上 AAA 苏 拔 贤 主编 f 44+ 学 册 版 社 oy f 四 ’ ‘ . Pad 7 : jie : . ay * at ¢ ; * ré = * i: ¥ a * tay 有 t - Be as “ : 2 oe 站 eh ‘ : 7 | - « al ’ 4 a 7 24 | ‘ ; . Pek : - > 本 - = ’ 和 4 有 2 “+ ’ ¢ { | . LHRER BRAM? AE Dy 46 7 itll tH D2 7K KE FE Ee 学 he 人 f 4 . f 上 了 HU 4 Bok Bm BR gy «y . 节 ? 各 354 (KR) MEF 092 号 内 容 简介 生化 制备 技术 涉及 面 很 广 包 括 材料 处 理 、 提 取 、 各 种 分 离 手段 的 使 用 ， 以 至 浓缩 结晶 、 纯 度 测 定 和 保存 等 内 容 。 由 于 生化 物质 种 类 繁多 ， 制 备 方 法 多 种 多 样 ; 不 可 能 有 一 个 统一 操作 规程 因此， 本 书 着 重 介绍 实验 的 设计 思路 有关 分 离 技术 的 原理 和 实验 条 件 的 选择 ， 并 列举 各 种 例子 加 以 说 明 。 书 末 并 附 有 各 类 生化 物质 制备 的 参考 文献 。 本 书 可 供 生 物化 学 ,生物 学 、 医 药 、 食 品 工业 技术 人 员 及 有 关 大 专 院 校 师 生 参考 。 生物 化 学 实验 技术 丛书 生物 化 学 制备 技术 苏 拔 贤 主编 责任 编辑 RHR eene Be 北京 市 东 黄 城 根 北 街 16 号 邮政 编码 : 100717 +O Se AIS Li) hl 新 华 书店 北京 发 行 所 发 行 各 地 新 华 书店 经 售 * 1986 年 1 月 第 一 版 开本 :787x1092 1/16 1994 年 8 月 第 二 次 印 剧 印张 ; 20 1/2 印 数 : 4 201 一 6 300 字数 : 467 000 ISBN 7-03-004198-4/Q + 515 SEU: 24.60 元 a a Wir 在 20 世纪 有 了 惊人 发 展 的 生物 学 中 ， 生 物化 学 是 最 活跃 的 分 支 学 科 之 一 。 促 使 生 物化 学 迅速 发 展 的 重要 因素 之 一 是 新 技术 的 开发。 过 去 一 \ 二 十 年 间 生物 化 学 的 实验 方法 日 趋 专门 化 和 复杂 化 ,这 涉 到 生化 实验 工作 的 领域 也 越 来 越 多 。 今 天 ,农业 ` 工 业 \ 医 学 \ 环 境 以 及 生命 科学 等 的 研究 都 涉及 生物 化 学 研 究 ,生化 实验 已 成 为 常规 的 实验 操作 了 。 因 此 , 对 于 开始 进行 生化 研究 的 工作 者 ,或 者 要 开拓 自身 专业 领域 以 外 生化 研究 领域 的 工作 者 来 讲 , 都 希望 能 有 一 本 合适 的 实验 指导 书 。 有 鉴于 此 ,科学 出 版 社 于 1977 年 夏 委托 中 山大 学 在 广州 召开 了 由 国内 从 事 生化 工作 的 部 分 研究 所 (中 国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 、 中 国 科学 院 微生物 研究 所 ) 、 大 学 (中 山大 学 \ 北京 大 学 、 武 汉 大 学 、 南 开 大 学 ,南京 大 学 复旦 大 学 ), 工厂 (江门 甘蔗 化 工厂 、 生物 化 学 研究 所 东风 生化 试剂 厂 ) 参 加 座谈 会 ,拟定 了 编写 一 套 切实 可 行 ， 供 有 关 工作 者 随时 查阅 参考 的 《生物 化 学 实验 技术 丛书》。 本 《丛书 》 各 册 编写 的 内 容 是 建国 以 来 国内 已 经 应 用 、 开 展 或 正在 开展 的 生化 技术 。 随 着 我 国生 化 研究 工作 的 进展 ;国外 新 技术 的 引进 ,国内 独创 技术 的 开展 ; 将 不 断 补充 新 的 内 容 。 未 《丛书 着重 在 实验 技术 ,各 册 内 容 力求 做 到 : (1) 理论 部 分 简洁 明了 ,实验 部 分 力求 重复 性 高 ; (2) 直接 触及 实验 设计 的 各 项 要 领 (3) 指出 实验 操作 中 应 注意 的 地 方 ; (4) 尽 可 能 多 地 举例 说 明 。 本 《丛书 的 编写 , 虽 经 大 家 共同 努力 ,但 缺点 错误 在 所 难免 ,热情 希望 读者 批评 指正 。 如 果 本 《丛书 的 出 版 ,能 推动 生物 化 学 的 进展 , 为 实现 科学 技术 现代 化 作出 一 些 贡 献 ,六 者 将 感到 十 分 高 兴 。 Olt 前 《生物 化 学 制备 技术 》 分 册 , 内 容 包括 生物 化 学 制备 技术 特点 、 实 验 设计 原理 ， 有 关 生 化 制备 一 些 常用 方法 如 提取 、 这 淀 \ 过 滤 与 超 滤 、 结 晶 、 浓 缩 与 干燥 样品 保存 ,以 及 在 分 离 纯化 时 使 用 较 多 的 色谱 法 , 超 离 心 技术 等 。 与 制备 有 关 的 分 析 鉴 定 方法 , 则 分 别 由 其 他 分 册 了 予以 介绍 ,使 本 分 册 篇 幅 与 其 他 分 册 大 致 相同 。 尽管 如 此 ,生化 制备 技术 所 涉及 的 面 还 是 很 宽 的 ,任何 一 类 生化 物质 的 制备 方法 或 制 备 方法 中 某 一 技术 都 可 以 写成 一 本 专著 。 在 实际 工作 中 我 们 还 体会 到 各 类 生化 物质 制备 的 方法 .手段 是 很 不 相同 的 ,即使 同一 种 生化 物质 也 有 多 种 制备 方法 ,就 是 同一 生化 物质 ， 采用 同一 制备 方法 ,也 因 材 料 差异 、 设 备 和 条 件 的 不 同 、 工 作 人 员 的 习惯 经 验 等 彼此 工艺 流 程 并 不 一 样 。 所 以 本 分 册 编 写 的 指导 思想 ,一 方面 是 作为 《生物 化 学 实验 技术 丛书 》 整 体 的 一 部 分 ,内 容 选 择 上 与 其 他 分 册 互 相 呼 应 互相 补充 ; 另 方面 希望 通过 本 书 的 介绍 ,使 读者 对 生化 制备 技术 有 一 比较 系统 认识 。 Ak, 在 内 容 方面 我 们 尽 可 能 把 有 关 技 术 原 理 讲 清楚 ,并 适当 多 举 一 些 例子 加 以 说 明 , 企图 使 理论 与 实例 结合 起 来 , 起 到 触 类 旁 通 的 作 用 。 同 时 在 本 书 末尾 ， 附 上 各 类 生化 物质 制备 及 测定 的 参考 资料 ， 以 便 读 者 查阅 。 参加 本 书 编写 的 有 : BRA. REN GTi. MRD BRERA aS 过 程 中 ， 上 海 生 物化 学 研究 所 东风 生化 试剂 厂 顾 凶 英 同志 、 香 港 中 文大 学 生化 系 江 润 祥 教授 等 均 先 后 赠送 了 大 量 珍贵 图 书 资料 。 本 书 初稿 完成 后 ,得 到 北京 大 学 王 镜 岩 副教授 、 中 山大 学 曾 淑 云 副教授 、 陈 俊民 副教授 等 在 百 忙 中 给 予 审 阅 并 提出 了 许多 宝贵 意见 。 全 书 编写 得 以 完成 ， 还 由 于 江门 甘蔗 化 工厂 、 中 国 科 学 院 微 生物 研究 所 、 上 海 生化 制药 厂 和 中 山大 学 生化 教研 室 同 志 们 的 具体 FE OP eS, 在 此 说 向 这 些 同志 致 以 最 囊 心 的 感谢 ! 由 于 我 们 水 平 所 限 , 实践 经 验 很 少 , 书 中 肯定 存在 不 少 错误 和 缺点 , 晨 请 读者 批评 指 IEo RAM 1983.8. cS 4 第 一 章 生物 化 学 泣 备 技术 特点 及 实验 设计 原理 sosoooeseseoosssseseooivriesooesvoooooeoooeseoisooe 1 第 一 节 生物 体 组 成 及 生物 分 子 间 的 作用 力 Pee cece ec ee ease ens ere ecs ens venessesseeseccces on。 1 一 、 生 物体 组 成 成 分 cer eec eee eeeeeeeereeeenscescceseecescencseescseenesrsenensscsreretessssnseaecaensnegans 1 二 、 生 物 分 子 间 的 作用 力 ee 2 ey 生化 分 离 制 备 方法 特点 及 基本 原理 aeeoeeeeaesssesaeasosoasod aaiaadaooosveeo os 6 一 、 生 化 分 离 制备 方法 特 版 ee enne sees 6 二 、 生 化 分 离 制备 方法 基本 原理 pe 7 第 三 节 生化 分 离 制 备 实验 的 设计 及 实验 方法 的 选择 ae 8 一 、 生 化 分 离 制备 实验 的 设计 ee 人 8 二 、 分 离 纯 化 各 阶段 对 实验 技术 的 选择 pe 16 参考 文献 Cuisine pice nb ecicisic puis ees 'ein'se0e ole'eicas pinisia.es pmianide cuilcies vclsisiss Uncivioddce cele cesepstisatiecescesoccers ig Sr-—B HRRISHSBE Seg uegeagessessnagccaesevsvoweacsFPececesedadsrecseeccccenne debatacadcemers 23 第 一 节 引言 sca cciscasccccnscicopececsnce vceswecccec ence eae dueess Manan dss cis Saabih tid fam aes.. 证 23 第 二 节选 用 的 溶剂 与 物质 溶解 度 的 一 般 规 律 二 相沿 人 1 信访 二 wa。 Pe Fe = AA EDR (AS a2 SI Fed a aa Se 26 一 、 离 子 强 订 ceveev ence eccccnsceeeevsnsersessneesseevenscsseseseesauvecsssseecnseneraseuarssanessenansensons 26 二 、pH 值 pe 26 三 、 温度 evoesosoooeooooooooosossooooooooeoooooooooooooososoosooooooooooooooooooosvioseooooooeooosoeooooooooooooos 27 四 、 VGH pp 27 第 四 节 ” 固 一 液 葵 取 中 扩散 作用 的 应 用 pp 27 FSA ” 液 一 液 荃 取 时 分 配 定律 的 应 用 :pp 28 第 六 节 提取 时 对 具有 生理 活性 物质 的 保护 措施 oooeooeoos。ooovs。oosoooss。oo。 29 第 七 节 ， 各 类 物质 的 提取 分 商 pe 30 a, MEE Fda IPT ECS BN | Sn kas adhe n DSSS SES deci ta uae PN SL AST ied. iE coset eat 30 . TZ BEB HEEB pe 37 SS FRSA A :有人 44 四 、 其 他 脂 盗 性 生化 物质 的 提取 分 离 .ee 45 五 、 糖 、 氮 基 酸 及 其 他 水 溶性 生化 物质 的 提取 分 亢 pe 47 六 、 植 物 次 生物 质 的 提取 及 深 剂 系统 分 离 的 选择 ee 48 参 芳 文献 pp 49 | 四 51 pis ts eee COCO eee eee eee 51 第 二 节 盐 析 法 ee 51 一 、 基 本 原理 pv 51 = BWSR RAUF RR neeeecce ene neesennencencencnennenansenccecccccecncseseesscnsersespecgeoansescees 53 三 、 一 般 常 用 的 中 性 盐 盐 析 方 法 ee 56 ess ALAR er ree ee ee 61 0 人 61 二 、 有 机 溢 剂 的 选择 及 浓度 计算 .pe 62 三 、 有 机 溶剂 沉淀 的 影响 因素 及 注意 事项 see 64 VE AT HUPESATTHE RE SYM) s-+--ncenadeensanncseesseencesosscstlennwedeonansesssneuannsteee ean 65 第 四 节 “等 电 点 沉淀 法 .0 .证 天 68 第 五 节 ”生成 盐 类 复合 物 沉淀 法 68 第 六 节 “选择 性 变性 沉淀 法 -0 79 fo ee |e Lon ES 73 Son BE FRUETTIE - wey oa ceenns sftp advises? a uepesme Deca o> fol 27s oka es nei .ve ca 73 ries, aml gr GRRL EEL o> - dlp DLP UE «gpg enee 173 TAR hats. on vec tein cea palpi tvisoaetuasernsyadecsesesenes - waite Fr "id ASS. : ’ : = aoa? “ht et it PUM LR Rte 3 34 b Bi + ee Rom hv 这 WE SA rr JR oe | ane i Oe vee ees eee eee eee . ee - re) eee : ‘ethane Come rikone> hones kemangs leat nae 7 ye ae + » ae! ble | > a owed tosh, ik ae +. er ie ae (es re ee ee Pe er Pree ee YA Bik 和 时 天 - -Re Ane i’ - - . « oe : . . m 六 ae vr A ‘ ‘ c ? tof TY Vii gg ee, es es. ae f A _ J ar 第 一 章 ” 生 物化 学 制备 技术 特点 及 实验 设计 原理 苏 RR Mk 第 一 节 “ 生 物体 组 成 及 生物 分 子 间 的 作用 力 一 生物 体 组 成 成 份 吕 2 现 知 地 球 上 约 有 一 百 八 十 多 万 种 动 \ 植 物 ( 包 括 微生物 ) 从 最 简单 的 病毒 、 细 苗 直 至 最 复杂 的 人 类 ,不 论 它们 之 间 形 态 上 多 人 么 不 同 , 但 它们 最 基本 组 成 成 份 都 含 核酸 和 蛋白质 两 类 物质 。 核 酸 是 遗传 信息 的 携带 者 ,在 生物 体内 指导 着 各 种 蛋白 质 的 合成 ,决定 着 每 一 生物 个 体 和 种 族 的 差异 。 和 蛋白 质 则 担负 着 机 体 的 生长 ,发 育 \ 感 觉 ,运动 、 保 护 、 运 输 营 养 物质 和 和 氧气 ,消灭 外 来 疾病 因素 等 多 种 重要 生理 功能 。 进 化 比较 高 级 的 生物 体 , 其 组 成 成 份 除 了 核酸 和 和 蛋白质 ( 包 括 酶 ) 两 大 类 物质 外 ,还 含有 糖 类 、 维 生 素 、 脂 类 ` 激 素 以 及 多 种 多 样 的 代谢 中 间 产 物 和 次 生物 质 。 一 个 生物 体内 含有 多 少 生物 分 子 ? 以 及 这 些 生 物 分 子 结构 EKA aA? 都 是 通 过 亿 万 年 进化 而 确定 的 ,每 一 种 生物 分 子 结构 与 功能 不 仅 十 分 协调 ,而 且 每 个 分 子 在 空间 排列 也 很 有 次 序 , 相 互 契 合 ,并 通过 细胞 的 形式 共同 组 织 起 来 ,执行 着 各 种 复杂 生理 功能 ， 体现 出 生命 的 高 级 活动 。 单 细 胞 生物 一 个 细胞 就 是 一 个 完整 的 生命 体系 。 多 细胞 生物 逐渐 出 现 高 度 分 化 的 器 BAA, 细胞 内 不 同 的 细胞 器 的 化 学 组 成 也 有 了 明显 区 别 。 一 个 细胞 究 责 由 多 少 生物 分 子 组 成 呢 ? 现 以 大 肠 杆 菌 为 例 , 说 明 一 个 简单 的 细胞 的 分 子 组 成 。 见 表 1-1。 表 1-1 可 以 代表 细菌 这 一 类 细胞 的 组 成 成 份 的 基本 情况 ,当然 不 同类 型 的 生物 \ 不 同 表 1-1 大 肠 杆 菌 细 胞 中 主要 的 分 子 组 成 c3 组 分 BBWAA 率 分 子 种 类 的 概 数 水 不 70 i 蛋白 质 15 3;000 本 1 1 RNA 6 1,000 pk ; Lae wee Bee 50 脂 类 2 40 基本 单位 分 子 与 中 间 产 物 2 500 无 机 离子 1 12 类 型 的 细胞 其 组 成 分 子 种 类 和 概 数 是 不 相同 的 ,有 的 差异 很 大 ,有 的 差异 较 小 。 但 在 同一 个 细胞 内 各 类 的 分 子 分布 大 致 有 一 个 规律 ,在 真 核 细胞 中 , 脱氧 核糖 核酸 CDNA) 大 部 分 存在 于 细胞 核 内 , 只 有 极 少 量 存在 于 线粒体 或 叶绿体 中 。 而 核糖 核酸 (RNA) 则 主要 存 在 于 细胞 质 中 。 电 子 传 递 系统 组 成 物质 ,包括 黄 素 蛋白 ,细胞 色素 cy Gay ay as 以 及 糖 类 分 解 ,脂肪 酸 合成 和 氧化 ,氧化 磷酸 化 等 有 关 酶 系 大 部 分 存在 于 线粒体 中 ,关于 蛋白 质 ( 包 括 酶 ) 和 核酸 两 大 类 大 分 子 在 细胞 内 分 布 情况 , 现 以 肝 细 胞 为 例 介 绍 于 表 1-2 R12 ZAR, 酶 及 核酸 在 肝 细 胞 内 分 布 情况 细胞 器 名 称 主要 蛋白 质 及 酶 类 核 酸 类 细胞 核 WEA BEA BRAS nt ee oe se oe Hk Ss FE ALR (t= RETR A BSAEALIC,| RNA 点 总 量 596 左右 ‘ 氨基 酸 氧 化 \ 腺 合成 等 酶 未 DNA 内 质 网 (微粒 体 ) 蛋白 质 合成 酶 系 \ 羟 化 酶 类 RNA 占 总 量 50% 左右 水 解 酶 系 ( 包 括 RNA AG, DNA AG PRRIEEG Bi 人 酸 酯 酶 、 脂 酶 组织 蛋白 酶 ,糖苷 酶 等 ) 高 尔 基 氏 体 糖苷 转移 酶 , 粘 多 糖 及 类 固 醇 合成 酶 系 a Ha 载体 与 受 体 蛋白 、 抗 原 ATP Ry UCOR ERE, 5'- 核 背 司 酶 以 及 多 种 脂 蛋 白 及 糖 重 白 a ee __ REARS NY) RAEI A RI PTI HE] RNA( 主 要 是 tRNA) Bilt 30% 由 上 两 表 可 见 ， 一 个 细胞 包含 着 成 生成 万 种 分 子 ， 每 种 分 子 每 时 每 刻 都 在 变化 运动 中 ,就 像 一 座 小 小 的 “化 工厂 "一 样 ,分 成 许多 车 间 , 有 着 各 种 各 样 的 机 器 ,不 断 消耗 着 各 种 原料 ,产生 出 各 种 产品 ;这 处 产品 运 到 别处 又 变 成 了 原料 ,重新 合成 或 分 解 成 另 一 产品 , 直 到 最 后 变 成 最 简单 的 CO,, IRA. HO 或 一 些 “ 低 值 ”废物 排出 体外 。 生化 分 离 制备 的 目的 ,就 好 像 是 把 这 一 工矿 "里 某 一 机 器 的 部件” 或 “产品 ”巧妙 地 、 毫 无 损伤 地 分 离 出 Ko 研究 其 结构 ,了解 其 功能 或 作为 一 种 药物 和 原料 满足 人 类 社会 生产 和 生活 需要 的 一 种 手段 。 =. EMD FIERA) 存在 于 地 壳 上 的 元 素 已 知 有 九 十 多 种 ,而 组 成 生物 体 的 元 素 不 过 二 十 多 种 ,其 中 最 重 要 的 元 素 是 碳 。 以 碳 为 主 链 连 结 氮 、 氧 、 氢 、 磷 、 硫 等 元 素 , 通 过 共 价 结合 ,组 成 各 种 原始 生 物 小 分 子 的 骨架 , 如 氨基 酸 、 核 背 酸 、 单 糖 、 甘油 、 脂 肪 酸 等 。 我 们 把 这 些 原始 生物 分 子 看 成 是 生命 组 成 的 基本 结构 单位 。 然 后 这 些小 分 子 通过 共 价 缩合 而 成 各 种 各 样 生物 大 分 子 , 如 蛋白 质 \ 酶 、 核 酸 、 多 糖 等 。 大 分 子 与 大 分 子 , 或 大 分 子 与 小 分 子 之 间 又 常常 相互 结 合 形成 更 大 的 复合 分 子 , 如 脂 蛋白 、 糖 蛋白 、 核 蛋白 等 。 蛋 白质 、 核 酸 等 生物 大 分 子 除 了 一 级 结构 外 ,还 有 二 ` 三 \ 四 级 结构 。 生 物 大 分 子 还 可 以 再 聚合 成 生物 超 分 子 复 合 物 , 如 核糖 . 体 便 是 一 个 超 分 子 结构 复合 物 。 每 个 核糖 体 含 有 一 个 大 亚 基 , 一 个 小 亚 基 ,每 个 亚 基 约 含 有 65 色 RNA、35 多 蛋白 质 。 各 种 细胞 器 实际 上 是 由 超 分 子 复合 物 所 组 成 ， 最 后 再 由 不 同 结构 的 细胞 器 建造 成 细胞 。 因 此 ,我 们 欲 把 细胞 中 各 种 生物 分 子 相互 间 的 结合 拆 开 ; 就 9 需要 了 解 这 些 分 子 结合 的 力 (或 称 化 学 键 ) 的 有 关 性 质 ,然后 才能 使 用 相应 的 措施 把 它们 彼此 分 离 出 来 , 这 就 是 我 们 生化 制备 实验 设计 的 主要 对 象 及 目的 。 现在 简单 地 就 一 些 主 要 生物 大 分 子 内 及 分 子 之 间 的 作用 力 讨论 如 下 : (—) 共 价 键 这 是 组 成 各 种 生物 分 子 元 素 及 基 团 之 间 “连结 ”主要 化 学 键 。 共 价 键 又 称 原子 键 , 是 指 由 两 个 原子 通过 共用 电子 对 而 产生 的 一 种 化 学 键 。 若 电子 对 是 由 两 个 原子 平均 共有 称 为 非 极 性 共 价 键 。 如 电子 对 偏 于 某 原 子 一 侧 使 整个 分 子 产生 极 性 , 称 极 性 共 价 键 。 极 性 键 的 极 性 渐 增 至 电子 对 脱离 一 个 原子 而 为 另 一 原子 所 单独 占有 时 ， 即 变 为 离子 键 《 如 图 1-1 im). Alt, 离子 型 化 合 物 是 一 种 极 性 最 强 的 化 合 物 。 上 面 所 述 是 由 二 个 原子 共同 提供 电子 对 所 形成 共 价 键 ,如 果 两 个 原子 之 间 , 由 某 一 原 子 单方 面 提 供 共用 电子 对 所 形成 的 共 价 键 称 为 " 配 位 键 "。 许 多 含有 人 金属 离子 的 蛋白 质 分 子 , 金 属 离子 与 蛋白 质 的 连接 大 都 是 配 位 键 。 蛋白 质 分 子 内 每 一 个 氨基 酸 的 氨基 与 另 一 氨基 酸 的 羧基 之 间 脱 水 缩合 形成 肽 键 ， 核 酸 分 子 内 每 一 个 核 背 酸 的 磷酸 基 团 与 相 邻 的 另 一 个 核 苷 酸 的 成 糖 上 的 羟基 脱水 缩合 形成 磷酸 二 酯 键 。 多 糖分 子 内 前 后 单 糖 上 羟基 脱水 缩合 形成 的 糖苷 键 都 是 共 价 键 。 现 以 蛋白 质 为 例 , 介 绍 一 些 共 价 键 的 键 长 及 键 能 如 表 1-3。 非 极 性 键 APE FT 表 1-3 蛋白质 中 共 价 键 键 长 及 键 能 HY iy SEE) i a FE 价 键 gtk CA) # fe (KJ/ 克 分 子 ) > Se ee > c_H 1.08 ~378.7 te c—c 1.53 276.9 本 C—N 1.47 232.2 a x C=N 1.30 468.6 H Sci: C—N (〈 肽 键 ) 1.32 a c—s 1.81 246.8 H : Bx — C=O 1.24 665.2 x O—H 0.96 462.7 xx N—H 1.01 352.7 Na a Pe C(F) S—N 1.33 366.9 Na S—s 2.08 266.9 离子 键 离子 型 分 子 P—O 1.66 ~335.0 Al-l 由 非 极 性 分 子 过 湾 到 离子 型 分 子 示意 图 1 卡 〈cal) = 4.1868 焦耳 (J) 从 表 1-3 中 可 以 看 到 ， 共 价 键 的 键 能 一 般 在 230 至 660 FH (KJ) 之 间 ， 其 中 肽 键 《一 C 一 N 一 ) 与 二 硫 键 (-S—S—) 都 具有 双 键 性 质 , 肽 键 不 能 沿 着 一 C 一 N 一 轴 自 由 转 动 , 二 硫 键 不 能 沿 着 一 S 一 S 一 轴 自 由 转动 。 肽 键 是 蛋白 质 一 级 结构 中 主要 共 价 键 ; 二 硫 键 是 维系 蛋白 质 空间 结构 最 强 有 力 的 桥 键 。 而 磷酸 酯 键 则 是 核酸 一 级 结构 的 主要 共 价 键 。 《二 ) 非 共 价 键 或 非 共 价 键 作用 力 生物 体内 的 生物 大 分 子 如 蛋白 质 \ 酶 核酸、 多 糖 等 的 空间 结构 和 分 子 之 间 的 作用 力 ， ee 3 。 NS 主要 是 通过 非 共 价 的 静电 引力 、 氢 键 和 范 德 瓦 耳 斯 力 (Van der Waals’) 等 联系 而 成 。 其 中 除 离子 键 的 键 能 与 共 价 键 相 近 外 ， 其 它 键 的 键 能 一 般 都 小 于 40 TR (KJ), mK 长 达 3 一 5A 左右 。 组 成 生物 分 子 共 价 键 的 强度 、 方 向 或 其 它 性 质 受 环境 影响 较 少 , 而 非 共 价 键 的 性 质 受 环境 影响 较 大 。 下 面 我 们 分 别 介绍 一 些 非 共 价 键 作 用 力 的 性 质 : 1. 离子 键 (或 称 离子 对 ,有 时 称 为 盐 键 或 盐 桥 ) ”离子 键 指 相反 电荷 的 静电 作用 力 ， 这 一 作用 力 与 两 个 带电 基 团 带电 量 的 乘积 成 正比 ,与 两 个 基 团 距离 平方 成 反比 , 称 为 库伦 定律 ,可 用 下 式 表 示 : F 一 9192 D7 qiq 表示 二 个 带电 基 团 的 带电 量 。 D 是 介 电 常数 ， 即 介质 对 有 相反 电荷 微粒 之 间 静 电 引 力 影响 的 数值 , 常 定 义 为 在 真空 中 与 在 介质 中 这 种 带电 微粒 之 间 的 电位 差 比 。y 为 二 个 基 团 的 距离 。 生物 大 分 子 能 形成 离子 键 的 带电 基 团 很 多 ， 如 蛋白 质 分 子 中 的 带 正 电 基 困 有 且 基 、 s- 氮 基 ,N- 末 端的 氨基 \、 味 唑 基 等 , 带 负 电 的 基 团 有 C- 端 羧基 , 天 门 冬 氮 酸 的 8- 羧 基 , 谷 ARN Y- 羧 基 等 ,都 可 以 相互 形成 离子 键 。 但 离子 键 在 水 中 , 因 水 的 介 电 常数 很 高 ,带电 基 团 受 屏蔽 , 从 而 使 正 负电 和 荷 相 吸引 的 能 力 大 大 减弱 。 所 以 分 布 在 蛋白 质 分 子 表面 的 带 电 基 团 , 实 际 形成 离子 键 的 机 会 并 不 多 , 主要 是 把 水 分 子 吸引 在 自己 周围 形成 水 合 层 , 使 BARAARKER. 在 核酸 分 子 中 的 磷酸 基 团 有 时 候 也 与 蛋白 质 分 子 中 碱 性 基 团 以 离子 键 相 结合 〈 如 组 蛋白 、 核 蛋 白 ), 另 某 些 酶 ,如 胆 碱 脂 酶 \, 酶 分 子 和 底 物 胆 碱 的 结合 ,也 是 通过 离子 静电 引力 相互 作用 的 。 2. 氢 键 ”在 化 合 物 分 子 中 ， 凡 是 和 负电 性 较 大 的 原子 相连 的 氢 原 子 (如 O-H, N 一 H，F 一 H) 都 可 以 和 同一 分 子 或 别 的 分 子 上 另 一 负电 性 较 大 的 原子 形成 氢 键 8。 Zk. 乙醇 、 栈 酸 等 分 子 的 缔 合 现象 和 和 蛋白质、 核酸 分 子 立 体 结构 的 维系 都 和 氧 键 有 关 。 氢 键 的 键 距 比 普通 的 化 学 键 长 , 约 为 2.63 至 3.10A。 键 能 比 普通 化 学 键 弱 ,一般 只 有 12-34 + 焦 / 克 分子。 氢 键 还 具有 方向 性 , 当 氢 键 供 体 与 受 体 上 N. H, O,C 等 原子 在 一 直线 上 时 , 键 的 强度 最 大 。 约 为 33 和 干 焦 。 在 水 溶 小 中 , 氢 键 的 产生 和 交换 都 以 很 高 速度 进行 。 这 对 生物 分 子 表现 其 生理 活动 有 着 重要 的 作用 ， 也 是 生物 大 分 子 形成 立体 构 型 的 主要 推 aie 3. SA AMA (Van der Waals’) 范 德 瓦 耳 斯 力主 要 包括 三 种 弱 的 静电 引力 : C1) 非 极 性 分 子 内 部 电子 运动 的 不 对 称 ,产生 瞬时 极 性 现象 ， eae: 起 周围 电子 分 布 的 变化 所 产生 的 作用 力 ,也 称 色 散 效应 或 London 77K Do 《2) 极 性 基 团 之 间 偶 极 与 偶 极 相互 吸引 力 (也 称 定向 效应 )。 (3) 非 极 性 分 子 与 极 性 分 子 接近 ,在 分 子 内 造成 的 偶 极 诱导 作用 (也 称 诱 导 效 应 郊 范 德 瓦 耳 斯 力 总 的 表现 趋势 是 偶 极 之 间 互 相 吸 引 ， 但 当 两 个 基 团 距离 很 近 时 排斥 作 用 又 占 主 导 地 位 。 范 德 瓦 耳 斯 力 的 键 距 约 为 3 一 4 人 , 其 能 量 比 氢 键 还 弱 , 在 水 中 或 一 些 极 性 介质 中 单独 起 作用 不 大 ,但 分 子 中 存在 许多 偶 极 ,这 些 偶 极 相互 作用 所 得 的 范 德 瓦 耳 斯 力 则 是 很 大 的 。 范 德 瓦 耳 斯 力 还 具有 某 些 特 点 ， 如 它 一 方面 可 以 使 分 子 之 间 具 有 吸引 能 力 , 同 时 这 种 引力 又 必需 使 二 个 分 子 保持 一 定 距 离 。 这 种 特殊 作用 力 对 于 酶 和 底 物 , 抗 se 40 原 和 抗体 的 结合 和 解 离 有 着 重大 意义 。 4. 疏水 基 相 互 作 用 站 水 基 相 互 作用 ,以 往常 称 为 " 臣 水 键 ”。 虽 “ 朴 水 键 ”这 一 启 不 确 , 因 习惯 了 现 关 用 之 。 它 对 于 维持 蛋白 质 \ 酶 核酸 等 大 分 子 立 体 结构 起 着 重大 作用 。 这 些 大 分 子 通常 都 有 亲 水 区 域 和 蕊 水 区 域 二 茧 水 区 域 一 般 位 于 分 子 内 部 ， 也 常 是 酶 与 底 物 , 抗 原 与 抗体 相互 结合 的 地 方 。 SA ARMRRA THRKRERLE RD T PAAR, BAR, AAAR, ZAR Se — EE BK EE KR FEA Pe iE A AE De EO SE CE iI Ro HERR KEA EMA ie, FLD AER EEA TET OK TB RA BABS. ERtKKM, MEE RRB TI HieK SA AKER ARMS REio A MLIS Hl BE PERS ST He FS CA SEK ENA. 2, 盐 类 可 使 非 极 性 基 PA Ze 7K HH Yes FPR BE cD FY (BE Bit 7k PEP 0 《三 ) 水 在 各 种 非 共 价 作 用 力 中 的 作用 没有 水 ,生命 便 不 可 能 形成 。 在 生物 化 学 反应 中 ，, 水 不 仅 是 一 种 良好 的 溶剂 , 也 是 在 各 种 生化 反应 中 提供 H* 和 OH ”的 主要 源泉 。 同 时 , 水 还 是 生物 分 子 表现 生理 活性 的 唯一 天 然 环 境 。 水 的 结构 特点 及 对 于 生物 分 子 作用 力 的 影响 可 归纳 如 下 : CQ) 水 分 子 由 一 个 氧 原 子 和 两 个 氮 原 子 组 成 ;由 于 分 子 不 对 称 的 空间 构 型 ,其 中 氧 原 子 具 有 负极 作用 ,而 相 邻 的 二 个 氧 原子 则 合成 偶 极 分 子 中 的 正极 。 “TART RSA 子 核 连 线 之 间 形 成 的 夹 角 约 为 105?， 是 一 个 高 度 极 化 的 极 性 分 于 ,具有 很 高 的 介 电 常数 。 图 1-2 是 水 分 子 结构 示意 图 。 2) 由 于 偶 极 分 子 中 场 力 的 作用 ， 水 分 子 彼 HS + A 此 吸引 而 缔 合 , 很 少 单独 存在 。 每 个 水 分 子 通过 105° ; 氧 原子 氢 键 可 与 另外 四 个 水 分 子 配 价 ， 形 成 四 面体 “ 冰 氨 原 于 <-- | 格 ” 的 结构 , 随 着 周围 条 件 的 变化 ,结构 中 的 氢 刍 正 电 性 部 分 ft 不 断 破坏 又 不 断 形成 ， 水 分 子 间 这 种 独特 结构 使 REE LD ; 水 有 极 高 的 内 聚 力 。 | (3) 水 溶液 中 的 水 分 子 因 自 身 形 成 氢 键 的 趋 势 极 强 。 故 水 分 子 的 存在 可 使 其 它 分 子 形成 氢 键 区 ‘hou 能 力 减 弱 , 水 分 子 还 可 以 减弱 离子 键 的 相互 作用 ， | ; 而 增强 非 极 性 芒 水 键 的 相互 作用 。 站 (4) 通过 气 键 的 缔 合 作用 ,许多 生物 分 子 如 多 糖 \ 淀 粉 \ 蛋 白质 、 核 酸 等 分 子 中 的 羟基 或 氧 、 氮 等 原子 都 可 以 通过 氢 键 与 水 结合 ,从 而 具有 巨大 的 水 合 或 称 “ 水 化 ”能 力 。 上 述 关于 一 些 生物 分 子 中 的 结合 力 及 分 子 间 的 作用 力 的 简单 介绍 ， 可 以 看 到 生物 体 系 中 分 子 结构 及 分 子 之 间 联 系 的 作用 力 十 分 复杂 。 作为 一 个 生物 分 子 ,其 基本 骨架 各 原 子 及 基 团 之 间 都 是 共 价 结合 , 整个 分 子 一 级 结构 是 比较 稳定 的 。 但 分 子 与 分 子 间 的 连结 主要 通过 一 些 非 共 价 键 如 氢 键 、 盐 键 、 金 属 键 、 范 德 瓦 耳 斯 引力 所 维系 ;其 键 能 较 弱 ,而 且 键 的 性 质 差别 较 大 , 故 可 采取 不 同方 法 使 之 分 离 , 而 不 损伤 其 分 子 基 林 结 构 。 但 须 注意 的 是 许多 生物 大 分 子 的 二 、 三 级 立体 结构 也 是 一 些 非 共 价 结合 ， 因 此 分 离 时 就 必须 十 分 小 心 * 使 其 立体 结构 不 受 破坏 。 故 常常 保持 在 十 分 温和 的 条 件 下 ,以 吉 免 由 于 强烈 的 外 界 因 ia oe" 子 而 丧失 其 生理 活性 。 这 就 是 生化 分 离 制备 技术 与 有 机 化 学 分 离 制备 技术 最 重要 区 别 之 处 。 第 二 节 ”生化 分 离 制 备 方法 特点 及 基本 原理 一 、 生 化 分 离 制备 方法 特点 混合 物 中 各 组 分 的 分 离 是 化 学 科学 中 一 个 重要 内 容 ， 但 某 些 经 典 的 化 学 分 离 方法 如 蒸馏 、 熔 炼 等 ， 对 具有 特殊 生理 活性 物质 的 分 离 是 不 适合 的 。 许 多 生理 活性 物质 如 蛋白 质 、 酶 ,核酸 等 的 分 离 已 给 经 典 的 化 学 分 离 方法 带 来 了 新 的 课题 ， 并 有 力 地 推动 了 化 学 分 离 技术 向 另 一 分 支 一 一 生化 分 离 技 术 的 发 展 。 生化 分 离 技 术 由 实验 目的 的 不 同 ， 可 分 为 生化 分 离 分 析 和 生化 分 离 制 备 二 个 方面 。 前 者 主要 对 生物 内 各 组 份 加 以 分 离 后 进行 定 性 ,定量 鉴定 , 它 不 一 定 要 把 某 组 份 从 混合 物 中 分 离 提取 出 来 。 而 后 者 则 主要 是 为 了 获得 生物 体内 某 一 单纯 组 份 。 生化 制备 技术 与 一 般 化 学 分 离 制备 技术 比较 ， 其 特点 有 下 列 几 Fas B— EDM RABE BR —/MEDH EH GRA MEST HAD. oH 化 合 物 的 形状 、 大 小 、 分 于 量 和 理化 性 质 都 各 不 相同 ,其 中 有 不 少 化 合 物 迄 今 还 是 未 知 物 质 ; 而 且 这 些 化 合 物 在 分 离 时 仍 不 断 在 代谢 变化 中 。 第 二 ， 有 些 化 合 物 在 材料 中 含量 极 微 。 只 达 万 分 之 一 ， 几 十 万 分 之 一 甚至 百 万 分 之 一 。 如 从 脑 垂体 组 织 提取 某 些 激素 的 释放 因子 ,从 乔 体 中 提取 某 些 信息 素 ,和 从 竹笋 中 提 取 狂 笋 素 等 ,都 是 用 几 吨 或 几 十 吨 的 原料 才 提 取 到 几 个 毫克 的 目的 物 。 第 三 ,许多 具有 生物 活性 的 化 合 物 一 旦 离开 了 生物 体内 的 环境 , 很 易 变 性 、 破 坏 。 因 此 ， 在 分 离 过 程 中 要 十 分 小 心 保护 这 些 化 合 物 的 生理 活性 , 这 是 生化 制备 最 困难 的 地 方 ， 许多 生物 大 分 子 在 分 离 过 程 中 ,过 酸 \ 过 碱 \ 重 金属 离子 ,高温 、 剧 烈 的 机 械 作用 、 强 烈 的 辐 射 和 机 体内 自身 酶 的 作用 均 可 破坏 这 些 分 子 的 生理 活性 。 故 分 离 具有 生物 活性 的 生物 分 子 , 特 别 一 些 生物 大 分 子 , 常 选择 十 分 温和 条 件 ,并 尽 可 能 在 较 低 温度 和 洁 静 环境 下 进行 。 第 四 ,生化 分 离 方法 几乎 都 在 溶液 中 进行 ,各 种 参数 (温度 、pH VAT RES ANE 液 中 各 种 组 成 综合 影响 常常 无 法 固定 ,以 致 许多 实验 的 设计 理论 性 不 强 ,实验 结果 常常 有 很 大 经 验 成 份 。 因 此 ,一 个 实验 的 重复 性 的 建立 , 从 材料 到 方法 直至 各 种 环境 条 件 ， 使 用 的 试剂 药品 等 都 必须 严格 地 加 以 规定 。 第 五 ,为 了 保护 所 提取 物质 的 生理 活性 及 结构 上 的 完整 ,生化 分 离 方 法 多 采取 温和 的 “多 阶 去 "进行 ,也 就 是 我 们 常 说 的 逐 层 剥皮 ”方法 ,一 个 生物 分 子 的 分 离 制备 常常 少 至 几 个 步骤 ,多 至 十 几 个 步骤 , 并 不 断 变换 各 种 分 离 方法 , 才 达 到 纯化 目的 。 多 阶 式 的 分 离 制备 方法 操作 时 间 长 , 手续 繁琐 ,常常 会 给 制备 工作 带 来 许多 影响 。 近 年 来 出 现 所 谓 兔 鱼 法 ,利用 某 些 分 子 特 有 的 专 一 亲和力 ,将 某 一 化 合 物 从 极 复 杂 的 体系 中 一 次 钓 出 ;这 一 方法 目前 虽 只 用 于 某 些 大 分 子 如 酶 .抗体 和 核酸 等 的 分 离 提纯 工作 ,但 比 起 任何 经 典 化 学 方法 都 具有 很 大 的 优越 性 。 第 六 , 生化 分 离 方 法 最 后 均一 性 的 证 明 与 化 学 上 纯度 的 概念 并 不 完全 相同 。 这 里 由 于 生物 分 子 对 环境 反应 十 分 敏感 ,结构 与 功能 关系 比较 复杂 , 故 对 其 均一 性 的 评定 和 稍 是 ° 6 & hos ¢% wie ee, SREY Bs RA A AINE RIAA HE TEA Seo RED 法 所 得 纯度 的 结论 往往 是 片面 的 ,甚至 是 错误 的 。 二 、 生 化 分 离 制备 方法 基本 原理 ”生化 分 离 方法 与 一 般 化 学 分 离 方 法 虽然 有 着 许多 不 同 特点 ， 但 生化 分 离 方 法 与 一 般 化 学 分 离 方法 原理 上 又 有 许多 是 相同 的 或 者 说 是 相通 的 地 方 ， 这 充分 说 明 反 映 了 近世 纪 ee ee K RGIS TUT. ge g hi OS 或 者 HEMET E— wi ASSAD 中 ;外 加 一 定 作用 万 ; 便 各 给 份 分 配 于 不 同 区域 , 从 而 达 汉 分 离 目 的 (如 电泳 , 超 离心 \ 超 小 等 )。 除 了 一 些 下 分 子 如 氮 基 酸 、 脂 肪 酸 、 某 些 维生素 及 固 醇 类 外 ， 几 乎 所 有 机 体 中 大 分 子 物质 都 不 能 融 化 , BRERA, 只 限于 分 配 在 固 相 和 液 相 中 ， Bl? 分 离 时 ? 咨 质 分 子 所 受 的 不 同 作用 力 下 意图 表 1-4 生化 分 离 方法 分 类 表 "”” 分 离 方法 推动 力 F， ow oF, Ba sees He —. 色谱 (a) 吸附 流体 动力 表面 能 , 范 德 瓦 耳 斯 力 位 阻 效应 F, “| 极 性 \ 位 阻 因素 (b) 离子 交换 | ”流体 动力 静电 吸引 力 , 极 化 度 分 子 筛 效应 F, | 离子 性 质 及 分 子 大 小 (c) afd 流体 动力 渗透 (扩散 ), AREA AMMAR OF, «| REAR (d) AF ii 流体 动力 Berek F, | AFR 二 、 逆 流 分 配 机 械 作 用 BE RA A AY F, | 极 性 因素 三 、 电 场 力 Ca) 在 自由 咨 液 中 静电 引力 分 子 摩擦 力 ? 极 化 度 动 电 作用 KF, | 离子 性 质 (b) 在 多 孔 支持 物 中 静电 引力 分 子 摩擦 力 * 极 化 度 动 电 作用 表面 能 F, | 离子 性 质 (c) 在 凝 胶 支 持 物 中 静电 引力 DF Vis DY. F, 和 F: | 离子 性 质 和 分 子 大 小 (d) 等 电 聚 焦 静电 引力 平衡 作用 | 离子 性 质 Ce) 对 流 电泳 静电 引力 分 子 摩擦 效 应 F, | 离子 性 质 (Electrophoresis- 电动 力 convection) (Electrokinetic) Cf) 电 渗析 静电 引力 分 子 得 效应 F, 和 F: | 分 子 大 小 和 离子 性 质 四 、 扩 散 方 法 电 动力 电动 力 (a) 透析 Be 分 子 筛 效应 和 2 卫生 4， (>) 超 滤 流体 动力 分 子 筛 效 应 ,表面 能 (吸附 ) F, | aFAN (c) ERR RAT 温度 梯度 分 子 摩擦 效应 F, “| 分 子 大 小 a. 7 五 、 结 晶 结晶 格子 能 | 扩散 Fy 分 子 大 小 及 形状 Ay it ) 重力 、 离 心力 “| 分 子 摩 擦 效应 Bit), kar a NY b) 平衡 作用 | 分 子 大 小 及 介质 密度 并 在 这 两 相 之 间 相 互 交替 进行 分 离 纯化 。 REAR BUI (Morris) 认为 许多 生化 分 离 制备 方法 都 可 以 看 作 是 各 种 溶质 分 子 在 溶液 中 沿 着 一 条 狭 罕 路 线 移动 的 结果 四。 例如 溶质 分 子 (A) 在 一 定时 间 内 只 有 一 个 运动 方向 ， 它 受 二 个 不 同方 向 力 的 作用 (如 图 1-3)。 F, 表示 与 溶质 分 子 运动 方向 相同 的 推动 力 ，F; 表示 与 溶质 分 子 运动 方向 相反 的 阻 滞 力 。 作 为 推动 力 可 能 是 流体 动力 (如 色谱 )\ 电 场 力 (如 电泳 )、 重 力 \ 离 心力 (如 沉降 ) 及 其 他 作用 力 如 扩散 , 活 透 中 的 分 子 运动 等 。 许 多 分 离 方法 常常 不 止 一 种 推动 力 ,而 是 几 种 推 动力 联合 起 作用 。 阻 滞 力 一 般 包 括 : (1) 在 均一 溶液 中 分 子 的 摩擦 效应 ; 2) 极 化 分 子 的 静电 作用 ,尤其 是 生物 大 分 子 溶质 与 溶液 中 其 他 溶质 分 子 的 静电 引 力 , 往 往 造成 这 些 大 分 子 溶质 流动 时 遇 到 的 主要 阻碍 力 。 (3) 在 两 相 体系 中 ,溶质 在 两 相 中 的 分 配 系数 及 分 子 筛 效应 等 。 (4) 吸附 作用 ,渗透 作用 及 其 他 因素 所 引起 的 阻 滞 力 。 因此 , 图 1-3 中 溶质 分 子 A 的 移动 速度 取决 于 Et 一 PA = AF^， 而 溶质 分 子 了 的 移 动 速度 取决 于 FE 一 F? 一 AFs。 溶质 分 子 A 与 溶质 分 子 B 的 分 离 效 果 将 取 次 于 AFA/ AFs = AF 的 比值 。 所 以 , 在 分 离 混合 物 的 各 组 份 中 ,必须 尽量 设法 扩大 各 组 份 之 间 AF 的 差别 ,以 其 达到 各 组 份 彼此 之 间 的 完全 分 离 。 史 特 朗 (Strain) 和 他 的 同事 根据 物质 分 离 各 种 力 的 作用 把 许多 分 离 方 法 作 了 一 些 归 纳 及 评论 四。 摩尔 里 斯 (Morris) 等 在 史 特 朗 等 基础 上 进一步 把 各 种 分 离 方 法 中 Ri、E; 及 分 离 时 主要 依据 一 一 物理 、 化 学 因素 作 了 小 结 , 如 表 1-4 所 示 。 表 1-4 中 所 列 各 种 生化 分 离 方 法 , 在 制备 中 使 用 较 多 的 有 吸附 色谱 、 离 子 交 换 色谱 、 分 子 筛 色谱 \ 逆流 分 配 、 凝 胶 电 泳 \, 电 渗析 、 透 析 、\ 超 滤 、 结 晶 、 沉 降 等 ,其 中 大 部 分 方法 将 在 以 后 各 章 中 分 别 予 以 介绍 。 第 三 节 ， 生 化 分 离 制备 实验 的 设计 及 实验 方法 的 选择 一 、 生 化 分 离 制备 实验 的 设计 生化 分 离 制备 实验 的 设计 ， 首 先 面临 的 是 所 要 求 分 离 的 物质 的 化 学 结构 及 性 质 存 在 着 "已 知 "与 未知" 两 种 情况 。 已 知 结构 性 质 物 质 的 分 离 制备 ,前 人 肯定 已 做 过 一 些 研 究 ， 在 继续 进行 这 类 实验 时 ,常常 是 为 了 取得 更 纯 、 更 多 的 产物 或 者 希望 找 出 更 简便 、 效 率 更 高 的 实验 方法 。 因 此 ,这 类 物质 分 离 制备 方法 的 改进 ,主要 依赖 于 对 所 分 离 物 质 的 理化 性 质 的 了 解 和 参照 前 人 已 用 过 的 各 种 实验 方案 ,通过 自己 具体 实验 条 件 加 以 比较 优选 ,或 者 是 参考 其 他 类 似 物 质 最 新 分 离 方法 加 以 引进 试用 ,从 而 求 得 最 佳 的 实验 方法 或 工艺 六 程 c 经 较 小 的 制备 规模 过 渡 到 中 间 规 模 试验 , 最 后 到 较 大 规模 的 工业 生产 。 但 任何 技术 方法 都 有 时 间 性 和 受到 具体 条 件 的 限制 ,一 个 认为 比较 理想 的 分 离 制备 方法 ,并 不 是 永远 都 是 最 好 的 , 随 着 时 间 的 推移 和 新 的 技术 实验 仪器 和 实验 器 材 的 出 现 , 总 得 不 断 革 新 ;完善 否则 便 将 逐步 地 被 新 的 方法 所 代替 。 所 以 , 熟练 掌握 实验 原理 , 根据 自己 实验 具体 条 件 ， 及 时 了 解 国内 外 有 关 先 进 技术 发 展 动态 ,不 断 改 进 自己 实验 方法 ,才能 适应 日 新 月 异 的 技 e- Ske SS 术 发 展 的 要 求 。 对 于 一 个 未 知 化 学 结构 ,性 质 的 物质 的 分 离 制 备 , 情况 则 比较 复杂 ， 由 于 所 分 离 制备 物质 还 是 一 个 "未知数 ” ,没有 什么 经 验 和 固定 方法 可 以 遵循 ,开始 设计 实验 时 ,只 能 根据 该 物质 某 一 生物 学 或 生物 化 学 的 性 质 或 现象 来 指导 每 一 分 离 制 备 步骤 (这 里 ,往往 也 需要 参照 前 大 有 关 工 作 ，, 并 不 是 赁 空想 出 )。 有 时 在 摸索 过 程 中 , 往往 认为 自己 设计 的 方法 很 理想 完善 了 ,但 最 后 得 不 到 什么 结果 或 得 到 很 小 的 结果 ,这 是 常 有 的 事 。 只 有 经 过 多 次 反 复 实践 ,不 断 总 结 失败 原 因 ， 修改 原 有 的 实践 方案 , 才 有 可 能 取得 最 后 成 功 。 当 实验 一 旦 获得 目的 制备 物 后 ;就 可 以 根据 产品 比较 详细 准确 理化 性 质 , 改进 已 有 制备 方法 条 件 , KR 步 提高 产品 的 质量 和 产量 。 生物 体内 某 一 组 份 , 特 别 是 未 知 结构 的 组 份 的 分 离 制备 设计 ,大 致 可 分 为 五 个 基本 阶 段 : GC) 确定 制备 物 研究 目的 及 建立 相应 的 分 析 鉴 定 方法 。 (2) 制备 物 物 理化 学 性 质 稳定 性 的 预备 试验 。 (3) 材料 处 理 及 抽 提 方法 的 选择 。 (4) 分 离 纯 化 方法 的 摸索 。 6) -获得 制备 物 以 后 ,均一 性 的 测定 。 现 就 以 上 五 个 基本 阶段 所 涉及 的 实验 设计 原理 及 实验 程序 简要 介绍 和 讨论 如 下 : 《一 ) 制备 物 研究 的 目的 及 分 析 鉴 定 方法 的 建立 前 已 提 到 ,分 离 制备 某 一 生物 组 份 的 目的 ,如 果 不 是 为 了 在 原 有 的 实验 方法 上 加 以 改 进 ， 以 求 得 更 多 更 纯 的 产品 ， 就 是 为 了 获得 新 的 物质 。 这 里 主要 涉及 的 问题 是 后 一 种 情 况 。 在 生物 化 学 研究 工作 中 , 新 组 份 的 分 离 常 常 是 科研 工作 主要 的 内 容 。 机 体内 一 个 新 _ 的 物质 的 发 现 , 对 了 解 有 机 体 的 生理 功能 具有 很 重要 的 意义 。 如 核酸 的 发 现 对 揭 开 生物 体 遗 传 变异 规律 之 谜 , 环 化 腺 一 磷 的 发 现 对 进一步 了 解 激素 和 代谢 调节 的 关系 , 反 向 转录 酶 的 发 现 对 于 了 解 RNA 控制 蛋白 质 的 合成 等 。 可 以 说 生物 体内 每 一 种 新 的 物质 的 发 现 ， 都 不 同 程度 地 推动 着 生物 化 学 甚至 整个 分 子 生物 学 前 进一步 。 通 过 科学 工作 者 的 长 期 劳 动 , 现 在 我 们 虽然 知道 了 很 多 机 体内 组 成 成 份 及 分 刻 的 物质 ,但 也 许 我 们 尚未 知道 的 东西 比 已 知 的 东西 数量 还 要 多 。 从 生物 不 断 变异 的 观点 来 看 人们 对 机 体内 组 成 的 物质 的 认 识 是 没有 尽头 的 。 从 机 体内 分 离 制备 一 种 未 知 物质 的 企图 ,通常 是 由 于 二 种 情况 引起 的 。 一 种 是 无 意 识 的 ,例如 ,在 进行 某 种 有 目的 的 实验 时 ,偶然 出 现 了 某 些 异 常 现 象 ,引起 了 研究 人 员 的 注 意 和 兴趣 ,从 而 进一步 去 追踪 研究 。 属 于 这 类 情况 往往 在 研究 者 获得 了 这 种 制备 物质 后 ， 开始 并 不 了 解 这 种 物质 的 生理 意义 或 实际 上 有 什么 用 处 。 只 有 经 过 一 定时 间 后 才 被 人 们 所 认识 。 这 种 开始 并 没有 固定 目的 的 实验 工作 , 对 于 应 用 研究 部 门 往往 容易 臣 忽 或 缺乏 深入 探索 的 兴趣 。 基 础 理论 研究 部 门 则 常 视 为 一 种 新 的 发 现 ,而 比较 重视 加 以 研究 。 第 二 种 情况 是 有 目的 的 ， 人 们 在 一 定 自 然 条 件 或 人 工 条 件 观察 到 某 种 异常 的 生物 学 或 生物 化 学 现象 ， 从 而 有 意识 地 追踪 研究 引起 这 种 现象 发 生 的 物质 基础 。 这 种 例子 在 科研 工作 中 是 很 多 的 。 如 根据 细菌 生长 被 抑制 的 情况 有 目的 分 离 某 种 新 的 抗菌 素 , 根 据 某 些 物 质 对 动 \ 植 物 的 代谢 调节 所 引起 的 作用 探求 新 的 激素 ,根据 昆虫 某 些 特殊 生理 反应 研究 它们 所 = 19 分 这 的 通讯 物质 ， 以 及 从 机 体内 某 种 代谢 中 间 产 物 的 积累 寻找 催化 这 一 反应 的 酶 等 等 。 属于 这 类 有 了 既定 目的 而 设计 的 分 离 制备 实验 方案 , 效果 一 般 比 较 显 著 。 建立 相应 的 分 析 鉴定 方法 也 比较 容易 ;获得 制备 物 后 对 其 生理 意义 及 实用 价值 事前 也 已 有 一 定 的 认识 。 生化 分 离 制备 实验 目的 性 尽管 有 不 同 , 当 一 旦 着 手 进 行 实验 工作 时 ,都 必须 首先 建立 对 制备 物 的 分 析 鉴 定 方法 ,才能 保证 分 离 制备 工作 顺利 进行 ,指导 生化 物质 分 离 制备 工作 的 分 析 鉴定 方法 大 致 可 分 为 三 种 类 型 : 1. 生物 测 定 方法 ”对 一 个 未 知 结构 的 新 物质 ， 生 物 测定 方法 常常 比 一 般 物理 化 学 方法 具有 更 大 优越 性 , 且 是 实验 取得 成 功 必 不 可 少 的 一 步 , 生 物 测 定 方法 全 面 涉 及 生物 学 各 科 的 实验 内 容 , 如 微生物 学 、 细 胞 学 .生理 学 、 组 织 解剖 学 、 药 理学 及 动 植物 形态 分 类 学 等 。 一 个 生物 测定 方法 的 建立 ， 必 须 选 择 适 当 的 生物 对 象 ， 继 而 决定 测试 的 生物 反应 类 型 ,如 细菌 的 生长 或 抑制 ,肌肉 的 舒张 或 收缩 , 某 种 器 官 呈现 抑制 或 兴奋 反应 ,血压 的 升 高 或 降低 , 受到 试验 物质 刺激 后 某 种 组 织 分 泌 物 增加 或 减少 等 。 然后 在 这 些 定性 反应 基础 上 进一步 建立 生物 反应 的 定量 标准 。 生物 测定 方法 很 多 , 而且 每 一 测定 方法 具体 规定 标 准 及 条 件 各 不 相同 ,其 详细 内 容 的 介绍 可 参看 有 关 专 著 及 资料 Ba。 2. 理化 测定 方法 ”这 是 最 常用 最 方便 的 分 析 测定 方法 ， 生 物 测 定 方法 虽 有 很 高 特 异性 ,但 手续 繁琐 ,对 于 指导 分 离 制备 实验 的 进行 ,时 间 上 太 受 限制 。 因 此 ,对 于 一 个 未 知 化 学 结构 的 物质 ,如 生物 反应 测定 确定 其 存在 后 ,应 立即 着 手 建立 理化 测定 方法 。 理 化 测 定 方法 的 建立 一 般 是 先进 行 预 试 ,初步 肯定 该 物质 属于 那 一 类 有 机 物 , 然 后 按 各 类 有 机 物 质 的 特殊 物理 化 学 性 质 建 立定 性 、 定 量 鉴定 方法 这 类 方法 常 有 : (1) 24%: 包括 染色 和 比 色 法 。 (2) 色谱 法 : 包括 纸 上 色 谱 、 薄 层 色谱 `\ 气 相 色 谱 和 高 效 液 相 色谱 等 。 (3) 光谱 法 : 包括 紫外 光谱 \ 红 外 光谱 、\ 荧 光 光 谱 等 。 (4) 电泳 法 : 包括 纸 电泳 , 凝 胶 电 泳 等 。 (5) 核磁 共振 波谱 法 。 (6) 其 他 : 如 电子 显微镜 观察 。 理化 测定 方法 的 最 大 优点 是 实验 操作 简便 快速 ,能 及 时 指导 分 离 制备 工作 。 3. 理化 方法 与 生物 学 方法 结合 测定 ”对 于 某 些 生物 体内 含量 较 低 ， 或 所 建立 的 理 化 测定 方法 的 特异 性 和 灵敏 度 不 足以 反映 该 物质 定性 与 定量 的 要 求 时 ， 常 需要 结合 生物 学 测定 方法 才能 全 面 地 准确 地 反映 该 物质 的 存在 情况 。 例如 Kaslson 和 Schmialak 根据 生物 反应 知道 是 也 存在 晓 皮 激 素 并 借用 昆虫 中 提取 晓 皮 酮 的 方法 企图 从 是 提取 这 种 物 质 , 由 于 使 用 的 理化 分 析 方法 不 够 灵敏 和 分 离 流程 的 不 合理 ,用 了 三 千 公 斤 虾 为 实验 材料 而 毫 无 所 获 。 后 来 Hampshire 和 Horn 以 丽 蝇 (Calliphora) 的 生物 测定 为 指导 ， 并 结合 理化 分 析 方 法 ,改进 了 实验 分 离 流程 , 才 由 一 千 公 斤 虾 的 废 液 中 成 功 地 分 离 了 2mg ARSE AOL ZAM: 又 如 从 家 短 中 提取 家 乔 醇 , 使 用 气相 层 析 方法 和 竺 峨 兴奋 反应 相 结合 ， 使 分 离 制备 流程 效果 大 大 提高 。 理化 分 析 方 法 与 生物 学 测定 方法 相 结合 ,用 于 各 类 抗菌 素 、 信 息 素 \ 激 素 、 维 生 素 和 各 种 具有 生理 活性 的 生化 药物 的 定性 及 定量 相当 普遍 。 不 论 是 生物 学 方法 或 物理 化 学 方法 或 是 二 者 结合 使 用 ， 一 个 好 的 分 析 鉴 定 方法 必须 WED BBE: « 10 « 1. 特异 性 或 专 一 性 强 ; 2. 重 现 性 好 ; 3. 准确 度 大 ; 4. 灵敏 度 高 ; 5. 手续 简便 ; 分 析 方 法 的 特异 性 或 专 一 性 ,对 于 整个 分 离 纯 化 实验 的 成 功 与 否 非常 重要 。 一 个 特异 性 高 的 分 析 方 法 的 建立 是 分 离 一 个 未 知 结构 的 化 合 物 的 指南 针 ， 如 果 分 析 方 法 特异 性 不 高 ,分 离 工作 前 进 方向 不 明 , 必 然 造 成 错误 的 结果 。 一 个 分 析 方 法 的 特异 性 除了 方法 本 身 因素 外 ,与 环境 因子 关系 十 分 密切 。 特 别 在 分 离 纯化 初始 阶段 ,各 种 干扰 物质 大 量 存 在 情 况 下 ,一 个 专 一 性 高 的 分 析 方法 更 显得 重要 , 但 除了 极 个 别 情况 外 , 很 少 有 绝对 专 一 的 分 析 方 法 。 所 以 为 了 提高 分 析 方 法 的 特异 性 , 常常 需要 把 起 始 材 料 中 干扰 成 份 减少 到 最 低 量 , 或 尽量 选择 适当 条 件 使 干扰 物质 不 起 作用 。 选 用 制备 物质 含量 较 丰 富 的 材料 ,也 可 大 大 提高 分 析 方 法 的 特异 性 。 重 现 性 或 称 重 复 性 , 是 指 分 析 结 果 能 经 受 起 时 间 的 考验 重复 测 出 的 程度 。 重 现 性 的 获得 主要 是 认真 规定 每 次 的 实验 条 件 ,包括 分 析 仪 性 装 置 , 试剂 药品 的 标准 度 , 样品 的 浓 度 , 操 作 方 法 及 材料 的 来 源 、 保 存 和 处 理 等 。 如 果 把 样品 . Wks ANSARI, 分 析 方 法 的 重 现 性 ,主要 和 实验 人 员 主 观 因素 有 关 a 分 析 方 法 的 准确 度 主要 反映 在 定量 测定 上 的 误差 范围 。 在 一 般 情 况 下 对 分 析 方 法 要 ” 求 的 准确 度 当 然 越 高 越 好 ,但 在 生化 制备 过 程 中 ,制备 物 由 一 个 混杂 体系 逐步 向 一 个 纯粹 单一 的 物质 过 渡 , 开 始 时 杂质 的 干扰 是 不 可 避免 的 ,因此 ,分 离 提纯 每 一 阶段 ,定量 上 存在 的 误差 只 要 不 影响 分 离 提纯 工作 沿 着 正确 方向 进行 , 即 可 满足 测定 要 求 。 有 的 分 析 的 精 确 度 甚至 可 以 粗略 到 用 正 反应 (十 ) 或 负 反应 (一 ) 表 示 ， 也 能 获得 很 好 分 离 效 果 。 所 以 在 分 离 制备 过 程 中 ,分 析 工 作 的 特异 性 和 重 现 性 在 某 种 意义 上 比 要 求 精 确 度 更 为 重要 一 些 。 灵敏 度 是 指 制备 物 在 某 一 体系 中 含量 的 可 测度 。 换 句 话说 ， 即 我 们 使 用 的 分 析 方 法 对 制备 物 所 能 测 出 的 最 低 含量 是 多 少 。 在 分 离 纯化 开始 阶段 或 所 用 原料 含 制备 物 的 量 较 低 时 ,高 灵敏 度 的 分 析 方 法 显得 比较 重要 些 。 此 外 ,高 敏 度 的 分 析 方 法 在 多 步骤 的 分 离 提 纯 工 艺 六 程 中 ,可 以 帮助 收回 一 部 分 产品 ,达到 节省 原料 消耗 ,增加 产量 的 目的 。 最 后 谈 谈 分 析 工 作 操 作 手 续 的 繁 简 与 指导 分 离 纯化 实验 的 关系 ， 人 们 往往 存在 这 样 一 个 倾向 , 即 言 目 追 求 某 一 分 析 方 法 的 特异 性 或 灵敏 度 等 指标 ,而 忽视 操作 手续 简便 的 重 要 性 ， 这 对 于 一 些 代谢 速度 较 快 或 者 容易 失去 生理 活性 的 物质 的 制备 ， 将 是 一 严重 的 错 误 。 生 化 分 子 一 般 都 是 一 些 具 有 生理 活性 的 物质 或 代谢 的 中 间 产 物 , 因 此 ,人 向 便 快 速 的 分 析 测 定 方法 有 着 重要 意义 。 人 们 在 提取 一 个 代谢 速度 较 快 的 中 间 产 物 时 , 往往 宁愿 要 一 个 快速 简便 而 精确 度 较 差 的 方法 ,而 不 要 一 个 繁琐 费时 而 高 精确 的 方法 ,这 似乎 是 一 个 普 通 的 原则 。 (=) 制备 物 的 物理 化 学 性 质 及 稳定 性 的 预备 试验 “” 制备 物 的 理化 性 质 及 稳定 性 的 预 试 验 是 对 一 个 未 知 物质 分 离 制备 实验 设计 的 基础 。 许多 生化 物质 在 有 机 体 特 定 环境 中 比较 稳定 ， 一 旦 离开 机 体 后 容易 受 外 界 条 件 影响 而 失 活 。 因 此 ,在 各 个 阶段 的 分 离 纯化 步骤 中 , 都 必须 在 制备 物 的 稳定 条 件 范 围 内 进行 , 以 保 * il. 证 被 分 离 物质 不 受 破坏 。 设计 一 个 未 知 结构 的 生化 物质 的 分 离 纯化 实验 方案 , 通常 所 涉 及 的 预备 试验 项 目 如 表 1-5 所 示 : 表 1-5 分 离 制备 物质 的 预备 试验 项 目 表 A; 溶解 性 能 1 .在 水 或 各 种 稀 盐 咨 液 中 的 溶解 性 能 ; 2. 在 弱 极 性 溶剂 中 溶解 性 能 (如 甲醇 乙醇 \ 丙 酮 等 ); 3. 在 各 种 非 极 性 溶剂 中 的 溶解 性 能 (如 蛇 仿 和 各 种 兹 类 等 关 B: 深 流 稳定 性 l.pH 稳定 范围 ; 2. 温 度 效 应 ; 3. 各 种 缓冲 咨 液 的 影响 ; 4. 有 机 咨 剂 (如 乙醇 丙酮) 的 影响 。 C: 固态 时 稳定 性 1. 温 度 影 响 ; 2. 水 份 含量 的 影响 ; 3. 低 压 冻 干 效应 。 D: 物理 性 质 1 . 透 过 不 同 大 小 孔径 膜 的 能 力 ; 2. 在 固体 上 的 吸附 作用 ， 3. 在 电场 中 每 一 pH 变化 的 迁移 值 ; 4. 在 超 离心 力 场 中 的 沉降 作用 。 E: 化 学 性 质 : ile A DA ok Ye FW Hs 2.%} DNase 和 RNase 作用 的 稳定 性 ; 3. 对 糖 类 分 解 酶 作用 的 稳定 性 ; 4. 在 温和 条 件 下 乙酰 化 作用 的 稳定 性 ; 5. 对 亚 硝酸 作用 的 稳定 性 ; 6. 在 温和 条 件 下 酯 化 作用 的 稳定 性 。 表 中 所 列 项 目 较 繁 多 ,不必 在 实验 一 开始 便 全 部 进行 试验 , 先 选 择 某 些 预 试 项 目 , 其 结果 能 说 明 一 个 未 知 物 的 主要 物理 、 化 学 性 质 就 够 了 。 例 如 未 知 物 是 极 几 还 是 非 极 性 化 合 物 , 是 电解 质 还 是 非 电解 质 , 是 大 分 子 还 是 小 分 子 及 pH (AVE, eens. 至 于 其 他 一 些 细 目 ,往往 需要 结合 分 离 制备 过 程 出 现 的 具体 情况 ,有 必要 时 , 才 进 一 步 加 以 测试 。 在 上 表 所 列 到 各 预测 项 目 中 , 溶解 性 能 的 测定 是 指导 制备 物 的 提取 、 议 淀 、 结 晶 的 基 础 。 必 须 最 先 完 成 ， 然 后 在 此 基础 上 ， 求 出 pH 值 `, 旭 度 、 离 子 强度 对 制备 物 溶解 度 及 稳 定性 的 影响 ,以 便 在 溶 被 中 找 出 最 适 提纯 条 件 。 对 于 绝 大 多 数 生化 物质 来 说 ,只 有 在 一 定 pH 值 、 温 度 及 离子 强度 下 进行 分 离 纯 化 才能 保证 其 活性 不 受 损 失 , 这 方面 内 容 在 本 节 以 后 几 章 中 还 详细 讨论 ,在 这 里 需要 指出 的 是 制备 物 在 分 离 过 程 中 , 随 着 其 他 成 份 不 断 被 除 去 ,原来 B 项 试验 有 关 的 化 学 性 质 将 有 所 改变 ,这 点 应 随时 予以 注意 。 物理 性 质 的 试验 主要 了 解 制备 物 的 分 子 大 小 、 形 状 及 带电 性 质 。 在 电场 中 可 逆 移 动 胸 方 向 及 进行 离子 交换 树脂 或 离子 交换 纤维 素 的 试验 ， 可 判断 此 未 知 物 是 否 属于 两 性 电 解 质 及 其 带电 荷 性 质 与 数量 情况 。 其 次 进行 某 些 吸附 试验 (如 活性 碳 、 硅 胶 、 氧 化 铝 、 磷 酸 钙 等 的 吸附 试验 ) 可 以 帮助 分 离 初期 制备 物 在 选择 方法 上 的 设计 。 吸附 作用 可 起 到 浓 缩 收集 作用 ,但 注意 活性 碳 和 硅胶 的 吸附 作用 不 适宜 蛋白 质 及 核酸 衍生 物 , 因 为 活性 碳 和 硅胶 对 这 些 物 质 的 吸附 常常 是 不 可 逆 的 ,不 仅 洗 脱困 难 , 而 且 容易 造成 变性 失 活 。 膜 透 过 e126. 性 、 分 子 筛 层 析 及 超 离 心 沉降 作用 的 试验 ， 主 要 是 为 了 获得 制备 物 分 子 大 小 及 形状 的 证 据 , 在 制备 中 后 期 的 提纯 是 十 分 有 用 的 。 但 这 种 试验 只 竺 分离 工作 到 了 一 定 程度 后 才 按 需要 进行 。 到 了 分 离 纯化 的 后 期 ,半成品 和 成 品 保存 的 温度 及 水 份 含 量 对 其 稳定 性 的 影 响 也 很 重要 ,大 多 数 生化 物质 固 相 保 存 都 要 低温 ,干燥 (但 也 不 是 温度 越 低 、 含 水 量 越 少 越 好 7) 还 有 些 生化 物质 除了 对 温度 含水 量 敏感 外 ,对 光线 \ 气 体 及 某 些 微量 金属 也 十 分 敏感 。 分 离 后 期 的 产品 如 以 液态 保存 ,影响 其 稳定 性 因素 更 多 ,更 不 可 有 所 忽视 ,否则 辛苦 制 得 的 样品 最 后 受到 破坏 或 损失 是 令 人 痛心 的 。 各 种 样品 的 保存 方法 在 本 书 最 后 一 章 还 将 详 细 讨 论 。 分 离 制备 物 如 果 是 一 复合 成 份 ， 或 某 制 备 物 的 生理 活性 与 分 子 内 某 一 基 团 或 分 子 外 某 一 辅 基 有 关 , 则 其 他 一 些 预 备 试验 便 不 能 获得 正确 的 结果 。 此 时 常 将 复合 物 拆 离 ,决定 其 中 那 一 组 份 是 所 要 制备 的 部 分 。 有 些 蛋白 质 和 酶 , 其 生理 活性 与 分 子 上 某 一 氨基 、 羧 基 或 产 基 有 关 ， 在 温和 条 件 下 进行 硝化 ， 乙 酰 化 及 酯 化 试验 ,， 便 可 推测 这 些 分 子 大 致 化 学 性 质 。 还 有 些 酶 ， 其 生理 活性 与 金属 离子 和 小 分 子 辅 基 有 关 ， 常 用 透析 或 超 离心 沉降 方法 ， 观 察 其 失 活 及 重组 后 复活 的 过 程 ， 便 从 中 了 了 解 到 整个 复合 分 子 中 各 组 份 的 关 Fo 总 之 ,在 整个 实验 的 设计 时 ,对 制备 物 各 项 稳定 性 及 一 些 理化 性 质 的 预 试验 是 整个 研 究 工 作 最 费 精 力 及 时 间 的 部 分 ,但 也 是 不 可 缺少 的 部 分 s (=) 材料 处 理 及 提 可 方法 的 选择 选择 材料 主要 根据 实验 的 目的 而 定 ， 同 一 种 物质 由 于 进化 的 关系 通常 在 不 同 种 类 的 生物 体 中 都 有 存在 。 从 工业 生产 角度 上 来 考虑 ,首先 是 材料 来 源 丰 富 , 含 量 高 、 成 本 低 。 有 时 材料 来 源 丰富 但 含量 不 高 ,或 者 材料 来 源 , 含 量 都 很 理想 ,而 材料 中 杂质 太 多 ,分 离 纯化 手续 十 分 繁琐 ,以 致 影响 质量 和 收 率 , 反 不 如 含量 低 些 但 易于 操作 获得 纯 品 者 。 因 此 ， 必 须根 据 具 体 情况 , 抓 住 主要 矛盾 而 决定 取舍 。 但 为 了 科学 实验 某 种 特殊 需要 ,例如 对 某 种 材料 或 某 一 生物 品种 中 寻找 某 种 未 知 物质 ,选材 时 则 无 需 全 面 卷 虑 上 述 问题 ,只 能 达到 实 验 目 的 即 可 。 三 与 无 栅 物 不 同 , 生物 体内 某 种 成 份 不 是 一 成 不 变 的 。 如 植物 材料 所 含 各 种 成 份 常 随 季节 和 生长 时 期 而 变化 ， 动 物 材料 中 的 各 种 组 份 处 于 不 同 生 理 状 态 也 有 很 大 差别 。 微 生 物 材 料 中 的 各 种 组 份 的 变化 受 环境 因子 影响 尤为 显著 ， 培 养 基 的 成 份 _pH、 度 的 影响 外 ;诱导 物 、 抑 制剂 的 落 加 都 可 以 大 大 增加 所 需 物 质 的 含量 。 菌 种 的 筛选 、 诱 变 已 是 人 们 所 芍 悉 的 提高 微生物 体内 某 种 物质 含量 最 常用 的 方法 。 此 外 ,近年 来 使 用 转 导 、\ 核 酸 重组 即 遗 传 工程 等 新 方法 已 使 细菌 中 一 些 原 来 含量 很 少 的 物质 大 量 增加 ， 原 来 没有 的 物质 成 份 , 也 可 以 通过 遗传 工程 方法 ,使 之 产生 。 当然 后 者 不 属于 材料 选择 讨论 范围 , 但 这 些 都 说 明生 物 材 料 所 含 的 组 分 并 不 是 一 成 不 变 的 ， 必 须 因 时 因 地 和 根据 实验 的 目的 要 求 而 具 体 解 决 。 一 个 材料 选择 是 否 合理 ,不 仅 关系 到 实验 进行 的 难 易 , 而 且 常 常 是 导致 实验 的 成 败 的 原因 。 实验 材料 选 定 后 ,常常 需要 进行 预 处 理 , 如 动物 材料 要 除去 一 些 与 实验 无 关 甚 至 有 防 -和 碍 的 结缔 组 织 , 脂 肪 组 织 和 人 血 污 等 , 植物 种 子 需要 除 壳 ,微生物 材料 需 将 菌 体 和 发 酵 液 分 开 等 。 材 料 处 理 及 洗 净 以 后 ,下 一 步 就 是 选用 适当 方法 将 组 织 细胞 破碎 ,进行 抽 提 。 材 料 ea 3wa 让 被 制备 物质 的 存在 形式 及 部 位 与 组 织 破 碎 及 抽 提 方法 有 直接 关系 ,必须 在 实验 前 有 所 了 了 解 。 如 属 体 液 \. 血 液 中 的 游离 物质 或 生物 体 分 泌 到 体外 的 分 废物 , 则 不 必 进 行 组 织 细胞 的 破碎 。 但 细胞 内 含 物 不 论 存在 于 哪些 部 位 《如 在 膜 上 ， 0 均 需 采取 不 同 方法 进行 细胞 破碎 。 组 织 细胞 的 破碎 方法 很 多 ,有 机 械 方法 ,物理 方 读 ,化 学 及 生物 化 学 方法 等 。 不 同 实 验 规模 ,不 同 实验 材料 和 实验 要 求 , 使 用 的 破碎 方法 和 条 件 也 不 同 。 例 如 一 些 坚韧 组 织 如 肌肉 ,植物 的 根茎 等 , 则 常 需 强 烈 的 绞 碎 或 研磨 作用 ,才能 把 其 组 织 细胞 破坏 。 而 比较 柔 软 的 组 织 如 肝 、 脑 等 ， 用 普通 的 玻璃 匀 浆 赤 即 可 达到 完全 破坏 细胞 的 目的 。 同 样 生 种 实 验 材 料 ,但 制备 大 分 子 量 的 核酸 和 制备 小 分 子 的 核 背 酸 , 对 细胞 破碎 的 方法 和 条 件 也 不 相 同 ,后 者 可 以 采用 强烈 手段 , 而 前 者 则 必须 保持 十 分 温和 的 条 件 ， 二 完整 性 。 组 织 细胞 破碎 常用 方法 有 如 下 几 种 : 1. 机 械 法 ”主要 通过 机 械 切 力 的 作用 使 组 织 细胞 破碎 的 方法 ， 常 用 的 器 械 有 组 织 的 碎 机 ，, 匀 浆 器 , 研 钵 和 了 研磨 \ 压 榨 器 等 。 CL) 组 织 的 碎 机 : 一 般 用 于 动物 组 织 , 植物 肉质 种 子 ， ZMH, FSM RARE 国产 的 的 碎 机 最 高 转速 可 达 每 分 钟 1 一 2 万 转 。 由 于 旋转 刀片 的 机 械 切 力 很 大 ,制备 一 些 较 大 分 子 如 核酸 则 很 少 使 用 。 (2) Dias: DIR ATT EK ARS A EZ RR TS ZL SOR BB Ho RMA ERAS Aili. MPO AME, RRR, WA ee BAG A, Ase Dee he S ta Ko (3) 研磨 : “多 用 于 细菌 或 其 他 坚硬 植物 材料 ,研磨 时 常 加 入 少量 石英 砂 ; 玻 璃 粉 或 其 他 研磨 剂 ,以 提高 研磨 效果 。 细 菌 磨 是 一 种 改良 了 的 研磨 器 , 比 一 般 研 钵 具有 更 大 的 研 磨 面 积 ,而 且 底 部 有 出 口 。 操 作 时 先 把 细菌 和 研磨 粉 调 成 糊 状 , 每 次 加 入 磨 内 一 小 勺 ， 研 磨 20 一 30 秒 钟 即 可 将 细菌 细胞 完全 破碎 。 (4) 其 他 大 型 细胞 破碎 器 : 如 French 压榨 器 Manton-gaulin 匀 浆 器 等 , 主要 是 高 压 下 使 细胞 通过 小 孔隙 而 被 挤 碎 , 每 小 时 可 处 理 数 十 升 至 数 干 升 样品 ,适用 于 微生物 发 酵 工 业 生 产 。 2.72% ”主要 通过 各 种 物理 因素 使 组 织 细胞 破碎 的 方法 。 在 生化 制备 中 常用 的 有 : C1) 反复 冻 融 法 : 先 将 样品 深 冷 至 一 15%C B— 20°C 使 之 冻 固 , 再 缓慢 地 融化 , 反 复 多 次 可 将 大 部 分 细胞 破碎 ,此 法 多 用 于 动物 性 材料 。 (2) ARBRE: 将 样品 材料 投入 沸水 , 维持 85—90°C 数 分 钟 后 , 置 冰 浴 中 急速 冷 却 ， 使 细胞 壁 结构 受到 破坏 。 此 法 可 用 于 细菌 及 病毒 材料 ， 但 制备 对 热 敏感 的 物质 时 愤 Filo (3) 超声 波 处 理 : 此 法 多 用 于 微生物 材料 ， 频 率 一 般 选 在 10KC 至 200KC, 功 率 200 一 500 瓦 范围 , 对 于 不 同 细菌 , 应 视 具 体 情 况 而 定 。 处 理 时 间 有 数 分 钟 至 数 十 分 钟 不 等 。 处 理 效 采 和 样品 浓度 及 使 用 功率 有 关 。 在 处 理 过 程 中 如 溶液 温度 升 高 时 ,注意 冷却 。 3. 化 学 及 生物 化 学 法 ”主要 有 自 溶 法 , 酶 解法 和 表面 活性 剂 处 理 法 等 。 《1) ABE: 自 溶 法 是 在 一 定 的 pH 和 适当 的 温度 下 ， 利 用 组 织 细胞 内 自身 的 酶 系 统 将 细胞 破碎 的 方法 。 自 溶 法 所 需 时 间 较 长 , 常 添加 少量 防腐 剂 如 甲苯、 氧 仿 等 防止 细菌 es 14 。 的 污染 。 C2) 酶 解法 : 利用 各 种 水 雇 酶 如 溶菌 酶 ,纤维 素 酶 “蜗牛 ?二 半 纤 纵 素 酶 : 壳 糖 酶 . 脂 酶 等 专 一 性 地 将 细胞 壁 分 解 ,使 细胞 内 合 物 释放 出 来 。 适用 于 制备 大 分 子 核酸 材料 的 破 壁 。 有 些 细菌 对 溶菌 酶 不 敏感 ,加 入 少量 琉 基 试剂 或 8M 脲 素 处 理 后 ,使 转 为 对 溶菌 酶 敏 感 而 融 溶 。 (3) 表面 活性 剂 处 理 : 如 十 二 烷 基 确 酸 钠 、 毛 化 十 二 烷 基 吡 啶 ,去 氧 胆 酸 钠 等 均 对 细 胞 膜 有 一 定 破坏 作用 。 此 外 ,使 用 真空 干燥 及 冷 丙酮 处 理 制 成 < 丙酮 粉 " 均 可 以 改变 细胞 的 透 性 ,不 同 程度 地 破坏 细胞 膜 结构 ,以 利于 提取 。 :有 时 为 了 防止 其 他 细胞 组 份 中 的 物质 对 制备 物 和 干扰 或 污染 ， 或 由 于 对 细胞 组 分 上 某 一 物质 进行 特殊 研究 的 需要 , 常 将 各 种 细胞 器 先行 分 离 , 然 后 在 某 一 细胞 器 中 提纯 某 一 物 质 。 细 胞 组 份 的 分 离 , 一 般 使 用 差 速 离心 法 ,即将 破碎 后 的 细胞 在 适当 介质 中 进行 离心。 常用 的 介质 有 生理 盐水 ， 芒 糖 或 葡萄 糖 - 聚 乙 二 醇 等 高 分 子 溶液 。 各 种 细胞 组 份 按照 质 量 ` 大 小 不 同 ,经 过 不 同 速度 的 离心 后 ， 便 沉降 于 离心 管 不 同 部 位 ， 经 过 多 次 分 步 离心 分 离 ;, 即 可 获得 所 需要 组 份 。 组 织 细胞 破碎 过 程 中 ,大 量 胞 内 酶 及 细胞 内 含 物 被 释放 出 来 , 须 立 即 选择 适当 条 件 进 行 提取 分 离 ,各 免 因 长 久 放 置 造 成 制备 物 的 分 解 破坏 。 提取 是 分 离 纯 化 的 第 一 步 ， 它 将 制备 物 从 复杂 的 生物 体系 中 转移 到 特定 的 人 工 液 相 体系 中 (通常 是 水 、 缓 冲 液 , 稀 盐 溶液 或 有 机 溶剂 )。 提 取 所 用 溶剂 的 选择 标准 首先 对 被 制 SORA BABE ,并 在 提取 中 应 尽 可 能 减少 一 些 不 必要 的 成 份 。 为 了 更 好 地 达到 以 上 两 个 目的 ,常用 的 手段 是 调整 溶剂 的 pH 值 、 离 子 强度 、 溶 剂 成 份 配 比 和 温度 范围 等 。 关 于 提取 方法 本 书 第 二 章 另 有 详细 介绍 ,这 里 不 再 玖 述 。 R16 供 选择 分 离 某 些 生 物 分 子 的 方法 时 参考 一 | 一 一 | 一 一 一 -一 | 一 -| 一 -一 一 一 nga | 吸附 柱 气 -六 色谱 ist 通 透 色谱 色谱 逆流 分 溶 | 离 子 交 换 | 亲 和 色 谱 | 电泳 ”| 超速 离心 氨基 酸 ++ 一 一 ++ ++ 二 HH 一 ++ = Bik ++ 一 十 一 ++ ++ 一 ++ 一 Ban * 二 一 二 一 十 十 eH) +++ ++ My [Mae + +t 一 一 it + ey 一 + — 核酸 一 4 Pe: et 一 | ++ 5 一 +442) + +++ 2A Be 十 十 十 十 + 一 十 十 一 十 一 十 = FERNS RB = - or +++ a aa = = = ++ 脂肪 酸 oe + | 一 +e 一 一 一 一 = BRE + | + 1, | - - ~ -- - Bee kKR | a ss ‘a 叶绿素 | | FB? 7024 [el BF 1) 可 以 使 用 的 情况 下 ,十 ,一 表示 选择 适宜 程度 。( 十 ) 示 适宜 (++) 较 适宜 、 (rt+) 最 适宜 并 一 ) 示 不 适宜 。 (四 ) 分 离 纯化 方法 的 摸索 分 离 纯 化 是 整个 生化 制备 过 程 的 核心 部 分 。 生物 体 的 组 成 成 份 干 干 万 万 种 , 分 离 纯 化 的 实验 方案 也 千变万化 。 没有 一 种 分 离 纯化 方法 可 适用 于 所 有 物质 的 分 离 纯 化 , 一 种 物质 也 不 可 能 只 有 一 种 分 离 纯化 方法 。 所 以 对 于 某 一 种 物质 , 究竟 选用 什么 分 离 纯化 方 法 最 理想 ， 主 要 是 根据 该 物质 的 物理 化 学 性 质 和 具体 实验 条 件 而 定 。 认 真 参考 借鉴 前 人 经 验 可 以 避免 许多 言 目 性 ,节省 实验 摸索 时 间 。 即 使 是 分 离 一 个 新 的 未 知 组 份 ,根据 分 析 和 预 试 验 的 初步 结果 ,参考 别人 对 类 似 物质 分 离 纯化 经 验 , 也 可 以 帮助 少 走 些 弯 路 。 威 廉 Ht (Williams) 和 威 尔 了 还 〈《Wilkgon) 等 根据 一 般 规 律 性 对 各 种 分 离 纯化 方法 适用 于 什么 物 质 的 作用 ,提出 了 很 好 的 意见 ，( 详 见 表 1-6) ”摩尔 里 斯 (Morris) 等 对 于 各 种 分 离 方 法 中 所 依据 溶质 的 物理 化 学 性 质 ， 作 了 一 个 分 类 表 ( 苑 表 -1-7)5 均 可 供 读者 参考 。 表 1-7 以 溶质 物理 性 质 为 基础 的 各 种 分 离 方法 | 4 + HH Efe pp tk: 分 子 大 小 分 子 电 荷 氢 键 结合 蕊 水 键 结合 色谱 吸附 3 +++ 分 配 十 十 十 +++ 离子 交换 树脂 +H +H = cea | = ++ 一 SF +++ ~ ag 气相 一 十 十 十 + 十 逆流 分 配 + + +H 电泳 自由 盗 液 ++ 十 + 十 一 一 聚 乙烯 介质 TF +++ = — 纤维 素 十 十 +++ + 一 BeBe +++ tet + =o 等 电 聚 焦 主 +++ 三 = 沉降 pat = 一 宇 ERE BCR UT AT ++ ++ aE + igs fe BE + ++ +++ +++ 二 、 分 离 纯化 各 阶段 对 实验 技术 的 选择 这 是 一 个 十 分 灵活 掌握 而 且 难 以 统一 规定 的 问题 ,但 是 也 不 是 说 没有 一 点 规律 可 循 。 现 根据 文献 介绍 的 经 验 和 一 般 原则 ,对 分 离 纯化 各 阶段 对 各 种 方法 的 选择 作 简单 的 讨论 : (一 ) 分 离 纯化 的 早期 使 用 方法 的 选择 分 离 纯 化 的 早期 由 于 提取 液 中 的 物质 十 分 复杂 , 制备 物质 浓度 较 稀 ,\ 在 理化 性 质 二 与 被 制备 物 相 似 的 杂质 ,数量 较 多 。 因此 在 这 一 阶段 选用 一 些 分 辩 能 力 较 高 的 分 离 纯化 方法 一 般 认 为 不 大 合适 。 原因 是 一 种 高 分 辩 率 的 分 离 纯化 方法 在 大 量 杂 质 存在 下 , 不 论 是 根据 物质 分 子 大 小 或 物质 带电 性 质 而 进行 分 离 ， 都 不 可 能 使 被 分 离 的 物质 集中 于 一 个 es 16 。 区 域 。 只 可 能 在 预定 区 域 中 得 到 一 些 理 化 性 质 相 近 的 同类 物 , 而 把 真正 要 分 离 的 成 份 沁 掉 。 出 现 这 种 现象 的 主要 原因 , 是 高 分 辩 率 的 分 离 方 法 在 杂质 多 的 情况 下 位 置 效 应 比较 严重 ,大 批 理 化 性 质 相 近 的 分 子 在 相同 分 离 条 件 下 ,彼此 在 电场 中 或 力 场 中 相 竞 占据 某 一 位 置 。 这 样 ， 被 目的 物 占据 的 机 会 就 很 少 ， 或 者 分 散在 一 个 很 长 区 域 中 而 无 法 集中 于 一 点 。 高 分 辨 效力 的 分 离 方法 大 部 分 是 根据 物质 二 个 以 上 理化 因素 而 建立 的 , 如 区 带电 泳 和 凝 胶 电 泳 是 根据 分 子 大 小 及 带电 数量 而 进行 分 离 的 ,一 次 分 离 物 质 的 量 不 大 , 即 负荷 能 力 都 比较 小 。 如 电泳 法 虽 有 较 高 分 离 能 力 , 但 如 果 早 期 使 用 电泳 法 ,不 仅 得 不 到 理想 效 末 而 且 活 杂 着 大 量 类 似 物 ,给 以 后 纯化 工作 带 来 更 大 困难 。 早期 分 离 纯化 用 萃取 \ 沉 淀 \ 吸 附 等 一 些 分 辨 力 低 的 方法 比较 有 利 。 这 些 方法 不 仅 负 荷 能 力 大 ,一 次 分 离 的 量 多 ,同时 可 以 除去 大 部 分 理化 性 质 相 差 较 大 的 杂质 。 萃 取 、\ 沉 证 、 吸附 分 离 方 法 既 起 着 分 离 提 纯 的 作用 ,又 起 着 浓缩 的 作用 ,可 为 以 后 进一步 分 离 纯 化 创造 良好 的 基础 。 离子 交换 树脂 分 离 有 时 也 用 于 早期 纯化 ， 如 搅拌 交换 或 短 胖 柱 交换 方法 用 于 发 酵 液 中 分 离 浓缩 抗菌 素 比较 常见 。 纤 维 素 离子 交换 色谱 也 常 直 接 用 于 粗 抽 提 液 中 进行 多 种 蛋 白质 的 制备 ,没有 出 现 明 显 的 同位 效应 ， 且 具有 较 高 的 负荷 能 力 。 其 中 的 DEAE- 纤 维 素 特别 适 于 从 中 性 或 碱 性 蛋白 质 中 分 离 纯化 酸性 蛋白 质 。 实 验 时 , 先 将 上 柱 液 调 到 pH 4.0~ 4.5 通过 DEAE- 纤 维 素 柱 时 ,酸性 蛋白 质 被 吸附 ,其 他 杂质 及 非 酸性 蛋白 质 不 被 吸附 ,从 下 面 流出 。 然 后 进行 洗 脱 和 浓缩 * 这 样 一 步 分 离 后 得 到 的 酸性 蛋白 质 纯 度 可 提高 许多 倍 。 据 A. Atkinson 报道 ,早期 使 用 DEAE- 纤 维 素 、. 羟 基础 灰 石 ， 从 B. Stearothermophilus & 体 细胞 提取 液 中 ,同时 分 离 了 十 多 种 酶 ,已 达到 了 工业 生产 规模 水 平 …。 亲 合 色谱 法 由 于 具有 极 高 生物 特异 性 ;， 分离 目 的 物 受到 理化 性 质 相 似 的 杂质 干扰 极 少 , 能 从 比较 复杂 的 组 织 抽 提 该 或 细菌 发 酵 液 中 一 步 提 取 分 离 出 所 需 的 物质 ,提纯 售 数 可 达 一 百倍 以 上 。 如 从 大 肠 杆菌 粗 抽 提 液 中 一 步 提纯 8- 半 乳糖 背 酶 , 即 达 电泳 纯 22。 亲 合 色谱 是 一 和 一 个 值得 推广 的 方法 。 总 的 来 说 , 早期 分 离 提纯 的 方法 , 选择 的 原则 一 般 是 从 低 分 辨 能 力 到 高 分 辨 能 力 ; 而 且 负 和 荷 量 较 大 为 合适 。 但 随 着 许多 新 技术 的 建立 ,一 个 特异 性 方法 其 分 辩 能 力 越 高 , 便 意 味 着 提纯 步骤 的 简化 ,提纯 步骤 的 减少 , 回收 率 便 越 高 , 具有 生理 活性 物质 变性 的 危险 性 BBD, 这 是 所 有 生化 制备 研究 工作 人 员 所 希望 的 。 如 上 述 亲 和 层 析 和 纤维 素 离子 交换 色谱 就 是 很 好 的 例子 。 其 他 方法 如 连续 流动 电泳 , 连续 流动 等 电 聚 焦 等 , 在 一 定 条 件 下 ， 用 于 早期 从 粗 抽 提 沪 中 分 离 制 备 小 量 物质 也 具有 许多 优点 ,但 目前 仍 处 于 探索 发 展 阶 段 ， 个 如 前 两 者 已 达到 比较 成 熟 的 程度 。 当 然 所 谓 低 分 辨 能 力 的 分 离 纯化 方法 如 有 机 溶剂 沉 . 证 `\ 盐 析 、 有 机 溶剂 伴 取 等 也 不 限于 分 离 的 早期 使 用 ,在 整个 分 离 制备 过 程 中 经 常 反复 应 用 ,而 每 次 应 用 其 分 离 的 能 力 和 效果 也 是 不 同 的 。 (=) 各 种 分 离 纯化 方法 的 使 用 程序 生物 体内 各 种 物质 的 分 离 都 是 在 液 相 中 进行 的 。 故 分 离 方法 常 根据 这 些 物质 的 分 配 系数 、 分 子 量 大 小 、 离 子 电荷 性 质 及 数量 和 外 加 环境 条 件 的 差别 等 因素 构成 不 同 分 离 方 法 的 基础 。 而 每 一 种 分 离 方法 又 都 在 特定 条 件 下 发 挥 作用 的 。 AL, 在 相同 或 相似 的 条 «176 件 下 连续 作用 同一 种 分 离 方 法 就 不 大 适宜 。 例如 纯化 某 一 两 性 物质 时 , 前 一 步 已 利用 该 物 盾 阴 离子 的 性 质 ,使 用 了 阴离子 交换 色谱 分 离 方法 ,那么 下 一 步 提纯 时 应 用 阳离子 交换 色谱 或 作为 一 个 阳离子 应 用 电泳 方法 分 离 ， 则 比 再 用 其 阴离子 性 质 作 色谱 或 电泳 具有 更 好 的 分 离 效果 。 各 种 分 离 方法 的 交叉 使 用 对 于 除去 大 量 理化 性 质 相 近 的 杂质 也 较为 有 ” 效 。 某 些 杂 质 在 各 种 条 件 下 带电 性 质 可 能 与 制备 物 相 似 , 但 分 子 大 小 与 形状 与 制备 物 相 差 较 大 ;而 另 一 些 杂质 的 分 子 大 小 形状 可 能 与 制备 物 相似 ,但 在 某 种 条 件 下 与 制备 物 带电 性 质 不 同 。 在 这 样 的 情况 下 , 先 用 分 子 筛 ` 超 速 离 心 沉降 或 膜 过 滤 方 法 除去 分 子 量 相 差 较 大 的 杂质 , 然后 在 一 定 pH 值 和 离子 强度 范围 下 使 制备 物 变 成 有 利 的 离子 状态 , 便 能 有 效 地 进行 色谱 分 离 。 当 然 , 这 两 种 步骤 的 先后 秩序 反 过 来 应 用 也 会 得 到 同样 效果 。 纯 北 方法 顺序 先后 的 安排 ,还 卷 虑 到 有 利于 减少 工序 ,提高 效率 。 如 在 盐 析 法 后 采取 吸附 法 ,必然 因为 盐 离 子 过 多 影响 吸附 效果 。 中 间 增 加 透析 脱盐 一 步 , 则 使 操作 大 大 复杂 化 。 如 倒 过 来 先 吸 附 ， 后 盐 析 ,吸附 洗 脱 时 的 含 盐 洗 脱 小 即 可 直接 进行 盐 析 ; 则 可 达到 操 作 简 化 节省 原料 时 间 的 目的 。 此 外 , 分 离 体积 过 大 时 使 用 盐 析 法 和 有 机 溶剂 沉淀 法 都 能 达到 浓缩 效果 :但 使 用 盐 析 法 成 本 就 低 得 多 。 对 于 一 未 知 物 通过 各 种 方法 的 交叉 分 离 纯化 ,还 可 以 进一步 了 解 到 制备 物 的 性 质 ,以 补充 预 试验 时 所 获得 的 知识 片面 性 。 但 不 论 是 已 知 物 或 未 知 物 , 当 条 件 改变 时 ,连续 使 用 同一 分 离 是 允许 的 ,如 分 级 盐 析 和 分 级 有 机 溶剂 沉淀 等 。 分 离 纯化 中 期 ;有 时 由 于 某 种 原 因 ( 如 样品 含 盐 太 多 ,或 含量 过 大 等 ), 一 个 方法 一 次 分 离 效果 不 理想 ,可 以 连续 使 用 二 次 ， 这 种 情况 在 凝 胶 过 滤 ， DEAE- 纤 维 素 色谱 等 比较 常见 。 当 分 离 纯 化 工作 已 进行 至 后 期 时 ,大 部 分 杂质 已 经 除去 , 欲 制备 的 物质 已 十 分 集中 ,重复 应 用 先 几 步 所 应 用 的 方法 ,对 进 一 步 肯 定 所 制备 的 物质 在 分 离 过 程 中 其 理化 性 质 有 无 变化 和 验证 所 得 的 制备 物 是 否 属于 矫 作 物 又 有 着 新 的 意义 。 《三 ) 分 离 纯化 后 期 的 保护 性 措施 各 种 活性 物质 在 生物 体内 的 含量 一 般 都 是 很 少 的 。 有 的 本 来 含量 已 经 是 十 分 微量 ， 再 由 于 多 步骤 的 纯化 过 程 的 流失 ,到 了 分 离 制备 后 期 可 获 的 产品 已 经 是 十 分 微量 了 ,有 的 量 只 有 原材料 的 干 分 之 几 。 有 的 只 有 万 分 之 几 ， 或 几 十 万 分 之 几 。 如 果 所 制备 的 物质 是 未 知 物质 ,分 离 纯化 方法 还 属于 探索 性 质 , 分离 过 程 中 损失 更 为 严重 。 现 在 数学 上 作 一 简 单 推算 : 假设 某 材料 含 A 物 质 为 万 分 之 一 。 纯 化 后 回收 率 只 有 20%, 即 在 分 离 过 程 中 损 失 了 百 分 之 八 十 (这 是 常 有 的 )， 如 开始 投料 为 一 干 公斤 ， 应 得 产品 是 20 克 , 到 了 分 离 后 期 ,损失 了 一 克 产 品 , 就 等 于 损失 了 五 十 公斤 的 原料 。 因 此 ， 到 了 分 离 工作 后 期 ， 必 需 注 意 避 免 产 品 的 损失 。 后 期 产品 的 损失 主要 途径 有 玻璃 器 严 的 吸附 。 操 作 过 程 样品 液体 的 残留 ,空气 的 氧化 和 某 些 事先 无 法 了 解 的 因素 ,当然 后 者 是 很 难 避 免 的 。 所 以 对 于 一 些 探 索性 的 制备 实验 ,为 了 取得 一 定量 ( 那 怕 是 很 少 也 好 ) 的 产品 , 提供 分 析 鉴 定之 用 ， is te 肥 加 大 原材料 的 用 量 , 并 在 后 期 纯化 工序 中 注意 保持 样品 溶液 较 高 浓度 ,以 防止 制备 物 在 希 溶 液 的 变性 ,有 时 常 加 入 一 些 电解 质 以 保护 生化 物质 的 活性 ,减少 样品 溶液 在 器 严 中 的 残留 量 等 ,这 些 都 是 十 分 重要 的 。 《四 ) 对 分 离 纯化 每 一 步骤 方法 的 优 劣 进行 综合 评价 es 18 。 每 一 个 分 离 纯化 步骤 方法 的 好 坏 , 除 了 从 分 辨 本 领 和 重 现 性 二 方面 考虑 外 ,还 注意 方 法 本 身 的 回收 率 的 高 低 , 特 别 是 制备 某 些 含量 很 少 的 物质 时 ,回收 率 的 高 低 十 分 重要 。 秋 1-8 是 分 离 制备 的 几 种 常用 方法 中 有 关 分 辩 本 领 、 重 现 性 及 回收 率 的 一 些 初步 评价 (参考 Morris 并 有 所 删 减 )%。 按 现 生 化 制备 中 应 用 的 分 离 纯化 方法 ,一 个 制备 的 原始 活力 经 过 五 至 六 步 的 提纯 后 ,一 般 都 可 以 达到 25% 以 上 的 回收 率 。 当然 , 不 同 物质 由 于 其 稳定 性 的 不 同 及 分 离 的 难 易 ,所 得 回收 率 是 不 同 的 。 表 1-8 一 些 常用 的 分 离 纯化 方法 的 几 项 特性 方 法 DRAG 重 现 性 回 收 率 色谱 法 : 一 吸附 +++ + + 分 配 ++ of ++ t+ 离子 交换 +++ +++ ra DF hii = Tine +++ 逆流 分 配 法 二 十 ++ ++ 电泳 法 : 一 自由 溶 流 十 二 十 +++ 聚 乙烯 支持 物 ++ ++ H+ 纤维 支持 物 +++ +++ 二 + dia +++ +++ + 等 电 聚 焦 +++ +t+ +++ 沉降 法 十 ++ HH 膜 透析 及 扩散 法 二 二 +++ +H 溶解 度 法 \ 十 ++ ++ 生化 物质 在 分 级 分 离 中 对 每 一 步骤 方法 的 优 劣 的 记录 ， 常 体现 在 所 得 产品 重量 及 活 性 平衡 关系 上 。 这 一 关系 ,可 通过 每 一 步骤 的 分 析 鉴 定 即 可 求 出 。 例如 酶 的 分 离 纯化 每 一 步骤 产物 重量 与 活性 关系 ,通过 测定 酶 的 比 活 力 及 溶液 中 蛋白 质 浓度 的 比例 ,其 他 活性 物质 也 可 通过 测定 总 活性 的 变化 与 样品 浓度 或 体积 作 比较 而 求 出 。 最 后 根据 各 步骤 所 得 样品 重量 或 体积 和 测 出 的 活力 列表 进行 对 比分 析 ， 算 出 每 步 的 提纯 倍数 及 回收 率 。 现 以 从 长 春花 CCathasanthus reseus) 中 提纯 Strictosidine 合成 酶 的 实验 为 例 吧 ， 将 各 步骤 提纯 倍数 及 回收 率 总 结 于 表 1-9。 21-9 长 春花 中 Strictosidqdine 合成 酶 的 提纯 总 蛋白 比 活 性 * 步 Be (毫克 ) naKat/ 毫克 蛋白 (CD 粗 抽 提 液 654 0.008 CII) BRE RITE 466 0.011 (111) DEAE- 纤 维 素 柱 38.7 0.10 CAV) BERRA 5.9 0.64 (V) Sephadex G 75 0.72 2.8 (VD 等 电 焦 点 0.08 5.9 * 比 活性 项 中 nKat 的 换算 方法 见 下 。 按 国际 酶 学 会 议 规 定 : 一 分 钟 转化 一 个 微克 分 子 底 物 为 一 个 国际 单位 酶 量 ,而 一 个 国际 单位 酶 量 天 16.67nKat， 原 酶 量 单位 “Katal ”定义 为 每 秒 钟 转化 一 个 克 分 子 底 物 的 酶 量 , 因 所 需 酶 量 太 大 , 现 一 般 很 少 应 用 。 上 面 表 中 : 比 活 力 一 一 总 活力 除 以 总 蛋白 质 含量 (或 蛋白 氮 ) 的 比值 。 回收 率 一 一 为 本 步骤 所 得 的 总 活力 与 第 一 步骤 所 得 总 活力 之 比值 ， 以 百 分 比 表示 ,开始 时 回收 率 假定 为 100 允 。 提纯 倍数 一 一 为 本 步 邓 所 得 之 比 活 力 与 第 一 步骤 所 得 之 比 活力 之 比值 ， 开始 时 假定 提纯 倍数 为 1 从 表 1-9 的 内 容 中 可 以 看 到 提纯 倍数 为 737.5， 但 回收 率 只 有 10%, BN 90% 损失 于 操作 中 。 总 蛋白 量 由 654 毫克 减少 至 0.08 Sic, 共 减 少 了 八 千 倍 , 而 酶 损失 仅 10 倍 ， 因 而 获得 了 纯化 。 从 每 一 纯化 步骤 看 , 比 活力 越 高 , 酶 的 提纯 倍数 越 大 , 一 个 好 的 分 离 提纯 方法 应 该 是 提纯 倍数 和 回收 率 都 同时 有 较 大 的 提高 。 但 必须 指出 ， 整 个 分 离 提纯 步骤 是 连续 进行 的 ,前 一 步骤 虽然 提纯 程度 和 回收 率 都 不 高 , 但 它 是 必需 的 , 前 一 步 主 要 为 后 一 步 提供 更 有 利 的 分 离 纯化 的 基础 。 (A) 对 制备 物 均一 性 的 鉴定 对 制备 物 均一 性 的 鉴定 是 分 离 制备 过 程 最 后 一 个 工序 ,一 个 新 分 离 的 物质 是 否 纯 , 常 用 "均一 性 ”表示 , 均一 性 即 指 所 获得 的 制备 物 只 具有 一 种 完全 相同 的 成 份 。 均一 性 的 评 价 常 须 经 过 数 种 方法 的 验证 才能 肯定 。 有 时 某 一 种 测定 方法 认为 该 物质 是 均一 的 ， 但 另 一 种 测定 方法 却 可 把 它 分 成 二 个 甚至 更 多 的 组 份 ， 这 就 说 明 前 一 种 鉴定 方法 所 得 的 结果 是 片面 的 。 如 果 某 一 物质 所 具有 的 物理 、 化 学 各 方面 性 质 经 过 几 种 高 灵敏 度 方法 的 鉴定 都 是 均一 的 ,那么 大 致 可 以 认为 它 是 均一 的 。 当然 , 随 着 新 的 鉴定 方法 的 出 现 , 还 可 以 发 现 加 入 的 固体 重 白质 量 它 不 是 均一 的 。 绝 对 的 标准 只 有 是 把 制备 的 Bl 14 ae Bee 全 部 结构 弄 清楚 并 经 过 人 工 全 合成 证 明 具 有 相同 的 生理 活性 ,才能 肯定 所 分 离 的 物质 是 绝对 纯净 的 。 但 通过 这 样 严格 的 核对 ,小 分 子 物质 还 是 容易 办 到 的 ,大 分 子 物质 如 蛋白 质 、 酶 、 核 酸 或 某 些 多 糖 则 是 一 件 十 分 困难 的 事 了 。 就 目前 水 平 来 说 ,除了 极 少 数 成 功 的 例子 外 ,生物 大 分 子 的 结构 全 面 分 析 及 人 工 全 合 成 工作 还 处 于 早期 发 展 的 阶段 。 现 以 蛋白 质 为 例 ， 说 明 均 一 性 试验 常用 的 一 些 物理 一 化 学 方法 。 蛋 白质 均一 性 的 经 典 试验 主要 基于 它 的 深 解 度 , 电 泳 和 沉降 行为 。 近 年 来 增加 了 未 端 氨基 酸 残 基 测 定 方 法 ， 即 一 个 纯 的 蛋白 质 含 有 一 定量 未 端 氨基 酸 残 基 ， 而 且 这 些 残 基 成 整数 比例 地 存在 于 蛋白 质 分 子 中 ， 如 有 其 他 未 端 氨基 酸 残 基 和 不 成 整数 比例 存在 于 蛋白 质 分 子 中 则 表示 该 蛋白 质 不 纯 。 另 还 有 生物 特殊 功能 测定 法 , 具有 某 些 特殊 功能 的 蛋白 质 , 如 酶 、 激素 蛋白 、 氧 载体 \ 抗 体 等 ,都 可 以 通过 其 特有 的 催化 效率 ,生理 活性 和 免疫 反应 等 加 以 测定 ,这 种 测定 方法 常 可 以 检 出 非常 低 的 杂质 含量 , 在 某 种 意义 上 比 物 理 和 化 学 鉴定 更 为 优越 。 现 就 蛋 ea 20 。 溶解 的 蛋白 质量 百 质 均一 性 常用 的 几 种 鉴定 方法 介绍 如 下 : 1. 溶 解 度 法 ”这 主要 根据 Gibb 相 律 理 论 而 建立 的 一 种 经 典 测 出 物质 纯度 的 方法 。 它 不 仅 用 于 蛋白 质 , 也 可 用 于 其 他 物质 的 纯度 测定 。 Gibb 相 律 理论 认为 ,一 个 单一 成 份 的 物质 在 一 定 条 件 下 其 溶解 度 是 一 定 的 ， 因 此 ， 当 某 一 物质 在 溶剂 中 的 溶解 度 达 到 饱和 时 ,其 溶解 曲线 有 着 非常 明显 的 转折 点 。 溶 解 度 测 定 法 操作 简单 ,方法 也 很 灵敏 。 例 如 用 此 法 测定 酶 的 纯度 时 ,将 一 系列 不 同 量 的 酶 制剂 分 别 加 入 等 容积 的 浩 剂 中 (水 或 盐 溶 沪 )。 搅拌 溶解 后 ,过 滤 除 去 固体 部 分 。 然 后 分 别 测 定 各 管 滤 液 中 蛋白 质 含 量 或 酶 的 活力 , 当 固 体 酶 蛋白 溶解 后 未 达到 饱和 度 时 ， 加 和 的 酶 量 和 庆 被 中 的 蛋白 质量 或 酶 活力 是 按 比 例 上 升 的 。 加 入 酶 量 至 一 定 程度 即 达到 饱和 度 时 ,固体 酶 蛋白 则 不 能 溶解 ,滤液 中 的 蛋白 质 含 量 或 酶 活力 也 不 再 提高 。 于 是 , 在 溶解 度 曲线 上 在 饱和 度 时 出 现 一 个 转折 。 如 固体 酶 制 剂 中 含有 少量 不 纯 物 质 时 ,就 不 会 出 现 一 个 明显 的 饱和 度 转 折 点 。 如 图 1-4 Bra, 在 图 1-4 中 ,曲线 1 只 出 现 一 个 明显 转折 点 ,表示 只 有 一 种 蛋白 质 组 份 。 曲 线 2 含有 二 种 组 份 的 混合 蛋白 质 , 故 出 现 二 个 转折 点 。 一 般 来 说 ,混合 蛋白 质 中 有 多 少 组 份 便 出 现 多 少 个 转折 点 ,但 实际 上 上 组 份 太 多 时 ,溶解 度 曲折 点 便 不 明显 了 。 曲 线 1 在 转折 点 以 前 直 线 的 斜率 应 为 1, 转 折 点 以 后 直线 与 横 座 标 平行 , 任 率 为 零 。 曲 线 2 在 二 个 转折 点 之 间 直 线 的 斜率 (图 中 虚线 部 分 ) 表 示 不 纯 成 份 在 混合 蛋白 质 中 所 占 比 例 。 溶解 度 法 测定 物质 均一 性 的 试验 , 在 实际 应 用 时 常 选 择 几 个 不 同 pH 和 离子 强度 的 条 件 进行 ,使 所 得 结果 更 加 准确 。 溶 解 度 法 的 测试 工作 因 需 要 大 量 的 样品 ,现在 已 很 少 应 用 。 2. 电泳 均一 性 的 测定 法 ， 近 二 十 年 来 电泳 法 有 了 很 大 发 展 。 SREB HBR, 建立 在 不 同 pH 及 离子 强度 条 件 下 测定 带电 物质 电泳 迁移 率 , 以 表示 电泳 的 均一 性 ,在 理 论 上 是 很 理想 的 ,但 在 实际 操作 中 常 存在 许多 影响 因素 ,难以 达到 理想 程度 。 前 沿 电泳 法 则 主要 由 于 分 辩 率 较 低 及 使 用 的 仪器 和 操作 都 比较 复杂 ,所 以 使 用 的 人 不 多 。 此 外 ,以 上 两 种 方法 样品 用 量 也 比较 多 , 故 已 渐渐 被 凝 胶 电 泳 所 代替 。 凝 胶 电 泳 不 仅 具 有 电泳 作用 ， 同时 还 具有 分 子 得 作用。 因此 有 极 高 的 分 辩 能 力 。 如 聚 丙 烦 酰 胺 凝 胶 电泳 可 以 检测 出 10° 210 克 样 品 的 含量 ， 含 量 10 一 15 微克 分 子 的 蛋 白 质 或 5 一 10 微克 左右 的 核酸 在 一 定 的 pH 下 能 做 出 很 漂亮 的 均一 性 试验 的 结果 。 凝 胶 电 泳 在 测定 样品 均一 性 的 同时 ， 还 可 以 分 析 鉴 定 样品 分 子 大 小 和 形状 。 是 目前 许多 生物 大 分 子 普遍 采用 的 均一 性 鉴定 的 方法 。 凝 胶 电 泳 也 适用 于 小 分 子 电解 质 的 纯度 测定 。 用 凝 胶 电泳 〈 包 括 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 ) 进行 蛋白 质 均 一 性 测定 时 ,一般 都 要 变换 二 至 三 种 pH 值 进行 实验 , 才能 对 所 得 结果 是 否 均一 加 以 评定 。 蛋白 质 可 以 作为 阴离子 或 阳离子 进行 电泳 试验 ,核酸 只 能 作为 阴离子 进行 试验 。 近 年 来 ,还 发 展 了 各 种 免疫 电泳 和 最 近 流 行 专门 检验 糖 蛋 白 使 用 的 亲 和 电 泳 。 它 们 都 是 由 凝 胶 电 泳 衍生 出 来 的 ， 具 有 更 专 一 ,操作 更 简便 的 优点 。 3. 高 速 离心 沉降 法 ”对 于 蛋白 质 及 其 他 生物 大 分 子 均一 性 的 测定 也 是 一 个 经 典 方 法 ,在 理论 上 这 一 方法 是 完善 的 。 主 要 问题 是 离心 设备 本 身 的 缺陷 ,以 至 每 个 组 份 在 离心 管 中 所 能 移动 的 距离 很 短 。 如 果 每 个 组 份 的 分 子 大 小 \ 形 状 、 带 电 性 质 差别 不 大 时 ,由 于 影响 分 子 移动 的 各 种 因素 综合 平衡 的 结果 ,往往 使 各 组 份 所 受 的 力 场 作 用 相等 ,于 是 就 很 难 区 分 。 所 以 使 用 高 速 离心 沉降 方法 测定 物质 的 均一 性 ,其 精确 度 的 提高 受到 一 定 限制 。 e 21 e 但 由 于 其 具有 测定 时 间 短 ,样品 用 量 少 等 优点 , 现 仍 是 经 常 使 用 的 方法 之 一 。 以 上 仅 就 蛋白 质 均一 性 测定 作 一 简略 讨论 ， 对 于 其 他 小 分 子 物质 纯度 的 测定 ， 供 使 用 分 析 方 法 更 多 , 如 制备 物 获得 一 定量 的 结晶 后 , 可 进行 核磁 共振 波谱 \、 质 谱 , 紫 外 光谱 ， 红外 光谱 测定 ,或 作 高 效 液 相 色谱 、 气 相 色谱 旋光 和 熔点 等 试验 ,经 过 综合 分 析 后 , 便 可 以 对 被 鉴定 物 作 出 纯度 的 结论 。 有 关 各 类 生化 物质 的 分 析 鉴 定 方法 , 本 丛书 各 分 册 均 已 详细 介绍 。 这 里 不 再 丈 述 。 参 + 文 献 [1] 沈 同 、 王 镜 岩 、 赵 邦 娣 主编 : 生物 化 学 ,人 民 教 育 出 版 社 (19807 [2] Lehninger, Albet 工 ，Biochemistry The moleculas basis of cell structlre and function, Worth Publishers Inc, 2nd ed. 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(1958) “22 e 第 二 价 ， 提 取 及 溶剂 分 离 法 mh KR iM Sh 5 =F 提取 常 指 制备 物 与 细胞 固体 成 份 或 其 他 结合 成 份 的 分 离 ， 由 固 相 转 人 波 相 或 从 细胞 内 生理 状态 转 人 外 界 特定 溶液 环境 的 过 程 。 如 果 被 提取 物质 在 细胞 内 呈 固 相 或 与 固体 结 合 存在 ,提取 时 由 固 相 转 人 液 相 ,， BRO, 如 被 提取 物质 原来 已 呈 液 相 存 在 ， 提取 时 由 一 液 相 转 和 人 另 一 互 不 相 溶 的 滚 相 ， 这 种 提取 方法 称 液 一 彼 萃取 ， 或 称 抽 提 。 提 取 、\ 荃 取 和 抽 提 英文 都 是 Extraction， 其 含义 基本 上 相同 。 习惯 上 ， 提 取 多 指 分 离 纯 化 前 期 , 被 提取 物质 从 破碎 的 细胞 中 释放 出 来 的 过 程 ， 而 抽 提 则 贯穿 在 分 离 纯化 整个 过 程 中 。 如 核酸 制备 中 用 氧 仿 或 苯酚 反复 振荡 抽 提 除去 蛋白 质 ,分 离 DNA 和 RNA, KAGE 楷 从 醇 提 取 液 抽 提 一 些 脂 深 性 类 脂 质 等 。 所 以 提取 应 是 分 离 纯化 工作 的 开始 , 提取 的 效 果 ,主要 取决 于 被 提取 物 在 溶剂 中 溶解 度 的 大 小 ,由 因 相 扩散 到 相 的 难 易 ,同时 ,选择 提 取 的 条 件 对 制备 物 稳 定性 的 影响 ,是 否 有 利于 以 后 的 提纯 步骤 等 因素 均 应 顾及 。 第 二 节选 用 的 溶剂 与 物质 溶解 度 的 一 般 规 律 AMER RAED 两 个 主要 的 目的 ， 一 是 选择 一 个 对 制备 物 溶 解 度 大 而 对 杂质 溶解 度 小 的 溶剂 ,使 制备 物 从 混合 组 份 中 有 选择 地 被 孤 离 出 来 ; 另 一 是 选择 一 个 对 制 备 物 溶解 度 小 而 对 杂质 溶解 度 大 的 溶剂 , 使 制备 物 沉 淀 或 结晶 析出 。 但 不 论 是 使 溶质 有 选择 地 溶解 或 有 选择 地 沉淀 都 是 为 了 达到 与 杂质 分 离 的 目的 。 一 个 物质 溶解 度 的 大 小 与 溶质 和 深 剂 性 质 都 有 关 。 即 溶质 一 溶质 ,溶质 一 溶剂 ,溶剂 一 溶剂 三 个 相互 作用 力 综合 平衡 的 结果 ,这 种 相互 作用 可 用 下 图 表示 : 溶质 溶剂 al —= [te nS 过 程 A 是 溶质 分 子 相互 作用 ,过 程 B 是 溶剂 分 子 相互 作用 ,过 程 C 是 溶质 与 溶剂 相互 作用 。 这 三 种 相互 作用 过 程 中 ,如 果 溶 质 一 溶剂 相互 作用 占 优 势 , 则 溶质 的 溶解 度 大 。 反 之 如 溶质 一 溶质 或 溶剂 一 溶剂 其 中 一 个 系统 相互 作用 很 强 ， 和 或 者 两 个 系统 两 个 系统 相互 作用 都 很 强 , 则 溶质 在 该 溶剂 中 的 溶解 度 小 。 溶质 一 溶质 ,溶剂 一 溶剂 ,溶质 一 溶剂 之 间 相 互 作用 力主 要 有 : (1) 偶 极 一 偶 极 相互 作用 ; (2) 偶 极 一 诱导 偶 极 作用 ; 《3》 弥散 力 ; 《4》 氧 键 ; (5) 离子 基 团 的 静电 作用 等 。 当然 ,要 定量 测定 每 一 种 作用 力 是 十 分 困难 的 ,影响 因素 也 很 复杂 。 所 以 对 于 一 个 有 机 分 子 或 生物 分 子 来 说 , 其 在 某 一 溶剂 中 的 溶解 度 , 往往 只 能 根据 实际 表现 而 加 以 描述 。 如 属 已 知 物质 ,可 查阅 有 关 资 料 或 手册 。 对 于 一 个 未 知 物质 ,只 能 根据 物质 溶解 的 一 般 规 律 进行 预 试验 ,最 后 确定 其 溶解 度 性 质 。 物 质 溶解 性 质 的 一 般 规律 可 归纳 如 下 几 点 : 1. 极 性 物质 易 溶 于 极 性 溶剂 中 , 非 极 性 物质 易 溶 于 非 极 性 溶剂 中 。 能 溶 于 水 的 物质 一 般 都 是 极 性 分 子 或 离子 化 合 物 ,; 有 些 化 合 物 虽然 是 非 极 性 物质 ,但 分 子 内 有 较 多 极 性 基 团 , 也 易 溶 于 水 ,如 糖 类 。 2. 碱 性 物质 易 溶 于 酸性 溶剂 中 ,酸性 物质 易 深 于 碱 性 溶剂 中 。 3. 在 极 性 溶液 中 ,溶剂 的 介 电 常 数 的 减少 ,溶质 的 溶解 度 也 随 之 减少 。 上 述 规律 也 可 以 用 所 谓 相 似 物 溶解 于 相似 物 的 原则 进行 解释 叫 。 所 谓 相似 ， 一 方面 表示 溶质 、 溶 剂 分 子 结构 上 的 相似 ， 另 一 方面 是 指 溶剂 与 溶质 二 者 分 子 间 作用 力 大 小 相 似 。 前 者 如 石油 等 烃 类 溶剂 是 烃 类 化 合 物 的 优良 溶剂 。 后 者 例子 如 具有 :OH COOH, NH、SO………， 等 基 团 之 物质 都 易 溶 于 水 ,， 因 这 些 基 团 周 围 有 与 水 分 子 周 围 同 样 大 小 的 引力 场 ,含有 这 些 基 团 的 分 子 能 均匀 地 分 布 于 水 分 子 之 间 , 并 通过 一 定 的 配 价 键 而 相互 结 合 。 已 烷 不 溶 于 水 而 溶 于 茶 ,由 于 已 烷 与 茉 分 子 间 吸引 力 大 致 相同 ,而 已 烷 与 水 分 子 间 吸 引力 很 小 ,水 分 子 自身 吸引 力 较 大 之 故 。 相 似 物 溶 于 相似 物 的 结论 一 般 地 符合 实际 情况 。 一 些 常用 溶剂 按 其 极 性 的 大 小 , 可 依 顺序 大 致 排列 如 下 :， 饱 和 烃 类 二 全 卤 代 烃 类 去 # 2-1 Hecker 的 溶剂 分 类 法 | ll | 3 个 或 更 多 形成 氢 键 的 能 力 0 (*BO AIK—OH CCl, fe) 烃 类 了 R 一 C 一 O 开 浴 R 一 NO 五 —CH,—CN 剂 —CH Nee 功 Ar—OH R —NH, R,=NH D 一 质子 供 体 ” A 一 质子 受 体 « 24 6 不 饱和 烃 类 一 醚 类 天 未 全 克 代 烃 类 一 脂 类 二 芳 胺 类 << 酚 类 到 关 类 雪 醇 类 。 rsa (Hecker) 认为 溶剂 按 极 性 进行 分 类 带 有 较 多 经 验 成 份 , 而 按 形 成 氢 键 能 力 分 类 科学 性 更 强 些 。 他 提出 非 电解 质 溶 于 极 性 或 非 极 性 溶剂 时 ,根据 形成 氨 键 能 力 的 大 小 ， WPAN D ABA: C1) 能 形成 二 个 以 上 氢 键 的 溶剂 分 子 , 在 溶液 中 这 些 分 子 有 三 维 空间 网 状 结构 。 水 就 是 这 类 溶剂 的 典型 例子 ， 水 的 二 个 氢 原 子 和 一 个 氧 原子 都 可 以 形成 氨 键 。(2) 能 形成 表 2-2 一 些 常 用 溶剂 的 性 质 % fF KB (0—25°) WH AR 沸 点 介 电 常 数 溶剂 在 水 中 (227 水 在 盗 剂 中 (927) 石油 醚 36—65°C 1.80 ILE AYE ILFAE a 6k 96°C 1.88 0.00095% 0.0111% Rak 81% 2.02 0.010% 0.0055% 二 氧 陆 环 101% 2.21 任意 混 盗 任意 混 盗 四 氧化 碳 77C 2.24 0.077% 0.010% # 80°C 2.29 0.1780% 0.063% Ro ae 110% 25h 0.1515% 0.0334% f= PR 139°G 2.38 0.0196% 0.0402% 二 硫化 碳 46°C 2.46 0.294% <0.005% a 醚 3 4.34 6.04% 1.468% 栈 酸 成 酯 149°C 4.75 0.17% 1.15% Bo 61% 4.80 0.815% 0.072% BROCE (pee 6.02 8.08% 2.94% 醋酸 118° 6.15 FE IBY FERRY x= 184°C 6.89 3.38% 4.76% POS ig 66°C 7.58 fERIBY 任意 混 次 x BB 182°C 9.78(60°C 8.66% 28.72% | 院 oe eG 1274 FERIBIA FERRY AT we 82°C 12.47 任意 混 溶 任意 混 溶 ERK Ss 138°C 13.9 2.19% 7.41% 异 戊 醇 131% 14.7 2.67% 9.61% ‘ep T 醇 100°C 16.56 12.5% 44.1% ET 118°C 17.5 7.45% 20.5% 甲 乙 酮 80"C 18.5 24.0% 10.0% AR 醇 82°C 19.92 FE RUB FERIBIS EA 醇 97°C 20.3 任意 混 深 FERRE a 140°C 20.7 7: ae m6 AR 页 56°C 20.7 FRR FERRE 乙 a 78°C 24.6 任意 混 盗 任意 混 溶 a 6 65°C 32.7 任意 混 盗 FERRE 二 甲 基 甲 酰胺 153°C 36.7 任意 混 盗 FERRIES ao oe 82°C 37.5 任意 混 溶 任意 混 次 乙 二 醇 197°G 37.7 任意 混 盗 FERRY 二 甲 亚 硕 189°C 46.68 25.3% 25.3% a 6B 101% 58.5 FERRIBY 任意 混 盗 水 100°C 81 FA 酰 AK 211% 111 FERRE FERRY © 25> 6 pees | 二 个 氢 键 的 溶剂 分 子 , 即 既是 氧 供 体 又 是 氧 的 受 体 , 例 如 脂肪 族 的 醇 类 。(3) 只 作 质 子 受 体 的 溶剂 分 子 ;, 如 脂肪 族 的 醚 类 。(4) 只 作 质 子供 体 的 深 剂 分 子 , 如 氯仿 。(5) 不 能 形成 气 多 的 烃 类 ,如 四 氧化 碳 。 以 上 分 类 法 见 表 2-1 所 示 。 按照 表 2-1 VHD, a,b 二 类 溶剂 宜 用 于 极 性 化 合 物 的 提取 ;<\ d RBA 于 对 溢 液 中 弱 极 性 或 非 极 性 化 合 物 进 行 抽 提 。 在 抽 提 中 如 加 入 质子 供 体 咨 剂 酚 或 质子 受 体 溶 剂 胺 , 均 可 增加 质子 受 体 溶质 或 质子 供 体 溶 质 的 溶解 度 。 以 上 仅 对 物质 溶解 一 般 规 律 在 理论 上 简单 介绍 ,实际 应 用 时 ,各 类 物质 的 溶解 有 关 数 据 均 可 在 手册 或 文献 中 查 到 。 现 将 一 些 常 用 溶剂 的 沸点 \ 介 电 常 数 及 溶解 度 列 于 表 2-2。 第 三 节 “影响 物质 溶解 度 的 几 个 主要 因素 一 、 离 子 强 度 离子 强度 是 影响 物质 溶解 度 主要 因素 之 一 。 有 些 物 质 在 高 离子 强度 下 溶解 度 增 加 (如 DNA- 和 蛋白 )， 另 一 些 物 质 〈 如 RNA- 和 蛋白) 在 低 离 子 强度 下 溶解 度 增加 3 而 在 高 离 子 强度 下 溶解 度 反 而 减少 。 绝 大 多 数 球 蛋白 和 酶 , 在 低 离 子 强度 的 溶液 中 都 有 较 大 的 深 解 度 ， 如 在 纯 水 中 加 入 少量 中 性 盐 ， 蛋 白质 溶解 度 比 在 纯 水 时 大 大 增加 。 称 为 “ 盐 溶 > 现 象 。 但 中 性 盐 的 浓度 增加 至 一 定时 * 蛋白 质 的 溶解 度 又 逐渐 下 降 , 直 至 沉淀 析出 。 则 称 为 “ 盐 析 ” 现 象 。 溶液 离子 强度 与 蛋白 质 溶解 度 的 关 系 见 图 2-1。 盐 溶 现 象 的 产生 主要 是 少量 离子 的 活动 ， 减 少 了 假 极 溶质 分 子 之 间 极 性 基 团 静 电 吸 引力 ， 增 加 了 溶质 和 溶剂 相互 作用 力 的 结 果 。 盐 溶 现象 不 仅 在 水 溶液 中 , 而 且 在 低 介 电 ape ”常数 溶剂 如 乙醇 中 也 同样 发 生 ， 低 离子 强度 深 ae Be) a 液 除了 增加 许多 生化 物质 的 溶解 度 外 ， 还 对 一 图 2-1 溶液 离子 强度 与 蛋白 质 盗 解 度 的 关系 些 物 质 生 理 活 性 有 稳定 作用 ， 所 以 稀 盐 溶 和 被 常 用 于 大 多 数 生 化 物质 的 提取 。 log (溶解度 ) io pid 值 许多 有 机 分 子 或 生物 分 子 都 同时 具有 酸性 或 碱 性 基 团 ， 这 些 基 团 在 不 同 pH 下 有 着 不 同 的 解 离 状态 ,在 水 中 或 有 机 溶剂 中 便 有 不 同 溶解 度 。 当 两 性 物质 分 子 上 酸 \ 碱 性 基 团 解 议 情 况 相 等 时 ,整个 分 子 所 带电 荷 总 和 为 零 ， 此 时 溶 滚 的 pH 值 称 为 该 分 子 的 等 电 点 。 在 等 电 点 时 ， 两 性 溶质 分 子 易 相互 聚集 , 溶解 度 最 低 , 而 远离 等 电 点 两 侧 的 pH 值 时 溶解 度 增 大 。 对 于 一 些 酸性 或 碱 性 小 分 子 物 质 , 当 pH 很 低 时 ,酸性 物质 大 部 分 呈 非 解 离 分 子 状态 ,而 碱 性 物质 大 部 分 呈 阳 离子 状态 。 如 pH 很 高 时 ,酸性 物质 大 部 分 呈 阴 离子 状态 在 在 ,而 碱 性 物质 则 呈 非 解 离 分 子 状态 。 离 子 状 态 的 物质 ,不 论 是 阳离子 或 阴离子 都 易 溶 于 es。 26 。 永 ; 非 离 解 的 分 子 状 态 则 易 溶 于 有 机 溶剂 。 所 以 当 酸 性 物质 处 于 低 pH fa, 碱 性 物质 处 于 高 pH 值 时 , 都 可 以 转 溶 于 有 机 溶剂 。 但 有 些 两 性 物质 如 氨基 酸 , 在 等 电 点 以 外 任何 pH 值 时 : 均 呈 离子 状态 存在 ,所 以 氨基 酸 一 般 不 用 有 机 溶剂 提取 ( 稀 的 乙醇 例外 )。 酸 竹 或 碱 性 物质 在 不 同 pH 下 的 溶解 性 质 的 差异 ， 和 它们 的 酸性 与 碱 性 的 强 弱 程度 有 关 。 如 非常 弱 的 酸 , 则 需要 高 PH 值 的 溶剂 内 ,才能 使 这 种 酸 解 离 。 以 上 从 pH 值 与 物质 溶解 度 之 间 的 关系 作 一 简单 的 讨论 。 对 和 蛋白质、 酶 、 核 酸 等 生 物 大 分 子 来 说 ,提取 溶液 选择 pH 值 首 先 要 保证 这 些 生 物 大 分 子 活性 不 受 破坏 为 前 提 , 过 酸 、 过 碱 均 尽量 避免 ,一 般 控 制 在 pH 6 一 8 范围 , 常 选 接近 中 性 的 pH 比较 稳定 。 如 单纯 从 溶解 度 方 面 考虑 ,等 电 点 在 酸性 范围 的 蛋白 质 或 酶 , A EVA EH EH AE 碱 性 范围 时 , 则 选用 偏 酸性 溶液 提取 ,酸性 条 件 还 可 以 解 离 一 些 蛋白 质 与 其 他 组 分 的 离子 键 结 合 。 并 有 利于 细胞 壁 的 溶解 。 aN 温 EE 温度 的 升 高 可 增加 物质 的 溶解 度 ,减少 溶液 的 粘度 ,这 是 大 家 熟知 的 。 所 以 , 略为 提 高 温度 对 提取 是 有 利 的 , 这 叫 热 提取 法 。 热 提 取 法 多 用 于 一 些 植物 成 份 和 某 些小 分 子 生 化 物质 , 提取 温度 常 控制 在 50~70°C 左右 。 热 提取 法 虽然 提取 效率 高 ,但 所 得 提取 液 含 杂质 较 多 ,不 如 冷 提 法 含 杂质 少 , 这 是 热 提 法 的 缺点 ,对 于 绝 大 多 数 生物 大 分 子 , 除 了 某 些 特殊 例子 外 , 一 般 提 取 温 度 选 择 O~ 10°C 范围 ,选择 温度 范围 不 但 使 溶质 有 较 好 溶解 度 ， 更 主要 是 防止 生物 大 分 子 的 变性 。 A. E be fil AGHNE-RERARKEXAARKANOMR. 可 分 阴离子 、 阳 离子 和 中 性 去 拍 HSS MAM, 去 垢 剂 一 般 具 有 乳化 \ 分 散 和 增 溶 作 用 , 其 中 中 性 去 拍 剂 对 蛋白 质 的 变性 作用 影响 较 少 ， 宣 于 蛋白 质 或 酶 提取 之 用 。 一 般 市 售 中 性 去 拍 剂 有 Tween 20、40、60、 85, Triton X-100 420; Lubrol W 等 多 种 规格 。 中 性 去 垢 剂 使 用 后 可 通过 Sephadex LH- 50 柱 除 去 所 ,和 欲 直接 用 DEAE-Sephadex 柱 层 析 , 不 必 先 分 离 除 去 去 拍 剂 名, 洗 脱 所 得 蛋白 质 溶液 ,接着 可 用 盐 或 有 机 溶剂 分 部 沉淀 。 某 些 阴离子 去 拍 剂 如 十 二 烷 基 硫酸 钠 , 它 可 以 促进 核 蛋 白 的 解体 ， 将 核酸 释放 出 来 ， 并 对 核酸 酶 有 一 定 抑制 作用 ,常用 于 核酸 的 提取 。 SOT 固 一 液 萃 下 中 扩散 作用 的 应 用 当 提取 物 是 由 固 相 转 为 沪 相 , 或 由 细胞 内 转 到 细胞 外 时 ,提取 的 效率 与 物质 的 扩散 作 星 有关。 扩散 作用 中 各 项 因素 关系 可 用 下 式 表示 : G=prA’; Ax AH: G 为 已 扩散 的 物质 量 。 e 27°¢ D 为 扩散 系数 。 物 质 分 子 量 越 大 ,扩散 系数 越 小 ,温度 升 高 ,扩散 系数 增 大 , 深 波 粘度 增加 ,扩散 系数 减少 。 F 为 扩散 面积 。 AC 为 两 相 界 面 溶质 的 浓度 差 , AC 越 大 ,扩散 越 快 。 Ax 为 溶质 扩散 的 距离 , Ax 越 大 ,物质 扩散 到 溶剂 中 的 速度 越 慢 。 t 为 扩散 时 间 , 时 间 越 长 ,扩散 的 量 越 多 。 从 上 式 各 因素 的 关系 可 知 ,为 了 增加 扩散 物质 的 量 , 也 就 是 提高 提取 速度 , WR 下 措施 : 《1》 提 高 材料 的 破碎 程 度 , 以 增加 扩散 面积 ,减少 扩散 距离 。 《2》 进 行 搅 拌 , 使 已 扩散 的 溶质 迅速 与 溶剂 混 匀 ,以 保持 两 相 界面 最 大 浓度 差 ， 或 分 次 提取 ,不 断 更 换 新 鲜 溶 剂 , 以 提高 扩散 速度 。 《3》 延 长 提取 时 间 ，, 提 高 提取 温度 (但 对 一 些 不 耐 热 的 物质 , 温度 不 宜 过 高 )， 以 及 减 少 溶液 粘度 (如 属 大 分 子 核 酸 干 扰 , 加 入 少量 鱼 精 蛋白 或 硫酸 链 霉 素 沉淀 去 除 ) 等 。 国 一 液 提 取 常 见于 动物 骨骼 \ 肌 肉 组 织 及 中 草药 等 材料 ,往往 由 于 这 些 材料 的 组 织 组 胞 破碎 比较 困难 ,提取 效果 受 扩 散 作 用 的 影响 较 大 。 实际 上 从 破碎 后 的 固体 细胞 提取 所 需 组 分 , 当 细 胞 破碎 程度 及 提取 温度 受到 限制 时 ， 采用 少量 多 次 提取 方法 较为 有 利 吕 。 设 K 为 所 制备 的 溶质 (A) 在 因 相 和 液 相 中 分 配 系数 ,，x 为 固 相 中 原 有 的 《〈A) HE 量 , xn 为 提取 kaa (A) NBER. WH 被 抽 提 固体 材料 体积 ， 工 为 每 次 抽 提 剂 所 用 溶剂 的 体积 。 可 得 如 下 公式 : ES KW + L 从 上 式 可 看 出 用 同样 体积 的 盗 剂 抽 提 ， 分 二 次 oor 2-2 表示 : SAW mmm 分 配 定律 的 应 用 液 一 芒 萃 取 选 用 的 溶剂 必须 与 被 抽 提 的 溶液 互 不 混和 ， 且 对 被 抽 提 的 溶质 有 选择 性 的 溶解 能 力 。 萃取 的 过 程 是 溶质 在 两 相 中 经 充分 振 沪 乎 衡 后 按 一 定 比例 分 配 的 过 程 。 溶 质 在 两 相 中 达到 平衡 后 分 配 比 例 受 分 配 定律 的 支配 。 分 配 定律 可 表示 为 在 恒温 、 恒 压 及 比较 稀 的 浓度 下 ,溶液 在 两 相 中 的 浓度 分 配 比 是 一 个 常 2-2 ”提取 次 数 与 提取 率 的 关系 数 , 即 : en ie ( C, sees 式 中 C 一 一 表示 分 配 达 到 平衡 后 ,在 上 层 液 相 中 溶质 的 浓度 。 C 一 一 表示 分 配 达到 平衡 后 ,在 下 层 液 相 中 溶质 的 浓度 。 se。 28 。 抽 提 比 一 次 抽 提 收 率 高 得 多 , 抽 提 次 数 与 比 可 用 K 一 一 为 分 配 常数 z 不 同 溶质 在 不 同 溶剂 中 有 不 同 的 K 值 。 开 值 愈 大 ， 表 示 该 溶质 在 上 层 液 相 中 溶解 度 GX, Ka), 表示 该 盗 质 在 下 层 该 相 中 溶解 度 愈 大 。 当 混合 各 组 分 的 天 值 很 接近 时 ， 须 通过 不 断 更 新 溶剂 进行 多 次 抽 提 才能 彼此 分 开 。 分 配 系数 与 物质 在 二 相 系 统 中 的 溶解 度 有 关 ，, 但 分 配 系数 不 等 于 溶质 在 二 个 相 溶剂 中 溶解 度 的 比例 ; 因 溶 解 度 是 指 饱和 状态 而 言 ,而 一 般 萃 取 常 限于 稀 的 溶液 。 如 溶质 分 子 在 提 查 的 溶 州 有 缔 合 现象 , 则 分 配 定律 公式 改写 为 : Ci C3 a Me M, a 为 溶质 缔 合 后 分 子 量变 化 的 数目 。 其 数值 等 于 在 上 层 相 中 的 分 子 量 (M.) 和 下 层 补 相 中 分 子 量 〈《M:) Zito 例如 , 酷 酸 分 子 量 为 60, 在 水 和 乙醚 之 间 分 配 ， 因 没有 缔 合 现象 发 生 ;, 故 , Mi = 60,M, = 60 oem n WBS PRE 7k FUR ZIAD Bc , Fa RE HB BK CCHCOOH ), 487473 FHM: = 120, 了 时 所 以 醋酸 在 水 一 葵 体 系 中 ,分 配 系数 开 应 为 : oe €: C3 KIRA E HS ATO eR KAR: 水 , 水 一 醇 为 一 相 ， 兄 一 相 为 与 水 不 相 混和 的 各 种 碳 氨 化合物 ,如 低级 醚 , BE. AS. KIRA eR 抽 提 和 多 次 抽 提 , 抽 提 时 可 用 普通 分 液 遍 斗 人 工 操作 , BAD ABR RD ALM 逆流 分 配 仪 是 一 种 多 次 液 一 液 萃 取 的 装置 ， 可 以 自动 进行 数 十 次 甚至 数 百 次 连续 的 转 液 抽 提 ,最 后 将 一 系列 民 值 十 分 相似 的 组 份 , 经 过 多 次 二 相 系 统 不 断 抽 提 和 重新 分 配 后 , 达 到 彼此 分 离 的 目的 。 逆 流 分 配 仪 已 广泛 用 于 多 肽 如 垂体 激素 、 加 压 素 、 催 产 素 、 短 杆菌 肽 和 tRNA 的 分 离 。 第 六 节 ”提取 时 对 具有 生理 活性 物质 的 保护 措施 对 于 一 些 具 有 生理 活性 的 物质 的 提取 ， 除 了 考虑 所 选用 的 溶剂 对 被 提取 物 有 较 大 的 入 解 度 , 对 杂质 有 较 少 的 溶解 度 外 ,还 应 综合 考虑 提取 所 用 的 溶剂 中 各 种 成 份 的 组 合 及 其 他 因素 ,使 这 些 活性 物质 在 提取 时 处 于 稳定 状态 , 对 于 一 些 生物 大 分 子 如 蛋白 质 、 酶 和 核 酸 来 说 ,主要 措施 常 有 如 下 几 点 : 1. 采用 缓冲 系统 。 防止 提取 过 程 中 某 些 酸 碱 基 团 的 解 离 ， 造 成 溶液 中 pH 值 变化 幅 度 过 大 ， 导 致 某 些 活 性 物质 的 变性 , 或 由 于 pH 影响 提取 的 效果 。 在 生化 制备 中 , 提取 用 的 绥 冲 系统 常 有 磷酸 盐 缓冲 液 , 柠 檬 酸 盐 缓冲 液 ，Tris 缓冲 液 , 醋 酸 盐 缓 冲 液 ， 碳 酸 盐 组 se。 29 。 冲 洲 和 巴 比 妥 缓冲 液 等 。 缓冲 液 所 使 用 的 浓度 均 比 较 低 ,以 利于 增加 溶质 的 溶解 性 能 。 2. 加 入 保护 剂 。 人 防止 某 些 生理 活性 物质 的 活性 基 团 及 酶 的 活性 中 心 受 到 破坏 。 如 最 常见 的 斑 基 ,是 许多 活性 物质 和 酶 催化 的 活性 基 团 , 它 极 易 被 氧化 , 故 提取 时 常 加 入 一 些 还 原 剂 如 半 胱 氨 酸 , o- GALS, 二 芒 基 赤 侠 糖 醇 ， 还 原型 合 胱 甘 肽 等 以 防 下 它 的 氧化 其 他 的 措施 如 提取 某 些 酶 常 加 入 一 些 底 物 。 一 些 易 受 重金 属 离子 抑制 生理 活性 的 物质 ; 加 入 某 些 金属 鳌 合 剂 , 把 有 害 金 属 离子 鳌 合 掉 , 而 保持 被 提取 的 活性 物质 的 稳定 性 5 3. 抑制 水 解 酶 的 破坏 。 是 提取 生化 物质 中 最 重要 保护 性 措施 之 一 。 可 根据 不 同 水 解 酶 的 性 质 采 用 不 同方 法 ， 如 需要 金属 离子 激活 的 水 解 酶 (如 DNase), HMA EDTA 或 用 柠檬 酸 缓 冲 液 除去 溶液 中 的 某 些 金属 离子 , 使 酶 的 活动 受到 抑制 。 对 热 不 稳定 的 水 解 AS, 可 用 热 提取 法 使 之 失去 作用 ， 或 根据 水 解 酶 的 溶解 性 质 的 不 同 , KAA pH 值 提 取 以 减少 水 解 酶 释放 到 提取 液 中 的 机 会 ;或 选用 pH 范围 使 酶 活力 最 低 。 但 最 有 效 方法 还 是 针对 性 地 加 入 某 些 抑制 剂 , 以 抑制 水 解 酶 的 活性 。 核 糖 核酸 酶 是 制备 完整 RNA OT 的 最 大 障碍 , 在 长 期 研究 中 已 发 展 了 许多 特殊 抑制 剂 对 付 此 本。 例如 阴离子 去 拍 剂 十 二 烷 基 硫酸 钠 ,脱氧 胆 酸 钠 ， 蒜 -1;5- 二 磺 酸 钠 , 三 异 丙 基 蘑 磺 酸 钠 ， 4- 氮 基 水 杨 酸 锁 等 , 坎 已 被 广泛 应 用 于 核酸 的 提取 。 另 最 近 还 使 用 了 皇 土 (Bentonite, Al,O,-4Si0,-H,0), FR (Heparin), DEP (Diethyl-pyrocarbesate， 二 乙 基 焦 碳 酸 盐 ), 和 蛋白酶 K( 该 酶 最 适 pH 7.5 ~ 12， 对 热 稳 定 , 在 很 高 浓度 的 SDS 和 尿素 溶液 中 仍 有 很 高 活性 ) 等 多 种 核酸 酶 的 抑制 剂 ? 使 具有 活性 的 核酸 提取 纯化 工作 获得 了 很 大 进步 。 此 外 提取 各 种 具有 活性 的 蛋白 质 或 酶 分 子 时 ， 常 加 入 某 些 蛋白 酶 抑制 剂 如 葵 甲 基 磺 酰 氟 化 物 (PMSF)， 二 蜡 丙 基 氟 磷酸 (DIFP 或 DFP), MOMS. 但 这 些 抑制 剂 在 帮 制 蛋白 水 解 酶 的 同时 , 也 常 抑制 其 他 蛋白 质 和 酶 的 活性 , 使 用 时 必须 小 心 选择 。 一 般 说 ， 提取 蛋白质 时 ， 加 入 蛋白 水 解 酶 的 抑制 剂 没有 象 使 用 核酸 酶 抑制 剂 在 核酸 提取 时 那样 普 遍 和 迫切 。 4. 其 他 一 些 特殊 要 求 的 保护 措施 , 除 前 面 已 提 及 过 种 种 引起 生物 大 分 子 变性 因素 , 嫩 紫外 光 、 强 烈 搅 拌 、 过 酸 过 碱 、 高 温 、 冻 结 等 均 避 免 外 。 某 些 生物 大 分 子 提 取 时 的 特殊 要 求 ; 如 固氮 酶 钼 一 铁 蛋 白 , 提取 分 离 时 严格 要 求 无 氧 条 件 下 进行 , 以 及 某 些 对 冷 或 热 敏感 的 蛋白 要 求 一 定 的 温度 下 操作 等 均 应 根据 不 同 具 体 对 象 予以 不 同 处 理 。 第 七 节 ”各 类 物质 的 提取 分 离 一 、 蛋 白质 和 酶 的 提取 分 离 《一 ) 不 同 结构 的 蛋白 质 及 其 溶解 性 质 蛋白 质 按 其 功能 可 分 为 活性 蛋白 和 非 活性 蛋白 二 类 ， 按 结构 又 可 分 为 简单 蛋 自 和 结 合 蛋 白 二 类 ; 再 一 种 分 类 法 是 根据 蛋白 质 的 溶解 度 差别 而 分 为 水 溶性 蛋白 ， 醇 溶性 蛋 自 等 , 还 有 一 类 硬 蛋白 不 溶 于 水 , 稀 酸 , 稀 碱 和 有 机 溶剂 , SRR eK BRE A AS 溶解 性 质 见 表 2-3。 REA 2-3 所 列 各 类 蛋白 质 的 溶解 性 质 , 可 以 看 出 大 部 份 蛋白 质 可 溶 于 水 、 稀 盐 、 称 碱 或 稀 酸 溶液 ,少数 与 脂 类 结合 的 蛋白 质 则 洛 于 乙醇 、 丙 酮 、 丁 醇 等 有 机 溶剂 。 蛋 白质 在 se。 30 。 2-3 不 同 结构 的 蛋白 质 及 其 溶解 性 质 蛋 白质 类 Al 溶 解 性 质 简单 蛋白 质 1. 白 蛋白 PSF AKI Ai ah » GD » PH TRIES RK » FT BR 50% TAAL HR KIT he 2- 球 蛋白 真 球 蛋 白 一 般 在 等 电 点 不 咨 于 水 ,但 加 入 少量 的 盐 \ 酸 \ 碱 则 可 咨 解 。 WREA 溶 于 水 ?可 为 5092 TAME ALERT Ho 3. 醇 溶 蛋白 溶 于 70 一 8092 乙 醉 中 ,但 不 溶 于 水 及 无 水 乙醇 。 4.858 在 等 电 点 不 溶 于 水 ?也 不 溶 于 稀 盐 液 ， 易 溶 于 稀 酸 , 稀 碱 咨 被 。 5. 精 蛋白 溶 于 水 和 稀 酸 , 易 在 稀 氨 水 中 沉淀 。 6 组 蛋白 PST AKA» DEA AK OTE, 硬 蛋白 质 AEF K » th » FRE » oT 结合 蛋白 质 此 类 和 蛋白质 溶解 度 性 质 随 蛋 白质 与 非 蛋 白 结 合 部 份 的 不 同 而 异 ， 除 脂 蛋白 外 ;一 般 可 溶 于 稀 酸 ， 稀 碱 及 盐 溶液 中 , 脂 蛋白 如 脂 质 部 分 露 于 外 * 则 脂 溶 性 占 优 势 , 如 脂 质 部 份 被 包围 于 分 子 之 中 , 则 水 溶性 占 优 势 。 《包括 磷 蛋 白 ? 粘 蛋白 " 糖 蛋白 , 核 蛋白 脂 蛋白 ,血红 蛋白 ,金属 蛋白 ， 黄 素 蛋白 等 ) 不 同 溶剂 中 的 溶解 度 差 别 ， 主 要 取决 于 蛋白 质 分 子 中 极 性 基 团 与 非 极 性 基 团 的 比例 和 这 些 基 团 的 排列 位 置 及 偶 极 距 ， 因 此 采用 不 同 溶剂 和 调整 影响 蛋白 质 溶 解 度 的 外 界 因 素 如 im BE. PHS SE BESS » BU 5] FE) res AS Sik J PO IA 7 A SS A 2 HEE DS HK 《二 ) 蛋白质 及 酶 的 一 般 提取 方法 1 水 溶液 提取 ” 凡 能 溶 于 水 、 稀 盐 、 稀 酸 或 稀 碱 的 蛋白 质 或 酶 ,一 般 都 可 用 稀 盐 溶 波 或 缓冲 溶 芒 进行 提取 。 稀 盐 溶液 和 缓冲 溶液 有 利于 稳定 蛋白 质 结 构 和 增加 蛋白 质 溶解 度 。 加 和 人 的 提取 流 的 量 要 适当 ,加 入 量 太 少 提取 不 完全 ,加 的 量 太 多 ，, 则 不 利于 浓缩 ,一 般 用 量 为 原材料 3 一 6 倍 体积 左右 ， 可 一 次 提取 或 分 次 提取 。 提 取 时 常 缓慢 搅拌 , 以 提高 提 取 效 率 。 以 盐 溶液 或 缓冲 液 提取 蛋白 质 和 酶 时 , 常 综合 考虑 下 列 因 素 : 《1) 盐 浓度 : 提取 和 蛋白质 的 盐 浓 度 ， 一 般 在 0.02 一 0.2M* 的 范围 内 。 常用 稀 盐 溶液 和 缓冲 液 有 0.02 一 0.05M 磷酸 缓冲 液 ,碳酸 缓冲 液 , 0.09~0.15M 氯 化 钠 溶液 。 在 某 些 情 况 下 ， 也 用 到 较 高 的 盐 浓 度 ， 如 提取 脱氧 核糖 核 蛋 白 及 膜 蛋白 。 有 时 为 了 整合 某 些 金属 离子 和 解 离 酶 分 子 与 其 他 分 子 的 静电 结合 ， 选 用 柠檬 酸 缓冲 液 和 焦 磷 酸 钠 缓冲 液 可 获得 较 好 效果 。 故 稀 盐 溶液 和 缓冲 溶液 的 浓度 及 缓冲 液 的 组 份 的 选择 , 应 根据 不 同 对 象 及 具 体 情 况 而 定 。 有 时 为 了 破坏 蛋白 质 与 其 他 物质 的 离子 键 或 氢 键 的 结合 , 加 和 人 少量 多 价 阴 离子 也 有 助 于 对 这 些 蛋 白质 提取 分 离 。 总 的 来 说 , 能 溶 于 水 溶液 而 与 细胞 颗粒 结合 较 松 A ABs, 在 细胞 破碎 以 后 , 只 要 选择 适当 的 盐 浓度 和 pH 值 , 一 般 是 不 难 提 取 的 。 (2) PH: 蛋白 质 和 酶 所 用 的 提取 沪 pH 值 一 般 选 择 在 被 提取 的 蛋白 质 等 电 点 两 侧 的 稳定 区 内 。 如 细胞 色素 丙 是 一 碱 性 蛋白 质 ,常用 稀 酸 提取 。 肌 肉 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 是 一 酸性 蛋白 质 ， 则 用 稀 碱 提取 。 植物 组 织 中 的 一 些 酸性 或 碱 性 蛋白 质 常 分 别 用 0.1% 一 0.2 多 的 氧 氧化 钾 水 溶液 或 1% 碳酸 钠 溶液 提取 。 在 某 些 情况 下 ,为 了 破坏 所 分 离 的 蛋白 质 与 其 他 杂质 的 静电 结合 ,选择 偏 酸 (pH 3 一 6) 或 偏 碱 (PH 10 一 11) 提取 ,可 以 使 离子 * 1i=I1mol/L, Fil, 键 破 坏 而 获得 单一 的 蛋白 成 份 。 (3) 温度 : 蛋白 质 和 酶 一 般 都 不 耐 热 , 所 以 提取 时 通常 要 求 低温 操作 。 只 有 对 某 些 耐 高 温 的 蛋白 质 或 酶 (如 胃 和 蛋白 酶 .酵母 醇 脱 氢 酶 及 某 些 多 肽 激素 ) 才 在 比较 高 的 温度 下 提取 ,使 更 有 利于 和 其 他 不 耐 热 蛋白 质 的 分 离 。 2. 有 机 溶剂 提取 .一些 和 脂 质 结合 比较 牢固 或 分 子 中 非 极 性 侧 链 较 多 的 蛋白 质 和 酶 , 难 溶 于 水 , 稀 盐 , 稀 酸 和 稀 碱 ,常用 有 机 溶剂 提取 。 如 丙酮 , 异 丙 醇 \ 乙 醇 \ 正 ] 醇 等 , 均 可 溶 于 水 或 部 份 溶 于 水 ， 这 些 溶剂 都 同时 有 亲 脂 性 和 亲 水 性 。 其 中 正 丁 醇 有 较 强 的 亲 脂 性 ,也 有 一 定 亲 水 性 ,在 0*c 时 于 水 中 有 105% 的 溶解 度 。 它 在 水 和 脂 分 子 间 起 着 类 似 去 污 剂 的 桥梁 作用 ,在 取代 蛋白 质 与 脂 质 的 结合 位 置 后 ,由 于 丁 醇 与 蛋 自 质 极 性 基 团结 合 的 竞争 力 比 脂 质 大 ， 能 阻止 脱落 了 的 脂 质 重新 与 蛋白 质 结合 。 使 原来 蛋白 质 在 水 中 溶解 度 大 大 增加 。- 丁 醇 在 水 溶液 及 各 种 生物 材料 中 解 离 脂 蛋白 的 能 力 极 强 ， 是 其 他 有 桃 咨 剂 ”所 不 及 的 。' 我 国生 化 工作 者 曾 用 此 法 成 功 地 提取 了 琥珀 酸 脱 气 酶 号 ， 对 于 碱 性 磷酸 酯 酶 的 提取 效果 也 十 分 显著 ”。 有 些 蛋白 质 和 酶 既 溶 于 稀 酸 、 黎 碱 ， 又 能 溶 于 一 定 比 例 的 有 机 溶剂 。 在 这 样 的 情况 -下 ,采用 稀 的 有 机 溶剂 提取 常常 是 为 防止 水 解 酶 的 破坏 ,并 兼 有 除 杂 和 提高 纯化 效果 的 作 用 。 现 举例 说 明 如 下 : 如 胰岛 素 可 溶 于 黎 酸 、 和 硕 碱 和 稀 醇 溶 流 ,但 针对 组 织 中 共存 的 糜 蛋白 酶 对 胰岛 素 有 极 高 的 水 解 活性 ,采用 68 多 酒精 溶 息 并 用 草酸 调 至 pH 2.53.0， 这 样 便 能 在 三 方面 抑制 了 了 糜 蛋白 酶 的 活性 : 《1) 6% 酒精 可 以 使 糜 蛋 白 酶 暂时 失 活 ; 2) 草酸 可 以 除去 激活 麻 蛋白 酶 的 金属 离子 Ca 六 3) 选 用 pH 2.5 ~ 3.0 是 糜 蛋白 酶 不 适宜 作用 的 pH 值 。 而 以 上 条 件 对 胰岛 素 的 溶解 度 和 稳定 性 并 没有 影响 ， 并 可 以 除去 一 部 份 在 稀 醇 及 酸性 深 液 中 不 溶解 的 杂 和 蛋白 。 当 然 胰 名 素 的 提取 现 已 有 了 新 的 进展 ,但 上 面 的 设计 仍 是 十 分 合理 的 。 又 如 提取 垂体 前 叶 ACTH 常 采 用 酸性 70 多 丙酮 ,其 设计 原理 是 酸性 可 以 促进 ACTI 孔 的 溶解 ,而 70% 浓度 丙酮 对 ACTH 的 溶解 度 没 有 影响 , 却 可 大 幅度 地 抑制 其 他 杂 蛋 白 的 溶出 ,对 提高 分 离 纯 化 的 效果 极为 显著 。 | 3. MHIREERKBCENSE DRAB 膜 上 的 蛋白 质 或 酶 一 般 有 二 种 存 在 状态 ,一 是 在 膜 表面 上 ,与 膜 成 份 联系 比较 松 ; 第 二 是 膜 的 内 在 成 份 之 一 ,或 与 膜 成 份 结 合 较 紧 。 蛋白 质 与 膜 成 份 的 结合 可 通过 脂 质 形 成 复合 物 ， 也 可 以 通过 金属 离子 与 膜 成 份 结合 ,或 与 膜 其 他 蛋白 质 形成 复合 物 。 与 膜 成 份 结合 较 松 的 蛋白 质 或 酶 ,经 过 充分 破碎 细 胞 ,在 一 定 pH 范围 用 稀 盐 溶液 即 可 提取 分 离 。 如 线粒体 上 的 细胞 色素 “，, 是 与 细胞 露 结 合 较 松 的 一 个 酶 ， 用 pH 4.0 的 酸 或 等 沙 KClI 溶液 破坏 其 与 膜 成 份 的 静电 引力 ;线粒体 上 的 细胞 色素 “ RSE RR. 但 一 些 与 膜 成 份 结合 较 牢 或 属于 膜 组 成 的 蛋白 质 , 提取 则 比较 困难 , 须 用 超声 波 , 去 污 剂 或 其 他 比较 强烈 的 化 学 处 理 , 才 能 从 膜 上 分 离 出 来 。 一 般 常 用 方法 有 如 下 几 种 : CL) 浓 盐 或 尿素 等 溶液 提取 :如 NaClo、 尿 素 \ 肛 盐酸 盐 等 溶液 均 有 人 应 用 于 提取 膜 蛋 日 ， 当 以 上 次 小 浓度 达到 2M 时 ,可 抽 去 27 多 以 上 的 膜 蛋白 , 但 使 用 这 样 条 件 易 引起 蛋白 质 和 酶 的 变性 。 2) MEME: 碱 性 条 件 也 可 以 解 离 与 膜 上 成 份 结合 的 蛋白 质 。 在 pH 8 一 11 范 围 内 , 茶 些 膜 蛋白 随 着 pH 值 的 提高 而 溶解 度 大 大 增加 , 至 pH 11 时 , 4A 40~50% AY e 32 ¢ 膜 蛋白 被 抽出 ,但 碱 提取 法 也 容易 引起 蛋白 质 和 酶 的 失 活 , 应 用 上 不 广 。 3) 加 入 金属 歼 合 剂 : 蛋白质 通过 金属 离子 与 膜 成 份 结合 时 ， 加 入 金属 歼 合 剂 如 EDTA 可 使 蛋白 质 释放 出 来 。 用 此 法 曾 成 功 地 提取 了 膜 上 ATP 酶 的 偶 联 因 了 于 To EDTA 与 超声 波 联合 处 理 抽 提 膜 上 磷 栈 转移 酶 , 据 报 导 效 果 更 好 ”。 (4) 有 机 溶剂 抽 提 9: 使 用 乙醇 \ 吡 啶 \ 叔 戊 醇 \ 正 丁 醇 等 溶剂 抽 提 及 用 冷 丙 酮 做 成 丙酮 粉 ,是 提取 膜 上 与 脂 质 结合 的 脂 蛋 白 或 膜 内 脂 蛋 白 组 份 最 常用 也 较 有 效 的 方法 ,其 中 权 成 醇 及 正 丁 醇 用 于 膜 内 脂 蛋 白 效果 尤 佳 。 前 已 提 到 正 丁 醇 可 在 广泛 的 pPH 值 (pH 3 一 10) AmB EEA C —2— + 40°C) 使 用 。 用 有 机 溶剂 结合 其 他 方法 已 成 功 地 提取 了 多 种 膜 圭 蛋白质 和 酶 ,如 NPDH 脱 氢 酶 ， 琥 珀 酸 脱氧 酶 ,细胞 色素 氧化 酶 , 碱 性 磷酸 酯 酶 ， 胆 碱 脂 酶 等 。 《5) AnH: 去 垢 剂 处 理 是 目前 广泛 应 用 于 提取 膜 上 水 盗 性 蛋白 和 脂 蛋 白 的 方 法 ;常用 的 去 拍 剂 有 弱 离子 型 去 拍 剂 脱氧 胆 酸 盐 , 胆 酸 盐 ， 强 离子 型 去 拍 剂 十 二 烷 基 硫 酸 销 (SDS)， 和 非 离子 型 去 垢 剂 Triton X-100 和 Tween, Lubrol 和 Brij 等 。 去 垢 剂 处 理 膜 蛋 自 时 的 浓度 通常 为 1 多 左右 ,用 此 法 提取 的 膜 蛋白 和 酶 有 细胞 色素 bf、 胆 碱 脂 酶 、 细 胞 色素 氧化 酶 、DPNH 氧化 酶 、ADP/ATP 载体 蛋白 等 。 Ringenberg 认为 用 去 垢 剂 分 离 BEAN, 选择 去 垢 剂 首 先 考 虑 : 〈1) 去 拍 剂 的 溶解 能 力 ; (2) 去 拍 剂 的 温和 性 。 强 离 FRAG Cl SDS) 一 般 具 有 很 好 盗 解 能 力 ， 但 温 和 情况 不 理想 ， 容 易 引 起 蛋白 质变 性 。 弱 离子 型 或 非 离子 型 去 拍 剂 对 蛋白 质变 性 影响 较 小 , 而 溶解 能 力 差 。 去 拍 剂 的 溶解 能 力 与 溶液 的 离子 强度 大 小 有 关 。 一 般 来 说 ,离子 强度 增加 ;去 垢 剂 的 溶解 能 力也 随 之 增 大 。 所 以 使 用 去 拍 襄 溶解 膜 蛋白 时 , 须 考 虑 各 种 条 件 。 根据 Klingenberg 等 的 经 验 , OB 线粒体 膜 ADP/ATP 载体 蛋白 :选用 Triton X100 比 用 Lubrol, Brij 和 Aminoxide 等 去 垢 剂 效果 较 好 ， 所 得 ADP/ATP 载体 蛋白 具有 较 高 的 天 然 活性 。 但 主要 缺点 是 Triton x100 在 280nm 处 有 强 的 紫外 吸收 ,干扰 用 紫外 法 测定 蛋白 质 的 含量 局 。 脱氧 胆 酸 盐 和 胆 酸 盐 也 常用 提取 细胞 色素 系统 的 酶 和 线粒体 膜 上 的 ATP Bo, Re 近 我 国 尤 美 莲 等 比较 了 Triton X100- 胆 酸 和 脱氧 胆 酸 - 胆 酸 对 猪 心 线粒体 内 膜 Ht-ATP 酶 复合 体 的 分 离 效果 ,结果 表明 Triton XI100- 胆 酸 盐 法 ,操作 简便 产 率 高 ,重复 性 好 ,而 脱 氧 胆 酸 - 胆 酸 盐 法 ,操作 较 繁 琐 ;, 脱 氧 胆 酸 对 酶 活性 影响 较 大 2。 另 有 报导 使 用 去 拍 剂 ,再 加 上 温和 条 件 的 超声 波 处 理 使 细胞 结构 松散 开 来 ,可 提高 膜 蛋 自 的 提取 率 。 《6) 加 入 酯 酶 或 磷酸 酯 酶 水 解 蛋 白质 - 脂 质 复 合 物 , 也 是 一 个 有 用 的 方法 : 其 中 蛇毒 中 提取 的 磷酸 脂 酶 A 主 要 作用 于 磷脂 ,最 适 pH 为 6 一 8g。 从 胰 脏 中 提取 的 酯 酶 作用 于 单 、 =. SHIR. MVE RIG pH 为 7 一 8 酯 酶 和 磷酸 酯 酶 均 需要 Cat 所 激活 。 用 酶 法 处 理 担 取 的 膜 蛋白 及 酶 有 细胞 色素 <，c- 磷 酸 甘油 脱 氨 酶 ，TPNH- 细 胞 色素 <“ 还 原 酶 等 。 (=) 蛋白 质 和 酶 提 权 后 的 进一步 纯化 蛋白 质 和 酶 从 细胞 内 提取 出 来 后 , 仍 处 于 十 分 混杂 的 体系 中 ,必须 进一步 纯化 。 但 经 过 提取 除去 了 大 量 与 制备 物理 化 性 质 差 别 较 大 的 杂质 ， 只 剩余 与 制备 物理 化 性 质 大 致 相 近 或 类 似 的 物质 。 因 此 ,经 过 有 选择 性 的 提取 这 一 步骤 ,对 以 后 纯化 工作 创造 十 分 有 利 条 6 we WSC 27) Hi eee ee] (snwoydéqod syns) a3 ee a 00°00 hag 4 we ty-4-v PaenIn “REL 007-9 xopeydos Bie IAG SIS Be dT % | z 000°8+ WHA (5314021112 suzT) MwH-G By Sle se xepeydas “WAM -avad SAHA IOPN vol Af uefa Z 000°€b WAYwY-avid WHAW 00I-D xepeydes Se MS ie eae |t BE 000°Le Were 4-Wo “BHG-avad “BMWBG os'(HN) | CME 人 全 00 了) v oo ie 00062 WR oVNIO “MEME MIAN + V BWR EER oe | (24 89H) P wel AES Tes (zz5zt 9ut7K1D) MWlek-A«< OVNIPO-d b OOOSTIT = re LWEIILSE RY sk -osoreydas “2210 'Os*C(HN) ‘SBEREMR IOPN 2a Rt yas BY 7 44-aV AC UY Ss a SL ee IX SUR POS*CHN) SBEHENZ aa sh PPO “SL 3V OvNIeo-a | + 000STIT WEE ATH + vB BReeE mamD | CCRT Soyo) BREED hy z WIS OVN 1D SLPS BEE -osoreydes SaQUn; fF MS BER saa aie. ee 5 (C39Vd)00050z MID WO “WEI (oded v4ysgunong) TEND Se Cit FEF#)000 67S RE e-ss0reydas “20M *os*( HN) ‘BME sda MOMMIES el hd 野 靶 未 -G 000‘0ZT MAREK ES LYS osoreydag 一- -一 一 一 一 一 一 | 一 一 一 一 | 一 一 -| 一 a4 A-d , Eye -a 000*Z0T Biel “IMSS Q¢-5 xepeydag S218 'Os'CHN) BEHEARM IOeN (v22unl 01.40191049) Ce Si a ) a MFA Mr wes Hd Wp NG) (szwofisua vsqvavuveu0)) YaoD Afr | | | lk 7-C Ue-- SEES “EL OWN Ie3-(5 < T)8IeD 000S0IT TH AREA TE a S Ld Sth SE “A Ee rk-9- DE 9-ssoreydag ‘3012 *Os*CHN) BeHEMSM [OPN a -一 | 一 -一 一 一 | -一 一 一 -| 一 一 DVNIED-da 野 丑 未 -G 一 是 必 未 -G 000“85 00040ZT #4 000“59 & le 437147 S00I-D xepeydes °3747-qvad SBEREMM IJOPN 开间 三 类 esoreydag ©2212 *OS*(HN) BFHEARM IOPN aco LUG RGR BRL 9-7 (vavso0dhy siysvep) VNd 373t (snaedsig snotuv3p) es 6 《3114010229 snsgp) #5 WEY URGE WA 2 SE ° 34 e 000°Z9 JNIAA 000°9¢T HAM MoM OVN 189-d 89 esoreydag <1={ xapeydes-qs “MU *Os*(*EIN) “BEHEMSE TOUN PUM Ee ats cr Ef € se 186 SMR RAAPS EWA MAND » mT (Shagogos20uL "TEA ppungiay ol ogangst M) WAM (opengssorf 0140151) HIM WwW S WEAR 05I-9 (vaviuevd3 v1214) nN eee ar ae 000°sor xopeydeag “IVS 4%%1F-AVAC “A212 *tos’CHN) * BPE Mees ali 3 LA SEIS AFT y-esoreydag (22082 01244) Mi OVN I"9-d 000 “0T XSW 00I-9 xsepeydos “ 苛 漂 尘 玛 观 OVEN “群星 sGI-IOeN wo Oe PHAR TOH- 3 PSA SL Sry Se ey 时 二 学 由 "Van 000°ZI EE he AMWA 007-d P80 ‘We eale-avad “yan (snavdosnsx217) (0H ae 2-1 "van “MUIR IOH- WE A Lysis ee exh a 30 Ld =f 00z-d [Borg <007 van Afi =) xepeydas S23%15-Wo S'van S22Uh *os*CHN) SEERERS IOaN 5 SUR) (sx423120 uens7714..) YNVN “2N 91D- 000 YE jioHNg0 0 “LYRIS NW BERS eh Me “ONIN IDHNT-0 用 十 二 烷 基 磺 酸 钠 和 溶菌 酶 破碎 细胞 二 > 加 大 过 和 氧 酸 WE 1M 浓度 分 离 蛋白 质 和 核酸 一 > 以 等 体积 氯仿 一 戊 醇 振 荡 30 分 钟 一 > 吸取 水 层 加 两 倍 体积 乙醇 沉淀 核酸 一 > 沉淀 再 溶 于 柠檬 酸 盐 溶液 中 ,反复 以 氯仿 一 戊 醇 振 荡 提 取 , 直 至 除 净 蛋 白质 一 > 加 入 核糖 核酸 酶 消化 RNA 一 > 最 后 在 含有 柠檬 酸 盐 和 EDTA WARK H, 滴 加 0.54 体积 的 异 丙 醇 或 乙醇 以 沉淀 DNA. 目前 氯仿 法 除 应 用 于 细菌 DNA 提取 外 ,植物 和 动物 组 织 也 常 应 用 此 法 。 当 然 许 多 具体 细节 上 已 有 了 改进 叫 国 ,但 基本 原理 及 38 。 过 程 和 marmur 报告 大 致 上 是 相同 的 。 (2) 去 污 剂 法 : 去 污 剂 法 早 在 三 十 年 代 已 经 有 人 提出 ,但 直到 1951 年 以 前 此 法 并 无 太 大 进展 。1952 年 ，Key 等 人 对 此 法 作 了 详细 的 介绍 局, 才 逐 潮 被 大 们 所 重视 。 1957 年 Zamenhof 报道 在 动物 组 织 中 制备 DNA 时 ,使 用 0.1M tee (或 0.1M EDTA) 充 分 洗 活 组 织 及 破碎 细胞 ,然后 以 2M NaCl Hite. 乙醇 沉淀 后 ， 所 得 的 核 蛋白 在 标准 缓冲 液 〈0.14M NacCl 十 0.01M 柠檬 酸 钠 ) 中 加 和 乙醇 -十 二 烷 基 硫酸 钠 混 合流 ,搅拌 使 核 蛋白 解 聚 。 在 解 聚 后 的 DNA 和 和 蛋白质 溶 液 中 加 入 固体 NaCl, 使 最 终 浓度 为 5 % Ute 蛋白 质 及 去 污 剂 ,离心 后 的 上 清 液 ,再 以 乙醇 沉淀 DNA， 反 复 在 标准 缓冲 被 中 以 去 污 剂 去 蛋白 ,最 后 得 到 具有 活性 的 DNA 产品 ， 芭 上 方法 已 应 用 于 小 牛 胸腺 、 脾 脏 \ 鸡 的 红 血 球 等 材料 的 DNA 提取 分 离 C。 许 多 去 污 剂 都 具有 溶解 细胞 ,使 蛋白 质 和 核酸 解 离 ， 抑制 核酸 酶 的 活性 , 调节 各 类 核酸 在 酚 相 及 水 相 的 溶解 度 等 作用 。 常用 的 去 污 剂 有 十 二 烷 基 硫酸 钠 (SDS), 十 二 烷 基 硫酸 锂 (LDS) ,脱氧 胆 酸 钠 , 4- 氮 基 水 杨 酸 ,三 异 丙 基 磺 酸 钠 , 茶 - 1 5 二 磺 酸 钠 , 二 甲苯 磺 酸 钠 等 。 实 际 上 ， 有 目前 单独 使 用 去 污 剂 法 提取 分 离 核 酸 ,， 除 超 离 心 法 外 [如 提取 吻 菌 体 (G) DNA 一 以 5 多 浓 度 SDS 一 0.1M EDTA 提取 ,于 CsCl 中 MBAR DNA]。 一 般 多 和 葵 酚 法 、 氯 仿 法 或 其 他 方法 结合 使 用 。 如 用 末 酚 抽 提 核酸 时 ,水 相 为 RNA FISH, DNA 和 和 蛋 白质 留 在 酚 层 或 两 相交 界 处 ,但 在 1 多 SDS 或 6 % 的 对 氨基 水 杨 酸 存在 下 ,可 将 DNA 和 RNA 同时 提 到 水 相 (0.1% 的 SDS ARE RNA 提 到 水 相 )。 #-1,5 二 磺 酸 钠 与 酚 法 结合 使 用 时 ， 可 将 tRNA, rRNA 提 到 水 相 ， 而 把 DNA 和 mRNA 留 在 酚 层 。 (3) BRE: 苯酚 法 是 近年 来 较 访 行 的 一 种 提取 核酸 方法 。 早期 由 Westphal 等 人 《19527 用 酚 和 水 混合 液 处 理 细 菌 分 离 多 糖 时 ,发 现 多 糖 和 核酸 留 于 水 相 , 而 蛋白 质 溶 于 酚 相 。。 1956 年 Kirby 用 此 法 提取 了 RNA), #24 1957 年 ，Kirby 又 将 此 法 作 了 改进 呈 。 方法 是 : BS 6 多 对 氨基 水 杨 酸 做 成 匀 浆 ， 然 后 用 90 多 酚 水 混合 液 抽 提 , 使 DNA 与 RNA 同时 进 和 人 水 相 , 再 用 2- 乙 氧 基 乙醇 沉淀 DNA. DNA 与 RNA 的 分 离 采用 加 和 人 核 糖 核酸 酶 降解 法 。 多 糖 的 除去 采用 在 浓 磷 酸 盐 存 在 下 的 2- 甲 氧 基 乙 醇 抽 提 法 (多糖 深 FPA, DNA 溶 于 上 面 有 机 相 )e 以 后 ，Kirby 又 对 酚 法 作 了 多 次 改进 2 人 ,为 酚 法 提取 DNA 商定 了 基础 。 葵 酚 法 可 用 于 RNA 和 DNA 的 提取 ,由 于 其 溶解 蛋白 质 能 力 强 ， 对 核酸 酶 具有 一 定 抑制 作用 ， 并 可 以 不 经 分 离 核 蛋 白 直接 从 细胞 匀 浆 中 提取 分 离 核 酸 , 抽 提 后 留 在 水 相 残 余 的 酚 很 易 被 乙醚 洗涤 除去 ， 以 及 所 获得 的 核酸 分 子 也 较 完 整 等 ， 故 在 核酸 提取 中 是 一 种 比较 受 人 欢迎 的 方法 。 (4) DNA' 提取 实例 : DNA .提取 分 离 方法 文献 资料 很 多 ,很 难 一 一 介绍 。 现 就 上 述 几 类 主要 方法 , 现 举例 说 明 如 下 : 例 一 ; 豆 胚芽 DNA 的 提取 分 离 29: 豆 胚 芽 收 集 后 ,用 蒸馏 水 充分 洗 净 ，500 hGH 轴 加 人 2 毫升 pH7.5- 的 0.5M NaCl (内 含 0.1M EDTA) 再 加 人 40 毫克 链 丝 菌 蛋白 酶 及 5 克 莽 糖 。 研 磨 破 壁 ， 匀 浆 深 于 50 毫升 0.5M NaCl—0.1M EDTA 溶液 (内 含 5 SH 20%SDS) 中 , 37 保温 4 小 时 。 后 加 入 等 量 氯 仿 - 异 成 醇 (40:1) 混合 液 振荡 30 分钟 ， 10,000 转 / 分 下 离心 10 分钟, 上 清流 两 次 用 等 量 氯仿 = 苯酚 (1:1) 混 合 液 振荡 ,离心 取 上 面 水 相 。 加 入 等 量 乙醇 沉淀 DNA。 用 玻 棒 搅 集 后 再 溶 于 10 毫升 0.15M NaCl—0.015M fF 檬 酸 三 钠 溶液 《pH7.0) 中 ,同时 按 每 毫升 2 微克 及 0.006 微克 的 量 分 别 加 人 核糖 核酸 酶 es 39 。 A AIM ER KOT, 核糖 核酸 酶 ，37%C 保温 60 分 钟 。 接着 用 50 微克 /毫升 的 链 丝 菌 蛋白 酶 37°C 处 理 二 小 时 。 此 混合 物 溶液 再 用 氯仿 一 葵 酚 (1:1) 反 复 抽 提 , 除去 RNA 及 和 蛋白质， mH Ce itt DNA。 例 三 ,短小 芽孢 杆菌 抗 药性 质粒 pCl 3 ANA 9: 37°C 振荡 培养 的 细菌 至 对 数 期 5 政 集 菌 体 , 以 溶菌 酶 及 SDS 先后 处 理 , 将 破 壁 裂解 后 的 粘 稠 物 加 入 5M NaCl 至 浓度 为 1M， 以 沉淀 染色 体 DNA。 置 冰箱 过 夜 ,取出 于 0 一 3” 离心 (17,000 一 20,000g) 一 小 时 ， 取 上 MMA 10ug/ml BM RRAAR RNA。 继 加 入 固体 聚 乙 二 醇 (MW 6,000) 310% KE (W/V) 沉淀 质粒 DNA, 0—3°C 放置 20 小 时 以 上 ， 离 心 《600g) 2 分 钟 得 沉淀 将 沉淀 悬浮 于 40% (NH,),S0,—0.05M Tris-HCl (pH 8.0) 一 0.05M NaCl—5mM EDTA 中 ， 离 心 (3500 转 / 分 ) 10 分 钟 除去 液 面 的 悬浮 物 及 聚 乙 二 醇和 下 面 的 蛋白 质 沉 淀 。 将 溶液 以 50mM Tris—HCl (pH 7.5)—5mM EDTA—5mM NaCl 低温 透析 过 夜 。 Birk 用 酚 抽 提 三 次 后 再 用 氯仿 抽 提 三 次 。 最 后 以 50mM Tris—HCl(pH 7.5)—20mM NaCl— 10mM MgCl, 透析 一 次 。 取 出 用 紫外 分 光 光 度 计 测 定 含量 后 置 4 保存。 所 得 的 质粒 DNA 经 电镜 观察 ,并 依 电镜 照片 用 图 形 数字 转换 器 测定 质粒 DNA 分 子 的 长 度 , 除 以 放大 倍数 得 到 各 个 分 子 实际 长 度 , 然 后 从 平均 长 度 计算 出 PCJ3 的 分 子 量 4.33 X 10°, LE] 本 文 质粒 分 离 的 主要 根据 下 列 文 献 的 方法 略 加 修改 : (1) Guerry，D. J. et al.: J. Bacteriol. 116: 1064, 1973 (2) Hympherys, G. O. et al.: Biochem. Biophys. Acta, 383: 457, 1975 (3) Johnson, J. B. et al.: Biochem. Biophys. Res. Comm., 75: 13, 1977 例 三 ， 酵 母线 粒 体 DNA WHEE: 酵母 原生 质 体 在 0.15M NaCl—2.5% SDS (pH 7.0) 60°C 保温 搅拌 一 小 时 ,溶解 后 加 入 氢化 钠 至 IM 浓度 ,在 冰 浴 中 过 夜 。 次 日 ES DAR LB. MBAR I~ CEI. AAS, WEARS 1M NaCl 溶液 中 ,如 此 反复 处 理 数 次 。 然 后 用 15%SDS 和 和 氯仿 处 理 去 除 蛋白 ,再 按 Bermardi KS, - 羟 磷 灰 石 柱 〈HA 柱 ) 进行 吸附 , 洗 脱 后 可 得 两 个 峰 。 第 一 个 峰 为 核 DNA， 第 二 个 峰 为 线粒体 DNA。 4. RNA 的 一 般 提 到 方法 RNA 的 提取 方法 一 般 有 酚 法 ， 去 污 剂 法 和 盐酸 县 注 等 ,这 些 方法 都 可 以 用 来 提取 具有 生物 活性 的 核糖 核酸 。 此 外 ,工业 上 还 常用 稀 碱 法 和 演 盐 法 提取 酵母 RNA™, 用 稀 碱 法 和 浓 盐 法 所 提取 的 核酸 均 为 变性 的 RNA， 主 要 用 作 制备 核 彰 酸 的 原料 ,其 工艺 比较 简单 。 稀 碱 靶 使 用 工 多 氢 氧 化 钠 使 酵母 细胞 裂解 ,使 核酸 稀 放 出 来 。 然 后 用 盐酸 中 和 ， 除 去 菌 体 , 水 溶液 中 的 RNA 用 酸 调 pH 2.5， 即 沉淀 得 核 糖 核酸 粗 品 。 浓 盐 法 是 在 10% AMAR 90°C 提取 3 一 4 小 时 ,然后 提取 液 经 离心 后 以 乙醇 沉淀 RNA。 下 面 主 要 介绍 提取 具有 生物 活性 RNA 的 几 种 方法 : (1) ERME RIM RNA 是 五 十 年 代 提 出 的 , 早期 由 于 各 实验 使 用 盐酸 县 的 浓度 不 同 , 所 得 到 RNA 分 子 量 大 小 差别 较 大 ， 后 来 证 明 4 M- 盐 酸 且 不 仅 可 以 使 蛋白 质变 性 而 与 核酸 分 离 , 而 且 还 有 效 地 抑制 了 核糖 核酸 酶 。 但 2 M 浓 度 的 盐酸 WMI ARE REF LEA il] RNase， 故 所 得 RNA 分 子 量 较 低 。 如 使 用 其 他 抑制 剂 配合 2 MEE 酸 且 提取 分 离 , 也 可 以 获得 较 高 分 子 量 的 RNA。 如 1959 年 Reichmann 和 Stace-Smith 曾 成 功 地 用 2.5M 盐酸 县 加 0.005M EDTA 提取 了 土豆 病毒 X 中 具有 感染 性 的 RNAS9。 盐酸 县 法 也 可 用 于 DNA 的 提取 ,如 Widnell 和 Tata 曾 用 6 M 盐酸 且 提 取 大 鼠 细 胞 核 es 40 。 中 DNA， 但 具体 例子 不 多 。 总 的 来 说 ,盐酸 县 是 提取 分 离 RNA 的 一 种 方法 , 但 不 如 盼 法 和 去 污 剂 法 效果 好 , 故 应 用 不 广 。 (2) 去 垢 剂 法 :去 拍 剂 不 仅 广泛 应 用 于 DNA 的 提取 ,也 普遍 应 用 于 提取 各 种 RNA。 其 中 使 用 最 多 的 是 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS), 使 用 浓度 范围 为 0.5 一 2 多 ,早期 单独 使 用 此 法 提取 动物 组 织 的 ,RNA 和 植物 病毒 的 RNA 取得 一 定 成 功 ,但 除去 蛋白 质 和 不 完全 。 近年 来 多 与 酚 法 、 氧 仿 法 、 超 离心 法 结合 提取 不 同 材 料 的 tRNA, rRNA, mRNA 获得 十 分 良 好 的 效果 。 其 中 尤 以 去 污 剂 - 茶 酚 法 最 受 欢迎 ,其 例子 将 在 酚 法 中 介绍 。 这 里 简要 地 提 一 提 Key 和 DounceBa 以 及 Fraenkel-Conratse 单独 使 用 去 污 剂 提 取 动 物 和 植物 病毒 RNA 的 大 致 过 程 : 从 动物 肝脏 中 提取 RNA 的 主要 过 程 如 下 : 动物 杀 死 后 ,尽快 将 组 织 在 冰 浴 中 冷却 ， 并 在 0.9% NaCl (内 含 0.01M 柠檬 酸 钠 ) 溶液 中 做 成 匀 浆 。 离 心 后 ,上 请 和 补 以 1N HCl Va pH 4.5, 离心 取 沉 淀 再 溶 于 0.9%NaCl 中 。 加 入 2 SSDS 溶液 去 蛋白 质 , 以 10 色 NaOH VA pH 7.0 搅拌 3 小 时 。 后 加 大 NaCl 至 1M 浓度 抽 提 ,离心 后 取 上 清流 ,用 2 倍 乙 醇 沉 淀 RNA。 用 SDS 去 蛋白 可 反复 进行 ,直至 RNA 达到 所 需 纯度 。 从 烟草 花 叶 病毒 (TMV) 中 提取 RNA 的 主要 过 程 如 下 : 4 KR1 ZTMV (内 含 10“EDTA) #£50°C 及 pH8.5 下 ,加 入 SDS 使 最 终 浓度 为 1 %o MHS DH, AM 后 ,以 33% 饱和 度 硫 酸 铵 沉淀 蛋白 质 ,离心 后 的 上 清 液 于 冰箱 中 过 夜 使 RNA 沉淀 ,第 二 天 离心 后 ;再 将 沉淀 溶 于 水 中 ,加 入 几 滴 pH 5.0，3M BRAK, 并 以 二 倍 体积 乙醇 沉 证 RNA。 最 后 将 沉淀 溶 于 水 中 ,用 超 离心 法 除去 病毒 及 凝集 物 , 即 得 RNA 水 溶液 。 (3) AME: 苯酚 法 用 于 提纯 RNA 47 DNA， 现 仍 是 分 离 提取 RNA 最 好 的 方 法 ， 此 法 可 以 单独 使 用 或 与 其 他 方法 结合 使 用 ,广泛 用 于 各 种 RNA 的 提取 。 根 据 其 使 用 条 件 及 与 其 他 方法 结合 情况 可 分 为 冷 酚 法 、 热 酚 法 , 皂 土 =- 酚 法 去 拍 剂 - 酚 法 等 ,其 中 热 熏 法 多 用 于 植物 组 织 及 病毒 RNA 的 提取 ,主要 由 于 这 些 材料 细胞 壁 及 外 壳 比 较 坚 硬 , 脂 质 较 多 ,必须 升 高 酚 的 提取 温度 ,才能 使 RNA 释放 出 来 。 皂 士 - 酚 法 和 去 拍 剂 - 酚 法 , 有 利于 抑制 RNase 的 作用 及 解 离 蛋 白质 与 核酸 的 结合 ,使 蛋白 质变 性 而 除去 。 各 种 方法 的 综合 使 用 是 目前 提取 核酸 最 常用 和 最 有 效 手 段 ;其 原理 通常 是 相互 取长补短 ,以 便 获 得 更 纯 更 完整 的 核酸 分 子 ,满足 分 子 生物 学 对 核酸 分 子 结构 和 功能 方面 研究 越 来 越 高 的 要 求 。 由 于 RNA 酚 法 提取 的 应 用 十 分 广泛 ,资料 甚 多 ,下 面 简单 地 介绍 几 种 以 说 明 此 法 应 用 的 大 致 过 程 : (4) 酚 法 提取 RNA 实例 例 一 、 植 物 组 织 RNA 的 提取 分 离 吧 : 新 鲜 植 物 组 织 在 溶液 A (1 克 SDS HF 100 毫 Fr 0.1M Tris BehIRAG 5 x 10°M EDTA 和 约 1 工 克 皂 土 并 调 pH 7.4) 中 。 加 砂 ( 酸 处 理 过 ) 研 磨 成 匀 浆 (不 同 组 织 有 时 须 变动 破碎 细胞 方法 )。 将 一 倍 体积 的 酚 先 预 热 60%C， 再 倒 进 组 织 匀 浆 ， 维 持 此 温度 3 分 钟 并 不 断 振荡 〈 某 些 难 提取 的 植物 组 织 需 提高 至 70%C 并 延长 提取 时 间 )。 然 后 迅速 冷却 和 离心 , 使 悬浮 液 分 成 二 相 。 取 出 上 面 水 相 , BMA 锌 A 反 复 抽 提 酚 层 。 合 并 水 相 后 ,用 乙醚 洗涤 数 次 ,除去 水 相 残余 的 酚 。 然 后 以 二 倍 体积 预 冷 的 95 9 乙醇 沉淀 RNA。 PI—.Kigtt rm tRNA 的 提取 : tRNA 分 子 量 小 ,在 105,000g 离心 后 常 存在 于 上 清 波 中 而 与 微粒 体 的 核 蛋白 很 易 分 开 , 故 提取 方法 早 在 六 十 年 代 已 解决 , 现 已 能 十 分 简便 « 41 « 地 大 规模 制备 ， 下 面 主要 以 大 肠 杆 菌 中 tRNA 的 提取 为 例 , 说 明 目 前 常用 酚 法 的 基本 过 二 让 对 数 生 长 期 的 大 肠 杆菌 菌 体 -> 破 壁 酚 处 理 去 蛋白 质 ， 水 相 以 乙醇 沉淀 RNA 并 除 去 低 分 子 量 物质 和 酚 一 > 沉淀 用 1M NaCl 抽 提 使 tRNA 和 大 分 子 RNA 分 离 一 > 进 一 步 提 纯 用 异 丙 醇 沉淀 或 上 DEAE- 纤 维 素 进 行 吸附 分 离别 。 每 公斤 大 肠 杆 菌 细胞 可 得 2~2.5 克 tRNA, 例 三 、 大 鼠 肉 瘤 -180 腹水 细胞 肌 动 蛋白 mRNA AYEERL SS: “收集 感染 6 一 8 天 后 的 大 鼠 肉 瘤 -180 腹水 细胞 ,在 完全 培养 液 中 培育 工 小 时 后 :用 Tritonx-100 在 低 离子 强 度 下 破碎 细 胞 ,并 以 镁 盐 沉 淀 法 从 原生 质 体 中 分 离 得 聚 核糖 体 吃 。 聚 核糖 体 悬 秀和 于 50mX KCl, ImM MgCl, 和 50mM Tris-HCl (pH 7.6) Bihikh, F-FRARM — 95°C 处 存放 后 ， 按 Brawerman ?£"" 在 碱 性 pH 下 用 酚 提 取 分 离 RNA. 酚 层 再 用 0.1M Tris-HCl (pH 9.0) 抽 提 。 合 并 水 相 , 再 用 酚 一 氯仿 一 异 成 醇 〈1:1:0.1) 反复 抽 提 ,使 二 相 界 面 无 蛋白 质 为 直 ， 取 出 水 相 加 NaCl 至 0.1M 及 2.5 倍 体积 的 乙醇 ,4%c 过 夜 。 次 日 离心 收集 帝 淀 ; 以 66% 乙醇 及 0.1M NaCl 洗 闪 。 用 乙酸 除 乙 醇 , 再 溶 于 水 中 ,吹风 除 乙醚 ， 所 得 的 聚 核 ek RNA 存放 于 一 20*c 下 :, 待 进一步 分 离 mRNA。 将 上 面 所 得 聚 核糖 体 RNA #iloligo-(dT)-F ARES HIERA CMA 500mM NaCl, 5mM MgCl，50mM Tris-HCI，pH7.6 和 0.1%SDS), Rit 30 分 钟 后 离心 。 并 用 上 述 缓 神 液 洗涤 二 次 ， 每 次 离心 后 的 上 清 液 合并 。 用 01M NaCl 和 2.5 CRE Poly(A)- RNA。 然 后 用 水 连续 地 洗 下 被 ligo-(dT) 所 吸附 的 Poly (A)+RNA， 收 集 后 用 上 述 乙醇 一 盐 帝 淀 。 Boly(A) -RNA 的 进一步 纯化 ， 可 以 用 3 一 30% 蔗糖 密度 梯度 离 忌 (介质 中 含 10mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.6, 0.1% SDS)， 使 用 Sw-27 Spinco 转子 , 在 23;500 gp 下 离心 17 小 时 ，Poly (A)-RNA 在 18S 处 被 纯化 。 PPA, T, 感染 的 大 肠 杆菌 中 RNA Ay gee: T 感染 的 细胞 4 毫升 按 Hagon 和 Young 法 加 入 0.5 BF SDS BMAMM (AZ 0.5M Tris, pH6.8 0.02M EDTA, 10% SDS) 在 沸水 中 加 热 2 分钟 ， 破 碎 细 胞 。 然后 在 提取 液 中 加 入 栈 酸 钠 (pH 5.2) 至 最 后 浓度 0.2M， 接 着 用 酚 和 和 氯仿 混合 溶剂 抽 提 ”离心 后 取 上 层 水 相 ， 以 乙醇 沉淀 。 离 心 后 收集 沉淀 再 溶 于 Tris-Mgt* (各 为 0.01M;pH 7.0) ZAR IA DNase〈 用 前 经 碘 代 乙酸 盐 处 理 ) 至 最 后 浓度 为 每 毫升 10 微克 5 在 37% 保 刘 半 小 时 ， 加 入 醋酸 钠 至 0.2M， 再 用 氯仿 抽 提 除去 DNase, 上 层 水 相 用 乙醇 帝 淀 RNA, (5) 其 他 提取 具有 生物 活性 RNA 方法 ; RGRILA, Wa, 具有 感染 性 的 TMV-RNAr。 氟 碟 化 合 物 法 ; 兽 用 于 制备 其 些 肿瘤 细 胞 中 的 ,RNAES 因 目前 应 用 不 广 , 这 里 就 不 再 详细 举例 说 明 。 核酸 的 提取 分 离 `, 纯 化 ,其 技术 方法 进展 极 快 ,日 新 月 异 , 不 胜 枚 举 。 仅 就 提取 或 盗 剂 分 离 方法 来 说 ,近年 来 发 展 特 点 主要 有 如 下 几 方 面 : 第 一 、 分 离 提取 方法 更 趋 简便 快速 。 例如 1978 年 Dirnoboin 和 Doly 介绍 三 种 快速 碱 抽 提 法 分 离 质粒 DNA, 一 天 之 内 可 提取 100 多 个 质粒 样品 ,只 要 一 个 人 操作 。 方 法 十 分 简单 ,将 培养 的 大 肠 杆 菌 用 溶菌 酶 破 壁 后 ,以 SDS-NaOH 处 理 菌 液 使 pH 达 12~12:5, ss 42 。 ie es ; 此 时 染色 体 DNA 变性 而 质粒 DNA 不 变性 ， 再 用 高 浓度 酸性 栈 酸 钾 一 醋酸 中 和 了 菌 液 ， 已 变性 染色 体 DNA、 大 分 子 RNA 和 和 蛋白质-SDS 复合 物 均 沉 淀 下 来 ,离心 后 上 清 液 用 无 水 乙醇 沉淀 即 可 获得 纯度 很 高 质粒 DNA, 有 少量 RNA 可 用 RNase 除去 。 又 如 分 离 WEB DNA 时 ;在 离心 管 底层 放置 5M NaClO,， 上 层 小 心 铺盖 30% 蔗糖 , 并 加 入 已 破 REHM. FHF 30% 基 糖 层 只 让 鸣 菌 体 通过 到 达 管 底 , 遇 到 SM NaClO, 后 ,噬菌体 内 DNA 即 释放 出 来 , 再 经 低速 离心 除去 一 些 杂质 碎片 ， 所 得 DNA 失 活 少 且 产 率 很 高 。 此 法 只 要 有 超 离心 设备 , 几 分 钟 即 可 把 噬菌体 中 DNA 提取 出 来 。 第 二 、 提 取 高 活性 大 分 子 核酸 时 , 条 件 要 求 更 加 温和 ;， 实验 设计 更 加 合理 。 在 操作 上 强调 温和 ,对 提取 大 分 子 核酸 《特别 是 DNA) 也 是 近年 来 技术 改革 一 个 方向 。 例 如 ，, 为 了 加 免 切 力 作用 ， 尽 量 不 用 吸管 和 滴 管 或 改 用 大 口 吸管 ; WBA REET 和 ;破碎 细胞 时 要 求 低温 、 短 时 ,使 用 高 剂量 溶 效 酶 等 等 ,都 直接 关系 到 所 提取 的 大 分 子 核 酸 的 活性 大 小 。 在 使 用 各 种 溶剂 提取 核酸 时 ,条件 也 越 来 越 具体 细致 ,包括 各 种 缓冲 液 、 变性 剂 、 去 污 剂 和 核酸 酶 的 抑制 剂 如 何 搭配 , 谁 先 加 谁 后 加 均 极 讲究 。 以 其 中 酚 试剂 提取 核酸 为 例 ; 不 同 pH 值 , 不 同 缓冲 液 或 试剂 饱和 酚 以 及 不 同 摇 荡 次 数 , 对 各 种 核酸 的 提取 其 效果 差别 很 大 ;如 0.1%SDS- 酚 提取 ,只 能 将 RNA 提 到 水 相 ,，1 匈 SDS- 酚 提取 时 ,可 将 DNA, RNA 同时 提 到 水 相 ; 中 性 酚 无 法 将 含有 多 聚 人 入 的 mRNA 提 到 水 相 , 但 pH8.5 以 4 生 或 加 大 少量 氯仿 的 酚 ， 即 可 把 :mRNA 提 到 水 相 ; FA Tris-HCl 饱和 酚 提 取 细 菌 质粒 DNA, 剧烈 振 摇 20 次 以 上 和 轻 轻 的 上 下 把 试管 颠倒 三 次 , 被 提取 的 内 含 物 差 别 很 大 , 前 者 包括 染色 体 DNA、 质 粒 DNA, RNA 和 和 蛋白质 全 部 被 提出 ,后 者 只 有 质粒 DNA AD 量 小 分 子 内 含 物 被 提取 。 最 后 ,分 离 提 取 阶 段 防止 核酸 酶 〈 主 要 是 RNase) 的 作用 仍 是 一 个 环 手 问题 。 由 于 RNase 很 难 失 活 ,使 制备 完整 的 RNA 分 子 遇 到 很 大 困难 ,如 提取 大 分 子 rRNA 和 mRNA, 常常 未 纯化 就 被 RNase ME. AMAIA SDS, Bt. FARRAR AES SARS K, Macaloid 〈 一 种 复合 硅 酸 盐 ) 和 二 乙 基 焦 碳 酸 (DEP) 等 ， 均 未 能 完全 抑 制 RNase 的 活力 。 新 的 更 有 效 的 方法 还 不 断 研 究 中 。 以 上 主要 指 核酸 的 提 取 方 法 而 言 ,* 至 于 核酸 提取 后 的 纯化 包括 沉淀 法 、 超 离心 法 、 各 种 色谱 法 \ 电 泳 法 、 免 疫 法 和 分 子 杂 交 法 等 ,其 种 奖 之 多 、 内容 之 广 , 要 讨论 其 发 展 方向 及 每 一 方法 具体 内 容 , 已 超出 本 书 篇 幅 范 围 , 读 者 可 参阅 有 关 核 酸 研 究 文献 。 但 核酸 一 一 作 为 生化 物质 中 的 一 大 类 ;此 处 从 历史 到 现状 把 不 同类 型 的 核酸 提取 方法 作 一 简单 介绍 ,并 列举 二 些 例 子 ; 其 目的 是 使 读者 了 解 一 些 主要 核酸 提取 方法 原理 ,并 不 意味 着 这 些 例 子 是 最 新 的 和 完满 的 方法 。 当 然 其 中 不 少 是 很 有 价值 的 现在 仍 有 普遍 应 用 的 意义 。 5. 核酸 提取 时 注意 事项 及 提取 后 进一步 纯化 ， 这 里 主要 指 提取 具有 生物 活性 的 核 酸 〈 包 括 DNA 和 RNA) 都 必须 注意 如 下 几 个 问题 : C1) 选用 的 材料 必须 要 新 鲜 , 材 料 的 预 处 理 不 要 时 间 太 长 。 (2) 整个 提取 分 离 过 程 , 除 注 明 在 某 一 温度 下 进行 外 , 一 般 均 维持 O—4°C 中 进行 操 作 。 但 不 同 材 料 和 不 同方 法 对 温度 要 求 的 严格 程度 也 不 等 。 (3) pH 要 适当 , 除 特 别 注 明 在 某 步 又 需要 比较 高 或 低 的 pH 值 外 ， 一 般 在 中 性 附近 进行 。 (4) 避免 强烈 的 理化 因素 作用 。 如 局 部 过 酸 过 碱 \ 过 热 , 以 及 强烈 机 械 切 力 , 及 剧烈 ea 43 。 抄 拌 等 。 特 别 对 大 分 子 量 的 DNA 或 mRNA 等 的 提取 尤 须 注意 。 (5) 防止 核酸 酶 的 作用 ,是 十 分 重要 的 问题 , 从 材料 预 处 理 ， 细 胞 破碎 直至 提取 分 离 纯 均 注意 抑制 核酸 酶 的 作用 。 | 核酸 提取 后 的 纯化 工作 ,由 于 各 类 核酸 性 质 的 不 同 ZONE o RMR 相 结合 的 蛋白 质 和 性 质 相 似 的 多 糖 的 分 离 方法 大 致 相同 外 ， 不 同 种 类 及 不 同 大 小 的 核酸 的 分 离 仍 是 一 个 十 分 复杂 的 问题 ,如 闭合 环 状 DNA《 质 粒 DNA) 与 染色 体 了 NA 的 分 离 , 主要 根据 二 者 变性 的 难 易 。 采取 CsCl-EB (〈 非 啶 省 红 一 一 一 种 核酸 染料 九 密度 梯度 离心 法 、 硝 酸 纤 维 膜 吸附 法 或 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 、 聚 乙 二 醇 一 葡萄 糖 二 相 分 配 法 而 分 离 。 mRNA 与 其 他 RNA 的 分 离 主要 根据 真 核 细胞 中 mRNA, 末端 常 含 PolyA 顺序 ,利用 这 一 特点 ,而 采取 Oligo(dT) 纤 维 素 或 PolyU- 琼 脂 糖 特异 性 吸附 mRNA 与 其 他 RNA 分 子 分 离 ， 这 是 一 个 十 分 简便 和 有 效 方法 。 但 末端 没有 PolyA 顺序 的 许多 原核 细胞 mRNA 的 纯化 ， 则 不 能 采取 上 述 方法 ,只 能 用 一 般 比 较 繁 琐 的 分 子 杂 交 方 法 。RNA 由 于 分 子 量 较 小 ; 与 其 他 大 分 子 DNA、RNA 的 分 离 ,方法 则 比较 简单 ,如 用 20 多 HAS FAM} (Cresol), 0.54 体积 的 异 丙 醇 ,1M NaCl 43% TAME RRA Wma DNA 及 RNA, 上 清 滚 中 回收 tRNA, 除了 以 上 所 述 一 些 特殊 方法 外 , 许多 带 有 共性 的 核酸 纯化 方法 如 梯度 超 离 心 法 ， 分 子 杂交 法 ， 柱 层 析 法 ， 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 法 等 。 均 可 根据 不 同 对 象 采 取 不 同 条 件 进行 实 验 。 以 上 共性 分 离 纯 化 方法 ,在 Cantoni 和 Grossman 等 人 所 编著 的 核酸 研究 方法 手册 中 已 有 详尽 的 介绍 ,读者 有 兴趣 时 ,请 参阅 [45，46]。 三 、 脂 类 化 合 物 的 提取 分 离 用 热 乙 醇 或 乙醚 抽 提 生物 组 织 可 得 到 油状 物 , 它 包括 脂肪 、 蜡 、 磷 脂 、 糖 脂 、 固 醇 及 它 和 们 的 水 解 产物 (如 高 级 脂肪 酸 ), 这 些 物 质 虽 结构 功能 不 同 , 但 都 属于 油脂 类 化 合 物 ， 都 能 溶 于 脂 溶 性 溶剂 中 。 脂 类 化 合 物 可 分 为 中 性 脂肪 和 类 脂 二 大 类 。 中 性 脂肪 的 比重 都 小 于 1.0, 不 与 水 相 混 盗 ,但 都 溶 于 乙醚 、 氧 仿 \ 丙 酮 \, 茶 、 二 硫化 碳 、 热 酒精 及 其 他 脂肪 和 咨 剂 中 。 类 脂 主要 有 磷脂 、 脑 苷 脂 \ 固 醇 及 蜡 等 .磷脂 也 是 一 种 其 铀 脂 , 但 不 同 于 中 性 脂 ,主要 是 甘油 上 的 三 个 羟基 其 中 有 一 个 不 是 与 脂肪 酸 结 合 , 而 是 与 磷酸 胆 碱 等 相连 ,不 同 的 磷脂 具有 不 同 的 溶解 性 质 , 如 脑 磷脂 不 溶 于 丙酮 而 溶 于 氧 仿 及 乙醚 , 卵 恋 脂 不 溶 于 冷 乙醇 而 溶 于 热 乙 丁 , 神 经 磷脂 则 不 咨 于 乙醚 。 这 些 溶解 性 质 的 差别 常 作 为 提取 分 离 磷脂 类 化 合 物 的 依据 。 国 醇 类 化 合 物 都 不 咨 于 水 ( 仅 在 水 中 溶 胀 或 形成 乳胶 状 物 )， 而 溶 于 有 机 溶剂 。 固 醇 类 化 合 物 中 因 无 脂 链 的 存在 , 故 在 碱 性 条 件 下 不 能 发 生 皂 化 反应 ,可 用 皂 化 法 使 固 醇 与 脂肪 分 开 , 又 因 固 醇 类 化 合 物 都 比较 容易 结晶 , 故 从 生物 材料 中 提取 制备 并 不 十 分 困难 。 油脂 化 合 物 的 提取 分 离 方法 常 有 下 面 几 种 : 1. 机 械 压榨 法 ”主要 通过 各 种 压榨 机 在 10 一 100 公斤 /厘米 "的 压力 下 ， 将 流动 性 较 大 的 油 从 材料 破碎 的 细胞 中 挤 压 出 来 ， 这 种 纯 属 于 物理 的 方法 常用 于 一 些 油 料 作 物种 子 的 制 油 , 如 花生 油 , 棉 子 油 的 生产 等 。 2. 水 代 法 ”这 是 我 国 劳动 人 民 几 千年 前 制造 的 一 种 简便 取 油 法 ， 其 原理 是 以 水 代 独 。 因 油料 细胞 中 蛋白 质 亲 水 性 强 , 而 油 的 蕊 水 性 强 , 在 热 的 条 件 下 加 入 大 量 的 水 ,剧烈 4 搅拌 ,水 进入 细胞 与 蛋白 质 结合 而 将 油 顶 替 出 来 。 此 法 设备 简便 , 成 本 低廉 , 生产 安全 面 « 44 « 出 狂 率 高 。 驰 名 中 外 的 小 磨 麻 油 就 是 用 此 法 提取 的 。 3. 皂 化 法 ”甘油 酯 易 与 碱 ( 如 氢 氧 化 钾 或 氢 氧 化 钠 ) 作 用 而 水 解 生 成 能 溶 于 水 的 脂 肪 酸 钠 或 钾 ( 即 肥皂 ) 和 甘油 ,此 过 程 称 为 皂 化 。 皂 化 液 再 经 酸化 处 理 , 即 分 离 析出 高 级 脂 肪 酸 。 不 被 皂 化 部 份 如 固 醇 等 通过 皂 化 反应 后 与 甘油 酯 分 开 ， 再 进一步 用 有 机 溶剂 提取 纯化 。 4. 有 机 溶剂 萃取 法 ”是 实验 室 常 用 的 一 种 比较 精细 的 分 离 方法 ， 它 主要 根据 不 同 油脂 化 合 物 , 在 不 同 溶剂 和 不 同 条 件 下 溶解 性 质 的 差别 而 进行 分 离 。 有 机 溶剂 萃取 的 实 验 仪器 及 操作 方法 都 比较 简单 ,在 各 种 有 机 化 学 实验 指导 中 都 有 描述 , 这 里 不 再 作 介绍 ， 而 各 种 脂 类 化 合 物 的 溶剂 系统 分 离 法 可 参考 图 2-3, 2-409, A 2-3 是 一 般 生 物 材料 在 不 同 溶剂 中 系统 分 离 ; 图 2-4 是 一 种 抗 酸 菌 的 菌 体内 不 同 脂 类 化 合 物 在 不 同 溶剂 的 系 统 分 离 情况 。 ama ne es 毛 仿 一 甲醇 (2:1 一 1:2) BEB 不 溶 部 份 ( 脂 蛋白 ) | 少量 氧 仿 及 10 倍 容积 的 丙 坪 aay | - tie PB 2 6) CHG A HG, rh Me , SEA PHD | DR OF 10 倍 容积 的 乙 本 BACB 沉 演 站 > ZRF AB 8 COPA, BUNA, SEA tT AHS) ‘Sa ae 同 以 上 乙醚 反复 抽 提 3 一 4 沉淀 (白色 ) | seston ta HCO) 同 以 上 用 吡啶 溶解 并 抽 提 3 一 4 次 Da Se LE) 沉淀 (神经 磷脂 类 ) 图 2-3， 脂 类 化 合 物 有 机 溶剂 系统 提取 分 离 示 意图 四 、 其 他 脂 盗 性 生化 物质 的 提取 分 离 除 上 面 所 说 的 脂 类 化 合 物 外 , 生物 体内 还 有 许多 非 脂 类 物质 , 它们 不 溶 或 难 溶 于 水 ， 而 易 溶 于 有 机 溶剂 。 如 植物 组 织 中 的 不 含 酚 羟 基 的 醒 类 ,内 酯 类 、 皂 耻 类 和 大 部 份 生 物 碱 都 属于 脂 溶 性 物质 。 常 用 氯仿 、 乙 醚 、 热 乙醇 甲醇 \ 甲 茶 、 乙 酸 乙 脂 等 有 机 溶剂 分 别提 取 。 ea 45 。 Home BREA IK | 乙醇 :乙醚 (1:1) 7 可 深部 份 Pt 水 加 脂 质 浓 缩 后 ， mate AHIR KE 可 深部 份 不 深部 份 | o> RO | 乙醇 一 乙 酝 ~ | 2 售 丙 妆 沉 这 | 1 多 HCl fie ae | | | Ee 可 浴 部 份 。 沉 泛 an Rit Fal yy ANAT wi Aiea soli ak (ig Bi BY (结合 脂 质 ) ! | igi BAe 沉淀 抽 提 式 中 人 性 脂肪 ) 热 丙酮 di | 抽 提 “9 Awe Ais BH | ( 脂 质 C) (igi D) Ai 可 深部 份 CAS) ( 脂 质 A) 图 2-4 ， 抗 酸 菌 菌 体 脂 质 的 系统 分 离 示 意图 ke a | 800 rR Reis (GFE) 甲醇 滤液 | 减少 浓缩 至 水 相 ,过 滤 。 | | 水 相 残 酒 ( 弃 去 ) | pH8.6 (IN NaOH) 乙酸 乙 酯 华 取 乙酸 乙 酯 相 水 相 FF 5 ASH LE 80% pH2.8 (1NHCI) Fe RFE TRS CEC ABER 7K #8 5 pH2 > 乙酸 乙 脂 革 取 | | | eS Kia (1) (FE) 书屋 a 7kt8 a pH 5.5， 用 水 饱和 iE TE odin | ¥ 正 丁 醇 相 a 含 (ID (Fe) 图 2-3 植物 样品 几 种 植物 激素 的 提取 分 离 示意 图 图 中 《1 ) @ IAA, ABA, GA, C1) 含 中 性 生长 素 ，(IHI) 含 细 胸 分 裂 素 钥 于 这 些 化 合 物种 类 繁 乡 , 本 章 只 能 扼要 地 提 及 ,详细 介绍 他 们 的 分 离 方法 请 参阅 有 关 植 物 成 份 化 学 的 专著 。 此 外 ， 许 多 植物 激素 如 呵 唆 乙酸 (IAA), DRE (GA), BSR (ABA) 及 细胞 分 发 素 等 ,这 些 物 质 均 具 有 极 高 的 生理 活性 ,对 植物 的 生长 开花、 结实 等 均 有 明显 的 影响 ， 在 农业 生产 上 应 用 较 广 ,这 些 物 质 , 其 分 子 都 具有 非 极 性 基 团 , 可 溶 于 甲醇 乙醇 及 乙醚 等 。46 。 有 机 溶剂 中 。 但 分 子 中 也 有 某 些 极 性 基 团 , 因此 又 可 溶 于 一 定 pH 的 水 溶液 中 。 根据 它 们 的 溶解 度 的 共性 ， 一 般 先 用 五 倍 于 材料 的 80% 甲醇 提取 后 , 再 通过 改变 pH 条件 及 改 用 不 同 溶 剂 抽 提 使 各 组 份 分 开 。 其 系统 分 离 见 图 2-559。 以 上 几 种 植物 激素 提取 初步 分 离 后 ,进一步 纯化 时 ， 常 用 离子 交换 树脂 柱 色 谱 人 (包括 使 用 强酸 性 树脂 Dowex 50 或 强 碱 性 树脂 Amberlite IRA-400) 或 用 DEAE 纤维 素 分 离 。 五 、 糖 、 氮 基 酸 及 其 他 水 溶性 生化 物质 的 提取 分 离 游离 单 炉 及 小 分 子 寡 糖 易 溶 于 水 , 材料 破碎 以 后 , 用 水 或 在 中 性 条 件 下 以 30 色 稀 乙 和 醇 进行 挠 拌 提取 , 提取 波 以 醋酸 铅 除去 蛋白 质 及 其 他 杂质 , 铅 离子 可 通过 HzS 而 除去 。 然 后 浓缩 至 干 , 再 用 沸 甲 醇 或 热 乙 醇 抽 提 , 冷 却 后 单 糖 便 结晶 析出 。 单 糖 或 小 分 子 袁 糖 也 可 在 提取 后 ,用 吸附 柱 色谱 或 离子 交换 法 而 纯化 。 大 分 子 的 多 聚 糖 或 杂 多 聚 糖 情况 则 比较 复杂 ， 应 依照 不 同 种 类 的 多 糖 的 具体 溶解 性 质 而 决定 提取 方法 。 如 昆布 多 糖 \ 果 聚 糖 、 糖 原 、 易 溶 于 水 。 壳 多 糖 纤维 素 溶 于 浓 酸 。 直 链 淀粉 易 溶 于 稀 碱 。 许 多 具有 医药 价值 的 酸性 炸 多 糖 常 含有 氨基 己 糖 ` 己 糖 醛 酸 ,以 及 硫 酸 等 多 种 成 份 , 其 结构 种 类 复杂 ,并 常 与 蛋白 质 结合 在 一 起 ,提取 分 离 时 , 先 用 蛋白 酶 破坏 蛋白 质 与 糖 的 结合 后 ,再 将 水 提取 六 减 压 浓缩 ,以 乙醇 或 十 六 烷 基 三 甲 基 省 化 较 沉淀 酸性 粘 多 糖 , 最 后 用 离子 交换 树脂 柱 色谱 进一步 纯化 。Danishefsky 和 Bell 等 曾 用 不 同 浓度 的 稀 毛 化 钠 ， 从 人 的 肚脐 带 提 取 了 几 种 含有 透明 质 酸 和 软骨 素 的 酸性 粘 多 糖 。 其 方法 如 2-6, | SA # Dowex! 47 Ji fe SAA, SAB, SAD 三 个 组 份 均 含 有 葡萄 糖 腕 、 糖 醛 酸 , 但 所 含 硫 酸 基 及 蛋白 质 差别 较 大 。SB、SC 所 含 葡 萄 糖 胺 较 微量 ,其 中 SB 含 半 乳 糖 胺 及 硫酸 基 较 多 。P-I，P-I 部 份 也 以 半 乳 糖 胺 为 主要 氮 基 己 糖 组 份 。 500 HAA 0.2%NaCl 在 0 一 5%C 5 分 钟 并 用 0.29%NaCl 提取 (5%) 一 天 | 离心 | EIR Bit 上 各 十 六 烷 基 氧化 吡啶 至 196 eee | EK RS 18 LE | | | 上 清 液 沉淀 沉淀 上 清流 | 0.4M Nacl 提取 《P-I) | ae | | | | mri.2 re 沉淀 上 清 液 | 1.2M (SA) 人 -ED NaCl 提取 l 克 ， | ne act 提取 0.5 克 spn sha (sc) 0.04 3% 2-6 从 人 肚脐 带 提 取 几 种 酸性 粘 多 糖 图 解 e 47 e 肝素 也 是 一 类 酸性 粘 多 糖 , 水 解 后 生成 葡萄 糖 醛 、 氨 基 葡 萄 糖 及 硫酸 , 临床 上 用 于 各 种 血栓 栓塞 。 肝 素 易 溶 于 水 ,不 溶 于 乙醇 ,丙酮 等 有 机 淤 剂 ,在 水 咨 液 中 带 强 负 电荷 小 用 水 提取 后 ,能 用 各 种 阴离子 交换 树脂 吸着 ,目前 国内 制备 方法 多 用 离子 交换 树脂 分 离 或 在 酸性 条 件 下 以 误 化 十 五 烷 吡 啶 〈 简 写 为 PPB) 选择 性 沉淀 而 获得 纯 品 。 此 外 ;, 某 些 水 溶性 的 小 分 子 物质 如 氨基 酸 、 核 苷 酸 及 其 衍生 物 , 大 部 份 都 溶 于 水 ,不 淘 于 乙醇 .乙醚 等 有 机 溶剂 , 当 材 料 经 破碎 后 ,用 水 或 一 定 pH 范围 的 水 溶液 提取 后 , 滤 去 残 洼 即 可 用 离子 交换 树脂 进行 分 离 ， 最 后 以 己 醇 或 调整 pH 至 等 电 点 沉淀 。 如 需要 较 纯 产 品 ,可 通过 反复 结晶 方法 而 获得 。 六 、 植 物 次 生物 质 的 提取 及 溶剂 系统 分 离 的 选择 51521 植物 次 生物 质 种 类 繁多 , 包括 各 种 生物 碱 \, 帖 类 \ 背 类 黄酮 类 和 有 机 酸 等 , 其 中 大 部 分 在 工业 上 医学 上 有 着 广泛 用 途 。 如 挥发 油 , 蜡 、` 油 潜 、 橡 胶 、 县 质 等 都 是 一 些 重要 工业 原 料 ， 这 些 物质 的 工业 提炼 方法 不 属 本 书 讨论 范围 。 但 其 中 某 些 对 人 类 或 动物 具有 极 强生 理 作用 的 药物 ， 它 们 的 提取 分 离 纯 化 方法 和 其 他 生化 物质 的 提取 分 离 纯化 方法 有 着 许多 共同 之 处 。 这 里 主要 根据 广州 医药 工业 研究 所 丘 晨 波 经 验 总 结 作 一 简要 介绍 : 作为 药 用 的 植物 次 生 代谢 产物 ,不 论 干 或 鲜 的 材料 ,粉碎 后 一 般 可 分 为 水 提取 和 醇 提 取 二 部 分 。 醇 提 部 分 ,使 用 最 多 的 溶剂 是 甲醇 ,有 时 也 用 60 多 或 95% 乙醇 代替 。 如 样品 中 含 挥发 油 较 多 ， 并 着 重 研 究 这 些 成 份 ， 可 用 石油 醚 提取 。 各 类 药 用 成 份 提取 选用 的 深 剂 , 主 要 依据 被 提取 物 的 极 性 大 小 而 定 , 欲 作 系统 分 离 , 其 溶剂 选择 可 参考 表 2-5, 由 于 植 物 药 用 成 份 种 类 繁多 ,系统 分 离 时 很 难 一 次 完成 。 先 粗 分 后 细 分 ,多 次 完成 。 如 仅 研究 其 某 一 成 份 ,如 生物 碱 可 选择 氯仿 为 主要 溶剂 进行 抽 提 控制 不 同 PH， 然后 加 入 细 分 。 关 于 药 用 植物 成 份 的 分 离 系统 , 丘 晨 波 提 出 了 如 下 模式 〈 图 2-7)。 #25 植物 药 用 成 份 及 其 适用 的 提取 溶剂 极 性 大 小 植 tee 适用 提取 溶剂 | BRAT RRR 亲 脂 性 最 强 He Te Sis De BP A th BE 1.80 〈 极 性 小 ) SpA KARI i ae 1.87 亲 脂 性 强 SiR. ie) Eee a & 4.3 RA A 仿 52 中 等 极 性 (小 ) ERA OR) 氯仿 :乙醇 (2:1) 一 CH) HERA RM RK) 乙酸 乙 脂 6.1 KERR ERK, BERS) i: T & 19 亲 水 性 强 极 性 大 的 起 类 \ 糖 类 和 和 氨基酸 等 A ff 21 aC 26 xf 31 亲 水 性 最 强 蛋白 质 、 粘 液 质 . 果 胶 、 上 si ( 极 性 大 ) aR BAERS ° 48 [1] 21 [3] {4 [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] (23] 24] [25] [26] [27] 药 用 植物 材料 | RRR (90%, 60% 各 浸 二 次 ) PET a | keh BEARER, Baa BUAE HEE 水 层 (及 悬浮 物 ) 石油 醚 层 氯仿 (或 乙醚 ) 抽 提 水 层 (及 悬浮 物 ) , | 乙酸 乙 脂 (或 氧 仿 :乙醇 二 231) 氧 仿 层 (或 乙醚 层 ) Hide Hive ( 极 性 关 小 部 份 ) 水 层 | 正 丁 醇 (水 饱和 ) 乙酸 乙 脂 层 (或 乙酸 乙 脂 : 忆 酸 一 2:1) (和 极 性 中 小 部 份 ) 抽 提 RED Oe De pune | samsazx 正 丁 醇 (或 乙酸 乙 醒 一 乙酸 ) 层 CREAMER) | Be REE Pk ( 极 性 中 大 部 份 ) 图 2-7 植物 成 份 分 离 系 统 简 图 参考 文 和 献 West, E. 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RAE RR BARE. 这 一 类 方法 也 常 称 为 选择 性 变性 沉淀 。 在 分 离 制备 中 ， 常 有 选择 地 用 于 除去 某 些 不 耐 热 及 在 一 定 PH 值 下 易 变 性 的 杂 蛋 白 。 但 应 以 在 实验 条 件 下 所 分 离 物质 的 活性 不 受 影响 为 前 提 。 7. 其 他 。 除 以 上 所 述 沉 淀 方法 外 ,只 对 某 一 种 或 某 一 类 物质 产生 沉淀 的 沉淀 方法 及 WBE Ho 下 面 介绍 几 种 主要 沉淀 方法 的 原理 ,操作 及 应 用 实例 : 第 二 节 BM 一 、 基 本 原理 一 般 地 说 , 所 有 固体 溶质 都 可 以 在 溶液 中 加 入 中 性 盐 而 沉淀 析出 ,这 一 过 程 称 为 " 盐 析 。 在 生化 制备 中 ,许多 物质 都 可 以 用 盐 析 法 进行 沉淀 分 离 , 如 蛋白 质 、 多 肽 多糖、 核酸 siST se So 20 一 40% 饱和 度 的 硫酸 贸 可 以 使 许多 病毒 沉淀 , 使 用 43% 饱和 度 的 硫酸 铵 也 可 以 使 DNA 和 rRNA 沉淀 ;而 tRNA 保留 在 上 清 液 中 。 但 盐 析 法 应 用 最 广 的 还 是 在 蛋白 质 领 域内 。 用 盐 析 法 分 离 提 纯 蛋 白质 已 有 八 十 多 年 的 历史 ,特别 是 粗 提纯 阶段 , 盐 析 法 是 一 种 十 分 常用 的 纯化 手段 。 当 然 在 生化 制备 技术 高 度 发 展 的 今天 , 盐 析 法 由 于 共 沉 作用 ， 不 是 一 个 高 分 辩 的 方法 ,但 和 其 他 方法 交替 使 用 , 盐 析 法 仍 具 有 许多 突出 的 优点 : 1. 成 本 低 , 不 需要 什么 特别 昂贵 的 设备 。 2. 操作 简单 ,安全 。 3. 对 许多 生物 活性 物质 具有 稳定 作用 。 关于 盐 析 原 理 , 现 以 蛋白 质 为 例 讨论 如 下 呈 : 蛋白 质 在 高 盐 浓 度 下 发 生 盐 析 , 在 低 盐 浓度 下 发 生 盐 溶 。 盐 溶 现 象 在 第 二 章 中 已 作 过 介绍 ,主要 是 中 性 盐 离 子 对 蛋白 质 分子 表 面 极 性 基 团 及 水 活 度 的 影响 ,增加 了 和 蛋白质 分 子 与 溶剂 分 子 相 互 作用 力 , 从 而 使 蛋白 质 的 溶解 度 增 大 。 但 中 性 盐 的 浓度 渐 增 至 一 定 程 度 时 ,水 分 子 在 中 性 盐 的 作用 下 活 度 大 大 减少 , 蛋白 质 表 面 电 荷 大 量 被 中 和 ，, 最 后 破坏 了 SARTORI, 使 蛋 曰 质 分 子 之 间 相 互 聚 集 而 沉淀 。 蛋白 质 盐 析 时 与 溶 补 中 中 性 盐 的 离子 强度 有 如 下 定量 关系 : Log = = ret ae (3-1) RES 是 指 在 离子 强度 为 I 时 蛋白 质 的 溶解 度 , S 是 在 纯 溶 剂 CII = 0) 时 蛋 自 质 的 溶解 度 。Ks 是 一 个 常数 ,也 称 盐 析 常数 。 离 子 强度 LRT PS: — = Smz’? (3-2) im?’ £=MAATRRNe a, Rom HRKRHSHATHROTRE, zHSMSs 子 的 价 数 , 3-1 式 中 当 咨 剂 的 温度 为 一 定时 , S 对 于 某 一 盗 质 也 是 一 个 常数 ; 即 := LogSn = BS 所 以 3-1 式 可 以 改写 为 : LogS = 8 — Kg - I (3-3) B ASAD BUR FA A EI, AT Ee UE, Ke EA REE T= 0 时 , 用 外 推 法 求 出 。 故 8 值 带 有 经 验 性 性 质 。 盐 析 常数 Ks 值 , 主要 决定 于 加 入 盐 的 性 质 , Ks 大 小 与 各 种 离子 价 数 成 正比 ,与 离子 半径 及 溶液 的 介 电 常 数 也 有 关 。 而 离子 价 数 对 Ks 影响 比较 主要 。 由 于 蛋白 质 表 面 有 很 多 亲 水 基 团 ,是 一 个 偶 极 离子 , 它 需 要 较 高 的 I 值 才 能 从 咨 液 中 析出 ,所 以 蛋白 质 的 Ks 常 数 很 高 , 常 比 一 般 小 分 子 高 出 10 一 20 倍 。 Ks 和 蛋白 质 性 质 关 系 不 大 ， 但 受到 溶液 的 pH 值 和 温度 的 影响 。 表 3-1 列举 了 一 些 蛋白 质 的 盐 析 常数 。 在 表 中 可 以 看 出 多 价 阴 离子 如 硫酸 根 和 磷酸 根 有 很 高 Ks， 但 高 价 阳离子 如 镁 (或 钙 ) 的 存在 反而 降低 Ks 值 。 表 中 还 可 以 看 到 ,蛋白 质 性 质 对 Ks 值 也 有 一 定 影响 (虽然 不 是 主 要 的 )， 如 在 一 种 盐 浓 度 中 ,大 而 不 规则 分 子 如 纤维 素 原 ,，Ks 最 大 ，p8- 乳 球 蛋白 Ks Reh, 但 目前 还 设 有 适当 理论 详细 说 明 溶质 的 分 子 性 质 与 Ks 的 关系 。 等 式 3-3 中 的 8 是 溶质 的 特征 常数 ,对 于 蛋白 质 来 说 , 8 值 大 小 主要 决定 于 不 同 蛋 自 质 的 性 质 。 关 村 蛋白 质 的 盐 析 条 件 的 研究 ,四 十 年 代 至 六 十 年 代 已 做 了 大 量 工作 。Czok 和 Bucher， es。 52 。 表 3-1 一 些 蛋 白质 的 盐 析 常 数 ” Na,SO, fia Be A NaCl MgSO, (NH,),SO, 0.63 0.71 0.76 1.00 马 血 红 和 蛋白 0.33 Dixon 和 Webb 对 利用 盐 析 方 法 进行 蛋白 质 分 离 纯化 作 了 系统 总 结 ” ,并 在 等 式 3-3 基 础 王将 盐 析 方 法 分 为 两 类 : C1) 在 一 定 的 pH 和 温度 下 改变 离子 强度 ( 盐 浓度 j 叫 Ks 分 段 盐 析 法 。 (2) 在 一 定 离子 强度 下 改变 pH 和 温度 叫 “8” 分 段 盐 析 法 。 Czok 和 Bucher 认为 第 一 组 适 于 早期 粗 抽 提 液 的 分 步 分 离 ， 而 第 二 组 则 适 于 后 期 进 一 步 分 离 纯化 和 结晶 时 使 用 。Czok 和 Bucher 应 用 “Ks” 分 段 盐 析 法 曾 成 功 地 从 肌肉 抽 提 液 中 分 离 了 多 种 酶 。 Jakoby 发 现 蛋白 质 在 硫酸 匀 溶 液 中 的 溶解 度 随 着 温度 升 高 而 降 低 ; 从 而 提出 了 在 .0%c 用 逐步 降低 浓度 的 硫酸 匀 溶 液 抽 提 蛋 白质 沉 淀 ,然后 在 室温 进行 结 Bo HEM MOMS RTS. GHA ARAB EE), 下 面 , 我 们 以 蛋白 质 为 主要 对 象 讨论 应 用 盐 析 法 的 几 个 问题 。 二 、 影 响 盐 析 的 寿 干 因素 《一 ) 蛋白 质 的 浓度 与 盐 析 的 关系 ”利用 盐 析 方 法 分 步 分 离 蛋白 质 各 组 份 和 溶液 中 蛋白 质 实 际 浓度 有 很 大 关系 。 例 如 一 种 蛋 和 白质 在 溶液 中 的 浓度 为 :Cu 加 入 中 性 盐 , 浓 度 直 至 离子 强度 等 于 工时 , 蛋白 质 开 始 沉 淀 并 从 溶 滚 中 析出 。 此 时 等 式 3-3 可 写作 : LogC = 6 — KL (3-4) 这 里 的 工 是 蛋白 质 开 始 沉 淀 时 的 离子 强度 。 但 如 果 这 种 蛋白 质 在 溶液 中 含量 较 低 〈 设 其 浓度 为 C), 则 需要 加 入 较 多 的 中 性 盐 , 蛋 白质 才 开始 沉淀 。( 设 此 时 离子 强度 为 卫 ) 应 写作 : LogC, = 8 — Ksl, (3-5) 3-4 式 减 3-5 式 得 : Ci Log are 2 Dixon 和 Webb Fi Mite Me KAMAL SHA, (Carboxymyoglobin) 4 kA PLAS AR BEA 30 be/ Ft, PARRA) 58% 时 开始 出 现 沉 淀 。 而 羧基 肌 红 和 蛋 自 的 浓度 为 3 克 / Ft IN 58% 饱和 度 硫 酸 铵 不 会 出 现 沉淀 ,直至 到 66% 饱和 度 时 才 开 始 产生 沉淀 。 但 在 较 浓 的 蛋白 质 溶液 中 (30 F/T) RAS) 66% 饱和 度 时 已 有 90% 蛋白 质 度 沉 淀 析 出 。 根 据 上 述 实验 结果 ，Dixon 等 计算 出 Cs 一 10 时 , 应 增加 大 约 7% 的 硫酸 往 饱 和 度 e 53 。 二 Ks(1, = I,) (3-6) 才 可 以 把 低 浓 度 〈C2) 的 蛋白 质 涡 淀 下 来 。 所 以 在 不 同 浓度 的 蛋白 质 溶 液 中 进行 盐 析 ， 使 用 硫酸 锐 的 饱和 度 范 围 是 不 同 的 。 高 浓度 蛋白 质 溶液 可 以 节约 盐 的 用 量 , 但 许多 蛋白 质 由 于 “p” 和 ，Ks ”常数 十 分 相近 ,车 蛋 白质 浓度 太 高 ， 会 发 生 严重 的 共 沉 作用 。 (HERRERA Pee. Ara hee Be 多 ,而 共 沉 作用 比较 少 ,因此 需要 在 二 者 之 闻 进 行 适当 选择 。 用 于 分 步 分 离 提纯 时 ,宁可 选 择 稀 一 些 的 蛋白 质 溶 液 ,多 加 一 点 中 性 盐 ,使 共 况 作用 减 至 最 低 限 度 , 当 然 浓 度 不 能 太 稀 ， 一 般 认 为 2.5 多 一 3.0 锡 的 蛋白 质 浓度 比较 适中 ,如 果 蛋 日 质 浓 度 太 稀 , 消 耗 大 量 的 中 性 盐 对 蛋白 质 的 回收 也 有 一 定 的 影响 。 (=) 离子 强度 和 离子 类 型 对 盐 析 的 影响 上 面 介绍 过 ,在 低 离 子 强度 下 , 许多 蛋白 质 比 在 纯 水 中 的 溶解 度 大 大 增加 ， 但 当 溶 液 中 离子 强度 不 断 增加 时 ,各 离子 之 间 及 离 于 与 溶质 分 子 之 闻 相 互 竞争 水 分 子 , 结 果 导 致 溶 质 的 溶解 度 渐 渐 减 少 , 产 生 盐 析 现 象 。 一 般 来 说 离子 强度 越 大 ,蛋白质 的 溶解 度 越 低 。 但 蛋白 质 的 盐 析 现象 比 一 般 有 机 分 子 复杂 一 些 ， 蛋白 质 分 子 大 ,而且 有 许多 表面 电荷 , 这些 控 解 度 〈 克 / 升 ) 的 对 数 1 i 2 a [—) on = 8 0 2 er F 表面 所 带电 荷 常 随 着 周围 离子 和 溶剂 分 子 排 列 秩序 的 影响 而 不 断 变化 着 ， 蛋 白质 分 子 内 还 有 许多 相互 作用 的 基 团 ， 这 都 造成 了 许多 经 典 理 论 不 能 十 分 完美 地 解释 蛋白 质 盐 析 的 原因 。 几 种 蛋白 质 在 不 同 离子 强度 下 的 盐 析 效 MILA 3-19， 从 图 中 可 以 看 出 , 当 硫 酸 贸 饱 和 度 达 到 20% 时 , 纤维 蛋白 原 首先 析出 , ta ra ”和 度 增 至 28 一 53 多 时 ,血红 蛋白 析 出 , 多 和 图 3-1 几 种 蛋白 质 析 出 时 所 需 硫 酸 匀 的 离子 的 强度 Rens eRe Oo er ee MOE eee hor SOEs. 50% 以 上 ，, 清 蛋白 析出 ， 饱 和 度 最 后 达 4 一 一 血清 清 蛋白 。 5 一 一 肌 红 蛋白 到 80 多 时 , 肌 红 蛋白 析出 。 可 见 不 同 蛋白 质 发 生 盐 析 时 所 需求 的 离子 强度 是 不 同 的 。 所 以 用 不 同 离子 强度 分 步 盐 析 的 方法 ,就 可 以 分 离 混 合 物 中 各 种 组 份 。 在 进行 分 离 的 时 候 ， 一 般 从 低 离 子 强度 到 高 离子 强度 ， 顺 次 进 行 。 每 一 组 份 被 盐 析 出 来 后 ,经 过 固 - 访 分 离 (冰冻 离心 或 过 证 )， 再 在 溶液 中 逐渐 提高 中 性 盐 的 饱和 度 , 使 另 一 种 蛋白 质 组 份 盐 析 出 来 。 离子 强度 的 大 小 对 蛋 拍 质 的 咨 解 度 起 着 决定 性 的 影响 。 但 在 同样 的 离子 强度 下 ,离子 种 类 的 不 同 对 蛋白 质 盗 解 度 的 影响 也 不 同 。 图 3-2 所 示 是 七 种 不 同 电解 质 下 ,一 氧化 碳 血 红 和 蛋白 溶解 度 曲线 吕 。 图 中 不 同 离子 种 类 对 : 蛋白 质 溶解 度 的 影响 ,可 以 从 Hofmeister 系列 理论 中 获得 解释 : 即 离子 半径 小 而 很 高 电 符 的 离子 在 盐 析 方 面 影 响 较 强 ,离子 半径 大 而 低 电 荷 的 离子 的 影响 较 弱 。 单 价 盐 如 KCl, NaCl 的 盐 析 效果 一 般 比 较 差 。 图 3-3 表示 不 同 盐 类 对 同一 蛋白 质 的 盐 术 效应 具有 不 同 的 “Ks” 值 四，Ks 值 可 由 各 种 盐 的 盐 析 曲 线 的 斜率 表示 。 它 们 的 减少 顺序 是 :磷酸 钾 之 硫 酸 钠 二 硫酸 锐 之 柠檬 酸 钠 二 硫酸 镁 。 按 照 Hofoneister 系列 ， 镁 离子 比 锌 离子 小 ,但 实际 上 硫酸 铁 的 盐 析 效 应 比 硫酸 镁 好 ， 主 要 是 镁 离子 在 高 离子 强度 下 产生 了 一 层 颇 大 的 离子 Kit m2 T EW EPA MZ 540 离子 强度 图 3-3 25° pH 6.6 时 一 氧化 碳 血 红 蛋 白 在 不 同 电解 质 中 的 盐 析 效 应 @ Na,SO, Oo (NH,),SO,, 人 MgSO, A 柠檬 酸 三 钠 ， O KH,PO, + K,HPO, (=) pH 对 盐 析 的 影响 一 般 地 说 ,蛋白 质 所 带 净 电荷 越 多 , 它 的 溶解 度 越 大 ; 如 果 所 带 的 电荷 减少 至 接近 于 零 时 溶解 度 最 少 ， 我 们 称 此 时 的 pH 值 为 该 蛋白 质 的 等 电 点 CPD. 改变 pH 或 特异 地 加 人 与 蛋白 质 极 性 基 团 结合 的 离子 ( 叫 反 离 子 ) 即 可 改变 蛋白 质 的 带电 性 质 , 也 就 是 改变 了 蛋 自 质 的 溶解 度 。 图 3-4 是 在 不 同 pH 的 浓 磷 酸 盐 缓冲 臣下 血红 蛋白 CHaemoglobin) 的 SRE HA. 从 图 中 曲线 可 见 , 蛋 白质 在 不 同 的 pH 下 有 着 不 同 的 溶解 度 , 远离 等 电 点 Ub BRAK, SH AMA NRE). 因此 在 盐 析 时 常 选 择 溶液 pH 值 在 该 蛋 白质 等 电 点 附近 。 但 必须 注意 在 水 中 或 黎 盐 溶液 中 测 得 的 蛋白 质 等 电 点 与 高 盐 浓度 下 所 测 的 结果 是 不 同 的 。 需 根据 实际 情况 调整 pH 值 至 蛋白 质 溶 解 度 最 低 处 ， 才 能 使 盐 析 获 得 更 好 效果 。 ° 556 2.0 logS 5 2 oe pH (b) 3-4 Ald pH 下 ?在 浓 磷 酸 缓冲 芒 中 血红 蛋白 的 溶解 度 曲线 (Ab 是 由 图 a 所 衍生 的 ) (OO) 温度 对 盐 析 的 影响 温度 是 影响 溶解 度 的 重要 因素 , 对 于 许多 无 机 盐 和 小 分 子 的 有 机 化 合 物 ， 温 度 升 高 ， 溶解 度 也 相应 增 大 。 但 对 于 蛋白 质 、 酶 多肽 等 生物 大 分 子 在 高 离子 强度 溶液 中 ,温度 的 升 高 ,它们 的 溶解 度 有 时 不 租 不 升 高 , 反而 减少 。 许多 蛋白 质 在 高 离子 强 BEYA WR 25°C 时 的 溶解 度 比 4%C 时 溶解 度 明 显 地 减 ” 少 。 如 图 3-5 所 示 外 。 但 必须 指出 这 种 温度 升 高 溶解 度 的 下 降 现象 只 有 在 高 离子 强度 下 才能 发 生 。 在 低 离 子 强度 或 纯 水 中 ， 蛋 白质 溶解 度 大 多 数 在 一 定 范围 内 是 随 着 温度 增加 而 增加 的 。 在 一 般 情 况 下 ,蛋白 质 的 盐 析 温度 要 求 不 严格 ,可 logS 离子 强度 a - se y = nite S Gees ee eee 以 在 室温 下 进行 ,只 有 某 些 对 温度 比较 敏感 的 酶 ,要 求 Se rch ig ch AO TS ARE 在 低温 0—4°C 下 操作 ,以 避免 活力 的 丧失 。 三 、 一 般 常 用 的 中 性 盐 盐 析 方 法 一 般 常 用 的 中 性 盐 有 硫酸 铵 、 硫 酸 钠 、 硫 酸 镁 、 磷 酸 钠 、 磷 酸 钾 、 氧 化 钠 、 氧 化 钾 、 栈 酸 钠 和 硫 氰 化 钾 等 ,其 中 用 于 蛋白 质 盐 析 的 以 硫酸 铵 、 硫 酸 钠 最 广泛 。 在 表 3-1 中 虽然 磷酸 盐 的 盐 析 效果 强 于 硫酸 锐 , 但 后 者 的 溶解 度 比较 大 (在 0°C 时 饱和 度 为 5.35M ,在 25°C 时 为 5.82M) 而 且 受 温度 影响 较 少 。 关 于 不 同 温度 下 硫酸 贸 在 饱和 水 溶 彼 的 性 质 详 见 表 3-2。 由 于 有 上 述 的 优点 在 蛋白 质 盐 析 时 ， 硫 酸 铵 态 是 最 受 欢 迎 的 盐 类 。 但 硫酸 匀 也 有 不 足 的 地 方 , 如 缓冲 能 力 比较 弱 , 此 外 , 因 含有 氮 原 子 , 对 蛋白 质 的 分 析 会 带 来 一 定 影响 。 硫 酸 钠 也 较 稼 用 于 蛋白 质 的 盐 析 , 它 的 优点 是 不 含 氮 , 不 影响 蛋白 质 的 定量 测定 。 缺 点 是 在 30°C 以 下 溶解 度 太 低 。 在 30°C 以 上 操作 效果 较 好 。 磷 酸 盐 、 柠 檬 酸 钠 、 硫 氰 化 钾 等 有 时 © 566 表 3-2 不 同 温度 下 硫酸 铵 在 人 鸳 和 水 溶液 的 性 质 "” 性 质 摩尔 /1000 克 水 克 /1000 克 水 重量 % 比重 克 /1000 毫升 溶液 摩尔 /1000 毫升 溶液 克 /1000 毫升 水 5.91 780.95 外 1.2450 545.88 —_—— | Tf | Ts 也 用 于 蛋白 质 的 盐 析 。 但 由 于 溶解 度 低 ， 易 与 其 它 金属 产生 沉淀 ， 或 因 酸性 过 强 , 都 不 如 硫酸 铵 应 用 那样 广泛 。 (—) 硫酸 铵 盐 析 法 】. 硫酸 铵 使 用 前 的 预 处 理 ”一般 生 化 工业 制备 用 的 硫酸 铵 。 选择 三 级 纯度 即 可 ， 但 对 于 实验 定 沉 证 蛋白 质 或 酶 用 的 硫酸 锐 ， 常 需要 纯度 较 高 或 进行 重 结晶 后 才能 使 用 。 , 区 处 RVR RERE 〈pH 5.0 左右 ), 使 用 前 也 需要 用 毛 水 或 硫酸 调 至 所 需 _pH 值 。 和 硫酸 铵 的 饱和 度 及 谓 蓝 法 ” 盐 析 时 硫酸 猴 的 浓度 常用 饱和 度 表 示 ， 达 到 饱和 状 态 时 的 硫酸 贸 饱 和 度 (P) 4 100%, 当 盐 析 要 求 不 同 的 硫酸 铵 饱和 度 时 可 用 下 面 三 种 方法 调整 GD -加 大 固体 盐 法 : 这 当 盐 析 要 求 饱和 度 较 高 而 又 不 增 大 溶液 的 体积 时 ,多 用 此 法 。 操作 时 先 将 硫酸 贸 磨 碎 成 均匀 细 粒 ,在 搅拌 下 缓慢 分 批 加 入 。 各 种 不 同 的 饱和 度 应 加 入 硫酸 贸 的 量 可 以 从 表 3-3, 3-4 PAB, (2) 加 入 饱和 溶液 法 : 饱和 硫酸 铵 的 配制 ,一 般 方法 是 取 过 量 硫酸 铵 加 热 溶解 ,再 在 0O%C 或 室温 放置 ,直至 固体 硫酸 铵 析出 为 度 。 实例 : 取 800 一 850 克 化 学 纯度 的 硫酸 铵 加 入 蒸馏 水 至 总 体积 为 1 升 , MRA 50°C, 保温 10 分 钟 , 待 大 部 分 固体 溶解 后 , 趁 热泪 去 不 溶 物 ,， 放置 过 夜 , A KMAD HBR 晶体 析出 , 即 达 100% 的 饱和 度 。 盐 析 时 要 求 的 饱和 度 所 需 加 入 饱和 硫酸 铵 溶液 的 体积 计算 如 下 式 : 全 = Vo(S; 5" SG S2) V = sere A 18 it RIA RA ARO Vo = 原来 待 盐 析 溶液 的 体积 。 Si = 原来 盗 液 的 硫酸 铵 饱和 度 。 S = 所 需 达 到 的 硫酸 铵 的 饱和 度 。 e 57 。 加 入 饱和 溶液 法 适 于 要 求 硫 酸 铵 饱和 度 不 高 , 而 且 原 来 溶 小 体积 不 大 时 使 用 。 二 种 不 同 浓度 的 硫酸 铵 溶液 混合 时 ,体积 的 变化 的 计算 误差 在 2 多 左右 5 在 一 般 实 验 王 作 有 及 王 业 生 产 上 影响 是 不 大 的 。 但 如 加 入 饱和 溶液 后 体积 增加 甚大 ， 选用 固体 加 入 法 较 好 。 i 和 硫酸 铵 溶液 加 入 法 ， REN HERD BOE PREM. 以 免 造 成 局 部 过 浓 ， 影 响 分 离 的 效果 。 表 3-3 ”室温 25”C 硫酸 铵 水 溶液 由 原来 的 饱和 度 达到 所 需要 的 饱和 度 时 ， 每 升 硫酸 铵 水 溶液 应 加 入 固体 琉 酸 铵 的 克 数 "” a eA RBH th BR KRM te mM 度 【《50 一 -一 | 一 -| 一 一 一 | S| 一 一 | 一 -一 | | 一 一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 | 一 -一 | 一 -一 | 一 一 一 | 一 一 一 25 30 ea 一 -一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 -一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 一 一 一 一 | 一 -一 | 一 一- 一 | 一 -一 一 一 一 | 一 一 | 一 -一 | 一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 | 一 | 一 | 一 一 | 一 一 | 一 一 一 aia &yx a & 看 一 一 | 一 -一 | 一 一 | 一 -一 | 一 -一 一 -一 | 一 -一 一 一 一 -一 一 一- 一 | 一 | 一 | -一 | 一 一 | 一 一 (&) likes fia tae Ob ood he OS ie! BS Sk 237 198 在 23°C F 5 Bite RUS HH WK BE VELA BEY » EFL ST I PR RA Ve (3) 透析 平衡 法 : 先 将 待 盐 析 的 样品 装 于 透析 袋 内 ， 然 后 淄 入 饱和 硫酸 贸 深 液 中 进 行 透 析 , 外 部 的 硫酸 铵 由 于 扩散 作用 不 断 通过 半 透 膜 进 入 透析 袋 内 ,逐步 达到 所 需要 的 盐 析 饱 和 度 , 蛋 白 质 便 产 生 沉淀 ,此 时 即 停止 透析 。 透 析 法 的 优点 是 硫酸 铵 浓度 变化 有 连续 性 , 盐 析 效 果 较 好 ,但 透析 法 计算 饱和 度 的 测定 工作 手续 烦琐 。 除了 结晶 时 多 使 用 外 , 一 般 盐 析 沉 淀 比 较 少 用 。 3. 使 用 硫酸 铵 进行 盐 析 必需 注意 的 几 个 问题 C1) 加 固体 硫酸 铵 时 ,必须 看 清楚 表 上 所 规定 的 温度 ,一 般 有 0"C 或 室温 (20" 一 25%C) 两 种 ,加 入 固体 盐 后 体积 的 变化 已 考虑 在 表 中 。 例 如 在 室温 时 Si 一 0, 要 求 达到 $ %H 100% 饱和 度 ， 每 升 溶液 加 固体 硫酸 铵 为 767 克 。 和 欲 使 S 为 50 匈 饱和 度 时 应 加 313 克 而 不 是 767/2=383.5 克 。 * 58 ， 表 3-4 OC FS, 提高 到 S, 时 每 100 毫升 加 固体 硫酸 铵 的 克 数 在 0°C PTA SUAS Wee Fe a EC %) 20 | 25 | 30] 35 | 40] 45:| 50] 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | 80 | 85 | 90 | 95 | 100 在 10 BHA bk Meh Kh RAH we 数 10.613.4116.4119.4122.6125 .8129.1132. 6136. 1139. 8143. 6147..6[51.. 615.9160. 3165. 0169. | | |- 一 | | | | | | | % 7.9|10.8|13.7|16.6]19.7|22 .9|26. 2/29. 6133. 1136. 8/40.5/44. 5.3) 8-1l10.9113.9|16.9220.0223.3)26. 6130. 1133.7[37-4|41.2)45.2|49..3)53.6 ® 7A 5-4) 8.alnt.alt4.alt7.20.4223.7]27. 1130.6)34.3]38. 1142. 0]46..0)50.3)54.7 0 | 2.7 5.5) 8.lt1.ah14.3lt7-sp0. 724. 1]27.6131 .2[34.9|38.7]42.7146.9)51.2 a Lo | 2.7) 5.4 8.alt1.5{t4.oli7. ofan. a}24.5)28. of31.7]35.5)39.543.0147.8 peane yh: 2.8| 5.6 8.6l11.7114.8{18.1121.4\24.9]28 r me. 2.4 5.1] 8.01.9|15.ah. 4a sbs. ie — 2.9] 5.8| 8.9112. 015.3118. 722. .8|29.6|33.5|37.6|41.8 ~ LL | Yo 2.9] 5.5} 9.012.315. of19. ol22. 26.3]30.2]34.2138.3 sia ~ TF 1 1 fo | 3.0 6.0} 9.2412.5]15.9]19.4123. ol26. 830. 8134.8 tf PE YP PY Yo ¥ 3.0} 6.1) 9.312.716. 19.7123. 5)27.3131.3 a yf TP [al ecah shiz sie abo alos aler.o MP loc alten af seo le adetenae ie cbtdd an 13.2 20.5{24.4 度 | FO Te i cobs 十 EE ee 75 Ree Ate thee ee | RR ba alte cig aes 717.4 | Ge 80 : Sere. wee ee 10.5 90 eh sb pr hs lls Lote Roadie al 7.0 95 fa) SR a el EP ee As MITE | 35.5 100 0 wae lo. (2) 分 段 盐 析 时 ,要 考虑 到 每 次 分 段 后 蛋白 质 浓度 的 变化 ,蛋白 质 浓 度 的 不 同 要求 盐 析 的 饱和 度 也 不 同 。 一 种 蛋白 质 如 经 二 次 盐 析 ,第 一 次 盐 析 分 离 范 围 比 较 宽 , 第 二 次 分 离 范围 较 罕 。 如 胆 碱 酯 酶 第 一 次 硫酸 贸 盐 析 的 饱和 度 范 围 为 33 多 至 60 免 , 第 二 次 为 40 多 至 60 多。 脱氧 核糖 核酸 酶 第 一 次 硫酸 匀 盐 析 的 饱和 度 范围 为 20 和 至 40 多, 第 二 次 则 为 30% 至 409%。 《3) 为 了 获得 实验 的 重复 性 , 盐 析 的 条 件 如 pH 值 温 度 和 硫酸 贸 的 纯度 都 必须 严 加 控制 。 盐 析 后 一 般 需 放置 半 小 时 至 1 小 时 , 待 沉淀 完全 后 才 过 滤 离 心 , 过 早 的 分 离 将 影响 收 率 , 低 浓度 的 硫酸 匀 溶 液 盐 析 后 固 液 分 离 常 采用 离心 方法 ,高 浓度 硫酸 冬 溶 液 则 常用 过 滤 方法 。 因 高 浓度 硫酸 贸 的 密度 太 大 ,蛋白 质 要 在 悬 序 液 中 沉降 出 来 ,需要 较 高 离心 速度 和 长 时 间 的 离心 操作 , 故 采 取 过 滤 法 较 合 适 。 es 59 e 4. 硫酸 铵 盐 析 的 实例 例 〈1) 面 清 中 各 主要 乍 白质 组 份 的 盐 析 分 离 100 毫升 血清 + 100 毫升 PBS## | iim 200 毫升 饱和 硫酸 馈 (PH 7.2) 液 沉淀 再 咨 于 PBS 中 ,使 体积 达 100 BH 蛋白 〈Ab) | iain 25 毫升 饱和 硫酸 匀 约 达 2096 饱和 度 Lik 沉淀 含 纤维 蛋白 质 (很 少量 》 | ion 18 一 25 毫升 饱和 硫酸 匀 使 达 30 一 3396 饱和 度 bie REELS 1-REAMLD SE B-REA 滴 加 35—40 毫升 饱和 硫酸 RAGA 49% 饱和 度 YF PBS 中 使 体积 达到 100 毫升 | | | im 43 一 50 毫升 饱和 硫酸 “RE jim =% 68= 球 蛋白 BAK 30-33% fame RE 毫升 te J 43 一 20 毫升 饱和 硫酸 铁 约 达 和 度 上 清 液 沉淀 为 少量 7- 球 蛋白 滴 加 30 一 40 a7} aM AK 45% 饱和 度 上 清流 少量 <- 球 lA B-KEA 蛋 折 及 清 蛋 白 ** PBS 为 磷酸 缓冲 液 ，0.2M，pH 7.2 并 加 入 氧化 钠 至 0.15M。 例 (2) 高 活性 组 织 蛋白 酶 C( 二 肽 酰 氮 基 肽 酶 ) 的 分 段 盐 析 制备 王 tale 5 公斤 (除去 脂肪 肋 膜 7 DCR, BH, Smit, BE 一 12”C 冻 硬 ， 反 复 冻 融 四 次 。 然后 加 入 10 升 冷 蒸 馏 水 0 一 4*C 浸泡 半天 ,盐酸 ( 重 蒸 ) 芯 化 至 pH 4.0，1 小 时 后 过 小。 滤液 (8000 毫升 ) | 加 固体 硫酸 锐 粉 末 560 克 ; 沉 淀 ; 0"c WH AER. 了 沉淀 BE KAGORBL pH 4.0, O-1M 柠 机 弛 缓冲 沪 中 。 离心 得 抽 提 沪 720 AA» nem Bese (pH 4.0) 至 5096 饱和 度 ，0?C iti. IB (850 毫升 ) | sm A Bee BERN ARE 7096 饱和 度 , 放 置 2 小 时 后 0C 离心 ,沉淀 为 50 一 7096 Ha FIDE EEE RBA 沉淀 Be TDM 37% 氧化 销 中 (化 量 分 批 ,每 次 不 超过 5 毫升) 放 在 锥 形 瓶 中 。60*c 水 浴 加 热 20 分 印 ， 加 热 后 立即 用 冰 水 冷却 ,0C BEL», Lisi 44 BEF 上 清 液 | momen BUS RA pH 5.6，0.02M 磷酸 钠 缓冲 液 OC 透析 过 夜 。 透析 液 上 DEAE- 葡 育 糖 凝 胶 A-5 (CI-) 柱 ( 先 用 pH 5.6 0.02M 磷酸 钠 缓 冲 液 平衡 ) 上 pH 5.6 0.02M 研 酸 钠 缓 冲 液 洗 脱 收集 第 一 峰 活 性 部 分 如 从 硫酸 匀 使 蛋白 质 全 部 沉 证 ， 然 后 对 PE 4.0，0.005M ABC WT IE FO AT es 60 。 透析 液 在 °C 上 Sephadex G200 柱 《6 克 Sephadex G200 置 于 pH 4.0，0.005M 柠 树 玛 钠 缓冲 液 中 冰箱 存放 待 完全 胀 开 ) ju pH 4.0, 0.005M #:igei 4g whic REIFF Wie 5 5 — EE HE BB 5) SEG 20 毫升 ( 含 蛋白 质 30 SR WGA 214 单位 /毫克 7) | 00 Fate ta ket 透析 液 再 上 Sephadex G200 柱 | oc mate ka 收集 第 一 峰 活 性 部 分 《 比 活 为 310 单位 /毫克 ) (=) 硫酸 销 盐 析 法 在 很 早 以 前 已 有 人 用 硫酸 钠 来 分 离 血 清 中 的 蛋白 质 , 但 由 于 其 盐 析 效 果 不 如 硫酸 匀 ， 因而 应 用 范围 也 不 及 硫酸 匀 盐 析 广 泛 。 其 操作 方法 如 硫酸 铵 盐 析 一 样 ， 这 里 不 另 效 述 。 硫酸 钠 在 不 同 温度 下 的 溶解 度 见 表 3-5o 袁 3-5 不 同 温度 下 硫酸 钠 的 溶解 度 …"” 溶解 度 ( 克 / 升 ) 13.8 18.4 24.8 28:2 32.6 34.0 硫酸 钠 应 用 于 蛋白 质 分 段 盐 析 举例 如 下 : A: 使 用 硫酸 钠 提 取 较 纯 IG (ARRAY 100 毫升 血清 + 100 毫升 PBS (0.2M, pH 8.0) 加 36 克 硫 酸 钠 使 最 后 浓度 达 18% 离心 取 沉淀 再 将 沉淀 咨 于 80 毫升 PBS 中 离心 取 上 清 液 加 入 9.6 克 硫 酸 钠 使 最 后 浓度 达 12% 离心 取 沉 淀 溶 于 40 毫升 PBS 中 BOR EAR. MA 4.8 克 硫 酸 钠 使 最 后 浓度 达 12% BBE A IEG【《〈 免 疫 球 蛋白 ) 透析 脱盐 得 较 纯 的 IgG (=) 其 它 中 性 盐 应 用 于 蛋白 质 的 盐 本 例如 : ”用 低 浓 度 氧化 钠 沉 证 DNA 核 蛋 白质 ， 用 低 浓 度 硫 氰 化 钾 沉 淀 人 膀 干 it 等 "。 但 没有 硫酸 铵 应 用 那样 广泛 。 第 三 节 ”有 机 溶剂 沉淀 法 一 、 基 本 原理 有 机 溶剂 对 许多 能 溶 于 水 的 小 分 子 生 化 物质 以 及 核酸 多糖、 蛋白 质 等 生物 大 分 子 都 * 61 e 能 发 生 沉 淀 作用 。 有 机 溶剂 的 沉淀 作用 主要 是 降低 水 溶液 的 介 电 稍 数 ,如 20°C 时 水 的 介 电 常 数 为 80 ,而 82% 乙醇 溶液 的 介 电 常 数 为 40。 溶 液 的 介 电 币 数 减少 就 意味 着 溶质 分 子 异性 电荷 库仑 引力 的 增加 从 而 使 溶解 度 减少 。 这 一 点 可 以 从 静电 学 的 库仑 定律 中 得 到 盖 明 。 在 库仑 定律 的 公式 中 带电 离子 基 团 之 间作 用 力 随 着 介 电 和 数 的 减少 而 增 大 ,离子 之 间 不 断 接近 ,两 带电 基 团 的 距离 也 随 之 减少 ,因此 带电 溶质 便 互 相 吸 引 凝 集 。 对 于 具有 表 面 水 层 的 生物 大 分 子 来 说 ,有 机 溶剂 与 水 的 作用 不 断 使 这 些 分 子 表面 水 层 厚度 压缩 ,最 后 使 这 些 大 分 子 脱水 而 相互 聚集 析出 。 不 同 溶质 的 沉淀 要 求 不 同 浓度 的 有 机 溶剂 , 是 有 机 溶剂 分 步 沉淀 的 理论 基础 。 了 有 机 溶剂 沉淀 法 的 优点 是 : CL) 分 辨 能力 比 盐 析 法 高 ， 即 一 种 蛋白 质 或 其 他 溶质 只 有 在 一 个 比较 窜 的 有 机 溶剂 浓度 范围 内 沉淀 。(2) 沉 淀 不 用 脱盐 , 过 滤 比 较 容易 。〈3) 在 生化 制备 中 应 用 比 盐 析 法 广泛 。 其 缺点 是 对 某 些 具有 生物 活性 的 大 分 子 , 如 酶 ,容易 引起 变性 失 活 , 操 作 常 需 在 低温 下 进行 。 =. 有 机 溶剂 的 选择 及 浓度 计算 用 于 生化 制备 沉淀 的 有 机 咨 剂 的 选择 首先 是 能 和 水 混 咨 。 使 用 较 多 的 有 机 溶剂 是 乙 醇 \ 甲 醇 \ 丙 酮 。 还 有 二 甲 基 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 硕 、 乙 有 睛 和 2- 甲 基 -2，4- 成 二 醇 CMPD) 的 沉淀 ,乙醇 甲醇 和 丙酮 都 可 以 使 用 , 但 甲醇 和 丙酮 对 人 体 有 一 定 毒性 。 总 的 来 说 蛋白 质 的 有 机 溶剂 沉淀 法 不 如 盐 析 法 普遍 。 核酸 的 有 机 盗 剂 帝 证 ;除了 乙醇 外 , 异 丙 醇 和 vc- 二 氧 基 乙醇 也 常 被 采用 。 其 他 一 些 有 机 溶剂 如 二 甲 酰 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 硕 、 乙 且 以 及 氯仿 、 乙 醚 等 ,作为 沉淀 剂 其 应 用 的 对 象 及 条 件 , 则 必须 根据 不 同 具体 情况 而 选择 。 进行 有 机 溶剂 沉淀 时 ,和 欲 使 原 深 液 达 到 一 定 的 有 机 溶剂 浓度 , 需 加 入 的 有 机 溶剂 的 浓 度 及 体积 可 按 下 公式 计算 : V 一 Vo(S: — S,)/C100 — S,) 式 中 : V 一 需 加 入 100% 浓度 有 机 溶剂 的 体积 。 Vo = 原 盗 液体 积 。 Si 一 RAR PALS AN RES S$ 一 所 要 求 达 到 有 机 溶剂 的 浓度 。 一 种 组 份 的 浓度 需要 混 ree 图 3-6 一 种 组 份 溶剂 的 比例 图 解 计 算法 > 62 。 表 3-6 制备 较 低 浓 度 乙 醇 1 升 所 需 较 高 浓度 乙醇 及 水 的 用 是 表 (毫升 ,20"C) UU GBH 浓度 J (V/V) e 63 。 100 指 加 大 的 有 机 溶剂 浓度 为 100% ， 如 所 加 入 的 有 机 溶剂 的 浓度 为 95 多 ， 上 式 (100-S) 项 应 改 为 (95-S:)。 上 式 的 计算 由 于 未 考虑 混 溶 后 体积 的 变化 和 溶剂 的 挥发 情况 ， 实 际 上 存在 一 定 的 误 差 。 如 有 机 溶剂 浓度 不 要 求 太 精 确 时 ， 可 用 简单 的 图 解 方法 求 出 CLA 3-6). 有 时 为 了 获得 沉淀 而 不 是 进行 分 离 , 可 用 溶液 体积 倍数 如 一 倍 \ 二 倍 、 三 倍 等 来 表示 5 # 3-6 是 制备 不 同 浓度 乙醇 溶液 所 需 较 高 浓度 乙醇 及 水 的 用 量 表 吧 。 =, 有 机 溶剂 沉淀 的 影响 因素 及 注意 事项 - (—) 温度 多 数 蛋白 质 在 乙醇 一 水 混合 液 中 的 溶解 度 随 着 温度 的 降低 而 降低 ， 对 于 其 他 物质 也 大 致 如 此 。 值 得 注意 的 是 大 多 数 生 物 分 子 如 蛋白 质 、 酶 和 核酸 在 有 机 溶剂 中 对 温度 反应 特别 敏感 ,温度 稍 高 即 发 生变 性 。 因 此 ,加 入 的 有 机 盗 剂 都 必须 预 冷 至 较 低 温度 ， 操 作 要 在 冰 浴 中 进行 ， 同 时 加 入 有 机 咨 剂 必须 缓慢 MAA RED SAT aR. KAM Kin TAAL Ie BS on A 3-7 Pra. 有 机 溶剂 帝 淀 一 些小 分 子 物 质 (如 核 背 酸 、 氢 BREW BRS), RGB BRKRAE ae 物 大 分 子 那样 苛刻 。 这 是 因为 小 分 子 物质 结 构 比 较 稳 定 , 不 易 破 坏 。 但 低温 对 于 提高 沉 图 3-7 ”低温 有 机 溶剂 沉淀 装置 淀 效果 仍 是 有 利 的 。 (=) 样品 浓度 样品 浓度 对 有 机 溶剂 的 影响 与 盐 析 情 况 相 似 ， 低 浓度 样品 使 用 有 机 溶剂 的 量 大 但 共 沉 作 用 小 ,利于 提高 分 离 的 效果 ;但 低 浓度 样品 损失 较 大 《〈 即 回收 率 小 ), 具有 生理 活性 的 样品 易 产 生 稀释 变性 。 反 之 高 浓度 样品 可 以 节省 有 机 盗 剂 ， 减 少 变性 危险 ， 但 共 沉 作用 大 ,分 离 效果 较 差 。 一 般 认 为 蛋白 质 最 初 浓度 为 5 一 20 毫克 / 毫升 , 粘 多 糖 1 一 2% 范围 较 为 合适 ,再 加 上 选择 适当 的 pH 值 , 进 行 分 段 沉淀 * 即 可 获得 较 好 的 结果 。 (=) pH fa 在 样品 结构 稳定 范围 下 选择 溶解 度 最 低 处 的 pH 值 ,' 有 利于 提高 沉淀 效果 。 另外, 适 HW pH 值 也 可 大 大 提高 分 离 的 分 辨 能 力 。 例如 上 海 生 化 制药 厂 用 乙醇 分 段 沉 淀 糖 蛋白 RRA CHCG) 时 ， 蛋 白质 浓度 为 1% ,乙醇 浓度 为 55%， 一 部 分 HCG -产生 沉淀 , 但 不 完全 。 加 入 一 定 酷 酸 铵 后 ,乙醇 浓度 增 至 66 多 ,但 没有 产生 沉淀 ， 再 结合 调整 pH 至 5.7 附近 ，HCG 则 在 非常 狭 罕 的 乙醇 浓度 下 沉淀 下 来 。 (四 ) 金属 离子 的 影响 一 些 多 价 阳 离子 如 Zn’* 和 Ca* 在 一 定 pH 值 下 能 与 呈 阴 离子 状态 的 蛋白 质 形成 es 64 。 95% 乙醇 乙醇 一 于 冰 混 合 液 复合 物 , 这 种 复合 物 在 水 中 或 有 机 溶剂 中 的 溶解 度 都 大 大 降低 ,而 不 影响 蛋 白 质 的 生物 活 性 。 0.005M 至 0.02M 的 Zn 可 以 使 原来 沉淀 蛋 日 质 的 有 机 溶剂 用 量 减少 #— ,这 在 工业 上 很 有 实用 价值 。 但 使 用 此 一 方法 时 ; 需 事先 加 有 机 溶剂 除去 杂 蛋 白 ， 同时 在 沉 省 后 尽 可 能 避免 这 些 离子 残存 于 蛋白 质 中 ，。 如 使 用 Zn’? WY, BAK 不 能 含有 磷酸 盐 ,以 免 产 生 磷 酸 锌 沉淀 不 易 与 蛋 日 质 分 开 。 钙 与 锌 离子 的 存在 ,也 可 提高 粘 多 糖 乙 醇 分 步 沉淀 的 效果 ,二 价 负 离 子 也 有 同样 作用。 (A) 离子 强度 的 影响 离子 强度 是 影响 溶质 在 有 机 溶剂 及 水 混合 液 中 溶解 度 的 一 个 重要 因素 ， 盐 的 浓度 太 小 或 太 大 都 对 分 离 有 不 利 影 响 , 对 于 蛋白 质 和 多 糖 , 在 有 机 溶剂 中 盐 的 浓度 不 超过 5% 比 较 合 适 , 使 用 的 乙醇 量 也 以 不 超过 二 倍 体积 为 宜 s 有 机 溶剂 沉淀 所 应 用 的 对 象 是 比较 广泛 的 。 许多 种 类 的 生化 物质 , 只 有 选用 合适 的 有 机 溶剂 ,注意 调整 样品 浓度 ,温度 、pH 值 和 离子 强度 ， 使 这 些 因 子 综合 地 发 挥 作用 ,都 可 以 获得 较 好 的 实验 结果 。 有 机 溶剂 沉淀 所 得 的 固态 样品 , 如 果 不 是 立即 溶解 进行 第 二 步 分 离 ? 则 应 尽 可 能 抽 王 ,减少 帝 证 中 有 机 溶剂 的 含量 ,以 免 影 响 样品 的 生物 活性 。 四 、 有 机 溶剂 沉 诈 法 实例 MC): 血浆 一 乙醇 分 步 沉淀 法 e9 [Cohn 方法 61 | ifm # 乙醇 8%6，pH7.2， 温 度 一 BP 0. i aR We 上 清 液 1 wie CPT) GB 25%, pH6.9, mB — 5°, 离子 强度 0. 09， 人 3.0% byw + a 沉淀 II + MCP + 1) CB 18%, pH5.2 离子 强度 0. 09, che 请 "6% 上 清流 IV-1 沉淀 IV-1 (PIV-1) ZB 40%, pH5.8, 温度 — 5°C 离子 强度 0.09, BE ke |. 0% 上 清 液 IV-4 © 沉淀 IV-4(PIV-4) e 65 。 : > 温度 *). 5°C 强度 0.11, Pew tye - 8% Ein v(sv) 沉淀 VCPV) 乙醇 10%6，pH 4.5， 温 度 —3° 离子 强度 pila eins 3% | she RAD 乙醇 40%, pH 5.2, > % 离子 强度 0.01, 质 浓度 2.5% | Em WES LUE 95%) 附 : [方法 6] 乙 醇 分 步 沉淀 有 关 条 件 及 组 份 的 分 析 1. [方法 6] 分 离 的 条 件 及 各 阶段 蛋白 质 浓 度 的 测定 m 原 i ee PIL + III Plv-1 PIV-4 PV SV 2. [方法 6] 各 分 离 阶段 蛋白 质 组 份 电泳 分 析 a 8 中 Yr WEL % J Bm # 13 16 3.8 11 100 iy PI 8.8 15 62 8.3 52 PIL + Il 5.8 48 53 ; 37 29 PIV-1 88 9.8 0 2 Yaad PIV-4 47 38 0 0 8.8 PV 4.1 0.9 0 0 48 SV 20 40 0 0 1.5 aa 66 。 3. [方法 5] 各 分 离 阶段 分 离 条 件 图 解 《 图 3-8) > PN 一 4 PIi—Il (0.09) 486.2 5.8 68 7.2. pH 3-8 各 分 离 阶 段 分 离 条 件 图 解 例 〈 二 ) 小 牛 胸腺 核 组 蛋白 ,全 组 蛋白 和 组 蛋白 各 组 份 的 分 离 29 小 牛 胸腺 (100 克 ) 0.9% NaCl 0.05M NaHSO, (pH 3.5) 洗涤 七 次 核 组 蛋白 0.25N HCI 抽 提 | 10% GuCl fy 25% 乙醇 抽 提 | | zw -1,25N HC! 抽 提 Ewe bie 8 倍 体积 1 %K HC1,1.75 全 组 蛋白 (1,700 毫克 ) | sizanin o6n ie | Hite 上 清 液 Tite 上 清流 Bite. FT at ee Fy, ”上 清流 ”残渣 弃 去 全 全 345 BH 3 倍 体积 3 ta tet 全 本: Fin 上 清 液 ”沉淀 F500 毫克 O00 | 2 倍 体积 丙 本 FF2b 520 a3 i: Fy, Frat. Fia?y Fop 和 F, A Johns 和 Butler 对 组 蛋白 的 分 类 系统 [ 见 Prog. Biophys. Mol. Biol, 18, 209 (1968)] A=) 多 糖 类 的 分 离 e 7 多 糖 类 的 水 溶 芒 加 入 等 量 或 倍 量 的 乙醇 〈 或 用 丙酮 和 甲醇 代替 ), 可 以 破坏 多 糖 颗 煌 的 水 化 膜 及 降低 溶液 的 电解 常数 ,使 多 糖 沉淀 而 析出 。 含 有 糖 醛 酸 或 硫酸 基 团 的 多 糖 , 可 以 在 其 盐 类 溶液 中 直接 加 入 乙醇 , 则 多 糖 以 盐 的 形式 沉淀 。 如 在 其 栈 酸 或 盐酸 溶液 中 加 和 人 乙醇 , 则 多 糖 以 游离 酸 形式 沉淀 。 乙 醇 分 步 沉淀 右 旋 糖 本 例子 如 下 : e 07 。 12% Ae HART i 乙醇 上 清 液 沉淀 == zm | EE 18 万 以 上 的 右 旋 糖 本 BRK wee = 乙醇 eas 4.5 一 7 万 的 右 旋 糖 本 his 沉淀 ae 分 子 量 2.5 一 4.5 万 的 右 旋 糖 本 Lik 分 子 量 为 1 一 2.5 万 的 右 旋 糖 本 第 四 节 SRR 等 电 点 沉淀 法 主要 利用 两 性 电解 质 分 子 上 的 电 中 性 时 溶解 度 最 低 ， 而 各 种 两 性 电解 质 具 有 不 同等 电 点 而 进行 分 离 的 一 种 方法 。 氨基 酸 、 核 痛 酸 和 许多 同时 具有 酸性 及 碱 性 基 团 的 生物 小 分 子 , 以 及 蛋 日 质 、 酶 、 核 酸 等 生物 大 分 于 都 是 一 些 两 性 电介质 。 在 处 于 等 电 点 时 的 pH 值 , 再 加 上 其 他 沉淀 因素 , 则 很 易 帝 证 析 出 。 如 不 加 其 他 沉淀 因素 , 带 有 水 膜 的 大 分 子 如 蛋白 质 等 仍 有 一 定 溶解 度 , 不 易 况 省 析出 。 另 许多 蛋 特 质 的 等 电 点 十 分 接 近 , 单 独 使 用 此 法 效果 不 理想 ,分 辩 率 也 差 。 一 般 用 于 提取 滚 中 除去 和 杂 蛋 白 , 如 在 工业 上 AEP RGD AN , ERK Sid pH 8.0 去 碱 性 蛋白 质 , 再 调 pH 3.0 去 酸性 蛋白 (以 上 均 常 加 入 一 定 有 机 溶剂 以 提高 沉淀 效果 )e 利用 等 电 点 除 杂 蛋白 方法 须 事先 了 解 所 制备 的 物质 对 酸 碱 的 稳定 性 ,不 然 , 言 目 使 用 是 很 危险 的 。 不 少 蛋白 质 与 金属 离子 结合 后 ,等 电 点 会 发 生 偏 移 , 如 胰岛 素 等 电 点 为 5.3，, 与 Zn 结合 后 ,形成 胰岛 素 锌 盐 ， 其 等 电 点 度 为 6.2, 故 加 入 金属 离子 后 选择 等 电 点 沉淀 时 ， 必 须 注意 调整 pH 值 。 等 电 点 法 常 和 盐 析 法 \ 有 机 溶剂 法 或 和 其 他 沉淀 剂 一 起 使 用 ,以 提高 其 沉淀 能 力 。 SAT ”生成 盐 类 复合 物 况 泥 法 生物 大 分 子 和 小 分 子 都 可 以 生成 盐 类 复合 物 沉 淀 , 此 法 一 般 可 以 分 为 〈1) SRD 能 团 作用 的 金属 复合 盐 法 〈 如 铜 盐 、 银 盐 、 锌 盐 \ 铅 盐 、 锂 盐 、 钙 盐 等 )，(2) 与 碱 性 功能 团 作用 的 有 机 复合 盐 法 (如 苦味 酸 盐 、 苦 酮 酸 盐 \ 丹 宁 酸 盐 等 )，(3) 无 机 复合 盐 法 《如 磷 钢 酸 盐 、 磷 钼 酸 盐 等 )。 以 上 盐 类 复合 物 都 具有 很 低 的 盗 解 度 , 极 容易 沉淀 析出 , 若 沉 淀 为 金 属 复合 盐 ， 可 通 以 WS 使 金属 变 成 硫化 物 而 除去 , 若 为 有 机 盐酸 盐 、 磷 钨 酸 盐 , 则 加 入 无 机 酸 并 用 乙醚 萃取 , 把 有 机 酸 ， 磷 钨 酸 等 移 人 乙醚 中 除去 ;或 用 离子 交换 法 除去 。 但 值得 注意 的 是 , 重金 属 、 某 些 有 机 酸 与 无 机 酸 和 蛋白质 形 成 复合 盐 后 , 常 使 蛋白 质 发 生 不 可 逆 的 帝 证 ,应 用 时 必须 谨慎 。 。68 。 (—) 金属 复合 盐 法 许多 有 机 物 包括 蛋白 质 在 内 ,在 碱 性 溶液 中 带 负电 荷 , 都 能 与 金属 离子 形成 沉淀 。 所 用 的 金属 离子 ， 根 据 它们 与 有 机 物 作用 的 机 制 可 分 为 三 大 类 。 第 一 类 包括 Mnz+、Fez+、 co+ 、Ni+、Cu+、Zn+ 和 Cd+， 它 们 主要 作用 于 羧 酸 、 胺 及 杂 环 等 含 氮 化 合 物 。 第 二 类 包括 Catt, Bat, Mg’* 和 Pbt+， 这 些 金属 离 了 予 也 能 和 羧 酸 起 作用 ， 但 对 含 氮 物 质 的 配 基 没 有 亲和力 。 第 三 类 金属 包括 He, Agt 和 Pb*, 这 类 人 金属 离子 对 含 硫 氢 基 的 化 合 物 具 有 特殊 亲和力 。 蛋 白质 和 酶 分 子 中 含有 羧基 、 氮 基 、 咪 唑 基 和 硫 氨基 等 , 均 可 以 和 上 述 金 属 离子 作用 形成 盐 复合 物 。 但 复合 物 的 形式 和 种 类 则 依照 各 类 金属 离子 和 蛋白 质 的 性 质 , 溶液 离子 强度 和 配 基 的 位 置 等 而 有 所 不 同 。 关于 蛋白 质 一 金属 复合 物 形成 的 机 理 ，Gurd 和 Wilcox 等 曾 作 过 全 面 论 述 aa, 读 者 有 兴趣 时 ,可 进一步 查阅 。 蛋白 质 一 金属 复合 物 的 重要 性 质 是 它们 的 溶解 度 对 介质 的 介 电 常 数 非常 敏感 ， 调 整 水 溶液 的 介 电 常数 (如 加 入 有 机 溶剂 ), 用 Znz+，Baxt 等 金属 离子 可 以 把 许多 蛋 自 质 沉 淀 下 来 ， 而 所 用 金属 离子 浓度 约 为 .0.02M .左右 即 可 。 金属 离子 复合 物 沉 淀 也 适用 于 核酸 或 其 他 小 分 子 , 例 如 0.01N 的 Cax+ 或 Mg2+ 在 室温 下 可 以 完全 沉淀 PolyA 和 PolyIo 金属 离子 沉淀 氨基 酸 ,多 肽 及 有 机 酸 等 。 详 见 实例 。 (=) 有 机 盐 法 含 所 有 机 酸 如 苦味 酸 \ 苦 酮 酸 、 县 酸 等 都 能 与 有 机 分 子 的 碱 性 功能 团 形 成 复合 物 而 沉 证 析出 。 但 这 些 有 机 酸 与 蛋白 质 形 成 盐 复 合 物 沉 淀 时 , 常 冲 发 生 不 可 逆 的 沉淀 反应 ,工业 上 应 用 此 法 制备 蛋白 质 时 , 需 采取 较 温 和 的 条 件 , 有 时 还 加 人 一 定 的 稳定 剂 , 以 防止 蛋白 质变 性 。 近年 来 应 用 一 种 咱 啶 染料 雷 凡 诺 (2- CASE -6 9-T ATEN) ME ZLB GE, 2-ethoxy-6, 9- diaminoacidine lactate), 虽然 其 沉淀 机 理 比 一 般 有 机 酸 盐 复杂 ,但 其 与 蛋 握 质 作用 也 主要 是 通过 形成 盐 的 复合 物 而 沉淀 的 。 此 种 染料 据 报 导 时 提纯 血浆 中 Y- 球 蛋白 有 较 好 效 A, 实际 应 用 时 以 0.4 多 的 雷 凡 诺 溶 小 加 到 血浆 中 , 调 pH 7.6 一 7.8， 除 7- 球 蛋白 外 ， 可 将 血浆 中 其 他 蛋白 质 沉 淀 下 来 。 然后 以 5 % 浓度 NaCl 将 雷 凡 诺 沉淀 (或 通过 活性 几 柱 或 马铃薯 淀粉 柱 吸 叭 除去 )。 WRN Y- 球 蛋白 可 用 25% 乙醇 或 加 等 体积 饱和 硫酸 BARRE HK. CHE LARERAR, 不 影响 蛋白 质 活 性 , 并 可 通过 调整 p 贡 fa, 分 段 帝 淀 一 系列 蛋白 质 组 份 。 但 蛋白 质 的 等 电 点 在 pH 3.5 以 下 或 pH 9.0 以 上 ,不 被 备 凡 诺 沉淀 。 核 酸 大 分 子 也 可 在 较 低 pH 值 时 (PH 2.4 左右 ), 被 雷 凡 诺 沉淀 。 《三 ) 无 机 盐 法 一 般 用 于 小 分 子 如 氮 基 酸 的 分 离 制备 ,大 分 子 蛋白 质 \ 酶 和 核酸 则 很 少 使 用 。 《四 ) 实例 关于 各 类 生化 物质 盐 类 复合 物 沉淀 法 举例 如 下 : 实例 一 “” 雷 凡 诺 提取 免疫 球 蛋白 吕 e 69 e 100 毫升 血清 十 69 eS} Rik K 十 55 毫升 雷 凡 诺 旋 (395，pH 7.5) 十 1M ZU Vv uy, ce 沉淀 ( 弃 去 ) LIAR 十 11.7 ES Sic ante ws 5% | 离心 Link (+S KR mRRAR) | 离心 沉淀 C8 F 50 Ri A aga seb 离心 沉淀 为 IEG《〈 免 疫 球 蛋 白 ) 实例 二 ” 攻 酸 沉淀 法 制备 菠萝 和 蛋白酶 25 ATS F BV SEEKE, 10%NaCl 拍 提 二 次 共 得 清 液 12 Ft BRIA pH4.5* BABU Lim (FA) MA 0.06% ACH» 0.02% 抗坏血酸 作 稳 定 剂 在 搅拌 下 缓慢 加 入 pie REMI. 离心 FUE pH 4.5, 0.0296 抗坏血酸 溶液 洗涤 数 次 ,除去 沉 汪 中 的 生 酸 (每 次 洗涤 后 离心) 沉淀 干燥 后 得 菠萝 蛋白 酶 成 品 * 选 自 广 西南 宁 航 头 厂 生产 工 艺 实例 三 ” 铜 盐 沉 淀 法 制备 谷 胱 甘 肽 100 公斤 面包 酵母 * 轧 碎 后 加 入 硫酸 ,乙醇 -乙醚 混合 液 10,000 毫升 * 降温 30°C AF a REFEREE 30 分 钟 。 | sie 滤液 以 浓 硫 酸 调节 到 0.5 当量 酸度 Y 约 得 8 升 滤液 在 40°C cites ee 4 ACW, BS 20D | 沉淀 用 0.5N H.SO, eA, SMRBKARARK, BABURSACMAKER ARE. 刮 下 无 硫酸 根 的 谷 胱 甘 肽 铜 盐 , 加 入 2 一 3 倍 体积 的 水 ,使 盗 解 。 A HS 三 小 时 , 抽 涉 ,得 饱和 的 硫化 氢 谷 胱 甘 肽 滤波 。 通 入 氮气, 除 净 滤 液 中 的 HS | 布 氏 户 斗 抽 沙 BEI A 10 倍 左右 的 丙酮 ,冷库 放置 1 一 2 天 沉淀 物 用 两 倍 冷 丙酮 洗 几 次 * 干 燥 后 得 谷 有 陇 甘 肽 产品 约 100 克 。 * 硫酸 ,乙醇 -乙醚 混合 液 的 配制 : 在 耐酸 缸 中 加 入 86% 乙醇 5000 毫升 (在 冰 浴 中 ), 逐 渐 加 入 浓 硫 酸 1000 BA CHEE ABE 30°C), 硫酸 加 完 后 , 待 液 温 降 至 10% 以 下 时 ,加 入 乙醚 4000 毫升 。 引 自 上 海 酵 母 厂 的 生产 工艺 上 法 用 有 机 溶剂 较 多 , 现 多 使 用 热 水 抽 提 ,。 上 离子 交换 树脂 柱 纯化 , 产 率 较 高 。 举 此 * 70 * 例 只 说 明 金 属 盐 沉 淀 方法 而 已 。 实例 四 铜 盐 法 制备 工 - 异 白 氮 酸 2 钝 齿 棒 状 杆菌 (Corynebacterium crenatum) AS1.998 发 酵 液 1 升 ( 约 含 190L- 异 白 氨 酸 ) | Bees (3500 转 /分 ) 30 分 名 上 清 液 | 如 0.5 克 cuco,、3HO， 升 温 咨 解 , 冷 后 过 下 滤液 | 加 6.5 克 CeCO,, 3H,0 洲 解 后 浓缩 至 150 毫升 离心 沉淀 | 加 水 煮沸。 浴 解 后 缓慢 冷却 aR IK | BA HLS “Uk iti. iB | 浓缩 至 100 毫升 ,调节 pH 至 6. 0， 加 二 倍 体积 5% 乙醇 静 置 过 夜 ,离心 Tit | 加 水 250 毫升 ,用 HCI 调节 pH 至 4.0， 加 活性 炭 2 克 ,煮沸 20 分 钟 , 过 让 。 wei | 浓缩 至 100 毫升 ,用 所 水 调节 pH 至 6.0， 加 二 倍 体积 9596 乙醇 放置 过 夜 , 离心 沉淀 | 70° se 半成品 (6.5 38) | 加 170 毫 升水 ,用 HC! 调节 pH 4.0， 加 活性 炭 1 克 煮沸 20 AH, LhiRS 滤液 上 | 该 缩 至 100 毫升 ,用 氨水 调节 pH 至 6. 0, 加 二 倍 体积 95% CRU. Bie 沉 证 | 7oc KF 精制 品 (5 克 ) 实例 五 ” 盐 类 复合 物 沉淀 制备 酸性 及 碱 性 氨基 酸 上 BARR KeK 去 除 盐酸 及 酸性 胡 敏 酸 低 氧 化 正 铜 处 理 硫 醇 盐 盗 该 ，| 硫化 氢 处 理 PRATER TL TE (LI) we (La ie Bi RR > Bs Bi ite | 第 一 次 石灰 ,乙醇 处 理 SP > 将 滤 该 及 母液 予以 脱 钙 RAB 及 去 乙醇 处 理 mw TI 。 第 一 次 磷 钨 酸 处 理 第 一 次 将 碱 性 氨基 酸 分 离 ”去除 滤液 中 沉淀 试 莉 分 离 难 盗 的 一 氨基 酸 生成 铜 盐 CL 4 用 醇 溶解 部 份 , 脱 铜 ,以 乙醇 提取 甲醇 不 溶解 部 份 | 一 ~ 不 深 于 乙醇 的 一 氨基 酸 苦味 酸 处 理 提取 液 冷水 提取 , 脱 铀 分 离 且 氨 酸 苦 味 酸 盐 溶解 于 冷水 部 份 。 不 和 次 于 冷水 部 份 睛 氨 酸 苦味 酸 盐 从 滤液 中 去 除 苦味 酸 ee 脱 铀 OH | 第 二 次 石灰 ,乙醇 处 理 析出 一 氨基 酸 第 二 次 从 酸性 氨基 酸 中 分 离 将 尖 液 脱 钙 与 去 除 乙醇 SRE, KZA ie ee + Renee 去 除 滤液 中 的 试剂 分 离 一 氨基 酸 分 离 出 碱 性 氨基 酸 Fi BR 第 六 节选 择 性 变性 沉 泥 法 这 一 特殊 方法 主要 是 破坏 杂质 ,保存 目的 物 。 其 原理 是 利用 蛋白 质 \ 酶 和 核酸 等 生物 大 分 子 对 某 些 物 理 或 化 学 因素 敏感 性 不 同 , 而 有 选择 地 使 之 变性 沉淀 ,使 达到 分 离 提纯 的 目的 。 此 方法 可 分 为 : Cl) 利用 表面 活性 剂 或 有 机 溶剂 引起 变性 。 如 制备 核酸 时 ,加 入 含水 酚 、 氯 仿 、 十 二 烷 基 磺 酸 钠 等 有 选择 地 使 蛋白 质变 性 与 核酸 分 离 。 (2) 利用 对 热 的 稳定 性 不 同 ,加热 破坏 某 些 组 份 ,而 保存 另 一 些 组 份 。 如 脱氧 核糖 核 酸 酶 对 热 稳定 性 比 核糖 核酸 酶 差 ， 加 热处理 可 使 混杂 在 核糖 核酸 酶 中 的 脱氧 核糖 核酸 酶 变性 沉淀 。 又 如 由 黑 曲霉 发 酵 制 备 脂肪 酶 时 ， 常 混杂 有 大 量 淀粉 酶 ， 当 把 混合 粗 酶 液 在 « 72 ¢ 40°C 水 浴 中 保温 二 小 时 半 (pH 3.4)，90% 以 上 的 淀粉 酶 将 受热 变性 而 除去 。 热 变性 方 法 简单 易 行 , 在 制备 一 些 对 热 稳定 的 小 分 子 物质 过 程 中 ,除去 一 些 大 分 子 蛋 日 质 和 核酸 特 别 有 用 。 《3) 选择 性 的 酸 碱 变性 。 在 本 章 第 三 节 中 已 述 及 调节 pH 值 除 去 杂 蛋 白 的 方法 。 利 用 酸 、 碱 变性 有 选择 地 除 杂 有 蛋白 在 生化 制备 中 的 例子 很 多 ,如 用 2.5% 浓度 的 三 氧 栈 酸 处 理 胰 蛋 折 酶 , 抑 肽 酶 或 细胞 色素 C 粗 提取 波 , 均 可 除去 大 量 杂 和 蛋白， 而 对 所 提取 的 酶 活性 设 有 影响 。 有 时 还 把 酸 碱 变性 与 热 变性 结合 起 来 使 用 ,效果 更 为 显著 。 但 应 用 前 ,必须 对 制备 物 的 热 稳定 性 及 酸 碱 稳定 性 有 足够 的 了 解 , 切 纪 谨 目 使 用 。 例 如 胰 蛋 白 酶 在 pH 2.0 的 酸性 溶液 中 可 耐 极 高 温度 ， 而 且 热 变性 后 所 产生 的 沉淀 是 可 逆 的 。 冷 却 后 沉淀 溶解 即 可 恢复 原来 活性 。 还 有 些 酶 与 底 物 或 者 竞争 性 抑制 剂 结合 后 ， 对 pH 值 或 热 的 稳定 性 显 著 增 加 , 则 可 以 采用 较 强 烈 的 酸 碱 变性 和 热 方法 除去 杂 有 蛋 日 。 第 七 节 ” 非 离子 多 聚 物 况 演 法 一 、 基 本 原 理 [24227] 非 离子 多 聚 物 是 六 十 年 代 发 展 起 来 的 一 类 重要 沉淀 剂 ， 最 早 应 用 于 提纯 免疫 球 蛋 白 《IgG) 和 沉淀 一 些 细菌 与 病毒 ， 近 年 来 逐渐 广泛 应 用 于 核酸 和 酶 的 分 离 纯化 2xz。 这 类 非 离子 多 聚 物 包括 各 种 不 同 分 子 量 的 聚 乙 二 醇 (Polyethylene Glycol 简写 为 PEG), FE 乙烯 化 氧 (简写 为 NPEO)， 葡 聚 糖 , 右 旋 糖 本 硫酸 钠 等 。 其 中 应 用 最 多 的 是 聚 乙 二 醇 , 其 结构 式 如 下 : CH,—(CH,—CH,— 0), —CH, | OH OH 根据 和 射线 衍射 和 红外 光谱 分 析 , 证 明 聚 乙 二 醇 具 有 螺旋 状 的 结构 。 聚 乙 二 醇 亲 水 性 强 ， 有 很 广 范围 的 分 子 量 ,在 生化 制备 中 用 得 较 多 的 是 PFG6000 一 20000, 分 子 量 超过 20,000 以 上 的 聚 乙 二 醇 , 则 具有 很 高 的 粘性 。 操 作 十 分 不 便 ,平时 很 少 使 用 。 聚 乙 二 醇 及 其 他 非 离子 多 聚 物 应 用 于 生物 大 分 子 微 粒 病毒 和 细菌 的 沉淀 时 ， 其 效果 与 沉淀 剂 本 身 浓 度 有 关外 ,还 受到 离子 强度 、pH 和 温度 等 因素 的 影响 , 例如 ， 用 PEG 沉淀 蛋白 质 , 使 用 PEG 的 浓度 与 溶液 中 盐 的 浓度 常 呈 反比 关系 ,在 固定 pH 值 下 , 盐 浓度 越 高 , 所 需 的 PEG KREUK. YR pH 值 越 接 近 微 粒 的 等 电 点 , 沉淀 微粒 所 需 PEG 的 浓度 越 低 。 其 次 , 使 用 PEG 的 分 子 量 大 小 也 与 沉淀 效果 有 直接 关系 。 在 一 定 范围 内 ,高 分 子 量 的 PEG 沉淀 的 效力 较 高 。 此 外 ,如 使 用 的 PEG 分 子 量 和 浓度 相同 、 沉 淀 效果 与 被 沉淀 微粒 的 分 子 大 小 \ 形 状 有 关 。 以 上 这 些 现象 ,到 目前 为 止 , 仍 未 找到 很 合适 的 理论 解释 。 曾 提出 的 假设 有 如 下 几 种 : 〈1) 认为 沉淀 作用 是 多 聚 物 与 大 分 子 发 生 共 沉 作 用 。 (2) 多 聚 物 使 大 分 子 在 多 聚 物 与 水 之 间 发 生 分 配 , 使 大 分 子 脱水 而 沉淀 。(3) 多 聚 物 与 大 分 子 之 间 以 氢 键 相 互 作 用 形成 复合 物 ; 或 由 于 大 分 子 被 多 聚 物 包 埋 形 成 复合 物 , 在 重力 作用 下 沉淀 析出 。 但 以 上 假设 都 没有 充分 根据 支持 。 最 近 劳 兰 梯 〈Laurent) 等 基于 多 聚 物 的 沉淀 作用 主要 依 赖 于 多 聚 物 的 浓度 和 被 沉淀 物 的 分 子 大 小 的 众多 事实 。 提 出 PEG 的 沉淀 机 理 主要 是 通 © IT3 。 过 空间 位 置 排 斥 , 使 液体 中 的 微粒 (包括 生物 大 分 子 、 病 毒 和 细菌 等 ) 被 迫 挤 聚 在 一 起 而 引 起 沉淀 的 发 生 光 9。 根据 上 述 排斥 理论 , 被 排斥 的 体积 、 其 数值 应 是 多 聚 物 的 浓度 函数 。 如 多 聚 物 的 浓度 固定 以 后 ,微粒 的 沉淀 则 主要 和 微粒 分 子 大 小 、 形 状 \ 带 电 情况 有 关 。 而 溶液 的 温度 、pH 值 和 离子 强度 正 是 通过 影响 微粒 分 子 性 质 而 起 作用 的 。 对 排斥 理论 , 目 前 虽 有 某 些 异 义 ,但 得 到 较 多 的 实验 支持 。 水 溶性 非 离子 多 聚 物 的 沉淀 方法 ， 近 年 来 在 生化 制备 应 用 发 展 迅 速 ， 其 主要 优点 在 于 : 操作 条 件 温 和 ,不 易 引起 生物 大 分 子 的 变性 。 同时 具有 极 高 的 沉淀 效能 。 很 少量 的 非 离子 多 聚 物 则 可 以 沉淀 相当 多 的 生物 大 分 子 。 沉 淀 后 的 多 聚 物 也 容易 除去 。 因 此 广泛 应 用 于 细菌 、 病 毒 、 核 酸 、 蛋 白质 和 酶 等 多 种 微粒 的 沉淀 分 离 。 二 、 应 用 方法 和 范围 用 非 离子 多 聚 物 沉 演 生 物 大 分 子 和 微粒 ， 一 般 有 两 种 方法 : 一 是 选用 二 种 水 溶性 非 离子 多 聚 物 组 成 液 一 液 两 相 系统 ,使 生物 大 分 子 或 微粒 在 两 相 系统 中 , 不 等 量 分 配 ， 而 造 成 分 离 。 这 一 方法 主要 基于 不 同 生 物 分 子 和 微粒 表面 结构 不 同 , 有 不 同 分 配 系数 。 并 外 加 离子 强度 , pH 值 和 温度 等 因素 的 影响 ,从 而 扩大 分 离 的 效果 。 二 是 选用 一 种 水 溶性 非 离子 多 聚 物 , 使 生物 大 分 子 或 微粒 在 同一 小 相 中 ,由 于 被 排斥 相互 凝集 而 沉淀 析出 。 对 后 一 种 方法 ,操作 时 先 离心 除去 粗大 悬 序 蜂 粒 , 调整 溶 芒 pH 值 和 温度 至 适度 ,然后 加 入 中 性 盐 和 多 聚 物 至 一 定 浓度 , 冷 处 贮 一 段 时 间 , 印 形成 沉淀。 = cy ERTS ROAM, FRETS: P ek (—) 细菌 和 病毒 方面 的 应 用 六 十 年 代 初 , 艾 伯 森 (Albertson) 等 人 用 此 法 分 离 多 种 细菌 当 度 ”和 病毒 ,他 们 以 葡 聚 糖 和 聚 乙 二 醇 作 为 二 相 系 统 , 经 过 逆流 分 配 操作 先后 分 离 了 不 同 株 的 大 肠 杆 菌 和 烟草 花 叶 病毒 ， 着 骼 灰白 8 age | RE AERA echo RES 以 后 , BRCM : 淀 分 离 病毒 和 吻 菌 体 研究 的 报导 越 来 越 多 ,2% 辐 ,七 十 年 代 我 国 科学 院 有 关 研 究 所 也 先后 使 用 此 法 分 离 病 毒 成 功 。 关 于 各 种 病毒 和 噬菌体 使 用 PEG 沉 淀 所 选用 的 条 件 见 表 3-6。 沉 淀 后 所 得 的 含有 病毒 沉淀 物 , 可 用 透析 法 或 逆向 PEG 梯度 离心 法 将 病毒 分 离 , 制 备 性 的 逆向 PEG 梯度 组 成 见 图 3-9。 含 病毒 的 PEG 沉淀 经 离心 后 ,病毒 在 适当 的 PEG 浓度 下 , 则 被 分 配 在 一 狭窄 区 带 内 。 (=) 核酸 方面 的 应 用 用 葡 聚 糖 和 聚 乙 二 醇 作 为 二 相 系统 分 离 单 链 DNA、 双 链 DNA 和 多 种 RNA 制剂 ， 在 六 十 年 代 也 有 过 报导 。 近 十 多 年 来 发 展 很 快 ,特别 是 用 聚 乙 二 醇 沉 证 分 离 质粒 _DNA， 已 相当 普遍 ”。 一 般 在 0.01M 磷酸 缓冲 液 中 加 聚 乙 二 醇 达 10% 浓度 , 即 可 将 DNA Wt 证 下 来 。 在 遗传 工程 中 所 用 的 质粒 DNA 的 分 子 量 一 般 在 104 范 围 ， 故 选用 的 PEG 分 子 量 也 常 在 6000 (BN PEG 6000) 因 它 易 与 分 子 量 在 10“ 范围 的 DNA 结合 而 沉淀 。 . 7 . a 3-7 用 PEG ARLARESHAEHRE” wae & 称 一 动物 病毒 Echo 29 受 泼 斯 坦 氏 -巴尔 氏 病 毒 口蹄疫 病 病 毒 流感 病毒 麻疹 病毒 多 瘤 病毒 劳 斯 氏 肉 瘤 风疹 病毒 猿 猴 病毒 40 = 植物 病毒 Bettas 苹果 绿叶 斑 病 毒 RGR RAS TRC PER ie BAR TEM AS 下 豆花 叶 病 毒 珊 豆 褪 绿 斑驳 病毒 胡椒 斑 驱 病毒 马 铃 昔 立 病毒 RARE RACMHAS 获 草 花 叶 病毒 RAGA ESRI A S 白花 叶 病 毒 三 ”分校 杆 菌 鸣 菌 体 丁 酸 分 枝 杆菌 BARA BRERA AEA (V72) P2.H, Tie BA AR Riy MRE T, MAK T, WR px 174 mie HE A We cs © © ©. 8.5.0 2] Gree <<. . . . . . . . . . wmnibv wn WwW 浓 氧化 钠 (M) 一 一- | 一 | 一 一 Sa DA RS se Grrr oe ee PEG (%) of Oo 澳 Ora oS & 一 SO MN oS. Sica (依照 Vaida 所 制 表 格 删 去 部 份 无 关 的 内 容 ) (=) 蛋白 质 和 酶 方面 的 应 用 PEG 分 子 量 15, 000 6,000 20, 000 6,000 6,000 6,000 6,000 6,000 20,000 6,000 6, 000 6,000 6,000 6, 000 6,000 6, 000 6, 000 6,000 6, 000 6, 000 6, 000 6,000 6,000 6,000 6, 000 6, 000 6,000 6,000 6,000 6,000 6,000 6,000 mee AW R pH 7.457.6 0.02M Tris 组 冲 液 (pH 7.6) 盐水 (pH7.47) 盐水 (pH 7.4) MADRE 0.2M 磷酸 组 冲 液 中 (PH 6.5) 0.5mM 氧化 镁 0.5M 磷酸 组 冲 液 (pbH7.5)。0.5950 NaSO,> IM 尿素 ，890 n-TH pH 5.0 叶 匀 浆 22°C pH 5.0 0.5M 磷酸 缓冲 液 (pH 7.5), 0.5%NaSO;> 1M RR 8%n-THR 同上 pH 7.0 66mM 磷酸 缓冲 液 (pH 7.0) 5mM 斑 基 乙 醉 栈 酸 缓冲 液 (pH 6.0) 0.1M 磷酸 缓冲 (PH 7.5) Polson $A) 早 在 1964 年 已 开始 使 用 聚 乙 二 醇 分 离 纯化 免疫 球 蛋白 ， 以 后 关于 这 « 75 14 方面 报导 逐渐 增多 。 使 用 聚 乙 二 醇 的 分 子 量 多 为 2000 一 6000，, 多数 认为 使 PEG 6,000 沉 淀 蛋白 质 较 好 ,但 是 近 有 报导 认为 低 分 子 量 的 PEG 也 获得 较 好 的 结果 。 用 育 乙 二 醇 进行 酶 的 沉淀 分 离 ,; 有 人 认为 容易 引起 变性 , 早期 应 用 较 少 , 仅 有 少数 例 于 如 黄 素 蛋白 乙醇 氧 化 酶 ,葡萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 等 的 分 离 纯 化 29。 最 近 又 有 新 的 发 展 ， 如 国内 从 大 肠 杆 菌 中 制备 -天 门 冬 酰胺 酶 和 从 小 牛 肾上腺 中 制备 葡萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 ， 使 用 了 聚 乙 二 醇 沉 证 法 ,获得 了 很 好 的 效果 ”。 三 、 应 用 实例 关于 聚 乙 二 醇 沉 淀 分 离 方法 举例 如 下 : 实例 一 ”水 稻 普 遍 矮 缩 病毒 的 分 离 ” 低温 冰冻 病 时 300 Fe 加 900 毫升 ?pH 7.050. aaa ie 2) AiG 7000 转 /分 | Lis 沉淀 加 20~25% Cf BALL AYA i» TK a ed Aa > 分 钟 ， 奔 去 底部 白色 糊 状 物 ，7000 转 / 分 离心 20 分 钟 。 沉淀 上 清 乙 二 醇 ei BA 12,000 e& 6,000) 4) 6%, NaCl A356 KAS F500 6/35 Bei 20 Ayah 上 清 沉淀 加 60 毫升 0.1M，pH 7.0 磷酸 缓冲 彼 抽 提 2000 转 / 分 ,离心 20 分 钟 x | a Z. 上 清 沉淀 Ree = (三 次 合并 ) | ee 有 6000 40,000 #6/4> 离心 60 4+ oh = 区 复 | | 一 上 清 沉淀 次 加 少量 pH7.0,0.1M 磷酸 缓冲 液 抽 提 10'000 转 / 分 (离心 15 分 钟 ) | | \ 重复 二 次 上 清 i Li 沉淀 Y 病毒 制剂 (4 1 It) 实例 二 NAM RASTA ie 329% Hi BEE 300 38) 加 900 毫升 0.3M 甘氨酸 (G. B) A 0.01M MgCl, pH 8.0 缓冲 液 (内 : 加 NaN, 4) 0.01%) FASE BL BK ie i 2A RA RL Be 9 YD Ap IL US 0 Hike | 3000~5000 转 / 分 离心 10 一 15 分 钟 沉淀 正清 Jn 20% CARRE) REET Rat 2 分钟, KAIBA &. 糊 状 物 ，4000 pee 0 分 钟 。 沉淀 if > | 加 聚 乙 二 醇 〈 分 子 量 为 12,000) 到 6%, NaCl 到 3%, Ht 拌 均匀 置 冰箱 过 夜 ，7000 转 /分 ,离心 20 分 钟 。 is 沉淀 加 0.1M 甘 所 本 MgCl, mK CpH 7.0): 约 3 倍 体积 抽 提 ，7000 转 /分 离心 20 分 钟 。 | BB 沉淀 ， (三 次 合并 ) | 重复 二 次 40,000 转 / 分 Sag ae 离心 60 分 钟 上 清 沉淀 加 少量 pH7.0 0.1M G. B ha$2 7000 转 / 分 离心 15 分 钟 EW Tie pee (三 次 合 并 ) 他 全 二 | 上 清 抗原 制剂 ( 约 | 毫升 ) 实例 三 ”肾上腺 葡萄 铺 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 的 分 步 沉淀 ea 小 牛 肾 上 腺 体 在 含有 B-5tHECB, EDTA, HWM REBAR (pH 8.0) 中 ， QR, ER, Bho KARMASRAA 15% 乙醇 的 栈 酸 缓冲 液 中 (pH 4.5) 进行 沉淀 ,沉淀 所 得 的 酶 ?再 溶 于 上 述 提取 用 的 磷酸 缓冲 液 中 ,为 已 提纯 10 倍 比 活力 = 3.0 的 悬浮 小, 作为 聚 乙 二 醉 沉 淀 的 起 点 。 MARCA CPEG-6000) 使 浓度 达 9%» 停留 5 分 钟 ，35,000Xg 离心 30 分 钟 。 沉淀 Lif ( 比 活力 0.03) ies PEG-6000， 使 浓度 达 2390, & -一 上 | 留 5 分 钟 , 35,000Xg 离心 30 分 钟 。 ‘ 沉淀 上 清 《 比 活力 0.80) 加 入 PEG-6000， 使 浓度 达 33%, 停留 : ae samme es 5 分 钟 ，353000Xg， 离 心 30 分 钟 。 se 77 mw | 沉淀 《 比 活力 2.00) 加 入 PEG-6000, 使 浓度 达 41%, ————————— | 4 54} #h, 35,000Xg 离心 30 分 钟 。 沉淀 上 清 《 比 活力 5.60) 加 入 PEG-6000 使 浓度 达 50%, & > | 2 at 35,000Xe guts 30 ahem 沉淀 上 清 〈 比 活力 6.30) 加 入 PEG-6000， 使 浓度 达 70%, & 一 -一 | 留 5 分 钟 ， 35,000Xg 离心 30 分 钟 。 沉淀 Lia ( 比 活力 1.40) Cis 0.01) 以 上 操作 均 在 4°C 下 搅拌 进行 ,从 图 解 可 见 酶 活力 主要 在 41~50% 浓度 的 PEG 沉淀 部 份 。 沉 淀 后 的 PEG 可 以 通过 DEAE- 纤 维 素 以 除去 。 第 八 节 其 他 沉淀 剂 除 上 述 各 节 应 用 较 普遍 的 沉淀 剂 和 沉淀 方法 外 ， 还 有 一 些 沉 淀 剂 和 沉淀 方法 只 用 于 沫 些 物 质 的 沉 剂 作用 。 一 、 氨 BRR 例如 使 用 葵 偶 氮 茶 磺 酸 选 择 性 地 沉 证 丙 氨 酸 和 丝氨酸 ，2, 4- 二 硝 基 荣 酚 -7- 磺 酸 选 择 性 地 沉淀 精 氨 酸 ,二 氮 合 硫 氰 化 铬 铵 选择 性 地 帝 淀 膊 氨 酸 和 羟 且 氨 酸 等 。 二 、 大 分 子 核 酸 类 多 价 阳 离子 鱼 精 蛋白 和 硫酸 链 霉 素 对 带 有 大 量 负 电荷 的 核酸 分 子 ， 也 是 两 种 十 分 有 效 的 沉淀 剂 。 但 由 于 沉淀 后 分 离 比较 困难 ,成 本 也 高 ， 较 少 使 用 于 核酸 的 制备 , 主要 用 于 制备 酶 时 选择 性 地 沉淀 除去 核酸 。 =. i ot — Hee Ss AE, 除了 较 多 地 使 用 乙醇 外 , 十 六 烷 基 三 甲 基 季 胺 盐 的 省 化物 (人 简 FA CTAB) Khe he a aean ee BBA BUTE HI”. CTAB 具有 下 列 结构 : CH;—(CH2)4—CH2,—N* (CH;);—Br7 和 李 胺 基 上 的 阳离子 与 粘 多 糖分 子 上 的 阴离子 可 以 形成 季 胺 络 合 物 。 此 络 合 物 在 低 离 子 强度 的 水 溶液 中 不 溶解 ,但 当 溶 液 离子 强度 增加 至 一 定 范围 , 络 合 物 则 逐渐 解 离 , 最 后 溶解 。 除 了 离子 强度 的 影响 外 ，CTAB 对 各 种 粘 多 糖 的 分 级 沉淀 效果 与 各 种 粘 多 糖 硫酸 化 程度 和 溶液 PH 值 有 关 。 由 于 CTAB 的 沉淀 效力 极 强 ， 能 从 很 稀 的 溶液 中 (如 万 分 之 一 浓度 ) 通 过 选择 性 沉 证 回收 粘 多 糖 。 78 。 A, oe ee: 王 世 中 : 生物 化 学 与 生物 物理 进展 ;第 4 期 y 55 页 (1975) Taylor, J. F., The protein, Eds. Neurath, H. and Bailey, K., 1st Ed, Vol. 1, Part A, P. 41, Aca- demic Press, N. Y (1953) Czok, R. and Bucher, T., Advance Protein Chem., 15, 315(1960) Dixon, M. and Webb, E. C., Advance. Protein Chem., 16, 197(1961). Green, A. A. J. Biol. Chem., 95, 47(1932) Green, A. A. J. Biol Chem, 93, 495 (1931) Taylor, J. F., The protein, Eds. Neurath, H. and Bailey, K., Ist Ed., Vol. 1, Part A, p. 54, Academic Press, N. Y (1953) 江苏 新 医学 院 : 生物 化 学 与 生物 物理 进展 ,第 2 期 ，38 页 (1976) Green, A. A. and Hughes, W. 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Biophys. 128, 567(1968). 79 e@ 第 四 章 “生物 小 分 子 常用 色谱 分 离 法 EHH RAKE 我 们 所 需 的 生物 体 组 成 成 份 ,经 过 溶剂 提取 初步 分 离 , 常 选用 沉淀 方法 进行 粗 分 及 浓 缩 ,接着 上 柱 色谱 分 离 , 或 者 不 经 沉淀 分 离 直 接 上 柱 进行 色谱 纯化 s 在 现代 生化 制备 技术 中 ,色谱 分 离 占有 核心 地 位 。 色 谱 方法 按 分 离 机 制 的 不 同 可 分 为 吸附 色谱 、 分 配色 谱 、 离 子 交换 色谱 、 凝 胶 过 小 (或 分 子 饰 ) 色 谱 和 亲 和 色 谱 等 。 用 于 制备 量 色谱 要 求 一 况 进 样 量 大 并 容易 回收 ,故常 用 柱 型 色谱 , 板 状 薄 层 色谱 也 常用 于 小 量 样品 的 制备 , 且 有 快速 ,操作 简便 的 优点 。 | MBM SEAS WAR, HS SA oe, BE POR OHI S AS LI UES i BLA CA 7a BA ES EE A. Cs PAR SK 各 种 组 成 生物 体 的 大 分 子 如 蛋白 质 、 多 肽 \ 酶 ,核酸 多糖 等 。 这 些 牺 质 使 用 色谱 分 离 制备 时 , 常 根据 它们 之 间 分 子 结构 和 化 学 特性 ,分 子 量 大 小 以 及 在 色谱 分 离 过 程 中 生理 活性 的 稳定 情况 ,选择 不 同色 谱 方法 。 蛋 白质 ,本 \ 核 酸 等 生物 大 分 子 由 于 它们 分 子 量 大 ,容易 在 操作 中 失去 生理 活性 ， 同 时 这 些 大 分 子 常常 具有 与 其 结构 相对 应 的 专 一 分 子 可 逆 地 结 从 的 特性 (或 称 生物 亲 和 性 ), 较 多 地 选用 多 糖 基 离子 交换 色谱 、 分 子 肇 色谱 和 亲 和 色 谱 法 ， 这 几 种 色谱 方法 ,将 在 本 书 第 五 章 介绍 。 而 一 些 代谢 产物 即 各 种 类 型 的 生 牺 小 分 子 ; 下 于 它们 分 子 量 小 ,结构 和 性 质 比 较 稳定 ,操作 条 件 要 求 不 太 苛 刻 ;采用 吸附 ,分配 柱 色谱 和 离 子 交 换 柱 色谱 进行 分 离 较为 适宜 。 其 中 人 氨基酸 \ 核 音 酸 有 机 酸 等 一 些 离子 化 合 物 的 制备 多 用 离子 交换 色谱 法 ,而 生物 碱 \ 蔬 类 、 童 类、 色素 等 次 生 代谢 小 分 子 则 多 采用 吸附 色谱 法 或 反 相 分 配色 谱 法 分 离 。 现 根据 一 些 发 表 的 资料 ， 统 计 近 年 来 植物 化 学 成 份 应 用 色谱 分 离 技 术 的 情况 如 下 口 : DAF 应 用 色谱 技术 占 总 的 分 离 方 法 百分数 硅胶 柱 色谱 49.4% 制备 量 薄 层 色谱 16.4% 氧化 铝 柱 色谱 10.1% 溶剂 法 7.3% 聚 酰胺 柱 色 谱 4.5% 离子 交换 柱 色谱 3.8% 纤维 素 柱 色 谱 1.9% 制备 量 气 相 色谱 1.3% 其 他 方法 5.3% 由 上 列 百 分 比 可 以 看 出 ,经 典 色谱 方法 在 天 然 药 物 的 分 离 制备 中 仍 占 很 大 比例 , 尤 以 硅胶 柱 色谱 方法 使 用 情况 最 多 ,其 次 是 各 种 制备 薄 层 色谱 。 色谱 技术 近年 发 展 很 快 , 各 种 固定 相 填 料 或 称 支持 剂 ) 型 号 日 益 增多 ,分离 性 能 越 来 越 好 ,各 种 色谱 附加 的 检验 系统 如 紫外 和 可 见 光 吸 收 分 光 计 ,折光 计 ， RIC SR ”80。 趋 完善 , 特 别 是 高 效 滚 相 色谱 系统 装置 的 出 现 (包括 分 配 与 吸附 ,离子 交换 , 凝 胶 过 滤 等 锅 效 芒 相 色 谱 ), 不 论 在 柱 分 离 效率 上 ,仪器 自动 化 程度 上 ,或 者 在 应 用 广泛 性 上 都 远 远 超过 了 其 他 经 典 色谱 方法 。 已 成 为 当前 生化 分 离 制备 最 有 效 的 手段 之 一 。 本章 将 结合 生物 小 分 子 的 分 离 制备 介绍 吸附 色谱 法 `\ 离 子 交 换 色 谱 法 和 高 压 液 相 色 谱 法 。 但 应 该 指出 的 是 : “根据 分 子 大 小 和 某 些 化 学 性 质 分 别 选 择 使 用 不 同色 谱 法 ， 并 不 意味 着 某 一 色谱 方法 只 适用 于 某 一 类 物质 ， 只 能 说 某 类 物质 较 多 地 使 用 某 一 色谱 法 。 例 如 ， 高 效 相 色谱 最 初 只 应 用 于 小 分 子 物质 ， 最 近 出 现 使 用 了 凝 胶 固 相 及 改进 了 仪器 结 构 ,应 用 于 生物 大 分 子 的 分 离 已 越 来 越 多 s -又 如 吸附 色谱 法 , 较 多 用 于 小 分 子 的 分 离 , 但 其 中 磷酸 钙 凝 胶 吸 附 柱 色 谱 却 十 分 适用 于 蛋白 质 的 分 离 ， 迄 今 还 是 工业 上 和 实验 室 大 量 制备 酶 的 常用 方法 之 一 * 亲 和 色谱 方法 绝 大 多 数 情况 用 于 生物 大 分 子 的 分 离 制备 ,但 反 过 来 以 大 分 子 酶 作 配 基 , 相 对 应 地 吸附 一 些小 分 子 辅 基 或 酶 的 底 物 ， 也 是 可 以 的 ， 只 是 使 用 机 会 较 少 而 已 。 第 一 他 吸附 色谱 法 吸附 色谱 法 是 指 混 合 物 随 流动 相通 过 吸附 剂 时 ， 由 于 吸附 剂 对 不 同 物质 有 不 同 的 吸 附 力 而 使 混合 物 分 离 的 方法 。 吸附 色谱 法 是 最 早期 的 一 种 色谱 分 离 技术 1903 3 AL Heer 用 菊 根 粉 柱 研究 植物 色素 的 提取 物 ; 以 石油 醚 冲洗 ,得 到 分 离 的 黄色 、 绿 色 区 带 , 故 称 为 色谱 分 离 法 。 1931 年 又 有 人 用 氧化 铝 柱 分 离 了 胡萝卜 素 的 两 种 同 分 异 构 体 ， 显 示 了 本 法 具有 较 高 的 分 :、 ， 辩 率 ;同时 ;吸附 色谱 法 操作 较 简 单 ,不 需 特 殊 的 实验 装置 , 分 离 物质 的 量 小 至 毫克 , 大 至 上 上 自 克 , 主 要 应 用 于 某 些 分 子 量 不 大 的 物质 的 分 离 提 纯 。 个 别 的 《如 羟基 础 灰 石 ) 也 适用 于 生物 大 分 子 的 分 离 提 纯 , 应 用 范围 比较 广 。 本 法 虽然 比较 古老 ,但 目前 仍 有 其 实用 的 意 义 。 特 别 是 一 些 新 的 改良 的 吸附 剂 的 出 现 ,结合 快速 的 分 离 和 监测 器 ,如 高 效 液 相 吸附 色 谱 法 的 发 展 , 赋 予 吸 附 色谱 技 术 更 新 的 生命 力 。 一 、 吸 附 过 程 的 本 质 吸附 是 表面 的 一 个 重要 性 质 之 一 。 任 何 两 个 相 都 可 以 形成 表面 ， 其 中 一 个 相 的 物质 或 溶解 在 其 中 的 溶质 在 此 表面 上 的 密集 现象 称 为 吸附 。 在 固体 与 气体 之 间 ， 固 体 与 液体 之 间 , 吸 附 菩 体 与 气体 之 间 的 表面 上 ,都 可 以 发 生 吸附 现象 。 凡 能 够 将 其 他 物质 聚集 到 自己 表面 上 的 物质 ,都 称 为 吸附 剂 ,聚集 于 吸附 剂 表面 的 物 质 就 称 为 吸附 物 。 既 然 吸附 是 发 生 在 表面 上 的 表面 现象 ， 因 此 要 了 解 固体 吸附 剂 的 吸附 作用 的 本 质 ,就 要 了 解 固体 的 表面 特性 。 为 什么 分 子 能 在 固体 表面 停留 一 定时 间 呢 ? 这 是 因为 固体 表面 上 的 分 子 〈 离 子 或 原 子 ) 和 固体 内 部 分 子 所 受 的 吸引 力 不 相 等 。 在 内 部 的 分 子 , 分 子 之 间 相 互 作用 的 力 是 对 称 的 ,其 力 场 互 相抵 消 ,而 处 于 固体 表面 的 分 子 所 受 的 力 是 不 对 称 的 ， 向 内 的 一 面 受 到 固体 内 部 分 子 的 作用 力 大 ,而 表面 层 所 受 的 作用 力 小 ,因而 气体 或 溶质 分 子 在 运动 中 磁 到 固体 表面 时 受到 这 种 剩余 力 的 影响 ,就 会 被 吸引 而 停留 下 来 。 es 81 在 不 同 条 件 下 ,吸附 剂 与 被 吸附 物 之 间 的 作用 , 既 有 物理 作用 的 性 质 又 有 化 学 作用 的 特征 。 物 理 作用 又 称 范 德 华 吸附 ,是 分 子 间 相互 作用 的 范 德 华 力 所 引 起 的 ,其 特点 是 无 选 择 性 ,吸附 速度 快 ;吸附 的 过 程 是 可 逆 的 ,伴随 放出 的 能 量 较 小 ,吸附 不 牢 ， 吸 附 的 分 子 是 单 层 或 多 层 的 。 化 学 吸附 主要 是 由 原子 价 力 〈 化 学 键 ) 的 作用 引起 的 ,如 电子 的 转移 或 分 子 与 表面 共用 电子 对 等 。 其 特点 是 有 选择 性 ， 吸 附 速 度 较 慢 ， 不 易 解 吸 ， 放 能 大 ， 一 般 吸附 的 分 子 是 单 层 的 。 物 理 吸 附和 化 学 吸附 可 以 同时 发 生 ， 在 一 定 条 件 下 也 可 以 互相 转 化 。 由 于 吸附 过 程 是 可 逆 的 ， 因 此 被 吸附 物 在 一 定 条 件 下 可 以 解吸 出 来 。 在 单位 时 间 内 被 吸附 于 吸附 剂 的 某 一 表面 积 上 的 分 子 和 同一 单位 时 间 内 离开 此 表面 的 分 子 之 间 可 以 建 立 动态 平衡 , 称 为 吸附 平衡 。 吸 附 色 谱 法 过 程 就 是 不 断 地 产生 平衡 与 不 平衡 ,吸附 与 解吸 的 矛盾 统一 的 过 程 。 二 、 和 荫 用 吸附 剂 的 特性 和 应 用 (—) 硅胶 是 应 用 最 广泛 的 一 种 极 性 吸附 剂 , 它 的 主要 优点 是 化 学 惰性 , 具 较 大 的 吸附 量 ， 易 制 备 不 同类 型 、, 孔 径 、 表 面积 的 多 孔 性 硅胶 ,一 般 以 SiO, - xH2O BARA 硅胶 制备 是 将 硅 酸 钠 溶液 酸化 ,产生 硅 溶 胶 , 同 时 发 生 辊 凝 作用 ,放置 一 定时 间 ( 陈 化 ) 后 ;收集 沉淀 ， 充 分 洗 去 可 溶性 杂质 ， 王 燥 磨 碎 。 用 前 要 在 150~200%c At. RR 作用 的 速率 取决 于 pH。 在 pH 3 一 4 时 ， 加 凝 作用 缓慢 ， 产 生 了 大 的 表面 积 硅 胶 (800 米 "/ 克 7); 而 在 PH 6 时， 加 凝 作用 很 快 ， 产 生 的 硅胶 结实 致密 ， 其 比 表面 积 二 400 米 / 克 。 硅胶 的 吸附 活性 取决 其 含水 量 ， 吸 附 色 谱 法 一 般 采 用 含水 量 10~12 多 的 硅胶 ; 当 含 50 水 量 小 于 1% 时 活性 最 高 ， 而 大 于 20 色 时 ， 和 吸附 活性 最 低 。 用 加 热 脱 水 法 可 使 硅胶 活 化 。 图 4-1 表示 加 热 活 化 温度 与 吸附 活性 之 oe, 30 闻 的 关系 。 当 加 热 到 150s*c 时 ， 吸 附 剂 失去 物理 结 合 的 水 ,活性 上 升 , 在 150~250°C 时 ,吸附 活 性 几乎 恒定 , 24 MAF 250~400C 时 ， 失 去 硅烷 醇 基 上 的 水 ,这 是 化 学 结合 水 ,从 而 使 图 4-1 豚 附 活性 (R°) 随 活化 温度 的 变化 ETHER DPA 00%S Chel Nae BER EHO PER: 相 邻 的 硅烷 醇 基 的 脱水 ,形成 了 硅 氧 烷 桥 , 另 O ZEN. i(k 15 分 钟 ， 外 部 份 硅 胶 颗 粒 的 熔 结 ， 而 使 吸附 活性 迅速 人 下 降 , 而 且 部 份 不 可 着, 至 1000°C 时 ,成 为 无 水 SiO;， 失 去 活性 ,因此 奸 胶 的 热 活化 通常 在 小 于 250°C 下 进行 。 降低 活性 的 硅胶 5 纯化) 能 显著 改善 分 离 性 能 ,增加 样品 的 负载 量 。Scott 等 所 认为 夸 了 胶 是 由 三 层 小 分 子 履 盖 在 表面 上 ,如 下 图 式 所 示 : * 82e 100 200 300 400 < 一 第 三 层 弱 吸 附 的 小 分 子 ，70%c 加 热 或 用 干燥 的 溶剂 就 能 除去 。 = \ <—FA_—RBRAKAF: 120°C 加 热 或 用 干燥 的 咨 剂 就 能 除去 。 < 一 第 一 层 强 吸附 小 分 子 ; 需 200~650C 加 热 才 能 除去 ,为 气 键 结合 的 小 分 子 。 \ —oO—Y—0—M----0—----9—M----0—= a O< 一 在 450°~1100°C 加 热 可 使 硅烷 醇 基 脱水 成 醚 基 * 为 不 可 逆反 应 。 fe) 活性 硅胶 是 指 在 150~ 195°C 加 热 活化 后 覆盖 有 第 一 层 小 分 子 的 硅胶 ,对 样品 溶质 分 子 有 较 强 的 吸附 作用 ,其 缺点 是 活性 部 位 非 均匀 性 ,样品 的 线性 容量 明显 地 小 ， 甚 至 产生 催化 反应 或 不 可 逆 吸 附 。 采用 加 水 纯化 的 办 法 可 解决 ,一般 100 AR? / 克 比 表面 积 的 吸附 剂 ,加 水 1—2 484 Bits 30~ 60% 的 吸附 剂 表面 , 能 提高 5 ~100 倍 样品 负载 量 。 实验 表明 ,加 入 4 ~20% 水 的 硅胶 ,能 提高 柱 效 。 这 是 因为 加 水 后 , 表面 活性 部 位 纯 化 ;加快 了 样品 溶质 在 吸附 剂 上 的 吸附 和 解吸 过 程 , 另 外 ,由 于 硅胶 上 的 细 和 孔 被 水 堵 住 ”， 也 改善 了 传 质 作用 。 硅胶 的 吸附 活性 测定 可 用 偶 氮 染料 法 ,含水 量 与 吸附 活性 的 关系 见 表 4-12 。 硅胶 的 再 生 : 用 过 的 硅胶 用 5 一 10 倍 量 的 1 多 NaOH 水 溶液 迎 流 30 Dh, ADE, 然后 用 蒸馏 水 洗 三 次 ， 再 用 3 一 6 倍 量 的 5 DARI 30 分 钟 ， 过 滤 ， 用 蒸馏 水 洗 至 中 性 ,再 用 甲醇 洗 , 水 洗 二 次 ,然后 在 120°C 烘 干 活化 12 小 时 , 即 可 重新 使 用 。 (=) Mitta 以 氧化 铝 作为 吸附 剂 的 色谱 法 适用 于 亲 脂 性 成 分 的 分 离 制备 。 氧 化 铝 具 较 高 的 吸附 容量 ,价格 低廉 ,分 离 效 果 好 ,因此 应 用 也 较为 广泛 。 氧化 铝 的 吸附 原理 一 般 认 为 是 物质 与 氧化 铝 表面 上 的 产 基 形成 氢 键 (如 下 式 ), FR on ae = Pp Ag \ 7 | he oe : Gu \_ 2 eo ee Al Al o- to ae pts noe 子 提 供 亲 电子 中 心 , 从 而 吸引 电子 供 体 基 团 (如 —OH, —NH)o 影响 氧化 铝 吸 附 色 谱 法 的 因素 很 多 ， 操 作 时 要 注意 选择 具 适 当 活 性 及 适当 的 酸碱度 的 氧化 铝 。 用 于 吸附 色谱 法 的 氧化 铝 通常 可 按 制 备 方法 的 不 同 而 分 为 以 下 三 种 : 1. 碱 性 氧化 铝 直接 由 氧 氧化 铝 高 温 脱 水 而 得 , 柱 色 谱 法 一 般 用 100~150 目 。 一 ATK BOHRA pH 为 9 ~10， 经 活化 后 即 可 使 用 。 碱 性 氧化 铝 主要 应 用 于 碳 氢 化 合 物 的 分 离 , 从 碳 氨 化合物 中 除去 含 氧化 合 物 以 及 某 些 中 性 、 碱 性 物质 的 分 离 。 es 83 e 2. 中 性 氧化 铝 用 碱 性 氧化 铝 加 入 蒸馏 水 ,在 不 断 搅 拌 下 孝 阐 10 oh, HAL 波 。 反 复 处 理 至 水 洗 流 的 pH 为 7.5 左右 , 滤 干 活化 后 即 可 使 用 。 中 性 氧化 铝 使 用 范围 最 三 ,适用 于 醛 、 酮 \ 柄 \ 某 些 背 类 及 在 酸 碱 溶液 中 不 稳定 的 酯 \ 内 酯 等 化 合 物 的 分 离 。 3. 酸性 氧化 铝 ”氧化 铝 用 水 调 成 糊 状 ,加 和 人 2 盐酸 ,使 混合 物 对 刚果 红 呈 酸性 反 Wo WMA LIRR, AKA IRM WRAL SAA , 滤 干 活化 备用 。 酸 性 氧化 铝 适 用 于 天 然 和 合成 的 酸性 色素 以 及 醛 . 酸 的 分 离 。 水 洗 彼 PH 为 4 一 4.5o 氧化 铝 的 吸附 活性 与 含水 量 关 系 很 大 ,在 一 定 的 温度 下 除去 水 分 可 使 氧化 铝 活 化 ,加 人 一 定量 的 水 又 可 使 氧化 铝 活性 改变 。 活性 与 含水 量 的 关系 见 表 4-1o 表 4-1 氧化 旬 、 硅 胶 、 硅 酸 镁 的 活性 与 含水 量 关系 a tt CKD) I 级 0 U 级 3 II 级 6 IV 级 10 v % 15 氧化 铝 活性 的 测定 可 采用 薄 层 色谱 法 , 按 表 4-2， 所 列 的 Re 值 确 定 活 性 级 别 。 表 4-2 测定 氧化 铝 活 性 的 Ri 值 . 按 Brockmann 和 Schodder 划分 活性 3 (BAA II II IV Vv AA 0.59 0.74 0.85 0.95 W- AS BAR 0.16 0.49 0.65 0.89 苏丹 黄 0.01 0.25 0.57 0.78 苏丹 红 A) 0.00 0.10 0.33 0.56 对 -氨基 偶 氮 苯 0.00 0.03 0.08 0.19 (=) SHR BEKRNKERADAD DR HORT DRO) =F OW AA Bminktink. HEBERKS MU AIBA RR ACE 700 ~ 800°C eat Re EF 活化 ,经 适当 处 理 除 杂质 而 成 。 根据 其 粗细 程度 活性 炭 可 分 为 以 下 三 种 : 〈1) BARB: MARA, SHAK 表面 积 大 ,吸附 量 及 吸附 力 大 ,但 因 颗 粒 太 细 , 流 速 慢 , 故 一 般 柱 色 谱 法 极 少 用 。(2) 颗粒 活性 炭 : 颗粒 较 大 ,其 比 面积 及 吸附 力 都 较 粉 未 活性 炭 小 ,但 易 控 制 流速 ,便于 装 柱 使 用 ， 故 在 柱 色谱 法 中 应 用 较 广 。(3 ) 锦纶 一 活性 炭 : 以 锦纶 为 粘 合剂 将 粉末 活性 炭 制 成 笑 粒 ， 比 表面 积 介 于 粉末 活性 几 和 颗粒 活性 炭 之 间 ， 吸 附 能 力 较 两 者 弱 。 一 般 用 于 前 两 种 因 吸 . 附 力 太 强 而 不 易 洗 脱 的 物质 。 活性 败 的 吸附 作用 ,在 水 溶液 中 吸附 力 最 强 , 在 有 机 溶剂 中 吸附 力 较 弱 。 在 一 定 条 件 下 ,对 不 同 的 物质 的 吸附 力 不 同 ,一 般 说 对 极 性 基 团 (如 COOH、 一 NH 、 一 OH 等 ) 多 的 化 合 物 的 吸附 力 大 于 极 性 基 团 少 的 化 合 物 。 在 酸性 溶液 中 活性 炭 的 吸附 力 大 ， 在 pH 6.8 es。 84 。 以 上 ,吸附 能 力 较 差 。 活 性 炭 在 水 溶液 中 对 同系 列 有 机 化 合 物 的 吸附 量 , 随 吸附 物 的 分 子 量 增 大 而 增 大 。 活 性 炭 对 化 合 物 的 吸附 力 一 般 认为 主要 为 范 德 华 力 。 活性 炭 用 前 需 活化 ,一般 在 150°C 加 热 4 一 5 小 时 ,将 吸附 的 大 部 分 气体 除去 ,对 于 锦 纶 活性 炭 , 因 易 受 热 变形 , 活化 时 常 不 超过 100°. 〈 四 ) 聚 酰胺 聚 酰胺 是 一 类 化 学 纤维 原料 ,国外 名 称 “ 尼 龙 ” ,我 国名 称 锦纶 ”。 由 已 三 酸 与 己 二 胺 聚合 而 成 的 叫 锦纶 66。 jb See CR 6 。 因 为 这 两 类 分 子 都 含有 大 量 的 醚 胺 基 团 , 故 统称 聚 酰胺 。 聚 酰胺 柱 色 谱 特别 适 用 于 低 分 子 量化 合 物 的 分 离 。 如 对 酚 ` 羧 酸 、DNP- 氨 基 酸 、 酝 及 芬 香 族 硝 基 化 合 物 的 分 离 是 一 个 良好 的 吸附 剂 。 它 们 的 吸附 等 温 线 在 较 广 浓度 范围 内 是 成 线性 的 。 聚 酰胺 具有 特异 的 色谱 分 辨 能 力 , 它 对 极 性 化 合 物 的 吸附 作用 ,是 由 于 到 酰胺 与 被 分 离 物 之 间 形 成 氨 键 ， 如 酚 类 和 酸 类 是 与 其 羟基 与 酰胺 键 的 痰 基 的 氧 形成 气 键 。 被 分 离 物 质 形 成 氢 键 能 力 的 强 弱 ,决定 了 吸附 力 的 大 小 。 在 色谱 过 程 中 , 洗 脱 剂 与 被 分 离 物 质 在 聚 酰胺 粒子 表面 上 竞争 形成 氢 键 ,可 选择 适当 的 洗 脱 剂 ,使 被 分 离 物 质 在 洗 脱 剂 与 聚 酰胺 表 面 之 间 的 分 配 系数 有 最 大 差异 。 经 过 吸附 与 解吸 的 色谱 过 程 ， 就 可 使 化 合 物 与 杂质 分 离 开 来 。 聚 酰胺 与 化 合 物 形成 氢 键 的 能 力也 与 所 用 的 溶剂 有 关 ， 一 般 在 水 中 形成 氢 键 能 力 最 强 , 而 在 有 机 溶剂 中 形成 氢 键 能 力 较 弱 。 在 碱 性 咨 剂 中 形成 氢 键 能 力 最 弱 。 聚 酰胺 的 吸附 活性 可 用 其 对 8- 秦 酚 栖 的 吸附 力 大 小 表示 。 《五 ) RECA RH Amberlite XAD 是 一 个 合成 的 非 极 人 性 吸附 剂 ; 它 直 葵 乙烯 和 二 乙烯 茉 共聚 合 而 成 。 它 的 比 表面 积 达 300 米 ?/ 克 ,和 孔径 约 90 有 ,虽然 它 是 多 孔 的 ,但 溶解 物质 穿 透 进 孔 内 的 能 力 很 弱 ， 吸 附 作用 主要 发 生 在 吸附 剂 表面 上 。 聚 茶 乙 烯 对 化 合 物 的 吸附 作用 是 基于 化 合 物 的 芯 水 基 与 非 极 人 性 吸附 剂 之 间 的 范 德 华 力作 用 。 聚 茶 乙 烯 吸 附 剂 已 成 功 地 应 用 于 肉 香味 前 体 的 水 溶液 分 离 ; 除去 过 量 的 蛋白 质 沉 这 剂 苦味 酸 ; 硝 基 和 和 氧 酚 的 分 离 ，Amberlite XAD-2 也 用 于 高 效 液 相 色 谱 的 固定 相 中 。 《六 ) BRS 在 无 机 吸附 剂 中 ;磷酸 钙 是 唯一 的 适用 于 生物 活性 高 分 子 物质 (如 蛋白 质 ; 核 酸 ) 的 分 离 的 吸附 剂 。 Swingle 等 用 蔗糖 钙 的 水 溶液 加 入 磷酸 ,得 到 磷酸 钙 沉 淀 , 用 于 蛋白 质 的 色谱 分 离 , 但 为 了 获得 适当 的 流速 ,， 需 挨 加 硅 藻 土 。 后 来 , Tiselius 用 0.5M CaCl 加 0.5M 磷酸 二 销 盐 ， 在 室温 下 反应 ， 得 到 满意 的 流速 的 磷酸 钙 。CaHPO, . 2H;O 在 pH7 以 上 ， 慢 慢 变 为 羟基 TRIRZG ; Bl Ca(PO,)OH 放出 HPO,。Levin S3GRT REMRAW AHH. | BEAKEERENT EE ROEM 普 分 离 ， 也 适用 于 较 小 分 子 的 核酸 ， 如 转移 RNA 的 分 离 。 ° 85 « Bernardi 等 用 几 个 合成 的 多 聚 氮 基 酸 在 羟基 础 灰 石 上 进行 色谱 分 离 , 以 磷酸 盐 们 度 洗 : 陪 , 研 究 其 对 蛋白 质 的 吸附 机 制 ,又 研究 几 种 蛋白 质 在 8 MRA PRA PBS 分 区 性 质 ,最 后 指出 ,磷酸 钙 对 蛋白 质 吸 附 的 机 制 是 溶质 的 酸性 基 团 与 在 洗 脱 流 中 的 磷酸 根 离子 对 吸附 剂 的 阳离子 钙 的 竞争 性 作用 。 对 核酸 分 子 的 吸附 机 制 也 与 蛋白 质 类 似 。 多 核 昔 酸 的 负电 性 磷酸 基 与 羟基 础 灰 石 结 晶 表 面 上 的 阳离子 钙 之 间 的 相互 作用 ， 糖 和 碱 基 没有 直接 影响 。 例 如 , 叮 吟 和 喀 啶 碱 及 其 相应 的 核 背 在 羟基 磷 灰 石柱 上 没有 阻 留 作用 《用 -0.001XM 磷酸 缓冲 液 平衡 )。 而 单 核 昔 酸 则 稍 有 阻 尘 ， 对 二 和 三 磷酸 酯 则 需 较 高 但 酸 盐 浓 度 才 能 洗 脱 下 来 。 多 聚 核 苷 酸 从 羟基 础 灰 石上 的 洗 脱 是 由 于 缓冲 液 的 无 机 磷 离 子 和 溶质 的 磷 残 基 之 间 对 吸附 剂 上 钙 离 子 的 竞争 作用 。 产 基 础 灰 石 对 于 分 辩 有 次 序 和 无 次 序 的 生物 大 分 子 结构 (包括 蛋白 质 和 核酸 ) 是 很 有 用 的 一 个 吸附 剂 。 生 物 大 分 子 从 有 序 到 混乱 的 螺旋 变性 结构 过 程 中 常常 伴随 着 电荷 密度 的 降低 ,这 可 能 是 由 于 破坏 了 高 级 结构 ,离子 基 团 间 的 静电 排斥 的 结果 所 引起 的 。 三 、 吸 附 柱 色谱 的 实验 技术 《一 ) 吸附 剂 的 选择 及 处 理 吸附 剂 的 选择 是 吸附 色谱 法 中 的 关键 问题 ,选择 不 当 , 达 不 到 要 求 的 分 离 效果 。 因 为 作为 吸附 色谱 中 的 吸附 剂 种 类 很 多 ,无 机 吸附 剂 有 硅胶 、 氧 化 铝 、 活 性 炭 、 硅 酸 镁 、 氧 化 镁 、 碳酸 司 、 磷 酸 钙 等 。 还 有 一 些 人 工 合成 的 硅 铝 酸 盐 (如 人 造 沸石 ); 有 机 吸附 剂 有 纤维 素 、 淀粉 ` 莽 糖 、 到 酰 胺 等 。 而 对 吸附 剂 的 选择 尚 无 固定 的 法 则 ,一 般 需 通过 小 样 实验 来 确定 ， 但 要 注意 ,同一 种 吸附 剂 因 制 备 及 处 理 方 法 不 同 ， 吸附 性 能 有 很 大 差别 5 Plan, ete Ee 500°C 活化 后 吸附 酸 而 不 吸附 碱 , 但 在 800°C shinai Slides eo pi adel BSE BARE BE SMR ILE A Xo 一 般 来 说 ,所 选 吸附 剂 应 有 最 大 的 比 表 面积 和 足够 的 吸附 能 力 ， At aR ROOK ELD 质 应 有 不 同 的 吸附 能 力 , 即 有 足够 的 分 辩 力 ; 与 洗 脱 剂 、 溶剂 及 样品 组 分 不 会 发 生化 学 反 应 ， 还 要 求 所 选 的 吸附 剂 颗粒 均匀 。 在 操作 过 程 不 会 破裂 。 吸附 的 强 弱 可 概括 如 下 : 吸 附 现象 是 与 两 相间 界面 张力 的 降低 成 正比 ， 某 物质 自 溶 液 中 被 吸附 程度 与 其 在 和 咨 剂 中 的 溶解 度 成 反比 , 极 性 吸附 剂 易 吸 附 极 性 物质 , 非 极 性 吸附 剂 易 吸附 非 极 性 物质 , 同族 化 合 物 的 吸附 程度 有 一 定 的 变化 方向 ,例如 , 同系 物 极 性 递减 , 因而 被 非 极 性 表面 吸附 的 能 力 将 递增 。 许多 吸附 剂 一 般 先 经 过 筛 取得 较 均 匀 的 颗粒 《100 一 200 目 )， 对 含有 杂质 的 吸附 剂 > 可 用 有 机 溶剂 如 甲 醇 \ 乙醇 、 乙 酸 乙 酯 等 浸泡 处 理 或 提取 除去 ,有些 吸 附 剂 可 用 讲 水 洗 去 酸 碱 使 呈 中 性 ,有 些 需 经 加 热处理 活化 。 (=) 溶剂 与 洗 脱 齐 溶剂 与 洗 脱 剂 实用 上 常 为 同一 组 分 ， 但 用 途 不 同 。 习 惯 上 把 用 于 溶解 样品 的 溶液 称 、 溶剂 。 把 用 于 洗 脱 吸附 柱 的 溶液 称 洗 脱 剂 。 原则 上 所 选 的 溶剂 和 洗 脱 剂 要 求 纯度 合格 。 与 样品 和 吸附 剂 不 起 化 学 反应 ， 对 样品 的 溶解 度 大 , 粘度 小 ， 易 流动 ， 易 与 洗 脱 的 组 分 分 开 。 常 用 的 溶剂 与 洗 脱 剂 有 饱和 碳 氧 化合物、` 醇 \ 酚 、 酮 . 醚 \ 卤 化 烷 \ 有 机 酸 等 。 选 择 溶 关 es 86 e 与 洗 脱 剂 时 ,可 根据 样品 组 分 的 溶解 度 \ 吸 附 剂 的 性 质 ` 溶 剂 极 性 等 方面 来 若 虑 , 极 性 大 的 洗 脱 能 力 大 ,因此 可 先 用 极 性 小 的 作 溶剂 ,使 组 分 易 被 吸附 ， 然 后 换 用 极 性 大 的 溶剂 作 洗 Digi , PAA A HMPA BEL o 表 4-3 按 介 电 常数 反映 的 极 性 递增 顺序 列 出 了 各 种 常用 溶剂 。 R43 溶剂 的 脱 附 系 列 〈 按 极 性 递增 排列 ) 介 电 常数 (255C) 溶剂 介 电 常数 (2530) 2 1.89 冰 乙 酸 Beis 1,92 PO aK Mi 环 已 烷 2.02 =A ke 1,4--BAK 2x21 cx= 甲 基 丙 醇 (2) (=) 柱 的 装填 和 样品 的 加 和 吸附 色谱 法 通常 采用 柱 型 装置 ;色谱 柱 二 般 为 玻璃 或 有 机 玻璃 管制 成 , 柱 下 端 装 上 一 块 2 一 4 号 烧结 玻璃 或 垫 一 层 玻璃 丝 以 支持 吸附 剂 。 柱 高 与 直径 比 根据 实验 的 要 求 而 定 。 管内 装 吸附 剂 。 管 顶 可 与 样品 溶液 或 洗 脱 液 贮 液 瓶 连接 过 下 端 可 用 活塞 或 用 胶管 连接 排 出 管 ， 并 在 胶管 上 装置 螺旋 夹 以 控制 流速 。 有 条 件 可 附加 压 或 减 压 装置 ， 使 流速 保持 恒 定 ; 色 谱 柱 外 也 可 配 重 温 管 套 。 装 柱 的 方法 通常 是 将 一 种 在 适当 溶剂 中 的 吸附 剂 调 成 糊 状 ， 慢 慢 地 倒 人 关闭 了 出 水 互 的 柱 中 ,同时 不 断 搅 拌 上 层 糊 状 物 , 赶 去 气泡 ,并 使 装填 物 均匀 地 自然 下 降 ,装置 所 需要 的 高 度 后 ,打开 出 水 口 ,让 盗 剂 流出 。 注 意 柱 的 任何 部 分 不 能 流 干 , 即 是 说 ,在 柱 的 表面 始 终 就 保持 着 一 层 溶剂 。 小 心地 用 移 液 管 把 样品 液 沿 绕 柱 内 壁 小 心地 加 入 ， 不 要 冲击 着 吸附 剂 的 表面 。 加 样 的 另 一 个 办 法 是 用 一 个 注射 器 或 蠕动 泵 把 样品 直接 送 到 柱 表面 上 。 《四 ) 洗 脱 在 整个 洗 脱 过 程 中 ,要 使 洗 脱 液 通 过 柱 时 保持 恒定 的 流速 ,可 以 用 调节 “操作 压 ” 来 控 制 (操作 压 相当 于 在 柱 上 部 的 贮 液 瓶 中 溶剂 的 水 平和 柱 出 水 口 位 置 的 水 平 之 差 )。 另 一 个 办 法 是 使 用 蠕动 和 泵 。 洗 脱 过 程 中 柱 内 不 断 发 生 溶解 (解吸 ), 吸 附 , 再 溶解 , 再 吸附 。 被 吸附 的 物质 被 溶剂 解吸 , 随 着 溶剂 向 下 移动 , 又 遇 到 新 的 吸附 剂 又 把 该 物质 自 溶剂 中 吸附 出 来 , 后 来 流下 的 es。 $7 e 新 溶剂 又 再 使 该 物质 溶解 而 向 下 移动 。 如 此 反复 解吸 ,吸附 , 经 一 段 时 间 后 , 该 物质 向 让 移动 至 一 定 距 离 ， 此 距离 的 长 短 与 吸附 剂 对 该 物质 的 吸附 力 及 溶剂 对 该 物质 的 溶解 能 力 有 关 ; 分 子 结构 不 同 的 物质 溶解 度 和 吸附 能 力 不 同 ,移动 距离 也 不 同 ， 吸 附 较 弱 的 就 较 易 溶解 ,移动 距离 较 大 。 经 过 适当 时 间 后 ,各 物质 就 形成 了 各 种 区 带 ， 每 一 区 带 可 能 是 一 种 纯 的 物质 ,如 果 被 分 离 物 质 是 有 色 的 , 就 可 以 清楚 地 看 到 色 层 。 随 着 洗 脱 剂 向 下 移动 , 最 后 各 组 分 按 吸附 力 的 不 同 顺序 流出 色谱 柱 , 以 流出 体积 对 浓度 作 图 ,可 得 由 一 系列 峰 组 成 的 曲线 ,每 一 峰 可 能 相当 于 一 个 组 分 。 如 果 样 品 中 含 组 分 较 多 , 某 些 组 分 吸附 力 相 近 ， 易 形成 两 峰 重 琶 间 界限 不 清 , 可 采用 梯度 洗 脱 法 。 二 节 离子 交换 色谱 ; 离子 交换 作用 是 指 一 个 溶液 中 的 某 一 种 离子 与 一 个 固体 中 的 另 一 种 具有 相同 电荷 的 离子 互相 调换 位 置 , 即 溶液 中 的 离子 跑 到 固体 上 去 , 把 固体 上 的 离子 替换 下 来 。 这 里 , 溶 液 称 流 动 相 , 而 固体 称 固 定 相 。 自从 人 类 远古 的 时 代 , 就 知道 利用 这 种 离子 交换 现象 ,例如 用 砂粒 来 净 水 s 但 真正 了 解 这 种 离子 交换 现象 的 机 制 以 及 在 实验 上 的 广泛 应 用 则 要 到 十 九 世纪 以 后 。t9350 一 1955 年 期 间 出 现 了 以 聚 丙 乙 烯 为 母体 的 阳离子 和 阴离子 交换 剂 ， 使 离子 交换 层 析 技术 得 到 迅 速 发 展 。 目 前 ,离子 交换 剂 已 发 展 到 数 百 种 ,各 种 离子 交换 色谱 法 已 成 为 最 广泛 应 用 的 色 谱 方法 之 一 。 一 、 离 子 交 换 剂 的 类 型 (一 ) 聚 葵 乙烯 耻 离 子 和 阴离子 交换 树脂 这 是 最 重要 的 一 类 离子 交换 树脂 ,由 苯 乙 烯 和 二 乙烯 苯 的 共聚 物 作 为 骨架 ,再 引信 所 需要 的 酸性 基 或 碱 性 基 。 例 如 聚 茶 乙 烯 磺 化 型 阳离子 交换 树脂 是 由 茶 乙 精 ( 母 体 ) 与 二 乙 烯 茶 ( 交 联 剂 ) 共 聚 后 再 磺 化 引入 磺 酸 基 而 成 的 。 其 中 苯 乙 烯 是 主要 成 分 ;形成 网 的 直 链 ， 其 上 带 有 可 解 离 的 磺 酸 基 ,而 二 乙烯 茶 把 直 链 交 联 起 来 形成 网 状 结构 ,所 得 的 产物 有 像 海 绵 似 的 结构 ， 磺 酸根 连 在 树脂 上 ， 氢 离子 与 磺 酸 根 的 负电 荷 互相 平衡 ， 颗 粒 内 部 就 像 一 个 茶 磺 酸 的 浓 溶 液 ， 只 是 负 性 根 不 能 自由 移动 ， 只 有 氢 离 子 才能 与 外 来 的 离子 相互 交 换 。 _—— en wae ae ae | ee ; 0% JF HEOOOD Sa H=CH, iE C&A) (748) --—-CH—CH, CHC, Ce re 二 * 88 。 E CH—CH—CH—CH,—CH----- | | 0 rs Bde. G) hi SO;Ht 调节 加 入 不 同 的 悬浮 液 稳定 剂 和 控制 介质 的 温度 、 粘 度 及 机 械 搅拌 速度 可 得 到 不 同 大 小 规格 的 树脂 (直径 从 1 微米 至 2 毫米 ),， 而 改变 二 乙烯 葵 的 量 则 可 得 到 不 同 交 联 度 的 树脂 。 根据 引入 的 可 离 解 基 团 的 性 质 又 可 分 为 下 列 两 类 离子 交换 树脂 。 1. 聚 茉 乙烯 阳离子 交换 树脂 这 类 交换 剂 可 再 分 为 强酸 型 、 中 强酸 型 及 弱酸 型 三 种 ,各 含有 以 下 的 可 解 离 基 团 。 磺 酸 基 —SOFHt (强酸 型 7 | Nou wen _PL [Nox | 一 一 了 Oo jou BRE —O— PC || ‘OH Oo 羧基 —COOH (弱酸 型 ) 这 些 交换 剂 在 交换 时 氢 离 子 为 外 来 的 阳离子 所 取代 ;如 下 式 所 示 : R—SO,H 十 Na*=>R—SO,Na + H* R—COOH + Na+ == R—COONa + Ht 2. 聚 茶 乙 烯 阴离子 交换 树脂 也 可 再 分 为 强 碱 性 \ 中 强 碱 性 及 弱 碱 性 三 类 ,这 三 类 都 是 含有 胺 基 , 碱 性 的 强 弱 按 胺 基 碱 性 强 弱 而 分 。 如 含 季 胺 盐 [—N*(CHy),] 为 强 碱 性 、 wf [一 NCCH:)]、 仲 胺 [一 NHCH:]、 伯 胺 [一 NH:] 类 都 属 弱 碱 性 、 既 含 强 碱 性 基 团 又 含 弱 碱 性 基 团 即 为 中 强 碱 性 ,交换 时 反应 如 下 : R—N*(CH,),0H + CI = 了 一 N+CCH)CL + OH- R—N(CH;)2 + HCI = = R—N(CH;), » HCl R—N(CH;), + H,O —=R—N(CH;),H;OH™ R—N*(CH;)H, OH + Cl” =~R—N1(CH;),H,Cl + OH- e 89 e (=) 聚 丙烯 酸 阳 离子 交换 树脂 CH, CH, CH, | | — C—CH,— C—CH,—CH—CH,— Cc — CH, CH=CH, COOH COOH | COOH | IS C= ea | 一 一 > COOH SX CH, CH, CH, | | | | CH=CH, — C—CH,—C—CH,—CH—CH,— c— | | | COOH COOH COOH 是 由 甲 基 丙 烯 酸 和 二 乙烯 共聚 合 而 成 。 这 类 树脂 具 高 度 的 交换 量 ， 每 克 干 重 树脂 可 交换 10 毫克 当量 物质 。 在 pH 8 以 下 , 这 类 树脂 中 的 羧基 不 完全 解 离 , 因此 要 在 高 的 pH 值 下 树脂 才 有 完全 的 交换 量 , 由 于 相 邻 羧基 距离 较 短 而 产生 的 缔 合 作用 , 故 有 很 高 的 表 观 PK 值 ; 在 低 离 子 树脂 强度 下 特别 明显 。 这 种 高 度 缔 合 的 非 离 子 化 羧基 使 树脂 的 表面 形成 一 个 亲 水 层 , 对 极 性 分 子 能 起 一 种 很 有 效 的 吸附 作用 。 由 丙烯 酸 或 甲 基 丙烯 酸 在 季 胺 型 阳离子 交换 树脂 (如 Dowex 1) 中 聚合 而 成 的 一 类 树脂 称 蛇 笼 树脂 ”(Snake-Cage resins) 结构 如 下 : 1 1 1 << ae 1 1 1 ca —CH,—Nt (CH,), —O—CO —CH | ei | CH, CH, | | CH— ca (CH,); —O— CO—CH | eee CH, 1 由 于 树脂 中 的 羧基 (一 COO ) 和 季 胺 基 [一 N"*(CHs)》] 是 等 当量 的 , 故 树 脂 在 反应 上 的 中 性 的 。 这 类 树脂 可 用 于 生物 化 学 上 的 脱盐 ,例如 一 个 NaCl 溶液 通过 这 类 树脂 柱 ， 则 Na 为 树脂 中 的 —COO” BRA, 而 Cl” 则 为 季 胺 基 除 去 ， 故 脱盐 后 的 溶液 没有 明显 的 pH 改变 ,随后 用 水 洗 柱 即 可 回收 盐 。 这 类 树脂 也 可 用 来 从 电解 质 中 分 离 非 电 解 质 ,因为 非 电 解 质 直 接 通 过 柱 流 出 。 另 外 也 用 于 从 大 分 子 的 等 电 点 两 性 电解 质 中 分 离 电 解 质 ， 因 为 前 者 不 能 进入 树脂 的 网 孔 中 。 (=) 其 他 离子 交换 剂 例如 选择 性 离子 交换 剂 是 利用 某 些 特殊 的 有 机 试剂 可 与 某 些 金属 离子 起 选择 性 反应 的 原理 而 制备 的 。 鳌 形 树脂 是 利用 金属 离子 与 有 机 试剂 生成 整形 化 合 物 的 性 质 而 制备 的 。 如 用 含 汞 的 树脂 分 离 含 综 基 的 化 合 物 (辅酶 A, EBERLE DEH IAS) 吸附 树脂 是 一 类 有 很 大 的 表面 积 ,吸附 能 力 强 , 但 离子 交换 的 能 力 很 小 的 树脂 主要 用 于 脱色 和 除去 蛋白 质 等 ,也 称 为 “脱色 树脂 ”。 电子 交换 树脂 , 这 类 树脂 所 交换 的 不 是 离子 而 是 电子 , 交换 反应 是 个 氧化 还 原 反应 ， 也 称 氧化 还 原 树脂 "。 可 用 于 氧化 剂 或 还 原 剂 再 生 ， 由 于 上 述 几 种 离子 交换 剂 与 生化 物 e 90 。 Se ae erie 质 的 分 离 制备 关系 不 大 ,这 里 不 作 详细 介绍 。 二 、 离 子 交 换 树 脂 的 性 质 (—) 一 般 离子 交换 剂 的 特性 LSA sO, 多 和 孔 的 网 状 物 质 * 而 活性 基 团 一 般 都 处 于 树脂 网 孔 内 ， 外 来 离子 必需 进入 到 网 孔 内 才能 进行 离子 交换 。 2. 不 溶性 ”树脂 在 水 中 及 稀 酸 、 稀 碱 和 一 般 有 机 溶剂 中 都 不 溶解 ,经常 维持 其 立体 网 状 结构 。 BEE 离子 交换 树脂 具有 强 稳 定 的 兹 学 性 质 ; 母 体 本 身 不 与 酸 、 碱 起 作用 。 例 如 强酸 型 阳离子 交换 树脂 (Dowex50, 国产 732 树脂 等 ) 很 稳定 ,可 使 用 几 百 次 ,其 交换 当 Bern, MAEM ASF 5S % NaOH, 0.1% KMnO,, H,0,, 0.1N HNO; 中 ， 耐 热 性 BE, Ay Ze 100°C 左右 处 理 。 一 些 强 碱 性 阴离子 交换 树脂 (如 Dowex 1, 国产 717* 树脂 等 ) 对 酸 碱 及 有 机 溶剂 稳定 ,但 在 浓 HNO, 中 不 稳定 。 一 般 游 离 型 ( 即 一 OH 型 ) 树 脂 ， 其 耐 执 性 较 差 (不 超过 45°C) 而 制 成 盐 型 (CI 型 ) 则 耐 热 性 大 大 提高 ,可 耐 受 100*C 处 理 。 和 .离子 交换 性 ”离子 交换 树脂 必需 具备 相当 数量 的 可 交换 离子 或 带电 基 团 , 这 些 离子 或 基 团 的 类 型 决定 了 离子 交换 剂 的 类 型 ， 而 基 团 的 总 数 和 它们 的 亲 和 性 决定 树脂 的 交换 容量 。 (=) 总 交换 量 | | 总 交换 量 是 指 交换 剂 中 可 交换 离子 数 ,一 般 用 单位 重量 (CF) 或 单位 容积 〈 湿 树 则 ) 交 换 剂 所 能 交换 的 毫克 当量 离子 来 表示 , 即 毫克 当量 / 克 或 毫克 当量 /毫升 。 总 交换 量 为 离子 交换 树脂 的 特性 ,与 操作 条 件 无 关 。 这 两 种 表示 法 之 间 的 关系 式 如 下 : Qv 和 Qw 各 为 体积 和 重量 表示 的 总 交换 量 ; Vi AAR RRR Vo 为 外 水 体积 ; 双 是 树 蕴含 水 量 的 百分数 ; 2 EMBASE BE 以 于 的 方法 仅 适 用 于 一 些 能 穿 透 树脂 网 孔 进 入 树脂 内 部 的 小 离子 ， 而 对 于 一 些 大 分 于 的 多 电解 质 则 有 很 大 的 区 别 , 取 决 于 它们 穿 透 进 入 树脂 的 能 力 。 在 实验 条 件 下 所 得 到 实际 交换 量 称 为 有效 交 换 量 "”， 其 大 小 取决 于 活性 基 团 的 亲 和 力 ; 洗 脱 剂 的 浓度 ,离子 强度 , 反 离子 性 质 及 活性 基 团 的 选择 性 。 (=) 交 联 度 合成 树脂 时 所 用 的 交 联 剂 ( 如 二 乙烯 茉 ) 在 原料 总 重量 中 所 占 的 百分比 叫做 树脂 的 交 联 度 。 交 联 度 也 是 离子 交换 剂 的 一 个 重要 参数 ， 交 联 度 的 大 小 与 树脂 的 膨胀 性 及 交换 量 均 有 关系 , 交 联 度 越 大 ,树脂 的 网 孔 越 小 ,膨胀 性 小 ; 故 交换 量 也 少 ; 反 之 , 交 联 度 越 小 , 网 孔 越 大 ,和 孔 内 活性 基 团 越 多 , 故 交换 量 也 越 大 ,但 膨胀 性 增 大 ,从 而 易 引 起 树脂 的 机 械 变形 Seine 交 联 度 的 表示 方法 是 在 树脂 型 号 后 面 标明 共聚 物 中 所 加 交 联 剂 的 比例 ， 如 Dowex 1 es 9le Xx 2 表明 为 Dowex 阴离子 交换 树脂 1 号 ,其 交换 度 为 2 匈 ,，Amberlite IR-120 (10%) 表明 其 交换 度 为 10 多。 而 国产 树脂 的 编号 规定 如 下 : 强酸 : 1 一 100 弱酸: 101—200 强 碱 : 200 一 300 Shia: 301 一 400 磷酸 : 401 一 500 如 201X 7 表明 为 强 碱 性 阴 树脂 , 交 联 度 为 7 多。 有 些 单位 仍 沿用 原 有 和 名称, 如 732 (1X7) 其 中 1 为 强酸 编号 ，7 为 交 联 度 。 (四 ) 离子 交换 剂 中 活性 基 的 性 质 所 用 离子 交换 剂 的 性 质 决定 于 它们 功能 基 的 性 质 。 阳 离子 交换 剂 的 活性 基 有 强酸 基 (—SO;) 或 弱酸 基 〈 一 COO-) 及 中 强酸 基 A ('POH-)， 而 阴离子 交换 剂 的 活性 基 困 有 强 weet: ‘ Bae CNTR,) aeSSMAE CONTHR,) 等 ; G Se ece ho ae (TE AHR TL 4-20 +? 2.4 图 4-2a se A JERE Zul BW 离子 交换 树脂 的 滴定 曲线 。 在 PH2 WL , 磺 Oo — Oo _ iS} es ITE WIA KHOR RB 10 为 强 碱 型 聚 苯 乙烯 阴离子 交换 树脂 的 滴定 井 ap Rs 带 有 季 胶 交换 基 ， 在 pH 10 以 下 碱 性 基 a i. 解 离 ,树脂 有 最 大 的 交换 量 。 wf Co 图 4-2 中 曲线 Cy AUC, 表示 二 个 弱酸 性 m4 羧基 阳离子 交换 树脂 的 滴定 曲线 ;与 强 酸 或 强 碱 性 的 树脂 相反 ,曲线 的 形状 明显 地 受 谷 质 的 离子 强度 所 影响 。 曲 线 Co 是 在 水 中 ，C， te i hae PE A 是 在 0.1 M NaCi 中 。 从 曲线 中 可 看 到 ,交换 pH 量 随 pH 的 变化 而 改变 很 大 ， 曲 线 了 为 弱 碱 (b) 性 阴离子 交换 树脂 的 滴定 曲线 ,在 pH5 以 下 4-2 ”离子 交换 树脂 的 注定 曲线 a | 完全 离 解 。 (A) 离子 交换 树脂 对 离子 的 亲和力 深 液 中 某 一 离子 能 否 与 交 联 剂 上 的 离子 进行 交换 主要 取决 于 离子 的 相对 浓度 《质量 作用 ) 与 交换 树脂 对 离子 的 相对 亲和力 。 一 般 说 来 , 电 性 越 强 , MARR, 对 于 阳离子 树 脂 ,在 常温 常 压 的 低 浓 度 溶 液 中 ,交换 量 随 交 换 离 子 的 电价 增 大 而 增 大 ,如 Na+ < Cat+ 志 AF < 天 To 如 原子 价 数 相 同 ， 则 交换 量 随 交换 离子 的 原子 序数 的 增加 而 增 大 ， Lit < Nat < KK 二 Pb*Ss*。 阴 离子 也 有 一 定 的 规律 ;在 常温 常 压 下 低 请 度 溶 液 中 * 强 碱 性 交换 树脂 的 各 负电 性 基 团 的 离子 亲和力 次 序 如 下 : CHCcOOoT 运 下 - Ag 时 为 凸 形 梯度 ， AA < As 时 为 凹 形 梯度 。 五 、 离 子 交 换 色 谱 法 的 应 用 (—) BEB 离子 交换 树脂 用 于 氨基 酸 的 系统 分 离 研究 工作 已 有 几 十 年 的 历史 ， 但 早期 的 工作 效 果 不 大 满意 ， 特别 是 对 碱 性 氨基 酸 回 收 率 很 差 。 自 从 Moore 和 Stein!” 引进 了 两 根 层 析 柱 分 离 氨基 酸 的 方法 之 后 ,在 氨基 酸 系 统 分 离 方面 有 了 很 大 的 发 展 。 方 法 是 在 Dowex 50X8 的 100 厘米 层 析 柱 上 分 离 酸性 和 中 性 氨基 酸 , 开 始 洗 脱 液 为 pH 3.41 的 柠檬 酸 钠 (37.5%C )， 天 FA 甲 异 门 苏 丝 5 Bit. 亮 i i cane reer 0.5| 本 BRR a 7 酸 0.4 甲 酸 Ea 5 5. 0.3 酸 酸 Zi KB Ne 3 x i 氨 氨 酸 Mw 亚 af 时 S\ 4 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250275 300 325 350 375 400 425 450 475 0 25 50 75100 125 H5.2 = 150em Kt, pH3.25, 一 十 一 150cm 长 柱 ，pH4.25 50cm 短 柱 ,p O.2N FRR 0.2.N FRB —| 0.35. NEF RERG HS 图 4-8 氮 基 酸 自动 色谱 仪 对 各 种 氨基 酸 分 离 结果 es 97 。 最 后 洗 脱 液 为 pH 4.25 的 柠檬 酸 钠 (50°C); 用 15 厘米 的 Dowex 50 X 8 层 析 柱 ， 以 磷酸 和 柠檬 酸 缓冲 液 (PH 6.8 和 6.5) 洗 脱 分 离 色 氨 酸 和 碱 性 氨基 酸 及 游离 氮 。 到 1958 年 , 以 上 的 手工 分 离 方法 被 氨基 酸 自动 色谱 仪 所 代替 ,Moore SO" 用 粉 状 树 f§ Amberlite IR-120 (400—600 目 ),， 150 X 0.9 厘米 层 析 柱 以 分 离 中 性 和 酸性 氨基 酸 ， 整 ”个 操作 过 程 在 50%C 下 进行 , 仅 用 一 种 缓冲 液 , 从 0.2 M 柠 檬 酸 钠 (pH3.25) 到 0.2 M 柠檬 FBS (pH 4.25)， 而 碱 性 氨基 酸 的 分 离 则 在 15 < 0.9 厘米 的 短 柱 上 用 同样 树脂 进行 ， 以 0.3 M 柠檬 酸 缓冲 液 (PH 5.28) 在 50%cC 下 洗 脱 ,其 分 离 结果 如 图 4-8。 (=) 糖 离子 交换 色谱 法 也 可 用 于 中 性 不 带电 荷 的 糖 类 的 分 离 。 主 要 原理 是 利用 糖 和 硼酸 盐 生成 的 糖 -硼酸 盐 复 合 物 有 离子 性 质 , 从 而 可 用 离子 交换 色谱 法 分 离 。 某 些 多 羟基 化 合 物 包括 糖 ) 在 碱 性 溶液 中 和 硼酸 盐 离 子 反应 生成 稳定 的 复合 物 , 可 包括 以 下 三 种 形式 : ew: Vase -¢- Se ye o-| : ws Oo te C— [I] [II] [III] | [I] 型 实际 上 是 非 离子 化 的 形式 ， 而 (0) 和 [IIT] 型 在 碱 性 溶液 中 是 完全 离子 化 的 ， 为 中 等 强度 的 酸 。 这 些 化 合 物 的 形成 为 以 下 的 因素 所 决定 : 糖 的 绝对 浓度 ， 硼 酸 盐 的 离 子 浓度 ,两 者 的 比率 。 在 低糖 浓度 和 低 的 糖 /硼酸 盐 的 比率 下 ,主要 产生 [TI] 型 复合 物 。 Khym 和 Zille2 用 强 碱 型 阴离子 交换 树脂 Dowex-1l 层 析 分 离 果糖 、 半 乳糖 和 葡萄 糖 的 混合 物 ,， 用 0.016M K,B,O, 洗 脱 果糖 和 半 乳 糖 ， 以 0.3 M KB4O; 洗 脱 葡萄 糖 。 这 个 方法 也 可 用 于 寡 糖 和 六 元 醇 的 分 离 呈 ， 如 山梨 糖 醇 、 半 乳糖 醇和 甘露 糖 醇 可 在 Dowex=1 硼酸 柱 上 用 K:B,O 溶液 洗 脱 ， 其 中 甘露 醇 由 于 它 的 一 对 顺 式 二 烯 基 而 在 柱 上 产生 强烈 BAT Fir BF o 对 单 糖 和 低 聚 糖 的 分 离 如 采用 硼酸 盐 复 合 物 阴 离子 交换 体系 ， 虽 然 具 有 较 高 的 分 辩 力 , 但 由 于 流速 慢 , 溶 质 要 暴露 在 碱 性 条 件 中 的 缺点 ,不 如 采用 分 配 匈 谱 为 佳 。 OD260x50 10x3 20x3 30 x3 40x3 50x3 V=NO x3 立 升 图 4-9 阳离子 交换 柱 分 离 四 种 单 核 苷 酸 曲 线 及 pH 值 变化 曲线 298 e 《三 ) 四 种 5 - 单 核 苷 酸 的 分 离 ” 在 pPH1.5 时 , AMP, CMP, GMP 上 的 氨基 离 解 , 带 正 电 荷 可 被 阳离子 交换 树脂 所 吸 附 。UMP 没有 氨基 ,不 带 正 电 荷 , 大 部 分 直接 流下 来 。 当 用 无 离子 水 洗 脱 时 , 随 着 pH 值 的 变化 , GMP, CMP, AMP 上 的 毛 基 解 离 度 降低 的 程度 不 同 , 而 先后 失去 阳离子 交换 树脂 上 的 吸着 能 力 , 按 GMP, CMP, AMP 的 顺序 依次 洗 脱 下 来 。 结 采 如 图 4-9。 树脂 : 聚 苯 乙 烯 -二 乙烯 茶 磺 酸 型 ，200~300 目 ，1 X 8。 柱 : 10 X 58 厘米 。 上 柱 量 : 占 树脂 全 交换 量 1.7% (四 ) Dowex-1 甲酸 型 树脂 柱 分 离 腺 苷 ，AMP、ADP 和 ATP 分 离 条 件 如 下 : 树脂 : Dowex-1 甲酸 盐 。 柱 : 1X 30 厘米 。 样 品 量 : 每 毫升 含 腺 彰 AMP, ADP 和 ATP 各 10 毫克 , 调 pH 至 7.9。 以 :0-5N 甲酸 线性 梯度 洗 脱 收 度 260mma 内 0.4 FT 12| 13 组 分 X10-! 图 4-10 在 Dowex-1 甲酸 盐 树 脂 柱 上 腺 苷 、AMP、ADP 和 -ATP HABA CA) 图 4-11 为 人 血红 蛋白 的 氨 乙 酰 化 B 链 的 胰 蛋 白 酶 水 解 物 的 色谱 分 离 s ”实验 条 件 如 下 : 柱 0.9 X 18 厘米 。 树 脂 : 磺 化 阳离子 交换 树脂 Spinco 15A, 在 50°C 下 以 线性 梯度 洗 脱 (混合 室 : 250 毫升 0.2 M 吡啶 醋酸 缓冲 滚 pH 3.1; 贮存 室 : 250 毫升 2.0M 吡 啶 栈 酸 缓冲 液 , pH 5) 流速 : 300 毫升 /小 时 。 第 三 节 ” 高效 液 相 色 谱 法 HB lt aM IS CPR HPLC) 是 最 近 十 多 年 兴起 来 的 一 门 新 技术 , 它 最 主要 的 特点 是 闹 动 相 在 高 压 泵 作用 下 高 速 地 能 准确 控制 流量 地 通过 色谱 柱 。 使 样品 中 各 组 分 在 流动 相 和 固定 相 之 间 迅 速 地 达到 平衡 ; 其 次 采用 了 封闭 的 能 重复 使 用 的 柱子 并 特殊 制作 了 各 种 类 型 固定 相 , 这 些 固定 相 不 仅 具 备 体积 小 、 均 匀 而 且 有 耐 压 和 传 质 快 等 特点 ,使 色谱 分 离 效率 大 大 提高 ， 一 般 定 量 分 析 可 达 +1% 准确 度 。 用 于 制备 色谱 时 又 可 以 连续 操作 。 每 次 制备 样品 量 最 高 可 达 克 量 级 。 高 效 液 相 色 谱 不 同 于 气相 色谱 是 对 分 离 的 样品 类 型 具有 «99 e. 非常 广泛 适应 性 ,样品 还 可 以 回收 。 从 各 种 无 机 化 合 物 、 有 机 化 合 物 到 具有 生理 活性 的 各 种 生物 大 分 子 ; 极 性 的 和 非 极 性 的 都 适用 ,此 外 整个 仪器 装置 自动 化 程度 很 高 ， 附加 的 各 种 检测 器 种 类 繁多 ， 因 此 ， 高 效 液 相 色谱 已 成 为 现代 化 学 和 生物 化 学 分 析 和 制备 最 有 力 武器 之 一 。 在 生化 领域 中 广泛 应 用 于 下 列 产物 的 分 离 和 鉴定 : (1) & 基 酸 及 其 衍生 物 ; (2) 有 机 酸 ;(3) 省 体 化 合 物 ;(4) 生 物 = 碱 ; (5) 抗菌 素 ; (6) 2K (7) AIK (8) 核酸 及 其 降解 由 产物 ; (9) BAR. MASK; (10) 脂 类 等 。 高 效 液 相 色 谱 的 分 离 原 理 与 经 典 色谱 相同 ， 主 要 是 各 种 溶质 在 色谱 柱 中 差 速 迁移 的 结果 。 这 种 差 速 迁移 现 象 ,是 样品 在 固定 相 和 流动 相 之 间 分 配 不 同 所 引起 的 ?所 以 按照 固定 相对 样品 的 保留 作用 机 理 不 同 ， 高 效 液 相 色 MALE IL: 1. 液 一 液 分 配色 谱 “又 可 分 为 正 相 色 谱 和 反 相 色 谱 。 正 相 色谱 以 极 性 较 强 的 填料 作 固 定 相 ， 而 以 极 性 较 小 的 溶剂 作 流动 相 , 极 性 较 强 的 化 合 物 被 保留 , 极 性 弱 的 化 合 物 先 被 洗 脱 下 来 。 反 相 色谱 则 固定 相 极 性 小 ， 流 动 相 极 性 大 ,用 于 分 离 非 极 性 或 弱 极 性 物质 。 2. 液 一 固 吸附 色谱 3. 离子 交换 色谱 4. 凝 胶 色 谱 此 外 最 近 正 出 现 高 效 聚 焦 色谱 和 和 蛋白质 快 速 液 相 色 谱 (FPLC) 等 主要 是 高 效 离子 交换 剂 和 琼脂 糖 凝 胶 等 色 . 谱 用 于 和 蛋白质、 多 肽 、. 酶 的 发 展 。 (ml) 图 4-11 人 血红 蛋白 的 氨 乙 酰 6 链 (100 mg) 的 胰 蛋 白 酶 水 解 物 的 制备 色谱 图 二 、 高 效 波 相 色谱 仪 概述 一 人 |= 高 效 液 相 色谱 仪 主要 由 高 压 泵 、` 色 谱 柱 \ 检 测 器 三 大 sw 部 分 组 成 。 附 件 可 增设 自动 记录 仪 、 洗 脱 液 自 动 部 分 收 集 器 \ 贮 液 器 及 梯度 混合 装置 、 进 样 阀 或 注射 器 等 。 色 谱 柱 是 获得 良好 分 离 率 的 核心 部 件 , 但 好 的 色谱 柱 必须 配备 优良 的 整 机 装置 ,才能 获得 满意 的 结果 。 图 4-1 是 高 效 液 相 色 谱 仪 器 装置 示意 图 。 现 按 仪器 各 个 部 分 作 一 简单 介绍 : 1. 溶剂 精 ( 或 称 流动 相 贮 色 ) 商品 贮 缸 是 用 不 锈 钢 制 成 , 常 附加 脱 气 设备 如 搅拌 、 加 热 、 抽 真空 和 吹 氨 等。 自制 简 单 溶剂 糟 可 用 玻璃 瓶 代 替 。 2. 溶剂 程序 控制 器 “主要 用 于 梯度 洗 脱 ， 梯 度 的 形成 可 分 常 压 混合 和 高 压 混合 两 类 。 前 者 是 在 常 压 下 将 溶剂 混合 再 用 单 泵 输送 给 色谱 柱 。 后 者 是 不 同 溶剂 用 双 泵 在 高 压 条 件 下 混合 ,自动 化 程序 较 高 ， 可 在 较 大 范围 的 流速 (600 毫升 一 3 升 /小 时 ) 和 较 长 时 间 范围 内 (15 分 钟 至 16 天 ) 获 得 梯度 。 *，100。 RS 溶剂 程序 控制 器 | | 样品 注射 器 或 进 样 闽 | 下 TYE 珊 | Ems et Li | 色谱 柱 eee u > eee | ree | 一 -| | ian | 部 分 收集 器 | | “数据 处 理 系统 | 图 4-12 高效 芒 相 色谱 仪 装置 示意 图 ， 3. 高 压 泵 “是 高 效 液 相 色 谱 主要 部 件 之 一 ， 可 用 优质 不 锈 钢 或 陶瓷 制 成 。 有 较 强 抗 化 学 侵蚀 性 和 抗 机 械 破 损 性 能 。 输 出 压力 最 高 达 350 至 400 巴 ( 约 为 5 一 6 千 磅 /英寸 7)。 常 分 机 械 泵 和 气动 泵 两 大 类 ,使 用 时 各 有 优 缺 点 ， 对 于 制备 色谱 来 说 ,一 般 要 求 泵 压 没有 分 析 色 谱 高 。 但 希望 有 较 大 流量 。 一 个 好 的 泵 应 该 是 工作 压力 范围 大 ， 没 有 输液 脉冲 或 者 很 小 的 输液 脉冲 (脉冲 对 荧光 、 紫 外 检测 影响 较 小 ,对 化 学 检测 影响 较 大 ,有 时 需 加 脉冲 、 阻尼 限制 器 以 减弱 之 )。 4. 进 样 装 置 ”最 简单 的 方法 是 使 用 注射 器 ,注射 器 进 样 隔膜 的 设计 应 能 承受 高 压 ， 多 用 硅 酮 弹性 体 或 氧 丁 橡胶 制 成 。 另 一 种 是 进 样 阀 ,能 在 高 压 下 操作 而 无 扰 流 , 宜 于 大 体 : 积 禅 品 的 注入 , 注射 器 和 进 样 阀 见 图 4-13。 5. 检测 器 ”检测 器 是 高 效 液 相 色谱 仪 的 眼睛 ,必须 具有 足够 灵敏 度 , 而 且 要 求 适应 条 件 范围 比较 广 些 ,最 常用 的 检测 器 有 : C1) 紫外 吸收 光度 计 : 凡是 有 紫外 吸收 的 化 合 物 都 可 以 使 用 。 使 用 最 多 的 波长 有 280 毫 微米 , 260 毫 微米 (蛋白 质 类 ), 254 (核酸 类 ), 210, 206 毫 微米 等 。 有 一 个 以 上 的 双 键 生 色 团 的 化 合 物 都 能 产生 紫外 吸收 。 有 些 蛋白 质 如 r- 球 蛋白 在 206 毫 微米 比 在 280 B 微米 的 吸收 度 大 40 倍 。 故 选择 波长 范围 时 还 需 依 不 同化 合 物 具 体 情 况 而 定 。 (2) 示 差 折光 计 : 也 是 应 用 较 广 的 检测 器 之 一 。 多 应 用 于 脂 质 、 糖 类 物质 渗 色 的 测 定 。 在 适当 的 条 件 下 能 检测 到 3 微克 /毫升 的 样品 量 , 缺 点 是 对 温度 比较 敏感 «101° EER 图 4-13 AHSAER RA 24-4 各 种 检测 器 性 能 一 览 表 "…” 紫 外 | 折光 lpm gee 参 。 数 (折光 指 (吸收 值 ) | 数 单位 | -安培 ) ——— | ee el 一 | 一 一 | 一 一 选择 性 普通 普通 选择 性 用 于 梯度 洗 脱 可 . 不 可 可 可 不 可 线性 动态 范围 上 限 | 2.56 107 10-8 无 现成 数据 1000 线性 范围 5X104 104 一 105 ~ 103 2x 10* Et 1% 噪音 下 满 | 0.05 10-3 10>*1 0.005 0.05 刻度 灵敏 度 对 合适 样品 灵敏 度 | 5 兴 10-! | 5X107 |10-* 克 / 秒 | 50 居 里 / 克 / 毫 升 | 克 / 毫 升 |( 约 5X107 克 / 毫 升 ) 对 流速 敏感 性 无 和 有 对 温度 敏感 性 低 10-*°C 可 忽略 * 也 称 火焰 离子 化 检测 器 (3) 放射 性 检测 器 : 主要 利用 色谱 柱 中 流出 含有 放射 性 标记 的 溶质 与 检测 器 中 闪烁 体 接 触 时 产生 脉冲 而 被 检 出 。 多 用 于 代谢 途径 中 间 产 物 的 分 离 。 4) 荧光 检测 器 : 也 是 一 种 受 干 扰 小 ， 灵 敏 度 很 高 的 测验 方法 。 只 要 能 在 紫外 光 激 发 下 能 发 射出 荧光 的 溶质 都 可 以 使 用 。 灵 人 敏 度 可 达 10-°—10°- 克 / 毫 升 。 适用 于 各 种 氨 基 酸 、 胺 类 维生素 、 当 醇化 合 物 的 测定 。 此 外 ,还 有 溶质 迁移 检测 器 或 称 火焰 离子 化 检测 器 , 极 谱 检测 器 ， 电 导 检 测 器 等 。 深 质 迁 移 检测 器 对 样品 有 一 定 破坏 性 ,制备 分 离 中 比较 少 用 , 由 于 制备 色谱 、 溶质 的 浓度 一 般 都 比较 大 ,对 检测 器 灵敏 度 的 要 求 没 有 分 析 色 谱 那 样 严 格 , 在 高 效 液 相 色谱 中 ， 一 些 常 es。 102。 "Se 用 的 检测 器 有 关 规 格 性 能 见 表 4-4。 三 、 高 效 液 相 色 谱 的 固定 相 填 料 经 典 液 相 色谱 所 用 的 多 和 孔 物 质 如 硅胶 、 氧 化 铝 \ 离 子 交 换 珠 等 ， 由 于 粒度 大 , 传 质 慢 而 不 均匀 ,造成 谱 带 扩散 严重 ,影响 了 柱 的 分 离 效 率 。 针 对 上 述 缺 点 ， 高 效 疲 相 色 谱 所 用 的 固定 相 填 料 大 部 分 具有 实心 圆 核 外 应 多 和 孔 薄 层 构 成 ， 使 溶质 在 多 孔 薄 晨 中 易于 出 人 。 另 ”一 种 是 形状 规则 的 全 多 和 孔 微 粒 (直径 一 般 在 5 一 10 pm EA), 这样 小 的 颗粒 ,溶质 在 孔 中 移动 的 距离 是 很 短 的 ,以 上 结构 都 使 溶质 易于 在 二 相 之 间 达 到 平衡 ,加 快 分 离 速 度 和 提高 分 离 效率 。 形 状 规则 的 填料 及 均匀 装填 都 使 样品 分 离 获得 良好 重 现 性 。 现 代 高 效 芒 相 色 谱 使 用 的 固定 相 填料 常 有 下 列 几 大 类 ; 1. 按 形 状 可 分 为 球形 和 无 定形 两 类 ， 圆 球形 填料 有 利于 分 离 效率 和 重 现 性 。 2. 按 硬度 可 分 为 硬 质 填料 , 半 硬 质 填 料 凝 胶 及 一 些 如 琼脂 糖 的 生物 软 胶 。 3. 按 结构 可 分 为 表面 多 孔 薄 层 填料 与 完全 多 和 孔 填 料 两 类 : 现 根据 不 同色 谱 的 要 求 , 介 绍 一 些 常用 固定 相 填 料 的 名 称 及 其 主要 结构 的 性 质 。 (一 ) 液 一 液 分 配色 谱 常用 的 固定 相 填料 液 一 液 分 配色 谱 的 固定 相 一 般 多 选 表面 积 小 ,孔径 较 大 的 为 填料 ,全 多 孔 和 表层 多 筷 填料 都 能 用 于 制备 液 一 液 分 配色 谱 , 主 要 有 : 1. 全 多 孔 硅 珠 : 如 商品 名 Porail 或 Spherosil, 2. 表层 多 和 孔 硅 胶 : 如 商品 名 .Zipax 和 Corasilo 3. 化 学 键 合 相 : 是 在 表面 多 孔 或 全 多 和 孔 的 小 球 上 经 过 化 学 反应 结合 上 一 层 固 定 相 。 有 的 在 多 和 孔 硅 珠 上 用 醇 类 脂 化 生成 脂 化 硅 质 填料 ( 刷 型 ) 如 商品 名 Drapak， 或 经 硅烷 化 生成 聚 硅 氧 烷 型 ( 涂 层 型 ) 盾 料 如 商品 名 Permaphase, 以 上 化 合 键 合 相 固定 相 都 比较 稳定 ， 不 易 在 使 用 中 脱落 。 (=) 液 一 国 吸 附 色谱 常用 的 国定 相 填 料 与 经 典 吸附 色谱 相似 , 需要 选择 良好 表面 吸附 性 能 的 物质 ， 其 中 极 性 吸附 剂 有 硅 胺 、 氧化 铝 、 氧 化 镁 、 硅 酸 镁 (Florisil) 等 。 非 极 性 吸附 剂 有 活性 火 。 如 按 结构 和 性 质 不 同 又 可 分 为 : “1 工 全 多 和 孔 高 效 吸附 剂 “如 全 多 和 孔 硅 胶 〈 商 品 Porasil A-F)， 全 多 孔 氧 化 铝 (商品 Bio-Red AG) 等 。 2. 全 多 孔 低 效 吸附 剂 ”如 多 和 孔 硅 胶 (商品 Divason Code 800)。 3. 表面 多 孔 吸 附 剂 ”如 薄 壳 型 硅胶 (商品 Corasil I) 及 用 于 制备 高 容量 薄 壳 型 氧 化 铝 (商品 Pellumina HC), (=) 离子 交换 色谱 常用 固定 相 填 料 主要 有 离子 交换 树脂 制 成 的 微 网 或 大 网 状 结构 的 全 多 孔 颗 粒 ， 或 在 固体 惰性 核 上 涂 渍 一 层 多 孔 离 子 交 换 剂 而 成 薄 壳 结构 。 离 子 交 换 剂 的 骨架 有 聚 茶 乙 烯 ， 葡 萄 糖 和 纤维 素 * 103。 等 。 它 们 都 可 以 带 上 大 量 可 交换 基 团 。 一 些 以 糖 基 为 骨架 的 离子 交换 剂 适用 于 分 离 各 生物 大 分 子 物 质 , 使 用 较 多 的 有 : 弱 碱 性 DEAE Sephadex A25, A50, 强 碱 性 QAE Sephadex A25，A50。 弱酸 性 CM Sephadex C25, C50, 强酸 性 SP Sephadex C25, C50, (四 ) 凝 胶 色谱 常用 固定 相 填 料 用 于 凝 胶 色 谱 的 凝 胶 有 : 1. 软 胶 和 半 硬 胶 , 如 葡 聚 糖 凝 胶 (Sephadex) 交 联 系 丙 烯 酰胺 凝 胶 〈Bio-gel-P) MET Ht (Sepharose) 等 ,这 些 凝 胶 多 使 用 水 或 缓冲 液 作 流动 相 ， 凝 胶 承 受 压力 较 低 ， 一 般 在 7 一 14 巴 之 间 , 过 去 由 于 高 效 澈 相 色 溢 高 压 泵 的 设计 未 能 满足 这 一 技术 和 要求, 在 生化 中 实 际 应 用 很 少 。 近 年 来 由 于 制 出 了 流速 低 而 稳定 的 低压 泵 及 各 种 防止 缓冲 液 中 金属 的 腐蚀 的 装置 ,生物 凝 胶 类 填料 才 广泛 用 于 HPLC。 2. 刚性 和 半 刚 性 凝 胶 , 包 括 刚性 多 孔 玻璃 和 多 和 孔 硅胶 (商品 Bio-glas, Porasil 和 Merck- O-gel-Si 等 ); 半 刚性 聚 葵 乙 烯 珠 〈 商 品 Poragel，Styragel，Bio-Bead-S) 乙烯 乙酸 脂 珠 ( 商 tu Merck-O-gel-OR)， 以 上 刚性 和 半 刚 性 凝 胶 一 般 均 可 承受 60 一 70 巴 以 上 压力 ,并 能 在 有 机 溶剂 中 使 用 。 四 、 色 谱 方法 的 选择 待 分 离 样品 对 色谱 法 的 选择 主要 基于 样品 的 物理 化 学 特性 及 溶解 度 。 对 于 一 个 未 知 样品 ,首先 要 大 概 了 解 它 的 分 子 大 小 ,然后 进一步 试验 其 溶解 性 能 。 根 据 分 子 大 小 和 溶解 性 能 便 又 粗略 地 选 定 一 种 色谱 柱 进行 初 分 .一 般 来 说 ,吸附 色谱 多 适用 于 非 极 性 样品 , 它 的 柱 容量 主要 决定 于 吸附 剂 表面 积 的 大 小 。 离 子 交 换 色 谱 和 波 一 液 分 配色 谱 多 用 于 水 溶性 样品 , 柱 容量 分 别 决 定 于 离子 交换 量 和 固定 相 中 国定 液 的 体积 , 凝 胶 过 滤 色 谱 可 根据 填料 的 性 能 不 同 分 别 用 于 亲 水 和 亲 脂 性 样品 ,但 以 上 选择 也 不 能 绝对 化 ,如 吸附 色谱 的 填料 经 过 特殊 处 理 后 也 可 以 吸附 极 性 很 强 的 水 溶性 化 合 物 ， 流 一 液 分 配色 谱 的 正 相 和 反 相 就 可 分 别 用 于 分 离 极 性 和 非 极 性 化 合 物 。 关 于 对 色谱 方法 的 选择 ,可 参考 工 .R. HAR (Snyder) 和 J. J. 柯 克 兰 (Kirkland) 合 著 的 “现代 液 相 色谱 法 导论 "一 书 中 所 提出 的 图 解 ( 见 图 4- 14)。 另 LKB 和 Beckman 公司 根据 他 们 生产 的 产品 也 提出 了 类 似 选 择 色 谱 方法 的 图 解 〈 见 图 4-15, 图 4-16), 均 可 结合 我 们 具体 情况 参考 选择 。 注 :离子 对 分 配色 谱 , 是 可 离子 化 或 离子 型 的 化 合 物 (在 水 的 介质 中 ) 用 一 个 适当 的 反 离 子 (如 四 烷 基 贸 化 物 / 苦味 酸 ) 与 离子 或 可 离子 化 的 溶质 生成 离子 对 ,该 离子 对 便 在 二 相 中 产生 新 的 分 配 系数 ,大 大 提高 柱 分 离 率 和 选择 性 ,此 法 用 途 很 广 。 五 、 分 离 度 的 调整 被 相 色 谱 的 分 离 度 ( 或 称 分 辩 率 ) 常 以 下 面 公式 表示 : 。104 。 = ee aaa ”Slyragel 非 水 溶 BRE SAYS | HEB / pens __Porasil 一 高 于 2000 一 Sephadex -一 seb ee 滤 色 谱 | 。 | _ 多 和 孔 玻璃 _| 凝 胶 过 滤 色 谱 | Sephadex (小 孔 ) 和 aie! os ee 一 树脂 Aminex-A 25 Feds yk _| nak we eta” 22831 。 | 薄膜 (pellioaex-SAX) pate 阳 ii (Durrum Type DCIA) Ke “交换 剂 ” | 薄膜 (Zipax SCA) _ | 分 配色 谱 上 水 / 蜡 辛 烷 / 乙 醇 一 三 元 (含水 固定 相 ) 一 低 于 2000 四 HB | Poragel 透 色 谱 Ae jt 非 水 盗 ( 按 分 子 大 小 显著 差异 分 离 ) 了 Corasil-II 让 吸 色 —Corasil- 名 是 帮会 凡人 e | 和 zaoes 一 Pellumina-HS é: —6,6'- A= Ak 极 性 化 合 物 —ETH-Permaphase/ 环 A (常规 分 配 ) Diss Pie 不 稳定 & if walk EP eae} Fist | zk 非 极 性 一 一 | 一 ODS-Permaphase/ - _ Key ( 反 相 分 配 ) ”| KAS 一 聚 烃 /水 - 乙 且 4-14 省 相 色 谱 方法 选择 _1f@-1) > /(_% . R= 7 a )VN (Se) 《1) 2, 表示 分 离 度 , 也 即 是 在 色谱 图 中 二 个 相 邻 的 峰 分 离 的 程度 。R, RK, RAR 二 峰 尖 分 隔 愈 远 , 二 峰 的 峰 宽 越 窗 。 分 离 度 也 可 以 在 色谱 图 计算 而 得 ,下 面 是 一 个 双 组 分 的 色谱 图 : R, 25 a(t, a te, W, + W; Wi, W2 AANA — PMH TE ERE, te,» te, OFA“ AY PR BT TT o 2) N 表 示 理 论 塔 板 数 。 N 与 柱 长 (L) 成 正比 ， 与 每 个 理论 塔 板 的 高 度 (H) 成 反 ko BIN 一 二 py 互 也 是 一 个 色谱 柱 单位 长 度 的 效率 的 量度 ， 小 的 五 意味 着 得 到 高 的 柱 效 率 , 它 受 各 种 因素 的 影响 ， 如 小 的 填料 颗粒 直径 , 低 的 溶剂 度 速 和 粘度 ,以 及 提高 分 离 温 度 均 可 获得 较 小 的 互 值 。 。105。 色谱 法 LKB 产品 的 选择 HPLC-CAT-EOL P.5 BRA 2150 HPLC 和 泵 一 流速 可 控制 10ul 一 5ml/min 之 内 核酸 2154 注射 器 — 2210 ia 2158 紫外 检测 器 区 制备 色谱 柱 2135 LKB Ultropac TSK G2,000, 3,000 或 4,000 sw 21.5mmX 60mm (2135 蓝 色 柱 ) 如 特异 吸附 少 , 回收 率 高 , 每 次 相 可 分 离 样 品 最 高 达 100 Soe, LET EAR LAA 碎片 能 经 受 变性 剂 及 各 种 去 污 剂 的 侵蚀 。 (2) RK 离子 交换 色谱 BEE 2150 HPLC # boa | 2154 注射 器 2210 记录 器 2158 紫外 检测 器 液 11300 Ultrograd 梯度 混合 器 制备 色谱 柱 : LKB 535/545 CM/DEAE 柱 ，21.5X150mm (2133 蓝 色 色 柱 ) 谱 RAK KE 2150 HPLC # 小 分 子 化 合 物 2154 注射 器 (氨基 酸 ) 2210 记录 器 BEE . 2158 紫外 检测 器 或 2151 UV/VIS 检测 器 2134 一 210 Lichrosorb RP-18 2134-220 Lichrosorb RP-8 2134 一 230 Lichrosorb RP-2 4-15 LKB 产品 色谱 方法 的 选择 (3) 5 为 选择 因子 也 称 分 离 因 子 ,是 二 种 物质 容量 因子 之 比 。 ae Ki 选择 因子 (a) 可 以 通过 变更 流动 相 和 固定 相 的 组 成 性 质 而 改变 。， (4) K' 为 容量 因子 ,一 般 可 以 看 作 淤 质 在 固定 相 中 的 总 摩尔 数 与 在 流动 相 中 总 摩尔 之 比 。 对 于 一 定 的 柱子 溶剂 分 离 温度 和 样品 浓度 足够 小 时 , K' 是 一 个 常数 ， 容 量 因子 与 分 配 常数 关系 如 下 : | |_ Kea BEAR 、 固 定 相 体积 RARER ”流动 相 中 溶质 浓度 ”流动 相 体积 ， bs 固定 相 体积 — BROT * oe RB 以 上 影响 分 离 度 的 三 个 因子 c、N、K' 基本 上 是 独立 的 , 可 以 调整 好 其 中 一 项 ， 然 后 再 调整 另外 两 项 ， 不 一 定 三 项 同时 改变 。w、N、K' 三 个 因子 对 R。 的 影响 情况 比较 复杂 ， 每 一 因子 的 作用 都 可 以 作 专门 的 论述 。 对 于 二 个 组 份 的 色谱 峰 来 说 ， 变 动 选择 因子 “ 时 ,ec 使 其 中 一 个 谱 峰 发 生 位 移 , 而 峰 高 不 变 。 增 大 理论 塔 板 数 扩 时 ， 可 以 使 二 个 谱 峰 同 时 变 窗 , 峰 尖 增高 。 而 变动 K' 时 ,对 分 离 度 影响 较 大 ,减少 K 时 ,又 使 谱 峰 提前 呈现 , 但 分 离 度 减少 ,增加 K' 可 以 提高 分 离 度 , 但 延长 分 离 时 间 , 谱 带 变 宽 。 图 4-18 表示 ws N、 ¢ 106 « HOUR HHH ueuryseg 9fT-y 图 Mk re XSI-[28oroydsn |。 sp: ee EB a oas 炒 类 I?3oroUdsn EX Tae ye fa oas 炒 非 OH/NOV MSR Hd | | O°H/HOPW Sao-e79ydsen Miri 2 < 一 dI eseydstayQ “| < 一 mii <— EY ie Val 3% VSH fel Da Ly xt at sao 一 一 二 -3JoUdseID OH/NOV dI-aroUdsezIO OH/AHO2WN fx tia + UG OoUP4D O*H/NOY ss9ydsesiiQ "HN TITSeJTID o'H/HOPW bade [4199 -ar0ydsesyQ SAO-e94dseyIN Wife \<— EM | _ CAPE Ree 2 | | [432O-arlaUdseIID 一 SGO-arf9UdszIID MEMdE ”| < 一 BY ay O'H/NOV O°H/HOPW VdI “HO?W a teehee Vdl peri Is [tg asoydseniy 一 | Be Le pie *IO"HO | ， asoydsvayjQ zTDzH Mpa QE SEE | | SHIN Tse Dever tra 下 w2LM ouekD VdI “HOW |’ -5I9UdszIIO IS-aroUdseIID |< 一 | z[IDzHD “HHL -3JoUdsPIl[D < 一 fx | NOV “HO?W BY 27 ACE WMoOLY B/ROMB H/ RH BLUR af 96 HYG 4g BHY—K Wee Fay wy ©107 + KR’ 三 个 因素 对 色谱 图 的 影响 。 在 制备 色谱 图 中 ,党 和 在 混合 组 份 中 要 求 分 离 其 中 一 个 组 份 ,此 组 份 如 在 谱 图 中 是 一 个 较 大 的 峰 时 ,可 先 提高 分 离 度 (改变 流动 相 成 份 ) 使 成 为 单 峰 ,再 使 桩 品 的 负载 增 至 最 大 ， 然 后 收集 谱 峰 中 心 部 分 。 如 所 要 求 组 份 在 谱 图 中 是 一 个 较 小 的 峰 〈 表 示 样 品 | 1 | 1 | 4-17 一 个 双 组 份 色谱 图 计算 R, 的 方法 图 4-18 改变 <、K'、N 保留 时 一 一 tR 分 辩 率 一 一 R。 峰 宽 一 一 W 对 样品 色谱 图 影响 中 含 所 要 求 组 份 的 量 很 少 )， 便 经 过 多 次 分 离 将 此 组 份 收集 浓 集 后 再 上 柱 ， 按 第 一 种 情况 处 理 , 先 提高 分 离 度 , 使 成 单 峰 , 然 后 在 超 负 荷 下 收集 纯 品 。 六 、 具 体操 作 及 注意 事项 (—) 进 样 前 准备 工作 首先 使 用 的 溶剂 , 即 流动 相 要 求 具 有 较 高 纯度 。 有 机 溶剂 事前 须 重 蒸 ; 用 水 要 经 过 混 合 离子 交换 树脂 处 理 和 活性 炭 处 理 后 ， 重 蒸 除去 各 种 杂质 才能 使 用 。 盐 类 稼 须 经 过 重 结 \FEIo 各 种 溶剂 一 般 要 求 新 鲜 配 制 , 使 用 前 经 过 脱 气 处 理 。 挥发 性 有 机 溶剂 脱 气 较 常 用 方法 是 超声 波 振荡 。 水 和 缓冲 液 先 通过 微 孔 薄膜 滤 去 固 体 微 粒 后 ;缓慢 加 热 搅拌 (在 电磁 搅拌 器 上 ) 抽 真空 去 气 。 样品 加 入 前 ,必须 用 流动 相 充分 洗 柱 , 待 流出 液 经 过 检测 器 的 基线 校正 ， 证 明 柱 内 残 留 杂 质 确 已 全 部 除 净 ,才能 进 样 。 进 样 时 ,样品 用 与 流动 相 相同 的 或 互 溶 的 溶剂 完全 溶解 , MARR, Folie 去 ,然后 通过 注射 器 或 进 样 阀 进 样 。 进 样 量 的 多 少 , 视 不 同 的 柱 容量 而 定 , 一 般 制 备 性 柱 每 次 最 大 上 柱 量 可 达 10 一 100 毫克 。 C=) 洗 脱 进 样 后 洗 脱 的 条 件 常 按 事先 计划 好 的 溶剂 程序 进行 ,内 容 一 般 包括 : C1) 每 次 色谱 计划 所 需 时 间 。 。108 。 (2) 洗 陪 液 ( 即 流动 相 ) 的 组 份 (单元 或 多 元 ) 及 对 形成 梯度 的 要 求 。 如 样品 各 组 份 与 固定 相 之 间 的 亲 和 能 力 差别 较 大 时 ， 采 用 梯度 洗 脱 方法 〈 包 括 极 性 , pPHE 和 离子 强度 的 改 变 ), 可 获得 较 好 的 分 离 效果 。 (3) 流动 相 的 流速 ,是 恒 速 或 变速 或 每 分 侦 时 内 要 求 流动 相 的 流速 。 实际 上 ,样品 展 层 以 后 所 得 色谱 图 一 次 很 难 获 良好 的 分 离 效 果 , 需 要 根据 色谱 图 各 组 峰 形 状 、 位 置 进行 综合 分 析 , 并 按 自己 所 需 制 备 的 组 份 的 谱 峰 分 离 情况 调整 流动 相 的 极 性 (或 离子 强度 ) 梯 度 组 合 、 流 速 及 展 层 时 间 等 。 以 上 这 些 因 素 一 般 现 代 高 效 液 相 色 谱 仪 都 有 自动 控制 程序 装置 ,再 加 上 检查 温度 和 pH 对 分 离 的 影响 , 直至 选择 到 最 好 的 分 离 条 件 后 , 便 开 始 大 规模 分 离 , 收 集 所 需 的 组 份 。 各 类 色谱 柱 加 进 样品 后 如 何 选择 适应 的 洗 脱 液 ( 即 流动 相 ) 其 基本 原理 与 经 典 色谱 洗 脱 法 大 致 相同 。 例如 液 一 液 分 配色 谱 的 正 相 与 反 相 色谱 的 操作 和 原则 大 致 如 表 4-5。 R45 正 相 与 反 相 色谱 操作 原则 z= 了 相 RK 固定 相 极 性 强 C5 AFA IR HE Beh 中 至 强 Feindé ii REA yeh 强 极 性 组 份 先 流 出 增加 溶剂 极 性 的 影响 减少 洗 脱 时 间 增加 洗 陪 时 间 当然 高 效 液 相 制 备 色 谱 对 流动 相 的 要 求 , 需 照顾 到 与 检测 器 相 匹配 ,同时 还 要 尽 可 能 获得 较 大 的 分 离 度 , 因 此 ,使 用 有 机 溶剂 时 要 求 粘度 要 低 并 有 一 定 挥 发 度 。 其 中 最 稼 用 的 有 机 溶剂 有 乙 且 * 里 醇 三 氧 甲烷 \` 已 烷 、 硝 基 丙 酮 等 。 有 些 工 厂 生产 的 色谱 柱 还 限定 不 准 使 用 某 种 溶剂 , 则 应 注意 遵守 。 (=) 色谱 柱 的 清洗 及 保存 色谱 分 离 完毕 后 ,应 用 溶剂 彻底 请 洗 色谱 柱 , 或 色谱 柱 用 后 存放 时 间 过 久 也 应 定期 清 洗 。 硅 胶 柱 先 用 甲醇 和 乙 且 冲 洗 ( 乙 有 睛 价格 较 贵 ,可 少 用 ,多 用 甲醇 ) 再 用 干燥 的 二 氧 甲 烷 清洗 后 保存 ， 烷 基 键 合 相 色谱 柱 可 用 甲醇 一 氯仿 一 甲醇 一 水 顺 次 交叉 冲洗 除去 有 脂 溶 性 及 水 溶性 杂质 。 离 子 交换 柱 可 按 一 般 经 典 方法 经 过 酸 碱 缓冲 液 平 衡 后 ， 再 以 水 和 甲醇 洗 净 。 凝 胶 柱 则 以 根据 其 使 用 流动 相 的 不 同 分 别 以 甲苯、 四 和 氢 叶 叶 、 和 氯仿 或 水 大 量 冲洗 至 净 。 但 亲 水 性 凝 胶 及 其 他 亲 水 性 色谱 柱 保存 时 ， 常 加 入 少量 甲苯 或 氯仿 以 防止 微生物 污 Ro 《四 ) 一 些 生化 样品 分 离 色 谱 图 的 举例 高 效 波 相 色谱 的 使 用 ,除了 认真 了 解 仪器 的 设计 原理 和 各 种 色谱 柱 的 性 质 , 应 用 范围 外 ,要 真正 掌握 好 这 门 技术 ,还 要 通过 大 量 实 践 才 能 得 心 应 手 。 目 前 国外 内 高 效 液 相 色谱 仪 和 色谱 柱 型 号 繁多 ,每 个 厂家 对 于 自己 产品 都 有 比较 详细 说 明和 应 用 举例 ,只 要 遵守 操 作 规则 及 结合 有 关 色 谱 的 原理 加 以 具体 运用 ， 在 短期 内 掌握 仪器 操作 开展 实验 工作 是 不 困难 的 。 下 面试 举 几 个 生物 样品 分 离 色谱 图 的 例子 , 供 读者 参考 5 1. 标准 核 昔 酸 混合 液 的 分 离 : 使 用 一 种 大 孔径 多 和 孔 硅 胶 高 效 阴离子 交换 剂 ， 分 * 109 。 离 各 种 5 - 核 背 磷酸 盐 ， 在 室温 下 进行 ,每 次 色谱 时 间 约 35 分 钟 。 色 谱 条 件 及 结果 见 图 4-19。 2. 数 种 单 糖 及 双 糠 的 分 离 9 PAP REBRAMDALER, (FERK-KOK 色谱 , Behe GHA: 7K (80:20) 出 峰 顺 序 与 样品 的 极 性 相同 , 极 性 强 最 后 被 洗 脱 ,色谱 条 件 及 结果 见 图 4-20。 3. 人 血清 蛋白 的 分 离 ”使 用 的 是 一 种 KLB 出 品 的 凝 胶 制 备 柱 ， 每 次 可 进 样 品 1.5 毫升 血 3 214 a, o. SRE Q oO. Zz Ee Sak 2 ¥! at 5 ‘ } A, 类 | 17 (5 2] is iy 全 On 名 | 1 一 Bi Os 0 |o a e 8 | 9 6 4 | i} 人 10 20 30 0 6 12 18 24 分 钟 (分 ) 4-19 标准 核 背 酸 混 合 息 的 分 离 4-20， 几 种 单 糖 及 双 糖 的 分 离 样品 : 12 种 5 " 核 苷 酸 混合 液 样品 : Ll, 2. 木 糖 ， 3. 1. 色谱 柱 : Polyomion Si 阴离子 交换 柱 5. FER «6. FURR PEN: BH th BHR 0.01 摩尔 至 1 摩尔 pH 7.0 色谱 柱 : Partisil 1025-PAC 柱 (10u) 4.6 X 250 mm 流速 : 0.4 毫升 /分 Bei: CiA27K (80:20) pH5.0 (HaPO4)， 流速 : 检测 : 紫外 254 nm 1.3 毫升 /分 检测 : 折光 计 & 一 = a 口 a 4! ll 4-21 人 血 精 蛋白 质 分 离 色谱 图 样品 : 未 稀释 的 人 血清 1.5 毫升 “色谱 柱 : LKB Ultropac, TSK G-4000 SWG 2135 蓝 色 柱 21.5X600mm; 流速 : 70 微 升 /分 检测 器 UV 280nm 铺 ;, 回 收 率 可 达 90% 以 上 ,色谱 条 件 及 结果 见 图 4-21。 4. 长 春花 培养 细胞 中 有 取 | 唆 生物 碱 的 分 离 5] 使 用 Water w Bondapak C18 (十 八 席 基 硅 烷 ) 反 相 色 谱 柱 , 按 Perkin-Elmer 3B 编 序 ,溶剂 系统 分 配 如 下 : ° 110+ 一 一 | 一 | 一 一 一 | 一 | 一 | 一 一 A Zit 35 40 55 85 90 90 B. 10mM 磷 琶 缓冲 液 CpH7.5) 75 55 45 15 10 10 时 间 ( 分 ) 0 10 10 25 5 hee 2 1 4 1 1 色谱 结果 如 图 4-22。 (autd:yeuly) et ~ 2) & rs S —] 人 他 E.. 5 © ~ 0.D254nm 时 间 (43) 4-22 长 春花 培养 细胞 中 吗 喧 生物 碱 的 分 离 样品 : 粗 生 物 碱 “色谱 柱 : 上 Bondapak C18 十 八 烷 基 硅烷 柱 “ 洗 脱 波 : Cia /10mM 磷酸 缓冲 He (PH7.5) 梯度 洗 脱 “” 流 速 : 1 毫升 /分 检测 器 : 紫外 ，254nm &$ + x SR 11) 姚 广元 * 古 德 珍 : 中 草药 ,第 五 期 ，41 页 (1982) 芷 2 ] Morris, C. J. O. 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BIER: 未 发 表 的 工作 。 -lile 第 五 章 ”生物 大 分 子 的 色谱 分 离 法 程 明基 生物 大 分 子 的 色谱 分 离 法 是 六 十 年 代 以 后 发 展 起 来 的 一 类 新 技术 s 包括 多 糖 基 离子 交换 色谱 法 、 分 子 得 色谱 法 \, 亲 和 色谱 法 和 色谱 聚焦 法 等 。 这 类 方法 的 建立 ,其 原理 虽然 不 完全 相同 ,如 分 子 得 色谱 分 离 主要 建立 在 分 子 大 小 形状 差别 的 基础 上 , 亲 和 色 谱 则 根据 分 子 生物 功能 团 对 载体 上 的 配 基 的 特殊 亲和力 而 建立 。 但 在 总 体 上 都 属于 色谱 分 离 范 畴 ， 即 生 物 大 分 子 与 其 他 组 份 的 分 离 主要 依赖 于 溶质 彼此 间 理 化 性 质 的 差别 在 固 相 载 体 和 访 动 相 之 间 分 布 和 流动 速度 不 同 而 达到 分 离 目 的 。 生物 大 分 子 色 谱 分 离 与 生物 小 分 子 色谱 分 离 在 固 相 载 体 性 质 和 色谱 条 件 上 要 求 稍 有 不 同 。 第 一 生物 大 分 子 要 求 固 相 载 体 具 有 亲 水 性 ， JESS Re. 使 生物 大 分 子 易于 接近 和 出 人 固 相 部 分 ,通过 表面 吸附 或 筛 眼 作 用 达到 分 子 之 间 的 分 离 ; 汪 外 ,要 求 固 相 载体 对 生物 大 分 子 生理 活性 有 稳定 作用 , 按 上 述 要 求 ， 各 种 来 源 于 生物 材料 的 凝 胶 及 其 衍生 物 是 比较 理想 的 固 相 载体 , 凝 胶 的 使 用 ,是 生物 大 分 子 色 谱 分 离 近年 来 得 以 迅速 发 展 最 主要 原因 之 一 。 第 二 ,与 生物 小 分 子 比 较 , 生 物 大 分 子 色谱 分 离 条 件 ( 包 括 上 柱 : 洗 脱 等 工序 )， 要 求 比 较 温 和 。 一 切 强酸 、 强 碱 ,高 压 \ 高 温 都 不 适用 。 生物 大 分 子 色 谱 分 离 在 近代 生化 制备 技术 中 ， 在 细 分 阶段 使 用 较 多 ， 效果 也 远 比 其 他 方法 好 。 因 每 一 种 色谱 原理 和 方法 所 涉及 的 知识 面 都 很 广 ， 在 本 丛书 中 其 他 分 册 中 已 另 有 详细 介绍 ,这 里 为 了 对 生化 制备 技术 有 一 系统 认识 ,只 结合 制备 有 关 方 面 作 一 简要 补充 介绍 。 第 一 节 ” 多糖 基 离 子 交 换 剂 色谱 法 这 类 交换 剂 中 应 用 最 广泛 的 有 离子 交换 纤维 素 和 离子 交换 交 联 葡 聚 糖 两 类 ,另外 ,还 有 离子 交换 琼脂 糖 , 但 应 用 不 广 。 其 中 离子 交换 剂 特别 适用 于 生物 大 分 子 活 性 物质 《如 有 蛋 白质 、 核 酸 及 其 衍生 物 ) 的 分 离 。 因为 这 类 交换 剂 的 多 糖 骨 架 来 源 于 生物 材料 * 且 亲 水 性 、 对 生物 活性 物质 是 一 个 十 分 温和 的 环境 。 它 们 的 色谱 原理 与 离子 交换 树脂 基本 相同 呈 沁 。 一 、 多 糖 基 离子 交换 剂 的 分 类 (—) 离子 交换 纤维 素 离子 交换 纤维 素 是 开放 性 的 长 链 骨架 ,大 分 子 物 质 也 能 自由 地 进 人 和 了 迅速 地 扩散 ; 它 也 有 较 大 的 表面 , 故 对 生物 大 分 子 的 吸附 容量 比 离子 交换 树脂 大 得 多 。 另 外 ,由 于 离子 交 换 纤维 素 上 所 含 的 离子 交换 基 团 较 少 ,排列 疏散 , 所 以 对 大 分 子 的 吸附 也 不 太 牢 固 ， 用 较 -112° Fi AA Ba 6 BY iA Sa hE HY BE <2 Bal Lo LB © Be Seb rny id ey SE A Ba 6 EY Hint Hd Bay Ls Ge DO Ed A ch Hi BY“ AY AY o'g> Hd 下 HAY p 2 一 1 Bio-Gel P-30，P-60 10 一 12 Bio-Gel P-100，P-150 24 Bio-Gel P-200, P-300 48 (=) 柱 的 选择 及 装填 色谱 柱 一 般 用 玻璃 管 或 有 机 玻璃 管制 成 , 管 底部 放置 玻璃 纤维 或 砂 芯 滤 板 (2 号 或 3 号 )* 上 面 再 装 上 2 厘 米 厚 的 玻璃 球 ( 球 径 约 0.5 厘米 ) 柱 顶部 联接 一 个 长 颈 漏斗 ,长 约 100 厘米 ,直径 约 为 柱 径 的 一 半 , 漏 斗 中 安装 搅拌 器 。 然 后 在 玻璃 柱 和 漏斗 中 加 满 水 或 洗 脱 剂 。 ©1276 在 搅拌 下 缓 缓 加 入 凝 胶 悬 浮 液 ,毛细 管 出 口 的 流速 维持 在 5 一 10 毫升 /分 。 凝 胶 粒 沉 积 管 底 后 关 紧 毛细 管 ,使 其 自然 沉积 达 1 一 2 厘米 时 再 打开 毛细 管 ,直至 达到 所 需 高 度 为 止 e 拆 除 漏 斗 , 用 较 小 的 滤纸 片 盖 住 凝 胶 床 表面 ， 的 水 或 洗 陪 剂 洗涤 过 夜 。 色谱 柱 的 大 小 规格 的 选择 也 很 重要 ， 通 常 对 于 高 分 辩 率 的 桂 则 采用 高 的 K 着 加 即 长 度 / 直 径 ) 比 率 。 例 如 ，Killander oe L/D 4 23:1, RRR. H 了 提高 分 辩 率 有 人 甚至 采用 100:1 (L/D) 的 比率 。 增 高 柱 长 虽然 提高 了 分 辩 率 ,但 影响 流速 和 增加 了 样品 的 稀释 度 , 所 以 在 实际 操作 中 应 通过 系统 实验 来 确定 色谱 柱 的 大 小 ` 规 格 。 3 色谱 分 离 效 果 和 装填 起 来 的 色谱 床 是 否 均匀 有 大 关系 ， 因 此 使 用 前 必需 检查 装 柱 的 质量 ,最 简单 的 方法 是 用 肉眼 观察 色谱 床 是 否 均匀 ,有 没有 “纹路 ”和 气泡 ， 或 用 一 种 有 色 的 物质 的 溶液 〈 如 铁 蛋 白 液 ,印度 墨水 或 带 色 的 多 糖 溶液 等 )， 当 有 色 溶 液 流 过 色谱 柱 床 后 ;观察 色 带 的 移动 ,如 色 带 狭 罕 , 均 匀 平 整 ,说 明 性 能 良好 , 色 带 出 现 焉 曲 , 散乱 变 宽 , 则 必需 重新 装 柱 。- (=) 加 样 及 洗 脱 分 子 筛 色谱 中 由 于 其 洗 脱 曲线 是 分 配 等 温 线 , 溶质 的 浓度 与 分 配 等 温 线 无 关 ， 故 对 比 许多 其 他 的 色谱 法 ,溶质 可 采用 较 高 的 起 始 浓度 ,但 也 不 要 太 高 ,浓度 太 高 粘度 太 大 :一般 溶质 的 粘度 不 能 超过 盗 剂 的 两 倍 。 对 于 高 分 辩 率 的 分 子 筛 色谱 ,开始 溶 小 的 体积 主要 为 内 体积 (Ya 所 决定 ， 故 高 得 水 值 凝 胶 ( 如 Sephadex G-200)， 每 毫升 总 床 体 积 (六 可 加 0.3 一 0.5 毫克 溶质 ,使 用 体积 约 为 0.02 Vig 而 低 得 水 值 凝 胶 〈 如 Sephadex G-75) 每 毫升 总 体积 (Z) 加 深 质 量 0.2; 毫 克 ， 样品 体积 为 0.01 Vo ‘a Peon LE the DF it i RE 要 求 尽 可 能 保持 色谱 床 表面 的 稳定 ， 可 用 人 工 方法 , 当 色谱 柱 经 平衡 后 , 吸 去 上 层 液 体 , 待 平衡 液 流 至 床 表面 以 下 1 一 2 毫米 时 , 关 闭 出 口 ， 以 最 小 体积 样品 用 滴 管 慢 旬 加 大 ， ATH, 调整 流速 ,使 样品 慢 慢 盗 大 色谱 床 内 , 当 样 品 加 完 流 至 快 干 时 ,小 心 加 人 洗 脱 液 洗 脱 。 加 冬 呈 的 体积 越 小 ?分 离 效果 越 好 ， 二 样 体积 不 得 超过 (Ke 一 Ka )。 非 水 溶性 物质 的 洗 脱 都 采用 有 机 溶剂 《如 葵 和 丙酮 等 ), 水 溶性 物质 的 洗 脱 一 般 采 用 水 或 具有 不 同 离子 强度 和 pH MRR, pH 的 影响 与 被 分 离 物质 的 酸碱度 有 关 ， 在 酸 性 pH 值 时 , 碱 性 物质 易于 洗 脱 ,在 碱 性 pH 值 时 ,酸性 物质 易 洗 脱 。 多 糖 类 物质 的 洗 脱 以 水 为 最 佳 。 有 时 为 了 使 祥 品 增加 溶解 度 而 使 用 含 盐 洗 脱 剂 ， 盐 类 的 另 一 个 作用 是 抑制 交 联 葡 聚 糖 和 琼脂 糖 凝 胶 的 吸附 性 质 。 某 些 物 质 洗 脱 剂 的 选择 实例 见 表 5-13。 《四 ) BREN RIF 交 联 葡 聚 糖 和 琼脂 糖 都 是 多 糖 类 物质 , 极 易 染 菌 , 由 微生物 分 泌 的 酶 能 水 解 多 糖 的 糖 背 键 , 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 虽 不 是 微生物 的 生长 介质 ,但 其 溶 涨 的 悬浮 液 内 也 常 染 菌 而 改变 色 谱 特 性 。 为 了 抑制 微生物 的 生长 ,磷酸 离子 和 所 有 底 物 必 需 在 凝 胶 床 保存 之 前 完全 除去 ; 将 柱 真空 保存 或 低温 保存 ,但 温度 不 可 过 低 , 介 质 的 离子 强度 要 高 一 些 , 以 防冻 结 。 | «128 。 四 表 5-13 某 些 物质 的 洗 脱 剂 入 分 离 物 质 OB ee ee) 多 肽 ;氨基 酸 Sephadex G_25 乙酸 : Meme: 7K = 65215125 ; 血红 蛋白 ， 血 清白 蛋白 1% 琼脂 0.07 M piRedh enh pH 7.2 REAR Sephadex G-25 0.15M 磷酸 盐 缓 冲 液 pH8.0 RAHA, RASH Sephadex G-75 0.1 M 柠檬 酸 盐 -磷酸 盐 缓冲 液 pH7.0 蛋白 质 类 9% 琼脂 0.04M 磷酸 钾 -0.12 M KCI 缓冲 洲 os 0 让 染料 结合 蛋白 Séphadex G-25 0.1M :磷酸 盐 缓 冲 液 pH7.0 虫 潜 酶 ,碳酸 栈 酶 BETAS A Ss EH | 0.05M 磷酸 盐 组 冲 液 pH8.0 Sec BEAM Sephadex G-50 0.2M 乙酸 钠 pH4.9 酸性 磷酸 酯 酶 Sephadex G-75 1M 乙酸 BR _ 9% 琼脂 水 甲状 旁 腺 激素 Sephadex G-50 0.2M OMB-CEeREamMRK A 72 HERE i Sephadex -G-25 0.1M NH,OH KARE EM IE 8% 琼脂 0.2M NaH,PO,-0.3MNaCl pH6.8 维生素 Bi, Sephadex G-25 7k 43 ch Ay ee Sephadex G-50 0.5M 磷酸 缓冲 液 pH7.4 RACH 硅 酸 5 常用 的 方法 是 在 凝 胶 中 加 入 一 些 抑 菌 剂 ， 如 登 氮 钠 (0.02%); =ATH (0.01 一 0.02%); CAR RKB (0.005—0.01%); RHR ( BEKERKCRA RB 盐 、 确 酸 盐 ) (0.001—0.01 %)o (A) 凝 胶 的 再 生 和 于 燥 凝 胶 色谱 的 载体 不 会 与 溶质 发 生 任何 作用 ， 因 此 色谱 分 离 后 稍 加 平 衔 即 可 进行 下 一 次 色谱 。 但 在 实际 操作 中 常 有 一 些 污染 凝 胶 或 色谱 床 玫 面 ， 必 需 作 适当 处 理 。 交 联 葡 聚 糖 凝 胶 柱 可 用 0.2N NaOH 和 0.5 N NaCl 的 混合 液 处 理 , 缘 丙烯 酰胺 凝 胶 和 琼脂 糖 凝 蒋 由 于 遇 酸 碱 不 稳定 ,常用 0.5 N NaOH 处 理 。 经 党 使 用 的 凝 胶 以 温 态 保存 为 主 ， 只 要 在 其 中 加 和 适当 的 抑 菌 剂 就 可 放置 几 个 月 至 一 年 ,不 需要 干燥 ,尤其 是 琼脂 糖 凝 胶 , 干 燥 操 作 比 较 麻 烦 ,干燥 后 又 不 易 溶 涨 , 一 般 都 以 湿 法 保存 。 如 需 进 行 干 燥 时 应 先 将 凝 胶 按 一 般 再 生 处 理 彻底 浮 选 ,除去 碎 颗粒 ,以 大 量 水 洗涤 除 杂 质 ,然后 用 逐步 提高 乙醇 浓度 的 方法 使 之 脱水 煞 缩 ,方法 是 先 用 70% 乙醇 ,接着 Fe 90% Cm, 最 后 为 95 9 乙醇 逐步 脱水 ,然后 在 60—80°C. 下 干燥 或 用 乙醚 洗涤 干燥 。 四 、 分 子 筛 色谱 的 应 用 《一 ) 脱盐 生物 大 分 子 物质 (如 蛋白 质 、 核 酸 \ 酶 \ 多 糖 等 ) 在 分 离 提纯 时 ,常用 盐 溶液 洗 脱 , 故 洗 PS A ICDL eh» 一 般 采 用 透析 法 除 盐 ， 费 时 又 繁琐 ,如 果 采 用 分 子 筛 层 析 法 除 盐 , 时 间 短 ,也 不 影响 生物 大 分 子 的 生物 特性 。 荷 聚 糖 凝 胶 G-25 因 其 流动 阻力 小 , 交 联 度 适 宜 , 故 稼 用 于 蛋白 质 深入 的 脱盐 ,一 般 要 达到 完全 脱盐 , 溶液 的 体积 应 在 0.8 V, 以 下 ， 如 果 桩 品 MIBLAXK, 0.75V, 可 达到 完全 脱盐 ,但 在 一 般 情 况 下 ， 采用 0.3: 殴 左右 体积 即 可 on。 ©1249 6 进行 蛋白 质 样品 的 脱盐 应 注意 蛋白 质 溶液 在 去 除 电 解 质 后 因 咨 解 度 显 著 下 降 而 沉 证, 以 致 被 吸附 在 柱 上 不 能 洗 脱 下 来 ,解决 的 方法 是 先 使 用 含有 挥发 性 盐 类 (如 甲 酸 贸 \ 栈 BES AOR EAE ES. AMA eH AAA RoE PRE AR ATR 法 除去 挥发 性 盐 类 。 (=) 分 子 量 的 测定 用 一 系列 已 知 分 子 量 的 标准 样品 放 人 同一 凝 胶 色 谱 柱 内 ， 令 其 在 同一 条 和 件 下 进行 凝 胶 色 谱 分 离 , 记 下 每 一 种 成 分 的 洗 脱 体积 ,并 以 洗 脱 体积 对 分 子 量 的 对 数 作 图 ， 在 一 定 分 S540 + 4.5: ore eee whee 分 子 量 对 数 5-11 溶质 的 洗 脱 特征 和 分 子 量 之 间 的 相互 关系 一 一 全 一 全 一 一 ， 交 联 葡 聚 糖 G-200; 一 0 一 0 一 一 交 联 葡 聚 糖 G-100; 一 2 一 9 一 一， RRMA G-75; 子 量 范 围 内 可 得 一 直线 ， 这 就 是 分 子 量 的 标 准 曲线 (图 5-11)9ss9。 测 定 未 知 物 的 分 子 量 时 ， 可 将 样品 加 在 测定 了 标准 曲线 的 凝 胶 柱 内 , 洗 脱 后 根据 此 物质 的 洗 脱 体积 ,可 在 标准 曲线 上 查 出 它 的 分 子 量 。 用 本 法 测定 高 分 子 物质 的 分 子 量 时 不 需要 复杂 的 仪器 设备 ， 操 作 简 便 , 样 品 用 量 少 , 有 一 定 的 实用 价值 , 但 本 法 也 会 产生 一 定 的 偏差 ;如 对 一 些 纤维 状 蛋白 质 , 糖 蛋白 等 , 因此 要 作 精 确 的 测定 ,要 和 其 他 方法 结合 比较 。 (=) 用 于 物质 的 分 离 提纯 1. 糖 ”John 等 四 用 微 孔 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 P-2 SR RRERRE (Cn = 11)， 采 用 色谱 柱 127X15 BK, Bie) F4008, £ 65°C 用 水 洗 脱 , 流 速 28 毫升 /小 时 ,得 到 良好 的 分 离 结果 (图 5-12)e Laurent & Granath? 研究 了 在 Sephadex G-200 上 可 溶性 葡 聚 糖 的 一 系列 色谱 特性 。 了 吸收 度 420nm 3 4 时 间 〈 小 时 ) 图 5-12 在 Bio-Gel P-2 上 葡萄糖 赛 聚 糖 的 分 离 图 + 130¢ 1000 ， 1200 Vo HL (ml) Vi 5-13 在 Sephadex G-200 LWAEMRBOD RE ARE FB 13,600 (组 份 D-6) 到 59,000 (组 份 D-1) 用 92 X5.1 厘米 凝 胶 床 ， 以 0.2 M NaCl 洗 脱 , 流 速 1.5 毫升 /小 时 . OK, 分 离 结果 如 图 5-13。 2. 核酸 及 其 衍生 物 “用 分 子 解 色谱 法 研究 核酸 及 其 衍生 物 的 分 级 分 离 首 要 问题 是 选择 一 个 适当 的 固定 相 。 在 Sephadex G-100 或 G-200 或 相应 的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 上 都 可 满意 地 分 离 转 移 RNA (4S. 分 子 量 约 25,000 一 28,000) 和 5S 核糖 体 RNA, 但 对 于 核 糖 体 16S 和 238 及 信使 RNA 的 分 离 , 则 需要 较 大 孔 的 基质 (如 琼脂 糖 )。 这 可 能 是 由 于 核酸 和 具 相 同 分 子 量 的 球 蛋白 比较 有 较 大 的 分 子 体积 , 例 如 : Hayes & Mitchell! 发 现 一 个 合成 的 寡 聚 脱氧 核 昔 酸 (分 子 量 为 25,000) 在 琼脂 糖 柱 上 其 Fo/T。 (8 1.29, 而 在 同样 柱 止 对 c- 糜 蛋白酶 (分 子 量 22;500), 其 了 e/T。 值 为 2.29， 这 个 区 别 意 味 着 寡 聚 脱氧 核 苷 酸 有 比 蛋白 质 大 的 斯 托 克 (stoke) 44, 这 是 因为 核酸 链 中 相 邻 的 离子 化 磷酸 基 之 间 的 静 电 排 斥 结果 。 增 加 洗 脱 芒 的 离子 强度 可 以 降低 静电 效应 ,使 分 子 更 紧密 ,从 而 降低 这 种 排 A260nm 50 100 150 组 分 图 5-14 在 Sephadex G-100 上 大 肠 杆菌 细胞 的 RNA 的 分 级 分 离 «131° 斥 力 。 Reynier 等 2 用 Sephadex G-100 分 离 大 肠 杆菌 细胞 抽 提 液 的 RNA， 色 谱 柱 187X3 厘米 ,以 0.05 M NaCl 洗 脱 ， 得 色谱 图 5-14。 显 示 有 四 个 峰 ,第 一 峰 出 现在 色谱 柱 的 外 水 体积 中 , 含 核糖 体 16S #1 23S RNA, I 工 峰 含 一 些 中 等 分 子 量 的 代谢 上 稳定 的 RNA WE 合 物 , 峰 II 是 5S 核糖 体 RNA， 而 峰 IV 为 转移 RNA。 对 于 分 子 量 超过 500,000 的 溶质 的 分 离 , 特 别 是 对 那些 有 展开 结构 的 分 子 , 需要 大 筷 隙 的 固定 相 〈 如 琼脂 糖 丈 )。Oberg 和 philison’” 测定 了 细胞 和 病毒 的 沪 酸 在 几 种 不 同 的 琼脂 糖 浓 度 上 的 色谱 行为 ， 如 图 5-15 所 示 为 细胞 的 核酸 和 宥 骨灰 质 炎 病毒 RNA WS 成 混合 物 在 60X2.1 厘米 柱 的 工 % 琼脂 糖 珠 上 分 离 结果 。 峰 工 仅 含 DNA， 峰 开 含 病毒 RNA; 峰 ITI 和 1IV BARBRA RNA, A5-1 表示 分 离 过 程 中 琼脂 糖 浓度 变化 的 影 . ti], DNA 在 所 用 的 琼脂 糖 涂 度 下 都 被 排 阻 ， 而 tRNA 在 4% 琼脂 糖 浓度 的 K. 值 为 0.6， 在 1%% 琼脂 糖 浓度 中 则 上 升 到 1.0, 洗 脱 芒 bpE 在 5 一 8 范围 内 变化 对 分 离 影响 很 小 , NaCfi 浓度 从 0.01 到 1.0 M 的 变化 不 影响 DNA 或 tRNA 的 色谱 行为 。 由 此 看 出 DNA 完全 为 固定 相 所 排 阻 ,而 tRNA 有 一 个 紧密 的 构 型 ,核糖 体 (16 S 和 23 S) 和 腺 病毒 RNA AT NaCl 浓度 的 增加 而 降低 了 静电 排斥 ,从 而 形成 更 紧密 的 构 型 , 故 在 柱 上 有 更 大 的 阻 留 。 图 5-15 (c) 表示 腺 病毒 型 DNA (分 子 量 20X 10°), A HGR RIA RNA (4 F & 370,000) AUBE (AIA SP EA Be RNA (分 子 量 370,000) 41% 琼脂 糖 珠 上 的 分 离 结果 ,色谱 柱 长 60 厘米 。 hock wm 2 30 50 70 90 30 40 50 60 70 80 ira, cay (b) 床 体 积 的 百分数 (c) o— 55 Aus o—o %/4}1072 %—* 数目 /分 10-3 5-15 高 分 子 量 核酸 在 琼脂 糖 珠 上 的 分 离 (sa) HHMRAARE RNA 与 细胞 核酸 分 离 ; (b) 琼脂 糖 浓度 对 核酸 洗 脱 体积 的 影响 。 e—e DNA, O—O rRNA, O—O MiP AW RNA，X 一 X tRNA; (c) 病毒 核酸 的 分 离 ，X 一 X 腺 病毒 RNA, O—O #HHKRARE RNA，@ 一 @ 随 体 烟草 坏 关 病 毒 RNA 3. 蛋白 质 分子 筛 色谱 是 期 重要 的 应 用 是 血清 蛋白 的 分 级 分 离 。 按 分 子 大 小 可 分 为 二 组 。 第 一 组 (A) 包括 约 50% 总 血清 蛋白 ， 其 中 主要 为 白 蛋白 〈 分 子 量 70,000), 较 少量 的 o-1 前 白 蛋白 (分子量 61,000) ,血清 粘 蛋白 分子量 54,000) , 铁 传递 蛋白 (分 子 量 60,000); 第 二 组 (G) 包括 免疫 球 蛋白 ,主要 为 IgG 及 较 少 量 的 IgA、IgD MIgE (分 子 量 15,000—170,000), 少量 的 血浆 铜 蓝 蛋 白 ( 分 子 量 151,000) AREA (FH 200,000) 和 8-2A REA; 第 三 组 (M) 包括 免疫 巨 球 蛋白 IgM) Meo 及 8 脂 蛋白 〈 分 子 量 约 2,000,000—3,000,000), 图 5-16 (a), (b), Cc) 表示 在 Sephadex G-100,G-150 及 G-200 上 这 些 组 别 的 分 离 图 谱 。 分 离 结果 最 好 为 G-200， 在 聚 丙烯 酰胺 球 上 则 以 6x5 的 孔径 上 分 辩 率 最 佳 [加 | «1326 四 BE =v ‘Ae = 9 a sb: care =: W TPR RRA 2G) “Cy *(8) =] MURRAY Me :GD) “(2) *(p) $F xepeydas H (9) *(q) Ce) Be MT MS ea oT-¢ 图 0°? Hales “01 V 9 8 008 0S2 002 0ST 00T HAAIE 708 (3) HEELS UU 082 627i 002 OST (用 Mie Ls 00T WU 082 3a (9): (9) 0S1-—5 (®) 。133 — 5-16(d)、(e)、(f)]， 但 巨 球 蛋白 组 份 的 分 辨 率 最 好 为 5X5 的 凝 胶 。 蛋白 质 的 分 子 量 在 200,000 之 下 的 在 琼脂 糖 凝 胶 上 分 离 效果 不 好 ， 但 10% 的 琼脂 糖 浓 度 可 以 用 来 分 离 巨 球 蛋白 15-16(G) CH)、 CD]， 而 6% 凝 胶 仅 用 于 分 离 如 病毒 的 颗粒 ， 分 子 量 在 300,000 以 上 的 物质 。 对 于 分 析 分 离 的 实验 最 好 在 柱 直径 1 厘米 长 200 厘米 下 进行 , 床 体积 80 一 300 毫升 ， ! ”最 大 加 样 量 5 一 50 毫克 ， 这 对 于 大 分 子 溶质 的 混合 物 的 分 离 有 良好 的 分 辨 力 。 假如 适 当选 择 操 作 条 件 ， 在 制备 范围 上 可 获得 高 分 辨 力 ，Mauritzen S 4 300X7.6 BAKA Sephadex G-100 色谱 柱 上 对 0.5 克 小 牛 胸腺 组 蛋白 的 富有 精 氨 酸 组 份 的 分 级 分 离 ， 以 0.01 MHCI 洗 脱 ， 流 速 67 一 90 毫升 /小 时 。 分 离 结 果 如 图 5 一 17 GAME, Ho 个 组 分 收集 ,蛋白 质 回收 率 达到 85 多 ,组 蛋白 在 峰 II, 而 峰 IV AV ERA es Rk ER 际 上 均一 组 份 。 假如 应 用 特制 的 双 头 柱 , 工 / 比率 (403:1) 控制 适当 流速 ,1.5 一 2 毫升 / 小 时 . BOK’. BURT DF 0.04 毫克 /毫升 床 体积 )， 可 得 良好 分 辩 力 。 吸收 度 230fim bp KH (3245SH) 5-17 在 Sephadex G-100 上 富有 精 氨 酸 -组 蛋白 的 分 级 分 离 5-18 人 血浆 铜 蓝 蛋 白 的 循环 分 子 第 色谱 以 上 的 色谱 操作 多 采用 长 的 柱 , 故 柱 的 装填 及 操作 较 繁琐 , 但 在 许多 情况 下 , 可 用 一 | _ ois aii. “Foe 根 短 柱 , 以 循环 色谱 法 代替 。 例 如 Porath 和 Bennich” 报导 的 人 血浆 铜 蓝 蛋白 的 分 级 分 离 (图 5-18)。 用 粗 血 浆 铜 蓝 蛋 白 156 毫克 ， 93 X 2.2 厘米 色谱 柱 ,Sephadex G-100， 以 Tris-HCl 缓冲 滚 〈PH8.0) 循环 上 柱 , 流 速 20 毫升 /小 时 。 在 三 次 循环 后 得 到 A 和 B 成 分 的 不 完全 分 离 ,进一步 的 循环 色谱 可 除去 B 峰 的 尾随 物质 (阴影 部 分 ); 至 第 四 循环 时 A 部 分 已 与 任何 残余 B 部 分 分 开 ; 至 第 六 和 第 八 循 环 之 间 ， 某 些 尾随 物质 已 除去 ;到 第 八 循 环 可 得 纯 A 组 分 。 B= 亲 和 色谱 一 基本 原理 生物 体 中 许多 高 分 子 化 合 物 具 有 和 某 些 相对 应 的 专 一 分 子 可 逆 结 合 的 特性 ， 例 如 酶 蛋白 和 辅酶 .抗原 和 抗体 ` 激 素 及 其 受 体 核糖 核酸 与 其 互补 的 脱氧 核糖 核酸 等 体系 ,都 具 有 这 种 特性 。 生 物 分子 间 的 这 种 结合 能 力 称 为 亲和力 ， 根 据 生物 分 子 间 亲 和 吸 附和 解 离 的 原理 ,而 建立 的 色谱 法 称 为 亲 和 色 谱 法 。 亲 和 色 谱 的 基本 过 程 如 下 : 把 欲 分 离 的 可 亲 和 的 一 对 分 子 的 一 方 作为 配 基 《ligand)， 在 不 伤害 其 生物 功能 情况 下 与 不 溶性 载体 结合 使 固定 化 , 装 人 色谱 柱 ( 称 亲 和 柱 ), 然 后 把 含有 欲 分 离 物 质 的 混合 液 作为 流动 相 ， 在 有 利于 配 基 固 定 相 和 和 欲 分 离 物质 之 间 形 成 络 合 物 的 条 件 下 进入 亲 和 柱 。 这 时 ,混合 物 中 只 有 能 与 配 基 形 成 络 合 物 的 物质 分 子 被 吸附 ,不 能 形成 络 合 物 的 杂质 则 直接 流出 。 变 换 通 过 亲 和 柱 的 溶液 ,促使 配 基 与 其 亲 和 物 解 离 , 从 而 释放 出 亲 和 物 来 (如 图 5-19)。 基体 7 人 载体 亲 和 层 析 Y Me Wi 配 基 Wea = : 亲 和 物 CY rs ey 5-19 亲 和 色 谱 基本 过 程 示意 图 亲 和 色 谱 中 最 常用 的 生物 体系 如 下 : 酶 : 基质 类 似 物 , 抑 制剂 ,辅酶 。 抗体 : 抗原 ,病毒 ,细胞 。 外 源 凝 集 素 .多糖 , 糖 蛋白 ,细胞 表面 受 体 ,细胞 。 BB: 互补 碱 基 序列 ,组 蛋白 ,核酸 聚合 酶 ,结合 蛋白 。 激素 及 维生素 : 受 体 ,载体 蛋白 。 细胞 :细胞 表面 特异 蛋白 ,外 源 凝 集 素 。 亲 和 色 谱 的 优点 是 在 温和 条 件 下 操作 简单 ,效率 高 ,特别 对 分 离 含量 极 少 而 又 不 稳定 的 活性 物质 最 有 效 。 甚 至 从 粗 抽 提 液 中 经 亲 和 色 谱 一 步 就 能 提纯 几 百 至 几 千 倍 。 例 如 分 离 胰岛 素 受 体 时 ,把 全 岛 素 作为 配 基 , 偶 联 于 琼脂 糖 载体 上 ,经 亲 和 色 谱 ,从 肝 细 胞 抽 提 液 © 135。 中 纯化 达 8000 FF, 亲 和 色 谱 的 局 限 性 在 于 不 是 任何 生物 高 分 子 都 有 特定 的 配 基 ， 针对 某 一 分 离 对 象 就 需要 制备 专 一 的 配 基 和 选择 特定 的 色谱 条 件 。 由 于 琼脂 糖 这 一 理想 载体 的 出 现 以 及 固定 化 技术 的 改进 ， 使 亲 和 色 谱 技术 得 到 越 来 越 广泛 的 应 用 ,发 展 十 分 迅速 ,目前 已 有 几 百 成 功 的 例子 ， 也 有 了 作为 亲 和 色 谱 载体 的 商 品 供应 。 因此 ， 亲 和 色谱 技术 已 成 为 生物 化 学 中 分 离 提纯 生物 活性 物质 的 重要 方法 之 —-[28 29) ° =. 2k KY 2 亲 和 色 谱 的 理想 载体 应 具备 下 列 特性 : CL) ABE 2) BBE: TAKA, 容 许 大 分 子 自由 通过 ; (3) 高 硬度 及 适当 的 颗粒 形式 (最 好 为 均一 的 珠 状 )3(〈4) 最 低 的 吸附 力 ;〈5) 较 好 的 化 学 稳定 性 ;《67 抗 微 生物 和 酶 的 侵蚀 ; (7) 亲 水 性 ; (8) 具 大 量 的 供 反应 的 化 学 基 团 可 供 活 化 ,能 与 大 量 配 基 共 价 连 。 (—) AtEm SKF ARTEDE AP RASH. Lerman 最 早 用 于 酷 氨 酸 酶 的 分 离 , 将 酷 氮 酸 的 抑制 剂 对 茶 重 氮 酚 连接 于 纤维 素 上 ,用 来 提纯 蘑菇 中 的 栈 氨 酸 酶 辐 ; 黄 素 衍生 物 侦 联 于 羧 甲 基 纤 维 素 上 ,能 特异 吸附 肝 黄 素 激酶 ,使 酶 纯化 几 百倍 ”。 纤维 素 衍生 物 用 于 核 背 酸化 学 上 特别 有 效 , 例 如 ,用 于 纯化 核酸 的 互补 链 转移 RNA AKER 虽然 纤维 素 衍生 物 有 价 廉 及 来 源 充 足 的 优点 ， 但 由 于 它 的 纤维 性 和 非 均一 性 限制 了 大 分 子 的 挨 入 “22。 而 且 非 专 一 吸附 作用 较 严 重 , 因 而 限制 了 其 广泛 的 应 用 。 (=) FARR TAR ik WAR RBCE HR AARAAA MRK, BARNS DB ¢ (BS FL WR ROOK FF RADAR, RKB KERE—S 缩减 ,因而 在 亲 和 色 谱 中 的 应 用 也 受到 一 定 限 制 。 (=) RAM aR 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 物理 化 学 性 质 也 十 分 稳定 , 抗 微 生物 侵蚀 的 能 力 比 琼脂 糖 强 , 有 更 多 的 可 供 化 学 反应 的 酰胺 基 , 提高 了 配 基 的 浓度 , 故 特别 适用 于 配 基 和 亲 和 物 之 间 亲 和 力 比较 弱 的 系统 。 用 Biogel 制 得 配 基 高 度 取代 的 衍生 物 , 就 能 增强 物质 间 的 相互 作用 而 成 功 地 进行 亲 和 色 谱 。 从 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 为 载体 可 制 得 各 种 衍生 物 。 1. 登 氢 衍生 物 ”通过 聚 丙烯 酰胺 的 酰胺 基 经 水 合 肝 处 理 后 形成 酰 肝 基 ， 再 由 亚 硝 酸 处 理 而 成 和 氮 衍生 物 。 它 可 以 和 具有 脂 族 或 芳香 旋 毛 基 的 配 基 偶 合 〈 以 { 表示 聚 丙烯 酰胺 )。 Ha2O: —C—N; 9 NH,—| 配 基 wise! 到 二 2. 氟 基 衍 生物 ” 带 有 酰胺 基 的 聚 丙烯 酰胺 衍生 物 可 与 脂 族 二 胺 反应 制 得 氨基 衍生 物 。 它 可 以 和 带 羧 基 的 配 基 偶 合 。 利 用 脂 族 二 胺 中 的 烃 长 度 可 以 控制 手臂 的 长 短 。 | Wj H,N (CH,),NH, -—C—NH - NH, ———-————>§ — C - NH(CH,), NH; Hooc—| faa} 9 Be —_——__—>$ — C—NH(CH,), - N—C— 配 基 | — Wik eel BARRED RAMRMKRATEDUE-SME ARAB SRS 栈 衍 生物, 它 可 以 和 带 有 氨基 的 配 基 经 重 氮 化 后 相 偶 联 。 Zeit ree AN 二 IN 一 0 一 一 上 二 上 本 一 —OH [s nl 一 [rex | (四 ) SAR 多 和 孔 玻 璃 的 优点 在 于 不 受 微生物 的 侵蚀 ,经 受 得 起 有 机 溶剂 和 缓冲 波 组 成 的 改变 。 但 是 玻璃 表面 由 于 含有 羟基 ,因而 在 水 溶液 中 显示 轻微 负 性 的 表面 电荷 ,对 于 大 多 数 酸性 蛋 白质 病毒 \ 多 糖 或 核酸 , 洗 脱 时 没有 任何 阻挡 或 吸附 ,而 对 所 有 强 磊 性 蛋白 质 和 一 些 中 性 蛋白 质 及 病毒 都 可 吸附 。 多 和 孔 玻 璃 表面 对 蛋白 质 这 种 非 专 一 性 吸附 ， 也 影响 了 其 广泛 应 用 。 烷 基 胺 取代 的 多 和 孔 玻璃 (商品 名 Bio-Glass) 共 价 连接 甘 氨 酰 -D- 葵 丙 氨 酸 , 制 得 羧 肽 Bs A RUF AIA HO, NAD* 偶 联 于 Bio-Glass 制 得 水 不 溶 辅酶 “"。 《五 ) 琼脂 糖 琼脂 糖 是 D- 半 乳糖 和 3,6- 脱 水 -L- 半 乳糖 交替 结合 的 链 状 多 糖 。 商品 中 相应 于 2, 4 16% 的 琼脂 糖 浓 度 的 珠 状 凝 胶 , 分 别称 为 Sepharose 2B、4B 和 6B。 凝 胶 浓 度 越 低 , 其 结构 也 越 蓝 松 ， 即 多 孔 性 越 高 ， 其 机 械 强 度 则 随 浓 度 的 降低 而 减 少 。 BUS SAF Kh, 40°C 以 下 即 形成 不 溶性 凝 胶 (甚至 浓度 低 于 04%). SH 聚 糖 和 聚 丙烯 酰胺 相反 ,其 多 聚 链 是 由 氢 键 连接 一 起 的 而 不 是 由 共 价 键 连接 的 ,这 就 使 琼 引 糖 凝 胶 在 化 学 上 的 稳定 性 比 葡 聚 糖 和 聚 丙烯 酰胺 差 ， 要 如 免 在 pH 低 于 4 高 于 9 下 操 作 。 破 坏 氨 键 的 试剂 能 降低 凝 胶 的 机 械 稳定 性 。 但 通常 用 0.1 M NaOH 或 1M HCI 处 理 2 一 3 小 时 不 致 引起 凝 胶 颗 粒 的 变化 。 琼 脂 糖 凝 胶 不 为 有 机 溶剂 (如 乙醇 、 丙 酮 ) 所 破坏 ， 而 葡 聚 糖 和 聚 丙烯 酰胺 用 丙酮 处 理 则 完全 收缩 。 经 6M HMMM 7M 尿素 长 期 处 理 , 只 引起 凝 胶 略 微缩 小 ,而 不 影响 吸附 性 能 ;这 种 稳定 性 保证 了 吸附 剂 可 反复 使 用 ， 并 可 采用 蛋白 变性 剂 作 为 洗 脱 大 分 子 及 彻底 洗涤 吸附 剂 的 手段 。 由 于 琼脂 糖 凝 胶 是 一 种 热 可 逆 凝 胶 , 凝 胶 受 热 即 失去 稳定 性 , 最 后 溶解 。 因 此 , 凝 胶 必需 保存 在 低温 下 ,但 不 能 冻结 , 因为 冻结 也 破坏 可 逆 结 构 。 凝 胶 不 能 加 热 消 毒 , Bs 储存 , 表 5-14 总 结 了 琼脂 糖 对 一 些 溶 剂 和 介质 的 耐 受 条 件 。 表 5-14 琼脂 糖 耐 受 的 溶剂 和 介质 的 条 件 溶剂 a = we 0.1M NaOH | 2 一 3 小 时 (室温 ) 2 一 3 小 时 (室温 )] 有 水 吡啶 80% V/V 2 一 3 小 时 (室温 ) 1M HCi 2 一 3 小 时 (室温 ) | FARR | 2 一 3 小 时 (室温 )} 有 水 二 甲 基 甲 骸 胺 50% V/V) 2 一 3 小 时 (室温 ) 6M 盐酸 县 2 一 3 小 时 (室温 ) | TH | 2 一 3 小 时 (室温 )| 乙 二 醇 5096 V/V 2 一 3 小 时 (室温 》 2 一 3 小 时 (室温 ) | 丙酮 | 2—3 小 时 (室温 ) 无 水 二 氧 六 环 6 个 月 三 、 了 琼脂 糖 的 活化 及 其 衍生 物 的 制备 RRS (Oy) 琼脂 糖 使 用 前 需 活化 ,通常 是 在 碱 性 条 件 下 用 溴 化 氰 处 理 引 入 “ 亚 氨 基 碳 酸 盐 ,再 在 弱 碱 的 条 件 下 直接 偶 联 含有 庆 离 的 脂 族 或 往 香 族 氨基 的 配 基 ， Fe BRR SE RIB th AFAR 生物 。 i > o— io Mee 配 基 | —OH CNBr 一 O HAN—| 配 基 i Tie —OH fit (-O ae a4 配 基 O --OH 由 于 亲 和 色 谱 中 常用 一 些小 分 子 化 合 物 作为 配 基 制 备 亲 和 吸附 剂 ， 但 小 分 子 的 配 基 直接 连接 于 琼脂 糖 上 常 产生 无 效 吸 附 剂 , 其 原因 是 由 于 载体 的 空间 位 阻 关 系 ,使 大 分 子 化 BD GRAD) 不 能 直接 接触 到 配 基 《如 图 5-20)。 解 决 的 办 法 是 在 载体 和 配 基 之 间 引 入 适当 长 度 的 手臂 减少 载体 的 空间 位 阻 ， 增 加 配 基 的 活动 度 。 作 为 “手臂 "的 烃 链 可 以 先 连接 于 载体 ,再 通过 它 连 接 于 配 基 上 。 图 5-21 表示 纯化 8- 半 乳 糖 音 酶 的 几 种 琼脂 糖 吸附 剂 。E. coli 8- 半 乳 糖苷 酶 的 竞争 性 抑制 剂 对 氨基 葵 -8-D- 莹 基 吡 喃 半 乳 糖 是 相当 弱 的 抑制 剂 ， 直 接连 于 琼脂 糖 上 的 衍生 物 不 能 用 来 纯化 6- 半 屯 糖 彰 酶 (图 5-21 A)， 而 在 抑制 剂 和 载体 之 间 引 入 “手臂 " ARS Bia Cie Sells BS | CA 5-21B) 和 琥珀 酰 化 的 3,3 -二 氮 基 二 丙胺 琼脂 糖 (图 5-21C) 上 连 © 1356 SR 图 5-20 ， 亲 和 色谱 中 引入 “手臂 ?原因 示意 图 Agarose CH,OH rena: | HO 7 OH Agarose 9 CH;OH B SF miercrrdanyr{)-s On . ; HO OH Agarose 0 0 CH;OH C HcHcHCHANHCHcHicHNHCCHcHLCNH《 Yas HO OH OH 5-21 纯化 8- 半 乳糖 背 酶 的 几 种 琼脂 糖 吸附 剂 ”” 接 抑制 剂 , 发 现 B 衍 生物 〈 手 臂 长 度 ~10A") 与 衍生 物 A 有 本 质 上 的 差别 ,8- 半 慑 糖 将 酶 的 洗 脱 峰 在 柱 色 谱 图 上 比 杂 蛋白 峰 的 迁移 稍 退 缓 , 而 衍生 物 C (手臂 长 度 约 21A"? 7) 则 对 B- 半 乳 糖 背 酶 有 很 强 的 亲和力 。 图 5-22 表示 几 种 激酶 和 脱氧 酶 与 琼脂 糖 衍生 物 ( 含 有 不 同 长 度 的 次 甲 基 手臂 连接 的 ATP 和 NAD*) 的 相互 作用 。 在 同一 实验 条 件 下 研究 它们 之 间 亲 和 力 的 大 小 关系 ,从 而 得 出 以 下 重要 结论 。 当 伸 长 手臂 含有 四 个 次 甲 基 时 , 核 背 酸 与 载体 骨架 很 接近 ,(0 一 5A?) 酶 和 亲 和 吸 附 剂 的 结合 力 很 弱 , 接近 于 零 , 而 当 伸 长 手臂 "达到 5 一 10A“( 即 次 甲 基 增 加 到 8 个 ) 时 ;其 结合 力 有 很 大 的 增加 , 故 需 较 高 的 盐 浓 度 才能 把 结合 的 酶 从 柱 上 洗 脱 下 来 ， 但 当 载 体 和 配 基 之 间 的 手臂 "含有 8 个 以 上 的 次 甲 基 ( 长 度 >10A"” ) 时 , 酶 和 亲 和 吸 附 剂 之 间 的 结合 力 反 而 下 降 , 这 可 能 是 由 于 手臂 "过 长 易 弯 曲 , 使 配 基 过 于 接近 载体 骨架 , 从 而 减弱 了 与 酶 的 作用 。 *。 139。 3 6 i > ee ee ee 在 伸 长 “手臂 ”中 次 甲 基数 图 5-22” 某 些 脱 气 酶 和 激酶 与 固定 化 核 苷 酸 结 合 时 伸 长 手臂 长 度 的 影响 “9 (2) 0 免 骨 链 肌 乳酸 脱 氢 酶 M; @ 猪 心肌 乳酸 脱 氢 梅 Hs OF RMMAMS © 图 葡萄 糖 6- 磷 酸 脱 氢 酶 ;固定 化 的 -NADt+。 《b) 口 已 糖 激酶 ; 外 3- 磷 酸 甘 油 激酶 ; @ 甘 油 激酶 ;固定 化 ATP, 6 代表 酶 和 固定 化 的 入 人 酸 之 间 相 互 作 用 的 强度 值 及 洗 脱 酶 所 需 的 KCl 浓度 (mM) 在 所 有 的 琼脂 糖 衍生 物 中 ,最 重要 是 wo- 氨 烷 基 琼脂 糖 。 琼脂 糖 经 溴 化 氰 活化 后 和 甲 叉 二 胺 或 乙 又 二 胺 的 一 个 氨基 偶 联 。 这 些 脂 族 二 胺 分 子 药 烃 链 的 长 短 , 可 以 控制 插 人 “手臂 ”的 长 短 ， 其 局 -氨基 可 SH REARS A 作用 下 脱水 连接 。 —NH(CH,),, NH, Hoes. 2 配 基 | —NH(CH,),NH - co-[ reat EK FENCE Os NH, 脂 is 糖 CNBr w- 氮 烷 基 琼脂 糖 可 用 来 进一步 制备 一 系列 的 琼脂 糖 衍 生物 〈 如 图 5-23). 四 、 亲 和 色谱 条 件 的 选择 亲 和 色 谱 一 般 采 用 柱 色谱 法 。 亲 和 柱 的 平衡 缓冲 流 的 组 成 pH 和 离子 强度 应 选择 亲 和 物 双方 作用 最 强 、 最 有 利于 形成 络 合 物 的 条 件 。 一 般 用 接近 中 性 pH 为 亲 和 吸 附 条 件 ;, 上 柱 的 样品 液 应 和 亲 和 柱 平衡 缓冲 小 一 致 。 为 了 有 利于 络 合 物 的 形成 , 亲 和 吸 附 可 在 4 下 进行 ,以 防止 生物 大 分 子 的 失 活 ,上 柱 流 速 尽 可 能 慢 。 样品 通过 亲 和 柱 后 ,用 大 量 平衡 缓冲 液 洗 去 杂质 , 也 常用 不 同 的 缓冲 液 洗 涤 , 进一步 除去 非 专 一 吸附 的 杂 有 蛋白, 尽 可 能 使 亲 和 柱 上 只 留 下 有 专 一 吸附 的 亲 和 物 ,然后 再 用 洗 脱 液 洗 脱 亲 和 物 , 洗 脱 牙 所 选取 的 条 件 正 好 与 吸附 条 件 相 反 , 应 能 减弱 配 基 与 亲 和 物 之 间 的 亲和力 ,使 络 合 物 完全 解 离 。 由 于 亲 和 色 谱 中 亲 和 对 象 差 异 很 大 ， 很 难 有 统一 的 标准 , 表 5-15 中 列举 了 一 些 亲 和 琢 附 和 洗 脱 条 件 , 以 供 参考 。 洗 脱 结束 后 , 亲 和 柱 需 继续 用 洗 脱 剂 洗涤 至 无 亲 和 物 存在 为 止 ,再 用 平衡 缓冲 液 使 亲 和 柱 充分 平衡 ,存放 于 冷 室 (4° EA) 。140 。 }—NH (CH,),—-COOH F— Wik $(CH—sepharose 4B) RNH, —NH(CH,),CONHR NH,(CH,),COOH CNBr 活化 的 Sepharose 4B —————_» _ $-— NHR NH,(CH,),NH, WK —————> §—NH(CH, )sNHCOR | NH, Ris OE | SE PBs te a (CH,). NHCOCH(CH,),SHi CH,—S | CH, | | NH,—CH—co _{_NH(CH,). NH, (同型 半 胱 氨 酸 硫 内 酯 7 —NH(CH : (AH 一 Sepharose 4B) | H(CH,)sNHCOCH, Br O iS BrCH, C ‘iy | by ro) (O- 省 乙酰 -N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 ) | —NH(CH,).NHCO(CH,),COOH (1)0.N—¢ 六 a Na CA SEE BRD (2) Na,S,0, ( 连 二 硫酸 钠 ) 9/0” Ng (3) HNO, RERET) ( 亚 硝 酸 ) -samoamaco-《 》-N+= N 图 5-23 “琼脂 糖 的 衍生 物 五 、 杀 和 色谱 应 用 举例 (—) 醇 脱 氢 酶 及 磷酸 果糖 激酶 的 纯化 9 在 N 生 氮 已 基 -5 -AMP-= 琼 脂 糖 柱 上 以 部 分 提纯 的 酶 液 可 纯化 醇 脱 氢 酶 及 磷酸 果糖 激 酶 。 结 果 如 图 5-24 (A) 0.5 BHR 〈 每 毫升 含 40.5 单位 的 磷酸 果糖 激酶 ,10 单位 或 9.9 毫克 的 醇 脱 氢 酶 ) 对 10 mM 磷酸 盐 (pH 6.8， 含 0.2M KCl) 充分 透析 ,， 然 后 吸附 在 AMP- 了 琼脂 糖 柱 上 ， 用 以 下 深 滚 顺序 洗涤 。 (a) 平衡 缓冲 液 (10 mM 磷酸 盐 , pH 6.8) 24 Ft; (b) 5mM NADH 5 毫升 (同上 缓冲 液 ); (c) 缓冲 液 5 毫升 ; (d) 5mM ATP，5mM Mg**(4E 5 毫升 缓 症 液 中 ) ,流速 0.4 毫升 /分 。(B) KC 梯度 处 理 : 与 (A) ASAE 后 吸附 ,以 10mM' 磷 酸 盐 (pH 6.8, 4 0.2M KCl) 20 毫升 洗涤 ， 再 以 0.2 一 0.8 M KCI 线性 梯度 (40 毫升) 洗 脱 。(C) pH 梯度 处 理 : 样品 对 10 mM-N-2- 羟 乙 基 吓 嗪 -N'- 乙 基 。I41 。 表 5-15 亲 和 对 象 乙酰 胆 碱 酯 酶 醛 缩 酶 天 冬 酰 胺 酶 TM BT Bs FRAKES A 羧 肽 酶 B 梳 酸 变 位 酶 2- 麻 蛋白 酶 胶原 酶 3- 脱氧 -D- 阿 拉 伯 糖 - 庚 酮 糖 酸 -7- 磷酸 合成 酶 脱氧 核糖 核酸 酶 抑制 剂 cay RRR b-* FL HS 3- 磷 酸 甘 油 脱 氢 酶 脂 蛋 白 酯 酶 HA BRE BB 核酸 酶 (葡萄 球菌 ) BE SE Mis OB Hcl FA 木瓜 蛋白 酶 木瓜 蛋白 酶 EAS, ASA MA 4S AAG 蛋白 酶 (小 麦 ) 核糖 核酸 酶 A( 胰 腺 ) 核糖 核酸 酶 -S- 肽 BE if REAM 2 Al S REARS 五 氨 酸 羟 化 酶 白 蛋 白 C 人 7) 绒毛 膜 促 性 腺 激素 (人 ) DNP- 和 蛋白 质 9- 半 乳 炉 苷 酶 免疫 球 蛋 白 IgE IgG | ]rM 胰岛 素 -142- 亲 和 色 谱 中 配 基 的 选择 和 洗 脱 条 件 27” Aden 2 ve HR XY ga Zé AL- = FAA L R 1M NaCl 醛 缩 酶 亚 单位 6M RK D- 天 冬 酰 胺 D- 天 冬 酰 胺 磺胺 乙酰 偶 氮 酰胺 L- 酷 氨 酰 -D- 色 氨 酸 0.1M KER D- 丙 氨 酰 - 工 - 精 氮 酸 0.05MNaCI, Tris-HCI, pH 7.9 L- fA Ag 0.001M L-fe& D-f ae FRB 0.1 M 醋酸 胶原 (豚鼠 皮肤 7) 1MNaCl, 0.05M Tris-HCl pH 7.5 0.005M CaCl, L- 酷 氨 酸 0.2M 磷酸 盐 ，pH 6.5 0.001 M CuSO, 核糖 核酸 酶 0.7 M 2M (在 0.5M 醋酸 钠 =3092 甘油 中 ) 2?4- 二 氨 -10- 甲 基 蝶 5- 甲 酰 四 氢 叶 酸 ， M-L-GAwR WY AE AE - B-D-Fi NaB, pH 10 Jé OU Mi HE FL BES 3- 磷 酸 甘 油 0.5M 3- 磷 酸 甘 油 、 肝素 0.16 一 1.5M NaCl 梯度 N-( 对 氨基 末 )- 草 氨 酸 对 - 氮 基 苯 - 磷 酰 -脱氧 0.1 M NaHCO, pH9.1 = 一 一 二 一 一 一 -一 胸 背 -5 -磷酸 0.1M 醋酸 麻 蛋 白 酶 0.2M KCI 一 HCL pH2 甘 氨 酰 - 甘 氮 酰 -( 邻 葵 甲 酰 - 工 - 水 酷 氨 酰 -并 - 精 氮 酸 WARE A- MRK 0.8005 M MgCl, 聚 赖 氨 酸 0.15—1M NaCl 梯度 (在 酷 酸 钠 中 ) pH 5.2 L- 赖 氨 酸 0.2M E- 氨 基 已 酸 血红 和 蛋白 0.1M we RY SS HE AE - RR - RF 23’ -磷酸 0.2M Rem 核糖 核酸 酶 -S- 蛋 白质 50% 栈 酸 RY ARIK 1M 葵 胺 -HCI( 在 磷酸 钠 ， pH7 中 ) 吡 哆 胺 -5 -磷酸 0.25M 谷 氨 酸 ,LM 磷酸 盐 ，pH4.5 SRG eA 0.1M 甲酸 -0.5MKCI pH4.5—2.75 梯度 ， 3- 吗 | 吕 栈 氮 酸 0.001 M KOH 抗 血清 白 蛋 白 0.5MNaCl, 4 88-HCl, pH2.8 绒毛 膜 促 性 腺 激素 (人 ) 6M 盐酸 县 ，pH3 DNP Jia 0.1M 醋酸 B- 半 乳糖 苷 酶 0.1M NaCi, 0.05M SH Tris-HCl, pH7.4, 0.01MMgCl, IgE 0.15 M NaC!, 0.1M 甘氨酸 - HCl, pH s°5 IgG 5M +eeH IgM 5M 盐酸 县 Wee hy HS 0.1 M BER, pH 2.8 ee nas 亲 和 对 象 Aloe ve 脱 mm 淋巴 细胞 ( 鼠 7 bum Eni KSA RF 0.2M 栈 酸 Sepharose 2B 上 #2 FLACAD 人 胎盘 催乳 激素 4M KSCN 转移 RNA 转移 RNA 0.14M NaCl, 0.01 M 磷酸 盐 pH7.4 补体 (组 分 C1) IgG - |0.2.M 二 氨基 丁 烷 pH11.0 皮质 醇 -结合 蛋白 (人 ) 皮质 醇 0.08 M 皮质 醇 , 在 0.05 M 磷酸 盐 。 pH6.8 中 ARB -BABACA)D NASA 水 , pH8 (NH,OH) BAR-ASREA L-ih A 0.002 M KOH,pH 9.3 抗 生 物 素 蛋白 E-N- 生 物 素 酰 -L- 赖 氨 酸 6M $i AeA 胰岛 素 抗 胰 岛 素 ，IgG 6M eRe 5mM sli ATP “e 蛋白 质 浓度 〈 塞 克 / 雍 升 》 洗 脱 体积 〈 毫 升 ) 5-24 以 N'- 氨 已 基 -5 -ATP- 琼 脂 糖 亲 和 柱 上 专 一 洗 脱 醇 脱 氢 酶 及 磷酸 果糖 激酶 © SAR; © 3- 磷 酸 -甘油 醛 脱 氢 酶 ; 全 MSG; 磷酸 果糖 激酶 磺 酸 盐 (pH 6.8) 平衡 ,其 他 条 件 同 (A)， 然后 吸附 在 柱 上 , 以 缓冲 洲 20 毫升 洗涤 , pH 梯 度 \10 mM BCR CRM, 5 mM 甘 氮 酰 甘氨酸 , pH 10.4) 40 毫升 洗 脱 。 (> “- 抗 胰 和 蛋白酶 的 分 离 纯化 ”9 在 伴 刀 豆 球 蛋 白 A- 琼 脂 糖 〈ConA-Sepharose) 柱 上 从 人 血清 中 可 分 离 纯化 c- 抗 胰 蛋 白 酶 。 。143 。 当 部 分 纯化 的 人 血清 制剂 通过 ConA-Sepharose 柱 时 ,蛋白 质 出 现在 外 体积 中 ,其 中 和 包 含 大 量 血 清白 蛋白 ， 随 后 用 0.1 M 甲 基 c-D- 葡 萄 糖 背 洗 脱 可 得 75—80% 的 抗 胰 蛋 白 酶 活性 ,其 中 也 包含 有 少量 的 蛋白 质 ( 见 图 5-25)。 ConA-Sepharose 柱 1.5 X 10 厘米 ,以 0.05M 磷酸 盐 缓 冲 滚 (pH7.6) 平衡 ,无 吸附 的 蛋 昌 质 被 洗 下 。 从 箭头 所 指 起 用 0.1M 甲 基 -c-D- fa a a ES CEE ALE ee ce 5} PBUCEE » Hk 15 毫升 /小 时 。 NaCI WW) 被 抑制 的 胰 酶 (ug/ml) 吸收 度 (260nm ) ES 0 10 20 30 40 50 60 分 部 数 (2.5ml/ 管 ) 洗 脱 体积 (毫升 ) 图 5-25 人 血清 <- 抗 胰 蛋 白 酶 在 固 图 5-26， 在 赖 氨 酸 -琼脂 糖 4B 定 化 - 伴 刀 豆 球 蛋白 A 上 的 亲 和 色 谱 上 RNA 的 色谱 (=) rRNA 的 分 离 ” 用 赖 氨 酸 -琼脂 糖 也 可 把 几 种 rRNA 按 分 子 大 小 分 开 (如 图 5-26)。 色谱 柱 1.6 X.7.5 厘米 〈 床 体积 15 毫升 )， 流 速 15 BSF /AD, UE 22°, Bim: 0.02 M Tris-HCl 缓冲 液 (pH 7.5) 4 0.01 M MgCl, 以 0.05 一 0.30 M NaCl 线性 梯度 洗 脱 。 样品 液 : E. coli rRNA (在 缓冲 液 中 )s (四 ) 还 原型 辅酶 A (CoA) 的 分 离 纯化 加 由 于 发 现 芒 黄 八 登 球菌 透析 的 抽 提 该 中 的 蛋白 质 绝 大 部 份 为 CoA 亲 和 蛋 白 , 故 可 直 接 将 此 透析 抽 提 液 与 CNBr 活化 的 Sepharose 6B 反应 ,， 制 得 固 相 CoA 亲 和 和 蛋白 柱 (1 关 及 26onm (CoA 氧 化 型 CoA、 脱 磷 CoA) —) = = i) oO o > oo o i) Asgonm (AM P,AD P 2 AT ) 一 心 分 部 数 〈 人 为 单位 ) 5-27 固 相 CoA 亲 和 和 蛋白 柱 的 吸附 专 一 性 ----; 离子 强度 ，A: AMP, B: 氧化 型 CoA, C: ADP, D: 还 原型 CoA, E: ATP, F: 脱 磷 CoA, G: 还 原型 CoA 21446 5 厘米 )， 以 醋酸 钠 (pH 6.0， 离 子 强度 0.01) 缓 冲 共 平衡 。 还 原型 CoA 可 吸附 在 柱 上 ， 增 加 NaCl 的 离子 强度 可 把 CoA 洗 脱 下 来 ,如 图 5-26, 还 原型 CoA 有 两 个 洗 脱 峰 , 洗 脱 的 离子 强度 各 为 0.025 和 0.06, 这 说 明 在 吸附 剂 中 至 少 存 在 两 类 CoA RAIA, Rf CoA 有 不 同 的 亲和力 。 氧 化 型 CoA， 脱 磷 CoA, ATP 和 ADP 也 被 吸附 ,但 AMP 不 吸附 。 收 集 的 还 原型 CoA 纯度 达 92 一 94% 。 5-27 中 表示 固 相 CoA 亲 和 蛋 白 柱 的 吸附 专 一 性 。 洗 脱 的 化 合 物 在 260 nm 测 光 吸 政 ,第 一 峰 为 平衡 的 缓冲 液 洗 下 ,其 他 峰 则 以 NaCl 线性 梯度 洗 脱 。 (A) 绒毛 膜 生 长 激素 的 提纯 ” 在 抗 HCS- 琼 脂 糖 柱 上 ， 以 正常 人 血清 提纯 人 绒毛 膜 生长 激素 (HCS)。 以 放射 免疫 测定 法 测定 , 发 现在 非 阻 留 组 分 中 没有 激素 , 99% RAM CRA, 几乎 定量 回收 ， 结果 如 图 5-28。 { ' 1 琼脂 糖 - 抗 HCS 2 I 6 HCS 3002 3 | 。 (在 正常 血清 中 ) : 6M #h al 1 1 pH3.1 1.5 一 | 1 ' Batts > | é i : & Scribe : 8 ' ee aaa ! = H ! 1 0.15M NaCl ° x yz Ct! -0.01M 磷酸 铀 ! 党 pH7.4 sop t 0.5 1 ! \ e | \ | Q H \ 99.0% \ be OQ 7& NG —0—0—9—0-l 9 —6 “Suny me E80 nt 5 R= 0.0 0 25 50 75 100 : 洗 脱 体积 〈 毫 升 )- 图 5-28 gp AY 第 四 节 色谱 聚焦 色谱 聚焦 是 - (chromatofocusing) 一 种 高 分 辩 率 的 新 型 的 蛋白 质 纯化 技术 。 Sluyterman 等 首先 发 展 了 这 一 技术 %" 9。 它 是 根据 蛋白 质 等 电 点 , 结合 离子 交换 技术 的 大 容量 色谱 ， 能 分 离 几 百 毫 克 蛋 白质 样品 , 洗 脱 峰 被 聚焦 效应 浓缩 , 峰 宽 度 可 达 0.04—0.05 5 单位 ,分 辩 率 很 高 ,操作 简单 ,不 需 特 殊 的 实验 装置 。 本 法 适用 任何 水 溶性 的 两 性 分 子 , 如 蛋白 \ 酶 多肽、 核酸 等 。 ° 145° 一 、 色 谱 聚 焦 的 原理 [5 104 (—) pH 梯度 的 形成 一 般 的 离子 交换 色谱 中 , pH 梯度 的 产生 , 通常 是 利用 一 个 梯度 混合 器 ， 例 如 要 得 到 一 个 下 降 的 pH 梯度 , 混合 容器 中 盛 高 pH 的 起 始 缓冲 液 ， 另 一 个 容器 装 低 pH 的 限制 组 TH (limit buffer)。 当 溶液 离开 混合 容器 进 到 柱 时 , 低 PH 限制 缓冲 液 进 入 混合 容 郝 ,使 4 TRAE LAY pH 逐渐 降低 (Al 5-29). A ml 图 5-29 梯度 形成 图 解 A: 离子 交换 色谱 ;j B: 色谱 聚焦 色谱 聚焦 是 利用 离子 交换 剂 本 身 的 带电 基 团 的 缓冲 作用 ， 当 洗 脱 缓冲 液 滴 到 离子 交 换 剂 上 ,自动 形成 pH 梯度 。 例如 要 形成 pH 9 一 6 的 下 降 梯 度 ， 色 谱 柱 内 的 pH 比 洗 脱 流 高 。 可 选择 一 个 具有 碱 性 缓冲 基 团 的 阴离子 交换 剂 ， 如 商品 名 为 PBE 94 的 阴离子 交换 剂 装填 在 柱 上 ， 首先 平 衡 到 pH 9, Sch PH (相应 为 限制 缓冲 液 ) BEA PHO, 其 中 含 商 品名 为 多 缓冲 剂 《polybuffer) 的 物质 (如 polybuffer 96)。 当 洗 脱 液 从 顶部 泣 人 PBE 94 色谱 柱 , 大 部 份 酸 性 成 份 与 阴离子 交换 剂 的 碱 性 基 团 结合 ， 最 初 从 柱 上 流出 的 溶液 的 pH 接近 于 起 始 缓 冲 CA 5-30), 洗 脱 过 程 中 在 柱 上 每 一 点 的 pH 随 着 更 多 的 缓冲 剂 加 人 而 逐渐 下 降 ， 最 后 几乎 整个 色谱 柱 被 洗 脱 液 所 平衡 ,最 后 流出 液 的 pH 等 于 洗 脱 液 的 pH (Bl pH6)e Meee mp me 5-30 PBE 94 柱 用 多 缓冲 剂 洗 脱 时 图 5-31 和 蛋白质 分 子 在 色谱 聚焦 时 的 行为 pH 梯度 (pH9 一 6) 的 形成 假定 蛋白 质 1 等 电 点 为 7 ， 蛋 白质 2 等 ay by Cy d 代表 不 同 的 洗 脱 阶段 电 点 为 8 。146 。 Ses eee (=) 蛋白 质 的 行 蛋白 质 所 带 的 电荷 取决 于 它们 的 等 电 点 和 介质 的 PH, 当 介 质 的 :pH 低 于 它 的 等 电 点 时 ,蛋白 质 带 正 电荷 , 它 不 与 阴离子 交换 剂 结合 , 随 洗 脱 芒 向 下 移动 , Am, 在 蛋白 质 从 柱 顶 向 下 移 的 过 程 中 ,其 周围 的 pH 逐步 增高 (图 5-31) 当 它 移动 到 某 一 点 ,其 环境 的 pH 高 于 蛋白 质 等 电 点 时 ,蛋白 质 由 带 正 电 荷 变 为 带 负 电荷 ,而 与 离子 交换 剂 结合 。 随 着 洗 脱 过 程 的 进行 ,所 形成 的 pH 梯度 也 不 断 下 降 , 当 pH 下 降 至 蛋 日 质 的 等 电 点 时 ,蛋白 质 又 重新 脱离 交换 剂 而 下 移 , 移 至 pH 大 于 其 等 电 点 时 又 重新 结合 ,这 样 不 断 重 复 ， 直 至 蛋白 质 从 柱 下 流出 。 不 同 的 蛋白 质 有 不 同 的 等 电 点 ， 在 它们 被 离子 交换 剂 结合 以 前 将 移动 不 同 的 距离 , 按 等 电 点 顺序 流出 〈 图 5-31)。 (=) 聚焦 效应 当 一 种 蛋白 质 在 柱 上 随 洗 脱 流下 移 至 等 电 点 处 ， 此 时 其 移动 速度 明显 减 慢 。 如 果 此 时 加 上 相同 的 第 二 个 样品 , 它 将 以 洗 脱 液 移动 的 速度 下 移 , 直 至 追 上 正在 慢 移 的 第 一 个 样 品 处 (聚焦 )。 然后 这 两 个 样品 一 起 下 移 ， 众 柱 下 一 起 洗 脱出 来 。 但 是 所 有 样品 必须 在 第 一 个 样品 峰 尚 未 被 洗 脱 之 前 加 入 ， 否 则 就 10 不 能 聚焦 。 如 果 加 入 的 第 二 个 样品 的 等 电 9 点 比 第 一 个 样品 高 ， 它 可 以 越过 第 一 个 样 品 区 而 先 被 洗 出 〈 图 5-32). Polybuffer 96 Polybuffer 74 EEE LT Biseetehat fepstetets] fg 6 8 18100 > 5 ™ © ©OO OOO 4 —-— %Q)- D- O00 FXG HTH7ZTK+7YTS+H7TT HTA+7 + 4 Sa 7 0.10.2 0.3 0.4 0.5 ; ct meq NaOH 5-32 RAR ADR ROL 5-33 28HS¢x A 0.1 N NaOH 滴定 曲线 =. 2 Re th Fil Be NP Fill Se — FH A PE HL HED TE eA I SE RA fT FE FRA NAR 同 的 多 种 组 分 的 多 羧基 多 氮 基 化 合 物 , 瑞典 的 Pharmacia 公司 专门 设计 生产 的 Polybuffer 96 和 Polybuffer 74, 它们 分 别 适用 于 pH 9 一 6 和 pH 7 一 4 范围 的 色谱 聚焦 。 这 二 种 多 缓 神 剂 相 匹配 的 多 缓冲 交换 剂 是 PBE 94。 对 于 pH 9 以 上 的 色谱 聚焦 则 选用 pH8 一 10.5 的 两 性 载体 电解 质 〈Pharmalyte) 配 以 相应 的 PBE 118, 在 所 使 用 的 pH 范围 内 ,多 缓冲 剂 %6 和 74 有 很 均衡 的 缓冲 容量 ， 当 色谱 聚焦 时 ， 能 提供 一 个 平滑 的 线性 pH 梯度 ,它们 的 滴定 曲线 见 图 5-33。 多 缓冲 剂 在 280 nm 的 吸收 很 低 ， 但 在 250 nm 有 较 大 的 吸收 ， 故 洗 脱 液 的 监测 应 在 280nm (图 5-34)。 .147 。 1.0. a 1.0 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.15 0.1 200 300 400 200 300 400 波长 (mm) 波长 (mm) 图 5-34 多 缓冲 剂 的 紫外 吸收 光谱 多 缓冲 剂 通常 以 无 菌 的 液体 形式 提供 (0.075 毫 摩尔 pH 单位 /毫升 )， 用 前 稀释 。 于 3 一 8%C 暗 处 贮存 。 三 、 多 缓冲 交换 剂 PBE 118 和 94 是 以 交 联 琼脂 糖 6B (Sepharose 6B) 为 载体 , 并 在 糖 上 通过 醚 键 偶合 上 配 基 而 成 的 。 它 们 在 pH 3 一 12 的 范围 内 对 水 `\ 盐 \ 有 机 溶剂 都 是 稳定 的 。 它 们 也 能 在 8M 服 中 使 用 。 多 缓冲 剂 的 交 联 性 质 使 它 有 很 好 的 物理 稳定 性 和 六 速 ,并 防止 了 由 于 不 同 pH 值 静 电 相互 作用 所 引起 的 床 体积 的 变化 ， 它 的 盐 型 在 pH 7 能 耐 受 110—120°C 的 高 压 灭 tah BA 偶 联 剂 Sepharose 6B 上 的 配 基 经 特别 选择 ， 确 保 在 很 宽 的 pH 范围 内 有 均衡 的 缓冲 表 5-16 多 缓冲 交换 剂 PBE 96 和 PBE 118 的 缓冲 容量 资料 多 缓冲 总 容量 meq/100 毫升 不 同 pH 间隔 凝 胶 PH 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 — TO 1.0 2.0 3.0 meg NaOH 图 5-35 10 毫升 PBE 118 和 PBE 94 在 1M KCl 中 的 滴定 曲线 。148 。 容量 。 这 两 种 多 缓冲 交换 剂 的 缓冲 容量 数据 见 表 5-16, 它们 的 滴定 曲线 见 图 5-35。 它 们 的 商品 是 以 巧 浮 臣 形式 提供 ( 含 24% 乙醇 )。 Pl, Bees MRCS 测定 样品 的 等 电 点 选择 适当 的 多 缓冲 剂 和 了 BE 调节 起 始 缓冲 ”用 起 始 缓冲 液 平 衡 凝 胶 ， 装 人 适当 的 一 “BEE LR | HE 装置 仪器 * KR * 紫外 监测 器 * pH it * 记录 仪 * 部 分 收集 器 调节 多 组 冲剂 pH ib5—10 毫升 多 组 冲剂 一 一 > 到 梯度 下 限 流 过 柱 一 一 ins BF BR FAS Bere HA BEE ARAHRKEALS BRAS DMO Be a (—) 凝 胶 和 缓冲 剂 的 选择 每 次 使 用 的 多 缓冲 剂 和 多 缓冲 交换 剂 的 pH 间隔 为 三 个 单位 。 为 了 提高 分 辩 率 ， 选 择 的 实验 pH 范围 应 包含 要 分 离 样 品 的 等 电 点 ， 并 使 其 有 2/3—1/2 的 柱 长 的 吸附 解吸 时 间 。 不 同 pH 范围 色谱 聚焦 缓冲 剂 和 凝 胶 的 选择 见 表 5-17。 (=) 凝 胶 柱 的 准 各 色谱 聚焦 需要 的 凝 胶 量 取决 于 样品 的 量 \ 样 品 的 性 质 \ 杂 质 的 情况 以 及 实验 分 辩 率 要 求 。 大 多 数 情况 下 , 20 一 30 毫升 床 体积 已 足够 分 离 1 一 200 毫克 蛋白 质 /pH 单位 。 装 柱 之 前 , 凝 胶 必 须 用 起 始 缓冲 液 平衡 ,每 种 pH 相应 的 起 始 缓冲 液 见 表 5-17。 交 换 WM RFE Cl, RC 以 外 的 单价 阴离子 也 可 作为 反 离 子 * 但 这 些 阴 离子 的 pKa 必须 化 榜 度 选择 的 最 低 点 至 少 低 二 个 p 再 单位。 碳酸 氢 盐 离子 (HCO; ) 会 引起 pH MEW 化 ,所 以 所 有 的 缓冲 液 使 用 前 必须 除 气 。 大 气 中 的 ,COz 在 THH5.5 一 6.5 条 件 下 会 使 梯度 变 平坦 ,用 酷 酸根 作 反 离子 可 防止 这 一 情况 ,但 对 多 组 冲剂 74 则 不 能 用 醋酸 根 作为 反 离 子 。 柱 装 填 的 好 坏 直 接 影响 分 辩 率 , 如果 操作 得 当 7 可 达 0.02 pH 带宽 的 分 离 效果 s 通常 装 柱 过 程 如 下 : as 149 。 表 5-17 AE pH 范围 色谱 聚焦 所 用 凝 胺 和 组 冲剂 RRA pH 范围 10.5—S! PBE 118 pH 11 pH 8.0 10.5—8 PBE 118 0.025 M pharmalyte Le 和 三 乙 胺 -HClI pH8-10.5 - HCl pH 11 pH7 10.5—7 PBE 118 0.025 M pharmalyte 1:45 三 乙 胺 -HCI pH 8-10.5 HCl 9—8? PBE 94 pH 9.4 0.025M pH 8.0 1245 乙醇 胺 -HC1 pharmalyte 9—7 PBE94 pH 9.4 pH8-10.5 - HCI 1:10 0.025 M pH7.0 Ce ik-HCl polybuffer 96-HCI 9—6 PBE94 pH 9.4 0.025M pH 6.0 1:10 乙醇 胺 CH,COOH polybaffer 96-CH,COOH pH 8.3 pH 7.0 8 一 7 PBE94 0.025M Tris. HCl | 。 polybuftfter 96-HCI == pH 8.3 pH 6.0 8—6 PBE 94 0.025 M polybuffer 96 1313 Tris - CH,COOH CH,COOH pH 8.3 pH 5.0 8—5? PBE 94 0.025M polybuffer 96 1:10 Tris - CH,COOH (30%) + polybuffer 74 (70%)—CH,COOH pH7.4 pH 6.0 7—6 PBE 94 0.025 M PKS polybuffer 96- 1:13 CH,COOH CH,COOH 7—5 PBE94 pH7.4 0.025M pH 5.0 polybuffer 1:8 咪唑 -HCl 74.HCI1 7 一 4 PBE94 pH7.4 0.025M pH 4.0 1:8 咪唑 -HCI1 polybuffer 74 。HCI nT pH 6.2 0.025M EER ares ren 组 氮 酸 -HCl polybuffer 74 - HCI pH6.2 0.025M pH 4.0 6 一 人 PRED 组 氨 酸 -HCl polybuffer 74+ HCl 1:8 pH5.5 pH 4.0 5—4 PBE 94 0.025 M 1:10 We - HCl polybuffer 74 - HCl C1) Be 1:1 (V/V) 悬浮 于 起 始 缓冲 液 中 ,除去 气泡 。 1 (2) 将 柱 调 垂直 并 除 尽 底部 尼龙 网 下 的 气泡 ,关闭 柱 下 端 出 口 。 (3) 在 柱 中 放 2 一 3 毫升 起 始 缓冲 液 ,在 搅拌 下 将 凝 胶 倒 人 柱 中 。 《4) 打开 柱 底部 开关 ，, 待 凝 胶 沉 降 后 仔细 将 柱 顶 部 接头 装 好 ,排除 所 有 气泡 。 aa]150。 (5) 用 10 一 15 个 床 体积 起 始 缓冲 液 平衡 至 流出 液 的 pH 和 电导 系数 与 起 始 缓冲 液 要 Flo 色谱 柱 的 装 贰 好 坏 可 用 有 色 的 牛 细胞 色素 。 检查 , 因 其 等 电 点 为 10.5， 不 被 柱 吸附 。 很 快 穿 过 柱 流出 。 (=) 样品 的 准备 上 样 量 取决 于 每 个 区 带 中 蛋白 质 的 量 , 通常 每 10 毫升 床 体积 可 加 100 毫克 蛋白 质 样 品 , 由 于 有 聚焦 效应 ,因此 样品 的 体积 是 不 重要 的 ， 只 要 在 欲 分 离 的 物质 从 柱 上 流下 之 前 ”加 入 样品 ,对 分 离 结果 均 无 影响 , 样品 体积 最 好 不 超过 0.5 个 床 体积 ， 样 品 不 能 含 过 量 盐 (L<0.05), EPP RI PE ah Be Di Bb ek Bk a PE OR RR 10 毫升 ， 最 好 先 通过 一 个 Sephadex G-25 柱 , 用 起 始 或 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 , 以 达到 最 好 的 平衡 效果 。 如 果 组 冲 液 浓度 很 低 , 样品 pH 也 不 重要 。 《四 ) 上 样 和 洗 脱 上 样 最 好 是 通过 一 个 加 样 器 ,为 了 确保 样品 均匀 平整 地 加 到 床 面 上 ,可 在 床 顶 部 小 心 铺 一 层 1 一 2 厘米 厚 的 Sephadex G-25。 上 样 前 应 先 加 5 EFT EIB BA RE SP SE Ti 〈 过 碱 ) 的 pH. 上 样 后 ， 首 先 用 洗 脱 缓冲 液 淋 洗 ,pH 梯度 自动 形成 。 梯 度 的 pH 上 限 由 起 始 缓冲 液 确定 , 其 下 限 由 淋 洗 缓冲 液 的 pH 决定 。 推荐 使 用 的 缓冲 液 组 成 及 所 用 洗 脱 液体 积 见 表 5-17。pH 梯度 的 斜率 (或 梯度 体积 ) 是 由 用 于 洗 脱 的 多 缓冲 剂 的 浓度 决定 的 。 浓度 高 ， 所 需 的 梯度 体积 小 , pH 梯度 斜率 陡 ， 洗 脱 峰 罕 , 但 分 辩 率 下 降 , 反之 ,pH 梯度 斜率 小 , 洗 脱 峰 宽 , 但 分 辩 率 高 。 采 用 通常 推荐 的 多 组 冲剂 浓度 ,总 洗 脱 体积 需 12 一 13 个 床 体 积 , 洗 脱 时 的 流速 一 般 选 择 30 一 40cm.h-:。 (A) 从 分 离 的 蛋白 质 中 除去 多 缓冲 剂 的 方法 1. 沉淀 法 一 加 大 固体 硫酸 铵 到 80—100% 饱和 度 ,放置 1 一 2 小 时 ,使 蛋白 质 沉 淀 。 因为 处 在 等 电 点 pH 的 蛋 白 质 很 容易 沉 注 。 离 心 收集 沉淀 ,用 饱和 硫酸 和 锭 和 洗 两 次 ,然后 透 BT VR it BR Fo 2. 凝 胶 过 滤 用 Sephadex G-75 可 以 将 分 子 量 大 于 25,000 的 蛋 自 质 和 多 缓冲 剂 分 IPs 3. 亲 和 色 谱 法 应 用 一 个 亲 和 色 谱 柱 ， 分 离 的 蛋白 质 通过 柱 为 柱 中 的 吸附 剂 所 吸 PAY ,而 多 缓冲 剂 没 阻 留 地 流出 柱 外 ,再 将 蛋白 质 洗 下 。 4. 朴 水 相互 作用 色谱 法 利用 载体 与 蛋 自 质 样 品 的 下 水 基 团 间 的 相互 作用 。 在 水 相 中 提高 中 性 盐 的 浓度 或 降低 乙 二 醇 的 浓度 增强 体系 的 疏水 性 可 增强 朴 水 基 团 的 相互 作 用 。 芯 水 色谱 柱 中 装填 葵 基 或 酚 基 -琼脂 糖 CL-4B, 用 80% 饱和 度 硫酸 贸 平 衡 , 对 10 2 克 蛋 白质 需 1 毫升 凝 胶 ， 用 2 一 3 个 床 体积 的 80% RRR. BARR REE 生 芯 水 作用 的 结合 ,然后 用 低 离子 强度 的 缓冲 液 洗 脱 。 «151-6 六 ) 多 缓冲 离子 交换 剂 的 再 生 多 缓冲 离子 交换 剂 的 再 生 可 以 在 柱 上 进行 。 凝 胶 用 2 一 3 个 床 体积 的 1 M NaCl 洗 ， 以 除去 结合 的 物质 。 用 0.1 M HCI 洗 则 可 除去 结合 牢固 的 蛋白 质 。 假如 使 用 互 Cl, 一 当 Be seve BUS POF GLI BBN pH。 五 .应 用 实例 5 1. 蛋 吉 质 的 一 个 模式 混合 物 的 分 离 5552 LA 5-36。 MAH Stan T BAZAN Ie 分 离 条 件 如 下 : 在 pH 7 一 4 范围 内 ， 柱 C10/20 Ki 1s 厘米， 样品 4 毫升 洗 脱 缓冲 液 含 有 马 肌 红 蛋白 (12 Sot). mist hs (8 毫克 ) 和 白 蛋白 《12 EH), RAH. 起 始 组 Wij 0.025M BRI HCl, pHZ7.4, 洗 脱 缓冲 液 0.075 mM /pH 单位 /毫升 多 组 冲剂 74。，pH4，。 流速 12.5 厘米 /小 时 。 50 100 150 200 EAA (ral) 50 100 150 图 5-36 ”蛋白质 的 一 个 模式 混合 物 的 分 离 5-37 。 孵 白 的 分 级 分 离 2. 粗 孵 蛋白 的 分 级 分 离 5-37 为 粗 卵 蛋白 在 pH 7 一 4 梯度 上 的 分 级 分 离 。 久 白 过 滤 , 用 多 组 冲剂 74 稀释 ,然后 3000g 离心 10 分 钟 , 上 PBE 94 柱 , 以 0.025 M PEM HCI (pH 7.2) 平衡 ,用 1:10 多 组 冲剂 74(pH4) 洗 脱 , 分 辩 率 良好 。 分 离 条 件 如 下 : FESR 10/50, 床 高 30 厘米 ， 样 品 5 毫升 ， 洗 脱 缓冲 液 含 0.5 毫升 归 白 。 洗 脱 条 件 : 起 始 缓冲 小 0.025 M PRUK-HCl, pH7.5, 流速 40 厘米 /小 时 sa: 3. 糜 庵 肌肉 提 权 水 溶性 蛋白 的 分 离 图 5-38 表明 在 高 pH 下 也 有 良好 的 分 辩 率 。 10 克 糜 鹿 肌 肉 用 等 体积 水 匀 浆 ，3000g 离心 10 分 钟 ,上 清 液 用 洗 脱 沪 平 衡 , 上 PBE94 柱 ， 以 多 缓冲 剂 96 洗 脱 s 分 离 条 件 如 下 : 柱 C10/40， 床 高 45 厘米 ,样品 : 5 SH REPEL AOR LBs BE 条 件 : MIA, 0.025 M CBR 一 HCl, pH 9.4， 洗 脱 缓冲 被 六 0.0075 mM/pH 单 位 / es ili52 。 毫升 ,多 组 冲剂 96, pH6 流速 20 厘米 /小 时 。 0.54. a | 0.4 \ { F5 bain ce 1 e 0.3 和 a. 8 8 ' © o.2 ~ “a € CRG as 7 _ 0.1 ee \ , A 6 J 0 ot oS IgG 100 150 200 - 250 体积 (nl) 图 5-38 SAME REIL PS MENA ck Ys Hea a BAO) BS 4. Trichoderma reesei 细胞 的 蛋白 质 的 分 离 ” 图 5-39 表明 色谱 聚焦 具 高 容量 分 BEAUUER. Trichoderma reesei 是 产生 大 量 孢 外 纤维 素 酶 的 微生物 ， 这 些 酶 可 用 在 PBE 94 LEBER IED Bo ,分 离 条 件 如 下 : 柱 ,SR 10150， 床 高 30 EK, 样品: 5 毫升 ， 洗 脱 缓冲 液 含 460 毫克 冷 次 干燥 的 培养 上 清 液 。 洗 脱 条 件 : 起 始 缓冲 液 0.025 M PKUS-HCI, pH 7.45 BEAR 0.0075 mM /pH 单位 /毫升 ,多 缓冲 剂 74， pH4, Pre 30 厘米 /小 时 。 1.0 ; 体积 (ml) 图 5-39 Trichoderma reesei 胞 外 蛋白 质 的 分 离 的 CD [1] Himmelhoch，S， R. “Methods in Enzymology,” Vol XXII, p. 273---286 (1971) [2] Mikes,O. et al, Laboratory Handbook of Chromatographic and Allied Methods p. 218 (1979) [3] 张 树 政 \ 仲 如 : 微生物 通报 ，2，30(19747 [4] Morris, C. J. O. R. and Morris, P., “Separation Methods in Biochemistry”, Pitman Publishing, Se cond edition, Canade, p. 293 (1976) £5] .5 林 卓 坤 主编 ?色谱 法 (一 ) 科 学 出 版 社 'p。42(1982)， [6] Sober, N. A. and Peterson, E. A.，Fedn，Proc.，17，116 (1958) [7] Rhodes, M. B. et al. J. Biol. Chem., 230, 399(1958) 234, 2054 (1959) [8] Hardy, S. J. 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Suppl. 1, 152 (1962) 即 得 与 第 三 者 的 交点 ,此 即 为 所 求 第 三 者 数值 。 2. 离心 时 间 离心 时 间 是 由 实验 要 求 所 决定 。 为 了 避免 不 稳定 颗粒 的 凝聚 、 挤 压 损 侨 或 变性 失 活 , 并 使 扩散 所 导致 的 区 带 加 宽 现 象 减弱 ,在 保证 分 离 的 前 提 下 ， 应 尽 可 能 缩短 离心 时 间 。 相 反 , 分 离 某 些 沉降 较 快 的 大 颗粒 时 ,为 了 达到 预期 的 分 离 效 果 ， 往 往 使 用 粘度 较 大 的 梯度 ,以 阻止 颗粒 的 过 度 沉 降 , 并 延长 离心 时 间 。 离 心 所 用 方法 不 同 》 Bb 时 间 也 不 相同 。 “160。 x 4% (BOK) } ABO (@) #4 (pm) 30 5,000 72°50, 000 25 5,000 500,000 4,000-4-400,0c0 47900 “i 3000-4 300,000 3,500 19 19 2,000 十 200,000 4 000 17 1,500-- 150,000 16 15 1,000-++ 100,000 2,500 14 800-4-80, 000 3 isa 12 50,000 2000 11 400-8 40, 000 10 300 ~~ 30.000 1,500 9 200 十 20.000 了 400 8 150-4-15,000 1,300 7 100 + 10,000 Jee abide 80 8.000 1,10 706.000 1000 50 == 5,000 5 404,000 30-43, 000 4 20-42, 000 15 + 1.500 10-F 1,000 3 图 6-4 离心 机 转速 与 离心 力 的 列 线 计 算 图 (1) 颗粒 沉降 时 间 的 计算 : 颗粒 的 沉降 时 间 可 用 下 面 公式 计算 : pe 2 [Aon (4) -起 中 ;7 为 样品 颗粒 完全 沉降 到 离心 管 底 的 时 间 ( 秒 )， 也 叫 澄清 时 间 ; S 为 颗粒 沉降 系数 ; p.m 分 别 为 旋转 轴 中 心 到 离心 管 底部 及 样品 波 液 面 的 距离 (厘米 )。 括号 内 的 部 分 可 用 常数 K 表 示 。 此 时 ， 。 K = St (5) 着 上 的 单位 用 小 时 ，S 以 Svedberg (S) 表示 ,由 于 18 一 107° 秒 ,可 得 : RE 站 5 4 ®)= 和 (6) KER TOR RAF GEM K EW 10—-1,000 或 更 大 ), 与 转子 大 小 和 速度 有 关 。 S、 ny 不 变 时 ,由 上 述 公 式 可 以 得 出 : (1) K 值 越 低 ,颗粒 沉降 时 间 越 短 , 转子 使 用 效率 越 (2) ot = wit,s (3) K 值 与 转速 平方 成 反比 ,wo 证 , = wKro 转子 出 广 时 都 已 标 上 最 大 转速 时 的 区 值 ， 由 此 可 求 得 低速 时 的 K 值 。 有 了 KK 值 就 可 估计 具有 二 定 沉降 系数 的 某 种 颗粒 的 沉降 时 间 。 但 文献 或 厂家 所 给 K 值 均 从 离心 管 腑 顶部 而 不 是 从 液 面 计算 的 ， 故 实 Br K (ALLER K io 如 果 颗 粒 接近 圆 球 状 , 但 不 知 其 沉降 系数 , 也 可 借助 其 它 有 关 参 数 ,用 下 式 估算 颗粒 “161。 表 6-2 某 些 盐 的 客 度 梯 度 比例 常数 PP Bx 10> 密 度 阴离子 阳 离子 (25°C, g/cm?) GE Br- SOF 1.20 2.04 1.46 1.06 1.30 1.55 1.06 0.76 1.40 1.33 0.89 0.67 1.50 L272 0.80 0.64 1.60 cag 1.17 0.73 0.66 1.70 1.14 0.69 1.80 1.12 0.74 1.90 1.12 1.20 3.42 2.15 1.30 2.76 1.56 1.40 Rb+ 2.25 1.34 1.50 1.22 1.60 1.05 28-7 12.8 1.10 18.7 7.7 1.15 15.8 5.9 1.20 Nat 14.3 5.2 1.25 4.5 1.30 1.35 1.05 22.1 11.3 1.10 13.1 6.2 1.15 10.1 4.6 1.20 Kt 3.80 1.25 3.36 1.30 3.05 Ps ‘ 1.30 42.3 8.9 1.40 9.1 1.50 he 10.5 1.60 11.4 1.70 11.4 1.80 10.0. 的 沉降 时 间 ( 秒 ): - 一 om 了 is (7) 2u’ d’ (oe — po) ty 式 中 d 为 颗粒 平均 直径 《厘米 ); 3 为 介质 粘度 ( 泊 ); es on 分别 为 颗粒 和 介质 密度 (58 / 厘米 )。 经 验 表明 ， EEE Ei SEA TORS AE EIS A es PPE MVE Bo (2) 颗粒 平衡 时 间 的 计算 : 上 上 述 离心 时 间 的 让 算 仅 适用 于 沉降 分 离 ,在 密度 梯度 区 “TI62 。 带 离心 中 ， 颗 粒 到 达 平 衡 点 所 需 时 间 的 计算 则 要 复杂 得 多 。 如 在 离子 介质 中 进行 平衡 等 密度 离心 ;计算 样品 中 颗粒 在 盐 梯 度 中 的 平衡 时 间 时 ,其 方法 如 下 ; (a) 样品 和 盐 介 质 一 起 离心 时 ， Py! rr x oe xX (p— 1) | (8) SUA, t 为 时 间 ( 小 时 ); 6° 为 特定 溶剂 (水 ) 中 盐 梯 度 的 比例 常数 CULL 6-2)5 P 为 颗 IAL A 7 Fy BB BE Ct / EK) 5 So,w 2) 20°C 时 颗粒 在 水 中 的 标准 沉降 系数 (S)n 为 转子 转速 《rpm);z 为 平衡 颗粒 至 旋转 轴 中 心 的 距离 (厘米 )。 因为 样品 颗粒 在 盐 梯 度 中 的 平衡 区 带 是 位 于 梯度 的 中 间 部 分 , 故 工 值 可 用 等 浓 点 (与 起 始 均匀 盐 介 质 密度 相同 的 梯度 中 某 一 点 ) 公 式 计算 : r= [LGitant a) |) GOMER EAD @) xt .-[-@+0) (区 带 转 于 用 | (10) 公式 (9) 也 可 用 于 角 式 转子 。 必 须 注 意 , 等 浓 点 公式 中 的 总 是 指 梯度 波 面 而 言 , 如 果 管子 未 充满 梯度 液 , 则 应 经 适当 换算 求 出 ma (以 缩短 离心 时 间 )。 此 法 计算 的 时 间 是 颗粒 平衡 的 时 间 (也 即 总 离心 时 间 )，, 形成 盐 梯度 所 需 的 平衡 时 间 则 要 少 得 多 。 (b) 用 预 形成 的 非 平衡 梯度 时 ， 2.53 x 104 xk (p— 1)[log(r, — n)/ry 十 4.61] (11) n’rSy,w X do/dr SUH, do /dr 为 线性 密度 梯度 的 斜率 《 克 / 厘 米 // 厘 米 ); niy 分 别 为 梯度 顶部 和 平衡 六 部 与 旋转 轴 中 心 的 距离 (厘米 ); 其 余 符 号 与 式 (8) 相同 。 AK C11) 和 (8) 仅 适 用 于 相对 粘度 约 等 于 1 的 梯度 液 Cho CsCl) ,在 粘度 较 大 的 深 被 中 ,应 对 颗粒 的 沉降 系数 作 适 当 校正 。 此 法 虽 用 预先 形成 的 梯度 ,但 离心 时 仍 存在 梯度 重新 平衡 、 再 分 布 问题 , 故 也 与 平衡 或 稳定 梯度 所 需 的 离心 时 间 有 关 ( 总 离心 时 间 比 (2) 少 )。 t 一 二 、 制 备 超 离心 的 方法 及 其 选择 [45681 制备 超 离心 法 可 分 为 二 大 类 型 : C1) 差 速 离 心 法 ; (2) 密度 梯度 区 带 离心 法 。 Ms 别 介绍 如 下 : 《一 ) 差 速 离心 法 BRAG 采用 逐渐 增加 离心 速度 或 低速 和 高 速 交替 进行 离心 ,使 沉降 速度 不 同 的 颗粒 ,在 不 同 离心 速度 及 不 同 离心 时 间 下 分 批 分 离 的 方法 ， 称 为 差 速 离心 法 。 差 速 离心 一 般 用 于 分 离 视 降 系数 相差 较 大 的 颗粒 。 进行 差 速 离心 时 ,首先 要 选择 好 颗粒 沉降 所 需 的 离心 力 和 离心 时 间 。 离 心力 过 大 或 离 心 时 间 过 长 ,容易 导致 大 部 分 或 全 部 颗粒 沉降 及 颗粒 被 挤 压 损伤 。 当 以 一 定 离 心力 在 一 定 163。 EEE EE 的 离心 时 间 内 进行 离心 时 ,在 离心 管 底 部 就 会 得 到 最 大 和 最 重 颗粒 的 “ 沉 证 ”， 分 出 的 “上 请 液 在 加 大 转速 下 再 进行 离心 ;又 得 到 第 二 部 分 较 大 、\ 较 重 颗粒 的 “沉淀 ”及 含 小 和 轻 栖 粒 的 上 清 液 "。 如 此 多 次 离心 处 理 , 即 能 把 液体 中 的 不 同 颗粒 较 好 地 分 离开 。 此 法 所 得 沉淀 是 不 均一 的 , 仍 基 有 其 它 成 分 需 经 再 悬 冯 和 再 离心 (2 一 3 次 ), 才 能 得 到 较 纯 颗粒 。 差 速 离心 法 主要 用 于 分 离 细 胞 器 和 病毒 。 其 优点 是 :操作 简易 ;离心 后 用 倾倒 法 即 可 将 上 清 液 与 沉淀 分 开 ;并 可 使 用 容量 较 大 的 角 式 转子 。 缺 点 是 : 〈1) 分 离 效 果 差 ， 不 能 一 次 得 到 纯 颗 粒 。 (2) 壁 效应 严重 。 特别 当 颗 粒 很 大 或 浓度 很 高 时 ， 在 离心 管 壁 一 侧 会 出 现 沉 淀 。(3) 颗粒 被 挤 压 ,离心 力 过 大 、\ 离 心 时 间 过 长 会 使 颗粒 变形 ,聚集 而 失 活 。 (=) 密度 梯度 区 带 离 心 法 (或 简称 区 带 离心 法 ) 这 是 1940 年 发 展 起 来 的 一 种 方法 。 区 带 离 心 法 是 样品 在 一 惰性 梯度 介质 中 进行 离 心 沉降 或 沉降 平衡 ,在 一 定 离心 力 下 把 颗粒 分 配 到 梯度 中 某 些 特定 位 置 上 ,形成 不 同 区 带 的 分 离 方 法 。 此 法 的 优点 是 : 〈1) RRR, 可 一 次 获得 较 纯 颗 粒 ; (2) 适应 范围 广 。 能 象 差 速 离心 法 一 样 分 离 具有 沉降 系数 差 的 颗粒 ， 又 能 分 离 有 一 定 序 力 密度 差 的 颗粒 ; 《3) 颗 粒 不 会 挤 压 变形 , 能 保持 颗粒 活性 ,并 防止 已 形成 的 区 带 由 于 对 访 而 引起 混合 。 缺 点 是 :(1) 离心 时 间 较 长 ;〈2 六 需要 制备 梯度 ; (3) 操作 严格 :不 易 掌握 区 带 离心 法 又 可 分 为 差 速 -区 带 离心 法 (动态 法 或 沉降 速度 法 ) 和 等 密度 离心 法 (平衡 法 或 沉降 平衡 法 )。 1. 差 速 - 区 带 离心 法 ”” 当 不 同 的 颗粒 间 存 在 沉降 速度 差 时 ， 在 一 定 离心 力作 用 下 5 颗粒 各 自 以 一 定 速度 沉降 ， 在 密度 梯度 的 不 同 区 域 上 形成 区 带 的 方法 称 差 速 = 区 带 离 心 法 。 差 速 -区 带 离心 仅 用 于 分 离 有 一 定 沉降 系数 差 的 颗粒 , 与 其 密度 无 关 。 大 小 相同 ， 密 度 不 同 的 颗粒 (如 线粒体 \ 溶 酶 体 和 过 氧 物 酶 体 ) 不 能 用 此 法 分 离 离心 时 ,由 于 离心 力 的 作用 ,颗粒 离开 原样 品 层 ， 按 不 同 沉 降 速 度 沿 管 底 帝 降 s 离心 一 定时 间 后 ,沉降 的 颗粒 逐渐 分 开 ; 最 后 形成 一 系列 界面 清楚 的 不 连续 区 带 。 沉 降 系数 越 大 , 往 下 训 降 得 越 快 ,所 呈现 的 区 带 也 越 低 。 帝 降 系 数 较 小 的 颗粒 ,， 则 在 较 上 部 分 依次 出 现 。 从 颗粒 的 沉降 情况 来 看 ,离心 必须 在 沉降 最 快 的 颗粒 《大 颗粒 方 到 达 管 底 前 或 刚 到 达 管 底 时 结束 ,使 颗粒 处 于 不 完全 的 沉降 状态 ,而 出 现在 某 一 特定 区 带 内 。 此 时 ;离心 管 梯 度 液 面 上 的 样品 层 ， 由 于 颗粒 沉降 而 变 成 了 仅 有 溶剂 分 子 的 上 清 液 。 若 样品 液 中 含有 太 量 沉降 系数 不 同 的 颗粒 ( 即 浓度 很 大 ) 时 ,也 可 能 得 到 一 条 不 同 颗粒 连续 分 布 的 区 带 。 在 离心 过 程 中 ,区 带 的 位 置 和 形状 (或 宽度 ) 随 时 间 而 改变 。 因 此 ,区 带 的 宽度 不 仅 取 决 于 样品 组 分 的 数量 梯度 的 斜率 、 颗 粒 的 扩散 作用 和 均一 性 ， 也 与 离心 时 间 有 关 。 时 间 越 长 ， 区 带 越 宽 。 适 当 增加 离心 力 可 缩短 离心 时 间 ， 并 可 减少 扩散 所 导致 的 区 带 加 宽 现 象 ,增加 区 带 界面 的 稳定 性 ,特别 是 较 小 的 颗粒 ,沉降 慢 , 易 扩散 , 需 用 高 速 离心 s 差 速 -区 带 离心 的 分 辩 率 (不 同 区 带 相互 间 分 开 的 清晰 程度 ) 比 差 速 离心 高 ,分 辩 率 高 低 受 颗粒 沉降 速度 和 扩散 系数 实验 设计 的 离心 条 件 〈 样 品 带 的 宽度 和 浓度 、 离 心力 和 离 心 时间, 梯度 斜率 和 长 度 \ 梯 度 介 质 的 性 质 等 六 离心 操作 的 熟练 程度 所 影响 。 梯 度 介质 的 厚 擦 阻力 (或 粘度 ) 越 大 \ 颗 粒 沉降 速度 和 扩散 系数 越 少 e 沉 降 速度 的 大 小 还 与 颗粒 的 表面 积 \ 形 状 有 关 , 大 的 、 球 形 的 颗粒 比 小 的 、 长 形 的 颗粒 沉降 得 快 ; 与 颗粒 和 周围 介质 间 的 密 度 差 及 梯度 上 某 一 点 的 离心 力 成 正比 。 若 颗粒 沉降 速度 差 值 小 ,就 会 影响 分 辩 率 ,颗粒 的 扩 散 系数 可 改变 区 带宽 度 , 也 影响 分 辩 率 。 操 作 中 应 尽量 避免 在 装 样 \ 离 心 及 取出 梯度 条 扰 。164 。 乱 梯 度 。 离 心 条 件 对 分 养 率 的 影响 ,将 在 有 关 部 分 叙述 。 2. 等 密度 离心 法 “文献 中 有 多 种 叫 法 ,但 均 离 不 开 平衡 "这 二 个 字 的 含义 , 故 也 称 平衡 法 。 当 不 同 颗粒 存在 浮力 密度 差 时 ,在 离心 力 场 下 ,颗粒 或 向 下 沉降 ,或 向 上 泽 起 ,一 直 沿 梯度 移动 到 与 它们 密度 恰好 相等 的 位 置 上 《〈 即 等 密度 点 ) 形成 区 带 , 此 即 为 等 密度 离 心 法 。 处 于 等 密度 点 上 的 颗粒 没有 重量 ,区 带 的 形状 、 位 置 均 不 受 离 忆 时间 所 影响 ,体系 处 于 动态 平衡 。 等 密度 离心 的 离心 过 程 与 差 速 离心 、 差 速 - 区 带 离心 的 比较 如 图 6-5。 时 间 从 堪 -> 右 增加 一 一 离心 一 差 速 一 区 带 离心 等 密度 离心 sats «2 De 6-5 ”颗粒 沉降 过 程 的 示意 图 等 密度 高 心 的 有 效 分 离 取决 于 颗粒 的 浮力 密度 差 , 密度 差 越 大 ,分 离 效 果 越 好 ,与 大 本 和 形状 无 关 ; 和 但 后 二 者 决定 着 达到 平衡 的 速度 时间 和 区 带 的 宽度 。 颗 粒 的 浮力 密度 不 是 恒定 不 变 的 ,还 与 其 原来 密度 \ 水 化 程度 及 梯度 溶质 的 通 透 性 或 溶质 与 颗粒 的 结合 等 因 素 有 关 。 例 如 某 些 颗粒 容易 发 生 水 化 ,使 密度 降低 ; 亲 水 梯度 材料 可 能 渗 人 颗粒 ， 取代 结 ”和 构 内 的 水 化 水 而 增加 表 观 密度 ,分 离 时 就 要 考虑 这 些 因素 的 影响 。 等 密度 离心 的 分 辩 率 受 颗 粒 性 质 (密度 ,均一 性 、 含 量 六 梯度 性 质 (形状 斜率 、 疾 度 )、 转子 类 型 .离心 速度 和 时 间 的 影响 。 颗 粒 区 带宽 度 与 柳 度 斜 率 、 离 心力 、 颗 粒 分 子 量 成 反 比 。 低 速 离心 虽 可 使 颗粒 沉降 平稳 ,但 不 易 建 立 平衡 , 需 延 时 离心 ,有 时 要 达 数 天 之 久 。 这 会 增加 某 些 分 子 的 搞 获 速度 ， 使 区 带 加 宽 ， 分 辩 率 降低 。 所 以 等 密度 离心 的 转速 一 般 较 isJo 角 式 转子 > 外 摆 式 转子 ;每 一 类 型 的 转子 也 有 大 小 之 分 。 区 带 转子 不 仅 容 量 大 ,有 些 还 有 连续 流动 装置 或 光学 监测 系统 ,很 适 于 大 : 规模 分 离 制备 。 角 式 转子 用 于 差 速 离心 分 离 时 ,由 于 每 次 处 理 样 品 多 , 离心 时 间 短 , 可 增 加 样品 的 处 理 次 数 和 体积 。 (=) 离心 管 及 其 选择 离心 管 通常 由 琉璃、 塑料 和 金属 (如 不 锈 钢 ` 铝 合金 ) 制 成 。 玻 璃 管 虽 质 硬 , 但 很 脆 , 不 能 耐 受 超速 离心 的 应 力 。 超 离心 所 用 离心 管 主要 用 塑料 和 不 锈 钢 制 成 。 塑料 离心 管 常用 的 材料 有 聚 乙烯 (PE)\ 醋 酸 - 丁 酸 纤维 素 (CAB)、 聚 碳酸 酯 (PC)、 聚 丙烯 (PP 入 硝酸 纤维 素 (NC) 等 。 塑 料 管 的 最 大 优点 是 透明 (或 半 透 明 ), 硬度 小 , 可 用 穿 刺 法 取出 梯度 。 某 些 管子 还 具有 良好 的 物理 性 能 ,如 抗 张力 、 耐 高 (或 低 ) 温 等 ,可 经 受 高 温 消 毒 \ 冷 冻 \ 超 速 离心 等 不 同 处 理 。 其 主要 缺点 是 易 变 形 , 抗 腐蚀 性 差 , 使 用 寿命 短 。 不 锈 钢 离心 管 强度 大 ,不 变形 、 能 抗 热 \ 抗 冻 \ 抗 化 学 腐蚀 。 但 使 用 时 也 应 避免 接触 强 腐蚀 性 的 化 学 药品 , 如 HCl, H,SO,, HF 等 。 在 某 些 特殊 场合 下 ,也 可 使 用 塑料 衬里 的 不 锈 钢 管 s 离心 管 的 选择 主要 从 容量 \ 强 度 、 抗 温 变 、 抗 化 学 腐蚀 等 方面 考虑 。 此 外 ,高 速 离心 的 应 力 还 会 加 剧 介质 对 管子 的 腐蚀 。 因此 ,必须 根据 制备 离心 的 不 同 要求 ( 体 积 `\ 转 速 、 介 质 等 ) 选 择 相应 的 离心 管 。 选 择 管子 的 最 好 办 法 是 查阅 有 关 管 子 的 资料 或 产品 说 明 书 ,并 在 离心 前 测试 梯度 介质 或 桩 品 对 离心 管 稳定 性 的 影响 。 制备 超 离心 普遍 采用 不 锈 钢管 ; 塑 料 管 则 主要 用 于 区 带 离心 。 选 用 塑料 离心 管 时 ;管子 的 大 小 须 与 梯度 液 或 样品 液 相 适应 。 未 充满 液体 的 管子 (甚至 拉力 强度 较 大 的 PC 管 ) 应 降 速 使 用 ; 在 角 式 转子 中 高 速 离心 时 ， 管 壁 受 压 不 匀 将 引起 管子 变形 或 崩 裂 。 上 下 密度 差 较 大 的 梯度 管 ， 也 容易 发 生 类 似 的 离 心 变形 ,使 转子 不 平衡 而 造成 严重 事故 。 有 些 管 子 (如 NC 管 、.PP 管 ) 即 使 充满 液体 ,也 不 能 在 5 万 cpm 以 上 转速 下 离心 。 超 速 离心 宜 选用 不 锈 钢管 , 厚 壁 塑料 管 、polyallomer (PA, 丙烯 和 乙烯 单 体 的 共聚 物 ) 管 。 严 禁 使 用 显著 变形 、 损 伤 或 老化 的 离心 管 。 另 外 , 还 应 了 解 管子 的 容量 \ 最 高 转速 ,使 用 次 数 ` 保 存 方法 等 ,以 便 合 理 使 用 。 薄 壁 管 在 6.5 rpm 的 高 速 下 仅 用 一 次 , 4 一 6 万 rpm 下 可 用 3 一 5 次 。 厚 壁 管 使 用 次 数 可 多 些 。 此 外 ,还 要 考虑 介质 对 管子 (如 前 述 ) 或 管子 对 分 离 颗粒 的 影响 ,例如 某 些 塑料 管 (如 硝酸 纤维 素 管 ) 的 表面 会 吸附 核酸 , 管子 的 长 短 , 大 小 等 也 要 适当 注意 。 如 外 扔 式 转子 用 ” 细 长 管 作 差 速 - 区 带 离 心 可 获得 较 高 的 分 辩 率 ; 薄 壁 管 仅 用 于 外 摆 式 转子 ; 角 式 转子 及 垂 直 转 子 用 的 管子 承受 的 压力 大 , 须 用 厚 壁 离心 管 等 等 。 (=) 离心 管 帆 BAMA LS RNA SI. 离心 前 管子 必须 戴 好 管 帽 。 管 帽 有 三 种 作用 : C1) 防止 样品 外 泄 。 用 于 生物 危险 、 放 射 性 或 腐蚀 性 的 样品 时 ,这 点 尤其 重要 。(2) 防 止 样品 挥发 。 样 品 暴 露 于 真空 时 ,很 容易 挥发 ,使 转子 失衡 运转 而 发 生 事故 。(3) 支持 离心 管 , 防 止 离心 变形 。 管 帽 一 般 由 塑料 ,电镀 铝 合 金 或 不 锈 钢 制 成 ,内 衬 橡胶 密封 垫圈 。 。 171 。 Kw 34 SH xopnT 中 洗 二 "HO H I | “FOODN | NOO‘SHO | 68/ = MW Se LS el-Z TAC EZ aprurezineyy Me OM Fy Labatt — GH oi SE NS apiurezinow Ke |B OMe i BRATS | ONY GHAR) Deitel SMO Rey Be om Opp Ce! 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RNA-DNA® > 变性 DNA > | 了 RNA-DNAs> 天 然 DNA (杂交 分 子 的 浮力 密度 随 组 成 而 改变 )。 核酸 的 浮力 密度 会 受到 某 些 因素 的 影响 。DNA 的 浮力 密度 与 以 下 因素 有 关 : 〈1) 在 盐 介 质 中 的 水 化 程度 ”已 利 用 水 化 程度 的 不 同 而 分 离 单 \ 双 链 DNA。(2) 螺旋 度 。 利用 在 CsCl BK Cs,SO, 中 加 入 KLEMM DNA 的 浮力 密度 。 螺 旋 度 大 的 ,结合 染料 少 , 浮力 密度 降低 就 不 明显 。 《3) 碱 基 组 成 。 天 然 DNA 的 GC 含量 \ 碱 基 的 修饰 \ 同 位 素 标 记 等 对 密度 均 有 影响 。 饮 盐 介质 也 用 于 病毒 及 某 些 复合 蛋白 (如 血清 脂 蛋白 、 mRNA 蛋白 \ 核 RNA SBS) 或 经 特殊 处 理 的 核 重 白 的 分 离 ， 但 盐 介质 所 产生 的 高 次 透 压 和 高 离子 强度 对 少数 病毒 及 多 数 复合 蛋白 的 稳定 性 不 利 , 可 能 会 导致 结构 改变 而 形 失 感染 活性 。 分 离 核酸 类 物质 也 用 其 它 盐 类 ,但 缺陷 更 多 , 仅 在 特殊 情况 下 使 用 。 如 某 些 动物 病毒 在 酒石酸 钾 梯 度 中 相当 稳定 ,分 离 效 果 比 CsCl &, Nal 可 用 于 分 离 核酸 ，NaBr 则 专用 于 分 离 脂 蛋白 等 。 2. 小 分 子 有 机 物 “，” 单 、 双 糖 梯度 主要 用 于 差 速 -区 带 离心 。 最 常用 的 是 蔗糖 , 梯度 范围 是 5 一 20 多 (大 分 子 及 小 颗粒 ) 或 15 一 30 多 (ABM). RiP tS Ronee. FE 损伤 浮力 密度 低 ( 在 CsCl 中 浮力 密度 为 1.38 的 病毒 ,在 芒 糖 中 为 1.20) 等 优点 只 少数 FAI AN f MER TK, 80S), SRP BAIT MAR 120—1,000 Se 使 用 蔗糖 梯度 时 ;通常 在 90,000 一 420;000 g 下 离心 0.5 一 3 小 时 即 可 。 蔗糖 也 常用 于 亚 细 胞 器 、 某 些 RNA, DNA 和 核 蛋白 的 分 离 , A SWS, 颗 狂 完 整 性 可 能 受到 一 些 影响 。 如 果 待 分 离 样品 液 含有 苍 糖 酶 或 芒 糖 干扰 某 些 酶 的 测定 时 ， 可 用 甘油 代替 蔗糖 。 甘 铀 在 性 质 上 类 似 蔗糖 ,但 可 保护 酶 活 , 能 高 压 消毒 , 易 蒸 发 除去 。 。174 。 i 3. 有 机 高 分 子 “多糖 、 白 蛋白 等 渗透 压低 , 适 于 具 膜 颗粒 的 差 速 - 区 带 和 等 密度 离 心 分 离 。 许 多 动 植物 、 微 生物 的 细胞 、 亚 细胞 器 和 病毒 已 成 功 地 用 多 糖 介质 进行 分 离 , 颗 粒 经 分 离 后 ;一 般 损伤 极 小 ,但 高 浓度 下 多 糖 的 渗透 性 增加 , 易 使 细胞 失 活 , 故 不 常用 于 活 缅 胞 的 等 密度 分 离 。 差 速 - 区 带 离 心 却 可 获得 相同 或 更 为 有 效 的 结果 , 而 且 时 间 短 , 转速 低 , 其 中 最 为 广泛 使 用 的 是 聚 蔗糖 和 牛 血清 白 蛋白 。 生 物 颗粒 在 多 糖 中 高 度 水 化 ,其 浮力 密度 比 在 蔗糖 中 低 。 高 浓度 的 大 分 子 梯度 介质 ， 对 颗粒 损伤 比 芒 糖 小 ,但 成 本 较 高 、 溶 度 较 小 , 而 且 粘 度 高 ,需要 延长 离心 时 间 , 不 宜 用 于 小 颗粒 的 分 离 , 应 用 上 并 不 优 于 莽 糖 。 4. 三 矿 化 荣 衍 生物 ， 复 合 蛋白 质 对 高 离子 强度 敏感 ， 容 易 引 起 结合 键 的 断裂 或 亚 基 解 离 。 分 离 这 类 复合 物 须 选 用 非 离子 型 的 梯度 介质 。: 最 常用 的 三 矶 化 葵 衍 生物 是 非 离 子 型 的 Metrizamide, Ait th ARB. Metrizamide 不 解 离 核 蛋 白 , 但 其 它 三 碘 化 茉 衍生 物 均 为 弱 离子 型 ,会 影响 核 蛋白 组 成 ;应 用 上 受到 一 定 限 制 。 三 磺 茉 衍生 物 也 能 用 于 分 离 核酸 、 蛋 白质 病毒 \ 亚 细胞 器 和 细胞 等 ,许多 成 功 的 例子 已 显示 出 它 的 潜在 作用 。 GES BEE HTHE th ERS IAS. DNA 在 Metrizamide HAY 7% spite Ei2: 克 /厘米 5 接近 完全 水 化 时 的 密度 ;而 在 离子 型 三 碘 茉 衍生 物 中 ， 密 度 还 稍 Kis,” WAS Metrizamide 的 离子 强度 或 DH 也 能 改变 DNA 的 浮力 密度 。 多 数 三 碘 共 衍生 物 能 与 蛋白 质 牢 固 结合 六 使 浮力 密度 增 大 达 1.30 克 / EDR 以上。 采用 重水 作 溶 剂 或 HERE AL) BSUS EE 或 用 较 低 浓度 的 Metrizamide (83484), Urografin (不 结合 ) 可 减弱 或 排除 这 种 结合 作用 。 和 蛋白 质 、 复合 蛋白 质 在 Metrizamide 中 的 浮力 密度 约 为 127 和 1.22 克 / 运 米 ?。 三 碘 茉 衍生 物 几 乎 可 用 于 任何 颗粒 的 分 离 ， 是 很 有 前 途 的 二 类 介质 。 .15. 胶 态 SiO, (Ludox) ， 具 膜 颗粒 对 渗透 压 人 敏感 ,不 能 用 高 盗 透 性 的 盐 类 、 芒 糖 或 高 粘性 的 Ficoll、Metrizamide 来 分 离 ; 粘度 高 ;沉降 慢 ， 离 心 时 间 长 也 易 引 起 不 稳定 颗粒 的 破坏 或 变性 。Ludox 的 淘 透 压 和 粘度 均 很 低 ; 是 分 高 不 稳定 颗粒 的 理想 介质 。 但 Ludox 在 到 二 7.5 不 稳定 ;对 细胞 有 低 毒 性 , 须 与 多 聚 体 ( 如 葡 聚 糖 , 聚 乙 二 醇 ) 配 成 混合 梯度 介 质 后 才 适 用 ;或 采用 新 型 号 的 Ludox (如 MCS 的 开 开 型 )。Ludox MCS AMR BT RA SiO, 的 优点 ;而 且 避 免 了 加 多 聚 体 所 带 来 的 次 病 ,在 活 透 性 、DH、 离 子 强度 上 接近 细胞 的 _ 生理 条 件 ,是 二 种 很 有 前 途 的 材料 eas 颗粒 在 Ludox 中 的 序 力 密度 较 低 ,大 部 分 细胞 器 小 于 1.10 S/R? (在 莽 糖 中 则 达 1.15—1.2 克 / 厘 米 ?) ,细胞 器 分 离 常用 介质 是 溶 于 0.25 M ET Ludoxs 选择 梯度 介质 还 要 考虑 介质 的 稳定 性 。 Ludox 在 高 速 下 ( > 100,000g) 会 出 现 SiO, 颗粒 沉淀 ,只 能 分 离 沉 降 速度 比 SiO, 颗粒 快 的 较 大 颗粒 ,不 宜 分 离 大 分 子 或 大 分 子 复 合 物 ( 如 桨 色 体 )。 大 量 制备 还 要 考虑 材料 的 成 本 ,来源 及 回收 等 。 如 二 时 找 不 到 合适 的 材料 作 梯 度 介 质 ,或 颗粒 不 稳定 ,不 能 用 高 粘度 介质 时 , 也 可 用 混合 材料 作 介质 。 混 合 材 料 的 梯度 在 等 密度 离心 中 已 得 到 广泛 应 用 ,如 40% Ludox 和 多 糖 的 梯度 常用 于 完整 细胞 的 分 离 。 e175¢ (=) 梯度 的 选择 梯度 的 作用 是 使 颗粒 沉降 稳定 或 稳定 颗粒 区 带 界面 ， 防 止 因 局 部 温度 变化 或 机 械 震 动产 生 的 对 流 扰 乱 而 影响 分 离 效 果 。 在 区 带 离心 中 , BEWARE, 梯度 的 斜率 形状 和 容量 的 选择 是 颗粒 分 离 的 关键 。 1. 梯度 的 形状 TRIER SEE, 直线 形 (RR). a (RBA B) ME RARE) MEMS BE. 超 离心 制备 常用 线性 梯度 。 差 速 - 区 带 离心 一 般 用 预 形成 线性 梯度 ; 等 密度 离心 则 可 用 预 形成 或 离心 形成 的 线性 梯度 。 预 形成 梯度 一 般 用 于 :， (1) 不 稳定 的 颗粒 3(2) 扩散 慢 , 不 易 离心 形成 梯度 的 介质 ; (3) 沉降 快 的 大 颗粒 《细胞 、 细 胞 器 等 )5 SRE 离心 18 小 时 (或 18 小 时 以 下 ) 后 ,能 清楚 分 成 区 带 时 五 可 用 预 形成 线性 梯度 。 aise BEM BET RAKN SD REPO BEBRAREME, 8 “Hitt 5-7 JRA PS ESE, SOLAS SSTRTER AO BI. BRERA SE LE i, ERAEREOTHHS, RETURN. BH, RAB, RABRAR 大 ;分 离 迅速 、 效果 好 的 优点 。 主要 用 于 等 密度 分 离 , ,有 有时 也 用 于 差 速 = 区 带 离心 训 使 用 阶梯 梯度 须 有 线性 梯度 的 分 离 数 据 作 依据 。 四 形 梯 度 常 用 于 低 密 度 颗粒 (如 脂 蛋 自 ) 的 土 浮 等 密度 分 离 ; 凸 形 梯度 则 用 于 较 高 密度 颗粒 的 沉降 等 密度 分 离 * 通常 都 采用 长 离心 管 。 以 提高 较 低 密度 区 ( 凹 形 ) 或 较 高 密度 区 ( 凸 形 ) 的 分 辩 率 5 ;复杂 梯度 可 同时 用 混合 物 申 颗 粒 的 沉降 系数 差 和 密度 差 。 这 种 混合 物 一 般 需 依次 经 颗粒 密度 差 及 沉降 系数 差 三 步 离 忆 分 离 (或 反之 ) ,采用 复杂 梯度 ,一 次 即 可 得 较 彻底 的 分 离 ; 简 化 了 分 离 步骤 5 沉降 系数 或 密 度 范 围 很 宽 ( 即 同 种 颗粒 大 小 不 均一 ) 的 颗粒 ,用 复杂 梯度 往往 也 能 与 其 它 颗 粒 很 妈 分 开 线性 梯度 的 缺点 是 离心 力 随 管 长 (或 半径 ) 增 加 3 无 法 抵消 粘度 增加 对 沉降 速度 的 影 i, 使 颗粒 的 沉降 变 慢 ， 影 响 了 梯度 下 部 分 的 分 辩 率 。 MT HES SD Me i, 让 颗粒 作 恒 速 运动 ,有 从 在 外 择 式 和 区 带 转 子 的 差 速 = 区 带 离心 中 使 用 村 等 动 办 学 和 等 体积 梯度 ;但 制备 上 除 常用 的 5—20% 蔗糖 梯度 处 ;其余 实用 价值 不 大 。 os 2 梯度 的 密度 范围 :线性 梯度 上 下 密度 比 为 卫 /4 最 好 : 差 速 -区 芝 离 心 所 用 梯度 的 密度 范围 小 , 其 最 大 密度 ( 即 底部 密度 ) 小 于 样品 液 中 所 有 颗粒 的 密 庶 s 这 种 梯度 的 作用 既 可 以 使 大 小 不 同 的 颗粒 在 离心 力 场 下 往 管 底 沉 降 , 又 能 防止 对 流 , 维 持 沉降 稳定 站 使 颗 粒 不 致 很 块 降 到 管 底 , 从 而 有 足够 时 间 形 成 区 带 。 还 能 人 避免 某 些 颗 粒 形成 等 密度 区 带 5 而 与 其 它 颗粒 的 沉降 区 带 相 混淆 5 等 密度 离心 所 用 梯度 的 密度 范围 较 大 , -包括 样品 液 中 所 有 颗粒 的 密度 在 内 s; 梯 度 的 最 大 密度 要 大 于 样品 中 所 有 颗粒 的 密度 ,: 防 山 某 些 颗 粒 在 没 有 等 密度 点 稳定 的 情况 下 ,继续 往 下 沉降 ,造成 与 其 它 等 密度 区 带 重 笃 ,影响 分 离 效果 。 选择 梯度 的 最 小 密度 ( 即 梯度 顶部 的 密度 ) 的 依据 是 , 它 必 须 能 支持 样品 液 半 并 在 未 离心 前 尽 可 能 减少 颗粒 的 沉降 , 又 必须 具有 分 离 所 要 求 的 最 小 密度 和 粘度 /以 使 离 i 迅 速 。 因 此 ， 梯 度 顶 部 的 密度 必须 比 样品 液 的 大 。 在 分 离 具 膜 颗 粒 《 细 胞 或 细胞 器 ) 时 ,为 了 如 免 溶 涨 ,一 般 将 样品 悬浮 于 等 活 介 质 中 。 如 用 0.25M 的 等 次 蔗糖 液 计 芒 粹 实 度 的 最 小 密度 为 0.3 M 或 0.35 一 0.40M。 分 离 大 分 子 或 核 蛋 白 体 亚 基 时 ; 因 颗 粒 不 必 悬 译 于 等 浆 介质 中 ,梯度 的 最 小 密度 可 用 0.15 M。 此 时 ,由 于 粘度 下 降 ,分离 时 间 大 为 缩短 。 如 果 用 盐 介 质 进 行 平衡 等 密度 离心 ， 形 成 梯度 的 密度 范围 与 梯度 介质 的 性 质 、 离 心 e 176。 力 \ 梯 度 顶 部 和 底部 与 转轴 的 距离 及 梯度 液 的 起 始 密度 有 关 。 可 用 公式 表示 如 下 : am am A) (13) 出 公式 可 见 ,离心 力 大 ,梯度 的 密度 差 也 大 。 通 常 起 始 密度 均 应 稍 高 于 样品 中 颗粒 的 最 大 浮力 密度 (大 于 0.01-0.02 克 / 厘 米 2， 以 避免 梯度 形成 之 前 出 现 颗粒 的 沉淀 ;并 让 所 有 颗 粒 都 能 在 平衡 梯度 中 分 成 稳定 区 带 , 出 现在 梯度 的 较 上 部 分 。 3. 梯度 (线性 ) 的 祭 率 ”颗粒 的 沉降 系数 或 浮力 密度 差 较 大 ， 可 选用 较 大 的 梯度 余 率 及 较 短 的 离心 管 , 但 这 会 导致 颗粒 区 带 变 窗 ， 降 低 区 带 容 量 ( 指 稳定 区 带 所 容纳 箱 粒 的 最 太 量 , 它 与 区 带宽 度 平方 成 正比 , 与 斜率 成 反比 )。 梯度 的 斜率 越 大 , Rie, He 近 :, 回 收 区 带 时 就 易 产 生 交叉 污染 ;梯度 的 斜率 小 ,虽然 区 带 容量 大 ， 但 由 于 粘度 小 , 扩散 严重 ,使 区 带宽 度 增 加 ,并 可 能 导致 区 带 重合 而 降低 分 辩 率 。 超 离心 分 离 一 般 采 用 斜率 较 小 的 线性 梯度 ,但 需 达 到 一 定 的 梯度 斜率 ,以 阻止 对 流 的 影响 ,维持 颗粒 区 带 的 稳定 性 。 差 速 - 区 带 离心 所 用 梯度 斜率 一 般 比 等 密度 离心 小 ,但 在 高 速 离心 并 使 用 低 样 品 浓度 和 相对 宽 的 样品 区 带 时 ,用 斜率 较 大 的 线性 梯度 也 能 得 到 很 好 的 分 辩 率 。 .平衡 等 密度 离心 的 梯度 斜率 与 转速 梯度 底部 与 转轴 的 距离 介质 性 质 或 8" REE CARTEL) vm BE CRE) 5 id icant asics ae 可 用 公式 表示 如 下 : do _ wt dr e wine FARA RS) KTR ABS, HR BARE BAS) RTA 1.241 CsSO, > CsCl > Nal, 与 盐 的 8" 值 相 反 。 一 般 的 分 离 最 好 用 斜率 稍 大 的 盐 梯 度 《 太 大 也 影响 分 辩 率 ) ,斜率 太 小 的 梯度 仅 作 纯化 使 用 。 平衡 等 密度 离心 所 产生 的 梯度 斜率 一 般 较 小 ,如 事先 使 用 阶梯 棋 度 或 线性 梯度 ,可 使 梯度 斜率 增加 ,但 此 梯度 不 稳定 ,离心 时 将 重新 分 配 为 斜率 小 的 梯度 。 4. 梯度 的 容量 梯度 容量 取决 于 样品 体积 和 浓度 、 梯 度 体积 和 斜率 .所 要 求 的 分 辨 率 、 所 用 的 回收 方法 和 转子 的 效率 等 。 已 发 现 梯度 的 实际 容量 低 于 理论 值 ， 为 后 者 的 90 驳 。 梯 度 的 容量 带 有 很 大 的 经 验 性 ,如 差 速 -区 带 离 心 为 每 毫升 梯度 体积 1 一 1000 微克 ， 一 般 在 100 微克 以 下 ;外 摆 式 转 子 的 离心 管 ( 直 径 2.5cm)， 每 厘米 直径 所 容许 的 样品 量 约 为 0.15 一 0.8 毫升 〈 随 直径 而 变化 )。 梯 度 斜 率 相同 时 ， 角 式 转子 的 梯度 容量 比 外 摆 式 转 子 大 , DNA 容量 为 后 者 的 10 倍 左右 。 角 式 转子 如 用 于 分 离 二 种 DNA (密度 差 0.005 克 / 厘米 裤 时 ,梯度 容量 为 50 一 150 微克 DNA, 如 用 于 制备 总 DNA， 容 量 可 大 至 5 毫克 。 i Ly Till Erk BS AER PRLS ¥8,9,14] 《一 ) 梯度 的 制备 : 梯度 可 用 机 械 法 或 手工 操作 法 制备 ， 也 可 用 离心 法 形成 。 常 见 梯度 的 制备 方法 介绍 如 下 : | 1: 不 连续 密度 梯 记 (或 阶梯 梯度 ) 的 制备 ”密度 随 管 长 或 半径 阶梯 式 增 加 的 梯度 为 不 连续 梯度 。 其 制备 方法 最 为 简单 ,通常 先 配 好 一 系列 不 同 密度 的 溶液 ,然后 用 移 液 管 将 ， 梯度 介质 从 浓 到 稀 沿 管 壁 小 心 加 入 ,或 用 一 加 细 管 的 注射 器 针头 插 到 管 底 , 从 稀 到 浓 一 层 层 地 铺 到 离心 管 中 ， 即 可 产生 一 个 不 连续 的 密度 梯度 。 这 梯度 不 稳定 ， 放 置 一 段 时 间或 «B72 « 用 金属 丝 轻 轻 搅拌 ， 或 轻 胡 离 心 管 后 ， 由 于 分 子 的 扩散 作用 ， 就 会 慢 慢 变 为 连续 的 线性 梯度 。 2. 连续 密度 梯度 的 制备 密度 随 管 长 或 半径 逐渐 增加 的 梯度 为 连续 梯度 。 连 续 宰 度 又 可 分 为 : (1) 线性 梯度 ; (2) 四 形 或 凸 形 梯度 ; (3) 复杂 梯度 . 制备 超 离 心 常 用 线性 梯度 ,其 制备 方法 有 三 种 : (1) 阶梯 梯度 自动 扩散 法 : 由 -上述 方 法 以 相同 体积 和 等 差 浓度 制 得 阶梯 梯度 后 ”将 梯度 自然 放置 一 段 时 间 , 即 能 形成 所 需 的 线性 梯度 。 此 法 仅 适用 于 低 分 子 梯度 介质 (分 子 量 和 1000) ,每 层 梯 度 液 以 1 一 2 厘米 为 宜 。 阶 梯 梯 度 应 在 无 振动 下 自动 扩散 形成 , 形成 时 的 温度 最 好 与 离心 时 的 相同 。 扩 散 形 成 线性 梯度 所 需 的 时 间 与 梯度 材料 的 分 子 量 和 扩散 系数 ， 梯 度 的 温度 、 浓 度 和 粘度 ,以 及 每 层 液 的 厚度 、 密 度 差 等 有 关 , 通 常 需 8 一 24 小 时 以 上 。 温 度 高 ;时间 可 略 短 。 例 如 蔗糖 梯度 不 易 离心 形成 ,制备 5 一 50% 蔗糖 线性 梯度 时 ;是 让 50 多 、45 男 ……5% 浓度 的 蔗糖 液 及 水 各 0.9 毫升 的 阶梯 梯度 , 在 4 *C 下 放置 过 夜 (或 室温 下 2 一 3 小 时 ) 自 动 扩散 而 成 。 如 用 1 毫米 直径 的 细 铁 丝 轻 轻 融 击 ) 可 大 大 缩短 时 间 。 多 糖 需 数 天 才能 扩散 成 线性 梯度 。 (2) 梯度 产生 器 法 : 此 法 最 通用 .其 装置 又 可 分 为 手动 式 和 自动 式 ， 实 验 室 自制 的 简易 梯度 产生 器 即 属 前 者 。 梯 度 产生 器 系 由 玻璃 或 有 机 玻璃 等 材料 制 成 的 大 水 相同 的 内 外 两 室 所 组 成 ,通常 把 外 室 称 为 储存 室 , 内 室 称 为 混合 室 。 小 室 高 度 与 直径 之 比 为 2.5 一 3:1。 二 个 圆柱 形 小 室 间 有 一 连接 管 , 管 中 间 配备 有 作 开 关 用 的 活塞 或 螺旋 夹 。 混 合 室 底 ERE KPEHALERA-BRSRE, 以 螺旋 夹 控 制 梯度 液 流入 离心 管 的 速度 。 混合 室 中 附 有 搅拌 器 ,使 用 时 一 般 控 制 转速 为 50 rpm 左右 。 现 以 蔗糖 作 梯 度 材 料 为 例 , 制 备 5—30% 的 线性 芒 糖 梯度 。 先 关闭 两 室 的 活塞 ;然后 向 外 室 和 内 室 分 别 加 入 10 毫升 5% 和 30 多 的 莽 糖 液 。 装 液 时 必须 先 装 外 室 , 在 芒 糖 液 快 满 过 连接 管 时 轻 轻 打 开 中 间 活 塞 ,使 蔗糖 液 充满 连接 管 到 活塞 间 的 通道 后 立即 关闭 活塞 。 手工 操作 中 这 是 一 个 重要 的 步骤 ;不 排除 管内 的 空气 ,将 会 影响 梯度 的 形状 。 内 容 充 液 时 > 可 将 导 液 管 流出 端 提起 ,使 之 高 出 液体 的 水 平面 ,以 阻止 液体 流出 。 两 室 中 的 溶液 应 调节 在 同一 水 平面 上 ,使 两 室 连 通 时 线性 梯度 不 致 为 相互 产生 的 对 流 所 扰乱 。 两 室 都 加 完 蔗 糖 液 后 ,用 固定 支架 将 导 管 紧 贴 离心 管 壁 , 使 梯度 液 沿 管 壁 流下 ， 以 避免 扰乱 梯度 。 开 动 电磁 搅拌 器 ,并 打开 两 室 连 接管 活塞 。 当 梯度 液 自 内 室 流 出 时 ,不 允许 再 移动 固定 于 支架 上 的 离心 管 。 混 合 时 流速 要 慢 , 控制 在 1 毫升 /分 左右 。 制 备 好 梯度 后 ,将 离心 管 小 心 移 到 冷 室 中 放置 备用 ,梯度 在 几 小 时 内 是 稳定 的 。 也 可 把 稀 液 加 入 内 室 ， 少 液 加 入 外 室 ,但 此 时 梯度 液 导 液 管 必 须 直 播 到 离心 管 底 ,让 浓 溶 液 将 稀 溶 液 顶 浮 起 来 ,最 后 仔细 地 将 导 液 管 取出 。 此 法 适用 于 朴 水 的 \ 在 管 壁 不 形成 水 流 的 塑料 离心 管 ( 如 聚 碳酸 酯 管 和 polyallomer 管 ) ,流速 可 相对 大 些 , 一 般 可 达 2 毫升 /分 。 手动 式 梯度 产生 器 虽 简 单 ,容易 操作 , 但 不 能 同时 制备 几 个 梯度 。 近 年 来 ,各 种 自动 梯度 产生 器 已 相继 出 现 , 这 些 装 置 尽管 在 产生 梯度 的 体积 ( 几 毫 升 ,多 至 100 毫升 以 上 ) 或 形状 上 各 不 相同 ,但 都 由 一 蠕动 泵 所 操纵 。 例 如 日 立 公司 55 P-2 型 超 离 心机 的 DGF-U 型 密度 梯度 产生 器 可 同时 制备 6 支 梯度 管 , 又 能 在 离心 后 自动 分 层 取出 梯度 中 各 区 带 。 改变 内 室 或 外 室 的 横 截面 积 也 可 得 到 某 些 特殊 的 非 线性 梯度 。 如 图 6-8 所 示 ， 当 A 二 B 时 为 凸 形 梯度 , A> B 时 为 凹 形 梯度 。 。178。 《a) ®) (c) 6-8 “ 几 种 不 同 梯度 形状 的 梯度 产生 器 示意 图 BAS (HFS) WKAR; A 为 内 室 ( 混 合 室 ), 用 稀 溶 液 。 Ce、CA、Va、VA 分 别 为 回收 梯度 的 浓度 和 体积 。Vz 为 残留 体积 梯度 产生 器 制备 梯度 虽 有 许多 优点 ,但 也 有 其 不 足 之 处 。 如 : 小 室 中 有 残留 液体 ,使 梯度 达 不 到 最 大 密度 ;机 械 搅 拌 增加 内 室 压 力 , 使 梯度 变形 ; 小 室 间 连接 管 太 小 不 易 迅 速 建立 平衡 ;高 粘液 难以 用 泵 控制 恒定 流速 等 。 G) 平衡 梯度 法 ， 盐 介质 的 线性 梯度 须 用 平衡 法 ， 通 过 长 时 间 高 速 离心 均匀 盐 溶液 和 样品 液 ( 有 时 还 含 Tris-HC1， 磷酸 盐 等 缓冲 液 ) 达 平衡 而 产生 。 盐 介质 离心 足够 长 的 时 闻 ; 当 盐分 子 的 沉降 速度 等 于 其 反方 向 的 扩散 速度 时 , 即 形成 盐 的 平衡 梯度 。 样 品 中 的 颗 粒 也 由 于 受 离心 力 影响 而 沉降 或 上 泽 到 梯度 内 相应 的 等 密度 点 上 ， 建 立 另 一 种 平衡 。 将 所 需 梯度 的 最 大 和 最 小 密度 液 分 成 二 层 , 让 盐分 子 静 置 扩散 12 小 时 ,然后 进行 离心 ,可 缩 短 平 衡 梯度 形成 的 时 间 。 外 摆 式 转子 离心 形成 的 梯度 线性 比 角 式 转子 的 好 。 此 法 的 关键 是 选择 介质 的 起 始 密度 ， 并 通过 折射 计 进 行 准确 校对 。 起 始 密度 所 需 盐 的 重量 (以 CsCl 为 例 ) ,可 从 表 6-9 求 得 。 也 可 用 下 面 公式 求 出 : x(%,W/W) = way 4g) Sree (15) eV p25 式 中 ;7 为 1 毫升 DNA 样 液 中 加 入 的 CsCl TEM, 0? 为 需要 制备 的 CsCl 密度 (25°C) 此 外 ， 有 人 介绍 一 种 制备 大 体积 蕊 糖 梯度 的 简单 方法 ,此 法 是 将 20% TP Ha 复 在 —20°C——40°C 冰冻 ,然后 在 4°C 或 室温 融 解 (2 一 3 次 )， 可 获得 近似 线性 的 10 一 30% TERRE BEM, ©1796 家 6-9 CsCl 的 起 始 密度 与 重重 及 最 后 体积 问 的 关系 起 始 密度 (E/E) | 1.66 | 1.67 | 1.68 | 1.69 | 1.70 | 1.71 | 1.72 Led 7 ler 22a te 24 e265) 291) 31 13D sled Oe) ch-oodentl 315 T2320 1532 | 1, 33 重量 ( 克 ) 最 后 体积 (毫升 ) 《二 ) 样 品 的 装 人 和 离心 : 样品 在 超 离 心 之 前 ,应 作 适 当 的 预 处 理 。 许 多 大 分 子 ( 或 颗粒 ) 在 溶液 中 都 带 有 电荷 ， 离心 沉降 时 ,沉降 快 的 分 子 可 被 沉降 慢 的 带 相反 电荷 的 分 子 所 吸引 , 减 慢 沉降 的 速度 。 分 离 这 类 样品 前 , 应 加 和 适量 的 低 分 子 电介质 ， 以 排除 沉降 时 电荷 的 相反 影响 。 如 在 10% 蛋白 质 湾流 中， 加 入 0.2 M NaCl Be KCL 可 使 静电 吸力 对 沉降 速度 的 影响 减少 到 19 以 Po 样品 中 如 有 容易 沉淀 的 凝聚 物 或 其 它 不 盗 物 时 ， 也 应 预先 沥 除 。 还 要 注意 样品 的 稳定 性 ， 有 时 须 加 入 组 冲剂、 稳定 剂 〈 硫 醇 、EDTA、 酶 的 底 物 ，Mg ) 等 。 样品 该 的 密度 应 小 于 梯度 的 最 小 密度 。 必要 时 也 可 将 样品 用 介质 做 成 倒 磁 度 ， 使 高 分 子 样 品 的 ”颗粒 向 梯度 方向 的 扩散 与 高 浓度 小 分 子 梯度 介质 向 低 浓 度 样品 带 的 扩散 速度 相等 ， 以 减 ” 少 因 离 心 前 颗粒 局 部 沉降 所 造成 的 分 辨 率 下 降 s 样品 在 梯度 中 所 处 位 置 有 四 种 ， 即 顶部 底部 ,中 间 及 混合 。 一 般 样品 是 以 薄 层 铺 放 在 梯度 顶 上 。 人 样品 的 用 量 对 分 辨 率 有 很 大 影响 。 当 颗 粒 沉 降 系数 或 浮力 密度 差 较 小 时 ， ARAM REBAR 5% 以 下 )。 样 品 浓度 不 要 太 高 (为 梯度 介质 最 低 浓 度 的 10% )。 操 作 时 用 吸管 吸取 ,然后 沿 管 壁 小 心 放 人 。 吸 管 的 尖端 绝 不 允许 接触 梯度 的 该 面 一 般 要 离开 0.5 毫米 ， 紧 贴 管 壁 ， 避 免 自 由 滴 落 。 离 心 管 最 好 事先 放 人 转子 内 ; 以 免 管 于 装 人 时 扰乱 梯度 和 样品 层 。 外 摆 式 转子 加 样 后 的 液 面 与 管 口 相距 2 一 3 毫米 如 果 用 角 式 转子 离心 ,最 好 将 管子 部 分 充满 ,以 防止 梯度 重新 定向 时 , 管 帽 分 裂 梯度 , 还 可 和 避免 梯度 分 质 对 金属 管 帽 的 腐蚀 。 盛 放 溶 液 的 多 少 与 管子 角度 、 材 料 强度 、 厚 薄 有 关 ; 一 般 装 量 约 为 1/3 一 1/2。 塑 料 离心 管 要 加 满 ,一 般 梯 度 介 质 及 样品 加 完 后 须 用 密度 小 于 水 的 、 与 水 不 相 溶 的 请 性 液体 一 一 矿物 油 ( 如 轻 石蜡 油 ) 填 满 ( 差 速 离心 可 全 用 样品 液 充 满 )o 有 时 样品 也 可 通过 一 根 长 金属 导管 导 人 管 底 。 此 法 对 分 离 密度 较 小 的 颗粒 特别 有 用 ， 已 用 于 分 离 细 臣 、 核 蛋白 等 。 使 用 时 须 注意 不 能 让 气泡 进入 梯度 ,样品 密度 需 用 固体 介质 调 到 大 于 梯度 样品 装 好 后 ,将 离心 管 盖 拧 紧 , 小 心 放 人 松紧 恰好 的 离心 管 腔 内 ， 按 照 事先 设 计 的 离 心 条 件 及 转子 \ 离 心机 的 使 用 说 明 书 进行 超 离心 操作 。 因 为 生物 颗粒 均 不 稳定 ,离心 一 般 均 在 低温 下 进行 ,管子 、 梯 度 液 、 转 子 也 最 好 预 冷 至 一 定 温度 后 再 装 大 样品 。 但 低温 会 增 加 梯度 的 粘度 ,使 离心 时 间 延 长 ,不利 颗粒 的 分 离 。 开 始 离心 时 应 缓 缓 加 速 , 离心 达 记 需 时 间 后 , 须 让 转子 自由 地 慢 慢 停 下 (不 许 制 动 ! )。 尤 其 在 5000 rpm 的 低速 下 ， 速 度 的 剧 变 很 容易 扰乱 梯度 液 和 样品 层 或 梯度 中 颗粒 区 带 , 当 用 粘度 小 的 梯度 如 《CsCDU 及 直径 大 的 管子 时 ,这 种 扰乱 更 为 严重 。 进 行 平 衡 等 密度 离心 时 ， 转 速 不 能 过 高 ,以免 盐 梯 度 的 平 均 密 度 超 过 1.2 , 管 底 盐 浓度 过 高 而 出 现 结晶 。 高 密度 的 盐 结晶 (如 CsCl 结晶 可 达 4 克 / 店 米 3 受 很 大 的 离心 应 力作 用 ,此 应 力 超出 了 转子 的 设计 限度 ,会 造成 事故 。 3D 。 区 带 转 子 的 离心 操作 不 同 。 以 动态 装 放 料 区 带 转子 为 例 。 梯度 液 是 在 转速 约 3.000 rpm 的 低速 下 泵 人 。 首 先 泵 人 的 是 低 密度 液 ， 通 过 导管 分 布 于 转子 的 四 周 。 由 于 离心 力 的 作用 ， 在 转子 内 壁 成 均匀 的 一 层 。 随 着 梯度 液 的 不 断 加 入 ， 较 浓 梯 度 液 将 把 较 黎 液 不 断 推 向 转子 的 中 心 。 梯 度 液 加 完 后 ,再 用 一 种 最 浓 的 液体 作 " 垫 层 ” ,将 转子 整个 密闭 空间 充满 ,以 防止 颗粒 在 转子 壁 积累 。 然 后 通过 转子 的 中 心 导 管 缓慢 地 (5 毫升 /分 ) 加 入 样品 《样品 层 一 般 为 10 一 200 毫升 ), 最 后 再 加 入 一 种 更 低 密 度 的 液体 作 “ 覆 盖 层 ” ,同时 有 等 体 积 的 “ 垫 层 ” 从 转子 四 周 被 取代 出 来 。 上 述 梯度 液 及 样品 加 完 后 移 去 转子 上 的 加 液 装 置 ， 将 转子 加 速 到 预定 速度 ， 经 过 一 定时 间 后 ， 就 能 得 一 系列 分 级 分 离 区 带 ， 然 后 转子 减速 到 3-000 rpm, 以 回收 颗粒 区 带 。 此 时 ,通过 进一步 把 “ 垫 层 ” 液 加 到 转子 周围 ， 可 逐渐 置 换 出 密度 较 小 一 端的 梯度 液 ; 并 进行 分 部 收集 、 测定 。 用 区 带 转 子 可 大 量 制 备 样品 , 一 次 Ay SIA 100 毫克 以 上 。 (=) 取出 梯度 : 从 离心 机 提出 转子 和 从 转子 取出 离心 管 并 进行 回收 梯度 区 带 的 操作 时 ,应 十 分 小 心 ， 避免 管子 震动 。 操 作 的 温度 最 好 与 离心 时 的 一 致 ,以 防 温 度 变 化 引起 的 热 对流 扰 乱 区 融 - 否则 的 话 ， 最 好 的 分 离 也 往往 由 于 回收 方法 的 不 当 或 回收 操作 的 错误 而 招致 失败 。 在 处 理 粘 度 小 或 斜率 小 的 梯度 时 ,更 应 特别 小 心 , 以 免 使 分 辩 率 降低 。 梯度 区 带 的 分 部 回收 有 如 下 三 种 方法 : 1. 底部 收集 法 〈 穿 刺 法 ) ”这 是 一 种 简易 的 手工 操作 法 。 采 用 针 穿 刺 离心 管 底 部 ， 使 樟 度 靠 重力 自由 滴 出 ， 然 后 依次 作 分 部 收集 〈 如 图 6-9A)。 此 法 适用 于 薄 壁 塑料 管 ， 操作 时 先 将 管 固定 在 支架 上 ,然后 用 一 根 针 将 管 底 刺 穿 ,使 梯度 液 从 小 孔 滴 出 。 也 可 事先 在 管 底 贴 一 块 胶布 ,防止 穿刺 后 液体 的 疹 漏 ,后 用 22 号 注射 针头 〈 锯 去 针 尾 ) 小 心地 经 胶 布 刺 人 管 底 , 让 让 体 缓慢 沿 针头 滴 下 。 流 出 液 分 部 收集 于 小 试管 中 ,经 分 析 后 决定 取 售 或 合并 。 滚 滴 的 大 小 (或 流速 ) 可 通过 将 梯度 管 塞 上 橡皮 塞 ， 塞 子 上 插 人 一 根 连 着 橡皮 管 和 螺旋 夹 的 玻 管 , 或 通过 与 一 测 压 计 连接 ,维持 恒定 的 压力 来 控制 。 也 可 将 离心 管 与 一 储 液 容器 连接 ,以 油 或 稀 溶 液 补 偿 滴 下 的 液体 , 保持 流速 不 变 。 流 速 一 般 控 制 在 0.5 一 1 毫升 / 分 ,特别 是 粘度 较 大 的 梯度 ,缓慢 的 流速 可 减少 区 带 沿 管 壁 的 拖 尾 现象 。 了 法 对 梯度 扰动 小 ,但 离心 管 不 能 再 用 ,而 且 不 适合 回收 管 底 有 沉淀 或 粘度 大 的 梯度 《 易 导 人 空气 ), 也 不 适 于 不 锈 钢管 或 厚 壁 塑料 管 。 2. 顶部 收集 法 ”顶部 收集 法 又 可 分 为 取代 法 和 虹吸 法 。 CQ) 取代 法 : 是 回收 梯度 中 最 常 使 用 的 一 种 方法 ， 分 为 向 上 及 向 下 取代 二 种 。 向 上 取代 可 用 人 工 操作 ,方法 是 通过 由 针头 穿刺 管 底 或 由 插 人 管 底 的 细 管 注 人 浓 梯 度 液 ,将 梯 度 液 从 黎 到 浓 经 顶 盖 另 一 出 口 管 排出 。 如 用 一 贮 沪 器 代替 注射 器 进行 穿刺 取代 ,控制 流 速 的 效果 会 更 好 。 使 用 梯度 回收 仪 时 ,从 管 项 盖 将 一 根 细 导 管 小 心 插 至 管 底 , 然 后 用 蠕动 泵 由 导管 注 人 高 浓 液 体 ( 其 密度 比 梯度 大 )， 迫 使 梯度 中 的 分 离 区 带 依次 从 盖 上 另 一 出 蝇 管 流出 ， 以 小 试管 分 部 收集 (图 6-9B)。 操作 时 应 先 排除 导管 内 的 空气 。 用 作 取 代 液 的 深 质 应 是 惰性 的 ,深度 要 足够 大 , 能 形成 高 浓 溶 液 。 常 用 的 取代 液 有 芒 糖 、 盐 以 及 某 些 与 水 不 相 混合 的 浓 溶 沾 , 如 四 省 甲烷 (密度 可 达 2.96 克 / 厘米 2) 等 。 取 代 洲 如 是 水 溶液 ， 则 最 好 与 梯度 介质 组 分 相同 ,以 免 产 生 扩散 混合 现象 。 。181 。 图 6-9 回收 梯度 的 方法 CA) 底部 穿刺 收集 法 (B) 向 上 取代 法 《C) 向 下 取代 法 向 梯度 顶部 充 人 空气 或 轻 液体 (水 ), 也 可 从 插入 底部 的 导管 由 浓 到 稀 地 从 顶 盖 取代 出 梯度 液 。 这 种 取代 法 称 为 向 下 取代 法 (图 6-9C) 但 效果 较 差 , 较 少 使 用 。 除 穿 刺 取 代 法 以 外 ,其 它 取 代 方 法 多 用 于 不 锈 钢管 和 厚 壁 管 ,使 用 取代 法 时 流速 应 组 慢 , 以 免 管 壁 滞留 液体 而 造成 梯度 混合 。 这 种 混合 现象 可 通过 使 用 划 水 的 罕 \ 短 梯度 管 而 减少 。 取 代 前 梯度 顶部 如 有 惹 浮 不 溶 物 , 须 事先 除去 。 流 出 管 应 尽 可 能 短 , 以 减少 管内 混 合 ， 导 致 分 辩 率 下 降 。 此 法 优点 是 不 破坏 离心 管 , 管 子 能 反复 使 用 ,能 用 于 较 粘 梯度 ,是 .182。 回收 梯度 最 好 的 一 种 方法 。 缺 点 是 开始 取代 操作 时 易 引 起 扰乱 ;操作 需要 特别 小 心 , 而 且 不 适合 类 度 更 大 的 樟 度 。 取 代 法 可 借 光 学 (或 放射 性 ) 系 统 进 行 流出 液 跟 喷 , 简 化 分 析 化 验 工作 。 (2) 虹吸 法 : 此 法 是 用 一 根 聚 乙烯 小 管 插 到 管 底 部 ， 用 虹吸 法 吸出 梯度 。 它 也 不 损 伤 离心 管 ,尤其 适用 于 不 锈 钢管 中 物质 的 分 级 分 离 。 但 虹吸 时 易 引 起 分 离 区 带 扰乱 ,最 好 使 用 专门 的 装置 。 例 如 DGF-U 型 密度 梯度 自动 产生 器 ， 就 是 一 部 用 蠕动 泵 逆向 运转 而 以 虹吸 收集 梯度 区 带 的 分 部 收集 器 。 除 以 上 取代 法 和 虹吸 法 外 ， 有 时 从 管 上 部 直接 仔细 地 用 注射 器 或 吸管 定量 移出 梯度 液 , 也 可 收 到 较 好 的 效果 。 如 果 已 知 某 颗粒 区 带 的 位 置 ， 也 可 用 注射 针头 刺 人 管 壁 抽 取 ， 但 效果 差 。 《3) 切 割 法 : 极 粘 的 梯度 宜 用 切割 法 。 所 谓 切 割 法 就 是 用 离心 管 切 割 器 将 冻结 的 塑 料 管 子 切 成 薄片 的 一 种 方法 。 此 法 仅 适 用 于 赛 璐 到 管 或 硝酸 纤维 素 管 。 操 作 时 把 离心 管 插 在 操纵 人 台 的 孔 中 ,后 用 一 锐利 的 切 刀 切割 管子 。 切 下 的 部 分 留 在 刀刃 上 ,然后 用 注射 器 或 吸管 吸取 这 部 分 梯度 液 ， 如 此 即 能 逐一 将 梯度 分 部 收集 。 操作 中 应 注意 夹 紧 各 可 动 部 分 ,减少 切口 周围 的 活 漏 现象 切割 器 的 型 号 很 多 ,如 日 立 公司 55 P-2 型 超 离心 机 的 TSU-2 型 离心 管 切割 器 。 较 新 Bel ee Cee HOA a 核 黄 素 和 交 联 剂 ， b he tee ake tet >» 然后 再 进 TDA RE. 《四 ) BER WSaT 在 制备 梯度 和 样品 液 或 需 了 解 离心 后 颗粒 区 带 在 梯度 中 的 位 置 时 ,应 进行 密度 测定 。 测定 密度 的 最 简单 方法 是 用 折射 计 , 此 法 迅速 ,用 量 少 , 如 阿 贝 折 射 计 仅 需 样 品 25 微 升 左 Ao 由 于 折射 率 与 密度 有 正比 的 关系 ， 通 过 折射 率 即 能 换算 出 被 测 梯度 液 的 密度 〈 如 表 6-10) 但 折射 率 与 温度 等 因素 有 关 ，, 须 考虑 这 些 因 素 的 影响 s 梯度 的 密度 也 可 用 比重 瓶 直接 测定 ,但 样品 用 量 较 大 ,通常 需 0.1 一 0.3 毫升 。 8 -梯度 通过 适当 方法 分 部 收集 后 ,应 进行 分 析 化 验 ;, 以 便 分 类 合并 或 作 后 处 理 。 分 析 梯 度 中 的 回收 物质 常用 紫外 吸收 法,\ 酶 活力 测定 法 * 放射 标记 法 等 。 蛋白质, 核酸 或 某 些 含 蛋 自 质 、 核 酸 占 优 势 的 细胞 器 ,病毒 等 可 用 紫外 吸收 法 测定 。: 细 胞 器 一 般 可 测定 标志 酶 活 性 ,通常 每 一 组 分 至 少 选 二 种 标志 酶 。 如 一 时 找 不 到 更 好 的 测定 目的 物 ,也 可 测 光 吸 收 来 推断 分 部 的 组 分 。 对 于 同位 素 标 记 物 ,最 好 是 测定 其 放射 活性 。 此 外 ， 某 些 情况 下 也 可 用 免疫 法 、 电 泳 法 或 在 500 一 600 om 下 用 光 散 射 法 测定 物质 在 梯度 中 的 分 布 。 亚 细胞 成 分 可 用 电镜 或 光学 显微镜 (如 相差 显微镜 ) 观 察 分 析 各 分 部 的 组 分 和 分 布 。 最 司 根 据 分 析 结 果 绘 图 。 梯度 介质 对 梯度 分 析 的 影响 很 大 。 如 糖 介 质 《 尤 其 芒 糖 )、metrizamide AEA HES, 测定 时 每 次 介质 浓度 应 一 致 。 有 时 适当 的 稀释 也 能 有 效 地 解除 这 种 影响 。 MAEM CD = BE TED. Ludox 等 有 强烈 紫外 吸收 ,能 干扰 核酸 \ 蛋 白质 紫外 测定 。 三 夏 葵 衍生 物 ， 芒 糖 等 也 干扰 放射 活性 测定 。 凡 对 分 析 有 干扰 的 梯度 介质 , 均 应 设 东 避免 。 如 单 双 糖 、 多 糖 或 ; metfizamida 都 干扰 核酸 和 蛋 蝗 质 和 糖 原 的 分 析 。 单 双 糖 、metrizamide -可 透析 或 超 泪 除 去 ,或 用 酸 、 乙 醇 使 核 。 183 。 表 6-10 各 种 梯度 介质 的 折射 率 7 SHE P 的 换算 公式 Sy Oi aX 式 蔗糖 0° 一 2.73297zoe 一 2.6425 Ficoll. 葡 聚 糖 020° = 2.381799 — 2.175 牛 血 清白 蛋白 0 =1.41297,,0 — 0.8814 : << | Metrizamide Oo 一 3.35072oe — 3.462505° = 3.453209 — 3.601 Ludex p = 8.2047 — 9.936 020° = 9-9688720 一 12.292 (适用 于 密度 1.00 一 1.29， 折射 率 1.333—1.360) dab 020° = 10.9276n0° 一 13.593 (适用 于 密度 1.22-1.90, He Hts 1.355—1.418) (25° = 10.2402750 一 12.6483 (适用 于 密度 1.00—-1.38, 折射 率 1.333 二 1.3707 Pus = 10. 8601750 — 13.4974 (适用 于 密度 1.25 一 1.90) 折射 率 工 357 志 IJ418) alta ose = 12.1207.90 — 15.1662 GERI SBE 1.10—-1.40, 折射 率 1.342 二 1.366 : (23° = 13.698672,0 — 17.3233(〈 适 用 于 密度 1.40 一 1.80, 折射 率 1.366 一 1.396) BE: (1) 水 在 20*C 的 折射 率 为 1.3330。(2) 上 述 公式 仅 适用 蒸馏 水 配制 的 介质 ,未 考虑 其 它 成 分 。 如 介质 中 还 包含 缓冲 剂 \, 其 它 盐 、EDTA 等 成 分 应 作 折射 率 修正 。 酸 , 蛋 白质 沉 演 而 分 开 ; 多 糖 则 用 稀 县 或 离心 解除 被 测 物质 的 浓度 也 影响 分 析 准 确 度 , 紫 外 分 析 蛋 白质 浓度 应 为 0.2—3 %o , 核酸 浓度 最 低 限 度 为 0.004 狗 。 进行 梯度 分 部 的 分 析 时 ,对 颗粒 的 分 布 必须 心中 有 数 ,才能 有 目的 地 选择 测定 方法 。 (A) 操作 注意 事项 超速 离心 机 是 生化 制备 和 生化 研究 的 重要 精密 设备 ， 又 因 其 转速 高 ， 产 生 的 离心 力 大 ,使 用 不 当 或 缺乏 定期 的 检修 保养 ,都 可 能 发 生 事故 。 离心 机 故障 大 多 由 转子 的 不 平衡 引起 。 离 心 管 的 称 量 误差 ;长 期 使 用 造成 转子 表面 的 腐蚀 、 损 伤 ; 离 心 管 放 错位 置 ;管子 重力 中 心 的 不 平衡 (重量 相同 的 梯度 管 和 非 梯度 管 不 能 一 起 离心 ) 塑 料 离心 管 的 变形 、 破 有 裂 等 是 引起 转子 失衡 的 主要 因素 。 失 衡 的 严重 后 果 是 导致 驱动 杆 讨 曲 ,甚至 使 转子 抛 离 转轴 。 在 离心 过 程 中 , 转子 必须 垂直 放下 或 提起 ,如 免 磁 撞 转轴 ,一 旦 发生 转轴 弯曲 或 断裂 ,应 更 换 后 才能 使 用 。 为 了 保障 使 用 安全 ,初学 者 除 严格 按说 明 书 规定 的 程序 使 用 外 ,还 要 熟悉 和 掌握 所 用 离心 机 和 转子 的 性 能 ,以 及 维修 保养 事项 。 遇 有 蜂 问 , 或 操作 中 发 生 故 障 时 , 应 请 专 大 处 理 。 转 子 \ 离 心 管 用 后 须 用 温水 或 中 性 去 污 剂 清洗, 干燥 后 保存 。 塑 料 管 最 好 在 低温 避 光 处 保存 。 区 带 转子 必须 拆 下 各 部 件 , 依 次 用 自来水 ` 燕 馏 水 (有 时 还 用 70 多 乙醇 ) 洗 涤 ; 除 去 痕 量 残 存 的 梯度 共 , 以 防 结晶 堵塞 液 管 。 铝 转子 应 定期 上 蜡 , 防 址 水 分 进入 裂 笑 。 六 、 制 备 超 离心 实例 (—) 用 CsCl 平衡 等 密度 离心 法 制备 质粒 DNA“ 此 法 是 利用 其 加 涡 化 乙 锭 影响 线形 DNA, 双 螺 旋 环 状 DNA、 或 超 螺 旋 环 状 DNA 等 的 浮力 密度 而 达 分 离 。 C1) 在 大 肠 杆 茵 培养 液 1.6 升 (E650 约 0.6) 中 加 入 约 0.2 多 〈V/V) 的 氯仿 , 摇动 10 。184 。 分 钟 以 杀 死 菌 体 , 然 后 除去 不 溶 氯 仿 。 (2) 在 4%C、8;000g 下 ,离心 15 分 钟 收集 菌 体 。 然 后 悬浮 在 1200 BF pH 8:0 的 54 mM Tris 一 HCL 中 ,再 在 4°C 8,000g 下 离心 15 分 钟 , 收 集 沉降 细胞 。 (3) 将 大 肠 杆 菌 细胞 沉积 物 悬 序 在 4°C 的 130 毫升 含 25% (W/W) 蔗糖 的 5mM Tris—HCl (pH8.0) 中 ,并 加 入 13 毫升 溶菌 酶 溶液 (10 毫克 /毫升 , 溶 于 pH 8.0 的 50 mAM Tris—HCl 中 )，5 分 钟 后 ， 再 加 入 26 毫升 0.5 M EDTA (pH 8.2)， 混 匀 后 30°C 保温 15 5} Ho (4) 加 入 120 BF 3.6% (V/V) 的 Triton X-100, @B AREY 15% (V/V), # 在 20°C 保温 10 分 钟 ,使 原生 质 体 胞 溶 。 (5) BART 4°C, 65,000g 下 离心 1 小 时 。 (6) 倾 析 除 去 上 清 液 ,在 约 200 毫升 残留 物 中 加 入 其 体积 1/9 的 5 M NaCl 和 最 终 浓 度 达 10% (W/V) 的 聚 乙 二 醇 (分 子 量 6.000)。 (7) 混合 液 在 20*C 下 搅拌 ,使 聚 乙 二 醇 溶解 ,然后 在 4%C 下 放置 过 夜 。 (8) ¥F 4、8;000 g 下 离心 15 分 钟 ， 再 将 沉淀 溶 于 10.8 毫升 0.1XSSC (15mM NaCl, 15 mM 柠檬 酸 钠 ，pH7.0) 中 ， 然 后 再 加 大 11.7 克 CsCl 和 1.2 毫升 省 化 乙 锭 液 〈2 毫克 /毫升 )e (9) 剧烈 搅拌 使 CsCl 溶解 ,再 用 水 或 CsCl 将 深 液 的 折射 率 调 到 1.3880 一 1.3890。 (10) 在 MSE 10 X 10 钛 角 式 转子 的 二 个 聚 碳酸 酯 管 中 各 加 入 7.5 BF EB 然后 RAAB RS FI. 20°C, 40,000 rpm 下 离心 64 小 时 。 Cil) 用 顶部 收集 法 回收 质粒 DNA 的 区 带 。 (12) 用 CsCl 所 饱和 的 异 戊 醇 或 异 丙 醇 反复 抽 提 ,或 将 收集 的 梯度 液 通过 Dowex 50 树脂 而 除去 有 机 杂质 。 然后 在 4%cC 下 对 0.1XSSC 透析 3 天 ， 可 得 基本 没有 非 质粒 DNA 的 活性 超 螺旋 质粒 DNA, 此 法 所 得 的 质粒 DNA 较 多 ,每 管 可 达 500 微克 。 (=) 用 RbCl BES eee C1). Faz) BRR a ee Eagle HEM 10% FM) 中 ,以 少 于 或 等 于 1 转 / 分 的 旋转 速度 进行 摇 瓶 培养 ， 使 细胞 生长 汇合 。 每 瓶 含 汇合 细胞 约 10°, 需 100 一 200 毫升 培养 基 。 (2) 培养 物 用 多 瘤 病 毒 毒 株 以 1 pfa/ 细 胞 进行 侵 染 , 在 37°C 下 保温 一 周 后 收获 。 (3) 将 每 瓶 细胞 和 培养 基 转 人 离心 管 ; 加 5 织 体 积 的 0.4 M 磷酸 缓冲 液 (pH5.6), 并 冷却 到 ;4*e。 低 pH 和 低温 可 保证 大 多 数 病毒 吸附 到 细胞 上 ， 培养 基 中 仅 留 下 极 少 病毒 (10° HAU/ 毫 升 或 更 低 )。2;000 g 下 低速 离心 15 Fh FLAK (4) 以 每 10 PAIR REF 2.5 SH Tris KH, 4c 下 存放 ,并 检查 有 无 细菌 污 染 。 若 无 污染 则 将 样品 4 份 合 并 转 和 人 烧瓶 (每 瓶 4X10% 企 细胞 ,10 毫升 Tris 盐水 ) 中 冻 、 融 三 次 。 GS) 每 10 毫升 悬浮 液 中 加 入 2.5 毫升 霍乱 绝 菌 的 受 体 破 坏 酶 (RDE), 37°C 保温 24 小 时 以 破坏 受 体 。 巧 浮 液 经 RDE 处 理 后 加 入 5% 体积 的 1M NaHCO, 使 呈 碱 性 ,加热 至 37"Ce。。 2000 g 下 离心 15 分 钟 以 除去 细胞 碎片 ， 然 后 用 10 毫升 热 Tris 盐水 洗涤 沉淀 ,并 “185。 EET 10 毫升 Tris 盐水 中 。 此 步 处 理 须 从 各 分 部 取样 0.1 毫升 ,用 磷酸 缓冲 的 盐水 稀释 100—10-000 倍 ;, 37°C Rik 30 分 钟 ， 再 用 血球 凝集 测定 法 估算 解 离 出 的 病毒 。 经 一 次 RDE 提取 后 ,如 仍 有 10-20% 以 上 病毒 留 在 细胞 碎片 上 ,应 重复 处 理 , 或 增加 RDE AS 《但 应 避免 过 量 RDE 进入 病毒 液 )。 (6) 将 较 稀 的 病毒 悬浮 液 在 80000 g 下 离心 2 小 时 ,使 病毒 浓缩 ,并 重 悬 在 少量 ris 盐水 中 。 (7) 53% RbCl 溶 于 7.6 毫升 0.05 M Tris 缓冲 液 (pH 8.0) 中 ,以 每 管 3 毫升 量 分 装 三 个 塑料 离心 管 。 SAMA 1 毫升 病毒 悬 译 液 并 抄 拌 到 上 半 个 梯度 。 在 10 士 5"c 下 ， 30,000 rpm 离心 24 小 时 。 用 穿刺 法 分 部 收集 。 (=) 用 CsCl 等 密 间 离心 提纯 染色 质 蛋白 质 ” + C1) 将 染色 质 在 缓冲 液 ( 含 5M TR, lm M ia BER, 0.1 mM EDTA 和 2MNaCl 的 10 mM, pH7.5 Tris—HCl) 中 匀 化 ， 然 后 在 12,000 g 下 离心 10 分 钟 。 倾 出 土 清洲, 沉 这 在 同一 缓冲 液 中 再 匀 化 ， 使 染色 质 在 高 离子 强度 的 盐 介 质 中 充分 解 离 为 核酸 和 蛋白质 组 分 ,再 在 12,000 g 下 离心 10 分 钟 。 合 并 二 次 上 请 液 , 用 蒸馏 水 稀 杰 染 色 质 的 蛋白 质 至 浓度 为 1 毫克 /毫升 (或 更 少 )， 然 后 加 入 等 体积 的 含 0.1 mM FABRA 55% (W/ W) CsCl 溶液 (5.5 M), BD. (2) #2 MSE 10 X 10 铁 角 式 转 子 的 离心 管 中 放 人 5 毫升 上 述 混 合 液 ， 再 用 液体 石蜡 ei FFE 4°C, 50,000 rpm 下 离心 68 小 时 。 《3) 离心 后 用 向 上 取代 法 取出 梯度 , 5 毫升 梯度 的 上 面 1.5 毫升 部 分 均 含 蛋白 质 ， 可 分 部 收集 。 (4) 通过 透析 或 凝 胶 过 小 脱盐 ,得 纯 染 色 质 蛋白 质 。 《四 ) 用 NaBr 等 密度 离心 分 离 血 浆 脂 蛋白 ” (1) 用 稀 NaBr 液 (11.4 克 NaCl 和 0.1 克 EDTA， 以 蒸馏 水 定 容 至 1 升 ，pH 7.8) AYE NaBr 液 (263 克 NaBr、11.4 克 NaCl 和 0.1 克 EDTA， 以 蒸馏 水 定 容 至 1 升 ， 调 pH 7.8) 通过 梯度 产生 器 ， 在 MSE 3 X 25 外 摆 式 转子 的 离心 管 中 制 备 20 毫升 密度 为 ,1.003 一 2 克 / 厘 米 葛 NaBr 线性 梯度 。 (2) 每 毫升 血清 样品 中 加 入 0.32 克 NaBr, 将 密度 调 到 1.22 $2/ BOK’. (3) 将 0.5 一 1 毫升 样品 分 层 到 梯度 的 底部 ,样品 层 下 面 再 铺 放 1.5 一 2.0 毫升 深 NaBr i (0.582 克 / 毫升)。 导 人 样品 层 应 注意 排除 气泡 ,以 免 扰 乱 梯 度 。 (4) 在 4°C, 30,000 rpm 下 离心 2 小 时 。 从 静止 到 5,000 rpm 要 上 得 慢 , 一 般 达 1-000 rpm 应 为 3 分 钟 左 右 ，1;000 一 5,000 rpm 为 2 分 钟 , 后 按 正常 加 速 。 《5) 离心 后 通过 向 上 取代 法 取出 宰 度 。 通 常 最 低 密度 脂 蛋 白 在 梯度 顶部 ， 较 低 密度 陛 蛋白 在 顶部 以 下 10 一 15 毫升 之 间 ; 而 高 密度 脂 蛋 白 与 其 它 血 清 蛋白 一 起 在 原样 品位 置 。 《五 ) PAM BRE eee aT C1) 500 SiR WRT te TAKA kX, BiB 30°, MMR T ER ° 186 。 发 5 天 。 (2) 除去 萌芽 草 麻 籽 的 胚芽 和 子叶 ,将 胚乳 组 织 用 蒸馏 水 洗 活 后 置 冰 中 冷却 。 (3) 制备 500 毫升 由 下 列 成 分 组 成 的 混合 液 ( 研 磨 介 质 ): 0.4M FENG, 0.165 M pH7.5 KAM (tricine) 缓冲 液 ， 0.01 M KCl, 0.01 M MgCl，pH 7.5 0.01 M EDTA, 0.01M 二 硫 苏 糖 醇 。 (4) 在 60 克 胚 乳 组 织 中 加 入 90 毫升 上 述 混 合 液 , 并 用 的 碎 机 的 碎 6 分 钟 。 (5) 将 粗 糊 状 物 在 冰 浴 中 研磨 成 细 糊 。 (6) 用 棉布 粗 滤 ,滤液 在 270g 下 离心 10 分 钟 ,除去 细胞 和 大 细胞 碎片 。 上 清 液 倒 人 冷却 离心 管 , 10,800 g 下 离心 30 分 钟 。 PSE WEAF 4 一 6 毫升 研磨 介质 中 。 (7) 用 pH 7.5、0.01 M EDTA 溶解 适量 芒 糖 , 配 成 60、57、50、44 和 339% ARE, 然后 按 顺 序 加 入 以 建立 蔗 烷 阶梯 梯度 。 也 可 先 加 16 毫升 60% 蔗糖 液 ， 然 后 仔细 地 在 上 面 建立 33 一 60 多 的 蔗糖 线性 梯度 。 (8) 在 梯度 上 仔细 地 铺 和 人 1 一 2 毫升 细胞 器 悬浮 入 的 样品 层 。 (9) FA SW 25.2 外 摆 式 转子 于 23,000 rpm 下 离心 5 小 时 。 (10) 离心 后 用 底部 收集 法 回收 分 离线 粒 体 。 测定 各 分 部 柠檬 酸 合成 酶 和 苹果 酸 脱 氢 酶 活性 。 (A) 用 差 速 离心 法 分 离 大 白鼠 肝脏 中 各 种 亚 细 胞 成 分 % 鼠 肝 脏 组 织 上 | 0.25 M preemie es hide RR (10% W/V) 1,000g, 10° Crp 8 厘米 ) “it te IEE: Tit Lit @ 0.25M HBE=K. 3! 1,000g 10" Cra98 DK) | Theo nL ee mi | 35300 g» 10° Cr 8 HDR (aise Pa a eee 沉淀 Lint 3 0.25 M fERBE= rk @ 3,300g,10’ (rpg 8 厘米 ) } Bear eae Le 沉淀 ( 溶 酶 体 ) | 100, 000g, 30’(rsexy 6 厘米 ) a 沉淀 上 清 液 (微粒 体 ) 和 4 省 0 11] 微生物 工程 编写 组 编 : 微生物 工程 (下 册 )。 上 海 科技 出 版 社 ， 第 32 页 (1982) {2] [ 苏 ] A. 再 .普兰 诺 夫 斯 基 等 著 ; 化 工 部 中 等 专业 学 校 教师 合 译 : 化 工 过 程 及 设备 (上 册 ), 化 学 工业 出 版 社 ， 第 212 页 (1960) [3] 上 海 化 工学 院 等 编 : 化 学 工程 (第 一 册 )? 化 学 工业 出 版 社 ， 第 178 页 41980) £4] Birnie, G. 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(4) ABBE , 滤 速 越 慢 。 《5) 沉淀 中 有 胶 状 物 或 其 它 可 压缩 的 物质 《如 细菌 或 发 酵 液 中 的 悬浮 物 等 ), BH 塞 滤 孔 , 使 滤 速 大 大 减 慢 。 =, BRE SHE 选择 适当 的 过 滤 介 质 , 添 加 助 泪 剂 , HMM RMA RS. 均 可 增加 渡 i» DL wo FB: « 189 。 《一 ) 选 择 适 当 的 过 滤 介质 1. 选择 过 滤 介质 应 考虑 的 因素 C1) 孔径 大 小 适 于 截留 被 分 离 的 固体 微粒 ， 孔 径 过 大 ， 则 滤 息 不 请 ， 太 小 则 滤 速 过 慢 。 (2) 孔 的 数量 多 ,孔道 短 且 不 很 弯曲 , 则 滤 速 快 ,否则 着 速 慢 。 C3) 耐酸 碱 ,化 学 稳定 性 好 。 (4) 有 一 定 机 械 强度 ,易于 回收 。 (5) 工业 上 要 求 再 生 方 便 , 使 用 寿命 长 ,成 本 低 。 2. 过 滤 介 质 简介 C1) 通常 棉 \ 麻 、 丝 织品 适用 于 沉淀 颗粒 较 粗 或 较 粘 稠 的 中 性 、 弱 酸性 或 弱 碱 性 物料 ， 但 不 耐 强酸 强 碱 。 (2) 实验 室 中 最 常用 的 是 滤纸 。 滤 纸 分 工业 用 和 分 析 用 两 类 。 按 其 材质 和 滤 速 的 差 别 又 分 慢 速 ,中 速 和 快速 三 种 。 一 般 姜 纸 不 耐 强酸 、 强 碱 。 近来 国外 滤纸 的 型 号 规格 很 多 ,分 别 适 于 过 滤 各 种 物质 。 离子 交换 凑 纸 在 过 沽 时 还 兼 有 分 离 作用 。 日 本 TOYO 出 品 的 离子 交换 滤纸 有 DEAE, ECTEOLA [ARS FAs CM 阳离子 交换 滤纸 。 此 IMA A BERS PRIA ee FAY Ee RAT EAS WN BAT BE DRM GRA 2. AKIES STA, 见 图 7-1。 多 折 法 滤 速 一 般 比 平 折 法 高 。 图 7-1 SARA aT BE (3) 过 滤 介 质 还 有 玻璃 纤维 , 垂 熔 玻 璃 ,石棉 或 烧 瓷 滤 板 ,涤纶 等 。 玻璃 纤维 或 垂 熔 玻 璃 滤器 可 耐 强酸 ,但 不 耐 强 碱 。 石棉 或 烧 瓷 泪 板 ， 涤 纶 等 可 耐 强 酸 、 强 碱 。 食 品 、 医 药 及 发 酵 工 业 中 因 过 滤 面 积 大 ,并 考虑 到 成 本 、 再 生 及 耐用 等 因素 ,多 FARA RS EK 66、 维 尼 纶 等 作 过 滤 介 质 。 它 们 不 仅 抗 酸 碱 ,耐用 , 而 且 不 沾 料 , ZB 。 190 。 再 生 。 涤 纶 有 多 种 规格 ,其 粗 密 孔 径 各 不 相同 ,可 根据 需要 选用 。 (=) 加 助 滤 剂 过 滤 时 滤 饼 的 形成 对 滤 速 影响 很 大 ,如 组 成 滤 饼 的 颗粒 很 小 而 粘度 较 大 , 则 增加 压力 不 但 不 能 增加 沽 速 ,而 且 滤 饼 中 毛细 孔 变 形 缩小 还 会 使 滤 速 减 慢 。 这 时 需 加 助 滤 剂 ,以 增 Ts BEGAWAN. HAHA WER, 纸 粕 , Aso MCAS DESEN BAMA BAAADTARENET RAH RSGRERG—-HMB, 滤 毕 再 回收 助 滤 剂 。 最 好 选用 易 与 样品 分 离 的 助 滤 剂 。 (=) 增加 过 滤 推 动力 通常 推动 力 合 大 , 滤 速 愈 快 。 和 根据 产生 过 泪 推 动力 的 条 件 不 同 , 分 为 常 压 、 加 压 和 减 压 过 涯 三 种 。 1. 常 压 过 滤 ”主要 由 滤液 位 差 产 生 推动 力 引起 过 泪 。 因 此 滤 速 慢 , 操 作 时 间 长 ,很 少 用 于 分 离 大 量 样品 或 不 稳定 物质 。 工业 上 的 吊 滤 及 实验 室 中 常规 过 滤 属 于 此 类 ， 简单 装置 如 图 7-2 及 图 7-3 (a)。 此 法 补充 加 样 时 间 难 掌 担 , 如 改 为 连续 过 潜 , 则 较 方便 ,简单 装置 如 图 7-3(b)。 2. 加 压 过 滤 用 压缩 气体 加 大 液体 所 受 的 压力 或 用 和 泵 把 样 液 输 送 至 过 滤 装 置 时 产生 液压 作为 过 滤 的 推动 力 。 加 压 过 滤 时 压力 愈 大 , 滤 速 愈 快 ,直至 滤 饼 的 厚度 和 粘 结 度 增加 至 一 定 限 度 时 增 压 才 失 去 作用 。 加 压 过 滤 适 用 于 粘度 较 大 ,沉淀 颗粒 较 细 的 溶液 。 如 工业 用 的 板 框 过 泪 机 ,加 压 叶片 过 滤 机 属于 此 类 。 实验 室 常 用 加 压 过 滤 装 置 如 图 7- 4。 它 的 特点 是 装 样 漏斗 或 过 滤器 需 用 坚固 材料 〈 如 人 金属 ) 制 成 旦 密封 。 并 注意 在 用 前 做 好 安全 检查 。 3. 减 压 过 滤 ”和 加 压 过 小 相反 ,是 在 过 滤 介质 下 方 抽 真 空 , 以 增加 过 滤 介 质 上 下 的 压 差 ， 推 动 溶剂 通过 过 滤 介 质 。 实 验 室 常 用 的 和 特殊 的 减 压 装置 如 图 7-5 及 7-6。 工业 (b) 7-32) 实验 室 几 种 常 压 过 滤 装置 as 191 * 7-3(b) 连续 过 滤 的 仪器 a 一 一 具 虹 吸 瓶 的 装置 ; pb 一 一 具 分 液 漏斗 的 装置 ， “ RABE RAN RE EA 调节 站 * 金属 制 石 愧 过 小 加 正装 置 ER MRLEMERE 图 7-4 实验 室 中 常用 加 压 过 滤 装 置 装置 有 陶瓷 抽 滤 缸 , 转 鼓 真空 过 滤 机 等 。 加 压 过 滤 与 减 压 过 滤 的 共同 点 是 过 滤 介 质 下 面 必须 有 支持 滤 板 ， 或 过 滤 介 质 。 都 是 一 些 强度 较 大 的 烧 瓷 滤 板 等 物质 。 此 外 ,还 有 离心 过 滤 法 ,实验 室 装置 如 图 7-7 所 示 。 利 用 离心 机 产生 的 离心 力促 使 滤 流通 过 过 泪 介 质 , 分 离 效果 更 好 。 但 过 滤液 体积 小 ,多 用 于 分 离 临床 的 小 量 组 织 样品 。 《四 ) 提高 过 滤 时 的 温度 升温 使 咨 液 粒 度 减 少 ,溶质 溶解 度 增 大 ,对 提高 滤 速 显然 有 利 。 但 此 法 不 适用 于 热 敏 %e 192° eR ENS RA A+ 图 7-5 “实验 室 中 常用 的 减 压 过 滤 装 置 减 压 膜 片 过 滤器 减 压 炙 棉 胶管 膜 过 滤器 图 7*6 实验 室 用 的 特殊 减 压 过 滤 装 置 物料 。 实 验 室 加 热 过 滤 装 置 如 图 7-8。 CH) 其 他 增加 过 滤 面 积 ,减少 滤 饼 厚度 等 均 可 提高 泪 速 。 93.e 7-8 实验 室 加 温 过 波 装 置 三 、 生 化 工业 党 用 的 过 着 装置 (—) 板 框 压 滤 机 它 是 一 种 加 压 过 滤 装 置 。 结 构 如 图 7-9。 主 要 部 分 由 交替 排列 的 滤 板 (1) 和 滤 框 (2) 组 成 ,其 中 滤 板 又 分 为 过 滤 滤 板 和 洗涤 滤 板 。 滤 板 和 滤 框 由 机 座 两 旁 两 条 平行 横梁 支撑 。 机 座 (3) 上 有 固定 端 板 (4) 和 借 滚轮 移动 的 可 动 端 板 (5)。 滤 板 和 滤 框 之 间 夹 着 滤 布 , 滤 布 上 开 有 与 滤 板 孔洞 相通 的 孔 。 当 端 板 (4) (5) 将 板 框 压 紧 时 , 相 邻 的 每 两 个 滤 板 与 其 所 来 住 的 滤 框 组 成 独立 的 过 滤 小 室 。 板 框 上 缘 有 三 个 孔 ( 有 的 只 在 上 缘 两 角 各 开 一 孔 )。 中 间 孔 为 过 滤液 进口 通道 ,旁边 两 孔 为 洗涤 液 通道 。 图 7-10 为 滤 板 与 泪 框 的 放大 图 。 使 用 时 按 过 滤 滤 板 、 滤 框 \ 洗 涤 滤 板 的 顺序 安装 , 压 紧 。 在 加 入 待 泪 液 以 前 , 先 从 过 滤 液 进 口 通 道 压 和 清水 试 漏 , 除 滤 清 液 开关 以 外 , 它 处 均 无 水 喷 出 。 即 证 明 滤 机 可 用 。 随 后 通 和 压缩 空气 驱 去 机 内 试 漏水 ， 再 用 泵 压 人 待 滤液。 图 7-11(a) 为 板 框 压 滤 机 的 工作 简 图 。 待 泪液 流 经 滤 进 口 通道 后 ,由 滤 板 瞳孔 进入 滤 框 。 滤 液 通过 滤 板 上 的 滤 布 , 沿 板 王 沟渠 自 下 方 旋塞 开关 排出 。 。194。 ” 天 让 sec 各 本 二 i IE a, Al SET is | he 图 7-9 FE ae HL 1. 3B, 2. IRE, 3. LE, 4-H, 5. ATA, 6. KEL 7. APR DRAKE 缩 空 气 的 进口 管 ，8. 滤液 及 洗涤 水 的 排放 旋塞 图 7-10， 滤 板 〈a) 和 滤 框 (KAA (a) sR EAs 〈b) 波 框 中 空 洗涤 滤 潜 时 ,关闭 待 滤液 进口 通道 ,洗涤 液 由 洗涤 液 进口 通道 压 人 ， 经 洗涤 滤 板 上 的 | REFLBE AGERE, WPS 7-11(b) BAAR, 关闭 过 滤 滤 板 下 的 滤液 排出 旋塞 , 洗涤 液 透 过 两 层 小 布 和 全 部 滤 酒 层 后 排出 。 板 框 压 泪 机 的 操作 压强 由 待 泪 物 的 性 质 决定 ;一 般 为 表 压 2 一 3 个 大 气压 。 过 滤 中 性 或 大 作物 料 多 用 铸铁 板 框 。 过 小 酸性 物料 常用 木兰 t 厦 3 2 1 2 3 2 1 2 1 板 框 。 此 外 还 可 用 针 钢 ,玻璃 钢 , 硬 聚 氧 乙 烯 等 制 RR. 它们 各 具有 优点 ， 使 用 滤 板 和 滤 框 的 数 量 一 般 为 10 至 60， 如 过 滤 少 量 物料 ,不 需 通 过 全 部 板 框 ,可 取 无 孔 隔 板 插 人 机 中 ,使 隔 板 后 面 的 板 框 不 起 作用 。 板 框 压 汪 机 因 结 构 简 单 ， 操 作 方便 ， 造 价 较 AK RRR, 现 仍 广泛 应 用 , 近年 又 不 断 向 机 械 化 \ 自 动 化 方 癌 发 展 。 NSNNZANSNNAIAMN NINNAAR NI 4 区 Ae XS ‘J VM Zz 7. 2 (=) 转 简 真 空 过 滤 机 是 一 种 减 压 过 滤 装 置 ， 也 是 生化 工业 中 常用 的 过 滤 设 备 。 它 包括 转 简 分 配 头 ， 料 槽 ， 真 空 系 绕 \ 压 缩 空气 系统 及 离心 泵 等 。 当 物 料 进 入 料 槽 后 , 需 搅拌 使 固体 不 致 沉降 。 (b) 洗涤 水 APRA, 见 图 7-12。 BEAST 公章 形 室 , 有 网 或 栅 便 于 铺 滤 布 。 已 铺 滤 布 的 转 科 转动 时 (转速 为 0.1 一 2.6j 转 /分 ), 各 室 经 转 条 的 空 轴 枢 内 的 通道 与 固定 的 分 配 头 相连 。 通 过 分 配 头 可 吸 气 或 压气 ， 使 区 I 各 室 产生 。 1956 A 真空 ,将 滤液 吸入 转 简 各 室 ， 而 固体 则 被 阻 留 于 简 面 。 转 简 旋 转 时 ， 滤 酒 随 之 上 升 到 区 开 的 位 置 AMARA RRA. KM 为 空白 区 。 到 区 IV 时 由 供水 管 7 喷 水 洗涤 (iE, MMAR. KV MESAR 到 区 VI 时 通过 分 配 头 压缩 空气 将 转 筒 上 已 洗 净 REMAKE. Ria BARAT, Re LWwWAEK VI BRA Bett Bit HA LE Alo 图 7-12 ” 转 简 真空 过 小 机 操作 简 图 : 图 7-13 epi MSW LA Ae: 1. $273, 2.40, 3.. 4. SRE, 5. 6. ， 1. 转动 盘 ，2. 固 定 盘 ，3. SRE, 4.5 与 压缩 空气 相 接 的 管 ，7. 喷 未 管 洗涤 贮 槽 相通 的 终 阶 ，5.、6. 与 压缩 空气 相通 的 lL RARE, 0. RARER, II Vv. xX. 空白 Bits 7. Feat EA FL K, IV.zERRBHR, VI. KM, VI. Wie BH, VIN. 滤 饼 清洗 区 分 配 头 是 真空 过 滤 机 的 重要 部 件 ， 各 区 的 工作 由 它 分 配 。 分 配 头 包括 苇 动 圆 盘 1 和 不 动 圆 盘 23 见 图 7-13。 SRA LOASADHR LOAM 3 相对 应 时 IES 即 与 真空 泵 相连 。 滤 出 液 由 滤液 槽 转 人 滤液 承受 缸 。 转 简 转 过 一 定 角度 ， 可 顺 次 与 4 和 SMM SRE. 最 后 经 孔 6 和 7 使 转 简 室 与 压缩 空气 管 硼 连 ， 以 便 吹 干 泪 饼 和 清洁 滤 布 。 空 白 区 是 用 于 防止 作用 不 同 的 相 邻 的 两 区 相互 串联 而 设 下 的 缓冲 区 。 转 简 真空 过 滤 机 适用 于 中 等 细 度 和 粘度 不 大 的 物料 。 其 式样 较 多 ， 毯 简直 径 可 小 至 30 厘米 ;大 到 4.5 米 , 长 度 由 30 厘米 到 6 米 , 适 用 范围 很 广 。 卸 料 方法 有 : 1. 刊 刀 法 ，， 用 于 剥离 较 厚 8 一 10 毫米 ) 的 泪 酒 ， 过 滤 困 难 的 胶 质 滤 沽 时) 每 转 三 AM Bei Se 5 一 一 19 REA ZIRE DIY, HE SFO Ea As 5 TE ee ARE GAEE2I4+B*) WeENTeRAARERBAA. MM, We ROPE oh anv, i 3. RB MIRAI < FE de SEP _L eR DS BF of \ : 6 ae AZ) on 和 i » Lee \ . Vase OIL D ? CD & (a) (b) (c) (d) 图 7-14 PPR BBN AE a. 用 刮刀 b. 用 环行 索 c 用 橡皮 圆 辊 d. 用 环行 滤 带 © 196« 在 圆 辊 上 的 滤 瘟 再 用 一 较 小 直径 的 贺 辊 除去 , 见 图 7-14(c)。 ARBRE ” 滤 咎 区 特别 薄 时 (小 于 2 毫米 ) 可 用 此 法 , 滤 带 通过 一 系列 圆 辊 , 然 后 被 刮刀 外 除 , 滤 带 再 经 洗涤 回 到 转 简 上 。 其 原理 见 图 7-14(d) 转 简 真空 过 滤 机 的 全 部 过 滤 \ 洗 桨 和 干燥 过 程 都 在 一 圆 面 上 进行 , 滤 闭 不 能 进行 细致 的 洗涤 和 王 燥 。 所 得 泪 饼 含水 量 一 般 为 18 盖 38 镶 。 若 要 得 到 较 干 的 滤 饼 ， 可 将 转 简 的 一 BB OT Be EE BA PAS EZ To 《三 ) 加 压 叶 片 连续 过 滤 机 它 的 特点 是 主轴 每 转 一 周 ， 依 次 完成 过 滤 、 水 洗 、 干 燥 、 和 外 料 四 个 工序 ， 结 构 见 图 7-15。 它 的 效率 高 ,密封 性 好 ,适应 性 强 。 多 用 于 过 滤 粘 度 大 \ 颗 粒 细 \ 有毒 \ 多 挥 发 物料 。 WMA 5 米 的 叶片 过 滤 机 的 生产 能 力 , 相 当 于 六 人 台 过 滤 面 积 36 米 - 的 板 框 过 滤 机 ,而 占 地 面积 缩小 2/3, 设备 投资 减少 50 多， 每 年 所 用 滤 布 量 为 板 框 压 姜 机 用 布 量 的 1/160。 A7-15 MERA (BQ) 其 他 如 叶片 真空 吸 泪 机 、 金 属 圆 片 自力 过 证 机、 圆 形 板 框 压 泪 机 、 陶 瓷 抽 洪 缸 等 分 别 用 于 生产 谷 氨 酸 钠 、 柠 檬 酸 `、 抗 菌 素 及 其 他 生化 药物 。 BT 膜 分 离 技术 早 在 1861 年 Thomas Graham 就 已 介绍 用 膜 分 离 法 可 从 大 分 子 〈 多 糖 ` 蛋 白质 ) 溶液 中 除去 一 些小 分 子 的 无 机 盐 类 号 。 那 时 的 膜 材料 多 来 源 于 动物 胶 ， 不 及 现 用 的 透析 膜 那 样 精致 和 高 效 。 但 分 离 的 原理 还 是 相同 的 。 膜 分 离 的 原理 ,主要 是 利用 溶液 中 溶质 分 子 的 大 小 \ 形 状 \ 性 质 等 的 差别 ,对 于 各 种 薄 膜 表 现 出 不 同 的 可 透 性 而 达到 分 离 的 目的 。 选 择 薄 区 在 膜 分 离 法 中 很 重要 。 薄 膜 的 作用 是 有 选择 地 让 小 分 子 通过 ,而 把 较 大 的 分 子 挡住 。 分 子 透 过 膜 ， 可 由 简单 的 扩散 作用 引 起 ， 或 由 膜 两边 外 加 的 流体 静 压 差 或 电场 作用 所 推动 。 由 上 述 原理 衍生 出 的 分 离 法 有 透 析 、\ 超 证 、 电 涂 析 、 反 活 透 等 。 它 们 还 可 根据 装置 的 不 同 或 所 用 膜 性 能 上 的 区 别 再 细 分 。 如 超 滤 装 置 有 静止 无 挠 拌 式 ,搅拌 式 ,武道 式 和 中 空 纤 维 式 等 类 型 。 * 197 « 膜 分 离 技术 的 发 展 和 制 膜 工艺 水 平 直接 有 关 。 早 期 用 的 动物 膜 , 不 论 在 材料 来 源 、 青 生 能 力 及 分 离 效 果 上 都 有 许多 缺点 。 三 十 年 代 初 Elford 制 成 硝化 纤维 薄膜 ,可 用 于 测定 某 些 病毒 颗粒 的 大 小 ,但 用 这 种 薄膜 时 ,流速 甚 慢 ， 操 作 和 烦琐， 因而 未 能 广泛 应 用 。 后 来 Graig 等 对 玻璃 纸 ( 赛 璐 珍 ) 做 的 透析 管 进行 了 细致 研究 ,用 各 种 理化 方法 改变 玻璃 纸 孔 径 大 小 ,克服 再 生 能 力 低 , 流 速 慢 等 缺点 ,并 改进 了 装置 使 透析 技术 前 进 了 一 步 “"”。 制 膜 工艺 的 革新 高 潮 是 在 近 十 多 年 出 现 的 。 工业 废水 处 理 、 海 水 痰 化 试验 及 制 盐 工 业 的 发 展 , 医 学 上 人 工 肾 脏 - 的 研究 等 ,使 人 们 对 薄膜 的 研究 的 兴趣 大 为 增加 。 因 此 新 的 薄膜 及 装置 应 运 而 生 , 其 中 最 重要 的 是 各 向 异性 的 不 对 称 薄 膜 或 称 表层 膜 。 它 不 仅 提 高 了 膜 的 选择 性 和 机 械 强 度 , 而 且 滤 速 也 比 玻 璃 纸 的 滤 速 增加 数 十 倍 甚至 成 百倍 。 其 次 是 出 现 了 多 种 新 装置 。 目前 ， 迅速 发 展 的 膜 分 离 法 已 成 为 物理 化 学 分 离 法 中 重要 组 成 部 份 。 它 在 生化 制备 中 用 于 浓缩 及 脱盐 已 占 压 倒 优势 , 用 于 分 离 提 纯 的 事例 逐年 增加 。 下 面 分 别 介绍 常用 的 几 种 膜 分 离 法 。 AR 适 1 二 玛 透析 法 的 特点 是 半 透 膜 两 边 都 是 站 相 ,一边 是 试验 液 ， 另 一 边 是 纯净 溶剂 〈 水 或 缓冲 洲 )。 试 验 液 中 不 可 透析 的 大 分 子 被 截留 于 膜 内 ,可 透析 的 小 分 子 经 扩散 作用 不 断 透 出 膜 外 ,直到 两 边 浓 度 达 到 平衡 。 以 前 透析 膜 两 边 的 液 相 用 的 名 称 较 混 乱 , 未 透 出 的 溶液 , 称 “不 可 扩散 的 物质 ” ,或 称 透析 残留 液 ” ,而 透析 后 的 溶液 称 "已 透析 液 “、 “BATH”. Craig 和 King 建议 使 用 的 “保留 深 (retentate)” 和 “ 活 出 液 〈diffusate)” 分 别 代 表 透 析 后 膜 ASR, 已 被 广泛 承认 。 透析 法 多 用 于 制备 及 提纯 生物 大 分 子 时 除去 或 更 换 小 分 子 物质 脱盐 和 改变 溶剂 成 份 。 近来 ， 透 析 法 有 很 大 发 展 ， 透 析 膜 和 透析 装置 更 有 新 的 进 步 。 《一 ) 透析 腊 除 动 物 膜 外 ,羊皮 纸 \ 火 棉 胶 和 玻璃 纸 及 最 近 使 用 的 Visking FET, AeA 维 或 纤维 素 衍生 物 制 成 的 。 纤 维 素材 料 来 源 丰富 ,价格 便宜 ,但 用 于 制作 透析 膜 的 高 聚 物 还 应 有 如 下 特点 : 1. 在 溢 剂 中 能 膨胀 形成 分 子 筛 状 多 孔 薄 膜 。 只 允许 小 分 子 溶质 和 溶剂 通过 ,而 阻止 大 分 子 ( 如 蛋白 质 ) 通 过 。 2. “ 具有 化 学 惰性 ， 不 具有 可 以 和 溶质 起 作用 的 基 团 ,在 水 \ 盐 溶 该 、 黎 碱 或 黎 酸 中 不 溶 解 。 3. 有 一 定 的 机 械 强 度 和 良好 的 再 生性 能 。 透析 膜 可 和 目 制 ( 如 火 棉 胶 ) 或 购买 ,国外 的 透析 膜 常 有 以 下 几 种 , 见 表 7-1e 商品 透析 膜 大 多 为 管状 ， 各 公司 采用 的 大 小 规格 又 不 相同 ， 曾 引起 混乱 。 购 买 时 需 注意 ,如 Visking 公司 最 初 的 透析 管 大 小 以 装 满 水 时 管内 膨胀 直径 为 多 少时 表示 ， 以 分 数 1132 为 一 个 单位 。 因 此 ,8/32 透析 管 的 膨胀 直径 约 为 0.25 时 ( 约 合 0.62 厘米 )。 Visking 并 人 Union Carbide 公司 后 , 仍 用 “32” HABER, 但 商标 上 常 略 去 “32” 而 代 以 透析 管 as 198 。 表 7-1 几 种 商品 透析 膜 ie a 本 | 相当 于 Visking Fas SE BE Abe SE BE 公司 型 号 CHK) CUBR) 8 8/32 和 0.390 2% 107 20 20/32 0.984 8x 10-4 27 27/32 1.312 1073 36 36/32 1.734 10-3 it ss 1Zss 2.88—3.14 1.6x10-° 3-188 3 Ss 4,65—5.10 3.51079 8 透析 管 0.62 5,732 20,000 18 透析 管 1.40 3,300 5,732 20 透析 管 1.55 30,000 45,000 27 透析 管 2.10 5,732 20,000 36 透析 管 2.80 20,000 _ 1 孝 透 析 管 4.70 不 详 , 但 与 8 号 管 大 致 相同 34 透析 管 8.13 REE. on 36/100 即 表示 36/32 号 管 每 卷 100 英尺 长 。 另 外 , 管 的 膨胀 直径 改 为 公制 ,以 厘 米 表 示 。Union Carbide 公司 的 几 种 透析 管 疹 透 范围 见 表 7-2。 透析 管 孔 径 大 小 可 经 机 械 作用 和 理化 处 理 而 改变 。 例如 乙酰 化 作用 可 缩小 膜 的 孔 径 , 直 至 能 阻 滞 甲 醇 分子 通 过 , 而 用 64% ZnCl 溶液 浸泡 时 ， 膜 的 孔径 可 增 大 到 能 使 分 子 量 为 135,000 的 大 分 子 通过 。 机 械 法 对 管 膜 孔 径 的 影响 可 因 作用 方向 而 异 。 线 形 膨胀 可 使 孔径 减 小 至 50 多， 而 放射 形 脱 胀 作用 由 于 管内 液体 静 压 力 加 大 ,可 使 管 膜 孔 径 增 加 1 一 2 倍 以 上 , 表 7-3 是 Union Carbide 的 二 种 透析 管 径 不 同 处 理 后 孔径 的 变化 ”。 此 外 ; 某 些 小 分 子 溶质 的 渗透 性 也 因 溶 液 中 存在 某 些 微量 表面 活性 剂 而 增加 ,可 能 是 由 于 它们 吸附 在 膜 的 活性 位 置 * 上 ,改变 了 膜 的 理化 特性 。 各 种 纤维 素 透 析 膜 片 孔径 度 一 般 不 如 管状 膜 那样 易 受 控制 ， 透 析 的 有 效 面 积 也 小 于 管状 膜 。 实 验 中 样品 量 少 , 用 透析 管 较 方便 ,而 工业 上 大 量 溶液 透析 脱盐 时 ,用 透析 膜 片 有 利 。 商品 透析 管 膜 常 涂 甘油 以 防 破裂 ,并 含有 极其 微量 硫化 物 \ 重 金属 和 一 些 具 有 紫外 吸 收 的 杂质 。 它 们 对 蛋白 质 和 其 它 生物 活性 物质 有 害 , 用 前 必须 除去 。McPhie 建议 先 用 50% 乙醇 慢 慢 煮 沸 一 小 时 ， 再 分 别 用 50 多 CH, 0.01M 碳酸 氢 钠 溶液 ,0.001M EDTA 溶液 © 199 。 表 7-3 ”不 同 处 理 方法 对 Union Carbide 透析 管 孔径 度 的 影响 透析 管 型 号 及 处 理 方 法 分 子 量 ) 范 j 国 18 DC 线形 膨胀 和 乙酰 化 100 二 2;7000 18 DC 线形 膨胀 2,000 一 6,000 18 DC 未 经 处 理 6,009—12,000 20 DC 未 经 处 理 12 ,000--20,000 20 DC 加 压 放 射 形 膨胀 20,000— 45,000 20 DC ZnCl, 处 理 45 ,000—135,000 依次 洗涤 ,最 后 用 蒸馏 水 浸 洗 三 次 , 基本 可 除 杂 质 ”。 实 验证 明 , 50% 乙醇 处 理 对 除去 有 有 紫外 吸收 杂质 特别 有 效 。 已 处 理 好 的 管 膜 如 果 不 用 , 可 贮存 于 4 蒸馏 水 中 。 如 需 长 期 贮存 ,可 加 少量 亚 氮 化 钠 、 氧 仿 以 防 细菌 食 蚀 。 再 用 时 需 用 蒸馏 水 充分 谋 洗 ; 再 以 透析 时 用 的 溶剂 漂洗 ,然后 灌 人 溶剂 ,仔细 检查 ,不 漏 即 可 用 。 (=) 透析 方法 及 装置 透析 方法 较 简单 ,可 将 已 处 理 及 检查 过 的 透析 袋 用 绒线 或 尼龙 丝 扎 紧 底 端 ; 然 后 将 待 BR A—100 毫升 ) 从 管 口 倒 人 袋 内 。 但 不 能 装 满 , 常 留 一 半 左 右 的 空间 ， 以 防 膜 外 洲 AXSBGARAN ARIK, MABHRBIK, 而 引起 殴 的 孔径 大 小 改变 。 装 透析 六 后， 即 紧 扎 袋 口 , 悬 于 装 有 大 量 纯净 溶剂 〈 水 或 缓冲 波 ) DAB A Cate) 如 图 7- 16; 7-17 所 示 ?” 进行 透析 。 小 分 子 《水 或 盐 ) 可 从 透析 膜 内 透 出 ， 直 到 膜 内 外 浓度 相等 。 如 用 透析 膜 片 , 实 验 室 中 简易 装置 也 可 装配 如 图 7-185": 在 三 个 刚好 可 以 互相 套 八 的 有 图 7-16， 透析 袋 透 析 人 简单 装置 图 7-17 ， 另 一 神 透 析 袋 透析 简单 装置 机 玻璃 圆 简 中 间 炎 入 透析 膜 , 笨 紧 ,使 透析 膜 表 面 平坦 ,然后 平 放 于 漏斗 中 。 漏斗 架 在 烧 杯 上 ,漏斗 口径 应 比 烧杯 大 4 一 6 公分 ， 烧 杯 高 度 应 能 容纳 漏斗 ， 使 其 末端 不 接触 烧杯 底 部 。 在 烧杯 中 放 人 水 或 缓冲 液 。 液 面 高 度 以 刚 触 及 透析 膜 为 好 ,用 玻璃 严 盖 住 漏斗 ;以免 杂 物 污染 。 如 需 冷 却 , 可 在 冰箱 内 进行 。 此 法 简单 ,安全 , 适用 于 少量 样品 脱盐 。 实验 室 小 型 透析 装置 党 加 上 搅拌 以 及 定期 (或 连续 ) 换 上 新 鲜 溶剂 ,这 样 均 可 大 大 提高 透析 效果 。 近来 ,国外 设计 透析 装置 多 是 如 此 。 现 举例 如 下 : 1. 旋转 透析 器 ”在 透析 容器 下 安装 电磁 搅拌 器 。 但 这 只 能 消除 膜 外 咨 剂 的 浓度 梯 BE ,而 不 能 消除 膜 内 咨 剂 的 浓度 差 。Feinstein 介绍 的 透析 装置 , 可 使 膜 内 外 两 侧 液 体 同时 - 200 « 图 7-18 用 透析 膜 片 透析 简单 装置 A7- 旋转 透析 器 简 图 C 一 一 盛 水 或 缓冲 该 容器 ; A、B 一 一 木 轮 ; D 一 一 横 轴 ; SS: 一 透析 袋 ; FF: 一 一 玻璃 珠 ; ‘s iat BS 流动 ,使 透析 速度 大 大 增加 ，EFeinstein 的 旋转 透析 器 如 图 7-19 Pra” 图 中 , C 为 装 有 大 量 水 或 缓冲 液 的 容器 (可 用 玻璃 或 塑料 制 成 ), D 为 横 轴 连接 二 个 木 轮 A、B, HAM E, 它 通过 传动 带 与 马达 相连 ， 转 速 约 4 转 / 分 。 BGR SS 成 对 角 线 推 紧 在 A、B 木 轮 的 两 端 。 当 D 转动 时 ，Si、S: 即 绕 着 横 轴 作 圆 周 运动 。 由 于 透析 袋 安 装 成 交叉 状 , 与 横 轴 不 平行 ,因此 D 轴 转动 时 透析 袋 中 液体 即 上 下 流动 。 必 要 时 还 可 在 袋 中 放 几 颗 玻璃 珠 (F,、F2)。 增 加 袋 内 液体 搅拌 速度 。 轴 D 及 轮 A、B 的 转动 ， 也 对 透析 膜 外 溶液 起 搅拌 作用 。 这 种 简单 装置 可 放 8 一 10 个 透析 袋 ， 透 析 速 度 比 图 7- 16, 7-17 示意 的 装置 约 快 2 一 3 倍 。 按 上 述 原理 尚 有 多 种 设计 5 有 的 仪器 将 许多 透析 袋 悬 挂 在 环 状 圆 简 上 , AKAs 有 溶剂 且 装 置 搅 拌 器 的 大 容器 中 ,由 马达 带动 旋转 。 这 种 装置 一 次 可 放 8 FBTR. SR 装 样 液 24 毫升 。 较 大 的 装置 一 次 可 放 16 EMR, 每 袋 装 样 液 220 毫升 。 这 种 装置 国 外 已 有 生产 。 有 的 仪器 除了 由 鼓 轮 引 起 旋转 外 ， 还 用 一 凸 转轴 使 透析 袋 产 生 10 一 30? fH 的 振动 。 这 种 振动 透析 器 透析 0.1M 氧化 钠 仅 需 2 一 3 小 时 即 达到 平衡 。 2. 平面 透析 器 圆 简 形 透 析 管 虽然 使 用 较 方 便 , 孔 径 易 控 制 ， 但 透析 面积 较 小 。 Kaz 等 介绍 了 平面 透析 器 装置 , 见 图 7-2080。 将 透析 管 装 在 长 方形 塑料 框 内 ,利用 塑料 框 把 透析 管 张 开 ,成 为 很 薄 的 平面 透析 器 。 然 后 把 它 的 两 端 连接 到 转动 装置 上 ,通过 电磁 转动 器 使 它 缓慢 转动 。 透析 器 外 面 是 七 有 溶剂 的 玻 耽 伺 或 塑料 箱 , 这 种 透析 器 一 次 即 可 32 PEK 0.5 一 20 毫升 。 效 率 比 管状 旋转 透析 又 有 提高 。 图 7-20 平面 透析 器 简 图 S 一 一 透析 袋 ; B 一 一 方形 塑料 框 ; EF, E: 一 一 透析 袋 两 端 接 旋转 装置 3. 连续 循环 透 本 器 上述 各 种 装置 在 膜 内 外 可 透析 物质 达到 平衡 后 必须 更 换 新 鲜 溶剂 ， 才 能 使 可 透析 物质 继续 通过 透析 膜 向 外 扩散 ;通常 要 更 换 3 一 4 次 溶剂 ， 这 比较 麻 。 201 。 烦 。Heospethom 介绍 的 简单 装置 如 图 7-2182。 用 一 根 很 长 的 粗 棉线 缠绕 在 两 端 扎 紧 的 长 透析 管 上 ,棉线 强 绕 的 螺 距 应 适当 ,以 保证 透析 液 有 一 定 疲 速 。 溶 剂 可 沿 棉线 目 上 而 下 访 动 把 透析 管 中 扩 散 出 的 小 分 子 不 断 移 去 。 用 这 种 装置 ， 可 使 50 毫升 0.9 M 硫酸 RA 在 18/32 透析 管内 对 蒸馏 水 透析 ,7 小 时 后 除去 99 罗 的 盐 , 见 图 7-21。 连续 循 环 透析 器 如 用 水 透析 可 在 冷 室 敞 开 进 行 。 如 用 缓冲 液 透 析 , 则 需 密封 以 防 缓冲 该 蒸发 而 使 浓度 改变 ， 装置 见 图 7-21 (b)o 图 7-21 连续 循环 透析 器 (a) FRA; Cb) 密封 式 连续 透析 装置 有 多 种 ， 其 原理 都 是 使 溶剂 更 新 以 加 大 膜 内 外 的 浓度 差 ， 提 高 透析 速 度 。 此 种 装置 除 用 于 分 离 浓 缩 外 , 还 可 用 于 酶 促 连 续 反应 。 我 国 轻工业 部 食品 发 酵 工 业 研究 所 试验 天 | 门 冬 妥 酸 酶 促 合 成 时 ， 用 连续 透析 法 使 酶 和 底 物 溶 臣 分 别 缓慢 六 入 用 半 透 膜 隅 开 的 压 着 机 形式 的 连续 透析 器 中 进行 反应 ,可 提高 酶 的 利用 率 和 避免 交 人 杂质 。 天 门 冬 氮 酸 转化 率 达 99% 以 上 "。 较 复杂 的 透析 装置 有 : 空心 纤维 透析 器 、 线 流连 续 透 析 7-22 色谱 用 微量 透析 器 。202。 人 器 \ 薄 膜 反 流连 续 透析 器 等 ,其 透析 效率 远大 于 简单 装置 。 4. 层 析 用 的 微量 透析 器 “有 时 柱 层 析 收 集 的 各 组 小 量 样品 必须 分 别 进行 层 析 。 用 透析 袋 在 同一 条 件 下 同时 透析 小 量 样品 是 很 为 难 的 。 Reitz，A. H. 和 Rilet, W. H. 介 绍 的 方法 是 6: ”在 一 块 平 请 的 硅化 橡胶 上 挖 许多 小 洞 《 如 图 7-227， 每 个 洞 可 放样 品 0.025—0.5 毫升 , 另 在 一 块 对 应 的 有 洞 硅化 橡胶 的 洞 中 放 溶 剂 , 用 平面 膜 把 样品 和 溶剂 隔 开 , 进 行 透析 。 如 需 移 去 透析 物 , 即 在 溶剂 一 侧 开 一 浅 沟 , 使 透析 流连 续 流出 。 安装 时 将 二 块 橡胶 (中 间 夹 着 膜 ) 用 夹子 紧 固 即 可 。 5. 反 流 透析 器 ”” 它 使 样 液 和 溶剂 在 膜 两 侧 反 向 缓慢 流动 , 既 有 较 大 的 透析 面积 ,又 能 使 膜 内 外 溶 洲 浓度 差 达 到 最 大 限度 ， 透 析 效 率 极 高 ， 透 析 的 样 液体 积 很 大 。 Craig 和 Stewart 设计 很 简单 的 反 流 透析 器 a1, 见 图 7-23。 样 芒 由 输入 泵 注入 后， 通过 内 管 从 膜 的 底 端 上 升 。 而 溶剂 从 膜 另 一 侧 上 端 往 下 流动 。 使 膜 两 侧 分 别 形成 不 同 流向 的 薄 液 层 。 膜 外 液 层 因 马 达 带 动 外 管 转动 而 流动 , 可 进一步 提高 透析 效率 。 调节 输入 和 泵 和 输出 泵 的 流 速 可 以 控制 透析 速度 。Craig 和 Stewart 用 六 种 溶液 测定 透析 效率 ,结果 见 表 7-4。 6. 减 压 透析 其 原理 是 在 疹 出 小 外 抽 真 空 使 膜 两 边 形 成 压 差 , 加 速 膜 内 物质 透 出 。 +j/5mm- Al7-23 ” 薄 层 反 流 透析 器 1. 透 析 溢 液 ; 2. 溶 液 输入 泵 ; 3. 聚 四 氟 乙 烯 管 ; 4. 支 持 夹 ; 5. 支 持 夹 ; 6. 溶 剂 ? 7 虹吸 管 ; 8 透析 后 保留 液 出 口 ; 9. 马达 ; 10. 皮带 ; 11. 轴 承 ; 12. 内 管 〈 中 5); 13. 透 析 膜 ; 14. 外 管 ( 旋 转 ); 15 SEES 16. ROMS 17. 透析 后 Bum MUR, 18 透析 后 次 出 液 ;出 口 。203 « 7-4 两 种 不 同 膜 在 25”C 进行 菏 层 反 流 透析 的 比较 结果 ( 慢 泵 速 ) No. 18 Visking [i 出 口 流速 村 (毫升 /分 3 滤 除 百分率 (毫升 /分 3 No. 20 Visking 膜 (%) 色 氨 酸 (2.46 X10-3M) 蔗糖 (1%) 杆菌 肽 (1.92 X 10-2) 70.5 1NNaCl 99.7 3% Wie 98.7 50% tibet : 其 装置 见 图 7-24， 图 中 了 为 一 个 15 一 60 BKK A Union Carbide 8 号 透析 管 , 下 端 用 线 LA DARA HPA Bie knees fe (T), BIB 2 (S) HRD SDR i+ (QO) WROAB Bi. elo ele ze 开关 ， 把 样 流 加 入 透析 管内 。 抽 真空 后 ， 将 抽 泪 瓶 抽 滤 嘴 处 橡皮 管 夹 紧 ， 即 可 减 压 透 析 。 必 要 时 可 将 装置 放 人 冰箱 内 透析 至 平衡 。 操 作 时 ， 要 预 先 估计 透 出 液体 积 , 加 上 原 有 溶剂 ,使 抽 滤 瓶 内 最 高 界面 不 得 超过 CL) 处 。 如 选用 其 它 透 析 膜 管 ， 应 测试 其 耐 受 压 力 (不 得 低 于 一 个 大 气压 )o 在 14 °C, 700-750 托 (Torr) 时 , 滤 速 为 0.6 一 0.7 毫升 水 /厘米 管 /小 时 。 此 装置 使 用 方便 。 效 果 很 好 。 7. 浅 流 透 本 器 它 是 近年 发 展 的 新 型 透析 装置 ， 国 外 已 有 商品 。 它 可 兼用 于 透析 和 超 滤 。 ; 样 液 经 小 沟 由 中 心 沿 螺旋 浅 流 流向 外 周 ， 沟 底 为 图 7-24 ” 减 压 透析 装置 平面 腊 , 样 液 边 流动 边 透 析 。 当 样 液 流 至 末端 , 透 RE, TONE, Co 史 了 PE 一 析 即 告 完成 。 关 于 浅 流 透析 的 效率 及 各 种 因子 的 真空 抽 滤 瓶 wl, Zeinch, R. A. SAMAR. 有 KRARRLBSAAE BRB o d ! — Se Vig 超 滤 是 加 压 膜 分 离 技术 之 一 ,操作 简便 ,成 本 低廉 ,分 离 效 率 高 , 且 不 5 引起 温度 、 离 子 状态 及 相 的 变化 。 近 来 广泛 用 于 生物 制品 ` 食 品 和 制药 工业 、 三 废 处 理 及 其 它 浓缩 、 脱盐 及 分 级 分 离 工序 。 至 今 , 国 内 外 已 有 很 多 关于 超 证 原理 及 应 用 的 专著 ,评论 及 文献 ”。 超 滤 原理 和 一 般 过 涨 一 样 , 主要 依赖 于 被 分 离 物 质 分 子 量 的 大 小 、 形状 和 性 质 不 同 ， 在 一 定 的 压力 差 ( 外 源 Na 或 真空 泵 压 ) 下 ,使 小 分 子 能 够 通过 具有 一 定 孔 径 的 特制 薄膜 ， 限额 以 上 的 大 分 子 被 膜 阻 留 ,使 不 同 大 小 的 分 子 得 以 分 离 。 要 在 膜 的 两 边 产生 压 差 , 可 在 样 液 一 边 加 正 压 或 在 超 滤液 一 边 产生 负 压 。 前 者 应 用 较 多 ,因为 抽 真 空 产 生 的 负 压 差 不 - 204+ 一 “人 超过 一 个 大 气压 , 超 滤 效 果 差 。 所 以 超 滤 通 常 是 指 外 源 加 压 的 膜 分 离 。 根据 所 加 的 操作 压 和 所 用 膜 平 均 孔 径 的 不 同 ,可 分 为 微 孔 过 滤 、 超 滤 和 反 诊 透 三 种 。 微 孔 过 滤 所 用 操作 压 在 每 平方 时 5 磅 以 下 , 膜 的 平均 我 径 为 500 埃 至 14 微米 ， 用 于 分 离 较 大 颗粒 。 加 压 超 泪 所 用 操作 压 为 5--100 磅 /时 :， 膜 的 平均 孔径 为 10 一 100 埃 , 用 于 分 离 大 分 子 溶质 。 | BEE REL REX, , 常 达 500—2000 磅 /时 ?:, 膜 的 平均 孔径 最 小 ， 一 般 为 10 埃 以 下 ,用 于 分 离 小 分 子 溶质 。 超 洪 与 反 渗透 及 微 孔 过 滤 的 比较 见 图 7-25, 7-264, (B) 7-25 is (A) SREB 7-26 jis (A) 与 微 孔 过 滤 (B) 的 比较 (示意 图 ) (B) 的 比较 (示意 图 ) (—) 超 滤 过 程 及 装置 超 滤 在 密封 的 容器 中 进行 , 外 源 压 力 迫 使 溶质 通过 薄膜 。 开始 时 溶质 分 子 在 溶液 中 均匀 分 布 , 后 来 由 于 小 分 子 溶质 通过 膜 , 而 大 分 子 溶 质 被 截留 于 膜 面 , 渐 形成 浓度 梯度 , 称 为 浓度 极 化 现象 。 大 分 子 溶质 在 膜 上 的 堆积 层 (或 称 浓缩 层 )， 就 好 似 超 滤 膜 上 附加 的 次 级 膜 , 因此 ， 溶 质 泪 过 时 必须 首先 通过 这 层次 级 膜 。 见 图 2-27。 随 着 大 分 子 溶质 堆积 层 的 加 厚 , 膜 的 选择 分 离 能 力 愈 来 愈 低 , 流 速 也 越 来 越 慢 。 如 用 各 向 同性 微 孔 薄膜 , 经 常会 堵塞 ;而 完全 丧失 过 滤 能 力 。 为 此 ,设计 超 沽 装置 时 ,都 力求 克服 浓度 极 化 , 增加 流速 , 提 高 选择 分 离 效 率 。 现 有 装置 一 般 可 分 四 种 类 型 。 1. 封闭 系统 无 搅拌 式 装 置 VCR RAMA RE KERRY ER. Mak 的 使 用 面积 小 , 庆 速 慢 , 常 需 较 大 压力 。 ARETRA)E MBER. 早期 装置 如 图 7- *。 205 。 tHE 和 4 f, TREE Bree } LIE a 保留 流 oN 流出 方向 。 超 滤液 图 7-27， 超 滤 过 程 的 浓度 极 化 现象 示意 图 图 7-28 “封闭 系统 无 搅拌 式 起 让 装置 示意 图 28。 目 前 已 不 常用 。 2. 封闭 系统 有 搅拌 式 装置 ” ” 超 滤 室内 溶液 中 放 铁 世 搅 拌 棒 , 室外 底部 的 电磁 搅拌 器 通电 后 可 带动 搅拌 棒 缓 慢 转 动 。 搅 拌 作用 减少 了 深 波 浓度 极 化 现象 ,使 滤 速 大 大 提高 ， 见 图 7-29。 北 京 植 物 研究 所 设计 的 搅拌 式 超 滤器 的 剖 视 图 见 图 7-302”, 超 滤器 由 盖 、 简 身 、 简 底 三 部 份 组 成 。 盖 用 金属 制 成 , 盖 上 有 加 样 器 和 连接 压缩 气 钢瓶 的 进 气 口 ,以 螺旋 结构 和 橡胶 垫圈 使 盖 和 简 身 保持 密封 。 简 身 和 简 底 用 有 机 玻璃 制 成 , 简 身 管 壁 厚 度 为 4 毫米 。 图 7-29 封闭 系统 有 搅拌 式 超 滤 装 置 图 7-30 fee ue BAMA 1. 进 气 口 2. 加 样 口 盖 3. 加 样 口 4. 盖 5. 有 机 玻璃 底 简 6. 超 滤 膜 7. 尼 龙 布 8. 支 持 板 9. 橡胶 垫圈 10. 塑料 杯 11. 磁 搅 棒 12. 有 机 玻 现 简 身 13. BAB 莉 身 底部 装 有 硬 塑 料 环 ,密封 在 玻璃 管 中 的 铁 棒 ( 磁 搅 棒 ) 位 于 此 环 上 。 滤 膜 、 尼 龙 布 、 支 持 板 装 在 简 身 与 简 底 之 间 , 简 身 和 简 底 以 螺旋 结构 和 橡胶 垫圈 保持 密封 ;支持 板 是 有 小 孔 * 206 « O_O 的 塑料 板 或 不 锈 钢板 。 超 滤器 操作 压力 是 由 压缩 气 钢瓶 经 减 压 器 从 进 气 口供 给 的 。 压力 受 减 压 器 控制 。 超 淖 器 装 在 磁力 搅 样 器 上 ,由 磁力 搅拌 器 带动 超 滤器 内 的 磁 搅 棒 转 动 ,小 出 波 收 集 在 结晶 严 内 。 所 用 的 二 五 酸 纤维 超 滤 膜 ,也 是 植物 研究 所 自制 的 , 超 让 时 膜 的 有 效 面积 为 6 厘米 35 压力 为 3 公斤 /厘米 ?，8 小 时 内 可 将 3100 毫升 的 Mo-Fe 蛋白 浓缩 至 10 毫升 ,蛋白 质 浓度 由 3 毫克 /毫升 增 至 30 毫克 /毫升 , 这 种 超 滤器 结构 简单 使 用 方便 , 国 内 已 有 不 少 商品 供应 ,用 于 生化 实验 。 3. 浅 道 系 统 超 滤 装 置 “ “这 类 装置 使 液体 通过 螺旋 形 浅 道 ,向 与 膜 平 行 的 方向 流动 。 浅 道 底部 有 膜 ,由 于 液体 在 膜 面 高 速 流动 ,浓度 极 化 不 显著 。 而 且 液体 与 膜 接触 的 面积 也 大 于 一 般 搅 拌 型 装置 , 故 有 很 高 滤 速 。 浅 道 系统 见 图 7-31(a), 装置 见 图 7-31(b)。 Bie 后 被 截留 的 大 分 子 溶液 从 小道 未 端 流 出 ,通过 蠕动 泵 再 循环 超 滤 , 见 图 7-31 (b), 最 后 浓 度 可 达 40 多 。 该 装置 适用 于 大 分 子 混合 液 的 分 级 分 离 , 生物 制备 中 细菌 、 病毒、 热 原 的 滤 除 及 生物 大 分 子 溶液 的 浓缩 \ 脱 盐 等 。 ， 4. 中 空 纤维 系统 超 滤 装 置 ““ 它 由 很 多 根 空心 纤维 丝 成 束 地 装配 组 成 。 每 根 纤维 丝 上 B “表层 2 向 上 ) (A) CB Al7-31 浅 道 系统 超 滤 示意 图 (A) 起 滤 过 程 。 (B) 超 滤 装 置 @ 大 浴 质 分 子 © 小 溶质 分 子 —= 溶剂 图 7-32 空心 纤维 膜 超 滤 示 意图 7-33) PM- 空 心 纤维 膜 横 切 面 扫 描 电 镜 图 (放大 400 倍 》 * 207 。 即 成 为 一 个 微细 管 型 膜 ( 相 当 于 一 个 超 滤 单 位 ), 如 图 7-32。 纤维 丝 横 切 面 内 壁 的 “表层 ” 细密 ;向 外 逐渐 蔚 松 ,形成 各 向 异性 微 孔 膜 管 结构 。 图 7-33 为 PM- 空 心 纤维 膜 横 切 面 的 扫描 电镜 图 。 空 忌 纤 维 管 的 内 径 一 般 为 0.2 毫米 ,有 效 面积 约 1 厘米 表面积 与 体积 的 比 BRA MAB BR. Pie DC-30 型 中 空 纤 维系 统 超 滤 装 置 共 有 三 根 装 有 许多 中 空 纤 维 膜 管 的 套 简 , 膜 表面 积 达 2.7 米 "， 在 3 个 大 气压 下 滤液 疲 量 可 达 1 升 / 分 。 中 空 纤 维 用 于 透析 \ 脱盐, 不 到 1 小 时 即 可 从 溶液 除去 99 多 的 盐 。 装 置 见 图 7-34。 一 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 人 图 7-34 ”中空 纤维 系统 超 滤 装 置 简 图 表 7-5 各 种 超 滤 系 统 滤 出 液 流 量 比较 * 流 - > 量 标准 流量 aie (平方 厘米 ) CB [47 (毫升 /分 ) “|( 毫 升 /分 .厘米 : . 磅 时 ) 非 搅拌 型 3.4 70 0.05 $e 拌 型 39 50 ay ree ics | i ae ee a EGS 浅 道 型 40 25 900 heed 50.00 * EMA 1% 牛 血清 白 蛋白 ,用 分 子 量规 格 为 10,000 的 膜 截留 。 ** 平均 的 透 膜 压力 5 以 上 几 种 实验 室 超 让 装置 的 规格 用途 及 让 出 液 流量 的 比较 见 表 7-5 及 表 7-65), (=) 超 滤 膜 的 选择 及 使 用 商品 膜 的 型 号 其 多 。 在 选择 时 ,一般 应 注意 以 下 指标 。 1. 额定 截留 水 平 “表示 每 种 超 油膜 所 规定 截留 溶质 分 子 量 的 范围 。 在 这 个 范围 内 绝 大 多 数 溶质 分 子 能 被 膜 截 留 。 和 截留 分 子 量 愈 大 ， 膜 的 表 观 孔径 愈 大 ， 反 之 表 观 孔径 愈 小 。 一 般 选 用 额定 截留 水 平 稍 低 于 所 分 离 、 浓 缩 的 溶质 分 子 量 。 由 于 额定 截留 水 平常 以 球状 溶质 分 子 所 得 的 测定 结果 表示 ， 故 纤维 状 或 不 规则 的 溶质 分 子 还 应 根据 实际 情况 在 « 208 。 表 7-5 几 种 实验 室 超 渡 装 置 的 规格 及 其 用 途 过 站 Maa | 处 理 浓度 9 | 滤 膜 规格 ta 最 初 | 最 终 | 直 ee ab 系统 | 直径 | wR 最 低 | 最 高 | 最 低 | 最 高 | 微米 北平 方 厘米 ) 125) | 1.0] 10 25 适用 于 溶质 大 分 子 的 浓缩 及 | GMT, 搅拌 : PSC IA GY . PBI BRE | 剂 灭 菌 , 有 的 滤 室 搅拌 型 | 202 型 | 5.01 200] 0.05] 5 62 We NP FE 7 BEE cB 402 型 | 10.0} 400 2000 型 | 60.0 | 2000 ee ee 一 | 一 一 一 一 一 一 一 适用 于 溶质 大 分 子 混合 液 的 | 用 化 学 药剂 灭 分 级 分 离 , 如 处 理 生物 制品 细胞 | 菌 ,低温 操作 蕙 祁 波 、 血清 、 糖 浆 等 ;回收 发 酝 婆 中 的 代谢 产物 , 庆 除 细菌 、 病 SAG 90 wis a, en Se SS ES a 0.05 40 RS 适用 于 处 理 血 液 组 份 ,疫苗 、| 滤 室 可 高 压 灭 TCE |1300.0|1 1950 150 | 138—690 So eee Pee 细菌 ,| 菌 , 低 温 操作 。 聚合 物 、 培 养 基 的 汪清 等 。 --- 化 学 药剂 灭 菌 CEC, 无 限 90 43 色谱 柱 线性 洗 脱 液 的 浓缩 低温 操作 4 适用 于 浓缩 及 脱盐 y 如 处 理 蛋 DC, 1000 | 2000 900 Hin. Ae REAVER 胶体 产物 等 中 空 二 a FE CH, | 500 | She} 0.4 | 20 900 fay «ck A OE 纤维 Fae Ce aie = BEE: age 适用 高 效 透析 浓缩 ?快速 处 理 .DC:。 | 5000 |, 无 限 28X10: | 大 分 子 咨 液 , 如 血 波 组 份 . 病毒 BS 无 搅 Hence nae asl ， et ‘0 ‘ seg [et | ne BE OLB EF HT 低温 操作 额定 截留 水 平 上 限 加 以 选用 。 国 外 常见 商品 超 滤 膜 的 型 号 及 性 质 见 表 7-7, Amicon 厂 所 生产 的 Diaflo 型 号 的 十 种 超 滤 膜 对 20 种 不 同 溶质 的 阻 留 率 及 11 种 空心 纤维 对 八 种 不 同 溶质 的 阻 留 率 分 别 测 定 结果 见 表 7-8(a)、7-8(b)。 2. 流 率 ”可 用 在 一 定 压 力 下 每 分 钟 通过 单位 面积 膜 的 液体 量 来 表示 〈 一 般 用 无 离 子 水 进行 测定 )。 实 验 中 常用 毫升 /厘米 "/ 分 表示 流 率 单 位 。 工 业 上 测定 流 率 〈 通 常 加 仓 / 忠 /分 表示 简称 GFD) 时 ， 需 注 明 条 件 才 能 比较 。 如 UM, PM, XM50, DM 膜 流 率 的 测定 规定 时 间 为 5 分 钟 ,压力 为 55 磅 /时 ,而 XM300，XM100A 膜 流 率 测 定 规定 时 间 也 是 ,5 分 钟 ,但 压力 为 10 磅 /时 ”。 流 率 大 小 不 仅 和 膜 的 表 观 孔径 大 小 有 关 ， 而 且 和 膜 的 结构 类 别 有 关 。 例 如 早年 的 各 向 同性 的 微 孔 超 滤 膜 [ 见 图 7-35 (a)] 和 近年 发 展 的 各 向 异 性 不 对 称 超 滤 膜 [ 见 图 7-35(b)、(c)、(d)] 作 比 较 , 虽 然 膜 的 表面 孔径 大 小 一 致 ,但 各 向 异性 不 对 称 超 滤 膜 的 流 率 却 大 得 多 。 它 是 由 很 薄 的 表层 (0.1 微米 或 以 下 ) 和 较 厚 的 多 筷 基层 〈200 一 250 微米 ) 粘 合 而 成 。 表 层 非 常 薄 ,有 圆锥 形 (或 喇叭 形 ) 的 孔道 ,因此 溶剂 通 透 性 极 好 ,流量 大 ,不易 被 溶质 阻塞 。 多 孔 基 层 厚 度 大 ,可 以 增加 膜 的 机 械 强 度 。 而 且 ,表层 噶 选 择 性 高 ,商品 规格 多 ,合成 膜 时 各 种 性 质 易 于 控制 ,质量 指标 较 有 保证 。 因 此 ,这 种 超 * 209 « 表 7-7 一 些 常见 商品 超 滤 及 透析 膜 的 性 质 型 号 组 成 材料 riven aT RAE (100 磅 /时 9 Sars Bat de PEM f& 均 质 纤维 素 0.02 60,000 (HB) Diaflo UM-0.5 Amicon ees 340 (HERE) Diaflo UM-2 Amicon 高 分 子 电 解 质 络 合 物 600 GD Diaflo UM-10 Amicon 高 分 子 电解 质 络 合 物 | 10,000( 葡 聚 猪 10) Diaflo PM-10 Amicon HERSEY : 10,000 (细胞 色素 c) Diaflo PM-30 Amicon 芳香 族 多 聚 物 30,000 (3S A) Diaflo XM-50 Amicon 烯 类 物质 。 50,000〈 白 蛋白 ) Diaflo XM-100A Amicon 烯 类 物质 100,000 (7S RBA) Diaflo XM-300 Amicon 烯 类 物质 300,000《 硫 铁 蛋 白 ) HFA-100 Abcor Inc IEMA : 10,000 C#i38%8 10) HFA-200 Abcor Inc | 非 均 质 纤 维 素 和 20,000〈 葡 聚 糖 20) HFA-300 Abcor Inc 4ES EE ; 70,000 (4241) PSAC Tisase 非 均 质 纤维 素 750 一 1250 Guana... PSED es 非 均 质 纤 维 素 25,000 (-BOEFLER EN) PSDM a, 非 均 质 纤维 过 40,000 (SRELSEI) Ue RS Fe AR Ee RR PE EBA SRI, RAE 3. 其 他 除 考 虑 额定 截留 水 平和 六 率 外 ， 还 应 了 解 各 种 超 滤 膜 的 使 用 条 件 和 注意 事项 。 例 如 : (1) VF: UM, XM, HX, OM 型 膜 耐 受 温 度 不 超过 50%C, 而 PM, HP ie 耐 受 温 度 可 高 达 120°C, (2) 膜 的 无 芮 措施: 一般 可 用 5 多 AER. 70% CB. KAGE REAM 20%). 有 的 超 小 器 (如 H1P8, H1P10, H1IP100 和 10P100, H10P8 等 型 号 ) 可 高 压 灭 菌 , 有 诲 超 滤器 (如 HIP5 和 HI10P5 等 型 号 ) 则 不 能 高 压 灭 菌 。 (3) 可 用 的 溶剂 与 禁用 的 溶 州 和 药物 : 不 同型 号 的 膜 也 不 完全 相同 。 需 先 查 明 膜 隐 配伍 性 。 例 如 ，DM 型 膜 禁 用 强 碱 、 氮 水 \ 肝 、 二 甲 基 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 硕 、 二 甲 基 乙 酰胺 "210 。 09 0T (8 x0001) vena (3% MR aC WRK ME SL — ae YS Cf / ROC Ad a NM > 000096 00008b 00009T 000Zz4I 0000IT 86< 00029 66< 00069 66< 000Sb 66< 000S€ S6< 00Sbz S6< 0008T S6< 00091 “56< 00yZzT 0000! a 000s SL 00yT 06 b6S 08 Zhe (4) & B (St) BBE GCWHOMRA cd Ce) 98- ¥ (s61) Hine LS My (SL) FR y i OUT Sikh Ae eI TG FAB Ha sl) FE Ed iii] fy El Be a - 2 Seratall'| iil "23% 2 369 BUG OLA. eae Me a 名 YF ROL eo Ae A Me-Ta Wie Bd-q BWAEGMR «211. 表 7-8 (b) Diaflo 空心 纤维 膜 的 溶质 分 子 阻 留 率 ORR # (%)* WRAT HP 分 子 量 H,P, H,P, ee H, X59 H,Pi00 名 称 Hy Bg HP, HoP， Eve HioX50 10x 180 Kat 594 0 5 一 一 一 多 聚 -DL- 丙 氨 酸 | 1,000 一 5,000 65 一 一 一 胰岛 素 5,000 15 0 0 0 PVP K,, 10,000 80 70 50 0 weasel PABA 17,000 >98 95 90 30 0 PVP Ka 40,000 >95 85 70 50 ] 15 白 蛋 白 67,000 >98 >98 >98 90 20 PVP Keo 160,000 >98 >98 >98 一 70 * MEA: 10psi (0.7 公斤 /厘米 7。 PVP = Polyvinyl pyrrolidone 聚 乙 烯 吡咯 烷 酮 。 图 7-35 不 同类 型 超 滤 膜 的 纵 切 面 模式 图 a. 各 向 同性 微 孔 膜 ， b. 各 向 异性 扩散 膜 ， .各 向 异性 微 孔 蜡 4d. Nucleopore UF 膜 的 显 微 照 相 和 m-Pyrol; XM, HX URAHARA. Ci RE ROG, TR, BRA 甲 基 甲 酰胺 等 ; UM 型 膜 禁用 强 离 子 表面 活性 剂 和 去 污 剂 。 可 用 的 溶剂 不 能 超过 一 定 洲 度 , 如 磷酸 缓冲 液 浓 度 不 能 大 于 0.05M, HCl 和 HNO, 溶液 浓度 不 能 超过 10 多 ， 酚 浓度 不 能 超过 0.5% , WAS pH 值 不 能 大 于 12; PM 和 HP 型 膜 禁用 芳香 烃 、 氧 化 烃 \ 酮 类 \ 芳 香 族 烃 化 物 、 脂 肪 族 酯 类 、 二 甲 基 甲 酰胺 、 二 甲 基 亚 础 、m-Pyrol 和 浓度 > 10% 的 磷酸 等 。 此 外 ,由 于 各 种 膜 的 化 学 组 成 不 同 ， 对 各 种 溶质 分 子 的 吸附 情况 也 不 相同 。 使 用 膜 时 ， 应 选择 尽量 少 吸 附 溶质 的 。 某 些 缓冲 液 如 会 改变 膜 对 溶质 的 吸附 能 力 ， 就 应 改 用 其 CAR. 例如 磷酸 盐 缓冲 液 常 增 加 膜 的 吸附 作用 ， 改 用 三 羟基 甲 基 毛 基 甲 烷 《〈Tris) 缓冲 小 或 琥珀 酸 缓 冲 液 , 则 可 减少 溶质 的 损失 和 保证 超 滤 时 溶剂 的 正常 流速 。 « 2122 4. 保存 超 滤 膜 较 稳定 ,如 使 用 适当 ,能 连续 用 1 一 2 年 。 暂 时 不 用 ,可 在 1% 甲醛 溶液 或 5 和 甘油 溶液 中 保存 ,避免 细菌 侵蚀 及 干燥 。 (=|) 各 向 异性 醋酸 纤维 素 超 滤 膜 的 制备 国外 超 证 膜 类 型 很 多 ,我国 北 京 、 上 海 等 地 近年 来 也 开始 研制 各 种 超 滤 膜 。 并 已 有 少 量 商品 供应 市 场 。 超 小 膜 可 由 二 乙 基 纤维 素 或 硝 基 纤 维 素 〈Collodion )， 或 二 者 混合 制 成 ， 称 为 纤维 性 膜 。 另 一 种 是 为 适应 医药 、 食 品 工业 上 灭 菌 的 需要 而 研制 的 非 纤维 性 膜 , 主要 用 聚 偏 二 氟 乙烯 各 种 淳 香 族 多 聚 物 ， 尼 龙 等 材料 制 成 。 实验 室 中 需要 的 各 向 异性 表层 超 淡 膜 可 按 照 Van Os 的 方法 制备 ca。 中 国 科学 院 植物 研究 所 制备 CAw 各 向 异性 醋酸 纤维 素 表 层 膜 的 方法 如 下 c9: 1. 制 膜 材料 成 膜 剂 : 二 醋酸 纤维 素 ( 结 合 酸 54.5 一 56 多 ,粘度 500 厘 泊 , 上 海 生产 )。 溶剂: 丙酮 (影响 制 膜 液 的 粘度 )。 添加 剂 : 甲 酰胺 (影响 膜 的 性 能 )。 2. 制 膜 液 的 配制 将 25 克 栈 酸 纤维 素 、100 毫升 丙酮 、80 毫升 甲 酰胺 加 入 密闭 容器 内 ， 间 歇 搅 拌 使 其 溶解 (防止 丙酮 过 量 挥发 )。 待 醋酸 纤维 素 全 湾 后 ,用 二 层 粗 棉布 一 层 尼龙 布 在 3 公斤 / 厘米 ?压力 下 过 滤 , 得 淡 黄 色 清 亮 粘 稠 滤液 , 室温 静 置 12 小 时 ， 待 滤液 中 小 气泡 完全 消失 后 ,立即 制 膜 ( 时 间 过 长 膜 液 变 性 , 呈 棕 红色 ,影响 膜 的 质量 )。 3. 制 膜 方法 工具 : 表面 平滑 的 玻璃 板 或 特制 的 抛光 玻璃 板 数 块 , 刊 膜 刀 可 用 表面 平 直 的 玻璃 管 、 玻璃 板 或 金属 板 制 成 , 刀 面 平滑 而 罕 , Pea eset (直径 0.27 2K) 以 控制 膜 的 厚度 (经 蒸发 和 浸水 后 实际 厚度 约 为 0.14 一 0.17 毫米 )。 制 膜 条 件 : 最 好 在 恒温 (20 士 1*c)、 恒 湿 ( 相 对 温度 75 一 80 匈 ) FT, RENCE 水 温度 控制 在 4 一 5“%C。 A: 将 制 膜 液 倒 在 玻璃 板 一 端 ， 用 刮刀 均匀 刊 膜 ， 刮 13X25 厘米 的 膜 约 需 5 秒 钟 。 刊 膜 后 蒸发 5 秒 钟 ,立即 把 带 膜 的 玻璃 板 淄 人 冰 水 ,一 小 时 后 , 从 玻璃 板 上 取 膜 。 贴 着 玻璃 板 的 膜 面 为 反面 ， 取 膜 后 应 做 上 识别 标记 。 用 膜 时 需 将 正面 向 着 被 超 滤 的 溶液 。 制 成 的 膜 贮 于 0.02 % WBRULE (NaN;) 的 水 溶液 中 备用 。 膜 乔 好 后 在 空气 中 停留 时 间 (蒸发 时 间 ) 越 长 , 膜 孔径 越 小 。 粘 稠 溶液 表面 的 溶剂 蒸 发 最 快 , 栈 酸 纤维 素 分 子 会 浓缩 形成 微 密 表层 ,妨碍 底层 溢 剂 蒸发 。 冷 浸 时 溶剂 和 应 加 剂 逐 汤 被 漂洗 出 来 , 栈 酸 纤维 素 分 子 形成 凝 胶 而 沉积 下 来 , 由 于 表层 沉积 作用 最 强 , 故 结构 更 严密 。 而 底层 沉积 作用 弱 , 结 构 较 疏松 ,形成 较 大 的 孔径 。 这 样 就 形成 了 表层 和 底层 结 构 不 同 的 各 向 异性 超 滤 膜 。 Edberg, Bronsen 和 Van Oss #844”), 7e—E AE SB EE RRNA BREA 时 间 ) 下 ic 2s FP We Me Se LL AA AFL. ER 之 比 为 50/65(V/V) 时 ,可 获得 截留 分 子 量 35-000 KFA; FR SRS LE 5) 35/65 《V/V)， 即 可 获得 截留 分 子 量 23,000 的 孔径 。 随 甲 酰 胺 量 的 增加 , 膜 的 孔径 增 大 。 ae 。 (四 ) 影响 流 率 的 几 个 因素 除了 上 述 膜 的 结构 性 质 起 重要 作用 外 , 流 率 还 受 以 下 因素 影响 : 1. 溶质 的 分 子 性 质 包括 溶质 分 子 大 小 \ 形 状 和 带电 性 质 。 一 般 来 说 ,比重 大 的 纤 维 状 分 子 扩散 性 差 , 对 流 率 影响 较 大 。 在 一 定 压力 下 浓缩 至 一 定 程度 时 ;大 溶质 分 子 很 容 易 在 膜 的 表面 达到 极限 浓度 而 形成 半 固 体 状 的 凝 胶 层 ,使 流 率 达到 极限 水 平 。 而 且 ， 随 着 凝 胶 层 的 不 断 增 厚 ,原先 能 透 过 膜 的 小 分 子 溶 质 和 溶剂 也 受阻 碍 , 流 率 越 来 越 锰 ,最 后 降 到 最 低 点 。 反 之 ,比重 较 小 的 球形 分 子 较 易 扩散 ,在 一 定 压力 下 虽 也 形成 浓度 梯度 ， 但 不 易 形 成 凝 胶 层 ， 随 着 压力 的 潮 加 ， 流 率 也 有 相应 提高 。 2. 溶 质 浓度 “溶液 浓度 对 流 率 有 影响 是 很 易 理 解 的 在 一 定 压力 下 ， favsweteike Rs RRS eS, M—iRkMARKRSB—-EREN RS Ait TM Ft seek i ren TE» AA RZD REE AC PS ee (ANGER SEN el. MAFAD Phish, a eee aa FE PRA DE FI» BRAY TAY ER A Tb 58 El Bs as A i as =). TRGBBAKD TARKEAE. MDDSTARMRRA PARRY » ea AT 将 小 分 子 溶 质 和 盐 类 脱 尽 。 此 法 已 称 透 滤 或 加 压 透 析 ,， 如 图 7-36 He aera A RM 进 样 (a) 保留 液 Nz2 RAR 溶剂 贮存 瓶 超 滤液 《b) 超 滤液 7-36， 透 滤 装 置 示意 图 3. 压力 ”对 于 具有 高 度 扩 散 性 的 溶质 分 子 和 较 稀 的 溶液 , 增 压 能 增加 流 率 。 但 增 压 也 常 加 速 浓度 极 化 , 故 开始 增 压 时 流 率 增加 较 快 , 当 压 力 增 至 一 定 程度 时 ， 流 率 增加 便 减 慢 ,二 者 并 不 成 比例 。 对 于 易 生 成 凝 胶 的 溶质 , 一 旦 形成 凝 胶 层 , ERM te RA 作用 。 因 此 ,对 不 同 溶质 ,应 选择 不 同 的 操作 压力 。 LRH 搅拌 可 以 破坏 深 质 在 膜 表 面 形成 的 浓度 梯度 , 即 加 快 溶质 分 子 的 扩散 , 减 少 浓度 极 化 ,从 而 提高 流 率 。 如 同时 增 压 , 可 大 大 提高 流 率 。 对 于 易 形 成 凝 胶 层 的 溶质 ， 效果 更 显著 。 对 搅拌 产生 的 切 力 较 敏 感 的 大 分 子 (如 酶 和 核酸 ), 必须 注意 控制 搅拌 速度 ， 以 免 破坏 它们 的 活性 。 采用 单程 传送 的 浅 道 系统 的 超 滤 方 法， 有 时 能 避免 这 种 不 恨 影 。214 。 lll 啊 。 5. 温度 ”通常 升 高 温度 可 以 降低 溶液 粘度 及 减少 凝 胶 的 形成 。 温度 升 高 , 溶质 溶 解 度 通常 也 增加 。 故 升温 可 提高 流 率 , 但 温度 过 高 易 使 活性 大 分 子 变 性 。 MUAH 提高 流 率 时 ,对 不 同 的 溶质 需 严 格 地 区 别 对 待 。 6. 其它 溶液 pH、 离 子 强度 及 溶剂 性 质 等 因素 对 访 率 均 有 影响 。 可 以 认为 ， 凡 能 增加 溶质 溶解 度 或 减少 溶质 形成 凝 胶 倾向 的 因素 都 能 增加 超 着 的 流 率 。 (A) 超 滤 的 应 用 1. 乳 清 的 回收 乳 清 是 用 牛奶 生产 干 栈 和 栈 蛋 折 过 程 中 栈 蛋 日 凝固 收获 后 留 下 的 残 液 。 它 含 有 牛奶 中 70 匈 左右 的 营养 成 份 〈 包 括 20 多 RAM, 极为 丰富 的 乳糖 、 维 生 素 及 矿物 质 ), 过 去 往往 作为 废水 弃 去 。 七 十 年 代 初 ， 全 世界 每 年 约 产生 乳 清 500 亿 磅 。 因此 , 乳 清 的 回收 不 仅 有 重大 经 济 意义 ,而 且 涉 及 环保 问题 。 KRABI, 乳 清 处 理 有 很 大 改进 。 如 图 3-37 所 示 , 采 用 一 级 超 滤 一 级 反 活 透 装置 ,每 天 可 处 理 乳 请 二 干 加 伦 ,分 别 将 蛋白 质 及 乳糖 浓缩 回收 ,除去 约 90% Tk HP", 蛋白 质 浓缩 液 乳糖 浓缩 液 BOD; 生物 耗 氧 值 低 BOD 物质 及 水 份 图 7-37” 乳 清 处 理 膜 分 离 法 示意 图 2EMADF REAM ” 酶 .蛋白 质 核 酸 、 多 糖 等 用 超 滤 法 浓缩 的 报道 日 益 增 加 :2 2, 其 中 较 多 用 于 酶 类 。 酶 的 回收 率 可 高 达 90 多 中。 间 时 可 除去 盐 和 低 分 子 杂质 ， 比 活力 有 较 大 提高 ,是 简单 \ 高效、 经 济 \ 快 速 的 浓缩 法 。Wang，D. I. C. 等 人 在 1970 年 报告 了 使 用 UM-10 腊 浓 缩 及 回收 几 种 酶 的 情况 叹 见 表 7-9。 7-9 几 种 酶 UM-10 膜 超 滤 浓 缩 及 回收 率 le 开始 体积 | 最 后 体积 | 体积 浓缩 酶 浓度 《单位 /毫升 7 回收 率 EF) (毫升 ) 倍数 原样 品 浓缩 液 we 液 (%) BK 1800 150 12.3 950 0 29.3 6-47 BS 1000 33 30.3 5.44 0 240) REAR” 1400 310 4.52 18.7 0 91.3 了 胰 蛋 白 酶 1320 290 4.56 14.9 0 76.6 ae BLE 1 ag — TRIG BUC ISTE x 1 2) Be Seem emer e° (2) 对 照样 品 中 47 9% SSL Ee RS HE HE DC HE A ELA HL Eo (3) 此 酶 在 llc 下 过 滤 , 其 它 三 种 酶 在 25—26 过 滤 。 。215。 此 外 ,也 有 人 用 超 滤 法 浓缩 病毒 、 多 糖 ， 从 尿 中 回收 蛋白 质 激素 ”。 用 超 沽 法 浓 绾 地 衣 芽 孢 杆菌 2709 碱 性 蛋白 酶 时 ; 酶 活力 损失 少 ( 和 5%), 浓 缩 倍 数 高 , 约 能 源 5 设 备 简 单 ,还 能 同时 除去 低 分 子 杂 质 和 部 份 色素 ”。 3. 大 分 子 溶质 的 分 级 分 离 与 提纯 蛋白质 、 酶 等 大 分 子 用 一 次 超 庆 法 很 难 达到 分 离 纯化 的 目的 , 需 用 2 一 3 级 超 滤 装 置 , 才能 收效 。 串联 超 滤 装 置 是 根据 截留 不 同 大 小 的 分 子 来 区 分 的 。 第 一 级 装置 选用 的 膜 分 子 量 截 留 值 大 于 第 二 级 , 第 二 级 用 的 膜 分 子 量 截 留 值 大 于 第 三 级 , 其 余 依 此 类 推 。 然后 用 色谱 分 析 法 测定 各 级 超 汪 装置 的 滤 出 该 及 保留 液 中 的 成 份 , 即 可 知 各 级 的 分 离 效果 及 组 份 的 纯度 ”2。 图 7-38 是 牛乳 乳 清 通过 二 种 不 同 超 滤 串 联 装置 (搅拌 型 和 浅 道 型 ) 分 级 分 离 的 色谱 分 析 示 意图 ”。 搅拌 型 浅 道 型 Sephadex G 一 100 膜 分 离 模 式 Sephadex G 一 100 膜 分 离 模式 A RE F DRA c Ae 最 后 超 滤液 图 7-38 和 牛乳 乳 清 用 二 种 超 滤 装 置 分 级 分 离 示意 图 表 7-10 二 种 串联 超 滤 装 置 对 牛乳 乳 清 分 离 的 产量 比较 = Aw et 额定 膜 间 隔 分 子 量 范围 实际 产量 C%) 理论 产量 (92) 搅拌 系统 730,000 50.3 17.6 10 ,000—30,000 PER ge Ea 38.1 2,000—10,000 Meroe ver on 4] <2,000 es ee 40.1 浅 道 系统 >30,000 24.7 13.2 10,000 一 30,000 机 41.5 二 10;000 本 45.2 Blatt, W. F. 比较 了 二 种 超 滤 串 联 装置 对 牛乳 乳 请 分 离 的 理论 和 实际 产量 ， 见 表 7- 10。 从 上 表 可 看 出 ,搅拌 系统 超 滤 中 各 级 分 离 所 得 实际 产量 与 理论 值 相差 较 大 ,而 在 浅 道 * 216。 系统 中 ,所 得 数据 都 比较 接近 理论 值 。 采 用 浅 道 系统 型 串联 装置 分 部 分 离 的 效果 较 好 。 4. 超 滤 分 离 与 酶 反应 中 (或 发 酵 ) 联 用 ”把 超 滤 分 离 与 酶 反应 器 联 用 多 见于 酶 促 分 解 反 应 。 将 大 分 子 底 物 变 成 小 分 子 产物 后 ,被 超 滤 除 去 ,保留 下 来 的 酶 分 子 和 底 物 返回 反 应 器 再 行 反应 ,连续 除去 底 物 。 反 复 进 行 反应 ,结果 大 大 提高 底 物 利 用 率 , 减少 酶 用 量 和 增加 酶 反应 速度 。 超 站 分 离 与 酶 反应 器 联 用 装置 见 示意 图 7-39"”。 这 类 装置 已 广泛 用 于 纤维 素 糖化 、 蛋 白 酶 对 蛋白 质 的 水 解 、 淀 粉 酶 对 淀粉 的 水 解 呈 、 以 及 大 豆 酶 解 产物 的 分 aS. 底 物 浓缩 的 酶 及 底 物 含有 产物 的 滤液 Al7-39 超 着 分 离 与 酶 反应 器 联 用 装置 简 图 图 7-40 超 滤 分 离 与 发 酵 饶 联 用 装置 简 图 同 理 , 超 滤 与 发 酵 联 用 , 见 图 7-40, 可 以 使 超 滤 回收 的 营养 物 继续 供给 细菌 利用 ,而 产物 及 有 毒物 不 断 泪 去 ,以 减少 对 微生物 的 抑制 。 微生物 分 这 至 胞 外 的 大 分 子 产物 在 超 泪 时 被 截留 还 是 透 过 膜 ,主要 决定 于 对 膜 的 选择 。 如 果 超 滤 时 营养 物 的 损失 过 多 ,还 需 适 当 补充 ,以 维持 微生物 正常 生长 环境 。 Sonoyma 和 Wang”) 利用 超 滤 与 发 酵 联 用 装置 连续 培养 深 组 织 梭 菌 ,使 蛋白 酶 分 沁 至 胞 外 ;然后 用 Abcor 的 -HEFA-300 膜 分 离 , 除 去 有 毒 代 谢 物 ,结果 酶 和 菌 体 的 产量 都 高 FRADE o 此 外 ,用 吸附 、 交 联 \ 共 价 键 合 等 方法 可 将 各 种 酶 做 成 单 酶 膜 或 多 酶 膜 ; 已 大 量 用 于 生 化 分 析 及 食品 医药 工业 %。 。2I7。 三 、 电 效 析 和 离子 交换 膜 电 渗析 540 (一 ) 电 渗 析 是 在 半 透 膜 二 侧 加 电极 使 可 透 过 膜 的 带电 物质 彼此 分 开 的 方法 。 可 用 于 大 分 子 溶液 脱盐 纯化 。 此 法 常 因 电流 作用 产生 大 量 的 热 ,需要 附加 冷却 装置 才能 保证 透析 正常 进行 。 此 外 ,通电 时 产生 电 滩 流 ( 即 外 加 电场 使 带电 粒子 与 介质 作 相对 移动 ), 也 常 对 膜 分 离 带 来 ARS. Atk BREED SS LAI SKM BBA Bg 7-419, 容器 中 有 二 块 半 透 膜 隔 成 三 个 室 , 中 心室 放 试 液 , 两 侧 人 eh 室内 装 纯净 溶剂 (一般 为 水 ), 并 分 别 插 人 正 缓冲 液 。。 我 拌 器 “缓冲 液 负电 极 。 通电 后 , 中 心室 内 试 液 的 阳离子 透 过 膜 移 向 阴极 槽 , 阴离子 则 移 向 阳极 槽 。 透 析 开 始 时 , 因 中 心室 内 离子 浓度 大 ,可 用 较 低 电压 ,当中 心室 离子 浓度 很 低 时 ,可 适当 升 高 电压 , 以 缩短 透析 时 间 。 实验 室 电 淆 析 常用 电压 为 200 一 300 伏 , 电 流 为 50 BREAD 用 电 奖 析 法 也 可 分 离 一 些 带 有 电荷 的 生 物 大 分 子 , 如 蛋白 质 和 核酸 等 。 但 具体 操作 时 , 需 经 凝 胶 电 泳 将 样品 初步 分 开 后 ,再 通过 7- 全 电话 析 基 本 装 中 四 电 淘 析 方法 使 所 需 组 份 与 凝 胶 分 离 。 现 举 电 BRED SM DNA 一 例 于 后 ca: E. coli 8021 (pBR322) 加 氧 霉 素 扩 大 培养 后 ,离心 收集 菌 体 。 用 终 浓度 为 2% 重 结 晶 SDS 使 菌 体 裂 解 。 加 等 体积 茶 酚 (水 饱和 并 用 Tris 调 至 pH8.0) kk 体积 氯仿 - 异 成 醇 (24:1) 提取 两 次 ,再 用 等 体积 氧 仿 - 异 戊 醇 (24:1) 提取 两 次 。 在 水 相 中 加 入 二 体 积 NaAc (2M, pH 5.0) 及 二 倍 体积 预 冷 的 无 水 乙醇 沉 证 DNA. 使 用 直径 为 1.4 厘米 的 电泳 管 进行 制备 电泳 ， 每 管 上 样 量 200 微克 DNA， 以 溴 乙 锭 为 DNA 定位 指示 剂 。 电泳 后 切取 发 荧光 的 含 质粒 DNA 的 凝 胶 薄 片 , 放 人 透析 袋 中 ,在 冰 浴 中 电 渗析 3 小 时 ， 电流 0.07 安培 , 在 电场 作用 下 质粒 DNA 与 凝 胶 分 开 ， 进 入 透析 袋 内 的 溶液 中 ， 吸 出 含 pBR322 DNA 的 溶液 即 为 成 品 。 (=) 离子 交换 膜 电 渗析 离子 交换 膜 电 渗 析 器 主要 由 离子 交换 膜 隔 板 , 电 极 及 电 疹 析 池 和 外 接 直流 电源 组 成 。 其 中 离子 交换 膜 最 为 重要 , 它 可 以 选择 透 过 或 阻 留 不 同 的 离子 。 离子 交换 膜 的 选择 透 性 一 方面 决定 于 膜 表面 的 孔隙 度 大 小 ,只 让 小 于 膜 上 孔隙 的 物质 通过 ,大 于 膜 上 的 孔隙 的 物 质 被 阻 留 。 另 一 方面 ,也 决定 于 组 成 膜 的 离子 基 团 ,它们 在 强 电 场 作用 下 对 某 种 离子 所 起 的 吸附 或 排斥 作用 ,能 够 达到 选择 分 离 的 目的 。 如 带 磺 酸 基 团 的 阳 膜 ,在 电场 中 电离 为 带 负电 的 R-SO ， 它 吸引 和 让 阳离子 通过 ,而 对 阴离子 则 起 排斥 作用 。 同样 ， 带 有 季 胺 基 团 的 阴 膜 ,在 电场 中 电离 为 带 正 电荷 的 R-N"(NHs)， 它 只 吸引 和 让 阴离子 通过 ;而 对 限 。 218 。 表 7-11 国外 离子 交换 膜 电 渗 术 应 用 简况 类 BI 试 验 中 i oA Ae 高 纯 水 海 (成 ) 水 淡化 向 蛋白 质 精制 放射 性 废 液 处 理 糖 类 脱盐 if 5 Be 液晶 脱盐 24:9 Ls BBL i AL'S BE PEATE PRK 同位 素 分 离 “海水 浓缩 Hh. 2 EO) BS 纸浆 黑 滚 处 理 i SREB RS 电镀 废 液 中 Ni 和 HSO, 回收 电镀 液 回收 人 造 冀 粘性 废 滚 回收 3 显影 剂 废 液 回收 酸 的 回收 造纸 废 滚 回收 氨 氟 酸 分 离 = ROG SLICE FP ARE BCR He 磷酸 纯化 无 机 和 有 机 药品 制备 | Eh We 食盐 电解 电解 硫酸 钠 电解 PaaS So PE 氧化 虽 肪 族 氧 化 生成 单 烷 基 酸 和 配 Zn-Ni 合金 电镀 还 原 甲 基 丙 烯 酸 聚 合 Fe 还 原 钻 洁 回 收 水 解 [ 酸 碱 制备 2NaCl + Ca(OH), = 2NaOH + CaCl, 2NaCl + (NH,),CO, = Na,CO, + NH,CI 电泳 同 价 离子 分 离 电泳 涂 流 离子 起 排斥 作用 。 现 以 淡化 海水 时 氧化 钠 的 电 活 析 为 例 ,说 明 电 活 析 原理 : 如 图 7-42 所 AN» VFS PARR MPR ACS ASB ITI, AHI PE >. Nat 趋向 阴极 并 SAI HY 交换 而 选择 性 地 透 过 阳 膜 (RR BS A 符号 的 浓缩 室 中 ; CI 趋向 阳极 并 与 阴 膜 上 OH ”交换 而 选择 性 地 透 过 阴 膜 ， 但 被 阳 膜 阻 留 于 有 符号 的 浓缩 室 中 。 于 是 在 有 公 符 号 的 淡化 室 中 ,由 于 溶液 中 NaCl 含量 减少 而 变 痰 ,而 浓缩 室 中 海水 因 NaCl 含量 增加 而 变 为 浓 盐 水 。 各 室 中 淡水 浓 盐 水 分 别 由 不 同 管道 排出 ,就 达到 成 水 淡化 和 浓 盐 水 用 于 制 盐 的 目的 。 实际 操作 时 还 应 附加 预 处 理 设备 , 淡水 再 除 盐 装置 及 浓 盐水 再 循环 处 理 等 。 离子 交换 膜 电 渗 析 主 要 用 于 海水 痰 化 与 制 盐 , 工业 上 脱盐 浓缩 。 在 生化 方面 也 常用 于 蔗糖 \ 柠 檬 酸 和 抗菌 素 等 的 分 离 提 纯 ,注射 用 水 的 制备 ,蛋白 质 与 氨基 酸 的 脱盐 等 只 知 。 六 十 年 代 后 , 离子 交换 膜 电 渗析 用 的 膜 及 各 种 电 渗析 器 装置 日 新 月 异 。 如 日 本 德 山 齐 达 公司 生产 的 离子 交换 膜 就 将 近 十 四 种 , 美国 AMF 公司 、 杜 邦 公 司 、 英 国 的 Permuti 公司 等 也 生产 多 种 型 号 的 离子 交换 膜 。 目前 离子 交换 膜 的 品种 繁多 , 根据 膜 上 所 带 活性 基 团 可 分 为 阳 和 阴 凡 二 大 类 型 。 近 来 按照 不 同 的 分 离 目 的 还 发 展 了 许多 不 同性 能 的 离 “219 。 AYR C~ BABE “Shalala 浓 出 水 吕 -人 多 图 7-42 ”海水 淡化 离子 交换 膜 电 渗析 示意 图 子 交 换 膜 ,如 磷酸 - 羧 酸 歼 合 型 膜 ,吡啶 季 腕 - 羧 酸 两 性 膜 , 用 于 压 盗 (是 一 种 次 析 和 反 次 析 相 结 合 的 新 技术 7 的 镶嵌 型 膜 , 以 及 无 机 离子 交换 膜 等 。 离子 交换 膜 电 渗析 在 国外 的 应 用 情况 见 表 7-11”“"， 近 年 来 , 国内 离子 交换 膜 的 研制 及 电 渗析 的 应 用 ,也 发 展 较 快 ,如 上 海 化 工行 业已 生产 多 种 异 相 膜 , 半 均 相 膜 及 均 相 膜 , 用 于 海水 淡化 ,污水 处 理 , 综 合 回收 等 试验 。5 在 生化 分 离 制备 方面 , LBP ABBE 从 柠檬 酸 发 酵 液 分 离 提纯 柠檬 酸 , 1977 年 经 鉴定 认为 可 以 投产 ””。 2 a ee 【1 1] 一 阿南 功 一 等 编 : 基础 生化 学 实验 法 2， 抽出: 分 离 精制, 丸 善 株式 会 社 (1974) [2] A. 多 别 尔 林 著 : 有 机 化 学 实验 操作 技术 ?化 学 工业 出 版 社 〈19522 [3] 韩 广 甸 \ 赵 树 纬 , 李 述 文 等 编译 : 有 机 制备 化 学 手册 (上 册 ); 石 油 化 学 工业 出 版 社 〈19777 [4] 广东 化 工学 院 工 业 发 酵 专业 委员 会 编 : 工业 微生物 生产 过 程 设 备 ( 上 册 ) 〈19767， 内 部 教材 {5] Graham, T. 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RAHA 结晶 形成 的 条 件 最 主要 的 是 建立 在 溶解 度 改变 的 基础 上 ,因此 找到 了 合适 的 浓度 , 结 量 物 的 分 子 或 离子 便 有 足够 的 相 磁 机 会 ,并 按 一 定 速率 作 定 向 排列 聚集 而 形成 晶体 。 浓 度 太 高 达 过 饱和 状态 时 ,结晶 物 的 分 子 在 溶液 中 聚集 析出 的 速度 太 快 ,超过 这 些 分 子 形成 晶 核 的 速率 , 便 得 不 到 晶体 ,只 获得 一 些 无 定形 固体 微粒 ,或 虽 得 到 一 些 结晶 , 但 共 沉 物 (或 杂质 ) 含 量 很 高 。 相 反 浓 度 太 低 , 样品 溶液 处 于 不 饱和 状态 ， 结晶 形成 的 速率 远 低 于 晶体 溶解 的 速率 ,也 不 能 得 到 结晶 。 因 此 只 有 在 稍稍 过 饱和 的 状态 (或 称 低 过 饱和 状态 ) 下 , 即 形成 结晶 速率 稍 大 于 结晶 溶解 速率 的 情况 下 才能 获得 晶体 。 结 晶 的 大 小 和 均 色 度 和 结晶 的 饱和 度 有 很 大 的 关系 ,获得 良好 的 结晶 一 般 常 控制 在 饱和 区 以 上 、` 过 饱和 区 以 下 的 稳定 区 范围 内 ( 见 图 8-2)。 此 时 ,晶体 附近 的 溶液 浓度 接近 于 饱和 状态 ,而 较 外 层 的 溶液 为 过 饱和 状态 ,利用 这 种 浓度 差 使 外 层 待 结晶 的 溶质 向 晶体 周围 扩散 ,最 后 定向 地 沉积 于 晶体 表面 上 ,使 结晶 逐渐 长 大 。 所 以 , 结晶 开始 时 , 应 使 溶液 处 于 稍稍 过 饱和 状态 以 利于 晶 粒 形成 ;然后 控制 在 稳定 区 范围 内 ,这 时 形成 新 的 晶 核 较 少 , 主 要 使 已 形成 的 结晶 长 大 * 便 可 获得 较 大 的 和 均匀 的 结晶 。 ik sans 在 过 饱和 区 是 新 晶 核 大 量 形成 的 浓 集 区 ， 晶 核 形 成 以 后 没有 一 个 稳定 的 使 晶体 长 大 的 所 谓 “ 养 晶 区 ”, 于 是 只 得 到 一 些 颗粒 很 小 又 不 均匀 的 晶体 。 过 饱和 度 的 大 小 与 晶 核 生 成 的 速度 关系 见 图 8-3, 在 图 中 可 以 看 到 ,过 饱和 越 大 , 晶 核 生成 速度 越 快 ,形成 结晶 的 颗 粒 愈 小 。 晶 粒 过 小 不 仅 影响 分 离 过 滤 上 的 困难 , 而 且 造 成 结晶 产 率 和 质量 下 降 。 如 在 味 精 ( 谷 氨 酸 钠 ) 的 结晶 过 程 中 , 常 保持 溶液 在 64 一 65sc EA, REERS 315~32 度 ， 结 晶 成 长 刚好 在 稳定 区 。 浓 度 过 高 时 ,结晶 液 发 生 混浊 现象 , 表示 新 的 晶 核 大 量 形成 , 此 时 晶 核 形成 的 速度 RAKE 一 一 图 8- 2” 晶体 形成 的 浓度 区 域 图 8-3- 晶 核 形 成 速度 和 过 饱和 度 关 系 示意 图 + 224+ 必须 用 热 的 蒸 溜 水 调节 ,消除 混浊 现象 , 保持 溶液 在 稳定 区 的 浓度 , 方 能 获得 较 大 整齐 的 三 结晶 。 在 晶 核 形成 时 ,如 何 控制 结晶 液 刚 好 在 低 过 饱和 度 状 态 ? 在 工业 大 规模 生产 时 , 常 将 结晶 溶液 浓缩 至 一 定 程度 ,或 加 和 各 种 沉淀 剂 〈 盐 或 有 机 溶剂 ), 至 溶液 出 现 乳 白色 混浊 > 即 认为 低 过 饱和 度 已 到 ,而 放置 结晶 。 这 种 粗略 估计 方法 ,对 于 制备 一 般 试 剂 药品 用 的 生 化 分 子 的 结晶 ,已 可 满足 要 求 , 但 对 于 制备 一 些 供 和 射线 结构 分 析 用 的 大 结晶 《 须 大 于 0.1 mm 直径 )。 按 常规 方程 , 当 样品 发 生 混浊 时 ,实际 已 超过 最 低 的 过 饱和 度 , 此 时 很 难 取得 较 大 的 晶体 ， 必 须 小 心地 测 出 样品 的 盗 解 度 曲线 ,然后 从 中 求 出 最 低 的 过 饱和 度 ;2 或 者 通过 十 分 缓慢 的 蒸发 和 扩散 作用 ，, 使 结晶 液 达 到 低 过 饱和 度 后 , 并 保持 溶液 的 稳定 浓度 ， 才 可 获得 较 大 的 单 唱 体 。 关 于 以 蛋白 质 为 对 象 的 一 些微 量 结晶 方法 本 章 后 面 还 将 进一步 讨论 。 =. BAW 溶剂 对 于 晶体 能 否 形 成 和 晶体 质量 的 影响 十 分 显著 ， 故 找 出 合适 的 溶剂 是 结晶 实验 首先 考虑 的 问题 , 一 个 物质 的 结晶 究竟 选用 什么 溶剂 合适 ? 需要 对 此 物质 某 些 性 质 如 洲 解 度 \ 稳 定性 及 温度 系数 等 进行 预 试验 才能 确定 。 对 于 大 多 数 生 化 小 分 子 来 说 ,水 、 乙醇、 甲醇 \ 丙 酮 . 氧 仿 \` 乙 酸 乙 酯 、. 异 丙 醇 、 本 醇 \ 乙 醚 、N- 甲 基 甲 酰胺 等 溶剂 使 用 较 多 。 尤 其 是 乙醇 ; 既 具 亲 水 性 ,又 具 亲 脂性 ,而 且 价格 便宜 ,安全 无 毒 , 所 以 应 用 得 最 广 。 至 于 蛋 白 质 、 酶 和 核酸 等 大 分 子 使 用 较 多 的 是 硫酸 铵 溶液 .氧化 钠 深 芒 、 磷 酸 缓冲 牙 、Tris 缓冲 液 和 丙 酮 、 乙 醇 等 。 有 时 某 单 一 溶剂 不 能 促使 样品 进行 结晶 , 则 需 考 虑 使 用 混合 溶剂 (但 这 两 种 溶 剂 应 能 相互 混合 )。 操作 时 先 将 样品 用 溶解 度 较 大 的 溶剂 溶解 ,再 缓慢 地 分 次 少量 加 入 对 样品 溶解 度 小 的 溶剂 , 直至 产生 混浊 为 止 , 然 后 放置 或 冷却 即 可 获得 结晶 。 也 可 选用 在 低 沸点 溶剂 中 易 溶 解 ， 在 高 沸点 溶剂 中 难 溶 解 的 高 低 沸 点 二 种 混合 溶剂 。 当 结晶 液 放 置 一 外 时 间 , 低 沸点 溶剂 由 于 慢 慢 蒸 发 掉 而 使 结晶 形成 。 许多 生物 小 分 子 结晶 使 用 的 混合 溶 - 剂 有 水 一 忆 醇 , 醇 一 醚 ,水 一 丙酮 ,石油 醚 一 丙酮 等 。 选择 结晶 溶剂 常 注 意 如 下 几 个 条 件 : C1) 所 用 溶剂 不 能 和 结晶 物质 发 生 任何 化 学 反应 。 (2) 选用 的 溶剂 应 对 结晶 物质 有 较 高 的 温度 系数 ， 以 便利 用 温度 的 变化 达到 结晶 的 目的 。 (3) 选用 的 溶剂 应 对 杂质 有 较 大 的 溶解 度 ， 或 在 不 同 的 温度 下 结 虽 物质 与 杂质 在 浴 剂 中 应 有 溶解 度 的 差别 。 (4) 所 用 溶剂 如 为 易 挥 发 的 有 机 溶剂 时 ,应 考虑 操作 方便 ,安全 。 工 业 生 产 上 还 考虑 及 成 本 高 低 , 是 否 容易 回收 等 。 当然 以 上 条 件 并 不 是 对 每 一 种 物质 都 是 符合 的 。 事物 的 矛盾 总 有 主 次 之 分 , 对 于 未 知 物 的 结晶 溶剂 的 选择 主要 为 了 能 获得 结晶 , 重 结晶 时 才 考 虑 溶剂 其 他 方面 的 性 能 。 对 于 具有 生理 活性 的 生物 大 分 子 , 溶 剂 对 分 子 活性 的 影响 〈《 即 生物 大 分 子 的 稳定 性 ) 常 是 最 先 孝 虑 的 问题 ,一 般 选 用 温和 的 条 件 下 缓慢 地 结晶 以 及 反复 多 次 地 进行 重 结晶 ,而 不 宜 使 用 强烈 的 条 件 。 。225 « 第 三 节 。 晶 核 形成 及 晶体 生长 的 影响 因素 一 、 唱 核 的 形成 及 诱导 方法 晶 核 的 形成 一 般 方法 是 将 移 和 溶剂 冷却 、 蒸 发 除去 部 分 溶剂 或 者 加 入 沉淀 剂 等 ,使 溶 MAD OARA, 则 其 中 过 饱和 部 分 的 溶质 便 渐 渐 析 出 晶 核 。 MAAR Cees 子 ) 自 身 定 向 聚集 形成 的 晶 核 , 叫 作 * 同 相 结晶 化 ,这 在 低 过 饱和 的 样品 溶液 中 很 难 发 村 ， 需要 较 高 过 饱和 度 或 放置 较 长 时 间 才能 产生 结晶 核 , 故 在 工业 生产 及 实验 常规 结晶 时 ， 通 常 待 溶 液 达 到 稍 过 饱和 状态 后 , 加 入 同 种 晶 核 ,或 某 些 异种 固体 微粒 ,使 形成 二 相交 界面 诱导 晶 核 的 形成 ,这 叫 作 *“ 异 相 结 晶 化 ”。 在 异 相 结晶 化 中 加 晶 种 诱导 结晶 方法 是 最 常用 的 方法 ,此 法 如 掌握 适当 ,不 仅 缩短 结晶 时 间 , 而 且 所 得 的 晶体 较 大 而 且 均 匀 整 齐 。 添加 晶 种 诱导 晶 核 形成 的 常用 方法 大 致 如 下 名 : (1) 如 有 现成 晶体 ,可 取 少 量 研 碎 后 ,加 入 少量 溶剂 ,离心 除去 大 的 颗粒 ,再 稀释 至 一 定 浓 度 ( 稍 稍 过 饱和 ) ;使 悬浮 液 中 具有 很 多 小 的 晶 核 , 然后 倒 进 待 结 晶 的 溶 洲 中 用 玻 棒 轻 轻 搅 拌 ,放置 一 段 时 间 后 即 有 结晶 析出 。 (2) 如 果 没 有 现成 的 晶体 , 可 取 1 一 2 滴 待 结晶 溶液 置 表面 玻璃 阵 上 ,缓慢 燕 发 除去 溶剂 ,可 获得 少量 晶体 。 或 者 取 少 量 待 结晶 溶液 置 于 一 试管 中 ,旋转 试管 使 溶液 在 管 壁 上 形成 薄膜 ,使 溶剂 蒸发 至 一 定 程度 后 ,冷却 试管 , 管 壁 上 即 可 形成 一 层 结 晶 。 ERM 试管 壁 上 的 结晶 ,用 玻 棒 刊 下 沾 取 少 量 接种 到 待 结晶 溶液 中 , 轻 轻 搅拌 ， 并 放置 一 定时 间 ， 即 有 结晶 的 形成 。 对 以 光学 异 构 体 进行 诱导 结晶 时 ,加 和 的 晶 种 须根 据 分 离 晶体 性 质 而 定 。 如 加 大 光 学 性 质 相 同 的 晶体 , 便 优先 诱导 形成 同 种 异 构 物 的 结晶 。 此 外 ,有 些 蛋 白质 和 酶 结晶 时 , 常 要 求 加 入 某 种 金属 离子 才能 形成 晶 核 。 int AAAEANER. ENACHER RT RLERREM UAT DRS 实验 室 结晶 操作 时 ， 人 们 较 喜 欢 使 用 玻璃 棒 轻 轻 刮 擦 玻璃 容器 的 内 壁 ， 刮 擦 时 产生 玻璃 微粒 可 作为 异种 的 晶 核 。 另 玻璃 棒 沾 有 溶液 后 暴露 于 空气 部 分 ， 很 易 蒸 发 形成 一 层 薄 薄 的 结晶 ,再 浸 人 溶液 中 便 成 为 同 种 晶 核 。 同时 用 玻璃 边 刮 掠 边 缓慢 地 搅动 也 可 以 帮 助 溶质 分 子 在 晶 核 上 定向 排列 ,促成 晶体 的 生长 。 最 后 应 该 指出 ,对 加 入 固体 微粒 诱导 形成 晶 核 的 方法 , 需 看 结晶 物质 的 用 途 而 有 选择 地 使 用 。 如 要 求 纯度 很 高 或 用 X 射线 衍射 结构 分 析 的 晶体 ,结晶 时 异种 晶体 、 玻 璃 微粒 、 尘埃 ,气泡 ,变性 生物 大 分 子 均 应 尽量 除去 。 制 得 的 晶体 的 纯度 才 合 乎 要 求 。 二 、 影 啊 结晶 生成 的 因素 结晶 的 生成 除 与 深 液 亿 和 度 和 溶剂 性 质 等 因素 直接 有 关外 ,还 受 下 列 因素 的 影响 : (一 ) 温度 温度 对 咨 解 度 的 影响 是 人 们 所 热 知 的 ,许多 物质 在 温度 升 高 时 , 溶解 度 升 高 ; 温度 降 es 276+ (RES ,溶解 度 也 随 之 减少 ,但 也 有 例外 。 故 许多 耐 热 小 分 子 物质 一 般 采 用 高 温 溶 解 , 缓慢 冷却 结晶 的 方法 。 冷 却 的 速度 及 冷却 的 温度 直接 影响 结晶 效果 ， 冷 却 太 快 引起 溶液 突然 过 饱和 ，, 易 形成 大 量 结晶 微粒 ,甚至 形成 无 定形 况 淀 。 冷 却 的 温度 太 低 ,溶液 粘度 增加 ,也 会 干扰 分 子 定向 排列 , 不 利于 结晶 的 形成 。 温 度 不 同 , 同一 物质 其 结晶 形态 及 结晶 大 小 ， 质量 也 有 很 大 差别 。 利用 温度 差 方 法 对 生物 大 分 子 进行 结晶 时 ,更 需 注 意 掌握 结晶 的 条 件 , 各 种 蛋白 质 的 结晶 对 刘 度 要 求 有 很 大 的 不 同 ， 如 触 珠 蛋白 在 高 盐 浓 度 下 常 需要 比 室温 稍 高 的 温度 才能 结晶 ， 而 血清 清 蛋白 则 需 较 低温 度 下 长 期 存放 才能 结晶 ”"。 所 以 很 多 生化 大 分 子 结晶 上 All FA in BEAR (CAS FE REE ERIE, RARE AME, 不 同 于 一 些 有 机 小 分 子 物质 。 生 物 大 分 子 整个 分 离 纯化 过 程 , 包 括 结晶 在 内 ,通常 要 求 在 低温 或 不 太 高 温度 下 进行 。 低 温 有 利于 保护 生物 活性 ,尤其 是 使 用 有 机 溶剂 进行 结晶 时 ,要 求 温度 更 低 。 否 则 由 于 有 机 溶剂 作用 引起 蛋白 质变 性 就 无 法 形成 结晶 。 (=) pH pH AW TAMEAROTHNTR EN, 是 影响 溶质 分 子 溶 解 度 的 一 个 重要 因 素 。 在 一 般 情 况 下 ,结晶 溶液 所 选用 的 pH 值 与 沉淀 大 致 相同 。 蛋白 质 、 酶 等 大 分 子 结 晶 的 pH 多 选 在 该 分 子 的 等 电 点 附近 。 如 果 结 晶 时 间 较 长 并 希望 得 到 较 大 的 结晶 时 ， pH 值 可 选择 离 等 电 点 远 一 些 , 但 必须 保证 这 些 分 子 的 生物 活性 不 受到 损害 。 高 野 常 让 、 森 本 英 树 等 对 细胞 色素 <【〈 和 氧化 型 ) 的 结晶 条 件 做 了 一 系列 研究 22。 细胞 色素 < 浓度 从 0.17% 25.0% 结晶 溶液 所 选用 的 pH 从 5.0、6.0、6.6、7.0、7.6 至 8.0, i Be ta AE (%)M 67% 2 85% 范围 ,实验 结果 表明 ,细胞 色素 < (氧化 型 ) 结 晶 时 最 佳 条 件 为 : 样品 浓度 为 1% pH6.0 左右 生成 的 结晶 最 佳 。 细 胞 色素 c (氧化 型 ) 对 pH 值 范围 要 求 很 罕 ， 超过 pH6.6 或 不 到 5.0, 虽然 增 大 细胞 色素 e 的 浓度 ， 也 得 不 到 结晶 。 当然 对 不 同 蛋 白 质 及 生化 物质 结晶 时 所 要 求 pH 范围 宽 罕 不 一 , 当 视 具体 情况 而 定 。 (=) 结晶 的 时 间 唱 核 形成 后 ,在 晶 核 表面 即 密集 着 大 量 待 结晶 的 溶质 ,这 些 待 结晶 溶质 先 铺 满 一 层 唱 面 后 才 开 始 铺 第 二 层 晶 面 ,最 后 得 到 内 部 十 分 整齐 排列 的 晶体 。 结晶 的 速度 以 单位 时 间 内 在 单位 晶体 表面 上 所 结晶 的 量 来 表示 。 当 结晶 速度 为 一 定 时 ,单位 时 间 内 总 结晶 量 与 结晶 总 表面 积 成 正比 。 一 定 重 量 的 结晶 所 含 晶体 数目 愈 多 , 则 总 面积 愈 大 ,单位 时 间 内 总 的 结晶 量 也 愈 大 。 也 就 是 说 生成 晶体 数量 很 多 , 但 颗粒 较 小 。 所 以 结晶 速度 太 快 ,不 仅 结晶 粒 小 , 而 且 常 常 含 杂质 量 多 。 因 为 在 重量 相同 的 条 件 下 ,小 晶 体 的 巨大 的 总 表面 积 对 杂质 吸附 的 机 会 要 比 大 晶体 多 。 故 大 的 晶体 总 比 小 的 晶体 纯净 。 蛋白 质 \ 酶 等 生物 大 分 子 结晶 时 ,由 于 分 子 内 有 着 许多 功能 团 和 活性 部 位 , 其 结晶 的 形成 过 程 也 复杂 得 多 。 简 单 的 无 机 或 有 机 分 子 形成 晶 核 时 需要 几 十 个 甚至 几 百 个 离子 或 分 子 组 成 。 但 蛋白 质 分 子 形成 晶 核 时 ,只 有 很 少 几 个 分 子 即 可 。 不 过 这 几 个 分 子 整 齐 排 列 成 唱 核 时 , 比 几 十 个 几 百 个 小 分 子 \ 离 子 所 费时 间 要 多 得 多 。 所 以 蛋白 质 \ 酶 、 核 酸 等 生 物 大 分 子 形成 结晶 常 需要 较 长 时 间 , 如 Bernal 和 Crowfoot 在 1934 年 制备 用 于 X 射线 衍射 的 胃 和 蛋白 酶 结晶 花 了 几 个 月 才 完 成 。 现 在 ,由 于 方法 的 进步 ,结晶 一 个 生物 大 分 子 时 间 比 。227。 以 往 少 得 多 了 ， 如 最 近 闻 栋 材 等 用 微量 静 置 法 , 在 柠檬 酸 缓 冲 臣 中 , 培养 出 可 供 和 射线 结 构 分 析 用 的 B 链 NH 端 工 -蛋氨酸 牛 胰 岛 素 单 晶 ， 晶 体 大 小 可 达 1.0X1.0X10mm， 外 形 为 正 棱 十 二 面体 ,只 用 了 四 周 时 间 色 , 当然 不 同 物 质 或 不 同 实验 要 求 所 需要 的 结晶 时 间 长 短 不 同 。 但 和 欲 得 到 纯净 ;整齐 的 大 结晶 体 都 必需 一 定 结晶 时 间 。 C(O) 搅拌 搅拌 主要 使 晶体 与 母液 均匀 地 接触 ,搅拌 的 快慢 , 对 晶体 大 小 和 均匀 度 有 一 定 影 响 搅 太 剧 烈 会 损坏 晶体 并 影响 晶体 的 生长 。 搅拌 速度 太 慢 ， 不 能 保持 整个 结晶 器 中 低 过 饱 和 度 的 恒定 ,甚至 使 大 部 分 晶体 颗粒 都 积 沉 在 容器 底部 ,晶体 生 长 不 均匀 ,一 般 工 业 大 生 产 所 设计 的 搅拌 结晶 装置 ,各 种 搅拌 器 的 搅拌 转 数 多 以 5 一 15 转 / 分 为 宜 。 第 四 节 ”结晶 衍生 物 及 重 结晶 己 ?] 生物 体内 某 些 组 份 ,其 游离 状态 很 难 形成 结晶 ,可 考虑 先 制 成 结晶 衍生 物 ， 然 后 用 其 他 方法 复原 。 例 如 有 机 酸 类 与 钙 、 钾 、 钠 成 盐 , 某 些 生物 碱 及 具有 碱 性 基 团 的 胺 类 与 有 机 酸 或 无 机 酸 成 盐 , 均 可 获得 很 好 结晶 衍生 物 , 然 后 通过 适当 方法 使 之 复原 。 有 些 生物 大 分 子 的 结晶 ,也 可 以 先 通 过 形成 无 活性 的 结晶 衍生 物 , 如 酵母 烯 醇化 酶 和 木瓜 蛋 自 酶 与 汞 结 合生 成 无 活性 的 落 炳 醇化 酶 和 未 木瓜 蛋 昌 酶 结晶 衍生 物 ， 再 经 透析 除去 汞 。 便 可 获得 活 EAS ib BE CBSA AR JI Sz Bo : 重 结晶 是 生化 制备 最 后 阶段 常用 的 一 种 精制 方法 , 当 粗 结晶 获得 后 ,再 结晶 则 可 得 到 更 纯 的 产物 。 重 结晶 时 宜 选 用 对 制备 物 比 较 难 咨 而 对 杂质 较 易 溶解 的 咨 剂 条 件 , 有 时 还 需要 用 二 种 不 同 溶剂 分 别 除 去 一 些 彼此 性 质 相 近 的 杂质 和 共 这 组 份 。 并 尽 可 能 利用 退 度 差 及 其 他 改变 溶解 度 的 因素 ,使 通过 重 结晶 获得 较 纯 的 晶体 。 如 粗 结晶 中 含有 两 种 以 上 的 成 份 ,它们 在 咨 剂 条 件 下 咨 解 度 存 在 差别 ,常用 分 步 结晶 法 使 之 分 离 。 分 步 结晶 时 ，, 一 般 将 粗 晶 中 含量 最 多 的 成 份 , 通过 溶剂 选择 及 温度 差 方法 。 使 之 首先 分 离 出 来 ,然后 再 把 留 在 母液 中 其 他 成 份 逐 个 地 处 理 分 开 。 分 步 结晶 的 方法 如 图 8-4 所 示 : 粗 结 晶 (十 溶剂 ) A \ 95 fay 1 EER 1 (十 溶剂 ) Pa \ vw Na 结晶 1A BRIA+AR2 BR 《十 溶剂 ) NT N HK 2A 十 结晶 3 BR a 1B Bb 1B+45 84 2B 图 8-4 三 角形 分 步 重 结晶 示意 图 。228。 实验 操作 时 , 先 将 粗 结晶 咨 于 少量 选 好 的 盗 剂 中 , 并 经 一 定 操作 后 , 使 达 稍 过 饱和 状 态 , 放 置 后 得 结晶 1。 离心 或 过 滤 后 与 母液 1 OT. 结晶 工 再 在 新 鲜 的 溶剂 中 重 结晶 ， 得 结晶 1A MBE 1A。 再 把 上 一 步 得 到 的 母液 1 浓缩 使 之 析出 结晶 2 和 母 滚 2 ， 然 后 再 使 结晶 2 与 母液 工 合并 再 结晶 ,得 结晶 2A 与 母液 2A。 如 此 交互 进行 再 结晶 ,在 某 一 溶剂 系统 中 溶解 度 低 的 一 方 得 近似 单一 成 份 的 结晶 物质 ， 而 在 另 一 方 的 母液 中 含有 洲 解 度 高 的 物质 ,最 后 通过 鉴定 可 分 别 获得 不 同 组 份 的 晶体 。 | 物质 经 过 结晶 与 重 结晶 后 ,所 得 的 晶体 虽然 纯度 有 很 大 的 提高 ,但 还 不 能 说 已 经 达到 十 分 纯 的 程度 了 。 有 时 须 经 多 次 重 结晶 ,直至 恒定 状态 ,并 通过 各 种 方法 的 鉴定 才能 判断 晶体 的 纯度 情况 。 鉴定 量 体 纯 度 和 鉴定 固态 或 液态 生化 物质 纯度 的 方法 基本 相同 , 但 结 晶体 常 可 从 外 形 观 察 晶 形 是 否 一 致 及 色泽 是 否 均匀 加 以 判断 ， 另 外 还 可 以 从 下 面 玫 方面 鉴定 其 纯度 : 1. 熔点 及 熔 距 测定 是 否 符合 规定 范围 。 2: 层 析 \ 电 泳 的 均一 性 的 鉴定 。 3. 光 学 活性 的 物质 的 旋光 测定 及 其 它 光 谱 法 鉴定 。 4 EDK RADA ERSS ER 2,3 二 点 测定 方法 外 , 还 可 进行 生物 活性 Wes 以 上 分 析 工 作 均 以 标准 品 为 对 照 , 以 判断 其 相对 “纯度 ”。 第 五 节 ”结晶 的 一 般 方法 在 工业 上 ,结晶 的 方法 在 原理 寺 常 分 为 两 大 类 ， 第 一 类 是 除去 一 部 分 溶剂 , 如 蒸发 浓 缩 使 咨 液 产 生 过 饱和 状态 而 析出 结晶 。 第 二 类 是 不 除去 溶剂 ,而 用 直接 加 入 沉淀 剂 及 降 低温 度 等 方法 ,使 盗 滚 达到 饱和 状态 而 析出 结晶 。 实际 上 策 是 两 者 结合 使 用 较 多 。 EX 验 室 进 行 一 些 生化 组 份 结晶 可 细 分 为 下 列 几 种 方法 : 〈1) 盐 析 法 : 主要 用 于 大 分 子 如 蛋 白质 , 酶 、 多 肽 等 物质 的 结晶 。 因 为 这 些 大 分 子 不 耐 热 , 对 pH 变化 及 许多 有 机 溶剂 的 使 用 均 十 分 敏感 , 而 使 用 中 性 盐 作 为 沉淀 剂 , 降低 这 些 物质 的 咨 解 度 而 产生 结晶 * 不仅 安全 而 操作 简便 。 盐 析 结 量 法 和 本 书 第 三 章 所 讨论 的 盐 析 沉淀 法 原理 相同 ,并 按照 加 盐 的 方 式 不 同 而 分 为 加 固体 盐 法 ,加 饱和 盐 溶 液 法 和 透析 扩散 法 。22 有 机 溶剂 结晶 法 :此 法 较 常 用 于 一 些小 分 子 物 质 的 结晶 ,如 氢 基 酸 、 核 音 酸 类 等 。 固 醇 类 在 有 机 溶剂 中 也 很 易 获得 结 晶 。 如 用 一 些 低 极 性 溶剂 提取 固 醇 类 时 ; 丁 炎 常 被 皂 化 生成 水 溶性 酯 肪 酸 钠 盐 和 甘油 , 固 醇 类 存在 于 中 性 不 皂 化 部 分 。 此 时 再 用 有 机 溶剂 把 固 醇 抽 提 于 甲醇 或 丙酮 中 , 浓缩 后 很 快 形成 白色 鳞片 状 结晶 析出 。 某 些 蛋白 质 也 可 以 在 稀 的 有 机 溶剂 中 进行 结晶 , 但 常 保持 比较 低 的 温度 以 防止 蛋白 质 的 变性 。(3) 等 电 点 结晶 法 : SATE ED OR 它 : 如 利用 温度 差 法 ,加 和 人 金属 离子 法 等 。 现 以 上 海 东 风 生 化 试剂 三 所 提供 资料 为 主 ””， 并 结合 国内 一 些 生产 单位 近年 来 在 生产 及 实验 中 应 用 的 二 些 结晶 方法 ,举例 如 下 : (—) 盐 析 法 : Lire abe Bl: APRA SSR AE ae 229 100 区 干 面包 酵母 经 磷酸 缓冲 让 提 取 , 热 变性 除 杂 蛋白 ,用 各 种 方法 纯化 至 一 定 程 度 后 ,用 冷 丙 酮 沉淀 ,得 酵母 醇 脱 氨 粗 酶 ,沉淀 悬 译 于 50 2H a 0.01% AAA 0.001M 半 胱 氨 酸 溶液 中 。 对 3 升 0.001M 磷酸 缓冲 液 (PH7.5) 透析 sy, BORA EE 100 毫升 上 清 液 中 缓慢 加 入 粉末 硫酸 贸 36 克 ， 边 加 边 搅拌 ， 在 0"c 下 放置 30 分 钟 后 离 Do 沉淀 溶 于 20 毫 升 蒸馏 水 中 ,再 加 入 4 Fe RRA A Lim IA 4 ce te 末 ( 缓 慢 地 在 几 个 钟头 内 加 完 )。 此 时 溶液 呈 微 混浊 状 , 冰 箱 放置 直至 结晶 完全 。 2. 加 饱和 盐 溶 液 的 方法 Pli: 牛 胰 核糖 核酸 酶 的 结晶 经 纯化 后 的 牛 胰 核糖 核酸 酶 , 用 70% 饱和 硫酸 铵 沉淀 所 得 的 牛 胰 核糖 核酸 酶 恶 饼 1 we MT 1 毫升 水 中 ,稀释 至 2H. Bis MA HMM RBRE HUE, Kia jl IN NaOH, 使 pH 2 4.6,20C REI Am. AniRKKEU SN OIE, KMEANE 3—4 天 后 能 转化 成 晶体 。 若 沉淀 过 多 ,并 不 变 成 晶体 ,可 逐 滴 加 入 水 促使 转 成 结晶 。3 一 4 天 后 结晶 完全 ,得 针 状 晶体 。 例 2: 溶菌 酶 的 结晶 初步 纯化 后 的 400 毫克 溶菌 酶 溶解 在 5 毫升 0.04M pH 4.7 KARERBA Mm, Blea 拌 5 分 钟 (避免 出 现 泡沫 ) 使 完全 溶解 。 后 慢 加 入 5 毫升 10%(W/V) 氧化 钠 溶液 ， 边 加 边 搅拌 ,5 分 钟 内 加 完 , 过 滤 。 滤 流转 到 一 个 塑料 容器 中 ,室温 下 放置 2 天 后 结晶 析出 。 3. 透析 法 例 : 羊 胰 蛋 白 酶 结晶 盐 析 法 获得 羊 胰 蛋白 酶 粗 品 ， 溶 于 0.4M、pIH9 硼酸 缓冲 深 中， 过滤。 滤液 加 入 等 量 “Sm” (04M 硼酸 缓冲 液 与 等 体积 饱和 硫酸 镁 混合 ， 以 饱和 碳酸 钾 调 ,PH8.0), 装 入 透析 袋 内 ,于 0~5%c 对 上 述 结晶 透析 波 透 析 ， 每 天 换 结 晶 透 析 锌 一 次 ,3 一 4 天 后 出 现 结晶 , 7 天 内 结晶 完全 。 (=) 用 有 机 溶剂 结晶 法 1. 直接 加 有 机 溶剂 结晶 的 方法 Gli: 丙 氨 酸 的 结晶 # 从 层 析 柱 上 收集 已 达 低层 析 纯 的 丙 氨 酸 溶液 ,合并 后 减 压 浓缩 至 体积 , 趁 热 缓慢 地 加 入 两 倍 体积 热 的 95% 乙醇 ,结晶 逐渐 析出 。 冷 却 放 置 过 夜 , 使 结晶 完全 。 例 2 : 麦 李 糖 的 结晶 米 TAM 80% 乙醇 搅拌 抽 提 ,上 清流 浓缩 除去 大 部 分 乙醇 ,后 用 水 稀释 ,依次 上 阳离子 和 阴离子 交换 树脂 柱 。 从 交换 柱 下 来 的 糖 芒 浓 缩 至 比重 1.35 EA. BABATLA. HA 后 加 入 等 体积 的 浓 乙 醇 , 边 加 边 搅拌 ,并 加 和 人 少量 晶 种 。 放 置 半 个 月 以 上 ,结晶 完全 。 糖 流 浓 缩 时 ,必须 控制 合适 的 浓度 , 太 浓 不 易 结晶 ; 即 使 结晶 ,晶体 质量 也 很 差 。 过 稀 时 ,结晶 不 完全 。 例 3 : TBAWAM* 5 克 粗 的 赤 霉 素 加 500 毫升 乙酸 乙 酯 加 热 回 流 半 小 时 ， 大 部 分 溶解 后 , 脱色 ,过滤 ee EEA 1250 毫升 石油 酸 , 即 生成 赤 霉 素 结晶 。 « 230° 2. 利用 挥发 性 溶剂 蒸发 结晶 方法 *# 例 工 1- 三 甲 胺 -5- 蔡 磺 酰 氧 的 结晶 米 1= 三 甲 胺 -5- 茶 磺 酸 和 五 氧化 磷 混 研 , 后 袖 人 冰 水 中 。 油 状 物 用 乙酸 乙 酯 抽 提 。 抽 提 液 用 水 洗 3 一 4 次 ,用 无 水 氯 化 钙 干 燥 1 一 2 KW. WRF 40°C 水 浴 中 减 压 浓缩 至 于 ， 得 1- 二 甲 胺 -5- 蔡 磺 酰 氧 粗 结晶 。 粗 结晶 用 石 视 醚 溶解 , 过 滤 。 滤 小 在 30°C KIB MEU 缩 至 干 , 得 橙色 1- 二 甲 胺 -5- 茶 磺 酰 氯 结晶。 例 2 : 麦角 固 醇 的 结晶 及 重 结晶 干 酵 母 粉 以 82 一 84 匈 乙醇 搅拌 抽 提 18 一 24 小 时 。 蒸汽 加 热 到 70—75°C 保温 3 小 NOB 30"c Fit. BARE IK. WE. BRAMMER ERD, I 5—10% 的 水 溶解 ,再 加 3 一 5 倍 体积 的 乙醚 ,剧烈 搅拌 2 一 3 小 时 ， 静 置 16 一 20 小 时 ,吸出 上 清 液 于 一 5 反 冰箱 中 放置 一 天 后 析出 结晶 。 粗 结晶 滤 集 后 加 10 倍 量 的 醚 酮 混合 小 ， 在 50 一 54sC 隔 层 水 浴 中 保温 30 一 40 分 钟 (间断 搅拌 ) 静 置 ， 后 吸出 上 清流 于 一 5 下 放置 过 夜 ， 得 白色 针 状 结晶 。 (三 ) 等 电 点 结晶 法 例 : 乙酰 -DL- 色 氨 酸 的 重 结晶 * 2.5 公斤 粗 乙酰 -DL- 色 氨 酸 加 1.2 一 1.3 立 升 5N 气 氧 化 钠 深 解 。40 克 活 性 炭 脱色 后 EHR. WRWEAE 10°C 以 下 用 冰 栈 酸 调 pH3 ， 缓 慢 搅拌 即 逐 渐 出 现 大 量 结晶 。 (四 ) 利用 温度 差 结晶 法 鲍 ; 葡萄 糖 -1- 磷 酸 饥 盐 的 重 结晶 葡萄 精 -1- 磷 酸 饥 盐 的 粗 结晶 溶 于 20 倍 体积 的 0.05N 盐酸 中 ,过滤 除 去 不 溶 物 。 清 液 在 80°C 水 浴 中 加 热 到 60—65°C, AFH IN 氢气 化 钠 调 pH7.0， 乘 热 过 滤 除 去 无 机 盐 沉淀 5 清 液 在 4 < 冰箱 中 放置 24 小 时 ,得 葡萄 贸 -1- 磷 酸 负 盐 的 片 状 结晶 。 (五 ) 加 人 金属 离子 结晶 法 例 : 铁 蛋 白 的 结晶 法 狗 肝 的 水 抽 提 液 加 硫酸 铁 至 50% 饱和 度 ， 沉 淀 后 将 沉淀 再 溶 于 少量 蒸馏 水 中 。 每 100 BHBRABRMA 5 克 固 体 hi. 冰箱 放置 过 夜 ， 得 红 褐 色 凌 形 含 锅 的 铁 蛋 白 结 EF o (CALA * SSALBRRAAN AMA RE IRA * 者 摘自 上 海 生 化 制 A)» LAMA) ROE HA) WAP LAME) 第 六 节 ” 有 关 蛋 白质 结晶 的 几 项 技术 一 、 抽 提 结 晶 技术 这 是 _Jakoby 介绍 的 一 个 比较 成 功 的 蛋白 质 用 不 同 浓度 硫酸 铵 抽 提 结晶 的 方法 上 。 浑 2 231 。 蛋 曰 质 被 提纯 至 一 定 纯度 ,经 浓缩 至 每 毫升 含 蛋白 质量 1 一 2 毫克 后 ,加 大足 量 固体 硫酸 BHR ARI. 然后 用 硫酸 贸 由 高 到 低 的 浓度 在 0 %C 附 近 进行 抽 提 ， 按照 蛋白 质 在 硫 坝 铵 中 低温 咨 解 度 大 ,角度 逐渐 升 高 ,溶解度 反而 减少 的 规律 , 将 低温 抽 提 的 蛋白 质 溶液 置 室温 中 即 可 析出 结晶 。 在 分 步 抽 提 中 ,溶解 在 高 浓度 硫酸 铁 中 的 蛋白 质 首先 被 抽 提 ,然后 按 各 种 蛋白 质 在 不 同 盐 浓 度 下 的 盗 解 度 差 别 而 彼此 分 离 。 具体 实验 时 , HBO RAR ARN RRA. MBEAN RR 盐 析 沉淀 范围 在 45— 60% 饱和 度 之 间 ， 选 用 硫酸 签 抽 提 的 饱和 度 依 次 为 653 61,58 和 52%. 如 果 盐 析 沉 淀 范围 为 25 一 35 锡 饱和 度 之 间 ， 则 选用 硫酸 匀 抽 提 的 饱和 度 依次 为 38、36、34 fl 32%. 如 在 实验 中 发 现 所 用 硫酸 和 欠 银 度 梯 度 太 高 或 太 低 ， 可 按 实际 情况 加 以 调整 ,直至 增 减 到 所 需 提 纯 组 份 产 生 结晶 为 止 。 OR. (Kine MRE SS ia IL 小 时 或 几 天 以 后 即 可 出 现 结晶 。 表 8-1 是 一 些 蛋白 质 抽 提 盐 浓度 及 结晶 情况 ”6 Jakoby 枝 已 十 分 成 功 地 抽 提 结晶 了 一 百 多 种 酶 蛋白 ， 晶 体 轴 长 一 般 为 1 朋 微 米 5 最 大 可 达 50 微米 ,可 供 和 射线 分 析 使 用 。 另 外 ， 此 法 对 分 离 纯化 蛋 白 质 也 是 十 分 有 用 的 技 术 。 现 以 微生物 研究 所 用 此 法 抽 提 结晶 红 曲 霉 葡 萄 糖 淀 粉 酶 为 例 , RP AF: 红 曲 霉 As3，978 的 变异 株 As 3.2199 菌株 生产 的 葡萄 糖 证 粉 酶 经 过 抽 提 ,硫酸 冬 《70% 饱和 度 ) 盐 析 沉 证 ，Sephadex G25 凝 胶 柱 过 滤 脱 盐 ， 后 上 DEAE- 纤 维 素 柱 。 所 得 酶 浓缩 液 对 蒸馏 水 透析 除 盐 ,在 冰 浴 中 慢 慢 加 入 预先 磨 细 的 分 析 纯 硫酸 贸 达 饱和 ，, 放 冰箱 中 过 夜 。 然 后 0 *c 下 离心 , FELAK. 和 根据 预先 所 作 硫 酸 贸 从 低 至 高 浓度 的 分 步 抽 提 试验 结果 ,选用 饱和 度 为 60、56、52、50% WY MMs 由 高 到 低 浓度 地 依次 进行 抽 提 。 每 次 抽 提 后 ,将 抽 提 液 放 人 冰 浴 中 20 一 30 分 钟 。 然后 在 0 CHL (12,000 转 / 分 ) 20 DHF, 表 8-1 一 些 蛋白 质 抽 提 结 晶 的 条 件 溶液 we 盐 浓度 结晶 蛋 白 质 分 子 量 缓冲 溶液 (mM) pH 添加 物 | (Ft AH) aig (%) 甲状 腺 球 蛋 白 660,000 一 一 1% NaCl. 47339537 70 WR ZE TPH 25% 甘油 十 st St 200,000 Heal 50mM2,3— 3% 555921547 543 <30 (50mM) 1 3 Tris 缓冲 液 50mM #4 ) BEAL BB ARM =3 at 55545540535 50 (40mM) Ce eB rhe 30mM BE 羟基 两 二 酸 半 醛 还 原 酶 104,000 7.0 55545540535 75 (100mM) BAR =) : PRET ’ 苹果 酸 脱氧 酶 43,000 Us 60, 55 35 (30mM) BABAK 55545540535 40 39 65,550545,36 90 磷酸 缓冲 液 3mM FE Bid Bw 76,000 7 全 7 50,45,40,35 70 (30mM) Sizes Coe 232 立即 将 上 清流 倒 人 带 塞 玻璃 试管 中 , 放 人 4 % 冰 箱 。 后 每 隔 10 一 12 小 时 交替 放 人 7 "各 4sC 的 冰箱 中 《而 不 是 室温 中 ),， 过 5 天 即 出 现 大 量 沉淀 。 继续 在 7%c 长 时 间 放 置 ， 每 隔 1 一 2 周 用 偏光 显微镜 检查 , 数 周 后 出 现 针 状 结晶 及 晶 簇 。 随 着 时 间 的 延长 , 晶 簇 增多 并 长 大 ，(50 一 100 微米 ), 由 奏 捆 状 变 成 放射 状 以 至 球状 。 援 动 试管 可 以 见 到 明显 的 丝光 。 三 批 结晶 试验 的 结果 如 表 8-2 所 示 。 表 8-2 用 Jakoby 法 进行 葡萄 糖 淀粉 酶 结晶 情况 wile BANE 出 现 混浊 的 | 蛋白 质 沉淀 | 看 到 结晶 实验 批号 毫升 : 30 毫升 含 蛋白 质 65 毫克 52 50 部 分 I 56* 2 sees 30 毫升 含 蛋白 54 2 = E 质 100 毫克 52 2 部 分 Il 60 3 30 毫升 含 蛋 白 56 3 质 130 毫克 54 S 52 3 * 实验 操作 有 失误 。 (—) 热 盒 技术 一 一 溶解 度 温度 梯 度 法 吕 热 盒 技术 适合 于 某 些 对 温度 比较 稳定 、 而 在 高 温 中 比 在 室温 下 有 较 大 溶解 度 的 蛋白 质 。 其 原理 和 利用 温度 差 进行 结 晶 相 同 ,设计 也 很 简单 ,如 图 8-5 所 示 。 操作 时 ， 先 将 蛋白 质 在 较 高 温度 下 溶 于 结晶 介质 中 , 并 装 人 一 带 塞 试 管内 ,试管 悬挂 于 一 内 装 有 热 水 的 热水瓶 里 。 管 口 露出 水 面 , 以 免 热 水 漫 人 试管 造成 污染 。 然后 把 热 水 瓶 垂 直 放 置 在 一 木 盒 内 , 盒 内 四 周 用 聚 茶 乙 烯 填 满 ,使 热水瓶 固定 不 动 。 上 面 加 上 木 盖 盖 紧 ? 让 热 盒 缓慢 冷却 , 当 试 管内 的 蛋白 质 溶液 到 达 一 定 温度 即 开始 析出 结晶 。 图 8-5 是 用 来 结晶 站 岛 素 的 一 个 热 盒 装置 。 热 盒 及 蛋白 质 溶液 最 初 均 处 在 50 的 高 温 下 ,渐渐 冷却 至 25%c 时 ,大 的 胰岛 素 结晶 即 开始 形成 。 如 冷却 温度 低 于 20°C, 溶液 过 饱和 度 太 大 ,反而 形成 晶体 较 小 。 此 法 曾 成 功 制备 了 胰 高 血糖 素 和 胰岛 素 的 结晶 。 这 二 种 蛋白 质 在 50°C 低 离 子 强度 缓冲 液 中 都 比较 稳定 和 有 较 高 溶解 度 。 se 233 ¢ 《二 ) 平衡 透析 技术 平衡 透析 技术 早 在 1932 年 已 由 Theorell 介绍 并 于 1947 年 由 Boyes 一 Watson 等 人 用 于 结晶 血红 蛋白 "9。 其 原理 是 通过 一 个 半 透 叶 WALLED LULA URS RIT TE, BER IT NY ; BUSOT ROA ea, he FATAL, 而 阻 上 蛋白 质 的 透 过 。 半 AD ORBAN OER BRA AR CE Bee BE A fl AG 成 , 膜 内 蛋白 质 溶液 的 pH 值 及 离子 强度 可 通 UR AD MUM RMT RET, HERR aN 形成 结晶 时 最 适 的 条 件 为 止 。 此 法 的 优点 是 ， Mie | 结晶 条 件 的 变化 可 通过 控制 扩散 作用 。 缓 慢 地 ar 到 达 结晶 核 化 点 。 使 晶体 的 生长 颗粒 大 ; 整齐 aut 均匀 。 如 蛋白 质 在 某 种 条 件 下 出 现 无 定形 沉淀 a ) 和 小 晶体 ,可 以 人 为 地 改变 膜 外 部 溶液 的 条 件 ， 2275 黎 RNSS 产 庆 。 使 沉 证 溶解 ,再 调整 到 形成 较 大 而 均匀 的 龟 体 。 wm au 平衡 透析 结晶 法 , 可 在 不 同 PE 和 不 同 溶剂 条 件 下 进行 。 此 法 也 适用 于 某 些 需要 金属 离子 的 蛋白 质 结晶 。 操 作 和 一 般 透 析 法 相同 。 方法 并 不 难 ,只 是 需要 耐心 摸 出 结晶 的 适合 条 件 便 可 获得 结晶 ， 有 时 在 结晶 形成 后 还 需 进一步 改变 外 部 缓冲 液 的 浓度 及 pHI 值 ,结晶 才 能 完成 。 平 衡 透析 方法 已 成 功 地 用 于 制备 多 种 蛋白 质 的 大 结晶 。 可 作为 常量 结晶 ， 也 可 以 进行 微量 结晶 。 如 Zeppezauer 设计 的 各 种 微量 毛细 管 及 穴 洞 透析 扩散 器 , 小 的 只 有 几 微 升 , 大 的 也 不 过 几 十 微 升 ,也 就 是 说 , 只 要 一 注 那 和 多 的 蛋白 质 溶液 便 可 进行 实验 s- 鞭 装置 形状 举例 如 图 8-6,， 8-709, 图 8-6 是 一 种 毛细 管 式 扩散 透析 结晶 装置 。 图 8-6(a) 毛细 管 上 的 膜 用 有 三 个 “县 ” 的 PVC 环 固定 ,使 膜 稍 离 开 容器 底部 ,以 免 损 坏 膜 。 操作 时 ， 把 装 有 蛋白 质 溶液 的 毛细 管 垂 直 置 于 结晶 介质 中 ,通过 改变 结晶 介质 的 条 件 促使 毛细 管 中 蛋 白质 结晶 的 形成 。 图 8- 6(p) 是 毛细 管 的 一 端 放大 图 。 各 种 毛细 管 扩散 透析 器 一 般 内 径 为 0.5 一 1 微米， 长 为 20 一 50 微米 ,能 装 10 一 30 微 升 蛋白 质 溶液 ,这 对 于 样品 是 十 分 节约 的 。 图 8-7 为 洞穴 式 扩散 透析 结晶 器 ,其 小 室 完全 使 用 光学 处 理 过 的 玻璃 制 成 ,不 用 取出 结晶 即 可 直接 用 显微镜 观察 。 因 此 它 比 毛 细 管 扩散 透析 装置 更 易 控 制 晶 体 生长 时 间 。 (=) 蒸发 扩散 技术 待 结晶 溶 沾 通 过 蒸发 作用 使 浓度 增加 ,最 后 达到 过 饱和 度 而 析出 结晶 ,这 是 小 分 子 传 统 结晶 方法 .但 简单 的 蒸发 作用 很 难 控制 饱和 度 并 容易 造成 盐 类 在 母液 中 形成 晶体 , 故 过 去 较 少 用 于 制备 高 纯度 蛋白 质 结 晶 。 近年 来 , 通过 浓 盐 溶液 与 结晶 溶液 车 发 扩散 的 平衡 作用 ,使 此 技术 具有 了 更 大 的 灵敏 度 ， 用 于 蛋白 质 和 RNA RBS, A 法 原理 是 : 先 将 蛋白 质 溶 于 一 个 适当 浓度 ( 低 于 沉淀 所 需 浓 度 的 10% 左右 ) 的 盐 溶液 中 ， 并 使 蛋白 质 含量 约 为 1 毫克 /毫升 。 另 在 一 大 容器 中 盛 放 高 浓度 的 盐 溶液 ,二 者 同时 置 于 一 密封 十 燥 吉 中 。 于 是 蛋白 质 溶液 中 的 溶剂 ,通过 蒸发 逐 新 转 到 较 浓 的 盐 溶液 中 ,直至 到 ° 234-6 Asam b22 wt Bi shes wet bras > 3 = (a) AZ Hee 1 = 30--50mm 6 = 24 0.5mm a<3mm (玻璃 )$ <1.2mm (DF) b 磨 圆 管 口 边缘 。. 图 8-6， 毛细管 扩 散 透析 结晶 器 (a) 毛细 管 扩散 透析 结晶 装置 (>) 毛细 管 磨 圆 的 管 口 边 ( 以 免 磨 破 透 析 膜 )。 Ea (a) 蛋白 结晶 溶液 14 (b> 图 8-7 穴 洞 式 扩散 透析 结晶 《a) 透析 器 侧面 及 正面 图 〈b) 透 析 器 全 套装 置 示意 图 达 平衡 为 止 。 当 蛋 白质 溶液 中 的 溶剂 蒸发 到 一 定 程度 后 ， 蛋 白质 便 从 溶液 中 结晶 析出 。 而 果 结 晶 的 泵 质 不 是 盐 溶 液 ; 而 是 易 挥 发 的 与 水 混合 的 有 机 溶剂 , 则 不 需要 在 蛋白 质 溶液 中 先 加 入 有 机 溶剂 (加 入 一 定 缓冲 液 及 调整 pH 值 仍 是 必要 的 )。 通 过 有 机 溶剂 的 蒸发 s 227° 很 快 便 扩 散 到 蛋白 质 溶液 中 。 如 所 用 有 机 溶剂 挥发 性 不 强 , 也 可 事先 加 入 适量 有 机 溶剂 到 待 结晶 蛋白 质 溶 沪 中 , 这 样 可 避免 平衡 时 间 过 长 。 当 有 蛋白 质 溶液 中 的 有 机 溶剂 到 适量 时 便 开 始 形成 结晶 。 图 8-8 是 二 种 简单 的 微量 蒸发 扩散 结晶 装置 的 示意 图 。 图 8-8(a) 为 碟 式 蒸发 扩散 结晶 器 。 用 一 塑料 盒 ( 或 培养 下 ) 将 底部 隔 开 二 半 ， 一 半 放 置 浓 盐 液 或 有 机 溶剂 , 另 一 半 放 待 结 晶 蛋 白质 溶液 ,一 次 可 结晶 16 个 样品 。 操 作 时 , 先 将 盛 放 蛋 白质 溶液 的 玻 片 硅化 以 防止 蛋白 质 溶液 的 散 开 。 整 个 装置 密封 后 放置 在 一 定 温 度 下 , 当 蛋 白质 中 溶剂 蒸发 或 吸收 有 机 溶剂 至 一 定 浓 度 后 ， 即 开始 结晶 。 图 8-8(b) 为 悬 滴 式 蒸 发 扩散 结晶 器 ,容器 底部 为 浓 盐 液 或 有 机 溶剂 , 上 面 用 一 玻 片 , 其 中 央 加 一 滴 蛋 白质 溶液 。 反 过 来 盖 住 容器 ,密封 后 即 可 进行 蒸发 结晶 。 此 法 比较 简易 ,容易 操作 。 下面 以 毕 汝 昌 、 雷 克 健 等 人 用 微量 气相 扩散 法 对 猪 和 牛 [Trp】: 胰岛 素 进行 结晶 为 例 : ‘aM [Trp] 胰岛 素 结晶 一 一 微量 气相 扩散 法 叫 晶体 生长 甲 液 为 0.02NHC1, 1 多 蛋白 质 溶液 ;晶体 生长 乙 液 为 含 0.07 多 氧化 镍 ,302 丙酮 , 0.2M 柠檬 酸 钠 -对 生长 猪 和 牛 [Trp]… 胰岛 素 晶体 , 乙 液 的 pH 分 别 调 至 6.9 和 :7.7。 生长 晶体 时 将 甲乙 二 滚 等 体积 混合 ， 按 每 滴 5 一 100 微 升 分 开 滴 在 预先 硅化 的 康 维 炙 内 表 8-3 茯 射线 衍射 研究 用 的 一 些 生 物 高 聚 物 的 结晶 方法 ”2 生物 高 聚 D 醛 缩 酶 ” (rabbit muscle) 天 门 冬 酰 胺 酶 (Erwinia carotovora) 叶绿素 蛋白 FET a oe ethylicum) 本 琼 氏 蛋 白 (human L-type) c a Yeast AMR BEE A 细胞 色素 b5 (calf liver) (rabbit liver) 抗原 结合 片断 Chuman myeloma protein IgGl) 黄 素 氧化 还 原 蛋白 (Clostridium pasteurianum) 谷 氮 酰 胺 合成 酶 〈E.。 colt) 聚 肌 红 蛋白 Gperm whale) 肌 红 和 蛋白 Cwna) 蛋 (Penicillium janthinellum) 蛋白 & (Sorangium sp.Myxobacter 405) & B & (Strain of Arthrobacter) 原 肌 球 蛋白 (rabbit muscle) 甲状 腺 球 和 蛋白 转移 RNA 转移 RNA 硫 氧化 蛋白 〈BE. cols) 番茄 丛 缩 病 毒 Am De MR 高 离子 强度 分 步 结 晶 法 在 低 离 子 强度 下 加 入 乙醇 缓慢 地 平衡 到 高 离子 强度 低 离 子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 低 离 子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 低 离子 强度 ;等 电 点 附近 缓慢 蒸发 结晶 高 离子 强度 分 步 结晶 法 ,或 平衡 透析 法 高 离子 强度 ;平衡 透析 法 pH6.4 一 6.8， 高 离子 强度 ,微细 管 平 衡 透 析 法 高 离子 强度 分 步 结晶 法 高 pH 值 和 高 离子 强度 分 步 结晶 法 高 离子 强度 分 步 结晶 法 高 离子 强度 ,缓慢 蒸发 结晶 法 高 离子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 高 离子 强度 ,微细 管 平衡 透析 法 中 度 的 高 离子 强度 ， 平 衡 透析 法 高 离子 强度 ,温度 梯度 结晶 法 〈Jackoby 法 ) 溶剂 平衡 或 等 温 蒸馏 ,再 助 以 温度 梯度 法 分 步 结晶 法 在 等 电 点 附近 * 微 细 管 平衡 透析 法 高 离子 强度 ,分 步 结晶 法 CGE: 本 表 中 所 列 作者 文献 从 略 ) - 236° 贮存 法 趟 溶液 一 滴 20ul ZAR BEER 图 8-8 微量 蒸发 扩散 结晶 装置 示意 器 室 , 再 将 10 毫升 的 乙 液 置 于 康 维 焉 外 室 中 ,然后 盖 上 玻璃 片 ,加 真空 油脂 封 密 ,， 于 培养 箱 放置 1 至 数 周 , 即 形成 晶体 ,大 小 为 0.5 至 0.7 毫米 的 单 晶 ,外 形 为 鞭 形 六 面体 , 可 供 和 射 线 结构 分 析 之 用 。 微量 结晶 方法 还 有 多 种 装置 ;由 于 篇 幅 限制 ,这 里 就 不 一 一 介绍 了 。 微 量 结晶 法 的 优 点 是 使 用 样品 较 少 ,所 得 的 蛋白 质 结晶 较 大 ,可 用 使 入 射线 衍射 的 分 析 。 关 于 专 供 和 射线 衍射 用 的 一 些 生物 大 分 子 的 结晶 方法 和 条 件 可 参考 表 8-3。 和 fi1] 唐 有 祺 编著 : 结晶 化 学 ，1 一 31 页 ， 高 等 教育 出 版 社 (1960) [21 中 为 科学院 药物 研究 所 编 : 中 草药 有 效 成 份 的 研究 ,第 一 分 册 ，54 页 ,人 民 卫 生出 版 社 〈1972) £3] Blundell, T. L. and Johnson, L. N., Protein Crystallography, P. 60—71, Academic Press, New York (1976) 14] ) 常 检 查 橡 皮 塞 是 否 漏 气 ， 如 已 变质 应 该 更 换 。 橡皮 塞 在 蒸馏 瓶 上 的 露出 部 分 不 得 少 于 1/3。 () 防 漏 与 涂 脂 : 如 发 现 真 空 系统 漏 气 ， 可 用 等 量 的 蜂蜡 与 松香 混 熔 后 涂 封 。 如 真 空 度 低 于 1 毫米 示 柱 可 涂 凡士林 ,高 于 1 毫米 未 柱 应 涂 高 真空 活塞 油 。 涂 脂 要 注意 均 义 。 (qd) 冷却 系统 : ,要 在 冷 阱 周围 造成 低温 条 件 , 可 用 冷冻 机 制冷 或 加 冷却 剂 。 常用 的 RAHA: KA: 无 色 流 体 , 大 气压 下 沸点 为 —195.8C, FAB 一 210%C。 干冰 (固体 CO): 升华 温度 为 一 78.5%C， 用 时 ,加 适量 溶剂 (OAM. CE. Cis) 则 冷却 均匀 。 可 冷 至 一 70 一 一 80sc 左右 。 结晶 氧化 钙 与 碎 冰 : ， 能 达到 的 低温 随 结晶 氯 化 钙 与 碎 冰 的 比例 而 变 ， 最 低 可 冷 至 —54.9°C (143 克 结 晶 氯 化 钙 与 100 克 碎 冰 )。 Rai SRA, 能 达到 的 低温 随 组 分 比例 而 变 ， 最 低 可 达 一 21.3"C《〈33 wes 克 雁 冰 )。 使 用 冷 阱 时 , 应 先 接 好 蒸馏 系统 , 然后 再 加 冷却 剂 以免 空 气 中 水 分 大 量 进 入 冷 阱 , 降 低 冷 阱 的 效率 。 (e) 于 燥 系 统 : 油泵 前 用 固体 氢 氧 化 钾 ( 钠 ) 毛 化 钙 \ 活 性 炭 、 碱 石灰 等 ,也 可 以 用 五 氧化 二 磷 。 活 性 炭 应 该 放 在 近 油泵 的 一 端 。 () 抗暴 沸 : 常用 毛细 管 〈 应 该 先 检查 是 否 通气 )。 燕 留 或 浓缩 容易 氧化 的 物质 ， 应 由 毛细 管 通信 人 氮气。 浓缩 过 程 中 如 有 固体 析出 ,可 将 毛细 管 倒 揪 〈 粗 端 朝 下 )， 以 免 堵 塞 - 浓缩 小 量 液体 时 ,可 用 抗暴 沸 管 ( 取 4 毫米 直径 的 玻璃 管 , 在 下 端 约 " 毫米 处 封闭 )o (g) 停止 浓缩 ,应 该 先 移 去 热源 。 稍 冷 ,再 关 真 空 泵 ,以 免 浓 缩 物 升 旭 分 解 。 (h) BRS, BRP Ro 3. 8 又 称 薄 膜 浓 缩 。 (1) 原理 : 薄膜 蒸发 是 使 液体 形成 薄膜 ,增加 气 化 表面 \ 加 速 蒸发 。 薄 膜 蒸 发 器 内 有 直立 的 加 热 (蒸发 ) 管 , 传 热 面 较 大 。 液 体 在 减 压 下 进入 加 热管 ,把 未 蒸发 液体 拉 成 薄膜 迅 ibd SA 2 ese (2) 薄膜 蒸发 的 优点 是 : (a) 液 膜 表面 很 大 , 传 热 快 而 均匀 。 液 体 在 蒸发 管内 停留 的 时 间 很 短 ( 仅 数秒 或 不 足 一 秒 )。 这 样 即使 温度 略 高 ,物料 也 不 易 破 坏 。 可 用 于 制备 对 热 较 稳定 的 酶 、 蛋 白质 和 小 分 子 物 质 。 (b) RARE AK, WAKER EWMMRADZES SE LDBRVARR ings LABS IAD 2 Hi wie RAAT ERRAND * 248 ¢ (3) 薄膜 蒸发 的 缺点 是 操作 温度 较 高 (浓缩 液 温度 可 达 60 一 80%C)， 且 液体 被 拉 成 膜 状 ， 因 此 不 适 于 浓缩 对 热 敏 感 的 或 易 受 薄膜 切 力 破坏 立体 结构 的 酶 与 核酸 等 生物 大 分 子 的 溶液 。 蒸 发 管 难 于 请 洗 和 更 换 , 不 适 于 浓缩 粘度 很 大 \ 容 易 析 出 结晶 的 物料 。 因 为 它们 不 易 成 膜 , 而 且 容 易 堵 塞 蒸发 管 。 (4) 使 用 薄膜 蒸发 时 ， 应 该 控制 进 料 速度 使 泡沫 在 气 液 分 离 器 中 能 够 全 部 破裂 。 如 速度 过 快 ,液体 受热 不 足 , 蒸 发 与 分 离 受 到 妨碍 。 速 度 过 慢 , 则 气 液 难于 分 离 MATER 发 管 中 干 酒 , 导 致 产品 分 解 。 此 外 气 液 分 离 器 的 直径 不 宜 过 小 ,以 免 浓 缩 液 冲 人 冷凝 管 。 (5) 小 型 薄膜 浓缩 装置 见 图 9-14。 用 时 先 夹 紧 14、13、12 的 螺旋 夹 ,以 水 通 人 冷凝 管 的 大 口 处 6 ,然后 开 真 空 汞 , FARMS 500 .毫米 汞 柱 区 下 , 打开 蒸汽 闽 并 适当 放出 冷凝 水 。 调节 螺旋 夹 14 使 溶液 缓 缓 沿 管 上 升 至 A 管 的 1/2 高 度 处 。 减 压 使 A 管 液体 迅 速 蒸发 ,蒸汽 充满 A 管 并 将 部 分 液体 拉 成 薄膜 沿 管 壁 上 升 。 液 膜 迅 速 蒸发 ,大 量 蒸 汽 和 人 少 量 流体 的 混合 物 通过 气 液 分 离 器 3. RRMA, 液体 逐 滴 流下 进入 2 中 即 为 浓缩 液 。 绝 大 部 分 气体 被 抽 人 冷凝 器 5 中 转变 为 冷凝 液 4。 浓缩 液 贮 瓶 2 装 满 后 ,抽出 液体 检查 浓 度 o 如 浓度 不 够 可 以 反复 浓缩 。 结 束 时 先 关 蒸汽 阀 , 拔 掉 抽 气泵 接头 8 ,再 关 真 空 泵 ,最 后 ARIK. 薄膜 浓缩 效率 很 高 ,例如 用 长 1 米 , 内 径 2 厘米 的 A 管 装 成 小 型 薄膜 浓缩 器 , 每 小 时 可 浓缩 稀 溶 液 1 一 2 升 〈 根 据 所 需 浓 度 而 定 )。 还 可 按 图 9-15 装置 使 提取 与 浓缩 连续 进 行 。 > WEES Re 图 9-14 RR RS 图 9-15 薄膜 浓缩 与 提取 连续 装置 工 . 待 浓缩 六; 2. 浓 缩 液 ;: 3. 气 -液体 分 离 器 ; 4. 冷 凝 疲 ; 1. 连 抽 气 和 泵 ; 2. 溶剂 ; 3. 提 取 物 料 ; 4. 浓 缩 液 ; 5 冷凝 管 ; 6. 冷 水 进口 ; 7. 冷 水 出 口 ;8. 抽 气泵 接头 ; 7. 蒸汽 导 人 9. 温 度 计 ; 10. 浓 缩小 吸出 管 ; 11. 冷 凝 芒 吸 出 管 ; 12、 13、14. 螺旋 夹 * 249 。 (=) 工业 上 用 的 蒸发 浓缩 设备 原理 与 实验 室 装 置 相同 , 特点 为 容量 大 , 附属 设备 多, 结构 较 复 杂 ， 由 于 生化 物质 在 60°C 以 上 一 般 容 易 瑚 失 或 降低 活性 ,常用 以 下 减 压 浓 缩 装 置 : 1. 减 压 蒸发 器 8 见 图 9-16, 用 时 先 开 真空 汞 ， 抽 出 内 部 空气 后 ， 再 由 人 口 4 吸 入 待 浓缩 该 。 继 续 抽 气 至 一 定 真 空 度 , 由 蒸汽 人 口 5 慢 慢 通 人 蒸汽 、 加 热 蒸发 , ANAK 气 出 口 8 。 蒸 汽 经 隔 沫 装置 9 分 出 液 滴 后 , 进入 冷凝 器 11, 冷 凝 液 流 入 接受 器 14。 从 观 AA 3 可 见 蒸发 情况 ,如 果 液 体 沸 腾 过 猛 , 应 该 稍稍 打开 放 气 阀 2 调节 真空 度 。 温 度 由 温 度 计 1 显示， 调节 蒸汽 人 口 5 ,可 控制 蒸发 速度 。 停 止 蒸发 时 先 关闭 蒸汽 人 口 及 抽 和 气泵 y 再 打开 放 气 阀 2, 使 蒸发 锅 的 压力 恢复 正常 。 浓 缩小 由 出 口 6 放出 。 2. 循环 减 压 蒸发 器 ”装置 见 图 9-17。 蒸发 速度 很 快 。 例 如 容积 为 150 HAIMA Res, 每 小 时 可 蒸发 100 升 浸 出 液 。 它 由 外 加 热 室 1 和 分 离 室 2 组 成 。 加 热 室 中 蒸汽 在 管 外 加 热 , 溶剂 蒸汽 由 上 部 横 管 经 分 离 室 上 部 及 附设 的 隔 沫 装置 进入 冷凝 器 冷凝 后 排出 。 液体 沿 循环 管 4 回 到 加 热 室 再 蒸发 ， 如 此 循环 直至 达到 所 需 浓 度 。 加 热 室 的 管子 很 长 (可 达 7 米 ), 沸 腾 管 长 度 如 果 增 加 ,循环 管 中 液 体 和 沸腾 管 中 气 臣 混 合 物 的 重量 之 差 也 增加 。 分 离 室 内 体 温度 低 \ 比 重大 ,所 以 不 断 流 入 蒸发 器 (加 热 室 );, 因 此 产生 搅拌 作用 加 速 蒸发 。 图 9-16 减 压 蒸发 器 1. 温 度 计 ; 2.0; 3. 观 察 窗 ; 4. 锌 体 入 口 ; 5. 蒸 汽 人 口 ; 6. 浓缩 流出 口 ; 7. 冷 水 出 口 ; 8. 废气 出 口 ; 图 9-17 ”循环 减 压 蒸发 器 9. 隔 沫 装置 3 10. 热 水 出 口 3 -11. 冷凝 器 ; 12 冷水 人 (蒸发 器 加 热 室 在 外 面 ) 口 ; 13 连 抽 气 机 ; 14. 接 受 器 1. 加 热 室 ; 2. 分 离 室 ; 3. 气 波 混 合 管 ; 4. 循 环 管 循环 减 压 蒸发 器 适 于 浓缩 易 结晶 、 多 泡沫 的 溶液 。 其 优点 是 生产 能 力 大 ,容易 维护 。 3. 管 式 薄膜 蒸发 器 ”” 液 膜 在 蒸发 器 的 管 壁 受 热 ， 溶 剂 迅速 蒸发 使 溶液 达到 所 需 浓 度 。 按 管 长 可 以 分 为 长 管 式 ( 管 长 6 一 8 米 )、 MEK ( 管 长 3 一 4 米 )o。 . 按 液 体 流 向 可 以 分 © 250° Oe 为 升 膜 式 、 降 膜 式 。 它 们 的 构造 简单 ,便于 操作 , 传 热效率 高 , 蒸发 速度 快 《 仅 数秒 至 数 十 秒 ), 适 用 于 对 热 敏感 、 易 发 泡 的 物料 。 C1) 升 膜 式 蒸发 器 : 见 图 9-18, 在 真空 下 操作 ,蒸发 管内 压力 小 ;蒸汽 流速 快 ,如 进 料 BES ,沸腾 液 被 蒸汽 流 急速 携带 向 上 , GRRE RMR RRAAKA. MENTS. 热 蒸汽 不 足 , 管 的 下 部 积 液 过 多 , 则 液 柱 虽然 上 升 但 不 能 成 膜 。 进 料 过 少 易 造 成 物料 在 管 中 干 亩 而 分 解 。 (2) 降 膜 式 : 结构 与 升 膜 式 基本 相同 。 但 液 膜 和 蒸汽 的 流动 方向 与 升 膜 式 相反 ; 见 图 9-19。 料 波 由 顶部 人 ;通过 料 液 分 配器 被 均匀 地 分 配 到 每 根 加 热管 中 受热 而 蒸发 , 因 重 力 的 影响 增加 了 蒸汽 的 抽 拉 作用 和 液 膜 的 流动 速度 ， 所 以 在 同样 条 件 下 降 膜 蒸发 器 的 液 膜 比 升 膜 燕 发 器 的 沪 膜 要 薄 一 些 。 而 且 液 流 的 加 速 方向 与 重力 方向 一 致使 得 降 膜 式 比 升 膜 式 有 更 多 优点 ,目前 已 被 广泛 采用 。 一 ， “宣王 || RAE iI | Bae | HRB HAN | i | Wilh | | | NN Re 连接 管 il, Ly Kot ine LU eine 图 9-18 升 膜 式 蒸 发 器 图 9-19 _ 降 膜 悉 发 器 结构 1. 料 流 分 配器 ; 2. 加 热 列 管 ; 3. 蒸 汽 挡 板 ; 4. 分 离 器 ; 于 冷凝 水 液 位 计 ; a. 料 液 进 口 ; b. 加 热 蒸汽 进口 ; c. 不 凝 性 气体 排出 口 ; d. 冷 凝 水 出 口 ;e. 浓 缩 流出 口 ; 世 二 次 蒸汽 出 口 4. 真空 离心 薄膜 蒸发 器 利用 维 形 盘 高 速 旋转 产生 的 离心 力 把 料 液 甩 到 锥 形 盘 的 传 热 面 上 ,分 散 为 一 层 极 薄 的 均匀 液 膜 ( 仅 0.1 毫米 )。 由 于 离心 力 的 作用 , RRERA 仅 停 留 1 秒 钟 。 操 作 是 在 700 毫米 未 柱 的 真空 度 下 进行 的 。 适 于 连续 浓 入 中 度 或 高 度 热 敏 性 及 高 粘度 物料 , 见 图 9-20。 “5 真空 离心 薄膜 蒸发 器 在 国外 已 广泛 用 于 浓缩 胰岛 素 、 葡 萄 糖 \ 蛋 白质 ;酵母 等 物料 5 他 如 胰岛 素 在 40°C 浓缩 就 会 视 失 将 价 , 而 采用 真空 离心 薄膜 蒸发 器 仅 在 二 秒 钟 内 就 能 使 物 料 达 到 一 定 的 浓度 ; 故 可 避免 效 价 的 损失 。 我 国 福建 厦门 已 有 生产 ,型 号 为 LZ-XJ26 型 ， 加 热 面积 为 2.6 米 ,蒸发 能 力 为 800 一 900 公斤 水 /小 时 ， 浓 缩 比 为 5 一 10， 物料 蒸发 温度 A 45Co 5. 大 型 薄膜 蒸发 器 ”为 了 提高 薄膜 蒸发 器 的 效率 ， 近 年 来 多 采用 一 种 改良 装置 是 在 蒸发 器 处 安装 多 条 加 热管 图 9-231 所 示 。 物料 IRBIR maser "十 图 9-20 离心 薄 跤 蒸发 器 结构 示意 图 图 9-21 大 型 薄膜 蒸发 器 1. FRR; 2. 流 量 计 ; 3. 预 热 器 ; 4. 蒸发 器 ;5. 气 液 分 离 器 ; 6.72; 7. 浓 缩 液 接受 器 ; 8. 热 水 槽 ; 9. 废气 出 口 ; 10. 蒸汽 fa; 11. 稳 压 箱 ; 12.89 5 13. RI; 14. Et 15. 冷 水管 me 吸收 浓缩 是 加 入 吸收 剂 从 溶液 中 吸收 水 或 溶剂 使 溶液 达到 浓缩 的 方法 。 吸 收 剂 应 具 有 不 与 溶液 起 反应 、 不 吸附 溶质 、 容 易 和 溶液 分 离 、 除 去 溶剂 后 还 能 重新 使 用 等 特性 。 党 用 的 吸收 剂 有 各 种 凝 胶 、 聚 乙 二 醇 到 乙 烯 呈 咯 酮 和 葡 聚 糖 等 。 吸 收 方法 有 用 凝 胶 直接 吸 收 和 在 半 透 膜 外 吸收 两 种 。 《一 ) 用 凝 胶 直 接 吸收 凝 胶 ( 例 如 葡 聚 糖 凝 胶 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 等 ) 由 多 育 物 组 成 ,具有 一 定 孔 径 的 微 孔 ,能 。252。 够 吸水 。 孔 径 小 的 凝 胶 吸 水 能 力 弱 ， 但 速度 快 。 孔 径 大 的 凝 胶 吸 水 能 力 强 ;, 但 速度 慢 。 选 用 适当 筷 径 的 于 北 胶 投入 大 分 子 溶液 后 ,大 分 子 不 能 进入 凝 胶 网 孔 , 仍 然 留 在 咨 液 中 。 深 剂 分 子 及 其 它 小 分 子 则 进入 凝 胶 内 ， 除 去 凝 胶 即 得 浓 溶 液 。 用 凝 胶 浓 缩 有 两 种 方式 : 动 态 浓 缩 (使 稀 溶 液 通过 凝 胶 柱 )， 静 态 浓缩 (将 干 凝 胶 投 入 稀 溶 该 )o 1. 使 用 凝 胶 直接 吸收 可 用 葡 聚 糖 凝 胶 Sephadex G-25、G-50， 还 有 近年 来 制 出 的 吸 水 性 强 、 容 易 分 离 的 聚 丙烯 酰胺 干 凝 胶 _〈Lyphogel)。 CL) 使 用 以 前 应 先 测定 王 凝 胶 吸 水 率 , 方法 如 下 : 65°C 加 热 4 小 时 得 到 干 凝 胶 。 然后 把 一 定 重量 的 干 凝 胶 吸 水 至 恒 重 后 测定 重量 ,可 用 下 式 计 算 吸水 率 : W,— W, eae: 1 ee S 为 吸水 率 ; W, 为 干燥 凝 胶 的 重量 ; W, 为 干 凝 胶 吸 水 至 恒 重 后 的 重量 。 根据 干 凝 胶 吸 水 率 计算 出 需要 加 入 的 干 凝 胶 量 。 例如 1 克 Lyphogel 吸水 达到 平衡 时 能 吸收 5 克 水 , 则 10 毫升 溶液 浓缩 5 倍 需 加 1.6 克 凝 胶 。 如 使 用 .Sephadex G-25, 吸水 率 为 2.5 毫升 / 克 干 凝 胶 , 则 3 毫升 蛋白 质 稀 咨 液 中 加 入 工 克 干 凝 胶 后 蛋白 质 溶液 可 浓缩 6 倍 。 将 一 定量 的 凝 胶 投 大 深 液 后 ; 凝 咬 开始 浮 于 液 面 ,不久 即 下 沉 , 应 放置 待 吸水 达到 平 衡 以 后 ,再 离心 分 出 上 层 浓 溶液 。 下 层 已 吸水 膨胀 的 凝 胶 经 回收 处 理 后 可 以 再 用 。 (2) ARMA RAE: RAGE, RY AST KERRIES 浓缩 时 溶液 中 盐 类 和 水 分 同样 进 大 吸收 剂 , 浓缩 前 后 溶液 pH 及 离子 强度 无 变化 。 有 的 吸收 剂 甚至 在 高 压 灭 菌 后 性 能 也 不 改变 ;可 以 对 溢 液 进行 无 菌 浓缩 。 缺点 是 吸收 剂 表面 有 时 粘 附 一 部 分 溶液 造成 损失 。 (=) 在 半 透 谭 外 吸收 即 高 阔 透 析 。 半 透 膜 能 使 小 分 子 或 离子 透 过 而 蛋白 质 等 大 分 子 不 能 透 过 。 半 透 膜 袋 的 外 面 如 果 有 浓度 很 高 的 能够 吸水 的 高 聚 物 , 膜 外 渗透 压 就 高 于 膜 内 。 膜 内 溶液 中 的 水 回 膜 外 扩散 ,立即 被 高 聚 物 吸收 直至 平衡 。 REVERSI RNR RK. HAM 水 高 聚 物 有 聚 乙烯 吡咯 酮 《polyvinyl pyrrolidone， 简 称 PVP， 分 子 量 12,000), ROM (polyethylene, 简称 PEG， 分 子 量 5000—10,000 适 于 浓缩 ，6000 最 好 ) 及 葡 聚 糖 等 。 使 FAB fie DRA A PEG 中 的 酸 。 用 过 的 PVP、 葡 聚 糖 等 经 过 加 热 或 吹风 去 水 后 可 以 再 用 。 但 是 PEG 不 能 加 热 和 干燥 ,因为 加 热 使 它 转变 为 无 用 的 蜡 状 物 。 此 法 的 缺点 是 : 吸收 剂 中 如 果 含 有 分 子 量 较 低 的 聚合 物 或 杂质 ,就 有 可 能 透 人 袋 内 ; 有 些 物 质 如 聚 乙 烯 吡咯 酮 对 280 毫 微米 波长 有 吸收 , 因而 对 测定 蛋白 质 有 干扰 。 蛋白 质 不 能 全 部 回收 ,因为 半 透 膜 有 吸附 作用 。 =. RR RR RAOBBEEABOATA. KERMIT AS ARR EB © 2536 (—) 减 压 透析 1. 基 本 原理 是 利用 浓缩 装置 内 外 的 压力 差 ， 将 样品 中 的 溶剂 挤 压 出 去 ， 使 样品 得 到 浓缩 。 例 如 在 图 9-22 所 示 的 装置 中 , 火 棉 胶 袋 的 容量 为 8 毫升 ,透水 速度 为 7 一 15 毫升 / 小 时 ,可 以 反复 用 十 几 次 。 火 粮 胶 弘 装 液 后 , 置 于 吸 滤 瓶 内 进行 真空 吸 滤 , 直至 袋 内 高 分 子 溶 液 达到 所 需 浓度 为 止 。 如 无 低温 工作 室 又 不 愿 连 续 使 用 水 泵 ,可 以 在 室温 减 压 后 关闭 吸 滤 瓶 出 口 , 置 于 冷 处 。 吸 滤 压 力 不 宜 过 大 :否则 引起 滤 孔 堵塞 ,反而 延 长 时 间 。 取 出 浓缩 液 时 为 了 不 损伤 膜 和 减少 样品 损失 ， 可 以 用 细 胶 管 套 在 吸管 〈 或 注射 器 ) 上 轻 轻 探 吸 膜 面 。 为 了 防止 透析 袋 干 燥 或 长 霉 , 可 保存 于 25% 乙醇 中 。 时 透析 液 处 于 大 气压 下 。 利 用 膜 面 的 压力 差 能 够 有 效 图 9-22 EB 地 进行 浓缩 。 透 析 液 内 有 垂直 的 管状 透析 膜 。 了 膜 内 的 杆 有 三 种 作用 : C1) 增加 单位 体积 样 液 的 膜 面积 。 (2) 透析 时 使 分 子 移动 的 距离 减少 至 1.5 厘米 左右 ， 基本 上 是 薄 层 透析 ; (3) 能 够 精 确 地 预定 浓缩 的 最 终 体积 。 微量 蛋白 质 浓缩 器 用 水 和 泵 (或 真空 泵 ) 抽 真 空 后 ,用 夹子 夹 住 , 停止 抽 气 , 可 以 在 一 定 的 温 度 条 件 下 进行 浓缩 。 加 样 液 后 透析 浓缩 立即 开 始 ， 样 液 弯 月 面 下 降 直至 样 液 贮 存 室 的 尖端 。 这 时 样 液 与 蛋白 质 透 析 膜 脱离 接触 ， 透 析 液 的 浓缩 就 自动 停止 。 因 此 样 荒 不 会 浓缩 至 干 。 可 以 自动 使 桩 液体 积 最 终 定量 地 小 至 25 微 升 。 透析 膜 如 不 垂直 ， 重 力 使 被 截留 的 蛋白 质 分 子 沉淀 在 膜 上 。 膜 的 吸附 作用 使 蛋白 质变 性 活力 受 损失 ;而且 产生 浓 差 极 化 。 朱 拌 虽然 可 以 使 蛋白 质 分 子 离开 膜 ， 但 又 产生 有 害 的 切 变 作 用 。 该 装置 中 透析 膜 是 垂直 的 , 能 消除 上 述 有 害 作 用 而 保留 重力 的 有 效 作 用 。 浓 缩 时 被 截留 的 分 子 直接 沉淀 到 透析 膜 底部 已 经 硅 酮 化 的 样 液 贮 存 器 中 。 这 些 改 进 使 回收 率 平均 达到 : 90 旬 ， 而 且 不 损害 蛋白 质 的 酶 活性 或 生物 活 图 9-23 ”微量 浓缩 器 性 。 国外 有 多 种 这 类 装置 。 它们 还 能 与 高 压 消 毒 装置 连用 。 浓缩 达到 的 预定 体积 为 15 微 升 至 1000 微 升 。 (二 ) 离心 超 滤 含 生物 大 分 子 的 少量 样 液 可 在 离心 管内 借助 于 离心 力 进行 超 潜 ， 如 图 9-24,， 用 小 圆 © 2546 2. 微量 蛋白 质 减 压 透 析 浓缩 器 ; 9-23, Bee a 简 插 人 离心 管 上 的 活塞 ,使 圆锥 形 亲 水 凝 胶 膜 固定 在 圆锥 形 支 架 上 。 膜 内 装 有 样 液 , 离 心 2 一 30 分 钟 ,部 分 溶剂 和 小 分 子 杂 质 透 过 膜 , 成 为 超 泪液。 含有 大 分 子 的 样 液 得 到 浓缩 。 (=) 加 压 膜 浓缩 _ 包括 加 压 超 滤 装 置 、 空 心 纤 维 浓 缩 器 、 微 孔 膜 过 滤器 及 反 渗 透 膜 过 滤 装 置 等 ， 已 大 量 用 于 分 离 与 小 缩 生化 产品 。 加 压 膜 浓缩 不 仅 效率 极 高 , 还 有 以 下 优点 : (1) 条 件 温 和 : :与 蒸发 \ 冻 干 \ 沉 淀 等 方法 比 较 ， 此 法 没有 相 的 变化 ， 保 持原 来 的 pH 和 离子 强度 ,可 以 在 低温 操作 ,能 较 好 地 保持 生物 大 分 子 的 活性 ,因此 广泛 用 于 浓缩 生物 大 分 子 的 稀 溶液 ， 特别 适 于 浓缩 不 稳定 的 酶 液 。 (2) 不 需要 添加 化 学 试剂 ,设备 简单 、 费 用 较 图 9-24 BBR 低 , 操 作 方 便 是 能 较 快 地 处 理 大 量 的 稀 溶 液 。 (3) -蛋白质 和 酶 的 溶液 可 以 浓缩 到 10-50% 浓度 ,回收 率 高 达 90% (4) 有 纯化 作用 ,可 以 同时 脱盐 及 除去 其 它 小 分 子 杂 质 。 “缺点 是 不 能 直接 得 到 干 品 。 膜 的 吸附 作用 会 造成 一 定 的 损失 。 PO. Uk 冻 融 化 冰冻 融化 是 浓缩 生物 大 分 子 及 它 物质 的 一 种 有 效 方法 , 能 用 于 浓缩 大 量 溶液 。 样 液 在 缓慢 冻结 时 ,水 不 断 形成 冰晶 而 析出 ; 盐 类 及 大 分 子 留 在 液 相 , 从 而 得 到 浓 溶 液 。 其 装置 如 图 9-25 所 示 , 浓 缩 室 的 中 央 有 浮动 式 搅 拌 器 。 深 液 中 的 水 在 浓缩 室 的 周围 逐渐 结 冰 , 溶 质 浓 度 不 断 增 大 ,集中 到 浓缩 室 的 中 部 。 可 以 使 溶液 浓缩 4 一 30 倍 。 图 9-253 冰冻 浓缩 装置 也 可 以 利用 溶剂 与 溶质 融 点 的 不 同 , 先 将 溶液 冻 成 固体 ,然后 缓慢 融化 。 用 此 法 浓缩 蛋白 质 和 酶 的 盐 溶液 时 ,不 含 蛋白 质 和 酶 的 冰 块 浮 在 液 面 上 ,而 蛋白 质 和 酶 则 集中 于 下 层 溶液 。 移 去 上 层 冰 块 ,可 以 得 到 蛋白 质 和 酶 的 浓 溶 液 。255。 H. Kft 离子 交换 ,吸附 剂 吸 附和 亲 和 层 析 方 法 都 同时 具有 分 离 和 浓缩 的 作用 。 (—) 离子 交换 Glin: 水 解 RNA 可 以 得 到 四 种 单 核 苷 酸 的 混合 液 。 经 阳离子 交换 树脂 分 离 :AMP 组 份 后 ,再 经 阴离子 交换 树脂 分 离 能 够 得 到 GMP, UMP 及 CMP 组 分 。 经 阳 柱 得 到 的 AMP 组 分 所 含 的 杂质 很 少 , 可 以 进行 减 压 浓缩 。 而 CMP, GMP, UMP 组 分 中 存在 较 多 色素 , 减 压 浓缩 将 使 产品 颜色 加 深 , 故 宜 再 用 阴 柱 浓缩 。 其 过 程 如 下 : CMP. 组 分 用 6N NaOH 调 pH 8.0 一 8.5，UMP 组 分 调 pH9.0 一 9.5，GMP 组 分 调 pH7.0 上 柱 ( 聚 茶 乙 烯 -二 己 烯 苯 季 胺 型 树脂 ,100 一 200 目 , 交 联 度 1X8)。100 毫升 树脂 可 上 柱 10 克 核 苷 酸 (吸附 越 饱和 ， 浓 缩 效 果 越 好 )。 上 柱 后 用 0.1INHCI (pH1.0), 3% NaCl 溶液 加 热 至 50*c 洗 脱 ,分 部 收集 ,用 10 倍 量 的 95 多 乙醇 沉淀 核 苷 酸 。 可 浓缩 50 一 100 倍 , 收 率 在 80% 以 上 。 | (=) 吸附 剂 吸附 闻 用 的 吸附 剂 有 活性 几 、 磷 酸 钙 、 氧 化 馈 与 硅胶 等 。 溶 剂 的 极 性 和 溶解 性 对 吸附 作用 有 很 大 的 影响 ， 所 以 考虑 吸附 作用 时 应 注意 两 个 方面 : ”被 吸附 物 的 极 性 和 溶剂 的 溶解 性 。 亲 和 层 析 与 有 选择 地 加 沉淀 剂 常用 于 分 离 , 但 同时 也 起 到 极 好 的 浓缩 作用 。 其 原理 及 操作 前 已 介绍 ,这 里 不 再 效 述 。 第 二 节 = peel 1-5, 11-18] PPR ee Ta ST) AR ED TR HR OR He ZK BR es TRIS 生化 制备 中 干燥 往往 是 最 后 一 道 工 序 。 生化 产品 含水 容易 引起 分 解 变性 、 影 响 质 、 量 。 干燥 的 目的 是 提高 产品 的 稳定 性 ,使 它 符合 规定 的 标准 ,便于 分 析 、 研 究 、 应 用 和 保 存 。 物料 含水 量 与 空气 湿度 之 间 存 在 着 动态 平衡 。 未 经 密封 的 物料 不 能 保持 干燥 ， 因 为 空气 中 就 含有 水 蒸气 。 要 使 物料 干燥 或 含水 量 低 于 空气 湿度 , 就 应 放 人 密封 容器 内 进行 干燥。 一 、 影 啊 干 燥 的 因素 《一 ) RAR 干燥 过 程 中 ,水 或 溶剂 从 物料 表面 蒸发 。 于 燥 效 率 与 蒸发 面积 成 正比 ， 蒸发 面积 大 ， 有 利于 干燥 。 如 果 物 料 厚度 增加 ,蒸发 面积 减 小 ,不 仅 难 于 干燥 。 还 可 能 因 温 度 升 高 而 引 。256。 ’ ‘ OO EE ea ae ee a a 起 物料 部 分 溶解 、 结 块 , 甚 至 变质 。 (=) FREE 干燥 过 程 先是 表面 蒸发 ,然后 内 部 的 水 分 子 扩 散 至 表面 ,继续 蒸发 。 如 果 干 燥 速 度 过 快 , 表 面 水 份 很 快 蒸发 ,就 使 得 表面 形成 的 固体 微粒 互相 楷 密 粘 结 ,甚至 成 帝 , 妨 碍 内 部 水 份 扩散 至 表面 。 所 以 应 根据 表面 蒸发 的 情况 对 干燥 速 度 进行 适当 控制 。 (=) 物料 所 处 的 状态 ve 静态 时 蒸发 面积 最 小 ,蒸发 效率 很 低 ， 需要 有 充分 的 时 间 使 内 部 水 份 扩散 到 表面 , 才 能 完全 干燥 。 如 用 气流 连续 吹 过 含水 的 固体 物料 使 之 分 散 跳 动 , 可 以 提高 干燥 效率 。 (四 ) 温度 升温 能 使 蒸发 速度 加 快 , 蒸 发 量 加 大 ,空间 相对 强度 降低 ， 从 而 有 利于 干燥 。 但 很 多 生化 物质 不 耐 热 ;所 以 于 燥 的 温度 不 能 高 。 对 于 需 在 低温 下 进行 干燥 的 样品 说 来 ,冷冻 干 RBS HIE Ho j . (五 ) 湿度 物料 所 处 空间 的 相对 温度 越 低 ， 越 有 利于 干燥 。 相 对 温度 如 果 达 到 饱和 ， 则 蒸发 停 止 , 也 就 无 法 进行 干燥 。 降 低 相 对 辟 度 的 办 法 如 下 : 1. 可 以 在 于 燥 器 内 放 人 干燥 剂 吸 水 6 2. 使 气体 流动 更 新 ,如 采用 鼓 风 干 燥 箱 和 烘 房 , 利 用 气流 降低 相对 避 度 。 而 在 哮 雾 干 TRARY ,相对 强度 决定 于 高 压气 流 的 相对 湿度。 如果 降低 气流 的 相对 退 度 (例如 用 干燥 剂 先 吸 去 气流 中 的 水 份 ) ,干燥 效果 更 为 理想 。 (六 ) 压力 蒸发 速度 与 压力 成 反比 , 减 压 能 够 有 效 地 加 快 蒸 发 的 速度 。 还 能 降低 干燥 的 温 度 ,并 使 产品 变 得 蕊 松 。 了 解 上 述 因素 将 有 助 于 选择 和 改进 干燥 方法 。 2, BERTH FE Pe EAS A PR UK A il. 此 法 的 关键 是 选用 合适 的 干燥 剂 。 1. 于 爆 剂 分 类 按照 脱水 方式 可 以 分 为 三 类 : C1) 能 够 与 水 可 逆 地 结合 为 水 合 物 。 例 如 无 水 氧化 钙 、 无 水 硫酸 钠 \ 无 水 硫酸 钙 、 KAA RAD) 等 。 这 类 干燥 剂 不 能 完全 除去 水 ,因为 它们 与 被 干燥 物 之 间 存 在 着 水 分 的 平衡 。 (2) 能 够 与 水 作用 生成 新 的 化 合 物 , 例 如 五 氧化 二 磷 、 氧 化 钙 等 。 、 (3) 能够 吸 去 微量 的 水 及 溶剂 ,例如 分 子 筛 。 e 257。 2. 选用 干燥 剂 除 考虑 效率 外 ， 还 有 以 下 的 要 求 (1) 不 与 被 干燥 物 发 生化 学 反应 《例如 水 解 \ 酸 碱 中 和 或 生成 分 子 化 合 物 等 );(2) 不 溶 于 被 干燥 物 ; 〈3) 对 被 于 燥 物 没有 催 化 作用 ;(42) 干 燥 速 度 快 , 吸 水 量 大 ,价格 合适 。 3. 常用 的 干燥 剂 及 其 性 能 ““(1) 无 水 硫酸 钠 〈NaSO4)， 中 性 \ 价 廉 、 吸 水 量 大 ,但 作用 慢 、 效 力 差 。 NaSO, 在 32.4°C 以 下 吸水 后 形成 NaSO10 HO， 但 超过 该 温度 以 后 ,这 种 水 合 物 即 不 稳定 。 (2) 无 水 硫酸 镁 (MgSO4)， 中 性 ， 效 力 中 等 、 tei 吸水 量 也 大 ， RAGES MgSO,°7H,0, 与 有 机 物 不 发 生 反应 。 (3) 无 水 硫酸 钙 〈CaSO,)， 作 用 快 \ 效 率 高 。 与 有 机 物 不 发 生 反 应 ,而 且 不 溶 于 有 机 BSH, SKE RBENKADW (2CaSO,-H,0), 25°C 时 蒸气 压 为 0.004 毫米 汞 柱 。 缺 点 是 吸水 量 小 ( 仅 为 其 重量 的 6.6 多 )。 可 用 于 进一步 干燥 (在 无 水 硫酸 钠 、 无 水 硫酸 镁 吸水 后 使 用 )。 (4) ARASH (或 钠 )， 可 吸收 水 、 氮 和 胺 类 。 和 氢 氧 化 钾 吸 水 能 力 比 氢 氧化 钠 大 60—80 倍 。 (5) 五 氧化 二 磷 〈P:O;)， 吸 水 ` 效 力 最 高 \ 作 用 非常 快 ,但 是 价格 较 贵 。 (6) 氧化 钙 (Ca0)， 即 生石灰 , 碱 性 ,吸水 后 成 为 不 溶 的 氨 氧 化 物 、 价 廉 。 (7) OF tf: 常用 的 是 沸石 分 子 筛 。 它 们 是 含 铝 硅 酸 盐 的 结晶 ;有 以 下 几 种 : (a) A 型 ,又 可 分 为 : 3A 7. K,Na;[(AIO,),,(SiO; ),.]-27H,O 4A 型 : Nay[CAlO,),CSiO,),.] > 27H,O 5A 型 : CaysNas[CAIO, ),.( SiO; ),2] + 30H,O (b) x # 13 X HY: Nags[ CAlO, )ge( SiO, ) 106] - x H,O 分 子 得 有 高 度 的 选择 吸附 能 力 ， 可 依据 它们 的 孔径 不 同 而 筛 分 不 同 大 小 分 子 的 混合 物 。 分 子 筛 用 前 应 在 550+10° Fat, MEK MS Mit 600% 则 使 晶体 结构 遭 到 破坏 ,导致 降低 或 丧失 吸附 能 力 。 分 子 筛 活化 后 冷 至 200%c， 应 立即 取出 存 表 9-1 分子筛 的 吸附 性 能 age 吸 附 情 w 类 型 GR) 能 TR 附 不 能 吸附 河 天 CO,\NH， REA 3A 时 a2, ee N,, O2, Hy, H,0 分 子 4A 4.2 一 4.7 CH,OH, C,H,OH, CH,;CN . CH,NH,, CH,Cl, CO,, CS, CO, NH,, CH,, C,He 以 及 能 被 3A 吸附 的 物质 5A 4.9 二 5.5 (C;—C,,) EE C:HiCl (CH,),NH, C,H,Cl, CH,CI 以 及 能 被 3A, 4A 吸附 的 物质 13X 9 一 10 小 于 ` 10 埃 的 各 种 分 子 n(C,H,),NH 及 更 大 的 分 子 | (GaN ee ee =". ie ee ys”. ee ee ae ee eee eee Pee 放 干燥 器 内 备用 。 分 子 饰 用 后 活性 降低 , 需 用 水 燕 汽 或 惰性 气体 把 吸附 的 物质 置换 出 来 ， 再 进行 活化 脱水 。 分 子 饰 适 于 吸 除 微量 水 份 ,如 果 样 品 水 分 过 多 应 先 用 其 它 干 燥 剂 吸水 ,再 用 分 子 筛 进 行 干燥 。 几 种 分 子 筛 的 吸附 性 能 如 表 9-1. a a Bi (—) 原理 真空 干燥 即 减 压 干燥 ,与 减 压 浓 缩 原 理 相同 。 (> 装置 包括 真空 干燥 器 \ 冷 凝 管 及 真空 汞 。 干燥 器 顶部 经 活塞 接 通 冷凝 管 。 冷凝 管 的 另 一 SER TRE AICR. RATNER ARERRS THT 放 有 干燥 剂 可 以 干燥 和 保存 样品 。 实验 室 中 常用 的 装置 有 : 1. 真空 干燥 器 (1) 使 用 时 真空 度 不 宜 过 高 , 抽 气 至 盖子 推 不 动 即 可 ,以 免 干 燥 器 被 压 碎 。 新 的 干燥 回 一 般 需 经 耐 压 试验 。 处 理 危 险 或 有 毒物 品 时 ,干燥 器 外 还 应 罩 铁 丝 网 或 用 布 包扎 。 打 开 干 燥 器 取样 时 放 人 空气 不 宜 太 快 ,应 缓 缓 旋 开 活塞 在 通气 口 放 一 小 片 清洁 让 纸 ,也 能 减缓 气流 ,避免 冲 散 样 品 。 (2) 选用 合适 的 干燥 剂 : 常用 的 干燥 剂 及 其 作用 见 表 9-2。 表 9-2 常用 于 燥 剂 及 其 作用 +. RR Fl 吸收 的 溶剂 或 其 它 杂 质 无 水 Na,SO,, MgSO,, CaSO,, 硅胶 水 CaO K. CR ALA KOH, NaOH Kk, CH. ACA. me a7 CaCl. P,0,. > 7K . Be 6 tall Hr ° 醇 、 醚 \ 石 油 醚 \ 葵 ,甲苯 ,氯仿 ` 四 氧化 碳 (3) 待 干 燥 物 所 含 溶剂 如 不 止 一 种 时 ,可 在 干燥 器 内 同时 放 两 种 干燥 剂 (例如 无 水 氧 化 钙 和 硅胶 ,氧化 钙 与 五 氧化 二 磷 、 石 晓 与 氨 氧 化 钠 等 )。 不 应 同时 放 两 种 效率 相差 很 大 而 又 吸收 相同 溶剂 的 干燥 剂 ( 如 五 氧化 二 磷 和 氧化 钙 )。 因 为 这 时 低 效 的 氯 化 钙 不 能 起 作 用 。 必 要 时 可 以 分 两 次 进行 干燥 ， 即 先 用 低 效 的 氯 化 钙 吸 除 大 部 分 水 再 用 高 效 的 五 氧化 二 磷 将 水 除 尽 。 2. 真空 干燥 箱 ”可 以 调控 温度 。 用 时 需 连 接 冷 凝 器 和 真空 泵 。 它 能 处 理 较 大 量 的 样品 ,但 是 被 干燥 物 的 加 量 应 该 适当 , 以 免 流体 起 泡 溢 出 容器 , 造成 损失 和 污染 真空 干燥 箱 。 © 259 « ALR mR TR (—) 概述 冷冻 干燥 CLyophilization), ZBARARRIRBRARKAA, RAE KRM 度 下 使 冰 升 华 , 留 下 干 物 。 冷 浆 干燥 的 原理 可 用 溶 刘 的 三 相 点 相 图 来 说 明 , 见 图 9-26。 图 中 OA 是 固 液 曲 线 ，OB RHA, OC 是 固 汽 曲线 ，O 为 三 相 点 。 当 温 度 在 三 相 点 O 以 下 时 将 压力 降 至 OC RUF. & 剂 就 可 以 由 固 相 直接 升华 为 汽 相 。 例 如 ， 冰 的 蒸气 压 在 一 40sC 时 为 0.1 BAKA, FE—60° 时 为 0.01 BER AREE , GU — 40°C 冰 上 的 气压 降 到 0.01 BARE, Al 态 的 冰 就 吸收 大 量 的 热 〈!1 克 0%c 的 冰 变 成 0%e AY HE BEE 5 图 9-26 “三 相 点 相国 汽 需 吸 涩 580 FE) 直接 升华 为 水 蒸气 。 故 升华 可 以 使 冻结 的 溶液 逐渐 脱水 而 留 下 溶质 干粉 。 因为 冰冻 干燥 是 在 低温 高 真空 度 下 进行 的 ,所 以 样品 不 起 泡 、 KBP 易 取出 ,而 且 成 为 朴 松 的 粉 块 , 极 易 溶 于 水 。 由 于 冰冻 干燥 有 上 述 优点 , 所 以 广泛 用 于 科研 和 生产 , 适 于 对 热 敏 感 \ 易 吸湿 、 易 氧化 及 溶剂 蒸发 时 易 产 生 泡沫 而 引起 变性 的 制品 (和 蛋 租 TB VBR aR BAS) 但 并 非 所 有 的 生化 物质 都 能 在 冻 王 时 稳定 。 应 该 先 用 小 量 做 试验 ,确证 冻 干 对 该 种 物质 无 害 以 后 再 进行 大 量 处 理 。 (=) 装置 核心 部 件 是 具有 足够 抽 气 容量 的 真空 汞 。 为 了 保持 泵 的 效率 ,防止 蒸气 进入 和 泵 内 ,在 泵 前 应 该 有 吸收 燕 气 的 装置 ,内 装 于 燥 剂 (如 P.O, 和 KOH) 用 以 吸水 。- 冷 阱 也 是 整个 装置 的 主要 部 件 。 冷 阱 外 转 可 用 化 学 制冷 或 机 械 制 冷 。 FEO eB Hl Fae as 麦 氏 真空 表 。 1. 实验 室 希 备 冻 千 品 的 简易 方法 C1) 将 物料 置 培养 下 内 (厚度 不 超过 1 厘米 ) ,在 冰箱 内 冻 成 硬块 (有 些 物料 需 在 深度 低温 下 迅速 江 硬 )。 准 备 真空 干燥 器 ,内 置 两 个 培养 亚 分 别 放 固体 KOH (或 NaOH) 及 P2Os 一 _， 真 空 油泵 | AERO ae meg ss 固体 蛋白 质 溶液 PO; -上 sai GS) wR 图 9-27 ”实验 室 冻 干 装置 C1) 图 9-28 实验 室 冻 干 装 置 (2) * 260。 P,05. 迅速 取出 冻 块 放大 干燥 器 ,干燥 器 通过 装 有 P.O, 的 干燥 管 与 真空 泵 相连 , 管 中 要 有 足 量 的 P0;， 两 端 塞 棉花 ,注意 切 勿 使 P0， 和 水 进入 油泵 。 拍 豪 皇后 ， 经 过 5 一 10 小 时 可 得 冻 干 品 , 见 图 9-27。 (2) 物料 置 圆 底 烧 瓶 中 ,将 瓶 刘 人 干冰 -乙醇 混合 物 内 ， Ae RUBE RRB, 然后 广 接 高 真空 度 的 真空 泵 ， 见 图 9-28。 连接 泵 的 管道 口径 不 宜 太 小 ,否则 降低 冻 于 效率 , 减 还 时 加 慢 可 以 加 速 蒸 发 。 但 以 不 使 试 料 解 头 为 限 ， 烧 瓶 外 面 通常 蒙 霜 。 如 果 霜 层 开 始 融 化 \ 冻 块 起 泡 应 即 停止 。 检 查 和 排除 故障 后 将 试 料 重新 冻结 ,继续 冻 干 。 如 果 霜 层 全 部 融 化 ,用 手 接触 烧 瓶 不 感觉 冷 ， 就 表明 升华 已 经 停止 。 但 可 能 还 有 冰 残 存 于 物料 内 部 ,因此 需 适 当 升 温 或 延长 抽 真 空 时 间 以 彻底 陪 水 。 3 学 微量 冻 干 :简便 易 行 ， 效 率 较 高 。 冻 干 30 毫升 以 下 水 湾流 仅 需 2 一 3 小 时 。 其 装置 见 图 9-29。 它 由 A 与 B 两 部 分 组 成 ，A 用 于 冷却 与 贮存 抽出 的 溶剂 ， 支 管 C 与 全 DER. 卫 为 真空 活塞 。 也 为 盛 放样 液 的 容器 。 了 为 盛 放 制 冷 剂 的 保温 瓶 , 其 中 放 干 冰 - 丙 酮 混合 物 或 冰 盐 混合 物 或 液 氮 等 冷却 剂 。 使 用 时 先 将 溶液 置 E 中 ,用 冰 = 盐 浴 或 丙酮 = 干冰 洽 冷 至 固态 。 EAMEDSRSER 联接 。 开 动 真 空 泵 (可 以 用 2X-1 型 旋 片 式 真 空 泵 ) 以 后 , 旋 开 活塞 D。 王 中 冻 块 内 的 溶剂 升 华 ; 册 支 管 C 切 向 进入 并 沿 媒 旋 线 通过 A ,了 E 的 冷却 作用 使 溶剂 蒸气 沿 A 的 周 壁 凝聚 。 15 分 钟 后 关闭 D, 数 小 时 后 王 中 溶剂 全 部 升华 至 A， 旋 开 DLA BARA, E PR RF iho 几 点 说 明 : 《a) 如 果 装 置 密闭 ， 待 真空 度 恒 定 以 后 就 可 关闭 活塞 D， 再 停 真空 汞 。 冷 洽 F BAK 温 ( 一 80% 一 一 20%C)， 以 保证 继续 冻 干 。 此 时 系统 内 真空 度 等 于 该 种 冷 浴 的 温度 条 件 下 王 中 ARIAS 《b7 待 冻 干 物 中 如 果 混 有 少量 低 凝 点 溶剂 Behe) SS es 《丙酮 \, 甲 醇 \ 乙 酸 乙 酯 等 ), 则 需 重复 以 下 操作 : 图 9-29” 半 微量 冷冻 干燥 装置 结构 简 图 先 冷 却 下 使 内 容 物 冻 固 , 然 后 打开 D 抽 真空 , 待 真空 度 恒 定 以 后 关闭 D 使 下 升 到 室温 , 再 RAE, 反复 操作 2 一 3 次 ,可 除去 混杂 的 盗 剂 ,否则 样品 不 易 冻 干 。 (c) 冻 干 速度 与 冷 阱 A 的 温度 有 关 。 A 与 瑟 的 温差 越 大 , 冻 干 效率 越 高 。 例如 要 将 20 晕 升 某 物 质 的 水 溶液 冻 干 ，F 处 用 干冰 -丙酮 混合 物 制 冷 ( 约 —60°C) 只 需 2 一 3 小 时 ; 如 用 冰 盐 混合 物 制 冷 ( 约 一 15%c)， 则 需 8 小 时 。 (d) 各 种 溶液 冻 干 效率 还 受 该 溶剂 的 汽化 热 等 因素 影响 。 汽化 热 越 小 , 冻 干 效率 越 高 。 例 如 ，20 毫升 某 物 质 的 茶 溶 六 ， 用 干冰 -丙酮 制冷 ; 1 小 时 即 冻 干 〈 葵 的 汽化 热 比 水 N\)o 2. 旋转 冷冻 离心 式 冻 于 机 (Spin-Freeze Centrifugal Freeze Dryer) 用 这 种 装置 可 以 冻 干 小 量 的 样品 而 无 需 制 冷 设 备 。 该 装置 与 真空 泵 相连 ,高 速 旋 转 中 的 样品 上 面 的 压 力 降低 导致 迅速 蒸发 。 利用 蒸发 的 冷却 作用 可 以 使 样品 降温 直至 冻结 。 在 和 用 的 冻 干 。261 。 机 中 * 如 果 使 样品 上 面 的 压力 降低 就 会 引起 沸腾 和 起 泡 , 导 致 损失 样品 。 然 而 旋转 冷冻 装 置 利 用 离心 力 可 以 防止 起 泡 而 使 样品 的 损失 最 少 。 旋转 产生 的 离心 力 (大 于 重力 五 倍 以 上 ) 还 有 一 个 好 处 就 是 能 够 迫使 部 分 样品 沿 管 壁 升 高 ,从 而 减少 样品 的 厚度 \ 增 加 表面 积 。 并 不 需要 在 整个 冻 于 过 程 中 连续 旋转 。 谍 干 装 置 中 的 定时 器 可 以 控制 旋转 时 间 , 样 品 冻结 后 转子 停止 旋转 而 冻 干 过 程 仍 继 续 进 行 。 3. 高 效能 多 用 途 的 实验 室 多 用 冰冻 干燥 机 “” ILG-3 型 实验 室 多 用 冰冻 干燥 机 采 计 自动 控制 技术 ,操作 方便 。 它 是 在 小 型 半导体 内 冷 式 冻 干 器 的 基础 上 改进 设计 的 ,用 于 冰 冻 于 燥 的 最 大 试 样 量 可 以 达到 500 毫升 (12 一 18 小 时 内 干燥 ,用 13A BOTT RA. 可 以 再 生 ) 此 外 还 能 用 于 : 〈1) 室 温 真空 干燥 ; (2) 升温 真空 干燥 (在 一 30? 一 士 50scC 范围 内 无 极 可 亩 );(3) 低 温 冷 藏 (容积 50 升 ,最低 一 25%*C); (4) 真 空 低温 贮存 ;《5) CAC Fo 4. 大 型 冻 干 装置 “示意 图 见 图 9-30。 LE aS Sas to ttii4y Ps Ly fs eer 图 9-30 ALATRERBA | 1. 装 待 干燥 物 ; 2. 真空 于 燥 箱 ; 3. 冷 凝 器 ; 1. HER; 5. 前 级 泵 ; 6. 隔 离 阔 一 般 由 制冷 系统 、 真 空 系统 、 加 热 系 统 和 电器 仪表 控制 系统 组 成 。 主 要 部 件 为 干燥 箱 、 凝 结 器 ,冷冻 机 组 、 真 空 汞 组 和 加 热 装置 等 。 制品 的 冻 干 在 干燥 箱 中 进行 。 BAK 可 用 针 铝 板 制 成 , 冷 管 及 热管 浇注 其 中 ,分 别 用 于 冷却 或 加 热 制品 。 凝 结 器 内 装 螺旋 状 冷 气 盘 管 , 使 其 工作 温度 低 于 于 燥 箱 内 制品 的 温度 CTIA 60°C). MRR RH ARSRIS 增 压 泵 (有 罗 茨 真空 泵 ) 串 接 , 用 以 抽空 真空 系统 。 制 冷 系统 的 冷冻 机 并 联 使 用 ,根据 负 告 情 况 可 以 只 开 一 台 也 可 同时 开 二 人 台 或 三 台 。 加 热 装 置 由 油泵 、\ 油 箱 , 电 吉 热 器 等 组 成 循环 管 路 。 控 制 台 控制 全 机 的 电动 仪表 。 利 用 铀 热电 阻 与 动 图 式 温 度 指示 仪 对 干燥 箱 中 各 层 的 板 温 、 制 品 温 度 \ 油 温 及 凝结 器 温度 进行 下 测 。 电阻 真空 计 能 够 测量 气体 的 全 压 , 并 具有 反应 时 间 快 和 适 于 遥测 等 优点 已 在 冻 王 机 中 广泛 应 用 。 例如 我 国 LZG-40 型 冷冻 干燥 机 就 是 采用 电阻 真空 计 的 。 (=) 冻 于 注意 事项 1. 样品 溶液 C1) 样品 最 好 溶 于 水 ,不 含有 机 溶剂 ,因为 有 机 溶剂 降低 冰点 * 使 冻 块 易 融 。 BAR 和 酶 溶液 的 冻 块 融化 后 再 经 减 压 则 引起 大 量 泡沫 导致 变性 。 而 且 低 沸点 溶剂 (乙醇 或 欣 酮 ) 的 蒸气 压 相当 高 ,不 易 凝 结 ;大 部 分 蒸气 将 经 过 冷 阱 进入 泵 内 ，, 冷凝 于 条 和 中 ， HAR 。262。 7 编写 组 : 有 机 化 学 实验 技术 ,科学 出 版 社 (1978) C2) 南京 药学 院 主编 : 药剂 学 ,人 民 卫 生出 版 社 〈1978) C3) 中 山大 学 生物 系 生 化 微生物 学 教研 室 编 : 生化 技术 导论 ,人 民 教 育 出 版 社 (1978)。 C4) 阿南 功 一 等 编 : 基础 生化 学 实验 法 [2], 抽 出 .分离 精制 , 丸 善 株式 会 社 (1974) £5) 王 世 中 主编 : 免疫 化 学 技术 ,科学 出 版 社 (1980) [6 ] Sixeak MIR: 生物 化 学 与 生物 物理 进展 1 ，71(1980) £7) 中 国 科 学 院 北 京 植物 研究 所 七 室 生 化 组 修理 组 : 生物 化 学 与 生物 物理 进展 , 2 22(1975) (8) 中 国 科学 院 上 海 生 物化 学 研究 所 三 室 : 生物 化 学 与 生物 物理 学 进展 ;36(1975) {9] Biomedical Products, Vol. 5，No. 2, p. 58(1980) [10] Freifeider, D. M., Physical Biochemistry Application to Biochemistry and Molecular Biology, W. H. Freeman and Company (1976) {1l] “微生物 工程 > 编写 组 : MAY LEC A), LRN SRA MR (1982) f12] Ka: 医药 工业 ,1 ;44 一 45(1979) 113) ”上海 轻工业 设计 院 \ 上 海 医药 工业 研究 院 编 : 干燥 技术 进展 第 一 分 册 ， 综 述 ;第 四 分 册 , 暑 雾 干 燥 (1977)， {14] ”Jakoby,W. B. (Fd.), Methods in Enzymology, Vol. XXII, Academic Press (1971) * 267 [15] Webb, F. C., Biochemical Engineering, D. Van Nostrand Company Ltd. London (1964) [16] 中 国药 学 会 生化 药物 学 会 ;商业 部 生化 药物 情报 中 心 站 : 1981 年 全 国生 化 药物 学 未 会 议 专题 报告 集 (一 )。 生 化 药物 进展 (1981) F C17] 高 业 部 脏 器 生化 制药 情报 中 心 站 编著 : 动物 生化 制药 学 *\ 人 民 卫 生出 版 社 (19817) [18] Freeze Dry Apparatus，Labconco p. 24(1978) ° 2686 第 十 章 样品 的 保存 o TR 第 一 节 Havre srhmRenxAr 生化 药物 或 生物 制剂 的 正确 保存 ,在 生物 化 学 以 及 医药 科学 领域 中 都 有 重要 的 意义 。 不 适当 的 保存 不 仅 造 成 经 济 上 的 损失 , 而 且 也 给 生化 研究 和 应 用 带 来 很 大 影响 。 特别 是 一 些 用 于 大 分 子 结构 和 功能 研究 的 制剂 或 药品 ,以 及 分 析 用 标准 生化 样品 ,要 求 更 为 严格 的 保存 条 件 , 防 止 失 活 \ 失 效 或 变质 。 要 保存 好 样品 , 首先 就 要 对 样品 变质 的 一 般 规律 以 及 样品 的 理化 性 质 有 足够 的 了 解 ,才能 确定 某 种 样品 的 最 适 保存 条 件 。 影响 生化 药物 或 制剂 质量 的 因素 很 多 ,主要 有 空气 ;温度 \ 水 分 、 光 线 、 酸 碱 度 、 样 品 的 状态 、 微 生物 活动 保存 时 间 和 容器 等 。 这 些 因 素 可 单独 起 作用 ,但 更 多 情况 是 协同 作用 ， 互相 影响 ,从 而 加 速 样品 的 变质 破坏 。 每 种 生化 药物 或 制剂 的 理化 性 质 和 对 上 述 因 素 的 稳定 性 都 不 相同 ,必须 结合 具体 情况 , 抓 住 主 要 矛盾 , 选择 适当 的 贮存 环境 和 条 件 。 现 将 影响 样品 质量 的 几 个 主要 因素 分 述 如 下 : 1. 空气 ，，” 空气 的 影响 主要 和 潮解 、 微 生物 污染 和 自动 氧化 等 有 关 。 空气 中 的 微 生 物 污染 可 以 使 样品 腐败 变质 ， 吸 湿 后 的 样品 除 引 起 潮解 变性 外 也 造成 微生物 活动 的 有 利 环境 。 某 些 具 有 较 强 还 原 性 的 样品 , 露 置 于 空气 中 不 久 便 氧化 变质 。 如 维生素 C 的 失效 、 油脂 的 酸败 、 并 基 酶 的 失 活 等 。 某 些 样品 (特别 是 波 体 桩 品 或 半成品 ) 在 空气 中 的 氧化 是 一 种 自动 氧化 过 程 , 是 由 空气 中 的 氧 自发 引起 的 游离 基 链 式 反应 。 自动 氧化 的 机 理 很 复 杂 , 包 括 氧化 .还 原 、 聚 合 \, 水 解 等 。 氧 浓度 、 水 、pH、 温 度 、 紫 外 线 等 对 自动 氧化 均 有 影 Hl o : 2: 温 度 每 种 样品 均 有 其 稳定 的 温度 范围 ， 温 度 升 高 有 利于 许多 物理 和 化 学 变化 《如 温度 升 高 10%c， 氧化 反应 约 加 快 数 倍 , 酶 促 反 应 约 增加 1 一 3 Ho SOC 以 上 蛋白 质 容 易 变性 等 等 》 不 利于 物质 的 稳定 。 同 时 ,适宜 的 温度 (如 室温 ) 又 是 微生物 感染 的 重要 条 件 。 而 低温 却 可 以 抑制 氧化 \ 水 解 等 化 学 反应 和 微生物 生长 ,使 微生物 处 于 生命 迟缓 和 隐 藏 状态 。 故 大 多 数 生化 样品 选择 低温 保存 ,稳定 性 可 大 大 增加 。 3. 水 份 ” 水 份 也 是 影响 样品 质量 的 主要 因素 之 一 。 这 里 所 指 的 水 份 , 可 能 来 自 样 品 本 身 , 也 可 能 是 样品 吸湿 的 结果 。 水 份 除 直接 参与 水 解 , 酶 解 . 水 合 和 加 合 等 反应 外 ,还 能 加 速 氧化 * 聚 合 \ 离 解 和 霉 坏 。 蛋 白质、 核酸 等 大 分 子 含水 量 太 高 时 ,会 导致 高 级 结构 松 散 ,稳定 性 下 降 而 易于 失 活 。 :因此 ,为 避 开 或 削弱 水 分 子 的 影响 ,保存 固态 样品 要 密闭 , 液 态 样品 须 冻 结 或 加 稳定 剂 。 4. 光 线 。” 某 些 分 子 可 吸收 一 定 波长 的 光 , 反射 或 透 过 其 它 光 波 的 光 。 样品 吸收 光 后 ,使 分 子 活化 ,内 能 增加 ,不 利于 样品 保存 。 日 光 中 的 紫外 线 能 量 大 ,对 生化 药物 或 制 痢 的 影响 最 大 。 在 不 同 条 件 下 ,样品 对 光 的 敏感 性 各 不 相同 , 受 光 作用 而 发 生变 化 的 程度 也 。 269。 不 同 。 样品 受 光 催 促 的 反应 有 变色 、 氧 化 和 分 解 等 ,通称 光 化 作用 , 其 中 重要 的 是 在 有 和 氧 参 与 下 的 自动 氧化 作用 。 光 化 作用 比较 复杂 。 如 肾上腺 素 在 空气 中 受 光 催化 进行 自动 氧化 灶 , 可 能 涉及 复杂 的 氧化 \ 聚 合 过 程 ,颜色 由 淡 黄 一 淡 红 一 褐色 一 棕 黑 色 。 se APN * +) es = 7 Joa eae HNGH, ef tele i 并 BERR RA ERR 肾上腺 素 红 全 |CTT 5 mci tb cu, = ERAS 维生素 C 的 光 化 作 用 也 涉及 一 系列 的 氧化 \ 水 解 等 反应 。 DO 一 C o=C— O=C—OH de a celine ats eae eee ele Ee Mig re et od nites He wih ae i HC OH Ho—cH HO oH HO- cH CH,OH CH,OH CH,OH 维生素 C 脱 氢 抗坏血酸 二 酮 古 乐 糖 酸 COOH COOH ae COMES TO eae HO—CH COOH 草酸 L- 丁 糖 屋 el 因此 ,保存 光敏 感 的 样品 时 ,必须 注意 吉 光 。 5. BRE 酸碱度 对 液态 样品 的 保存 影响 较 大 。 不 同样 品 的 稳定 pH 不 同 5 可 由 实验 求 得 或 从 文献 资料 查 得 。 液 体 样品 保存 时 ,控制 pH 常用 缓冲 剂 ， 但 选择 缓 首 剂 未 能 只 考虑 缓冲 容量 的 大 小 , 还 要 注意 缓冲 剂 的 种 类 和 浓度 对 样品 稳定 性 的 影响 。 Me 浓度 的 毛 霉 素 液 用 磷酸 盐 和 醋酸 盐 缓冲 剂 调 pH5.95 时 ,半衰期 分 别 为 6.3 和 10.9 小 时 ， 差别 很 大 。 青 霉 素 用 柠檬 酸 盐 而 不 用 磷酸 盐 和 栈 酸 盐 作 缓 冲剂 ， 因 前 者 催化 水 解 的 速度 小 得 多 522。 某 些 以 无 机 磷 或 有 机 磷 作 底 物 或 反应 产物 的 酶 ， 不 宜 用 磷酸 和 焦 磷 酸 缓冲 Bio si 6. 时 间 ”按照 现代 技术 ,生物 或 生化 料 品 的 永久 存活 仍 无 法 办 到 ,不 同样 品 多 有 其 不 同 的 有 效 期 。 因 此 ,保存 的 样品 需要 作 定 期 检查 .处理 或 更 换 。 第 二 节 ”样品 保存 的 一 般 方法 1. 密闭 保存 凡 露 置 在 空气 中 受 水 分 、 空 气 的 影响 易 发 生 吸水 水 解 (如 含 .RCO 一 、 a 270。 HNC、RSO, 一 等 基 团 的 样品 /或 潮解 (如 含有 Br-、CL、S07、SCN-、NOi、 一 COoH、 >so 基 团 的 样品 ) 或 聚合 (如 含 一 CHO、 AG =CK C 三 C 一 基 团 的 样品 )\. 吸 收 Ca， 而 碳酸 化 ( 含 OH-、R, 一 N+ 一 OH 的 样品 )、 易 风化 〈 含 结 蜡 水 的 样品 )、 挥 发 或 霉 坏 的 ， 以 至 几乎 所 有 的 样 吡 ,都 可 用 密闭 保存 方法 ,以 防止 空气 及 水 份 的 侵入。 SURI. REL 密闭 保存 最 理想 的 容器 ,固体 、 液 体 均 可 采用 。 有 些 极 易 氧 化 的 桩 品 ,瓶装 时 应 尽量 装 满 ， 少 留 空隙 ,以 减少 瓶 内 氧气 的 相对 含量 ,加 塞 RS) 后 蜡 封 保存 。 如 果 样 品 量 少 ;或 为 了 取样 方便 及 避免 取样 时 桩 品 明 水 污染 ,可 用 安 额 或 小 瓶 分 装 。 有 时 需 充 N; 或 抽 真 空 后 再 保存 。 易 吸湿 发 霉 (如 胃 和 蛋白 酶 、 胰 蛋白 酶 \ 淀 粉 酶 及 一 般 含 糖 和 蛋白 质 的 不 纯 制 剂 ) 或 吸 缠 后 易 分 解 失效 (如 青霉素 、NAD 等 ) 的 样品 ,应 放 人 内 盛 无 水 CaCl, EB. P.O, SF 燥 剂 的 干燥 器 中 密闭 保存 。 某 些 样品 吸 误 后 ,经 检查 如 不 变质 , 或 未 被 其 他 杂质 污染 , 干 爆 后 仍 可 再 用 (如 糖 类 )。 2. 低温 保存 ”生化 药物 或 制剂 一 般 对 热 敏感 ,特别 是 生物 大 分 子 , 性 质 很 不 稳定 ， 容易 受 温度 等 环境 因素 的 影响 而 变性 失 活 。 对 热 敏 感 的 生物 活性 物质 及 易 水 解 、 氧 化 的 物质 的 保存 ,一 般 是 温度 愈 低 傅 好。 低温 保存 是 多 数 样品 保存 的 必要 手段 ,但 由 于 不 同样 是 具有 不 同 理化 性 质 , 耐 热 性 不 全 相同 ,必须 根据 样品 的 具体 特性 选择 保存 温度 。 例 如 木 ME Awe Hei 100°C 干 热 3 小 时 ,甚至 在 溶液 中 对 热 也 极 稳定 s 抗菌 素 、 抗 血清 和 胎盘 球 蛋 自 等 血清 类 制剂 ,在 低温 冰冻 下 保存 最 稳定 。 但 一 些 对 低温 敏感 的 样品 ,保存 温度 不 能 太 低 。 此 外 还 要 注意 ,用 玻璃 瓶 或 安庆 低温 保存 液体 时 , 不 能 装 满 容器 , 以 防 液体 冻结 时 膨胀 ;使 瓶子 破裂 。 3. 固态 干燥 保存 ”， 液体 样品 的 保存 虽然 可 省 去 较 费时 的 干燥 处 理 ， 但 由 于 水 的 存 在 ,使 样品 稳定 性 大 大 下 降 。 加 稳定 剂 可 延长 保存 期 ,又 给 使 用 带 来 许多 的 不 便 。 Ait, 样品 通常 都 制 成 结晶 ,或 经 干燥 以 至 冰冻 干燥 成 固体 后 再 干燥 保存 。 固态 千 燥 保存 排除 了 水 导致 的 不 稳定 , 创造 了 不 利于 微生物 生存 的 条 件 。 一 些 在 水 溶液 牛 容易 变性 或 水 解 、. 氧 化 的 样品 ,在 干燥 或 低温 干燥 下 都 比较 稳定 。 如 干燥 青霉素 在 完全 无 水 条 件 下 可 以 长 期 保持 效 价 不 变 , 但 吸湿 或 含水 在 10 和 以 上 时 即 分 解 失 效 aae A i, 干燥 后 的 固态 样品 须 瓶 装 并 放 人 干燥 器 内 ，, 必要 时 置 冰箱 内 保存 。 干燥 保存 是 最 十 老 ;最 普遍 采用 的 方法 ,在 生化 药物 和 制剂 的 保存 中 占有 重要 的 地 位 。 ABR 凡 见 光 引 起 分 解 、 氧 化 或 变色 的 样品 , 均 应 置 棕色 玻璃 瓶 或 安 颜 内 如 光 保 在。 棕色 玻璃 能 阻 亚 某 些 波长 的 光线 ;特别 是 紫外 线 的 透 过 。 如 没有 棕色 瓶 , 也 可 用 Ma RRR, URE. 对 光 特 别 敏 感 者 需 用 棕色 瓶 再 外 包 一 层 黑 纸 保存 。 如 上 述 肾上腺 素 、 维 生 素 C 等 都 是 对 光 极 敏感 的 物质 。 维生素 B 干 品 较 稳 SE, 但 液态 遇 光 也 极 易 变 质 , 在 碱 性 下 生成 光 黄 素 ,， 中 性 或 酸性 下 生成 光 色素 。 BAR (如 葡萄 糖 氧 化 酶 ) 在 有 氧 存在 下 也 受 光 的 影响 。 这 些 物 质 需 用 棕色 瓶 密封 后 置 冷 处 避 光 保存 ,同时 还 要 设法 减少 参与 光 化 反 应 的 其 它 因素 (如 O,、H;O、 温 度 、pH) 的 影响 。 E. 添加 稳定 剂 ”液态 保存 常 需 根据 不 同样 品 的 要 求 落 加 某 些 辅助 成 份 , 如 防腐 剂 、 抗 氧 剂 \ 酸 碱 调 节 剂 等 。 这 些 物 质 对 样品 起 一 定 稳定 作用 , 故 通称 为 稳定 剂 。 * 271° C1) 防腐 剂 : 用 于 抑制 微 主 物 生长 ,繁殖 的 防腐 剂 有 :;， 乙醇 \ 酚 类 和 和 毛 酚 类 (如 苯酚 、 毛 甲 酚 六 有 机 和 汞 化 合 物 ( 如 硫 柳 秒 、 硝 酸 葵 秒 、 栈 酸 茶 汞 )、 对 羟基 葵 甲 酸 酯 类 (如 对 羟基 茶 ARH FR CEES. 选择 防腐 剂 应 以 防腐 能 力 和 对 样品 有 无 影响 为 依据 例如 酶 的 保存 不 能 用 汞 和 其 它 重 金属 化 合 物 作 防腐 剂 , 因 它们 对 酶 有 毒害 作用 。 酶 和 一 般 蛋 白质 的 防腐 剂 常用 甲苯 、NaNs、 和 氯仿 \ 百 里 酚 等 。 (2) 抗 氧 剂 : 抗 氧 齐 本身 是 较 强 的 还 原 剂 ,容易 氧化 。 有 和 氧 存在 时 ,其 自身 首先 被 氧 比 ;, 从 而 保护 并 延缓 了 样品 的 氧化 。 能 强烈 地 与 样品 争夺 !O; 的 物质 ,或 能 固定 或 鳌 合 金属 离子 的 物质 都 可 以 作 抗 氧 剂 。 抗 氧 剂 选 择 的 原则 是 : ， 它 不 应 与 样品 的 主要 成 分 作用 ， Mo 本 身 是 还 原 剂 时 , 它 的 标准 还 原 电 位 要 比 桩 品 低 , 而 且 低 浓度 下 也 应 有 抗 氧 能 力 5 常用 的 水 溶性 抗 氧 剂 有 :NaSQ;、NaHSO;,、 焦 亚硫酸钠 、 硫 代 硫 酸 钠 、 半 胱 氨 酸 ,维生素 C3 Hi RPRERS., SORBED: BATRA WEB. SEROMA 二 坡 丁 基 对 甲 茶 酚 、 集 性 没食子 酸 、 去 甲 二 氢 合 疮 酸 等 。 例 如 斑 基 酶 用 半 胱 氛 酸 作 抗 草 剂 ,维生素 , A、D、 油 脂 等 可 用 没食子 酸 丙 酯 或 对 羟 板 于 茄 香 醚 等 作 抗 氧 剂 9 样品 中 微量 金属 杂质 (如 Cutt, Fet**) 是 自动 氧化 或 水 解 作 必 的 催化 剂 ,起 促进 芝 解 的 作用 ,通常 可 加 入 基 些 金属 整合 剂 或 沉淀 剂 来 防止 。 例 如 维生素 C 在 航 微量 的 Cut+、 Fettt、Mnt+ 存 在 下 便 能 被 氧化 和 水 解 ， 但 如 加 入 磷酸 三 钠 与 金属 离子 作用 即 能 抑制 分 解 。 最 常用 于 结合 金属 的 抗 氧 剂 是 EDTA 钠 盐 (1 一 3 x 10° M), 在 广 范 的 pH 范围 内 它 都 能 与 样品 液 中 许多 金属 离子 整合 ,生成 稳定 的 水 溶性 五 合 物 。EDTA 已 广泛 用 作 酶 、 搞 坏 血 酸 肾上腺 素 、 青 霉 素 等 的 抗 氧 剂 , 有 效 地 防 站 或 延缓 了 氧化 分 解 作用 。 (3) 情 气 填充 剂 : 充填 情 气 是 稳定 样品 , 防止 氧化 的 有 效 方 法 之 一 。 少量 易 氧 北国 体 祥 品 可 用 安 靖 充 填 情 气 保存 。 如 果 是 液体 样品 ,也 可 用 情 气 驱除 液 中 残存 的 氧 , 然 后 再 充气 保存 ,此 时 不 加 任何 抗 氧 剂 , 效 果 也 很 理想 。 样品 充气 保存 的 例子 很 多 ,站 细 胞 色素 c HFS Ny 保存 ,维生素 C 的 充 CO, 保存 等 。 但 不 是 所 有 样品 都 能 充 情 气 保存 》 如 维 生 素 开 充 惰 气 后 反 使 分 解 速度 加 快 ,使 用 时 必须 加 以 注意 6. 制 成 高 稳定 性 的 盐 类 或 衍生 物 “许多 样品 由 于 水 解 或 氧化 会 使 稳定 性 下 降 租 制 成 盐 类 或 对 其 结构 进行 化 学 修饰 改造 后 ,效力 不 降 , 稳 定性 却 得 到 了 很 天 的 改善 》 如 青 BACARRA, 维生素 C BIB HiME CA ALE AE, (ARE 大 提高 了 。 | PLOW RERT ERE LADIES), BARU PSH: (1) 保存 的 样品 一 律 要 贴标签 ,标明 样品 的 名 称 、\ 制 造 单位 、 含 量 CEES 效 价 或 活 竹 )\ 落 加 成 份 . 日 期 \ 有 效 期 或 使 用 期 ,以 及 必要 的 附加 说 明 。 (2) 定期 检查 ,如 有 变质 者 ;应 立即 查找 原因 ,并 作 及 时 处 理 。 凡 保存 期 过 长 的 样品 均 应 愤 用 或 经 检验 、 处 理 后 再 用 。 变 质 样品 一 般 可 用 眼 ` 口 . 鼻 从 外 观 上 (如 发 霉 \ 变 色 、 沉 淀 、 挥 发 ,酸败 ` 气味、 潮解 \ 粘 结 等 ) 判 断 ,但 也 有 的 外 观 不 变 而 已 失效 者 ; 切 幻 大 意 5 (3) 不 同样 品 应 按 性 质 分 类 保存 。 如 干燥 样品 和 液态 样品 不 宣 一 起 存放 ， BERN 品 应 与 其 它 样 品 分 开 保存 等 。 ¢ 2726 B= ”各 类 生化 物质 的 保存 ~. BaRWRE 蛋白 质 失 活 受 多 种 理化 因素 的 影响 ,保存 时 必须 根据 其 不 同 特性 , 采用 不 同 措施 , 以 仿 止 变性 或 降解 。 蛋白 质 的 保存 方 污 如 下 : 《一 ) 液态 保存 1. 在 低温 下 保存 “蛋白 质 对 热 敏 感 , 温 度 越 高 5 ,稳定 性 越 关 =, At, 低温 保存 蛋白 质 溶液 在 绝 大 多 数 情况 下 是 有 利 的 。 一 般 蛋 白质 越 纯 ， 其 稳定 性 越 差 。 RS 液 ,对 热 甚 不 稳定 (少数 酶 例外 ， 如 核糖 核酸 酶 能 短期 煮沸 ， 胰 蛋白 酶 能 在 稀 HCL 中 耐 90*C， 及 某 些 高 温 细菌 产生 的 耐 热 性 酶 等 ), 多 数 在 35—40°C 以 上 就 会 失 活 ， 难 以 长 期 保 存 ,在 普通 冰箱 中 通常 也 只 能 保存 一 周 左右 。 因此 ， 液态 蛋白 质 样品 常常 在 一 5 一 一 10"C WU —20C 以 下 冰冻 保存 比较 理想 ,有 了 时 经 数 月 或 数 年 仍 保留 大 部 份 活性 中 。 但 是 ,各 种 蛋白 质 的 耐 热 性 不 同 , 并 非 温度 越 低 , 保存 越 稳定 。 例如 鸟 肝 丙 酮 酸 羧 化 酶 对 冷 敏 感 ; OC 左右 稳定 ,低温 反而 容易 失 活 。 而 南北 极 中 革 些 鱼 类 的 抗 冻 蛋 白 ,在 极 低温 度 下 仍 保留 其 活性 。 羧 肽 酶 、 脂 蛋白 和 某 些 抗体 经 冰冻 再 融 解 后 , 即 完全 变性 破坏 。 但 某 些 酶 如 酿 酶 液 经 冻 融 后 ,活性 反而 增加 , 这 可 能 是 由 于 酶 颗粒 发 生 了 散 解 ,表面 积 增 大 ,暴露 出 更 多 活性 基 团 的 缘故 。 反复 冰冻 和 融化 一 般 会 导致 蛋白 质变 性 ， 必 须 尽 量 吕 免 &a。 为 了 防止 冻 融 损伤 ,冰冻 保存 要 求 样品 浓度 大 \、 体 积 小 表面积 大 、 含 盐 低 、 冻 结 迅 速 、 一 70sc 以 下 保存 ,用 时 迅速 融化 等 。 2. 在 稳定 pH 下 保存 ”多 数 蛋 白质 只 有 在 很 狭 窑 的 _ pH 范围 内 才 稳 定 ， 超 出 此 范围 即 迅速 变 狂 。 如 鲸 肌 红 蛋 和 白 在 等 电 点 pH6.8 附近 时 稳定 ,， 卵 类 粘 蛋 白 在 中 、 酸 性 条 件 下 对 热 稳定 四 。 和 蛋白 质 较 稳 定 的 _pH' 一般 在 等 电 点 。 因 此 ;酸性 .中 性 和 碱 性 蛋白 酶 的 稳定 pH 分 别 为 pH2 一 6、pH6 一 9 和 pH5 一 10.50。 但 也 有 例外 ,如 血浆 蛋白 质 的 等 电 点 :pH4.6， 而 其 稳定 :pH 为 6.8, 稳定 pH 与 其 等 电 点 并 不 相同 。 酶 的 最 稳定 PH 也 并 非 是 酶 反应 的 最 适 pHy 二 者 有 时 可 相差 二 至 数 个 pH 单位 。 所 以 保存 液态 蛋白 质 样品 峙 ,应 小 心 调 到 其 稳定 pH 范围 内 。 3. 在 高 浓度 下 保存 ，， 液态 蛋白 质 易 受 水 化 作用 影响 ， 保 存 时 浓度 不 能 太 稀 Co 1 毫克 /毫升 以 下 ), 否 则 将 可 能 引起 亚 基 解 离 , 表 面 变性 或 器 壁 吸附 。 一 般 蛋白 质 在 浓 溶 液 中 比较 稳定 ,中 间 样 品 的 保存 可 采用 温 的 沉淀 。 需 要 保存 酶 溶液 时 ,其 蛋白 质 浓度 也 应 大 于 1%。 保 存 较 长 时 , 还 需 加 入 防腐 剂 \ 蛋 白 酶 抑制 剂 或 其 它 稳定 剂 。 如 免疫 球 蛋 白 可 加 NaN; #4 0.04%, —20C 下 进行 冰冻 钙 。 和 蛋白酶 抑制 剂 的 选择 : 中 性 蛋白 本 常用 EDTA; Bite BARRA (DEP) APE BR (PMSF); 酸性 蛋白 酶 用 十 二 烷 基 磺 酸 钠 、N- 省 琥珀 酰 亚 胺 。 活 性 中 心 为 丝氨酸 的 蛋白 酶 加 二 异 丙 基 氟 磷 酸 ;活性 中 心 为 KRAWHRAMMNAREP RS, 但 某 些 抑制 剂 (如 DFP, PMSF)AR MBE ABS, 对 其 它 酶 可 能 也 有 抑制 作用 ,使 用 时 应 慎重 。 4. 在 保护 剂 存在 下 保存 ”很 早 就 有 人 观察 到 ,在 无 菌 条 件 下 ,室温 保存 了 四 十 五 年 * 273 。 的 血液 ,血红 蛋白 仅 有 少量 改变 ,许多 酶 仍 保留 部 分 活性 pm。 另 一 方面 又 观察 到 , 有 些 纯 酶 液 即 使 在 冷却 下 也 甚 不 稳定 了 保存 期 仅 为 九 示 时 至 几 天 。 这 是 由 于 血液 中 含有 某 些 蛋 白质 稳定 因素 ,而 纯 酶 则 恰好 相反 ,缺乏 这 些 稳定 因素 。 为 了 较 长 期 保存 蛋白 质 溶液 ( 特 别 是 敏感 的 纯 酶 或 稀 蛋白 溶液 ) ,常常 加 入 某 些 稳定 剂 进行 保 护 。 现 将 几 类 和 蛋白质 的 稳定 剂 介绍 如 下 : CG) 惰性 生化 或 有 机 物质 : 多 数 蛋 白质 要 求 较 为 踢 水 的 环境 才能 长 期 保存 。 加 人 某 些 物 质 降低 溶液 的 极 性 ,可 保护 蛋白 质 以 免 变 性 失 活 。 这 类 和 蛋白质 的 稳定 剂 有 糖 类 CA, 双 糖 ,或 多 糖 )、 脂 肪 类 (包括 脂肪 酸 )、 蛋 白质 类 (如 牛 血清 白 蛋白 .明胶 )\ 氨 基 酸 (如 谷 氨 酸 钠 、 甘 氨 酸 、 半 胱 氨 酸 ) 等 生化 物质 ,以 及 多 元 醇 (如 甘油 \ 丙 二 醇 )` 二 甲 亚 硕 ,有 机 溶剂 、 羟 羧 酸 ( 如 柠檬 酸 钠 )、 多 聚 阴 离子 (如 多 磷酸 盐 )、 表 面 活性 剂 等 普通 有 机 化 合 物 ; 可 根据 需要 而 加 以 选择 。 如 消化 性 蛋白 酶 在 甘油 液 中 十 分 稳定 , 浓 酶 液 加 等 体积 甘油 于 一 20"C 下 可 较 长 期 地 保存 ;但 稀释 时 活性 会 下 降 m20。 二 甲 基 亚 硕 也 是 蛋白 类 物质 低温 保存 的 常用 保护 剂 。 在 某 些 情况 下 ,加 入 有 机 溶剂 使 酶 处 于 稳定 的 非 极 性 环境 ,对 酶 也 呈现 稳定 作用 。 如 小 四 假 单 孢 菌 的 间 葵 二 酚 酶 在 含 10 和 丙酮 的 50mM 磷酸 缓冲 液 (pH7.5) DRE, BMA HEROES RAN A 20% 丙酮 或 乙醇 几乎 能 保存 全 部 活性 ca 许多 蛋白 质 可 用 糖 类 来 保存 。 如 酵母 转化 酶 的 活性 与 糖 类 有 关 ，, 用 皂 士 除去 多 糖 后 稳定 性 即 下 降 。 血 浆 r- 球 蛋白 也 可 用 糖 类 (甘油 也 可 以 ) 来 稳定 , 但 不 为 脂肪 酸 稳定 吧 。 用 蛋白 质保 存 蛋白 质 也 是 一 种 常见 保存 方法 ,如 溶菌 酶 用 白 蛋白 \ 鱼 精 蛋白 \ 涌 赖 氨 酸 ; 木 瓜 蛋 白 酶 用 骨 胶 元 的 部 分 水 解 产物 来 保护 四 与。 一 些 蛋 白质 也 用 脂肪 酸 保存 ， 如 结晶 的 大 或 牛 血 清白 蛋白 需 少量 脂肪 酸 保护 ;除去 后 变 得 不 稳定 。 (2) 中 性 盐 : 相当 部 份 的 蛋白 质 要 求 高 离子 强度 (1-4M 或 饱和 盐 液 ) 的 极 性 环境 才 能 保持 其 活性 ， 加 大 中 性 盐 可 稳定 这 类 和 蛋白质 。 例如 胰 蛋 白 酶 在 饱和 MgSO, HRA 置 可 较 长 期 保存 5 未 瓜 蛋 白 酶 悬浮 在 浓 NaCl 中 ; 4c 下 可 保持 许多 个 月 不 失 活 。 EG 质 用 硫酸 铁 沉 演 或 用 硫酸 镑 反 透 析 浓 缩 成 糊 状 (硫酸 铁 糊 ) 是 一 种 很 好 的 保存 方法 ， 用 前 再 透析 或 用 分 子 租 脱盐 Ba。 (3) MHRA: 一 些 蛋白 质 表 面 或 内 部 含有 半 胱 氨 酸 琉 基 ， 易 被 空气 中 的 氧 缓慢 氧 化 为 次 磺 酸 或 二 硫 北 物 ; 使 蛋白 质 的 电荷 或 (和 ) 形 状 发 生 改 变 而 失 活 。 保 存 时 可 加 大 性 基 试剂 半 胱 氨 酸 、2- 斑 基 乙 醇 、 二 入 基 苏 糖 醇 、 二 斑 基 赤 伦 糖 醇 等 (浓度 10- 僵 5X10-3M)， 保护 蛋白 质 处 于 还 原状 态 , 然 后 在 隔绝 空气 下 (甚至 真空 或 惰 气 中 ) 密 闭 保存 。 Sit RGR SWINE SHS (Fey Mn, Cu 等 ) 结合 而 失 活 ， 这 时 加 从 微量 EDTA, NaS 等 可 以 解除 。 在 保存 中 应 注意 容器 、 试 剂 和 水 的 质量 , 尽 可 能 和 避免 重金 属 污 染 。 4) 酶 反应 因子 : 某 些 酶 可 为 底 物 \ 辅 酶 竞争 性 抑制 剂 、 活 化 离子 、 反 应 产物 等 所 稳 定 。 例 如 酵母 已 糖 激酶 、 顺 乌 头 酸 酶 、N- 甲 基 谷 氨 酸 合成 酶 等 只 有 分 别 与 底 物 葡萄 糖 `, 茶 檬 酸 、L- 谷 氨 酸 共存 ; D-H RS ORNL) 只 有 与 其 辅酶 NAD 共存 才能 稳定 。 一 旦 这 些 底 物 或 辅酶 被 除去 或 不 存在 , 酶 的 稳定 性 大 大 下 降 。 又 如 淀粉 对 淀粉 酶 有 稳定 作 用 ， 故 往往 将 酶 吸附 在 淀粉 上 保存 。 D- 氨 基 酸 氧化 酶 与 其 底 物 D- 氮 基 酸 的 竞争 性 抑制 剂 安息 香 酸 钠 或 其 辅酶 FAD 结合 时 , 抗 热 变性 的 能 力 大 增 ca。 有 人 认为 ; 底 物 、 辅 酶 . 抑 。274 。 SEE SSE ee ne ee, ae a 制剂 直 使 壮 稳 定 的 可 能 原因 是 降低 了 活性 中 心 的 能 量 水平 , 使 酶 趋 于 稳定 。 添加 活化 在 栅 离子 也 能 增加 某 些 酶 的 稳定 性 。 例如 当 动 物 和 微生物 淀粉 酶 存在 Cat+， 溶 菌 酶 和 精 氮 酸 酶 存在 Mott 及 透明 质 酸 酶 存在 Cl 或 Br 时， 稳定 性 可 大 大 eR), 青 霉 属 的 核糖 核酸 酶 和 脱氧 核糖 核酸 酶 当 存 在 1 X103 一 1 X 107M 的 Zn++ 时 ， 耐 热 性 则 大 大 提高 9。 因 此 ; 某 些 含 金 属 离子 的 纯 酶 (如 淀粉 酶 、 蛋 白 酶 \ 脂 肪 酶 ) 变 成 另 一 特定 活化 金属 离子 的 结晶 时 , 即 能 大 大 提高 酶 活 , 并 增加 酶 稳定 性 。 如 结晶 Ca 式 淀粉 酶 和 骨 和 蛋白酶 的 酶 活力 甚至 比 一 般 结晶 酶 活力 高 2.8 一 3.6 (507, 但 是 ， 同 一 类 保护 剂 对 一 种 蛋白 质 或 一 种 保护 剂 对 同一 类 蛋白 质 的 保护 作用 往往 根 差 很 大 。 例 如 5 -AMP 能 激活 磷酸 化 酶 a 并 对 热 失 活 有 保护 作用 ,而 3-AMP 则 对 酶 无 激 活 作 用 且 能 加 速 酶 失 活 ha。 0.2MKCI 可 使 KB 细胞 DNA RAB Ni 稳定 并 使 活性 增 13%, mix} KB 细胞 的 DNA 聚合 酶 C 却 有 抑制 作用 ， 使 酶 活 下 降 到 110°, 使 用 时 不 能 大 意 。 (=) BARE 1. 制 成 干粉 或 结晶 “固态 蛋白 质 比 液态 稳定 。 一 般 蛋白 质 含水 量 超过 10ON, 无 论 在 室温 或 低温 均 容 易 失 活 ; 含 水 量 若 降低 至 5 多 时 ， 在 室温 或 冰箱 中 均 比 较 稳 定 , 但 在 37°C 活性 则 明显 下 降 。 低 含 水 量 对 微生物 和 化 学 活性 不 利 , 一 般 认 为 , 微生物 活性 在 含 KE 10% 以 下 \ 化 学 活性 在 3% 以 下 即 被 抑制 Pue 长 期 保存 蛋白 质 的 最 好 办 法 是 把 它们 制 成 结晶 或 干粉 。 于 粉 的 制备 有 很 多 方法 , 冰 冻 王 燥 是 酶 保存 普遍 采用 的 方法 之 一 * 由 于 冰冻 王 燥 蛋白 质 分 子 内 脱水 比 冻 融 更 完全 ,为 了 防止 冻 干 过 程 中 蛋白质 的 部 分 变性 , 除 于 燥 时 间 须 迅速 外 ;有 时 可 选择 加 大 某 些 稳定 剂 或 缓冲 剂 (如 挥发 性 的 碳酸 盐 和 酮 酸 盐 缓冲 液 )。 所 用 稳定 剂 与 前 述 冻结 保存 相同 , 最 低 有 效 浓 度 为 0.03M 即 可 达 保 存 大 部 分 活性 的 目的 。 : 冻 干 失 活 也 与 温度 和 离子 强度 有 关 。 如 谷 氮 酸 脱氧 酶 对 冻 融 稳定 ， 但 冻 于 也 引起 失 活 。 离子 强度 为 "0 上 时 ;一 30"C、 一 80"C、 — 196°C 冻 干 使 此 酶 活性 由 100% 下 降 为 51 和、 42% 和 38% FARE 0.01 时 ,活性 MBNA 45%. 42% Fl 30%), Baia DARA WE BER ARR RR, MA ATR. ETE. | SRAAE A ee AIR HAT IR SH Ri F CO—4°C 或 更 低 ) 可 相当 长 期 地 保 存 s 如 于 态 葡萄 糖 氧化 酶 在 0%c 下 可 保存 二 年 ,一 15"C 下 可 保存 八 年 。 有 些 甚 至 在 室温 下 也 能 保存 数 月 或 经 年 之 久 m。 2. 制 成 水 不 溶 酶 ，， 除 物理 吸附 法 制 成 的 不 溶 酶 热 稳 定性 下 降 外 ,在 多 数 情况 下 , 酶 经 固定 化 后 ,其 对 酸 碱 \ 蛋白 酶 、 温 度 等 稳定 性 普遍 提高 ， 并 更 易于 保存 。 如 氨基 酸 酰 化 酶 用 离子 结合 法 与 DEAE-Sephadex 制 成 不 咨 酶 后 ,经 在 70°C 加 热 15 分 钟 进行 比较 ;天然 酶 与 DEAE-Sephadex- 酶 的 残留 酶 活 分 别 为 10% M80%, 上述 酶 在 一 定 条 件 下 用 胰 蛋 白 酶 处 理 后 ， 残 留 酶 活 分 别 为 23 和 7187%™, 不 溶 酶 的 耐 热 性 及 抗 蛋白 酶 能 力 均 比 天 然 酶 大 大 提高 了 。 因 此 , 酶 和 载体 结合 普遍 增加 酶 的 保存 期 。 如 脲酶 4" 保存 15 天 失 活 60 匈 ， 二 个 月 失 活 80 多 ,而 固定 化 脲酶 4%C; 保 存 50 一 80 KRARE™ FLAS 25°C 30 天 全 失 活 ， 而 用 载体 交 联 法 〈 多 孔 玻璃 加 戊 二 醛 ) 固定 的 不 溶 酶 则 仍 保 留 100% 活 HE?) [VERY 3- 核 糖 核酸 酶 低温 冰箱 保存 一 年 活性 仍 无 明显 变化 2?。 3. 制 成 酶 衍生 物 “这 也 能 提高 某 些 酶 的 稳定 性 。 如 淀粉 酶 可 制 成 氧化 烷 二 甲 基 葵 sa 275 9 胺 或 育 碳 酸 卤 化物 的 衍生 物 , 细 菌 蛋白 酶 * 核糖 核酸 酶 、 葡 萄 糖 氧 化 酶 和 酸化 酶 等 都 可 用 某 种 高 分 子 化 合 物 作成 衍生 物 。 天 然 酶 经 上 述 处 理 后 , 耐 热 性 均 得 到 提高 。 如 木瓜 蛋白 酶 经 制 成 结晶 汞 衍生 物 后 ,稳定 性 增加 ,可 数 月 保持 不 失 活 呈 。 总 的 来 说 ， 和 蛋白 质 的 保存 主要 还 是 从 稳定 构 型 保护 活性 中 心 `. 避 免 辅 助 因 子 丧失 等 方面 考虑 ;以 防 正 变性 、 稻 聚 或 降解 。 由 于 温度 和 水 份 对 蛋白 质 结构 的 稳定 性 影响 最 大 ; 故 蛋 白质 最 好 是 低温 、 冰 冻 或 冰冻 干燥 后 低温 于 燥 保 存 。 一 些 酶 的 保存 方法 和 稳定 性 见 3210-1, 二 、 核 酸 的 保存 核酸 保存 的 条 件 与 蛋白 质 和 酶 大 致 相同 ? 凡 影 响 核酸 变性 和 降解 的 因素 在 样 呈 保存 中 均 应 避免 。 一 般 保 存 方法 如 下 : 1. 浓 盐 液 ”由 于 水 、 稀 电解 质 都 可 以 断裂 核酸 的 氢 键 ,破坏 其 双 螺 旋 结 榴 ; 使 核酸 变性 》 因此， 保存 核酸 时 ， 必 须 注意 水 的 影响 ， 防 止 稀释 变性 。 二 = 般 保存 可 用 演 盐 液 、 NaCl- 柠 檬 酸 缓冲 液 〈《pH7) 或 0.1 M 醋酸 缓冲 液 。 DNA 的 液态 保存 ;所 用 盐 浓 度 常 芝 1M 或 0.01 一 LMNaCl， 浓 度 不 应 低 于 10°—-10M, 用 盐 溶液 保存 核酸 时 ， 须 配合 低温 (OC 以 上 ) 及 加 防腐 剂 (氯仿 或 ImMNaNs)s 筷 酸 酶 抑制 剂 等 措施 Ca。 如 DNA 可 在 0.15 MNaCl 和 0.015M 柠檬 酸 钠 溶液 中 〔1 毫克 /毫升 )， 加 几 滴 氯 仿 后 于 4% 保存 ， 几 个 月 仍 稳定 不 变 2a。 低 分 子 量 RNA (如 tRNA) 可 干 态 保存 ， 但 高 分 子 量 RNA WEA 2% NaAc AY 75% 乙醇 中 4%C FURR, 液态 质粒 可 加 甘油 后 贮存 在 二 10%C ,也 可 在 10mM Tris-HCl(pH7.8), 10mMNaCl, ImM EDTA-Na, 溶液 中 于 4°C 下 保存 Cn。 2. 稳定 pH ， 核酸 深 液 的 保存 也 受 pH 的 影响 ,过 酸 过 碱 均 会 导致 碱 基 上 形成 氢 键 基 团 的 解 离 , 使 氨 键 稳定 性 下 降 以 至 断裂 。 对 DNA Rik, OF EAM pH4—11 范围 较 稳 定 ,超出 此 范围 DNA 易 变性 或 降解 。 低温 、 酸 性 或 稀 碱 下 保存 DNA 及 低温 酸性 下 保存 RNA 均 较 稳定 。 | 3. 低温 - RAS YEE 8H) 70—85°C, DNA 的 变性 温度 还 与 GC 含量 有 关 ， GC 含量 愈 天 ,变性 温度 愈 高 。 通常 固态 核酸 在 0° 以 上 低温 下 干燥 保存 即 可 。 丰 分 子 核酸 保存 温度 还 可 更 低 些 ,如 固态 tRNA 可 在 一 10%C 下 保存 ca。 液 态 核 酸 室温 下 容易 变 性 ,短期 最 好 低温 (49°C) 保存 ， 但 不 宜 冻结 ， 否 则 将 破坏 大 分 子 结构 9。 也 有 报道 牛 肝 RNA #&F 50mM NaCl 后 一 35%C 低 温 冰 冻 保 存 , 二 个 月 内 不 变性 或 降解 , 但 应 避免 重复 冻 融 9。 电解 质 的 存在 对 核酸 冰冻 有 一 定 保 护 作 用 。 如 将 含 0.15MNaCl 和 0.015M 柠檬 egy DNA 在 一 70%C 快 速 冷 冻 , 后 于 一 20" 保 存 , 可 长 达 一 年 之 久 不 变 ca。 核酸 的 保存 也 与 使 用 目的 有 关 ,， 用 于 制备 单 核 背 酸 和 用 于 结构 、 功 能 研究 的 样品 ,所 要 求 的 保存 条 件 各 不 相同 。 = th As AY TR 脂肪 和 油 保存 不 当 会 发 生 酸败 , 酸败 是 由 水 解 和 氧化 作用 所 引起 。 酸败 的 油脂 比重 诚 小 \ 碘 值 降 低 、 酸 值 增高 , 可 作为 油脂 保存 中 质量 检查 的 指标 。 根据 油脂 酸败 时 化 学 变 es 276° TNR aN ay Sea 化 的 特点 ,可 把 酸败 分 为 两 大 类 ,其 特点 及 保存 方法 如 下 中 1 水 解 酸败 水解 酸败 是 由 于 油脂 杂 有 脂肪 酶 ， 在 水 及 其 它 适 宜 条 件 下 (如 25- 一 35sC、pH4.5 一 5)， 催 化 油脂 的 不 饱和 双 键 水 解 ， 产生 游 离 脂肪 酸 。 含 水 油脂 容易 长 霉菌 : 和 酵母 效 * 产 生 脂 肪 酶 和 脂肪 氧化 酶 ,因此 即使 在 0%c 以 下 保存 ,也 会 发 生 酶 水 解 。 所 以 ， 长 期 保存 油脂 的 关键 是 除去 水 分 ,在 无 水 状态 下 保存 。 通 篆 把 油脂 加 热 灭 菌 处 理 , 即 可 达 . 破坏 脂肪 酶 和 除去 水 分 的 目的 。 2 氧化 酸败 ”氧化 酸败 比 水 解 酸败 更 常见 , 在 油脂 保存 上 也 更 重要 。 油脂 一 般 都 含有 不 饱和 脂肪 酸 , 不 饱和 程度 愈 高 , 也 即 含 双 键 愈 多 , 愈 易 发 生 氧 化 酸败 〈 如 亚 油 酸 )。 某 些 金属 (如 Co, Mn, Cu, Fe 等 信 光 \ 水 和 热 等 都 能 加 速 油脂 的 氧化 变质 , 使 不 饱和 双 键 加 氧 生成 过 氧化 物 , 后 者 进一步 聚合 或 分 解 为 具有 特殊 臭 味 和 味道 的 低 分子 游 离 酸 、 醛 、 酮 等 ,可 借 感 官 来 判断 。 由 于 油脂 氧化 酸败 是 由 多 因素 引起 ,长 期 保存 必须 消除 不 利 因素 的 影响 。 因 此 ,油脂 - 一 般 都 应 避 光 、 低 温 、 密 闭 保 存 ， 尽 量 充 满 容器 ， 除 尽 水 分 和 灭 菌 。 必 要 时 也 可 加 和 人 抗 氧 剂 ; 阻 止 或 延缓 氧化 进行 。 粗 制 油脂 一 般 含有 天 然 抗 氧 剂 (如 维生素 EHR. SRD 胚 酚 等 ) 但 精制 后 含量 降低 , 故 精制 油脂 (尤其 是 油 ) 较 不 稳定 ,容易 氧化 酸败 。 因 此 ,精制 油 必 须 加 人 抗 氧 剂 ( 如 邻 葵 二 酚 ), 但 非 天 然 抗 氧 剂 多 为 侵 闻 性 物质 〈 酚 \ 胺 等 ), 较 理 想 的 DUAR A BIRR. MANTA NE BS RNa ROT RAM, BER ES, th 可 加 增 效 剂 CHU BES AEE CC ABS) 增强 抗 氧 效果 。 抗 氧 剂 、 增 效 剂 的 选择 标准 Fe: 〈1) 能 较 长 期 抗 酸败 ;(2) 能 溶解 油脂 ;3) 无 不 良 气味 和 味道 并 4) 无 毒性 。 此 外 , 某 些 含 不 饱和 双 键 的 固 醇 类 (如 麦角 固 醇 信 磷 脂 类 《如 卵 磷 脂 ) 也 容易 氧化 变 Ro 如 麦角 固 醇 经 一 系列 光 化 反 应 可 变 为 维生素 D:， 后 者 继续 氧化 为 无 活性 或 有 毒 的 化 合 物 。 所 以 这 类 物质 也 要 避 光 低温 下 密闭 保存 。 高 级 不 饱和 脂肪 酸 、 油 脂 或 磷脂 类 也 可 根据 需要 固化 后 在 P.O; 中 保存 ， 或 用 低 极 性 : 溶剂 咨 解 为 高 浓 溶 液 , 后 者 在 避 光 低 刘 (一 20%C) 下 密闭 保存 1 一 2 年 不 分 解 “。 四 、 细 胞 及 生物 制剂 的 保存 、 动 植物 培养 《或 分 离 ) 细胞 、 以 至 器 官 和 组 织 都 可 加 入 低温 保护 剂 ( 常 用 5 一 10% 甘 油 和 二 甲 基 亚 硕 ) 后 ,于 低温 冰冻 下 保存 。 保存 细胞 的 存活 率 与 冰冻 方法 、 保 存 温度 和 时 间 、\ 融 化 温度 \ 保 护 剂 、 细 胞 的 种 属 和 性 状 等 有 关 。 不 同 细胞 对 保存 条 件 的 要 求 往 往 相差 很 大 。3 植物 培养 细胞 保存 的 主要 环节 如 下 = “ 预 培养 一 加 等 体积 低温 保护 剂 混 匀 一 冰冻 〈 慢 冻 1—5°C/ 433 MH, —20——70C ; 快 冻 ,直接 浸 大 液 氮 ) 一 一 40 一 一 100%C 一 在 营养 条 件 王 低温 保存 (一 100 一 一 196%C) 一 迅速 解冻 (34 一 40%C) 一 再 培养 。 动物 细胞 的 冰冻 保存 大 致 相同 ,但 动物 细胞 与 植物 细胞 的 保存 期 和 存活 率 各 有 差别 汪 ”"。 病毒 和 喉 菌 体 常 在 10mM Tris-HCl( pH7.6), 10mMNaCl, 1mM EDTA-Na, 溶液 中 4°C 下 保存 刀 。 纯 化 病毒 悬浮 液 也 可 加 少量 防腐 剂 (NaN, FAAS MS ARH ih 保存 于 0 一 4" (lk Ho RF REN RMA 5 一 10 匈 BAM wee Hl, ARG 冰冻 时 丧失 感染 活性 加。 生物 制剂 (如 菌 苗 、 疫 苗 、 类 毒素 、 抗 毒素 等 ) 的 稳定 性 差别 较 大 , 需 根 据 不 同情 况 远 择 © QI 袁 10-1 一 些 酶 保存 的 条 件 和 稳定 性 "7 (17 数 周 内 不 失 活 。 如 PH2.3 一 3 室温 下 可 稳定 几 天 ， 低 于 pH3 易 变性 。 高 于 pH 易 自 溶 3(2 这 稳定 几 个 月 不 不 变 BEAM | WRitCTRERE Jeeta Mik pH>6 易 C1) 可 保存 一 年 ; C2) ree aT Ae is 活 加 Catt 和 调 pH4. 8 一 10.6， 可 增加 稳定 人 性 \ 冻 干 易 失 活 。 (1) 天 粉 4 保存 ; Biv pH2 一 6, 37°C) = ILE NARIES(2) 4 小 时 失 活 20965 BEAM |p te (3)Rie pHs HRB (3j 元 天 内 稳定 (1) 干粉 —20°C 保存 ; (2 $e 淀粉 酶 INaci—cacl, 或 Bee hea eb eT | FRSC PRE ?一 5 年 内 稳定 RNA BA | 干粉 4q0 下 干燥 保存 最 灶 生 内 稳定 。 酌 六 酸性 范 围 (PH2 -2.5 BR |, 20% 甘油 中 2 下 保存 (22 干粉 ”| (17 可 稳定 几 个 月 ;(27 可 稳定 一 年 C1) 可 长 期 保存 ;(2) 二 年 内 不 失 活 ? 但 稀释 至 0.1mg/ml 则 迅速 失 活 , 反 复 代 融 引起 失 tio Hew 25CpH5.5 一 8.0 下 8 小 时 内 稳定 较 稳 定 -| C1) 在 饱和 硫酸 铵 中 — 20°C 下 保存 ;(2) 酶 BIKBEY | (ioe, pH7) te 20% thik RES RBA | 酶 结晶 水 盗 液 4 保存 RNC AS pHT.5 HRT sek cms TT aR (1) FA 0—4°C RES(2D) BEF 3M 解 viinaesdinase ve SRN a Most BY ae 2)4 i g C1) Rew, RBS Ns tc RACER UC RIE es 一 年 内 稳定 C1) 可 稳定 几 个 月 ;(27 可 保存 4 个 月 。 其 水 pH7 一 9 最 稳定 * 可 保存 2 天 C1) 可 保存 一 个 月 ;(27 可 保存 二 年 可 保存 6 一 12 SA, We pHA—10.5 F 2 下 较 稳定 ，pH <6 稳定 性 有 所 增加 弹性 蛋白 酶 | Tin 53°C 下 保存 (一 10?C 更 好 ) |S Aa il FEB IR 50°C faze, 62°C30’ 全 Fe BC FE AC 保存 木瓜 蛋白 酶 |, _617, 2 VC ORES 2) 悬浮 于 浓 NaCl 中 | (17 可 稳定 6 + AQT RHE T Ae pal ASR: AE hh ith ali i MOREE TN COR I 0 CBE | 1 RT ie PO RE DURE as 200 FY cya peers eS (2) aT oRee DEBE : 1) 可 稳定 一 年 以 上 ;(2) 可 稳定 2 Bo A 透明 质 酸 酶 | CD uPAR A 保存 ; C2) 酶 液 fi 保存 Nalin 0.2% ae 0.596 sf eat 0.2% 、 明胶 保护 。 用 pH6 的 缓冲 液 可 增加 稳定 性 。 溶菌 酶 C1) Fit 4°C 保存 Speers 酶 液 酸 性 条 件 下 _ (pH1 一 可 保存 二 年 。 酶 液 中 性 pH, 70°C 可 放 1 氮 基 酰 化 酶 | 干粉 —20°C 保存 小 时 ，pH<5 立即 失 活 Ca | 40 保存 4 一 6 个 月 内 稳定 * 278 et) Oe ith a iach 保 存 条 件 eee oe ea PHY CO) (1) 可 稳定 半年 ;23 很 稳定 FR AC 保存 可 保存 一 年 。 酶 液 pH4 一 6 最 稳定 C1) 能 保存 二 年 ;(2) 可 保存 半年 -最 适 稳 本 \ 肠 )* 血 中 碱 性 磷酸 酯 酶 25°C (1) ALAS UF it —20° 保存 ;(27 纯 酶 干粉 —20°C 保存 冻 干 品 —20°C 保存 可 保存 二 年 。 酶 液 在 pH<6.5 BNC ie 1x HN xk AFF RRR PRR 5 EK pH 可 增加 稳定 性 6 个 月 失 活 15%. MIR PH<5,\pH>10 不 ie re tO nt Buz Uke EE Be PREPARA] 在 1M KCI—1mM2 莹 基 乙 醇 中 冰箱 保存 | 20-25 天 内 稳定 8 缓冲 液 中 冰冻 保存 “CD) 干粉 4 保存 ;2) 酶 该 在 50mM、 一 pH? 2 ERAN 4G 保存 | BAR is aS Ps oe — 20°C 或 —50°C 保存 ;27 纯 酶 ime 几 个 月 内 不 失 活 ;(22 相 当 长 时 间 不 失 P. ti C1) “FRAG (2) FT fa BRK 一 年 内 不 失 活 。 酶 液 pH6 一 10 最 稳定 C1) 可 稳定 几 个 月 。 高 度 稀 释 极 不 稳定 ;(37 三 个 月 左右 活力 不 变 ;(4) 可 稳定 1] 一 几 年 。 a 0. $ HIE MARDER IRIE; OH 0.1M Tees ; SHS AKIRA fi pH7 磷酸 缓冲 液 透析 后 冰冻 保存 并 47) 酶 结晶 在 3.2M, pH7 Mise eet 4 C L-ABRA | Cl) FRACKRE; a Big BI 3.2M (CBS pH6 Meee 4°C HR ee C1) 几 个 月 内 活力 在 变 ;5(〈27 可 保存 一 年 C1) 12 个 月 内 稳定 ;27 几 个 月 内 稳定 ， 但 D- 氨 基 酸 氧 | (1) 基 AS aaa 1.8M time wep a3 CRF 稀释 后 易 失 活 如 含 1X10M FAD 可 排除 H6.25 下 i C1) 所 有 制剂 6 一 12 个 月 均 稳 定 , 但 冰冻 或 WAAR | 〈《1755C REIQ)FH AC 避 光 干燥 保存 冻 王 会 失 活 ;(2) 一 年 内 稳定 。 液 态 pH? RA 氧 定 ¥ 过 氧化 物 酶 | 干粉 4C 避 光 干燥 保存 = 天 weo 液态 pH<3.5, pH>12 不 ee m | 醇 脱 氢 酶 ”| ES 20° 保存 Et ii FOES | 在 5096 甘油 中 4° 下 保存 可 稳定 几 个 月 0- 磷酸 葡 萄 | C1) °C gt ees 糖 脱 氢 酶 ”|3.2M7 FARE (PHO) (1) 3 一 6 个 月 内 稳定 ; (2) 几 个 月 内 稳定 seein), TN RR tes COMER MBTET 7096 |) AERA) ARIES HE fia ARR He 5°C 液 加 外 蛋白 可 增加 稳 cc- 羧 丁 酸 脱 C1) 保存 过 夜 失 活 1090 左右 ;(2) 6 个 月 活 Se | 《1) sumac 保存 3(2) 酶 该 冰冻 保存 |) 六 | Cl) 浆 干 品 4%C 保 存 ;(2) 酶 液 调 pH4 一 6.5 | CL) 半年 至 一 年 内 稳定 ;(2) 酶 液 -oH>8 温 葡萄 禧 氧化 酶 | 并 加 箱 萄 糖 牛 4%C 保存 HERE 50G RBG. MAUR PRD FE JA 一 大 mei | FR -20%C 干燥 保存 可 至 少 稳定 二 年 。 液 态 pH6.5 一 10.5 较 名 称 保 tT aN fa 定 HE 胺 氧化 酶 冻 干 品 一 205 到 他 REE. KA pH7.2—7.6 最 稳定 E 黄 厌 叭 氧化 酶 | 冻 干 品 4G 保存 6 个 月 基本 稳定 还 ae ted #6 0.5—1.09% Triton X-100 中 4°0 保存 “| 3 一 4 天 内 稳定 = nee Ree tae Oe! 酶 URAL AC 保存 相当 稳定 悬浮 在 2.5M 硫酸 铁 中 0 一 4qC 保存 可 稳定 半年 。 酶 液 在 PH<6 不 稳定 一 个 月 活力 不 变 。 冻 干 唱 37*C MH 2 天 或 i 5°C 密闭 保存 液态 _pfi7 emp ee mien 60°C 加 热 卫 小 时 活力 不 变 , 但 pH5 以 下 易 失 活 、 RFE 4°C BR —20C 保存 。 ed a ee —20° 可 保 转 ES J gi Tee 保存 ;最 学 于 3M 硫酸 铁 中 HC) 诗 少 可 保存 一 年 S| 全 两 转 所 栈 |p) TR CORR CARI 3.2M | (1) 可 稳定 2 年 ;(2) 可 称 定 36 涉 月 谷 章 转 氨 醒 :| 2 PRE ROR COE 3.2M GER) (1) 6-12 + ABET A GL) ERA CREO) 9 E 3.0M Bie Sa} aT ae Mv 悬浮 在 3.2M BiARBEh (pH7.6)4°C 保存 | 6 个 月 内 稳定 。pH<4-5 酶 不 可 秆 变性 i Ps Gael dear Cie (ee ees T TO / x 10952 pete 2) © PRES Diab CED 二 -TD separ 52) a ee SIF RET SF FIBRE) PM 40 保存 ee SARA (0.86m I 200mM -. T4 DNA lessees me CoH. 分 和 ni SECM | 10 个 月 内 活力 不 灾 SME 50% 甘油 ,保存 在 一 ‘MAE IDR | SER, SOmM ARABI (oH 0), DNA |lmM 2-383E 7,83, 50% 甘油 中 ,保存 在 Re |--20sc 一 DNA AE hes | ae 在 10mM6-#i3E 7B. 10 mMMegC!l,, 100 a mMKCI, 0.1lm4/ EDTA, 50% #ih, 10m4f CBE i. 水 S. 乙醇 ,氯仿 , |B. J. 52, 535 (1952) ZB, KE; lJ. C. S. 1952, 2657, i. 水 28 乙醇; 25% ala; S. 乙醚 ; i 水 S. CBA 酮 ,氯仿 ; i. 7K S. 乙醇 , 丙 Ald» A> CBE; i 水 RK R 制备 方法 分 析 方 法 S. 7,5 ZB, |Biochem. Preps., 9, 30 (1962) J. B. C. 234, 2169 (1959) B. B. A. 32, 73 (1959) J. A. C. S. 82, 1647 (1960) S. 7, BH, ABE, |The Vitamins. 2nd ed., The Vitamins, 2nd vo]. 1, p. 1 (1967) ed., vol. 6, p. 139 (1967) Vitams Horm. 18, 295 Meth. biochem. Anal. (1960) 4, 43 (1957); 15, 1(1967) The Vitamins, 2nd ed., vol. 6, p. 139 1955, 2763 Meth. biochem. Anal. Vitams Horm. 18, 295 4, 43 (1957); 15, 1 (1960) (1967) The Vitamins, 2nd ed., vol. 6, p. 211 (1967) B. J. 49, 36, 45, 54, 232, 243 (1951) The Vitamins, 2nd ed., vol. 6, p. 211 (1967) Meth. biochem. Anal. 11, 279 (1963) The Vitamins, 2nd ed vol. 6, p. 245 (1967) B. J. 49, 45 (1951) J. A. C. S. 67, 609 (1945) J. A. C. S. 67, 609 (1954) Hely. chim. Acta. 22, 310,945, 1464 (1939) J. A. C. S. 76, 4592 (1954) 4. 核 苷 \ 核 苷 酸 及 其 衍生 物 的 制备 溶解 度 0.0977, 2.5% 水 ; Sl.s. 乙醇 ， i. CRE, 氧 仿 S. 水 ; SLs. 乙醇 S. 7k il &@ DT 法 分 析 方 法 Meth. biochem. Anal. 3, 97 (1956) Meth. biochem. Anal. 6,79 (1958) J. B. C. 167, 445 (1947) Arch. B. 25, 347 (1950) *Levene and Bass, p. 114 8-"C. Biochem. Preps. 5, 62 (1957) J. B. C. 237, 2283 (1962) J. A. C. S: 73, 1650 (1951) Levene and Bass, p. 163 - B. C. 232, 1065, 1077 (1958) Analyt. Biochem. 13 . B. C. 224, 463 (1957) 71 (1965) . A. C. S. 79, 3608 (1957) . A. C. S, 83, 698 (1961) - Org. Chem. 31, 3247 (1966) Biochem. Preps. 1, 1 (1949) B. B. A. 91, 1 (1964) Ber. 95, 1664 (1962) Meth. biechem. Anal. 1, 341 (1954) Ber. 98, 1045 (1965) ° 293 « x R 名 称 分 子 量 | wee | 制 & 方 法 分 析 方法 腺 苷 -5 -磷酸 347.2 S. 热 水 Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) J. B. C. 167, 445 (1947) Adenosine- Biochem. Preps. 9, 5 (1962) Meth. Enzymol. 10, 474 5 -phosphate B. J. 58, 503 (1954) (1967) B. B. R. C. 24, 872 (1966) 腺 苷 -5 -三 磷酸 507.2 Biochem. Preps. 1, 5 (1949) Analyt. Biochem. 14, 261 (ATP) Arch. B. B. 62, 253 (1956) 17, 456 (1966) Adenosine- B. B. A. 91, 1 (1964) eth. Enzymol. 10, 474 5’-triphosphate J. A. C. S. 87, 2265 (1965) (1967) B. B. R. C. 9, 556 (1962) Meth. Enzymol. 10, 702, 773 (1967) Fee ee RF 243.2 Sok Levene and Bass, p. 164 Cytidine Sls. CH (J. B. C. 237, 2283 (1962) J. C. S. 1950, 2084 fat-5'-— Rs 403.2 Arch. B. B. 35, 465 (1952) (CDP) J. B. C. 209, 23, 41 (1954) Cytidine-5’- J. A. C. S. 83, 649 (1961) diphosphate heal y-5'- BRR 323.2 Arch. B. B |Arch. B. B. 35, 465 (1952) The Nucleic Acids, Cytidine-5’- B. B. R. C. 24, 872 (1966) Vol. 1, p. 211 (1955) phosphate 胞 背 -5- 三 磷酸 483.2 J. B. C. 209, 23, 41 (1954) (CTP) B. B. A. 91, 1 (1964) Cytidine-5’- Biochem. Preps. 9, 120 (1962) triphosphate Je AN C2 SH3T, 2265* (1965), BeEKRE 283.2 | 0.08!%, 3.0! |Levene and Bass, p. 163 J. B. C.. 167, 429 (1947) Guanosine 水 ; Ber. 74, 694 (1941) S. BGR, |J. Be ©. 237, 2283 (1963) AVKEEER J. C. S. 1958, 1593 i. CBs G BF, iA 8-5’ -二 磷酸 443.2 下 Bis@9209792357 41 (1954) J. B. C. 218, 505 (1956) (5’-GDP) J. B. C. 218, 521 (1956) Guanosine-5’- Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) diphos-phate Ber. 98, 1045 (1965) B. B. A. 91, 1(1964) 岛 苷 -5- 磷 酸 363.2 J. B. C. 209, 23, 41 (1954) (5 -AMP) Meth. Enzymol. 6, 645 (1963) Guanosine-5’- B. B. R. C. 24, 872 (1966) phosphate 鸟 背 -5 -三 磷酸 Sy ey) fee BY CF1209,2235. 41 (1954) J. B. C. 209, 41(1954) (GTP) J. B. C. 218, 521 (1956) Guanosine-5- triphos-phate - 2946 B. B. A. 91, 1 (1964) Biochem. Preps. 9, 120 (1962) J. JA. (Ge 82°87, 2265 (1965) 续 OR 名 称 一 -一 一 RARKE BMF) Inosine RRB ROMA) Inosine-5- phosphate Fie RR E-S’- 磷酸 Orotidine-5’- phosphate 胸腺 喀 啶 Thymine 尿 喀 啶 核 昔 Uridine 尿 苷 -5 -二 磷酸 UDP Uridine-5- diphosphate RA-5' -磷酸 5’-UMP Uridine-5’- Phosphate RE-5' -三 磷酸 UTP Uridine-5’- triphosphate 脱氧 尿 苷 -5 -磷酸 Uracil deoxyribose -5'-phosphate RARE Uracil deoxyriboside 脱氧 胸 苷 -5 -三 磷酸 Thymine deoxyr- ibose-5’- triphosphate Ait Thymine deoxyriboside 分 子 量 268.2 348.2 368.2 126.1 244.2 404.2 324.2 484.2 308.2 228.2 482.2 242.2 溶解 度 1.62 水 V. Sieg. CB S. 水 甲酸 VieiSke iss 乙醇 ， 乙 醚 0.42 水 S. 热 水 ; Sl. S. 乙醇 s. xk Sp.s. 乙醇 S. 甲醇 ,水 il &@ FD & Ber, 42, 336 (1909) B. B. R. C. 13, 394 (1963) J. B. C. 167, 477 (1947) B. J. 36,729 (1942) J. B..C. 190,, 611 (1951) B. J. 58, 503 (1954) Meth. Enzymol]. 6, 645 (1963) B. B. R. C. 24, 872 (1966) J. A. C. S.76, 2844 (1954) Biochem. preps. 9, 5 (1962) yo As CrS.c6s, 1118" (1963) Levene and Bass, p. 57 B. J. 70, 642 (1958) Nature, Lond. 181, 254 (1958) B. B. A. 61, 141 (1962) Levene and Bass, p. 165 J. B. C. 237, 2283 (1962) J. B. C. 209, 23, 41 (1954) J. A. C. S. 81, 3032 (1959) B. B. A. 91, 1 (1964) Ber. 98, 1045 (1965) J. B. C. 203, 319 (1953) Biochem. Preps. 9, 5 (1962) B. B. A. 61, 29 (1962) B. B. R. C. 24, 872 (1966) J. A. C. S. 75, 5449 (1953) J. B. C. 209, 23, 41 (1954) Biochem. Preps. 9, 120 (1962) J. A. C. S. 87, 2265 (1965) B. B. R. C. 10, 289 (1963) Nature, Lond, 166, 557 (1950) J. C. So 1952, 2721 J. C. S.°19585 3035 B. B. A. 39, 82 (1960) Biochem, Preps. 9, 120 (1962) J. B. C. 233, 263 (1958) B. J. 86, 562 (1963) J.-C. S. 1950, 1990 a. Cee Se 495292721 B. J. 35, 855 (1941) 分 析 方 法 J. B. C. 167, 429, 477 (1947) J. A. C. S. 76, 2844 (1954) J. B. C. 197, 227 (1954) Analyt. Biochem. 1, 249 (1960) J. B. C. 209, 41 (1954) J. B. C. 209, 41 (1954) Arch. B. B. 73, 180 (1958) 名 . HK Wha a a GE Thymine 5- FA 2 aE 5-Methylcytosine 6- FA 3 a ae RS 6-Methylamino- purine RAI -5'-= ww Cytosine deoxy- ribose-5’- triphosphate RARH-S -三 磷酸 Adenine deoxy- ribose-5’- triphosphate RE-5 -二 磷酸 - D- 葡 萄 糖 Adenosine-5 - diphosphate D- glucose (ADPG) 胞 苷 -5 -二 磷酸 胆 碱 Cytidine 5 -di- phosphate choline 胞 苷 -5 -二 磷酸 D- 葡 萄 糖 CDPG SH-5'-—BB D- 荷 萄 糖 Guanosine ‘5’-diphosphate D-glucose 哆 腺 -5 -二 磷酸 D- 葡 萄 糖 Thymidine 5'-diphosphate D-glucose RE-5’-— BR N- 乙 酰 葡萄 糖 胺 Uridine 5’- diphosphate N-acetylglucos- amine UDPAGal 分 子 量 126.1 125.1 溶解 度 0.4042 水 S. 热 水 Sl. s. 乙醇 4.07 KK 制备 FE J. A. C. S. 68, 912 (1946) Levene and Bass, p. 67 B. J. 48, 581 (1951) Levene and Bass, p. 73 JAC S.0815"178: C1959) 149.2 |0.1279, 2.0%°7K|B. J. 68, 627 (1958) 467.2 491.3 589.3 506.3 565.3 605.3 564.4 607.4 Ss. Kk i. 甲醇 丙酮 ， 乙 醚 S. 水 Ss. 水 i. 甲醇 Abi, CB Jo A. C. S. 74, 411 (1952) B. B. A. 39, 82 (1960) Biochem. Preps. 9, 120 (1962) B. J. 86, 562 (1963) B. B. A. 39, 82 (1960) Biochem. Preps. 9, 120 (1962) B. J. 86, 562 (1963) Arch B. B. 106, 371 (1964) J. B. C. 237, 3577 (1962) B. B. A. 91, 1 (1964) . A.C. S. 77, 250 (1955) . B. C. 222, 185 (1956) .B. R. C. 7, 1 (1962) . 75, 428 (1960) . C. 237, 1260 (1962) . A. 91, 1 (1964) . S. 1961, 2574 Ow mum & . C. 263, 1791 (1961) . C. 237, 3014 (1962) jee) B. B. A. 46, 595 (1961) 8, 147 (1966) eth. biochem. Anal. 10, 107 (1962) Meth. Enzymol. 6, 777 (1963); 续 OR 分 析 方 法 J. B. C. 197, 227 (1952) J. Bact. 84, 17 (1962) B. J.48, 581 (1951) Meth. biochem. Anal. 6, 79 (1958) J. B. C. 237, 3577 (1962) B. B. A. 40, 425 (1960) J. B. C. 235, 37 (1960) B. J. 78, 209 (1961) J. B. C. 237, 3041 (1962) J. B. C. 203, 1055 (1953) en tee EE ° 296 « A er aaa x R 名 称 分 子 量 YS fe BE il 备 FR 分 析 方 法 RF-5'-— Rw 566.4 | S. 水 ;甲醇 ; |Arch. B. B. 33, 186 (1951) D-¢ 9 i. ABS J. B. C. 223, 977 (1956) Uridine 5 J. A. C. S. 83. 659 (1961) diphosphate Meth. biochem. Anal. 10, D-galactose 107 (1962) RF-5'-— BE 580.3 B. B. A. 53, 589 (1961) D->4 9 Rites Arch. B. B. 78, 401 (1958) Uridine 5’- J. B. C. 235; 910 (1960) diphosphate D-galacturonic acid RB-5'-— BB 566.4 | S. 水 ,甲醇 |B. J. 51, 426 (1952) Meth. biochem. Anal. D- 葡 萄 糖 i. FRA, J. B. C. 223, 977 (1956) 10, 107 (1962) Uridine 乙醚 B. B. A. 26, 146 (1957) Meth. Enzymol. 2, 676 5-diphosphate Meth. Enzymol. 6, 777 (1963) (1955); 3, 968, 974 D-glucose . A. C. S. 83, 659 €1961) (1957) 尿 苷 -5 -二 磷酸 580.3 S. 7 B. J. 59, 279 (1955) D-F BER i、 甲 醇 ; 丙 酮 |Jj. A. C. S. 79, 2342 (1957) Uridine 5 -di- IJ. B. C. 228, 357 (1957) phosphate J. Biochem., Tokyo 51, D-glucuronic acid 277 (1962) Biochemistry 1, 1171 (1962) 尿 苷 -5 -二 磷酸 550.3 B. B. A.33, 276 (1959) L-R 235 B. B. R. GC. 8,204 (1962) Uridine 5’-di- Arch. B. B. 103, 276 phosphate (1963) L-rhaminose 尿 苷 -5 -二 磷酸 536.3 J. B. C. 223, 977 (1956) - D-E Meth. Enzymol. 6, 782 Uridine 5 -di- (1963) phosphate D-xylose 5. 磷酸 酯 类 物质 名 称 分 子 量 制备 方法 分 析 方 法 磷酸 精 氨 酸 254.2 |B. J. 62, 358 (1956) B. J. 63, 153 (1956) Arginine B. J. 92, 429 (1964) phosphate 脱氧 核糖 -5- 磷 酸 2 到 .区 BCGe 215, 389/(1955) Biochem. Preps. 9, 35 (1962) Deoxyribose-5- J. B. C. 198,885 (1952) phosphate Biochem. Preps. 9, 35 (1962) J. B. C. 235, 1292 (1960) D- 果 糖 -1, 6- 二 磷酸 340.1 |J. A. C. S. 64, 2722 (1942) J. B. C. 208, 55 (1954) D-Fructose-1, Arch. B. B. 3, 33 (1944) Biochem. Preps, 2, 52 (1952) Meth. Enzymol. 3, 240 (1957) B. Z. 161, 240 (1925) B. J. 53, 157 (1953) 6-diphosphate Arch. B. B. 74, 326 (1958) ¢ 297 « 名 称 D- 果 糖 -1- 磷 酸 D-Fructose-1- phosphate D- 果 糖 -6- 磷 酸 D-Fructose-6- phosphate cx-D- 葡 萄 糖 -1- 磷酸 c-D-Glucose-1- phosphate D- 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 D-Glucose-6- phosphate D-1，3- 二 磷酸 甘 油 酸 D-Glyceric acid 1,3-diphosphate D-( 一 )-3- 磷 酸 甘油 酸 D-(—)Glyceric acid-3-phosphate L-cx- 甘 油 磷 酰 胆 碱 LIL-wx-Glyceryl-phosphory1l- choline L-x- 甘 油 磷 酰 乙醇 胺 L-a-Glycerylphosphoryl- ethanolamine Hi aa Le Glyceryiphos- phorylinositol 甘油 磷 酰 丝氨酸 Glycerylphos- phorylserine 磷酸 烯 醇 丙 酮 酸 Phosphoenolpyruvic acid 核糖 -1- 磷 酸 Ribose-1-phosphate D- 核 糖 -5- 磷 酸 D-Ribose-5-phosphate D- 核 酮 糖 -5- 磷 酸 D-Ribu lose-5-phosphate 260.1 260.1 260.1 266.0 186.1 区 7 215.2 334.2 239 2 168.0 230.1 230.1 230.1 制备 方法 J. B. C. 201, 645 (1953) Meth. Enzymol, 3, 169 (1957) Biochem. Preps. 7, 58 (1960) Arch. B. 3, 33 (1944) Meth. Enzymol. 3, 167 (1957) J. A. C. S. 66, 560 (1944) Biochem. preps. 4, 63 (1955) B. J. 59, 203 (1955) Biochem. Preps. 2, 39 (1952) Biochem. Preps. 3, 71 (1953) B. J. 59, 13 (1955) B. Z. 301, 135 (1939) Arch. B. 3, 105 (1944) 04.BicC@: 226, 37772(1957) B. J.62, 689 (1956) J. B. C. 161, 523 (1945) Biochem. Preps. 6, 16 (1958) J. B. C. 220, 1 (1956) Jz A.eG: Sz 78, 4510 (1953) B. J. 50, 449 (1952) B. J. 71, 195 (1959) J. A. C. S. 81, 2591 (1959) J. B. C. 236, 1907 (1961) J. A. C. S. 81, 2167 (1959) B. J. 71, 195 (1959) B. Z. 273, 60 (1934) J. B. C. 180, 145 (1949) J. B. C. 190, 21 (1951) B. B. A. 78, 732 (1963) J. B. C. 167, 477 (1947) J. B. C. 193, 497 (1951) J. A. C. S. 79, 441 (1957) Arch. B. B. 34, 209 (1951) J. A. C. S. 75, 1153 (1953) J. A. C. S. 76, 5523 (1954) B. J. 58, 503 (1954) Arch. B. B. 74, 295 (1958) J. B. C. 236, 2975 (1961) Biochem. preps. 11, 101 (1966) Meth. Arch. B. Z. J... J. B. Ba ae i} Bs 瑟 J. B. B. Z. J. 8. Fens. Arch. 续 R 分 析 方 法 Enzymol.3, 171 (1957) B. B. 74, 306 (1958) 53, 157 (1953) C. 208, 55 (1954) C. 208, 55 (1954) . B. B. 74, 306 (1958) - 303, 132 (1939) 297, 60 (1938) C. 197, 601 (1952) C. 212, 887 (1955) 62, 693 (1956) C. 212, 887 (1955) 71, 195 (1959) C. 212, 887 (1955) 273, 60 (1934) C. 162, 421 (1946) C. 167, 369 (1947) B. B. 74, 306 (1958) J. B. eth. Enzymol.9, 41, 46 (1966)|Arch. B. B.74, 306 (1958) C. 196, 135 (1952) 续 R 名 称 ay Fk 制备 方法 YP A D- Ai Bi-5- BEE 230.1 |J. B. C. 223, 993 (1956) Arch. B. B. 74, 306 (1958) D-Xylulose-5- Meth. Enzymol.9, 41 (1966) phosphate 6. 固 醇 类 物质 的 制备 名 称 分 子 量 制 备 方 法 分 析 方 法 可 的 松 360.4 J. B. C. 114, 613 (1936) J. clin. Endocr. Metab. Cortisone J. A, C. S. 74, 4223 (1952) 12, 519 (1952) B. J. 54, 523 (1953) 氢化 可 的 松 362.4 J. B. C. 124, 459 (1938) J. clin Endocr. Metab. Hydrocortisone J. B. C. 175, 451 (1948) 21, 1146 (1961) 176- 肉 (省 ) 二 醇 | 272.4 J. B. C. 115, 435 (1936) J. Endocr. 16, 49 (1957) J. B. C. 134, 391 (1940) 丙酮 及 碱 液 |B- J. 34, 1293 (1940) Ber. 74, 1914 (1941) HEC ES) = BF 288.4 Sp.s. 水 “|B. J. 24, 435, 1021 (1930) J. Endocr. 16, 49 (1957) Oestriol S. CB, Nature, Lond.131, 766 (1933) Alvis Che [J. B.C. 91, 641, 655 (1931) HE C SS) 270.4 S. Fete Am. J. Physiol. 90, 329 (1929) |J. Endocr. 16, 49 (1957) Oestrone i. 7K B. J. 34, 1293 (1940) 4.0 A 脱氧 可 的 松 358.5 Sp. s. 水 “|Scieace 121, 176 (1955) Prednisone 0.67 乙 醇 |] A. C. S. 77, 4781 (1955) 2( 9) — 8 320.5 |Sp.s. APL |J. B. C. 143, 716 (1942) J. A. C. S. 60, 2931 (1938) 2) 5 BS A 316.5 Sp.s. 水 |Ber. 67, 1611 (1934) Pregnenolone 17 AG J. A. C. S. 71, 1840 (1949) 2 乙醇 J. B. C. 174, 925 (1948) 2=() Ad 288.4 i. 7K Z. B. C. 233, 281 (1935) Testosterone S. 乙醇 /乙醚 |Z. PLC: 237, 89°C1935) ALIA] |Ber. 71, 2278 (1938) HAAR SB} 394.4 S. Ald, J. A. C. S. 78, 5693 (1956) Triamcinolone Ce, Ath 81, 1689 (1959) Abi LB CS 360.5 Sls. 水 Science 121, 176 (1955) Prednisolone 3250C Be VW ALC. SISITA ATS (1955) 0.55 A Oestradiol-17 Pregnanediol i El BE hs — Ad 288.4 S. 7 Bk, 2 (Ber. 68, 2097 (1935) J. B. C. 172, 263 (1948) Androstanedione BE ICS A 346.4 Corticosterone J. B. C. 114, 613 (1936) J. clin. Endocr. Metab. 21, 1146 (1961) © 299.0 7. 腕 ;酰胺 氨基酸, 多 肽 及 其 衍生 物 的 制备 名 称 乙酰 胆 碱 Acetylcholine bromide 了 -肾上腺 素 D-Adrenaline IT- 氨基 丁 酸 r-Amino-butyric acid L-#5 VK L-Anserine 工 - 精 氨 琥珀 酸 L-Arginino-Succinic acid Pik Cadaverine A tk Carnitine 工 - 肌 肽 L-Carnosine 工 - 瓜 氨 酸 L-Citrulline 促 肾 上 逐 皮 质 素 ACTH ‘Corticotrophin L-3-(3,4-—# ER) AA L-g-(3, 4-Dihydr- oxy pheny]) alanine (DOPA) 3,5-— BAB 3,5-Diiodotyrosine © 300 ¢ 226.1 (Br) 183.2 103.1 240.3 290.3 102.2 161.2 226.2 175.2 4566 197.2 433.0 溶解 度 i. CRRA S. 冰 酷 酸 ， FB Wi Sl.s. 水 ， 乙醇 ij- CRE, A Mi, Ai "V ISCSK i. Chto G , V.S. 水 Sls. FAB, 乙醇 Ve S. 水 L GBF se 7K Sl.s。 乙 醇 ， 乙醚 V.S. 水 ;乙醇 SLs. A 酮 ， 异 丙 醇 i. CK 32 Kk i: CB 制 备 FO V. S. 7koZ.B |J. A. C. S. 73, 2968 (1951) J. gen. Chem, U. S. S. R. 28, 3040 (1958) Am. J. Physiol. 5, 457 (1901) Ber. 59, 1068 (1926) C. A. 28, 4398° (1934) B. J. 48, 429 (1951) Arch. B. B. 46, 248 (1953) Org. Synth. Coll. 2, 25 (1943) J. 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J. 81, 98 (1961) J. B. C. 209, 145 (1954) Acta Endocr. 29, 70 (1958) Endocrinology 71, 13 (1962) Ser. 90, 1687 (1957) Meth. Enzymol.4, 856 (1957) Meth. biochem. Anal. 12, 143 (1964) : 名 称 L- 谷 胱 甘 肽 (和 氧 化 型 ) L-Glutathione oxidized GSSG L-4 peo ik 《还 原型 ) L-Glutathione reduced GSH 5 羟色胺 5-Hydroxytrypt- amine We) CB Indolacetic 3- 碘 酷 氨 酸 3-Iodotyrosine RRA Kynurenine EPERERR Noradrenaline L- 鸟 氨 酸 L-Ornithine 催产 素 Oxytocin 肌 氨 酸 SarcoSine co FRA L-thyroxine 35 55 3’-=faR-L- 甲状 腺 素 355,3’,-Triodo-L- thyroxine DFE 612.6 ~ 307.1 176.2 175.2 307.1 208.2 169.2 13272 651.0 溶解 度 S. 水 : i. 乙醇 ,乙酸 S. 水 i. 乙醇, 乙醚 227710104 水 S. 冰 和 醋酸 Sl. s. 甲醇 ， 9550 乙 醇 i. 丙酮 ;乙醚 ， a 0.16 7k; V.S. ZB; S. 丙酮 ,乙醚 ; SI i AG 6.7 SI]. s. S. 7K S. 矿 酸 , 碱 Shs. 水 > FRY, Cae Vv. S. 水 Sl.s. 乙醚 s- 水 SLs. FAA 4.8179 5k Sls. 乙醇 S. Bx SLs. 水 i. GBs G BE Sl. s. 7K il &@ A J. B. C. 98, 409 (1931) J. B. C. 194, 119 (1952) Biochem. Preps. 9, 52 (1962) Biochem. Preps. 2, 87 (1952) J. C. S. 1957, 880 Ber. 97, 2434 (1964) Meth. Enzymol. 3, 603 (1957) J. gen. Chem. U. S. S. R. 34, 1605 (1964) J. CxnS5419615.2919 J. Org. Chem. 24, 894 - (1959) JEP C24S 7; 1958, (3493 Ber. 85, 323 (1952) J. A.C. S. 75, 3589 (1953) Ber. 91, 1141 (1958) J. Org. Chem. 28, 589, 1246 (1963) B. J. 38, 320 (1944) Meth. Enzymol. 4, 856 (1957) Nature, Lond. 197, 180 (1963) Biochem. Preps 3, 108 (1953) J. A. C. S. 76, 1708 (1954) C. A. 47, 12489d (1953) SAMEHS.. 75, 1757 (C1953) J. A. C. S. 77, 2896 (1955) Biochem. Preps. 3, 97 (1953) Ber. 91, 2418 (1958) - A. 53, 199041 (1959) . A. C. S. 81, 2504 (1959) B. C. 233, 116 (1958) - As C. Ss 76, 3213 (1954) 1 CoS. 1931, 1894 - CgS. 1949, 3424 Ber. 96, 1 (1963) Biochem. Preps. 10, 171, 176 (1963) Meth. Enzymol. 4, 856 (1957) B. J. 53, 645 (1953) Ber. 96, 1 (1963) Meth. Enzymol. 4, 856 (1957) 分 析 方法 Bergmeyer. Methods of Enzymatic Analysis, p, 363, Academic press (1963) Arch. B. B. 82, 70 (1959) Analyt. Biochem. 8, 217 (1964) Meth. Enzymol. 6, 598 (1963) Meth. biochem. Anal. 6. 95 (1958) Analyt. biochem. 6, 393 (1963) Analyt. Biochem. 4, 423 (1962) eth. biochem. Anal. 12, 143 (1964) B. J. 53, 379 (1953) J. B.C. 219, 985 (1956) Arch. B. B. 85, 345 (1959) Meth. med. Res. 9, 125 (1961) B. J. 39, 46 (1945) B. J. 41, vii (1947) Endocrinology, 71, 196 (1962) J. B. C. 200, 803 (1953) Meth. Enzymol.4, 856 (1957) Meth. biochem. Anal. 12, 143 (1964) 同 工 -甲状 腺 素 *，301。 名 称 分 子 量 溶解 度 al 备 FT & 分 析 方法 一 | 一 | 一 一 -一 -| -一 -一 一 一 色 胺 160.2 | V.S. 乙醇 。 |jBer. 85, 324 (1952) .|Meth。med。Res。9，169， Tryptamine 丙酮 J. Org. Chem. 23, 146 175 (1961) Sl.s. 水 (1958) Analyt. Chem. 32, 666 乙醚 J. A. C. S. 82, 2386 (1960) (1960) 后 叶 加 压 素 1084 SS BC 222,951 C1956) Methods in Hormone 〈 抗 利尿 激素 ) i. AA J.B. C. 2334116, (1958) Research, vol. 2, p. 495, Vasopressin J. A. Cs-S. 82, 3195 (7960) Academic Press (1962) 8. 某 些 生物 大 分 子 的 制备 名 称 分 子 量 制备 及 测定 方法 清 蛋 白 ( 卵 ) 45,000 一 -46,000 B. J. 30, 227 (1936) Albumin The Proteins, eds. Neurath and Bailey, vol. 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C. 211, 605 (1954) Chondroitin 硫酸 软骨 素 A 和 C | 30,000—50,000 S. 水 硫酸 软骨 素 A 与 C 在 与 其 他 酸性 多 糖分 离 提取 时 ,二 者 常 混在 一 起 , 因 需 进一步 用 色谱 法 纯化 。 eB; A. 21, 506 (1956) 硫酸 软骨 素 A, Meth. Enzymol. 3, 20 (1957) 硫酸 软骨 素 C，J. B. C. 215,-685 (1955) 硫酸 软骨 素 B 20,000 一 30,000 Je B.C. 233, 541JKC1929) Chondroitin B B. B. A. 21, 506 (1956) 硫酸 软骨 素 A. B.C. 的 测定 见 透明 质 酸 的 方法 Chondroitin sulphates A and C - ' 名 称 溶解 度 制备 及 测定 方法 ibe Si 3 水 3 Ady. Carbohyd. Chem. 15, 341 (1960) Ale AE. 甲 酰胺 Dextran 脱氧 核糖 核酸 Sls. 水 ; J. molec. Biol. 3, 208 (1961) Deoxyribonucleic S.1—3M # |Nature, Lond. 191, 1375 (1961) acid DNA 成 胶 液 , 稀 碱 ; |Prog. Nucl. Acid Res. 3, 1 (1964) i. BAA ”| 测定 方法 见 : B. J. 62, 315 (1956) J. B. C.. 213, 107 Cts55) Meth. Biochem. Anal. 1, 287 (1954); 6, 1 (1958) 14, 113 (1966) 糖 原 Adv。Carbohyd，Chem. 12, 262 (1957) (动物 淀粉 ) J. A. C. S 64. 2349 (1942) Glycogen J. B. C. 199, 97 (1952) 测定 方法 见 ; J. B. C. 220, 583 (1956) masa J. B. C. 127, 123 (1939) Haemoglobin Arch. B. 21, 224 (1949) J. B. C. 185, 231 (1950) J. Lab. clin. Med. 46, 255 (1955) 测定 方法 见 : Nature, Lond. 175, 903 (1955) 硫酸 乙酰 肝素 17,000 一 20,000 J. B. C. 235, 3283 (1960) Heparan sulphate B. B.A. 29, 443 (1958) 测定 方法 见 透明 质 酸 组 蛋白 8400 一 57,000 Phillips, Prog. Biophys. Chem. 12, 21 (1961) Histones 透明 质 酸 0.1 一 10 B. B. A. 69, 574 (1963) Hyaluronic acid BA J. B. C. 239, 726 (1964) B. J. 92, 34p (1964) 测定 方法 见 : Meth. biochem. Anal. 2, 313 (1955) Meth. Enzymol. 3, 73 (1957) Meth. biochem. Anal. 8, 145 (960) 菊 粉 3000 一 5000 8. Modern Methods of Plant Analysis. vol. Inulin 2, p- 189, Springer, Berlin (1955) 本 B.C. 58, 27501922) P. S. E. B. M. 74, 117 (1950) 硫酸 角质 素 10,000 一 20,000 J. B. C2 205, 611 (1953) Keratan sulphate Acta chem. scand. 11, 668 (1957) 6-FALKEA 35, 000—42 ,000 : B. J. 58, 332 (1954) 8-Lactoglobulin Biochem. Preps. 4, 23 (1955) Acta Chem. scand. 16, 2067 (1962) 昆布 多 糖 Modern Methods of Plant Analysis, vol. Laminarin 2, p- 178, Springer, Berlin (1955) RRB (ERE) J. B. C. 140, 105 (1941) Levan ¢ 303 。 名 称 肌 红 蛋白 Myoglobin 果 胶 酸 Pectic acid 鱼 精 蛋 白 Protamine 核糖 核酸 Ribonucieic acid (RNA) 烟草 花 叶 病毒 Tobocco mosaic virus 转运 核糖 核酸 Transfer-RNA (tRNA) ©3046 分 子 量 溶解 度 18,500—18, 800 S. 水 8000 S. K>, Ff HSE 酸 ? 氮 水 10 ,000 一 Sl. s. 水 】 2,000,000 i. ADLIA 40X 10° S. 水 。 生 理 盐 水 24,000 一 30 ,000 S. 7k 制备 及 测定 方法 Arch. B. B. 91, 319 (1960) J. B. C. 236, 2238 (1961) Arch. B. B. 91, 310 (1960) Nature, Lond, 198, 1201 (1963) B. J. 47, 437 (1950) J. Gen. Physiol. 30, 101 (1946) B. B. A. 91, 416 (1964) Ady. Protein Chem. 15, 1 (1960) B. J. 96, 266 (1965) B. J. 93, 5c (1964) B. N. R. C. 13, 61 (1963) Progr. nucl. Acid Res. 3, 1 (1964) J- Be C. 198, 297 (1952); 221, 635 (1956) eth. biochem. Anal. 1, 287 (1954); 6, 1 (1958)s 14, 113 (1966) Biochem. Preps. 9, 132 (1962) Prog. Nucl. Acid Res. 2, 259 (1963) J. B. C. 236, 200 (1961) J. B. C.236, 1726, 1741 (1961) J. Molec. Biol. 4. 347 (1962) B. B. A. 80, 574 (1964) Meth. Enzymol. 12B, 166, 169, 173 (1968) 附 孙 二 ”部 分 国际 单位 换算 及 缓冲 液 配 制 方法 A. 部 分 国际 单位 及 换算 方法 1. 长度 单 位 2 Gn) = 10 4+ (dm) = 100 BK (cm) = 10 毫米 (mm) = 10° HAH Cum) = 10" 纳 米 (am) = 10" te CAD 1 RY =2.539998 厘米 2. 体积 单位 F (D =10 AF (dD = 100 BA Cl = 10 毫升 (mD) = 10 微 升 〈PD) 3. 重量 单位 公斤 (kg) = 10°? 克 (Ce) = 10° 分 克 (de) = 10° SE (cg) = 10° 毫克 (mg) = 10° 微克 Cus) 15a (g) = 10° 毫克 (mg) = 10° 微克 Cus) 1 市 斤 =500 克 1 磅 二 453.59237 克 4. 浓度 单位 144} F7KE=—1M = 1mol/L = 103mol/ms (mole 译 为 中 文 : BA) 5. SI 单位 制 所 用 的 词 头 符 “号 i 符 FS deca (da) centi (c) hecto (h) milli (m) kilo (k) micro(p) mega(M) nano (n) giga (G) pico (p) tera (T) femto (f) deci (d) atto (a) 量 的 名 称 J 单位 相当 量 能 量 N-m 力 kg - m/s? 压力 m~'kgs~? Nm-: 功率 m*kgs~° Jaz? 电荷 As Jv“ 电位 ; 电压 m’kgs°A7! WA-i 电阻 m’?kgs3A~? vA! Fa m~*kg~!s?A? Av-! 电容 m~?kg~!s*A? cv-! 光 通 量 cd + sr * 305 。 一 一 | 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 SI 单位 定义 | 单位 宜 当 量 -一 na-zcdsr 7. SI 单位 制 ( 米 一 千 克 一 秒 ) 基 本 物理 量 数 及 符号 物理 量 数 SI 单位 制 名 称 符号 基本 单位 长 度 米 m 质量 千克 (公斤 ) kg 时 间 0 S 电流 安 ( 培 ) A 热力 学 温度 开 ( 尔 文 ) K 发 光 强 度 坎 ( 德 拉 ) cd 物质 的 量 摩 ( 尔 ) mol 补充 单位 平面 角 gh BE rad 立体 角 球面 度 ST 8. 一些 常用 的 “C.G.S” 制 单位 与 SI 单位 制 换算 举例 (1) EA: 每 平方 英寸 上 1 H=6894.76Pa 45 1 BK AECL) =133.322Pa 1 K&FE=101325Pa 1 毫 巴 王 100Pa 1 &=10'Pa (2) 能 : 1 ARHR=10-7J 1 F+-KAE=101.328J 1 RRM )=4.184J 1 卡 (国际 表 ) (Cal) = 4.1868) 1 + 15% (Call5) = 4.1855J 电子 伏 ( 特 ) (eV) = 1.6021 x 10-1°J (3) HE: 0"C 一 273.15K 0°F = 459.67K (4) 放射 性 ; 1 BB Ci) = 3.7 K 10"%s"* (MA) (5) 照明 : 1 英尺 -烛光 王 10.7693Ix CAH) 1 平方 英尺 -流明 = 王 10.76391x 1 平方 米 -流明 ( 光 通 量 ) 一 11x 8. 生化 分 离 制备 一 些 常 用 缓冲 液 的 配制 方法 1. 挥发 性 缓冲 液 (PH1.9—8.9) pH 范围 组 ty 87 ZEFt VK ARAB, 25 REF 88% 甲酸 用 水 稀释 至 1 升 25 Ft 88% 甲酸 ,用 水 稀释 至 1 升 > 毫升 吡啶 ，100 毫升 冰 酷 酸 , 用 水 稀释 至 1 升 * 306。 pH 范围 组 份 3.5 5 毫升 吡啶 , 50 毫升 冰 栈 酸 。 FAK PREZ 1 Ft 4.7 25 毫升 吡啶 ， 25 毫升 冰 栈 酸 , 用 水 稀释 至 1 升 6.5 100 毫升 吡啶 4 毫升 冰 栈 酸 , 用 水 稀释 至 1 升 7:9 0.03M NH,HCO, 8.9 CNH,),CO; (29 克 / 升 ) 深 液 [“Data for Biochemical Research” 2nd Edition P.505—506 (1969)] 2. 挥发 性 缓冲 液 ( 高 压 电 泳 用 ) pH 范 转 系 Be 接近 2 酷 酸 一 甲酸 2.3 一 3.5 吡啶 一 甲酸 3.5—6.0 吡啶 一 酷 酸 3.0—6.0 *# 三 甲 胺 一 甲酸 (或 醋酸 ) 5.5 一 -7.0 三 甲 基 吡 啶 一 醋酸 7.0—12.0 *= Fig—— Stim 6.0—10.0 氨水 一 甲酸 (或 醋酸 ) 6.5—11.0 单 (或 三 ) 乙 醇 胺 一 盐酸 8.0—9.5 TRE RAK * =F ieee mente ABs Porath, Nature, Lond. 175,478 (1955) 3. 氯 化 钾 -盐酸 缓冲 液 (pH 1.0—2.2) 25 毫升 0.2 M KCI (14.919 克 / 升 ), 加 xz 毫升 0.2M HCL， 用 蒸馏 水 稀释 至 100 毫升 pH, 25°C x 毫升 0.2MHCI 1.00 67.0 1.10 52.8 1.20 42.5 1,30 33.6 1.40 26.6 1.50 20.7 1.60 16.2 1.70 13.0 1.80 10.2 1.90 8.1 2.00 6.5 2.10 5.1 2.20 S29 {Bower and Bates, J. Res. natn. Stand. 55, 197 (1955)] 4. 甘 氨 酸 -盐酸 缓冲 液 (pH2.2 一 3.6) 甘氨酸 分 子 量 : 75.07 25 毫升 0. 2M 甘氨酸 (15. 01 克 / 升 ), 加 z 毫升 0.2NHCI， 用 蒸馏 水 稀释 至 100 毫升 。 oO7 + pH, 25°C x f+ 0.2NHCI 2.2 22.0 2.4 16.2 2.6 (7.1 2.8 8.4 3.0 | 342 4.4 3.4 ‘ 3.6 2.5 {Sgrensen, B. Z. 21, 131 (1909); Gomori, Meth. Enzymol. 1, 141 (1955)] 5. HRB-BRS—WEFB (pH 2.6—7.6) 0.1M Fre: 含 柠檬 酸 - HO (4 FH 210.14) 21.01 克 / 升 。 0.2M 磷酸 氢 二 钠 : 含 Na,HPO, (4H 141.98) 28.40 克 / 升 ;或 含 Na,HPO,-2H,O (分 子 量 178.05)35.61 克 / 升 。 * 毫 升 0.1M 符 榜 酸 和 ?毫升 0.2M 磷酸 气 二 钠 混合 。 pH zx 毫升 0.1M FRR y 毫升 0.2M 磷酸 氢 二 钠 2.6 89.10 10.90 2.8 84.15 15.85 3.0 79.45 20.55 3.2 75.30 24.70 3.4 71.50 28.50 3.6 67.80 32.20 3.8 64.50 35.50 4.0 61.45 38.55 4.2 58.60 41.40 4.4 55.90 44.10 4.6 53.25 46.75 4.8 50.70 49.30 5.0 48.50 51.50 5.2 46.40 53.60 5.4 44.25 55.75 5.6 42.00 58. 00 5.8 39.55 60.45 6.0 36. 85 63.15 6.2 33.90 66.10 6. 30.75 69.25 6.6 27.25 72.75 6.8 22.75 77.25 7.0 17.65 82.35 7.2 13, 05 86.95 7.4 9.15 90.85 7.6 6.35 93.65 [MclIlvaine, J. B. C. 49, 183 (1921)] 6. 广泛 缓冲 液 (pH2.6—12.0) BH RARAS: 柠 榜 酸 6.008 克 ， 磷 酸 二 氢 钾 3.893 克 ， 础 酸 1.769 BR 5.266 克 。 * 308 « 每 100 毫升 混合 液 滴 加 xz 毫升 0.2NNaOH 至 所 需要 pH fa (18°C) pH x 25+ 0.2NNaOH pH x 毫升 0.2NNaOH pH x 毫升 0.2VNaOH \ 2.6 2.0 5.8 36.5 9.0 72.7 2.8 4.3 6.0 38.9 9.2 74.0 3.0 6.4 6.2 41.2 9.4 75.9 3.2 8.3 6.4 43.5 9.6 77.6 3.4 10.1 6.6 46.0 9.8 79.3 7 3.6 11.8 6.8 48.3 10.0 80.8 3.8 13.7 7.0 50.6 10.2 82.0 - 4.0 15.5 7.2 52.9 10.4 82.9 r 4.2 17.6 7.4 55.8 10.6 83.9 = 4.4 19.9 7.6 as. 10.8 84.9 , 4.6 22.4 7.8 61.7 11.0 86.0 ? 4.8 24.8 8.0 63.7 11.2 8727 5.0 27.1 8.2 65.6 11.4 89.7 5.2 29.5 8.4 67.5 11.6 92.0 5.4 31.8 8.6 69.3 11.8 95.0 5.6 0 34.2 | 8.8 the 12.0 99.6 [Johnson and Lindsey, Analyst 64, 490 (1939)] 7. HRB-HRBRARAR (pH3.0—6.2) 0.1M frig: BirieR - H.O (> FH 210.14) 21.01 克 / 升 : 0.1M FRR: QHRR=W - 2H2O GO} FH 294.12) 29.41 克 / 升 。 iF 0.1M tree y 毫升 0. 1M 柠檬 酸 三 钠 18.0 22.5 27.0 3153 36.5 41.0 46.0 50.5 ke 60.0 65.0 69.5 74.5 79.0 84.0 88.5 92.0 EN JE We em Bw em eh Ah WW WD WwW W NCAA ANOTOHOH ANO HORA AN OO 一 和 oO OoOUuMOoO oO UUEeo CN. Hemington and R. M. C. Dawson] 8. 乙酸 -乙酸 钠 缓冲 液 (PH3.7 一 5.8) 0.2M 乙酸 钠 : 含 NaAc-3H,O (分 子 量 136. 09) 27.22 克 / 升 0.2M CR: BUCS 11.7 毫升 / 升 e 309 o pH, 18°C x BF 0.2M 乙酸 钠 毫升 0.2M 乙酸 3.7 10.0 90.0 3.8 12.0 88.0 4.0 18.0 82.0 4.2 26.5 73.5 4.4 37.0 63.0 4.6 49.0 51.0 4.8 59.0 41.0 5.0 70.0 30.0 i. 5.2 79.0 21.0 . 5.4 86.0 14.0 5.6 91.0 9.0 5.8 94.0 6.0 [Walpole, J. C. S. 105, 2501 (1914)] 9. 磷酸 氢 二 钠 -磷酸 二 氢 钠 缓冲 液 (pH5.8 一 8.0) Na,HPO,-2H,O 分 子 量 王 178.05,， 0.2M 溶液 含 35.61 H/F Na,HPO,-12H,O -分子量 三 358.22，0.2M 溶液 含 71.64 克 / 升 NaH,PO,-H,O 分 子 量 138.01, 0.2M 溶液 含 27.6 克 / 升 NaH,PO,-2H,O 4>-$& 156.03, 0.2M 溶液 含 31.21 克 / 升 x 毫升 0.2M RBS AMY 毫升 0.2M 磷酸 二 氢 钠 ,用 蒸馏 水 稀释 至 100 SH. pH, 25°C zx 毫升 0.2M 磷酸 氢 二 钠 ”毫升 0.2M 磷酸 二 氢 钠 5.8 4.0 46.0 6.0 6.15 43.85 6.2 9.25 40.75 6.4 13.25 36.75 6.6 18.75 31.25 6.8 24.5 25.5 7.0 30.5 19.5 7 36.0 14.0 7.4 40.5 9.5 7.6 43.5 6.5 7.8 45.75 4.25 8.0 47.35 2.65 (Gomori, Meth. Enzymol. 1, 143 (1955)] 10. KH,PO,-NaOH 缓冲 液 (0.05M，pH5.8 一 8.0) x ZF} 0.2 MKH,PO, + y Ft 0.2NNaOH 加 水 稀释 至 20 毫升 pH(20°C) pH(20°C) 5.8 7.0 6.0 7.2 6.2 7.4 6.14 7.6 pH(20°C) | pH(20°C) 《毫升 ) 《毫升 ) 6.6 5 7.8 4.520 6.8 5 8.0 4.680 [ 潘 家 秀 等 ;蛋白质 化 学 研究 技术 ,科学 出 版 社 〈19627] 11. 巴 比 受 缓冲 液 (pH6.8 一 9.6) | | 0.04M 巴 比 妥 钠 盐 0.2NHCI pH(18°C) pH(18°C) bz. (2H) (Fr) 毫升) 6.8 100 100 | 5.2K. 7.0 100 100 | ees 2 100 100 N 2 7.4 100 100 1.65 7.6 100 100 1.13 7.8 100 100 0.70 8.0 100 100 0.35 8.2 100 Lib Shh —=206.2,0.04M WH 8.25 H/F [Britton and Robinson, J. Chem. Soctety 1931, 1456] 12. WRB A (0.2M BAR, pH7.4—9.0) 0.05M 硼砂 0.2M BAR 0.05M BAR 0.2M BAR pH (2F) CF) (SF) (毫升 ) ‘7 245 é:4 7.6 4.5 5.5 7.8 6.0 4.0 8.0 硼砂 Na,B,O,-10H,O, 4>-FB=—381.43, 0.05 M 溶液 (=—0.2M Meh) & 19.07 H/F, BRDFB—61. 34, 0.2M 溶液 含 12.37 H/F 硼砂 易 失 去 结晶 水 ?必须 放 带 塞 的 瓶 中 保存 ,硼砂 盗 液 也 可 以 用 半 中 和 的 硼酸 咨 液 代替 [Holmes, Anat. Record, 86, 157 (1943)] 13. 甘氨酸 -NaOH 4 xb% (0.05M, pH8.6—10.6) xz 毫 升 0.2M 甘氨酸 十 y 毫 升 0.2N NaOH 加 水 稀释 至 200 毫升 pH x y pH x y 8.6 50 4.0 9.6 50 22.4 8.8 50 6.0 9.8 50 272 9.0 50 8.8 10.0 50 32.6 9.2 50 1250 10.4 50 38.6 9.4 50 16.8 10.6 50 45.5 HARA FB=75.07, 0.2M BRS 15.01 H/F (Gomori, Meth. Enzymol. 1, 145 (1955)] e311. 到 .Tris- 绥 冲 液 (9.05M, pH7—9) zx 毫升 0.2M 三 羟基 甲 基 氨 基 甲 烷 十 》 毫 升 ,0.1NHSCI 加 水 稀释 至 100 毫升 0.1NHCI 0.2M ‘Tris 23°C 9.10 8.05 i. 25 was 8.92 7.96 7.82 25 30.0 8.74 7.87 7.73 25 32.5 | Wat 7e77 7.63 25 35.0 8.50 7.66 7.52 25 37.5 8.40 7.54 7.40 25 40.0 8.32 7.36 不 22 25 42.5 8.23 7.20 7.05 25 45.0 ORF yo pE H =BRERERE ( c ) 分 子 量 一 121.14，0.2M 溶液 含 24.23 克 / 升 HOCH,” NH, [ 潘 家 秀 等 ,蛋白 质 化 学 研究 技术 ,科学 出 版 社 (19627] 15. W%-NaOH 缓冲 液 (0.05M 硼酸 根 ] xz 毫升 0.05M 硼砂 + y 毫升 0.2NNaOH 加 水 稀释 至 200 毫升 [ 放 家 秀 等 ,蛋白 质 化 学 研究 技术 ,科学 出 版 社 (19627] 16. 碳酸 钠 - 碳 酸 氢 钠 缓 冲 液 (0.1M) Catt, Met? 存在 时 不 得 使 用 pH 0.1MNa,CO,| 0.1M pH 0.1M 0.1M athe ee XChe Ohm Eo sae be Dee Seed Sean may Wr ve NaHCo, 20°C 37 (SF) 《毫升 ) 20°C 37°C (毫升 7 (毫升 ) 9.16 8.77 1 9 | 10.14 9.90 6 4 9.40 9.12 2 8 10.28 10.08 7 3 9.51 9.40 3 7 10.53 10.28 8 2 9:78 9.50 4 6 10.83 10.57 9 1 9.90 9.72 5 5 Na,CO, - 10H,O 分 子 量 一 286.2; 0.1 M WHR 28.62% 克 / 升 ; Na;HCO， 分 子 量 二 84.0，0.1M BRS 8.40 克 / 升 [ 潘 家 秀 等 ,蛋白 质 化 学 研究 技术 ,科学 出 版 社 (19629) 17. 磅 酸 氢 二 钠 - 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 (pH 11.0 一 11.9) 50 毫升 0.5 MNa,HPO, (7.10 %/F+), I+ BF 0.INNaOH, FAR BKMEZ 100 毫升 «312 iy \ x 毫升 0. 1NNaOH xz 毫升 0.1NNaOH 4.1 11.1 5.1 WE 13.5 6.3 YT, oikeee. apes 7.6 ong | 1 dD.4 9.1 23.0 . . 全 [Bates and Bower, Analyt. Chem. 28, 1322 (1956)] | | | ra . Tit 4 bebe gaa 7 ) gon. erg 18. 氯 化 钾 - 氢 氧化 钠 级 冲 液 (pH12.0—13.0) vy ; wag P cm 25 毫升 0.2MKCI 加 * 毫 升 0.2VNaOH， 用 水 稀释 至 100 毫升 | ore. eae pH, 25°C x J+ 0.2NNaOH x J+ 0.2NNaOH 12.00 6.0 752 5! 12.10 8.0 32.2 12.20 10.2 41.2 ~ 12.30 12.2 53.0 12.40 16.8 66.0 12.50 20.4 [Bates and Bower, Analyt. Chem. 28, 1322 (1956)] C. 常用 酸 碱 溶液 的 比重 及 浓度 配制 1 硝酸 溶液 的 比重 和 浓度 > 1 > Sa) eos | eS BE) emma | De 1.100 2.985 17.10 1.440 17.06 74.68 1.200 6.159 32.34 1.450 18.53 79.98 1.300 9.759 47.48 1.480 20.21 86.05 1.340 11.49 54.07 1.500 22.39 94.09 1.360 12.42 57.57 1.510 23.50 98.10 1.380 13.42 61.27 1.520 24.04 99.67 1.400 14 ore 65.30 ae | emote | (OE ReRS rami | 1S ARS 1.100 6.037 20.01 ; 10.03 Sea 1.110 6.673 24.92 10.74 33.46 1.120 7.307 23.82 5 11.45 35.38 1.130 7.981 25.75 238 3725 15140 8.648 27.66 a 12.87 39.11 1.150 9.327 yh ee e313 。 3 硫酸 溶液 的 比重 和 浓度 100 i 100 ite venue | "ieee we 14.35 ’ 35. 95.6 27.32 35. 95.95 39.19 j 36. 96.38 50.11 36. 97.35 59.70 ; 36. 98.20 68.70 36. 98.52 77.17 ; 37. 98.72 . 86.92 ay. 98.77 . : 88.30 : 37. 99.12 : ~ 一 一 一 | 一 一 33- 90. : 37. 99.31 92.10 37. 100.00 Ha mmommne | ‘OReRS 洲 液 的 当量 这 度 | WE RS 0.960 5.58 9.91 24.99 0.950 7.10 12.74 14.97 28.33 0.940 8.63 15.63 16.59 3173 0.930 10.18 18.64 18.10 34.93 1/5 IBS) sre a vB MAREE | rye se 10.85 8.26 34.60 12.95 8.84 36.47 14.99 , 9.42 38.25 17.08 10.00 40.09 19.13 10.60 41.88 21.15 11.20 43.64 23.13 11.81 45.38 oy. 12.42 47.09 .05 站 13304 48.79 13.68 50.48 14.31 52.15 6. 苛 性 钠 溶液 的 比重 和 浓度 He | women | OL BREE SS 2 aR nen RS RRERRO RD 1.100 2.47 8.99 1.120 3.02 10.79 1.140 | 3.59 12.59 1.160 4.17 14.39 1.180 4.78 16.19 1.200 5.40 17.99 1.220 6.04 19.80 1.240 6.70 21.60 1.260 7.37 23.42 1.280 | 8.68 25.25 1380, “vk S| 98879 27.07 e315 e Eira AF — iM 山 il il ll YX