 型 .722 型 ), 紫外 可 网 光 分 光 光 度 计 ( 如 751G 型 \UV- 120 型 ) 固定 波长 流动 比 色 计 ( 如 核酸 蛋白 检测 仪 )、 原 子 吸 收 分 光 光 度 计 和 荧光 分 光 光 度 计 。 3) 色谱 仪器 有 气相 色谱 仪 、 高 效 液 相 色谱 仪 . 常 压 液 相 色谱 仪 等 。 氨 基 酸 自动 分 析 仪 是 根据 离子 交换 层 析 原理 制 成 的 专用 液 相 色谱 仪 。 4) 电化 学 仪器 有 pH 计 、 离 子 计 等 。 5) 专用 电源 ”如 交流 稳 压 器 、 稳 压 电 泳 仪 、 稳 压 稳 流 电 泳 仪 三 恒 ( 恒 压 恒 流 恒 功 率 ) 电 泳 仪 等 。 ‘eee (2) 玻璃 仪器 1) 烧 器 、 加 热血 和 耐 高 温 高 压 玻璃 仪器 包括 烧杯 、 烧瓶 ` 凯 氏 烧 瓶 、 锥 形 烧 瓶 、 碘 值 烧 瓶 、 蒸 馏 烧 瓶 分 馏 烧 瓶 、 曲 颈 瓶 、 合 成 瓶 、 蒸 发 下 结晶 亚 、 培 养 下 表面 亚 、 压 力 管 水 面 计 、 宕 视 镜 、 培 养 瓶 等 。 2) 厚 壁 不 加 高 温 玻璃 仪器 包括 酒精 灯 `、 玻 璃 珠 \、 UR RIB RAE 硫酸 干燥 器 、 真 空 干燥 器 、 钟 四 水槽 、 标 本 币 、 研 钵 、 细 口 瓶 、 广 口 钴 、, 蒸 馏 水 瓶 、 抽 VER. FEE fe + J EL 3) 不 刻度 的 薄 壁 灯 工 玻璃 仪器 TR Re ike ee LE 融 点 测定 管 、 活 栓 玻 管 、 蛇 形 管 冷凝 管 、. 毛 化 钙 管 、 干 燥 管 、 采 气 瓶 .气体 洗 瓶 . 苛 性 钾 球 、 淡 气球 ` 淡 气 定量 器 \、 称 量 瓶 、 搅 拌 器 、 密 闭 水 银 杯 洗涤 瓶 、 普 通 滴 瓶 、 滴 瓶 、 漏斗 管 、 安 全 漏斗 滴 液 漏斗 分 液 漏斗 .氧化 瓶 . 旺 化 脂 测定 器 水 分 测定 器 、 分 子 质量 测定 器 \ 蒸 气 密 度 测定 管 、 沸 点 测定 器 \、 还 原 度 测定 器 、 砂 时 计 \ 水 银 蒸馏 器 水 银 减 压 计 、 碳 酸 测定 器 、 氮 素 测定 器 、 A HBL A A a. 气体 爆 发 器 .取样 器 吸收 管 、 滤 侍 器 .采集 管 .脂肪 抽出 器 、 快 速 提取 器 等 。 4) 量 器 包括 万 能 管 、 消 化 管 . 比 色 管 、 分 液 漏斗 (刻度 ) 量 筒 、 量 杯 、 容 量 瓶 、 黏度 计 用 瓶 、. 量 瓶 、 滴 征管 、 自 动 滴定 管 、. 吸 管 、 比 重 瓶 ,水泥 沉降 测定 器 吸引 器 等 。 5) 测定 仪器 包括 试管 (1327 试管 )、 氧 气 分 析 句 五 管 测 氮 计 、 氮 素 计 、 氨 基 酸 测定 器 、 氨 岩 分 解 测定 器 、 砷 素 测定 器 、 定 砷 器 、 含 砂 量 测 定 器 、 纤 维 黏度 测定 管 、 血液 测定 器 .血液 气体 测定 器 、 定 温 真 空 干燥 器 、 真 空 蒸 馏 器 、 低 温 真 空 精 馏 塔 、 精 密 分 馏 塔 等 。 6) 玻璃 转子 流量 计 和 差 压 式 气 体 流 量 计 。 7) 标准 玻璃 量 器 包括 标准 量 器 \ 标 准 补助 量 器 、 标 准 黏度 计 、 标 准 皂 膜 式 气 体 流量 计 等 。 8) MEM WA AER. REA WERK EHR. ER ERK We WM FEE UA BT BR AE RD AT a. UR DT BB. UR BR £8 PT 9) 微量 玻璃 仪器 。 通过 参观 实验 室 , 熟悉 环境 , 认识 实验 设备 和 仪器 , 为 今后 学 习 和 工作 芮 定 基础 。 实验 二 ”植物 试 材 水 分 出 定 和 干 样 制备 => Ed BEAR ARM AE PH DA ORR ea re at (Pie — To) AA. TEPER EB, 出 于 下 列 研 究 目的 ,经 常 要 作 植 物 材料 成 分 分 析 : 1) 环境 对 作物 的 影响 及 作物 对 环境 变化 的 反应 。 2) 土壤 营养 诊断 及 技术 措施 的 制定 。 3) 不 同 农 业 技 术 措 施 的 效应 。 - 63° 4) 作物 生长 AR ALES OTE 5) 不 同 物种 或 品种 (材料 ) 遗 传 特 性 比较 。 6) 特定 化 合 物 的 鉴别 、 提 取 。 7) 农药 残留 分 析 等 。 各 种 植物 材料 都 含有 水 分 ,但 不 同 材 料 水 分 含量 差异 很 大 。 在 用 鲜 样 进行 生 化 分 析 时 , 为 了 使 其 他 成 分 的 分 析 结 果 能 相互 比较 , 必须 首先 进行 水 分 测定 , 可 以 说 水 分 测定 是 生化 分 析 的 基础 。 当 待 测 样品 很 多 短 时 间 内 来 不 及 分 析 时 , 往往 要 把 植物 样品 干 制 保存 。 水 分 测定 中 最 常 使 用 的 加 热 干 燥 法 , 实际 上 也 是 鲜 样 干 制 的 方法 。 无 论 是 植物 材料 的 水 分 测定 ,还 是 其 他 成 分 的 分 析 , 都 只 能 用 少量 试 样 进行 。 从 群体 中 采集 少量 供 试 样品 , 必须 保证 所 采样 品 要 具有 代表 性 。 通过 本 试验 ,学 习 天 平 、 干燥 箱 、 样 品 磨 等 仪器 设备 的 使 用 , 了 解 植物 样品 的 采 集 , 掌握 水 分 含量 的 测定 和 干 样 制备 的 方法 。 =. Jn 植物 材料 水 分 测定 方法 很 多 , RRA BOAR, BRS AT RA 常 压 加 热 干燥 法 。 真 空 加 热 和 干燥 法 适用 于 受 高 温 易 变化 的 材料 , 其 做 法 是 将 一 定 鲜 重 的 待 测 样品 ,在 S$ 一 100mmHg 柱 D 400 ~100C 以 下 的 真空 干燥 箱 中 , 烘 至 恒 重 , 根据 失重 求 得 样品 的 水 分 含量 。 常 压 加 热 干 燥 法 , 准确 度 较 高 , 适用 于 不 含 易 热 解 和 易 挥 发 成 分 的 植物 样品 。 其 原理 是 将 一 定 鲜 重 的 植物 样品 ,在 105 高 FAS, BF 807 恒温 下 烘 至 恒 重 , 计算 植物 样品 的 含水 量 。 表 示 含 水 量 的 方 法 有 两 种 , 即 鲜 重 法 和 干 重 法 : 含水 量 ( 占 鲜 重 %) = “TEM x 100 (1) Sk (h F-H %) = = x 100 (2) 式 中 ， 内 一 鲜 重 (g); 太一 干 重 (g)。 Ee he 1) 电子 项 载 天 平 ( 感 量 0.001g) 2) 烘箱 1) mmHg 为 压强 单位 ,非法 定 。 法 定 压 强 单 位 为 Pa lmmHg=1.333 22 x 102Pa。 *。 64 + 3) 干燥 器 (内 有 干燥 剂 ) 4) 剪刀 5) 铝 盒 ( 直 径 46 mm, & 25 mm) 6) fF 7) 样品 磨 8) J AK (250ml) 四 、 操 作 步 又 1. 样品 的 采集 与 干 样 制备 (1) 植株 组 织 样品 的 采集 与 干 样 制备 植株 组 织 样品 的 采集 首先 要 选择 具有 代表 性 的 样 株 。 在 生长 均一 的 情况 下 ， 可 按 对 角 线 或 平行 的 直线 等 距离 采样 。 如 果 植 株 长 势 不 均匀 , 则 应 根据 生长 的 强 弱 ,; 按 比例 在 采样 区 内 多 点 采样 ,组 成 混合 样品 。 每 个 点 采取 的 植株 数 根据 植物 的 种 类 、 密 度 、 株 形 大 小 .生育 期 和 要 求 的 精度 而 定 。 植 株 过 大 或 过 小 、 受 病虫害 以 及 机 械 损伤 . 田 边 路 旁 的 植株 不 能 采集 。 如 果 为 了 某 一 特定 目的 (如 缺 素 症 诊断 等 )， 采样 时 应 注意 样 株 的 典型 性 , 同时 采取 附近 有 对 比 意义 的 正常 典型 植株 作为 对 照 。 样 株 选 定 后 , 还 要 选 定 取样 的 部 位 , 其 原理 是 所 选 组 织 器 官 要 有 最 大 的 代表 性 。 大 田 作物 苗 期 常用 整个 地 上 部 分 ;在 生殖 生长 期 通常 采取 主 茎 和 主 枝 上 部 新 长 成 的 健壮 功能 叶 。 植物 体内 的 许多 物质 处 在 不 断 的 转移 和 代谢 变化 过 程 中 , 在 不 同 的 生育 期 其 至 在 一 天 的 不 同时 间 其 含量 都 在 不 断 地 变化 。 因 此 , 分 期 采样 的 采样 时 间 应 规定 一 致 , 通常 是 在 上 午 8:00 一 10:00 时 采样 为 宜 , 此 时 植物 的 生理 活动 已 趋 活跃 , 根 系 吸收 作用 和 叶子 的 光合 作用 接近 稳定 状态 , 此 时 采样 最 具有 代表 性 。 测定 植物 易 起 变化 的 成 分 ( 硝 态 氨 、 氨 态 氨 .无 机 磷 、 可 溶性 糖 ` 维 生 素 . 有 机 酸 等 ) 须 用 新 鲜 样 品 。 测 定 不 易 变 化 的 成 分 可 用 干燥 样品 。 采 回 植物 样品 如 需要 分 不 同 器 官 (如 叶片 .叶鞘 .叶柄 ` 茎 和 果实 等 ) 测 定 , 须 立 即将 其 剪 开 , 以 免 养分 运输 转移 。 样 品 如 带 有 泥土 灰尘 等 , 需要 冲洗 干净 并 用 吸 水 纸 吸 干 表面 的 水 分 。 新 鲜 样品 必须 尽快 杀 死 , 以 减少 其 化 学 和 生物 变化 , 这 需要 足够 高 温度 ;但 烘 千 的 温度 又 不 能 过 高 , 以 防止 组 织 热 分 解 和 炭化 。 因 此 , 一 般 分 两 步 进行 : 先 将 鲜 祥 在 85~90T RF EEA FE 20 一 30 min, 以 杀 死 酶 , AIA ZE 60 ~ 80T HE 24 一 48 h, 除去 水 分 。 烘 干 的 样品 经 粉碎 \. 过 40 号 筛 (孔径 0.45 mm)、 充 分 混 匀 后 装 入 广 口 瓶 中 , 并 贴 上 标签 , 密封 保存 于 阴凉 干燥 处 。 (2) 籽粒 样品 的 采集 与 干 样 的 制备 籽粒 样品 一 般 用 于 品质 鉴定 , 可 分 为 下 列 几 种 情况 采集 :@ 采 自 个 别 植株 时 ， as 则 个 别 植 株 的 种 子 全 部 作 样 品 , 再 按 四 分 法 缩 为 平均 样品 , 重量 不 少 于 25¢; OX 自 实 验 区 或 大 田 时 , 可 按照 植株 组 织 样品 的 采集 方法 , 选 定 样 株 收 取 籽 粒 、 混 匀 , 用 四 分 法 缩 分 , 取得 约 25S0g 样品 ; OKA MAURY, 在 保证 样品 有 代表 性 的 原 则 下 , 可 在 散 堆 中 设 点 取样 ,或 从 包装 中 随机 插 取 样品 , 再 用 四 分 法 缩 分 至 500g A 右 。 样 品 经 风干 后 , 除去 杂质 和 不 完全 籽粒 , 粉碎 过 筛 , 贴 上 标签 贮 于 广 日 瓶 中 。 (3) 果实 样品 的 采集 与 干 样 的 制备 这 里 的 果实 样品 包括 各 种 果实 以 及 块根 块茎 等 。 一 般 在 主要 成 熟 期 采样 , 必 要 时 可 在 果实 的 生长 过 程 中 定期 采样 。 果 实 的 采样 要 选取 品种 特征 典型 的 样 株 才 能 比较 各 品种 的 品质 。 样 株 要 注意 挑选 树龄 、 株 型 、. 生 长势、 载 果 量 等 一 致 的 正常 株 , 老 、 幼 和 旺 长 的 植株 缺乏 代表 性 。 在 同一 果园 和 同一 品种 的 果树 中 约 选 3 一 5 株 (或 $ 一 10 株 浆果 作物 ) 为 代表 株 , 从 每 株 的 全 部 收获 物 中 选取 大 中、 小 和 向 阳 及 背 阳 的 果实 共 10~15 个 组 成 平均 样品 ,一 般 总 重量 不 少 于 1.5 kg。 果实 样品 分 析 通 常 都 要 用 新 鲜 样 品 。 采 回 的 样品 应 洗 净 、 控 和 干 。 大 的 果实 或 样 品 数 量 多 时 , 可 均匀 切取 其 中 一 部 分 ,但 要 使 所 取 部 分 中 各 种 组 织 的 比例 与 全 样品 的 相当 。 将 样品 切 成 小 块 , 用 高 速 组 织 的 碎 机 (或 研 钵 ) 打 成 匀 浆 ,多 点 匀 取 称 样 。 多 汗 的 样品 可 在 切 碎 后 用 纱布 挤 出 大 部 分 汁液 , 残渣 打 碎 后 再 与 半 液 混 匀 取 样 。 AF READ TAY, 必须 快速 干燥 , 以 保证 样品 成 分 不 变 。 将 果实 切 成 小 块 或 片 状 后 先 在 110 ~ 120 的 鼓 风 干 燥 箱 中 烘 20 一 30 min, 然后 在 60~ 70 HE BA He FZ 碎 为 止 。 最 后 将 干 样 粉碎 过 筛 , REF Oe. 2. 植物 样品 水 分 含量 测定 (1) 常 压 加 热 干 燥 法 将 铝 盒 置 于 110C 的 烘箱 中 烘 2h, 用 狠 子 取出 放 入 干燥 器 中 冷 至 室温 后 称 重 ， 如 此 反复 直至 恒 重 , 记录 铝 盒 重 ( ;)。 烘 箱 的 使 用 方法 参见 本 书 附录 十 六 (一 )。 将 采 回 的 新 鲜 植 物 样品 放 入 铝 盒 中 加 盖 称 重 (W;), 把 样品 放 入 预 热 至 105T 恒温 的 烘箱 中 打开 铝 盒 烘 20min, 然后 将 温度 降 至 80°C 恒温 继续 烘 千 2h, 打开 人 烘 箱 立 即 盖 上 盒 盖 , 取出 放 入 干燥 器 中 冷 至 室温 并 迅速 称 重 , 反 复 上 述 操作 直至 恒 重 (W3). r (2) AE AAP 真空 干燥 箱 由 密封 烘箱 ( 带 有 抽 气 管 和 进 气管 ) 真 空 泵 和 吸湿 系统 三 部 分 组 成 。 使 用 前 密封 烘箱 的 抽 气 管 先 与 抽 气 的 吸湿 系统 (防止 空气 中 的 水 分 进入 真空 R\IER, 再 接 通 真空 泵 。 进 气管 则 与 进 气 吸湿 系统 相连 接 ( 需 进 气 时 防止 空气 中 水 分 进入 密封 烘箱 内 )。 在 预先 烘 至 恒 重 的 铝 盒 ( 矶 !) 中 放 入 植物 样品 , HW.) 将 盒 盖 打开 放 六 已 预 热 (高 出 要 求 温度 SY ) 的 真空 干燥 箱 中 , 然后 起 动 真空 泵 抽 气 至 要 求 的 低压 (5 一 100 mmHg 柱 )。 在 最 初 阶段 由 于 样品 的 水 气 大 量 锡 出 而 凝结 在 箱 门 玻璃 上 ， ee 同时 仪器 本 身 难以 避免 的 缓慢 漏 气 , 箱 内 气压 会 渐 有 上 升 。 当 气压 计 所 示 气 压 上 升 到 150 mmHg 柱 时 , 即 须 再 行 抽 气 。 此 时 箱 内 空气 稀薄 ,水 分 蒸发 , 箱 内 温度 可 能 稍稍 低 于 要 求 的 温度 , 须 注 意 调节 温度 至 需要 的 范围 (40Y ~ 100). a, 先 关闭 真空 泵 与 吸湿 系统 连通 的 阀门 ,再 切断 电源 停止 抽 气 。 使 干燥 箱 内 保持 一 定 的 温度 与 低压 ; 约 经 5 h 后 , 小 心地 打开 进 气 活 塞 , 使 空气 缓慢 流入 , 至 箱 内 压力 与 大 气压 力 相 平衡 , 打开 箱 门 , 盖 好 盒 盖 , 移入 干燥 器 中 冷却 至 室温 称 重 , 反 复 以 上 操 作 直 至 恒 重 (W3)。 五 、 结 果 处 理 本 本 3 W.-W, 植物 的 含水 量 (% ) = AP, 丈 1! 一 铝 盒 的 恒 重 (g); 太一 鲜 样 及 铝 盒 的 重量 (g) ; 凡 3 一 干 样 及 铝 盒 的 重量 (g)。 1) 在 生化 分 析 中 测定 的 对 象 主要 是 有 机 物 , 因 此, 必须 考虑 其 热 稳定 性 问题 ， 对 受热 易 分 解 或 易 挥发 的 材料 如 油料 种 子 应 在 40 ~ 70°C AF FET. 2) 天 平 与 被 称 量 物 之 间 如 有 温度 差 会 影响 称 量 结果 。 因 此 , 每 次 烘 干 后 需 将 盖 上 盖子 的 铝 盒 放 入 干燥 器 中 冷却 (一 般 至 少 需要 放置 30min) 后 才能 称 重 。 3) 烘箱 内 一 次 放 入 的 样品 不 能 过 多 , 靠近 箱 体 的 边 角 及 下 层 不 能 放置 样品 。 4) 干燥 器 内 分 上 下 两 层 ,中 间 用 带 大 和 孔 的 瓷 板 隔 开 , 下 层 放置 干燥 剂 ( 如 无 水 毛 化 钙 、 变 色 硅 胶 等 ), 上 层 放样 品 等 。 干 燥 剂 应 占 干 燥 器 底部 容积 的 1/3 一 1/2。 干燥 剂 需 经 常 干燥 再 生 后 使 用 。 七 、 思 考题 1. 以 植物 叶片 为 实验 材料 时 , 应 如 何 采 集 ? 2. 测量 植物 材料 水 分 含量 时 , 应 如 何 选择 测定 方法 ? 参考 文献 劳 家 树 主 编 .土壤 农 化 分 析 手 册 .北京 :农业 出 版 社 , 1988 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 实验 三 ”高 等 植物 材料 丙酮 粉 的 制备 x 100 ree epi 了 解 制备 植物 丙酮 粉 的 基本 原理 , 学 习 用 植物 材料 进行 核酸 提取 的 一 种 前 处 . 67 . ETT. —. Ae 植物 材料 经 适当 的 预 处 理 后 可 制 成 丙酮 粉 。 制 备 丙 酮 粉 时 , POA LBZ 醚 \ 丙 酮 等 有 机 溶剂 , 在 低温 条 件 下 操作 , 逐步 达到 脱水 、 脱 色 、 脱 脂 、 抑 制 酶 活性 的 目的 。 丙 酮 粉 在 密闭 容器 中 或 冷冻 条 件 下 可 保存 较 长 时 间 。 当 我 们 从 植物 材料 中 提取 核酸 时 , 可 采用 上 述 的 预 处 理 方法 ,让 核 蛋 自 以 沉 演 形式 与 植物 残渣 一 起 先 成 为 有 一 定 防腐 能 力 的 丙酮 粉 ,为 下 一 步 的 提取 和 纯化 工 作 提 供 方便 。 本 实验 以 植物 种 子 的 芽 为 材料 , 因为 种 子 萌发 时 期 为 细胞 核 分 裂 旺盛 期 。 此 时 , 纤维 素 较 少 , 细胞 壁 容易 破裂 ,色素 等 杂质 的 干扰 较 小 , 提取 核酸 收 率 较 高 。 三 、 仪 器 、 试剂 和 材料 1. 仪器 1) 恒温 培养 箱 2) ee 3) 冰箱 4) BER 5) 布 氏 漏斗 抽 滤 装置 6) Be 7) 50ml 量 简 8) 30ml 广 口试 剂 瓶 9) 滴 管 10) 天 下 2. 试剂 1) 10% KARE 2) 95% 乙醇 3) 乙醚 4) 丙酮 3. 材料 植物 种 子 DO. FEVER 1. 取 植 物种 子 适量 , PRE BOK, TE 10% AIR A IIE 2 一 3 h, 再 用 清水 * 68 - 漂洗 数 次 , Bath PT, HA AY PEP, 30 ~ 35°C 避 光 培养 二 天 。 培 养 期 间 常 酒 点 蒸馏 水 , 待 芽 长 0.1~1.0 cm 时 ,取出 ,去 种 子 壳 , 称 重 。 2. 每 组 取 芽 3g ZA, 放 入 冰 浴 的 研 钵 中 , MAG HY 0.01~0.02 g.10ml fil 冷 的 95% 的 乙醇 ,研磨 匀 浆 ,再 加 入 10ml CB, RA. 3. 加 入 10 一 20ml 预 冷 的 乙醚 , 混 匀 , 转 入 通风 橱 内 冰 浴 静 置 30min。 4. 用 滴 管 吸 去 上 清 液 ,加 入 30ml HY AB, ft, 静 置 10min, 转 入 布 氏 漏 斗 抽 滤 。 5. 用 玻璃 棒 挑 碎 滤 饼 , 再 用 20ml 丙酮 淋 洗 研 钵 和 滤 饼 , TH, BS Pel 6. 将 干净 的 广 口试 剂 瓶 贴标签 , 称 空 重 后 , 再 将 挥发 尺 丙 酮 的 丙酮 粉 转移 至 瓶 中 , 称 总 重量 , 丙酮 粉 置 低温 干燥 处 贮存 备用 。 五 、 结 果 处 理 外 Wh HB KR em RA & 六 、 思 考题 1. 实验 中 采用 了 哪些 有 机 溶剂 ? 各 起 何 作 用 ? 2. 实验 中 为 何 需 要 用 预 冷 的 有 机 溶剂 ? 参考 文献 谭 魁 刨 , 张 瑞 良 .小 牛 胸腺 丙酮 粉 的 制备 及 DNA 的 提取 .镇 江 医学 院 学 报 ,1994,4(2) :89 一 90 实验 四 缓冲 溶液 的 配制 和 氨基 酸 两 性 性 测定 — {AB 细胞 是 生物 的 基本 结构 单位 。 在 细胞 内 进行 着 各 种 各 样 的 生物 化 学 反应 , 这 些 反应 是 在 各 种 酶 的 催化 作用 下 完成 的 。 酶 的 活性 受 环境 pH 的 影响 极为 显著 。 通常 各 种 酶 只 有 在 一 定 的 pH 范围 内 才 表现 它 的 活性 。 在 进行 细胞 或 组 织 培养 ， 在 体外 研究 各 种 生物 化 学 反应 时 , 广泛 使 用 各 种 缓冲 溶液 。 通 过 本 试验 , 了 解 缓冲 溶液 的 作用 及 缓冲 原理 ,学 习 缓 冲 溶液 的 设计 配制 及 酸度 计 的 使 用 方法 。 观 察 验 69 - 证 甘氨酸 的 两 性 性 和 缓冲 作用 。 | 能 抵抗 一 定量 酸 或 碱 的 影响 , 而 保持 溶液 pH 值 基本 不 变 的 溶液 称 为 缓冲 液 。 缓冲 液 一 般 是 由 弱酸 或 弱 碱 与 它 的 盐 组 成 。 如 乙酸 和 乙酸 钠 组 成 乙酸 缓冲 液 、 硼 酸 和 硼砂 组 成 融 酸 缓冲 液 等 。 缓 冲 液 可 分 为 一 般 缓 冲 液 (或 通用 缓冲 液 ) 和 标准 组 冲 液 两 类 。 标 准 缓冲 液 pH 值 是 一 定 的 (与 温度 有 关 ), 叫做 pH 标准 液 , 当 用 酸度 计 测 量 溶液 的 pH 值 时 , 就 要 用 pH 标准 液 来 校正 仪器 。 一 般 缓 冲 液 的 pH 值 可 用 下 式 计 算 : pH=pKw 一 PKb+1lg 8 (适用 于 碱 型 缓冲 液 ) pH= pK, tle (适用 于 酸 型 缓冲 液 ) 式 中 的 C.. Cy. C, BAIA 55 RR, 55 DEE AY EE (mol/L); K,. Ky, 分 别 为 弱酸 、 弱 碱 的 电离 常数 ; Kw 为 水 的 离子 积 。 当 温度 一 定时 , pK,(K% pK, A-HM ANWR 冲 液 pH 值 就 随 着 盐 和 酸 ( 或 碱 ) 的 浓度 比值 而 变化 。 如 果 制 备 缓冲 液 时 所 用 的 盐 和 酸 的 浓度 相同 , 则 配制 时 所 取 盐 和 酸 的 溶液 的 体积 比 就 等 于 它们 的 浓度 比 , 故 上 AAS A pH= pK, + lg in Tay i, Be ae Eb A RA HS SE FY YS Te) EC i a aT 7 EI ANT] pH 值 的 缓冲 液 。 如 加 水 稀释 , 其 盐 和 酸 的 浓度 都 以 相同 比例 降低 , 比值 不 变 , 因此 适量 稀释 不 影响 缓冲 液 的 pH 值 。 缓冲 液 能 抵抗 一 定量 酸 或 碱 的 作用 称 缓冲 作用 ,缓冲 作用 的 大 小 称 为 缓冲 能 力 或 缓冲 容量 (8), 可 定义 为 每 升 缓冲 液 改 变 一 单位 pH 值 所 需 加 入 强 碱 或 强酸 的 量 (摩尔 数 )。 p= Ape 一 种 特殊 的 酸 和 它 相 配对 的 碱 在 它们 的 浓度 相等 ( 即 pH 值 等 于 酸 的 pK。) 时 , 缓冲 能 力 最 大 。 缓 冲 能 力 除 与 其 共 斩 碱 对 的 比率 有 关外 , 还 与 总 浓度 有 关 , 总 浓度 越 大 , 缓冲 能 力 越 强 , 一 般 缓 冲 液 浓度 在 0.05~0.2 mol/L, pH=pK,+1% 范围 内 具有 满意 的 缓冲 能 力 。 a- 氢 基 酸 是 一 类 两 性 物质 , 既 可 以 和 酸 作 用 , 又 可 以 和 碱 作用 , 对 酸 、 碱 的 加 入 具有 一 定 的 缓冲 能 力 。 通 过 甘氨酸 的 酸 、 碱 滴定 及 测量 不 同 浓度 的 酸 、 碱 条 件 下 甘氨酸 溶液 的 pH, 绘 出 一 条 滴定 曲线 , 从 中 可 以 看 到 这 种 变化 。 - 70 ， = (Wa Rah A BY 1. 仪器 (1) 酸度 计 (2) 碱 式 滴定 管 (3) RE 1mlx2，2mlx3，S$mlX2，10mlXx2 (4) 试管 1S$mlx8 (5) AHH ”100mlx2 (6) 三 角 瓶 SOml x2 (7) BEAR 100ml x2, 50ml x 15 2. 试剂 (1) 0.01mol/L NaOH (2) 0.01mol/L HCl (3) 0.1% FAIRE Eh RAK (4) NazHPO4 :2H2O( 化 学 纯 )v (5) KHzPO4( 化 学 纯 ) v (6) 0.1mol/L 甘氨酸 溶液 (7) 0.1mol/L HCl (8) 0.1mol/L NaOH 四 、 操 作 步 双 1. 磷酸 缓冲 液 的 配制 及 pH 值 的 测定 (1) FX KH,OP, 13.61g 于 100ml 的 烧杯 中 加 S0ml 蒸馏 水 搅拌 溶解 后 , 转移 到 100ml 容量 瓶 中 ,用 少量 蒸馏 水 洗 烧 杯 3 次 并 转移 到 容量 瓶 中 , 定 容 到 100ml, 为 0.1mol/L KH,PO,. (2) 称 取 NazHPO4 :2H2O 17.81lg, 按 (1) 的 方法 溶解 定 容 到 另 1 只 100ml 容量 瓶 中 , 4 0.1mol/L NazHPO4。 (3) 取 三 支 试管 编号 , 按 下 表 加 入 试剂 配制 不 同 pH 值 的 缓冲 液 。 试管 号 试剂 (ml) 1 2 3 0.1 mol/L KH2PO， 8 5 2 0.1 mol/L NagHPO, 2 5 8 sn Ft 。 混 匀 后 用 酸度 计 测 定 三 种 缓冲 液 的 pH 值 [酸度 计 使 用 方法 参见 本 书 附 录 十 六 (十 )、( 十 一 )]。 按 公式 计算 所 得 值 是 否 与 测定 值 相 符 (KHzPO4 的 pK,=6.81). 2. 稀释 对 缓冲 液 pH 值 的 影响 取 2 支 试管 编号 , 按 下 表 加 入 试剂 。 nh & F 试剂 (ml) 4 5 2 号 试管 缓冲 液 4 2 蒸 饮 水 0 2 混 匀 后 分 别 在 各 管 中 加 入 1 滴 廊 香草 酚 蓝 指示 剂 , 比较 两 管 溶液 的 颜色 , 并 用 酸度 计 测 定 4.5 号 管 的 pH 值 , 解释 之 。 3. 缓冲 能 力 的 测定 取 4 个 50ml 三 角 瓶 编号 ,给 1、2 SH BNA 0.01 mol/L 的 KH,PO, 和 0.01mol/L 的 NazaHPO, 各 50ml( 将 0.1molL 的 溶液 稀释 10 倍 ),3、4 号 瓶 分 别 加 A. 0.1mol/L 的 KEH2PO: #1 0.1mol/L 的 NazHPO4 各 $ml, 混 匀 后 各 加 1L 滴 廊 香 草 酚 蓝 指 示 剂 , 1.3 号 三 角 瓶 为 对 照 ,2、4 5 = AA 0.01mol/L 的 NaOH 滴定 , 至 溶液 刚 改 变 颜 色 为 止 ,记录 滴定 的 NaOH 用 量 并 用 pH 计 测 定 滴定 后 2、4 号 瓶 的 pH 值 ,计算 并 比较 它们 的 缓冲 能 力 。 4. 测定 甘氨酸 的 滴定 曲线 取 50ml 烧杯 15 个 , 编号 , 按 下 表 数 据 加 入 试剂 , 充分 摇 匀 后 分 别 测定 bDH 值 。 pufz[a[4]s[o]7]e]9 [wo] i | [13] 14 | 1s ia aM [5.0 |5.0[5.0|5.0/3.0[5.0].0|5.0].0]5.0]5.9].0[s.0[s0] 5.0 cami nel tad [00[0.s|s.0[20]2.5]3.0[«a]s0| -|-|-|-|-[- ET 加 看 面 回 男 面 四 加 四 古 西国 四 西区 aK cod _ [saa sha ofa. aha. shaf-af.ae. sah.) ah.oho.0 五 、 结 果 处 理 (1) 缓冲 液 pH 值 的 计算 : pH=pK, + Ig = - 7% (2) 缓冲 能 力 的 计算 : _ db PE aD (3) 以 pH HAA ER, LA HCl 和 NaOH 的 ml MARA, 绘 出 甘氨酸 的 酸 碱 滴定 曲线 。 六 、 思 考题 1. 试 述 缓冲 溶液 的 作用 及 决定 缓冲 能 力 大 小 的 因素 。 2. 在 实际 应 用 中 如 何 正确 选用 和 配制 符合 要 求 的 缓冲 液 ? 3. 在 甘氨酸 的 酸 碱 滴定 曲线 上 , 哪些 部 分 代表 缓冲 区 域 ? 何 处 为 等 电 点 ? 参考 文献 董 维 宪 编 .化 学 分 析 法 基础 (上 册 ) .北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1982 南京 中 医学 院 主 编 . 生 物化 学 实验 .南宁 :广西 科学 技术 出 版 社 ,1989 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 实验 五 ”分 光 光 度 计 线性 分 辨 范围 出 定 = sale EY 比 色 法 是 常用 的 生化 分 析 方 法 。 仪 器 简单 , 价格 便宜 , 操作 方便 。 有 分 光 光 度 计 的 实验 室 , 可 以 很 方便 地 完成 多 种 生物 物质 的 定量 分 析 。 比 色 法 的 理论 基础 是 朗 伯 -比尔 吸收 定律 , 它 的 使 用 要 求 在 分 光 光 度 计 线 性 分 辨 范围 之 内 , 否则 将 使 结 果 出 现 较 大 的 误差 , 这 一 点 恰恰 是 容易 被 忽视 的 。 通 过 对 一 人 台 分 光 光 度 计 线 性 分 辨 范围 的 测定 , 加 深 对 比 色 法 的 理解 , 对 今后 的 科学 研究 也 将 是 十 分 有 益 的 。 =. JR 在 用 紫外 -可 见 分 光 光 度 计 进行 某 种 物质 溶液 的 吸收 光谱 测定 之 前 , 先 将 光源 灯 发 射 的 连续 光谱 分 光 获 得 一 定 波 长 的 单 色 光 , 然后 测定 单 色 光 透 过 溶液 的 吸光 度 , 所 以 比 色 法 也 称 为 分 光 光 度 法 。 当 一 柬 平 行 的 单 色 光照 射 到 一 定 浓度 的 均匀 溶液 时 ,入射 光 被 溶液 吸收 的 程 度 与 溶液 厚度 的 关系 为 Ig p= bb 这 就 是 朗 伯 (S.H. Lambert) 定 律 。 式 中 , To 为 入 射 光 强度 , Ip 为 透射 光 强 度 , 5 为 溶液 厚度 ,& 为 常数 。 当 入 射 光 通过 同一 溶液 的 不 同 浓度 时 , 入 射 光 与 溶液 浓度 的 关系 为 . 73 . lg ee =kC 这 就 是 比尔 (Beer) 定 律 。 式 中 , C 为 溶液 浓度 , k 为 另 一 常数 。 当 溶 液 厚度 和 浓度 (通常 为 稀 溶 液 ) 都 可 改变 时 , 这 时 就 要 考虑 厚度 和 浓度 两 者 的 变化 同时 对 透射 光 的 影响 , 则 有 I A=lg 7° =lg 7 = ebC 这 就 是 在 分 光 光 度 测 定 中 常用 的 朗 伯 -比尔 定律 。 该 定律 表示 入 射 光 通 过 溶液 时 ， 透射 光 与 该 溶液 的 浓度 和 厚度 的 关系 。 式 中 , A 为 吸光 度 , 工 为 透 光 率 T= 严 ,以 % 表 示 ,e 为 摩尔 吸收 系数 。 如 果 溶 液 浓度 以 mol/L 表示 ,溶液 厚度 以 cm 表示 ,e 单位 为 L/(mol'cm)。e 愈 大 , 表示 溶液 对 单 色 光 的 吸收 能 力 愈 强 ， 根据 朗 伯 -比尔 定律 ,吸光 度 与 溶液 浓度 应 是 通过 原点 的 线性 关系 (溶液 厚度 一 定 ), 但 在 实际 工作 中 吸光 度 与 溶液 浓度 之 间 和 常常 偏离 线性 关系 , 产生 偏离 的 主 要 因素 有 : (1) 样 品 溶液 因素 。 朗 伯 - 比 尔 定 律 通常 只 在 稀 溶 液 时 才能 成 立 , 这 是 由 于 随 着 溶液 浓度 增 大 , 吸光 质点 间距 缩小 , 彼此 间 相 互 影响 和 相互 作用 加 强 , 破坏 了 吸 光度 与 浓度 之 间 的 线性 关系 。 (2) 仪 器 因素 。 朗 伯 - 比 尔 定律 只 适用 于 单 色 光 , 但 经 仪器 狭 缝 投射 到 被 测 溶 液 的 光 , 并 不 能 保证 理论 要 求 的 单 色 光 , 这 也 是 造成 偏离 朗 伯 -比尔 定律 的 一 个 重 要 因素 。 在 仪器 确定 的 情况 下 , 着 重 考察 溶液 浓度 变化 对 吸光 度 线性 的 影响 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 紫外 -可 见 分 光 光 度 计 工人 台 (2) 试管 6 文 (3) 试管 架 工 个 (4) AK 100ml 2 个 (5) 烧杯 100ml 1 个 (6) ME O.1ml 1X, Sml 2 支 (7) 玻璃 棒 1 根 2. 试剂 牛 血 清白 蛋白 溶液 (Img/ml) : 称 取 牛 血清 白 蛋白 (BSA)100mg, 水 溶 后 定 容 至 . 74 e 100ml. 四 、 操 作 步 又 1. 样品 稀释 取 100ml 容量 瓶 1 只 , 准确 加 入 0.1ml 浓度 为 1mg/ml 的 牛 血清 日 蛋 白 溶液 ， 加 水 稀释 至 刻度 , 为 1 ng/ml 牛 血清 日 蛋 日 稀释 液 。 2. 取 试 管 6 支 编号 1->6。 顺 次 分 别 加 入 1 pg/ml 牛 血 清白 蛋白 稀释 液 0、0.5、1.0、1.5、 2.0, 2.5ml, 各 管 分 别 加 去 离子 水 $5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5 ml 补足 至 5.0ml。 播 匀 。 各 管 分 别 含 牛 血清 白 蛋白 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 pg. 3. ke 波长 280 nm, 以 第 1 管 溶液 调 零 , 比 色 。 记 录 2-6 管 各 管 吸 光度 。 五 、 结 果 处 理 在 坐标 纸 上 以 牛 血 清白 蛋白 含量 (ng ) 为 横 座 标 , 以 相应 各 管 吸 光度 为 纵 座 标 ， 绘制 分 光 光 度 计 线性 分 辨 范围 曲线 。 六 、 注 意 事项 (1) 溶解 牛 血清 白 蛋白 时 不 可 剧烈 搅拌 , 避免 产生 泡沫 。 (2) 分 光 光 度 计 用 气 灯 , 比 色 时 用 石英 杯 。 七 、 思 考题 1. 适 于 光谱 分 析 的 溶剂 应 具备 哪些 性 质 ? 2. 在 用 分 光 光 度 计 做 比 色 测 定时 , 如 何 选择 波长 和 狭 缝 ? 3. 为 减少 比 色 的 相对 误差 ,吸光 度 应 控制 在 什么 范围 ? ms Js 第 二 单元 ”基本 实验 实验 六 BHAA ety 2 i 酶 是 生物 催化 剂 ,是 具有 催化 功能 的 蛋白 质 , 生物 体内 的 化 学 反应 基本 上 都 是 在 酶 催化 下 进行 的 。 通 过 本 实验 了 解 酶 催化 的 高 效 性 、 特 异性 以 及 pH tk BE Hl 剂 和 激活 剂 对 酶 活力 的 影响 , 对 于 进一步 掌握 代谢 反应 及 其 调控 机 理 具有 十 分 重 要 的 意义 。 =. RR 过 氧化 氢 酶 广泛 分 布 于 生物 体内 , 能 将 代谢 中 产生 的 有 害 的 HzO; 分 解 成 HzO 和 Op, 使 H,O, 不 致 在 体内 大 量 积累 。 其 催化 效率 比 无 机 催化 剂 铁 粉 高 10 个 数量 级 ,反应 速率 可 观察 On 产生 情况 。 酶 与 一 般 催化 剂 最 主要 的 区 别 之 一 是 酶 具有 高 度 的 特异 ( 专 一 ) 性 , 即 一 种 酶 只 能 对 一 种 或 一 类 化 合 物 起 催化 作用 。 例 如 , 淀粉 酶 和 蔗糖 酶 虽然 都 催化 糖苷 键 的 水 解 , 但 是 淀粉 酶 只 对 演 粉 起 作用 , 芒 糖 酶 只 水 解 芒 糖 。 还 原 糖 产物 可 用 本 乃 狄 试剂 鉴定 。 通过 比较 淀粉 酶 在 不 同 pH 不 同 温 度 以 及 有 无 抑制 剂 或 激活 剂 时 水 解 淀粉 的 差异 ,说明 这 些 环境 因素 与 酶 活性 的 关系 。 三 、 仪 句 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 恒温 水 浴 (37Y7 , 70T ) BRAK (100T ) KYA (OT ) (2) 试管 18x180 共 19 支 (3) MAF Iml 7 XX, 2ml 3 KM. SmI 5 支 (4) 量 简 100ml 1 个 (5) Ath (6) 胶 头 滴 管 3 支 2. 试剂 (1) Fe 粉 - 76° (2) 2% H,O,( FA AY HR Ac ) (3) WEYL TE BRA : oA RR KK, FES 110ml 左右 蒸馏 水 , BRD, 数 分 钟 后 吐出 收集 在 烧杯 中 , 用 数 层 纱布 或 棉花 过 滤 , BN vt AD BY ea Eh HK, 根据 酶 活 高 低 稀 释 50 ~ 100 倍 , 即 为 唾液 淀粉 酶 溶液 。 (4) 蔗糖 酶 溶液 : 取 1g 鲜 酵 母 或 干 酵母 放 入 研 钵 中 , 加 入 少量 石英 砂 和 水 研 磨 ,加 SOml 蒸馏 水 , 静 置 片刻 , 过 滤 即 得 。 (5) 2% 芒 糖 溶液 :用 分 析 纯 蔗糖 新 鲜 配 制 。 (6) 1% 淀粉 溶液 :1g 淀粉 和 0.3g NaCl, 用 Sml 蒸馏水 悬浮 , 慢 慢 倒 入 60ml 煮沸 的 蒸馏 水 中 , 煮沸 1min, 冷却 至 室温 , 加 水 到 100ml, 冰箱 贮存 。 (7) 0.1% 淀 粉 溶液 :0.1g 淀粉 ,以 Sml 水 悬浮 , 慢 慢 倒 入 60ml 煮沸 的 蒸馏 水 中 , AM 1min, 冷却 至 室温 , 加 水 到 100ml, 冰箱 贮存 。 (8) 本 乃 狄 (Benedict) 试 剂 :17.3g CuSO, .5HO, 加 100ml 蒸馏水 加 热 溶 解 ， 冷却 ;173g 柠檬 酸 钠 和 100g Na.CO3;*2H,0, 以 600ml 蒸馏 水 加 热 溶 解 ,冷却 后 将 CuSO, 溶液 慢 慢 加 到 柠檬 酸 钠 -碳酸 钠 溶 液 中 , WINS, 最 后 定 容 至 1000ml。 如 有 沉淀 可 过 滤 除 去 ,此 试剂 可 长 期 保存 。 (9) BUR :3g KI 溶 于 Sml 蒸馏 水 中 , 加 lg D ,溶解 后 再 加 29$Sml 水 , 混 匀 贮存 于 棕色 瓶 中 。 (10) 磷酸 缓冲 液 : A 液 :0.2 mol/L Na,HPO, 称 取 28.40g NazHPO,( 或 71.64g NazHPO;.12HO) 溶 于 1000ml 水 中 。 B 液 : 0.1mol/L 柠檬 酸 称 取 21.01g 柠檬 酸 (CeHsO7'HzO) 溶 于 1000ml 水 中 。 pH5.0 缓冲 液 : 10.30ml A 液 +9.70mlB 液 pH7.0 缓冲 液 : 16.47ml A 液 13.53mlB 液 pH8.0 缓冲 液 : 19.45ml A 液 10.55SmlB 液 (11) 1% CuSO4 :5H2O 溶液 。 (12) 1% NaCl 溶液 。 3. 材料 $3029 0.5 cm 的 马铃薯 方 块 ( 生 、 熟 )。 PO. FRIEZE RR 1. 酶 催化 的 高 效 性 取 4 支 试管 , 按 下 表 操 作 : ‘a: 操作 项 目 2% HzOz(ml) 生 马 铃 薯 小 块 ( 块 ) 熟 马铃薯 小 块 ( 块 ) 铁 粉 现 R 解释 实验 现象 2. 酶 催化 的 专 一 性 一 有 Os) & 取 6 支 干净 试管 , 按 下 表 操作 : 操作 项 目 1% 淀 粉 (ml) 1 2% FEE (ml) 0 唾液 淀粉 酶 原液 (ml) 1 蔗糖 酶 溶液 (ml) 0 蒸馏 水 (ml) 0 酶 促 水 解 本 乃 狄 试 剂 (ml) 2 反 应 现 象 解释 实验 现象 3. 温度 对 酶 活力 的 影响 取 3 支 试管 , 按 下 表 操 作 : 操作 项 目 唾液 淀粉 酶 溶液 (ml) pH7.0 磷酸 缓冲 液 (ml) 温度 预 处 理 Smin 1% 淀粉 溶 液 (ml) wre ° o;Ni Oo ;]WwWIN 0 摇 匀 ,37 尼 水 浴 中 保温 10min 2 摇 匀 ,沸水 浴 中 加 热 5 一 10min mR 0 2 o;o ;}o;w] & 465), 保持 各 自 温度 继续 反应 , BT Ps BEE ot A 2 号 管 吸取 1 滴 反 应 液 于 白 瓷 板 上 , 用 碘 液 检查 反应 进行 情况 , 直至 反应 液 不 再 变色 (只 有 碘 液 的 颜 色 ), 立 即 取出 所 有 试管 ,流水 冷却 2min, 各 加 !1 HM, 混 匀 。 观 察 并 记录 各 管 反 应 现象 , 解释 之 。 4. pH 对 酶 活力 的 影响 取 3 支 试管 , 按 下 表 操 作 : 操作 项 目 pH5 .0 磷酸 缓冲 液 (ml) pH7.0 磷酸 缓冲 液 (ml) pH8.0 磷酸 缓冲 液 (ml) 1% 淀 粉 溶液 (ml) 1 1 1 预 保温 混 匀 ,37 水 浴 中 保温 2min 唾液 淀粉 酶 溶液 (ml) 1 1 1 摇 匀 , 置 37 立 水 浴 中 继续 反应 , 每 隔 半分 钟 从 第 2 号 管 中 取 检查 淀粉 水 解 程度 出 工 滴 反应 液 于 白 瓷 板 上 , 加 碘 液 检查 反应 情况 , 直至 反应 液 不 再 变色 , 即 可 停止 反应 , 取出 所 有 试管 。 BOK (78) 1 1 1 现 R 解释 实验 现象 “- Oo |S {so © lbw TS Pw wo LS to ww 5. 酶 的 抑制 与 激活 操作 项 目 1% NaCl (ml) he 0 1% CuSO,(ml) 0 1 A 7K (ml) 0 0 1 唾液 淀粉 酶 溶液 (ml) 1 1 1 0.1% 淀 粉 溶液 (ml) 3 3 3 #25),370 KRM 1min 左右 即 可 用 碘 液 检查 1 号 试管 淀粉 水 解 程度 , 待 1 号 试管 的 反应 液 不 再 变色 时 取出 所 有 试管 。 碘 液 ( 滴 ) 1 1 1 现 象 解释 实验 现象 Qo | & | @ 保温 反应 并 检查 淀粉 水 解 程度 *。 79 - 五 、 注 意 事 项 (1) 各 人 唾液 中 演 粉 酶 活力 不 同 ,因此 实验 3.4、5 应 随时 检查 反应 进行 情况 。 “如 反应 进行 太 快 ,应 适当 稀释 唾液 ;反之 , 则 应 减少 唾液 淀粉 酶 稀释 倍数 。 (2) 酶 的 抑制 与 激活 最 好 用 经 透析 的 唾液 , 因为 唾液 中 含有 少量 Cl 。 另 外 ， 注意 不 要 在 检查 反应 程度 时 使 各 管 溶液 混杂 。 FRR 思考 题 1. 何谓 酶 的 最 适 pH 和 最 适 温度 ? 2. 说 明确 物 浓 度 酶 浓度 温度 和 pH 对 酶 促 反应 速度 的 影响 。 3. 酶 作为 一 种 生物 催化 剂 , 有 那些 催化 特点 ? 参考 文献 文 树 基 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 实验 七 “转氨酶 活性 鉴定 ( 薄 层 层 析 法 ) —, BW | 氨基 酸 是 组 成 蛋白 质 的 基本 结构 单元 , 构成 蛋白 质 的 站 -ua- 氨 基 酸 共有 20 种 。 其 中 丙 氨 酸 族 、 丝 氨 酸 族 、 天 冬 氢 酸 族 等 12 种 氨基 酸 是 通过 转 氨 基 作用 合成 的 。 催 化 转 氨 基 作用 的 酶 叫 转氨酶 , 植物 体内 转氨酶 种 类 很 多 , 在 氮 代 谢 中 具有 重 要 作用 ,有 3 类 转氨酶 即 谷 - 丙 转氨酶 、 谷 - 乙 ( 乙 醛 酸 ) 转 氨 酶 、 谷 - 草 转氨酶 活性 最 高 。 转 氨基 作用 除了 是 合成 氨基 酸 的 重要 途径 , 经 过 它 沟 通 了 生物 体内 和 蛋 白 质 、 碳 水 化 合 物 、 脂 类 等 代谢 , 是 一 类 极为 重要 的 生化 反应 。 通过 本 实验 初步 认识 转 氨 基 作用 ,学习 并 掌握 菏 层 层 析 的 原理 和 操作 方法 。 这 一 技术 在 生化 物质 的 分 离 \ 鉴定、 纯化 制备 等 方面 有 着 广泛 的 应 用 。 —. JR 转氨酶 在 磷酸 吡 哆 醛 ( 醇 或 胺 ) 的 参与 下 , 把 oe -氨基 酸 上 的 氨基 转移 到 oe — 酸 的 酮 基 位 置 上 , 生成 一 种 新 的 酮 酸 和 一 种 新 的 v -氨基 酸 。 新 生成 的 氨基 酸 种 类 可 用 薄 层 层 析 法 鉴定 。 以 谷 - 丙 转 氨 酶 为 例 , 其 可 逆反 应 用 下 式 表示 : AM + ot Rom AEA. 丙酮 酸 + 谷 氨 酸 > 80 - = AEE ik Hh A TB _ 工 . 仪器 (1) 离心 机 、 离 心 管 (2) 吹风 机 (3) 恒温 培养 箱 (4) 烘箱 (5) 玻璃 板 (8x 15cm) (6) BT gL (7) 培养 四 (直径 10cm) (8) WES at (9) 玻璃 棒 及 滴 管 (10) AREAS R (11) 研 钵 (12) HF 3X (13) RE 0.5ml 3 X, 2ml 1 X 2. 试剂 (1) 0.1mol/L AAR (2) 0.1mol/L a - 酮 戊 二 酸 ( 用 NaOH 中 和 至 pH7.0) (3) 含有 0.4molL ERE 0.1mol/L pH8.0 的 磷酸 缓冲 液 (4) pH7.5 的 磷酸 缓冲 液 (5) 正 丁 醇 (6) 乙酸 (7) 0.1mol/L FAR (8) 0.25% Ef — Biel A Ba A HK 3. 材料 RF2~3 日 的 绿豆 芽 DY. BRIER 1. 酶 液 的 制备 取 3g(25Y ) 萌 发 3 天 的 绿豆 芽 ( 去 皮 ), 放 入 研 钵 中 加 2ml pH8.0 磷酸 缓冲 液 研 成 匀 浆 , 转 入 离心 管 。 研 钵 用 lml 缓冲 液 冲洗 ,并 入 离心 管 , 离心 (3000r min, 10min), 取 上 清 液 备用 。 . 81 四 2. 酶 促 反 应 取 三 个 干 试管 编号 , 按 下 表 分 别 加 入 试剂 和 酶 液 。 in 管 号 试剂 (ml) 1 2 3 0.1 mol/L af K—R 0.5 0.5 ma, 0.1 mol/L HAR 0.5 一 0.5 AS 液 0.5 0.5 0.5 pH 7.5 缓冲 液 i) 2.0 . 2.0 HEA Bike F 37C 恒温 箱 中 保温 30min, 取出 后 各 加 3 滴 30% 乙 酸 终止 酶 反应 ,于 沸水 浴 上 加 热 10min, 使 蛋白 质 完全 沉 省 ,冷却 后 离心 或 过 滤 , 取 上 清 液 或 滤液 备用 。 3. 薄板 的 制备 取 3g 硅胶 G( 可 制 8x 15cm 的 薄板 2 块 ), 放 入 研 钵 中 加 蒸馏水 10ml 研磨 , 待 成 糊 状 后 , 迅速 均匀 地 倒 在 已 备 好 的 干燥 洁净 的 玻璃 板 上 , 手持 玻璃 板 在 桌子 上 轻 轻 振 动 。 使 糊 状 硅胶 G 铺 匀 , 室温 下 风干 ,使 用 前 置 105 辫 烘箱 中 活化 30min。 4. RE FE PEE RID 2cm 处 , 等 距离 确定 5 个 点 样 点 ( 相 邻 两 点 间距 1.Scm)。 取 反 应 液 及 谷 氨 酸 \ 丙 氨 酸 标准 液 分 别 点 样 ,反应 液 点 5 一 6 滴 , 标准 液 点 2 滴 , 每 点 一 次 用 吹风 机 吹 干 后 再 点 下 一 次 。 5. RE et il PRA—AZA 10em 的 培养 四 , 注入 展开 剂 ( 正 丁 醇 : 乙 酸 :水 ; 体 积 比 为 3:1:1), 深度 为 0.5Scm 左右 。 将 点 好 样 的 薄板 放 入 缸 中 (注意 不 能 浸 及 样 点 ), SHEL, 上 行 展开 。 待 溶液 前 沿 上 升 至 距 薄 板 上 沿 约 lcm 处 时 取出 , 用 毛细 管 标 出 前 沿 位 置 。 吹 干 后 用 0.25% 的 草 三 酮 丙酮 溶液 均匀 喷 圾 ( 注 意 不 能 有 Wiis), 置 烘 箱 (60 一 80Y ) 中 或 用 热 吹 风机 显 色 5~ 15min, 即 可 见 各 种 氨基 酸 的 层 析 斑 点 ,用 毛细 管 轻 轻 标 出 各 斑点 中 心 点 (或 照相 记录 )。 五 、 结 果 处 理 从 层 析 图 谱 上 鉴定 - 酮 成 二 酸 和 丙 氨 酸 是 否 发 生 了 转 氨 基 反应 , 并 写 出 反应 式 。 。 82 - 六 、 注 意 事 项 (1) 在 同一 实验 系统 中 使 用 同一 制品 同一 规格 的 吸附 剂 ,颗粒 大 小 最 好 在 250 一 300 目 。 制 板 时 硅胶 G 加 水 研磨 时 间 应 掌握 在 3 一 Smin, 研磨 时 间 过 短 硅胶 吸水 膨胀 不 够 ,不易 铺 匀 ;研磨 时 间 过 长 ,来 不 及 铺 板 硅胶 G 就 会 凝固 。 (2) 配制 展开 剂 时 , 应 现 用 现 配 ,以 免 放 置 过 和 久 其 成 分 发 生变 化 。 (3) 保持 薄板 的 洁净 , 避免 人 为 污染 ,干扰 实验 结果 。 (4) 点 样 和 显 色 用 吹风 机 时 勿 离 薄 板 太 近 , 以 防 吹 破 薄 层 。 七 、 思 考题 1. 转 氨 基 作用 在 代谢 中 有 何 意义 ? 2. 用 薄 层 层 析 还 可 分 离 鉴 定 哪些 物质 ? 参考 文献 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 中 山大 学 生物 系 生化 微生物 学 教研 室 编 .生化 技术 导论 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1981 Ce HME ME —. AN 淀粉 是 葡萄 糖 以 v- 1,4 糖苷 键 及 au- 1,6 糖苷 键 连结 的 高 分 子 多 糖 , 是 人 类 和 动物 的 重要 食物 , 也 是 食品 发酵 酿造 医药、 纺织 工业 的 基本 原料 。 淀粉 酶 是 加 水 分 解 演 粉 的 酶 的 总 称 , 淀粉 酶 对 演 粉 的 分 解 作 用 是 工业 上 利用 淀粉 的 依据 ,也 是 生物 体 利用 淀粉 进行 代谢 的 初级 反应 。 小 麦 成 熟 期 如 遇 阴 雨天 气 , 有 的 品种 会 发 生 严 重 的 穗 发 芽 , 造成 巨大 损失 , 这 是 小 麦 种 子 中 洗 粉 酶 活动 的 结果 。 因 此 , 淀粉 酶 的 活性 测定 , 具有 理论 和 应 用 研究 的 意义 。 通 过 本 实验 , 学习 酶 活 测定 的 一 般 方法 , 巩固 并 熟练 分 光 光 度 计 的 使 用 。 ,二 、 原 理 DE tt AG EE LIS -证 粉 酶 .8 -省 粉 酶 .葡萄糖 省 粉 酶 和 R - 酶 ,它们 广泛 存在 于 动物 、 植 物 和 微生物 界 。 不 同 来 源 的 淀粉 酶 , 性 质 有 所 不 同 。 植 物 中 最 重要 的 演 PAGE a -淀粉 酶 和 8B- 演 粉 酶 。 a -淀粉 酶 随机 作用 于 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 的 直 链 部 分 -1, 4 糖苷 键 ,单独 使 用 时 最 终生 成 寡 聚 和 葡萄糖. -极限 糊 精 和 少量 葡萄 糖 。Ca 能 使 -淀粉 酶 活化 和 稳定 , 它 比 较 耐 热 但 不 耐酸 ,pH 3.6 以 下 可 使 其 钝 化 。 B- 深 粉 酶 从 非 还 原 端 作用 于 — 1,4 糖苷 键 , 遇 到 支 链 淀粉 的 - 1,6 键 时 停 ae 止 。 单 独 作用 时 产物 为 麦芽 糖 和 8B -极限 糊 精 。B -淀粉 酶 是 一 种 琉 基 酶 , 不 需要 Ca 及 Cl 等 辅助 因子 ,最 适 pH WM, 与 -淀粉 酶 相反 , 它 不 耐 热 但 较 耐 酸 ,707C 保温 15min 可 使 其 钝 化 。 通常 提取 液 中 a -淀粉 酶 和 B- 淀 粉 酶 同时 存在 。 可 以 先 测定 (w+B) 淀 粉 酶 总 活力 , 然后 在 70C 加 热 13min, 钝 化 B -淀粉 酶 , 测 出 -淀粉 酶 活力 ,用 总 活力 减 去 a- 淀 粉 酶 活力 ,就 可 求 出 B- 演 粉 酶 活力 。 淀粉 酶 活力 大 小 可 用 其 作用 于 淀粉 生成 的 还 原 糖 与 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 的 显 色 反 应 来 测定 。 还 原 糖 作 用 于 黄色 的 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 生成 棕 红 色 的 3 - 氢 基 -5 - 硝 基 水 杨 酸 , 生成 物 颜色 的 深浅 与 还 原 糖 的 量 成 正比 。 以 每 克 样 品 在 一 定时 间 内 生成 的 还 原 糖 (麦芽 糖 ) 量 表示 酶 活 大 小 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 电子 顶 载 天 平 (2) He (3) AHH 100ml 2 个 (4) 具 塞 刻度 试管 ”2$ml 15 X (5) 试管 8X (6) RH i1ml3 X, 2ml 12 X, 5ml1 X (7) 离心 机 (8) 离心 管 (9) 恒温 水 浴 (10) 分 光 光 度 计 2. 试剂 (1) 1% 演 粉 溶液 (2) 0.4 mol/L AML (3) pHS.6 柠檬 酸 缓冲 液 ” 称 取 柠 檬 酸 20.01lg, 溶解 后 定 容 至 1000ml, 为 A 液 。 称 取 柠 檬 酸 钠 29.41lg, 溶解 后 定 容 至 1000ml, 8 BM. WA MW 13.7m1 FB 液 26.3ml 混 匀 , 即 为 pHS.6 之 缓冲 液 。 (4) 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 ”精确 称 取 1g 3,5 -二 硝 基 水 杨 酸 溶 于 20ml 1mol/L AAA, 加 入 S0ml 蒸馏水 , 再 加 30g 酒石酸 钾 钠 , 待 溶解 后 用 蒸馏 水 黎 释 至 100ml, 盖 紧 瓶 塞 , 防止 CO, 进入 。 (5) BFR HER (1mg/ml) PMR 0.100g 麦芽 糖 , 溶 于 少量 蒸馏水 , EAB 100ml。 。，84 ， 3. 材料 萌发 3 天 的 小 麦芽 。 PO. RIFE TR 1. 酶 液 提 取 称 取 2g 萌发 3 天 的 小 麦 种 子 ( 芽 长 1 cm 左右 ), 置 研 钵 中 加 少量 石英 砂 和 2ml 左右 蒸馏 水 , 研 成 匀 浆 ,无损 地 转 入 100ml 容量 瓶 中 , 用 蒸馏 水 定 容 至 100ml。 每 隔 数 分 钟 振 蔓 1 次 ,提取 20min。3000 r/min 离心 10min, 转 出 上 清 液 备 用 。 2. o -淀粉 酶 活力 测定 (1) 取 试 管 4 支 ,标明 2 支 为 对 照管 ,2 LAME. (2) 于 每 管 中 各 加 酶 液 lml, 在 70C +0.5C 恒温 水浴 中 准确 加 热 13min, 钝 化 B= 淀 粉 酶 。 取 出 后 迅速 用 流水 冷却 。 (3) 在 对 照管 中 加 入 4ml 0.4mol/L AA H. (4) 在 4 支 试管 中 各 加 入 lml pHS5.6 的 柠檬 酸 缓冲 液 。 (5) 将 4 支 试管 置 另 一 个 40C +0.5C 恒温 水 浴 中 保温 15min, 再 向 各 管 分 别 加 入 40C 下 预 热 的 1% 淀 粉 溶液 2ml, 摇 匀 ,立即 放 入 40 恒温 水 浴 准 确 计时 保温 Smin。 取 出 后 向 测定 管 迅 速 加 入 4ml0.4moyL AAA, 终止 酶 活动 ,准备 测 糖 。 3. 淀粉 酶 总 活力 测定 取 酶 液 sml, 用 蒸馏 水 稀释 至 100ml, 为 稀释 酶 液 。 另 取 4 支 试管 编号 ,2 支 为 对 照 ,2 支 为 测定 管 。 然 后 加 入 稀释 之 酶 液 1Iml。 在 对 照管 中 加 入 4ml 0.4mol/L 氢 氧 化 钠 。4 支 试管 中 各 加 lml pH5.6 之 柠檬 酸 缓冲 液 。 以 下 步骤 重复 v -淀粉 酶 测定 第 (5) 步 的 操作 , 同样 准备 测 糖 。 4. 麦芽 糖 的 测定 (1) 标准 曲线 的 制作 «FR 25ml 刻度 试管 7 支 , 编 号。 分 别 加 入 麦芽 糖 标准 液 (1mg/ml)0, 0.2, 0.6, 1.0, 1.4, 1.8, 2.0 ml, RE AREAS SIMA KER WA 2.0ml, 再 各 加 3,5 -二 硝 基 水 杨 酸 试剂 2.0ml, 置 沸水 浴 中 加 热 Smin。 取 出 冷却 ,用 蒸馏 水 稀释 至 2Sml。 混 匀 后 用 分 光 光 度 计 在 520 nm 波长 下 进行 比 色 , 记 录 吸 光度 。 以 吸光 度 为 纵 坐 标 , 以 麦芽 糖 含 量 (mg ) 为 横 坐标 , 绘制 标准 曲线 。 (2) Fem Me FAR 2,3 中 酶 作用 后 的 各 管 溶液 2ml, 分 别 放 入 相应 的 8 支 25Sml 具 塞 刻度 试管 中 , 各 加 入 2ml 3,5 -二 硝 基 水 杨 酸 试剂 。 以 下 操作 同 标 准 曲线 制作 。 根 据 样 品 比 色 吸光 度 , 从 标准 曲线 查 出 麦芽 糖 含 量 , 最 后 进行 结果 计 . 85 . 算 。 五 、 结 果 处 理 ER i ves) _ (A=Ag)* Vz a- 演 粉 酶 活力 (mg 麦芽 糖 /g 鲜 重 .Smin) WX Vy 淀粉 酶 总 活力 (mg HEEB / 鲜 重 .5min) = P Bo Va 式 中 “去 为 -淀粉 酶 水 解 淀粉 生成 的 麦芽 糖 (mg); Aig 3 a -淀粉 酶 的 对 照管 中 麦 菠 糖 量 (mg); Ba (a-+ BE BBG SEK EW BE EPA ma) Bo 为 (a+ 站 淀粉 酶 的 对 照管 中 麦芽 精 (mg); V7 为 样品 稀释 总 体积 (ml); Vy 为 比 色 时 所 用 样品 液体 积 (ml); W 为 样品 重 (g)。 六 、 注 意 事项 (1) 酶 反应 时 间 应 准确 计算 。 (2) 试剂 加 入 按 规定 顺序 进行 。 七 、 思 考题 1. 淀粉 酶 活性 测定 原理 是 什么 ? 2. 酶 反应 中 为 什么 加 pHS.6 的 柠檬 酸 缓冲 液 ? 为 什么 在 40C 进行 保温 ? 3. 测定 酶 活力 ,应 注意 什么 问题 ? 参考 文献 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 实验 九 肽 酶 K,, (alle —, BW 脲酶 是 氮 素 循环 的 一 种 关键 性 酶 , E HEAR SKE HE RRR, 在 促进 土 壤 和 植物 体内 尿素 的 利用 上 起 有 重要 作用 。 对 其 进行 多 方面 研究 ,早已 引起 人 们 重视 。 通 过 本 实验 ,学 习 脲酶 K。 值 的 测定 方法 。 ee ©. 原理 脲酶 催化 下 列 反应 : - 86° OR Bis (NH, )2CO + 2H,O (NH, )2CO3 在 碱 性 条 件 下 , PPR RAT AE RTE EF AE RR FE ETI, “ 旺 色 深浅 与 碳酸 贸 量 成 正比 。 故 可 用 比 色 法 测定 单位 时 间 内 酶 促 反 应 所 产生 的 碳 酸 铵 量 , 从 而 求 得 酶 促 反 应 速度 。 (NH, )2CO; + 8NaOH + 4(KI),Hgl, 一 > H y¢ 2 Re ln! + 6Nal + 8KI + Na2CO; + 6H,0 H (HES £8) HEL EB GE AR OF , Fe 0 LS i BE RE KS KEI. ZE—REDRE Pa, EE CE SR ERLE, BR Ve PRE TOR 酶 的 K,, (fi 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 试管 16Xx160mm 21 支 (2) 吸管 0.Smlx15$，lmlx1，2mlx1，10mlx1l (3) 漏斗 5 个 (4) 721 型 分 光 光 度 计 (5) 电热 恒温 水 浴 (6) 离心 机 (7) 康 氏 振荡 机 2. 试剂 (1) 1/10 mol/L#R 15.015g, KRREAZ 250ml, . (2) 不 同 浓度 脲 液 ”用 1/10 mol/L Aik fi FER 1/20.1/30.1/40.1/50 mol/L 的 TRY (3) 1/15 mol/L pH7.0 BF REE RMR = NaHPO, 5.969g, KR ERE 250ml. KH,PO, 2.268g, K#WaeA ZZ 250ml. A NazHPO4 4H 60ml, KH,PO, 溶液 40ml 混 匀 , 即 为 1/15 mol/L pH7.0 磷酸 盐 缓冲 液 。 (4) 10% 硫 酸 锌 “20g ZnSO, WF 200ml 蒸馏 水 中 。 (5) 0.5 mol/L 氢 氧 化 钠 5g NaOH, KWARERZ 250ml. (6) 10% 酒 石 酸 钾 钠 ”20g 酒石酸 钾 钠 溶 于 200ml 蒸馏 水 中 。 (7) 0.005 mol/L 硫酸 匀 标 准 液 ”准确 称 取 0.6610g 硫酸 铵 ,水 溶 后 定 容 至 1000ml。 87 . (8) 30% ZR 60ml 95% 乙 醇 , 加 水 130ml, #4. (9) 奈 氏 试剂 @ 甲 8.7S$g KI 溶 于 S0ml 水 中 。 四 乙 8.75g KI 洲 于 S0ml 水 中 。 @ WW 7.5g HgCl WF 150ml K+. @® J 2.5g HgCh WF 50ml K+, © 甲 与 两 混合 ,生成 朱红 色 沉 演 。 用 蒸馏 水 以 倾 海 法 洗 沉 淀 几 次 , 洗 好 后 将 乙 液 倒 入 , 令 沉 诞 溶解。 然后 将 丁 液 逐 滴 加 入 , 至 红色 沉淀 出 现 摇动 也 不 消失 为 lk, ZZ 250ml. © # NaOH 52.5g, WF 200m! 蒸馏 水 中 , HY. @ 混合 (5)、(6), 并 定 容 至 S00ml。 上 清 液 转 入 棕色 瓶 中 。 存 暗 处 备用 。 3. 材料 大 豆 粉 四 、 操 作 步 骤 (1) 脲酶 提取 ” 称 大 豆 粉 lg, 加 30% 乙 醇 2Sml, 振 功 提取 1h。4000r/min 离 > 10min, 取 上 清 液 备用 。 (2) 取 试 管 5 支 编号 , 按 下 表 操 作 : 加 入 量 (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 pH7 磷酸 盐 缓冲 液 (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 37°C 7KY8 Rid (min) | 加 入 脲酶 (ml) 加 入 煮沸 脲酶 (ml) 37 尼 水 浴 保 温 (min) 加 10% ZnSO4(ml) DFR 4B 7K (ml) bil 0. 5mol/L NaOH (ml) 5 10.0 在 旋涡 振 功 器 上 混 匀 各 管 , 静 置 Smin 后 过 滤 。 (3) 另 取 试 管 5 支 编号 , 与 上 述 各 管 对 应 , 按 下 表 加 入 试剂 (ml) : 。， 88 » if 0.5 fevk 9.5 10% 7 0.5 0.Smol/L. NaOH 0-5 He Rit 1.0 迅速 混 匀 各 管 , 然后 在 460nm 比 色 , 36% 1cm。 (4) 制作 标准 曲线 , 按 下 表 加 入 试剂 (ml) : 0.005moL (NH4)2S04 po | on | 02 | 03 | o4 | os ANU | too | 99 | 98 | 97 | 96 | 9.5 10% 38-2 0.5 0. Smol/L NaOH 0.5 AEA po | 10 | to | to | 10 | 10 迅速 混 匀 各 管 ,在 460nm 比 色 , 绘制 标准 曲线 。 五 、 结 果 处 理 在 标准 曲线 上 查 出 脲酶 作用 于 不 同 浓度 腺 液 生成 碳酸 贸 的 量 , 然后 取 单位 时 间 生 成 碳酸 铵 量 的 倒数 即 \ 为 纵 坐标 , 以 对 应 的 脲 液 浓度 的 倒数 即 TS] 为 模 坐标 作 双 倒数 图 , 求 出 K。 值 。 (1) 准确 控制 各 管 酶 反应 时 间 尽 量 一 致 (2) 按 表 中 顺序 加 入 各 种 试剂 。 (3) 奈 氏 试剂 腐蚀 性 强 , 勿 酒 在 试管 架 和 实验 台面 上 。 七 、 思 考题 除了 双 倒 数 作 图 法 ,还 有 哪些 方法 可 求 得 K,, (A? 参考 文献 陈 簿 莽 . 生 物化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农 业 出 版 社 , 1995 郑 洪 元 , 张 德 生 .土壤 动态 生物 化 学 研究 法 .北京 :科学 出 版 社 , 1982 “ 89 - S'+ SARHKRNAERHRERLDS ay A 1. 学 习 水 解 重 白质 的 方法 。 2. 掌握 纸 层 析 的 基本 技术 。 3. 学 习 用 纸 层 析 分 离 \ 鉴 定 氨 基 酸 的 方法 。 bee 原理 1. 时 白质 的 水 解 蛋白 质 可 以 用 酸 、 碱 或 酶 如 胃 和 蛋白 酶 , 胰 和 蛋白 酶 , 糜 蛋 白 酶 水 解 成 最 终 产 物 氢 基 酸 。 实 验 室 中 常 使 用 酸 解 法 水 解 重 白质 。 当 在 6 mol/L 盐酸 溶液 中 将 蛋 百 质 在 110°C 加 热 大 约 20 h, 肽 键 断 裂 , 此 时 蛋白质 完全 分 解 为 氨基 酸 。 酸 法 水 解 重 白 质 的 优点 是 在 水 解 过 程 中 不 发 生 外 消 旋 作用 , 所 得 到 的 氨基 酸 均 为 工 -氨基 酸 。 大 多 数 氨 基 酸 在 煮沸 酸 中 是 稳定 的 , 但 色 氢 酸 则 完全 被 破坏 。 丝氨酸 和 苏 氨 酸 在 酸 解 过 程 中 或 多 或 少 地 也 有 破坏 。 色 氨 酸 的 水 解 产物 已 知 是 一 种 棕 黑 色 的 物质 一 一 腐 黑 质 , 因此 , 用 酸 法 水 解 蛋 白质 得 到 的 水 解 液 为 棕 黑 色 的 。 2. 纸 层 析 法 分 离 氨基 酸 纸 层 析 是 以 滤纸 作为 支持 物 的 分 配 层 析 法 。 它 利用 不 同 物质 在 同一 推动 剂 中 具有 不 同 的 分 配 系数 , 经 层 析 而 达到 分 离 的 目的 。 在 一 定 条 件 下 , 一 种 物质 在 某 浴 剂 系统 中 的 分 配 系数 是 一 个 常数 , AU K 表示 分 配 系数 及 二 溶质 在 固定 相 中 的 浓度 溶质 在 流动 相 中 的 浓度 层 析 溶 剂 ( 又 称 推动 剂 ), 是 选用 有 机 溶剂 和 水 组 成 的 。 滤 纸 纤 维 素 与 水 有 较 强 的 亲和力 (纤维 素 分 子 的 葡萄 糖 基 上 的 - OH 基 与 水 通过 氢 键 相 作 用 ) 能 吸附 很 多 水 分 ,一 般 达 滤纸 重 的 22% 左 右 ( 其 中 约 有 6% 的 水 与 纤维 素 结合 成 复合 物 ), 由 于 这 部 分 水 扩散 作用 降低 形成 固定 相 ;而 推动 剂 中 的 有 机 溶剂 与 滤纸 的 亲和力 很 弱 , 可 在 滤纸 的 毛细 管 中 自 由 流动 ,形成 流动 相 。 层 析 时 , 点 有 样品 的 滤纸 一 端 浸 入 推动 剂 中 , 有 机 溶剂 连续 不 断 地 通过 点 有 样品 的 原点 处 ,使 其 上 的 溶质 依据 本 身 的 分 配 系数 在 两 相间 进行 分 配 。 随 着 有 机 溶剂 不 断 向 前 移动 ,溶质 被 携带 到 新 的 无 溶质 区 并 继续 在 两 相间 发 生 可 逆 的 重新 分 配 , 同时 溶质 离开 原点 不 断 向 前 移动 ， 溶质 中 各 组 分 的 分 配 系 数 不 同 , 前 进 中 出 现 了 移动 速率 差异 , 通过 一 定时 间 的 层 析 , 不 同 组 分 便 实 现 了 分 离 。 物 质 的 移动 速率 以 Rf 值 表示 : R, = 原点 到 层 析 点 中 心 的 距离 原点 到 溶剂 前 沿 的 距离 。 90 . 各 种 化 合 物 在 恒定 条 件 下 , 层 析 后 都 有 其 一 定 的 Ry, 值 , fe WIRE, 定性 、 鉴 别 的 目的 。 溶质 的 结构 与 极 性 `\ 溶 剂 系统 的 物质 组 成 与 比例 .pH 值 \ 滤 纸 质 地 以 及 层 析 温 度 、 时 间 等 都 会 影响 Ry 值 。 三 、 仪 器 试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 干燥 箱 (2) 水 浴 锅 (3) 安培 瓶 (4) Je tril (5) 吹风 机 (6) "RSS at 2. 试剂 (1) 6 mol/L HCl (2) 标准 氨基 酸 (1mg/mL): KRRAR. KAAR AAR AAR AAR 各 lmg, 分 别 溶 于 1ml 0.01mol/L 的 HCI 溶液 中 , 保存 于 冰箱 。 (3) BUA: 正 丁 醇 :88% 甲酸 :水 =15:3:2(V/AV) (4) 0.5% 的 曹 三 酮 丙酮 溶液 (5) 10% 蜡 丙 醇 溶液 3. 材料 (1) 层 析 滤纸 (10cm X 10cm), 普通 滤纸 (21cmx21cmy) (2) B48 SFL aT 四 、 操 作 步 又 1. 蛋白 质 的 水 解 称 取 0.2g 酵母 粉 , 放 进 一 个 小 安培 瓶 中 , 向 瓶 中 加 入 lml 6mol/L 的 盐酸 , 于 喷 灯 火焰 上 封口 。 将 安培 瓶 放 入 干燥 箱 内 ,在 110C 下 水 解 20h 后 ,把 安培 瓶 内 的 水 解 液 倒 进 蒸 发 严 内 , 将 蒸发 下放 于 沸水 洽 上 加 热 以 除去 水 解 液 中 的 盐酸 。 将 水 解 液 蒸 干 ,溶解 于 0.5 一 lml 10% 的 异 丙 醇 中 。 2. 纸 层 析 法 分 离 氨基 酸 取 1 张 10x10cm 的 层 析 滤 纸 放 在 普遍 滤纸 上 , 用 直 尺 和 铅笔 在 距 滤 纸 底 边 s op * 2 cm 处 划一 条 平行 于 底 边 的 很 轻 的 直线 做 为 基线 。 沿 直线 以 一 定 的 间隔 做 标记 以 指示 标准 氨基 酸 和 蛋白质 水 解 液 的 加 样 位置 。 用 毛细 管 吸 少 量 氢 基 酸 样品 点 于 标 记 的 位 置 上 。 点 样 时 , 毛细 管 口 应 与 滤纸 轻 轻 接触 , 样 点 直径 一 般 控制 在 0.3cm 之 内 。 用 吹风 机 稍 加 吹 和 王后 再 点 下 一 次 ,重复 3 次 ,每 次 的 样品 点 应 完全 重合 。 加 样 完毕 后 , 将 滤纸 卷 成 圆 简 状 , 使 基线 吻合 , 两 边 不 搭 接 ,用 针 和 线 将 纸 两 边 缝 合 。 将 点 好 样品 的 滤纸 移入 层 析 和 缸 中 ( 层 析 和 仙 内 事先 加 入 一 个 注入 40ml 展 层 剂 的 直径 为 10cm 的 培养 开 , 使 液 层 厚度 为 lcm 左右 , GEE TF 20min, URES 内 有 一 定 蒸汽 压 ), 采用 上 行 法 进行 展 层 。 当 溶剂 前 沿 上 升 到 距 纸 上 端 1 cm 时 , 取 出 滤纸 ,立即 用 铅笔 记 下 溶剂 前 沿 的 位 置 , 剪断 缝 线 , 用 吹风 机 吹 干 滤纸 上 的 溶剂 。 之 后 用 曹 三 酮 丙酮 溶液 均匀 地 喷洒 在 滤纸 有 效 面 上 , 切 纪 喷 得 过 多 致使 斑点 扩散 。 然后 将 滤纸 放 入 烘箱 ,于 80C 下 显 色 Smin 后 取出 。 五 结果 处 理 用 铅笔 轻 轻 描 出 显 色 斑 点 的 形状 , 并 用 一 直 尺 度量 每 一 显 色 斑点 中 心 与 原点 之 间 的 距离 和 原点 到 溶剂 前 沿 的 距离 , 计算 各 色 斑 的 Ri 值 , 与 标准 氨基 酸 的 Ri 值 对 照 , 确定 水 解 液 中 含有 哪些 氨基 酸 。 1. 点 样 时 要 避免 手指 或 唾液 等 污染 滤纸 有 效 面 ( 即 展 层 时 样品 可 能 达到 的 部 分 )。 2. 点 样 斑点 不 能 太 大 (直径 应 小 于 0.3 cm), 防止 层 析 后 氨基 酸 斑 点 过 度 扩 散 A Be, 上 且 吹 风 温 度 不 宜 过 高 , 否则 斑点 变 黄 。 3. 展 层 开 始 时 切 勿 使 样品 点 浸入 溶剂 中 。 4. fA RRA KIET RR ERA, 甲酸 须 用 分 析 纯 的 。 且 展 层 剂 要 临 用 前 配制 , 以免 发 生 酯 化 , 影响 层 析 结果 。 5. 如 果 样 品 中 溶质 种 类 较 多 , 且 某 些 溶质 在 某 一 溶剂 系统 中 的 Ry 值 十 分 接 近 时 , 单 向 层 析 分 离 效果 不 佳 , 则 可 采用 双向 层 析 ,即将 样品 点 在 一 方形 滤纸 的 角 上 , 先 用 一 种 溶剂 系统 展 层 。 滤 纸 取出 干燥 后 , 再 将 滤纸 转 90` 角 , 用 另 一 溶剂 系 统 展 层 。 所 得 图 谱 分 别 与 这 两 种 溶剂 系统 中 作 的 标准 物质 层 析 图 谱 对 比 , 即 可 对 混合 物 样 品 中 各 成 分 进行 鉴定 。 七 .思考 题 1. 为 什么 点 样 时 要 避免 手指 或 唾液 等 污染 滤纸 有 效 面 ? 2. 影响 物质 移动 速率 R+ 值 的 因素 有 哪些 ? 参考 文献 文 树 基 主 编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 . 92 . Stenesh, J., Experimental Biochemistry, Allynand bacon, Inc., Boston, US, 1984 Set— SARHALERRSS AME 一 、 目 的 通过 实验 了 解 蛋 白质 的 两 性 性 质 及 等 电 点 与 蛋白 质 分 子 聚 沉 的 关系 。 掌 握 通 过 聚 沉 测定 蛋白 质 等 电 点 的 方法 。 一 原理 蛋白 质 是 两 性 电解 质 。 蛋 白质 分 子 中 可 以 解 离 的 基 团 除 N - 端 a- 氨 基 与 C- 端 -羧基 外 , 还 有 肽 链 上 某 些 氨基 酸 残 基 的 侧 链 基 团 , OT BE STE ATE OK hE 等 基 团 , 它们 都 能 解 离 为 带电 基 团 。 因 此 , 在 蛋白 质 溶 液 中 存在 着 下 列 平 衡 : COOH A P NS NH; 和 蛋白质 分 子 COO- COO- COOH - +H we +H A P 一 了 P Ss + OH iS + OH NH, NH} NH}; 阴离子 两 性 离子 阳离子 pH> pl pH= pl pH< pl 电场 中 :， 移 向 阳极 不 移动 移 向 阴极 调节 溶液 的 pH 使 蛋白 质 分 子 的 酸性 解 离 与 碱 性 解 离 相 等 , 即 所 带 正 负电 荷 AS, MAS, 此 时 溶液 的 pH 值 称 为 蛋白 质 的 等 电 点 。 在 等 电 点 时 , 蛋白 质 溶解 度 最 小 , 溶液 的 混浊 度 最 大 , 配制 不 同 pH 的 缓冲 液 , 观察 蛋白 质 在 这 些 缓冲 液 中 的 溶解 情况 即 可 确定 蛋白 质 的 等 电 点 。 三 、 仪 器 和 试剂 1. 仪器 (1) 试管 架 (2) 试管 : 15ml x 6 (3) 刻度 吸管 : ImlX4, 2mlx4, 10ml x 2 ah (4) 胶 头 吸管 x2 93 . 2. 试剂 (1) Imol/L 乙酸 : WAR 99.5% ZR( WH 1.05)2.875ml, 加 水 至 S0ml。 (2) 0.1mol/L ZR: 吸取 1mol/L 乙酸 Sml, 加 水 至 S0ml。 (3) 0.01mol/L ZR: 吸取 0.1mol/L 乙酸 Sml, 加 水 至 S0ml。 (4) 0.2mol/L NaOH: 称 取 NaOH 2.000g, 加 水 至 50ml, 配 成 1mol/L NaOH. 然后 量 取 1moyL NaOH 10ml, 加 水 至 S0ml, Ack 0.2mol/L NaOH. (5) 0.2mol/L 盐酸 : 吸取 37.2%( 比 重 1.19) 盐 酸 4.17ml, 加 水 至 50ml, 配 成 1mol/L 盐酸 。 然 后 吸取 1mol/L 盐酸 10ml, 加 水 至 50ml, 配 成 0.2mol/L 盐酸 。 (6) 0.01% 溴 甲 酚 绿 指示 剂 : 称 取 溴 甲 酚 绿 0.00$g, 加 0.29ml 1mol/L NaOH, 然后 加 水 至 S0ml。 (7) 0.5% MR ARM: 称 取 栈 蛋白 ( 干 酷 素 )0.2$g WA 50ml 容量 瓶 中 , 加 入 约 20ml 水 ,再 准确 加 入 1mol/L NaOH Sml, 当 酪 蛋白 溶解 后 , 准确 加 入 1mol/L 乙 酸 Sml, 最 后 加 水 稀释 定 容 至 S0ml, 充分 摇 匀 。 四 、 操 作 步 又 1. 蛋白 质 的 两 性 反应 (1) 取 一 支 试管 ,加 0.5% 酷 蛋白 Il, 再 加 溴 甲 酚 绿 指示 剂 4 滴 , EO. 溶液 呈 蓝 色 , 无 沉淀 生成 。 (2) 用 胶 头 滴 管 慢 慢 加 入 0.2mol/L ER, 边 加 边 摇 直 到 有 大 量 的 沉淀 生成 。 此 时 溶液 的 pH 值 接近 酪 蛋白 的 等 电 点 。 观 察 溶 液 颜色 的 变化 。 (3) 继续 滴 加 O.2mol/L 盐酸 , 沉淀 会 逐渐 减少 以 至 消失 。 观 察 此 时 溶液 颜色 的 变化 。 (4) 滴 加 0.2mol/L NaOH 进行 中 和 , 沉淀 又 出 现 。 继 续 滴 加 0.2mol/L NaOH, 沉淀 又 逐渐 消失 。 观 察 溶 液 颜 色 的 变化 。 2. 酪 蛋白 等 电 点 的 测定 (1) 取 同 样 规格 的 试管 7 支 , 按 下 表 精 确 地 加 入 下 列 试剂 ; 试剂 (ml) 1.0mol/L 乙酸 0.1mol/L 乙酸 0.01mol/L 乙酸 H2O 溶液 的 pH - 94 。 (2) 充 分 摇 匀 , 然后 向 以 上 各 试管 依次 加 入 0.5% BEA 1ml, 边 加 边 摇 , HY 后 静 置 Smin, 观察 各 管 的 混浊 度 。 五 、 结 果 处 理 用 -、+、 二 f\ 枚 等 符号 表示 各 管 的 混浊 度 。 根 据 混浊 度 判 断 栈 蛋白 的 等 电 点 。 最 混浊 的 一 管 的 pH 值 即 为 酷 蛋 日 的 等 电 点 。 缓冲 液 的 pH 值 必须 准确 。 七 、 思 考题 1. 解释 蛋白 质 两 性 反应 中 颜色 及 沉 演变 化 的 原因 。 2. 该 方法 测定 蛋白 质 等 电 点 的 原理 是 什么 ? 参考 文献 宋 治 军 , 纪 重光 主编 .现代 分 析 仪 器 与 测试 方法 .西安 :西北 大 学 出 版 社 ,1995 文 树 基 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986 张 龙 翔 主编 .生化 实验 方法 和 技术 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1982 实验 十 二 ”蛋白质 含量 测定 ( 考 马 斯 亮 蓝 G- 250 法 ) 一 、 目 的 Ih 蛋白 质 是 细胞 中 最 重要 的 含 所 生物 大 分 子 之 一 ,承担 着 各 种 生物 功能 。 和 蛋白 质 的 定量 分 析 是 忆 昌 质 构造 分 析 的 基础 ,也 是 农 牧 产品 品质 分 析 、 食 品 营养 价值 比 较 ` 生 化 育种 ,临床 诊断 等 的 重要 手段 。 根 据 蛋 白质 的 理化 性 质 , 提出 多 种 蛋白 质 定量 方法 。 考 马 斯 亮 蓝 G- 250 法 是 比 色 法 与 色素 法 相 结合 的 复合 方法 , 简便 快 捷 , 灵敏 度 高 , 稳定 性 好 ,是 一 种 较 好 的 常用 方法 。 通 过 本 实验 学 习 考 马 斯 亮 蓝 G - 250 法 测定 蛋白 质 含 量 的 原理 , 了 解 分 光 光 度 计 的 结构 、 原 理 和 在 比 色 法 中 的 应 用 。 原理 考 马 斯 亮 蓝 G - 250 是 一 种 染料 , 在 游离 状态 下 旦 红色, 当 它 与 蛋白 质 结合 后 RARE. ZARA HL 0 一 1000 pe 范围 内 , 蛋白 质 -色素 结合 物 在 $595 nm 下 的 吸光 度 与 蛋白 质 含量 成 正比 , 故 可 用 比 色 法 测定 。 - O5 - =. (Aas. Al A BI 1. 仪器 (1) HK (2) 具 塞 刻度 试管 10ml x8 (3) RH O.1mlX1, 1mlxX2, 5mlXx1 (4) 研 钵 (5) 漏斗 (6) 离心 管 “10ml (7) AM ”10mlx1l (8) 离心 机 (9) 721 型 分 光 光 度 计 2. 试剂 (1) 标准 蛋白 质 溶液 WR 10m 牛 血 清白 蛋白 , 溶 于 蒸馏 水 并 定 容 至 100ml, 制 成 100 pg/ml 的 原液 。 (2) 考 马 斯 亮 蓝 G - 250 FARA KR 100mg 考 马 斯 亮 蓝 G - 250, AF 50ml 90% 乙 醇 中 ,加 入 85% (m/v) MBER 100ml, 最 后 用 蒸馏水 定 容 到 1000ml。 此 溶液 在 常温 下 可 放置 一 个 月 。 3. 材料 绿豆 芽 四 、 操 作 步 又 1. 标准 曲线 的 制作 取 6 支 具 塞 试管 , 编号 后 , 按 下 表 加 入 试剂 。 *， 96 ， 成 )。 以 牛 血 清白 蛋白 含量 (wg) 为 横 坐 标 , 以 吸光 度 为 纵 坐标 , 绘 出 标准 曲线 。 2. 样品 中 蛋白 质 含量 的 测定 (1) 准确 称 取 约 200mg ARF PARR, 放 入 研 钵 中 , 加 入 Sml 蒸馏 水 在 冰 浴 中 研 成 匀 浆 , 离心 (4000rxmin，10min), 将 上 清 液 倒 入 10ml 容量 瓶 ,再 癌 残渣 中 加 入 2ml 蒸馏 水 , 悬浮 后 再 离心 10min, 合并 上 清 液 , 定 容 至 刻度 。 (2) 另 取 1 支 具 塞 试管 ,准确 加 入 0.1ml 样品 提取 液 ,再 加 入 0.9ml 蒸馏 水 ， Sml 考 马 斯 亮 蓝 G - 250 试剂 , 充分 混合 ,放置 2min 后 , 以 标准 曲线 1 号 试管 做 参 比 ,在 595 nm 波长 下 比 色 ,记录 吸光 度 。 五 、 结 果 处 理 根据 所 测 样 品 提取 液 的 吸光 度 , 在 标准 曲线 上 查 得 相应 的 蛋白 质 含量 (ng), 按 下 式 计算 : _ 查 得 的 蛋白 质 含量 (ug) x 提取 液 总 体积 (ml 样品 蛋白 质 含 基 (peg/g 鲜 重 ) ~ 祥 品 鲜 重 (g) x 测定 时 取 用 提取 液体 积 (ml) 比 色 应 在 出 现 蓝 色 2min 一 1h 内 完成 。 5 思考 题 1. FHM EK G- 250 法 测定 蛋白 质 含量 的 原理 是 什么 ? 还 有 哪些 蛋白 质 定 HIE? 2. 如 何 正 确 使 用 分 光 光 度 计 ? 参考 文献 陈 毓 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 ,1995 鲁 子 贤 .蛋白 质 化 学 .北京 :科学 出 版 社 ,1981 文 树 基 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 张 龙 翔 . 生 物化 学 实验 技术 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 ,1981 实验 十 三 ”还 原 糖 和 总 糖 含量 的 测定 (3,5 -二 硝 基 水 杨 酸 比 色 法 ) 一 、 目 的 @ 植物 体内 的 还 原 糖 , 主要 是 葡萄 糖 、 果 糖 和 麦芽 糖 。 它 们 在 植物 体内 的 分 布 ， | 不 仅 反 映 植物 体内 碳水 化 合 物 的 运转 情况 , 而 且 也 是 呼吸 作用 的 基质 。 还 原 糖 还 能 形成 其 他 物质 如 有 机 酸 等 ;此 外 ,水 果蔬 菜 中 含 糖 量 的 多 少 ,也 是 鉴定 其 品质 的 . 97 下 重要 指标 。 还 原 糖 在 有 机 体 的 代谢 中 起 着 重要 的 作用 , 其 他 碳水 化 合 物 , 如 淀粉 、 蔗糖 等 , 经 水 解 也 生成 还 原 糖 。 通 过 本 实验 , 掌握 还 原 糖 定量 测定 的 基本 原理 , 学 习 比 色 定 糖 法 的 基本 操作 , 熟悉 分 光 光 度 计 的 使 用 方法 。 pat 原理 各 种 单 糖 和 麦芽 糖 是 还 原 糖 ,蔗糖 和 洗 粉 是 非 还 原 糖 。 利 用 溶解 度 不 同 , 可 将 植物 样品 中 的 单 糖 ` 双 糖 和 多 糖分 别提 取出 来 , 再 用 酸 水 解法 使 没有 还 原 性 的 双 糖 和 多 糖 彻 底 水 解 成 有 还 原 性 的 单 糖 。 在 碱 性 条 件 下 , 还 原 糖 与 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 共 热 ,3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 被 还 原 为 3 -氨基 - 5 - 硝 基 水 杨 酸 ( 棕 红色 物质 ), 还 原 糖 则 被 氧化 成 糖 酸 及 其 他 产物 。 在 一 定 范围 内 , 还 原 糖 的 量 与 棕 红 色 物 质 颜 色 涤 浅 的 程度 成 一 定 的 比例 关系 , 在 540nm 波长 下 测定 棕 红 色 物 质 的 消光 值 , 查 对 标准 曲线 并 计算 , 便 可 分 别 求 出 样 品 中 还 原 糖 和 总 糖 的 含量 。 三 、 仪 器 、. 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 刻度 试管 :2Smlx 11 (2) 离心 管 或 玻璃 漏斗 x2 (3) 烧杯 :100mlx1 (4) 三 角 瓶 :100mlx1l (5) 容量 瓶 :100mlx3 (6) 刻度 吸管 :1mlx1，2mlx4，1l0mlx1l (7) toi KIA (8) 沸水 浴 (9) 离心 机 (过 滤 法 不 用 此 设备 ) (10) 电子 顶 载 天 平 (11) 3636 Et 2. 试剂 ; (1) 1mg/ml 葡萄 糖 标准 液 :准确 称 取 100mg 分 析 纯 葡萄 糖 ( 预 先 在 80 HE 恒 重 ), 置 于 小 烧杯 中 , 用 少量 蒸馏 水 溶解 后 , 定量 转移 到 100ml 的 容量 瓶 中 , UA 饮水 定 容 至 刻度 , ES, 冰箱 中 保存 备用 。 (2) 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 试剂 :将 6.3g 3, 5 - 硝 基 水 杨 酸 和 262ml 2mol/L NaOH 溶液 ,加 到 500ml 含有 185¢ 酒石酸 钾 钠 的 热 水 溶 液 中 ,再 加 Se 结 唱 酚 和 Sg 亚硫酸钠 , 搅拌 溶解 。 冷 却 后 加 蒸馏水 定 容 至 1000ml, 贮 于 棕色 瓶 中 备用 。 . 98 « (3) 碘 - 碘 化 钾 溶 液 : 称 取 Sg BRAN 10g 碘化钾 , 溶 于 100ml 蒸馏 水 中 。 (4) MBAR: KR 0.1g MR, WF 250ml 70% 乙 醇 中 。 (5) 6mol/L HCl. (6) 6mol/L NaOH. 3. 材料 食用 面粉 。 四 、 操 作 步 又 1. 制作 葡萄 糖 标准 曲线 取 7 支 25Sml 刻度 试管 , 编号 , 按 下 表 操作 。 葡萄 糖 标准 液 (ml) 3, 5 -二 硝 基 水 杨 酸 (ml) 将 各 管 摇 匀 ,在 沸水 浴 中 加 热 Smin, 取出 后 立即 冷却 至 室温 , 再 以 蒸馏 水 定 容 至 Umi. ££ $S40nm 波长 下 ,用 0 号 管 调 零 ,分 别 读 取 1~6 号 管 的 吸光 度 。 以 吸光 度 为 纵 坐 标 , 葡萄 糖 毫 克 数 为 横 坐 标 , 绘制 标准 曲线 。 2. 样品 中 还 原 糖 和 总 糖 含量 的 测定 (1) 样品 中 还 原 糖 的 提取 :准确 称 取 3g 食用 面粉 , 放 在 100ml = AIF, FEV 少量 蒸馏 水 调 成 糊 状 , 然后 加 50ml 蒸馏 水 , HA, A SOC 恒温 水 浴 中 保温 20min, 使 还 原 糖 浸出 。 离 心 或 过 滤 , 用 20ml 蒸馏水 洗 残渣 , 再 离心 或 过 滤 , 将 两 次 离心 的 上 清 液 或 滤液 全 部 收集 在 100ml 的 容量 瓶 中 , 用 蒸馏 水 定 容 至 刻度 , 混 匀 , 作 为 还 原 糖 待 测 液 。 | (2) 样品 中 总 糖 的 水 解 和 提取 :准确 称 取 lg 食用 面粉 , 放 在 100ml 的 三 角 瓶 中 ,加 入 10ml 6mol/L HC! 及 15ml 蒸馏 水 , 置 于 沸水 浴 中 加 热 水 解 30min。 取 1 一 2 滴水 解 液 于 白 瓷 板 上 ,加 !1 滴 碘 - 碘化钾 溶液 , 检查 水 解 是 否 完全 。 如 已 水 解 完 全 , 则 不 显 赣 色 。 待 三 角 瓶 中 的 水 解 液 冷 却 后 ,加 入 1 滴 酚 本 指示 剂 , 以 6molL NaOH 中 和 至 微 红 色 , 过 滤 , 再 用 少量 蒸馏 水 冲洗 三 角 瓶 及 滤纸 , 将 滤液 全 部 收集 在 100ml 的 容量 瓶 中 ,用 蒸馏 水 定 容 至 刻度 , 混 匀 。 精 确 吸 取 10ml 定 容 过 的 水 解 液 , 移入 另 一 100ml HABA, WK HR EA IES, 作为 总 糖 待 测 液 。 (3) 显 色 和 比 色 , 取 4 支 2Sml 刻 度 试管 , 编号, 按 下 表 所 示 的 量 操作 。 . 99 . 还 原 糖 测 定 管 号 总 糖 测定 管 号 管 号 总 糖 待 测 液 (ml) 1 其 余 操 作 均 与 制作 葡萄 糖 标准 曲线 时 相同 。 五 、 结 果 处 理 以 管 @ 、@ 的 吸光 度 平均 值 和 管 、 开 的 吸光 度 平 均值 , 分别 在 标准 曲线 上 碍 出 相应 的 还 原 糖 毫克 数 。 按 下 式 计算 出 样品 中 还 原 糖 和 总 糖 的 百 分 含 量 。 提取 液 总 体积 查 曲线 所 得 还 原 糖 质量 (mg)X 潭 全 时 证 国人 有 不 上 测定 时 取 用 体积 人 样品 质量 (mg] — 样品 质量 (mg) 标准 曲线 制作 与 样品 含 糖 量 测定 应 同时 进行 ,一 起 显 色 和 上 比 色 。 七 、 思 考题 1. 可 用 不 同 材 料 , 以 比较 含 糖 量 的 差异 。 2. 面粉 中 主要 含有 何 种 糖 ? 3. 在 提取 糖 时 , 其 他 杂质 是 否 会 影响 到 测定 ? 参考 文献 西北 农业 大 学 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986。 Seto ARE SMe xn 丙酮 酸 是 一 种 重要 的 中 间 代 谢 物 。 通 过 本 实验 掌握 测定 植物 组 织 中 丙酮 酸 含 量 的 原理 和 方法 , 增加 对 代谢 的 感性 认识 。 ie 原理 植物 样品 组 织 液 用 三 氯 乙酸 除去 蛋白 质 后 , 其 中 所 含 的 丙酮 酸 可 与 2,4 -—15 - 100 - ZEAE HEI, 生成 丙酮 酸 - 2,4 - ERR, 后 者 在 碱 性 溶液 中 呈 樱 红色 , 其 颜色 深度 可 用 分 光 光 度 计 测量 。 与 同样 处 理 的 丙酮 酸 标准 曲线 进行 比较 , 即 可 求 得 样 _ 品 中 丙酮 酸 的 含量 。 三 、 仪 器 .试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 分 光 光 度 计 (2) 离心 机 (4000r min) (3) 容量 瓶 (25ml) (4) Be (5) 具 塞 刻度 试管 (1Sml) (6) 刻度 吸管 (1ml，Sml) (7) 电子 顶 载 天 平 2. 试剂 (1) 1.5mol/L NaOH (2) 8% 三 氯 乙酸 (当日 配制 置 冰 箱 中 备用 ) (3) 0.1% 2,4 —— AA AEE HF . PRM 2, 4 -二 硝 基 葵 肝 100mg, HF 2mol/L HCl 中 使 成 100ml, BA te AHIR, 保存 于 冰箱 内 。 (4) 丙酮 酸 标准 液 (60xg/ml) :精确 称 取 7.Smg 丙酮 酸 钠 , 用 8% 三 氯 乙 酸 溶 解 并 定 容 至 100ml 保存 于 冰箱 内 。 3. 材料 四 、 操 作 步 又 1. 丙酮 酸 标准 曲线 的 制作 取 6 支 试管 , 按 下 表 加 入 试剂 : 丙酮 酸 标准 液 (ml) 8% 三 氯 乙酸 (ml) 丙酮 酸 含量 (ng) - 101 。 在 上 述 各 管 中 分 别 加 入 1.0ml 0.1% 2,4 -— THEM, 2S, 再 加 入 Sml 1.5mol/L NaOH 溶液 , 摇 匀 显 色 ,在 520nm 波长 下 比 色 。 作 标准 曲线 。 2. 植物 材料 提取 液 的 制备 称 取 lg HOME (KA TER Kae) FRA ie 8% =ACR, 仔细 研 MAR, BA S%6=ACLRKEA ml 容量 瓶 , 定 容 至 刻度 。 塞 紧 瓶 塞 , 振 摇 提取 ， 静 置 30min。 取 约 10ml 匀 浆 液 离心 (4000 r/min)10min, 上 清 液 备用 。 3. 组 织 液 中 丙酮 酸 的 测定 取 1.0ml 上 清 液 于 一 刻度 试管 中 , 加 2ml 8% =AZR, dN 1.0ml 0.1% 2,4- — BEE YK, 摇 匀 ,再 加 5$.0ml 1.5mol/L NaOH 溶液 , 摇 匀 显 色 ,在 520 nm 波长 下 比 色 , 记录 吸光 度 ,在 标准 曲线 上 查 得 测定 管 (7 号 ) 的 丙酮 酸 含量 。 五 、 结 有 果 处 理 oO 公 - = 样品 中 丙酮 酸 含量 (mgy/g 鲜 重 ) = 和 cir 式 中 , A 为 在 标准 曲线 上 查 得 的 丙酮 酸 的 微克 数 。 1. 所 加 试剂 的 顺序 不 可 颠倒 , 先 加 丙酮 酸 标 准 液 或 待 测 液 ,再 加 8% 三 氯 乙 酸 , 最 后 加 1.5mol/L NaOH. 2. 应 反应 10min 后 再 比 色 。 3. 标准 曲线 的 各 点 应 分 布 均匀 , 范围 适中 。 七 、 思 考题 测定 丙酮 酸 含量 的 基本 原理 是 什么 ? 参考 文 献 文 树 基 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1994 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986 实验 十 五 ”抗坏血酸 含量 则 定 (2,6 —Mw aw) —. AW 学 习 维生素 C 的 生理 功能 和 性 质 , 掌握 用 2,6 -二 毛 酚 靛 酚 法 测定 维生素 C 的 原理 和 方法 。 - 102 - ver, TREE 维生素 C 是 一 种 水 溶性 维生素 , 是 人 类 营养 中 最 重要 的 维生素 之 一 , ARR 乏 维生素 C 时 会 出 现 坏 血 病 ,因此 它 又 被 称 为 抗坏血酸 。 此 外 维生素 C 还 具有 预 防 和 治疗 感冒 以 及 抑制 致癌 物质 产生 的 作用 。 维生素 C 的 分 布 很 广 , CTE ZK AR OR AR BG HP LL 等 ) 和 蔬菜 (苋菜 芹菜 青椒 、 菠 菜 、 黄 瓜 、 番 茄 等 ) 中 的 含量 更 为 丰富 。 抗坏血酸 NA oH Cl 2,6- _—AMRM y (红色 ) O 4 T OF Cl ha sds ls n-< 0H wr Cl H ( 蓝 色 ) ide 还 原型 2,6 -二 毛 酚 靛 酚 CHOH (无 色 ) 脱 氢 抗坏血酸 不 同 栽培 条 件 、 不 同 成 熟 度 和 不 同 的 加 工 贮藏 方法 , 都 可 以 影响 水 果 、 蔬 菜 的 抗坏血酸 含量 。 测 定 抗坏血酸 含量 是 了 解 果蔬 品质 高 低 及 其 加 工 工艺 成 效 的 重要 指标 。 维生素 C 在 金属 铜 和 抗坏血酸 氧化 酶 存在 下 极 易 氧化 ,因此 , 在 用 铀 制品 做 食品 时 , 维生素 C 易 丢 失 。 此 外 在 碱 性 溶液 中 , 维生素 C 也 易 被 破坏 , 而 在 酸性 溶 液 中 比较 稳定 。 利 用 它 具 有 的 还 原 性 质 可 测定 其 含量 。 还 原型 抗坏血酸 能 被 染料 2,6 -二 氧 酚 靛 酚 氧 化 为 脱 氢 型 , 该 染料 在 碱 性 溶液 中 呈 蓝 色 , 在 酸性 溶液 中 呈 红 色 , 被 还 原 后 变 为 无 色 。 因 此 用 2, 6 -二 氧 酚 靛 酚 滴定 含有 维生素 C 的 酸性 溶液 - 103 - 时 ,维生素 C Pah AS AY, 则 滴 下 的 染料 立即 使 溶液 变 成 粉红 色 , 当 溶 液 中 的 抗坏血酸 全 部 被 氧化 成 脱 氨 抗 坏 血 酸 时 , 滴 入 的 2,6 -二 氧 酚 靛 酚 立 即使 溶液 呈 现 淡 红 色 。 用 这 种 染料 滴定 抗坏血酸 至 溶液 呈 淡 红色 为 滴定 终点 ,根据 染料 消耗 量 即 可 计算 出 样品 中 还 原型 抗坏血酸 的 含量 。 = Mak ik Fl Al Ht BL 1. 仪器 (1): (2) 组 织 的 碎 机 (3) 微量 滴定 管 (Sml) (4) 容量 瓶 ($0ml) (5) 刻度 吸管 (Sml，10ml) (6) 锥 形 瓶 (100ml) 2. 试剂 (1) 1% 草 酸 溶液 :草酸 1g AF 100ml 蒸馏 水 中 (2) 2% 草 酸 溶液 :草酸 2g WF 100ml 蒸馏 水 中 (3) 抗坏血酸 标准 溶液 (0.1mg/ml) :精确 称 取 10mg 纯 抗 坏 血 酸 ( 应 为 洁白 色 , 如 变 为 黄色 则 不 能 用 ) 用 1% 草 酸 溶液 溶解 并 定 容 至 100ml。 此 溶液 应 贮存 于 棕色 瓶 中 , 最 好 临 用 前 配制 。 (4) 0.05% 2,6 -二 氧 酚 靛 酚 溶液 : 称 取 500mg 2,6 -二 氯 酚 靛 酚 溶 于 300ml & 104mg 碳酸 氧 钠 (A.R) 的 热 水 中 ,冷却 后 用 蒸馏 水 稀释 至 1000ml, 滤 去 不 溶 物 ， 贮存 于 棕色 瓶 中 ,4 人 冷藏 可 稳定 一 周 , 临 用 前 以 标准 抗坏血酸 标定 。 3. 材料 新 鲜 水 果 或 蔬菜 四 、 操 作 步 又 1. 提取 抗坏血酸 取 新 鲜 水 果 或 蔬菜 50g, 加 入 50ml 2% BRIM, HAART ROR, 滤 取 得 滤液 , 滤 饼 可 用 少量 2% 的 草酸 洗 几 次 ,合并 滤液 ,记录 滤液 体积 。 2. 2,6 RRS RN HE 准确 吸取 4.0ml 抗坏血酸 标准 液 ( 含 0.4g 抗坏血酸 ) 于 100ml 锥 形 瓶 中 , 加 16ml 1% 草 酸 溶液 ,用 2,6 -二 氧 酚 靛 酚 滴定 至 淡 红 色 (15 秒 内 不 褪色 即 为 终点 )。 。， 104 - 记录 所 用 染料 溶液 的 体积 ,计算 出 1ml 染料 溶液 所 能 氧化 抗坏血酸 的 量 。 3. 样品 滴定 准确 吸取 样品 提取 液 两 份 , 各 20ml, 分 别 放 入 两 个 100ml EHH, 滴定 方法 同 2 中 的 操作 , 另 取 20ml 1% 草 酸 作 空白 对 照 滴定 。 五 结果 处 理 取 两 份 样品 滴 定 所 耗 用 染料 体积 的 平均 值 ,代入 下 式 计算 100g 样品 中 还 原型 抗坏血酸 的 含量 : 抗坏血酸 含量 (mg/100g 样品 ) = AP, Vy 为 滴定 样品 所 耗 用 的 染料 的 平均 毫升 数 ; V2 为 滴定 空白 对 照 所 耗 用 的 染料 的 平均 毫升 数 ; V 为 样品 提取 液 的 总 体积 ; Vs3 为 滴定 时 所 取 的 样品 提取 液 的 训 升 数 ; M 为 Iml 染料 所 能 氧化 抗坏血酸 的 量 (mg)( 可 由 操作 2 计算 得 到 ); W 为 待 测 样品 的 重量 (g)。 (1) 用 本 法 测定 抗坏血酸 含量 虽 简 便 易 行 ,但 有 下 述 缺 点 :第 一 ,本 法 只 能 测 定 还 原型 抗坏血酸 , 不 能 测 出 具有 同样 生理 功能 的 氧化 型 抗坏血酸 和 结合 型 抗 坏 血 酸 。 第 二 , 样品 中 的 色素 经 常 干扰 对 终点 的 判断 , 虽 可 预先 用 白 陶 土 脱色 ,或 加 A2~3 ml 二 氧 乙 烷 ,以 二 氯 乙 烷 层 变 红 为 终点 ,但 实际 上 仍 难免 产生 误差 。 (2) 用 2% 草 酸 制备 提取 液 , 可 有 效 地 抑制 抗坏血酸 氧化 酶 , 以免 抗 坏 血 酸 变 为 氧化 型 而 无 法 滴定 , 而 1% 的 草酸 无 此 作用 。 (3) 如 样品 中 有 较 多 亚 铁 离子 (Fe ) 时 , 也 可 使 染料 还 原 而 影响 测定 , 这 时 应 改 用 8% 乙 酸 代替 草酸 制备 样品 提取 液 , 此 时 Fe 不 会 很 快 与 染料 起 作用 。 (4) 如 样品 浆 状 物 泡沫 过 多 , 可 加 几 滴 辛 醇 或 丁 醇 消 泡 。 (5) 市 售 的 2,6 -二 氧 酚 靛 酚 质量 不 一 ,以 标定 0.4mg 抗坏血酸 消耗 2ml 左右 的 染料 为 宜 , 可 根据 标定 结果 调整 染料 溶液 浓度 。 (6) 样品 提取 制备 和 滴定 过 程 中 , 要 避免 阳光 照射 和 与 铜 、 铁 器 具 接 触 , 以免 破坏 抗坏血酸 。 (7) 滴定 过 程 宜 迅 速 ,一般 不 超过 2min。 样 品 滴定 消耗 染料 1 一 4ml 为 宜 , 如 超出 此 范围 ,应 增加 或 减少 样品 提取 液 的 用 量 。 (8) FER MARY OA Dive, 亦 可 进行 离心 收集 上 清 液 。 (VI-V)xVxMx1l00 V;xW - #05 ~ 七 、 思 考题 1. 维生素 C 具有 什么 性 质 和 生理 功能 ? 2. 为 了 在 实验 中 得 到 准确 的 抗坏血酸 含量 应 注意 哪些 问题 ? 参考 文献 冯 盗 主编 .维生素 趣 谈 . 重 庆 : 四 川 科学 技术 出 版 社 , 1999 李 建 伍 等 .生物 化 学 实验 原理 和 方法 .北京 :北京 大 学 出 版 社 ,2001 文 树 基 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1994 Strong, F.M. and Koch, G.H., Biochemistry, Laboratory Manual, WM.C. Brown Co. Publishers, Iowa, USA, 1974 “ep ° 第 三 单元 ”重点 实验 验 十 六 “脂肪 含量 的 测定 及 高 级 脂肪 酸 组 分 分 析 ( 气 相 色谱 法 ) “加 的 高 级 脂肪 酸 与 丙 三 醇 或 高 级 一 元 醇 能 生成 单 脂 , 单 脂 再 与 磷酸 、 含 氨 碱 或 糖 类 结合 可 构成 复合 脂 。 单 脂 和 复合 脂 参 与 细胞 、 细 胞 器 等 结构 组 成 , 具有 多 方面 的 生 物 学 功能 。 高 级 脂肪 酸 的 差异 , 往往 赋予 不 同 的 物种 、 品 种 或 个 体 具 有 不 同 的 遗传 或 生理 特性 。 高 级 脂肪 酸 中 的 亚 油 酸 、 亚 麻 酸 、 花 生 四 烯 酸 等 是 人 和 动物 的 必需 脂 肪 酸 , 完全 依赖 从 食物 中 获得 。 因 此 , 生物 材料 或 农 牧 产品 中 高 级 脂肪 酸 组 分 的 分 析 在 生物 科研 和 食品 营养 评价 中 都 具有 重要 意义 。 本 实验 介绍 脂 类 的 抽 提 定量 方 法 ;通过 油脂 高 级 脂肪 酸 组 分 的 定性 定量 分 析 , 了 解 气相 色谱 仪 的 结构 、 原 理 及 在 生化 分 析 中 的 应 用 。 aS 原理 油脂 易 溶 于 乙醚 、 石 油 醚 或 正己 烷 中 , 因此 用 有 机 溶剂 抽 提 , 然后 用 油 重 法 或 残 重 法 测定 油料 中 油脂 的 含量 。 油 脂 在 碱 性 条 件 下 水 解 形成 的 脂肪 酸 挥发 性 小 ， 不 易 气 化 ,因此 在 分 析 前 , 必须 将 脂肪 酸 进 行 甲 酯 化 处 理 , 然后 经 气相 色谱 仪 分 离 即 可 确定 脂肪 酸 组 分 及 含量 。 三 、 仪 右 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 分 析 天 平 (2) 恒温 水 浴 (3) 索 氏 脂肪 抽 提 器 (4) 气相 色谱 仪 (5) ABM ”10mlx1l (6) 吸管 lmlx2 2. 试剂 (1) 石油 醚 ( 沸 程 30 一 607 ) - 107 - (2) 0.4mol/L RAkLA-FRBAR 11.2 氢 氧 化 钾 用 甲醇 溶解 并 定 容 至 500ml. (3) 1:1°V/V) 4 ARS EVIE RK (4) 无 水 乙醇 3. 材料 油料 ,植物 油 或 动物 油 DO. Hever RR 1. 脂肪 定量 (1) 安装 好 索 氏 脂肪 抽 提 器 。 下 部 烧瓶 约 1/3 浸入 水 浴 水 中 。 (2) 将 待 测 材料 全 粉 置 于 100Y 烘箱 中 烘 干 , 称 取 10g, 装 入 用 石油 醚 处 理 过 的 已 知 重量 的 滤纸 简 内 , 盖 上 处 理 过 的 脱脂 棉 一 块 (重量 已 计 )。 将 纸 简 置 入 抽 提 简 中 , 并 于 其 内 加 入 1/3 容积 的 石油 醚 浸润 样品 。 下 部 烧瓶 内 装 入 其 1/3 容积 的 石油 栈 。 然 后 将 仪器 连接 好 。 打 开 冷 却 水 ,开启 水 浴 , 使 水 温 保 持 在 50 ~60T ( 夏 R)K 60~70C (冬天 )。 石 油 醚 沸腾 后 开始 回流 提取 , 约 需 12 一 16 h( 样 品 预先 用 石油 醚 浸润 数 h 或 过 夜 ,可 适当 缩短 回流 时 间 )。 (3) 提取 完成 后 ,关闭 水 浴 和 冷却 水 ,取出 纸 简 , 立 于 干净 烧杯 中 , 置 室 外 或 通 风 橱 内 挥发 掉 残 留 石 油 醚 , 然后 置 100Y 烘箱 中 烘 8 h。 取 出 后 放 入 干燥 器 内 冷 Al, 称 重 ( 残 重 法 )。 (4) 所 有 溶剂 转 入 下 部 烧瓶 ,用 蒸馏 法 回收 溶剂 。 所 得 油脂 烘 干 残留 溶剂 后 称 重 ( 油 重 法 )。 2. 油脂 中 高 级 脂肪 酸 的 气相 色谱 分 析 (1) 脂 肪 酸 甲 酯 化 处 理 称 取 制 得 油脂 约 SOmg, KA 10ml 容量 瓶 中 , 加 入 lml 石油 醚 与 苯 的 混合 液 ， 使 油脂 溶解 。 再 加 入 lml 氧 氧化 钾 - 甲醇 溶液 ,摇动 min, 室温 下 项 置 10min。 用 蒸馏 水 定 容 , 翻转 几 次 容量 瓶 , 使 有 机 相 上 浮 。 如 果 上 层 液 混 儿 , 可 加 少量 无 水 乙 醇 澄清 。 取 上 层 液 直 接 进 行 气相 色谱 分 析 。 (2) 测 定 条 件 检测 器 FID( 氢 火焰 离子 化 检测 器 ) 色谱 柱 2mx3mnm 玻璃 柱 两 根 固定 液 6%DEGS( 聚 二 乙 二 醇 丁 二 酸 酯 ) 担 体 101 白色 担 体 ( 酸 洗 ,60 一 80 目 ) 气 化 室 、 检 测 器 温度 250TC “ 108 - 195T N>, 40ml/min 1.5 kg/cm? 1.2 kg/cm’ ERE SyplAA (3) 开 机 步骤 1) 接 通 电源 , a oh fa ae, 调 电 压 至 220V。 2) 打开 载 气 钢瓶 主 阁 , HO KAR AI 5 kg/cm’. FTF MAR ARIE. 调节 1.2 路 载 气 为 40ml/min。 3) 在 文件 中 设 定 柱 温 、 气 化 室 、 检 测 器 温度 。 4) 打开 柱 箱 门 , 先 对 气 化 室 、 检 测 器 加 温 。 待 快 达到 设 定 温度 时 关上 柱 箱 门 ， 使 柱 温 升 高 至 设 定 值 。 5) FRA SEAL, 调节 氢气 为 1.5 kg/cm’, 空气 为 0.3 kg/cm2。 接 通 点 火 开 关 , 同时 加 大 空气 压力 ,至 点 火 成 功 。 6) 打开 发 火 机 电源 , 按 要 求 调 节 量 程 及 衰减 。 7) 打开 记录 仪 电源 , 将 记录 笔调 至 零 位 。 8) 半 小 时 后 , 待 基线 稳定 后 进行 分 析 。 (4) 定性 分 析 根据 各 峰 的 保留 时 间 与 已 知 脂肪 酸 的 标准 色谱 图 比较 进行 定性 。 (5) LEDER 采用 面积 归 一 化 法 进行 定量 分 析 。 Ty, 一 口 结果 处 理 1. 脂肪 含量 at at At ht Hy bt sa HE 粗 脂 肪 (% ) = 其 中 , WwW 为 样品 干 重 (g); Wi ip vapes tats a 2. 脂肪 酸 的 定性 与 定量 根据 打印 结果 作出 报告 。 六 、 注 意 事项 (1) 含油 量 高 的 样品 , 抽 提 脂肪 之 前 最 好 能 用 石油 醚 浸泡 样品 过 夜 。 (2) 抽 提 脂肪 时 注意 实验 室 通风 。 * x 100 - 109°» 七 、 思 考题 高 级 脂肪 酸 气相 色谱 分 析 的 原理 是 什么 ? 分 析 前 为 什么 要 进行 酯 化 处 理 ? SX PARE . HE EE ER . Ie: Bd AR RAL, 1995 REE, 纪 重 光 . 现 代 分 析 仪器 与 测试 方法 .西安 :西北 大 学 出 版 社 , 1994 实验 十 七 ” 单 核 苷 酸 的 离子 交换 柱 层 析 分 离 rae RERELAWET ES LRA SRR PRABEZSRY. AHR RH 酸 生 产 除 了 用 微生物 直接 发 酵 外 , 主要 是 结合 综合 利用 ,用 酿酒 酵母 .白地 霉 、 谷 氨 酸 菌 体 、 青 霉菌 菌 丝 体面 包 酵 母 等 抽 提 核酸 , BAM SS (Penicllium citriuzza ) 产 生 的 5’ -磷酸 二 酯 酶 在 最 适 条 件 (pH 5.2, 75°C ) 下 酶 解 RNA, 得 4 种 S$- 单 核 苷 酸 混合 物 。 本 实验 通过 用 离子 交换 树脂 分 离 AMP、\GMP、CMP、UMP, 学 习 和 和 掌握 核 苷 酸 生 产 中 下 游 工 程 的 离子 交换 柱 层 析 分 离 技术 , 也 为 熟练 应 用 液 相 色谱 葛 定 基 础 。 =, JR 离子 交换 层 析 是 指 溶液 中 的 离子 通过 和 交换 剂 上 的 解 离 基 团 进 行 连续 、 竞 争 性 的 交换 平衡 而 达到 分 离 目的 的 方法 。 包 括 吸 附和 洗 脱 两 个 过 程 , 而 且 都 是 根据 质量 作用 定律 进行 的 。 阳离子 交换 剂 时 Re Cr + Cf 一 REC2 +C 阴离子 交换 剂 时 RAAT + Ay 一 RAA + Ap R 代表 离子 交换 剂 骨架 ; CTA -分别 代 表 阳 离子 和 阴离子 。 要 成 功 地 分 离 某 物质 , 必须 根据 该 物质 的 解 离 性 质 ,选择 适当 类 型 的 离子 交换 剂 ,并 控制 吸附 和 洗 脱 条 件 。 核 苷 酸 分 子 内 可 解 离 的 基 团 是 氨基 、 烯 醇 基 和 磷酸 基 , 它们 是 进行 离子 交换 层 析 分 离 的 基础 。 四 种 单 核 苷 酸 的 解 离 常数 (pK ) WE BY OL, HeBEZERS pK 值 在 9.5 左右 ,此 pK (A -MAATRPRND 离 。 四 种 核 苷 酸 的 磷酸 基 一 级 解 离 、 二 级 解 离 的 pK 值 比较 接近 , 不 能 用 作 彼此 分 离 的 主要 依据 。 而 氨基 (UMP 无 氨基 ) 却 不 同 , 它们 的 pK AE 2~S 之 间 相 差 很 大 , 在 离子 交换 层 析 分 离 中 起 着 决定 性 的 作用 。 本 实验 采用 阳离子 交换 树脂 分 离 四 种 核 苷 酸 。 在 pH 1.5 时 , 核 苷 酸 的 磷酸 基 大 部 分 解 离 带 负电 荷 。UMP 因 无 氨基 , 所 以 其 净 电 和 荷 为 负 值 , 不 与 阳离子 交换 树 虽 发 生 吸 附 , 在 洗 脱 时 直接 流出 来 ,而 AMP.CMP.GMP 具有 氨基 , 在 此 pH 条 件 下 解 离 带 正 电荷 , 分 子 的 净 电 荷 为 正 值 ,被 阳离子 交换 树脂 吸附 。 在 pH 2 一 5 之 间 各 种 核 苷 酸 氨基 的 pK 值 不 同 , 净 电荷 产生 明显 的 差异 。 因 此 , 当 用 无 离子 水 进行 洗 脱 时 , 便 可 将 它们 一 一 分 开 。 图 17.1 表示 核 苷 酸 分 子 的 净 电 荷 与 pH 之 间 的 关 系 。 静电 荷 图 17.1 核 苷 酸 分 子 的 净 电 荷 与 pH 的 关系 根据 图 17.1 分 析 , 理论 上 的 洗 脱 次 序 应 是 UMP—>GMP—AMP—CMP, 而 实 际 的 分 离 顺 序 却 是 UMP->GMP->~CMP->AMP, 这 是 由 于 应 用 聚 葵 乙 烯 树脂 为 交 换 剂 时 , 树脂 对 味 叭 碱 的 吸附 能 力 大 于 对 喀 喧 碱 的 吸附 能 力 ( 非 极 性 吸附 ) ,电荷 及 非 极 性 吸附 综合 作用 的 结果 ,致使 AMP 和 CMP 的 洗 陪 位 置 发 生 互 换 。 四 种 核 苷 酸 混合 样品 上 柱 后 用 蒸馏 水 洗 脱 , UMP 最 先 洗 出 , 以 后 随 着 流出 液 人 ' pH 逐步 升 高 , GMP 和 CMP 分 别 相 继 洗 下 , 再 经 一 段 较 长 的 无 核 苷 酸 空白 区 ， AMP 才 最 后 流出 。 为 缩短 整个 洗 脱 过 程 ,用 蒸馏 水 将 UMP、GMP、CMP 洗 下 后 ， 换 用 3% NaCl 作 洗 脱 液 , 增加 竞争 性 离子 强度 , 减弱 树脂 的 吸附 作用 ,使 AMP 提 前 洗 出 。 洗 脱 情况 用 核酸 蛋白 检测 仪 和 记录 仪 进行 监测 , 洗 下 的 不 同 组 分 由 部 分 收集 器 进行 分 步 收集 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) fait (2) FRE ARMM (3) BBO WC Se at (4) 计 滴 器 (5) waetX (6) 酸度 计 (7) BARE 1X 20cm 8% 1.5 X 30cm (8) YAR 500ml x 2 (9) 皮 头 滴 管 x2 2. 试剂 (1) $ -AMP+5 - GMP +5’ - CMP +5’ -UMP 混 合 液 (各 含 1Imgy/ml) (2) 3% NaCl BE AS Chis — Cf AS Ts 7) BF 3 $B A A (EE 9 Ber ah ) BK fe] AS AY Zerolite( 32), PO. PRE AAR 1. 离子 交换 树脂 的 前 处 理 新 树脂 先 用 水 浸泡 , 以 浮 选 法 去 除 漂浮 物 及 杂质 后 ,用 1 mol/L NaOH BK, 再 用 蒸馏 水 洗涤 到 近 中 性 ;以 1 mol/L HCl 浸 洗 , 再 以 蒸馏 水 洗涤 到 近 中 性 。 如 此 反复 处 理 2 次 ,最 后 水 洗 至 中 性 , 待 用 。 2. 装 柱 垂直 固定 好 层 析 柱 , 在 经 过 前 处 理 的 树脂 中 加 入 少量 蒸 馆 水 , BEAD, 缓 缓 地 加 到 柱 内 ,然后 打开 下 端 活塞 或 止 水 夹 , 边 排水 边 继 续 加 树脂 (注意 切 纪 使 树脂 床 面 暴露 于 空气 中 ), 直至 树脂 床 高 度 达 层 析 柱 的 3/5~4/5 左右 。 要 求 柱 内 均匀 无 气 泡 ,无 明显 界面 , 床 面 平 整 。 柱 子 装 好 后 , 需 用 蒸馏 水 流 过 , 平衡 过 夜 。 - 112° a SS -~ 3. 安装 仪器 ”参照 附录 十 六 之 (六 )、( 七 ) 等 安装 、 调 试 好 恒 流 和 泵 、 部 分 收集 器 、 计 滴 器 、 核 酸 蛋白 检测 仪 . 记 录 仪 等 备用 。 4. DARA 加 样 前 , 层 析 柱 先 用 0.03 mol/L HCl 流 过 , 直至 流出 液 pHiA 1.5, 将 树脂 床 表面 多 余 之 液体 用 滴 管 轻 轻 地 吸 去 , 再 用 滴 管 沿 柱 壁 缓 缓 加 入 适量 样品 (注意 不 要 扰动 床 面 ), 打开 层 析 柱 下 端 活 塞 或 止 水 夹 ,样品 入 床 后 ,立即 用 少 量 蒸 馏 水 将 层 析 柱 内 表面 粘 附 的 样品 洗 下 , 再 在 床 表面 加 2 一 3 cm 蒸馏 水 , 戴 上 柱 帽 用 恒 流 泵 加 洗 脱 液 ( 蒸 馏 水 ), 用 部 分 收集 器 进行 分 部 收集 , 核酸 蛋白 检测 仪 ( 波 长 254 nm) 检 测 结果 , 在 记录 仪 上 自动 绘 出 洗 脱 和 出 峰 曲 线 。 当 3 个 峰 出 完 后 , 换 用 3% NaCl 继续 洗 脱 至 第 4 个 峰 (AMP) 出 完 , 记录 笔 回 到 基线 。 5. 柱 再 生 最 后 用 0.03 mol/L HCI 过 柱 , 待 流出 液 bpDH 达 1.5 时 , 柱子 已 经 再 生 , 可 以 重 复 利 用 。 五 、 结 果 处 理 根据 出 峰 时 间 , 可 确定 四 种 核 苷 酸 的 收集 高 峰 管 。 可 用 电泳 或 薄 层 层 析 鉴 定 其 种 类 , 是 否 与 本 实验 一 致 。 (1) 离子 交换 树脂 类 型 一 定 要 选 对 , 处 理 彻底 , 转型 合适 。 (2) 层 析 柱 一 定 要 装 好 , 它 直接 影响 分 离 效 果 。 (3) 整套 液 相 色谱 设备 较为 复杂 , 充分 利用 洗 脱 过 程 的 等 待 时 间 , 详细 了 解 各 种 仪器 的 结构 原理、 正确 使 用 方法 故障 产生 原因 及 排除 方法 等 。 七 、 思 考题 1. GRAM Aw? 如 何 生产 ? 2. 离子 交换 柱 层 析 分 离 核 苷 酸 的 原理 是 什么 ? 3. 何谓 离子 交换 树脂 的 转型 ?有 什么 作用 ? 根据 什么 原则 进行 转型 处 理 ? 4. 可 和 否 用 浮 选 法 处 理 阴 离子 交换 树脂 ? 为 什么 ? SX PRE . ALE OF FEAR AR . ACR sR tH LL, 1995 ~ be - AAS, BUNS, 周 润 琦 等 .生物 化 学 实验 .上 海 : 上 海 科学 技术 出 版 社 , 1981 中 山大 学 生物 系 生化 微生物 学 教研 室 .生化 技术 导论 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1978 实验 十 八 _RuBP 羧 化 酶 -加 和 氧 酶 的 纯化 —. 目的 RuBP 羧 化 酶 -加 氧 酶 存在 于 叶绿体 中 , 其 含量 约 占 叶绿体 间 质 蛋白 的 50% 以 上 ,其 分 子 质量 约 为 Sx105 一 6x105Da, 具有 羧 化 和 加 氧 的 双重 功能 ,在 光合 作用 中 具有 重要 的 作用 。 本 实验 通过 对 RuBP 羧 化 酶 -加 氧 酶 的 提取 、 纯 化 ,了 解 并 掌 握 蛋 白质 纯 化 的 一 般 方 法 。 =. RE RuBP 羧 化 酶 -加 氧 酶 是 一 种 可 溶性 蛋白 质 , 经 盐 析 可 使 其 沉淀 出 来 , 再 经 凝 胶 层 析 脱 盐 和 分 离 , 可 使 其 纯化 。 BEBO, 又 称 凝 胶 过 滤 法 , 是 利用 凝 胶 把 分 子 大 小 不 同 的 物质 分 离开 的 一 种 方法 。 当 待 分 离 的 物质 缓慢 流 经 凝 胶 柱 时 , 各 物质 分 子 在 柱 内 同时 进行 两 种 不 同方 向 的 运动 , 即 垂直 向 下 的 移动 和 无 定向 的 扩散 运动 。 由 于 大 分 子 不 能 进入 北 胶 颗粒 内 部 而 沿 凝 胶 颗 粒 间 的 间隙 最 先 流出 柱 外 , 而 小 分 子 可 以 进入 凝 胶 内 部 , 向 下 运动 路 线 迁 回 曲折 , 流速 缓慢 , 以 臻 最 后 流出 柱 外 , 从 而 使 样品 中 分 子 大 小 不 同 的 物质 得 到 分 离 。 凝 胶 层 析 技 术 操 作 方 便 , 设备 简单 ,重复 性 好 , 而 且 条 件 温 和 , 一 般 不 会 引起 生物 活性 物质 的 变化 。 三 、 仪 器 与 试剂 1. 仪器 (1) 层 析 柱 2.0x30cm 及 2.0x70cm 各 一 套 (2) BARA (3) 冷冻 离心 机 (4) 部 分 收集 器 (5) BBE ARM (6) Thi A (7) 记录 仪 (8) 恒温 水 浴 (9) 磁力 搅拌 器 (10) HAR - 114 - 2. 试剂 (1) Tris-HCl 缓冲 液 (pPH7.4) 缓冲 液 A: 内 含 0.0SmoVL Tris - HCl, 1.0mol/L NaCl, 0.001mol/L EDTA, 0.002mol/L MgCl, 0.08mol/L 8B- 琉 基 乙 醇 (为 洗 脱 液 )。 缓冲 液 B: 内 含 0.025mol/L Tris - HCl, 0.2mol/L NaCl, 0.0005mol/L EDTA。 (2) (NH4)2SO4 3. 材料 (1) Sephadex G-S0 和 G-200 (2) 纱布 (3) 冰 块 (4) BER 四 、 操 作 步 又 1. 酶 粗 提 液 制 备 取 新 鲜 菠 菜 叶 片 100g, 洗 净 泥 沙 , 用 蒸馏水 冲洗 三 遍 , 纱布 吸 干 水 , BYE, 加 入 100ml 的 缓冲 液 A, 用 组 织 的 碎 机 匀 浆 。 匀 浆 用 4 层 纱布 挤 压 过 滤 , 滤液 置 于 烧杯 中 ,在 SSC 恒温 水 浴 中 保温 Smin, 随后 在 冰 浴 中 冷却 至 20C 。 然 后 用 冷冻 离心 机 离心 (48 000g, 30min), 小 心 倾 出 上 清 液 即 为 RuBP 羧 化 酶 粗 提 液 。 2. (NH,)2SO, 盐 析 部 分 纯化 准确 计量 酶 粗 提 液 体积 ,计算 35% 饱和 度 所 需 的 (NH4)2SO4 量 , 在 磁力 搅拌 下 慢 慢 加 入 (NH4)2SO4, 4°C 静 置 20min, 48 000g 离心 去 杂 和 蛋白 。 上 清 液 再 加 (NHy)2SO, 至 65% 饱 和 度 , 4°C HH 20min, 离心 收集 沉淀 。 将 沉淀 溶 于 20ml 组 冲 液 B 中 , 即 为 部 分 纯化 的 酶 液 , 供 进一步 纯化 。 3. Sephadex G - 50 脱盐 (1) 溶 胀 凝 胶 取 一 定量 的 Sephadex G - 50 于 烧杯 中 ( 视 层 析 柱 容积 而 定 ), 用 足 量 的 缓冲 液 A 充分 溶 胀 。 在 室温 下 溶 胀 ,Sephadex G- 50 需 6~8 h。 为 缩短 溶 胀 时 间 , 可 在 沸 水 浴 中 进行 溶 胀 ,一 般 只 需 1~2 h。 溶 胀 好 的 凝 胶 , 稍 加 静 置 ,用 虹吸 法 除去 含有 细 颗 粒 的 上 层 液 , 然后 再 加 缓冲 液 A 用 玻璃 棒 轻 轻 搅 拌 , 稍 静 置 , 待 大 部 分 凝 胶 沉 ta, 再 利用 虹吸 法 除去 含有 细 颗 粒 胶 的 上 层 液 。 如 此 反复 操作 多 次 ,直至 无 细 颗 = #15 ° 粒 为 止 。 最 后 将 漂洗 好 的 凝 胶 在 真空 干燥 器 中 减 压 脱 气 。 (2) Rte 取 层 析 柱 一 支 , ERMETRKRAL, 在 下 口 连接 带 有 滴 嘴 的 乳胶 管 。 层 析 柱 中 注入 缓冲 液 A 约 5 一 10 cm( 要 防止 下 端 出 口 寅 藏 气泡 ), 夹 上 螺旋 止 水 夹 , 同时 在 层 析 柱 的 瓷 必 上 铺 一 块 400 目 圆 形 尼龙 网 。 将 脱 气 后 的 凝 胶 用 玻璃 棒 搅 义 。 打 开 螺旋 止 水 夹 ,用 一 烧杯 承接 流水 。 沿 玻 璃 棒 倒 入 凝 胶 浆 , 凝 胶 逐 渐 沉 降 。 当 胶 床 表面 仅 有 2 cm 液 层 时 , 旋 紧 螺旋 夹 。 床 面 上 履 盖 一 块 圆 形 滤 纸 片 ,以 防止 不 溶 物 侵入 床 面 和 液 滴 对 床 面 的 冲击 。 为 了 防 止 胶 床 分 层 , 最 好 一 次 装 完 。 如 分 几 次 填 装 , 在 二 次 填 装 前 应 在 已 经 沉 演 的 表面 用 玻璃 棒 轻 轻 搅拌 后 再 倾注 , 重复 这 一 过 程 直 至 装 到 需要 的 高 度 。 层 析 柱 下 口 与 核酸 蛋白 检测 仪 连接 , 继而 连接 部 分 收集 器 。 连 接 恒 流 泵 于 柱 上 端 ,用 3 倍 柱 体积 的 缓冲 液 A 进行 平衡 后 即 可 使 用 。 (3) L# 上 样 前 胶 床 表面 只 留 约 1 mm WOR, 然后 吸取 适量 样品 提取 液 , ) -D MBE Ht 柱 床 面 中 央 , 开启 收集 右 , 打开 螺旋 夹 开始 收集 。 同 时 调节 好 记录 仪 。 待 大 部 分 样 液 进入 胶 床 , 床 面 上 仅 有 Umm 左右 液 层 时 , 再 用 少量 洗 脱 液 淋 洗 床 面 和 柱 壁 两 次 。 但 要 尽量 避免 样品 的 稀释 。 之 后 ,用 滴 管 小 心 加 入 3~5 cm 的 洗 脱 液 , 戴 上 柱 帽 ， 用 恒 流 和 泵 输液 。 调 整流 速 ,使 上 下 流速 同步 。 (4) RL KR fe ER 将 部 分 收集 器 收集 的 各 管 洗 脱 液 与 记录 仪 上 的 洗 脱 峰 相 比 较 , 确定 蛋白 峰 对 应 的 管 号 。 4. sephadex G - 200 进一步 纯化 将 sephadex G - 50 柱 层 析 所 得 蛋白 高 峰 管 合并 , 对 缓冲 液 B 透析 后 ， 加 sephadex G- 200 柱 ( 装 柱 等 同 sephadex G - 50), 用 缓冲 液 B 洗 脱 ,收集 蛋白 高 峰 管 溶液 。 五 、 结 果 处 理 将 sephadex G - 200 柱 层 析 收 集 到 的 蛋白 高 峰 管 溶液 合并 , 置 冰箱 中 保存 , HE 备用 电泳 检测 (实验 十 九 ) 。 (1) 凝 胶 层 析 柱 装填 是 否 均匀 与 分 离 效 果 好 坏 关 系 密切 。 装 填 不 符合 要 求 应 倒 出 重 装 。 (2) 不 同型 号 的 凝 胶 有 不 同 的 操作 压力 ,G- 50 柱 的 操作 压力 为 0 一 100 cm, G-200 柱 为 10 cm. * M16 ” (3) 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 为 糖 类 化 合 物 , 不 用 时 要 注意 防止 其 发 霉 或 长 菌 , 一 般 加 0.02 % HY & A 1k AH (NaN; ) 溶 液 防腐 。 七 、 思 考题 凝 胶 层 析 的 原理 是 什么 ? 在 实验 操作 中 应 注意 哪些 问题 ? 参考 文献 陈 簿 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农 业 出 版 社 , 1995 袁 静 明 . 凝 胶 层 析 法 及 其 应 用 .北京 :科学 出 版 社 , 1975 St ERP RREBKAME 蛋白 质 的 分 子 质量 及 纯度 23) Fas 了 解 连续 密度 梯度 电泳 法 测定 蛋白 质 分 子 质量 及 其 纯度 的 原理 ,学 习 和 掌握 连续 密度 梯度 电泳 的 操作 技术 。 了 原理 在 连续 密度 梯度 凝 胶 电 泳 中 , 蛋 白 质 在 电场 中 同 着 凝 胶 浓 度 逐 渐 增 高 的 方 回 即 孔 径 逐 渐 减 小 的 方向 迁移 。 随 着 电泳 的 继续 进行 , 重 白 质 受 到 孔径 的 阻力 愈 来 愈 大 。 起 初 , 蛋白 质 在 凝 胶 中 的 迁移 速度 主要 受 两 个 因素 影响 , 一 是 蛋白 质 本 身 的 FE fay 2 JE, 电荷 密度 愈 高 ,迁移 速度 愈 快 ;二 是 蛋白 质 本 身 的 大 小 , 分 子 质 量 愈 大 ， 迁移 速度 愈 慢 。 当 蛋白 质 迁 移 所 受到 的 阻力 大 到 足以 完全 停止 它 前 进 时 , 低 电 和 荷 密度 的 蛋白 质 将 “ 赶 上 "与 它 大 小 相似 但 具有 较 高 电荷 密度 的 蛋白 质 。 因 此 , 在 梯 度 凝 胶 电 泳 中 , 蛋白 质 的 最 终 迁移 位 置 仅 决定 于 它 本 身分 子 的 大 小 , 而 与 蛋白 质 本 身 的 电荷 密度 无 关 。 由 于 和 蛋白质 的 相对 迁移 率 与 其 分 子 质量 的 对 数 在 一 定 范围 内 呈 线 性 关系 , 因此 通过 制作 标准 曲线 , 在 相同 条 件 下 进行 未 知 样品 的 电泳 , 便 可 测 得 未 知 量 白 质 的 分 子 质量 。 梯 度 凝 胶 电 泳 可 提供 清晰 的 蛋白 质谱 带 。 可 用 于 鉴定 非 变 性 蛋白 质 的 纯度 。 =. Wat ih il A$ RL 1. 仪器 (1) F(A SE AR Uk (2) 梯度 混合 器 (3) Baa AR - 117 - (4) 微量 注射 器 (5) 脱色 摇 床 (6) HER (7) 台式 高 速 离心 机 (8) HB 2. 试剂 (1) 2% SAS 2g 琼脂 加 电极 缓冲 液 100ml, 于 水 浴 上 加 热 溶化 。 (2) 电极 缓冲 液 (0.09molL Tris -= 0.08mol/L 硼酸 - 0.0025mol/L EDTA, pH8.4) 称 取 10.90g Tris, 4.95g 硼酸 ，0.93g EDTA(EDTA:2Na:2H,0), 加 水 溶解 , EAE 1000ml。 (3) KERB PHL 10.75¢g Tris, 5.04g 硼酸 ，0.93g EDTA(EDTA.2Na. 2H2O), 溶 于 蒸馏 水 中 , EZ 100ml, 其 pH 为 8.3。 (4) BERR =O PH 57.6g Acr，2.4g Bis， 溶 于 凝 胶 缓 冲 液 中 , 定 容 至 100ml, 过 滤 , 存 冰箱 备用 。G@O) 称 取 7.68g Acr，0.32g Bis， 溶 于 凝 胶 缓 冲 液 中 , = AF 100ml, Wve, 存 冰 箱 中 备用 。 (5) 10% RRR 1g HME, DN 10ml 水 溶解 , 现 用 现 配 。 (6) TEMED( 19 #248 Z — &) (7) 25% 乙醇 (8) 脱色 液 ”甲醇 : 冰 乙酸 :水 =5S:1:5 (9) 染色 液 (0.25% 考 马 斯 亮 蓝 R250) 1g 考 马 斯 亮 蓝 R250, 用 脱色 液 400ml 溶解 。 (10) 低 分 子 质量 标准 蛋白 溶液 ”包括 溶菌 酶 (MW = 14 400) 大 豆 胰 和 蛋白 酶 抑制 剂 (21 500). BeAR BBS (31 000). 59 A HA (45 000)、 牛 血清 自 和 蛋白 (66 200)、 磷酸 化 酶 B(92 00)。 用 含 20% 芒 糖 (或 甘油 ) 的 电极 缓冲 液 将 标准 蛋 自 样品 配 成 lmg/ml 的 浓度 , 每 毫升 加 入 $ 凡 0.1% 溴 酚 蓝 染料 , ROSH. (11) 高 分 子 质量 标 准 蛋白 溶液 ”包括 卵 白 蛋白 (MW = 45 000)、 牛 血清 自 蛋 白 (66 200)、 磷 酸化 酶 B(92 500)、8 - 半 乳 糖苷 酶 (116 250)、 肌 球 蛋 白 重 链 (200 000) ,配制 方法 同上 。 . 材料 实验 十 八 制备 的 RuBP 羧 化 -加 氧 酶 。 四 、 操 作 步 又 (1) 在 制 板 支架 上 置 一 专用 有 机 玻璃 槽 , 将 固定 好 的 玻璃 板 下 部 插入 槽 内 , 中 部 用 两 个 文具 夹 固定 在 支架 竖 板 上 。 在 槽 内 倒 入 已 充分 溶化 的 琼脂 ,冷凝 后 封 财 - 118 胶 腔 底部 。 (2) 用 直径 约 2mm 的 聚 乙烯 管 连接 好 梯度 混合 器 、 恒 流 泵 、 凝 胶 模 。 (3) 30% 胶 液 的 配制 ” 取 $0ml 烧杯 一 只 , 加 凝 胶 贮 液 @@14ml, 水 14ml, 10% RAR EE Syl, 减 压 抽 气 10min。 (4) 4% 胶 液 的 配制 ” 取 S0ml 烧杯 一 只 , 加 将 胶 贮 液 @14ml, 水 14ml, 10% 过 MiP Syl, 减 压 抽 气 10min。 (5) 灌 制 梯度 胶 ”在 两 胶 液 中 分 别 加 入 TEMED 15yl, 25, 分别 吸取 18ml 胶 液 于 梯度 混合 器 相应 的 混合 杯 中 。 打 开 磁 力 搅拌 器 和 梯度 混合 器 开关 , 接 通 恒 流 泵 ,将 梯度 混合 器 中 的 胶 液 缓 缓 输入 胶 腔 中 。 事 先 应 将 输液 管 出 口 由 胶 腔 上 口 中 央 伸 向 底部 , 随 着 胶 腔 内 液 面 的 升 高 逐渐 提高 输液 管 , 使 管 口 始 终 接近 液 面 而 不 伸 入 液体 内 部 。 灌 胶 的 流速 要 适当 , 以 管 口 流 出 液 对 液 面 不 形成 冲击 为 好 。 (6) 灌 胶 完毕 后 , 在 液 面 上 小 心地 加 入 25% 乙醇 约 0.5cm 封闭 胶 面 。 静 置 半 小 时 左右 即 可 聚合 。 (7) 待 凝 胶 聚 合 后 , 倒 掉 乙 醇 溶液 ,用 滤纸 条 吸 干 上 层 残 留 液 ,吸取 Sml 4% 胶 液 ,加 入 Spl TEMED, 于 烧杯 中 轻 轻 摇 匀 , 加 到 梯度 胶 上 , 迅速 插入 样品 梳 , 样品 杭 下 沿 刚好 触及 梯度 胶 面 为 宜 , 静 置 聚合 。 (8) BERR Ala, 拔 掉 样品 梳 , 装 好 电泳 槽 ,在 上 下 槽 中 注入 电极 缓冲 液 。 (9) 待 测 样品 的 制备 同 标准 和 蛋白质, 制备 好 的 样品 用 微量 注射 器 点 样 , 每 样品 槽 点 样 25 一 50 pl. (10) ERA ith, 下 槽 为 正极 ,连接 好 电泳 仪 ,用 恒 压 (100V 左右 ) 或 恒 流 (20mA 左 右 ) 电 泳 。 当 指示 剂 跑 出 胶片 后 ,将 电压 升 高 至 130V, 继续 电泳 15h A 右 。 (11) 剥 胶 后 用 蒸馏 水 洗涤 胶片 , 然后 浸入 染色 液 中 4 一 S$ h 或 过 夜 。 取 出 后 用 自来水 稍 加 洗涤 , 置 于 脱色 液 中 振荡 脱色 , 中 途 更 换 脱色 液 数 次 , 直至 背景 清晰 为 止 。 五 、 结 果 处 理 (1) 分 子 质量 的 测定 ”以 凝 胶 中 迁移 距离 最 大 的 标准 蛋白 质 为 参考 点 , 计算 每 种 标准 蛋白 质 的 相对 迁移 率 (mzR) : _ 重 昌 质 从 原点 迁移 的 距离 “R ”从 原点 到 参考 点 的 距离 以 mp 值 为 横 坐 标 , 标准 蛋白 质 分 子 质量 的 对 数 为 纵 坐 标 , 绘制 标准 曲线 。 根 据 待 测 样品 的 相对 迁移 率 , 从 标准 曲线 上 查 出 其 分 子 质 量 的 对 数 , 即 可 求 出 分 子 质 量 。 (2) 重 昌 质 样品 纯度 鉴定 可 根据 待 测 样品 泳 道 出 现 条 带 的 数目 加 以 判定 。 ~ G29 « 六 、 注 意 事项 (1) Acr 和 Bis 有 神经 毒性 , 操作 时 避免 与 皮肤 接触 。 (2) 过 硫酸 欠 最 好 当天 配制 ,在 冰箱 中 贮存 不 能 超过 一 周 。 (3) 本 实验 至 少 要 达 2000 伏特 小 时 , 否则 影响 分 辨 率 及 结果 的 准确 性 。 (4) 根据 温度 等 条 件 , 可 以 适当 调整 过 硫酸 铵 及 TEMED 的 用 量 , 使 之 在 灌 胶 时 不 聚合 , 灌 完 胶 后 半 小 时 左右 聚合 。 七 、 思 考题 1. 连续 密度 梯度 电泳 法 测定 蛋白 质 分 子 质量 及 纯度 的 原理 是 什么 ?” ES SDS- PAGE 测定 分 子 质 量 有 何不 同 ? 2. 灌 制 梯度 胶 时 应 注意 的 事项 有 哪些 ? 参考 文献 陈 毓 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农 业 出 版 社 , 1995 张 龙 翔 , 张 庭 芳 等 .生化 实验 方法 和 技术 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 ,1992 实验 二 十 “过 和 氧化 物 酶 同 工 酶 聚 丙 烽 酰 胺 凝 胶 圆 盘 电 泳 一 同 工 酶 是 指 能 催化 同一 种 化 学 反应 , 但 酶 重 白 本 身 的 分 子 结构 组 成 却 有 所 不 同 的 一 组 酶 ,是 DNA 上 遗传 信息 表达 的 结果 。 同 工 酶 与 生物 的 遗传 .生长 发 育 、 代谢 调节 及 抗 性 等 都 具有 一 定 的 关系 。 过 氧化 物 酶 是 植物 体内 存在 的 活性 较 高 的 一 种 酶 , 与 呼吸 作用 、 光 合作 用 及 生长 素 的 氧化 等 都 有 关系 , 而 且 在 植物 生长 发 育 过 程 中 它 的 活性 不 断 发 生变 化 。 因 此 测定 过 氧化 物 酶 的 活性 或 其 同 工 酶 , 具有 重 要 的 意义 。 本 实验 采用 聚 丙 烽 酰 胺 凝 胶 圆 盘 电泳 ,分离 小 麦 幼 苗 过 氧化 物 酶 同 工 酶 。 用 电泳 技术 分 离 鉴 定 同 工 酶 ,方法 简便 , 灵敏 度 高 , 重 现 性 强 。 通过 本 试验 掌握 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 的 原理 及 其 操作 。 im. Je BE VAS i OB RE PGE IBS FL A BE FE ( Accra AA 3 WB Fl) A SC AL ei PE HE (Bits) ZE HEE 化 剂 作用 下 聚合 成 的 多 孔 介质 。 控 制 凝 胶 的 浓度 和 交 联 度 可 获得 符合 需要 孔径 的 凝 胶 。 在 由 浓缩 胶 、 分 离 胶 组 成 的 碱 性 不 连续 体系 中 , 存在 着 浓缩 效应 ( 仅 在 洲 缩 胶 中 ) 电 荷 效 应 和 分 子 筛 效应, 同 工 酶 分 子 在 这 三 种 效应 的 共同 作用 下 , 经 过 电泳 被 有 效 地 分 离 , 最 后 染色 , 显现 出 不 同 的 酶 带 , 比较 不 同 材料 酶 谱 的 差异 , 可 对 其 遗 - 120 - 传 特性 等 进行 研究 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 电泳 仪 和 圆 盘 电泳 槽 1 套 (2) 台式 高 速 离心 机 (3) 电 冰 箱 (4) BER (5)- 真 空 干燥 器 (6) Fave (7) # 简 500mlx1, 10mlx1 (8) 4E 杯 250ml x4 (9) HERB “lmlx1，2mlx1，Smlx1l (10) HERE K BHAX2, RHKX1 (11) 玻璃 管 12K (12) HBG 12% (13) fein 1 个 (14) 小 培养 下 1 个 (15) AR 1X (16) 其 他 ”试管 架 、 玻 棒 、 橡 皮 圈 等 2. 试剂 见 表 20.1。 表 20.1 RARRRRRB AM RaMAL Ac 制 方 法 2g 琼脂 , 100ml pH8.3 电极 缓冲 液 ( 配 法 见 后 述 ) 浸 泡 ,用 前 加 热 溶 化 取 1mol/L HCl 48ml, Tris 36.8g, TEMED 0.28ml, 用 无 离子 水 溶解 后 定 容 至 100ml 分 离 胶 缓冲 液 (pH8.9 Tris- HCl Bp HR) 取 1mol/L HCl 48ml, Tris 5.98g, TEMED 0.48ml, 用 无 离子 水 溶解 后 定 容 至 100ml Acr 28.0g, Bis 0.735g, 用 无 离子 水 溶解 后 定 容 至 100ml, 过 滤 除 去 不 溶 物 Acr 10g, Bis 2.5g, 无 离子 水 溶解 后 定 容 至 100ml He 4a BER WK ( pH6.7 Tris - HCl BrP HR) 分 离 胶 贮 液 (Acr- Bis, 贮 液 工 ) 浓缩 胶 贮 液 (Acr- Bis, YK 1) > aor * 续 表 序号 试 剂 名 称 配 制 方 法 14 i Hit RFRA 0.4g RR EIAF 100ml 无 离子 水 中 (当天 配制 ) 核 黄 素 溶液 核 黄 素 4.0mg, 无 离子 水 溶解 后 定 容 至 100ml Tris 6g, 甘氨酸 28.8g, 无 离子 水 溶解 后 定 容 至 1000ml, 用 时 解释 10 倍 40% 芒 糖 溶 液 FER 40g, WF 100ml 无 离子 水 中 乙酸 钠 70.52g 溶 于 500ml 蒸馏 水 中 再 加 36ml 冰 乙 酸 , 蒸馏 水 定 容 至 1000ml 7% 乙酸 溶液 19.4ml 36% 乙酸 稀释 至 100ml Tris 12.1g, 加 无 离子 水 1000ml, 以 HCl 调节 pH 至 电极 缓冲 液 (pH8.3 Tris -甘氨酸 缓冲 液 ) pH4.7 乙酸 缓冲 液 样品 提取 液 (pH8.0 Tris - HCl 缓冲 液 ) 8.0 0.5% 溴 酚 蓝 溶液 0.5¢ 省 酚 蓝 溶 于 100ml 无 离子 水 中 抗坏血酸 70.4mg, 联 苯胺 贮存 液 20ml(2g HARI 抗坏血酸 - 联 苯胺 染色 液 于 18ml KCK DA AS Ok BE RP FR 7K 72ml) ,水 50ml, 使 用 前 加 0.6% 过 氧化 氢 20ml 3. 材料 不 同 品 种 或 不 同 处 理 小 麦 幼 苗 。 四 、 操 作 步 又 1. 凝 胶 的 制备 (1) 将 贮 液 由 冰箱 取出 , 待 与 室温 平衡 后 再 配制 工作 液 。 (2) 用 橡皮 圈 把 细 玻 管 扎 在 粗 玻 管 周围 , 垂直 放 在 小 培养 下 中 , 倒 入 用 电极 组 冲 液 配制 的 2% 琼 脂 溶 液 , 令 其 自然 凝固 。 (3) 按 下 表 比 例 配 制 分 离 胶 - FREE ee ae 分 离 胶 缓冲 液 分 离 胶 贮 液 RR 4 然后 pi A 25.4 号 液 和 无 离子 水 放 一 烧杯 , 6 号 液 放 另 一 烧杯 ,用 真空 泵 抽 气 10min. 小 心 混 合 两 杯 溶液 ,用 2ml 注射 器 吸取 混 匀 的 溶液 , 沿 小 玻 管 管 壁 灌 胶 , 每 管 “二 2 一 灌 胶 高 度 6.5cm, 再 用 注射 器 沿 管 壁 加 水 0.$Scm。 刚 加 过 水 可 看 出 界面 ,后 逐渐 消 失 。 等 再 看 出 界面 时 ,表明 分 离 胶 已 聚合 。 再 静 置 20 一 30min, 将 水 抽出 ,用 细 滤 纸 条 吸 干 。 (4) 按 下 表 比 例 配制 浓缩 胶 名 称 浓缩 胶 缓 冲 液 浓缩 胶 贮 液 Ke 糖 体积 比例 取 用 量 (ml) eel a a tn 操作 同 分 离 胶 配制 。 核 黄 素 亦 需 单独 放置 。 灌 胶 高 度 1cm, MAKE 0.5cm, 然 后 置 日 光 灯 下 聚合 20min, PR SAE MLA fH, 聚合 即 告 完 成 。 吸 去 水 层 , 把 凝 胶 玻 管 装 到 上 槽 圆 孔 内 , 槽 内 露出 1.5 cm 左右 , 准备 点 样 。 2. 样品 的 制备 称 取 小 麦 幼 苗 葵 部 0.$g, 放 入 研 钵 内 ,加 pH8.0 提取 液 1ml, 于 冰 水 浴 中 研 成 SR, 然后 以 2ml 提取 液 分 几 次 洗 入 离心 管 , 在 高 速 离心 机 上 以 8000 r/min 离心 10min, Ji} LK, SSH 40% PRES, 留 作 点 样 用 。 3. RH LAF (1) Fe PRA OE 10 倍 的 电极 缓冲 液 400ml 放 入 下 槽 , 安 好 装 ABER ERR SA EA. (2) 装 上 槽 电极 缓冲 液 : 在 上 槽 内 加 一 滴 溴 酚 蓝 指示 剂 , 将 稀释 10 倍 的 电极 缓冲 液 倒 入 上 醒 , 淹没 胶 柱 上 端 1 一 2 cma (3) 点 样 :用 im 注射 器 吸取 少量 样 液 , 在 法 缩 胶 上 层 点 样 ,每 管 加 1 一 2 滴 。 4. 电泳 将 电泳 槽 放 入 冰箱 , 接 好 电源 线 ( 上 槽 为 负极 )。 打 开 电 源 开 关 , 调节 电流 到 每 管 1ImA 左 右 ,15Smin 后 调 至 每 管 2mA, 电泳 约 90min。 待 示 踪 染料 下 行 到 距 胶 柱 末端 0.$cm 处 , 即 可 停止 电泳 。 关 闭 电 源 ,取出 电泳 槽 , 剥 胶 , 染色 。 5. FRR 拔 下 所 有 凝 胶 柱 玻 管 , 用 Sml 注射 器 装 满 水 , 安 上 10cm 长 的 细 针 头 , 沿 管 壁 内 侧 穿 入 , 边 前 进 , 边 注水 , 边 转动 玻 管 , 借 水 的 润滑 作用 和 针头 的 刮 切 作用 把 胶 柱 剥离 , 然后 用 洗 耳 球 轻 轻 吹出 胶 柱 , EIA pH4.7 的 乙酸 缓冲 液 的 指 形 管 中 浸 泡 10min。 “ 了 3 。 6. 染色 .记录 结果 倒 去 乙酸 缓冲 液 , 加 抗坏血酸 - 联 茶 胺 染色 液 ,使 淹没 整个 胶 柱 ,于 室温 下 显 色 20min, 即 得 到 过 氧化 物 酶 同 工 酶 的 红 褐 色 酶 谱 。 倒 掉 染 色 液 , 重新 加 入 7% 的 乙 酸 溶液 。 五 、 结 果 处 理 于 日 光 灯 下 观察 记录 酶 谱 , 绘图 或 照相 。 六 、 注 意 事项 (1) Acr, Bis 是 神经 性 毒剂 , 旦 对 皮肤 有 刺激 作用 。 操 作 时 要 上 和 乳胶 手套 或 指 套 , 避免 与 皮肤 接触 。 (2) 如 室温 过 高 ,可 适当 减 小 电流 , 延长 电泳 时 间 , 最 好 将 电泳 槽 置 冰箱 中 电 泳 ,以免 温 度 过 高 使 酶 失 活 。 七 、 思 考题 1. 简 述 盘 状 电泳 的 浓缩 效应 。 2. 上 下 槽 电极 缓冲 液 用 过 一 次 后 ,是否 可 以 混合 后 再 用 ? 为 什么 ? 3. 凝 胶 的 化 学 聚合 与 光 聚 合 有 何不 同 ? 4. 什么 叫 同 工 酶 ? 研究 它 有 何 意义 ? 5. 在 电泳 中 , 观察 到 什么 现象 ? 其 本 质 是 什么 ? 参考 文献 陈 毓 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1995 莽 克 强 等 . 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 .北京 :科学 出 版 社 , 1975 文 树 基 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 西北 农业 大 学 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 实验 二 十 一 “双向 免疫 扩散 试验 eee 将 可 溶性 抗原 与 相应 抗体 混合 , 当 两 者 比例 合适 且 有 电解 质 存 在 时 , 即 有 抗 原 - 抗 体 复合 物 沉 演出 现 , 称 为 沉 演 反应。 沉淀 反应 是 许多 免疫 检测 方法 的 基础 。 双向 免疫 扩散 试验 又 称 琼脂 双 扩 散 试 验 , 是 利用 琼脂 凝 胶 为 介质 的 一 种 沉淀 反应 。 此 方法 设备 简单 , 操作 方便 , 特异 性 强 , 灵敏 度 高 , 是 免疫 分 析 的 重要 手段 , 可 定性 抗原 或 抗体 , 诊断 疾病 , 也 是 最 为 常用 的 免疫 学 测定 抗原 和 测定 抗 血 清 效 价 的 方 “124 - 通过 本 实验 掌握 免疫 双 扩 散 试 验 的 原理 和 方法 。 二 、 原 理 琼脂 凝 胶 具 有 多 孔 的 网 状 结构 , 大 分 子 物 质 如 重 白 质 可 自由 通过 。 测 定时 将 抗原 和 抗体 分 别 加 入 同一 凝 胶 板 中 相隔 一 定 距 离 的 小 孔 内 , 使 两 者 在 凝 胶 中 扩散 ， 这 种 分 子 的 扩散 作用 最 终 使 抗原 和 抗体 相遇 , 形成 抗原 -抗体 复合 物 , 比例 合适 时 出 现 沉 淀 。 由 于 凝 胶 透 明度 高 , 可 直接 观察 到 复合 物 不 透明 的 白 色 沉 淀 线 ( 弧 )。 沉淀 线 ( 弧 ) 的 特征 与 位 置 取 决 于 抗原 相对 分 子 质量 的 大 小 ,扩散 系数 和 浓度 等 因 素 。 如 果 抗原 和 抗体 存在 多 种 系统 时 , 则 会 出 现 多 条 沉淀 线 ( 弧 )。 因 此 可 用 此 方 法 检测 抗原 或 抗体 。 三 、 仪 器 .试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 7.$Scmx3.Scm 玻璃 片 ( 或 显微镜 用 载 玻 片 ) (2) 吸管 Sml (3) 4mm 打 孔 器 (可 用 直径 相当 的 玻璃 管 代 替 ) (4) 注射 器 针头 (5) 试管 及 试管 架 (6) 小 滴 管 (7) 电热 恒温 水 浴 (8) 恒温 箱 (9) 电炉 (10) 湿 盒 2. 试剂 (1) 1% 一 1.5% 的 离子 琼脂 1) 离子 强度 0.06，pH8.6 巴 比 妥 缓冲 液 : 称 取 10.3g 巴 比 妥 钠 ,1.84g 巴 比 妥 酸 溶 于 水 后 定 容 至 1000ml。 2) PAR 1~1.5g 纯净 琼脂 , 加 蒸馏 水 S0ml, 在 沸水 洽 上 加 热 至 琼脂 溶化 后 加 入 巴 比 妥 缓冲 液 S0ml 混 匀 , 即 为 1% 一 1.5% 的 离子 琼脂 。 水 浴 中 保温 , 备 铺 板 用 。 (2) 0.9% 的 生理 盐水 :500ml (3) 抗原 :人 全 血清 (4) 抗体 : 兔 抗 人 全 血清 = 125 。 (5) 染色 液 :0.05% 氨基 黑 10B。 称 取 0.5g 氨基 黑 10B, WF 500ml 1mol/L 乙酸 及 500ml 0.1mol/L 乙酸 钠 溶 液 中 。 (6) 脱色 液 :53% 乙酸 。 四 、 操 作 步 又 1. 制备 离子 琼脂 板 用 吸管 取 4ml 溶化 的 离子 琼脂 加 到 玻璃 板 或 载 玻 片 上 , 待 凝固 后 , 按 图 21.1 tT FL. 35mm | 75mm | 图 21.1 双向 扩散 打 孔 示意 图 打 孔 后 用 注射 器 针头 将 孔 内 琼脂 挑 出 , 在 酒精 灯 上 烘 烤 背面 , 使 琼脂 与 玻璃 板 贴 紧 。 2. 稀释 抗原 或 抗体 用 倍 比 稀释 法 。 将 抗原 或 抗体 按 2 的 等 比 级 数 即 2",21,2“,… 方 式 连续 稀释 。 方法 是 取 试 管 数 支 ,各 加 入 稀释 液 (生理 盐 水 ) 一 份 ,再 于 第 一 管 中 加 入 抗原 或 抗体 一 份 ,用 吹 吸 法 混 匀 后 吸出 一 份 加 入 第 二 管 , 如 此 稀释 至 最 后 一 管 。 其 稀释 倍数 分 别 为 2,4,8,… 倍 。 3. 加 样 将 稀释 好 的 抗原 或 抗体 依次 加 入 外 周 孔 内 (记录 顺序 ), 向 中 心 孔 加 入 相应 的 抗体 或 抗原 。 抗 原 抗 体 的 加 入 量 以 与 琼脂 表面 持平 为 度 或 用 微量 注射 器 定量 加 入 。 加 样 后 把 琼脂 板 放 入 湿 盒 中 , 37 温 箱 中 保温 24 一 48 h。 五 、 结 果 处 理 扩散 后 可 出 现 清 晰 的 沉淀 线 , 以 出 现 沉 证 线 的 抗体 稀释 倍数 最 高 的 一 孔 的 称 释 倍数 为 抗体 效 价 。 为 提高 沉 演 线 可 见 度 和 保存 标本 , 可 进行 染色 处 理 。 - 126 - 染色 及 保存 方法 : 1) 漂洗 琼脂 板 :将 琼脂 板 置 生 理 盐水 中 浸泡 2 天 , 每 天 更 换 生 理 盐 水 两 次 , 以 洗 去 未 结合 的 抗原 抗体 。 生 理 盐 水 浸泡 后 ,更 换 蒸 馏 水 浸泡 1 天 , 换 水 两 次 以 便 除 去 盐分 。 琼 脂 较 脆 易 破 , 操作 需 小 心 。 2) 干燥 :取出 琼脂 板 , 覆盖 滤纸 片 , 置 室温 自然 干燥 或 吹 干 , 烘 干 。 3) 染色 :将 琼脂 板 浸 入 染色 液 中 5 一 10min( 注 意 观 察 染 色 深 度 )。 4) 脱色 :染色 完毕 , 将 琼脂 板 放 在 脱色 液 中 浸泡 , 以 除去 多 余 的 染料 至 胶 板 背 景 无 色 为 止 。 5) 保存 :脱色 后 滴 加 少量 5% 甘 油 至 琼脂 板 上 , 置 室温 干燥 保存 。 六 、 注 意 事项 1. 玻璃 板 必 须 仔 细 洗 干净 , 铺 板 时 放置 水 平 ,使 制 得 的 琼脂 板 薄 厚 均匀 ,一般 Be ROE RE 1 一 2 mm 为 宜 。 2. 琼脂 应 在 沸水 中 溶化 , 一 次 配制 较 多 的 琼脂 液 时 应 分 装 成 20 一 50ml 小 体 积 ,以 免 多 次 溶化 后 改变 浓度 。 3. 琼脂 浓度 可 视 气温 变化 略 加 调整 ,夏天 泊 度 可 大 至 1.2% ~1.5%, SRA FA 0.8% ~1.2%. 七 、 思 考题 1. 免疫 双 扩 散 试验 的 原理 是 什么 ?” 有 哪些 应 用 ? 2. 什么 是 抗体 的 效 价 ? 参考 文献 陈 簿 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1995 李 建 武 等 .生物 化 学 实验 原理 和 方法 .北京 :北京 大 学 出 版 社 ,1994 张 龙 翔 , 张 庭 芳 , 李 令 姐 等 .生化 实验 方法 和 技术 .北京 :高 等 教育 出 版 社 , 1997 实验 二 十 二 ”质粒 DNA 的 提取 酶 切 及 电泳 鉴定 一 、 目 的 细菌 质粒 是 细菌 染色 体外 的 遗传 因子 , 常 使 细菌 带 有 某 些 特性 和 生物 功能 , 如 抗 药性 产生 细菌 毒素 等 。 绝 大 部 分 质粒 为 环 状 双 链 DNA 分 子 。 经 过 人 工 改 造 后 的 质粒 是 遗传 工程 中 重要 的 基因 载体 之 一 。 通 过 本 实验 学 习 质 粒 DNA 的 提取 方法 ,掌握 酶 切 和 电泳 鉴定 的 基本 操作 技术 , 为 从 事 基因 工程 和 分 子 生 物 学 研究 芮 定 初步 基础 。 127 - 二 < 原理 从 大 肠 杆菌 中 提取 质粒 DNA 的 方法 很 多 , 其 中 的 碱 性 SDS 法 提取 质粒 是 基 于 染色 体 DNA 与 质粒 DNA 的 变性 与 复 性 存在 差异 而 予以 分 离 的 。 在 强 碱 性 条 件 下 ,染色体 DNA 和 质粒 DNA 均 变 性 ( 双 链 解 开 )。 由 于 质粒 DNA 是 共 价 闭合 环 状 超 螺 旋 结 构 , 变性 后 两 条 互补 链 不 会 完全 分 开 。 当 溶液 pH 调节 到 中 性 时 , 质 粒 DNA 容易 复 性 并 溶解 在 溶液 中 , 而 染色 体 DNA 不 容易 复 性 , 互相 缠绕 , 在 离心 时 极 易 和 蛋白 质 - SDS 复合 物 等 一 起 沉淀 下 来 。 转 移出 上 清 液 , 再 用 乙醇 沉淀 出 其 中 的 质粒 DNA。 限制 性 核酸 内 切 酶 是 基因 操作 中 不 可 缺少 的 工具 酶 , 它 能 够 识别 双 链 DNA 的 特定 位 点 并 切 开 DNA, 这 个 特定 位 点 是 一 段 具 有 旋转 对 称 结构 的 DNA 片段 。 EcoRI 的 识别 顺序 与 切割 位 点 为 : + 个 酶 切 之 后 得 到 的 两 条 单 链 具 有 黏 性 未 端 , 在 做 基因 重组 时 是 个 很 好 的 连接 部 位 。 以 具有 质粒 pPUC19 的 大 肠 杆 菌 DHSau 为 实验 材料 , 用 碱 性 SDS 法 可 从 该 菌 体 中 提取 到 质粒 DNA, 质粒 pUC19 在 396 一 401 核 苷 酸 处 有 一 个 ECoRI 识别 顺序 。 经 该 酶 酶 切 后 , pUC19 由 环 状 分 子 变 为 具有 黏 性 末端 的 线性 分 子 , 经 琼脂 糖 凝 胶 电泳 可 以 检测 出 这 种 变化 。 琼脂 糖 凝 胶 电泳 适 于 分 离 鉴 定 200 一 20 000bp 的 核酸 片段 。 在 中 性 pH 条 件 下 ,核酸 带 负电 和 荷 ,在 电场 中 向 正极 移动 。 电 泳 后 , 核酸 在 凝 胶 中 的 位 置 通过 * 染 色 " 来 显现 。 染 色 剂 省 化 乙 锭 (EB) 是 一 种 咱 啶 类 染料 , 其 分 子 呈 扁平 形 ,能 插入 DNA fh) EZ |B], 导致 和 DNA 结合。 在 300nm 的 紫外 光照 射 下 , 省 化 乙 锭 = DNA 复合 物 发 射出 590nm 的 橘红 色 荧 光 。 三 、 仪 器 .试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 高 压 蒸汽 灭 菌 锅 (2) i LEG (3) 恒温 振荡 摇 床 (4) 台式 高 速 离心 机 (5) 真空 干燥 器 (6) 低温 冰箱 - 128 - (7) 恒温 水 浴 (8) 电泳 仪 (9) 水 平 电泳 本 (10) BR at 2. 试剂 (1) LB 培养 基 950ml 去 离子 水 , 10g HL BAK, Sg 酵母 提取 物 , 10g NaCl, 在 容器 中 溶解 后 调节 pH 值 至 7.0, 加 去 离子 水 定 容 到 1000ml, 在 1.1kg/cm? 高 压 KH 20min. (2) 氨 葵 青霉素 用 无 菌 水 配 成 100mg/ml 的 母液 , 使 用 浓度 为 100wg/ml。 母液 4 保存 可 使 用 1 A, - 200 保存 可 使 用 6 周 。 (3) TE 10mmol/L 的 Tris- HCl(pH8.0), 10mmol/L 的 EDTA. (4) GTE 25% WHE, SOmmol/L 的 Tris - HCI(pH8.0), 100mmol/L 的 EDTA, (5) NaOH/SDS 0.2mol/L 的 NaOH, 1% (W/V)#Y SDS. (6) KAc 29.5ml 冰 乙 酸 , 用 KOH 颗粒 调节 pH 到 4.8, 定 容 到 100ml. (7) 无 水 乙醇 (8) RNAase A 将 RNAase A 溶 于 10mmol/L 的 Tris - HCl (pH7.5), 15mmol/L 的 NaCl 溶液 中 ,浓度 为 10mg/ml, 于 100T 加 热 13Smin, 缓慢 冷却 到 室 温 , 分 小 份 保存 于 -207 。 (9) EcoRI 及 10x 组 冲 液 ”从 试剂 公司 购买 。 (10) 琼脂 糖 (11) 标准 分 子 质 量 DNA 取出 SOpl 标准 分 子 质 量 DNA 溶液 稀释 到 20ng/ ml, —20C 保存 待 用 。 (12) 上 样 缓冲 液 0.25% 的 溴 酚 蓝 ,0.25% 的 二 甲苯 青 FF,30% 的 甘油 水 洲 MAC 保存 。 (13) 电极 缓冲 液 ” 和 常用 的 有 Tris -硼酸 缓冲 液 (TBE) 和 Tris -乙酸 缓冲 液 (TAE)。 10X TBE 54g Tris, 27.5g 硼酸 ，20ml 0.5mol/L 的 EDTA(pH8.0), 定 容 到 1000ml, 使 用 时 稀释 10 售 。 50X TAE 242g Tris, 57.1ml 冰 乙 酸 ，100ml 0.5mol/L 的 EDTA(pH8.0), 定 容 到 1000ml, 使 用 时 稀释 50 倍 。 (14) 染色 液 ( 贮 存 母液 ) 50mg 省 化 乙 锭 , 100ml 7K, 4°C 避 光 保存 。 使 用 时 稀释 1000 倍 。 ”人 29 - 3. 材料 带 有 pPUC19 的 大 肠 杆菌 DHSa. 四 、 操 作 步 又 1. 质粒 提取 (1) 接种 一 单 菌落 于 100ml LB 液体 培养 基 中 , 加 入 $0ml HAKAS RA, 37C 振 功 培养 8 一 10 h, 使 培养 达到 饱和 状态 (Akoo 宅 0.6)。 (2) 取 1.5ml 培养 液 离心 20s, 沉淀 用 100 岂 GTE 悬浮 并 于 室温 放置 Smin。 (3) 加 入 200pl NaOH/SDS 溶液 , 混 匀 ,于 冰 上 放置 Smin。 (4) 加 入 150pl KAc 溶液 , 在 旋涡 混合 器 上 振荡 2s, 于 冰 上 放置 Smin。 (5) 离心 3min, 然后 吸取 0.4ml 上 清 液 移入 干净 的 微量 离心 管 中 , 加 入 0.8ml 无 水 乙醇 ,室温 静 置 2min。 (6) 室温 下 离心 3min, 用 lml 70% 的 乙醇 洗 沉 淀 , 然后 真空 于 燥 。 (7) 沉淀 用 30pl ddH2O 溶解 , — 20T 保存 。 2. HY) (1) 取 一 干净 的 微量 离心 管 ,加 入 Syl 提取 的 质粒 DNA, 2p] 10 x RM, lpl RNAase A, 121 ddH2O. (2) 于 37°C BB f# 2h. 3. 电泳 鉴定 (1) 称 取 1g 琼脂 糖 ,加 入 100ml 的 1x TBE, 加 热 溶 化 。 待 温度 降低 到 50C A 右 ,将 凝 腕 加 入 放 好 梳子 的 胶 槽 中 。 (2) 等 完全 冷却 后 , 将 胶 槽 放 入 电泳 槽 中 ,加 入 1xTBE, 使 电极 缓冲 液 没 过 凝 We, 拔 去 样品 梳 。 (3) 取 稀 释 过 的 标准 分 子 质 量 DNA 和 未 经 酶 切 的 质粒 DNA 各 6pl, 经 过 酶 切 的 质粒 DNA 10pl, 以 3:1 的 比例 与 上 样 缓冲 液 混合 , 小 心地 将 样品 加 入 样品 槽 。 (4) 检查 好 电路 和 正 负 极 后 接 通电 源 , 将 电压 调 至 SV/cm, 电泳 约 1.5h 左 右 ， 当前 沿 指示 剂 距离 凝 胶 前 沿 约 2cm 时 停止 电泳 。 (5) 取出 凝 胶 放 入 盛 有 染色 液 的 容器 中 , 染色 10 一 20 min。 拿 出 用 水 冲洗 , 在 302nm 的 紫外 灯 下 观察 并 记录 结果 。 五 、 结 果 处 理 绘制 电泳 区 带 图 谱 , 根据 迁移 率 计 算 酶 切 样 品 DNA 条 带 的 分 子 质量 。 “人 省 化 乙 锭 是 强 诱 变 剂 , 与 其 有 关 的 操作 必须 戴 上 手套 。 紫 外 线 对 眼睛 有 伤害 ， 观察 凝 胶 时 也 应 注意 。 七 、 思 考题 为 什么 未 经 酶 切 的 质粒 DNA 4 2 一 3 条 带 , 而 酶 切 后 只 出 现 一 条 带 。 参考 文献 陈 簿 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 ,1995 Frederick M. Ausubel et.al. 精 编 分子 生 物 学 实验 指南 . 颜 子 颖 等 译 . 北 京 :科学 出 版 社 , 1998 本 . Sambrook et.al. 分 子 克 隆 实验 指南 . 金 冬 雁 等 译 . 北 京 : 科 学 出 版 社 , 1992 ' 实验 二 十 三 “高 等 植物 DNA 的 提取 和 纯度 鉴定 二 、 目 的 掌握 提取 真 核 细 胞 DNA 的 一 种 基本 方法 ,学 习 用 紫外 吸收 法 测定 DNA 的 含 量 和 纯度 。 三 、 原 理 高 浓度 的 盐 和 离子 型 表面 活性 剂 SDS 能 破坏 细胞 膜 , 并 能 解 聚 脱氧 核糖 核 蛋 白 复合 物 (DNP), 使 DNA 释放 出 来 。 苯酚 可 使 蛋白 质变 性 , 蛋白 质 溶 于 酚 相 , DNA 则 溶 于 上 层 水 相 。 将 氯仿 与 葵 酚 混 合 使 用 , 可 减少 酚 相 中 因 水 的 存在 而 造成 DNA 的 少量 溶解 。95% 乙醇 可 使 核酸 从 水 相 中 沉淀 出 来 ,用 70% 的 乙醇 洗涤 可 去 除 一 些 盐 分 , 经 RNase 降解 RNA, 可 得 较 纯 的 DNA. DNA 含量 与 纯度 测定 , 目前 常用 紫外 吸收 法 , 利用 核酸 在 260nm 有 吸收 峰 ， 根据 公式 (DNA[wg/ml] = Azso X 50 < 稀释 倍数 ) 可 计算 出 DNA 的 浓度 。 由 于 和 蛋 日 质 在 280nm 有 吸收 峰 , 可 根据 比值 判断 DNA 纯度 :Axso/Azso<1.8 时 ,表明 蛋白 质 含 量 偏 高 ;Aso/Azso<1.9 时 ,表明 样品 较 纯 ; Argo / Acgo >2.0 时 ,表明 RNA 或 DNA 碎片 较 多 。 = Was ik Fl Fl $B} 1. 仪器 (1) 普通 离心 机 (2) 冰箱 。 (81 - (3) THY ZKIA (4) 紫外 分 光 光 度 计 (5) 可 调 微量 取样 器 (6) 50ml 量 简 (7) 2ml 刻度 吸管 (8) 50ml 烧杯 (9) 滴 管 2. 试剂 (1) 抽 提 液 (2moyL NaCl - 1mmol/L EDTA) (2) 10%SDS (3) 盐 饱 和 莱 酚 (SS -苯酚 ) : 重 蒸 苯酚 用 1mol/L Tris - HCl 缓冲 液 (pH8.0) 饱 (4) 氯仿 - 异 戊 醇 (24:1) (5) 95% 乙醇 (6) 70% 乙 醇 (7) TE 缓冲 液 (10mmolyL Tris - HCl, Immol/L EDTA, pH8.0) (8) RNase 3. 材料 四 、 操 作 步 又 1. DNA 的 提取 (1) 将 已 制备 好 的 丙酮 粉 转 入 S0ml 离心 管 。 (2) 加 15ml 抽 提 液 及 1.$ml 10% SDS, 用 玻 棒 搅拌 后 放 入 60T apps 2h. (3) %0(4000r/min, 8min, 25C), LWA 100ml 离心 管 中 。 (4) 分 别 加 入 一 倍 体积 的 SS - 葵 酚 和 和 氯仿 - 异 成 醇 , 盖 上 离心 管 盖 , BRA 混 匀 。 (5) 再 离心 (4000rmin，8min，25Y ), 用 干净 滴 管 取 上 层 水 相 转 入 S0ml 烧杯 中 。 (6) 加 入 二 倍 体积 预 冷 的 95% 乙 醇 , 置 冰箱 冷冻 层 0.$ 一 2 h。 (7) 用 玻璃 棒 将 DNA 沉淀 轻 轻 迭起 , 转移 至 干净 的 S0ml 离心 管 ,加 入 Sml 10% 乙醇 浸泡 数 分 钟 , 离心 后 弃 去 乙醇 , 管 口 扣 于 吸水 纸 上 , 吸 去 残留 溶液 。 (8) 加 入 4ml TE 缓冲 液 , 摇动 ,使 沉淀 完全 溶解 。 «* 732° - (9) 加 入 RNase 液 10pl, 37C 7K 1h. (10) 重复 步骤 (4) 一 (8)。 2. DNA 紫外 测定 以 TE 作 空 白 调 零 , 在 波长 260nm 和 280nm 处 分 别 测定 样 液 的 吸光 值 。 五 、 结 果 处 理 1. 计算 样 液 中 DNA Fie (pug). 2. 分 析 样 品 纯度 。 六 、 注 意 事项 离心 管 中 加 入 SS - 葵 酚 和 氯仿- 异 戊 醇 后 , 需 轻 轻 倒 转 混 勺 , 此 时 注意 动作 的 FE. 七 、 思 考题 1. 为 什么 实验 步骤 (1)~(S$) 没 有 在 冰 浴 条 件 下 进行 ? 2. 实验 中 数 次 离心 , 每 次 离心 后 应 保留 哪 部 分 ? 弃 去 的 部 分 主要 含 什么 ? 参考 文献 李 建 武 等 .生物 化 学 实验 原理 和 方法 .北京 :北京 大 学 出 版 社 ,2000 刘 文 轩 , AH, 王振华 .氯仿 - 异 戊 醇 - 核 糖 核酸 酶 法 一 一 快速 提取 植物 DNA 的 好 方法 .生物 学 杂志 , 1990, 37 (5$) :30 实验 二 十 四 “酵母 蛋白 质 和 RNA WEIS (MRS) 一 、. 目 的 掌握 从 酵母 中 分 离 制备 蛋白 质 和 RNA 的 原理 和 方法 ,学 习 普 通 离 心机 的 使 用 方法 。 =. Re 酵母 细胞 富 含 蛋 白质 和 核酸 。 用 稀 碱 液 (0.2% AY AE ) Zh FE BE HH A 裂解 , 离心 收集 上 清 液 , 得 到 酵母 核 蛋 白 抽 提 液 。 用 盐酸 调节 抽 提 液 pH 至 3.0( 核 蛋白 的 等 电 点 ), 核 蛋白 溶解 度 下降 大 量 沉 出 , 离心 收集 沉淀 物 为 酵母 蛋白 质 粗 制 酵母 核 蛋 白 是 一 种 结合 蛋白 质 , 是 蛋白 质 与 核酸 的 复合 物 。 酵 母 核酸 主要 是 RNA( 含 量 为 干 菌 体 的 2.67% 一 10.0%),DNA 含 量 较 少 , 仅 为 0.03% 一 0.516% 。 - #83 - ONT 7: (88 EE A, PY I KR Ot SPR EE JA DNA, 就 可 得 到 较 纯 AY RNA dilin GCA) PERE Se: FE A hl na aA SDS 的 缓冲 液 中 ， 加 等 体积 的 水 饱和 酚 , a ik a, HE ot MP, ERA KA A RNA, 下 层 为 酚 相 , 变性 蛋白 及 DNA 存在 于 酚 相 及 两 相 界面 处 。 吸 出 水 相 并 加 乙醇 即 可 沉淀 出 酵母 RNA。 者 用 氯仿 - 异 成 醇 进一步 处 理 RNA 制品 , 可 获得 纯度 更 高 的 RNA。 三 、 仪 器 .试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 离心 机 (2) 干燥 箱 (3) 恒温 水 浴 (4) 真空 干燥 器 (ae (6) 751 型 分 光 光 度 计 (7) 冰箱 (8) 量 简 (50ml) (9) aA IM (10) Eppendorf # (1.5ml) (11) #84 (50ml, 100ml) 2. 试剂 ( 均 为 分 析 纯 ) (1) 0.2% NaOH Ww (2) 6mol/L HCl 溶液 (3) 95% Ze (4) SDS -缓冲 液 :0.3% SDS, 0.1mol/L NaCl, 0.05mol/L 乙酸 钠 ,用 乙酸 调 到 pH5.0 (5) ABM: BAA (OAM A (6) 氯仿 - 异 成 醇 液 :24:1(V/V) (7) 含 2% 乙 酸 钾 的 95% 乙醇 溶液 (8) FEKAE (9) 乙醚 3. 材料 Hit EEE a BEBE HY, pHO.5~5.0 的 精密 试纸 ° AB4 .- ee me 四 、 操 作 步 又 1. 酵母 核 重 白 的 提取 称 取 鲜 酵母 30g 或 干 酵母 粉 Sg, BIA 100ml 的 烧杯 中 。 加 入 40ml.0.2% NaOH YK, E 20~ 40 水浴 上 搅拌 提取 30 一 60min 后 4000rmin 下 离心 10min, 取 上 清 液 于 $0ml 的 烧杯 中 , 并 置 于 放 有 冰 块 的 230ml 烧杯 中 冷却 , FE B 10T 以 下 时 ,用 6mol/L HCl 小 心地 调节 溶液 的 pH 至 3.0 左 右 。 随 着 pH 下 降 , 溶 液 中 白 色 沉 淀 逐渐 增加 ,到 等 电 点 时 沉淀 最 多 (注意 严格 控制 pH). pH 调 好 后 继续 于 亲 7K PRE 10min, 使 沉淀 充分 , 颗粒 变 大 。 将 此 悬浮 液 以 3000vmin 离心 20min, 倒 掉 上 层 清 液 。 将 沉淀 物 转 入 蒸发 亚 内 , 放 入 真空 干燥 器 或 干燥 箱 中 干燥 之 后 称 重 ， 这 就 是 酵母 核 和 蛋白 粗 品 。 2. 茶 酚 法 提取 酵母 RNA By ER KE AEE, 加 10ml SDS -缓冲 液 使 成 匀 浆 , 洗 入 各 Eppendorf 管 ( 略 少 于 管 容积 的 一 半 ), SRE 10min, 再 加 等 体积 的 饱和 酚 液 , 室温 下 剧烈 振荡 Smin 后 置 冰 浴 中 分 层 ,4000r/min 离心 10min, 吸出 上 层 清 液 , 转 入 新 的 Eppendorf 管 ,加 2 倍 体积 95% 乙 醇 ( 含 2% 乙 酸 钾 ), 在 冰 浴 中 放置 30min, 使 RNA 沉淀 。 再 以 10 000xmin 离心 Smin, F# LAM, 沉 汪 用 少许 无 水 乙醇 和 乙醚 各 洗 一 次 , 迅速 离心 各 1min, 保留 沉淀 。 倾 去 乙醚 后 , 减 压 真 空 干燥 , 准确 称 重 , 记录 。 五 、 结 果 处 理 1. 计算 核 蛋 白 提 取 率 zz _ 核 蛋白 重量 (g) 核 蛋 白 提 取 率 (% ) = 酵母 重量 (g) X100 2. RNA 含量 测定 将 干燥 后 的 RNA 产品 配制 成 浓度 为 10 一 50wg/ml 的 溶液 , 在 751 型 分 光 光 度 计 上 测定 其 260nm 处 的 吸光 度 , 按 下 式 计 算 RNA 含量 : A260 RNA 深 液 总 体积 (ml) “A> = RNA @H(%) =D Qo4x0* RNA 称 取 量 (we) ~ 100 AF, Acco A 260nm 处 的 吸光 度 ; 工 为 比 色 杯 光 径 (cm); 0.024 为 1ml 溶液 含 1vg RNA 的 吸光 度 。 3. 计算 RNA 提取 率 RNA 3852 ( % ) = RNA SHC) X RNA fol in Bt) ee fils Bg) x 100 - 453° - 1. 利用 等 电 点 控制 核 蛋 白 析 出 时 , 应 严格 控制 pH。 2. 用 苯酚 法 制备 RNA 过 程 中 ,用 乙醇 沉 汪 得 到 的 RNA 中 , 除 RNA 外 还 含有 部 分 多 糖 , 本 实验 采用 2% 乙酸 钾 去 溶解 非 解 离 的 多 糖 以 达到 纯化 RNA 的 目的 。 七 、 思 考题 1. 为 什么 用 稀 碱 溶液 可 以 使 酵母 细胞 裂解 ? 2. 如 何 从 酵母 中 提取 到 较 纯 的 RNA? 参考 文献 李 建 武 等 .生物 化 学 实验 原理 和 方法 .北京 :北京 大 学 出 版 社 ,2001 文 树 基 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1994 张 龙 翔 等 .生化 实验 方法 和 技术 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 ,1981 Plummer, D. T., A Introduction to Practical Biochemistry, McGraw-Hill Book Co., Led., London, UK, 1978 实验 二 十 五 ”酵母 RNA 的 提 制 ( 浓 盐 法 ) > il 学 习 和 掌握 从 酵母 中 提 制 RNA 的 原理 和 方法 , 以 加 深 对 核酸 性 质 的 认识 。 hes 原理 酵母 含 RNA 2.67% 一 10.0%,DNA 很 少 (0.03% ~0.516%), MA RAAF 收集 ,RNA 也 易于 分 离 ,所 以 选用 酵母 为 实验 材料 。 RNA 提 制 过 程 是 先 使 RNA 从 细胞 中 释放 , 并 使 它 和 和 蛋白质 分 离 , 然后 将 菌 体 除去 。 再 根据 核酸 在 等 电 点 时 溶解 度 最 小 的 性 质 , 将 pH 调 至 2.0 一 2.5, 使 RNA 沉淀, 进行 离心 收集 。 提取 RNA 的 方法 很 多 , 在 工业 生产 上 常用 的 是 稀 碱 法 和 浓 盐 法 。 前 者 利用 稀 碱 溶解 细胞 壁 ,使 RNA 释放 出 来 ,这 种 方法 提取 时 间 短 ,但 RNA 在 此 条 件 下 不 稳定 , 容易 分 解 ; 后 者 在 加 热 的 条 件 下 , 利用 高 浓度 的 盐 改变 细胞 膜 的 透 性 , 使 RNA 释放 出 来 , 此 法 易 掌握 , 产品 颜色 较 好 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 量 简 (S0ml) (2) 三 角 瓶 (100ml) 。 136 。 (3) BAF (250ml, 50ml, 10ml) (4) 布 氏 漏斗 (40mm) (5) 吸 滤 瓶 (125Sml) (6) #2 ML(6cm) (7) 751 型 分 光 光 度 计 (8) 离心 机 (4000r min) (9) 恒温 水 浴 (10) 药物 天 平 (11) 烘箱 2. 试剂 (1) NaCl( 化 学 纯 ) (2) 6mol/L HCl (3) 95% 乙 醇 ( 化 学 纯 ) 3. 材料 鲜 酵 母 或 干 酵母 ;pH0.5 一 5.0 的 精密 试纸 。 四 、 操 作 步 又 1. 提取 Pray at BEE 15g 或 干 酵母 粉 2.$g, BIA 100ml 三 角 瓶 中 , 加 NaCl 2.5g, 水 25ml, 搅拌 均匀 , 置 于 沸水 浴 中 提取 1h. 2.53 将 上 述 提 取 液 用 自来水 冷却 后 , 装 入 大 离心 管内 , LA 4000r/min 离心 10min, ERMA RRA STA. 3. 沉淀 RNA 将 离心 得 到 的 上 清 液 倾 于 SOml KEAN, FF ABA KIRA 250ml HER PH 4, YF 10C 以 下 时 ,用 6mol/L HCl 小 心地 调节 pH 值 至 2.0 一 2.5( 注 意 严格 控制 pH)。 调 好 后 继续 于 冰 水 中 静 置 10min, 使 沉淀 充分 , 颗粒 变 大 。 4. 洗涤 和 抽 滤 ERB HRV 4000r/min 离心 10min, 得 到 RNA 沉淀 。 将 沉淀 物 放 在 10ml 小 烧杯 内 ,用 95% 的 乙醇 S$ 一 10ml 充分 搅拌 洗涤 , 然后 在 布 氏 漏 斗 上 用 射 水 泵 抽 "全 3 和 - Sate, FEA 95% CBF S~10ml 淋 洗 3 次 。 5. FR 从 布 氏 漏 斗 上 取 下 沉淀 物 , WE 6cm AML, 铺 成 薄 层 , 置 于 80 烘箱 内 干 燥 。 将 干燥 后 的 RNA 制品 称 重 , 存放 于 干燥 器 内 。 6. 含量 测定 将 干燥 后 RNA 产品 配制 成 浓度 为 10 一 5S0rg/ml 的 溶液 ,在 751 型 分 光 光 度 计 上 测定 其 260nm 处 的 吸光 度 , 按 下 式 计算 RNA GE: A260 RNA 洲 液 总 体积 (ml) 公 RNA 含量 (%) 一 1 024X 工 X， RNA 称 取 量 (ug) “X100 AL, Argo A 260nm 处 的 吸光 度 ; 工 为 比 色 杯 光 径 (cm); 0.024 为 1ml 溶液 含 lvg RNA 的 吸光 度 。 五 、 结 果 处 理 根据 含量 测定 的 结果 按 下 式 计算 提取 训 gog ) = RNA @ it (% ) X RNA 制品 重 (g) RNA 提取 率 (% ) = RNA SH aia x 100 1. 用 浓 盐 法 提取 RNA 时 应 注意 掌握 温度 , 避免 在 20~27C 之 间 停 留 时 间 过 长 ,因为 这 是 磷酸 二 酯 酶 和 弯 酸 单 酯 酶 作用 活跃 的 温度 范围 ,会 使 RNA 降解 而 降 低 提 取 率 。 2. MPR 90~ 100T 使 蛋白 质变 性 , 破坏 两 类 磷酸 酯 酶 , 有 利于 RNA 的 提 取 。 七 、 思 考题 1. 沉淀 RNA 之 前 为 什么 要 冷却 上 清 液 至 10 人 以 下 ? 2. 为 什么 要 将 pH 调 至 2.0 一 2.5 ? 参考 文献 文 树 基 主 编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1994 西北 农业 大 学 主编 .基础 生物 化 学 实验 指导 .西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986 REA, ROE, 陈 钧 辉 编 .生物 化 学 实验 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 ,1979 AL, TLS, Fed a Fey, HEIR, 吉 厚 积 编著 .生物 化 学 实验 . 上海: 上海 科 学 技术 出 版 社 , 1981 ° 188 : 实验 二 十 六 “多 酚 氧 化 酶 的 制备 和 化 学 性 质 —. AB 学 习 从 组 织 细胞 中 制备 酶 的 方法 ,掌握 多 酚 氧 化 酶 的 化 学 性 质 。 二 、 原 理 多 酚 氧 化 酶 是 一 种 含 铜 的 酶 , 其 最 适 pH 为 6 一 7。 由 多 酚 氧 化 酶 催化 的 反应 可 用 下 式 表示 , 以 儿 茶 酚 的 氧化 为 例 : 多 酚 氧 化 酶 ron jar 0 + 0 O OH 多 酚 氧 化 酶 的 氧化 -还 原 反 应 可 通过 溶液 颜色 的 变化 鉴定 之 , 这 个 反应 在 自然 界 中 是 常见 的 , 如 去 皮 的 马铃薯 和 碰 破 皮 的 水 果 变 成 褐色 就 是 由 于 该 酶 作用 的 结 果 。 多 酚 氧 化 酶 作用 的 最 适 底 物 是 邻 葵 二 酚 ( 儿 茶 酚 )。 间 苯 二 酚 和 对 葵 二 酚 , 与 前 者 结构 相似 , 它们 也 可 被 氧化 为 各 种 有 色 的 物质 。 = Was AFF] A BL 1. 仪器 (1) SAR (2) 恒温 水 浴 (3) 烧杯 〈100ml) 2. 试剂 (1) 0.1mol/L NaF 溶液 :将 4.2g 氟 化 钠 溶 于 1000ml RAK +P (2) 0.01mol/L 邻 葵 二 酚 溶解 于 100ml 蒸馏 水 中 , 用 稀 的 氢 氧 化 钠 调 节 溶 液 的 pH 为 6.0, 防 止 其 自身 的 氧化 作用 。 (3) 柠檬 酸 缓冲 液 (pPH4.8，0.05SmolL) (4) S% 的 三 氯 乙酸 溶液 (5) 苯 硫 脲 (结晶 (6) 0.01mol/L 间 葵 二 栈 溶液 (7) 0.01mol/L 对 苯 二 酚 溶 液 (8) Ped AA Bit BR RY HK - $59 - 3. 材料 BRS, Fon, AS, KER, 7 四 、 操 作 步 又 1. Bh DHHS 将 马铃薯 洗 净 削 皮 后 切 成 小 块 , 称 取 50g 放 入 匀 浆 器 中 , 再 加 入 S0ml NaF ¥ 液 ,在 匀 浆 器 中 研磨 30s 后 , 把 匀 浆 物 通过 几 层 细 布 滤 入 一 个 100ml 的 烧杯 中 , 加 入 等 体积 的 饱和 硫酸 入 溶 液 , 混合 后 于 4Y 放置 20min。 在 3000r/min 下 离心 15min, 倒 掉 上 清 液 后 将 沉淀 物 用 大 约 1Sml 柠檬 酸 缓冲 液 溶 解 , 即 得 到 含有 多 酚 氧化 酶 的 粗 制 品 。 2. 多 酚 氧 化 酶 的 化 学 性 质 取 3 支 试管 编号 , 分 别 按 下 表 加 入 试剂 nk & mM > 试剂 处 理 其 中 试管 3 中 酶 抽 提 物 和 葵 硫 腺 结晶 需 充 分 混合 , 连续 振荡 Smin 后 再 加 入 邻 葵 二 酚 溶液 。 将 3 支 试 管 放 入 377 KA F 10min, 观察 溶液 颜色 的 变化 。 3. 底 物 专 一 性 取 3 支 试管 编号 后 , 分 别 加 入 15 滴 酶 抽 提 液 , 再 向 试管 中 加 入 -15 滴 0.01mol/L 邻 茶 二 酚 溶液 , 试管 2 中 加 入 15 滴 0.0lmolL 间 苯 二 酚 溶 液 , 试管 3 中 加 入 15 滴 0.01mol/L 对 葵 二 酚 溶液 。 混 合 试管 中 的 溶液 , RF 37ICKAF, 以 Smin 的 间隔 , 保温 10min, 观察 溶液 的 颜色 变化 。 Ry RM 1. 多 酚 氧 化 酶 的 化 学 性 质 将 颜色 变化 结果 记录 于 下 表 : ”和 四 - 试管 1 试管 2 试管 3 酶 ” 活 “人 性 底 物 5 分 钟 10 分 钟 六 、 注 意 事项 为 防止 邻 葵 二 酚 自 身 的 氧化 作用 , 须 用 和 的 氢 氧 化 钠 调节 溶液 的 pH 为 6.0。 当 溶 液 变 成 带 褐色 时 , 应 重新 配制 。 新 配制 的 溶液 应 储存 于 棕色 瓶 中 。 七 、 思 考题 1. 制备 多 酚 氧 化 酶 时 , 加 入 等 体积 的 饱和 硫酸 铵 溶液 的 目的 是 什么 ? 2. 检验 多 酚 氧 化 酶 的 化 学 性 质 实验 中 加 入 三 氯 乙酸 溶液 和 葵 硫 逐 结 晶 各 起 什么 作用 ? = 141 - SY See 实验 二 十 七 ”种 子 重 白质 系统 分 析 |. 种 子 和 蛋白 质 含量 测定 ( 凯 氏 定 氨 法 ) Tae 谷物 是 人 类 特别 是 发 展 中 国家 人 民 的 主要 蛋 日 质 来 源 , A Re 衡量 其 品质 和 营养 价值 的 最 重要 的 指标 。 培 育 高 蛋 白 谷物 品种 , 是 广大 育种 工作 者 的 备 斗 目标 。 对 现 有 谷物 进行 评价 \ 利 用 , 对 大 批 原始 材料 (种 质 资源 ) 及 育成 品 系 进 行 品质 筛选 , 都 需要 测定 种 子 蛋白 质 含 量 。 测定 种 子 恒 日 质 含量 的 方法 很 多 , 一 般 可 分 为 间接 方法 和 直接 方法 两 大 类 。 凯 氏 定 氮 法 是 间接 方法 中 的 一 种 , 国际 谷物 化 学 协会 (ICC)、 美 国 分 析 化 学 协会 (AOAC) 美国 谷物 化 学 协会 (AACC) 等 及 不 少 国家 都 把 凯 氏 定 氮 法 定 为 标准 法 。 通过 本 实验 学 习 凯 氏 定 氮 法 的 原理 ,掌握 样品 的 处 理 和 自动 凯 氏 定 氮 仪 的 操作 。 =x JR 根据 和 蛋 昌 质 的 含 氮 量 比较 恒定 ,平均 约 为 16% ,通过 测定 样品 的 含 氮 量 进 而 推算 蛋白 质 的 含量 。 种 子 中 的 氮 化 物 可 分 为 蛋白 氮 和 非 蛋 白 所 。 用 三 氯 乙 酸 溶出 种 子 粉 或 脱脂 种 子 粉 中 的 非 蛋白 氮 化 物 ( 氨 基 酸 、 酰 腕 和 无 机 氮 ), 沉淀 样品 中 的 蛋白 质 并 使 二 者 分 离 。 在 催化 剂 参 与 下 , AUR IRIE A TR in, 使 蛋白 氮 转 化 为 氨 态 氮 , 并 与 硫酸 结合 生成 硫酸 铵 。 加 碱 蒸馏 , 使 氨 释 放出 来 并 吸收 于 一 定量 的 硼酸 中 , 再 用 标准 酸 滴定 , 求 出 样品 中 氮 含 量 , 乘 以 16% 的 倒数 6.25 RAR AM. = Mat iF Al ot BL 1. 仪器 (1) aA (2) 消化 炉 (3) ke 4X (4) 具 塞 三 角 瓶 100ml x2 - 142° ee (5) 康 氏 振荡 机 18 (6) 漏斗 2 个 (7) Kh 10mlX1, 5mlX1 (8) 自动 凯 氏 定 氮 仪 (VS-KT-P 型 ) 2. 试剂 (1) 5% 三 氯 乙 酸 (2) 浓 硫 酸 (3) 混合 催化 剂 ” 硫 酸 铜 :硫酸 钾 =1:4(W/W) (4) 40% 氢 氧化 钠 (5) 4% 硼 酸 (6) c| 了 HSOi| =0.05mol/L 标准 硫酸 (7) 混合 指示 剂 “S$0ml 0.1% 甲 烯 蓝 乙醇 溶液 与 200ml 0.1% HEALEY 液 混 合 配 成 , 贮 于 棕色 瓶 中 。 四 、 操 作 步 又 (1) 用 分 析 天 平 称 取 谷物 全 粉 0.1000g 二 份 ,分 别 加 入 2 只 100ml 具 塞 三 角 i. (2) 在 三 角 瓶 中 加 5% 三 氯 乙酸 20ml, 置 康 氏 振 荡 机 上 振荡 提取 ( 非 蛋 白 氮 化 物 )1h, 过 滤 , 弃 滤液 。 用 5% 三 氯 乙 酸 洗涤 滤纸 上 的 沉淀 ,最 后 将 漏斗 里 的 沉 省 连 同 滤纸 二 起 放 入 1.2 号 消化 管内 ,在 3.4 号 消化 管内 各 加 1L 张 相同 滤纸 , 作为 空 =e (3) 在 1 一 4 号 管内 各 加 适量 催化 剂 及 Sml 浓 硫 酸 。 置 消化 炉 上 , 200T 消化 0.5h, 然后 升温 至 400Y 再 消化 0.5Sh。 消 化 液 呈 清亮 、 蓝 绿色 。 (4) 待 消 化 液 冷 却 后 ,用 自动 定 氮 仪 进行 蒸馏 滴定。 仪器 可 自动 打印 出 结果 报告 ,也 可 根据 仪器 给 出 的 标准 硫酸 消耗 体积 进行 手工 计算 。 五 、 结 果 处 理 (让 二 CR 0 piace op Er 式 中 , Vi, Vo, V3, V4 分 别 是 滴定 1 一 4 号 消化 液 消 耗 的 标准 硫酸 的 体积 ， Clit so, 为 标准 硫酸 的 浓度 , WA 1.2 号 样品 的 平均 重量 (g)。 六 、 注 意 事 项 消化 样品 时 要 注意 安全 , 防止 烫伤 或 损失 样品 。 143 ， 七 、 思 考题 1. 在 消化 过 程 中 , 观察 到 什么 现象 ?其 本 质 是 什么 ? 2. 催化 剂 中 的 KzSO4 在 消化 过 程 中 有 何 作用 ? 参考 文 献 蔡 武 城 , 圳 厚 积 .生物 物质 常用 化 学 分 析 法 .北京 :科学 出 版 社 , 1982 陈 簿 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1995 ll. 种 子 和 蛋白 质 和 氨基酸 组 分 分 析 ( 和 氨基 酸 自 动 分 析 仪 法 ) =. Eis 氨基 酸 是 蛋白 质 的 基本 结构 单位 。 构 成 蛋白 质 的 氨基 酸 共 20 种 , 其 中 Lys、 Phe, Trp, Val, Leu, Ile, The.Met 等 8 种 是 人 体 的 必需 氨基 酸 , 必需 由 蛋白 类 食物 供给 。 不 同 食品 的 蛋白 质 含量 不 同 , 氨基 酸 组 成 也 有 差异 , 其 必需 氨基 酸 的 含量 是 否 平衡 , 对 营养 品质 有 很 大 影响 。 氨 基 酸 组 成 分 析 又 是 蛋白 质 顺 序 分 析 的 重要 组 成 部 分 , 因此 , 氨基 酸 组 分 分 析 是 常用 的 重要 分 析 项 目 。 通 过 本 实验 了 解 氨基 酸 分 析 仪 的 结构 及 工作 原理 ,学 习 待 测 样品 的 处 理 方 法 。 =. 原理 种 子 蛋白 质 在 110 AEF, A 5.7mol/L 恒 沸 点 盐酸 作用 22 一 24 h, 被 水 解 生成 组 成 该 蛋白 质 的 各 种 游离 氨基 酸 ( 色 氨 酸 破坏 , 天 冬 酰胺 和 谷 酰胺 分 别 转变 成 天 冬 氨 酸 和 谷 氨 酸 ), 经 上 机 前 处 理 即 可 用 氨基 酸 分 析 仪 测定 出 各 种 氨基 酸 的 含 量 。 =. Mas 试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 水 解 试管 (2) 喷 灯 (3) 台式 高 速 离心 机 (4) 121MB 或 其 他 型 号 氨基 酸 自动 分 析 仪 2. 试剂 (1) 5.7mol/L 恒 沸 点 盐酸 (2) pH2.2 柠檬 酸 缓冲 液 :柠檬 酸 21g, 氢 氧 化 钠 8.4g, KER 16ml, 水 洲 后 定 + 144 - 容 至 1000ml。 四 、 操 作 步 又 (1) 准确 称 取 谷物 全 粉 或 脱脂 粉 30mg, 小 心 送 入 水 解 试 管 底部 , 加 8ml 5.7mol/L 盐酸 。 在 超声 波 水 槽 中 振荡 除 气 后 于 喷 灯 上 封闭 管 口 , 置 110 +1 供 箱 中 水 解 22h。 (2) 冷却 后 切 开 试管 ,将 水 解 液 过 滤 到 25ml 容量 瓶 内 , 并 用 无 离子 水 冲洗 试 管 和 滤纸 , 然后 定 容 至 刻度 。 (3) 取 Sml 滤液 置 于 蒸发 四 中 , 在 水 洽 上 蒸 干 。 残 留 物 用 无 离子 水 3 一 5 ml 溶 解 并 车 和 干 ,反复 3 次 。 (4) 准确 加 入 pH2.2 柠檬 酸 缓冲 液 Sml, 溶解 提取 物 。 取 1.5Sml 样品 , 在 高 速 离心 机 上 离心 (10 000r/ min, 20min). (5) 用 121 MB 型 氨基 酸 分 析 仪 专用 注射 器 吸取 上 清 液 S0 由 于 样品 贮存 螺旋 管 中 , 上 机 分 析 。 五 、 结 果 处 理 氨基 酸 分 析 仪 采用 外 标 法 ,根据 标准 氨基 酸 校正 液 的 浓度 和 保留 时 间 确 定 样 品 液 中 各 种 相应 氨基 酸 的 浓度 。 主 机 随 带 的 数据 处 理 机 和 打印 机 , 自动 打印 出 各 种 氨基 酸 的 浓度 , 样品 中 各 种 氨基 酸 的 含量 可 由 下 式 计 算 : 氨基 酸 含量 (gz/100g RR) = AA. DXMX100 Ao W x 10° EY, A, -样品 中 氨基 酸 峰 面积 ; Ao -标准 氨基 酸 峰 面积 ; Co -标准 氨基 酸 浓 度 (kmol/ml) ; D -样品 稳 释 倍数 ; M -氨基 酸 分 子 质 量 ; W -样品 量 (g)。 六 、 思 考题 1. 氨基 酸 自动 分 析 仪 分析 氨 基 酸 组 分 及 含量 的 原理 是 什么 ? 2. 是 否 可 利用 氨基 酸 分 析 仪 进行 蛋白 质 的 测序 工作 ? 如 果 可 以 , 试 说 明 原 理 。 参考 文献 陈 毓 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 ,1995 严 国光 , 王 福 钧 .农业 仪器 分 析 法 .北京 :农业 出 版 社 ,1982 - 145 - 下 .种 子 和 蛋白 质 组 分 分 析 ( 连 续 球 进 提取 法 ) —. AW PH A 10% ~ 15% AE i I ( GEA) A 85% ~ 90% WIE 藏 蛋白 质 ( 简 单 蛋白 质 ) 组 成 。Osborne 在 种 子 中 发 现 与 分 离 出 来 清 蛋白 、 球 蛋白 、 谷 蛋 白 及 醇 溶 和 蛋白 等 4 个 组 分 。 不 同 作 物种 子 中 各 和 蛋白 组 分 比例 有 很 大 差异 , 不 同 蛋 白 组 分 的 必需 氨基 酸 含量 也 不 相同 , 通常 醇 溶 蛋白 中 缺乏 Lys, Trp.Met & Ile 等 必需 氨基 酸 , 其 营养 价值 最 低 。 因 此 , 根据 种 子 蛋 白质 组 分 的 相对 含量 , 可 以 评 判 蛋白 质 的 品质 。 通 过 本 实验 学 习 并 掌握 用 连续 累进 提取 法 分 离 种 子 蛋白 质 各 组 SH | 根据 清和 蛋白 可 溶 于 水 、 球 蛋白 溶 于 稀 盐 溶液 . 醇 溶 蛋白 溶 于 乙醇 、 谷 蛋白 可 洲 于 稀 碱 或 稀 酸 溶液 的 性 质 , 可 用 不 同 溶 剂 把 这 4 种 组 分 从 样品 中 分 离 提 取出 来 。 然后 用 凯 氏 法 分 别 定 量 或 利用 SDS-PAGE 进行 各 组 分 亚 基 分 析 。 三 、 仪 器 .试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 日 本 MRK 公司 产 VS-KT-P 自动 定 氮 仪 (2) 样品 磨 (3) 玻璃 层 析 柱 2. 试剂 (1) 50% 异 丙 醇 (V/V) 或 70% 乙 醇 (2) 3% 硼 酸 (3) 0.5mol/L NaCl (4) 0.1mol/L NaOH 四 、 操 作 步 又 1. 制 样 谷物 籽粒 风干 ,用 样品 磨 粉 碎 , 放 干 燥 器 中 备用 。 2. 装 柱 在 玻璃 层 析 柱 底 部 过 滤 盘 板 上 置 一 层 滤纸 。 称 取 酸 洗 并 经 S40 高 温 处 理 的 ”146 - 石英 砂 60.000g, 样品 2.000g FA= MI PRS, 每 个 样品 重复 3 次 , 设 空白 对 照 。 另 称 取石 英 砂 20.000g, 其 中 10.000g 置 于 层 析 柱 底部 , 将 三 角 瓶 中 混合 物 装 _ 入 柱 内 , 再 将 剩余 的 10.000g 石英 砂 加 入 层 析 柱 上 部 。 装 好 后 用 小 木 棒 轻 轻 敲 打 把 空气 排出 。 3. 提取 在 提取 前 加 20ml 蒸馏 水 , 排出 柱 内 气体 , 浸 湿 样品 , 然后 按 下 列 步 又 进行 。 (1) 加 100ml 蒸馏 水 调节 流速 为 0.5ml/min, 提取 清 蛋白 , 定 容 于 100ml 容量 瓶 中 。 (2) 加 100ml 0.S5mol/L NaCl 提取 球 和 蛋白, 定 容 于 100ml 容量 瓶 中 。 (3) 加 100ml 70% 乙醇 提 取 醇 溶 和 蛋白 , CAF 100ml 容量 瓶 中 。 (4) 加 100ml 0.1 mol/L NaOH 提取 谷 和 蛋白 , 定 容 于 100ml 容量 瓶 中 。 4. 提取 液 中 蛋白 质 含量 测定 (1) 从 每 一 容量 瓶 中 吸取 10ml 提取 液 放 入 消化 管 中 ( 摇 义 后 再 吸 )。 然 后 加 3ml 浓 H,SO,, 2.5g 催化 剂 。 用 150°C 加 热 0.5h RPM, 然后 用 200Y 消化 0.5h, 400T 消化 0.5h。 (2) 消化 管 自 然 冷却 后 , 即 可 用 自动 定 氮 仪 进行 含 氨 量 测定 。 5. 样品 总 蛋白 质 含量 测定 每 一 样品 称 取 0.2000g, 重复 3 次 , 然后 按 本 实验 工 方法 用 自动 定 氮 仪 测定 含 氮 量 。 五 、 结 果 处 理 (1) 计算 样品 中 蛋白 质 含量 。 (2) 计算 各 重 日 组 分 在 样品 中 的 含量 及 占 总 蛋白 质 的 比率 。 参考 文献 陈 统 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 ,1995 案 治 军 , 纪 重光 .现代 分 析 仪器 与 测试 方法 .西安 :西北 大 学 出 版 社 , 1995 NV. 种 椰 和 蛋白 质 亚 基 分 析 (SDS - 聚 丙烯 栈 腔 凝 胶 电泳 法 ) —, AA Se ASS FA BE OE A SEAR A AT aR, SE AE AR BY SAR BE 又 称 亚 基 。 通 过 对 天 然 蛋白 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 和 变性 蛋白 的 SDS - 聚 丙烯 酰 « 287 - Wisc ee IBS HB Uk PS AY ER, BY A 8 PP I ot FA. Fb, SDS -RA Hes OG HSC OE IBS DK eM EW EY FA RTT IK. HAR SE, = J SDS - 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 的 原理 、 技 术 和 实际 应 用 。 Pree 原理 用 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS) 和 还 原 剂 ( 琉 基 乙醇 或 二 硫 苏 糖 醇 ) 热 处 理 蛋白 质 样 im, 蛋白 质 分 子 中 的 二 硫 键 被 还 原 , 解 离 的 亚 基 与 SDS 发 生 1:1.4 的 定量 结合 。 SDS 使 蛋白 质 亚 基带 上 大 量 负 电荷 ,掩盖 了 有 蛋白质 各 种 亚 基 间 原 有 的 电荷 差异 。 亚 基 的 构象 均 呈 长 椭圆 棒状 , 各 种 蛋白 质 亚 基 - SDS 复合 物 表 现 出 相等 的 电荷 密 度 。 在 电场 中 其 迁移 速率 仅 与 亚 基 分 子 质量 有 关 , 因此 , SDS - 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 可 以 进行 蛋白 质 亚 基 分 离 ,并 用 来 测量 蛋白 质 亚 基 的 分 子 质量 。 = Mas ih iil Al ot Bt 1. 仪器 (1) 稳 压 稳 流 电泳 仪 (2) 垂直 板 电 泳 模 (3) 微量 注射 器 (4) 烧杯 50mlx2 (5) Bem (6) 脱色 摇 床 (7) 吸管 ”0.5Smlx2，S$mlx2，10mlx3 (8) RAR (9) 台式 高 速 离心 机 2. 试剂 (1) 2% 琼 脂 92g 琼脂 加 电极 缓冲 液 100ml, 水 浴 中 溶化 。 (2) 电极 缓冲 液 Tris 6g, Gly28.8g, SDS 2g， 去 离子 水 溶解 后 ,用 HCl 调 pH 值 至 8.3, 水 定 容 至 2000ml。 (3) 30%Acr Acr 30g, 水 溶 后 定 容 至 100ml, UE, 冰箱 中 贮存 备用 。 (4) 1% Bis Bis lg, 水 溶 后 定 容 至 100ml, 过 滤 , 冰箱 中 贮存 。 (5) 分 离 胶 缓冲 液 (1.SmoVL Tris, pH8.7) Tris 18.17g,， 适 量 水 溶解 , 然后 用 1mol/L HCl J pH 值 至 8.7, 定 容 至 100ml。 (6) 浓缩 胶 缓冲 液 (0.SmoyL Tris-HCl, pH6.8) Tris 6.06g, 适量 水 溶解 ， 然后 用 站 moVL HCl jl pH 值 至 6.8, 定 容 至 100ml。 (7) 10%SDS SDS lg， 加 水 10ml 溶解 。 ， 148 ， (8) 10% 过 硫酸 铵 1lg 过 硫酸 铵 ,加 水 10ml 溶解 , 现 用 现 配 ,冰箱 中 最 多 可 贮 存 一 周 。 (9) TEMED( 四 甲 基 乙 二 腕 ) 4?7 ,棕色 瓶 中 贮存 。 (10) 样品 缓冲 液 (pH8.0) Tris 6.0Sg， 甘 油 S0ml, 琉 基 乙醇 25ml, 省 酚 蓝 0.5g, SDS10g, 溶 于 水 ,用 HCI 调 pH 至 8.0, 定 容 至 500ml. (11) 脱色 液 “甲醇 :乙酸 :水 =5$:1:5( 体 积 比 ) (12) 染色 液 (0.25% 考 马 斯 亮 蓝 R250) 1.00g 考 马 斯 亮 蓝 R250, 用 脱色 液 400ml 溶解 , 过滤 备用 。 (13) 低 分 子 质量 标 准 蛋白 溶 液 ,包括 溶菌 酶 (MW = 14 400Da) KEIRA 酶 抑制 剂 (21 5000) , Be MR BF BR (31 0000)、 卵 白 蛋 白 (45 0000)、 牛 血清 白 和 蛋白 (66 2000) 、 磷 酸化 酶 B(92 000)。 用 样品 缓冲 液 配 成 2mg/ml 溶液 , 在 沸水 浴 中 加 热 3 一 4min, 冷却 后 使 用 。 (14) 高 分 子 质量 标 准 蛋白 溶液 ”包括 卵 白 和 蛋白 (MW = 45 0000)、 牛 血清 白 蛋白 (66 2000) 磷酸 化 酶 B(92 $000)、B - 半 乳 糖苷 酶 (116 2500)、 肌 球 蛋 日 重 链 (200 0000), 配制 方法 同 (13 ) 。 (15) 25% 乙醇。 四 、 操 作 步 又 (1) 在 制 板 支架 上 置 一 专用 有 机 玻璃 槽 , 将 固定 好 的 玻璃 板 下 部 插入 槽 内 , 中 部 用 两 个 文具 夹 固定 在 支架 竖 板 上 , 在 槽 内 倒 入 已 充分 溶化 的 琼脂 ,冷凝 后 封闭 胶 腔 底 部 。 (2) 取 5$0ml 烧杯 1 只 ,加 30% Acr 18.8ml，1%Bis 4.7ml，pH8.7 Tris-HCl 组 冲 液 11.3ml, H,O 9. 8ml。 混 匀 后 减 压 抽 气 Smin。 取 出 后 向 烧杯 中 再 加 10% SDS 0.5ml, 10% it Hi 0.2ml, TEMED 50pwl， 轻 轻 摇 匀 后 灌 入 玻璃 板 胶 腔 中 至 适当 高 度 , 加 25% CBA 0.5m 封闭 表面 。 (3) 待 分 离 胶 聚 合 后 , 倒 掉 乙 醇 溶 液 ,再 灌 浓缩 胶 。 操 作 方 法 : 另 取 S0ml 烧杯 只 ,加 30% Acr 3.0ml, 1% Bis 3.0ml, pH6.8 Tris-HCl 缓冲 液 7.5ml, H,O 1 .5ml。 混 匀 后 减 压 抽 气 。 取 出 后 向 烧杯 中 再 加 入 10% SDS 0.3ml，10% 过 硫酸 phe. 2ml, TEMED SO, $2483 91 Jes Hi Be A REE, EAA HEA (ee HL vo (4) 待 测 样品 用 样品 缓冲 液 配 制 成 mg/ml 左右 的 溶液 , 在 沸水 浴 中 加 热 3 一 4min, 冷却 后 在 台式 高 速 离心 机 上 离心 (10 000r/min, 10min), 取 上 层 液 备用 。 (5) 拔 掉 样 品 梳 , 装 好 电泳 构 , 在 上 \、 下 槽 中 注入 电极 缓冲 液 , 用 微量 注射 器 点 样 , 每 样品 槽 点 样 20 一 50wl。 在 标准 蛋白 泳 道 点 标准 蛋白 质 溶液 。 (6) LAN HR, 下 槽 为 正极 , 连接 好 电泳 仪 电源 , 恒 压 (100V 左右 ) 或 恒 流 (30mA 左右 ) 电 泳 。 当 指示 染料 溴 酚 蓝 到 达 凝 胶 前 沿 还 有 1 一 2 em 时 停止 电泳 ， * 149 - (BF HR, BR (7) 剥 胶 后 用 蒸馏 水 洗涤 胶片 , 然后 浸入 染色 液 中 4 一 5 h 或 过 夜 。 取 出 后 用 蒸馏 水 漂洗 数 次 , 浸入 脱色 液 中 振 功 脱色 , 中 途 更 换 脱 色 液 数 次 , 至 背景 清晰 透明 为 止 。 照 相 或 进行 凝 胶 干 燥 。 (8) 凝 胶 干燥 ”人 先 在 一 块 玻 璃 板 上 铺 一 张 用 水 浸润 透 的 玻璃 纸 , 放 上 胶片 ,再 盖 上 一 张 同样 处 理 过 的 玻璃 纸 ,用 玻璃 棒 赶 出 可 能 帘 藏 的 气泡 。 然 后 把 玻璃 纸 多 余 的 四 边 反 向 贴 到 玻璃 板 后 面 , 在 室温 下 自然 风干 , 制 成 可 以 长 期 保存 的 透明 胶 Fro 五 、 结 果 处 理 量 出 染料 及 各 区 带 迁 移 距离 , 按 下 式 计算 相对 迁移 率 mp: _ 样 品 迁移 距离 mR 一 染料 迁移 距离 以 标准 恒 昌 分 子 质量 的 对 数 对 相对 迁移 率 做 图 , 得 标准 曲线 。 根 据 待 测 样品 的 相对 迁移 率 , 从 标准 曲线 上 查 出 其 分 子 质 量 的 对 数 , 再 求 出 其 分 子 质量 。 (1) Acr. Bis 有 神经 毒性 , 操作 时 要 小 心 。 (2) 不 同 的 凝 胶 浓度 适用 于 不 同 的 分 子 质量 范围 。 可 根据 所 测 分 子 质量 的 范 围 选 择 最 适 的 凝 胶 浓 度 , 并 尽量 选择 分 子 质 量 范围 与 待 测 样品 分 子 质量 相近 的 蛋 白质 作 标 准 蛋 白质 。 七 、 思 考题 1. 样品 缓冲 液 中 各 种 试剂 的 作用 是 什么 ? 2. 本 实验 是 否 需 要 在 低温 下 进行 ? 参考 文献 陈 笠 茎 .生物 化 学 研究 技术 .北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1995 郭 尧 君 .生物 化 学 与 生物 物理 进展 .1991, 18(1) 张 龙 翔 .生物 化 学 实验 方法 和 技术 .北京 :人 民 教 育 出 版 社 ,1981 实验 二 十 八 _ 果 实 波 葛 蛋白 酶 的 动力 学 则 定 a oa had 酶 是 生物 细胞 产生 的 以 蛋白 质 为 主要 成 分 的 生物 催化 剂 。 酶 催化 生物 体内 各 种 化 学 反应 有 条 不 紊 的 高 效 进行 。 酶 促 反应 动力 学 研究 各 种 因素 对 反应 速度 的 影 响 , 包 括 底 物 浓度 \ 酶 浓度 、 抑 制剂 的 种 类 和 浓度 .pH 和 温度 等 。 最 基本 的 动力 学 - 150 ， 关系 是 底 物 浓度 对 酶 促 反 应 速度 的 影响 。 在 无 抑制 剂 的 最 简 情 况 下 , 米 - 曼 方程 正 确 地 描述 了 这 种 动力 学 关系 : 反应 速度 V 和 底 物 浓度 [S] 有 一 一 对 应 的 关系 , 要 深刻 认识 某 种 酶 , 关键 是 通过 实验 测定 其 最 大 反应 速度 Vina KR BRM Ka。 通过 对 米 - 曼 方程 变形 , 可 找 到 4 种 方法 ,通过 作 图 求 得 V .和 天 。。 其 中 比较 常用 的 是 Lineweaver-Burk 作 图 法 ( 双 倒 数 作 图 法 ), 其 依据 的 变形 方程 为 : 将 实验 获得 的 一 系列 [S ]- V 值 转变 成 Ts、 六 ,以 上 FS] 为 横 坐 标 ,以 苹 1 为 纵 坐 标 可 得 一 曲线 (图 28.1)。 Wis 斜率 = Km / Vmax * $86 =-1/ Km 28.1 Lineweaver-Burk 双 倒 数 图 该 曲线 在 横 轴 上 的 截 距 为 -一 -在 纵 轴 上 的 截 距 为 去 一， 这样 即 可 通过 实验 求 得 Km 和 Vinaxo 本 实验 以 果实 菠 葛 蛋白 酶 粗 制 品 为 实验 材料 , 先 用 离子 交换 柱 层 析 纯 化 该 酶 ， 再 通过 时 间 进 程 曲 线 酶 活性 、 蛋 白质 含量 测定 , 求 得 Ke。 值 , 加 深 对 酶 活性 、 比 活 和 蛋白 质 纯化 的 认识 ,掌握 酶 动力 学 测定 的 一 般 原理 和 方法 。 =. RERESRABE—HHWRERAM, HAKRAR, SA 4% RAD, 4C FSH pl 为 9.4, 分 子 质 量 约 28 100。 为 了 缩短 提纯 时 间 , 防止 或 减少 自身 = £51 - 降解 ,可 采用 DEAE -纤维 素 离 子 交 换 层 析 , 使 其 作为 第 一 个 洗 脱 峰 被 洗 脱 下 来 而 得 到 纯化 。 果实 菠 葛 和 蛋白 酶 可 将 底 物 酷 蛋 白水 解 为 能 溶 于 三 氯 乙酸 溶液 的 小 肽 ,反应 一 定时 间 后 用 三 氯 乙酸 终止 酶 反应 ,用 滤液 中 生成 的 小 肽 使 吸光 度 的 增加 值 表示 酶 促 反应 速度 。 据 此 可 作出 酶 促 反 应 的 时 间 进 程 曲线 , 确定 反应 初速 度 Vu 的 范围 。 粗 酶 液 和 纯化 酶 液 的 蛋白 质 含 量 可 用 考 马 斯 亮 蓝 G- 250 法 测定 。 据 此 可 计 算 酶 的 回收 率 。 根据 底 物 浓度 和 测 得 的 反应 速度 ,通过 作 图 求 得 K,, 值 。 根据 测 得 的 反应 速度 和 蛋白 质 含量 , 可 以 计算 出 酶 的 比 活 、 纯 化 倍数 。 在 本 实 验 中 , 果实 菠 葛 蛋白 酶 活力 单位 定义 为 :一 个 酶 活力 单位 是 指 在 该 实验 条 件 下 (pH7.2, 35°C BY, 一定 底 物 浓度 反应 体积 反应 10min) 水 解 酷 蛋 白 产 生 的 溶 于 三 氧 乙酸 的 小 肽 在 275nm 的 吸光 度 等 于 0.01(1jxg/ml 酷 氨 酸 在 275Snm 的 吸光 度 ) 时 所 需要 的 酶 量 。 其 比 活力 定义 为 :每 毫克 蛋白 所 含 蛋白 酶 活力 单位 的 数量 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 层 析 柱 (2x 20cm) (2) 自动 部 分 收集 器 (3) oii (4) FRE ARM (5) 离心 机 (6) 紫外 分 光 光 度 计 (7) 恒温 水 浴 (8) 分 析 天 和 平 (9) HOKE (10) tte dt FF az (100p1) (11) ABH 50m1 x2, 100m! x1 (12) RF 1mlX5, 2mlX2, 5mlX6, 10ml x2 (13) 漏斗 (14) 具 塞 刻度 试管 ”15ml (15) AB 12% (16) 烧杯 2. 试剂 (1) 0.002mol/L pH6.0 磷酸 缓冲 液 = 152 - r (2) 0.02mol/L pH6.0 磷酸 缓冲 液 (3) 0.5mol/L HCl (4) 0.5mol/L NaOH (5) 蛋白 质 标准 溶液 ” 称 取 10.0mg 牛 血 清白 蛋白 , AFCRABK, 然后 用 蒸 馅 水 定 容 至 100ml, 为 100pg/ml 的 原 溶 液 。 (6) 考 马 斯 亮 蓝 G - 250 试剂 ” 称 取 100mg 考 马 斯 亮 蓝 G - 250, WF 50m! 95% 乙 醇 中 ,加 入 85%(W/V) 的 磷酸 100ml, 最 后 用 蒸馏 水 定 容 至 1000ml, 过 滤 后 即 可 使 用 ,此 溶液 在 常温 下 可 放置 1 个 月 。 (7) 25mmol/L 磷酸 缓冲 液 (pH7.2) NaH,PO,+2H,O 0.109g，NazHPO4， 12H,O 0.645g, KW eA F 100ml。 (8) 酶 反应 终止 液 (D) 称 取 9 三 氯 乙酸 , 15g CRB, 19.5ml KOR, 水溶 后 定 容 至 S00ml。 (9) 1% 栈 蛋白 (水 浴 中 加 热 溶解 ) 四 、 操 作 步 又 1. 样品 处 理 称 外 购 或 自制 的 2g 果实 菠萝 蛋白 酶 粗 品 溶 于 冷 的 20ml 0.002mol/L pH6.0 磷酸 缓冲 液 中 , 置 冰箱 内 1Smin。4C 下 , 27 000g 离心 20min。 上 清 液 在 冷 的 1000ml 0.002 mol/L pH6.0 磷酸 缓冲 液 中 透析 Sh( 冰 箱 内 )。 相 同 条 件 下 离心 , 收 集 上 清 液 ,冰箱 内 保存 备用 (以 后 所 有 纯化 操作 均 在 27 一 4 下 进行 )。 2. DEAE -纤维 素 离 子 交 换 层 析 称 取 8g DEAE -纤维 素 , 蒸馏 水 溶 胀 后 用 0.5mol/L NaOH 溶液 浸泡 0.5h, 然 后 用 蒸馏 水 洗 至 中 性 。 再 用 0.5mol/L HCl 溶液 浸泡 0.5h, 然后 用 蒸馏水 洗 至 中 性 ,最 后 用 0.5moyL NaOH 溶液 浸泡 0.5h, 再 用 营 馅 水洗 至 中 性 。 将 处 理 好 的 DEAE -纤维 素 用 0.02moVL pH6.0 BRR MA iat TE, 充分 平衡 , 至 流出 液 为 pH6.0。 将 10ml 菠萝 蛋白 酶 样品 液 沿 柱子 的 管 壁 徐徐 注入 (多 余 的 酶 液 放 回 冰箱 保存 ), 待 样品 全 部 入 床 后 ,用 恒 流 泵 输入 8 一 10ml 0.02mol/L pH6.0 磷酸 组 冲 液 进行 洗 脱 (流速 0.Smlmin), 用 核酸 蛋白 检测 仪 (280nm) 监 测 出 峰 情 况 , 洗 脱 液 用 部 分 收集 器 收集 ,合并 第 1 峰 溶 液 , 为 纯化 的 果实 菠 葛 蛋白 酶 。 3. 蛋白 酶 的 浓度 测定 (1) 制作 蛋白质 含量 测定 的 标准 曲线 取 6 支 刻度 试管 , 按 表 28.1 配制 O~ 100pg/ml 牛 血清 白 蛋 白 溶 液 Iml。 * 253 « 表 28.1 牛 血 清 蛋 白 标 准 液 的 配制 加 入 Sml SK G - 250 试剂 , 盖 好 塞 子 , 混 匀 , 放置 2min 后 ,用 10mm 光 径 的 比 色 杯 , 在 595nm 下 比 色 ,以 第 1L 管 作 参 比 ,做 出 标准 曲线 。 (2) 果实 菠萝 蛋白 酶 样品 中 蛋白质 浓度 的 测定 将 菠萝 蛋白 酶 粗 提 液 和 离子 交换 柱 层 析 纯 化 后 的 酶 液 分 别 进 行 适当 稀释 , 然 后 分 别 吸取 lml, 并 做 1 一 2 个 重复 , 放 入 具 塞 刻度 试管 中 , 加 入 $ml 考 马 斯 亮 蓝 G-250 试 剂 , 充分 混 匀 , 放置 2min 后 以 标准 曲线 第 工 管 为 参 比 , 同样 条 件 下 比 色 ， 记录 吸光 度 , 并 通过 查 标 准 曲 线 计 算出 粗 酶 液 和 纯化 后 酶 液 的 蛋白 质 含量 。 4. 反应 体系 的 准备 A, (纯化 酶 液 ) 根据 第 3 步 的 纯化 酶 液 的 和 蛋白质 含 量 , 取 纯 化 酶 1250wg, 用 25mmol/L pH7.2 的 磷酸 缓冲 液 定 容 至 S0ml。 A:>( 粗 酶 液 ) 根据 第 3 步 测 得 的 粗 酶 液 的 蛋白 质 含 量 , 取 粗 酶 1250wg, 用 25mmol/L pH7.2 WR RM ME AE S0ml。 B 2% AM, A 25mmol/L pH7.2 的 磷酸 缓冲 液 配制 。 C 6mmol/L EDTA/30mmol/L L - Cys, 用 25mmol/L pH7.2 的 磷酸 缓冲 液 配制 2Sml。 D 见 试剂 (8) 反 应 终止 液 。 5. 进程 曲线 的 制作 取 试 管 12 支 , 编号 (0 SABA). 1~11 管内 各 加 入 纯化 酶 液 Al20ml， 也 液 3.0ml，C 液 1.0ml 后 混 匀 并 立即 精确 计时 ,1 一 11 管 在 35°C 恒温 下 的 反应 时 间 分 别 为 3.5.7\、10、12、15、20、 25、 30、 40 和 5$0min。 当 酶 促 反 应 进行 到 上 述 相应 时 间 时 , 在 相应 的 试管 内 加 入 Sml D 液 终 止 反 应 。3SYC FRE 30min, 过 滤 , 滤液 在 紫外 分 光 光 度 计 上 275nm 比 色 (0 管 为 对 照 ,反应 前 先 加 等 量 BC、D 液 ,最 后 加 2.0ml A, 纯 酶 液 ,3SY 保温 30min 后 过 滤 , 滤液 作 参 比 液 ) 。 以 反应 时 间 为 横 坐 标 , Az75 为 纵 坐 标 绘制 进程 曲线 , 确定 果实 菠 葛 蛋 白 酶 反应 初速 度 的 时 间 范 围 。 .154 ， 6. BBG TEM 将 Ay, Ao, B,C, D 五 种 溶液 分 别 在 35°C 恒温 水 浴 中 保温 , 取 8 支 1Sml HA 刻度 试管 ( 纯 酶 及 纯 酶 的 对 照 、 粗 酶 及 粗 酶 的 对 照 各 2 个 ) 按 表 28.2 进行 操作 表 28.2 酶 活性 测定 酶 反应 体系 中 加 入 Ay, A,B,C 后 混 匀 ,在 3SC 下 保温 10min, 然后 加 入 Sml D 液 终止 反应 ,3SC 下 , 静 置 30min, 过 滤 。 实 验 的 对 照 组 ,条 件 与 反应 组 完全 相同 ， 只 是 在 加 入 底 物 (B 液 ) 之 前 , 先 加 入 了 D 液 , 使 酶 失 活 。 滤 液 在 紫外 分 光 光 度 计 上 275nm 测定 吸光 度 。 7. Ky HME 反应 系列 的 底 物 稀释 : 取 Sml 2% AY BE AK, DNA Sml 25mmol/L pH7.2 的 磷酸 缓冲 液 , HD, 从 中 吸取 Sml, 同样 操作 ( 倍 比 稀释 ), 分 别 得 到 1%，0.5%， 0.25%, 0.125%, 0.0625%，0.0312% 的 溶液 。 AR 6 MX 15ml 具 塞 刻度 试管 ,分 别 吸取 2ml Ai 液 ,3ml 上 面 配制 的 倍 比 稀释 酷 蛋 白 底 物 及 lml CW, HY, 35C 保温 10min。 然 后 加 入 Sml D 液 终 止 反应 ， 3S Pit 30min, 过 滤 后 在 275nm 下 测定 吸光 度 。 实 验 对 照 用 纯 酶 Al 的 对 照 ， 测定 的 结果 填 入 表 28.3。 表 28.3 K,, 值 测定 数据 表 oF) PE UAC Es 0.25% 0.125% 0.0625 % 0.0312 % * 3 - 五 、 结 果 处 理 (1) 将 洗 脱 后 测定 得 到 的 第 一 高 峰 的 2 一 3 管 样品 合并 , 然后 用 0.02mol/L NazHPO4 溶液 将 酶 液 pH 调 至 7.2, 并 测 出 混合 后 的 吸光 度 , 置 于 冰箱 内 备用 。 六 (2) 在 坐标 纸 上 画 出 洗 脱 曲线 (以 洗 脱 体 积 为 横 坐 标 , 吸光 度 为 纵 坐 标 作 图 )。 (3) 画 出 测定 蛋白 质 浓度 的 标准 曲线 。 (4) THERES HABA Se pg/ml. (5) 计算 1250 pg RBS BE A BS Pr AY A SE FPL (6) 根据 以 上 测定 求 出 粗 酶 、 纯 酶 的 下 列 值 : @ 活力 单位 数 ;@) 比 活 力 ;Q) 回收 率 ;@ 纯化 倍数 ;Q@) 纯 酶 的 Ku 值 。 1. 本 实验 为 酶 学 大 实验 , 为 保证 顺利 完成 , 请 做 好 预习 。 2. 反应 条 件 要 保持 一 致 , 计时 要 准确 。 七 、 思 考题 1. 用 重复 相同 的 步骤 和 方法 来 纯化 酶 是 否 合理 ? ATA? . 简 述 纯化 酶 的 主要 方法 和 依据 , 比较 它们 的 特点 。 . 离子 交换 剂 常 以 离子 交换 树脂 和 离子 交换 纤维 素 为 母体 , 比较 两 者 的 特 WwW WN 4. 和 常用 的 研究 酶 反应 速度 的 方法 有 哪些 ? 5. 测定 反应 速度 时 , 是 测定 反应 物 的 减少 好 还 是 测定 生成 物 的 增加 好 ? 为 什 实验 二 十 九 “ 杀 丙 氨 酸 解 氨 酶 的 纯化 及 活性 册 定 — 2 HE 1 BS BY SEAS BR EA IK 5 FO a FE HK =. . A A BB fe ABS (L-phenylalanine: ammonia lyase, fa) #¥ PAL; EC4.3.1.5)# 植物 体内 葵 丙 烷 类 代谢 的 关键 酶 , 与 一 些 重要 的 次 生物 质 如 木质 素 、. 异 黄酮 类 植保 素 、 黄 酮 类 色素 等 合成 密切 有 关 , 在 植物 正常 生长 发 育 和 抵御 病菌 侵害 过 程 中 起 重 要 作用 。PAL 催化 工 - 葵 丙 所 酸 裂解 为 反 式 肉桂 酸 和 和 所, 反 式 肉桂 酸 在 290nm 处 有 最 大 吸收 值 。 若 酶 的 加 入 量 适当 , Az% 升 高 的 速率 可 在 几 小 时 内 保持 不 变 , 因此 通过 测定 Az% 升 高 的 速率 以 测定 PAL 活力 。 规 定 1h 内 Az% 增 加 0.01 为 PAL 的 - 156 °° INGA. BAIS Ta i PS A SE A. ER 验 中 将 会 看 到 , 随 着 PAL 逐步 被 纯化 ,其 比 活力 也 在 逐步 增加 。 在 蛋白 质 溶液 中 加 入 一 定量 的 中 性 盐 ( 如 硫酸 贸 、 硫 酸 钠 等 ) 使 蛋 日 质 沉淀 析 出 称 为 盐 析 。 溶 液 的 盐 浓 度 通常 以 盐 溶液 的 饱和 度 表 示 , 饱和 溶液 称 100% 饱和 度 。 沉 淀 某 一 种 酶 所 需 的 具体 浓度 , 需要 经 实验 确定 。 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 ( 商 品名 称 为 sphadex) 是 由 细菌 葡 聚 糖 长 链 , 用 交 联 剂 1 - 毛 - 2, 3 - 环 氧 丙烷 交 联 而 成 。 凝 胶 商 品名 后 面 的 G 值 表示 每 克 干 胶 吸 水 量 (毫升 数 ) 的 10 倍 。 交 联 度 大 , 网 孔 小 ; 交 联 度 小 , 网 孔 大 。 交 联 度 的 大 小 还 与 凝 胶 颗 粒 的 机 械 强 度 有 关 , 交 联 度 大 , 机 械 强度 也 大 ( 硬 胶 ), 在 柱 层 析 过 程 中 流速 快 。 根据 需要 , 选用 一 定型 号 的 凝 胶 作 柱 层 析 介 质 (蛋白 脱盐 一 般 用 G-25 或 G- 50,G-100 一 G-200 分 离 不 同 分 子 质量 的 蛋白 质 组 分 )。 由 于 被 分 离 物 质 的 分 子 大 小 和 形状 不 同 , 分子 质量 大 的 由 于 不 能 进入 凝 胶 的 网 孔 中 , 而 沿 着 颗粒 间 间 隙 最 先 流出 柱子 ;分 子 质量 小 的 由 于 进入 效 胶 网 孔 中 被 阻 滞 , 从 而 后 流出 柱子 , 达到 分 离 的 目的 。 DEAE 纤维 素 是 以 天 然 纤 维 素 为 母体 联结 了 二 乙 基 氨基 乙 基 制备 而 成 的 。 DEAE 纤维 素 柱 层 析 属 于 阴离子 交换 层 析 中 的 一 种 ,DEAE 纤维 素 经 过 处 理 上 柱 后 ,由 于 静电 吸力 等 可 吸引 在 固定 相 和 流动 相 中 的 一 些 阴 离子 (如 OH Cl 等 )。 蛋白 质 分 子 在 水 溶液 中 可 以 作 两 性 解 离 , 控制 溶液 pH, 可 使 蛋白 质 分 子 或 成 为 阴离子 ,或 成 为 阳离子 。 对 于 DEAE 纤维 素 而 言 , 应 使 酶 溶液 pH 大 于 酶 蛋白 分 FA pl, 使 其 成 为 阴离子 。 洗 脱 时 , 可 以 用 阶段 洗 脱 法 (stepwise elution), 即 先后 更 换 不 同 离子 强度 (或 pH) 的 洗 脱 液 ; 也 可 以 用 梯度 洗 脱 法 (gradient elution), 使 洗 脱 液 的 pH 或 离子 强度 在 洗 脱 过 程 中 产生 一 个 连续 的 梯度 变化 。 = Was Fh A TB} 1. 仪器 (1) 高 速 冷冻 离心 机 (2) 研 钵 (3) 恒温 水 浴 (4) 电子 天 平 (5) 双 光 束 分 光 光 度 计 (6) 刻度 试管 (7) 烧杯 (8) 剪刀 (9) Hf (10) 层 析 柱 。 BST 。 (11) 滴 管 (12) 止 水 夹 2. 试剂 (1) 0.1mol/L 硼酸 -硼砂 缓冲 液 (pH8.7) (2) 酶 提取 液 :0.1molL 硼酸 -硼砂 缓冲 液 ( 含 1mmol/L EDTA, 20mmol/L B— Rize ZB) (3) 0.6mol/L L -EFHARBK (4) 6mol/L HCl (5) ARBRE (6) 0.02mol/L 磷酸 盐 缓 冲 液 (pH8.0, & 0.5mmol/L EDTA, 2.5% 甘油 ， 20mmol/L 8 -3it2& Z BE) (7) Sephadex G - 25 (8) DEAE 44-44% 52 (9) 标准 蛋白 质 溶液 (100wg/ml) :准确 称 取 10mg 牛 血 清白 蛋白 于 烧杯 内 , 用 ANB KYA HE, 完全 转移 到 100ml 容量 瓶 内 , 定 容 至 刻度 , ES. (10) 考 马 斯 亮 蓝 G -250 和 蛋白质 染色 液 : 称 取 10mg 考 马 斯 亮 蓝 G- 250, WF Sml 95% 乙醇 中 , 加 入 85% (W/V) RRB 10ml, 混 匀 后 即 为 母液 。 用 时 , 按 15ml 母 YIM 85ml 蒸馏 水 的 比例 稀释 , 混 匀 后 过 滤 即 为 稀释 液 。 3. 材料 供 试 植 物 材 料 四 、 操 作 步 又 1. BATE (1) 以 植物 材料 lg， 剪 成 小 段 ,加 入 5 倍 体积 的 酶 提取 液 ,于 冰 浴 上 用 研 钵 研 和 (2) 将 已 匀 浆 的 酶 液 ,用 三 层 纱布 过 滤 。 滤 液 转 入 离心 管 , 10 000g URED 30min. (3) 取 离 心 后 的 上 清 液 ( 酶 粗 提 液 ), 量 出 其 体积 , 放置 冰 浴 中 备用 。 2. 硫酸 铵 分 级 沉淀 酶 蛋白 (1) 从 酶 粗 提 液 中 吸出 0.5ml, 以 作 后 面 活力 测定 用 。 下 余 酶 液 根 据 实际 体 FA tek IE A ie RR EF SLE), 算出 达到 38% 饱和 度 应 加 入 酶 液 中 的 硫酸 贸 量 , FFP PR EK 158 - | (2) 将 酶 液 倒 入 烧杯 内 , ARE PERS A PR ARK, 待 全 部 加 完 后 , 再 缓慢 搅拌 10min; 然后 于 10 000g 下 冷冻 离心 10min, 保留 上 清 液 于 烧杯 内 。 (3) 根据 硫酸 铵 饱和 度 用 量 表 , 算出 从 38% 到 75% 饱 和 度 所 需 硫 酸 贸 用 量 。 (4) 按 上 述 (2) 步 同 法 处 理 , 离心 后 , 弃 去 上 清 液 , 保留 沉淀 。 (5) 将 沉淀 溶 于 1 ml BHM. 3. Sephadex G - 25 层 析 脱盐 (1) 凝 胶 溶 胀 : 称 取 Sephadex G -25 5g, 加 入 适量 0.02mol/L 磷酸 盐 缓 冲 液 ， 在 室温 下 溶 胀 。 待 溶 胀 平衡 后 ,虹吸 去 除 上 清 液 中 的 细小 凝 胶 颗 粒 , 这 样 处 理 2 一 3 次 。 (2) 装 柱 : 固 定好 层 析 柱 , 柱 保持 垂直 , 将 20ml 蒸馏 水 装 入 柱 内 , 打开 止 水 来 赶 去 出 口内 气泡 , SHARES 1 ml 左右 水 层 时 , 把 处 理 好 的 Sephadex G - 25, AR 璃 棒 搅 匀 , 尽量 一 次 加 入 柱 内 , 待 胶 床 表面 仅 有 1 一 2cm WE, WEA IKK, R 好 的 胶 柱 应 无 气泡 无 节 痕 、 床 面 平 正 , 床 面 铺 1 张 圆 形 滤纸 片 。 (3) 上 样 : 让 胶 床 表面 几乎 不 留 液 层 , 将 lml 酶 液 小 心 注入 胶 床 面 中 央 , 注意 不 要 冲 坏 床 面 , 吸取 lml 磷酸 盐 缓冲 液 ,把 吸附 在 玻璃 壁 上 的 沉淀 液 洗 入 柱 内 ,在 床 表面 仅 有 lml 左右 液 层 时 , 再 小 心地 用 滴 管 加 入 5 一 6cm 高 的 磷酸 缓冲 液 洗 脱 。 (4) 洗 脱 收集 : 取 刻 度 试 管 5 支 (包括 上 面 一 支 ), 编号 , 柱 床 上 面 不 断 加 磷酸 盐 缓冲 液 洗 脱 , 出 水 口 不 断 用 刻度 试管 收集 洗 脱 液 , 每 管 收 集 3ml。 (5) 测定 每 管 的 PAL 酶 活力 ,合并 PAL 活力 高 的 试管 , 记 为 酶 洗 脱 液 。 4. DEAE 纤维 素 柱 梯度 洗 脱 (1) 称 取 DEAE 纤维 素 52 干粉 1 一 1.$g, 加 20ml 的 0.02mol/L 磷酸 盐 缓 冲 液 (pH8.0) 浸 泡 4h 以 上 (或 浸泡 过 夜 )。 (2) 装 柱 : 把 预 处 理 的 DEAE 纤维 素 52 装 柱 ( 方 法 及 要 求 同 凝 胶 层 析 柱 )。 装 柱 完 成 后 ,用 2 一 3 个 床 体积 的 0.02molL 磷酸 盐 缓冲 液 (pPH8.0) 洗 脱 平衡 该 柱 。 (3) 上 样 :把 所 得 的 酶 洗 脱 液 小 心地 注 六 柱 床 面 中 央 , 所 有 注意 点 和 方法 也 与 凝 胶 层 析 中 上 样 相 似 。 上 样 结束 后 , 在 床 面 以 上 小 心地 加 入 0.02mol/L 磷酸 盐 缓 冲 液 2 一 3cm 厚 液 层 。 注 意 上 样 开始 就 收集 流出 液 。 (4) 洗 柱 : 约 用 2 倍 床 体积 的 0.02mol/L 磷酸 盐 缓 冲 液 洗 柱 , 收集 洗 柱 液 。 按 洗 脱 管 编号 , 每 隔 3 管 ( 如 1.4、7 等 ) 取 其 洗 脱 液 0.1ml, 测 各 管 中 PAL 的 活力 ; 合 并 主要 含有 PAL 活力 的 各 管 洗 脱 液 ,并 量 出 其 总 体积 (ml)。 5. BEAM (1) 取 试 管 3 支 , 按 表 中 所 述 加 样 (0 号 为 调 零 管 , 1 号 为 测定 管 , 2 号 为 对 照 159 - (2) 将 各 管 混 匀 , 放 入 40C Thi KIA Rik 1h, FNAL HI 0.2ml 2mol/L HCl 终止 反应 (3) 紫外 分 光 光 度 计 预 热 10min, 于 波长 290nm 处 测定 各 管 的 Azoo。 6. 蛋白 质 测 定 ( 考 马 斯 亮 蓝 染 色 法 ) (1) 取 酶 液 0.1ml, 用 蒸馏 水 稀释 至 Sml。 (2) 取 试 管 8 支 , 按 下 表 加 入 各 溶液 : 标准 蛋白 质 溶 液 (ml) Fi FE AK (ml) 蒸馏 水 (ml) 考 马 斯 亮 蓝 (ml) (3) BERS BIRD, 静 置 2min, 测定 各 管 的 Azo5。 五 、 结 果 处 理 PAL 总 活力 、 比 活力 ` 蛋 白质 含量 的 计算 蛋白 质 含量 总 活力 比 活 力 (m) (m/mg protein) 注 : (1) 22 iil Br A SN EY ME HH RA 1 ~5 号 管 溶液 的 Ases 值 为 纵 坐 标 , 相 应 管 中 的 电 日 质 微 克 数 为 横 坐 标 , 作 图 。 * 360 « (2) PAL His Hit#: EWE PAL 总 活力 单位 数 RE LOIS 7) = ， 酶 液 中 蛋 自 质 总 mg 数 六 、 注 意 事项 1. 往 酶 液 中 加 固体 硫酸 铵 时 , 注意 不 能 有 大 颗粒 , 加 的 速度 也 不 能 过 快 。 2. 层 析 柱 要 保持 与 地 面 垂 直 , 往 柱 内 加 样品 时 要 小 心 , 避免 冲 坏 床 面 。 七 、 思 考 事项 1. 在 PAL 活力 测定 中 , 设置 0 号 管 和 对 照管 的 目的 是 什么 ? 2. 如 何 确 定 硫 酸 铵 沉淀 某所 需 酶 蛋白 质 的 最 佳 饱和 度 的 范围 ? 3.Sephadex G- 25 柱 层 析 脱 盐 成 功 的 关键 有 哪些 ? 4. 如 果 改 变 DEAE 纤维 素 为 CM 纤维 素 ( 阳 离子 交换 剂 ), 其 他 条 件 均 不 变 ， 问 各 蛋白 的 洗 脱 行为 有 何 变化 ? 参考 文献 苏 海 翔 , 姚 侃 . 深 红 酵 母 菌 葵 丙 氨 酸 解 氢 酶 的 诱导 纯化 .兰州 医学 院 学 报 , 1995,21(4) :195 一 197 薛 应 龙 .植物 生理 学 实验 .北京 :高 等 教育 出 版 社 , 1985 赵 永 芳 . 生 物化 学 技术 原理 及 其 应 用 .武汉 大 学 出 版 社 , 1994 Koukol J. Conn E E. The metabolism of aromaic and properties of the phenylalamine deanninese of Hordeum Vul- gafe. J. Biol. Chem, 1961, 236(10) :2692—2698 * $63 5° 第 五 单元 ”选择 实验 实验 三 十 “蛋白 质 含 量 测定 ( 双 缩 腺 法) | —. Bs 掌握 双 缩 腺 法 测定 蛋白 质 含 量 的 原理 和 方法 。 掌 握 分 光 光 度 计 的 使 用 方法 。 二 、 原 理 碱 性 溶液 中 双 缩 腺 (NEH - CO - NH - CO - NH2) 能 与 Cu?* 产生 紫红 色 的 络 合 物 , 这 一 反应 称 为 “ 双 缩 脲 反应 ”。 和 蛋白 质 分 子 中 的 肽 键 也 能 与 铜 离子 发 生 双 缩 RY, 溶液 紫红 色 的 次 浅 与 蛋白 质 含量 在 一 定 范 围 内 符合 朗 伯 -比尔 定律 , 而 与 蛋白 质 的 氨基 酸 组 成 及 分 子 质量 无 关 。 其 可 测定 范围 为 1 一 10msg 蛋白 质 , 适用 于 精度 要 求 不 高 的 蛋白 质 含量 测定 。Tiis, 一 些 氨基 酸 , EDTA 等 会 干扰 该 测定 。 三 仪器、 试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 分 光 光 度 计 (2) 分 析 天 平 (3) HRB (4) 刻度 吸管 :1mlx2，5mlx2，10mlx1 (5) 具 塞 三 角 瓶 :100ml (6) 漏斗 :13 个 2. 试剂 (1) 双 缩 腺 试剂 : 取 硫 酸 铜 (CuSO4 .5HzO)1.5g 和 酒石酸 钾 钠 (NaKC4H40O56， 4H,0O)6.0g, 溶 于 500ml 蒸馏 水 中 , 在 搅拌 的 同时 加 入 300ml 10% NaOH 溶液 定 容 至 1000ml, ERA BHAA IA (2) 0.05mol/L 的 NaOH. (3) PWEBEABM: ERARBEA 0.5g WF 0.05mol/L 的 NaOH 溶液 中 ,并 定 容 至 100ml, 即 为 Smg/ml 的 标准 溶液 。 + 162 * 3. 材料 小 麦 、 玉 米 或 其 他 谷物 样品 , AP SPA 100 目 铜 筛 。 四 、 操 作 步 又 . 1. 标准 曲线 的 绘制 取 6 支 试 管 , 编号 , 按 下 表 加 入 试剂 管 号 fH 15min, 室温 静 置 30min, 540nm 比 色 , WHA et (mg) Ate hh, RIA 纵 坐 标 , 绘制 标准 曲线 。 2. 样品 测定 (1) 将 磨 碎 过 筛 的 谷物 样品 在 80 下 烘 至 恒 重 ,取出 置 干 燥 器 中 冷却 待 用 。 (2) 称 取 烘 干 样品 约 0.2g 两 份 ,分 别 放 入 两 个 干燥 的 三 角 瓶 中 。 然 后 在 各 瓶 中 分 别 加 入 Sml 0.05mol/L 的 NaOH 溶液 湿润 ,之 后 再 加 入 20ml 的 双 缩 腺 试剂 ， fe 15min, 室温 静 置 反应 30min, 分 别 过 滤 , 取 滤 液 在 540nm 波长 下 比 色 , 在 标准 曲线 上 查 出 相应 的 蛋白 质 含 量 (mg)。 五 结果 处 理 伴 品 蛋白 质 (%) een EGR 100% BREESE 1. 三 角 瓶 一 定 要 干燥 , 勿 使 样品 粘 在 瓶 壁 上 。 2. 所 用 酯 蛋白 需 经 凯 氏 定 氮 法 确定 蛋白 质 的 含量 。 七 .思考 题 双 缩 腺 法 测定 蛋 日 质 含量 的 原理 是 什么 ? 168. - 参考 文 献 宋 治 军 , 纪 重 光 主 编 . 现代 分 析 仪 器 与 测试 方法 . 西安 :西北 大 学 出 版 社 ,1995 文 树 基 主 编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 西北 农业 大 学 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 张 龙 翔 主编 . 生化 实验 方法 和 技术 . 北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1982 S3e=+—- BARSSME (Folin - WX) ms A 的 掌握 Folin - 酚 法 测定 重 白 质 含 量 的 原理 方法 , 熟悉 分 光 光 度 计 的 操作 。 三 :原理 Folin - 酚 法 测定 蛋白 质 含量 的 过 程 包 括 两 步 反 应 :第 一 步 是 在 碱 性 条 件 下 和 蛋 白质 与 Cu 作用 生成 络 合 物 , 第 二 步 是 此 络 合 物 还 原 Folin 试剂 ( 磷 钼 酸 和 磷 钨 酸 试剂 ), 生成 深蓝 色 的 化 合 物 , 上 且 颜 色 深 浅 与 蛋白 质 的 含量 成 正比 关系 。 该 方法 灵 敏 度 高 于 双 缩 腺 法 100 倍 。 硫 酸 铵 甘氨酸、 还 原 剂 如 二 硫 苏 糖 醇 (DTT)、 琉 基 乙 醇 等 会 干扰 反应 。 三 、 仪 器 与 试剂 1. 仪器 (1) 分 光 光 度 计 (2) 水 浴 (3) 试管 (4) 具 塞 试管 8 支 (5) 小 烧杯 2 支 (6) 漏斗 及 架 (7) DHF (8) 吸管 :0.Smlx1l1，lmlx2，Smlx1l (9) 容量 瓶 :100mlx2，10mlx1l (10) 滤纸 、 玻 棒 等 (11) BRE (12) BOOB Oe 2. 试剂 (1) 0.5mol/L NaOH - 164 . ee. aa (2) 试剂 甲 1) 称 取 10g NazCOi,2g NaOH #1 0.25 g 酒石酸 钾 钠 ,溶解 后 用 蒸馏 水 定 容 至 500ml. 2) 0. 5g 硫酸 铜 (CuSO4 .5HO) 溶 解 后 ,用 蒸馏 水 定 容 至 100ml. 每 次 使 用 前 将 A 液 50 份 与 B 液 1 份 混合 , 即 为 试剂 甲 。 此 混合 液 的 有 效 期 只 有 1 天 ,过 期 失效 。 (3) 试剂 乙 : 在 1.5L 容积 的 磨 口 回流 器 中 加 入 100g 5 RAH (Na, WO, - 2HO),25$g 钼 酸 钠 (NazMo0O4'2HzO) 及 700ml 蒸馏水 ,再 加 S0ml 85% BEB, 100ml 浓 盐 酸 充 分 混合 , 接 上 回流 冷凝 管 ,以 小 火 回流 10h。 回 流 结束 后 ,加 入 150g 硫酸 锂 , S0ml 蒸 饮水 和 数 滴 液 体 溴 , 开口 继续 沸腾 15min, 驱除 过 量 的 省 ,冷却 后 溶液 呈 黄 色 ( 若 仍 呈 绿色 , 须 再 重复 滴 加 液体 省 数 滴 , 再 继续 沸腾 13Smin)。 然 后 黎 释 至 1L, 过 滤 , 滤液 置 于 棕色 试剂 瓶 中 保存 。 使 用 时 大 约 加 水 1 倍 , 使 最 终 浓度 相当 于 1mol/L 盐酸 。 3. 材料 绿豆 芽 或 其 他 植物 材料 。 四 操作 步骤 1. 标准 曲线 的 绘制 (1) 配置 标准 牛 血清 白 蛋白 溶液 :在 分 析 天 平 上 精确 称 取 0.025g 结晶 牛 血清 AeA, 倒 至 小 烧杯 内 , 加 入 小 量 薰 馅 水 溶解 后 转 入 100ml 容量 瓶 中 , 烧杯 内 的 残 液 用 少量 蒸馏 水 冲洗 数 次 , 冲洗 液 一 并 倒 入 容量 瓶 内 , 最 后 用 蒸馏 水 定 容 至 刻度 ， 配制 成 标准 蛋白 质 溶 液 , 其 中 牛 血清 白 蛋 自 的 浓度 为 230kg/ml。 (2) 系列 标准 牛 血 清白 蛋白 溶液 的 配制 : 取 具 塞 试管 6 支 , 按 下 表 加 入 牛 血清 白 蛋 白 标 准 溶液 及 蒸馏 水 。 然 后 各 管 加 入 试剂 甲 Sml, 混合 后 在 室温 下 放置 10min, 再 加 0.5ml 试剂 乙 , 立 即 混合 均匀 (这 一 步 速度 要 快 , 否则 会 使 显 色 程度 减 弱 )。30min 后 , 以 不 含 蛋白 质 的 工 号 试管 为 对 照 ,与 其 他 5 支 试 管内 的 溶液 依次 用 分 光 光 度 计 于 500nm 波长 下 比 色 。 记 录 各 试管 内 溶液 的 吸光 度 。 (3) 标准 曲线 的 绘制 :以 吸光 度 为 纵 标 , 以 牛 血清 白 蛋 白 含量 (ng ) 为 横 坐 标 ， + 165 - 绘制 标准 曲线 。 2. 样品 测定 (1) 称 取 绿豆 芽 下 胚 轴 1g 于 研 钵 中 , 加 蒸馏 水 2ml, SR, RAB OS, FFA 6ml 蒸 饮水 分 次 洗涤 研 钵 , 并 入 离心 管 。4000rxmin 离心 20min。 弃 去 沉淀 , LF 液 转 入 容量 瓶 , 定 容 至 10ml。 | (2) 取 具 塞 试管 2 支 ,各 加 入 上 清 液 tml, 分 别 加 入 试剂 甲 Sml, 混 匀 后 放置 10min, 然后 加 试剂 乙 0.$Sml, RID, 室温 下 放置 30min, 于 500nm 波长 下 比 色 ， 记录 吸光 值 。 五 结果 处 理 从 标准 曲线 上 查 出 测定 液 中 蛋白 质 的 含量 X(ng), 然后 计算 样品 中 蛋白 质 的 百 分 含 量 。 站 口 是 | _ X(ug) x PFE TGR 样品 中 和 蛋 日 质 含量 (% ) 样品 重 (g) x 10° x 100 Folin 试剂 (试剂 乙 ) 在 碱 性 条 件 下 不 稳定 ,但 此 实验 中 反应 在 pH 10 时 发 生 ， 因此 在 Folin 试剂 反应 时 应 立即 混 匀 , 否则 显 色 程度 减弱 。 本 法 也 可 用 于 测定 游离 酷 氨 酸 和 色 所 酸 。 七 ` 思 考题 Folin - 酚 法 测定 蛋白 质 含量 的 原理 是 什么 ? 参考 文献 宋 治 军 , 纪 重 光 主 编 . 现代 分 析 仪器 与 测试 方法 . 西安 :西北 大 学 出 版 社 , 1995 文 树 基 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 西北 农业 大 学 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986 张 龙 翔 主编 . 生化 实验 方法 和 技术 . 北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1982 实验 三 十 二 ”紫外 吸收 法 测定 蛋白 质 含 量 ais 目 的 学 习 用 紫外 吸收 法 测定 蛋 白 质 含量 的 方法 。 = JRE 蛋白 质 分 子 中 的 酷 氨 酸 、 色 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 等 残 基 在 280nm 波长 下 具有 最 大 166 - SRS “TOMES 吸收 。 由 于 各 种 蛋白 质 中 都 含有 酷 氨 酸 , 因 此 280nm HY RIG EE A A — 遍 性 质 。 在 一 定 程 度 上 , 蛋白 质 溶液 在 280nm 吸光 度 与 其 浓度 成 正比 , 故 可 用 作 蛋白 质 定量 测定 。 核 酸 在 紫外 区 也 有 强 吸收 , 可 通过 校正 加 以 消除 。 该 方法 的 优 点 是 定量 过 程 中 无 试剂 加 入 , 蛋白 可 回收 。 = Ma AIR 1. 仪器 (1) 紫外 分 光 光 度 计 (2) 离心 机 了 (4) 研 钵 (5) HR: 50ml x 4 (6) 刻度 吸管 :Imlx2 (7) 定量 加 液 器 :2 个 2. 试剂 (1) 30% NaOH: 称 取 NaOH 30g 溶 于 适量 水 中 , 定 容 至 100ml, SARK 试剂 瓶 中 备用 。 (2) 60% 碱 性 乙醇 : 称 取 NaOH 2g, 溶 于 少量 60% 乙醇 中 , 然后 用 60% 乙醇 定 容 至 1000ml。 四 、 操 作 步 又 1. 提取 小 麦 种 子 蛋白 称 取 粉 碎 过 40 号 筛 的 小 麦 样品 0.$g, 置 研 钵 中 , 加 少量 石英 砂 和 2.0ml 30% NaOH, 研磨 2min, 再 加 3ml 60% 碱 性 乙醇 ,研磨 Smin。 然 后 用 60% 碱 性 乙醇 将 研 磨 好 的 样品 无 损 地 洗 入 ml 容量 瓶 中 , EA, 摇 匀 后 静 置 片刻 , 取 部 分 浸 提 液 离心 10min(3500r/min)。 吸 取 上 清 液 1Iml 于 225ml 容量 瓶 中 ,用 60% 碱 性 乙醇 稀释 并 定 容 , HORM ALA. 在 做 样品 的 同时 , 做 空白 , 比 色 时 以 空白 调 零 。 2. 比 色 在 紫外 分 光 光 度 计 上 ,于 280nm 和 260nm 波长 下 分 别 测 其 吸光 度 , 然后 根据 下 式 进 行 计 算 。 ”本 五 结果 处 理 3 A J (pg/ml) FF (1 -45 Argo a 0.74Ar¢60) x 稀释 倍数 式 中 ，As2so 为 蛋白 质 溶液 在 280nm 处 测 得 的 吸光 度 。 Aveo A AJA MAZE 260nm 处 测 得 的 吸光 度 。 不 同 蛋白 质 酷 氨 酸 的 含量 有 所 差异 , 蛋白 溶液 中 存在 核酸 或 核 苷 酸 时 会 影响 紫外 吸收 法 测定 蛋白 质 含 量 的 准确 性 , 尽管 利用 上 述 公 式 进 行 了 校正 , 但 由 于 不 同 样品 中 干扰 成 分 差异 较 大 , 致使 280nm 紫外 吸收 法 的 准确 性 稍 差 。 七 、 思 考题 1. 紫外 吸收 法 测定 蛋白 质 含量 的 原理 是 什么 ? 2. 比较 紫外 吸收 法 、 双 缩 腺 法 、Folin - 酚 法 、 考 马 斯 亮 蓝 G - 250 法 测定 蛋白 质 含 量 的 优 缺 点 。 参考 文献 宋 治 军 , 纪 重 光 主 编 . 代 分 析 仪 器 与 测试 方法 . 西安 :西北 大 学 出 版 社 , 1995 西北 农业 大 学 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1986 张 龙 翔 主编 . 生化 实验 方法 和 技术 . 北京 :人 民 教 育 出 版 社 , 1982 实验 三 十 三 “还原 糖 含量 的 测定 (Somogyi-Nelson bfx) —. BW 在 植物 营养 及 代谢 研究 中 , 常 需 测定 还 原 糖 的 含量 ,本 实验 要 求 掌握 Somogyi- Nelson 比 色 法 的 测定 原理 。 二 、 原 理 还 原 糖 是 具有 插 基 (>C=O) 的 糖 ,能 将 其 他 物质 还 原 而 其 本 身 被 氧化 。 (1) 还 原 糖 在 碱 性 条 件 下 加 热 , 在 酒石酸 钾 钠 存在 的 情况 下 , 可 以 定量 地 将 二 价 铜 离子 还 原 为 一 价 铜 离子, 即 产生 砖 红色 的 氧化 亚 铜 沉淀 , 其 本 身 被 氧化 。 具 体 反应 如 下 : CuSO, + 2NaOH -~NazSO4 + Cu(OH), HO—CH—COONa DAM, Ma: Cu(OH)> a | oe + 2H2O HO—CH—COOK \No—CH—COOK * 168 - Au | OREN POC te Ca + HO-€38 +42H,0O>-"5 ‘o—CH—COOK 人 H—C—OH CH,OH COOH HO—CH—COONa (CHOH), + 2 | + CHOY HO—CH—COOK CH,OH (2) 氧化 亚 铜 在 酸性 条 件 下 , 可 将 钥 酸 铵 还 原 , Ra ARR SRR a — 钠 起 作用 , 生成 一 种 蓝 色 复合 物 即 砷 钼 蓝 , RE ERAS Set ( 即 被 还 原 的 CuzO 量 ) 成 正比 ,用 标准 葡萄 糖 与 砷 钼 酸 作用 , 比 色 后 用 做 标准 , 就 可 测 得 样品 中 还 原 糖 含量 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 分 光 光 度 计 (2) 水 浴 锅 (3) 具 塞 刻度 试管 :1Smlx 10 (4) 吸管 :Imlx1，2mlx4，5mlx3 (5) 容量 瓶 :100mlx2 (6) 漏斗 (7) BRR (8) 电子 项 载 天 平 2. 试剂 (1) 铜 试剂 1) 4% CuSO.SH2O 2) 称 取 24g 无 水 碳酸 钠 ,用 850ml 水 溶 于 大 烧杯 中 ,加 120g & 4 分 子 结晶 水 的 酒石酸 钾 钠 , 待 全 溶 ( 可 适当 加 热 ) 后 加 入 碳酸 氢 钠 16g, 再 加 入 120g 无 水 硫酸 钠 ,全 溶 及 冷却 后 加 水 至 900ml, 沉淀 1 一 2 K, 取 上 清 液 (要 求 严 格 时 过 滤 ) 即 可 备 用 。 - 169 - 使 用 前 将 A 与 B 按 1:9 混 匀 即 可 。 (2) 砷 钼 酸 试剂 :2$g FARR EE (NH, )6Mo70.4°4H,O]¥# F 450m! 蒸馏水 中 (加 热 溶 解 ,但 温度 接近 150°C 时 易 分 解 ), 待 冷却 后 再 加 入 21ml % HzSO4 KA. BH 3g 砷 酸 氢 二 钠 (NazHAsO4.7H2O) 溶 解 于 2$ml 蒸 馅 水 中 , 然后 加 到 钼 酸 贸 溶 液 中 ， 室温 下 放置 于 棕色 瓶 中 可 长 期 备用 。 (3) 200wg/ml 葡萄 糖 标准 液 :准确 称 取 分 析 纯 葡萄 糖 200mg, 溶解 定 容 到 1000ml。 3. 材料 新 鲜 植 物 组 织 。 四 、 操 作 步 又 1. 标准 曲线 的 制作 在 7 支 刻 度 试 管 中 , 分 别 加 入 200wg/ml 标准 葡萄 糖 0、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5, 0.6 ml, 再 顺序 加 入 蒸 饮水 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4 ml, 配 成 每 毫 升 含 0、10、30、40、50、60 pe 葡萄 糖 的 溶液 。 每 试管 加 入 铜 试剂 2ml, Saw 水 浴 中 加 热 10min, 立即 冷却 ,再 加 入 2ml 砷 钼 酸 试剂 , 振 功 两 分 钟 后 稀释 到 15Sml， 用 分 光 光 度 计 在 620nm 波长 下 比 色 , 测 其 吸光 度 。 以 糖 含量 (ng) 为 横 坐 标 , 吸光 度 为 纵 坐 标 , 绘制 标准 曲线 。 2. 植物 样品 还 原 糖 的 提取 将 样品 洗 净 , 吸 干 其 表面 水 分 , RRS, 称 取 1g 放 入 研 钵 中 , 加 入 石英 砂 约 0.5g, 磨 成 匀 浆 ,将 样品 转移 至 100ml 三 角 瓶 中 , 加 水 约 70~80ml, HAF 80T 恒温 水 浴 上 浸 提 半 小 时 。 竺 样品 冷却 后 , 沉淀 和 蛋白质: 加 入 5% 硫酸 锌 Sml, 再 慢 慢 滴 入 0.3 mol/L Ba (OH), Sml, 以 沉淀 蛋白 质 。 振 蔓 后 静 置 ,至 上 层 出 现 清 液 后 再 加 一 滴 Ba(OH)，， 直至 无 白色 沉淀 时 , 溶液 转移 至 100ml 容量 瓶 并 加 水 至 刻度 。 3. 还 原 糖 含量 的 测定 过 滤 上 述 已 定 容 的 样品 液 , 取 Sml 滤液 ,再 定 容 到 100ml( 此 步 视 样 品 的 含 糖 量 而 定 )。 取 已 稀释 的 溶液 2ml, 与 标准 葡萄 糖 溶 液 显 色 法 相同 :加 铜 试剂 2ml, 者 沸 10min, 加 砷 钼 酸 试剂 2ml, HH 2min, 定 容 到 15ml, 620nm 波长 下 比 色 , 记录 吸 光度 。 ~ 2 * Th. RB 从 标准 曲线 上 查 得 含 糖 量 x 稀释 液 倍数 x 100 样品 重 W(g) x 10° 还 原 糖 含量 (% ) = 因 材 料 不 同 , 应 适当 调整 稀释 液 倍 数 。 七 .思考 题 在 提取 样品 时 为 何 要 沉淀 蛋白 质 。 参考 文献 西北 农业 大 学 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986 年 。 实验 三 十 四 “可 溶性 总 糖 的 测定 ( 草 酮 比 色 法 ) — AB I EES A ATT = RE 强酸 可 使 糖 类 脱水 生成 糠 醛 , 如 : HO—CH—CH—OH wad, Fox an eA CH _C—CHO + 3H,0 OH OH ee ( 戊 糖 ) (HERE) HO—CH—CH—OH ‘hi oH PS Sipe SH C—CHO + 31,0 OH OH HO—H,C =O (Cs) (2 FA AE RE ) FE: FG ES) ie RE BC FEE FA PRE SB HK a, 形成 糠 醛 的 衍生 物 , 呈 蓝 绿色 , 该 物质 在 620nm 处 有 最 大 吸收 。 在 10 一 100rg 范围 内 其 颜色 的 深浅 与 可 溶性 糖 含 量 成 正比 。 “和 9 和 O Koy ft. a a O ‘HC=CH (Be ) (BR RE RT HAD ) 这 一 方法 有 很 高 的 灵敏 度 , 糖 含量 在 30wg 左右 就 能 进行 测定 ,所 以 可 做 为 微 量 测 糖 之 用 。 一 般 样 品 少 的 情况 下 , 采用 这 一 方法 比较 合适 。 = Mas AF A AD 1. 仪器 (1) 43636 it (2) 电子 项 载 天 平 (3) 三 角 瓶 :3S0mlx1 (4) 大 试管 :9 支 (5) 试管 架 , 试管 夹 (6) 漏斗 ,漏斗 架 (7) 容量 瓶 :S0mlx2 (8) 刻度 吸管 :1mlx3，2mlx1，5Smlx1l (9) 水 浴 锅 2. 试剂 (1) 葡萄 糖 标准 液 :100kg/ml (2) KiB (3) wR -0.2¢ AAAYAT 100ml %# H,SO, 中 当日 配制 使 用 。 3. 材料 IW BEA} BET - iV2 > 四 操作 步 又 1. 葡萄 糖 标准 曲线 的 制作 在 每 支 试管 中 立即 加 入 砷 酮 试剂 4.0ml, 迅速 浸 于 冰 水 浴 中 冷却 ,各 管 加 完 后 一 起 浸 于 沸水 浴 中 , 管 口 加 盖 玻 璃 球 ,以 防 蒸发 。 自 水 浴 重 新 煮沸 起 , 准确 煮沸 10min 取出 , 用 流水 冷却 ,室温 放置 10min, 在 620nm 波长 下 比 色 、 以 标准 葡萄 糖 含量 (wxg) 作 横 坐标 , 以 吸光 值 作 纵 坐 标 , 作出 标准 曲线 。 2. 植物 样品 中 可 溶性 糖 的 提取 将 小 麦 分 昔 节 剪 碎 至 2mm 以 下 , 准确 称 取 1g, BA 50ml 三 角 瓶 中 , 加 沸水 25ml, 在 水 浴 中 加 盖 者 沸 10min, 冷却 后 过 滤 , 滤液 收集 在 S0ml 容量 瓶 中 , EAS 刻度 。 吸 取 提 取 液 2ml, 置 另 一 S0ml 容量 瓶 中 , 以 蒸馏 水 稀释 定 容 , 摇 匀 测定 。 3. 测定 吸取 lml 已 稀释 的 提取 液 于 大 试管 中 , 加 入 4.0ml 草 酮 试剂 ,以 下 操作 同 标准 曲线 制作 。 比 色 波长 620nm, 记录 吸光 度 , 在 标准 曲线 上 查 出 葡萄 糖 的 含量 (ug)。 五 结果 处 理 ’ _ 查 表 所 得 的 糖 量 (ug) x EEA 植物 样品 含 糖 量 (% ) 样品 重 (g) x 10° x 100 1. FREARMIEK RR, BRMPUADBRARBRER. 2.H,SO, 要 用 高 纯度 的 。 3. 不 同 糖 类 与 意 酮 的 显 色 有 差异 , 稳定 性 也 不 同 。 加 热 、 比 色 时 间 应 严格 掌 握 。 七 .思考 题 1. 用 水 提取 的 糖 类 有 哪些 ? - £96 « 2. 制作 标准 曲线 时 应 注意 哪些 问题 ? 参考 文献 eR. 生物 化 学 研究 技术 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 ,1995 实验 三 十 五 ”可 溶 性 总 糖 的 则 定 (地 衣 酚 -硫酸 法 ) — Bs 学 习 另 一 种 测定 可 溶性 总 糖 的 方法 -地 衣 酚 -硫酸 比 色 法 。 二 \ 原 理 可 溶性 糖 经 无 机 酸 处 理 脱水 产生 糠 醛 ( 戊 糖 ) 或 糠 醛 衍 生物 (如 羟 甲 基 糠 醛 ) ( 己 糖 ), 生成 物 能 与 酚 类 化 合 物 缩合 生成 有 色 物 质 。 通 常 使 用 硫酸 , 常用 的 酚 有 地 衣 酚 (又 名 苦 黑 酚 )、 间 - 葵 二 酚 、a - 蔡 酚 等 。 三 、 仪 器、 试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 可 见 光 分 光 光 度 计 1L 台 (2) 试管 9 文 (3) 吸管 Sml 3 支 (4) 电热 恒温 水 浴 2. 试剂 (1) 100wg/ml 标准 甘露 糖 溶液 :10mg 甘露 糖 ,水 溶解 后 定 容 至 100ml。 (2) 地 衣 酚 -硫酸 试剂 :将 600ml 冷却 到 4°C AY HzSO4 小 心地 加 入 到 400ml 冷水 中 ,为 60% HzSO4,4 贮 存 。 另 配 1.6% 地 衣 酚 水 溶液 , 置 4 亿 贮 存 。 使 用 前 将 75ml 60% HSO4 加 到 10ml 地 衣 酚 溶液 中 , 即 为 地 衣 酚 -硫酸 试剂 。 3. 材料 玻璃 球 小 麦 分 莫 节 或 其 他 植物 材料 四 、 操 作 步 又 1. 制作 甘露 糖 标准 曲线 : 取 7 支 试管 , 编号 , 分 别 加 100pg/ml 甘露 糖 标准 液 0.0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 ml, BS dB 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, * 174 > 0.5, 0 ml 补足 至 3.0ml, 各 管 加 8.5ml 冷却 到 4C 的 地 衣 酚 -硫酸 试剂 , FOAM 一 玻璃 球 , 将 试管 放 入 80T KIF FOIA 13min。 取 出 后 流动 水 冷却 , S0Snm 比 色 (以 0 管 调 零 ) 。 2. 可 溶性 糖 样品 液 显 色 :将 实验 三 十 四 制备 (或 其 他 材料 提取 ) 的 可 溶性 糖 样 品 适量 ( 约 含 糖 $S0 一 200wg) 加 入 试管 ,加 蒸馏 水 补 至 3.0ml, 再 加 8.5ml 冷 的 地 衣 酚 - 硫 酸 试剂 , 同 标 准 曲线 制作 一 样 处 理 。 冷 却 后 S05nm 比 色 。 五 、 结 果 处 理 工 . 以 甘露 糖 含量 (pg) 为 横 坐 标 , 以 Asos 为 纵 坐 标 , 制作 标准 曲线 。 2. 根据 样品 的 Asos 在 标准 曲线 上 查 出 相当 的 甘露 糖 含量 (wg), 再 按 下 式 计算 样品 中 可 溶性 糖 含 量 (以 甘露 糖 计 )。 口 _ 查 曲线 所 得 糖 量 x 稀释 倍数 植物 样品 可 溶性 糖 (% ) = 样 重 (g) x 10° x 100 WER PH 1. 该 法 操作 简便 , 可 广泛 用 于 测定 糖 蛋白 中 总 糖 含量 。 2. 氨基 糖 存在 可 导致 颜色 降低 。 大 量 的 色 氢 酸 存在 也 可 导致 一 些 误差 , 但 对 中 性 糖 的 测定 结果 是 可 靠 的 。 3. 如 果 样 品 中 含有 较 多 葡萄 糖 , 加 热 时 间 应 延长 至 45min, 因为 葡萄 糖 显 色 较 慢 。 七 、 思 考题 样品 显 色 过 程 中 , 试管 口 为 何 加 盖 玻 璃 球 ? 参考 文献 PROLAE . 生物 化 学 研究 技术 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 ,1995 实验 三 十 六 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 的 测定 ( 双 波 长 法 ) — AW 淀粉 一 般 都 是 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 的 混合 物 。 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 含量 和 比 例 因 植 物种 类 而 不 同 , 决 定 着 谷物 种 子 的 出 饭 率 和 食 味 品质 , 并 影响 着 谷物 的 贮藏 加 工 。 通 过 本 实验 学 习 掌握 双 波 长 测定 谷物 中 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 的 含量 。 = Re 根据 双 波 长 比 色 原理 , 如 果 溶 液 中 某 溶质 在 两 个 波长 下 均 有 吸收 , 则 两 个 波长 - 175 + 的 吸收 差 值 与 溶质 浓度 成 正比 。 直 链 淀粉 与 碘 作 用 产生 纯 蓝 色 , 支 链 淀粉 与 碘 作用 生成 紫红 色 。 如 果 用 两 种 淀粉 的 标准 溶液 分 别 与 碘 反 应 , 然后 在 同一 个 坐标 系 里 进行 扫描 (400 一 960 mm) 或 做 吸收 曲线 , 可 以 得 到 图 36.1 所 示 结 果 。 入 nm 1 Aq Ay 3 400 480 560 640 720 800 880 960 A 36.1 作 图 法 选择 直 链 、 支 链 淀粉 的 测定 波长 、 参 比 波长 图 36.1 中 , 1 为 直 链 淀粉 的 吸收 曲 线 , 2 为 支 链 淀粉 的 吸收 曲线 。 对 直 链 演 粉 来 说 ,选择 Ay 为 测定 波长 (不 一 定 是 最 大 吸收 波长 ), 在 X 处 作 x 轴 垂 线 , 垂 线 与 曲线 1、2 分 别 相 交 于 ALL AQ. Tt A:, 作 x META, 与 曲线 2 相交 于 Ai 。 通过 A, 再 作 x 轴 垂 线 , 垂 线 与 曲线 A x 轴 分 别 相 交 于 Ay AA, A 即 为 直 链 演 粉 测定 的 参 比 波长 。Az -= Ai = AA 埋 SH 链 淀粉 含量 成 正比 ,在 此 条 件 下 , Ad = Al, 支 链 淀粉 的 存在 不 会 干扰 直 链 淀粉 的 测定 。 同样 , 可 以 通过 作 图 选择 支 链 淀粉 的 测定 波长 为 X, 参 比 波长 为 为 。A4 - As=AA 支 与 支 链 淀 粉 含量 成 正比 ,在 此 条 件 下 , As = As, 直 链 淀粉 的 存在 也 不 会 干扰 支 链 淀粉 的 测定 。 对 含有 直 链 演 粉 和 支 链 淀粉 的 未 知 样品 , 与 碘 显 色 后 , 只 要 在 选 定 的 波长 六 、 Ao \)3、)4 处 作 4 次 比 色 ,利用 直 链 淀粉 和 支 链 狂 粉 标准 曲线 即 可 分 别 求 出 样品 中 两 类 淀粉 的 含量 。 三 、 仪 器 .试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 电子 分 析 天 平 (2) 索 氏 脂肪 抽 提 器 1 套 (3) 分 光 光 度 计 1 台 (4) pH 计 (5) AHH ”100mlx2，50mlx16 (6) 吸 & O.5mlX1, 2mlx1, 5ml x1 2. 试剂 (1) CREST AE CH FE 30 ~60T ) * Pro * (2) 无 水 乙醇 (3) 0.5ml/L KOH 溶液 (4) 0.1mol/L HCl 溶液 . (5) 碘 试剂 : 称 取 碘化钾 2.0g, AFD BAK, FONE 0.2g, FIA a 馏 水 稀释 定 容 至 100ml。 ， (6) 直 链 淀粉 标准 液 : 称 取 直 链 淀 粉 纯 品 0.1000g, 放 在 100ml 容量 瓶 中 , 加 入 0.5mol/L KOH 10ml, 在 热 水 中 竺 溶解 后 ,取出 加 蒸馏水 定 容 至 100ml, BUA 1mg/ ml 直 链 淀粉 标准 溶液 。 (7) 支 链 淀粉 标准 液 : 用 0.1000g 支 链 演 粉 按 (6) 法 制备 成 Img/ml 支 链 淀粉 标准 溶液 。 3. 材料 供 试 谷物 粉 。 DY PR VEER 1. HEA BH. CHEM ERK. AWRK. 直 链 淀粉 : 取 mg/ml 直 链 淀粉 标准 液 lml, HA SOml 容量 瓶 中 , 加 蒸馏 水 30ml, LA 0.1mol/L HCl 溶液 调 至 pH 3.5 AA, MA MIRA O.5ml, 并 以 蒸馏 水 定 容 。 静 置 20min, 以 蒸馏 水 为 空白 ,用 双 光 束 分 光 光 度 计 进行 可 见 光 全 波段 扫描 或 用 普通 比 色 法 绘 出 直 链 淀粉 吸收 曲线 。 支 链 淀粉 : 取 lmg/ml 支 链 淀粉 标准 液 lml, 放 入 50ml 容量 瓶 中 , 以 下 操作 同 直 链 淀粉 。 在 同一 坐标 内 获得 支 链 淀粉 可 见 光 波段 吸收 曲线 。 根据 原理 部 分 介绍 的 方法 , 确定 直 链 淀粉 和 支 链 淀粉 的 测定 波长 、 参 比 波长 XI 和 Ago 2. 制作 双 波 长 直 链 演 粉 标准 曲线 :吸取 1mg/ml 直 链 淀粉 标准 溶液 0.3、0.5、 0.7、0.9、1.1、1.3 ml 分 别 放 入 6 只 不 同 的 50ml 容量 瓶 中 , 加 入 蒸馏 水 30ml, 以 0.1mol/L HCl 溶液 调 至 pH 3.5 左右 ,加 入 碘 试 剂 0.Sml, 并 用 蒸馏 水 定 容 。 静 置 20min, 以 蒸馏 水 为 空白 ,用 cm 比 色 杯 在 Ado 两 波长 下 分 别 测定 A, AY, BIG A4 直 =A -Ai。 以 A4 直 为 纵 坐 标 , 直 链 洽 粉 含量 (mg ) 为 横 坐 标 , 制备 双 波 长 直 链 淀粉 标准 曲线 。 3. 制作 双 波 长 支 链 淀粉 标准 曲线 :吸取 1mg/ml 支 链 淀粉 标准 溶液 2.0、2.5、 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 ml 分 别 放 入 6 只 不 同 的 S0ml 容量 瓶 中 。 以 下 操作 同 直 链 演 粉 。 以 蒸馏 水 为 空 日 ,用 lcm 比 色 杯 在 )as、X 两 波长 下 分 别 测定 其 A, Ag, 即 得 AA x =A, - Ajo U A4 支 为 纵 坐 标 , 支 链 淀粉 含量 (mg ) 为 横 坐 标 , 制备 双 波长 支 链 淀粉 标准 曲线 。 -177- 4. 样品 中 直 链 淀粉 、 支 链 淀 粉 及 总 淀粉 的 测定 :样品 粉碎 过 -60 目 筛 ,用 乙醚 脱脂 , 称 取 脱脂 样品 0.1g 左 右 (精确 至 1mg), BF S0ml 容量 瓶 中 。 加 0.$mol/L KOH 溶液 10ml, 在 沸水 浴 中 加 热 10min, 取出 , 以 蒸馏 水 定 容 至 $S0ml( 若 有 泡沫 采 用 乙醇 消除 ), 静 置 。 吸 取样 品 液 2.$Sml 两 份 ( 即 样品 测定 液 和 空白 液 ); 均 加 蒸馏 水 30ml, VA 0.1mol/L HCl 溶液 调 至 pH 3.5 左右 ,样品 中 加 入 碘 试 剂 0.$ml 2A 液 不 加 碘 试 剂 , 然后 均 定 容 至 5SOml, HE 20min, 以 样品 空白 液 为 对 照 , 用 lem tt 色 杯 , 分别 测定 xz 、 Xi、X4、)Xs 的 吸收 值 Ai、Ax、A As。 得 到 A4 直 =Au — Ay, AA x= Aj -A。 分 别 查 两 类 淀粉 的 双 波 长 标准 曲线 , 即 可 计算 出 脱脂 样品 中 直 链 淀 粉 和 支 链 淀 粉 含量 。 二 者 之 和 等 于 总 淀粉 含量 。 五 结果 处 理 X, x50 100 2.5 X m X 1000 ’ _ _X,x 50100 支 链 淀粉 (% ) =F 75x, X1000 式 中 ，Xi 一 查 双 波长 直 链 淀粉 标准 曲线 得 样品 液 中 直 链 淀粉 含量 (mg) X2 一 查 双 波长 支 链 淀粉 标准 曲线 得 样品 液 中 支 链 演 粉 含量 (mg) 7 一 样品 质量 (g) 总 淀粉 (% ) = 直 链 淀粉 (% ) + SC HEVE TH ( % ) KIER SHR DS Jt Al IE BS Ia Sc ETE HS BB BK, FE till UR AK Se BE 线 时 , WY AS HE YE BY Zo RS A ae FEAR I] Sc GE HE A i (Jo BAC A J A ) 七 .思考 题 1. 双 波长 法 测定 谷物 中 直 链 、 支 链 淀 粉 的 原理 是 什么 ? 2. 除了 双 波 长 法 外 , 比 色 法 (620nm) 和 安培 滴定 法 也 能 分 别 测定 直 链 和 支 链 淀粉 。 了 解 其 原理 , 比较 不 同方 法 的 优 缺 点 。 参考 文献 鲍 士 日 主编 . 农 畜 水 产品 品质 化 学 分 析 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1996 陈 培 榕 , 邓 勃 主编 . 现代 仪器 分 析 实验 与 技术 . 北京 :清华 大 学 出 版 社 ,1999 严 国光 , 王 福 钧 主编 . 农业 仪器 分 析 法 . 北京 :农业 出 版 社 , 1982 直 链 淀粉 (% ) = > 178 > 实验 三 十 七 “ 粗 纤维 的 测定 (酸性 洗涤 剂 法 ) — AN 在 植物 性 饲料 和 食品 中 , 含有 一 定量 的 纤维 , 它 包 括 纤 维 素 、 半 纤维 素 \ 木 质 素 和 果 胶 物质 。 测 定 粗 纤维 , 有 助 于 对 饲料 、 食 品 及 果蔬 产品 进行 品质 评定 。 = RE +76 = AER 1b FE (Cetyltrimethyl ammonium bromide, fa #K CTAB) 是 一 种 表面 活性 剂 ,在 0.5S0moVL HSO4 溶液 中 能 有 效 地 使 动物 饲料 、 植 物 样 品 中 和 蛋 白质 、 多 糖 、 核 酸 等 组 分 水 解 ` 湿润 乳化、 分散, 而 纤维 素 和 木质 素 则 很 少 变化 。 酸 -洗涤 剂 法 就 是 利用 这 个 原理 , 将 样品 用 2% CTAB 的 0.50mol/L HzSO4 溶液 者 沸 1h, 过滤, 洗 净 酸 液 后 烘 干 , 由 残渣 重 计算 酸性 洗涤 剂 纤维 百分比 。 三 仪器、 试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 电子 分 析 天 平 (2) 250ml 回流 装置 1 套 (3) Hf} 100ml x 1 (4) 可 调 电炉 (5) SRR FAYE as 2 个 (6) 多 用 循环 水 泵 1 台 (7) 干燥 箱 2. 试剂 (1) 酸性 洗涤 剂 溶液 : 称 取 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (三 级 )20g, 加 到 已 标定 好 的 0.$0mol/L HSO, 溶液 1000ml 中 , 摇动 ,使 之 溶解 。 (2) 丙酮 3. 材料 (1) 酸 洗 石 棉 (2) 植物 或 食品 样品 DY PRE AE TR (1) 称 取 过 lmm Hi RLF Fi lg 或 相当 量 的 鲜 样 , 放 入 回流 装置 的 230ml = = 179 - 角 瓶 中 , 加 酸 -洗涤 剂 溶液 100ml. (2) 加 热 ,使 三 角 瓶 内 容 物 在 5 一 10min 内 沸腾 ,立即 计时 并 装 上 冷凝 管 回 流 1h( 始 终 保 持 缓 沸 状 态 )。 (3) 取 下 三 角 瓶 ,将 内 容 物 倾 入 已 知 重量 的 玻璃 卉 塌 式 滤器 中 减 压 抽 滤 。 (4) 用 玻 棒 搅 散 滤 器 中 残 酒 ,用 90 一 1007 热 水 倾 洗 3 一 4 次 , 洗 尽 酸 = 洗涤 剂 。 (5) 再 用 丙酮 洗 残 酒 3 次 , 至 滤液 无 色 为 止 。 (6) FHT RIE AY PB, 将 滤器 放 入 100 干燥 箱 中 干燥 3h, 冷却 后 称 重 。 五 、 结 果 处 理 粗 纤维 (酸性 洗涤 纤维 ), % = IER RRO) x 100 FAP, mA UE ae JE (g) 7m2- 玻 璃 滤器 加 残渣 质量 (g) 两 次 平行 测定 结果 允许 差 : 当 含量 <5% 时 , 允许 差 0.5% ; 当 含 量 在 5% 一 2$% 时 , TIF 1% ; 当 含量 >2$% 时 , 允许 差 2% 。 七 .思考 题 和 常规 酸 碱 洗涤 法 相 比 , 酸性 洗涤 剂 法 测定 粗 纤维 有 何 优点 ? 参考 文献 鲍 士 旦 主编 . 农 畜 水 产品 品质 化 学 分 析 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1996 实验 三 十 八 _ 果 胶 质 含量 册 定 (重量 法 ) — BY 果 胶 物质 是 一 种 植物 胶 , 是 半 乳 糖 醛 酸 及 其 甲 酯 为 主要 成 分 的 聚合 物 。 它 的 变化 与 果实 、 蔬 菜 的 成 熟 、 新 鲜 程 度 有 密切 关系 。 果 胶 制品 在 食品 工业 和 医药 上 有 重要 有 用途。 通过 本 实验 学 习 掌 握 果 胶 质 含量 测定 的 一 种 方法 一 一 重量 法 。 二 、 原 理 根据 结构 和 某 些 性 质 , 果 胶 质 分 为 水 不 溶解 的 原 果 胶 和 能 溶 于 水 的 果 胶 酸 及 果 胶 酯 酸 。 将 这 两 类 果 胶 质 从 样品 中 分 别提 取出 来 ,加 入 氯 化 钙 生成 不 溶 于 水 的 - 180 - 果 胶 酸 钙 , 测 其 重量 后 换算 成 果 胶 质 的 质量 。 = ASAE. AGF A AB} 1. 仪器 (1) 电子 分 析 天 平 (2) 烧杯 1000ml x2, 250ml x 1 (3) ttf] S$00mlx1，50mlx1 (4) ABH 500m1 x1, 250ml x 2 (5) 玻璃 漏斗 2 只 (6) 250ml 回流 装置 1 套 (7) 吸管 10mlx2 (8) 玻璃 砂 芯 漏斗 1G, x2 2. 试剂 (1) 0.05mol/L HCl (2) 0.1mol/L NaOH (3) 1mol/L HAcO (4) 0.1mol/L CaCl 溶液 (5) 2mol/L CaCl, 溶液 3. 材料 (1) %2K (11cm) (2) 植物 样品 ( 干 样 或 鲜 样 ) 四 、 操 作 步 又 1. 果 胶 质 的 提取 (1) 总 果 胶 物质 A. 新 鲜 样 品 : 称 取 磨 碎 的 样品 50g, 置 于 1000ml 烧杯 中 , DNA 0.05mol/L HCl 400ml, 在 80 ~ 90T 加 热 2h, 加 热 时 随时 补充 蒸发 损失 的 水 分 。 冷 却 后 , 移入 500ml 容量 瓶 , 加 水 定 容 。 过 滤 , 收集 滤液 并 记录 滤液 容积 数 。 B. 于 燥 的 样品 : 称 60 BA FH Sg, BF 250ml 三 角 瓶 中 ,加 入 加 热 至 沸 的 0.05mol/L HCl 150ml, 连接 冷凝 器 , 加 热 回 流 1h, 冷却 至 室温 , 用 水 定 容 至 250ml, FE), DUE, 收集 滤液 并 记录 滤液 容积 数 。 (2) 水 溶性 果 胶 物质 将 样品 研 碎 。 新 鲜 样 品 准确 称 取 30 一 50g; 干 燥 样 品 准确 称 取 5 一 10g。 以 - 181 - 150ml 水 将 样品 移入 250ml 烧杯 中 。 加 热 至 沸 , 保持 沸腾 1h, DAT BAY Fh Ae 发 所 损失 的 水 分 。 最 后 把 杯 内 物质 全 部 移入 250ml 容量 瓶 内 , 加 水 定 容 。 过 滤 , 收 集 滤 液 并 记录 滤液 容积 数 。 2. 测定 (1) 吸取 一 定量 滤液 (其 量 相 当 于 能 生成 果 胶 酸 钙 约 25mg), WA 1000ml 烧 杯 中 。 中 和 后 , 加 水 至 300ml, 再 加 入 0.1mol/L NaOH 100ml, 充分 搅拌 , 放置 过 夜 以 皂 化 之 ( 脱 去 甲 氧 基 , 使 生成 果 胶 酸 钠 )。 (2) 加 入 1mol/L HAcO 溶液 50ml, Smin 后 , 加 入 0.1mol/L CaCl 溶液 25ml, 然后 , 一 边 滴 加 2mol/L CaCl 溶液 25ml, 一 边 充分 搅拌 。 放 置 1h。 (3) 加 热 Smin, BRU AE 1lcm 的 折 释 滤纸 过 滤 , 用 热 水 洗 涤 至 不 含有 和 氧化 物 。 (4) 用 热 水 把 滤纸 上 的 沉 演 无损 地 洗 入 原先 的 烧杯 中 , 加 热 煮 沸 数 分 钟 ,用 已 知 重 量 的 玻璃 砂 芯 漏斗 (1G; ) 过 滤 , 在 105C HE 1.5h RAB, BRA AEF 燥 至 恒 重 为 止 。 五 结果 处 理 结果 有 两 种 表示 方式 。 (m,-—m2)X V 果 胶 酸 钙 , % =; Re TT ca ae 果 胶 酸 ， % st: see RE Ee x 100 式 中 ，x 1 一 果 胶 酸 钙 质 量 和 玻璃 砂 忆 漏斗 质量 (g); mm2 一 玻璃 砂 芯 漏斗 质量 (g); m= 样品 质量 (g); 一 用 去 提取 液 ml 数 ; V 一 提取 液 总 容积 数 . 0.9233 一 由 果 胶 酸 钙 换算 成 果 胶 酸 的 系数 , 果 胶 酸 钙 的 实验 式 定 为 Ci7H2z2Oi6Ca, 其 中 钙 含量 约 为 7.67% , 果 胶 酸 约 为 92.33% 。 六 \ 注 意 事 项 样品 中 存在 果 胶 酶 时 , 为 了 钝 化 酶 的 活性 , 可 以 加 入 热 的 95% 乙醇 , 使 样品 溶 液 的 乙醇 最 终 浓 度 调整 到 70% 以 上 。 然 后 加 热 煮沸 1h, 过 滤 后 ,以 95% 乙醇 洗涤 多 次 ,再 以 乙醚 处 理 。 这 样 , 可 除去 全 部 糖 类 、 脂 类 及 色素 。 最 后 再 提取 果 胶 物质 。 七 .思考 题 1. 果 胶 质 的 测定 ,除了 重量 法 外 , 尚 有 果 胶 酸 钙 测 定 法 和 味 唑 反应 比 色 法 等 。 182 - 其 测定 原理 各 是 什么 ? 2. 果 胶 质 在 实践 中 有 哪些 用 途 ? 参考 文献 。 鲍 士 旦 主编 . 农 畜 水 产品 品质 化 学 分 析 . 北京 :中 国 农业 出 版 社 , 1996 [日 ] 农 林 省 农林 水 产 技术 会 议事 务 局 监 修 , 作物 分 析 法 委员 会 编 . 邹 邦 基 译 . RR. 栽培 植物 营养 诊 断 分 析 测 定 法 . 北京 :农业 出 版 社 ,1984 实验 三 十 九 1393 中 性 蛋白 酶 活性 的 测定 —.AN 掌握 测定 1398 PER ABIAEN IRE, SIA AEM EMEA. = JRE 绝 大 多 数 酶 是 活 细 胞 产生 的 具有 催化 功能 的 蛋白 质 , 生物 体内 的 化 学 反应 基 本 上 是 在 酶 催化 下 进行 的 。 和 蛋白 酶 可 以 水 解 蛋 白质 分 子 中 的 肽 键 。 和 蛋白 酶 与 其 底 物 如 酷 蛋 白 一 起 保温 , 在 最 适 条 件 即 最 适 温度 最 适 pH 条 件 下 产生 的 酷 氨 酸 与 福 林 试 剂 反应 产生 一 种 蓝 色 的 复合 物 ,颜色 的 深浅 在 一 定 的 浓度 范围 内 与 酷 氨 酸 的 浓度 成 正比 , 这样, 可 以 利用 测定 单位 时 间 内 释放 出 的 栈 氨 酸 的 量 来 测定 蛋白 酶 的 活性 。 = A aE hl A HB} 1. 仪器 (1) thi 7K (2) 722 型 分 光 光 度 计 (3) 试管 及 试管 架 (4) RH: 100ml, Sml, 2ml, 1ml (5) 烧杯 : 500ml 2. 试剂 (1) 1000pg/ml AY AR 2a AR AE AR F100 ~ 105 WR A PR 3h, 冷却 后 , 称 取 0.1 g YF 10ml SmolL 的 盐酸 中 , 再 用 O.1mol/L 的 盐酸 稀释 到 100ml, 放置 于 冰箱 中 保存 。 (2) BRADY AYR: 100wxg/ml (3) 福 林 试剂 + M83) - 称 取 100g #3 RA ( Na)WO, - 2H,O),. 25g 4H RFA ( Na>MoO, - 2H,O) & ¥ 2000ml 磨 口 回流 装置 内 ,加 蒸馏 水 700ml, 85 % 磷酸 50m! 和 浓 盐 酸 100ml, 充分 混 匀 使 其 溶解 。 小 火 加 热 , 回流 10h( 烧 瓶 内 加 小 玻璃 珠 数 颗 , 以 防 溶液 爆 沸 ), 再 加 入 硫酸 锂 LizSO4 150g, 蒸馏 水 S0ml 及 液 溴 数 滴 。 在 通风 橱 中 开口 煮沸 15min, 以 除去 多 余 的 溴 。 冷 却 后 定 容 至 1000ml, 过 滤 即 得 鲜 黄 色 溶 液 。 使 用 前 , 取 lml 加 水 稀释 到 3ml。 (4) 0.55mol/L 碳酸 钠 溶 液 (5) 10% 的 三 氯 乙 酸 :将 10g 三 氯 乙酸 溶 于 100ml 水 中 (6) 0.5% 酷 蛋白 溶液 称 取 0.5¢ 酪 蛋白 放 于 一 个 150ml 的 小 烧杯 中 , 加 入 大 约 2ml 0.5mol/L 的 氢 氧 化 钠 ,搅拌 使 其 溶解 , 然后 用 0.2moUyL 的 磷酸 盐 缓 冲 液 (pH 7.5) 稀 释 到 100ml。 (7) 0.2mol/L 的 磷酸 盐 缓冲 液 (pPH 7.5) 1) 0.2mol/L 的 磷酸 氢 二 钠 溶液 :将 3.56g NazHPO4:2H2O 溶 于 100ml 水 中 。 2) 0.2mol/L 的 磷酸 二 氢 钠 溶液 :3.121g NaHzPO, .2HO 溶 于 100ml 水 中 。 3) 把 84ml 0.2mol/L 的 磷酸 所 二 钠 溶液 和 16ml 0.2mol/L 的 磷酸 二 氢 钠 溶 液 混合 即 得 。 3. 材料 1398 +E ae A Berl sel, 纱布 四 、 操 作 步 又 1. 制作 酷 氨 酸 标 准 曲线 取 7 支 试管 编号 , 按 下 表 制 备 不 同 浓度 的 酷 氨 酸 溶液 : (100pg/ml) (ml) (ml) (ug/ml) i a eee cr - 284 > | { 2. 另 取 7 支 试管 , 按 下 表 编 号 并 加 入 相应 试剂 管 号 上 表 中 配制 的 各 浓度 0.55mol/L 碳酸 钠 溶 液 福 林 试 剂 BAR (ml) (ml) (ml) : : : ; : ; 试剂 加 入 后 , 充分 混合 , 把 各 管 放 入 30T KIA FAR 1Sming BE Mi 置 盛 有 冷水 的 烧杯 中 冷却 至 室温 。 用 “0 号 管 作为 空白 对 照 , 于 650nm HK Fil 各 管 的 光 吸 收 值 (A ), 以 此 吸收 值 为 纵 坐 标 , 每 管 的 酷 氨 酸 含量 (ng 数 ) 为 横 坐 标 ， 绘制 酷 氨 酸 的 标准 曲线 。 3.1398 中 性 蛋白 酶 活力 测定 精确 称 取 1398 中 性 蛋白 酶 2g, 溶 于 100ml 0.2mol/L, pH 7.5 的 磷酸 盐 缓冲 液 中 , 并 用 该 缓冲 液 稀 释 到 230ml。 混 合 振荡 13Smin 后 用 纱布 过 滤 。 吸 取 Sml ve 液 , 放 入 一 个 50ml 的 容量 瓶 内 ,用 pH 7.5 的 磷酸 盐 缓 冲 液 定 容 , 充分 混合 。 将 酶 液 和 栈 蛋 白 溶 液 放 入 30 水浴 中 预 热 Smin。 取 三 支 试 管 编号 后 按 下 表 加 入 相应 试剂 : 试剂 样品 1 样品 2 | ah 0.5% 酷 蛋白 溶液 (ml) 2 在 30°C 7Ki4 FA ARI 15min 取出 各 管 ,室温 下 静 置 13min 过 滤液 , 滤液 留用 。 另 取 三 支 试管 , HP RMA 试剂 福 林 试剂 (ml) 试剂 加 入 后 , 充分 混合 , 放 于 30°C 水 浴 中 精确 显 色 15min, 取出 各 管 冷 却 到 室 温 ,以 空白 为 对 照 , 测 样品 的 Aso。 五 结果 处 理 (1) 由 样品 测定 的 A 值 ,在 标准 曲线 上 查 出 对 应 的 酷 氨 酸 的 微克 数 。 (2) 1398 中 性 蛋白酶 活力 (mg BE AR/ min: g 酶 ) 样品 酷 氨 酸 的 质量 (ug)X 稀 释 倍数 15(min) x 酶 质量 (2g) 六 `\ 注 意 事 项 1. 配制 磷酸 盐 缓 冲 液 时 , 磷酸 氢 二 钠 以 含 结晶 水 的 为 好 , 不 含 结 晶 水 的 易 受 潮 。 2. 配制 的 福 林 试剂 应 为 鲜 黄 色 , 不 带 任 何 绿色 , 置 于 棕色 瓶 中 , 可 在 冰箱 中 长 期 存放 。 若 此 储存 液 使 用 过 入, 颜色 由 黄 变 绿 , 可 加 几 滴 液 溴 ,煮沸 数 分 钟 , 恢复 原 色 仍 可 继续 使 用 。 3. 酶 促 反 应 时 间 要 准确 控制 。 4,548 1. 实验 中 加 入 Na CO; 溶液 的 目的 是 什么 ? 2. 测定 蛋白 酶 活力 时 为 什么 要 严格 控制 反应 时 间 ? 参考 文献 Peis Se. 生物 化 学 实验 . 北京 :中 国 科 学 技术 大 学 出 版 社 , 1994 李 建 武 等 . 生物 化 学 实验 原理 和 方法 . 北京 :北京 大 学 出 版 社 ,2001 实验 四 十 “谷物 种 子 中 赖 迄 酸 含量 的 则 定 SS vec 目 的 学 习 掌 握 用 比 色 法 测定 谷物 种 子 蛋 白质 中 赖 氨 酸 含量 的 原理 和 方法 。 = JR BE A Ja FY ys — Bel isk Fh Jz AE J, 其 中 最 主要 的 反应 基 团 是 赖 氢 酸 残 基 上 的 s- NH, 反 应 后 颜色 的 深浅 与 蛋白 质 中 赖 氨 酸 的 含量 在 一 定 范围 内 呈 线性 关系 。 因 此 ,用 已 知 泊 度 的 游离 氨基 酸 制 作 标准 曲线 , 通过 比 色 分 析 (530nm ) 即 可 测定 出 样品 中 的 赖 氨 酸 含量 。 186 - 亮 氨 酸 与 赖 氨 酸 所 含 碳 原子 数目 相同 , 且 与 肽 链 中 的 赖 氨 酸 残 基 一 样 含有 一 个 游离 氨基 ,所 以 通常 用 亮 氨 酸 配制 标准 液 。 但 由 于 这 两 种 氨基 酸 分 子 质 量 不 同 ， 以 亮 氨 酸 为 标准 计算 赖 氨 酸 含量 时 , 应 乘 以 校正 系数 1.1515, 最 后 再 减 去 样品 中 游离 氨基 酸 含量 。 = AME ih Fil AB} 1. 仪器 (1) TOF (2) 721 型 分 光 光 度 计 (3) 恒温 水 浴 (4) 具 塞 试管 (5) 漏斗 (6) 50ml = faith 2. 试剂 (1) 节 三 酮 试剂 : 称 取 1.00g 水 合 草 三 酮 和 2.00g Ah HH (CdCl, -2H,O), BA 棕色 瓶 内 , 加 2Sml 甲酸 -甲酸 钠 缓冲 液 及 7$ml 乙 二 醇 , 室温 下 放置 24h eA. 瓶 内 出 现 沉淀 , 可 过 滤 后 使 用 。 该 试剂 放置 不 得 超过 48h。 (2) 甲酸 -甲酸 钠 缓 冲 液 : 称 取 30g 甲酸 钠 溶 于 60ml 热 蒸 饮水 中 , 再 加 10ml 88% FR, 最 后 加 水 定 容 至 100ml。 (3) 4% Na,CO; (4) 95% 乙醇 (5) 亮 氨 酸 标准 液 (100xg/ml) :准确 称 取 Smeg 亮 氨 酸 ,溶解 于 lml 0.5mol/L 盐酸 溶液 ,加 蒸馏 水 定 容 至 S0ml。 3. 材料 脱脂 玉米 粉 四 、 操 作 步 又 1. 制作 标准 曲线 按 下 表 将 亮 氨 酸 标准 液 加 入 编号 的 试管 中 , 各 管 加 入 1ml 4% Na,CO;, 2ml Ei 三 酮 试剂 ,加 塞 后 摇 匀 , 置 80C 水 浴 中 显 色 30min。 然 后 用 冷水 冷却 ,再 各 加 95% 乙醇 Sml, 摇 匀 ,在 530nm 下 比 色 ,以 吸光 度 为 纵 坐 标 , BARE (ug) Ae tH, 绘 出 标准 曲线 作为 定量 依据 。 - 187 - 亮 氨 酸 标准 液 (ml) 亮 氨 酸 含量 (ug) 2. 样品 测定 准确 称 取 两 份 约 300msg 的 脱脂 玉米 粉 , 放 入 50ml 三 角 瓶 内 ,加 入 约 300mg 4A 石英 砂 和 10ml 4% NazCO3、10ml 蒸馏 水 , 充分 振 划 3 一 4min, 置 SOC KA FER 10min。 取 2ml HMM, 然后 加 入 2ml 节 三 酮 试剂 , MBEA, 在 80 人 水 浴 中 显 色 30min。 取 出 后 用 冷水 冷却 ,各 加 95% 乙醇 Sml, 混 匀 后 过 滤 , 滤液 在 530nm 下 上 比 色 。 如 果 滤 液 颜 色 太 深 , 加 适量 95% 乙醇 稀释 后 比 色 。 五 结果 处 理 将 所 测 样品 的 吸光 度 在 标准 曲线 上 查 出 对 应 的 亮 氨 酸 含量 , 再 按 下 式 计 算 : ”在 标准 曲线 上 查 得 的 亮 所 酸 质量 (ng) X 稀释 倍数 x100X1.1515 FERS fA (mg) x 10° -样品 中 游离 氨基 酸 含量 AER SH (1) 样品 须 预先 脱脂 , 以 免 干 扰 显 色 且 使 滤液 浑浊 而 影响 比 色 。 可 用 丙酮 或 石油 醚 浸泡 数 次 或 用 索 氏 脂肪 抽 提 器 脱脂 。 (2) 各 种 谷物 样品 中 游离 氨基 酸 含量 不 同 , 可 预先 测定 。 玉 米 种 子 中 游离 氢 基 酸 含量 约 为 0.01% 。 七 .思考 题 为 什么 可 用 比 色 法 测定 赖 氨 酸 的 含量 ? 参考 文献 文 树 基 主 编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 , 1994 西北 农业 大 学 主编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1986 实验 四 十 一 “甲醛 滴定 法 间 定 氨 基 氢 — AW 初步 掌握 甲醛 滴定 法 测定 氨基 氮 含 量 的 原理 和 操作 要 点 。 - 188 - = 二 原理 氨基 酸 是 两 性 电解 质 , 在 水 溶液 中 有 如 下 平衡 ; ne —— By hth pn + H* NH NH; ~ NH, 是 弱酸 , 完全 解 离 时 pH 为 11 ~12 或 更 高 , 若 用 碱 滴 定 ~ NH, 所 释放 的 H+ 来 测定 氨基 酸 , 一 般 指示 剂 变色 域 小 于 pH 10, 很 难 准 确 指示 滴定 终点 。 常温 下 , 甲醛 能 迅速 与 氨基 酸 的 氨基 结合 , 生成 羟 甲 基 化 合 物 , 使 上 述 平衡 右 移 , 促使 ~-NH; 释放 H+ ,使 溶液 的 酸度 增加 , 中 和 滴定 终点 移 至 酚 酸 的 变色 域内 (pH 9.0 左 右 )。 因 此 可 用 酚 栈 作 指 示 剂 ,用 氢 氧 化 钠 标准 溶液 滴定 。 NaOH 中 和 a — wi italic + 再 NH; NH, | HCHO win ities NHCH,OH HCHO ea repel N(CH,OH)> 如 样品 为 一 种 已 知 的 氨基 酸 , 从 甲醛 滴定 的 结果 可 算出 氨基 氮 的 含量 。 如 样 品 为 多 种 氨基 酸 的 混合 物 如 和 蛋白质 水 解 液 , 则 滴定 结果 不 能 作为 氨基 酸 的 定量 依 据 。 但 此 法 简便 快速 ,常用 来 测定 蛋白 质 的 水 解 程度 , 随 水 解 程度 的 增加 滴定 值 也 增加 , 滴定 值 不 再 增加 时 , 表明 水 解 作 用 已 完全 。 三 仪器、 试剂 和 材料 1. 仪器 (1) 锥 形 瓶 25ml (2) 微量 滴定 管 3ml (3) 吸管 2mlx3，Smlx1l (4) Be 2. 试剂 (1) 300ml 0.05mol/L 标准 甘氨酸 溶液 ”准确 称 取 375mg HAR, 溶解 后 定 * 189 - 容 至 100ml. (2) 500ml 0.02mol/L 标准 氢 氧 化 钠 溶 液 (3) 20ml 酚 栈 指示 剂 ”0.5% 酚 本 的 50% 乙 醇 溶液 (4) 400ml 中 性 甲醛 溶液 在 5S0ml 36% 一 37% 分 析 纯 甲醛 溶液 中 加 入 lml 0.5% 酚 本 乙醇 水 溶液 ,用 0.02moUL 的 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 到 微 红 , 储 于 密闭 的 试 WKF. 四 、 操 作 步 又 1. R34 25ml H= AMM, eS. 1.2 SHA AIA 0.05mol/L PETA 酸 溶液 2ml 和 水 Sml, RSD. A 3 号 瓶 内 加 入 7ml 水 。 然 后 向 三 个 瓶 中 各 加 入 5 滴 酚 本 指示 剂 , 混 匀 后 各 加 2ml 甲醛 溶液 再 混 匀 , 分 别 用 0.02moL AAA 液 滴 定 至 溶液 显 微 红 色 。 重复 以 上 实验 两 次 ,记录 每 次 每 瓶 消 耗 的 氢 氧 化 钠 标 准 溶 液 的 毫升 数 。 取 和 平 均值 ,计算 甘氨酸 氨基 所 的 回收 率 。 2. 取 未 知 浓度 的 甘氨酸 溶液 2ml, 依 上 述 方 法 进行 测定 ,平行 做 几 份 , 取 平 均 值 。 计 算 每 毫升 甘氨酸 溶液 中 含有 氨基 氮 的 毫克 数 。 五 结果 处 理 1. 回收 率 计 算 甘氨酸 氨基 氨 回收 率 % = FETE x 100 公式 中 实际 测 得 量 为 滴定 1 和 2 号 瓶 耗 用 的 氢 氧 化 钠 标准 溶液 毫升 数 的 平均 值 与 第 3 号 瓶 耗 用 的 标准 氢 氧 化 钠 溶液 毫升 数 之 差 乘 以 标准 氢 氧 化 钠 的 摩尔 浓 度 , 再 乘 以 14.008。 2. 氨基 氨 计 算 ZEA (mg/ml) = 公式 中 Vs 为 滴定 待 测 液 耗 用 氢 氧 化 钠 标 准 溶 液 的 平均 毫升 数 。 Vx wz 对 照 液 (3 号 瓶 ) 耗 用 标准 氢 氧 化 溶液 的 平均 毫升 数 。CNaoH 为 标准 氢 氧 化 钠 溶 液 的 摩尔 浓度 。 1. 氢 氧 化 钠 标准 溶液 应 在 使 用 前 标定 , 并 在 密闭 瓶 中 保存 。 不 可 使 用 隔日 储 存在 微量 滴定 管 中 的 剩余 氢 氧 化 钠 。 2. 中 性 甲醛 溶液 在 临 用 前 配制 , 若 已 放置 一 段 时 间 , 使 用 前 需要 重新 中 和 。 - 190 - (Vs— Vex) X Cnaon X 14.008 2 3. 本 实验 为 定量 实验 , EP ART A A 1 BS AR EE SE, 加 量 要 准确 , 全 部 操作 要 按 分 析 化 学 要 求 进行 。 4. 且 氨 酸 与 甲醛 作用 生成 不 稳定 的 化 合 物 , 使 滴定 毫升 数 偏 低 。 而 酷 氨 酸 的 滴定 毫升 数 结果 偏 高 。 七 、 思 考题 早已 证 实 , 氨基 酸 在 结晶 状态 下 或 在 水 溶液 中 , 均 以 离子 状态 存在 , 为 什么 不 能 直接 用 碱 进行 滴定 定量 ? 参考 文献 MH, 陈建新 , 吴 鸣 建 主编 . 基础 生物 化 学 . 北京 :气象 出 版 社 ,2000 实验 四 十 二 “醋酸 纤维 薄膜 电泳 分 离 核 苷 酸 = 和 的 学 习 核糖 核酸 碱 水 解 的 原理 和 方法 , 掌握 核糖 核 苷 酸 的 醋酸 纤维 薄膜 电泳 的 原理 和 方法 。 二 、 原 理 RNA 在 稀 碱 条 件 下 水 解 , 先 形成 中 间 物 2 , 3- 环 状 核 苷 酸 , 进一步 水 解 得 到 2 和 3 一 核 苷 酸 的 混合 物 。 在 pH3.5 时 ,各 核 苷 酸 的 第 一 磷酸 基 (pK0.7 一 1.0) 完 全 解 离 , BHR (pK 6.0) #il fi BE (pK9.5 以 上 ) 不 解 离 , 而 含 氮 环 的 解 离 程度 差别 很 大 ( 见 附 表 )。 因 此 在 pH 3.5 条 件 下 进行 电泳 可 将 这 四 种 核 苷 酸 分 开 。 四 种 核 苷 酸 在 pH 3.5 时 的 离子 化 程度 : 含 氮 环 的 pK 值 离子 化 程度 本 实验 先 用 稀 氢 氧化 钾 溶 液 将 RNA 水解 ,再 加 高 毛 酸 将 水 解 液 调 至 pH 3.5, 同时 生成 高 毛 酸 钾 沉 演 以 除去 K”, 然后 用 电泳 法 分 离 水 解 液 中 各 核 背 酸 , 并 在 紫 外 分 析 灯 下 确定 RNA 碱 水 解 液 的 电泳 图 谱 。 - Oi - = Aas RFF] A TB 1. Ms (1) 电热 恒温 水 浴 (2) 紫外 分 析 灯 (波长 为 234nm) (3) Rar (4) 离心 机 (5) FLUKA A AB ok 2. 试剂 (1) 100ml 0.3mol/L AA HARK (2) 40ml 200g/L fe ARIA HK (3) 1000ml 0.02mol/L pH 3.5 柠檬 酸 缓冲 液 3. 材料 (1) 酷 酸 纤维 薄膜 (2x 8cm) (2) 4g 核糖 核酸 (粉末 ) 四 、 操 作 步 又 1.RNA 的 碱 水 解 称 取 0.2g RNA, WF Sm! 0.3mol/L AAA BAM $F, HE RNA 的 浓度 达到 20~30mg/ml. £ 37C 保温 18h( 或 沸水 浴 30min)。 然 后 将 水 解 液 转移 到 锥 形 瓶 内 , 在 水 浴 中 用 高 所 酸 溶液 滴定 到 水 解 液 的 pH A 3.5. 20001r/min 离心 10min, 除 Hive, 上 清 液 即 为 样品 液 。 2. 点 样 将 醋酸 纤维 薄膜 在 pH 3.5 0.02mol/L 柠檬 酸 缓冲 液 中 浸 湿 后 ,用 滤纸 吸 去 多 余 的 缓冲 液 。 然 后 将 膜 条 无 光泽 面向 上 平 铺 在 玻璃 板 上 , 用 点 样 器 在 距 膜 条 一 端 2 一 3cm 处 点 样 。 3. 电泳 将 点 好 样 的 薄膜 小 心地 放 入 电泳 槽 内 ,注意 点 样 的 一 端 应 靠近 负极 。 调 节 电 FE 160V, 电流 强度 为 0.4mAy/cm, 电泳 2Smin。 - #2 - FARE 电泳 后 , 将 膜 条 放 在 滤纸 上 , 紫外 分 析 灯 下 观察 ,用 铅笔 将 吸收 紫外 光 的 暗 斑 ik, Zeid A LAM RNA 水 解 液 的 醋酸 纤维 薄膜 电泳 图 谱 , 并 根据 附 表 中 的 数据 分 析 确 定 各 斑点 代表 哪 种 核 苷 酸 。 1. 点 样 时 , 在 膜 条 无 光泽 面 点 样 , 上 且 点 样 量 要 适中 。 2. 电泳 时 , 膜 条 的 点 样 端 要 靠近 负极 。 七 .思考 题 1. 为 什么 要 在 膜 条 无 光泽 的 一 面 点 样 ? 2. 为 什么 在 pH 3.5 时 进行 电泳 分 离 核 苷 酸 的 效果 最 好 ? 参考 文 献 刘 卫 群 , 陈建新 , 吴 鸣 建 主编 . 基础 生物 化 学 . 北京 :气象 出 版 社 ,2000 实验 四 十 三 ”蛋白质 脱 盐 (透析 和 凝 胶 过 滤 ) 在 蛋白 质 的 研究 中 , 经 常 要 进行 蛋白 质 脱盐 ,即将 蛋白 质 同 其 他 盐 类 小 分 子 分 离开 。 和 蛋白 质 脱盐 的 方法 很 多 ,各 有 优 缺 点 。 以 下 仅 介 绍 常 用 的 透析 和 凝 胶 过 滤 方法 , 可 根据 实验 条 件 和 要 求 选 用 。 |. 蛋白质 透析 = TAs 学 习 透 析 的 基本 原理 和 操作 。 二 、 原 理 蛋白 质 是 大 分 子 物 质 , 不 能 通过 透析 膜 而 小 分 子 物质 可 以 自由 透 过 。 在 分 离 提纯 蛋白 质 的 过 程 中 , 常 利 用 透析 的 方法 使 蛋白 质 与 其 中 夹杂 的 小 分 子 物 质 分 开 。 三 、 仪 器 、 试 剂 和 材料 1. 仪器 (1) 烧杯 > £03 - (2) Re (3) 离心 机 (4) 离心 管 (5) 冰箱 (6) 电炉 2. 试剂 (1) 1% ABLE (2) PLB EA (3) 1lmol/L EDTA (4) 2% NaHCO, 3. 材料 (1) 透析 管 ( 宽 约 2.$cm, 长 12 一 1$cm) 或 玻璃 纸 (2) Ri (3) 鸡蛋 清 溶液 : 将 新 鲜 鸡 蛋 的 蛋清 与 水 按 1:20 FY, 然后 用 六 层 纱布 过 滤 。 四 、 操 作 步 又 1. 透析 管 ( 前 ) 处 理 : 先 将 一 适当 大 小 和 长 度 的 透析 管 放 在 1mol/L EDTA ¥%& 液 中 , 煮沸 10min, 再 在 2% NaHCO; 溶液 中 煮沸 10min, 然后 再 在 蒸馏 水 中 煮沸 10min 即 可 。 2. 加 Sml 蛋白 质 溶 液 于 离心 管 中 , 加 4g 硫酸 铵 粉末 , 边 加 边 搅拌 使 之 溶解 。 然后 在 4C 下 项 置 20min, HRA RULE. 3. BD HERBARIUM 1000r/ min 的 速度 离心 20min。 4. 装 透 析 管 :离心 后 倒 掉 上 清 液 ,加 Sml 蒸馏 水 溶解 沉淀 物 , 然后 小 心 倒 入 透 析 管 中 , 扎 紧 上 口 。 5. 将 装 好 的 透析 管 放 入 盛 有 蒸馏 水 的 烧杯 中 , 进行 透析 , FEA 6. 每 隔 适当 时 间 (5$ 一 10min), 用 氯 化 饥 滴 入 烧杯 的 蒸馏 水 中 , 观察 是 否 有 沉 淀 现象 。 五 结果 处 理 记录 并 解释 实验 现象 。 硫酸 贸 盐 一 定 要 充分 溶解 ,才能 使 蛋白 质 沉 省 下 来 。 > 194 > 七 、 思 考题 在 透析 袋 处 理 过 程 中 , EDTA 和 NaHCO, 起 何 作 用 ? ||. 关 胶 过 滤 Ho 学 习 凝 胶 过 滤 的 基本 操作 技术 , TF AEE C UE Ad ae AY Ja ER A OY = JR 凝 胶 过 滤 的 主要 装置 是 填充 有 凝 胶 颗 粒 的 层 析 柱 。 目 前 使 用 较 多 的 凝 胶 是 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 (sephadex)。 这 种 高 分 子 材料 具有 一 定 孔 径 的 网 络 结构 。 高 度 亲 水 , 在 水 溶液 里 吸水 显著 膨胀 。 用 每 克 干 胶 吸 水 量 (ml) 的 10 倍 (G 值 ) 表 示 凝 胶 的 KE, 可 根据 被 分 离 物质 分 子 的 大 小 和 工作 目的 ,选择 适合 的 凝 胶 型 号 。 交 联 度 高 的 小 号 胶 如 Sephadex G- 25 适 于 脱盐 。 当 在 凝 胶 柱 顶 加 上 分 子 大 小 不 同 的 混合 物 并 用 洗 脱 液 洗 脱 时, 自由 通 透 的 小 分 子 可 以 进入 胶 粒 内 部 , 而 受 排 阻 的 大 分 子 不 能 进入 胶 粒 内 部 。 二 者 在 洗 脱 过 程 中 走 过 的 路 程 差 别 较 大 ,大 分 子 只 能 沿 着 胶 粒 之 间 的 间隙 向 下 流动 ,所 经 路 程 短 ， 最 先 流出 。 而 渗入 胶 粒 内 部 的 小 分 子 受 迷宫 效应 影响 , 要 经 过 层 层 扩散 向 下 流动 ， 所 经 路 程 长 ,最 后 流出 。 通 透 性 居中 的 分 子 则 后 于 大 分 子 而 先 于 小 分 子 流出 。 从 而 按 由 大 到 小 的 顺序 实现 大 小 分 子 分 离 。 凝 胶 过 滤 的 操作 条 件 温 和 , 适 于 分 离 不 稳定 的 化 合 物 ; 凝 胶 颗 粒 不 带电 荷 , 不 与 被 分 离 物质 发 生 反应 , 因而 溶质 回收 率 接近 100% , 而 且 设备 简单 、 分 离 效 果 好 、 重 现 性 强 , 凝 胶 柱 可 反复 使 用 ,所 以 广泛 使 用 于 蛋白 质 等 大 分 子 的 分 离 纯 化 、 分子 质量 测定 、 脱 盐 等 用 途 。 本 实验 利用 凝 胶 过 滤 的 特点 ,将 (NH4)2SO4 同 蛋 白质 分 子 分 离开 。 = AM ae ih At BL 1. ME (1) RATE (2cm X 15cm) (2) HER (3) 真空 干燥 器 (4) TAR (5) 核酸 蛋白 检测 仪 (6) 部 分 收集 器 . 195 . (7) 记录 仪 2. 试剂 (1) 1% 氧 化 钢 溶 液 (2) 硫酸 铵 粉末 3. 材料 (1) Sephadex G- 25. (2) 鸡蛋 清 溶液 :将 新 鲜 鸡 蛋 的 蛋清 与 水 按 1:20 BA, 然后 用 六 层 纱 布 过 滤 。 四 、 操 作 步 又 1. 凝 胶 溶 胀 : 取 Sg Sephadex G-25， 加 200ml 蒸馏 水 充分 溶 胀 (在 室温 下 约 需 6h 或 在 沸水 浴 中 溶 胀 2h)。 待 溶 胀 平衡 后 ,用 虹吸 法 除去 细小 颗粒 , 再 加 入 与 凝 胶 等 体积 的 蒸馏 水 , 在 真空 干燥 器 中 减 压 除 气 , 准备 装 柱 。 2. 装 柱 : 将 层 析 柱 垂直 固定 ,加 入 1/4 BKM RK. HHRMA eit, 然后 边 搅拌 边 倒 入 柱 中 ( 柱 口 保持 排放 )。 最 好 一 次 连续 装 完 所 需 的 凝 胶 ， 若 分 次 装 入 , 需 用 玻 棒 轻 轻 搅动 柱 床 上 层 凝 胶 , 以 免 出 现 界 面 影响 分 离 效果 。 最 后 放 入 略 小 于 层 析 柱 内 径 的 滤纸 片 保 护 凝 胶 床 面 。 3. 平 衡 :继续 用 蒸 馅 水 洗 脱 , 调整 流量 使 胶 床 表面 保持 2cm 液 层 , 平衡 20min。 4. 样品 制备 : 取 Sml 蛋白 质 溶 液 于 离心 管 中 , 加 4g 硫酸 接 粉末, 边 加 边 搅拌 使 之 溶解 。 然 后 在 4C FRE 20min, 出 现 絮 状 沉淀 。 将 上 述 絮 状 沉 演 液 以 1000r/ min 的 速度 离心 20min, 离心 后 倒 掉 上 清 液 ,加 Sml 蒸 饮水 溶解 沉 演 物 , HA 样品 。 5. 上 样 : 当 胶 床 表面 仅 留 约 .1mm 液 层 时 , 吸取 lml 样品 , 小 心地 注入 层 析 柱 胶 床 面 中 央 , 慢 慢 打开 螺旋 夹 , 待 大 部 分 样品 进入 胶 床 、 床 面 上 仅 有 lmm 液 层 时 ， 用 乳头 滴 管 加 入 少量 蒸馏 水 , 使 剩余 样品 进入 胶 床 , 然后 用 滴 管 小 心 加 入 3 ~ Sem 高 的 洗 脱 液 。 6. 洗 脱 :继续 用 蒸 饮水 洗 脱 , 调整 流速 ,使 上 下 流速 同步 。 用 核酸 蛋白 检测 仪 检测 , 同时 用 部 分 收集 器 收集 洗 脱 液 。 合 并 与 峰值 相对 应 的 试管 中 的 洗 脱 液 , 即 为 脱盐 后 的 蛋白 质 溶液 。 7. 用 氯 化 饥 溶 液 检 测 蛋 白质 溶液 和 其 他 各 管 收集 液 , 评价 脱盐 效果 。 五 结果 处 理 记录 并 解释 实验 现象 , 讨论 凝 胶 过 滤 的 脱盐 效果 。 o 196 - OO 1. 整个 操作 过 程 中 凝 胶 必 须 处 于 溶液 中 , 不 得 暴露 于 空气 , 否则 将 出 现 气泡 和 断层 ,应 当 重 新 装 柱 。 2. 加 样 时 应 小 心 注 入 床 面 中 央 , 注意 切 勿 冲动 胶 床 。 七 、 思 考题 影响 凝 胶 过 滤 脱 盐 效果 的 因素 有 那些 ? 参考 文献 陈 簿 茎 主编 . 生物 化 学 研究 技术 . 北京 :中 国 农 业 出 版 社 , 1995 文 树 基 主 编 . 基础 生物 化 学 实验 指导 . 西安 :陕西 科学 技术 出 版 社 ,1994 实验 四 十 四 ”叶绿素 含量 出 定 (分 光 光 度 法 ) 一 、 目 的 叶绿素 是 植物 光合 作用 的 主要 色素 , 测定 叶片 中 叶绿素 的 含量 对 研究 光合 作 用 和 和 氮 素 营养 状况 有 重要 意义 。 通 过 本 实验 学 习 并 人 掌握 叶绿素 含量 测定 的 一 种 常 用 方法 一 一 分 光 光 度 法 。 二 :原理 叶绿素 是 脂 溶性 色素 , 主要 存在 于 以 叶绿体 为 首 的 色素 体 中 。 在 活体 内 , 叶 绿 素 与 脂 蛋 白 结 合并 受到 还 原 系统 的 保护 , 对 氧 和 光 是 稳定 的 。 Mackinney 研究 了 叶绿素 丙酮 提取 液 的 吸收 光谱 , 测定 出 在 80% 的 丙酮 溶液 中 叶绿素 a 的 吸光 系数 Kis = 82.04, K 45 =16.75, 叶绿素 b 的 吸光 系数 K 1663 =9.27， 玫 nu64 =45.6。 并 建立 了 以 下 联 立 方程 ee (1) Mess = 16.75C,, + 45.60, (2) HF, Ages. AcssA TRAM 80% AAAS RLM TE 663.645nm 的 吸光 度 , C,.C, 分 别 为 叶绿素 a 和 叶绿素 b 的 浓度 , 单位 为 g/L。 后 来 Arnon 解释 了 Mackinney 的 方法 并 发 表 了 Mackinney 方程 的 解 : = 0.0127 A 663 — 0.00269 A 645 (3) Cy =0.0229A g45 — 0. 00468 A 663 (4) 已 知 叶绿素 a 和 叶绿素 b 80% 丙酮 提取 液 在 652nm 有 相同 的 吸光 系数 (34.5), 因 此 , 叶绿素 的 总 量 Cy 有 两 种 求法 , 即 « 下， Ce= C24 Cy (5) 或 ， aos (6) 单位 均 为 g/L 此 后 至 今 数 十 年 来 , Arnon 法 在 国际 上 广 为 采 用 。1980 年 在 科研 工作 中 , 运 | 用 这 些 公式 进行 结果 计算 时 ,发 现 用 (5) 式 求 得 的 数值 总 是 小 于 用 (6) 武 未 得 的 值 。 最 在 排除 了 仪器 波长 不 准 的 基础 上 , 引起 了 我 们 对 (5)、(6) 式 不 一 致 的 怀疑 。 经 过 对 原 联 立 方程 (1)、(2) 重 新 求解 得 : C, = 0.0127 Ales = 0100259 A cas (7) Cy = 0.0229 A 645 — 0.00467A 663 (8) t 用 公式 (7).(8) 和 (5)、(6) 重 新 计算 实验 结果 , 获得 了 一 致 。 据 此 我 们 认为 Arnon 在 解 方程 中 可 能 存在 计算 差错 , 并 建议 修正 叶绿素 分 光 光 度 测定 法 中 的 计 算 系 数 。 虽 然 这 一 建议 几经 周折 才子 发 表 , 但 与 后 来 见 到 的 日 本 学 者 的 发 现 是 完 全 一 致 的 。 为 此 ,建议 叶绿素 的 定量 测定 (分 光 光 度 法 ) 应 以 (7)(8) 式 为 准 ,这 两 个 公式 中 浓度 单位 为 g/L, EL mg/L 表示 则 为 ， 4 下 属国 (9) Cy=2259A ws — 4.67 A ges (10) MY BR ae A BE CHC CG 若 以 试 材 中 的 色素 含量 来 表示 , 可 按 下 式 计算 ， #) -CCmg/L)x 提取 液 总 体积 (ml) Ot RR & ft (e/g SRE) — Cimale GE Ss EAC = Am AGH] AB 1s | (1) FDL aS6st Ett 1 A (2) 研 钵 1 个 (3) 剪刀 1 把 (4) 50ml FH 1 A (5) 玻璃 漏斗 1 个 (6) 玻璃 棒 1 支 (7) BAe 1 XZ 2. 试剂 (1) 丙酮 (分 析 纯 ) RE - 0 (2) 85% 丙酮 (3) 80% 丙酮 3. 材料 (1) 滤纸 (快速 ) (2) 石英 砂 (3) 碳酸 镁 四 、 操 作 步 又 1. 在 遮光 室内 取出 待 测 样品 , BE RS, 称 取 鲜 样 0.1 一 0.Sg。 2. 样品 置 研 钵 中 , 加 入 少量 碳酸 镁 和 石英 砂 ,加 入 4 倍 体积 的 丙酮 研 成 匀 浆 ， 再 加 85 % 的 丙酮 适量 继续 研磨 至 组 织 呈 白色 。 3. 经 铺 有 滤纸 的 漏斗 将 匀 浆 液 转 入 50ml 容量 瓶 中 , 并 用 80% 丙酮 分 次 洗 净 研 钵 和 滤纸 , 最 后 用 80% 丙酮 定 容 至 S0ml。 4. 以 80% 丙 酮 为 参 比 液 ,在 663.645nm 分 别 测定 样品 液 的 As 、Ak4( 应 在 0.2~0.8 范围 之 内 ,浓度 过 大 应 用 80% 丙酮 适当 稀释 )。 五 、 结 果 处 理 按 公式 (9)、 EF aE elo) 叶绿素 b 的 浓度 , 最 后 再 算出 叶绿素 含量 (mg/g 鲜 样 )。 WAVER PH 1. 在 活体 中 , 结合 态 叶 绿 素 是 稳定 的 ,组 织 一 经 破坏 , 叶绿素 易 被 光 解 。 因 此 抽 提 和 分 析 工 作 尽 可 能 避 光 快速 完成 。 2. 对 含 大 量 酸性 液 胞 的 样品 , 应 首先 加 入 微 碱 性 的 缓冲 液 , 仔细 研磨 后 加 磨 碎 液 4 倍 体积 的 丙酮 进行 抽 提 。 3. 分 光 光 度 计 的 精度 对 测定 结果 有 至 关 重 要 的 影响 , 最 好 选用 质量 较 好 的 分 光 光 度 计 , 对 波长 进行 仔细 校正 。 七 、 思 考题 1. 当 溶 液 中 有 两 种 成 分 共存 时 , 用 分 光 光 度 法 进行 各 成 分 含量 的 测定 , 如 何 选 定 测定 波长 ? 2. 如 何 检验 并 校正 一 台 分 光 光 度 计 的 波长 。 3. 除了 本 实验 介绍 的 方法 , 叶绿素 的 定量 测定 还 有 哪些 方法 ? SX 献 PRE . 关于 叶绿素 的 定量 测定 (分 光 光 度 法 ) 中 计算 系数 的 修改 意见 . 西北 农业 大 学 学 报 , 1986, 14(1) - (199 84 - 85 F.H. Savi, D.F. RT, R.M. 戴 维 林 著 , 中 国 科 学 院 植物 研究 所 生理 生化 研究 室 译 . 植物 生理 学 实 验 . 北京 :科学 出 版 社 , 1974:74 吉田 昌 一 , D. A. 福 尔 诺 , J.H. 科 克 , K.A. 戈 梅 斯 著 . 北京 市 农业 科学 院 作 物 研 究 所 资料 情报 组 译 . 水 稻 生理 学 实验 手册 . 北京 :科学 出 版 社 ,1975:38 - 40 (A) 农林 省 农林 水 产 技术 会 议事 务 局 监 修 , 作物 分 析 法 委员 会 编 . AE. eR . 栽培 植物 营养 诊 断 分析 测 定 法 . 北京 :农业 出 版 社 ,1984:527 一 531 山东 农学 院 , 西北 农学 院 编 . 植物 生理 学 实验 指导 . 济南 :山东 科学 技术 出 版 社 , 1980:60 一 61 陕西 师范 大 学 化 学 系 分 析 化 学 教研 室 , 陕西 省 农林 科学 院 分 析 室 编 . 农业 化 学 常用 分 析 方 法 . 西安 :陕西 科 学 技术 出 版 社 , 1980:391 - 392 严 国 光 , 王 福 钧 主编 . 农业 仪器 分 析 法 . 北京 :农业 出 版 社 , 1982:542 - 543 Arnon, D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts polyphenoloxidase in Beta Vulgaris. Plant Physiol. 1949, (24):1-15 Draper, Simon R. Biochemical Analysis in Crop Science, Oxford University Press, 1976:77 — 78 Mackinney, G. Absorption of light by chlorophyll solution. J.Biol. Chem. 1941, (140) :315 — 322 ZeOth MRBASRSRSE (ERARES-Z) —. am 干旱 是 世界 上 最 严重 的 一 种 自然 灾害 , 是 农业 生产 的 主要 限制 因素 。 全 世界 年 降水 量 少 于 250mm 的 干旱 地 区 约 占 陆地 的 25% , 250~ 500mm 的 半 干 旱地 区 约 占 30% 。 此 外 ,有 些 地 区 降水 量 虽然 在 S00mm 以 上 , 但 也 经 常 出 现 作物 生育 期 内 的 季节 性 和 干旱。 因此 , 对 作物 品种 资源 进行 抗旱 性 鉴定 和 筛选 , 是 进行 作物 布局 、 选 育 抗旱 品种 、 挖 掘 干 旱地 区 农业 生产 潜力 的 重要 基础 。 细胞 质 膜 是 维持 细胞 有 序 结 构 沟通 外 界 环境 的 屏障 。 植 物 组 织 受 到 胁迫 时 ， 质 膜 的 结构 和 功能 首先 受到 伤害 , 质 膜 透 性 增 大 , 造成 细胞 内 容 物 如 电解 质 、 可 浒 性 有 机 物 向 外 渗 出 。 对 环境 干旱 低温. 高温 、 盐 渍 、 病 原 微生物 侵 染 和 环境 污染 等 胁迫 , 不 同 物种 不同 品 种 或 材料 的 抗 性 存在 一 定 的 差异 。 这 种 抗 性 上 的 差异 可 用 质 膜 透 性 的 变化 进行 测量 。 通 过 本 实验 , 观察 抗旱 性 不 同 的 小 麦 叶片 ,在 连续 升温 条 件 下 外 渗 液 电导 率 的 规律 性 变化 , 认识 质 膜 结构 与 抗旱 性 的 关系 , 为 今后 从 事 植 物 抗 性 研究 掌握 一 种 全 新 的 方法 。 = Re 将 一 定量 待 测 小 麦 叶 片 剪 成 叶 段 , BK EY Del SH Js a Fi 边 测量 组 织 外 渗 液 电导 率 的 变化 ,在 记录 仪 上 记录 到 一 条 电导 率 (S)- 温 度 (t) 曲 线 (图 45.1)。 该 曲线 表示 在 连续 升温 条 件 下 组 织 外 渗 液 电导 率 的 动态 变化 。 经 数学 拟 合 表 明 , S-t 曲线 在 607 左右 之 前 为 指数 曲线 ,在 60 人 左右 之 后 为 米 氏 曲线 , 两 段 曲线 有 一 个 数学 交点 。 * (200 … 前 一 段 指数 曲线 方程 为 : 要 打 ) (1) (1) 式 中 ，Ui 为 OT 段 曲线 上 的 电 导 率 值 ;A 为 常数 , 即 ce = OT 时 的 ”电导 率 值 ;b 为 常数 , 表示 温度 每 升 高 1 时 ,电导 率 自 然 对 数 的 增值 ， b= SOS e 为 自然 对 数 的 底 (e= 2.71828…); ¢ Aim BECC )。 方程 (1) 两 边 同 时 取 自 然 对 数 , 则 InU;=InA+be (2) & InU, = Y;, InA=a, Il Y,=at+bt (3) 这 样 ,方程 (1) 就 转换 成 线性 方程 ,方程 (3) 中 :a AA BE, 表 示 OT 时 外 渗 液 电导 率 值 的 自然 对 RUA; b 为 回归 系数 ; : 为 温度 (位 ) 。 电导 率 (hz7/cm ) 图 45.1 电导 率 随 温度 变化 曲线 方程 (3) 实 际 上 描述 了 不 同 温度 条 件 下 外 渗 液 电导 率 的 变化 , 如 果 测 量 不 同 温 度 下 对 应 的 外 渗 液 电导 率 , 根据 一 系列 实验 数据 对 (S,t), 对 方程 (3) 进 行 直线 回 IA, 约 在 55°C Wa, 每 增加 一 组 实验 数据 (S,z), 计算 出 一 个 相关 系数 ~ 值 ,用 该 ~ 值 与 前 一 个 ~ 值 相 比较 ,如 果 > 值 是 增加 的 , 就 继续 算 下 去 , 直到 > 值 与 前 一 个 ~ 值 相 比较 开始 减 小 为 止 (浮动 法 )。> 值 减 小 时 对 应 的 温度 叫 拐点 温度 , 这 就 是 前 后 两 段 曲 线 的 数学 交点 。 根 据 大 量 研究 , 拐点 温度 越 低 的 品种 , 其 抗旱 性 越 强 。 三 、 仪 器 和 材料 1. MV (1) DDS=-11A 型 电导 率 仪 及 DJS-1 电 导电 极 (2) 电热 磁力 搅拌 器 、 磁 子 (3) XWD 1-100 型 自动 记录 仪 (4) O~S0°C 精密 温度 计 ( 最 小 分 度 值 0.1YC ) 1 支 (5) 50~ 100°C 精密 温度 计 ( 最 小 分 度 值 0.1C ) 1 支 (6) 500ml 烧杯 及 木质 杯 盖 ( 自 制 ,有 温度 计 揪 孔 2 个 , 电导 电极 插 孔 1 个 ) 2. 材料 在 水 分 供应 充足 的 相同 条 件 下 生长 的 小 麦 功 能 叶片 (品种 :旱地 小 麦 陕 合 6 号 | 和 水 地 小 麦 郑 引 1 号 ) PU BREA (1) 连续 升温 电导 测量 装置 由 电导 仪 . 电 热 磁力 搅拌 器 、 记 录 仪 3 部 分 组 成 。 用 双 攻 导线 把 电导 仪 输出 插口 和 记录 仪 信号 输入 端 连接 起 来 。 电 导 仪 电极 提前 活 化 好 , 插入 装 有 蒸馏 水 的 烧杯 中 ,输出 端 与 电导 仪 连接 好 。 打 开 电 导 仪 电源 开关 ， 指示 灯亮 。 频 率 选 择 开 关 置 低 周 档 。 量 程 开 关 置 x 10” 档 。 工 作 开 关 先 置 校 正 位 。 仪 器 处 于 预 热 、 待 机 状态 。 (2) 打开 电热 磁力 搅拌 器 电源 开关 , 将 调 速 旋钮 反 时 针 方 向 旋 到 底 (0 位 ), 处 于 待机 状态 。 (3) 打开 记录 仪 电源 开关 , 指示 灯亮 , 预 热 仪器 。 记 录 纸 速 置 慢 档 位 , 2mmy/ min。 测 量 开 关 关 闭 。 (4) 选取 一 定 叶 位 的 小 麦 叶 片约 Sg, 用 自来水 洗 净 叶 面 ,再 用 蒸馏 水 冲洗 2 YK, FAYE ARR EK, PKL 4.0g 样品 , 前 成 lcm 左右 的 叶 段 , 放 入 七 有 350ml & 馏 水 的 烧杯 中 (内 有 磁 子 ), 置 真空 干燥 器 内 抽 和 气 10min, 使 叶片 下 沉 。 取 出 后 将 烧 杯 放 在 电热 磁力 搅拌 器 上 , 盖 上 杯 盖 。 插 上 2 支 温度 计 和 电导 电极 (下 端 浸入 水 中 )。 顺 时 针 方 向 旋转 搅拌 器 调 速 开 关 , 使 杯 中 的 磁 子 旋转 搅拌 溶液 (速度 不 可 过 高 ), 记录 初始 温度 。 再 将 电导 率 仪 的 测定 开关 及 记录 仪 的 记录 开关 同步 打 到 测量 档 , 同时 将 电热 磁力 搅拌 器 的 加 热 选择 开关 顺 时 针 方 向 打 到 二 档 , 开 始 测定 。 每 个 样品 从 室温 加 热 到 1007 , 约 需 40min, 如 果 只 求 拐点 温度 , 只 需 升 温 到 70~80C, 即 可 停机 。 记 录 仪 会 自动 绘 出 一 条 电导 率 随 温度 变化 的 曲线 。 为 了 能 在 记录 纸 上 标 出 温度 值 ,采取 如 下 操作 : 当 温 度 计 指示 某 一 欲 测 值 (例如 1SY ) 时 , 瞬间 关闭 电 导 仪 测定 开关 , 然后 又 迅速 打 回 到 测量 档 。 这 样 , 曲线 右 侧 就 打出 一 条 温度 (15Y ) 标记 线 。 标 记 线 与 曲线 交点 的 横 坐 标 , 就 是 该 温度 下 的 电导 率 (St), 也 可 以 用 电 导电 压 (mV) 表 示 ( 满 度 为 10mV)。 由 于 从 起 始 温度 到 SSC 电导 率 变化 不 大 , 因而 FE SSC 以 前 每 隔 SC thrid 1 KBE. SSC 以 后 ,每 隔 1C 标 记 1 次 。 这 样 就 得 到 一 条 横 坐 标 表 示 电 导 率 (或 电导 电压 )、 纵 坐标 ( 走 纸 方 向 ) 表 示 温 度 的 St 曲线。 (5) 1 个 样品 测定 完毕 之 后 , 迅速 关闭 电导 仪 测量 开关 、 电 热 磁 力 搅拌 器 选 速 开关 、 加 热 开 关 、 记 录 仪 测量 开关 。 取 下 杯 盖 , 用 蒸馏 水 冲洗 电极 。 倒 掉 烧 杯 内 的 样品 和 滤液 , 回收 并 冲洗 磁 子 。 然 后 按 步骤 (4) 重 新 处 理 第 2 份 样品 。 五 结果 处 理 将 St 曲线 上 每 一 温度 值 与 对 应 的 电导 率 值 一 一 填 入 预先 设计 好 的 表 45.1， 按 方程 Y=atbt 进行 直线 回归 。5SY 以 后 , 每 增加 一 组 数据 , 求 一 个 ~ 值 , 确定 出 > 值 开 始 下 降 “ (202"'- 时 , 对 应 的 拐点 温度 (zT)。 表 45.1 ERARSSMEBR TEST S(x102pu/cm) 陕 合 6 号 S( X 10? 20/cm) 郑 引 1 号 根据 实验 结果 , 确定 拐点 温度 tr (BEE 6 F) = e in (951153) = “C WER SH (1) 当 液 温 达 SOT 时 ,应 将 O~ SOT 精密 温度 计 拔 出 ,以 防 损坏 。 测 下 一 个 样 品 时 重新 插入 。 (2) 操作 时 不 可 接触 电热 磁力 搅拌 器 加 热 盘 , 避免 烫伤 。 七 、 思 考题 1. 连续 升温 电导 法 与 普通 电导 方法 相 比 ,有 何 优点 ? 2. 陕 合 6 号 小 麦 比 郑 引 1 号 抗旱 性 强 , 为 什么 其 拐点 温度 反而 比 郑 引 1 号 低 ? 试 解释 之 。 参考 文献 ee . 连续 升温 电导 一 一 鉴定 小 麦 抗 旱 性 的 一 种 新 方法 . 西北 农业 大 学 学 报 ,1988, 16(4) Pret . 连续 升温 电导 及 其 在 小 麦 抗 旱 性 鉴定 中 应 用 的 初步 探讨 . 见 ( 作 物 抗 闭 性 鉴定 的 原理 与 技术 》. 北 京 :北京 农业 大 学 出 版 社 , 1989 PRE . 农作物 抗旱 性 鉴定 仪 的 研制 和 应 用 . 西北 农业 学 报 ,1997,6(3) a Ur ' {le2 - | SS ae P : wie Be). om. f =f Bt Si ~4+ a Pat a! * ’ 人 } 7 fy) wt ( J.) } ( le N Bt at Fa wx Hak Pet 年 $8 coi na he r f 47 4 t+ is | he i a bases Pap ade. «Ll - > i 1 ee LR + 关 : ss 1 ease eH Soi * ‘ +> , ‘sul ony i ‘ l, “a era wt (Gage? ve Nha 届 ie = = = a — i 一 、 实 验 室 安全 及 防护 知识 生物 化 学 实验 室 是 进行 教学 和 科研 的 场所 , 稍 有 不 慎 , LK Ke 均 可 能 发 生 ,危及 人 体 健康 乃至 生命 ,造成 国家 财产 重大 损失 。 教 师 和 实验 室 管 理 人 员 应 当 经 常 对 学 生 进 行 实 验 室 安 全 观念 的 教育 , 并 十 分 重视 安全 工作 , 防 患 于 未 然 。 学 生 应 该 熟悉 实验 室 安全 及 防护 知识 。 万 一 发 生 事故 , 应 及 时 采取 适当 的 急 救 措施 。 (一 ) 实验 宇 安 全 知识 1. 安全 用 电 , 慎之 又 慎 (1) 实验 室 管 理 人 员 必 须 经 党 检查 电 源 线 路 及 插座 ,发现 电 线 绝缘 胶皮 老化 或 插座 破裂 等 隐患 要 及 时 维修 更 换 。 (2) 不 得 超 负 荷 使 用 电器 设备 。 保 险 丝 熔 断后 应 寻找 可 能 原因 ,排除 故障 或 确认 为 无 危险 后 用 相同 保险 丝 更 换 , 不 得 用 铁丝 、 铀 丝 和 粗 保险 丝 代 替 。 (3) 使 用 电学 仪器 或 设备 时 , 要 注意 电压 电流 是 否 符合 铭牌 规定 要 求 。 必 要 时 应 使 用 稳 压 器 或 调 压 器 。 (4) 严格 按照 电器 使 用 规程 操作 ,不 能 随意 拆 印 、 玩 弄 电器 。 (5) 严防 触电 。 电 阅 是 控制 局 部 电路 、 实 施 维修 的 必要 装置 , 原则 上 谁 拉 闸 (维修 后 ) 谁 关闭 。 发 现 闸 刀 被 拉 下 , 在 情况 不 明 的 情况 下 不 能 贸然 合 闸 , 以 免 他 人 触电 。 绝 不 可 用 湿 手 或 在 眼睛 劳 视 时 开关 电 阅 和 电器 开关 。 检 查 电器 设备 是 否 漏 电 时 应 使 用 试 电 笔 。 凡 是 漏电 的 仪器 一 律 不 能 使 用 。 2. 水 火 无 情 , 注重 防范 (1) 水 是 宝贵 的 资源 , 应 注意 节约 用 水 , 使 用 完毕 随手 关闭 水 龙头 。 工 作 完 毕 离开 实验 室 前 应 检查 一 下 室内 所 有 水 龙头 是 否 已 经 关 严 并 养 成 习惯 。 水 槽 内 不 可 堆积 仪器 或 杂 物 , 以 防 排水 不 利 时 溢出 槽 外 。 随 时 保证 地 板 上 地 漏 畅 通 。 (2) 实验 室 必 须 配 备 一 定数 量 的 消防 器 材 , 并 按 消防 规定 保管 、 检 修 和 使 用 。 所 有 在 实验 室 工作 的 人 员 , 都 应 接受 消防 器 材 使 用 培训 。 (3) 实验 室 发 生火 灾 主 要 是 不 安全 用 电 、 不 正确 用 火 及 不 合理 使 用 .处置 可 燃 易 爆 试剂 如 乙醚 \ 丙 酮 、 乙 醇 、 苯 金属 钠 、 白 磷 等 引起 。 实 验 室内 严禁 吸烟 。 冰 箱 内 不 许 存 放 可 燃 液体 。 实 验 室 内 必须 存放 的 少量 即将 使 用 的 可 燃 物 , 应 远离 火 源 和 电器 开关 。 倾 倒 可 燃 性 液体 时 , 室内 不 得 有 明火 或 开启 电器 。 低 沸点 的 有 机 溶 剂 不 准 在 火焰 上 直接 加 热 , 只 能 利用 带 回流 冷凝 管 的 装置 在 水 洽 上 加 热 或 蒸 饮 。 - 207 - (4) BRAS HEB AE SRE AY BT RRA, 应 立即 切断 室内 所 有 的 火 源 和 电 加 热 堪 的 电源 。 关 上 室 门 ,打开 窗户 。 用 毛巾 或 抹布 控 试 酒 出 的 液体 , 回收 到 带 塞 的 HLA « (5) FY RRA Sy Bae KE Hy Jo BY Ac Te (8 Se Je AK RSA SE) ANA BAT Hi ak 水 槽 中 , 应 收集 在 指定 的 容器 内 。 可 燃 的 有 机 溶剂 废 液 也 不 能 倒 入 水 槽 , 须 回收 在 带 塞 的 瓶 内 。 3. 严防 中 毒 ,注意 安全 (1) 毒物 应 按 实验 室 规 定 办 理 审批 手续 后 领取 , FRAZER. EWE 险 品 或 放射 性 物质 存放 及 操作 的 实验 室 \ 不 同类 型 的 实验 化 学 药品 存放 处 应 有 国 际 通用 标志 (图 版 工 )。 (2) 使 用 毒性 物质 和 致癌 物 必 须根 据 试 剂 瓶 上 标签 说 明 严 格 操作 , 安全 称 量 、 转移 和 保管 。 操 作 时 应 戴 手 套 , 必要 时 戴 口 罩 或 防毒 面罩 , 并 在 通风 橱 中 进行 。 沾 过 毒性 、 致 癌 物 的 容器 应 单独 清洗 、 处 理 。 (3) 水 银 温度 计 `、 气 量 计 等 汞 金属 设备 破损 时 , 必须 立即 采取 措施 回收 示 , 并 在 污染 处 撒 上 一 层 硫磺 粉 以 防 汞 蒸汽 中 毒 。 4. 规范 操作 , 避免 伤害 使 用 玻璃 金属 器 材 或 动力 设备 时 , 注意 防止 割 伤 . 机 械 创伤 。 清 除 碎 玻 璃 不 可 用 抹布 ,以 免 测 洗 抹布 时 划 伤 或 扎 伤 手 部 。 量 取 洛 酸 ` 浓 碱 液体 需 格 外 小 心 。 用 吸管 量 取 液 体 试 剂 尤 其 是 毒品 时 , 必须 用 橡皮 球 , 不 得 用 口 吸 。 5. 预防 生物 危害 (1) 生物 材料 如 微生物 动物 的 组 织 `、 细 胞 培养 液 . 血 液 和 分 废物 都 可 能 存在 细菌 和 病毒 感染 的 潜伏 性 危险 。 处 理 各 种 生物 材料 必须 谨慎 小心 , 做 完 实 验 后 必 须 用 肥 时 洗涤 剂 或 消毒 液 充分 洗 净 双手 。 (2) 使 用 微生物 作为 实验 材料 时 , 尤其 要 注意 安全 和 清洁 卫生 。 被 污染 的 物 品 必 须 进行 高 压 消 毒 或 烧 成 灰 氏 。 被 污染 的 玻璃 用 具 应 在 清洗 和 高 压 灭 菌 之 前 立 即 浸泡 在 适当 的 消毒 液 中 。 (3) 进行 遗传 重组 的 实验 室 更 应 根据 有 关 规 定 加 强生 物 伤 害 的 防范 措施 。 6. 警惕 放射 性 伤害 放射 性 同位 素 的 使 用 必须 在 有 放射 性 标志 的 专用 实验 室 中 进行 , 切忌 在 普通 实验 室 中 操作 或 存放 有 放射 性 同位 素 的 材料 和 器 具 。 实 验 后 应 及 时 淋浴 , 定期 进 行 体检 。 + 2m - 7. 2SRSNKBAT RA 科研 资料 是 科研 人 员 艰 苦 劳 动 的 文字 记录 或 视听 记载 、 实 物证 据 , 应 妥善 保 藏 , 防止 水 沌 、 火 烧 、 鼠 咬 \ 发 霉 或 丢失 。 (=) 实验 室 灭火 法 实验 中 一 旦 发 生 了 火灾 , 切 不 可 惊慌 失措 , 应 保持 镇 静 。 首 先 立 即 切断 室内 一 切 火 源 和 电源 。 然 后 根据 具体 情况 积极 正确 地 行进 抢救 和 灭火 。 较 大 的 火灾 事故 应 立即 报警 , 必须 清楚 说 明 发 生火 灾 的 实验 室 的 确切 地 点 导线 着 火 时 应 切断 电源 或 使 用 四 氧化 碳 灭火 器 , 不 能 用 水 及 二 氧化 碳 灭火 恬 ， 以 免 人 员 触 电 。 可 燃 性 液体 着 火 时 , 应 立即 转移 着 火 区 域内 的 一 切 可 燃 物质 。 若 着 火 面积 较 小 时 , 可 用 石棉 布 ` 湿 布 或 沙土 覆盖 , 隔绝 空气 使 之 熄灭 。 但 覆盖 时 切 鼠 忙中 生 乱 ， 不 要 碰 破 或 打 翻 盛 有 可 燃 液体 的 器 下, 避免 火势 蔓延 。 绝 对 不 要 用 水 灭火 , 否则 会 扩大 燃烧 面积 。 金 属 钠 着 火 时 可 用 砂子 覆盖 。 RAR AUS FRE, 应 卧 地 滚动 灭火 。 (三 ) 实验 室 急 救 实验 中 不 慎 受 伤 , 应 立即 采取 适当 的 急救 措施 。 (1) 有 人 触电 时 应 立即 关闭 电源 或 用 绝缘 的 木 棍 、 竹 笔 等 使 被 害 者 与 电源 脱 离 接触 。 急 救 者 必须 采取 防止 触电 的 安全 措施 , 不 可 用 手 直 接 接触 受害 者 。 (2) 受 玻璃 割 伤 及 其 他 机 械 损伤 时 , 首先 检查 伤口 内 有 无 玻璃 或 金属 碎片 , 然 后 用 硼酸 水 洗 净 , 再 涂 控 碘 酒 或 红 汞 水 , 必要 时 用 纱布 包扎 。 若 伤口 较 大 或 过 深 而 大 量 出 血 , 应 迅速 在 伤口 上 部 和 下 部 扎 紧 血管 止血 ,立即 到 医院 诊治 。 (3) 泌 伤 ” 轻 度 泌 伤 一 般 可 涂 上 知味 酸软 膏 。 如 果 伤 处 红 痛 或 红肿 (一 级 灼 伤 ), 可 控 医 用 橄榄 油 ;者 皮肤 起 泡 ( 二 级 灼伤 ), 不 要 弄 破 水 泡 , 防止 感染 ; 若 伤 处 皮 肤 呈 棕色 或 黑色 (三 级 灼 烧 ), 应 用 干燥 而 无 菌 的 消毒 纱布 轻 轻 包扎 好 , 急 送 医院 治 疗 。 (4) 化 学 试剂 灼伤 ， 强 碱 和 碱 金属 引起 的 灼伤 , 先 用 大 量 自 来 水 冲洗 , 再 用 5% 硼 酸 溶液 或 2% 乙 酸 溶液 涂 洗 。 强 酸 、 溴 等 引起 的 灼伤 , 立即 用 大 量 自来水 冲 洗 ,再 用 5% 碳酸 氢 钠 溶液 或 5% 氢 氧化 铵 溶液 洗涤 , 如 酚 触 及 皮肤 引起 灼伤 , 可 用 酒精 洗涤 。 (5) AA Sy HF REA A, 也 可 以 经 皮肤 直接 吸收 而 引起 积累 性 中 毒 。 严重 中 毒 的 症状 是 口中 有 金属 味 , 呼出 气体 也 有 气味 ; 流 唾液 . 打 哈 从 时 疼痛 , 牙 床 及 嘴唇 上 有 硫化 对 的 黑色 ;淋巴 腺 及 唾液 腺 肿 大 。 若 不 慎 中 毒 时 , 应 送 医 院 急救 。 209 - 急性 中 毒 时 , 通常 用 碳 粉 或 呕吐 剂 彻 底 洗 胃 , KAA A EA (O01 A 3 个 鸡 蛋清 ), 或 用 葛 麻 油 解 毒 并 使 之 呕吐 。 =. Union Carbide 各 种 型 号 透 析 管 的 渗透 范围 近似 膨胀 直径 ( 刘 ) 可 透 过 的 分 子 质量 不 能 透 过 的 分 子 质量 8.13 不 详 , 与 8 号 管 大 致 相同 三 、Sepctro por 再 生 纤维 素 膜 透析 袋 的 数据 ue = as 1.2 10*~1.4 x 104 体 积 /(ml/cm) Spectra por 1 Spectra por 2 Spectra por 3 “210. - 续 表 分 子 质量 截留 值 体积 /Da /(ml/cm) Spectra por 4 5 1.2x10‘~1.4 x 104 0.32 2.0 3.2 6.4 17.9 Spectra por 5* 1.2x10*~1.4 x 104 13.4 32.2 45.8 : 63.6 Spectra SMT * * 1.2x 10*~1.4 x 104 0.05 8 a 0.20 10 .4 0.510 0.32 16 .2 0.81 Spectra por 6" * * 4 1x 10° 12 .6 0.46 (1) 18 5 1.0 38 ¥, 4.6 45 .6 6.3 Spectra por 6 2XT0? 12 .6 0.46 (2) 18 .5 1.0 38 2 4.6 45 .6 6.3 Spectra por 6 3 3.5 10° 18 .5 1.0 (3) 45 .6 6.4 54 .4 9.3 Spectra por 6 3 8 x 10° 23 .6 17 (4) 32 .4 3.2 50 8 8.0 Spectra por 6 Tx 10" 10 .4 0.32 (5) 25 .9 2.0 45 .6 6.4 Spectra por 6 1.5104 10 4 0.32 (6) 25 .9 2.0 45 .6 6.4 续 表 让 fr 二 全 扁平 宽度 和 径 度 体 积 /mm /(ml/cm) Spectra por 6 (7) 2.5104 11.5 0.030 21.6 0.025 5 x 10* 7.6 11.5 0.030 21.6 0.025 * 新 产品 目录 中 未 列 入 , 仅 供 定货 订购 及 使 用 参考 。 * * SMT: simemicro tubing 半 微 量 透 析 袋 。 * * * por 6 透析 袋 是 湿润 型 的 ,其 防腐 剂 是 1% 葵 甲酸钠 。 另 有 规格 型 号 与 por 6 完全 相同 的 产品 , 但 不 含 重 金属 及 硫化 物 。 无 需 预 处 理 即 可 使 用 。 四 、 纤 维 素 酯 膜 透 析 袋 的 数据 了 扁平 宽度 人 Spectra por /mm Spectra por 6 (8) _ co _ - 上 2 宁 刘 CE(1) 1 x 10? 5 0.20 10 6.4 0.32 12 ie, 0.44 16 10.2 0.79 — on SN non A 和 oof © sa f+ & W oOo & No CE(2) 5 x 10? 8 10 12 16 CE(3) 4 1x 10° 8 5 0.20 10 6.4 0.32 12 TS 0.44 16 10.2 0.79 CE(4) 2x 10° 8 5 0.20 10 6.4 0.32 12 7.5 0.44 16 10.2 0.79 CE(5) 4 3.5 10° 8 5 0.20 10 6.4 0.32 12 7.5 0.44 16 10.2 0.79 ‘wee * 型 号 体 积 Spectra por /ml/cm CE(6) CE(10) 超 滤 膜 直径 /mm 21 * 超 滤 膜 型 号 YCOS YMI1 YM3 YM10 PM10 YM30 PM30 XMS0 YM100 XM300 [fee [a [2 | fo [i fo 1 || [sf | fs | | 9 Pre | 9 24 | 20) Yat 2h ee ee |__| 10 | 20 | 2s | 30 | 33 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | 20 | 90 | . Amicon AZ iE RY ii 标 称 分 子 质量 水 流量 / 溶质 流量 / 截留 值 [mly(min'cm2)] [ml/(min+ cm?) ] 500 1 000 3 000 10 000 o i=) Ww 10 000 30 000 30 000 50 000 100 000 300 000 o°o.,0 ©\|o oe oo o ied Oo 七 、 硫 酸 铵 饱和 度 的 常用 表 1. 调整 硫酸 铵 溶液 鲍 和 度 计 算 表 (257 ) 在 25°C 硫酸 贸 终 浓度 /% 饱 和 度 每 1L 溶液 加 固体 硫酸 铵 的 克 数 127 314 | 356 | 449 | 546 107 | 142 292 | 333 | 94 | 129 | 164 | 200 278 | 319 | 63 | 97 | 132 | 168 469 ese 214 i) Oo an cy P23 | 6 | Bow | wt eel | 一 w]e =a es nN un So we o Na) >! Oo 237 * FE 2ST FB, WR BPE MK eh WM BE Wel Bll 2 Hae BEY, BF PS PBT BB 8 Bt PR BK BY ESL. - 214: 2. 调整 硫酸 铵 溶液 饱和 度 计 算 表 (0T ) FE OU FRR RAM BE / % HAE ~ a) N Oo \o on um ~ 4% 100ml 75K DN A HR RY Fe So ~ aS RS ik ~ REN * ET FP, PRIS KH WK EB) AR EY, 每 100ml 溶液 所 加 固体 硫酸 铵 的 克 数 。 ee a OT T'8€ T 号 (aa a9! € CST b 061 ty 877 S-997 9 POE 9 ChE 人 08#5 8 8T 6 99 6 b6r 0 559 T TLS T 609 (a5 2!) €°$89 上 《ZL vy T9L 06- S6° 《LE 9 了 人 N aA © my | “6rl “981 ECC 097 “867 "SEE “CLE “OL “LbY 了 8 “TCS “OSS “96S 59 049 “80L 一 OST £99 0°SZ SL 08- TSE T 0L Z SOL 0yT £° SLI y OI7 9 Sve S087 9°STE LOSE L’S8€ 8 0¢Pr 6 SSP 6 067 0°97S BE’ 19S Seeliilin onal 007 0°00T 0°0S 0°02 OL: SL. PvE 8 89 Z 50T 9 Le | 6 TLT €°907 4 0tZ 下 :SLC 9 6085 6 Cre €°8Le 9°CIP 0 Lt 上 18P 8°STs 0Sz © eet 0°SL 0 OP | Hie | 59° 0 EI CE S- 人 Z TIOT 6 vel L891 707 E-98¢ 6 697 9 上 08 en Les ET 8 p0Pr 9 8 旬 €°CLb ( O,€7 ) SE BE 44 BO BY BH Ss a ft € (ET) Ie 1 2 A UA Te GH fs RA TOOT fis HK 00€ L°99T 0°00T 0°09 i 3 “OEP Ose 0°007 0 SCcT 0 08 0 09 9°87 S 2 SS 09- Ste 0°S9 S°L6 0 0¢T 9 Z9T 0 56[ SL 0°097 S67 0°ScEt 9 LSE 0°06€ 00+ EC 0 05SfT 0 00F 4 扫 9 6 CP 0°SZ PITT 0s: SS 6 [5 8 59 4 56 2 9 65ST S T6l 发 《Ce 8 99C 上 -8C © Ort 二 TS 人 OS? L°997 O°SLT 0 0ZT 5 58 rds SLE Z CC 0 0T SP. 0S: ple L°t9 T ?6 SCZT 89ST I 881 S617 8 O0SZ C787 Sele 00S 0 008 0°002 0 OPT 0 00T t TL 0 09 & €& 0°02 OL 6 Or: SP. 8 08 9°19 76 (a4! 0 t9ST 6 ty8T L 人 -SIC 9 9%t< ELLC Oss € ete 0 SCZC 0 09T L°9IL L°S8 $°c9 t tt 0 08 2-8T 55 8 S5. or: €°0€ 9°09 6 06 on ra vy Ist L Ist 0 ZIC cyC ( ET) Wi Bes Me Hh GA ch MKS TI [OL 009 L“99E 0°0Sz 0 08T Ser 0 00T 0°SL 9°Ss 0°0F €°Lé L910 0s9 0 .00 0 SLC 0°007 0°OST € ptt 9 L8 L°99 0°0S y'9¢ 0 SC b°ST VIL ST: 05. 85 65 9°8S 6°L8 下 各 下 v OFT 00) €'€eh 0° 00€ 0°022 L°991 9°71 0°001 8°LL 0°09 SS €°€€ 让 人 gtT /199 Oz: SZ. 8°82 9°LS b'98 Z'SIT OSL 上 99t 0 SC8 0°07 € 81 6 CPI ScrL 6°88 0°0L 9 了 9 人 Tt 8 08 v7 P87 4 95 T 98 L°SLT O'vPT PETIT 008 0°00S 0 098 0 095 T 005 下 全 0 SCT 0 00T 0 08 Lite 0°0S 9 88 9°87 0°02 S CT 0S8 006 5 "55S 4 995 0'SLE 0°00 0°08Z 0°00 L‘9IZ 5 585Z PILI S L8T S*LEL 00ST TBieic eet 0°06 0°00T Le 8°18 5 8S 1°99 Z 9b 6°SS L°S€ 6°@ LG €°€€ ser 0°Sz 9te Lit 89°Sa TTT S0. 97'S oT 0 5 密码 0° 6 和 SS 1 027 人 < 八 、 缓 冲 溶液 的 配制 方法 1. 氯 化 钾 -盐酸 缓冲 液 (0.05 mol/L, pH 1.0~2.2,25T) 首先 配制 0.2 mol/L 氯 化 钾 溶液 (14.919 g 氯 化 钾 溶解 后 定 容 至 1L)。 然 后 量 取 25 ml 0.2 mol/L 氯 化 钾 +x ml0.2 mol/L HR, MAKES 100 ml. 0. ee HCl 0.2mol/L HCl 0.2mol/L HCl /ml /ml 2. 甘氨酸 -盐酸 缓冲 液 (0.05 mol/L, pH 2.2~3.6, 2ST ) 首先 配制 0.2 mol/L 甘氨酸 溶液 (1$.01 g 甘氨酸 溶解 后 定 容 至 1L)。 然 后 量 取 25 ml 0.2 mol/L 甘氨酸 + x ml 0.2 mol/L 盐酸 ,加 蒸馏 水 稀释 至 100 ml. 0.2mol/L HCl BS 0.2mol/L HCl Pp /ml 3. PR— PRAHA EBA HR (0.05 mol/L, pH 2.2~4.0, 25C) 首先 配制 0.1 mol/L 邻 茶 二 甲酸 氢 钾 (20.42 g 邻 茶 二 甲酸 氢 钾 溶解 后 定 容 至 1L)。 然 后 量 取 50 ml 0.1 mol/L 邻 葵 二 甲酸 氧 钾 +x ml 0.1 mol/L 盐酸 , 加 水 稀 释 至 100 ml。 /ml 4. 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓冲 液 (0.1 mol/L, pH 3.0~6.2) 0.1 mol/L 柠檬 酸 ( 含 柠檬 酸 .HzO 21.01 g/L) 0.1 mol/ 工 柠檬 酸 三 钠 ( 含 柠檬 酸 三 钠 .2H2O 29.4 g/L) 0.1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L TERR 柠檬 酸 三 钠 柠檬 酸 三 钠 /ml 5. 磷酸 氢 二 钠 -柠檬 酸 缓冲 液 L(pH 2.6~7.6) 0.1 mol/L 柠檬 酸 ( 含 柠檬 酸 .HzO 21.01 g/L) 0.2 mol/L BRA — fA(& Na,HPO,:2H,O 35.61 g/L) 0.1 mol/L 0.2 mol/L 柠檬 酸 Na2HP, /ml /ml 6. 乙酸 -乙酸 钠 缓冲 液 (0.2 mol/L, pH 3.7~5.8, 18T) 0.2 mol/L 乙酸 ( 含 冰 乙酸 11.7 ml/L) 0.2 mol/ 乙 酸 钠 ( 含 乙酸 钠 .3HO 27.22 g/L) 。 218 。 0.2 mol/L 0.2 mol/L 0.2 mol/L 0.2 mol/L 7. 二 甲 基 戊 二 酸 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05 mol/L, pH 3.2~7.6) 0.1 mol/L 8B:B- 二 甲 基 戊 二 酸 ( 含 B:B- 二 甲 基 戊 二 酸 16.02 g/L). 50 ml0.1 mol/L B:B= 二 甲 基 戊 二 酸 +xml0.2 mol/L NaOH, 加 蒸馏水 稀释 至 100 ml, KE 冲 溶液 适用 于 要 求 紫外 吸收 值 较 低 的 酶 学 研究 工作 。 0.2 mol/L NaOH 0.2 mol/L NaOH /ml /ml 8. 丁 二 酸 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05 mol/L, pH 3.8~6.0, 25T) 0.2 mol/L 丁 二 酸 ( 含 CHO, 23.62 g/L). 25 ml 0.2 mol/L 丁 二 酸 +x ml 0.2 mol/L NaOH, 加 蒸 饮水 稀释 至 100 ml. 0.2 mol/L NaOH pH 0.2 mol/L NaOH 9. 邻 葵 二 甲酸 氢 钾 - 氨 氧 化 钠 缓冲 液 (pH 4.1~5.9, 25T) 50 ml 0.1 mol/L 484% — FRAP (20.42 g/L) + x ml 0.1 mol/L NaOH, 加 水 稀释 至 100 ml. 3 0.1mol/L NaOH 0.1mol/L NaOH 0.1mol/L NaOH P Pp. /ml /ml /ml 4.1 36.6 4.2 38.8 4.3 40.6 4.4 42.3 4.5 43.7 4.6 4.7 10. 磷酸 氢 二 钠 - 磷 酸 二 和 氢 钠 缓冲 液 (0.2 mol/L, pH 5.8~8.0, 25T) 0.2 mol/L 磷酸 氨 二 钠 ( 含 NaaHPO4.12H2O 71.64 g/L); 0.2 mol/L 磷酸 二 Sf (4 NaHPPO4.2H2O 31.21 g/L). 0.2 mol/L 0.2 mol/L 0.2 mol/L 0.2 mol/L Nap HPO, NaH, PO, Naz HPO, NaH, PO, /ml /ml /ml /ml pH 11. 磷酸 二 氢 钾 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 L(oH 5.8~8.0) 50 ml 0.1 mol/L 磷酸 二 氧 钾 (13.60 g/L) +xml0.1 mol/L NaOH， 加 水 稀释 至 100 ml。 ¢ 0.1 mol/L 0.1 mol/L 0.1 mol/L NaOH NaOH NaOH (x ml) (x ml) (x ml) - 220 - eg ata ———— 12. Tris — HCl 缓冲 液 (0.05 mol/L, pH 7 一 9) 25 ml 0.2 mol/L =#% FEA FE (24.23 g/L) +x ml 0.1 mol/L 盐酸 , 加 水 = 100 ml, 0.Amol/L HCI 0.1mol/L HCI 13. 巴 比 受 -盐酸 缓冲 液 (pH 6.8~9.6, 18T) 100 ml 0.04 mol/L Bh (8.25 g/L) +x ml 0.2 mol/L HCI 混合 : an “ot an i za 0.2mol/L HCl /ml 14.2,4,6 -= FAI te EER SS oh HR (pH 6.4~8.3) 0.2 mol/L 2,4,6— = ZEN ME (BS CgHyN 24.24 g/L). 25 ml 0.2 mol/L = FA EO WE + x ml 0.2 mol/L HCl, 加 水 稀释 至 100 ml. 0.2 mol/L 三 甲 基 吡 喧 0.2 mol/L HCl /ml 0.2 mol/L = FEE 0.2 mol/L HCl /ml /ml 15. 硼砂 -硼酸 缓冲 液 (pPH 7.4~9.0) 0.05 mol/L 硼砂 ( 含 Na?B40).H2O 19.07 g/L) 0.2 mol/L WR (& WR 12.37 g/L) pH 0.05mol/ 工 硼砂 | 0.2mol/L WR sm 0.2mol/L 硼酸 7.4 6.5 7.6 5.5 7.8 4.0 8.0 2.0 16. 硼砂 缓冲 液 (pH 8.1~10.7, 25T) 50ml 0.05mol/L 硼砂 (NaB4O7 :10H2O 9.52g/L) + x ml 0.1mol/L HCL 或 0.1 mol/L NaOH, 加 水 至 100 ml. 0.1 mol/L 0.1 mol/L HCl /ml 0.1 mol/L HCl /ml 0.1 mol/L HCl pH ~wnwnonoTwTnwnewono @ on nD nA & WH NY 一 17. 甘氨酸 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (pPH 8.6~10.6, 25C) 25 ml 0.2 mol/L 甘氨酸 含 (15.01 g/L) + x ml 0.2 mol/L NaOH, 加 水 至 100 ml, ao 0.2 mol/L NaOH 0.2 mol/L NaOH /ml /ml 18. 碳酸 钠 -碳酸 氢 钠 缓冲 液 (0.1 mol/L, pH 9.2~10.8) 0.1 mol/L Na,CO;(4 Na,CO;°10H,O 28.62 g/L) 0.1 mol/L NaHCO;(4 NaHCO; 8.40 g/L)(A Ca ,Mg 时 不 得 使 用 ) 0.1 mol/L 0.1 mol/L Na2CO,; NaHCO, /ml 19. 硼酸 - 氯 化 钾 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 (0.1mol/L，pH 8.0~10.2) 0.1mol/L KCLH3BO; 混合 液 各 含 KCl 7.455g/L 和 H;BO; 9.184 g/L。 取 50ml 0.1mol/L KCLH3BO; 混合 液 +x ml 0.1mol/L NaOH, 加 水 稀释 至 100ml。 Gv 00° 200 wo rm ee 20. 二 乙醇 胺 -盐酸 缓冲 液 (0.05Smol/L，pH 8.0~10.0, 25T ) 0.2mol/L 二 乙醇 胺 (21.02 g/1000ml)25ml + x ml 0.2mol/L 盐酸 , 加 水 稀释 2° 2235 ， 全 100ml. 0.2 mol/L HCl pH /ml 8.0 10.20 8.3 7.80 8.5 5255 8.7 3.45 8.9 1.80 21. 硼砂 - 氨 氧 化 钠 缓冲 液 (0.05Smol/L WBA, pH 9.3~10.1) 0.05mol/L 硼砂 (19.07g/L) 25ml+ x ml 0.2mol/L NaOH, 加 水 稀释 至 IL。 0.2 mol/L NaOH /ml 3.0 56 id ae 9.4 22. 磷酸 所 二 钠 - 氢 氧化 钠 缓冲 液 (0.02SmolL，pH 11.0~11.9, 25T) 0.05mol/L NazHPO4:( 含 NaHPO4.12HO 17.91g/L)50 ml+x ml 0.1mol/L NaOH, 加 水 稀释 至 100 ml. 23. 毛 化 钾 - 氢 氧化 钠 缓冲 液 (0.0SmoVL，pH 12.0~13.0, 25T) 0.2mol/L KCIL14.91lg/L)25$ml+ x ml 0.2mol/L NaOH, 加 水 至 100 ml. 0.2 mol/L NaOH 24. 广 范 围 缓冲 液 (pH2.6 一 12.0,， 18T) “混合 液 A(6.008 g 柠檬 酸 ,3.893 g 磷酸 二 氢 钾 ,1.769 g 硼酸 和 5.266 g 巴 比 IMA AK x BF 1L) 每 100 ml 混合 液 HM 0.2 mol/L NaOH x ml 至 所 需 pH ffi. 0.2mol/L NaOH ne 0.2mol/L NaOH 0.2mol/L NaOH . /ml 36. 2.06 .0 5.8 5 .0 oa | 2.8 se, 6.0 38.9 472 74.0 3.0 .4 6.2 41.2 .4 15-9 IZ 3 6.4 43.5 -6 77.6 3.4 wi 6.6 46.0 8 79.3 3.6 8 6.8 50.6 .0 80.8 3.8 Si 7.0 52.9 2 82.0 4.0 J Ted 55.8 4 82.9 4.2 .0 7.4 58.3 .0 83.9 4.4 2 7.6 58.6 8 84.9 4.6 .4 18 GE: 7 .0 86.0 4.8 .8 8.0 63.7 .2 87.7 5.0 sh 8.2 65.6 .4 89.7 ey i 8.4 67.5 .0 92.0 5.4 .8 8.6 69.3 8 95.0 5.6 me 8.8 71.0 .0 99.6 25. 离子 强度 恒定 的 缓冲 液 (pH 2.0~12.0) 按 下 表 配 制 0.1I 或 0.2I 的 缓冲 液 ,加 荣 馏 水 至 2L。 适 用 于 电泳 中 的 缓冲 液 。 1mol/L 5mol/L NaCl( ml) weg 2mol/L | 2mol/L | 2mol/L |8.5mol/L]0.5mol/L} 4mol/L ] N 0.1I 时 |0.2I 时 | NaCl/ml * BE ， 1mol/L 5mol/L NaCl( ml) ipo” 2mol/L | 2mol/L | 2mol/L |8.5mol/L]0.5mol/L} 4mol/L Lmol/L HCl NaOH NaAc HAc ony /ml /ml /ml /ml 5.3 2.0 26. 酸度 计 标 准 缓冲 溶液 的 配制 (1) pH 4 缓冲 溶液 (0.05 mol/L 邻 葵 二 甲酸 氢 钾 溶液 ) 称 取 ( 先 在 115$+STC PHF 2~3 hh) 48 — BBA 10.12 g 溶 于 蒸馏 水 , 在 容量 瓶 中 稀释 至 1L。 (2) pH 7 缓冲 溶液 (0.025 mol/L BR — AA 0.025 mol/L 磷酸 氢 二 钠 混 合 溶 液 ) 分 别称 取 先 在 115+SC 下 烘 干 2 一 3 h 的 磷酸 氢 二 钠 3.53 g 和 磷酸 二 和 氢 $13.39 g 溶 于 蒸馏水, EAR PRES 1L。 所 用 蒸馏 水 应 预先 煮沸 15 一 30 (3) pH 9 缓冲 溶液 (0.01 mol/L 硼砂 即 四 硼酸 钠 溶液 ) 称 取 硼 砂 3.80 g( 注 意 :不 能 烘 ! ) 溶 于 蒸馏 水 , 在 容量 瓶 中 稀释 至 1L。 所 用 蒸 饮 水 应 预先 煮沸 15~30 mino (4) 缓 冲 溶液 的 pH 值 与 温度 的 关系 对 照 表 0.05 mol/L 0.025 mol/L 0.01 mol/L Re ARAM 1k eR eh 硼砂 = 和” 九 、 凝 胶 数据 表 1.Sephadex G 型 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 的 数据 ” 床 体积 有关 人 高 共 因 | pH ( 混 球 ) wer po 稳定 性 55~ 166 <7 10? <7 10? G-15 60~181 21.5x10° | <1:5x iP’ D 1x 10?~ 1x 10°~ G-25 #1 | 172~516 D 5x 10° 5x 10° 中 86 一 256 细 34 一 138 超 细 17.2 一 69 G-50 #1 | 200~606 D 中 101 一 303 细 40 一 60 超 细 20 一 80 G-75 92~277 6.4 BA 1.5 G-100 10.0+1.0 4.2 超 细 G-150 15.0+1.5 1.9 BA 0.5 129~388 | 20.0+2.0 * 本 表 数 值 取 自 Pharmacia Biotech Biodirectory 1996. * * 为 2.6x30 cm BEEZ 25U 用 蒸馏 水 测定 之 值 。 D= Darcy’s law. +» 287: » 2.Sephadex G 型 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 溶 胀 所 需 时 间 “ 凝 胶 型 号 所 需 最 小 溢 胀 时 间 ” G-10 一 G-200 20~22U (室温 ) Sephadex G-10 3 G-15 3 G-25 3 G-50 3 G-75 24 G-100 72 G-150 72 G-200 72 * 溶 胀 时 要 将 凝 胶 浸 泡 在 过 量 的 水 或 缓冲 液 中 。 在 整个 溶 胀 过 程 中 应 避免 剧烈 的 搅拌 , 尤其 不 能 使 用 电磁 搅拌 , 以 免 破坏 了 它 的 颗粒 结构 , 以 及 产生 许多 碎 末 而 影响 洗 脱 时 的 流速 。 3. 琼脂 糖 凝 胶 的 数据 ” 琼脂 糖 含 量 / % 分 离 范 围 ERE A 多 糖 DNA 排 阻 限 /bp 颗粒 范围 /pm pH 稳定 度 (长 时 ) pH 稳定 度 ( 短 时 ) ea" 最 大 体积 流速 * * 最 大 线性 流速 ”“ * 5| Pharmacia 公司 Biotech BioDirectory 1996。 * * A: 化 学 消毒 ，C:pH 7 时 可 于 1200 高 压 灭 菌 30 分 钟 。 * * * ml/min. < * * * cm/h。 * 228 > 100T (沸水 浴 ) 1 1 5 5 4.Superose 的 数据 Superose 12 pg 商品 类 型 预 装 柱 HR 10/30 | 大 包装 ,12Sml | 预 装 柱 HR 10/30 | 大 包装 ,125ml 床 体积 24ml - 24ml 一 柱 尺 寸 /mm 10 x 300 - 10 x 300 一 推荐 用 柱 = HR 16/50 - HR 16/50 分 离 范围 蛋白 质 Mr 5X103 一 5x1056 | 5x10°~5x10® | 5x10°~5x10® | 5x103 一 5X105 排 阻 限 4X107 4X107 2x 10° 2x 10° ALE /pm 11~15 20~ 40 8~12 20~ 40 ip RB/ yl 200 A 200 A pH 稳定 性 (工作 ) 3 一 12 3 一 12 3 一 12 3 一 12 (清洗 ) 1 一 14 1 一 14 1 一 14 1 一 14 最 大 反 压 /Mpa 1.5 0.4 3.0 0.7 推荐 流速 /ml/min * 0.3 一 0.5 0.3 一 0.5 0.5~1.0 0.5~1.0 标 称 分 离 时 间 /min 20 一 30 A 20 一 30 A * 3] Pharmacia catalog, Pharmacia Biotech BioDirectory 1996。 A: 视 柱 的 尺寸 而 定 。 < x 蒸馏 水 ,25TY 。 HR 10/30 的 数值 。 5. 琼脂 糖 凝 胶 Bio-Gel A 型 的 数据 ” Ag || 粒度 “| 琼脂 糖 | 。 分 级 范围 re mann ( 湿 pm) | (HB) | 含量 /% (REA) /bp (om 水柱 ) 50 一 100 100 一 200 10 1x 10*~5x 10° 200 >100 200 ~ 400 粗 50 一 100 中 100 一 200 1X104 一 S$X105 2000 >100 细 200 一 400 粗 50 一 100 100 一 200 4x 104~1.5x 107 7000 200 ~ 400 75~150 | 100~200 * 新 的 Bio-Rad 公司 目录 中 Bio-Gel A-150 RAW A, 但 国内 有 些 单位 仍 有 该 型 号 的 凝 胶 , 故 仍 列 入 供 参 考 。 表 中 数值 取 自 Bio-Rad 公司 Life Sciences Rescarch Products 1996。 - oe - 6. Bio-Gel P 2 5% eb) Adz * 得 水 值 | 床 体 积 上 上 站 E Ti) | FR) 200~400 | 45~90 1.5 1x 107~1.8 x 10° Bet eee 90 ~ 180 8 x 10?~4x 10° ~ 45~90 <45 100~200 | 90~180 1x 10°~6 x 10° 200~400 | 45~90 ~400 <45 ac Hee eileen 200~400 | 45~90 oar aa 41 | 200~400| 45~90 Heese ea eae 细 | 200 一 400 | 45~90 细 | 200 一 400 | 45 一 90 x 本 表 所 列 数 值 取 自 Bio-Rad 公司 Life Seicnces Research Products。 新 目录 中 一 些 老 型 号 产品 均 未 列 入 ,如 Bio-Gel P-150、Bio-Gel P-200 和 Bio-Gel P-300。 Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-4 Bio-Gel P-6 Bio-Gel P-10 Bio-Gel P-30 Bio-Gel P-60 Bio-Gel P-100 7. RKRAC BBR Bio-Beads S-X 型 的 数据 EE PB 胀 的 体积 /(myg 胶 ) Bio-Beads S-X 1 Beads 200~ 400 6x 10?~1.4x104 | 1.4x104 S-X 2 Beads 200 ~ 400 1x 107~2.7x10? | 2.7x10° S-X 3 Beads 200 ~ 400 ~2x 10° 2x 10° S-X 4 Beads 200 ~ 400 ~1x 10° 1.4x 10° S-X 8 Beads 200 ~ 400 ~1x10° 1x 10° S-X 12 Beads 200 ~ 400 ~4x 10? 4x 10? 6 x 10?~1.4x 104 S-M 2 Beads 20 ~ 50 * AS BCE HUE Bio-Rad Life Sciences Rescarch Products 96 编辑 。 其 中 老 产品 目录 中 尚 有 Bio-Beads S-X 2. Bio-Beads S-X 4 及 Bio-Beads S-M 2 数 种 规格 ,新 目录 中 均 未 列 入 。 这 几 种 型 号 的 数值 均 系 老 产 品目 录 中 的 数据 。 - 2 * 8. 制备 级 Superdex 凝 胶 过 滤 介质 的 数据 ” cm/h) 100 100 100 3~12]1~14] 0.3 KA, 多 糖 , 小 蛋白 等 3~12]1~14| 0.3 重组 蛋白 , 细胞 色素 等 3~12|1~14] 0.3 单 抗 ,大 和 蛋白 等 24 一 44 ED 24 一 44 |3 x 10°~7 x 104|5x 102 一 3X 104 24 一 44 |1x104 一 6Xx105|1x103 一 1x 10° * Pharmacia 公司 提供 平均 粒 径 为 13 pm 的 预 装 柱 和 不 同 规格 的 制备 级 预 装 柱 。 9. RCMB RR Toyopearl HAF * Toyopear! pS: 湿 粒 径 得 水 值 分 离 范 最 大 操作 压力 型 号 (pm) (myg 干 凝 胶 )| “球形 蛋白 /Da Wi 聚 糖 /Da (kgy/cm2 ) 粗 3 一 4 1x 10?~1.5x10*} 1x10? 一 8X103 5x10? 一 8Xx104 | Sx10? 一 2x104 1x 10°~7x10° | 1x103 一 2x105 3.5~4.5 | 5x10?~1x10° | 2x10°~3x10° 5x 107~5x 10° | 1x 10?~1x 10° 5x 10°~5x10’ | 1x10°~1x 10’ * 本 表 引 自 井 村 伸 正 等 编 , EB y ERY 7, BARRA, 1984, 10. 各 种 凝 胶 所 人 允许 的 最 大 操作 压 建议 的 最 大 静水 压 /cmH2O Sephadex G-10 G-15 100 G-25 100 G-50 100 Sephadex G-75 ae 建议 的 最 大 静水 压 /cmH2O Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 Bio-Gel P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 Bio-Gel P-100 Bio-Gel P-150 Bio-Gel P-200 Bio-Gel P-300 Sepharose 2B 4B Bio-Gel A-0.5M A-1.5M A-5M Bio-Gel A-15M Bio-Gel A-50M Bio-Gel A-150M | 30 a. 每 厘米 凝 胶 长 度 。 +, Beet Ain A 1. 凝 胶 过 滤 用 低 分 子 质量 标准 的 组 成 分 子 质量 范围 13 700 一 67 000 蛋白 质 分 子 质量 /Da 核糖 核酸 酶 A(ribonuclease) 13 700 REALS ABBR (chymotrypsinogen A) 25 000 5838 SA (ovalbumin) 43 000 牛 血 清白 蛋白 (bovine serum albumin) 67 000 蓝 色 葡 聚 糖 (blue dextran 2000) 一 2 000 000 * 232 « 2. 凝 胶 过 滤 用 高 分 子 质量 标准 的 组 成 分 子 质 量 范围 138 000 一 669 000/Da 分 子 质量 /Da 醛 缩 酶 (aldolase) 158 000 it Att AS (catalase) 232 000 EA (ferritin) 440 000 甲状 腺 球 蛋 白 (thyroglobulin) 蓝 色 葡 聚 糖 (blue dextran 2000) 3. 凝 胶 过 滤 用 分 子 质量 标准 品 分 子 质量 标准 品 分 子 质量 /Da 中 文 名 称 谷 胱 甘 肽 (还 原型 ) 300 glutathioin reduced 谷 胱 甘 肽 (二 硫化 物 ) glutathionim disulfide 600 维生素 By vitamin By 1 300 杆菌 肽 bacitracin 1 400 fe FF ER RHR ACTH 3 500 细胞 色素 C cytochrome C 13 000 肌 红 蛋白 myoglobin 17 000 a- 廉 蛋白 酶 原 a-chymotrypsinogen 24 500 RATS carbonic anhydrase 31 000 卵 清 蛋 白 ovalbumin 43 000 牛 血 清白 蛋白 bovin serum albumin 67 000 转 铁 蛋 白 transferrin 74 000 免疫 球 蛋白 G Ig G 158 000 血 纤 维 蛋 白 原 fibrinogen 341 000 KEA ferritin 470 000 甲状 腺 球 蛋白 thyroglobulin 670 000 病毒 核酸 nucleic acid viruses >1 000 000 +—, #EEVPD RSS AHREBH 被 分 离 的 物质 类 型 (1)70% 乙 醇 , 或 96% 乙 醇 :25% 氨 水 =4:1 (2) 正 丁 醇 : 乙 酸 :水 =6:2:2 (3) Bt: 7K =3:1(W/W) (4) IEPA: 7K = 1:1, RB: K=10:4 (5) Ai : ABE: 17% BK =2:2:1 TET B: CB: 7K =6:4:4 (1) 正 丁 醇 : 乙 酸 :水 =4:1:5 (2) EE: TAR: 7K = 15:70:15 (3) 正 丙 醇 :水 =7:3 (4) 甲 醇 : 水 :吡啶 =80:20:4 * 233 。 AER 续 表 被 分 离 的 物质 类 型 x 持 ffl 展 层 溶剂 (1) 氧 仿 :丙酮 =9:1 (2) 环 己 烷 :乙酸 乙 脂 =1:1 (3) 氧 仿 :甲醇 =9:1 (4) 丁 醇 饮 和 的 0.1% NH,OH Sephadex G 一 25 (1)0.05mol/L NEH4OH (2) 水 蛋白 质 及 酶 DEAE - Sephadex 多 ik 硅胶 G a 各 种 浓度 的 磷酸 缓冲 液 硅胶 G 乙酸 :丙酮 : : 葵 =1:1:4: 水 溶性 维生素 B 族 tis AES 氧化 铝 甲醇 ,或 CCl, 或 石油 本 (1) 石 油 醚 :乙醚 :乙酸 =90:10:1 脂 溶性 维生素 B 族 硅胶 G (2) 丙 酮 : 己 烷 : 甲 醉 =15:135:13 纤维 素 C (1) 水 (2) 饱 和 硫酸 铵 :1molL 乙酸 钠 : 异 丙 醇 =80:18:2 J (3) TBE: PARR: Z.BE: 5% BOK 7K =3.5:2.5:1.5:1.5:1 (1)0.02mol/L~0.04mol/L HCl (2)0.2mol/L~2mol/L NaCl BR (1) 正 丁 醇 水 饱和 溶液 (2) PB: PR AUK: 2K = 6:3:1 硅胶 G (3)iE TB: CR: 7K =5:2:3 (4) 正 丁 醇 :丙酮 : 冰 栈 酸 :5% 和 氨水 :水 =7:5:3:3:2 脂肪 酸 硅胶 G REM + (1) 石 油 醚 :乙醚 :乙酸 =70:30:1 (2)2R: PH=1:1 (3) 石 油 醚 :乙醚 :乙酸 =70:30:2 (1) 4 THRE (B. P60~70T ): 葵 =95:5 2 ? = 92: 脂肪 类 HERE G (2) 石 油 醚 :乙醚 =92:8 (3)CCh (4) 石 油 醚 :乙醚 : 冰 醋 酸 =90:10:1( 或 =80:10:1) (S)A Rien a3 (1) 葵 : 冰 乙 酸 :甲醇 =1:1:3 (2): A: K=4:5:1 VL aR (3) 氧 仿 : 丙 酮 : 冰 酷 酸 =6:3:1 mo. 糖 类 (4) 正 丁 醇 :乙酸 乙 酯 :水 =7:2:1 (1) 乙 酸 乙 酯 : 异 丙 醇 :水 =65$:23.5:11.5 硅 藻 土 (2) 75: OK BAAR: FABER =1:1:3 (3) 甲 基 乙 基 甲 酮 : 冰 醋 酸 :甲醇 =3:1:1 BE Ag FER G (1) 氧 仿 : 甲 醇 : 水 =80:25:3 > (2) AGH: FA BE: 7K = 65:25:4( BK = 65:2:4; BK = 132671) (1)A+5%~15% BE 。 (2) 氧 仿 : 乙 二 腕 =9:1 (3) 乙 醇 : 乙 酸 :水 =60:30:10 生物 碱 (4) 环 已 烷 : 氧 仿 : 乙 二 胺 =5:4:1 (DAH 〈2) 环 已 烷 : 氧 仿 =3:7, 再 加 0.05% 乙 二 胺 (3) 正 丁 醇 : 二 丁 醚 :乙酸 =40:50:10 (1) 葵 (2) 石 油 醚 :乙酸 =90:10:1 (3) 氧 仿 (4) 环 己 烷 (5) 苯 :甲醇 =95:5 硅胶 G 氧化 铝 G 型 oF 中 iS a 十 二 、 各 类 物质 常用 的 薄 层 显 色 剂 化 合 物 YE 氨基 酸 类 | 茧 三 酮 液 :0.2 一 0.3 g 划 三 酮 溶 于 95Sml 乙醇 中 , 再 加 入 Sml 2, 4 -— EM Me 5% 磷 钼 酸 乙醇 液 脂肪 类 | 三 氧化 锁 或 五 氧化 锯 氧 仿 液 0.05% 若 丹 明 B 水 溶液 2g 二 苯胺 溶 于 2ml KKK, 10ml 80% 磷酸 和 100ml 丙酮 液 0.3% ABARAT 80% 乙醇 中 , 每 100ml 中 加 入 30% NaOH 3 滴 邻 联 茄 香 腕 乙酸 溶液 5% 三 氯 化 铁 深 于 甲醇 (与 水 1:1) 中 7% 盐 酸 产 胺 水 溶液 与 12%KOH 甲醇 液 等 体积 混合 , 喷 于 滤纸 上 将 纸 与 薄 层 在 30 ~ 40T 接触 10~15 min, 取 下 滤纸 ,喷洒 5%FeCl( 溶 于 0.5mol/L HCl 中 ) 于 纸 上 me | || | me | PR | Bt | Be | Oe 十 三 、 腐 蚀 性 万 能 薄 层 显 色 剂 KTR I HK GER, 加 热 到 100~110T 50% H,SO, 喷 上 后 ,加 热 到 200 , 在 日 光 或 紫外 光 下 观察 iB : REAR BF = 1:3 喷 上 后 加 热 H,SO4-KMnO, 0.5g KMnO, 溶 于 15ml 浓 硫 酸 , 喷 后 加 热 H2SO4-HCrO4 将 HCrO, 溶 于 洲 硫 酸 中 使 成 饱和 溶液 , 喷 后 加 热 H,SO,-HNO; 喷 H,SO4: HNO; = 1:1 后 加 热 ,或 用 含有 5%HNO3 的 浓 硫 酸 , 喷 后 加 热 HCIO, Ii 2% (BK 25% )HCIO, ARIA, DIA 150C lz 喷 1% 碘 的 甲醇 溶液 , 或 放 在 含有 L 结晶 的 密闭 器 严 内 十 四 、 电 泳 染 色 方 法 生物 高 分 子 经 电泳 分 离 后 需 经 染色 使 其 在 支持 物 ( 如 琼脂 糖 、. 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 等 ) 相 应 位 置 上 显示 出 谱 带 ,从 而 检测 其 纯度 、 含 量 及 生物 活性 。 每 种 待 检 物 质 均 有 多 种 染色 方法 ,读者 可 以 选择 使 用 。 (一 ) 核酸 染色 核酸 经 电泳 分 离 后 , 将 凝 胶 先 用 三 氯 乙酸 、 甲 酸 -乙酸 混合 液 、 毛 化 高 汞 、 乙 酸 、 乙酸 铀 等 固定 , 或 者 将 有 关 染 料 与 上 述 固定 液 配 在 一 起 , 同时 国定 与 染色 。 有 的 染 色 液 可 同时 染 DNA 及 RNA, 也 有 RNA,DNA 各 自 特 殊 的 染色 法 。 1.RNA 染色 法 (1) 焦 宁 Y(pyronine Y): 此 染料 对 RNA 染色 效果 好 , 灵敏 度 高 , TRH 0.0lpg 的 RNA。 脱 色 后 凝 胶 本 底 色 浅 而 RNA 色 带 稳定 , 抗 光 , FAIRE. WH 料 最 适 浓度 为 0.5% 。 方 法 :0.5% 焦 宁 了 Y 溶 于 乙酸 -甲醇 -水 (1:1:8,V/V) 和 1% 乙 酸 铀 的 混合 液 中 染 16 h( 室 温 ), 用 乙酸 -甲醇 -水 (0.5:1:8.5) 脱 色 。 (2) 次 甲 基 蓝 (methylene blue) :染色 效果 不 如 焦 守 立 和 甲苯 胺 蓝 OO, 检 出 灵敏 度 较 差 ,一般 在 Sug UE. We fia RNA 条 带宽 , 且 不 稳定 , 时 间 长 了 易 褪 色 。 但 次 甲 基 蓝 易 得 ,溶解 性 能 好 , 所 以 较 常 用 。 方 法 :1 mol/L 乙酸 中 国定 10 一 15 min, 2% 次 甲 基 蓝 溶 于 1 mol/L 乙酸 中 , 室温 下 染 2 一 4 h。 用 1 mol/L 乙酸 脱色 。 (3) FY MEE (acridine orange) :染色 效果 不 太 理 想 , 本 底 颜 色 深 , 不 易 脱 掉 。 与 fey Y #HIL,RNA 色 带 较 浅 , 甚至 有 些 带 检 不 出 。 但 却 是 常用 的 染料 , 因为 它 能 区 别 单 链 或 双 链 核酸 (RNA,DNA), 对 单 链 核酸 显 红 色 荧 光 (640 nm), 对 双 链 核酸 显 绿色 荧光 (530 nm). FE: 1% HY MERE F 15% 乙酸 和 2% 乙 酸 铀 混合 液 中 染 4h( 室 温 )。 用 7% 乙 酸 脱色 。 (4) FA4E HIE O(toluidine blue O) :其 最 适 浓度 为 0.7% , 染色 效果 较 焦 宁 立 稍 差 些 , 因 凝 胶 本 底 脱 色 不 完全 , 较 浅 的 RNA 色 带 不 易 检 出 。 方 法 :0.7% 甲 苯胺 蓝 溶 于 1$% 乙 酸 中 , 染 1 一 2 h, 用 7.5% 乙 酸 脱色 。 2.DNA 染色 法 (1) 甲 基 绿 (methyl green) :一 般 将 0.25% 甲 基 绿 溶 于 0.2 mol/L pH4.1 的 乙 酸 缓冲 液 中 , 用 氯仿 反复 抽 提 至 无 紫色 ,室温 下 染 1 h。 此 法 适用 于 检测 天 然 DNA。 (2) 二 葵 胺 (diphenylamine):DNA 中 的 «o -脱氧 核糖 在 酸性 环境 中 与 二 苯胺 试 剂 染 色 1 h, 再 在 沸水 浴 中 加 热 10 min 即 可 显示 蓝 色 区 带 。 此 法 可 区 别 DNA 和 RNA。 (3) Feulgen 染色 :用 此 法 染色 前 ,应 将 凝 胶 用 1moly 工 冷 HCI fl € 30min, 60 lmoV1 HCl 中 浸 12 min, 然后 在 Schiff 试剂 中 染 1 h( 室 温 )。Schiff 试剂 配制 方法 :用 6% 亚 硫酸 溶液 配制 0.1% 品 红 溶液 (无 色 )。 3.RNA、DNA 共用 染色 法 - 莞 光 染 料 省 乙 锭 (ethidium bromide, 简称 EB) 可 用 于 观察 琼脂 糖 电泳 中 的 RNADNA 带 。EB 能 插入 核酸 分 子 中 碱 基 对 之 间 , 导致 EB 与 核酸 结合 。 可 在 紫外 分 析 灯 (253 nm) 下 观察 荧光 。 如 将 已 染色 的 凝 胶 浸 泡 在 1m mol/L MgSO, 溶液 中 1 h, 可 以 降低 未 结合 的 EB SRM RRR 光 , 有 利于 检测 极 少量 的 DNA。 EB 染料 的 优点 :操作 简单 。 凝 胶 可 用 1 一 0.5 mg/ml 的 EB 染色 , 染色 时 间 取 - 236 ， 决 于 凝 胶 浓 度 , 低 于 1% 的 琼脂 糖 凝 胶 染 15 min Bay, SAW EB 不 干扰 在 紫外 灯 下 检测 荧光 。 染 色 后 不 会 使 核酸 断裂 , 而 其 他 染料 做 不 到 这 点 ,因此 可 将 染料 直 接 加 到 核酸 样品 中 , 这 样 可 以 随时 用 紫外 灯 追 踪 检 查 。 灵 敏 度 高 ,对 1 ng RNA, DNA 均 可 显 色 。 注意 :EM 染料 是 一 种 强 裂 的 诱 变 剂 , 操作 时 应 戴 上 聚 乙烯 手套 , 加 强 防 护 。 (二 ) BARRE 1. 氨基 黑 10B 将 凝 胶 于 12.5% 三 氯 乙酸 中 固定 30 min, 然后 用 0.05% AES 10B(12.5% 三 氯 乙酸 配制 ) 染 色 3 h, 再 经 12.5% 三 氯 乙酸 脱色 , 直至 背景 清晰 为 止 。 蛋 白质 条 带 呈 蓝 绿 色 或 蓝 色 。 2. 考 马 斯 亮 蓝 R250 将 凝 胶 浸入 固定 液 ( 乙 醇 : 冰 栈 酸 :水 =5$:1:4，V/V) 固 定 1 h, 然后 用 0.25% 考 马 斯 亮 蓝 R250( 用 脱色 液 配制 ) 染 色 3 一 4 h 或 过 夜 。 染 色 后 的 胶片 用 水 冲 去 表 面 染 料 , 用 脱色 液 ( 乙 醇 : 冰 醋酸 :水 =5:1:5,V/V) 脱 色 至 条 带 清晰 为 止 。 该 方法 的 灵敏 度 比 氨 基 黑 高 $ 倍 。 3. 考 马 斯 亮 蓝 G250 将 凝 胶 浸 入 12.5% 三 氯 乙酸 中 国定 30 min, 然后 浸入 0.1% 考 马 斯 亮 蓝 G250 溶液 (用 12.5% 三 氯 乙酸 配制 ) 中 染色 30 min, 一 般 无 需 脱色 , 染色 灵敏 度 为 氨基 黑 的 3 倍 。 4. 荧光 染料 染色 (1) 蛋白 质 样品 的 荧光 标记 “将 蛋白 质 溶液 与 等 体积 用 1 mol/L NaHCO; 配 制 的 2mg/ml 异 硫 氰 酸 荧光 素 (FITC) 混 合 , 置 室温 下 反应 2 h( 或 在 4 忆 冰 箱 中 过 夜 RE), 然后 于 上 样 前 加 入 等 体积 的 样品 缓冲 液 , 即 可 用 于 上 样 。 (2) 结果 观察 ”电泳 结束 后 , 剥 取 凝 胶 , 在 紫外 灯 下 观察 即 可 看 到 蛋白 条 带 。 未 与 蛋白 质 结合 的 荧光 素 在 前 沿线 形成 一 条 荧光 带 。 凝 胶 可 放 在 30% 甲醇 中 固 定 。 蛋 白质 荧 光 带 至 少 在 4 天 内 保持 稳定 。 5. RABE (1) 电泳 后 立即 将 凝 胶 浸 泡 在 固定 液 ( 乙 醇 : 冰 醋酸 :水 =5:1:4) 中 至 少 30 ming (2) 将 凝 胶 置 浸泡 液 (乙醇 75 ml, 醋酸 钠 17.00g, 25% SR — MB 1.25 ml, Mitt = 237 。 硫酸 钠 .SH2O 0.50 g 用 蒸馏 水 溶解 后 定 至 250 ml) 30 min. (3) 用 蒸馏 水 冲洗 3 次 ,每 次 $S min. (4) 将 凝 胶 在 银 溶液 (AgNO; 0. 25g, 甲醛 2$ 几 ,用 蒸馏 水 溶解 并 定 容 至 250 ml) 中 放置 20 min. (5) 接着 在 显 色 液 ( 无 水 NazCO; 6.25g, 甲醛 25yl, 用 蒸馏 水 溶解 并 定 容 至 250 ml) 中 放置 2 一 10 min, MHA ERR AIL. (6) 终止 反应 :将 凝 胶 放 在 终止 液 (EDTA-Naz .2H2O 3. 65g, 用 蒸馏 水 加 至 250 ml)# 10 min. (7) 用 蒸馏 水 冲洗 3 次 ,每 次 5 一 10 min. (8) 凝 胶 于 1% 甘 油 溶 液 中 浸 30 min, 用 玻璃 纸 包 胶 , Sih FR. (=) PRA 1. 过 碘 酸 - Schiff 试剂 将 凝 胶 放 在 2.5 g 过 碘 酸 钠 、86 ml H.O.10 ml 冰 醋 酸 .2.5 ml HK HCL1 g = 氯 乙酸 的 混合 液 中 , 振 功 过 夜 。 接 着 用 10 ml KAR. g 三 氯 乙酸 .90 ml HOW 混合 液 漂洗 8 h, HAN EER AMM. FA Schiff 试剂 染色 16 h, 最 后 用 1g KHSO4、20 ml 浓 HC1.980 ml H,O 的 混合 液 漂洗 2 次 , 共 2 h, 操作 是 在 4 进行 ， Schiff 试剂 配制 参见 本 书 附录 十 四 (一 ) 之 2(3)。 2.DNS - Gly - NHNH, 325¢B AH #8 AA SDS-PAGE 分 离 后 , SER pH 7.2 10mmol/L 磷酸 缓冲 液 漂洗 两 次 ,用 4mmol/L NalO, 于 磷酸 缓冲 液 (pH 7.2, 10mmolL) 中 避 光 氧化 1 h, RB 水 多 次 漂洗 凝 胶 , 再 用 磷酸 缓冲 液 (pPH 7.2，10mmolyL) 洗 涤 除 去 过 量 的 NaIO,， 然后 用 0.06% DNS-Gly-NHNH, ( 溶 于 63% 的 乙醇 中 ) 于 23~25C 下 避 光 标记 过 夜 ,标记 后 倒 出 DNS-GNHNH, 溶液 (4Y 保存 备用 ), 依次 用 30%、20% 的 丙酮 漂 洗 凝 胶 数 次 , 以 除去 残存 的 DNS-G-NHNH。 获 光标 记 的 糖 蛋白 在 紫外 灯 王 呈现 明亮 的 条 带 。 用 荧光 酰 肝 DNS-G-NHNH, 在 凝 胶 上 显示 糖 蛋 白 灵 敏 度 高 (可 检测 10 ~ 25 ng 的 糖 蛋 白 ) 专 一 性 强 , 可 区 分 糖 蛋 白 和 非 糖 蛋白 。 3. 阿尔 山 蓝 染色 凝 胶 在 12.5% 三 氯 乙酸 中 国定 30 min, 用 蒸馏 水 漂洗 , 放 入 1% 过 碘 酸 溶液 (用 3% 乙 酸 配制 ) 中 氧化 S0 min, 用 蒸馏 水 反复 洗涤 数 次 以 除去 多 余 的 过 碘 酸 盐 ， 再 放 入 0.5% 偏重 亚 硫 酸 钾 中 , 还 原 剩 余 的 过 碘 酸 盐 30 min, 接着 用 蒸馏 水 洗涤 ， 最 后 浸泡 在 0.5% 阿 尔 山 蓝 ( 用 3% 乙 酸 配制 ) 染 4 h。 ?29 - (四 ) 脂 蛋 白 染 色 1. 油 红 0 染色 将 凝 胶 置 于 平 血 中 ,用 S$% 乙 酸 固定 20 min, 用 H2O MAK, BAZ O 应 用 液 染 色 18 h, 在 乙醇 :水 =5:3 中 洗涤 S min, 最 后 用 蒸 馅 水洗 去 底 色 。 必 要 时 可 用 氨基 黑 复 染 , 以 证 明 脂 和 蛋白 区 带 。 2. 苏丹 黑 B 将 2 g 苏 丹 黑 加 60 ml 吡 哇 和 40 ml 乙酸 酥 混 合 ,放置 过 夜 。 再 加 3000 ml #& 馅 水 ,乙酰 苏丹 黑 即 析出 。 抽 滤 后 再 溶 于 丙酮 中 , 将 丙酮 蒸发 , 剩 下 粉 状 物 即 乙酰 苏丹 黑 。 将 乙酰 苏丹 黑 溶 于 无 水 乙醇 中 , 使 呈 饱 和 溶液 。 用 前 过 滤 , 按 样品 总 体积 1/10 量 加 入 乙酰 苏丹 黑 饱 和 液 , 将 脂 蛋 白 预 染 后 进行 电泳 。 (五 ) 同 工 酶 染色 1. 过 氧化 物 酶 染色 液 组 成 :70.4 mg 抗坏血酸 , 20 ml 联 苯胺 贮 液 (2 g 联 葵 胺 溶 于 18 ml vk 醋酸 中 再 加 水 72 ml) ,20ml 0.6% 过 氧化 氨 , 60 ml 水 。 染色 方法 :电泳 完毕 , 剥 取 凝 胶 ,用 蒸馏 水 漂洗 数 次 后 , WA REM, A1~5 min 出 现 清 晰 的 过 氧化 物 酶 区 带 , 迅速 倾 出 染色 液 ,用 蒸馏 水 洗涤 数 次 ,于 7% 乙酸 中 保存 。 2. Gees le) Tay 染色 液 组 成 : 坚 牢 蓝 RR 盐 30mg HF 30m! pH 6.4 HY 0.1mol/L 磷酸 缓冲 液 中 ,2ml 1% 0 -醋酸 蔡 酯 (少许 丙酮 溶解 ,用 80% 酒精 配 ), lml 2%8 -醋酸 蔡 酯 ( 配 制 同 o -醋酸 蔡 酯 ), 1 SBN AY 染色 方法 :电泳 完毕 , 剥 取 凝 胶 , 立即 转移 至 上 述 染色 液 中 , 37C 保温 数 分 钟 ， 当 呈 现 棕 红色 的 酯 酶 同 工 酶 谱 带 时 , 迅速 倾 出 染色 液 , 用 蒸馏 水 漂洗 ,于 7% 乙酸 中 保存 。 3. 细胞 色素 氧化 酶 同 工 酶 染色 液 组 成 :1% 二 甲 基 对 葵 二 腕 3 ml，1% a- 蔡 酚 ( 溶 于 40% 乙醇 )3ml， 0.1mol/L pH 7.4 磷酸 缓冲 液 75 ml, 混 匀 后 即 可 。 Ye fh, PILE, BA LRA MH, 37C 保温 数 分 钟 , 直至 条 带 清晰 时 , 立即 倒 掉 染 色 液 ,用 无 离子 水 冲洗 数 次 ,立即 照相 或 记录 结果 , 否则 天 蓝 色 的 酶 带 会 褪 ° 239 。 去 , 在 水 中 只 能 做 短期 保存 。 4. 淀粉 酶 同 工 酶 (1) 电泳 凝 胶 中 加 可 溶性 淀粉 的 负 染 色 方 法 剥 取 凝 胶 置 于 200ml 0.15mol/L, pH 5.0 的 醋酸 缓冲 液 中 ,37 和 保温 1.5 h, 倾 去 保温 液 , 用 0.15 mol/L, pH 5.0 的 醋酸 缓冲 液 冲洗 数 次 以 除去 多 余 的 淀粉 , HK 后 加 入 显 色 碘 液 (0.$ g 磺 用 95% 乙醇 溶 解 ,0.80 g 碘化钾 ,用 蒸馏 水 定 容 至 1L)， 胶 板 逐渐 变 成 蓝 色 , 在 蓝 色 背景 上 出 现 各 种 透明 条 带 , 即 淀粉 酶 带 。 (2) 凝 胶 中 未 加 可 溶性 淀粉 的 染色 方法 电泳 毕 , 吸取 适量 1% 可 溶性 淀粉 (沸水 中 煮沸 至 无 色 透 明 无 沉淀 才 可 使 用 ) 均匀 地 倒 在 胶 板 面 上 , 静 置 1 h, 待 淀粉 溶液 被 胶 板 吸 收 后 ,用 pH 5.0, 0.15mol/L 醋酸 绥 冲 液 洗 去 胶 板 表面 的 剩余 省 粉 , 然后 加 200ml 0.15mol/L, pH 5.0 的 醋酸 缓冲 液 ,377 保温 1.5 h。 倾 去 保温 液 ,加 显 色 碘 液 200ml( 显 色 磺 液 配 法 同上 ) ,在 蓝 色 背景 上 出 现 白色 透明 粉红 、 红 或 褐色 条 带 , 即 为 淀粉 酶 带 。 5. Cie hi Sasi] Las 染色 液 组 成 :NAD 20mg, NBT 15mg, PMS( 4} — AE EAB ER) Img, 0.2mol/L Tris-HCl( pH 8.0) 277% 7 ml 和 重 蒸 水 41 mil, Feta ATH 2 ml 95% 乙醇 作 底 物 。 染色 :电泳 后 剥 下 的 凝 胶 板 放 在 染色 液 中 , 37°C 保温 至 显现 深蓝 色 的 条 带 时 ， 停止 染色 ,用 7% 乙 酸 固定 保存 。 6. 苹果 酸 脱 氢 酶 同 工 酶 染色 液 组 成 :NAD 25mg, NBT 15mg, PMS 1mg, 0.2mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10ml, 7K 35ml, 底 物 溶液 Sml(13.4g L -苹果 酸 溶 于 50 ml MAA 24.3% 的 NazCO3 HzO 溶液 中 , 定 容 至 100 ml). 染色 :用 上 述 染色 液 浸 没 凝 胶 ,37 人 黑暗 中 保温 , 酶 活性 区 带 呈 蓝 色 , 染色 后 的 凝 胶 用 水 漂洗 数 次 ,于 固定 液 ( 乙 醇 : 乙 酸 : 甘 油 :HO=5:2:1:4) 中 保存 。 7. 酸性 磷酸 酯 酶 同 工 酶 染色 液 组 成 :100mg a -磷酸 蔡 酯 钠 盐 100 mg 坚 牢 蓝 RR 盐 、100ml 0.2mol/ L, pH 5.0 醋酸 缓冲 液 。 染色 :取经 蒸馏 水 漂洗 数 次 的 凝 胶 浸 入 染色 液 ,37Y 保温 至 出 现 玫 瑰 红 区 带 为 止 ,用 7% 乙 酸 终止 反应 及 保存 。 8. 碱 性 磷酸 酯 酶 同 工 酶 染色 液 组 成 : 100mg a - 蔡 酚 酸性 磷酸 钠 盐 、100mg 坚 牢 蓝 RR 盐 、100ml - 240 - 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.5).10% MgCl 10 ji, 1% MnCl, 10 滴 。 染色 : 凝 胶 置 于 混合 液 中 25C 保温 2 一 8 h, 待 出 现 橘红 色 的 酶 带 后 , 用 水 冲 YE, 拍照 。 9. 乳酸 脱 氢 酶 同 工 栈 染色 液 组 成 : NAD50mg, NBT30mg, PMS2mg, Imol/L D, L -乳酸 钠 10ml, 0.1mol/L NaCl 5.2ml,0.5mol/L Tris-HCl 271 ¥# (pH 7.4)15.2ml, 加 水 至 100ml。 该 溶液 应 避免 低温 保存 , 一 周 内 有 效 , 如 溶液 呈 绿 色 , 即 失效 。 染色 :将 凝 胶 浸 入 上 述 染 色 液 1h 左右 , 凝 胶片 上 可 显示 出 蓝 紫 色 的 乳酸 脱氧 酶 同 工 酶 区 带 图 谱 , 染色 后 的 凝 胶 用 重 蒸 水 冲洗 两 次 , 放 入 50% ~ 70% 乙醇 中 保 存 。 1mol/L D, L -= 乳酸 钠 溶 液 (pH 7.0) 的 配制 : 称 取 6.07g NazCO3 .HO 溶解 于 50ml 水 中 , 置 冰 浴 中 并 在 搅拌 时 慢 慢 加 入 (一 滴 滴 的 加 )8$% 的 D,L = 乳酸 10.6 ml, 加 水 至 100 ml。 10. FRB Lis 染色 液 :0.1 mol/L pH 7.0 FFT te AR A EE (= ARE 25.8 g WF 100 ml 水 中 , 用 1 mol/L 盐酸 调 至 pH 7.0)8 ml, NADP 15mg, NBT 15mg, PMS img, MgCl,50 mg, 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 缓 冲 液 10 ml, *K 32 ml. 染色 : 凝 胶 浸 入 染色 液 中 在 黑暗 中 37C 保温 , 直至 出 现 深 蓝 色 的 酶 活性 区 带 ， 停止 染色 , 用 水 漂洗 凝 胶 , 浸入 固定 液 中 保存 (乙醇 :乙酸 :甘油 :水 =5:2:1:4， V/V). 11. 过 和 氧化 氨 酶 同 工 酶 染色 液 :3% HzO 25ml, 0.1mol/L we MB Ht HK (pH 7.0) 5ml, 0.1mol/L Na.S,O3*5H2O 3. 5ml, 配制 成 染色 A 液 。 另 取 0.09 mol/L KI 25ml, 加 水 25ml, 配 成 B 液 。 染色 : 凝 胶 浸 泡 在 A 液 中 , 室温 下 放置 15min 后 , 倾 出 A 液 ,用 蒸馏 水 彻底 冲 洗 干 净 残 液 ,加 入 B 液 , 酶 活性 区 带 为 蓝 色 背景 上 的 白色 带 。 水 洗 后 , 可 在 甘油 溶 液 中 保存 (甘油 :水 =1:1,V/V)。 12.ATP 酶 同 工 酶 染色 液 :0.1mol/L pH 8.0 Tris -甘氨酸 缓冲 液 100ml, ATP 0.3116g, CaCl, 0.555, 摇 匀 溶解 。 染色 : 凝 胶 置 于 染 液 中 30 保温 4h 以 上 , 即 显现 出 乳白 色 的 条 带 。 7 241 - 13 .6- 磷 酸 葡萄 糖 酸 脱 氢 酶 同 工 酶 染色 液 :6 -磷酸 葡萄 糖 酸 ( 三 钠 盐 )100 毫克 , NADP 15mg, NBT 15mg, PMS Img, MgCl, 50mg, 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.0)10ml, 7K 40ml, 溶解 摇 匀 即 染色 : 凝 胶 于 染色 液 中 37 黑暗 中 保温 , BIKAR KG. BER Km 洗 , 固 定 液 中 保存 (乙醇 :乙酸 :甘油 :水 =5:2:1:4,V/V)。 14. 谷 氨 酸 草 酰 乙酸 转氨酶 同 工 酶 染色 液 : 室 温 下 , 依次 加 入 以 下 组 分 (在 加 下 一 种 组 分 之 前 , 每 种 组 分 必须 溶 解 ) :0.2 mol/L Tris-HCI(pPH 8.0) 50ml, 吡 哆 醛 - $ -磷酸 盐 ml, L-KA ARB 200mg, a - 酮 成 二 酸 100mg, 坚 牢 蓝 BB 盐 300mg, 用 1 mol/L NaOH 调 pH 在 7.0 一 8.0 之 间 。 染色 : 凝 胶 于 染 液 中 37 黑暗 保温 , 酶 活性 区 带 呈 深蓝 色 。 染 色 后 凝 胶 用 水 漂洗 数 次 ,用 甘油 水 溶液 (甘油 :水 =1:1,V/V) 固 定 。 15. 谷 氨 酸 丙 酮 酸 转氨酶 同 工 酶 染色 液 :NADH 15mg, L - 丙 氨 酸 20mg, a - 酮 友 二 酸 10mg, 0.2mol/L Tris-HCl (pH 9.0)1ml, 水 4 ml, 乳酸 脱 氢 酶 150 单位 。 染色 :用 滴 管 吸取 染色 液 然 后 一 滴 一 滴 的 加 在 凝 腕 上 , 让 染色 液 渗 入 凝 胶 中 ， 在 紫外 光 (375nm) 下 观察 并 注意 整个 胶 面 上 的 荧光 。 出 现 荧光 的 暗 带 即 为 酶 活性 的 区 带 。 立 即 通过 一 个 黄色 滤 光 镜 拍照 。 16. 超 氧化 物 歧 化 酶 同 工 酶 (1) 正 染 色 法 正 染色 液 :10mmoyL pH 7.2 磷酸 缓冲 液 中 含 2mmol/L 茄 香 胺 ,0.1mmol/L 正 染色 : 凝 胶 在 室温 下 于 上 述 缓冲 液 中 浸泡 1 h, 快速 水 洗 两 次 ,光照 5 一 15 min 显示 棕色 SOD 活性 谱 带 。 染 色 后 的 凝 胶 经 蒸馏 水 漂洗 数 次 用 于 照相 或 制 成 FB. (2) RAAB 负 染 色 液 :0.05moVL pH 7.8 的 磷酸 缓冲 液 中 含有 0.028mol/L BFC — fit, 2.8 10> °mol/L 核 黄 素 ,1.0x10-“moVL EDTA. 17. 肽 酶 同 工 酶 染色 液 :0.2moVL pH 8.0 Tris-HCl 缓冲 液 2Sml, 水 25ml, MgCbS0mg, 邻 联 大 - 242 ~ 苘 香 胺 (二 盐酸 盐 )S0mg, 过 氧化 物 酶 1500 单位 , 蛇毒 10mg, 待 完全 溶解 后 , 加 入 80mg 2 肽 或 3 肽 作为 底 物 ( 如 甘 氨 酰 - 世 RAR LL RAM- L AAR, L-BA 酰 - 甘 氨 酰 -甘氨酸 )。 染色 :将 凝 胶 置 于 上 述 溶液 中 , 室温 过 夜 (或 至 少 6h), 酶 活性 区 带 为 褐色 。 水 洗 后 ,在 甘油 溶液 中 保存 (甘油 :水 =1:1,V/V)。 18.0 - 半 乳 糖苷 酶 同 工 酶 染色 液 :4 - 甲 基 锌 形 酮 -ac-D AIL RAE FL 10mg, 0.5mol/L Fr te th BE BEE RM (pH 4.0)2.$ml, 水 2.Sml。 染色 :将 凝 胶 浸 入 上 述 混 合 液 中 37Y 保温 4Smin。 水 洗 后 ,在 凝 胶 面 上 喷洒 7.4mol/L 的 NH3s.HO, 在 37Snm 紫外 光 下 观察 , 显 荧光 处 即 为 酶 活 区 带 ,立即 通 过 一 个 黄色 滤 光 镜 拍照 。 19. 葡萄 糖 磷酸 异 构 酶 同 工 酶 染色 液 :果糖 - 6 -磷酸 ( 钠 盐 )80mg, NADP 10mg, PMS lmg, MTT( 甲 基 噬 只 基 四 唑 )10mg, MgCl, 40mg, 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.0)25ml, 水 25ml, 葡 萄 糖 - 6 -磷酸 脱 氢 酶 80 单位 。 染色 :将 凝 胶 浸入 上 述 溶液 中 ,4 人 黑暗 中 保温 , 深蓝 色 条 带 为 酶 活 区 带 。 水 洗 后 ,于 甘油 水 溶液 中 保存 (甘油 :水 =1:1,V/V)。 20.6 -磷酸 葡萄 糖 脱 氨 酶 同 工 酶 染色 液 : 葡萄 糖 - 6 -磷酸 (二 钠 盐 )200mg, NADP 15mg, NBT 15mg, PMS Img, MgCl,50 mg, 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.0)10 ml, 水 40 ml, 染色 :用 水 漂洗 凝 胶 后 ,浸入 上 述 溶液 中 ,37 黑暗 中 保温 , 酶 活性 区 带 为 深蓝 色 。 水 洗 后 ,用 固定 液 保存 (乙醇 :乙酸 :甘油 :水 =5:2:1:4,V/V)。 21. 醛 缩 酶 同 工 酶 染色 液 :果糖 - 1,6 -二 磷酸 (四 钠 盐 )27$Smg，NAD 25mg, NBT 15mg, PMS Img, HERE 75mg, 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.0)10ml, 水 40ml 以 及 甘油 醛 -3 -磷酸 脱 氢 酶 100 单位 。 染色 : 凝 胶 浸 入 上 述 溶液 中 ,37 人 黑暗 保温 , 酶 活性 区 带 为 深蓝 色 。 水 洗 后 ,用 固定 液 保存 (乙醇 :乙酸 :甘油 :水 =5:2:1:4,V/V)。 22. Bret it sis) Tas 染色 液 : 腺 苷 40mg, NBT15mg, PMSSmg, 砷 酸 钠 50mg, 0.2mol/L Tris-HCl & 冲 液 (pH 8.0)1 ml, 水 4ml, 黄 味 叭 氧化 酶 1.6 单位 和 腺 苷 磷酸 化 酶 $ 个 单位 。 - 243 - 染色 :用 滴 管 吸取 上 述 染色 液 滴 在 凝 胶 上 并 浸没 凝 胶 , 让 染色 液 渗 入 胶 内 ， 37°C 黑暗 中 保温 , 酶 活性 区 带 呈 深蓝 色 。 23. 延 胡 索 酸 酶 同 工 酶 染色 液 : 延 胡 索 酸 钠 盐 385mg, NAD 40mg, NBT 15mg, PMS lmg, 加 入 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.0)10 ml, 7K 40 ml, 苹果 酸 脱氧 酶 600 单位 。 染色 :将 凝 胶 浸 入 上 述 染 液 中 ,37 黑暗 保温 , 酶 活性 区 带 呈 深蓝 色 。 24.0 -磷酸 甘油 脱 氢 酶 同 工 酶 染色 液 :1.0molL a -甘油 磷 酸 钠 ( 即 21.6g a -甘油 磷酸 钠 溶 于 适量 水 中 , 用 lmol/L HCl 调 至 pH 7.0, 定 容 至 100ml) 5ml, NAD 25mg, NBT 15mg, PMS 1mg, 0.2mol/L Tris-HCi 缓冲 液 (pH 8.0) 10ml, 7K 35ml. Ye 4, REBAR, 37C BR, ERK SR, Re KEK 次 , 置 于 固定 液 中 保存 (乙醇 :乙酸 :甘油 :水 =5:2:1:4,V/V)。 25. BERR ita Le 染色 液 : 肌 苷 100mg, NBT 15mg, PMS 5mg, 砷 酸 钠 100mg, 0.2mol/L Tris- HCl 缓冲 液 (pH 8.0) 10 ml, 水 40 ml, 黄 味 叭 氧化 酶 1.6 单位 。 染色 : 凝 胶 浸入 上 述 溶液 中 , 37 黑暗 中 保温 , 酶 活性 区 带 为 深蓝 色 。 蒸 馏 水 冲洗 数 次 ,于 固定 液 中 保存 。 固 定 液 为 乙醇 :乙酸 :甘油 :水 =5$:2:1:4 (V/V). 26. BERS is) Lis 染色 液 :40mg LAR 8 -ARRER, 50mg AA SAHA 100ml 0.2mol/L Tris - 顺 丁 烯 二 酸 盐 缓 冲 液 (pH 6.0). 染色 : 凝 胶 在 上 述 溶液 中 染色 1 h。 其 余 同 前 。 27.Y - 谷 氨 酰 移 换 酶 同 工 酶 染色 液 :Smg 2 GBC 溶 于 Sml 0.1mol/L 醋酸 缓冲 液 (pH 4.7) 中 即 为 染 液 。 染色 : 凝 胶 浸 入 上 述 染 液 中 约 15min 即 显 示 出 酶 谱 带 。 置 5% 乙酸 中 国定 。 28. 磷酸 甘油 酸 激酶 染色 液 :3 -磷酸 甘油 酸 钠 盐 10mg, NADH 15mg, ATP 10mg, MgCl, Smg， EDTA 1mg, 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲 液 (pH 8.0) 1 ml, 水 4 ml, 甘油 醛 - 3 -磷酸 脱 AE 100 单位 。 染色 : 凝 胶 浸 入 上 述 染 色 液 中 , 在 375 nm 紫外 光 下 观察 , 并 注意 整个 胶 面 均 匀 的 荧光 , 酶 活性 区 带 为 荧 脱 光 的 带 。 “244 ， 29. RRS tS fis la] Las 染色 液 ; 葡 萄 糖 - 1 — BEAR ( — AHEL) 300mg, NADP 15mg, MTT 20mg, PMS Img, MgCl, 50mg, 0.2mol/L Tris-HCl 2? ¥ (pH 7.0) 10 ml, *K 40 ml, 葡萄 糖 -6 -磷酸 脱 氢 酶 80 单位 。 染色 : 凝 胶 浸 入 上 述 染色 液 中 ,37Y 黑暗 中 保温 , 酶 活性 区 带 呈 深蓝 色 。 30.RNA 酶 同 工 酶 Ye fk: ERE RNA 250mg, 黑 钾 盐 100mg, 0.05mol/L 醋酸 缓冲 液 (pH 5.0) 100ml, 磷酸 酶 10mg. 染色 : 凝 胶 在 上 述 染 液 中 37Y 保温 , BRE i a. BEBE St fa A 2k oh 洗 , 于 5% 乙 酸 中 保存 。 十 五 、 实 验 误 差 与 提高 实验 准确 度 的 方法 (一 ) 实验 误差 生化 分 析 过 程 中 , 由 于 受 分 析 方 法 测量 仪器 所 用 试剂 和 分 析 工 作者 等 方面 的 限制 ,测量 值 与 真实 值 之 间 存 在 一 定 差 异 即 误差 。 分 析 工 作者 不 仅 要 测定 出 样 品 中 待 测 组 分 的 含量 , 还 应 对 测定 结果 作出 评价 , 判断 它 的 准确 度 和 可 靠 程度 , 找 出 产生 误差 的 原因 , 并 采取 有 效 措施 减少 误差 。 1. 准确 度 和 误差 准确 度 表 示 实 验 分 析 测 量 值 与 真实 值 相 接近 的 程度 。 称 测定 值 与 真实 值 之 间 的 差 值 为 误差 , 误差 越 小 , 准确 度 越 高 。 误 差 可 用 绝对 误差 和 相对 误差 来 表示 : AN=N-N’ 相对 误差 (% ) = 二 x 100 式 中 ,AN 为 绝对 误差 N 为 测定 值 N 为 真实 值 因 真 实 值 是 不 知道 的 , 实际 工作 中 用 精确 度 代替 准确 度 来 评价 分 析 结 果 。 2. 精确 度 和 偏差 在 分 析 测 定 中 , 常 在 相同 条 件 下 对 同一 试 样 进行 多 次 重复 测定 ( 称 平 行 测定 )。 但 所 得 结果 并 不 完全 一 致 。 若 取 它 们 的 平均 值 ,就 有 可 能 更 接近 真实 值 。 如 果 多 + 245 ， 次 重复 的 测定 值 比 较 接 近 , 表示 测定 结果 的 精确 度 较 高 。 精确 度 表 示 在 相同 条 件 下 , 进行 多 次 实验 的 测定 值 相近 的 程度 。 一 般 用 偏差 来 衡量 分 析 结 果 的 精确 度 。 偏 差 也 有 绝对 偏差 和 相对 偏差 两 种 表示 方法 。 设 一 组 测定 数据 (>” 次 平行 测定 ) 为 zi, 225°, Tn, 其 算术 平均 值 为 : xz = eet ta ty 157, Bll; d;=2;- z 相对 偏差 (% ) = eens x 100 = Sx 100 此 外 , 精确 度 也 常 有 平均 绝对 偏差 和 平均 相对 偏差 来 表示 。 平 均 绝 对 偏差 是 个 别 测 定 值 的 绝对 偏差 的 算术 平均 值 。 在 分 析 实 验 中 , 有 时 只 做 2 次 平行 测定 , 这 时 就 用 下 式 表达 结果 的 精确 度 (%): i x 100 3. 准确 度 和 精确 度 的 关系 准确 度 和 精确 度 、 误 差 和 偏差 各 有 不 同 的 含义 , 既 有 区 别 又 有 联系 ,不 能 混 为 一 谈 。 准 确 度 表 示 测 定 值 与 真实 值 相符 合 程度 , 用 误差 来 衡量 , 误差 越 小 , 测定 准 确 度 越 高 。 精 确 度 则 表示 在 相同 条 件 下 多 次 重复 测定 值 相 符合 程度 ,用 偏差 来 衡 量 , 偏差 越 小 , 测定 的 精确 度 越 好 。 用 精确 度 来 评价 分 析 的 结果 有 一 定 的 局 限 性 , 分 析 结 果 的 精确 度 很 高 4 即 平均 相对 偏差 很 小 ), 并 不 一 定 说 明 实 验 的 准确 度 也 很 高 。 这 是 由 于 存在 系统 误差 造成 的 。 但 是 , 精确 度 不 高 ,不 可 能 保证 准确 度 , 所 以 精确 度 是 保证 准确 度 的 先决 条 件 。 (二 ) 误差 来 源 所 有 的 测量 都 可 能 产生 误差 , 误差 分 为 系统 误差 (可 测 误差 ) 和 偶然 误差 (随机 误差 ) 两 类 。 1. 系统 误差 它 是 由 于 测定 过 程 中 , 某 些 经 常 发 生 的 原因 所 造成 的 , 它 对 测定 结果 的 影响 比 较 稳 定 ,在 同一 条 件 下 重复 测定 中 常 重复 出 现 ,使 测定 结果 不 是 偏 高 ,就 是 偏 低 , 而 且 大 小 有 一 定 规律 , 它 的 大 小 与 正 负 往 往 可 以 测定 出 来 , 故 又 称 可 测 误差 5。 系统 误 差 主 要 有 4 个 来 源 : 方 法 误差 、 仪 器 误差 .试剂 误差 和 个 人 操作 误差 。 .246 ， 2. 偶然 误差 它 来 源 于 某 些 难以 预料 的 的 偶然 因素 , 或 是 由 于 取样 不 随机 , 或 是 因为 测定 过 程 中 某 些 不 易 控 制 的 外 界 因 素 ( 如 测定 时 环境 ` 温 度 ,湿度 和 和 气压 的 微小 波动 ) 的 影 响 。 为 了 减少 偶然 误差 ,一般 采 取 平 均 取 样 或 多 次 取样 的 方法 。 (三 ) 提高 实验 准确 度 的 方法 提高 分 析 结 果 的 准确 度 除 了 减少 偶然 误差 外 , 主要 是 通过 设置 标准 物 对 照 和 设置 空白 试验 减少 系统 误差 。 校 正 所 用 仪器 也 是 十 分 必要 的 。 TA, TAM a8 1 AA (一 ) 恒温 箱 1. 恒温 箱 的 分 类 与 结构 恒温 箱 是 实验 室 常 用 加 热 设 备 之 一 。 按 最 高 使 用 温度 分 为 干燥 箱 ( 又 称 烘箱 、 烤箱 ) 保 温 箱 (又 称 培 养 箱 ) 两 类 。 干 燥 箱 最 高 温度 300 , 用 以 烘 干 样品 ` 药 品 、 容器 等 的 水 分 , 灭 菌 及 零 配件 的 热处理 , 功率 1000 一 4000W。 保 温 箱 最 高 使 用 温 RE 60C ,用 以 培养 、 贱 化 等 ,功率 S00W。 按 特 殊 用 途 恒温 箱 又 可 分 为 真空 干燥 箱 、 隔 水 式 恒 温 箱 、 鼓 风干 燥 箱 、 防 爆 干 py 恒温 箱 一 般 由 箱 体 、 发 热 体 ( 镍 铬 电热 丝 ) 测 温 仪 或 温度 计 、 控 温 机 构 、 信 和 号 系 统 等 组 成 , 特殊 用 途 的 恒温 箱 还 有 水 箱 、 鼓 风 马 达 、 防 爆 装 置 等 。 进 气孔 一 般 在 箱 体 底 部 , 排 气 孔 在 顶部 。 外 壳 为 铁皮 或 木质 箱 体 , 内 为 保温 层 , 常用 石棉 板 、 玻 璃 纤 维 或 珍珠 岩 等 做 绝热 材料 。 电 热 丝 装 在 底层 , 单 根 或 多 根 并 联 ,分 主 加 热 丝 和 辅 加 热 丝 ,有 的 在 侧 壁 也 装 有 电热 丝 。 箱 外 涂 烤 漆 , 箱 体 内 壁 涂 耐 高 温 银 粉 防腐 。 2. 恒温 箱 的 正确 使 用 方法 (1) 使 用 前 做 好 内 、 外 检查 , 箱 内 如 有 他 人 存 物 , 取出 放 好 。 试 验 开关 、 调 温 手 柄 等 是 否 灵 活 好 用 。 打 开 风 项 ( 排 气孔 ), 揪 好 温度 计 ( 干 燥 箱 一 定 要 用 250Y 或 300°C 的 高 温 竹 节 温 度 计 )。 注 意 电 源 和 铭牌 上 标 称 电压 是 否 相符 。 箱 壳 要 接 好 地 线 ,以 防 漏电 。 (2) 通电 后 指示 灯 应 亮 , 如 加 热 指示 红 灯 不 亮 应 将 调 温 旋钮 顺 时 针 方 向 转动 至 红 灯 发 亮 。 恒 温 箱 如 有 辅助 加 热 丝 及 鼓 风 马 达 , 应 将 它们 的 开关 都 打开 。 若 时 间 充 裕 , 可 关 掉 主 加 热 丝 以 延长 其 使 用 寿命 。 (3) 当 箱 内 温度 (由 温度 计 读 出 ) 接 近 所 需 温 度 时 , 关 掉 辅助 加 热 丝 , 只 用 主 加 - 247 - 热 丝 继续 加 热 , 箱 内 温度 即将 达到 所 需 温度 时 , 反 时 针 旋 转调 温 旋 钮 使 红 灯 刚 灭 ， 绿灯 刚 亮 。 待 红绿灯 自动 交替 明 灭 时 , 表示 箱 内 温度 已 处 恒温 状态 。 由 温度 计 读 数 看 是 否 为 所 需 温度 , 如 有 偏离 可 稍 调节 调 温 旋钮 。 (4) 当 箱 内 温度 稳定 在 所 需 温度 后 放 入 待 干燥 或 待 培养 (保温 ) 样 品 。 温 度 计 指示 最 上 层 网 架 中 心 2/3 面积 的 近似 温度 , 所 以 样品 尽量 放 在 这 个 部 位 ; 其 他 层次 和 部 位 实际 温度 要 偏 高 一 些 。 (5) 使 用 完毕 , 关 掉 各 个 开关 , 并 把 调 温 旋钮 反 时 针 退 回 零 位 。 (6) 要 等 箱 内 温度 不 很 高 时 才 可 打开 箱 门 , 以 防 又 然 降 温 造 成 玻璃 门 破裂 。 (7) 调 温 旋钮 所 指 刻度 并 非 箱 内 温度 。 每 次 恒温 后 可 把 恒温 温度 及 旋钮 所 指 刻度 对 应 记录 , 以 后 使 用 时 作为 参考 , 可 以 节省 时 间 。 (二 ) 电热 恒温 水 浴 电热 恒温 水 浴 是 另 一 种 常用 加 热 设 备 。 工 作 温 度 从 室温 以 上 至 100Y , 恒温 波动 范围 土 0.SY 。 1. 使 用 方法 (1) 关闭 水 浴 底 部 外 侧 的 放水 阀门 , 向 水 浴 内 注入 蒸馏 水 至 适当 的 次 度 。 (2) 接 好 电源 , 插座 的 粗 孔 必须 安装 地 线 。 (3) 打开 电源 开关 , 接 通电 源 , 将 调 温 旋钮 沿 顺 时 针 方 向 旋转 至 红 灯 亮 ,表示 电热 管 开 始 加 热 。 (4) 当 水 温 接近 所 需 温度 时 , 沿 反 时 针 方 向 旋转 调 温 旋 钮 至 红 灯 刚 灭 、 绿 灯 刚 亮 为 止 。 此 后 ,红绿灯 交 蔡 熄 、 亮 ,达到 恒温 状态 。 如 果实 际 水 温 与 所 需 温 度 有 偏 差 , 可 微调 调 温 旋钮 使 达到 要 求 。 (5) 使 用 完毕 , 将 调 温 旋 钮 回 零 , 关闭 电源 开关 , 拔 下 插头 。 若 长 时 间 不 再 使 FA, 应 放 尽 水 浴 槽 内 的 全 部 存 水 。 2. 注意 事项 (1) 水 浴 内 的 水 位 绝对 不 能 低 于 电热 管 , 否则 电热 管 易 被 烧 坏 。 使 用 过 程 中 严防 蒸 干 。 (2) 控制 箱 部 分 切 勿 受潮 见 水 。 (3) 调 温 旋钮 度 盘 的 刻度 并 不 表示 水 温 , 实际 水 温 应 以 温度 计 读 数 为 准 。 (三 ) 电动 离心 机 为 了 使 固 相 和 液 相 分 开 , 常 使 用 离心 方法 , 以 小 型 落地 式 电动 离心 机 为 例 ,说 明 其 使 用 方法 。 ”248 + 1. 使 用 方法 (1) 离心 机 平稳 放置 于 水 平地 面 或 坚实 的 台面 上 。 调 速 杆 应 位 于 零点 (最 右 侧 )。 (2) 将 离心 液 转移 到 大 小 合适 的 离心 管内 , 最 多 装 到 2/3 体积 处 , 将 离心 管 放 入 外 套 内 。 (3) 一 对 外 套 连 同 离心 管 放 在 台秤 上 平衡 ,平衡 时 可 用 小 吸管 调整 左右 离心 管内 容 物 , 也 可 在 一 侧 放 待 测 离心 液 , 在 另 一 侧 放 一 支 水 管 , 通过 增 减 水 管内 的 水 量 使 其 平衡 。 绝 不 允许 将 平衡 用 水 直接 加 入 皮 套 内 、 外 。 (4) 将 平衡 好 的 一 对 套 管 对 称 放 到 离心 机 转 头 吊环 内 , 把 不 用 的 空 离心 套 管 取出 , 盖 严 离心 机 盖 。 (5) 打开 电源 开关 , 绥 缓 向 左 拨 动 调 速 杆 , 顶部 转速 表 内 液 面 逐 渐 下 降 , 指示 转速 大 小 。 当 达到 要 求 转速 时 , 按 要 求 计时 。 停 止 时 , 先 将 调 速 杆 向 右 拨 至 零 位 ， 再 关闭 电源 开关 , 待 离 心机 自动 停止 后 , 才能 打开 离心 机 盖 取 出 样品 。 2. 注意 事项 (1) 安全 正确 使 用 离心 机 , 关键 在 于 做 好 离心 前 的 平衡 。 (2) 离心 过 程 中 如 果 离 心 管 破碎 , 应 立即 减速 停 目 离心。 小心 清理 掉 玻 璃 碎 (AAA PAGE), 重新 换 管 装 样 ,平衡 后 再 离心 。 (3) 应 不 定期 检查 电机 的 电 刷 与 整流 子 磨 损 情 况 ,严重 时 更 换 电 刷 或 轴承 。 (四 ) 722 型 光栅 分 光 光 度 计 722 型 光栅 分 光 光 度 计 能 在 近 紫 外 、 可 见 光 谱 区 对 样品 作 定 性 、 定 量 分 析 。 1. 使 用 方法 (1) 将 灵敏 度 旋钮 调 至 “1” 档 (放大 倍率 最 小 )。 (2) 打开 样品 室 盖 ( 光 门 自动 关闭 )。 开 启 电源 , 指示 灯亮 ,仪器 顶 热 20 min. 选择 开关 置 于 “T" 旋 钮 ,使 数字 显示 为 “00.0”。 (3) 旋 动 波长 手 轮 , 把 所 需 波长 对 准 刻 线 。 (4) 将 装 有 溶液 的 比 色 亚 放 置 比 色 架 中 , 令 参 比 溶 液 置 于 光路 。 (5) 盖 上 样品 室 盖 , 调节 透 光 率 “100% T? 旋 钮 ,使 数字 显示 为 “100.0T”。 如 显示 不 到 100%T, 则 可 适当 增加 灵敏 度 的 档 数 , 重复 (2) 步 调 零 操作 。 (6) 顺 次 将 被 测 溶 液 置 于 光路 中 , 数字 表 上 直接 显示 出 被 测 溶液 的 透 光 率 (T) 值 。 (7) 吸光 度 A 的 测量 :仪器 调 工 为 0 和 100% 后 将 选择 开关 转换 至 A, HET A 调 零 旋钮 使 数字 显示 为 “.000”。 然 后 移入 被 测 溶液 、 数 字 显 示 值 即 为 试 样 的 吸光 > 249 - EA fA. (8) RE C 的 测量 :将 选择 开关 由 A HES C, 将 标定 浓度 的 溶液 移入 光路 , 调 节 浓 度 旋 钮 ,使 数字 显示 为 标定 值 。 再 将 被 测 溶液 移入 光路 , 即 可 读 出 相应 的 浓度 值 。 2. 注意 事项 实验 中 如 果 大 幅度 改变 测试 波长 ,在 2 种 波长 下 测定 的 时 间 应 间隔 数 分 钟 ,使 光电 管 有 足够 的 平衡 时 间 。 其 他 注意 事项 参照 本 书 附录 十 六 之 (五 )751G 型 分 光 光度 计 。 (二 ) 751G BASH Et 751G 型 分 光 光 度 计 (上 海 分 析 仪 器 厂 出 品 ) 是 紫外 光 和 可 见 光 分 光 光 度 计 , 其 波长 范围 为 200 一 1000 nm。 在 200~ 320 nm 范围 内 用 氢 灯 作 光 源 ,在 320 ~ 1000 nm 范围 内 用 钨 灯 作 光源 。 可 对 在 紫外 光 区 、 可 见 光 区 及 近 红 外 光 区 有 吸收 光谱 的 物质 进行 定性 定量 分 析 。 1. 使 用 方法 (1) 将 主机 与 稳 压 电源 、 稳 流 电源 用 专用 缆 线 相连 , 揪 上 电源 插头 。 (2) 根据 使 用 波长 进行 光源 灯 选 择 , 拨 动 主机 右 后 方 的 光源 选择 杆 到 所 需要 的 方向 ,在 一 定 波长 下 只 能 选用 一 灯 , 两 灯 不 能 同时 打开 。 (3) 检查 各 种 开关 及 旋钮 使 处 于 关闭 位 置 。 首 先 打 开放 大 器 稳 压 电源 开关 ， 预 热 仪 器 。 如 果 做 可 见 光 及 近 红 外 光 比 色 , 打开 稳 压 电源 上 的 钨 灯 开 关 ; 如 果 做 紫 外 光 比 色 时 ,不 打 钨 灯 灯 源 开 关 , 需要 打开 稳 流 电源 的 氢 灯 开关 , 当 继 电器 吸 合 后 ， AUT BLA, 此 时 工作 电流 应 为 300 mA。 若 有 偏离 ,用 稳 流 电源 左下 方 的 电位 器 仔细 进行 调整 ,以 保证 必要 的 亮度 , 又 能 最 大 限度 的 维持 氨 灯 使 用 寿命 。 (4) RMR. 350 nm 以 下 用 石英 比 色 杯 ,350 nm 以 上 用 玻璃 比 色 杯 。 一 个 装 参 比 液 ,三 个 装 待 测 液 。 液 层 高 度 不 超过 杯 高 的 3/4。 用 控 镜 纸 将 比 色 杯 外 的 液体 擦 净 。 将 透 光 面 对 准 比 色 架 透 光 孔 , 垂直 插入 比 色 架 。 一 般 参 照 液 放 在 靠近 操作 者 的 第 一 孔 , 按 浓度 递增 的 顺序 插入 待 测 液 。 打 开 样 品 室 盖 , FE RAF 品 室内 的 滑板 上 , 梢 钉 对 准 梢 孔 , 放 稳 后 盖 上 样品 室 盖 。 用 试 样 选 择 拉 杆 把 参 比 溶 液 送 入 光路 。 (5) 转动 波长 选择 旋钮 , 使 波长 分 度 盘 刻 线 对 准 所 需 波 长 。 转 动 读 数 电 位 器 旋钮 ,使 读数 盘 上 刻 线 对 准 光 吸 收 A 的 0 位 ( 透 光 率 工 为 100%)。 (6) 根据 所 用 波长 ,选择 适当 的 光电 管 , 以 获得 最 大 的 灵敏 度 , 波长 为 200 一 625 nm 时 , 选用 蓝 敏 光电 管 , 将 光电 管 选择 拉杆 推 入 。 波 长 为 625 一 1000 nm 时 选 用 红 敏 光电 管 , 将 光电 管 选 择 拉 杆 全 部 拉 出 。 * 250 。 (7) 调节 狭 缝 调节 旋钮 。 稀 溶液 或 吸光 小 的 溶液 调 大 狭 颖 ,反之 调 小 , 一 般 设 在 0.02 左右 。 (8) 灵敏 度 旋钮 控制 一 个 多 圈 电 位 器 , 一 般 从 关闭 位 置 顺 时 针 旋 转 5 圈 左 右 作为 起 点 , 便于 进行 正 负 调整 。 (9) 将 选择 开关 由 关闭 位 置 右 旋 一 档 进 入 “校正 位。 旋转 暗 电流 旋钮 使 电表 (10) 将 选择 开关 由 校正 档 再 右 旋 一 档 至 “ 1 测量 档 。 此 时 电表 指针 如 果 偏 离 零 位 ,用 暗 电流 旋钮 使 其 回 零 。 拉 出 光疗 拉杆 使 透 过 参 比 溶液 的 单 色 光照 射 到 光电 管 上 。 此 时 电表 指针 迅速 偏离 零 位 , 停 于 右 侧 ,用 灵敏 度 旋钮 使 电表 指针 回 零 , 仪器 校正 完毕 ,开始 比 色 。 (11) 拉动 试 样 选择 拉杆 , 使 第 1 份 待 测 液 位 于 光路 , 由 于 光 吸 收发 生变 化 , 电 表 指 针 又 偏离 零 位 。 此 时 右 旋 读数 电位 器 旋钮 , 使 电表 指针 回 零 , 读 取 度 盘 上 的 吸 光度 或 透 光 率 值 。 拉 出 第 2 份 待 测 液 , 再 旋转 读数 旋钮 , 使 电表 回 零 , LRA 2 份 待 测 液 的 吸光 度 或 透 光 率 值 。 如 是 测定 第 3 份 样品 , 这 一 组 比 色 完成 。 (12) 将 光 阅 拉杆 迅速 推 入 切断 光路 , 令 读 数 盘 回 光 吸 收 零 位 。 打 开 样 品 室 盖 , 取出 比 色 架 , 保留 参 比 溶液 , 倒 掉 3 份 样品 液 , 重新 装 3 份 待 测 液 , 放 进 样品 室 ， 重复 第 (10)、(11) 步 。 (13) 测量 完毕 , 将 光疗 拉杆 推 入 。 选 择 开 关 左 旋回 零 , 光电 管 拉 杆 推 入 ,关闭 放大 器 和 灯 源 开关 。 打 开 样 品 室 盖 , 取出 比 色 架 , 清洗 比 色 杯 。 在 样品 室内 放 入 烘 于 的 变色 硅胶 , 拔 下 电源 插头 , ERK, 2. 注意 事项 (1) 751G 型 分 光 光 度 计 是 用 电 桥 测量 的 , 灵敏 度 很 高 , 而 仪器 的 结构 比较 复 杂 , 操作 旋钮 、 拉 杆 等 很 多 , 不 熟练 时 易 出 现 操 作 错 误 , 调整 时 应 缓慢 微调 。 (2) 比 色 一 般 在 稀 溶 液 条 件 下 进行 ,如 果 吸 光度 > 1, 透 光度 <10% 时 , 需 把 选 择 开 关 拨 到 “xx0.1” 档 , 读 得 的 吸光 度 结果 加 上 1.0, 透 光 率 则 除 以 10。 (3) 同 套 比 色 杯 吸光 度 肯定 有 差异 , 如果 4 个 比 色 杯 内 装 上 莹 馏 水 , 在 相同 波 长 下 吸光 度 有 较 大 差 值 , 应 选用 空白 吸收 值 最 小 的 杯子 装 参 比 溶 液 , 其 他 杯子 在 读 数 后 应 减 去 空白 读数 值 以 做 校正 。 (4) 比 色 杯 必 须 成 套 使 用 , 注意 保护 。 清 洗 时 用 0. 1mol/L HCl 和 乙醇 溶液 或 稍 加 稀释 的 洗涤 液 浸 泡 去 污 ,用 蒸馏 水 充分 清洗 干净 , RFS. (5) 仪器 每 年 或 每 搬 动 1 次 ,应 请 有 经 验 的 人 对 波长 做 一 次 校正 。 (WN) 自动 部 分 收集 器 自动 部 分 收集 器 是 柱 层 析 的 重要 配套 仪器 , 通过 时 间或 滴 数 的 预 置 , 可 以 定量 地 分 部 收集 洗 脱 液 , 把 柱 层 析 分 离 的 各 种 组 分 收集 到 不 同 试管 中 。 - 251° 自动 部 分 收集 器 有 圆 形 和 长 方形 两 种 类 型 , 收集 管 数 有 «100, 160.200 管 等 数 种 , 计量 有 计时 和 计 滴 两 种 方式 。 可 以 单独 使 用 , 也 可 以 和 恒 流 泵 、 计 滴 器 、 梯 度 仪 、. 组 分 信号 器 、 记 录 仪 、 核 酸 和 蛋白 检测 仪 等 联合 使 用 ,组 成 一 套 完整 的 常 压 液 相 系 统 ,以 圆 形 收集 器 为 例 简 介 用 法 。 1. 使 用 方法 (1) 首先 要 熟悉 仪器 外 观 结 构 ”正面 板 上 从 左 至 右 有 时 间 选 择 旋钮 \ 时 间 选 择 紧 固 螺钉 、 自 动手 动 选择 开关 、 手 动 按 钮 顺 反 开关 、 电 源 开 关 及 相应 指示 灯 s 背 面板 上 有 计 滴 器 记录 仪 、 安 全 痿 、 恒 流 泵 、 报 警 器 电源 线 、 保 险 管 等 插口 。 仪 器 正 上 方 有 承接 盘 \ 带 有 试管 的 擒 盘 承接 盘 的 凹 槽 内 置 报警 探测 线路 板 ` 立 柱 寺 有 安 全 姜 及 滴 头 或 计 滴 句 探 头 。 用 专用 接线 连 好 各 装置 , 因 各 接口 电压 不 尽 相同 ,不 可 接 错 。 (2) 调整 仪器 ”首先 确定 控制 方式 。 如 果 是 用 计 滴 器 控制 收集 体积 , 把 自动 手动 选择 开关 置 于 手动 位 。 者 用 定时 咽 控 制 换 管 , 则 把 自动 手动 选择 开关 置 自动 位 。 然 后 在 电源 关闭 情况 下 旋 松 时 间 选 择 紧 固 螺钉 ,旋转 时 间 选 择 旋钮 , 使 刻 线 对 准 盘 上 所 需 时 间 ( 分 钟 ), 再 拧紧 紧 固 螺钉 。 以 下 调整 按 定 时 情况 进行 叙述 。 为 了 确定 首 管 的 正确 位 置 ,暂时 将 自动 手动 选择 开关 拨 向 手动 位 , 顺 反 开关 拨 向 顺 时 针 位 ,手指 压 住 手动 位 按钮 不 放 , 此 时 收集 盘 开始 按 顺 时 针 方 向 连续 转动 。 等 听 到 “ 哪 、 嘟 "报警 声 及 闪光 后 ,释放 手动 按钮 。 接 着 把 顺 反 开关 拨 到 反 时 针 位 。 接 下 来 调整 滴 头 对 准 外 圈 第 1 管 , 仪器 调整 完成 。 首 管 的 定位 也 可 反 向 进行 ;此 时 首 管 将 是 内 圈 第 1 管 , 按 顺 时 针 方 向 进行 收集 。 (3) 收集 自动 手动 选择 开关 在 手动 位 时 , 时 间 选 择 开 关 处 于 关闭 位 置 , 不 起 作用 , 此 时 可 用 手动 按钮 控制 换 管 , 压 1 次 旋即 释放 , 收集 盘 向 前 走 1 步 。 如 想 进 行 自动 收集 , 只 需 将 自动 手动 开关 拨 向 自动 位 , 定时 器 即 开始 计时 ,到 了 设 定时 间 ja, REARS IEE GIA, 收集 盘 转动 换 工 支 收集 管 。 2. 注意 事项 (1) 设置 收集 时 间 必 须 在 关闭 电源 状况 下 进行 操作 , 首先 拧 松 紧 固 螺钉, 方 可 拧 动 时 间 选 择 旋钮 , 然后 再 拧紧 紧 固 螺钉 。 不 可 在 螺钉 紧 固 状态 下 任意 旋 动 时 间 选择 旋钮 ,也 不 能 在 自动 运行 状态 下 倒 拧 时 间 选 择 旋钮 。 时 间 选 择 禁 置 “0 位 ”, 因 为 它 表 示 连 续 转 动 。 (2) 收集 盘 首 管 ( 内 端 或 外 端 ) 的 正确 定位 是 自动 收集 的 关键 , 否则 会 造成 漏 滴 或 越 管 收集 。 (3) 安全 阀 的 动作 距离 应 仔细 调整 , 否则 不 是 不 止 流 就 是 吸 合 过 紧 管 内 无 液 流 。 “5 Oe EEE (七 ) ARE A ail {1X 核酸 蛋白 检测 仪 是 一 种 在 线 紫 外 流动 比 色 计 , 可 对 层 析 柱 流出 组 分 的 紫外 吸 收 进行 跟踪 检测 。 配 合 使 用 记录 仪 ,可 连续 绘 出 洗 脱 液 中 各 种 组 分 的 出 峰 图 谱 。 以 8802 型 核酸 蛋白 检测 仪 为 例 , 简介 用 法 。 1. 使 用 方法 (1) 接 好 主机 、 记 录 仪 电源 线 及 二 者 之 间 的 信和 号 线 。 (2) 主机 进 样 管 接 层 析 柱 出 口 , 出 样 管 接 部 分 收集 器 , 管道 内 不 得 有 气泡 。 (3) 选择 所 需 波长 , 量程 拨 到 100%T FA. (4) 打开 主机 :打开 主机 电源 开关 , 指示 灯亮 。 如 未 灯 不 亮 , 压 一 下 主机 背面 下 方 的 “ 示 灯 启动 "按钮 。 仪 器 预 热 16h 左 右 。 (5) 打开 记录 仪 电 源 开 关 , 指示 灯亮 。 按 下 10 mV 按键 。 (6) 调 100% T: JAY Ft ie $4 6 Ht he A, 使 记录 仪 笔头 达 10 mV 满 刻 度 即 100% T. (7) A 调 零 :把 量程 拔 到 所 需 A AGH 1A 档 ), 此 时 记录 笔 回 到 零 位 附近 ,用 A 调 零 旋钮 准确 调 零 。 仪 器 校 好 , 可 以 开始 启用 。 (8) 去 掉 笔 帽 , 压 下 抬 笔 杆 , 按 要 求 压 平 走 纸 和 纸 速 按钮 ,仪器 开始 记录 。 (9) 实验 结束 , RSH, SER LS, 关闭 电源 。 2. 注意 事项 (1) 0.2A 以 下 量程 , 仪 右 灵敏 度 高 , 易 漂 移 , 需 预 热 4 h 以 上 , 基线 才能 平 直 。 (2) 更 换 样品 池 架 时 , 必须 先 关 闭 电源 。 ( 八 ) BF WRF 电子 顶 载 天 平 是 粗 天 平 的 更 新 换代 产品 , 最 大 载荷 280 g, 感 量 0.001 g, 对 使 用 环境 要 求 不 太 高 , 在 现代 实验 室 中 广泛 应 用 。 采 用 压力 传感器 进行 单 盘 称 量 , 有 称 量 范围 选择 开关 , 最 大 称 量 量 设 280 g( 精 度 0.01 g) 和 28 g( 精 度 0.001 g) 两 档 ， 变换 自如 。 有 消除 键 (TARE), 可 方便 除 皮 、 连 续 称 量 。 数 字 显 示 反 应 灵敏 ,一 目 了 然 。 机 后 有 打印 机 接口 ,面板 上 有 打印 键 (PRINT), 对 多 数 样品 称 量 时 可 自动 编号 , 打印 称 量 结果 , 免 去 手工 记录 数据 , 准确 无 误 。 称 量 盘 上 有 防风 圈 , 能 防止 或 减弱 空气 流动 对 称 量 造成 的 影响 ,所 以 可 以 在 普通 实验 室内 使 用 。 面 板 上 有 水 准 仪 ,能 方便 调整 仪器 的 水 平 。 3.: 使 用 方法 (1) APART SE, 首先 检查 称 量 盘 和 防风 圈 内 有 无 撤 落 的 药品 , 必要 时 小 心 取 253 ， 下 称 量 盘 、 探 头 和 防风 圈 , 清扫 干净 后 重新 装 好 。 (2) 观察 仪器 是 香水 平 , 必要 时 进行 调整 。 (3) 根据 称 样 量 和 盛装 容器 的 重量 , 将 称 量 范 围 选 择 开 关 拨 至 适当 档 位 (280 g 或 28 g). (4) 插 上 电源 , 打开 天 平 左 后 方 的 电源 开关 。 显 示 屏 闪烁 几 次 之 后 出 现 “0.00? 或 “0.000”, 如 有 读数 , 按 清除 键 使 回 零 , 初次 称 量 最 好 预 热 10 min, (5) 将 称 量 瓶 ( 称 量 纸 或 小 烧杯 ) 轻 轻 放 在 称 量 盘 中 央 。 待 数值 显示 稳定 后 ， 按 消除 键 扣除 皮 重 使 数字 显示 为 0。 然 后 小 心 加 入 被 称 量 物 , 待 数字 显示 稳定 后 ， 即 可 读数 。 如 不 符合 要 求 , 可 酌情 增 减 。 记 录 称 量 结果 或 用 打印 机 自动 记录 。 (6) 称 量 完 毕 , 取 下 被 称 量 物 ,关闭 电源 开关 , 拨 下 插头 。 (7) 检查 并 做 必要 的 清洁 工作 , 最 后 盖 上 防 尘 田 ( 布 )。 (8) 每 个 使 用 者 均 应 在 天 平 使 用 记录 本 上 登记 , 记载 天 平 最 终 状 况 。 ( 九 ) 电子 分 析 天 平 德国 Sartorius HF aT KFA A, 性 能 优良 , 最 大 载荷 200 g, 感 量 0.1 mg, 自动 计量 , 数字 显示 , 操作 简便 。 清 除 键 可 方便 去 皮 , 适 于 累计 连续 称 量 。 1. 使 用 方法 (1) 使 用 天 平 前 , 首先 清洁 称 量 盘 , 检查 、 调 整 天 平 的 水 平 。 (2) 接 通电 源 , 显示 屏 左下 角 显 出 一 个 “ 〇 ", FAFA 15 min。 (3) 反 时 针 扭 动 右 侧 的 开关 旋钮 , 显示 屏 上 很 快 出 现 “0.0000”。 如 果 空 载 时 有 读数 , 按 一 下 清除 键 回 零 。 (4) 称 量 : 推 开 天 平 右 侧 门 , 将 干燥 的 称 量 瓶 或 小 烧杯 轻 轻 放 在 称 量 盘 中 心 ， 关上 和 天平 门 , 待 显示 平衡 后 按 消除 键 扣除 皮 重 并 显示 零点 。 然 后 推 开 天 平 门 往 容 器 中 缓 缓 加 入 待 称 量 物 并 观察 显示 屏 , 显示 平衡 后 即 可 记录 所 称 取 试 样 的 净重 。 (5) 称 量 完 毕 , 取 下 被 称 物 。 如 果 不 久 还 要 继续 使 用 天 平 , 可 暂时 不 关闭 , 天 平 将 自动 保持 零 位 ,或 者 关闭 开关 但 不 拨 下 电源 插头 , 天 平 将 处 于 待机 状态 , 此 时 显示 屏 上 数字 消失 ,左下 角 出 现 一 个 “ 〇 "。 再 次 称 样 时 打开 开关 就 可 使 用 。- (6) 如 果 称 量 后 较 长 时 间 内 不 再 使 用 天 和 平 ,应 拨 下 电源 插头 , amo FB 2. 注意 事项 (1) 被 称 量 物 的 温度 应 与 室温 相同 , 不 得 称 量 过 热 或 有 挥发 性 的 试剂 , 尽量 消 除 引 起 天 平 示 值 变动 的 因素 , 如 空气 流动 \ 温 度 波 动容 器 潮湿 、 振 动 及 操作 过 猛 等 。 (2) 开关 天 平 的 停 动 手 钮 , 开关 侧门 , 放 \ 取 被 称 物 等 操作 , 其 动作 都 要 轻 、 缓 ,不 可 用 力 过 狐 。 - 254 + (3) 调 零点 和 读数 时 必须 关闭 两 个 侧门 , 并 完全 开局 天 平 。 (4) 使 用 中 如 发 现 天 平 异 常 ,应 及 时 报告 指导 教师 或 实验 室 工作 人 员 , 不 得 自 行 拆 印 修理 。 (5) 称 量 完毕 , 应 随手 关闭 天 平 , 并 做 好 天 平 内 外 的 清洁 工作 。 (十 ) pHS -3C 型 数字 酸度 计 pHS - 3C 型 数字 酸度 计 是 较为 新 式 的 国产 酸度 计 , 可 用 于 pH 和 电动 势 (mV) 测定 。 由 于 采用 了 复合 电极 和 数字 显示 , 使 用 极为 方便 。 面 板 上 设 有 温度 补偿 旋 钮 .斜率 调节 旋钮 定位 调节 旋钮 等 ,使 仪器 标定 十 分 容易 。pH 和 mV 选择 旋钮 ， 使 得 pH 和 mV 测定 实现 瞬间 转换 。 1. 使 用 方法 (1) 按 下 电源 开关 , 仪器 预 热 30 min。 (2) 标定 :仪器 在 连续 使 用 时 , 每 天 要 标定 一 次 。 @ 在 测量 电极 持 座 处 插 上 复合 电极 。 @ 把 选择 旋钮 调 到 pH 档 。 @) 调节 温度 旋钮 , 使 旋钮 刻 线 对 准 溶 液 温度 值 。 ® 把 斜率 调节 旋钮 顺 时 针 方 向 旋 到 底 。 © 把 清洗 过 的 复合 电极 插入 pH 7 标准 缓冲 液 , 调节 定位 旋钮 使 读数 与 当时 温度 条 件 下 中 性 缓冲 液 的 pH 值 一 致 (参见 本 书 附录 八 之 26(4) )。 © 取出 电极 ,用 蒸馏 水 清洗 后 再 插入 pH 4 或 pH 9 的 标准 缓冲 液 中 , 调节 和 斜 率 旋钮 到 显示 当时 液 温 条 件 下 的 pH 值 ( 参 见 本 书 附 录 八 之 26(4))。 仪 器 标定 完 成 。 (3) 测量 pH 值 ” 当 被 测 溶液 与 标准 溶液 液 温 相同 时 , 把 清洗 过 的 电极 浸入 被 测 溶液 ,用 玻 棒 捞 勺 溶液 后 在 显示 屏 上 读 出 溶液 的 pH 值 。 当 被 测 溶液 与 标准 溶液 温度 不 同时 , 需 将 温度 调节 旋钮 调节 到 实际 温度 值 , 此 时 测 出 的 pH 值 为 被 测 溶液 的 pH 值 。 2. 注意 事项 (1) 电极 输入 插头 应 保持 清洁 干燥 。 (2) 缓冲 溶液 应 严格 配制 , 祥 见 本 书 附录 八 之 26(1) 一 (3)。 (3) 电极 球 泡 应 注意 保护 , 防磁 、 防 污 。 (十 一 ) pHS -2 型 酸度 计 1. 仪器 安装 按照 仪器 的 要 求 接 上 电源 。 - 255 ， 2. 电极 安装 先 将 玻璃 电极 和 甘 示 电 极 固定 在 电极 夹 上 , 并 调整 二 者 使 之 处 于 适当 的 高 度 ， 电极 插 在 电极 插 孔 内 并 固定 , 新 使 用 或 长 期 不 用 的 玻璃 电极 用 前 应 在 蒸馏 水 中 浸 泡 活 化 48 小 时 , 甘 示 电极 在 使 用 时 应 把 上 面 的 小 橡皮 塞 和 下 端 橡皮 套 拔 去 , 以 保 持 液 位 压 差 。 3. 校正 如 要 测量 pH 值 , 先 按 下 #7 键 , # 5 保持 不 按 下 状态 ,左上 角 指 标 灯 亮 , 一 般 短 时 间 测 量 , 只 需 预 热 数 分 钟 ,但 要 保持 仪表 零点 稳定 , 必须 预 热 0.$ 一 1 以 上 。 然后 用 标准 缓冲 液 校正 仪器 : C1) 测量 标准 缓冲 溶液 的 温度 。 (2) 调节 #11 温度 调节 器 使 旋钮 指示 该 温度 值 。 (3) 将 2# 分 档 开 关 放 在 “6”, 调 节 # 10 使 指示 在 pH“1”。 (4) 将 2# 分 档 开 关 放 在 校正 位 置 , 调节 # 3 校正 调节 器 使 指针 达 满 刻度 。 (5) 将 #2 放 在 “6” 位 置 ,重复 检查 pH“1” 位 置 。 (6) 重复 (3)、(4) 二 步骤 (调整 不 能 立即 进行 , 须 保持 半分 钟 左右 稳定 后 进 (7) 将 #2 放 在 “6" 位 置 。 4. 定位 (1) 在 试 杯 内 放 入 标准 缓冲 溶液 , 按 该 溶液 温度 表 [ 附 录 八 之 26(4)] 查 出 在 该 温度 的 pH 值 。 (2) 按 下 读数 开关 # 5。 (3) 调节 定位 #4 使 指示 在 该 pH 值 ( 即 #2 档 开 关 的 指示 数 加 表 针 指示 值 )。 并 摇动 试 杯 使 指示 稳定 为 止 。 重 复 调 节 # 4 调节 器 。 s. 测量 (1) 被 测 溶液 温度 应 与 标准 溶液 温度 相同 。 (2) 放 开 读数 开关 # 5. (3) 将 电极 头 部 用 蒸馏 水 清洗 , 并 用 滤纸 吸 干 ,将 电极 移入 被 测 溶液 中 , FP 动 试 杯 。 (4) 按 下 读数 开关 # 5, 调节 #2 分 档 开 关 使 读 出 指示 值 , 重复 数 次 直至 读数 稳定 为 止 。 此 值 ( 分 档 开 关 值 加 表 针 指示 值 ) 即 为 被 测 溶液 的 pH 值 。 “" :255 ” lL eee (十 二 ) Bitar tS A 移 液 器 是 生化 与 分 子 生 物 学 实验 室 常 用 的 小 件 精密 设备 , 移 液 器 能 否 正 确 便 用 , 直接 关系 到 实验 的 准确 性 与 重复 性 , 同时 关系 到 移 液 器 的 使 用 寿命 , 下 面 以 连 续 可 调 的 移 液 器 为 例 说 明 移 液 右 的 使 用 方法 : 移 液 器 由 连续 可 调 的 机 械 装置 和 可 替换 的 吸 头 组 成 ,不 同型 号 的 移 液 器 吸 头 有 所 不 同 , 实验 室 常 用 的 移 液 器 根据 最 大 吸 用 量 有 2pl, 101, 20u1, 200u1, 1ml, Sml, 10ml 等 规格 。 移 液 器 的 正确 使 用 包括 以 下 几 个 方面 : (1) 根据 实验 精度 选用 正确 量程 的 移 液 器 (使 用 者 可 根据 移 液 器 生产 厂家 提 供 的 吸 量 误差 表 确 定 )。 当 取 用 体积 与 量程 不 一 致 时 , 可 通过 釉 释 液体 , 增加 吸取 体积 来 减少 误差 。 (2) 移 液 器 的 吸 量 体 积 调节 移 液 器 调整 时 , 首先 调 至 取 用 体积 的 1/3 处 , 然后 慢 慢 调 至 所 需 刻 度 , 调整 过 程 动作 要 轻 缓 , 切 缴 超 过 最 大 或 最 小 量程 。 (3) 吸 量 将 吸 头 套 在 移 液 器 的 吸 杆 上 , 有 必要 可 用 手 辅助 套 紧 , 但 要 防止 由 此 带 来 的 污 染 , 然后 将 吸 量 按钮 按 至 第 一 档 (first stop), 将 吸 嘴 垂 直 插 入 待 取 液 体 中 , 深度 以 刚 浸 没 吸 头 尖 端 为 宜 , 然后 慢 慢 释放 吸 量 按钮 以 吸取 液体 ;释放 所 吸 液体 时 , 先 将 吸 头 垂直 接触 在 受 液 容器 壁 上 , 慢 慢 按压 吸 量 按钮 至 第 一 档 , 停留 1 一 2 秒 钟 后 , 按 至 第 二 档 (second stop) 以 排出 所 有 液体 。 (4) 吸 头 的 更 换 性 能 优良 的 移 液 器 具有 外 载 吸 头 的 机 械 装 置 , 轻 按 印 载 按钮 , 吸 头 会 自动 脱 落 。 注意 事项 : 1. 连续 可 调 移 液 器 的 取 用 体积 调节 要 轻 组 ,严禁 超过 最 大 或 最 小 量程 ; 2. 在 移 液 右 吸 头 中 含有 液体 时 禁止 将 移 液 器 水 平 放 置 , 平时 不 用 时 置 移 液 器 RE; 3. 吸取 液体 时 , 动作 应 轻 缓 , 防止 液体 随 气流 进入 移 液 器 的 上 部 ; 4. 在 吸取 不 同 的 液体 时 , 要 更 换 移 液 器 吸 头 ; 5. 移 液 右 要 进行 定期 校准 , 一 般 由 专业 人 员 来 进行 。 ian 1 有 二 were te Be OE ‘S43 CG SRR CS) * , | ‘Ss ¥ al o 711 - 7 we 18 DBs . _ te ah WR \ \ i = CTH oS i Se 2 SRS I th LTO a as SE OW >> . 4 / oy ‘a an F % ; 4 YY a: 站 J iT ‘2 ay 2 che ; te Pa ¥ ‘ "te 2a 5 de mS a |! ,, pees 0 : ae in Oo) oe eet aS ba si ape 所 关于 人 ® } SPR Ts Set at oh ES ‘| tH # W Fae, fAl-R e ® MIE Len ene ee St Se ee PB pa SO , FRR aS ay Ae iw, pb Ace vi iw (eo) Bee rit aa hates St EEA : 导热 RE ee RT Rd (qote brosse FRIAR - #® ti Ade BS HER rf he $ oy wif ‘osha ies i, Preteen Sa 生物 危险 品 辐射 性 的 (a) 展示 在 门 上 和 工作 地 点 的 警告 标志 » OR 2°. (On am 刺激 性 的 和 有 害 的 爆炸 性 的 腐蚀 性 的 高 度 可 燃 的 可 氧化 的 (b) 危险 化 学 药品 分 类 所 用 的 警告 标志 a? Gs. >> pues | Dow ae 二 “UNS 09429] Pola Bes pas : 中 科 院 植物 所 图 书馆 WA $0003540 58.173057 27857 294 一 省 单位 | 倘 者 姓名 | 伴 遇 日 期 上 还 韦 日 其 a3 < AIG) ; | SPER we (Q—1197,0102) 责任 编辑 : EME 李 锋 责任 印 制 : 刘 士 平 ISBN 7-03-010685-7 787030°1068