3 ya Y 复 旦 大 学 朱 俭 «LNG Jal ay RR RER 土 海 科 学 技术 出 版 社 ms Hr TA HE 物 A, FS Ty 复旦 大 学 a te We A ARR KER 编著 上 海 科 学 技术 出 版 社 927570 © 生物 化 学 实验 复旦 大 学 Win ia Kah Hep | RE LYRE RRAR HH EE HR (上 海 瑞金 二 路 450 号 ) GELALWRAR RG 上 海中 华 印刷 厂 印刷。 开本 787 x 1092 1/32 印张 10.875 字数 228,000 1981 年 7 月 第 1 版 1981 年 7 月 第 1 次 印刷 Epa: 1 一 13,500 统一 书号 : 13119.924 ”定价 ;，( 科 四 )0.97 元 nt oa eae 站 4 an YF Ye: 7? 3 Ae ga" 3 iva 7 . 站 ne 生物 化 学 实验 技术 在 生物 科学 特别 是 分 子 生 物 学 的 发 展 中 起 着 很 重要 的 作用 ， 它 与 工业 \ 农 业 、 医 药 等 各 个 方面 都 有 十 分 广泛 而 又 密切 的 联系 ， 因 此 该 项 实验 技术 已 成 为 生物 科 (4 学 研究 中 一 个 非常 重要 的 手段 ， 并 列 为 各 高 等 院 校 生物 系 及 4 ， 有关 专 业 的 实验 必修 课程。 鉴于 从 事 这 类 科学 研究 工作 的 科技 人 员 及 高 等 院 校 有 关 “专业 的 需要 , 我 们 在 历年 实验 教学 的 基础 上 , 并 根据 近年 来 生 物化 学 实验 技术 的 发 展 作 了 若干 修改 和 充实 ,汇编 成 这 本 《 生 物化 学 实验 ?>。 内 容 包括 生物 物质 一 一 糖 、 脂 肪 、 蛋 和 白质、 核酸 和 三 等 的 分 析 测定 方法 及 其 分 离 提取 技术 ;物质 代谢 部 分 实 ， 。 验 。 我 们 力求 在 原理 冰 述 上 做 到 简单 明了 ,方法 上 具体 详尽 ， 以 适应 初学 者 的 要 求 ， 并 对 同一 类 物质 的 测定 和 分 离 分 析 选 用 罗 种 不 同 的 实验 方法 , 供 读者 选择 参考 。 限于 我 们 的 经 验 和 水 平 ， 本 书 不 免 还 存在 不 少 缺 点 和 问 题 , 尽 请 读者 不 吝 指正 。 编 者 ae on ‘eieeiem(—)—s 5 =mat tom pat ee or 85 at pA ot Sa A SSE Che aT a 二 5 ae a ewer teres Se appar see 9 4a Remains ~ eSexis ee ee | i area 脂肪 酸 值 测定 ， 全 pane ee pe regret 1693 if = Poa 油料 作物 脂肪 抽 提 和 含 BATU 2 ssivscssecd sonst ies paepakavoae D5 5 ABB ee ween teen ete n ern ee eee teneseeneeeseee een ss DT ae FARRAR KTR BRP HE rere A MANS 27 Paul x innate. hectic ao hs cao rca Lah ale Ie £60633 : 氨基 酸 双 向 纸 层 析 …' ov rt 0 cine bie Wb binWS 0.0 n'dio. 60 va vAldeiee tats ewe 89 16. BAHT Be acre se SA SELIRD, 全 信人 本 于 o 2 蛋 和 白质 等 电 点 测定 .……………: 和 Se etteenans 51 18 总 氨 测 定 (一 ) 一 常量 克 氏 定 氮 法 玉 0 a 53 FAD, FW () —— BE eects ee ecceeceeeesennee +56 .面粉 中 赖 氨 酸 含量 测定 RD so” 35 4, 和 氨基酸 纤维 素 薄 层 层 析 :4 ge teeacnsasoees 4S" ees 2b), 0:00 9 了 is eee eeenseeees peneees 45. 21， 和 蛋白 质 浓度 测定 (一 ) 一 一 福 林 - 酚 试剂 法 6 22， 和 蛋白质 浓度 测定 (二 ) 一 一 染色 测定 法 :7 3. 血清 蛋 和 白质 醋 酸 纤维 薄膜 电泳 ……pp 69 OA. FS JLERRRER ES YEE AL ete ereeseeseees ip oa 73 Os es SE Ey GS TS SP ER kee eect enee ate ae 76 6. ri FESS SE ey BS PPPS TB PREBEIBE HEL Devens cceeesteeeesseneens 93 97, ENSUE GE cess sonerestsceesetnevins neneey 36 28. BEA RUBS EN —SRBB UGE coceceeceeccectceseceeecenenee +4 V 29. 葡 聚 糖 凝 胶 层 析 特 性 9 Ta 98 30， 蛋 白质 分 子 量 测定 (一 ) 一 一 >D:- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 沪 潜 。ennoaasessne sonoonnniooovanononninaer 人 nn 让 全 2 31， 蛋 白质 分 子 量 测定 (二 ) 一 一 葡 育 糖 凝 胶 过 滤 法 ……: 110 五 、 核 酸化 学 和 pe 5 39, 生物 材料 中 总 磷 量 测定 一 一 比 色 法 .pe rahe i. 33. BOR EW eM BE BD erect Seip 120. 34. IBLE CBOE PRE BW Bc BRE BEE seven eeen eens ae 35， 紫 外 吸收 法 测定 核酸 及 核 背 酸 含量 :pp LE 86. 动物 组 织 细胞 内 核酸 (DNA 与 RNA) 含 量 测定 rE aes | I. 肝脏 组 织 中 DNA 和 下 NA 的 分 离 creer certs tee reteees 133 ect I. 肝脏 组 织 中 DNA 和 下 NA 含量 测定 vee eee 3 37. 动物 肝脏 组 织 中 核糖 核酸 的 提 耻 0 140 38. 脱氧 核 糖 核酸 (DNA) 的 提取 和 2 143 一 ou: I. 动物 组 织 中 TDNA 的 提取 cocecceceterersenseeseeereseneens 142 i H， 细 菌 中 DNA 的 提取 pe ve 了 39， 从 人 酵母 中 制备 5- 核 苷 酸 ……… OPT 149 A TL. 酵母 核糖 核酸 的 提 制 coeeeeereeceeeeeeeereeteeennerntengens 149 a M. 5PM IPR ANGIE eee 156 4 一 2 一 q pe VV. BERING FREE Ta dons Keke Deane ebie 8 che 159 OY. 单 核 昔 酸 的 纸 电 泳 法 鉴定 ee 5 166 40. iA RAR RFE ZAM RIG BM Eee 169 41.，DEAE- 纤 维 素 薄 层 层 析 一 一 核 背 及 核 音 酸 的 分 离 ; AMP, ADP 及 ATP 的 分 离 pe 172 42. 核糖 核酸 碱 水 解 产 物 的 琼脂 糖 电泳 鉴定 ………… 和 ”175 43. ECORI 酶 解 入 噬菌体 DNA 片段 的 电泳 4 De Sandie ane 178 reo Marc coca s vnc unl Oe ipedcswerspngetenmbanedtrceratecsinads 182 4 WAGE Asp 2 Sear BY) a ASB BE A AY eee 182 45. 1398 中 性 蛋白 酶 活力 测定 本 186 AG. 脂肪 酶 活力 测定 Ne 190 AT. FERS BE EL FAO LEI IU Re cree eee tee eee e een ee eee ee een enes 193 48. FRE LE Fe HR all YE AS TR) IR ET Dz BR BEY - 影响，……… 本 199 和 .蔗糖 酶 的 米 氏 常数 Km 和 最 适 PH 测定 :pp 204 ee A 2. hd) el 211 | eae pease Foe 工 ed 110 11 fe. IT. PH 对 酶 活性 的 影响 及 酸 碱 稳定 性 测定 ………P 214 下 旭 度 对 酶 活性 的 影响 及 热 稳定 性 测定 pp 217 W. 米 氏 常数 测定 ppp 220 Y. 抑制 剂 类 型 的 判断 及 抑制 常数 Kp 测定 ，……… 226 V51. 用 正 交 试 验 设计 法 测定 几 种 因素 对 溶菌 酶 活性 的 影响 … 234 ie 酶 的 超过 滤 浓 缩 Aare Ge hy d wirgie Ph wia'b onic einige kas RS PRET ne Meee oo kme 244 和 省 二 碳酸 三 南 梅 的 制备 249 ”二 代谢 二 PP 256 5 发 醇 过 程 中 无 机 磷 的 利用 外人 256 市 间 产 物 的 鉴定 3 和 和 257 56， 脱 氢 酶 活性 测定 .pe ee 9 Ue ECON fone 260 57. 脂肪 酸 B- 氧 化 cercttee tt et etter tere repeeneneeeeneneeeeneeees sess G9 IN, Pp RR cceececcccceceeeccccenseccessesssssesssseesssessnsuccssesnas 270 1. 市 售 浓 酸 和 和 毛 水 的 比重 和 浓度 cet ett et eee ete eeeeeeeeeeueecees 270 2， 标 准 溶 液 的 制备 和 标定 cece eet cere eee et eeeeeeeeeneeeenneeeeees 270 3， 一 些 层 析 滤 纸 的 规格 与 性 能 273 4, 各 种 离子 交换 树脂 类 似 商品 对 照 表 cere eecee ee eecteueereenee 2714 5， 国产 离子 交换 树脂 的 物理 常数 和 9 276 6. 葡 聚 糖 凝 胶 Sephadex 的 物理 性 质 .………: Raper Speer oF 981 7， 常 用 参考 蛋白 质 的 分 子 量 pp sa eae 7 999 8 常用 核酸 类 物质 常数 表 ceeeceecceseeeenssestsstnecenerereeee 8 -9， 酸 碱 指示 剂 pp Perret 292 LO. SERB De cceece cere ee eeceeecee cone ecseneseneesaresenecens 293 11. p 互 计 测 溶液 pH 的 原理 和 步 双 -ppp 309 12. ASSES RED esusstoanis dou ensialtscds¥e sess date odtaea ttt anes 5 a sa) CO 000s tases hae aaees Mammen 323 Oe F302 a ERE EI eM 266 — te 化 = 1. 总 糖 和 还 原 糖 测定 (一 ) ”一 一 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 法 一 、 目 的 掌握 还 原 糖 和 总 糖 的 测定 原理 ， 学 习 用 比 色 法 测定 还 原 糖 的 方法 。 =, RE : 糖 的 测定 方法 有 物理 的 和 化 学 的 两 类 。 物 理 方 法 有 测定 ”其 折光 率 、 比 旋 度 的 变化 , 也 可 利用 比重 计 进 行 测定 。 比 较 精 确 和 常用 的 是 化 学 测定 法 。 还 原 糖 的 测定 是 糖 定量 测定 的 基本 方法 。 还 原 糖 就 是 指 含有 自由 醛 基 或 酮 基 的 糖 类 , 单 糖 都 是 还 原 性 糖 , 双 糖 和 多 糖 不 一 定 是 还 原 糖 , 其 中 乳糖 和 麦芽 糖 是 还 原 糖 。 利 用 单 糖 、 双 糖 与 多 糖 的 溶解 度 不 同 可 把 它们 分 开 ， 并 且 可 以 用 酸 水 解法 使 没有 还 原 性 的 双 糖 和 多 糖 , 彻底 水 解 成 具有 还 原 性 的 单 粳 ， 再 进行 测定 ， 这 样 就 可 以 很 别 求知 样品 中 总 糖 和 还 原 灶 的 量 。 本 实验 是 利用 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 与 还 原 糖 共 热 后 被 还 原 成 棕 红色 的 氨基 化 合 物 , 在 一 定 浓度 范围 内 , 还 原 糖 的 量 和 棕 红色 物质 颜色 的 深浅 程度 成 一 定 比例 关系 ， 可 以 用 分 光 光 度 计 进 行 测定 。 本 方法 的 优点 是 快速 ,杂质 干扰 较 小 。 三、 实验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 =F Hy; PH RA, 了 仪器 量 瓶 100 毫升 (x 3); 玻璃 漏斗 6 厘米 (x 2); RF1S sie, 10 EFC x3); Hi 10 SFC x1), 100 SFC Xx 1); 大 试管 3.0x20 厘米 (x8); RE 1.5 15 AKC x 12), 72 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 洽 箱 ; TBs 3. As 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 (DNS) JAH: 6.3 克 DNS #1 262.35 升 2V 氢 氧化 钠 ， 加 到 500 毫升 含有 182 HG 酸 钾 钠 的 热 水 溶液 中 ， FEIN 5 TEAR A OS TEL RR, BOTHER eH 后 加 水 定 容 至 1000 Ft, We TIF 1000 BEE ETE MERE, NEMA EIA 葡萄 糖 1 克 ， 加 少量 水 溶解 后 再 加 8 毫升 12N 浓 盐 酸 (防止 微生物 生长 ), 以 蒸 饮水 定 容 至 1000 SF 6N 盐酸 ; 6N 氧 氧 化 钠 。 四 、 操 作 步 又 1. 和 葡萄糖 标 准 曲线 制 取 王 支 大 试管 按 表 加 入 1000 微克 /毫升 标准 葡萄 糖 液 及 管 号 1000 微 区 葡萄 糖 /毫升 aie 葡萄 糖 最 终 浓度 (Fr) (毫升 ) 《微克 /毫升 ) 1 1 9 | 100 2 2 3 200 3 4 6 400 4 6 4 600 5 8 2 800 —— FRBK, 得 到 从 100 微克 /毫升 至 800 微克 /毫升 标准 管 。 ; 分 别 吸取 上 述 不 同 浓度 的 葡萄 糖 溶 液 0.5 毫升 ，3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 0.5 毫升 ， 混 合 均匀 ， 在 沸水 浴 上 加 热 5 分 6h, 取出 后 用 水 冷却 , 每 管 再 加 入 4 毫升 蒸馏 水 稀释 ， 最 后 在 72 型 分 光 光 度 计 上 以 540 毫 微米 比 色 测 出 光 密 度 值 (OD)。 另 做 一 空白 试验 , 即 用 蒸馏 水 代替 葡萄 糖 ， 其 他 试剂 相同 , 在 测 光 密 度 值 时 , 以 此 管 作 空白 , 调 光 密度 到 零 。 会 糖 量 mie ee DNS 试剂 bi H,0 = A 试剂 了 2 管 号 | (微克 ) elm | Ge) | | Gea [OP 《微克 /毫升 )| (EF) 热 二 RE oan <4 0.5 a 人 2 0.5 i 4 7. 3 0.5 He 4 4 0.5 却 4 j 5 以 葡萄 糖 含量 (微克 ) 为 横 坐 标 、 光 密度 值 为 纵 坐 标 作出 葡萄 糖 标准 曲线 。 2. 山 泣 粉 中 还 原 糖 和 总 糖 的 测定 C1) 样品 中 还 原 糖 提 取 : PRA LUE HY 1.00 克 放 在 大 试管 中 ; 先 以 少量 水 调 成 糊 状 , 再 加 50~60 毫升 水 摇 匀 后 ,50*C 保 it 20 分 钟 ， 使 还 原 糖 浸出 ， 在 容量 瓶 定 容 到 100 BF, At - 滤 , 取 滤液 测 还 原 糖 。 (2) 样品 中 总 糖 的 水 解 和 提取 : PRK Ly EH} 0.50 克 ， 放 a 在 大 试管 中 ， 加 入 6N 盐酸 10 毫升 ,水 15 毫升， 放 沸 水 浴 上 ay cd ta > @@ . 全 * id 加 热 水 解 半 小 时 ， 冷 却 后 加 入 ON ASU, PHB] 中 人 性, 并 用 容量 瓶 定 容 到 100 毫升 ,经 过 滤 , 取 滤 液 10 毫升 称 释 至 100 毫升 , 即 为 稀释 1000 倍 的 总 糖水 解 液 。 (3) 定 糖 ， 取 上 述 还 原粮 和 总 糖 的 提取 稀释 液 各 0.5 BE 升 , 加 入 DNS 试剂 , 与 葡萄 糖 标准 曲线 制作 同样 处 理 。 将 样品 所 测 得 的 OD 值 ， 在 标准 曲线 上 ， 查 出 相应 的 还 原 糖 量 ， 并 按 下 式 计 算出 山 茸 粉 内 含 还 原 糖 和 总 糖 的 百 分 量 。 _ 还 原 糖 毫 区 数 x 样品 稀 杰 倍 数 X100 BIRR 2 = PERE XO.5 wp og = ZAHEER. 9 100 a Pe RATE Xx 0.5 1 总 糖 和 还 原 糖 测定 (二 ) 一 一 斐 林 氏 法 二 二 学 习 掌握 生产 实践 中 常用 的 快速 定 糖 方法 。 ams 原理 . = ee © at a ~ rere «eee ee ee ee Fe Oe ee bo 4 | ao | rete ie ve te les aE Bas aly: : ai-05 dette Pe a is pee oe ; be il i “| iw ¥ 到 Mie ee - 2 H—C—oO 2 葡萄 糖 COOK = CH,OH(CHOH),COOH + = Cu,OJ 葡萄 糖 酸 氧化 亚 铜 ”此 氧化 亚 铜 与 试剂 中 亚 铁 氰 化 钾 反 应 生成 可 溶性 的 亚 铁 ws Hd CI) BP Eh. Cu,0 十 开 ,Ee(CN)6 二 H,O _—_> K2Cu,Fe(CN).¢ + 亚 铁 氰 化 钾 WLR RA CD) PR EE + 2 KOH + 2 H,0 eee : 3 ; 斐 林 试剂 中 二 价 铜 的 还 原 力 比 次 甲 基 蓝 强 ， 因 此 所 滴 信 的 标准 葡萄 糖 溶液 首先 使 二 价 铀 还原， 只 有 当 三 价 铜 被 还 原 完毕 后 ,才能 使 次 甲 基 蓝 ( 甲 烯 蓝 ) 还 原 为 无 色 , 测定 中 以 此 作 为 滴定 终点 。 次 甲 基 蓝 (他 CE eee Bae" 和 + 糖 酸 十 HC1 - 次 甲 基 蓝 (还 原型 无 色 ) 在 测定 时 先 做 一 对 照管 (不 加 祥 品 )， 用 标准 区 者 精 洒 定 求知 一 定 体积 斐 林 试剂 中 二 价 铜 和 次 甲 基 蓝 的 量 ， 即 测定 对 “ 照管 消耗 的 标准 葡萄 糖 量 (A)。 再 做 样品 管 ， 样 品 中 还 原 糖 消耗 斐 林 试剂 中 一 部 分 二 价 铜 ， 剩 余 的 量 再 用 标准 葡萄 糖 来 滴定 ， 即 样品 消耗 的 标准 葡萄 糖 量 (B)。 将 (A) 减 去 (B) 就 可 求 得 样品 中 还 原 糖 量 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 FH; 广 范 试 纸 P 也 1 一 12。 ae | A Mees 吸管 5 毫升 (x4), OMA CX 2); 容量 瓶 100 BAC Xx 3); 烧杯 150 ZFC x1), 100 ZAC x1); 三 角 烧 瓶 250 SFr x 6); 滴定 管 25 毫升 (x 1); 双 孔 橡皮 塞 ; 电炉 300W( x1); 天 3. 试剂 一 6 一 SERRE I AL. 15 克 硫 酸 铜 .0.05 克 次 甲 基 蓝 洲 于 1 ThA Hib. SEAR ZK: 50 克 酒 石 酸 钾 钠 、54 克 氧 氧化 钠 、 se at 铁 氰 化 钾 深 于 1 升 蒸馏 水 中 。 0.1 多 标准 葡萄 糖 溶液 ， 准 确 称 取 干 燥 恒 和 的 葡萄 粮 1.00 52, DAZ EL ASK YA a, 再 加 8 毫升 浓 盐 酸 〈 防 止 微 生物 生长 ) 蒸馏 水 定 容 至 1 升 。 6N 盐酸 ; 6N BAH, Do, RED R C1) 还 原 糖 提取 : 称 取 2.00 WA Hh, 在 小 烧杯 中 先 用 少量 水 调 成 糊 状 ,再 加 入 70 毫升 水 ，50C 保 温 15 分 钟 , 取出 后 在 100 毫升 容量 瓶 中 定 容 至 100 毫升 , 经 过 滤 , 取 滤 液 进行 还 原 糖 测定 。 (2) 总 糖水 解 : 称 取 1.00 克 山 幸 粉 在 小 烧杯 中 , MEN 盐 酸 10 毫升 , 蒸馏 水 15 毫升 , 在 沸水 浴 上 加 热 半 小 时 ， 取 出 后 用 ON 氢 氧 化 钠 中 和 至 中 性 ， 然后 定 容 至 100 毫升 , ANE, BR 10 毫升 稀释 至 100 毫 Ft, 即 为 稀释 1000 倍 的 总 糖水 解 液 。 (3) 糖 的 定量 测定 : KA 1 装置 热 滴 定 仪器 。 在 三 角 瓶 中 按 下 表 加 入 各 试剂 。 在 加 入 SEPIA FRA CW, AT 孔 橡皮 塞 了 eg 图 1 裴 林 氏 热 滴定 装置 一 II 一 iE Lh FRR ASF BORE 〈 整 个 滴定 时 间 在 三 分 名 内 究 成 )， 在 滴定 前 先 从 滴定 管 中 加 入 适量 的 葡萄 糖 液 , 然后 在 沸 腾 状 态 下 以 A~5 秒 一 滴 的 速度 ， 继 续 自 滴定 管 加 入 葡萄 糖 Mi, EWA ML. HR a 气 后 又 能 转 为 氧化 型 ， 而 恢复 蓝 色 ， 因 此 当 滴 定 到 蓝 色 刚 消 定 。 龙 林 民 试剂 ame | Bow | 0.1% €8 0.1 多 葡萄 瓶 号 二 一- 提取 液 | 水 解 液 | 糖 初 滴 人 量 Ree me | om | CFT) | CFD | erp) Cai >: | (47+) | GEFD | St i 1 5 5 = == 7 和 is at 7! ; 2 5 5 7 i 3 B 5 = a x 4 5 5 5 5 5 5 as 6 5 aw 5 ae ay A. its BEE LAD ATT LIE 250 HP JR AY 3 Hak (A=B) x 9 Hye /mLx FEAMAR TERA yop | cy ees ME EFT BX AEA i. _ (A—B) x a ikem~g/ml X FF tn es a a ee ESE AWS AD MSI, BOP ATE 8) 4d BE EFT BL 一 § 一 失 ， 出 现 黄 色 时 应 立即 停止 滴定 ， 如 果 再 现 蓝 色 切 勿 继续 滴 At ee toe te ae + iter poll RT ath. Ci , 7. ee ere es fy “Ace TAO ie bo ale ae ds wp a Nat Ge aa ei Baa os lt a ae oe a. 3. 总 糖 和 还 原 糖 测定 (三 ) 一 碱 性 钢 试 剂 法 一 、 目 的 2) FLARE A AE A A . =, RE 还 原 性 糖 与 碱 性 铜 试剂 一 起 加 热 后 ， 试 剂 内 二 价 铜 离子 3 ER 价 铜 离子 , 形成 氧化 亚 铜 的 红色 沉淀 , 这 样 的 一 从 岗 在 酸性 条 件 下 又 被 试剂 中 过 量 的 砚 氧 化 ， 然 后 用 硫 代 硫 RAPE ERMA OME, 就 可 计算 出 还 原 糖 的 含量 。 实验 过 程 中 所 包含 的 化 学 反应 如 下 : CL) 三 价 铜 离子 在 碱 性 条 件 下 被 还 原 性 糖 还 原 为 一 价 钢 ere | Cu*t sincere Cut 还 原 糖 《2) 试剂 中 过 量 的 碘 是 以 碘 酸 锂 与 碘化钾 的 形式 存在 ， = 在 应 用 时 ， 随时 加 入 硫酸 酸化 ， All a PE BC HE 来 : KIO,+5KI1+3H,SO,—>3I,+3K,S0,+3H,O (3) 一 价 的 铜 离子 在 酸性 条 件 下 被 碘 氧 化 ， 消 耗 了 一 部 BSB: 全- Cu,0+1,+ H,SO,—>CuSO,+ Cul, + H,O0 S (4) 剩余 的 碘 , 用 标准 硫 代 硫 酸 钠 来 滴定 : : 2 L, + 2Na,S,0,—>2Nal + Na,S,0,; FE. 由 于 被 还 原 的 铜 量 与 还 原 糖 之 间 的 关系 十 分 复杂 ， 它 和 泡 ” 糖 的 浓度 、 试 剂 的 浓度 反应 温度 和 时 间 等 因素 有 关 ， 因 此 在 。 ”测定 样品 时 ， 必 须 在 相同 条 件 下 做 一 条 已 知 糖 浓度 的 标准 曲 ae | mi in 线 , 从 标准 曲线 上 找 出 样品 的 含 糖 量 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 山芋 粉 ; FRAG PH1~12; 滤纸 。 2. 仪器 容量 瓶 100 毫升 (x 3); 量 简 50 毫升 (x1); 吸管 工 毫 升 (4Cx4)， 5 毫升 (x2), 10 毫升 (x1); 大 试管 3.0x20 厘米 Cx | 13); 滴定 管 2 毫升 (x 1); 漏斗 6 厘米 (x 2)。 3. 试剂 10% AA; 6N 盐酸 ; ON 硫酸 ; 标准 葡萄 糖 溶 液 1 x wi / EF; 1 DHE BMA. 0.005 硫 代 硫酸 钠 溶液 称 取 1.24 FE Na.S,0; -5H,0 — 溶解 在 蒸 饮 水 中 , EAB 1 Fre 8 碱 性 铜 试剂 : 25 克 无 水 碳酸 钠 和 25 克 酒 石 酸 钾 钠 溶解 在 500 ZHAI KP, IMA 10 双 硫酸 铀 溶液 75 毫升 (7 .5 克 Cus045HszO 溶解 在 75 毫升 水 中 )， 两 液 混合 时 应 慢 慢 加 入 并 迅速 的 拌 。 称 碳酸 氢 钠 20 克 ， 碘 化 钾 5 克 ， 加 到 上 述 洲 液 中 搅拌 使 溶解 。 取 150 毫升 0.1N 碘 酸 钾 溶 液 (150 毫升 中 CC 含有 碘 酸 钾 3.210 克 )， 加 到 上 述 溶液 中 , 最 后 用 薰 馅 永定 容 ue | . 四 、 操 作 步 又 1. 样品 中 还 原 糖 提取 PRR LU HY 1.00 克 ， 放 在 大 试管 中 ， 先 用 少量 水 调 成 糊 状 , 再 加 入 50 毫升 水 , 使 搅拌 均匀 , 放 在 50*C 水 浴 上 保温 半 小 时 , 取出 后 定 容 至 100 ZH, 再 经 过 滤 , 滤液 进行 还 原 糖 测定 。 2. 样品 中 总 糖 的 提取 和 水 解 rae PA AF 1. 0058, 放 在 大 试管 中 用 少量 水 调 成 糊 状 后 ， » Gas Og oa = RAMA. 15 毫升 水 和 6N 盐酸 10 毫升 ， 揽 拌 均匀 后 放 在 沸水 BR EK Ret, WAVER 10% 氢 氧 化 钠 中 和 至 DH 呈 中 性 ,然后 定 容 至 100 毫升 , 过滤 , 取 滤 液 10 毫升 定 容 至 100 毫 «Fk, BRAG RE 1000 倍 的 总 糖水 解 液 。 3. 还 原 糖 测定 取 11 支 大 试管 , 按 下 表 次 序 加 入 试剂 。 1 豪 克 / 0.005N 2 | 葡萄 | itr on Be | HoO 铜 试 re ae Na2S203 Pee | cue (毫升 | Fl | GN 滴定 数 (毫克 ) | Ma | 5. (GBI \Gen)| HER (毫升 hi 生出 aie © LOE Eee ee ae me 热 1 -一 一 5 5 x 1 a “st ees = 5 eae ee 1 : 8 3 | 0.2 | 0.2 4.8] 5 | 9 | 4 4 | 0.4 0.4 4.6| 5 1 6 | 0.6 0.6 4.4| 5 ‘a 1 at as- 4 0.8 4.2| 6 =! 1 30 7 BG Eh 1.0 4.0| 5 1 8 1 4.0| 5 td 1 Ag 1 4.0] 5 1 10 ) tae ae eee 1 ee 1 | 4.0] 5 1 (1) 准确 地 吸取 糖 液 和 铜 试剂 于 大 试管 中 ， 混 合 均匀 后 在 沸水 浴 中 加 热 十 五 分 钟 。 (2) 在 流动 水 中 冷却 , 不 可 摇动 。_ (3) 加 入 5N H,SO, 1 毫升 , 轻 轻 摇动 。 (4) 用 0.005N Na,S,0, 滴定 剩余 的 碘 量 ， 当 碘 的 颜色 人 接近 消失 ,， 达 滴定 终点 前 ， 加 入 1% 淀粉 溶液 三 滴 作 指示 剂 ， 继续 滴定 至 蓝 色 消 失 。 (5) 将 空白 管 ( 1.2 二 管 ) 所 用 的 硫 代 硫 酸 钠 的 平均 值 减 去 含 糖 溶 液 所 用 硫 代 硫 酸 钠 的 体积 ， 即 该 糖 溶液 实际 所 消耗 的 碘 量 , 以 此 值 作为 横 坐 标 ， 含 糖 量 作为 纵 坐 标 ， 作 出 标准 曲 线 。 然 后 样品 还 原粮 和 总 糖 的 滴定 值 在 标准 曲线 上 分 别 找 出 相应 的 含 糖 量 , 再 各 目 乘 上 它 的 稀释 倍数 , 即 可 求 出 山 储 粉 样 品 含 总 糖 和 还 原 糖 的 百分数 。 4. 糖 的 硅胶 G Wz Ja pr” 一 、 目 的 了 解 并 掌握 吸附 层 析 的 原理 ， 学 习 薄 层 层 析 的 一 LE 及 定性 鉴定 方法 。 、 原 理 | ARIA TT HORE RATT. SOLAS 持 剂 均匀 地 涂 布 于 玻璃 板 (或 涤纶 片 基 ) 上 成 一 个 薄 层 ， 把 要 分 析 的 样品 加 到 薄 层 上 ， 然 后 用 合适 的 溶剂 进行 展开 而 达到 分 离 、 鉴 定 和 定量 的 目的 。 因 为 层 析 是 在 吸附 剂 或 支持 剂 的 菠 层 上 进行 的 , 所 以 称 它 为 薄 层 层 析 。 为 了 使 所 要 分 析 的 样品 的 各 组 分 得 到 分 离 ， 必 须 选择 合 “ 适 的 吸附 剂 。 硅 胶 、 氧 化 铝 和 聚 酰胺 由 于 它们 的 吸附 性 能 良 ” 好 , 是 应 用 最 广泛 的 吸附 剂 , HE EE 最 常用 的 支持 剂 。 在 吸附 剂 或 支持 剂 中 添加 了 合适 的 烙 合 齐 后 再 涂 布 , 可 使 薄 层 粘 牢 在 玻璃 板 上 。 硅 胶 G 就 是 已 经 加 入 石 膏 的 层 析 用 吸附 剂 ， 它 可 以 把 一 些 物质 自 溶液 中 吸附 到 它 的 ” RL 利用 它 对 各 种 物质 的 吸附 能 力 的 不 同 , TS 剂 系统 展 层 就 可 以 达到 使 不 同 物质 分 离 的 目的 。 eee SH A PRON see PEE EE RE 司 + ek WE VAT as was 者 - ? we 学 二 本 人 wr a , ax i - ’ a me : rm i - F a Pree ee eae A a cs Boe ee at ge ah ES — ’ fet i ai elt 2 in 2 ahs : « a : a v 人 4 : N < - [有 和 ‘ne } : ps ig : at carey 2 Sue. ~ < ‘ *, es ye oe a he 、 ne ; RE 于 ve i eer sk : ; 5 WwW ¢ é rene te eae eer ee eT ay iis ae = a e ‘ ‘ Sen en CL Ue see 迅 之 PAULI. 糖 在 硅胶 G 薄 层 上 的 移动 速度 与 糖 的 分 子 ，““ 量 和 羟基 数 有 关 , 经 适当 溶剂 系统 展开 后 样品 移动 距离 如 下 : 成 糖 > 己 糖 > 双 糖 > 三 糖 。 若 采用 弱酸 盐 溶液 〈 如 醋酸 钠 溶 ““ 滚 ) 代 替 水 来 调制 硅胶 G 制 成 的 薄 层 能 提高 糖 的 分 离 效 果 。 为 了 控制 薄 层 的 厚度 以 及 得 到 恒定 的 Re 值 , 必须 控制 吸 附 剂 颗粒 的 大 小 。 吸附 剂 颗 粒 大 小 不 适 会 影响 层 析 的 速度 和 分 离 效果 , 一 般 无 机 吸附 剂 直径 在 0.07~0.1 毫米 , 薄 层 厚度 在 0.25~I 毫米 较为 合适 ， 有 机 吸附 剂 的 颗粒 可 略 大 ， 直 径 在 0.1~0.2 SEK, 薄 层 厚度 在 1~2 毫米 较 适 宜 。 薄 层 层 析 的 原理 与 纸 层 析 、 柱 层 析 相似 , 同时 又 兼备 这 二 种 层 析 的 优点 : 1. 观察 结果 ` 显 色 方 便 , 如 薄 层 由 无 机 物 制 成 , 可 用 腐蚀 性 显 色 剂 ; 2. 层 析 时 间 短 ; (3. 微量 ，0.1 至 数 十 微克 样品 均 可 分 离 ， 比 纸 旦 析 灵 敏 度 大 10~100 倍 。 若 薄 层 铺 得 厚 些 也 可 进行 几 百 毫克 样品 的 制备 。 由 于 这 ” 些 原因 加 之 操作 方便 , 设备 简单 , 薄 层 层 析 应 用 很 广泛 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 材料 I 儿 标准 糖 溶液 : ARE Aa BR SE RE PL HB 分 别 以 75% CRE Bo 1% YAK. I 狗 标 准 糖 混 合 溶液 : 上 述 各 种 糖 混合 后 以 75% 乙醇 配 成 各 种 糖 为 1 和 浓度 的 溶液 。 FE BEG OBST HH, E. Merck), 2. ME <1 ene 7 和 烧杯 50 毫升 (x 1); 玻璃 板 20x 20 K(x); Beri 25 x 30 HK; 毛细 管 0.5 毫米 直径 ; RE; 喷雾 器 。 烘箱 ; R; 铅笔 。 3. 试剂 0.02 1 醋酸 钠 (NaAc, 分 析 纯 )。 层 析 溶剂 系统 : 氯仿 :甲醇 =60:40(V/V)。 苯胺 -二 苯胺 -磷酸 显 色 剂 : 1 克 二 苯胺 , 工 毫 升 葵 胺 和 5 毫升 85 色 磷酸 溶 于 50 毫升 丙酮 中 。 四 、 操 作 步 骤 1. HERG MAM tl | Till YE Fes FA ARSE FM SF, PRA He i BE 求 光滑 。 称 取 8 克 硅 胶 G 加 入 16 BH 0.02M 醋酸 钠 ， 手 烧 杯 中 搅拌 均匀 后 倒 在 玻 板 上 , 倾斜 玻璃 板 , 使 硅胶 G 成 为 均匀 的 薄 层 。 板 于 110'C 烘 箱 内 烘 30 分 钟 ， 取 出 供 使 用 。 制 成 的 薄 层 要 求 表 面 平整 , SEY. 号 FEY AR— dic 1.5 厘米 处 每 隔 2 厘米 作 一 记号 〈 用 铅笔 轻 。。 轻 点 一 下 , 切 不 可 将 薄 层 刺 破 )， 共 七 点 。 用 0.5 毫米 直径 的 毛细 管 吸 取样 品 , 各 样品 按 图 2 点 样 一 次 , 样品 量 在 5~50 微 更 内 均 可 适用 。 控 制 所 子 直径 不 超过 2 毫米 。 3. 展开 将 薄板 点 样 一 端 放 入 层 析 缸 中 ， 玻 板 不 铺 薄 层 一 侧 加 层 析 溶 剂 以 避免 硅胶 G 从 玻璃 板 上 脱落 ， 层 析 溶 剂 液 面 不 得 超 过 点 样 线 。 展 层 至 溶剂 前 沿 距 顶端 0.5~!1 厘米 处 时 取出 薄 板 ( 约 二 小 时 ), ZEA AT IEA EIS. SAPP, 除 尽 溶剂 。 4. 显 色 苯胺 -二 苯胺 - 碍 酸 显 色 剂 均匀 喷雾 在 薄 层 上 ， ¥F 85°C Ht 箱 内 加 热 至 层 析 斑点 显现 ， 此 显 色 剂 可 使 各 种 糖 显现 出 不 同 的 颜色 。 根 据 各 标准 糖 层 析 后 所 得 斑点 的 位 置 确定 混合 样品 让 所 分 离 出 的 各 个 斑点 分 别 为 何 种 精 。 苯 胶 -二 共 胶 -三 酸 显 色 剂 显 色 后 糖 的 颜色 如 下 表 : 计算 各 斑点 的 R; 值 。 5. 精 的 聚 酰胺 薄膜 层 析 包 的 学 习 用 聚 酰胺 薄膜 层 析 法 定性 分 离 糖 。 —, Ae FR Wik Polyamide) 是 一 类 称 为 锦纶 的 高 分 子 物质 。 如 由 己 二 酸 与 己 二 胺 聚合 而 成 的 称 锦纶 66; eee er: at 3 二 oa pt eS ie 7 a aes nHOOC(CH;) ,COOH+nH.N(CH,),NH2—> Doskee HN— C a Es 0 Pp ree c —NH—(CH,),—NH— 人 人 O 由 己 内 醋 胺 聚合 而 成 的 称 饥 给 6: CH 一 CH 一 CH、 n NH -一 > -—-—HN—(CH,);,—CO—4, G4 Beil ot 5 ane . | 在 这 一 类 高 分 子 中 都 含有 大 量 酰胺 基 团 , 故 统称 聚 酰 胶 , 它 对 极 性 物质 有 吸附 作用 , 目前 已 成 为 分 离 水 溶性 物质 (或 亲 水 物 质 ) 的 主要 方法 之 一 。 由 于 锦纶 分 子 内 的 酰胺 键 能 与 酚 类 、 酸 类 、 醒 类 、 硝 基 化 合 物 等 形成 氢 键 ， 因 而 对 这 些 物 质 产 生 了 吸 附 作用 , 使 事 酰胺 具有 特异 的 层 析 分 辨 性 能 。 酚 类 (包括 黄酮 类 、 攻 质 等 ) 和 酸 类 是 以 羟基 (或 羧基 ) 与 锦纶 分 子 中 的 酰胺 键 2 a GY, Oo I a” 2 = | ee ; 1 | 1 } | “By 四 (2) RN LT Nj ° CH, CH, \ / A ia = ee | CH. CH, Ye “é \ f Bets: ae te a nh aod 0-0 - ----- at =e ° CH, CH, ; ee 4 f 固定 相 ( 聚 酰胺 ) 流动 相 ( 展 层 溶剂 ) 一 16 we bd 7 ae ay =o re 7 =e (i ae Pets ay Release) Mee es aa re ee ee, ee er a ey Sis 1 ali san 和 所 ”内 基 形成 氧 键 。 芳 香 硝 基 化 合 物 (包括 DNP- 氨 基 酸 ) 和 醒 类 。 “是 以 硝 基 (或 柄 基 ) 与 锦纶 分 子 中 的 酰胺 键 的 氨基 形成 氢 键 ”被 分 离 的 物质 由 于 其 与 锦纶 形成 气 键 的 能 力 不 同 ， 锦 纶 对 其 吸附 力也 不 同 ， 在 层 析 中 ， 展 层 溶剂 与 被 分 离 物 在 聚 酰胺 粒 “ 子 表面 竞相 形成 氢 键 。 在 实验 中 选择 适当 的 展 层 溶剂 ， 各 被 分 离 物质 在 溶剂 与 聚 酰胺 表面 之 间 的 分 配 系 数 有 差异 ， 经 吸 附 与 解吸 的 展 层 过 程 而 形成 一 个 分 离 顺序 , 达到 分 离 目 的 。 自 发 现 聚 酰胺 对 极 性 物质 有 吸附 作用 以 来 ， 即 用 于 柱 层 析 分 离 制备 和 薄板 层 析 等 , 现在 用 聚 酰胺 薄膜 又 是 进一步 发 展 。 将 薄 膜 固定 在 载 片上 , 质地 均匀 紧密 层 析 性 能 更 加 优越 。 本 实验 采用 聚 酰胺 薄膜 对 八 种 糖 进行 单 相 层 析 ， 具 有 微 量 、 快 速 、 分 辩 率 高 的 特点 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1 实验 材料 ARBRE, SUH EB, 2B PLB, 23 Hb Si, WG BE, ARB 5 毫克 分 别 用 80% 乙醇 0.5 毫升 溶解 聚 酰胺 沙 腊 “浙江 黄岩 化 学 分 析 材料 厂商 品 )。 2. BR Far iL 12x 20 厘米 ; 烘箱 ; BANA 1.0~1.5 毫米 内 径 ; 喷雾 器 。 3. 试剂 HORA. PME: RUIZ <1:8(V/V), 显 色 剂 : 苯胺 -二 茶 腕 - BRR CALs JL we 4), 四 、 操 作 步 又 L. 到 酰 胺 薄膜 制备 (或 采用 商品 聚 酰胺 薄膜 ) 涤纶 片 基 《上海 感 光 胶片 厂 生产 ) 切 成 17x 35 EDK, 浸 ee) ae eee eee ee ee ee A10% 氢 氧 化 销 与 工业 乙醇 (1:1) 混 合 液 过 夜 ， 以 清水 冲洗 一 好 一 干净 直至 膜 面 不 挂 水 为 止 。 洗 净 的 片 基 趁 湿 贴 在 玻璃 板 上 ， 两 边 贴 上 厚度 为 0.4 毫米 的 聚 氯 乙烯 条 〈 作 为 控制 膜 的 厚度 用 )， 待 片 基 表 面 干燥 后 ， 将 玻 瑞 板 放 在 通风 柜 的 水 于 本 板 上 《只 有 木板 达到 水 平 位 置 , 才能 使 膜 厚 薄 均 匀 )。 在 100 毫升 烧杯 内 ， 称 入 锦纶 5 克 ， 加 甲酸 (85%)25 B 升 , 用 表面 严 盖 好 ， 电 磁 搅 拌 溶解 ， 约 2~3 小 时 后 呈 透 明 清 液 。 将 清 液 倒 在 水 平板 上 的 片 基 上 , 迅速 用 拉 膜 器 推动 , 使 液 体 均 匀 铺 在 片 基 上 《甲酸 易 挥 发 具 腐 蚀 性 ， 需 在 通风 柜 内 操 “ 作 )。 膜 铺 好 后 ， 关 闭 通风 柜 ， 让 甲酸 缓慢 挥发 过 夜 ， 次 目 取 出 , 在 空气 中 吹 于 , 切 勿 用 高 温 烘 于 以 免 薄膜 变形 和 断裂 。 于 后 裁 成 所 需 大 小 。 2. WREST 取 10x10 厘米 聚 酰胺 薄膜 一 张 , 在 离 底 边 0.6 厘米 处 用 铅笔 轻 轻 地 每 隔 1 厘米 画 一 点 ( 共 九 点 )， 然 后 用 毛细 管 将 各 “ PHA A AED eH ASE, RAR RN RPE REST 糖 的 样品 ， 每 个 样品 点 三 次 ， 直 径 不 超过 2 毫米 。 待 点 样 干 后 , 将 膜 卷 成 圆 简 形 , 用 玻璃 胶 纸 粘连 , BOE OTL DT, 待 溶剂 前 沿 达 到 离 膜 顶端 0.3 厘米 处 取出 ， 膜 上 溶剂 挥发 后 进 行 显 色 。 3. Bf : 在 除 尽 层 析 深 剂 的 聚 酰 胺 薄膜 上 喷 显 色 剂 ， 放 85°C HE FA PS BESS) Bh, 即 可 看 到 标 黄 色 的 斑点 ,各 种 糖 的 斑点 颜色 也 略 有 差异 , 对 照 标准 糖 的 Rs 值 分 析 样 品 中 有 何 种 糖 。 {ae ol) eee : ate: ‘yee ee : Me : Ni . t+ “taal NS 人 ~ a eo cS 6. 脂肪 皂 化 值 测定 一 、 目 的 测定 脂肪 的 皂 化 值 。 二 、 原 理 和 拒 化 一 克 脂 肪 所 需 的 氢 氧 化 钾 的 毫克 数 称 为 该 脂肪 的 皂 化 值 .本 实验 用 过 量 的 氢 氧 化 钾 乙 醇 深 液 与 脂肪 起 皂 化 作用 ， ”然后 用 标准 的 酸 来 滴定 剩余 的 氢 氧 化 钾 。 和 皂 化 每 一 克 分 子 的 脂肪 , 需要 三 个 克 分 子 的 氢 氧 化 钾 。 如 果 组 成 某 脂肪 的 脂肪 酸 的 分 子 量 是 大 的 ， 那 么 皂 化 一 克 脂 肪 所 需要 的 氢 氧 化 钾 的 量 就 相应 地 小 了 , 反之 ,组 成 某 脂肪 的 脂 肪 酸 的 分 子 量 是 小 的 ， 那 么 皂 化 一 克 脂 肪 所 需 的 氧 氧化 钾 量 就 相应 地 大 了 ， 因 此 从 皂 化 值 就 可 估计 组 成 脂肪 的 脂肪 酸 的 分 子 量 大 小 , 下面 的 数字 可 以 帮助 我 们 了 解 这 一 点 。 脂肪 分 子 量 Lal: 三 丁 酸 甘油 脂 302.2 557.0 三 己 酸 甘油 脂 554.4 303.6 三 软 脂 酸 甘 油脂 806.8 208.6 三 硬 脂 酸 甘 油脂 890.9 188.9 三 油 酸 甘油 脂 884.8 190.2 cae FQ =e | 72 sane le tee ee” 5 ee 5 = 4 fat ol Pe AE 7 As peg apne 7 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 see 1. 实验 材料 菜油 。 2. Mak 三 角 烧 瓶 150 毫升 (x 3); 冷凝 管 Penk 15 毫升 (x 1); 酸 式 滴定 管 36 毫升 (x 1); KIB. 3、 试 剂 O.5N 标准 氢 氧 化 钾 乙 醇 溶液 ; 0.5XN 标准 盐酸 ; 0.1% 酚 Bk BAYA MK. 四 、 操 作 步 骤 (1) 称 样 ， 用 差 数 法 称 取 二 份 1 克 的 菜油 ,分 别 注入 150 毫升 的 三 角 烧 瓶 中 , 在 瓶 上 注 上 1 和 2, ee | (2) Bk: REFRES 角 烧 瓶 1 2 和 3 号 中 分 别 准 确 地 a 加 入 25 BH O.5N 氧 氧 化 钾 乙 醇 溶 液 。 没 有 脂肪 样品 的 3 号 烧瓶 作为 空白 对 照 。 将 上 述 三 个 三 角 瓶 接 上 冷凝 管 ， 在 者 沸 的 水 浴 上 回流 加 热 半 小 时 进行 充分 皂 化 反应 。 0.5N HCl 《毫升 六 二 站 菜油 量 0.5N KOH ( 克 ) (毫升 ) 星 化 值 \ ASHKSE DSRS (3) 滴定 : 皂 化 完毕 后 取 下 三 角 瓶 ， 分 别 加 入 酚 本 指示 剂 2~3 滴 , 然后 用 标准 盐酸 滴定 至 指示 剂 褪 色 为 止 。 样 品 所 消耗 的 盐酸 量 减 去 空 空白 所 耗 盐酸 量 即 可 计算 电化 一 克 脂 肪 所 、 耗 的 氧 氧化 钾 毫 升 数 。 oe eal ae (4) 结果 计算 ， 按 下 式 计算 皂 化 值 。 oF (asa) x 0.5 < 56 时 化 值 = eB EGE) 式 中 .了 为 鹤 白 对 照 消 耗 的 0.5N 盐酸 毫升 数 ，P 为 脂肪 样品 所 消耗 的 0.5N 盐酸 毫升 数 ，56 为 氧 氧化 钾 的 分 子 量 。 7 脂肪 碘 值 测定 ” 一 、 目 的 测定 脂肪 的 碘 值 。 二 、 原 理 100 过 脂肪 吸收 碘 的 克 数 称 为 碘 值 。 碘 值 是 脂肪 的 一 重要 常数 , 它 表示 脂肪 中 双 键 的 数目 。 i POA HARRAH, CRSA RM 用 。 氯 和 氟 与 油脂 作用 剧烈 , 除 加 成 于 双 键 外 , 也 能 取代 氢 原 子 , 而 碘 在 一 定 条 件 下 主要 是 与 双 键 起 加 成 作用 , 因此 常用 碘 “来 测定 脂肪 的 不 饱和 程度 。 每 种 脂肪 都 有 它 特有 的 碘 值 。 本 ”实验 采用 格 尤 布 里 - 瓦 列 尔 (ITo6xp-Baxrxrep) MAE, He 试剂 是 由 碘 的 乙醇 溶液 和 氧化 高 末 的 乙醇 溶液 相 混合 ， 产 生 (oat (AgCl, + 2I: 一 >HgI: 十 2IC])， 毛 化 碘 比 碘 更 易 与 脂 肪 起 加 成 作用 ; 碘 试 剂 中 加 入 盐酸 ， 可 使 溶液 更 加 稳定 。 实 验 中 只 要 加 入 足够 量 的 碘 试 剂 使 形成 过 量 的 氧化 碘 ， 与 不 饱 和 脂肪 起 加 成 作用 , 然后 测定 剩余 的 氯 化 碘 , 从 而 计算 出 消耗 的 砂 量 , OR C1) 加 成 作用 : RCH, —CH=CH—(CH,),—COOH + ICI—> RCH,—CH—CH—(CH,),—COOH | | re 2 Ol (2) RI AB By PER: IC ER 《3) 用 硫 代 硫 酸 钠 滴定 释放 出 来 的 碘 : I,+2Na,S,0,—>2NalI-+ Na,S,0, 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 菜油 。 2. 仪器 BUI 250 毫升 (x 3); FEAL 25 毫升 (x 1)， 20 2H (xi); 量 简 10 毫升 (x 1D); WER XD. 3. 试剂 BURFI. (1) PAL 25 克 碘 溶解 在 500 毫升 乙醇 中 江 2) 称 30 De SS ARYA E500 毫升 乙醇 中 。(1) 与 (2) 溶 液 混和 后 ， 再 加 入 25 毫升 比重 为 1.19 的 盐酸 。 IN 硫 代 硫 酸 钠 溶液 : 称 取 24.8 克 硫 代 硫酸 钠 (NazS:O:. 5H2O) 溶 解 在 1 升 者 沸 过 的 蒸馏 水 中 ， 再 加 入 0.1 克 碳酸 钠 使 溶液 稳定 。 氯仿 (化 学 纯 ); 10% KI, 1 多 淀粉 溶液 四 、 操 作 步 骤 1， 称 样品 用 差 数 法 称 取 0.1~.0.2 克 菜 油 样品 两 份 ,分 别 放 在 干燥 的 碘 瓶 中 , IMA AU 10 毫升 并 轻 轻 摇动 , 使 脂肪 溶解 ,在 第 三 只 碘 瓶 中 同样 加 入 10 毫升 氧 仿 , 但 不 加 样品 作为 空白 。 2 加 碘 试 剂 用 吸管 准确 吸取 碘 试剂 2 毫升 于 碘 瓶 中 , 切 勿 使 试剂 与 瓶 口 接触 ,立即 塞 紧 瓶 塞 , 轻 轻 摇动 ,如 发 现 瓶 中 颜色 变 浅 褐 、 2 BY, 表明 试剂 不 够 , 必须 再 添加 1O~15 毫升 试剂 ， 放置 I~ 2 小 时 后 旺 瞳 红色 。 如 果 在 碘 试剂 加 入 后 液体 变 混 浊 ， 这 是 2 因为 油 在 乙醇 中 溶解 不 好 而 引起 , 可 再 加 些 氧 仿 使 溶液 澄清 。 8. 使 过 剩 的 IC] 释放 出 I, 上 述 反应 结束 后 ,小心 打开 瓶 塞 , 加 入 20 BF 10% KI, 然后 用 5~10 毫升 蒸馏 水 冲洗 瓶 塞 及 瓶颈 。 4. 用 NasS;O, 滴定 释放 的 L, 在 用 Na,S,O, 滴定 时 要 用 力 摇动 , 使 CHCl 中 的 工 能 与 水 层 的 NasSzOs 作用 ， 待 成 黄色 时 再 加 入 5~10 滴 淀 粉 溶液 ” 帮 为 指示 剂 , 至 蓝 色 恰好 退去 时 为 滴定 终点 。 5. 计算 碘 值 ; 按 下 式 计算 脂肪 的 碘 值 。 设 空白 所 耗 Na.S,0, 毫升 数 为 A; 样品 所 耗 Na,S,O; 毫升 数 为 B。 厂 的 分 子 量 为 127。 gute — 《A 一 B)xNazSu0, 浓度 x127 "yh & x 1000 *I00 8. 脂肪 酸 值 测定 一 、 目 的 测定 脂肪 中 游离 脂肪 酸 的 含量 。 2 RE 脂肪 或 油 关 品 露 在 空气 中 日 久之 后 ， 部 分 甘油 酯 即 会 分 解 产生 游离 的 脂肪 酸 ， 使 油脂 变质 酸败 。 因 此 测定 脂肪 中 游 离 脂肪 酸 的 含量 是 检验 脂肪 质量 的 主要 指标 之 一 。 中 和 一 克 脂肪 毛 需 的 氢 氧 化 钾 的 毫克 数 称 为 “ 酸 值 ”。 脂 肪 酸败 的 程度 用 酸 值 -表示 , 脂肪 中 脂肪 酸 含量 越 高 ,中 和 时 氢 氧 化 钾 的 消 耗 量 就 越 高 , 酸 值 越 大 , 脂肪 的 质量 也 越 差 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 豆油 或 菜油 。 2. 仪器 三 角 烧 瓶 150 毫升 (x 3); 碱 式 滴 定 管 25 EFC 1). 3. 试剂 | 乙醚 和 乙醇 的 等 体积 混合 液 ， 以 酚 栈 作 指示 剂 , 用 0.1XV AR id PH 至 中 性 。 ， | 0.1% MK CRAM. O.1N 标准 氢 氧 化 钾 深 液 。 四 、 操 作 步 又 用 差 数 法 准确 称 取 油 样 3 克 二 份 , 分 别 放 在 三 角 瓶 中 , 另 取 一 个 三 角 瓶 不 加 油 样 作 为 空白 ,在 3 个 瓶 中 各 加 50 SIZ 醚 和 乙醇 混合 液 , 播 匀 ， 得 透明 溶液 。 如 溶液 旺 混 浊 ， 表 示 油 没有 全 部 溶解 , 可 再 酌 量 增加 溶剂 ,使 溶液 呈 透 明 为 止 。 加 入 0.1 狗 酚 本 指示 剂 1~2 滴 ， 用 0.1X 标准 氢 氧 化 钾 溶 液 进行 一 滴定 至 溶液 呈 粉 红色 为 止 ， 从 消耗 的 氢 氧 化 钾 量 按 下 式 计 算 可 求 得 酸 值 。 wee | 油 重 | 乙 栈 和 乙醇 混合 0.1 多 酚 本 |0.1N KOH i218] a 瓶 号 GEA) ( 滴 ) (毫升 ) “| BE SMM UTES Sy oy = EAE SE EFT x 0.1% 56 _ 71h He et Cod) 9. 油料 作物 脂肪 抽 提 和 含量 测定 一 、 目 的 学 习 脂肪 的 提取 和 测定 方法 。 a : 脂肪 为 三 元 醇 ( 甘 油 ) 和 脂肪 酸 结 合成 的 酯 类 。 脂 肪 的 种 ”类 很 多 , 它们 的 化 学 组 成 及 物理 性 质 各 不 相同 , 但 它们 都 可 深 解 在 脂 溶性 有 机 溶剂 中 。 利 用 这 一 特性 ， 在 索 氏 抽 提 器 中 用 石油 酸 对 油料 作物 进行 脂肪 提取 。 提 取 脂 肪 后 将 石油 醚 燕 发 去 除 , 称 取 瓶 中 残留 物 的 重量 或 称 量 样品 损失 的 重量 ， BP Ay SR 得 该 作物 中 脂肪 的 含量 。 此 法 仅 可 应 用 于 游离 脂肪 的 提取 ， 对 结合 脂肪 不 能 提取 此 外 本 法 除 能 提取 游离 脂肪 外 ， 对 游离 脂肪 酸 、 磷 脂 、 固 醇 及 ee EMS 所 以 抽 提 物 称 为 粗 脂 Mio 3 7 三 、 实 验 材料 ， 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 THAT; 脱脂 滤纸 15 x 12 厘米 一 张 ; 脱脂 棉花 。 2. 仪器 . 索 氏 脂肪 抽 提 器 (一 套 ); 分 析 天 平 ; 恒温 水 浴 锅 ; 烘箱 ; 二 燥 器 。 3. 试剂 石油 醚 (化 学 纯 , 沸 程 30~60°C). 四 、 操 作 步 骤 1. 样品 先 在 100C 烘 箱 中 干燥 3~4 小 时 ， 并 在 研 钵 中 研磨 破碎 , 精确 称 取 5 克 。 2. 取 15x12 厘米 脱脂 滤纸 一 张 , 绕 成 圆 简 形 , 底部 裙 起 提取 管 联接 管 冷凝 器 HH eT 而 封闭 ， 使 成 为 长 7 厘米 直径 3 厘米 的 圆 简 形 纸 包 。 将 称 好 的 样品 个 入 简 中 ， 上 部 覆盖 一 层 脱 脂 棉 花 以 防 社 品 “ 3. 洗 净 索 氏 提取 瓶 , 在 100~ 105 C 烘 箱 内 干燥 工 小 时 , 放 于 燥 器 冷 却 后 称 重 记 下 重量 ， 加 入 五 油 酸 达 撼 容积 的 三 分 之 二 。 将 样品 包 放 在 索 氏 提取 管 中 , 按 图 3 装置 仪器 , 提取 瓶 在 70 一 80 C 水 浴 中 加 热 抽 提 16 小 时 去 A. Aika HRS EASY an, Bea ROK, 滴 入 提取 管 中 。 到 一 定 高 度 后 ， 溶 有 脂肪 的 石油 醚 经 虹吸 管 流入 提取 瓶 , 如 此 循环 抽 提 脂肪 。 4. 提取 完毕 ， 取出 滤纸 包 ， 并 回 收 提取 瓶 中 石油 醚 。 洗 净 提 到 瓶 外 壁 ， 图 3 AACR SS 放 100~105C 人 烘箱 中 干燥 后 称 重 。 结果 计算 按 下 式 计算 油菜 籽 中 脂肪 的 百 分 含 量 。 设 A 为 空 的 提取 瓶 重量 ， 也 为 提取 的 妥 肪 和 提取 的， 总 重 : 祥 品 中 脂肪 含量 儿 一 卫 aa = x 100% 三 .有 机 酸化 学 10. 柠檬 酸 的 提取 一 离子 交换 树脂 法 一 、 目 的 通过 应 用 离子 交换 树脂 从 发 酵 液 中 提取 柠檬 酸 ， 学 习 离 TRAD Be MIE. | =, AE _ 离子 交换 树脂 是 带 有 离子 基 团 的 不 溶 物质 。 这 种 离子 基 团 能 和 周围 溶液 中 的 离子 进行 交换 ， 而 树脂 本 喘 物 理性 能 不 变 。 通 常 离子 交换 树脂 , 按 所 带 基 团 可 分 为 强酸 (一 05 卫 )、 55 We (—COO-H*), Rik (—NRICI-), 549i (—=NH, —NH,) 四 类 。 按 照 被 分 离 物 质 的 性 质 可 选择 适当 的 树脂 。 离 子 交 换 树脂 在 溶液 中 与 相应 的 离子 进行 交换 作用 ， 例 如 强酸 性 阳 离 了 于 树脂 ( 钠 型 ) 和 溶液 中 钙 离 子 进 行 交 换 作用 : 交换 R(SO;Na),+Catt == R(SO,),Ca+9Na* EBL 离子 交换 过 程 是 可 道 的 ， 它 服 从 质量 作用 定律 , 当 添 加 足 量 的 Nat 时 , 反应 向 洗 脱 方向 进行 ， 释 放出 Ca++， 树 脂 再 生 为 钠 型 ,因此 离子 交换 树脂 可 反复 使 用 , 一 般 二 ,三 年 内 性 能 不 致 有 显著 衰退 。 离子 交换 过 程 在 柱 中 进行 称 为 柱 式 法 。 柱 内 存放 一 定 离 村 型 的 树脂 ,要 分 离 的 溶液 流 经 交换 柱 ， eT SS 然后 ae Dp ae es 根据 不 同 目的 , 采用 取代 法 或 洗 脱 法 , 将 分 离 物 从 柱 上 交换 下 来 。 取 代 法 通常 用 于 物质 的 提取 和 浓缩 ， 例 如 本 实验 的 柠檬 酸 提 取 。 洗 脱 法 一 般 用 于 相似 混合 物 的 分 离 ， 根 据 这 些 被 分 离 物 与 离子 交换 树脂 的 亲和力 的 不 同 ， 采用 不 同 p 也 缓冲 液 或 不 同 离子 强度 洗 脱 液 将 其 分 别 洗 脱 下 来 , 例如 混合 氨基 酸 、 核 昔 酸 之 类 物质 的 分 离 。 由 于 离子 交换 树脂 具有 上 述 特性 ， 被 广泛 应 用 于 生物 化 学 物质 的 分 离 、 提 取 和 分 析 工 作 。 柠檬 酸 是 带 羟基 的 三 元 酸 ， 其 酸根 能 和 碱 性 701 树脂 上 的 阴离子 进行 交换 。 当 发 酵 液 流 经 701 树脂 时 ， 柠 榜 酸 被 浓 缩 在 树脂 上 (根据 静态 吸附 试验 , 弱 碱 性 树脂 701 对 柠檬 酸 交 ” 换 容量 最 高 可 达 每 克 树 脂 吸 附 344 毫克 柠檬 酸 ), 其 他 杂质 从 树脂 上 流出 弃 去 。 然 后 用 稀 氨 水 将 柠檬 酸 从 树脂 上 以 按 盐 形 式 取代 下 来 。 柠 榜 酸 匀 又 通过 另 一 根 强酸 性 的 732 树 脂 H+ 型 柱 , 转型 复原 为 柠檬 酸 , 而 从 柱 上 流出 。 经 收集 浓缩 后 获得 白色 柠檬 酸 结晶 。 产 品 的 纯度 可 用 纸 层 析 鉴 定 。 操作 流程 和 反应 式 如 下 : 1. 流程 701 树 脂 柱 + 5% NH4OH 洗 脱 AT ERR OCG 液 732 树 脂 柱 柠檬 酸 流出 液 Sse x 结晶 2. 反应 式 一 28 一 re ; Bi eae 000— CH, aes 有 1 OH + 1000—¢oH — RZ00C— 一 9og + 33,0 yee 0C 一 CHs g- OH | NH;- 000~GH, OH + NH 一 00C “GOH OH NH,-O00-0H, . TRE ‘ R 让 SOsH + NH «000 — COH 一 R 7-80,NH, + HOOC- GOH 2 000—OH -80,NH, HOOG—OH, - 4 TRI 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 柠檬 酸 发 酵 液 ;1 狗 柠 檬 酸 标 准 液 ; 701 弱 碱 性 阴离子 树 脂 ; 732 强酸 性 阳离子 树脂 ; 层 析 滤 纸 15 x 17 EK; 精密 试纸 pH0.5~5.0, 广 范 试纸 PH1~12。 2. 仪器 层 檀 柱 1x 20 厘米 (2 HR); 灯泡 瓶 100 BAC R); 量 简 10 毫升 (x 1); 烧杯 100 毫升 (x 2); Ati 28x 20 厘米 ; 喷 . Sar; RT; 毛细 管 ; WE. 3. 试剂 人 5% Bk; 2N 所 氧化 钠 ; 2N 盐酸 。 层 析 溶剂 : TES: FAR: 7k =100:32:100(V/V), 0.049 溴 酚 蓝 显 色 剂 : 25 毫克 甲 基 黄 、75 SR RY 于 200 毫升 %5 色 乙醇 中 ,用 0.1N 氢 氧 化 钠 调 至 中 性 。 四 、 操 作 步 又 1. 树脂 处 理 商品 树脂 含有 极 少量 单 体 、 反 应 物 等 , 必须 去 净 并 使 树脂 转 成 一 定型 式 。 将 商品 树脂 732 和 701 分 别 先 用 水 漂洗 , 除去 树脂 中 悬浮 的 固体 物质 ， 直 到 洗涤 液 澄清 为 止 ， 然 后 分 别 用 2N 氢 氧 化 钠 浸泡 2 小 时 ， 倒 去 氢 氧 化 钠 后 用 蒸馏 水 洗 到 中 性 , 再 分 别 用 2 盐酸 浸泡 2 小 时 ， 倒 去 盐酸 溶液 后 再 用 蒸 饮 水 洗 到 中 性 。 如 此 处 理 过 的 732 和 :701 树脂 再 次 用 2X Bt 化 钠 通过 ， 蒸 馅 水洗 至 中 性 ,这 时 701 树脂 已 处 理 完 毕 , 树脂 * OH 型 , 可 以 备用 。732 树脂 则 再 要 用 2 盐酸 通过 ,最 后 - 用 蒸馏 水 洗 到 中 性 , 树脂 转 为 五 型 , 即 可 备用 。 2. ett 在 层 析 柱 中 装 三 分 之 一 蒸 馅 水， 并 排除 柱 下 端 出 rab fii» x, ‘ > ©. LEAS 0 COND RE: FTN 气泡 , 然后 把 已 处 理 好 的 701 树脂 均匀 地 装 入 柱 中 , 使 树脂 床 高 8 厘米 。 另 取 一 层 析 柱 按 相同 方法 把 732 树脂 装 入 ， 树 脂 床 高 16 厘米 。 层 析 柱 装 好 后 分 别 调节 流速 使 达 1.5 SE FE/ 4d Bb, 并 注意 纪 使 水 流 于 、 树 脂 床 露 出 水 面 。 3. 吸附 与 洗 脱 上 样 前 先 把 柱 中 高 于 701 树脂 床 的 溶液 降 到 床 表面 ， 再 小 心地 用 滴 管 逐渐 加 入 15~20 毫升 发 酵 液 , 并 用 精密 PH AK 测 其 流出 液 , 当 PH 达 2.5~3.0 时 停止 上 样 ， 这 时 树脂 已 达 WA, SRG FA ARB AK VET BEE, 并 测 PH fH, 当 pH K4.5~5 时 停止 洗涤 。 取 59% 氨 水 10 毫升 ,用 滴 管 加 入 柱 内 ， 这 时 流 出 液 要 收集 在 容器 中 ， 当 PH 达 5~-6 时 为 洗 脱 高 峰 ， 继 续 收集 到 PH iA 11 时 停止 。 此 柠檬 酸 镁 收集 液 准 备 上 732 树 脂 柱 。 4. 转型 ”上 先 把 装 好 的 732 树脂 柱 中 的 溶液 降 到 床 表面 , 再 把 从 701 | 树脂 上 收集 的 柠檬 酸 铵 溶液 加 到 柱 上 ， 流 出 液 开始 时 pH 较 高 ， 约 为 5~6 左右 ， 此 液 弃 去 。 直 到 流出 液 pH iK3) 2.5~ 3.0 时 开始 收集 ， 这 时 P 瑞 还 会 不 断 下 降 ， 至 PH 再 恢复 至 2.5~3.0 时 停止 收集 。 流 出 液 即 为 柠檬 酸 。 5 .浓缩 结晶 收集 的 柠檬 酸 溶液 放 在 灯泡 瓶 中 ， 在 水 浴 上 加 热 并 水 泵 抽 气 , 减 压 浓缩 至 粘 稠 状 为 止 。 在 瓶 中 加 入 几 颗 柠檬 酸 唱 种 ， 放 入 冰箱 结晶 很 快 就 析出 。 6. 树脂 再 生 701 树脂 柱 先 以 蒸馏 水 洗 到 PH9, 用 15 毫升 2V BAL 钠 通过 此 柱 进行 再 生 , 然后 再 用 蒸 饮 水 洗 至 中 性 , 即 可 进行 第 二 次 交换 。732 树脂 的 再 生 是 先 用 蒸 馅 水 洗 至 中 性 ， 再 用 30 Seed ee tae as) | Nf 站 本 产 四 了 = > ar ree. 3 - 区 ZF ON 盐酸 进行 再 生 ， 然后 以 燕 馅 水 洗 到 中 性 即 可 重复 应 用 。 7. 纯度 鉴定 结晶 析出 后 , 进行 纸 层 析 鉴 定 其 纯度 。 取 巧 x17 厘米 层 ， 析 滤 纸 一 张 ， 在 离 纸 一 端 2 厘米 处 用 铅笔 划一 基线 。 取 少量 结晶 溶解 在 蒸馏 水 中 , 点 样 在 滤纸 的 基线 中 间 , 在 此 点 子 的 两 边 间 隔 2 厘米 处 ， 分 别 点 上 发 酵 液 和 标准 柠檬 酸 液 。 待 点 子 干燥 后 用 正 戊 醇和 甲酸 配制 的 溶剂 进行 展 层 , 约 生 小 时 左右 ， 取出 滤纸 并 吹 净 洲 剂 ， 喷 上 溴 酚 蓝 显 色 剂 。 在 有 柠檬 酸 等 有 机 酸 处 即 可 出 现 黄色 斑点 , 与 标准 柠檬 酸 斑点 比较 ， ils 酸 结晶 是 否 纯净 。 rs 内 区; 下 ahi th te a ee Meakk tk + 11. 人 发 中 提取 胱 氮 酸 一 、 目 的 学 习 用 酸 水 解 蛋白 质 的 方法 来 提取 氨基 酸 ; TRS HA 意义 及 其 应 用 价值 。 二 、 原 理 蛋白 质 是 由 多 种 氨基 酸 通 过 肽 键 连 接 而 成 的 多 肽 化 合 物 ， 若 用 酸 、 碱 或 酶 处 理 , 可 以 使 肽 键 水解 , 如 果 肽 键 彻底 水 解 则 可 得 到 组 成 这 有 蛋白质 的 各 种 氨基 酸 。 某 些 蛋 白质 含有 某 种 氨基 酸 特别 丰富 ， 就 可 采用 这 种 蛋白 质 为 材料 ， 进 行 水 解 , 再 厄 据 氨基 酸 理化 性 质 上 的 特点 ,用 简易 方法 分 离 , 获得 较 纯净 的 殷 基 酸 。 本 实验 采用 含 胱 氨 酸 丰富 的 头发 为 材料 , 进行 酸 水 解 。 然 后 利用 在 等 电 点 时 氨基 酸 溶解 度 最 小 的 原理 ， 调 节 水 解 液 达 胱 氨 酸 等 电 点 时 的 P 互 值 4.8, 使 胱 氨 酸 自 水 解 液 中 沉 淀 出 来 , ALVA RM, MAT RS AR He Hh 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 人 发 ; 滤纸; 精密 试纸 pH 3.8 一 5.4。 2. 仪器 [Bi ERIE IHL 500 毫升 (x 1); 冷凝 管 (x 1); 长 玻 管 (x 1); 漏 斗 9 厘 米 (x 1); 烧杯 400 毫升 (x 1), 100 毫升 (x 1); eyes 250 毫升 (x 1); 布 氏 漏斗 5 厘米 (x 1); 玻 棒 ; 滴 管 。 3. 试剂 浓 盐 酸 ; 浓 所 水 ; 1N 盐酸; 75% CRAM, ERR 四 、 操 作 步 骤 1. HEX . FA PAVE KBE RSA RG, 再 用 清水 洗 净 并 干燥 之 。 2. 水 解 按 图 4 装置 仪器 , 在 左面 烧杯 中 注入 水 ,注意 漏斗 要 恰好 接触 水 面 , 但 又 不 可 浸入 太 深 , 以 免 杯 中 的 水 吸 至 烧瓶 中 。 称 取 头 发 10 SEA 30 毫升 浓 盐 酸 于 烧瓶 中 , 然后 回流 加 热 2 小 时 。 取 少量 水 解 液 , 中 和 后 以 双 缩 腺 反应 *+ 检 验 蛋 白质 , 直到 此 反应 呈 阴 性 , 表 示 水 解 已 完全 。 3. ASH AA | 水 解 完全 后 , 打开 瓶 塞 , 加 入 等 体积 水 , 继续 加 热 , 使 蒸发 至 原 图 4 人 发 水 解 仪器 装置 因 体积 的 1/3。 将 此 水 解 液 用 布 氏 WA} RUS, APRA, WER Ste * BREN, FRM STRATED SMARTER. EVRA ASA EME, 故 有 此 反应 。 NH, NH, ™ GCC CuSO, w- NH, 180°C NH Nao INH, | — 7 O= ra * NH, = ~ 人 .- ay ara 155. Cr ©. Foe PS _ io Sat -= 1 sage a il : é . " Pe 4 . 7 aS +g 上 hs ; ; > Teen Fig Kf cw a 7 . ‘ 了 ir): : ae en 4 fey ey ; fo 加 工 克 活性 炭 ， 加 热 10 4) PBL TER, DERE A, 根据 脱色 情况 , 可 脱色 1~2 次 * 在 通风 柜 中 用 浓 氨 水 调节 PH W4A8AAGER PH 切 缴 调 过 头 )， 即 可 观察 到 白色 沉淀 产 生 , 放 冰 箱 过 夜 ,使 沉淀 完全 ， 次 日 用 布 氏 漏斗 过 滤 得 到 胱 氮 酸 粗 结晶 。 4. Hai in 将 粗 结 晶 溶 于 IN 盐酸 中 ( 约 15 BSAA), INHER 1 Gi, INP BE 10 分 钟 脱色 滤液 星 无 色 透 明 , 再 用 浓 氮 水 调 PH $4.8, 白色 结晶 很 快 析 出 , 待 结 晶 完 全 后 用 布 氏 漏斗 WE, 结晶 用 少量 蒸 人 饮水 洗涤 ， 再 用 75 狗 乙醇 洗涤 一 次 , TAA AF Fai 50'C 烘 箱 内 干燥 : 5. 纯度 鉴定 Inaendiese abe 715873 Lee en, 也 可 测 其 熔点 258~261°C; TORAH HW 11.66%,S W 26.65%, 12. Way A eH we 一 、 目的 学 习 用 三 硝 基 茶 磺 酸 法 测定 蛋白 质 中 赖 氨 酸 的 含量 。 re OH an | NH»,—Cu—H " Oc GROOT O = oC na vant o7? du OH 红色 化 合 物 蛋 自 水 解 程 度 鉴定 ， 取 水 解 液 4~ 避 滴 ， 加 少量 蒸馏 水 稀释 ， 加 10 多 氢 氧 化 钠 0.5 毫升 ,再 沿 管 壁 加 入 1 多 硫酸 铜 数 滴 ， 观 察 有 和 否 红色 反应 产生 , 如 出 现 阴 性 表示 水 解 完 全 。 MARE mALRZ— EAYHEAR PS, MARE ~ 量 的 高 低 与 谷物 的 质量 有 密切 关系 。 三 硝 基 葵 磺 酸 〈INBs) 是 定量 测定 所 基 酸 的 重要 试剂 之 一 TINBS 在 偏 碱 性 的 条 件 下 与 氨基 酸 反应 , 先 形 成 一 中 间 络 合 物 , 如 下 式 所 示 : R NO, xo, 7 | ， ~~ 一 oo 0-CCD > am SE no BN-C—Cop : SO; Ht NO, 中 间 络 合 物 在 光谱 上 有 二 个 吸收 值 相 近 的 高 峰 ， 分 别 位 于 355 毫 微米 和 420 毫 微米 附近 。 然 而 溶液 一 旦 酸化 后 , 中 间 络 合 物 都 转化 成 三 硝 基 苯 -氨基酸 (TNP- 氨 基 酸 )， 在 420 & 微米 处 的 吸收 峰值 显著 下 降 ， 在 355 毫 微米 附近 的 吸收 峰 则 BE 340 毫 微米 处 。 利 用 TNBS 与 氨基 酸 反应 这 一 特性 ， 可 在 420 毫 微米 处 ( 侦 碱 性 溶液 中 ) 或 在 340 毫 微米 ( 偏 酸 性 洲 液 中 ) 对 氨基 酸 进行 定量 测定 。 由 于 三 硝 基 葵 磺 酸 只 与 蛋白 质 中 N- 未 端的 a- 所 基 及 赖 氨 酸 残 基 的 8s- 氨 基 起 反应 ， 反 应 后 所 生成 的 TNP- 蛋 白质 经 部 分 酸 水 解 后 ， 分 别 产生 含有 a-TNP- 氨 基 及 s-TNP- 氢 基 的 小 肽 碎片 。 在 酸性 溶液 中 前 者 可 用 有 机 溶剂 抽 提 除去 ， 而 酸 溶液 中 留 下 的 s-TNP- 氨 基 含 量 即 可 在 340 毫 微米 处 定 量 测定 , 此 含量 即 相当 于 蛋白 质 中 赖 氨 酸 的 含量 。 赖 氨基 的 标准 溶液 应 该 用 s-TNP- 赖 氨 酸 。 在 s-TNP- 赖 氨 酸 来 源 困 难 时, 由 于 不 同 种 类 的 TNP- 氨 基 酸 在 340 毫 微 米 处 的 吸收 值 一 至 可 以 用 其 他 气 基 酸 代 蔡 。 本 实验 用 丙 氨 酸 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 面粉 ; AAR, 2. 仪器 吸管 上 毫升 (x6)，2 毫升 (x2)，5 毫升 (x 2) ,10 BF (x 2); 试管 1.5x15 厘米 (x 11); 分 液 漏 斗 25 毫升 (x 1); 烘 箱 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 离心 机 ; 751 型 分 光 光 度 计 。 3. 试剂 4 多 碳酸 氢 钠 溶液 : 4 克 碳 酸 氢 钠 加 蒸馏 水 至 100 毫升 。 50% Fil 5 儿 三 氯 乙酸 溶液 : 称 取 50 TAS 克 三 氯 乙酸 各 一 份 ,用 蒸馏 水 分 别 定 容 至 100 毫升 。 区 0.1% 三 硝 基 藉 磺 酸 溶液 : 0.1 克 三 硝 基 葵 磺 酸 加 蒸馏 水 > 至 100 毫升 , 贮 于 棕色 瓶 中 。 - 6N 盐酸 溶液 ，1XN 盐酸 溶液 ; 丙酮 (化 学 纯 ) 乙醚 (化 学 纯 )。 四 、 操 作 步 骤 1. 标准 曲线 制作 精确 称 取 丙 氨 酸 2.85 克 溶 解 在 100 毫升 水 中 ,使 成 0.5 mM 7k ¥ Ko 取 五 支 试管 , 按 表 配 制 各 管 和 进行 操作 , 最 后 在 340 Bik 米 测 定 光 密度 值 ( 以 蒸 饮水 作 空 白 )。 以 丙 氨 酸 微 克 分 子 数 ( 即 相当 于 赖 氨 酸 微克 分 子 数 ) 为 横 座 标 ，O D 值 为 纵 座 标 绘制 标准 曲线 。 2. 面粉 中 赖 氨 酸 含量 的 测定 面粉 用 过 量 20 倍 的 丙酮 脱脂 二 次 , 再 用 乙醚 处 理 并 干燥 TDY TNBS (Fr) 0.3 0.6 0.4 取 脱 脂 面粉 0.200 SEF IAG A, I 2 SH 4 多 碳 酸 氧 钠 ， 不 断 用 玻 棒 搅拌 抽 提 数 小 时 ， 离心 后 用 2 毫升 4 狗 碳 酸 氢 钠 抽 提 三 次 , 合并 抽 提 液 , 加 5 毫克 左右 固体 三 硝 基 葵 磺 酸 , 于 40'"C 保 温 2 小 时 。 反 应 后 用 50 多 三 所 乙酸 酸化 ， 使 TNP- 和 蛋 白质 沉淀 完全 。 离 心 去 上 清 液 ， 沉淀 用 5 多 三 氯 乙酸 洗涤 五 次 , 丙酮 洗涤 五 次 , 倾 去 洗涤 液 , 干燥 后 得 TNP- 和 蛋 自 质 。 在 INP- 和 蛋白 质 中 加 入 6NEEMR 2.5 毫升 ,封口 ,于 110C 水 解 2 小 时 。 开 启 水 解 管 , 取水 解 液 2 毫升 , 置 分 液 漏斗 中 加 蒸 饮水 10 SH, 用 8 毫升 乙醚 抽 提 4~5 次 。 取 水 相 在 60°C 水 浴 中 略 保温 ， 以 除去 乙醚 ,最 后 取 其 3 毫升 (重复 2~3 份 ) FEB 7K 1 毫升 , 在 340 SPOR MIE (WK EWE). 五 、 结 果 计 算 | 将 样品 测 得 的 光 密 度 值 从 标准 曲线 上 查 得 相当 入微 克 分 子 氨基 酸 ， 计 算 至 每 克 脱 脂 面 粉 中 碱 可 溶性 蛋白 质 中 的 赖 氮 酸 含量 为 赖 氨 酸 含量 (毫克 / 克 脱脂 面粉 ) = A122 B NS 式 中 145.2 为 赖 氨 酸 分 子 量 。 Fain, CE ee MEE OTE | OF 13. 氨基 酸 双向 纸 层 析 一 、 目 的 学 习 双向 纸 层 析 法 的 原理 和 操作 方法 ， si a at sia 二 、 原 理 纸 层 析 是 以 滤纸 作 支 持 物 , 用 一 定 的 溶剂 系统 展开 , 使 混 合 样 品 达到 分 离 分 析 的 层 析 方法 。 此 法 常用 来 进行 生物 化 学 物质 的 定性 定量 .分 离 制备 工作 。 纸 层 析 法 的 一 般 操 作 是 将 样品 溶解 在 适当 溶剂 (水 、 缓冲 液 或 有 机 溶剂 ) 中 ， 点 样 在 滤纸 的 一 端 , 再 选用 适当 的 溶剂 系 统 , 从 点 样 的 一 端 通过 毛细 现象 向 另 一 端 展开 。 展 开 完 毕 , 取 出 滤纸 凑 干 或 烘 干 , 再 以 适当 的 显 色 剂 或 在 紫外 条、 荧光 灯 下 “观察 纸 层 析 图 谱 。 样 品 经 展 层 后 某 一 物质 在 纸 层 析 谱 上 的 位 ” 置 常 用 比 移 值 人 :来 表示 : 本 os ers Ri = 2s Fe THE oD BS Jak ek 22 YA FA HT Ye FAI BE 纸 层 析 可 以 看 作 是 溶质 (样品 ) 在 固定 相 与 流动 相 之 间 的 连续 抽 提 , 由 于 溶质 在 两 相间 的 分 配 系数 不 同 而 达到 分 离 .一 定 的 物质 在 两 相 之 间 有 固定 的 分 配 系数 , 在 恒定 的 条 件 ( 如 层 析 溶 剂 .p 瑟 、 展 层 温度 等 ) 下 ,各 物质 在 纸 层 析 谱 上 有 固定 的 比 移 值 , 借 此 可 以 达到 分 析 鉴 定 目的 。 由 于 滤纸 纤维 常 能 吸收 20~ 25 M74), HAH 6~ 7 锡 的 水 是 以 氢 键 形式 与 纤维 素 上 的 羟基 结合 , 在 一 般 条 件 下 较 难 脱 去 , 所 以 一 般 的 纸 层 析 实 际 上 是 以 水 作 固 定 相 , 展开 的 溶剂 作为 流动 相 , 以 达到 分 配 层 析 的 目的 。 纸 层 析 操 作 按 溶 剂 展开 方 问 可 分 为 上 行 、 下 行 、 径 向 三 种 。 氮 基 酸 分 离 一 般 采 用 上 行 法 。 上 行 法 中 又 可 分 为 单 向 和 双 四 ， 对 一 般 成 分 较为 简单 的 样品 单身 展开 即 能 达到 分 离 目 的 。 成 分 较为 复杂 的 样品 由 于 在 单 向 层 析 中 某 些 物质 的 斑点 HMEBBA BAH, 必须 采用 双 相 层 析 , 即 先 以 一 种 溶剂 系统 展开 后 ， 再 以 另 一 种 性 质 相 异 的 溶剂 系统 在 其 垂直 方向 作 第 二 次 展开 ， 如 此 获得 的 双向 层 析 谱 可 以 分 离 鉴别 十 几 种 或 更 多 种 的 氨基 酸 或 其 他 样品 。 一 般 层 析 用 滤纸 要 求 : (1) 质地 均匀 , 平整 无 折 痕 ,厚薄 适当 , 使 溶剂 以 适宜 的 速度 均匀 展开 。 (2) 机 械 强度 好 ， 使 深 剂 展开 后 滤纸 保持 原状 ， 不 致 折 倒 。 (3) 滤纸 有 一 定 纯度 , 杂质 要 少 , 以 免 影 响 层 析 图 谱 出 现 杂质 斑点 或 背景 不 清楚 等 现象 。 (4) 滤纸 纤维 松紧 适宜 , 太 松 易 使 分 离 物质 扩散 , 太 紧 则 延长 展 层 时间 , 一 般 选 择 中 速 滤纸 , 或 根据 溶剂 来 选择 。 如 丁 “ 醇 类 溶剂 粘度 大 展开 速度 慢 用 快速 滤纸 较 好 , 而 石油 醚 、 氧 仿 展开 速度 快 , 则 采用 慢 速 滤纸 。 在 定性 鉴定 时 常 采用 较 薄 的 滤纸 , 制备 时 选用 厚 质 滤纸 。 要 选择 适当 的 溶剂 ， 使 获得 满意 的 层 析 图 谱 。 一 个 理想 的 溶剂 应 满足 如 下 条 件 : (1) 被 分 离 物质 在 该 溶剂 系统 中 比 移 值 Ri 在 0.05~0.8 之 间 , 二 个 被 分 离 物质 的 Rs 值 相差 最 好 大 于 0.05， 以 免 班 点 HB. 3 (2) 溶剂 系统 中 的 每 一 组 成 分 与 分 离 物质 之 间 不 起 化 学 反应 。 — 40 — | | E> 4 a 4 “ NS eh Art 5 ilps sal BN ha iS abe | a (3) 分 离 物 质 在 溶剂 系统 中 的 分 配 比 较 恒定 ， 不 随 温 度 变化 而 改变 ， 而 且 容 易 迅速 达到 平衡 ， 这 样 获得 的 斑点 较 加 i: 本 实验 采用 八 种 混合 氨基 酸 溶液 为 实验 材料 ， 用 酸性 和 碱 性 两 种 溶剂 进行 双向 层 析 ， 并 用 划 三 酮 淤 液 作为 氨基 酸 层 析 图 谱 的 显 色 剂 , 可 以 获得 分 离 清 晰 的 层 析 图 谱 。 正 丁 醇 : 甲 酸 : 水 =15:3:2. 2 小 时 I 相 工 小 时 II 相 正 丁 醇 ; 吡 啶 ;95% 乙 醇 ; 水 王 5:13:1:| 图 5 毛 基 酸 双 向 纸 层 析 图 谱 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 标准 氨基 酸 混合 溶液 : RAR BAR, AAAM, Hisz 酸 、 丙 氨 酸 、 天 门 冬 氨 酸 、 组 氨 酸 、 丝 氮 酸 各 1 毫克 溶解 于 0.5 毫升 0.01 N 盐酸 中 。 新 华 层 析 滤 纸 15x 11 厘米 ; 铅笔 ; Ro 2. Wat a | : ; FART HL 25 x 40 厘米 (x 2); 培养 下 15 厘米 直径 (x 2); 喷 雾 器 ; 毛细 管 0.1 厘米 内 径 ; 电 吹 风 ; 烘箱 。 3. -试剂 0.1% (W/V) = MAM RK, | 溶剂 系统 : A—H, TET RE: 88% AR: 7k =15:3:2 (V/ V); 第 二 相 , TET WE MBE +95 % ZRF: ak = 52 1:1: 1(V/V)o 四 、 操 作 步 又 1. 点 样 取 层 析 滤 纸 一 张 (15x 11 厘米 )， 在 距 纸 边 1.2 厘米 处 划 一 基线 ， 再 将 纸 转 90 度 ， 距 纸 边 1.2 厘米 处 作 一 垂直 线 ， 用 0.1 厘米 粗 的 毛细 管 吸取 混合 氨基 酸 溶液 ， 点 在 三 线 交 点 上 ( 见 图 5)， 点 子 的 直径 控制 在 2 毫米 左右 ， 待 样品 干燥 后 ， 再 重复 点 一 次 。 滤 纸 上 点 样 班 点 干燥 后 ;把 滤纸 卷 成 圆 简 形 , 纸 的 二 边 用 铬 丝 连接 但 不 要 重 和 迭 。 2， 展 开 在 25x 40 厘米 的 层 析 亿 中 放 六 一 装 有 第 一 相 层 析 洲 剂 的 培养 四 , 要 求 放 平 稳 。 将 点 好 样 并 卷 成 圆 简 形 的 滤纸 放 六 征 PY, 使 点 样 一 端 接触 溶剂 ， 但 点 样 处 不 能 浸入 溶剂 中 , 证 溶剂 自 下 而 上 均匀 展开 ， 约 2 小 时 后 溶剂 前 沿 达到 距 纸 边 0.5 厘 米 时 取出 滤纸 , 悬挂 在 室温 中 ,用 电 吹 风 充 分 吹 尽 溶剂 ， 并 将 未 走 过 溶 剂 的 滤纸 边 裁 去 。 再 把 滤纸 转 90 度 方向 , 卷 成 圆 简 Ry 放 入 盛 第 二 相 溶剂 的 层 析 红 内 进行 展开 , 约 工 小 时 后 溶剂 展开 到 距 纸 边 0.5 厘米 时 取出 , HAM LCR AAA), 滤纸 干燥 。 3. BA 用 喷雾 器 将 草 三 酮 溶液 均匀 喷雾 在 纸 上 ， 滤 纸 悬 挂 在 65"C 的 烘箱 内 ， 加 热 20 分 钟 左右 即 可 看 到 紫红 色 的 氨基 酸 斑点 ， 层 析 图 谱 上 的 斑点 用 铅笔 圈 出 。 五 、 注 意 点 (1) 在 喷雾 曹 三 酮 溶液 后 , 烘箱 加 热 温 度 不 宜 过 高 , 并 要 求 避 免 氨 的 干扰 , 否则 会 使 纸 层 析 图 谱 的 背景 泛 红 。 (2) 溶剂 中 所 用 的 正本 醇 需要 重新 处 理 ， 可 用 氯 化 钙 干 Wa AE 1~2 次 ,收集 沸点 LIT~118°CHM A; 甲酸 、 乙 醇 、 吡 啶 等 都 要 用 分 析 纯 试剂 。 (3) 第 一 相 溶剂 最 好 在 使 用 前 才 按 比例 混合 ， 否 则 过 时 混合 在 一 起 会 引起 酯 化 , 影响 层 析 结 果 。 14, 氨基 酸 纤维 素 薄 层 层 析 一 、 目 的 学 习 纤 维 素 薄 层 层 析 的 操作 方法 , 掌握 分 配 层 析 的 原理 。 二 、 原 理 以 纤维 素 作 为 支持 物 ， 把 它 均匀 地 涂 布 在 玻 板 上 成 一 基 层 ， 然 后 在 此 薄 层 上 进行 层 析 即 为 纤维 素 薄 层 层 析 。 纤 维 素 是 一 种 隋 性 支持 物 ， 它 与 水 有 较 强 的 亲和力 而 与 有 机 溶剂 亲 和 力 较 弱 。 层 析 时 吸着 在 纤维 素 上 的 水 是 固定 相 ， 而 展 层 深 剂 是 流动 相 。 当 和 欲 被 分 离 的 各 种 物质 在 固定 相 和 流动 相 中 的 分 配 系 数 不 同 时 , 它们 就 能 被 分 离开 。 =. RRM, 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 标准 氨基 酸 溶液 ， 丙 氨 酸 、 酷 氨 酸 、 且 氨 酸 、 组 氨 酸 以 及 四 种 氨基 酸 的 混合 样品 分 别 以 0.0LN 盐酸 配 成 4 毫克 /毫升 的 溶液 。 纤维 素 粉 〈 层 析 用 ，Serva) 或 微 晶 型 纤维 素 CRT, 上 海 试 剂 四 厂 或 下 .M, 必 )。 羧 甲 基 纤 维 素 钠 〈 上 海 长 虹 塑料 is | 一 -一 Dae 2. 仪器 烧杯 50 毫升 (x 1): 玻璃 板 10x 20 BDKCx 1; BR 22x 22 厘米 ; 毛细 管 0.5 毫米 直径 ; 喷雾 器 ; 研 钵 ; 玻 棒 。 3. 试剂 层 析 深 剂 系统 : 正 丁 醇 ( 分 析 纯 ): 栈 酸 \ 分 析 纯 六 水 三村: 1:5(V/V). 显 色 剂 : 0.1% Bj = AAA Ma, 四 、 操 作 步 又 1. Hil AR 取 少 量 羧 甲 基 纤 维 素 钠 ( 约 12 毫克 ), 加 数 毫升 水 在 烧杯 中 搅和 玛 ， 使 羧 甲 基 纤 维 素 钠 溶解 。 称 取 纤 维 素 粉 或 微 鸣 型 纤 图 .6 “氨基 酸 纤 维 素 薄 层 层 析 示 意图 谱 — 44 — 维 素 2 克 放 入 此 烧杯 内 并 把 水 补 足 到 12 毫升 ， 充 分 搅 匀 (者 是 微 草 型 纤维 素 则 要 放 在 研 钵 中 研磨 均匀 ), 把 纤维 素 浆 倒 在 洗 净 烘 于 的 玻璃 板 上 ， 倾 斜 玻 板 同时 轻 轻 拍 动 此 板 ， 使 纤维 素 均匀 分 布 在 RPL, WE ERA 0.5 SAK, 1K 平 放置 片刻 后 放 入 100~110 C 烘 箱 中 ， 烘 三 十 分 钟 。 干 燥 的 纤维 素 薄 板 贮存 于 干燥 器 内 备用 。 此 处 羧 甲 基 纤 维 素 钠 是 起 粘 合剂 作用 ， 它 使 纤维 素 粉 能 较 牢 固 地 粘 附 于 玻璃 板 上 。 加 入 量 过 多 破坏 纤维 素 薄 层 的 毛细 作用 而 使 层 析 速 度 延 缓 ;加 的 量 过 少 则 粘 合 不 牢固 , 因此 须 加 注意 s 2. 点 样 在 纤维 素 薄 板 上 距 一 端 15 毫米 处 ， 用 铅笔 每 隔 15 毫米 作 一 记号 , 共 五 点 。 用 0.5 训 米 直径 的 毛细 管 吸取 样品 , KA 分 别 点 样 一 次 , 样品 点 子 直径 控制 在 2 毫米 左右 (不 超过 3 Z 米 )。 3. 展开 将 薄板 有 样品 的 一 MEA CRORE, BAT Ye FH) MR TE AS AE es PE ih 2, FF ER YA A aE BA PB he TO . ~~ 工 厘 米 处 时 取出 此 薄板 ( 约 1~2 小 时 )， 用 铅笔 在 溶剂 前 沿 处 作 一 记号 后 放 在 100"C 烘 箱 中 烘 干 。 4, Bf, KE Es = Bel ie. £4, 7) Wek SE HE AE, FR FE65'C BE FKP BEB BH, 即 可 观察 到 紫红 色 的 氨基 酸 斑点 , He RR SP, 它 的 斑点 2nf, APSR KARR A, 并 计算 各 氨基 酸 的 R: 值 。 15. 缓冲 液 的 性 质 一 、 目 的 通过 本 实验 了 解 缓冲 液 的 特性 。 二 、 原 理 由 弱酸 和 弱酸 盐 配 成 的 溶液 具有 一 种 性 能 ， 即 当 外 加 少 量 酸 或 碱 后 ， 溶 液 能 保持 原 酸度 不 变 ， 这 一 作用 称 为 缓冲 作 用 。 缓 冲 溶液 的 酸度 即 PH 值 , 主要 取决 于 弱酸 的 电离 常数 ， 同时 当 弱 酸 和 弱酸 盐 的 比例 变化 时 , YAW DH 也 会 变化 。 设 弱酸 的 电离 平衡 常数 为 K, 平衡 时 弱酸 的 浓度 为 [ 酸 ]， 弱酸 盐 的 浓度 为 ( 盐 ], 则 由 弱酸 的 电离 平衡 得 到 下 式 ; (th) pH=pK + log C3 根据 上 式 可 得 以 下 几 点 结论 : C1) 缓冲 溶液 的 meer ei tere 浓度 有 关 。 弱酸 一 定 ， , 但 酸 和 盐 的 比例 不 同时 ， 可 以 得 到 不 同 的 PH 值 。 当 酸 和 盐 浓 度 相等 时 ， 溶液 的 P 瑞 值 与 PK 值 相 lA}, (2) 酸 和 盐 的 浓度 等 比例 地 增 减 时 , 溶液 的 DH 值 不 变 。 (3) 酸 和 盐 浓度 相等 时 ， 缓 冲 液 的 缓冲 效率 为 最 高 。 比 例 相 差 越 大 , 缓冲 效率 越 低 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 醋酸 和 了 酷 酸 钠 组 成 的 缓冲 液 。 2. 仪器 吸管 10 毫升 (x3); 试管 1.5x15 BKC x 24); 烧杯 100 毫升 (x 1); 量 简 100 毫升 (x 1); 滴 管 。 3. 试剂 0.1N wR Hy (NaAC); 0.1N 醋酸 (HAC); 0.1N 盐酸 ; 0.1N AA. | 省 甲 酚 绿 (简称 B.C.G 指示 剂 ): 指示 范围 PH3.8~5.4 由 黄色 到 蓝 色 。 配 法 见 附录 9。 省 酚 蓝 (简称 B.P.B ANA): 指示 范围 pH3. O~4. 6 由 黄色 变 为 紫色 。 配 法 见 附录 9. 四 、 操 作 步 又 1. 缓冲 溶液 的 配制 和 指示 剂 的 有 效 指示 范围 按 下 表 配 制 一 套 缓冲 浴 液 的 标准 管 ， 作 为 本 实验 比 色 之 用 。 0.1N HAC (毫升 ) 观察 颜色 一 一 ooo —_ | | — m ow bh BS. CO. -rSB 2 de. Ot 9.25 8.80 8.20 7.35 6.30 5.10 4.10 3.00 2.10 结论 : BAHL UE AAR TB AN HA AS ta as TEE A PHS. 都 能 清晰 反映 出 来 。 2. 缓冲 溶液 的 缓冲 作用 6 一 -5.2 在 烧杯 中 放 入 100 毫升 的 蒸馏 水 , 加 入 0.1N HAC 数 滴 使 5 互 调 至 4.6, 作为 下 玫 中 的 酸 水 , 按 下 表 配 制 各 管 。 sk |l0.1NNaAClo1.N HAC|B.C.G| 观 察 o.1N HCI] 2-14 gee Ga) Ges) | ess) | Ga) PPA) Gap aha te 10 a ia 10 -一 i0 an = 10 1 TA 10 a 10 ae 1 aa 4.90 5.10 10 ak pone — | 4.90 b.10 | 10 -一 1 将 各 管 和 前 一 表 中 的 管 1~ 管 9 相 比 较 ， 并 佑 计 各 管 的 PH 值 , 分别 填 入 表 中 。 从 实验 中 观察 到 ， 加 入 等 量 的 酸 或 碱 会 使 酸 水 的 DH 很 快 发 生变 化 ， 但 对 缓冲 液 的 PH 值 影响 其 微 。 说 明 缓 冲 溶液 能 忍受 外 加 的 酸 和 碱 , 而 不 使 PH 变化 。 3. 稀释 对 缓冲 液 pH 的 影响 0.1NNaAClo. LNHAC H,O |B.C.Gi#\0.1N HCl NaOH 观察 (ii) 《毫升 ) (37+) | 毫升 )〈 滴 ) | pH pH 一 | 一 | 一 | -一 | -一 | -一 | 一 一 一 一 一 一 | 一 一 ee 2.45 2.45 0.98 0.98 按 上 表 配 置 后 与 管 6 比较 其 DH, BiH He em AD 倍 后 , PH 值 不 变 , 并 仍 有 缓冲 作用 。 4. 缓冲 效率 按 下 表 配 制 三 种 不 同 PH 的 缓冲 液 , 用 BC.G 和 B.P.B 为 指示 剂 , 然后 逐渐 加 入 少量 的 酸 , 并 随时 观察 那 一 种 P 孔 组 冲 液 的 缓冲 效率 大 。 he 品 H Ba | P 《毫升 ) 《毫升 ) ( 滴 ) L9o7 4.6 2.45 2.55 10 1 20 4.6 2.45 2.55 10 21 4.0 0.90 4.10 | 22 4.0 0.90 4.10 < 23 3.6 0.38 4.62 1 - " a P ‘ 人 ae wf aS PERT ch LM POE RBS EE EI +e 7 区 Pra ae ae ll - a tm 人 ro : x Z aay 从 实验 结果 可 观察 到 管 19 的 缓冲 效率 大 于 管 21 ， 而 管 21 又 大 于 管 23, 说 明 缓 冲 液 的 DH 值 愈 接 近 于 所 用 酸 的 PK 。 值 者 缓冲 效率 愈 大 。 16. 蛋白质 的 电荷 一 、 目 的 通过 本 实验 ， 证 明和 蛋白 质 在 较 它 的 等 电 点 的 PH 值 更 小 或 更 大 溶液 中 时 带 有 不 同 的 电荷 。 说 明和 蛋白 质 具有 两 性 特征 。 —, RE 在 较 等 电 点 的 DH 值 低 的 溶液 中 , 蛋白 质 带 阳 电 荷 , 因此 能 和 阴离子 化 合 为 盐 。 在 较 等 电 点 的 p 互 值 高 的 溶液 中 ， 蛋 白质 带 阴 电荷 ， 因 此 能 和 阳离子 化 合 为 盐 。 蛋 白质 的 某 些 盐 不 深 于 水, 例如 蛋白 的 铅 盐 和 蛋白 质 的 亚 铁 氛 酸 盐 , 都 是 不 溶 于 水 的 。 本 实验 利用 这 类 盐 的 生成 ,来 测定 在 不 同 PH (AA 液 中 所 负 的 电荷 性 质 。 其 化 学 反应 式 表示 如 下 : QC) 在 较 等 电 点 为 酸 的 溶液 里 ， 蛋 白质 只 和 亚 铁 握 化 钾 生成 沉淀 , 而 与 醋酸 铅 不 起 反应 。 NHiPCOO-+HCI 一 >NHiPCOOH+CIL- NH+!PCOOH + Pb(AC),—»>NH:PCOOH + Pbtt + 2AC~ NH; PCOOH + K,Fe(CN) ,—> (NH+PCOOH} ,Fe(CN), | +4Kt (2) 在 较 等 电 点 为 碱 的 溶液 里 ， 2 SAA 沉淀 , 而 与 亚 铁 氰 化 钾 不 起 反应 。 NH? PCOO- + NaOH—>NH,PCOO- + Nat+H,0O NH,PCOO- + Pb(AC),—» Pb(NH,PCOO), | +2AC~ NH,PCOO- + K,Fe(CN),—»NH,PCOO~ +4K++Fe(CN)§7 - 三 、 仪 器 和 试剂 1. 实验 材料 0.5% Nik eA. 2. Wat 试管 1.5x15 OKC x 4); 吸管 2 毫升 (x 1); HEA), 3. 试剂 0.5% WiSEA; 0.5N 盐酸 ; 0O.SNAALM; 10% 3 铅 ; 1% WEA 四 、 操 作 步 又 取 4 支 试管 按 下 表 配 制 : 10%Pb(AC)2 | 1 多 KEe(CN)6 | AR ”从 实验 可 知 蛋白 质 在 比 其 等 电 点 偏 酸 的 溶液 中 ， 以 阳 离 子 形式 存在 ;在 比 其 等 电 点 偏 碱 的 溶液 中 ,以 阴离子 形式 存在 。 17. 蛋白 质 等 电 点 测定 —, Bay FAA ORL AR SRARS TRAN AR: =. AE 和 蛋白质 的 分 子 量 很 大 ， 它 能 形成 稳定 均一 的 溶液 , 主要 是 由 于 蛋白 质 分 子 都 带 有 相同 符号 的 电荷 ， 同时 蛋白 质 分 子 周 围 有 一 层 深 剂 化 的 水 膜 , 避免 蛋白 质 分 子 之 间 聚 集 而 沉降 。 蛋白 质 分 子 所 带 的 电荷 与 溶液 的 P 瑞 值 有 很 大 关系 ， 和 蛋 白质 是 两 性 电解 质 , 在 酸性 溶液 中 成 阳离子 ， as os 阴离子 : 卫 | O O NH}—c —COOH =* NHj—C—COO- ==> i a See NH2— C —COO- 上 蛋白 质 分 子 所 带 净 电荷 为 零 时 的 PH 值 称 为 蛋白 质 的 等 电 点 (IP)。 在 等 电 点 时 ， 蛋 白质 分 子 在 电场 中 不 向 任何 一 极 移动 , 而且 分 子 与 分 子 间 因 碰撞 而 引起 聚 沉 的 倾向 增加 , 所 以 这 时 可 以 使 蛋白 质 溶液 的 粘度 ,渗透 压 均 减 到 最 低 , EL PEE 混 泪 。 若 再 加 入 一 定量 的 溶剂 如 乙醇 丙酮 , 它们 与 蛋白 质 分 子 争 夺 水 分 子 ， 竟 力 减低 蛋白 质 水 化 层 的 厚度 而 使 混浊 更 加 明显 。 — 0 a 各 种 蛋白 质 的 等 电 点 都 不 相同 , 但 偏 酸性 的 较 多 , 如 牛乳 SAWS BA 4.7~4.8, MABASRAW 6.7~6.8, 胰 岛 素 是 5.3 一 5.4， 鱼 精 蛋白 是 一 个 典型 的 奏 性 蛋白， 其 等 电 点 在 PH12.0~12:4, 近年 来 蛋白 质 的 等 电 点 可 以 采用 等 电 聚焦 技术 加 以 准确 测定 , 但 需 一 定 的 实验 条 件 。 本 实验 采用 重 白质 在 不 同 P 互 溶液 中 形成 的 混浊 度 来 确定 ， 即 混浊 度 最 大 时 的 PH 值 即 为 该 种 蛋白 质 的 等 电 点 值 ， 这 个 方法 虽然 不 很 准确 , 但 在 一 般 实 验 条 件 下 都 能 进行 , 操作 也 简便 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 - eA. 2. 仪器 试管 1.5x 15 厘 米 (x 9); MB 1 BFC Xx 2), 2AFCX 2), 10 毫升 \(x 2); 容量 瓶 50 毫升 \x 2), 500 毫升 (x 1); 试管 架 。 3. 试剂 0.01N 醋酸 溶液 ，0.1X 醋酸 溶液 ，1N 醋酸 溶液 ; IN 氢 ee ne . RIED R + eet 胶 液 C1) 称 取 酷 蛋 月 3 5h, 放 在 烧杯 中 ， 加 入 40 C 的 蒸馏 水 。 (2) 加 入 50 毫升 1A 氢 氧 化 钠 溶液 ， 微 热 搅拌 直到 和 蛋白 - 质 完 全 溶解 为 止 。 将 溶解 好 的 蛋白 溶液 转移 到 500 毫升 容量 瓶 中 , 并 用 少量 蒸馏 水 洗 净 烧杯 , 一 并 倒 入 容量 瓶 。 (3) 在 容量 瓶 中 再 加 入 LN 醋酸 溶液 50 EH, HS. (4) 加 入 蒸馏 水 定 容 至 500 毫升 ， 得 到 略 现 浑浊 的 ， 在 0.1VNaAC 溶液 中 的 酷 蛋 白 胶 体 。 2. 等 电 氮 测定 — §2— — EE USF TEBE PIMA ABM, FMEA EIA ae Viel 7K 7 5 FH He BBE FS Pe PR HS HK TMA ig 3 BERG J. 管 蛋白 质 | H,O 0.01N | 9. 0. re spe ze 观 察 了 (EF) EF) 《毫升 ) (Es) GE) E 0 分 钟 |10 分 钟 |20 分 钟 1 1 |8.38 | 0.62 一 wk: 5.9 2 Bol Tr7e, | 186 一 一 5.6 3 1 | 8.75 一 0.25 — 5.3 4 1 | 8.50 ae 0.50 一 5.0 5 P8004) 1.00 一 4.7 6 1 7.00 — 2.00 一 4.4 7 1 | 5.00 一 4.00 一 4.1 8 ETL; — 8.00 一 3.8 9 本 一 一 1.60 | 38.5 WB EF 7 A BD YEG TR SE AAR TR To PE Oe A BS BAY SH 点 。 观 察 时 可 用 +, ++, +++, 表示 浑浊 度 。 18. 总 氨 测 定 (一 ) 一 一 常量 克 氏 定 氮 法 一 、 目 的 采用 和 背 量 殉 氏 定 氮 法 测定 生物 材料 的 含 氨 量 。 —. 原理 测定 有 机 物 中 的 含 氮 量 ， 通 常 是 设法 使 其 转变 成 无 机 含 氮 物 后 再 加 以 测定 。 本 实验 将 有 机 物 与 浓 硫 酸 一 起 加 热 消化 ， 待 消化 完毕 后 , 有 机 氮 形 成 贸 盐 , 再 加 碱 , 使 氨 游 离 , 经 蒸馏 逸 出 的 氨 为 定量 的 标准 酸 所 吸收 ， 然 后 以 标准 碱 液 滴 定 剩 余 的 - 酸 。 从 标准 碱 液 的 消耗 量 , 求 出 含 氮 量 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 于 酵母 ; 沸石 。 2. 仪器 克 氏 烧瓶 100~200 毫升 (x3); 三 角 烧 瓶 150 Ft Cx 3); HEE RAM NA — XX); Bie 100 毫升 (x 2); KF. 3. 试剂 浓 硫 酸 ; 45% AA; 0.1V 标 准 盐酸 溶液 ; 0.1V 标准 氢 氧 化 钠 溶液。 指示 剂 : 0.1% PHA CRAM. 催化 剂 : 硫酸 铀 :硫酸 钊 =1:4(W/W )， 研 成 细 末 备用 。 四 、 操 作 步 又 1. 消化 精确 称 取 干 酵母 0.5~~1 克 (其 重量 以 含 蛋白 质 多 少 而 定 ) =}, 分 别 放 在 150 毫升 克 氏 烧瓶 底部 ， 加 浓 硫 酸 10~15 & Ft, HAG 1 克 ,， 瓶 口 捅 一 玻璃 漏斗 , 放 在 通风 柜 中 进行 加 热 消化 , 温度 不 宜 过 高 ， 只 要 保持 瓶 内 微 沸腾 状态 ,至 瓶 内 成 透 a ecient 即 表示 消化 完毕 。 .蒸馏 毫升 三 角 瓶 三 只 ， 自 滴定 管 中 精 确 地 放 入 0 1N 慰 准 盐酸 溶液 中 毫升 , 和 2 TPE ANT. Ma 7 装 置 仪器 。 盛 有 标准 酸 的 三 角 瓶 接 在 冷凝 管 下 ， 冷 凝 器 的 导管 必须 插入 酸 溶液 中 。 已 消化 好 的 克 氏 瓶 冷却 后 ,加 蒸 馅 水 50 BARA BARK, FDU A 40~50 毫升 45% Si AOA, thi AB iRAMIAE REA HE, AJL RMA, 连接 各 部 装置 , HFHMAA AIA, MPA, BRAS eM CL ee 性 为 止 (以 石 蕊 试纸 检验 ), 取 下 三 角 瓶 , 并 冲洗 冷凝 器 导管 。 Ase 4a, 取 下 三 角 瓶 , 加 二 滴 甲 基 红 指 示 剂 ,用 0.1A 氧 氧化 钠 溶液 滴定 至 终点 。 五 、 结 果 计 算 (N,V,—N,V,) x ae Dat . 1000 pee Te 1 Rees ane 式 中 : Ni 为 盐酸 当量 浓度 ， Vi 为 盐酸 的 毫升 数 ， N, HAAS KE, V2 为 氨 氧 化 钠 消 耗 毫 升 数 。 19. 总 - 氮 测 CS) BS et FR rE BI —. Ba 学 习 用 微量 克 氏 (Micro-Kjeldahl) 定 氮 法 来 测定 生物 材 料 的 总 氮 量 。 =, AE 生物 材料 中 含有 许多 含 氮 化 合 物 ， 如 有 蛋白质、 核酸 、 氮 基 酸 等 .对 其 含 捧 量 的 测定 在 生物 化 学 研究 中 具有 一 定 的 意义 ， 例如 已 知 蛋 白质 含 氮 量 通常 在 16 色 ,因此 只 要 测 出 蛋白 质 样 mia Aw, 再 乘 6.25 即 可 知道 蛋白 质量 。 又 如 核酸 中 的 氮 磷 比 值 CN/P) 通 常 是 一 定 的 ， 如 果 提 取 的 核酸 样品 含有 和 蛋 自 质 杂 质 , 则 N/P 比值 就 增高 , 它 是 说 明 核 酸 纯度 的 指标 之 一 。 生物 材料 总 气量 的 测定 , 通 向 采用 微量 克 氏 定 氮 法 , 它 适 用 于 测定 0.2~2.0 毫克 的 氮 。 其 方法 原理 如 下 : 1. 消化 有 机 物 与 浓 硫 酸 共 热 ,使 有 机 所 全 部 转变 为 无 机 所 (硫酸 铵 )。 由 于 消化 过 程 进行 缓慢 , 在 实验 中 常 添加 硫酸 铜 和 硫酸 钾 的 混合 物 来 促进 , 硫酸 铀 是 催化 剂 , 硫酸 钾 可 提高 硫酸 的 沸 点 。 消 化 所 需 时 间 视 样品 性 质 而 定 , 一般 在 30 分 钟 至 1 小 时 - 左右 。 消 化 时 化 学 反应 如 下 : 有 机 物 (C.H.O.N.P.S) 十 浓 H,SO,—>(NH,),SO, +CO,4 +S0O, 4 +SO; 4 + H;PO, 2. 加 碱 蒸馏 消化 得 到 的 硫酸 匀 与 浓 氢 氧化 钠 作 用 生成 氢 氧 化 贸 ， 加 热 后 得 到 所 。 氮 通过 蒸 饮 导入 过 量 的 标准 酸 中 被 吸收 。 (NH,),SO,+2Na0H 2% 2NH,OH +Na,SO, |, + +H,0 NH,+HCl 一 > NH,Cl 3. 滴定 FS ah Tk FY os HE ER PR A, Fe TF aE AA 钠 滴 定 , EE JOT FL eR ak BB Ye DS TET PE AAA FS Et Bi, BAA BCH a I, I REIS, OR ASE SL ete jal, HCl+NaOH—+NaCl+ H,0, : FES he FP tH BY AR FA BPE A SA A, NPR 氨 后 ， 使 确 酸 溶液 的 氢 离 子 浓度 降低 ， 这 时 混合 指示 剂 (PH 4.3 人 ~ 扣 .4) 由 黑 紫色 变 为 绿色 。 再 用 标准 酸 来 滴定 , HEM RA 液 恢复 到 原来 的 氢 离 子 浓 度 为 止 ， 指 示 剂 出 现 淡 紫 红色 为 终 点 。 这 时 所 耗 的 盐酸 当量 即 为 氨 的 当量 , 此 法 称 直 接 法 , 只 需 配制 酸 的 标准 液 。 NH,+ H,BO,—»NH,H,BO, NH,H,BO, + HCI—>NH,Cl+ H, BO, 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 豆腐 废水 4( 豆 制品 厂 废 液 )。 2. 仪器 EE rE RU (— EE); 胖 肚 吸管 中 毫升 \x 1); 吸管 工 毫 升 Cx 3),2 BFC x 1); 酸 或 碱 式 滴 定 管 25 毫升 (x 1); 烧杯 200 Ft Cx 2); 量 简 10 毫升 (x 1); 三 角 烧 瓶 150 毫升 (4x4); 消 化 管 30 毫升 (x 6); 吸 耳 球 (x 1); 消化 炉 。 3. 试剂 浓 硫 酸 (C.P.); 30% 过 氧化 氧 ; 10N 气 氧 化 钠 ; 0.01N 盐 酸 标准 溶液 ; 0.01V BAL PREVA; 3% HREM, 指示 剂 : 0.1% PSEA CBR MK. 混合 指示 剂 : FS RAR 0.2% IRA AR CRA AM 1 HK «FR 0.2% FET CBYAMIRA Tm. 3 催化 剂 : 硫酸 铀 :硫酸 钾 =1:4(W/W) 混 合 , 研 成 细 未 备 aes: 0.6 Sht/BAMRMRAAM: 准确 称 取 2.829 RAM 水 定 容 至 上 升 。 Bee . DB, REDR 1. (ar iy 2 BAYS BE || Gate=a LRA mse =i s7 \ fe RR "iL. lilly be As AY T1150 a ig ~ ~ p 图 8 微量 克 氏 定 氮 装 置 按 图 8 装置 仪器 ， 要 求 稳妥 便于 操作 。 由 于 定 氮 仪 的 进 出 口 都 是 细 管 , 而 且 是 由 几 个 部 分 连接 在 一 起 的 整套 装置 ,所 . 以 不 能 用 一 般 方法 来 清洗 ， 只 能 采用 蒸汽 冲洗 。 此 外 在 整个 测定 过 程 中 要 求 没有 漏 气 现象 。 因 此 在 蒸气 冲洗 过 程 中 还 要 检查 装置 有 否 漏 气 。 蒸汽 发 生 器 中 加 三 分 之 二 体积 的 水 ， 几 滴 甲 基 红 指示 齐 和 沸石 ,用 硫酸 调 水 至 橙 红色 表示 水 呈 酸 性 , 因为 具有 在 酸性 条 件 下 ,水 中 的 氨 才 不 会 燕 出 。 打 开 漏 斗 下 夹子 ,加 热 至 水 沸 WS 使 薰 汽 通 入 仪器 的 每 一 部 分 , 达到 清洗 目的 。 在 冷凝 管 下 放 一 盛 器 承接 冷凝 水 。 然 后 关 紧 漏斗 下 面 夹子 ， 再 冲洗 五 分 钟 ,冲洗 完毕 移 开 煤气 灯 , 夹 紧 蒸汽 发 生 器 和 收集 器 间 的 连接 橡皮 管 , 蒸馏 瓶 里 的 废 液 由 于 减 压 倒 吸 到 收集 器 中 , 打开 收集 器 下 端的 活塞 排除 废 液 。 如 此 反复 清洗 二 次 。 2 标准 硫酸 铵 测定 为 了 进一步 检查 仪器 有 否 漏 气 和 热 练 操作 ， 常 用 已 知 这 BE HTM BEM IK 2~3 次 。 。 用 胖 肚 吸管 量 取 0.01Y 标准 盐酸 25 毫升 (或 3% 确 酸 10 毫升 )， 注 入 到 三 角 瓶 中 再 加 入 2 滴 甲 基 红 指 示 剂 (采用 硼酸 吸收 时 则 加 入 混合 指示 剂 )， 将 此 三 角 瓶 承接 在 冷凝 管 下 端 并 使 冷凝 管 的 出 口 浸入 液 内 ， 注 意 在 此 操作 前 必须 先 打开 收 集 器 活塞 ， 以 免 三 角 瓶 内 液体 倒 吸 。 正 确 吸取 2 毫升 0.6 毫 克 / 毫 升 硫酸 铵 溶液 ,加 到 漏斗 中 , 并 小 心 打 开 漏斗 下 夹子 ,使 BPO TR A ARABI, FL 3~-5 毫升 蒸馏 水 分 三 次 清洗 漏斗 ,也 让 其 流入 蒸馏 瓶 中 。 再 用 量 简 量 取 5 毫升 10N 氢 氧化 钠 ， 通 过 漏斗 慢 慢 流 入 蒸馏 瓶 ， 然 后 用 少量 水 洗 漏斗 并 留 少量 水 在 漏斗 内 作 水 封 。 关 闭 收集 器 活塞 ,加 热 燕 汽 发 生 器 , 使 蒸汽 冲 入 六 馏 瓶 内 ， 反 应 生成 的 氨 逸 出 被 吸收 在 盛 有 了 酸 液 的 三 角 撼 De em ee ny i, AAS TLE Ay ER FEF ba tt AT A), 2 3 分 钟 , 此 时 氮 已 蒸 饮 完全 ， 放 下 承接 的 三 角 瓶 ， 让 冷凝 管 出 口 离开 液 面 ， 继续 蒸 1 分 钟 并 用 蒸馏 水 冲洗 冷凝 管 出 口外 壁 。 取 下 三 角 瓶 ， 用 0.01LA 标准 氢 氧 化 钠 滴定 (如 用 硼酸 吸收 可 用 0.01N 标准 盐酸 滴定 )。 记 下 所 耗 的 碱 (或 酸 ) 的 体积 。 蒸馏 完毕 后 , BRAM, RARE RARE Be, 排除 反应 完毕 的 废 液 ， 并 用 水 洗 漏斗 几 次 ， 废 液 也 通过 减 压 从 收集 瓶 排除 , 如 此 冲洗 后 即 可 进行 下 一 个 样品 测定 。 标准 硫酸 贸 样 品 连续 测定 三 次 ， 其 滴定 数据 差 值 不 得 超 过 十 0.05 毫升 ,否则 说 明 操 作 有 误差 。 另 取 2 毫升 水 代替 硫 酸 铵 溶液 进行 空白 测定 。 取 三 次 滴定 数据 的 平均 值 进行 含 氮 ”. 量 计算 ,并 将 结果 与 标准 值 进 行 比 较 。 2 每 毫升 硫酸 锐 中 含 氮 量 按 下 式 计 算 : BA HY SS bt BL / 毫升 ES V 公式 可 简化 为 : 氨 的 毫克 数 /毫升 = ADS M008 Ah. A 为 滴定 样品 所 耗 氢 氧化 钠 毫 升 数 ，B 为 滴定 空 白 所 耗 氢 氧化 钠 毫升 数 ，Ni 为 盐酸 的 当量 浓度 ， N, 为 氢 氧 化 钠 的 当量 浓度 ，V 为 测定 所 用 硫酸 Be VE WE HY Ft BL 3. 豆腐 废水 含 氮 量 测定 取 四 个 清洁 干燥 的 消化 管 ， 加 入 约 50 毫克 的 催化 剂 , 用 “ 吸管 加 入 工 毫 升 均一 的 豆腐 废水 (吸管 要 接近 消化 管 底部 , 不 re er ee « ~~ 使 样品 粘 附 在 瓶 口 或 瓶颈 ), 再 加 1 毫升 浓 硫 酸 。 另 取 二 个 消 -化 管 加 入 工 毫升 水 代 豆腐 废水 , 其 余 试剂 同上 , 此 为 空白 。 将 消化 管 放 在 通风 柜 内 的 消化 炉 上 加 热 ， 先 用 小 火 ， 待 水 份 燕 发 后 可 用 略 大 些 的 火 加 热 。 消 化 管内 液体 逐渐 由 黄色 变 为 黑 色 , 继续 消化 , 黑色 的 碳 又 逐渐 被 氧化 成 浅黄 色 。 为 了 缩短 消 化 时 间 ， 此 时 可 以 取出 消化 管 ， 稍 冷 后 沿 壁 加 入 30 狗 过 氧化 氮 2 滴 加 速 氧化 。 继 续 加 热 直 至 溶液 呈 淡 蓝 色 止 ， 此 时 消化 已 完全 。 将 消化 液 在 定 氮 仪 上 进行 含 氮 量 测定 ， 方 法 同 硫酸 铵 测 定 。 为 把 消化 瓶 中 的 消化 液 全 部 转移 到 燕 馏 瓶 中 ， 可 在 消化 管 瓶 口上 涂 一 层 薄 薄 的 凡士林 ， 再 小 心地 将 消化 液 注入 漏斗 流入 蒸馏 瓶 中 , 并 用 蒸馏 水 将 消化 管 清洗 三 次 (每 次 用 2 毫升 蒸馏 水 ), 把 每 次 洗 液 也 倒 入 漏斗 内 。 测定 结果 按 上 述 公式 进行 计算 ， 求 得 豆腐 废水 中 的 含 氨 量 。 20. 氨基 扼 测 定 一 一 甲醛 滴定 法 一 、 目 的 掌握 氨基 酸 的 两 性 离子 性 质 ， 以 此 法 定量 测定 发 酵 液 中 氨基 气 含量 。 、 原 理 ”氨基酸 是 有 氨基 与 次 基 的 两 性 化 合 物 ， 在 溶液 中 以 两 性 离子 状态 存在 。 在 一 般 条 件 下 碱 不 能 直接 滴定 其 氨基 上 游离 下 来 的 氢 离 子 。 但 是 用 甲醛 处 理 后 ， 由 于 甲醛 能 与 氨基 相 结 合 使 氛 基 上 的 氢 离 子 游离 , 这 样 就 可 以 用 碱 来 滴定 , 从 而 计算 氨基 酸 的 含量 。 ”反应 式 ; R—CH—CO0-+ 2HCHO—»R—CH—C00-+ H+ / : a9 NHt N(CH,OH), H++Na0H 了 和 Nat++H,O 甲醛 滴定 法 简单 易 行 ， 在 发 酵 工 业 中 常用 此 法 测定 发 酵 过 程 中 发 酵 液 内 氨基 氮 含 量变 化 ， 以 了 解 可 被 微生物 利用 的 氮 源 的 量 , 并 以 此 作为 控制 发 酵 生产 的 指标 之 一 。 甲 醛 滴定 法 快速 , (AA GE AW ERK PH ABA. ARS PRA 时 产生 不 稳定 的 化 合 物 , HARE; BARE AHA, 滴 定时 也 要 消耗 一 些 碱 , 可 使 结果 偏 高 ; 此 外 溶液 中 若 有 铵 存在 也 可 与 甲醛 发 生 与 氨基 类 似 的 反应 , 往往 使 结果 偏 高 。 “ ” =. RRMA, 仪器 和 试剂 1. 材料 发 酵 液 ; 滤纸 。 2. (Mat 吸管 2 毫升 x2), 5 毫升 (x1); B10 ZACK); Mo 式 滴定 管 中 毫升 (x 1); 三 角 烧 瓶 100 毫升 (x4); 漏斗 Cx 1), 3. 试剂 1 匈 酚 本 指示 剂 : 称 取 1 SEED BK, 以 95% CR 100 &Ft. 0.1% PSEA BNA: 称 取 甲 基 红 0.1 Ft, 以 95% CG 解 稀释 至 100 Ft. 0.02858N 所 氧化 钠 标准 溶液 *， 精 确 吸 取 一 定量 的 已 标 *# 在 生产 部 门 为 了 达到 快速 测定 的 目的 ,选择 标准 氢 氧 化 钠 的 浓度 为 0.03858 N, 以 此 数值 代入 计算 公式 可 使 计算 简化 为 , 氨基 氨 毫 克 /100 SEF =20XV— > 定 的 O.BN ALA hr MEM, FA AR ZK PEE 0.02858, 18% PPE RE. EAE 36~40% HY) AREY 100 毫升 《冬天 如 有 沉淀 , 须 在 27"C 左 右 保温 溶解 ,， 不溶 物 则 需 过 滤 除 去 )， 加 入 等 量 蒸馏 水 , 加 酚 本 指示 剂 数 滴 , 以 0.1X 氢 氧 化 钠 中 和 至 微 红 色 , 保存 备用 。 0.3N 硫酸 。 四 、 操 作 步 骤 发 酵 液 用 滤纸 过 滤 在 三 角 烧 瓶 中 , 从 中 吸取 2 毫升 滤液 于 另 一 三 角 瓶 内 , MARK 10 毫升 , 甲 基 红 指示 剂 2 滴 , 以 0.3N 硫酸 调节 溶液 至 红色 ， 再 用 0.02858N AA WARE 橙色 , 使 成 中 性 。 加 18 多 中 性 甲醛 溶液 4 毫升 ， 摇 匀 静 止 10 分 钟 , 加 1% 酚 本 指示 剂 8 滴 ， 用 0.02858N 氢 氧 化 钠 标准 深 液 滴定 至 微 红色 为 终点 \ 作 二 次 重复 )。 空白 试验 是 在 三 角 烧 瓶 中 加 入 12 毫升 蒸 饮 水 ,2 滴 甲 基 红 指示 剂 , 然后 操作 步骤 同 发 酵 液 的 测定 。 = | 空白 | 发 酵 液 | 0.02858N 氨 氧 化 钠 消耗 量 ， eS 五 、 计 算 sat M38 32/100 e573 - NY 0.014% 100% 1000 =V x 20 SU: N HAA EA ee RE ED 0.02858N, VA ER ARH mMEAALA BK ZH, 21， 和 蛋白 质 浓度 测定 (一 ) 一 福 林 - 酚 试剂 法 = 一 、 目 的 学 习 一 种 常用 的 蛋白 质 浓度 测定 方法 。 二 、 原 理 福 林 = 酚 试 剂 (Folin-phenol reagent) 的 显 色 包括 二 步 反应 : 第 一 步 是 在 碱 性 条 件 下 ,和 蛋白质 与 铜 作用 生成 蛋 和 白质- 铜 复合 物 ; 第 二 步 是 蛋白 质 - 铜 复合 物 还 原 磷 钼 酸 - 磷 钨 酸 试 剂 , 生成 蓝 色 物质 ,在 一 定 条 件 下 ， 蓝 色 强 度 与 蛋白 质 的 量 成 IEG. 福 林 - 酚 试 剂 法 是 生化 工作 领域 里 应 用 较 广 泛 的 一 种 蛋 白质 浓度 测定 方法 。 它 的 优点 是 操作 简便 , 灵敏 度 高 ,可 测定 - WHE 25~2 0 微克 蛋白 质 ; 缺点 是 该 试剂 只 与 蛋白 质 中 的 酷 氨 酸 、 色 氨 酸 起 反应 ， 因 此 本 方法 有 蛋白质 的 特异 性 影响 ， 即 不 同 蛋白 质 因 酪 氨 酸 、 色 氨 酸 含量 不 同 而 使 显 色 强度 稍 有 不 同 , 标准 曲线 也 不 是 严格 的 直线 形式 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1, 实验 材料 结晶 牛 血 清白 蛋白 (生化 试剂 , 上 海 东 风 试 剂 厂 )。 2. 仪器 试管 1.5x 15 厘米 (x 13); 吸管 0.5 毫升 (x1)，1I 毫 升 (x 3),5 毫升 (x 1); 72 型 分 光 光 度 计 。 3. 试剂 AFA. (A) 10 克 碳 酸 钠 、2 克 氧 氧化 钠 和 10.25 FE 石 酸 钾 钠 ( 或 其 钾 盐 或 钠 盐 ) 溶 解 于 500 毫升 蒸馏 水 中 。 (B) 0.5 克 硫 酸 铜 (CuSO,. 5HsO) 深 解 于 100 毫升 燕 饮 Se 。 cat 、 my a5, i A= = 4. b ‘ae Ki, BUA RH (A)50 5 (B)1 份 混 和 ; 即 为 试剂 甲 。 RAZ: 在 1.5 升 容积 的 磨 口 回流 瓶 中 加 入 100 BBR 销 (NazWO,.2H:0), 25 3244 R4(NaMoO, -2H,0) & 700 Z ss FEE BK, 再 加 50 SFt 85% BM, 100 毫升 浓 盐 酸 充分 混和 ， ， ，“ 接 上 回流 冷凝 管 以 小 火 回流 10 小 时 。 回 流 结 束 后 , 加 入 150 RRB, 50 毫升 车 饮 水 及 数 滴 液 体 溴 , HORSES 15 分 钟 ， 了 驱除 过 量 的 省 ， 冷 却 后 溶液 呈 黄 色 ， 微 带 绿 色 ( 如 仍 旦 绿 4, 项 再 重复 滴 加 液体 溴 的 步 又 ) 稀 释 至 LA, 过 滤 , 滤液 填 于 棕色 试剂 瓶 中 保存 。 使 用 时 用 标准 氢 氧 化 钠 滴 定 ， 以 酚 栈 为 指示 剂 , 然后 适当 稀释 ( 约 加 水 工 倍 ) 使 最 终 浓 度 为 IN 酸 。 四 、 操 作 步 又 1. 标准 曲线 制作 称 取 结晶 牛 血清 和 白 蛋 白 2.5 毫克 溶解 于 10 毫升 车 饮水 | 含 蛋 自 质量 | 2.5ug/ml 牛 血 清 自 下 白 | HO 管 号 (毫升 ) cen) | 22 | OP eso 加 速 1 0 1.0 试 混 剂 合 2 0.2- 0.8 Fae 3 0.2 0.8 =e . z 开 39 ) 分 4 0.4 0.6 混 钟 5 > 0.6 = 7 6 0.6 0.4 | i 了 0.6 Fe ee = 8 0.8 0.2 加 | ree 9 0.8 | 0.2 试 ii 10 1.0 0 ZI 0.5 | 11 1.0 0 | = ; | g | -中 , 使 成 250 PGE / ZF. 取 试 管 11 支 ， 按 表 加 入 牛 血清 白 蛋 白 标准 溶液 及 蒸馏 “ 水 。 以 后 加 试剂 甲 5 毫升 ,混合 后 室温 下 放置 10 分 钟 ， 再 加 0.58F AA, 立即 混合 均匀 (这 一 步 混 和 速度 要 快 ， 和 否则 会 使 显 色 程度 减弱 )，30 分 钟 后 , 以 不 含 蛋白 质 ,试剂 量 相同 的 管 为 空白 ,在 72 人 选用 650 ZMK, whe OD ff, 以 蛋白 质 含量 为 横 座 标 ， 光 密度 值 为 纵 座 标 作出 标准 曲 线 。 2. 样品 测定 待 测 样品 溶液 1 毫升 〈 适 当 稀 释 至 约 含 25~250 微克 蛋 白质 ), 加 试剂 甲 、 乙 及 比 色 等 操作 步骤 同 标准 曲线 操作 。 由 待 测 样品 OD 值 , 查 标准 曲线 ， 求 得 蛋白 质 含量 乘 以 称 释 倍 数 , 即 得 样品 的 蛋白 质 含量 值 。 22. 和 蛋白质 浓度 测定 (二 ) 一 一 业 色 测定 法 “~ 一 、 目 的 ASABE AER ee ee , RB 染色 测定 法 是 将 蛋白 质 样品 固定 在 各 种 类 型 纤维 膜 上， 与 各 种 类 型 染料 结合 后 , 把 被 染色 的 蛋白 质 洗 脱 下 来 , 在 适当 波长 下 进行 比 色 测定 。 这 种 方法 的 特点 是 灵敏 度 高 ， 可 以 测 定 几 微克 ,甚至 零点 几 微克 水 平 的 蛋白 质 , 只 需 少量 蛋 自 质 洲 “ 液 就 可 分 析 测定 。 本 实验 选用 层 析 滤 纸 为 支撑 物质 , 三 氧 乙酸 为 固定 剂 , 考 马 斯 亮 蓝 为 染料 的 测定 方法 。 考 马 斯 亮 蓝 和 蛋白 质 通过 范 德 2 es ” ay af “7 ne ly ee as 人 瓦尔 键 结合 , 在 一 定 蛋白 质 浓度 范围 内 , 蛋白 质 的 染色 符合 比 尔 定律 。 本 方法 可 人 允许 的 测定 范围 是 2~20 微克 蛋白 质 。 受 蛋白 - 质 的 特异 性 影响 较 小 , 除 组 蛋白 外 , 其 他 不 同 种 类 蛋白质 的 染 - 色 强 度 差 异 不 大 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 牛 血 清白 蛋白 (或 其 他 纯 蛋 白质 ); 层 析 滤 纸 。 2. 仪器 | 微量 吸管 20 HFT CX 1); 试管 1.5x5 厘 米 (x 12); 吸管 0.1 毫升 (x1),2 毫升 (x 1); RH Hl; 72 型 分 光 光 度 计 。 3. 试剂 染色 液 .0.25 克 考 马 斯 亮 蓝 R-250(Coomassie brilliant blue R-250) 740 TS 7.5% RAR, 57% PRA KYM 100 Z 升 中 。 209% 三 氯 乙酸 溶液 :20 克 三 氯 乙酸 加 蒸馏水 至 100 训 Fe 脱色 液 : 含 7.5 儿 醋酸 和 5 狗 甲 醇 的 水 溶液 。( 使 用 过 的 脱色 液 , 加 少量 活性 炭 处 理 , 过 滤 后 可 反复 使 用 。) 洗 脱 液 : FO0.12N 氢 氧 化 钠 80 儿 的 甲醇 溶液 。 BN 盐酸 溶液 : 25 BH 12N 盐酸 加 蒸 饮水 至 100 BF. 四 、 操 作 步 又 1. 标准 曲线 制作 ” 称 取 纯 牛 血清 白 蛋 白 1 毫克 溶解 在 1 毫升 蒸馏 水 中 ， 使 成 工 毫克 /毫升 标准 蛋白 溶液 。 C1) WE: 取 5x 20 厘米 滤纸 一 张 ， 分 成 五 等 分 。 用 微 量 吸 管 取 标准 蛋白 溶液 5、.10、15、20 微 升 , 分别 点 样 在 各 等 分 “滤纸 的 中 央 ， 或 先 将 蛋白 质 标 准 液 稀释 成 0.25.0.5.0.75.1 毫克 /毫升 ,分 别 点 样 20 微 升 于 滤纸 上 , 使 蛋白 质 含量 分 别 相 当 于 -5 105 15 & 20 WH, FEF His FE FEA TRI 进行 固 定 。 《2) AE: 点 好 样 的 滤纸 浸没 在 20 多 三 氯 乙酸 溶液 中 5 ~10 分 钟 , 时 时 轻 轻 搅动 。 (3) fa: 将 三 氧 乙 酸 固定 好 的 滤纸 浸没 在 染色 液 中 ， 30 C 染 色 60 分 钟 \ 或 固定 某 种 温度 士 1 C, 一 定时 间 士 1)。 (4) 脱色 : 为 了 除去 未 与 蛋白 质 结合 的 染料 ， 需 充分 脱 色 。 将 已 染色 的 滤纸 浸没 在 脱色 液 中 , 十 余 分 钟 或 更 长 时 间 。 如 此 反复 数 次 , 至 滤纸 背景 基本 无 色 。 | (5) 洗 脱 ， 剪 下 滤纸 的 染色 蛋白 质 部 分 ， 要 求 各 蛋 自 质 浓度 的 滤纸 片 大 小 一 致 ， 另 在 其 附近 前 一 块 面积 大 小 一 样 的 滤纸 背景 作为 空白 。 分 别 将 滤纸 片 放 入 试管 中 ， 加 1.8 毫升 洗 脱 液 , 摇动 , 室温 放置 , 使 滤纸 片 颜色 洗 净 为 止 ( 约 扣 分 钟 )。 再 加 0.09 毫升 3N 盐酸， 摇动 , 显现 蓝 色 。 如果 小 纸 破碎 ， 需 离心 除去 。 (6) 比 色 ， 取 洗 脱 液 的 上 清 液 部 分 放 入 0.5 厘米 光 径 的 比 色 杯 , 以 空白 管 作对 照 在 590 毫 微米 进行 比 色 测定 , ROE 密度 OD 值 。 蛋 白质 含量 为 横 座 标 , OD 值 为 纵 座 标 绘制 标准 曲线 。 2. 样品 测定 待 测 蛋 白质 样品 适当 调节 至 约 0.5~1 毫克 /毫升 浓度 ，- 取 20 微 升 点 样 于 滤纸 上 , 使 完全 吸收 , 充分 干燥 , 然后 在 上 述 标准 蛋白 样品 测定 的 相同 条 件 下 操作 。 注 意 要 前 取 同 样 大 小 面积 的 滤纸 片 进行 洗 脱 , 并 在 590 毫 微米 进行 比 色 ,， 读 取 OD 值 。 根 据 OD 值 从 标准 曲线 查 得 蛋白 质 含量 。 - 23. GE TC RS Ae Dk 一 、 目 的 学 习 蛋 白质 电泳 的 一 般 原 理 和 方法 ， 掌 握 酷 酸 纤维 薄膜 电泳 分 离 蛋白 质 技 术 。 二 、 原 理 带电 质点 循 着 与 它 带 相反 电荷 的 电极 移动 的 现象 称 为 沪 动 。 带 电 质 点 之 所 以 能 在 电场 中 辐 一 定 的 方向 移动 ， 并 具有 一 定 的 移动 速度 , 是 取决 于 带 点 质点 本 身 所 带 的 电荷 、 电 场 强 度 、 溶 液 的 P 开 等 因素 。 蛋 白质 分 子 在 溶液 中 的 电泳 是 由 于 蛋白 质 的 分 子 上 具有 一 些 自由 的 可 解 离 的 基 团 如 一 COOHI —NH,; —OH 等 ， 因 而 在 某 种 P 于 值 溶液 中 蛋白 质 分 子 就 带 有 一 定 电荷 ， 一 个 混合 的 蛋白 质 样 品 由 于 各 蛋白质 的 等 电 氮 不 同 , 在 相同 的 DEL 溶液 中 所 带 的 电荷 性 质 不 同 , 电荷 的 数目 不 同 , 在 电场 中 各 种 蛋白 质 泳 劲 的 方向 和 速度 也 不 相同 , 从 而 ”使 蛋白 质 混合 样品 得 到 分 离 。 电 泳 技 术 在 生物 化 学 研究 中 被 广泛 用 来 分 离 分 析 生 物 物 质 , 如 和 蛋白质、 氨基 酸 、 核 酸 等 。 本 实验 采用 的 醋酸 纤维 薄膜 电泳 ， 是 近年 来 推广 的 电泳 方法 之 一 , 它 是 将 蛋白 质 混合 物 点 在 酶 酸 纤维 薄膜 上 , 然后 放 在 存 有 一 定 P 卫 缓冲 液 的 电泳 槽 上 , 通电 一 定时 间 , 控制 一 定 的 电压 进行 电泳 ， 经 电泳 后 的 薄膜 放 在 氨 黑 10B Pet, FF 经 脱色 液 浸泡 去 除 未 与 蛋白 结合 的 染料 ， 即 可 观察 到 各 组 份 蛋白 质 的 电泳 图 谐 ， 由 于 染料 与 蛋白 质 的 结合 是 与 蛋白 质 的 量 成 正比 的 ,因此 将 各 蛋白 区 带 前 下, 分别 用 0.4AX Aa 浸 洗 下 来 可 以 进行 比 色 测定 其 量 。 酯 酸 纤维 薄膜 电泳 与 纸 上 电 泳 相 比 有 如 下 优点 : 第 一 ， 电 泳 图 谱 清 晰 , 提高 了 定量 测定 的 正确 性 。 va ts -~ re Ok Oe eae xy AO ee re ea . : 4S, oe 99 ett an Age = thts hes 4 mv AL SO te a Bae no ie ~~. 本 z bd ¥ a "to ~ _ 《 be : "Taet, ei eat baa, & 、 - : : > . 4 二 uy . 7. a a) ‘ | SS—, HATKIN IH, 45 4} SR BN ay RAI I, gob te ” 速 染色 、 脱 色 , 整个 电泳 过 程 仅 需 90 分 钟 。 ae 第 三 ， 灵 人 敏 度 高 , 蛋白 质 浓 度 在 5 微克 /毫升 以 上 即 可 检 iH | 某 些 蛋白 如 胎儿 甲 种 球 蛋白 在 纸 电 泳 上 不 易 分 离 ， 但 醋 酸 纤维 薄膜 电泳 却 能 清晰 分 离 。 此 外 电泳 图 谱 可 浸 在 冰 醋 酸 乙醇 溶液 中 透明 化 , 便于 长 期 保存 。 本 实验 采用 人 血清 为 材料 ， 血 清 中 各 蛋白 质 组 份 的 等 电 点 如 下 : | YREA : 6.85~7.3 C- 球 蛋白 5.12 一 a- 球 和 蛋白 - B.06 . 白 蛋 白 (A) 4.64 电泳 时 采用 的 缓冲 液 P 瑟 为 8.6， 这 时 有 蛋白质 都 带 负电 荷 , 均 向 正极 移动 , 由 于 白 蛋 白 的 等 电 点 最 低 ， 所 带 的 负电 荷 最 多 , 在 电场 中 移动 速度 最 快 , 电泳 图 谱 上 的 迁移 率 最 大 ; y- 球 蛋 白 等 电 点 最 大 ， 所 带 的 负电 荷 最 少 , 迁移 速度 小 , ZA 土 它 最 接近 原点 。 样品 的 电泳 迁移 速度 除了 与 样品 分 子 本 身 所 带电 荷 有 关 Sh, 还 取决 于 电场 强度 , 即 每 厘米 的 电位 差 ,一 般 采 用 10~15 伏 / 厘 米 强 度 。 电 场 强 度 越 高 , 则 带电 质点 移动 越 快 。 组 冲 液 的 离子 强度 也 影响 电泳 的 迁移 速度 , 离子 强度 越 高 , 电泳 移动 速 度 越 慢 ,反之 则 快 ,一 般 最 适 离子 强度 在 0.02 一 0.2 之 间 。 此 外 醋酸 纤维 薄膜 要 均匀 , 通 透 性 要 好 , 才能 获得 较 清 晰 的 图 谱 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 ”人 血清 或 兔 血 清 。 2. 仪器 试管 1.5x15 OKC X 5); 毛细 管 1.5 毫米 内 径 ; 2 ai, 电泳 仪 , 电泳 槽 , 有 盖 扩 瓷 盘 。 3. 试剂 0.4N AREA, 巴 比 妥 缓冲 液 PH8.6: 巴 比 妥 钠 6.38 克 、 巴 比 妥 酸 0.83 克 溶 解 在 500 毫升 蒸馏 水 中 。 染色 液 : 称 取 氨 黑 10B 0.5 克 , 加 甲醇 50 毫升 , 冰 酯 酸 10 毫升 , 燕 饮水 40 毫升 。 漂洗 液 : 乙醇 或 甲醇 45 毫升 , 冰 栈 酸 5 毫升 ,水 50 毫升 配 成 。 AM: 冰 酯 酸 30 毫升 加 95% CAS 70 毫升 。 四 、 操 作 步 又 1. 醋酸 纤维 薄膜 制备 将 二 醋酸 纤维 素 置 110C 烘 箱 烘 ?2 小时, PR 10 克 放 入 250 毫升 密闭 输血 瓶 中 ， 加 入 70 多 丙酮 100 毫升 混和 ， 放 在 沸水 WEBER AR, 然后 放置 过 夜 或 离心 使 杂质 沉淀 , 气泡 消失 后 , 倒 在 清洁 玻 板 上 ， 用 涂 膜 器 迅速 向 一 个 方向 涂 布 ， 待 丙酮 挥发 后 将 膜 到 下 ， 赤 在 滤纸 内 压 平 备用 。 制 备 好 的 薄膜 应 该 是 白色 不 透明 的 , 正面 光滑 , 背面 无 光泽 , 厚度 应 控制 在 0.1~~ 0.15 毫米 , 干 时 脆 , 湿 时 具有 弹性 。 目前 醋酸 纤维 薄膜 已 有 商品 〈 上 海 市 徐汇 区 湖南 路 街道 化 剂 室 )。 2. 点 样 将 薄膜 切 成 2x7 厘米 ， 取 二 张 浸 在 巴 比 妥 缓 冲 液 中 , 使 全 部 湿 透 , 取出 后 用 滤纸 吸 干 , 在 无 光泽 一 面 距 膜 一 端 1.5 悍 米 处 ,用 直径 为 1.5 毫米 的 毛细 管 吸 取 血 清 ， 划 线 点 样 ， 待 样 品 渗入 膜 内 后 , 放 入 电泳 槽 中 , 点 样 一 端 放 在 阴极 ,静止 10 分 ” 钟 , 使 薄膜 渗透 的 缓冲 液 达到 平衡 。 3. 电泳 开启 电源 ， 调 节 电 流 0.4~0.6 毫 安 /厘米 ， 电压 100~ 160 伏 , 通电 50~70 分 钟 。 4. 染色 和 漂洗 通电 完毕 取出 薄膜 , 浸入 染色 液 中 , 约 5 A 膜 , 用 漂洗 液 浸 洗 数 次 ， 使 背景 漂洗 清楚 为 止 ， 即 可 观察 到 电 Uae (A9). (+) io seo SLM me KET 5。 薄膜 透明 化 取 一 EN 20 分 钟 , 取出 平 贴 于 玻璃 板 上 , 使 完全 王 燥 即 成 透明 膜 , 图 雍 仍 清 晰 可 见 , 便于 长 期 保存 。 6. 定量 取 另 一 条 漂洗 好 的 薄膜 用 滤纸 吸 千 后 ， 剪 下 各 蛋白 质 区 、 带 ， 分 别 放 在 试管 内 ， 薄 膜 浸 在 5 毫升 0.4 N 氢 氧 化 钠 溶液 中 ， 振 功 数 次 ， 使 蛋白 质 区 带 浸出 ; 另 剪 一 条 大 小 相同 样品 ~ 的 膜 作 为 空白 也 以 相同 方式 浸 在 0.4N 氢 氧 化 钠 溶 液 中 。 取 其 浸出 液 在 580~600 毫 微米 比 色 , WHA, al, az,B,y 各 蛋白 质 组 份 的 光 密 度 值 。 五 、 结 果 计 算 JE BEAT) =A+a,t+ta,+B+y 各 组 份 蛋白 质 的 百分数 为 *: Ama (%) =2x 100 as BRAT (%) = x 100 a, BREE (%) = 52 x 100 B SRI (%) = 2 x 100 y BREE (%) = 2 x 100 24. 胎儿 甲 种 球 和 蛋白 对 流 免疫 电泳 9201 RS 目的 学 习 对 流 免疫 电泳 技术 , 测定 胎儿 甲 种 球 看 白 。 二 、 原 理 胎儿 甲 种 蛋白 质 (AFP) 是 人 体 在 胚胎 时 期 存在 于 血清 中 的 一 种 球 蛋 白 ， 它 由 胎儿 肝 细 胞 合成 ,在 出 生 后 1~2 周 内 即 * 血清 蛋白 电泳 正常 值 : AeA 64% al REA 2.8% a2 REA 6.6% BREA 7.2% YREA 14.4% 自行 消失 。 但 在 原 发 性 肝癌 患者 的 血清 中 又 可 找到 这 种 蛋白 质 。 利 用 免疫 学 方法 , 将 SO 个 月 的 胎儿 血清 或 强 阳性 的 届 瘤 病 人 血清 免疫 家 免得 到 抗 AFP 血清 , 然后 利用 抗原 抗体 特 异性 结合 的 原理 来 测定 病人 血清 中 有 无 AFP 的 存在 , 以 此 作 为 较 早 期 肝癌 诊断 。 常 用 的 方法 有 琼脂 免疫 扩散 法 和 对 流 免 疫 电 泳 。 对 流 和 疫 电泳 的 原理 是 ， 由 于 抗原 AFP 的 等 电 点 为 4.75, 在 PH8.6 缓冲 液 中 带 负 电荷 , 在 电场 中 向 阳极 移动 ;而 抗体 ( 抗 AFP 血清 ) 属 于 y-REA, HEB AH 6.85~7.3,. 在 PH8.6 缓冲 液 中 虽然 也 带 负 电荷 ， 但 负电 荷 的 数量 少 于 AFP, 因此 移动 速度 较 AFP 慢 ， 又 因 琼 脂 载体 具有 较 大 的 电 渗 作 用 (由 于 琼脂 上 极 性 基 团 带 有 负电 荷 , 琼脂 为 固定 相 不 移 动 , 液 相 的 正 电荷 向 负极 移动 ,引起 电 渗 作 用 ), MoM BB 作用 超过 了 电泳 作用 , 使 抗体 向 阴极 移动 , 因此 只 要 将 抗原 置 阴极 一 端 , 而 抗体 置 阳极 一 端 , 通电 后 , 抗原 抗体 就 会 相遇 , 在 合适 的 浓度 比例 条 件 下 形成 白色 的 免疫 沉淀 线 。 又 因 电 场 的 作用 限制 了 抗体 .抗原 的 自由 扩散 ， 而 使 其 定向 移动 , 因而 增 加 了 抗原 、 抗 体 的 局 部 相对 浓度 ， 提 高 了 灵敏 度 RUD 比 琼脂 扩散 法 提高 了 8~64 FH), 同时 又 大 大 缩短 了 试验 的 时 间 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 正常 人 血清 (稀释 10 倍 ); 胎儿 血清 (\ 黎 释 10 4); AFP 抗 血 清 。 2. 仪器 载 玻 片 ; 吸管 5 毫升 (x 1)。 电泳 仪 ; HATA; 4 毫米 孔径 打 孔 器 (可 用 滴 瓶 的 玻璃 滴 - 管 代 替 )。 3. 试剂 电泳 缓冲 液 PH8.6: 巴 比 妥 钠 9 克 ,0,.1XV 盐酸 65 毫升 ， AGN 1 克 加 蒸馏 水 1 升 。 3 1 多 琼脂 溶液 ， 取 工 克 纯 化 过 的 琼脂 或 琼脂 粉 , IE 钠 - 盐 酸 缓冲 液 PH8.6; 100 毫升 ,水 浴 加 热 熔化 而 成 。 oe 四 、 操 作 步 又 1. 琼脂 板 制备 2 ”在 干净 的 载 至 片上， 放 3 毫升 熔化 的 40'\C 左 右 的 1% 琼 脂 , 并 均匀 涂 布 于 整个 载 玻 片上 。 冷却 后 琼脂 凝结 , 用 内 径 4 毫米 打 孔 器 按 下 图 打 和 孔 。 | 图 10 对 流 免 疫 电 访 打 孔 示意 图 ee 2. 加 样 用 滴 管 到 稀 释 10 倍 的 正常 人 血清 (抗原 ) 放 在 左边 一 + | 抗原 孔 内 。 用 另 一 支 滴 管 取 胎 儿 血 清 ( 抗 原 ) 放 在 右边 一 排 抗 原 孔 内 。 用 滴 管 吸取 AFP Suis Give) 放 在 左 、 右 两 排 抗体 孔 内 。 23。 电泳 将 已 加 好 抗原 抗体 的 琼脂 板 放 入 电泳 槽 内 , 两 端 用 湿润 的 滤纸 作 盐 桥 , 使 与 槽 内 缓冲 液 相通 。 在 抗原 端 接 上 负极 ， 抗 as 体 端 接 上 正极 , 电流 强度 为 3 ee / JDK, 3H 60 分 钟 。 4. 结果 观察 BT Ha RR, 对 光 观 察 抗原 与 抗体 结合 的 沉淀 线 , 若 有 沉淀 线 产 生 为 AFP 阳性 ,反之 AFP 为 阴性 。 五 、 实 验 注意 点 1. 葵 脂 板 孔 径 要 打 整 齐 ， 孔 径 大 小 要 适当 ,打扰 时 不 能 “ 让 琢 脂 移动 。 2. eR IAT AY SRI EA Ne, JE MER a 小 , 否则 造成 假 阴性 机 率 增 大 。 3. 电流 不 宜 过 大 , UREA ARE, 4. 抗原 浓度 要 适当 稀释 , 太 浓 或 太 黎 都 不 易 出 现 沉淀 线 或 出 现 异 常 沉淀 线 。 25. 血清 蛋白 质 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 吕 —. BA ie >) GED His BE A aE BC HTK AY JR SAUER ETI, FPO 。 PAUL Re =, AE FEY Nis BE HK Be JB RIE DLR TS MAEDCHE aR KT — 种 区 带电 泳 。 这 种 凝 胶 是 由 丙烯 酰胺 (简写 为 Acr) 和 交 联 剂 N,N- 甲 又 双 丙 烯 酰胺 (简写 为 2 s) 聚 合 而 成 的 ， 其 聚合 反应 见 下 页 。 Acr 和 Bis 在 它们 单独 存在 或 混合 在 一 起 时 是 稳定 的 ， 且 具 有 神经 毒性 ， 操 作 时 应 避免 接触 皮肤 。 但 在 具有 自由 基 团体 系 时 ， 它 们 就 聚合 。 引 发 产生 目 由 基 团 的 方法 有 化 学 的 和 光化学 的 方法 两 种 。 化 学 方法 的 引发 剂 是 过 硫酸 铵 《简写 Wy Ap), 催化 剂 是 四 甲 基 乙 二 腕 (简称 TEMED); 光化学 法 是 oa OE Na eds 9 te Sign oa aa: = \ AK a ba at we 各 全 es ara 2 ey | ee ee ese EMD NH: NH Acr ( 单 体 ) Lee / CH,=CH -Bis( 交 联 剂 ) sse0s—CH,--CH—CHa—-CH—CHy—CH—-+s0+e | ciate eH iP NH, NH; NH 以 光敏 感 物 如 核 黄 素 (简写 Va,) 来 代替 AP， 它们 在 紫外 光照 射 下 引发 自由 基 团 ， 而 使 聚合 。 采 用 不 同 浓度 的 Acr、Bis， Ap 和 TEMED 使 之 聚合 ， 产生 不 同 孔径 的 凝 胶 。 因 此 可 按 分 离 物质 的 大 小 ,形状 来 选择 凝 胶 浓 度 。 选 用 时 可 参见 下 表 : RB RA AR 蛋白 质 分 子 量 适用 的 凝 胶 浓 度 多 >104 20~80 . 1x 104~4 x 104 15~20 4x 104~1 x 105 10~15 1x10°~5 x 10° 5~10 >5x10° 285 本 实验 采用 不 连续 盘 状 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ， 即 电泳 系 统 是 由 二 种 以 上 不 同 PH 的 缓冲 液 和 凝 胶 孔 径 所 组 成 。 电 泳 凝 胶 上 层 是 低 浓 度 大 孔 胶 称 为 浓缩 腕 ， 此 胶 的 缓冲 液 为 三 产 甲 基 氨 基 甲 烷 - 盐 酸 (简称 Tris-HCl 缓冲 液 ), pH6.7; FE 为 小 孔径 凝 胶 称 为 分 离 胶 ， 它 的 缓冲 液 是 Tris-HCIPH8.9; 电极 缓冲 液 为 PH8.3 的 Tris- 甘 氨 酸 。 通 电 以 后 带电 离子 在 凝 胶 系 统 中 形成 离子 流 ， 它 们 向 正极 的 迁移 率 决 定 于 离子 电 荷 的 数目 分子 大 小 和 形状 。 电 荷 数 越 多 迁移 率 就 大 ; 相反 分 子 越 大 、 摩 擦 力 大 , 迁移 率 就 小 。 当 电泳 缓冲 液 中 的 甘氨酸 进 入 浓缩 胶 层 ， 碰 到 PH6.7 的 缓冲 液 ， 使 甘氨酸 的 平均 负电 荷 大 大 减少 ， 结 果 降 低 了 甘氨酸 向 正极 移动 的 迁移 率 。 蛋 白质 样品 在 PH6.7 时 ， 带 有 较 多 的 负电 荷 ， 因 此 它 的 迁移 速度 超 过 了 甘氨酸 , 蛋白 质 堆 积 在 甘氨酸 前 面 , 而 胶 层 中 的 氯 离子 全 都 带 有 负电 荷 ， 又 有 较 小 的 分 子 和 摩擦 力 ， 比 蛋 和 白质 迁移 快 ， 结果 在 浓缩 胶 层 中 , 离子 迁移 率 形成 CI > 蛋白 质 - 之 甘氨酸- 这 样 的 次 序 。 蛋 白质 在 氯 离子 和 甘氨酸 离子 之 间 ， 被 浓缩 成 很 狭 的 薄 层 ， 如 图 11 所 示 。 当 离子 流 进 入 PH8.9 的 小 孔径 分 离 胶 层 时 , 甘氨酸 带 有 较 多 的 负电 荷 , 它 的 迁移 速度 超过 了 , :甘氨酸 缓冲 液 一 s pH8.3 混合 蛋白 质 样品 - PHS8.3 浓缩 胶 PH 6.7 分 离 胶 PH8.9 甘氨酸 缓冲 液 pH8.3 All 在 盘 状 凝 胶 电泳 中 蛋白 质 的 分 离 过 程 示 意图 蛋白 质 。 而 蛋白 质 样品 进 入 分 离 胶 层 后 ， 由 于 各 种 蛋白 质 的 等 电 点 不 同 , 使 它 它们 各 自 带 有 负电 荷 数 不 等 ,又 因 和 多 和 蛋 自 质 分 子 的 大 小 、 形 状 不 一 ， 摩 擦 力 不 同 ,因此 在 分 离 胶 层 砷 各 蛋白 质 组 份 的 迁移 率 不 同 , 电泳 后 能 达到 分 离 的 目 关 。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 作 为 载体 应 用 于 电泳 分 离 高 分 子 物 质 ， EENGRN ARRAS, ve 4 = * ier val 0 ~S ve ~ 7 j . : - +4} Ses 4 y 3c vo yr ~ : . a ; . Ss, ~ en ee aaa 人 要 于 Ate ese’, ‘7 APs A) © > ee alee “hs eft tee 3 a 3 _ +H,NCHCOOH SO,—NH CHCOOH Rasa) R, DNS-_ 氨 基 酸 氢 基 酸 -_ 在 有 过 量 DNS-Cl 存在 下 , 有 副 产 物 DNS-NH,, eer ant : ch) ee + a4 | er . \Y : VA B SO2Cl SO,—NH—CH—COOH ~ CH NOCH, Ee. OO Ga + HCl 一 > eS : : \Y aR SO,—NH—CH— C —O—SOz,z a (CH3)a NCCE £3 ee cage OO VA | y | R | SO,—NH2 SO; (DNS-NH,) 在 p 也 高 的 情况 下 ，DNS_C1 要 水 解 ， 有 副 产 物 DNS OH. oat ee aw. 一 88 一 Ae ae N(CH): ae N(CHa3)2 em hears +H,O— 2 +HCl \G 7 MA SO,.Cl SO,—OH (DNS-OH) DNS-NH 和 DNS-OH 在 紫外 光照 射 下 ， 产 生 蓝 色 欧 光 , 可 以 与 DNS- 氨 基 酸 所 呈现 的 黄色 获 光 区 别 开 来 , LEH 图 谱 上 还 可 以 借助 它们 的 位 置 来 确定 氨基 酸 的 种 类 。 本 实验 选用 聚 酰胺 薄膜 对 DNS- 氨 基 酸 进行 双 相 层 析 《 层 析 原理 见 实 验 五 ), KPT ARR, DNS-RERER 酰胺 薄膜 上 的 荧光 点 也 不 易 消 失 , 可 保存 较 和 久 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 标准 氨基 酸 溶液 : MRRBRAR, BAR. ABABA AR. MAR. AAR. AAR. HAR. FAR MARE 0.5 ho, ARAR. ZAR. FAMERS 2 B5t, THB 13 X 小 指 管 中 , 1 SH 0.2M 碳酸 氧 钠 溶解 。 混合 标准 氨基 酸 溶液 : 氨基 酸 品 种 和 称 量 同 标准 氨基 栈 溶液 。 各 种 氨基 酸 称 量 后 放 在 同一 支 小 指 管 中 ， 用 0.227 碳 PRA PYAR 1 毫升 溶解 。 胰岛 素 溶 液 : 2 毫克 胰岛 素 用 0.2 RRA AR 1S 升 深 解 ,使 成 2 毫克 /毫升 浓度 。 聚 酰胺 薄膜 (浙江 黄岩 化 学 分 析 材 料 厂 ) 4x 8 厘米 ,4x4 厘米 ; 精密 试纸 PHO.5~5.0, 2. 仪器 小 指 管 1x.10 厘米 (x 20); 毛细 管内 径 0.5 毫米 ; WE; APT MT 12x 20 厘米 。 紫外 层 析 灯 ( 上 海 科 艺 光 学 仪器 厂 ); 真空 泵 ; 温 箱 ; 烘箱 ; FAK A; R; 铅笔 。 3. 试剂 0.2 人 履 碳 酸 氨 钠 溶液 : 用 无 离子 水 配制 ， 并 用 所 氧化 钠 溶 液 调 pH & 9.8, BMRA: 3. 1d: FARR (85~95%): 7K =1.5:100(V/V) SS UA: AR: UK BRR =9:10V/V) | DNS-Cl 丙酮 溶液 : 用 丙酮 (分 析 纯 ) Aca 2.5 2 yi, / 2 升 溶 液 ( 密 闭 , 冰箱 保存 )。 ON 盐酸 溶液 ; 1AV 盐酸 溶液 ; 水 饱和 的 < | 四 、 操 作 步 骤 本 实验 分 二 部 分 一 DNs- 2a AE 岛 素 N- 未 端的 测定 。 (—)DNS-A RM RRM BBA 1, DNS- ze mR til 4 | 以 滴 管 吸取 各 种 标准 氨基 酸 溶液 及 氨基 酸 混 合 溶液 2 滴 ， 注入 小 指 管内 ， 然 后 加 入 2 滴 ( 等 体积 )DNS-CLl 丙酮 溶液 , 摇 匀 , 以 胶布 封 住 管 口 , 40C 温 箱 保 温 30 分 钟 。 取 出 , 电 吹 风 热 风 吹 去 丙酮 , 以 LV th pH 2~2.5， 加 入 水 饱和 的 乙 酸 乙 酯 4~5 7H, HY, LE CR Ons 2 含 DNS- 氨 基 酸 。 2. RRO | 取 二 张 (4x8 厘米 ) 聚 酰胺 薄膜 ,在 离 底 边 0.6 厘米 处 用 管 将 各 种 DNS- 氨 基 酸 (注意 取 乙 酸 乙 酯 相 , 不 要 取水 相 )， 分 别 点 在 相应 的 点 子 上 ， 每 个 样品 点 样 直径 不 超过 2 毫米 。 点 样 量 以 在 紫外 层 析 灯 下 能 见 明 亮 荧光 为 佳 。 点 样 后 二 张 膜 分 别 放 入 甲酸 :水 系统 与 葵 : 冰 醋酸 系统 内 进行 单 向 层 析 ， 待 溶 剂 前 沿 达到 离 膜 顶 端 0.3 厘米 处 取出 , 除去 膜 上 溶剂 , 在 紫外 层 析 灯 下 观察 结果 并 画 出 各 斑点 位 置 ， 计 算 各 DNS- 氨 基 栈 在 上 述 两 相 溶剂 系统 中 的 Ri 值 。 另 取 一 张 聚 酰胺 薄膜 (4x 半 厘米 )， 在 左下 角 距 二 边 0.6 厘米 处 ， 轻 轻 画 一 点 子 作为 原点 。 用 毛细 管 将 标准 DNS- 氢 基 酸 混合 液 点 样 于 此 点 内 , 点 样 直径 不 超过 2 毫米 , 然后 进行 双向 层 析 。 以 甲酸 -水 系统 作为 第 一 向 层 析 , 层 析 后 取出 用 电 吹风 除 尽 溶剂 , 再 放 入 葵 - 冰 醋酸 系统 作 第 二 向 层 析 。 取 出 膜 并 待 膜 干 燥 后 于 紫外 层 析 灯 下 观察 结果 并 记录 各 斑点 位 置 。 3. 将 DNS- 氨 基 酸 混合 液 双 向 层 析 后 各 斑点 的 位 置 与 前 二 张 DNS- 氨 基 酸 单 向 层 析 结果 比较 确定 各 DNS- 氨 基 酸 在 双向 层 析 后 的 位 置 。 < Ile WU = Leug) Val Tyr @) © Met @ DNS NE 站 a 2) bys \\ aly 关 Glu@> © Thr # As © ? O Ser o His e CYS CLD © e-Lys 原点 DNS-OH Arg 一 一 一 甲酸 :水 Li 图 14 _ DNS- 氨基酸 双向 层 析 图 谱 图 14 DNS- 氨基酸 的 层 析 图 谱 可 作 参 考 。 (=) 胰岛素 N- 未 端 测 定 1. DNS- 胰岛素 的 制备 取 胰 岛 素 溶 液 3 滴 于 小 指 管内 ， 加 入 3 i DNS-Cl 丙酮 溶液 ， 播 匀 ， 胶 布 封口 后 于 40"C 保 温 半 小 时 。 Ri aR F, 残 剩 固体 物 即 为 DNS- 胰 岛 素 。 2. KERR MW KMR DNS- 氮 基 酸 提取 在 含 DNS- 胰 岛 素 的 小 指 管内 加 0.2 BF 6N HCl, 在 煤 气 籽 上 将 管 口 封闭 ,于 110'C 烘 箱 内 水 解 12 小 时 左右 。 水 解 后 打开 封口 , REF 100 CH AA AF. MM 2 滴 0.2M NaHCO, 溶解 剩 留 物 ， 并 用 1N HCL 调 至 pHo~2.5 (注意 尽量 小 体 BA), 加 入 水 饱和 乙酸 乙 酯 5~6 滴 , 有 机 相 内 即 含有 DNS- 氨 基 酸 (胰岛 素 N- 末 端的 氨基 酸 )。 3. 层 析 以 毛细 管 吸取 上 述 有 机 相 点 样 于 聚 酰胺 菏 膜 (4x4 有 厘米 ) 的 左下 端 离 二 边 端 线 0.6 厘米 处 , 点 样 直 径 不 超过 2 BK, 点 样 后 在 紫外 灯 下 检查 以 见 到 明亮 荧光 为 佳 。 在 与 原点 相对 的 “ 另 二 边缘 分 别 点 上 对 照 用 DNS-Gly 与 DNS-Phe。 于 甲酸 -水 系统 走 第 一 向 层 析 , KARA, DAE 乙酸 系统 走 第 二 向 层 析 ， 溶 剂 前 沿 不 要 走 到 标准 氨基 酸 对 照 Ao 层 析 结束 , 待 膜 干燥 后 , 于 紫外 层 析 灯 下 观察 结果 。 4. 将 上 述 层 析 谱 与 DNS- 氨 基 酸 标准 图 谱 比 较 , 由 其 相 对 位 置 确定 胰岛 素 N- 末 端的 氨基 酸 种 类 。 对 照 点 作为 进 一 步 确定 N- 末 端 氨基 酸 种 类 的 参考 。 另外 , 在 胰岛 素 NAMM EBL, ROR PAR DNS-Phe 和 DNS-Gly 二 点 外 ， 在 8-DNS-Lys #1 O-DNS- Tyr 位 置 上 也 有 荧光 斑点 , 这 是 胰岛 素 的 氨基 酸 组 份 内 , BA ~ %— 酸 和 赖 氨 酸 残 基 的 侧 链 基 团 与 DNS-CI 作用 的 产物 ， 它 不 属 于 人 -末端 的 氨基 酸 , 因为 如 果 是 N- 末 端 氨基 酸 , 那么 应 该 在 Bis-DNS-Tyr 及 Bis-DNS-Lys 的 位 置 上 产生 荧光 斑点 。 DNS-Phe: ae EVK BGS DNS-Gly 图 15 点 样 示意 图 II 相 FE: VK ° QP O-Tyr © e-Lys ee BRK fa 图 16 ”胰岛素 N- 未 端 层 析 图 谱 28. REA RINE 一 、 目 的 学 习 从 血液 中 分 离 红细胞 并 制备 珠 蛋 白 的 方法 ;掌握 二 硝 基 氟 化 苯 法 定性 测定 珠 蛋 白 N- 未 端 氮 基 酸 的 方法 。 二 、 原 理 血液 可 分 为 血浆 和 血细胞 两 部 分 。 血 浆 占 全 血 容 积 的 55 儿 ， 血 细胞 占 生 多 。 血 细胞 中 大 部 分 是 红细胞 ， 红 细胞 除 65D KAS, 主要 成 分 是 血红 蛋白 ( 约 32 多 )。: 血 红 蛋 白 是 : 一 种 色素 蛋白 , 由 珠 蛋白 和 血色 素 复 合 而 成 。 为 了 制备 珠 蛋白 , 首先 必须 得 到 自由 状态 的 红血球 。 这 可 以 在 新 鲜 全 血 中 加 入 抗 凝 剂 一 一 柠檬 酸 钠 或 草酸 钠 ， 使 血液 不 凝结 , 经 离心 取 下 层 红 血球 ， 加 水 使 胞 壁 膨胀 破裂 ; 或 用 忆 醚 ,甲苯 等 破坏 红血球 膜 ,使 血红 蛋白 释放 出 来 ,再 用 酸性 丙酮 处 理 , 脱 去 血色 素 , 获得 无 色 的 珠 蛋白 。 为 了 增加 血红 蛋白 的 、 稳定 性 , 在 制备 过 程 中 可 通 入 一 氧化 碳 , 制 成 碳 氧 血 红 蛋 白 。 制备 好 的 珠 蛋 白 可 采用 二 硝 基 氟 化 茉 法 (简称 FDNB 法 ) 进行 N- 未 端 氨 基 酸 的 测定 。 FDNB( 二 硝 基 氟 茶 ) 在 PH8.5~-9.0、 室温 条 件 下 与 蛋白 质 或 肽 的 自由 氨基 定量 而 迅速 地 缩合 为 DNP- 和 蛋白 “〈 二 硝 基 葵 基 蛋白 ) 或 DNP- 肽 (二 硝 基 葵 基 肽 )。 由 于 DNP 与 游离 氨 基 缩 合 的 键 结合 很 牢固 ， 不 易 被 酸 水 解 , 因此 当 酸 解 时 ， 其 他 肽 键 都 已 打开 , 而 二 硝 基 葵 基 团 仍 和 N- 端 氨基 酸 形成 DNP- 氨基 酸 , 这 种 黄色 的 DNP- 氨 基 酸 能 溶解 在 有 机 溶剂 中 , 因此 可 用 乙醚 将 其 抽 提 出 来 。 然 后 经 纸 上 层 析 或 聚 酰胺 薄膜 层 析 ， 根据 其 Ri 值 , 鉴定 N- 未 端 氮 基 酸 。 如 果 将 黄色 的 DNP- 氨 基 酸 斑 点 从 纸 上 洗 下 来 , 用 分 光 光 度 计 可 以 进一步 定量 测定 。 P : ‘ fq 1 4 «4% %. of ye - ede a Tomes FDNB 法 的 反应 过 程 如 下 : : o,n< yer “7 NOs FDNB t 1 Pr 全 人 ‘~~ 4 ~ ee oe: gy SMS te ee oe ee ha Re Ee Tt sO ae ee BH cO— NH Gea oon NH eae : R, R, Ra 蛋白 质 [em 8.5 ~ 9, Bill BR 40°C O, Nagoo- NE os CO «+s NH en COOH | R, R, ; Ra NO, DNP 一 蛋白 质 5.7NHCl 3 100 ~ 110°C 水解 16 小 时 O.N NA coe tana +-NH, OHEOON NO, Ry . Rea+ nm DNP-AER BIER 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 猪 血 或 免 血 。 DN PA AR on HE. 用 丙酮 配 成 1 毫克 /毫升 的 溶液。 透析 袋 1x7 厘米 ; 层 析 滤 纸 10x 22 厘米 ; 精密 试纸 PH 8.2~10; 黑色 纸 ; RE. 2. Mat 小 试管 1x 10 厘米 (x 1); 刻度 离心 管 (x 3): Bia 10 毫 升 (x1); 分 液 漏斗 中 毫升 (x 1), 100 毫升 (x 1D); 布 氏 漏斗 4 厘米 4(x 1); RYE 250 毫升 (x 1); 三 角 烧 瓶 50 毫升 (x 1); 灯泡 瓶 100 毫升 (x 1); Rit; 毛细 管内 径 0.5 BK; WH; 玻 棒 。 离心 机 ; 天 平 ; 烘箱 ; 尺 ; 铅笔 。 3. 试剂 酸性 丙酮 : 丙酮 :2MV 盐酸 =79:1(V/V)。 2.5% FDNB ZHI: 2.5 MAEM 100 毫 升 无 水 乙醇 中 。 0.2M 磷 酸 缓冲 液 pH6.0. 12.3 毫升 0.2 民 磷酸 氢 二 钠 (Na,HPO,-12H20 71.64 52/Ft) Fi 87.7 BH 0.2M 磷酸 二 4 i (NaH,PO,-2H,O 31.21 克 / 升 ) 混 合 而 成 。- 5.7N 盐酸 ( 重 燕 二 次 ); 10% RRA; 0.9% MLM; Z Ak; 丙酮 。 四 、 操 作 步 又 1. 红细胞 的 制备 8 在 刻度 离心 管 中 放 入 除去 血 纤 维和 蛋白 (预先 用 竹 后 轻 轻 $45 2 UL RBRA) AY UK 5 EFL, 3000 转 /分 离心 10 分 钟 , 仔细 吸出 上 层 清 液 , 并 弃 去 。 沉 淀 用 0.9% ALAWAR, EM 涤 时 小 心 搅动 勿 使 红细胞 破裂 , 然后 离心 去 除 清洗 液 , 如 此 反 复 洗 涤 4~ 护 次 。 将 清洗 净 的 红细胞 移入 三 角 瓶 中 , 在 通风 柜 中 缓慢 通 入 煤气 10~20 分 钟 (在 缺乏 煤气 设备 条 件 时 ， 可 采 用 甲酸 和 硫酸 反应 生成 一 氧化 碳 )， 使 形成 稳定 的 碳 氧 血红 蛋 Ao , : = 96 — 2. 血红 蛋白 的 制备 在 上 述 制 备 好 的 红血球 中 加 入 等 体积 的 乙醚 和 水 的 混合 物 [ 乙 醚 :水 =1:1(V/V)]， 使 红血球 充分 溶血 。3000 转 /分 离心 10 分 钟 , 小 心 吸取 中 层 红色 的 血红 蛋白 ， 弃 去 下 层 杂 质 和 上 层 乙 醚 及 乙醚 底部 的 油状 残 酒 。 吸 出 的 血红 和 蛋白 放 在 透 Pras, WAR KET 24 小 时 , 直到 乙醚 气味 除 净 。 3. 珠 蛋 白 的 制备 将 上 述 透 析 好 的 血红 蛋白 转移 到 三 角 瓶 中 , 加 入 10 倍 体 积 的 酸性 丙酮 ， 经 激烈 振 葛 15 分 钟 后 有 大 量 沉 淀 产生 ， 然 后 经 布 氏 漏斗 抽 滤 , 沉淀 用 少量 丙酮 洗涤 三 次 , 去 除 棕 红 色 的 血 AH, 即 可 获得 粉 未 状 的 白色 珠 蛋 白 , 经 干燥 后 称 重 。 4. DNP- 珠 蛋白 的 制备 称 取 珠 蛋白 100 毫克 ， 放 在 离心 管内 ， 加 1 工 毫升 10 狗 碳 酸 氢 钠 并 搅拌 溶解 , DH 调 至 8.5~9.0 再 加 入 2.5% FDNB 乙醇 溶液 3 SH, 立即 用 橡皮 塞 塞 紧 管 口 , 试管 外 用 黑色 纸 包 Je, 经 激烈 振 葛 15 分 钟 , 即 有 黄色 DNPE- 珠 蛋白 沉淀 生成 , 继 续 维 持 PH FE 8.5~9.0 之 间 ， 并 间歇 振 功 ，45 分 钟 后 离心 ， 弃 去 上 清 液 ， 沉 淀 用 水 洗涤 二 次 (每 次 用 5 毫升 )， 乙 醇 洗 二 次 , 最 后 用 乙醚 洗 二 次 (每 次 用 3 SH), 经 抽 滤 后 得 到 草绿 色 的 粉末 状 DNP- 珠 蛋白 。 5. DNP- 珠 蛋白 的 水 解 称 取 上 述 DNP- 珠 蛋白 50 毫克 ， 放 在 小 试管 中 ,加 入 3 毫升 5.7N 盐酸 , Kin FA MRI, 150~160°C Ht Ai 7k MF 2 小 时 (或 110°C 7k ft 16 一 24 小 时 )。 6. DNP- 氨 基 酸 提取 打开 DNE- 珠 蛋白 的 水 解 管 , 取出 水 解 液 放 在 25 毫升 的 分 液 漏斗 中 ,用 45 毫升 乙醚 分 三 次 提取 , 合并 乙醚 抽 提 液 , 置 于 100 毫升 分 液 漏斗 中 , 用 5 毫升 水 洗涤 二 次 , 然后 将 分 离 的 乙醚 层 放 入 灯泡 瓶 ， 经 减 压 抽 气 去 除 乙 醚 ， 剩 下 的 黄色 物 ( 含 “ 有 少量 水 分 ) 用 0.2 毫升 丙酮 溶解 , 此 即 为 DNE- 和 氨基酸。 7. DNPE- 氨 基 酸 的 纸 层 析 鉴 定 . 取 10x29 厘米 的 滤纸 一 张 , 在 距 纸 边 2.5 厘米 处 划一 基 线 , 并 取 三 点 ， 然后 用 毛细 管 分 别 吸 取 DNE- 顷 氨 酸 、DNE- NH, 和 了 DDNPE- 末 端 氨基 酸 点 样 ， 点 样 斑点 干燥 后 放 在 盛 有 0.24 磷酸 缓冲 液 (PH6 .0) 的 层 术 条 中 层 析 1~2 HN, Bot 结束 后 取出 滤纸 上 晾 干 , 观察 结果 , 即 可 看 到 了 NEPE- 氨 基 酸 的 黄 色 斑 点 (如 果 层 析 滤 纸 用 浓 盐 酸 标 一 下 ,在 二 硝 基 氟 苯 的 斑点 上 5 分 钟 后 黄色 会 褪去 ,而 DNPE- 氨 基 酸 斑点 不 会 褪去 )， 根 ig DNPE- 氢 基 酸 的 下 值 和 标准 DNE- 顷 所 酸 下 : 值 对 比 可 以 知道 珠 蛋白 的 N- 末 端 氨基 酸 。 在 DNP 化 过 程 中 , SR 子 存在 会 产生 DNP-NH2:， 因 此 用 氢 氧 化 贸 与 EDNB 作用 形 成 DNE-NH2 在 层 析 时 作为 对 照 点 样 。 29. Fi Fe BH BEBO OT RE Pe 一 、 目 的 掌握 葡 聚 糖 凝 胶 的 特性 及 凝 胶 过 滤 的 原理 和 方法 。 二 原理 凝 胶 过 滤 是 广泛 应 用 于 蛋白 质 、 酶 、 核 酸 等 生物 高 分 子 的 分 离 分 析 的 有 效 方法 之 一 ， 它 是 以 被 分 离 物质 的 分 子 量 差异 为 基础 的 一 种 层 析 方法 。 此 类 层 析 的 固 相 载体 是 具有 分 子 得 性 质 的 凝 胶 。 目 前 使 用 较 多 的 是 具有 各 种 孔径 范围 的 葡 聚 糖 凝 胶 ( 商 品名 为 Sephadex)， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 ( 商 品名 为 Bio- gel) 以 及 琼脂 糖 凝 胶 (商品 名 为 Sepharose)。 此 外 还 有 这 些 凝 胶 的 各 类 衍生 物 ， 此 处 不 二 一 例 举 。 本 实验 以 葡 聚 糖 凝 胶 为 例 学 习 凝 胶 过 滤 的 一 般 原理 及 方法 。 Pett eae CLE ed font 甘油 基 以 本 桥 (一 0 一 CH 一 CH 一 CH 一 9 一 ) Hes 30m 形成 三 维 空间 的 网 状 结构 而 组 成 ， 是 一 种 水 不 溶性 物质 。 通 OH tak PN SEE th Se NDEI RD Se A AG BR LD HB I 条 件 可 控制 交 联 度 而 获得 具有 不 同 “ 网 眼 ” 的 凝 腕 。 “网 眼 ” 的 大 夏 决 定 了 被 分 离 物 质 能 够 自由 出 入 凝 胶 内 部 的 分 子 量 范 9 O—CH; CH, O CHOH H/YH H CH; NOE # CH, O | H OH H ei H H Bp HO U CH, OHOH H OH HAS ONE es f O OH H O = O | H OH CH, ¥ CH, nt 8 WO OH #H O——OH, nie H OH ek nO : HEN ee CH: ‘H OH np O. H OH H ape H OH 交 联 葡 聚 糖 的 化 学 结构 和 sie sd Be“ ee ay.) tanita 围 。 它 们 可 分 离 的 分 子 量 从 几 百 到 数 十 万 不 等 。 HP sR AARP NS BES AK et OW 28, Ae ee RA 有 很 强 的 亲 水 性 ， 能 在 水 和 电解 质 溶 液 中 膨胀 。 凝 胶 的 交 联 BERK, 孔径 愈 小 , 吸水 量 少 , 随 之 膨胀 度 也 就 愈 小 ; 反之 若 凝 胶 交 联 度 愈 小 ,孔径 愈 大 , 吸水 量 大 ， 因 而 膨胀 度 也 愈 大 。 不 同型 号 的 交 联 葡 聚 糖 用 G 表示 (\ 如 G-25, G-100 ), G Jai 的 数字 为 凝 胶 的 吸水 量 〈 毫 升水 / 克 于 胶 ) 乘 以 10 得 到 的 数 ， 如 C-25 即 表 示 此 型 号 凝 胶 吸 水 量 是 2.5 毫 升 / 克 干 胶 。 各 种 型 号 交 联 葡 聚 糖 的 主要 物理 性 质 见 附录 6。 进行 工作 时 一 般 根据 欲 分 离 物质 的 大 小 及 工作 目的 来 选 择 合适 的 葡 育 糖 凝 胶 装 层 析 柱 。 待 分 离 的 物质 通过 此 柱 时 ， 它们 相互 之 间 由 于 分 子 量 大 小 各 不 相同 以 及 在 固定 相 上 的 阻 清 作 用 的 差异 而 在 柱 中 以 不 同 的 速率 移动 。 分 子 量 大 于 允许 进入 凝 胶 ` 网 眼 范围 的 物质 完全 被 凝 胶 排 阻 ， 不 能 进入 凝 胶 颗粒 内 部 , 阻 滞 作 用 小 ， 随 着 溶剂 在 凝 胶 颗 粒 之 间 流 动 , 因此 . 流程 短 , 移动 速度 快 而 先 流出 层 析 柱 ; 分 子 量 小 的 物质 可 完全 图 17。 凝 胶 层 析 简 单 原理 示意 图 Qe; @ 大 分 子 。 @ MENT + 小 分 子 Ort We =o a - en oF ee 渗入 凝 胶 颗 粒 , 阻 滞 作 用 大 , 流程 长 , 移动 速度 慢 , 从 层 析 柱 中 流出 就 较 晚 。 若 物质 分 子 量 介 于 完全 排 阻 物质 和 完全 渗入 北 胶 物 质 的 分 子 量 之 间 ， 则 在 前 二 者 之 间 从 柱 中 流出 。 由 此 就 可 达到 分 离 的 目的 。 本 实验 采用 葡 聚 糖 凝 胶 G-50 作为 固 相 载体 ， 它 适用 于 分 子 量 范围 在 1500~30000 之 间 的 多 肽 与 蛋白 质 的 分 离 。 当 蓝 色 葡 聚 糖 2000( 分 子 量 200 WUE, 蓝 色 )， 细 胞 色素 c (分 子 量 12400, 红色 ) 和 DNP- 甘 氨 酸 (分 子 量 255, 黄色 ) 的 混合 物流 经 层 析 柱 时 ， 三 种 有 色 物 质 的 分 级 分 离 明 显 可 见 。 蓝 色 葡 聚 糖 因 全 排 阻 而 首先 流出 ， 细 胞 色素 c MBA BER 内 部 较 次 流出 ，DNP- 甘 氨 酸 则 完全 渗入 凝 胶 内 部 而 最 后 流 出 。 通 过 作 洗 脱 曲线 可 以 清楚 地 表示 出 葡 聚 糖 凝 胶 G-50 对 这 三 种 物质 的 分 离 效果 。 鉴于 凝 胶 是 一 种 不 带电 荷 的 隋 性 物质 ， 本 身 不 会 与 被 分 离 物 质 相 互 作用 , 因而 分 离 效 果 好 , 重复 性 高 。 凝 胶 过 滤 所 需 仪器 设备 简单 , 操作 简便 , 每 次 样品 洗 脱 完毕 则 已 经 再 生 可 反 复 使 用 。 这 些 优 点 使 凝 胶 过 滤 法 应 用 广泛 ， 成 为 一 种 前 途 广 阔 的 分 离 分 析 方 法 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 Aaj BE BE ee WE G-50(Sephadex G-50, 28~80 微米 , Phar- macia 进口 分 装 ); 蓝 色 葡 聚 糖 2000( Pharmacia); 细胞 色素 《生化 试剂 ,上海 酵母 厂 ); DNPE- 甘 氨 酸 (生化 试剂 ,上 海 东 风 试剂 厂 )。 2， 仪 器 吸管 1 毫升 (x1); 层 析 柱 1x 20 厘米 (x 1); 刻度 离心 管 (x 4); 小 试管 1x7.5 厘米 (x 40); 烧杯 5 毫升 (x1)，100 B < Ft (Cx 2); 灯泡 瓶 (x 1); 滴 管 ; BE. 分 析 天 平 ; BF; 秒表 ; KB. 3. 试剂 洗 脱 液 -一 一 0.05M Tris- 盐 酸 ，pPH7.5，0.1M7 氧 化 钾 洲 WK: 称 取 12.12 克 Tris (=]HP RAR GE), 15 克 氯 化 钾 ， | 先 用 少量 水 溶解 ， 再 加 入 6.67 毫升 浓 盐 酸 ， 以 蒸 饮水 定 容 到 2000 ZF, DO. EDR 1. BEBE YAK 称 取 3 克 SephadexG-50 加 入 到 50 毫升 蒸 饮 水 内 , 室温 溶 胀 6 小 时 或 沸水 浴 溶 胀 2 小 时 , 一 般 常 采用 后 一 种 方法 。 泪 水 浴 溶 胀 不 但 节约 时 间 ， 而 且 可 消毒 ， 除 去 凝 胶 中 污染 的 细 菌 和 排除 凝 胶 内 的 气泡 。 用 倾 泌 法 除去 凝 胶 上 层 水 及 细小 颗 粒 , 反复 以 蒸 饮水 洗涤 直至 无 细小 颗粒 止 ( 细 小 颗粒 的 存在 会 影响 层 析 的 流速 凝 胶 以 洗 脱 液 洗 活 几 次 后 放 在 灯泡 瓶 内 ， 水 和 泵 抽 气 除去 气泡 。 iii 2. 3B: 洗 净 的 层 析 柱 保持 垂直 位 置 , 柱 内 装 放 洗 脱 液 , 排除 层 析 柱 滤 板 下 的 空气 ,关闭 出 口 ， 柱 内 留 下 约 10 毫升 洗 脱 液 。 加 入 搅拌 均匀 的 葡 聚 糖 凝 胶 G-50 的 浆液 , 打开 柱 底部 出 口 , 调 节 流 速 0.3 毫升 /分 。 凝 胶 随 柱 内 溶液 慢 慢 流下 而 均匀 沉降 到 层 析 柱 底部 , 不断 补 入 凝 胶 浆 直 到 凝 胶 床 高 15 JK Ik, PR 面 上 保持 有 洗 脱 液 。 操 作 过 程 中 注意 不 能 让 凝 胶 床 表面 露出 液 面 ,并 防止 层 析 床 内 出 现 “ 纹 路 "。 关 闭 出 口 。 3. 加 样 称 取 蓝 色 葡 聚 糖 2000 0.5~ 江 毫克 ， 细 胞 色素 c1.0~ 1.5 毫克 , DNP- 甘 氨 酸 0.2~0.3 BH, 溶 于 0.5 AEF <= 102 用 滴 管 吸 去 凝 胶 床 顶 部 大 部 分 液体 ， 打 开 出 口 使 洗 脱 液 恰 流 到 床 表面 止 ， 关 闭 出 口 。 小 必 地 把 上 述 样 品 加 于 柱 内 成 一 薄 层 ， 切 纪 搅 动 床 表面 。 打 开 出 口 使 样品 溶液 渗入 凝 胶 内 并 开始 收集 流出 液 计 量 体 积 。 用 0.5 一 1 毫升 洗 脱 液 洗 凝 胶 床 表 面 二 次 ， 在 尽量 不 稀释 样品 溶液 同时 使 样品 完全 进入 凝 胶 柱 内 , 当 液 面 降 至 床 表面 时 ， sedate hashed tbne oes 床 面 露出 液 面 。 4A. 洗 脱 与 收集 调节 洗 脱 液 流速 为 0.3 毫升 /分 。 仔 细 观 察 样 品 在 层 析 柱 内 的 分 离 现象 ,收集 并 量 取 洗 脱 液体 积 ， 当 达 4 毫升 后 , 开 始 用 刻度 离心 管 每 隔 0.3 毫升 收集 一 管 ， 用 肉眼 观察 并 以 -， +, ++, +++ 符 号 记录 三 种 物质 洗 脱 液 的 颜色 及 深浅 程度 。 5. 绘制 洗 脱 曲 线 以 洗 脱 管 数 为 横 坐 标 ， 洗 脱 液 的 颜色 强度 〈-，+，++， ee RN MRS HEA 标 纸 上 作 图 ， 即 得 洗 脱 曲线 。 本 洗 脱 管 数 图 18 洗 脱 曲线 ~~ 103 一 \ te A aes eet. 30. 蛋白 质 分 子 量 测定 (一 ) 一 一 SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 法 2 一 、 目 的 学 习 >D>- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 技术 , 并 用 于 测定 蛋白 质 的 分 子 量 。 二 、 原 理 >Ds- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 即 是 在 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 系 统 - 中 引进 SDS (+o), 蛋白 质 在 一 定 浓度 的 SDS 溶液 中 , 与 >Ds 分 子 按 比例 结合 ，SDs 能 破坏 蛋白 质 分 子 间 以 及 与 其 他 物质 分 子 间 的 非 共 价 键 ， 使 蛋白 质变 性 并 失去 原 ， 有 的 空间 构 型 ,形成 带 负电 荷 的 SDs- 蛋 白质 复合 物 。 这 种 复 合 物 由 于 结合 了 大 量 的 *D>， 使 蛋白 质 丧 失 了 原 有 的 电荷 状 AS» 形成 仅 保持 原 有 分 子 大 小 为 特征 的 负离子 团 块 , 从 而 降低 或 消除 了 各 种 蛋白 质 分 子 之 间 天 然 的 电荷 差异 。 由 于 SDS 与 蛋白 质 的 结合 是 按 重量 成 比例 的 《 当 SDS 浓度 大 于 工 毫 死 分 子 时 ， 大 多 数 蛋白 质 以 1.4 克 SDS/ 克 蛋白 质 的 比例 结合 妨 因此 在 进行 电泳 时 ， 和 蛋白 质 分 子 的 迁移 速度 仅 取决 于 分 子 大 小 。 当 蛋白 质 分 子 量 在 12, 000~165, 000 ZAR, BARA 迁移 率 和 分 子 量 的 对 数 呈 直线 关系 , 符合 下 式 : log MW=K—bxX AP, MW 为 分 子 量 , XALBR, KBAR. AH 已 知 分 子 量 的 标准 蛋白 质 的 迁移 率 对 分 子 量 的 对 数 作 图 ， 可 获得 一 条 标准 曲线 。 未 知 蛋白 质 在 相同 条 件 下 进行 电泳 ， 根 据 它 的 电泳 迁移 率 即 可 在 标准 曲线 上 求 得 分 子 量 。 有 人 对 37 种 不 同 的 已 知 分子 量 的 多 肽 链 进行 测定 , RS BOS 图 19)。 w= 104 = 采用 SDS- 聚 丙烯 酰 胺 。 ， BERRI KM EARS 8 BM, DACSHHO HR, 7 否则 由 于 蛋白 质 分 子 结合 ° SDS 量 较 少 , 而 使 结果 偏 低 ， 5 因此 在 用 SDS 处 理 样 品 同 .4 时 往往 用 琶 基 乙醇 处 理 。 斑 基 乙 醇 是 一 种 强 还 原 剂 ， 它 使 被 还 原 的 二 硫 键 不 易 再 氧 化 ， 从 而 使 很 多 不 溶性 蛋白 ° 质 溶解 而 与 SDS 定量 结合 。 “ ， 采用 本 方法 测定 分 子 量 HH, BRE, WHEN +10%, its, BRMRE 7 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 迁移 率 简单 , 样品 微量 , 能 适用 于 较 广 的 分 子 量 范围 内 样品 的 测 定 ; 用 此 法 测定 所 得 结果 与 其 他 理化 方法 得 到 的 结果 基 _ 本 相符 合 ， 所 以 它 是 一 种 很 图 19 37 种 不 同 多肽 链 (分 子 = 11, 000~70, 000) 用 SDS- 凝 胶 电泳 测 其 分 子 量 图 ” 蛋白 质 样 品 在 0.012 磷酸 钠 组 冲 液 pH7.0-1%SDS-1% 8- 综 基 CR fRim 87°C 2 小 时 。 凝 胶 缓 冲 系 统 为 SDS- 磷 酸 钠 中 性 , 10 多 凝 胶 有 前 途 的 方法 。 但 是 对 于 一 些 电荷 特殊 、 构 型 特殊 、 含 碳水 化 合 物 、 带 有 未 还 原 的 SHH 的 “不 正常 ”蛋白 质 会 出 现 迁 移 率 偏 低 而 分 子 量 偏 高 的 现象 ， 对 这 类 样品 分 子 量 的 测定 还 需 用 其 他 测定 方法 作 参 照 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 工 . 实验 材料 牛 血 清白 蛋白 (生化 试剂 ,上 海 东风 试剂 厂 ); 核糖 核酸 酶 《生化 试剂 , 上海 东 风 试 剂 厂 ); 细胞 色素 c (生化 试剂 ,上海 酵 ， 0 * 中 a 了 和 = | FEY); 靡 蛋白 酶 原 。 待 测 分 子 量 的 蛋白 质 样品 。 2. 仪器 玻璃 管 0.6x LOM K(x 10); 吸管 0.1 毫 升 (xT)，1 毫 升 (x1),2 毫升 (x 1), 10 毫升 (x2); 具 塞 子 试管 (x5); 试管 1.5x15 厘米 (x10); 烧杯 50 毫 升 (x 1), 100 毫升 (x 1); 微量 进 样 器 50 微 升 (x5); 灯泡 瓶 (x 1); 注射 器 及 注射 针 (5 号 9 号 ); He; RE. 分 析 天 平 ; 电泳 仪 ; BE HK; 洗 耳 球 ; R; RAB. 3. 试剂 | 凝 胶 缓 冲 液 一 一 0.24 磷酸 ->Ds Brpyy, PHT.0. Pw 酸 二 氢 钠 (NaH:pO,. 2HO， 分 析 纯 7 8.7, BRA—W (NasHpO,.12H2O， 分 析 纯 )51.6 克 ,SDS( 十 二 烷 基 砚 酸 钠 ， 需 以 乙醇 重 结晶 *)2 克 加 蒸馏 水 定 容 到 1000 SF. 电泳 缓冲 液 一 一 0.1 磷酸 -3Ds 缓冲 液 ，PH7.0:， 取 凝 胶 缓冲 液 以 蒸 镶 水 稀释 一 倍 即 成 。 22.2% 丙 烯 酰胺 -0.6 狗 甲 撑 双 丙烯 酰胺 溶液 : 22.2 克 两 烯 酰胺 ，0.6 克 甲 撑 双 丙烯 酰胺 加 水 溶解 ， 定 容 到 100 SF, 滤 去 不 溶 物 , 装 入 棕色 瓶 贮 冰箱 。 过 硫酸 铵 (分 析 纯 溶液: 临 用 前 以 燕 馆 水 配 成 荆 5 毫克 / 毫升 的 溶液 。 处 理 蛋 白 样 品 缓冲 液 一 -0.01M 磷酸 缓冲 液 ，DH7.0- 1% SDS-1 儿 琉 基 乙醇 : 称 取 磷 酸 二 氢 钠 (NaH,pO,-2H,0, 分 析 纯 ) 0.44 克 ， 磷 酸 氢 二 钠 CNa,HpO,-12H,0, 分 析 纯 ) 机 SDS 重 结晶 : 250 克 SDS 加 到 4 H+ 8 多 乙醇 中 , BN. BAN MK 漏斗 过 滤 , 滤液 捞 搓 冷却 到 室温 ， 然 后 4"C 下 搅 搓 过 夜 。 抽 滤 收 集结 局, See 干 ,冷冻 至 完全 干燥 。 2 Sa 1. 标准 蛋白 质 样品 的 制备 分 别称 取 标 准 蛋 白质 样品 牛 血 清白 和 蛋白 (分 子 量 68000)， BEE A Big Jk (Gt Ft 25700)， 核糖 核酸 酶 (分 子 量 13700) AAA 胞 色素 c( 分 子 量 11700)0.5 毫 克 , 置 于 具 塞 小 试管 中 , 加 入 0.5 毫升 处 理 蛋 白 样 品 缓冲 液 。100'C 水 浴 中 保温 2 分 钟 ,冷却 后 加 2 滴 0.05 狗 溴 酚 蓝 溶 液 、4 滴 甘 油 ,混合 均匀 ,保存 于 冰箱 Alo 2. 10% Be BE AY il 4 15 毫 升 凝 胶 缓冲 液 与 13.5 BAS BE A PS LS BE 胺 溶液 混和 , 在 灯泡 瓶 中 用 水 和 泵 抽 气 , 除去 空气 后 , 再 加 入 1.5 毫升 新 鲜 配 制 的 1.5 毫克 / 训 升 过 硫酸 铵 溶液 以 及 0.045 & Ft TEMED, 搅拌 均匀 即 可 装 玻 管 。 玻 璃 管 必须 预先 用 洗 液 浸 泡 并 清洗 干净 , 烘 和 于。 它 的 一 端 用 乳胶 管 与 一 根 长 3 厘米 , 直 径 与 玻璃 管 外 径 相同 的 玻璃 棒 相 接 以 达到 封闭 的 目的 。 玻 管 垂直 地 放 在 架子 上 。 将 上 述 准 备 好 的 凝 胶 溶 液 用 滴 管 加 到 玻 Sa ’ 下 ees ee 管内 直至 离 上 端 1 厘米 处 止 。 用 一 注射 器 通过 注射 针 小 心地 加 蒸馏 水 到 每 支 玻 管 的 凝 胶 溶 液 顶部 ， 注 意 切 纪 搅 动 凝 胶 溶 液 。 这 一 步 又 保证 了 凝 胶 的 聚合 并 形成 平坦 的 凝 胶 玫 面 。20 SF chee 水 与 凝 胶 之 间 出 现 明显 的 界面 ， 玫 示 凝 胶 已 聚 合 , 除去 上 层 水 。 3. 加 样 把 凝 胶管 放 在 电泳 槽 装置 中 , 加 电泳 缓冲 液 到 下 槽 , 轻 轻 裔 凝 胶管 除去 凝 胶 与 缓冲 液 界面 中 的 气泡 ， 同 样 加 电泳 绥 冲 液 到 上 槽 ， 使 凝 胶管 上 端 空隙 内 充满 缓冲 液 。 用 微量 注射 器 吸取 已 处 理 好 的 蛋白 质 样品 溶液 50 微 升 通过 缓冲 液 加 在 雍 胶 表 面 上 , 由 于 样品 比重 大 于 缓冲 液 ， 因此 在 凝 胶 的 顶部 形成 致密 的 一 层 。 每 种 样品 分 别 上 样 于 二 支 凝 胶 上 。 4. 电泳 把 电源 与 电极 接 通 , 阴极 在 上 槽 , 阳极 在 下 槽 。 电 泳 在 每 支 胶 恒定 8 毫 安 电 流下 进行 。 电 瀛 45 小 时 后 , 指示 染料 进 DEBE 3/4 处 即 可 结束 电泳。 用 装 有 长 针头 的 注射 器 把 水 注入 凝 胶 和 管 壁 之 间 ， 使 凝 胶 和 管 壁 脱离 ,用 洗 耳 球 套 住 玻 管 的 一 头 轻 轻 加 压 , BEBE A BE 管内 滑 出 。 用 尺 量 出 每 支 凝 胶 长 度 和 溴 酚 蓝 区 带 中 心 移 动 的 距离 , 作 好 记录 。 5. 染色 和 脱色 将 凝 胶 条 分 别 装 在 各 试管 中 ， 每 支 试 管 上 注 明 是 何 种 蛋 白质 样品 。 加 入 考 马 斯 亮 蓝 Roo 染色 液 ， 覆没 凝 胶 ， 染 色 2~12 小 时 。 倒 去 染色 液 , 凝 胶 以 蒸馏 水 漂洗 几 次 ， 然后 加 入 洗 脱 液 淄 没 凝 胶 进行 扩散 脱色 。 经 常 更 换 脱 色 液 直至 凝 胶 背 景 蓝 色 禄 清 ， 蛋 白色 带 清晰 为 止 。 已 用 过 的 洗 脱 液 可 用 活性 炭 脱色 后 二 。 反复 使 用 。 ”测量 凝 胶 长 度 和 蛋白 质 区 带 移动 的 距离 。 6. 电泳 迁移 率 的 计算 和 标准 曲线 的 制作 _ 按 下 公式 计算 各 蛋白 质 样 品 的 迁移 率 : sym - 恒 自 质 移动 距离 、， ”染色 前 胶 长 脱色 后 胶 长 指示 染料 移动 距离 e 9 | ROA | 脱色 后 | 染料 移动 有 重 白 质 ood “| 了 胶 长 | 胶 长 | 距 高 移 动 距离 _ | CBDR) | CR) | CBDR) | CHDK) 4a AS A (68000) EEE EE ee ee 一 | 一 | | SS | ee 靡 蛋白 酶 原 (25700) ——— ee | rear | ee 核糖 核酸 酶 ~~ (48700) 一 | 一 一 | 一 — qe eer |- 2 细胞 色素 c 1 PAR Ses (11700) 2 以 各 和 蛋白质 样品 迁移 率 作 横 坐标 ， 蛋 白质 分 子 量 的 对 数 作 纵 坐标 ， 在 半 对 数 坐 标 纸 上 作 图 可 得 一 条 测 蛋白 质 分 子 量 的 标准 曲线 。 7. 待 测 样品 的 分 子 量 测定 称 取 待 测 蛋白 质 样品 0.5 毫 克 , 与 标准 蛋白 质 样品 完全 相 同 的 步骤 处 理 , 电泳 , 染色 和 脱色 , 计算 出 相应 的 电泳 迁移 率 。 在 标准 曲线 上 可 求 出 该 样品 的 分 子 量 。 — 109 — 31. 和 蛋白质 分 子 量 测定 (二 ) -一 葡 聚 糖 凝 胶 过 滤 法 ae —,. BR 2 FA eA HE ES =. AE 葡 聚 糖 凝 胶 (Sephadex) 过 波 法 测定 看 白质 分 子 量 的 原 理 , 主要 是 依据 这 种 凝 胶 具有 分 子 得 作用, 一 定型 号 的 凝 胶 具 有 大 体 上 一 定 大 小 的 孔径 。 在 一 定 的 凝 胶 柱 内 ， 凝 胶 孔 隙 所 : 占 的 体积 称 为 内 水 体积 了 ， 凝 胶 颗 粒 间 的 自由 空间 所 占 的 体 积 称 为 外 水 体积 Fu。 当 样 品 流 经 凝 胶 柱 时 , 大 于 孔隙 的 大 分 子 完全 不 渗入 到 凝 胶 内 部 , 只 需 T 体积 的 洗 脱 液 便 可 将 它 由 一 端 洗 脱 到 另 一 端 ， 相 反 如 果 样 品 分 子 小 于 孔隙， 则 需要 VotVi 体积 的 洗 脱 液 , 才能 将 它们 由 一 端 洗 脱 到 另 一 端 。 中 “ 等 分 子 即 分 子 的 大 小 在 上 述 二 种 极限 之 间 ， 其 所 需 洗 脱 液体 积 介 于 两 者 之 间 ， 亿 = 人 十 Ki(O 一 有 <1T)。， Ki 为 分 配 系数 ， 它 表 示 一 种 物质 在 孔隙 内 的 渗透 程度 ， t 加 样 并 开始 洗 脱 图 20 三 个 不 同 大 小 分 子 组 份 在 凝 胶 过 滤 柱 十 的 洗 脱 曲线 示意 图 ig 相当 于 这 种 物质 在 孔 阶 内 所 占 体积 和 孔隙 总 体积 的 比值 ， V.—V, ”如果 假定 蛋白 质 分 子 近 于 球形 ， 同 时 没有 显著 的 水 合作 JA, 则 不 同 大 小 分 子 量 的 蛋白 质 ， 进入 凝 胶 筛 孔 的 程度 不 同 ， 其 洗 脱 体积 取决 于 分 子 大 小 。 当 蛋白 质 分 子 量 在 10, 000~ 150, 000 时 , 蛋白 质 在 葡 育 糖 凝 胶 柱 上 层 析 的 洗 脱 体积 和 分 子 量 的 对 数 呈 直线 关系 。 若 用 已 知 分 子 量 的 标准 蛋白 质 在 一 定 型 号 葡 聚 粳 凝 胶 柱 上 层 析 ， 精 确 测 其 洗 脱 体积 ， 并 以 洗 脱 体 BV. 对 分 子 量 的 对 数 log MW 作 图 ， 可 获得 一 条 标准 曲线 。 未 知 分 子 量 的 蛋白 质 在 相同 条 件 下 进行 凝 胶 层 析 ， 根 据 它 的 “ 洗 脱 体积 即 可 在 标准 曲线 上 求 得 分 子 量 。 采用 本 方法 测定 分 子 量 所 需 设备 简单 , 结果 处 理 方便 , 因 此 近 十 元 年 来 应 用 较 广 泛 ， 但 本 方法 仅 适用 于 轴 比 相近 的 球 状 蛋白 。 对 轴 比 大 的 纤维 蛋白 不 适用 ; 对 含 糖 量 大 于 5 多 的 220 未 200 ey bie 180 一 AEREA BM HF S | | BOE FL Awe aaa eee 140 gz : 3 血清 白 蛋白 saaegp 120 TRE pear e-100 | 80 心 o- 乳 清白 蛋白 入 60 肌 红 蛋白 ny ee oe Ty st es Se EE ee ees Se LE a eee ee ee ee 300 2x103 104 105 106 分 子 量 -图 21 Ve 对 log MW 作 图 洗 脱 液 0.05M Tris-HClpH7.5;0.1M KCl TT — 糖 蛋白 因 有 较 大 的 水 合作 用 ; 测 得 的 分 子 量 偏 高 ; 对 含 铁 蛋 白 质 测定 数据 偏 低 。 因 此 对 这 类 样品 分 子 量 的 测定 还 需要 用 其 他 测定 方法 作 参 考 。 由 于 及 和 柱子 的 大 小 有 关 , 如 果 用 Vie/ Vo 对 分 子 量 的 对 数 作 图 ， 同 样 可 得 到 一 个 线性 关系 的 标准 曲线 。 由 于 及 / 可 以 消除 柱子 大 小 和 吸附 效应 的 影响 ， 因 此 是 比较 好 的 测定 方法 。 1， 细 胞 色素 c 2. 核糖 核酸 酶 ”3. 肌 红 蛋白 4. a- 胰 凝 乳 蛋白 酶 5、 胰 : SAB 6. BEAR 7. 过 氧化 物 酶 8. 卵 清 蛋 A 9. 血清 蛋白 10. K 伴 蛋白 图 22 V,./Vo xt} log MW 作 图 O—O 1.2X184 厘米 柱 交 联 葡 聚 糖 G-75 @—@ 1.1x192 厘米 柱 交 联 葡 聚 糖 G-100 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 牛 血 清白 蛋白 (生化 试剂 ， 上 海 东 风 试 剂 厂 ); ONE 《生化 试剂 ,上 海 东 风 试 剂 厂 ); 细胞 色素 (生化 试剂 ,上 海 酵 BEY); 核糖 核酸 酶 (生化 试剂 ,上 海 东 风 试 剂 厂 ) ee AB AIR 糖 2000 (Pharmacia); Sephadex G- 100(Pharmackt, a2 BR); TER. 2. (Mar Fine mE 1 FC < 1); 称 量 瓶 (x 4); PTH 2.6 x 60 厘米 Cx 1); 洗 脱 液 贮 瓶 5000 毫升 (x 1); 烧杯 500 BFC x1); KH 滤 瓶 (加 橡皮 塞 )500 毫升 (x 1); 滴 管 ; TEE. 151 型 分 光 光 度 计 或 蛋白 核酸 检 出 仪 〈 上 海 闵行 五 金 厂 生产 ); 自动 部 分 收集 器 。 3. 试剂 洗 脱 液 一 -0.05M Tris-HCI 缓 冲 液 , PH7.5,0.1M 氯 化 钾 溶 液 ， 称 取 12.12 克 Tris( 三 羟 甲 基 氮 基 甲烷 ), 15 克 氯 化 钾 , 先 用 少量 无 离子 水 溶解 , 再 加 入 6.67 毫升 浓 盐 酸 ,水 定 容 至 2 升 。 N- 乙 酰 酷 氨 酸 乙 酯 鸳 和 溶液 (以 洗 脱 液 饱 和 )。 四 、 操 作 步 又 1. 溶 胀 凝 胶 称 取 交 联 葡 聚 糖 G-100 15 克 , 加 500 毫升 蒸馏 水 室温 深 AKER BARA AIK OUD). BYR aa, MALE 清 液 , 包括 细 颗 粒 , 然后 再 放 些 蒸馏 水 搅拌 , 静 置 使 凝 胶 下 沉 ， 再 倾 去 上 清 液 ， 至 无 细 颗 粒 为 止 。 溶 胀 平衡 和 漂洗 清 的 凝 胶 经 减 压 抽 气 除去 气泡 , 即 可 准备 装 柱 。 2. 装 柱 取 2.6x60 厘米 层 析 柱 一 根 ， 底 部 用 玻璃 纤维 或 砂 芒 滤 板 衬托 ， 并 要 求 滤 板 下 的 体积 (入 口 处 和 出 口 处 的 混合 室 ) 尽 -可 能 小 ,以 提高 层 析 的 灵敏 度 , 否则 被 分 离 的 组 份 间 重 新 混合 的 可 能 性 就 大 , 其 结果 影响 洗 脱 峰 形 ， 出 现 拖 尾 现象 ， 降 低 分 离 效果 。 在 砂 芒 滤 板 上 覆盖 一 张大 小 与 柱 的 内 径 相 同 的 快速 滤纸 片 。 将 柱 垂直 装 在 铁 架 上 ， 然 后 在 柱 顶 部 通过 橡皮 塞 连 接 一 长 颈 漏 斗 ， 漏 斗 颈 的 直径 约 为 柱 直 径 的 一 半 。 在 柱 中 加 水 或 洗 脱 液 ， 并 将 滤 板 下 气泡 赶 净 ， 使 支持 滤 板 底部 完全 充 oon Ee eg ~~ | —_— si Se al ie 满 液体 ， 然 后 将 柱 的 出 口 关闭 。 把 已 经 党 胀 好 的 凝 胶 调 成 薄 效 ， 从 漏斗 倒 入 柱 内 ， 胶 粒 逐 渐 扩 散 下 沉 , 薄 浆 连续 加 入 , 当 沉 积 的 胶 床 达到 2~3 厘米 高 时 , 打开 柱 的 “ 出 口 ， 并 注意 控制 操作 压 以 均匀 不 变 的 流速 直到 胶 装 完 为 止 。 柱 装 好 后 ， 在 床 的 上 面 盖 上 一 张 滤 纸 片 ,其 大 小 略 小 于 柱 的 内 径 , 以 便 防 止 样品 中 一 些 不 深 物 质 混入 床 中 。 再 以 洗 脱 液 平 衡 层 析 柱 ， 直至 层 析 柱 的 床 高 不 变 为 止 。 柱 装 得 是 否 均匀 ， 可 用 蓝 色 葡 聚 粮 图 29 维持 信 压 次 四 图 “上 柱 检验 ， 如 果 蓝 色 葡 聚 糖色 带 均匀 下 移 , 说 明 柱 子 已 装 好 , 可 以 使 用 。 层 析 柱 的 流速 可 借 操 作 压 来 控制 ， 操 作 压 即 进出 口 液 面 的 高 度 差 ( 图 23)。 凝 胶 床 受 操作 压 的 影响 极为 明显 。 增 加 操 作 压 虽 能 增加 流速 ， 但 时 间 长 久 后 ， 凝 胶 被 压 紧 而 使 流速 减 各 型 Sephadex 的 最 大 承受 压力 型 号 压力 极限 (毫米 H29) G-200 10 G-150 15 G-100 35 G-75 50 G-50~G-10 >100 om Tt ” 慢 。 各 类 凝 胶 能 耐 受 的 最 大 压力 如 表 和 图 24 BA. i 交 联 葡 聚 糖 G-25 下 So ” 心 流速 (毫升 /厘米 ?小 时 ) S no & D ow 10 20 30 40 50 加 在 床上 的 压力 (厘米 20) 24 凝 胶 床 上 所 加 压力 与 洗 脱 速度 的 关系 曲线 3. LF 称 取 0.5 BET 44 BE HH 2000(4} FH 20057 WE) OH, 分 别 放 在 称 量 瓶 中 ， 再 称 取 标 准 蛋 白 牛 血清 白 蛋 日 ATH 68000), SN 352 A (4+ F-43000), 核糖 核酸 酶 (分 子 量 13700)， 细胞 色素 《分子 量 11700) 各 10 毫克 ， 分 别 放 在 各 称 量 瓶 中 ,各 瓶 中 再 加 入 N- 乙 酰 酷 氨 酸 乙 酯 饱和 溶液 0.5 毫升 ， 使 混合 物 溶 解 后 分 别 上 柱 。 样品 上 柱 是 实验 成 败 的 关键 之 一 ， 如 果 引 起 样品 稀释 或 - LEAHY, 会 使 区 带 扩 散 , 影响 层 析 效 果 。 上 样 时 要 尽量 保 持 床 表面 稳定 。 先 打开 柱 的 出 口 ， 待 柱 中 洗 脱 液 流 至 距 床 表 面 1~2 毫米 时 ， 关 闭 出 口 , 用 滴 管 将 溶解 好 的 标准 蛋白 慢 慢 地 小 心 加 至 床 表 面 , 打开 出 口 并 开始 计算 流出 液体 积 , 当 样 品 渗入 床 中 流 至 接近 床 表面 1 毫米 时 关闭 出 口 ， 同 加 样品 时 一 :人 样 小 心地 加 入 少量 洗 脱 液 , 再 打开 柱 的 出 口 ,使 床 表面 的 祥 品 也 全 部 渗入 柱 内 。 这 时 样品 已 经 加 好 ， 在 床 玫 面 再 小 心地 加 入 洗 脱 液 , 使 高 出 床 表面 3~-5 厘米 , 接 上 恒 压 洗 脱 瓶 , 调节 操 “ 作 压 在 30 厘米 以 内 。 4. 收集 和 鉴定 | 将 柱 的 出 口 处 与 部 分 收集 器 相连 接 〈 或 与 蛋白 核酸 检 出 ” 仪 相 连 )。 开 始 层 析 , 流出 液 分 管 收集 (4 毫升 / 管 ) 和 检测 。 收 集 液 可 分 别 在 751 型 分 光 光 度 计 280 毫 微米 测 出 洗 脱 液 吸收 峰 (或 通过 蛋白 核酸 检 出 仪 描记 )。 记 下 各 峰 的 洗 脱 体积 。 待 - 乙酰 酷 氨 酸 乙 酯 洗 脱 峰 出 现 后 ， 按 同样 方法 进行 第 二 个 标准 蛋白 质 样品 的 上 柱 , 操作 方法 和 步骤 同 前 。 将 各 标准 蛋白 质 测 得 的 洗 脱 体积 Ve 对 它们 的 分 子 量 对 数 作 图 , 获得 一 标准 曲线 。 待 测 蛋白 质 样品 与 标准 蛋白 质 一样 操 作 ， 并 在 同一 柱 上 ， 进行 层 析 , 根据 其 洗 脱 体积 在 标准 曲线 上 查 得 它 的 分 子 量 。 5. BER RAE 实验 后 的 胶 床 一 般 不 必 再 生 ， 但 长 时 间 使 用 后 流速 会 减 慢 , 主要 是 由 于 液 流 把 胶 床 压 紧 的 缘故 , 可 以 用 水 逆向 洗涤 或 ， 重新 装 柱 恢 复 流 速 。 流 速 的 减 慢 也 会 因 灰尘 之 类 沉积 在 胶 床 上 造成 , 在 每 次 实验 结束 后 把 凝 胶 床 顶部 表面 一 层 的 胶 去 除 ， 再 补 些 新 胶 即 可 。 如 果 用 过 的 凝 胶 需 要 长 时 间 保 存 ， 则 以 干燥 成 千 胶 粒 为 宜 。 方 法 是 先 用 水 洗 去 游离 的 分 子 ， 再 用 50% CAME, 胶 粒 中 的 水 分 尽量 除去 , 经 抽 滤 后 放 干燥 器 抽 王 , 接近 王 燥 时 加 1~2 倍 体积 的 98 儿 乙醇， 搅 开 干 凝 胶 块 ， 静 止 0.5~ 工 小 时 ， 如 此 反复 用 乙醇 处 理 3~ 次 ， 抽 王后 放 60~80°C FR, 可 长 期 保存 。 人 五 、 核 酸化 32. 生物 材料 中 总 磷 量 测定 一 一 比 色 法 一 、 目 的 应 用 比 色 法 测定 生物 材料 中 的 总 磷 量 。 二 、 原 理 生物 体 中 有 许多 含 磷 化 合 物 , 如 核酸 、 磷 脂 `.ATP 等 。 磷 的 测定 方法 很 多 ， 有 重量 法 、 比 浊 法 、 比 色 法 等 。 微 量 而 准 确 的 定 磷 方法 常 种 是 生物 化 学 研究 中 必需 的 。 比 色 法 具有 准 确 、 微 量 , 快 速 的 特点 , 被 广泛 应 用 于 生物 化 学 工作 中 。 磷 测 定 的 原理 是 : 有 机 含 磷 物 质 与 浓 硫 酸 〈 同 时 加 入 少 量 硫酸 铜 -硫酸 钾 催 化 剂 ) 共 热 , 使 变 成 无 机 磷酸 , 此 过 程 称 为 消化 。 在 酸性 条 件 下 无 机 磷酸 与 钼 酸根 形成 磷 钼 酸 复 离子 ， 在 还 原 剂 作用 下 磷 钼 酸 复 离子 被 还 原 成 深蓝 色 的 钼 蓝 。 磷 含 量 愈 高 , 则 形成 的 钼 蓝 物 质 亦 多 , 蓝 色 就 愈 深 。 应 用 分 光 光 度 计 在 660 毫 微米 处 可 以 测 得 此 深蓝 色 深 液 的 光 密 度 (OD) 值 ， 通过 与 已 知 浓度 的 标准 磷 深 液 所 测 得 的 OD ooo 值 相 比较 , 就 能 得 到 所 测 样品 中 磷 的 含量 。 核糖 核酸 (RNA) 和 脱氧 核糖 核酸 (DNA) 中 都 含 磷酸 。 BEAT, 纯 的 核酸 含 磷 量 为 9 多。 如 从 核酸 样品 中 测 到 总 磷 量 ， 就 可 计算 出 样品 中 核酸 的 量 。 例 如 某 核 酸 样品 测 得 磷 为 工 毫 克 , 那么 此 样品 中 就 有 11 毫克 核酸 。 生物 有 机 磷 材 料 中 有 时 含有 无 机 磷 杂 质 ， 要 用 定 磷 法 来 Ede =? . Ms oe oak teh 测定 该 有 机 磷 物 质 的 量 时 , 必须 分 别 测定 该 样品 的 总 磷 量 ( 样 品 经 消化 后 所 测 得 的 含 磷 量 ) 以 及 样品 中 的 无 机 磷 含 量 (样品 不 经 消化 而 直接 测 得 的 含 磷 量 )。 将 总 磷 量 减 去 无 机 磷 量 即 为 该 有 机 磷 物 质 的 含 磷 量 。 本 实验 测定 ENA 制品 中 的 含 磷 量 ， 由 于 样品 纯度 较 高 ， 不 必 测 定 无 机 磷 含 量 ， 仅 测 总 磷 量 就 ADs. 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 RNA WR: 在 分 析 天 平 上 精确 称 取 下 NA《〈 上 海 药 用 畏 BL), 以 0.1N 氧 氧化 钠 配 成 5 毫克 /毫升 的 溶液 。 2. 仪器 吸管 1 毫升 (x6),2 毫升 (x2),5 毫升 (x3); 容量 瓶 50 毫升 (x 2); 消化 管 30 毫升 (x2), 试 管 1.5x 15 RKC 10), 72 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 温度 计 。 3. 试剂 ”磷酸 盐 标准 溶液 : 准确 称 取 预先 在 105`C 下 烘 至 恒 重 的 磷酸 二 氢 钾 (HPO4,， 分 析 纯 )0.4389 克 ， 以 蒸馏 水 定 容 至 100 毫升 即 成 含 磷 为 1 毫克 /毫升 的 标准 溶液 。 使 用 时 将 该 液 再 稀释 100 FF, 此 稀释 液 含 磷 量 是 10 微克 /毫升 。 定 磷 试剂 : 6N 硫酸 :水 :2.5% ARB 10% 抗坏血酸 =1:2:1:1 (V/V)。 此 试剂 要 现 用 现 配 。 配 好 时 试剂 应 旺 黄 绿色 或 黄色 , 如 呈 棕 黄色 或 深 绿 色 应 弃 去 。 REACH. 硫酸 铜 (CuSO,. 5H,O) :硫酸 钾 ( 了 SOJDJ) =1:4 CCW/W), 研 成 细 末 备用 。 浓 硫 酸 ( 化 学 纯 ); 30% ct ALA CH,O,), DO. EDR 1. 标准 曲线 的 制作 -— 118 — HEE SE UCR ZEA EE PHL ARAL EY 10 微克 /毫升 的 磷酸 SARE PAIR ALIRIN), 充分 播 匀 后 于 45*C 7K YO FRI 20 分 钟 。 在 分 光 光 度 计 上 测 OD scoff. 管 号 pet 含 磷 量 水 定 磷 试剂 45 ODee0 Be YE ii ( ) (微克 ) | GBF) | Geth 4 1s 1 0 0 3.0 3.0 保 a 2 0.5 Sey 2.5 3.0 20 分 3 1.0 10 2.0 3.0 钟 4 1.5 15 1.5 3.0 5 2.0 20 1.0 3.0 6 2.5 25 0.5 3.0 以 各 管 的 磷 含 量 作 横 坐 标 ，ODeeo 值 为 纵 坐 标 作出 标准 曲线 。 2. 核酸 总 磷 量 的 测定 G1) 消化 : 准确 吸取 5 毫 死 /毫升 的 核糖 核酸 溶液 1 毫 升 于 干燥 的 消化 管 中 , 加 入 少量 催化 剂 ( 约 50 ae), FRI STR RRO bi. RAKE AN, 取出 消化 管 ， Ae Ja MB 30% WALA, MRA HE KM IG 色 或 浅 蓝 色 即 为 消化 完全 。 样 品 消化 完 后 , 稍 冷却 , 加 入 1 训 升水 , 100C 加 热 片刻 , 使 焦 磷酸 成 为 磷酸 。 、 与 被 测 样品 消化 同时 , 另 作 一 个 空白 样品 , 即 其 他 条 件 相 同 , 仅 在 消化 管内 不 放样 品 。 《2) 测定 核糖 核酸 的 总 磷 : 将 已 消化 完毕 的 核酸 样品 和 空 自 样品 管 溶液 分 别 转移 到 50 毫升 的 容量 瓶 中 , 并 加 水 定 容 全 50 ST. BCU Ah ERE AS YER PF RUE ET ME. = (19 >= 7 > fs. = - oe a, NT 让 ae Pt ¥ ry << , =~ 、 Fr eae 多 . - 一 y SA | 核糖 核酸 消化 稀释 液 | ， 水 | 定 磷 试 剂 《毫升 ) (毫升 ) | Gem) |} °C 《毫升 ) 五 、 结 果 计算 | 测定 用 核糖 核酸 (RNA) 量 为 W 微克 ， 从 标准 曲线 查 得 1 毫升 核酸 消化 稀释 液 中 含 磷 了 微克 ， 则 核酸 中 磷 的 百 分 含 量 为 : - 2 BE% 2 is aoe 100 式 中 : 50 为 稀释 倍数 。 33. 核糖 核酸 定量 测定 . 一 一 改良 苦 黑 本 法 mo 一 、 目 的 学 习 用 定 糖 法 测定 核糖 核酸 (RNA) 的 含量 。 二 、 原 理 RNA 与 浓 盐酸 共 热 酸 解 生成 喀 哇 核 昔 酸 、 WS BRE BK 糖 。 核 糖 在 浓 酸 中 脱水 环 化 成 糠 醛 。 它 与 苦 黑 酚 〈3;5- 二 产 甲 蘑 ) 作 用 显示 蓝 绿色 , 在 670 毫 微米 有 最 大 吸收 。 本 测定 用 铜 离子 代替 苦 黑 酚 法 中 的 铁 离子 进行 催化 ， 故 称 为 改良 营 黑 酚 法 。 它 使 反应 灵敏 度 提高 一 倍 以 上 。 BRR PERNA 5~50 微克 /毫升 之 间 ， 则 光 密 度 与 RNA 的 浓度 成 线性 关 系 。 ON 一 反应 方程 式 如 下 : cH EG H—C—OH }HCl Cutt, HO | —3H,0 | | | ee O pie Xe RE CH,OH 核糖 样品 中 少量 脱氧 核糖 核酸 (CDNA) 存 在 对 测定 无 干扰 , 蛋 ”白质 、 粘 多 糖 则 干扰 测定 。 由 于 测 糖 法 只 能 测定 RNA 中 与 叮 叭 连接 的 糖 ， 而 不 同 KURA RNA 含 的 味 叭 、 喀 啶 的 比例 各 不 相同 ， 因 此 用 所 测 得 的 核糖 量 来 换算 各 种 RNA 的 含量 是 不 正确 的 。 最 好 用 与 被 测 物 相同 来 源 的 纯化 RNA 作 RNA- 核 糖 标准 曲线 ， 然 后 通 TL Hi iB Re tH BO) PRN AB Se Bo | =, RRMA, 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 RNA 标准 溶液 : 在 分 析 天 平 上 精确 称 取 纯 RNA (上 海 药 用 辅料 厂 ), 用 0.001N NaOH 配 成 50 微克 /毫升 的 溶液 。 待 测 RNA 样品 FA 0.001N NaOH ¥% # fi RR 10~100 PA ht / SF RM. 2. WB We 1 BAC x 2), 2 SFC x5); 试管 1.5x15 BKC x 11), 72 型 分 光 光 度 计 ; KG O% an SAS Sit 人 3. 试剂 ee Oe SA Flam aaR: 5 Ha RRAT 10 毫升 95% CB 中 , 溶液 呈 深 红色 。 乙 、 铜 离子 溶液 : 0.75 AH (CuCl,-2H,0)%F 500 毫升 12A 盐酸 中 , 溶液 呈 深 黄色 。 J 使 用 前 2 STA RBIE SM M 100 SAMS 四、 操作 步骤 1. 标准 曲线 的 制作 按 下 表 次 序 在 7 支 试 管内 加 入 50 微克 /毫升 的 RNAA 标 准 溶液 与 试剂 ， 充 分 播 匀 后 在 100 CC 水浴 中 保温 35 FP, Tit 动 水 冷却 。 以 工 号 管 作 空白 ， 在 分 光 光 度 计 上 于 670% 微米 下 测 光 密度 \OD)7 值 。 “ “ ODer AAA, RNA tk 你 准 曲 线 。 | 50 微 克 / 毫 升 RNA 含 量 管 号 | RNA 标 准 液 =, "| Gey | oe 0 0 0.2 10 0.4 20 | he 60 x 洽 保 温 35 4y > 站 Ui 动 水 冷 却 1 2 3 4 0.8 40 5 6 1.6 80 7 2.0 | 100 2. 样品 中 RNA 含量 测定 EC 2 ETI ae RNA 约 10-~100 微克 /毫升 的 待 测 样品 溶液 与 2 毫升 苦 黑 一 铜 离子 溶液 充分 据 匀 。 同 制作 标准 曲线 同样 步骤 操作 。670 毫 微米 下 测 得 OD 值 ， 在 标准 曲线 上 可 » RNA (fast) 平均 RNA 量 (微克 ) pee ae ree | ODer0 ~ 找 出 相应 的 NA 量 。 样品 测定 需 与 制作 标准 曲线 使 用 同一 批 试 剂 ， 同 一 台 分 五 样品 中 RNA 含量 可 以 下 式 计算 : RN 大 次 量 = 二 YX 光 光 度 计 。 | 2x Wx 10° AP: y 为 样品 测 得 ODe7 值 在 标准 曲线 上 查 得 的 RNA ph oe KL, N 为 所 测 样品 稀释 倍数 ， W 为 配制 样品 溶液 时 所 用 的 样品 毫克 数 ， 2 为 测定 时 取 2 毫升 样品 溶液 。 例 : 某 RNA 制品 10 毫克 ， 以 0.001N 氢 氧 化 钠 溶 液 深 解 并 定 容 到 250 毫升 。 取 2 毫升 此 RNA 溶 液 按 上 法 测 得 Ol)szo=0.450， 查 标准 曲线 得 RNA W 67 微克 ,故此 样品 中 aon sp i it Oe w= oe.) o> “ RNA 含量 为 : 67 微克 x 250 毫升 2 BF x 10 BE x 10° * 100% = 83.75% 34. 脱氧 核 糖 核酸 定量 测定 改良 二 苯胺 法 2 一 、 目 的 re 学 习 用 定 糖 法 测定 脱氧 核糖 核酸 CDNA) 的 含量 。 二 、 原 理 在 强酸 环境 下 加 热 ， 可 以 使 DNA 中 味 叭 碱 与 脱氧 核 精 间 的 糖苷 键 断 裂 。 因 而 DNA 酸 解 后 生成 味 叭 碱 基 、 脱 氧 核 糙 和 脱氧 喀 啶 核 背 酸 。 脱 氧 核糖 在 酸性 条 件 下 脱水 生成 w- 羟基 -7- 酮 基 戊 醛 ， 后 者 与 二 苯胺 作用 后 显示 蓝 色 , 在 595 毫 微米 有 最 大 吸收 。 反应 方程 式 如 下 : CHO CHO YN H-¢_H ee OU OU aes ip H—¢_—OH 合 核 音 酸 的 量 样品 于 260 毫 微米 处 测 得 光 密 度 COD) 值 后 可 按 下 式 计 FRA AH RN Ee, OP 200 Vin x D= (微克 ) 0.032 : AH. 0.032 为 核 背 酸 的 比 消光 系数 ， 即 浓度 为 1 微克 / 毫升 的 3’ 5 IRA KH RAK ZTE 260 毫 微米 波长 处 , 通过 光 径 为 工 厘 米 时 的 光 密 度 经 验 值 。 由 于 NA 降解 后 常 含有 少 MAH RE ER, 它们 也 有 紫外 吸收 , BOR MS 酸 量 比 定 磷 法 高 约 10~15%, VY 总 为 被 测 样品 溶液 总 体积 (毫升 )。 D 为 样品 溶液 测定 时 的 稀释 倍数 。 六 、 应 用 克 分 子 消 光 系 数 法 测 碱 基 、 核 苷 、 核 苷 酸 的 量 ”此 法 仅 适 用 于 碱 基 、 核 背 、 核 苷 酸 的 定量 测定 。 对 于 大 分 FRR, 由 于 它 的 分 子 量 很 难 准 确 测定 , 无 法 配制 克 分 子 浓 度 溶液 , 因此 不 能 采用 这 种 方法 进行 定量 测定 。 各 种 样品 在 与 它 相应 的 特定 波长 ( 见 附 录 八 ) 下 测 得 OD 值 后 , 即 可 对 含量 进行 计算 , 计算 公式 如 下 : OD, x us Vw = (#25) AP. €& ARM Bt, BRAKE RAM THR pH 件 时 , 在 某 一 特定 波长 处 的 克 分 子 消光 系数 ( 见 附 - RN); OD, 为 被 测 碱 基 、 核 苷 或 核 苷 酸 溶 液 于 某 一 pH .条 件 时 , 在 某 一 特定 波长 处 测 得 的 光 密 度 值 ; M 为 被 测 碱 基 、 核 背 或 核 苷 酸 的 分 子 量 ; V 总 为 被 测 碱 基 、 核 背 或 核 苷 酸 样品 溶液 总 体积 人 wr Pas ¢ Cena : (ZF); | D 为 样品 溶液 测定 时 的 稀释 倍数 。 计算 示例 : 为 了 测定 发 酵 液 中 腺 味 叭 的 含量 , 可 取 20 微 升 腺 味 叭 发 酵 液 点 样 于 层 析 滤纸 上 , 经 展 层 后 , 滤纸 上 的 紫外 吸收 斑点 剪 下 用 3 毫升 0.1N 盐酸 洗 脱 。 洗 脱 液 经 测定 ODze=1.00， 已 知 腺 味 岭 分 子 量 为 135, 在 0.1N 盐酸 中 8zez=13x 10， 则 UBF ABR PRES EME 3 ZAMIR PREY 的 含量 ) 是 : 1.00x135x3 _ 5 St BET REM PRR SEH: 0.031 毫克 _ “0.02 eH. 毫克 /毫升 七 、 克 原子 磷 消 光 系 数 [8)] 法 此 法 可 用 于 衡量 核酸 样品 天 然 状 态 的 程度 。 在 pHr 时 ， 对 于 天 然 状态 的 DNA， 若 配 成 每 升 含 1 RAT BRB 液 , 在 260 毫 微 米 处 通过 工 厘 米 光 径 时 的 紫外 吸收 值 8 在 6200~6600 范围 内 。 在 核酸 发 生变 性 降解 时 ， 此 数值 增 大 ， 因此 可 以 从 so 四 值 初 步 判 断 核酸 的 天 然 状态 程度 。 被 测 核酸 样品 溶液 经 定 磷 法 测 得 克 原 子 磷 浓度 ， 再 于 紫 外 分 光 光 度 计 中 测 得 OD :eo 值 ， 即 可 按 下 式 进行 计算 ; ee Dy6o $)- >= Cx Lt 式 中 : OD2eo 为 被 测 核酸 溶液 在 260 毫 微米 处 的 光 密 度 值 。( 为 被 测 核酸 溶液 的 克 原 子 磷 浓度 Cal FA 磷 法 测 得 )。 — 132 — | | 二 L 为 比 色 杯 光 径 ( 厘 米 )。 计算 示例 ; KE DNA 样品 溶液 , 经 定 磷 法 测定 含 磷 量 为 3.0 微克 / 毫 升 ， 该 溶液 的 ODseo=0.610， 比 色 杯 的 光 径 为 1 厘米 ， 计 算 此 DNA 样品 se- 此 样品 溶液 克 原 子 磷 浓度 为 : Sree ERs geet 过 C= Fx 107 一 0.096x10 出 0.610 人 结果 说 明 该 DNA 样品 未 变性 及 降解 ， 天 然 状 态 程度 很 高 。 36. 动物 组 织 细 胞 内 核酸 (DNA 5 RNA) 含量 测定 |. 肝脏 组 织 中 DNA 和 RNA 的 分 让 离 一 、 目 的 学 习 从 新 鲜 的 动物 组 织 中 分 离 DNA Al RNA 的 方法 。 —., Re 要 进行 细胞 内 了 DNA AI RNA 的 总 量 测定 , 必须 包括 二 个 步骤 : C1) 一 个 并 不 需要 保持 核酸 分 子 完整 性 的 分 离 纯 化 步 了 又; 《2) 对 于 核酸 中 的 三 个 组 分 之 一 〈 碱 基 、 戊 糖 或 脱氧 戊 糖 、 磷 酸 ) 进 行 定 量 测定 。 为 了 获取 组 织 细胞 内 的 DNA Al RNA, 首先 必须 用 适当 at" Soa 的 方法 将 细胞 破碎 ， 使 核酸 处 在 易于 抽 提 的 状态 ， 然 后 从 脂 质 、 重 白质 等 物质 中 将 核酸 分 离 出 来 ， 再 利用 DNA 4 RNA 的 水 解 特性 不 同 而 使 二 者 分 开 。 | 由 于 所 采用 的 组 织 材 料 不 同 ， 细胞 的 性 质 以 及 影响 核酸 测定 的 杂质 , 如 核 苷 酸 类 多糖 类 及 多 聚 磷酸 类 等 的 含量 也 不 “ 同 , 因此 相应 的 破碎 细胞 和 分 离 核酸 的 方法 也 各 不 相同 , 所 以 没有 适合 一 切 对 象 的、 固定 的 分 离 方法 。 本 实验 中 所 采用 的 是 在 分 离 、 测 定 动物 组 织 KARE) 全 部 尽 酸 时 能 够 得 到 良好 结果 的 常用 分 离 方法 一 一 施 密 特 - 撒 哈 泽 - 彰 莱 德 法 (Schmidt-Thannhauser-Schneider), 简称 STS 法 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 大 白鼠 肝脏 。 2. Ma 吸管 1 毫升 (x1)，2 BAC XxX), 5 BHCX D1 10 EF (x 2); 离心 管 (x 3); 试管 3.0x 20 厘米 (x 3); BA 10 毫升 Cx 2), 50 毫升 (x 1); 烧杯 50 毫升 (x 1); RAR ae X 2); 注射 器 (x 1); 滴 管 ; BEE 离心 机 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; UKE; 解剖 台 ; ET; 剪刀 。 3. 试剂 20 细 三 氯 醋酸 (TICA)7: 称 取 100 克 三 所 醋酸 (分 析 纯 ) 加 蒸馏 水 至 500 Ft. 109% 三 所 醋酸 (ICA): HR 50 克 三 氯 醋酸 (分 析 纯 ) 加 蒸 饮水 至 500 毫升 。 5% ij AMR(PCA). 7.1 EF 70% mH AMCHCIO,, 分析 纯 ) 加 蒸馏 水 92.9 毫升 。 无 水 乙醇 ; 氯仿 :甲醇 (2:1V/V); 乙醚 ; 0.3N BBA, =~ fod ==. 0.1N 盐酸 ; 6N 盐酸 。 DO. IEDR 1. 组 织 磨 碎 和 酸 溶性 杂质 的 去 除 打 空 气 针 于 大 白鼠 心脏 ， 大 白鼠 立即 死亡 。 剖 腹 取 出 肝 脏 组 织 , 放 入 搁 于 冰 浴 中 的 小 烧杯 中 。 剪 碎 肝 组 织 , 称 取 1 克 置 于 玻璃 匀 浆 器 中 ， 加 入 已 预 冷 的 蒸馏 水 5 ZH, TEMA KK. FMS 毫升 预 冷 的 20% TCA 溶液 ， 搅 匀 并 转移 到 离心 BA, O~4°C, 3000 转 /分 离心 20 分 钟 , 上 清 液 必 须 澄 清 , F 去 。 沉 淀 物 加 10 毫升 预 冷 的 10% TCA 溶液 , 搅 匀 ,0 一 4 C， 3000 转 / 分 离心 20 分 钟 ,上 清 液 澄清 , HE. 2.， 脂 质 的 去 除 。 沉淀 物 加 冷 蒸馏 水 1 毫升 ， 搅 成 糊 状 。 用 滴 管 缓慢 加 入 8~10 毫升 预 冷 的 无 水 乙醇 ,成 均匀 悬 浊 液 , 0~4C, 于 3000 转 / 分 离心 10 分 钟 ， 弃 去 上 清 液 。 再 加 入 8~10 毫升 预 冷 无 水 乙醇 , RIGA RTI, O~4°C, 3000 转 /分 离心 10 分 钟 , 弃 去 上 清 液 。 以 上 的 操作 宜 在 0~4'C 进 行 ,以 后 的 操作 可 以 在 室温 下 进行 。 回 沉淀 物 中 加 S~10 毫升 氯仿 :甲醇 (2:1V/V) 溶 液 ， 使 成 均匀 悬 浊 液 , 3000 转 /分 离心 10 分 钟 , 弃 上 层 。 此 步 又 重复 | 进行 一 次 。 缓 慢 加 入 8~10 毫升 乙醚 于 沉淀 物 ， 使 成 均匀 悬 浊 液 ，3000 转 / 分 离心 分 离 , 弃 上 层 。 此 步骤 再 重复 一 次 。 把 具 沉 淀 物 的 离心 管 置 于 30~40"C 水 浴 中 ,充分 除去 沉淀 中 的 乙醚 , 最 后 得 淡 黄 色 粉 末 。 3. RNA 的 分 离 ARE EMAILED PIMA 0.3N 氢 氧 化 钾 溶 液 并 完 全 转移 到 玻璃 匀 浆 器 中 ， 共 加 0.3N AML 10 BF, A — 139. to,” oe pein ee 2 oe eee os OE ae ‘= it eae ee, ern > lal — = 2 «< “th . 4 . < 本 r Ms yA oe ‘ -分子 都 是 与 1 分 子 戊 糖 及 1 分 子 磷 酸 相 连接 的 ， 因 些 测 出 其 : 浆 器 中 将 沉淀 物 磨 碎 成 糊 状 。37*"C 水 浴 保 温 90 分 钟 , 液 面 有 气泡 逸 出 ,此 时 沉淀 物 中 的 RNA 已 水 解 成 为 核 苷 酸 ( 加 入 氢 - 氧化 钾 后 , 如 果 呈 均一 的 溶解 状态 , 37"C 水 解 90 分 钟 就 够 了 ， 否则 可 延长 保温 时 间 至 18 小 时 )。 碱 水 解 后 , 加 ON 盐酸 1.65 毫升 ， 充 分 搅拌 并 转移 至 离心 管内 ， 冷 却 使 沉淀 完全 ，3000 转 /分 离心 15 分 钟 ， 上 清 液 即 是 已 水 解 成 核 苷 酸 的 RNA 部 4}, ULE PMG DNA REAM, 沉淀 再 悬 于 0.1N 盐酸 8.35 毫升 中 ， 离 心 分 离 之 。 合 并 上 述 二 步 所 得 上 清 液 , 并 以 0.IN — 盐酸 定 容 至 20 毫升 ， 此 为 工 克 新 鲜 肝 组 织 中 的 RNA 部 分 5 置 冰箱 待 测 含量 。 4, DNA 的 分 离 HERA RNA 的 沉淀 物 悬 浮 于 20 毫升 5 多 高 氯 酸 溶液 中 , 95"C 水 浴 保 温 15 分 钟 后 离心 分 离 , 取 上 清 液 并 定 容 到 20 - 毫升 即 是 工 克 新 鲜 肝 组 织 中 已 降解 的 DNA 部 分 。 置 冰箱 等 测 含量 。 T ， 肝 脏 组织 中 DNA fe RNA 含量 测定 一 、 目 的 测定 已 分 离 到 的 大 白鼠 肝脏 组 织 中 DNA 与 RNA 的 会 ait , RE ee 般 是 利用 其 碱 基 、 友 糖 或 脱氧 友 糖 以 及 磷酸 这 三 种 组 份 的 各 种 性 质 和 特殊 反应 来 进行 的 。 核酸 分 ， 子 中 三 个 组 份 是 以 等 分 子 比 例 存在 的 ， 即 每 一 个 嗓 叭 或 喀 啶 中 任何 一 组 份 的 量 , 即 可 求 出 核酸 的 量 。 一 般 常用 紫外 吸收 法 测 碱 基 的 量 ， 戊 糖 采用 与 苦 黑 酚 的 一 736 一 ia SE 62 JZ J Wa, Pk SIE SU ad Fj Re pe A Ba FW OR We, BEANE FALL REET. ERITREA 实验 35.33.3432 有 关 测 定 方 法 。 ”根据 上 述 各 种 方法 测定 用 STS 法 分 离 得 到 的 大 白鼠 肝 组 织 的 RNA 与 DNA 的 含量 均 为 : 每 克 新 鲜 肝 组 织 含 8~9 aes RNA, 2~3 毫克 DNA;RNA 与 DNA 的 比值 为 3.5 左 A, BAK 70 狗 。( 在 与 测定 样品 同 量 的 组 织 中 加 入 已 知 Biy RNA 和 DNA,， 一 般 加 入 相当 于 组 织 中 所 含有 的 核酸 的 量 ， 然 后 进行 各 项 测定 。 通 过 与 样品 测定 的 结果 相 比 较 即 可 求 出 回收 率 。) 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 大 白鼠 肝脏 组 织 分 离 得 到 的 DNA Al RNA HR, 标准 DNA YER (100 微克 /毫升 ); 标准 RNA HR (SO 微 克 / SF); 标准 磷酸 盐 溶 液 (10 微克 /毫升 )。 2， 仪 器 Aa ee 1 SHC X12), 2 毫升 (x7)，5 SHC <6), 10 ZF (x 2); 试管 1.5x15 OKC X 35); 消化 管 30 毫升 (x 3); 容量 i. 10 毫升 (x 3)。 751 型 分 光 光 度 计 ; 72 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; TK A; 消化 炉 ; 温度 计 。 3. 试剂 5D RAR: 7.1 ZF 10% BAMCHACIO,, 分 析 纯 ) 加 蒸馏 水 92.9 毫升 即 成 。 定 糖 法 试剂 : 分 别 见 实 验 33 和 34 试剂 部 分 。 定 磷 法 试剂 : 见 实验 32 试剂 部 分 。 四 、 操 作 步 又 — 137 — 1. APR) RNA Al DNA 含量 GQ) RNA 含量 的 测定 : 取 大 白鼠 肝脏 组 织 的 RNA 分 离 部 分 0.5 毫升 于 试管 中 , 加 5 多 高 氧 酸 9.5 BHA. th ”水 浴 中 水 解 15 分 钟 , 冷却 后 以 5 多 高 毛 酸 为 空白 在 751 型 分 光 光 度 计 上 测 OD2eo 值 。 (2) DNA 含量 的 测定 : 取 大 白鼠 肝脏 组 织 的 DNA 分 离 部 分 1 毫升 ,加 5 狗 高 氧 酸 4 毫升 ， 以 5 多 高 氧 酸 为 空白 测 = OD:eo 值 。 RNA fil DNA 溶液 测 得 的 结果 以 每 毫升 10 微克 核酸 OD... =0.286 进行 计算 (0.286 是 通常 从 STS 法 得 到 的 核 酸 部 分 所 选用 的 消光 系数 )。 即 : OD:eox 10/0.286=RNA 或 DNA 微克 /毫升 。 测定 所 用 样品 原液 中 核酸 的 含量 按 下 式 计算 : OD % RNA 微克 /毫升 = 9 Se x0.5 式 中 : 0.5 为 测定 时 用 0.5 Ft RNA 原液 , 10 AU eH 液 共 10 毫升 ，10/0.286 为 每 毫升 1 微克 核酸 在 260 毫 微米 处 的 光 密度 值 ,OP*s 为 测定 溶液 在 260 毫 微米 处 的 光 密度 值 。 OD DNA (3/285 = ——10 AP. 5 Aili eM 5 毫升 ,其 余 同 上 式 。 上 述 计算 所 得 核酸 原液 的 微克 /毫升 数 分 别 乘 以 20 CK 酸 原 液 总 体积 ) 即 得 到 核酸 毫 殉 / 克 肝 组 强 。 相当 于 核酸 量 微克 /毫升 一 一 一 | 一 一 一 一 -| 一 | 一 | 一 一 2. 定 糖 法 测 RNA #1 DNA 含量 GQ) RNA 含量 的 测定 ， 取 大 白鼠 肝脏 组 织 的 RNA 和 分 离 部 分 0.5 BH, M5%mAR 9.5 VST, HY HF 20 倍 )。 吸取 1 毫升 按 改 良 苦 黑 酚 法 测定 RNA 的 含量 〈 具 体 的 操作 步骤 详 见 实验 33)。 最 后 根据 稀释 倍数 计算 每 克 新 鲜 肝 组 织 中 RNA 的 毫克 数 。 (2) DNA 含量 的 测定 ; MEAS 20 毫升 的 大 白鼠 肝脏 组 织 的 DNA 分 离 部 分 1 毫升 ,加 5% AM 2 毫升 (稀释 3 i), #5, RR !1 毫升 按 改 良 二 苯胺 法 测定 DNA 的 含量 (具体 操作 步 又 详 见 实验 34)。 最 后 根据 稀释 倍数 计算 每 克 新 鲜 肝 组 织 中 DNA 的 毫克 数 。 3. PREM RNA 和 DNA 含量 (1) RNA 4 DNA 样品 的 消化 Re RNA 分 离 部 分 原液 5 EFF, DNA 分 离 部 分 原液 10 毫升 ， 分 别 于 消化 管 中 。 在 消化 炉 上 微 火 加 热 浓缩 至 1 毫升 左右 ,冷却 后 加 约 50 毫克 催化 剂 ，1 毫升 浓 硫 酸 ， 微 火 加 热 ， 样品 由 褐色 至 淡 黄色 ， 稍 冷 ， 加 30 多 过 氧化 氨 二 滴 促 进 其 氧 化 , 继续 加 热 至 溶液 呈 无 色 或 浅 蓝 色 为 止 。 稍 冷 , 加 1L 毫 升水 ， 100*C 加 热 10 分 钟 以 分 解 消化 过 程 中 形成 的 焦 磷 酸 。 此 外 另 取 一 只 消化 管 作 空白 样品 , 除 不 加 样品 外 , 其 余 步 又 同样 品 管 一 样 。 消化 液 和 空白 均 用 茹 饮 水 定 容 至 10 BH, (2) RNA 和 DNA 含量 测定 取 上 述 定 容 至 10 毫升 的 消化 液 0.5 BH, 按 定 磷 法 分 别 测定 RNA 与 DNA 的 含 磷 量 (操作 步 又 详 见 实验 32)， 然 后 根据 核酸 中 磷 含 量 为 9 多 计 算出 核酸 的 量 。 = 39> 37. 动物 肝脏 组 织 中 核 粳 核 酸 的 提取 一 、 目 的 学 习 从 动物 组 织 中 提取 RNA 本 二 、 原 理 . 要 研究 核酸 的 结构 、 功 能 及 理化 性 质 ， 首 先 必 须 提取 核 酸 。 核 酸 是 一 种 具有 生物 活性 的 高 分 子 聚 合 物 ， 为 得 到 高 度 育 合 状态 的 天 然 核 酸 ， 分 离 过 程 中 需 用 温和 条 件 以 免 核酸 降 解 , 同时 亦 要 防止 核酸 降解 酶 类 的 作用 。 在 低温 下 把 组 织 匀 浆 ， 使 细胞 破碎 释放 出 核 蛋白 。 利用 DNA-KEA A RNA- 核 蛋白 在 一 定 浓 度 的 氧化 钠 溶液 中 浴 解 度 不 同 的 特点 , 以 0.15 了 氧化 钠 溶液 抽 提 出 RNA- 核 蛋白 。 再 用 酚 作为 蛋白 质变 性 剂 去 除 RNA- 核 蛋白 中 的 蛋白 质 ， 杰 ” 放出 RNA。 最 后 用 乙醇 作 沉淀 剂 即 得 天 然 程 度 较 高 的 了 NA 沉淀 物 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 KA A; 纱布 。 2. 仪器 吸管 1 毫升 (x 1D); 离心 管 10 BFC x 18); 量 简 10 毫升 (x2)，50 毫升 (x 1); 玻璃 匀 浆 器 (x 1); 烧杯 50 毫升 (x 3); HSI 60 毫升 (x 1); 玻璃 漏斗 (x 1); 滴 管 。 离心 机 ; 电动 搅拌 器 ;电热 恒温 水 浴 箱 ; BWA A 锅 ; 注射 器 ; 解剖 剪刀 ; BF. 3. 试剂 SSC 溶液 一 -0.15M SULA, 0.015M 柠檬 酸 三 钠 溶液 PpH7.0.8.77 克 毛 化 钠 ,4.441 EE RR A CNa;C,H;0,-2H,0) 一 eet oro 人 PT oar. 4 a 人 人 “7 rx f > “ea Ty- ee ate: eS -—- f ; nx 中 1 ， : a * ， 四 以 蒸馏 水 定 容 到 1000 毫升 。 5 为 十 二 烷 基 磺 酸 钠 (SDS) 溶液 : 5 克 5D3 HEF 45% Z 醇 中 配 成 100 毫升 溶液 。 水 饱和 酚 : 新 鲜 重 蒸 酚 以 水 人 饱和。 95% 乙醇 -2% Be RR FF: 2 克 醋 酸 钾 溶 于 95% ZRH me 成 100 毫升 溶液 。 95% ZR; 冰 ; 粗 盐 。 四 、 操 作 步 又 1. RAARITE 大 白鼠 饥饿 过 夜 。 在 大 白鼠 心脏 处 打 空气 针 后 大 白 记 立 即 死亡 。 解 剖 取 出 肝脏 , 立即 放 在 搁 于 冰 盐 浴 上 的 小 烧杯 中 。 2. BRK Fay SSC 溶液 洗 去 肝脏 的 血水 ， 倾 去 洗涤 液 。 用 不 锈 钢 前 万 将 肝脏 剪 成 碎 块 ， 称 取 5 克 放 入 玻璃 匀 浆 器 内 ， 加 10 2 升 SSC Yee Hk Ce A eB HIM 2 ZH SSC 溶液 计算 )， 勺 浆 10 分 钟 。 3, RNA- 核 蛋白 的 分 离 匀 浆 液 经 纱布 过 滤 在 离心 管 中 ， 波 液 以 3000 转 / 分 离心 20 分 钟 。 离 心 后 分 二 层 , 上层 是 RNA- 核 蛋白 ; 下 层 为 细胞 核 和 细胞 碎片 。 小 心 吸出 上 层 溶液， BRAK a BAR BA 塞 细 颈 瓶 中 。 4, RNA- 核 蛋白 的 解 聚 fm 5%SDS 溶液 于 上 述 上 层 溶液 内 , 使 SP> 的 最 终 浓度 为 0.5% 左 右 , Bilt HEA. 5. 酚 去 蛋白 水 饱和 酚 在 65"C 下 预 热 ， 加 等 体积 水 伺 和 了 酚 于 上 述 解 聚 溶液 内 。65"C 水 浴 中 摇动 10 分 钟 ， 移 入 冰 浴 内 继续 摇动 10 一 4} Bh, 3000 转 / 分 离心 15 分 钟 。 离 心 液 分 三 层 : 上 层 水 相 含 RNA, 中 层 为 变性 蛋白 与 少量 RNA, 下 层 是 酚 层 。 小 心 吸出 上 层 水 相 ， 再 加 等 体积 水 饱和 酚 同 上 步骤 抽 提 去 蛋 自 。 如 此 重复 2~3 次 , 直至 上 下 二 相 界 面 之 间 无 蛋白 为 二。 小 心 吸取 上 层 水 相 溶液 , 量 取 体 积 后 置 于 烧杯 内 。 6. RNA 的 沉淀 “He 2.5 倍 体积 预 冷 的 95% ZRE-296 RENE, MAE 述 去 蛋白 的 RNA 溶 液 内 ,RNA 沉 淀 并 以 3000 H/A BD 15 分 钟 收集 此 沉淀 。RNA 沉淀 复 溶 于 SSC 溶液 中 “〈 此 处 SSC 溶液 体积 不 易 过 大 ， 否 则 影响 下 一 步 得 率 )， 再 用 二 倍 体积 . 95 % % CRE RNA, 离心 收集 了 NA。 RNA BES 溶液 。 7. 含量 及 纯度 测定 用 紫外 法 、 定 磷 法 及 改良 苦 黑 酚 法 测 RNA 含量 ; BRS 法 测 RNA 中 蛋白质 含量 (具体 方法 详 见 各 有 关 实 验 )。 计算 每 克 新 鲜 大 鼠 肝 脏 内 RNA 的 含量 和 提取 所 得 RNA 的 纯度 。 38， 辜 氧 核 精 核 酸 (DNA) 的 提取 22 |. sadam DNA 的 提取 ， 一 、 目的 掌握 从 动物 组 织 中 提取 脱氧 核糖 核酸 的 方法 。 二、 原理 利用 脱氧 核糖 核 蛋 白 和 核糖 核 蛋白 在 电解 质 溶液 中 溶解 度 的 显著 不 同 , 使 二 者 分 离 。 在 0.154 氧化 钠 溶 液 中 脱氧 核 糖 核 蛋白 的 溶解 度 最 低 ， 此 时 的 溶解 度 相当 于 它 在 纯 水 中 的 溶解 度 的 1%; 而 在 1M 氧化 钠 溶液 中 , 它 的 溶解 度 至 少 是 在 — 142 — 水 中 的 三 倍 。 相 反 ， 核 糖 核 蛋 白 能 在 0.15M CA Pf 利用 这 一 点 ， 可 以 使 脱氧 核糖 核 蛋 白 与 核糖 核 蛋 白 分 开 。 为 抑制 组 织 中 的 脱氧 核糖 核酸 酶 对 DNA 的 降解 作用 ， 在 氧化 钠 溶液 中 加 入 柠檬 酸 钠 作为 金属 离子 的 络 合剂 ， 通 第 用 0.15M 毛 化 钠 ,0.0152M 柠 檬 酸 钠 溶液 , 并 称 为 SSC 溶液 。 使 用 阴离子 去 污 剂 十 二 烷 基 磺 酸 钠 (SDS) 可 以 使 DNA 从 脱氧 核糖 核 蛋 白 中 解 离 出 来 ， 而 蛋白 质 则 变性 沉淀 从 而 得 到 DNA。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 小 牛 胸腺 。 2. 仪器 量 简 10 毫升 (x1D)，100 毫升 (x 3); 烧杯 100 毫升 (x 2), 250 毫升 (x2); 磨 口 试剂 瓶 125 毫升 (x 1),500 毫升 (x | TD 玻璃 匀 浆 器 (x1); 吸管 1 毫升 (x1)，,10 毫 升 (x1); 滴 管 ; 玻 棒 。 BED BL; 电动 搅拌 器 ; 药物 台 冬 ; WBA; 剪刀 ; RT. 3. 试剂 1x SSC 溶液 一 -0.15M 氯 化 钠 、0.015M 柠 桂 酸 三 钠 浴 Ye, PH7.0: 8.77 克 毛 化 钠 ，4.41 克 柠 檬 酸 钠 (NasCiHsO)， 2H20) 以 蒸馏 水 定 容 到 1000 毫升 ; 10x SSC 溶液 一 -1.5M 氧化 钠 、0.15M rR R= We Wi, PH7.0， 87.7 克 毛 化 钠 ，44.1 克 柠 檬 酸 钠 (NasCeHs9O7， 2H2:0) 以 蒸 饮水 定 容 到 1000 毫升 。 0.1xSSC 溶液 ， 1x SSC 溶液 用 蒸馏 水 稀释 十 倍 即 成 。 0.15M 氧化 钠 -0.1M 乙 二 胺 四 乙酸 钠 (Na, EDTA), pHs. 8577 克 氧化 钠 (分 析 纯 )，37.2 克 Na, EDTA( 分 析 纯 ) —ia= WF 800 ZF Ak, 以 氢 氧 化 钠 调 PH 4 8 后 定 容 到 1000 毫升 。 5 %o + =o ERR A (SDS) 溶液 CW/V)-5 FE SDS = 100 Ft 45% CRP, 氧 仿 - 异 戊 醇 : A 〈 分 析 纯 ): ARB GHA =24:1 (V7 95 % ZB; 70% ZB; 氯 化 钠 ( 分 析 纯 ); —_ Ko 四 、 操 作 步 又 1. 称 取 20 克 新 鲜 的 小 牛 胸腺 ， BEREAN 却 的 1x SSC 溶液 中 , 除去 脂肪 、 血 块 等 杂质 , 再 用 预 冷 的 1x SSC 溶液 反复 洗涤 数 次 , 直至 胸腺 组 织 块 无 色 为 止 。 2 把 洗 净 的 胸腺 组 织 块 剪 碎 ， 加 100 毫升 1x SSC 溶液 [胸腺 : 1x SSCs1:5(W/V)]。 在 玻璃 匀 浆 器 内 勾 浆 直至 细 胞 基本 上 破碎 止 。 3. 组 织 匀 浆 放 在 离心 杯 中 , 浸 于 冰 盐 浴 内 冷却 后 以 4000 转 /分 离心 10 分 钟 。 弃 去 上 清 液 ， 沉 淀 物 中 再 加 2 倍 体积 的 1xSSC BRKT, 离心 , 弃 上 清 液 。 如 此 再 重复 二 次 。 4, 将 离心 后 所 得 沉淀 悬 于 5 倍 体积 的 PH8、0.15 民 氧 化 钠 -0.1M Na,EDTA Wik, Wwe Bw MM 5%+— GEDA, 直至 SDS HRAR EK 1 ik, RRMA 固体 氧化 钠 使 其 最 后 浓度 达 1M, OE 30~60 分 钟 以 确 保 氧化 钠 全 部 溶解 。 5. 上 述 混合 溶液 倒 入 磨 口 塞 的 试剂 瓶 内 , 加 入 同体 积 的 AFR, BRE 20 分 钟 ，4000 转 / 分 离心 30 分钟。 小 心 吸 取 上 层 水 相 , 记 取 体积 后 置 于 烧杯 内 ”加 入 2 倍 体 积 预 冷 的 9%5 儿 乙醇 ,用 玻 棒 慢 慢 搅动 DNA 纤维 绕 于 玻 棒 上 并 挤 F, JA 70% ZR DNA 纤维 二 次 ， 再 用 %5 匈 乙醇 洗涤 一 次 ; : : } 取出 并 挤 干 。 6. 所 得 DNA 复 溶 于 0.1x SSC 溶液 中 ， 以 同体 积 氯仿 =- 异 戊 醇 重复 去 蛋白 2 次 ， 重 复 步 又 5， 最 后 得 到 的 DNA 深 于 0.1xSSC 溶液 中 , 溶解 后 再 加 入 1/10 体积 的 10xSSC x 液 , 使 成 1x SSC 溶液 , 置 冰 箱 保存 。 7. 分 别 用 紫外 吸收 法 、 定 磷 法 、 定 糖 法 定量 测定 核酸 含 量 ， 用 福 林 - 酚 试剂 法 测定 制剂 中 蛋白 质 含 量 〈 具 体 方 法 详 、 见 各 有 关 实 验 )。 计 算 所 得 DNA 制品 的 纯度 及 小 牛 胸腺 中 DNA 的 含量 。 Il. w+ DNA 的 提取 一 、 目 的 掌握 从 细菌 中 分 离 提取 DNA 的 方法 。 = Re 为 了 研究 微生物 的 遗传 特性 ， 根 据 人 们 的 要 求 定向 改造 和 培养 微生物 ,必须 分 离 得 到 具有 高 度 聚 合 状态 的 天 然 DNA， 然后 才能 对 它 的 生物 活性 、 物 理 和 化 学 特性 进行 研究 。 细菌 具有 坚韧 的 细胞 壁 , 常 采用 溶菌 酶 分 解 细胞 壁 , 结合 使 用 阴离子 去 拍 剂 十 二 烷 基 栅 酸 钠 (SDS) 使 菌 体 进一步 溶解 而 释放 出 核酸 与 蛋白 质 。 此 外 ,，SDS 还 可 以 抑制 脱氧 核糖 核 酸 酶 的 作用 并 使 一 部 分 蛋白 质变 性 。 溶 菌 后 得 到 的 高 粘度 悬 液 在 PH8 .2 yk AME, 可 以 保持 DNA 活性 同时 使 蛋白 有 效 地 变性 ， 离 心 可 除去 变性 蛋白 。 由 于 细菌 细胞 质 中 SAKE RNA, 为 得 到 较 纯 的 DNA 可 用 核糖 核酸 酶 处 理 样品 使 RNA 降解 而 除去 。 最 后 用 95% 乙醇 作 近 淀 剂 就 可 以 得 到 较 纯 的 丝 状 DNA 沉淀。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 i EE EY (B. subtilis) 。 2. 仪器 了 吸管 1 毫升 (x2), 5 毫升 (x1); WH 1.515 BKC 1); 刻度 离心 管 10 毫升 (x 2)， 离 心 管 10 毫升 (x 10); Bia 10 毫升 (x2)，50 毫升 (x 1); 烧杯 50 毫升 (x 2); 细 颈 瓶 60 毫升 (x2); 三 角 烧 瓶 250 毫升 (x 5); HE; BE. 离心 机 ; 托盘 式 扭 力 天 平 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; WB. 3. 试剂 肉 汤 培养 基 : 称 取 牛肉 襄 5 RH, BAK 10 克 ， 氯 化 钠 5 克 , 加 水 到 1000 毫升 , WAAL PHT .2~7.5, 0.15M 氧化 钠 -0.1M 乙 二 胺 四 乙酸 二 钠 CNa,-EDTA) 溶液 , PH8.0: 8.76 克 氧 化 钠 (分 析 纯 )，37.2 克 Nas-EDIA 加 800 BFA AK, LAA A pH 8.0, Fite DA A TK 定 容 到 1000 毫升 。 0.1M =H Rae GE 〈Iris)-1 多 十 二 烷 基 磺 酸 钠 (SDS)-1.0M 氧化 钠 缓冲 液 ， PH9.0:0.4M Tris 〈48.46 克 / Ft) MK 125 毫升 ,0.2MV 盐酸 25 毫升 , 29.2 TEAL AA 5 oe SDS 混合 并 以 蒸馏 水 定 容 到 500 BF. 0.1M 氧化 钠 -0.01M 醋酸 钠 缓冲 液 ，PH5.2: 0.01M 酯 Mew (NaAc-3H,0, 1.36 克 / 升 ) 溶 液 79 SHS 0.01M fam 〈 冰 醋酸 ，0.57 毫升 / 升 ) 溶 液 21 毫升 混合 ,加 入 0.58 desks 钠 。 水 饱和 酚 : 新 鲜 重 蒸 酚 用 水 饱和 后 以 ha 调 pH 3] 8.2, SSC Wy. 0.15M Rik W- 0.015M FF RR=aWBRM, pH 7.0。 — 146 —- 0.1 SSC 溶液 : 取 SSC 溶液 以 蒸 饮水 稀释 10 倍 。 10x SSC # wR. 1.5M A 1b Hh - 0.15M FR RB = BYE Ww, pH7.0. YAR MHA. 结晶 溶菌 酶 〈 生 化 试剂 , 活力 20000+1000 单位 , 上海 禽 蛋 二 厂 ) 以 氯 化 钠 -EDTA (pH8.0) 溶液 配 成 2 毫 死 /毫升 的 酶 溶液 。 核糖 核酸 酶 溶液 : 结晶 牛 胰 核 糖 核酸 酶 (生化 试剂 ,上海 东风 试剂 厂 ) 以 0.1M 和 氧化 钠 -0.01M 酯 酸 盐 缓冲 液 (PH5.2) 配 成 2 毫克 /毫升 的 酶 液 。 使 用 前 此 酶 液 先 在 80°C 水 浴 中 加 RA 10 分 钟 ,使 污染 的 脱氧 核糖 核酸 酶 失 活 。 95 % Z.RE, 70% ZRF, 80% 乙醇 ; 干冰 ， 1 粗 盐 。 四 、 操 作 步 又 1. 枯草 杆菌 的 培养 5 只 250 毫升 三 角 瓶 内 分 别 放 入 30 毫升 肉 汤 培养 基 , 15 磅 灭 菌 30 分 钟 ， 冷 序 后 接种， 37C 通 气 振 蔓 培 养 12~15 小 时 。 2. 菌 体 的 收集 和 洗涤 合并 五 瓶 枯 草 杆菌 培 养 液 于 离心 杯 中 ， 冰 盐 浴 中 预 冷 3000 转 /分 离心 20 分 钟 , 弃 去 上 清 液 。 用 50 毫升 预 冷 的 氯 化 钠 -EDIA (PH8.0) 溶 液 洗涤 菌 体 , 3000 转 / 分 离心 20 分 钟 ， 弃 去 上 清 液 。 以 少量 氯 化 钠 -EDTA (PH8.0) 溶液 将 离心 杯 中 的 菌 体 完全 转移 到 已 称 重 的 刻度 离心 管 中 ，3000 转 / 分 离心 20 分 钟 ,小 心 吸 去 上 清 液 后 称 重 , 计算 出 湿 菌 体重 量 。 “ 3. A DAME DA AS: YA PA = 121 (W/V) AY EL BLIMA 2 毫克 /毫升 YA MYA, 搅 匀 后 在 37"C 水 浴 中 保温 10~20 分 钟 ， 当 菌 液 — 147 一 变 粘 开始 溶菌 时 取出 , 倒 入 50 EFT ERR A. ETE be OF 在 干冰 中 冷冻 。 按 1 克 湿 菌 体 加 8 毫升 Tris-SDS NaCl Aap 液 (pH9.0) 的 比例 加 入 适量 Tris-SDS-NaCl 缓冲 液 到 已 冷 洪 的 细胞 中 ,用 玻璃 棒 把 冻 块 执 成 悬浮 液 。 在 60 CKA HEH 悬浮 液 温 热 到 完全 融化 。 溶 菌 完成 后 得 到 粘 稠 状 溶液 。 为 确 PRY TA SEE, 可 重复 干冰 速冻 与 60C 了 融化 这 一 步骤 。 4. BREA | | 已 溶菌 的 悬浮 液 置 于 磨 口 塞 细 颈 瓶 中 ， 加 入 同体 积 的 水 饱和 酚 ,4C 下 手 摇 20 分 钟 ,得 到 的 乳 浊 液 3000 转 / 分 离心 15 分 钟 。 离 心 液 分 三 层 , 最 下 层 是 酚 层 ; 中 间 为 变性 蛋 自 层 , 上 ERS A DNA。 小 心 吸出 上 层 液 相 并 量 取 体 积 。 再 加 同 ARRAS KA HERE A, MURR 3~ 涉 次 ， 直 到 二 液 相 界面 上 和 蛋白质 沉淀 消失 止 。 小 心 吸取 上 层 水 相 并 记 取 体 积 。 5. DNA 的 沉淀 ER DNA BREA, BMA HF DNA 深 液体 积 的 预 冷 %5% 乙醇 ， 用 玻 棒 慢 慢 搅 动 ， 白 色 丝 状 DNA SET BAR LE. DNA TLE RK 10% .80% 95% 乙醇 中 在 一 试管 中 加 6~8 毫升 0.1x SSC 溶液 ， 玻 棒 上 的 丝 状 DNA 反 绕 脱 下 在 试管 中 。 待 DNA 完全 溶解 后 补 入 0.6 一 0.8 毫升 10xSSC 溶液 ,使 成 DNA 的 SSC 溶液 。 6. 核糖 核酸 酶 去 RNA 加 已 预 处 理 的 2 毫克 /毫升 核糖 核酸 酶 溶液 到 含 DNA 的 溶液 中 ， 使 此 酶 最 终 浓度 为 50 微克 / 毫升， 混合 物 于 温 育 30 分 钟 。 消 化 物 冷 却 后 再 与 等 体积 水 饱和 酚 混合 ， FIED 10 分 钟 ，3000 转 /分 离心 15 shee 取 体 积 。 — Tie ; i; a 7. DNA 的 沉 演 重复 步骤 5 的 操作 得 DNA 丝 状 沉淀 。 溶 于 适量 0.1x SSC 溶 液 后 以 1L/10 体 积 10xSSC 溶液 调节 成 1xSSC 的 _DNA 溶液 , 贮 于 冰箱 。 ‘ ry as a 8. 含量 测定 分 别 用 紫外 吸收 法 、 定 糖 法 定量 测定 核酸 含量 ; 福 林 - 酚 试剂 法 测定 蛋白 质 含 量 ( 具 体 测 定 方法 详 见 各 有 关 实 验 )。 计算 所 得 DNA 的 纯度 及 每 克 湿 菌 体 中 DNA 的 得 率 。 39， 从 酵母 中 制备 5’ Rte” 核 苷 酸 在 工农 业 生产 、 医 学 实践 以 及 科学 研究 中 都 有 着 重要 的 意义 。 目 前 我 国 核 苷 酸 生产 除了 用 微生物 直接 发 酵 外 ， 主要 是 结合 综合 利用 , 用 啤酒 酵母 白地 霉 、 谷 氮 酸 菌 体 、 青 霉 著 菌 丝 体 , 面 包 酵 母 等 抽 提 核酸 , 再 经 水 解 获得 核 音 酸 。 本 实验 用 面包 酵母 作 材料 , 制备 5 BR. AK ARE “个 方面 , 即 酵母 核糖 核酸 的 提 制 , 核糖 核酸 的 酶 解 ，5/- 核 音 酸 的 定量 测定 , 单 核 苷 酸 的 离子 交换 柱 层 析 分 离 , 单 核 苷 酸 的 纸 电泳 鉴定 。 通过 这 一 组 实验 ， 要 求 了 解 核 苷 酸 生 产 的 一 般 过 程 及 基 本 原理 ,学习 和 掌握 基本 的 实验 技术 。 Ls, 酵 母 核糖 核酸 的 提 制 一 、 目 的 了 解 从 酵母 中 提 制 RNA 的 方法 。 =. Az 微生物 是 工业 上 大 量 生产 核酸 的 原料 ， 其 中 以 酵母 尤为 理想 。 这 是 因为 酵母 核酸 中 主要 是 RNA (2.67~10.0%), 一 DNA 48> (0.03~0.516%), BIKA BH, RNA he 于 分 离 。 此 外 ， 抽 提 后 的 菌 体 蛋白 质 ( 占 于 燥 菌 体 的 509) 还 具有 很 高 的 利用 价值 。 RNA 提 制 过 程 是 先 使 RNA 从 细胞 中 释放 ， 并 使 它 和 重 白质 分 离 , 然后 将 菌 体 除去 , 再 根据 在 等 电 点 溶解 度 最 小 的 性 酵母 | 洗涤 分离 og ae | meta: 10, NaC1 最 终 浓度 10%,100°C, 1 小 时 提取 | 3500 转 /分 720 分 钟 分 离 | SN 菌 体 残 温 isk | <10°C, HipH2.0~2.5 沉淀 及 NA | 3000 转 /分 ,10 分钟 mk 2 a eens 清 液 RNAJ | 乙醇 洗涤 ae bse Sees 滤液 RNAJ | 80°C 干燥 RNA 制品 酵母 核糖 核酸 的 提取 过 程 i, 将 PH 调 到 2.0~2.5, 使 RNA 沉淀 ， 进 行 离心 收集 。 提取 方法 有 很 多 ， 在 工业 生产 上 常用 的 是 黎 碱 法 和 浓 盐 法 。 前 者 利用 黎 碱 使 细胞 壁 溶解 ， 这 种 方法 抽 提 时 间 短 ， 但 RNA 在 此 条 件 下 不 稳定 , 容易 分 解 ; 后 者 是 在 加 热 条 件 下 , 利 用 高 浓度 的 盐 改 变 细 胞 膜 的 通 透 性 , 此 法 易 掌 握 , 产品 颜色 较 好 。 提取 时 应 注意 温度 , 避免 在 20~70'C 之 间 停 留 时 间 太 长 ， 因为 这 是 磷酸 二 酯 酶 和 磷酸 单 酯 酶 作用 活跃 的 温度 范围 ， 会 使 RNA 因 降解 而 不 能 收集 到 , 利用 加 热 至 90~100'C 使 蛋白 变性 , 破坏 该 类 酶 , 有 利于 人 NA 的 提取 。 本 实验 采用 浓 盐 法 (10% NaCl), 提 制 流程 见 上 页 。 - =, RAMA, 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 压榨 酵母 (上 海 酵母 厂 ); 精密 试纸 PH 0.5~5.0, 2. 仪器 Bf 10 毫升 (x 1); 三 角 烧 瓶 100 毫升 (x 1); 烧杯 250 毫升 (x1)，100 毫升 (x1),50 毫升 (x1)，10 毫升 (x1); 布 氏 漏斗 40 毫米 (x 1); 吸 滤 瓶 125 毫升 (x 1); HAM 6 厘米 4Cx 1); 滴 管 及 搅 棒 ; 干燥 器 ; 温度 计 100°C. 离心 机 ; KAM; 药物 台秤 ; 烘箱 ; 试管 木 夹 。 3. 试剂 和 NaClL( 化 学 纯 ); 6N HCl; 95 儿 乙醇 (化 学 纯 )。 四 、 操 作 步 又 1. 酵母 的 洗涤 与 分 离 取 压 榨 酵 母 , 低温 下 用 水 洗 3 ~4 次 , 离心 得 湿 酵 母 泥 ，, 含 水 量 一 般 为 75 多 左右 。 2. 提取 — 151 一 根据 有 关 生 产 单位 的 经 验 ， 一 般 控 制 干 酵 母 量 与 食盐 水 之 比 ( 液 比 ) 为 1:10, HRAREA 10%, 称 取 湿 酵 母 泥 30 克 于 100 毫 升 三 角 烧 瓶 内 ， 34610085 烧杯 内 称 7.5 克 NaCl 并 溶 于 52.5 毫升 蒸馏 水 中 , 将 此 NaCl 溶液 加 到 三 角 烧 瓶 中 去 , 使 达 最 终 浓 度 为 10% (30 克 湿 酵 母 泥 BIKE = 30 75% =22.5 区 ， 所 以 干 酵母 重量 =30 一 22. 1S 7.5 克 ), 搅拌 使 匀 , 然后 于 沸水 浴 中 提取 工 小 时 。 3. 分 离 将 上 述 提 取 液 取出 ， 用 自来水 冷却 分 装 在 离心 管内 ， 以 3500 转 / 分 离心 20 分 钟 , EEE RA ARASH 4. 沉淀 了 NA 离心 得 到 的 上 清 液 ， 倾 于 50 毫升 烧杯 内 ， 并 置 于 放 有 冰 块 的 250 毫升 烧杯 中 冷却 ， 待 溶液 冷 至 OCU FR, Ei 下 小 心地 用 6N HCl 调节 pH 4 2.0~2.5, bi pH FM, KR WPS LEY I, 到 等 电 点 时 沉淀 量 最 多 (注意 严格 控 fil PH)。 调 好 后 继续 于 冰 水 中 静 置 10 分 钟 ， 全 涝 这 各 颗 粒 变 大 。 5. 洗涤 及 抽 滤 ER BURL, 3000 转 /分 离心 10 分 钟 , 得 到 RNA 沉 淀 。 将 沉淀 物 放 在 10 毫升 小 烧杯 内 ， 用 95% CRE 5 一 10 % 升 充 分 搅拌 洗涤 , 然后 在 布 氏 漏斗 上 用 水 泵 进行 抽 气 过 滤 , 再 用 95% 乙醇 5 一 10 BH MVE 3 次 。 HF RNA 不 溶 于 乙醇 ,用 乙醇 洗涤 不 仅 可 脱水 , 使 沉淀 物 疏 松 ， 便 于 过 滤 、 王 燥 ， 而 且 可 除去 可 溶性 的 脂 类 及 色素 等 杂质 , 提高 了 制品 的 纯度 。 6. 干燥 从 布 氏 漏斗 中 取 下 沉淀 物 , 放 在 6 厘米 表面 阵 上 , HER 一 层 , 置 80C 烘 箱 内 干燥 。 将 干燥 后 的 RNA 制品 称 重 ， 放 在 干燥 器 内 ， 供 5- 磷酸 二 酯 酶 酶 解 用 。 用 紫外 吸收 法 或 戊 糖 显 色 法 进行 NA 制品 的 含量 测定 〈 见 实验 33、35) 并 求 出 提取 率 : RNA 提取 率 (和 ) 2M 甲 胺 | 45 ci 25 lODe60 GEIS CED) Fes |EMiae| Cie] 发 | a sa) eR 9 aan ee aaa aie || came “空白 0.1 | 一 2 | 钟 | 0.4 1 一 0.5 {10} 3 |20 \ 分 分 FA, 0.1} 1 1 0.4 | — 0.5 | 钟 | 3 | 钟 (氧化 ) | ? 甲 ? 0.1 1 1 0.4 一 0.5 3 〈 氧 化 ) Ci Ki 二 二 一 1 0.4 1 0.5 3 (ABUL) 3 Col = 1 0.4 1 0.5 3 【不 氧化 ) PLP HERA HSH, PORES KR BE 按 下 式 可 计算 出 酶 解 液 中 5- 核 苷 酸 含量 。 5 BARES (毫克 /毫升 ) _ 甲 含 磷 量 (微克 /毫升 ) 一 乙 含 磷 量 (微克 /毫升 ) x340x100 31 xx1000 式 中 : 31 为 磷 原 子 量 ，340 为 四 种 单 核 背 酸 平 均 分 子 量 , 100 -为 样品 稀释 倍数 。 从 酶 解 前 RNA 总 量 及 酶 解 后 5/- 核 苷 酸 总 量 , 便 可 计算 出 降解 率 : 降解 率 ( 匈 ) = 2 100 V. 单 核 昔 酸 的 离子 交换 柱 层 析 分 离 一 、 目 的 用 离子 交换 树脂 分 离 四 种 纪 - 单 核 苷 酸 , 学 习 和 掌握 离子 —— [ae Oe ee it oe Se ns < 你 ”交换 树脂 柱 层 析 的 分 离 技术 。 二 、 原 理 离子 交换 层 析 法 是 指 溶液 中 的 离子 通过 和 交换 剂 上 的 解 离 基 团 进行 连续 的 、 竞 争 性 的 交换 平衡 而 达到 分 离 目的 的 方 “ 法 。 具 体 地 说 包括 吸附 和 洗 脱 二 个 过 程 ， 而 且 都 是 根据 质量 作用 定律 进行 的 。 阳离子 交换 时 RizCit+C3<~RiCi 上 Ci 阴离子 交换 时 ~=R{A;+A;—ER{A;4+Az (RE 代表 离子 交换 剂 骨架 ; CA, 分 别 代表 阳离子 和 骨 离子 。) 要 成 功 地 分 离 某 物 质 , 必须 根据 该 物质 的 解 离 性 质 , 选择 适当 类 型 的 离子 交换 剂 , 并 控制 吸附 和 洗 脱 条 件 。 核 苷 酸 由 碱 基 、 核 糖 和 磷酸 组 成 ， 可 解 离 的 基 团 是 氨基 、 烯 醇 基 和 磷酸 基 ， 解 离 常 数 (P 玫 ) 见 下 页 表 ， 它 们 是 进行 离子 交换 层 析 分 离 的 基础 。 烯 醇 基 的 PK (RTE 9.5 左右 ， 此 了 PK 值 一 般 不 用 于 核 苷 酸 的 分 离 。 而 氨基 和 磷酸 基 却 很 重要 , 磷酸 基 一 级 解 离 的 PK 值 为 0.7~1.0， 相 对 各 核 昔 酸 来 说 数值 比 较 接近 , 因此 不 能 用 作 彼 此 分 离 的 主要 依据 ; 而 氨基 ( 尿 喀 啶 - 核 苷 酸 UMP 除外 ) 却 不 同 , 它们 的 PK 值 在 2~5 ZAR 大 , 在 离子 交换 层 析 分 离 中 起 着 决定 性 的 作用 。 BER AAT RAAF RRM. 离子 交换 时 ， 先 在 一 定 pH Af FE EGER Be HB ay 被 树脂 吸附 , 然后 降低 PH 进行 洗 脱 , 使 磷酸 基 和 氨基 的 解 离 度 减 小 , 分 子 的 净 电荷 发 生变 化 , 这 样 就 能 把 它们 层 析 分 离开 来 。 本 实验 采用 阳离子 交换 法 ， 其 原理 见 图 26， 在 5 时 , 核 苷 酸 的 磷酸 基 大 部 份 解 离 带 负电 ，UMP Bice ae, 净 一 “00 — 0 A PEO AE CDR) | : Bm | RECN) | 燃 醇 基 (OHD) (me “ eo 和 AROS Me 3.70 一 0.89 6.01 a ; (AMP) | ve - ISMN RTE BE 2.30 9.70 0.70 5.92 oat CME) | | 3 Rane TE wR 4.24 ae 0.80 5.97 | 4 PRE EAA IR 一 9.43 1.02 5.88 a (UMP) : ”电荷 为 负 值 不 与 阳离子 树脂 进行 交换 而 直接 流出 来 ， AMP、 _CMP、GMP 具有 氨基 , 在 此 DH 条 件 下 解 离 带 正 电 , 因此 分 子 _ 的 净 电 荷 为 正 值 , 被 阳离子 树脂 吸附 , 然后 再 利用 在 DH2~s < 人 和 Pe yy 4 全 ce Si ae he OS A. Oe ee 26 BTM Fes pH 的 关系 a —161= : Ee, eee a eS ee 之 间 各 种 核 背 酸 氨 基 DR 值 的 不 同 ， 净 电荷 产生 明显 的 差异 ， 因此 , 当 用 蒸馏 水 (或 无 离子 水 ) 进 行 洗 脱 时 , 便 可 将 它们 一 一 SF MEY RAD Ft Het SPH Z lal A C26), FEE 论 上 洗 脱 次 序 应 是 UMP->GMP->AMP->CMP， 而 实际 的 分 离 情 况 却 是 UMP->GMP->CMP->AMP,， 这 是 由 于 应 用 育 苯 乙烯 树脂 为 交换 剂 时 ， 树 脂 对 嘻 叭 碱 的 吸附 能 力 大 于 对 喀 喧 碱 的 吸附 能 力 ( 非 极 性 吸附 ), 致使 AMP FA CMP 的 洗 脱 位 置 发 生 互 换 。 用 蒸馏 水 洗 脱 ，UMP 最 先 洗 出 , 以 后 随 着 流出 液 pH w 步 升 高 ，GMP 和 CMP 分 别 相继 洗 下 ， 经 过 一 段 较 长 的 无 核 昔 酸 空白 多，AMBP 最 后 流出 。 本 实验 为 缩短 整个 洗 脱 过 程 ， 用 蒸馏 水 将 UMP, GMP, CMP 洗 下 后 , 换 用 3%NaCl 作 洗 脱 WM, 增加 竞争 性 离子 强度 ， 减 弱 树 脂 的 吸附 作用 , 使 AMGE 提 柱 层 析 分 离 过 程 中 ， 最 方便 是 通过 紫外 吸收 光谱 的 测定 进行 定性 和 定量 ， 也 可 先 根据 紫外 吸收 斑点 定性 观察 分 离 效 果 , 再 通过 5 -磷酸 测定 作 定 量 分 析 , 最 后 进行 纸 电 泳 鉴定 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 交换 剂 : 聚 茶 乙烯 -二 乙烯 苯 磺 酸 型 阳离子 交换 树脂 (全 交换 量 5 毫克 当量 /1 克 于 树脂 ， 粒 度 150~300 BH, KE 1x8)， 上 海 化 工学 院 产品 , 相当 于 -Zerojlite Ss RAR. 酵母 RNA BRK. | 精密 试纸 PH 0.5~5.0; 滤纸 ; 纱布 。- 2. 仪器 吸管 0.1 毫升 (x1),，0.5 I(x 5), 1 SFC x2), 5 训 eH iGe + Ft (<2); GRAF 1.5% 15 厘米 (x 100); 层 析 柱 1x 20 厘米 (x 1); 烧杯 250 毫升 (x 2); 玻 棒 ; 滴 管 。 自动 部 分 收集 器 ; 751 型 分 光 光 度 计 或 92 型 分 光 光 度 计 ; 紫外 层 析 灯 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 电 吹风 ; 铅笔 ; Ro 3. 试剂 (配制 方法 见 本 实验 亚 ) 6 % it MLR IXIA); 30% 乙 二 醇 ; 2M FA; 定 磷 试剂 。 四 、 操 作 步 又 1， 离子 交换 树脂 的 前 处 理 新 树脂 先 用 水 浸泡 ，- 以 浮 选 法 去 除 漂 浮 物 及 杂质 后 ， 用 1~2NNaOH 浸 洗 , 再 用 蒸馏 水 洗涤 到 近 中 性 ; 以 1~2N HCl 浸 洗 ， 再 以 蒸馏 水 洗涤 到 近 中 性 ， 如 此 反复 碱 酸 处 理 1 一 2 次 , 然后 用 适当 试剂 处 理 , 使 成 为 所 要 求 的 型 式 ( 如 五 型 用 也 Cl 处 理 ，Na 型 用 NaOH 或 NaCl 处 理 , 本 实验 为 也 型 )， 最 后 水 洗 至 中 性 , HA. 2. 装 柱 (装置 示意 图 见 图 27) 柱 先 用 铁 架 、 铁 夹 垂直 固定 , 在 经 过 前 处 理 的 树脂 中 加 入 少量 蒸馏 水 , TD, 缓慢 地 加 到 柱 内 , 然后 打开 下 端 活 塞 , HE 水 边 继续 加 树脂 CER W Dt 7k 面 低 于 树脂 表面 ), HERE eye Co 达 12 厘米 左右 。 要 求 柱 内 无 气 泡 , 均匀 ， 无 明 瞳 界面 产生 ,树脂 表面 应 水 平 。 装 完 后 ， 为 使 柱 稳 乳胶 管 定 , 需 用 蒸馏 水 流 过 平衡 过 夜 。 a 3. 加 样 及 洗 脱 加 样 前 ， 柱 先 用 0.03N HCl 流 过 , 直至 流出 液 P 互 达 1.5。 图 27 “离子 交换 柱 层 析 将 树脂 表面 多 余 之 液体 用 滴 装置 示意 图 — 163 — #6 HA Ys Je, FL ES RE I ORE (ZY 20 BEF 混合 物 ), 注意 不 使 树脂 表面 扰动 , 打开 下 端 活 塞 ,样品 被 吸收 后 , 立即 用 少量 蒸馏 水 将 玻璃 柱 内 表面 附着 的 样品 洗 下 , 再 在 柱 表面 加 蒸馏 水 至 颈 端 并 加 塞 , 然后 和 柱 上 端 洗 脱 液 瓶 接 通 ， 用 燕 饮水 进行 洗 脱 。 通 过 流出 液 紫 外 吸收 光谱 或 紫外 吸收 班 点 观察 , 待 前 三 个 峰 出 现 后 , 即 换 用 39% NaCl 作 洗 脱 液 。 。 洗 脱 开 始 时 , 打开 自动 部 分 收集 器 , 调节 到 每 隔 5 分 钟 转 动 一 次 , 流速 控制 3 毫升 /5 分 钟 ， 随 着 洗 脱 的 连续 进行 , 一 般 流速 会 降低 ,为 使 恒定 , 常 可 通过 升 高 洗 脱 液 面 的 高 度 来 调整 。 4. 流出 液 紫 外 吸收 斑点 观察 | 核酸 的 各 种 碱 基 在 紫外 部 分 都 有 强烈 吸收 , 因此 , 2 FB 纸 作 定 性 观察 时 , 如 流出 液 中 含 核 背 酸 , 则 在 紫外 层 析 灯 焉 旺 暗黑 色 的 吸收 斑点 ,颜色 的 深度 代表 其 含量 的 高 低 。 用 一 干净 玻 棒 ， 按 次 序 将 上 述 各 管 收集 的 流出 液 各 疗 一 滴 于 已 划 格 编号 的 滤纸 上 (编号 应 与 收集 管 号 相同 , 并 注意 在 点 下 一 管 之 前 ， 玻 棒 需 在 盛 蒸馏 水 的 烧杯 中 洗涤 并 用 纱布 控 干 ), 然后 用 电 吹 风 将 湿 点 吹 干 , 置 紫外 层 析 灯 下 观察 , BM 收 斑点 处 用 铅笔 图 出 , 用 +, ++, +++…… 表 示 颜 色 的 深度 。 通过 流出 液 紫 外 吸收 斑点 的 观察 ， 可 以 了 解 柱 层 析 分 离 情况 ， 待 被 分 离 的 四 种 5- 核 昔 酸 全 部 现 出 即 为 洗 脱 终点 〈 约 4~b 小 时 ), 停止 洗 脱 , 关闭 自动 部 分 收集 器 。 5. 流出 液 5- 核 背 酸 的 测定 (1)5'- 核 苷 酸 磷 的 测定 (原理 、 方 法 抑 本 实验 亚 ) KH 6% 过 碘 酸 试剂 0.1 毫升 于 试管 中 ， 加 入 样品 工 毫 升 (空白 用 蒸馏 水 代替 ), 混 匀 ,室温 反应 约 工 分 钟 ， 加 30% Z 二 醇 0.4 毫升 (破坏 过 量 的 过 碘 酸 ), 再 加 2M 甲 胺 0.5 毫升 ， 混 匀 ，45"C 水 浴 反 应 10 分 钟 ， 加 入 定 磷 试 剂 3 毫升 ， 混 匀 ， gs ABC AKIA PRI 20 分 钟 , 冷 至 室温 后 于 660 毫 微米 读 取 光 密度 COD¢60). 为 了 减少 测定 工作 量 , 可 根据 滤纸 的 紫外 吸收 斑点 观察 ， 按 吸收 峰 的 大 致 分 布 和 形状 , 适当 进行 “ 跳 间 ? 抽 测 。 测定 吸收 峰 范 围 内 的 EF L,I 10 #8 (0.55.0 毫升 )， 而 峰 间 各 管 不 必 稀释 , 可 直接 进行 测 Tex (2) 紫 外 吸收 法 测定 由 于 核 童 酸 组 份 中 的 碱 基 都 具有 共 罗 双 键 ， 在 紫外 区 有 吸收 谱 带 ， 260 毫 微米 处 吸收 最 大 。 因 此 ， 根 据 260 SRK 的 光 密 度 测定 值 和 已 知 核 昔 酸 在 260 毫 微米 的 克 分 子 消光 系 数 , 可 以 算出 它们 的 含量 (参见 实验 35)。 应 用 紫外 吸收 法 测定 吸收 峰 范 围 内 的 区 核 背 酸 含量 时 ， 一 般 需 稀释 50 倍 (0.1->5 毫升 ), 峰 间 则 不 必 稀 释 。 6. 中 - 核 苷 酸 分 离 曲线 的 制作 以 横 坐 标 代表 管 号 (或 流出 液体 积 )， 纵 坐标 代表 每 毫升 流出 液 的 光 密 度 值 (0Dee 或 OD:eo， 注意 应 将 测定 时 的 稀释 倍数 计算 在 内 ) 作 图 , 得 到 中 - 单 核 苷 酸 分 离 曲 线 。 - 用 定 磷 法 测定 时 ， 则 需 进一步 通过 纸 电 泳 来 确定 样品 中 BERNA, 如 用 紫外 吸收 法 测定 ， 由 于 各 种 单 核 昔 酸 都 有 特征 的 吸 收 光谱 , 因此 ， 根 据 已 分 离 的 样品 在 250, 260, 280, 290 it 米 的 光 密 度 值 ， 计 算出 相应 的 比值 COD 2 50/OD a6, OD2¢o/ DDsso,OD:swOD;eo), 并 与 已 知 单 核 苷 酸 的 标准 比值 ( 兄 实验 35) 比 较 , 便 可 对 核 苷 酸 的 性 质 作 出 判断 。 OU | 了 ee ih pe be or. Sal V. 单 核 苦 酸 的 纸 电 泳 法 鉴定 一 、 目 的 用 纸 电 泳 法 鉴定 柱 层 析 分 离 的 瑟 - we, 掌握 纸 电 泳 技 Pe =. he 纸 电泳 法 是 以 纸 作 为 惰性 支持 物 ， 利用 物质 电学 性 质 上 的 差异 在 电场 中 产生 泳 动 而 进行 的 分 离 \ 鉴 定 方法 a / Ay 50 C | b 号 | = i a}? se ax 100 | 时 了 站 b = 50 = AN 100 : a E 50 ; E = =) | 5 6 pH 图 28 单 核 昔 酸 的 解 离 曲线 a. 磷酸 基 一 级 解 离 ; b. 磷酸 基 二 级 解 离 ; c， 碱 基 氨 基 解 离 ; d. 碱 基 烯 醇 基 解 离 iGo? AMP, GMP, CMP, UMP DU Fe ET PBR TD) FD HU 离 、 鉴定 的 主要 依据 是 在 PH 3.5 时 ， 核 背 酸 磷酸 基 的 一 级 解 离 是 完全 的 ， 磷 酸 基 的 二 级 解 离 全 部 不 能 进行 ， 因 而 使 每 一 核 昔 酸 分 子 带 有 一 负电 荷 ， 但 氨基 的 解 离 程度 则 因 解 离 党 数 不 同 而 不 同 〈 图 28)， 净 负电 荷 在 PH3.5 时 差异 最 大 \ 见 下 页 表 )。 这 样 , 在 进行 电泳 时 , 单 核 苷 酸 向 正极 移动 ， 由 于 净 电 荷 的 大 小 , 其 次 序 UMP>GMP > AMP>CMP, 可 将 它们 一 一 分 开 。 IKI, LE 酸 样品 的 地 方 ， 在 紫外 展 析 灯 下 就 显示 暗黑 色 斑 点 RE A), HIER REA WE, 核 苷 酸 氨基 解 离 常数 4 FA fay AMP 3.70 0.46 GMP 2.30 0.95 CMP 4,24 6.16 UMP _ Be 1.00 在 一 定 条 件 下 经 洗 脱 后 ， 用 紫外 分 光 光 度 计 测 其 特征 吸收 光 谐 可 确定 某 种 成 分 。 根 据 每 一 单 核 苷 酸 在 一 特定 波长 下 具有 一 定 的 克 分 子 消光 系数 便 可 计算 其 浓度 , 进行 定量 测定 ( 见 实 验 35)。 本 实验 要 求 通 过 纸 电泳 法 定性 鉴定 柱 层 析 分 离 后 四 个 峰 的 成 分 。 为 此 , 以 四 种 标准 单 核 背 酸 同时 作 比 较 鉴 别 用 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 根据 测定 ， 分 别 选用 四 个 吸收 高 峰 相 应 管 号 的 流出 液 为 代表 。 标准 单 核 苷 酸 〈 2 毫克 /毫升 ): 分 别称 取 AMP, GMP, CMP, UMP 四 种 单 核 背 酸 10 毫克 ,各 溶 于 5 毫升 蒸馏 水 中 。 酶 解 液 ; 新 华 1 号 滤纸 15 x 30 BK, 2. 仪器 电泳 仪 ; 紫外 层 析 灯 ; 电 吹 风 ; 喷雾 器 ; 毛细 管 ; 铅笔 ; 尺 。 3.- 试剂 PH3.5 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓 冲 液 : 称 取 柠檬 酸 (C.H,O;- H,0)16.20 克 , tr BARN (Na,C,H;O0,-2H,0)6.70 克 ， 溶解 后 定 容 至 2000 BH, 2 四 、 操 作 步 又 1. 缓冲 液 的 装 放 将 PH3.5 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓冲 液 注入 电泳 槽 内 ， 共 约 2000 毫升 ,注意 二 边 槽 内 液 面 高 度 应 一 致 。 2. 点 样 (采用 干 点 法 ) 距离 纸 端 7 厘米 处 先 划一 基线 ， 从 基线 的 中 点 开始 向 左 _ 右 二 侧 各 间隔 1.3 厘米 作 一 记号 ， 然 后 用 毛细 管 分 别 将 酶 解 液 、 柱 层 析 分 离 之 流出 液 ( 四 个 吸收 高 峰 ) 以 及 四 种 标准 核 昔 酸 ( 共 九 点 ) 小 心 点 于 滤纸 上 , 点 直径 为 2 毫米 左右 ,点 完 一 次 J AKAKT, HA-KE i, BK. ATRRRAEA 同 , 为 在 紫外 层 析 灯 下 清晰 地 观察 电泳 后 的 分 离 图 谱 , 除 流出 液 的 第 3.4 二 峰 点 8 次 外 , 其 余 样 品 均 点 和 次 。 待 样品 全 部 点 完 后 , 用 盛 有 相同 缓冲 液 的 喷雾 器 将 滤纸 喷 湿 , 有 样 草 处 最 后 im, 注意 液 量 , 控制 喷射 均匀 。 3. 电泳 将 滤纸 平整 地 放 在 电泳 槽 内 的 滤纸 架 上 ， 纸 二 端 垂 于 组 冲 液 中 , 接 上 电极 , ERA tk WB), vay HAE 380 (KAA, 室温 电泳 2.5 小 时 。 4. 烘 于 电泳 完毕 后 , 关闭 电源 ， 拔 下 电极 持 头 ， 取出 滤纸 平 放 于 玻璃 架 上 , 80~100C 烘 箱 中 烘 干 。 5， 紫 外 吸收 观察 及 成 分 的 确定 取出 烘 干 的 滤纸 , 在 紫外 层 析 灯 下 观察 分 离 情况 , 用 铅笔 圈 出 各 吸收 点 的 位 置 ， 并 与 同一 图 谱 上 的 标准 单 核 苷 酸 作 比 Br, 确定 各 峰 的 成 分 。 —= 108 机 40. 脱氧 核糖 核酸 的 碱 基 组 成 及 其 含量 测定 一 、 目 的 学 习 脱 氧 核糖 核酸 CDNA) 中 碱 基 的 定性 及 含量 分 析 方 法 。 二 、 原 理 测定 核酸 的 味 叭 碱 和 喀 啶 碱 的 组 成 首先 要 使 核酸 进行 彻 底 水 解 , 使 水 解 最 终 产物 为 碱 基 。 一 般 水 解 的 方法 很 多 , 其 中 高 氧 酸 水 解 是 较 好 的 方法 。 高 氯 酸 的 水 解 产 物 为 游离 的 碱 基 ， 但 是 胸腺 喀 啶 会 遭 破 坏 ， 使 回收 率 降低 。 利 用 纸 上 层 析 法 可 以 把 碱 基 清 楚 地 分 离开 , 其 方法 与 氨基 酸 层 析 相 仿 , 主要 不 同 在 于 氨基 酸 层 析 一 般 采 用 上 行 法 ， 而 核酸 的 碱 基 层 析 一 般 采 用 下 行 法 。 因 为 溶剂 要 走 较 长 的 距离 才能 将 这 几 个 成 分 分 开 ， 在 下 行 法 中 , 溶剂 虽然 已 行 至 滤纸 的 下 缘 进而 流出 纸 端 , 但 只 要 层 析 溶剂 槽 内 有 足够 的 溶剂 , 层 析 尚 可 继续 进行 , 因而 便 无 须 很 长 的 滤纸 。 由 于 味 叭 碱 和 喀 啶 碱 对 紫外 光 有 强烈 吸收 ， 因此 也 可 以 在 紫外 层 析 灯 下 鉴定 结果 。 如 将 斑点 剪 下， 经 洗 Wit a AY ERP EERE TT EE EWE, RG AR ee OS Bik, FUNG Wie HB EA) EF 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 Pte WEAK: SGM (Gua), PREM (Ade), famene (Cyt), 胸腺 喀 啶 (Thy) 分 别 以 0.1V 盐 酸 配 成 5 毫克 /毫升 溶 液 。 其 中 鸟 嘎 叭 需 用 1AX 盐酸 配制 ， 若是 鸟 味 叭 盐酸 盐 则 仍 可 用 0.1N 盐酸 溶解 。 小 牛 胸 腺 或 鱼 精 DNA( 上 海牛 奶 公司 综 合 加 工厂 )。 新 华 滤纸 15x 45 厘米 ; 广 范 PH 试纸 。 一 2. (#8 吸管 5 毫升 (x1D，0.2 毫升 (x 1); 微量 进 样 器 10 微 升 (x4), 50 Cx D; 小 试管 1.0x7.5 厘 米 (x1) 试管 1.5x15 厘米 (x 8); BOT il 25 x 60 厘米 ; HE; 毛细 管 。 751 型 分 光 光 度 计 ; 紫外 层 析 灯 ; 离心 机 ; KBR; FAK 风 ; 剪刀 ; 尺 ; 铅笔 。 3. 试剂 10% i AIR(HC1O,, 4+ Hp Ai); 6N 氢 氧 化 钾 ;0.015 NV 盐酸 。 层 析 溶剂 系统 异 丙 醇 (分 析 纯 )170 毫升 ， He ahh Ori 纯 )41 毫升 , 加 水 至 250 Ft. 四 、 操 作 步 又 1. DNA KK 称 取 5 BH DNA 置 于 小 试管 内 ， 加 入 100 LF 10% 毛 酸 ， 然 后 将 试管 封 成 安 客 管 。100C 沸 水 浴 中 加 热 工 小 时 ， tI FRE, 用 6N AAT a coker g@ | PHBA. 2. 点 样 , 层 析 距 滤纸 一 端 10 JK Ab FA 笔划 一 基线 ， 从 中 间 疝 二 侧 相距 2 厘米 作 一 记号 ， 共 五 点 滤纸 的 另 一 端 用 剪刀 剪 成 饮 齿 状 ， 以 利于 溶剂 及 时 滴 出 纸 外 ， 使 下 行 层 析 能 连续 进行 。 用 毛细 管 将 各 种 标准 碱 基 溶 液 和 DNA 水 解 液 按 图 点 在 层 析 滤纸 的 记号 上 ， 用 - 电 吹 风 吹 生 后 再 点 第 二 次 ， 注 意 图 29 碱 基层 析 示 意图 ”务必 使 几 次 点 样 的 斑点 重合 ， 各 . ae 种 标准 碱 基 溶 液 点 样 5 Bt, DNA 水 解 液 点 样 30 BOE. 样品 斑点 完全 干燥 后 小 心地 把 滤纸 悬 于 层 析 人 缸 中 〈 此 时 切 勿 使 滤纸 与 溶剂 相 接触 )。 平 衡 一 小 时 后 , 小 心地 把 滤纸 放 入 盛 放 层 析 溶 剂 的 玻璃 船 内 ， 并 用 一 粗 玻 棒 压 住 滤纸 以 免 滤 纸 从 玻璃 船 中 滑 下 。 下 行 层 析 20 小 时 后 取出 滤纸 , BR a UK Fo 3. 层 术 结 果 观 察 已 干燥 的 滤纸 在 紫外 层 析 灯 下 观察 结果 ， 用 铅笔 画 出 各 紫外 吸收 斑点 ， 根据 标准 碱 基层 析 的 位 置 确定 DNA 水 解 液 中 相应 各 斑点 为 何 种 碱 基 。 4. DNA 中 各 种 碱 基 的 含量 测定 By DNA 水解 液 经 层 析 后 分 离 的 各 碱 基 斑点 ， 同时 在 其 附近 前 下 同样 大 小 的 空白 滤纸 作为 对 照 。 滤 纸 片 分 别 置 于 8 支 试 管内 ,加 3 毫升 0.015 盐酸 , 浸泡 6~8 小 时 (不 时 加 以 摇动 )。 洗 脱 液 经 3000 转 / 分 离心 5 分钟 除 去 滤纸 纤维 , 用 克 分 子 消 光 系 数 法 测 出 各 上 清 液 中 碱 基 的 含量 。 每 一 种 碱 基 洗 脱 液 分 别 以 相应 的 空白 滤纸 洗 脱 液 作 对 照 ， 在 此 碱 基 的 最 大 吸收 波长 下 (PH2 时 ) 测 光 密 度 (OD) 值 ， 即 可 计算 得 DNA 水 解 液 层 柱 谱 中 各 碱 基 的 量 ( 具 体 测定 计算 方法 见 实 验 35 中 有 关 部 分 )。 碱 基 “| 分 子 量 | 入 最 大 (PH2) | emx x 1073 guar a OD, = Re ws 262.5nm 13.15 ff EE ; 276.0nm 10.0 3 See i‘. 275.5nm 7.35 3 3 3 胸腺 喀 啶 264.5nm 7.89 a 41, DEAE- 纤 维 素 薄 层 层 析 一 一 核 背 及 核 昔 酸 的 分 离 ; AMP, ADP & ATP 的 分 离 一 、 目 的 学 习 核 苷 与 核 苷 酸 的 分 离 方法 以 及 AMP、ADP、ATP 相 互 分 离 的 方法 。 二 、 原 理 应 用 纤维 素 粉 或 其 它 诸如 硅 酸 、 氧 化 铝 等 吸附 剂 来 分 离 核 苷 和 核 音 酸 混合 物 或 分 离 AMP、ADP、ATP, 往往 效果 不 佳 , 而 应 用 离子 交换 纤维 素 进 行 层 析 分 离 效 果 显 著 提高 。 本 实验 中 所 采用 的 DEAE- 纤 维 素 具 下 列 结构 : CH,OH H OH O 本 Vi Noon N 7m: pe oN By ea H CH,OH OCH,CH,;NH(CH,CH;), OCH,CH,NH(CH,CHs3), | ares fe . . H / is 区 可 AS AH Noe BA H H 2 i 纤维 素 骨 可 CH,OH OC H,CH;NH(CH,CHs), DEAE- 纤维 素 的 结构 使 它 除 了 具有 分 配 层 析 的 作用 外 ， 还 具有 阴离子 交换 的 能 力 , 因 此 它 对 于 分 子 量 大 小 相似 , 而 在 at re _ . » a A ee nt or 时 3 一 定 PH 值 时 带 的 电荷 数 略 有 差异 的 物质 ， 有 较 大 的 分 离 能 力 。 在 PH2.0 或 PH2.3 时 ,各 核 苷 酸 的 磷酸 基 一 级 解 离 程度 一 致 ， 而 各 核 背 酸 的 氨基 由 于 其 PK 值 不 同 导致 解 离 程度 各 不 相同 ， 因 此 它们 带 负 电荷 的 量 是 : UMP>GCMP>AMP>> CMP。 带 负电 荷 愈 多 ， 与 DEAE- 纤 维 素 进行 离子 交换 的 能 力 愈 大 , 因而 样品 移动 的 速度 就 愈 慢 。 在 DEAE= 纤 维 素 薄 层 上 各 核 昔 酸 上 行 的 速度 是 CMP>AMP>GMP>UMP。 核 ”埋没 有 磷酸 基 , 不 具有 负电 荷 ， 展 层 后 位 于 核 背 酸 前 面 ， 因 此 能 与 相应 的 核 背 酸 分 离开 。 PRs — PERK AR (AMP), FRM — BRK mR (ADP) FIRM =ReERKAR ATP) 三 者 带 有 不 同 量 的 磷 酸 基 。 在 PH3.5 时， 它们 带 的 负电 荷 量 是 : ATP>ADP> AMP。 所 以 在 DEATI- 纤 维 素 薄 层 层 析 中 亦 能 分 离 。 此 方法 最 小 检 出 量 为 1~2 微克 , 它 可 以 与 紫外 分 光 光 度 计 配 合 使 用 进行 定量 测定 。 三、 实验 材 料 , 仪器 和 试剂 ，1. 实验 材料 RRA. PRA CAR). SH CGR), RH COUR,. a (CR) 4} FLA 0.01N 盐酸 配 成 10 毫克 /毫升 的 溶液 。 BERR. AMP, GMP 分 别 以 0.1N 盐酸 配制 成 10 毫克 /毫升 溶液 ，UMP、CMP 分 别 以 0.01N 盐酸 配 成 10 % 克 / 毫升 溶液 。 % A¥-%K TF IB & YER. AR-AMP, GR-GMP, UR- UMP, CR-CMP 分 别 以 0.1N 盐酸 或 0.01N 盐酸 配 成 10 这 死 /毫升 溶液 。 Pe Rew. AMP、ADP、AIP 及 三 种 样品 混合 物 各 以 一 0.1N 盐酸 配 成 10 毫克 /毫升 溶液 。 DEAE- 纤 维 素 〈 层 析 用 ， 国 产 或 “Serva” DEAE- 纤 维 素 )。 2. 仪器 Dk HB HY 10x 20 厘米 (x1)，20x 20 厘米 (x 1); 烧杯 250 毫升 (x 1); 层 析 缸 25 x 30 厘米 ; BAF 0.5 毫米 直径 。 紫外 层 析 灯 ; 铅笔 ; Ro 3. 试剂 LN 氧 氧 化 钠 ( 分 析 纯 ); LV 埠 酸 (分 析 纯 )。、 层 析 溶剂 系统 : 分 离 核 苷 - 核 苷 酸 一 一 0.0LN 盐酸 (PH2.0) 或 0.005N 盐酸 (PH2.3)。 分 离 AMP-ADP-ATP—0.1M 柠檬 酸 缓冲 液 (PH 3.5) 或 0.02AN th (pH1.7), 四 、 操 作 步 又 | 1. AR 国产 DEAE-4F 4 2 it “Serva” DEAE-4 #42) 1N& 氧化 钠 浸泡 一 小 时 ， ARKEE PH. BAIN 盐酸 浸泡 一 小 时 ,， 蒜 饮水 洗 至 中 性 ， 即 得 糊 状 DEAE=- 纤 维 素 (CL 型 )， 冰箱 保存 备用 。 已 处 理 过 的 DEAE- 纤 维 素 (CL 型) 加 水 调匀 (干粉 :水 = 1:12W/W)，, 铺 在 已 调整 水 平 的 洁净 玻璃 板 上 ,加 水 调 勺 后 的 Wk DEAE- 纤 维 素 100 克 可 铺 20x 20 JK Fil 10x 20 JK 玻璃 板 各 一 块 。 铺 好 的 板 在 室温 下 放置 ， 待 薄 层 表面 固定 后 T 60°C 烘箱 烘 干 〈 烘 箱 垫 板 亦 要 校正 到 水 平 )。 烘 干 的 薄板 放置 在 于 燥 器 中 备用 。 2， 核 苷 - 核 背 酸 的 分 离 — 174—. 点 样 前 将 备用 板 \20 x 20 JHE AK) ZE60°C BEAR HB ELE ~304} 钟 。 在 离 板 一 端 15 毫米 处 用 铅笔 轻 轻 作 十 二 点 记号 ,用 毛细 管 点 样 ， 点 样 体 积 1 ~2 微 升 ( 含 样品 10 一 20 微克 )。 待 样品 王后 ,将 板 放 入 层 析 代 内 ， 室 温 下 展 层 2~3 分 钟 。 溶 剂 前 沿 从 点 样 线 起 上 行 7~7.5 厘米 即 可 取出 薄板 ,60~80C 烘 箱 中 烘 于 。 在 紫外 层 析 灯 下 观察 结果 ， 用 铅笔 画 出 紫外 吸收 斑点 的 位 置 。 FAO. O1N 盐酸 (PH2.0) 或 0.005N 盐酸 (PH2.3) 二 种 深 剂 系统 都 能 很 好 地 分 离 各 对 核 苷 - 核 苷 酸 。 脱 氧 核 并 -脱氧 核 苷 酸 也 能 得 到 类 似 的 结果 。 3, AMP-ADP-ATP 混合 物 的 分 离 备用 板 (10x 20 厘米 ) 在 60°C HE AA HA HE 15~30 分 钟 。 在 离 板 一 端 15 毫米 处 每 隔 2 厘米 作 一 记号 , 共 四 点 。 每 种 样品 点 样 体积 1~2 微 升 〈 含 样品 10~20 微克 )。 室 温 下 展 层 10 分 钟 , 溶剂 前 沿 从 点 样 线 起 上 行 10 量 米 即 可 取出 薄板 ，60~~ 80C 烘 箱 中 烘 干 ， 置 紫外 层 析 灯 下 观察 并 记录 结果 。 AQ. 核糖 核酸 碱 水 解 产 物 的 琼脂 糖 电泳 鉴定 一 、 目 的 ist FR Dak 5 ie ee IB HK YE EK PETAR CRNA) 碱 水 解 所 得 的 PR RY, 掌握 琼脂 糖 电泳 分 离 单 核 背 酸 的 方法 。 二 、 原 理 ”核糖 核酸 经 酶 解 或 碱 水 解 后 可 得 到 四 种 单 核 苷 酸 ， 即 腺 id Aw CAMP), Se ey (GMP), jmemE aR (CMP) Fil DR me he KAR (UMP), 7#¢ pH3.2 的 条 件 下 , 上 述 四 种 单 核 背 酸 带 有 数量 不 同 的 负电 荷 (原理 见 实 验 39 中 纸 电泳 ne eee 4 EAS), 因此 它们 在 电场 中 向 正极 移动 的 速度 是 : UMP > GMP>AMP>CMP, 从 而 达到 分 离 。 防 脂 糖 电 注 是 以 琼脂 糖 凝 胶 作 为 惰性 支持 物 ， 使 被 分 离 ， 物质 在 它 上 面 进行 电泳 分 离 。 琼 脂 糖 是 由 琼脂 除去 琢 脂 胶 后 纯化 而 得 。 由 于 除去 了 不 少 带 负电 荷 的 极 性 物质 《主要 是 磺 酸 基 和 一 定量 的 羧基 ), 因此 克服 了 用 琼脂 作 电 泳 支持 物 时 的 电 渗 和 吸附 作用 。 鉴 于 琉 脂 糖 凝 胶 电泳 具有 分 辨 率 高 、 分 离 速度 快 、 操 作 方便 以 及 支持 介质 透明 而 无 紫外 吸收 等 特点 , 近 年 来 已 成 为 核酸 及 核 苷 酸 类 物质 分 离 、 鉴 定 的 常用 技术 。 核 背 酸 类 物质 的 分 离 一 般 在 十 分 钟 内 即 能 完成 ， 并 可 直接 利用 紫外 光 作 定性 鉴定 及 定量 测定 。 本 实验 要 求 通过 琼脂 糖 电泳 鉴定 RNA 经 碱 溶液 水 解 成 四 种 单 核 背 酸 的 成 分 。 为 此 用 四 种 标准 单 核 苷 酸 同时 作 比 较 鉴别 用 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 | 1. 实验 材料 四 种 标准 单 核 苷 酸 AMP、.GMP、CMP 和 UMP 分 别 以 0.1 N 盐酸 配 成 2 毫克 /毫升 的 溶液 。 核糖 核酸 (上 海 药 用 辅料 厂 ); 琼脂 糖 ( 生 化 试剂 , 上海 东 海 制药 厂 ); ABE Whatman No.3); 滤纸 ; 广 范 试纸 PH ”1 一 12。 | / 2 吸管 1 毫升 \x1)，10 毫升 (x1); 微量 进 样 器 10 FT (x5); 试管 1.0x7.5 厘米 (x1); 量 简 50 毫升 4(x1 烧杯 100 毫升 (x 1); 玻璃 板 7x7.5 厘米 (x 1); WH 电泳 仪 与 电泳 槽 ; 紫外 层 析 灯 ; 药物 台秤 ; 电 吹 风 ; 恒温 水 浴 箱 或 温 箱 ; 温度 计 ; ARR A; GRP; 刀片 ; 特种 铅笔 ; 斥 。 一 0 一 3. iil 0.05M 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓 冲 液 ，PH3.2: 0.05M 柠檬 酸 溶液 830 ZH 0.05M 柠檬 酸 三 钠 溶液 140 毫升 混合 ,以 了 也 计 校 正 混合 液 P 了 五 到 3.2。 0.3N KOH; 高 氯 酸 ( 分 析 纯 )。 四 、 操 作 步 又 1. RNA 的 碱 水 解 经 常用 来 水 解 RNA Ky pA NaOH, KOH %, (Ab) KOH 为 好 , 因为 水 解 后 用 高 氯 酸 中 和 水 解 液 , 生成 的 高 氯酸钾 溶解 - 度 小 而 沉淀 , 这 样 可 除去 水 解 液 中 的 钾 离 子 。 称 取 5 毫 克 RNA 置 于 小 试管 中 , 加 入 1 毫升 0.3WN KOH, 然后 将 此 试管 封 成 安放 管 。38"C 人 恒温 水浴 箱 内 (或 温 箱 中 ) 保 温 18 小 时 ,使 完全 水 解 成 单 核 苷 酸 。 打 开 安 闪 管 ,用 高 氧 酸 中 和 至 pH5~6 左右 , 待 测 。 2， 芒 脂 糖 凝 胶 板 的 制备 称 取 0.2 克 琼 脂 糖 ， 加 25 毫升 蒸 饮 水， 水 浴 加 热 溶 解 。 另 取 25 毫升 pDH3.2、0.054d 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓 冲 液 加 热 至 近 沸 , 趁 热 与 前 者 混 匀 , BB 0.4% pH3.2,0.025M eRe 冲 液 的 琼脂 糖 溶 液 , 备用 。 已 洗 净 的 7x7.5 厘米 玻璃 板 平 放 于 预先 用 水 平 仪 校正 的 平板 上 。 水 浴 加 热 使 0.4 多 琼脂 糖 熔化 , 稍 冷 到 60'"C 左 右 ， 吸取 7 一 8 BH MGS AMAT RRL, Ik 10~20 分 钟 使 其 凝固 。 3. 加 样 用 刀片 把 厚 质 滤纸 裁 成 宽 1.5 毫米 长 8 毫米 的 小 条 。 用 微量 进 样 器 吸取 每 种 单 核 苷 酸 溶液 所 微 升 以 及 RNA 水 解 液 10 微 升 ， 分 别 加 到 五 片 小 滤纸 条 上 ， 吹 干 。 用 一 片 刀 口 宽 8 — hth oa, = > Prey ee ey! 7 ya Aes ae a SE OK ERY YEE TJ Jar ZS aE IBS — Mi 1 OK A SEB SCN EB, FEES REI A RN ADK ARE BY NAR AR IRA TJ Br DF 取出 刀片 。 在 此 小 纸 条 二 侧 分 别 以 0.5 JEL OK Yad BR A 条 吸 有 不 同 单 核 苷 酸 样品 的 小 纸 条 。 注意 在 嵌 信 时 不 能 使 纸 KER. 4. 电泳 向 二 侧 电 极 槽 中 倒 入 pH 3.2, 0.05M 柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓冲 液 , 使 二 槽 中 的 液 面 在 同一 水 平面 上 。 已 加 好 样品 的 琼脂 糖 凝 胶 板 平 放 于 电泳 槽 中 ， 样 品 端 为 负极 。 些 凝 胶 板 与 电极 槽 缓冲 液 的 液 面 越 近 越 好 ， 用 以 缓冲 液 浸 湿 的 滤纸 覆盖 于 防 脂 糖 凝 胶 板 的 二 端 作 盐 桥 。 接 通电 源 , 调节 电压 到 300 伏 ， 电 泳 持 续 10 分 钟 后 关闭 电源 , EBC Hy ae IBC AN, 5. 结果 观察 GRAS BEER TERE Sb a OTT PE, CEA ER 外 吸收 斑点 ， 比 较 RNA 水 解 液 ONE PE 电泳 的 结果 , BE RNA 的 核 苷 酸 组 分 。 43. ECORI 酶 解 噬菌体 DNA Fr Bory Hak ap Bg 8 7 一 、 目 的 SERRE ESS DNA Tn =. Ae 限制 性 内 切 核酸 酶 卫 CORI xy A Mit A DNA 有 五 个 切 点 ， 因此 酶 解 后 生成 六 个 DNA 片段 。 当 以 琼脂 糖 作 为 电泳 支持 介质 时 ， 被 分 离 DNA 的 电泳 迁移 率 仅 与 DNA 的 分 了 予 BAX, Aimy DNA 片段 分 子 量 不 同时 可 获得 分 离 。 poet V4 Fane 利用 溴 乙 锭 插入 DNA Ja fe OP AR IR P 2c th t ZL f 光 可 检 出 DNA 各 片段 的 区 带 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 ADNA (进口 ) 以 蒸 饮水 配 成 500 微克 /毫升 的 溶液 。 ECORI( 进 口 ) 以 蒸馏 水 配 成 2.5 毫克 /毫升 的 溶液 。 琼脂 糖 ( 生 化 试剂 ,上海 东海 制药 厂 )。 2. 仪器 iA 1X 7.5 KC x1); 玻璃 管 0.6x15 AKC <4); 微 量 进 样 器 10 LFF CX 7), 50 微 升 (x 1); 烧杯 50 BF CX 1); 量 简 50 ZH (x 1); WH; RE. Ha AE Yih KA AA; 水 浴 锅 ; 电泳 仪 ; 盘 状 电泳 模 ROP BMT KT; 温度 计 ; 台秤 ; 刀片 ; 橡皮 圈 ; 尼龙 布 ; 橡皮 塞 。 3. 试剂 TMN 缓冲 液 : 0.1M Tris- 盐 酸 缓冲 液 , pH7.6, A®. | pmM 氧化 镁 ,50mM 氯 化 钠 。 10x TMN 缓冲 液 : 比 上 述 TMN 缓冲 液 浓 十 倍 。 0.1% HARK: 0.1 克明 胶 溶 于 100 毫升 水 中 。 省 酚 蓝 -蔗糖 溶液 : 0.2 克 省 酚 蓝 ，50 克 蔗 糖 溶 于 100 毫 Ft 7 VK. 电泳 缓冲 液 一 一 89mM =A cane can HMR, 2.5mM Z,— fe CR—W(Na,EDTA), pH8.5, 含 省 Ze (EB)0.5 hat / BA: 称 取 10.8 克 Tris, 5.5 MRA 0.93 克 Na,EDTA, 以 蒸 饮 水 定 容 到 1000 毫升 ,加 0.5 毫克 溴 乙 锭 。 四 、 操 作 步 又 1. ECORI 酶 切 XDNA - 一 129 一 10 微 升 0.5 微 克 / 微 升 XADNA 溶 液 中 加 3 微 升 2.5 微 - ” ge Ft hy ECORI YY. 5 GF} 10x TMN 缓冲 液 、5 微 升 4 0.1 儿 明胶 溶液 , 然后 以 27 微 升 蒸 馆 水 补体 积 到 50 微 升 。 此 混合 液 于 37C 中 保温 1 小 时 ， 取 出，65 CC 加热 五 分 钟 使 酶 失 活 。 再 加 10 WAR RAMA, ROB. 2. 琼脂 糖 凝 胶 的 制备 称 取 0.2 克 琼 脂 糖 于 小 烧杯 内 ， 加 入 20 毫升 电泳 缓冲 液 ,水 浴 内 加 热 挠 拌 至 完全 溶解 ， 以 蒸 馅 水 校正 总 体积 到 20 毫升 。 取 洗 净 的 0.6x 15 厘米 玻璃 管 4 支 ， 一 端 以 橡皮 塞 封 - 住 ,用 滴 管 把 60 一 80'C ASKS PAPA TER. PEGS OE BE Aa, 尼龙 布 包 在 每 支 凝 胶管 的 顶部 并 用 橡皮 圈 扣 紧 , Aw 倒 此 凝 胶管 , 除去 橡皮 塞 ， 让 凝 胶 从 玻 管 口 稍 滑 出 一 些 ， 用 刀 片 切 去 前 部 不 平 的 凝 胶 而 成 一 平坦 的 表面 。 让 凝 胶 向 下 滑 入 玻 管 内 并 贴 在 尼龙 布 上 。 3， 族 胶管 的 安装 及 上 样 将 琼脂 糖 凝 胶管 垂直 擂 入 上 电极 槽 底板 的 橡胶 塞 孔 中 ， 使 凝 胶管 在 孔 上 部 分 刚 可 见 到 凝 胶 层 的 顶部 ， 注 意 橡胶 塞 孔 必须 密封 不 漏 。 上 、 下 两 电极 槽 中 装 放 电泳 缓冲 液 , 凝 胶管 两 端 必须 浸没 在 缓冲 液 内 。 用 微量 进 样 器 吸取 已 加 溴 酚 蓝 -蔗糖 溶液 的 和 ADNA- 酶 解 液 10 微 升 , 小 心地 加 在 缓冲 液 下 的 凝 膀 顶 部 ; 另 用 一 支 微 量 进 样 器 吸取 3 微 升 ADNA [预先 在 DNA 溶液 中 加 入 省 酚 蓝 -蔗糖 溶液 (体积 比 为 5:1)] 加 样 于 另 一 支 凝 胶 顶 部 作为 对 照 。 上 述 二 种 样品 各 做 二 HEB 4. 电泳 PSHE, LANARK, FRAIER, 4 ES 60 伏 ， 室温 电泳 5 小 时 后 关闭 电源 ， i Hi Be =i ee “es - t 5. 结果 观察 小 心 让 凝 胶 从 玻 管 内 滑 出 , 置 于 层 析 灯 下 观察 电 沪 结果 ， 记录 有 桔 红 色 草 光 区 带 的 位 置 。 I EEE SLES EEE ET a a ES ee es EE a Pe SE Se ; 6-5 = ee. oS 六 、 酶 44. 酶 在 生物 组 织 中 的 分 布 和 某 些 因 素 对 酶 的 影 啊 —. Ba . i SY SER ALI WE, THN Ce EL Bs 情 次 和 某 些 因素 对 酶 活力 的 抑制 作用 。 —. fe . 酶 的 提取 根据 蛋白 质 的 溶解 原则 ， 一 般 采 用 水 、 稀 乙醇 、 黎 丙 柄 等 和 组 织 一 起 研磨 , DEE AA, 其 清 液 即 为 可 溶性 的 酶 WK. THAW FE KEE RIT PR: Bs 来 源 活力 测定 所 依据 的 原理 BAR | SRS Ee eee ee 最 后 形 成 结构 还 不 清楚 的 一 种 黑色 物 过 氧化 氢 酶 可 使 HO. 分 解 形成 He Oo, FAK ET RE RT ETRE 口上 , 可 见 其 复 燃 ， 证 明 有 O2 产生 AR BS A) HRA RA NH3 及 CO;。 NH, 可 用 蓝 入 本 国生 或 用 钠 氏 试剂 观察 其 红 过 氧化 氢 酶 | 肝 .脲酶 南瓜 子 脂肪 酶 分 解 脂 类 物质 ， 生 成 醇和 酸 ， 用 pH 试纸 测 其 反应 前 后 PH 变化 All ARS Ew SRA, FERRET, 不 再 与 碘 呈 蓝 色 反应 脂肪 酶 南瓜 子 bE 1 BS Wee Pe 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 马铃薯; 猪 肝 ; 南瓜 子 ; 唾液 ; BOR, KAA SARA; 精密 试纸 pH6.4~8.0, 2. 仪器 - MB 1 SHC x5), 2 毫升 (x3),， 5 毫升 (x2); 滴 管 (x 6); 量 简 10 SAC x1), 25 毫升 (x 1); 漏斗 6 厘米 (x 1); ik 管 1.5x15 厘米 (x20); HH; KIER. 3. 试剂 硝酸 银 固 体 ; 2 多 过 氧化 氨 ; 0.05M BAW; 0.19R#W MW; 0.01% AURA; 丁 酸 丁 酯 ;0.1 儿 淀粉 溶液 ; PH8.5 磷 酸 缓冲 液 ; 1% Ak. 0.05% MAR: 用 0.01N 碳酸 钠 配 制 。 稀 碘 液 : 碘化钾 15 克 , BL 12.7 克 溶 解 在 200 毫升 水 。 纳 氏 试剂 : 碘化钾 15 克 , 碘 10 Fo, A 15 克 和 蒸馏 水 10 毫升 放 在 100 毫升 平底 烧瓶 中 振 划 15 分 钟 左右 , 使 碘 完全 溶 解 , 此 时 溶液 温度 过 高 ， 可 用 冷水 冷却 ， 继 续 振 划 使 溶液 呈 浅 绿色 的 碘 化 钊 和 碘 化 未 复 盐 ， 倾 出 上 清 液 ， 定 容 至 200 毫升 ， 此 为 纳 氏 浓 溶 液 。 在 应 用 时 取 浓 溶液 75 毫升 加 入 到 10% A 氧化 钠 溶液 350 毫升 中 , 再 加 水 至 500 毫升 。 DO. RED R 1. MAR 取 生 马铃薯 5 克 , 用 刀 去 皮 后 切 成 小 块 , 置 研 钵 中 加 蒸 饮 水 10 毫升 ,研磨 后 用 纱布 过 滤 ， 滤 液 即 酶 提取 液 。 按 表 配 置 1~3 号 管 , WA 37"C 水 浴 培 养 十 小时， 观察 结果 并 加 以 说 明 。 — dar OS a en : ws oO ae i BAY so 液 Ces) | 87 | 现象 记录 | 结果 解 和 2 1 2( 者 沸 酶 ) | : (Ayes) ia 2. WALA 取 猪 肝 3 HLINARIALTK 10 毫升 , 置 研 钵 中 研磨 后 用 纱布 或 棉花 过 滤 ， 滤 液 即 含有 过 氧化 所 酶 。 按 表 配 置 4 了 号 管 , 放 入 BT CARRIE, FERMI FH HIG BY AA A HR BR a 口 有 否 氧气 逸 出 。 己 |2 多 过 和 氧化 委 。 酶 液 Re) ees) 1 ee eee | (毫升 ) | 于 过 ated Soe gig he aN 培 出 4 3 一 1 养 并 5 3 ~ 1( 煮 沸 酶 ) 24 6 3 1) 1 有 8 7 3 一 一 氧 3. KEE 称 取 去 壳 南 瓜子 15 克 , 置 研 钵 中 磨 碎 , 加 入 84 毫升 水 与 “ 16 毫升 5 多 乙醇 混合 液 , 研磨 15 分 钟 ， 置 冰箱 中 过 夜 , 倾 出 于 层 含 脲酶 之 清 液 备用 。 按 表 配 置 8~11 SF, 放 在 40~50C 水 浴 中 , 培养 5 分 钟 后 加 纳 氏 试剂 三 滴 , 观察 结果 。 4， 脂 酶 称 取 去 壳 南 瓜子 5 克 置 研 钵 中 磨 碎 ， 加 25 毫升 水 研磨 ， 过 滤 后 取 滤 液 备 用 。 按 表 配 置 12~14 号 管 , HA BT CK 养 30~60 分 钟 , 用 精密 PH 试纸 (6.4~8.0) 检 验 PH MARL, © — 184—— 纳 氏 试剂 eG iii 3 滴 3 滴 3 滴 PHS. Si RRM Me et: Sg ates pH 变化 | 结果 解释 管 号 | 0.1 多 淀粉 | 1 多 氧化 钠 | 水 现象 记录 2) (毫升 ) | (毫升 ) |( 毫 升 ) 和 解释 15 3 1 = 16 3 一 1 17 3 一 一 1x (者 沸 的 ) 18 3 一 1 ] (煮沸 的 ) 19 3 和 1 1 5. 淀粉 酶 C1) Breen yy (A) 配置 ， 嗽 口 后 开始 收集 唾液 1 毫升 ， 加 蒸馏 水 稀释 到 40 毫升 , 充分 混 匀 后 备用 。 一 (2) 制备 不 含 Cl 离子 的 唾液 CB): RE mR (A) 20 毫升 放 入 透析 袋 中 , 置 盛 有 蒸馏 水 的 容器 中 透析 过 夜 , 直至 用 硝酸 银 试 验 无 氧化 银 混浊 反应 止 , 倾 出 袋 中 酶 液 备用 。 按 表 配置 1S~19 管 ， 放 37"C 水 浴 中 保温 10 分 钟 后 加 砚 液 2 滴 , 观察 结果 。 45. 1398 中 性 蛋白酶 活力 测定 一 、 目 的 学 习 蛋 白梅 活力 的 测定 方法 。 . Ae 酶 活力 大 小 通常 是 以 在 该 酶 适宜 的 温度 和 PH AEE, 酶 催化 一 定时 间 后 ， 反 应 物 中 底 物 减 少 的 量 或 产物 形成 的 量 来 表示 。 本 实验 是 以 测定 产物 形成 的 量 来 表示 1398 有 蛋白酶 WE. | 5 A Be RE HE 1h Ee A RB A, A Pe ER Zs K. MREABHBHA KM KR KBR, AR eR HMA, RGR KB AA 5 KR 《或 色 氨 酸 ) 作 用 生成 蓝 色 物 ， 从 蓝 色 深浅 的 程度 可 以 求知 栈 氨 酸 的 多 少 ， 从 而 确定 酶 活力 的 大 小 。 蛋白 酶 的 活力 用 分 解 出 酷 氨 酸 的 量 来 表示 ， 目 前 国内 通 用 的 蛋白 酶 活力 单位 定 为 : 每 分 钟 内 分 解 出 工 微 元 酷 氨 酸 的 酶 量 称 为 1 单位 。 在 测定 酶 活力 前 ， 先 用 福 林 酚 试剂 与 已 知 的 不 同 浓度 的 酷 氨 酸 作用 , 作出 蓝 色 深浅 程度 4 用 光 密 度 值 表 示 ) 与 酷 氨 酸 浓度 关系 的 标准 曲线 。 然 后 再 将 酶 和 抵 物 反应 - 的 产物 与 福 林 酚 试剂 作用 , 在 分 光 光 度 计 上 测 出 光 窗 度 , 从 标 准 曲 线 上 查 出 相当 于 多 少 微克 的 酯 氨 酸 ， 再 计算 出 酶 的 活力 单位 。 — 186 — 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 1398 和 蛋白酶 粗 酶 粉 ( 上 海 新 型 发 酵 厂 ); 滤纸 。 2. 仪器 ”大 试管 3.0x 20 K(x 6); 试管 1.5x15 厘米 (x 18); 吸管 工 毫 升 (x14)，2 毫升 \(x 1)，5 毫升 \x 2)，10 SAX 1). 721 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 。 3. 试剂 福 林 - 酚 试剂 ( 配 法 见 实验 21 试剂 乙 )。 标准 酷 氨 酸 溶液 ， 称 取 100 毫克 酷 氨 酸 (预先 在 105"C 烘 箱 干 燥 至 恒 重 )， 加 0.2WN 盐酸 溶解 后 定 容 至 100 毫升 ， 再 用 - 水 稀释 5 倍 , 得 到 200 微克 /毫升 的 酷 氨 酸 溶液 。 酪 蛋白 溶 液 : 称 取 酷 蛋白 2 克 , 置 150 毫升 三 角 瓶 中 , 加 入 0.2M BRA A 61 毫升 ， 在 水 洽 上 搅拌 使 溶解 ， 再 加 入 39 毫升 0.24 磷酸 二 氢 钠 , 5) PHT MRAM, th be 液 备 用 。 0.4M 三 氯 醋酸 溶液 (TCA); 0.4M Na,CO,, 四 、 操 作 步 又 1. ABA RE Hh ZX til PE 6 MKAEG, HE RMARAMR AA KK, 得 到 一 系列 AB TF ee BE BY a PRA HK. EB Mc iit) BY A YK BE AAR PK SR 1 毫升 于 6 支 试 管内 。 按 下 表 次 序 加 入 试剂 ， 并 混合 均匀 ， 然 后 在 400K 中 保温 20 分 钟 , 取出 各 管 在 721 型 分 光 光 度 计 上 , 测 出 650 训 _ 微米 处 光 密 度 值 。 以 酷 氨 酸 浓度 为 横 坐 标 ， 光 密度 值 为 纵 坐 标 ， 作 出 标准 Tae A RASA R200 Poe / Ft 《毫升 ) 0.4M NazCOs | 广 林 酚 试剂 (2H (BF) ) zs Gal Pt [2 SEUSS MSE OB HMO) 曲线 。 2. 蛋白 酶 活力 测定 (1) 浸出 酶 液 ， 称 取 0.5 克 酶 粉 加 入 40 下 放置 一 小 时 并 时 加 搅动 ;_ 将 酶 浸出 液 过 滤 ， 用 水 稀释 至 20 毫升 , 即 为 稀释 1600 倍 酶 液 。 酷 氮 酸 最 终 浓度 (微克 /毫升 ) 0 20 40 PP oe 80 400 毫升 水 , 在 室温 取 滤 液 1 毫升 (2) 活力 测定 : M4 支 试管 ， 每 管 中 加 入 稀释 好 的 酶 液 1 毫升 , 第 一 管 作 空白 ,在 比 色 时 用 此 管 调节 —188--— 光 密度 为 堆 , 使 其 他 三 管 在 此 比 色 计 上 读 得 的 光 密度 值 , 直接 代表 酶 活力 。 空 ， pe. 4 te tae tal ” 白 管 在 加 入 酶 液 后 立即 加 入 0.4! TCA 2 毫升 ， 使 酶 在 没有 遇 到 底 物 时 已 失 活 。 在 另外 三 支 试管 中 加 入 酶 液 后 ， 再 加 入 1 毫升 PHT 酷 蛋 白 溶 液 作为 底 物 , 并 立即 放 入 40"C 水 浴 准 确 保温 10 分 钟 。 酶 反应 时 间 一 达到 , 立即 在 第 2.3.4 管 中 加 入 0.4M ICA 2 毫升 ， 终 止 酶 反应 。 在 第 一 管 中 加 入 1 毫升 底 物 , 四 管 继续 在 40C 保 温 10 分 钟 ， 使 蛋白 质 沉 淀 完全 。 经 过 滤 ， 去 除 多 余 的 酪 蛋白 和 酶 蛋白 。 各 管 滤液 分 别 取 1 SHE 另外 对 支 试管 , 再 加 入 0.4M NasCOs 5 毫升 ， 福 林 - 酚 0.5 训 升 ,处理 方法 同 标准 曲线 , 测 其 光 密 度 值 。 Fa KAD | NasCO, “试剂 (毫升 ) | 毫升) 混 | 管 | mem | TCA | 酪 蛋白 | TCA lee, | 滤液 GEF)|GEF)| GEM belEID|GEH cle] 。 Brat Meee 号 1 2 3 1 《3) BREATH: 将 酶 活力 测定 的 光 密 度 值 ， 在 标准 曲 线 上 碍 得 相应 的 酷 氨 酸 的 毫克 数 , 即 可 按 下 式 计算 酶 活力 蛋白 酶 活力 (单位 ) = 酷 氨 酸 毫克 数 x 和 x A 式 中 4/10 的 意义 是 ,活力 测定 总 量 为 生 毫 升 , 而 福 林 - 酚 试剂 显 色 时 仅 取 1 毫升 ,所 以 要 乘 4。 由 于 酶 反应 时 间 为 10 分 钟 , 而 计算 酶 活力 单位 为 每 分 钟 分 解 出 的 酷 氨 酸 毫克 数 , 故 应 除 以 10。 如 果 生 产 和 科研 工作 中 需要 经 常 测 定 蛋白 酶 活力 ， 则 可 在 标准 曲线 制作 好 后 , 求 出 斜率 民 值 , 即 可 直接 从 下 式 求 出 酶 活力 : "人 蛋白 酶 活力 (单位 ) = 酶 活力 测定 的 OD Ax K x & x 酶 的 稀释 信 数 K 值 求法 是 ， 在 酷 氨 酸 标准 曲线 上 取 100 微克 时 的 光 密 度 值 , 再 用 1 00 BR, 即 为 从 值 。 如 标准 曲线 上 相当 于 100 微克 Ws za PRY OD 值 为 0.95, WK =100/0.95=105, 46. 脂肪 酶 活力 测定 一 、 目 的 25 ROR EH AL =. RB. 脂肪 酶 为 一 种 水 解 酶 ， 在 一 定 条 件 下 ， 可 以 把 甘油 三 Ae Be, BERT AR, SPB | HRP ALPES YB TK FE YB EA 即 可 定量 求 出 脂肪 酸 的 量 ， “从 而 求 出 脂肪 酶 活力 。 绅 肪 酶 催化 反应 如 下 CH 一 0 一 C 一 及 EEC- R Pelee” CH_OH +3R—COOH 2 | sr 脂肪 酸 GCCGERRSAR 甘油 甘油 三 酯 在 一 定 条 件 下 , 脂肪 酶 水 解 脂肪 , 每 分 钟 产 生 1 微 到 分 子 此 肪 酸 的 酶 量 定 为 一 个 国际 单位 。 在 测定 中 由 于 氢 氧 化 钠 与 = 脂肪 酸 是 等 当量 作用 的 ， 因 此 测定 中 所 耗 去 的 氢 氧 化 钠 的 微 克 分 子 数 就 是 脂肪 酸 的 微克 分 子 数 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 脂肪 酶 制剂 。 2. 仪器 吸管 1 毫升 (x1),5 毫升 (x 2); MH 50 毫升 (x 1D); Ww EFL WAAC mE E(x 1); 烧杯 50 毫升 (x 1); 三 角 烧 瓶 100 毫 升 (x3); 容量 瓶 250 毫升 (x 1); RHE. 电热 恒温 水 浴 箱 ; 温度 计 。 3. 试剂 聚 乙烯 醇 (P. V. A) 橄 榄 油 乳 化 液 : 称 取 40 克 聚 乙烯 醇 CREA 1000~1750)， 加 蒸 馆 水 约 1000 毫升 ,水 浴 加 热 搅 FER. VA REA 1000 毫升 ， 双 层 纱布 过 滤 ， 备 用 。 取 EX 4 多 聚 乙烯 醇 溶 液 150 毫升 ， 加 50 毫升 橄榄 油 ， 于 高 速 组 织 拆 碎 机 中 搅动 6 分 钟 ( 分 二 次 进行 )， 即 成 乳白 色 聚 乙烯 醇 橄榄 油 乳 化 液 ， 冰 箱 保 存 。 ( 若 贮存 后 上 层 有 油 析 出 ， 需 再 进行 搅动 使 成 均一 乳化 液 。) 0.025M 磷酸 缓冲 液 , PH7 .5: 甲 液 一 一 称 取 磷 酸 二 氧 钾 ( 民 再 PO,， 分 析 纯 )17.01 克 ， 加 水 定 容 到 500 SF. 乙 液 一 一 称 取 磷酸 氨 二 钠 (Na,HPO,-12H,0, 4} 2H) 44.77 克 , 加 水 定 容 到 500 毫升 。 取 甲 液 13 Ft, 乙 液 100 SFE A Bl mk PH7.5, 0.25M 磷酸 缓冲 液 , FERRE 10 倍 即 成 PH7.5、0.02524 磷酸 缓冲 液 。 0.05N 氢 氧 化 钠 标 准 溶液 : 称 取 40 克 氧 氧化 钠 (分 析 纯 ) 加 蒸馏 水 至 1000 毫升 , 成 为 约 LN 的 溶液 ， 经 标定 浓度 后 — ter fe 准确 稀释 到 0.05N。 1 狗 酚 酸 指 示 剂 : 1 THAT 100 毫升 %5 狗 乙醇 中 。 95% 乙醇 。 四 、 操 作 步 又 1. 酶 液 的 制备 haga 精确 称 取 脂 肪 酶 粉 SE, PEWS HE) Ee 状 ， 再 加 水 定 容 到 250 毫升 即 成 稀释 250 倍 酶 液 〈 每 次 稀释 倍数 视 酶 活力 单位 而 定 )。 由 于 脂肪 酶 主要 附 在 细胞 表面 , 很 少 游离 , 因而 在 浸出 液 中 酶 活力 很 低 ， Bi DA eA 的 酶 液 摇 匀 再 取样 , 切 不 可 过 滤 后 取 清 液 测定 。 2. REA WE 加 5 ZF PH 7.5, 0.025M 磷酸 缓冲 液 和 4 SHROM 醇 橄榄 油 乳 化 液 于 三 角 烧 瓶 中 置 40C 水 浴 中 预 热 10 分 钟 。 加 入 酶 液 1 毫升 (从 加 入 酶 液 开始 精确 计时 ),40'C 保 温 15 分 钟 ， 立 即 加 入 15 毫升 95% 乙醇 中 止 酶 反应 。 加 酚 酚 指示 剂 2~3 滴 后 以 0.05N 氧 氧化 钠 标 准 溶 液 滴定 到 微 红 色 , FA 氧化 钠 溶 液 的 消耗 体积 。 重 复 二 次 测定 。 3. 对 照样 品 的 测定 在 已 加 有 5 毫升 PDHE7.5、0.0252《 磷酸 缓冲 液 和 4 毫升 聚 乙烯 醇 橄榄 油 乳 化 液 的 三 角 烧 瓶 内 ， 先 加 入 95% 乙醇 15 pen, | 0.05N 氧 氧化 钠 耗 量 0.05N 氢 氧化 钠 平均 耗 量 | 脂肪 酶 活力 ”. HH (毫升 ) (EF) (单位 / 克 ) 毫升 , 然后 再 加 工 毫 升 酶 液 。 以 酚 栈 作 指示 剂 , 0.05N AA 钢 滴 定 至 微 红 色 ， 记 下 所 消耗 的 氢 氧 化 钠 溶液 体积 No 五 、 结 果 计 算 脂肪 酶 活力 单位 按 下 式 计算 ， 单位 /真人 0 EX. A 为 酶 液 样品 消耗 的 0.05A A Ha, B 为 对 照样 品 消耗 的 0.05N Shh St; N 为 每 毫升 0.05N 氧 氧 化 钠 溶液 中 所 含 氢 氧 化 钠 的 微 元 分子 数 ( 为 50); f{ 为 酶 粉 黎 释 倍数 ; w 为 测定 时 所 用 酶 粉 的 克 数 ; t 为 酶 作用 时 间 ( 分 )。 例 : 某 一 脂肪 酶 制剂 1 TERRE 250 倍 后 ， 取 1 BARE 法 测定 ， 平 均 耗 碱 量 为 5.90 毫升 ， 对 照 耗 碱 液 为 1.40 毫升 ， 本 BE / 38 (5.90 一 工 . -40) x 50x 250 = 3000 单位 / 死 47， 基 糖 酶 的 纯化 和 比 活力 测定 吕 , 吧 一 、 目 的 学 习 吸 附 剂 提纯 蔗糖 酶 的 基本 方法 ， 正 确 掌握 蔗糖 酶 比 活力 测定 技术 。 二 原理 酶 的 纯化 是 研究 酶 的 重要 步骤 , 在 多 数 情 况 下 , 它 都 是 必 不 可 少 的 。 由 于 酶 是 蛋白 质 ， 因 此 常用 的 分 离 提 纯 方 法 也 就 一 93 一 a | ee a 是 常用 的 蛋白 质 纯化 的 方法 。 对 于 不 同 来 源 的 各 种 酶 ， 通 常 采用 盐 析 沉 淀 、 吸 附 、 离 子 交 换 、 结 晶 及 各 种 物理 从 学 方法 将 它 提纯 。 在 纯化 过 程 中 , 外 界 各 种 物理 、 化 学 因素 往往 容易 引 起 酶 的 失 活 , 因此 酶 的 纯化 最 好 能 尽量 避免 高 温 、 激 烈 的 机 械 搅拌 、 强 酸 、 强 碱 等 容易 造成 蛋白 质变 性 的 各 种 激烈 条 件 。 莽 糖 酶 在 PH6 的 条 件 下 , 能 被 新 鲜 制 备 的 铝 胶 (AI(OH),) 所 吸附 。 通 常 每 1 毫克 所 氧化 铝 凝 胶 能 吸附 12~36 活力 单 位 的 蔗糖 酶 , 被 吸附 的 酶 保持 着 原来 的 活性 ， 并 且 能 够 被 DH 2.9 的 缓冲 液 洗 脱 下 来 。 蔗糖 酶 是 一 种 水 解 酶 , 它 能 使 蔗糖 水 解 为 果糖 和 葡萄 糖 。 在 20"C 下 每 三 分 钟 能 使 2.5 多 蔗糖 溶液 释放 1 毫克 还 原 糖 的 酶 量 定 为 一 个 活力 单位 。 基 糖 酶 催化 的 反应 式 如 下 : CH,OH CH,OH O O AN Le ee HON) a /Lo-\G / CHAO 7 H H ou H CH,OH CH,OH H A °\ 4 ear OH H “4 + x O H H H CH,OH H OH OH H 葡萄 糖 果糖 因此 ， 只 要 用 一 种 适当 的 试剂 测定 反应 中 还 原 糖 数量 就 可 以 获知 它 的 活力 , 又 由 于 蔗糖 酶 在 碱 性 环境 中 非常 容易 失 活 , 因 、 此 可 以 用 碱 来 停止 酶 的 作用 。 —Bi- 实验 中 的 比 活力 测定 是 以 每 毫克 蛋白 质 含 有 酶 的 活力 单 位 数 来 计算 。 为 适应 实验 室 条 件 ， 在 35'C 下 进行 活力 测定 。 蛋白 质 的 浓度 测定 采用 福 林 - 酚 试 剂 方法 ， 同 时 利用 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 与 葡萄 糖 生成 红色 化 合 物 ， 通 过 比 色 法 测定 酶 反 应 后 生成 的 还 原 糖 量 来 测 酶 活力 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 ”0.1 狼 葡 萄 糖 标准 液 : 精确 称 取 葡 萄 精 (Ara) 工 克 用 蒸馏 水 定 容 至 1000 BF. 蛋白 质 标 准 溶 液 ， 精确 称 取 结晶 牛 血清 白 蛋 白 ， 以 蒸 饮 水 配制 成 300 微 克 / 毫升 的 溶液 。( 牛 血清 白 蛋白 需 预先 用 微量 克 氏 定 氮 法 测定 其 蛋白 含量 ， 然 后 根据 其 含量 配制 标准 溶 液 。) 新 鲜 酵 母 ; 透析 袋 或 透析 纸 ; 精密 试纸 PHO.5~5.0; 丝 线 ; 软木 塞 。 2. 仪器 吸管 工 毫 升 (x5)，2 毫升 (x5)，5 毫升 (x5)，10 毫升 (x1); 试管 1.5x15 厘米 (x15); 血糖 管 25 毫升 (x 11); 离 心 管 10 毫升 (x 3)， 刻 度 离心 管 10 毫升 (x 1); Bf 10 ZH (x1), 50 BF (x1); 三 角 烧 瓶 50 毫升 (x1); 滴 管 ; KR 棒 。 72 型 分 光 光 度 计 ; 温 箱 ; 冰箱 ; 离心 机 ; 电热 恒温 水 浴 箱 TBA; GPF; 温度 计 。 3. iA 测 蛋 白 试 剂 甲 、 乙 : 见 实验 21, 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 : 见 实验 1, 0.1M RAM wR, PH4.6: 0.2! 醋酸 溶液 (11.55 毫升 =~ UKM EAE 1 FP) 25.5 毫升 与 0.2M MAM (16.4 克 NaAC x 27.2 克 NaAL.3H2O € RA 1 F}) 24.5 毫升 混和 稀 释 到 100 毫升 。 5% KERRY CW/V). 5 克 蔗 糖 以 PH4.6 的 0.1M 醋酸 缓冲 液 配 成 100 毫升 的 溶液 。 4M 乳酸 缓冲 液 ，PH2.9: Were Tyee 钠 溶液 1 份 混合 而 成 ,以 PH BIE PH (3 2.9, 新 鲜 制 备 的 所 氧化 铝 凝 胶 A: 称 取 250 克 硫酸 铝 (AL (SO,)3-18H,O)] 溶 于 750 毫升 水 内 , 加 温 至 55"C 后 把 溶液 立 刻 倒 入 2.5 Ft 15 多 氨水 ( 预 热 至 55"C) 中 ， 同 时 用 搅拌 器 剧 烈 搅拌 , 温度 将 升 到 58\C， 此 时 必须 使 温度 保持 在 55~60°C 之 间 并 连续 搅拌 半 小 时 。 把 溶液 移 到 5 升 圆 底 烧 瓶 中 ， 装 上 回流 冷凝 器 ， 回 流 48 小 时 。 移 入 一 大 瓶 内 ， 加 水 稀释 至 12 升 ,用 倾 泌 法 洗涤 三 次 。 沉 淀 内 加 500 VF 15%AK, BPH, 以 分 解 残留 的 少量 的 碱 或 硫酸 , 继续 以 水 洗涤 , 使 连续 三 次 的 洗 水 不 再 澄清 并 使 沉淀 成 为 凝 胶 状 。 栈 酸 钠 ( 化 学 纯 ); PACs); 4A 醋酸 ; INARI 、 钠 。 四 、 操 作 步 又 1. 和 蛋白质 浓 度 测定 的 标准 曲线 制作 六 支 试管 分 别 按 下 表 顺 序 加 入 300 微克 /毫升 牛 血 清 白 蛋白 溶液 与 水 。 加 试剂 甲 5 eH, 播 匀 后 室温 放置 十 分 钟 ， 再 加 0.5 毫升 试剂 乙 ， 播 义 ， 继 续 放 置 三 十 分 钟 ，650 毫 微米 处 测 光 密度 (OD) 值 。 以 蛋白 质 含量 (微克 ) 为 横 坐 标 ， 光 密度 值 为 纵 坐 标 作出 标准 曲线 。 2. 葡萄 糖 浓度 测定 的 标准 曲线 制作 — 196.-— CTE TE: Ce eT ry Ae ee TK Phat, Meee . a oF : a + , Ns * a ; DOOD AE TAS TRC Po a : ee) ann ODes0 Petre) ae TE 剂 剂 1 0 L044 FS | a 8 | me 2 of Oe | HH 5 3 0.4 0.6 >? 4 和 10 半 0.8 分 小 钟 时 和 1.0 后 取 11 支 血糖 管 ， 按 下 表 顺 序 加 入 0. 1% Ti Hed BRYA IK. 7K 及 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 : 4 Ee} 0 0 2 1.5 é 9°) 0.2 0.2 1.8 1.5 3 | 0.4 0.4 1.6 1.5 4 | 0.6 0.6 1.4 1.5 5 | 0.8 0.8 1:2 1.5 ‘ 6 | 1.0 1.0 1.0 1.5 PAS 12 1.2 0.8 1.5 8 fsl.4 1.4 0.6 1.5 9 | 1.6 1.6 0.4 1.5 10 | 1.8 1.8 0.2 1.5 fa F370 2.0 0 1.5 上 述 试剂 混合 均匀 后 在 沸水 浴 中 加 热 丘 分钟， 取出 立即 用 冷水 冷却 ， 以 蒸 馅 水 稀释 至 25 BF, HY. Wl 540 毫 微米 Jt BE (OD) fi. -过 以 葡萄 糖 含量 (毫克 ) 为 横 坐 标 ， Es JAE BA 标准 曲线 。 3. 蔗糖 酶 粗 制 品 的 提取 在 50 毫升 三 角 瓶 中 加 入 鲜 酵 母 10 克 ( 若 用 干 酵母 , 则 加 少量 水 调 成 糊 状 ) 加 0.8 TERRA, HEPE 15~20 分 钟 后 团 块 液化 ,加 1.5 毫升 甲苯 ,用 适当 的 软木 塞 将 瓶 口 塞 住 , 摇动 10 分 钟 , BOA 37°C 温 箱 中 保温 60 小 时 。 取 出 后 加 1.6 毫升 4V BARRA 5 毫升 水 ， 使 PHW4.5 RH. BAW 3000 转 / 分 离 心 半 小 时 , 离心 后 形成 三 层 , 将 中 层 移入 刻度 离心 管 中 , 上 .下 层 混和 后 再 加 5 毫升 水 , 摇 义 ，3000 转 / 分 离心 30 分 钟 , 取出 中层 与 第 一 次 合并 , 记录 总 体积 。 此 即 为 蔗糖 酶 的 粗 制 品 。 吸取 0.5 毫升 蔗糖 酶 的 粗 制 品 溶液 ,用 蒸 馆 水 稀释 到 10 毫升 , 按 下 述 方法 测定 比 活力 。 4. 蔗糖 酶 的 比 活力 测定 | (1) 将 上 述 酶 液 再 稀释 二 倍 ， 取 0.3 毫升 按 标准 曲线 同 样 操作 进行 蛋白 质 浓 度 测 定 \ 以 水 作对 照 )， 计 算出 样品 中 的 蛋白 质 总 量 ( 以 毫克 计算 )。 (2) 取 二 支 试管 分 别 加 入 2 毫升 稀释 的 酶 液 。 一 支 做 对 HA, 加 入 0.5 毫升 1IV NaOH, #4, 使 酶 失 活 ; 另 一 支 做 测 定 管 。 此 二 支 试管 和 59% 蔗糖 溶液 放 在 35°C 水 浴 中 预 热 10 分 钟 。 分 别 吸取 2 毫升 5% 的 蔗糖 液 于 上 述 二 试管 中 ， 并 且 正确 计算 时 间 ，3 分 钟 REM ee PMA 0.5 SHIN NaOH， 摇 匀 ( 整 个 反应 过 程 在 35"C 下 进行 )。 从 反应 混合 物 中 取出 0.45 毫升 溶液 用 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 测定 酶 反应 生成 的 还 原 糖 数量 (方法 同 标准 曲线 的 制作 )， 计 算出 所 有 的 梅 在 35C 下 , 以 5 多 蔗糖 为 底 物 时 ，3 分 钟 能 释放 出 的 还 原 糖 = em“ 2) eon er ke ae eS ee eee ’ ad * - ° on 总 的 毫克 数 , 此 即 总 活力 单位 (A)。 以 总 蛋白 质量 为 分 母 ， 总 活力 单位 数 为 分 子 ， 计 算 每 训 克 蛋 白质 所 含 的 活力 单位 , 即 比 活力 (A/ 毫 克 )。 5. WORN EZE 48 BE [AI(OH):] 上 的 吸附 和 洗 脱 (1) 吸附 :将 酶 的 粗 制 品 稀释 成 100 单位 /毫升 左右 的 溶液 , 到 3 毫升 置 于 离心 管 中 , 加 入 等 体积 的 AI(OH)s。 搅 拌 15 分 钟 后 放 入 冰箱 。 次 日 离心 ,分 出 上 清 液 ， 沉淀 用 5 毫升 水 洗涤 一 次 ， 离 心 后 吸出 上 清 液 与 第 一 次 上 清 液 合 并 。 同 前 法 测定 上 清 液 的 比 活 力 。 (2) 洗 脱 ， 上 述 沉淀 用 3 毫升 4 pH2.9 乳 酸 -乳酸 钠 缓 冲 液 搅拌 抽 提 30 分 钟 ，3000 转 / 分 离心 15 分 钟 , 移出 上 清 液 , 沉淀 复 用 2 毫升 缓冲 液 洗 提 1d 分 钟 , 离心 后 弃 去 沉淀 。 合并 二 次 上 清 液 , 对 水 透析 24 小 时 。' 得 到 的 透明 液体 即 为 提 纯 的 酶 液 , 测定 其 比 活力 。 五 、 结 果 计 算 根据 粗 酶 液 和 提纯 的 酶 液 的 总 活力 及 比 活力 ， 计 算 雯 粮 酶 提纯 的 总 回收 率 以 及 纯化 倍数 。 计算 式 如 下 : 提纯 酶 总 AS = Ee ae 提纯 酶 比 活 纯化 信 数 = -相册 波 比 活力 A8. 蔗糖 酶 进程 曲线 的 制作 及 不 同 酶 浓度 对 反应 速度 的 影响 一 、 目的 寻找 在 一 定 条 件 下 测定 蔗糖 酶 活力 的 初速 度 时 间 范围， 一 了 09 二 并 了 解 它 的 意义 。 _—, RE 酶 是 生物 体内 一 系列 复杂 的 生化 反应 中 的 催化 剂 ， 它 的 特殊 功能 是 加 速 体 内 化 学 反应 的 进行 。 研 究 酶 作用 的 反应 速 度 规律 , 即 酶 作用 的 动力 学 , 是 酶 学 中 最 重要 的 内 容 之 一 。 酶 动力 学 的 研究 不 仅 有 助 于 寻找 酶 活力 测定 的 最 适 条 件 及 分 离 提纯 的 条 件 ， 而 且 对 于 深入 了 解 酶 在 机 体 中 的 作用 及 立 明 本 的 作用 机 制 具有 积极 的 意义 。 酶 的 活力 测定 是 研究 酶 反应 速度 规律 的 最 基本 环节 。 测 定 酶 的 活力 实质 上 就 是 测定 酶 所 催化 的 反应 速度 ， 通 常用 单 ”位 时 间 内 底 物 的 减少 或 产物 的 增加 来 表示 。 酶 反应 过 程 中 产 驳 的 生成 和 时 间 关 系 可 用 图 30 的 进程 曲线 来 说 明 , HRA 率 就 是 酶 反应 过 程 中 的 反应 速度 。 从 进程 曲线 可 看 出 ， 在 一 定时 间 内 反应 速度 维持 恒定 , 但 随 着 时 间 的 延续 , 反应 速度 逐 渐 降低 。 这 是 由 于 产物 浓度 的 增加 使 反应 的 逆 过 程 加 速 以 及 产物 的 累积 可 能 导致 PH 变化 、 酶 的 失 活 等 原因 造成 。 所 以 为 了 准确 表示 酶 的 反应 速度 就 必须 采用 初速 度 即 维持 恒定 时 的 速度 。 WSS 酶 反应 时 间 图 30 FERRO HOE HAR — 200 — : ”采用 初速 度 来 表示 酶 活力 的 重要 性 ， 还 可 以 用 酶 浓度 不 ~、 _ 同 时 的 反应 过 程 加 以 说 明 ( 图 31)。 从 图 中 可 见 ， 只 有 取 反 应 过 程 成 直线 的 部 分 来 计算 反应 速度 (初速 度 ) 时 ， 才 能 得 到 反 应 速度 和 酶 量 成 正比 关系 。 蔗糖 酶 在 一 定 酶 浓度 和 底 物 浓度 情况 下 ， 表 现 出 与 上 述 ”相同 的 性 质 。 Ya Bat Ft 酶 浓度 [了 B] 图 31 酶 反应 不 同时 间 [ 卫 ] 与 " 作 图 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 蔗糖 酶 的 粗 酶 液 ， 实验 47 中 提取 所 得 。 2. 仪器 吸管 1 毫升 (x5)，2 毫升 (x5)，10 毫升 (x2); 血糖 管 (x 32); 试管 1.5x15 KC x 32); 烧杯 50 毫升 (x2); 三 角 烧瓶 100 毫升 (x 1)。 72 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 水 浴 锅 ; 定时 钟 ; 温 度 计 。 3. 试剂 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 : 见 实 验 1。 — 201 — Ty et ee ae 0.5% 蔗糖 溶液 : 以 pH4.6, 01M BRAM ML 47) 配 制 。 1N NaOH, OO, RED R 1. JRE AoE Fe Hh ee ail VE (1) 取 12 支 试管 依次 编号 , 每 管内 先 加 入 0.25 毫升 1N NaOH #8. (2) FR RA KO eR hh EM 3 单位 /毫升 ， 取 20 & FEF 100 毫升 三 角 瓶 中 ,35 C 保 温 10 分 钟 , 加 入 在 35°C F PU 0.5% HERE 20 毫升 ， 摇 匀 后 立即 从 中 吸出 2 毫升 混 合 液 注入 “0 号 试管 内 ， 摇 匀 作 为 对 照 ， 同 时 把 三 角 烧 瓶 放 入 35C 水 浴 中 保温 ,记录 时 间 。 (3) 按 下 页 表 保 温 3.6、9、12.…… 分 钟 时 ， 吸 取 2 SFE 糖 酶 反应 混合 物 分 别 注 入 相应 的 已 加 入 0.25 毫 升 IV NaOH 溶液 的 1、2、3、4'…… 号 试管 中 ， 摇 匀 中 止 酶 反应 。 在 上 述 ”每 一 试管 中 吸出 0.5 毫升 溶液 分 别 注 入 相应 的 盛 有 1.5 毫升 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 的 血糖 管 中 ， 加 蒸 饮 水 1.5 BF. OU 水 浴 加 热 5 分钟, 冷水 冷却 后 以 蒸馏 水 稀释 至 中 毫升 , HB. 读 取 540 毫 微米 处 光 密 度 COD) 值 。 从 葡萄 糖 浓 度 测 定 标准 曲线 ( 见 实 验 47) 查 出 酶 解 产 物 量 。 以 反应 时 间 为 横 坐 标 ， 产 物 量 为 纵 坐 标 作出 进程 曲线 。 求 出 本 实验 的 初速 度 时 间 范 围 。 2. 不 同 酶 浓度 对 反应 速度 的 影响 . C1) 将 酶 提取 液 稀 释 至 5 单位/ 毫升。 取 20 支 试管， 分 成 四 组 。 每 组 按 表 编 号 并 加 入 蒸馏 水 和 酶 液 ， 置 于 .35"C 水 浴 中 预 热 10 分 钟 。 其 中 一 组 试管 内 先 加 入 LN NaOH ym 0.5 毫升 以 作对 照 用 。 一 204 一 间隔 | IN | 0.0% | 吸取 | 25M 管 号 Rial | NaOH | 芒 糖 十 酶 | 混合 液 基 水 杨 酸 7K ODs40 产物 量 G)| Gen) |Get) |G | Ba) [en "(ex ea aa | er | Se eee 0 0 | 0.25 2 0.5 ay aaa ae OF 1 3 | 0.25 2 0.5 £55 AES 2 6 |. 0.28 2 0.5 将 - 3 9 | 0.25 2 0.5 ret a Sek a 4 |-42 |: 0.25 2 0.5 和 5 | is |. 0.25 2 0.5 “AG, Aes ha 6 | 20 | 0.25 2 0.5 15 88 7 | 25° | 0.26 2 0.5 en eee s | 30 | 0.25 2 0.5 te a 9 | 40 | - 0.26 2 0.5 16 | 16 10 | 50 | 0.25 2 0.5 pe eas 1 | 6 | 0.28 | 2 0.5 ee es Bi a ff ef LL" BEAL / AE Ft Bis WR CZ Ft) 0.8 ee ae 2 水 (毫升 ) 酶 活力 单位 数 1.2 0.8 0.4 0 (2) 各 管内 分 别 加 入 已 预 热 的 0.5% 芯 糖 液 2 毫升 ， 立 即 摇 匀 ,35C 下 保温 , 记 取 反应 开始 时 间 。 (3) 三 组 分 别 在 37C 保 温 5、10、15 分 钟 后 依次 加 入 0.5 毫升 1N NaOH, 摇 匀 中 止 酶 反应 。 ‘ae 20a (4) 从 上 述 每 一 试管 中 吸取 0.5 毫升 加 入 到 相应 的 盛 有 1.5 毫升 3 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 的 血糖 管 中 ， 再 加 1.5 毫升 水 ， 沸 水 浴 加 热 5 分钟 ,冷水 冷却 , 黎 释 至 25 毫升 , 摇 匀 后 于 540 毫 微米 处 读 取 光 密度 值 。 计 算出 反应 速度 (毫克 /5 PE), 将 数值 填 入 下 表 。 V (毫克 /5 分 ) OD5u0 亦 (毫克 /6 分 ) ODss V (毫克 /5 分 ) | eS ee eee 用 ca 以 酶 活力 单位 数 作 横 坐 标 , 反应 速度 作 纵 坐标 作 图 。 根据 所 作 的 图 求 出 在 本 实验 条 件 下 的 初速 度 。 49. 蔗糖 酶 的 米 氏 常数 ( 玉 。) 和 最 适 PH 测定 . Be 了 解 底 物 浓度 与 酶 反应 速度 之 间 的 关系 以 及 pH 对 酶 活 ee = 习 求 蔗糖 酶 米 氏 常数 和 最 适 PH WIT. = Re 米 切 利 斯 (Michaelis) 运 用 酶 反应 过 程 中 形成 中 间 络 合 物 -的 学 说 ， 导 出 了 有 名 的 米 氏 方程 。 这 个 方程 直接 地 给 出 了 酶 反应 的 速度 和 酶 浓度 、 底 物 浓度 的 关系 , 这 个 方程 还 给 出 了 一 一 204 一 个 非常 重要 的 物理 常数 一 一 米 氏 常数 天 w。 对 于 每 一 个 酶 促 反应 ， 在 一 定 条件 下 都 有 它 特 定 的 天 值 ， 因 此 常 可 用 于 监 = 别 酶 。 米 氏 方程 和 米 氏 常数 对 于 研究 酶 作用 的 动力 学 有 很 大 的 意义 。 米 氏 方 程式 如 下 : FS] co) Rm (S) AP: ?2 为 反应 速度 ， (S) 为 底 物 浓度 ， Kn 为 米 氏 常数 ， F 为 最 大 反应 速度 。 由 上 式 可 见 ， 当 "= 部 玉 时 ， 开 就 等 于 底 物 浓度 [S]。 基于 这 一 点 , 测定 不 同 底 物 浓度 时 的 酶 反应 速度 , 利用 作 图 法 求 出 最 大 速度 ， 在 立 太 处 的 相应 位 置 上 就 可 以 求 出 及 的 近 似 值 ( 见 图 32)。 反 应 速 度 —_—ase eee ww ew wee SS cz v aV K. 底 物 浓度 1S] 图 32 [9 与 v 作 图 如 果 将 米 氏 方程 的 形式 改变 成 下 述 直线 方式 ， A we 和 x Ae’ S34 IONE e Ey ae be ay ee gue’ somal ay ee ee 人 以 亏 为 纵 坐 标 ,TS 为 模 坐 标 作 图 。 所 得 直线 的 截 上 距 是 下 BER K,,/V CL 33), fi Linewerver-Burk 作 图 法 作 图 后 可 方便 地 求 出 Km 值 。 蔗 糖 酶 的 米 氏 常数 为 16 毫克 分 子 。 图 33 下 与 二 作 图 p 吾 对 酶 的 活力 影响 很 大 , 通常 在 菜 一 DH FERIA eee 出 最 大 的 活力 , 此 时 的 PH fe gt eI HY ei PH, ANI UR AY) EOE Bite i PH 也 各 不 相同 ， 其 中 酵母 的 蔗糖 酶 最 适 了 有 范围 在 PH3.5~5.5 ZI, 而 以 PH4.5 为 最 好 。 通 过 酶 与 一 系列 不 同 五 底 物 的 反应 速度 测定 可 求 出 最 适 PH。 它 对 于 寻找 酶 的 分 离 纯 化 条 件 与 活力 测定 最 适 条 件 亦 具 有 积极 的 意 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 2 单位 /毫升 、3 单位 /毫升 、5 单位 / SE Fr SB HEB: 取 实 验 47 sbi) Fo AY BH ih FF IT 2. Wet a. WF 1 RFC x5), 2 毫升 (x6); WH 1.5 15 KCX 23); 血糖 管 (x 23), 72 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 水 浴 锅 ; 定时 钟 ; 温 度 计 。 3. itl 0.1M RRMA MR, PH4.6: 见 实验 47。 0.5% 蔗糖 溶液 以 PH4.6.0.LM 醋酸 缓冲 液 配制 。 0.1M!.0.2M 攻 糖 溶液 : 以 PH4.6、0.144 mR RAC 制 。 AN le) pH fy 0.5% 蔗糖 溶液 : 0.1M 柠檬 酸 溶液 (19.21 克 / 升 ) 和 0.2M wR A — Hh (Na, HPO,-7H,0 53.65 克 / 升 或 Na,HPO, - 12H2O 71.7 克 / 升 ) 按 下 表 量 混合 并 稀释 至 100 毫升 , 以 此 不 同 PH He HK AC hil 5 多 的 蔗糖 溶液 。 2.6 44.6 5.4 3.6 | 33.9 16.1 4.6 25.2 24.8 5.6 21.0 29.0 6.6 13.6 36.4 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 : 见 实验 1。 1N NaOH, 四 、 操 作 步 又 1. KBR A, FA il RE C1) REPRE 12 支 试 管 中 分 别 加 入 0.14 ER KA pH — aE 06 090 0 1°96 3280 0 OF 950 0 0g 60°0 1°99 $T0°0O 08 S310" 00F 0T0* 8 PIT | 800° O9T | $2900° 0 0 0 eet | 920070 0 005 | 200°0 0 oH HH RE CRAKE AR 产 ~ BRAK 09'T | 09'T | 090 02°0 00° 09 "0 09'T IT 09'T | 09'T | og'o 02°0 00° 00°T 00°T Or og'T | O8'T | og'0 09°0 00° 03°T 08°0 6 09'T | 09'T | og'0 09°0 00° Ov'T 09°0 8 02°T | OS'T | 6920 09°0 00° 09'T og'0 |, 2 09'T | OST | 09°0 02°0 00° 09°T 040 9 09'T | 09'T | og'0 09 :0 00° a9°T 98'0 9 09'T | OST | 09°0 09 .0 00° OL°T 08°0 7 09'T | 09'T | og'0 09°0 00° Q)°T 95 0 8 Of'T | ost | og'o 09 :0 00° 08°T 02°0 5 09'T | 09'T | 09'0 03°0 00°% 00°S 0 T af a 一 一 一 一 一- 一 | GER | CER) (Lem) | Ces) | Cem) CLE) CERO [| alice | Witte | BLN HONA | /对 两 8 | 疆 9'5Hd | TIT0 BM fk cf Rt tk Al y - — 703. 4.6、0.1M 醋酸 缓冲 液 使 总 体积 达 2 毫升 ， 置 于 35"C 水 浴 内 预 热 ， 另 取 3 单位 /毫升 酶 溶液 在 35°C 水 浴 中 保温 10 分 钟 。 依次 向 各 试管 中 加 入 2 毫升 酶 液 ， 准 确 作用 五 分 钟 后 按 次 序 加 入 0.5 BF 1N NaOH, 摇 匀 ,中止 酶 反应 。 吸 取 0.5 毫升 酶 反应 液 ， 加 入 盛 有 1.5 毫升 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 的 血糖 管 中 ， 并 加 1.5 毫升 水 。 沸 水 浴 加 热 五 分 钟 后 立即 用 冷水 冷 HH, AK MRE 25 SH, HY, RM 540 毫 微米 处 光 密 度 (OD) 值 。 以 1/MPERRAR ER, 1/0 作 纵 坐 标 作 图 ， 求 出 最 大 反应 速 BEV ADK GR Kn (2) 另 取 11 支 试管 按 下 表 加 入 0.2M 蔗 糖 溶 液 和 pH4.6 醋酸 缓冲 液 , 使 总 体积 达 2 毫升 , 置 35C 水 浴 内 预 热 ， 然 后 依 (毫升 ) | Ges) | GED) 六 v Peat 0 2.00 2.00 0.50 0 2 | 0.10 | 1.90 2.00 0.50 0.005 3 | 0.20 | 1.80 2.00 0.50 0.01 4 | 0.30 | 1.70 2.00 0.50 0.015 5 | 0.40 | 1.60 2.00 0.50 | 0.02 6 | 0.60 | 1.40 2.00 0.50 0.03 7 | 0.80 | 1.20 2.00 0.50 0.04 8 | 1.00 | 1.00 2.00 | 0.50 0.05 9 | 1.20 | 0.80 2.00 0.50 0.06 10 | 1.60 | 0.40 2.00 0.50 0.08 11 | 2.00 | 0 2.00 | 0.50 0.10 208 — 次 加 入 已 预 热 的 2 单位 /毫升 蔗糖 酶 溶液 , 按 上 述 同样 方法 进 行 测定 。 以 底 物 浓度 为 模 坐标 , 反应 速度 为 纵 坐标 作 图 ， 求 出 最 大 REV SKM K,,. 2. mid PH MMe 7 按 下 表 在 6 支 试管 中 加 入 不 同 PH H 0.5% KERR 2 & 升 , 35"C 水 浴 预 热 。1 号 管 作对 照 , 先 加 0.5 毫升 IN NaOH, 然后 依次 加 入 已 预 热 的 5 单位 /毫升 酶 液 (以 不 同 PH 缓冲 液 稀释 ) 2 毫升 ， 准 确 作用 五 分 钟 后 在 2~6 号 管 中 依 次 加 入 0.5 毫升 IV NaOH, #4, 中 止 酶 反应 。 吸 取 上 述 酶 反应 液 0.5 毫升 加 到 盛 有 1.5 毫升 3, 5- 二 硝 基 水 杨 酸 试剂 的 血糖 管 中, 加 1.5 毫 升水 , 沸水 浴 保 温 五 分 钟 后 立即 用 冷水 冷却 ,以 妆 馏 水 稀释 至 25 毫升 , HE, 读 取 540 毫 微米 处 光 密 度 (OD) 值 。 以 pH 为 横 坐 标 , 产 物 量 为 纵 坐 标 作 图 ， 找 出 蔗糖 酶 的 最 ig pH, Bee ores 4 Vi on... 42T FaS 50. cL PE PE Soci EP 通过 oe SLE OE AE EA se, 初步 掌握 一 般 酶 反应 动力 学 的 实验 方法 ， 为 自行 设计 任何 一 种 酶 的 酶 学 性 质 测定 方案 打下 一 定 基 础 。 具体 要 求 掌握 下 列 基本 分 析 方 法 : 进程 曲线 的 制作 ,P 开 和 温度 对 酶 活性 的 影响 , 酸 碱 稳定 性 和 热 稳定 性 , 米 氏 常数 的 测定 ， 抑制 剂 类 型 的 判断 。 进程 曲线 的 制作 一 汪 目 的 通过 进程 曲线 的 制作 , 求 出 反应 初速 度 的 时 间 范 围 , 这 是 司机 此 个 实 验 过 行 科 速度 测定 所 的 很 和 二 、 原 理 本 实验 所 选用 的 a- - 半 乳 糖苷 酶 (a-D-galactosidase; E. C.3.2.1.22] 能 专 一 水 解 非 还 原 性 未 端的 ac-D- 半 乳 糖 残 基 ， 可 用 下 式 表示 : +ROH == SIT = 12k FA 6 FB JER) 2: SB BH SE AF FL EF (a-ON PG), Jy fi 如 下 : HO 47° y NO, H Hee lo + HO = HOH 邻 - 硝 基 葵 半 乳 糖苷 CH,OH | HO 4-—°\ H eee.) 人 oe Hts oH + HO “3 OH | ) 半 乳 糖 邻 - 硝 基 栈 当 底 物 c-ONPG 经 酶 催化 反应 后 , 生成 的 产物 邻 - 硝 基 酚 «BPG, 可 在 420 毫 微米 进行 光 吸 收 测定 。 在 一 定 条 件 ( 温 度 .pH) 下 , 每 分 钟 生成 1 微克 分 子 邻 - 硝 基 酚 所 需要 的 酶 量 定 为 一 个 单位 。 进程 曲线 表明 反应 时 间 和 底 物 或 产物 化 学 反应 量 之 间 的 关系 。 由 进程 曲线 可 以 了 解 酶 反应 随时 间 的 变化 情况 , 并 求 得 酶 反应 的 初速 度 。 本 实验 在 反应 的 最 适 条 件 (PH7，65'"C)， 有 一 定 酶 量 和 足够 底 物 量 条 件 下 ， 测 出 一 系列 不 同时 间 的 相 对 产物 变化 量 。 以 反应 时 间 为 横 坐 标 ， 相 对 产物 变化 量 为 纵 坐标 ， 绘 制 出 进程 曲线 。 进 程 曲 线 的 起 始 直线 部 分 玫 示 反应 ， 初速 度 , 由 此 可 求 出 代表 初速 度 的 适宜 反应 时 间 。 酶 的 活性 测 定 及 酶 反应 动力 学 的 实验 都 必须 测定 反应 的 初速 度 ， 所 以 通 过 进程 曲线 的 制作 所 求 出 的 代表 初速 度 的 反应 时 间 范 围 是 我 3 们 后 面 一 系列 实验 的 基础 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 a- 半 绾 糖苷 酶 溶液 : 称 取 一 定量 酶 制剂 ， 用 蒸 馅 水 配 成 10 毫克 /毫升 的 溶液 。 测 定 前 用 0.1W、P 五 7 磷酸 盐 缓冲 液 再 适当 稀释 之 〈 酶 溶液 稀释 倍数 应 使 ODizo<0.8 的 范围 内 )。 2. 仪器 试管 1.5x15 厘米 (x20); 吸管 0.5 毫升 (x2)，L1 毫升 (x1). 721 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 时 钟 ; 温度 计 。 3. 试剂 2m MON PG 溶液 .12.04 BH ONPG, 加 0.14 人 4、pH7 磷 酸 盐 缓冲 液 至 20 SH. 1MNasLCoOs wR: 53 克 无 水 碳酸 钠 加 蒸馏 水 至 500 训 aT “0.1 pH7 磷酸 盐 缓 冲 液 : 6.08 克 NaH,PO,-2H,0 和 21.85 $f Na,HPO,-12H,O 加 蒸馏 水 至 1000 毫升 。 四 、 操 作 步 又 取 18 支 试 管 , 分 别 加 入 0.5 毫升 2m MONPG 溶液 ， 在 65C 恒 温水 浴 中 预 热 5 分 钟 ， 精 确 计 时 ， 于 各 管内 分 别 加 入 0.5 毫升 酶 溶液 , 然后 按时 间 间 隔 5、10、15、20、25、30、40、50 和 60 分 钟 的 要 求 加 入 1 SF 1M NasCO 溶液 中 止 反应 〈 每 - 组 并 列 二 支 )。 空白 管 以 0.5 毫升 缓冲 液 代 替 酶 , 其 他 步骤 相同 。 全 部 反应 结束 后 ， 以 空白 管 作 对 照 在 721 型 分 光 光 度 计 上 于 420 毫 微米 下 测定 光 窗 度 值 。 — 213 — A. GRAM 以 反应 时 间 为 横 坐 标 ，OD4zo 为 纵 坐 标 作 出 进程 曲线 。 由 进程 曲线 求 出 代表 初速 度 的 适宜 反应 时 间 。 I]. pH 对 酶 活性 的 影响 及 酸 碱 稳定 性 测定 一 、 目 的 通过 pH 对 酶 活性 影响 的 测定 求 出 该 酶 表现 活性 的 最 适 pH 范围 ， 由 酸 碱 稳定 性 的 测定 了 解 该 酶 所 稳定 的 酸 碱 范围 。 二 、 原 理 pH 对 酶 反应 的 速度 有 显著 的 影响 ， 每 一 种 酶 都 有 一 个 ee hy PHAM, EM PH (A FA RE BR, Ted Be PH 的 两 侧 反应 速度 都 比较 慢 。 因 此 ， 进 行 酶 反应 的 实验 都 必需 加 合适 的 缓冲 液 以 控制 PHA, Bob, PH 对 酶 活性 的 关系 还 可 以 为 酶 作用 机 制 的 研究 提供 有 用 的 资料 。 因 为 酶 是 二 性 电解 质 ， 具 有 许多 解 离 基 团 ， 酶 的 功能 和 某 些 特 殊 基 团 有 关 ， 某 一 特定 的 酶 要 表现 活性 , 某 种 基 团 必须 以 非 解 离 状态 存在 ， 或 另 一 些 酶 中 则 要 求 以 离子 状态 存在 。 通 过 比较 DH WME 性 的 影响 , 以 及 蛋白 质 中 可 滴定 基 团 的 PK 值 , 就 可 能 推测 出 酶 分 子 可 能 参与 催化 作用 的 基 团 是 什么 。PH 对 酶 活性 的 影 响 除 了 通过 酶 分 子 作 用 外 ， 也 可 以 通过 对 底 物 分 子 的 解 离 作 用 , 或 其 他 间接 的 作用 影响 酶 的 反应 速度 。 pH- 酶 活性 关系 的 测定 是 在 其 他 条 件 〈 例 如 底 物 浓度 、 vane 2 © So 酶 浓度 、 反 应 温度 等 ) 恒 定 的 最 适 情况 下 , FP RAE (LY DH 里 进行 初速 度 的 测定 。 通 过 绘制 pH- 初速 度 坐 标 图 往往 可 以 得 到 钟 形 的 曲线 。 在 设计 实验 方案 时 ， 要 注意 缓冲 液 成 分 不 应 对 分 析 有 干扰 。 不 同 范围 的 PH 有 时 选用 不 同 成 分 的 缓冲 液 往往 对 酶 活性 有 不 同 的 影响 。 这 里 我 们 选用 广 范围 的 缓冲 液 系 统 可 以 消除 这 方面 的 影响 。 酶 象 其 他 蛋白 质 一 样 ， 只 有 在 有 限 的 PH 范围 里 才 是 稳 定 的 ， 大 多 数 酶 往往 在 中 性 pH 下 是 稳定 的 。 通 过 酶 的 酸 碱 稳定 性 的 测定 可 以 了 解 该 酶 所 稳定 的 PH 范围 。 酸 碱 稳定 性 测定 时 ， 把 酶 先 放 在 一 系列 的 不 同 pH 缓冲 液 里 (一 定 温度 , 一 定时 间 ), 然后 在 最 适 PH 下 进行 初速 度 测 定 。 在 设计 实验 方案 时 ， 要 注意 前 一 系列 的 PH 缓冲 液 浓 度 ”应 该 尽量 低 ， 而 后 一 pH 于 缓冲 液 的 浓度 应 该 足够 保证 各 组 在 测定 时 达到 最 适 P 互 值 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 a- 半 乳糖 背 酶 溶液 . 同 实验 50I 配制 的 10 毫克 /毫升 的 ” 酶 溶液 。 测 定 前 用 蒸馏 水 再 适当 黎 释 之 。 2 仪器 7 试管 1.5x15 厘米 (x34); 吸管 0.1 BHC<2),0.58 升 (x4), 工 毫升 (x2),10 毫升 (x 1); 微量 进 样 器 100 微 升 (x Say! 721 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 时 钟 ; Yah Eth. 3. 试剂 10m M ONPG 水 溶液 : 60.2 毫克 ONPG 加 水 至 20 毫 升 。 2m M ONPG 溶液 : 同 实验 50I ,用 PH7 缓冲 液 配制 。 — 215 — 1M Na,CO; 溶液 ， 同 实验 501. 0.1M, pH7 磷酸 盐 缓 冲 液 : WL 501, 各 组 缓冲 液 配制 如 下 : 原液 甲 : 柠檬 酸 6.008 克 , BEM — Sl FF (KH, PO,)3.893 克 ， 硼 酸 (H 了 BO) 1.769 克 ， 巴 比 妥 5.266 克 ， 加 蒸 饮 水 至 1000 Ft, 原液 乙 . 0.2N NaOH ¥xR, 按 下 列 比 例 配制 ,分别 用 PH th RIED ee 四 、 操 作 步 骤 1. PH 与 酶 活性 关系 的 测定 取 试 管 17 支 , 编号 1~8 每 种 P 瑟 做 二 支 , 空 自 一 支 。 各 管 加 0.1 毫升 10m M ONPG 水 溶液 , BRE RMA pH 的 缓冲 液 0.4 BH, HY. F 65"C 恒 温水 浴 箱 内 逐 管 计时 加 入 酶 水 溶液 0.5 毫升 , 摇 匀 。 各 管 精确 反应 15 分 钟 后 加 入 1 毫升 1M Na,CO; 溶液 ,冷却 后 以 空白 管 (以 水 代 酶 , 其 他 操作 相同 ) 作 对 照 , 在 721 型 分 光 光 度 计 于 420 毫 微米 下 测 出 ODsz fi, BURA TR: 以 反应 PH 为 横 坐 标 ，ODso 为 纵 坐 标 ， 绘 制 DH- ME HE 曲线 , 并 分 析 在 本 实验 条 件 下 该 酶 的 最 适 P 瑟 范围。 2. 了 酸 碱 稳定 性 的 测定 取 试 管 17 支 , 编号 1~8, 每 种 P 卫 做 二 支 ， 空 白 一 支 。 各 RE ZI 0.1 SAA PH MAMA, A eee REM ARIMA 0.1 ZA MKB, HS, 65°C Rid 1 小 时 。 保温 终了 , 各 管 加 入 0.3 BF 0.1MpH7 磷酸 盐 缓 冲 液 ， 摇 匀 。 FOC 恒温 水 浴 锅 内 逐 管 计时 加 入 0.5 毫 升 2m M ONPG yy (PH 7 缓冲 液 配 ), 精确 反应 15 分 钟 ,加 入 工 毫 升 1M Na,CO, 溶液 , 冷却 后 ， 以 空白 管 (以 水 代替 酶 ， 其 他 操作 相同 ) 作 对 照 , 在 721 型 分 光 光 度 计 于 420 毫 微米 下 测 出 光 密 度 值 。 数 据 填 入 下 表 。 以 处 理 的 P 也 为 横 坐 标 ，ODsz 为 纵 坐 标 ， 绘 制 PH 稳定 曲线 , 并 分 析 在 本 实验 条 件 下 该 酶 的 酸 碱 稳定 范围 。 We. 温度 对 酶 活性 的 影响 及 趟 稳定 性 测定 一 、 目 的 通过 温度 对 酶 活性 影响 的 测定 ， 求 出 该 酶 表现 活性 的 适 宜 温度 范围 , 由 热 稳 定性 的 测定 了 解 该 酶 的 耐 热 程 度 。 — 217 — DA CA 0 as * Se ae ee 3 } i =. AE | 温度 对 酶 反应 的 影响 表现 在 ; 随 着 温度 的 增高 反应 速度 也 加 快 , 直至 达到 最 大 值 ; 温度 再 升 高 时 , 反应 速度 随 着 温度 的 增高 而 减 慢 。 温 度 有 双重 性 影响 ， 温 度 的 升 高 一 方面 加 快 催化 反应 速度 , 另 一 方面 促使 酶 蛋白 的 变性 , 是 两 种 对 抗 效 应 的 综合 效果 。 测 定 酶 活性 时 , 应 该 取 酶 反应 的 最 适 温度 。 温度 与 酶 活性 的 关系 测定 方法 与 前 一 实验 相似 ， 只 要 把 其 他 条 件 ( 例 如 底 物 浓度 、 酶 浓度 和 PH 等) 固定 在 最 适 状态 下 ， 然 后 在 温度 一 系列 变化 条 件 下 进行 初速 度 测 定 。 通 过 给 ”和 制 温度 -初速 度 座 标 图 , 可 以 得 到 温度 - 酶 活性 曲线 。 酶 是 蛋白 质 ， 它 像 其 他 蛋白 质 一样 ， 温 度 增 高 会 使 酶 变 ， 性 ， 因 此 酶 有 一 定 的 热 稳定 范围 。 酶 往往 在 其 起 功能 作用 的 生理 条 件 下 是 最 稳定 的 ， 例 如 耐 热 的 细菌 含有 高 温 下 稳定 的 酶 。 另 外 , 酶 的 热 稳定 范围 和 测定 时 的 条 件 有 很 大 关系 , 例如 p 也 .是否 有 底 物 存在 、 离 子 强度 等 都 有 影响 。 酶 的 热 稳定 性 也 是 容易 测定 的 ， 只 要 把 酶 在 不 同 温度 下 处 理 一 段 时 间 , 然后 在 最 适 温度 下 进行 初速 度 测 定 。 应 该 注意 ， 通 过 上 述 测定 所 得 出 的 最 适 温度 及 热 稳定 范 围 都 是 有 条 件 的 , 这 个 条 件 就 是 实验 分 析 时 的 条 件 , 不 能 推论 至 一 切 情况 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 a- 半 乳糖 昔 酶 溶液 ， 同 实验 50I 配 制 的 10 毫 克 / 毫 升 的 酶 水 溶液 。 测 定 前 用 0.1M pH7 磷酸 盐 缓 冲 液 再 适当 稀 释 之 。 2. 仪器 试管 1.5x 15 DK (x 32); LEE 0.5 毫升 (x2), LEFF — 218 — (x1), 721 型 分 光 光 度 计 ; HUT YK A 4B Cx 6); 温度 计 (x6)。 3. 试剂 2m M ONPG 溶液 : 同 实验 50I,， 用 PH7 缓冲 液 配制 。 1M Na,CO, 溶液 ， 同 实验 501, 四 、 操 作 步 又、 1. 温度 与 酶 活性 关系 的 测定 取 试 管 13 X, HS 1~6 , 每 种 温度 二 支 ， 空 白 一 支 。 各 -管内 加 0.5 毫升 2mM ONPG 溶液 , 置 于 各 种 不 同 温 度 (40， 50,60,65,70, 75"C) 的 恒温 水 浴 箱 内 。 逐 管 计 时 加 入 0.5 毫 升 酶 WK, 精确 反应 15 分 钟 后 加 入 1 毫升 MM Na,CO; 溶液 ,冷却 后 以 空白 管 (以 水 代替 酶 , 其 他 操作 步骤 相同 ) 作 对 照 ,在 721 型 分 光 光 度 计 于 420 毫 微米 下 测 出 ODs。 值 。 数 据 填 入 下 表 : 以 反应 温度 为 横 坐 标 ，ODsz 为 纵 坐 标 ， 绘 制 温度 - 酶 活 性 曲线 , 并 分 析 该 酶 在 本 实验 条 件 下 的 最 适 温度 范围 。 2. 热 稳定 性 的 测定 热处理 条 件 取 60，6 5 和 TS°C 三 种 。 每 种 温度 处 理 时 间 为 15, 30 和 60 分 钟 三 种 。 RGAE 19 支 , 编号 1~9, 每 种 温度 .时 间 各 二 支 , 空白 一 Mo AMA IMNO.5 毫升 酶 液 ， 分 别 置 于 相应 温度 的 恒温 水 浴 AL, 每 经 过 15, 30 和 60 分 钟 各 取出 2 支 。 =< 219 — 让 站 TOP ， — eee ere ee Tee es) he eee 全 部 热处理 完 后 ,在 65"C 下 进行 初速 度 测定 。 即 逐 管 计 时 加 入 0.5 毫升 2mM ONPG 液 ， 精 确 反 应 巧 分 钟 ,加 1 Na,CO; 工 毫 升 中 止 反 应 ， 冷 却 后 以 空白 管 (以 水 代替 酶 ， 余 同 ) 作 对 照 , 在 721 型 分 光 光 度 计 于 420 毫 微米 测定 OPDszo 值 。 将 数据 填 入 下 表 : 热处理 时 间 ( 分 钟 ) OD4o0 以 处 理 温度 为 横 坐 标 ，OD,o 为 纵 坐 标 ， 绘 制 热 稳定 性 曲线 图 。 V. AKRAM Se 一 、 目 的 WU EO -B PLE ED ON PG 或 棉籽 糖 为 底 物 时 的 米 氏 常数 。 一 、 原 理 米 氏 常数 Kn, 等 于 达到 反应 最 大 速度 一 半 时 的 底 物 浓 度 , 具有 浓度 的 单位 ( 邮 )。 对 于 每 一 种 酶 - 底 物体 系 来 说 ， 玉 是 一 个 特性 值 ， 它 和 酶 浓度 无 关 ,， 但 和 PH, WMA AR 有 关 。 如 果 同 一 个 酶 能 够 作用 于 几 个 底 物 ， 那 么 Ky 值 往往 可 用 来 比较 酶 和 各 种 底 物 亲和力 的 大 小 。 至 w 的 数值 小 (大 ) 说 明 底 物 与 酶 之 间 的 亲和力 强 ( 弱 )。- 一 Ky BME, TE RTE EE BR A 初速 度 ， 即 测 出 作为 底 物 浓度 函数 的 反应 速度 〈 酶 的 相对 活 HE), 通过 作 图 而 求 得 Kn. 最 常用 的 是 Lineweaver-Burk 的 个 数 作 图 法 。 其 根据 “是 将 米 氏 方程 "= -Rs 司 ] -进行 重 排 , 变 成 如 下 形式 , 1_ Kn 1 Uv | Poe oe 55) Tabs Wake Soy 作 图 得 出 一 条 直线 ,直线 在 横 轴 上 的 截 距 为 一 及- 在 纵 轴 上 的 鹤 距 图 33)。 近年 来 ， Eisanthal = Cornish-Bowden 介绍 mae 作 图 法 ， 这 个 方法 十 分 简单 、 快 速 ， 不 必 进 行 计算 就 可 以 直接 利用 数据 作 图 。 其 根据 是 将 米 氏 方程 改写 为 : RE 7 oS 根据 此 式 ,在 给 定 的 (3] 上 可 测 得 "在 坐标 上 截取 [和 并 =1 [Sa] [82] (8,] [S] 图 34(a) 上 isenthal 作 图 法 — 221 一 图 34(b) Ejisenthal 作 图 法 连接 二 点 成 一 直线 , 通过 一 系列 [S] fy 连 成 的 直线 在 座 标的 第 一 象限 内 的 交叉 点 可 求 得 天 (和 Vinax), JL 34 (a)。 在 实 际 测 定时 常 有 误差 , 得 不 到 唯一 的 交叉 点 , 则 可 由 每 组 点 的 中 值得 出 K, HEE, PM, 如 果 有 5 个 实验 点 ， 由 五 条 直线 ”得 到 十 个 交点 , 则 可 取 第 5 至 第 6 点 之 间 的 中 值 ( 图 33b)。 本 实验 选用 的 底 物 有 二 种 : 邻 - 硝 基 苯 半 乳糖 昔 及 棉 将 糖 。 棉 籽 糖 经 酶 催化 反应 后 ,产物 中 的 半 乳 糖 具有 还 原 性 ,用 Nelson-Somogyi 法 进行 还 原 糖 测定 。 CH,OH 和 K Bee os) E/'_o=CHe CH,OH LE Samm a RN [7 = \/ CH,OH | OH 下 H Aint ei sea Baas CH,OH CH,OH CH,OH Ho 全 -ON a AON | On Bt 一 《ea uw + K Ba rp ne Hoy) HN |’ OH ony SXA’; cule H,OH 半 乳 糖 蔗糖 在 一 定 条 件 (pH, 温度 ) 下 ， 每 分 钟 释 放 1 微克 分 子 半 屯 糖 所 需要 的 酶 量 为 一 个 酶 活性 单位 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 ao- 半 乳 糖 昔 酶 溶液 ， 同 实验 50 工 , 适当 稀释 。 2， 仪 器 ”试管 1.5x15 OKC x 42); 吸管 0.5 BFE Xx 4), 1 毫升 (x 3), 2 毫升 (x3)。 “721 型 分 光 光 度 计 ; HARM KYA; ZK A; 时 钟 ; 温度 ite 3. 试剂 0.1M pH7 磷酸 缓冲 液 ， 同 实验 50 工 。 am M ONPG 溶液 ， 同 实验 501. 1M Na,CO, 溶液 : 同 实验 501, 100m M Hak REYSYR: 1.189 克 棉 籽 糖 ,用 0.1M pH7 磷 酸 盐 缓 冲 液 加 至 20 毫升 。 铜 试剂 : 〈 工 ) 无 水 碳酸 钠 24 克 , 酒石酸 钾 钠 12 克 , 碳酸 Hh 16 克 , 硫酸 钠 144 克 , 溶解 于 800 毫升 水 中 ; (IT)4 克 硫 酸 铜 , 36 克 硫 酸 钠 溶解 于 200 毫升 水 中 。 ”使 用 时 取 工 : 工 以 4:1 混合。 Nelson 试剂 ，25 F24H MRE ((NH,).MO,O2,-4H,0) 溶解 — 223 — 于 450 毫升 蒸馏 水 ,加 21 毫升 浓 硫 酸 混合 。3 HRA (Na,HAsO,:7H,O) 溶解 于 25 SIRI. WA, + 37"C 保 温 48 小 时 后 使 用 。 四 、 操 作 步 又 1. 以 ONPG 为 底 物 的 米 氏 常数 测定 — C1) 不 同 浓度 的 ONPG 底 物 溶液 的 配制 : 5 xe 中 按 下 表 配 制 。 Aca AYRE (mM) | 一 一 一 一 | 一 一 一 一 一- 一 一 一 一 | 一 2m MONPG( 毫 升 ) 0.1M pH7 磷酸 盐 缓冲 液 《毫升 ) @ 上 述 五 种 底 物 浓度 ， 在 酶 反应 系统 中 的 余波 度 分 别 相当 于 0.2,0.4,0.6,0.8 和 1.0 mM, (2) 取 16 支 试管 , 编号 1~5， 每 种 浓度 重复 做 三 只 。 各 加 入 不 同 浓度 的 底 物 溶液 0.5 毫升 ,652C 预 热 后 , 逐 管 计 时 加 入 0.5 ZABM, BA, MMR 15 Doe, M1 SA1M Na,CO; 溶液 , 冷却 后 , USAR KER, RRA) 作对 照 , 在 721 型 分 光 光 度 计 于 420 SCORN IER BEL DL 此 值 作为 反应 速度 。 数据 填 入 下 表 , 并 作 计算 。 用 二 种 作 图 法 ( 按 基本 原理 中 叙述 ): (1) 个 数 作 图 法 -FS 为 横 坐 标 ， 志 为 纵 坐 标 ， 由 直线 在 横 轴 上 的 交点 一 -六 一 ,计算 得 天 w。 — 224 — 一 -| 一 一 | | -一 | 一 全 ONPG 终 浓度 [S](m ) eae! ODaao( {CH ¥) 1 v (2) 直接 线性 作 图 法 : (SS) 为 横 坐 标 ，2 为 纵 坐 标 。 把 每 一 实验 点 的 两 个 数值 3] 和 "， 分 别 绘制 在 横 轴 和 纵 轴 上 ， 并 连 成 一 条 直线 。 五 个 实验 点 的 五 条 直线 有 十 个 交点 ， 取 第 5 和 第 6 点 的 中 值 ,相应 于 横 轴 上 的 [S] 值 即 为 六 值 。 二 种 作 图 法 应 该 得 到 相似 的 六 值 。 2. 以 棉籽 糖 为 底 物 的 米 氏 常数 测定 CL) 不 同 浓度 棉籽 糖 底 物 的 配制 : 于 5 支 试 管 中 按 下 表 配制 。 配制 的 浓度 (ma ) 100mM 棉籽 糖 (毫升 ) PH7 0.124 磷酸 盐 缓冲 液 《毫升 ) 上 述 五 种 底 物 浓度 ， 在 酶 反应 系统 中 的 终 浓 度 分 别 相当 于 10,20,30,40 和 50 mM, | 《2) R16 Xi, 编号 1 一 5,， 每 种 浓度 重复 做 三 只 。 各 加 入 不 同 浓度 的 底 物 溶液 0.5 毫升 , 65"C 预 热 后 , 逐 管 计时 加 we B05. = os : Ry PER RC ae Leng See ate . ae, See rey kA? SS Le e.My’ pa oe: te Fr hy ies 2 5 ER se ® aan a 入 0.5 毫升 酶 深 液 ， 精确 反应 30 分 钟 后 , SAMA 1 eT 试剂 , 摇 匀 。 加 完 后 ， 置 同一 试管 架 放 入 沸水 浴 中 加 热 10 分 钟 , 流动 水 冷却 (注意 加 热 和 冷却 时 尽 可 能 少 摇动 试管 )) 逐 管 加 入 1 毫升 Nelson 试剂 , 立即 摇 匀 , 至 没有 气泡 后 , MBM 馏 水 (使 光 密 度 范围 在 0.8 以 内 )。 以 空白 管 (以 水 代替 酶 , 其 他 操作 相同 ) 作 对 照 ,用 721 型 分 光 光 度 计 于 500 毫 微米 测定 光 密度 值 , 以 此 值 作 为 反应 速度 。 | 数据 填 入 下 表 , 并 作 计 算 。 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 一 HAT A IRIE [S] (mM ) re [S] ODso0( KH) 1 v 与 ONPG 为 底 物 的 相同 方法 作 图 求 出 玉 : 值 。 了 .抑制 剂 类 型 的 判断 及 抑制 常数 K; 测 定 ees 目 的 ， 判断 出 o- 半 乳糖 音 酶 的 二 种 抑制 物 一 Ag+ 和 半 屯 糖 属于 可 逆 还 是 不 可 逆 抑 制 ， 判 断 半 乳糖 的 抑制 作用 是 属于 部 争 性 、 非 竞争 性 还 是 反 竞争 性 , HOR MIM eK, 二 、 原 理 抑制 剂 是 能 引起 催化 反应 速度 降低 的 一 种 化 合 物 。 酶 的 “ — 296 — | | 抑制 剂 有 不 可 逆 的 ， 也 有 可 逆 的 。 不 可 逆 抑 制剂 一 经 与 酶 结 合 就 难 分 开 ， 其 抑制 不 能 用 透析 等 物理 法 解除 。 可 逆 抑制 齐 与 酶 的 结合 建立 在 解 离 平 衡 基 础 上 ， 可 以 用 透析 等 方法 使 抑 制 减轻 或 消除 。 对 于 不 可 逆 抑制 剂 ， 其 抑制 作用 将 随 着 抑制 剂 浓度 的 增 加 而 逐渐 增加 , 倘若 抑制 剂 的 量 足 够 以 使 所 有 的 酶 予以 结合 ， 则 将 出 现 完全 抑制 。 对 于 可 逆 性 抑制 剂 ， 其 抑制 作用 也 是 递 增 式 的 , 但 很 快 达到 一 个 平衡 值 , 这 个 数据 万 由 抑制 剂 浓度 所 决定 。 我 们 可 以 通过 在 固定 抑制 剂 浓度 下 ， 以 一 系列 不 同 浓 度 的 酶 进行 初速 度 的 测定 ， 从 而 判断 出 此 抑制 剂 是 属于 可 道 还 是 不 可 逆 抑制 ( 见 图 35)。 35 ”抑制 剂 类 型 图 在 可 逆 抑 制剂 中 , 又 有 竞争 性 抑制 、 非 竞争 性 抑制 和 反 竞 - 争 性 抑制 之 区 别 。 竞 争 性 抑制 剂 的 效应 在 于 使 天 w 的 表 观 值 增加， 至 w 表 观 值 可 由 抑制 物 浓 度 [ 工 ] 的 增加 而 增 大 ; 竞争 性 抑制 剂 的 抑制 作用 只 需 用 足够 大 的 底 物 浓度 就 能 被 抵 销 ， 最 大 速度 仍 能 达到 。 而 非 竞 争 性 抑制 中 ， 抑 制程 度 和 底 物 浓度 之 间 没 有 关系 , 抑制 只 取决 于 抑制 剂 的 浓度 ; 非 竞争 性 抑制 剂 的 效应 在 于 降低 最 大 速度 而 不 改变 玉 w。 另 外 ， 反 竞争 抑制 Hi, 其 效应 表现 在 Ky, A Vea WHT HR. Witte 二 作 mest 77 Comme i 图 可 以 清楚 看 出 ( 见 图 36)。 [Ss] 反 竞 争 性 抑制 图 36 抑制 类 型 K, 是 抑制 剂 - 酶 复合 物 的 解 离 常数 ， 可 以 通过 实验 计算 求 得 。 AFI MA, "2 -本 有 抑制 剂 I 时 ， eM EG a aK Ke -K.(1+ 9), ,由 -上 ~ 了 图 上 得 出 之 Rs 和 Ko， 及 已 知 值 (D， 计 算出 瑟 ; 值 = 同样 ， 一 2 一 对 于 非 竞争 性 抑制 剂 ， mw= 一 amaz G] gee (Kn+ (S))(1+%) 有 抑制 剂 ,时 ， 表 观 最 大 速度 Vn =—™—, 2 ~1 eS Se ee 图 上 得 出 Vink 和 | gee 及 已 知 值 I, 计算 出 K; 值 。 另外 , Wwe wht I~ Pe RA K,, 如 图 37。 竞争 性 抑制 非 竞 争 性 抑制 图 37 可 逆 抑 制 的 类 型 “本 实验 要 求 通过 [E]~" 图 的 制作 判断 出 Ag+ 及 半 弛 粮 属于 可 逆 还 是 不 可 着 抑制 剂 。 通 过 -sj 一 志 图 的 制作 判断 出 半 乳 糖 属于 竞争 性 还 是 非 竞 争 性 抑制 , JER Ks 值 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 a- 半 屯 糖 背 酶 溶液 ， 同 实验 50I 配 制 的 10 毫克 /毫升 的 水 深 液 。 测 定 前 用 0.1M pH 磷酸 盐 缓冲 液 再 适当 稀释 “200 2 PY ot ae OPEL Coed ate 和 Soe mir 2. 仪器 iA 1.5 15 厘米 (x70); MB O.1 BCX 3), 0.2% Ft Cx 1),0.5 BFC x 6), 1 BHC 3), 10 BFC 2), 721 型 分 光 光 度 计 ; PAPA YK YAR; 时 钟 ; 温度 计 。 3. 试剂 2m M ONPG 溶液 : 同 实 验 50 工 用 pH 7 BrP ye. _4m M ONPG 溶液 ， 24.08 毫克 ONPG， 加 0.1HXAPH7 磷酸 盐 缓 冲 液 至 20 毫升 。 et 1M Na,CO, Ww: [ASM 501, | AgNO; 溶液 : 169.87 毫克 AgNO; 加 重 蒸 水 至 10 毫升 成 100 m M, 稀释 至 0.04 m M (ike A ACH). 半 乳 糖 溶 液 : 1.8016 克 半 乳糖 加 0.1M pH7 磷酸 盐 组 冲 液 至 25 毫升 成 0.444, 再 稀释 成 0.1,0.2 和 0.344。 四 > :操作 步骤 :二 二 1. 半 乳 糖 `、AgNOs 抑制 类 型 (可 道 或 不 可 逆 ) 的 判断 - 在 固定 的 抑制 物 浓 度 〈 半 乳糖 终 浓 度 为 0.02M，AgNOs 终 浓 度 为 0.004 mM), 一 系列 不 同 酶 浓度 下 , 进行 初速 度 测 定 。 每 种 酶 浓度 重复 2 支 , 以 下 三 组 同时 做 。 C1) FLA: 取 试 管 13 支 编号 ， 各 加 酶 液 0.1,0.15, 0.2,0.25,0.3 和 0.4 毫 升 , 再 于 各 管 分 别 补 加 0.124 pH7 磷 酸 盐 缓冲 液 使 达到 0.4 EF. 各 试管 中 分 别 加 0.2M 半 乳 糖 溶液 0.1 毫升 。 按 次 序 计时 ,分别 加 入 0.5 毫升 4mM ONPG 液 , 精确 反 应 15 4} 4a 1 2H 1M Na,CO,, 4a, VBA UK 代 酶 , 其 他 操作 相同 ) 作 对 照 测 出 OD y20, (2) AgNO, 4. 各 步骤 与 半 乳 糖 组 相同 , Ree 一 230 一 糖 处 改 用 加 0.04 毫克 分 子 A8NOs YAM. 《3) 无 抑制 物 组 :; 各 步骤 与 半 乳 糖 组 相同 ， 只 要 在 加 半 乳糖 处 改 用 加 缓冲 液 。 将 上 述 三 组 数据 分 别 填 入 下 表 。 一 -| 一 一 -| 一 -一 一 一 | | 酶 毫升 数 一 -一 | 一 | 一 -| 一 -| 一 -一 -| 一 一 无 抑制 物 ODy | 半 乳 糖 组 Ss | FT | | | 一 一 一 AgN 0348 45 20 A) Fill DAA OR BE BARS, ODA WBE, 根据 曲线 比较 分 析 所 属 抑 制 类 型 。 2.。 半 乳糖 抑制 类 型 (竞争 性 、 非 竞争 性 或 反 竞 争 性 ) 的 判 断 及 抑制 常数 A, 的 测定 。 在 三 种 不 同 浓度 半 乳 糖 ( 终 浓度 分 别 为 0, 0.02, 0.04 和 0.06! ) 的 四 个 组 中 ,分 别 取 不 同 底 物 浓度 (ONPG 的 终 浓 度 分 别 为 0.2,0.4,0.6,0.8 及 lm) 进行 初速 度 测 定 。 取 试 管 41 支 ， 编 号 1 一 20( 每 编号 重复 2 支 ， 空 白 1 支 ) 按 下 表 加 入 半 有 乳糖、 缓冲 液 及 ONPG 溶液 。 然后 计时 ,分别 加 入 酶 液 0.3 毫升 ，65"C 精 确 反 应 15 分 钟 , 加 入 1M Na,CO; 溶液 1 毫升 ,冷却 后 , 于 721 型 分 光 光 度 计 以 空白 管 ( 以 水 代替 酶 ， 其 他 操作 相同 ) 作 对 照 , 测 出 OD4o fH, 分 别 填 入 下 表 , 并 作 计 算 。 二 = 5 the, Soe hs 6 Soke 半 乳 糖 0 0.1M ”0.2 毫升 ONPG 2mM (毫升 ) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 | 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 pH7 0.1M BBE 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 | 0.4 0.3 0.2 0.1 0 TYR (SFL) 半 乳 糖 0.2M “0.2 毫升 0.3M -0.2 毫 升 ONPG 2mM (毫升 ) 0.1 0.2 0.8 0.4 0.5 0.1 0.2 0.8 0.4 0.8 pH7 0.1M 磷酸 盐 组 冲 液 (毫升 ) 管 = 11 12 .138°214" Ibs) 46 ae 19 20 0.4 0.3 0.2 0.10 0.4 0.3 0.2 0.1 0 - uk jana axceceeu RM AD, HRA ARE RUAER HK, 按 原理 部 分 所 述 绘制 下 于 坐标 图 , 求 出 Ki, 或 按 公式 计算 五 。 半 乳 糖 终 浓度 0.02M ONPEG 终 浓度 [LS] (mM ) 0.2 0.40.6 0.8 1); 0.20.4 0.6 0.8 1 re 5 2.5 1.671.251 16 2.5 1.67 1eed ODy0(v) A v (& 表 ) 管 号 th 19°38 OT AS at 18, A 半 乳 糖 终 浓度 0.04! 0.06M ONPG 终 浓度 [S] (ma ) | 0.2 0.4 0.6 0.8 1] 0.20.4 0.6 0.8 1 1 = 6 2.5 1.671.251 | 6 2.5 1.67 1.25 1 [5] OD,20(v) i v 附 : &- 半 乳糖 苷 酶 的 制备 选用 产 x- 半 乳糖 苷 酶 的 嗜 热 脂肪 芽孢 杆菌 中 通过 亚 硝 基 肌 多 次 诱 “ 变 的 菌株 Nz-3468。 用 半 乳 糖 诱导 培养 , 菌 体 悬 液 保温 处 理 ， 酶 即 释放 出 来 ,用 硫酸 铵 分 级 沉淀 , 制 得 酶 制剂 供 酶 学 性 质 测定 。 一 、 菌 体 的 国体 培养 1. 和 斜面 培养 基 (2 12 厘米 培养 下) 牛肉 膏 0.5%, SARK 1.0 多 ， 氧 化 钠 0.5%， 琼 脂 2.5%, pH7.5, 灭 菌 工 公 斤 , 15 ay Bh, 55°C FE 16 小 时 。 2. wa- 半 乳糖 苷 酶 的 诱导 培养 基 ( 50 只 12 厘米 培养 下 ,配制 2000 Ft). AE 0.5%, SAK 1.0%, At 0.5%, D--E FL 0.3%, UH 2.5%, pH7.5, Kid 1 AF, 15 分 钟 。 将 斜面 培养 基 上 的 菌 种 ， 加 无 菌 水 得 县 间 液 ， 滴 加 在 诱导 培养 基 +L, RAHA. SS C 培 养 16 小 时 。 =. BARY 用 无 菌 水 刊 取 诱导 培养 基 上 生长 的 菌 体 〈 无 菌 水 的 量 尽量 少 些 )， 将 菌 体 悬 浊 液 于 55"C 放 置 过 夜 , 次 日 , 3000 转 / 分 离心 20~30 分 钟 。 侨 — 233 — (Se Lf ee? 取 上 清 液 即 为 酶 的 浸出 液 。 三 、 硫 酸 铵 的 分 级 沉淀 以 0.8~0.55 饱和 度 硫酸 铵 分 级 沉淀 。 取 上 述 酶 抽 提 滚 加 固体 硫 RK 0.3 ME, 充分 搅拌 溶解 , 冰箱 内 放置 6 小 时 以 上 上 。 3000 转 / 分 离心 20~30 分 钟 ， 弃 去 沉淀 物 。 上 清 液 再 加 固体 硫酸 铵 至 0.55 饱 和 度 交 冰箱 放置 6 小 时 以 上 。3000 转 / 分 离心 20~30 分 钟 。 取 沉淀 物 F 37°C RT, BRS) w- 半 乳糖 苷 酶 制剂 。 或 将 沉淀 物 溶 于 少量 水 ， 透析 去 盐 后 冷冻 干燥 。 酶 制剂 干 冻 贮存 备用 。 SL. 用 正 交 试验 设计 法 测定 几 种 因素 对 溶菌 酶 活性 的 影响 呈 —. BB | 通过 运用 正 交 试验 设计 法 测定 DH, HE MAH MK ik 度 对 溶菌 酶 活性 的 影响 , 求 得 溶菌 酶 的 最 适 温度 和 最 适 PH; 初 步 掌握 正 交 试 验 设计 法 的 使 用 。 二 、 原 理 C1) 酶 的 催化 作用 是 在 一 定 条 件 下 进行 的 ， 它 受 多 种 因 素 的 影响 , 如 诬 物 浓度 、 酶 浓度 、P 也 值 . 温 度 、 抑 制剂 和 激活 剂 等 都 能 影响 酶 催化 的 反应 速度 。 通 党 在 其 他 因素 恒定 的 条 件 下 ， 通 过 东 因 素 在 一 系列 变化 条 件 下 的 酶 活性 测定 求 得 该 因素 的 影响 ， 这 是 单 因 素 的 试验 方法 。 本 实验 运用 正 交 试 验 设计 法 测定 PH, 温度 和 缓冲 液 的 浓度 这 三 个 因素 对 酶 酒 作 的 影响 , 这 是 多 因素 的 试验 方法 。 正 交 试 验 设计 法 是 通过 正 交 表 安 排 多 因子 试验 ， 利 用 统 计数 学 原理 进行 数据 分 析 的 一 种 科学 方法 。《 有 关 正 交 试 验 * 0.8 硫酸 铵 物 和 度 溶液 的 加 入 量 280 克 / 升 ， 增 加 至 0. 中 硫酸 铁 伯 和 度 应 添加 量 165 克 / 升 。 = Pee = ne a 设计 法 的 基本 思想 、 适 用 范围 和 使 用 方法 等 可 参阅 中 国 科学 院 数学 研究 所 统计 组 编 * 常 用 数理 统计 方法 >, 34 页 ，1973, 科 学 出 版 社 ， 上 海 市 科学 技术 交流 站 编 ,《 正 交 试 验 设 计 法 》 1975, 上 海 人 民 出 版 社 。) (2) 本 实验 以 溶菌 酶 为 测定 对 象 。 溶 菌 酶 卫 .(C.3.2.1.7. 是 糖苷 水 解 酶 ， 作 用 人 -乙酰 氨基 葡萄 糖 和 人 -乙酰 胞 壁 酸 之 间 的 B-1 4 键 : H NHCOCHs va H NHCOCH, H ,CHCOOH GlcNAC MurNAC ve is tae H OH > H oe aan ¢H,CHCOOH GicNAC . MurNAC (GICNAC 表示 X- 乙 酰 -D- 氢 基 葡 萄 糖 ; MurAC 表示 N-Z EM) 也 可 以 作用 于 N- 乙 酰 氨基 葡萄 糖 之 间 的 B-1,4 键 ， 本 实验 所 用 底 物 甲壳 素 即 是 。 酶 活性 的 测定 是 以 活性 染料 了 人 emazolbrilliant Blue R 标记 的 水 浴 性 乙 二 醇 甲 壳 素 (了 RBB-G.Ch.) 为 底 物 进行 比 色 测 — 235 — Te eee ee ee 定 的。 由 于 标记 的 是 非 酶 作用 的 位 置 (Cs TE), 故 酶 催化 水 解 游离 出 染料 标记 的 水 溶性 乙 二 醇 甲 壳 素 碎片 ， 在 除去 未 经 作 用 的 底 物 后 溶液 颜色 的 深浅 就 能 代表 酶 的 活性 大 小 ， 此 溶液 可 以 直接 进行 比 色 测 定 。 NHC NH20 ee “ou ee H Bye NaOs H2OCH2CH2O mp | | RBB-Z,— #212 (RBB-G.Ch.) —CH, CH, SO m 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 溶菌 酶 溶液 : 称 取 10 毫克 溶菌 酶 粉剂 〈 上 海 禽 蛋 二 a 由 蛋清 制备 ) 定 容 于 50 毫升 燕 饮 水 中 ， 使 成 0.2 毫克 /毫升 。 滤纸 , 毛 边 纸 。 2. at 试管 1.5x15 厘米 (x 60); ME 1 SFX 6), 5 BHC 1), 10 毫升 (x 2). 72 型 分 光 光 度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 (x 4); 温度 计 ; PE. 3. 试剂 2% RBB- 乙 二 醇 甲 过 素 (RBB- G.Ch. pC. 称 取 RBB- 7 乙 二 醇 甲壳 素 工 克 , EAT 50 SARK. 酸 乙 醇 溶 液 : 98 毫升 9%5 儿 乙醇 中 加 2 毫升 浓 盐 酸 。 不 同 p 了 的 柠 样 酸 - 柠 机 酸 钠 缓冲 液 : 0.6M 柠 檬 酸 原液 一 -63 Het ERM (CeHsO7 了 H2O) 加 水 — 236 — = 500 Ft; 0.6M Fr ee Re kK ——88.2 克 柠 檬 酸 钠 (Na,C,H;0;: 2H2O) 加 水 至 500 毫升 。 上 述 二 原液 按 下 表 比 例 混 合成 不 同 P 卫 缓冲 液 。 * 及 BB- 乙 二 醇 甲 壳 素 制备 : 1. PREAH: 将 新 鲜 虾 , 角 背 壳 用 水 清洗 ， 除 去 杂质 ，80?C 烘 干 并 粉碎 经 40 目 过 科 。 为 除去 其 中 大 量 的 碳酸 钙 , HF 2N HCl (工业 用 ) 中 浸渍 过 夜 ， 次 目 用 涤纶 布 抽 滤 除去 酸 液 ， 用 新 盐酸 再 浸渍 , 如 此 重复 三 次 ， 至 无 气泡 产生 , 软 化 之 甲壳 用 水 洗 至 无 酸性 ， 抽 干 。 然 后 将 此 甲壳 浸 于 10% NaOH (工业 用 ) 中 ， 40 一 50%C 浸 涡 过 夜 ， 次 日 用 丙纶 布 抽 滤 除去 碱 液 , 换 用 新 碱 再 浸 病 ， 重 复 四 次 以 去 除 蛋 白质、 色素 及 脂 类 ， 抽 干 ,水 洗 至 中 性 ，80?C 烘 干 ， 得 无 色 或 微 红 色 甲 壳 素 (ch.), . 2._、 申 过 素 的 乙 二 醇化 : SRPRRETO HH, MA43% NaOH (W/ W)100 毫升 , 搅 匀 后 于 25"C 浸 渍 , 同时 减 压 使 NaOHL 充分 渗入 , 2 小 时 后 用 2 号 砂 芯 漏斗 抽 滤 除去 碱 滚 ， 并 压榨 至 约 为 甲壳 素 重 量 的 3 倍 (〈 即 15 克 左 右 )。 碱 化 甲壳 素 置 于 研 钵 中 , 在 冰 盐 浴 内 与 3.5 倍 量 冰 导 混和 使 迅速 分 散 成 高 粘度 的 透明 液 。 用 48% NaOH 调节 分 散 液 浓度 为 13 和 多 (W/W ), 再 加 入 18% NaOH, 使 溶 液 总 重量 为 原 甲 壳 素 重 量 的 20 倍 ( 即 100 克 )。 此 溶液 转移 至 烧瓶 内 ， 置 冰 浴 中 ， 加 环 氧 乙 烷 5 克 ， 搅 匀 后 于 0?C 左 右 放置 过 夜 , 次 日 再 在 搅拌 下 移入 83°CRIB 1.5 A, 完成 乙 二 醇化 后 得 到 淡 黄 色 水 乌 状 乙 二 醇化 甲壳 素 的 透明 粘液 。 用 少量 蒸 饮水 将 粘液 转 入 烧杯 在 搅拌 下 加 入 丙酮 乙醇 混合 液 ( 丙 酮 :90 多 乙醇 =1:9V/V) 约 1000 毫升 ,使 乙 二 醇化 甲壳 素 沉淀 。 离 心 收集 沉淀 , 以 90 多 乙醇 洗涤 至 基本 上 无 碱 性 后 加 入 少量 蒸馏 水 使 之 膨 润 ， 再 在 搅拌 下 用 乙醇 沉淀 , 离心 , 洗涤 ， 如 此 反 复 膨 润 8~4 KK, SVR pH 达 8~9， 继 而 用 无 水 乙醇 洗涤 沉淀 , 最 后 用 乙醚 干 燥 , 得 到 白色 粉末 状 水 溶性 乙 二 醇化 甲壳 素 (G.ch.)。 3. 乙 二 醇 甲 壳 素 的 RBBR 共 价 标记 : 3 克 CG. Ch. 于 三 颈 瓶 内 ， 加 蒸 饮水 150 毫升 ,使 完全 溶解 呈 水 馈 状 透明 粘液 , p 卫 8 一 8.5，505C 保 温 , 在 搅拌 下 加 入 活 EH RBBR (上 海 染 化 八 矿产 品 ) 0.6 克 /20 毫升 水 ， 然 后 加 6 区 无 水 硫酸 钠 《于 工 小 时 内 分 数 次 加 入 ), 再 加 0.3 克 三 聚 磷酸 钠 (3odium Triphosphate), 4 续 反 应 2 小 时 后 取出 冷 至 室温 , 搅拌 下 缓 缓 加 入 90 多 乙醇 600 毫升 ， 使 标记 的 乙 二 醇化 甲壳 素 ( 了 及 BB-G.ch. ) 沉 淀 ， 离 心 收集 并 用 乙醇 洗涤 以 基本 除去 吸附 于 沉 淀 上 的 未 反应 的 游离 染料 , 再 加 入 少量 蒸馏 水 使 之 膨 润 ， 并 用 乙醇 再 沉淀 , 如 此 反 复 2 一 3 次 至 上 清 液 完全 无 色 。 用 90 多 、9%5 匈 、 无 水 乙醇 脱水 , 乙醚 干燥 成 深蓝 色 产品 ;或 将 沉淀 悬 于 少量 蒸馏 水 中 , 流动 水 透析 过 夜 , 最 后 冷冻 干燥 。 一 2 ; Ss Bite ee) fit | lot Oe) CO rae . NT i - mt ‘ $ p- , . ‘en i‘? <> 53 > “cy ’ 本 了 “75> re Ay, > pH 0.6M 柠檬 酸 (毫升 ) 0.6M HERR (EFT) 3.5 wi. oy 11.4 4.5 27.0 23.0 5.5 14.8 os 35.2 ee 4.3 45.7 四 、 操 作 步 又 1. 正 交 表 的 选择 本 实验 取 三 个 因子 , 即 :温度 .PH AR EE, 每 个 因 素 取 四 个 水 平 , WER. 水 平 i ECC) pH ”| SB hye YR BEC) 1 30 3.5 0.15 2 50 4.5 0.30 3 70 5.5 0.45 4 80 cS Nes 0.6 BMI, MSE OEE 虑 , 共 需 做 A? = 64 个 试验 ， 而 用 正 交 表 Lig (4°) 只 需 做 16 次 试验 。 Li。(49 表 有 任何 正 交 表 都 具备 的 下 列 特点 : @ 任何 一 列 各 水 平 出 现 的 次 数 相等 (这 里 均 为 和。 0 上 tz a | 1 1 1 2 1 2 2 ae a 3 1 8 3 3 3 4 1 4 4 4 | 4 5 2 1 2 3 4 6 2 2 1 4 3 7 2 3 4 1 2 8 2 4 3 2 1 9 3 1 3 4 2 10 3 2 4 3 1 11 3 3 1 2 4 12 3 4 2 1 3 13 4 1 4 2 3 14 4 2 3 1 4 15 4 3 2 4 1 rT >>) 心 = | 一 co bo @ 任何 二 列 的 横行 组 成 的 数 对 出 现 次 数 相 等 〈 这 里 有 16 个 数 对 , 即 1, 1; 1, 2; 1,3; 1, 4; 2, 1; 2, 2; 2, 3; 2, 4; 3, 1; 3, 2; 3,3; 3,4; 4,1;4,2;4,3;4,4, WB 1 Mu), @ 任何 两 行 同 名 数 对 出 现 次数 相 等 (这 里 有 4 个 同名 数 对 ， 即 1 1 2, 2; 3, 3; 4, 4。 均 出 现 一 次 )。 — tae a 这 些 特性 保证 了 用 正 交 表 安 排 的 试验 计划 是 均衡 搭配 的 , 因此 可 以 进行 综合 比较 和 方差 分 析 。 2. 试验 安排 把 本 实验 三 个 因子 温度 、pH 和 缓冲 液 浓度 依次 放 在 Lie(45) 的 第 1,2 和 5 列 ， 各 列 PARP SE AT IB PS HR, 就 得 到 下 面 的 试验 安排 表 。 试验 安排 表 1 1(30°C)/1(3.5)} 1 | 1 | 100.16) 2 1(30°C)|2(4.5)} 2 | 2 | 2(0.30) 3 1(30°C)|3(5.5)| 3 | 3 | 3€0.45) 4 1(30°C)|4(6.5)| 4 | 4 | 4(0.60) 5 2(50°C)|1(3.5)) 2 | 3 | 4(0.60) 6 2(50°C)|2(4.5)) 1 | 4 | 3(0.45) og 2(50"C)|3(5.5)| 4 | 1 | 2(0.30) 8 2(50°C)/4(6.5)} 3 | 2 | 100.15) 9 3(70°C)|1(3.5)} 3 | 4 | 2(0.380) 10 3(70°C)|2(4.5)| 4°} 3 | 1(0.15) 11 3(70°C)|38(5.5)} 1 | 2 | 4(0.60) 12 3(70°C)/4(6.5)} 2 | 1 | 3(0.45) 13° 4(80°C)|1(3.5)} 4 | 2 | 3(0.45) Vege 4(80°C)/2(4.5)| 3 | 1 | 4(0.60) 15 4(80°C)|3(5.5)| 2 | 4 | 1€0.15) 16 A(B0'OKG.5) 1 | 3 | 2(0.30) a —_ 【一 水 平 试验 结果 总 和 ) Sve Ke | (二 水 平 试验 结果 总 和 ) i K. (三 水 平 试验 结果 总 和 ) K (四 水 平 试验 结果 总 和 ) 3 K? K3 . K? K? Ki+Ki+Ki3+Ki 4 K?4K?+K?+K? Si = F —CT 3. 具体 操作 步 又 GQ) 将 已 配制 好 的 四 种 不 同 pH fy oO. 6M 缓冲 液 ， 于 16 支 试管 内 按 表 进 一 步 黎 释 至 一 定 浓 度 。 (2) 取 试 管 16 3c, 按 试 验 安 排 表 第 2 列 编号 分 别 加 入 上 述 不 同 P 卫 不 同 浓度 的 缓冲 液 0.5 毫升 。 (3) 在 上 述 16 支 试管 内 各 加 2% RBB-G.Ch. 溶液 0.5 毫升 , 混和 之 。 (4) 按 试验 安排 表 第 1 列 编号 分 别 放 入 相应 的 30,50， 70 和 80 C 恒 温水 浴 箱 内 预 热 5 分 钟 。 一 2 一 Ee Se eS ee ee. Pe ; 0.61 428 pH WARM 7k MEBZIKE(M) (毫升 ) (Ft) 0.15 2 6 0.30 4 4 "0.45 6 2 0.60 8 0 (5) 进行 酶 反应 : FLA 16 支 试管 中 , 依次 每 间隔 一 分 钟 加 溶菌 酶 溶液 0.5 毫升 , HB, 精确 反应 30 分 钟 , 分别 加 4 ZF RCMB, HA, AWE, SAA: 于 一 试管 内 加 2% RBB-G.Ch. Wy 0.5 SF, K0O.5 27, ROZBAM 42S, Ram 0.5 ZAHAABA (6) 比 色 : F 72 B46 HEE th 600 S Hh HK Wl 6 BF BE (ODioo)。 五 、 数 据 记 录 和 分 析 1. 数据 记录 将 上 述 16 个 数据 填 入 试验 安排 表 yi 项 内 。 2. 数据 分 析 | 可 直观 分 析 进 行 综合 比较 ， 也 可 方差 分 析 。 前 者 方法 简 单 直观 ,后 者 比较 精细 , 但 有 一 定 的 计算 量 。 et (1) 直观 分 析 : 在 表 上 计算 各 水 平 试验 结果 总 和 ， 即 第 1,2 和 5 列 上 的 下 天， 下 和 天 并 分 别 除 以 生 作用 因子 和 试验 数据 的 关系 图 ， 即 把 每 个 因子 玉 ;/ 各 K,/4, K,/4, Ky/4K ODgo0 值 点 在 坐标 AE, RES Hl — 242 — . pS 4 i le § aa a ee, OD 600 0.15 0.30 0.45 0.60 缓冲 液 浓 度 (MD OD 600 OD 600 30 50 70 90 3.5.4.5 5.5 6.5 im fF (°C) - pH 从 这 些 数据 和 图 可 以 比较 ,在 3 个 因子 中 , 哪些 因子 对 酶 活性 影响 大 , 哪些 因子 影响 小 ; 如 果 茶 因子 对 试验 数据 的 影响 大 ,那么 它 取 哪 个 水 平 对 酶 活性 最 有 利 。 《2) 方差 分 析 : 方差 分 析 可 以 给 出 误差 大 小 的 估计 。 首 先 按 试 验 安 排 表 所 示 项 目 进行 表 上 和 运算， 然后 进一步 计算 下 列 方差 分 析 表 , 进行 显著 性 检验 。 显著 性 : 由 F 4} 4p He 得 上 .05 (3.6 = 4.76, Fo.01 (3.6) =9.78。 如 果 计 算得 之 某 因子 下 比 >Foos (3.6), Bp 此 因子 显著 , 就 在 显著 性 一 栏 上 打 # 号 ， 表 示 有 和 站 狗 的 把 握 说 该 因子 是 显著 的 ， 如 此 Fi Fo.o1 (3.6)， 则 打 ## 号 ， 表 示 有 99% 把 握 说 该 因子 是 显著 的 。 我 们 对 照 直 观 分 析 的 结果 ， 可 以 看 出 直观 分 析 和 方差 分 术 的 结果 是 一 致 的 。 243. = Wea yee 3. 结果 讨论 Hu LAA. PH 及 缓冲 液 浓度 在 未 rae 验 条 件 下 对 溶菌 酶 的 酶 活性 影响 如 何 ; 温度 和 PH AY aE 围 如 何 。 De. i yo (37,39~42] 一 、 目 的 通过 各 向 异性 超 滤 膜 的 制备 和 应 用 ， 了 解 超过 滤 技 术 的 基本 原理 和 方法 。 二 、 原 理 - 超过 滤 是 以 半 透 性 薄膜 为 介质 , 在 加 压条 件 下 ， 根据 溶液 中 分 子 的 大 小 和 形态 ， 在 埃 (10-* 厘米 ) 数 量 级 进行 选择 性 滤 过 , 从 而 达到 大 分 子 物质 分 离 和 浓缩 目的 的 一 种 技术 。 半 透 性 膜 在 该 技术 中 是 个 关键 。 目 前 已 有 多 种 成 膜 材料 和 不 同 的 制 膜 方法 。 本 实验 以 一 般 常 用 的 二 醋酸 纤 维 素 为 材 oe ae a = 和 ae, a ee : BL, 采用 入 水 凝冻 法 制 成 各 向 异性 膜 ( 指 薄膜 的 正 反 二 面 结构 不 同 , 又 称 不 对 称 膜 )， 即 将 二 酷 酸 纤维 素 溶 解 于 溶剂 (丙酮 ) 和 添加 剂 ( 甲 酰胺 ) 中 ,过 滤 , 脱 除 气 泡 后 乔 成 薄膜 ,随即 浸入 冰 水 中 完成 成 膜 过 程 。 这 样 制 成 的 膜 由 致密 而 极 薄 的 “表皮 层 ” 《厚度 约 0.1~10 微米 ) 和 较 朴 松 的 海绵 状 “支持 层 “ 厚 度 约 100~200 微米 ) 组 成 。 表 皮层 决定 膜 的 选择 性 ， 而 支持 层 则 增加 机 械 强 度 ， 这 种 膜 通 透 性 好 , 流量 大 ,物理 性 能 优越 。 根 据 制 膜 液 的 不 同 配 比 和 控制 成 膜 条件 , 可 制 成 各 种 孔径 的 膜 ， 以 起 到 不 同 的 “得 分 效用 ?”。 “超过 滤 条 件 温和 ， 没 有 *“ 相 态 ” 变 化 ,而且 设 备 简单 , 操作 方便 ,因此 正 日 益 受 到 人 们 重视 , 应 用 也 越 来 越 广泛 。 本 实验 用 该 技术 浓缩 洲 菌 酶 溶液 。 三 、 实 验 材 料 , 仪器 和 试剂 1， 实验 材料 二 酯 酸 纤 维 素 〈 上 海 群 力 塑料 厂 ， 批 号 75-01-28 )， 结 合 酸 54.5~56%, FARE 500 厘 泊 左 右 。 YAS YAIR C1 毫克 /毫升 ): MRA A Lea =)" )100 毫克 , 溶 于 自来水 100 ZH, 滤纸 ; 毛 边 纸 。 2. NG 吸管 9.5 毫 升 (x3)，1 毫 升 (x1)，5 毫 升 (x1); 试管 1.5x15 厘米 (x17); 量 简 100 毫升 (x 1D); 三 角 烧 瓶 100 毫 Ft (x 1); 烧杯 100 毫升 (x 1)。 Cs=-1 实验 型 超 滤器 (上海 市 轻工业 研究 所 ); 72 型 分 光 光度 计 ; 电热 恒温 水 浴 箱 ; 秒表 ; 水 平 仪 ; 温度 计 ; 玻璃 板 12x 12 厘米 ; 金属 刮刀 ; 细 铜 丝 ; HEE; 圆珠笔 ; 剪刀 。 3. 试剂 ces!) os 1% RBB-G.Ch.《〈 染 料 标记 的 乙 二 醇 甲壳 素 制备 方法 见 实验 51). 1 克 溶 于 0.1M pH4.5 栈 酸 缓冲 液 100 毫升 。 ae 酸 乙 醇 : 无 水 乙醇 98 毫升 加 浓 盐 酸 2 毫升 。 丙酮 (化 学 纯 ); 甲 酰 胺 (化 学 纯 )。 a | . 二 酷 酸 纤维 素 超 滤 膜 的 制备 上 制 膜 液 制备 : 100C 左 右 烘 于 的 二 酷 酸 纤维 素 5 克 ， 丙酮 22 .5 ZF, A 酰胺 10 毫升 〈 三 组 份 比例 为 1:4.5:2.0) 于 100RH = fae TAS, 迅速 搅 均匀 (三 角 烧 瓶 应 放 在 冰 浴 中 ， 防 止 丙 酮 大 量 挥 发 )， 加 塞 密闭 ， 置 室温 或 30"C 左 右 水 浴 使 纤维 素 完 全 溶解 。 然后 用 小 型 超 滤器 在 3 公斤 / 厘米 "压力 下 ， 通 过 二 层 粗 棉布 和 一 层 尼 龙 布 加 压 过 滤 ， 得 到 淡 黄 色 清 亮 粘 稠 液 ， 滤 液 再 于 上 上述 相同 条 件 静 置 ， 脱 除 气泡 ( 约 二 天 ) 后 ， 即 为 可 用 的 制 膜 “ 液 。 (2) 制 膜 : 为 了 得 到 具有 一 定性 能 的 超 滤 膜 ， 一 方面 要 保持 制 膜 室 的 恒温 恒 湿 (温度 22~24°C, 湿度 70~ 全 80 多 )， 条 件 简陋 的 情 况 下 也 可 在 通风 柜 内 进行 , 夏季 加 冰 水 ,冬季 用 电炉 煮沸 水 以 满足 这 种 要 求 ; 另 一 方面 要 严格 控制 制 膜 条 件 。 制 膜 时 , 先 将 洁净 干燥 的 玻璃 板 (12x 12 厘米 ) 放 置 水 平 〈 需 用 水 平 仪 校 验 ), 把 制 膜 液 倒 在 玻璃 板 上 端 , 用 二 端 绕 有 细 铜 丝 的 金属 刮刀 由 上 而 下 连续 、 均 匀 刊 成 薄膜 , 并 准确 控制 莱 发 时 间 为 15 秒 ( 燕 发 时 间 是 指 刮 完 膜 后 到 浸入 冰 水 之 前 在 空 气 中 暴露 的 时 间 , 此 静 置 过 程 中 , 随 深 剂 挥 发 ， 膜 表面 形成 一 结构 紧密 的 表皮 层 ), 然后 立即 把 带 膜 的 玻璃 板 全 部 均匀 地 浸 入 盛 有 0~4C 冰 水 的 瓷 盘 内 。( 冷 浸 过 程 中 , 膜 内 溶解 的 浴 剂 —246.>— 和 添加剂 被 漂洗 出 来 , 同时 醋酸 纤维 素 起 胶 凝 作用 ,而 冷却 促 进 胶 凝 ， 以 形成 多 孔 的 网 状 结构 。) 冷 浸 时 间 一 般 为 1 小 时 以 上 。 膜 取出 前 ， 在 正面 ( 刊 膜 时 接触 空气 的 一 面 ) 用 圆珠笔 做 记号 。 膜 应 放 在 水 中 保存 ,用 前 需 浸泡 12 小 时 以 上 。 2. 超过 滤 将 膜 对 光 观 察 , 选择 均匀 无 孔洞 处 , 按 超 滤器 滤 板 大 小 前 成 直径 为 9 厘米 的 圆 形 膜 ， 装 入 CS-1 实验 型 超 滤器 中 (注意 膜 正面 朝 上 ! ), 量 取 溶菌 酶 溶液 100 毫 升 , 从 进 样 口 加 入 , 出 口 “处 用 100 毫升 烧杯 盛 接 透 出 液 , 密闭 超 滤器 , 进 气 口 接 上 氮 压 缩 气 钢瓶 , 通 氮气 加 压 , 维持 3.0~3.5 公斤 /厘米 2， 然 后 开动 振 功 器 并 调节 频率 和 振幅 〈 振 功 器 的 作用 是 为 了 减少 膜 表 面 浓 卷 极 化 现象 ， 使 透 出 速度 较 恒 定 )， 室 温 下 进行 超过 滤 浓 缩 。 从 透 出 液 流出 开始 起 , 计时 20 分 钟 , 移 开 盛 接 的 烧杯 , 切 断 氮 气 ， 关 闭 电源 开关 。 浓 缩 液 由 进 样 口 倒 出 ， 拆 开 超 滤器 ， 取出 超 滤 膜 。 记 录 浓 缩 酶 液 和 透 出 液体 积 。 分 别 对 原 酶 液 、 浓 缩 液 和 透 出 液 进行 活力 测定 。 3， 酶 活力 测定 测定 系统 为 , 1%RBB-G.Ch.1 毫升 , 酶 液 0.5 毫升 , 50"C ”准确 反应 15 分 钟 ， 加 酸 乙 醇 4.5 毫升 停止 反应 (注意 空白 管 先 加 酸 乙 醇 , 后 加 酶 液 )， 简 易 过 滤 , 滤液 于 72 型 分 光 光 度 计 600 毫 微米 读 取 光 密度 。 hh, 计算 将 具体 操作 条 件 和 数据 填 入 下 表 , 并 按 要 求 进 行 计 算 。 ae << hao ; . =. Pane arate in 7 Hey vou bp ned —_ ‘ oF gee ox - open ln ee ins EFI, T= 4 es : Ee 制 膜 液 组 分 二 醋酸 纤维 素 5 克 丙酮 22.5 毫 升 甲 酰胺 10 毫 升 制 膜 条 件 温度 °C | 湿度 多 蒸发 时 间 秒 冷 浸 温度 oat > 冷 浸 时 间 | NEE BIB AE 温度 sige Soa 3 时 间 Bp ake | | 毫 天 /厘米 >. 分 酶 液体 积 原 酶 液 毫升 浓缩 液 Ft 透 出 液 Pee G5 毫升 体积 沪 缩 倍数 Be | - 原 梅 液 (CODeo) 浓缩 液 (ODeoo) 透 出 液 CODeoo) 活力 浓缩 倍数 活力 回收 (多 ) # 透 水 速度 是 指 一 定 压力 下 ,每 分 钟 通过 单位 面积 膜 的 液体 量 。 一般 以 毫升 / 厘米 2 . 分 表示 。 实 际 上 在 超过 滤 过 程 中 , 由 于 滤 膜 的 “ 压 密 > 现 象 , 透 永 速度 随时 间 而 变化 , 这 里 采用 平均 值 。 ， _ 原 酶 液体 积 (毫升 ) PPR = “Se EBLE) 浪 缩 液 活力 (ODso/ 毫 升 ) 活力 浓缩 倍数 一 - 原 酶 液 活力 (5Deo/ 毫 升 ) ”浓缩 液 总 活力 (ODaoy/ 毫 升 x 章 升 ) 活力 回收 (名 ) = - 原 酶 液 总 活 为 (5Deo/ 毫 升 X 毫 升 ) — 248 — 53. Fl AE S’—1ol Se — is sill sor “94 一 、 目 的 通过 用 重 氮 法 制备 固 相 5 -磷酸 二 酯 酶 ， 了 解 固 相 酶 ( 载 体 偶 联 法 ) 制 备 的 基本 过 程 和 方法 。 二 、 原 理 固 相 酶 是 近 十 几 年 来 迅速 发 展 的 一 项 新 技术 。 它 是 将 水 溶性 酶 通过 物理 或 化 学 方法 ， 使 之 成 为 不 溶 于 水 而 仍 具 有 活 性 的 一 种 酶 衍生 物 。 它 的 特点 是 : — ) 经 固 相 化 后 , 可 以 反复 使 用 , 降低 酶 的 成 本 ; 《2) 易 与 产物 分 离 ， 便 于 后 处 理 ， 提 高 产品 的 质量 和 产 aes (3) 有 利于 生产 连续 化 和 目 动 化 等 ， 从 而 使 酶 的 实际 应 用 进入 一 个 新 的 阶段 。 制备 固 相 酶 的 方法 很 多 ， 本 实验 采用 载体 偶 联 法 中 的 重 RIE, BRB Pencilium citrium) 发 酵 生 成 的 5 -磷酸 二 酯 酶 ， 借 助 双 功能 试剂 一 一 对 -C- 硫 酸 酯 乙 硕 基 葵 腕 (SE- SAJ) 偶 联 于 甘蔗 酒 纤 维 素 载体 上 制 成 固 相 5 -磷酸 二 酯 酶 。 反应 过 程 如 下 : ~|—-OH | | Peete 10. -S>-0O—CH.CH, Ss —€_S-NH; ae | I er 碱 化 纤维 素 ”对 -/ 太 硫酸 酯 乙 砚 基 葵 胺 (3SESA) (se : pH13, 100°C, 30 分 钟 — 249 — So Mth: ior Sb So aS ead 一 | 一 OH ~ - I a! O—CH,CH,-S—€ ‘S——NH2+H2SOQ, 一 | Po at = 本 -of 对 -氨基 葵 砚 乙醚 纤维 素 (ABSE 纤维 素 ) |Ecl ore 2 kes I ee are HOH HRY, HCl, NaNO2 0~5°C, 15 分 钟 a 二 oH 0 5 =k OCH OH : —€_S-Nt=NCI-+H,0 al 了 本-oH 重 氮 盐 (BR | = 5 一 磷酸 二 酯 酶 ， pH7. O~7.5, 0~5°C, 30 分 钟 本 -oOH x 本 o-c 本 CH -&_》-N=N 一 @+HCI 本 -oOH 男 相 酶 一 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 5 -磷酸 二 酯 酶 溶液 (10 毫克 /毫升 )。 FER. 甘蔗 洼 纤 维 纸板 (广东 江门 甘蔗 化 工厂 )。 广泛 试纸 PH1I~14; WR ise pH5.6~9.0, pH9.5~13; 滤纸 。 2. 仪器 吸管 10 毫升 (x5)，2 毫升 (x3),0.2 毫升 (x3),0.1 训 ” 升 C(x2); 量 简 50 毫升 (x 1)，250 毫升 (x 1); 三 角 烧 瓶 100 毫升 (x1); 烧杯 50 毫升 (x 1),250 毫升 (x 1),500 毫升 (x 1); 试管 15x 150 毫米 (x 10); 玻璃 小 漏斗 (x 1); 2 Swi 斗 100 毫升 (x 1); ye Hi 50 毫升 C(x 1); 牛奶 瓶 (x 2); 滴 管 ; 玻 棒 。 电热 恒温 水 浴 箱 ; 水 浴 锅 ; 电动 搅拌 器 ; 药物 台秤 ; 分 析 天 751 型 紫外 分 光 光 度 计 ; 秒表 ; 温度 计 。 3. 试剂 SESA( 染 料 中 间 体 ,上海 染 化 八 厂 ); 12% NaOH (w/w); 1M Na,CO;; 0.5N NaOH; 0.05N NaOH; 1N HCI; 0.05N HCl, 5% NaNO,; 12% (NH,).SO,; 3% NaCl, 5 -磷酸 二 酯 酶 溶液 : HERARRARBAM A, MA 预 冷 至 一 10C 的 工业 酒精 , PRAM EIKO, ie MwA 吹 干 得 酶 粉 (活力 一 般 为 15 万 单位 / 克 )。 称 取 酶 粉 2 克 ， 加 少量 蒸馏 水 研磨 溶解 , 再 定 容 至 200 毫升 , 过 滤 得 棕色 透明 酶 液 , 即 为 下- 磷酸 二 酯 酶 溶液 (10 毫克 /毫升 )。 底 物 溶液 : 称 取 了 NA (广东 江门 甘蔗 化 工厂 ) 2 克 , 加 少量 蒸 饮 水 调 成 糊 状 ， 再 加 适量 水 ， 用 5~6% 氨水 调 PH 5.1， 待 全 部 溶解 后 ， 定 容 至 100 毫升 ， 配 成 29 RNA WM, 一 257 一 Px BM HH (Na Ac-3H,0)3.402 克 ,， 用 蒸馏水 定 容 至 100 豪 ”” Ft; AMM 99.8%k2RM1.47 毫升 ， 同 样 定 容 至 100 毫升 。 然后 按 NaAc: HAc=7.45:2.55 ALL) BAR 0.25M, pH 5.1 BARRA PK, FF DLA ER HE (ZnSO,-7H,0)57.5 Sn, Eb 2% RNA 100 毫升 与 酷 酸 缓冲 液 100 毫升 混和 即 成 。 高 氯 酸 - 钼 酸 铵 试剂 ， 配 法 见 实验 35。 DO, ESR 1. 纤维 素 的 碱 化 * 称 取 撕 碎 的 甘蔗 酒 纤维 素 3 克 ， 于 冰 盐 浴 中 加 了 2 匈 NaOH 25 毫升 ，0?C 搅 拌 工 小 时 。 用 375 毫升 水 稀释 后 , Wild 漏斗 抽 滤 压 干 , 将 此 羟基 活化 的 碱 化 纤维 素 直 接 进 行 醚 化 。 2. 了 碱 化 纤维 素 的 醚 化 (1) SESA 的 溶解 : SESA 3 oe, Ine 1B 7k 6 Ft, = 40°C, 在 搅拌 下 用 17 Na,CO, 调 PH6.5， 溶 解 后 经 滤纸 过 滤 - 至 100 毫升 三 角 瓶 中 。 (2) 醚 化 : 将 碱 化 纤维 素 加 到 上 述 SESA 滤液 中 ， 室 温 JH 0.5N NaOH 调 pH 至 13， 再 于 沸水 浴 中 加 热 30 分 钟 ， 不 断 搅 拌 ， 继 续 调 DH 使 保持 13。 然 后 用 砂 芯 漏斗 抽 王 ,并 用 0.05N NaOH 洗涤 2 次 ( 约 100 BH /tk), BBR 2 次 ( 约 100 毫升 /次 ) 至 中 性 ， 抽 干 ， 尽 可 能 洗 除 未 与 纤维 素 醚 化 的 SESA_ 3. 醚 化 纤维 素 的 重 氮 化 将 醚 化 纤维 素 置 于 牛奶 瓶 (或 厚 质 玻璃 杯 ) 中 ， 加 蒸 馆 水 20 毫升 ，1AN HCl 7.5 毫升 , 冰 浴 中 搅拌 15 分 钟 ， 使 生成 葵 胺 盐酸 盐 ， 并 降温 到 0~5"C， 然 后 在 搅拌 下 滴 加 预 冷 的 5 多 *# 甘蔗 酒 纤维 素 系 甘 蔗 洼 - 芒 秆 纤维 素 。 其 羟基 的 活化 也 可 用 稀 碱 法 ， 即 将 纤维 素 浸 于 0.6 和 多 NaOH th, 85"C 以 上 碱 化 80 分 钟 , 抽 压 千 后 用 SESA BE (Ge =e NaNO, 7.5 毫升 , 盖 好 瓶 口 ， 以 防 亚 硝酸 (CHNO;:) 逸 出 ,反应 15 分 钟 , 每 3~5 分 钟 搅拌 1 次 ,反应 后 迅速 于 砂 芯 漏斗 中 抽 _ 于， 并 用 预 冷 的 0.05 和 N HCl 洗涤 3 次 ( 约 100 毫升 /次 六 以 除 去 过 剩 的 NaNO:, 再 用 预 冷 的 蒸馏 水 洗涤 1 次 , 除去 HCl, 抽 于 ， 立 即 作 酶 偶 联 用 。( 注 意 : 由 于 重 氮 盐 在 高 温 下 不 稳定 ， 因此 反应 于 低温 进行 ， 重 氮 化 纤维 素 的 洗涤 也 要 求 低温 和 快 速 ! ) . 4. 重 氮 化 纤维 素 与 酶 的 偶 联 将 重 氮 化 的 纤维 素 加 入 已 盛 有 预 冷 至 0 一 5 C 酶 液 [ 含 5- 磷酸 二 酯 酶 溶液 7 EFL, 12% (NH,).SO, 13 毫升 , 蒸馏 水 10 毫升 ] 的 另 一 牛奶 瓶 内 ， 在 冰 浴 中 搅拌 反应 30 分 钟 ， 用 1 Na,CO, 维持 pH7.0~7.5, 然后 将 反应 物 抽 于 ,收集 滤液 ( 即 为 偶 联 反应 上 清 液 ， 内 含 未 与 载体 偶 联 的 酶 )， 固 相 本 用 3 纪 NaCl 洗涤 3 次 ( 约 100 毫升 /次 )， 以 除去 吸附 于 纤维 素 上 的 酶 , 压 干 并 称 重 。 分 别 进行 溶液 酶 和 固 相 酶 的 活力 测定 。 5. 酶 活力 测定 5'- 磷 酸 二 酯 酶 的 活力 测定 通常 用 紫外 光 吸 收 法 ， 但 也 可 以 用 定 磷 法 ( 见 实验 39I 中 引 - 核 背 酸 磷 的 测定 )， 本 实验 采 用 前 者 。 CQ) 溶液 酶 活力 测定 : 将 偶 联 反应 上 清 液 简易 过 滤 ， 除 去 固 相 酶 残 酒 后 进行 测定 。 于 一 试管 中 加 入 底 物 溶 液 AF 1% RNA, 0.125MpH5.1 BRAMR, 1mMZnSO,)1.9 & 升 ，67"C 预 热 5 分钟 , 加 酶 液 0.1 毫升 ， 准 确 反 应 15 分 钟 ,用 AR -AR EIR 2 毫升 终止 反应 ， 置 冰 浴 10 分 钟 使 沉淀 完全 , 简易 过 滤 后 取 滤 液 0.2 毫升 , MARK 9.8 BSF, A, 于 260 毫 微米 测定 光 密 度 值 〈《ODaseo)。 空 白 先 加 沉淀 剂 后 加 — 253 — 酶 液 , 其 余 操 作 相同 。 原 酶 液 稀 释 (20 a, 同样 测定 。 (2) 固 相 酶 活力 测定 ， 于 50 毫升 烧杯 中 , 加 入 底 物 溶液 20 毫升 ，67"C 预 热 5 分钟 ,加固 相 酶 0.2000 克 左 右 , 准确 反 应 15 分 钟 , 立即 过 滤 ， 吸 取 滤 液 2 SH, PAR ARR 剂 2 毫升 终止 反应 ， 置 冰 浴 10 分 钟 使 沉淀 完全 ， 简 易 过 滤 后 取 滤 液 0.2 SF, MAAK 9.8 BH, HD, F 260 SACK 定 光 密 度 值 。 SES (3) 酶 活力 单位 的 定义 ， 在 上 述 条 件 下 ， 每 分 钟 所 形成 的 核 背 酸 量 在 260 毫 微米 的 光 密 度 为 1.0 时 为 1 个 单位 。 6. 计算 溶液 酶 活力 (单位 /毫升 7 _ OD 2% 100 FFE > OD269 x 20 x 100 AME CH A / 52)" = —— Oooo xia : __ 上 清 液 总 活力 单位 未 偶 联 酶 ( 匈 ) = eB eA x 100 _ AME 梅 活力 回收 \ 多 ) = - 原 酶 液 总 活力 单位 ~ 100 ”相对 活力 (多 ) : ALA RH A sk ~ TREE 79 — EG * 固 相 酶 活力 (单位 / 友 )， 应 指 单位 干 重 的 固 相 酶 所 具有 的 活力 。 本 实验 按 一 压 干 后 之 重量 表示 。 — 254 — st 相对 活力 表示 偶 联 到 载体 上 的 酶 所 表现 的 活力 百分数 。 将 测定 和 计算 结果 填 入 表 内 : 酶 活力 或 单位 / 殉 ) — | | | |__| 一 -一 一 -一 一 | -一 一 一 一 | 一 -一 一 — 25) — 4 te iff 54. 发 酵 过 程 中 无 机 磷 的 利用 一 、 目 的 了 解 发 酵 过 程 中 无 机 磷 的 利用 。 二 、 原 理 酵母 菌 利用 葡萄 糖 进 行 发 酵 时 ， 能 使 无 机 磷 转 化 为 高 能 有 机 磷 。 在 发 酵 实 验 中 可 以 看 到 , 在 开始 阶段 发 酵 速度 较 快 ， 后 来 速度 逐渐 缓慢 , 以 至 停止 。 若 再 加 入 无 机 磷 , 则 发 酵 速度 又 可 恢复 。 本 实验 中 我 们 测定 发 醇 前 后 无 机 磷 含 量 的 变化 来 证 明 发 酵 过 程 无 机 磷 的 消耗 。 无 机 磷 含 量 的 测定 ， 可 利用 它 与 钼 酸根 形成 磷 钼 酸 复 离 子 ， 并 在 适当 的 还 原 剂 作用 下 磷 钼 酸 复 离子 能 还 原 成 深蓝 色 的 钼 蓝 , 根据 颜色 的 深浅 可 比较 无 机 磷 的 多 少 。 三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 新 鲜 酵 母 。 2. 仪器 烧杯 50 毫升 (x 1); 试管 1.5x 15 厘米 (x 6); M1 升 (x4),， 5 毫升 (x1)，10 毫升 (x 1); 漏斗 4 厘米 (x2); K fe. ! 电热 恒温 水 浴 箱 。 3. 试剂 — 256 — 5% Fil 4d BRYA; 5% =A CMCTCA); 定 磷 试剂 ( 见 实验 aa 四 、 操 作 步 又 1. 在 50 毫升 烧杯 中 加 入 2 克 新 鲜 酵 母 ， 和 1 毫升 5 多 “葡萄糖 溶液 ,用 玻 棒 搅 拌 成 均匀 糊 状 ， 再 加 入 9 毫升 5 多 葡萄 糖 溶 液 并 搅拌 均匀 成 葡萄 糖 酵母 悬 液 。 2. 取 试 管 二 支 按 下 表 次 序 加 入 葡萄 糖 酵母 悬 液 1 毫升 ， 在 管 工 中 立即 加 入 ICA 3 BH, H2AAMICA, 二 支 试 管 BA 37 C 水 浴 箱 保温 2 小 时 。 保温 后 在 管 2 中 也 加 入 TCA 3 毫升 ,放置 10 分 钟 使 发 酵 完 全 中 止 , 二 管 分 别 过 滤 , 取 滤 液 。 3. REL 和 管 2 滤 液 工 毫升 ， 分 别 放 在 另 二 支 试管 中 ， 再 加 入 定 磷 试剂 1 毫升 , 在 45"C 水 浴 中 保温 20 分 钟 ， 观 察 形 成 钼 蓝 的 深浅 , 以 此 比较 无 机 磷 含 量 的 变化 , 并 解释 其 结果 。 过 | 滤液 ERA] 45 | 观察 (aFt)| GE) | ° 结 OD. 糖 酵 解 中 间 产 物 的 鉴定 一 、 目 的 了 解 精 酵 解 过 程 的 某 一 中 间 步 骤 及 利用 抑制 剂 来 研究 中 间 代 谢 的 方法 。 二 、 原 理 利用 碘 乙 酸 对 糖 酵 解 过 程 中 3- 磷 酸 甘 油 醛 脱氧 酶 的 抑 制作 用 ， 使 3- 磷 酸 甘油 醛 不 再 向 前 变化 而 积累 。 硫 酸 肝 作 为 = 稳定 剂 , 用 来 保护 3- 磷 酸 甘油 醛 使 不 自发 分 解 。 然 后 用 2, 4- 二 硝 基 葵 肝 与 3- 磷 酸 甘 油 醛 在 碱 性 条 件 下 形成 2 4- 二 硝 基 葵 肝 - 丙 糖 的 标 色 复合 物 ， 其 标 色 程 度 与 3- BRP ECIMRE ey Ht bas =. RRM, 仪器 和 试剂 1. 实验 材料 新 鲜 酵 母 。 发 酵 管 (x 3); 烧杯 50 毫升 (x 3); 试管 1.5x-15 厘米 (X 3); 吸管 1 毫升 (x5)，2 毫升 (x1)，10 毫升 \x1); 小 漏斗 5 厘米 (x 1); RE, 恒温 箱 。 3. 试剂 5 %o Fail 4 Ba YA MK; ln SEER: 0 —-0.002M Bt Z RAK. 0.56M iiRmBYAm. PH 7.28 Se HIB 50 毫升 水 中 , 这 时 不 易 全 部 溶解 , 当 加 入 氧 氧 化 钠 使 PH A 7.4 Se 全 溶解 。 此 液 也 可 用 水 合 肝 溶 液 配制 ， 可 按 其 克 分 子 浓度 称 释 至 0.5642, 此 时 溶液 呈 碱 性 , 可 用 浓 硫 酸 调 DH 达 7.4 即 可 。 2,4- TAFE BAM. 0.1 克 2,4-— MAHA 100 毫升 2 盐酸 溶液 中 , 贮 于 棕色 瓶 备 用 。 四 、 操 作 步 又 1， 取 小 烧杯 3 只 ,分 别 加 入 新 鲜 酵 母 0.3 克 ， HER | 分 别 加 入 各 试剂 , 混合 均匀 。 2. 将 各 杯 混合 物 分 别 倒 入 编号 相同 的 发 酵 管 内 ， 放 入 37C 保 温 1.5 小 时 , 观察 发 酵 管 产生 气泡 的 量 有 何不 同 。 3. 把 发 酵 管 中 发 酵 液 便 倒 入 同 号 小 烧杯 中 , 并 在 2 和 3 — 208 —- 一 Lepr Seah UAL, 播 与 放 10 分 钟 后 和 第 一 只 烧杯 中 内 容 物 一 起 分 别 过 滤 , 取 滤液 进行 测定 。 4. 取 三 个 试管 ,分 别 加 入 上 述 滤 液 0.5 SH, HIKER 加 入 试剂 和 处 理 。 0.75N a nap 0.75N ge | IR | NaOH | = | 24- 二 硝 基 葵 肝 | 38 | NaOH | 观察 结果 和 置 洽 1 0.5 0.5 ~ 0.5 = 3.5 2 0.5 0.5 钟 0.5 10 3.5 73 3 0.5 0.5 Bh 3.5 五 、 结 果 记 录 和 解释 那 一 管 发 酵 生 成 的 气泡 最 多 ? 那 一 管 最 后 生成 的 颜色 反 应 最 深 ? 为 什么 ? = 20> ‘ b » c ‘~~ 名 en eS ee Te, eo ee ~ Soe aw =- /' > ia, 56， Fi a ie HE MM 5 一 、 目 的 aA Mis ee es 种 研究 代谢 作用 的 方法 。 二 、 原 理 在 生物 体 的 物质 代谢 中 , 有 各 种 脱氧 酶 参加 , 它 的 作用 机 制 在 于 促使 底 物 分 子 上 脱 去 两 个 氢 原 子 , 而 使 底 物 氧化 , 脱 下 的 氢 原 子 又 通过 细胞 内 一 系列 的 氧化 还 原 酶 系 ， 逐 渐 传 递 至 氧 形成 水 。 如 果 我 们 要 测定 脱氧 酶 活性 ， 就 必须 避免 由 于 这 一 连 串 酶 系 所 引起 的 复杂 反应 ， 设 法 使 脱 下 的 氢 能 被 人 工 受 体 接受 ， 从 而 直接 测定 脱 氢 酶 活性 。 本 实验 采用 染料 甲 烯 蓝 (MB) 作 为 人 工 受 体 , 由 酶 催化 底 物 脱 下 的 氢 ， 直 接 为 染料 搂 受 , 使 染料 本 身 被 还 原 成 无 色 (MB.2H)。 根据 甲 烯 蓝 褪色 的 程度 , 可 以 检测 脱 氢 酶 的 活性 。 如 果 要 作 定 量 测定 , 可 以 用 不 同 浓度 甲 烯 蓝 溶液 作为 比较 的 标准 。 焉 珀 酸 脱 氢 酶 广泛 存在 于 动物 植物 和 微生物 中 , EA te 化 琥珀 酸 脱 氢 生 成 延 胡 索 酸 。 此 反应 能 被 丙 二 酸 抑制 。 CH,COOH & CHCOOH | eee +2H CH,COOH CHCOOH 琥珀 酸 WAR 2H 二 MB ca MB-2H 蓝 色 无 色 CFA is i) - GER PRE) BEA SM LT, LH BEE A LR 原 有 底 物 清洗 干净 。 此 外 由 于 还 原状 的 甲 烯 蓝 在 空气 中 会 被 氧化 , 重 现 蓝 色 , 因此 这 个 实验 要 在 隔绝 空气 的 容器 中 进行 。 BR RPS DETAR MBN, 在 ” 便 抽 去 其 中 的 空气 ( 见 图 38)。 这 种 特殊 式 “ 桑 氏 管 便 是 用 来 研究 脱 氢 酶 的 特殊 仪器 ， ” 它 是 一 个 具有 可 盛 液体 的 空心 玻璃 塞 的 斌 试管 口上 有 一 支管 ,可 连接 在 抽 气 条 上 , 以 样 的 试管 有 三 个 特点 ， 一 是 酶 和 底 物 可 以 分 别 盛 在 空心 塞 和 试管 内 ， 在 抽 气 前 可 以 “ 互 不 作用 , 二 是 有 支管 可 以 抽 气 , 使 实验 在 氧气 浓度 较 低 的 情况 下 进行 ， 退 色 的 甲 燃 蓝 在 短 时 间 内 可 避免 重新 氧化 。 < ”三 、 实 验 材料 , 仪器 和 试剂 图 38 RS 1. 实验 材料 大 白鼠 肌肉 。 2. 仪器 桑 氏 管 (x4); MH 1 I(x 3), 10 毫升 (x 1); 油泵 或 KE; 剪刀 。 3. 试剂 1/15M 磷酸 缓冲 液 ，pPH7.0:， 11.86 克 磷 酸 氨 二 钠 (Na,HPO,-2H,0) 溶解 在 1 升水 中 即 为 /15 人 溶液 ,9.078 克 磷 酸 三 氨 钾 (HPO,) 深 解 在 1 升水 中 为 1/152M7 深 液 。 取 1/15 MNa,HPO, 溶液 60 % Ft hn 1/15M KH,PO, 深 液 40 EFL, BR, 3 0.02M 5TH YAK; 0.02M 丙 二 酸 钠 溶液 ;0.019 甲 烯 KAR, 四 、 操 作 步 又 1. 取 肌 肉 3 克 在 冰 浴 中 前 碎 ， 并 用 冰 水 洗涤 三 次 ,每 次 420 毫升 ， 用 吸水 纸 吸 干 后 称 量 。 称 取 0 5 克 肌 肉 4 份 , 其 — Pon a Ph — Gt IM 5 EFL BER UE MR AR UE 0 2. RFRA HMA, HM Bm, ie 酸 溶液 放 在 桑 氏 管 中 , KWRARBERKRE SDE 3. 在 空心 塞 小 孔 两 侧 ;小 心 涂 上 垂直 的 两 条 凡士林 , 把 瓶 塞 的 小 孔 对 准 管 上 的 抽 气 支管 , 然后 将 瓶 塞 压 入 稍 转动 , 使 凡士林 均匀 布 满 磨 口 塞 的 表面 , 不 使 漏 气 。 4. 将 支管 连接 在 水 泵 中 进行 抽 气 ， 并 轻 轻 融 击 试管 , 使 “ 气泡 容易 逸 出 , 待 气泡 全 部 消除 即 可 将 空心 塞 旋转 180"。 5. 待 四 只 管 全 部 抽 毕 后 , 同时 放 入 37"C 水 浴 内 ,10 分钟 后 将 空 放 于 中 底 物 合 入 管内 并 混和 ， 再 将 骤 氏 管 放 回 水 浴 保 温 , 静 置 不 要 振动 , 观察 各 管 褪 色 时 间 和 程度 。 2、 OT. 脂肪 酸 8- 氧 化 =. 目的 ees a 了 解 脂肪 酸 B- 氧化 作用 机 制 及 学 习 一 种 研究 代谢 作 用 的 方法 。 二 、 原 理 re 脂肪 酸 的 分 解 代谢 主要 是 通过 一 种 PAIL 5 — 262 — B- 氧 化 过 程 在 肝脏 中 进行 ， 它 包括 一 系列 酶 反应 。 首 先 在 长 链 脂肪 酸 的 品位 碳 原子 上 氧化 , 然后 从 羧基 端 断 下 二 碳 物 , 故 称 为 B- 氧 化 作用 。 断 下 的 二 碳 物 以 乙酰 辅酶 A 的 形式 存在 ， 它 可 以 进一步 参加 三 羧 酸 循环 彻底 氧化 为 二 氧化 碳 和 水 ， 也 可 在 肝脏 内 又 缩合 形成 乙酰 乙酸 。 而 乙酰 乙酸 可 经 脱羧 作用 形成 丙酮 ， 本 实验 以 丁 酸 为 底 物 和 小 白鼠 肝脏 中 脂肪 酸 氧 化 酶 系 一 起 培养 , 通过 丙酮 的 形成 ,来 了 解 6- 氧 化 作用 机 制 。 脂肪 酸 的 B- 氧 化 反应 ; re 和 =O ~ COOH CH; 乙酰 乙酸 Fal HOH CH3;:COOH (以 乙酰 辅酶 A 形 式 存在 ) 三 羧 酸 循环 CO2.+H20 s~ 260 生成 的 丙酮 , 可 经 与 碘 反应 后 , 滴定 剩余 的 碘 来 测定 : CH; CH; | | C 一 O 十 3I? 十 3NaOH 一 > 2 =0+3NaI+3H,0 CH; CI; In + 2Na2S203—>Na2S10, + 2Nal =, RAMA, 仪器 和 试剂 1. 实验 材 料 小 白鼠 肝脏 ; 滤纸 。 2， 仪 器 三 角 瓶 50 毫升 (x5); MBS BHCX 8), 2 BHCX1); A BB AE OD EFL CX 1); 漏斗 4 厘米 (x2)。 剪刀 ; 小 台秤 ; 电热 恒温 水 浴 箱 。 3. 试剂 0.5V TRAM: 45 毫升 正 丁 酸 用 0.1N AA HE 调 pH B 7.6, 并 稀释 至 1 升 。 Locke 溶液 : NaCl0.9 3, KCl 0.042 克 ， CaCh 0. 024 克 , NaHCO; 0.015 克 和 葡萄糖 0.1 克 深 于 水 中 后 定 容 至 100 毫升 。 1/15 改 磷酸 盐 缓冲 液 PH7.6. 1/15M Na,HPO, 86.8 % Ft Al 1/15M NaH,PO, 13.2 毫升 混合 即 可 。 O.1N Ys. 12.7 克 碘 和 25 克 碘 化 钾 ， 用 水 溶解 后 ， ERS 1 FH; 10% 盐 酸 : 按 38% RERMUT HE. O.1N 硫 代 硫酸 钠 溶 液 : 结晶 硫 代 硫酸 钠 (NasS0。， - 5H2O) 25 克 溶解 在 煮沸 并 冷却 的 蒸馏 水 中 , 加 入 3.8 EO 溶解 后 定 容 至 1 升 。 — 264 — 2. M50 毫升 三 角 瓶 二 只 , 按 下 表 配 制 。 了 多 三 氧 乙酸 溶液 ;10 多 所 氧化 钠 溶液; 0.1% BEB HEME, 四 、 操 作 步 又 1 到 刚 杀 死 的 小 白鼠 肝脏 在 冰 浴 上 剪 碎 , 称 取 0.5 克 二 磷酸 缓冲 液 | 0.5N sek | 肝 麻 pH7.6 | TR | Ae Ge) | Ger | EP | OY SEN 一 | 一 一 . HEAR 37'"C 水 浴 中 保温 3 小 时 ， 然 后 加 三 氯 醋酸 停止 酶 反应 。 静 止 15 分 钟 后 , 分 别 过 滤 。 3. 另 取 三 个 三 角 瓶 ,分 别 取 上 述 滤液 5 毫升 加 入 3 与 4 号 瓶 ,5 号 瓶 加 水 ,并 在 各 瓶 中 加 入 0.1N 碘 溶液 .10 匈 氧 氧化 ， 钠 溶液 各 5 毫升 ， 摇 匀 后 静止 10 分 钟 使 碘 仿 反应 完全 ， 再 加 10% 且 C15 毫升 ,用 0.1N Na,.S,.0; 滴定 。 10% — 0.1N NagS2O03 NaOH 蒸馏 水 H = > i = 0.1M RAR | 0.1 Ma-Mik [0.01M pH7. 45%] HLA | eS (毫升 ) REF) RRR EH) Gt) 1 1 1 ror : 9 an 1 1 1 后 煮沸 1 一 1 1 ee ee ee EAB ; 1 1 1 ein 糊 状 备用 。 : 2. 按 表 次 序 分 别 在 四 支 试管 中 加 入 上 述 试剂 ， 其 让 管 4 为 对 照 , 在 37"C 保 温 前 先 将 肌肉 在 水 浴 中 煮沸 10 分钟， 其 余 1、.2、3 管 加 入 肌肉 后 于 37°C 保温 0.5~ 工 小 时 ， 沸 水 浴 加 热 10 分 钟 终止 酶 反应 。 冷 却 后 , 简易 过 滤 到 4 支 清净 试管 内 以 作 层 析 用 。 3. 取 15 厘米 直径 的 圆 形 层 析 滤 纸 一 张 ， 在 圆心 处 用 加 规划 一 3 厘米 直径 的 同心 圆 ， 通 过 中 心 将 滤纸 划 成 六 等 分 记 形 ， 用 0.1 厘米 粗 的 毛细 管 分 别 吸取 上 述 滤液 和 标准 的 谷 氮 酸 和 丙 氨 酸 溶液 分 别 点 在 扇形 小 圆周 上 ， 点 样 直径 约 0.3 厘 “ 米 , 待 点 样 斑点 干燥 后 再 重复 点 样 二 次 。 4. 在 滤纸 的 圆心 上 剪 一 小 孔 直 径 约 1 一 2 训 米 , 另 取 一 滤 纸 小 条 将 其 下 端 剪 成 刷 状 , 卷 成 “灯芯 ?插入 中 心 小 孔 , 但 不 使 “灯芯 ?突出 纸 面 。 然 后 将 圆 形 滤纸 平 放 在 盛 有 层 析 溶剂 的 培 养 四 中 , 使 “灯芯 ?向 下 接触 溶剂 , 另 一 大 小 相同 的 培养 严 盖 在 滤纸 上 (图 39)。 此 时 溶剂 经 过 灯芯 上 升 到 纸 上 向 四 周 扩散 ， 直到 溶液 移动 到 距 纸 边 1 厘米 处 ， 打 开 上 盖 培 养 亚 ， 取 出 滤 纸 , 拔 去 灯芯 , 在 烘箱 中 使 干燥 , 然后 喷 上 节 三 酮 溶液 , 在 60C 烘 LO~15 分 钟 , 滤纸 上 即 可 看 到 紫红 色 的 氨基 酸 斑点 。 — 268 — 图 39 圆 形 层 析 示 意图 五 、 实 验 结果 本 实验 预期 的 结果 应 该 是 ,2 号 管 中 因 未 加 丙 氨 酸 , 滤纸 上 不 呈现 任何 斑点 。3 号 管 中 加 入 丙 氨 酸 但 未 加 入 oR 酸 ， 转 氨基 作用 也 不 进行 ,滤纸 上 仅 出 现 加 入 的 丙 氨 酸 斑点 。 但 因 组 织 里 可 能 含有 少量 游离 氨基 酸 和 o- 酮 戊 二 酸 , 在 2 号 A 3 号 瓶 的 滤纸 上 出 现 很 淡 的 谷 氨 酸 斑点 。 4 号 瓶 中 虽 含 有 两 氨 酸 和 a- MRM, 但 在 保温 前 曾 煮沸 使 酶 破坏 ， 因 此 滤纸 上 只 呈现 丙 氨 酸 斑点 。 1 号 瓶 中 含有 两 氨 酸 、a- 酮 戊 二 MAM, 并 有 适合 的 反应 条 件 , 因此 滤纸 上 可 清楚 地 看 到 谷 氨 酸 和 丙 氨 酸 斑点 。 一 009 一 STERNER AS, FSR a = See me <4 oo = ss na ia ; 二 ee: a. 八 、 附 Og 1. 市 售 浓 酸 和 和 氨水 的 比重 和 浓度 名 称 tt 百 分 浓度 克 分 子 浓 度 th & 1.19 37.2 3 zk ons |. Hee 35.2 11.3 | mM 1.425 71.0 16.0 = 硝酸 1.4 65.6 14.5 硫 “ 酸 1.84 95.3 18.0 高 氧 酸 1.15 70 ae BOR 1.69 85 14.7 _ 醋酸 1.05 99.5 > 17.4 fe mR 1.075 80 CE Woo Ok 0.904 27 Aes 14.3 Ree, Ge 0.91 25 13.4 ae. eae 0.957 10 5.4 2. 标准 溶液 的 制备 和 标定 一 、 标 准 氢 氧化 钠 溶液 的 配制 和 标定 Bee a F-AAUCANAAR A ORI, 7K AE EL RE CE BEG, — 270 — = Es 和 Ps erm, mitt 48 _ 基 二 中 酸 秘 钙 盐 和 草酸 等) 来 标 定 。 如 要 配制 0.1V 氢 RS 和 1 克 ， 用 水 溶解 后 转移 38 BL ELH, PRU AB REE RUD, PICOR AP CAR AE 3A LH ne, ”中 ， 待 标定 。 若 用 酸性 邻 - 葵 二 甲酸 氢 钾 (KHCgH,0,, 分 子 量 204.22) 作 为 基准 物质 时 , 可 先 准确 地 (准确 到 0.1 毫克 ) 称 取 分 析 纯 的 邻 苯 二 甲酸 氢 钾 0.41~0.48 克 三 份 , 分 别 宣 于 150 毫升 三 角 瓶 中 ， 各 加 入 20 SET ARI Tk, 使 全 部 溶解, 加 酚 栈 指示 剂 3 滴 ， 用 待 测 的 氧 氧化 钠 溶 液 滴定 至 淡 红 色 出 现 为 止 , 记 下 氢 氧 化 钠 的 滴定 体积 ， 通 过 计算 即 可 知道 氢 氧 化 钠 的 准确 浓度 : | . Nwwoa= W a 0 W W KHC3H,O, 的 称 量 ( 克 ); MA KHC,H,O, 分 子 量 ; V 为 NaOH 滴定 体积 。 二 、 标 准 盐酸 溶液 的 配制 和 标定 | 标定 盐酸 通常 采用 硼砂 (Na?B4O7.10HzO, 分 子 量 381.43) 为 基准 i, AWD AR AUK, MRK, 标定 时 准确 度 高 。 硼砂 提纯 : 称 取 约 80 Fear PTAA, YARAZE 100 毫升 热 水 中 ， 这 时 溶液 温度 为 55"C 以 上 , 待 溶液 冷却 后 就 析出 硼砂 结晶 经 烧结 玻璃 漏 斗 将 结晶 吸 渡 出 ， 再 用 少量 水 、95 移 区 醒 、. 无 水 乙醇 和 无 水 乙醚 分 别 依 次 洗涤 ， 所 用 乙醇 和 乙醚 的 量 大 约 是 每 10 克 结晶 用 5 毫升 溶剂 。 然 后 结晶 平 铺 成 薄 层 , 放 室温 使 乙醚 挥发 。 把 纯化 的 硼砂 放 在 密闭 的 玻璃 瓶 FR, 再 贮 放 在 盛 有 饱和 蘑 糖 和 氧化 钠 溶液 的 于 燥 器 内 ， 硼 砂 中 的 结晶 水 — 可 保持 不 变 。 如 要 配制 O.1N 盐酸 标准 液 ， 可 吸取 分 析 纯 盐酸 〈 比 重 1.19, 4 12N)8.5 毫升 ,用 蒸馏 水 稀释 至 1 升 , 贮 于 清洁 的 试剂 瓶 中 待 标定 。 稚 确 称 取 三 份 干燥 的 提纯 的 硼砂 0.381~0.383 克 ， 分 别 放 在 150 ”毫升 三 角 瓶 中 ,加 入 20 descent 使 溶解 ， 加 入 三 滴 甲 基 红 指示 剂 ， FA 35 WU AY) Eb iE BST BIE, ie FIER 通过 计算 可 Sar a Se ee . Wx 10 Nuci= al “M/2xV_ W AMR RB (SE); V 4H HC1 WEAR; M On SE: 三 、 标 准 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 的 配制 和 标定 由 于 硫 代 Pie AA RES AK, 其 溶液 易 被 硫化 菌 分 解 ， 故 对 标准 : 溶液 要 进行 标定 。 硫 代 硫 酸 钠 (NazSz03s.5HzO, 分 子 量 248. 切 ) 标 准 溶 液 可 用 重 铬 酸 钾 、 溴 酸 钊 、 碘 酸 钾 等 氧化 剂 来 标定 。 其 中 常用 碘 酸 钾 ( 必 IOas, 分 子 量 214.01)， 因 它 不 吸水 , 较 稳 定 ， 全 的 氧化 能 力 。 | 如 要 配制 O.1N 硫 代 硫酸 钠 标 准 液 , 可 称 取 25 eee 酸 钠 ， BREAK, HRRPBZIF, 贮存 在 橡皮 塞 的 试剂 HL, 待 标定 。 其 准确 浓度 采用 KIO3 Kinz, “EHR 0. 1420~0. 1500 克 纯 的 碘 酸 钾 三 份 ， 分 别 放 在 150 毫升 三 角 瓶 中 ， 加 入 . 20 SARK, 解 , 再 各 加 入 10% 碘化钾 溶液 10 毫升 和 LN 硫酸 溶液 20 毫升 , 混合 后 用 待 标定 的 硫 代 硫 酸 钠 溶液 滴定 ， 当 溶液 由 棕 红 色 变 为 黄色 时 ,加 入 3 滴 1 多 淀粉 指示 剂 ,继续 滴定 至 蓝 色 消失 为 止 。 记 下 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 的 滴定 体积 ,并 按 下 式 计算 其 准确 浓度 。 5KI+KI03+3H,SO,—>3K;SO,+3H,0+3I2 _ 2NazS,03+1,—>NazS,0,+ 2Nal 从 反应 式 中 可 知 碘 酸 钾 中 的 碘 从 正 5 价 降 到 负 工 价 ， 其 价 的 变动 hy 为 6, 所 以 碘 酸 钾 的 区 当量 为 6。 NasSsOs 溶液 浓度 二 ER NaS,03 WE HR -2 全 呈 — 272 — eo 3. aE A ARI HA A ae Saas: ED) GE) (@) | ft sia 15 90 0.17 woe 快速 , WK ee 90 0.16 | 0.08 中 速 , 薄 纸 HERS 90 0.15 | 0.08 慢 速 , WEA 新 华 滤纸 4 号 180 0.34 0.08 | 快速 , 厚 纸 新 华 滤纸 5 号 Ri 180 0,32 0.08 中 速 , 厚 纸 新 华 滤纸 6 号 180 0.30 0.08 慢 速 , 厚 纸 SS598G (48) 140~145 0.25~0.28 rs! 快速 , 厚 纸 | Whatman 1 号 85~95 0.16 0.027 | rhs, 薄 纸 Whatman 2 号 95~100 0.18 一 中 速 , 薄 纸 Whatman 3 号 185 0.36 0.075 中 速 , 厚 纸 Whatman 4 号 90~95 0.91 0.15 快速 , 厚 纸 = 273 CE) 1. 国产 树脂 编号 : 1~100 为 强酸 型 树脂 ， a ™ “ss eh xf rot the . Ps ty < % } oth 4, 各 种 离子 交换 树脂 相 * 应 国 外 国内 产品 型 号 英 华东 强酸 阳刚 2 Zerolit 215 了 yar OP 华东 弱酸 阳 所 22 Zerolit 216 Zeo Karb 216 35101 x 1~ 20% - 724(101 x4) Zerolit 226 Zeo Karb 226 ~ 2B x 1~24zh : Amberlite - 732(1X7) Zerolit 225 Zeo Karb 225. IR-120 弱 碱 320 Zerolit E De Acidite E aT 强 碱 201 或 717 ae Amberlite . (2017) De Acidite FF IR-400 Zerolit FF : Amberlite 52 Hl 202 x 1~24 IR-410 55931154704 R Aciai Amberlite (311 x2) | Zerolit G stig cidite G ‘IR-45 弱 碱 301 Zerolit H De Acidite H 701 (339330) pe hi 1 号 或 Decolorite 通用 工 号 脱色 树脂 2 号 101~200 为 弱酸 型 树脂 ; 2， 交 联 度 的 表示 :如 201x7, 201 为 强 碱 型 树脂 编号 ,7 为 交 联 度 ; SS 编号 , 工 到 20 为 交 联 度 。 — 274 — 4 类 似 商品 对 照 表 树 脂 型 号 树 脂 类 德 日 本 苏联 型 Duolite C3; | Dowex30 Ne cs gg Duolit Wofatit 水 杨 酸 CS-100 Cc 酚醛 型 Wofatit ,丙烯酸 _Duolite Wofatit | , re 磺 化 聚 C20 Dowex 50 KPS 神 胶 1 号 | KY-2 蕉 ie Eee As: WofatitN AH-21 | BRED Dowex 1 800 | AB-17 wex 神 胶 —- Prd 型 强 碱 Dowex 2 神 胶 801 | AB-18 Dowex 3 AH-22 nets AH-18 Wofatit 环 氧 型 多 筷 弱 碱 BFL 弱酸 201~300 为 强 碱 型 树脂 , 301~400 为 弱 碱 型 树脂 。 MAAXT 1 为 强酸 型 树脂 编号 ，7 为 交 联 度 ; 又 如 10LX1~20, 101 为 弱酸 型 树脂 人 HZ Ye SEE MIS 9 ~0 reach Ry BT (%) 0€-xomoqg (3f) 9T5 op]0107 (36)00T-y1 | Cite HOF O°'I~8"0) Sze ep [requry | Sil S43 OT~T (fen) 96 5 B~0' BIGE~62| I Who as S|" AY ay (日 ) & T ake (@)%-8M (3) 932 . 3ITorIe7Z| AM ‘xe f8 0 一 8 0 〈 美 )05T-XI HZ 人 ap [Iequry]| 44 2 x LIS |CI~9F/ SE MST eT UY [S9~ SF AAS REM He el ls (M/E pane | CHE | HIRE | ¢9,) 1 (%) | OKR) oat ETE yaa ali led] oe arenas NAY ae NAW eR BH Ge RSX oe SG noe Robt la H®OS—|3il | Hal Bale $Y ty Hfos—|al esl Hh) seL Zia wt fee eT 由 918 38079Z ‘a GH (26) -xomoqg (=) 0TIFT-VXI YY OPI] 10q uly |e Bs MLE (2€)3-xemoqg 0Tf-VXI WA 9} 1 [Joqury |e 2 Me (%)-GH (36932 31ToIeZ ( 美 )09-DXI opt roqury |fie FY Md AY Md SF Hy 3 MH a Hy ‘Ase “Al G YC Wek se (3%) ‘ss Ane Es CTE PT PT a J 4%065! ‘FH 09~9T Vk Be _{ |-190®(®H9) (FX 102 get [09~09 SSO M Mealy ay +N— AO Hale ES) TTL 0'I~s'0 Bi fy YE -ID8CSTITD) MS Fie Ad 1% OS~OR HAR BRIAN +N — [SY 5) TOS» eh At BS % 061 一 09T 7T1%08)) +eN ‘A 09 一 05 _( (8~T1 X TOT «Hi 62 | oS MED ESIMRT| HOOO— MSM SE) FL 0°I~$'0 时 时 章 Uf S- fe Hd 9 8 HBB AFH) HOOO—MSSTOTs HES Bill fxg 0'I~8'0 iia YR EA HO— ae 6 8 BY BMHLEYICH) OOO Es SE TE (2/57 ql a Me) BH fy MER SL Sa Ad 1 age t~E loo~os aye in TA ea — Bit (#1 )09T-T CET) _1o%(®H9) : +N Ree Bo) LIL HN 一 (ore ZEIN—MORE) &E) TOL (xs 再 qT a Die) ja Tosa fy ZTN 一 YE ze SE he Hf HIN= |i 88) Aa 86 SF ty Bah Ue Sha Hd -1o®(®H9) 10% (LX 102 19eJoAA () WE | _ [JOT-ETE| 8724 , VA GSS 78°0~2 0} (H)aqos-y EY 2a] 92°0 Ds TRAE MiG | enlong| 442 ¥| ~9°0 | I -HO} 6S [89~ aah a) Fea EH Re BT 4) 2g Bal hk 28H Se (ge) |2 2-24 Wx W 39eJo 人 AI 二 * [el L~0 09 9~F OF~L8) RM) ts TA) at axel WO | o-t~e-olg ae MERE Me 0 8 一 395 KAD El | et ad (@)L1-dV a CH 008 2 ht (36) TT 3TToIez 1% 96 (3) ct cage 00f-VXI MD! 90 OT “YS et sjTIIIeqUIV HEI 一 99 0 EX 09~OF MSSM HUA ART Ce} aE CBE/ Pe sf BG Soe = Bean RC’ ' Harsha RIO) HE beet aH Allis HR) |e el Pragya ieee] Fade | EE | caves Awe dea < | BS sah! 5) H]0197 ( 美 )9f wT HD OF! [Joqury |e 38 MAE ee | I ne f seen 0 8 9 忆 | ss 一 sj 淮 润 号 站 泥 轨 聊 孙 于 0.T~e:0 Su dite RFE EA Te EH Ae (8p) N— [OSS |EE LEE) TOS xpeatleruel TNThwelemnoe 0-1~"0 | pad YD WH Atl opr) — fh ENO TOS 78°0~8'0} =f ZHN 一 HN (2X IIe ase 5) OL “2 一 ET Oe ee 6. HRRRR & BAN 持 水 量 柱 床 体积 | eee | (微米 ) | 水 ( 克 )/ 干 胶 ( 克 ) | 毫升 / 干 胶 ( 克 ) | E/E G-10 40~120| “1.0 士 0.1 2~3 一 G-15 40~120) 1.50.2 ~ 2.5~8.5 a , G28 : 1.13 粗 粒 |100~300| 2.50.2 4~6 中 粒 | 60~150| 2.5 士 0.2 4~6 细 粒 | 20~80| 2:5+0.2 | 406 微粒 | 10~40| 2.50.2 4~6 7 G-50 . 1.07 : 粗 粒 [100~300| 5.00.3 9~11 中 粒 | so~160| 6.00.3 9~11 细 粒 | 20~80| .5.0 士 0.3 9~11 : 微粒 | 10~40 5.0+0.3 9~1l G-75 | 40~120| —-7.5-£0.8 12~15 | 1.05 微粒 |10~40| 7.5 士 0.5 13 必 15= 这 G-100 40~120| 10.0+1.0 15~20 1.04 微粒 | 10~40| 10.0+1.0 15~20 : G-150 40~120) 15.0+1.5 20~30 -一 微粒 | 10~40 | 15.0 士 1.5 20~30 | G-200 40~120| 20.0+2.0 so~40 «|i. 小 微粒 | 10~40 | 20.0 土 2.0 30~40 } * 在 100°C 水 洽 中 。 nig. - i 和 全 ~ " , a , CORREIA oy ae OND 3 一 1500 100~5 000 a> 500~10, 000 1, 000~60, 000 1, 000~100, 000 1, 000~150, 000 - 1,000~200, 000 UREA | BESTE 副 肌 球 蛋白 PARRICES Q 血清 白 蛋白 工 -氨基 酸 氧化 本 过 氧化 氢 酶 丙酮 酸 激活 酶 谷 氨 酸 脱氧 酶 FUE > REA, He 3 HR 孵 白 蛋白 乙醇 脱氧 梅 ( 肝 ) 烯 醇化 本 HERS 肌 酸 激酶 D- 氨 基 酸 氧化 酶 ZBL BEE) HE YRS BEAL a 站 Myosin B-galactosidase Paramyosin Phosphorylase QO Serum albumin L-amino acid oxidase Catalase Pyruvate kinase Glutamate dehydrogenase Leucine aminopeptidase y-Globulin,H chain Fumarase Ovalbumin Alcohol dehydrogenase Enolase Aldolase Creatine kinase D-amino acid oxidase Alcohol dehydrogenase( yeast) Glyceraldehyde phosphate deh- ydrogenase 220, 000 130, 000 100, 000 94, 000 68; 000 63, 000 60; 000 57,000 53, 000 53, 000 50, 000 49, 000 43, 000 ~ 41,000 41,000 40, 000 40, 000 87,000 37,000 36, 000 Tropomyosin BUR 36; 000 乳酸 脱 所 本 ‘Lactate dehydrogenase 36,000 eae Pepsin = 35, 000 is Ke I HE Aspartate transcarbamylase 345 000 «BBS C HE C chain 羧 肽 酶 A Carboxypeptidase A 34, 600 网 BRAT ES Carbonic anhydrase 29, 000 枯草 杆菌 蛋白 酶 Sustilisin 27,600 7-H, LH y-globulin, L chain 23,500 胰 凝 乳 蛋 白 酶 原 Chymotrypsinogen 25, 700 REA Trypsin 23,300 ~ FRB CR FRE) Papain(Carboxymethy]) 23, 000 B- 乳 球 蛋白 B-Lactoglobulin 18, 400 肌 红 蛋白 Myoglobin 17; 200 天 冬 氨 酸 氨 甲 酰 转 Aspartate transcarbamylase 17,000 ee 移 酶 及 链 R chain = 血红 蛋白 Hemoglobin 15) 500 只 外壳 蛋白 Q, Coat protein 15, 000-- YA GA BS Lysozyme 14, 300 Ri 外壳 蛋白 Riy Coat protein 13,760 核糖 核酸 酶 Ribonuclease 13,700 | 细胞 色素 c Cytochrome c 11,700 eee SLE As, Qt Chymotrypsin, 2 chains 11, 0004113, 000 ~~ Die > » « t) oa PAE hi ae Ul CON TEL had $4 Ol waa YC MS SS ia BEY? Pe UH2ON HY Lah — 980 0 | 928 0 94°0 | O°ST| 99'5 | 655| 9T 8T| 9 595| S~T/*O.9s ‘th YC} O98) T98T 909:0 | ¥e°L | .g08'0 | 8 | 91's | OFe| 66 | FE 二 $82°0 | TSTTIT | 986 0 | %°9 | 20°9 | G9} 0 "8 19 825 IT 9 0 70 °T CPT | &°L | 80°L | G98) ST°8 | S° 925 L 2A FIT] 9 8 有 BAERS ci “Sa 2 Loy imal 6F°0 78 °0 LE°L | O°8 | ST°2 | 29] SG°2 | 99.45| SHTML «6ogsl TTS] & | ie cae : : P ; ; : HOeN|E * gZ0°0 09°0 /9'0 | SPOT] S8°S | LEZl 8 5T 698) T10"ON “YD EU Ke Mal RA G00°0 | &zr"o 9L°0 | 8'8T| 49° | 92z] 98 8T| S°09Z| B~9 QZ a “),001‘60°0' ial 4 一 | 一 | 一 一 | 一 | 一 | 一 | 一 | -一 095/065| 092/082 | 09¢/09% |*o7,|Paug (™™X|"sug | | Hd | BM | eh Vere) we SRSRWUHaEBAY SR “8 — 284 一 100%" 6T°0 || @0L°0 | SIT] 3° | ez . 000°0 | 00| ST) 96°2] 2° | 912 SIL GB ) 2a He ‘hi 1 i] 2000 | 5gT0 | ¥8°0| g6-oT| 2's | sez wa Ty HORN NOT | | 和 % Fosty NIH} 010°0 | 5g60'0| 5g8T | 672 | 99°S | Tes oet] t-9et] ¥ \ EE Se ER ee) 2 Es es se Sd ERE ee) Sa ee Be So ME 2 Ee 和 s0:0| 08:0| 962°0| 08-2 | gf|6gz 0 24 iy : To°0 | gzt'0| 380] z8| 8'r | 222 age] T°stI| 34 了 wt] tet} s90| se! zz] a E 34 fl | 一 8T8 T°92T) fff | 一 | 一 一 | 一 一 | -一 | 一 -一 80| est} 870| 0'9 885 zs 一 于 9。se tO ~068| TTT ct — 285 — e¢°3| oo's| To 5g aga | 68g| 于 €L°T SLT); 62°0 | 96° | HE | SHB 86 9 985|8T~5T g9°2 | 9°822| get | TT | sso] 97% 9°11] L0%/6"L~ ; , 2a | 085 | og 8T 0 最 16'S | 68'S | TIT1908| 9° | 292] F6| 385HOSN ii Nt g 9q8:9 | 9082 900'0 | ato] 992°0| at°6 | 2:9 | ste at'6 | 092 iy IME Bf 6°8 | 8'0FZ Uy AOL SOTLE GGA xt | TANG MLR mH SEV Me T Ht} 5560 TL'T 62°T | 3°29] O'S | 29%] S'6 | 9° 222 OT z°0 oA TY HOeN NOT 1 4D。00T590'0 Pa ostH NTH} 20°0| 19°0] 999'0 |98"8 | 大 8g | OFZ] 95'0I| 29%] 9~ go05 ‘th ¥ rest] 装 % OT X|¢_0T X layun,,| ¢-OT X (Do) | 芹 科 性 一 “|09g/06g |09g/08g | 09%/09z 929 ag | NX} xemg | “"X | Hd Fl YA wey PEM) Ae 3 | (ET 4%) AP 800 0 8TL 0 有 二 8935| 5 IT Cn BON weq-a| 0000| 110] ET| 06 19% et “2 £4 ; C1 Sat an BEE AE He YC 县 BGhmi¢e wy 90:0] 9g'0|1 sot] TL] Fe Q°8hZ| 9 一 8|5D。05 rh 81z| 2°892) lH 50'0| 65'0| 88'0 | ae'2] 9 595|5T~TI XH Pe | ai 2+} 991~ 县 ZONHH{ HBS §=©80°0 98'0 0 | 96°6 | 05 5935| L~ THAME SNC-LRI 9 89T| °F] 3 . *8°0 | 6°0| 98'0 | Sa°Z TL3| ZI~L ar a2 9T5 A} ; 82° | O12 9p°0 | ¥'9 083) G~TIRAM OLR) 一 5T8| 5 Ss) = BH | 县 B 4 Es 4.5 OE ONE HD i ZONH EH “K26 99% ZEmr GW YMA SC3e) 8T0 19°0 68°0 | SIT] IF 一 895 TT) EMU ee SY Si MEN DANG 1A 26 HM | Teds “A-]| 95'0|1 29'01 ST | «LTT 68°2 Q° Zaz y} o's Ta Baer 29 AC ‘9,001 '80°0 ib Ghai ws} o09'0| 969.0] 6:0 | S2'IT| He 9 "998 T}‘0.8T ‘th ¥4 075| 5 885| 每 EMRE SON BR “a -d Sv wy yon | rome ite 500'0 | 和 LI0 | 82L°0| 6°FT| 92's 9°693| ZI~2 | : ie ATs a | | 村 ; W2LM) 985 县 his? th genes cakes €0°0 | 912°0| 38'0| s'FT] g's ‘19% o~ TN ER ~ VEG! 5 192 wt N - 县 xe T9°0.| 66°0 19 六 TIT gg5 | 082 L fT | | 车 YOM AE WY | 02°0 COL |= SIT . 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Rm wm 18 fq om 剂 名 称 中 文 英 x Bs BBEBHK | Thymol blue 红 甲 基 黄 Methyl yellow ral , 间 甲 酚 紫 | m-cresol purple 红 2~2.8 水 ， 含 3.62 毫 升 〈 酸 范围 ) 0.1N NaOH - ABE Bromophenol blue =. : .6 | 水 ， at. sg * fr OE 0.1N NaO 甲 基 橙 Methyl orange 红 13. . 1K 全 3 剖 #o.1 1 iA ER Bromocresol green 黄 : : 3 ake 1. sit .IN NaOH - 刚果 红 Congo red 红 紫 | 红 橙 | 3. 水 或 80 移 Zt FASE ST Methyl red 红 -2~6.2 (60% CRIA 氧 酚 红 Chlorophenol red 黄 .8~6.4 | 水 ， 含 2. Beat Ft es 0.1N Seer ‘ var Litmus 红 ARB Bromocresol purple 黄 GHB] Bromothymol blue |# 酚 红 Phenol red 中 性 红 Neutral red | 黄 (8 ER) 指示 剂 名 称 颜色 pHi 配制 方法 0.152% F 250% es > 英 RE he tp 升 的 下 列 溶剂 和 Cresol red 红 | 7.2~8.8 | 水 ， 含 2.62 sit, ge ioe ae NIN NaOH a . -cresol e 1 7.4~9.0 452.62 Aee 3 m-cre purpte 黄 “| 紫 ma vert a-2MHR | a-naphtholphthalein [4S4Z0\K4R| 7.0~8.7 |50 多 乙醇 中 Sete Thymol blue te | 8.0~9.6 lk, 42.15% ‘eirtacieg y u 黄 | 蓝 he Peat BK Phenolphthalein 无 色 | 粉 红 | 8.3~10.070% AB RBM | Thymolphthalein 无 色 蓝 | 9.4~10.6190% 7B Be Alizarin yellow | 黄 | 红 |10.0~12.0 708% 10， 缓 冲 液 配制 方法 广 范围 的 缓冲 液 (PH2 .6 一 12.0) ; 0.2N NaOH pH 混合 液 | 0.2N NaOH (SBF) (18°C) | (2Fh) (毫升 ) 4,2 100 17.6 4.4 100 19.9 4.6 100 22.4 4.8 100 24.8 5.0 100 27.1 5.2 100 29.5 5 .4 100 31.8 5.6 100 34.2 — 293 — OO aa Cp. Ss pH | 混合 液 | 0.2N NaOH || pH Am | 0.2N Wate te . (18°C) GH) 《毫升 ) | 18°C) GoD . CED) | 5.8 100 36.5 9.0 100 72.7 6.0 100 38.9 9.2 100 | 74.0 oe 6.2 | 100 41.2 9.4 | 100 1. wate es 6.4 100 43.5 9.6 100 | 77.6 a 6.6 100 46.0 9.8 | 100 | | 79.3 me 6.8 100 48.3 10.0 106° | ages i, 7.0 100 50.6 10.2 100 yar 7.2 100 52.9 10.4 | 100 82.9 7.4 100 55.8 10.6 100°. Seen 7.6 100 58.6 10.8 100 RE 二 7.8 100 61.7 11.0 100 Pn RS eee 8.0 | 100 63.7 11.2 100 Be eae 8.2 100 | 65.6 11.4 100 we tee’ 8.4 100 67.5 11.6 100 92.0 yee 8.6 100 69.8 - || 11.8 | 100 “9305S 8.8 100 71.0 12.0 100 99.6 * 混合 液 配 制 : 6.008 RRM, 3.893 RRR AB, 1. ok 和 5.266 克 巴 比 妥 酸 混 和 于 1000 毫升 水 中 。 人 为 0.028577I 。) 4-H RANK PH 1~2.20) 百 | 0-2M@ KCl | 0.2MHCI | 水 || 5, /0.2M KCl] 0.2MHCI | 水 P (毫升 ) (毫升 ) ”| 毫升 外 三 “| GED (毫升 ) (EF) ee J ee Lf 一 | 一 | SS LS / 1.0 25 67.0 8.0/1.7) 25 13.0 62.0 1.1 25 52.8 22.2 |1.8| 25 10.2 64.8 1:2 25 42.5 32.5 || 1.9] 25 8.1 66.9 1.3 25 33.6 42.9 | 2.0] 25 6.5 68.6 Set ee 26.6 48.4 | 2.1 25 oh 69.9 1.5 25 20.7 64.3 || 2.2) 25 3.9 71.1 1.6 25 16.2 58.8 0.2M ACH KCDB REE ACH 14.919 克 。 甘氨酸 -盐酸 缓冲 液 C(P 了 再 2.2~3.6) pH - 0.2M 甘氨酸 0.2N HCl 水 (25°C) 《毫升 ) 《毫升 ) 《毫升 ) 2.2 25 22.0 53.0 2.4 25 16.2 58.8 2.6 25 12.1 62.9 4.8 25 8.4 68.6 3.0 25 5.7 69.3 3.2 25 4.1 70.9 3.4 25 3.2 71.8 3.6 25 2.5 72.5 HARA fH =75.07,0. 2MHARIAREHAHAR 15.01 克 / 升 。 — 295 -一 ae Oe Re, Se PO Re EB Oe ae F 不 “a " : 二 > ~ cs Ag EE ea ee ea, Ie Red See PEE EE age Pies ore > as Py ye 了 和 E Ps we 全 aA r = ° ne by bar ’ , 过 , ag r w : ? a 1 ie & aE a > % t ‘ ov Ew fy 7) as ? O.ANHCL |. GEA) | < (25°C) . AN a + 49.5 45.8 42.2 38.8 35.4 32.1 > 28.9 25.7 人 22.3 18.8 15.7 12.9 10.4 8.2 3.6 ae hie ees 4) ee 3.9 4.0 KH-_ 邻 茉 二 甲酸 分 子 量 =204.23, : 0.1M KH-A— FRR 20.42 克 / 升 。 pH (25°C) 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 心 = 了 eS; AS 8 St. GR NG GR St Ea © GR Ss Ory aes |. Fis oe Oe os SE) Se OS per OO. | SBE KH- 邻 葵 二 甲酸 分 子 量 =204.23。 0.1M KH-GA_— FRAKES ~0.42 克 / 升 。 RAF R-S AL HAH MR (PH4.1~5.9) 0.1M 下 也 - 邻 葵 二 甲酸 《毫升 ) 50 50 0.1N NaOH 《毫升 ) 水 (ZF) 48.7 47, 45. 43, 41. 38. 7 iw) 相克 -和 YF DD a — 29F = pH 2.2 5.2 | 58.60 2.4 5.4. | . 85.75 2.6 5.6 58.00 2.8 6.8 60.45 3.0 6.0.) 6846 3.2 6.2 | 66.10 3.4 6.4 69.25 3.6 6.6 72.75 3.8 6.8 77.25 4.0 7.0 82.35 4.2 ree; 86.95 三 本 到 44 7.4 | 90.85 ws 4.6 7.6 98.65 eae 7.3 95.75 次 is 6.0. 8.0 97.25 - 2. NazgHPO,-2H,O 分 子 量 =178.05,0.2M 溶液 含 35.61 克 / 升 。 -Nas?HPO4 分 子 量 =141.98,0.2M 溶液 含 28.40 克 / 升 。 柠檬 酸 .H2O 分 子 量 =210.14, 0.10 溶液 含 21.01 克 / 升 。 好 inh 世 poy a ws - iy her 四 are oh ag Came se Aer i : ~ roe YX 本 rr - 六 a ey inne « Fo 5 - ! e a tc ee > > be - 了 dee aN oF a 四 . ‘ 4 > > Be By —FAR-RRRHD}(DH3.0~6.2) \ 1 01M 4, yi 5 . 31.5 5. 5. 5. 6. 6. 50.5 8. 92.0 a | 55.8 ‘ “hie bo Oo Qo for) Lad bo o oe a) or o ow i=) o oO or =) Oo s- 柠 样 酸 *2HzO 分 子 量 =294.12，0.1M7 溶液 含 29.4 克 / 升 本 四 全 be 二 4 63.0 5.6 91.0 9.0 29:0 51.0 5.8 94.0 6.0 ae. Vat : . “4 eh Ac+3H,O 分 子 量 = 136.09，0.2M7 溶 液 含 27.22 克 / 升 。 + ZIG pH 0.1M_B:B/- 一 甲 基 戊 二 酸 | 0.2N NaOH | ia ee VOLE EF) CBF) 2 3.2 | 50 4.18 2 3.4 50 7.35 : } “WT aed 50 11.0 nee Bo. 13.7 2 50 16.65 4.2 ge 50 18.40. 4.4 80 19.60 — 4.6 | 50 ; 20.85 BO tare 50 21.95 are 50 23.10 x 5.8 : 50 29.85 6.0 aS Sg ~ 82.60 = 有 iy 6.2 ee 50 35.25 6.4 ” 50 2 ~ 37.76 | aes! ‘ . oi = ay eet 6.6 cS. r. = 50 a - 42.35.— ee a. 6.8 3 ” 50 44.00 rs 0.2. 1%, 50 45.20 7.2 50 | 46.05 74 as ee 46.60. 7.6. 50 Lil’ Be aT eo 7 : Bo sa ee ae Vn ee” Nia” pea. joe PPS RIO, an PSS Fe yey: Mae eee (毫升 ) | GEFr) |} (28°C) | 〈 《毫升 ) | (Fh) 一 一 | -一 一 | 一 | | 一 | 一 -一 | J LS 3.8 67.6 | 5.0° | 25 | 26.7 | 48.3 j a Rite 65.0 5.2 25 30.3 | 44.7 oe 4 py 61.7 5.4 25 34.2 | 40.8 eee 4.4 58.3 | 5.6 25 | 37.6 | 37.5 3 55.0 5.8 25 40.7 | 24.3 4.8 51.5 | 6.0 25 43.5 22.5 丁 三 酸 分 子 量 =118.09，0,.27 的 溶液 含 23.62 H/F “Fe he eae HRA +H (DH5.8~8.0) “ee : ae 3! are A 3 Sires pHl 0.2M 0.2M pH . 0.2M 0.2M . Na;HPO, | NaH,PO, Na;HPO, | NaH,PO, (25°C) 《毫升 ) (Ft) (25°C) (Ft) 《毫升 ) 5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0 fee. 6.0 12.3 97.7 7.2 72.0 28.0 2 6.2 18.5 81.5 7.4 81.0 19.0 6.4 26.5 73.5 7.6 87.0 13.0 6.6 37.5 62.5 78 91.5 8.5 6.8 49.0 51.0 8.0 94.7 5.3 © NagHPO,-2H,0, 4+ =178.05, 0.2M 溶液 含 85.61 克 / 升 。 Ha2HPO4,12H2O, 分 子 量 =358.22，0.27M 溶液 含 71.64 克 / 升 。 NaH2P94.HzO, 分 子 量 =138.0，0.2M 溶液 含 27.6 克 / 升 。 NaH,PO,+2H,0, 分 子 最 =156.08，0,2MM 溶液 含 31.231 克 / 升 。 ~~ ot 磷酸 二 氨 钾 -- 氨 氧化 纳 缓 冲 液 (PH5. 8~8.0) 水 《毫升 ) 0.1M 0.1N pH KH,PO, NaOH 《毫升 ) (Fr) 一 | 一 一 一 | 一 一 一 一 一 | 一 | 一 一 一 | 一 一 -一 pH Hipo， NaOH (毫升 ) 《毫升 ) 8 50 3.6 9 50 4.6 0 50 5.6 1 50 6.8 2 50 8.1 3 50 9.7 4 50 11.6 5 50 13.9 6 50 16.4 7 50 19.3 8 50 22.4 .9 50 25.9 Rare ar Sag Sos Sa a De se OE (Oe 46.4 45.4 44 .4 43.2 41.9 40.3 38.4 36.1 33.6 30.7 27.6 24.1 50 29.1 50 32.1 50 34.7 50 37.0. 39.1 50 7.5 50 — 40.9 7.6 50 42.4 7.7 50 43.5 7.8 50 44.5 7.9 500Cfi«d|sCs«4B 8.0 50 46.1 KH PO, 43 =136.06, 0 Se secciaee 0.1M 溶液 含 3.61 克 / 升 。- 23°C pH 37°C 6.4 6.5 6.7 6.8 02M Saabs -0.2N HCl Fr) | GF) ms Ae.) AS 5 PT RET TS eA ete et bie Ty ‘> ’ 所 as ee oe jE i Oa? Ee er Ale. ae eRe hee = 区 t Py ae TO os dee, pagye ay , ree \2e= te _ FRAO OE 5) FE =121.18,0.2M 溶液 含 24.24 克 / 升 。 - : ee 性 。 EULH-BRAY HK (PHE.8~9.6) — 2? 了 ‘iin a, aaa A -0.04M 0.2N pH | - 0.04M 0.2N 巴 比 妥 钠 HCl bb 4h HCl GH) | Ge | ase | 100 18.4 7.4 100 15.3 100 =| © :17.8 7.6 100 13.4 100 16.7 7.8 100 11.47 whee x. a | IT) 《毫升 ) y % 4 as FR en meee a i. eel ) oe ti ‘x ory + ty! re . 0.0m | o2N — pH 0.04M. pH ; 巴 比 妥 钠 CEG ea pe eee (18°C) (Ft) (18°C) (Fr) (® eee 8.0 100 9.0 100 8.2 100 9.2 100 8.4 100 9.4 100 8.6 100 9.6 8.8 100 Pri 2A TB =206.2, 0.04M BRS 8.25 H/F. Tris-4 43% (PHT.1~8.9) Fite ce pH |o0i1M|oinN| x pH | 0.1M Re Tris | HCl Tris (25°C) | (EF) | 〈 毫 升 ) | 《毫升 大 | (28°C) | CEA) Gert | cen eee 7.1 | 50 | 45.7 | 4.8 || 8.1 50 7.2 so | 44.7 | 5.3 | 8.2 50 7.3 50 | 43:4 | 6.6 | 8.3 60 7.4 50 | 42.0 | 8.0 || 8.4 50 7.5 50 40.3 9.7 | 8.5 50 7.6 oa | 38.5 1s 88 50 fe 50 «| «(36.6 | 13.4 BF 50 7.8 | 5o | 34.6 | 15.4 || 8.8 50 7.9 50 | 32.0 | 18.0 | 8.9 50 8.0 50 | (29.2 .8 后 HOCH, ,CH,OH cee yess ris 即 三 产 甲 基 氨 基 甲 烷 C 分 子 量 =121.14，0.1M 溶 、 过 HOCH, \NH, /” 2 io. : B 5; 液 含 12.114 克 / 升 。 AE, cease —304— - . isi ma x _89-ARDHROTT. 4~9, 0) 人 0.2M 硼酸 | pH 0.05M 确 砂 | 0. 2M Bi oe B29 5 (毫升 ) (天生 90 «6 83 35 65 : 85 Ga OP Rage 55 内 80 全 二 本 4 40 70 0， ean 2) : NayB,O7-10H,0 7 4) fit = 381. 43, 0.05.M 溶液 含 19.07 ese : ee ; GPRS) FH = 61.84, 0.2M 溶液 含 12.37 克 / 升 。 Aa ae aoe 失去 结 昌 水 必须 在 带 春 的 瓶 中 保存 ， 开 砂 也 可 用 半 中 和 的 确 酸 溶液 an. 44(CH-AAR Meth (PHB .0~10.2) | 0.1M KCI-H3BQ,| 0.1N NaOH 水 和 (Ft) FT) acne SETH) aka gts 50 ne ee “EB Se : 50 4.9 | PO": RSet oat, es) Wie 50 1.30% {S48 50 8 Bi6 rer BO 0.1 89.9 50 11.8, hte en 50 ie ea Geo 50 15.8 34.2 r 50 18.1 Caner 50 20.8 29.2 50 23.6 26.4 rhe — 305 — PRR SSA aes BAL Son Rac any Oe lager 2 CUM Pr Me RTE iE | ET aig ’ 和 ent he hb Le y pH «| 01M KCI-H,BO,| 0,1N NaOH | (毫升 ) (毫升 | 9.2 50 96.4 i; 9.3 sore “29 '3 ne 50 | 39.1 oS 50 38.9 - 9.8 50 40.6 9.9 ae? 1. 42.2 10.0. A BQ. 43.7 10.1 50 aa Ries 10.2 50 46.2 | | | foe | tox | on | See | | 《毫升 ) (毫升 ) (EF) | Soe ke | ea 4.0 9.6 50 : 8.8 | 50 站 -机 bs 9.0 | 60 8.8 |} 10.0 50 “ | 9.21: 60 12.0 10.4320 2) 8D | 9.4 50 16.8 10.6 50 3 HERR F Bt = 75.07, 0.2M BRE 15.01 克 / 升 -— 806 —~ SIERO ALY SS . > , Se F 过 让 所 中 YY yess ee zr : ‘ uit Cie Dany, Di pak ie ita ent eR thea). Pet Nie ene! ant : 如 re. Ye fh a 8 eee p ae! ae, oot eee ee eee 和 a Er vA ? . 上 7 -. 2 n “a ae ao ain elie: oan 不 大 了 NU WS ; . n ag i 3 es ys, ee, = ~~ 7 2 br} ne re 上 四 ] 2 7 5 : maf i ig a ae ee 人 四 a => ym ah i Laa% = + ing 等 特点 , AMOR NMEA ORT eI, os. 实验 证 明 ， 当 一 束 单 色光 (具有 一 定 波长 的 光 ) 通 过 有 色 溶 吸收 的 光量 与 溶液 的 浓度 、 液 层 的 厚度 以 及 入 射 光 的 强度 有 关 ， 物质 (均匀 而 透明 的 固体 ,液体 或 气体 ) 对 光 吸 收 的 规律 nie 又 称 比尔 (Beer) 定 律 , 它 是 比 色 分 析 法 的 定量 基础 。 a _ RADII To Ht CRI To 度 为 工 (如 图 41)， 则 透 光 率 T (常用 百 分 透 光 率 表示 ) Sia : pein be re ee ais 二 Sapte aes 式 中 两 项 取 对 数 则 得 | é lg 于 = 一 区 CL iy Si nd ” im-KcL ley ee ere ae EB CE HSBECODY, 如 果 光 吸收 程度 越 大 , 则 工 越 小 , rs ， E=G ‘e 式 中 玉 为 一 常数 , 称 为 消光 系数 ， 与 入射 光 的 该 长 和 深 性 质 有 关 。 如 果 溶 液 浓 度 以 克 分 子 / 升 表示 ， 液 层 厚度 以 厘 ; 此 第 数 称 为 克 分 子 消光 系数 ,用 s 表示 , BI E= co eR — 814— a ee 和 > 4 3 | 本 Se oe: ~~ s 3" ars ca wre < ~ ‘ : jae ， 比 色 分 析 广 法 orn i Ne AL 8 A, 即 目 视 比 色 法 和 __ HAAR, KOLAR sae | 度 的 方法 。 这 各 方法 无 须 任何 仪器 但 由 于 内 眼 分 辩 力 有 限 ,准确 度 丰 划算 作 |， 。 分 光 光 度 法 是 以 一 定 波长 的 光 通 过 溶液 ， 远 出 的 光照 到 光电 池 或 。 。 光志 管 上 ;产生 光电 流 ， 在 筱 电 计 上 以 光 窗 度 或 透 光 率 表示 出 来 ,从 而 。 ， 求 得 被 测 物 含量 的 方法 。 分 光 光 度 法 通常 是 在 某 一 种 单 色 波长 和 固定 深 液 ,在 光电 比 色 计 上 分 别 测 出 它们 的 消光 度 , 然后 以 光 密度 OD 为 Sere 待 测 样品 按 标 准 溶液 相同 a 但) 并 测 得 光 密 度 , MRE FRE, ead 除了 有 色 物 质 对 光 有 吸收 外 ， 溶 剂 、 试 剂 和 比 色 亚 ， 空 白 溶液 仅仅 是 不 人 被 测 物质 ， 而 其 他 溶剂 .试剂 和 处 理 条 件 与 被 出 深 液 完全 相同 。 测 定时 先 测 空白 溶液 。 调节 仪器 使 空白 溶液 的 透 光 Wr cial 00%, Hom RES E y, AU LE Ree | i 出 定 被 测 溶液 的 光 密 度 所 用 的 光源 ， 实际 上 相当 于 采用 通过 空白 深 Ar GHEE RIED Sees 它 快 速 简便 ， oe Serra BSE (BEALL) 条 件 下 ， 配 制 一 系列 已 知 的 不 同 浓度 的 标 地 有 吸收 ， 从 而 会 引起 分 析 误差 ， 为 此 必须 采用 “ 空 室 自 深 液 * 作 参 ane, oo. Io, 而 透 过 被 测 溶液 的 光 强度 为 T) WSR ~ (e* 三 、 深 液 的 颜色 和 吸收 光波 的 选择 % 分 光 光 度 法 中 ， aL AERA AeA ee 日 2 白炽 灯 光 ) 是 波长 为 400~750 % SPS 束 白光 通过 有 色 溶 液 时 ， sake: xe ane ”的 光 反 射 和 透射 出 来 ， 人 们 所 看 到 溶液 的 颜色 就 是 反射 和 透射 这 一 部 分 波长 光 的 颜色 。 例 如 高 锰 酸 钾 水 溶液 吸收 了 蓝 , 绿 、 英和 波长 的 光 , 反射 和 透射 出 红色 和 紫色 光波 ， 因 此 它 呈 紫红 色 。 特 有 色 溶 液 ， 被 溶液 吸收 的 一 部 4 分 光 的 颜色 与 溶液 本 身 所 旺 现 的 为 补 色 , 如 果 这 二 部 分 光 加 在 一 起 就 复合 成 白光 。 Be ei 如 果 用 不 同 波长 的 光 通 过 浓度 一 定 的 深 液 测 得 每 二 波 上 的 消光 度 ， 然 后 以 波长 为 横 坐 标 , 光 密度 OD 为 纵 从 标 作 图 , 可 得 线 ,这 种 曲线 反映 了 谈 种 物质 的 溶液 对 不 同 波长 光 的 吸收 能 力 ， RR 图 44), Wt Bt He 400 600630 600 700 HK (am) 图 44 KMnO, 溶液 的 吸收 曲线 re Rae mets _ 比 色 分 析 法 中 总 是 选用 被 RY cK 大 的 单 色光 波 进行 cae 样 才能 因 溶液 浓度 微小 变化 而 引起 光 密度 的 较 大 变化 ， 以 提高 比 析 的 灵 笋 度 。 ARERR ATA ERM FEW BIRD 7 体 情 况 另 选 合适 波 长 , 以 消除 干扰 。 纯粹 的 单 色光 仅 是 一 种 理想 情况 ， 在 光电 比 色 计 中 常用 3 得 到 近似 的 单 色 光 ， eye Ie ACTOS, TR ap —316— Rj SI KAUR 在 分 光 光度 计 中 则 是 利用 楼 镜 来 获 nhl a | pre 让 400~700 BALK, Ti ae et 200~1000 2& | Beonomomncnveune: 四 、 比 色 分 析 的 误差 | 引起 比 色 分 析 的 误差 主要 原因 有 二 方面 ， 一 是 方法 的 误差 , 二 是 仪 的 误差 。 。 广 汪 刘 关 主要 来 源 于 比 色 测 定时 流 液 波 度 、 操作 条 件 和 王 汶 物 质 、 @ ” 的 存在 。 当 溶液 的 总 浓度 改变 时 可 能 引起 有 色 物 质 的 解 离 、 Ba “成 新 的 络 合 物 , 引起 溶液 浓度 的 变化 而 使 = | IID AS MemmmCERAELL, 5 有 在 一 sh : is au : eer 显 色 条 件 必须 严格 控制 Sperry 。 量 , 溶 液 的 酸度 、 温度 和 反应 时 间 都 直接 影响 到 生成 的 有 色 络 合 畅 的 角 3 Fe ER, 这 些 因素 的 变化 能 引起 颜色 深度 的 变化 ， 从 而 影响 比 色 测定 的 准确 度 。 有 些 杂质 也 能 与 显 色 剂 生成 有 色 溶液 而 干扰 测定 ， 有 的 杂质 ， | 与 金属 离子 或 显 色 剂 产生 稳定 的 无 色 络 合 物 或 沉 , 从 而 影响 比 色 测 mi He Bice MMR T RR. r SUR, sali ramapnas 如 电源 电 © inn 光电 池 的 疲劳 滤 光 片 的 质量 。 或 单 旬 光 器 的 于 宽 度 ， 不 上 邦交 “eit ws —SEEEEE O10 荡 国 内 :测定 准确 度 较 好 。 五 、 常 用 分 光 光 度 计 的 构造 和 使 用 1. 72 型 分 光 光 度 计 EM ABNOR HEH, BAK A 400~700 2 米 。 由 单 色光 器 、 MRR EBREABEAR, BEEHEM 钨 丝 灯 供给 光源 ， 通过 一 个 光学 玻璃 棱镜 及 二 个 透镜 组 成 的 。 由 单 色 光 器 获得 的 光谱 带 较 狭 ， 单 色光 透 过 有 色 溶 液 的 光线 通过 光电 池 将 光 能 转变 为 电能 , 在 高 度 灵 敏 的 微 电 计 上 指示 出 相应 的 消光 度 或 透 光 率 。 i: > > 图 生 72 型 分 光 光 度 计 光 学 系统 图 1. 光 源 “2. 进 光 狭 锋 “”3. 透 镜 4. 反 射 镜 5. 楼 镜 6. 反 映 BS TR 8. 出 光 狭 颖 -9. 比 色 器 10. 光量 调节 器 11. 光 电池 ”12. 微 电 计 操作 步骤 : (1) 使 用 前 先 检查 供电 电源 与 仪器 所 标志 的 电压 是 否 相符 ,， 然后 “ 插 上 电源 。 (2) 把 单 色光 器 的 光路 闸门 扳 到 “ 黑 点 2 位置， 将 微 电 计 电源 打开 史 此 时 指示 光斑 出 现在 标尺 上 ， 用 “02 位 调节 器 将 光斑 准确 地 调 到 透 光 率 标尺 “0? 位 上 。 (3) 打开 稳 压 器 电源 开关 和 单 色 光源 开关 ;把 光路 闸门 扳 到 “条 点 2 上 ，, 再 以 顺 时 针 方 向 调节 光量 调节 器 ， 使 微 电 计 上 的 指示 斑 达 到 标尺 上 限 附近 , 隔 10 分 钟 待 硒 光 电池 趋 于 稳定 后 再 开始 使 用 仪器 。 一 入 8 一 = ease: ST FPG CLA A, AH Ee LR, see HEB — He a 只 放 待 测 溶液 EE Il, ) 用 波长 调节 器 将 所 需 波长 调节 至 对 准 红线 。 打 开光 路 闸门 ， 拍 溶 液 正 好 对 在 光路 上 ， 调节 光量 调节 器 以 顺 时 针 方向 或 着 时 Be 旋 动 , 使 指示 光斑 正确 地 调 到 透 光 率 100 狗 读数 上 。 cece 格 ， 使 第 一 个 比 党 ma OEE __ CAt a Mo LMR, ete LAIN. Em poe : s a oo la a i @ Scie LemacceReO 格 ， 其 余 三 只 放 待 测 tebe, il。 将 比 色 下 暗箱 盖 合 上 ， EE ATO, Sa iw die aes ) SHALE mem, 6835 7b Ce TL ARERR, ist SMETANA RRO LEENA LE, 依次 推 入 第 —819 — : am Apa ~~ » a ae 1 46 721 型 分 光 光 度 计 光 学 系统 图 ” 1. 光源 灯 12V25W 2. 透镜 3. 棱镜 4. WRB Sb. 保 oe 6. #4 7. 反射 镜 8. KE 9. WEAR 10. 比 色 严 1 护 玻璃 12. 光电 管 13. 光 门 =. 三 第 四 个 比 色 下 ， 读 取 其 光 密 度 。 (4) 放大 器 灵敏 度 挡 的 选择 是 根据 不 同 的 单 色 波长 ， 光 能 “选用 ， 灵敏 度 范围 是 第 一 档 x1L 倍 ,第 二 档 x 10 fF, 第 三 档 x20 则 是 使 空白 溶液 良好 地 用 光量 调 节 器 调整 于 100% IANS 38. 751 Ein, 从 0~.2 毫米 可 连续 调节 。 准 直 镜 是 半径 为 1000 毫米 的 镜 反 射 的 平行 光 ， 照 亮 整个 楼 镜面 。 herrea 光 和 紫外 光 的 吸收 很 少 ， 几乎 完全 透明 。 光 学 系统 中 的 制 成 ， 适宜 于 紫外 光 区 使 用 。 光 电 管 暗盒 内 装 有 紫 敏 光电 管 一 320 一 ame 好 75 even. HOR RS. 10. MEH 11. RAH 12. RIE — heaped HHI <0”. 为 了 得 到 较 高 的 正确 度 ， 每 - at.) Saco 芭 。 障 电流 控制 闸门 14. ROCA 15. WOR 一， % -*y- hea (9) 调节 狭 妖 ， 大 致使 电表 指针 到 “0 位 ， Fars a Ree ee a 调 , 使 指针 正确 地 指 在 “0 12. (10) 轻 轻 拉动 比 色 亚 架 拉杆 Sis — PLS DE ROR AEB, ON : 电表 指针 偏离 “0 ”位 。 C11) 旋转 读数 电位 器 , 使 电表 指针 重新 指 到 “0 位。 这 时 读数 电 位 器 上 所 指 五 值 即 欲 测 溶液 的 光 密度 。 接 着 拉动 拉杆 使 第 二 。 三 只 溶 液 对 入 光路 , 按 相 同方 法 读 出 瑟 值 。 (12) 在 指针 平衡 后 , 要 将 暗 电 流 闸门 重新 关上 ， 以便 保护 光电 入 4 DE ZICKKM RF (18) 当选 择 开 关 放 在 “x1? 时 , 透 光 率 从 0~1009%5 ELE Shoo 3 0。 当 透 光 率 小 于 10% Ht, 可 选用 “x 0.12 的 选择 开关 ; 使 获得 较 精确 的 数值 , 此 时 读 出 的 透 光 率 数值 要 除 以 10, 相应 的 光 密 度 值 应 加 上 工 ae — 322 — d ' . < a j ¥ . ‘ 过 . . Ri $4 she us 只 | i an ieee «a « ij re ~ ee were [23] Marmur. J., J. Mol. Biol., 3,208-218 (1961). (24) 中 国 科 学 院 微生物 研究 所 编 ， SOR 本 本 全 全 下 人 1971， “科学 出 版 社 。 (25) E.AMAK AN. AAS, 黄 德 民 译 , 核酸 , 第 一 卷 , 1963, 科学 出 版 社 。 [26] KR => 气田 康 雄 , 蛋白 质 核酸 酵素 ;11(6)7107;1966. [27] E. Volkin, W. E. Cohn, Methods of Biochemieal Analysis, 1,287 (1954). [28] Harris-Warrick, R. M., Elekana, Y., Ehr.,ich, S. D., & Lederb- erg, J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 2207-2211(1975). [29] Thomas, M. et al., J. Mol. Blol., 91, 315-328 (1975). 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