VERZAMELDE GESCHRIFTEN VAN M, W. BEIJERINCK TER GELEGENHEID VAN ZIJN 70STEN VERJAARDAG MET MEDEWERKING DER NEDERLANDSCHE REGEERING UITGEGEVEN DOOR ZIJNE VRIENDEN EN VEREERDERS V 1} F D E D E E L D ELFT /MD CC CCXX I imBmmiinirnMM.üi^^ VERZAMELDE GESCHRIFTEN VAN M.W. BEIJERINCK VERZAMELDE GESCHRIFTEN VAN UW. BEIJERINCK TER GELEGENHEID VAN ZIJN 70STEN VERJAARDAG MET MEDEWERKING DER NEDERLANDSCHE REGEERING UITGEGEVEN DOOR ZIJNE VRIENDEN EN VEREERDERS VIJFDE DEEL DELFT / MDCCCCXXIl Impr. : F. Bruckmann AG. und J. B. Obernetter, München VIJFDE DEEL Inhoud van het Vijfde Deel. Pigments as products of oxidation by bacterial action. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XIII, 191 1, p. 1066 — 1077. — Verscheen onder den titel »Pigmenten als oxydatieproducten door bakteriën gevormd« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XIX, 191 1, blz. 1092 — 1 103, en onder den titel »Ueber Pigmentbildung bei Essig- bakterien« in Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena II. Abteilung, XXIX. Band, 1911, 169-176 S. i An Experiment with Sarcina ventriculi. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Vol. XIII, 191 1, p. 1237 bis 1240. — Verscheen onder den titel »Een proefneming met maagsarcine« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XIX, 1911, blz. 1412 — 1415 S. 11 Ueber die Absorptionserscheinung bei den Mikroben. Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, XXIX. Band, 191 1, S. 161 - 166 S. 15 Structure of the starch-grain. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van vx/'etenschappen, Amsterdam, Vol. XIV, 1912, p. 1 107 — 11 10. — Verscheen onder den titel »De bouw der zetmeelkorrel« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Deel XX, 1912, blz. 1252— 1256 S. 21 Mutation bei Mikroben. Folia Mikrobiologica, Delft, I. Jahrgang, 1912, S. 1-97 S. 25 Die durch Bakteriën aus Rohrzuckererzeugten schleimigen Wandstoffe. Folia Microbiologica, Delft, I. Jahrgang, 19T2, S. 377— 408. — Is eene samenvatting der volgende publicaties: Ie »Viscosaccharase, een enzym, dat uit rietsuiker slijm voortbrengt*, verschenen in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd. Amsterdam, Deel XVIII, 1910, blz. 591 — 595, (ook verschenen onder den titel »Viscosacharase, an enzyme which produces slime from canesugar« in Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XII, 1910, p. 635 -640) en 2e. »Emulsielaevulan, het product der werking van visco- saccharase op rietsuiker*, verschenen in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XVIII, 1910, blz. 898-902, (ook verschenen onder den titel »Emulsion laevulan, the product of the action of viscosaccharase on cane-sugar« in Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XII, 1910, p. 795—798) S. 89 On the composition of tyrosinase from two enzymes. Proceedings of th Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XV, 1913, p. 932 — 937. — Verscheen onder den titel »Over de samen- stelling der tyrosinase uit twee enzymen« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXI, 1913, blz. 923—930 S. III Penetration of met hylena blue into living cellsafterdesiccation. Pro- ceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XV, 1913, p. 1086 — 1088. — Verscheen onder den titel »Over het indringen van methyleenblauw in levende cellen na in- droging* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd.. Amsterdam, Deel XXI, 1913, blz. 930 — 933 S. 116 De infusies en de ontdekking der bakteriën. Jaarboek voor 1913 van de Koninklijke Akademie van Wetenschappen, gevestigd te Amsterdam, 1913 S. 119 Oxydation des Mangancarbonates durch Bakteriën und Schimmelpilze. Folia Microbiologica, Delft, II. Jahrgang, 1913, S. 123 — 134. — Verscheen gedeeltelijk onder den titel »Oxydatie van mangaancarbonaat door Mikroben« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXII, 1913, blz. 415 — 420, en onder den titel »Oxidation of manganocarbonate by microbes*, Proceedings of the Section of Sciences. Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XVI, 1913, p. 397 bis 401 S. 141 Ueber Schröter und Cohn's Lakmusmicrococcus. Folia Microbiologica. Delft, II. Jahrgang. 1913, S. 185—200 S. 149 Ueber die Selbstgarung bei der Alkoholhefe. Livre Jubilaire van Laer, 1913, S. 128 — 136 S. 161 Gummosis in the fruit of theAlmond and the Peach-almondasaprocess of normal life. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, \'ol. XVII, 1914, p. 810 — 821. — Ver- scheen onder den titel »Gummosis in de Amandel-en de Perzikamandel- vrucht als normaal ontwikkelingsverschijnsel* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel, XXIII .1914, blz. 531 — 543 S. 168 Ueber das Nitratf erment und über physiologische Artbildung. Folia Microbiologica, Delft, III. Jahrgang, 1914, S. 91 - 113. — Verscheen onder den titel »Over het nitraatferment en over physiologische soortvorming« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXII, 1914, blz. 1163 — 1170 S. 178 Crystallised Starch. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XVIII, 1915, p. 305 — 309. — Ver- scheen onder den titel «Gekristalliseerd zetmeel* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXIV, 1915, blz. 240 — 245 S. IQ5 Die Leuchtbakterien der Nordsee im August und September. Folia Microbiologica, Delft, IV. Jahrgang, 1916, S. 15—40 S. 199 and Folpmers, T. Formation of pyruvic acid from malie acid by microbes. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XVIII, 1916, p. 1 198— 1200. — Verscheen onder den titel »Vorming van brandigdruivenzuur uit appelzuur door bakteriën« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd.. Amsterdam, Deel XXIV, 1916, blz. 1116 — 1119 5.-^17 und Hest, J. J. van. Lebedeff's Hef emazeration ssaf t. Folia Microbiologica, Delft, IV. Jahrgang, 1916 S. 107 — 118 S. 220 Vorming van eiwitten, koolhydraten en vetten door mikroben. 2Se Jaarverslag (1915 — 1916) van het Technologisch Gezelschap te Delft, blz. 104 — 129, Lezing, gehouden op 10 Februari 1916 S. 228 Nachweis der Violaceusbakterien. Folia Microbiologica, Delft, IV. Jahrgang, 1916, S. 207 — 210 S. 243 Het voorkomen van urease bij hoogere planten. Chemisch Weekblad, Amsterdam, 13e Jahrgang, 1916, blz. 443 — 444 S. 246 The Enzyme Theory of Heredity. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XIX, 1917, p. 1275 — 1289, Verscheen onder den titel »De enzym-theorie van de erfelijkheid» in Vers- lagen. Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amster- dam, Deel XXV, 1917, blz. 1231 — 1245 S. 248 Levüres chromogènes. — Nouvelle réaction biologique du fer. Archives Néer- landaises de Physiologie de l'homme et des animaux, tome II, 1918, p. 609—615 S. 259 The Significance of the tubercle bacteria of the Papilionaceae for the host tant. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie von Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XXI, 1918, p. 183 — 192. — Verscheen onder den titel »De beteekenis der bakteriën van de Papilionaceën- knolletjes voor de voedsterplant« in Verslagen Kon. Akademie von Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXVI, 1918, blz. 1456 — 1465 S. 264 Oidium lactis, the milkmould, and a simple method to obtain pure cultures of anaerobes by means of it. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XXI, 1919, p. 1219 — 1226. — Verscheen onder den titel »Oidium lactis, de melk- schimmel en een eenvoudige methode om met behulp daarvan anaeroben zuiver te kweeken* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXVII, 1919, blz. 1089 bis 1^97 S. 272 Bereiding van tyrosine voor de ty rosinase-reactie. Chemisch Weekblad, i6e Jaargang, 1919, blz. 1494 — 1495 S. 279 Chemosynthesis at denitrification with sulfur as source of energy. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XXII, 1920, p. 899 — 908. — Verscheen onder den titel »Chemosynthese bij denitrificatie met zwavel als energiebron* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Wis-en Natuurk. Afd., Deel XXVIII, 1920, blz. 845-S56 S. 281 Pigments as products of oxidation by bacterial action. Froceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol. XIII, 1911, p. 1066— 1077. — Verscheen onder den titel «Pigmenten als oxydatie- producten door bakteriën gevormd« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XIX, 1911, biz. 1092— 1103; en onder den titel ^>Ueber Pigmentbildung bei Essigbakterien« in Centralblatt für Bakteriologie und Para- sitenkunde Jena, II. Abteilung, XXIX. Band, 1911, S. 169—176. T he following experiments make it possible casiiy to find some notable bacteria more or less common in our surromidings and partly not observed hitherto. I. Formation of Protocatechetic acid front Chinic acid. As Löw 1) had shown that i proc. solutions of calcium chinate become brown when exposed to the air by the formation of protocatechetic acid, E m m e r 1 i n g and Abderhalden^) have investigated this biochemism bacteriologically. They neutralised 10 proc, solutions of chinic acid with calcium carbonate, added 0.5 proc. peptone, o.i proc. kalium phosphate, and o.i proc. magnesium phosphate, inoculated this mixture with a few drops of an infusion of putrefying meat, and cultivated for some weeks at 35" C. They obtained protocatechetic acid together with a slimy bac- terial mass in the liquid, from which it was possible to isolate a likewise slimy Micrococcus, which proved to be the cause of the production of the latter acid and was named M. chinicus. The reaction goes af ter the formula: C7H12O6 + O = C7H604 + 3 H2O ' Chinic acid Protocatechetic acid whereby at most 12 proc. chinic acid is converted; into what the remaining 88 proc. change is not noted by these experimenters. It is remarkable that only one atom of oxygen takes part in this reaction. ') Berichte der Deutschen Chem. Gesellschaft, Bd. 14, pag. 450, 1902. '-) Ueber einen Chinasaure in Protocatechusaure überführenden Pilz. Centralblatt für Bakteriol. 2te Abt. Bd. 10, pag. 337, 1903. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 1 2 As the said authors had not applied in their experiments the so intense colouring of ferrisalts by protocatechetic acid, it seemed desirable to make use of it for the easier recognition of the inferred bacteria. To this end the experiment was efïected as follows: For the rough or preliminary cultivation a liquid was used of the composition: Tapwater loo.oo Dikaliumphosphate 0.05 Ammoniumchlorid 0.05 Calciumchinate (C7Hii06)2 Ca + 10H2O o.i to 10 Ferrichlorid o. 01 In a wide Erlenmeyer flask, so that a strong aëration occurs in the thin layer, inoculated with soil and cultivated at 20" to 25" or 30" to 35° C, the liquid colours deep black after a few days, in consequence of the formation of ferriproto- catechate. To purify the bacterial culture a tracé is transferred to a similar medium and cultivated at 20° or 30° C. If this culture is sown on a medium of the same composition but solidified with agar and containing some ferricitrate ^), colonies are obtained, from the cultures kept at 20" to 25" C, of different varieties of B. üiwrescens, and from those kept at 30° to 35° C. chiefly of a Micrococciis, all lying amid difïusion fields of ferriproto- catechate of an intense violet or red colour. This Micrococcus belongs perhaps to the same species as that described by E m m e r 1 i n g and Abder halden, but then certainly to another variety, for it does not produce, neither in presence of peptone nor of ammoniumsalt. This form, very common in our environment and which can be obtained with various other organic salts in a similar way as with chinate, I shall name Micrococcus calco-aceticus, as calcium acetate is very fit for its accumulation. Here it may be observed that acetates are also very useful for the accumulation of certain varieties of B. ftuorescens non-liquefaciens which still grow at 30" C. Streaks of these various bacteria on broth agar with one proc. calcium chinate, and a little ferricitrate, or on the above medium, give again deep black or red- coloured difïusion fields of ferriprotocatechate. Part of the chinate oxidises directly to water and calciumcarbonate which preci- pitates as crystals dyed deeply violet, by having sucked up the ferrisalt of the proto- catechetic acid during their crystallisation. Other species, able to couvert the chinic acid into water and calciumcarbonate or protocatechetic acid, but not found in the foregoing experiments, are mentioned in the following table where it is indicated by + and — whether the substances placed at the head are either or not formed. These experiments were made with broth agar- plates with i proc. calciumchinate at 30" C, or use was made of the above named nutriënt liquid containing ammonium chlorid, after its solidification with agar. *) Ferricitrate does not give a precipitate of ferriphosphate in the somewhat al- kaline broth. From chinates result by Protoca- techetic acid Calcium- carbonate as crystals Remarks Bacillus prodigiosus „ punctatus Aërohacter coli „ aërogenes „ liquefaciens Pseiidonwnas aromatica „ üuorescens non liquefaciens „ Auorescens liquefaciens pyocyaneus Proteus vul garis Microspira tyrosinatica Micrococcus calco-aceticus Acetic acid hacteria Yeast species + + + Some varieties Some varieties Some varieties All varieties This table shows that the common species which oxidise chinate to protocate- chetic acid, namely the fluorescents, also embrace varieties devoid of this faculty. The second column is but of relative value, for a numbre of bacteria oxidise the chinate and grow from it with great intensity without crystallisation of the thereby formed calciumcarbonate. The chinates, belong (with the malates) to the most easily assimilable organic salts for non-sporulating bacteria in general. It is remarkable that there do not seem to exist spore-forming bacteria which produce protocatechetic acid, for I did not succeed in obtaining microbes from pa- steurised materials, such as garden soil or canal mud, which, in solutions or on plates of the before given composition gave rise to an obvious change of colour. But by various spore-formers calciumchinate was changed into carbonate, though slowly. With exclusion of air solutions of chinate are apt to come into fermentation, as was already observed by Löw, whereby carbonic acid, acetic and propionic acid are formed. Hydrogen was not found; the inferred microbes belong to Aërobacter aërogenes and allied forms. 2. Oxidation of Quercite to Pyrogallic acid by Pseudomonas aromatica. The knowledge that chinic acid derived from the hexamethylene ring (hexa- hydrotetraoxybenzoic acid) can so readily be converted by many microbes into an aromatic substance, easily demonstrated by the ferri-reaction, suggested the question if substances exist, related to chinic acid, that behave similarly. This consideration induced to subject quercite to an investigation analogous to the foregoing, the structure of this substance being the hexamethylene ring, in which 5 atoms of hydrogen have been replaced by hydroxyl. It was proved that also here, under the influence of life, an aromatic substance is easily produced, but at the same time that addition of a ferrisalt to indicate that substance is superfluous; further, that but one single species of microbes seems to exist, of which only some varieties possess the faculty to form that substance. A more precise investigation showed that here the chemical reaction proceeds quite correspondingly with the oxidation of chinic acid, but that the product is, after all probability, pyrogallic acid, evidently resulting thus: CaHiaOa + O = CeHeOg + 3 H^O Quercite Pyrogallol Here, too, only one atom of oxygen per molecule of quercite is used. It should be noticed that in these experiments a large portion of the quercite vanishes in another way, probably as carbonic acid and water. The microbes causing this conversion are very generally distribued in our sur- roundings, but although there occur among them a number of clearly distinct varieties, they all belong to one and the same species, namely that of the »aroma bacteria<3:, well known in milk and milk products and for the first time distinctly described by M i g u 1 a ^) as Pseudomonas aromatica. It is a polarmonociliate short rodlet, little motile in plate cultures, more so in broth. The very dark colour of the pigment in an aerated alkaline medium makes it easy to detect the quercite bacterium. If for example, on a broth agar plate with 0.5 proc. quercite, some drops of sewage water are spread, there is much chance that after one or two days at 30" C. some colonies appear that are jet-black, or He amid a black diffusion field, distributed among the numerous non-pigment producing colonies, which latter are little troublesome, excepting B. Huorescens liquefaciens, whose secretion is injurious to the quercite bacteria. In a previous paper I alluded to a simple experiment whereby aromatic milk results^). To this end milk should be kept at a relatively low temperature, for example at 15" to 20» C, with f uil admission of air, so that it is left to spontaneous corruption by the aerobic germs it contains. The acidification is at first feeble on account of the low temperature, but it is then the »aroma bacteria« increase very much and produce the characteristic ester which has not yet been nearer examined. If of such aromatic milk streaks are made on a quercite plate of the above com- position a large number of brown colonies of quercite bacteria appear after 2 X 24 hours at 30° C. An examination of their faculty of producing the aroma in milk ') System der Bakterien, Bd. 2, p. 880, 1900; with fig. Bd. i, Tab. i, fig. 8. This description is based on Bacillus crassus aromaticus Tataroff. — Probable synonyms: B. aromaticus lactis Gr immer, Centralbl. f. Bacteriol. 2te Abt., Bd. 8, S. 584, 1902. — B. butyri aromafaciens Keith, Bacillus N°. 41 Conn; Pseudomonas fragariae Gruber^ Centralbl. f. Bact.' 2te Abt. Bd. 9, p. 705, 1902. — Ps. fragariae Gruber, ld. Bd. 14, p. 122, 1905, — and Pj. fragaroidea Harald Huss ld. Bd. 19, p. 661, 1907. — Perhaps likewise the yellow-coloured Ps. trifolii of Harald Huss, ld. Bd. 19, p. 68 and 149, 1907, and several other different forms less easily recognisable in the literature are synonyms. — Bacillus esteriücans Maassen, Arbeiten des Kais. Gesundheitamtes, Bd. 15, 1899, is quite another species, producing spores and belonging to the hay bacilli, and thus related with Granulobacter polymyxa Prazmowski. *) Fermentation lactique dans, Ie lait. Archives Neérlandaises, Sér. II. T. 13. p. 350, 1907. proves that it does exist but only in a slight degree. The real »aroma bacteria«, which (levelop by the side of the »quercite colonies« and correspond with these in all other respects, do not possess the power of producing pyrogallol from quercite, hence, though belonging to the same species, they represent other varieties. The quercite bacterium might thus be named P. aromatica var. quercito-pyrogallica. That P. aro- niatica is so easily distinguished as a species, makes it in this case possible to in- dicate a character by means of which forms found in nature and seemingly alike, may be recognised as belonging to different varieties. The oxidation function here, thus proves to be very variable, being present or lacking in closely allied forms which are themselves constant and differ only in this quality. Another character by which the natural varieties of P. aromatica are mutually distinct, consists in their very unequal power of liquefying gelatin, this power being intense in some and quite absent in other varieties, with all intermediate degrees. The same is to be observed in the quercite bacteria; hence the variability of this pro- perty is in some degree a property of the whole group. All varieties, apparently without exception, produce in glucose bouillon about 3 cm.' N acid per loo cm.'' liquid. For growth, oxidation and acid formation, pep- tones are wanted as source of nitrogen, ammonium salts and nitrates can hardly serve as such and only in pure cultures, but by no means in free competition with other microbes. Although aromatic milk contains a great many quercite bacteria, its tlora chiefly consists of other varieties of P. aromatica, but the foUowing experiment, based on the principle: slow rising of the concentration of a good nutriënt medium apt to produce a slight acidification, makes it possible almost exclusively to obtain the quercite bacteria. Large glass beakers are filled with i L. of distilled water and therein are floated a few small dialysators of parchment paper, manufactured by Schleicher and Schuil, of the shape of experiment tubes, each filled with about 15 cm.^ of extract of greenmalt. This extract is prepared by rubbing two parts of greenmalt with three parts of water in a mortar and filtrating after some hours', digeration at room temperature. The clear solution contains relatively little maltose and is of course extremely fit for bacterial growth, where, likewise as in milk, lactic acid ferments are able to develop, but only little lactic acid can be formed on account of the low rate of sugar. Kept in a room where the temperature varied from 15° to 20" C. the spontaneously corrupted infusions in the beakers produced at repeated experiments, made in December 19 10 and January 191 1, so great an excess of quercite bacteria, that other species could hardly be found in the black mass, obtained by streak inoculations on brothagar quercite plates. If instead of submitting the malt extract to dialysis, different quantities of the extract itself were directly added to the water, then, with for the rest like conditions, much less quercite bacteria developed. The aroma formed in the malt extract is of the same nature as that found in aromatic milk. Other bacteria but the above named, producing a pigment from quercite, have not been found, neither by experiments with non-sporulating forms at higher tempera- tures nor among the microbes that remain alive in pasteurised materials. Finally it may be remarked that quercite (which is not susceptible of alcohol fermentation) is attacked, when no air is admitted, by fermentation bacteria of the Aërobacter-group, such as A. aërogenes, under production of carbonic, hydrogen, and of organic acids which have not been more exactly examined. 3. Oxidation of Tyrosine to Melanine by Microspira tyrosinatica. It is well known that the enzyme tyrosinase is able to oxidise tyrosine to a jet-black substance, which is formed at the air from dioxyphenyl acetic acid or homogentisinic acid. It is accepted that this substance originates af ter the formula i) : C9H11NO3 + 03 = CsHsO, + NH3 + CO2. Tyrosine Homogentisinic acid In the experiments now to be treated I could not find ammonia which, according to the formula should come free, probably because all the nitrogen present in the tyrosine, is used for the growth of the bacteria. Hitherto this conversion had only been studied as a consequence of the action of an enzyme occurring in higher plants and also in higher Fungi. Nobody, however, had as yet described tyrosinase-producing bacteria, whose existence will be referred to in the next lines. As they are rather easily cultivated and are able to produce great quantities of the black pigment formed from tyrosine, which is identic with or closely allied to the melanines of the human body, they are of importance for ex- perimental physiology. Tyrosine microbes are small vibrios, chiefly occurring in the sea and during the winter months present in the plankton. Fresh water is not however quite devoid of them and without much trouble they may be isolated from sewage water. The forms living in the sea produce, at least as regards the stronger varieties, besides tyrosinase, also tyrosine, and as this takes place from peptone they are to be recog- nised by the black stains which their colonies produce on broth-agar plates which, as we have to deal here with inhabitants of the sea, should contain 3 proc. common salt. It is remarkable that these tyrosine-vibrios of the sea can be accumulated in seawater with addition of agar as sole source of carbon, ammonium chlorid as ni- trogen food, and kalium phosphate. In this respect they show analogy to the gelase vibrios, which secrete the enzyme gelase by which agar is changed into sugar and which are also easily produced in this manner. Accumulation of these microbes in seawater with tyrosine as source of carbon has not succeeded, as little as with their relatives from fresh water, by corresponding experiments. Endeavours to accumulate the latter from sewage water with tyrosine as source of carbon and nitrogen have produced fluorescents, which thus prove the stronger in the competition at such an "elective" cultivation. The fresh-water form is fairly common in the sewage water of Delft; to obtain it in pure culture the undilute sewage water must be poured over a plate of the composition: ') Abderhalden, Physiolog. Chemie. 2te Aufl. p. 367, 1909. Tapwater loo Tyrosine o.i Natrium carbonate .... o.i Dikalium phosphate .... 0.05 Agar 2 The superfluous water is allowed to flow off the plate, which is cultivated for some days at 30" C. It is true that here the tyrosine is at the same time source of carbon and of nitrogen, but the method is now a »separative« one, as competition is excluded. On the second or third day peculiar black spots are seeen to appear around some colonies and slowly extend over a distance of some millimeters ^). The black pigment proves able to diffuse only to a rathef short distance, whilst the enzyme itself remains bound up with the bacterial bodies as belonging to the endo-enzymes. That here we have indeed to deal with a true enzyme, is more easily shown in the species of the sea than in the fresh-water microbes. To this end some material cultivated on broth agar is killed by the vapour of chloroform, then transported to a culture plate of the above composition, or to a nutriënt liquid of the same preparation, but with omission of the agar. At a temperature of 40" C. the black-colouring is then rather quickly perceived but, of course, without development of he germs. As endo- enzymes may be considered as constituents of the protoplasm, it is not surprising that the reactions with such preparations, containing only dead material, are feeble, for the enzyme itself is for the greater part annihilated. Hence, in my opinion, endo-enzymes are best studied when still within the living cells themselves and by considering them as an essential part of the living protoplasm. Taken in this sense tyrosinase may be called a »respiration enzyme«, and it is remarkable that as a product of repiration, beside the carbonic acid, ammonia is formed, instead of water as in the ordinary respiration. In sewage water only a small number of tyrosine bacteria are found per cM^. This number may be a little increased by leaving the sewage water for some time at room temperature, then making on plates streaks of the microbes accumulated in the layer at the surface. This microbe layer, very rich in infusoria and flagellates, produces, in particular as it seems in late summer, many more tyrosine bacteria than the sewage water itself. Nevertheless, as said above, it has not been possible to find a really good accumulation method of these tyrosine bacteria, although many trials have been made. The black pigment can be prepared in great quantities by cultivating the pure microbes at 30" C. in large Erlenmeyer flasks of the said feebly alkaline solution of natriumtyrosinate with the required anorganic salts. The conversion is relatively slow, so that it is complete only after some weeks, but then a liquid is obtained which may be used as ink. Traces of ferrisalts favoui' somewhat the formation of melanine. ') As the so generally distributed fluorescent bacteria likewise attack tyrosine under production of a light red-brown pigment, there are always found spots of that colour on such culture plates, which can, however, by no means be mistaken for those ot tyrosinase. 8 The tyrosine bacteria belong to the genus Microspira created by Mig ii l a. They are very small polar-monociliate, curved rodlets, somewhat varying in thick- ness, mostly thinner than the cholera vibrios, which for the rest they resembly very much. Like these they quickly liquefy broth gelatin and form on broth agar white, vigorously growing soft masses. Sometimes they are united in long chains; the longest individuals show distinct curves and remind of spirilli. If tyrosine is present in the nutriënt medium, many individuals take partly a black colour, swelling up very much and sometimes becoming quite spherical, but the cilia do not become visible. They produce indol, but do not give the nitrosoindol reaction. They grow well in peptone solutions. The fresh-water form colours broth agar without tyrosine not or only very late, but if tyrosine is added the brothagar grows rapidly black. The black-colouring begins still earlier on the before mentioned culture medium, containing only tyrosine, although the growth on it is much slower than on brothagar. As nobody had ever before observed tyrosinase formation by bacteria, there is reason to consider these microbes as new for science; the species occurring in sewage water may be called Microspira tyrosinatica^). It is an organism highly sensible to the nature of the nutriënt substances, apt to lose the tyrosinase function by various not yet explained influences, but notwithstanding continuing for years in the labora- tory as an hereditary constant species. § 4. The hrown pigment formed by the acetic bacteriuvi Acetobacter melanogemim. When beer is left to corrupt at the air a film forms at the surface in which Saccharomyces Mycoderma and acetic bacteria develop, or only the latter, in accor- dance with the temperature and other culture conditions. If the corruption takes place at room temperature it will be perceived, when the beer is contained in beaker- glasses, that after the film has closed over the surface, some of the beakers slowly assume a dark brown colour and after two or three weeks get so dark, that the beer seems coloured by caramel. For the isolation of the here active organisms streaks are to be made of the film on wort- or beer gelatin. Then these culture plates being kept two or three weeks at room temperature, they show deep brown spots evidently coloured by the same sub- stance which originated in the beer itself, spots in whose centre the colony of a vinegar bacterium is lying. As a matter of course the plates are further covered with colonies of Saccharomyces Mycoderma and of ordinary vinegar bacteria. Culture plates of 100 water, 10 gelatin, 2 peptone, 3 glucose, are also very good for growth and pigment production. The »brown« vinegar bacterium obtained in this way, I recently described under the name of Acetobacter melanogenum^). It is commonly but not always, a motionless organism, which can only develop on pep- ') Migula's Microspira nigricans, System d. Bakteriën, Bd. II, p. 1013, does not liquefy gelatin, but colours it brownish black. Whether tyrosine and tyrosinase occur in this case has not been examined. ^) Pigmentbildung bei Essigbakterien. Centralblatt f. Bakteriol. 2te Abt. Bd. 29. S. 169, 191 1. tone as source of nitrogen and produces the pigment from this substance, if at the same time glucose or maltose is present. Other nitrogen sources but peptone have not been found. The sugar is during the growth partly converted into a streng acid, probably gluconic acid. In presence of alcohol much acetic acid is formed. Conse- quently beer acidifies with great intensity. Solutions of 10 proc. glucose and 2 proc. peptone in tapwater with 10 proc. calcium carbonate at 25° or 30" C. grow black after a few weeks, the carbonate changing at the same time into calcium-gluconate. Although for the formation of the pigment the simultaneous presence of sugar and peptone is required, there is cause to admit that the pigment is an aromatic sub- stance, taking rise from peptone alone, whereas this reaction only occurs during the growth of the microbe, for which growth also sugar is wanted. In an earlier paper I gave to such the name af auxobolisms. By the formation of the pigment in the gelatin plates the gelatin not only be- comes deep brown, but at the same time quite insoluble in boiling water, which is the more remarkable as the newly isolated stocks of A. melanogenum liquefy the gelatin in the beginning (probably by the intense acid production and not by a specific enzyme). Older stock lose this liquefying power, probably as they become slower in producing acid; their pigment formation, however, remains the same. Only very few substances render gelatin insoluble in boiling water as for example, formalin and chinon, whilst among the microbes, as far as known, only Actinomyces chromogenes (Streptothrix chromogena) has the same efïect on gelatin by chinon production from peptone. As, moreover, the brown-coloured gelatin reduces silver in an ammoniacal solution of silver nitrate, and produces metallic mercury from an alkaline mercury solution, there is reason to admit that A. melanogenum does really produce chinon, this substance giving the same reactions. However the most characteristic reactions of chinon could not be obtained, namely, the blue- colouring of guajac emulsion and the production of iodium from hydroiodic acid. But the secretion product of the brown vinegar bacteria gives quite well the black- colouring with ferrisalts, also characteristic for chinon. Siimmary. The oxidation of chinic acid to protocatechetic acid is brought about by number üf microbes belonging to very different groups and is easily demonstrated with ferrisalts. In particular Mtcrococcwj calco-aceticus and some varieties of B. üuorescens non liquefaciens possess this faculty in a high degree and hence can be found and isolated from mixtures of bacteria. The oxidation of quercite to pyrogallol is caused only by certain varieties of Pseudomonas aromatica, so that we have here a very specialised function. Green- malt extract allowed to grow »aromatic« by spontaneous corruption at low tempera- ture abounds in that species and always contains numerous quercite bacteria which besides, are fairly common in sewage and even in canal water as also in »aromatic milk«. Melanine formation from tyrosine is proper to certain sea-vibrios and to Micro- spira tyrosinatica not uncommon in sewage water and easily found by this reaction. It is a microbe closely allied to the cholera and the photogenic vibrios. The tyrosinase function is sometimes suddenly lost by unknown influences, but may return in the same stock. Notwithstanding, the species can be considered as fairly constant and remains so for years in the laboratory. Beer, poer in extract, colours dark brown when corrupting at the air. This is owing to the presence of a vinegar bacterium, Acetohacter melanogenutn, which produces a pigment reminding of caramel from peptome. By the secretion products of A. melanogenutn gelatin is as it were tanned and becomes insoluble in boiling water. Perhaps chinon is inferred in this process. In natura! varieties of the species of microbes, which in all other respects show no difference, the oxidation function in regard to certain substances may be either or not present, but if present it may be very constant in these varieties. An experiment with Sarcina ventriculi. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol. XIII, 191 1, p. 1237 — 1240. — Verscheen onder den titel »Een proefneming met maagsarcine« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XIX, 1911, blz. 1412 — 1415. Some years ago I presented a paper concerning a method to obtain and cultivate an anaërobic fermentation Sarcina from garden soil ^). As the microscopic image and the dimensions of the thus obtained organism corresponded in all respects with the Sarcina of the stomach^), of which Suringar^) has given so exact a description, I already then tried to prove their identity by experiments, similar to those with garden soil, with material containing stomach sarcina, which I owed to Professor van Leersum at Leiden. These experiments, however, failed. A later one, made at Leiden after my indications, proved likewise unsuccessful. My supposition that the cause of the failure might have been a too strong aëration of the infection material by which the anaërobic stomach sarcina had lost all its vegetative power, induced me to pay special attention to this point at renewed experiment for which Professor van Leersum again aft'orded me an opportunity in the Academie Hospital at Leiden. It was proved that my supposition had been right: when transferring the contents of the stomach with the sarcina to a fit culture liquid, so quickly that with the air might be considered as excluded, it was possible to make the growth and fermentation proceed vigorously. The experiment was managed as follows. Some bottles of about 130 cm." were filled with boiling malt extract quite freed from air by previous boiling. The malt extract was prepared by soaking about 20 g. of grist of kiln-dried malt in 80 g. of water, saccharifying one hour at 63° C, boiling and filtering. Some bottles were acidified with phosphoric acid to 5 cm* N per *) Proceedings of the Meeting of 25 February 1905 p. 580. Archives Neérlandaises Sér. 2, T. 9. page 199, 1905. ^) Discovered by Goodsir, History of a case in which a fluid, periodically ejected from the stomach, contained vegetable organisms of an undescribed form. With a Chemical analysis of the fiuid by Wils on. Edinburgh Medical and Surgical Journal, T. 57, p. 430, 1842. Wilson asserts he has found acetic acid in the gastric juice, but does not speak of lactic acid, which is in fact produced by Sarcina ventriculi. *) De Sarcina (Sarcina ventriculi Goodsir), Leeuwarden 1865. 100 cm^, some others to lo cm^ X, and others were not acidified at all. The acidi- fication was applied as the experience with the sarcina of the soil had taught that this organism endures a high degree of a'cidity much better than all other microbes occurring in the soil, so that the same might be expected with regard to the stomach sarcina if this were indeed identical with it. The further course of the experiment confirmed the correctness of this expectation too. The bottles destined fort the experiment were cooled after closing to about 40° C. and only opened at the moment the infection material was at hand, which consisted in the contents of the stomach of a person suffering of stenosis oesophagi. About 5 cm^ of it was introduced into each bottle and that so quickly after the pum- ping out of the stomach, that the material had no time, neither to be saturated with air nor to be cooled considerably below the temperature of the body. Microscopically a great many sarcines were to be recognised, other microbes being hardly to be found. It is true that many yeastcells occurred, but they proved dead and originated evidently from the yeast used for the preparation of the bread-porridge which the patiënt had eaten. Rests of potatoes and rice were also recognised in the contents. Before proceeding the following observation may be mentioned here. Directly after the pumping out of the stomach a little bottle was also quite filled with the thus obtained contents only, closed with a cork and placed in a thermostat at 37° C. The result was that in this bottle, already after a few minutes, so vigourous a fermentation set in that the cork was thrown off. As microscopic examination proved that in this way a very pure Sarcina fermentation was obtained, this simple experiment had for the first time demonstrated that the stomach Sarcina can be nothing else but an anaërobic fermentation sarcina. The acid titer of the clear filtrate of the contents was, according to Professor van Leersum, 3.8 cm^ N per 100 cm", with phenolphtalein as indicator, whilst free hydrochloric acid seemed quite absent, so that the acid must chiefly have been the lactic acid secreted by the sarcina itself, which is in fact very well possible, as at laboratory experiments the sarcina of the soil grows readily in somewhat saccharified meal-mashes and can form therein about 4 cm^ N lactic acid per 100 cm^. The striking purity of the sarcina fermentation in so heterogeneous a mass as the stomach contents, in which neither lactic acid ferments nor alcohol yeasts were to be found, might have been explained by the presence of free hydrochloric acid, this acid being much better tolerated by the sarcina than by the other microbes. But as this acid seemed to be quite absent, the said pure development of the sarcina in the stomach, all other organisms being excluded, is not yet quite clear. But we return to our chief experiment. The bottles prepared as described, arrived at Delft at a temperature of about 25'' C. and were directly placed in a thermostat at 35" C. The result was that in all without exception, so as well in absence of acid as with 5 and 12 cm» N phosphoric acid, already after some hours a distinct fermentation was visible. By and by it increased in vigour and after about 18 hours the sarcina had so much niultiplied, that at the bottom of the bottles a thick layer of the so characteristic microbe had deposited, from which an abundant current of fermentation gases, consisting of car- bonic acid and hydrogen, mounted upwards. This state continued about 24 hours before the fermentation feil considerably. 13 My supposition that the earlier experiments had only failed because the stomach contents had been too strongly cooled and aërated during the transit from Leiden to Delft was thus proved to be well founded, and now all doubt is excluded about the identity af the soilsarcina af the hydrogen fermentations and the sarcina of the stomach. It is of interest still to note here that in this experiment the addition of acid to the nutriënt liquid had proved superfluous, as the fermentation had gone on also in the bottles without acid. In these latter bottles, however, many lactic-acid strep- tococci and lacto-bacilli were visible already after i8 hours' cultivation, which was not at all the case in the bottles with phoshoric acid. Only the latter could thus be used for the continuation of the fermentation by inoculation into a new quantity of culture liquid, without the chance that the sarcina might be overgrown and expelled by the lactic-acid ferments. Likewise as with the sarcina of the soil, by some repeated transfers into the described medium, acidified with phosphoric acid to 13 cm^ N per 100 cm^, it was possible within the course of three days to obtain so pure a culture of the sarcina, that inoculation into the malt extract without acid was successful, not any other microbes coming to development. The thus obtained fermentations have become very vigorous and are not to be distinguished from the best fermentations with the soil sarcina. Now that the identity of the latter and that of the stomach is ascertained, still the question exists how it feeds and multiplies at the low temperature and under the other conditions of life of the relatively cold soil, which must evidently be quite different as well from those of the stomach contents as from those of the described nutriënt liquids, so rich in carbohydrates and various nitrogen compounds, and at temperatures between 35" and 40" C. The answer to this question I hope to give later. That the sarcina should only accidentally occur in the soil and the mud of ditches and not multiply there, cannot be admitted on account of the very common occurrence of this organism ; near the Laboratory at Delft, for example, the sarcina could easily be found to a depth of 70 cm in all earth-layers, even in so small quantities of soil as o.i to 0.5 g. Why the sarcina develops so easily in the diseased stomach is in my opinion connected with the readiness with which this organism grows in meal-mashes, sup- ported by the absence of hydrochloric acid which under normal circumstances inhibits all microbic growth in the stomach. The general occurrence of the sarcina is perhaps best shown by the following experiment. If some coarsely ground rye is mixed with water and placed in a thermostat at 300 to 35° C. it will the next day be found in a strong coli-aërogenes fermentation. If then this mass is carefuUy examined with the microscope many packets will be found of the sarcina in a state of very acitve multiplication. They clearly originate from the dust deposited on the surface of the corn at the reaping, the sarcina being quite well adapted to endure severe drying. Although the sarcina of the stomach, in itself harmless, can at most be troublesome by the evolution of hydrogen^), it should still be observed that deve- lopment of this microbe is impossible in absence of carbohydrates, so that at a flesh *) The periodical vomitting observed in some cases of stomach sarcina may be connected with the accumulation of hydrogen, formed in the stomach. 14 diet, if there were no reasons to avoid such a regimen, it would soon disappear. A milk diet, too, would have such a result, as well if the milk were acidified by lactic- acid ferments, as without previous acidification. So it was not possible in laboratory experiments to cultivate the sarcina in butter-milk, and even fresh milk, acidified with various quantities of lactic or phosphoric acid, gave only in few instances a feeble growth. In absence of acid the growth of the sarcina in crude milk is quite im- possible, this organism being overgrown by the other microbes. Ueber die Absorptionserscheinung bei den Mikroben. Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, Jena, II. Abteilung, XXIX. Band, 1911, S. 161 — 166. DaB die lebende Zelle imstande ist, allerlei Körper aus verdünnten wasserigen Lösungen zu sich zu ziehen und in viel betrachtlicheren Konzentrationen zu speichern, wie der Tension der dargebotenen Lösung entspricht, ist besonders für die Reserveorgane der höheren Pflanzen bekannt. So kann sich im Saft der Zuckerrüben eine 22-proz. Rohrzuckerlösung, in den Gerbstoffvacuolen vieler Gallen eine mehr wie 20proz. Gerbstofflösung anhaufen. Auch können die Pflan- zenwurzeln die auBerst verdünnten Lösungen der Bodennitrate reichlich an- haufen. Die Meeresalgen saugen die Jodverbindungen aus dem Meereswasser und gewisse Anthozoen das Strontium zu sich. DaB es sich hierbei um eine Funktion gröBter Allgemeinheit handelt, welche ebenfalls bezüglich der verschiedenartigsten Nahrstofïe für die Mikroben gilt, scheint noch nicht beachtet zu sein; darum soll im folgenden ein einfacher Versuch angegeben werden zum Nachweis der Wahrheit dieser Behauptung. Der Versuch beruht auf der Anwendung des auxano- graphischen Verfahrens ^), wobei die Mikroben sich in einem festen Nahrboden be- finden, welcher ein für das Wachstum notwendiges Element, wie Stickstoff, Kohlen- stofï, Phosphor, Magnesium, Kalium oder Schwefel nicht enthalt, wahrend alle übrigen Nahrstofïe gegenwartig sind. Infolgedessen ist bei geeigneter Versuchsein- richtung das Wachstum sehr gering und nur bedingt durch die zufallig gegenwar- tigen Verunreinigungen, welche Spuren des fehlenden Elementes enthalten können. Wird dann aber irgend ein assimilationsfahiger Körper zugesetzt, worin das fehlende Element vorkommt, so wird kraftiges Wachstum eingeleitet, welches so lange dauert, bis ein anderer Nahrungsstoft' verbraucht ist, oder schadliche Absonderungs- produkte beeintrachtigend werden. Nicht alle Mikroben sind gleich gut für solche Versuche geeignet. Besonders die Schimmel- und Hefearten, sowie die sehr schnell und kraftig wachsenden Bak- terien lassen sich gut verwenden; die langsamer wachsenden Arten lassen sich nach diesem Verfahren zwar nicht so gut untersuchen, doch habe ich mich durch allerlei direkte und indirekte Beobachtungen überzeugt, dass auch für sie die Regel der Ab- sorption von allgemeiner Anwendung ist. *) L'auxanographie ou la methode de l'hydrodiflfusion dans la gelatine appliquée aux recherches microbiologiques. (Archives Néerlandaises. T. 23. 1889. p. 367.) i6 Die Ausführung des Versuches mag an einem bestimmten Beispiele naher er- lautert werden. Wahlen wir dafür Oidium lactis, isoliert von Milch, welche bei Zimmertemperatur der Verderbnis überlassen war, wobei bekanntlich eine dicke, trockene Kahmhaut der genannten Art entsteht. Das Isolieren geschieht am schnell- sten auf Würzegelatine, worauf ebenfalls das Weiterzüchten stattfindet. So bekommt man ein reichliches Material, welches nun wie folgt verwendet wird: AuBer Nitraten und Nitriten, welche für Oidium nicht geeignet sind, dafür sozusagen nicht existieren, sind die gewöhnlichen StickstoftVerbindungen für Oidium lactis assimilationsfahig; Ammonsalze und Harnstofï gehören zu den besten Stickstoffquellen. Auch bezüglich der Kohlenstoffverbindungen ist Oidium nicht be- sonders wahlerisch, doch können Rohrzucker, Mahose und Milchzucker nicht als Nahrung dienen. Dagegen sind Glukose, Lavulose, Glyzerin, Acetate, Propionate und Butyrate gut verwendbar ^). Fig. I. Zirkulares Diffusionsfeld ohne Mikroben. Die Ordinaten bedeuten das MaB der Konzentration der dififundie- renden Substanz in einem zirkularen Diffusionsfeld, dessen Mittelpunkt bei O liegt; die Abscissen sind also die Entfernungen vom Mittelpunkt. Fig. 2. Diffusionsfeld mit Mikroben (Absorptionsfeld). Die Ordinate OA bedeutet diejenige Konzentration, wel- che bei den gegebenen Bedingungen absorbiert wird. Mit mehr .Substanz bleibt OA gleich, doch dehnt sich das Auxanogramm aus, AB wird dann also gröBer. Bringt man nun in eine Agar- oder Gelatinelösung in Leitungswasser z. B. 5 Proz. Glukose und 0,05 Proz. KH2PO4, und wenn dann noch eine Trübung von Calciumphosphat bemerkbar ist, einzelne Tropfen Phosporsaure, vermischt die noch flüssige, jedoch auf ca. 300 C a 35" C abgekühlte Masse mit einem ÜbermaB von Otdmmkeimen und gieBt zu einer Platte aus, so wird darin nur sehr wenig Wachstum stattfinden, weil assimilierbarer Stickstofï fehlt. Bringt man nun lokal auf die Platte einige Kristalle von Harnstofï oder eines Ammonsalzes, so wird schon nach mehreren ') Weil es leicht ist, vermittels der auxanographischen Methode Mikroben aufzu- finden mit einem gegenüber verschiedenen Substanzen entgegengesetztes Absorptions- vermögen, so können darauf sehr gute analytische Trennungsverfahren basiert werden. So f and ich z. B., daB Saccharomyces Mycoderma Laktate wohl und Propionate nicht absorbiert, was gleichfalls bezüglich der freien Sauren gilt. Dadurch wurde es möglich, auf sehr einfache Weise diese beiden Sauren nebeneinander zu bestimmen was sich z. B. als wertvoll ergibt bei der Untersuchung der Propionsauregarung aus Caliumlaktat. Auf ahnliche Weise können Essigsaure und Propionsaure voneinander getrennt werden, weil .S. Mycoderma auch die erstgenannte Saure sowie die Acetate absorbiert und assimiliert. Überhaupt ist die ganze Gruppe der Saccharomyceten im weiteren Sinne eine wahre Fundgrube für solche Trennungsverfahren, und durchaus noch nicht ge- nügend in dieser Richtung untersucht. Doch gibt es auch sehr viele Bakterien, die sich dafür ausgezeichnet eignen, und zvvar in allerlei ungeahnten Richtungen. 17 Stunden oder ein paarTagen einOidtMwauxanogramm sichtbar,welches kurz nachdem CS kenntlich geworden ist, aufhört sich weiter auszudehnen. Letzteres wird festge- stellt, indem man auf die AuBenseite des Bodens der Glasdose mit einer Schreib- feder einen Zirkel zieht, welcher mit der GröBe des Auxanogrammes zusammenfallt. Es ist nun sehr auffallend, daB diese Grenze des Auxanogrammes nicht difïus ist, so wie das von einem Diffusionsfeld sicher zu erwarten ist, und z. B. bei Diffusions- feldern von Farbstofïen (Fig. i) auch wirklich zutrifft, sondern durchaus scharf (Fig. 2); nur bei genauer Betrachtung mit der Lupe sieht man eine ganz schmale Übergangszone, welche die Stelle andeutet, wo ein beinahe, aber nicht absolut plötz- licher Konzentrationsfall der absorbierten Substanz vorliegt; in der Figur 2 ent- sprechen die Ordinaten zwischen B und C diesem Konzentrationsfall. Als zweiter Umstand kommt dazu, daB in dem Felde, zur Zeit, wo eine weitere Ausdehnung da- von nicht mehr stattfindet, das eigentliche Wachstum eintritt. Die Keime speichern die dargebotene Stickstoffquelle also betrachtlich und verwenden denselben erst nach- traglich für Wachstum. DaB letztere Auffassung tatsachlich richtig ist, geht aus dem folgenden hervor. Eben dann, wenn das Diffusionsfeld aufgehört hat, sich weiter auszudehnen, und die Keime erst recht anfangen zu Koloniën auszuwachsen, laBt sich überall im Felde in gleichmaBiger Verteilung mit Nessiers i) Reaktiv mit gröBter Leichtigkeit Ammon nachweisen. Selbst schreitet das Wachstum noch fort, kurz nachdem dieser Nachweis nicht mehr gelingt. Im ganzen durchlauft jedes Auxanogramm also drei Hauptphasen: Zunachst gibt es eine Diffusionsperiode, wahrend welcher der Körper sich sozusagen bis zur richtigen, absorbierbaren Verdünnung ausbreitet. Darauf folgt die Absorptions- periode, wahrend welcher die Zeilen zunachst speichern, vielleicht auch schon wach- sen, was mit der Möglichkeit des Nachweises innerhalb der Zeilen der nicht mehr frei diffundierenden Substanz einhergeht, SchlieBlich tritt die Periode des Haupt- wachstums ein, wobei die Substanz schnell verschwindet. Alacht man den Versuch in umgekehrter Richtung, wird also die Stickstoft'- quelle in den Nahrboden gebracht und die Kohlenstoffquelle fortgelassen, so kann auf einer derweise zubereiteten Platte ein Glyzerin-, Glukose-, ein Lavulose-, ein Acetat-, ein Propionat- oder ein Butyratauxanogramm hervorgebracht werden, worin sich die drei gleichen Phasen nachweisen lassen wie im vorigen Falie. Das heiBt, es wird in der zweiten Phase z. B. Glukose gespeichert, welche sich, trotzdem die Diffusion vollstandig aufgehört hat, leicht vermittelst der F e h 1 i n g schen Methode nachweisen laBt. Auch für die Acetate, welche sich als Tetraeder von Uranylnatrium- acetat gut auffinden lassen, ist die Absorptionserscheinung direkt nachweisbar. Für die Propinate und Butyrate kann aus der scharfen Begrenzung der Felder ebenfalls mit Sicherheit auf die Existenz der Absorption geschlossen werden, Gleiches gilt für Milchsaure und die Laktate, welche durch die Ceriumreaktion leicht nachzuweisen sind2). *) Für diesen Nachweis werden kleine Agarstückchen aus der Platte gestochen und in eine Porzellanschale gebracht, worin sich eine dunne Schicht von Nessiers Reaktiv befindet. Ahnlich verfahrt man für andere Körper mit den entsprechenden Reaktionen. ^) Rohrzucker, Laktose und Maltose werden von Oidium la'ctis mit Ammon oder Hefewasser als Stickstoffquelle nicht assimiliert. O. Magnusii betragt sich auch in M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 2 i8 Für die Leuchtbakterien, welche nur mit Pepton als Stickstoft'quelle wachsen können, habe ich früher gezeigt, daB die Absorptionsphase der assimilierbaren Kohlenhydrate, des Glyzerins und der organischen Salze für Photobacter phosphoreus sich durch starkes Leuchten auszeichnet, also eine erhöhte Respirationsfunktion an- zeigt, wodurch der Versuch als ein schoner Momentversuch verwendbar ist. Oidium lactis eignet sich besonders gut, um auch die Bindung voii Phosphor- saure in den Auxanogrammen nachzuweisen. Solche Versuche geben überdies noch Veranlassung zu folgender Beobachtung: Nachdem die Auxanogramme in der dritten Phase einige Zeit verweilt haben, bemerkt man, wenigstens wenn die Kohlenstoff- quelle noch nicht erschöpft ist, daB sich auBerhalb des Auxanogramms ganz allmah- lich wieder ein neuer, schmaler Wachstumsring bildet, offenbar weil zunachst ab- sorbierte Phosphate spater wieder das Auxanogramm verlassen, was mit einer Er- schöpfung gewisser Zeilen in Verbindung stehen muB und vielleicht mit dem Über- gang des Glycogenvorrates in öl zusammenhangt. Nicht selten entsteht noch spater wieder ein neuer Ring und dieses kann sich noch ein zweites Mal wiederholen. Auch die Alkoholhefen eignen sich besonders gut für das Studium dieser ,,Ringbildung", wie überhaupt für die auxanographische Methode im allgemeinen. Was in den vorgehenden Zeilen geschildert wurde für den Stickstoff, den Kohlenstoff und den Phosphor, laBt sich bei genügender Sorgfalt ebenfalls für das Magnesium und das Kalium nachweisen, wobei man besonders, wenn es sich um ursprüngliche Abwesenheit der Kalisalze handelt, nur solche Glasgerate für die Versuche verwenden kann, welche dieses Element nur in geringer Menge enthalten und es überdies schwierig an die benetzende Nahrlösung abgeben. Es wurde gesagt, daB es für das Gelingen der Absorptionsversuche nötig ist, in den festen Kulturboden eine sehr groBe Anzahl Keime zu verteilen. Die Entfer- nungen zwischen denselben werden dann so klein, daB der diffundierende Körper überall zurückgehalten wird. Ist dagegen die Keimzahl relativ gering, so kann die Substanz durch die Zwischenraume ohne merkliche Absorption weiter difïundieren, und man bekommt dann, anstatt der Absorptionsfelder, die etwas verkleinerten Diffusionsfelder zu Gesicht, natürlich ebenfalls als Auxanogramme. Man kann nun leicht den folgenden bemerkenswerten Umstand feststellen: Bei der Verwendung von sehr vielen Keimen haben die Absorptionsfelder eine ziemlich konstante GröBe, welche in weiten Grenzen unabhangig ist sowohl von der Menge der Keime, wie von der j enigen der verwendeten Substanz. Dieses durf te wohl damit zusammenhangen, daB irgendeiner der anderen, ursprünglich dargebotenen Nahrstofïe durch die sehr zahlreichen Keime bald ganzlich absorbiert wird, was eine Grenze stellt an die Absorption der übrigen, also auch an diejenige der diffundierenden anderen Hinsichten ahnlich wie O. lactis, unterscheidet sich davon jedoch durch Gar- vermögen bezüglich Glukose. Glukose in Hefewasser wird durch O. lactis also nur für Wachstum, durch O. Magnusii für Wachstum und Garung verwendet; Maltose in Hefewasser wird durch beide Arten weder für Wachstum noch für Garung ver- wendet, was ich hervorhebe, weil jüngst von Herrn Ludwig Rosé (Wochenschr. f. Brauerei. 1910. No. 42 uf.) behauptet wurde, daB Glukose durch O. Magnusii nur ver- goren wird, wahrend Maltose nur Wachstum dieses Mikroben würde verursachen können. Wenn es sich hierbei nicht um eine zufallige Verwechslung handelt, verdient die Sache weitere Aufklarung. 19 Substanz. Man kaïin aber die Konzentration eines jeden Nahrstoffes nur bis zu einem bald erreichten Grad erhöhen, wenn nicht die optimalen Ernahrungsbedingun- gen gestort werden sollen. Dieser Grad wird bestimmt durch das MaB der plastischen Aquivalente, das heiBt derjenigen Mengen der verschiedenen Nahrstofïe, welche sich zu gleicher Zeit an dem Aufbau der organischen Substanz beteiligen und offenbar auch die absorbierbaren Mengen der anderen Substanzen bedingen. So waren z. B. in Kulturplatten von 2 mm Dicke, welche bestanden aus: Lei- tungswasser 100, Agar 2, Glukose 5, KH2PO4 0,05, MgS04 0,02 mit sehr viel Oidium (viele Millionen Zeilen pro ccm) die Auxanogramme von 10 und 20 mg Ammonsulfat resp. 6,5 und 7 cm in Mittellinie, diejenigen von 5 und 10 mg Ureum resp. 5,5 und 6 cm. Als bei einem anderen, übrigens gleichen Versuche die ur- sprüngliche, sehr groBe Zellenzahl halbiert wurde, ergaben 10 und 20 mg Ammon- sulfat Felder von 7 und 7,5 cm, 5 und 10 mg Ureum solche von 6 und 6,5 cm. Alle diese Differenzen sind also relativ gering und deuten nur an, daB das Ammonsulfat schneller diffundiert wie das Ureum. Etwas ahnliches wird beobachtet, wenn die Keimzahl eine sehr viel geringere ist, wie aus folgendem Beispiele hervorgeht: Es wurden in 25 ccm Leitungswasser 100 Glukose 10 Monokaliumphosphat 0,1 Magnesiumsulfat 0,1 Agar 2 ca. 580 000 Keime pro ccm gebracht und auf eine Spiegelglasplatte ausgegossen zu einer Schicht von i mm Dicke. Um den EintluB der Lüftung zu beurteilen, wurde bei einem zweiten Versuch mit dem gleichen Nahrboden die halbe Keimzahl gebracht und ausgegossen zu einer Schicht von 0,5 mm Dicke. Jede Platte erhielt dann an drei genügend entfernten Stellen i, 3 und 10 mg Ureum, welche nach zwei Tagen scharf begrenzte Auxanogramme lieferten. Diese maBen bei Versuch I resp. 7, 8,5 und 9 cm, Versuch II 9, 9,5 und 9,5 cm. Zwar hat hier die geringere Schichtdicke eine etwas gröBere Ausdehnung der Felder verursacht wie die gröBere, doch ist die Differenz viel geringer, als wie man wohl erwarten würde, und wird erklarbar aus dem merklich dichteren Kolonienwachs- tum überall auf I wie auf II, was beweist, daB eine Schichtdicke von i mm etwas gunstiger ist für Oidium lactis, wie eine solche von 0,5 mm, so daB diese Art ein wenig anaërob ist. Viel bemerkenswerter ist aber die nur wenig verschiedene Aus- dehnung der Felder bei der Verwendung von i, 3 und 10 mg Ureum in beiden Fallen. Die Erklarung dieses Umstandes war jedoch sofort den Auxanogrammen anzusehen: 10 mg Ureum batten ein viel starkeres Wachstum ergeben wie 3 mg, und diese ein viel starkeres wie i mg. Die Felder indizieren in diesem Falie offenbar die Aus- dehnung, welche das Ureum infolge der Hydrodiffusion erreicht, woran erst nach 2 Tagen eine Grenze gestellt war, wahrend welcher Zeit eine Absorption stattgefun- den hatte, ungefahr proportional mit der Konzentration. Weil nun in Fig. i die mittlere Ordinate schnell abnimmt beim Weiterdiffundieren der Substanz, wahrend die Diffusionskonstante natürlich gleich bleibt, muB die ursprüngliche Konzentration ziemlich gleichgültig sein für die schlieBlich erreichte Ausdehnung der Diffusions- felder. 2* Natürlich wird dieses alles anders bei mittleren Zellenzahlen. So erzeugten in Agarplatten von 2 mm Dicke und letztgenannter Zusammensetzung, j edoch mit ein paar Millionen Zeilen pro ccm. i, 3 und 10 g Ureum resp. Felder von 5, 6 und 7,2 cm, also von 25, 36 und ca, 50 qcm, so daB in diesem Falie 10 mg Ureum sich über eine Flache von der doppelten GröBe verteilt hatten wie i mg. Man sieht aus all diesem, daB die Versuche, je nach den Bedingungen, sehr ver- schieden groBe Auxanogramme liefern können, daB diese GröBe jedoch von einer bemerkenswerten Konstanz wird, wenn sehr groBe Zellenzahlen verwendet werden. Eine praktische Folgerung, wozu Vorgehendes Veranlassung gibt, bezieht sich auf die Frage der biologischen Reinigung der Abfallwasser. Es stellt sich bei einigem Nachdenken namlich heraus, daB die Mikrobenschicht, welche als schleimige Sub- stanz die Oberflache der Elemente des Tropfkörpers und des Oxydationsbettes be- kleidet, zunachst vergleichbar ist mit einer für einen auxanographischen Versuch be- stimmte Versuchsplatte. Auch in jener Schleimschicht wird Bedürfnis an allerlei Nahrungsstoffen existieren; auch dar in wird also eine Phase der Absorption mit einer solchen des Wachstums abwechseln können und mussen, wenn auch die Tren- nung beider Perioden, besonders in den Tropfkörpern, nur eine unvoUstandige ist und die sehr komplizierte mikrobiologische Zusammensetzung der Schleimschicht gewisse Verwicklungen mit sich bringt, welche für die Auxanogramme fehlen. So- viel steht also fest, daB alle theoretischen Betrachtungen bezüglich der biologischen Reinigungsprozesse mit der hier beschriebenen Absorptionserscheinung zu rechnen haben. Obschon die Absorption zu einem sehr hohen Grade der Erschöpfung an assi- milierbarer Substanz führt, handelt es sich doch nicht um einen absoluten Verbrauch, w^ie schon oben gesagt wurde, und auch aus dem zweiten Kurvendiagramm hervor- geht. Ein kleiner Teil der dargebotenen Substanz wird also von den Mikroben aus den Lösungen nicht eher aufgenommen, als wenn die Verdünnung sich dem Un- endlichen nahert. Dieses geschieht bei der auxanographischen Methode am Randc der Diffusionsfelder natürlich von selbst, und nach einiger Zeit lassen die Mikroben der ausgewachsenen Felder überhaupt keine Substanz mehr weiter diffundieren. In den Lösungen ist das jedoch anders, weil darin keine Mikroben vorkommen können, welche durchaus noch nicht mit dem zu absorbierenden Stoffe in Kontakt gewesen sind. Wie sich diese Verhaltnisse in den Schleimschichten auf den Elementen der Kontinufilter und Kontaktkörper der biologischen Reinigungsverfahren ausgestalten werden, wird abhangig sein von der Dicke jener Schleimschicht und von der Zeit, welche man dieser Schicht laBt, sich vollzusaugen. Aus dem Vorhergehenden ergibt sich von selbst, daB kurze Kontakt- oder Absorptionszeiten und lange Oxydations- zeiten dabei rationell sind. Structure of the starch-grain. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol. XIV, 1912, p. 1107 — iiio. — Verscheen onder den titel »De bouw der zet- meelkorrel« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Deel XX, 1912, blz. 1252— 1256. If one gram of potato-starch is boiled vi^ith 100 cM' of distilled water this is just sufficiënt to bring the grains to their maximum of swelling and make the starch take up about 70% of the water so that it remains suspended and cannot precipitate, as the swollen grains touch one another. Each grain swells thereby to a somewhat irregular globulewhose diameter is about 3.5times that bef ore the ebullition. Whether the boiling lasts shorter or longer is of no consequence. If more water is used for the boiling no further swelling takes place; when left to sedimentation the liquid above the starch colours but feebly blue with iodine. When a microscopic preparation is made, containing but few starch-grains, and a strong tannin solution flows sideways under the cover-glass, the following is seen (compare the figure). At the moment the tannin comes into contact with them, the grains, which at firstsightseemhomogeneous,show a very distinct membrane through which the tannin easily diffuses to the inside where it directly forms a characteristic precipitate. When using a more dilute solution ^) this precipitate consists of little droplets in very lively Brownian movement and with a more concentrated tannin solution, of solid particles, adhering together and filling up the whole inner space of the vesicle. This experiment is so simple and convincing that it cannot be doubted for a moment but the boiled starch-grain consists of a solid, sac-shaped, quite closed wall, containing a liquid. How it is possible that this fact seems unknown I cannot understand, but I have nowhere found it mentioned in the extensive literature about this subject. The liquid in the vesicle is a granulose solution, or as is said at the present day, an amylose solution, containing 0.6 gram of the i gr. originally used, which difïuses but with difïicultly through the walls into the surrounding water. If, however, the boiled starch is rubbed fine with sand the delicate sacs burst and the granulose solution diffuses in the water, which then becomes intensely blue with iodine. That the wall consists of a very soft substance may be observed as well by its great variability of shape at pressure, as by the ease with which it is distended to short threads by moving the cover-glass, to which it adheres, when touched by it. *) Very much diluted tannin solutions give no precipitate at all with starch or granulose solutions. When the boiled starch-grains are washed out during some days with water constantly renewed, it is possible finally to obtain the vesicles without their contents and fiUed with water only; after drying they weigh 0.4 gr. if one gr, of starch has been used. With iodine they colour lighter than the granulose and somewhat violet. When preserved they become partly soluble in water containing chloroform. By leuko- diastase they are easily converted into maltose and dextrine, quite like granulose; by erythrodiastase a little less easily, but a marked difference does not exist^). Explanation of the figure. Magnified 200 times. Potato-starch after prolonged boiling and treatment with a tannin solution. The grains are by the boiling changed into little vesicles with dissolved contents. The wall of the vesicles consists of amylocellulose (amylopectose), the contents of granulose (amylose), the latter being precipitated by the tannin. If the boiling is efïected not in distilled but in canal water, the starch shows a strong disposition to precipitate whereby after 24 hours a layer results of ^U to ^/4 of the whole volume if again 1% starch is used. If 4% starch or more is boiled in canal water no sedimentation at all occurs, the swoUen grains again touching one another. The precipitation may be caused in the starch boiled with distilled water by addition of dilute Solutions of salts, acids, or alkalies. At 0,001 % a slight con- ') By leukodiastase I understand the slowly diflfusing diastase secreted by the germs of germinated corn-grains, which on starch-gelatin plates, when treated with iodine, produces diffusion fields which remain uncoloured. By erythrodiastase the more quickly diffusing diastase of the endosperm of the grain, which on the said plates after treating with iodine, is recognisible by the erythrodextrine reaction. Wijsman (De diastase beschouwd als mengsel van maltase en dextrinase, Amsterdam, 1889) called leukodia- stase »dextrinase« and erythrodiastase »maltase«, but these terms are not well chosen. 23 traction of the vesicles is already visible and it reaches its maximum at abouto,i%i). With still stronger concentrations an accrease in thickness of the precipitated layer is observed, probably because the vesicles then lose somewhat of their weight in the heavier liquid^). As non-electrolytes such as cane sugar, urea, aethylalcohol, and methylalcohol, even in i% solutions, cause no sedimentation at all, it is evident that we have to deal here with an ionreaction, which perhaps will prove to be very well apt for exact measure. Aethylalcohol of 5% and methylalcohol of 6%, hovv^ever, distinctly bring the vesicles to precipitation, but then the superstanding liquid becomes rather turbid, the dissolved granulose precipitating also. Above 10% methylalcohol the precipitation is complete. If the starch is boiled in dilute salt solutions, the volume of the sediment after standing is as large as if the salt had been added later to the starch boiled in distilled water. When the sedimentation is caused by ammonium sulphate it is easy to show that as well the ammonium as the sulphuric ion are present in stronger concentration in the precipitate than in the liquid above it. The foregoing is quite in accordance with the results of an investigation of Mme Z. G a t i n - G r u z e w s k a '). By extraction of starch with dilute caustic soda she obtained a soluble substance, amylose, and an insoluble rest of amylopectose in about the same proportion as the above (0.6 and 0.4). Her view, however, of the localisation of the two constituents is another than that which follows from my observations. She says that amylopectose forms little scales or sacs, evidently corresponding with the layers of the starch-grain, so that this constituent would occur as well within as outside the grain, whilst, according to my experience, the whole inner portion dissolves in boiling water and is homogeneous, the outerwall only being insoluble and thus materially dififerent. The words » amylose « and » amylopectose « have first been used by L. Maquenne and E. Roux'*^), but they consider both these substances as perfectly mixed and say : »L'empoix d'amidon est constitué par une solution parfaite d'amylose, épaissie par ramylopectose« (1, c. pag. 219). That Maquenne, even after the communication of Mme. Gatin-Gru- z e w s k a, had by no means the view here given follows from the observations which he adds to the said communication ■'). The change of the terms »amylocellulose« and »granulose«, so long existing in the literature, into »amylopectose« and »amylose« by Maquenne, seems not necessary. *) No great difiference in the thickness of the precipitated layer (ca. 4 cm. from a liquid layer of 17 cM.) was perceptible after 24 hours at room temperature when using 0,1 »/o K2HPO4, KCl, Na Cl, (NH4)2 SO4, CaCh, Al. Cis, K NO3, HCl, or NasCOi. *) More dilute solutions of sugar and urea do cause some sedimentation for a not yet explained reason. Stronger solutions do the same perhaps because of contamination by electrolytes. *) Comptes Rendus T. 146 p. S40, 1908. *) Recherches sur l'amidon et la saccharification diastasique. Ann. d. Chimie et de Physique, 8e Série. T. 9, pag. 179, 1906. *) Observation sur la Note de Mme Gatin-Gruzewska. Comptes Rendus T. 106, p. 542, 1908. 24 The difference between the walls and the contents of the starch-grain probably reposes on incrustation. We have namely to think the surface of the grain as con- sisting of the albuminous matter of the amyloplast mixed with the secreted granulose by which the thus formed mixture has become insoluble in boiling water, This would be in accordance with the general observation, that incrusting substances highly alter the solubility of bodies susceptible of imbibition, of which the lignified and suberified cell-walls of plant cells and tanned leather are good examples. This con- ception would lead to the conclusion that the amyloplast does originally incrust the membrane of the starch-grain, but later draws back from it, wherewith the change of amylocellulose (amylopectose) into granulose (amylose) would correspond. If this view is right the quantity of albuminous matter, which occurs in the membrane, must be very small, for in the rate of nitrogen no distinct difference between amylocellulose (amylopectose) and starch could be found, in both cases it being about 5 milligrams per 100 grams of dry matter. Maquenne says that his amylopectose is not coloured by iodine ; the amylo- cellulose (amylopectose) obtained from starch after extraction of the granulose (amylose) in the manner here described, proves to colour violet blue with it. It is not impossible that in this case, too, a kind of incrustation should occur, namely of an adsorption of granulose in the amylocellulose wall, which then itself would in pure condition remain uncoloured by iodine. All other species of starch examined by me behave in the same way as potato- starch. Mutation bei Mikroben'\ Folia Mikrobiologica, Delft, I. Jahrgang, 1912, S. 1—97. Bei früheren Gelegenheiten 2) habe ich für die hier zu besprechenden Variabili- tatserscheinungen bei den Mikroben das Wort »Variation« und für 'das Pro- dukt das Wort »Variant« verwendet. Bei der Beschreibung der Entstehung asporo- generHefen aus den sporenerzeugenden Arten gebrauchte ich denAusdruck »Keimes- variabilitat« '). Seitdem ist es mehr und mehr üblich geworden, Variationen, welche stossweise entstehen und Produkte mit erblicher Konstanz erzeugen, Mutationen zu rennen, ohne zu fragen nach deren klassifikatorischem Wert. Dieses ist in Überein- stimmung mit der Bedeutung, welche Hugo de Vries, in seinem interessanten, an wertvollen Tatsachen so reichen Buche »Die Mutationstheorie«, diesem Ausdruck zuerkannt ha't, indem er darunter nicht nur verstand, was er »Elementararten« nannte, welche Bezeichnung ungefahr mit den »Kleinarten« der Literatur zusammenfallt, sondern auch die Knospenvariationen und andere auf vegetativem Wege entstandene ahnliche Bildungen. Aus praktischen Rücksichten lasse ich hier meine früheren Be- zeichnungen fallen und schliesse mich dem Gebrauche des Wortes Mutation an. Wir werden sehen, dass darin verschiedene Begriffe zusammengefasst sind, welche jedoch bei den Mikroben nicht getrennt werden können. Kapitel I. Allgemeine Betrachtungen. I. Die Formen der Variabilitdt. Die Verschiedenheiten zwischen den Nachkommen derselben Mikrobenart können beruhen: erstens auf Modiükation; zweitens auf Fluktuation; drittens auf Mutation, wozu, bei den sexuell differenzierten Organismen noch als vierte Form der Variabili- *) Nach einem Vortrag gehalten in der Ersten Sitzung der Niederlandischen Ver- einigung für Mikrobiologie am 11"" November 191 1 zu Delft. -) Handelingen van het Natuur- en Geneeskundig Congres te Amsterdam, April 1895, Verslag d. Akad. v. Wetenschappen Amsterdam, 21 November 1900. Recueil des travaux botaniques Néerlandaises, T. i. pag. 14, 1905, Versl. d. Akad. v. Wetensch. Amsterdam, 9 Febr. 1910. ') Regeneration der Sporenbildung bei Alkohoh Itefen, Cenralbl. f. Bakteriologie 2te Abt. Bd. 4. d. 657, 1898. Archives Néerl. Sér. 2, T. 2, p. 269, 1899. 26 tiit die Kombination kommt, welche letztere Bezeichnung von B a u e r eingeführt wurde^). Von den Produkten dieser Vorgange sind die Modifikationen nicht erblich oder nur erblich wahrend weniger Zellgenerationen bei anderen Lebensbedingungen als denj enigen, wobei sie entstehen ; wohl erblich und zwar wahrend unbegrenzter Zahlen von Zellgenerationen sind die Fluktuationen, die Alutationen und die Kom- binationen. Auf Modifikation beruht die bei der fliessenden Ontogenese zustandekommende Difïerenzierung, wobei gewöhnlich innere, seltener aussere Bedingungen die Ver- anderung beherrschen, und sobald diese Bedingungen selbst verandern, geschieht das- selbe mit ihrem Produkt. Bei der Fluktuation entsteht die erbliche Veriinderung unter dem Einfluss der Aussenbedingungen derweise, dass alle oder bei weitem die meisten Individuen eines daran unterworfenen Stammes eine gleiche Veranderung erfahren. Bei vielen Arten sind Fluktuationen von dieser Natur überhaupt nicht bekannt. Haecker sagt darüber Folgendes^): »Dass auch die continuierlichen Varia- tionen durch die spezielle Lebenslage hervorgerufen werden können und dass dieses für die sogenannten Standortsmodifikationen gesichert ist, wird allgemein anerkannt, und durch die Versuche K a m m e r e r's und W o 1 1 e r e c k's ist neuerdings gezeigt worden, dass durch kontinuierliche Lebensbedingungen hervorgerufene Verschiebun- gen erblich fixiert werden können, derart, dass auch bei Zurückversetzung in die ursprüngliche Lebenslage die Nachkommen zunachst den neugewonnenen Typus bei- behalten«. Mehrere auf Mikroben Bezug habende Beispiele von Fluktuationen giebt H. Pringsheim^), tier die Tatsachen, woraus er seine Folgerungen ableitet, über- sichtlich zusammengestellt hat. An dieser Stelle wird von den Fluktuationen nur eine Erscheinungsform kurz besprochen werden, namlich die Degeneration. In Bezug auf alle zu den Fluktuationen gehörigen Variabilitatserscheinungen muss bemerkt werden, dass es unrichtig ist, dieselben als »kontinuierlich« zu be- zeichnen: sie finden ebenso wohl stossweise statt, wie die Mutationen, doch sind die Sprünge kleiner und machen dadurch den Eindruck des Fliessenden, und, wenn sie sich in derselben Richtung wiederholen, des Kumulativen. Das Diskontinuierliche oder Sprunghafte ist dabei gewissermaassen eine Notwendigkeit, welche sich aus dem Prozesse der Zellteilung ergiebt. Hat eine Zelle eine neue Eigenschaft erworben, gleichgültig wie, so wird diese, wenn erblich, bei der Teilung unverandert übertragen, und die neue Eigenschaft muss natürlich irgend einen Betrag haben, welcher eine sprungweise Verschiedenheit zwischen Mutter- und Tochterzellen bedingt. Bei der Mutation spielen die Aussenbedingungen eine mehr untergeordnete Rolle wahrend die in relativ wenigen Individuen eines Stammes realisierten Innen- bedingungen Hauptfaktoren der Veranderung sind. Dennoch ist für mehrere Mi- krobenmutationen sicher nachgewiesen, dass ein von aussen kommender Reiz not- wendig ist, um die Mutation auszulösen. Ein kumulativer Erfolg des Vorganges ist im Falie der sekundaren Mutanten bei der Octosporusheie unabweisbar. Daraus geht ') Bauer, Experimentelle Vererbungslehre, S. 184, 1911. -) AUgemeine Vererbungslehre, pag. 292, 1911. ') Die Variabilitat niederer Organismen. Berlin 1910. I 27 aber hervor, dass auch in dieser Beziehung eine scharfe Grenze zwischen Fluktuatiou und Mutation nicht besteht. Obschon man auf Grund der Existenz der Anpassungen geneigt sein kann, den Fluktuationen die grössere Bedeutung für die Ausbildung des Hauptstammes der organischen Welt zuzuerkennen und die Mutation mehr als Ursache der Entstehung der Seitenzweige zu betrachten, können, bei dem gegenwiirtigen Stand der Wissen- schaft, solche Spekulationen als nutzlos bei Seite bleiben. Fluktuationen und Mutationen werden beobachtet sowohl bei normalen Ernah- rungsbedingungen wie infolge chemischer Reize und schwacher Giftwirkung; hier werden nur die bei normaler Ernahrung auftretenden Mutationen naher besprochen werden. Die Kombinationen bleiben an dieser Stelle ganzlich ausser Betrachtung. 2. Der Mutationsvor gang im Allgemeinen. Das eigentümliche einer Mutation besteht darin, dass man in einem reinkulti- vierten Mikrobenstamm, bei einigermaassen umfangreicher erneuter Aussaat einzelne Koloniën findet, welche durch ein abweichendes Merkmal sich von der überwiegenden Mehrheit der normal gebliebenen deutlich unterscheiden, so dass auf den ersten Bliek der Verdacht einer Infektion vorliegen kann. Dieser Verdacht muss jedoch dem Umstande weichen, dass die neue Form in allen übrigen Merkmalen mit der Haupt- form übereinstimmt und immer und immer in mit allen Kantelen gemachten Aus- saaten aufs Neue hervortritt. Dieses wiederholte Auftreten derselben Mutante war die Ursache, warum ich lange gezögert habe, die Mikrobenmutanten mit denjenigen der Pflanzen und Tiere zu identifizieren. Gegenwartig liegen jedoch auch schon Erfahrungen vor bezüglich der wiederholten Entstehung derselben Mutante bei Pflanzen, was, zusammen mit an- deren Erwagungen diese Schwierigkeit beseitigt hat. Eigentümlich bei der Mutation ist ferner das Auftreten der Neubildung, ohne dass dabei von Zwischenformen zwischen der Mutante und der Hauptform deutliche Anzeigen nachweisbar sind. Dieses ist besonders klar bei mutierenden Schimmel- kolonien, welche durch »Sektormutation« verandert sind und worin man, an der Ent- stehungsstelle der »Sektormutante« den plötzlichen Übergang sehen kann. Inzwischen ist es immer noch eine offene Frage, ob die Aussaat der Zeilen, welche eben an der »Wurzel« einer Mutante liegen, doch nicht einzelne Mittelstufen erzeugen würden. Für diese Untersuchung dürfte Actinomyces (Streptothrix) annulatus, welche leicht das Vermogen der »Ringbildung« ^) in scharf begrenzten Sektoren verliert, beson- ders geeignet sein. Bei der Aussaat der Sporen der in Fig. 2 abgebildeten Mutante dieser Art entsteht eine Form ohne die im Stamme Fig. i so deutliche Ringbildung. Doch ist es möglich, dass in einer frisch mutierten Kultur, von der Gestalt von Fig. 2, im Centrum einzelne Mycelpartieen sich vorfinden, aus weichen Individuen mit intermediaren Eigenschaften hervorgehen könnten. Eine andere Bemerkung, zu welcher die Mutation veranlasst, besteht darin, dass eine und dieselbe Art eine Reihe von verschiedenen Mutanten erzeugen kann, wor- runter es einige giebt, welche sehr oft, andere, welche viel seltener entstehen. *) Die Ringbildung ist hier nicht, wie bei so vielen Schimmelarten, eine durch Licht verursachte Erscheinung, sondern beruht auf den Ernahrungsbedingungen. 28 Es wird dadurch sicher, dass wir nur in umfangreichen Aussaaten genügend Chance haben, um auch die letzteren aufzufinden, und weiter, dass es sehr unwahr- scheinlich ist, dass wir alle Mutanten, welche eine bestimmte Art überhaupt erzeugen kann, auch wirklich kennen. Ob es sich bei den Mutanten um wahrhaft Neues, m. a. W. um einen phylogene- tischen Fortschritt, oder nur um Atavismus, oder um den Verlust, oder um die starkere Ausbildung irgend eines bereits bestehenden Merkmals handelt, bleibt zwar für die allgemeine Bezeichnung gleichgültig, doch muss ich schon hier hervorheben, dass ein unzweifelbarer Fortschritt sich bisher ebenso wenig bei den höheren kulti- vierteren Tieren und Kulturpflanzen, wie bei den Mikroben einwandsfrei hat nach- weisen lassen. Dass bisweilen bei den Mikrobenmutanten ein Charakter hervortreten kann, welcher bei der Stammrasse sicher nicht existierte, werden wir z. B. bei Bacülus prodigiosus viscosus, das heisst bei der Schleimform von Bacillus prodigiosus sehen, wobei es jedoch unentschieden bleiben muss, ob das neue Merkmal »Vermögen zur Schleimbildung« nicht schon bei entfernten Vorfahren bestand, so dass das Her- vortreten davon, obschon der direkte Nachweis nicht vorliegt, dennoch als Atavismus aufzufassen ware. Vorlaufig muss es als wahrscheinlich betrachtet werden, dass die Mutanten keine neuen Glieder des Hauptstammes der sich in phylogenetischem Sinne entwickelnden Organismenwelt sind, sondern nur das schon Dagewesene oder besser gesagt, das schon in der Anlage Vorhandene reprasentieren. Die Wörter »Variation«, »Variieren« und »Variant« werde ich für Verander- lichkeit im allgemeinen verwenden. Dass es wirklich eine Fluktuation, eine Verander- lichkeit giebt, welche ganzlich von der Mutabilitat verschieden ist, lehren uns, um das am besten bekannte Beispiel zu wahlen, die bei so vielen Mikroben vorkommenden Degenerationserscheinungen, welche sich über alle Individuen einer Kultur ausdehnen und sich eben dadurch von den Mutationen unterscheiden, die immer nur bei verein- zelten Individuen eines Kulturstammes vorkommen, der in allen übrigen Individuen unverandert bleibt. Oberflachlich machen die Mutanten also mehr den Eindruck als durch innere, die degenerierten Formen als durch aussere Beeinflussung hervorge- rufen. Wahrend die Vererbungslehre in den letzteren Jahren unter dem Einfluss der wieder entdeckten Mende l'schen Gesetze grosse Fortschritte gemacht hat, kann dasselbe nicht gesagt werden bezüglich unserer Kenntniss von den Ursachen der Variabilitat. Zwar sind bei den höheren Organismen die Spaltungen, welche nach der Hybridisation in der zweiten und in den folgenden Generationen auftreten und früher als »regellose Variationen« aufgefasst wurden, unter dem Einfluss der neueren Einsichten über die Vererbungsfaktoren in einem besonderen Kapitel der Variabili- tatslehre untergebracht, und von Bauer in seinem schonen Buche »Einführung in die experimentelle Vererbungslehre«, mit Recht als Kombinationen bezeichnet, doch war schon langst die Einsicht durchgedrungen, dass Sexualitat und Hybridismus keine direkten Variabilitatsursachen sind^), sondern direkt nur zu neuen Kombi- *) Um nicht missverstanden zu werden, wünsche ich hier noch zu bemerken, dass die eigentliche Bedeutung der Sexualitat oder, genauer, der Amphimixis, eben die ist, dass sie die Variabilitat auf indirektem Wege fördert, ahnlich wie dieses durch gunstige Ernahrungsbedingungen geschieht. Die Vermehrung des Protoplasmas der Keimzelle, welche mit einer anderen Zelle verschmilzt ist, denn auch vielfach mit der Vermehrung 29 nationen des schon Daseienden führen, wodurch scheinbar neue Fornien entstehen können, welche schon von der zweiten Generation heran konstant sind oder dieses in spateren Generationen werden, je nach den in Bezug kommenden Arten^). Nene Genen werden dabei jedoch nicht gebildet. Für das Studium der sexuell differenzierten Organismen ist die Aufklarung auf diesem Gebiete der »regellosen Variation« natürlich von hervorragender Bedeutung, für die meisten Mikroben dagegen, wo eben die Sexualitat fehlt, liegen die Sachen natürlich ganz anders. Anderseits kann nicht übersehen werden, dass dieEinheitlichkeit des Natürlichen Systems uns nötigt gleichartige Gesetze bezüglich der Variabilitat in allen Abteilungen desselben vorauszusetzen, und wenn wir auch bei vielen Bakterien nicht von einer haploden und diploden Generation sprechen können, weil der Zellkern zu fehlen scheint, so sind doch die dabei zur Beobachtung kommenden Variabilitatserscheinun- gen nicht deutlich verschieden von denjenigen, welche z. B. bei der Octosporushtit vorkommen, wo wir genötigt sind, Karyogamie verbunden mit Reduktionsteilung anzunehmen. Wenn hier von der »Einheitlichkeit des Natürlichen Systems« gesprochenwird, so soll damit nicht gemeint werden, dass es nötig ist, eine gleiche Bedeutung des Art- begriffes in allen Abteilungen desselben anzuerkennen., Denn es ist klar, dass das Fehlen der Sexualitat bei den meisten Pilzen und vielen anderen Mikroben, selbst geringe Verschiedenheiten, welche bei freier Kreuzung verloren gehen würden, zu konstant vererbbaren Merkmalen erheben kann, worin offenbar eine Ursache gelegen ist, warum es eine so gewaltige Menge von Arten eben bei den Pilzen und Mikroben giebt, Arten, welche wohl besser mit den »Kleinarten« der höheren Pflanzen zu ver- gleichen sind, wie mit den L i n n é'schen »Grossarten«. Von Homo und Heterozygoten und von Bastardanalyse kann natürlich nur allein bei den sexuell differenzierten Mikroben, wie die Infusorien, die Phycomyceten und die niederen Algen, wie die Chlamydomonaden, die Rede sein. Hier muss jedoch bemerkt werden, dass Vieles, was als Copulation zvveier Zeilen beschrieben worden ist, ebensogut erklart werden kann als beginnende Teilung einer einzigen Zelle. Für viele Falie sogenannter Sexualitat muss die Entscheidung also noch gebracht werden, üb tatsachlich Zellcopulation vorliegt oder ob dabei nur an noch nicht vollendete Zellteilung zu denken ist. Dieses gilt jedoch nicht für die Bakterien, welche sicher asexuell sind. Durch das Fehlen der Sexualitat geht zwar, wie schon betont, das wichtige Hilfsmittel der Bastardanalyse bei der Untersuchung der Mikroben verloren. Ander- seits eignen dieselben sich jedoch viel besser wie die Pflanzen und Tiere für experi- mentelle Eingriffe in die Lebensbedingungen, weil die Letzteren ein für uns schwer erreichbares inneres Ernahrungsmedium besitzen. Wir können deshalb boffen, dass wenigstens in dieser Beziehung eben von den asexuellen Mikroben am ehesten neues Licht bezüglich der Variabilitatsvorgange im AUgemeinen zu erwarten ist. Dass es desselben mfolge Wachstum verglichen. Diese indirekte Beeinflussung hat jedoch nichts zu schaffen mit der hier genannten Neubildung durch Kombination. *) Ros en. Die Entstehung der elementaren Arten von Erophila verna. Cohn's Beitr. z. Biol. d. Pflanzen. Bd. lo. Heft 3,5. 406, 1911. Bau er 's Kritik dieser Arbeit (Zeitschr. f. ind. Abstammungslehre, Heft i, 1912), schliesse ich mich an. 30 in letzterer Instanz die Aussenbedingungen und besonders die Ernahrungsbedingungen sein mussen, welche die Mutationen auslösen und auch alle anderen Variabilitats- erscheinungen beherrschen, kann nicht bezweifelt werden, denn Mutation und Varia- bilitat überhaupt sind Funktionen des Wachstums, und das Wachstum wird natürlich beherrscht durch die Ernahrung. Dabei kommt dann der weitere Umstand, dass Temperaturen, welche dem Optimum des Wachstums naheliegen, für das Zustande- kommen der Mutationen gunstig sind, wahrscheinlich weil bei grosser Schnelligkeit des Wachstums am leichtesten Störungen im normalen Entwickelungsprocesse der Zelle eintreten. 3. Sekunddrkolonien. Ein wichtiger Umstand, welcher bei Variabilitatsuntersuchungen vielfach als Leitfaden dienen kann, besteht darin, dass die als Mutanten in den Koloniën vieler Mikrobenauftretenden neuenFormen mehrere.bisweilen selbst sehr zahlreicheZelltei- lungen erfahren und so direkt sichtbar werden alsSekundarkolonien. In einigenFallen istdieseErscheinungsoauffallend,dass man sofort dieÜberzeugung bekommt, esmüsse die Mutante bessere Entwickelungsbedingungen vorfinden, wie die Hauptform, wo- durch sie sozusagen eine neue Kolonie in der alten bilden kann. Das ist z. B. mit grosser Klarheit der Fall bei der Octosporushtle., wo die vegetative Asporus-j sowie die Oligosporusmutanten ziemlich grosse, etwas braunliche Koloniën erzeugen (Taf. I. Fig. 3), welche sich scharf von der schneeweissen, nicht variierten Sporenmasse der Hauptform abheben. Ahnliches wird bei vielen Bakterien beobachtet, jedoch nur unter Umstanden, welche bisweilen klar, in anderen Fallen nicht völlig aufgeklart sind, so dass es sein kann, dass man in bestimmten Kuituren von ein und derselben Art solche Sekundarkolonien leicht erkennt, oder dieselben auch gar nicht auffinden kann. Letzteres kann die Folge des Umstandes sein, dass die Mutanten, welche den Sekundarkolonien Dasein geben, im einen Falie früher, in einem anderen Falie spater entstehen, und wenn das Entstehen so spat stattfindet, dass die Ernahrungsbedingun- gen nur ausreichen für sehr wenige Teilungen, so kann es sein, dass dadurch keine sichtbareFolgen, also keine Sekundarkolonien bemerkbar werden. In diesem Falie kann man jedoch die etwa gebildete Mutante finden, wenn man demj enigen Teil des Kultur- materiales, worin dieselbe gelegen ist, durch eine gewöhnliche Kolonienaussaat Ge- legenheit giebt sich zu Koloniën zu entwickeln, welche dann frei zu liegen kommen, wodurch die mutierten und nicht mutierten Keime sichtbar werden. Eine gute Demon- stration des hier Gesagten findet man z. B. bei der farblosen Mutante von Bacillus prodigiosus, welche durch Atavismus in die gefarbte Hauptform zurückschlagt. Da- bei kann es vorkommen, dass man in den zunachst ganz gleichmassig farblos er- scheinenden Kuituren, bei genauer Betrachtung rosa gefarbte Pünktchen oder farblose Erhebungen aufïindet ; diese ergeben sich bei neuer Aussaat als aus der roten Haupt- form bestehend. Es kann aber auch sein, dass man von solchen Sekundarkolonien gar nichts sehen kann und, dass dennoch bei einer umfangreichen Aussaat des schein- bar gleichartigen, farblosen Materiales sich vereinzelte rote Koloniën zwischen den zahlreichen unveranderten entwickeln. Es muss hier besonderer Nachdruck auf das Wort »umfangreich« gelegt werden, denn es steht fest, dass die Mutanten immer Seltenheiten sind und dass dieselben z. B. in unseren in Eprouvetten gehaltenen 31 Stammkulturen auf festen Kulturböden sehr zerstreut und in ganz geringer Zahl vorkommen. Hat man dann gar keine Anweisung bezüglich der Stelle in der Stamm- kultur, WO sie sich finden, so ist es klar, dass die Chance zu ihrer Entwicklung bei erneuter Aussaat nur dann eine grosse ist, wenn diese Aussaat eine sehr umfangreiche ist, Am besten ware es natürlich, wenn das gesammte zur Verfügung stehende Kultur- material ausgesat werden könnte; selbst dann würde man j edoch noch keineswegs sicher sein, dass etwa vorhandene Mutanten auch wirklich zur Beobachtung kommen soUten, denn bekanntlich bleiben bei unseren Aussaaten beinahe immer sehr viele Keime durch allerlei Ursachen in der Entwicklung zurück und bilden überhaupt keine Koloniën. Aus diesen Erwagungen sieht man, wie wichtig die Frage ist nach der Ursache, wodurch die Sekundarkolonien sichtbar werden. Wahrscheinlich ist diese jedoch für die verschiedenen Arten nicht dieselbe, und es wird für jeden bestimmten Fall notwendig sein durch neue Studiën festzustellen, unter welchen Bedingungen diese Bildung so deutlich wie möglich bemerkbar und für die weitere Untersuchung leicht erreichbar gemacht werden kann. Gewöhnlich ist die Differenz zwischen den Sekundarkolonien und der Hauptform eine sehr betrachtliche. Bei der Indischen Leuchtbakterie fallen dieselben in den alten Kuituren durch die lange Fortdauer ihrer Leuchtkraft auf ; bei der Octosporus- hefe durch das Fehlen von Sporen, oder, wenn diese darin vorkommen, durch deren geringe Anzahl; bei gewissen Varietaten der fluorescierenden Bakterien durch ihre Vegetationskraft, welche diej enigen des Stammes stark übertrifft, was auch für die meisten anderen Falie zutrift't. Welcher innere Zustand für die sich zu Sekundar- kolonien entwickelnden Individuen bezeichnend ist, bleibt vorlaufig unklar. Bei der Octosporushti^ scheint es das Ausbleiben der Karyogamie zu sein. In anderen Fallen durf te jedoch gerade das Umgekehrte zutreffen und eben die Karyogamie der Ent- stehung der Sekundarkolonien zugrunde liegen. Vorlaufig sind diese Betrachtungen aber, wenigstens für die Bakterien, wertlos. 4. Für V ariabilitdtsversuche gunstige und ungünstige Charaktere. Nicht alle Charaktere der Mikroben eignen sich gleich gut für das Studium der Veranderlichkeit. Nicht allein gilt dieses für ihre mikroskopischen Eigenschaften, sondern ebenfalls bezüglich derjenigen ihrer Koloniën. Man denke sich z. B. eine Kulturplatte, worauf nebeneinander viele Koloniën liegen, welche irgend einen Riech- stoff erzeugen, wie z. B. Essigather und, dass der Verdacht vorliegt, dass es da- zwischen vereinzelte giebt, welche bei übrigens gleichen Eigenschaften diesen Stoft" weniger ausgiebig oder überhaupt nicht produzieren. Wie sollen nun diese Letzteren aus dem Gemisch isoliert werden? Oft'enbar dadurch, dass alle Koloniën der Platte in Bearbeitung genommen und jede für sich auf Produktion oder nicht Produktion des Riechstoffes untersucht wird. Bei Virulenzuntersuchungen von Pathogenen müsste Ahnliches geschehen, wobei der Versuch noch viel umfassender ware. Dagegen vereinfacht sich die Sache ganz betrachtlich, wenn man jeder aus einer individuellen Zelle hervorgegangenen Kolonie sofort ansehen kann, ob das im Studium genommene Merkmal dabei konstant ist oder Variabilitat zeigt, wie das z. B. mit dem I.euchtvermögen der Leuchtbakterien, sowie mit der Pigmentbildung in so ausge- zeichnetem Maasse der Fall ist. Auch die Sporenbildung sowie die Glycogenbildung, 32 welche bei einigen Alkoholhefen vermittelst der Jodreaktion in jeder individuellen Kolonie sehr scharf angezeigt werden können, und sich dabei als höchst variable Funktionen herausstellen, mussen zu den besser studierbaren Erscheinungen gerechnet werden und lassen sich, bei gut eingerichteten Versuchen, leicht in Tausenden von Zellgnerationen übersehen. Zwar ist das hier Gesagte nur bezüglich einer relativ kleinen Anzahl von Merkmalen der Fall, weil die meisten zur selben Kategorie wie die Riechstoffe gehören und der Beobachtung an der Einzelzelle oder der Einzel- kolonie schwer zuganglich sind. Sie sind jedoch genügend zahlreich und von solcher Klarheit, dass sie eine gute Grundlage für das weitere Verstandniss zwischen den Mikrobiologen und den Variabilitatsforschern der höheren Organismen werden können. Oft kommt die Natur uns dadurch zu Hilfe, dass bei der Feststellung nicht direkt erkennbarer Merkmale irgend eine morphologische Verschiedenheit, welche ausserlich wahrnehmbar, auch mit den inneren physiologischen correlativ verbun- den ist. Ja, man kann die Behauptung aufstellen, dass niemals physiologische Ver- schiedenheit existiert ohne morphologische; doch sind unsere Beobachtungsmethoden viel zu grob, um das im Allgemeinen erweisen zu können. Wie gross in dieser Rich- tung jedoch die Fortschritte der Wissenschaft sind, haben uns die Erfahrungen ge- zeigt bezüglich der Zahl der Chromosomen in den Zellkernen, sowie die Difïerenzie- rungsmethoden vermittelst der Farbstoft'e auf mikrobiologischem Gebiete. 5. Degeneration. Die Degenerationserscheinungen sind jedem Mikrobiologen zu seinem Schaden wohl bekannt. Sie aussern sich gewöhnlich dadurch, dass langere Zeit aufbewahrte Kuituren mehrere ihrer Eigenschaften zu gleicher Zeit in sehr geschwachtem Zu- stande vererben, oder dieselben selbst ganzlich verlieren, und darunter auch die- jenigen, wodurch sie beim ersten Isolieren unser Interesse erregten. Die Erschei- nung ist eine sehr allgemeine, ebenso verbreitet bei den Saprogenen wie bei den Pathogenen. Bemerkenswert ist, was M i g u 1 a darüber sagt im Vorwort zum 2tenTeile seines Systems der Bakterien. Es heisst dort, »dass von den 600 Kui- turen, die er von verschiedenen Forschern zum Vergleich erhielt, die meisten sich in der langjahrigen Kultur so in ihren kulturellen Eigenschaften verandert batten, dass sie mit den ursprünglichen Beschreibungen nicht im mindesten mehr übereinstimm- ten.« Jeder Mikrobiologe hat ahnliche Erfahrungen. Die grossen Schwierigkeiten, welche daraus für richtiges Determinieren entstehen, sind allbekannt und es wird noch lange dauern, ehe die Wissenschaft diese ernsthafte Schwierigkeit überwun- den hat. Es hat den Anschein als ob beinahe alle Eigenschaften der Mikroben bei dieser Veranderung in Bezug kommen: Beweglichkeit, Dimensionen, Absonderungspro- dukte, Vegetationskraft, Farbungsvermögen, Sporenbildung sind in alten Kultur- stammen vöUig verschieden von dem, was sie beim ersten Auffinden in den Natur- materialien waren. Besonders der Verlust an Vegetationskraft macht viele Stamme für jede weitere Versuchsverwendüng völlig unbrauchbar; sie sind nur wert, weg- geworfen zu werden. Auch die chemischen Leistungen zeigen, neben dem A'erlust an Wachstums- 33 fahigkeit, beim langeren Kultivieren grosse Störungen. Selbst eine übrigens so kon- stante Bakterienart wie B. prodigiosiis nimmt schon nach zweijahriger Kultur einen leichteren Farbenton an wie früher. Hat das Kultivieren dabei fortwahrend im Brut- schrank stattgefunden, so ist auch die Vegetationskraft sehr beeintrachtigt. Für die meisten Stamme von B. violaceus gilt dasselbe, j edoch ist hier die Beeinflussung durch die Kulturbedingungen besonders frühzeitig zu beobachten, sodass schon nach ein- zelnen Wochen die Pigmentbildung bei dieser Art sehr gering wird. Auch die vor kurzem von mir beschriebenen Aromabakterien, welche aus Quercit Pyrogallol er- zeugen, verlieren diese Eigenschaft nach einer langeren Kulturzeit mehr oder weniger. Wie dieser Verlust zu erklaren ist, ist noch nicht deutlich geworden. Es scheint jedoch, dass man demselben ziemlich allgemeïn dadurch vorbeugen kann, dass sehr oft und sehr frühzeitig auf frischen Kulturboden übergeimpft wird. Es hat deshalb den Anschein, als ob sich innerhalb des Mikrobenkörpers in den alteren Kui- turen Absonderungsprodukte bilden, welche nicht mehr beseitigt werden können, deren Bildung in den sehr jung übergeimpften Kuituren jedoch noch nicht stattgefunden hat. Letzteres ist inzwischen nicht als ausnahmslose Regel zu stellen. So scheint in der Fio/oc^Mj'gruppe bei vielen, wenn nicht bei allen Stammen, das Vermogen zur Pigmentbildung unwiderruflich verloren zu gehen, wie das Überimpfen auch statt- finden moge. Offenbar ist hier der richtige Kulturboden noch nicht bekannt. Eine andere Reihe von Erscheinungen, welche zu den Degeuerationen zu rechnen sind, welche aber auch an die Modifikationen erinnen, sind diejenigen Veranderun- gen, welche man bei gewissen Garungsmikroben bemerkt. So z. B. kann bei Sarcina ventriculi, selbst bei den anscheinend günstigsten Wachstumsbedingungen, namlich in peptonisierter Malzwürze bei 37" C, sowohl bei voUkommenem Luftabschluss wie bei partieller Lüftung, ein allmahliches Abnehmen der Garungs- und Wachstums- intensitat nicht verhindert werden. Nicht unwahrscheinlich ist es, dass es sich hier- bei um ein Missverstandnis zwischen Sauerstofïdruck und Concentration der Nahr- stoffe, welches Missverhaltniss allerdings in der Natur sehr allgemein vorkommen kann und auch dort zum Aussterben der bezüglichen Stamme veranlassen muss. In der Natur werden jedoch immer Stellen gefunden werden, wo sich Keime unter in jeder Beziehung günstigen Bedingungen vorfinden. Und diese werden überleben, die Art existenzfahig erhalten und sich in unseren Kuituren wieder normal entwickeln. Das sehr eigentümliche Verhalten vieler Anaëroben dem Sauerstoff gegenüber, kann sich noch auf eine andere Weise aussern, namlich dadurch, dass der Kontakt mit diesem Elemente bei vollem Atmospharendruck dafür tödlich wird, für so weit es sich handelt um krjiftig wachsende anaërobe Kuituren. Pasteur hat dieses erwahnt für ein von ihm beschriebenes Buttersaureferment. Viel leichter ist dasselbe Verhal- ten bei Sarcina ventriculi zu beobachten, worüber ich vor einiger Zeit Naheres mit- geteilt habe^). Auch hier zeigt sich, dass die Garung und das Wachstum bei den überimpfungen nur dann weitergehen können, wenn diese derweise stattfinden, dass selbst ein vorübergehender Kontakt mit der Luft ausgeschlossen ist. Dieses ist aber um so auffallender, weil andere Mikroben, z. B. die Fermente der Butylalkohol- garung, sehr gut eine kurze Aëration vertragen und es auch feststeht, dass an einer der natürlichen Fundstellen, sowohl von den Buttersaurefermenten, wie von den Sar- *) Proceedings Academy of Sciences Amsterdam, 26 May 191 1. M. W. Keijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 3 34 cinen^), namlich Gartenerde, in sehr verschiedener Schichttiefe, sicher der Luft- sauerstoff leicht durchdringen kann. Es ist deshalb ebenfalls sicher, dass die gleichen Mikroben in zwei, dem Sauerstoff gegenüber ganzlich verschiedenen Stimmungen vorkommen können: in der Gartenerde in einer für den Druck dieses Gases wenig empfindlichen, in den aktiven Garungen dagegen in einer dafür so empfindlichen Stimmung, dass der Sauerstoff als ein intensives Gift betrachtet werden muss. Dieses Beispiel ist geeignet urn zu beweisen, dass die Mikroben in ihren Natur- verhaltnissen sich ganzlich anders betragen können, wie in unseren Kuituren, und es kann nicht genug darauf gewiesen werden, wie es bei jedem mikrobiologischen Ver- suche mit Naturmaterialien absolut notwendig ist, diesen Umstand scharf ins Auge zu fassen. 6. Modifikation. Wenn Mikroben beim Wachsen bei bestimmten Bedingungen konstant eine an- dere Eigenschaft zeigen, wie bei anderen Bedingungen, so wird von Modifikation ge- sprochen. So beobachte ich bei einem Colistamme die folgende nur wahrend einiger wenigen Zellgenerationen erbliche und dann verschwindende Ernahrungsmodifikation. Bei elektiven Kulturversuchen zur Gewinnung von Buttersaurefermenten Granulo- hacter saccharohutyricum) in Starke-Chlorammonlösungen bei Luftabschluss fïndet man gewöhnlich nebenbei Coli und AërogenesSiammt, welche ein stark anaërobes Wachstum zeigen. Saet man Material einer solchen Garung auf Würzegelatine- platten aus, so findet man bisweilen, dass alle entwickelnden Coli-Kolonien sich mit Jodlösung tief blau farben und zwar durch die Gegenwart von Granulose, so dass man glauben sollte, es könnte sich um eine Granulobakterart handeln. Jedoch schon bei der etsten Überimpfung auf eine neue Würzegelatineplatte geht die Eigenschaft völlig verloren und es resultiert ein Colistamm, der mit Jodlösung sich, wie gewöhnlich, braun farbt. Alle Ernahrungsmodifikationen in dem hier betrachteten Sinne sind ausgezeich- net durch plötzliches Entstehen, wenn unter gewisse Ernahrungsbedingungen ge- bracht, und ebenso plötzliches Verschwinden, wenn diese Bedingungen auf horen. Erb- liche Konstanz ist also nur bei der Fortdauer jener Bedingungen realisiert, doch ist Erblichkeit wahrend einiger Teilungen auch bei abweichenden Bedingungen nicht ausgeschlossen. Für unseren gegenwartigen Zweck, welcher die Entstehung neuer Rassen mit erblicher Konstanz bei den verschiedenartigsten Lebensbedingungen zum Gegenstand hat, haben diese Ernahrungsmodifikationen also nur untergeordnete Be- deutung. *) Was die Erdsarcinen betrifft, muss ich es auf Grund vieler Versuche, welche ich gemeinsam mit meinem früheren Assistenten, Herrn D.C. J. Minkman, ausgeführt habe, als wahrscheinlich betrachten, dass der im Erdboden vorkommende Zustand der Wasserstoflf- oder Magensarcine in Verbindung steht mit der Methansarcine und zwar derweise, dass die Magensarcine sehr leicht als Mutant von der Methansarcine abge- worfen wird, jedoch nicht umgekehrt. Die experimentellen Schwierigkeiten, welche sich dem strengen Beweis dieser Auffassung entgegenstellen, konnten jedoch noch nicht völlig überwunden werden. Sicher ist, dass beide, sowohl Magen- wie Methansarcine, in ihren Garungen höchst empfindiich sind für den Sauerstoff bei semem Normaldruck, welcher die Magensarcine tötet, die Methansarcine zu garen verhindert. 35 Eigentlich ist der Ausdruck »Ernahrungsmodifikation« für den hier festzulegen- den Begrifï zu enge gewahlt, denn auch andere Beeinflussungen können einen gleichen Efïekt haben. So die Warme. Kultiviert man z. B. Bacülus prodigiosus bei Tempera- turen, welche etwas oberhalb 30" C. liegen (die Temperatur muss für verschiedene Naturstamme verschieden gewahlt werden), so stellt sich bekanntlich heraus, dass die Pigmentbildung dabei nicht stattfindet, obschon das Wachstum normal sein kann. Man kann dieses Kultivieren fortsetzen wochenlang, ohne dabei auch nur die ge- ringste Veranderung zu bemerken; lange Seriën von Überimpfungen können auf diese Weise als farblose Bakterien weiter gezüchtet werden. Sobald das Wachstum j edoch wieder bei ca. 20" C. stattfindet, kehrt auf einmal das Vermogen der Farbstoffbildung mit voller Kraft zurück und der ursprüngliche Stamm stellt sich heraus als ganzlich unverandert. Vielleicht ist dieses Beispiel zu gleicher Zeit geeignet, um die Antwort zu geben auf die so oft gestellte und so verschieden beantwortete Frage, ob der Gebrauch oder der Nichtgebrauch eines Organes bei langerer Fortsetzung einen erblichen Erfolg hat. Wir mussen hier namlich als Trager der Eigenschaft der Pigmentbildung einen bestimmten Teil des Protoplasmas betrachten, wofür der Name Chromoplasma ge- eignet ist. Bei der relativ hohen Temperatur bleibt jedoch bei Tausenden aufeinan- der folgenden Generationen die Pigmentbildung aus, das heisst die Funktion des Chromoplasmas ist ausser Gebrauch gestellt. Wir sehen hier aber ganz überzeugend, dass dieser Nichtgebrauch auch nicht die geringste Abanderung in das Chromoplasma zu erzeugen im Stande ist, und kommen auf diese Weise zur Ansicht, dass der Nichtgebrauch an und für sich keine Ursache von Veranderlichkeit sein kann, wenig- stens nicht bei der Zeitdauer unserer gegenwartigen Experimente. Auch Licht- bakterien, welche ein paar Jahre lang in nicht leuchtendem Zustande fortkultiviert waren, zeigten schon bei der ersten Überimpfung unter günstigen Bedingungen so- fort wieder ihre volle Leuchtkraft. Hier ist vielleicht die geeignete Stelle, um auch noch auf die allgemeine Regel hinzuweisen, dass das Aufbewahren der Kuituren in getrocknetem Zustand, oder all- gemeiner unter Bedingungen, wobei kein aktives Leben und keine Vermehrung statt- finden, dievölligeKonstanz derselben sichert, vorausgesetzt, dass der Trocknungsvor- gang selbst nicht Störungen mit sich bringt, welche bei spaterem Wachstum den Ein- druck hervorrufen, das Bewahren habe doch einen Einfluss ausgeübt. So ist es z. B. schwierig B. prodigiosus-YLnXturtn derweise zu trocknen, dass man daraus vöUig kon- stantes Material zurück erhalt, wahrscheinlich weil beim Eintrocknen die Concen- trationsbedingungen gewisser, in der ursprünglichen Kultur gegenwartigen Substan- zen geandert werden, so dass sie, beim spateren Aufweichen, zum Zwecke erneuer- tenWachstums,einige Zeilen derweise angreifen, dass diese bleibende Modifikationen erfahren. Dass diese Erklarung richtig sein kann, geht aus den Versuchen von Wolf ^) hervor, der unter dem Einfluss von Kupferacetat oder Kaliumbichromat, welche er dem Kulturboden von B. prodigiosus einverleibte, solche Veranderungen erzeugt hat. Bei genügender Vorsicht und bei weniger empfindlichen Mikroben findet man jedoch *) F. Wolf, Ueber Modifikationen und experimentell ausgelöste Mutationen bei Bacillus prodigiosus. Zeitschr. für induktive Abstammungs- und Vererbungslehre, Bd. 2, S. 99, 1909. 3* 36 die genannte Regel durchgehends bestatigt. Man kann dieselbe auch in dem noch allgemeineren Satz zusammenf assen: »Ohne Wachstum keine Variabilitat«. 7. Populationen und Associationen. Gegenüber dem Begrifï eines »Mikrobenstammes« oder »reine Linie« kann der- jenige einer »Population« gestellt werden^). Eine Population besteht aus so vielen Stammen als wie es darunter Keime giebt, welche zwar zur selben L i n n é'schen Art gehören, untereinander jedoch irgend eine erbliche Verschiedenheit zeigen. Für un- seren Zweck ist es natürliich von besonderer Wichtigkeit nicht allein mit einem ein- zelnen Stamme, sondern mit mehreren experimentieren zu können. Man kann dafür in manchen Fallen die aus verschiedenen Laboratorien erhaltenen Kuituren verwen- den, vorausgesetzt, dass diese durch unabhangige Isolierungen erhalten sind, und noch nicht der Degeneration anheimfielen. Besonders von saprophytischen Arten kann man sich bekanntlich viele, so oft man will, aus der Natur verschaffen, sobald man nur bekannt ist mit den Kulturbedingungen und vorausgesetzt, dass sie sich durch das Plattenverfahren rein kultivieren lassen, weil sie anders für Variabilitats- versuche unbrauchbar sind. Es giebt zwei Hauptmethoden, welche uns dabei zum Zwecke führen können, namlich das akkumulative oder elektive, und das separative Verfahren. Die akkumulativen Methoden sind zuerst von Pasteur, wenn auch nur in un- vollkommener Weise angewendet und zwar bei Alkoholhefen, Essigbakterien, Milch- saure- und Buttersaurefermenten, wozu er offenbar die Anregung aus der Garungs- industrie erhalten hat. Spater haben Winogradsky und andere dieses Feld weiter bearbeitet, doch bleibt darauf noch sehr viel zu tun übrig. Durch diese Me- thoden ist man in der Lage, aus Materialien die eine bestimmte Mikrobenspezies, sei es auch in sehr geringer Anzahl enthalten, diese Spezies durch die Wahl von nur dafür allein oder dafür besser wie für andere Mikroben geeigneten Kulturbedingun- gen derweise zu vermehren, dass die Nebenbuhler ganzlich oder doch so weit ver- drungen werden, dass die gewünschte Art in reichlicher Anzahl auf der Kulturplatte zur Entwicklung zu bringen ist. Folgendes Beispiel moge dieses erlautern. lm Boden findet sich sehr allgemein verbreitet der bekannte in Fleischbouillon stark fluorescierende Bacillus fluorescens non liquefaciens, und zwar in einer sehr grossen Menge von Stammen, welche voneinander in Bezug auf ihr Oxydationsver- mögen organischer Salze verschieden sind. Um nun die »Population« des Bodens von dieser Bakterienart kennen zu lernen, hauft man dieselbe an in Lösungen verschiede- ner Salze organischer Sauren mit den notwendigen weiteren mineralen Nahrstoft'en. ') Die Worte »Population« und »reine Linie« sind von Johannsen eingeführt in zwei Publikationen: »Erblichkeit in reinen Linien und in Populationen«, Jena, 1903 und >Exacte Erblichkeitslehre«, Jena 1909. Den zweiten Begriff definiert er wie folgt: »Eine reine Linie ist der Inbegriff aller Individuen, welche von einem einzelnen absolut selbst- befruchtenden homozygotischen Individuum abstammen.« Eigentlich sind die »Mikroben- stamme« der Mikrobiologen nicht ganzlich identisch mit diesen reinen Linien, denn sie bestehen, wenigstens bei den Bakterien und vielen Hefen, aus noch naher verwandten Individuen, wie durch das Wort »Homozygoten« angegeben, namlich aus »Azygoten«. 37 Mit der ausserordentlich leicht assimilierbaren Kinasaure als organische Saure, lasst sich z. B. bei 20° C. bis 25" C. eine Population von zwei Non liquefaciens-St'ammtn erhalten, welche daran kenntlich sind, dass sie aus dem Kinat Protocatechusaure erzeugen, welche mit Eisensalzen grünlich-schwarz oder rötlich-schwarz wird, was eine sehr empfindliche Reaktion ist. Wahlt man für den Versuch eine Lö- sung in Leitungswasser von 1% Calciumkinat, 0,05% Kaliumphosphat und 0,05% Chlorammon, worin man als Infektionsmaterial etwas Gartenerde gebracht hat, und zugleich als Indikator eine Spur Ferrichlorid, so wird bei ca. 25" C. die Flüssigkeit bald schwarz und liefert bei Aussaat auf Bouillon, Chinat, Ferricitrat-Agarplatten, die gesammten Formen unserer Art als Koloniën, welche daran kenntlich sind, dass sie in der Mitte von einem dunklen Fleck liegen, welcher sich nach einiger Zeit über die ganze Platte ausdehnt und aus Ferriprotocatechat besteht. Andere Stamme, welche das Kinat nicht oder schwacher angreifen, kann man auf iihnliche Weise erhalten mit Hilfe von Malaten, Tartraten, Laktaten, Acetaten, Malonaten, Glycolaten und mehreren anderen ahnlichenSalzen. Hatte es irgend einen Zweck so würde man durch das Vermischen der verschiedenen Reinkulturen dieser Stamme »Populationen« zusammenstellen können, welche aus vielen Gliedern be- stehen. Dass ihre Gesammtheit einen Einblick giebt in die Zusammensetzung der Population dieser Spezies, so wie dieselbe im Boden vorkommt, ist deutlich. Bei der Untersuchung der beschriebenen Kinatanhaufung, besonders, wenn diese bei 30° C. oder bei noch höherer Temperatur ausgeführt ist, wird man neben der Non liquefaciens-Populait'ion noch eine andere nicht zu derselben Art gehörige Bak- terie antrefïen, namlich Micrococcus chinicus (Bacterium calcoaceticum), welche unter den gleichen Bedingungen leben kann. Die Anhaufung führt in diesem Falie also nicht auf eine einzelne, sondern auf zwei verschiedene Populationen, denn es- stellt sich heraus, dass auch diese letztere Form aus mehreren deutlich verschiedenen Stammen besteht. Man kann in einem solchen Falie sagen, dass man durch die An- haufung eine »Association« erhalten hat, welches Wort der Pflanzengeographie ent- lehnt ist und andeutet, dass mehrere gar nicht verwandte Pflanzenarten unter glei- chen Lebensbedingungen gefunden werden. Obschon solche Associationen für un- seren direkten Zweck nicht in Betracht kommen, war es nötig, auf dieselben zu wei- sen, um die Natur der Populationen scharfer hervortreten zu lassen. Die separativen Kulturmethoden bestehen darin, dass man die zu kultivierende Mikrobenpopulation auf irgend eine Weise schützt gegen die Concurrenz ihrer Ne- benbuhler, dadurch, dass man die letzteren vernichtet oder fernhalt. Wünscht man z. B. sporenerzeugende Bakterien zu kultivieren, so erhitzt man das zu verwendende Kulturmaterial bevor der Ernahrungsversuch beginnt, um die Nichtsporenbilder zu entfernen. Durch »Laktisieren« (erhitzen von infizierten zucker- und peptonhaltigen Flüssigkeiten auf ca. 65" C.) gewinnt man Populationen von verschiedenen Milch- saurefermenten, welche Beispiele leicht mit anderen vermehrt werden können. Das allgemeinste separative Verfahren ist die Koe h'sche Plattenmethode, vor- ausgesetzt, dass dabei die Zusammenstellung der Platte die geeignete ist und die Aussaat auf der Oberflache (und nicht in der Tiefe) der Gelatine oder des Agars stattfindet und die Koloniën sich so weit voneinander entwickeln, dass sie keinen gegenseitigen Einfluss ausüben. Der grosse Vorzug dieses Verfahrens besteht in dem Umstande, dass z. B. auf den Fleischbouillonplatten allerlei Arten zur Entwicklung 38 kommen, die an ganz andere Ernahrungsbedingungen adaptiert sind, und in der freien Concurrenz in flüssiger Bouillon durch andere Arten vollstandig verdrungen werden. Nicht allzuseltene Arten können durch das Plattenverfahren an ihren natür- lichen Standorten entdeckt werden, wenn sie auf den Platten durch spezifische Merk- male erkennbar sind. So gelang es uns mehrfach, sowohl aus Milch wie aus Austern- magen, Rotkleeknöllchen, von verdorbenen Cocosnüssen, von Knochen, Kartoffeln, gekochtem Fleisch, aus Flusswasser und aus Sielwasser zu Delft, Bacillus prodigiosus zu isolieren, wobei jedesmal neue, uns noch nicht bekannte Stamme gefunden wur- den, was beweist, dass die Zusammenstellung der Populationen dieser Art sehr com- pliziert ist. Einige dieser Stamme haben, wie zu erwarten war, schon besondere Artnamen erhalten, wie B. Pleymouthii, B. Kieliensis, welcher letztere von uns aus dem Magen von in Pfützen aufbewahrten Austern zu wiederholten Malen isoliert wurde, und B. Beroliniensis. Es ist kaum zu bezweifeln, dass die verschiedenen Stamme, woraus die Popu- lationen bestehen, als Fluktuanten oder Mutanten entstanden sind aus einer einzigen Form; es muss jedoch hervorgehoben werden, dass der direkte Nachweis davon nur selten gelungen ist und derselbe Zweifel in dieser Beziehung bestehen bleibt, wie bezüglich des Ursprunges der verschiedenen »reinen Linien« bei den oben genannten Versuchen von Johannsen mit Bohnen, wovon allein die Existenz, nicht aber der Ursprung bekannt ist. Um diesen Nachweis zu bringen ist es namlich notwendig, dass die neu aufgefundene Form, einer durch Kultur, also experimenten erhaltenen Mutante oderFluktuante entsprechen sollte, was bisher nur im Falie der Ascococcus- Mutante von Bacillus herbicola beobachtet wurde. Hierbei wurde die Ascococcus- Mutante, welche Form regelmassig in zuckerreichen Nahrlösungen aus der Haupt- form entsteht, auch in der Natur gefunden und zwar in den Gefassen von sereh- krankem Zuckerrohr, sowie in Milch. Die grosse Schwierigkeit, welche das Deter- minieren selbst der gemeinsten Bakterien verursacht, lasst sich natürlich bei solchen Untersuchungen lebhaft fühlen. Diese Betrachtungen über allerdings für bei weitem die meisten Arten noch sehr unvoUstandige Methoden, durch welche die Mikroben erhalten werden, sind hier an- geführt, um die Wichtigkeit zu betonen von der Untersuchung nicht degenerierter Naturstamme für das Studium der Mutation. 8. Die Genentheorie. Weil im weiteren dann und wann von der Genentheorie Verwendung gemacht wird, moge darüber Folgendes bemerkt werden. Die Genen oder Erbeinheiten sind die Trager der sichtbaren Eigenschaften und können am besten als Teile des Protoplasmas oder des Zellkernes gedacht werden. Sie kommen in zwei Zustanden in den Zeilen vor, namlich als aktive Genen, welche die ausserlich wahrnehmbaren Merkmale verursachen, und als schlummernde oder Progenen^), welche den Erscheinungen der Mutabilitat und des Atavismus zu- *) Dieses Wort ist ein Sammelname für einige verschiedene Zustande, worin die latenten Genen vorkommen können, Zustande, welche gegenwartig noch nicht zu trennen sind. 39 grunde liegen, indem sie dabei in aktive Genen übergehen. In gewissen Fallen hat man genügend Ursache anzunehmen, dass die Genen sozusagen als »Protoplasma- Keime« aufgefasst werden können und durch ihre Vermehrung die für die verschie- denen Mikroben eigentümlichen, den verschiedenen Funktionen entsprechenden Protoplasmaarten erzeugen, Hierbei muss also weiter geschlossen werden, dass es so viele Genen und also auch verschiedene Protoplasmaarten in einer Zelle oder einem Mikroben giebt, wie darin voneinander unabhangig erbliche Eigenschaften vorkommen. So muss in Bacillus prodigiosus die rote Farbe abhangig sein von wahrscheinlich vier oder fünf verschiedenen Genen, welche bei ihrer Vermehrung das »Chromo- plasma« hervorbringen, das seinerseits den roten Farbstoff produziert. Dass hierbei mehr wie eine einzige Gene in Betracht kommt, muss geschlossen werden aus dem Umstande, dass die Farbe von B. prodigiosus, wenn man alle die von dieser Bakterie erhaltenen und deutlich unterscheidbaren Farbmutanten in Bezug nimmt, in fünf, und, wenn man auch die ganzlich ungefarbte Mutante dazuzahlt, in sechs Farbnuancen vorkommt. Diese Mutanten sind namlich die folgenden: 12 Bacillus prodigiosus hyalinus, welche die am starksten rot gefarbte Mutante ist *). 1 » » , die Normalform. 2 » » roseus i, welche eine erste Farbabstufung von i ist. 3 » » » 2, welche eine weitere Farbabstufung von i ist. 8 » » auratus, welche die orangefarbige Mutante von i ist. II » » alhus welche die farblose Mutante von i ist. Es ist sehr wohl möglich, dass es noch andere Abstufungen der Farbe giebt, welche in anderen erblich stabilen Roseus-MntSinttn vorkommen, was auf die Exi- stenz noch mehrerer der Farbe bedingender Genen weisen würde, dass unser Ge- sichtssinn jedoch nicht empfindlich genug ist, dieselben zu unterscheiden von den beiden hier genannten. Hierbei muss beachtet werden, dass die angeführten Mutan- ten sich in keiner anderen Eigenschaft, wie die durch den Namen bezeichnete, von- einander unterscheiden, dass es wenigstens nicht gelungen ist, solche andere Eigen- schaften zu finden. Untersucht man z. B. das Garvermögen bezüglich Glukose, so findet man, dass es bei allen genannten Mutanten dasselbe ist, wie bei der Normal- form I, woraus sie entstanden sind, was ebenfalls zutrifft für die Bildung der En- zyme, für die morphologischen Eigenschaften und für die chemischen Leistungen ver- schiedenster Art. Das Garvermögen muss von einer anderen Gene, oder, vielleicht von einer an- deren Genengruppe wie die die Farbe bedingende abhangen. Wieder eine andere Gene oder Genengruppe muss in der Schleimmutante, Bacillus prodigiosus viscosus, vorkommen und auf deren Vermehrung muss eine sich im Bakterienkörper anhaufende Protoplasmaart zurückgeführt werden, welche die Eigenschaft hat, die starke Her- ausbildung der Wandsubstanz zu verursachen, die wir als Schleim beobachten. Dieses Protoplasma konnte dann Viscoplasma genannt werden. Die Leuchtsubstanz, woran die Leuchtkraft der leuchtenden Organismen haftet, muss auf eine ahnliche Weise von Genen abhangig sein, welche das Protoplasma er- zeugen. Die Zymase der Alkoholhefen muss auf Genen des Zymoplasma's zurück- geführt werden. ') Diese Zifïern sind dieselben, wie die in der Tabelle pag. 45 verwendeten. 40 Auf diese Wei se kann man weiter schliessen und für jede bemerkbare und un- abhangig veranderliche Eigenschaft bestimmte Genen annehmen. Es ist nicht unwahrscheinlich, dass wir in den Enzymen die Genen selbst, oder Peptisationsprodukte ^) von Genen zu erblicken haben, welche in bestimmten Pallen die Zelle verlassen und ihre katalytische Arbeit ausserhalb des Verbandes mit dem übrigen Protoplasma ausführen können. So z. B. das Trypsin, die Diastase, das Emulsin, die Invertase, die Oxygenase, die Peroxydase. In anderen Fallen ver- lassen sie die Zelle nicht und sind dann als Endoenzyme bekannt. Hierzu ge- boren die Katalase, die Laktase, die Urease und viele andere. Es ist diese letztere Gruppe durch so viele Übergange mit der lebenden Substanz verbunden, dass es nicht immer möglich ist zu sagen, ob eine Reaktion von einem Endoenzym oder vom leben- den Protoplasma selbst besorgt wird. Jedenfalls besitzen die Enzyme viele Eigen- schaften, welche für das Protoplasma charakteristisch sind, und ihre Bildung und Vermehrung ist nur innerhalb des Protoplasma's der Zelle möglich, geradezu, wie die Vermehrung der Genen nur allein im Innern der lebenden Substanz stattfindet. Zwar hat die Genentheorie für die Mikroben noch keine besondere Wichtigkeit erlangt. Da dieses wohl der Fall ist für die höheren Organismen muss angenommen werden, dass beim weiteren Studium der Mikrobenvariabilitat die Fruchtbarkeit dieser Theorie sich ebenfalls herausstellen wird. In didaktischem Sinne ist auch jetzt schon für den Mikrobiologen die Beziehung der Eigenschaften seiner Objekte auf konkrete Substanzen nicht unwichtig. Schliesslich noch folgende Bemerkung. Bei der »Bastardanalyse« der höheren Organismen, wobei die Theorie der Genen besonders aufklarend gewirkt hat, wird die »Presence- and Absencetheory« von B a t e s o n -) als richtig vorausgesetzt. Das heisst, es wird angenommen, dass die in einer bestimmten Eigenschaft mendelnden Rassen, sich dadurch voneinander unterscheiden, dass die Gene der bezüglichen Eigenschaft in der einen Rasse vor- kommt und in der anderen fehlt. Es muss nun hervorgehoben werden, dass bei der Mikrobenmutation niemals mit Sicherheit das Verlorengehen der Genen festgestellt werden konnte ^), Dagegen gelang es für sehr viele Falie bei Mikroben sicher zu beweisen, dass eine durch Mutation scheinbar verloren gegangene Eigenschaft, durch Atavismus in normaler Ausbildung zurückgebildet werden kann. Darum aber ist es notwendig, die Existenz von Progenen anzunehmen, sowohl in den Mikroben wie in ihren Mutanten. Von den Progenen mussen natürlich die »aktiven Genen in laten- tem Zustande« unt'erschieden werden. Die letzteren werden aktiviert durch die Reize der Modifïkation, die ersteren durch diej enigen der Mutation und des Atavismus. Beim Durchführen dieser Auft'assung kommen die Schwierigkeiten des Entwick- lungsproblems jedoch erst recht zur Geltung. ') Peptisation ist der Name, welcher in der Kolloidchemie dem Vorgang des Zer- fallens eines grobmolekularen Kolloids in kleinere Moleküle gegeben wird. °) Mendel's Principles of Heredity, Cambridge 1909. ^) Es ist allerdings möglich, dass z. B. in der Asporusmutante der Octosporusheie das Vermogen der Sporenbildung, das sicher von mehreren Genen abhangt, wirklich fehlt, weil dabei kein Atavismus zur Stammform beobachtet ist. Viel wahrscheinlicher ist es aber, dass Atavismus auch hier möglich ist. Nur bei der Degeneration ist es vielleicht anders. 41 Kapitel II. Spezielle Beispiele. Es hat sich herausgestellt, dass die meisten Mikroben, wenn sie genügend lange in Untersuchung genommen werden, Mutabilitatserscheinungen zeigen. Besonders gilt dieses für die Pilze und die Bakterien. Doch haben sich auch einige Algen als mutabel erwiesen, namlich Arten von Chlamy domonas und Chlorella, wovon letztere naher betrachtet werden wird. Obschon wir seit vielen Jahren eine Reihe von Cyanophyceen in Reinkulturen beobachtet haben, wurden dabei bisher noch keine Mutationen beobachtet, vielleicht ist das j edoch nur Folge ihrer Beweglichkeit, welche in den Kuituren auf Kiesel- und Agarplatten selbst bei Nostoc nicht fehlt, und ver- hindert, eine etwaige Spaltung in den Koloniën zu bemerken. Die meisten niederen Grünalgen haben sich ebenfalls als sehr stabil gezeigt. So habe ich im Jahre 1888 einen Stamm von Pleurococcus vulgaris isoliert, der, auf Würzegelatine kultiviert, noch immer unverandert ist. Ahnliches wurde für Strichococcus bacillaris und für Cystococcus (Protococcus) humicola, welcher letztere aus der Lichene Parmelia parietina auch in 1888 isoliert wurde, konstatiert. Bei Chlorella variegata ist da- gegen die Mutation sozusagen eine normale Erscheinung, Auch bei den Alkoholhefen ist die Mutation etwas ganz gewöhnliches und es ist unbegreiflich, dass darüber nur eine so dürftige Literatur vorliegt. Schon im Jahre 1895 habe ich auf die Mutabilitat der Essigatherhefe gewiesen 1) und im Jahre 1898 eine Übersicht der Mutabilitats- verhaltnisse bei derSporenbildung von Saccharomyces und Schizosaccharomyces ge- geben 2). Bei Schizosaccharomyces octosporus macht die Mutation auf den Beobachter, der damit zum ersten Male bekannt wird, einen eigentümlichen Eindruck, weil erinnernd vielmehr an einen normalen Vorgang, wie an Variabilitat. Ich habe erst dann davon eine klare Auffassung bekommen als ich zur Einsicht kam, dass die Mutation eben- sowohl zu den phylogenetischen, wie zu den ontogenetischen Processen gehort, letzteres namlich dann, wenn es sich um die Organbildung handelt. »Ontogenetische Mutation« findet statt bei der Geschlechtsausbildung der Diözisten, bei der Wurzelbil- dungderhöherenPflanzen, sowie bei der Schwimmglockenbildung derPolypen, umiuir einige besonders deutliche Beispiele zu nennen. Vergleicht man einen solchen»Entste- hungsvorgang« mit demdarauffolgenden»Entwicklungsvorgang« des Individuumsoder des Organes, welcher auf fliessende Ontogenese beruht, so sieht man leicht, dass der letzteren Modifikation mit nicht erblichem Erfolg zugrunde liegt. Diese Modifikation findet statt unter dem Einfluss der Bedingungen, welche in dem bezüglichen Organe herrschen und deren Veranderung auch den Gang der Modifikation andert oder zum Verschwinden bringt, wahrend die durch Mutation, oder in diesem Falie besser ge- sagt, die durch »organbildende Mutation« erzeugten Einheiten oder Organe selbst auch unter veranderten Bedingungen erblich stabil bleiben. Eine Adventivwurzel oder eine Adventivknospe einer Pflanze aufzufassen als eine Mutante giebt allerdings anfangs einige Schwierigkeit; sobald man aber mit ') Handelingen Natuurk. Congres Amsterdam 1895. *) Ueber Regeneration der Sporenbildung bei Alkoholhefen. Centralbl. f. Bakterio- logie, 2te Abt., Bd. 4, pag. 657, 1898. Archives Néerlandaises Sér 2, T. 2, pag. 269, 1899. 42 dem Gedankengang besser vertraut ist, überzeugt man sich, dass die Ontogenese aus einem System von Modifikationen besteht. Zwar ist die Sache noch nicht vollstandig genug durchgedacht, um überall bei der Ontogenese sicher entscheiden zu können, WO der eine oder der andere dieser beiden Vorgange einsetzt, das ist jedoch nur eine Frage der Zeit. Bei den Bakterien ist der Verlauf der Mutation sehr verschieden je nach den Arten. Die nachfolgenden Beispiele geben davon den Beweis, doch geben dieselben nur ein sehr dürftiges Bild von dem Umfang und der Vielseitigkeit der dabei obwal- tenden Erscheinungen. Die meisten Arten sind noch zu wenig genau untersucht, um davon einigermaassen befriedigende Darstellung schon jetzt geben zu können. I. Mutabilitat bei Bacillus prodigiosus^). a. Das Konstanthalten der Kuituren. Jeder Stamm von Bacillus prodigiosus, gleichgültig ob ein Naturstamm oder eine durch Mutation erhaltene Mutante, bleibt, wie es scheint, unbegrenzt lange unverandert, wenn man denselben nach sehr kurzen Zeitintervallen überimpft unter sehr günstigen Ernahrungsbedingungen, z. B. jede 24 Stunden in Fleisch- bouillon oder auf Fleischagarplatten bei 30° C, und unter Verwendung von nur sehr wenig Impfmaterial. Es muss wohl angenommen werden, dass unter diesen Bedingun- gen die für die Mikroben schadlichen Absonderungsprodukte oder Erschöpfungsum- stande nicht entstehen, wodurch allem Anscheine nach die Mutationen ausgelöst werden. Welche die Natur der dabei wirksamen Absonderungsprodukte ist, ist unbe- kannt, doch ist es wahrscheinlich, dass dieselben alkalischer Natur sind, wenigstens bleibt die Mutation völlig aus in Bouillon, welche zu 0,5 — 1,5 cM^ normaler Milch- saure pro 100 cM^ angesauert ist, vorausgesetzt, dass das Überimpfen stattfindet be- vor die Saure durch das aus der Bouillon erzeugte Alkali neutralisiert ist. Hierbei ist man unabhangig von der Zeit, so dass solche saure Kuituren selbst nach Monaten sich als völlig frei von Mutanten herausstellen. Es ist zu bemerken, dass aus con- centrierten Nahrlösungen viel mehr Alkali entsteht wie aus verdünnten, so dass die ersteren, um neutral zu bleiben, mehrere Male neutralisiert werden mussen, was für verdünntere natürlich nicht nötig ist. Auch soll bedacht werden, dass in Bouillon (von ca. 20 Fleisch auf 100 Wasser bereitet) schon 4 cM' Normalmilchsaure pro lOOcM^ Nahrlösung das Wachstum beeintrachtigt, 9 cM' dasselbe völlig hemmt. Nach der hier vertretenen Auffassung soll die Mutation also durch einen alka- lischen Körper herbeigeführt werden. Dass dieser Körper sich jedoch innerhalb und nicht ausserhalb des Bakterienkörpers vorfindet, geht aus dem folgenden Umstande hervor. Kultiviert man unsere Mikrobe auf Platten, worin man neben den Nühr- itoffen grössere oder geringere Quantitaten schon für frühere Versuche verwendeter ') Bei den sehr zahlreichen Versuchen, welche für die Bearbeitung von diesem Kapitel notwendig waren, batte ich mich fortwahrend zu erfreuen über die rege Beihülfe meines Assistenten Herrn H. C. Jacobsen. 43 Kulturmaterialien gebracht hat, so hat das nicht den geringsten Einfluss auf die Mi- kroben, sie mutieren oder mutieren nicht je nach den weiteren befolgten Maassnah- men, woraus also hervorgeht, dass die ausserhalb des Bakterienkörpers befindlichen Absonderungsprodukte auf die Mutationserscheinung keinen Einfluss ausüben. Die Gegenwart von Glukose wirkt wie freie Saure, weil B. prodigiosus daraus Saure erzeugt, namlich ca. 4 cM^ Normal bei genügender Glukosemenge. Aus Bouil- lon mit 1% Glukose entsteht 1,5 — 2 cM^ Normalsjiure, wahrend aus der gleichen Bouillon 2,3 cM' Normal Alkali entstehen kann, woraus man sieht, dass bei lang- samen Uberimpfungen, trotz der Gegenwart von 1% Glukose, dennoch Variabilitat möglich ist, weil in der Flüssigkeit sich mehr Alkali wie Saure bildet. Übrigens kann man das Mutieren merkwürdigerweise auch durch Alkalizusatz verhindern, namlich durch ca. 3 cM" Normal Ammon- oder Natriumcarbonat pro 100 cM^ der Bouillon und Kultur bei 30" C. Man könnte darum auch annehmen, dass sowohl Saure wie Alkali die Bildung der Substanz, welche die Mutation aus- löst, verhindern. Man erreicht aber dasselbe Resultat mit 3 — 4 proz. Magnesium- hydrophosphat (MgHP04 . 2 H2O), so dass anderseits Ursache vorliegt anzuneh- men, dass die die Mutation auslösenden Substanzen unter gewissen Bedingungen in Alkali löslich sind und dadurch aus den Zeilen entfernt werden können. b. Die Bedingungen der Mutation im Allgemeinen. Verkehren die Kuituren von B. prodigiosus unter günstigen Bedingungen, so findet dar in zwischen 10 — 30*' C. beim langeren Aufbewahren, j edoch ohne weitere Fürsorge, von selbst Mutation statt, so dass man aus solchen Kuituren neben der unveranderten Form die Mutanten isolieren kann. In derselben Kulturflüssigkeit sollte man, wie wir sahen, beim schnellen Überimpfen und bei übrigens gleichen Be- dingungen eine vollstandig konstante Kultur finden. Dennoch kann man durch Über- impfen die Mutation beschleunigen und zwar dadurch, dass dieses Überimpfen ziemlich langsam und mit nicht allzuwenig Impfmaterial stattfindet, z. B. nach 2 bis 3 Tagen, wobei nach ungefahr einer Woche die Mutanten auftreten, wah- rend dann die erste sich selbst überlassene Kultur noch nicht abgeandert ist. Offen- bar entstehen bei diesemüberimpfungsverfahren fortwahrend neue Mutanten, welche Gelegenheit finden sich neben der Stammform zu vermehren, ohne Atavisten abzu- werfen. Auf festem Kulturboden entstehen die Mutanten, welche in diesem Falie nur durch die Albus- und seltener durch die Roseusmnt^nten reprasentiert werden, nur an vereinzelten Stellen in den Impfstrichen, deren Lage von noch nicht klaren Be- dingungen abhangt. Bei B. prodigiosus wachsen dieselben nur selten zu deutlichen Sekundarkolonien aus, man muss sie also in umfangreichen Aussaaten erwarten, welche aus an verschiedenen Stellen des Impfstriches entlehnten Keimen entstan- den sind. Wie gesagt, sind von allen bisher erhaltenen und in der folgenden Tabelle ange- führten Mutanten nur die weissen und rosafarbigen auf festen Kulturboden erhal- ten und davon die letzteren nur selten, wahrend in den flüssigen Kuituren nicht nur diese, sondern ebenfalls alle andern gefunden sind. Jedenfalls geht daraus hervor, dass die Ernahrungsbedingungen, wenn auch auf indirekte Weise, die Mutation au3- 44 lösen, obschon es anderseits feststeht, dass der Vorgang nur in vereinzelten, durch 'einen besonderen inneren Zustand dafür beanlagten Keimen stattfindet. Die Viel- seitigkeit der Mutation in den Nahrlösungen macht es wahrscheinlich, dass der be- schrankte Luftzutritt auf die Entstehung der meisten Mutanten von enscheidendem Einfluss ist. Demgegenüber muss j edoch betont werden, dass bei der Kultur in ge- schlossenen Flaschen, also bei ziemlich vollstandigem Luftabschluss, überhaupt keine Variabilitat bemerkbar ist; dieses dürfte jedoch mit dem sehr beschrankten Wachs- tum zusammenhangen, welches ganzlich aufhört, sobald die letzten Spuren Sauer- stoff verschwunden sind. Da es nun feststeht, dass die Mutation ein seltener Vor- gang ist, ist es zunachst notwendig, die Chance für das Zustandekommen davon durch die Erzeugung einer sehr grossen Individuenmenge zu erhöhen. Überhaupt ist letzteres Prinzip für die ganze Mutationsfrage von hervorragender Bedeutung, weil nur in sehr umfangreichen Kuituren die weniger allgemeinen Mutanten zu er- warten sind. Um solche seltenere Individuen aus den Kulturflüssigkeiten zu erhalten, tut man am besten, die Methode der Impfstriche mit Beharrlichkeit durchzuführen, weil es dadurch am leichtesten gelingt, sehr grosse Koloniemengen schnell zu übersehen, und weil die Prodigiosusmutanten alle sehr scharf kenntlich sind, kann man eben dadurch mit Sicherheit auf das Stattfinden oder das Ausbleiben der Mutation schliessen. Weil unsere Bakterie beweglich ist und leicht über die Platte kriecht, wodurch die Isolierungsversuche ganzlich misslingen können, muss die Kulturplatte derweise prapariert werden, dass das Kriechen ausgeschlossen ist und die Koloniën deutlich getrennt neben einander liegen. Dieses wird dadurch erreicht, dass man die Bouil- lonagarplatten, nachdem sie schon in der Glasdose erstarrt sind, auf einen auf 37° — 40" erwarmten Thermostaten stellt mit dem Glasdeckel nach oben, und den sich an diesen Deckel verdichtenden Wasserdampf davon entfernt ehe die Tropfen auf die Platte abfallen können. Merkwürdigerweise erreicht man den Zweck nicht, wenn das Erwarmen bei höherer Temperatur stattfindet, z. B. über einer Gasflamme. Es dürften namlich bei erhöhter Temperatur aus dem Innern der Agarplatte durch »Thermodiffusion« ^) kolloidale Stoffe an die Oberflache gelangen, welche spater beim Abkühlen sich polymerisieren, nicht mehr hinein diffundieren können und die Oberflache bleibend feucht halten, durch welche Flüssigkeitsschicht die beweglichen Keime dann herum schwimmen. c. Die verschiedenen Prodigiosusmntanten. Durch die Untersuchung einer Reihe verschiedener ProdigiosusSi^mmt durch unabhangige Isolierungen aus Naturmaterialien erhalten (aus Milch, aus dem stiid- tischen Schwemmkanale zu Delft, von an der Luft aufbewahrten Gebeinen, aus Maaswasser, von Fleisch, sowie aus anderen Sammlungen herkünftig), stellte sich heraus, dass sie alle ungefahr auf dieselbe Weise variieren, jedoch mit ungleicher Leichtigkeit. Ganz ahnlich sind die dabei entstehenden Mutanten nicht, was beson- ders deutlich ist bei den Schleimmutanten, welche je nach ihrem Ursprunge aus ver- *) Bekanntlich diffundieren geloste Körper von warmen nach kalten Stellen, weil die Warme ihre Molekularbewegung erhöht. 45 schiedenen Stammen Schleim von ungleicher Zahigkeit und Konsistenz erzeugen. Auch entstehen nicht aus allen Naturstammen die Schleimmutanten mit derselben Leichtigkeit. Ausser der gewöhnlichen Prodigiosiisiorm wurden auch noch die starker ab- weichenden Stamme, welche in der Literatur als B. Kieliensis und B. Plytnouthii bekannt sind, untersucht. Kieliensis, welcher in Bezug auf die Garung viel kraftiger wie der gewöhnliche Prodigiosus ist und ein lackrotes anstatt ein karminrotes Pig- ment erzeugt, variiert beinahe auf dieselbe Weise wie letzterer, produziert jedoch leicht eine gekrauselte, eigentümlich trocken und fest auf der Platte liegende Mutante, welche von keiner anderen Form erhalten wurde. Die /ÏMrofMjmutante ist hier wegen der lackroten Normalfarbe nicht zu erkennen. Dagegen sind eine Schleim- mutante und eine dunkelfarbige mit HyaUnus parallele Form, sowie die ^/&M.ymutante auf gleiche Weise vorhanden wie in den anderen Fallen. Plymouthii ist eine La- boratoriumsform und wahrscheinlich stark degeneriert seit der ersten Isolierung, so dass die damit ausgeführten Versuche nicht in Betracht kommen. In relativ kurzer Zeit ist es gelungen, von einem von faulendem Gebein isolier- ten Prodigiosusstamm 15 verschiedene Mutanten zu erzeugen, jedoch ist diese Anzahl bei vielen neuen Versuchen nicht vermehrt worden, so dass es scheint, dass entweder keine anderen Mutanten möglich sind, oder nur so selten vorkommen, dass wir die- selben erst bei viel umfangreicheren Aussaaten, als die von uns angefertigten, fin- den würden. Die gefundenen Formen sind aber in unseren Kuituren wiederholt aufgetreten, und wir können auch genau angeben, wie dieselben zu erhalten sind, namlich durch das vorher beschriebene Kulturverfahren in Bouillon in Kölbchen an der Luft bei 28» — 30" C, und Überimpfen mit wenig Material, z. B. 2 Ösen, nach zwei bis drei Tagen (oder langerer Zeit) und dieses drei- bis viermal wiederholen. Nach 7 — 10 Tagen ist die Mutation dann in vollem Gange, was man daran bemerken kann, dass die Flüssigkeit schleimig wird infolge der Bildung von Schleimmutanten, neben welchen aber auch die anderen Mutanten vorkommen können. Es folgt nun zunachst eine Liste der bisher von dem gewöhnlichen Prodigiosus abgeleiteten Mutanten, und dann eine in Stammbaumform gegebene Ubersicht von deren Ursprung. Es moge hervorgehoben werden, dass alle die anzuführenden Mutan- ten nur allein in der bezüglichen, durch den Namen angegebenen Eigenschaft von ihrer Stammform verschieden sind und für so weit untersucht, in allem Übrigen da- mit übereinstimmen. So haben wir z. B. die Alhus- und die Schleimmniznitn mit der Mutterform verglichen in Bezug auf Vergarung von Glukose und Rohrzucker, auf Salpeterreduktion, Glukosidspaltung, Diastase-, Invertase-, Trypsinbildung, Oxy- dation organischer Salze, Fettspaltung und mehrere andere Eigenschaften und nir- gendwo Verschiedenheiten gefunden. Die Liste der sammtlichen Mutanten ist diese. 1. Bacillus prodigiosus, Normalform aus der Natur isoliert. 2. » » roseus i. 3. » » » 2. 4. » » albus. 5. » » » hyalinus. 6. » » viscosus. 46 Bacillus prodigiosus, viscosus albus. » » auratus. » » » viscosus. albus. hyalinus. albus. albus. albus. Wie man sieht, finden sich darunter nicht weniger wie sechs Albusiorratn ; diese sind in ein paar Fallen mikroskopisch etwas verschieden bezüglich der Stabchen- lange, wodurch ihre Koloniën opak oder hyalin aussehen, lassen sich übrigens auf keinerlei andere Weise voneinander unterscheiden, wie durch den Atavismus. Dabei hat sich als allgemeine Regel ergeben, dass dieser Vorgang diejenige Form erzeugt, woraus die bezügliche Mutante selbst entstanden ist. Jeder Schritt vorwarts bei der Mutation entspricht deshalb dem gleichen Schritt rückwarts beim Atavismus oder um- gekehrt, woraus man zugleich bemerkt, dass Mutation und Atavismus verwechselbare Vorgange sind. au r. VISCOSUS aur.viscalbus VISCOSUS \- hyal.viscosus viscosus albus hyal. viscosus albus auratus -<- roseus 1 prodiglo5US Normal ->.h^alinue albus hyalinus hyal.albus roscus 2 Experimenteller Stammbaum. Die Pfeile zeigen durch Richtung aufwarts scheinbare Gewinn- oder Plusmutanten an, abwarts Verlust- oder Minusmutanten; horizontale Richtung ist angegeben, wenn selbst der Schein von Gewinn- oder Verlustmutation nicht vorliegt. Punktierte Pfeile zeigen an, daB Atavismus beobachtet. lm Stammbaum sind die beiden Farbmutanten Auratus und Hyalinus auf eine Linie mit der Hauptform gestellt, weil ich früher annahm, dass dieselben als »quali- tative« Mutanten aufzufassen waren und Merkmale hatten, welche überhaupt in der Hauptform fehlten. Inzwischen glaube ich zur Zeit nicht mehr, dass dieses der Fall ist. Wahrscheinlich muss der Sachverhalt wie folgt aufgefasst werden. Die HyalinusmuiSinit unterscheidet sich von der Normalform durch eine inten- sivere, mehr weinrote Farbe und durchsichtigere Koloniën; diese Durchsichtigkeit dürfte jedoch von den im Mittel etwas geringeren Dimensionen der Zeilen abhangig sein. Die dunkle Farbe scheint die am starksten ausgepragte Farbung zu sein, welche überhaupt bei Prodigiosus vorkommt und es liegt also Ursache vor, um anzunehmen, dass die gewöhnliche Form eine Verlustmutante von Hyalinus ist. 47 Was nun die ^«ro^M^mutante betrifft, darin scheint, entgegen der Angabe im Stammbaum, eine Verlustmutante von Prodigiosus vorzuliegen, welche dadurch zu erklaren ist, dass die Farbstoffbildung, welche bei der Normalform durch mehrere, wahrscheinlich vier unabhangige Erbeinheiten oder Genen bedingt wird, bei der ^«ro^Mjmutante nur auf der Wirkung einer einzelnen Gene beruht. Auch die Roseusmuidinitn scheinen anzuzeigen, dass die Farbstoffbildung von mehreren Erbeinheiten abhangig ist. Wie viele es von diesen Roseusm\x\.z.nie.n giebt, ist noch nicht sichergestellt. Es gelingt zwar nur, darunter zwei deutlich zu unter- scheiden, doch ware es möglich, dass es mehrere giebt, welche jedoch zu wenig in Farbintensitat verschieden sind, um von unserem Auge bemerkt zu werden. Besonders interessant sind die verschiedenen Schleimmutanten desshalb, wei! sie ein Merkmal besitzen, welches unzweifelhaft in der für die Versuche verwendeten Form fehlt. Wir haben darum die Schleimmutanten als (scheinbare) Gewinnmutanten oberhalb der Normalform im Stammbaum gestellt. Auch hier ist es jedoch nicht sicher, dass eine wirklich neue Eigenschaft vorliegt. Wir sehen vielmehr in den da- mit ausgestatteten Formen den eigentlichen und vollstandigsten Typus der Art und können nicht annehmen, dass unsere Kulturversuche dieses Merkmal zum ersten Male hervorgerufen haben. Es muss dabei an eine bis dahin schlummernde Progene gedacht werden, welche durch den in unserem Versuche ausgelösten Atavismus er- weckt ist. Die nachste Ursache der Bildung der Schleimmutante dürfte, in Übereinstim- mung mit dem, was wir bei einer anderen Bakterie, namlich Streptococcns holandicus, mitSicherheithabenfeststellen können, im beschranktenSauerstoffzutritt gelegen sein. Sicher ist, dass die Schleimmutanten niemals auf den Platten entstehen, wie lange und unter welchen Bedingungen diese auch bewahrt werden; zu ihrer Bildung ist die Kultur in einer nicht allzu dunnen flüssigen Schicht notwendig, wobei offenbar die in der Oberflache wachsenden Bakterien diejenigen geringeren Sauerstoffspan- nungen in der Tiefe hervorrufen, worunter die für die Entstehung der Schleim- mutante notwendige vorkommt. Dass dabei die übrigen Ernahrungsbedingungen nicht in erster Linie maassgebend sind, folgt aus dem Umstande, dass die Schleim- mutante ebensowohl bei der Kultur in Fleischbouillon wie in den folgenden Nahr- lösungen entsteht: Fleischbouillon mit i% Glukose; Leitungswasser mit 5% reiner Gelatine und 0,02% K2HPO4; und Leitungswasser mit 2% Glukose, 0,5% Asparagin und 0.02% K2HPO4; alle bei 30" C. gehalten und bei Überimpfung mit zwei bis mehreren Tagen Zwischenzeit. Die ^Mro/M^mutante ist ausser aus Bouillon aus der genannten Asparagin-Glu- kose-Kulturflüssigkeit erhalten. Die //3ra/mM.fmutante ausser aus Bouillon auch aus der genannten reinen Gelatinelösung; dabei entstand zu gleicher Zeit Hyalinus viscosus. Die farblosen Mutanten entstehen sehr leicht aus ihren Stammformen und sind sicher die bekanntesten; dieselben sind ausgezeichnet durch eine grössere Konstanz wie die Hauptform. Sie bilden sich unter allen bisher untersuchten Kulturbedingun- gen (natürlich mit Ausnahme der für das »Konstanthalten« beschriebenen) und aus allen gefarbten Formen ; demzufolge sind drei farblose Schleimmutanten bekannt und drei andere, welche keinen Schleim erzeugen. Unter einander sind die Glieder bei- der Gruppen, wie schon hervorgehoben, kaum anders zu unterscheiden, wie durch 48 ihren Atavismus, wobei unveranderlich nur die Stammform, woraus die bezügliche Mutante unmittelbar hervorgegangen ist, regeneriert wird. Nur in einer anderen Be- ziehung wurde noch eine Verschiedenheit zwischen den Albusiormen bemerkt, nam- lich in Bezug auf die grössere oder geringere Durchsichtigkeit ihrer Koloniën, welche in Beziehung steht mit der Lange der Stabchen und Glieder und anfangs in unserem laboratorium Veranlassung gab, einen Alhus opacus und Albus hyalinus zu unter-^ scheiden. Doch ergab sich das Merkmal als in den Überimpfungen nicht immer wie- der erkennbar. Die Albusmutanttn sind gut geeignet zur Beobachtung von Sekundarkolonien, welche sich aus der glanzenden Oberflache alterer Kuituren konvex erheben, entweder als wenige vereinzelte Koloniën oder in sehr grosser, gleichmassig über die ganze Oberflache verteilter Anzahl. lm ersteren Falie erzeugen diese Sekundarkolonien bei Aussaat die rote Normalform, woraus der bezügliche Albusst^mm entstanden ist. lm zweiten Falie wieder ^/&Mjkolonien, welche nicht von dem Albusst^mm zu unter- scheiden sind. Die Ursache, welche zur Entstehung von Albus Veranlassung gegeben hat, kann also in den Sekundarkolonien wieder rücklaufig werden. Weil die Ent- stehung der Albusmutanten besonders leicht auf Kulturplatten stattfindet, muss an- genommen werden, dass reichlicher Luftzutritt dafür gunstig ist im Gegensatz also zu den Schleimmutanten, wo eben beschrankte Aëration eine unumgangliche Entste- hungsbedingung darstellt. Die Viscosus albusmuta.ntt kann zu gleicher Zeit mit der Viscosusmutante selbst aus der Normalform entstehen bei dem oben beschriebenen Überimpfungsversuch in flüssigen Kulturmedien. Weil dieselbe jedoch noch leichter bei diesem Versuche zu erhalten ist, wenn man von der roten Viscosusmutante ausgeht, so muss es als wahr- scheinlich betrachtet werden, dass auch im ersteren Falie keine direkte Bildung von Viscosus albus aus der Normalform geschieht, sondern, dass dieses erst sekundar stattfindet aus Viscosus. Die Roseusmnianitn sind auf verschiedene Weisen erhalten. Erstens bei einer Versuchsanstellung, wobei auch die gewöhnlichen nicht schleimigen ^/tMjmutanten hervortreten, namlich durch Kultur unterhalb 20" C. auf einer Platte von io% Gelatine, gelost in destilliertem Wasser. Eine auf einer solchen Platte wachsende Kolonie breitet sich infolge der Verflüssigung natürlich schnell seitwarts aus; nimmt man davon taglich Impfmaterial und macht damit ausgedehnte Strichkulturen auf Bouillonagarplatten, so findet man am fünften oder sechsten Tag die ersten Roseus- mutanten entweder oder nicht mit gleichzeitig gebildeten Albusmutanitn, welche letz- tere gewöhnlich spater entstehen. Zwei i?o.y^Mjmutanten (2 und 3 in der Tabelle) sind dabei leicht zu unterscheiden, es ist jedoch bisher zweifelhaft geblieben, ob es noch mehrere giebt, zu deren Beobachtung unser Gesichtssinn nicht imstande ist. Gegenwartig betrachte ich letzteres als unwahrscheinlich. Ein anderes Verfahren, wobei RoseusmntanXtn erhalten werden, besteht darin, dass die Normalform kultiviert wird in durch Eindunsten z. B. auf ein Drittel con- centrierter Bouillon. Schon nach ein paar Überimpfungen werden aus solchen Kui- turen eine Anzahl einer Roseusmnianit (3) erhalten, welche durch schwache Farbung der Albusiorm 4 nahesteht. Diese Mutante hat die Eigenschaft, noch leichter durch Atavismus wieder die Normalform sowie Albusmxxianitn zu erzeugen, wie die Roseus- mutante 2, welche in der Farbe der Hauptform nahert. 49 d. Atavismus. Alle bisher erhaltenen Mutanten von der Prodigiosusgvn^^^ liaben mehr oder weniger oft atavistische Erscheinungen gezeigt. Bemerkenswert dabei ist die Ver- schiedenheit, welche der gleiche Stamm aufweisen kann, insoweit die erbliche Kon- stanz bei den an verschiedenen Zeiten ausgeführten Experimentenreihen grösser oder kleiner ist. Vielfach bekommt man dabei den Eindruck, dass frische Isolierungen leichter atavieren, wie schon lange in Kultur befindliche, doch hat sich das noch nicht einwandsfrei feststellen lassen. Auch muss dabei überlegt werden, dass das Tempo, womit das Überimpfen der Reinkulturen beim Aufbewahren stattgefunden hat, aus- schlaggebend sein kann. Wir haben namlich gesehen, dass ein sehr schnell wieder- holtes Überimpfen das Mutieren verhindert und dieses gilt erfahrungsgemass auch für das Atavieren. Dieses ist auch durchaus natürlich, denn Atavismus und Mutation sind in diesem Falie verwechselbare Begriffe. Hatte man namlich aus der Natur eine Alhusiorm von B. prodigiosus isoliert, was als sehr wohl möglich zu betrachten ist, so würde die Entstehung der roten Normalform daraus durch Atavismus mit vollem Rechte als Mutation aufgefasst werden. In vereinzelten Pallen sind aus Albusmnidinitn durch Atavismus neben der nor- malen Form auch in geringer Anzahl AuratuskoXon'x&n erhalten. Es ware jedoch über- eilt zu behaupten, dass diese direkt aus Alhus selbst entstanden sind, denn die Wahr- scheinlichkeit liegt vor, dass bei ihrer Entstehung sozusagen zuerst die Normal- phase durchlaufen wird, welche bekanntlich sehr leicht Auratus als Mutante erzeugt. Diese Erklarung ist desshalb die wahrscheinliche, weil als allgemeine Regel gilt, dass beim Atavismus diejenige Form entsteht, aus welcher die Mutante zuletzt entstanden ist und nicht eine weiter zurückliegende Ahnenform. So wird beim Atavismus von B. prodigiosus hyalinus viscosus alhus entstehen B. prodigiosus hyalinus viscosus, und nicht direkt B. prodigiosus hyalinus oder B. prodigiosus Normal. Aus B. prodigiosus hyalinus viscosus entsteht durch Atavismus B. prodigiosus hyalinus und nicht direkt B. prodigiosus Normal, u.s.w. Man kann also sagen, dass heim Atavismus der letste Mutationsschritt rückgdngig gemacht wird und nicht die weiter zurückliegendeti Schritte. Wir haben diese Regel in so vielen Fallen bestatigt gefunden, dass dieselbe auch wohl bei der Erklarung der Entwicklung von Auratus aus Albus zutreft'en dürfte, weil es sicher ist, dass die gewöhnliche Stammform von Auratus die Normal- form von B. prodigiosus ist. Eben wie von der Mutation ist das Alterwerden der Kuituren die Ursache des Atavismus, was wieder am deutlichsten in den Agarkulturen zur direkten Beobach- tung kommt. Die Schleimmutante bleibt z. B. auf einer Bouillonagarplatte bei tag- licher oder zweitaglicher Uberimpfung voUstandig konstant ; verlangert man jedoch das Tempo der Uberimpfung auf 14 Tage oder noch mehr, so ergiebt sich, dass sich meistens irgendwo am Rande der Kultur ein oder einige Auslaufer bilden, welche nicht mehr schleimig sind und sich bei der Aussaat als die Normalform ergeben. Solche Auslaufer sind nichts anderes als Sekundarkolonien, welche zufallig am Rande der Impfstriche entstanden sind. Weil sowohl bei der Mutation wie beim Atavismus selbst bei sehr verschieden- artigen Bedingungen, immer und immer wieder die gleichen Mutanten und Atavisten abgeworfen werden und zwar nur von ganz vereinzelten Keimen unter Tausenden M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 4 50 oder Millionen anscheinend identisch behandelter, ist es klar, dass innere Zustande der variierenden Individuen bei diesen Prozessen maassgebend sind. Anderseits mussen doch sicher die Ernahrungsbedingungen im weiteren Sinne dabei eine Rolle spielen, wenn auch auf indirekte Weise, denn wenn man die variier- ten Kuituren, welche in verschiedenen Nahrlösungen entstanden sind, mit einander vergleicht, so findet man, dass die Mutantengemische Verschiedenheiten zeigen, welche bei der Wiederholung der Versuche sowohl quantitativ wie qualitativ immer auf gleiche Weise wiederkehren. Besonders die ^«ro/w^mutante ist in dieser Be- ziehung wichtig, weil dieselbe z. B. sehr leicht und sicher aus Fleischbouillon-Kul- turen zu erhalten ist, jedoch niemals in Malzwürze entsteht, wahrend dagegen die Schleimmutante in beiden Nahrlösungen mit gleicher Wahrscheinlichkeit zu erwar- ten ist. e. Zusammenfassuiig. Versuchen wir aus dem Vorgehenden einige Schlüsse zu ziehen, so sind es die folgenden. Bacillus prodigiosus erzeugt leicht ca. 14 verschiedene Mutanten, von welchen sechs farblos, die übrigen gefarbt, sechs schleimig, die übrigen nicht schleimig sind. Die Schleimmutanten können sowohl weiss wie gefarbt sein. Weil diese Mutanten nicht alle gleich leicht entstehen (die ^/&».ymutanten z. B. leichter wie die Schleitn- und //3;o/mMjmutanten), muss angenommen werden, dass bei sehr umfangreichen Aussaaten noch unbekannte Mutanten erhalten werden können. Die Mutanten können in den Impfstrichkulturen oft als Sekundarkolonien ge- sehen werden, jedoch nicht immer. Die Entstehung derselben wird sicher zunachst durch innere Ursachen bestimmt, ist jedoch indirekt von den Ernahrungsbedingungen abhangig. Die Schleimmutanten entstehen nur in flüssigen Kuituren, niemals auf Platten, ihre Entstehung wird also wahrscheinlich durch einen herabgesetzten Sauerstoffdruck beherrscht. Die ^Zèw^ymutanten entstehen dagegen sowohl in flüssigen Kuituren wie auf Platten. Weil sichere Beweise für eine weitgehende Teilbarkeit der Merkmale nicht vor- liegen, können die Prodigiosusmuiznitn als mit der Genentheorie in Übereinstimmung betrachtet werden. Für die Farbe mussen dann aber wenigstens 4 oder 5 Genen oder Erbeinheiten als maassgebend angenommen werden ; viel grösser ist diese Zahl wohl nicht, weil anders wohl mehrere Roseusmui^LWitn gefunden waren. Die Auratusmntdinit ist nur in einer Form gefunden und scheint in abge- schwachter Farbung (analog den Roseusmni2i\\itn der Hauptform) nicht zu exi- stieren. Die Hyalintism\iidLï\it dürfte bezüglich der Farbung die am reichsten ausge- stattete Form sein und ein Gen für Farbildung mehr besitzen wie die Hauptform. Die beiden Roseusmuidinitn dürften ein und zwei Gene weniger wie die Hauptform haben. In allen diesen roten Mutanten dürfte die Gene, welche für Auratus charakte- ristisch ist, vorkommen. In der Auratusmuidinte. fehlen die vier übrigen Farbgenen. Weil die Schleimbildung bei den sechs Schleimmutanten immer die gleiche ist, besteht dafür nur eine Erbeinheit. 51 Hauptform und Mutanten können durch Überinipfen nach kurzen Zeitinter- vallen und auf guten Nahrboden, wie es scheint, unbegrenzt lange völlig konstant gehalten werden (also ohne neue Mutanten abzuwerfen). Alle Mutanten mutieren ahnlich wie die Hauptform; so giebt die Auratus- mutante eine Au rat ussch.lQ\ïnmuta.nte und eine Alb usmutante; die Schleimmutaiite kann wieder eine Albusmutante abwerfen, u.s.w. Auch alle anderen untersuchten Naturstamme mutieren auf analoge Weise; Gleiches gilt bezüglich des als besondere Art beschriebenen B. Kieliensis. Obschon z. B. die Schleimmutanten ein wirklich neues Merkmal erworben zu haben scheinen, muss es doch als wahrscheinlich betrachtet werden, dass tatsachlich keine neue Gene gebildet ist, sondern nur eine schlummernde Progene durch Ata- vismus erweckt wurde. Die Naturstamme von Prodigiosus sind sehr verschieden in bezug auf ihr Gar- vermögen von Glukose und andere Zuckerarten ; alle bisher untersuchte Mutanten haben dagegen das gleiche Garvermögen wie die Form, woraus sie entstanden sind. Dieses kommt daher, dass man einem individuellen Keime oder einer individuellen Kolonie nicht ansehen kann, ob sie sich in Garvermögen von ihren Nachbarn unter- scheidet; bei der Seltenheit der Mutation hat man also wenig Chance, eine in diesem Merkmal abweichende Kolonie zu finden. Gleiches kann von allen anderen der Un- tersuchung weniger zuganglichen Eigenschaften gesagt werden. Die merkwürdige Tatsache scheint festzustehen, dass die Erbeinheit oder Gene, wodurch eine Mutante sich von der Hauptform unterscheidet, eben nur in einem ein- zigen Merkmal kenntlich wird. Die experimentellen Prodigiosusxxmiantt.n wurden noch nicht in der Natur ge- funden. Bei einer anderen Art, namlich Bacillus herhicola, ist dieses wohl gelungen, wohl deshalb, weil es viel leichter ist, letztere Art aus Naturmaterialien zu isolieren wie erstere. Alle bisher erhaltenen Prodigiosusmuidinitn können atavieren; dabei entsteht wahrscheinlich immer diej enige Form, woraus die bei der letzten Mutation entstan- dene hervorgegangen ist. So ataviert B. p. auratus viscosus alhus zu B. p. auratus viscosus und nicht direkt zu B. p. auratus, und noch weniger zu B. p. selbst. Die scheinbaren Ausnahmen mussen wohl erklart werden durch schnell aufeinander fol- gende Mutationen; entsteht z. B. aus B. p. auratus albus sofort B. p., so ist in dieser Kultur auch wohl B. p. auratus selbst vorhanden, zu dessen Nachweis jedoch viel- leicht eine sehr umfangreiche Aussaat notwendig sein sollte. Nimmt man an, dass beim Mutieren niemals etwas wirklich Neues entsteht und auch keine Gene absolut verloren geht bei den Verlustmutanten, so können die Be- griffe Mutation und Atavismus verwechselt werden, was jedenfalls der Erfahrung entspricht. Verlustmutanten mussen erklart werden durch den Ubergang der aktiven Genen in latente oder Progenen. Die .^/èw^mutanten enthalten deshalb die Farbgenen als Progenen; die Normalform enthalt die Gene der Schleimbildung ebenfalls als Progene. Atavismus beruht also auf der Aktivierung der Progenen. 52 2. Mutabilitat bei Bacillus herbicola. a. Verbreitung dieser Art. Bacillus herbicola ^) ist ein in unserer Umgebung allgemein verbreitetes, nicht garendes, keine Sporen erzeugendes, bewegliches Kurzstabchen, welches auf der Oberflache von Pflanzen lebt. Man erhalt diese Art am leichtesten auf die beiden folgenden Weisen. Erstens, aus Roggenmehl, welches mit Wasser zerrieben und eingeweicht wird; macht man davon eine Strichkultur auf Würzegelatine und kultiviert bei ca. 22" C, so entstehen sehr viele Koloniën von B. herbicola und nur wenige von anderen Arten, weil eben erstere Art die einzige auf der Oberflache der jungen Roggenkörner normal vor- kommende und sich dort vermehrende Bakterienart ist ^), wahrend-die übrigen Arten nur accidentelle, nicht auf der Pflanze lebende Ansiedler sind. Zweitens, von den Wurzelspitzen gekeimter Samen der verschiedensten Pflan- zen, z. B. von gekeimter Gerste, Kohl, Flachs, u.s.w. Man macht dazu einfach Impf- striche mit der Wurzelspitze auf Nahrgelatineplatten, w^obei entweder Bacillus üuorescens liquefaciens, oder B. herbicola, oder beide erhalten werden. Gewöhnlich sind die Koloniën farblos, bisweilen mehr gelblich ; Verflüssigung der Gelatine ist schwach und kann selbst ganzlich fehlen; die meisten Koloniën sind daran kenntlich, dass sie eigentümliche Zoogloeaklumpen erzeugen ahnlich den- jenigen, welche von C o h n ^) für Ascococcus Billrothii beschrieben sind. Die Art ist leicht kenntlich durch ihr Wachstum auf Bouillonpeptongelatineplat- ten, indem dabei kleine gelbliche, erst spat verflüssigende Koloniën entstehen, welche einen eigentümlich trüb-weissen, aus Albumose bestehenden Niederschlag in ihrer Umgebung erzeugen. Dieses ist die Folge einer sehr schwachen Saurebildung, wo- durch die Albumose aus dem Pepton herausfallt. Fügt man der Bouillonpepton- gelatine etwas Glukose zu, wodurch noch mehr Saure entsteht, so bildet sich der Albumoseniederschlag noch deutlicher. Auch in Bouillonagarglukosepeptonplatten tritt diese Erscheinung auf. b. Mutation. Aus der vorgehenden kurzen Beschreibung geht schon hervor, dass diese Art eine veranderliche ist. Diese Veranderlichkeit zeigt sich ferner in der Kultur aller bisher untersuchten Naturformen durch die Entstehung von drei ziemlich scharf ge- trennten Mutanten. Macht man z. B. von irgend einer "der genannten mehr weisslich gefarbten Naturformen, nachdem diese mehrere Wochen oder Monate in Würze- gelatineröhren aufbewahrt oder in flüssiger Würze kultiviert sind, Impfstriche auf Würzegelatineplatten, so stellt sich heraus, dass sich viererlei Kolonienarten ausbil- den, welche wie folgt bezeichnet werden können: ') Max Düggeli, Die Bakterienflora gesunder Samen und daraus gezogener Keim- pflanzen. Centralbl. für Bakteriol. 2te Abt. Bd. 12, S. 602, 1904. *) Ausser B. herbicola leben auf der normalen Pflanzenoberflache auch die verschie- denen DematiumaTten; diese sind jedoch auf den Grasern und auf dem Getreide selten. *) Cohn, Beitrage zur Biologie der Pflanzen. Bd. i, S. 151, 1875. 53 1. B. herhicola, Normal, weiss (Fig. lo Taf. IV). 2. „ „ üavus ^) 3. „ „ colioides (Fig. 11 und 13 Taf. IV). 4. ,, ,, Ascococcus (Fig. 12 Taf. IV). Alle diese Formen betragen sich durch ihre erblichen Eigenschaften als Mutan- ten, welche jedoch wieder mehr oder weniger leicht atavieren. Die Flavusvnniznit gleicht gewissen gelblichen Naturformen so sehr, dass Iden- titat möglich erscheint. Sicher besteht diese bezüglich der sehr abweichenden ^.ycococc«.ymutante, welche sich in grosser Menge in den Holzröhren von serehkrankem Zuckerrohr befand, mir von Professor Went von Java zugesandt, und die auch aus Milch isoliert wurde. Es war mir unmöglich, Unterschiede zwischen diesen Naturbakterien und den in der Kultur entstandenen Mutanten zu erkennen. Die drei genannten Mutanten entstehen anscheinend unter gleichen Kulturbedin- gungen, namlich durch Kultur der Hauptform in Würze bei ca. 25" — 30° C, ver- altern diese Kultur, überimpfen, wieder veraltern und schliesslich Aussaat auf Würzegelatineplatten. Hat man eine weisse Naturform verwendet, so ist die Flavus- nmtante kenntlich an der Farbe und dem betrachtlicheren Verflüssigungsvermögen. Die Co/ioz(i^.$-mutante an der flachen Ausbreitung auf der Gelatineplatte und die an Coli erinnernde Durchsichtigkeit der Koloniën, welche erst nach langer Zeit etwas verflüssigen. Besonders interessant ist die Ascococcusmutdinte, welche so voUstandig verschie- den aussieht im Vergleich mit der Hauptform, wie überhaupt bei Bakterien möglich ist. Es handelt sich dabei um durchsichtige ziemlich feste Massen, welche blumen- kohlartig auf der Würzeplatte wachsen und Gelatine gar nicht verflüssigen. Mikro- skopisch bestehen sie aus aneinander verbundenen Zoogloeen, sowie man dieselben vereinzelt in den Koloniën der Normalform findet und welche erinnern an die von Cohn für Ascococcus gegebene Beschreibung und Abbildung (l.c), nur dass sie nicht, wie C o h n's Material, mit Ammontartrat ernahrt werden können. Ausserlich zeigen sie auch viel Ahnlichkeit mit den als Leuconostoc beschriebenen Bakterien, unterscheiden sich jedoch durch die Natur ihres Schleimes, welcher bei unserer Mutante ein Zelluloseschleim ist, bei Leuconostoc dagegen aus Dextran besteht. Dieses geht daraus hervor, dass der Herbicolaschleim, welcher massenhaft aus Rohr- zucker-Chlorammonkulturen zu erhalten ist, sich nicht für Buttersauregarung eignet, was mit Dextran wohl der Fall ist. Bei der Überimpfung ist die Ascococcusmutante von gleicher Konstanz wie die Hauptform und ataviert auf gleiche Weise und unter denselben Bedingungen, wobei die Hauptform mutierte. Also hat man diese Mutante nur in Würze zu kulti- vieren, überzuimpfen und dann auf Würzegelatineplatten auszusaen, um neben der unveranderten Mutante wieder die Hauptform und eine oder die beiden anderen Mu- tanten, je nach der Dauer der Kultur und das für die Überimpfung gewahlte Tempo hervortreten zu sehen. Die Ascococcusiorm bleibt dagegen ganzlich konstant ?o lange dieselbe kultiviert wird auf Rohrzucker-Kaliumnitrat-Platten, sowohl beim ^) Noch zwei andere Mutanten, welche i und 2 nahe stehen, sind erkannt, jedoch noch nicht naher studiert. 54 Veraltern wie beim schnellen Überimpfen der Kuituren, was Monate lang fortge- setzt werden kann, ohne dass dabei Mutation bemerkt wird. Wird solches konstantes Material jedoch auf Malzwürzeplatten gebracht, so entstehen wieder ziemlich bald einige Normalkolonien. Es giebt zwischen den verschiedenen Ascococct4sstammen eine Difïerenz in der erblichen Konstanz, welche unabhangig von ausseren Ursachen erscheint. Vom Standpunkte der Genentheorie dürften die vier verschiedenen Mutanten sich je durch eine einzelne Gene von der Hauptform unterscheiden, weil keine Zwi- schenformen bekannt sind und ausser den ausserlich sichtbaren keine andern Ver- schiedenheiten zwischen den Mutanten und ihrer Hauptform zu existieren scheinen. Dass auch in diesem Falie kein Grund vorliegt anzunehmen, dass die verschie- denen Mutanten wirklich neue Merkmale besitzen, liegt auf der Hand. Auch ist es klar, dass hier, wie bei Prodigiosus, Mutation und Atavismus verwechselbare Be- griffe sind. Welche die bewirkenden Faktoren sind, die bei B. herhicola die Mutation aus- lösen, ist noch weniger deutlich wie bei B. prodigiosus. Es hat sich namlich her- ausgestellt, dass die verschiedenen //^r&/co/omutanten unter beinahe allen Kulturbe- dingungen entstehen und dass der Atavismus zu der Hauptform in denselben Kui- turen stattfinden kann, worin die Mutanten entstanden sind, bei welchem Vorgange das flüssige Nahrmedium sich wieder als besonders gunstig erweist. Vielleicht wird die weitere Verfolgung des nun zu beschreibenden Versuches im- stande sein, etwas mehr Licht über die Mutationsursachen zu werfen. c. Promutationsphase. Dass noch, bevor die Mutation ausserlich sichtbar wird, eine Promutation exi- stieren muss, lasst sich durch folgenden Versuch nachweisen. Beim Kultivieren der Ascococcnsnmi2ir\it auf Würzegelatine und auf Würzeagar bei 20° — 30° erhalt man leicht ein beim fortgesetzten und raschen Überimpfen völlig konstantes Material. Wird davon eine Aussaat gemacht auf einen Kulturboden von der Zusammensetzung: Lei- tungswasser-Agar, 5% Rohrzucker, 0,05 KNO3, 0,05 K2HPO4, so bleibt die Form ebenfalls unverandert, wie oft die Überimpfung darauf auch stattfindet und zwar, was besonders bemerkenswert ist, sowohl beim raschen wie beim langsamen Über- impfen, indem in diesem Falie das Veraltern der Kultur keine Mutabilitatsursache ist. Wird nun aber von dieser Rohrzuckersalpeterplatte zurückgeimpft auf eine Würzegelatine oder eine Würzeagar bei 20" — 30°, so findet sofort Mutation oder, vielleicht besser gesagt, Atavismus statt nach //^rè/co/o-Normal, wenigstens war es nicht möglich, die dabei entstehende Mutante deutlich von der Normalform zu unter- scheiden. In diesem Falie war es auch möglich, annahernd die Zahl der Atavisten festzustellen. Hier haben wir also ein Beispiel einer bekannten Nahrungsbedingung, welche einen bestimmten Erfolg bezüglich der Mutation auslöst. Dass dabei der ge- bundene Stickstoff der Nahrung die Hauptrolle spielt, ist wohl sicher, das Wie bleibt allerdings vorlaufig noch unklar. Es verspricht dieser Versuch bei weiterer Aus- arbeitung eine Vertiefung unserer Einsicht in den Mutationsvorgang sowohl nach der qualitativen wmc der quantitativen Seite. 55 3- Mutabilitatbei Leuchtbakterien. a. übersicht der Hauptarten. An den hoUandischen Kusten finden sich sowohl im Meereswasser, wie auf lebenden und eben abgestorbenen Meerestieren drei allgemeinere und zwei seltenere Leuchtbakterienarten. Die allgemeineren sind B. phosphoreus, B. indicus und B. luminosus; die selteneren B. Fischeri und B. degenerans. B. phosphoreus ist iden- tisch mit Micrococcus phosphoreus C o h n und ist f rüher von mir als Photobacter phosphorescens beschrieben ; die meisten Formen dieser Art verflüssigen Nahr- gelatine nicht. Alle übrigen genannten Arten tun dieses mehr oder weniger stark. B. luminosus ist die gewöhnliche stark verflüssigende Leuchtbakterie des Küstensan- des und des Meereswassers, namlich in bestimmten Jahren, und kommt auch allge- mein im Austernmagen vor. B. indicus ist in anderen Jahren, besonders in den Monaten August und September, haufig im Nordseewasser und auf dem Plankton desselben, diese Art wurde zuerst von F i s c h e r isoliert bei St. Croix im Atlanti- schem Ocean^). B. Fischeri ist eine ganz abweichende sehr variable Form, be- sonders der Ostsee, und kommt nur selten auf Nordseeplankton vor. B. degenerans ist im Herbst ziemlich oft auf Meeresfischen zu finden und steht Fischeri nahe. Von diesen verschiedenen Arten sind Fischeri und Degenerans unter allen Be- dingungen einem langsamen Degenerationsprocesse unterworfen, wodurch sie ihre Vegetationskraft und Leuchtvermögen allmahlich verlieren und für jede Versuchs- anstellung unbrauchbar werden. Phosphoreus und Indicus dagegen mutieren auf eine ahnliche Weise wie Prodigiosus, wobei Mutanten von verschiedener Leuchtkraft er- halten werden von ungefahr derselben Konstanz, wie diejenige der Stammform. Für Luminosus steht noch nicht fest, ob dabei die erste Form der Variabilitat allein vor- liegt oder auch gewöhnliche Mutation; jedenfalls sind die Sprünge bezüglich des Verlustes an Leuchtkraft dabei viel weniger deutlich wie bei Indicus. b. Mutation bei Bacillus indicus. Diese Art eignet sich am besten für Mutationsversuche, weil es leicht ist, die- selbe Jahre lang völlig konstant zu halten. So habe ich den Stamm, welchen ich im Tahre 1886 von Herrn F i se her erhielt, als er von der Planktonreise im Atlantischen Ocean zurückkehrte, noch immer in Kultur und konnte im Sommer 191 1, bei speziell dafür angestellten Versuchen, keinen deutlichen Unterschied bemerken verglichen mit dem Zustand, wie derselbe in 1886 war. Es ist dieses auch deshalb bemerkens- wert, weil wir den Stamm fortwahrend für einen Selektionsversuch verwendet haben, indem wir daraus viele hunderte Male die augenscheinlich starkst leuchtenden Ko- loniën ausgesucht und weiter kultiviert haben. Obschon dieses ungefahr 25 Jahre lang fortgesetzt ist, wurde dabei kein anderes Resultat erhalten wie das genannte: Die Leuchtkraft blieb nahezu unverandert. Vom Plankton der Nordsee haben wir im Laufe der Jahre viele Stamme dieser interessanten Bakterien isoliert, wovon einzelne besser leuchteten wie der Stamm ') Zeitschr. f. Hygiëne Bd. 2. S. 54, 1887. 56 von F i s c h e r. Ein paar dieser Stamme habe ich früher als Splendidum und Splendor maris besprochen. Ohne scharfe Selektion degenerieren alle untersuchten Stamme allmahlich, jedoch mit ungleicher Schnelligkeit. Bei der schnellen Uber- impfung bleibt die Hauptform konstant, das heisst, es werden dabei keine Mutanten abgeworfen und auch von Degeneration wird nichts bemerkt. Die Tatsache, dass es gelungen ist, die Stammkultur seit 1886 nahezu unverandert beizubehalten, ist wolil der beste Beweis dafür, dass die Bakterienarten bezüglich ihrer Konstanz ganzlich mit den höheren Organismen übereinstimmen. Weil diese Art im Laufe der Jahre wiederholt vom Nordseeplankton isoliert wurde, war es möglich, die Artcharaktere davon durch den Vergleich der alten Stamme mit den Neuen sehr gut kennen zu lernen, obschon ein guter Anhaufungs- versuch dafür noch fehlt. Vier verschiedene Mutanten können aus den veralteten Kuituren isoliert wer- den, welche mit Inbegriff der Normalform die folgenden sind: 1. Bacillus indicus, Normalform. 2. » » parvus. 3. » » semiobscurus i. 4. » » » 2. 5. » » obscurus. Die ParvusmutdLi^te unterscheidet sich von der Hauptform durch die Kleinheit der Koloniën sowohl auf Bouillonagar wie auf Gelatineplatten; sie besitzt also eine ge- ringere Vegetationskraft. Auch das Verflüssigungsvermögen ist dabei gering, ebenso die Beweglichkeit, welche Eigenschaften an Degeneration erinnern, die jedoch in diesem Falie gar nicht vorliegt, wie schon aus der, der Parz'M.ymutante eigenen, allerdings schwachen Schleimerzeugung hervorgeht. Diese Mutante ist bemerkens- wert durch die ausserordentliche Leichtigkeit ihres Atavismus zur Stammform, wo- durch die in flüssigen Nahrmedium geführten Kuituren leicht die Meinung erwecken, dass hier nur eine fluktuierende Variation vorliegt, welche nur wahrend weniger Generationen einen reinen Parvusstamm liefert. Es handelt sich jedoch tatsachlich, wie gesagt, um Mutation, denn es lassen sich aus den Kuituren immer noch einzelne unveranderte Port^M.ykolonien erhalten. Bei dieser Mutante liegt der eigentümliche Fall vor der direkten Beeinflussung von der Mutation der Hauptform nach Parvus durch Kultur bei Temperaturen unterhalb ca. 22 " C, und Atavismus von Parvus nach der Hauptform durch Kultur oberhalb 25" C, was zur Folge hat, dass die im Laboratorium bei Kellertemperatur aufbewahrten Kuituren sich immer sehr reich an Parvusmntainttn zeigen. In den Plattenkulturen auf Bouillonagar wird die Parvusmutantt dann und wann in sehr grosser Anzahl als Sekundarkolonien erzeugt, welche langst nachdem die Kultur übrigens dunkel geworden ist, ihre Leuchtkraft beibehalten haben. Hieraus geht hervor, dass diese Mutante, trotz ihrer geringeren Vegetationskraft, durchaus nicht als durch Degeneration entstanden aufzufassen ist; vielmehr handelt es sich dabei um eine Gewinnmutante. Die ObscurusmutsLiüQ entsteht mit besonderer Leichtigkeit in frisch von Plank- ton isolierten Kuituren von B. indicus; schwieriger in den wahrend langerer Zeit im Laboratorium kultivierten und wiederholt übergeimpften Stammen dieser Leucht- bakterie. Doch lasst sich die Chance, dieselbe aufzufinden, vergrössern durch Kultur 57 bei Temperaturen oberhalb derj enigen des Leuchtkraftmaximums, also oberhalb 25° — 30" C, in Fischbouillon mit 3% Kochsalz. In solchen Kulturflüssigkeiten findet man nach ein paarmal Überimpfen die ObscurusmutSinte neben der unveranderten Hauptform. lm Wachstum und Verflüssigungsvermögen unterscheidet sie sich von der letzteren durch eine schwachere Intensitat dieser Funktionen, welche jedoch die- jenigen der Parvusmutante noch weit übertreffen. Auch mikroskopisch ist die Ver- schiedenheit ziemlich gross, indem Hauptform und ParvuSj in den Plattenkulturen immer, in Flüssigkeiten gewöhnlich sich als kleine vibrioartige Glieder vortun, wah- rend Obscurus aus langeren Stabchen oder Faden besteht, welche etwas dunner wie die Glieder der Hauptform sind. Bezüglich der Leuchtkraft der O bscur usmuta.nte veranlasst ein oberflachliches Studium zu schliessen, dass diese ganzlich fehlt. Es hat sich aber herausgestellt, dass alle genau untersuchten Obscurusmuta.nttn tatsachlich eine sehr geringe Leuchtkraft besitzen, welche jedoch erst dann bemerkbar wird, wenn man, durch langeres Ver- weilen im Dunkeln, die Empfindlichkeit des Auges genügend gescharft hat. Ver- weilt man kürzer wie zwanzig Minuten oder eine halbe Stunde in einem vollstandig dunkeln Zimmer, so ist man noch nicht sicher, möglichst empfindlich zu sein und kann das Licht der Obscurusmutdinte noch nicht sehen. Seitdem ich auf diesen Umstand aufmerksam geworden bin, habe ich, wie gesagt, noch keine vöUig dunkle Obscurus- mutante gefunden. Es ist dieses interessant in Verbindung mit der Frage nach der Möglichkeit oder Unmöglichkeit des Atavismus, welcher hier auf eine ahnliche Weise wie bei den Albusmuta.nten von B. prodigiosus zur Beobachtung kommt. Man bemerkt letztere Erscheinung in den lange aufbewahrten ObscurusknWnvtu durch die Entstehung sehr kleiner, nur im völligen Dunkel sichtbarer Sekundar- kolonien der Normalform, kenntlich durch ihre hohe Leuchtkraft. Diese Koloniën liegen jedoch in der Mitte der nicht leuchtenden Masse und sind daraus nur sehr schwierig zu trennen und in Reinkultur zu bringen, was daher rührt, dass dieselben zwar stark leuchten, jedoch aus sehr wenigen Keimen bestehen. Wie mühevoU es aber ist aus einem Gemisch von zwei nahe verwandten Formen die eine zu isolieren, welche darin nur in geringer Keimzahl vorkommt, ist allbekannt, besonders, wenn wie im vorliegenden Falie gute elektive Trennungsmethoden unbekannt sind. In einzelnen Fallen ist diese Trennung jedoch gelungen, wobei sich herausgestellt hat, dass der Atavist wieder identisch mit der Hauptform ist. Die Voraussetzung, dass der Rückschritt beim Atavismus nicht sofort zur Hauptform, sondern zu den Semi- obscurusmwid^nitn würde führen können, trifft hier nicht zu. Von den S emiobscur^dsnmianitn sind eine Zweizahl als verschieden erkannt. Be- züglich der Frage, ob es deren noch mehrere giebt, herrscht zur Zeit noch die gleiche Unsicherheit, wie bei den i?o.y^Mjmutanten von B. prodigiosus. Es giebt jedoch einen Umstand, welcher in beiden Fallen dafür zu sprechen scheint, dass es von diesen Zwischenformen nur eine sehr beschrankte Zahl geben kann, und das ist die Art und Weise, wie der Atavismus stattfindet. Es stellt sich namlich heraus, dass wenn die Obscurusm\xia.ntQ^ ataviert zur Normalform, die Leuchtkraft, wie gesagt in einem ein- zigen Sprunge zurückzukehren scheint, und zwar in ihrer vollen Intensitat. Das- selbe haben wir bezüglich der Pigmentbildung bei den Albusmnidinitn von E. pro- digiosus gesehen. Da es sich nun bei B. prodigiosus als allgemeine Regel herausge- stellt hat, dass beim Atavismus der beim Mutieren zuletzt gemachte Sprung, und 58 dieser allein, zurückgangig gemacht wird, muss ofïenbar angenommen werden, dass bei der Entstehung der Obscnrusmuta.ntQn ebenfalls durch einen einzigen Sprung die Leuchtkraft vollstandig verloren geht. Ein solcher Sprung entspricht einer einzigen Zellteilung; die Semiobscurusmuta.nten können nach dieser Erfahrung nicht betrach- tet werden Phasen zu reprasentieren, welche notwendig durchlaufen werden mussen, wenn aus der Normalform die Obscurusform entsteht. Es muss jedoch bemerkt wer- den, dass dieser Schluss noch nicht als vollstandig erwiesen zu betrachten ist. Denn einerseits muss an die Möglichkeit gedacht werden, dass beim Atavieren eine Semi- obscurusmutantt zwar geblidet ist, jedoch sofort durch èinen vs^eiteren Sprung in die Hauptform umgewandelt wurde. Anderseits muss beachtet werden, dass wohl für B. prodigiosus die aufgestellte Regel für den Atavismus allgemein zu gelten scheint, dass jedoch die Erfahrung noch nicht genügend umfangreich ist, um daraus auf irgend ein Gesetz zu schliessen, so dass ein Überspringen von Mutationszustanden beim Atavismus für andere Falie nicht ausgeschlossen erscheint. Weil die diesbezüg- lichen Versuche noch keinen entscheidenden Aufschluss gebracht haben, können die- selben hier übergangen werden. Bei den höheren Organismen sind die Erfahrungen bezüglich Atavismus noch viel zu unvollstandig, um dafür jetzt schon irgend eine Regel aufzustellen. c. Degenerationserscheinung bei Bacillus phosphoreus. Obschon nicht gehörig zu den Mutationserscheinungen, sondern zu den erb- lichen Degenerationen, moge hier noch die folgende Eigenschaft der gewöhnlichen, nicht verflüssigenden Leuchtbakterie Bacillus phosphoreus in Erinnerung gebracht werden. Es handelt sich um folgendes Verhalten. Wenn man diese Bakterie frisch isoliert von Schollen oder anderen Meeres- tieren, welche wahrend der Wintermonate gefangen und versandt werden, so findet man, dass die bei Kellertemperatur, also zwischen io° und 15" C. gehaltenen Rein- kulturen, als feste, in einem Stücke von der Fischbouillongelatine abhebbare Ko- loniën, welche mikroskopisch an Sarcinen erinnern, hervortreten. Impft man auf gleichem Kulturboden bei dieser niederen Temperatur weiter über, so bleibt die ge- nannte Eigenschaft mit vöUiger Konstanz fortbestehen. Wird das Überimpfen je- doch bei höheren Temperaturen ausgeführt, so ist anfangs auch Konstanz dabei zu beobachten. Dieses dauert jedoch nicht lange; meistens schon bei der zweiten oder dritten Impfung beginnt eine Erweichung am Rande der Koloniën zu entstehen, in deren Innerem sich noch eine feste Zoogloea befindet. Bei einer weiteren Uber- impfung geht leztere ganzlich verloren und es entsteht das bekannte weiche, sich in der Kulturflüssigkeit völlig vertellende Material. Bringt man dieses wieder zurück unter die ursprüngliche niedere Temperaturbedingung, so findet durchaus keine Rückbildung der Zoogloea statt. Diese ist auf keine Weise daraus wieder zu erhal- ten. Wie man sieht, handelt es sich hierbei also durchaus nicht um eine Modifikation, vergleichbar mit der farblosen Temperaturmodifikation bei B. prodigiosus, sondern vielmehr um einen Fluktuations- oder Degenerationsvorgang. Dass man beim Vornehmen der Isolierung dieser Leuchtbakterie bei Sommer- temperatur wenig oder nichts von dem hier beschriebenen Verhalten bemerkt, kann nach dem Vorgehenden nicht wundernehmen. 59 4. Mutabilitatbei Chlorella variegata. o. Vorkommen und Reinkidtur. Die Gattung Chlorella besteht aus kugeligen oder ellipsoidischen Zeilen init einem einzigen grossen muschelschalenartigen Chloroplasten und mit innerer Zell- teilung. Die kleinen, jungen Zeilen sind meistens bewegungslos, doch ist es Herrn H. C. J a c o b s e n in einigen Fallen gelungen, bei Ch. variegata, kultiviert auf Lei- tungswasser-Agar mit Salzen, kleine langliche, monociliate Schwarmer zu ca. i6 innerhalb einer Zelle zu finden, welche sich nach der Infreiheitstellung fortbewegten (Taf. III Fig. d). Die Chlorellen bewohnen stark verunreinigte Gewasser, Lösungen verschiedener Salze, welche in den Laboratorien im Lichte aufbewahrt werden, wie diejenigen von Magnesiumsulfat, Natriumphosphat und Aluminiumsulfat (hiervon selbst lo Pro- zentige), anderseits auch lange aufbewahrtes destilliertes Wasser, und schliesslich Schleimflüsse und Saftflüsse, welche aus Baumstammen fliessen, wenn durch Weiden- holzraupen (Cossus) angegrifïen. Chlorella variegata ist an den beiden zuletzt genanten Stellen angetroffen, zu- gleich mit der Gattung Protothea, welche aus Chlorella hervorgegangen ist. Am Sichersten gelingt die Isolierung aus Saftflüssen. Wird Material davon abgeimpft auf Biergelatineplatten, so entwickeln sich aus den Chlorellaktimtn anfangs beinahe farblose Koloniën, welche sich erst nach mehreren Tagen im Lichte erst gelb und dann intensiv grün farben. Im farblosen Stadium sind dieselben kaum von Proto- theca zu unterscheiden, doch besitzen sie einen etwas gelblichenStich, der jedoch erst bei genauer Betrachtung sichtbar wird. Ist einmal das gefarbte Stadium erreicht, so kann dieses nicht mehr derweise rücklaufig gemacht werden, dass dadurch wieder die genannte farblose Anfangsphase erreicht wird, woraus hervorgeht, dass beim Uber- gange aus der Natur in die Kultur eine bleibende Umwandlung stattfindet, die ofifen- bar sich über alle Individuen erstreckt und als erbliche fluktuierende Variation auf- gefasst werden muss. Ausser Chlorella variegata sind noch zwei andere Arten derselben Gattung in denSchleimflüssen gefunden ^), namlich C. protothecoides Krüger und C. saccharo- phila (Chlorothecium saccharophilum) Krüger. Eine dritte Art, namlich Chlorella ■vulgaris, wurde aus Wasser isoliert, dieselbe ist C. variegata sehr ahnlich, hat aber in den Kuituren keine Aureamuidinie. erzeugt. Eine vierte Art, C. microscopica, welche ebenfalls in Grabenwasser vorkommt, besteht aus Zeilen sehr verschiedener Grosse, wovon die kleinsten nicht mehr wie 0,5 bei i |a messen, also so klein sind, wie die kleineren Bakterienarten. Eine fünfte Art, C. xantheUa, welche gelb ge- farbt ist, wurde aus künstlichem Meereswasser isoliert. b. Mutation. Abgesehen von der soeben besprochenen Variation zeigen die Kuituren nach einiger Zeit eine andere Veranderung, welche den Charakter einer Mutation tragt, und darin besteht, dass in den Impftstrichen gelbgefarbte Sektoren, in den Kolonien- ') W. Krüger, Organismen des Saftflusses der Laubbaume. Zopf's Beitrage zur Physiol. und Morpholog. niederer Organismen, Heft 4, S. 69, 1894. 6o kuituren gelbe Koloniën hervortreten, welche von Anfang an ihre, oft'enbar auf Ver- lust beruhende Eigenschaft, auf ihre Nachkommen fortpflanzen. Die gelbliche Far- bung der auf diese Weise erhaltenen y^wr^omutante beruht auf der Eigenschaft des Chloroplasten nur an einer einzigen, oder an einigen wenigen eng umschriebenen Bezirken das Vermogen zur Farbstoffbildung bewahrt zu haben, welches Vermogen übrigens im Chloroplasten verloren gegangen ist. Die Mutation beruht also nicht auf dem Verlust des Chloroplasten selbst und kommt in dieser Beziehung überein mit dem, was bei den albicaten Formen der höheren Pflanzen beobachtet wird, ist davon jedoch verschieden durch die nur teilweise grüne Farbung des Chloroplasten, welche Farbung von der normalen Intensitat ist, wahrend bei den höheren Pflanzen eine gleichmassige Gelbfarbung des Chloroplasten bei Aureaiormen vorkommen kann. Es ist bisher nur gelungen, ausser der spater zu besprechenden, vollstandig farblosen, eine einzige Mutante aufzufinden mit einer abgestuften Intensitat der Chlorophyll- farbung, welche weiterhin ChloreUa variegata aurea genannt werden soll. Wohl meint man beim Anfang des Studiums der Variabilitatsverhaltnisse eine ganze Reihe Zwischenstufen vor sich zu haben, doch lehrt die nahere Untersuchung, dass diese Stufen zur Hauptform oder zur ^j^r^omutante gehören, welche beide in allen Farbnüancen zwischen ihrer Hauptfarbe und sehr schwach grün vorkommen können, jedoch als Modifikationen, welche keine Konstanz zeigen. Dass Prototheca tatsachlich durch Mutation a.usChlorella entstehen kann, ist nur ein paar Male in Kuituren auf Agar mit Mineralsalzen von ChloreUa variegata in meinem Laboratorium vorgekommen, wobei einzelne farblose Koloniën von dieser so eigentümlichen Pilzgattung in der als neu zu betrachtenden Art P. Krügeri, gefun- den wurden. Spatere Versuche haben das gleiche Resultat zwar nicht wieder ge- geben. Hieraus folgt jedoch nur, dass die Mutation von ChloreUa nach Prototheca ein seltener Vorgang ist. Es stellt sich also heraus, dass unsere Art, sammt ihren Mutanten folgender- maassen zusammengesetzt ist^): 1. ChloreUa variegata, Normalform (Fig. 5 o, b, c, d). 2. » » at4rea (Fig. 5 a', a' , a'). 3. Prototheca Krügeri (Fig. i, 2, 3, 4, 5, 6 Taf. III). In mineralischen Lösungen, mit Kohlensaure als Kohlenstofïquelle, wachsen die Chlorellen im Lichte sehr intensiv und bilden darin dunkelgrüne Zeilen mit einem scharf begrenzten Chloroplasten, welcher mehr wie die Halfte der Zelle in dunner Schicht umspannt. Die Aureamnidinit wachst in dieser mineralischen Lösung an- fangs nur langsam mit Beibehaltung der gelben Farbe; bald findet dann jedoch Atavismus zur Normalform statt, und nur schwierig kann man von da an Aurea- zellen in derKultur zurückfinden. Da es uns nicht gelungen ist.y^wr^omutanten zu iso- lieren aus den »mineralischen« Kuituren der Normalform, steht es wohl fest, dass die Mutation von Normalform zu Aurea ausgelöst wird durch die Ernahrung mit orga- ') Der Zusammenhang der anderen Arten dürfte die folgende sein: Die grosszellige ChloreUa protothecoides Krüger gehort zu der ebenfallsauffallendgrosszelligenProfof/ieco chlorelloides (P. Beijerinckii der Kralschen Samrnlung), welche letztere also als Mutante der ersteren auf zuf assen ist. Die stark schleimige Prototheca moriformis Krüger ist wahrscheinlich eine sekundare Mutante von der viel weniger schleimigen Prototheca Krügeri und also auch wohl auf ChloreUa variegata zurückzuführen. 6i nischenVerbindungen. DieAusbildung des grünen Farbstoffes imChloroplasten istbei GegenwartorganischerNahrungwenigerdeutlich,wieindermineralischenNahrlösung> jedoch ist der Chloroplast selbst in beiden Fallen von ungefahr gleicher Ausdehnung. Die zweite Funktion des Choroplasten, namlich die Glycogenbildung, ist bei Gegenwart organischer Nahrung nicht verschieden von dem gleichen Vermogen bei der Autotrophie. Man könnte der Meinung sein, dass diese Substanz, welche ausser- halb der Zelle ziemlich stark wasserlöslich ist, auch ausserhalb des Chloroplasten und des Protoplasma's im Zellsaft gelost vorkommen sollte. Eine genaue Unter- suchung hat jedoch gezeigt, dass dieses nicht der Fall ist: überall, nicht allein bei Chlorella und Prototheca, sondern bei allen Algen, Pilzen und Mikroben, wo die Frage weiter verfolgt wurde, stellte sich heraus, dass das Glycogen ausschliesslich im Protoplasma und nicht ausserhalb desselben gefunden wird. Hierbei kommt der weitere Umstand, dass bei allen Pilzzellen auch innerhalb des Protoplasten selbst eine Lokalisation des Glycogens unzweifelhaft ist. Nicht also das Protoplasma im Ganzen erzeugt Glycogen, sondern dieses geschieht nur im Rahmen eines bestimmten, scharf umschriebenen Areales, oder einiger solcher Areale des Gesammtprotoplasma's. Bei den glycogenhaltigen Bakterien, wie diejenigen der Gattungen Megatherium und Aërobacter, ist die Glycogenablagerung dagegen nicht so deutlich lokalisiert, sondern findet in der ausseren Schicht des Bakterienkörpers statt. Doch bemerken wir bei der Granulosebildung in der Gattung Gramdohacter wieder eine Lokalisation. Vergleichen wir aus diesem Gesichtspunkt die Chlorellazelle mit der j enigen von Prototheca mit dem Mikroskope, nachdem in beiden eine Jodlösung das Glycogen rot- braun gefarbt hat, so bekommt man die Überzeugung, dass das in der Protothecazdlt lokalisierte Glycogen ebensowohl in einem, wenn auch farblosen Chloroplasten ge- legen ist als wie bei Chlorella in dem grün gefarbten. Mit anderen Worten, die farb- lose Zelle des Pilzes Prototheca besitzt ein spezifisches Organ für die Glycogenbil- dung, welches »Glycophor« genannt werden kann und durch einige wenige, wahr- scheinlich zwei, Mutationsvorgange aus dem Chloroplasten von der Grünalge Chlorella hervorgegangen ist. Es ist leicht, sich davon zu überzeugen, dass dieselbe Schlussfolgerung auch für die übrigen Pilze gilt, dass also auch dabei selbstandige Glycophoren vorkommen. Besonders überzeugend in dieser Beziehung sind die Al- kbholhefen, Endomyces, die Oidien und die Dematien, bei welchen allen die Lokali- sation des Glycogens auf ein, zwei oder mehr getrennte Bezirke, nicht nur bei der Ablagerung, sondern auch bei der Bildung davon in bestimmten Abschnitten des Protoplasten klar hervortritt. Auch bei den übrigen Glycogen erzeugenden Pilzen muss die Existenz be- sonderer Glycophoren als sehr wahrscheinlich betrachtet werden. Aus diesen verschiedenen Beobachtungen und Betrachtungen geht hervor, dass die zuerst von Sachs durchgeführte Ansicht des Parallelismus von Algen und Pilzen eine empirische Basis erhalten hat durch die Uberführung einer Chlorella in ein Prototheca. Und ferner, dass die bei der Mutation in den Chloroplasten der Alge entstehenden Veranderungen beweisen, dass dieselben das Vermogen Chlorophyll- farbstoff zu erzeugen zwar verloren, ihre selbstandige Existenz als Zellorgane, nam- lich als Glycophoren auch bei den Pilzen noch beibehalten haben. 62 5. Mutabilitat bei Schizosaccharomyces octosporus. a. Erwerbung dieser Hefe aus Naturmaterialien. Associationen und, mit günstigem Ausgangsmaterial, selbst aus einzelnen Sporen entstandene Stamme oder »reine Linien« der so merkwürdigen OctosporushQÏe, wer- den folgenderweise erhalten. Trockene Orientfrüchte, wie rohe Datteln, Korinthen, Rosinen, Feigen, werden in schwach angesauerter Malzwürze aufgeschüttelt, und bei 30" C. der Alkoholgarung überlassen. Die Schizosaccharomycessportn keimen dabei aus und oft findet man schon im mikroskopischen Bilde einer solchen Garung ein- zelne oder viele der so charakteristischen Zeilen unserer Hefe, gewöhnlich liegen diese aber zwischen einer Unmasse von anderen Hefen (besonders Saccharomyces zygosaccharomyces und 5". ellipsoideus). Die Reinigung findet dadurch statt, dass die rohe Hefe, durch Absetzen aus der Flüssigkeit und Decan- tieren concentriert, auf Filtrierpapier gebracht und bei 50" C. 24 Stunden lang ge- trocknet wird. Durch das Trocknen bei so hoher Temperatur sterben alle gewöhn- lichen Hefen ab und bleiben nur die Schisosaccharoniyceszellen lebendig. Das Papier wird in Stücke geschnitten, diese werden wieder in angesauerte Malzwürze gebracht und die daraus erhaltene Alkoholgarung ist dann meistens eine im Anfange reine Schizosaccharomycesgavung, woraus die Hefe selbst durch Plattenkultur rein ge- wonnen wird. Einzelne resistente Sporen von Weinhefen können in den spateren Phasen der Garung mit den Papierstücken zur Entwicklung gelangen; geschieht dieses zu früh, so kann eine Wiederholung des Trockenverfahrens notwendig sein. Die Populationen der auf diese Weise in Kultur gebrachten Schizosaccharo- myceten sind oft sehr einfach und bestehen meistens aus nur einem Octosporus- stamme. Von Datteln wurde jedoch bisweilen ein Gemisch von zwei mikroskopisch etwas verschiedenen Stammen der Octosporiishtit erhalten, wovon der eine, die Normalform, ellipsoidische Ascen hat, die zweite (Schizosaccharomyces octosporus contractus) in der Mitte eingeschnürte. Von Korinthen werden bisweilen Associationen von Schizosaccharomyces pombe und Sch. octosporus erhalten, wovon der Erstere, welcher hier nicht weiter be- trachtet werden soU, in mehreren Naturvarietaten oder nahe verwandten Kleinarten auf den Korinthen vorkommt. b. Mutation. Auf Malzwürze-Agarplatten wachsen die Koloniën der so gewonnenen Octo- sporushtie bei 30" zu ausgebreiteten Riesenkolonien aus. Diese sind anfangs flach und weiss und bestehen aus den noch vegetativen Hefezellen (Fig. 4 Taf. H) und vielen achtsporigen Ascen (Fig. 6 Taf. IV). Beim Veraltern der Kuituren, z. B. nach I bis 2 Wochen, wachsen aus der Oberflache sekundare Koloniën hervor, welche sich als Mutanten herausstellen (Fig. 3 Taf. I). Es ist ganz leicht, drei verschiedene solcher Mutanten von der Oberflache beinahe jeder Kolonie in Reinkultur zu brin- gen, wobei man als Indicator zur scharfen Erkennung der Mutanten Jod verwenden kann, welches die Granulose enthaltenden Sporen dunkelblau und die vegetativen Zeilen, welche frei von Granulose und im Gegensatz zu den gewöhnlichen Hefen 63 auch glycogenfrei sind, nur gelblich farbt. Weil die Mutanten sich eben durch das Vermogen, eine grössere oder eine geringere Menge Sporen zu erzeugen, von der Hauptform und voneinander unterscheiden, bekommen die Sekundarkolonien beim übergiessen mit der Jodlösung eine violette Farbe, wenn sie nur wenige Sporen ent- halten, sie werden schwarzblau, wenn sie daran reich sind, und bleiben gelblich bei Abwesenheit derselben. Das Bild einer mit Jod übergossenen mutierten Kolonie zeigt demzufolge eine sich schwarz farbende Grundmasse, welche aus der in Ascen übergegangenen Hauptform besteht, woraus sich die violetten und gelben Sekundar- kolonien erheben. Werden diese letzteren in Reinkultur gebracht, so stellen sie sich als erblich konstant heraus, jedenfalls konstanter, wie die Mutterform, aus der sie entstanden sind, weil diese aus ihren Sporen wieder aufs Neue die gleiche Mutationserschei- nung zeigt, wahrend die Mutanten viel seltener mutieren und also gewöhnlich keine Sekundarkolonien erzeugen. Inzwischen giebt es ein paar Mutanten, welche leichter wie die übrigen mutieren und dann und wann neue Sekundarkolonien erzeugen, die cigentlich besser Tertiarkolonien oder tertiare Mutanten genannt werden können. Dieses gilt z. B. für die Asporus- und Seriatusm.VLi2initn 3 und 9. Überblicken wir die gesammten bisher beobachteten Mutanten, so ergiebt sich folgende Übersicht: 1. Schizosaccharomyces octosporus.^oxmsMoTm i 2. » » asporus. 2 3. » » » secundarius. 3 4. » » oUgosporus I 4 5. » » » 2 ^ 5 6. » » » 3 5 » » seriatus. 6 » » » sporoseriatus. 8 » » » secundarius. 9 Wozu dann noch sekundare Mutanten kommen von den drei Oligosporusiovmtn. welche bisher nicht weiter untersucht sind. c. Die Asporus- und Oligosporusmutanten. Die /^j/'orM.ymutante ist die am meisten auffallende, weil sie sehr allgemein ist und sofort durch ihre gelbe Farbe bei der Jodreaktion sich scharf von der übrigen Masse hervorhebt. Sie besteht (Fig. 7 Taf. IV) aus runden Zeilen, welche bei der Teilung zunachst Halbkugeln bilden, die sich dann etwas verlangern und wieder zu Kugeln anschwellen, wobei die meisten ganz frei werden oder zu kleinen Klumpen in Zusammenhang bleiben. Bei der Normalform (Fig. 4 Taf. II) sind die vegeta- tiven Zeilen verlangert und sind beinahe immer zu den bekannten Jochen, oder zu 8- bis 64zelligen Zellklumpen verbunden, wodurch es möglich wird, die Asporus- mutante in Kulturflüssigkeiten zu erkennen neben der Hauptform. In Bezug auf Enzymbildung und Garvermögen ist die ^^/'orj/.ymutante nicht von der Normalform zu unterscheiden, wie das bei den übrigen hier betrachteten Mutanten ebenfalls all- gemein und wahrscheinlich ohne Ausnahme zutrifft. 64 Merkwürdigerweise kann die As por usmutante aus ihren Koloniën auf Malz- würzeagar wieder Sekundarkolonien erzeugen, welche sich von ihrer Mutterform da- durch unterscheiden, dass sie mit Jod sich kaum gelb farben, und desshalb bei der Übergiessung einer alten Asporuskultur mit Jodlösung in Mitte des nicht mutierten Teiles der Koloniën an ihrer leichten Farbe kenntlich sind. Die Ursache der Farbverschiedenheit zwischen Asporus und ihrer Mutante nach der Jodbehandlung ist noch nicht völlig aufgeklart. Bei anderen Hefen, wo ahnliche Erscheinungen beobachtet werden, bewirkt ein ungleicher Gehalt an Glycogen die Difïerenz in der Intensitat der Jodfarbung. Bei Schizosaccharomyces ist dagegen kein Glycogen gegenwartig und die Blaufarbung durch Jod bei der Hauptform be- ruht auf der Gegenwart von Granulose in der Sporenwand. Die dois Asporus entstehende Mutante ist in der Tabelle als 5". octosporus asporus secundarius bezeichnet. Sie ist seltener wie die Asporusmutante selbst, und wurde niemals als direktes Mutationsprodukt der Hauptform aufgefunden. Auch diese ab- geleitete Mutante kann wieder mutieren, jedoch ist diese tertiare Form noch nicht weiter untersucht. Die in der Tabelle als 5". octosporus oligosporus i, 2 und 3 angegebenen Mutanten sind durch drei Hauptmerkmale von der Normalform verschieden, namlich, erstens, dadurch, dass sie zwar Ascen erzeugen, jedoch in geringerer Menge wie die letztere ; zweitens, durch die Entstehung der Ascen ohne vorhergehende Bildung von Brillen- zellen aus Zelljochen, also ohne Karyogamie, und drittens, durch das beinahe voU- standige Fehlen des Vermogens zur Bildung von Sekundarkolonien. Untereinander unterscheiden sie sich durch die verschiedene, für jede Mutante ziemlich konstante Anzahl von Ascen, welche Zahl gross ist bei i, kleiner bei 2, am kleinsten bei 3, was sich sehr scharf abspiegelt in der Intensitat der Jodfarbung. Bei diesen drei Mutanten erhob sich die wichtige Frage, ob sowohl aus deren Sporen, wie aus ihren vegetativen Zeilen bei weiterer Kultur wieder die Form selbst unverandert erhalten werden sollte oder ob sich zwischen diesen beiden irgend eine Difïerenz würde feststellen lassen. Dazu ist eine grosse Menge Kulturmaterial der Mutante, durch das oben beschriebene Trockenverfahren, wobei die vegetativen Zeilen leichter absterben wie die Sporen, derweise bezüglich der letzteren ange- reichert, dass eine Aussaat eine sichere Erkennung der aus Sporen hervorgegangenen Koloniën möglich machte. Dieses haben wir wegen der besonderen Bedeutung der Versuche zu wiederholten Malen und mit verschiedenen Oligosporusiormen ausge- führt. Es hat sich dabei herausgestellt, dass kein Unterschied zwischen den beiden Kolonienarten bemerkbar ist, so dass wir in dieser Beziehung das gleiche finden, wie bei der Presshefe, wo es ebenfalls nicht gelang, Verschiedenheiten zwischen aus Sporen und aus vegetativen Zeilen hervorgegangenen Koloniën aufzufinden ^). Man sieht aus diesem Beispiele, dass die betrachteten OligosporusmutiLnten ebensowohl durch ihre Sporen unverandert zu vermehren sind, wie durch ihre vege- tativen Zeilen. Dieses Resultat war nicht a priori sicher. Weil die Mikrobenmutan- ten sich namlich mit den Knospenmutanten der höheren Pflanzen vergleichen lassen, ') Bei anderen Hefen wurde in den aus Sporen entstandenen Koloniën mehr Sporen gefunden, wie in den aus den vegetativen Zeilen entstandenen. Dieses ist ebenfalls wahr- nehmbar bei Schizosaccharomyces pombe. 65 welche aus ihren Samen gewöhnlich eine stark variable Nachkommenschaft er- geben, hatte man Ahnliches für die Oligosporusmut^nttn erwarten können, und ich meinerseits glaubte, ehe das Experiment anders belehrte, dass ich aus den Sporen die Normalform erhalten sollte. Da diese Voraussetzung also nicht realisiert wurde, soll noch etwas naher eingegangen werden auf die Frage der Ascusbildung bei der Hauptform und den Oligosporusmutanten. d. Ascusbildung. Der Vorgang der Ascusbildung ist für die Normalform genau untersucht durch Guilliermond, derselbe findet wie folgt statt. Zunachst erinnere ich an den Umstand, dass bei unserer Hefe in allen jungen Kuituren Doppelzellen oder Zelljoche gefunden werden, welche durch einen schmalen Kanal miteinander verbunden sind. Beginnt die Ascusbildung, so schwellen die bei- den Zeilen eines solchen Joches an bis zur Kugelgestalt, ohne dass dabei ihre Ver- bindung verloren geht, wobei die so eigentümliche »Brillenform« der Zellpaare ent- steht. Guilliermond hat nun nachgewiesen ^), dass in diesen »Brillen« Karyo- gamie stattfindet. Dieses geschieht derweise, dass die in den beiden Zeilen des Joches leicht nachweisbaren Zellkerne sich dem Kanal zu bewegen und dort ver- schmelzen. Sobald dieses geschehen ist, schwillt der feine Kanal, welcher auch mit einem kurzen Verbindungsstiel verglichen werden kann, allmahlich ebenfalls an und zwar bis zu einer solchen Dicke, dass schliesslich aus dem Zelljoche eine einzelne grosse Zelle entsteht von ellipsoidischer Gestalt, mit der grössten Dicke in der Mitte, also gerade an der Stelle, wo einst der Verbindungskanal war. Bei diesem merkwür- digen Vorgange, der nirgendwo anders bei den Pilzen mit solcher Klarheit hervor- tritt, sieht man den einen von den beiden Faktoren, woraus jeder vollstandige Sexualitatsprocess besteht, allein und unabhangig vom zweiten Faktor in Wirkung. Jeder vollstandige Sexualprocess umfasst namlich, erstens die Karyogamie, zweitens die Amphimixis ^). Amphimixis beruht auf Cytogamie zwischen Zeilen verschie- dener Herkunft. Dass Amphimixis ein essentielier Vorgang bei der Sexualitat ist, steht fest seit dem Erscheinen von D a r w i n's »Origin of Species«. Dass dabei Karyogamie vorkommt, braucht hier natürlich nicht bétont zu werden. Erst in den letzten Jahren ist die ziemlich allgemeine Verbreitung von Karyo- gamie bei allerlei Pilzen, bei welchen Amphimixis sicher fehlt, durch Clausen, Dangeard, Harper und andere bekannt geworden. Wir haben dadurch einen Vorgang kennengelernt, welcher in seinem Erfolg sehr überraschend ist, denn die Verschmelzung zweier Kerne, welche zu Schwesterzellen gehören, die durch Tei- lung einer Mutterzelle entstanden sind und einander noch nicht einmal verlassen haben, erscheint auf den ersten Bliek etwas ganzlich Überflüssiges. Dennoch er- zeugt z. B. die Octosporushtit nur unter dem Einfluss von diesem Vorgang ihre Ascen, so dass darauf doch offenbar irgend eine Wirkung von prinzipieller Bedeutung ') Recherches cytologiques sur les levüres, pag. 164, Paris 1903. ^) Guilliermond verwendet die Worte Isogamie und Heterogamie. Für die Ver- schmelzung zweier Schwesterkerne, wie bei den Pilzen, ist der Ausdruck Isogamie allerdings richtig, nicht aber bei den copulierenden Organismen, wobei Heterogamie stattfindet und ausserdem Karyogamie zwischen Kernen verschiedener Herkunft. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 5 66 beruhen muss, über welche es gegenwartig nur möglich ist, unsichere Hypothesen aufzustellen. Tatsachlich sehen wir, dass nur die Nachkommen, welche aus diesen Ascen her- vorgehen, imstande sind, die ganze Reihe von Mutanten zu erzeugen, welche möglich ist, wahrend die Mutation bei den abgeleiteten, also den sekundaren und tertiaren Mutanten eine beschranktere ist. Letzteres ist auch wahr für die Oligosporns- mutanten, wo es schwierig ist, überhaupt sekundare Mutanten zu finden und zwar sowohl in den aus den vegetativen Zeilen, wie aus den aus Sporen hervorgegangenen Koloniën. Offenbar muss also zwischen den Sporen der Hauptform und denj enigen der Oligosporusmnidini&n eine Verschiedenheit existieren, welche erst in den spateren Nachkommen bemerkbar ist. Diese Verschiedenheit besteht wahrscbeinlich darin, dass bei der Bildung der Ascen der Oligosporusm\i\.^.x\ttn keine Karyogamie vorkommt, so dass diese Mutan- ten apogam sind. Es folgt dieses, wie es scheint, aus der Beobachtung, dass die Zell- joche hier nicht in das so eigentümliche »Bril!enstadium« übergehen. Das ist in guter Ubereinstimmung mit der Gestalt der Ascen bei diesen Mutanten, welche den Eindruck eines rudimentaren Organes machen, indem sie durcbaus nicht immer die ellipsoidische, stark angeschwoUene Form der normalen Ascen haben, sondern oft mehr unregelmassig sind und nur an angeschwoUene, gewöhnliche Zellpaare er- innern. Es ist dieses auch noch darum von Wichtigkeit, weil die Oligosporusm\x\.diW- ten eben in dieser Beziehung übereinstimmen mit der von Korinthen isolierten For- men von Schizosaccharomyces pombe, welche ebenfalls apogam ist, nur rudimentare Ascen erzeugt, und kein deutliches »Brillenstadium« durchlauft, aber ohne weiteres in den beiden oder nur in einer Zelle des Zelljoches direkt zwei oder vier Sporen bildet. Dieselben geben die Überzeugung, dass auch hier eine Kernverschmelzung fehlt. Es muss hier aber betont werden, dass Guilliermond bei den anderen Pombeiormen Karyogamie nachgewiesen hat, welche ahnlich verlauft, wie bei OctospOTMs. Durch die Tatsache, dass diese Pom&^formen sehr leicht Mutanten er- zeugen, welche sich bezüglich ihres Reichtums an Sporen unterscheiden und sehr stabil sind, schliessen sie sich ebenfalls an die Hauptform von Octosporus an. Der einzige Schluss, welcher sich inzwischen mit genügender Sicherheit aus diesen noch nicht völlig durchgearbeiteten Beobachtungen ableiten lasst, ist, dass die Karyogamie die Art mit ihren ursprünglichen Eigenschaften konstant halten kann. e. Das Konstanthalten der Kuituren. lm Anfang unserer Besprechung der Mutation bei Bacillus prodigiosus haben wir gesehen, dass das Konstanthalten der Kuituren möglich ist durch frühzeitiges Überimpfen bei günstigen Ernahrungsbedingungen, und wir haben dabei hervorge- hoben, dass dieses eine sehr allgemeine Regel zu sein scheint. Dass sie für die Octosporusheie ebenfalls guitig ist, ist leicht festzustellen. Es wurde ferner der Um- stand erwogen, dass die Sexualitat zwei unabhangige Prinzipien umfasst, namlich, das Prinzip der Protoplasmavermehrung der Keimzelle, welches hier also stattfindet durch die Verschmelzung zweier Kerne oder zweier Zeilen, und das D a r w i n'sche Prinzip der Amphimixis, welches der Blumentheorie zugrunde liegt und aussagt, dass Cytogamie zwischen Zeilen, welche nicht allzunahe verwandt sind, nützlicher ist für die Nachkommen, wie Cytogamie zwischen Nachstverwandten. 67 Hier muss unter »nützlich« variabel verstanden werden, denn es ist zweifellos, dass nur in der Erhöhung der Variabilitat, das heisst in der Erhöhung der Zahl der Kombinationen, die eigentliche Bedeutung der Amphimixis und der zahllosen Ein- richtungen, welche Kreuzung sichern, gelegen ist. In Verbindung mit dem Schluss des vorgehenden Paragraphen nach welchem die Karyogamie die Spezieseigenschaf- ten stabilisiert, die Mutation zunachst vorbeugt, in der Zukunft ermöglicht, ist es also klar, dass bei der sexuellen Verschmelzung zwei in gewisser Beziehung einander ent- gegengesetzte Vorgange zustande kommen: ein die Form gegen Abanderung schüt- zender, und ein die Chance auf Abanderung vergrössernder Vorgang. Das Merk- würdige und auf den ersten Bliek Paradoxale dabei ist, dass im Pilzreiche, wo die Variabilitat eine excessive gewesen und sicher noch ist, eben der Vorgang, welcher die Variabilitat begunstigt, namlich die Amphimixis, gewöhnlich fehlt. Bedenkt man aber, dass selbst bei den sich rein vegetativ fortpflanzenden Pilzformen die Muta- tionen allgemein vorkommen, so sieht man, dass die Amphimixis dann auch eben hier eine überflüssige Einrichtung werden konnte, weil auch ohne dieselbe schon ge- nügend neue Formen entstehen, um die in der Natur noch offenen Stellen zu be- völkern. Die Frage, warum die Pilze auch ohne Amphimixis so sehr variabel sind, dürfte wohl mit dem Saprophytismus zusammenhangen, wobei in den veralternden Kuituren überall die Bedingungen für die Auslösung der Mutationen vorhanden sind, unter dem Einfluss von allerlei chemischen Absonderungsprodukten, deren Wirkung auf die Mutation, besonders bei B. prodigiosus so deutlich nachweisbar sind. Das alles lasst sich zur Erklarung der Eigenschaften der Octosporushtie gut anwenden. Dass dabei sowohl die Karyogamie wie eine kraftige Ernahrung und Vorbeugung des Veralterns der Kuituren die Mutantenbildung verhindern, wurde schon betont, und dieses erhartet unseren Vergleich der Zellverschmelzung mit einem Ernahrungsprocesse, weil beide zu Protoplasmavermehrung veranlassen. Dass ander- seits das D a r w i n'sche Prinzip der Amphimixis hier gar nicht realisiert ist*), kann in Übereinstimmung mit der grossen Mutabilitat dieser Hefe nicht wunder- nehmen. Dass übrigens auch die Karyogamie in der Gruppe der Schizosaccharo- myceten im Verschwinden begrifïen ist, lehren uns einerseits die Oligosporus- und ^.y/>or«.ymutanten der Octosporusheie, anderseits wird dieses erwiesen durch das Ver- halten der zweiten Art dieser Gruppe, namlich Schizosaccharomyces pombe, welche zwar Sporen erzeugt, jedoch anstatt acht nur eine Vierzahl in rudimentaren, un- regelmassig gestalteten Ascen, bei deren Entwicklung allerdings nach G u i 1 1 i e r - mond Karyogamie normalerweise stattfinden soll, wo dieser Autor jedoch auch, namlich bei einer Unterart, Apogamie constatiert hat -). Nach meiner Ansicht ist letztere bei dieser Hefe eben die Regel, Karyogamie Ausnahme. Dass die Pombehefe auch eine stark veranderliche Hefe ist, zeigt sich in der I-eichtigkeit, womit dabei Abanderung in der Sporogenese stattfindet und wodurch eine Reihe von Stammen dieser Hefe zu erhalten ist, welche sozusagen mit den Oligosporus- und den As por usmxxidinitn der Octosporusheie parallel gehen. ') Die von einigen Mikroskopikern ausgesprochene Ansicht, es sollen bei der Octo- sporusheie frei herausschwimmende Zeilen copulieren, ist sicher unrichtig. ') Copulation du Schizosaccharomyces mellacei, Annales de la société Botanique de Lyon 1903. 68 Auch hier wird j edoch sowohl durch kraftige Ernahrung wie durch Karyogamie die Mutabilitat vorgebeugt, die Rasse also konstant gehalten. f. Die S er iatusmut anten. Wir gehen über zur Besprechung der 6"^nof?/jmutanten der Octospornshtit. Diese sind viel seltener wie die vorhergehenden und würden auch nicht bei allen Kulturstammen gefunden, sondern nur bei einem von rohen Datteln isolierten Stamm '). Wie der Name andeutet, besteht diese Mutante (Fig. 9 Taf. IV) aus Zellenserien und nicht, wie die Normalform und die anderen Mutanten, aus Einzelzellen oder Zelljochen oder Gruppen von Jochen. Dieselbe erinnert dadurch an ein vielzelliges Pilzmycel und da die Teilzellen sich auch verlangern können, ist der Name »Faden- mutante« dafür zutreffend. Beim ersten Aufïinden auf einer Würzeagarplatte war diese Mutante nicht soTort konstant, sondern als die Kolonie übergeimpft wurde, ent- wickelten sich daraus neben einzelnen neuen Seriatus- viele ^j/'orMjmutanten. Dieses hat sich bei ein paar weiteren Überimpfungen wiederholt, spater jedoch nicht mehr. Dagegen hat sich in den spateren SeriatuskuXi-ürtn eine neue Mutation ereignet, welche darin bestand, dass einzelne Zeilen Sporen erzeugt haben, welche Eigenschaft sofort erblich übertragbar war und zur Aufstellung des Namens Sporoseriatus ver- anlasste. Man kann diese Form als eine Parallelform zu den Oligosporusmviidint&n. betrachten, denn die Sporen bildenden Ascen sind auch bei Sporoseriatus rudimentar ausgebildet, enthalten nur ausnahmsweise acht, dagegen gewöhnlich vier oder sechs Sporen, und machen durchaus den Eindruck, dass sie nicht durch Karyogamie ent- stehen, was jedoch noch nicht sicher entschieden ist. Mit Ausnahme von Seriatus sind bei den verschiedenen Mutanten der Octo- sporusheie atavistische Erscheinungen nicht bei Kulturversuchen, sondern nur aus- nahmsweise bei vereinzelten Zeilen der ^^/'orH.ymutante im mikroskopischen Pra- parate bemerkt, und dann war es nicht ganz sicher, ob wohl die Hauptform zurück- gebildet war oder eine der letzteren nahestehende Oligosporusïorm, was an ver- einzelt liegenden Ascen nur schwierig festzustellen ist. Di-e 5"^rm;M.ymutanten da- gegen zeigen, solange sie noch nicht ganz stabil sind, Atavismus wobei daraus ge- wöhnliche Asporusmutantcn hervorgehen, weil Seriatus eine sekundare aus Asporus entstandene Mutante ist. Früher haben wir gesehen, dass die Asporusmutante wieder asporogene Sekun- darkolonien erzeugen kann, welche direkt sichtbar sind, und auch durch Jod anders wie ihre Mutterkolonie gefarbt werden. Es stellt sich heraus, dass Gleiches bei der Seriatusmutante vorkommt, wobei eine Form entsteht, welche in der Tabelle als Seriatus sekundarius bezeichnet ist. Einer genaueren Untersuchung ist dieselbe noch nicht unterworfen, nur wurde festgestellt, dass sie konstant ist und im Gegensatze zu der Mutante P. octosporus seriatus sporoseriatus keine Sporen erzeugt. ') Eine ahnliche Mutation bei Schizosaccharomyces mellacei ist von Lepeschkin beschrieben, Centralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt. Bd. 10, pag. 145, 1903. ög g. Die V erschiedenheit swischen Mutanten und Hanptform. Wenn man die Mutanten von S. octosporus mit der Normalform vergleicht, nmss es auffallen, dass dieselben daraus einerseits mit einer so ungewöhnlichen Leichtigkeit entstehen und anderseits, dass sie so sehr verschieden von ihrer Stamm- form sind, dass dabei eher an eine generische, wie an eine spezifische Trennung ge- dacht werden kann. Dieses veranlasst zur Frage, ob es wohl richtig ist, bei diesem Tatbestand die Mutanten mit den konstanten Varietaten der Literatur zu verglei- chen, und ob daraus nicht geschlossen werden muss, dass es Einheiten einer ganz anderen Natur sind. Für eine solche Auffassung liegt jedoch keine genügende Ur- sache vor. Man kommt namlich leicht zur Ein^cht, dass es noch andere erblich stabile Einheiten giebt, wie die Arten und Varietaten, welche dennoch mit diesen parallelisiert werden mussen, weil sie ebenfalls durch Mutation entstehen. Ich denke hierbei namlich an denjenigen Vorgang der wegen der Natur der dabei entstehenden Produkte »Organbildende Mutation« zu nennen ist, und der im nachsten Kapitel noch weiter besprochen werden soll. Hier wünsche ich nur zu bemerken, dass die Ein- heiten, womit die Octosporusmnta.nten am besten verglichen werden können, einer seits die verschiedenen Formen der Heterostylen oder die Geschlechter der Poly- gamen und Diözisten bei den Pflanzen, anderseits die Hydroiden und die Schwimm- glocken bei den Cölenteraten unter den Tieren sind. Es mag nun etwas überraschend erscheinen, die letzteren Bildungen unter den Mutationsbegrifï zu bringen, wer je- doch die klassische Untersuchung von D a r w i n über Lythruni salicaria gelesen hat, wird die Analogie leicht erkennen. Dass man bei der Octosporushcit nur Mutanten findet, welche so ganzlich von der Hauptform verschieden sind und keine, welche der letzteren sehr nahe stehen, ist wahrscheinlich so zu erklaren, dass solche Parallelformeri wohl dann und wann in den Kolonienkulturen hervortreten, jedoch darin nicht erkannt werden eben wegen ihrer grossen Ahnlichkeit mit der Hauptform. Man muss jedoch nicht übersehen, dass die gleiche Bemerkung auch bezüglich aller anderen untersuchten Mikroben gemacht werden kann, weil es bekanntlich ausserordentlich schwierig ist, Mikroben voneinander zu unterscheiden, welche nicht ein scharf hervortretendes Merkmal be- sitzen, welches nur dem einen Stamme zukommt, beim anderen fehlt. Man denke bei- spielsweise an die Schwierigkeit, um Presshefe von obergariger Bierhefe zu trennen, die dennoch durch eine Reihe von Merkmalen voneinander verschieden sind. Selbst hat es sich als schwierig herausgestellt, überhaupt in der Natur abweichende Formen von der in unseren Kuituren so ausserst variablen OctosporushQiQ zu finden und trotz vieler Aufmerksamkeit konnte ich nur einmal eine solche Form erkennen. Dieses war der Fall bei Gelegenheit eines mit Datteln ausgeführten Akkumulationsver- .suches, wobei eine Association mit einer ebenfalls neuen Form von Sch. pombe er- halten wurde. Die neue Naturform wurde als S chisosaccharomyces octosporus con- tractus unserer Sammlung einverleibt, weil die achtsporigen Ascen in der Mitte eiwas zusammengezogen sind. Dieselbe mutiert auf die gleiche Weise wie die übrigen von Orientfrüchten isolierten Octosporussidimmt und stimmt, ausser bezüg- lich der genannten Verschiedenheit, in allen anderen Hinsichten mit den letzteren überein. Dass die beschriebenen Kulturmutanten nicht aus Naturmaterialien isoliert sind, 70 liegt einfach daran, dass die bisher bekannten Anhaufungsmethoden nur Populationen liefern, welche aus den Sporen entstehen; dabei können natürlich die Asporus- und Seriatusmni^^nit unmöglich, OU go s por usmntdinicn nur als seltene Ausnahmen er- wartet werden. Dass diese Mutanten j edoch auf den Orientfrüchten in der Natur gebildet werden können, ist sicher. Zusammenfassung. Fassen wir das über die Mutation der Octosporushtit Gesagte kurz zusammen. Weil auf Orientfrüchten vorkommend, kann man Populationen oder Associa- tionen dieser Species mit Sch. po^he erhalten, wenn man sich basiert auf die un- gewöhnlich grosse Resistenz der Sporen von Schizosaccharomyces beim Trocknen auf 50° C, gegenüber der viel geringeren bei der Gattung Saccharomyces, welche die gleichen natürlichen Fundorte bewohnt. Die Octosporusheit erzeugt in den Impfstrichen, sobald diese veraltern, mehrere Mutanten, von welchen bisher neun naher untersucht wurden. Dieselben sind sehr verschieden von der Hauptform, und weil sie als Sekundarkolonien entstehen, welche mit Jod sich gelblich oder violett farben, wahrend die Hauptform damit schwarz wird, sind sie sehr leicht in Reinkultur zu bringen. Sie zeigen dann grosse Kon- stanz und viel geringere Neigung zu atavieren, wie die früher betrachteten Bak- te ri en. Es ist bemerkenswert, dass bei allen diesen Mutanten das Vermogen zur Karyogamie, welches der Ascenbildung bei der Hauptform zugrunde liegt, mehr oder weniger vollkommen verloren gegangen ist. Dieses gilt selbst für die OUgosporus- mutanten, welche zwar Ascen erzeugen, jedoch gewöhnlich apogam sind und nicht ausschliesslich aus Zelljochen, sondern meistens aus Einzelzellen bestehen. Nirgendwo im Pilzreiche ist die Karyogamie und deren Erfolg so deutlich zu beobachten, wie bei Sch. octosporus, wo sie von Guilliermond in 1903 ent- deckt wurde. Die Karyogamie kann als Modus der Vermehrung des Kernplasma's mit einem Wachstumsvorgang verglichen werden. Dieser Vergleich wirft einiges Licht auf den Umstand, dass sowohl die Karyogamie, wie schnelles Überimpfen bei gunstiger Ernahrung den Octosporusstamm konstant halt, dem Mutieren also vorbeugt. Eigentliche Sexualitat fehlt bei Octosporus, weil dafür ausser Karyogamie das Darwin'sche Prinzip der Amphimixis realisiert sein muss, dass heisst die Copu- lation zweier Zeilen von verschiedener Herkunft, was hier nicht zutrifft. Wir wissen aber, dass die Mutation ein von der Amphimixis völlig unabhangiger Vorgang ist, obschon die Amphimixis, wie vor allem durch B a u e r betont wurde, die Ursache der Entstehung einer besonderen Gruppe von Variationen werden kann, welche er Kombinationen genannt hat. Die grosse Verschiedenheit zwischen der Hauptform von Sch. octosporus und ihren Mutanten muss wohl darin gesucht werden, dass es schwierig ist, nahe ver- wandte Mikroben voneinander zu unterscheiden, und man immer geneigt ist, dem deutlich Erkennbaren mehr Aufmerksamkeit zu schenken, wie dem schwer Erkenn- baren, die mit der Hauptform naher verwandten Mutanten mussen also noch gesucht werden. 71 Dass die Kulturmutanten der Octosporushtie auch in der Natur entstehen, ist unzweifelhaft. Dass sie nicht bei den Akkumulationsversuchen gefunden werden, folgt aus der Seltenheit der Sporenbildung bei denselben, weil diese Versuche auf die Existenz der Sporen basiert sind. 6. Mutabilitat bei Saccharomyces. o. Mutabilitat der Glycogenbildung. Die meisten Saccharomycesairten sind sehr instabil, nur die Presshefe besitzt eine viel grössere Konstanz, wie die anderen Arten, und auch die kuhivierten Bier- hefen, obschon veranderlicher wie Presshefe, sind viel konstanter wie die wilden Formen. Es ist deshalb sicher, dass die Kultur und die damit verbundene ziemlich strenge Selektion, die Formen einigermaassen stabilisiert hat. Inzwischen kann man wenigstens von der gewöhnlichen Oberhefe (ich untersuchte einen Stamm, welcher in der Brauerei »De Oranjeboom« in Rotterdam verwendet wird), doch ziemlich leicht Mutanten bekommen, welche sich in ihrem Glycogengehalt unterscheiden. Da- zu lasse man die Koloniën zu Riesen-Kolonien auf Würzeagarplatten auswachsen und, nachdem die Kuituren alt geworden sind, z. B. nachdem dieselben drei bis vier Wochen aufbewahrt sind, werden sie mit Jodlösung übergossen. Man wird dann sehen, dass sich in den Hauptkolonien entweder scharf erkennbare Sekundarkolonien oder Sektormutanten gebildet haben können, wekhe eine deutliche Differenz im Far- benton zeigen, die sich als erblich erweist. Um diese Erblichkeit zu sehen, muss die Reinkultur der Mutante wieder veraltern, denn ehe diese Veralterung stattgefun- den hat, ist der Glycogengehalt in allen Zeilen zu hoch, um dazwischen einen Unter- schied zu bemerken. Auch ist es nötig, die zu vergleichenden Kuituren nebeneinan- der auf der Kulturplatte abzustreichen und dann mit Jod zu übergiessen, weil an- ders der Vergleich erschwert wird wegen der Subtilitat der Differenz. Bei einer Prüfung dieser Mutanten bezüglich ihrer übrigen Eigenschaften gelang es noch nicht, ausser in ihrem Glycogengehalt, dieselben voneinander und der Mutterform zu differenzieren. b. Mutabilitat der Sporenbildung. Sehr variabel ist bei allen SaccharomycesdiXitn das Vermogen zur Sporenbil- dung, und dass die dabei sich aussernden Differenzen auf Mutation beruhen können, habe ich früher gezeigt ^). Mit etwas Geduld kann man durch die Anwendung der damals angegebenen Se- Jektionsmethoden aus den stark sporulierenden Koloniën, bei wilden Hefearten, welche ihr Vermogen zur Sporulation mehr oder weniger verloren haben, wieder Stamme mit der ursprünglichen, starken Ausbildung dieser Funktion zurückbekom- men. Die eigentliche Schwierigkeit dabei ist die richtige Unterscheidung der mutier- ') Régénération de la Sporogénèse. Archives Néerlandaises. Sér. 2, T. 2, pag. 269, i\ Centralbl. f. Bakt. Bd. 4, pag. 657, 1898. 72 ten Koloniën von den unveranderten in den Kolonienkulturen, wofür ich auf obige Abhandlung verweise. Ich glaube, dass diese Angelegenheit bei weiterer Ausarbei- tung sich als geeignet erweisen wird, einiges Licht zu werfen auf die so schwierige Frage der fluktuierenden Variation. c. Mutabilitat der Zellform. Eine dritte Reihe von mutabeln Eigenschaften bei den Alkoholhefen findet man in der Gestalt der Zeilen bei mehreren wilden Formen. Bemerkenswert in dieser Beziehung ist eine eigentümliche in Presshefe aufgefundene Art, welche auf Grund der schleimigen und flockenbildenden Eigenschaft ihrer Kuituren in Würze S. niuci- parus genannt wurde. Junge Kuituren auf Würzeplatten bestehen aus gleich geform- ten, rundlich-ellipsoidischen Zeilen von ca. 5 — 6 \x. Lasst man die Kuituren ver- altern, so wachsen am Rande der Impfstriche sehr langgestreckte Zeilen heraus, welche einigermaassen an kleine Mycodermazellen erinnern und Saccharomyces muciparus secundarius genannt werden mogen. Es stellt sich heraus, dass letztere bei weiterer Überimpfung sehr konstant sind, jedenfalls konstanter wie die Mutanten, welche immer wieder ihre Mutante hervorbringt, wahrend die Mutante selbst nur sehr schwierig durch Atavismus dann und wann eine runde Zelle erzeugt, die nach weiterer Vermehrung sich wieder der Mutterform ahnlich herausstellt. Wir sehen hier also etwas Ahnliches wie bei der Octosporiisheie: eine Hauptform, welche fort- wahrend mutiert, eine Mutante, welche viel stabiler ist, und wir erkennen darin wie- der einen Fall, welcher sich der »Organbildenden Mutation« anschliesst. d. Mutabilitat im Fettgehalt der Fett- oder Insektenhefen. Wieder ein anderes stark mutierendes Merkmal ist die Fettbildung bei den »In- sektenhefen«. Diese Hefen, welche beschrieben sind als Saccharomyces (Toruia) pulcherrimus Lindner^), sind leicht aus dem Kropf und dem Magen von Hummein und Bienen zu erhalten und sind daran kenntlich, dass sie bei frischer Isolierung auf Würzeplatten innerhalb jeder Einzelzelle einen grossen durchsichtigen Öltropfen führen, welcher deren Inhalt beihahe ganzlich anfüUt und dem mikroskopischen Bilde der vollstandig gleichen, 7 |i messenden, kugeligen Zeilen, eine ungemein zier- liche Struktur verleiht. Schon beim ersten Uberimpfen zeigen sich jedoch grosse Veranderungen in der Fettbildung und besonders in flüssiger Würze verschwindet die Eigenschaft so vollstandig, dass man dabei nach ein oder zwei Tagen eine ganz andere kleine, 4 — 5 u messende, fettfreie, etwas langliche Hefe bekommt (S. pul- cherrimus secundarius), welche man bei oberflachlicher Untersuchung als eine, durch Modifikation gebildete Pleonte ansehen kann. Diese letztere Auffassung ware jedoch unrichtig, denn bei erneuter Aussaat auf Platten lassen sich wieder einzelne Fettkolonien auffinden, die es ermöglichen, die ursprüngliche Ferm zu regenerieren. Die Hefe gart schwach und gehort zu den Glukosehefen ; die Garung ist dem Merkmal »Fettbildung« durchaus ungünstig, gunstig dagegen der Entstehung und Vermehrung der kleinen fettfreien Mutante, ') Mikroskopische Betriebscontrole, 3te Aufl., Tafel i, 1901. 73 welche ihre Mutterform fortwahrend" verdringt und überwachst. Otïenbar ge- schieht dieses im Insektenmagen nicht, oder wenigstens nicht in gleichem Maasse, denn daraus bekommt man die Sekundarform zwar ebenfalls, j edoch in ein weit kleineres Verhaltniss zu Pulcherrimus selbst, wie in den Kuituren. Inzwischen kann nicht bezweifelt werden, dass in diesem Falie die Begrifïe »Mutation« und »Modifikation« weniger scharf getrennt sind, wie bei 5". muciparus und seiner Mutante. Ich glaube nicht, dass es notwendig ist, hier noch weitere Beispiele anzuführen, was mir allerdings nicht schwierig sein sollte, denn das Arbeitsfeld der Mikroben- mutation fangt erst an bearbeitet zu werden und überall findet man Material. Neue Wege auf diesem verwickelten aber viel versprechenden Gebiet werden sich voraus- sichtlich erst dann eröffnen, wenn nicht allein, wie im Vorhergehenden, die unter normalen Kulturbedingungen stattfindenden Mutationen studiert sind, sondern auch die durch chemische Reize, sowie die durch andere direkte Beeinflussung verursach- ten in Betracht gezogen werden. Letzteres wird bei einer anderen Gelegenheit ge- schehen. Inzwischen giebt das Vorhergehende Veranlassung, noch einige weitere Be- trachtungen anzustellen bezüglich der Natur der Mikrobenmutanten, wenn dieselben verglichen werden mit anderen Produkten der Mutabilitat. Darüber im dritten Kapitel. Kapitel III. Die Natur der Mikrobenmutanten. Es muss zunachst betont werden, dass die scheinbare Einheitlichkeit des Natür- lichen Systems veranlasst, anzunehmen, dass keine prinzipiellen Verschiedenheiten zwischen den Arten der verschiedenen Abteilungen vorauszusetzen, dieselben also als vergleichbare Einheiten zu behandeln sind. Fasst man aber die von diesen Arten abgeleiteten niederen Klassifikationsstufen ins Auge für so weit sie erblich sind, das heisst ihre Fluktuanten, Mutanten und Kombinationen, so kommt man zur Ansicht, dass die unter diese Begriffe gebrachten Einheiten entsprechende Reprasentanten unter den Arten haben können. Vorlaufig sind wir jedoch noch gar nicht imstande, eine Trennung der Art in diesem Sinne durchzuführen, und besonders die Fluktuation ist ein so schwierig zu fassender Vorgang, dass wir zunachst darauf angewiesen sind, die ausserliche Einheitlichkeit von möglicherweise sehr Verschiedenem als Leit- faden zu verwenden. Für unseren Zweck ist dieses allerdings von untergeordneter Bedeutung, weil wir uns hier allein mit unzweifelhaften Mutanten beschaftigen, doch musste auf die Verschiedenheit im AUgemeinen hingewiesen werden, weil die Fluk- tuationen bei der Ausbildung des Natürlichen Systems wahrscheinlich die HauptroUe gespielt haben. Ferner stellt sich heraus, dass, wenn man die erbliche Konstanz unter verschie- denartigen Lebensbedingungen als Maass des Vergleiches in Betracht zieht, die Mu- tanten mit gewissen anderen Bildungen in Parallele gestellt werden können, welche 74 man früher als grundverschieden von den natürlichen Arten betrachtet hat, Von letzterer Ansicht kommt man j edoch gegenwartig zurück, unter dem Einfluss der neueren Erblichkeitslehre. Der hier gemeinte Vergleich bezieht sich für die Mutanten überhaupt, also auch für die Mikrobenmutanten, auf die beiden folgenden Einheiten. Die Mutanten kön- nen verglichen werden: Erstens mit den beiden Geschlechtern der Diözisten oder den verschiedenen Formen der Heterostylen, welche sich tatsachlich verhalten wie ver- schiedene Rassen und bei der Amphimixis sich nach den Mende l'schen Gesetzen spalten; und zweitens mit den durch erbliche Stabilitat bei ihrem Wachstum und ihrer Vermehrung sich auszeichnenden Zellencomplexen oder Organen der Metazoen und Metaphyten. Dagegen ist der Vergleich der Mutanten mit den Pleonten der polymorphen Pilze nicht durchführbar, weil die Pleonten Modifikationen sind, welche be- stimmten Lebensbedingungen entsprechen und nur so lange, wie diese fortdauern, erbliche Konstanz zeigen. Ebensowenig kann der Vergleich der Mikrobenmutanten durchgeführt werden mit den bei der Ontogenese entstehenden und durch den Diffe- renzierungsprozess hervortretenden verschiedenartigen Zeilen, woraus die vielzel- ligen Organismen aufgebaut sind, für so weit deren Verschiedenheit nur auf Modi- fikation beruht. Dieses aber ist der Fall bei den Zeilen, woraus die an zweiter Stelle genannten Organe und Zellcomplexe aufgebaut sind und deren Veranderung bei der Entwicklung zwar zu neuen Zellformen führt, deren neue Eigenschaften jedoch nur bei der Fortdauer der Bedingungen, wobei sie entstanden, konstant bleiben. Die Erkenntniss der Homologie der oben bezeichneten Einheiten mit den Mi- kroben und ihren Mutanten ist nicht unwichtig und wird beim weiteren Ausbau sicher der Vertiefung der Entwicklungslehre förderlich sein. Betrachten wir darum die hier kurz erwahnten Punkte noch etwas naher. T. Die Mutanten aus allen Ordnungen des Natürlichen Systems sind vergleichhar. Dass die Mikrobenspezies im Allgemeinen auf dieselbe Weise in das Natürliche System hineinpassen, wie diejenigen der Pflanzen und Tiere, kann als eine communis opinio aller Naturforscher bezeichnet werden, unsere ganze Klassifikation beruht auf diesem Prinzip. Für die niederen Einheiten, von welcher Natur diese übrigens auch sein mogen, muss das gleiche gelten, also auch für die Mutanten. Die Einzellig- keit ist dabei durchaus kein Hinderniss: auch die Einzelzelle kann eine Reihe von Difïerenzierungen, von Entwicklungsstufen zeigen, ganz so wie ein vielzelliger Or- ganismus. Man denke z. B. an die allmahliche Ausbildung der Sporen, der Cilien, also der »Organe« ^), der Einzelligen, Die polynuclearen aber nichtzellularen Or- ganismen, wie die Siphoneen und die Phycomyceten, zeigen auf andere Weise, dass zellige und nichtzellige Struktur für das Zustandekommen der Differenzierung und für die Artbildung gleichgültig sind. Niemand hat denn auch gezögert, bei der Aus- bildung der Systematik nach gleichen Prinzipien vorzugehen und überall hat man vergleichbare Arten gefunden und ist, bei deren Abgrenzung sowie bei derj enigen ') Die »Zellorgane« sind von Haeckel (Die Lebenswunder, Volksausgabe S. 66, 1906) »Organelle« genannt. Andere Forscher nennen dieselben »Organite«. 75 der niederen Einheiten derselben auf ahnliche Schwierigkeiten gestossen. Dadurch befestigt sich die Uberzeugung, dass es gewisse sehr umfassende Variabilitatsge- setze giebt, die den Vorgang im Grossen und Ganzen beherrschen, und durch alle Zciten beherrscht haben. Eben die Analogie zwischen den Mutationserscheinungen bei den Mikroben, den Pflanzen und den Tieren giebt davon einen überzeugenden Beweis. In einer wichtigen Hinsicht scheinen auf den ersten Bliek viele niedere Mikro- ben sich von den höheren Formen zu unterscheiden, namlich dadurch, dass sie in chemischer Beziehung ihren organischen Nahrsubstanzen naher stehen und sich des- halb mit ausserordentlicher Leichtigkeit vermehren können, wenn die Lebensbedin- gungen gunstig und die Nahrstoffe reichlich vorhanden sind. Inzwischen ist dieses doch mehr Schein wie Wahrheit, denn auch gewisse pflanzliche und tierische Organe können mit grosser Geschwindigkeit wachsen und neue Zeilen erzeugen, wenn auch nur auf Kosten der von ihnen selbst gebildeten Nahrstoffe. Ja, man kann die Be- hauptung umkehren und sagen, dass auch eben unter den Mikroben diej enigen For- men vorkommen, welche sich wie irgendwo anders chemisch unterscheiden von den von ihnen verwendeten Nahrmaterialien. Solche Argumente können also unser Hauptthema nicht storen und wir können behaupten, dass die Arten der Mikroben den Arten der Metazoen und Metaphyten entsprechen, und dass dasselbe gilt bezüg- lich der Mutanten in allen Abteilungen des Systems. Das Fehlen der Amphimixis bei vielen Mikroorganismen bedingt natürlich eine Verschiedenheit mit den sexuell differenzierten von grosser Bedeutung in experi- mentelier Beziehung, weil demzufolge das für die Untersuchung der letzteren so wichtig gewordene Hilfsmittel der Bastardanalyse für die asexuellen Mikroben fehlt. Prinzipiell ist das aber gleichgültig, weil der Mutationsvorgang an sich un- abhangig von der Sexualitat ist. Und wenn es sich herausstellen sollte, dass die Mende l'sche Spaltung und die Mutation auf einem ahnlichen Mechanismus be- ruhen, was durchaus nicht unabweisbar erscheint, so würde das nichts an der Haupt- sache verandern, denn auch die Mende l'sche Spaltung findet statt in den Zeilen langst bevor eine sexuelle Verschmelzung zustande kommt. Es liegt deshalb keine genügende Ursache vor, um anzunehmen, dass die Mutanten von Organismen mit Amphimixis in irgend einer prinzipiellen Beziehung verschieden sein sollten von den Mutanten der Asexuellen. 2. Die Pleonten der polymorphen Pilze sind Modiükationen ohne erbliche Konstanz. Besonders die Verhaltnisse der Octosporushtit, jedoch auch diej enigen vieler anderen Hefearten, führen wie von selbst dazu, die Mutanten mit den Pleonten *) zu vergleichen. Man denke z. B. an die weitgehende Analogie der Mutanten mit dem Hefestadium der Brandpilze, welches erhalten wird, wenn letztere auf gute Nahr- böden kultiviert werden. Dennoch lehrt eine nahere Betrachtung, dass dabei Ver- schiedenheiten vorliegen, welche von prinzipieller Natur sind. Es ergiebt sich nam- *) Das Wort Pleonte ist von Delp ino eingeführt zur Bezeichnung der verschiedenen Zustande der pleomorphen Pilze. 76 lich ganz allgemein, dass die verschiedenen Pleonten einer bestimmten Pilzspezies verschiedenen Lebensbedingungen entsprechen, womit ihre Existenz ofïenbar unzer- trennlich verbunden ist, so dass bei ihrer Bildung alle Zeilen des Aussaatmateriales, anstatt sich als solche zu vermehren, sich in die bezüglichen Pleonten umwandeln. Bei den Brandpilzen z. B. ist das Hefestadium der saprophytischen, das Ustilago- stadium der parasitischen Lebensweise streng adaptiert und bei der Aussaat auf Würzeplatten entzieht sich keine einzige wachsende UstilagozeWe der Umwandlung in Hefe. Bei den Rostpilzen entsprechen das Aecidium- und das Uredo- und Puccinia- stadium verschiedenen Nahrpflanzen, wahrend das Uredo- und das Pj^?o Fig. 6. Fig. 7. Fig. 13. Fig. 6, 7, 8, 9 Schisosaccharomyces octosporus und Mutanten. Fig. 10, II, 12, 13 BaciUus herhicola und Mutanten. Die durch Bakterien aus Rohrzucker erzeugten schleimigen Wandstoffe'\ Folia Microbiologica, Delft, I. Jahrgang, 1912, S. 377—408. — Is eene samenvatting der volgende publicaties: ie »Viscosaccharase, een enzym, dat uit rietsuiker slijn voort- brengt», verschenen in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XVIII. 1910, blz. 591—595, (ook verschenen onder den titel »Viscosaccharase, an enzyme which produces slime from canesugar* in Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XII, 1910, p. 635 — 640) en 2e. sEmulsielaevulan, het product der werking van viscosaccharase op rietsuiker*, verschenen in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XVIII, 1910, blz. 898 — 902, (ook verschenen onder den titel »Emulsion laevulan, the product of the action of viscosaccharase on cane- sugar« in Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XII, 1910, p. 795—798). Die nachfolgenden Beobachtungen sind hervorgegangen aus der allgemeinen Fragestellung nach der Beziehung der Bakterien zum Rohrzucker, wobei die Aufmerksamkeitzunachst gerichtetwar auf dielnvertasebildung, sich jedoch bald her- ausstellte, dass auf dem eingeschlagenen Wege die Frage nach der Natur der Wand- stofife gefördert werden konnte. Es v^^urden dabei namlich gute Verfahren gefun- den für das Auffinden der bisher noch so unvoUstandig bekannten Levulan- und Dextranbakterien, und demzufolge zur Erzeugung der für diese Bakterien durch den Namen angegebenen oharakteristischen Wandstofïe in beliebiger Menge. Der Deut- lichkeit halber wird es notwendig sein, auch andere Wandstoffe von Bakterien kurz zu betrachten, welche nicht in naherer Beziehung zum Rohrzucker stehen. Bekanntlich haben die Bakterien in vielen Fallen ahnliche Wandstoffe wie die höheren Pflanzen, und eben wie bei den letzteren bestehen die Zellwande auch hier manchmal aus einer festen, dem Protoplasma anliegenden und einer ausseren ver- quollenen oder schleimigen Schicht. Dass dieser Schleim nicht als ein Absonde- rungsprodukt des Bakterienprotoplasma's aufzufassen ist, welches aus dem Innern durch die feste Wand nach aussen kam, geht daraus hervor, dass demselben die Fahigkeit zu diffundieren ganzlich fehlt. Dass die innere, feste, dem Protoplasma anliegende Wand aus Zellulose be- stehen, oder wenigstens aus einer Substanz, welche nach Vorbehandlung mit Schwefelsaure oder Natronlauge oder mit Chlorzink die gewöhnliche für Zellulose charakteristischen Blau- oder Rotfarbung mit Jod geben kann, ist in einigen Fallen *) Nach einem Vortrag gehalten in der 2ten Versammlung der Niederlandischen Vereinigung für Mikrobiologie am Sten Juni 1912 zu Utrecht. Meinem früheren Assistenten, Herrn D. C. J. Minkman, verdanke ich rege Mithülfe bei dieser Untersuchung. 90 sichergestellt. So von S u r i n g a r i) für Sarcina ventricuU, was ich durch eigene Erfahrung bestatigen kann ; von B r o w n 2) für die Essigbakterie B. xylinum, welche auf Bier und Würze die merkwürdigen zahen Haute erzeugt und auch wohl unter dem Xamen Sorbosebacterium bekannt ist. Trocknet man die Haute auf einer Glasplatte, so bekommt man wie Papier aussehende Massen, welche sich besonders gut eignen, die Zellulosereaktionen als Vorlesungsversuche anzuzeigen '). Für B. tuniescens erwahnt Arthur Meijer*) die Blaufarbung der Innen- haut mit Chlorzinkjod, doch ist die Membran nicht löslich in Kupferoxydammoniak. Der Nachweis der Schleimschicht, welche die Wand vieler Bakterien auf der Aussenseite bekleidet, gelingt bekanntlich leicht durch Betrachtung des mikroskopi- schen Praparates, welches lebend in Tusche gebracht ist. Ich verwandte für den Nachweis der Schleimhülle der AsotobacterzeWen Mikroskopiertropfen von Wasser, worin sehr viele ausserst kleine Bakterien suspendiert waren, welche nicht in den Schleim hineindringen und dessen Grenze deshalb scharf anzeigen'^). Die nachfolgenden Beobachtungen beziehen sich auf die Schleimschicht der Bakterienzelle. Diese Schicht kann seiner stofïlichen Natur nach zu wenigstens drei Gruppen von verschiedenen Substanzen gehören, welche zwar alle Kohlehydratnatur besitzen, jedoch von der Zellulose verschieden sind und hier als Dextran Levulan und Zellulan bezeichnet werden sollen. Vielleicht kommt dazu bei einigen Arten noch ein vierter Körper, welcher stick- stoffhaltig sein könnte und dann mit Mucus oder Chitin vergleichbar ware. Dieses dürfte namlich zutreffen für den Mikroben der »lange wei«, Streptococcus hol- landicus, dessen Schleim jedoch noch nicht gut erklarte Eigenschaften hat und hier weiter übergangen werden wird. Unter dem Namen Zellulan verstehe ich Schleimsubstanzen, welche durch Bak- terien der verschiedenen Verwandtschaftsgruppen, nicht, wie Dextran und Levulan aus Rohrzucker allein, sondern auch aus allerlei anderen Kohlehydraten und selbst aus nicht zu den Kohlehydraten gehörigen Verbindungen hervorgehen. Zwar stehen dieselben der Zellulose nahe, doch erfahren sie mit Chlorzink-Jod oder mit Jod- Schwefelsaure keine Blau- oder Rotfarbung. Obschon es wahrscheinlich ist, dass die durch verschiedene Bakterienarten erzeugten Zellulanschleime nicht identisch sind, stimmen dieselben in einer wichtigen Beziehung miteinander überein, namlich darin, dass sie nicht durch die Fermente der Butyl- und Buttersauregarung angegrifïen werden und deshalb zur Einleitung und Unterhaltung dieser Garungen nicht ge- eignet sind. Weil dieses wohl der Fall ist bei den Körpern der Dextran- und Levulangruppen, stellen sie sich diesen letzteren gegenüber in scharfen Gegensatz. Die Einrichtung solcher Garungen ist also methodisch wichtig für die Untersuchung ') De Sarcine, Leeuwarden 1866. ^) Journal Chemical Society, T. 49, pag. 432, 1886. *) Ein mir bekannter Essigfabrikant Hess seine Visitenkarten auf Xylinumhaute drucken; dieselben glichen sehr feinem Briefpapier, batten jedoch weniger Festigkeit. *) Die Zelle der Bakterien, pag. 155, Jena 1912. '") Centralbl. f. Bakteriologie, 2te Abt., Bd. 7, pag. 561, 1901. 91 der Bakterienschleime und soll darum etwas naher besprochen werden, wobei jedoch besonders die sehr einfach zu erhaltende Buttersauregarung und nicht die schwie- riger darzustellende Butylalkoholgarung ins Auge gefasst werden wird. Methodisches. Die ^Buttersdureprobe^. Man füllt eine Stöpselflasche von loo bis 200 cM* ganzlich an mit einer Nahr- lösung folgender Zusammenfassung: Leitungswasser, 2% verkleisterte Starke, 0,05% CINH4, 0,05% K2HPO4 und 2% Kreide, infiziert mit frischer Gartenerde, worin das Buttersaureferment immer allgemein verbreitet ist, und kultivert bei 30" — 35" C. Am folgenden oder am zweitfolgenden Tage beginnt eine kraftige Garung, verur- sacht durch wenige »Colibakterien« und sehr viele Stabchen und Clostridien von Granulohacter saccharohutyricum. Die Produkte der Garung sind Wasserstoft', Kohlensaure, Essigsaure und nor- male Buttersaure. Bei der Uberimpfung in die gleiche Nahrlösung findet bald eine Reinigung statt, so dass nach ein paar Erneuerungen dieses Vorganges, sowohl die aeroben Sporenbilder, wie die verschiedenen Formen der Coligruppe, welche alle mit der für die Infektion verwendeten Gartenerde eingeführt waren, ganzlich ver- schwinden. Weil dieser Versuch nicht nur mit Starkekleister, sondern ebensogut mit Glu- kose,Levulose,Rohrzucker, Maltese, Laktose.Inulin und Rafïinose gelingt, lag es nahe, denselben auch für die Vergarung der Pektose zu verwenden, wodurch es gelang, die Lebensgeschichte von Granulohacter pectinovorum weiter aufzuklaren und die Praxis des Flachsröstes zu verbessern 1). Die Analogie der Pektose mit dem Zellulan veranlasste eine gleiohe Anwendung des Versuches für die Wandstoffe im allge- meinen in Betracht zu ziehen; dieses führte dann zur Entdeckung der Vergarbarkeit von Levulan und Dextran durch G. saccharohutyricuvi , wahrend die Zellulane durch diese Bakterie nicht angegriffen werden. Natürlich mussen die Wandstoffe für diese Versuchsanstellung in reichlicher Menge vorliegen, weil sie in wenigstens 100 cM^ einer 2% Lösung zu vergaren sind. Obschon nun die Darstellung derselben natürlich das Kultivieren der bezüg- lichen Bakterien erfordert, worüber erst spater gesprochen werden wird, mussen hier einige Bemerkungen gemacht werden bezüglich der Absonderung jener Stoffe aus den Nahrlösungen, worin sie entstanden sind. Sobald die Schleimbildung in der Kulturflüssigkeit den Höhepunkt erreicht hat, wird mit Alkohol prezipitiert, dessen für das Ausfallen des Schleimes notwendige Konzentration ungefahr 50% ist. Bei dieser Verdünnung des Alkohols bleiben die übrigen Substanzen der Nahrflüssigkeit gelost, so dass der Schleim nach der Ent- fernung des Alkohols ziemlich rein erhalten wird. Zwar prezipitieren die Bakterienleiber zugleich mit dem Schleime, was jedoch für die Untersuchung der Garungsfahigkeit, — wofür ausser den Granulobakterien auch dieMilchsaure-und Alkoholfermente verwendet werden, — eher als gunstig wie als ungünstig zu betrachten ist, weil das »Bakterieneiweiss« einen wenig gebundenen Stickstofï in für die genannten Garungsfermente gut assimilierbarer Form abgiebt. ') Bactéries actives dans Ie rouissage du lin. Archives Néerlandaises, Sér. 2, T. 9, pag. 439, 1904. 92 Weil die durch den Alkohol prezipitierten Schleime ziemlich schwer sind, setzen sie sich schnell ab und können dann weiter leicht gesammelt werden. VoU- standig rein sind solche Praparate natürlich nicht zu erhalten ^). Eine partielle Reinigung ist aber in einigen Pallen möglich. So beim Levulan, welches in kochen- dem Wasser löslich ist, durch Auflösen und wiederholtes Prezipitieren mit Alkohol. Dextran ist jedoch in Wasser bei allen Temperaturen beinahe unlöslich und kann durch kochendes Wasser nur von den absorbierten Körpern befreit werden. Da- gegen kann es in verdünnten Akalien gelost und daraus mit, mit Salzsaure versetztem Alkohol prezipitiert werden, wobei jedoch die alkalilöslichen Eiweisskörper mit aus- fallen. Schliesslich wird die Masse getrocknet und pulverisiert, wobei schnee- weisse Pulver entstehen, welche in gut verschlossenen Flaschen aufbewahrt werden mussen, weil sie mehr oder weniger hygroskopisch sind, was besonders für Levulan zutrifft. Der Schleim wird dann auf dieselbe Weise dem »Buttersaureversuch« un- terworfen als wie das mit irgend einem Zucker geschehen soUte. Es wird eine i- bis 2-prozentige Lösung oder Suspension des Schleimes in Leitungswasser, versetzt mit o,oi% K2HPO4, 0,01% NH4CI und I — 2% Kreide, und nach Impfung mit einer nicht zu geringen Menge einer in Glukose- oder Starkelösung auf die früher be- schriebene Weise angestellten Buttersauregarung bei 30" C. bis 35" C. in einer ganz- lich geschlossenen Stöpselflasche kultiviert. Es stellt sich heraus, dass Levulan dabei ebenso leicht wie Glukose und Rohr- zucker zersetzt wird. Dextran wegen seiner Unlöslichkeit oder, nach Vorbehand- lung mit Alkaliën geringen Löslichkeit in Wasser, etwas schwieriger jedoch nicht zweifelhaft, und Zellulan gar nicht. Weil bei dieser Zersetzung Kohlensaure und Wasserstoff entstehen, welche sehr genau gemessen werden können, so ist dieser Versuch auch in quantitativer Beziehung für den Vergleich der Schleime geeignet. Auch ist es leicht, die gebildeten Sauren als Kalksalze abzutrennen. Ausser der Buttersaureprobe sind die Schleime einer chemischen Untersuchung unterworfen, wobei auch die Produkte der Inversion festgestellt wurden. Hierbei sind die schon von S c h e i b 1 e r und L i p p m a n n erhaltenen Resultate besta- tigt. Auch wurde das Drehungsvermögen der Schleime für das polarisierte Licht, für soweit die starke Opaleszenz ihrer Lösungen dieses erlaubte, bestimmt, wobei immer geringere Zahlen gefunden wurden, wie die in der Literatur angebenen, was wohl daraus zu erklaren ist, dass unsere Praparate untersucht wurden, ohne dass dieselben zuvor irgend einer chemischen Umwandlung hatten unterliegen können. Dagegen haben andere Forscher Alkaliën als Lösungsmittel verwendet, was wahr- scheinlich zur Verminderung der Molekulargrösse dieser Körper veranlasst. Ferner ist die Assimilation des Dextrans und des Levulans für verschiedene aërobe Mikroben untersucht, wobei sich herausstellte, dass sie für zahlreiche Arten eine sehr gute Nahrung darstellen. •) In meiner Abhandlung über die Butylalkoholgarung (Fermentation et ferment butyliques, Archives Néerlandaises. Sér. i, T. 29, pag. i, 1893) habe ich die auf ahnliche Weise eingerichtete Bereitung der dabei in Betracht kommenden Bakterie beschrieben und darauf aufmerksam gemacht, dass beim Prezipitieren derselben zugleich die Diastase ausfallt. Auch das Levulan oder Dextran werden bei der Darstellung gewisse Enzyme, wie z. B. Invertase, Katalase und Emulsin mitschleppen; dieselben können aber durch Kóchen vernichtet werden. 93 I. Levulan als Wandstoff. I. Rohkultur von Levulanhakterien. Ausgangspunkt für die Untersuchung der Beziehung zwischen den Bakterien und dem Rohrzucker, worüber schon im Anfange gesprochen wurde, bildete das Ver- halten der sporenerzeugenden Arten zu diesem Körper, wobei sich ergab, dass einige der am allgemeinsten verbreiteten Bazillen dieser Gruppe Levulan als Wand- stoff erzeugen ^). Für die Versuchsanstellung wird folgendermaassen verfahren. Pasteurisierte Gartenerde wird geimpft in eine Nahrlösung von der Zusammen- setzung: Leitungswasser, 2 — 10% Rohrzucker, 0,02% KNO3 und 0,02% K2HPO4, welche sich in einer Schicht von nur wenigen Centimetern Dicke in einem E r 1 e n- m e y e r kolben findet und also aeriert ist. Wenn darin wahrend ein paar Tagen bei ca. 30» C. kultivert wird, zeigt die anfangs ganz klare und durchsichtige Flüssigkeit eine allmahlich starker werdende Opaleszenz von sehr eigentümlichem Charakter, welche entweder durch mikroskopisch sichtbare, in der Lösung suspendierte Tröpf- chen verursacht wird, oder die Folge der Entstehung einer ultramikroskopischen Kolloidlösung sein kann. Die Tröpfchen können zu Boden sinken, wobei viele Bak- terien mitgeschleppt und sich dort als eine gelatinöse Schicht absetzten, wovon die darüberstehende Flüssigkeit abgegossen werden kann, oder die Emulsion kann suspendiert bleiben und die ganze Nahrlösung in eine weiche Gallerte verandern, was jedoch nur bei der Verwendung von Rohrzuckerkonzentrationen von 10 — 20% beobachtet wird. Der Versuch giebt, wie zu erwarten war, nicht immer das gleiche Resultat, denn besonders die gelatinöse Schicht ist sehr veranderlich in Dicke und kann ganzlich fehlen. Das Opaleszieren bleibt jedooh niemals aus. Es hat sich herausgestellt, dass die Tröpfchen, welche diese Opaleszenz ver- ursachen, aus Levulan bestehen, und weil ich dieselben bei keinem anderen mir be- kannten Körper unter solchen Umstanden gesehen habe, betrachte ich die Erschei- nung, welche ich die »Emulsionserscheinung« nannte, als eine empfindliche Reaktion auf Rohrzucker, wobei allein Verwechslung mitRaffinose möglich ware, woraus eben- falls eine Levulanemulsion entstehen kann. Dieses geschieht jedoch aus keiner an- deren Zuckerart. Die Levulantröpfchen können verglichen werden mit den Galatintröpfchen, welche entstehen, wenn eine wasserige Gelatinlösung mit Alkohol versetzt wird, wo- bei das Dispersionsmittel aus viel Wasser mit viel Alkohol und sehr wenig Gelatine, die disperse Phase 2) aus viel Gelatine, wenig Alkohol und wenig Wasser bestebt. Dass man in diesem letzteren Gemisch den wasserigen Alkohol ersetzen kann durch eine wasserige Lösung von löslicher Starke oder von Agar oder anderen ahn- lichen Körpern habe ich anderwarts naher besprochen ^) und erinnere hier nur deshalb daran, weil durch diese Beobachtung Licht fallt auf die Natur der Levulanemulsion. O Zuerst habe ich darüber berichtet in'zwei Mitteilungen »Ueber Emulsionslevulan, das Produkt der Wirkung des Enzyms Viscosaccharase auf Rohrzucker. « Verslagen d. Akad. v. Wetensch. te Amsterdam 9 Februari und 12 Mei 1910. ^) Diese Nomenclatur nach Wo. Ostwald, Kolloidchemie 3te Aufl., pag. 27, 1912. *) Ueber Emulsionsbildung bei der Vermischung wasseriger Lösungen gelatinierender KoUoide. Zeitschr. f. Kolloidchemie Bd. 7, pag. 16, 1910. 94 2. Die Levulan erzeugenden Bakterien. Die :i,Etnidsionserscheinung«i in Agar platten. Für die Isolierung der Levulan erzeugenden Bakterien wird eine Platte ange- fertigt von folgender Zusammensetzung: Leitungswasser, 2% Agar, 2% Rohr- zucker, 0,02% K2HPO4 and 0,02% NH4CI, worauf, nach sorgfaltiger Sterilisation zur Entfernung der resistenten, stets im Rohrzucker vorkommenden Bakterien, die beschriebene Rohkultur in Impfstrichen oder als Streukultur ausgesat wird. Auch kann darauf direkt pasteurisierte Erde ohne vorherige Rohkultur gebracht werden, wobei dann auch wohl vereinzelte »Levulankolonien« erhalten werden, jedoch sehr viel weniger wie nach dem zuerst genannten Verfahren. Auf den Agarplatten ist die Erscheinung der Levulanproduktion eine sehr hübsche, indem sich ringsum die Koloniën, sowohl innerhalb, wie auf der Ober- flache des Agars eine, besonders beim durchfallenden Lichte sichtbar werdende Le- vulanemulsion bildet (zu vergleichen die Figuren i und 2 auf Tafel XI), welche den Agar zu einer betrachtlichen Volumvermehrung bringt und darin selbst die Ent- stehung von Rissen verursachen kann. Die Levulantröpfchen können eine Grosse von bis 0,2 mM. erreichen und werden dann mit der Lupe leicht sichtbar; sie finden sich bis auf Zentimeterentfernung von den Koloniën. Obschon dieselben an Öl- tropfen erinnern, zeigt ihre Löslichkeit in Schwefelsaure, dass von Fett hier nicht die Rede sein kann. In Gelatinplatten ist die Erscheinung nur sehr unvollkommen. Im Agar wird dieselbe durch Saurebildung beeintrachtigt. Darum ist bei der Versuchsanstellung die Verwendung von Kaliumnitrat als Stickstofïquelle, woraus Kaliumcarbonat, also Alkali entsteht, gunstig, wahrend die zu Saurebildung veranlassenden Ammonsalze als Stickstofïquelle ungünstig sind. Auch die Peptone und Amide begunstigen bei Gegenwart von Zucker die Saurebildung durch Bakterien, so dass deren Verwen- dung ebenfalls zu meiden ist. Fertigt man Agarplatten an von obengenannter Zu- sammensetzung, jedoch mit etwas mehr Rohrzucker, z. B. 10%, mit Weglassung des gebundenen Stickstoffs und ohne zu sterilisieren, indem allein gekocht wird, so bekommt man einen besonders günstigen Boden für den noch zu besprechenden, im Rohrzucker selbst ganz allgemeinen B. emulsionis, sowie für den gleichfalls Levulan erzeugenden Asotohacter chroococcum. Ersetzt man den Rohrzucker durch Rafïinose, so entsteht die Emulsionserschei- nung ebenfalls. Glukose, Levulose, Mannose, Galaktose, Laktose, Maltose, Treha- lose, Melibiose, Mannit und Xylose erzeugen die Erscheinung dagegen nicht, sind also ungeeignet für Levulanbildung. Obschon die Levulanbazillen sehr allgemein vorkommen, gehören dieselben nur zu wenigen Arten, worunter der gewöhnliche Heubazillus B. mesentericus vulgatus, B. me gather ium und der im Rohrzucker selbst so allgemeine B. emulsionis. Dagegen sind die übrigen besonders charakteristischen aeroben Bodenbakterien, wie B. sub- tilis, B. mycoides, B. polymyxa, B. nitroxus, B. sphaerosporns, B. luteus, so wie die Anaeroben Granulobacter hutylicum, Gr. saccharobutyricum und G. pectinovorum keine Levulanbakterien. Wenn man auf ahnliche Weise wie hier beschrieben, frische, nicht pasteurisierte Erde untersucht, so stellt sich heraus, dass es nur sehr wenige nicht sporenbildende 95 Arten giebt, welche Levulan hervorbringen. Hierzu gehort, wie schon gesagt Azoto- bacter chroococcum, jedoch nicht die anderen Arten der Gattung wie As. agilis, As. Vinlandi und As. Spirülum^). Ja es giebt selbst Varietaten van As. chroococcum, welche kein Emulsionslevulan erzeugen, die wenigstens die »Emulsionserscheinung« in den Agarplatten nicht hervorrufen. Aus stickstofïanhaufenden Asotobacter- kulturen wurde weiter eine Form von B. radiobacter isoliert, welche stark »emulsio- niert«. Alle gewöhnlichen keine Sporen erzeugenden Arten, wie B. coli, B. aero- genes, B. üuorescens liquefaciens, B. f. non liquefaciens, B. prodigiosus, B. cyano- genus, die Milchsaurefermente und sehr viele andere Arten, bilden überhaupt kein Levulan. Auch unter den Hefen und Schimmelarten konnten ebensowenig Levulan- bilder gefunden werden, 'wie bei der Gattung Streptothrix. Früher haben wir gesehen, dass in den flüssigen Kuituren der Levulanbakterien zu Boden der Kolben ziemlich dicke, durchsichtige Schichten entstehen, welche so fest werden können, dass die darüber stehende Nahrlösung abgegossen werden kann, ohne dass die Schicht zerfliesst. Auch kann es vorkommen, dass eine eigentliche Schichtbildung zwar nicht stattfindet, dagegen die ganze Nahrlösung gelatiniert, wo- bei eine allerdings weiche und sehr leicht zerbrechliche Masse entsteht. Eine nahere Prüfung lehrt, dass solche Schichten teils aus untergesunkenen Levulantröpfchen, andernteils aus den mit Levulanschleim umhüllten Bakterien selbst, welche mit ihren Oberflachen zusammengeflossen sind, bestehen. Dieses Levulan unterscheidet sich von dem noch in der Flüssigkeit suspendierten »Emulsionslevulan« durch eine etwas geringere Löslichkeit in kochendem Wasser, hat übrigens die gleichen chemischen Eigenschaften, wie die mehr lösHche Modifikation und geht wie diese durch Koohen mit Sauren leicht in Levulose über. Hier soll noch auf eine andere Erfahrung aufmerksam gemacht werden, welche mit dem Vorhergehenden eine gewisse Analogie hat, jedoch auf eine andere Weise erklart werden muss. Ich meine den L^mstand, dass die Koloniën gewisser Varie- taten von Heubazillen, sowie von B. megatheriiim, welche auf der Oberflache von Rohrzuckeragarplatten waohsen, sich zu grossen durchsichtigen Tropfen entwickeln können, welche durchaus nicht die »Emulsionserscheinung« in ihre Nachbarschaft zeigen und so sehr an die spater zu betrachtenden Dextranbakterien erinnern, dass ich anfangs auch wirklich meinte, dieselben hatten Dextran erzeugt, was sich jedoch als Levulan herausstellte. Hier hat sich das Levulan also nur als gewöhnlicher Wandstoff in direkter Berührung mit dem Bakterienkörper abgesetzt. Dieses führt aber zu der Auffassung, dass in diesem Falie die Ursache der Levulanbildung am Bakterienkörper gebunden bleibt, wahrend das Emulsionslevulan auch ganz unab- hangig vom Bakterienkörper in der Flüssigkeit entstehen kann. Die Erklarung dieser Verschiedenheit dürfte sich ergeben aus der Bildungsweise des Levulans unter dem Einfluss eines Enzyms, welches nicht immer genau dieselben Eigenschaften hat. lm Falie namlich, wenn durch dessen Wirkung auf Rohrzucker das Emulsionslevulan entsteht, muss es aus einem leicht diffusiblen, den Bakterienkörper verlassenden, im Falie dagegen, wo es sich um die Bildung des an den Koloniën gebunden bleibenden Levulans handelt, aus einem nicht diffusiblen Stoft' bestehen. Wir können also sagen, *) As. spirilluni ist eine noch nicht beschriebene Art, worauf ich an anderer Stelh zurückzukommen hofife. 96 dass das leicht lösliche Emulsionslevulan durch ein Exoenzym, die etwas schwieriger lüsliche Modifikation durch ein Endoenzym erzeugt wird. Beide Enzymen sind je- doch wahrscheinlich nur als nach der Molekulargrösse abgestufte Formen eines ein- zigen Körpers aufzufassen, welches ich Viscosaccharase genannt habe. ?. Das Enzym Viscosaccharase. Dass das Levulan, welches sich ausserhalb des Bakterienkörpers aus dem Rohr- zucker bildet, tatsachlich durch Einwirkung eines Enzyms erzeugt wird, geht aus folgender Beobachtung hervor. Sohneidet man aus dem Emulsionsfeld, welches sich rings um eine Mesentericns- oder eine Megatheriuniko\om& in einer Rohrzuckeragarplatte befindet, derweise ein Stück heraus, dass die Bakterienkolonie selbst nicht berührt wird, und legt dieses Agarstück, welches also Levulantröpfchen enthalt, auf eine andere Rohrzuckeragar- platte, so ergiebt sich, dass darunter wieder eine neues Emulsionsfeld entsteht, wah- rend das Levulan, als nicht diffusionsfahiger Körper das aufgelegte Agarstück nicht verlasst. Wird das Agarstück vor dem Auflegen auf die neue Platte zuvor gekocht, so geht darin das Vermogen zur weiteren Levulanerzeugung verloren. Chloroform vernichtet diese Eigenschaft j edoch nicht. Es muss also im Levulanfeld ein lös- liches und difïusionsfahiges Enzym vorkommen, welches im Stande. ist, aus dem Rohrzucker Levulan zu erzeugen und wohl bei einer Siedehitze, nicht jedoch durch Chloroform, vernichtet wird. Inzwischen sind sowohl Chloroform wie Alhohol der Enzymwirkung einigermassen schadlich, wohl dadurch, dass das Enzym durch diese Substanzen teilweise unlöslich wird. Das Enzym wurde Viscosaccharase genannt als das Produkt noch unvollstandig untersucht war und soUte auch als Saccharolevu- lanase bezeichnet werden können. Die Eigenschaft des Levulans, in den Agarplatten nicht von der Entstehungs- stelle durch Difïusion sich entfernen zu können, zeigt deutlich, dass dieser Körper aus grosseren Molekülen aufgebaut sein muss, wie seine Muttersubstanz, der Rohr- zucker, welcher sich mit Leichtigkeit durch Difïusion fortbewegen kann. Daraus folgt aber, dass das Enzym eine synthetisierende Wirkung auf den Rohrzucker ausübt. Weil hierbei ein das polarisierte Licht nach links drehender Körper entsteht, könnte man meinen, dass die Wirkung nicht direkt auf den Rohrzucker, sondern auf die Levulose stattfinden muss. Dieses ist jedoch nicht der Fall, denn früher wurde schon hervorgehoben, dass Levulose an sich nioht für Levulanbiltiung geignet ist, was insoweit bemerkenswert ist, als die Levulanbazillen mit Levulose als Kohlen- stoffquelle sich gut ernahren und damit wachsen können. Die Hypothese ware jedoch zu retten durch die Annahme, dass Levulan nur aus Levulose im status nascens ge- bildet werden kann. Schliesslich soll in diesem Verbande noch bemerkt werden, dass alle bisher auf- gefundenen Levulan erzeugenden Bakterien zugleich zu einer energischen Rohr- zuckerinversion veranlassen, was übrigens von B. mesentericus vulgatus sohon langst bekannt war. Neben Levulan werden denn auch immer Levulose und Glukose ge- funden. 97 4- Das Levulan. Das Levulan wurde entdeckt von Lippmann^), der es, wie aus seiner aller- dings in bakteriologischer Hinsicht unvoUstandigen Beschreibung hervorgeht, eben wie wir als Wandstoff von Bakterien erhielt, welche er jedoch nicht deutlich be- zeichnet. Identisch damit ist wohl das von Greig-Smith und S t e e 1 e und von Selich angegebene Lavan^), welches durch eine als B. laevaniformans ange- deutete, aus der Beschreibung jedoch nicht wieder erkennbare Bakterie entstehen soll. Ausserdem wurde durch Maassen») Levulan als Produkt einer Bakterie erkannt, welche er Semidostridium commune nennt, und neuerlich haben F e r n - bach und Schoen einen anaeroben Bazillus gefunden, welcher ebenfalls aus Rohr- zucker Levulan erzeugt *). L i p p m a n n giebt an, dass die Drehung des polarisierten Lichtstrahls für sein Levulan betragt a D = — 22 1" Greig-Smith und S t e e 1 e geben für Levan eine Drehung von a D = — 20*^ was ein sehr unwahrscheinlicher Wert ist, der auf irgend eine Beimengung hinweist. Wir fanden für das vermittelst B. mesentericus und B. emulsionis bereitete Emulsionslevulan a D = — 8o" was jedoch infolge der starken Opaleszenz der Lösung nur eine angenaherte Zahl ist. Reines Levulan ist beinahe ganzlich unlöslich in kaltem, ziemlich gut löslich in siedendem Wasser. F e h 1 i n g's Kupferlösung wird beinahe nicht reduziert, erst nach langerem Kochen ist eine schwache Reduktion. bemerkbar. Es eignet sich nicht für Alkohol- und Milchsauregarung, wird dagegen, wie schon früher gesagt, durch Buttersaurefermente bei Luftabschluss ebenso leicht ver- goren wie Rohrzucker, unter Bildung von Essigsaure, normaler Buttersaure, Wasser- stoff und Kohlensaure. Viele Bakterien können Levulan als Kohlenstoffquelle für aerobes Wachstum verwenden. Azotohacter chroococcum vermag mit demselben zu wachsen und atmospharischen Stickstofï zu binden, was umso bemerkenswerter ist, als diese Bakterie selbst unter Umstanden aus Rohrzucker Levulan erzeugen kann. In den Rohrzuckerplatten bemerkt man dann auch, dass rings um Impfstriche von A. chroococcum sich anfangs eine Levulanemulsion absetzt, welche spater ver- schwindet. Weil hierbei keine Saure im Spiel ist, hat es den Anschein, dass in diesem Falie auch das Verschwinden des Levulans unter dem Einfluss eines Enzyms stattfindet. Mit Sauren, besonders beim Erwarmen, geht es sehr leicht über in Levulose, wodurch es für Alkohol- und Milchsauregarung geeignet wird. Nach der Inversion entsteht beim Erhitzen mit Resorcin und Salzsaure die für Levulose charakteristische ') Chemie der Zuckerarten, pag. 8o6, 1312, 3te Aufl. 1904. '^) Lippmann 1. c, pag. 806. •) Arbeiten des Kaiserl. Gesundheitsamtes, Biel. Abt. Bd. 5, pag. i, ipoS- *) Sur la production du levulose par voie biochimique. Comptes Rendus, T. i5S» pag. 84, 1912. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 7 98 Rotfarbung, wahrend mit Orciii und Salzsaure die Yiolettfarbung, welche aut Xylose deutet, fehlt. Nach Vorbehandlung mit Schwefelsaure und Destillation findet sich im Destillat kein Furfurol. Nach langerer Erhitzung im Autoclaven bei 125" C. findet eine teilweise Vernichtung statt. 5. Darstel} uu g von Levulan mit reitikultivierten Art en. Das Levulan wurde vermittelst mehrerer reinkultivierter Bakterienarten ange- fertigt. Besonderes Interesse vv'ar daran verbunden, dasselbe zu bereiten mit dem im Rohrzucker ausserordentlich allgemeinen Bacillus emulsionis, dessen Vorkommen eben in diesem Zucker darauf deutet, dass die Entwicklungsbedingungen desselben, wahrend der Zuckerfabrikation an irgend einem Augenblick im Zuckersaft realisiert sein mussen. Diese also auch in praktischer Hinsicht nicht unwichtige Bakterien- art, erzeugt auf Bouillonagar ohne Zucker nur ausserst kleine kaum auffindbare Koloniën. Ebenso auf Bouillongelatine ohne Zucker, wobei von Verflüssigung nichts zu bemerken ist. Auf Hefeagar mit 0,1% NaoCOs und auf alkalischem Erbsen- blatteragar ist das Waohstum ziemlich gut. Auch Kreide wirkt gunstig. Bei Gegen- wart von Rohrzucker bilden sich Stabchen mit endstandigen Sporen von elliptischer oder bohnenförmiger Gestalt, welche 0,6 bis 1,5 ja messen, und beim Kochen sehr resistent sind. In zuckerhaltigen Nahrlösungen entsteht etwas Saure und ein un- angenehmer Geschmack. Mit letzterem Umstand soll im Betriebe der Zuckerbackerei gerechnet werden, weil B. emulsionis zur Verderbniss von Zuckerwaren veranlassen kann. Dieser kann aber vorgebeugt werden dadurch, dass der Wassergehalt der Ware nur niedrig (unterhalb 8 — 10%) gehalten wird. Die Bakterie ist noch bemerkenswert durch den geringen Stickstofïbedarf. Die Form ist sehr variabel und bildet beim Veraltern zwei Arten von Koloniën: trübe Koloniën mit viel und durchsichtige mit wenig Sporen. Weil es sich herausgestellt hat, dass das damit erhaltene Produkt nicht verschieden ist von dem mit Heubazillen dargestellten, verdient die Bereitung mit Reinkulturen von letzterer Art den Vor- zug, weil dieselbe schneller wachst und eher zum Ziele führt. Die am besten ge- eignete Nahrlösung ist die salpeterhaltige, schon früher angegebene, worin übrigens der Rohrzuckergehalt gewaltig variieren kann. So erhielten wir ein gutes Resultat sowohl mit Lösungen, welche nur 0,1%, wie mit solchen welche 50%, also fünfhundert- mal mehr Rohrzucker enthielten. Die Quantitaten Levulan, welche aus dem Rohrzucker erhalten werden, ergeben sich aus dem folgenden. Aus grossen Erlenmeyer kolben, worin 500 cM" einer 20% Rohrzucker- lösung in Leitungswasser mit 0,02% KNO3 und 0,02% K2HPO4, geimpft mit B. mesentericus viilgatus durch das »Verfahren der Kartoft'elschnitte« erhalten ^), ') Dieses Verfahren besteht darin, dass man mit Gartenerde infizierte Scheiben, welche aus lebenden Kartoffeln geschnitten sind, bei 35° C. kultiviert. Nach ein oder zwei Tagen wachsen nur B. mesentericus und B. subtilis darauf zu Koloniën aus, wahrend alle andere Bakterien hier ihre Entwicklungsbedingungen nicht finden. Dieses beruht einerseits auf dem Umstand, dass die Kartoffel bei 35 a 37° C. zwar noch lebt, jedoch bei dieser Temperatur kein Kork erzeugen kann. Anderseits auf die Bildung irgend eines Giftes durch B. mesentericus und B. subtilis, wodurch die Kartoffelzellen getötet und so für diese Bakterien Nahrung werden. 99 wurcle nach 7 Tagen Kultur bei 30" C. 8 G. trockenes, reines Levulan erhalten, also 8%, wahrend in der Flüssigkeit noch 70 G. Rohrzucker und 20 G. Invertzucker ge- genwartig waren, welche beim langeren Stehen in ahnlichen Kolben zum Teil weiter in Levulan batten verandern können. In einem anderen Falie wurde unter denselben Bedingungen aus 100 G. Rohr- zucker nach 17 Tagen 13 G. Levulan geerntet, wahrend noch 45 G. Rohrzucker und 35 G. Livertzucker gegenwartig waren. Am Boden fand sich eine durchsichtige, gelatinöse, aus B. mesentericus mit Levulan-s^anden bestehende Schicht, welche Schicht, nachdem die darüber stehende Flüssigkeit entfernt war, übergossen wurde mit der obengenannten Minerallösung, worin anstatt 20% nur 2% Rohrzucker gelost war. Nach 18 Tagen wurden aus den 10 G. ursprünglich gegebenem Rohrzucker 2,25 G., oder 22,5% Levulan geerntet, also nahezu die Halfte der Menge, welche bei der völligen Verwandlung von der gesamten Levulose zu erwarten war. Bereitet man auf eine ahnliche Weise, jedoch durch Kultur in einer Nahrlösung ohne gebundenen Stickstoff, die schleimigen Produkte, welche durch Azotobacter chroococcuin erzeugt werden, so stellt sich heraus, dass dabei ausser Levulan noch ein anderer Körper erhalten wird, welcher zu den Zellulanschleimen gehören dürfte. Zu gleicher Zeit erhalt man dann aber auch Glycogen, welches in den jungen Azoto- hacterknXiViVfn. reichlich vorkommt. Zwar findet sich Glycogen auch in den Heu- bazillenkulturen vor, jedoch in geringerer Menge. Weil Levulan aber in kochendem Wasser viel leichter löslich ist wie Glycogen und Zellulan, ist eine ziemlich gute Reinigung davon in allen Fallen möglich. IL Dextran als Wandstoft'. /. Allgemeines iiber Dextranbakterien. Lenconostoc. lm vorigen Abschnitt haben wir gesehen, dass die Untersuchung der Beziehung zwischen den Sporen erzeugenden Bakterien zum Rohrzucker Licht geworfen hat auf die Entstehung des Levulans und dessen Bedeutung als Wandstoff der Bakterien- zelle. Auf eine ahnliche Weise hat das Studium der in nicht pasteurisierten Ma- terialien vorkommenden Bakterien in ihrem Verhalten zum Rohrzucker Aufklarung gebracht über die Dextranfrage, wobei sich herausgestellt hat, dass es nur die Milch- siiurefermente sind, welche dabei in Betracht kommen, und weiter, dass die aus den Zuckerfabriken unter dem Namen Lenconostoc bekannten Mikroben, welche von van Tieghem^), Zopf und Liesenberg^) und Z e 1 1 n o w ^) beschrieben wurden, nichts anderes als Dextranlaktokokken sind, welche aus Rohrzucker Dextran ') Sur la gomme de sucrerie. Annales des se. nat. Botan. 6e Sér., T. 7, 1878. ^) Ueber den Froschlaichpilz der Ruben- undRohrzuckerfabriken. Beitr.zur Morphol. imd Physiol. niederer Organismen, Heft i, pag. i, 1892. ^) Froschlaichbildungen in Saccharose enthaltenden Flüssigkeiten. Zeitschr. für Hygiëne. Bd. 57, pag. 154, 1907. Hier gute Microphotographien. als Wandstofï erzeugen. Ferner wurde festgestellt, dass nur aus Rohrzucker allein Dextran entstehen kann, wahrend die Ernahrung der bezüglichen Fermente, welche auch sehr gut mit anderen Zuckerarten möglich ist, niemals zur Entstehung von Dextran veranlasst. Es lasst sich deshalb recht gut begreifen, warum die früheren Untersucher, welche mit diesen Umstanden unbekannt waren, sich immer für das Auffinden von Leuconostoc an die Zuckerfabriken gewendet haben, was jedoch, wie wir nachher sehen werden, nicht nötig ist, weil diese Mikroben in unserer Umge- bung ziemlich allgemein vorkommen. Für die Dextranproduktion muss methodisch ganz anders verfahren werden, wie für diejenige des Levulans, weil die Differenz in den Lebensbedingungen und der Er- nahrung zwischen den Milchsaurefermenten und den bei der Levulanbildung vorzugs- weise in Betracht kommenden, sporenerzeugenden Bazillen eine sehr grosse ist. Hauptsache für die Kultur der Milchsaurefermente, wenigstens für die uns hier be- sonders interessierenden aktiveren Formen, ist die gleichzeitige Gegenwart in ihrem Nahrboden eines geeigneten Kohlehydrates, woraus Milchsaure entstehen kann, und von pflanzlichem oder tierischem Pepton als Stickstoffquelle. Daraus erklart sich die Leichtigkeit, womit die Milchsaurefermente sich in den »natürlichen«, zuckerhal- tigen Flüssigkeiten, wie Milch, Malzwürze, Most und in pflanzlichen Saften über- haupt entwickeln können und die Seltenheit und Schwierigkeit, womit dieses in künstlichen,nurauskristallisierbarenSubstanzen zusammengesetzten Nahrlösungen ge- schieht. Zwar ist es uns bisweilen gelungen, in einer Flüssigkeit von der Zusammenset- zung: Leitungswasser, io% Rohrzucker, 0,02% CINH4, 0,02% K2HPO4 und 2% Kreide mit stadtischem Sielwasser als Impfmaterial, Dextranbildung zu beobachten und daraus auf Hefewasser-Rohrzucker-Gelatinplatten einen Dextrankokkus zu iso- lieren, doch stellte sich heraus, dass die Uberimpfungen davon in der genannten Nahrlösung nicht weiter wachsen konnten, dagegen in den natürlichen, Zucker und Pepton enthaltenden Flüssigkeiten ausgezeichnet 1). Um die Dextranbakterien aufzufinden und zu isolieren, verwendet man deshalb für ihre Rohkultur mit Rohrzucker (oder mit anderen Zuckerarten) versetzte Bouil- lon, Hefewasser oder Molken, oder auch Würze oder Most mit oder ohne Rohr- zucker. Für die Isolierung werden vorzugsweise Rohrzucker-Bouillon-Gelatine- oder Rohrzucker-Hefewasser-Gelatine-Platten verwendet. Zwar kann man für diesen Zweck auch Agar gebrauchen, doch bleibt darauf, durch eine noch nicht völlig auf- geklarte Ursache die Dextranbildung schwacher wie auf Gelatine. Auch Malzwürze mit Rohrzucker ergiebt sich für die Dextranbildung als weniger gunstig wie Hefe- wasser mit Rohrzucker, vielleicht weil durch die Würze die Saureproduktiou be- sonders gefördert wird. Die Koloniën der Dextrankokken sind auf den Rohrzuckerplatten sofort kennt- lich an ihrer starken Ausdehnung und ihrer glasartigen Durchsichtigkeit. Sie kön- nen dabei jedoch unter sich grosse Verschiedenheiten zeigen. Es giebt namlich darunter Varietaten, welche als feste, knorpelartige Massen auf den Platten liegen, und das bekannte blumenkohlartige Bild von Leuconostoc zeigen. Anderseits können *) Hier sieht man also wieder ein Beispiel des schon oft betonten Umstandes, dass die in der Natur vorkommenden Organismen Eigenschaften besitzen, welche bei anderen Kulturbedingungen sofort oder allmahlich verloren gehen, und wie vorsichtig man deshalb sein muss aus den letzteren auf die ersteren zu schliessen. die Koloniën weich, ja beinahe flüssig werden und sich als Tropfen auf den Platten vortun, wobei es sich um verschiedene konstante Varietaten und Unterarten handelt. Die Dextrankokken erzeugen niemals Dextran ausserhalb ihrer Koloniën, so dass die Emulsionserscheinung bei diesen Mikroben vollstandig fehlt, Auch in den Nahrlösungen wird das Dextran nur in Verbindung mit den Erzeugern angetroffen, wodurch auch die für Levulan so charakteristische Opaleszenz hier ebenfalls nicht vorkommt. Die echten Milchsiiurefermente erzeugen auf den Rohrzuckerplatten nur ganz kleine Koloniën weil sie darauf keine Wandstoffe hervorbringen. Sie sind dadurch sofort von den Dextrankokken zu unterscheiden. Auf Kulturplatten mit anderen Zuckerarten wie Rohrzucker, bleiben die Ko- loniën der Dextrankokken ebenso klein, wie die der gewöhnlichen Milchsaurekokken, so dass beide, was hier noch besonders hervorzuheben ist, z. B. auf den, bei der Milchuntersuchung so vielfach verwendeten Molkengelatinplatten nicht voneinan- der zu unterscheiden sind. Von den beiden Hauptgruppen, wozu die Milchsaurefermente gebracht werden mussen, namlich Lactococcus und Lactobacülus, ist Dextranbildung bisher allein bei ersterer Gattung beobachtet. Weil alle Laktokokken einer niederen, die Lakto- bazillen dagegen gewöhnlich einer höheren Temperatur adaptiert sind, mussen die Versuche zur Erhaltung der Dextrankokken denn auch bei niederen und mittleren Temperaturen ausgeführt werden. Die Verbreitung der Dextrankokken in der Natur lasst sich auf zwei Wegen studieren, namlich durch die direkte Untersuchung von Materialien, worin Milch- sauregarung stattgefunden hat, und durch geeignete Anhaufungsversuche, wodurch nur oder vorzugsweise Dextranbakterien zur Vermehrung gebracht werden. Zu den bei oder durch Milchsauregarung erhaltenen Materialien, welche reich an Dextranbakterien sind, oder dieses wenigstens unter Umstanden sein können, ge- hören z, B. Presshefe, Lohbrühe, Sauerteig und sauere Milch. Doch sind auch ver- dorbener Wein und Bier und ahnliche alkoholisch vergorene Flüssigkeiten bisweilen reich daran. Weil, wie ich das schon mehrfach betont habe, allen aktiven Milchsaurefermen- ten das Vermogen zur Bildung von Mannit aus Levulose zukommt, könnte man meinen, dass irgend ein ursachlicher Zusammenhang zwischen Dextran- und Man- nitbildung existiert. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass dieses nicht der Fall ist und dass z. B. bei der sogenannten »Mannitgarung« im Wein, welche allerdings ge- wöhnlich durch kurze Laktobazillen verursacht wird, in gewissen Pallen dagegen auf Laktokokken zurückgeführt werden muss, als Schleimsubstanz, wie es scheint, immer nur Zellulan und niemals Dextran entsteht (zu vergleichen Pag. io8). Eine in praktischer Beziehung nicht unwichtige Eigenschaft der Dextranbak- terien besteht darin, dass dieselben, neben Milchsaure, mehr oder weniger Essig- saure erzeugen, welche bekanntlich in den bei der Milchsauregarung erhaltenen Produkten ungewünscht ist. Dagegen erzeugen die echten, für die Rahmsauerung verwendeten Laktokokken weder Dextran noch Essigsaure. Daraus ergiebt sich, dass der Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens der Dextranbakterien, z. B. in den als »Saurewecker« verkauften Handelsprodukten, für die Milchwirtschaft wichtig sein muss. Eine genaue Ermittlung des Verhaltnisses zwischen Dextrankokken und kein Dextran hervorbringenden Laktokokken scheint für die Untersuchung von allerlei gesauerten* und für »saure Verderbniss« sich eignenden Nahrungsmitteln über- haupt empfehlenswert, und ich erwarte, dass dafür geeignete Verfahren früher oder spater bei der Nahrungsmitteluntersuchung allgemein eingeführt werden sollen. Wie ein solcher Abzahlungsversuch auszuführen ist, ergiebt sich aus dem Vor- hergehenden. Man hat nur eine Gelatinplatte anzufertigen, welche ausser der ge- eigneten Stickstofifquelle Rohrzucker enthalten muss. Besonders dafür zu empfehlen ist z. B. Bouillongelatine mit 2 bis 10% Rohrzucker, wobei es geeignet sein kann, Kreide zuzusetzen, wenn die zu erwartende Saurebildung eine starke ist. Hefe- vvassergelatine mit Rohrzucker mit oder ohne Kreide, oder Würze-Rohrzucker- gelatine, führen in anderen Pallen, z. B. bei der Untersuchung von gesauerten Ma- terialien zu guten Resultaten. lm Ganzen ist die Verschiedenheit der echten Milchsaurekokken und der Dex- trankokken so gross, dass ein besonderer Name für die letzteren notwendig ist. Ich schlage vor, dafür Lactococcus (Streptococcus) dextranicus zu wahlen, wahrend dann für die eigentlichen Laktokokken der Rahmsauerung der Name Lactococcus lactis L i s t e r , oder, nach dem Vorgehen von N e u m a n n und L e h m a n n, Streptococcus acide lactici Groten feldt (1889) beibehalten bleibt. 2. Anhdufung der Dextrankokken in Rohkidtur. Die Dextranbakterien sind in unserer Umgebung nicht besonders allgemein ver- breitet, in welcher Hinsicht sie mit den echten Milchsaurefermenten übereinstim- men. Dennoch gelingt es dieselben z. B. aus Erdmustern verschiedener Herkunft mit grosser Sicherheit in Kultur zu bringen, auch dann, v\-enn sie darin so selten sind, dass sie auf Kulturplatten nicht direkt zur Entw^icklung gebracht werden kön- nen, was vielleicht der gewöhnliche Fall ist. Auch das kann mit denselben Worten ven den echten Milchsaurebakterien des Erdbodens gesagt werden, und weil es Erd- proben giebt, woraus die beiden Bakteriengruppen ziemlich leicht zu erhalten sind, crhebt sich wie von selbst die Frage nach der Lebensweise derselben eben in Erde, welche so ganzlich verschieden sein muss von derjenigen in unseren künstlichen Nahr- medien^). Diese Frage kann hier jedoch nicht weiter behandelt werden. Zur Anhaufung der Dextranbakterien in einer Nahrlösung kann man wie folgt \erfahren. Eine Stöpselflasche von 100 cM'' Inhalt wird voUstiindig angefüUt mit Hefe- wasser, versetzt mit 10% Rohrzucker; es wird infiziert mit Gartenerde (z. B. I — 20 G.) und kultiviert bei 30°. Hierbei entsteht innerhalb 24 Stunden eine Butter- sauregarung, ohne dass von Dextranbildung etwas zu bemerken ist. Von dieser Kultur wird übergeimpft bei den gleichen Kulturbedingungen, jedoch bei 20 ^ C *) Wenn es sich hierbei wenigsteus nicht handelt um accidentell angeführte, in Ruhe verkehrende Keime, welche keine Bedingungen für Vermehrung und aktives Leben finden, was eben für die Milchsaure- und Dextrankokken unwahrscheinlich ist, weil sie zwar dem Trocknen widerstehen, jedoch in feuchtem Zustande empfindlich sind und bei un- genügender Nahrung nach einigen Wochen oder Monaten, wenigstens in unseren Kuituren, absterben. 103 Gewöhnlich bemerkt man dann schon in dieser zweiten Impfung einen Beginn von Dextranbildung. Findet dann noch eine Überimpfung statt in die gleiche Nahr- lösung, nachdem diese nunmehr mit Kreide versetzt ist, so wird die Dextranbildmig sehr stark und bei der Aussaat auf eine Hefewasser-Rohrzucker-Gelatin-Platte er- halt man vorzugsweise Dextrankokken mit mehr oder weniger echten Milchsaure- fermenten. Das Verfahrenkann in allerlei Richtungen abgeandert werden und schliesslichdoch auf Dextrankokken führen. So kann zur Einschrankung der Buttersiiuregarung von Anfang an angesauert werden mit z. B. 3 — 5 cM» normal Milchsaure pro 100 cM* Nahrlösung, und sobald die Milchsaurekokken daini wieder deutlich entwickelt sind, wird übergeimpft in dieselbe Lösung mit Kreide. Kultur bei ca. 20" C. ist gunstig; ebenso Luftabschluss. Letzterer Umstand ist j edoch nicht unumganglich notwendig, denn bei Luftzutritt, z. B. in E r 1 e n m e i j e r kolben, entsteht unter den gleichen Kulturbedingungen ebenfalls Milchsauregarung, verursacht durch die beiden Lakto- kokken, w^obei sich aber zu gleicher Zeit eine Vegetation von Hefe, Mucor und Oidium entwickelt, welche erst bei anaerober Überimpfung ganzlich verschwindet. Auch kann die Quantitat des Rohrzuckers stark vermehrt werden, z. B. bis 40%, wodurch ebenfalls die Buttersaurefermente mehr zurücktreten, dagegen ge- wisse Formen von Coli und Aerogenes einigermaassen begunstigt werden (und dar- unter auch Schleimsubstanz erzeugende) ^). Schliesslich bekommt man beim Über- impfen auch auf diesem Wege Dextrankokken. Natürlich kann man anstatt Erde als Impfmaterial auch die früher genannten, für direkte Isolierung der Dextranbilder empfohlenen Materialien für die Anhau- fungsversuche verwenden, wobei besonders saure Milch Aussicht auf eigentümliche Formen giebt. Das Wasser der stadtischen Schwemmkanale ist reich an Dextran- kokken und deshalb ebenfalls ein gutes Impfmaterial. Anstatt Rohrzucker können sehr gut andere Zuckerarten für die Anhiiufung \erwendet werden, wie Glukose, Levulose, Maltose und Laktose. Bei der letzten tjberimpfung wahrend der Vorkultur ist jedoch der Gebrauch von Rohrzucker zu empfehlen, weil allein dadurch festgestellt werden kann, ob man wirklich Dextran- kokken erhalten hat. Natürlich muss die Reinkultur notwendig auf Rohrzucker- platten stattfinden, worauf, wie schon gesagt, die Dextrankokken zu grossen durch- sichtigen Klumpen, die eigentlichen Laktokokken nur zu sehr kleinen Koloniën ohne deutlichen Wandstoff auswachsen. Vergleicht man die bei diesen verschiedenen Verfahren erhaltenen Rohkulturen miteinander, so stellt sich heraus, dass die Konsistenz des dabei in den Hefewasser- Rührzucker-Kreide-Flaschen erhaltenen Schleimes nicht immer dieselbe ist. Diese Konsistenz kann »lange« und »Faden ziehend« sein, wie bei der »lange wei«, oder auch »kurz« und mehr »bröckelig«, an Kleister erinnernd. Die Isolierung auf Hefewasser-Rohrzucker-Gelatinplatten liefert Reinkulturen von Dextrankokken, welche die bezeichneten Eigenschaften erblich übertragen, wodurch es möglich ist, ') Eine sichere Methode, um die Schleim erzeugenden Formen der Co/igruppe in Rohkultur anzuhaufen, fehlt noch; bei allen bisher üblichen Anhaufungen der Bakterien dieser Gruppe werden diejenige Arten, welche Schleim produzieren (wie B. viscosus), eben durch die nicht Schleim bildenden verdrungen. Jedoch handelt es sich dabei nicht um Dextran, sondern um Zellulan. 104 eine Reihe untereinander sehr abweichende Formen zu erhalten, wovon einzelne sehr weiche, andere sehr feste, wieder andere fadenziehende Koloniën erzeugen. Auch besteht noch eine grosse Difïerenz in dem Garvermögen der verschiedenen Stamme, worunter es einzehie giebt, weiche viel Wasserstoff und Kohlensaure bil- den, andere, weiche keine merkliche Quantitat Wasserstoff, sondern nur Kohlen- saure abgeben und wieder andere, weiche kein Gas überhaupt erzeugen i). Die Wasserstoff produzierenden zeigen eben dadurch eine grosse Verwandtschaft zu B. lactis aerogenes, wovon sie jedoch scharf verschieden sind durch den Mangel an Eigenbewegung und die viel höhere Saurebildung, weiche 9 — 12 cM^ Normal pro 100 cM^ Nahrlösung werden kann, vorausgesetzt, dass keine Kreide zugesetzt war. Die Anordnung der Kokken in den Koloniën ist sehr verschieden, bisweilen mehr unregelmassig, in anderen Fallen in sehr regelmassiger, strahlenförmiger Ver- teilung. Bei schwacher Vergrösserung sieht man in den Koloniën ziemlich umfang- reiche Stellen, weiche ganzlich durchsichtig sind und allein aus Dextran, ohne Bak- terienleiber bestehen, was auf eine excentrische, nicht gleichmassig rings um den Bakterienkörper stattfindende Bildung des Dextrans hinweist. Es ist sehr bemerkenswert, dass alle die genannten Verschiedenheiten bei der Yererbung sich als sehr stabil ergeben, so lange die Kulturbedingungen nicht abgedndert werden. So sind bisher keine deutlichen Mutanten aus den Kuituren der verschiedenen Stamme unserer Dextranbakterien erhalten, trotzdem diese seit Be- ginn 1910 in Kultur und immer auf Bouillon-Rohrzucker-Gelatine übergeimpft sind. Hier finden wir also einen scharfen Kontrast z. B. mit B. herhicola, dessen As- cococcwjmutante ausserlich mit den Dextrankokken übereinstimmt, davon jedoch verschieden ist durch grosse Mutabilitat unter unveranderten Kulturbedingungen. Anderseits muss hervorgehoben werden, dass bei B. herhicola auch die Natur des Wandstoffes eine andere ist, weil dieser zu den Zellulanschleimen gehort. Finden jedoch grosse Abanderungen in den Kulturbedingungen statt, so können die Dextrankokken mutieren. Dieses wurde z. B. beobachtet bei einem sehr fest und relativ »trocken« wachsenden, aus Sielwasser isolierten Stamm, welcher in den Ko- loniën stark an Kefyrkörner erinnert, jedoch beim Überimpfen auf Rohrzucker- gelatine, weiche mit Natriumcarbonat alkalisch gemacht ist, in sehr grosser An- zahl eine weiche, ja, beinahe in flüssigen Koloniën wachsende Mutante abwirft, weiche sofort erblich konstant ist und bleibt, auch bei Zurückversetzung in die ur- sprüngliche Wachstumslage. Bei einer anderen Gelegenheit werde ich darauf zu- rückkommen. 5. Die von den Dextranbakterien erseugten Produkte. Um Klarheit zu bekommen bezüglich der biochemischen, durch die Dextran- bakterien in den Kohlehydraten hervorgerufenen Umwandlungen, haben wir die Hauptprodukte derselben vergleichsweise bestimmt im Falie Dextranbildung mög- lich war, also bei Gegenwart von Rohrzucker und im Falie diese nicht stattfinden konnte, namlich wenn nur Glukose oder Levulose in der Nahrung vorkamen. Ein •) Die Gasbildung kann wegen der Saure natürlich nur in Kuituren ohne Kreide beurteilt werden. 105 Gemisch von Levulose und Glukose ist für die Dextranbildung ebensowenig ge- eignet, wie diese Zuckerarten allein. Bei verscliiedenen Versuchen kamen Dextran, Milchsaure, Essigsaure, Mannit und Kohlensaure zur Bestimmung. Die verschie- denen Varietaten der Dextrankokken geben j edoch sehr abweichende Resultate, so dass die gegebenen Beispiele nur als Einzelfalle zu betrachten sind, Wir verwen- deten einerseits die durch das Hefewasser-Rohrzucker- oder Bouillon-Rohrzucker- Verfahren aus Erde gewonnenen Dextrankokken, deren Koloniën Strahlenstruktur zeigten (a)j anderseits einen mit Rohrzucker und Chloramon aus einem Schwemm- kanal isolierten Stamm, dessen Koloniën, bei der Betrachtung ihrer Oberflache, keine Strahlen, sondern mehr Ascococcusstruktur hatten (b). Mit ersterer Form erhielten wir in Hefewasser (20 G. Hefe gekocht mit 100 Wasser und klar filtriert) mit 25% Rohrzucker und 2% CaCos bei 20" C. nach 20 Tagen 40% Dextran 21% Mannit auf den verschwundenen Rohrzucker berechnet, wahrend die 39% des nicht zer- setzten Rohrzuckers teilweise als Invertzucker, anderenteils als Calciumlaktat und Azetat zurückgefunden wurden. Bei Versuchen mit dem Dextrankok b, ebenfalls in Hefewasser mit 12,5% Rohrzucker und 20% Kreide, wurden in zwei Fallen 25% des verbrauchten Rohr- zuckers als Dextran und 11 und 10% als Mannit zurückgefunden, wahrend im Gan- zen in einem Volumen von 200 cM^ in 14 Tagen von 25 G. Rohrzucker ungefahr 13 G. verschwunden waren. Mit 100 Hefewasser und 3% Levulose bei 30" C. wurde mit o nach 10 Tagen gefunden 0,540 G. oder 18% Milchsaure 0,306 » 10,2% Essigsaure 1,264 » 42,10% Mannit 0,181 » 6% Kohlensaure 0,670 » 22,3% nicht zersetzte Levulose, wahrend durch die Jodoformreaktion Alkohol nachweisbar war. Hier war also von der verbrauchten Levulose 23,2% zu Milchsaure 13,1% » Essigsaure 54.3% » Mannit 7,3% » Kohlensaure geworden, wahrend die Flüssigkeit einen Sauretiter von ii,i cM» normal pro 100 cM« bekommen hatte, was offenbar die Ursache des Stillstandes im weiteren Zuckerabbau geworden war. Mit Hefewasser 3% Glukose wurde von a aus 3 G. Glukose, bei 30°, in einer Woche, wenn keine Kreide zugesetzt war, 0,84 G. zersetzt und ein Sauretiter von 8 cMs normal pro 100 cM" Nahrlösung gebildet. Von dem verbrauchten Zucker wurden zurückgefunden 0,45 G. als Milchsaure 0,06 als Essigsaure 0,18 als Kohlensaure io6 ocler umgerechnet auf loo Teile verschwundenen Zucker 53,6% Milchsaure 7,1% Essigsaure 21,5% Kohlensaure. Bei Zusatz von Kreide war es leicht, durch a in zwei Wochen aus Hefewasser init 3% Glukose und Kultur bei Luftabschluss bei 25", den gesammten Zucker zum Verschwinden zu bringen. Bekanntlich findet aus Glukose keine Mannitbildung statt, indem dieser Körper allein aus Levulose entsteht. Prazipitiert man das Dextran aus den Hefewasser-Rohrzucker-Lösungen da- durch, dass man diese auf einen Alkoholgehalt von 50% bringt, und trocknet und pulverisiert man das Prazipitat, so bekommt man ein schneeweisses, geschmackloses Pulver, welches selbst in kochendem Wasser beinahe ganzlich unlöslich ist. Das- selbe kann deshalb viel weniger gut wie Levulan von den Bakterienkörpern ge- trennt werden. Durch Alkaliën oder Kalkwasser kann es in Lösung gebracht und dann, nach der Neutralisation mit Salzsaure, als löslicher Körper prazipitiert wer- den^), wobei jedoch eine Trennung von den Proteinkörpern nur unvollkommen ge- lingt. Eine mehr vollkommene Reinigung zu erreichen durch Entfernen der Proteinkörper vermittelst einer vorhergehenden Behandlung mit Trypsin ist nicht raerklich gelungen. Das Drehungsvermögen für polarisiertes Licht ist rechts, doch wird der Betrag verschieden angegeben. L i p p m a n n giebt, nach mehreren Autoren, Zahlen zwischen + 195" und + 227,7", wahrend wir a D = + 125" fan- den. Ob jedoch bei der Behandlung mit Alkali zum Auflösen keine chemische Um- wandlung stattfinden sollte, ist sehr unsicher. Jedenfalls sind diese Zahlen für eine in Wasser ursprünglich nicht lösliche Substanz von untergeordneter Bedeutung. Dextran wird durch Kochen mit verdünnten Sauren in Glukose übergeführt. Durch Diastase wird es nicht angegriiïen, und natürlich auch nicht durch Invertase. Für Alkali und Milchsauregarung ist es nicht geeignet. Dagegen wird es von den verschiedenen Buttersaure- und Butylalkoholfermenten leicht vergoren, wobei wohl ein spezifisches, mit der Pektinase nahe verwandtes, jedoch noch nicht deutlich nachgewiesenes Enzym wirksam sein muss ^). Das Dextran kann auch vielen aeroben Mikroben als Kohlenstoffquelle dienen. Die Emulsionserscheinung, welche für Levulan so charakteristisch ist, fehlt bei Dextran ganzlich, so dass es niemals ausserhalb den erzeugenden Bakterien an- getroffen wird. Da es aber sicher ist, dass das Levulan unter dem Einfluss eines Enzyms aus dem Rohrzucker entsteht, muss für das Dextran wohl dasselbe an- genommen werden. Hierbei bleibt es unsicher, ob die Neubildung der Dextran- schicht am Bakterienkörper nur stattfindet an der Stelle, wo die Hautschicht des Protoplasma's die schon gebildete Dextranschicht berührt, oder auch in einiger Entfernung davon. lm letzteren Falie müsste es möglich sein mit Dextran, ohne Bakterienkörper, jedoch impragniert mit dem hypothetischen Enzym, auf ahnliche ') Lippmann, Chemie der Zuckerarten, pag. 427 und pag. 1309, 3te Aufl., 1904. ^) In dieser Beziehung mache ich darauf aufmerksam, dass gewisse Buttersaure- fermente, namlich die verschiedenen Formen von Granulobacter pectinovorum, nicht nur die Pectosewand der Zeilen der höheren Pflanzen, sondern auch die »Zellulose« des Endoperms gewisser Samen, so des Datteis und von Phytelephas angreifen, nicht aber die »gewöhnliche« Zellulose. 107 Weise Dextran aus Rohrzucker zu erzeugen, wie das beim Levulan möglich ist. Bisher ist es noch nicht gelungen, in dieser Beziehung zur Klarheit zu kommen. Bei den Versuchen, ausgeführt mit dem Zwecke, zu beweisen, dass sich überhaupt in den Dextrankokken ein solches Enzym vorfindet, konnte nur gezeigt werden, dass allein, wenn die Bedingungen für das Wachstum der Kokken gegeben sind, diese imstande sind Dextran zu erzeugen. \'orlaufig muss die Frage also noch unbeant- wortet bleiben. 4. Wachstumsverhdltnisse der Dextrankokken (Lactococcus dextranicus). Obschon es, in Anbetracht des Umstandes, dass die Dextrankokken zu den Milchsaurekokken gehören, deren Eigenschaften allgemein bekannt sind, nicht nötig ist, hier eine ausführliche Beschreibung unserer Bakterie zu geben, dürfte folgende Übersicht der kuhurellen Verhaltnisse derselben nicht überflüssig sein. Zunachst sei daran erinnert, dass Hefewasser oder Bouillon mit Glukose, Levulose, Rohr- zucker, Laktose oder Maltose für alle naher untersuchten Formen sich als gute Nahrstoffe und Saurequellen herausstellten, wovon nur Rohrzucker zugleich zur Dextranbildung veranlasst. Raffinose und Galaktose werden schwieriger angegrif- fen. Dextrin, Melibiose und Xylose sauerten gar nicht. Alle untersuchten orga- nischen Salze werden nicht angegriffen, selbst nicht die Malate und Tartrate, welche durch mehrere Formen der Co//'gruppe zersetzt werden. Kulturboden. Wachstum Hefewasser- oder Bouillon-Gelatine mit 5 — 10% Rohrzucker bei 20" C. Hefewasser- oder Bouillon-Agar mit 5 — 10% Rohrzucker und Kreide bei 30" C. Bouillongelatine 40% Rohrzucker bei 20» C. Leitungswassergelatine, 10% Rohr- zucker, 0,02 K0HPO4, 0,02 CINH4. Idem, jedoch anstatt Chloramm.' 0,25% Asparagin. Je nach den Varietaten mehr oder weniger Dextran ; bei einzelnen For- men Leuconostoc- oder Zoogloeabildung. Saurebildung, Mannitbildung und In- version. Keine Verflüssigung. Starkes und ausgedehntes Wachs- tum ; die Platte bedeckt sich schliess- lich mit einer zusammenhangenden Schleimschicht. Starke Saurebildung, Mannitbildung und Inversion. Keine Zoogloeen. Wachstum langsam. Keine Zoogloeen (diese nur bis ca. 25% Rohrzucker). Nur die vermittelst Rohrzucker- Chlorammon isolierte Form wachst ; beim Uberimpfen auf gleichen Boden hort das Wachstum jedoch bald auf. Wie vorgehend. io8 Kulturboden Wachstum. Leitungswasser, 2% Pepton, 10% Wachstum, Dextran- uiid Saurebil- Rohrzucker, Agar 3%. dung, jedoch nur schwach. Bouillongelatine,Würzegelatine, Milch Wachstum ausserst gering, nicht von oder Molkengelatine ohne Rohrzucker. demj enigen gewöhnlicher Laktokokken zu unterscheiden. Als besondere Reaktionen erwahne ich noch, dass die meisten Dextrankokken imstande sind gewisse Glukoside, wie Aesculin und schwieriger Indican, zu spalten, wodurch sie ihre Verwandtschaft zu B. lactis aerogenes und einigen Co/tformen zeigen. Der Versuch mit Aesculin wird wie folgt ausgeführt: Bouillongelatine wird versetzt mit 2% Rohrzucker, 0,1 Aesculin und ein wenigFerricitrat. Auf die erstarrte Platte werden Impfstriche der zu untersuchenden Arten gezogen. Die spaltenden Arten erzeugen Aesculetin, welches bei neutraler oder schwach alkalischer Reaktion rnit dem Eisensalz eine braune Verbindung giebt, jedoch eine Schwarzfarbung, wenn die Reaktion des Bodens sauer ist. Die Reaktion ist sehr empfindlich, findet sich aber auch bei einigen gewöhnlichen Milchsaurefermenten und dürfte allgemein zutrefïen für alle diejenigen Formen, welche aus Milchzucker Saure hervorbringen. Schliesslich muss noch hervorgehoben werden, dass die Dextranbakterien ver- dünntes Wasserstoffsuperoxyd einigermaassen zersetzten, jedoch nur schwach und deshalb nur sehr wenig Katalase enthalten. III. Zellulan als Wandstoff. Die Schleimsubstanzen, welche unter diesem Haupte kurz berührt werden sollen, sind sicher nicht einheitlich, so dass der Name Zellulan nur als ein vorlaufiger Sam- rnelname aufzufassen ist. Für mich gehören dazu die mit der Zellulose nahe ver- wandten, schleimigen Wandstoffe, welche durch Buttersaurefermente nicht ange- griffen werden und deren Entstehung durchaus nicht allein von Rohrzucker ausgeht, sondern auch von anderen Kohlehydraten und von anderen Kohlenstoffquellen über- haupt. Bakterien der verschiedensten Verwandtschaftsgruppen können solche Körper erzeugen, wovon im folgenden einige Beispiele gegeben werden sollen, nicht um die Frage zu erschöpfen, sondern eben um dieselbe in Fluss zu bringen. Von den sporenerzeugenden Arten sind es besonders die vielseitig untersuchte, halbaerobe Granulobacter polymyxa, auch wohl B. asterosporus genannt, und das anaërobe Ferment der Butylalkoholgarung, Gr. butylicum, welche hierher gehören, wahrend die anderen ebenfalls besser bekannten Granulohacterzrttn, namlich Gr. saccharobutyricum und Gr. pectinovorum viel weniger oder überhaupt keinen Schleim erzeugen. Die beiden erstgenannten sind Bewohner von Getreidemehl und Kartofïeln und anderen ahnlichen Materialien, woraus sie sich durch gute Anhaufungsverfahren leicht in Kultur bringen lassen. log Von den nicht Sporenbildern erwahne ich als geeignet für die Erzeugung von Zellulanschleim die verschiedenen, früher beschriebenen Viscosusmnta.nten von B. prodigiosus, ferner den zur Co/igruppe gehörigen B. viscosus, die AscococcusmnisuxtQ von B. herhicola, die verschiedenen, schleimerzeugenden Formen von Bacillus radici- cola, welche dafür Rohrzucker besser verwenden können, wie andere Zuckerarten, und viele andere. Ein besonderes Interesse knüpft sich auch an die Schleime, w^elche das »Lang- werden« von Wein verursachen und worüber F. K a i s e r und E. M a n c e a u ein interessantes Buch^) geschrieben haben. Die dabei in Betracht kommenden Arten sind in vielen Fallen sehr kurze Milchsaurebazillen, bisweilen jedoch sicher Milch- saure Streptokokken, v^^elche, v/ie alle Arten dieser Gruppe, aus Levulose Mannit er- zeugen, jedoch nicht zu den Dextranbakterien gehören, weil sie ihre Schleimsubstanz auch aus Glukose und Levulose hervorbringen können. Auch beim »Langvi'erden« von Bier können Mannit und Zellulan erzeugende Milchsaurefermente im Spiele sein, namlich wenn der Vorgang in geschlossenen Flaschen stattfindet, was allerdings selten ist. Bei Luftzutritt sind es Essigbakterien, welche die Schleimbildung im Bier verursachen. Zellulanschleim erzeugende Milchsaurebazillen wurden durch absichtlich dafür eingerichtete Kuituren gewonnen, indem Rübenschnitzel mit Kreide versetzt und mit Zuckerlösung übergossen bei 37° der Garung überlassen wurden. Anfangs entsteht darin eine Buttersauregarung, doch kann diese, besonders beim Überimpfen, in Milch- sauregarung übergehen und daraus sind dann und wann interessante Zellulanbazillen erhalten, welche in Hefewasser oder Bouillon mit Glukose viel Milchsaure und Schleim erzeugten. Hat 'man die Rübenschnitzel mit einer Glukose oder Levulose- lösung und nicht mit Rohrzucker der Garung unterworfen, so kann es vorkommen, dass schon die Rohkultur »lange« wird, was allerdings nur selten geschieht. Dann kann man aber mit Sicherheit auf die Gegenwart von Zellulanbakterien schliessen, was beim »Langewerden« von mit Rohrzucker eingeweichtem Material nicht der Fall ist, weil dabei auch Dextrankokken die Schleimbildung verursachen können. Aller- dings werden die Dextrankokken auch in den mit Glukose oder Levulose schleimig gewordenen Rübenschnitzelgarungen angehauft. Unter den aus solchen Schleimgarungen isolierten Bazillen sind neben sehr weichen, dann und wann Stamme gefunden, welche Koloniën von solcher Festigkeit auf Würzeagarplatten erzeugten, dass dieselben an Kefyrkörner erinnerten. Ich bezweifle übrigens auch nicht, dass die Hauptsubstanz der wirklichen Kefyrkörner ebenfalls eine Zellulanmodifikation ist. In gewissen Fallen könnte man meinen, dass das Zellulan ein stickstoffhaltiger Körper sein muss. so z. B., wenn es durch die ViscosusnrnidLwit von B. prodigiosus aus Bouillon, oder in undestilliertem Wasser gelöster Gelatine hervorgebracht wird. Hierüber chemisch zu entscheiden ist schwierig, weil eine Trennung dieser Substanz von den Bakterienleibern und anderen stickstoffhaltigen Komponenten der ver- wendeten Nahrung nicht wohl gelingt. Man kann sich jedoch dadurch überzeugen, *) Les ferments de la graisse des Vins, Epernay 1909. Man vergleiche auch Hermann Müller-Thurgau, Bakterienblasen (Bacteriocvsten). Centralbl. f. Bakteriol. 2te Abt. Bd. 20, Nr. 12—17, 1908, wobei es sich u. a. um Schleimbildung aus Aepfelsaure handelt. dass auch in diesem Falie die Substanz stickstofïfrei sein muss, dass man die Bak- terien in einem Medium kultiviert, worin gebundener Stickstoff fehlt. Bringt man z. B. B. prodigiosus viscosus in Leitungswasser mit 2% reinem Mannit und o,oi% K2HPO4, so sieht man nach eine paar Tagen bei 30" die Flüssigkeit dick und schleimig werden, obschon dieselbe beinahe ganzlich durchsichtig bleibt. Es haben namlich die darin geimpften Bakterien, mit Hilfe ihrer eigenen Stickstofifreserve, einige Teilun- gen durchmachen können und dabei zugleich eine so dicke Schleimschicht gebildet, dass man anfangs meint, es soll starkes Wachstum stattgefunden haben. Mikro- skopisch lasst sich der eigentliche Tatbestand leicht feststellen, wobei man sich über- zeugt, dass die Bakterien nur in sehr geringer Anzahl vorhanden sind und der Schleim nur aus Mannit entstanden und also frei von Stickstoff sein muss. Figurenerklarung. Fig. I (384). Kolonie van Bacillus mesentericus vulgatus (Kartoffelbakterie) auf: Leitungswasser, 2% Agar, i % Rohrzucker, 0,02% K N Os, und 0,02% Ka H P O4, die »Emulsionserscheinung« ringsum die Kolonie zeigend. Fig. 2 (385). Kolonie von Bacillus emulsionis aus Rohrzucker isoliert, auf: Leitungs- wasser, 2% Agar, 0,1 % Rohrzucker, 0,02% CL N H4, 0,02% Kj H P O4 gleichfalls mit der »Emulsionserscheinung« in der Agarplatte. Inhalt. Einleitung. Methodisches — Die Buttersaureprobe. L Levulan als Wandstoff S. 93 1. Rohkultur von Levulanbaktericn. 2. Die Levulanbaktericn. Die »Emulsionserscheinung« in Agarplatten. 3. Das Enzym Viscosaccharase. 4. Das Levulan. 5. Darstellung von Levulan mit reinkultivierten Arten. [L Dextran als Wandstoff -. S. 99 1. Allgemeines über Dextranbakterien. Leuconostoc. 2. Anhaufung der Dextrankokken in Rohkultur. 3. Die von den Dextrankokken erzeugten Produkte. 4. Tabelle der Wachstumsverhaltnisse der Dextrankokken. IIL Zellulan als Wandstoff S. 108 Figurenerklarung. Laboratorium für Mikrobiologie der Technischen Hochschule cu Delft. M.W. BEIJERINCK. >V-t^.. Fig. I. Bacilliis meseniericiis vulgatus. ,'-'v< .^ .v-^ Fig. 2. Bacilliis einulsionis. Die Emulsionserscheinung On the composition of tyrosinase from two enzymes. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol. XV, 1913, p. 932 — 937. — Verscheen onder den titel »Over de samenstelling der tyrosinase uit twee enzymen* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXI. 1913, blz. 923—930. The product of the action of tyrosinase on tyrosin is commonly called melanin, whose colour may be jet black, but takes all shades between light brown, pure red, brownish red, sepia and black in experimental conditions. These pigments are of uncommon stability and resist even heating with strong alkalies and sulfuric acid, whereby the black runs somewhat into brown but in chief remains unchanged. Even when boiled with nitric acid the melanin remains almost unchanged. It is accepted that the pigment of the hair and hide of higher animals is associated with these substances and is derived from tyrosin. Melanin forniation by symbiose of an Actinomyces with a bacterium. On a culture plate of the composition: distilled water, 2% agar, 0.1% tyrosin (dissolved in a few drops natriumcarbonate) and 0.02% K2HPO4, on which some centigrams garden soil are sown and which is kept at 30" C, hundreds or thousands of little sods of Actinomyces (Streptothrix) will develop after two or three days. The tyrosin serves at the same time as source of carbon and of nitrogen. But the agar itself also is attacked by these microbes, although with difïiculty, and used as food. This is not surprising as many Actinomyces-s\iQc\ts can even live on cellulose as source of carbon. The common bacteria of the soil develop not or hardly on the tyrosin plate and cannot in the given circumstances compete with the slowly growing Actinomyces as they do on better media, e.g. on broth agar, where Actinomyces never occurs when bacteria are present. As the delicate threads of this genus enter deep into the agar, the plates may be f reed by washing from the bacterial colonies and the adhering soil; then the Actino- myces sods can be easily counted. In humus and humus containing soil their number is amazing. When they can freely multiply on plates which are poor in food their growth is unlimited and they produce sods of great extension, even of one or more decimeters in surface, commonly producing very fine mycelial-rings, which by turns bear spores or not. These rings are independent of light and suggest a periodicity in the nutrition not yet fully explained. In somewhat extensive culture experiments, similar to the above, it may with certainty be expected that at some places brownish red or jet-black spots will ori- ginate. The brown spots are caused by the oxidising action of some common soil bacteria, which produce a red or brown-red pigment from tyrosin; the black ones, caused by melanin, which will be more exactly considered here, have quite another origin. In or near the centrum of these black spots always lies a colony of Actino- myces. Streaks on new culture plates of the said composition to obtain a pure cul- ture, give the surprising result, that the organism can vigorously grow on the tyrosin but produces no pigment at all. A more minute examination shows further, that the black plants of Actinomyces lie under a thin, glassy, transparent layer of fine rod- bacteria. This layer covers like a crust the jet-black sods of Actinomyces and prevents them from producing spores, which does take place on that part of the mycelium, which develops outside the bacterial cover. If from this layer the bac- terium is brought into pure culture, which is easily done on brothgelatin- or broth- agarplates, it proves to be an extremely delicate polar ciliate rodlet, which forms no spores and strongly liquefies culture gelatin. Streaks of the pure culture on a tyrosin plate produces no melanin at all, so that in this respect the bacterium resembles Actinomyces. It is obvious that we here have a case of pigment formation reposing on the symbiose of the two organisms. Experience shows that this supposition is right: their combined streaks on a new tyrosin plate produce beautiful black spots of any extension. As they can both be very well grown on better media, such as broth-agar, the experiment is, the first isolation effected, easy and interesting. The experiment may be improved by providing the culture plates with a better source of carbon be- side the tyrosin, for which glucose and peptone proved particularly useful. On the other hand, additions of an ammoniumsalt or of nitrates had no effect. In order to ascertain which of the two organisms is the real cause of the melanin production, the following experiment was made. On an agar-tyrosinplate of the said composition, parallel streaks of both organisms were drawn with some millimeters, distance between. The result was not dubious ; after a few days the streaks of Actinomyces vigorously developed and covered with snow- white spores, but for the rest were quite colourless. The bacterial streaks, on the other hand, which had developed to a thin, hardly visible transparent layer, had become jet-black wherever they were near Actinomyces. The following must therefore take place: Actinomyces decomposes the tyrosin and pro- duces from it a colourless chromogene which is converted into melanin by the bac- terium and easily diffuses through the agar, evidently without spontaneously oxidising at the air. From the foregoing it is clear that Actinomyces, as well as the bacterium, can only be found in garden soil when germs of both species occur in each other's immediate vicinity. To promote this occurrence I have tried first on fit agarplates to grow Actinomyces and later floated them with a tyrosin solution, in which the melanin bacterium was present in so great quantity, that it could develop anywhere on the plate, after the tyrosin had diffused. As the various of Actinomyces are very vigorous, polyphagous microbes, which 113 develop especially in dilute media at the side of the common bacteria, the most different food may be used for the first part of the experiment. So, an agarplate, only containing some potassiumfosfate and ammoniumsulfate, was sprinkled with a little dry inulin mixed with garden soil. The soon developing flora was washed off under the tap by which the loosely adhering bacterial colonies together with the non-decomposed inulin, were removed. The agarplate was now clear again but in the surface were hundreds of Actinomyces colonies which had not been removed by the washing, as they had penetrated too deep into the agar. After treating with the tyrosin solution in which he melanin bacterium was suspended and a renewed cultivation for some days at 30" C, black melanin spots appeared around some six colonies of Actinomyces ; this species must thus be rather common in the soil. The tyrosin Actinomyces can also very easily be isolated from the roots of the clmtree (Ulmus campestris), in whose dead periderm cells an almost pure Actino- myces flora occurs, as I demonstrated before^). For the development of this flora some of the hairroots are carefully washed, to remove the adhering soil and are then ground in a mortar. The thus obtained brown paste is diluted with water, mixed with the tyrosin bacterium (which however is also rather common on the elm roots themselves), then sown out on a tyrosinplate of the above composition. After a few days numerous colonies of Actinomyces develop at 30" C, among which some jet- black ones. Here it should be called to mind that the two organisms produce no pigment on peptone or broth-containing media, neither each for itself nor in combination. But herefrom cannot be concluded that at their cultivation from peptone no tyrosin ori- ginates. Nevertheless the conclusion must be drawn, that if at the splitting of the peptone tyrosin is indeed formed, it is oxidised in another way but not to melanin. That this Actinomyces must belong to another species than Actinomyces cki^omogenes, so common in our environment, is obvious. The latter namely is characterised by the production of a dark brown pigment from pepton, (but not from tyrosin) in which, as I have formerly^) shown, under certain circumstances chinon may be found. Several other species of Actinomyces produce blue, red, or yellow pigments, whereby, as to the blue and red, the simultaneous presence of certain varieties of hay bacteria is favourable. In this case it is not tyrosin, but glucose, malates and nitrates that form the chromogeneous food, so that the symbiose is then evidently associated with other factors than those active in the production of melanin from tyrosin. Hitherto I have not yet been able in liquid cultures with the help of Actino- myces and its symbiont to produce a somewhat considerable quantity of melanin. This could not be foreseen as this genus is as common in the mud of moats and canals as in garden soil. But some experiments as the above to find our Actinomyces in mud gave no result, so it seems that this species at least is a real inhabitant of the soil. ') Centralbl. f. Bakter. 2. Abt. Bd. 6, S. 2, 1900. Arch, Néerl. 1900, p. 327. *) Centralbl. f. Bakter. 2. Abt. Bd. 6, S. 2, 1900. Arch. Néerl. 1900, p. 327. Commonly the chinon is absent, which I did not know in 1900. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 8 114 That pigment production in this case is difficult in liquid media, whereas Microspira tyrosinatica, which I described earlier '), produces it as readily in liquid as in solid media, is perhaps owing to the general propriety of Actinomyces to grow but slowly in solutions, probably in consequence of the little tension of the dissolved oxygen. Microspira, on the other hand, is as a true water microbe, evidently better adapted to that tension. Theory of tlie tnelanin forniation^). In physiological chemistry it is generally accepted that at the tyrosin reaction from the tyrosin first originates homogentisinic acid, ammonia and carbonic acid after the formula C9H11NO3 +03 = CsHgO, + NH3 + CO2 Tyrosin Homogentisinicacid and that only afterwards by a new oxidation the homogentisinic acid is converted into melanin. This might give a good explanation of the symbiose experiment, supposing that Actinomyces produces homogentisinic acid from tyrosin and that the symbiotic bac- terium oxidises this acid to melanin. Taken for granted that these two processes are due to two separate enzymes, this conception may be called »the two enzymes theory« of the melanin production. In order to obtain more certainty regarding the correctness of this supposition, I made some experiments with the soda salts of the homogentisinic acid (C8H8O4) and compared the results with the conversion of the calcium and soda salts of the gentisinic acid (CyHeO*). Both substances I owed to the Chemical Laboratory of the Technical University, the homogentisinic acid as lead salt, which I converted into the soda salt, the gentisinic acid in free state. Both behave towards microbes in a corresponding way, but the gentisinic acid oxidises more greater difficulty. I also received from Professor Pekelharing the lead salt of homogentisinic acid, prepared from urine, but this could not be distinguished from the other. At the preparation with these substances of neutral or feebly alkaline agar plates, on which the oxidising microbes were to be grown, the difficulty arose that already during the heating at the air a brown colour appeared, which was not the case when cold. It could, however, with certainty be stated that, as was expected, Actinomyces produced no pigment from these acids; on the other hand, the symbiotic bacterium gave a dark brown colour, which may finally run into jet-black. As this bacterium produces some alkali, it might seem doubtful whether this alkali might be the cause of the more intense pigment production, or if any oxidising enzyme, pro- duced by the bacterium, were active in this case. By cautiously neutralising the existence of an oxidase, which diffuses in the agar to a relatively great distance from the bacterial colony, could be ascertained. It is clear that the thus found enzyme might be called »homogentisinase«. It will be seen by and by that it also occurs in higher plants and perhaps corresponds to the common laccase. ') These Proceedings, XIII, 1066. -) For the literature sec Czapek, Biochemie der Pflanzen. Bd. 2, p. 462 and 478. 1905. Abderhalden, Physiologische Chemie, p. 362 and 365, 1909. 115 The formerly described Microspira tyrosinatica (l.c.) living in the sea and in sewagewater, oxidises tyrosin directly to melanin without intervention of any ether organism. That this is done here also by a vigorously active tyrosinase is easily shown with the ferm living in the sea, the bacterium, when killed by chloroform, being still able to cause the melanin reaction. I think it is proved now, that also in this case the tyrosinase consists of two enzymes, as it is possible with Microspira te oxidise the homogentisinic acid to a dark pigment. In order to ascertain how in this respect the tyrosinase of the higher plants behaves, I took strong tyrosinase preparations derived froni the potato, the beetroot and latex of Eiiphorhia Lathyris ^) which quickly colour tyrosin solutions deep black, and made them act on homogentisinic acid salts. The latex of Euphorbia Lathyris is extremely fit for these experiments as it can always be made to drip from the living plant, which supports our winters very well in the garden. A single drop on an agar-tyrosin plate at from 30° to 50° C. forms deep black melain spots after a few hours already. But homogentisinic acid can also be oxidised with great velocity. For this experiment I used an agarplate of this compositon: water, 2% agar, 0,5% natrium homogentisinate, 0,02% NH4CI and 0,02% K2HPO4. On this plate drops of the latex were put and besides streaks were made of Actinomyces and the symbiotic bacterium. After some hours, at 30" C, dark brownish black fields appeard, evidently more readily formed than the black fields from the tyrosin. After about 24 hours Actinomyces also began to grow but no pigment at all appeared, as was to be expected. The symbiotic bacterium did not develop under these conditions. But some broth being added to a like medium the bacterium could grow and oxidised the homogentisinic salt to melanin. So it is certain that also the tyrosinase of Euphorbia Lathyris must be a mixture of two oxidising enzymes ; one of these, which may preserve the name of tyrosinase, produces homogentisinic acid from tyrosin, the other, »homogentisinase«, forms melanin from the acid, and corresponds with the oxidase of the symbiotic bacterium. This enzyme requires no special name as »homogentinase« and »laccase« are probably identic. Although the »two enzymes theory« of the tyrosinase may be considered as confirmed by what precedes, still it should be called to mind that, when a method of experimenting is used somewhat deviating from the described the above result with Euphorbia Latyris is not obtained. Such is, namely, the case when the milky juice of the plant is put on agarplates with homogentisinic acid salt, with addition of broth for the bacteria. Then the surprising f act occurs that the bacterium is active but the latex is not. Whereon this difference reposes is no clear. Finally it may be mentioned that the existence of two enzymes in the tyrosinase of the beetroot was already made probable by P. C. van der Wolk (Recherches au sujet de certains processes enzymatiques chez Bèta z'idgaris, Nimègue 1912.) *) The latex of Euphorbia palustris, E. Peplus, E. helioscopia, E. Mysinitis, contain no tyrosinase. Penetration of methyleneblue into living cells after desiccation. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XV, 1913, p. 1086— 1088. — Verscheen onder den titel »Over het indringen van methyleenblauw in levende cellen na indroging« in Verslagen Kon. Akademie van Weten- schappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXI, 1913, blz. 930—933- It is generally knovvn that methyleneblue does not enter living yeastcells, when these are first soaked with water or swimming in a fermenting liquid, whilst it colours the dead cells intensely. It is even possible several days to cultivate yeast in wort, coloured dark blue with this pigment, without the cells being coloured in the least. On wortagar plates with methyleneblue, colourless colonies will develop. On these facts a method is based to ascertain in living yeast the number of dead cells, which gives very good results. Meanwhile there is an exception to the rule that the cells, colouring blue are dead, and this exception will be more closely considered here. At the examination of dried yeast, most cells of which take a dark blue colour with methyleneblue, whilst only a very small percentage remain colourless, the fer- menting power often proves so great, that no other explanation can be given, but that the blue-colouring cells have for the greater part preserved that power. This is not unexpected, for it is well known that the alcoholic function is more permanent in dieing cells than the power of growth. Meanwhile, counting-experiments, whereby on one hand the number of cells colouring with methyleneblue was microscopically determined, on the other hand by plate culture, that of the cells growing out to co- lonies, showed that from certain dry yeast samples a much greater percentage of colonies developed, than the percentage of cells not colouring with methyleneblue. This fact was indeed unexpected and induced to a more minute observation. First of all it was proved that the number of cells, colouring in a dilute solution of methyeneblue, depends on the way in which the solution is brought into contact with the cells. If this is done by introducing dry yeast into the solution, all the cells colour darkblue and cannot be distinguished from the dead ones. In plate cul- tures, however, a greater or smaller number of colonies may be obtained from these cells, although all seem perfectly alike in their dark blue colour, and should be considered as dead by anyone ignorant of their origin. In favourable circumstances the number of colonies mounts even to 100%, which is to say, that all the cells may colour blue and still grow out to colonies. This is in particular obvious when the cells are beforehand coloured with methyleneblue, and the coloured material is used for sowing; it is easy then to recognise the blue 117 cells on the plate and watch their germination under the microscope. The blue colour is then commonly seen to disappear before the formation of buds begins. Eut many of the later germinating cells remain blue and produce colourless daugther- cells. I never saw young cells taking the least tracé of blue from the mother-cell. But if the dried cells are beforehand allowed to swell up in wort or in water and if the soaked material is laid in the methyleneblue solution, which is the usual way to effect the colour reaction, the result is quite difïerent. Then only part of the cells assume the colour and this part is the smaller as the cells have longer remained in the uncoloured solution. A certain percentage, however, continue to take up the colour without having lost their reproductive power, and it seems to be very difficult to soak these cells with water. The simplest way to effect these experiments is by using dry yeast, quite free, or nearly so from dead cells. I obtained it by centrifugation of the small-celled variety of pressed yeast from strong fermentations, these being in their most active state. To this end it was cultivated at 28" C. in nearly neutral wort, after 6 to 8 hours brought into the centrifuge, and then quickly transferred to filterpaper in a thin layer for desiccation. The large-celled variety of pressed yeast is less resistant to drying. To com- pare the two varieties, of which the smallcelled is richer in protoplasm than the other, the yeast must very cautiously be dried, first at low temperature, e.g. 25° C, then at a higher one, e.g. 50° C. This precaution is not, however, necessary to render the blue-colouring of the dry living cells visible; to this end drying of common yeast at room temperature will do. I have, however, also met with commercial dry yeast satisfying the requirement of containing hardly any dead cells at all, namely the »Konservierte Getreide Brennerei Hefe« of the yeast works of H e 1 b i n g in Hamburg, which was sent directly from the manufactory. This preparation is delivered in solidly closed tins, but after some time it loses its power of growth and icermentation; its quality thus evidently depends on the length of time past since its fabrication. It seems that this loss corresponds to that of the germinative power of seeds, which depends on their state of humidity. I posses some more preparations from the same factory, that have hardly any fermentative power and contain no cells fit for reproduction, but they have not been directly got from the manufactory and are already some years old. When using seed of Brassica rapa, saked in solutions of i per 1000 or less of methyleneblue, the pigment penetrates through the seed coat into the germ, which partly colours blue. The germroot takes up the earliest; then foUows a triangular field on the outer of the two seedlobes, which lie folded up in the seed. The base of the triangle, which colours first and most intensely, lies at that margin of the cotyledo, which is turned towards the germroot. Obviously the pigment has very quickly penetrated through the micropyle of the seed, and only later through the seed coat. With stronger methyleneblue solutions the experiments do not succeed much better, because then the pigment accumulates so much in the seed coat, that even water can only enter with diflficulty. After 24 hours such seeds are but imperfectly swollen but, somewhat later, the germination ii8 takes place as well. The coloured germs swell at 30° C. so vigorously, that many scon burst out of the seed coat. When the partly blue germs, f reed from the seed coat, germinate on filterpaper, they yield part of their pigment to it, but especially in the meristem of the germroot it continues to show for several days and disappears only at length, by the dilution which accompanies the growth. It is then easy to see how the part near the rootmeristem grows the most rapidly whilst the region of the roothairs grows no more at all. That the pigment, without killing the cells, has penetrated into the inner part of the tissues, is not only shown by the germeroots, but also by the coloured spots of the seedlobes, whose phloembundles even have taken up the colour. De infusies en de ontdekking der bakteriën. Jaarboek voor 1913 van de Koninklijke Akademie van Wetenschappen, gevestigd te Amsterdam. De infusies, af- of opgietsels, met hun mikroskopische bewoners, gaven in den loop der tijden aanleiding tot het doen van een aantal groote en kleine ont- dekkingen. In de eerste plaats tot de ontdekking van die mikroskopische be- woners zelve. Alvorens deze nader te beschouwen begin ik, duidelijkheidshalve, met de be- schrijving van de volgende zeer eenvoudige proef om in drinkwater, niet alleen de aanwezigheid van bakteriën, maar ook die van de daarin veel zeldzamer voorkomende infusoriën, monaden en amoeben aan te toonen. Dit geschiedt door van het drink- water, door toevoeging van een weinig moutextract of bouillon, een »infusie« te maken en deze in een verwarmde ruimte te plaatsen. Het moutextract of de bouillon vervangen hierbij datgene, wat in de gewone infusies, verkregen door plantaardige of dierlijke stoffen met water te overgieten en dan aan zich zelf over te laten, door het water uit die stoffen getrokken en in oplossing gebracht wordt. Spoedig beginnen, ten koste van het opgeloste voedsel allerlei zeer kleine bak- teriën zich sterk te vermeerderen en, zoodra dat voedsel is opgebruikt, gaan juist de veel grootere monaden, amoeben en infusoriën groeien, die zich niet kunnen voeden met de toegediende opgeloste stoffen, maar wel met de bakteriën zelve, welke zij in groote hoeveelheid verslinden. Men heeft deze twee voedingswijzen de vegetale en de animale voeding genoemd, omdat de hoogere planten zich alleen met opgeloste stof- fen, de hoogere dieren zich ook met vaste stoffen kunnen voeden, maar men ziet, dat dit kontrast reeds bij de mikroben voorkomt. Ook ziet men steeds bij deze proef, dat de amoeben, infusoriën en monaden veel later in de infusies ontstaan dan de bakteriën, hetgeen voor onze verdere be- schouwingen van bijzondere beteekenis is. De infusies van Leeuwenhoek en Huygens. Overgaande tot de bespreking van de eerste in de geschiedenis der biologie genoemde infusies, namelijk die van Leeuwenhoek en Chr. Huygens, wensch ik op te merken, dat mijn hoofdbedoeling daarbij is aan te toonen, dat de ontdekking der bakteriën vroeger heeft plaats gehad, dan dit tot nu toe wordt aan- genomen, en samenvalt met die der mikroskopische wezens in het algemeen. De eerste waarnemingen van Leeuwenhoek op dit gebied zijn wel bekend. Omstreeks het midden van September 1675 zag hij in regenwater, dat eenigen tijd in een pot van aardewerk gestaan had en daarna ook in Maaswater, putwater, sneeuwwater en zeewater geschept te Scheveningen, levende wezens zoo klein, dat zij alleen met zijn eenvoudige maar uitmuntende mikroskopen konden gezien worden. Een eeuw later n.1. in 1760 gaf Ledermulier 1) daaraan den naam van »Tnfusionsthierchen« en in 1765 werden zij door den Deen Wrisberg^) »ani- malcula infusoria« genoemd, welke naam voor een groep van de grootere dezer organismen verder bewaard is gebleven. L i n n é , die zich met het mikroskoop niet bezighield, ofschoon hij het zeer bewonderde, vatte op echt karakteristieke wijze alles, groot en klein, samen onder den naam Chaos infusiorum ^). Als eerste publicatie dezer ontdekking moet gelden de brief van Leeuwen- hoek van 9 October 1676 aan den secretaris der Royal Society te London, Thomas Gale, opgenomen in de Philosophical Transactions van 1676*). Maar bovendien bevindt zich in de »Oeuvres complètes de Christiaan Huygens« van de Hollandsche Maatschappij van wetenschappen (T. 8, Pag. 22, No. 2100) ten bijna gelijkluidende brief door Leeuwenhoek gericht aan Constantijn H u y g e n s , den vader van Christiaan, en door den laatsten in het fransch vertaald, gedateerd 7 November 1676, die de engelsche editie eenigszins aanvult^). Alvorens dezen brief nader te beschouwen moge het volgende worden op- gemerkt. In L e e u w e n h o e k's tijd was onder de geneeskundigen de humoraalpatho- logie in eere, dat is, men bracht den toestand van ziekte of gezondheid van het lichaam, zeer terecht, in verband met de geaardheid der verschillende vochten, zooals het bloed, de urine, de gal en het speeksel en dat gaf veelvuldig aanleiding tot het onderzoek der stofïen, vooral van de kristallen, die bij het verdampen dier vochten achterblijven. Leeuwenhoek was in die soort van waarnemingen een meester en het laat zich begrijpen, dat hij ook, zooals hij trouwens zelf vertelt, herhaaldelijk getracht heeft het bijtende beginsel van peperkorrels op die wijze te zien te krijgen. Zoodoende had hij aanleiding eerst ongemalen en later ook gemalen peper, onder water te bewaren en te trachten in dat water of na het verdampen ervan met zijn mikroskopen het een of ander bijzonders te vinden. Dat men bij het vervaardigen der infusies gedurende de i8de eeuw zoo veel- vuldig gebruik maakte van aromatische planten, zal wel uit deze proeven van Leeuwenhoek juist met peper moeten verklaard worden; wellicht heeft daartoe *) M. F. Ledermüller. Mikroskopische Gemüths- und Augenergötzungen. Nürn- berg 1760. '') H. K. Wrisberg. Observationes de animalculis infusoriis natura. Göttingen 1765. *) Chaos: Corpus liberum, uniforme, redivivum, artubus, sensusque organis externis nullis (Systema naturae, 12e druk 1767). *) Observations communicated to the Publisher (Thomas Gale) bij Mr. Antony van Leeuwenhoek, in a Dutch Letter of the gth of Octob. 1676, here English'd: Concerning little Animals by him observed in Rain-, Well-, Sea- and Snow-water; as also in water wherein Pepper had lain infused. Philosophical Transactions, Vol. 12 No. 133, pag. 821-831, London 1676. *) De kennis van de plaatsen in de werken en handschriften van Huygens, waar gehandeld wordt over de infusies, heb ik te danken aan wijlen Prof. Bosscha en vooral aan Professor D. J. Korte weg. ook bijgedragen de opvatting, dat de infusiediertjes uit de lucht moesten komen en door de aroma's werden aangelokt. Maar keeren wij tot L e e u w e n h o e k's brieven aan G a 1 e en aan H u y g e n s van 1676 terug. Hij geeft daarin zijn welbekende beschrijving van de verschillende door hem in den loop van 1675 waargenomen vormen, waaruit blijkt, dat hij de gewone in- fusoriën van de raderdiertjes heeft onderscheiden. Veel belangrijker is echter het feit, en daarop is voor zoover ik weet tot nu toe nog door niemand de aandacht gevestigd, dat hij toen reeds, dus in 1675, ook de kleinere in de infusies levende wezens gezien heeft, welke door Spallanzani omstreeks 1766 infusoriën der tweede orde, door Ehrenberg in 1838 vibrionen en later, naar het in 1841 door F é 1 i x D u j a r d i n opgestelde geslacht Bacterium, bakteriën genoemd werden. De daarop betrekking hebbende zin in den brief van Leeuwenhoek aan H u y g e n s is de volgende: »Ik heb vijf verschillende waarnemingen gedaan met infusies van heele peper- korrels en van 2^ ons gestooten peper, waarvan ik niet alle bijzonderheden zal mededeelen, maar alleen, dat wanneer de peper twee maal 24 uur in het water had gestaan, ik een ongeloofelijke menigte van die kleine diertjes in een enkele droppel waarnam, die sterk in aantal toenamen, zoodat ik naar waarheid zeggen kan dat ik daarin heb zien leven en zich bewegen meer dan honderdduizend in een enkele van de oppervlakte genomen droppel, terwijl andere dit getal nog tienmaal grooter schatten. « In zijn brief in de Philosophical Transactions van 1676 spreekt hij, bij het beschrijven der verschillende door hem waargenomen diertjes van: »een vierde soort, die zoo klein is, dat ik in het geheel niet in staat ben daarvan den vorm te beschrijven«; op twee andere plaatsen in dien brief komt hij daarop terug. Aan het einde van den franschen brief vindt men nog de volgende door C h r. H u y g e n s toegevoegde noot: »Dit zijn de waarnemingen van den heer Leeuwenhoek. Zijn wijze van die te doen bestaat daarin, dat hij het water brengt in zeer dunne glasbuisjes van een derde of een halve lijn in doorsnede, welke hij dan onder het mikroskoop brengt. Hij heeft mij zeer duidelijk de kleine insekten laten zien, die zich aanhoudend door het water voortbewogen. Ik acht het waarschijnlijk, dat zij uit de lucht komen, want zij zijn klein genoeg om daarin te kunnen zweven. Eenmaal in het water kunnen zij zich daarin voortplanten en vermeerderen zooals de schrijver opgeeft dit gezien te hebben «. Ofschoon in de inrichting der hier beschreven proef eenige onzekerheid bestaat, b.v. ten aanzien van de gebruikte hoeveelheid water en de temperatuur, is de her- haling daarvan onder verschillende omstandigheden gemakkelijk. Ik heb dit inderdaad gedaan en met welk resultaat? Dat ik hierbij, hoe ook gewijzigd, na twee maal 24 uur in de peperinfusies nooit iets anders heb aangetroffen dan bakteriën behoorende tot twee verschillende klassen van grootte, even als Leeuwenhoek dit in zijn verdere beschrijving aangeeft. Merkwaardigerwijs komen juist in deze infusies, behalve de gewone steeds in alle infusies aanwezige kleinere, de buitengewoon groote bakteriën der geslachten Asotobacter en Amylobacter tot ontwikkeling, welke bij aanwezigheid van een toereikende hoeveelheid organisch koolstofvoedsel, hier het zetmeel van de peper, het geheel bijzondere vermogen bezitten zich bij voorkeur te vermeerderen in vloei- stoffen, die geen of zeer weinig assimileerbare stikstofverbindingen bevatten, waarbij zij dan van de vrije stikstof uit de atmosfeer leven. En dit blijkt nu juist het geval te zijn in de peperinfusies, waarin de gebonden stikstof ten deele als moeilijk oplos- bare eiwitstikstof, anderdeels in de niet assimileerbare piperine voorkomt. Het toeval is Leeuwenhoek dus gunstig geweest bij het ontdekken dezer grootere bak- teriën, maar zijn schrijven toont overigens ten duidelijste, dat hij de kleinere vormen evengoed heeft waargenomen. Andere, grootere organismen dan bakteriën komen op den genoemden tijd nooit in de infusies voor en het duurt dan nog vele dagen of weken eer deze grootere, daarin somtijds levende vormen, namelijk amoeben, infusoriën en monaden, zicht- baar worden. Dikwijls ontstaan zij in het geheel niet, al naar den aard van de peper of het water, dat daarop wordt gegoten, en indien zij reeds in het daarvoor gebruikte water aanwezig zijn, dan worden zij aanvankelijk door de bakteriën geheel ver- drongen. De ontdekking juist van de bakteriën in de infusies is ongetwijfeld het feit geweest, waardoor in die dagen de waarnemingen van Leeuwenhoek zoozeer de aandacht hebben getrokken, want het waarnemen van de zooveel grootere in- fusoriën en raderdiertjes, die iedereen met een normaal gezichtsvermogen, al vereischt dit ook groote oplettendheid, zonder vergrootglas in het water kan zien rondzwemmen, zou bij de zoo objektieve waarnemers van dien tijd onmogelijk grooter verwondering hebben kunnen verwekken dan dat van de watervlooien van Swammerdam. Met de bakteriën vas dit geheel anders, om die te zien moesten noodzakelijker- wijze de uitmuntende lenzen van Leeuwenhoek gebruikt worden. Dat deze interpretatie werkelijk juist moest zijn volgt eigenlijk reeds volkomen duidelijk uit L e e u w e n h o e k's woorden: »zoodat ik naar Waarheid zeggen kan, dat ik heb zien leven en zich bewegen meer dan honderdduizend diertjes in een enkele van de oppervlakte genomen droppel, terwijl andere dit getal nog tienmaal grooter schatten. « Maar ook de afmetingen, welke Leeuwenhoek opgeeft aangaande de door hem in het peperwater waargenomen diertjes zijn daarmede in volledige overeen- stemming. Die opgaven waren uitgelokt door een opmerking, welke Thomas G a 1 e gemaakt had bij het publiceeren van L e e u w e n h o e k's brief in de Philo- sophical Transactions van 1676 bovengenoemd. Daarin leest men namelijk op Pag. 829, waar Leeuwenhoek over de peperinfusies begint te handelen, in een noot: »Daar deze verschijnselen en eenige van de volgende zeer buitengewoon schijnen is de schrijver uitgenoodigd ons (dat is de Royal Society) in kennis te stellen met zijn onderzoekingsmethode, zoodat andere in staat zullen zijn deze waarnemingen te bevestigen «. Leeuwenhoek heeft aan die uitnoodiging blijkbaar spoedig gevolg gegeven, want in het zelfde deel der Transactions van 1676 vindt men op Pag. 844: »Mijnheer Leeuwenhoe k's brief aan den Uitgever, waarin een beschrijving wordt gegeven van de wijze, waarop hij in verschillende watersoorten zulk groot aantal Diertjes heeft waargenomen, als in de voorgaande aflevering der Transactions is medege- deeld.« 123 Na eenige algemeene beschouwingen over het tellen der diertjes en het nemen van een kleine hoeveelheid water, ongeveer van de groote van een gierstkorrel, zegt hij, dat hij die hoeveelheid brengt in een zeer fijn glazen capillairbuisje, dat door deelstreepjes in 20 of 30 deelen is verdeeld, die achter elkander onder het mikroskoop onderzocht kunnen worden. Hij komt tot het besluit, dat daarin kunnen geteld wor- den, met de mikroskopen, die hij aan anderen leent, omstreeks 1000 en met het mikro- skoop, dat hij alleen voor zichself bewaart, 30 000 diertjes. Iedereen, die met infusies en infusioriën bekend is, zal onmiddellijk moeten toegeven, dat ook hier alleen van bakteriën sprake kan zijn. Dit wordt bovendien nog bevestigd door de meting van de grootte, die hij als volgt geeft: »Maar ik kan verklaren, dat ik mijn getallen nooit overdrijf, en daar nu de kleinste diertjes, die ik dagelijks in mijn infusies aantref, een lengte hebben, die meer dan drie maal kleiner is dan de as van een bloedbolletje, moeten zij in waarheid meer dan 25 maal kleiner zijn«, zoodat de lengte van zijn diertjes omstreeks een derde deel van de middellijn van een bloedbolletje was. Wat nu aangaat de afmetingen der roode bloedlichaampjes vindt men bij den mensch 7.74 ^, bij den hond 7.3 |a, bij het konijn 6.9 ^ en bij de kat 6.5 |n. Volgens de schatting van Leeuwenhoek was de afmeting der door hem waargenomen diertjes een derde van deze grootte, dus omstreeks 2.3 ji, hetgeen met de afmetingen van vele bakteriën overeenstemt, terwijl zelfs de kleinere monaden en amoeben even zoo groot zijn als de bloedlichaampjes, en infusoriën minstens 100 jn meten, dus meer dan tienmaal grooter zijn. Bedenkt men nu nog bovendien, dat zooals ik boven zeide, in de peperinfusies van twee maal 24 uur monaden, infusoriën en amoeben geheel ontbreken, dan is voor ieder mikroskopist duidelijk, dat L e u w e n h o e k, bij ^ijn meting, alleen bakteriën onder het oog kan hebben gehad. Toen Leeuwenhoek eenmaal den weg had gewezen, was ook Hartsoeker in staat dien te volgen en wij vinden in zijn brief van 12 April 1678 aan H u y g e n s (Oeuvres, T. 8 No, 2122) een bericht, waaruit kan worden afgeleid, dat ook hij reeds toen bakteriën gezien heeft. De betrefïende zinsnede is deze: »Gisteren avond heb ik een ontallike menighte dierkens gevonden in het water 't welk ik veertien dagen een duym hoogte op coriandersaet heb laeten staan. De selve schenen van alderhande slach te sijn, maar door dien zij zeer snel in 't swemmen waren, en sich duyster op deden, kon ik hare gedaente niet wel be- kennen. Ik twijfel ook of ik geen leven in het note-moschaet en foeliewater sie, maar de dierkens van deselve wateren souden soo klein sijn, dat sij met het meest ver- grootende bolleken nauwelijks souden te bekennen wesen«. Het zichtbaar maken van onzichtbaar leven moet op een zoo scherpzinnig man als Chr. Huygens. natuurlijk grooten indruk hebben gemaakt en twee jaar na Leeuwenhoek houdt hij zich dan ook niet ter loops maar maanden achtereen, met verschillende infusies bezig. Raadpleegt men zijn handschriften, aanwezig in de Leidsche universiteits-biblio- theek, dan vindt men in Codex No. 9I) op de bladen 58, 62, en 63, gedateerd den Haag II Juni 1678, een aantal schetsen en aanteekeningen, die op Diatomeën be- trekking hebben, verder op Flagellaten, waarbij hij beginnende copulatie of deeling ') Was vroeger E. van Huygens. 124 afbeeldt. Hij teekent een raderdiertje met de geledingen, klokdiertjes met uitgerekte en samengetrokken steel en verschillende andere infusoriën, met zoo veel scherpte, dat zelfs de inplanting en de lengte der ciliën geheel natuurlijk worden teruggegeven. Men moet zich vervv^onderen over de juistheid, waarmede Huygens de ciliën of zweepdraden der infusoriën heeft abgebeeld en daaruit noodzakelijk tot het besluit komen, dat hij ook de zooveel gemakkelijker zichtbare bakteriën, die steeds in de infusies, waarin de grootere infusoriën leven, aanwezig zijn, gezien heeft. Dit is ook werkelijk het geval, zooals blijkt uit zijn aanteekeningen in Codex 9, blz. 62 onder den datum 27 Augustus 1678, die ik hier uit het Fransch vertaald ten deele teruggeef): »Ik heb mijn urine onderzocht nadat deze 24 uur bewaard was. Ik vond daarin een aantal kleine diertjes, die lang en smal waren aldus (hier teekent hij een draadbakterie), en die zich voortbewogen en zich langzaam omdraaiden; verder andere, die minder lang waren (hier teekent hij een bakteriënstaafje), en die wat sneller voortgingen op de manier van de alen. Eindelijk nog andere, zeer kleine (hier teekent hij een zeer kleine bakterie), die de sterkste beweging vertoonden. De heer Hartsoeker had mij gezegd deze dieren eveneens in den laatsten tijd op- gemerkt te hebben. Er waren ook zeer vele gele kristalplaatjes aanwezig, die snel in de urine onder- zonken.« Onder den datum 28 Augustus leest men: »In dezelfde urine werden nu geen aaltjesmeer opgemerkt, maar alleen kortere vormen (hierbij teekent hij een bakterie als dubbelstaafje omgeven door nog fijnere deeltjes), die bijna geen beweging vertoon- den. Ik merkte een aantal kleine bolletjes op, waarvan vele twee aan twee verbonden waren aldus (waarbij hij een Diplococcus afbeeldt) en ik was in twijfel of zij niet eenigszins in beweging waren. De zoutplaatjes als vroeger. « Deze aanteekeningen bewijzen met zekerheid dat Huygens op 27 en 28 Augustus 1678, dus 5 jaar voor den tot nu toe aangenomen datum van de ontdekking der bakteriën, deze organismen gezien en afgebeeld heeft. Hij vond toen de zaak blijkbaar belangrijk genoeg om daarover eene mede- deeling te doen aan de Parijsche Acad. v. Wetenschappen, waarvan men in het 28e Journal des Sqavants van 1678 (uitgegeven te Amsterdam bij Pierre 1 e G r a n d), op pag. 345 een door Ie Sieur G. B. opgesteld uittreksel vindt, dat hier volgt voor zoover het op ons onderwerp betrekking heeft: Uittreksel van een brief van den heer Huygens, lid der Kon. Acad. van Wetenschappen aan den Auteur van dit Journaal betreffende een nieuw mikroskoop medegebracht uit Holland. »Dit mikroskoop bestaat uit een klein glasbolletje gelijk aan die, waarmede men in Holland en Engeland de dieren heeft waargenomen, die ontdekt zijn in put-, regen- en peperwater, en waarover reeds gesproken is in het 9e en iie No. van het Journaal van dit jaar; maar deze bolletjes zijn van een veel geringere grootte dan de vroegere. Onder die, welke ik uit Holland heb medegebracht zijn er, die niet grooter zijn dan een zandkorrel, en eenige zelfs zoo klein, dat zij nauwlijks te zien zijn. Dit *) Deze aanteekingen zullen over eenigen tijd worden uitgegeven door de Huygens Commissie van de Holl. Mij. van Wetenschappen in Deel 13, Dioptrica. 125 maakt dat zij de voorwerpen buitengewoon sterk vergrooten, daar de vergrooting des te sterker is naarmate de bolletjes kleiner zijn. Het voorwerp, dat men beschouwen wil is ingesloten tusschen een stukje glas en een stukje talk, en dit geplaatst in een klein toestelletje, dat mij geschikter toeschijnt dan wat men daarvoor tot nu toe gebruikt heeft. Een zeer klein waterdroppeltje, genomen uit een glas, waarin men peper twee of drie dagen heeft laten liggen, op deze wijze ingesloten, vertoont zich als een grooten vijver, waarin men een oneindig aantal kleine vischjes ziet rondzwemmen. Zonder te herhalen wat reeds vroeger in dit Journaal is opgegeven, wil ik er nog op wijzen, dat niet elke pepersoort dezelfde soort van dieren geeft. Die van een bepaalde pepersoort zijn veel grooter dan die van andere, hetgeen wellicht berust op den ouderdom der korrels of op eenige andere oorzaak, die zich op den duur wel zal laten vaststellen. Er zijn nog andere zaden, die overeenkomstige dieren opleveren, zooals dat van de Koriander. Ik heb het zelfde gezien bij het sap van den berk, nadat dit vijf of zes dagen bewaard was.« In verband met mijn vroegere opmerkingen en met de door Huygens in dien zelfden brief beschreven wijze van waarnemen, kan ook de alinea: »Een zeer klein waterdroppeltje, genomen uit een glas, waarin men peper, twee of drie dagen heeft laten liggen, op deze wijze ingesloten, vertoont zich al een grooten vijver, waarin men een oneindig aantal kleine vischjes ziet rondzwemmen, « onmogelijk ergens anders op slaan dan op bakteriën. Huygens heeft zich in 1686 en 1692 opnieuw met de infusies bezig gehouden en doet daarvan verslag in Hugeniorum Codex No. 15 der Leidsche biblioteek, zijnde een almanak van het jaar 1686 met een aantal voortrefïelijke penteekeningen en beschrijvingen van infusoriën ; daarin handelt hij echter niet meer over bakteriën. Maar keeren wij tot de ontdekking der bakteriën door Leeuwenhoek terug. Tegenwoordig vindt men overal opgegeven ^) dat hij die het eerste gezien heeft in het tandslijm en beschreven en afgebeeld in zijn brieven van 12 September 1683 en van 16 September 1692 aan de Royal Society 2) en waarin men gemakkelijk de eerst in 1853 door Robin opnieuw ontdekte Leptothrix buccalis herkennen kan, het nimmer in ons tandslijm ontbrekende organisme, dat zich met jodium intensief blauw kleurt en dat, voor zoover ik weet nog door niemand gekultiveerd is'). Wij hebben echter gezien, dat die datum moet teruggevoerd worden tot de eerste publicatie van Leeuwenhoek in de Philosophical Transactions van October 1676 of tot zijn brief aan Const. Huygens van November 1676. Het kan nu geen verwondering wekken, dat toen Leeuwenhoek eenmaal met de bakteriën bekend was, hij daarvan ook nog in een tweeden vóór 1683 geschreven brief gewaagt, n.1. in den brief aan de Royal Society van 14 Juni 1680. Daar die *) Men zie b. v. P'. Löf f Ier. Vorlesungen über die geschichtliche Entwicklung der Lehre von den Bakteriën, pag. 4 en 6. Leipzig 1887. *) Deze beide brieven zijn in het duitsch vertaald door Dr. J. Petri. Das Mikroskop. pag. 38 en 34. Berlin 1896. *) De opgaven van Vignal (Archives de Physiologie 1886) zijn onvertrouwbaar. [26 N brief ook nog om een andere reden merkwaardig is, laat ik een gedeelte van den inhoud hier volgen ^). » Xa dat ik verstaan hadde de verscheide gevoelens over de voortelinge van de kleine dieren, en wel voornamentlijk dat seker Heer geschreven hadde datter geen levend schepsel en kan voortkomen soo men eenig vat of fles wel digt toe stopt, daar men alvorens eenig nat, of vlees in hadde gedaan. Hiervan heb ik mede eenige preuven willen nemen hebbende dan genomen twee glase tube ABCDEFGHIKL. die na dat deselvige beide onder aan AL w^aren toe gemaakt gevolt met gestoote Peper tot BK. en voort ge- volt tot aan CL met schoon regenwater dat soo aenstonts op den 26 Mei in een schoone Porceleine Schotel (in de welke in geen thien jaren eenige spijs en hadde geweest) was gevangen, en als doen door de hitte van het vuur het glas de figuur gegeven van ABCDGHIKL hebbende het sel- vige aan het spitse einde G. een kleine opening uit consideratie, dat het glas warm sijnde, de lugt die binnen het glas was, soude gelijke koude aan nemen met de lugt die buiten het glas was; en na verloop van ontrent een quartier van een ure, heb ik de openheid aan G. door het vuur digt toegesloten. Ik heb mij ook bereid een tweede glas, en daar insgelijkx mede gehandelt, uitgezondert dat ik aan het laatste de opening aan G. heb open gelaten, omme was het mogelijk waar te nemen waar eerst levende dierkens in 't water soude komen, maar na dat het selvige soo drie dagen hadde gestaan, en in die tijd verscheide observatien daar ontrent hadde gedaan, oordeelde ik dat schoon daar seer kleine levende dierkens in dit water waren, dat het mij onmogelijk soude wesen omme die te ontdecken, om redenen dat het glas te dik was, en om veel kleine deeltgens van de peper van binnen tegen het glas aan lagen, sodanige naaukeurige observatien als hier toe vereiste, voor mij niet doenlijk was te weeg te brengen. Derhalven nam ik door de kleine opening aan G. uit het tweede glas een weinig water, en ontdeckte in 't selvige een groote menigte van seer kleine dierkens, en dat van verscheidene soorten die door malkander haar beweegden, hebbende yder soort hare bysondere voortgang. Dog alsoo de eerste tube wat dunner was van glas, heb ik de selvige tot den vijfden dag toe gesloten gelaten, en sedert dien tijd nog verscheide observatien gedaan, maar geen levende dierkens daar inne konnen ontdekken, als wanneer ik resolveerde het glas aan G. ontstukken te breken, in welk breeken, de lugt die in het glas dus 5 dagen hadde besloten geweest (en die door de lugtbelletgens die doorgaans uit het water omhoog quamen seer in een gedrongen was) met force uit *) Het begin van dezen brief, dat hier weggelaten is, bevat de zeer gebrekkige beschrijving van de ontdekking der biergist. It gebruikte hierbij den tweeden druk der «Ontdekkingen en Ontledingen», Deel i, tot Leiden, bij Cornelis Boutestein, boek- verkooper 1696, aanwezig in de Biblioteek der Technische Hoogeschool en beginnende met den 28e sendbrief van 25 April 1679. In de uitvoerige biografie van Leeuwenhoek, bewerkt door P. J. Haaxman, Apotheker te Rotterdam (A. van Leeuwenhoek, de ontdekker der infusoriën. Leiden S. C. van Doesburgh 1875) wordt nog niet van de ontdekking der bakteriën gesproken. Naar ik meen is Löf f Ier, bovengenoemd, de eerste geweest, die de aandacht gevestigd heeft op de bakteriënfiguren van Leeuwenhoek van 1683 en 1692. 127 het glas vloog, uit welke oorsaak ik mij eenigzins inbeelde datter geen levende schepsels in dit water soude wesen maar ik sag ter contrarie: want ik hadde soo ras door de kleine opening die ik aen G. gemaakt had, geen water voor het gesigt gebragt, of ik sag daar een soort van levende dierkens in, die rond en grooter waren dan de grootste soort, die ik geseid heb dat in het andere water waren, maar deselvige echter soo klein, dat mij die onmogelijk door de dikte van de glase tube te bekennen waren« (hij heeft hier blijkbaar de clostridiën van Amylobacter saccharobutyricum voor zich gehad) »en na dat de verhaalde tube dus 24 uren hadde open gestaan, ob- serveerde ik het water weder, en doen sag ik boven de geseide dierkens nog ver- scheide soorten, dog deselve waren soo klein dat die beswaarlijk te bekennen sijn; maar ik heb gedagten, dat als die Heer van levende schepsels spreekt, dat hij alleen meent van wormen of maijen, die men ordinaris in bedurven vlees siet, en die ge- meenlijk voort komen uit de eieren van vliegen, en die soo groot sijn dat wij geen goet mikroscope daar toe van nooden hebben om die te beschouwen. Afbrekende blijve, &c.« Ook deze proefneming is nauwkeurig genoeg beschreven om die te kunnen her- halen. Ik heb dit gedaan, reeds vooraf, uit vele overeenkomstige proeven met andere infusies wetende, wat ongeveer het resultaat zou zijn, en dit ook bevestigd gevonden. Dit nu bestaat daarin, dat zoowel in de open als in de gesloten buis in welke Leeuwenhoek blijkbaar gasontwikkeling had gekregen, weder niets anders als bakteriën tot ontwikkeling komen, in de open buis verschillende kleinere soorten, waaronder de coli bakteriën, in de gesloten, behalve laatstgenoemde, ook het anaërobe boterzuurferment behoorende tot de soort Amylobacter saccharobutyricum. Van het voorkomen van infusoriën, monaden en amoeben kan onder deze omstandigheden in Tiet geheel geen sprake zijn, daar al deze organismen tot de aëroben behooren, en zich bij luchtafsluiting niet ontwikkelen. Wij komen hierbij dus tot de merkwaardige gevolgtrekking, dat het zeker is, dat Leeuwenhoek bij zijn proef met de geheel gesloten buis echte anaërobe bak- teriën heeft gekultiveerd en gezien, hetgeen eerst bijna 200 jaar later opnieuw zou geschieden, n.1. omstreeks 1862 en vooral in 1876 door Pasteur. Dat Leeuwen- hoek, honderd jaar voor de ontdekking van de zuurstof en de samenstelling van de lucht, de beteekenis van zijn waarneming niet kon inzien is begrijpelijk, maar het feit, dat hij in zijn gesloten buis een verhoogden, door gistingsbakteriën veroorzaakten ^:asdruk vaststelde en tevens deze bakteriën zag, toonen in elk geval, dat hij niet alleen in staat was goed waar te nemen, maar ook een proef wist in te richten, waaruit een besluit kan getrokken worden. Het resultaat dezer beschouwing is, dat Leeuwenhoek de bakteriën ont- dekt heelft in zijn peperinfusies, en dat de eerste publicatie daarvan, wat de aëroben aangaat, plaats had in 1676, en wat de anaëroben betreft in 1680, terwijl zijn waar- nemingen over de bakteriën van het tandslijm dateeren van 1683 en 1692, Niet in ip8^ maar op p Oktober igyó zal dus de driehonderdjarige herdenking van de eerste publicatie der ontdekking, zoowel van de bakteriën als van de mikroskopische wezens in het algemeen moeten plaats hebben. Verder staat vast, dat H u y g e n s de medeontdekker der bakteriën is, maar dat hij die eerst in Augustus 1678 duidelijk gezien en afgebeeld heeft. 128 Nadat de waarnemingen van Leeuwenhoek en H u y g e n s bekend waren geworden, werden te Londen en Parijs de mikroskopen te koop aangeboden, waarmede de wormpjes, zooals men toen de bakteriën en de afgietseldiertjes noemde, zichtbaar konden worden gemaakt. De infusies werden zeer populair om dit verder voor altijd te blijven. Alle mogelijke stoffen werden in water gebracht om te zien of zich daarin ook iets bijzonders zou ontwikkelen. Zoo beschrijft Job lot, Professor in de wiskunde te Parijs in zijn in 1716 verschenen werk: »Description et usage de plusieurs microscopes tant simples que ccmposés avec des observations sur une grande multitude d'Insectes qui naissent dans les liqueurs« de bewoners der infusies van: Anemonen, oesters, bloed, goudsbloemen, champignons, oranjebloesem, eikenschors, eierschalen, aardbeien, azijn, fenkelzaad, vuurzwam, gerst-, tarwe-, mais- en haverstroo, versch en oud hooi, jasmijn, knoflook, korenbloemen, meloenen, anjelieren, basilicum, witte, zwarte en lange peper, rabarber, rozen, roet, salie, sennebladen, selderie, tabak, versche en afgetrokken theebladen, vvijndruiven en veldbloemen. Zeer vele andere waarnemers hebben zijn voorbeeld gevolgd, waardoor de bouw van een groot aantal mikroskopische wezens bekend is geworden. Maar behalve tot mikroskopische waarnemingen hebben de infusies in de i8e eeuw tot proeven aanleiding gegeven, die de biologische wetenschap niet alleen hebben uitgebreid maar ook verdiept, en daaraan zullen de namen verbonden blijven van Needham en Spallanzani. De infusies van Needham en Spallanzani. De engelsche Katolieke geestelijke T. Needham had in 1746 bij H i 1 1, te Londen, allerlei infusies van plantenzaden gezien, welke hem aanleiding gaven zich eveneens met dit onderwerp bezig te houden. Door zeer goede maar onjuist verklaarde proeven leverde hij in 1748 het bewijs^), dat in infusies o.a. van schapenvleesch, zelfs na een half uur koken en onder omstandigheden, waarbij geen luchtverver- sching plaats vond, b.v. in een gesloten flesch, toch een rijke bevolking van levende mikroskopische organismen kan ontstaan. Hij was overtuigd, dat bij die voor- waarden alle oorspronkelijk aanwezige levende kiemen moesten gedood zijn en be- sloot derhalve tot het bestaan van spontane generatie, of generatio primaria zooals hij het noemde. B u f f o n , die deze proeven gezien had en gemeenschappelijk met Needham ook eenige infusies maakte, heeft daarop zijn berucht systeem der levende molekulen gegrond, waardoor hij omstreeks het jaar 1750 aan N e e d h a m's dogma algemeenen ingang heeft verschaft, zonder dat dit echter van zijn systeem zelve kan gezegd worden. Thans weten wij, dat er vele bakteriën bestaan, wier sporen nog langer dan een half uur kookhitte kunnen verdragen en dan bij afkoeling zeer goed kunnen ontkiemen, zoodat men zeggen kan, dat de N e e d h a m'sche infusies alleen uit zulke sporenvormers bestonden. De Italiaansche abt Spallanzani toonde dan ook reeds in 1776 2) aan, dat *) J. Turbervill Needham, Nouvelles observations microscopiques, pag. 50* Paris 1750. *) Opuscules de physique animale et végétale. Traduct. de l'Italien par J.Sénebier, Genéve 1777. 129 indien de verhitting der infusies maar lang genoeg wordt voortgezet, b.v. drie kwar- tier, daarin later volstrekt geen leven meer wordt waargenomen, en alle kiemen van bederf gedood kunnen worden, waardoor een ontdekking gedaan was van grooLe en blijvende waarde, en tevens het bewijs was geleverd, dat de afstand tusschen een groote fout en een belangrijke ontdekking klein kan wezen. De Parijsche kok M. Appert heeft van S p a 1 1 a n z a n i's vinding in het jaar i8ii gebruik gemaakt om door verhitting in gesloten potten allerlei levensmid- delen voor bederf te bewaren, welke dan A p p e r t'sche konserven werden genoemd en waaruit later de steriliseeringsindustrie ontstaan is i). Appert schreef daarover een boek: »Le livre de tous les ménages, ou l'art de conserver pendant plusieurs années toutes les substances animales et végétales«, waarvan de 3e druk in 1813 te Parijs is verschenen. Maar de moeielijkheden waren nog niet overwonnen. Bewezen moest nog wor- den, dat bij onze tegenwoordige proefnemingen nooit spontane generatie plaats heeft, en dat het slechts noodig is om de infusies van kiemen te ontdoen en de verdere toetreding daarvan te verhinderen, om alle mikroskopisch leven en alle daarmede samenhangende verschijnselen, zooals infektie, gisting, bederf, rotting, vergaan, ook in niet verwarmde infusions onmogelijk te maken. De eigenlijke kiemtheorie moest nog ontstaan. De infusies van Pasteur. Het is algemeen bekend, dat de groote stap, die daarvoor noodig was eerst omstreeks 1862 door Pasteur gedaan is, die voortbouwde op de grondslagen gelegd door S p a 1 1 a n z a n i , bevestigd en uitgebreid door de onderzoekingen en ontdek- kingen van Cagniard de la Tour, Schwann, Schultze, Schröder en D u s c h. Eerst van dien tijd af heeft de mensch macht gekregen over de miskroskopische wereld. Zoo ook over de infusies. De omwenteling in de kennis daarvan door Pasteur is begonnen in 1858 met zijn onderzoek over de melkzuurgisting -), waarvan hij als oorzaak den kleinen rnikrokok ontdekte, die thans den naam draagt van Lactococcus lactis of Strepto- coccits acidi lactici. Juist hetzelfde verband, dat reeds in 1837 door C a g n i a r d d e 1 a T o u r en in 1838 door Schwann tusschen gist en alkoholgisting was vastgesteld bestaat ook hier tusschen het ferment en de werking ervan. Men onderschatte de moeilijkheid dezer ontdekking niet. De herkenning van de melkzuurfermenten in de aan melk- zuurgisting onderhevige stoffen is, zelfs tegenwoordig, met onze uitmuntende hulp- middelen, niet altijd gemakkelijk en voor dien tijd iets buitengewoons scherpzinnigs, zoodat de gevolgtrekking, dat aan die moeielijk vindbare deeltjes het ontstaan van het melkzuur verbonden is, als een bewijs van merkwaardige geestkracht beschouwd moet worden. Nog in 1870 zeide een zoo opmerkelijke kop als Liebig: »Es wird ') Rocques, Les industries de la conservation des aliments. Paris 1906. ^) Mémoire sur la fermentation appelée lactique. Annales de Chimie et de Physique. T. 52, pag. 204, 1858. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. O 130 wohl niemand den Nutzen mikroskopischer Beobachtungen bestreiten wollen ; aber man sollte doch endlich zur Einsicht kommen, dasz man Ursachen auch mit dem Mikroskop nicht sehen kann«. Ofschoon P a s t e u r's uitmuntende biografen, zijn leerling en vriend Emile D u c 1 a u X 1) en zijn schoonzoon en bewonderaar R é n é V a 1 é r y R a d o t 2) dit niet zeggen, komt het mij voor, dat de voorbereiding tot zijn ontdekking gelegd moet zijn op de looierij van zijn vader te Arbois. Daar moet hij het eerst gezien hebben, dat het looien der huiden alleen goed gaat, wanneer er in de kuipen een behoorlijke melkzuurgisting plaats vindt en het oorzakelijke verband daarvan hebben opgemerkt met de mikroskopisch daarin betrekkelijk gemakkelijk zichtbare melkzuurstaafjes. Dit moet hem op de gedachte gebracht hebben infusies te maken, waarin melk- zuurfermenten zich konden vermeerderen en zuur vormen. Pasteur zelf geeft een andere verklaring van de reden waarom hij als chemicus zich met de gistingsprocessen is gaan bezighouden, waarbij zijn doordrin- gingsvermogen prachtig tot uiting komt. Toen ter tijde werd algemeen aangenomen, dat de foeselolie, die als bijproduct der spiritusfabrikate verkregen wordt, door gisting uit suiker ontstaat. Die olie is echter in hoofdzaak uit de optisch aktieve en de inaktieve amylalkoholen samen- gesteld en nu achtte Pasteur de chemische struktuur dezer alkoholen zóó ver- schillend van die van de suiker dat het hem onmogelijk scheen, dat levende organis- men de diepe omzetting van het suikermolekuul, die daarvoor noodzakelijk zou zijn, kunnen bewerken. Hij zelf heeft het daaruit voortvloeiende vraagstuk niet opgelost, want de wederlegging van de toen zoo hardnekkig verdedigde spontane generatie, had al zijn werkkracht in beslag genomen. Eerst in Mei 1905 werd de oorsprong van de amylalkoholen door Félix E h r 1 i c h opgehelderd en het bewijs geleverd, dat Pasteur juist had gezien: Zij ontstaan niet uit de suiker der gistende vloeistof maar uit de daarin steeds aanwezige leucinen, de draaiende amylalkohol uit de het gepolariseerde licht draaiende a-leucine, en de niet draaiende amylalkohol uit de isoleucine. Maar hoe dit zij ik blijf er bij, dat, als Pasteur niet op een looierij was op- gevoed zijn groote mikrobiologische ontdekkingen niet met de melkzuurfermenten zouden begonnen zijn en ook later een geheel ander verloop zouden hebben genomen dan geschied is. Zijn beschrijving van de melkzuurgisting is voortreffelijk. Hij bewijst, dat in een oplossing, waarin behalve suiker zekere eiwitachtige stoffen voorkomen, b.v. in suiker opgelost in een infusie van gist, en waaraan tevens krijt is toegevoegd om het melkzuur te binden, bij 30" a 35" een geweldige vermenigvuldiging der melk- zuurfermenten kan plaats hebben. Van de regelmatigheid en de groote intensiteit dezer gisting, voegt hij er bij, zullen de scheikundigen verwonderd zijn, indien het melkzuurferment maar alleen, zonder door andere fermenten gestoord te worden, tot ontwikkeling komt. Wel was reeds in 1841 door D u j a r d i n opgemerkt, dat stikstof als ammonium- nitraat aan sommige infusies toegevoegd den groei der mikroben sterk begunstigt, ') Histoire d'un esprit. Sceaux 1896. ^) La vie de Pasteur. Paris 1900. 131 maar het onafscheidelijk verband tusschen de vermeerdering van een bepaalde mikrobensoort en een bepaalde soort van voedsel is het eerst door Pasteur voor de melkzuurfermenten met voldoende scherpte aangegeven om daarop ook andere proeven te gronden. Hij zelf heeft dat in 1860 voor de alkoholgist, in 1861 voor de azijnbakteriën gedaan, waardoor de wijn, het bier en de azijn tot de meest klassieke infusies zijn geworden, en later, in 1876, met minder geluk voor de boterzuurfer- menten. Door deze en vele latere onderzoekingen is aangetoond, dat ook bij de mikroben de aanpassingsleer van Dar win tal van bevestigingen vindt en het is een opmerkelijk feit, dat dit juist terzelfder tijd aan het licht is gekomen toen de »Origin of Species« verscheen en Darwin zijn bloementheorie neerlag in het gedenkwaardige Orchideën- boek, waarvan de eerste editie van 1862 dateert. Vele der schijnbaar zoo laagge- organiseerde eencellige wezens zijn buitengewoon goed toegerust in den strijd voor het bestaan, de melkzuurfermenten b.v. in die mate, dat het zeer gemakkelijk is daarvan «natuurlijke reinkulturen« te verkrijgen, dat is infusies, waarin aanvankelijke alle mogelijke mikroben voorkomen en die ten slotte niets anders als melkzuurfermen- ten bevatten. Wenscht men bijv. melk door deze organismen in een volkomen zuivere melkzuurgisting te brengen, waarbij alle vreemde mikroben die daarin voorkomen, — en die zijn legio, — totaal verdrongen worden, dan behoeft men slechts als volgt te handelen. Men vuile een stopflesch geheel met versche melk, waaraan men enkele droppels karnemelk heeft toegevoegd, — hetgeen echter niet bepaald noodzakelijk is omdat de melkzuurfermenten bijna nooit in hoeveelheden melk van 20cc of meer ont- breken, — en plaatse de flesch in een warme kamer bij 20 a 25" C. Na korten tijd stremt de melk, hetgeen dikwijls gepaard gaat met allerlei gistingen en veel gasvor- ming door ongewenschte mikroben. Men schudt goed door en schenkt een flinke scheut uit de flesch, deze weder aanvullende met versche melk, en laat opnieuw in de warmte staan. Na een of twee herhalingen hebben de melkzuurfermenten zich reeds zoo reusachtig vermeerderd, dat van de in de toegevoegde melk aanwezige vreemde mikroben bijna niets terug te vinden en de zure melk voor het gebruik geschikt is. Houdt men daarbij de temperatuur niet te hoog, b.v. rondom 20° C, dan kan men, door maar altijd opnieuw uit dezelfde flesch de verzuurde melk uit te gieten en door versche te vervangen op den duur een reinkultuur van het echte melkzuurferment der melk, Lactococciis lactis, dat een zacht en aangenaam zuur voortbrengt, en de melk in een weldadig, van ziektekiemen vrij voedsel verandert, aanhouden. De aanpassing van dit ferment aan de melk is zoo volkomen, dat als men de in gebruik zijnde flesch geheel ledig giet, tegen het glas genoeg krachtige fermentkiemen achter blijven om de nieuwe vulling weder na eenige uren gereed te doen worden voor het gebruik. Goed doorschudden is daarbij noodig, waarbij wat lucht boven in de flesch nuttig is; verwarming tot 25 a 28° C. kan de aanzuring versnellen. Doet men de zelfde proef bij hoogere temperatuur, b.v. 40 a 45'^ C, dan kan men, op overigens dezelfde wijze, andere melkzuurfermenten verkrijgen, n.1. die van de Koumyss, Kefyr, Yoghurt, Leeben, Matzoen of hoe deze dranken in verschillende landen ook verder mogen genoemd worden, fermenten die echter in onze omgeving zeldzamer voorkomen, zoodat men, om ze te vinden, aanvankelijk met grootere hoeveelheden melk dan bovengenoemd moet beginnen, of, beter nog, direkt enkele droppels van een dier vloeistoffen zelve kan toevoegen. Voor huiselijk gebruik is 9* 132 echter de in de eerste plaats beschreven karnemelkmethode veel meer aan te bevelen, omdat zij eenvoudiger is w^egens de uitvoering bij lagere temperatuur, en bovendien geen gevaar voor al te sterke zuurvorming geeft, die met de genoemde melkzuurfer- menten der hoogere temperatuur gemakkelijk kan plaats vinden, waardoor zeer onhy- giënische dranken ontstaan, zooals ieder, die Kefyr of Yoghurt wat te lang in de warmte heeft bewaard bij ondervinding kan weten. In deze melkzuurgistingen is naast een zeer bepaalde voeding en een bepaalde temperatuur nog bovendien de omstandigheid verwezenlijkt, dat door het gebruik van een met de melk bijna geheel gevulde flesch de luchttoetreding tot de mikroben nagenoeg is uitgesloten. Juist deze laatste omstandigheid is beslissend voor het verkrijgen van de »natuurlijke reinkultuur« der melkzuurfermenten. Laat men de lucht vrij toetreden dan is het onmogelijk om de melkzuurfermenten alleen te ver- krijgen en de melk voor schimmels en andere bederfkiemen te bewaren. Is de lucht- toetreding begrensd dan is het mogelijk, naast de melkzuurfermenten, ook gistsoorten in de kuituur te ontwikkelen, die uit de melksuiker alkohol voortbrengen. Het is echter niet gemakkelijk om daarbij de juiste maat van de lucht te vinden. Wat voor de melk geldt is ook in andere gevallen toepasselijk en de nauwkeurige waarneming leert, dat de bewoners der infusies steeds verschillend zijn al naar mate van de levensomstandigheden, die in de infusies zijn verwezenlijkt. Dit resultaat is lijnrecht tegenovergesteld aan dat, wat uit de vele vroegere onder- zoekingen der infusies scheen voort te vloeien en aan den grooten infusoriënkenner E h r e n b e r g, in 1838 aanleiding had gegeven te besluiten, dat de aard van de bewoners der infusies geheel en al door het toeval wordt bepaald ^). In de Pasten r'sche infusies is daarentegen het toeval geheel of bijna geheel uitgesloten. De weg was geopend om door het invoeren van vooraf vastgestelde levensvoorwaarden de vraag te beantwoorden of de natuur levensvormen heeft voort- gebracht, die onder die voorwaarden kunnen bestaan en zich vermeerderen. Wel is ook hierbij nog veel onzekerheid gebleven, want de betrokken kiemen kunnen door allerlei omstandigheden, zelfs daar ter plaatse ontbreken waar hun levensvoorwaar- den verwezenlijkt zijn, zoodat het dan twijfelachtig blijft of zij wellicht ergens anders zouden kunnen gevonden worden of in het geheel niet bestaan. Maar hoe dit ook mogen zijn, de ondervinding heeft geleerd, dat vele kiemen zoo algemeen in onze omgeving voorkomen, dat als het bovengenoemde vraagstuk maar met vol- doende nauwkeurigheid onderzocht wordt, ook dikwijls een scherp antwoord kan worden verkregen aangaande den aard der organismen, die onder bepaalde levens- condities in de infusies kunnen verwacht of niet verwacht worden. Een nieuwe tak van wetenschap is daardoor onstaan.de mikrooekologie, die reeds eenige opmerkelijke uitkomsten heeft opgeleverd, waarvan hier een paar voorbeelden volgen. Infusies met aithrobios. Als eerste voorbeeld kies ik de infusies van het Aithrobios, van de luchtflora, die zich uitsluitend voedt en ontwikkelt ten koste van de onreinheden der atmosfeer. Zij is eigen aan den dampkring onzer laboratoriën en kan zich ook in de huiskamer ') Die Infusionsthierchen als vollkommene Organismen, pag. 525. Leipzig 1838. 133 vormen. In de vrije natuur leeft zij in de diepte van het aardrijk ten koste van de dampen, die in de aardlucht hangen en zich langzaam voortbewegen door de kanalen en poriën tusschen de aarddeeltjes. In reine buitenlucht is zij niet of nauwelijks tot ontwikkeling te brengen. Om deze zonderlinge infusie te verkrijgen is niets anders noodig dan wat water, waaraan een weinig kaliumfosfaat is toegevoegd en waarin de kiemen van het Aithrobios gebracht zijn. Deze kiemen zijn in genoegzame hoeveelheid in den grond aanwezig om gemakkelijk ontleend te kunen worden aan den waterspiegel van water, dat men op tuingrond heeft gegoten en daarboven enkele weken heeft laten staan. Zij vormen daarop een wit, drijvend huidje, waarvan een spoor aan de spits van een glasstaafje overgebracht wordt in een wijde kolf, waarin het water met kaliumfosfaat zich in een dun laagje bevindt. De onzichtbaar kleine hoeveelheid der aangebrachte kiemen ontwikkelt zich in de kamerlucht, drijvende op het water en zich voedende met de vluchtige koolstofverbindingen, welke in die kamerlucht nooit ontbreken en die, ten minste ten deele, van het lichtgas afkomstig kunnen zijn en tot de koolwater- stoffen behooren. Na drie of vier meer weken, al naar de mate van verontreiniging, waaraan de lucht is blootgesteld, ontwikkelen zich die kiemen tot een sneeuwwitte, drijvende huid, die ten slotte de geheele oppervlakte van de vloeistof als een aaneengesloten, later zelfs geplooide laag bedekt, die uiterlijk sterk herinnert aan bier- of wijnkaam, maar mikroskopisch daarmede niets gemeen heeft. Die huid is samengesteld uit fijne en korte staafjes, die altijd bewegingloos zijn en nooit sporen voortbrengen, en die in het natuurlijke systeem moeten gebracht worden tot de zeer opmerkelijke familie der Actinomyceten of straalzwammen, waartoe ook de bacil van de tuberkulose en de diphteritis behooren. Steeds worden twee soorten in de drijvende huiden naast elkan- der aangetroffen, die wegens hun geringe behoefte aan koolstofvoedsel met recht Actinohacülus oligocarhophiliis en Actinohacillus oligotrophus kunnen genoemd wor- den. In den bouwgrond behooren zij en hun vele verwanten in zoo ver tot de voor den landman nuttige aardmikroben, als zij de zoo hoogst belangrijke bakteriën van het nitrificatieproces en in het bijzonder het nitraatferment, bij hun werking onder- steunen. Veel is dienaangaande echter nog duister, en wacht op de inrichting van proefstations voor het mikrobiologisch onderzoek van den grond, van akkers, velden en bosschen, om verder opgehelderd te worden. Als tweede voorbeeld eenige opmerkingen over de Infusies met photosynthese. Zij zijn al is het ook in ruwen en onwetenschappelijken vorm reeds gemaakt door Priestley omstreeks 1780. Deze geheel buitengewone man, die meende, dat alle ontdekkingen slechts bij toeval gedaan worden en die de natuuronderzoekers vergeleek met honden, die bij het rondsnuffelen nu en dan wat vinden 1), had in 1774 de levenslucht of zuurstof ontdekt door verhitting van kwikoxyd en van menie. Bij zijn veelvuldige proeven met ') De opmerking is gemaakt, dat Priestley, met meer recht, den natuuronder- zoeker had kunnen vergelijken met den jager, die door zijn scherpzinnigheid het wild opspoort en door zijn overleg het vermeestert. 134 allerlei gassen en met planten, waarvan hij de gaswissel in het licht trachtte vast te stellen, maakte hij gebruik van groote, zeer omslachtige apparaten, b.v. een houten met water gevulde tobbe, waarin groote glascilinders omgekeerd opgesteld waren. Nu doet zich de volgende opmerkelijke omstandigheid voor: laat men willekeurige in- fusies, met plantendeelen of dierlijke stoffen gemaakt, langdurig in het licht staan dan ontwikkelen zich daarin, zoodra de organische stof begint te verdwijnen, steeds lagere groenwieren, die, indien de infusies voldoende verdund zijn, aan de glaswan- den als een dun neerslag zichtbaar worden, gelijk dit aan ieder chemicus bekend is, die in zijn laboratorium in de flesschen met niet geheel zuiver gedestilleerd water, die in het licht staan, steeds dit groene beslag opmerkt. Zoo ook in de glasapparaten van Priestley, die, voorbereid door zijn vroegere ontdekking van de zuurstof, de hoogst belangrijke waarneming deed, dat door het groene beslag in het licht eveneens zuurstof wordt ontwikkeld. Tusschen de jaren 1779 en 1781 maakte hij infusies van bloed, visch, augurken, kalfsvleesch, aardappelen, kool, doode muizen, kropsla, worteltjes, schapengal, lever, longen, hersenen, watermos en wolfsmelk, om zijn ont- dekking verder te bevestigen. De groene mikroben, die in dergelijke infusies steeds worden verkregen hebben later den naam van P r i e s 1 1 e y'sche stof ontvangen, die gedurende langen tijd opzien heeft gebaard en waarvan ik mij levendig herinner, dat de overlevering nog omstreeks 1860 onder de niet geleerden voortbestond ^). Priestley kende de behandeling van het mikroskoop niet en wist niet waaruit zijn groene substantie was samengesteld. Onze landgenoot Ingenhousz, beroemd geworden door de ontdekking van de zuurstofademhaling in het licht en van de koolzuurademhaling in het licht en in het duister bij de groene planten, heeft tusschen de jaren 1781 en 1784 de proeven van Priestley herhaald, en hij slaagde er in de kennis aangaande de groene infusies te verdiepen door de beschrijving van de door hem voor het eerst waargenomen zwermsporen, en de ontwikkeling daaruit van zoetwater wieren 2), Wat wij tegenwoordig weten stelt ons instaat de infusies van Priestley langs een meer wetenschappelijken weg te verkrijgen. Daartoe handelt men als volgt. Een kolf half gevuld met leidingswater, waarin is opgelost 0.1% ammonium- nitraat en 0.05% kaliumfosfaat, wordt in een warm vertrek voor een venster in het licht geplaatst. Na een a twee weken ziet men hier en daar tegen den glaswand kleine groene of bruine vlekjes ontstaan, afkomstig van reeds in het leidingswater aan- wezige kiemen van wiercellen of Diatomeën en somtijds van mossen. Deze vermeer- deren zich sterk en langzamerhand verandert het water in een groene brei. Het prin- cipe der proef is juist in het weglaten der door Priestley gebruikte organische stoffen gelegen, maar eischt de toevoeging van de voor de ontwikkeling der lagere organismen in ■ het leidingswater in ontoereikende hoeveelheid voorkomende verbin- dingen van stikstof, fosfor en kali. Het is mij gelukt te bewijzen, dat de op deze wijze verkregen lagere wieren meerendeels tot het algemeen verspreide geslacht Chlorella behooren, vooral wanneer het water zeer arm is aan mikroben voedsel. ') Deze overlevering bestond in de volgende uitspraak: Leg een keisteen in een glas water en laat daarop de zon schijnen; na eenigen tijd bedekt de steen zich mit een slijmige groene laag van levende stof, die Priestley'sche stof heet. -) JuliusWiesner,JanIngen. Housz, sein Leben und Wirken als Naturforscher iind Arzt, pag. 140. Wien 1905. 135 Hoe eenvoudig de hier beschreven proef ook is, daarin kan toch nog een verdere vereenvoudiging worden aangebracht, die dan een niet minder opmerkelijk resultaat oplevert 1). Deze vereenvoudiging bestaat in het weglaten van de salpeterzure ammoniak, dat is van de m de infusie gebrachte stikstofverbinding. Men verkrijgt dien ten gevolge een vloeistof van de samenstelling: Leidingwater met ^20% kalium- fosfaat, en indien deze, na infectie met tuinaarde, in het licht wordt opgesteld, zal men het antwoord verkrijgen op de vraag of in de natuur mikroben aanwezig zijn, die het vermogen bezitten om in hun koolstofbehoefte te voorzien uit het vrije kool- zuur en ni hun stikstof behoef te uit de vrije stikstof der atmosfeer. Dat antwoord is niet dubbelzinnig: men verkrijgt na twee of drie weken een infusie van Myxo- of Cyanophyceën, slijm of blauwwieren, waarin groenwieren en Diatomeën zoo goed als geheel ontbreken, welke laatste dus blijkbaar niet van de vrije atmosferische stikstof kunnen leven. Twee genera van de genoemde merkwaardige klasse van het plantenrijk vertoonen daarentegen dit kenmerk bij uitnemendheid, n.1. de Myxophyccën geslachten Nostoc en Anabaena, waarvan in deze infusies meerdere soorten worden aangetroffen. Een dezer soorten is bijzonder opmerkelijk, n.1. de Nostoc punctiforme, omdat die niet alleen uit de stikstofbindende infusies is verkregen maar ook uit de in rein- kuituur gebrachte gonidiën van het op onzen zandgronden zoo algemeene korstmos Pcltigera canina. Ook dit korstmos moet dus in staat zijn, door middel van de daarin voorkomende gonidiën, zich met de vrije atmosferische stikstof te voeden. Overal waar het licht beschikbaar is kan men zich geen eenvoudiger geval van levensontwikkeling denken dan het hier beschouwde. Stelt men zich op het stand- punt, dat op onze aarde het leven niet is ontstaan maar uit de wereldruimte is aange- voerd, als cosmobios, gedragen door meteoren, van vergane werelden afkoms'tig, dan zouden het Cyanophyceën kunnen geweest zijn, die op de nog woeste aarde aange- komen, hier de voor hun ontwikkeling zoo eenvoudige levensomstandigheden konden gevonden hebben, waarbij geen andere levende wezens bestaanbaar waren. Dit zoude reeds mogelijk zijn geweest in het tijdvak, lang voor de vorming der oudste, thans bekende fossielen bevattende sedimentaire formaties, n.1. in den tijd toen de opper- vlakte van de aarde nog niet beneden 50 of 60" C. was afgekoeld, want zelfs thans nog kent men Cyanophyceën, welke in heete bronnen bij deze hooge temperaturen kunnen leven. De hypothese der zoogenaamde cosmische panspermie is echter zoo onwaar- schijnlijk, dat het nauwlijks waard is daar lang bij stil te staan, en bovendien begint zij meer en meer aan beteekenis te verliezen, naarmate de bezwaren tegen de mogelijkheid van het bestaan der spontane generatie ons minder onoverwinnelijk toeschijnen. Een andere opmerkelijke uitkomst van de Mikrooekologie vinden wij in de Infusies met chemosynthese. Stelt men zich de vraag of er infusies kunnen bestaan met wezens, die in staat zijn in volslagen duisternis hun koolstofbehoefte te dekken uit het koolzuur van de atmosfeer, dan weet men, dat het noodig zal zijn in die infusies een bron van energie te brengen, die het licht kan vervangen. Tot nu toe is het nog maar alleen gelukt daar- ') Centralblatt für Bakteriologie, 2e Abt. Bd. 7, pag. 561, 1901. 136 voor chemische energie toe te passen en wel op een wijze, die het duidelijkst zal worden door een voorbeeld. De zwavel is een element, dat bij de verbranding tot groote energie ontwikkeling in den vorm van warmte aanleiding kan geven; bestaan er mikroben, die in staat zijn op in water gesuspendeerde, fijn verdeelde zwavel, zuurstof over te dragen en te oxydeeren, dan laat zich voorzien, dat daardoor in die mikroben genoeg chemische energie kan ontstaan om deze voor de ontleding van het vrije koolzuur dienstbaar te maken, gelijk dat in de groene en blauwe organismen onder den invloed van het licht geschiedt. Daar vrije zwavel in onze wateren, tenge- volge van de ontleding van de zoo algemeen verspreide zwavelwaterstof in betrek- kelijk groote hoeveelheid voorkomt, was te verwachten, dat in den loop der tijden in dezen zin bepaalde aanpassingen, men kan zeggen »een zwavelflora« zou kunnen ontstaan zijn. Inderdaad is een dergelijke flora gevonden 1), bestaande uit zeer kleine, bewege- lijke bakteriën, die in de diepte der wateren vooral in de modder der grachten, in de klei der wadden en in de schorren onzer rivieren voorkomen. Zij leven in het duister en zijn geheel ongekleurd. Men kan op.de volgende wijze een aan deze organismen zeer rijke infusie verkrijgen. Aan leidingswater voege men een weinig kaliumfosfaat en een flinke hoeveelheid bloem van zwavel, dat is sulfur precipitatum der apotheken, toe, en evenveel krijt, en infekteere met grachtmodder. Men drage zorg voor sterke luchttoetreding door slechts een dunne vloeistoflaag te gebruiken. Bij 30" C. geplaatst, vindt men reeds na weinig dagen de zwaveldeeltjes geheel omhuld met bakteriën. Bij het oxydatie- proces ontstaat vrij zwavelzuur, dat zich aan het krijt bindt en als gips neerslaat, en ten slotte is de hoeveelheid bakteriën, wier lichamen grootendeels ten koste van het gereduceerde koolzuur ontstaan zijn, zoo belangrijk, dat men daarvan, na verwijdering van de zwavel door oplossing in zwavelkoolstof, omvangrijke huiden en vliezen in de infusies terug vindt. In deze proef is een wijziging te brengen, die het verloop ervan nog belangrijker uiaakt. Het is namelijk mogelijk om de zwavel bij volledige luchtafsluiting te doen oxydeeren, waarbij de zuurstof ontleend kan worden aan salpeter, terwijl de bij dit proces betrokken mikroben de salpeter ontleden, onder afscheiding van vrije stikstof, wat »denitrificatie« genoemd wordt, en waarbij de uit de salpeter afkomstige zuurstof weder op de zwavel wordt overgedragen onder zwavelzuurvorming. Ook hier wordt chemische energie in vrijheid gesteld, die gedeeltelijk gebruikt kan worden voor reductie van koolzuur, gevormd uit het krijt, dat tevens weder dient om het zwavel- zuur te binden. Dit alles kan plaats hebben in een gesloten flesch bij 30° C, waarin zich dan bevindt een mengsel van water met poederzwavel, krijt, 0.1% salpeter en wat kalium- fosfaat, terwijl een weinig slootmodder dient voor aanvoer der mikroben. De gang van de omzetting laat zich beoordeelen door de vorming \a.n de stikstof, die men als gasbellen ziet opstijgen. Natuurlijk is de invloed van de koolstofhoudende veront- reinigingen, die in de lucht voorkomen op den groei der bakteriën in dit geval vol- komen uitgesloten. •) Phénomènes de réduction produits par les microbes. Archives Neérlandaiscs. Sér. 2, T. 9, pag. 150, 1903. Folia microbiologica. Bd. i, pag. 487, 1912. 137 Een andere chemische energiebron, die voor -de voortbrenging van deze merk- waardige soort van infusies kan dienen is het knalgas, dat is het mengsel van water- slof en zuurstof, dat bij de ontleding van water ontstaat, of, eenvoudiger nog, een mengsel van lucht en waterstof, waaraan in beide gevallen nog wat koolzuur is toegevoegd. Brengt men zulke gasmengsels in een gesloten ruimte boven leiding- water, waarin wat kaliumfosfaat en een ammoniakzout zijn opgelost en waaraan bovendien een weinig grond voor aanvoer der noodige kiemen is gebracht, dan ziet men daarop bij 30° C. na enkele dagen een drijvende huid ontstaan, uit twee soorten van zeer kleine bakteriën samengesteld, die, veel gelijken op, maar niet dezelfde als die van de zwavelinfusies. Dit tweetal samen oxydeert de waterstof tot water en hierbij ontstaat weder zooveel energie, dat de ontleding van het koolzuur en de opbouw van organische koolstofverbindingen, in het binnenste der bakteriën mogelijk wordt. Waarom dit proces alleen tot stand komt door mikroben van twee verschillende soorten en waarom niet elk dezer mikroben alleen reeds hetzelfde vermogen bezit is nog niet opgehelderd. Evenmin is het bekend, welk deel van de chemische energie van de verbruikte waterstof voor de koolzuurreductie dient. Het is opmerkelijk dat de vermaarde plantenphysioloog Th. de Saussure, reeds in 1838 ^) het verdwijnen van het knalgas heeft opgemerkt, door dit, in een afgesloten ruimte, in aanraking met heidegrond te brengen en dit proces, zeer juist, aan een fermentatie heeft toegeschreven, blijkbaar veroorzaakt door bakteriën, die aan de oppervlakte van de gronddeeltjes kleven. Omtrent de rol, die deze bakteriën in de natuur spelen is weinig bekend. De zwavelbakteriën zijn, in den bouwgrond aanwezig maar niet algemeen; daarentegen zijn zij in de klei onzer wadden zeer menigvuldig, zoodat zij met recht tot de zeeflora kunnen gerekend worden. Welk aandeel zij nemen in de langzame ophooping van organische stof in den bodem is nog geheel onzeker. Wat de knalgasbakteriën betreft staat vast, dat zij zoowel in den tuingrond als in de wateren onzer grachten zeer algemeen zijn en daarin ongetwijfeld aanleiding geven tot het verdwijnen van water- stof, die door andere mikroben in niet geringe hoeveelheid wordt voortgebracht, maar welke beteekenis zij hebben voor het vormen van organische stof in de natuur is ook hier onbekend. Wel zijn nog enkele verdere voorbeelden van infusies onder- zocht, waarin chemosynthetische processen door mikroben bewerkt tot stand komen, maar van dit nieuwe hoofdstuk der natuurwetenschap is tot nu toe slechts de eerste bladzijde opgeslagen. Infusies met vloeibare contagiën. De groep van infusies bij wier bespreking ik thans nog een oogenblik zal stil- staan is van zeer bij zonderen aard. Ik bedoel die infusies, waarvan het werkzame beginsel uit zoo kleine deeltjes bestaat, dat deze de poriën der fijnste filters kunnen passeeren, zooals b.v. het contagium van de mosaiekziekte der tabaksplant en de oorzaak van het mond en klauwzeer der runderen. De smetstoffen van pokken en ') Wirkung der Garung auf ein Gemenge von Sauersfoflfgas und Wasserstofïgas. Journal für praktische Chemie, Bd. 14, pag. 152, 1838. Bihliothèque universelle de Genève, No. 26, 1838, pag. 380. Mémoires de la societé de physique etc.de Genève T.8, pag. 163, 1839. 138 roodvonk, van mazelen en gele koorts, het actieve bestanddeel der vaccinelymfe, zijn andere voorbeelden. Daar de zichtbaarmaking dezer deeltjes door het gewone en het ultramikroskoop niet gelukt, evenmin als het kultiveeren daarvan in vloeibare of op vaste voedings- bodems, kunnen het geen mikroben in den gewonen zin van het woord zijn en is ook de naam ultramikroben daaraan ten onrechte gegeven. Zij deelen echter met de gewone mikroben van vele besmettelijke ziekten, die door aanraking kunnen over- gebracht worden, zoo vele eigenschappen, dat zij met recht contagiën kunnen genoemd worden. Met uitzondering van het contagium der hondsdolheid, dat in de volwassen cellen van het zenuwstelsel zich uitbreidt en aangroeit, is de vermeerdering dezer deeltjes tot nu toe alleen waargenomen in het binnenste van groeiende organismen en, naar het schijnt, uitsluitend binnen in cellen, die zelve in een toestand van groei en deeling verkeeren. Zij herinneren in vele opzichten aan de enzymen, die evenmin buiten de levende organismen, waarin zij ontstaan, tot vermeerdering konden gebracht worden. Het is echter nog niet gelukt om vreemde enzymen met zerkerheid binnen in de groeiende cellen van planten, dieren of mikroben te brengen. Wellicht zou daardoor, in bepaalde gevallen, een nieuwe toestand kunnen geboren worden, het enzym een deel gaan uitmaken van het levend protoplasma en in het vermeerderings- en deelingsproces daarvan worden medegesleppt, op dezelfde wijze als dit met de bovengenoemde contagiën het geval is. Het bestaan dezer contagiën bewijst, dat het begrip van het leven, indien men voeding en geschiktheid tot vermeerdering als kriteriën daarvan beschouwt, niet onafscheidelijk verbonden is met dat van struktuur, ook met den vloeibaren toestand zijn de kenmerken van het leven, zooals wij dit bij deze laagste vormen aantreffen, vereenigbaar. Even als in de kristallografie de erkenning van het bestaan der vloeibare kristallen onvermijdelijk is geworden, waardoor het begrip kristal niet langer alleen aan een vereeniging van molekulen, maar in bepaalde gevallen, ook aan het molekuul zelve m.oet verbonden worden, zoo zijn de biologen gedwongen het bestaan van vrij levende molekulen, van biomolen, aan te nemen, die ook in vrijen toestand, onafhankelijk van andere organismen bestaanbaar zijn. In zijn laagsten vorm is het leven dus niet meer aan de cel verbonden, de cel, die struktuur bezit en vergeleken kan worden met een samengesteld raderwerk, met een horloge, dat ophoudt te bestaan, wanneer het in een vijzel gestampt wordt. Maar in dien lagen toestand is het leven als het vuur, als een vlam, die gedragen wordt door levende stof ; — als een vlam, die in oneindige verscheidenheid voorkomt, en toch het specifieke in zich draagt ; — die de vormen kan aannemen van de organische wereld, van het spichtige grasblad en den stam van den boom ; — die groot kan zijn en klein: een molekuul kan in vlam staan; — die lauw genoeg kan wezen om de menschelijke hand niet te schroeien; — die gebonden is aan een stoffelijken grondslag en onstoffelijke gevolgen veroorzaakt; — die energie voorbrengt en in andere energievormen omzet; — zich gedraagt als een katalysator, welke in de omgeving veranderingen aanbrengt, niet in verhouding tot eigen grootte; — die zuurstof in- en koolzuur uitademt; — die zich voedt, zich vermenigvuldigt en zich 139 deelt; — die niet ontstaat door spontane generatie maar voortgebracht wordt door een andere vlam. Deze beschouwing, ook reeds door Wilhelm Roux uitgesproken, moge nog in vele opzichten vaag zijn, in verbinding met de enzymtheorie der levende stof is er een kern van waarheid in gelegen, die uitzicht opent op nieuwe proeven. De infusies der natuur. Naast de infusies der wetenschap staan die van de natuur. Rivieren en meren zijn infusies in het groot, zoo ook de zee. De akker van den landman bestaat uit aarddeeltjes, die elk met een waterlaagje omhuld zijn, waarin een rijkdom van mikroskopisch leven voorkomt, dat overeen- stemt met dat der infusies, gemaakt met plantaardige of dierlijke stoffen: een Geobios met de zelfde elementen als het Hydrobios. Maar overal in den grond bevinden zich ook luchtrufmten, die begrensd zijn door de waterlagen der aardeeltjes, en in die grondlucht verzamelen zich de gassen van den bodem, die tot voedsel kunnen dienen aan het Aithrobios, de luchtflora, levende niet in maar drijvende op dat aardwater. Schimmels en hoogere fungi zenden tallooze myceliumdraden uit over de zandkorrels en door de humusdeeltjes en concurreeren met de bakteriën en de plantenwortels om het meestal nauw afgepaste voedsel, zij vormen het »zenuwstelsel« van het aadrijk, en de verwoesting ervan door de ploeg van den landman, veroorzaakt een chaotische verwarring onder de bewoners, die zich slechts langzaam herstelt. Ook hier wordt een verbitterde strijd gestreden. Infusoriën, monaden en vooral amoeben verslinden op reusachtige schaal de nuttige bakteriën en de uitslag van den strijd beheerscht, in wellicht even hooge mate de vruchtbaarheid van den bodem, als de daarin gebrachte A-ruchtbaar makende stoffen dit doen. Maar deze ingewikkelde infusie, deze mundus subterraneus, is thans nog slechts zeer onvolkomen bekend en zal ongetwijfeld in den loop der tijden vreemde verrassin- gen brengen. Daar toch, zijn omstandigheden verwezenlijkt, die in de kunstmatige infusies tot nu toe niet konden worden nagebootst en waaraan bewoners kunnen zijn aangepast, van welke ons de duidelijke voorstelling ontbreekt. Wat de diepte van de zee voor ons verborgen houdt is nog veel geheimzinniger. Ook daar zwermt een mikroskopische wereld rond van ontaglijke samengesteldheid en beheerscht door allerlei andere nooden en driften dan die, waaraan de heden- daagsche wetenschap aandacht schenkt. In het slijk van den Oceaan heerscht diepe duisternis, al moge daarboven de fantastische stralen der diepzeebewoners alles in schemerlicht brengen. In die duistere omgeving is de aanwezigheid mogelijk van zwavel en zwavelwaterstof en van andere anorganische lichamen, die door hun om- zetting bronnen van energie worden, en waaraan bekende en onbekende levensvormen kunnen zijn aangepast, die door deze energie in staat zijn het aldaar aanwezige koolzuur te reduceeren en zoodoende in hun koolstofbehoefte kunnen voorzien. Zij leveren het bewijs, dat een organische wereld bestaanbaar is in volslagen duisternis. Donkere wereldbollen, niet meer door een zon beschenen, kunnen niettemin het tooneel van het leven zijn. Maar op den bodem van den oceaan heerscht een druk van gemiddeld 300 atmo- sferen. Wat zal de invloed daarvan moeten zijn op de processen, die in het slijk van 140 de diepte verloopen? Het antwoord is nog niet te voorzien, de scheikunde der hoogere drukkingen is pas in begin van wording. En welke zijn de daar heerschende temperaturen? Thans moge deze bij omstreeks het vriespunt van water liggen, in lang vervlogen tijden, toen de oceaan nog zoutvrij was, moet ook dit geheel anders geweest zijn, waarschijnlijk, ja zeker was er een tijd toen ook daar groote warmte heerschte. Ons doel moet zijn nieuwe infusies te maken, die met al deze ingewikkelde voor- waarden rekening houden, en tevens met de andere omstandigheden, die in onze om- geving nog verwezenlijkt zijn of eenmaal verwezenlijkt waren. De thans bekende grens van het leven zal daardoor een verplaatsing ondergaan ; de doode en de levende slof zullen verbonden worden door nieuwe, nog onbekende schakels. Niet het zoeken naar den Bathybius, het bedriegelijke oerslij m, maar het ontraadselen van de onver- klaarde en het ontdekken van nieuwe processen, die in de diepte van het aardrijk en \an de zee tot stand komen of kwamen, zal ons struktuurlooze stof, infusies van levende molekulen leeren kennen, die nieuw licht zullen werpen op den oorsprong van het leven. Oxydation des Mangancarbonates durch Bakterien und Schimmelpilze. Folia Microbiologica, Delft, II. Jahrgang, 1913, S. 123 — 134. — Verscheen gedeeltelijk onder den titel »Oxydatie van mangaancarbonaat door Mikroben» in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXII, 1913, blz. 415 — 420, en onder den titel «Oxidation of manganocarbonate by microbes», Procee- dings of the Section of Sciences. Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XVI, 1913, p. 397—401. I. Die Bakterien des Mangancarbonates. Bei Gelegenheit einer erneuten Untersuchung des Nitrifikationsprozesses, wor- über ich spater berichten werde, hatte ich mir die Frage vorgelegt, ob diese Fermente vielleicht imstande sein soUten, auch andere Körper wie die Ammonsalze und die Nitrite zu oxydieren. Dazu brachte ich auf die Oberflache geeigneter, an löslicher organischer Substanz .sehr armer Agarplatten frisch prazipitiertes, schnee- weisses Mangancarbonat in der Form einer sehr dunnen, etwas feuchten Schicht und zog darauf Impfstriche der zu untersuchenden Kuituren, wodurch die Keime Koloniën entwickeln konnten, allseitig durch das Carbonat eingeschlossen. Es stellte sich heraus, dass weder das Nitrit- noch das Nitratferment das Mangancarbonat um- wandeln, doch fand sich bisweilen in nitrifizierenden Flüssigkeiten in reichlicher Anzahl eine bemerkenswerte Bakterie, deren ziemlich ausgedehnte Koloniën eine dunkelbraune bis schwarze Farbe besitzen, verursacht durch die Umwandlung des Carbonates in eine Manganiverbindung. Weiter zeigte sich, dass dieselbe Bakterie schon in reichlicher Anzahl im Boden selbst vorkommt, und nicht oder wenigstens nicht deutlich in den nitrifizierenden Kuituren angehauft wird. Dass die Braunfarbung wirklich von irgend einer Manganiverbindung herrührt, ergiebt sich aus den beiden folgenden Reaktionen, welche sich als besonders gut brauchbar für die weitere Untersuchung herausstellten: die Spaltung von Wasser- stoffsuperoxyd unter starker Sauerstofïbildung und die Erzeugung von Jod aus Jod- kalium in stark sauerer Lösung. Reines Mangancarbonat hat diese Eigenschaften nicht, enthalt es jedoch auch nur eine Spur einer Manganiverbindung, so wird dieses eben durch die genannten Reaktionen leicht nachgewiesen. Als weitere Reaktionen können noch verwendet werden die Chlorbildung aus konzentrierter Salzsaure, und die Löslichkeit der Verbindung, mit dunkelbrauner Farbe, in konzentrierter Schwefel- sciure. Für die Darstellung von reinem Manganocarbonat, f rei von Manganiverbindun- gen, kann man wie folgt verfahren. Man prazipitiert Manganosulfatlösung mit 142 Natriumcarbonat und setzt eine Spur Wasserstofïsuperoxyd zu, um die kleine Menge von Manganiverbindungen, welche, wie es scheint, gewöhnlich in Manganisulfat vor- kommen und durch das Natriumcarbonat als höhere. Oxyde gefallt werden, zu zer- setzen^). Das reine Manganocarbonat wird aufbewahrt unter Wasser in einer ge- schlossenen Flasche, wodurch man immer das Praparat als einen in Wasser suspendier- ten Brei zur Verwendung fertig hat. Die Angabe der chemischen Lehrbücher, dass das Alangancarbonat an der Luft oxydiert, muss so aufgefasst werden, dass dieses geschieht beim Eintrocknen und in feuchtem Zustand bei Gegenwart von Alkaliën. Meine Mangancarbonat-agarplatten habe ich in Glasdosen, bei freiem Luftzutritt, langer wie ein Jahr aufbewahrt, ohne dass die weisse Farbe sich auch nur im allerwenigsten verandert hat. Reines Manganocarbonat erhalt man ebenfalls in für unseren Zweck geeigneter Form durch das Prazipitieren von reinem ]\Ianganosulfat mit Natriumbicarbonat in Kohlensaureatmosphare. Da ich die genannte Bakterie sehr oft in meinen Kuituren fand, wurde ich zu einer naheren Untersuchung derselben veranlasst, wobei sich herausstellte, dass sie bei der Überimpfung der Nitrifikationen verloren gehen kann, und mit diesem Vor- gange selbst nicht in direkter Verbindung steht, dagegen in Gartenerde sehr allgemein verbreitet ist. Organische Substanzen werden nur in grosser Verdünnung ver- tragen, so dass die Reinkultur einige Schwierigkeit verursachte. Inzwischen gelang es, auf Agarplatten mit 0,05% Manganlaktat, die Art in der Gestalt sehr kleiner, sich durch eine Manganiverbindung braunfarbender Koloniën rein zu erhalten. Auf meinen Mangancarbonatplatten wachsen diese Bakterien auf zweierlei Weisen, namlich entweder als grosse, feuchte, braui^ Flecke, welche sehr unregel- massig begrenzt sind und aus Bakterien bestehen, welche sich infolge des Wachs- tums über die Oberflache der Platte seitlich ausbreiten. Oder die Koloniën bestehen aus braunschwarzen, dicht nebeneinander gelagerten kleinen Kapseln von 0,1 bis 0,5 mm Mittellinie. Die Gruppen dieser Kapseln können wieder ziemlich umfangreich werden und z. B. Felder von i bis 2 cM Mittellinie erzeugen. Sie wachsen lang- sam und entwickeln sich erst nach zwei bis drei Wochen, am besten bei ca. 25" C. Mikroskopisch bestehen, sowohl die weichen wie die festen Koloniën auf den Mangan- carbonatplatten scheinbar aus Mikrokokken, welche stark erinnern an die von Molisch unter dem Namen Siderocapsa beschriebenen Eisenbakterien -), doch kann man bei den eingekapselten auch Eigenbewegung bemerken. Die Reinkulturen auf Manganlaktatplatten wachsen ebenfalls schwierig und bestehen aus sehr kleinen, lebhaft beweglichen Stabchen, welche sich kaum einkapseln, jedoch in den Koloniën mit braunen Körnchen von Manganiverbindungen gemischt vorkommen. Werden die Koloniën von den Manganlaktatplatten zurückgeimpft in eine Mangancarbonat- schicht, welche auf eine Agarplatte mit Salzen ausgebreitet ist, so bilden sie darauf wieder die braunen Flecke, welche bisher jedoch immer zu der weichen Modifikation gehörten, auch wenn die Reinkultur auf der Laktatplatte von der harten eingekapsel- ten Form abstammte. ') Es muss noch daran erinnert werden, dass Wasserstofifsuperoxyd, bei Gegenwart von Alkali, das Manganohydroxyd sofort in dunkelbraune Manganioxyde überführt, was jedoch nicht der Fall ist, wenn Carbonate zur Fallung verwendet werden. -) Die Eisenbakterien, pag. 10. Jena 1910. 143 Iii den Rohkiilturen, mit Gartenerde angefertigt, wobei überall in der Mangan- carbonatschicht auch andere Bakterien und Amöben vorkommen, ist das Wachstum unserer Bakterie viel üppiger wie in den Reinkulturen. Versuche mit verschiedenen organischen Körpern, ausgeführt um die Mangan- bakterien zu einer kraftigeren Entwicklung zu bringen, haben kein Resultat gegeben, woraus jedoch nur der Schluss zu ziehen ist, dass die verwendeten Stamme eine ge- ringe Vegetationsenergie besitzen und nicht, dass diese Eigenschaft eine allgemeine ist, dafür ist die Zahl der untersuchten Formen noch nicht betrachtlich genug. Die Frage, ob die Manganbakterien vielleicht imstande sein solhen, das Man- gancarbonat zu gleicher Zeit als Energie- und als Kohlenstoft'quelle zu verwenden und also zu den Mikroben mit Chemosynthese würden gehören können, muss verneint werden, — ohne organische Kohlenstofïquelle war keine Entwicklung herbeizuführen. Bemerkenswert muss es dabei erscheinen, dass der Oxydationsvorgang so viel besser stattfindet auf Agarplatten, welchen keine besondere organische Nahrung zu- gesetzt ist, wie wenn letzteres wohl geschieht, so dass hier jedenfalls eine bestimmte Adaptation vorliegt, welche an diejenige der Fermente der Nitrifikation erinnert, wo- niit unser Mikrobe übrigens in morphologischer Beziehung, sowohl bezüglich der Formverhaltnisse, wie der Beweglichkeit und Grosse, auch nahe übereinstimmt. Ich glaube denn auch, dass hier wirkliche Verwandtschaft vorliegt und, dass die Oxy- dation des Mangancarbonates in diesem Falie auf einem ahnlichen Biochemismus beruht, wie der Nitrifikationsprocess. Es war darum wichtig festzustellen, ob die Absonderung der Manganiverbindung ausserhalb des Bakterienkörpers stattfindet oder im Innern desselben. Es ergab sich, dass von der Absonderung irgend einer Oxydase, nichts zu bemerken war und, dass die Oxydation sicher an die Substanz des Bakterienkörpers gebunden ist. Ob dabei eine Endooxydase oder das Proto- plasma selbst in Betracht kommt, ist, wie in so vielen anderen Fallen, eine müssige Frage, weil man Ursache hat, das Protoplasma, jedenfalls für einen grossen Teil, als aus Endoenzymen zusammengesetzt zu betrachten, so dass Worte wie »Endo- enzym« und »Protoplasma« Begriffen entsprechen, welche nicht scharf zu trennen sind und fliessend ineinander übergehen. Weil unsere Bakterie zu einer besonderen, noch nicht beschriebenen Art gehort, scheint es geeignet, dafür einen neuen Artnamen aufzustellen, namlich Bacillits manganicus, mit der folgenden Diagnose: Bodenbakterie, welche wachst auf Platten von reinem Agar mit Salzen und be- deckt mit einer anklebenden Schicht von Manganocarbonat, welches oxydiert wird. Die Bakterie erzeugt braune oder schwarze Flecke von 0,5 bis i cm. Mittellinie, worin entweder lose Mikrokokken von 0,2 |li bis 0,7 \x vorkommen, oder kleine, feste in Manganioxyd eingekapselte Körnchen oder Knöpfchen, welche aus sehr kleinen, stark beweglichen Stabchen von 0,2 |li dick bei 1,5 bis 2 jj lang bestehen. Auf Agar- platten mit 0,05 Prozent Manganolaktat, schwieriges, schwaches Wachstum zu kleinen, braunen Koloniën von beweglichen Bazillen, wie oben. Auf reicheren Kultur- böden kein Wachstum. 144 II. Die Schimmelpilze des Mangancarbonates. Papidospora )nanganica. Als ich im Januar 1912 eine der vorgehend beschriebenen Mangancarbonat- Agarplatten in meinem Laboratorium einige Tage bei ca. 18" C. off en an der Luft bewahrt hatte, entvvickelten sich darauf einige Schimmelkolonien, welche zu meiner Verwunderung, eben wie die Koloniën der Manganibakterien, sich durch die Bildung von Manganiverbindungen ^) tief braun und schwarz farbten. In einem anderen Falie crhielt ich den gleichen Schimmelpilz aus einer jungen Nitratation selbst, so dass kein Zweifel daran war, dass derselbe aus den für die Nitrificationsversuche verwendeten Erdmuster herkünftig sein musste. Mikroskopisch betrachtet stellte sich heraus, dass das neugebildete Manganisalz ttilweise in der Form von vollstjindig runden Kornern, welche bis in ziemlich grossen Entfernungen vom Mycelium, lose im Agar verbreitet waren, andernteils als ómorphes, braunes, den Mycelfaden anhaftendes Pulver, abgesetzt war. Weil das Mycel tief im Agar eingedrungen war, verbesserte ich den Versuch dadurch, dass das Mangancarbonat nicht mehr auf die fertige Agarplatte gebracht, sondern, beim Anfertigen davon, in den noch flüssigen, in Leitungswasser gelösten Agar suspendiert wurde, wodurch es leicht ist, kreideweisse Platten zu erhalten, v/elche ausser dem Mangancarbonate nur noch etwas Kaliumphosphat und Chlor- ammon oder Nitrat enthalten. Wurde auf eine solche Platte Material des neuen Schimmels übergebracht, so kam das Mycel im Innern besser mit dem Carbonat in Kontakt, wodurch eine vollstandige Lösung desselben unter Aufhellung der Platte zustandekam, wahrend die »Braunsteinsferite« sich in dem durchsichtig gewordenen Boden als tiefschwarze Körner absetzten (Taf. III Fig. i). Zugleich wurde dabei die Erscheinung der L i e s e g a n g'schen Ringe sichtbar, welche bei Actinomyces annulatus unter ganz anderen Bedingungen entsteht und wovon man das Bild findet auf Taf. I, Bd. I dieser Zeitschrift. Man wird sehen, dass es sich bei der Entstehung d;eser »Braunsteinplatten« um einen der schönsten mikrobiologischen Versuche handelt. Glücklicherweise erzeugte der neue Pilz auf den Manganplatten sehr leicht Sporen, wodurch das Determinieren möglich wurde. Es stellte sich heraus, das (s sich dabei handelte um eine Art der Gattung Papidospora, welche verwandt ist mit F. sepedonioides P r eu s s'''),mit dieser Art nach der Beschreibung von Saccardo^) jedoch nicht völlig identisch sein kann, und deshalb weiterhin Papidospora man- ganica genannt werden wird. Weil die durch diesen Pilz erzeugte Manganiverbindung bei makroskopischer Betrachtung tief schwarz ist, lasst sie sich nicht leicht von Braunstein unterschei- den, und es ist wahrscheinlich, dass dieselbe auch teihveise oder ganzlich wirklich aus Braunstein besteht, in welchem Falie die neue Papidospora, sowie die übrigen sofort zu besprechenden Pilze »Braunsteinpilze« würden genannt werden können. ') Wahrscheinlich handelt es sich hierbei (und ebenso bei den Manganibakterien) um Mns O4, doch werde ich weiterhin von »Braunstein« sprechen. ^) Lindau, Engler's Pflanzenfamilien, Th. i, Abt. i, S. 428, Fig. 221 D. • *) Saccardo, Sylloge Fungorum, Bd. 4, pag. 59, 1886. 145 Wenn dieses nun auch nicht ganz sicher ist, werde ich doch kurzheitshalber diesen Namen verwenden, weil die genannten Reaktionen auch für Braunstein charak- teristisch sind. Die Braunsteinsferite erreichen, wie man aus der Fig. 2 ersehen kann, relativ gewaltige Dimensionen und können selbst dem unbewafïneten Auge sichtbar wer- den; so misst der in der Fig. 2 links photographierte Sferit beinahe 350 \x, wahrend ein scharfes Auge schon schwarze Kügelchen von 100 ja auf weissem Boden als ge- sonderte Teilchen erkennt. Die Sferite sind vollstandig rund oft mit rauher Ober- flache. Daneben liegt jedoch im Agar ein unregelmassiger Detritus, welcher beson- ders an den Zellwanden der Pilzfaden abgesetzt ist. Die Reaktionen dieser Massen sind wieder, eben wie bei der Mangancarbonatbakterie, diej enigen des Braunsteins, oder vielleicht genauer gesagt, der höheren Manganoxyde, insoweit dadurch in sauerer Lösung aus Jodkalium Jod frei gemacht, wahrend Wasserstofïsuperoxyd energisch gespalten wird, und Lösung, mit dunkelbrauner Farbe in concentrierter Schwefelsaure stattfindet. Es ergiebt sich jedoch, dass die Sferite nicht völlig aus Manganioxyden bestehen, sondern es ist möglich, nach Extraktion mit einer nicht allzu concentrierten Saure, darin eine farblose, aus organischem Stoff bestehende Kugel zu beobachten. Dass auch in anderen Fallen, wobei Sferite in kolloidalen organischen Massen entstehen, eine Kugel organischen Materiales Trager der abgelagerten Sferitsubstanz ist, wissen wir seit 1872 aus H a r t i n g's i) Beobachtungen über die künstlichen Calcosferite und die natürlichen der Muschel- und Eischalen 2). Das Mycel der Papulospora kriecht in und über die Agaroberflache und er- zeugt sehr kurze, sich kaum aus dem Agar erhebende Hyphen, welche die Conidien- köpfchen tragen. Diese fallen leicht auseinander in farblose durchsichtige Sporen von langlicher Gestalt (Fg. 3). Die Sporen keimen auf den verschiedensten Nahrböden und können z. B., auf Bouillongelatine gebracht, reine Schimmelkolonien erzeugen. Auf diesem Boden erzeugt der Pilz jedoch keine deutlichen Conidienköpfchen, son- dern mehr vereinzelt stehende Sporen, welche auf Agarplatten ohne andere Nahrunjr wie Chlorammon und Kaliumphosphat, wieder zu der gewöhnlichen Papulosporafonn auswachsen. Hierbei ist das Agar selbst Kohlenstoffquelle. Hat man dem Agar Mangancarbonat zugesetzt, so wird das Wachstum allerdings begunstigt, jedoch ist auch dann das Agar die einzige Kohlenstoffquelle. Versucht man den Schimmel mit Mangancarbonat allein zu ernahren, so bekommt man ebensowenig ein Resultat, wie mit Bacillus manganicus, so dass bei der Ernahrung auch von Papulospora Chemo- synthese sicher ausgeschlossen ist. Das Mangancarbonat ist aber dem Wachstujn entschieden gunstig und als Nahrung zu betrachten. Über den eigentlichen Chemismus des Oxydationsvorganges ist noch wenig be- kannt. Die Lage der Braunsteinsferite in ziemlich grossen Entfernungen der Mycel- *) F. Harting, Recherches de Morphologie synthétique. (Acad. Royale Neérlandaise) Amsterdam, v. d. Post, 1872. -) Wunderschöne »Eisenphosphatferite« erhalt man, wenn in Gelatine Ferroammon- sulfat gegen Natriumphosphat diffundiert. Auch darin wurde, nach vorsichtiger Extrak- tion mit Saure, eine durchsichtige Kugel organischer Substanz als Trager des Eisen- phosphates gefunden. Manganioxydsferite werden hier, wie ich glaube, zum ersten Male beschrieben. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 10 146 faden zeigt vielleicht, dass irgendeine aus dem Mycel herausdiffundierte oxydierende Substanz dabei in Betracht kommt. Um Alkali handelt es sich dabei nicht, denn die Reaktion der Kulturplatte verandert durch das Wachstum des Pilzes nicht merkbar. Salze wie Manganlaktat und Manganacetat sind für Papulospora ziemlich gut geeignete Kohlenstofïquellen und auch daraus entstehen in Agarplatten kleine Braun- steinsferite von schwarzer Farbe, jedoch nur langsam und durchaus nicht so reich- lich, wie aus dem Carbonate, Mit Manganpepton und ahnlichen Praparaten, erhielt ich wohl Wachstum des Mycels jedoch keine Sporen und keine Manganibildung. Andere >>Braunsteinbildner«. Sowohl die verwandtschaftlichen Beziehungen von Papulospora, wie die Her- kunft dieses Pilzes aus Gartenerde und die Leichtigkeit, womit die Ernahrung des- selben mit dem so schwierig angreifbaren Agar stattfindet, haben mich veranlasst, eben im Gartenboden die Gegenwart auch von anderen »Braunsteinpilzen« zu er- warten. Weil ich aus früheren Untersuchungen wusste, dass eine Reihe sehr inter- essanter Erdpilze Cellulose als Kohlenstoffquelle angepasst sind, habe ich zunachst mit diesen einige Versuche angestellt, welche bald lehrten, dass eben unter den »Cellulosepilzen« auch die wichtigsten »Braunsteinschimmel« vorkommen. Das Verfahren um die Cellulose Schimmel zu erhalten, kann wie folgt einge- richtet werden: Filtrierpapierscheiben werden angefeuchtet mit einer Lösung in Lei- tungswasser von ^Iw Proz. Ammonnitrat und ^Uo Proz. Kaliumphosphat, imd infiziert mit Humus oder gewöhnlicher Gartenerde und bei 20" bis 25" C. kultivert. Zahlreiche Arten kommen darauf zur Entwicklung, welche, sobald die Sporenbildung beginnt, ab- gestrichen werden auf eine frische Platte von Agar-Mangancarbonat-Ammonnitrat- Kaliumphosphat, mit oder ohne i Proz. Cellulose. Zur Erhaltung der Cellulose in einer Form, welche sich leicht in dem Agar ver- teilen lasst, wird Baumwolle mit starker Salzsaure behandelt, und nachdem dieselbe ganz spröde geworden (»carbonisiert«) ist, nach vollstandiger Entfernung der Saure getrocknet und pulverisiert, wobei man leicht ein sehr feines, beinahe struktur- loses Pulver erhalten kann, welches eine sehr gunstige Mikrobennahrung, insbe- sondere für Schimmel darstellt. Auch habe ich Waldhumus und Gartenerde sofort ausgesat auf Mangancarbonat- Agarplatten, also ohne vorherige Kultur auf Filtrierpapier und auch dann Braun- steinschimmel erhalten. Ebenso auf Filtrierpapier mit Mangancarbonat und Salzen. Es hat sich bei diesen verschiedenen Versuchen herausgestellt, dass Pilze aus \'erschiedenen Verwandtschaftsreihen das Vermogen der Manganibildung besitzen und darunter z. B. Arten aus den Gattungen Botrytis, Mycogone, Trichodadium und Sporocyhe. Mehrere Arten darunter scheinen noch nicht beschrieben zu sein. Auch wurden ein paar anscheinend neue Gattungen gefunden, worauf ich spater noch zurückzu- kommen hoffe. Kurz, die Manganmethode hat sich herausgestellt als geeignet um unsere Kenntnisse des Pilzreiches, sowohl in physiologischer wie in systematischer Hinsicht zu bereichern. Von den verschiedenen Formen, womit ich mich schon etwas naher beschaftigt 147 h.'ibe, gehören die in Gartenerde ausserordentlich allgemein vorkommenden Myco- gone-z.ritr\, wovon besonders eine noch nicht beschriebene Art, mit aus vier tetraëdrisch angeordneten Zeilen bestehenden dunkelbraunen Sporen, beinahe nie in meinen Kuituren fehlte. Auch die so interessante Familie der Stilbaceen ist sowohl auf den Filtrier- papierscheiben, wie auf den Manganplatten, beinahe immer durch irgend eine Art reprasentiert. Die allgemeinste davon moge hier noch kurz besprochen werden. Dieselbe gehort zur Gattung Sporocybe und ich will daran den Namen geben: Sporocyhe chartoikoon ^). Wenn diese Art sich auf Filtrierpapier entwickelt hat, so sieht man darauf mit unbewafïnetem Auge kleine, schwarze Tröpfchen von ca. K- mM Mittellinie, welche durch sehr kurze Stiele von ca. i mM Lange getragen werden, und in ziemlich weiten Entfernungen voneinander vorkommen. Es sind diese die Coremien, welche sich aus dem im Papier umherkriechenden Mycelium erheben. Drückt man ein solches Coremium flach zwischen Objektglas und Deckglas, so sieht man, dass das Sporenköpfchen aus langlichen, ziemlich grossen, ca. 9 bei 3 |.i messenden Sporen bcsteht, welche grau gefarbt sind und jede für sich durch einen Stiel getragen wer- den, wie bei der der Gattung Monosporium (Taf. IV Fig. 4). Die Hyphenverzwei- gung im Köpfchen ist monopodial, doch sind die mittleren Zweige kürzer wie die seitlichen. Eben wie die Sporen sind die reifen Stiele der Coremien dunkelgrau, wahrend das Mycelium im Papiere farblos ist. An der Basis der Coremien finden sich, auch in den Reinkulturen, eine zweite Art von Conidien, welche kugelrund sind eine ziemlich dicke Zellwand besitzen, und ca. 6 jli messen. Wie alle Papier bewohnenden Schimmelarten ist auch diese Sporocybe überall mit Bakterien bedeckt, welche jedoch in den ausgereiften Sporenköpfchen nur selten sind, so dass man daraus leicht soviel bakterienfreies Sporenmaterial abheben kann, dass daraus reine, weit auseinander liegende Koloniën kultiviert werden können. Eben wie bei Papulospora wachsen diese Koloniën auf den verschiedensten Kultur- böden; mit Erfolg verwendete ich dafür die gewöhnliche Bouillongelatine. Diese wird wenig und erst ziemlich spat verflüssigt; Coremien bilden sich darauf nicht, sondern nur vereinzelt stehende, einsporige Hyphen, wesshalb das Determinieren des Pilzes, wenn die Kultur nur von diesem Kulturboden bekannt ware, unmöglich sein sollte. In dieser Verbindung wünsche ich noch zu bemerken, dass die Cellulosemethode nicht allein für die Ausbildung der Coremienzustande der Hyphomyceten, sondern für diej enige der Fruktifikationsorgane im allgemeinen besonders gunstig ist, was z. B. hervorgeht aus der Leichtigkeit, womit sich auf den Filtrierpapierscheiben die Perithecien von Chaetomium und Sordaria entwickeln. Auf den Mangancarbonatagarplatten sind die Wachstumserscheinungen und die Bildung der »Braunsteinsferite« jihnlich den namlichen Vorgangen bei Papulospora, die L i e s e g a n g'schen Ringe werden dabei wohl oder nicht gebildet; warum dieses ') Ob diese Art wirklich neu ist, ist natürlich unsicher. Saccardo (Sylloge fun- gorum, Bd. 4, pag. 604, April 1886) erwahnt aber keine einzige Papier bewohnende Art, und die beiden von ihm angeführten Erdbewohner, namlich S.sphacrophila und S.Phillipsii, sind, seiner Diagnose nach, andere Arten. 148 nicht immer geschieht, ist mir unbekannt. Zwar giebt Fig. i das Bild einer Kultur von Papulospora, welche diese Ringe in schönster Weise erzeugt hat, kann jedoch, unter Umstanden, auch auf Sporocybe passen. Dass auch hier für die Oxydation des Mangancarbonates organische Nahrung, wenn auch in grosser Verdünnung notwendig ist, lasst sich leicht feststellen und eben- falls, dass sowohl Agar wie Cellulose für diese Nahrung geeignet sind. Dass die Umwandlung dieser Körper die Gegenwart eines spezifischen, die Cellulose oder den Agar lösenden Enzyms erfordert, ist gewiss. lm Falie des Agars handelt es sich da- hei nicht um die durch Bakterien gebildete Gelase, denn dieses Enzym vermag in den Agarplatten mehr oder weniger leicht zu diffundieren, was hier nicht beobachtet wird. Die Oxydation des Mangancarbonates dürfte auch bei der hier betrachteten Schimmelart wohl mit irgendeinem, nicht nur in, sondern auch ausserhalb dem Mycel vorkommenden oxydierenden Körper zusammenhangen, denn anders ware es nicht k!ar, warum die Braunsteinsferite sich in relativ grossen Entfernungen der Mycel- fjiden absetzen können. Bei den Mangancarbonatbakterien haben wir dagegen gesehen, dass die Bildung des Manganisalzes sicher nur in Contact mit dem Bakterienkörper stattfindet. Die Oxydation von Ammonsalzen oder Nitriten können die Manganschimmel ebensowenig bewirken, wie die Manganbakterien. Wie man sieht, hat die Manganmethode eine Reihe von Fragen in Fluss ge- bracht, welche nur zum kleinsten Teile und dann noch unvollstandig beantvvortct sind. Figurenerklarung. Fig. I. (Taf. III) Papulospora manganica. Kultur dieses Pilzes auf einer Platte von der Zusammensetzung: Leitungswasser, 2% Agar, "50% N H« N O3, V^o % Ki H F O4, I % Mn C O3. Die Manganisferite setzen sich zum Teil ab mit Bildung der Liese- gang'schen Ringerscheinung. Fig. 2 (Taf. III) (350). Papulospora manganica. Kultur auf einer Platte der bei Fig. i genannten Zusammensetzung. Die grossen schwarzen Flecke sind Braunstein- sferite. Uebrigens sieht man das Mycel und einige Sporenköpfchen. Fig. 3 (Taf. IV) (350). Papulospora manganica. Reinkultur auf Boden ohne Mangan- carbonat. Fig. 4 (Taf. IV) (900). Kleines Stück eines Coremiums von Sporocybe chartoikoon, auf Filtrierpapier wachsend. Laboratorium für Mikrobiologic der Technischen Hochschule cii Delft. M. W. BEIJERINCK, Oxydation des Mangancarbonates. Fig. I. Papiilospora manganica. Fig. 2. Papulospora manganica. Fig. 3. Papulospora manganica. Fig. 4. Sporocybe chartoikoon. Ueber Schröter und Cohn's Lakmus- micrococcus'). Folia Microbiologica, Delft, II. Jahrsang, 1913, S. 185—200. I. Micrococcus cyaneus in der Literatur. Im Jahre 1870 wurde im pflanzenphysiologischen Institut zu Breslau von Dr. J. Schröter ein eigentümlicher, Micrococcus ahnlicher Organismus gefunden, wovon der Entdecker Folgendes mitteilt 2): »Auf einer im Anfang Januar 1870 zur Bacterienkultur ausgelegten gekochten Kartoffelscheibe wurde eine umfangreiche, sehr intensive Blaufarbung beobachtet. Sie nahm schnell zu, so dass die Scheibe in der Ausdehnung mehrerer Centimeter davon eingenommen wurde, und schritt auch in die Tiefe fort und durchdrang nach und nach das Gewebe bis zur entgegengesetzten Seite der Scheibe. Bei mikroskopischer Untersuchung wurden im Innern der blaugefarbten Masse keine Bacteriën vorgefunden, die Membranen der Starkekörper waren hellblau gefarbt, zwischen ihnen wucherte reichlich Pilzmycel, dessen contrahierter Inhalt tief indigoblau gefarbt erschien. Von der blauen Masse wurde eine Aussaat auf frische Kartoffelstücke ge- macht. Erst nach zehn Tagen zeigte sich auf den Impfstellen eine blauviolette Far- bung. Hier wurde das Vorhandensein kleiner, elliptischer, unbeweglicher Or- ganismen constatirt. Die Farbung schritt centrifugal fort, wurde tief indigoblau und drang wieder weit in die Tiefe. Bei mehreren darauf wiederholten Kuituren trat immer nach etwa zehn Tagen dieselbe Pigmentbildung in derselben Weise auf. Der blaue Farbstofï wurde durch Sauren intensiv carminroth gefarbt. Alkaliën stellten die blaue Farbe wieder her, Sauren farbten dann wieder roth. Das Pigment verhalt sich darin ganz so wie Lakmus, zu dessen Bildung ist mithin kein den Flechten eigenthümlicher Stoff erforderlich. Da ich im Innern der blaugewordenen Substanz keine Bacteriën, dagegen sehr constant ein Pilzmycel auffand, war ich lange geneigt, letzterem die Blaufarbung zuzuschreiben. Diese Vermuthung musste schon desshalb aufgegeben werden, weil nicht überall in der blauen Masse Mycel nachweisbar war und die Zeilen der Xahr- substanz ebenso wie der Pilz blau gefarbt waren. Es ist anzunehmen, dass die Bac- teridien sich nur an der Oberflache vermehren und nur hier wie B. prodigiosum, (las Pigment bilden. Dieses scheint in Wasser löslich zu sein, und desshalb von der Oberflache aus in die Nahrsubstanz einzudringen und sie zu farben. ') Nach einem Vortrag mitDemonstration gehalten zu Leiden am 13. Dezember 1913. -) Ueber einige durch Bacteriën gebildete Pigmente. Cohn's Beitrage zur Biologie der Pflanzen, Bd. i, pag. 122, 1875. 150 Das regelmassige Auftreten des Schimmels mit der Pigmentbildung in meinen Culturen erklart sich leicht dadurch, dass von der ersten Culturstelle gleichzeitig mit den Bacteridien Schimmelsporen und lebende i\Iycelstücke übertragen und dann immer weiter fortgepflanzt \vurden«. Nachdem Schröter das Pilzmycel als Fusisporiimi solaiii Martius determiniert hat, sagt er weiter: »Es lasst sich daraus wohl schliessen, dass auch hier durch die Vegetation der Bacteridien anfangs sauere, spater alkalische Sub- stanzen gebildet wurden. Das hier betrachtete blaue Pigment, ist in seinen Reactionen ganzlich ver- schieden von dem der blauen Milch, wie sie O. Erdmann angibt^). Nach den dort citierten Untersuchungen von Dr. T r ö m m e r verandern Atzkali und Natron den Farbstoff derselben in Pfirsichroth, Sauren stellen die blaue Farbe wieder her. Ammoniak verandert die Farben wenig ins Violett, wahrend Essigsaure sie wieder herstellt. Salzsaure zerstört sie nicht. Salpetersaure (rauchende) zerstört sie, Chlorwasser dessgleichen. Die gegebenen Reactionen sind wiederum die der Anilin- körper und zwar desj enigen Anilinblaues, das man nach A. W. H o f f m a n n's Untersuchungen als Triphenylrosanilin bezeichnet. Wie es scheint, wird das Pig- ment durch lebhaft bewegliche Bacteriën gebildet, welche sich in zahlloser Menge in der blauen Milch finden. Es existieren also zwei specifisch verschiedene blaue Bacterienpigmente, das eine durch unbewegte Bacteridien, das andere durch bewegte Bacteriën gebildet, ebenso wie wir es bei dem gelben Farbstoff gesehen haben«. In 1872 hat Cohn selbst eine mit der von Schröter entdeckten Bacterie nahe verwandte Varietat gefunden und zwar durch einen Anhaufungsversuch, wel- cher mir bei der Wiederholung allerdings nicht den gleichen Organismus gegeben hat, aber worin ich dennoch einen guten Kern sehe, welcher wahrscheinlich, bei richtiger Anwendung von Ammoncarbonat und Infection mit fruchtbarer Garten- erde, den Lacmusmikroben auf's Neue wird liefern können. Cohn beschreibt seinen Fund folgenderweise^^) : y>Micrococciis cyaneus (Bac- teridium cyaneum Schröter). Die elliptischen unbeweglichen Kügelchen dieser Art wurden von Schröter im Januar 1870 als Ursache einer auf gekochten Kartoffeln erschienenen umfangreichen und intensiven Blaufarbung beobachtet. Mir selbst kam dieses blaue Pigment zur Beobachtung, als ich zuerst am 22. Januar 1872 ein Gemisch von 8 cc. destillirtem Wasser, 2 cc. concentrirter Lösung von saurem weinsteinsaurem Kali und 2 cc. kauflichem essigsaurem Ammoniak nebst den nöthigen Nahrsalzen mit einem Tropfen Bacterienflüssigkeit versetzte und in einem geheizten Blechkasten bei ca. 30" C. offen stehen Hess. An der Oberflache bildete sich eine Zoogloea (Mycodermahaut) von Kugelbacterien, neben unzahligen Stab- chenbacterien ; nach neun Tagen begann die Flüssigkeit sich schwach blaugrün ;ai farben, die Farbung wurde von Tag zu Tag intensiver und 1 einer blau und war am 17. Februar ganz blau, wie KupfervitrioUösung. Durch tjbertragung der auf der Oberflache schwimmenden Zoogloeahaut, sowie des sich allmahlich bildenden Bac- ') Bildung von Anilinfarben aus Proteinkörpern. Journal für praktische Chemie, 1866, pag. 386. -) Untersuchungen über Bacteriën. C oh n's Beitr. zur Biel. d. Pflanzen, Bd. i, pag. 156, 1875. 151 terienabsatzes, konnte ich aus neuen Lüsungen von ahnlicher oder niudifizirter Zu- sammensetzung den blauen Farbstoff immer wieder erzeugen, so dass die Ferment- thatigkeit dieser »Pigmentmutter« nicht bezweifelt werden kann; bei Aussaat wurde die Flüssigkeit zuerst alkalisch trübe, milchig, solange die stets gleichzeitig vorhan- denen Stabchenbacterien sich überwiegend vermehrten, schliesslich aber ganz klar und rein blau, nachdem die Bacteriën sich am Boden abgesetzt hatten. Ich werde auf diese Verhaltnisse noch einmal zurückkommen. Der blaue Farbstoff wurde von mir in einer vorlaufigen Mittheilung vom 14. Februar 1872 mit dem Lacmiis verglichen, dem er ausserlich ganz gleicht; auch wird derselbe durch Sauren roth, durch Ammoniak wieder blau; er wird durch Alkohol nicht gefallt; er fluoreszirt nicht und besitzt ein Spectum ohne Absorp- tionstreifen, nur mit Verdunkelung der schwacher brechenden Halfte. Bekanntlich ist der Lacmusfarbstoff auch nicht als solcher in den Flechtenaus- zügen enthalten, aus denen er dargestellt wird; diese sind vielmehr ursprünglich farblos, und erlangen ihr Pigment erst durch eine Art Gahrung oder Fjiulniss, bei welcher Ammoniak und andere Basen (Kalk) eine noch nicht naher ermittelte Rolle spielen ; es lasst sich bis jetzt noch nicht feststellen, ob bei der echten Lacmus- gahrung auch Kugelbacterien betheiligt sind. Der von mir erzeugte blaue Farbstoff enthalt kohlensaures Ammoniak, welches durch die Fermentthatigkeit aus dem ursprünglich zugesetzten essigsauren Ammon entstanden ist; derselbe zeigt jedoch nicht jene Bestandigkeit, wie einige andere Pigmente chromogener Kugelbacterien; denn die Flüsigkeit, in welcher er sich lost, erscheint in der Regel anfangs spangrün und wird erst allmahlich blau ; am Licht verliert er nach einiger Zeit an Intensitat und zeigt eine blaugrijne Nuance, wobei sich ein dunkelbraunes Pulver absetzt ; in anderen Fallen erhielt sich die span- oder lauchgrüne Farbung ohne in Lacmusblau überzugehen und steigerte sich sogar zu grosser Intensitat und Reinheit; auch lauchgrüne Lösung wird durch Sauren roth, durch Ammoniak wird das Grün wieder hergestellt, es handelt sich hier offenbar nur um Modifikationen eines und desselben Pigmentes durch noch unbe- kannte chemische Reactionen. Eine sehr intensive spangrüne Fleckenbildung beobach- tete ich auch am 8. August 1872 auf gekochten Kartofïelscheiben, und auch hier fan- den sich auf und zwischen den Kartoffelzellen zahllose Kugelbacterien, denen die Er- zeugung des Pigmentes zuzuschreiben ist«. Die geringe Stabilitat des Farbstofïes, wovon C o h n spricht, ist nicht im Streite mit seiner Natur als Lacmusfarbstoff, denn ich fand eine ahnliche Des- organisation des letztgenannten Körpers in alkalischen Bacteriengemischen. Schrot er ist in 1889 noch einmal auf den gleichen Organismus zurückge- kommen, namlich in der von C o h n herausgegebenen Kryptogamenflora von Schlesien, wofür er die Pilze bearbeitet hat, und zwar in der sehr guten Übersicht der damals bekannten oder vermeintlichen 149 Micrococcus-arten^), wo man untor No. 129 die Beschreibung findet von M. cyaneus (Schröter 1870), wobei er als gesonderte Varietat die von C o h n aufgefundene Form als M. pseudo-cyaneiis (C o h n 1872) anführt, ohne jedoch den oben gegebenen Beschreibungen irgend etwas Neues zuzufügen. ') Die Pilze Schlesiens. Erste Halfte, pag. 145. Breslau 1889. 152 Wie man aus dem vorgehenden sieht, sind C o h n und Schröter völlig über- zeugt von der Unbeweglichkeit ihrer Mikroben, und was die Form betrifft, sprechen beide von langlichen oder elliptischen Zeilen, wahrend Schröter anfangs denn auch den Namen Bacteridium gebraucht hat, welcher erst spater, nach C o h n's Befund, in Micrococcus verandert wurde. Der Micrococcus cyaneus ist in vielen Lehrbüchern und Compilationen an- geführt, scheint jedoch nur einmal zurückgefunden zu sein und zwar in der Leit- meritzer Wasserleitung i), so dass derselbe als selten bezeichnet wird. Die von Reiner Muller gefundene Form, worauf ich zurückkomme, ist jedenfalls abweichend. Ich selbst fand die Art zuerst bei Gelegenheit von Boden- untersuchungen zur Isolierung von Azotohacter, und spater wieder bei der Aus- führung eines Versuches, welchen ich den »Actinomycetenversuch« nenne. 2. Der Actinomycetenversuch. Derselbe besteht in der Aussaat der zu untersuchenden Bodenprobe auf Platten von folgender Zusammensetzung: Leitungswasser loo, Agar 2, Glukose 2, Calcium- malat o,i, Ammonsulfat (oder Ammonnitrat) o,i, Bikaliumphosphat 0,05 und Kultur im Brutschrank bei 28" C. Viele Bodenorganismen erzeugen auf einer solchen Platte Calciumcarbonat aus dem Malat, wodurch die Reaktion neutral bleibt, selbst dann, wenn andere, nebenbei liegende Arten aus der Glukose Saure bilden. Es ist nicht zu empfehlen eine bessere Stickstoffquelle zu verwenden, weil dann die gewöhnlichen Erdmikroben die Platte zu sehr überwuchern. Es hat sich nun herausgestellt, dass die verschiedensten Arten der Familie der Actinomyceten, welche bekanntlich auf den gewöhnlichen Fleischbouillonplatten nur schwierig zur Entwicklung kommen, auf dem genannten Nahrboden durch die übrigen Boden- mikroben nur wenig gehindert werden, so dass man selbst die vielen sehr langsam wachsenden Formen dieser Gruppe nicht leicht übersehen kann. Allerdings bilden sie darauf nur kleine Koloniën, wesshalb man natürlich scharf zusehen muss, um die allerkleinsten darunter zu finden. Bei der Unterscheidung derselben wird man ge- fördert durch das starke Vermogen der Pigmentbildung, welches sehr vielen Actino- myceten eigen ist, und wobei besonders gelbe, braune und schwarze, seltener, die für den gegenwartigen Fall wichtigen blauen oder roten Farbkörper entstehen. Man kann auf diese Weise in Gartenerde die Gegenwart von drei verschiedenen Arten nachweisen, welche rings um ihre Koloniën blaue Diffusionsfelder erzeugen. Hier- von lasst eine sich mit Micrococcus cyaneus der Literatur identifiziren ; dieselbe zeigt überdies grosse Ahnlichkeit mit Bacteriiim coelicolor von Reiner Muller wovon sie sich jedoch, der Beschreibung nach, unterscheidet durch die Natur des Pigmentes und durch ihre Morphologie. Eine zweite Art ist wohl identisch mit der Streptothrix coelicolor dieses Autors ; die dritte, auffallend kleine Art ist noch nicht genügend studiert. Muller fand seine blauen Mikroben zufallig: das Bacterium auf einer Serumplatte bei der Untersuchung eines diphterieverdachtigen Mandel- ') Migula, System der Bakterien, Bd. 2, pag. 187. Jena 1900. 153 belages, die Streptothrix in einem Kartoffelröhrchen; er betrachtet dieselben als aus der Luft herkommend ^). Besonders die erste Art ist interessant, nicht allein wegen der Pigmentbildung, scndern auch durch ihre unzweifelhafte Zugehörigkeit zu der Familie der Actino- myceten, was mir für einen Micrococcus sehr bezeichnend und merkwürdig erscheint. Ob diese Art wirklich so selten ist, wie es bisher den Anschein hat, betrachte ich durchaus nicht als sicher; bei unseren unvollkommenen Methoden der mikro- biologischen Bodenuntersuchung, können allerlei allgemeine Formen sich noch immer leicht unserer Beobachtung ganzlich entziehen, und andere, reichlich in unserer Umgebung vertretene Arten, nur ausserst selten zur Anschauung kommen, was wohl am deutlichsten daraus hervorgeht, dass beinahe jeder neue, gut eingerichtete Kulturversuch auch zur Entdeckung neuer Formen Veranlassung giebt. In diesem Falie kommt dazu noch der Umstand, dass unsere Art sehr leicht das Vermogen der Pigmentbildung erblich verliert, und dass es allen Anschein hat, dass dieses auch in der Natur stattfinden kann; das Auffinden und Identifiziren solcher pigment- freier Formen muss aber mit ausserordentlichen Schwierigkeiten verbunden sein. Was uns also als eine seltene Art erscheint, könnte sich schliesslich herausstellen als eln für die im Boden verlaufenden Processe dennoch wichtiger Faktor von grosser Verbreitung. Ich halte es für sehr wohl möglich, dass die hier beschriebene Lacmusmikrobe (der ihre nachsten Verwandten auch das Agens der technischen Lacmuserzeugung sind. Zwar habe ich bei der Aussaat der Microbe auf einem Brei von fein gemahlener Orseilleflechte nur vereinzelte blaue Punkte erhalten, jedoch sind mir die prak- tischen Bedingungen der Lacmusfabrikation nicht genügend bekannt, um diesen Misserfolg als entscheidend zu betrachten. 3. Pigmentbildung. Unsere Mikrobe kann auf den verschiedensten Nahrböden wachsen, und ist ein makrobiotischer Organismus, der scharfes Austrocknen und grosse Koncentra- tionsanderungen gut überdauern kann. Kulturgelatine wird nur langsam und spat verflüssigt. Bouillonagar wird schliesslich alkalisch durch Bildung von Ammon- carbonat. übschon die Pigmenterzeugung gegenwartig nicht mehr so intensiv ist, wie zur Zeit der ersten Isolierung, ist es leicht, mit der rein kultivierten Mikrobe Lacmus- farbstoff in grosser Menge zu erzeugen. Nur kommt es darauf an, den dazu ge- eigneten Kulturboden zu finden. Nach sehr vielen Versuchen, welche nicht inter- essant genug sind, um hier beschrieben zu werden, stellte sich heraus, dass der bei dem Actinomycetenversuch genannte Nahrböden für diesen Zweck zwar gut ge- eignet ist, jedoch, wenn es sich um die Reinkulturen handelt, noch betrachtlich ver- bessert werden kann dadurch, dass als Stickstoffquelle Pepton anstatt Ammonsalz, ') Eine Diphteridee und einc Strepthotrix mit gleichem blauen Farbstofif, sowie Unter- suchungen über Streptothrix-artcn im allgemeinen. Centralbl. f. Bakteriologie, Erste Abt. Bd. 64. pag. 195, 1908. (Institut Kiel.) 154 und als Kohlenstoffquelle Mannit anstatt Gliikose verwendet wird. Man erhalt dann also folgenden Kulturboden: Leitungswasscr loo Agar 2 Mannit 2 Pepton 0,5 Calciummalat 0,10 Bikaliumphosphat 0,05 Weil dieses Material für die Kultur der meisten Bacteriën sehr gunstig ist, besonders auch für die Heubacillen, muss sterilisiert werden. Zufügung von Natriumcarbonat ist jedoch nicht nötig. Die Bedeutung des Mannits ist darin zu suchen, dass die Pigmentbildung der Lacmusbacterie besser in schwach alkalischer oder neutraler, wie in schwach sauerer Lösung stattfindet, und die Glukose hier wie in so vielen anderen Fallen die Saurebildung begunstigt, wahrend aus Mannit keine Saure entsteht, obschon das Wachstum dadurch sehr gefördert wird. Überhaupt ist Mannit wohl als die beste aller untersuchten Kohlenstoffquellen zu betrachten. Weil aber auch Malat als solche sehr geeignet und eine gemischte Nahrung für viele Mikroben vorteilhafter ist, wie eine einseitige, so lasst sich einigermaassen begreifen, warum Mannit und Calciummalat zusammen wohl am günstigen sind für die Le- bensfunktionen unserer Art überhaupt. Übrigens geben Aussaaten auf Agarplatten, worin 0,1% Calciummalat, 0,1% Pepton und 0,02 % Bikaliumphosphat ohne weitere Zusatze, ebenfalls kraftige Kuituren, welche viel Lacmusblau erzeugen. Weil das Pigment wasserlöslich und sehr stabil ist, kann es leicht durch Auslaugen der Agarplatten und Ausdunsten der erhaltenen Lösung in concentriertem Zustand erhalten werden. Als Indikator ver- wendet findet der Umschlag bei genau derselben Saure- und Alcaliconcentration statt, wie beim gewöhnlichen Lacmus, dessen Absorptionsspektrum hier ebenfalls zurückgefunden wird. Obschon die Pigmentbildung durch eine alkalische Reaktion begunstigt wird, kann nicht gesagt werden, dass sie davon abhangig ist, denn auf Nahrböden mit Glukose entsteht ebenfalls Pigment, jedoch nicht blau, sondern rot gefarbt, wegen der zu gleicher Zeit stattfindenden Saurebildung. Verwendet man neben Glukose Ammon- oder Kaliumnitrat als Stickstoffquelle, so erhalt man violette Kuituren. Das Pepton ist also bei Gegenwart von Glukose auch für die Saurebildung als gunstig zu betrachten, was übrigens sozusagen nur cin neues Beispiel eines Naturgesetzes zu sein scheint, welches ebenso sehr für die Saurebildung in unserem Magen, wie in den höheren Pflanzen und bei den Mikro- ben gilt. Auch Malzwürze-Agar ist ein ziemlich guter Kulturboden für die Erzeugung des roten Pigmentes, was wieder ofïenbar mit dessen Gehalt an pflanzlichen Pepton und Zucker zusammenhangt. Um festzustellen, ob C o h n's Lacmusmicrococcus mit meiner Mikrobe wirkliche Übereinstimmung gehabt hat, habe ich in reinen und in mit spontanen Bacterienge- mischen versehenen Lösungen von Ammonacetat kultiviert und von den weiteren von Cohn angegebenen Salzen (siehe oben). Es hat sich dabei herausgestellt, dass Ammonacetat sich für Wachstum und Pigmentbildung wirklich eignet, wahrend die 155 anderen Lösungen kein sicheres Resultat gaben. Eine gute Anhaufungsmethode aiis Erde oder anderen Naturmaterialien vermittelst einer Kulturflüssigkeit fehlt jedoch noch, wie ich schon oben bemerkte. Obschon die Lacmusmikrobe den Aëroben zugehört, ist es möglich, dadurch allerlei Reduktionen hervorzurufen. Da ich über solche Versuche schon früher ausführlich gehandelt habe ^), wünsche ich darüber an dieser Stelle nur hervor- zuheben, dass die Mikrobe, wenn auch schwierig, imstande ist in Nahrlösungen ihr eigenes Pigment zu dem entsprechenden Leukokörper zu reduzieren, und dass sie wie zu erwarten war, dieses ebenfalls mit Handelslacmus zu tun vermag, was inso- weit bemerkenswert ist, als dieser Vorgang bekanntlich nicht durch Schwefelwasser- stoff oder durch andere Sulfide hervorgerufen werden kann. 4. Mutation. Die roten Kuituren haben die bemerkenswerte Eigenschaft, dass sie beim Überimpfen, selbst auf Kulturböden, worauf die Normalform sofort Lacmusblau er- zeugt, einige Zeit als rote Modifikation weiter wachsen. Es ist als ob die Mikrobe nicht sofort ihre Gewohnheit der Saurebildung ablegen kann, denn die Erscheinung dauert zu lange, um etwa durch in den Keimen angehaufte Saure, welche nur langsani verarbeitet wird, erkliirt werden zu können. Schliesslich werden aber z. B. auf Mannit- malatboden, die anfangs rot wachsenden Impfungen, beim Weiterwachsen blau, so dass es sich hierbei offenbar nicht um eine Modifikation oder Mutation mit erblicher Konstanz handelt, sondern um eine Fluktuation mit sehr begrenzter Erblichkeit. Weil der Lacmusfarbstoff einer der besten Indikatoren ist, dessen Umschlag mit grosser Scharfe beobachtet werden kann, diirfte die Erscheinung eine der geeignet- sten sein, um die schwierige Frage der fluktuierenden Erblichkeit weiter zu bringen. Neben den hier besprochenen vorübergehenden, ist es nicht schwierig, bei un- serer Mikrobe auch eine erblich stabile Veranderung hervorzurufen, welche im mehr oder weniger vollstandigen Verluste des Vermogens der Pigmentbildung überhaupt besteht. Es scheint dieses bei den verschiedenartigsten, als ungünstig zu bezeich- nenden Lebensbedingungen einzutreten, wozu auch die Umstande, welche zur Saure- bildung Veranlassung geben, gehören. Jedenfalls geben die auf Glukose-Pepton oder auf Malzwürzeboden gezüchteten Kuituren, wenn sie darauf drei oder vier Wochen verweilt haben, beim Überimpfen auf Malatmannitagar neben dem blauen Haupt- stamm ganzlich farblose Koloniën und blaue Zwischenformen mit einer sehr ver- schiedenen Intensitat der Farbung, wobei ich zwei bis drei Stufen gut unterschei- den konnte und wegen der erblichen Konstanz auch langere Zeit in Kultur gehal- ten habe. Auch werden farblose Koloniën erhalten, wenn man dem Kulturböden c,i% Chlorcalcium zusetzt, welcher Körper das Wachstum etwas hemmt und das reine Blau des Pigmentes in Violett verwandelt. Beim Überimpfen auf Mannit- Malatagar ohne Chlorcalcium entwickelten sich dann daraus viel mehr farblose wie blaue Koloniën. Obschon die Erscheinung der Hauptsache nach mit der früher beschriebenen ') Phénomènes de réduction produits par les microbes. Archives Néerlandaises, Sér. 2. T. 9, pag. 131, 1904. 156 Mutation i) von Bacillus prodigiosus zu B. p. albus und B. p. roseus i und 2 über- einstimmt, unterscheidet sie sich davon durch die hier viel geringere Stabilitat der Pigmentbildung, wie bei B. prodigiosus. Dieses ist übrigens im Einklang mit der ausserordentlichen Varabilitat, welche bei der Gattung Actinomyces beobachtet wird, und womit unsere Mikrobe sicher verwandt ist. Obschon die Lacmusmikrobe dadurch ein gutes Objekt für Variabilitatsversuche ist, ist die relative Langsamkeit des Wachstums derselben ein dafiir wenig gunstiger Umstand. Die Koloniën der blauen Hauptform sind etwas gerunzelt und zusamenhan- gend, diejenigen der farblosen Mutante ganzlich weich und, wie gewöhnliche Micrococcus-Kolonien, ohne jeden Zusammenhang. 5. Actinomyces (Streptothrix) coelicolor Reiner Muller. Obschon mein Stamm nicht völlig mit der Beschreibung von Reiner Mül- 1 e r's Material übereinstimmt, und davon zum Beispiel durch das Fehlen der von Muller so hübsch dargestellten Ringbildung abweicht, zögere ich nicht, den- selben mit dem gleichen Namen zu belegen, weil die Variabilitat dieser Art sehr hetrachtlich ist. Ich fand namlich bei beinahe jeder Aussaat, wenn ein paar Wochen alt, nicht nur verschieden gestaltete Koloniën, sondern auch Sektormutanten, welche bei der Vermehrung entweder atavierten oder erblich stabile morphologische Typen hervorbrachten. Bei einigem Suchen werden sich, wie ich meine, auch wohl ring- bildende Mutanten aufïinden lassen. Auch bezüglich der Pigmente finde ich nicht genau dasselbe wie Muller. Ich komme namlich bei alten Kuituren meistens (nicht immer) zum Schlusse, dass das blaue Pigment Lacmus sein muss, finde aber in Übereinstimmung mit Muller, dass junge Kuituren ein anderes, an Carotin erinnerndes Pigment enthalten, ohne dass ich imstande bin, dieses mit erblicher Veranderlichkeit der Mikroben selbst in Zusammenhang zu bringen. Es dürften also noch andere mit dem Lacmus verwandte Pigmente existieren. Es ist jedoch auch möglich, dass dieses nur scheinbar richtig ist, und dass das verschiedene Verhalten nur darauf beruht; dass der Lacmusfarbstofï, wenn frei, andere Eigenschaften zeigt, wie wenn noch an die Zelle gebunden. Die Richtigkeit der Ansicht Mulle r's, dass das Pigment seines Stammes eine Modi- fikation des Anthocyans (Erythrophylls) sein sollte, konnte ich bei dem meinigen nicht überzeugend nachweisen. Ich muss aber bemerken, dass mein Stamm nur sehr schwierig Pigment erzeugt. Auf den gewöhnlichen Boden wachst derselbe farblos. Auf Mannit-Malat-Pepton-Agar ist die Pigmentbi'dung gut bemerkbar, jedoch schwach. Am besten gelang dieselbe auf Platten von der Zusammensetzung: Lei- tungswasser 100, Glukose 2, Calciummalat 0,1, Ammonnitrat 0,1. Bikaliumphosphat 0,05, bei 20" bis 28" C. -). Mit der nötigen Geduld kann man in solchen Platten genug Pigment erhalten, um dasselbe mit Wasser auszuziehen und sich zu überzeu- gen, dass darin Lacmus vorkommt. Dieser positive Nachweis hat insoweit Inter- esse, als dadurch die Verwandtschaft des Lacmusmikrococcus mit A. coelicolor eine neue Stütze erhalt. ') Mutation bei Mikroben. Folia microbiologica, Bd. i, pag. 30, 1912. -) Mit Starke als Kohlcnstoflfquelle war das Resultat nicht besser. 157 5- Verzvandtschaft. Aufstellung der Gattung Actinococcus. Die richtige Auffassung und Umgrenzung der Actinomyceten als besondere Pflanzenfamilie ist das Verdienst von N e u m a n n und Lehman n^), und schnn in der ersten Auflage ihres hierbei genannten Buches von 1896 durchgeführt. Wie wenig dieses von anderen Autoren verstanden wurde, geht z. B. daraus hervor, dass Migula weder in seinem »System der Bacterien« noch in den für E n g 1 e r's Pflanzenfamilien behandelten »Schizomyceten«, dieses berücksichtigt, und Macé noch in 1913 die echten Actinomycesdi.T\.&n mit der voUstandig abweichenden Gat- tung Cladothrix zusammenfasst -). Auch Reiner Muller, welcher, N e u m a n n und L e h m a n n folgend, seine blaue Mikrobe ganz richtig als eine Diphteridee bezeichnet, hat dennoch den Fortschritt nicht bemerkt, welcher in der Aufstellung der Gattung Mycobacterium dieser Autoren gelegen ist, wie aus dem von ihm gewahlten Namen Bacterium hervor- geht. Bei M i e h e •'') fehlt ebenfalls noch die richtige Auffassung, denn zu der Familie der Mycobacteriaceae können keine beweglichen Formen gebracht werden, wie er das tut. N e u m a n n und L e h m a n n bringen die drei folgenden Gattungen zu der von ihnen aufgestellten Familie: Erstens, Corynebacterium mit sechs Arten, worunter C. diphteriae L ö f f 1 e r, und der Erreger des Rotzes, C. mallei F 1 ü g g e. Zweitens, Mycobacterium mit mehreren Arten ; worunter bemerkenswert M. leprae A. H a n s e n , M. tuberculosis K o c h und M. phlei M o e 1 1 e r ^). Drittens, Actinomyces mit vielen Arten, w'orunter A. bovis Har z — B o s t r ö m, A. chroniogenes G a s p e r i n i ''). Bei allen drei Gattungen handelt es sich um typisch unbewegliche Formen, welche mehr oder weniger deutlich verzweigt sein können. Die am vollstandigs:en ausgestattete Gattung ist Actinomyces mit reich verzweigtem Mycel und, bei den höheren Formen, schnurenweise angeordneten, kugelförmigen Luftconidien. Bei Mycobacterium und Corynebacterium fehlt die Bildung von Luftconidien, wahrend die Mycelfaden durch Fragmentation zu kleinen Stücken auseinander- fallen. Beide Gattungen sind nahe verwandt, und ob ihre Trennung eine natürliche ist, muss die Zukunft lehren. ') Bakteriologische Diagnostik. 5. Aufl. pag. 159 und 545, 1912. -) Traite de Bacteriologie, 6. Ed. T. 2, pag. 720, IQ13. ■^) Handwörtcrbuch der Naturwissenschaften, Band i, pag. 786, 1912. *) Letztere Art mit Photographie: Söhngen, Paraffinbakterien. Centralblatt f. Bakteriologie 2. Abt. Bd 37, pag. 595, 1913. '") Weil der Name Streptothrix Foersteri schon im Jahre 1875 von Cohn verwendet wurde (Beitrage zur Biologie der Pflanzen, Bd. i, pag. 186) für die von Koerster in 1855 (Archiv für Ophtalmologie I, 284 und weiter II, 224, und XV, 318) entdeckte Mikrobe des menschlichen Thranenkanals, wahrend der Name Actinomyces bovis für die von Ri volta in 1868, Perroncito in 1875 und Bollinger in 1877 beschriebene Mikrobe, erst in 1878 (Jahresbericht der Kön. Centralanstalt f. Thierarz. zu Viünchen) von Harz eingeführt ist, soUte auf Grund der Prioritatsregel, Streptothrix an Stelle von Actinomyces gewahlt werden mussen. Die von Neumann und Lehmann getroffene Wahi des Namens Actinomyces, scheint mir aber in diesem Falie für ihre Nachfolger entscheidend. 158 Nach meiner Ansicht stellt es sich nun als notwendig heraus diesen Gattungen noch zwei neue hinzuzufügen, welche ich Actinobacillus und Actinococcus nennen will. Auf Actinobacillus werde ich bei einer anderen Gelegenheit noch einmal zu- rückkommen. Hier will ich nur bemerken, dass von dieser Gattung bisher mehrere Arten bekannt geworden sind, wovon ich eine schon früher besprochen habe, namlich unter dem Namen Bacillus oligocarbophilus, wovon mir damals die natürliche Yer- wandtschaft nicht klar war^). Zur Gattung Actinococcus mussen diej enigen Micrococcus-arten der Literatur gebracht werden, welche unzweifelhafte Actinomyceten sind, und das ist sicher der Fall bei Micrococcus cyaneus, welcher darum weiterhin Actinococcus cyaneus heis- sen muss (Fig. 2, Taf. V). Besonders die Hauptform zeigt ihre natürliche Yer- wandtschaft mit den Actinomyceten so deutlich, dass jeder, welcher mit den hier vorliegenden \''erhaltnissen bekannt ist, meine Ansicht als richtig anerkennen wird. Nicht nur die eigentümliche rauhe und gekrauselte Oberflache der Koloniën ist hier- bei maassgebend, sondern ebenfalls die von einem Centrum ausstrahlende Anordnung der Zeilen in den jungen Koloniën, welche sehr deutlich, sozusagen eine Verzwei- gung der Strahlen anzeigt, was dasselbe ist wie eine Yeranderung in der Richtung der Ebene, worin die Zellteilung zustandekommt (Fig. i, Taf. V). Bei gewissen Mutationen werden in den Koloniën langere Elemente, wie die gewöhnlichen gefunden, und darin lassen sich dann auch bisweilen Stabchen mit Gabelungen nachweisen (Fig. 3 u. 4, Taf. VI). Ich komme dadurch zum Schlusse, dass die alte Gattung Micrococcus der Literatur keine natürliche ist, sondern wenigstens zwei und möglich noch mehr durchaus nicht verwandte Formengruppen umfasst. Meine vorlaufige Gattung Lacto- coccus, wozu die Mikroben der Rahmsauerung, Lactococcus lactis sowie die Dextran- kokktn, Lactococcusdextranicus-),gthövtr\,\n eine ganz andere Verwandtschaftsgruppe untergebracht werden wie die Actinomyceten, namlich in diejenige der Co/j'-gruppe. Das heisst also, sie sind phylogenetisch verwandt mit beweglichen, ciliaten Bacteriën, womit sie vermittelst der verschiedenartigen Aerogenesavten durch alle möglichen i'bergange zusammenhangen. Dieses ist mit ihren physiologischen Leistungen in vöUiger Ubereinstimmung, weil sowohl die Aerogenes- wie auch alle anderen Arten der CoZï-gruppe nicht nur Milchsaure erzeugen, sondern auch einige andere in wechselnden Verhaltnissen vorkommende Producte, welche in den echten Milchsaure- garungen erkannt sind, wie Bernsteinsaure, Acetylmethylcarbinol und Essigsaure. Aus diesen Betrachtungen entwickelt sich nun die eigentümliche Frage, ob Actinomyces durch progressive Variabilitat aus Actinococcus oder umgekehrt, ob Actinococcus retrogressiv aus Actinomyces entstanden ist. Die Antwort kann nicht zweifelhaft sein. Schon früher habe ich auf den Umstand hingewiesen, dass eine der Mutationen der Lacmusmikrobe Kurzstabchen hervorbringt, worunter gegabelte gefunden werden, was in Verbindung mit der typischen Unbeweglichkeit die Ver- wandtschaft zu der Gattung Mycobacterium unzweifelhaft macht. Dass diese Gat- tung aber aus Actinomyces hervorgegangen ist, wird sozusagen erwiesen durch die ') Farblose Bakterie, deren Kohlenstofifnahrung aus der atmospharischen Luf t herrührt. Centralbl. f. Bakteriologie, 2. Abt., Bd. 10, pag. 33, 1903. -) Folia microbiologica, Bd. i, 377, 1912. 159 Morphologie von Actinoniyces chromogenes, dessen »Mycel« sich bei schlechter Er- nahrung mit staubigen, weissen Conidien bedeckt, wodurch derselbe einem Luft- conidien erzeugenden Schimmelpilz ahnlich ist ; bei sehr reichlicher Ernahrung je- doch oidienartig auseinanderfallt und so den Eindruck eines Mycobacteriums macht. Ich glaube, dass wir noch einen Schritt weiter gehen mussen, und dass alle Mycologen wohl zugeben werden, dass die Gattung Actinoniyces selbst, ein stark reduzierter Stamm irgend einer niederen Fungusgruppe ist, was zum notwendigen Schlusse führt, dass zu der durchaus künstlichen Gattung Micrococcus im phylo- genetischen Sinne tief reduzierte höhere Fungi gehören, wahrend, wie oben bemerkt, gegenwartig dazu auch zu ganz anderen Verwandtschaftsgruppen gehörige, wirkliche Bacteriën gebracht werden. Eben das Reich der niederen Pilze ist offenbar ein Gebiet, wo die Erscheinung der Mutation, durch Verlust von Merkmalen, in grossem Maasstabe im Laufe der Zeiten zur Bildung neuer Arten Veranlassung gegeben hat. Zu gleicher Zeit sehen wir dort jedoch andere Formen der Variabilitat wirksam, welche zur Vervollkomm- imng schon existierender oder zur Entstehung neuer Merkmale und neuer Genen geführt haben. So mussen die Genen der Lacmusbildung von Actinococcus cyaneiis wohl durch eine langsame Umbildung der entsprechenden Genen von Actinoniyces coelicolor oder einem anderen gemeinsamen Urahn entstanden sein. Figurenerklarung. Fig. I (So). Koloniën von Actinococcus cyaneus auf Bouillonagar. Die kleineren mit MïcrococcMJschnuren als Auslaufer. Fig. 2 (looo). Actinococcus cyaneus auf Bouillonagar. Fig. 3 (looo). Bacteridienzustand von y^c^mocofcji.? cyöM(?!« auf Mannit-Malat-Pepton-Agar. Fig. 4 (looo). Bacteridienzustand von Actinococcus cyaneus auf Malzwürzeagar mutiert, und Saure erzeugend. Inhalt. 1. Micrococcus cyaneus in der Literatur. 2. Der Actinomyceten -Yersuch. 3 Pigmentbildung. 4. Mutation. 5. Actinoniyces (Streptothrix) coelicolor Reiner Muller. 6. Verwandtschaft. Aufstellung der Gattung Actinococcus. M. W. BEITERINCK. Schröter und Cohn's Lakmusmicrococcus. Fig. I (50). Koloniën von Actinococcus cyaneiis. Fig 2 (1000). Actinococcus cycniens auf Bouillonagar. Fig. 3 (1000). Actinococcus cyaneus auf Mannitagar. Folia Microbiologica II. l'is- 4- (1000). Actinococcus cyaneus, saurebildcnd auf Malzagar. Ueber die Selbstgarung bei der Alkoholhefe. Livre Jubilaire VAN LAER, 1913, S. 128—136. Die Erscheinung, dass Hefe, welche sich selbst überlassen ist, gleichgültig ob mit Wasser vermischt oder nicht, eine gewisse Menge Alkohol und Kohlen- saure entwickelt, war schon Liebig bekannt, und wurde von Pasteur in 1860 ctwas naher untersucht. Seitdem sind mehrere Autoren darauf zurückgekommen, und gegenwartig wird allgemein angenommen, dass dabei das von dem zu früh gestorbenen, grossen bel- gischen Forscher, Leo E r r e r a, in 1882 in der Pilzzelle entdeckte Glycogen an- gegriffen wird und die Menge des gebildeten Alkohols dem verschwundenen Gly- cogen quantitativ entspricht. Dabei soll das allerdings nicht abgesonderte Enzym Glycogenase aus dem Glycogen Zucker, — wahrscheinlich Glukose, — erzeugen, welcher Zucker dann weiter vergoren wird. Jedenfalls muss der Vorgang ziemlich compliziert sein. Sollte, was nicht un- möglich erscheint, aus dem Glycogen kein Glukose, sondern Maltose entstehen, so müsste noch ein weiteres Enzym, die Malto-glukase, in Betracht gezogen werden. Die Pombehefe, Schizosaccharomyces pombe, welche übrigens der Presshefe sehr ahnlich ist, zeigt, in Übereinstimmung mit dem Mangel an Glycogen, keine Selbstgarung. Was die biologische Bedeutung der Selbstgarung betrifft, wünsche ich schon hier hervorzuheben, dass diese aus dem Umstande erklart werden muss, dass der \''organg ausgelöst wird durch alle als für die Hefe schadlich erkannten Einflüsse, welche jedoch nicht genügend stark einwirken, um den Tod der Zelle zu verur- sachen. I. Die Menge des Glycogens, welches bei der Selbstgarung verschwindet. — Die auf chemischem Wege in den Hefen gefundenen Glycogenmengen werden, je nach der Bereitungsmethode, so verschieden angegeben, dass es für unseren Zweck nicht lohnt, dabei zu verweilen ^). Nimmt. man die durch die Selbstgarung erzeugte Alkohol- und Kohlensaure- nienge als Mass für den Glycogengehalt, so findet man bei frisch abgepresster Press- und Bierhefe bei verschiedenen Versuchen gut übereinstimmende Zahlen. Für Press- hefe ist die Zahl jedoch geringer, wie für die besseren Oberhefen. So erhielt ich aus I g. ganz frischer Presshefe höchstens 8 bis 10 cm^ Kohlensaure, aus sehr guter Oberhefe dagegen 14 bis 16 cm^. *) Die beste Studie darüber ist diejenige von G. Clautriau, Étude chimique du glycogène chez les champignorts et les levures. Mémoires de 1'Acad. royale de Belgique 1895. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. II l62 Nehmen wir an, dass i Liter Kohlensaure 2 g. wiegt, so entsprechen 16 cm'' un- gefahr 0,03 g., also 3 eg. und die Verdoppelung dieser Zahl giebt das ungefahre Mass für den entsprechenden Glycogengehalt. Da nun i g. Oberhefe höchstens 16 cm» Kohlensaure liefert, ergiebt sich als Glycogengehalt nahezu 6 Prozent. Finden wir also bei Presshefe 8 cni^ Kohlensaure pro g., so enthalt diese Hef e ungefahr 3 Prozente jenes Körpers. Wünschen wir diese Zahlen auf Trockensubstanz umzurechnen, so kann man für abgepresste Oberhefe 80% Wasser anschlagen, wesshalb man das in der Trocken- substanz vorkommende Glycogen findet, dadurch, dass die in der abgepressten Hefe nachgewiesene Menge 5 mal genommen wird, was auf 30% auskommt. Für Presshefe mit einem Wassergehalt von 75% wird nach dem Vorstehenden in der Trockensubstanz 4X3 oder 12% Glycogen gefunden. Vielleicht ware es je- doch richtiger, hierbei nicht von Glycogen, sondern von bei der Selbstgarung alkoho- lisch vergarenden Substanzen zu sprechen, denn es ist nicht ganz sicher, dass bei der Selbstgarung auch nicht kleine Mengen von anderen Körpern in Betracht kom- men. Für unseren Zweck ist das jedoch gleichgültig. Durch eine nahere Untersuchung des Vorganges der Selbstgarung bin ich zum Schlusse gekommen,. dass es eine Reihe von Bedingungen giebt, welche diesen Vor- gang auslösen können, namlich: Erstens, eine erhöhte Temperatur ; Ztveitens, lösliche Körper von der verschiedensten Art, welche den osmotischen Druck erhöhen; Drittens, Eintrocknen ; Viertens, Gifte und Desinfectionsmittel, wie Sublimat, Jod, Jodoform, Chloro- form,* Phenol, Kresol, Toluol, Sauren, Alkaliën. 2. Versitchseinriclitung. — Bevor wir zu einer gesonderten Betrachtung dieser verschiedenen auslösenden Bedingungen übergehen, mag Folgendes bezüglich der Versuchsanstellung bemerkt werden, welche übrigens auch für gewisse andere Zwecke dienlich ist, wie für eine angenaherte Triebkraftsbestimmung. Die zu verwendende Hefe wird vermittelst Koliertuch abfiltriert, durch Ab- pressen auf die gewünschte Konsistenz gebracht und dann gewogen; Presshefe wird natürlich als solche verwendet und gewogen. Es wird das Material dann mit soviel Wasser, oder der zu untersuchenden Lö- sung versetzt, dass dabei ein Teig erhalten wird, dünn genug, um, ohne Luft zurück- zuhalten, leicht in das gleich zu betrachtende Experimentierzylinderchen hineinge- presst werden zu können, jedoch auch steif genug, um die ruhig darin entstehende Kohlensaure vollstandig zurückzuhalten, kurzum wie Brotteig aufzukommen, ohne eine betriichtliche Gasmenge zu verlieren. Geschieht dieses in einem kalibrierten Messzylinder, so kann man ohne weiteres die Steighöhe des Teiges und damit die Kohlensauremenge, ablesen. Dieser Messzylinder (Fig. i) besteht aus dem kleinen Füllzylinder A C B, wor- auf das kalibrierte Messzylinderstück CAD, vermittelst des Schliffes A C genau passt. Der Füllzylinder wird mit dem Hefeteige bis zum Rande angefüllt, wodurch man eine sehr genau bekannte Menge als Ausgangsmaterial bekommt. Das Glas i63 wird nuu in ein Wasserbad von bekannter Temperatur gestellt und nach bestimmten Zeitintervallen wird der Anstieg abgelesen. Man kann natürlich anstatt dieses Apparates auch Reagentienröhren verwen- den, worin man dann am besten die Hefe einfallen lasst, nachdem man damit ein kleines Glasröhrchen angefüllt hat, welches nahezu in die Eprouvette hineinpasst. Betrachten wir nun die verschiedenen schon genannten Einflüsse, welche die Selbstgarung auslösen können. Zunachst also die Temperatur. Fig. 1. Selbstgarungszylinder. A C B = Messzylinder, A C = Schliff. Ist wirklich höher wie hier angegeben. Fig. 2. Beziehung der Selbstgarung der Presshef e zur Temperatur. Die Or- dinaten sind die Kohlensauremengen. die Abcissen die Temperaturen. 3. Einflitss der Temperatur auf die Selbstgarung. — Wir füllen das Messzylin- derchen mit einem Hefeteige von 2 Teilen Hefe und i Teil Wasser und stellen den Apparat in ein Wasserbad bestimmter Temperatur. Dabei stellt sich heraus, dass die Selbstgarung bei der Presshef e selbst noch bei 30" C. sehr langsam verlauft, j edoch bei der Temperatursteigerung schnell in Intensitat zunimmt, um bei 48 — 49" C. éine optimale Schnelligkeit zu erreichen, wobei die ganze Glycogenmenge schon in ganz wenigen, namlich 3 bis 5 Stunden, verschwinden kann. Diese Zeit verlangert sich sowohl unterhalb, wie oberhalb der Optimaltemperatur, so dass z. B. bei circa 40° pro Minute ebensoviel Kohlensaure entsteht wie bei óo" C etc. Bei 65" ist der Vorgang kaum mehr merkbar. Für Bierhefe liegt das Temperaturoptimum niedriger und es ergiebt sich dar- aus ein sehr einfaches Mittel, um Press- und Bierhefe voneinander zu unterscheiden. Obschon dieser einfache, jedoch sehr bemerkenswerte Versuch zu einer Reihe theoretischer Betrachtungen Veranlassung giebt, scheint es mir besser, diese zurück- zuhalten, weil die eigentlichen Grundlagen derselben noch ungenügend bekannt sind. 4. Eiufluss der Konzentration von Sahen und anderen gelösten indifferenten Stoffen. — Betrachten wir nun die zweite der die Selbstgarung auslösenden Ur- sachen genauer, namlich den Einfluss von Lösungen von Salzen und anderen in- diiïerenten Stoffen. *64 Eine genaue Messung der Beziehung zwischen Salzkonzentration und Intensi- tat der Selbstgarung ist schwierig, jedoch stellt sich mit Sicherheit heraus, dass diese Beziehung eine ahnliche ist wie zur Temperatur. Um dieses zu beobachten, inuss man bei einer so niederen Temperatur arbeiten, dass dadurch allein gar keine deutliche Selbstgarung verursacht werden kann, nam- lich bei 28° C Es stellt sich dann heraus, dass jede Salzmenge bis zu einer bestimm- ten Grenze, gleichgültig von welchem Salze, wenn nur nicht giftig, einen die Selbst- garung begünstigenden Efifekt hat, und weiter, dass auch hier die Beziehung zwischen Intensitat des Vorganges und Salzmenge durch eine Kurve dargestellt wird, welche ein Optitnum hat. Dieses Optimum liegt für Kochsalz nicht weit von 5%, also bei 4vahezu molarcr Konzentration (5,8%), jedoch, wie es scheint, nicht unbetrachtlich darunter, und auch hier giebt es eine höhere und n iedere Konzentration, welche zu gleicher Intensitatsvermehrung veranlassen, z. B. 2 bis 3 und 6 bis 8%. Vergleicht man damit den Einfluss anderer Salze und indifferenter Stoffe, so stellt sich heraus, dass isosmotische Lösungen der verschiedensten, nicht giftigen Körper, dabei nahezu entsprechende Wirkungen haben. Das lasst sich am besten feststellen, wenn man diej enigen Konzentrationen bestimmt, welche das Optimum der Selbstgarungsintensitat in gleichen Zeiten auslösen, wobei sich herausstellt, dass da- heï als Aequtvalent zu betrachten sind z. B., 6 — 8% Kaliumsulfat, 15 — 25% Na2S04+ 10 H2O, 4—6% Kochsalz, 4—8 CIK, 10—15 CaClo + ÓHoO, 4—5 KNO,, 4 — 8 (NH4)gS04. 4 — 8 Na-acetat, bei einer Untersuchungszeit von i bis 5 Stun- den. Bei kürzeren Zeiten kann man diese Grenzen etwas genauer bestimmen, wie bei langeren, doch fallen die dabei gefundenen optimalen Conzentrationen nicht mehr genau zusammen mit den bei langeren Versuchszeiten erhaltenen, und zwar derweise, dass die Optima sich bei der Zeitkürzung nach den Seiten der höheren Conzen- trationen verschieben. Andere Salze, wie Bariumchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Natriumthiosulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumtartrat haben eine ahnliche Wir- kung, wie die genannten. Von iiicht jonisierten Substanzen nenne ich noch Alannit, dessen optimale W'irkung bei 13 bis 15% liegt. Beim Alkohol wirkt eine Conzentration von 4 bis 0% nur sehr wenig beschleunigend, was auf das Eindringen dieses Körpers in die Hefezelle hinweist. Bei 15 bis 20% ist die Wirkung jedoch viel kraftiger. Ureum und Glycerin wirken selbst bei hoher Conzentration schwacher, wie eine isosmotische Mannitlösung, und auch diese Körper dringen bekanntlich leicht in die Zelle hinein. Man itm.s.', bei allen diesen Versuchen die Temperatur scharf in Be- tracht ziehen, denn es ist klar, dass man dabei immer mit einem Summationseffect zu schaften hat, wobei es richtig ist, die Temperatur auf ein Minimum zu redu- zieren, wie das übrigens bei 28" C. genügend der Fall ist, weil dabei die infolge der VViirme gebildete Kohlensaure gegenüber der durch die Wirkung des gelösten Kör- fers gebildeten Menge vernachlassigt werden kann. 5. Einfluss des Eintrocknens. — Sehr bemerkenswert ist der Umstand, dass trockene Hefe. sowohl die im Laboratorium dargestellte, wie die von Sc h roder zu Mnncheii -rkaufte Unterhefe, und die von der Fabrik zu Wandsbeck bei Ham- i65 burg gelieferte conservierte Presshefe ^), beim Vermischen mit Wassci bei allen Temperaturen, auch unterhalb 28° C, in eine kraftige Selbstgarung kommt, gerade als ob man eine Salzlösung zugefügt hatte. Nach meiner Meinung ist letzterer Ver- gleich auch wirklich richtig. Wenn namlich die Hefe getrocknet wird, so mussen sich darin die in der Zelle in gelöstem Zustande verkommenden Inhaltskörper sehr betrachtlich conzentrieren und demnach ahnlich wirken, wie wir das von den gelösten Stofïen überhaupt schon gesehen haben. Beispielsweise muss dieses zutreffen für das Kaliumphosphat, welches in der trocknen Hefe in nicht unbetrachtlicher Menge an- gehauft ist. Bekanntlich erhah, die durch Trocknen und Selbstgaren vorbereitelo Hefe, die weitere merkwürdige Eigenschaft, beim Extrahieren die Zymase durch die Zellwand nach aussen diffundieren zu lassen. & /:posed to sunlight '). The supposition that secretion products of the parasitic caterpillar or the Fun- gus could be the direct cause of the stimulus, is contrary to the positively existing relation between mechanical wounding and gummosis. Glim caiials iii the fniitflesh of ahiwnd and peaclialmond. To the preceding facts, long since stated, I wish to add the following. Already in my first paper of 1883 I called attention to the circumstance, that in the fruit-flesh of the peachalmond, and as I may add now, a'so in that of the almond itself, there is a systeni of gum canals, precisely corresponding to that of the vascular bundels. Of these the phloem bundies are converted into gum canals by cytolysis, either entirely or with the exception of the outer protophloem; the gum canal ( gp Fig. 2 and 3) thus, is a'ways immediately contiguous to the woody hundle xl. The presence of gum in the canals of the fruit is easily shown. In August or September the summit of a peachalmond fruit is cut of¥ and the fruit, or the branch with the fruit, is placed in water. Af ter some moments all over the section droplets of gum are seen evidently issuing from the vascular bundies. As these bundies are (listributed through the fruit-flesh, running longitudinally and transversely, and are partly reticulated, the number of droplets is very great and they are of different size. In particular near the stone they are big. If in August the gum is allowed to flow out in cold water it dissolves completely or nearly so. In September the dissolving is no more complete. By drying the gum, its sohibility in cold water gets almost lost, but it continues in hot water. From lateral incisions also much gum flows out. In Fig. i the drops are repre- sented after drying, foliowed by swelling up in cold water. Although this gum does not only consist of dissolved wall material but also of cell contents, the microscope can only detect fine granules, evidently correspon- ding to the microsomes of the protoplasm, which are not dissolved during the cyto- lysis I could not find back the cell nuclei in the gum, but in the cells of the not yet cytolised phloem bundies, they are neither perceptible. As under normal circum- stances the gum does not flow out, its volume must be about as great as that of the phloem bundies which are cytolised. It is, however, certain that the capability of ihe gum to swell up by imbibition is much greater than that of the cell-tissue which gave rise to its formation. It seems thus certain that imbibition with sufficiënt access *) The apperancc of anthocyan in the light is commonK' a token of diminishcd vitality and often a consequence of necrobiose in the adjoining cells. Hence, wounds, poisons and parasitism cause anthocyan production in the most different plants. 174 of water must lead to a perceptible pressure and also some thickening of the fruit- wall. This must promote the opening of the fruit as well as the remarkable de- taching of the stone, although the required mechanical power for these processes must, no doubt, chiefly be the tension of the tissue of the parenchyma of the fruit- wall existing independently of the gummosis. Finally the stone is found quite loose within the fleshy shell, which mostly opens like a bivalvate moUusk, but sometimes shows three or four fractures. The vascular bundies, which pass from the fruit- Fig. 2 (3). Gum canals in the transverse sectionof thefruit- flesh of a peachalmond: ha hairs on epidermis; Jiw der- moidal tissue; &/)chlorophyll- parenchyma; xl xylem bund- ies; ph phloem bundies; gp gum canals sprung from phloem bundies. Fig. 2 and 3 are reproductions from my above mentioned treatises of 1883 and 1886. ^ lm f^esh into the stone, are thereby torn ofï clear from the stone. At the base the separation seems provided for by an intercepting layer, as at the fall of leaves. The portion of the phloem bundies within the stone of the peachalmond is never converted into gum; in the almond itself such gum is found in rare cases inside the shell. Woiiiid gum hl tlic friiit-ivall as a conseqnence of mechanical stress of the tissue. Gumniing aJmotids. In many cases real wuund gum is found in the fruits of the almond and the peachalmond, not proceeding from the gum canals but from fractures in the paren- chyma of the fruit-flesh. lts origin must undoubtedly be sought in the tension or stress of the tissue, which causes the openinig of the fruit. An additional circum- stance, however, is required, namely a loss of vital strength, by which the regenera- tive power of the tissue that coats the fracture is annihilated. The thereform resul- ting incapability of regeneration is associated with the ripening of the fruit in a way not yet explained and should rather be attributed to superfluous than to poor nutrition. Parasitism is wholly absent in the production of wound gum from the parenchyma of the fruit. 175 The fracture is niostly at the side where the two edges of the carpels are grown together and the fruit later opens. Not seldom in this case is wound gum seen to flow spontaneously from the base of the fruit along the short peduncle. In other cases the wound is at the side of the middie nerve of the carpel. Always the edges of the fracture are coated with cells in a condition of necrobiose, which is evident by their quickly colouring brown at the air, which normal living cells do not. These necrobiotic cells and -the adjoining tissue produce gum. With the microscope not quite dissolved cellwalls may be found in the gum, showing that the cells were about full- grown when the process began. Fig. 3 (360). Gum canal with surrounding; gp gum; xl xylum bundies, unchangeds/j/i non-dissolved cells of the phloem bundies; cd threadshaped cells in a gum canal, originating from the phloem bundies. In common almonds gum is sometimes found within the hard shell^), and even- tually part of the kernel itself is then also changed into real wound gum with still recognisable remains of the cellwall. In such almonds the phloem of the vascular bundies, which run through the stone to the funiculus, is always changed into a gum canal, so that the gum can reach the surface of the young seed. If we suppose that gummosis originates by the action of a cytolysine, it seems very well possible, that the lysine which has flowed inward together with the »canal gum«, is able to attack the developing seed and is yet too labile to be demonstrated by infection of bark wounds with gum. Experiments in this direction may perhaps be effected with the peachalmond. Wound stiiiniliis as factor of developnient. Formerly I thought that the presence of gum canals in the fruits was accidental and should be explained by parasitism, although I could not find any parasites. O The small quantity of gum found, especially in »hard almonds«, at the surface of the shell, proceeds from the gum canals of the fruit-flesh. The sugar layer which covers the shell of the »soft« species is dextrose. 176 In later years, with better knowledge, I again examined the gum canals in the pcachalmond and their surroundings repeatedly. Never did I find a fruit without them, but they were not equally developed in different trees from different gardens. In specimens of sandy grounds they can sometimes only be found with the micro- scope. Neither microscopically nor by experiments has it been possible to detect gum parasites. This makes it quite certain that in the formation of gum canals parasitism is excluded^). The great ease wherewith mechanical tension causes wounds in the fruit-flesh of the peachalmond, gives rise to the supposition, that the normal gum canals may be the product of some bidden wound stimulus. If this supposition is true, we cannot think of wounding in the common sense of the word. When the fiowers fall off, a ring-shaped wound forms around the base of the young fruit, but this is a normal process, taking place in an intercepting iayer and soon foliowed by complete healing. In the flowers of peach, plum, apricot, cherry, we observe the same without any formation of gum canals in the fruit-flesh. Moreover, although the peculiar structure of the Iayer between the woody peduncle and the stone, along which the ripe fruit detaches, reminds of rent tissue, no gum is formed at that spot and the Iayer also exists in the other stone-fruits, where no gum canals occur. So long as nothing else has been proved it must therefore be accepted that in the phloem bundies of the fruit of the peachalmond, where cytolysis takes place, the same factor of development is active as that, which gives rise to the pathological gum canals in the cambium of the branches. This leads to the conclusion, that the wound stimulus belongs to the normal factors of development of this fruit, although nothing is seen of external wounds. When considering, that the phloem bundies are built up of extremely thin and soft-walled cells, it is conceivable, that by great tension of the tissue in the surrounding parenchyma, they undergo strain and pres- sure causing mechanical rupture and necrobiose, centre and prey of the wound stimulus being the phloem bundies themselves. This conception is in accordance with the fact that the sfum canals are broad in the fruits of well-fed trees on rich grounds, which have a hard and solid flesh, wherein stress and strain are certainly very great. Only here and there remains of the protophloem along the gum canals are still to be found in such fruits. But in the softer fruits of sandy soils, along the much narrower gum canals not only the protophloem is still present, but also stripes of the secondary phloem. Summarising we come to the foUowing conclusions. Mechanical wounds in growing tissues of Amygdalaceae will sometimes heal directly, sometimes after previous gummosis. The chief tissue, which is transformed into gum is the young secondary wood newly sprung from the cambium and not yet dift'erentiated. By the wound stimulus a network of gum canals is formed around the wound. In thick branches, with a ') The supposition, sometimes met with in literature that the gum of the Amyg- dalaceae should consist of bacterial slime is quite erroneous. That parasilic bacteria eventually occur as gum parasites, as is stated by some authors, I do not think impos- sible, although till now I only found caterpillars and Fnngi as active agcnts. 177 bark wound, this network has au elliptical circumference, the wound being in the lower focus of the ellipse. If the stimulus is removed by the cure of the wound, the cambium again con- tinues to produce normal secondary wood, so that afterwards the gum canals may be found in the wood itself. If the stimulus continues the gum formation also becomes lasting. The stimulus issues from the cells that die slowly by wounding, poisoning or parasitism. Probably a cytolysine flows these cells into the young wood or the pro- cambium; these bind the lysine and liquefy to gum. Hence, gummosis is caused by necrobiose. Young medullary rays and phloembundles are with more difficulty converted into gum than the young secondary wood. But in the fruit-flesh of the almond and the peachalmond it is the phloem which changes into gum. The protophloem of the bundies often remains unchanged. Although gummosis in these fruits belongs to their normal development, a wound stimulus is nevertheless active. This stimulus springs from the strong tension in the parenchyma of the fruit-wall^ which gives rise to tearing, necrobiose and gum formation in the delicate tissue of the phloem bundies. Consequently the wound stimulus is here a normal factor of development. It might also be said that the almond and the peachalmond are pathological species, but thereby nothing would be explained. M. \V. Deijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. Ueber das Nitratferment und über physio- logische Artbildung. Folia Microbiologica, Delft, III. Jahrgang, 1914, S. 91 — 113. — Verscheen onder den titel »Over het nitraatferment en over physiologische soortvorming« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXII, 1914, biz. 1163 — 1170. I. Allgemeine Bemerkungen. Es ist eine wohlbekannte Tatsache, dass sowohl im Boden wie in Kulturflüssig- keiten, voorin sehr viele Individuen des Nitratfermentes vorkommen, relativ grosse Mengen organischer Körper gegenwartig sein können, ohne die Nitration, das ist die Oxydation von Nitriten, zu storen ^). Anderseits bemerkt man bei denjenigen Nitratationsversuchen, wobei das Nitratferment nur in einer geringen Anzahl von Individuen vorkommt, und also um eine deutliche Wirkung auszuüben zunachst wachsen und sich vermehren muüs, dass schon sehr geringe Quantitaten der verschiedenartigsten organischen Stofïe die Versuche zum Misslingen bringen und alles Nitrit unverandert im Kulturmedium verbleibt. Zur Erklarung dieser Erscheinungen wird angenommen, dass das Nitratferment nur dann wachsen und sich vermehren kann, wenn im Nahrmedium wasserlösliche organische Stofïe vöUig oder beinahe völlig fehlen, wahrend es, einmal ausgebildet, von einer relativ grossen Menge organischer Substanz wenig beeinfiusst wird und die Nitratation fortsetzt. Eigene Untersuchungen haben mich zu einer ganz anderen Auffassung gebracht, njimlich diese, dass das Nitratferment eben mit grosser Leichtigkeit von allerlei or- ganischen Körpern leben und sich vermehren kann, dabei jedoch, das ist beiiii Wachstum auf Kosten organischer Nahrung, das Vermogen Nitrite zu Nitraten zu oxydieren sehr bald völlig verliert, wobei es sich in eine scheinbar gewöhnliche saprophytische Bakterie umwandelt. Diese bei der Assimilation der organischen Substanz stattfindende Umwandlung kann physiologische Artbildung, die beiden Formen, worin das Nitratferment dem- zufolge vorkommt, können als oligotropJier und polytropher Zustand desselben be- zeichnet werden. Ferner hat sich herausgestellt, dass dem polytrophen Zustand in den Labora- toriumsversuchen, wobei diese Form, bei Abwesenheit organischer Stofïe, mit einer ') lm Folgenden setze ich voraus, dass der Leser mit Winogradsky's Unter- suchungen über die Nitriiikation (Handbuch der Technischcn Mykologie, Bd. 3, pag. 132, Jena 1904, wo man auch die Literatur findet) bekannt ist. Doch muss ich einige von ihm schon bcriihrte Fragen von meinem Standpunktc aus aufs neue behandeln. 179 verdünnten Nitritlösung iu Berührung bleibt, das Vermogen Nitrite zu oxydieren nicht zurückgegeben werden kann, selbst nicht in zehn Jahren. Wird also in Flüssigkeiten, worin viel assimilirbare organische Substanz vor- kommt, dennoch Nitratation beobachtet, so muss diese Substanz vorher auf irgend eine Weise verbraucht sein. Bezüglich des Nitratationsvorganges im Ackerboden muss daraus Folgendes ge- schlossen werden. Bei Gegenwart von viel organischer Substanz im Boden, wird diese nicht allein von anderen Mikrobenarten oxydiert werden mussen, um die Arbeit der Nitratkeime zu ermöglichen, jedoch wird diese Vernichtung auch stattfinden können durch einen Teil der Nitratfermente selbst, welche dabei allerdings als solche verloren gehen, weil sie sich in die polytrophe Form umwandeln, aber im Boden werden immer Stellen vorkommen, wo keine oder nur Spuren von gelösten organischen Substanzen Aorkommen und unveranderte, oligotrophe Nitratkeime sich vermehren und ihre Um- gebung nach Vernichtung des Organischen, wieder mit einer neuen nitratierenden Flora bevölkern können. Wachstum und Nitratation sind getrennte Funktionen: erst, wenn das Wachs- tum beendet, setzt die Nitratation ein. Eigentlich ergiebt sich das schon daraus, dass beim Nitratferment keine Chemosynthese stattfindet. Denn ware dieses wohl der Fall, so müsste eben die Nitritoxydation Ernahrung und Wachstum ermöglichen, was jedoch nicht zutrifft. Immer bemerkt man, dass zunachst ziemlich rasch eine Bakterienvermehrung stattfindet, und, dass es die neu gebildeten Bakterien sind, welche, ohne sich zu vermehren, das Nitrit in Nitrat umwandeln. Es steht denn auch fest, dass das Nitratferment, auch in Reinkultur, Spuren von gelösten organischen Stotïen verarbeiten kann. ohne das Vermogen zur Nitratation zu verlieren. Concentrationen von ^/loo, ja von 1/20 Prozent Pepton siccum oder Natrium- azetat können unter Umstanden vertragen werden; gewöhnlich sind solche geringe Mengen jedoch schon verderblich. Der Zustand der Keime ist also nicht gleich- gültig; worin dieser Zustand aber besteht, ist nicht bekannt. In einzelnen Fallen habe ich gute Nitratationen erhalten bei der Aussaat von auf Fleischbouillongelatine erhaltenen, gemischten Koloniën, welche sich entwickelt batten aus darauf ausge- saten Nitratationen. Vielleicht handelte es sich dabei um Keime, welche infolge ihrer zufalligen Lage nicht ernahrt und nicht gewachsen waren, denn die Regel: »ohne Wachstum keine Veranderung« dürfte auch hier gelten. Die Reinkultur des Nitratfermentes im nitratierenden Zustand ist mühsam luid crfordert im ganzen einige Wochen. Zunachst wird auf bekannte Weise und in Übereinstimmung mit Winogradsky's schönem Versuche eine Rohnitratation angefertigt. Dazu wird in einem Erlenmeye r-kolben, mit einer dunnen Schicht einer Lösung von: Leitungswasser 100, Natriumnitrit 0,05 — 0,1 und Bikaliumphos- phat 0,01, infiziert mit Garten- oder Ackererde, kultiviert bei 30". Nach 10 bis 14 Tagen ist das Nitrit völlig verschwunden und das Nitratferment derweise ange- hauft, dass eine Überimpfung weniger Tropfen in eine neue Nahrlösung bei übrigens gleichen Bedingungen, jedoch in klarer Lösung, schon nach ungefahr einer Woche das Nitrit zum Verschwinden bringen kann. Bei Versuchen im Laboratorium ent- steht nun ebenfalls die für die Rohnitratationen so eigentümliche »Kahmhaut«, welche aus ein paar Bakterienarten besteht, worauf wir noch zurückkommen. In i8o Kolben, welche im Freien aufgestellt sind, entsteht diese Kahmhaut zwar ebenfalls, jedoch in viel schwacherer Ausbildung und wird erst bei genauem Zusehen bemerkt. Einen Einblick in die Mikrobenbevölkerung der nitratierenden Lösungen be- kommt man am besten durch Aussaat auf Kiesel- oder Agarplatten. Das Agar muss vorher ausgelaugt werden, um daraus die löslichen organischen Körper zu ent- fernen, und es soll nicht mehr wie ^Uo Proz. Natriumnitrit zugesetzt werden, weil an- ders das Verschwinden dieses Salzes zu spat zur Beobachtung kommt. Die Anfertigung der Kieselplatten habe ich schon in den Jahren 1896 und 1903 beschrieben ^). Gegenwartig verwende ich das getrocknete und pulverisierte Natrium- silikat des Handels, welches in 8-prozentiger, wasseriger Lösung gekocht und filtriert wird. Eine solche Lösung ist beinahe halb-normal ; 100 cc. werden also durch 50 cc. Normalsalzsaure neutralisiert. Die Erstarrung findet bei dieser Verdünnung noch langsam genug statt, um die Silikatlösung und die Saure vollstandig zu vermischen und ruhig auszugiessen in die Glasdose. Hat die Vermischung nur unvollstandig stattgefunden, so bilden sich wahrend der Erstarrung Schlieren, welche die Beobach- tung der Koloniën auf der Oberflache erschweren. Die erstarrte Platte wird durch Auslaugen mit destilliertem Wasser von Kochsalz befreit, mit der nirithaltigen Nahrlösung übergossen und, wenn die Salze hineindiffundiert sind, so lange »ge- trocknet«, bis die ausserlich anhangende Flüssigkeit entfernt ist, und schliesslich flambiert. Humatzusatz zum Wasserglas, welcher natürlich vor dem Vermischen mit der Salzsaure stattfinden muss, begunstigt einigermassen das Bakterienwachs- tum, jedoch nicht den Nitrifikationsvorgang in den Platten. Obschon die Humus- saure durch die zugesetzte Salzsaure unlöslich wird, bleibt dieselbe sehr gleich- massig kolloidal in der Kieselplatte verteilt. kann jedoch wegen ihrer Unlöslichkeit in Wasser nicht hinaus difïundieren. Durch viele spezielle Versuche wurde in meinem Laboratorium nachgewiesen, dass die gunstige Wirkung der Humate, sowohl bei der Nitrifikation wie beim Azoto- bactervizchsinm, jedenfalls der Hauptsache nach auf der katalytischen Tatigkeit der gelösten kolloidalen Kieselsaure beruht, wahrend eine gunstige Wirkung des kol- ioidalen Eisenhydroxyds in viel geringerem Maasse nachweisbar war, obschon in der Literatur eben dem letztgenannten Körper eine besonders gunstige Wirkung bei der Nitratation zugeschrieben wird. Es war darum denn auch zu erwarten, dass Humatzusatz zu den Kieselplatten sich nur wenig bemerkbar machen würde. Bei guter Vermischung des Wasserglases und der Salzsaure erhalt man Platten, welche nach der Sattigung mit der Nahrsalzlösung und nach dem »Abtrocknen« eine gleichmassig spiegelnde Oberflache besitzen, worauf selbst die kleinsten und durch- sichtigsten Bakterienkolonien erkennbar sind. Die Platten sind sehr wasserreich und enthalten 3 bis 4 Proz. Kieselsaure als Trockensubstanz. Unterhalb 3 Proz. werden sie so weich, dass sie bei der leisesten Berührung mit dem Platinfaden geschadigt werden. Gut gefertigte Kieselplatten sind fest und elastisch und geben beim An- schlag der Glasdose mit dem Finger, einen eigentümlichen Ton. Vorgreifend muss ') Centralblatt für Bakteriologie, Bd. 19, S. 259, 1896, und Centralblatt für Bakte- riologie, 2. Abt. Bd. 10, S. 38, 1903. Wie geeignet solche Platten sind für die Kultur der Diatomeen, habe ich ebenfalls daselbst nachgewiesen. Auch Grün- und Blaualgcn wachsen darauf vorzüglich. i8i ich jedoch bemerken, dass solche Kieselplatten zwar sehr geeignet sind, um eine Trennung des Nitratfermentes von den groberen Verunreinigungen vorzunehmen, weil die Nitrifikation darin leicht stattfindet, allein dass es ausserordentlich schwierig ist, wirklich reine Koloniën des Nitratfermentes von den Kieselplatten zu bekommen ; beinahe jede Kolonie ergiebt sich namlich als eine Mischkolonie, so dass man wohl annehmen muss, dass die Einzelkeime des Nitratfermentes viel schwieriger zur Ent- wicklung kommen, wie die mit anderen Keimen verklebten. Welche diese Sym- bionten sind, werden wir bald sehen. Die Reinkultur geschieht viel leichter durch die Verwendung von Nitritagarplatten, obschon man darin die Nitrifikation erst spater beobachtet. Offenbar sind die im Agar gegenwartigen Spuren von löslichen organischen Substanzen für die erste Entwicklung des Nitratfermentes gunstig. Für die Untersuchung der Nitritfermente, welche die Ammonsalze oxydieren, und die noch viel empfindlicher sind für geloste organische Stoffe wie das Nitrat- ferment, können richtig angefertigte Kieselplatten sehr nützlich werden, und bei einer anderen Gelegenheit hoffe ich darauf noch zurückzukommen. 2. Flora der Rohnitratationen. Ebenso wie in der Natur sind die Rohnitrifikationen in den Laboratoriumsflüssig- keiten essentiell symbiotische Vorgange. Die Reinkulturen geben in keiner Beziehung bessere Erfolge wie die Rohanhaufungen, können denselben jedoch bei guter Aus- führung gleichkommen. Vergleicht man diesen Umstand mit den wundervollen Re- sultaten, welche man mit Reinkulturen z. B. von Leucht- und Pigmentbakterien er- halten kann, deren Rohkulturen wertlos sind, so sieht man, dass der Unterschied von prinzipieller Bedeutung ist. Obschon die Jiusserlich sichtbaren Eigenschaften, sowohl der Rohnitrifikationen von Ammonsalzen, wie die der rohen nitratierenden Kuituren, ungemein charakteri- stisch sind, habe ich davon nirgends eine Beschreibung gefunden, was umso auf- falliger ist, als es sich dabei handelt um eine Frage, welche von der grössten prak- tischen Bedeutung ist für die Landwirtschaft, und von nicht geringerer theoretischen Wichtigkeit durch die damit in Verbindung stehenden Probleme der Chemosynthese und der physiologischen Artbildung. Wenn auch die für Nitratation bestimmten Nahrsalzlösungen frei oder nahezu frei von löslichen organischen Körpern sein mussen, so sind doch die in verwesenen Bodenproben gegenwartigen organischen Stoffe der Nitratation nicht ungünstig. l^nd wenn auch kraftig nitratierende Flüssigkeiten ganzlich klar und durchsichtig sein, und unter Umstanden, z. B. bei der Verwendung von Reinkulturen, auch blei- ben können, so braucht dieses bei den Rohnitratationen (sowie bei den Rohnitrifika- tionen aus Ammonsalzen) jedoch gar nicht der Fall zu sein: dieselben überdecken sich im Laboratorium schnell, im Grünhause und im Preien langsamer, mit der durchaus eigentümlichen, ausserlich wie »Bierkahm« aussehenden Haut, welche ich schon im Jahre 1903 beschrieben habe, ohne damals das Nitratferment selbst noch genügend zu kennen ^). Seitdem sind meine Kenntnisse der hierbei waltenden Wachstumsvorgange und Bedingungen viel verbessert. ') Farblose Baktericn, deren Kohlenstoff aus der atmospharischen Luft lierrührt. Centralbl. f. Bakteriologie, 2. Abt. Bd. 10, pag. 38, 1903. In dieser Abhandlnng steht: paiicitrophus, lies: paulotrophus. l82 Die treibende Haut enthalt gewöhnlich zahlreiche Keime des Nitratfermentes und kann dann mit einigem Rechte als »Nitratmutter« bezeichnet werden. Der Hauptsache nach besteht dieselbe jedoch aus zwei nicht nitrifizierenden Arten, welche ich damals Bacillus oligocarbophilus und Actinomyces (Strephtothrix) paulotrophiis genannt habe, ohne ihre Verwandtschaft richtig zu verstehen. Seitdem erkannte ich aber, dass B. oligocarbophilus ein echter Actinomycet ist und der von N e u m a n n und Lehmann aufgestellten Gattung Mycobacterium zwar nahe steht, davon je- doch generisch getrennt werden muss^). Ich schlage darum vor, diese wichtige Art als Actinobacillus oligocarbophilus zu bezeichnen, und bringe auch die zweite ge- nannte Form zu derselben Gattung als Actinobacillus paulotrophus-). Echte Actinotnyces-arten, wie besonders A. robur K r a i n s k y ") und A. griseus K r y , finden sich in der treibenden Haut ebenfalls, jedoch in viel geringerer An- zahl und nur dann, wenn die Kuituren lange aufbewahrt werden. A. diastaticits K r y und A. cellulosae K r y wurden bisweilen auch aufgefunden, jedoch in noch geringerer Anzahl. Diese Actinomyces-avten gehören nicht zu der Normalflora der Rohnitrifikationen, obschon sie dem Vorgang nicht ungünstig sind. Wie ich das früher (1. c.) gezeigt habe, leben alle diese haut-bewohnenden Mi- kroben von den organischen Stoffen, welche sich in merklichen Mengen in der La- boratoriumsluft und gewiss auch in der Bodenluft vorfinden. Diese Stoffe sind in der freien Aussenluft sowie in den Grünhausern, wie ich durch viele spezielle Ver- suche festgestellt habe, nur in einer sehr viel geringeren Menge gegenwartig, ob- schon sie auch darin, niemals ganzlich fehlen. Versucht man die verschiedenen haut-bewohnenden Arten auf bessere Kultur- böden, z. B. auf Bouillongelatine, zu kultivieren, so stösst man dabei auf Schwierig- keiten. Actinobacillus oligocarbophilus wird dabei zunachst unkenntlich, indem die Koloniën das »Kahmmerkmal« verlieren, was sie auf einem armen Kulturboden je- doch wieder zurückbekommen. Actinobacillus paulotrophiis konnte ich auf bessere Kulturboden überhaupt nicht kultivieren. Die echten Actinoniyces-a.rten wachsen auf solchen Boden, wenn einmal in Reinkultur, nicht schlecht, viel besser jedoch auf festen Boden mit verdünnter Nahrung, wofür übrigens die verschiedensten organi- schen Stoffe geeignet sind. Wenn in den nitratierenden Nahrlösungen das Xitrit völlig in Nitrat umge- wandelt ist, hort das Wachstum der Actinobacillus-haiUt nicht auf, sondern geht un- gestört fort. Offenbar steht die Nitritoxydation nicht in direkter Beziehung zu diesem Wachstum^). Auch in den vollstandigen Nitrifikationen mit Ammoiisalzen, kann die Haut- bildung auf die gleiche Weise stattfinden, wie in den Nitratationen. Dabei beobachtet ') Bakteriologische Diagnostik, i. Aufl., 1899, 5. Aufl. pag. 582, 1912. -) Vor kurzem (Folia Microbiologica, Bd. 2, pag. 196, 1914) habe ich noch eine weitere Actinomycetengattung aufgestellt, namlich Actinococcus, welche bis dahin zu Micrococcus gerechnet war. *) A. Krainsky, Die Aktinomyceten und ihre Bedeutung in der Natur. Centralbl. f. Bakteriologie, 2. Abt., Bd. 41, pag. 649, 1914. *) Ob dasNitratferment selbst auch noch wachsen und sich vermehren kann, nachdem die Nitrite völlig oxydiert sind, ohne dabei dieses Oxydationsvermögen zu verlieren, konnte ich trotz vieler Versuche noch nicht einwandfrei feststellen. Weil die Frage offenbar eine interessante ist, hoffe ich spater die definitive Antwort geben zu können. i83 man aber die folgendc wichtige Erscheinung: beim Uberimpfeh der Nitritphase, ehe darin Nitratbildung stattfindet, ist schon bei ein oder zwei Wiederholungen die Hautbildung vollstandig beseitigt, so dass weder Act. olgiocarbophilus noch Act. paulotrophus aus solchen stark Nitrit erzeugenden Lösungen überhaupt mehr zur Entwicklung zu bringen sind. Dieses ist desshalb so bemerkenswert, weil das Ver- schwinden der genannten Arten aus den Kuituren begleitet ist von dem Verschwin- den des Nitratfermentes selbst. Die Gegenwart selbst vereinzelter Keime des Nitrat- fermentes lasst sich nachweisen durch Aussaat auf Agarplatten, worin ^/oo Proz. Pepton. Das Ferment erscheint darauf in der polytrophen, sehr charakteristischen Form. Die Beseitigung des Nitratfermentes aus den Rohnitrifikationen z. B. von Ammonsulfat geschieht am schnellsten, wenn man der Lösung keine Kreide oder Magnesiumcarbonat zusetzt. Es ist also leicht, zwei Arten von Rohnitrifikationen der Ammonsalze beim ersten Blicke zu unterscheiden, namlich erstens, Nitrifika- tionen, welche kein Nitrat bilden und an ihrer Oberflache klar bleiben, und zweitens vollstandige Nitrifikationen, welche neben Nitritferment auch Nitratferment enthal- ten und sich an ihrer Oberflache gewöhnlich (aber nicht notwendig) mit der be- schriebenen Kahmhaut bedecken. Die Erklarung dieses Umstandes beruht auf zwei Eigenschaften des Nitratfermentes, welche ebenfalls bei den Actinobacillen gefun- den werden, namlich ihre Empfindlichkeit für freie Saure und ihre, wenn auch ge- ringere Empfindlichkeit für Ammonsalze, wovon besonders die erstere ausschlag- gebend ist. Anderseits stellt sich heraus, dass die in den Nitritationen herrschende sauere Reaktion dem Nitritfermente viel weniger schadlich ist wie dem Nitratferment. Wenn also in den Rohnitrifikationen der Ammonsalze Calciumcarbonat und andere Basen in ungenügender Menge vorkommen, um alle Saure zu binden, führt dieses zum Verschwinden der Nitratflora. Verwendet man Ammonsulfat, oder besser noch Ammonmagnesiumphosphat, ohne weiteren Zusatz von Carbonaten, so kann eine weitgehende Nitritation stattfinden und wegen der sich langsam anhauf enden Saure wird die Nitratflora dabei von Anfang au unterdrückt, um schliesslich vollstandig zu verschwinden. Weil die Hautbildung auf den nitrifizierenden Flüssigkeiten in der Aussenlutt sowie im Grünhause nur schwach ist, muss man, um die beschriebenen Verhaltnisse unter diesen Umstanden zu beobachten, scharfer zusehen als wenn der Versuch in der Laboratoriumsluft stattfindet. Niemals habe ich aber vollstandige Rohnitri- fikationen gesehen, wo die Haut der Actinobacillen ganzlich fehlte, solche lassen sich im allgemeinen nur durch partielle Reinkultur vermittelst der Plattenmethode erhal- ten, obschon sie natürlich auch zufallig bei den gewöhnlichen Rohkulturversuchen mussen entstehen können. Hat man Reinkulturen des Nitratfermentes angefertigt, so bleiben die damit stattfindenden weiteren Kuituren durchsichtig und wasserklar. Hautbildung findet darauf niemals statt, nur an der Glaswand der Gefasse ist eine sehr dunne Schleim- schicht bemerkbar, welche aus den kleinen Nitrobakterien besteht. Wie zu erwarten war, entwickeln sich in den Rohnitrifikationen massenhaft Amoeben, welche auch auf den Platten wachsen und sich dabei oft derweise ver- mehren, dass sie die Erzielung reiner Bakterienkolonien unmöglich machen, weil sie beim Herumkriechen die an ihrem Körper haftenden fremden Keime überall auf die i84 Platte bringen. Ausser der f rüher beschriebenen Amoeba nitrophila *) ist es besoii- ders eine sehr kleine und weit verbreitete Art, welche ich Amoeba nana nenne, die sich in den Nitrifikationen ansiedelt und sich daselbst massenhaft vermehrt, aut Kosten des Nitratfermentes selbst. Auf Kieselplatten habe ich mehrfach kleine Acarinen gefunden, welche sich ebenfalls mit den Nitratfermenten ernahrten. Eine merkwürdige Eigentümlichkeit speziell der Rohnitrationen, viel weniger der Rohnitratationen, ist ihre Fahigkeit, sich mit Pigmentbakterien zu bevölkern, welche zu der Familie der Actinomyceten und wahrscheinlich zur Gattung Actino- bacillus und nicht zu Mycobacterium gehören, weil sie sich durchaus nicht verzwei- gen. Dieselben sind ausgezeichnet durch braune oder rein rote Pigmente, welche am Bakterienkörper gebunden sind, so dass diese Bakterien als »chromatophore« bezeichnet werden mussen. Das rote Pigment ist sicher Carotin, denn die roten Ko- loniën farben sich in concentrierter Schwefelsaure schön indigoblau. Auch kann das Pigment leicht mit Chloroform extrahiert werden; nach Verdunstung bleibt dann das Carotin zurück, das sich mit starker Schwefelsaure wieder indigoblau farbt. Weil diese Pigmentbakterien sich auf den Nitritagarplatten auf eine ahnliche Weise ernahren wie die Actinobacillen, und aus atmospharischen Kohlenstoffverbin- dungen ihre Körpersubstanz aufbauen, lasst sich verstehen, dass ihre Koloniën die- jenigen des Nitratfermentes überwuchern und, dass es schwierig ist, dieselben von dem letzteren zu reinigen. Man kann dadurch leicht in den Irrtum verfallen, dass sie imstande sind zu nitratieren, doch ergiebt die genauere Untersuchung, dass diese Auffassung unrichtig ist. Solche mit Nitratferment infizierte Koloniën dieser eigen- tümlichen Pigmentbakterien sind aber für Nitratationsversuche, besonders auf Platten, sehr geeignet. Dabei kann es vorkommen, dass durch unbekannte Ursachen, die Pigmenterzeugung ganzlich ausbleibt, so dass diese Bakterien veranderlich sind. Dagegen ist sowohl das rote wie das braune Pigment selbst ausserordentlich stabil, sowohl im Dunkeln wie im Lichte. Platten mit diesen Pigmentkolonien habe ich im feuchten Zustande zwei Jahre lang aufbewahrt, ohne die geringste Farb- .'inderung zu bemerken. Wünscht man Reinkulturen des Nitratfermentes anzufertigen, so ist es geeignet, zunachst durch das Plattenverfahren eine vorlaufige Trennung auszuführen, wobei bei der Impfung in die zu nitratierenden Lösungen eine partielle Rohkultur erhal- ten wird, die dann spater, auf dieselbe Weise weiter zerlegt wird. Die grösste Schwierigkeit, welcher man dabei begegnet, ist die Trennung des Nitratfermentes von Bacillus nitroxus, worauf wir weiter zurückkommen werden. 3. Reinkidtur. Die mechanische Schwierigkeit der Erkennung des Nitratfermentes auf den Platten hangt damit zusammen, dass der Nachweis, ob eine Bakterienkolonie, auf einer Kulturplatte wachsend, Nitrite in Nitrate überführt, nicht direkt möglich ist. Dieses ist besonders augenfallig beim Vergleich dieser Umwandlung mit der Nitritbildung auf Platten mit Ammonsalzen, wobei jede einzelne salpeterige Saure ') Kujturversuche mit Amöbcn auf festem Substrate. Centralbl. f. Baktcriologie Bd. 19, S. 258, 1896. i85 erzeugende Kolonie sofort daran zu erkennen ist, dass sie, z. B. beim Wachstum auf einer Kieselplatte, worin fein verteiltes Ammonmagnesiumphosphat suspendiert ist, Mittelpunkt eines hellen Diffusionsfeldes in der trüben Platte wird, vvelches Feld dann noch überdies die so empfindlichen Farbenreaktionen der Nitrite geben kann'). Vergebens habe ichversucht, diesenUmstand zu beseitigen durch dieVerwendung unlöslicher Nitritsalze, deren Umwandlung in Nitrate zu löslichen Verbindungen führt, namlich das schön gelbe Kalium-Cobalt-Nitrit, Co(No 2)3-3KNOo.i }^H-'0, und das weisse Kalium-Iridium-Nitrit. Diese Salze sind aber für das Nitratferment giftig und werden nicht merklich nitratiert. Weil nun die Nitratkolonien auf den Nitritplatten morphologisch wenig charak- teristisch sind, ist man genötigt, die Einzelkolonien gesondert zu untersuchen. Bisher musste dieses durch den Nitratationsvorgang selbst geschehen, was sehr viel Zeit beansprucht. Es hat sich nun aber herausgestellt, dass die Umwandlung bei bes- serer Ernahrung des Nitratfermentes in die polytrophe Art, diese Erkennung sehr vcreinfacht. Für die Reinkultur des Nitratfermentes sind Agarkulturplatten viel geeigneter wie Kieselplatten. Es muss jedoch durch Auslaugen mit destilliertem Wasser aus dem Agar das Lösliche vorher entfernt werden, damit das Nitratationsvermögen in den Koloniën erhalten bleiben soll. Jedenfalls steht fest, dass in den Nitritagar- platten, welche nicht vollstandig ausgelaugt sind, wenn sich darauf relativ grosse Nitratfermentkolonien entwickeln, diese gar nicht mehr nitratieren, und, wenn sie klein bleiben, erst dann zu deutlicher Nitratbildung veranlassen, wenn man keine Vergrösserung derselben mehr bemerken kann. Letztere Beobachtung ist in t'ber- einstimmung mit der Auffassung, dass Wachstum und Nitratation nicht zugleicli zustandekommen, und erst die erwachsenen, sich nicht mehr vermehrenden Bak- terien die Nitratation bewirken. Weil das Nitratferment sowie die übrigen in den Rohnitrifikationen vorkom- menden Mikroben das Agar nicht angreifen, muss für die Entwicklung ihrer Ko- loniën auf der Platte ein geringer Gehalt an löslicher organischer Substanz vor- handen sein, welche Substanz den Nitratationsvorgang überhaupt erst ermöglicht '-'). Die Nitratkolonien bilden bei dichter Aussaat auf den Agarplatten (Tafel VII Fig. i) kleine Koloniën von K> — i mM. Mittellinie, welche als glasartig durch- sichtige Plattchen, selbst mit der Lupe etwas schwierig sichtbar, unter dem Mikro- skop bei 20 bis 50-maliger Vergrösserung jedoch sehr charakteristisch sind. Bei *) Die Verwendung von Ammonmagnesiumphosphat beim Plattenverfahren hat mehrere Vorzüge vor derjenigen von Ammonsulfat mit Kreide oder Magnesiumcarbonat. Ich bringe das Ammonmagnesiumphosphat auf die Oberflache der schon fertigen Kiesel- oder Agarplattc, durch Aufgiessen ciner neucn, papierdünnen Schicht Kicsel- oder Agar- lösung, worin das Salz suspendiert ist. ^) Die Agar verflüssigenden und daraus Zucker erzeugenden Gelasebakterien können in Grabenmoder vorkommen; auf dem Lande fand ich dieselben nicht. Bei deren Gegenwart kann die direkte Isolierung des Nitratfermentes im nitratierenden Zustande auf Agarplatten Schwierigkeiten bieten. Bei Anhaufung und Ueberimpfung in Nitrit- lösung verschwinden die Gelasebakterien jedoch bald. Im Schlamme des Schiffahrt- kanales zu Delft sind besonders sporenbildende Gelasebakterien haufig, wahrend die nicht sporenbildendcn Arten besonders in der Nordsee vorkommen. Doch kommen auch im Kanalschlamme nicht sporenbildende Arten dieser Gruppe vor. i86 weniger dichter Aussaat und in Impfstrichen kömien sie durch seitliche Ausbrei- tung viel grössere Dimensionen annehmen, bleiben aber immer sehr dünn. Ist der Wassergehalt des Agars relativ gering, so können die Koloniën rund bleiben ; auf wasserreicherem Agar bilden sie dagegen leicht Auslaufer, was zu mediisenartiger oder dendritischer Verzweigung der Koloniën veranlasst. Diese Verzweigungen können ausserordentlich fein werden und zugleich zu einer grossen seitlichen Ausdehnung führen, wodurch dann Koloniën von mehreren Millimetern Durchschnitt entstehen. Solche stark verzweigte Nitratkolonien wachsen leicht in die Koloniën anderer Arten hinein, was man erst bei mikroskopischer Beobachtung bemerkt (siehe die Tafel). Für die Reinkultur mussen die Koloniën auf der Oberflache gut abgetrockneter Agarplatten liegen, und in so grosser Entfernung von ihren Nachbarn, dass man über ihre Randbegrenzung nicht im Zweifel ist. Obschon in gut zubereiteten Kieselplatten die Nitratation leichter stattfindet, wie in Agarplatten, ist dennoch die Erhaltung von Reinkulturen von den erstercn schwieriger wie von Agar. Es stellt sich namlich heraus, dass bei weitem die meisten auf Kieselplatten entwickelten Nitratkolonien, obschon sie ganzlich homogen aus- sehen, Mischkolonien sind und zwar seltener mit Act. oligocarhophilus, viel öfter dagegen mit dem höchst eigentümlichen, und hi"ër sicher nicht erwarteten sporen- bildenden und denitrifizier enden Bacillus nitroxus ^). Diese letztere Art ist bei allen meinen Versuchen, — welche jedoch nur mit Gartenerde aus Delft angestellt wurden, — in den Rohnitratationen ausnahmslos in ungefahr gleicher Individuenzahl gefunden, wie das Nitratferment selbst, und hat auch bei der Verwendung von Agarplatten erhebliche Schwierigkeiten bei der Tren- nung gegeben. Wahrend langer Zeit meinte ich namlich, dass eben B. nitro.viis nitratieren konnte, was jedoch durchaus nicht der Fall ist. Ubrigens kann ich gegenwartig, nun ich den Tatbestand gut übersehe, angeben, wie man verfahren muss, um in der kürzesten Zeit das Nitratferment und B. nitroxus nebeneinander zu erkennen. Dabei muss man von der schon mehrfach genannten Eigenschaft des Nitratfermentes Verwendung machen, bei besserer or- ganischer Nahrung sich in eine gewöhnliche saprophytische Bakterie umzuwandeln, welche leicht kenntliche Eigenschaften besitzt. Weil dabei das Vermogen zur Ni- tratation völlig verloren geht, und eine rücklaufige Verwandlung bisher nicht ge- lungen ist, muss man vorher durch Versuche sich von der Richtigkeit dieser An- gabe überzeugt haben. Etwas Ahnliches gilt bei der Virulenzbeurteilung gewisser pathogener Mikroben, wobei jedoch von einer so grundsatzlichen Veranderung, wie beim Nitratferment, niemals die Rede ist. Bevor wir auf diese Unterscheidung von B. nitroxus noch etwas naher eingehen, muss die zuletzt genannte sehr wichtige Eigenschaft des Nitratfermentes genauer betrachtet werden. 4. OligotropJier tiiid polytropher Zustand des Nitratfermentes: Physiologische Arthildung. Das Hauptresultat der gegenwartigen Untersuchung ist die Erkenntnis der bei- den hier genannten Zustande des Nitratfermentes. *) Naheres über diese schwierige Art in: Bildung und Verbrauch von Stickoxydul durch Bakterien. Centralbl. f. Bakteriol. 2. Abt. Bd. 25, pag. 45, 1910. i87 Die Umwandlung' der nitratierenden oligotrophen, in die nicht nitratierende polytrophe Form, iindet, wie wir schon gesehen haben, statt bei besserer Ernahrung, nicht nur bei der Impfung auf Platten, sondern auch in Nahrlösungen. Impft man z. B. die reine nitratierende Form in Bouillon, so erhalt man schon den zweiten oder dritten Tag bei 30° C. eine sich ziemlich lebhaft entwickelnde Kultur von dunnen St'abchen und F'Aden, wovoH sich viele bewegen. Sie verzweigen sich niemals und ihre Beweglichkeit beweist, dass das Nitratferment unmöglich zur Familie der Actinomyce- ten geboren kann, welche typisch unbeweglich sind. Ich hebe dieses desshalb besonders hervor, weil der nitratierende Zustand des Fermentes niemals Bewegungs- erscheinungen zeigt, und unter den gleichen, so eigentümlichen Ernahrungsbedin- gungen lebt, welche für die Actinomyceten Actinohacillus oligocarbophilus und A. paulotrophus so charakteristisch sind. Wie man sieht, ist die in den Handbüchern vorkommende Angabe, dass das Nitratferment in Bouillon nicht wachsen kann, durchaus unrichtig: es wachst darin vorsüglich, nur geht dabei das Nitratationsvermögen verloren. Auf Bouillonagar oder auf Peptonagarplatten entwickelt das Ferment sich eben- falls ausgezeichnet. Bouillongelatine wird anfangs nicht, spater stark verflüssigt, wobei viel Ammon entsteht. Bei Gegenwart von Pepton entwickelt sich ein schwa- cher Faulnissgeruch; Pigmente oder fluorescierende Körper werden nicht erzeugt. Auf reine Gelatinplatten, das heisst Gelatin gelost in Wasser, mit oder ohne Salzen, findet kein Wachstum und keine deutliche Verflüssigung statt, obschon da- bei das Nitratationsvermögen verloren geht. Dia'stase, Tyrosinase und Glukosidenzyme werden durch das Nitratferment nicht erzeugt ; ebensowenig werden dadurch Kohlehydrate unter Gasbildung vergoren : auch Denitrifikation findet nicht statt, was allerdings zu erwarten war, weil die Stickstofïbildung aus wasseriger salpetriger Saure ein endothermischer Vorgang ist, wobei 308 Kal. absorbiert werden 1). Weil die jungen Nitratkolonien auf Bouillongelatine (Tafel VII Fig. 2 c, d), so lange sie diese nicht verflüssigen, sowie auf Peptonagarplatten sehr charakteri- stisch sind, und sich von allen anderen Arten unterscheiden durch die »trockene« und rauhe Oberflache und ihre flache Ausbreitung, muss es möglich sein, dieselben in Erdproben durch das gewöhnliche Plattenverfahren bei oberflachlicher Aussaat zu erkennen, was mir in einigen Fallen auch wirklich gelungen ist. Natürlich fehlt dabei jedoch die Controlle der Nitratation, weil nur der polytrophe, nicht nitratie- rende Zustand erhalten wird, so dass man für die Erkennung Übung haben muss. Der Versuch wird am besten ausgeführt durch Aussaat der Bodenproben auf Agar- platten, welche ^Uo Proz. Pepton siccum und weiter nichts enthalten, und vor dem Gebrauch bei einer Temperatur unterhalb 40° abgetrocknet sind, so dass kriechende Bakterienarten, besonders der Subtilisgru^^t, welche in Kulturerde allgemein sind, sich nicht allzusehr ausbreiten können. *) Ostwald giebt die Forniel: HNO2 (aq) = H 4- N + 2 O + Aq — 308 Kal. Dagegen soll die Zerlegung des Anhydrids exothermisch sein und stattfinden nach; NïOa aq = 2 N + 3 O + aq -t- 68 Kal. (W. Ostwald, Allg. Chemie, 2. Aufi. Bd. 2, Th. i, pag, 143, 1893.) Hier findet sich bei Ostwald ein Druckfehler. i88 Die Conzentration löslicher organischer Stofïe, welche die Nitratationsfunktion zum Yerschwinden bringt, kann sehr gering sein. Mengen von ^/oq Proz. Glukose, Rohrzucker, Starke, Mannit, Natrium- und Calciumazetat, Pepton, Tyrosin, Aspara- gin veranlassen mehr oder weniger starkes Wachstum und Verlust des Nitrations- \ermögens. Ist die Conzentration der gelösten organischen Substanzen noch viel geringer, verwendet man z. B. nicht ausgelaugten Agar, übrigens ohne jeden weiteren Zu- satz, so kann bei dichter Aussaat das Nitratferment anfangs wachsen und spater dennoch nitratieren, welcher letztere Vorgang, wie wir gesehen, erst anfangt, wenn die für das Wachstum verbrauchten gelösten organischen Substanzen verschwunden sind. Das kann aber Monate dauern und manche Versuche misslingen ganzlich. Ich schliesse noch aus folgendem Umstande, dass das Nitratieren auch bei den Reinkulturen erst dann beginnt, wenn die löslichen organischen Stoffe vöUig ver- schwunden sind. Die kürzeste Zeit, worin ich o,i Proz. Nitriumnitrit oxydieren konnte, war drei bis vier Tage. Dazu musste aber eine sehr grosse, von einer Kultur- platte herkünftige Bakterienmenge in eine sehr kleine Menge der Nitritlösung ge- bracht werden, und die dazu verwendeten Bakterien mussen auf der Platte, wovoii sie hergenommen werden, völlig aktiv sein. Es stellte sich nun heraus, dass so lange die Koloniën oder Impfstriche auf der Platte noch im Wachstum begriffen waren, das davon genommene Material erst nach viel langerer Zeit, z. B. nachdem es zwei bis drei Wochen in der Lösung verwedt hatte, das Nitrit völlig oxydierte, woraus hervor- geht, dass die noch in den Bakterienleibern angehauften Nahrsubstanzen zuerst auf- gebraucht werden mussen, ehe Nitratation möglich ist. Nitratation und Wachstum scheinen also unter allen Umstanden Funktionen zu sein, welche einander ausschlies- sen. Dieser Fall steht im Mikrobenleben nicht vereinzelt, doch wird er auch bei an- deren Oxydationsvorgangen beobachtet, z. B. bei der Melaninbildung aus Tyrosin durch Actiiiomyces tyrosinaticiis, welcher Vorgang nur dann kraftig stattfindet, wenn das Wachstum der Koloniën vollstandig aufhört. Wie lange eine solche Oxydation dauern kann, die offenbar stattfinden muss ohne Vernichtung, oder vielleicht richtiger, ohne Regeneration lebender Substanz, ist unbekannt. Nach Analogie mit den enzymatischen Vorgangen wird diese Zeit nicht lange sein und also auch das Nitratferment unter diesen Bedingungen seine Funktion nicht lange fortsetzen können. Es muss aber als möglich betrachtet werden, dass in der Natur, in ein und demselben Bakterienkörper, lokaüsiert an verschie- dcnen Stellen, Regeneration der bei der Oxydation verschwindenden lebenden Sub- stanz, und die durch andere Molekülgruppen dieser Substanz bewirkte Oxydation nebeneinander zustandekommen können. Vollstandig umgewandelter Dünger bringt das Nitratationsvermögen nicht zum Verschwinden. Dagegen fiihren aus Pflanzen gepresste Siifte, selbst bei starker Verdünnung, die oligotrophe in die polytrophe Form über, was unter gewissen Be- dingungen auch im Boden muss vorkommen können. Natriumhumat, selbst in grosser Conzentration in Platten oder Nitritlösungen gebracht, beeintriichtigt die Nitratation nicht. Auch Paraffinöl wird gut vertragen, obschon dadurch der Eintritt des Vor- ganges verzögert wird, vielleicht durch im Paraffinöl vorhandene Verunreinigungen. 5- Unterscheidung des Nitratfermentes von Bacil! iis nitroxus nnd Actinobacillus. Auf besseren Nahrböden wachsen das Nitratferment und Bacillus nitroxus gleich gut und geben darauf, bei 25" — 30" C. in 2 Tagen deutliche Koloniën. Ver- wendet man als Kulturboden Agar in Leitungswasser mit ^/on Proz. Pepton siccum und eine Spur Kaliumphosphat (oder auch gewöhnlichen Bouillonagar, welcher je- doch kein deutlicheres Resultat giebt), so erkennt man das Nitratferment leicht an den anfangs trockenen, wie Kahmpilz aussehenden Koloniën, welche erst nach meh- reren Tagen glanzend feucht werden. Vom Anfang an ist der Rand dieser Koloniën mehr oder weniger unrege'.massig ausgeschnitten oder gelappt, wahrend ihre Ober- ilache anfangs glatt, spater, beim Feuchtwerden, sich mit radialen Leisten oder Kippen bedeckt. Bis zum Ende bleiben die Koloniën flach und dünn und können eine sehr betrachtliche Ausdehnung erlangen. Auf Bouillongelatine sind dieselben eben- falls sehr charakteristisch durch ihre anfangs gekörnte, rohe und »trockene« Ober- flache. Spater verandert sich dieses Bild, weil dann eine starke Verflüssigung der Nahrgelatine stattfindet. Die Nitroxus-Yio\on\tn sind unter diesen Bedingungen sofort daran kenntlich, dass sie vom Anfange an als kleine, feuchte, runde, wenig abgeflachte Massen auf rlen Platten vorkommen. Sie bleiben viel kleiner wie die Nitratkolonien, und, wenn mit letzteren in Berührung, werden sie von diesen überwachsen und bedeckt, gleich wie der Nahrböden selbst. Beim langeren Aufbewahren entstehen Sporen, was beim Nitratferment nicht stattfindet. Übrigens ist das mikroskopische Bild der beiden so weit verschiedenen Arten, sehr ahnlich: iiusserst kleine meistens unbewegliche Stabchen, welchen jedoch die Fahigkeit, Schwiirmer zu bilden, nicht völlig fehlt. Auch Nitroxus verflüssigt schliesslich die Kulturgelatine sehr kraftig. Einzelre N itroxus-siRnwxïQ besitzen das Vermogen zu denitrifizieren, welche Eigenschaft hei der Überimpfung aber verloren gehen kann. Bei der Aussaat auf für Nitratation ge- cignete Boden, arm an organischer Nahrung, entwickelt Nitroxus sich zwar wenig, jedoch auf ahnliche Weise wie bei besserer Ernahrung und ist dann zwischen und in den sich seitlich viel starker ausbreitenden Nitratkolonien leicht zu erkennen. In diesem Falie können auch die früher genannten, in den Rohnitratationen so hau- figen Actinobacillus oligocarbophilus und A. paulotropus zur Entwicklung gelan- gen; dieselben sind jedoch sofort durch die schimmelartig schneeweisse Farbe ihrer Koloniën kenntlich und leicht von den glasartig durchsichtigen Nitratkolonien zu unterscheiden. Bei besserer Ernahrung ist A. oligocarbophilus eine nur langsam zu kleinen feuchten Koloniën sich entwickelnde Art, welche durchaus nicht mehr an den kahmpilzartigen oligotrophen Zustand erinnert. A. paulotrophus habe ich auf keinem einzigen guten Nahrböden zur Entwicklung bringen können. Bisher erkannte ich nur eine einzige nitratierende Art. Das mag jedoch Folge fles Umstandes sein, dass sich nur mit Boden aus dem Laboratoriumsgarten zu Delft Versuche anstellte. Weil ich aber mit gesonderten Beeten von Ton- Garten- erde, Sand und Moor arbeitete, welche erfahrungsgemiiss sehr verschiedene Mi- krobenfloren enthalten, und mit allen das gleiche Resultat erhielt, dürfte das Nitrat- ferment sehr gleichmassig sein und auch anderswo in derselben Form vorkommen wie hier. igo Die hierbei gegebenen Bilder (Fig. i und 2 Taf. VII) sollen die Unterscheidung von B. nitroxiis und dem Nitratferment erleichtern. Die übrigen für die Roh- nitratationen charakteristischen Arten sind so leicht kenntlich, dass es nicht nötig erschien, dieselben abzubilden. Es scheint mir aber nicht überflüssig, an dieser Stelle eine Recapitulation zu geben von den, in den Rohnitratationen hier in Delft stets vorkommenden Bewohnern, welche auch nach wiederholten Überimpfungen standhalten und desshalb, im Gegen- satz zu der accidentellen (wozu z. B. die so merkwürdigen roten und braunen Pigmentbakterien gehören), als »Haupt-Flora« bezeichnet werden können. Dazu gehören : Er stens, Nitrobacter oligotrophiim ► Nitrobacter polytrophum, das Nitrat- ferment selbst^). Im nitratierenden, meist unbeweglichen Zustand als N. ollgo- trophum, im saprophytischen oft beweglichen nicht nitratierenden Zustand, als A'. polytrophum, zu bezeichnen. Die beiden Formen mussen als physiologische Arten bezeichnet werden und verhalten sich zueinander als Modifikationen und nicht als Mutationen. Der Ubergang findet, wie der Pfeil andeutet, nur in einer Rich- tung statt. Zweitens, Bacillus nitroxus. Sehr kleine sporenerzeugende meist unbewegliche Stabchen, welche nicht nitratieren, übrigens in ihren Lebensbedingungen dem Nitrat- ferment ahnlich und davon schwer zu trennen sind. Einige Varietaten zeigen De- nitrifikation. Drittens, die Gattung Actinobacillus, welche zu der Familie der Actinomyceten gehort und desshalb typisch unbeweglich ist. Unterscheidet sich von der von N e u- m a n n und L e h m a n n aufgestellten Gattung Mycobacterium durch das vollstan- dige Fehlen der Yerzweigung, so dass man nur Stabchen oder Faden findet. Er- zeugt die charakteristische treibende »Kahmhaut« auf der Oberflache der nitrifizie- r enden Flüssigkeiten. Darin finden sich zwei Arten namlich: a. Actinobacillus oligocarbophilus , welche sich ernahren kann von den Kohlen- stofïverbindungen der atmospharischen Luft und dann das »Kahmpilzmerkmal« zeigt; anderseits auf den verschiedensten organischen Nahrböden wachst ohne das »Kahmpilzmerkmal«. Letzterer Zustand auf Kieselplatten zurückgeimpft, zeigt das »Kahmpilzmerkmal« wieder-). Doch kann das Merkmal verloren gehen durch lange fortgesetzte saprophytische Lebensweise. Verflüssigt Nahrgelatine nicht. b. Actinobacillus paulotrophus. Erzeugt auf den nitratierenden Platten schini- melartige Koloniën mit »Lufthyphen« ; besteht jedoch mikroskopisch anscheinend aus gleichartigen Stabchen und Faden. Wachst durchaus nicht bei Gegenwart or- ganischer Substanz. Viertens. die Gattung Actinomyces, wovon verschiedene Arten, in geringer An- zahl in den »Kahmhauten« von Actinobacillus vorkommen können, daraus jedocli bei den Überimpfungen bisweilen ganzlich verschwinden. ') In meiner Mitteilung in der Akademie der Wissenschaften zu Amsterdam, Bd. 23. pag. 1163, 28. Marz (10. April) IQ14, habe ich das Nitratferment, wegen seiner Beweg- lichkeit Nitribacillus genannt. Doch scheint es mir gegenwartig, daB der von Wino- gradsky eingeführte Name Nitrobacter bleiben kann. -) Diesen Tatbestand habe ich in meiner, in voriger Note genannten Mitteilung etwas anders und nicht ganz richtig vorgestellt. igi 6. Kann das Nitratferment Kolilcnsiiure reduziercn? Die höchst auffallende Tatsache, dass das Nitratferment nur daini funktioniert, wenn geloste organische Stoffe so voUstandig wie müglich fehlen, führt wie von selbst zur Hypothese, dass die bei der Nitritoxydation freikommende, nicht unbe- tr.ïchtliche Energiemenge, namlich 184 Kalorien nach der Formel HNO, aq + 0 -♦ HNO3+184 KI) vielleicht für die Reduktion atmospharischer Kohlensaure, also zur Chemosynthese dienen könnte. Beweise dafür habe ich bisher jedoch nicht finden können. Kultiviert man das Ferment in Nahrlösungen, so bleiben diese ganzlich klar, nur mit dem Mikroskop findet man, besonders an der mit einer ausserst dunnen Schleimlage bekleideten Glaswand viele sehr kleine Bakterien. Die Masse dieser letzteren ist so gering, dass ein einzelnes Sonnenstaubchen, z. B. ein Fadchen WoUe oder Baumwolle in die Kulturflüssigkeit gefallen, eine Million derselben reprasen- tieren kann. Auf Kieselplatten, gesattigt mit Lösungen von o,r Proz. bis 0,05 Proz. Natrium- nitrit und o,oi Bikaliumphosphat, bildet das Nitratferment erst mit der Lupe deut- lich sichtbare, jedoch sehr aktive Koloniën, desto kleiner, aber nicht weniger aktiv, je vollstandiger man geloste organische Körper aus der Platte fernhalt. Dass für das geringe Kohlenstoffbedürfniss, welches hierbei in Betracht kommt, eine ge- nügende Menge organisches Material als Yerunreinigung in den Platten gegenwartig ist, erscheint durchaus nicht unmöglich. Sollten die organischen Verunreinigungen der Platte dazu nicht ausreichen, so zeigt das kraftige Wachstum der Oligocarbophilushaute auf der Oberflache der nitratierenden Flüssigkeiten, sowie der Rohnitrifikationen im allgemeinen, dass die Atmosphare, wenigstens für deren Wachstum, genügend gebundenen Kohlenstofï liefern kann. Werden solche Rohkulturen auf Kieselplatten ausgesat, welche so vollstandig wie müglich von löslichen organischen Körpern befreit sind, so wachsên neben den immer sehr klein bleibenden Koloniën des Nitratfermentes diej enigen der genann- ten Arten als schneeweisse, trockene Platten (A. oligocarhophilus) , oder als kleine, schimmelartige, sehr zarte Pölsterchen A.paulotrophus), welche nach einigen Wochen, wenigstens was A. oligocarbophilus betrifft, hundert- oder tausendmal grösser wer- den können, wie die daneben liegenden Koloniën des Nitratfermentes. Da es nun feststeht, dass weder A. oligocarphiliis noch A. paulotrophus imstande sind, Nitrite zu oxydieren und deshalb keine Chemosynthese ausüben können, mussen diese Arten in ihrer Umgebung organisch gebundenen Kohlenstofï in genügender Menge vor- finden, um damit ihrem nicht so besonders kleinen Bedürfnis an dieses Element Ge- nüge leisten zu können. Hieraus folgt jedoch mit Notwendigkeit, dass das so viel weniger bedürftige Nitratferment bei diesen Bedingungen dann doch auch sehr wohl eine genügende Nahrung an organisch gebundenem Kohlenstotï in der atmo- sphiirischen Luft muss finden können. Allerdings ist es noch unsicher, von welcher Natur die hier in Betracht kommenden Substanzen sind. \'ielleicht handelt es sich ') W. Ostwald. Alls. Chemie, 2. Aufl. Bd. 2, Tb. 1, pag. 145. 1893- 192 dabei um Kohlenwasserstoft'e, deren Gegenwart in geringer Menge in der Luft fest- gestellt ist. Die in meiner oben genannten Abhandlung 1) zitierte Ansicht von Henriet, dass es sich dabei um Alkylaminen handeln sollte, dürfte aber wenig wahrscheinlich sein. Jedenfalls konnte ich mit Formamid nichts erreichen ; ebenso- wenig mit Ammonformiat und Hexamethylentetramin. Anderseits muss es auch als möglich betrachtet werden, dass flüchtige Stotï- ^^echselprodukte anderer Mikroben dem Nitratferment zur Ernahrung dienen können. Überblicken wir das Vorgehende noch einmal, so ergiebt sich, dass, wenn wir das Nitratferment, welches nur erblich stabil ist bei Gegenwart von Spuren von löslichen organischen Nahrsubstanzen, mit den Namen Nitrohacter oligotrophum bezeichnen, daraus, bei besserer Ernahrung, z. B. mit Bouillon, eine scheinbar ge- wöhnliche, schwach bewegliche, stark wachsende saprophytische Bakterie hervor- geht, mit sehr charakteristischen Eigenschaften, welche Nitrohacter polytrophuin genannt werden kann. Dieser Vorgang ist nicht umkehrbar, das heisst, bei Labora- toriumsversuchen gelingt es nicht, die Umwandlung N.p * N.o zustande zu bringen. Wie man sieht, handelt es sich dabei um physiologische Arthildung, und wenn man sich abfragt, wo diese in das System der Biologie unterzubringen ist, so kommt man zu folgendem Schlusse. Ein Beispiel von Mutation, so wie ich diese für viele Mikroben, beschrieben habe -), kann es nicht sein, denn die erblich mehr oder weniger stabilen Produkte des Mutationsprozesses entstehen neben der Hauptform und bestehen neben dieser, unter den verschiedensten Ernahrungsbedingungen weiter fort. Allein es handelt sich dabei um ein neues und besonders auffallendes Beispiel erblich stahiler Modiükation, nur durch die Deutlichkeit verschieden von dem Virulenzverlust bei vielen pathogenen Mikroben; vergleichbar mit der essentiell einseitig stattfïndenden, nicht umkehrbaren Ontogenese der höheren Pflanzen und Tiere, deren Folge wir kennen in der Zellendifferenzierung. Die verschiedenen, bei der Ontogenese entstehenden Zellenformen, woraus schliesslich die erwachsenen Pflanzen und Tiere aufgebaut sind, mussen als Modifikationen der ursprünglichen embryonalen Zelle aufgefasst werden; dass auch sie unter Umstanden mehr oder weniger erblich stabil sind, lasst sich in vielen Fallen zeigen. Ich erinnere in dieser Beziehung an die Wachstumsverhaltnisse der Epidermiszellen der Tiere und der Korkzellen der Pflanzen, welche sich fortwahrend aus ihren Mutterzellen regene- rieren. Künstlich sind embryonale Bindegewebezellen und Muskelzellen des embryo- nalen Herzens, wahrend einer Reihe von Generationen, in Blutplasma, ohne sich zu andern, reproduziert bei den Versuchen von C a r r e 1. Es muss allerdings anerkannt werden, dass es sehr schwierig, wenn nicht un- niöglich ist, Mutation und erblich stabile Modifikation in allen Fallen scharf von- einander zu unterscheiden. Diese beiden Vorgange fliessen derweise zusammen, dass ') Centralbl. f. Bakteriologie, 2. Abt. Bd. 10, pag. 38, 1903. -) Folia Microbiologica, Bd. i, pag. i, 1912. 193 man manchmal in Zweifel gerat, wie ein Entwicklungsprozess, wobei eine neue Ent- wicklungsrichtung eingeschlagen wird, bezeichnet werden muss. Ich meine aber, dass im Falie des Nitratfermentes die Verhaltnisse deutlich sind, und niemand bestreiten wird, dass der Ubergang »oligotroph« zu »polytroph« wirklich als Modifikation zu betrachten ist. Es muss aber bemerkt werden, dass der Modifikationsbegrifï zwei verschiedene Begrifïe umfasst, welche bisher nicht durch bestimmte Worte angegeben werden, namlich umkehrbare und nicht umkehrbare Modifikation. Damit parallel im Mutationsbegriff waren Mutation mit und ohne Atavismus. Es ist aus dem Vorgehenden klar, dass beim Nitratferment nur nicht umkehrbare Modifikation stattfindet. Hierin liegt auch eine Verschiedenheit dieses Vorganges mit der Pleomorphie vieler Pilze, welche übrigens an die physiologische Artbildung beim Nitratferment erinnert. Figurenerklarung. Fig. I (37)- Koloniën des oligotropen Nitratfermentes, Nitrobacter oligotrophum, und von Bacillus nitroxus auf Nitritagar. Die grossen, dendritisch verzweigten Koloniën sind das Nitratferment, die runden, kleinen B. nitroxus. Fig. 2 (37). Koloniën des umgewandelten, polytrophen Nitratfermentes, Nitrobacter polytrophum, und Bacillus nitroxus auf Bouillongelatine. Die grossen, körnigen Koloniën (c, d) sind das Nitratferment, zwei davon (c, c) fangen an die Gelatine zu verflüssigen; die kleinen, runden Koloniën (a, b) sind B. nitroxus, im noch nicht verflüssigenden Zustande. M. W. Beijerlnck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. 13 M.W. BEIJERINCK, Das Nitratferment. Fig. I (37). Nitratferment und B. nitroxus auf Nitritagar. Fig. 2 {37). Nitratferment fc, il) und B. nitroxus (a. b) auf Fleischbouillongelatine. Crystallised Starch. Proceedings of theSection of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XVIII, 1915, p. 305 — 309. — Verscheen onder den titel «Gekristalliseerd zetmeel* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXIV, 1915, blz. 240-245. The fact that starch crystallises easily is not generally known. It is true that Arthur Meyer supported the view that the starch grain is a sphero-crystal^), but convincing figures he does not give ; his considerations are hypothetical and not decisive as he did not make any microscopical examination on soluble starch. Moreover, the highest temperature used by him was but 145" C. and he continued the heating not long enough. Most species of starch, such as that of potato, wheat, barley, rye, rice, maize, behave as follows. When a 10 "/o solution, after previous boiling and gelatinising in distilled water, is heated during fifteen minutes or half an hour at 150" to 160° C, the grains dissolve to a perfectly clear, transparent liquid, in which, at slow cooling a crystalline deposit sets ofï, consisting of very fine needies, which are either isolated or united in groups of various shapes, not seldom resembling natural starch, and which must undoubtedly be considered as crystallised starch on account of their behaviour towards diastase and chemical reagents, The free needies, measuring but few microns or parts of microns, make the impression of an amorphous sediment. The groups, formed by longer needies have the shape of corn-sheaves or bundies of arrows (bolidesms) ; or of discs (bolidiscs), reminding in size and form of the red blood-cells ; or they are more or less regular globules (spherites or sphero-crystals) from whose surface, however, here and there project the crystal needies. Potato starch is very well apt to produce bolidesms and spherocrystals ; it is sufficiënt to heat to 150° C, during a quarter of an hour, a 10% solution in distilled water, previously boiled and gelatinised. After being kept 24 hours in a cold room loose needies, bolidesms or sphero-crystals are precipitated, and their crystalline nature is easily observable. What circumstances determine the union of the needies to bundies is not yet well known, but certainly slowness of crystallisation favours it, and the concentration has also some influence. Not seldom the whole deposit consists of a magnificent mass of sphero-crystals (Fig. i). The discs, to which I shall return presently, are formed from potato starch at a somewhat lower temperature than the needies mentioned here. The two con- ') Untersuchungen über Starkekörner, Jena 1895. Beitrage zur Kenntnis der Starke- gallerten, Kolloidchemische Beihefte Bd. 5, pag- i, 1913. The observations and opinions of Bütschli, Untersuchungen über Strukturen, pag. 283, Leipzig 1898, are obscure. 13* igó stituents of the starch grain, which I described earlier^) namely the amylopectose, non-soluble at boiling, which forms the wall of the starch grain, and the granulose (amylose), which does dissolve at boiling and forms the inner part, change both at 150° C. into crystallisable starch. It is not difficult to convert 40% of the original starch into needies or sphero-crystals. With a lower temperature or a shorter time of heating the quantity of starch, which crystallises increases, but at the same time the needies become shorter and less distinct. When heated at 110° to 120° C. the solution, at first per- fectly clear, quite coagulates at cooling and becomes white as porcelain. This coagu- lated substance or gel, must also be considered as consisting of crystals but the needies are nearly, or in fact ultramicroscopic. They do not show any orientation. As the temperature is taken higher, the quantity of dextrine, which does not crystallise, increases. The iodine reaction shows that this dextrine contains much erythrodextrine at lower temperatures, and at higher consists only of leuko- dextrine, colouring light brown. At temperatures of from 160° to 170° C. the 10% potato starch quite changes into dextrine in from half an hour to three quarters of an hour; besides, the presence of sugar, susceptible to alcoholic fermentation, may then already by observed. The sphero-crystals and needies of the starch dissolve, when heated in water, more slowly than soluble starch, which I ascribe to the greater size of the artificial needies, compared with that of the needies composing the natural and soluble starch. These needies consist in my opinion of a substance (granulose) impermeable to water, so that the dissolving must begin at the outside and will be the slower as the needies are thicker. At 70° C. the solubility becomes very great, without any sign of production of paste or of gelatinising. With iodine the colour of the solution is pure blue. The effect of diastase on the granulose needies is as usual : erythrodiastase extracted from crude barleyflower, forms erythrodextrine and maltose, whilst leukodiastase prepared from malt, produces leukodextrine and maltose. Of crystallisable dextrine and amylodextrine, so much discussed in literature, I perceived nothing in my experiments; the latter substance is evidently crystallised starch, with so much erythro- or leukodextrine between the needies, that te pure blue iodine colour of the granulose is modified to violet or reddish brown. When the crystalline mass, which in fact sometimes colours red with iodine, is washed out with much water, the dextrine, and with it the »amylodextrine reaction« quite disappears, to make place for pure blue. The crystals may also be obtained from soluble putato starch. Such starch is prepared by keeping raw starch during 10 days under 10%-ic cold hydro- chloric acid. Crystal discs (bolidiscs) result very easily from wheat starch. The heating must be somewhat longer and the temperature higher than for potato starch. Besides, it is more difficult to obtain a perfectly clear solution from wheat paste. Fig. 3 shows, 230 times magnified, the discs formed in a beakerglass of 100 cm•^ in which wheat starch, previously boiled in distilled water, is heated to ') Proceedings of the Academy of Sciences. Amsterdam, 11 April 1912. 197 i6o° C. The discs are thinnest in the middle and from this centre the needies radiate. The discs resemble natural wheat starch as well in shape as in size. With polarised light I could not, however, perceive anything of the axial cross, which is so very obvious in natural starch. I suppose that it does exist, but is too feeble to be observed. It is, namely, a fact that the structure of the spherites and discs is much looser than that of natural starch, so that in a volume unit of the latter many more needies occur than in the discs and spherites. If now the doublé refraction of the separate needies be not great, their united power in the discs need not necessarily show the same as is seen in the natural grains. That de doublé refraction of the common starch grains reposes on their crystalline nature and not on tangential and radial tensions, may be concluded from the fact, that the axial cross is in the usual way perceptible in soluble starch. As this substance is prepared with strong hydrochloric acid, whereby from lo to i6% of the dry substance is extracted, it must be concluded that all tensions, originally present in the grain, disappear. That the discs may also be obtained from potato starch is demonstrated in Fig. 3, where io% potato starch, after boiling and gelatinising in distilled water, in a 100 cm^ beakerglass, heated to 1250 C. during 3V2 hour, and after 24 hours of crystallisation in a room of about 16° C, is figured 600 times magnified. By moving the coverglass on the slide, many discs may be observed laterally, as is clearly seen in the photo. In the preparation of wheat starch used for Fig. 3, all the grains are lying on their broad side. The crystal discs of the starch are now and then referred to in literature as »Jacquelain discs«, but without any allusion to their crystalline structure. Jacquelain himself, who first mentioned these grains, called them »granules de fécule«^). After having become acquainted with the described facts and found them confirmed for other species of starch, I convinced myself that the natural starch grain also it built up of crystal needies radiating from the dot or hilum. This may best be seen in soluble potato starch, very cautiously heated in the micro- scopic preparation on the slide under the coverglass, when all the stages of the dissolving in hot water can be foliowed. The tiny radiating crystal needies then become visible in a ring-shaped arrangement, such as might be expected from the structure of the starch grain itself. It seems that the length of the needies corresponds with the thickness of the rings. From the preceding I conclude, that the formation of the starch grain takes place in the following way. The amyloplast produces granulose, which in the interior crystallises to small spherites, just as in a solution. But this granulose production occurs periodically and so the process of crystallisation gives rise to the formation of the layers of the grain. To explain the great difference existing between starch gelatinised at 100° C. and that heated to 150° and 160° C. it must be accepted that in the starch grain, beside the granulose, an incrustating substance exists, functioning as a »protecting •) J. A. Jacquelain, Mémoire sur la fécule. Annales de Chimie et de Physique. T. 63, pag. 173, Paris 1840. Much in this treatise is incorrect and obscure, else the discs would certainly already earlier have drawn general attention. igS colloid«, whose presence makes the needies remain short, the shorter the more of the colloid is present. It remains active unto about ioo° C, hut above this temperature it slowly decomposes, quite to vanish at about 150° C. The hypothesis that this protecting colloid might be a phosphoric ester of granulose, is contrary to the properties of soluble starch, for this behaves at crystallisation of the solutions, prepared between 100° and 150° C, precisely in the same manner as natural starch so that the protecting colloid is still present in this substance, whereas it might be expected that an ester would be decom- posed by the strong, 10%-ic hydrochloric acid used for its preparation. Perhaps the colloid is the amyloplast itself, which, at the formation of the starch grain, remains partly enclosed between the fine granulose needies. lts greatest accumulation would then occur in the amylopectose wall of the grain, which does not yet dissolve at boiling. That no difïerence could be found in the rate of nitrogen between the granulose and the amylopectose of the starch grain, to which circumstance I directed attention in my communication of 11 April 1912, I ascribe to the extremely small absolute rate of nitrogen in both constituents; but I think that the relative difïerence is considerable. I will not omit to draw attention to the existence of starch species, which after heating, do not crystallise in the usual way. To these belongs arrowroot. If a 10% paste of arrowroot is precisely treated as above described, it becomes after cooling, as usually, turbid and precipitates ; but instead of a crystalline deposit we find in the microscopic preparation drops of various sizes, and homogeneous structure (Fig. 4), which later, however, become turbid and granulous. With iodine these drops turn deep blue and evidently consist of granulose like the crystal needies of the other starch species. The liquid between the drops is also a granulose solution, but less concentrated. The drops remind of a heavy oil, but they difïer from it by such a small surface tension that notwithstanding their liquid state many may be pear- or egg shaped, and even pointed. Doublé refraction I could not perceive, but, nevertheless, I think it probable that they must be reckoned to the liquid crystals. That after some time the drops become turbid can be explained by the growing in length and thickness of the ultra-microscopic needies, which constitute the liquid crystal drops, hence, by the same process of crystallisation by which the needies originate. The facts here briefly described deserve further attention from a physico- chemical view. Explanation of the figures. Fig. 1 (600). Sphero-crystals of 10% potato starch, half an hour at 150° C. Fig. 2 (600). Bolidiscs or Jacquelain discs of potato starch, half an hour at 125° C. Fig. 3 (230). Bolidiscs or Jacquelain discs of wheat starch, three quarters of an hour at 160° C. Fig. 4 (200). Drops or liquid crystals of 10% arrowroot, three quarters of an hour at 140° C, coloured with iodine. M.W. BEIJERINCK, Crystallised Starch. --"i> fl '■<:'■ (f -^•- ' r. X >" ■i/-; ■■;„,' i ■ #-•.. Fig. 10 (380). Bacillus inesentericus vulgatus, de gewone Fig. 11 (380). 5ac///;<^ é?)h«/^/o«J5, afkomstig uit rietsuiker, hooi- of aardappelbacil op agarplaat. Brengt uit rietsuiker Veroorzaakt, door laevulan-afscheiding, het «emulsie- laevulan voort, dat in de agarplaat aanleiding geeft tot verschijnsel» in een agarplaat. het »emulsieverschijnsel«. Fig. 12 (440). Endoiiiyccs iMag)ntsii, levende cellen niet met jodium behandeld. Het glycogeen is onzichtbaar. Fig. 13 (440). Eiidoiiiycrs Mü};)iiisil, het glycogeen is door jodium ziclitbaar gemaakt. M. W. BEIJERINCK, N'orming van eiwitten, koolhydraten en vetten. Fig. 14 (4^0). De gewone melkschimmel {Oiiliiiiii lactis); in de cellen is het glycogeen door jodium bruin gekleurd. I''ig. 15 (600). SaccJiaroniyces piilcherriiiius de vetgist. De uit honing geisoleerde hoofdvorm met groote vetdruppels. Fig. 16 (600). Saccharomyces pulcherruniis. De ineeste cellen zijn door mutatie veranderd in Saccliaroniyces pidcherriinus secHndarins. Fig. 17 (600). SaccJiaroniyces pulchcrriinus. Alle cellen zijn door mutatie veranderd in Saccha- romyces pulchcrrimiis sccitndarius. Nachweis der Violaceusbakterien. Folia Microbiologica, Delft, IV. Jahrgang, 1916, S. 207 — 210. Die Violaceus-Bakterïen bilden eine ziemlich umfangreiche Formengruppe, welche schleimige und nicht schleimige, stark bewegliche und kaum beweg- liche Apfelsaure in Brenztraubensaure überführende und nicht überführende, diasta- tische und nicht diastatische, dunkel violett gefarbte und voUstdndig farblose Arten oder Stamme umfasst. Ob die Bildung des violetten Pigmentes bei den so verschie- denen Formen auf wirklicher Verwandtschaft beruht, kann fraglich erscheinen. Nach meiner Meinung besteht diese Verwandtschaft jedoch unzweifelhaft und eben diese Überzeugung gab Veranlassung, farblose Stamme dennoch als Violaceusiormtn zu er- kennen und Versuche ausfindig zu machen, um Stamme, welche bei den gewöhnlichen Bedingungen farblos sind, derweise zu kultiviren, dass sie Pigment erzeugen. Sie sind auf verdünnte Nahrlösungen angewiesen und kommen selbst im unfrucht- barsten Wasser der Heiden und Moore vor. Einen schleimigen Stamm fand ich reich- lich in Tümpeln mit Raseneisenstein. In den Laboratorien sind die Violacei4S-Bakttrien bekannt als nicht seltene Be- wohner unserer Gewasser, welche sich auf Bouillonagar und Bouillongelatineplatten entwickeln; sie sind beschrieben als Bacillus violaceus und B. janthinus. Mein Interesse erregten die Violaceus-Bakterïen als Bewohner von Infusen, welche einfach dadurch bereitet waren, dass Weizengluten oder Fibrin in Leitungs- wasser, ohne weitere Zusatze, bei Zimmertemperatur der Faulnis unterworfen wurde ^). Auf der Flüssigkeit treibende Teilchen dieser Substanzen und am Glasrand, iin Meniscus sich absetzende Flocken, sind dann oft dunkel violett gefarbt. Als ich je- doch versuchte, daraus die F/o/oc^M^-Bakterien zu isolieren auf Bouillonagarplatten, entwickelten sich nur farblose Koloniën, so dass ich anfangs glaubte, dass jene Bak- terien darauf nicht wachsen konnten. Diese Meinung war jedoch nicht richtig: sie entwickelten sich auf dem Bouillonkulturboden sehr gut, jedoch erzeugen die Gluten- und Fibrinstamme darauf kein Pigment. Es stellte sich dann ferner heraus, dass be- sonders die Gegenwart von Phosphaten die Pigmentbildung hemmt oder verhindert, und so kam die folgende einfache Versuchsanstellung zustande um, z. B. im Garten- boden, eben diese auf Bouillonplatten kein Pigment erzeugenden Stamme leicht sicht- ') Bei reichlichem Luftzutritt haufen sich im Sediment solcher Glaser noch zwei andere Pigmentbakterien an, wovon die eine einen roten, die andere einen schwarzen Farbstoflf erzeugt. Aërober Hauptbewohner solcher Infuseist eine noch nicht beschriebene, sehr interessante, farblose Art, welche ich, wegen der eigentümlichen Wachstumsweise B. vesiculosus nenne, und die sofort an der Blasenbiidung kenntlich ist. 16^ 244 bar zu machen. Fertigt man eine Platte an von der Zusammensetzung: Destillirtes Wasser loo, Agar 2, trockenes Fibrin i — 2, und Chlorkalium 0,02, übergiesst mit Wasser, worin Gartenerde aufgeschüttelt und abgesetzt ist, und kultivirt bei 22" bis 25° C, so bekommt man nach wenigen Tagen eine ziemlich dichte Bakterienkultur mit mehr oder weniger Violaceiis-Kolomen, welche bei diesen Bedingungen gut wach- sen und viel Pigment erzeugen. Bisweilen ist das Verhaltnis der Violaceus-Bakterien zu allen übrigen Bakterien zusammen überraschend gross und kann 25% und noch mehr betragen. Man bekommt dadurch den Eindruck, dass diese Bakterien im Boden nicht ohne Bedeutung sein können, obschon ihre RoUe noch unklar ist^). Kultivirt man die so gewonnenen violetten Koloniën auf reine, in destilliertem Wasser geloste Gelatine (ohne weitere Zusatze), so erzeugen dieselben darauf erst langsam, spater schnell verflüssigende Koloniën, welche gewöhnlich auch Pigment erzeugen, einzelne Stamme selbst auffallend viel. Andere Stamme bleiben auf diesem Kulturboden jedoch farblos. Alle von mir naher untersuchten Stamrne, farblose sowie violette, zeigen in den verflüssigten Koloniën auf Gelatinplatten charakteristische Aggregate oder Zoögloën, welche aus unbewegten Individuen bestehen, die wie durch Agglutination zusammengeballt sind. Diese Erscheinung ist, wenn auch weniger deut- lich, selbst in den Koloniën auf Agarplatten bemerkbar und dann ein gutes dia- gnostisches Merkmal. Das einigermaassen überraschende Resultat, welches die Versuche mit Fibrin ge- geben batten, gab zunachst Veranlassung, das Fibrin durch getrocknetes Weizen- gluten zu ersetzen, womit der Versuch ebenfalls gelang, obschon die Pigmentbildung etwas geringer ausfallt, wohl infolge der Gegenwart einer grosseren Phosphatmenge im Gluten wie im Fibrin-). Inzwischen ermunterte das Resultat, den \"ersuch mit Weizenkörnern und mit nackter Gerste zu wiederholen, was ebenfalls zu einer Anhaufung führte, welche sicli folgendermaassen am einfachsten gestaltet. Alan wascht und schüttelt gewöhnliche Gerstengrützen tuchtig mit Wasser und zwar so lange, bis 'alles anhangende Mehl völlig verschwunden ist. Die Körner wer- den dann auf feuchtes Filtrirpapier gelegt, welches in einem grossen, mit Leitungs- wasser gefüUten Becherglase vermittels eines halbgefüllten und dann umgekehrten Glaskölbchens, oder einer umgekehrten Eprouvette, oder eines Korkringes, treibend gehalten wird. Das Papier hangt mit dem Rande im Wasser und sobald das Bak- terienwachstum auf den Körnern beginnt, was bei Zimmertemperatur am zweiten oder dritten Tage der Fall ist, werden die Absonderungsprodukte der Bakterien, bald nach ihrer Entstehung abgeführt, und die an den Körnern hangende Nahrlösung bleibt sehr verdünnt. Hierdurch sind alle Umstande realisirt, welche für das Wachs- tumvon F/o/oc£'M.ynotwendigsind und bald farbensich dann auch dieGrützenkörner tief viülett. Es ist leicht, weitere Impfungen davon auf frische Grützenkörner und auf Fibrinplatten für die Reinkultur anzufertigen. Leitungswasser lasst sich durch diesen Versuch sehr einfach auf die Gegenwart *) Ich habe Ursache anzunehmen, dass es eben gewisse V iolaceiis-Bukterien sind, welche Nitritbildung hervorrufen oder begunstigen. ^) Auch Eiereiweiss gibt ein ziemlich gutes Resultat. Mit Casein gelang die An- haufung nicht, weil dieser Stoff im Wasser allzuschnell durch andere Bakterienarten verflüssigt wird. 245 oder Abwesenheit der Violacetis-Bakterien prüfen. Übergiesst man die Körner mit Bodeninfusen, so bekommt man, wie es scheint ausnahmslos, Violacens-Kultnren, wenn die Infuse von einem Centigramm Erde oder mehr herstammen. Die auf diese Weise isolirbaren Formen sind besonders die oben genannten, auf Fleischbouillon- platten kein oder sehr wenig Pigment erzeugenden, also gerade die allgemein ver- breiteten und desshalb uns am meisten interessirenden. Schliesslich erlaube ich mir noch den folgenden einfachen Versuch von Herrn H. C. Jacobsen anzuführen. Er legt ein Stück Weissbrot unter einen Hahn einer Wasserleitung, welcher langsam tröpfelt und zwar derweise, dass das Brot, welches im Abfuhrtrog liegt, nicht direkt, sondern durch das von den fallenden Tropfen aufspritzende Wasser durch- nasst wird, wobei zu gleicher Zeit eine langsame Auslaugung und Entfernung der Exkretionsprodukte der sich reichlich entwickelnden Bakterien stattfindet. In unserem Laboratorium wird das Brot unter diesen Bedingungen ausnahmslos nach wenigen Tagen tiefviolett, infolge der Entwicklung einer reichhaltigen V iolaceus-Kultur. Diese besteht wieder aus mehreren Varietaten, die am besten vermittels der Fibrinagar- platte ohne Phosphat isolirt und erkannt werden, weil dieselben mehrenteils auf F-leischbouillonplatten keinen Farbstoff erzeugen. Laboratorium für Mikrohiologie der Technischen Hochschule su Delft. Het voorkomen van urease bij hoogere planten. Chemisch Weekblad, Amsterdam, 13e Jaargang, 1916, blz. 443—444. Onlangs heeft de Heer C. P. Mom in dit blad ^) bij vergissing gezegd, dat in soja-boonen geen urease voorkomt. De Heer M om is echter voor deze vergissing niet verantwoordelijk, maar ik zelf ben dit. Door de onachtzaamheid van mijn laboratoriumpersoneel waren namelijk aan den Heer M o m verkeerde monsters ter hand gesteld, die ook door mij als soja- boonen beschouwd waren, omdat ik meende, dat zij afkomstig waren van mijn collega Prof. van Iterson, hetgeen niet het geval was. Later ontving ik van Prof. van Iterson vier monsters soja-boonen uit de collectie van zijn laboratorium; twee daarvan zijn geel, de twee andere zwart. Alle zijn zeer rijk aan urease. Een van de twee zwarte variëteiten, die het etiket draagt »Karbin«, bestaat uit levende boonen, die bij 30" C. reeds na 2 X 24 uur kiemen. De andere zijn gedeeltelijk dood. Voor de ureasereaktie maakt dit geen verschil. Een ander monster ontving mijn laboratorium van den Heer T e m m i n c k Groll uit Amsterdam; ofschoon dood zijn alle deelen der kiem vol urease. Ta- k e u c h i heeft dus volkomen gelijk -). Daar ik geloof, dat de »irisreaktie«, die ik in 1901 ^) beschreven heb om urease in uiterst kleine hoeveelheden materiaal, bijvoorbeeld in zeer kleine bacteriënkoloniën aan te toonen, weinig bekend is, maar door sierlijkheid en eenvoud een ander lot ver- dient, wensch ik daarop nog eens de aandacht te vestigen. Aan gistwater, verkregen door 30 a 40 gram gist met 100 cM'. water te koken en te filtreeren, wordt 10 gram gelatine en 2 gram ureum toegevoegd. De gesmolten massa wordt in een glasdoos uitgegoten, waardoor men, na stolling, een vaste gelatine- plaat van een paar millimeters dikte verkrijgt. Brengt men op de oppervlakte van zulk een plaat eenig materiaal, dat urease bevat, bijv. koloniën van ureasebakteriën of mikroskopische doorsneden van soja- boonen of van andere straks te noemen planten, of strooit men er een weinigje stof op, verkregen door droge soja-boonen of zaad van gouden-regen fijn te stampen, dan ziet men reeds na enkele minuten of uren, al naarmate van den ureaserijkdom, een hoogst eigenaardige verandering in de oppervlakte der gelatine rondom het preparaat ont- staan, tengevolge van de vorming van ammonium-carbonaat uit het ureum. Deze ver- andering bestaat daarin, dat zich in de oppervlakte koolzure kalk, wellicht gemengd ') Een quantitatieve bepaling van het ureum. Chem. Weekbl. 1916, 72. ^) Chem. Zeitung 35, 408 (1911). ') Arch. Ncerl. (2) 7, 36 (1902); Centralbl. f. Bakteriol. 2. Abt. 7, 33 (1901). 247 met fosforzure kalk, ophoopt, die daarin echter niet uitkristalliseert maar in amorphen toestand blijft. Bij de uitbreiding van het ammoniumcarbonaat door diffusie ontstaan nu in deze oppervlakkige laag prachtige N e w t o n'sche kleurringen. Later vormt zich ook in de diepte een wit neerslag van calciumcarbonaat. De sojaurease is een exoenzym, dat echter moeielijk in gelatine, gemakkelijker in agar diffundeert. Bakterienurease behoort tot de endoenzymen. Door op een dergelijke plaat onderdeden van mikroskopische preparaten te bren- gen, bijvoorbeeld dwarse doorsneden van vaatbundels uit de zaadlobben, parenchym, epidermis of schorsweefsel, wordt de reaktie, met eenig geduld een »mikrochemische«, en kan men zich gemakkelijk omtrent de verspreiding van het enzym in de organen der plant overtuigen. In de ontkiemde soja-boonen zit het zoowel in de zaadlobben als in het kiemworteltje. Voor den chemicus is het wellicht belangrijk te weten dat het niet alleen voorkomt in de soja-boonen (Glycine hispida), maar eveneens in de schors van de windende stammen en zelfs van de kleinste takjes en knopjes van de »blauwe-regen«, Glycine sinensis, verder in alle deelen van onze gewone gouden regen (Cytisus Lahurnum), in het bijzonder in de zaden, ofschoon daarin niet zoo geconcentreerd als in de soja-boon. Ook in de schors en de zaden van de gewone Acacia, Robinia pseiido-acacia, is het enzym rijkelijk voorhanden. Evenzoo in het zaad van de indigoplant, alsmede in de weefsels van verschillende andere kruidachtige Papilionaceen. In arachiden, erwten en boonen, in vlaszaad, in amandelen en in zeer vele an- deren willekeurig daarop onderzochte planten van andere familiën, werd het enzym niet gevonden. Tot nu toe is het alleen in die soorten van Papilionaceen bekend geworden, die in hun kiem eiwit en olie geen zetmeel bevatten. Delft, Laboratorium voor Mikrobiologie der Technische Hoogeschool, 31 Maart 1916. The Enzyme Theory of Heredity. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol. XIX, 1917, p. 1275 — 1289. — Verscheen onder den titel »De enzym-theorie van de erfelijkheid* in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXV, 1917, blz. 1231 — 1245. Combining the results of the enzymological researches of recent years with those obtained by the experiments on heredity, an insight is obtained into the nature of the thereby concerned substances which deserves attention. The most acceptable theory of heredity is the conception that the living part of the protoplasm of the cell is built up from a great number of factors or bearers, dif- ferent from one another, which determine the hereditary characters of the organism; at the cel! division these bearers doublé or multiply, in consequence of which the characters, latent or unfolded, are transferred to the daughter-cells. They are called: differirende Zelleleniente (M e n d e 1), gemmules (Dar win), biophores, pangens, gens, character units, heredity units, M e n d e 1 i a n factors, or factors ^). How they appear in the cell, how they behave to nucleus, chromidia, chromo- somes, and other cell-organs, and many questions more, form the subject of the here- dity researches of to-day, which however start from the supposition that the said theory is in the main right. Nor does the observation that heredity units or factors may occur in latent condition and must then be activated by special kinds of food, by alcalies or acids, or other stimuli, touch the fact of their existence. By the side of this view stands another, only apparently quite different, namely that the living part of the protoplasm is built up of a large number of various en- zymes. A nearer consideration of these two views shows that »heredity units« and »enzymes« means the same -). Hence the fundamental conception here to be proposed, that every hereditary *) G. J. Mendel, Versuche üher Pflanzen-Hybriden. Verhandl. d. naturforschenden Vereines in Brünn. Bd. 4, Abh. pag. 42, 8. Februar u. 8. Marz 1865. — C. Darwin, Provisional hypothesis of Pangenesis. Domestication, ist Ed. T. 2, pag. 357, 1868. 2nd Ed. T. 2. 349, 1875. — H ugo de Vries, Intracellulare Pangenesis, Jena 1889, and the .American edition, Intracellular Pangenesis, Chicago 191 o. — V. Haecker, Allgemeine Vererbungslehre, pag. 265, 1911. — M. W. Beijerinck, Mutation bei Mikroben. Folia microbiologica. Bd. i, pag. 24, 1912. — W. Johannsen, Elemente der exakten Erblich- keitslehre. 2nd Ed. pag. 143, 1913, etc -) Younger physiologists (as E. Abderhalden, Physiologische Chemie, 3. Aufl. Theil 2 pag. 997, 1915) wrongly use anew the old and equivocal word »ferment«, instead of the practical and clear word enzyme«. The history of the introduction of the word enzyme is as follows. In »Verhandlungen des Naturhistor. und Medicin. Vereins zu Heidel- berg«, Sitzung am 4. Februar 1876, Bd. i, N. F., the account of a lecture of Kühne begins 249 character of an organism corresponds to one or more enzymes, which exert a reaction on specific substrates. Long ago already I came to the conviction that the ontogenetic evolution of the higher plants and animals can be best explained by admitting that it is caused hy a series of enzymes, for the greater part endoenzymes, which, becoming active in a fixed succession, determine the morphological and physiological properties gradually manifest in the development. These enzymes in the formation of plant-galls are likewise concerned, and in a study on the galls of the saw-fly Nematiis capreae on the leaves of Salix amygdalina, I gave them the name of »growth enzymes«i). It is still my opinion that this view is in the main correct, but while I formerly thought that the growth enzymes partly derived from the gall-insect, I now recognize that they belong to the plant only and that the animal does not introducé enzymes into it. Research material. In the free living unicellular organisms morphological differentiation, joined with cell division, is quite or almost quite absent, which much simplifies the ontogenetic development. That in this case the properties must be represented just in the same way by specific factors, that is by heredity units or M e n d e 1 i a n factors, as in the cell protoplasm of the higher organisms, is beyond question. Although it would be erroneous to admit that the number of characters, and so of the heredity units or factors of the unicellular organisms must be small, we certainly have to deal here with a simpler case than in the multicellular. Hence it seemed probable that heredity cxperiments with the former would give some chance better to understand the nature of the heredity units in general. But not all properties are equally well adapted to such a research. To show that some character of a cell corresponds to one or more units or Mendelian factors, that character must be able to change by mutability in such a way that the mutants prove to be hereditary constant races, distinctly different from the original form, for the conception of heredity units must also for the unicellulars start from the possi- bility of race formation. The character to be studied must further be observable with ease and accuracy and it must be possible to cultivate the concerned organism in a simple way, so that in few days thousands of individualscanbeexaminedand that no doubt is left as to their distinction from foreign infections. These requirements are very well answered by some pigment- and by the lumineus bacteria as I repeatedly stated before^). Espe- thus: »Herr W. Kühne berichtet über das Verhalten verschiedener organisirter und sogenannter ungeformter Fermente. Um Missverstandnissen vorzubeugen und lastige Umschreibungen zu vermeiden, schlagt Vortragender vor, die ungeformten oder nicht- organisirten Fermente, deren Wirkung ohne Anwesenheit von Organismen oder ausser- halb derselben erfolgen kann, als Enzyme zu bezeichnen«. This proposai is still acceptable. That Kühne only thought of exoenzymes was in accordance with the times. The term »endoenzyme« was introduced in 1900 by M. H ahn (Zeitschr f. Biologie Bd. 40 pag. 172, 1900). But the conception existed already long before. Enzyme comes from the Greek »en« in, and »zymè« leaven, and is related to »zeo« I boil. *) Das Cecidium von Nematus capreae aui Salix amygdalina. Botan. Zeitung 1888, pag. i. -) These Proceedings, 21 November 1900 and 9 February 1910. 250 cially the phosphorescence of the latter I have minutely examined, no character being botter qualified to show the process of mutability and to enable us more quickly and precisely to judge of the vital energy of the culture material. Errors in the nutrition are in this way prevented, which so easily occur in microbiological experiments, in particular by too strong concentration and too alcaline reaction. Besides, the function of phosphorescence is not only found in certain luminous bacteria, but it is widely spread throughout the natural system and a remarkable similarity exists everywhere^), notwithstanding the enormous differences in the respective phosphorescent organs. Another consideration which induced me to study with particular care the pro- duction of light by living microbes was the following. I saw the great difficulty of explaining by the enzyme theory a function so obviously the attribute of the living protoplasm. Yet I had the conviction that if it were possible to account for this exceptional character by that theory, the same would be the case for any ether character, physiological or morphological. Presently we sha'1 see that facts are in accordance with the expectation. Not all luminous bacteria are equally well qualifïed for this investigation. Photo- bacter splendidum, common in the North Sea at the end of summer^), and Ph. phos- phoreum C o h n, always present on sea-fish, whose properties are very ditïerent and in many respects complementary, are recommendable. Ph. splendidum produces tryp- sin, urease, diastase and invertase, and assimilates mannite with light production. Ph. phosphoreum has none of these enzymes and does not attack mannite '). The chief result of this study is that the function of phosphorescence may be ascribed as well to living protoplasm as to one or more enzymes. I chose this function to elucidate the theory with regard to a physiological character ; the production of the cell-wall shall be treated to test it f rom a morpho- ïcgical point of view, and also in the latter case it can be shown that the protoplasm as well as one or more enzymes may be regarded with the same right as the cause of its formation. The subsequent considerations must be given in a short and somewhat aphoristic but I think not unclear form. Enzymes considered as the bearers of phosphorescence. Irritability. Already in 1898 Rafaël Dub o is endeavoured to demonstrate that phos- phorescence should be considered as caused by an enzyme-action *). He experimented particularly with the luminous sipho-slime of Pholas dactylus and calls the enzyme, he thinks he has found »luciferase« and the unknown matter it acts upon »luciferine«. ') Perhaps with exception of the higher Fungi, where the luminosity seems to he in correlation with a state of collabescence. *) Die Leuchtbakterien der Nordsee im August und September. Folia niicrobio- logica, Bd. 4 pag. i, 1915. *) Aliment photogène et aliment plastique des bactéries lumineuses. Archives Néer- landaises T. 24, F. 369, 1891 (Feeding of Ph. phosphoreum Cohn). *) R. Dubois, Le^ons de Physiologie générale, pag. 450 und 524. Paris 1898, Drawings of the phosphorescing organ of Pholas by Ulric Dahlgren: The production of light by animals. Franklin Institute, February 1916, pag. 38. 251 The latter substance corresponds to what is called an »enzyme-substrate«, hut which niight better be denominated »enzymoteel« ^), the word »enzyme-substrate« being evidently equivocah To prepare a luciferase solution, free from luciferine, he leaves the luminous mucus till it becomes dark. He makes a sohition of luciferine, free from luciferase, by slightly heating the mucus whereby the luciferase is destroyed. By mixing the two dark solutions light is evolved, from which he concludes that the luci- ferase acts as a catalysator similarly as other enzymes. The luminous slime consists of the cell-content of peculiar glands of the epiderm and flows from the cell through a fine canal ; it seems not impossible that it contains protoplasm. Yarious other sea animals as some Annelides, Cephalopodes and Coelenterates likewise secrete a luminous slime, which spreading in the sea-water illumines the surroundings of the animal. E. Newton Harvey has examined the phosphorescence of insects and comes to the same results as Dubois, but he calls the related substances »photogenine« and »photopheleine« '^). It is also easy to show that the phosphorescent cells of our glow-worms, after mechanical destruction do not loose their luminosity. But these facts cannot be considered as proving incontestably the accuracy of the enzyme theory, it not being impossible that in all these cases not yet destroyed protoplasm is still active. A better evidence for the view that the bearer of the phosphorescence consists of one or more endoenzymes is to be derived from the luminous bacteria. Here the production of light is inseparably bound to the bacterial body and secretion of a luminous slime never occurs *). If thus there is question here of an enzyme as cause of the phosphorescence it can only be an endoenzyme, and that this supposition is in accordance with the facts may be shown by exposing the luminous bacteria to the in- fluence of ultra-violet light. It is namely possible by means of the light of a quartz- kimp, to bring them into the necrobiotic state, wherein they have lost their power of reproduction, but preserved their phosphorescence*). If the time of the radiation is well chosen, the necrobiotic condition may last for hours and it may be shown that the luminosity of Ph. phosphoreum during this period is greatly intensified by glucose. Hence the very same argument which leads us to consider the alcohol function of the necrobiotic yeast-cell as an enzyme action, caused by one or more enzymes, called zymase, holds likewise with regard to the connection between phosphorescence and its factor or factors the luciferase. The still unknown »luciferine« which, as said, can result in the case of Ph. phosphoreum from glucose, is the natural analogon of the »glucose-phosphoric-acid ester«, i. e. the substrate or enzymoteel of the zymase. The necrobiotic yeast-cells have lost their semi-permeability, as shown by the ease wherewith they are dyed by methylene-blue, their power of reproduction and cer- tainly the motility of their protoplasm, whence they are considered as dead by several investigators. The same is probably the case with the necrobiotic luminous bacteria; but change of permeability could not be stated, since also in the condition of normal *) Of »telos«, aim. *) Science N. S. T. 44, pag. 208, 440, 652, 1916. *) The slimy matter produced by some kinds of luminous bacteria is non-phos- phorescent cell-wall substance. *) For the particulars of this experiment see Folia microbiologica, Bd. 4, pag. 10, 1915. 252 life they have a great affinity for pigments. I venture to think that the loss of the above properties when based, as is supposed, on the becoming inactive or on the de- struction of the more sensitive heredity units or enzymes, can quite well go side by side with the continued activity of another part of the protoplasm, so that then it cannot be said that the cell is »dead« in the same sense as when all its functions are destroyed. The importance of this view is obvious if we bear in mind that the theory of the units of heredity consists in the very supposition that from their combination energies and activities may arise strange to the units separately. The demonstration of the properties to be ascribed to special factors and of those due to the co-operation of two or more factors is the chief subject of the heredity researches of to-day and the difificulties met with are well known. That the enzyme theory will here be useful is obvious. About irritability I need not be long here, as for the lower immotile microbes this conception is only then based on observable facts if we think it conciding with the power of metabolism and of reproduction. In this connection I call to mind that the peculiarity of actions caused by stimuli, consists in their showing an optimum for certain intensities of these stimuli, which is also the chief character of enzyme action. So the influence of temperature and of different concentrations of poisons on the process of cell division and on that of amy- lolysis by diastase is analogous, and this is of course one of the best evidences for the correctness of the enzyme theory. Phosphorescence considered as boiind to protoplasm. Combination of the two views. That the function of phosphorescence of the luminous bacteria is bound to the living protoplasm is supported by the following facts. Anaesthetics, such as chloroform and aether, stop the light production almost completely, while after vaporisation of these substances it sets in anew only slightly diminished. A short heating of temperatures near 40° to 45" C. of Ph. splendidum and of 30" to 35** C. of Ph. phospJioreum, with subsequent cooling, has the same effect. By the action of acids and alcalies the phosphorescence disappears and returns after neutralisation. A strong salt concentration darkens, after dilution the light is com- pletely restored. Diminution of luminosity in these cases is caused by the dying of part of the germs. The phosphorescence of very active broth cultures, kept at rest for some time, undergoes a sudden and remarkable enhancement in its intensity by mechanical stimuli, such as shaking. The thus produced light reminds of the behaviour cf higher luminous animals, possessing a nervous system, which by contact, or other mechanical stimuli, suddenly react with light production. All these facts induced me already long ago ^) to call the bearer of the phos- phorescence »photoplasm« and its elementary units »photophores«. Also for the Flagellate Noctiluca miliaris de Quatrefages has demonstrated that the light issues from the protoplasmic threads that run from the nucleus to the cell-wall which, when seen under the microscope, presents a large number of minute light centres, ') De InRcnieur, 15c Jaarg. pag. 53, 27 Januari 1900. 253 corresponding to the ends of the threads, closely grouped near the flagellum, but farther on the surface at greater relative distances ^). The sudden radiance of Noctiluca by shaking the sea-water wherein it is suspended is well-known. When »fatigued« the cells become entirely luminous and de Quatrefages called the so produced light »pathological light«, but he does not say whether it originates from the cell-wall or the cavity. A principal argument for the view that the photoplasm of the luminous bacteria possesses the properties of the protoplasm lies in the relation between food and luminosity. For if peptones are present in sufficiënt quantity the phosphorescence is considerably increased by several carbon compounds either free from or containing nitrogen, as glucose, levulose, glycerin, malates, asparagin, and many others that do not act as stimuli, but as in the normal respiratory process are oxidised to carbonic acid and water. Peptones alone can also be broken off by the photoplasm, likewise under production of ammonium carbonate, carbonic acid, and water. Phosphorescence thus proves to be bound to the photoplasm in the same way as the respiratory process in genera! is bound to the protoplasm, so that it may be said that the photoplasm of the luminous bacteria forms part of their respiration protoplasm. As now the chief criterion of enzyme action consists in the fact that enzymes act only on a specific substrate, in the case of phosphorescence this criterion at first sight seems to fail, and the process more reminds of a catabolism bound to the protoplasm as a whole and which is rather unanalyse. But considering what should be understood by a catabolism we find in many cases that it is based on the co-operation of various factors of the nature of enzymes. The respiratory process itself supports this view, for recent enzymological investigations have shown that the respiration protoplasm is composed of different factors, in general called oxidases, with the specific distinction of peroxidases, oxigenases and oxidones. These units possessing the character of enzymes, and only oxidising special sub- stances, or but few nearly related ones, we must accept that in this case, too, a pre- formation of enzyme-substrates or enzymoteels takes place on which they exert their function. The composition of the photoplasm of several of such factors or oxidases is thereby rendered probable, and the ease wherewith by ineans of mutation experi- ments with the luminous microbes hereditary constant races arise of very unequal phosphorescence (but as it seems always of the same colour), is evidently connected with these facts. That the factors of the photoplasm of the various species of luminous bacteria are not always the same foUows from the before described experiments about the relation between nutrition and phosphorescence -). So, in the photoplasm of Bacterium phosphoreum an oxidase must exist associated with a substrate resulting from peptones only, and another oxidase whose substrate is an unknown matter, produced by peptone and sugars and perhaps by peptone and ') Mémoire sur la phosphorescence de quelques invertebrés marins. Ann. d. se. nat. Zoölogie, 3me Sér. T. 14, pag. 326, 1850. Vide also R. Dubois. Lecons de Physiologie générale, pag. 498, Paris 1898. ^) For Ph. phosphoreum. Aliment photogène, Archives Néerl. 1851. For PJi. plendidum Folia microb. 191S. 254 glycerin too. In the photoplasm of Bacterium splendidian another factor occurs adap- ted to a still unknown substrate deriving from peptone and mannite. Really these still hypothetical substrates are but different »luciferines« in the sense of D u b o i s. It should be borne in mind here that D u b o i s knows nothing at all of his luciferine of the polades, whereas regarding the photobacteria at least the substances are known from which they result. By multiplying the nutrition experiments it will be possible to come to a coroplete »factor analysis« of the photoplasm. For other bacteria the difficulties will be greater, but for B. prodigiosum, where race formation easily occurs, a corresponding factor analysis of the »chromoplasm« will be possible, since, according to former demon- strations, it must quite like the photoplasm be regarded as a complex of heredity units possessing the character of oxidases. So we arrive also here at a result analogous to that already obtained for the alcohol function, which may be ascribed as well to »alcohol protoplasm« as to some enzymes, the zymase of B ü c h n e r. In consequence of the foregoing it is clear that conceptions such as »chromo- plasm«, »photoplasm«, »alcoholprotoplasm« etc, are not in contradiction with the wider view that considers the protoplasm in general as composed of enzymes, as they themselves are built up of these. There being nothing to object to the further generalisation of the view here for- warded, it is allowed to consider the heredity units as enzymes and these as heredity units, clearly two difïerent names for the molecules or micells of the living part of the protoplasm ^). Cell-zvall factors are enzymes. For the higher plants and animals factor analysis is based on crossing experi- ments between forms of which we wish to state by what and by how many heredity units they differ. For the bacteria and the other microbes, where for want of sexuality crossing is impossible, factor analysis is then possible when the factors of special pro- perties can be recognised by race formation through mutation, which I already put fcrward before. The recognition of the heredity units as enzymes may likewise lead to factor analysis by applying the property of enzymes only to act on special sub- stances. We saw how this principle may be applied to a physiological function; that it can likewise lead to the factor analysis of a morphological character I will now endeavour te show with regard to the cell-wall. The formation of the cell-wall is commonly considered as a function of the parietal protoplasm and must necessarily repose on the action of factors or heredity units. For some microbes this process is clearly caused by one or more enzymes and this is distinctly the case when the wall substance consists of levulan. This matter results from canesugar (and slow.er and less profusely from rafïinose), but from no other substances. It forms the cell-wall of many species of sporulating bacteria, such ') This theory I first advanced, though with some doubt, in: Mutation bei Mikroben, Folia microbiologica, Bd. i, pag. 2, 1912, but now the difficulties are overcome. 255 ab B. megatherimn and also the common hay bacterium B. mesentericus, but only if f ed with cane-sugar. The levulaii arises in two ways ; it either remains in contact and entirely united with the bacterial body as a slimy cell-wall, in which case on cane- sugar-agar plates strongly swelling colonies develop, or the levulan is deposited outside the bacterial body at some distance from the colony. If the latter takes place the remarkable reaction occurs which I have called the »emulsion reaction« i). lts ex- planation was given by the discovery of a specific exoenzyme, viscosaccharase, which acts on cane-sugar and converts it into levulan slime, which is incapable of diffusion but attracts water, so that droplets are formed causing a «trong swelling of the agar. This enzyme, acting synthetically and evidently polymerising the cane-sugar, might as well be called saccharo-levulanase and is obviously one factor of the factorcomplex that governs the cell-wall formation. That it is not the only one foUows from the fact that some levulan bacteria, for instance the hay bacterium itself, when fed with other sugars, produce another not slimy wall-substance, probably cellulose, which likewise derives from cane-sugar beside levulan, but only in slight quantity. If the production of cellulose is brought about by one or more factors is not yet known. As to the visco- saccharase, however, there is not the least doubt but that it consists of one single enzyme or factor. Hence it may be concluded that it is quite well possible to become acquainted with the separate factors of a process at first sight so complicated as the formation of the cell-wall, and it may safely be predicted that further experiments will show whether the cellulose production also depends on one single or on more than one enzyme. On the other hand, at the factor analysis by crossing experiments with higher plants and animals, without the guidance of the enzyme conception, we are continually in doubt whether a factor, thought to be elementary, will not, on continued examina- tion, prove to be composed of other still unknown factors. As to dextran I have stated elsewhere ^) that it is a wall substance comparable to levulan, likewise only resulting from cane-sugar, but produced by some lactic acid ferments, belonging to the physiological genus Lactococcus. Dextran, however, never originates independently from the cell, as may occur with levulan, but exclusively at the surface of the outer layer of the protoplasm and in direct contact with it. But the knowledge of the relation between levulan and its producing enzyme, viscosac- charase, indicates clearly that dextran, whose properties are so analogous to those of levulan, must have a similar origin. It is therefore most probable that dextran also arises under the influence of one single factor or specific enzyme, which might be called saccharo-dextranase, but which, being an endoenzyme, cannot leave the cell. The formation of the slime wall by B. prodigiosum viscosum ') must be brought about by at least two factors, differing from levulanase and dextranase since the slime produced by this bacterium, belongs to the celluloses or cellulan-slimes. That beside the slime factor, which might be called cellulanase and which produces cellulan ') These proceedings 9 February and 2 Mei 1910. Folia microbiologica Bd. i pag 382, 1912. ^) Die durch Bakterien aus Rohrzucker erzeiigten Wandstoffe. Folia microbiologica. Bd. I, page 392, 1912. ') B. prodigiosum viscosum is no natural form but a mutant or race, easily obtained rom B. prodigiosum. Folia microbiologica, Bd. i, pag. 35, 1912. 256 from carbohydrates, still quite another factor operates here is proved by the following observations. By feeding this bacterium with glucose, cane-sugar, maltose or lactose, walI slime is readily yielded. In several other species, for instance Aerohacter viscosus and Bacillus polymyxa we find the same. But B. prodigiosum can besides produce slime from albuminous substances such as gelatin and peptone, which B. polymyxa and A. viscosus cannot. As now it is quite unacceptable that one and the same factor could beableto produce cellulose slime as well from proteids as from carbohydrates, B. prodi- giosum must possess a specific factor able to split off from the albuminous matter an enzyme-substrate, converted* into cellulose slime by the wallforming factor. But this proteid-splitting factor does not exist in B. polymyxa and A. viscosum. B. prodigiosum viscosum is thus a mutant, distinct by at least two factors from B. prodigiosum itself, which produces no slime at all, neither from carbohydrates nor from proteids. It must thus be possible to detect another still unknown mutant lacking the factor to produce from proteids a substrate that can be converted into slime, that is a mutant capable to produce slime from carbohydrates only and not from proteids. A great number of other examples might be added demonstrating that the specu- lations about the heredity units or factors have relation to enzymes. Limitation of the ensyme conceptiou. In my opinion the preceding may lead to a better enzyme conception than the existing. I will try to elucidate this by a few instances taken from the cecidia or galls and the substances called ferments in immunology. Elsewhere I pointed out that the change of the plant at gall-formation is not hereditary. From the galls of Nematus viminalis, kept on moist sand, quite normal roots of the gall-bearer Salix purpurea, and from those of the gall-fly Neiiroterus Icnticularis on oak-leaves, quite normal oak roots may arise ^). From the axil-buds of the willow-rose, caused by Cecidomya rosaria on Salix alba, I have cultivated quite normal willow trees; likewise I grew normal plants of Poa nemoralis from the bud in the remarkable gall of Cecidomya poae, whose strange metamorphic roots readily develop into normal roots, when the whole gall is planted in earth 2). By strongly pruning the twigs of Rosa canina whereon Bedeguars deve- loped, caused by the gall-fly Rhodites rosae, the wonderful appendices of this gall changed into long-petiolated, simple, green leaflets, whose anatomie structure and external appearance were quite identic with those of the leaf on which the gall originates. These instances, to which I could easily add others, show that in the formation cf galls two groups of substances are concerned: the protoplasm of the plant, consi- sting of the unchanged heredity units, and substances deriving from the tgg of the gall-animal, or from the larva of Cecidomyia, which evidently have the character of enzymesubstrates. It is however clear that the heredity units concerned in the mor- phologically higher galls, multiply more intensely, in any case become more numerous ') Only very few LgMiicw/arügalls possess this disposition, which is probahly connectcd with the spot where the gall grows on the leaf. -) Botanische Zeitung 1886. 257 iinder the influence of the gall-animal than under norinal circumstances. Hence we come to the conclusion that either the enzyme-substrates may serve as food for the heredity units or enzymes to which they belong and may give rise to their multi- plication, or that the gall-animal, beside the enzyme substrate, also supplies »enzymo- sites«^), that is to say a special »enzyme food«. The latter supposition will pro- bably be the right one, for the real enzymes are in their origin in no way dependent on their substrates, as we learn from almost every experiment with microbes 2). The enzymosites apparently correspond to A b d e r h a 1 d e n's »Bausteine« of the specific living proteids, that is of the protoplasm. That, in case these enzymo- sites differ, different heredity units or protoplasm micells will develop from the mix- ture of units from which the latter is built up, is to be expected. For if we remember in how remarkable a way in elective culture experiments with microbes, the thereby obtained floras depend on nutrition, we may safely conclude that the same will be the case in the subtle world of protoplasm molecules. That from the gall-animal no enzymes pass into the plant, is in accordance with the fact that foreign exoenzymes commonly do not enter living cells. The diastase, which in the distilleries occurs in great quantity in the food of yeast, which consists for a great part of malt, does not penetrate into the yeast-cell. Experiments pur- posely carried out with other exoenzymes and various kinds of other microbes have invariably given the same result. The possibility of endoenzymes passing by diffusion from one living cell into another is of course wholly excluded^). On the other hand, in the range of immunology, facts are known which prove that living cells sometimes take up enzymes from their surroundings. In those cases namely when acquired immunity is hereditary the thereby con- cerned substances must needs belong to the heredity units, hence to the enzymes. They give evidence that D a r w i n's view, according to which the »gemmules« of his pangenesis hypothesis freely move within the organism, is true in certain cases, at least for the higher animals. Non-hereditary immunity might be caused by freely moving enzymes, unable to enter the cells. Van C a 1 c a r's opinion that the anti-bodies of the serologists are ferments, that is enzymes, is thus undoubtedly right. He says"*^) : Whichever immunity reaction is examined, it is constantly found that the whole course of these reactions depends on the action of two substances, one of which having in all respects the character of a *) Sitos, food. ^) Many diastatic bacteria for example produce diastase without the presence of amylum in their food. This must be ascertained by a special experiment^ amylum being the only known reactive on diastase; the literature proves that this has sometimes been forgotten bv the investigators. ^) It is not impossible that endoenzymes such as zvmase are to some degree capable of ordinary diffusion (which is quite another thing than penet rating into living protoplasm) . Gelatin can slightly penetrate into agar, Ukewise starch and even the carbon of Indian ink. Gold seems able to penetrate indo lead. In the protoplasm of luminous bacteria no disposition for diffusion is to be observed. However the pathological light of Noctüuca miliaris, described bydeQuatrefages, seems torepose on the entering of the photoplasnf or luciferase into the cell-sap in which the luciferine must then be dissolved. *) R. P. van Calcar, Voordrachten over algemeene biologie, pag. 182 and 188, Leiden 1915. M. W. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. •• I? 258 ferment, the other that of an enzyme-substrate to be decomposed by that ferment. The ferment-like substances are called »anti-bodies«, the various substrates they act upon, »antigens«. In my opinion there is however no sufïicient ground also to call the antigens and the complement »enzymes«, as is done by several investigators. If these substances are considered as enzymes only because of their action after injection into the blood of higher animals, it will be necessary, in order to be consi- stent, likewise to bring to the enzymes toxins and even some common coagulable proteids, which would make this word lose its real significance. Whereas in the descriptive sciences the necessity is feit to designate by special names even but slightly differing objects, it would be an error to attribute to the words enzyme and ferment a continually varying and wider meaning no more in accordance with the original con- ception. On the other hand it is clear that further knowledge about the enzymes or factors may necessitate the creation of new names to mark the vast difïerences between them, as now we are already compelled to use the words exo- and endoenzymes. There is still another group of bodies worth being considered from the new point of view, namely the viri in general and in particular those of plant diseases, such as tlie mosaic disease of the tobacco. They clearly belong to the enzymes or factors, although commonly not hereditarily transported. But the further discussion of this point must be deferred to later. The only place in literature, hitherto come to my knowledge, where an hypothesis is indicated somewhat corresponding to my view, is to be found in B a t e s o n. He says^): »Über die physikalische Natur der Erbeinheiten können wir noch nichts aus- sagen; die Folgeerscheinungen ihrer Gegenwart sind aber in so vielen Fallen mit den durch Fermente hervorgerufenen Wirkungen vergleichbar, dass wir mit einiger Be- stimmtheit annehmen, dass die Fahigkeiten einiger Erbeinheiten im wesentlichen in der Bildung bestimmter Substanzen bestehen, welche in der Art von Fermenten wirken.« Although the observations on which this statement is based are in accordance with the enzyme theory, it is clear that B a t e s o n's view is quite different from mine. O W. Bateson, Mendel's Vererbungstheorien, pag. 269, 1914 (Translation of the English edition of 1909). Levüres chromogènes. Nouvelle réaction biologique du fer. Archives Néerlandaises de Physiologie de rhomme et des animaux, tome II, 1918. p. 609—615. Diverses levüres du lactose^), ainsi que »la levüre a graisse«, Saccharomyces pulcherrimus, ont la propriété de secréter, dans des conditions de nutrition favorables, un chromogène incolore, qui, en présence d'un sel de fer et lorsque l'air a librement acces, donne par oxydation un pigment rouge foncé. Ce pigment a Ie carac- tère d'un acide et donne avec de fortes bases des sels incolores, qui, acidifiés, pro- duisent de nouveau des solutions rouges. C'est un corps tres stable, qui ne se trans- forme même pas par ébullition en présence d'acide sulfurique. Il est soluble dans l'eau et se dissout Ie mieux en extrayant a la potasse caustique la matière rouge qui a pris naissance pendant Ie développement du ferment, — matière qui se compose en partie du substratum nourricier, coloré en rouge, en partie de cellules de levüre, aussi colorées en rouge parce qu'elles ont absorbé la matière colorante, — puis, filtrant Ie liquide incolore et acidifiant ensuite Ie filtrat clair, qui par la se colore de nouveau en rouge, sans se troubler. D'après les propriétés mentionnées Ie pigment pourrait être considéré comme une substance appartenant au groupe des anthocyanes, s'il n'était pas ferrifère, ce qui parait ne pas être Ie cas pour Ie véritable anthocyane. Il ne parait pas avoir de rapport avec les carotinoïdes, qui colorent ce qu'on appelle les »levüres rouges« (Blastomyces et Cryptococcus). La matière colorante ne peut pas être extraite a l'alcool, a l'éther, au sulfure de carbone, au chloroforme, au tétrachlorure de carbone, ni au benzène. Pour obtenir Ie pigment on doit connaitre les conditions de culture des espèces de levüres qui inter- viennent. Des plaques d'extrait de malt a 2% d'agar et contenant un peu de sel de fer, conviennent parfaitement pour obtenir la matière colorante a l'état rouge pur, au moyen de Saccharomyces pulcherrimus, et elles peuvent aussi servir pour isoler du lait de beurre les levüres du lactose, génératrices du pigment. Mais pour isoler les dernières espèces il est recommandable d'ajouter 2% de glucose a l'agar a l'extrait de malt, servant de substratum nourricier. Sur les plaques d'agar au glucose et a l'eau de levüre, contenant du sel de fer, les ferments du lactose produisent un pigment brun foncé au lieu d'un pigment rouge. *) La teinte rouge de beaucoup de levüres du lactose sur des plaques d'agar au serum de lait est due a la présence de fer dans Ie lait. 26o Comme la formation de pigment a lieu plus facilement et plus abondamment avec Saccharomyces pulcherrimus qu'avec les levüres du lactose, nous ne parlerons plus des dernières, mais seulement de la première levüre. Lorsqu'en automne, ici a Delft, on met dans des flacons contenant de l'extrait de malt, faiblement acidifié a l'aide d'acide lactique et auquel on a ajouté 235% de glucose, des raisins provenant du Westland, et qu'on place ces flacons dans une étuve a 30" C, Ie liquide entre toujours en fermentation alcoolique. Comme l'acide a uni- quement pour but d'arrêter dans leur développement les bactéries du groupe Colt (Bacterium lactis aerogenes et B. coli), il sufïit d'acidifier jusqu'a 234 cm^. d'acide normal sur 100 cm^. d'extrait de malt. Au début on ne trouve alors que diverses espèces de ferments alcooliques; mais, a mesure que la culture est plus vieille, et surtout par transplantation, on voit se développer aussi les bactéries du vinaigre et les ferments lactiques, qui d'ordinaire existent aussi sur les pellicules des raisins. Si l'on fait des cultures de ces ferments alcooliques sur des plaques d'agar a l'extrait de malt, on constate que les ferments du maltose y sont rares^), mais on obtient toujours des colonies de Saccharomyces apicu- latus, reconnaissables Ie plus souvent, mais pas toujours, a la forme en citron des cellules, souvent aussi Ie mycoderma ordinaire du vin (S. mycoderma) et a cóté de cela quelques autres espèces de levüres du glucose, plus difïiciles a déterminer. Si l'on garde ces dernières pendant quelque temps en culture pure sur de l'agar a l'extrait de malt, on constate que l'espèce la plus répandue parmi ces microbes est la levüre a graisse, Saccharomyces pulcherrimus, qui alors se reconnait tres aisément au dépót de globules de graisse dans les cellules pas trop jeunes. C'est un véritable ferment des monoses, qui peut produire de l'alcool aux dépens de glucose, de saccharose et de mannose, bien qu'en petite quantité seulement, mais pas aux dépens de maltose ni de lactose. Le maltose peut donner une croissance vigoureuse lorsque l'aérage est parfait. Le saccharose est interverti. La meilleure source d'azote est la peptone, mais l'aspara- gine aussi peut être employee comme telle, et moins bien encore les sels d'ammonium. La graisse, qui se présente dans les cellules sous forme d'une seule grosse goutte, peut remplir 60 a 80% de tout le volume de la cellule, et les cellules d'abord petites, mesurant 3,5 a 4 jlX, se dilatent alors jusqu'a prendre les dimensions de cellules de levüre ordinaires (6 a 7 fi), en devenant parfaitement globulaires, et présentent au microscope la belle image, se caractéristique pour 5". pulcherrimus, de cercles enfermés dans six autres de mêrne grandeur. J'ai déja décrit cette espèce de levüre a deux autres occasions, a propos de son extraordinaire mutabilité ^) et en vue de la possibilité d'une importance pratique de la formation de graisse "■) ; j'ai fait remarquer alors que 5". pulcherrimus parait être un hóte régulier du jabot du bourdon et qu'on le trouve aussi dans le miei des abeilles visitant la bruyère ordinaire. Je l'ai rencontre quelques fois dans le nectar de fleurs (espèces de Lamium) et d'une faqon tres générale dans la poussière sèche qu'on obtient en polissant les grains de malt, de sorte qu'il parait pouvoir se développer a la surface des grains d'orge germant. ') Sur des raisins provenant de Belgique, par contre, j'ai toujours trouve aussi des levüres du maltose appartenant au groupe S. pastorianus. ^) Mutation bei Mikroben. Folia microhiologica, i, 75, 1912. *) Dans ma conférence faite a la Société Technologique de Delft, le 10 février 1916. »Sur la formation d'albumines, d'hydrates de carbone et de graisses par les microbes. « 26l En exaniinant au microscope les liquides en fermentation, dans lesquels existe Ie S. pulcherrimiis, on ne voit pas du tout de graisse dans les cellules, ce qui fait qu'il est difficile et même inipossible de les distinguer d'autres espèces de levüres. En semant dans un bon liquide nourricier les cellules remplies de graisse et en observant au microscope la multiplication de ces cellules, on voit que déja la première génération gemmaire est exempte de graisse. Mais, si l'on fait la même expérience après avoir ensemencé sur un substratum solide, on constate que certaines cellules a graisse pro- duisent des bourgeons qui a leur tour se remplissent bientót de graisse après leur formation, tandis que d'autres cellules donnent naissance a des descendants sans graisse. Ces cellules exemptes de graisse ont un caractère tres variable; elles peuvent notamment, après avoir produit quelques générations de cellules qui ne contiennent pas de graisse, revenir a la formation de graisse, ou bien elles peuvent, par multipli- cation, se transformer en une race qui a totalement perdu la faculté de former de la graisse. J'ai donné a cette dernière race Ie nom de Saccharomyces pulcherrimus se- cundarius et, a cause de sa grande constance, je l'ai considérée comme une mutation. Il est pourtant possible, en partant de cette race, de retourner a la branche adipogène primitive, parce que dans les vieilles cultures il se forme, dans des conditions fa- vorables, p. ex. sur l'agar a extrait de malt ou la gelatine a extrait de malt, toujours quelques colonies ou l'on retrouve des cellules remplies de graisse, qui peuvent de nouveau transmettre par hérédité Ie caractère adipogène. Mais je n'ai jamais pu obtenir une race constante, exclusivement composée de cellules produisant de 'a graisse. D'après de ce qui précède, la formation de graisse est fortement influencée par l'air et elle ne s'observe bien que sur un substratum solide richement pourvu de matières nutritives, ce qui reduit presque a zéro la valeur pratique de cette espèce. La nature de la graisse est encore incertaine; il est difficile de la retirer des cel- lules, parce que les solutions dans l'éther ou dans d'autres solvants ne diffusent presque pas a travers les parois cellulaires. Le globule graisseux n'est pas tout a fait homogene, mais il se compose en partie d'une autre substance car, traitée a la potasse caustique, il se produit une granulation du globule, qui est peut-être de nature albu- minoïde. Les cellules du mutant S. p. secundarius sont entièrement remplies de proto- plasme, ou contiennent en outre une grande vacuole et parfois aussi le granule rond bien connu, que l'on trouve dans beaucoup d'espèces de levüre, qui a conduit a établir le »genre« artificiel Toruia. Ce granule est en réalité un »élaioplaste«, oü la graisse se dépose et peut-être aussi se forme. Le globule de notre levüre semble donc aussi être un élaioplaste rempli de graisse et qui peut tres facilement devenir inactif sans disparaitre complètement. La propriété remarquable de donner avec des sels de fer un pigment rouge, présentée par cette levüre, tant par la forme principale que par la mutante secun- darius, était restée inobservée jusqu'ici. Il est vrai que d'autres observateurs avaient déja remarqué que le 5". pulcherrimus peut prendre une teinte rose^), mais le fait que cela n'a lieu que par la présence de fer dans le substratum nourricier, auquel le phénomène doit son importance, était resté inconnu. Or, une fois qu'on sait cela, on ') H. Euler, Chemie der Hefe und der alkoholischen Gahrung, p. 39, Leipzig, 1915. 262 peut faire avec cette levüre plusieurs expériences importantes, dans lesquelles, tout comme dans la formation de graisse, on est frappe de la variabilité particulièrement grande du caractère »pigment«. Comme je l'ai déja dit au commencement, il s'agit ici de la production d'un chromogène incolore spécifique qui produit Ie pigment rouge en se combinant avec Ie fer et avec l'oxygène de l'air. Pour en étudier la formation on peut employer les substratums les plus divers. L'agar a extrait de malt avec quelques millièmes de citrate ferrique convient tres bien. Dans Ie cas oü on désire avoir un substratum de culture incolore, la recepte suivante est a recommander: Eau de canalisation 100 Agar 2 Saccharose 2 Glucose 2 Peptone sèche 0,1 Asparagine 0,2 Phosphate acide de potassium 0,1 acidifiée par quelques gouttes d'acide phosphorique et melangée de 20 a 40 mgr. de citrate ferrique. Dans ce cas, comme dans tant d'autres, on a constaté qu'une nourri- ture »mixte« produit une croissance beaucoup plus vigoureuse que les matières nutri- tives simples, prises isolement, ce qui explique cette composition un peu compliquée. Au lieu de citrate ferrique on peut prendre tout autre sel ferreux ou ferrique soluble. Si Ton sème sur un pareil terrain un tres grand nombre de cellules, on obtient, a 30° C, déja au bout de 24 heures une culture fortement développée, qui, toutefois, ne commence a presenter la couleur rouge qu'au bout de 2 fois 24 heures et devient alors peu a peu de plus en plus foncée dans Ie champ de diffusion du fer. Si l'on n'a pas ajouté de sel de fer au terrain de culture, Ie développement se fait tout a fait de la même faqon, mais les colonies restent incolores ; il est donc clair que la levüre n'a pas du tout besoin de fer pour se développer. Lorsqu'on introduit dans une de ces plaques une petite quantité de sel de fer, p. ex. du chlorure ferrique, du citrate ferrique, du sulfate ferreux ou du sel de IMohr, il se forme au bout de quelques jours un pigment rouge foncé dans Ie champ de diffusion du fer. Si l'on a recouvert la culture partiellement d'un couvre-objet, de faqon a empêcher l'accès de l'air, on voit que la coloration ne s'y produit pas, même s'il y a assez de sel de fer. Le pigment rouge est donc une combinaison de fer qui se forme par oxydation. On démontre aisément et de diverses faqons que le pigment est formé par un chromogène incolore, qui produit le pigment rouge, aussi bien dans la cellule qu'au dehors, en présence de sel de fer et d'air. On peut s'en convaincre le plus facilement en n'ajoutant au terrain de culture qu'une toute petite quantité de sel de fer, p. e. 10 milligrammes de citrate ferrique a 100 cm'. Le Piilcherrimus inoculé en traits sur ce substratum ne trouve pas alors assez de fer dans son voisinage immédiat pour fixer immédiatement toute la matière chromogène formée; celle-ci a l'occasion de diffuser en partie hors des cellules et de se transformer dans le pigment rouge dans le terrain de culture même, c. a d. a l'ex- térieur des cellules. On peut aussi laisser se développer des traits de Pulcherrimus sur un terrain de culture exempt de fer; la levüre y déverse alors sa matière chromo- 263 gene incolore, qui se propage par diffusion jusqu'a quelque distance du trait, et on peut alors colorer au inoyen d'un sel de fer la matière chromogène ainsi éloignée de sa source. A des concentrations élevées du sel de fer les cellules elles-mêmes se colorent en rouge. Mais alors les cellules meurent prématurément, ce qui explique Ie phc'nomène remarquable suivant. Le pouvoir de produire la matière chromogène est une propriété fort variable: des cultures conservées pendant longtemps donnent naissance a des colonies, dont la teinte varie entre le blanc permanent et le rouge foncé ; il est, par la, aisé d'obtenir des races plus OU moins constantes, et c'est surtout une race qui reste tout a fait incolore qui prédomine, une race qui n'a donc rien de commun avec le mutant Secundarius, dont il a été question ci-dessus. Ce n'est qu'en partant de jeunes cultures colorées qu'on peut, par de nouveaux ensemencements, obtenir uniquement des colonies identiques qui se colorent en rouge par le fer. Mais dans la grande majorité de ces colonies il se produit, par vieillissement, une transformation, dans laquelle prennent de nouveau naissance des cellules qui se colorent moins bien avec le sel de fer ou ne se colorent même pas du tout, donc ne produisant pas le chromogène. Lorsqu'on sème a nouveau des cellules de pareilles colonies vieillies et transfor- mtes, il se développe le plus souvent seuleinent des colonies qui restent tout a fait incolores, parce que les cellules formant la matière chromogène ont accumulé la matière colorante rouge et sont mortes par la. On voit donc qu'a concentration élevée le pigment, donc le fer, devient un poison pour les cellules non transformées, tandis que les cellules variées achromogènes y sont immunes. Aucun organisme ne se prête aussi bien que le Pulcherrimus a l'étude de cette forme de variabilité ou de mutabilité, et une culture de cette levüre sur une plaque d'agar a l'extrait de malt et au citrate ferrique constitue, lorsqu'elle est dans un état de forte mutabilité, une préparation aussi interessante pour l'étude de ce phénomène important que les mutations dans le caractère adipogène décrit au commencement. Laboratoire de Microbiologie de l'Université technique de Delft. The Significance of the tubercle bacteria of the Papilionaceae for the host plant. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol, XXI, 1918, p. 183—192. — Verscheen onder den titel »De beteekenis der bakteriën van de Papilionaceënknolletjes voor de voedsterplant« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXIV, 1918, blz. 1456-1465. A s there is no reason to doubt of the accuracy of H e II r i e g e I's 1) experiments, _X JL it appears certain that the bacteria of the nodules on the roots of the Legu- minosae are indispensable for the fixation of atmospheric nitrogen by these plants^). But I shall prove that the theory, at present generally adopted, according to which this process takes place only within the tubercles, cannot be correct. But previously some remarks on the occurrence of the tubercles and the cultivation of bacteria from them. For some plant species such as serradella (Ornitlwpiis sativus) and the yellov^r lupine (Lnpinus Intens), it cannot be doubted that only the tubercle-bearing specimens grow vigorously in nitrogen-poor soils and consequently, after the theory, fix the atmo- spheric nitrogen. It is therefore easy on poor heath fields to find languishing, stunted lupine plants, always devoid of nodules, amid the luxuriantly growing tubercle-bearing ones. Never did I find there well-developed lupine or serradella plants quite without them. But the number of tubercles is of no consequence, it evidently suffices if only few come to development. In garden experiments on open sandbeds, without supply of nitrogen, but where inevitably more nitrogen compounds occur than in heath soils, also in peas and beans (Vicia f aha), plants with nodules grow better than those devoid of them. In fertile garden soil such as in the laboratory garden at Delft, yellow lupine and serradella do not fuUy develop, and especially their roots make the impression of sickliness; tubercles do not grow on them, not even when the soil has been abundantly provided with the concerned bacteria. Whether the latter die in the soil or are not attracted by the roots of the plant is not vet clear. Alost other leguminous plants, such ^) H. Hellriegel und H. Wiifarth, Untersuchungen über die Stickstoffnahrung der Gramineen und Leguminosen, Zeitschrift für Rübenzuckerindustrie, Beilageheft November 1888. See further the excellent treatise of Hiltner, Bindung von freiem Stickstofï in höheren Pflanzen, in Handbuch der technischen Mykologie, Bd. 3, 1903 — 1905. ^) For the objective proof that here free atmospheric nitrogen is fixed see, besides Hellriegel (1. c. p. 191), Schlösing et Laurent, Fixation de l'azote libre par les plantes, Ann. de l'Institut Pasteur, Tomé 6, pag. 65, 1892. 265 asclover,F/cm,peas and Ficia faba, bear also in fertile soil many nodules, and it is not easy to find specimens whoUy devoid of them, unless the soil has been previously sterilised. On the roots of Genista anglica and Genista pilosa, growing on poor heath fields, I found after long seeking only very few tubercles, although they and in particular the former, bore many pods with good seeds; the tubercles are, however, never quite absent. When sown in my garden at Delft or brought there as plants, they die after some few years. On the other hand, Genista tinctoria thrives as well at Delft as along the highway of Zutphen to Vorden and at both places bears a small number of nodules. For Robinia pseudo-acacia the favourable influence of B. radicicola only on the young plant, has been stated by Nobbe^). As to fuUgrown specimens on poor heath soil at Gorssel I could after long digging find but few tubercles, while at a small distance, but on somewhat better soil more tubercles occurred, but still so little numerous, that nobody would attribute to them any direct significance for such a large tree, had not the fixation of nitrogen in the tubercles become an inveterate belief. Sarothamnus viilgaris and Ulex europaeus behave in the same way as Robinia. On Phaseolus vulgaris on sandy soils I found but few nodules, and then only on thin rootlets and nearly always enclosed by plant remains; in the pure sand the nodules are very rare. In garden soil at Delft Phaseolus produces no nodules, but it does in a there arranged sandbed; Lupinus luteus and Serradella behave likewise. When comparing the various mentioned plants, all noted in agriculture for their power of ameliorating the soil, as they contain in their dry substance nearly doublé the quantity of nitrogen found in other plants, for example the grasses, we come to the conclusion that only for lupine and serradella the number and weight of the tuber- cles is of some significance in regard to the whole weight of the plant. For other species they are of so little volume that even if within them free nitrogen were fixed with great intensity, only an extremely little quantity of fixed nitrogen could be ex- pected, whilst in reality this amount is very considerable. Hence the theory, at present generally accepted, after which the fixation takes place in the nodules only, requires reconsideration. Also other experiences make this reconsideration necessary. But previously a few remarks on the isolation of the bacteria from the nodules and from other materials, and on the question of their specificity . An very convenient medium for isolation was already described in 1888 -), namely pea leaves- or clover-extract-gelatin with 2% cane sugar. B. radicicola grows thereon in soft, non-liquefying colonies, while B. ornithopodis from Ornithopus perpusillus, O. sativus or Lupinus luteus, when isolated in the autumn or in March, liquefy some- what, as does B. hcrbicola ^). As a solid medium, poor in nitrogen compounds, I recommend a plate of: Tap- ') Hiltner l.c. Also Büsgen, Eau und Leben unserer Waldbaume, 2. Aufl., pag. 246, 1917. ^) Botan. Zeitung 1888, pag. 764. '^) Occasionally a great number of colonies of B. herbicola are obtained from the tubercles; whoever is unacquainted with this species may make mistakes in the isolation of B. radicicola. But even with this knowledge the isolation of serradella- and lupine- bacteria is difficult. Good descriptions of these forms do not exist. 266 v/ater loo, agar 2, cane sugar i, starcli J, bipotassium-phosphate 0,05, in which, be- cause of the all)uminous matter of the agar, enough fixed nitrogen is present tö cause a distinct growth of B. radicicola, but the colonies remain small. Later a little salt- petre or ammoniumsulphate may be added locally, which makes the tubercle bacteria like the other saprophytes thrive well, showing that they do not assimilate the free atmospheric nitrogen. If on such a plate eventually germs of Azotobacter, which is able to assimilate free atmospheric nitrogen, are present, these will grow quite well if no nitrogen compounds are added. Such nitrogeri-poor plates are also useful to recognise the spore-bearing soil bacteria, which almost constantly appear at the isolation of B. radicicola. I only call tubercle bacteria those species which develop mutually identic colonies by thousands or hundreds of thousands from the externally well-sterilised and cau- tiously crushed nodules. These bacteria derive for the greater part from within the cells. I consider the deviating and less numerous colonies obtained at the culture ex- periments as the product of germs accidentally present in the intercellular cavities of the rind of the nodules i). That the full-grown bacteroïds cannot develop on the plates is well-known; hence bacteria may be expected from the tubercles only in the begin- ning of their development. It is an important and until now not yet sufficiently investigated circumstance that from the tubercles of the same plant not always the same bacteria are obtained. So I found for Ornithopus perpusillus the bacteria I had isolated in March different from those grown in October, whilst the tubercles came from plants growing side by side and being in the same state of development. With the yellow lupine and serra- della I had similar results. In most other cases, however, for example with Pisum, Lathyrus, Vicia, and Trifoliniii. the similarity of the various mutually in- dependently isolated stocks is so complete and the image of B. radicicola can so distinctly be recognised, that the above observation requires nearer confirmation. But we cannot now enter upon this point. When trying to isolate B. radicicola from materials other than the nodules, for example from the soil and from the dying surface cell-layers of the root, it proves very difficult to recognise this species amid the numerous other saprophytes, especially when the number of the germs of the difïerent species is to be determined quanti- tatively. B. üuorescens liquefaciens causes much trouble by the liquefying of the ge- latin plates, and yet it is necessary to use these plates as on them the colonies of all the species lie free from one another, while on agar they are overgrown and rendered unrecognisable by B. ftuorescens, which extends strongly sideways. Concerning the question if oidy one or more species of tubercle bacteria exist the followinp. Already in 1892 experiments thereabout were made by the late H e 1 1 r i e g e 1 -) in the experimental station at Bernburg with pure cultures of the bacteria made by myself at Delft. Of his results H e 1 1 r i e g e 1 sent me two reports. In the first, dated 24 July 1^92, he gives as »Augenblickliches Hauptresultat» : »Es gelingt mit den ') Besides B. radicicola B. herbicola can also occur within the living cells. *) He died 24 September 1895 of a stomach disease and was already suflfering when I visited him at Bernburg in i8()2. 267 Rcinkulturen von B. radicicola var. Pisi oder von l'icia faba, die Erbsen und Bohneii, und mit denen des Bac. radic. var. Liipin. oder Ornithopodis Lupinen uiid Serradella erfolgreich zu infiziren und zum VVachstum resp. der Assimilation des freien Stick- stoffs zu bringen, und das ist was unsere anfangliche Behauptung bestatigt«. Already ,oarlier H e 1 1 r i e g e 1 had arrived at the conclusion that the bacteria of Liipinus and Ornithopus belong to a species different from that of Pismn and Vicia, which was also my own opinion. In later years many interesting experiments were made in this direction, especially by H i 1 1 n e r. Yet the evidence is unsatisfactory as it proved hitherto impossible in the sand cultures ^) to bring Leguminosae to complete develop- ment by infection with B. radicicola only and with exclusion of all other microbes. Such cultures are ahvays at the end of the vegetation period rich in various other species, in particular in B. fluorescens liquefaciens and the nitrogen-fixing spore-for- ming Granulobacter (Clostridium) pasteuriayium and Helobacter cellulosae. This ob- servation holds good as well for the first experiments made by myself as for those of others, and this should never be lost sight of when reading the descriptions of the infection experiments with the so-called »pure cultures«. It had not escaped Hell- r i e g e I's attention, and we see it in all the photographs of his above mentioned treatise at the film of the glass vessels, wherein he cultivated his plants (in bright daylight), which film consisted of Chlorophyceae and various other species of mi- crobes, but he thought it of no consequence (1. c. p. 169). For myself I have ob- served in nitrogen-free sand, besides the mentioned species, Chlorella and Cystococcus and sometimes also Palmella cruenta and many Cyanophyceae. Many of my later efforts to bring clover plants to complete growth on agar with nutriënt salts and E. radicicola in large cotton-plugged E r 1 e n m e y e r-flasks, failed as the plants ceased to grow before they blossomed, although the nodules developed very well. Tlie tubercle bacteria do not üx the atmospheric nitrogen zvlien cultivated in nutriënt media. I will now call attention to my chief subject namely the want of power of the tubercle bacteria to fix the free atmospheric nitrogen. They do this neither when culti- vated out of the plant nor wihin the nodules. Regarding the first point the experiment is very simple. We have but to crush the nodules and bring the thus obtained material into culture soils used for the ordinary experiments to fix free nitrogen and then cultivate at 20" to 30" C. ; or we use the pure cultures for infection of the same media. A convenient medium is: Tapwater 100, Glucose 2, Dikaliumphosphate 0,05, lime 2, fresh garden soil 2. This liquid, to which ihe garden soil is added as a catalyst, must previously be sterilised to kill the germs of Azotobacter, Granulobacter and Helobacter; notwithstanding the sterilisation, the soil preserves its catalytic power very little impaired. The spores of the nitrogen-fixing Plelobacter and Granulobacter often adhere to the nodules and, when present, fermen- tation phenomena show that the experiments cannot be relied upon, B. radicicola not causingfermentation.Commonly however, these fermentingandnitrogen-fixing microbes can be removed by thoroughly washing of the nodules with alcohol and water. In the ') It is a well-known fact that the Papilionaceae, when cultivated in iiquids, do not fix thf; atmospheric nitrogen indifïerently whether they produce tubercles or not. 268 course of many years I have experimenteel in this way with numerous species of tubercle bacteria, and with many modifïcations in the nutriënt media as well in the temperature as in the source of carbon. Moreover I have, as said, tried to grow pure cultures of the bacteria themselves in the liquid culture medium as also on solid culture soils of various compositions, and at first I thought I had observed a rather considerable increase of these organisms. This increase, however, proved to be really veryslight,soslight that gain of atmospheric nitrogen is not proved, whilst the obvious augmentation of dry weight of the sown bacteria derives from the formation of thick slime v^^alls, that is of nitrogen-free, cellulose-like substances around the hardly aug- mented original protoplasmic material ^). Only when cultivating the microbes in plant extracts with cane sugar, wherein nitrogen compounds are evidently present, I could observe a very slight and by no means convincing increase of the total nitrogen rate of the liquid in consequence of the growth of B. radicicola. But when performing these experiments I was not yet acquainted with the circumstance that laboratory air contains sufficiënt carbon and nitrogen compounds to be made perceptible by the growth of microbes which can feed on them. This was afterwards demonstrated by Ir. A. van D e 1 d e n and myself in our investigation on Bacillus (Actinobacillus) oligocarbophilus ^). There exists moreover an aerobic spore-producing bacterium ''), hard to kill by sterilisation of the nutriënt liquids, which fixes f ree nitrogen; at that time it was still quite unknown to me and even now it is very imperfectly understood. It may have been present at my experiments likewise as at those of other investigators who think they have observed fixation of free nitrogen out of the plant in the pure cultures of B. radicicola. With sufficiënt precautions the results of such experiments are however always the same: The bacteria of the nodules do in no way fix the free atmospheric nitrogen. When the experiments are performed, not with nutriënt liquids, but with a solid medium, the results are quite the same: fixation of nitrogen does not take place then ^ither. Stress must be laid on the latter fact as it seems impossible to fix free nitrogen by the Papilionaceae when cultivated in liquid media even under the best circumstances and whether tubercles are produced or not. So it seems probable that for this process a direct contact with the air is necessary, which cannot be realised in the liquid culture media, but very well in solid ones. Further it must be observed. that the plate cultures of some of the nodule organisms'^), for example the forms from Pisuni, Vicia, and Trifollum, on glucose- *) The slime formation is of importance for the explanation of the »slime threads« (erroneously called «infection threads«) within the nodules. See »Die Natur der Faden der PapilionaceenknölIchen«. Centralbl. für Bakteriologie. Bd. 15, pag, 928, 1894. ^) Ueber eine farblose Bakterie, deren Kohlenstofïnahrung aus der atmospharischen Luft herrührt. Centralbl. f. Bakteriologie 2. Abt. Bd. 10, pag. 33, 1903. *) Bacillus danicus, T. Westermann and F. Löhnis, Centralbl. f. Bakteriologie, 2. Abt. Bd. 22, pag. 250, T909. *) The wonderful »experiments« of Mazé (Annales de ITnstitut Pasteur T. 11 pag. 44, 1897, T. 12, pag. I and pag. 128, 189S), who asserts that on broth gelatin plates at the same time ammoniumcarbonate is produced and fixation of free nitrogen by B. radicicola takes place, need not be considered, although they are taken up uncritisised in the handbooks of Plantphvsiology. 269 agar-potassiumphosphate plates, in absence of purposely added nitrogen compounds, at superficial view make the impression of being quite able to develop, but here too, it is only the formation of much wall substance, as already described above, and not of nitrogen-rich protoplasm, which explains the voluminosity of the colonies^). With other slime-producing bacteria, as B. radiohacter and Aerobacter viscosum, of which it is quite certain that they cannot live on the atmospheric nitrogen, extensive colonies may likewise be grown on the said nitrogen-poor medium with fit carbon food. By a better nitrogen nutrition such colonies may even be greatly reduced in volume, the wall substance then serving as food under a strong increase of the bacterial proto- plasm, which gives rise to very interesting experiments. It is only when being ac- quainted with these facts by personal observatioii that we can understand how in the literaturesomany statements can occur on the nitrogen fixation by the nodule bacteria, vvhich does not take place. Within the nodules the atmospJieric nitrogen is ucithcr fi.ved. The preceding gives rise to the question, whether the protoplasm of the host plant mightbe the catalyst that enables the invading bacteria, in their bacteroidal state, to fix the free nitrogen. However improbable this hypothesis may appear, being in contra- diction with the laws of heredity, still it deserves attention because the rate of albu- minous matter in the nodules is so very high. I myself found about 4% nitrogen, which is about 25% albumen in the dry matter of pease-nodules. Others found 5 to 6% nitrogen. It is noteworthy that the bacterial colonies on agar plates, grown out of the plant, contain but i to 2% nitrogen of the dry weight, which consists for the greater part of carbohydrates. So it is certain that the bacterial body is very much modified by its entrance into the plant cell as well morphologically as physiologically. Therefore it was tried gazometrically to state nitrogen absorption in the tubercles. If the hypothesis is founded it must be possible, with a great quantity of tubercles in a closed space and under favourable physiological conditions, easily to observe that ab- sorption. For the number of tubercles, for examplcs of the woody papilionaceae, being as said very small, while yet these plants are noted in agriculture for their consider- able nitrogen-fixing power, the action of the tubercles must necessarily be very intense. To test the hypothesis we acted as follows -). First small, later larger quantities of lupine and serradella tubercles were placed in wide glass tubes which could readily be connected with the gas burettes, then put in thermostats at about 25° C. The tubercles respiring vigorously we had to keep account with a rapid assimilation and supply of the oxygen. Further it was only necessary to determine the quantity of nitrogen still present after deduction of the carbonic acid and the oxygen. The only difficulty we met with was that the nodules, which by their abundant content of al- buminous matter are an excellent food for bacteria, when they touch each other and get moist, easily give rise to fermentations in particular by Bacterinni aërogenes. ') Likewise for the ordinary saprophvtic bacteria the want of nitrogen compounds varies very much: the large-celled Bacillus inegatJierimn requires verv little, the small celled Bacterium fluorescens very much. ^) In some of these experiments I was assisted bv Ir. D.C, J. Minkman, formerly assistant to the Laboratorv for Microbiology of the Technical High School at Delft. 270 Hereby hydrogen and much carbonic acid are produced, so that it is then necessary also to determine the hydrogen. But this fermentation may be prevented by intro- ducing the material very loosely into the burette, so that there are but few points of contact between the nodules, and the air can freely pass between. Under such con- ditions there is no danger that f ree nitrogen will be formed; this only occuring through the action of the denitrifying bacteria on nitrates, which substance is in the nodules completely absent. Of the tubercles of yellow lupine we used in our experiments quantities of ioo grs., 500 grs., and later even of i kil. In some experiments we had the root tubercles cut off, in others the roots with the tubercles were left united with large pieces of the stem, so that eventually formed nitrogen compounds might be able to flow into the stem. All our estimations, however, showed that not in a single case the slightest fixation of nitrogen by the tubercles was observable. As at first we doubted of the accuracy of our results obtained with relatively little material, we after- wards used the just mentioned larger quantities, but this did not make any difference either. Besides the two said species we still examined several times 10 to 20 grs. of the nodules of Vicia f aha, and once about 15 grs. nodules of Robin ia pseudo-acacia, but other results were not obtained. As our researches did not last longer than 12 to 20 days it might be objected that we have not sufficiently imitated the conditions of the plaiits in the field. Further, that in these experiments the growth of the tubercles, together with that of the whole plant, was excluded. Although these objections have not been refuted in the pre- ceding, it is still highly improbable that nitrogen fixation would be associated with the growth of the tubercles and not with the augmentation of the bacteria out of the plant. Principal, however, is the fact that if within the nodules nitrogen fixation were to take place, which might have escaped our attention, the concerned quantity must certainly be extremely small. When we now consider how difficult it is to coUect a few grams of tubercles for example of Robiitia, it is clear that if this material is to be of any significance for such a great tree, its nitrogen-fixing power must be enormous. The experiments, however, show that the tubercles are wholly inactive or nearly so, hence there can be no question of attaching to them any importance con- cerning the nitrogen nutrition, whilst yet nitrogen fixation by this tree is as certain as for lupine and serradella and even on a much larger scale. So the nitrogen nutrition of the Papilionaceae can only be indirectly connected with the bacteria of the nodules. In my opinion this relation can only exist in the herbaceous species and in. the germ plants of the shrubs and trees of that plant order, but in full-grown specimens of the woody species such al Robinia pseudo-acacia the presence or the absence of the nodules is wholly indifferent. Likewise on the roots of shrubs, such as Sarothamnus zndgaris, Spartium scoparium, Genista anglica, and Genista pilosa in full-grown condition, the number of tubercles is so small, their volume so insignificant to ithat of the whole plant, that even if they were able to assimilate some free nitrogen their slight activity could not possibly explain the rich nitrogen store of the whole plant. Hence, the at present generally accepted explanation of the peculiar behaviour of the Papilionaceae cannot be correct. New researches, especially with Phaseohis, are desirable. 271 From the preceding follows: For various Papilionaceae, excelling by their abundance of nitrogen compounds, even when cultivated in media without such compounds, the number and volume of the tubercles is so small, that if only within them the fixation of free nitrogen should take place, the intensity of the process in these tubercles must necessarily be very great. We have not, however, succeeded gazometrically in observing the process in the tubercles at all. Neither do the tubercle bacteria fix the atmospheric nitrogen when cultivated out the plant in nutriënt liquids or in plate cultures, nor enclosed in solid media. The contradictory statements in the hand books of Plantphysiology are erroneous. Oidium lactis, the milkmould, and a simple method to obtain pure cultures of anaërobes by means of it. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amster- dam, Vol. XXT, 1919, p. 1219— 1226. — Verscheen onder den titel «Oidium lactis, de melkschimmel en een eenvoudige methode om met behulp daarvau anaëroben zuiver te kweeken« in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Wis-en Natuurk. Afd., Amsterdam, Deel XXVII, 1019, blz. 1089— 1097. The many methods recommended for the pure culture of anaërobes, — whose multitude proves that none of them quite satisfies the investigators, — may be distinguished in chemical and biological. As to the former, of which N o v y's ex- siccator method is certainly the best, everything has been tried. This cannot be said of the biological methods based on the use of living organisms in particular aerobic microbes for the removing of the oxygen. For myself only after using the milkmould te that end I have obtained results worth fixing once more the attention on it. Some chief points from the life history of Oidium lactis important for experi- ments with this species may precede ; a complete description is not necessary here. Properties of the milkmould. The milkmould possesses a number of properties which render it very fit for ex- periments in relation to respiration, nutrition, growth and symbiosis. It unites the character of the moulds to that of the yeasts, in particular with regard to the growth in and upon the substrate which takes place without being accompanied by fermen- tation, as also without the formation of conidia which currents of air might spread. Within the substrate the long-celled mycelium is found, on the surface the chains of conidia which, even when extending free in the air, cohere and never contaminate the environment as moulds may do. It is easily obtained. A rich growth results when market milk is left a few days in an open glass in a warm room; the milk then always covers with an Oidium film. Lactic acid fefments also develop and by their production of acid further the growth of Oidmm, whilst they themselvesarefavouredintheir development by Oidium, because it oxidises the lactic acid to carbonic acid and water. In garden soil Oidium is generally spread as may be shown by inoculating feebly acidified malt infusion with soil and keeping it at 25" to 30" C. The film which finally covers the liquid contains besides Mycoderma. always Oidium. Pressed yeast, long whey, sour milk, cheese, the output 273 V aters of distilleries and all kinds of acid sewage, are inhabited by Oidium. Natural h ibitats are furthermore the sap tiow of many trees caused by Cossiis ligniperda and allies. For pure culture acidified malt infusion- or broth-glycerin plates are recommcn- dable. The acid serves to exclude the hay bacteria which have a great disposition to grow in symbiosis with Oidium in neutral environment. The transfers for the collection are kept on malt-agar, but they change thereby in a few months into a tough, leathery mycelium, almost exclusively consisting of long mycelial threads difficult to separate and evenly to mix with the nutriment. To obtain normal material in this case a new isolation from milk or soil is necessary, for the change is an hereditary non-reversible mutation. Under favourable feeding conditions the growth is remarkably . rapid and the respiration and oxygen absorption go parallel with it. This intensity exceeds by far that of the ordinary moulds of the genera Penicilliitiii and Asperglllus, whilst it equals that of Mticor. This holds, however, only good with regard to easily assimilable sub- stances ; less decomposable matter such as pectine, cellulose and chitine are not at- tacked by Oidium. Gelatin and agar are neither assimilated. Fermentation pheno- mena, joined with the evolution of gas, are as said also wanting. Hence, Oidium never forms rents or holes in the solid substrata wherein it is cultivated, not even in pre- sence of glucose. This is one of the reasons why it is so well adapted to the culture experiments with the anaërobes to be discussed below. The products of metabolism are chiefly or only water and carbonic acid; volatile or non-volatile substances noxious to other organisms are not produced. In regard to carbon-food Oidium exhibits a great specialisation. Most hexoses, in particular glucose, levulose and mannose, are readily assimilated and oxidised. Likewise aethylalcohol. Glycerin, too, is a very good carbon source. On the other hand, starch, raffinose, maltose, cane sugar, mannite and all similar substances, are in no way assimilated. Enzymes, as diastase, maltoglucase, invertase, lactase, are hence ccmpletely absent. Glucoside enzymes could neither be found. By the absence of these enzymes, Oidium, which so easily reacts on the hexoses, is especially fit as a reagent on these enzymes in case they are to be detected in parts of higher plants or as pro- ducts of secretion of other microbes; here the auxanographic method may advantage- ously be applied. Fats are however split up by Oidium, by means af the exoenzymelipase, active outside the cells. Hence, in presence of fats growth of Oidium may be expected at Ihe expense of glycerin and this explains the general occurence of Oidium as well iii milk and butter as in other fat-containing materials. For the preparation of lipase the milkmould can atïord a good starting material. As to the nitrogen food Oidium resembles the ordinary yeast species and is in this respect rather many-sided. With exception of nitrates and nitrites, and unchan- ged albuminous substances, the ordinary nitrogen compounds are easily assimilated in presence of good carbon food such as glucose and glycerin. This is in particular true for ammonium salts and urea. Peptones and the higher amino acids, if alone, are not or very slowly assimilated, but in presence of a good carbon source they may serve as a very good nitrogen food, so that the complete nutrition of Oidium in presence of these substances should be called dualistic. Consequently broth bouillon is for Oidium M. \V. Beijerinck, Verzamelde Geschriften; Vijfde Deel. l8 274 an insufficiënt food and on a broth-agar plate it develops but poorly. This changes however by adding a good carbon source. If this is done locally on a broth-agar plate there results an auxanogram in the dilïusion circle of the related matter, which proves at the same time that the other clements required for the growth of Oidiuni, as potassium, magnesium and phosphor, are present in sufficiënt quantity in the broth. As these clements accumulate in the young cells, either as the same chemical com- pound found in the substrate or not, such experiments are apt to demonstrate the ab- sorption phenomenon formerly described by me. It is also easy in reversing the experiment, that is by feeding with carbohydrates, to find with the microscope by means of iodine, glycogen accumulated in the so large Oidium cells and its disap- pearing in the auxanograms of nitrogen food, such as ammonium salts or urea, as soon as the carbon food in the substrate is wholly assimilated. A feebly acid reaction of the medium furthers the growth of Oidium, and organic acids, for example acetic and lactic acid, may disappear by oxidation. Other acids as molybdenic and tungstic acid are in good media, such as glucose-broth-agar, reduced by Oidiuni to the well-known blue oxides, which gives rise to beautiful colour experiments. In neutral solutions the salts of these acids are however not affected so that this is a case of reduction in an acid medium. The ordinary alcohol veasts behave likewise. Use of the milkmonld for the pure culture of anaërobes. In nature the withdrawing of oxygen from the environment, which is required for the development of anaërobes, is usually caused by aerobic, microbes. They not only absorb the last traces of oxygen from the surroundings but even produce reducing substances in it. In the laboratory this may be imitated by adding to a culture medium containing in small number germs of the anaërobe to be exa- mined, a great number of germs of an appropriate microbe. How such experiments have hitherto been carried out ^) may be illustrated by a definite example namely the cultivation of the spore-forming aërobes of the albumin putrefaction ; then I wil! describe the modified method. A crude culture of putrefaction bacteria is obtained thus. A stoppered bottle is quite filled with a watery infusion of albuminous matter, infected with garden soil and boiled to kill all non-sporogenous microbes. Placed in the incubator the mass soon passes into stinking putrefaction, characteristic by the presence of mercaptans produced by the spore-forming anaërobes. Now to ordinary broth-gelatin or broth- agar an abundant quantity of some intensively growing aerobic bacterium, such as B üuorescens or B. prodigiosum is added, together with a little of the to 90" or 100" C. heated material containing the spores of the putrefaction microbes. Af ter solidification in a test tube the aërobes near the bottom will soon absorb the last traces of oxygen and being unable to grow there, not give rise to liquefaction of the gelatin ; but they will retain the oxygen penetrating from above and develop strongly in the surface of the gelatin. In the lower part of the tube the spores of the putrefaction ') E. Macé, Traite pratique de Bacteriologie, 6c Ed. T. i, pag. 305, Paris 1912. Besson, Technique microbiologique et sérothérapique, 6e Ed., pag. 102, Paris 1914. 275 bacteria can now germinate and if gelatin is used there will soon appear the large liquefying colonies of the su remarkable Bacillus septicus, together with the non- liquefying putrefiers, for the greater part recognisable by the flocculent structure of their colonies, a character related to their sensitiveness to extension and contraction of the substratum where in they grow, quite as by B. Zopfii. For the microscopical examination this method undoubtedly affords good material, but it is hardly possible to reach the single anaërobic colonies without touching others. To this end it is necessary to remove the culture gelatin from the by heating it in the flame so that only the outer side of the gelatin melts and the contents inay be thrown out as a whole. One may also with a file make an incision in the glass wall in the neighbourhood of favourably situated colonies. But it is clear that there is much chance that thereby also different colonies intermix so that of a pure culture of anaërobes in the usual sense of the word there is no question in such experiments. For examination with the microscope and for studying the appearance of the colonies the method is useful, but for the culture of pure species it is worthless. Every good method for pure culture of aërobes and still more of anaërobes should answer the following requirements ; the colonies must be situated quite f ree and at due distances from each other on the surface of the solid plates, they must further- more be readily attainable with the platinum wire. These requirements can only be satisfied by cultivation in ordinary glass boxes or P e t r i dishes, which may take place in the laboratory by means of the exsiccator method of N o v y (see M ace, 1. c). After this method, — the best of the chemical ones, — ordinary culture boxes are placed in an exsiccator filled with pure hydrogen and moreover containing some oxygen-removing substance, such as ferro-ferrocyan or alkaline pyrogallol. But this method also has its drawbacks. It is namely impossible quite to prevent the deposition of vapour at the glass covers, so that drops of water falling down come on the plates; this makes the colonies intermix and spoils the experiment. It is, besides, hardly possible distinctly to see the state of development of the colonies in the closed ex- siccator, which may lead to it being opened too early and oblige the experimenter to begin anew. This is very troublesome considering the complication of the experiment. The Oidium method has none of these disadvantages, and if well-managed, pro- duces colonies of the anaërobes situated quite free on the surface of the plates and easily reached with the wire. The principle of the method is the placing one over the other of two culture plates, separated by a relatively small space of air. One of the plates contains the aerobic microbe which is to absorb the oxygen, while on the surface of the other the anaërobe is to grow. Here, also, I select a definite example for illustration, namely the strictly anaërobic bacilli of the butyric-acid and the butyl-alcoholic fermentations; they have corresponding nutrition conditions and may be isolated in the same way. They are spore-producers, thriving best in malt infusion where they cause strong fer- mentations accompanied with production of hydrogen and carbonic acid. A crude butyric-acid fermentation is prepared as foUows. Wheat- or rye-flour, or better a pap of potatoes infected with soil, is mixed in a glass beaker with water to which is added some calcium-carbonate, then heated for a few^ seconds to 90° or 100'' C. Kept at 30" to 40° C. there usually results after two days a strong butyric-acid fermen- tation in which occur various butvric-acid bacteria which are then to be isolated. 276 For the preparation of a crude butyl-alcoholic fermentation crushed corn ^) of Hordeum vulgare nudum may be used ; a pap of potatoes infected with soil and heated iiot higher than 80° to 85° C. will also do; addition of chalk is not necessary, the butyl bacteria producing no acid. Of course the spores of butyric-acid ferments are slill present in such preparations and the surprising f act that by application of the said temperature no butyric-acid but a butylic fermentation ensues, should probably be attributed to the injurious action of the butyl alcohol on the butyric-acid ferments. Lr GS2. ^^^^^^^^^^^^^^^^m I .^èZ3\_ /TA -! ^^e^^.^^^-^^^:^^^^^m^^;-^^>r^.^m Cultivation of anaërobes by means of Oidium lactis. Gsi large glass dish with the oxygen-absorbing Oidium plate Op. Gsi smaller dish with the culture plate Ka whereon the anaërobic colonies Ak grow. Lr space between the plates. At g the hole in the glass wall of Gsi for the escape of the air from Lr, which is afterwards closed with paraffin. Gd glass lid of the large dish Gsi. The higher temperature is at the side of Gd. The pure culture is efïected as follows. Malt-infusion agar with 5" to 10" glucose is liquefied and after cooling to near solidification and addition of a great quantity of Oidium lactis is plated (Op) in a large glass dish (Gsi). At a temperature of 25" to 28"^ C. the whole surface of the plate is already after 24 hours covered with a thick snow-white film of conidia and the interior of the agar is wholly interwoven with mycelium, which causes a con- siderable absorption of oxygen. A second malt-infusion-agar plate (Ka) without Oidium is now prepared in n glass dish (Gs-j), much smaller tlian Gsi. The space between Gsi and Gs-^ must be large enough Gs-j to be caught with the fingers. On its surface a little of the material containing the anaërobes, that is of the crude butyric-acid or butyl-alcoholic fermen- tations, diluted with sterile water, is spread. Now the lid of the smaller dish (Gs-) is removed and the plate pressed on the Oidium plate the agar side (Ka) upward as showaï in the figure. For the escaping of the air from Lr a little hole g is bored in the glass wall of ') Fermentation et ferments butyliques. Archives Néerlandaises I, 39, pag. i. Bactéries actives dans Ie rouissage du lin. Ibid. Sér. 2. L 9. p. 418, 1904. 277 Gs2 and closed with a droplet of paraffin introduced with a heated glassrod. At 28" to 30" C. the air in Lr, which space can be relatively small, will soon be free from oxygen and the anaërobes on Ka can begin to grow. To further the absorption of oxygen from the agar Ka in Gs>, Oidium may also be added to it, but then a thin layer of malt agar without Oidium should be poured on the surface of Ka to obtain a germ-free surface for the sowing of the anaërobes. Oidium being strictly aerobic the mycelia do not perceptibly grow through this protecting layer. If the glass dishes have good dimensions and the space Lr is not too small, one can sideways look through the glass wall and follow the development of the anaërobic colonies on Ak. So it is easy to decide when the moment for further observation has come without it being necessary to remove plate Ka from the Oidium plate Op. and thus prevent too early opening. When it is time to open, liquefied malt agar must be at hand to be poured out over the Oidium plate, especially in the groove formed by Gs'2, as soon as plate Ka is to be restored to its place. The fresh food causes new oxygen absorption by Oidium and the growth of the anaërobes can go on. For the success of the experiment it is essential to mind the foUowing. The pla- cing in the incubator should be managed in such a way that the Oidium layer Op comes in the cooler, and the cover Gd as also plate Ka in the warmer part. The vapour in Lr will then condense in Op and not on the surface ofA'o. In the reserved position Ka will become moist, the colonies intermingle and the experiment fails. Hence the figure is represented in such a position that the colder air is above, the warmer below, ab is the actual state in an incubator with bottom-heat. How simple all this may appear, in the execution it will be found necessary to pay special attention to it. In this way it is possible from the ordinary crude butyric-acid fermentations, obtained as described above, to separate three distinctly different Amylohacter species, two of which I described already before (Proceedings Vol. 12, Pag. 973, 1903) under the names A. (Granulobacter) saccharobutyricum and A. (G.) pectinovorum, while from the butyl-alcoholic fermentations two species were isolated, one of which pro- duces large slimy colonies and was described as A. (Gr.) butylicum (Archives Néer- landaises, ire Série, T. 29, Pag. 2), whereas the other, which secretes no slime, has not yet been investigated. The colonies of all these species colour dark blue with iodine like starch, the staves and clostridia containing a great quantity of granulose. The butyric-acid and butyl-alcoholic fermentations acquired in other ways than the above mentioned have not yet been examined thoroughly. As the anaërobic Sarcina ventriculi likewise develops very well on malt-infusion agar at 30" tot 37" C. (Proceedings 28 April 191 1, Pag. 1412), this species may be isolated just in the same way as the above. As regards the spore-producing bacteria of the real protein putrefaction the Oïc/mm-plate may be prepared just as in the experiment described, only for the culti- vation of the anaërobes themselves in Gs^ it is better to make use of broth agar with 0.5 or I % common salt, either with addition of 2% glucose or not. In this case, too, nutrition with carbohydrates gives in some species rise to production of granulose, in others not. Another anaërobe isolated by the Oidium-meVaod is BaciJlus acidi urici (Procee- dings 23 April 1909, Pag. 990), which ferments uric acid to carbonic, ammonium 278 acetate and ammonium carbonate> This species also develops best on broth agar at 30" to 35" C. For beginners it must be noted that on plate Ka the facultative anaërobes, such as Bacterium aërogenes and B. coli, develop quite well, as may be proved by streaking off all the colonies Ak on aerobic plates on which the anaërobes only do not grow. This is in accordance with the fact that at the starting of the experiment some oxygen is present in Lr sufficiënt for the very small oxygen want of the facultative, better called temporary anaërobes. Bereiding van tyrosine voor de tyrosinase- reaktie. Chemisch Weekblad, i6e Jaargang 1919, blz. 1494 — 1495. Daar de prijs van tyrosine steeds zeer hoog is en deze stof in de laatste jaren in den handel niet of moeilijk was te verkrijgen, schijnt de beschrij- ving van een eenvoudige bereidingswijze niet overbodig. Vele jaren geleden maakte ik de volgende opmerking. Teneinde proeven met trypsine te doen, kocht ik bij een slager een ossen-pancreas, wreef daarvan een gedeelte in een mortier fijn, digereerde met lauw water en filtreerde. Het filtraat bleek echter onwerkzaam te zijn. Het grootste deel van de pancreas was overgebleven en werd in een warm vertrek aan de lucht bewaard. Na twee dagen zag ik dat de geheele massa wit was geworden en bevond, bij mikroskopisch onderzoek, tot mijn groote verwondering, dat het geheel veranderd was in een kristalbrij van tyrosinenaalden. Na opnieuw te hebben gedigereerd bleek het filtraat nog zeer rijk aan trypsine te zijn. Het was dus duidelijk dat de pan- creasklier bij het bewaren trypsine had voortgebracht en dat deze eerst de eiwit- achtige stof van dat orgaan had gepeptoniseerd en daarna de pepton (of trypton) in tryosine had omgezet. Deze waarneming gaf aanleiding tot de volgende be- reidingswijze. Voeg aan een lo-procentige oplossing van pepton siccum van den handel een kleine hoeveelheid trypsinum (pancreatinum) activum der apotheken toe; vul met de oplossing een stopflesch geheel en al en schud door met een weinig chloroform om de rotting door anaërobe bakteriën te verhinderen; plaats in een thermostaat bij 40" en schud nu en dan om. Na 10 a 14 dagen verandert de pepton in een kristalbrij van tyrosine, die met tyrosinase de zoo belangrijke melaninereaktie geeft en dus gewone tyrosine is. Het affiltreeren en uitwasschen geeft bij de groote onoplosbaarheid van de tyrosine geen bezwaar; men verkrijgt omstreeks 30 a 35 "/o van het pepton- gewicht als tyrosine. Voor de uitvoering der melanine-reaktie met tyrosinase-preparaten los ik wat tyrosine op in enkele droppels natriumcarbonaat, voeg de oplossing toe aan gesmolten leidingswater-agar, giet hei mengsel in een glasdoos en laat tot een dunne plaat stollen. Hierop worden de tyrosinase-preparaten gebracht. Als zoo- danig kan ik de volgende aanbevelen : I. Het melksap van EiipJiorlna L'iihyris. Dit bevat echter ook trypsine en eiwit en kan dientengevolge ook zelve een weinig tyrosine voortbrengen. Een 28o blanco-proef met een agar-plaat zonder tyrosine is in dit geval noodig voor controle. 2. Fijn geraspte, met water uitgeloogde roode biet {Bèta vidgaris), welke massa goed wordt uitgeperst, gedroogd en tot stof gemalen. Dit poeder is zeer aktief en geeft de melanine-reaktie zuiver. Evenzoo aardappelen. 3. Het melksap van de bladeren van de zwarte moerbezie {Afonis tii^i^ra). De daarmede verkregen kleuring is echter niet zwart maar groen (chloro- tyrosinase-reaktie). Verschillende andere Moraceën gev'en deze groene reaktie eveneens (maar niet het sap van de witte moerbezie). 4. De tyrosinase-bakteriën Microspira tyrosinatica uit rioolwater en Bacterium symbioticum uit den grond (die vooral in symbiose met een Actinojnyces-soovt maar ook alleen de melanine-reaktie geeft), welke ik bij een vroegere gelegenheid (Verslagen der Akademie 28. Dec. 1913) beschreven heb. Del/i, November 1919. Chemosynthesis at denitrification with sulfur as source of energy. Proceedings of the Section of Sciences, Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Vol. XXIT, 1920, p. 899 — 908. — Verscheen onder den titel »Chemosynthese bij denitri- ficatie met zwavel als energiebron» in Verslagen Kon. Akademie van Wetenschappen, Amsterdam, Wis-en Natuurk. Afd., Deel XXVIII, 1920, blz. 845-856. In photosynthesis organic matter results'from the reduction of carbonic acid by light as source of energy; the same tak"es place in chemosynthesis by chemical energy. Organisms with photo- or chemosynthesis are called autotrophes; those which feed on other organic substances are heterotrophes. The product of chemosynthesis is the body substance of the producers, always spore-free bacteria. I described chemosynthesis at denitrification with sulfur as source of energy, on 16. April 1903 at the 9*^ Dutch Congress of Natural and Medical Science^). I then thought that in the process a facultatively anaerobic bacterium was concerned difficult to isolate by the plate-culture method. It was further presumed, that this species produced so much organic substance by chemosynthesis that the many directly visible bacteria, denitrifying with organic food, might live thereon. This supposition has proved to beerroneous; the latter themselves are in fact the operators of the sulfur denitrification as well as of the chemosynthesis. They are easily cultivated on broth-agar or broth-gelatin, but then they lose, and this is the new view, their autotrophy together with the power of sulfur deni- trification, whilst preserving this power with organic food. The loss is caused by the growth with organic food and this loss being hereditarily constant, we have a case here similar to that which I described earlier for the nitrate ferment, and which I called »physiological species formation« ^). Just as I then distinguished the oligotrophic from the polytrophic state we may in this case speak of the autotrophic and the heterotrophic condition of the operators^). The heterotrophic forms is thus some common denitrifying bacterium. On account of the little acquaintance with chemosynthesis acquired until now, I will begin with describing once more the original experiment'*). *) Phénomènes de reduction produits par les microbes. Archives Néerland. Sér. 2. T. 9, Pag. 153, 1904. ^) These Proceedings. Vol. 23, Pag 1163, March 28 (10 April) 1914. ") As the existence of chemosynthesis is proved with certainty for the sulfur de- nitrification, but not for the nitration, the same nomenclature could not be foliowed in the two cases. '') An enumeration of the chief processes accompanied with chemosynthesis is to be found in my paper: Bildung und Verbrauch von Stickstoffoxydul durch Bakterien. Centralbl. f. Bakteriologie 2te Abt. Bd. 25, Pag. 30, 1910. 282 Arraiigeiiient aiui coitrse of the experiment. If a mixture of sulfur and chalk is introduced into a saltpetre solution with addition of some garden soil or canal mud, ihere will soon evolve at room tem- perature or at 25*^ to 30" C, a current of gas consisting of free nitrogen and carbonic acid. Thereby the saltpetre is denitrified, the sulfur is oxidised to sul- furie acid, found back as gypsum and potassiumsulfate, after the formula. 6 KNO3 + 5S + 2 CaCOs = 3 K2SOi + 2 CaSOi + 2 CO2 + 3N2 whereby per gram of decomposed nitrate about i cal. is produced. When after some days the process has become intense, the mud with the gas rises to the surface, and if the experiment is carried out in a flask, the contents can flow out with the gas as a slimy mass. This is bacterial slime, which keeps the sediment together. If using distilled water with 10% chalk, lo^o sulfur, 2" o potassiumsaltpetre, 0,02^/0 bipotassium phosphate, o,02'^/o magnesium chloride, and infecting with a small floccule from the said denitrification, we see after some days at 25" to 30" C. the very same phenomena as when using soil, only less intense; so the presence of soil is not necessary, but is clearly acts favourably. If the soil or mud is beforehand left a few days under a dilute saltpetre solution, so that all the or- ganic substances fït for denitrification are removed, the soil remains quite as good for the sulfur-chalk experiment, hence the organic matter cannot be the cause of the favourable action on the pj-ocess. It seems to result from the presence in the soil of colloidal silicic acid and aluminium siMcate, which are to be considered as catalyzers that hasten the decomposition. So, in a thiosulfate denitrification the reaction goes on much swifter in presence of chalk and bolus (aluminium silicate) than with chalk only. The saltpetre solution can be used in the most different concentrations. Even in io"/o Solutions in tapwater made to a pap with sulfur and chalk, I saw at room temperature a spontaneous, intense gas production, with slime formation. The gas was nitrogen and carbonic acid; nitrogen oxydul seemed quite absent. The slime is bacterial slime, for the greater part consisting of different varieties of Bacteriuin stiitzeri and B. denitrificans. It is so voluminous that its formation can only be explained by admitting that the said bacteria themselves produce this slime from the carbonic acid by chemosynthesis. With distilled water the result of the experiment is the same. In a closed bottle and with destilled water the process goes on as with accession of air, which proves convincingly, that presence of organic substance is not required for the development of the rich bacterial flora which encloses the chalk and sulfur, and where at last many in- fusoria and monads, that feed on the bacteria, may be observed. As said the organic matter of the bacterial bodies must here be formed from the carbonic acid, whilst the required chemical energy is produced by the oxydation of the sulfur. Consequently this is a case of chemosynthesis and no other analogous process is known which produces organic substance in a simpler and more profuse way'). ') It is true that chemosynthesis at the oxidation of hydrogen in presence of carbonic acid and soil, described by Niklewsky and Lebedeff, is as productive in organic substance, but the experiment is less simple. 283 By decanting and renovating the saltpetre solution as soon as the evolution of gas diminishes, the activity returns^). This being repeated a few times the precipitate changes into a sliniy mass, so rich in slime-forming bacteria that at heating on a platinum plate in the Bunsen burner carbon is separated. With concentrated sulfuric acid carbonisation is also easily demonstrated. As the rate of nitrogen of this slime is less than 3%, it must chiefly consist of wall substance, which is evidently the chief product of the chemosynthesis*). It results from the carbonic acid after the same formula as the starch in the chlorophyll granules by photosynthcsis, thus 6 CO2 + 5 H2O = C«Hio05 + 6 02 so that oxygen is set free, which explains the reatly course of the process in a closed bottle, when considering that all denitrifying bacteria require a little free oxygen. Just as the organic denitrification, that with sulfur may as well take place in the dark as in the light. After pasteurisation no sulfur-denitrification or oxy- dation is observed. The quantitative estimation of the carbon fixed by chemosynthesis was made as follows. The sediment was treated with hydrochloric acid and later with alkali to remove the chalk and the sulfur, whereby certainly a great portion of the organic substance ist lost. In the remaining precipitate, which still contains gypsum, the organic matter was determined as carbonic acid after the method of Herz- feld-Wolff-Degener*^), by oxydation with bichromate and sulfuric acid. After a culture of about six weeks there was in this way found about 0.05 gram of carbonic acid per gram of oxidised sulfur, which corresponds to 0.OT3 gr. of organic carbon^). This quantity, however, must certainly be doubled, for at the extraction of the cham and sulfur at least half the weight of the bacterial sub- stance in lost. I therefore esteem the production of organic carbon in relation to the oxidised sulfur at 2% in weight. Old cultures containing much organic matter and in which the nitrate has disappeared produce H2S, obviously in consequence of sulfate reduction, and perhaps, too, directly from the still present sulfur, whilst the hydrogen wanted for this originates from the organic material formed by chemosynthesis. Such liquids finally teem with infusoria and monads, and various other members of the so remarkable »sulfur-flora« and »-fauna«. *) Addition of soda instead of decantation and renovation, also acts favourably. Evidently the dissolved sulfuric acid is difficultly neutralised by the chalk of the precipitate -) Sec also: A. J. Lebedef f, Ueber die Assimilation des Kohlenstoffs durch Wasser- stoff-oxydierende Bakteriën. Berichte d. Deutschen Botan. Gesellsch. Bd. 2"], pag. 598, 1909. He says that the bacterium can oxidise hydrogen in absence of CO2; this, however, is manifestly erroneous. Nor does he take into consideration the oxygen produced at the denitrification by the hydrogen of the saltpetre, used by him as source of nitrogen. His fear that by using ammonsalts nitrification would foUow, is under these conditions unfounded. ^) F. Tiemann und A. Gar tner. Die chemische, mikroskop. und bakteriol. Unter- suchungen des Wassers. 3. Aufl., pag. 247, 1889. ■*) The quantity found by Mr. Jacobs en at the direct oxidation of sulfur by bacteria was of the same order. (Die Oxydation des elementaren Schwefels durch Bakteriën. Folia Microbiol. Jahrg. i, pag. 487, 1912.) 284 The niicroscopical image during the period of chemosynthesis is that of very small, partly motile rodlets and micrococci. Spore-formers with chemosynthesis do not exist. Plaie culture. The agents of the denitrification with sulfur were isolated on dififerent solid media, but always with the result that the pure cultures, grown on organic media did not, or only feebly denitrify in the anorganic mixture; only those of the silicic plates rvcre but süghtly enfeebled in this function. The media used were: washed agar dissolved in distilled water, with sahs; or tapwater-agar with ^11% thiosul- fate, 0,1% saltpetre and 0,02% bipotassium fosfate; or silicic plates with the same mixture with or without addition of chalk, and finally broth-agar and broth-gelatin. If on the media containing organic matter floccules of the sulfur denitri- fication are streaked off and cultivated at 30° C, there appear, already within 24 hours, denitrifying colonies which, especially on the broth plates grow with a remarkable rapidity. The two or three chief spezies recognisable among the denitrificators mav be easily distinguished. On the media containing sulfur or thiosulfate and chalk, and on the silicic plates, the colonies remain small and cannot be wel! recognised on account of the opaqueness uf the medium. Yet I have further examined these colonies by making streaks of them on broth-agar plates, always finding that they more or less readily develop ; colonies failing in this respekt I did not find. I have also tried to obtain anorganic denitrifications with those portions of the streaks on the sulfur- and thio-sulfate plates lying between the colonies, but as well in aerobic as in anaërobic condition always in vain. dMeither microscopically nor by colouring, bacteria or microbes of other nature could be found in these parts. Hence it follows with certainty that the agents of the anorganic denitri- fication grow to colonies both on the sulfur-chalk and the thio-sulfate plates and besides, as will be still further proved below, on the ordinary broth plates. The highlv improbable hypothesis that they might be obligative anaërobes is disproved by these experiments, which are, however, well in accordance with the conception that by growth on organic matter their power of autotrophy gets lost. To compare the broth with the thiosulfate medium I made the following experiment. A platinum wire was bent so as to form at one end a loop, with which droplets of the same size could easily be taken up; the other end was curved to a circular base, which made it possible to place it on the balance and deter- mine the weight of the droplet. Now drops of equal size were taken up with this loop from the anorganic denitrifications and transported for comparison to a thiosulfate- and to a broth-plate. The result was that the number as well as the species of the developing colonies were about the same. All the colonies grown on the thiosulfate plates, after being sown on brothplates, developed very well, quite in accordance with what was observed already for the colonies grown on the sulfur-chalk plates. So it is certain that the microbes causing the anorganic denitrification produce colonies on the organic plates. 285 This statement is of particular interest as the colonies, when again trans- ferred to the anorganic sulfur-chalk mixture, do not, or only very feebly, denitrify, which means that they have almost or quite lost their power of chemosynthesis' ). This is not only true for the pure colonies separately, but likewise for the combinations that may be made of them. Even when te whole bacterial mixture on the plates is transported to the anorganic medium, only a slight or no chemo- synthesis or denitrification at all occurs. On the thiosulfate plates the germs preserve their autotrophy longer than on the broth plates, but there too, this. power finally gets lost. The real cause of this loss is not yet quite explained. With certainty it can only be said to take place when the concerned germs augiueut when fed with orgaiiic food. Especially on the broth plates at 30° C. the colonies develop rapidly. It seems that four or five species are thereby active. Three or four denitrify strongly in broth bouillon with 0,1 to 1% potassiumnitrate, and they predominate so much that non-denitrifying species are not easily found. There is even no surer and easier method to obtain bacteria denitrifying with organic food than this anor- ganic denitrification, for although it is often difficult to isolate the active bacteria from the organic denitrifications, this is here by no means the case"). Among the colojiies obtained from the anorganic mixture there are, as said, some which do not denitrify with organic food. Probably they live in the sulfur- chalk cultures as saprophytes at the expense of the organic matter formed by the autotrophes. On silicic-thiosulfate-nitrate-chalk plates develop, after two or three weeks, yellowish colonies of i to 1^/2 mm. in diameter and nearly i mm. high, evidently autotrophic. In the anorganic mixture, freed from air by boiling, they cause a vigorous denitrification after 24 hours at 28° C. already. When sown on broth- gelatin the colonies appear to consist of two soft varieties ^) of j5. ^///tó^r/, which do not melt the gelatin and of which one shows the usual structure; the other, the commonest by far, lacks that structure completely, nevertheless it resembles B. sluizen in the other cultural aspects. It consists of a white soft mass of extremely small rodlets. In broth nitrate both show strong denitri- fication, especially the soft form, so that it is one of the most intensely denitri- fying bacteria I know. At reinoculation from the organic into the anorganic food we also find here that the autotrophy and the power of anorganic denitri- fication are lost. ') In «Untersuchungen über die Physiologie denitrifizirender Schwefelbakteriën, Sitzungsberichte Heidelberger Akademie. Biol. Abt. 1912», R. Lieske has coma to another result. -) The most important denitrifying soil bacterium, the spore-forming5ac27/n.y nitroxus, loses its denitrifying power quite or partly by growing on aerobic plates. Other species, such as Bacterium pyocyaneuni, B. stutzeri, B. denitrofluorescens preserve, in aerobic plate cultures and in the collections, their denitrifvmg power unchanged for years. *) In reality there are three varieties, but the third which shows the character of the ordinary tough, folded colonies of B. stutzeri, is rarer. — It must be admitted that the difiference between the soft colonies and the typical B. stutzeri is, super- ficially, considerable, and I think that many other observers would bring them to distinct species. 286 The principal species. The colonies from the sulfur-chalk denitrifications, which develop on the broth plates are for a part coloured 3'ello\v or reddish brown by carotin^), for the greater part, however, colourless. The brown species is a Micrococcus; it liquefies the gelatin and the micrococci differ much in size; the smaller ones are highly motile, but they lose their motility when transferred to broth-agar, whereby their denitrifying power, too, disappears. The yellow species is related to the brown and consists of small very motile rodlets. Here also the same variability. The uncoloured colonies are of two types: soft, and tough or slimy. All the soft ones liquefy the gelatin on which they grow intensely; sugars are not fermented, no fluorescence; they belong to three classes dififerent by their size: i. Extensive, rapidly growing, strongly denitrifying. 2. Middle sized, less rapidly growing, as strongly denitrifying. These two classes are allied by inter- mediate forms and may be brought to one single species, Baderium denitrijicans. 3. Very small and feebly growing, non-denitrifying bacteria, manifestly living at the expense of organic food produced by the other species through chemosynthesis. With the pure cultures on an organic medium of the second form, I have succeeded in obtaining very feeble anorganic denitrifications, hence, chemosynthesis- This could, however, only be observed in the quite young cultures that had but for a short time grown on the broth medium. Cultures which have longer than two or three days been in contact with organic food and the air, can no more denitrify with sulfur and chalk, but still very well in saltpetre broth. For demon- strating the anorganic denitrification, test tubes are partly filled with mud, previously deprived of organic matter by keeping the mud under a saltpetre solution. To the mud sulfur and chalk are added and subsequently 1% saltpetre; the dissolved oxygen and the germs are removed by boiling; sterilisation is not wanted, as spore-formers with chemosynthesis do not exist. Entrance of air is prevented by a hollow glass sphere, well fitting in the tube and floating on the liquid, but this precaution is not necessary. With the pure cultures of the soft colonies I could not obtain any evolution of gas in this mixture, they manifestly lose their autrotrophy still sooner than those of the second group. The more or less tough, or slimy, or cartilaginous colonies belong all to Bacterium stutzeri, if taking the conception of species in a broad sense; superficially there is a great difïerence between the colonies of this group. The usual form, which is very remarkable and easily recognisable bv the shape of the colonies, has been described in these Proceedings by Professor van Iterson^). Even in the smallest floccules of the sulfur denitrifications some form of B. stutzeri is found, although the soft colonies prevail. But besides, other varieties of B. stutzeri occur, for example such which sligthly liquefy gelatin, or such which are light brown or rose-coloured. ') This pigment is soluble in CSa and turns blue or violet with concentrated sulfuric acid. ^) Ophoopingsproeven met denitrificeerende bakteriën. Acad. of sciences, Amsterdam, July 1902. 287 or whose colonies lack the so characteristic structure, and again others with that structure, but wanting the denitrifying power. There are, too, intermediate forms between the tough and the soft class, and I think it possible that they originate froni each other by mutation. That Bacteiium stiiizcri in the anorganic denitrifications possesses autotrophy, follows from the above described experiment with the silicic plates. But this may also be proved for colonies of «organic» origin, if only the right moment be chosen for experimenting with them. In the organic plate cultures the autotrophy of this species gets however rapidly lost, Only with quite fresh colonies, grown on thiosulfate-agar plates, and transferred to the anorganic medium, just at the time of their becoming visible a feeble but distinct anorganic denitrification could be obtained, which continued during several days with the same degree of intensity. only much feebier than the spontaneous denitrification. So it seems proved that the autotrophy does not disappear as an indivisable factor, but may get lost in parts. That the autotrophy is really lost in the originally active colonies, is corro- borated by the fact that not only the single colonies of the organic plates, but likewise the combinations of the colonies of the different species are quite inactive. Even all the colonies of broth-agar plates together, mixed with the undeveloped germs lying between them, do not produce any denitrification in the anorganic mixture. And this must be true for all the different species which produce anor- ganic denitrifications and evidently possess the power of chemosvnthesis in their natural habitat. This form of variability is obviously analogous to that of the nitrate ferment, which I formerly described^) and as said called physiological species-formation. In both cases a new elementary species is produced. It is remarkable that a number of species or varieties living under the same conditions are subject to this transformation, and that between the principal form and the one that has completely lost its original character, some feebly denitrifying intermediate forms are found, which may be compared to subspecies. Taking B. denitrificans as an example we can speak of B. denitrificans auto- trpphus and of B. denitrificans heterotrophus, the change being possible only in one direction, at least with our present knowledge. This change is not a mutation in the accepted sense, as thereby the primitive stock continues to exist wit the mutant under the same conditions under which the latter was formed. Here on the contrary all germs change simultaneouslv, so that in this case we have to do with a hereditarily constant modification, comparable to the pleomorphy of many Fungi, and to a certain extent, to alter- nation of generation. Comparable also to the production of somatic cells from germ cells during the ontogony of higher animals and plants, a fact certainly of general physiological signification. But modification and mutation are concep- tions not sharply distinguishable and gradually related. ') Ueber das Nitratferment und über physiologische Artbildung. Folia microbiologica, 3. Jahrg., Heft 2, pag. i, 1914. Recently I found that the ferment which produces nitrous acid from ammonium salts behaves in the same manner and changes, when fed with organic food into a saprophytous non-nitrifying form. 288 Another case of variability, similar to the loss of chemosynthesis by feeding with organic substances, I observed in various lower Algae respecting photosyn- thesis. For a long time I have been cultivating the gonidia of the lichen Xanihorea pariethia, which are identical with the Protococcacee Cvstococciis humicola. The first isolation was made by streaking of¥ the said lichen, rubbed to a mash, on pure agar with salts and cultivating it in light. The thus obtained green, pure colonies, develop very readily as well in the light as in the dark on maltextractagar and form large green masses, which, however, in course of time completely lose the power of photosynthesis, so that neither on agar with salts, nor in anorganic liquid media any growth takes place. Microscopically no difference is to be seen between the inactive chloroplasts of these cells and the active ones of normal Cysto COC Cl/ s cells. The very same I observed in cultures of Pleiirococcus vtdgaris, isolated from the bark of trees and long cultivated on maltextractgelatin, on which it grows vigorously in the dark without losing the green colour. Hence it is clear that for photosynthesis the presence of chlorophyll in the living protoplasm is not sufficiënt, but the process requires still another factor, which mav get lost through culiivation with organic food. The greater part of the chlorella's of Hxdra viridis, undoubtedly belonging to the so easily cultivable species CIdorella vu/garis, lose, when out of the Hydia body, howsoever fed, as well the power of photosynthesis as that of growth, so that it is very difficult to cultivate, them. So, here is a case where change of food causes the loss as well of the function of photosynthesis as of that of growth. Conclusion. Some of the common denitrifying bacteria, such as B. denitrificans dLnd B.stiitzeri (these names taken in a broad sense), and probably some other species, may occur under two phvsiologically difïerent modifications, which are hereditarily constant, when their feeding conditions remain unchanged. One form, the autotropic, is adapted to the anorganic medium (sulfur- or thiosulfate-chalk-nitrate) and shows chemosynthesis; the other, the heterotrophic form, requires organic food. They may be compared to the oligotrophic and the polvtrophic condition of the nitrate ferment. Intermediate forms, feebly denitrifying in the anorganic medium, also occur, hence the autrotrophy may be lost gradually. The heterotrophic forms preserve the power of denitrification with organic food. The uitrite ferments of the ammonium salts are also related to hereditary modifications with the character of saprophytes, living on organic food and unable to oxidise ammonium salts. Great changes in the nature of the food may thus be the cause of hereditary modifications of certain factors, and this seems to throw some light on the causes which underlie ontogonv.