Ala lade tte Pp IAS A AS ODO 0 AS > Go 1 cd Mi h j > eN AE Y Aida ,. e ad AN AMAR y ANOl 7 ; JUNTA PARA AMPLIACIÓN DE ESTUDIOS E INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS TRABAJOS DEL MUSEO NACIONAL DE CIENCIAS NATURALES SERIE ZOOLÓGICA, NÚM. 42. ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA, QUOY ET GAIM. POR MANUEL BORDÁS, SCH. P. (CON 78 FIGURAS INTERCALADAS EN EL TEXTO) (Publicado el 15 de Agosto) MADRID 1920 MADRID.— Imprenta y Librería de Nicolás Moya, Garcilaso, 6, y Carretas, «e Introducción. El presente trabajo sobre la reducción numérica de los cro- mosomas en la ovogénesis del Quetognato Sagitta bipunclata, Quoy et Gaim., no viene a ser más que la continuación o Se- gunda Parte del que llevamos a cabo en 1911 en el Laboratorio Carnoy, de la Universidad de Lovaina, bajo la dirección del Profesor V. Grégoire, y que apareció en las Memorias de la Real Sociedad de Historia Natural, tomo X, 1914. Lo comenzamos a estudiar en aquel mismo Laboratorio, y lo hemos podido llevar a término en el Museo Nacional de Ciencias Naturales, gracias a la amabilidad de su Director y a la del Profesor encargado del Laboratorio de Biología. A los dos les expreso mi reconocimiento. 5 El estudio de la espermatogénesis, que primeramente hici- mos, necesitaba completarse con el de la ovogénesis; pues Si, como ya dejamos allá advertido (pág. 52), la espermatogénesis había sido poco estudiada en la Sagítta, menos aún lo ha sido la ovogénesis. Esta sólo ha sido estudiada hasta el presente, al menos que sepamos, por P. BucHnER (1910) y N. M. SrE- VENS (1903-04). El primero de estos autores insiste repetidas veces en que, después de la última división gonial de crecimiento, viene inme- diatamente el estado de sinapsis, seguido del paquinema o bou- quet, durante el cual, los filamentos cromatínicos engruesan, pero que no dejan en modo alguno reconocer división longitu- dinal de ninguna clase. Lo único que hay claro y evidente, a su Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm, 42,— 1920 6 - MANUEL BORDÁS, SCH. P. modo de ver, es que, cuando se reunen en un polo, aparecen ya con el número reducido, que es 9. «Figuras, dice BUCHNER, como la 12 [a nuestro parecer quiere representar el estrepsi- nema incipiente] afirman mi opinión de que debe excluirse toda conjugación paralela, y confirman una vez y siempre que los ex- tremos están reunidos. Los filamentos son excesivamente del- gados para que permitan reconocer una división longitudinal, pero suficientemente largos para que permitan reconocer una hipotética división transversal» (1). No nos parece ésta una razón convincente; antes al contra- rio, creemos que el ser excesivamente delgados los filamentos favorece la suposición (dado caso de que no se pudiera confir- mar por la observación directa, que ya veremos que es factible y real) de que se han dividido longitudinalmente los cordones del paquinema o bouquet, y que precisamente por eso resultan tan delgados. Lo mismo que el ser suficientemente largos abona la opinión de que no se han dividido trasversalmente, pues en ese caso no serían tan largos. De las palabras de P. BucHNER anteriormente citadas, se de- . duce que dicho autor opina, que la sindesis de los filamentos se verifica en el estado de la sinapsis o en el del paquinema, y que al salir de este estado se presentan los filamentos largos y del- gados, metasindéticos, que darán origen a los cromosomas dia- cinéticos del primer huso. Si esto es así, debiera demostrarnos el autor el modo cómo las dos porciones, de que consta cada filamento, se repliegan una sobre otra, para dar origen a los dobles cromosomas de la diacinesis. Es decir, debiera demos- trarnos el replegamiento metasiíndético, que GRÉGOIRE exige con razón a los partidarios de esta teoría reduccional. No lo hace así BUCHNER, sino que, sin presentar documento alguno, (1) «Die Fiiden sind zu diinn um einem Láingspalt in sie verlegen zu kón- nen, aber lang genug, um einem hypotetischen Querspalt sich vorstellen zu kónnen», pág. 440, ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA Ze pasa inmediatamente del estado del bouquet al del primer huso de reducción. De modo que BucHNER omite enteramente los estados prepa- quiténicos, que preceden al bouquet, y que dejamos descritos en nuestro resumen de 1914, pág. 15 y siguientes; menciona sólo el paquinema, como inmediatamente derivado de la última división gonial de crecimiento, y omite asimismo todos los esta- - dos postpaquiténicos (ib., pág. 32 y siguientes) hasta llegar a la metafase. Ya vimos también (ib., pág. 54) que, con respecto a la esper- matogénesis, se excusa el autor con la extremada pequeñez de los elementos y con lo difícil de su fijación, para obtener bue- nas preparaciones. N. M. STEVENS, en sus trabajos aparecidos en 1903 y 1904, hace un estudio más detallado de la ovogénesis. Establece en el primero que los cromosomas del paquinema derivan inmediata- mente de la última división gonial sin intervenir un estado de reposo (1). Es decir, que, al igual que BUCcHNER, niega la exis- tencia de los estados de la profase, anteriores al paquinema. En su segundo trabajo (1904) se decide por la parasindesis, afir- mando que los cromosomas de la placa ecuatorial del primer huso se dividen dos veces longitudinalmente, formando una te- trada parecida a la del Ascaris (2). Es muy digno de tenerse en cuenta que STEVENS es partida- rio de la metasindesis o conjugación end to end de los cromoso- mas somáticos en la espermatogénesis, motivo por el cual es de mayor valor su voto en favor de la parasindesis en el ovocito, aunque sea sumamente extraño que admita la metasindesis para un caso y la parasindesis para el otro. (1) «The regular arrangement of loops in such oocytes, as are shown in fig. 5 and 6 [el paquinema], indicate the possibility that they may have begun their development after the last oogonial division without an inter- venning resting stage». (1904, pág. 229). (2) Are split twice longitudinaly, forming a tetrad similar that of Ascarís, Trab. del Mus. Nac, de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm, 42,—1920 8 MANUEL BORDÁS, SCH. P. En nuestro trabajo de 1914 dejamos descritos todos los esta- dos clásicos del desarrollo citario en la espermatogénesis, de- mostrando que el bouquet o paquinema no deriva inmediata- mente de la última división gonial de crecimiento, sino que el núcleo espermatocitario pasa por todos los estados típicos de la profase de reducción, que preceden y siguen al paquinema. Asimismo dejamos sentado que la reducción es parasindética, y que la primera cinesis es heterotípica, siendo, por consi- guiente, la metafase 1 eumeiótica, o sea que verifica la verda- dera reducción cromática en la espermatogénesis. Esto mismo hemos podido comprobar en el estudio de la ovo- génesis, que no es más, como verá el lector, que una plena con- firmación de los fenómenos espermatogenéticos. Técnica empleada. Nada hemos de añadir a lo que dijimos en nuestro anterior trabajo (pág. 58) respecto a la técnica que hemos empleado en nuestro estudio. Como la Sagitta bipunctata es hermafrodita, nos hemos servido de los mismos ejemplares para el estudio de ambos procesos. Hemos de hacer notar, sin embargo, que aunque hemos apro- vechado los mismos ejemplares, procedentes de Nápoles, no nos hemos servido de las mismas preparaciones, a pesar de que en el mismo cristal se encontrasen cortes del ovario y del testí- culo, como sucede cuando se secciona el animal longitudinal- mente. Los espermatocitos toman con más intensidad la hema- toxilina férrica de Heidenhain que los ovocitos, y es necesaria una acción más prolongada del decolorante para los primeros que para los segundos. De donde resulta que, generalmente hablan- do, las preparaciones que dan imágenes claras de la espermato- génesis, apenas las ofrecen visibles de la ovogénesis, por la excesiva decoloración que en ésta se produce. Y viceversa, las preparaciones buenas para el estudio de la ovogénesis resultan ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 9 excesivamente teñidas para la espermatogénesis, presentándose la hematoxilina amontonada en los núcleos del espermatocito y no permitiendo definición alguna buena. Hecha esta salvedad, recordaremos que el fijador que nos ha dado mejores resultados es el fijador de Bouin. Todas las figuras han sido observadas con el objetivo apocro- mático de Zeiss 1.40, dist. foc. 2 mm., con la serie de oculares compensadores, y dibujadas con la cámara clara de Abbe, te- niendo el papel a la altura de la platina. El microscopio estaba provisto de un condensador holoscópico Watson, y hemos obser- vado siempre con luz artificial, filtrada a través de una disolu- ción de acetato de cobre, teniendo el filtro 19 mm. de espesor, y siguiendo en todo las instrucciones de BoLLEs- LEE (1902) con respecto a la iluminación y empleo del condensador. Estructura del ovario. Podemos considerar dividido el cuerpo de la Sagítta bipunc:- tata en cuatro porciones: cabeza, tronco, ovarios y testículos. Los testículos ocupan el último segmento; los ovarios les pre- ceden inmediatamente. Son dos, y están colocados a lo largo de los lados del cuerpo, en la cavidad celómica, y separados uno de otro por el intestino. Mirados en corte transversal (fig. 1) se ofrecen a la vista como un conjunto de huevos en diversos estados de desarrollo, abarcados por una especie de semiestuche (c. f., c. f.), en forma de media luna, o de cuarto creciente, como dice STEVENS, más delgado por el centro que por los extremos. Este estuche cons- tituye el epitelio germinativo, pero directamente sólo por su porción céntrica (e. p. g.), en donde constantemente se encuen- tran los estados más primitivos del desarrollo del óvulo. Las demás células de ese epitelio, o sea las que hay en las alas de ese semicerco, contribuyen, sin duda, a la nutrición de la por- ción central, que es la propiamente germinativa, y poco a poco, Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat, de Madrid. — Serie Zool. núm. 42.— 1920 10 MANUEL BORDÁS, SCH. P. van sustituyendo a las células centrales, que se apartan trans- formadas en ovocitos. Pudiérase comparar con más exactitud a la sámara del arce, de modo que el centro, en donde se encuentran las semillas, representara el epitelio germinativo, y las alas las dos prolon- gaciones laterales de dicho epitelio, que forman el estuche prin- cipal al conjunto de huevos. Figura 1. Corte transversal del ovario.—a.!., aleta lateral; c.f., arco de células foliculares; e. $. £., epitelio germinativo; s. 0. d., espermi-ovi-ducto; c. C., cavidad celómica; f. m., paredes musculares; /, intestino. 300. El número de óvulos, que aparecen en el corte transversal, es de unos 12 a 18. Comienzan a aparecer en las inmediaciones del epitelio germinativo; y paulatinamente, a medida que van ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 11 transformándose y creciendo, se corren hacia el interior, llegan- do hasta ponerse en contacto con las paredes del intestino. En corte longitudinal el aspecto es vario, según el lugar por donde pasa la sección. Si el corte pasa por la región del epitelio ger- minativo o próximo a él, abundan en el corte los ovocitos en las primeras fases del desarrollo citario, y de vez en cuando se ob- servan entre los mismos las células suspensoras de los ovocitos más avanzados y los conductos micropilares, que se abren en el interior de los óvulos ya maduros o casi maduros. Si el corte longitudinal del microtomo viene dado por la región inmediata al intestino, en ese caso la preparación aparece completamente formada por óvulos en sus últimos períodos de desarrollo. El epitelio semilunar, que abarca y protege el conjunto de óvulos, se termina superior e inferiormente por un capuchón, que se suelda por sus extremos a las paredes del cuerpo. El capuchón inferior, por su superficie externa, que es con: vexa, forma el fondo superior del conducto seminal, que viene desde las vesículas seminales de los testículos y que va poco a poco abriéndose en forma de embudo, hasta quedar cerrado por la pared de dicho capuchón. Entre la región germinativa del epitelio ovárico y la pared exterior del cuerpo corre un conducto (5. 0. d.) que lo es a la vez para los espermatozoos y para la puesta de los huevos, por lo cual puede llamársele espermi-ovi-ducto. Sus paredes están formadas por una membrana epitelial de células pequeñas, por entre las cuales se ven tractus más o menos gruesos de subs- tancia amorfa, que se tiñen intensamente por la hematoxilina, y de una textura análoga a la red testicular, que describimos en el testículo (1914, pág. 62, figs. 24, 25 y 26). Estos tractus amoríos y elásticos, juntamente con las células epiteliales, cons- tituyen la red ovárica que sostiene agarrados los óvulos hasta su completo desarrollo; pues esos filamentos se prolongan por las paredes de la cavidad cónica, que se forma a la entrada del conducto del micropilo, que da paso al espermatozoo (figs. 16 Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. —Serie Zool. núm. 42. — 1920 12 MANUEL BORDÁS, SCH. P. a 25). Dichos ligamentos filamentosos se sueltan cuando el huevo está completamente desarrollado, o aun tal vez contribuyen a facilitar el paso del huevo al oviducto, para verificar la puesta. El espermi-ovi-ducto recorre todo el ovario, adosado en su trayecto al epitelio germinativo. Por la parte superior termina encorvándose un poco hacia dentro de la cavidad ovárica y se abre en ella en forma algo ensanchada (fig. 2, s. o. d.), en tanto que el epitelio germinativo queda recogido debajo de él (e. p. £.). | o Figura 2. Capuchón superior con la abertura del espermi- ovi-ducto, Ss. 0. d.; C. f., capuchón de células foli- culares; €. hb. £., epitelio germinativo replegado; Cc. C., cavidad celómica en la que se encuentran los óvulos. 475. Por la parte inferior el espermi-ovi-ducto se arquea casi en ángulo recto hacia atrás y desemboca en la porción dorsal in- mediata a las aletas laterales (1). Este conducto de comunicación con el exterior (figs. 5, 6 y 7) se presenta ligeramente estrechado en forma de cuello y se abre al exterior por un mamelón, formado por un conjunto de células alargadas (c. m.). Estas células se apoyan en el epitelio subya- cente, y encorvándose un poco, se reunen por su extremo libre, (1) SencwicH dice equivocadamente que los oviductos desembocan a am- bos lados del ano, en el punto de unión de las regiones media y caudal. (A Student's Text-book of Zoology. Vol. I, London, Swan Sonnenschein and Co., 1898, pág. 589), : 4 ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 18 formando el orificio de salida. Son en número de unas 9 a 12, en corte transversal, y están finísimamente estriadas en el sentido de su mayor longitud. De modo que no sería extraño que for- masen un esfínter de músculos involutarios, que rigiera la aber- tura o cierre del orificio sexual. El orificio sexual masculino se encuentra detrás, en las vesí- culas seminales, no lejos de este mamelón. De donde resulta que SE E E Figura 3. Corte del ovario antes de llegar al canal de comuni- cación con el exterior.—s. 0. d., espermi-ovi-ducto; c. s., boquete superior del conducto seminal; c. f., arco de células foliculares. <475. es casi seguro que los espermatozoos, al salir de la vesícula seminal, penetren fácilmente y con abundancia en el oviducto; razón por la cual éste se halla constantemente lleno de infinidad de espermatozoos, siendo probable en muchos casos la autofe- cundación, como opina STEVENS. Las figuras 3, 4, 5, 6 y 7 representan varios cortes de la ter- minación del espermi-ovi-ducto y sus anejos, hechos a diferen- tes alturas. En la figura 3 el espermi-ovi-ducto aparece de forma Trab, del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. —Serie Zool. núm, 42. —1920 14 MANUEL BORDÁS, SCH. P. aproximadamente elíptica (s. 0. d.); a su izquierda se extiende un conjunto bilobado de células (c. f.), que corresponde a las dos alas laterales del estuche ovárico (fig. 1, c. f.), y que tiende a formar el fondo del capuchón inferior del ovario. A su vez, este mismo capuchón cierra superiormente el conducto semi- nal, del que se ve el ancho boquete en c. s. En el corte repre- sentado en la figura 4, hecho algo inferiormente, persiste aún el porte elíptico del conducto ovárico (s. o. d.); hemos llegado CS. > 17 Cc. mt. 2) AL ES Ef a) LN Figura 4. Corte del ovario practicado más inferiormente que el anterior. — C. m., mamelón de células; P. M., paredes musculares; a. l., aleta late- ral. 475. al último plano del fondo del capuchón (e. fp. £.), del que sólo quedan algunos restos. En cambio, está completamente abierta la porción superior del conducto seminal (c. s.). En c. m. co- mienzan a verse los primeros indicios del mamelón que forma el orificio sexual, situado, como claramente se ve, superiormente a la aleta lateral (a. 7.), y, por consiguiente, en la región dorsal, y no al lado del ano, como dice SeDGwicH. En la figura 5 hemos llegado al nivel superior del canal de comunicación del oviducto ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 15 con el exterior. El corte del oviducto, que era elíptico, se pro- longa en forma de cuello (s. o. d.), terminado por el mamelón (c. m.) de células reguladoras. Ha desaparecido el fondo del capuchón ovárico, del que únicamente queda un resto insignifi- cante en c. f. El conducto seminal (c. s.) continúa abierto. En el corte siguiente (fig. 6), dado precisamente en medio y a lo largo del canal de comunicación, se ve de un modo claro el estrechamiento en cuello del mismo (s. 0. d.) y la abertura for- Figura 5. Corte practicado en el plano superior del canal de comunicación del espermi-ovi-ducto s. 0. d. con el exterior. Las letras el mismo significado que anteriormente. X475. mada por las células del mamelón (c. m.), las cuales dejan, por debajo de la pirámide achatada que forman, una cavidad o cámara ensanchada. Esta cavidad, juntamente con las células reguladoras, cuando se abren, contribuye a la formación de un embudo colector de los espermatozoos, y sirve, por consiguiente, para facilitar la fecundación. Del capuchón ovárico apenas queda indicio (c. f.). En el corte de la figura 7, dado más infe- riormente que el anterior, se ve abierto el orificio formado por las células del mamelón (c. m.). Lo cual parece indicar que el Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. —Serie Zool, núm. 42.— 1920 16 MANUEL BORDÁS, SCH. P. orificio exterior de la cámara no se corresponde con el eje del canal de comunicación, sino que está algo desviado inferior- mente; posición altamente favorable para el fin a que está des- tinada, pues, encontrándose el orificio sexual masculino situado inferiormente, los espermatozoos, al ascender, encuentran en seguida el embudo colector, por donde pueden penetrar en el espermi-ovi-ducto. En cambio, si el animal cierra la abertura por la contracción de las células reguladoras, los espermatozoos se deslizan a lo largo del cuerpo, sin penetrar en el canal. Figura 6. Corte en el centro del canal. Las letras el mismo significado que la figura 5. 475. Este conducto que estamos describiendo no sólo sirve para la entrada de los espermatozoos, sino que también, y aun princi- palmente, para la expulsión o puesta de los huevos. Por este motivo llamamos a este conducto espermi-ovi-ducto. La puesta de los huevos se verifica según el modo descrito por STEVENS (1904). Lo hemos podido observar parcialmente en nuestras preparaciones. El huevo maduro se abre paso por entre las células que le rodean (fig. 8), por entre las cuales penetra a modo de ameba, contrayéndose y estirándose, para buscar el ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 17 hoyo o divertículo que el oviducto forma a su nivel (figs. 15 a 25), en continuidad, o mejor dicho, al comenzar el canal micro- pilar de entrada para el espermatozoo. El arco de células epite- liales del tejido germinativo, correspondiente al lado en que se encuentra el huevo maduro, es rechazado lateralmente, intro- duciéndose el huevo poco a poco en el espermi-ovi-ducto. Los cambios de forma, que para todo esto verifica el huevo, son fá- ciles, merced a la blandura y flexibilidad de la membrana vite- lina, que, aunque gruesa, no se endurece en todo el desarrollo ovocitario. Fígura 7. Corte en el plano inferior del canal. Las Jetras el mismo significado que la figura 5. 475. BoveRrI ha podido comprobar que los huevos de Sagtilta, al pasar por el estrecho orificio en el momento de la puesta, toman una forma alargada, pero que en el agua recobran su forma re- dondeada (1). Según E. W. MacbBRrIDE (1914) la puesta de los huevos madu- ros tiene lugar de diferente manera: «Las células degeneradas (1) Citado por E. KorscheLT y K. HeIDER. Trabajos del Mus. Nac. de Cienc. Nat, de Madrid.— Serie Zool, núm. 42,—1920 2 18 MANUEL BORDÁS, SCH, P. [dice] que se interponen, especialmente en la base del ovario, en- tre el epitelio germinativo y el ectodermo, desarrollan eventual- mente una cavidad y forman el oviducto. Este crece hacia atrás, y en la época de la madurez llega hasta el ectodermo y ¡Qe Q cf. ese 0 a ES SAS NS dc Figura $. Expulsión del huevo maduro.—S. 0. d., espermi-ovi-ducto; f. M., paredes musculares; c. f., arco de células foliculares, rechazado lateralmente; I, intestino. X< 300. se funde con él en un punto en el cual se ha formado la abertura sexual femenina. BucHner (1910) [añade el mismo autor] ha en- contrado que los huevos grandes pasan dentro del estrecho ovi- ducto, a través de una estrecha abertura, a modo de hendidura, , .d : 4 < ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 19 que es visible únicamente en el momento del paso del huevo» (1). Hemos de advertir que ni MACBRIDE, ni BUCHNER (1910) pre- sentan dibujo alguno del oviducto, ni de la expulsión de los hue- vos, tal como la describen. La membrana vitelina y la membrana nuclear. De las dos membranas, corion y vitelina, que envuelven de ordinario al huevo, únicamente podemos certificar en nuestro caso la existencia de la vitelina. Está formada, cuando ha llegado a su completo desarrollo, por una cubierta anhista, bastante gruesa, flexible, que se adapta perfectamente a las presiones que sobre el huevo ejer- cen los ovocitos inmediatos, como puede verse en las figu- fast, 2,3 y.8. En un principio, la membrana del ovocito no se distingue en nada de las membranas de las restantes células. No presenta ningún cuerpo extraño adherido a la misma en su superficie ex- terior. A lo más se ven pequeñas incrustaciones de forma inde- terminada, que se colorean en azul intenso o negro por la hema- toxilina, y que parecen ser de la misma naturaleza que las tra- béculas del espermi-ovi-ducto, que mencionamos anterior- mente (pág. 11). Más adelante, cuando el núcleo está en el estado de estrepsi- nema y el protoplasma comienza a llenarse de granulaciones, (1) «Asthe ova enlarge and mature they become pressed out of this layer of epithelium, and are found projecting from the surface of the ovary to- wards the body cavity, though covered with a structureless membrane. The loose cells wich intervene, specially at the base of the ovary between the germinal epithelium and the ectoderm, eventually develop a cavity and form the oviduct. This grows backwards and at maturity reaches and fuses with the ectoderm at a point where the female opening is formed. Bucnner (1910) has found that the large ova pass into the narrow oviduct through narrow slit-like openings wich are only visible at the moment of passage». (E. W. MaceripE. Text-book of Embriology. London, MacMillan and Co., 1914, págs. 434 y 435). Trab. del Mus. Nac. de Cienc, Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm, 42.— 1920 20 MANUEL BORDÁS, SCH. P. empieza también a verse algo engrosada dicha membrana. Es digno de notarse, que este engrosamiento de la membrana vite- lina, no sólo coincide con la presencia y desarrollo de los gránu- los vitelínicos en el interior del protoplasma, sino que también con la mayor proximidad del ovocito a la región exterior del ovario, que está inmediata al intestino, comolo demuestran las figuras. El espacio que dejan sin ocupar los ovocitos, es decir, los intersticios que entre ellos quedan, y los espacios que median entre los mismos, las paredes del intestino y las paredes musculares del ecto- dermo, quedán rellenos de un líquido nutritivo o linfa, que ha de contribuir no poco a la nutrición del óvulo, como Figura 9. Corte del capuchón inferior del ovario. ASIMISMO a la formación y c f., células foliculares;s. /., substancia á linfática; Oz ovocitos. "x 680. desarrollo de esta membrana. La figura 9 representa un corte del ovario hecho en el fondo del capuchón inferior; en él se ve, que dicha linfa rellena el espacio entre el epitelio germi- nativo y los dos ovocitos que se encuentran como sumergidos en ella. Por efecto, sin duda, de los reactivos empleados en la técnica, dicha linfa, al coagularse, ha dejado como burbujas vacías en su seno. Efecto, pues, dela más abundante nutrición de que disfruta, la membrana va engrosando por su cara interna, infraponién- dose nuevas capas a las anteriormente formadas; de lo cual re- sulta el aspecto estratificado que tiene en los ovocitos maduros o casi maduros (figs. 16 a 23 y 65 a 74). La misma blandura y elasticidad que permiten a esta membrana, como antes decíamos, ESTUDIO DE LA OVCGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 21 adaptarse a las presiones de las células circunvecinas, le facilita extenderse y dilatarse, a medida que el aumento de volumen del ovocito exige mayor superficie en la membrana envolvente. En la membrana vitelina, ni mirada de frente, ni en corte transversal, hemos podido descubrir el menor indicio de poros figurados. Presenta de vez en cuando pequeñas irregularidades y engrosamientos (figs. 61,67 y 68); pero, en general, puede de- cirse que es bastante uniforme en su conjunto. Para la expulsión de los cuerpos polares, comienza a resque- brajarse (figs. 69, 73 y 74) por la región inmediata al lugar en . que se forma el huso acromático, y sin duda bajo la influencia del mismo. Este resquebrajamiento mecánico va acompañado de la acción química, disolvente, de la substancia acumulada en el interior de las resquebrajaduras, la cual acción, juntamente con la de tracción verificada tal vez por el huso acromático (tracción parecida a la que ejerce sobre los cromosomas), hace que la cubierta del huevo se abombe interiormente y acabe por dejar paso libre al cuerpo polar directivo. Resquebrajaduras análogas se producen en la membrana vite- lina, durante la formación del aparato micropilar (figs. 16 a 23), por la acción de las células suspensoras. No hemos podido observar ningún indicio de corion. Si existe, debe ser finísimo y tan íntimamente unido a la membrana vite: lina, que en ningún caso se desprende una de otra. En algunos huevos, como en los de Plychomyía selecta, Meig., según re- sulta de las observaciones del P. PANTEL—recientemente arre- batado a la ciencia —fórmanse unas burbujas en la periferia del citoplasma, burbujas que están limitadas por la membrana vite- lina, que se ha desprendido de la cara interior del corion. De modo que dicha membrana forma la periferia de la burbuja. En los huevos de la Sagíita bipunctata fórmanse también abundan- temente burbujas, que predominan las más de las veces en la pe- riferia del citoplasma y en inmediato contacto con la membrana envolvente, como lo demuestran las figuras 11, 55, 57, 58 y 59. Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.—Serie Zool. núm. 42 — 1920 22 “MANUEL BORDÁS, SCH. P. Mirado de frente un corte tangencial del ovocito en el estado de la figura 59,se presenta como acribillado de burbujas (fig. 10). Pero en ningún caso, sobre todo en los cortes secantes (figs. 11 y 59), que mejor se prestan a la observación, hemos podido des- cubrir el menor indicio de membrana vitelina, que se hubiera desprendido del corion, para formar la burbuja. El límite de ésta está sen- cillamente formado por el mismo cito- plasma que, a lo más, se espesa lige- ramente, como por efecto del mayor retraimiento o acumulación de subs- tancia (figs. 57 y 58). Además, estas burbujas las encontramos también, y a veces en abundancia, en el interior Figura 10. : del citoplasma y en regiones muy Corte tangencial y super- A á ficial de un ovocito: burbu- apartadas de la periferia (figs. 55, 56 jas que se forman en el cito- . - plasma en contacto con la y 58). Estas vacuolas están, a nuestro membrana vitelina. 680. + modo de ver, en conexión con la mul- tiplicación de los gránulos del vitelo nutritivo, como ya notó H. Kinc (1908) en el ovocito del Bufo lentiginosus. ES 23 : » La membrana nuclear presenta una estructura más diferen: ciada que la vitelina, que acabamos de describir. Tanto en las células goniales, como en las citarias, es perfectamente visible, teñida con la hematoxilina, aunque finísima. Persiste durante casi toda la profase, y comienza a desaparecer cuando los cromo- -somas se reunen para formar la figura de la metafase (fig. 70). En ese núcleo se ve que el núcleoplasma se extravasa por dife- rentes lugares, sin que sea posible distinguir ningún girón, ni ro- tura en la membrana. De modo que su manera de ir desapare-: ciendo más bien nos parece que ha de ser por disolución, que por rotura propiamente dicha. STEVENS (1904) opina en cambio, que la membrana nuclear desaparece únicamente en las cercanías ] : | NS: 4 SE gc AE AA dc ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 23 del lugar en que se forma el huso acromático, para lo cual se rompe o desgarra, y por la rotura producida se extravasa el carioplasma y fluye en el citoplasma. En un estado más avanzado de desaparición se conserva el perfil del núcleo, marcado, no por la membrana, de la que ya no se descubre rastro alguno, sino por las granulaciones que sobre ella se acumularon. Así, en la figura 71 se ve aún la membrana nuclear finísima, sobre cuya superficie interior se han acumu- lado multitud de granulaciones. En cambio, en la figura si- guiente 72 ha desaparecido todo rastro de membrana; pero su situación queda denunciada por la alineación más o menos re- gular, que conservan aún las granulaciones, como puede verse también en la figura 69. Esa disolución de la membrana nuclear es uno de tantos pro- cesos que están ligados con el fenómeno de la maduración del ovocito. Principalmente, teniendo en cuenta que dicha mem- brana no deja de ser un depósito de substancias utilizables en aquella transformación. En efecto, en estados muy primitivos del desarrollo citario, obsérvanse sobre la misma numerosos cariosomas que la incrustan en diferentes lugares. Lo mismo hi- cimos notar en los núcleos de la espermatogénesis (1914, pág.73). Estos cariosomas no están distribuídos con regularidad, como puede verse en las figuras 26, 29, 33, 35, 49, 50 y 53. Una vista polar de los mismos nos enseña, que son de contornos irregulares y que no pueden en manera alguna confundirse con el nucleolo, que es siempre redondeado y ocupa un lugar interior en el núcleo. En corte transversal (figuras antes citadas) se los ve íntimamente adheridos a la membrana nuclear y, no sólo son de grosor variable, sino que este grosor no es el mismo en las diferentes partes del cariosoma, siendo de ordinario más abul- tados hacia el centro o hacia uno de los bordes. Este es el aspecto que presentan en los primeros tiempos de la profase. Mas a medida que crece el ovocito y con él el nú: cleo, los cariosomas van dando origen a una red (fig. 11), que se Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.—Serie Zool. núm. 4?.— 1920 24 MANUEL BORDÁS, SCH. P. extiende por encima de la membrana nuclear, a la manera del armazón silíceo que se observa en los Radiolarios. Las bandas de esta red recorren irregularmente toda la membrana, formando un tejido laxo de cintas, en las cuales hay depositadas granula- ciones diversas. Las bandas son escasas en un principio, y rela- tivamente gruesas, como se ve en los cortes de los núcleos en que dichas bandas quedan cortadas transversalmente, presen- tándose como engrosamientos de la membrana nuclear (figu- ras 52 y 54). Posteriormente, con el desarrollo del ovocito, di- chas bandas se subdividen mu- chas veces hasta hacerse nume- rosas, delgadas y de un grosor uniforme (figs. 55, 56, 57, 58 y 39). Únicamente en las unio- Figura 11. nes de varias bandas es en don- Red de la membrana nu- de se acumula mayor cantidad clear. 680. de substancia. Finalmente, cuando el núcleo ha llegado al estado representado en la figu- ra 61, las bandas llegan casi a confundirse con la misma mem- brana nuclear, sobre la que reposan, hasta que al fin desapare- cen. Pero, cosa notable, cuando la membrana nuclear es finí- sima, estando a punto de desaparecer (figs. 67 y 68), y cuando ya ha desaparecido (figs.69 y 72), se ve—en su cortorno, en el primer caso, yen el lugar que ocupaba, en el segundo —una multitud de granulaciones, que bien pudieran ser las mismas, que tan abun- dantemente se encuentran encima de las bandas. Efectivamen- te, una vista polar, exterior y superficial, del núcleo nos presen- ta su membrana enteramente cubierta de esas granulaciones. No nos atrevemos, sin embargo, a asegurar que realmente esas granulaciones últimas, que se observan sobre la membrana nuclear —o en su contorno, cuando ha desaparecido —sean todas ellas las mismas que se ven sobre las bandas de la red; pues pu- se da ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 25 dieran también estar relacionadas con la formación o existencia de las gruesas inclusiones, microsomas, yolk-granules o grá- nulos vitelínicos, que, como veremos más adelante, llenan por completo el óvulo en este período del desarrollo citario. Pero, de todas maneras, no hay duda de que a medida que el núcleo avanza en su evolución y se aproxima al momento de su madurez definiva, dichas granulaciones desaparecen como pro- pias de la membrana nuclear, y se mezclan con los gruesos grá- nulos, que forman en gran parte el depósito alimenticio del huevo. El crecimiento de la membrana nuclear sigue, en general, las mismas fases que el de la vitelina. En los primeros estados del desarrollo citario apenas aumenta de superficie; mas, desde el período del paquinema, comienza a dilatarse grandemente, per- mitiendo de esta manera el desarrollo y crecimiento extraordi- narios de los cromosomas y su dispersión por el interior de la ca- vidad. Una serie de medidas nos dará idea de ese crecimiento de la membrana nuclear, consecuencia natural del crecimiento del núcleo. El núcleo a de la figura 30, que es el más pequeño que hemos dibujado, y que es aproximadamente esférico, mide 6'2 p. de diámetro, lo que da para su membrana una superficie de 120 p cuadradas aproximadamente. Al terminar el primer período de crecimiento, representado en el paquinema de la figu- ra 37, dichas medidas son respectivamente 8 y para el diámetro del núcleo y 201 p cuadradas para la superficie de su cubierta, Ha crecido, por consiguiente, sólo 81 + cuadradas. En cambio, a partir del comenzamiento del periodo postpaquiténico, los núcleos . crecen con una rapidez extraordinaria. Así el núcleo (fig. 48) mide 13 y de diámetro, siendo la superficie de 530 p cuadradas. El núcleo mayor de la figura 55-d mide aproximadamente 22 y. de diámetro, y la superficie 1.520 p cuadradas. La membrana del núcleo de la figura 57 llega ya a medir 9,852 p. cuadradas de superficie, y la del núcleo de la figura 59, que casi ha llegado al término del crecimiento, mide 16.461 y cuadradas de superficie. Trab, del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. —Serie Zool. núm, 42.— 1920 26 MANUEL BORDÁS, SCH. P. A pesar de tan notable crecimiento, no está todavía en pro- porción con el de la membrana vitelina, que es mucho más rápido y mayor, sobre todo a partir del estado de la figura 59, Hasta ese estado el crecimiento se mantiene, poco más o menos, proporcional en ambos. A partir de este estado, en que comienza a cumplirse, a lo que parece, el aprovisionamiento vitelínico del óvulo, el núcleo queda casi estacionario en su aumento en volu- men, y en cambio, tiene lugar el rápido crecimiento de todo el óvulo en conjunto y, por consiguiente, el de su cubierta exte- rior. Esta mide, aproximadamente, en el ovocito de la figura 59, 50.192 p cuadradas, y al terminar el desarrollo en volumen, que puede considerarse completado en el ovocito de la figura 65, mide la membrana vitelina, próximamente, unas 212.371 y cua- dradas. No hay duda ninguna de que los cariosomas dan origen a la “red nuclear (que no debe confundirse con la red ovárica), ya que están en perfecta correlación, pues, a medida que la red se extiende, aquéllos son más delgados, y quedan limitados a mar- car las encrucijadas de varias bandas. Lo mismo opina STE- VENS (1903). Pero ¿cuál es el origen de estos cariosomas? ¿Deri- van, como se pregunta BucHner (1910), de las células suspen- soras, que veremos más adelante? Pudiera ser; mas no nos pa- rece probable. En primer lugar, porque las células suspensoras, según nuestra opinión, están exclusivamente en relación con la suspensión del óvulo y, sobre todo, con la formación del aparato micropilar, que vamos a describir luego. Y, en segundo lugar, porque los cariosomas, aunque no tan abundantes, se observan también en los primeros estados de la espermatogénesis; y allí no existen células suspensoras, como no sean las somáticas, a las que están unidas las células de la última división gonial. Pero para que los cariosomas de estas células de la última divi- sión gonial fuesen originados por las adyacentes suspensoras, sería preciso ver señales de degeneración en éstas ya desde los estados primitivos. Cosa que no se observa en ningún caso. 1 ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 27 Nos parece más probable la idea de que estos cariosomas nu- cleares sean producidos por la actividad trófica del ovocito, a expensas, al menos en parte, no de las células suspensoras, sino de las adyacentes del epitelio germinativo, que se van corriendo por los lados de las suspensoras (figs. 16, 20, 21, 22, 23 y 24) y van lentamente degenerando, hasta desaparecer por completo, facilitando con su disolución la salida del huevo maduro por el boquete, que dejan abierto en la pared del espermi-ovi-ducto, por el cual, según dejamos explicado en la página 16, se verifica la expulsión del huevo. Aparato micropilar. No es simplemente un sencillo micropilo el lugar por donde se verifica la entrada del espermatozoo en el huevo. En la Sagitta bipunctata se forma un verdadero conducto micropilar, como ya notó STEVENS en 1904. Este aparato está esencial- mente constituido por un canal cilíndrico, más o menos flexuoso, que va desde el divertículo formado en la pared del espermi- ovi ducto hasta el interior del huevo (1). En un principio los ovocitos se encuentran unidos directa- mente a la pared del epitelio germinativo, sin intermedio de ninguna célula Suspensora, de tal manera, que algunos ovocitos llegan a limitar con la pared misma del espermi-ovi-ducto (figu- ras 35, 48, 51 y 35). El lado de la membrana celular, que está en contacto con dicho epitelio germinativo, suele presentar pe- queños engrosamientos, que se tiñen fuertemente por la hema- toxilina y parecen ser de la misma naturaleza que los filamentos (1) ¿Será este conducto el filamento suspensor de que habla BucHNer? Tal vez. Pero de todos modos téngase en cuenta que, según dicho autor (pá- gina 435), el filamento suspensor se rompe y la célula que lo produce se hunde en el óvulo, en donde degenera. En cambio, el conducto micropilar penetra hasta el interior del misino óvulo, juntamente con la célula, que ciertamente degenerará después. Tra), del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid, — Serie Zool, núm. 42,— 1920 28 MANUEI, BORDÁS, SCH. P; "PAS o tractus, que dijimos están distribuidos por las paredes inte- riores del espermi-ovi ducto. Poco a poco el ovocito es rechazado hacia el interior del ova- rio por las células adyacentes del epitelio, que siguen multipli- cándose, y por los ovocitos nuevos que se van formando. De donde resulta que el ovocito queda unido al epitelio germinativo únicamente por el intermedio de una célula epitelial (fig. 54), que se va alargando, y aumenta de tamaño con relación a las restantes células epiteliales. Esta es la primera célula suspen- Figura 12. - Figura 13. Formación del aparato micropilar. —Cortes pertenecientes a un mismo aparato.—s. 0. d., pared del espermi-ovi-ducto ; S. C. s., segunda célula suspensora; f. C. S., primera célula suspensora; O., ovocito. 1.000. sora (Cc. S.), cuyo protoplasma se tiñe con bastante intensidad por la hematoxilina. Su núcleo, que es relativamente volumi- noso, se encuentra siempre en la región que está en inmediato contacto con el ovocito. Más tarde es arrastrada otra célula, que comprime a la ante- rior contra el óvulo, haciéndola tomar una forma lenticular; es la segunda célula suspensora, cuyos caracteres de colorabilidad y núcleo voluminoso son análogos a los de la anterior. - En la segunda célula suspensora, que es la que queda inme- diatamente unida al espermi-ovi-ducto, se forma una vacuola, » ] | y ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 29 rellena, sin duda, de algún jugo especial citoplásmico; vacuola que se va prolongando a lo largo del eje mayor de la célula, y que, atravesando la membrana celular por la parte que forma límite con la pared del espermi-ovi-ducto, penetra en las pare- des de éste, disolviéndolas poco a poco, hasta penetrar en él (figs. 12 y 14). La forma mazuda e irregular que presenta esta vacuola en su porción superior, nos hace sospechar en la exis- tencia de una substancia amorfa en el interior de la misma. Por el otro extremo la vacuola disuelve las dos membra- nas celulares, que están en contacto (fig. 14), y se termina, por ahora, en el interior de la célula infe- rior, siempre en lugar muy próximo al núcleo. A veces, por un efecto de proyección, parece que la vacuola se termina en el mismo núcleo (fig. 13). La Figura 14. terminación inferior de la Formación del aparato micropilar. A S. 0. d., espermi-ovi-ducto; 7., va- vacuola no es irregular, cuolas en la segunda célula suspen- . . sora. 1.000. como la superior, sino acampanada o embudada, como se observa en las mismas figu- ras 13 y 14. Durante este tiempo, la membrana vitelina del óvulo perma- nece aún delgada y fina, pues estos fenómenos tienen lugar, mientras el ovocito está en las primeras fases del gran creci- miento. Posteriormente, al mismo tiempo que la membrana vitelina comienza a engrosar, la primera célula suspensora, que es la más próxima al ovocito, se va hundiendo paulatinamente en el interior del mismo, y no sólo impide el engrosamiento de la vitelina en esa región, sino que llega a disolver la delgada capa ya existente (fig. 15). En su descenso arrastra consigo la Trab. del Mus. Nac. de Cienc, Nat, de Madrid. —Serie Zool. núm. 42. —1920 30. MANUEL BORDÁS, SCH. P. vacuola, a la que podemos ya llamar desde este momento canal micropilar. De este modo queda formado en la membrana vi- telina un gran agujero, que no tardará en cerrarse del todo. Efectivamente, una vez hundida la primera célula suspensora en el interior del óvulo, comienzan a degenerar las dos células suspensoras. La segunda célula ya manifiesta indicios de pro- gresiva vacuolización, cuando aún la primera no ha atravesado la pared del óvulo (fig. 14). La misma formación de la vacuo- la-canal a sus expensas es una señal de degeneración que si- gue acentuárdose al mismo tiempo que avanza la forma- ción del conducto. Una vez ve- rificado el hundimiento de la primera célula, aumentan de modo extraordinario las va- cuolas en la segunda, hasta que terminan por ocuparla casi en- teramente. Estas vacuolas, sin embargo, no son de la misma Figura 15. naturaleza que la que ha dado Formación del aparato micropilar. origen al canal. Y prueba de c.m., canal micropilar; mm. v., mem- brana vitelina; g.., gránulos vite- ello es que esas vacuolas se línicos. 1.000. funden al ponerse en contac- to (figs. 17, 18 y 21), mientras que la vacuola canal pasa por entre ellas (figs. 15, 18, 21 y 25), sin perder su individualidad : tiene, por consiguiente, paredes propias. La primera célula suspensora, hundida en el citoplasma del óvulo, pierde, por disolución, su membrana, quedando, como indicios o señales de la misma, pequeñas granulaciones (figs. 16, 17, 19, 20, 22 y 23), como las que anotamos al hablar de la diso- lución de la membrana nuclear del ovocito (pág. 24 y figs. 69, 71 y 72). Su citoplasma se va también vacuolizando lentamente, ts Ds il AS AE AA: e MN us de. a ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 31 y, por último, citoplasma y núcleo desaparecen en el seno del plasma ovocitario. Pero al mismo tiempo que tienen lugar estas vacuolizaciones y disoluciones de las células suspensoras, se va constituyendo la membrana vitelina en el agujero que había quedado abierto. La Figura 17. Cortes pertenecientes a un mismo aparato micropilar. Cc. A4., células accesorias; M. 1., membrana vitelina; Ss. 0. d., espermi-ovi-ducto; Ss. C. s., segunda célula sus- pensora; f.C.S., primera célula suspensora;cC.»m., canal micropilar, pasando a través del agujero micropilar de la membrana. xx 1.000. porción de membrana nuevamente formada a expensas sin duda de las células adyacentes (fig. 20, c. a.), es, en un principio, delgada; y su punto de soldadura con la porción de vitelina ya existente, está denunciado por resquebrajaduras en un todo se- mejantes a las que hemos visto se forman (pág. 21) para la ex- Trab, del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid, — Serie Zool. núm, 42, — 1920 32 MANUEL BORDÁS, SCH. P pulsión de los glóbulos polares. Tal vez esas resquebrajaduras sean efecto de alguna retracción, que tiene lugar en dicho pun- to de la membrana, para redondearla y hacer desaparecer el saliente que allí forma el óvulo hasta el presente estado. Figura 20. Tres cortes de un mismo aparato micropilar. C. 4., Células accesorias; 52M. V., membrana vite- lina; s. 0. d., espermi-ovi-ducto; S. C. S., segunda célula suspensora; f.C.S., primera célula sus- pensora; Cc. m.,canal micropilar. 1.003. Los bordes de la abertura no se ajustan, por ahora, completa- mente; sólo llegan hasta ponerse en contacto con el canal con- ductor, y vienen, por consiguiente, a dejar un pequeño agujero, que pudiéramos considerar como el agujero micropilar (figuras 16, 19 y 22), a través del cual pasa el conducto. ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 0) El conducto propiamente dicho es de forma cilíndrica, delgado, de una a dos y de diámetro, y se extiende, algo flexuoso, desde el espermi-ovi-ducto hasta el interior del óvulo. Sus paredes toman con alguna intensidad la hematoxilina férrica. En su punto de comunicación con el espermi-ovi-ducto no presenta apenas en- sanchamiento, se conserva con su mismo diámetro (figs. 16 y 19). Sigue enteramente cilíndrico, pasando al través de la célula superior, del micropilo de la membrana, y termina en el interior Figura 21. 5.0. Figura 22. Figura 23. Tres cortes de un mismo aparato micropilar.— c. a., células accesorias; S. 0. d., espermi-ovi-ducto; $f.C. S., primera célula suspensora; s. C. s., se- gunda célula suspensora; C. m., canal micropilar. 1.000. del óvulo, en la primera célula, siempre cercano a su núcleo. La extremidad inferior es embudada (figs.16, 19 y 22). El tubo cilín- drico está lleno de una substancia amorfa, incolora a los reacti- vos, que no contiene ninguna granulación, como puede verse perfectamente en la abertura que deja al desembocar en el óvulo (cuando se ha disuelto ya la membrana de la célula sumergida), formando a modo de vacuola (fig. 23). Por su extremo superior, como hemos dicho, desemboca libremente en el divertículo, Trabajos del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm. 42.—- 1920 3 34 MANUEL BORDÁS, SCH. P. que en dicho lugar forma el espermi-ovi-ducto. Sin duda, la substancia que llena el tubo conductor micropilar se confunde con la que rellena el espermi -ovi-ducto. De aquí que, así como esta substancia sirve de conductor a los espermatozoos, cuando pasan por este último conducto, así también sirve para el mismo oficio, para atraerlos y facilitar su entrada, a través del canal micropilar, al interior del óvulo. Sd Figura 24. Figura 25. Aparato micropilar en que intervienen cuatro células. —f. C. S., primera célula suspensora formadora del canal; s. C. s., segunda célula idem; Pp”.c”.s”., primera célula suspensora; s”. c”. s”., segunda ídem; C. 4., Cé- lulas accesorias con numerosos tractus filamentosos; e. $. g., epitelio germinativo. 1.000. Una vez ha penetrado el espermatozoo, las dos células sus- pensoras acaban de rehacer la membrana vitelina, degenerando enteramente, una al exterior y otra al interior de la misma. Las células adyacentes (fig. 20, c. 4.), que vienen a representar el fo- lículo ovárico de otros animales, degeneran también, y contri- buyen entre todas a la formación del trozo de membrana, al mismo tiempo que permiten, con su desaparición, que se dilate grandemente el divertículo, que en ese lugar forman las pare- des del espermi-ovi-ducto. De esta manera se forma, frente al ia des ti de ds a a Da * ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 35 punto de suspensión del óvulo, un gran boquete o agujero, por el que el huevo es expulsado más tarde, penetra en el esper- mi-ovi-ducto, lo recorre hasta llegar a su porción posterior y sale al exterior por el conducto que dejamos descrito en otro lugar. Hemos podido observar un caso, que por ser único lo consi- deramos como excepcional, pero que lo queremos dar a conocer porque da buena idea del modo cómo se lleva a término la for- mación del aparato micropilar. Las células que intervienen son cuatro: dos como suspensoras, y otras dos como formadoras del conducto. Las dos suspensoras (fig. 24) se encuentran unidas al espermi-ovi-ducto por un conjunto de filamentos del mismo. La célula inferior (p”. c”. s'.) está en íntimo contacto con la mem- brana vitelina, sobre todo el grueso núcleo, e impide el engro- samiento de dicha membrana. Esta célula está ya degenerando, por lo cual se ve llena de vacuolas; de modo que en el corte si- guiente de la misma preparación (fig. 25) puede observarse que las vacuolas están descansando sobre la misma membrana vite- lina, a la cual llegan únicamente algunos cordones de proto- plasma. De la otra célula suspensora sólo se conservan restos encima de la anterior, como puede verse en la figura 24, s”. C”. S'. Las otras dos células, formadoras del aparato micropilar, son mayores, y aún no se han puesto en contacto con el huevo (fig. 24). El conducto (c. m.) está ya formado en gran parte, y pasa al lado de una vacuola de la célula superior. En el descenso del huevo son arrastradas también algunas células accesorias (fig. 24, c. a.), cuyos núcleos son alargados y mayores que los de las restantes del epitelio germinativo (e. p. g.), y están recubiertas por abundantes tractus filamen- tosos. Periodo ovogonial. Las células pertenecientes a todo este período, juntamente con las de las primeras fases del período meiótico, son las que Trab. del Mus, Nac, de Cienc. Nat. de Madrid,— Serie Zool. núm. 42, — 1920 36 MANUEL BORDÁS, SCH. P. forman todo el epitelio germinativo, que, según queda dicho, ocupa la parte central del arco de células que abarca al ovario (fig. 1, e. p. g.). Las células que se encuentran en el período gonial son relativamente escasas y pequeñas; y de aquí la difi- cultad en poder obtener una serie completa de observaciones. Cosa sumamente deseable, aunque no constituya el fin principal que nos hemos propuesto en el estudio de la ovogénesis de la Sagitta., Las células goniales están casi siempre adheridas directa- mente a la pared del espermi-ovi-ducto; por lo cual la porción de su membrana, que limita con dicho conducto, suele ser recti- línea, y presenta incrusta- ciones de substancia amor- fa, que se tiñen intensa- mente por la hematoxilina férrica, como sucede con todas las células que se encuentran en semejante posición (figs. 35, 48 y 51). Figura 26. Formación de los cromosomas ovogo- Las células ovogoniales niales. 2.250. ; É en reposo tienen el núcleo ovalado, y es sumamente difícil reconocer en el mismo ninguna señal visible o figurada de cromatina. Parece uniforme por com» pleto, y con el rojo Congo y la eosina se tiñe de un color rosado algo más intenso que el protoplasma. El nucléolo está siempre presente: es redondeado, excéntrico y no presenta ninguna señal de vacuolización. Sobre la membrana nuclear hay escasos cariosomas que no pueden confundirse con el nucléolo, pues son exteriores al nú- cleo, de formas irregulares y de grosor variable. La primera manifestación de la cromatina que hemos podido apreciar es la representada en la figura 26. Los núcleos se en- cuentran recorridos por numerosos filamentos, más o menos pareados, que siguen direcciones flexuosas e indeterminadas, y RN A GU A ee a A ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 37 presentan frecuentes anastomosis de uno a otro, que los relacio- nan. El origen de estos filamentos pareados tiene lugar apare- ciendo primero algo esponjosos, luego se pierde ese esponja- miento y se determinan y concretan en filamento. Por lo menos así lo parecen indicar los núcleos representados. Efectivamente, sobre todo en el núcleo b de la derecha, se encuentra debajo del nucléolo un par de esos filamentos, que tiene una parte de los mismos todavía esponjosa y el resto ya definido y bien formado. Sobre las porciones ya formadas se depositan gránulos de cro- matina algo espaciados, y de preferencia en los ángulos que forman las inflexiones. Estos filamentos, más o menos pareados, una vez constituí- dos, se aproximan uno a. otro, atraídos por las anastomosis que los relacionan, expulsan de su intermedio el jugo nuclear que los separaba, y se sueldan finalmente, dando origen a uno sólo, como puede verse en algunas porciones del filamento que hay a la izquierda superior del núcleo a. Así quedan formados los cro- mosomas goniales. El nucléolo continúa presentando los mismos caracteres que antes: es redondeado, no ocupa lugar fijo en el núcleo, ni pre- senta vacuolización alguna; además suele estar relacionado con algún filamento. Se tiñe intensamente por la hematoxilina férrica. A la membrana nuclear siguen adheridos algunos cariosomas, variables en número y figura, y aplastados. El protoplasma es escaso y enteramente uniforme, de manera que no hemos podido distinguir en él ninguna formación espe- cial. No se ve rastro alguno de centrosomas, ni del resto fusorial. Tampoco se observa en la célula polarización que la oriente o disponga en una dirección determinada. Los cromosomas goniales formados se contraen durante el resto de la profase, para lo cual suponemos que seguirán el mismo proceso que en los espermatogonios. Es decir, que primero son angulosos y de contornos irregulares, como corres: Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid, —Serie Zool. núm. 42. — 1920 38 MANUEL BORDÁS, SCH. P. ponde a su manera de originarse, ya que los cromosomas pre- sentarán las mismas inflexiones que los pares de filamentos de que proceden, y la cromatina se acumulará en los lugares en que había gránulos y anastomosis. Después se regulariza la distri- bución de la cromatina, y quedan constituidos los 18 bastoncitos rectos, que son los cromosomas metafásicos. Durante este tiempo desaparece la membrana nuclear con sus cariosomas, lo mismo que el nucléolo. Los cromosomas, que en un principio están dispersos por la célula, se agrupan en la metafase (fig. 27), para formar la placa ecuatorial. No se observa en estos cromosomas la hendidura Ñ 7) : SS PI Figura 27. Figura 20: Metafase ovogonial. Longitud Metafase espermatogonial. de los cromosomas, 22 y. Xx 2.250, longitudinal que tan manifiesta pudimos ver en la metafase de los espermatogonios (fig. 28). Pero, si recordamos que en la me- tafase espermatogonial, a medida que avanza, va obliterándose esa hendidura, hasta tal punto, que cuando están los cromoso- mas unidos a las fibras del huso, es imposible distinguirla, de- duciremos que la metafase ovogonial, representada en la figu- ra 27, está algo más avanzada que la espermatogonial de la figura 28. Esto mismo nos lo da a entender el hecho de que los cromosomas ovogoniales están más agrupados que los esperma- togoniales, como más cercanos a la formación del huso. Es de notar el exacto parecido que existe entre las dos meta- fases, ovogonial y espermatogonial, representadas; y que del mismo modo que en ésta no se puede reconocer ninguna reunión ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 39 de cromosomas por pares, así tampoco en la ovogonial podemos relacionar un cromosoma con otro. De unos a otros no hay más aproximación, que la que naturalmente resulta de la formación de la placa ecuatorial. Cada cromosoma es una unidad indepen- diente y verdadera, contra lo que pretende DEHORNE (1910). Cómodamente pueden contarse los 18 cromosomas goniales metafásicos. La longitud de los cromosomas en este estado es aproximada- mente de 2'2 p como término medio. Periodo meiótico o de reducción. Conocido es el concepto que se tiene formado de la cinesis de reducción, considerada por algunos autores como una cinesis rápida, interpuesta entre dos cariocinesis ordinarias. Abarca las mismas etapas que éstas. En el estudio de esta cinesis de reducción en la ovogénesis de la Sagitta bipunctata, seguire- mos la misma división que adoptamos en nuestro anterior tra- bajo (1914) sobre la espermatogénesis. Debemos advertir que no hemos sido tan afortunados como en aquella ocasión, pues no nos ha sido posible llegar más que hasta la metafase 1. El material empleado, procedente de la Estación Zoológica de Nápoles, en donde fué fijado por el pro- fesor Lebrun, no nos ha ofrecido ocasión de poder certificar la expulsión del primer cuerpo polar y, por consiguiente, la termi- nación de la primera cinesis. Mas esto no es grave inconveniente para el fin principal que nos hemos propuesto en el presente trabajo, que consiste en es- tudiar el proceso reductor, que tiene lugar en la ovogénesis de la Sagítta. Sabido es, como dejamos anotado en otro lugar (1914, pág. 24 y siguientes), que las etapas en las cuales se en- vuelve fundamentalmente la interpretación del modo de verifi- carse la reducción numérica de los cromosomas, son las que forman la profase citariía; ya que las demás etapas, meta- Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm, 42.— 1920 40 MANUEI. BORDÁS, SCH. P. fase, anafase y telofase, no hacen más que ordenar primero, y distribuir más tarde en las dos células hijas, los filamentos cro- máticos, tales como se los ha preparado la profase. Por consi- guiente, el estudio de las cinesis de reducción exige principal- mente una investigación detallada y fina de la profase citaria, siendo indispensable seguir la evolución de los filamentos cro- máticos, paso a paso, desde la salida del último reposo gonial hasta la inserción de los cromosomas definitivos en el huso de la metafase 1. En el material empleado hemos encontrado abundantemente representados todos los estados de dicha profase, lo cual nos ha permitido un estudio de la misma tan detallado como el de la es- permatogénesis. Al igual que en el estudio de ésta, dividiremos la profase ci- - taria reductora, en la ovogénesis, en los siguientes estados: / Reposo citario. Salida del reposo. Estados prepaquiténicos..: Leptonema. Leptozigonema. Sindesis. Profase en la ca- riocinesis de re- e - | Paquinema. E Eaqiiema. ta y ñ dUCCIÓN / Sinapsis. Estrepsinema. Segunda contracción. Diacinesis. Estados postpaquiténicos. De estos diversos estados, el que ocupa más tiempo y com- prende mayor número de ovocitos es el estrepsínema, durante el cual tiene lugar principalmente el gran crecimiento del óvulo, característico de la ovogénesis; lo que indujo a GRÉGOIRE a mo- dificar el conocido esquema de BoveERI. 1.—Estados prepaquiténicos o prespiremáticos. Al exponer el estado de la cuestión en las primeras páginas de este trabajo, hicimos notar que BUCHNER afirma que los ovo- AAA EEK — II ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 41 citos, al salir de la última división gonial, se presentan ya en el estado de bouquet, durante el cual es imposible distinguir o averiguar el modo cómo tiene lugar la sindesis o unión de los filamentos cromatínicos. Estos cromosomas del bouquet, que son ya en el número reducido de nueve, se colocan directamente en el huso acromático durante la metafase. N. M. STEVENS afirma también (1903) que los cromosomas del paquinema derivan directamente de la última división gonial, sin pasar por ningún estado de reposo. Omite, por consiguiente, al igual que BucHNER, la existencia de los estados prepaqui- ténicos. Esas observaciones son deficientes, como vamos a ver. Salida del reposo.— No hemos podido observar el reposo ct- tario. La escasez de elementos en ese estado nos da a entender que es un estado de corta duración. o Realmente, todos los estados prepaquiténicos adolecen de ese inconveniente, y esa debe ser la causa porque han pasado in- advertidos a otros observadores. Así es que nos vemos preci- sados a comenzar la descripción por la salida del reposo y for- mación de los filamentos cromatínicos. Las figuras 29, 30, 31, 32 y 33 representan diversos aspectos de ese estado. La analogía sorprendente que tienen con iguales estados en la espermatogénesis, bastaría para que pudiésemos considerar estos núcleos como los representantes de la salida del reposo. Las células son algo menores que las del período gonial y contienen un núcleo ovalado o esférico: más frecuentemente ovalado. Todo el interior del núcleo está recorrido en diferentes direcciones por los filamentos cromatínicos incipientes. Apare- cen estos filamentos con un contorno incierto y poco definido, que se acentúa e individualiza de trecho en trecho, mientras que en Otras porciones desaparece, al menos aparentemente, en el fondo nuclear (fig. 29, a), En las porciones, en las cuales no se ha individualizado aún el Trab, del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid, —Serie Zool. núm, 42.—-1920 42 MANUEL BORDÁS, SCH. P. filamento, se ve claramente que su estructura es alveolar y re- ticulada; y que, apretándose y rellenándose sus huecos, es como el filamento termina su constitución definitiva. Así puede verse perfectamente en los varios núcleos que presentamos. ñ Cierto es que, a veces, el filamento aparece como formado de otros dos más finos y delicados que corren paralelos (figs. 29 y 33), y que terminarían por juntarse, como afirman algunos autores (DEHORNE, BONNEVIE). Mas en nuestro caso, dado el modo predominante de presentarse, que es el de alveolización, y dada la relación que dichos filamentos dobles guardan con las Figura 29. Figura 30. Salida del reposo citario y formación Salida del reposo citario y forma: de los cromosomas. 2.250. ción de Jos cromosomas. 2.250. porciones alveolizadas o bandas rellenadas, nos parece más ló- gico interpretar dichos filamentos paralelos como los bordes de una banda, cuya porción central se encuentra en estado atrasado de relleno o reticulación, que no considerarlos como dos filamen- tos más o menos independientes que se reunen para dar origen al definitivo. Mucho menos podemos aplicar a nuestro caso el modo de for- mación encontrado por BONNEVIE, que consiste en que los fila- mentos dobles y delgados se arrollan en espiral uno sobre otro. En la ovogénesis de la Sagítta se verifica la salida del reposo citario exactamente como dejamos explicado en la espermato- génesis. Los filamentos no siguen, en general, orientación alguna pre- dominante, si bien podríamos hacer notar que en muchas oca- siones se encuentran apoyados y como si irradiasen del nucléolo, ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 43 Además de este tipo de núcleos en salida del reposo, se pre- senta, aunque no con tanta frecuencia, otro tipo (fig. 31), en el cual los filamentos y bandas alveolizadas se encuentran forman- do marcados paralelismos y orientados todos más o menos ha- cia el mismo polo del núcleo. De aquí que el punto en el que convergen los filamentos, aparece rellenado y oscuro a causa del cúmulo de elementos reunidos. Encuéntranse también otros núcleos (fig. 33, c) que presentan muy precozmente el fenómeno de la primera contracción 0 si- napsis. Los filamentos se amontonan y comprimen en un lado del núcleo, dejando libre una gran porción de la cavidad nuclear. Pueden también observarse varios ejem- plos en los que los filamentos se encuentran no sólo orientados hacia el mismo lado de los núcleos y apoyados sus extremos en la membrana nuclear, sino que además están formando pares, en los cuales es muy de Figura 31. Salida del reposo ci- notar la simetría que ofrecen. tario y formación de los cromosomas por A nuestro modo de ver, la aparición de po. ee los filamentos cromatínicos en la salida del reposo tiene lugar, en definitiva, de la siguiente manera. Sobre las bandas o armazones, digámoslo así, de linina ya existentes, se deposita lentamente la cromatina, comenzando de ordinario a depositarse por los bordes y por los extremos. Por este motivo aparecen trozos de bandas ya concretas por sus extremos y con los bordes bien marcados, en tanto que su parte media está ocu- pada aún por regiones incoloras, en las que todavía no ha tenido lugar la precipitación de la cromatina, dispersa por el jugo nu- clear (figs. 29, 30, 32 y 33, a). Más adelante, esas bandas acaban de rellenarse y recorren el núcleo en direcciones indeterminadas aunque en relación con el nucléolo (fig. 33,b), y presentando con frecuencia pares de filamentos paralelos (figs. 29 y 33, a), que en ocasiones llegan a entrecruzarse (figs. 33, b, y 32 izquierda). Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm. 42.— 1920 44 MANUEL BORDÁS, SCH, P. Ese paralelismo sigue acentuándose hasta que, cuando están constituidas las bandas, o la mayor parte de ellas, se encuentran orientadas hacia un polo del núcleo (fig. 31), en el que se amon- tonan, aproximándose por sus extremos libres, independiente- mente del nucléolo, y con el resto de la banda extendido por la cavidad nuclear. Algunos núcleos entran prematuramente en sinapsis, fenómeno qne de ordinario suele presentarse más tarde, aunque en las inmediaciones de los estados que describi- mos, y, por de pronto, siempre (cuando existe) dentro del es- tado prepaquiténico. -* Figura 32. Figura 33. Salida del reposo citario Formación del leptonema. y formación de los cro- Xx 2.250. mosomas. 2.250. Estos núcleos, cuando no están excesivamente contraídos, permiten ver que los extremos de los filamentos cromatínicos son libres y, por consiguiente, permiten afirmar que el ovillo nu- clear no es un filamento continuo que se fracciona más tarde en un número determinado de trozos, sino que son trozos sueltos desde un principio. El nucléolo no falta nunca, como no sea por excepción, en los núcleos contraídos (fig. 33, c), que son también excepcionales en su desarrollo avanzado. Ocupa indiferentemente cualquier lugar del núcleo, pero casi siempre en relación con alguna banda cro- mática. A veces se le encuentra completamente aislado. Es re- dondeado y no suele presentar signos de degeneración. Sobre la membrana nuclear hay adheridos multitud de cuer- ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 45 pos periféricos, o cariosomas «Randkórper» de BucHNER, de formas irregulares, inconfundibles con el nucléolo, y en cuya descripción nos hemos ocupado en otro lugar (pág. 23). La membrana nuclear es bien visible. El protoplasma es uniforme. Se ven en el mismo varias for- maciones, sobre las cuales no hacemos más que consignar su existencia, sin entrar en su estudio. Una de ellas tiene forma ovalada (fig. 29, b), a modo de anillo, con dos prolongaciones. A su alrededor se acumulan las granulaciones (sin duda mito- condrios esféricos), que son sumamente pequeños. Esta forma- ción persiste al través de las mutaciones citarias (figs. 50 y 55, a), hasta que comienza el período de gran crecimiento, en cuyo caso desaparece (fig. 54). Otra formación notable consiste en una esfera (fig. 31) —que, cuando se pone en contacto con la membrana nuclear, toma la forma hemisférica (figs. 40 y 41) —constituída por numerosos y pequeñísimos gránulos, entre los cuales predominan o se des- tacan unos cuantos más gruesos, que se sitúan en la periferia. Su existencia queda también limitada al período prepaquiténico. ¿Pudiera ser eso la formación mitocondrial que algunos au- tores (DUESBERG, MEVES, etc.) han señalado en el desarrollo de otros ovocitos? Finalmente, hemos observado otras acumulaciones de mate- rial protoplasmático (fig.33), junto a la membrana nuclear, alre- dedor de un cuerpo más condensado de forma elipsoidal. Pare- ce como si este material protoplasmático se precipitara a veces sobre el cuerpo que le sirve de centro, dando origen a una for- mación de contornos definidos (figs. 35, 36, 38, 47, 48 y 55, a), que no puede confundirse con un cariosoma. Su forma es más irregular que la de los cariosomas, y se tiñe menos intensa- mente. Tal vez sea el llamado resto fusorial. | Las células son pequeñísimas. Su diminuto tamaño ha sido un obstáculo para que algunos autores pudieran llevar a cabo sus observaciones. He aquí algunas medidas que servirán de punto Trab, del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm. 42,—1920 46 MANUEL BORDÁS, SCH. P. de partida para las que sucesivamente iremos dando en los di- versos estados del desarrollo citario del óvulo. Figura 30: diámetro de la célula a, 7'5 »; idem del núcleo, 6'2 p.; superficie del núcleo, 120 p?. Figura 29: diámetro de la célula a, 16 4; idem del núcleo, 10D: Figura 31: diámetro del núcleo, 6'6 +. Leptonema.—El leptonema en la ovogénesis de la Sagítta no se presenta con el mismo aspecto que en la espermatogénesis, aunque es del mismo tipo. En la espermatogénesis los filamen- tos se presentan con un aspecto varicoso en un principio, y paulatinamente van tomando la forma de filamentos cromatí- nicos bien definidos. A veces, en los nú- cleos leptoténicos más primitivos, que si- guen inmediatamente a la salida del re- poso, puede observarse que sus filamen- tos presentan todavía indicios de la va- cuolización, co que aparecieron a la sa- Figura 34. Leptonema. 2.250. lida del reposo. En la ovogénesis no nos ha sido dado sorprender esos estados más primitivos: los núcleos leptoténicos que hemos encontrados los vemos ya con los filamentos bastante bien formados y defi- nidos (fig. 34), si bien aún conservan un aspecto algo tortuoso, que lo podemos considerar como indicio de las varicosidades pri- mitivas, que lo formaron, al igual que en la espermatogénesis. No hay en estos núcleos aparejamientos bien manifiestos que nos autoricen a llamarle núcleo leptozigoténico, pero puede ob- servarse una polarización bien manifiesta de los filamentos hacia uno de los lados de la membrana nuclear, en tanto que la por- ción media de los mismos rellena todo el espacio restante, Un punto muy digno de ser comprobado es el relativo a saber si es un solo filamento, muchas veces arrollado, el que forma el núcleo, o bien si son varios filamentos sueltos e independientes y más o menos entrelazados. No hemos podido observarlo direc- e Erin di” dd Edd a la did AAA E EA A A AAA A O si —— que son tantos como cromosomas ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 47 tamente. Sin embargo, en el estado anterior, y precisamente cuando las bandas comienzan a concretarse en filamentos defi- nidos (fig. 33, a), hemos podido ver sus extremos libres apoyados sobre la membrana nuclear o muy próximos a ella. Por consi- guiente, podemos deducir con fundamento que también en el es- tado del leptonema continúan libres e independientes. Además, en la descripción del estado análogo en la espermatogénesis, pu- dimos comprobar que realmente los filamentos, ya constituídos, se apoyan en la membrana nuclear por sus extremos libres. Sería también de gran utilidad, E por su mucha importancia, poder 7 pS A): : eS O) £:) contar en este estado, al igual que Vivan 2% en el anterior, el número de fila- E RE mentos cromatínicos que hay en el : A y Figura 35. Zigonema. Conjugación para- sindética de los filamentos. Xx 2.250. núcleo, para podernos cerciorar de goniales, que son 18. Mas esto es imposible, tanto en este estado como en el de salida del reposo, a causa del intrincado camino que siguen, y principalmente a causa de que .«en tan reducido espacio han de reunirse todos los filamentos, dando origen al apelotonamiento cromatínico, cono- cido con el nombre de ovillo nuclear. El nucléolo es redondeado y perfectamente visible. El tamaño del ovocito no ha experimentado ningún cambio notable. | Zigonema.—Del estado anterior pasamos naturalmente al de sigonema o síndesis, representado en la figura 35. En este es- tado se concretan y definen los paralelismos y aparejamientos, esbozados en el precedente. Este es uno de los estados de mayor importancia en el estudio de la ovogénesis, como ya dejamos advertido en otro lugar. Sabido es que los autores que estudian el problema de la re- ducción numérica de los cromosomas, se dividen en dos gran- Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.— Serie Zoul. núm, 4?.— 1920 48 MANUEL BORDÁS, SCH. P. des escuelas: los parasindetistas, o partidarios de la conjuga- ción paralela de los cromosomas goniales, y los metasindetis- tas, O partidarios de la conjugación por los extremos, end to end. Esta unión o aproximación de los filamentos cromatínicos, que recibe el nombre de síndests, es la que realiza el primer paso para la reducción numérica. De aquí que en todo estudio detallado de las cinesis de maduración, no puede prescindirse del estudio de este estado de la profase citaria. En nuestro caso creemos que es bien claro el modo de verifi- carse la sindesis. La figura 35 sigue naturalmente y sin violen- cia alguna al estado representado en la figura 34. Los filamen- tos cromatínicos, que en el leptonema siguen direcciones va- rias, pero sin paralelismos bien manifiestos, no sólo se han orientado manifiestamente hacia un lado del núcleo, sino que se agrupan paralelamente, de dos en dos, desde sus extremos; y aun hay caso en que los extremos de dos filamentos se han aproximado tan intimamente, que han dado lugar a la formación de un cordón más grueso, El zigonema, por lo tanto, es evi- dente. La misma polarización, que, según hemos hecho notar, se manifiesta en algunos núcleos del leptonema, no es. más que una prematura manifestación del zigonema subsiguiente. Porque, en realidad, si los filamentos del zigonema debieran unirse o rela- cionarse únicamente end to end, no habría razón alguna para que debieran aproximarse por pares en toda su extensión y con- verger sus extremos, como se ve aquí. En cambio, esta polari- zación y manifiesto paralelismo tienen adecuada explicación en el supuesto de una conjugación síde by síde o parasindética. Además, puede admitirse como ley general que la sindesis tiene lugar dentro del mismo tipo en los dos sexos. Precisamen- te es de maravillar, como dice BUCcHNER, que STEVENS admita la conjugación end to end para la espermatogénesis, y defiende la conjugación side by side en la ovogénesis. BUcHNER, como ya vimos en las primeras páginas, defiende la conjugación por AA o e Sd. de ña” tr A a A A ed Md ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 40 metasindesis, pero sin apoyarla en observación alguna, y única- mente porque los filamentos de su figura 12 (que, a nuestro modo de ver, representa el estrepsinema incipiente) le parecen excesivamente delgados, para que en ellos pueda reconocerse la conjugación parasindética. Más adelante, al discutir las opiniones, veremos en qué con- siste fundamentalmente su error. El zigonema que estamos describiendo no se presenta ente- ramente análogo al que describimos en la espermatogénesis. Vimos allí que los filamentos del leptozigonema se ofrecen arro- sariados y varicosos, y que con mucha frecuencia se entrelazan y arrollan mutuamente unos en otros, dando origen a bucles. Después, al definirse más el paralelismo y aproximación de los filamentos, resultan otros más lisos, pero que dejan reconocer todavía el entrecruce de unos con otros por el mayor grosor con que se presenta la sindesis en los puntos de cruce. En la ovogénesis el caso es algo diferente: los filamentos del lepto- nema se presentan lisos o casi lisos desde su origen, y no se observan mutuos arrollamientos en forma de bucles. De aquí resulta que, al iniciarse el zigonema, los filamentos tampoco se presentan varicosos, sino lisos y sin entrelazarse unos con otros. Esto, sin embargo, no quiere decir que no tenga lugar su arrollamiento mutuo, más adelante en el estado siguiente. Hasta lo creemos probable. Lo único que decimos es que los núcleos, que nos ha sido posible observar, todos son del tipo de la figura 35, que no lo presentan. Otra cosa queremos recordar por su mucha importancia. Vi- mos anteriormente que la salida del reposo tiene lugar con la aparición de bandas y que esas bandas, condensándose cada vez más, dan origen a los filamentos del leptonema. Acabamos ahora de ver que, aproximándose paralelamente dos de esos filamentos, es como se originan las figuras del zigonema. Por consiguiente, cada par de filamentos representa un par de bandas cromatíni- Trabajos del Mus. Nac, de Cienc. Nat, de Madrid.—Serie Zool. núm. 42. —1920 4 50 MANUEL BORDÁS, SCH. P. cas. Ahora bien, si admitimos que cada banda cromatínica es un cromosoma gonial, como parece probable, deduciremos lógica- mente que cada dualidad zigoténica está formada por dos cro- mosomas goniales; y que, por lo tanto, está iniciándose ya la reducción numérica de los cromosomas por parasindesis, como vimos también en la espermatogénesis. El nucléolo ha desaparecido durante el paso del anterior ésta- do al que estamos describiendo. La membrana nuclear es bien visible. Sobre la misma se en- cuentran adheridos los cariosomas, cuyo número, figura y situa- ción no han cambiado. También encontramos lo que, según dejamos indicado, pudie- ra ser un resto fusorial, colocado en la parte superior izquierda del núcleo, al exterior. El protoplasma es uniforme, o presenta muy escasos y pe- queños gránulos. Aunque hemos visto algunos de éstos muy próximos a la membrana nuclear, no hemos podido distinguir a su alrededor ninguna condensación o modificación del protoplas- ma, que hiciera sospechar fuesen los gránulos del centrosoma. Tanto el tamaño del núcleo como el de todo el ovocito, no han cambiado sensiblemente. Este estado, como todos los prepaquiténicos, es de corta du- ración, y sus células muy escasas en las preparaciones. Se en- cuentran casi siempre adheridas todavía a la pared del epitelio germinativo y aun a la pared misma del espermi-ovi-ducto, razón por la cual un lado de la membrana aparece engrosado con la substancia amorfa que, en forma de tractus o tirantes, cubre la pared de dicho conducto. Núcleos sinápticos.—La sinapsis o primera contracción del núcleo es un fenómeno que suele presentarse alrededor de los estados que estamos describiendo. Por muchos autores no es considerada como un estado del desarrollo nuclear, sino simple- mente como un fenómeno accesorio, que puede muy bien faltar, sin que por eso se altere en lo más mínimo la marcha del des- y x ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN,LA SAGITTA BIPUNCTATA 51 arrollo citario. Autores hay también que llegan a considerarla como una anormalidad producida, en parte, por la técnica em- pleada. Otros, en cambio, lo consideran como fenómeno normal. En otro trabajo (1914, pág. 80) dejamos apuntadas las razones aducidas en pro y en contra de la existencia normal de este es- tado o fase. En la Sagitta se presenta, tanto en la espermatogénesis como en la ovogénesis. En la espermatogénesis el núcleo sináptico sigue inmediatamente al paquinema, o mejor dicho, ambos co- existen; ya que, de ordinario, se en- cuentra bien formado únicamente en los poliplastos paquiténicos. En la ovogénesis, por el contra- rio, la sinapsis sigue inmediata- mente al núcleo zigoténico, y pre- cede, por consiguiente, al paquine- Figura 36. ma. Los filamentos cromatínicos se es o A han apelotonado a un lado del nú- cleo, en contacto con la membrana nuclear, dejando vacía una gran porción de la cavidad (fig. 36). Ha disminuido conside- rablemente su longitud, por lo cual ha aumentado su grosor. Sus contornos son algo irregulares y un tanto arrosariados, lo cual nos hace sospechar que ha tenido lugar un arrollamiento mutuo de uno sobre otro, comparable al que tan evidentemente se observa en el espermatocito. Debido al apelotonamiento y contracción que han sufrido los cromosomas, es imposible desci- frarlos y seguirlos en toda su longitud. Únicamente algunos extremos y alguna que otra asa o porción media pueden distin- guirse, cuando se proyectan en buenas condiciones de obser- vación. De la masa de cromosomas salen a veces pequeños filamentos, sumamente delicados, que la unen a las paredes de la cavidad nuclear, como han observado también otros autores en diferen- tes objetos. Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.— Serie Zool, núm. 42,— 1920 52 MANUEL BORDÁS, SCH. P. ¿Hay fusión y compenetración real de los cromosomas unos con otros, de manera que la sinapsis indique que se ha formado una masa cromatínica única? No lo creemos probable. En pri- mer lugar por lo que describimos en la espermatogénesis, en la cual probamos que no tiene lugar la fusión de los cromosomas. Y en segundo lugar porque, como puede observarse, no forman los cromosomas una masa enteramente homogénea, sino que es dable distinguir numerosas porciones de asas, si bien no es po- sible seguir ninguna de ellas en toda su longitud, como dijimos antes. Por lo demás, este estado es de muy corta duración, y son muy escasos los núcleos que pueden observarse. El nucléolo ha desaparecido. La membrana nuclear es bien visible y entera. El desgarro, que presenta el núcleo que hemos dibujado, es un accidente fortuito. Sobre dicha membrana subsisten los cariosomas de los estados precedentes. Encuéntrase también adherido a la misma el que podría ser resto fusorial, de contornos bien definidos. j El protoplasma no ofrece ninguna particularidad digna de mención. El tamaño, tanto de la célula en conjunto como el del núcleo, no ha experimentado cambio alguno notable. Las células en sinapsis se encuentran, al igual que las anterio- res, adheridas inmediatamente al epitelio germinativo. II.—Paquinema o «bouquet». — Desdoblamiento longitu- dinal. — Primera fase del crecimiento del ovocito. Todos los estados que acabamos de describir han pasado des- apercibidos a STEVENS y BUCHNER, quienes comienzan la des- cripción de la ovogénesis por el estado del paquinema. En las primeras páginas de este trabajo expusimos sucintamente las observaciones de estos autores, y a ellas remitimos al lector, PA » ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 53 El paquinema es absolutamente clásico en la ovogénesis de la Sagitta (figs. 37, 38, 39, 40 y 41). El parecido de estas figuras hasta con paquinemas observados en animales tan diferentes de la Sagítta, como en el Zepus, estudiado por WINIWARTER, es altamente sorprendente. E Las asas cromosómicas manifiestan con evidencia su indivi- dualidad, saliendo del estado de apelotonamiento de la sinapsis. En el primer tiempo del paquinema estas asas están perfecta- mente orientadas hacia un polo del núcleo, dando origen a la clásica figura, conocida con el nombre de bouquet (figs. 37, 38 y 39), en un todo análoga a la observada en la espermotogénesis. Las asas cromosó- micas están dobladas en U y constituyen la conocida fase de los cromosomas en hor- quilla. Por sus dos extremos se apoyan so- bre la membrana nuclear y por su porción Figura 37. media se dilatan, ocupando gran parte de Ren: CA la cavidad. Se entrelazan frecuentemente y de distintas maneras unas con otras, pero sin confundirse, ni fusionarse, ni presentar los pequeños filamentos de comuni- cación de unas a otras, que observamos en el paquinema del espermatocito. La individualidad e independencia de cada asa es innegable. Al igual que en la espermatogénesis, es muy factible, en este estado, contar el nú- mero de asas, que es 9, número ya redu- Figura 38. e cido; siendo, por lo tanto, el paquinema el Paquinema clásico z : en bouquet. x2.250. estado en que se manifiesta evidentemente la reducción, iniciada al aparearse los fila- mentos cromosómicos primitivos en el núcleo zigoténico. En el núcleo de la figura 37 se reconocen perfectamente siete asas paquiténicas: en el de la figura 38 cuatro, por lo menos; en la A Trab, del Mus, Nac, de Cienc. Nat. de Madrid, — Serie Zool. núm, 42,— 1920 54 MANUEL BORDÁS, SCH. P. figura 39 también siete. Las restantes asas han sido separadas por la navaja en otra porción de núcleo. De este estado de perfecta orientación polar, se pasa insensi- blemente al de dispersión de las asas por toda la cavidad del núcleo. Comienzan primero por aumentar su longitud y des- hacer los entrelazamientos que las reunen, al mismo tiempo que se agranda la cavidad nuclear (fig. 39). Pierden poco a poco su polarización y acaban por encontrarse dispersas por todo el núcleo (figs. 40 y 41), sin orienta- ; ción fija, ni relación alguna de unas con otras. Este es el primer paso para el es- tado siguiente. En el núcleo de la figu- Figura 39. - ra 40 pueden contarse con comodidad las Paquinema algo disten- nueve asas. dido. 2.250. Al mismo tiempo que tiene lugar esta dispersión se verifica un fenómeno importantísimo. En las asas del paquinema clásico (fig. 37) no se distingue (al menos en pre- paraciones ordinarias no sometidas a enérgica decoloración por el alumbre de hierro) señal alguna de se- paración entre las dos ramas o porciones longitudinales que constituyen el cromo- soma en el paquinema. Mas apenas se inicia la dispersión de las asas por la ca- vidad nuclear, comienzan también a apa- recer indicios de la separación de las dos mitades que las formaron. Ya en la figu- ra 39 puede notarse lo que decimos: pre- 3 É ¡CN Figura 40. cisamente las dos más largas (las dos que Paquincióa LN presentan dos inflexiones en ángulo rec- dispersas por la cayi- LO, dad nuclear. 2.250, to), y que, por consiguiente, están más avanzadas en su crecimiento citario, presentan puntuaciones claras en medio del grueso del asa en sus porciones extremas. Esta fenestración sigue acentuándose paulatinamente, hasta ser e is. AAA AA IS AA PA TE A SA “sariado, y dijimos que era indicio de ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 55 muy manifiesta en el núcleo de la figura 41, visible sobre todo en el asa, que ha sido arrastrada fuera del núcleo y en otras dos que han quedado dentro de él. El motivo por el cual esta separación longitudinal de las dos porciones constitutivas del asa paquiténica tiene lugar de ese modo fenestrado es bien evidente. Hi- cimos notar que en la sinapsis se pre- sentan las asas con aspecto algo arro- que los dos filamentos constitutivos pu- dieran haberse entrelazado uno con el otro, arrollándose a manera de bucle, como sucede en los núcleos espermato- citarios. En correspondencia, pues, con Figura 41. ese entrelazamiento aparecen las fenes- Paquinema. Reaparición : de la separación longitu- traciones en los lugares en que los dos dinal de susdos filamentos filamentos se ofrecen a la observación MPonentes: Es colocados de plano. Además, hay que tener en cuenta que, du- rante la primera contracción, tiene lugar, como ya hemos visto, una íntima aproximación y contacto de las asas, unas con otras, y aun llegan a entrelazarse, como se comprueba observándolas al salir de ese estado (figs. 37 y 39), en que conservan todavía dichos entrelazamientos. Ahora bien; dada la plasticidad de la substancia cromática, es muy natural que se verifiquen adhe- rencias entre los diversos elementos que intervienen en el fenó- meno. De aquí que, al venir el estado del desdoblamiento longi- tudinal, se vean algunos tractus de substancia que no se han roto todavía y que relacionan una porción de asa con su congé- nere, y pueden también relacionar unas asas con otras, aunque de un modo pasajero. Así se comprende perfectamente el as- pecto fenestrado que presentan las asas del paquinema, cuando comienzan a dar señales de la separación longitudinal de sus dos filamentos constitutivos. Trab, del Mus. Nac. de Cienc, Nat. de Madrid. — Serie Zool, núm, 42. 1920 56 MANUEL BORDÁS, SCH. P. Más tarde veremos que el aspecto que presenta el estrepsi- nema confirma plenamente esta interpretación. y En la espermatogénesis vimos esto palpablemente en los nú- cleos que reproducimos aquí para mayor claridad (figs. 42, 43 y 44). En estos núcleos se ve cómo des- pués de haber tenido lugar la adherencia de las partes que constituyen un asa, y también la adherencia de un asa con otra, durante la sinapsis, se conservan nume- rosos tractus de substancia cromática que las relacionan al verificarse la sepa- ración y alejamiento de cada una de esas Figura 42. partes en el crecimiento estrepsiténico. Paquinema hendido en : - el espermatocito. Vista No nos ha sido dado encontrar esos nú- AS cleos tan demostrativos en la ovogénesis que estamos estudiando. Pero el exacto parecido del paquinema del ovocito con el mismo estado del espermatocito, nos afianza en la creencia de que el desdoblamiento tiene lugar en las mis- mas condiciones en uno que en otro. Y más aún teniendo en cuenta el aspecto del núcleo estrepsiténico, que luego vamos a describir. Además de ese desdoblamiento, digá- moslo así, fenestrado, hay otro muy no- table, que carece de entrelazamientos, y está en perfecta correspondencia con la zi- AY. gotenia que queda descrita (pág. 39). Ese Figura 43. nuevo aspecto es el representado por el nú- A cleo a de la figura 55. En él se evidencia ed cómo las asas paquiténicas conservan toda- vía la polarización propia del bouquet, apoyándose sobre la membrana nuclear. La porción media de estas asas se extiende por el resto de la cavidad, que ya se ha ensanchado notable- mente. Estas porciones medias están ya desdobladas, casi no ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 07 presentan entrelazamientos y no dejan la menor duda de que su origen es precisamente debido a la división longitudinal del cordón grueso del paquinema. Pues así como vimos en el zigo- nema (fig. 33, a, c) que la aproximación comienza a verificarse por los extremos y va corriéndose paulatinamente hacia el me- dio del asa; ahora, por el contrario, el desdoblamiento comienza por la porción media y va corriéndose hacia los extremos, razón por la cual estos extremos se ven aún gruesos y sin desdoblar. El fenómeno es exactamente igual al descrito en la espermato- génesis. He aquí lo que decimos en aquel caso: «Hemos advertido anteriormente que la conjugación de los filamentos comienza por sus extremos y que, hacia el medio del asa, los filamentos presentan casi Figura 44. siempre una separación bastante , Paquinema hendido en el es- notable. Pues bien; también aquí po renal observamos el mismo fenómeno: la «hendidura» o separación es casi siempre más pronunciada en el medio que en las porciones terminales del asa» (1914, pág. 83). La formación y separación de las asas del paquinema se adapta con exactitud a la descripción que dan H. J. Snook y J. A. Lon en el estudio de los estados parasinápticos del Anetdes lugubris. Comienzan los filamentos del leptonema a unirse primero por sus extremos, side by side, paralelamente, dando origen a figuras en forma de V; la conjugación parasin- dética va corriéndose, transformándose las figuras anteriores en otras en forma de Y, hasta que, finalmente, resultan las asas paquiténicas. El desdoblamiento es inverso: aparecen primero las figuras en forma de Y (fig. 55, a), para terminar por las figu- ras en forma de V y por el aislamiento total de los filamentos conjugados. Trab, del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. —Serie Zool. núm. 42.— 1920 58 MANUEL BORDÁS, SCH. P. Las porciones que están ya separadas unas de otras se pre- sentan algo granulosas y arrosariadas; fenómeno parecido al que hicimos notar en la descripción del núcleo del leptozigone- ma del espermatocito, pero que aquí tiene significación distin- ta. Pues allá es efecto de la precipitación o condensación de la cromatina en forma de gránulos sobre el andamiaje de la banda de linina: aquí, en cambio, esa granulación está íntimamente ligada con el crecimiento del ovocito, y es el primer paso para la depuración que va a sufrir el cromosoma durante el período de gran crecimiento; de modo que más bien constituye un des- prendimiento o pérdida de cromatina. Estos núcleos paquiténicos desdoblados y los del zigonema (pág. 38) se confirman mutuamente en el procedimiento de ve- rificarse la reducción numérica de los cromosomas por parasin- desis pseudomeiótica. Del nucléolo no queda vestigio ninguno visible, pues no con- ceptuamos como a tal el gránulo que aparece en el núcleo a de la figura 55, y que más bien relacionamos con los gránulos esfé- ricos descritos por STEVENS y otros autores como adheridos a algunos cromosomas. La membrana nuclear es visible y entera. Los cariosomas que hay sobre ella son escasos y del mismo contorno irregular que en los estados anteriores. Sobre la misma membrana subsiste adherido el problemático resto fusorial de contornos bien definidos (fig. 38). En el protoplasma, que en general es uniforme, se observa la formación anillada con los extremos libres y prolongados en forma de corbata (fig. 55, a), que mencionamos anteriormente. Encuéntrase también la acumulación mitocondrial de forma hemisférica, pegada a la membrana nuclear. Las mitocondrias son pequeños granos, que se agrupan, dando origen a una media esfera en cuya superficie se colocan los granos más gruesos; y aun parece que hay un finísimo filamento que une y relaciona estos granos mayores. ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 59 El tamaño de la célula y del núcleo comienza a marcar, con su aumento, el primer paso para el gran crecimiento del ovo- cito. He aquí algunas medidas: Figura 37: diámetro del núcleo, 8 ; diámetros de la célula, MtSs 15 y. Figura 39: diámetro del núcleo, 9'8 p; diámetros de la célula, 11x12 y. Figura 55: diámetro mayor del núcleo a, 12 +; diámetros de la célula, 17'7 < 15 y. Si recordamos que el núcleo a de la figura 30 mide 6'2 p de diámetro y la célula 7'5 u, veremos que el núcleo ha duplicado su diámetro y cuadruplicado aproximadamente su volumen. Estas células se encuentran de ordinario adheridas aún direc- tamente al epitelio germinativo. Sin embargo, cuando se inicia el desdoblamiento longitudinal, comienzan ya a apartarse de dicho epitelio (fig. 559, a) y a quedar relacionadas con él por me- dio de las células suspensoras, que originan el aparato micropi- lar, y por las accesorias, que son arrastradas con los ovocitos al hundirse éstos en la cavidad del celoma (figs. 13 y 20, c, a). III. — Gran crecimiento del ovocito. — Estados postpaquité- nicos. — Núcleos estrepsiténicos. El crecimiento que ha experimentado el ovocito hasta el es- tado en que acabamos de dejarlo, es análogo al que experimenta el espermatocito durante toda la profase citaria. En efecto, los mayores núcleos, que pudimos observar en la espermatogénesis, no pasan de 9'8 p de diámetro, es decir, idéntico al que mide el núcleo paquiténico de la figura 39 en la ovogénesis. Mas a partir de este momento, y tan pronto como empieza a manifestarse la «hendidura» longitudinal de las asas, y la sepa- ración de los filamentos, crece de una manera extraordinaria el núcleo y el ovocito entero, justificando (por lo que a la ovogé- nesis se refiere) la adición de un nuevo y ancho triángulo o tra- Trab, del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.—$erie Zool. núm. 42.— 1920 60 MANUEL BORDÁS, SCH. P. pecio al conocido esquema, que BovERI dió para las génesis de las células reproductoras. Apenas se esboza el desdoblamiento longitudinal, el diámetro del núcleo del ovocito supera al del es- permatocito en su máximo desarrollo. El núcleo a de la figu- ra 55 mide ya 12'2 y de diámetro; y la célula entera 17'7 y. Si- guen ambos creciendo incesantemente hasta alcanzar un diá- metro máximo de 16 y para el núcleo y 329 y. para el huevo. En correspondencia con ese gran crecimiento, el período que vamos a estudiar es el de mayor duración en la ovogénesis: en todos los cortes del ovario predominan los óvulos en diversas fases de este período. De aquí que sea sorprendente en sumo grado que BUCHNER afirme que es absolutamente claro que en la ovogénesis no se produce ningún desdoblamiento longitudi- nal de las asas paquiténicas (1910, pág. 290) (1). Veamos qué aspectos van tomando el núcleo y el óvulo entero durante estos estados postpaquiténicos. Los dos filamentos constituyen el asa del paquinema y acaban por separarse completamente uno de otro, corriéndose hasta los extremos del asa la «hendidura» que separaba las porciones medias de la misma. De este modo se originan los núcleos es- .trepsiténicos o el estrepsinema. Pero, como consecuencia de la relación íntima que se estableció entre los dos filamentos du- rante el paquinema, y sobre_todo durante la sinapsis, conservan, una vez separados, ciertas relaciones entre sí, al menos al prin- cipio, que facilitan el reconocimiento de las dos porcienes conju- gadas. Efectivamente, en todos los núcleos estrepsiténicos pue- de siempre reconocerse con claridad cierta relación de depen- dencia entre cada par de filamentos cromatínicos (figs. 47 a 55). Algunas figuras, sobre todo, no dejan lugar a la menor duda. La cavidad nuclear aumenta rápidamente de capacidad y los filamentos se extienden y dispersan por la misma de mil dife- (1) «... an diesem Objekt... nicht nur dass Bukett sich auflóst, ohne etwas von einem Lángspalt zu sehen ist, sondern auch von den folgenden Stadien das gleiche gilt.> ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 61 rentes maneras, siguiendo direcciones variadísimas, que no están en relación ninguna con la polaridad, tan manifiesta en el paqui- nema. Pero en medio de esa expansión y crecimiento conservan los filamentos ciertos indicios de su común origen de una misma asa paquiténica. Lo más frecuente son mutuos entrelazamientos que hacen que los núcleos estrepsiténicos primitivos del ovocito tengan gran parecido con sus si- milares del espermatocito. Compárense al efecto las figuras 45 y 46, que repre- sentan dos aspectos clásicos del estrep- sinema en la espermatogénesis, con los Figura 45. núcleos, figuras 48, 52 y 54, de la ovogé- Estrepsinema en el es- , permatocito. 2.250. nesis, y se verá que, si se reducen estas últimas figuras al tamaño de las del espermatocito, el parecido es muy notable. Los filamentos tienen en un principio los contornos bien defi- nidos (fig. 48). Se parecen en todo, menos en la polarización, a los que hemos visto en el zigo- nema (fig. 35); pero no pueden con- fundirse con éstos, porque, además de la falta de polarización y para- lelismo, tan manifiestos en el zigo- nema, los núcleos que describimos tienen una cavidad nuclear muy grande en comparación con aqué- llos; lo cual es buen medio para re- conocer el período por el que atra- Figura 46. viesa el ovocito en aquel aspecto a NA de su desarrollo. El diámetro ma- yor del núcleo del zigonema (figu- ra 35) es de 9'8 f; en tanto que el del estrepsinema incipiente (figura 48) mide 13 y y es casi esférico. Los filamentos que primeramente, como dijimos, son de con- Trab. del Mus, Nac. de Cienc, Nat. de Madrid.—Serie Zool, núm. 42. — 1920 62 MANUEL BORDÁS, SCH, P. tornos lisos, comienzan a presentar señales de lo que podríamos llamar depuración cromatínica, que ha de dar origen a las varia- dísimas e intrincadas figuras, que tanto admiran cuantos se de- dican al estudio de la ovogénesis. Empiezan, primero, por pre- sentar contornos irregulares (fig. 55, b), como si el filamento Figura 47. Figura 48. Principio del estrepsi- Forma normal del estrepsinema incipien- nema en el ovocito. teen el ovocito. Asas con los extremos Xx 2.250. independientes. Principio del crecimiento citario. 2.250. entrase en un período de desintegración; aumentan de longitud y grosor y, como consecuencia de ello, toman aspecto esponjoso (figuras 49 y 50); recorren toda la cavidad nuclear sin dejar por eso de presentar frecuentes entrelazamientos. Más adelante, la substancia cromatínica, que parece que se desintegra, se apelotona y re- une en gránulos sobre el eje del fila- mento, tomando éste entonces el as: pecto arrosariado (fig.51). Las figuras son bien claras y demostrativas: es- Figura 49. Estrepsinema. 2.250. tamos en pleno estrepsinema. Mas desde este momento va a verifi- carse en los cromosomas del ovocito un curioso fenómeno, que ha sido interpretado de diferentes maneras por los diversos au- tores. El hecho es que los cromosomas pasan por un período característico, durante el cual crecen primero enormemente, ro- deándose de una nebulosidad, que los emborrona casi por com- ETA ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 63 pleto (figs. 55, d, y 56); vuelven después a presentarse profun- damente alterados en su morfología (figs. 57, 58, 99 y 60); y, pa- sando por el período, que FARMER y MooRE llamaron de segunda contracción, y que constituye lo que nosotros llamamos diact- nesís (fig. 61), dan finalmente origen a los gemini (fig. 71) defi- nitivos. Describiremos primeramente cómo tiene lugar el fenómeno, según nuestras observaciones. Figura 50. Figura 51. Estrepsinema y formación mito- Estrepsinema. Célula dependiente condrial. 2,250, todavía de la pared del espermi- ovi-ducto. Filamentos arrosaria- dos. 2.250. Los filamentos procedentes del desdoblamiento longitudinal del asa del paquinema, parten a veces de un lado del núcleo (figura 53), que bien pudiera corresponder al polo hacia el cual estaban orientadas las asas precedentes. No es esto, sin embar- go, lo normal. De ordinario, los filamentos no siguen orienta- ción determinada; antes al contrario, no sólo están distribuídos por toda la cavidad nuclear, sino que presentan frecuentes infle- xiones en su trayecto (figs. 52 y 53), que recuerdan las formas de las asas que les dieron origen. Los filamentos de aspecto arrosariado (fig. 51) difunden su substancia por el carioplasma bajo el aspecto de pequeñísimos hilillos que se desprenden, sobre todo, de los gránulos; por lo Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat, de Madrid. — Serie Zool. núm. 42.—1920 64 MANUEL BORDÁS, SCH. P. cual toman un aspecto erizado (figs. 52, 53 y 54), que ya fué observado y descrito por STEVENS (1904). El protoplasma de estas células no ha sufrido aún modifica- ción notable: se conserva uniforme y poco coloreable. Mas a medida que se hace más manifiesto ese erizamiento tan característico y sorprendente, aparecen sobre los finísimos hi- lillos una infinidad de gránulos de tamaño muy reducido, que los recorren a lo largo, como si se deslizaran sobre ellos, emborro- nan las figuras (fig. 55, c), y acaban por envolverlo todo en una Figura 52. Figura 53. Estrepsinema. Principio del eriza- Estrepsinema. miento de los filamentos. X2. 250. x 2,250. especie de niebla (figs. 55, d, y 56) espesa, perdiéndose por com- pleto los contornos de las figuras. Las figuras son sumamente variadas y características. Si se examinaran aislados algunos de estos acia fácil- mente se caería en el error de que los filamentos cromatínicos habían desaparecido por completo, disueltos en el magma que se forma. Pero, si se sigue el desarrollo de los mismos, se llega al convencimiento de que esta transformación que sufren no los destruye por completo, sino que, en cierto modo, les hace sufrir primero un crecimiento desmesurado, y más tarde una depuración, que los reduce grandemente en su tamaño, deján- dd >». AAA INIA IIA APS A ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 65 dolos reducidos casi a las mismas dimensiones que tienen los gemini espermatocitarios. Los cordones cromatínicos crecen en longitud y grosor; y para esto es preciso que se nutran considerablemente y estén bien provistos de substancias nutritivas. Al efecto, estos ovo- citos se encuentran ya'en la zona limítrofe con la cavidad celó- mica, por la cual pasa el intestino, como hicimos notar en otra parte (figs. 1 y 2), y, por lo tanto, están en las mejores condi- ciones, para recibir abundante riego nutritivo. Además, aunque Estrepsinema.—C. s., célula suspensora dependiente de la pared del espermi-ovi-ducto. 2.250. apartados ya de la región germinativa del ovario, están depen- dientes de sus paredes por medio de las células suspensoras (figura 54,c.s.), que no sólo los mantienen relacionados con aqué- lla, sino que les sirven de vehículo para la nutrición. Al mismo tiempo, según vimos anteriormente, los ovocitos arrastran en su descenso algunas células accesorias del folículo ovárico (figura 20,c.a.),las cuales con su degeneración, además de con- tribuir a la formación de la gruesa membrana vitelínica, toman también parte en el enriquecimiento total del ovocito. Y como, por otra parte, la membrana vitelina aún no se ha engrosado en este estado, resulta que los fenómenos osmóticos han de ser Trabajos del Mus, Nac. de Cienc, Nat. de Madrid.— Serie Zool, núm. 42.—1920 5 y 66 MANUEL BORDÁS, SCH. P. muy activos, y la nutrición del ovocito ha de ser muy fácil y abundante. Esa extraordinaria actividad del ovocito se manifiesta por su rápido y extraordinario crecimiento, tan característico del mis- mo. Los cromosomas siguen la misma marcha que los demás elementos constitutivos de la célula, y por esto manifiestan su actividad, aumentando su longitud y grosor. Pero en virtud de ese metabolismo vital, es preciso que se produzcan abundantes transformaciones químicas y morfológi- cas en esos mismos elementos; transformaciones que llevarán, en último término, a la constitución definitiva del cromosoma, que, como se ve, vive su vida, como un verdadero individuo vi- viente dentro del núcleo del ovocito. Ese metabolismo no sólo lleva consigo adquisición e incorpo- ración de substancia transformada, sino que supone también secreción y desprendimiento de las inútiles o perjudiciales. Es decir, en resumen, que el cromosoma ha de llegar a su madurez, y para ello es preciso que incorpore, se nutra, crezca y excrete, y se depure para el fin a que está destinado. Todo esto queda más o menos denunciado por los cambios químicos y morfológicos que experimenta. Así vemos que, al comenzar esta gran nutrición, aumentan las expansiones filamentosas, que erizan por todos lados a los cromosomas (fig. 54); los gránulos se hacen mayores y más coloreables; la longitud del filamento entero crece también. Más adelante (fig. 55, c) empiezan a aparecer los gránulos finí- simos sobre esas expansiones, y se pierde de vista el contorno del cromosoma y de los filamentos. Un paso más allá y ya es preciso buscar núcleos en las mejores condiciones de observa- ción, para que pueda apreciarse algún eje filamentoso (fig. 55, d), hasta que en último término casí se ha perdido por completo el individuo, sombreado y oculto por la abundante nebulosidad granular que le envuelve (fig. 56). G. Levi (1905) advierte, con mucha razón, que es muy difícil ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 67 afirmar, si la forma desdoblada de los cromosomas, después de la sinapsis, se conserva en períodos sucesivos. «Ed ognu- no [dice] comprende quanto riesca difficile il farlo, quando il volume della vesicola germinativa cresce, ed i cromosomi di- vengono poco distinti. Ma anche in una fase immediatamente succesiva e quella che ho descritto, quando la disgregazione dei cromosomi incomincia appena ad accennarsi, é quasi im- possibile di definire la sorte dei filamenti cromatici sdiopiati » (pág. 719). Figura 55. Varias etapas del desarrollo y crecimiento del estrepsinema. A, estrepsinema incipiente, inmediatamente anterior al de la figura 48; b, estrepsinema más adelantado; c, erizamiento de los filamentos arrosariados del estrepsinema; d, formación de la nube de gránulos. X2.250. De todas maneras, reconociendo con Levi la dificultad, y aun la imposibilidad misma, de seguir los cromosomas desdoblados en todos los estados posteriores a la sinapsis, ya hemos visto que, posteriores a la primera contracción, existen núcleos, en los cuales se reconoce claramente la existencia de la dualidad cromosómica, tal como la representan las figuras 47 a 50. La confusión y dificultad comienzan, cuando se acentúa considera- blemente la nebulosidad granular que da origen a la formación del magma carioplásmico, como lo llamaron Carnoy Y Lr- Trab. del Mus. Nac, de Cienc, Nat. de Madrid, — Serie Zool. núm, 42.— 1920 68 MANUEL BORDÁS, SCH. P. BRUN. Pero, aun en este caso, es dable ver que esa nebulosidad no es del todo uniforme, sino que presenta acumulaciones pre- dominantes en direcciones determinadas, y que, en lugar de formarse una nube uniformemente repartida, se forman fajas separadas entre sí por espacios más claros y menos provistos de gránulos. Al comenzar ese emborronamiento se distinguen todavía, en medio de las fajas, unas porciones más densas y te- ñidas, que, sin duda, corresponden a la porción axial de los fila- mentos (fig. 55, d). Efectivamente, se observa que esas porcio- nes axiales siguen las mismas inflexiones que los filamentos es- trepsiténicos anteriores, y que, por lo tanto, son restos de los mismos. Siguiendo adelante ese proceso depurativo, nos encon- tramos, al fin, con núcleos, en los cuales hay fajas, que pre- sentan todavía algunas porciones axiales bastante manifiestas, y otras fajas, en las que se ha perdido el vestigio de esos ejes, quedando únicamente, como señal de su existencia, la porción más clara que separa, más o menos, una faja de otra. En la figura 56 existe, en la parte superior izquierda del núcleo, una porción de faja, en la que aún se distinguen, medio emborrona- dos, los dos filamentos axiales, que presentan las mismas infle- xiones y entrelazamientos estrepsiténicos, al paso que la faja inmediatamente inferior no permite reconocer su porción axial, aunque la deja adivinar por su posición y separación de las demás. Los núcleos que siguen a esos, contienen exclusivamente un conjunto de fajas más o menos distintas o, mejor, nebulosidades alargadas y algo separadas unas de otras. Y aun a veces es muy difícil llegar a distinguir unas de otras esas diversas nebulosi- dades, a causa de la uniformidad general que toma el núcleo, sobre todo si su proyección óptica es desfavorable. Pues fácil- mente se comprende que, aunque la cavidad nuclear ha aumen- tado de un modo extraordinario, el espacio resulta relativa- mente pequeño para dilatarse por él las nueve fajas, que deben existir, correspondientes a los nueve cromosomas del paquinema. AAA Y ds ds COI AAA A AAN AAA AAA AA A ici ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 69 Y esta dificultad para percibirlas como algo aisladas, sube de punto si se tiene en cuenta que no llenan por completo la cavi- dad nuclear, sino que se acumulan aproximadamente en el cen- tro del núcleo (fig. 55, d/), o bien hacia un lado del mismo (fig. 56), quedando aquella masa unida a la membrana nuclear por medio de algunos tractus, filamentosos en un principio y llenos de finos grá- nulos más tarde. Es muy significativo lo que se ob- serva en el núcleo de la figura 59, d. En él se ve que a la izquierda del conjunto nubloso y en contacto ín- timo con él, aparecen dos filamen- tos casi paralelos, arrosariados y con el mismo aspecto que los del estrepsinema de las figuras 47 y si- guientes. Los dos extremos infe- riores aparecen enteramente li- bres; los dos superiores quedan cu- Figura 56. > : E; ión de 1 be d á- biertos por la nebulosidad del mag- adios eds paitendia arta ma. Además de esta dualidad, se io AA distinguen perfectamente otras cuatro, envuelta cada una en su correspondiente nube de grá- nulos finísimos que las emborronan. Pero, cosa muy notable, no sólo se aprecia que las porciones axiales de estas fajas se entre- cruzan dos a dos, como en el estrepsinema, sino que la dualidad de la derecha presenta una porción nubosa y emborronada, y otra, en la parte superior, en el límite del magma, que por no tener granulaciones se destaca con la misma claridad que la dualidad de la izquierda, de que hablábamos antes. Esta porción distinta y la dualidad de la izquierda confirman plenamente lo que estamos diciendo, esto es, que las dualidades se conservan dentro de cada faja de gránulos, aunque ocultas por el fenóme- no; y que, aun en aquellos casos en que no sea posible distinguir Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm. 42.—1920 A 70 MANUEL BORDÁS, SCH. P. ninguna porción axil bien manifiesta, es lícito suponer la exis- tencia de los dos filamentos cromatínicos que constituyen la dua- lidad, como lo prueba también la presencia de fajas, en las que, en una porción, se pueden reconocer los restos axiales y, otras porciones, no son ya visibles (fig. 56). Esto mismo opina H. D. KinG (1908) hablando de la génesis de los huevos en el Bufo lentiginosus. «Es una lástima [dice] que la cromatina no pueda ser seguida durante el período de la formación del primer huso polar, ya que por esta causa se hace imposible identificar los cromosomas del primer huso polar con los cromosomas que se encuentran en el ovocito antes de la des- integración de la vesícula germinativa. Empero, si los cromo- somas pueden mantener su individualidad en el núcleo en reposo de los oogonios y en el de los ovocitos jóvenes, cuando la cro- matina se encuentra bajo la forma de gránulos, que están espar- cidos irregularmente por una red de linina o están distribuidos so- bre la membrana nuclear, yo no veo razón que obligue a conside- rar que los cromosomas pierden su individualidad cuando se frac- cionan en gránulos al comenzar el período de maduración» (1). Realmente es una lástima que no se puedan seguir en todos estos estados los filamentos cromatínicos; pero, aunque quedan ocultos por la niebla granulosa que los envuelve, creemos que hay razones y señales suficientes para poder admitir que per- sisten, aun a través de ese trabajo de metabolismo que experi- mentan. ; (1) «It is unfortunate that the chromatin cannot be traced during the pe- riode of the formation of the first polar spindle, since it thereby becomes impossible to identify the chromosomes of the first polar spindle with the chromosomes that are found in the oócyte previous to the disintegration of the germinal vesicle. If, howewer, the chromosomes can maintain their individuality in the resting nuclei of the oógonia and of the young oócytes, when the chromatin is in the form of minute granules, which are scattered irregulary along a linin meshwork or distributed on the nuclear membrane, IT see no reason why they should be considered to lose that individuality, when they break up into granules at the beginning of the maturation pe- riode» (pág. 413). ERA Ú ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 71 Sigámosles en su ulterior desarrollo y veremos confirmadas las suposiciones precedentes. El núcleo pasa, como dejamos expuesto, por un período crítico de gran nutrición y crecimiento, durante el cual es tan abun- dante la nebulosidad que envuelve los filamentos, que la presen- cia de éstos se deja más bien adivinar, que percibir.Son marca- dos y numerosos los tractus o anastomosis que se estable- cen entre la nebulosidad y la Figura 57. Figura 58. - Aparición de los cordones cromo- Cordones cromosómicos erizados sómicos y de los filamentos arrosa- de innumerables filamentos arro- riados irradiantes. Xx 1.000. sariados irradiantes. Xx 1.000. membrana nuclear (fig.56), siendo tanto más abundantes cuanto mayor es la proximidad de la masa nuclear a la periferia, como se observa en la citada figura, en la que se ve que, estando la masa aproximada a la izquierda, son siete las anastomosis que por ese lado la unen a la membrana, en tanto que del lado con- trario no hay más que una bien marcada y tres indicadas sólo por pequeños filamentos. Trab. del Mus, Nac, de Cienc, Nat, de Madrid,— Serie Zool, núm. 42. — 1920 7 MANUEL BORDÁS, SCH. P. Poco a poco va despejándose esa nebulosidad, y entonces se ofrece a nuestros ojos el resultado de la transformación, sufrida en el misterio de la niebla, que lo enmascaraba. Nos encon- tramos, en primer término, con gruesos y alargados cordones cromatínicos, de cuya periferia arrancan infinidad de finísimos hilos, a lo largo de los cuales se hallan depositados granos relati- vamente gruesos de substancia cromatínica (figs. 57,58 y 59). Figura 59. Figura 60. Cordones cromosómicos erizados Estructura filamentosa de los cor- de innumerables filamentos irra- dones cromosómicos. X2.250. diantes. Citoplasma lleno de grá- nulos vitelínicos repartidos unifor- memente. 750. Las direcciones y variadísimos aspectos que presentan esas ex- pansiones filamentosas son infinitas y producen un espectáculo, que es más para verlo y apreciarlo al microscopio con el rápido girar del tornillo micrométrico, que para traducirlo en dibujo alguno. Cualquier dibujo que se intente para reproducirlo, nos dará, como dice CARNOY, «une idée bien imparfaite, grossitre méme; car il est impossible de rendre par le dessin ces admira- bles figures»; figuras que, como el mismo añade, no se cansa- ría uno nunca de contemplar. Y téngase en cuenta que CARNOY, ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 73 además de expertísimo observador, era excelente dibujante; sus delicadísimas figuras resisten un análisis con la lupa en opinión de SCHWALBE. Sobre todo, los aspectos del núcleo en el estado de la figura 58 son verdaderamente sorprendentes y maravillo- sos. A cada movimiento del tornillo micrométrico se presentan nuevos aspectos y nuevos y finísimos filamentos, que por todas partes se desprenden de los cordones cromatínicos y se entre- lazan y se cruzan unos con otros, dando origen a figuras enma- rañadísimas imposibles de reproducir. Si el cordón está cortado de través, el aspecto es aracnoideo y puede compararse al que ofrecen las células óseas o nerviosas más abundantes en ramifi - caciones. Si el cordón se presenta a lo largo, parece un miriá- podo de incalculable número de apéndices. «Ces figures [prosi- gue CARNOY] arrivent a leur apogée, pendant la seconde pério- de, pour décliner ensuite graduellement, jusqu'aux cinéses po- laires ». IV. —Segunda contracción y diacinesis. Veamos cómo tiene lugar esa declinación de los cordones cro- mosómicos. Dejemos para más adelante la exposición de las observaciones que hemos hecho, relativas al citoplasma y de- más elementos del ovocito, y concretémonos por ahora a seguir los cordones en sus metamorfosis. Han crecido de una manera considerable. El metabolismo vital se manifiesta en ellos activísimo y se hace evidente no sólo por el aumento en tamaño y facultad de teñirse, sino también por la emisión o pérdida de substancia. De su superficie se des- prenden numerosos hilillos, que unas veces son rectilíneos y es- tán sueltos en su extremo, y otras forman asas, anillos o laza- das de muy diversas formas. Sobre esos hilillos se depositan in- numerables gránulos cromatínicos, que les comunican ese as- pecto arrosariado tan característico. En un principio estos grá- nulos son relativamente gruesos y el eje del cordón es real- mente sólido y continuo. Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.— Serie Zool, núm. 42.— 1920 74 MANUEL BORDÁS, SCH P. Mas a medida que adelanta la transformación, los filamentos irradiantes son mucho más finos y delicados, lo mismo que los gránulos en ellos incrustados. El eje del cordón cromatínico pier- de su continuidad y solidez, y se presenta como descompuesto y formado por un espeso entrecruzamiento de filamentos irra- diantes (figs. 58 y 59), que, sumamente próximos y casi para- lelos, forman el grueso del cordón. Podríamos compararlo a una tupida madeja de hilos de la cual se desprendieran algunas es- piras o vueltas más grandes y laxas. El cuerpo apelotonado de filamentos paralelos de la madeja representaría el cuerpo del cordón cromatínico, y las espiras sueltas, los filamentos que irradian del mismo. Esta estructura puede perfectamente apre- ciarse, examinando con más detalle y a mayor aumento los nú- cleos de las figuras 58 y 59. Se llega al convencimiento de que, lo que a primera vista parece cordón uniforme, se resuelve en un enjambre apretado de filamentos paralelos (fig. 60) y provis- tos de innumerables gránulos. Esta estructura filamentosa se presenta de esta forma, tanto si se examina un cordón visto de lado, en la dirección de su longitud, como si se observan cortes transversales del mismo. Esa es, pues, su estructura íntima. Algunas de estas expansiones filamentosas son sumamente largas y sobresalen del conjunto, originando los filamentos irra- diantes, que tienen la misma forma arrosariada, que los que se encuentran en el mismo cuerpo de la madeja. Parece también que, así como los filamentos irradiantes de un mismo cordón, se reunen y anastomosan entre sí y originan las asas o bucles, que abundan por todos lados, así también se anastomosan los fila- mentos correspondientes a diversos cordones cromatínicos próxi- mos. Esto último, sin embargo, no podemos certificarlo con exactitud, pues la extremada delicadeza del filamento está ya en los límites de lá resolución del microscopio. Todas estas formaciones no quedan aisladas de la membrana nuclear, Del conjunto nebuloso, que forman los cordones croma- tínicos y sus filamentos irradiantes, se desprenden corrientes o Pa Sn dd EAS rs is AAA EA ASADAS DAA A iia ds á PRA SEA IA A Le Ad st ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 75 de gránulos que llegan hasta la membrana nuclear y se ad- hieren a ella en forma ensanchada, como pata de oca (fig. 57). Cuando más adelante se despeja el conjunto y se aclara el cam- po, esas corrientes son también muchos más tenues y menos nu- merosas (fig.58), su colorabilidad disminuye rápidamente y dan, por fin, origen a la trama general reticulada del núcleo. Toda estas figuras tienen sorprendente parecido con las ob- servadas en la vesícula germinativa de otros muchos animales, tanto invertebrados como vertebrados. Sobre todo, es maravi- llosa su semejanza con las de los batracios, estudiadas por CAR- NOY y LEBRUN y por G. Levi, y con las del Bufo lentiginosus, en particular, estudiado por H. D. Kinc. Algunos núcleos contienen gránulos bastante gruesos, que po- dríamos llamar nucléolos, adheridos al extremo del cordón cro- matínico. Esto se ve claramente en las figuras 58 y 59. De ordi- nario, estos nucléolos no presentan expansiones filamentosas sino que su contorno es liso y bien determinado. Otros también presentan, al igual que el resto del cordón cromosómico, las expansiones filamentosas, tan características de este estado. También en el espermatocito, durante el período de su máxi- mo crecimiento, pudimos observar el nucléolo adherido a los filamentos del asa estrepsiténica (figs. 45 y 46). Al terminar este período de gran crecimiento de la vesícula germinativa e iniciarse la diacinesis, desaparecen estos nu- cléolos. Lo mismo sucede en el espermatocito. Diacinesis. — El aspecto de descomposición que presentan los cordones cromosómicos, que estamos estudiando, haría creer que tienden a resolverse y desparecer en el jugo cario- plásmico. Así lo opinaron CARNOY y LEBRUN en la vesícula ger- minativa de los batracios, aunque viendo en el núcleo un pro- ceso distinto del que queda expuesto. Sin embargo, podemos asegurar que los cromosomas no desaparecen nunca: no se en- cuentra ningún núcleo que no presente algún aspecto, más o menos avanzado en su desarrollo, de los cordones cromosómi- Trab. del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid, —Serie Zool. núm. 42.— 1920 76 MANUEL BORDÁS, SCH. P. . cos. No hay en todo el ovario de la Sagítta ni un solo núcleo desprovisto de cromosomas, o en el que los cromosomas se ha- yan resuelto enteramente en gránulos que se difundan por el carioplasma. Pues, aunque hemos visto que la estructura ín- tima de los cordones, cuando han llegado al apogeo de su creci: miento y depuración, es claramente filamentosa, estos filamen- tos, que constituyen el eje del cordón, no acaban por separarse y perderse, como a primera vista parece que ha de suceder, sino que ahora tiene lugar un fenómeno de concentración, contrario al precedente, o mejor dicho, complementario del mismo. Va a venir ahora la segunda contracción nuclear o diacinesís de HACKER. No creemos fuera de lugar, el recordar aquí lo que sobre este estado dejamos consignado en otra parte (1914, pág. 34). «El es- tado de gran expansión, suele ser de duración prolongada en el ovocito y relativamente corto en el elemento masculino, ani- mal 0 vegetal. Al fin, más tarde o más temprano, los filamentos estrepsiténicos repiten el fenómeno del acortamiento y aumento de grosor, dando origen a una segunda simapsís o segunda contracción cromática. Al mismo tiempo que engruesan, dismi- nuyen de volumen, y van como concentrando y depurando su cromatina, cuya colorabilidad llega pronto al máximum; pero los filamentos no se apelotonan, como en la primera sinapsis, sino que permanecen bien distintos por pares, y más o menos aislado un par de otro, sobre todo en el ovocito, en el que el enorme tamaño, que alcanza la célula, lo permite; y aun con mayor holgura, porque en este último período de la profase ci- taria empieza a desaparecer la membrana nuclear, y se mezcla el jugo del núcleo con el del citoplasma». Este es el estado en que va a entrar la vesícula. germinativa. Efectivamente, lejos de acabar de separarse aquellos filamen- tos arrosariados, que forman el grueso del cordón, lo que suce- de es que, una vez llevado a cabo el trabajo químico de nutrición y depuración del cromosoma, aquellos filamentos vuelven a a ul Aa As ds dida da A be. DADAS Ad Ss Aids e. e ME OI 10: DAY ACEPTA LAIA Bt A A e AAA A A ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA WL apretarse unos contra otros, y originan de nuevo bastoncitos sólidos y macizos, como los que se ven al comenzar aquel es- tado. No sólo se comprimen y espesan de nuevo, sino que, como ya hizo notar STEVENS, se reabsorben las mismas expansiones filamentosas que parecían desprenderse del cromosoma, y todo contribuye a reconstruirlo. Esto es lo que se observa en los cro- mosomas de la figura 61. El cuerpo del bastoncito es macizo: aun empleando los mejores objetivos y condensadores, no se re- Figura 61. Segunda contracción nuclear o diacinesis.— £. Y., gránulos vitelínicos; £. f., gránulos finos; mM. v., membrana vitelina. 750. suelve en filamentos, como sucedía anteriormente. Las expan- siones filamentosas irradiantes han disminuido considerable- mente. Apenas se encuentra alguna en forma de asa, ni que pueda tomarse como unida a los filamentos de otro cromosoma: todo tiende a ser reabsorbido por el eje del cordón. Pero, como es natural y evidente, esa nueva concentración y compresión de un elemento, cuya estructura era filamentosa y como fofa, lleva consigo una gran disminución de volumen y acortamiento en todas las dimensiones. Por encontrarse acumu- lada en menor espacio la misma cantidad de cromatina, y ésta Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm. 42.—-1920 78 MANUEL BORDÁS, SCH. P. escogida y depurada, aumenta también la colorabilidad de los elementos. Es decir, que los cordones cromatínicos dejan ver otra vez claramente su individualidad, que antes había queda- do enmascarada, primero con las nieblas de gránulos (figs. 55, 56 y 57), y después con las expansiones filamentosas irradiantes (figuras 57, 58, 59 y 60). El núcleoplasma adquiere un aspecto característico. Toda la cavidad carioplásmica se halla recorrida por una red de malla irregular que la cruza en todos sentidos. Las mallas de esta red no son filamentosas. Están constituídas por corrientes de gránulos muy finos y de tamaño diferente: el fondo está for- mado por los gránulos casi imperceptibles, y metidos en ese fondo se ven otros gránulos algo mayores. Esta red se en- cuentra unida a la membrana nuclear por numerosos puntos de adherencia. , Durante casi todo este período encuéntrase con alguna frecuencia el nucléolo; pero no debemos considerar como tal las secciones transversales de los cordones cromosómicos (figuras 57 y 58), que con frecuencia se presentan en los cortes. En el último período de esta fase, y antes de entrar franca- mente en la diacinesis, se encuentran adheridos a los cromo- .somas algunos gránulos de tamaño variable, ya que pueden lle- gar a tener el mismo (fig. 58) o mayor diámetro que el cordón cromosómico (fig.59). Si representáramos el núcleo de la figu- ra 59 con la misma ampliación que el de la figura 33, en que claramente aparece el nucléolo, tendríamos que dibujar el grá- nulo tres veces mayor que este nucléolo (1). Más tarde, durante la diacinesis (fig. 61), desaparecen com- pletamente estos nucléolos, o por lo menos no pueden distinguirse (1) La figura 33 ha sido dibujada a 2.250 diámetros, mientras que la figu- ra 59 lo está únicamente a 750. ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 79 de los gránulos vitelínicos, que invaden el campo nuclear, al desaparecer la membrana. Con respecto a la membrana nuclear, no tenemos que añadir nada a lo expuesto en las páginas 22 y siguientes, en donde que- dó explicado el proceso que sigue en su formación y crecimien- toa expensas de los cariosomas, que se hallan adheridos a la misma. No queda señal alguna visible del resto fusorial. El protoplasma es el que, después de los cromosomas, experl- menta mayores mudanzas durante este período de gran cre- cimiento. Primeramente se presenta homogéneo (figs. 47 a 55) o casi homogéneo, con algunos gránulos redondeados (fig. 53). A medida que avanza la emisión de expansiones filamentosas, pro- pias del estrepsinema, el protoplasma adquiere rapidísimamente gran colorabilidad para con la hematoxilina, no distinguiéndose más que un espeso hacinamiento de substancia citoplásmica, granugienta. Después, una vez establecidas las corrientes intra- nucleares que unen el cenjunto cromosómico a la membrana, se forman vacuolas, que predominan en la periferia del ovo- cito (figs. 10, 11, 58, y 59), de tal manera que, examinado un óvulo en vista polar, aparece como una criba; y en corte trans- versal puede apreciarse, según dejamos indicado, que esas bur- bujas o vacuolas no son debidas a retracciones de la membrana vitelina. Si bien predominan en la periferia del óvulo, no por eso faltan en el interior del citoplasma, aunque no son tan nume- rosas (figs. 55, 56 y 58). En el interior de estas vacuolas existen en muchas ocasiones uno o dos gránulos de tamaño variable, que toman intensamente la hematoxilina. Estos gránulos vitelínicos se forman y multiplican de una ma.- nera asombrosa en estados sucesivos (figs. 59 y siguientes), dando origen al deutoplasma globular o discoidal, formado prin- cipalmente por lecitina. No deben confundirse con los «condriosomas » esféricos, pues, Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid. — Serie Zool. núm, 42.— 1920 80 MANUEL BORDÁS, SCH. P. según J. DUESBERG, los gránulos del vitelo son elementos bas- tante regulares, esféricos y de tamaño variable, al paso que los condriosomas son mucho más pequeños, y se acumulan princi- palmente en el polo vegetativo. + E: ¿Cuál es el origen de estos gránulos del deutoplasma? Parece cierto que son debidos al metabolismo intenso, de que es asiento el ovocito en ese estado. A su nutrición contribuyen, sin duda, las células suspensoras y las accesorias, proporcionando abun- dantes materias. En cuanto a su formación, STEVENS indica que comienzan a aparecer, cuando el núcleo entra en el estado re- presentado por nuestra figura 58, en cuyo caso, el .protoplasma tiende a tomar aspecto reticular. Añade además que estos grá- nulos se acumulan a veces en las cercanías de la membrana nu- clear, entre el núcleo y el conducto del micropilo. Otros autores son de parecer que los gránulos del vitelo derivan directamente de uno primero, que ya se encuentra en los oogonios prima- rios. Así lo opina KinG en la ovogénesis del Bufo lentiginosus, en la que, ya al comienzo de la profase, describe un gránulo vitelínico en el protoplasma, llamándole cuerpo vitelínico (vzte- line body). Cierto es que ya en el estado de la salida del reposo (fig.29,b), en la sinapsis (fig 36), en el paquinema (fig. 39) y en el estrepsi- nema incipiente (figs. 53 y 55, a) se ven algunos granos grue- sos, que pudieran ser considerados como cuerpos vitelínicos. Pero hemos de decir que no hemos podido sorprender en ellos el momento de la división, si bien hace sospechar su existencia la proximidad en que, a veces, se encuentran dos de ellos (figu- ra 29, b). En cambio, cuando el núcleo se encuentra en el estrep- sinema de gran crecimiento (figs. 54 y 55, c) se presentan ade- más algunos gránulos contenidos en vacuolas o fuera ya de ellas, y cuya formación pudiera ser parecida a la de los plastidios de las células vegetales, formados por condensaciones del mismo Ub pi di ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 81 citoplasma. Estos gránulos son pequeñísimos en un principio, y, al parecer, se multiplican por división directa, pues es muy frecuente encontrarlos por pares dentro de una misma vacuola (figs. 55, c, y 62, A). A medida que avanza la madurez del óvulo, aumentan rapidísimamente en número, invadiendo todo el cito- plasma de una manera casi uniforme. Junto a la membrana vi- telina se forman algunos más gruesos, sobre todo en la proxi- Figura 62. Gránulos vitelínicos en diferentes estados de crecimiento, dibujados con el mismo aumento.— A, en el núcleo del estrepsinema incipiente; 1. 21., mem- brana nuclear; m. v., membrana vitelina; B, en el estrepsinema en estado de máximo erizamiento; mM. 7., membrana vitelina; C, D, E, en el núcleo en fases diversas de la diacinesis; F, durante la tormación del huso defini- tivo, 4,000. midad de las células suspensoras (fig. 57). Estos gránulos suelen estar contenidos en vacuolas hemisféricas, y parece que también se multiplican por división directa, pues se les encuentra fre- cuentemente por pares en el interior de una vacuola (fig. 62, B). Más adelante, cuando el ovocito aimenta considerablemente de volumen, y el protoplasma se aclara y se hace transparente (figs. 57 y 58), los gránulos acaban por encontrarse uniforme- mente repartidos por toda la cavidad citoplásmica en número in- Trabajos del Mus. Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.—Serie Zool. núm. 42, —1920 6 82 MANUEL BORDÁS, SCH. P. calculable (fig. 59). Finalmente, el fondo de la cavidad está for- mado por una red granugienta, por entre cuyas mallas se repar- ten los gránulos vitelínicos, que continúan aumentando de volu- men, hasta llegar a adquirir un tamaño considerable (fig.62,F). Para que el lector pueda apreciar .el aumento de tamaño, que experimentan, representamos algunos de estos gránulos, toma- dos de distintos óvulos en diferentes grados de desarrollo, y di- _bujados a la misma escala (fig. 62). Figura 63. Formas diversas de granos vitelínicos voluminosos. —C, en su parte superior, muestra una metafase en huso múltiple. 1.000. Los gránulos de un mismo ovocito no son todos del mismo vo- lumen. La figura anterior y la figura 73 son buena prueba de esto. Unos toman con la hematoxilina una coloración azul intensa, casi negra: otros se tiñen de un color más claro, tirando a rojo purpúreo. Se encuentran indiferentemente mezclados unos con otros. Cuando se disuelve la membrana nuclear, parece como si se estableciera una corriente predominante de los mismos hacia la Trab, del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid.—Serie Zool, núm, 42. — 1920 a ea e e ds E E AE AAA PR ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 83 región carioplásmica, y abundan algo más en el lugar mismo del núcleo (fig. 1). Pero cuando el ovocito llega a su completa madurez, no se acumulan con preferencia en ninguna región del mismo, sino que están uniformemente repartidos por todo él. En este mismo último período del crecimiento ovocitario, se encuentran algunos granos de tamaño mucho mayor que los restantes, y que en un principio nos hicieron creer que era la cabeza del espermatozoo que había penetrado ya en el huevo (1). Son de diferente volumen y forma, predomi- nando las formas globulares. Presen- tamos varios ejemplos de los mismos (figura 63). Su volumen extraordina- rio puede apreciarse comparándolos con los granos pequeños que les ro- dean, que son los mismos represen- tados en la figura 62, letras E y F. Para explicar la presencia de estos Figura 64. gruesos granos, podríamos aceptar Grano vitelínico voluminoso 7 en un ovocito, en cuyo inte- la opinión de H. LEBRUN, según el rior se observa un largo fila- E mento f. 1.000. cual los gruesos nucléolos de los ovo- citos maduros resultan de la fusión de los gránulos vitelínicos. Estos granos extraordinarios pueden también multiplicarse (1) Nos inclinaba más a esta idea la presencia, dentro del huevo, de un filamento sumamente largo (fig. 64); tanto que los trozos del filamento, sec- cionados por el microtomo, se encuentran en cinco o seis cortes de la prepa- ración. La forma de ese gránulo es muy característica, pues aparece trun- cada por un extremo del eje y redondeada por el otro. Además, a su alre- dedor, se condensa el protoplasma de una manera particular, produciendo una figura estrellada, pero sin que sea posible distinguir ningún áster ni centrosoma. El gránulo ocupa el centro de la figura estrellada. No nos atre- vemos a tomar ese grano, como la cabeza del espermatozoo, a pesar del largo filamento que presenta la célula en su interior y que pudiera repre- sentar la cola del mismo, porque en otras células encontramos granos de ese tamaño, a cuyo alrededor también se acumula el protoplasma de un modo parecido, y que presentan los mismos caracteres que el anteriormente mencionado, salvo la presencia del filamento. Trab. del Mus, Nac. de Cienc. Nat. de Madrid, — Serie Zool. núm, 42,— 1920 84 MANUEL. BORDÁS, SCH. P. por división directa. La figura 63 C ofrece un claro ejemplo, que no puede ser tomado, a nuestro parecer, como un caso de fusión; pues el estiramiento que se produce es claro indicio de la tracción que se verifica, mientras que si se tratara de una fusión de los granos, estarían en contacto las dos superficies de los mismos sin ningún estiramiento. Además de todos estos cuerpos vitelínicos, existen en el proto- plasma otras formaciones, que se manifiestan de un modo espe- cial, al comenzar la diacinesis. Consisten en una acumulación de finísimos gránulos en inmediato contacto con la membrana nu- clear (fig. 61), y que, al principio, se colocan preferentemente en el hemisferio del núcleo que mira al conducto micropilar y al punto de suspensión del óvulo, Se distinguen dos clases de estos gránulos: unos sumamente finos, que forman el fondo, y otros algo más gruesos, pero siempre mucho menores que los cuerpos vitelínicos. Más adelante estos gránulos se extienden de un modo uniforme por toda la membrana nuclear y la envuelven completamente (figs. 67 y 68), encontrándose los granitos lo mismo al interior que al exterior de la membrana. En otros núcleos más avanzados en el proceso de maduración, desapare- cen los gránulos externos, quedando únicamente los interio- res (fig. 71), aunque muy reducidos (1); hasta que por fin, al des- * aparecer por completo la membrana nuclear, sólo quedan algu- nos granitos (figs. 69 y 72) de diferentes tamaños, pero siempre muy pequeños, que indican el perímetro que ocupaba la mem- brana. Ya indicamos en otra parte (pág. 59 y siguientes) que esos pequeños gránulos, sobre todo los más visibles, proceden en parte también de la red nuclear, que envuelve la vesícula ger- minativa. Pero los más finos y delicados están sin duda relacio- nados con la depuración de los cordones cromosómicos, que * (1) Téngase en cuenta el diferente aumento de las figuras. Las figuras 67 y 68 están dibujadas a 750 diámetros; la figura 71, a 2.250. lot A ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 85 hemos descrito, y con los fenómenos osmóticos que deben acom- pañarla. Creemos esta explicación la más apropiada para los gránulos que se observan en el interior de la membrana. Interviene también en la existencia de todos esos gránulos, la formación mitocondrial, que hemos descrito en diversos ovo- citos del principio de la profase (figs. 31, 40, 41 y 50). El tamaño de los ovocitos aumenta rapidísimamente en este período, sobre todo a partir de la figura 54. Figura 48 diám.núc. 13 -<10 p;diám. cél. 11x tres contenidos en el cuadro pertenecen ocupada por las fibras irra- al mismo núcleo y han quedado separa- : - dos en otro corte por el microtomo). diantes. Más tarde se rompe a pe pa Cé- la línea que limita el campo - fusorial, y las fibras irra- diantes exteriores entran en relación (fig. 70) con las que se en- cuentran en el interior del campo, originando una formación única en una pequeña escotadura que se forma cercana a la peri- feria de la región, que ocupaba el núcleo. Los cromosomas co- mienzan a dejar ver su hendidura longitudinal. En algunos nú- cleos (fig. 71), en los cuales se ha retrasado un poco la desapa- rición de la membrana, se observa que todas estas transforma- ciones se verifican en las cercanías de la periferia, y que las fibras que intervienen en esta formación, se ponen en comuni- MN Ds e A Md + A a AS Do 3 ESTUDIO DE LA OVOGÉNESIS EN LA SAGITTA BIPUNCTATA 103 cación con la misma membrana por el medio de una laxa red de fibras. Las fibras del huso se orientan ya hacia los polos, atraídas por los centrosomas, uno de los cuales es visible y grueso. La hendidura longitudinal de los cromosomas es eviden- tísima: están presentes seis de ellos en el corte: al lado hemos dibujado los otros tres, tomados del corte siguiente del mismo núcleo. Total: nueve cromosomas dobles, bivalentes. Las líneas del campo siguen acentuándose cada vez más y, reuniéndose, dan origen a un huso múltiple (fig. 72), cuyo eje Figura 72. Formación del huso.— Huso múltiple, paralelo a la mem- brana vitelina. Célula: 329