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锡 培 
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主编 孙 勇 如 副 主编 安 


主 


”全 物 工程 文库 


主 编 ， 谈 家 杭 

名 誉 编 委 ， 习 元 村 

副 主 编 ， 王 祖 农 郑 国名 
李 致 肌 卢 囊 霖 

编 委 , 都 水 程 玉 华 
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遗传 学 手册 


主 编 孙 勇 如 

副 主编 ” 安 锡 培 赵 功 民 

编 者 劳 为 德 赵 世 民 赵 上 炬 白 夷 华 
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湖南 科学 技术 出 版 社 


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遗传 学 手册 
孙 勇 如 主编 
责任 编辑 : 沙 一 飞 
尝 
湖南 科学 技术 出 版 社 出 版 发 行 


(长 沙市 展览 馆 路 3 号 》 
湖南 省 龙 才 党 大 经 销 湖南 省 新 华 印 刷 二 厂 印 刷 


党 


1989 年 9 月 第 1 版 第 1 次 印刷 
和 850x 1168 训 米 1/32 印张 : 23.25 捕 页 , 4 字数 ， 608,000 
印 数 ，1 一 一 4,500 


ISBN 7 一 5357 一 0568 一 5 
Q。15 ”定价 ，11.50 元 
地 科 89 一 27 


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遗传 学 手册 是 由 中 国 遗 传 学 会 组 织 编写 的 。 它 的 宗旨 是 冰 明 
遗传 学 的 基本 原理 ， 介 绍 遗 传 学 研究 的 历史 ， 反 了 映 当 前 遗传 学 研 
究 的 现状 。 同 时 ， 作 为 实用 性 手册 ， 闪 体 介 绍 了 遗传 学 教学 与 研 
究 中 的 技术 与 方法 。 

遗传 学 是 一 门 涉及 面 广 、 内 容 丰 富 的 学 科 。 为 了 用 尽 可 能 少 
的 文字 阐明 遗传 学 的 基本 原理 与 概念 ， 我 们 突破 遗传 学 教学 的 传 
统 程 序 ， 抓 住 遗 传 学 的 核心 问题 ， 深 入 浅 出 地 介绍 了 基因 作用 的 
机 制 与 原理 ， 从 而 阐明 遗传 规律 最 本 质 的 概念 ， 这 些 知 识 又 反映 
了 遗传 学 研究 的 最 新 成 果 。 我 们 在 手册 中 还 归纳 了 基因 定位 的 方 
法 ， 这 在 国内 外 还 属 初次 尝试 。 

我 们 在 手册 中 将 遗传 学 研究 的 重大 进展 以 年 表 的 形式 介绍 给 
读者 。 它 反映 了 遗传 学 发 展 的 历史 ， 又 反映 了 遗传 学 直至 1987 年 
的 最 新 进展 。 我 们 希望 读者 能 由 此 了 解 遗 传 学 的 发 展 过 程 ， 同 时 
也 了 解 遗 传 学 发 展 的 趋势 。 

”为 了 适应 广大 教学 单位 的 需要 ， 我 们 参照 了 复旦 大 学 、 北 京 
大 学 、 北 京师 范 大 学 及 北京 农业 大 学 等 高 等 院 校 的 遗传 学 实验 ， 


汇集 了 30 个 教学 实验 。 和 希望 这 些 实验 能 适合 不 同 水 平 的 学 生 进 行 


基础 操作 技术 的 训练 ， 并 通过 这 些 实 验 ， 加 深 对 遗传 学 基本 原理 
的 理解 。 


为 反映 当前 遗传 学 研究 中 天 勃发 展 的 生物 工程 技术 ， 我 们 编 
写 了 细胞 工程 与 遗传 工程 技术 ， 力 求 文字 人 简练， 操作 具体 ， 以 桥 
为 从 事 该 项 研究 的 入 门 指 导 。 同 时 也 使 读者 全 面 了 解 当 前 葡 传 学 
研究 中 所 采用 的 技术 及 其 发 展 趋势 。 对 于 从 事 某 项 专门 研究 的 人 
员 未 说， 了解 劳 系 的 研 完 方 法 与 动态 应 是 不 无 收益 的 。 手 册 交 和 的 
高 等 生物 染色 体 数 、 送 传 学 主要 期 刊 、 实 验 用 培养 基 及 遗传 工程 
常用 质粒 与 菌株 等 附录 ， 也 是 研究 人 员 的 有 用 资料 。 

为 使 手册 既 反 映 当 前 遗传 学 研究 的 最 新 水 平 ， 同 时 又 符合 各 
类 研究 与 教学 人 员 的 实际 需要 ， 扣 写 者 在 参阅 了 大 量 文献 资料 的 
基础 上 进行 精 选 和 摘编 ， 在 此 向 原 编 作 者 表示 感谢 。 尽 管 我 们 篇 
写 这 本 手册 付出 了 很 大 的 努力 ， 但 不 足 之 处 实 为 难免 ， 训 心 希望 
读者 批评 指正 。 汪 
: : 谈 家 祯 赦 授 为 本 手册 写 了 序言 , 童 克 目 、 蒋 炮 青 与 李 向 涯 教授 
审阅 了 全 文 。 在 手册 的 编写 出 版 过 程 中 ， 得 到 了 陈 受 宜 、 林 章 视 
同志 的 大 力 协助 ， 以 及 湖南 科学 技术 出 版 社 同 志 们 的 大 力 支持 ; 
我 们 仅 在 此 一 并 表示 庄 心 的 谢意 


二 编者 SS 
1988 年 10 月 


3 


遗传 学 是 一 门 突飞猛进 的 学 科 ， 特 别 是 近年 来 生物 工程 技术 
的 兴起 ， 使 遗传 学 走向 产业 化 道路 。 它 作为 一 种 生产 力 ， 将 导致 
传统 工业 结构 的 调整 与 改革 ， 在 解决 人 类 面临 的 难题 中 发 挥 着 巨 
大 的 作用 ， 成 为 推动 新 技术 草 命 的 动力 。 为 了 适应 这 种 形势 ， 中 
国 遗 传 学 会 组 织 编写 了 《遗传 学 手册 >。 它 介绍 了 遗传 学 的 历史 和 
现状 ， 阐述 了 现代 遗传 学 的 基本 理论 ， 特 别 是 汇集 了 遗传 学 实验 
及 和 遗传 学 研究 的 实用 资料 。 我 认为 ， 这 是 -- 本 基本 上 反映 了 当前 
先进 水平 的 实用 性 手册 。 我 相信 ， 它 的 出 版 将 能 使 广大 读者 对 遗 
传 学 这 门 学 科 ， 从 基础 知识 到 目前 发 展 的 现状 有 较 全 面 的 了 解 。 
同时 也 不 失 为 从 事 遗 传 学 研究 工作 者 的 一 本 较 好 的 参考 书 。 手 册 
主编 条 勇 如 同志 是 一 位 严 放 的 科学 工作 者 ， 编 写 者 大 部 分 是 多 年 
从 事 科研 教学 工作 的 中 青年 同志 ， 他 们 结合 自己 的 工作 经 验 ， 查 
阅 了 大 量 文献 资料 ， 编 自 了 这 本 近 50 万 字 的 手册 ， 它 必 将 有 力 地 
促进 遗传 学 知识 的 传播 和 研究 工作 的 开展 。 因 此 ， 我 高 兴 地 向 雇 
者 推荐 这 本 手册 。 


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第 一 章 ” 遗传 学 简介 


第 一 节 
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0 
(四 ) 
(五 ) 
(六 ) 
(七 ) 
( 八 ) 

( 九 ) 
人 
(十 一 ) 
2 
(十 三 ) 


遗传 学 分 科 介绍 1 
遗传 学 1 
细胞 遗传 学 2 
体 细胞 遗传 学 3 
人 类 遗传 学 
毒 理 遗 传 学 
肿瘤 遗传 学 
辐射 遗传 学 
免疫 溃 传 学 
微生物 遗传 学 8 
分 子 遗 传 学 8 
发 生 遗 传 学 ”10 
行为 遗传 学 1 
数量 遗传 学 12 


只 号 O 二 


(十 四 ) 群体 遗传 学 14 


二 沁 
第 三 节 


遗传 学 发 展 年 表 15 
遗传 学 大 会 与 遗传 学 会 ”60 


2 


第 二 童 :基因 .ee 


第 一 节 ”基因 概念 的 演变 72 
(一 ) 生物 性 状 的 符号 72 
(二 ) 位 于 染色 体 上 的 遗传 功能 单位 75 
(三 ) 有 功能 的 DNA 片 断 77 
(四 ) 顺 反 子 是 一 个 基因 一 条 多 肽 ”80 
(五 ) 操纵 子 是 遗传 信息 传递 和 表达 的 统一 体 82 
(六 ) 基因 是 实现 一 定 遗传 效应 的 核 苷 酸 顺序 83 
基因 的 表达 与 调控 87 
原核 生物 基因 的 表达 与 调控 87 
原核 生物 转录 起 始 的 调节 88 
负 调 节 系 统 : 乳糖 操纵 子 “96 
色 所 酸 操纵 子 的 阻 遇 作用 ”103 
正 、 负 双 元 调节 系统 一 阿拉 伯 糖 操纵 子 .103 
正 调节 一 一 分 解 代谢 物 阻 遇 ”104 
半 乳 糖 操纵 子 ， 双 启动 区 106 
精 氮 酸 调节 子 ; 一 种 盟 遏 物 有 多 个 作用 位 点 108 
歧路 转录 108 
调节 蛋白 本 身 的 调控 方式 108 
10。 4 噬菌体 的 阻 巡 蛋白 “110 
11。 原核 生物 转录 终止 的 调 榨 113 
12。 RNA 聚 合 酶 的 修饰 120 
13。 多 顺 反 子 操纵 子 中 各 基因 祖 对 性 表达 的 调控 “122 
(二 ) 真 核 生物 基因 的 表达 与 调控 卫 4 
1。 真 核 生物 基因 调控 的 信号 “127 
2。 真 核 生物 RNA 的 合成 与 加 工 132 ， 
3。 ImRNA 代 谢 各 级 水 平 上 的 调节 154 
. 4。 转录 调控 的 机 制 172 
5 
6 


小 
和 
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四 oo <] 加 外 心情 
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染色 质 结构 与 转录 调控 196 
化 学 修饰 调控 200 
基因 表达 的 RNA 调 控 ”203 


人 和 


第 三 节 ”基因 定位 ”204 


KE》 


遗传 重组 值 定 位 ”205 

二 点 测 交 206 

三 点 测 交 206 

同 功 酶 标记 定位 207 

限制 性 内 切 酶 片段 长 度 多 态 性 标记 定位 207 


。 缺失 重组 定位 208 


利用 卵巢 畸 胎 瘤 进行 基因 定位 209 


。 近 端 着 丝 粒 染色 体 分 析 “219 


四 分 体 分 析 211 

家 系 分 析 214 

性 连锁 ”214 
基因 一 染色 体 连 锁 214 
基因 -基因 连锁 215 

杂种 蛋白 质 的 所 基 酸 顺序 分 析 定 位 “215 
连锁 不 平衡 的 分 析 定 位 “216 
非 整 倍 体 定位 216 

非 整 倍 体 分 析 定 位 法 216 
非 整 倍 体 剂 量 定 位 ，222 
细胞 学 定位 ”223 

缺陷 定位 223 


。 病毒 影响 定位 224 


基因 剂量 定位 224 

体 细胞 杂种 定位 ”225 

同 线性 测验 ”225 

选择 定位 226 

易 位 定位 226 

缺失 定位 227 
蛋白 质 的 分 析 定 位 ”227 

点 杂交 定位 228 

Southern blot 定 位 ”228 

利用 放射 性 处 理 细 胞 来 定位 “228 


基因 转移 定位 ”229 

染色 体 介 导 的 基因 转移 定位 229 
载体 介 导 的 基因 转移 定位 229 
细菌 接合 转移 定位 230 
物理 学 定位 ”233 

变性 定位 233 
转录 及 - 环 定 位 233 

异 源 双 链 定位 ”234 

限制 性 内 切 酶 分 析 定位 “234 
播 入 失 活 定位 236 

原 位 杂交 定位 237 
基因 图 与 基因 符号 ”238 
大 肠 杆 刻 KK: :的 连锁 图 揪 页 
玉米 的 连锁 图 ” 搬 页 

小 鼠 的 连锁 图 揪 页 : 
西红柿 的 连锁 图 揪 页 

人 的 基因 图 238 

人 的 基因 符号 索引 241 


第 三 章 ”遗传 学 教学 实验 ppsooew 《260) 


RE OO COSTFYR5 人 一 
人 @ 人 后 @ 因 四 @@ 


采 蝇 的 培养 与 观察 260 

采 蝇 单 因子 杂交 实验 ”262 

采 蝇 二 对 因子 杂交 实验 264 

果 蝇 的 伴 性 遗传 265 

果 蝇 的 三 点 测 交 267 : 

采 蝇 的 唾 腺 染色 体 239 

粗糙 链 玖 霉 的 分 离 和 交换 270 
酵母 菌 的 杂交 实验 273 

大 肠 杆菌 的 杂交 实验 276 

大 肠 杆菌 的 基因 顺序 分 析 277 
物理 因素 诱发 营养 缺陷 型 菌株 280 
化 学 因素 诱发 营养 缺陷 型 菌株 283 
枯草 杆菌 噬菌体 普遍 性 转 导 “286 


PT 


14。 
15 。 
16 
17 。 
18 。 
19。 
20。 
21。 
22。 
23。 
24。 
25 。 
26 。 
27 。 
28 
29， 
30。 


第 四 章 ”遗传 学 研究 常用 实验 技术 .ee 


第 一 节 
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1。 

和 


大 肠 杆 菌 4 哈 菌 体 局 限 性 转 导 “290 

化 学 诱 变 剂 的 细菌 检测 法 〈Ames 法 ) 292 
枯草 杆菌 感受 态 细胞 的 转化 297 

大 肠 杆菌 转化 300 

切片 制作 法 302 

孚 尔 根 (Feulgen) 染色 法 304 
花粉 母 细胞 的 制 片 技术 306 
植物 染色 体 组 型 分 析 307 

物化 因素 对 染色 体 的 影响 310 
植物 的 有 性 杂交 312 

植物 花药 培养 “314 

遗传 力 的 估算 317 

人 的 外 周 血 淋 巴 细胞 培养 及 染色 体 标本 制作 ”319 
骨 散 细胞 染色 体制 片 技 术 321 

人 类 和 -染色 质 的 标本 制作 与 观察 ”322 

二 倍 体 细胞 株 的 培养 及 染色 体制 片 技 术 324 
人 群 中 P.T.。C 味 盲 基因 频率 的 分 析 330 


常用 生化 技术 333 
离心 技术 333 

原理 333 

几 种 离心 技术 334 
应 用 实例 336 

电泳 技术 339 

原理 ”339 

几 种 常用 的 电泳 技术 341 
电泳 技术 应 用 实例 343， 
层 析 技术 ”349 

原理 349 

层 析 的 分 类 350 : 

柱 层 析 法 指 一 般 技 术 354 
应 用 实例 355 


(333) ， 


(四 ) 


诽 o 轴 四 可 人 
三 人 


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人 
区 


第 四 


下 遇 
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LDH 同 切 酶 的 亲 和 层 析 355 
放射 性 同位 素 技术 358 

原理 358 

放射 性 衰变 的 类 型 ”359 

放射 性 衰变 率 ”359 

放射 性 的 单位 ”360 

使 用 放射 性 同位 素 的 安全 问题 360 
放射 性 的 探测 和 测量 ”360 

放射 性 同位 素 在 遗传 研究 中 的 应 用 360 
放射 性 同位 素 的 应 用 实例 361 
微生物 基本 操作 364 

纯 种 分 离 ” 364 

单 菌 分 离 ”365 

生长 与 保存 “365 
噬菌体 鸣 菌 开 的 纯化 、& 吹 菌 体 的 制备 ”367 
史 菌 斑 的 纯化 367 

4 噬菌体 的 大 量 制备 367 
酵母 的 遗传 操作 ”379 
酵母 的 分 离 与 保藏 ”379 
酵母 的 生长 和 生活 周期 ”380 
酵母 的 遗传 分 析 383 

酵母 的 遗传 转化 ”385 

免疫 技术 ”369 

免疫 球 蛋 白 制 备 ”369 

抗原 制备 ”369 

抗 血 清 制备 371 

抗 血清 效 价 测 定 ”372 

抗 血清 的 纯度 鉴定 374 

从 抗 血 清 中 提取 免疫 球 蛋 白 374 
微量 淋巴 细胞 毒 试 验 377 

植皮 378 二 
电子 显微镜 技术 ”392 0 


电子 显 微 氏 .392 
透射 式 电镜 装置 简介 ”392 
电子 显微镜 中 常用 的 长 度 单 位 393 
电子 显微镜 研究 的 技术 方法 ”394 
生物 样品 的 超 菏 切片 的 制备 395 
生物 材料 的 超 薄 切片 技术 : 
切片 机 400 
玻璃 刀 400 
样品 块 ”400 
样品 块 与 刀刃 的 调整 ”401 
制备 优良 切片 的 条 件 及 切片 中 的 问题 401 
染色 402 
《 (三 ) 电子 显微镜 细胞 化 学 技术 “403 
1。 电镜 细胞 化 学 的 几 个 步骤 404 

2。 酶 的 细胞 化 学 404 

(四 ) “扫描 电子 显微镜 ”408 

1。 扫描 电镜 的 一 般 结 构 及 原理 408. 

2. 生物 样品 的 制作 方法 410 

3. 生物 样品 的 断裂 法 412 

4。 扫 找 电镜 在 生物 学 上 的 应 用 “和 4 

(五 ) 核酸 分 子 的 电镜 技术 “414 

1。 铺 膜 展 开 法 “415 

2。 扩展 法 也 叫 扩散 法 ”417 

3 一 步 释放 法 也 叫 尿素 释放 法 “418 


第 五 节 ”染色体 显 带 方法 “418 


(和 Q 带 - 418 

(2 G 带 420 

21 

(四 ) R 带 422 

(五 ) Ag 带 423 

(六 ) BUqR- Giemsa 显 示 姐 妹 染色 体 单 体 的 方法 .424 


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(七 ) 高 分 辨 染色 体 标 本 制备 424 
第 五 章 ”细胞 工程 技术 .pe ee 人 (426) 


第 一 闻 植物 体 细胞 遗传 操作 426 
(一 ) 原生质 体 培 养 与 植株 再 生 426 
1. 原生 质 体 的 游离 ”427 
2。 原生 质 体 培养 430 
3。 植株 再 生 434 
4。 原生 质 体 培养 的 操作 程序 〈 实 例 )” 431 
(二 ) 植物 体 细胞 杂交 436 
1。 原生 质 体 融合 技术 437 
2。 杂种 细胞 的 选择 ”439 
3。 体 细 胞 杂种 的 鉴定 “444 
4。 原生 质 体 融合 的 操作 程序 ”447 
(三 ) 植物 细胞 转化 448 
1。 致 瘤 农 杆菌 接种 无 菌 苗 或 外 植 体 而 诱发 肿瘤 “449 
2。 烟草 叶 盘 感染 家 杆菌 ”450 
3 植物 细胞 与 农 杆 菌 共 培养 452 
4。 上 EG 法 转化 植物 原生 质 体 454 
5。 植物 原生 质 体 的 电 激 法 转化 ”455 
(四 ) 从 培养 细胞 分 离 突变 体 457 
1。 诱 变 因 素 及 诱 变 处 理 458 
2。 选择 461 
《五 ) 利用 组 织 培养 生产 有 用 物质 “463 
1。 筛选 高 产 细胞 系 464 
2。 控制 培养 条 件 ， 改 进 培养 方法 “465 
第 二 节 ”动物 体 细 胞 遗传 操作 468 
(一 ) 完整 细胞 融合 ”468 
1。 位 台 病 毒 中介 的 细胞 融合 ”468 
2。 聚 乙 二 醇 中 介 的 细胞 融合 470 
(二 ) 细胞质 与 细胞 核 融 合 470 
1。 细胞 去 核 技术 470 


核 质 制备 471 
细胞 质 与 核 质 的 融合 472 
微细 胞 中 介 的 基因 转移 “472 


”染色 体 中 介 的 基因 转移 474 


在 pH3 条 件 下 分 离 染 色 体 474 

在 pH7 分 离 染 色 体 ”475 

中 期 染色 体 的 导入 475 
DNA 中 介 的 基因 转移 477 

载体 DNA 的 分 离 ”477 

细胞 DNA 的 制备 477 

磷酸 钙 DNA 沉 淀 和 转移 缓冲 流 的 制备 478 
受 体 细 胞 的 制备 和 转移 478 

选择 系统 478 

细胞 或 豚 胎 内 微量 注射 外 源 物 质 479 
显 微 操 作 器 479 

操作 步骤 480 


单 克 隆 抗体 技术 482 


- 单 克 隆 抗体 的 产生 与 纯化 483 


动物 和 细胞 系 的 选择 ”483 
免疫 ”485 

培养 液 和 细胞 悬 液 的 制备 486 
融合 程序 487 
杂交 瘤 克 隆 化 489 
杂交 瘤 细 胞 的 冻 存 439 
杂交 瘤 的 扩大 培养 490 
抗体 的 纯化 490 

单 克 隆 抗体 的 保存 492 
抗体 的 测定 ”492 

固 相 试验 493 

液 相 系统 498 

细胞 试验 499 


。 免疫 细胞 化 学 试验 501 


(三 ) 单 克 隆 抗体 的 鉴定 501 
1。 抗体 类 和 亚 类 的 测定 ”501 
2. 对 抗体 所 针对 的 抗原 决定 基 进 行 分 析 ”502 


esi 8 
第 一 节 洛 和 二 相册 各 508 
(一 ) 遗传 工程 及 其 特点 ”509 
(二 ) “遗传 工程 的 施工 程序 ”510 
1。 目的 基因 的 获得 510 
2。 目的 基因 与 载体 的 体外 重组 511 
3。 杂种 重组 PNA 分 子 引 入 受 体 细 胞 并 正确 表达 512 
(三 ) 第 二 代 遗 传 工 程 一 一 蛋白 质 工 程 “515 
(四 ) 遗传 工程 的 开发 及 其 进展 516. 
1。 重组 DNA 活 性 蛋白 质 和 多 肽 ”516 
2。 次 级 代谢 产物 519 
3。 基因 元 件 520 
4。 改良 和 创建 生物 性 状 5520 
第 二 节 “遗传 工程 基 永 操作 技术 ”523 
(一 ) 染色 体 DNA 的 制备 ”525 
分 离 细菌 细胞 DNA 的 一 般 方 法 ”525 
分 离 枯草 杆菌 染色 体 DNA 526 
分 离 大 分 子 量 大 肠 杆 菌 DNA 527” 
酵母 DNA 的 分 离 528 
分 离 真 核 细 胞 高 分 子 量 DNA 528 
乙醇 沉淀 DNA 529 
用 冷冻 干燥 的 植物 材料 制备 DNA 530 
用 新 鲜 植 物 组 织 提取 DNA 531 
植物 DNA 的 区 带 离 心 531 三 
10。 为 Southern 印迹 法 制备 少量 DNA 532 
11。 二 其 胺 法 定量 测定 DNA ， 533 
12。 从 新 鲜 叶 片 或 愈 伤 组 织 中 分 离 核 DNA 534 
13。 叶绿体 DNA 的 分 离 ”535 5 


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ER OSETCIS TECN 二 
六 - 导 了 


| 


RNA 的 制备 536 

抽 提 果 电 成体 总 RNA 537 

提取 果 蝇 胚胎 的 多 聚 核糖 体 RNA 537 
植物 总 RNA 的 制备 538 

提纯 PolyA-mRNA 539 


质粒 DNA 的 分 离 ”541 


大 量 制备 大 肠 杆 菌 质粒 DNA，542 
大 量 制 备 枯草 杆菌 质粒 DNA 544 


。 Ti 质粒 DNA 的 制备 ”545 


快速 分 离 少量 质粒 DNA 的 方法 ”546 
酵母 质粒 DNA 的 分 离 ”548 

从 质粒 DNA 中 去 除 RNA 549 

限制 性 内 切 酶 和 DNA 连 接 酶 的 应 用 549 
DNA 的 限制 性 内 切 酶 消化 和 连接 554 
DNA 的 凝 胶 电 泳 ”555 

大 量 筛 选 含 质粒 细菌 的 方法 ”558 
限制 性 内 切 酶 消化 和 DNA 的 凝 胶 电 泳 ”561 
从 琼脂 糖 凝 胶 上 回收 DNA 562 

制备 性 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 564 
Southern 印 迹 转 移 ”565 

质粒 的 转化 568 

大 肠 杆 菌 的 质粒 转化 I) 568 

大 肠 杆菌 的 质粒 转化 ID) ， 569 
枯草 杆菌 的 质粒 转化 569 

枯草 杆菌 原生 质 球 的 质粒 转化 570 
哮 热 脂肪 芽孢 杆菌 的 质粒 转化 ”571 
致 瘤 农 杆菌 的 转化 573 

用 碱 性 阳离子 处 理 酵 母 细 胞 的 转化 573 
特异 DNA 顺 序 的 检测 574 

杂交 探 针 的 制备 一 缺口 平移 ”575 
DNA 一 DNA 杂 交 576 

原 位 叹 菌 斑 杂 交 578 


入 11 。 


质粒 编码 多 肽 的 合成 579 
1。 大 细胞 的 基因 表达 系统 操作 580 
2,， 小 细胞 的 基因 表达 系统 操作 ”582 
3。 细菌 离 体 蛋白 质 合 成 系统 操作 583 


( 九 ) 真 核 细胞 离 体 翻译 系统 590 


1。 离 体 麦 胚 翻 译 系统 591 


2。 离 体 网 织 红细胞 翻译 系统 “593 


(十 ) 蛋白 质 的 因 胶 电泳 分 析 “595 


(市 


1。 SDS 蛋 白质 抽 提 液 的 制备 ”596 

2。 SD5- 束 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 蛋 白质 “597 
3。 凝 胶 电 泳 分 离 蛋 白质 的 银 染 色 法 “599 

一 ) 利用 Cosmid 载 体 建立 基因 文库 ”599 
1。 Sau3A 酶 部 分 消化 细菌 DNA 602 

2。 分 离 Sau3A 部 分 消化 的 45KkKbDNA 片 段 603 
3 .应 用 省 化 乙 锭 琼脂 糖 平 血 测定 PDNA 浓 度 603 
4。 Cocsmid 杂 交 分 子 的 形成 ”603 

5。 包装 混合 液 的 制备 和 离 体 包装 反应 “604 


6。 侵 当 和 重组 体 的 选择 二 606 


附录 


一 一 
有 


ee 


主要 的 遗传 学 期 刊 目录 607 


二 、 高 等 生物 的 染色 体 数 637 
一) 柏 物 “637 


1。 宰 子 植物 637 
2. 被 子 植物 638 


(二 ) 动 物 642 


1。 节肢 动物 642 
2。 兰 索 动物 642 
3。 肴 椎 动物 ”642 
4。 实验 动物 643 


三 、 常 用 缓冲 液 的 配制 ”644 


和 


1。 甘氨酸 -盐酸 缓冲 液 (0.05M) 644 


下 
鲜 


邻 茶 二 甲酸 -盐酸 缓冲 液 〈0.05M) 6 看 
磷酸 氢 二 钠 -柠檬 酸 缓冲 液 ”645 
柠檬 酸 - 氧 氧化 钠 - 盐 酸 缓冲 液 ”646 
柠檬 酸 -柠檬 酸 钠 缓冲 液 〈0.1M) ，646 
乙酸 -乙酸 钠 缓 冲 液 (0.2M) -647 
磷酸 盐 缓 冲 液 ”647 
磷酸 二 氢 钾 - 氢 氧 化 钠 缓冲 液 0.05M) 648 
巴 比 妥 钠 -盐酸 缓冲 液 〈18"C) 649 
Tris- 盐 酸 缓冲 液 〈0.05M，25"C) 649 
硼酸 -硼砂 缓冲 液 〈0.2M 硼 酸根 ) 650 
甘氨酸 - 氨 氧 化 钠 缓冲 液 〈0.05M) ”650 
硼砂 - 氧 氧 化 钠 缓冲 液 〈0.05M 硼 酸根 ) ”650 
14. 碳酸 钠 - 碳 酸 氢 钠 缓冲 液 "0.1IM) “651 
四 、 植 物 、 动 物 及 微生物 的 常用 培养 基 651 
(一 ) 植物 材料 的 常用 培养 基 651 
1. 适用 于 组 织 培养 的 培养 基 651 
2。 适 于 花粉 和 花药 培养 的 培养 基 653 
3. 适 于 胚 培 养 的 培养 基 ”656 
4 
5 


We 959- “OOI 作 3 
、 


本 
ci 靖 瑟 
生 生 二 @ 


. 适 于 细胞 悬浮 培养 的 培养 基 658 
。 适 于 原生 质 体 培养 的 培养 基 663 
(二 ) 微生物 实验 的 常用 培养 基 ”668 
(三 ) 动物 组 织 培养 常用 培养 基 675 
五 、 酶 ”680 
(一 ) 制备 植物 原生 质 体 常用 的 酶 ”680 
(二 ) 常用 的 限制 性 核酸 内 切 酶 ”682 
(三 ) 重组 DNA 实 验 所 用 的 主要 酶 ”685 
六 、 遗 传 工程 常用 的 菌株 和 质粒 686 
(一 ) 大 肠 杆菌 克隆 系统 686 
1. 常用 的 大 肠 杆 菌 菌株 及 性 质 686 
2. 载体 系统 689 
(二 ) 枯草 宇 菌 克隆 所 用 菌株 和 质粒 701 
41。 克隆 用 的 枯草 杆菌 菌株 701 


-13 


一 一 ssamsise os 二 
和 


。 克 隆 用 的 质粒 701 
。 克隆 用 的 重组 质粒 702 
。 大 肠 杆菌 和 枯草 杆菌 中 均 能 复制 的 穿梭 载体 702 


pC194 及 DUB110 的 物理 图 谱 ”702 


本 母 克 隆 系统 704 
酵母 基因 克隆 常用 的 细菌 和 酵母 株 系 701 


。 酵母 基因 克隆 常用 的 载体 704 


植物 遗传 工程 中 常用 的 菌株 及 穿梭 载体 和 Ti 质粒 的 衍 
生 载 体 705 


。 DGV3850 系 统 707 


SEV 系 统 708 

双亲 载体 系统 710 

哺乳 动物 遗传 工程 的 载体 _710 
PSV2 载 体 710 

DRSV 载 体 711 


七 、 常用 的 同 功 酶 检验 法 712 
八 、 其 它 有 关 的 生化 数据 718 


4 


第 一 节 ”遗传 学 分 科 介 绍 


(一 ) 遗传 学 (Genetices) 


遗传 学 是 研究 生物 遗传 和 变异 的 学 科 。 它 的 研究 范围 包括 遗 
传 物质 的 本 质 、 遗 传 物质 的 传递 和 遗传 信息 的 实现 三 个 方面 。 遗 
传 物质 的 本 质 包 括 它 的 化 学 本 质 、 它 所 包含 的 遗传 信息 、 它 的 结 
构 、 组 织 和 变化 等 。 遗 传 物 质 的 传递 包括 遗传 物质 的 复制 、 染 色 
”和 困 的 行为 、 遗 传 规律 和 基因 在 群体 中 的 数量 变迁 等 。 遗 传 信息 的 
实现 包括 基因 的 原初 功能 、 基 因 的 相互 作用 、 基因 作用 的 调 琛 以 
及 个 体 发 育 中 基因 的 作用 机 制 等 。 

作为 一 门 学 科 ， 遗 传 学 的 起 源 要 妃 漳 到 奥地利 学 者 孟 德 尔 的 
葛 豆 杂交 实验 。 他 在 1866 年 发 表 了 论文 4 植物 杂交 试验 ?>， 揭 示 了 
后 人 称 为 熏 德 尔 定律 的 遗传 规律 ， 商 定 了 遗传 学 的 基础 。 他 的 工 
作 到 20 世 纪 初 才 受 到 重视 。1909 年 英国 遗传 学 家 贝 特 森 发 表 了 著 
作 * 孟 德尔 的 遗传 原理 ?， 并 提出 了 遗传 学 这 一 学 科 名 称 。 从 那 时 


[站 汗 -者 


， 起， 遗传 学 的 发 展 天 致 可 以 分 为 三 个 时 期 ， 细胞 遗传 学 时 期 、 微 
生物 遗传 学 时 期 和 分 子 遗 传 学 时 期 。 


细胞 遗传 学 时 期 大 致 是 1910 一 1940 年 。 六 -本 


学 规律 和 染色 体 行为 的 研究 确立 了 遗传 的 染色 体 学 说 。1926 年 美 
国 遗传 学 家 摩尔 根 发 表 的 《基因 论 ? 和 1932 年 英国 达 灵 顿 发 表 的 
《细胞 学 的 最 新 成 就 ?是 这 一 时 期 的 代表 著作 。 

微生物 遗传 学 时 期 大 致 是 1940 一 1960 年 。 这 一 时 期 以 微生物 
为 材料 ， 研 究 基 因 的 原初 作用 、 精 细 结 构 、 化 学 本 质 、 突 变 机 制 
以 及 细菌 的 基因 重组 、 基 因 调 控 等 ， 大 大 发 展 了 遗传 学 的 基础 理 
论 ， 并 使 人 们 认识 到 遗传 学 的 基本 规律 适用 于 一 切 生 物 。 

分 子 遗 传 学 时 期 是 从 1953 年 沃 森 和 克 里 克 提 出 DNA 的 双 螺 旋 
模型 开始 的 。 分 子 遗传 学 的 基础 研究 工作 都 以 微生物 ， 特 别 是 以 
大 肠 杆 菌 和 它 的 叭 菌 体 作 为 研究 材料 ， 在 原核 生物 领域 取得 许多 
成 就 后 ， 才 逐渐 在 真 核 生 物 方面 开展 起 来 。 在 分 子 遗 传 学 时 代 ， 
另 两 个 发 展 迅速 的 遗传 学 分 支 是 人 类 遗传 学 和 体 细 胞 遗传 学 。 自 
从 进入 了 分 子 和 遗传 学 时 期 以 来 ， 在 遗传 学 许多 分 支 的 研究 中 ， 都 
采用 了 分 子 遗传 学 手段 ， 特 别 是 重组 DNA 技 术 。 因 此 ， 分 子 遗 伟 
学 已 成 为 遗传 学 领域 的 前 沿 学 科 。 


(二 ) 胞 遗传 学 〈(Cytogenetics) 


细胞 遗传 学 是 遗传 学 与 细胞 学 相 结合 的 一 个 遗传 学 分 支 学 
科 。 研 究 对 象 主要 是 真 核 生 物 ， 特 别 是 包括 人 类 在 内 的 高 等 动 植 
物 。 旱 期 的 细胞 遗传 学 着 重 研究 分 离 、 重组、 连锁 、 交 换 等 遗传 
现象 的 染色 体 基 础 ， 以 及 染色 体 畸 变 和 倍 性 变化 等 染色 体 行为 的 
遗传 学 效应 。 

细胞 遗传 学 是 遗传 学 中 最 早 发 展 起 来 的 学 科 ， 也 是 最 基本 的 
学 科 。 从 细胞 遗传 学 衍生 的 分 支 学 科 主 要 有 : 1. 体 细胞 遗传 学 元 
主要 研究 体 细 胞 ， 特 别 是 离 体 培 养 的 高 等 生物 体 细胞 指 遗传 规 
律 。2 ,分 子 细胞 遗传 学 ， 主 要 研究 染色 体 的 亚 显 微 结 构 和 基因 
活动 的 关系 。3. 进 化 细胞 遗传 学 ， 主 要 研究 染色 体 结 构 和 们 性 


人 


坦 变 与 物种 形成 之 间 的 关系 。4. 细 胞 器 遗传 学 ， 主 要 研究 细胞 器 
如 叶绿体 、 线 粒 体 等 的 遗传 结构 。5. 医 学 细胞 遗传 学 ， 是 细胞 遗 
| 传 学 的 基础 理论 与 临床 医学 紧密 结合 的 边缘 科学 ， 研 究 课 色 体 哺 


变 与 遗传 病 的 关系 等 ， 对 于 遗传 咨询 和 优生 优育 具有 重要 意义 。 


(三 ) 体 细 胞 遗传 学 (Somatic cell geiteties ) 


和 体 细胞 遗传 学 以 高 等 生物 的 体 细胞 为 实验 材料 ， 采 用 细胞 离 
体 培养 、 细 胞 融合 和 遗传 物质 在 细胞 间 转 移 等 方法 ， 研 究 真 核 细 
胞 的 基因 结构 功能 及 其 表达 规律 等 。 

1956 年 哺乳 动物 的 体 细 胞 在 离 体 培养 条 件 下 分 裂 ， 并 增殖 成 
为 克隆 。 在 植物 中 也 发 现 了 激动 素 ， 并 从 离 体 培 养 的 组 织 诱发 了 
器 官 分 化 ， 从 而 使 体 细胞 遗传 学 的 研究 进入 了 新 的 阶段 。 以 后 在 
细胞 融合 、 转 化 以 及 植物 的 原生 质 体 技术 等 方面 的 研究 工作 都 迅 
速 地 展开 。 由 于 这 方面 的 工作 对 研究 基因 功能 、 调 控 以 及 核 质 关 
系 等 都 具有 重要 意义 ， 同 时 在 医学 与 植物 育种 实践 上 也 具有 重大 
价值 ， 因 此 这 门 分 支 学 科 受 到 了 人 们 极 大 的 重视 。 

“植物 离 体 细胞 或 原生 质 体 再 生 完 整 植株 的 研究 证 实 了 植物 细 
胞 的 全 能 性 。 这 使 植物 体 细 胞 遗传 操作 的 研究 迅速 发 展 ， 包 括 植 
物 细胞 或 原生 质 体 的 离 体 培养 、 细 胞 突变 体 筛 选 、 植 物体 细胞 杂 
交 及 遗传 转化 等 。 人 们 期 望 通过 离 体 细胞 的 遗传 操作 ， 探 索 改 良 
作物 性 状 的 新 途径 ， 成 为 当前 蓬勃 发 展 的 生物 技术 研究 中 重要 的 
组 成 部 分 ， 也 是 体 细胞 遗传 学 中 最 为 活跃 的 一 个 领域 。 


(四 ) 人 类 遗传 学 (Human genetics ) 


人 类 遗传 学 研究 人 类 的 形态 、 结 构 、 生 理 、 生 化 、 免 疫 、 行 
为 等 各 种 性 状 在 遗传 上 的 类 别 、 人 类 群体 的 遗传 规律 以 及 人 类 遗 
传 性 疾病 的 发 生机 理 、 传 递 规律 及 预防 等 。 着 重 于 人 类 遗传 性 疾 
病 的 研究 ， 亦 称 为 医学 遗传 学 (medical genetics ) 。 

1875 年 英国 戈 尔 顿 首 倡 双 生 儿 法 ， 用 来 研究 遗传 与 环境 的 关 
系 ， 成 为 人 类 遗传 学 研究 的 经 典 方法 ， 疯 定 了 人 类 遗传 学 的 基 


_- 相 
沸 


IIRRIIRRRRRRIRRRREERREERRERERREEREERERRERERERRRRR 


础 。 人 类 遗传 学 将 果 蝇 与 植物 的 遗传 学 研究 中 所 取得 的 基本 规律 
加 以 运用 ， 又 不 断 地 引进 其 他 有 关 学 科 的 技术 与 方法 ， 紧 密 地 与 
医疗 保健 事业 的 需要 相 结合 ， 使 这 门 学 科 得 以 迅速 发 展 。 

常用 的 方法 有 系谱 分 析 法 ， 从 某 一 症状 或 性 状 入 手 ， 追 漳 移 
证 者 的 直系 与 旁 系 亲属 。 这 一 般 用 于 单 基 因 遗 传 性 状 分 析 。 数 理 
沉 计 则 用 于 多 基因 性 状 的 分 析 ， 例 如 体高 、 体 重 、 邓 压 和 茶 些 遗 
传 病 等 。 多 基因 性 状 在 群体 中 呈正 态 分 布 ， 并 易 受 环境 的 影响 ， 
所 以 常 以 遗传 力 来 表示 遗传 因素 和 环境 因素 的 相对 效应 。 由 染色 
体 煞 目 或 结构 异常 而 引起 的 染色 体 病 则 依靠 细胞 遗传 学 方法 分 
析 。 染 色 体 技术 和 人 类 性 染色 质 的 研究 结果 广泛 应 用 于 染色 体 病 
诊断 和 人 性别 鉴 定 等 。 此 外 ， 层 析 、 电 泳 、 色 谱 分 析 、 同 位 素 示 肾 
等 生化 技术 及 免疫 学 方法 也 在 人 类 遗传 学 研究 中 广泛 地 应 用 。 


(五 ) 毒 理 遗 和 传 学 (Toxicogenetics) 


毒 理 遗传 学 又 称 为 遗传 毒 理 学 (genetic toxicolosgy)， 是 用 遗 
传 学 方法 研究 环境 因素 对 遗传 物质 的 损害 及 其 毒 理 效应 。 突 变形 
成 、 癌 形成 、 致 畸 效 应 三 者 简称 为 毒 理 遗传 的 三 致 效应 。 研 究 三 
者 关系 ， 通 过 检测 诱 变 作用 来 判断 药物 的 致癌 、 致 畸 的 可 能 性 已 
成 为 毒 理 遗 传 学 的 重要 课题 。 
由 于 绝 大 部 分 致 辣 质 具有 诱 变 作用 ， 人 们 现在 孝 用 细 间 或。 
离 体 培 养 细 胞 作为 测试 对 象 来 代替 动物 试验 。 艾 姆 斯 测验 〈 回 复 
突变 法 ) 以 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 的 组 氨 酸 缺陷 型 菌株 为 测试 对 象 ， 如 
果 菌 株 用 某 待 测 化 学 物质 处 理 后 能 在 没有 组 氨 酸 的 培养 基 上 形成 
菌落 ， 说 明 发 生 了 回复 突变 。 根 据 菌 落 数目 可 估算 该 物质 的 诱 变 
能 力 。 这 一 检测 系统 还 包括 大 鼠 肝 的 微粒 体 酶 系 (Sg)， 它 能 使 一 
些 前 诱 变 剂 转变 为 诱 变 剂 ， 从 而 提高 了 检测 的 准确 性 。 微 核 测试 
法 以 骨 允 细胞 或 外 周 血 淋巴 细胞 中 微 核 (无 着 丝 粒 的 染色 体 断 片 ) 
出 现 的 数目 ， 作 为 染色 体 畸 变 的 指标 。 姐 妹 染 色 单 体 互 换 (SCE) 
测试 法 ， 是 在 培养 细胞 中 添加 5- 省 脱氧 尿 喀 啶 核 苷 (BrdU) ,经 过 
两 个 细胞 分 裂 周 期 ， 用 吉姆 萨 染 料 染 色 。 这 时 丙 个 染色 单 体 之 间 

本 本 


因 Bidu 的 挫 入 程度 不 同 而 出 现 了 色差 ， 它 们 的 互 换 也 就 显 而 易 
克 ， 扫 据 SCE 率 来 检测 环境 诱 变 剂 ， 是 简 速 灵敏 的 方法 。 
其 他 还 有 DNA 损 伤 修复 的 检测 和 离 体 培养 细胞 恶性 转化 试验 


”等 检测 方法 。 


(六 ) 肿瘤 遗传 学 (Cancer getitietics) 


脏 瘤 遗传 学 研究 瘤 的 发 生 与 遗传 和 环境 间 的 关系 ， 主 要 包括 
三 方面 肉 容 ，1，, 恶性 肿 瘤 易 患 性 的 遗传 背景 : 2 遗传 物质 的 变化 
或 遗传 信息 的 异常 表达 与 恶性 肿瘤 发 生 的 关系 3， 以 遗传 学 的 方 
法 分 析 环 境 中 的 致 瘤 因 素 。 常 用 的 研究 方法 有 系谱 调查 、 双 生 几 


法 、 流 行 病 学 调查 、 细 胞 遗传 学 方法 、 免 疫 学 方法 等 。 


人 类 恶性 肿瘤 中 只 有 少数 几 种 是 按 单 基因 方式 遗传 的 ， 如 神 
经 母 细胞 瘤 与 Wilm 瘤 等 ， 但 在 人 类 3000 多 种 单 基因 的 遗传 性 疾 
病 中 ，240 多 种 为 遗传 性 瘤 前 疾病 ， 有 不 同 程度 的 发 瘤 倾 向 ， 如 
家 族 性 结肠 息肉 病 、 基 底细 胞 疙 综合 征 、 多 发 性 内 分 洲 腺 肿瘤 综 
侣 症 等 。 常 见 的 恶性 瘤 是 多 基因 的 遗传 因素 与 环境 因素 共同 作用 
的 结果 ， 如 乳腺 癌 、 胃 癌 、 肺 冶 、 前 列 腺 癌 、 子 宫颈 瘤 等 ， 患 者 
的 一 级 亲属 的 发 病 率 显著 高 于 群体 的 发 病 率 。 此 外 ， 先 天 性 的 染 
色 体 异常 与 恶性 肿瘤 的 发 生 也 密切 相关 ， 如 先天 愚 型 〈 唐 氏 综 合 
征 ) 患者 易 患 白血病 。 

关于 肿瘤 发 生 的 遗传 机 理 ， 目 前 有 几 种 假说 。 染 色 体 不 平衡 
假说 ， 认 为 染色 体 异 常 是 癌变 的 原初 变化 ， 各 种 因素 造成 细胞 的 
不 对 称 分 裂 而 使 子 细胞 内 遗传 物质 的 分 布 不 平衡 ， 从 而 影响 基因 
的 正常 动能 ， 这 是 肿瘤 发 生 的 原因 。 有 些 结构 异常 的 染色 体 可 以 
作为 某 种 肿瘤 药 特 征 性 染色 体 ， 如 慢性 粒 细胞 白血病 的 phl 染 色 


体 等 ， 被 称 为 标记 染色 体 。 两 次 突变 假说 认为 肿瘤 可 分 为 两 种 类 


型 : 一 类 是 非 遗 传 型 肿瘤 ， 这 是 由 于 体 细胞 连续 发 生 两 次 突变 而 
形成 的 ; 另 一 类 为 遗传 型 肿瘤 ， 第 一 次 突变 发 生 在 患者 亲 代 的 生 
殖 细胞 中 ， 而 后 一 次 则 发 生 在 患 着 的 体 细胞 中 。 第 一 次 突变 是 肿 
冯 的 始 动 过 程 ， 第 二 次 则 是 促进 过 程 。 转 化 基因 假说 认为 ， 正 常 


站 2 


细胞 转化 为 恶性 细胞 是 由 转化 基因 (TT ) 与 其 调节 基 央 i*Tr 所 控 
制 的 。 当 iTz 基 因 突 变 为 iTr 基 因 时 ， 在 纯 合 体 iaTz/inTr 中 ， 
Tr 基 因 消 除 阻 过 而 被 激活 ， 致 使 细胞 发 生 恶 性 转化 。 瘤 基因 假 
说 认为 在 所 有 的 细胞 中 都 包含 着 致癌 病毒 的 全 部 遗传 信息 ， 其 中 
与 致癌 有 关 的 信息 称 为 癌 基 因 。 正 常 细胞 中 与 病毒 癌 基 因 同 源 的 
DNA 顺 序 被 称 为 原 癌 基因 或 细胞 瘤 基 因 ， 以 区 别 于 病毒 中 的 癌 基 
因 。 分 子 杂 交 方 法 证 明 同 一 种 瘤 基 因 在 不 同类 别 的 生物 中 极为 相 
似 ， 酶 切 图 谱 也 说 明 同 一 种 肿瘤 的 癌 基 因 的 种 族 差 异 不 大 。 原 瘤 ， 
基因 活化 可 能 有 两 种 方式 ，1， 通 过 DNA 的 重 排 而 提高 原 癌 基 因 
的 转录 活性 。2, 原 瘤 基 因 中 编码 顺序 的 局 部 变化 ， 从 而 转录 出 异 
常 的 产物 。 这 两 种 情况 都 会 导致 细胞 癌变。 


(所 ) 辐射 遗 传 学 (Radiation genetics) 


辐射 遗传 学 主要 以 高 等 动 植物 为 研究 对 象 ， 研 究 辐 射 的 遗传 
效应 。 辐 射 包 括 电离 辐射 和 非 电 离 辐射 ， 电 离 辐射 包括 X、7Y 射 
线 等 电磁 辐射 和 B、 中 子 、 质 子 、% 等 粒子 辐射 ， 非 电离 辐射 主要 
是 紫外 线 。 

从 细胞 水 平 来 说 ,电离 辑 射 的 遗传 效应 主要 是 引起 染色 体 畏 
变 ， 畴 变 类 型 有 末端 缺失 、 微 小 体 、 具 着 丝 粒 和 不 具 着 丝 粒 的 
环 、 臂 间 倒 位 、 相 互 易 位 、 双 着 丝 粒 体 或 多 着 丝 粒 体 、 单 位 断 
裂 、 单 体 互 换 等 。 辐 射 也 可 引起 染色 体 数目 的 改变 而 出 现 非 整 们 
体 。 染 色 体 畸变 已 被 作为 一 种 灵敏 的 生物 剂量 法 普遍 用 于 职业 性 
照射 、 医 疗 照射 、 军 事 照 射 等 方面 。 

在 分 耶 水 平 上 ， 电 离 辐射 的 遗传 效应 是 引起 基因 突变 。 研 究 
方法 主要 有 显 性 、 隐 性 致死 突变 法 ， 特 定位 点 突变 法 等 。 

电离 辐射 导致 遗传 效应 的 过 程 为 ，@ 使 各 种 分 子 电离 激发 
(10-? 一 10-15 秒 ); @ 这 些 分 子 产生 许多 活泼 的 自由 原子 或 自由 
基 (10-12 一 1 秒 );@ 它 们 互相 反应 并 和 周围 大 分 子 发 生 反应 (10-1 
~10-2 秒 )》 轩 细 胞 器 的 结构 组 分 变化 ， 包 括 染 色 体 畸变 和 基因 
突变 ( 儿 秒 锌 至 若干 年 )。 


2 


紫外 线 是 广泛 应 用 的 非 电离 辐射 ， 它 能 使 DNA 分 子 结构 发 生 


多 种 变化 ， 如 氨 键 和 链 的 断裂 ， 胞 喀 了 啶 的 水 合作 用 ， 以 及 胸腺 喀 


院 二 聚 体 的 形成 等 。 胸 腺 喀 啶 二 聚 体 的 形成 可 以 发 生 在 两 链 之 
间 ,也 可 发 生 在 同 链 相 邻 的 胸腺 喀 喧 之 间 。 双 链 间 的 二 聚 体 使 双 链 
的 解 开 受阻 ， 从 而 使 复制 过 程 或 修复 过 程 发 生 差错 。 同 链 上 的 二 
聚 体 也 会 导致 突变 。 辐 射 遗 传 学 的 生 究 对 突变 育种 及 辐射 危害 的 
防护 都 是 非常 有 用 的 。 


( 八 ) 免疫 遗传 学 (Immunogenetics) 


免疫 遗传 学 主要 研究 免疫 系统 的 结构 和 功能 ， 包 括 抗原 遗 
传 、 抗 体 遗 传 和 免疫 应 答 遗 传 三 个 方面 。 

红细胞 血型 抗原 是 一 类 糖 蛋白 ， 其 抗原 的 特异 性 由 糖 蛋白 的 
糖 基 结 构 决 定 。 血 型 基因 产物 是 一 些 专 一 性 的 糖 基 转 移 酶 ， 分 别 
催化 血型 抗原 前 体 特 定 部 位 的 糖 基 化 反应 ， 从 而 形成 相应 的 特异 
性 抗原 。 人 体 的 主要 组 织 相 容 性 复合 体 称 为 大 白细胞 抗原 ， 即 
HLA， 决 定 HLA 的 复合 位 点 在 第 6 号 染色 体 的 短 臂 上 。 

抗体 分 子 是 由 两 条 轻 链 和 两 条 重 链 组 成 的 免疫 球 蛋 白 。 根 据 
氨基 酸 顺序 的 变异 程度 ， 每 条 链 都 可 分 为 可 变 区 (V) 和 恒定 区 
《C)。 基 因 分 析 表 明 ， 决 定 轻 链 的 染色 体 上 ， 有 L、V、J、C 四 类 
基因 片段 ， 世 为 引导 片段 ，C 为 恒定 片 盟 ， 各 有 一 种 ，V 为 可 变 片 
段 ， 有 150 种 ，J 为 连接 片段 ， 共 有 5 种 。 决 定 重 链 前 染色 体 上 有 
L、V、D、J、C 五 类 基因 片段 ， 分 别 有 1 种 、80 种 、50 种 、6 种 及 
8 种 。 在 淋巴 细胞 分 化 过 程 中 ， 这 些 基 因 片 段 经 过 重 排 .连接 后 才 
被 转录 。 这 种 重 排 和 组 合 ， 可 产生 180 亿 种 免疫 球 蛋白 分 子 , 说 明 
了 抗体 的 多 样 性 。 

免疫 应 答 基因 ( 工 ) 控 制 着 个 体 对 抗原 发 生 免 疫 应 答 的 程度 。 
实验 表明 高 应 答 反应 是 显 性 ，, 低 应 答 反应 是 隐 性 。 

免疫 遗传 学 是 输血 、 器 官 移植 、 新 生 儿 溶血 症 和 亲子 鉴定 等 


现代 医学 临床 实践 的 重要 理论 基础 ， 对 于 阐明 免疫 系统 的 演化 、 


人 种 差异 和 生物 进化 也 有 重要 意义 。 


( 九 ) 微生物 遗传 学 (Mierobial geaaetics) 


微生物 遗传 学 是 以 病毒 、 细 菌 、 小 型 真菌 以 及 单 细胞 动 厢 物 
等 为 研究 对 象 的 遗传 学 分 支 学 科 。 
微生物 由 于 个 体 小 ， 生 长 周期 得 ,繁殖 迅速 等 优点 ,是 遗传 学 
研究 的 良好 材料 。 在 40~50 年 代 取 得 了 巨大 的 进展 ， 主 要 和 包括， 
(1) 用 射线 处 理 链 孢 霉 ， 得 到 了 多 种 营养 仙 陷 型 。 这 对 于 研究 基 
因 的 原初 功能 .基因 结构 和 基因 突变 具有 重大 的 意义 ,提出 了 一 个 
基因 一 种 酶 的 假设 。(2) 在 大 肠 杆菌 中 ,， 以 营养 缺陷 型 为 选择 标 
记 ，- 发 现 了 细菌 的 基因 重组 现象 ,说 明生 物 界 遗传 规律 的 普遍 性 ， 
并 使 大 肠 杆菌 和 它 的 叭 菌 体 成 为 分 子 遗 传 学 研究 的 主要 对 象 。(3) 
发 现 转化 因子 就 是 DNA， 从 而 逐渐 认识 到 DNA 的 重要 意 义 。(4) 
实验 证 明 抗 药性 的 出 现 可 以 发 生 在 细菌 接触 药物 以 前 表明 抗 药 
性 是 基因 突变 的 结果 ， 这 一 实验 使 人 们 对 于 生 牺 变异 规律 的 普 蜗 
性 加 深 了 认识 。(5) 史 曹 体 的 遗传 学 研究 证 明了 DNA 是 遗传 攻 质 ， 
三 联 体 是 遗传 密码 的 基本 单位 ， 并 阐明 了 基因 是 不 容 分 割 的 荔 能 
单位 ， 而 不 是 突变 和 重组 的 单位 ， 发 现 了 基因 突变 的 钓 点， 又 揭 
示 了 基因 的 重 倒 现 象 。 
微生物 遗传 学 的 迅速 发 展 与 其 研究 方法 有 密切 的 联系 。 最 突 
出 的 是 突变 型 的 筛选 和 选择 性 培养 方法 的 应 用 。 用 选择 性 培养 方 
法 ， 可 以 检 出 上 距离 十 分 接近 的 两 个 突变 位 点 之 间 的 重组 ， 能 在 旺 
时 间 内 测定 大 量 的 这 类 突变 型 ， 并 从 根本 上 改变 了 对 于 基因 的 认 
识 。 
微生物 遗传 学 的 发 展 推进 了 人 们 对 遗传 规律 的 认识 ， 同 时 也 
推动 了 生产 的 发 展 ， 对 于 氨基 酸 和 该 昔 酸 的 发酵 生 产 、 医 疗 卫 竺 
事业 以 及 重组 DNA 技 术 也 都 作出 了 重要 的 贡献 。 


(十 ) 分 子 和 遗传 学 (Melecular gemneties) 


分 子 遗传 学 是 在 分 子 水 平 上 研究 遗传 与 变异 的 机 制 ， 主 要 研 
究 基因 的 本 质 〈 包 括 基因 的 化 学 性 质 、 结 构 和 组 织 )、 基 因 的 功能 


8 浊 


_ 及 基因 的 变化 等 问题 。 

一般 认为 , 1953 年 沃 森 和 克 里 克 提出 DNA 分 子 结构 的 双 螺 族 
模型 是 分 子 遗 传 学 的 起 点 ， 它 是 在 微生物 遗传 学 的 基础 上 发 展 起 
来 的 。 早 期 工作 应 提 及 1955 年 车 泽 用 基因 重组 分 析 方法 对 大 肠 杆 
菌 的 T4 哈 菌 体 中 基因 精细 结构 的 研究 ， 其 精细 程度 达 到 DNA 链 
上 相隔 仅 三 个 核 背 酸 的 水 平 ， 沟 通 了 分 子 遗 传 学 和 经 典 遗 传 学 的 
概念。1954 年 美英 科学 家 分 别 证 实 了 ， 基 因 的 核 苷 酸 顺 序 和 它 所 
编码 的 蛋白 质 分 子 的 氨基 酸 顺 序 之 间 存 在 着 排列 上 的 线性 对 应 关 
_ 系 ， 从 而 充分 证 实 了 一 个 基因 一 种 酶 的 假说 。 此 后 ， 真 核 生物 的 
分 子 遗 传 学 研究 才 逐 渐 开 展 起 来 。 

真 核 生 物 除 了 与 原核 生物 相同 的 特点 以 外 ,， 还 有 一 些 自身 的 
特点 ， 如 普遍 存在 着 不 编码 肽 链 的 重复 顺序 。 在 真 核 生物 及 其 病 
毒 的 基因 组 中 还 发 现 了 大 量 的 断裂 基因 。 真 核 生 物 的 染色 体外 遗 
传 物质 与 原核 生物 也 有 很 大 差别 。 著 座 因子 是 一 种 可 以 转移 位 置 
的 遗传 因子 ， 真 核 生 物 的 转 座 因子 与 原核 生物 的 转 座 子 同样 都 是 
.目前 分 子 遗 传 学 研究 的 重要 课题 。 

在 分 子 遗 传 学 的 发 展 过 程 中 ， 一 系列 重要 的 研究 方法 与 技术 
人 
学 科 的 进程 。 

用 遗传 学 方法 可 以 得 到 一 系列 突变 型 ， 如 不 能 合成 某 种 所 
酸 、 不 能 进行 DNA 复 制 s 不 能 进行 细胞 分 裂 、 不 能 完成 某 发 育 过 
. 程 、 不 能 表现 某 种 趋 化 行为 等 。 进 而 可 对 它们 进行 遗传 学 分 析 ， 
应 用 互补 测验 和 基因 定位 等 手段 ,了 解 这 些 突变 型 代表 几 个 基因 ， 
各 基因 在 染色 体 上 的 位 置 。 

如 果 两 个 突变 分 别 位 于 两 个 同 源 的 染色 体 上 , 称 为 反 式 构 型 ， 
-位 于 同一 染色 体 上 则 称 为 顺 式 构 型 。 如 果 两 个 突变 不 在 一 个 基因 
座位 上 ， 由 于 基因 的 互补 作用 ， 细 胞 的 表 型 正常 ， 如 果 两 个 突变 
在 同一 个 基因 座位 上 ， 反 式 构 型 的 细胞 则 表现 为 突变 型 。 通 过 比 
较 顺 式 和 反 式 构 型 的 细胞 表 型 ， 从 而 判断 两 个 突变 是 否 属于 同一 
基因 座位 的 测验 称 为 顺 反 位 置 效应 测验 ， 简 称 顺 反 测 验 或 互补 测 

s 9 有 


ET 


验 。 在 反 式 构 型 中 不 能 互补 的 各 个 突变 型 ， 在 染色 体 上 所 占 的 一 
个 区 域 称 为 一 个 顺 反 子 。 顺 反 子 是 一 个 必须 保持 完整 才 具 有 正常 
生理 功能 前 遗传 物质 最 小 单位 ， 因 而 是 基因 的 同义词 。 

抽 提 、 分 离 、 纯 化 和 测定 等 生物 化 学 方法 都 是 分 子 遗 传 学 中 
的 常用 方法 。 特 别 有 用 的 技术 是 顺序 分 析 、 分 子 杂 交 和 重组 DNA 
技术 。 由 于 核酸 、 蛋 白质 结构 单元 的 排列 顺序 决定 着 它们 的 生物 
学 活性 ， 因 而 常 需要 了 解 它们 的 顺序 。 由 于 DNA 分 子 的 两 条 单 
链 之 间 ， 以 及 DNA 与 其 转录 产生 的 mRNA 之 间 ， 具 有 互补 结构 ， 
可 以 形成 杂种 分 子 -. 测 定 杂种 分 子 形成 的 方法 就 是 分 子 杂 交 方 法 ， 
可 用 它 来 测定 两 种 生物 的 DNA 总 的 相似 程度 ， 以 及 某 一 mRNA 
分 子 从 DNA 的 哪 一 部 分 转录 等 。 重 组 DNA 技 术 则 是 通过 限 制 酶 
和 连接 酶 等 的 作用 ,把 目的 基因 与 载体 相连 接 , 并 引进 细菌 细胞 ， 
通过 载体 的 复制 和 细菌 的 繁殖 便 可 得 到 这 一 基因 DNA 的 夫 量 纯 
制品 。 如 果 这 一 基因 得 以 在 细菌 中 表达 ， 还 可 获得 这 一 基因 所 纺 
码 的 蛋白 质 。 这 一 方法 还 有 助 于 研究 特定 基因 前 结构 和 功能 。 

分 子 遗 传 学 研究 的 方法 ， 特 别 是 重组 PNA 技 术 ， 已 经 成 为 许 
多 遗传 学 分 支 学 科 的 重要 研究 方法 。 分 子 遗传 学 也 已 经 渗入 到 许 
多 生物 学 分 支 学 科 中 。 以 分 子 遗传 学 为 基础 的 遗传 工程 则 正在 发 
展 成 为 一 个 新 兴 的 工业 生产 领域 。 


(十 一 ) 发 生 遗 传 学 (Developmental genetics ) 


发 生 遗 传 学 研究 基因 如 何 控制 发 育 ， 分 析 基 因 和 性 状 发 育 之 
闻 的 关系 。 

19 世 纪 末 德国 魏 斯 曼 最 早 提出 发 育 是 受 细胞 核 控制 的 。 后 来 
美国 的 威 尔 森 和 摩尔 根 分 别 强 调 了 基因 在 发 育 中 的 作用 。1940 年 
英国 沃 丁 顿 首先 提出 应 从 基因 与 细胞 质 环境 的 相互 作用 来 理解 胚 
胎 学 中 的 反应 能 力 、 诱 导 和 决定 等 基本 概念 。70 年 代 初 马克 特 与 
乌 尔 施 普 龙 合 著 的 发生 遗传 学 ?总结 了 前 大 的 研究 ， 初 创 了 这 门 
学 科 的 和 体系 。 2 

黑 腹 果 电 、 小 鼠 ,海胆 及 线虫 是 发 生 遗 传 学 研究 的 向 用 材料 。 


7T0 -。 


生 


攻 果 蝇 有 许 允 影响 发 育 的 突变 型 ， 而 且 唾 腺 巨大 染色 体 上 芷 松 区 的 
| 消长 反映 了 不 同 发 育 时 期 的 基因 活动 情况 。 小 鼠 也 有 许多 遗传 背 

景 清楚 的 纯 系 和 致死 突变 型 ， 但 它们 都 难以 得 到 足 量 的 样品 可 供 
| 生化 分 析 。 海 胆 则 便于 取得 足 量 的 同一 发 育 阶 段 的 材料 ， 但 可 供 
| 研究 的 突变 型 较 少 。 线 虫 党 殖 迅 速 ， 细 胞 数 少 而 恒定 ， 胚 胎 发 育 
_ 属 镶 霸 型 ， 每 一 器 官 的 来 源 有 确定 的 细胞 谱系 可 循 ， 而 且 有 许多 
罕 变 型 。 此 外 ， 细 菌 形成 芽孢 的 过 程 、 鸣 菌 体 的 自动 装配 过 程 也 
作为 发 育 模 型 应 用 于 发 生 遗 传 学 的 研究 。 
| 动物 发 育 是 从 受精 开始 ， 通 过 受精 孵 核 质 之 间 、 分 裂 球 之 间 
以 及 胚胎 不 同 部 位 之 间 的 相互 作用 ,使 基因 按 一 定时 空 顺序 表达 ， 
从 而 控制 细胞 和 器 官 原 基 的 逐步 决定 和 分 化 。 动 物 的 发 育 类 型 不 
同 ， 基 因 控 制 发 育 的 具体 方式 也 可 能 不 同 。 果 蝇 属 于 镶嵌 卵 类 型 ， 
细胞 的 发 育 命运 决定 得 早 ， 发 育 过 程 是 一 系列 由 大 到 小 的 发 育 区 
愈 分 愈 细 的 过 程 ， 其 中 每 一 步 都 可 能 受 一 个 或 一 组 选择 基因 的 控 
制 。 两 栖 类 属于 调整 卵 类 型 ， 发 育 中 细胞 的 命运 决定 得 晚 ， 细 胞 
迁移 和 相互 作用 在 发 育 中 起 重要 的 作用 。 

发 现 了 一 类 在 胚胎 发 育 中 控制 某 些 酶 出 现 的 时 间 和 位 置 的 基 
因 ， 称 为 时 序 基 因 。 倒 如 编码 黑 腹 果 蝇 淀粉 酶 的 结构 基因 附近 有 
一 个 map 基 因 ， 它 的 三 个 等 位 基因 控制 着 淀粉 酶 在 中 肠 出 现 的 时 
间 和 地 位 。 小 鼠 编码 6- 葡 萄 糖 酸 苷 酶 的 结构 基因 也 与 它 的 时 序 基 
因 Gut 紧 密 连锁 。 

在 小 鼠 的 第 17 号 染色 体 上 发 现 了 T 基 因 复 合体 ,包括 六 个 互补 
群 。 除 显 性 突变 T 以 外 ， 还 包括 一 系列 隐 性 致死 或 半 致 死 突变 t， 
它们 各 自 对 早期 发 育 的 某 一 阶段 起 作用 。 如 ft 使 胚 停 留 在 桑 棋 
期 ， 而 包 使 中 胚层 细胞 内 迁 受 阻 ， 造 成 中 轴 器 官 发 育 异 常 。 

发 生 遗 传 学 的 研究 对 于 了 解 畴 胎 、 肿 瘤 等 发 生 的 机 制 ， 以 及 
对 于 遗传 病 的 治疗 、 动 物 遗 传 工 程 的 应 用 等 都 具有 重要 的 意义 。 


(十 二 ) 行为 遗传 学 (Behavioral genmetics) 
行为 遗传 学 研究 控制 生物 行为 的 基因 及 其 作用 机 制 。 行 为 


是 受 基因 控制 的 复杂 的 生 物 学 过 程 。 深 入 了 解 生 物 行为 的 遗 忧 机 
制 ， 将 提高 人 类 利用 动物 资源 的 能 力 ， 推 动 仿生 学 的 发 展 ， 同 时 
也 为 防治 行为 异常 的 遗传 病 提供 理论 依据 。 

0 年 代 后 期 ， 忆 冀 科 学 家 通过 诱 赤 处 理 得 到 了 许多 影 师 和 
的 突变 型 ， 行 为 遗传 学 逐渐 发 展 成 为 一 门 独立 的 学 科 。 

大 肠 杆 菌 对 某 些 化 合 物 的 趋向 或 趋 避 行 为 ， 包 括 识 别 、 信 号 
输入 和 上 鞠 毛 运动 三 个 环节 。 每 一 环节 与 一 系列 基因 有 关 ， 已 经 测 
定 这 些 基因 的 位 置 。 草 履 虫 对 障碍 物 的 回避 行为 也 受 若 干 个 基因 
的 控制 。 线 串 中 也 已 经 发 现 与 趋 化 性 有 关 的 十 多 个 基因 。 

果 蝇 的 行为 比较 复杂 ， 已 经 获得 影响 趋 光 性 、 移 化 性 、 趋 地 
性 、 摄 食 、 飞 翔 、 求 偶 和 交配 、 记 忆 等 多 种 行为 的 突变 型 。 已 经 
发 现 蜜蜂 将 死 在 梨 穴 中 的 幼虫 和 师 丢 到 远 处 的 特殊 行为 ， 是 受 两 - 
个 隐 性 基因 支配 的 。 小 鼠 的 一 种 华 尔 效 舞蹈 突变 型 是 由 单 基 因 隐 
性 突变 造成 的 。 

人 类 也 有 一 些 由 于 单个 基因 发 生 突变 而 造成 的 行为 异常 ， 例 
如 自 般 容 犁 综合 症 和 严重 的 莽 丙 酮 尿 症 ， 表 现 为 智能 低下 ， 行 动 
困难 。 人 的 党 车、 晕船 、 梦 游 、 便 秘 、 夜 尿 、 磨 牙 等 行为 在 一 镍 
双生 儿 中 有 很 高 的 一 致 性 ， 智 力 方面 的 调查 也 都 说 明了 遗传 因素 
的 重要 性 。 


(十 三 ) 数量 遗传 学 (Quamntitative genetics) 

数量 遗传 学 是 运用 数理 统计 和 数学 分 析 的 方法 研究 生物 数量 
性 状 遗 传 的 规律 。 

时 在 1909 年 瑞典 的 尼 尔 松 - 埃 勤 提 出 多 基因 学 说 , 认为 同一 数 
量 性 状 由 若干 对 基因 控制 ， 各 个 基因 对 于 性 状 的 效应 都 很 微小 ， 
而 且 大 致 相等 ， 称 为 微 效 基因 。 微 效 基因 的 作用 一 般 是 累加 性 的 ， 
等 位 基因 之 间 没 有 明显 的 显 隐 性 关系 。50 年 代 以 来 随 着 概率 论 、 
线性 代数 、 允 元 统计 和 随机 过 程 的 应 用 ， 使 数量 遗传 学 有 了 很 大 
的 发 展 。 

群体 某 一 数量 性 状 的 遗传 变异 在 数量 遗传 学 中 用 遗传 型 方 姜 


全 党 


ie 
3 


(Vc) 来 表示 ， 它 是 累加 方差 (VA) 、 显 性 方差 (Vp) 和 上 位 性 
方差 (Vi) 之 和 ,而 测量 到 的 表 型 变异 的 表 型 方差 〈(V。) 等 于 遗传 
型 方差 (Vc) 与 环境 方 盖 (VE) 之 和 ， 用 公式 表示 为 ， 
Vu=Vc+VE=VA+YVDp+YVI+YVE 

由 于 纯 系 亲 本 或 杂种 一 代 的 遗传 性 一 致 ， 即 Vc=0， 所 以 可 用 它 
们 的 方差 来 表示 环境 方差 。 根 据 上 式 ， 我 们 可 以 由 表 型 方差 和 环 
境 方差 求 得 遗传 型 方差 。 

为 判断 某 种 性 状 变异 可 能 传递 给 后 代 的 程度 ， 数 量 遗 传 学 中 
用 遗传 力 来 表示 。 如 奶牛 出 生体 重 的 遗传 力 是 49% ， 说 明 出 生体 
重 在 很 大 程度 上 是 由 遗传 因素 决定 的 。 广 义 遗传 力 (h"B) 以 遗 


传 理 方 差 占 表 型 方差 的 比值 来 表示 ， 即 h*B = Ye。 由 于 遗传 方差 中 


只 有 累加 方差 VA 是 上 下 代 可 以 固定 遗传 的 变异 量 , 所 以 育种 上 常 
用 狭义 遗传 力 ， 以 累加 方差 占 表 型 方差 的 比值 来 表示 ， 即 
hzN 


为 估算 群体 或 个 体 某 一 性 状 的 稳定 性 ， 确 定 某 表 型 值 应 该 测 


量 的 次 数 ， 数 量 遗传 学 中 用 重复 力 的 概念 ， 指 某 狂 状 的 表 型 值 在 


”不 同 生产 周期 之 间 可 能 重复 的 程度 。 如 和 牛奶 乳脂 率 的 重复 力 为 


80， 表 明 重 复 力 较 高 ， 测 量 少数 几 次 就 能 大 致 确定 该 乳牛 今后 
的 乳脂 率 水 平 。 

在 育种 工作 中 ， 常 根据 性 状 的 相关 性 进行 间接 选择 ， 这 就 需 
要 反映 基因 型 之 间 相 关 程 度 的 遗传 相关 的 概念 。 遗 传 相关 指 同一 
个 体 两 个 性 状 的 基因 型 中 ， 累 加 效应 之 间 的 相关 ， 它 等 于 两 性 状 
的 遗传 协 方差 与 各 性 状 址 传 标准 差 乘积 之 比 。 由 于 去 除了 环境 影 
响 ， 它 比 表 型 相关 可 靠 。 如 家 鸡 的 卵 重 与 体重 的 遗传 相关 达 50%， 
而 外 重 变异 的 遗传 力 (60%) 显著 大 于 体重 (31%) ,所 以 按 卵 重 
性 状 来 间接 选 育 大 种 鸡 ， 效 果 较 好 。 

为 确定 选择 效果 ， 预 测 某 性 状 在 选择 情况 下 的 绝对 进度 及 其 
它 性 状 的 相应 进展 ， 数 量 遗 传 学 运用 遗传 进度 的 概念 。 遗 传 进度 


es 1 了 。 


是 杂种 后 代 某 一 数量 性 状 的 平均 数 ， 在 一 定 选择 强度 下 比 原来 群 
体 平 均 数 提高 的 数值 。 它 是 遗传 力 h 与 选择 差 i 的 函数 ， 即 
信人 G=Tn2> 

选择 指数 是 对 多 个 数量 性 状 进 行 综合 选择 时 的 指标 。 它 等 于 
各 性 状 表 型 值 与 指数 系数 乘积 的 代数 和 。 

由 于 经 济 性 状 绝 大 多 数 是 数量 性 状 ， 所 以 数量 遗传 学 的 研究 
对 于 育种 实践 具有 重要 的 指导 作用 。 近 年 来 基因 型 与 环境 的 相互 
作用 也 成 了 数量 遗传 学 的 重要 研究 课题 。 


(十 四 ) 群体 遗传 学 (Population genetics) 


群体 遗传 学 研究 群体 的 遗传 结构 及 其 变化 规律 。 它 应 用 数学 
和 统计 学 方法 研究 群体 中 基因 频率 和 基因 型 频率 以 及 影响 这 些 频 
率 的 因素 ， 并 由 此 来 探讨 生物 的 进化 过 程 。 

群体 遗传 学 起 源 于 英国 哈 迪 与 德国 温 伯 格 1908 年 提出 的 平衡 
定律 。 如 果 一 个 随机 交配 的 无 限 大 群体 ， 在 没有 突变 、 迁 移 或 任 
何 形式 的 自然 选择 的 情况 下 ， 群 体 中 各 基因 型 的 比率 从 - 代 到 曙 
一 代 将 保持 不 变 ， 这 就 是 哈 迪 -- 温 伯 格 定律 。 

。 群体 遗传 学 的 重要 研究 指标 ， 是 考查 各 种 遗传 方式 使 群体 达 
到 平衡 的 速度 ， 以 及 由 此 所 达到 的 平衡 的 稳定 性 。 只 有 在 这 种 平 
衡 被 打破 时 才 发 生 演变 ; 打破 平衡 的 因素 有 突变 、 选 择 、 迁 移 和 
漂 变 。 

突变 对 基因 频率 的 影响 力 不 大 ， 但 突变 是 生物 群体 中 遗传 村 
变异 的 根本 来 源 ， 加 上 自然 选择 和 随机 漂移 等 因素 的 作用 ， 闪 而 
导致 生物 的 进化 。 

为 考虑 自然 选择 对 群体 赵 传 组 成 的 影响 ， 必 须 了 解 适合 度 的 
概念 。 它 是 指 生 物 生存 并 把 它们 的 基因 传 给 后 代 的 相对 能 力 。 适 
合 度 受 环 境 的 影响 ， 某 一 基因 的 适合 度 ， 还 受 该 基因 以 外 的 基因 
的 状态 即 遗 传 背景 的 影响 。 生 物 群体 中 ， 由 于 有 害 基 因 的 存在 而 
使 群体 适合 度 下 降 的 现象 称 为 遗传 负荷 。 在 影响 群体 的 基因 频率 
和 基因 型 频率 的 因素 中 ， 特 别 重要 的 是 突变 和 自然 选择 的 关系 )- 


ww 1 本 。 


其 平衡 频率 都 是 受 突变 率 及 人 选 择 系数 控制 的 。 突 变 率 的 增高 或 先 


择 系数 的 减 小 都 导致 有 害 基因 平衡 频率 的 提高 。 

迁移 也 是 影响 基因 频率 的 一 个 因素 。 在 上 自然界 中 , 全 体 均 一 
的 生物 种 是 不 允 的 ， 和 常 因 分 布 范围 和 生活 环境 的 变化 而 产生 种 内 
分 化 5 如果 遗 传 组 成 不 同 的 群体 之 间 发 生 个 体 迁 移 的 话 ， 基 因 频 
率 就 受到 影响 。 

当 和 群体 不 大 时 ， 由 某 一 代 基 因 库 中 抽样 形成 下 一 代 个 体 的 配 
子 时 所 发 生 的 误差 ， 严 重地 影响 群体 的 基因 频率 ， 这 就 是 基因 频 
率 的 随机 漂移 。 与 上 面 提 到 的 突变 、 自 然 选 择 和 迁移 不 同 ， 它 导 
致 基因 频率 无 方向 性 的 变化 。 另 外 ， 非 随机 的 交配 方式 ， 包 括 选 
型 交配 和 近亲 交配 ， 都 能 导致 基因 型 频率 的 变化 。 近 交 增 加 纯 合 


率 ; 血缘 越 近 则 纯 合 率 增 加 越 快 ， 而 杂交 则 正好 相反 。 但 这 种 非 ， 


随机 交配 方式 不 影响 基因 频率 。 
群体 遗传 学 不 同 于 进化 遗传 学 ， 进 化 迁 传 学 研究 物种 内 变异 


转化 为 物种 间 变 异 的 过 程 ， 即 物种 的 形成 和 绝 灭 。 而 群体 遗传 学 
研究 不 同 世代 中 遗传 结构 的 演变 ， 它 仅仅 涉及 品系 间 、。 品种 间 和 


亚 种 间 的 变迁 ， 并 据 以 培育 各 种 新 的 生物 品系 和 部 种。 
〈 孙 勇 如 ) 


第 二 节 ”得 传 学 发 展 年 表 


1590 Zand 了 .Janssen 将 两 个 凸透镜 组 合 在 简 内 ， 首 次 生产 出 


复合 显微镜 。 

1651 。 双 .Harvey 提 出 了 全 部 生物 〈 包 括 人 在 内 ) 都 起 源 于 卵子 
的 概念 。 8 
1657 R 人 .de Graaf 在 人 的 卵巢 中 发 现 了 卵泡 ， 但 错误 地 把 它们 看 

作 是 卵子 。 
1665 及 .Hooke 发 表 “Micrographia2，, 首 次 描述 了 细胞 。， 
1668 了 .Redi 驳 斥 了 蛆 是 自然 发 生 的 学 说 。 


1677 “” A.Van Leeuwenhoek 观 察 了 人 和 其 它 哺乳 动物 的 精子 。 

1694 J.R.Camerarius 初 次 进行 授粉 实验 ， 报 道 了 显 花 植物 中 性 
的 存在 。 

1735 C。V。Linn6 出 版 了 < 自然 的 体系 ?第 一 版 ,在 他 的 生涯 中 ， 
该 分 类 学 著作 共 完 成 了 16 版 。 该 书 的 第 10 版 ， 成 为 动物 界 现 代 
科学 命名 的 出 发 点 。 与 他 的 《Species Plantarum > 一 书 在 植物 
界 齐 名 。 他 倡导 的 二 名 法 至 今 还 在 应 用 。 他 坚持 种 不 变 的 观点 
及 客观 分 类 的 主张 ， 从 而 提出 了 研究 种 起 源 的 方法 论 。 

1761-1767 J.G .Kolreuter 进行 了 烟草 属 的 种 间 杂交， 发 现 杂 
种 的 外 表 形 质 在 量 上 介 于 双亲 之 间 ， 正 反 交 没有 差异 。 他 认为 
双亲 对 于 子 代 特性 的 影响 是 均等 的 。 

1769 工 .Spallanzani 证 明 如 果 将 器 严密 封 ， 并 在 沸水 中 处 理 30 
分 钟 以 上 ， 就 可 防止 微生物 在 培养 基 中 “自发 发 生 *.1780 年 ， 
他 用 两 栖 类 作 人 工 授 精 实验 ， 证 明 卵 与 精液 的 接触 是 受精 与 发 
育 所 必需 的 。 

1798 了 T.R.Malthns 匿名 发 表 了 人 口 论 “AnEssay on the Prin- 
ciple of Population?， 启 示 了 达尔 文 在 1838 年 提出 的 生 存 竞 
争 与 适 者 生存 的 概念 。 

一 一 “Edward Jenner 首次 报道 接种 牛 阁 病 毒 来 防止 天 花 , 从 而 
建立 了 主动 免疫 的 原理 ， 创 始 了 免疫 学 。- 

1809 J.B.de Monet Lamatrck 提出 ， 通 过 适应 性 状 的 不 断 强 化 
及 完善 ， 物 种 可 以 逐渐 变 为 新 种 ， 而 这 些 获 得 性 状 能 被 传递 给 
后 代 。 

1820 C。EF.Nasse 记 述 了 人 的 血 友 病 是 伴 性 遗传 。 

1822-1824 了 工 .A.Knight,J.Goss 与 A .Seton 分 别 用 更 豆 进 行 杂 
交 ， 观 察 到 了 子 一 代 的 优势 及 各 遗传 特征 在 子 二 代 中 的 分 离 。 
但 没有 继续 研究 它们 的 后 代 ， 也 没有 测 定 遗 传 特 性 的 分 离 比 
例 o 
1825 .下 .V .Raspail 进行 了 淀粉 的 碘 反 应 实验 ， 成 为 组 织 化 学 的 

基础 。 c 5 

昌 16 5 


1827 玫 .E.von Baer 首次 准确 地 描述 了 人 卵 。 

1830 G.B.,Amici 展示 了 花 鞠 管 伸 向 花柱 底部 ， 直 达 胚 珠 。 

1831 R.Brown 记述 了 细胞 中 的 细胞 核 。 

一 一 12 月 27 日 英国 Beagle 号 军舰 从 普 利 匾 斯 港 出 发 ， 开 始 绕 地 
球 航 行 。22 岁 的 博物 学 家 达尔 文 乘 船 随行 。1933 年 9 月 15 日 到 
达 Galapagos 诸 岛 。 达尔 文 花 了 5 个 星期 考察 了 动 植物 。 岛 上 极 
丰富 的 近 缘 种 ， 使 达尔 文 想到 岛 上 有 些 种 是 从 大 陆 迁 居 而 来 ， 
这 些 种 后 来 发 展 成 各 式 各 样 的 姐妹 种 ， 专 门 适应 于 各 种 新 的 环 
境 条 件 。 

1838 和 蛋 自 质 一 词 首 次 在 化 学 论文 中 出 现 ， 作 者 是 G.J.Mulder。 
但 这 个 词 是 J.J.Berzelius 首次 提出 的 。 

1838-1839 1MJ。Schleiden 和 T.Schwann 建立 了 细胞 学 说 ,这 是 
生物 学 界 唯一 可 与 进化 论 相 比 的 伟大 法 则 。Schleiden 在 核 内 
发 现 了 核 仁 。 


1841A.Kslliker 证 实 精子 就 是 从 精 集 里 的 细胞 转变 来 的 性 细 


胞 。 
1845， J.Dzierzon 报道 了 雄 蜂 是 从 未 受精 的 卵 钙化 而 来 的 ， 而 
工蜂 与 蜂王 是 从 受精 卵 邬 化 来 的 。 


1855 R.Virchow 提出 了 新 细胞 是 从 原 有 的 细胞 分 裂 产生 的 原 


理 。 。 

1856 Gregor Mendel， 奥 地 利 Brann 市 Augustinian 修道 院 的 和 修 
道士 ， 开 始 用 六 豆 进行 育种 实验 。 

1859 达尔 文 发 表 物 种 起 源 。 


1860 了 T.A.E.Klebs 介绍 了 石蜡 包 埋 法 。 


1861 工 .Pasteur 反 驭 微生物 自然 发 生 学 说 。 

1865 Gregor Mendel 于 2 月 8 日 和 3 月 8 日 、 在 Brinn 自然 科学 
研究 协会 的 每 月 例会 上 报告 并 解释 了 他 的 况 豆 遗传 研究 。 

1866 G.Mendel 发 表 了 “植物 杂交 试验 "。 但 未 引起 重视 。 

一 一 FE.Miescher 分 离 出 核 蛋 和 白 。 

1869 FE.Galton 发 表 “ 天 资 遗 传 ”， 强 调 了 智力 的 遗传 基础 ， 首 


区 了. 巡 ， 


ee ww wa 


次 对 双胞胎 的 智能 特性 进行 比较 。 

1870 W。His 发 明 切 片 机 。 

1873  A.Schneider 首次 记述 有 丝 分 展 。 - 

1875 Q.Hertwig 从 海胆 繁殖 的 研究 得 出 结论 ， 动 植物 的 受精 在 
于 肉 雄 双亲 所 提供 的 两 个 细胞 核 的 物理 结合 。 

一 了 .strasbufger 记述 了 种 籽 植 物 的 细胞 分 裂 : 

-一 E.Galton 引 人 注 目地 用 双胞胎 的 研究 来 盖 明 遗传 与 环境 - 
对 于 行为 的 相对 重要 性 。 

1876 OO.Bitschli 记述 原生 动物 核 的 二 形 性 。 

1877 吾 .Fol 报道 了 海星 精子 穿 入 久 子 的 观察 ， 本 有 用 
完整 核 转移 到 卵 内 ， 成 为 雄性 原核 。 

一 一 王 .Abbe 开始 发 表 显 微 镜 光 学 原理 的 重要 资料 名 

了 878”W .Kuhne 创造 “ 酶 ”一 词 。 

1879 Wo.Flemming 研究 了 蝶 旺 尾鳍 上 皮 的 有 丝 分 裂 。 他 寿 出 
核 的 分 裂 包括 染色 体 的 纵 裂 及 由 此 产生 的 姐妹 染色 单 体 迁 移 到 
未 来 的 子 核 中 。 他 也 创造 了 “染色 质 ” 一 词 。 

1831 王 ,G.Balbiani 在 播 蚊 幼 虫 唾 腺 细胞 中 发 现 “ 交 又 条 玫 状 
细 线 ,但 他 没有 认识 到 这 是 多 线 染 色 体 。 
一 一 人 .Koch 发 明了 至 今 还 用 的 纯 菌 分 离 培养 法 

1882 W.Flemming 发 现 灯 刷 妆 色 体 ， 提 出 “有 丝 分 裂 ” 一 词 。 

1883 己 .van Beneden 研究 了 多 种 蚌 虫 的 减 数 分 裂 ; 淇 染色 体 
数 为 20=4。 他 报道 了 好 虫 配子 的 染色 体 数 为 体 岗 胞 的 一 半 ,而 
体 细 有 跑 的 染色 体 数 在 受精 时 恢复 。 er 
过 程 。 

一 内 .Roux 提出 核 内 的 染色 体 是 遗传 因子 的 载体 ， 

1887 A.Weismann 推测 所 有 有 性 生物 都 必然 发 生 业 和 色 笨 前 凋 
期 性 减 数 。 

1888 工 .Boveri 记述 了 中 心 粒 。 

一 一 允 .Waldeyer 提出 染色体” 一 词 。 

1889 E.Galton 将 群体 的 数量 性 状 测定 法 引入 遗传 学 
18 = 


人 习 
“于 
| 


1890 R.Altmann 报道 了 细胞 内 存在 着 “细胞 质 生活 粒 ”, 并 推 斯 
它们 作为 细胞 内 的 共存 者 ,是 “基本 的 生物 体 ” ,执行 着 它们 的 寄 
主 所 必 不 可 少 的 过 程 。C .Benda(1898) 称 这 些 细胞 器 为 “ 线 粒 
体 ”。 

-一 了 .von Behring 证 明 已 被 免疫 过 的 动物 的 血清 里 含有 一 种 
因子 ,能 专门 杀 死 用 作 免 疫 的 生物 体 。 这 些 因子 现在 叫做 抗体 。, 

1892 T.Boveri 记述 了 电 虫 成 熟 分 裂 中 染色 体 的 配对 。 

-- 一 人 A.Kossel 发 现 RNA。 

一 一 A.Weismann 主张 种 质 是 独立 於 生殖 细胞 其 它 部 分 的 特 丈 
物质 ， 遗 传 变异 是 由 种 质 的 变化 产生 的 。 否 定 拉 马 克 的 获得 性 
遗传 学 说 。 

1895  W。C。oentgen 发 现 X 射 线 。 

1896 了 E.B.Wilson 发 表 了 “发 育 与 遗传 中 的 细胞 >(The Cell in 
Development and Heredity) 。 这 篇 有 影响 的 论文 ,精辟 邮 上 归纳 
了 Schleiden 和 Schwann 提 出 细胞 学 说 半 个 世纪 以 来 的 细胞 学 资 
料 。 


897 E.Buchner 展示 用 无 细胞 酵母 提取 物 进行 酒精 发 酵 。 


1898 CC.Benda 发 现 线粒体 。 

一 - 了 工 .Boveri 记述 了 蚌 虫 染 色 质 的 减少 ， 

1899 M.W.Beijerinck 证 明 烟 草 灸 嵌 病 起 因 于 一 种 自体 繁殖 因 
子 。 这 些 因子 能 通过 细菌 滤纸 ， 光 学 显微镜 看 不 到 ， 在 细菌 培 
养 基 上 也 不 能 生长 。 他 提出 这 种 病毒 是 自体 繁殖 的 生命 亚 细 胞 
形式 ， 是 迄今 未 知 的 一 种 生物 体 类 型 。 

1900 吾 ,de Vries,C.Correns 和 王 .Tschermak 各 自重 新 发 现 了 熏 
德尔 的 论文 de Vries 和 Correns 用 几 种 植物 作 了 与 孟 德 尔 早期 
研究 相 类 似 的 育种 实验 ， 并 分 别 对 他 们 前 结果 作出 了 相似 的 解 
释 。 因 此 当 他 们 看 到 重 德 尔 的 论文 时 ， 就 立即 确认 了 它 的 重大 
意义 。 双 .Bateson 也 在 伦敦 皇家 学 会 上 强调 了 备 德 尔 贡献 的 重 
要 性 。 

一 一 于,Pearson 确立 了 X: 检 定 法 。 


要 


一 一 天.Lansteiner 发 现 了 人 的 血液 凝集 反应 。 
一 一 了 P.Ehrlich 推测 抗原 与 抗体 粗 结合 是 由 于 它们 结构 上 的 互 
补 性 。 
1901 吾 .de Vries 用 突变 ”一 词 来 解释 月 见 草 突然 的 、 光 

自发 的 变化 。 

一 一 工 . 吾 .Montgomery 研究 了 几 种 米 翅 目的 精子 发 生 , 他 断定 
减 数 分 裂 时 母 本 染色 体 只 与 父 本 的 染色 体 配 对 。 

一 一 必 .Landsteiner 提出 人 类 可 分 成 三 种 血型 ， A、B 和 C，C 
型 后 来 改称 为 O 型 。 

一 一 E.von Behring 由 于 抗 血 清 疗法 药 研 究 而 获得 诺 贝 尔 奖 
金 。 

1902 C.E.McClung 注意 到 各 种 昆虫 都 产生 数量 相等 的 两 类 精 
子 ， 一 类 精子 含有 “ 副 染 色 体 ”, 而 另 一 类 没有 。 他 提出 这 种 额外 
染色 体 是 性 的 决定 因素 ， 并 声称 性 别 是 受精 时 决定 的 ， 不 只 昆 
虫 是 这 样 ， 其 他 生物 ， 包 括 人 类 在 内 可 能 也 不 例外 。 

一 一 T.Boveri 研究 了 单 倍 体 、 二 倍 体 及 非 整 倍 体 海 胆 胚 的 发 
育 ， 发 现 生物 必需 有 完整 的 染色 体 组 才能 正常 发 育 。 从 而 推断 
各 染色 体 都 载 有 不 同 的 遗传 要 素 。 

一 一 W .S.Sutton 发 展 了 染色 体 学 说 ， 提 出 基因 对 的 独立 分 配 起 
源 于 减 数 分 裂 时 染色 体 行 为 的 假设 。 因 为 二 价 体 中 同 源 物 的 分 
离 方向 不 受 其 他 二 价 体 的 影响 ， 所 以 它们 所 含 的 基因 也 是 独立 
分 配 的 。 

一 一 了 .了 ofmeister 和 卫 。Fischer 提出 所 有 蛋白 质 是 氨基 酸 常 规 
地 通过 肽 键 缩 合 而 形成 的 。 

1902-1909 W 。Bateson 采用 了 “遗传 学 >“ 等 位 基因 2 纯 合 体 ” 
杂 合 体 *、Fi”、E:” 及 “上 位 基因 ?等 名 词 。 

1903  W.WaldeyeT 称 有 丝 分 虱 时 妆 色 休 上 由 幼 狂 丝 附 着 的 各 们 
为 着 丝 氮 。 

1904 A.F.Blakeslee 在 真菌 中 发 现 了 异 核 融合 。 

1905 工 .Cuenat 发 现 将 携带 黄 毛 基因 的 小 鼠 互 相交 配 轩 ， 后 代 


人 人 


总 是 以 2:1 的 比例 产生 黄 毛 鼠 和 野 色 鼠 。 因 此 推断 黄 毛 鼠 是 杂 合 

体 。Ww .E,Castle 和 C.C。Little 于 1910 年 证 明黄 色 纯 合体 死 在 子 

官 内 。 因 此 , 野 鼠 色 系 列 中 的 这 一 显 性 等 位 基因 〈A7) 是 第 一 个 

被 证 明 的 纯 合 致死 基因 。 

1906 ” 双 .Batson 和 R.C.Punnett 以 香 葛 豆 为 材料 ， 报 道 了 连锁 

的 首 例 。 

1907 R.G.Hartison 用 血 淋 巴 液 培养 蛙 的 中 枢 神 经 片段 ， 观 察 
到 了 神经 纤维 的 派生 。 他 由 此 而 发 明了 组 织 培养 。 

-1908 G.H.Hardy 和 W.Weinberg 通过 各 自 独立 的 研究 ,将 群体 

遗传 学 的 哈 迪 - 温 伯 格 定律 公式 化 。 

了 909 G.H.Shull 倡导 用 自 交 系 生 产 商 品 化 玉米 种 。 该 杂交 玉米 

”方案 导致 价值 十 亿美 元 的 粮食 增产 。 

一 一 A.E.Gartrod 发 表 “ 先 天 性 代谢 异常 ,这 是 人 类 (或 其 他 任 
何 物种 ) 生 化 遗传 学 的 最 早 研 究 。 

-一 F.A.Janssens 指出 非 姐 妹 染 色 单 体 之 间 的 交换 产生 交叉 。 

一 一 《.C,Little 创始 了 一 种 育种 法 ， 首次 沙 育 出 忌 的 近亲 繁殖 

。 系 (现在 被 称 为 DBA) 。 

-一 W.Johannsen 从 事 豆 科 植物 自 交 系 的 种 籽 大 小 的 遗传 研 
究 ， 认 识 到 将 有 机 体 的 表现 与 它 的 基因 构成 进行 区 分 是 必 要 
的 。 为 此 他 提出 了 基因 型 >、 表 型 及 “基因 ?这些 新 闻 汇 。 

一 CS.Correns 和 E.Bauer 研究 花 斑 植物 中 叶绿体 缺失 的 遗传 ， 
发 现在 某 些 情况 下 ， 不 能 形成 正常 叶绿体 的 特性 是 非 孟 德尔 方 
式 遗 传 的 。 

一 再 .Nilsson Ehle 用 多 因子 假设 来 解释 小 麦 种 皮 颜 色 的 数量 
遗传 。 

1910 工 H.Morgan 发 现 了 白眼 果 蝇 ， 由 此 又 发 现 了 性 连锁 。 开 

′ 始 了 果 蝇 遗传 学 。 

一 一 W.Weinberg 发 展 了 一 种 方法 ， 用 小 家 族 资 料 所 得 的 各 种 

”确定 值 ， 来 修正 人 类 谱系 孟 德 尔 分 离 的 期 待 值 。 

一 一 了 P.Rous 将 鸡肉 痛 的 无 细胞 滤液 注射 到 受 体 鸡 中 ,诱发 了 新 


ea。 2T 。 


的 肉瘤 。 

1911 T.Morgan 提出 果 昵 的 白 腿 、 黄 体 和 小 型 地 基因 都 连 锦 
在 染色 体 上 。 

一 一 W.R.B.Robertson 指出 一 种 直 才 上 有 目 昆 虫 的 等 臂 染 色 体 可 能 
与 另 一 个 种 的 两 个 近 端 着 丝 点 染色 体 一 致 ， 并 推断 等 劈 染 色 体 
可 能 是 进化 过 程 中 ， 由 近 端 着 丝 点 染色 体 融 合 产生 的 。 为 纪念 
他 ， 这 种 整 臂 融合 被 称 为 罗 勃 逊 氏 易 位 。 

1912 A.Wegener 提出 大 陆 漂移 的 概念 

一 一 FE.Rambousek 认为 提起 原 细 胞 中 交 双 条 纹 状 组 线 " 就 是 
染色 体 。 

一 一 T.H.Morgan 证 实 雄性 黑 度 果 遍 不 发 生 交换 。 他 还 首次 发 
现 性 连锁 致死 。 

1913 Y.Tanaka 报道 雌性 家 午 不 发 生 交换 。 该 种 的 异 配 性 别 是 
内 性 。 

一 一 W.H.Bragg 和 W.L.Bragg 证 实 对 和 X 射 线 衍射 图 进行 分 析 可 
以 确定 晶体 的 三 元 原子 结构 。 

一 -  A.H.Sturtevant 提供 了 果 电 连锁 概念 的 实验 基础 ,并 制作 
了 第 一 张 基因 图 。 

1914 _C.B.Bridges 在 果 蝇 的 减 数 分 裂 中 发 现 不 分 离 现象 。 

-一 CS.C.Little 假设 移植 瘤 的 接受 或 拒绝 有 其 遗传 基础 。 

1915 FE.W.Twort 分 离 出 第 一 个 滤 过 性 细 菌 病毒 。 

一 一 R.B.Goldschmidt 用 “ 间 性 体 ? 一 词 来 描述 舞 毒 蛾 的 一 些 亚 
种 间 杂 交 所 产生 的 性 畸形 。 

一 一 JB.S.Haldane, A.D.Sprunt 和 N.M.Haldane 记述 了 糊 椎 动 

。 物 ( 鼠 ) 连 锁 的 首 例 。 

1916 也.J.Muller 在 果 蝇 中 发 现 交 叉 于 扰 。 

1917 F.d'Herelle 提 出 术语 “ 鸣 菌 体 ", 开 发 了 病毒 滴定 度 检验 法 。 

一 一 9.Renner -展示 月 见 草 属 的 各 个 种 都 是 复合 杂 合 体 s 

一 一 0.Winge 强调 了 多 倍 体 在 被 子 植物 进化 过 程 中 的 重要 作 

用 。 

ZXX 


一 一 C.B.Bridges 在 果 蝇 首次 发 现 了 染色 体 缺 从。 


1918 互 .Spemanmn 证 实 胚 的 生命 部 分 可 以 刺激 它 部 分 的 形态 建 


成 ， 并 导致 它 的 形态 分 化 〈 胚 胎 诱 导 ) 。 从 而 他 发 现 并 命 各 了 
“组 织 原 ”。 

一 一 互 .J.Muller 在 果 蝇 中 发 现 平衡 致死 现象 。 

1919 了 .了 .Morgan 强调 黑 腹 果 蝇 的 连锁 群 数目 与 年 倍 染色 体 数 
相等 5 

一 Cc.B.Bridges 发 现 了 果 蝇 的 染色 体 复制 。 

1920 和 A.F.Blakeslee, J.Belling 和 M. 刁 .Farnham 在 曼 陀 罗 中 发现 
了 三 体 。 

一 一 互 .Kniep 记述 并 正确 地 解释 了 ScPiyophy1TU COMHe 及 
相关 的 担子 菌 纲 中 的 不 亲 和 系 统 。 

1921 了 下 .G.Banting 和 C.H.Best 分 离 出 胰岛 素 并 研究 其 生理 特性 。 

一 - R.B.Goldschmidt 发 表 了 工业 黑 化 型 的 初次 遗传 分 析 并 论 
述 其 进化 含义 。 

一 一 “.B.Bridges 在 果 蝇 中 报道 了 第 一 例 单 体 ( 第 四 染色 体 为 单 
数 ) 。 

1922 L.V.Morgamn 发 现 果 蝇 的 并 连 驻 染色体、 


一， R.E.Cleland 记述 了 月 见 草 减 数 分 裂 中 的 染色 体 环 。 


一 一 A.F.Blakeslee, J.Belling，M. 卫 .Farnham 及 A.D.Bergner 发 


现 了 单 倍 体 曼 陀 罗 。 
1923 (.B.Bridges 观察 到 了 果 蝇 的 染色 体 易 位 。 


一 一 R.Feulgen 和 H.Rossenbeck 记述 了 当今 DNA 定 位 最 有 效 的 


细胞 化 学 方法 。 

一 一 0.Winge 在 植物 (小 麦 ) 中 最 时 发现 了 单 体 。 

一 一 T.Svedberg 制作 了 第 一 台 超 速 离心 机 。 

一 一 A.E.Boycott 和 C.Diver 记述 了 控制 蜗牛 壳 螺 旋 方 向 的 “ 延 
迟 的 " 备 德 尔 遗 传 。 

一 一 A.H.Sturtevant 提出 蜗牛 壳 螺 旋 方 向 是 由 母体 基因 型 控制 
的 卵 质 特性 押 决 定 的 。 


本 本 训 


一 一 J. KR.Santos 用 Elodea， H.Kihara 和 工 . 0na 用 Re o.wWin- 
-ge 用 Humulus 分 别 证 实 ， 某 些 礁 雄 异 株 植物 是 XX-XY 的 性 决 
定型 。 

1925 《CC.B.Bridges 完成 了 他 对 三 倍 体 果 蝇 的 非 整 倍 体 后 代 的 细 
胞 学 分 析 ， 确 定性 染色 体 与 常 染 色 体 之 间 的 关系 控制 着 性 的 表 

主 列 。 

一 一 卫 .M.East 和 A.J.Mangelsdorf 首次 满意 地 解释 了 显 花 植物 
的 自 花 不 孕 现 象 。 

-一 .A.H.Sturtevant 分 析 果 蝇 的 棒 眼 现象 ， 发 现 了 位 置 效应 。 

一 F.Bernstein 提出 ABO 血 型 是 由 一 组 等 位 基因 决定 的 。 

一 一 IT.H.Goodspeed 和 有 R.E.Clausen 创造 了 一 个 烟草 双 二 倍 体 。 

1926 王 .G.Anderson 证 实 果 蝇 X 染 色 体 的 着 丝 点 在 黄体 位 点 的 对 
侧 端 。 

二 ss.chetverikoy 介绍 了 野生 果 电 群体 的 扯 伟 分析。 

一 一 J.B.Sumner 分 离 第 一 个 结晶 酶 ， 并 证 明 它 (脲酶 ) 是 一 种 蛋 
日 质 。 

一 一 A.H.Sturtevant 最 先 在 果 蝇 中 发 现 倒 位 。 

二 R.E.Clausen 和 T.H.Goodspeed 记 述 了 植物 (烟草 属 ) 中 第 一 
例 单 体 分 析 。 

1927  - 久 .M.Bauer 报 道 将 皮肤 从 一 个 单 卵 双生 省 移植 到 另 一 个 身 
上 时 ， 没 有 遭 到 排斥 。 

一 一 J.Belling 提 出 减 数 分 裂 时 非 同 源 染 色 体 间 的 交换 导致 环 状 
染色 体 。 

一 一 J.B.S.Haldane 推测 在 各 种 员 齿 动物 与 食肉 动物 中 控制 皮 . 
毛 颜 色 的 一 些 基因 在 进化 上 可 能 是 同 源 的 。 

一 J.Belling 介绍 用 乙酸 洋红 技术 压 片 的 染色 体 。 

一 一 .8B.0.Dodge 介绍 红色 链 犯 霉 的 遗传 研究 。 

一 瑟 .J.Muller 报道 用 X 射 线 人 工 诱 发 果 蝇 突变 。 

1928 5;E.J.Stadler 报 道 玉 米 的 人 工 诱 变 ， 证 实 剂量 与 频率 呈 直 线 
关系 。 


。 24 。 


-一 ER.Griffith 发 现 肺炎 球 亡 属 的 模式 转化 。 成 为 M- 
acleod 和 McCartbhy(1944) 工 作 的 基础 。 

一 L.F.Randclph 识别 了 植物 细胞 的 正常 染色 体 与 超 数 染 色 
体 。 称 正常 染色 体 为 “A 染 色 体 ”, 超 数 染 色 体 为 “B 染 色 体 ?。 

一 一 了 E。Heitz 引入 异 染 色 质 ?一 词 。 

19%29 A.Fleming 发 现 青 霉 素 。 

一 《.D.Darlington 首次 提出 ,交叉 使 同 源 染 色 体 在 减 数 分 肥 
中 期 保持 在 一 起 ， 从 而 使 它们 能 在 后 期 I 分 到 两 极 。 

一 R.C.Tryon 对 大 鼠 的 迷宫 学 习 能 力 成 功 地 进行 了 连续 选 
择 。 

1930 及 .E.Cleland 和 A.EF.Blakeslee 证 明月 见 草 属 中 基因 组 的 特 
殊 传 递 模式 ,是 由 平衡 致死 与 相互 易 位 的 复合 体系 所 造成 的 。 
一 一 - R.A.EFisher 发 表 “ 自 然 选 择 的 遗传 学 原理 ”(The Gengtic- 

al Theory of Natural Selection ) 。 

一 一 开 .Landsteiner 的 免疫 学 研究 获 诺 贝 尔 奖 。 

:931 C.Stern 提供 了 交叉 的 细胞 学 证 据 。 

一 一 有.B。Creighton 和 B.Mcclintoack 也 得 到 同样 结果 。 

一 一 ”98.Wright 发 表 和 孟 德 尔 式 种 群 的 进化 (Evolution in Me- 
ndelian Populations) 。 该 书 与 Fisher 的 著作 ,以 及 J.B.S.Halda- 
ne 于 1930 到 1932 年 在 “自然 与 人 工 选择 的 数学 原理 ?总 标题 下 发 
表 的 一 系列 论文 一 起 ， 构 成 了 群体 遗传 学 的 数学 基础 。 

一 C.D.Darlingten 报告 交叉 可 以 移 到 二 价 体 的 末端 而 染色 
体 不 断裂 。 现 在 已 经 知道 这 种 “ 移 端 ?过 程 只 在 某 些 种 内 存在 。 
一 一， B.Mcclintock 用 玉米 证 明 ， 如 果 一 个 染色 体 片段 相对 倒置 

的 话 ， 该 倒 位 的 个 别 杂 合子 在 粗 线 期 逆向 配对 。 

1932 M.Knoll 和 也 .Ruska 记述 了 现代 电子 显微镜 的 原型 。 

1933 T.S.Painter 介绍 了 果 蝇 唾 腺 桨 色 体 的 细胞 遗传 学 研究 。 

一 一 互 .Hashimoto 解决 了 家 等 性 决定 的 染色 体 控 制 问题 。 

一 一 A.W.K.Tiselius 发 明了 将 带电 分 子 分 离开 的 电泳 装置 。 

一 一 ，B.Mcclintock 证 实 了 玉米 中 臂 内 倒 位 杂 谷 体 的 倒 位 环 中 ， 


4 25 


单一 交换 产生 了 无 着 丝 粒 和 双 着 丝 粒 的 染色 单 体 。 

一 一 T.H.Morgan 由 于 发 展 了 基因 理论 而 获得 诺 贝尔 奖金 。 

1934 ， M.Schlesinger 报道 某 些 噬 菌 体 是 由 DNA 与 蛋白 质 组 成 的 。 

-二 “PIHAPitier 和 GTeiasier 用 实验 证 明了 有 害 的 基因 从 饲 
育 箱 饲育 多 代 的 果 蝇 群体 中 消失 。 

一 一 A 人 .Folling 发 现 了 遗传 代谢 失调 的 葵 酮 尿 症 能 导致 智力 障 
碍 。 

一 于 Bauer 认为 蝇 蛆 唾 腺 细胞 的 巨大 染色 体 是 多 线 染 色 体 。 

一 一 。，B.Mcclintack 提出 玉米 的 核 仁 组 织 者 会 因为 易 位 而 分 裂 
开 ， 每 个 裂片 都 能 组 织 独立 的 核 仁 。 

1935 ，J.B.S.Haldane 首次 计算 了 人 的 基因 自发 突变 频率 。， 

一 一 E.Zernicke 记述 了 相差 显微镜 的 原理 。 

一 一 G.W.Beadle, B.Ephrussi, A.Kuhn 和 A.Butenandt 完成 了 
果 蝇 和 Ephestia 眼睛 色素 合成 的 生化 遗传 研究 。 

一 一 W.M.Stanley 成 功 地 分 离 并 结晶 出 烟草 镶嵌 病毒 。， 

-一 C.B.Bridges 发 表 黑 腹 果 蝇 厦 腺 的 染色 体 图 。 

一 一 再.3pemann 因 胚 胎 诱导 研究 而 获得 诺 贝尔 奖金 。 

1936 ， JSchultz 报告 了 果 蝇 基因 的 镶嵌 表现 与 它 对 蜡染 色 质 的 相 

对 位 置 有 关 。 

一 一 。J.Caspersson 用 细胞 分 光 光 度 测定 法 研究 了 细胞 的 定量 化 
学 组 成 。 

-~ 一 JJ Bittner 报道 小 筷 乳 房 癌 是 由 母乳 传递 的 病毒 样 因子 引 
起 的 。 

-一 一 A.H.Sturtevant 和 T.Dobzhansky 首 次 报道 将 倒 位 用 于 构建 
染色 体 的 系统 树 。 

一 一 冬 :Sterna 发 现 果 蝇 体 细胞 的 染色 体 交 换 。 

一 一 R.sScott-Moncrieff 综述 了 植物 的 色素 遗传 。 这 项 研 究 的 
大 部 分 工作 是 John Innes 园艺 学 院 的 英国 学 者 做 的 ,早期 成 员 
的 工作 确定 了 导致 类 黄酮 与 类 胡 葛 hs iv 

1937 工 Dobzhansky 发 表 “ 遗 传 学 及 种 的 起 源 ?。 让 


OO6 


一 A.F.Blakeslle 和 A.G.Avery 报道 用 秋水 仙 素 诱发 多 倍 体 。 

一 一 IT.M.Sonneborn 在 草 履 虫 属 发 现 接合 型 。 

一 一 FF.C.Bawden 和 N.W.Pirie 报 道 烟 草 镰 骨 病 毒 中 虽然 主要 是 
蛋白 质 ， 但 也 含有 少量 的 RNA( 约 5%)。 

一 一 PA.Gorer 在 实验 鼠 中 发 现 第 一 个 组 织 相 容 性 抗原 。 

一 一 豆 .Karstrom 指出 某 些 细菌 酶 的 合成 是 由 于 培养 基 中 加 入 
了 它们 的 作用 物 而 受到 激发 的 。 他 称 其 为 “适应 酶 "以便 与 不 
受 培养 基 成 分 的 影响 而 总 能 形成 的 “组 成 酶 " 相 区 别 。 

1938”B.Mceclintock 记述 了 裂 合 桥 周 期 。 

一 一 T.M.Sonneborn 发 现 草 履 虫 的 杀伤 因子 。 

一 一 M.M.Rhoades 记述 玉米 的 增 变 基 因 。 

一 一 也 .Slizynska 对 黑 腹 果 蝇 唾 腺 和 染色 体 上 ， 缺 刻 “地 "基因 的 
儿 个 重复 缺失 作 了 细胞 学 分 析 ,确定 了 有 关 基 因 (w, N) 条 带 的 
位 置 。 

1939 卫 .L.Ellis 和 M.Delbfack 研究 大 肠 杆 菌 吻 蔚 体 的 生长 ,这 标 
志 着 现代 喉 菌 体 研 究 的 开始 。 他 们 设计 了 一 步 生 长 "实验 ， 证 
实 了 在 噬菌体 吸附 到 细菌 上 之 后 的 “潜伏 期 " 间 ， 鸣 菌 体 在 细菌 
内 复制 ， 最 终 其 后 代 被 “ 突 发 性 "释放 。 

一 一- 卫 .Levine 和 了 , 王 . Stetson 发 现 了 由 于 胎儿 带 有 父亲 的 一 个 新 
血型 抗原 而 导致 的 母体 免疫 。 后 人 验 明 该 抗原 就 是 引起 胎儿 溶 
血 症 的 人 类 Rh 血型 。 

二 一 A.W.K,Tiselius 和 也,A.Kabat 证 实 抗体 属于 ?类 撑 清 球 蛋 
白 。 

1940  W.Earle 从 C3H 小 鼠 建立 稳定 的 工 细 胞 株 。 

一 一 K.Landsteiner 和 和 A.S.Wienez 发 现 Rh 因 子 。 

1941 “G.W3:Beadle 和 利己 .L.Tatum 发 表 红 色 链 孢 霉 生 化 遗传 的 经 典 
研究 ， 提 出 一 个 基因 与 一 个 酶 的 学 说 。 

一 J.Bfachet 和 T.Caspbersson 分 别 得 出 结论 ，RNA 了 
和 细胞 质 里 ， 细 胞 的 RNA 含 量 直 接 与 它 的 蛋白 质 合 成 能 力 有 
本 

os 227 2 


一 AJ.P.Mafrctin 利 R _ L.M.Synge 开发 了 分 配色 谱 技 术 ，, 并 
用 以 测定 蛋白 质 水 解 物 中 的 氨基 酸 。 

一 一 A.H.Coons, 百 .J,.Creech 和 R.N.Jones 开 发 了 机 汪 沿 交 生 
证 实 特异 细胞 上 存在 有 抗体 反应 位 点 。 

1942 及 .Schoenheimer 发 表 “ 生 物体 组 分 的 动态 ” (TheDynam- 
ic State of Body Constituents) ， 记 述 了 同位 素 标 记 化 合 物 在 
代谢 研究 中 的 应 用 。 他 提出 了 有 机 化 合 物 在 细胞 内 “周转 “tu- 
rnover) 及 “代谢 库 ” 的 概念 。 

-  -  L.J.Stadler 和 FE.M.Ubef 证 明 紫 外 光 诱 发 玉米 花粉 突变 的 效 
果 与 核酸 的 吸收 光谱 一 致 。 

一 一 G.D.Snell 开始 培育 高 席 纤 化 幢 小 风光 夺 需 沉 罗 下 于 研 
究 与 移植 排斥 相关 的 基因 。 

1943 ”美国 田纳西 州 奥 克 里 季 城 的 X- 10 反 应 堆 开始 生产 放 射 性 
同位 素 。 

一 A.Claude 分 离 并 命名 了 微粒 体 ， 出 光 让 全 用 和 中 

滞 类 部 分 。 

一 一 SSE.Luria 和 M,Delbrack 明确 地 证 实 细 疯 经 历 的 自发 突变 ， 
开创 了 细菌 遗传 学 的 研究 领域 。 

1944- 0.T.Avery，C.M.Maclecod 和 M.Mccarty 叙 述 子 肺炎 莹 草 的 
转化 原理 。 近 乎 纯 DNA 转 化 的 事实 表明 遗传 物质 是 DNA 而 不 
是 蛋白 质 。 

一 一 IT.Dobzhansky 冰 述 了 果 蝇 Drosophila DpSsetdoobsckra 和 D 
persimilis 第 三 染色 体 基因 排列 的 系统 发 生 。 

一 一 卫 .L.Tatum，D.Bonner 和 G.W.Beadle 用 脉 孢 菌 属 Newrosp- 
ora crassa 的 突变 株 研究 了 色 氨 酸 合成 的 中 间 代 谢 。 

1945 及 .R.Hunmphrey 证 实 wwrodeles 的 异 配 性 别 是 雌性 ; 

一 一 卫 .B.Lewis 发 现 果 蝇 的 顺 反 位 置 效应 。 

三 三 R.D,Owen 报道 二 卵 双 生 牛 常常 终生 保持 混合 的 红 面 际 ， 

这 是 胎 睁 绒毛 贤 血 管 吻合 的 结果 。 这 种 嵌 合 现象 是 免疫 本 受 性 
的 首 例 。 


2) 8 


1946” 谈 家 祯 以 亚洲 异 色 际 虫 为 实验 材料 ,提出 了 灸 嵌 显 性 理论 。 

一 A.Claude 在 差 速 离心 的 基础 上 建立 了 组 织 分 级 分 离 技 术 
及 其 生化 鉴定 的 方法 。 

一 一 M. 人 以 及 A.D,Hershey 分 别 证 实 鸣 
菌 体 的 遗传 重组 。 

-一 J.Lederberg 和 王 .L.Tatum 证 实 细 菌 的 遗传 重组 。 

一 -  C.Auerbach 和 J.M.Robson 报道 芥子 气 诱发 了 果 蝇 突变 。 

一 一 本 A. Rapoportt 证 实 了 甲醛 对 果 蝇 的 诱 变 效 应 。 

一 一 本 Oudin 发 展 了 凝 胶 扩散 ， 抗 原 -抗体 沉淀 法 ， 称 为 
Oudin 法 。 

一 一 HH. J. Muller; J. B. Sumnet 及 W. M. Stanley 分 别 册 于 
他 们 对 辐射 遗传 学 的 贡献 ， 结 晶 酶 的 工作 及 病毒 纯化 与 其 化 学 
特性 的 研究 ， 获 得 了 诺 贝 尔 奖金 。 

1948 A. Boivin, R. Vendrely 和 C，、Vendtely 证 实生 物体 的 各 
种 细胞 中 ， 单 套 染 色 体 的 DNA 量 是 一 定 的 。 

一 一 下 .KK, Mitchell 和 J. Lein 发 现 红 色 链 孢 霉 的 一 些 突变 体 
侧 乏 色 氨 酸 合成 酶 ， 为 一 个 基因 一 个 酶 的 学 说 提供 了 第 一 个 直 
接 的 证 据 。 

一 P. A. Gotet, S. Lyman 和 G. D. Snell 发 现 了 小 鼠 中 主 
要 的 组 织 相 容 性 位 点 。 它 在 第 17 染 色 体 上 ， 被 称 为 H2。 

一 09. Ouchterlony 开发 了 抗原 -抗体 的 双向 扩散 沉淀 试验 ， 
被 称 为 9uchterflony 试验 。 

-一 G. D. Snell 引入 “组 织 相 容 性 基因 ”一 词 ， 并 阐明 了 移 
植 时 是 否 被 排斥 的 规律。 

1949 ”BEphrussi，H，Hottingef 和 A,， M.，、Chimenes 发 现 酵 
母 小 群落 胞 质 突变 。 

一 M. M. Green 和 .，C. Green 证 实 果 蝇 的 “ 葵 形 ”(1lozenge) 
位 点 可 分 为 三 个 亚 位 点 。 

一 人 .Kelnet 发 现 酵 母 菌 中 湾 伏 的 紫外 线 伤 害 被 可 见 光 激活 
的 光 致 复活 作用 。 


到 


一 一 了 VY. Neel 用 遗传 学 证 据 证 明 ， 镰 刀 形 红细胞 贫血 病 ， 是 
以 简单 的 重 德尔 方式 遗传 的 常 染 色 体 隐 性 性 状 。 

一 一 工 . Pauling,，H. A. Itano, S. J. Singel 和 玉 C。Wells 证 
明 也 : 基因 产生 异常 的 血红 蛋白 ， 从 而 引入 分 子 病 受 遗 传 控制 
的 概念 。 

一 一 M. 二 Barr 和 了 E.G，Bertram 还 明 大 和 难 在 入 经 
胞 性 染色 质 的 形态 上 存在 着 差异 。 

1950 “了 B. Mcclintock 发 现 玉 米 Ac 系 和 Ds 系 转 位 因子 。 

一 一 EChargaff 为 核酸 结构 的 研究 葛 定 了 基础 。 他 证 实 DNA 
中 腺 味 吟 (A) 与 胸腺 喀 啶 〈T) 的 数量 总 是 相等 的 ;同样 ， 鸟 呆 
叭 (G) 与 胞 暗 啶 〈C) 的 数量 也 总 是 相等 的 。 这 些 发 现 后 来 给 
Watson 与 Crick 以 启示 ，DNA 是 由 两 条 多 核 音 酸 链 组 成 ， 
它们 以 A 与 TI 及 G 与 C 之 间 的 氢 键 相 结合 。 


一 一 A. Lwoff 和 A. Gutman 研究 巨大 芽 苞 ' 杆 | 菌 (Bociws 


1egatheritkm) 的 深 源 株 ， 证 实 每 个 细菌 都 隐藏 着 非 感 染 型 病 
毒 。 它 使 细菌 能 在 没有 外 源 叭 菌 体 参 与 的 情况 下 产生 新 的 鸣 菌 
体 。 他 们 称 这 非 感染 期 病毒 为 “ 原 鸣 菌 体 ” :CPPrtophage) 。 ELWo- 
ff 与 工 Siminovitch, N. 术 jeldgaard 共同 证 明 ， 原 鸣 菌 体 可 
以 被 紫外 线 诱发 产生 感染 性 病毒 。 

一 一 。，E. Lederberg 在 大 肠 杆 菌 发 现 第 一 个 病毒 诉 离 基因 
“lambda”。 

一 一 了 H. Latta 和 工 FE. Hartmann 介绍 用 玻璃 刃 作 超 薄 切片 。 

一 一 G. L. Stebbins 出 版 “植物 的 变异 与 进化 >。 

1951 G. Gey 建立 人 的 海 拉 〈HeLa) 细胞 株 。 

一 一 J. Mohi 首次 证 实 人 常 染 色 体 基因 Lewis 与 Eutheran 间 
的 连锁 。 

一 一 C. Stormont, 及 . D. Owen :与 M. R. Ifrwin 记述 了 牛 的 复 
等 位 基因 了 与 C 血 型 系 的 血清 交叉 反应 。 

一 一 到 Chiba 用 细胞 化 学 方法 证 明 叶 绿 体 中 存在 着 DNA。 

一 一 N. 也 .Horowitz 和 U.Leupold 培育 了 大 莉 的 孔 . c017 和 


ss 50。 


本 


N。 crassa 的 温度 敏感 突变 群体 ， 以 确定 它们 执行 必要 机 能 的 
基因 的 百分比 。 所 得 的 值 分 别 为 23% 和 46% 。 

1952 徐 道 党 首次 提出 人 的 染色 体 数 是 46。 

-一 G. 王 ，Palade 首次 发 表 线 粒 体 的 高 分 辨 率 的 电子 显微镜 
照片 。 

一 一 RDulbecco 运用 细菌 病毒 学 技术 研究 动物 病毒 。 他 统计 
了 西方 马 脑 养 散 炎 病毒 在 鸡 胚 单 细胞 层 上 的 噬 菌 斑 。 

一 一 D. Mazia 和 玉 ，Dan 分 离 出 海胆 的 有 丝 分 裂 器 ， 并 开始 

-研究 其 生化 特性 。 

一 一 N.D. Zinder 和 J. ELederberg 记述 了 沙门 氏 菌 (Sa71zrom- 
elle) 的 转 导 。 

一 一 R. Briggs 和 IT:J， King 将 襄 胚 细胞 的 活性 核 移 植 到 去 

“ 核 的 蛙 卵 里 。 事 后 观察 到 移植 的 细胞 核 经 历 了 染色 体 变 化 。 

一 一 W. Beermann 观察 了 多 线 染 色 体 膨 松 形成 的 时 期 与 组 织 
专 一 性 ， 指 出 它们 是 不 同 的 基因 活性 的 表 型 反映 。 

一 ESanger 及 其 同事 阐 明了 蛋白 质 激 素 一 一 胰岛 素 的 全 部 
氮 基 又 序列 ， 证 明 它 含有 两 条 以 二 硫 键 相 结合 的 多 肽 链 。 

一 一 A. D. Hershey 和 M. Chase 证 明 噬菌体 的 DNA 进入 寄 
主 ， 而 大 部 分 蛋白 质 留 在 外 面 。 

一- D. M. Brown 和 A, Todd 证 明 DNA 与 RNA 是 3/-5/ 键 连 
结 的 聚 核 苷 酸 。 

-一 一 G. Pontecorfrvo 和 J. A. Roper 记述 了 曲霉 Aspergilluws 
8&iduIans 的 体 细胞 重组 。 与 果 蝇 不 同 ， 重 组 核 形 成 能 繁殖 的 
纯 系 供 进 一 步 的 分 析 。 

1953 二 D，Watson 和 FE. H，C. Crick 提出 了 DNA 的 模式 ， 认 
为 DNA 是 由 靠 叮 叭 与 喀 喧 之 间 的 氢 键 相 结合 的 两 条 互相 缠绕 
的 螺旋 链 所 组 成 的 。 

一 一 CC，Lindegren 发 现 酵母 菌 的 基因 转换 。 

一 一 A. Howard 和 S. R，Pele 用 放射 自 显影 技术 证 明 ， 真 核 
细胞 的 细胞 分 裂 周 期 ， 包括 不 合成 DNA 的 合成 前 期 (G1)， 核 


=。3] 。、 


TAN 


内 DNA 含 量 加 倍 的 DNA 合 成 期 (S)， 合 成 后 期 〈G。， 然 后 有 
丝 分 裂 。 
一 一 W. Hayes 在 细菌 重组 中 发 现 极 化 行为 。 他 分 离 出 大 肠 杆 
菌 的 高 频 重组 的 H 系 菌株 〈Htr 互 ) ,证 明 有 些 基因 容 易 从 Hfr 

株 转移 到 F- 株 ， 而 另 一 些 基因 不 行 。 

一 一 R. 三 . Billingham, 工 _ Brent 和 P. B. Medawar -证 明 用 实 
验方 法 可 产生 免疫 耐 受 性 。 

一 一 Portef-Blum 和 Sijostrand 使 超 薄 切片 机 成 为 商业 产品 。 

一 一 JJ B. Finean, F. S. Sjostrand 和 王 . -Steimann 首次 发 表 
了 叶 缘 体 切 片 的 电子 显微镜 照片 。 

一 一 区. R. Porter 发 现 并 命名 了 内 质 网 (endoplasmic Teticu- 
ium)， 验 明 它 就 是 胞 质 嘴 碱 性 的 源泉 。 

一 一 GD snell 发 现 小 鼠 主 要 的 组 织 相 容 性 复合 体 ( 汪 一 2 ) 
是 由 复合 位 点 组 成 的 。 

1954 A. J. Dalton 和 M. D. Felix 首次 详细 地 记述 了 高 尔 基 受 
合体 的 超 微 结构 。 

一 一 JJ Dausset 观察 到 一 此 接受 多 次 输 近 的 病 义 窜 产 焉 训 林 ， 
抗 别 人 的 白细胞 抗原 ， 而 不 抗 自己 的 白细胞 抗原 。 这 些 抗体 确 
定 了 最 早 的 HLA 抗 原 ， 并 导致 人 组 织 相 容 性 体系 的 解说 。 

一 N.K. Jerfne 提出 抗原 的 作用 是 在 抗原 显露 之 前 选择 性 地 
刺激 那些 合成 相应 抗体 的 细胞 。 

一 一 卫 . S. Barghoorn 和 S$. A. Tyler 在 沉积 岩 中 发 现 20 亿 年 
前 的 丝 状 与 球状 微生物 化 石 。 wei 
存在 着 生命 。 

= 丰 尖 HISFAIlSa 关 于 肯 订 四 后 风 朋 某 竺 荣 语 全 人生 全 于 村 
区 具有 优势 。 

1955 M. B，Hoagland 站 汐 基 队 的 -和 机 村 全 可 合成 
白质 。 

一 .5 Benzer 研究 了 天 肪 杆菌 了 4 哈 背 体 总 名 位 前 多 机 二 条 二 
杜撰 了 “ 顺 反 子 ”(cistron)、“ 重 组 子 ” (Tecon) 和 “ 罕 变 子 ” 


8 3 了 2 ae 


人 和 


(muton) 等 术语 。 

一 - N. R， Jerne 提出 抗体 形成 的 选择 学 说 ， 主 张 所 有 的 抗体 
都 是 遗传 决定 的 。 这 一 基本 概念 后 来 被 所 有 的 克隆 选择 学 说 所 
接受 。 

一 一 “也 . Fraenkel-Conrat 和 R，C， Williams 将 来 源 不 同 的 核 
酸 和 和 蛋白质 重组 成 烟草 镶嵌 病毒 “杂种 ”。 

一 0. Smithies 用 淀粉 凝 胶 电 泳 鉴定 血浆 蛋白 质 的 多 型 性 。 

-一 R. H. Pritchard 研究 曲霉 “需要 腺 味 叭 ”突变 体 的 等 位 
基因 系列 的 线性 排列 。 他 证 实 了 Pontecorvo 的 结论 ， 假 如 突 
变 体 基因 在 不 同 的 亚 位 点 上 ， 那 么 同一 基因 的 不 同等 位 基因 之 
闻 可 以 发 生 交换 。 

一 C. de Duve 与 四 位 同事 记述 了 含有 水 解 酶 的 细胞 内 小 泡 ， 
称 其 为 溶 酶 体 (1ysosome) 。 

一 P. Grabar 和 C. A，Williams 发 明 用 免疫 电泳 技术 来 分 
析 复 杂 的 抗原 分 子 混合 物 。 


“1956 “了 B. Kettlewell 研究 酸 Peppered Mo 妇 的 工业 黑 化 现 


象 。 他 证 明 在 冯 的 栖息 地 ， 与 不 显 目的 问 相 比较 ， 显 目的 归 被 
岛 吃 掉 的 更 多 。 

一 一 FJacob 下 . 直 ，Wollman 用 实验 方法 阻碍 大 肠 杆 菌 的 
接合 过 程 ， 并 表明 供 体 菌 的 一 段 DNA 插 入 受 体 菌 。 


-一 一 5S. Ochoa 和 A. Kornberg 领导 的 小 组 成 功 地 用 离 体 酶 法 


合成 RNA 与 DNA 。 

一 - 本 HH.Tjio 和 A. Levan 证 明 人 的 二 倍 体 染 色 体 数 是 46。 

一 一 C. 0. Miller eetogeneav 和 
一 激动 素 ， 并 确定 了 它 的 化 学 结构 。 

一 一 了 T T. Puck, S. J. Cieciura .和 P. I。Marcus 成 功 地 将 人 
体 细 胞 离 体 培养 成 克隆 。 

一 一 G. E.. Palade 和 P. Siekevitz 分 离 出 核糖 体 。 


-一 M. J Moses 和 D. Fawcett 各 自 观 察 了 精 母 细胞 的 联 会 


丝 复合 物 。 
本 


一 一 A. Gierer, G，、Schtramm 和 互 ，Fraenkel-Contat 各 自用 
实验 说 明 , ;一 个 化 学 纯 的 核酸 一 一 烟草 镶 褒 病毒 的 RNA 具有 
感染 性 ， 也 有 遗传 能 力 。 

1957 9. A. Berson 和 R. S， Yalow 首次 用 放射 免疫 测定 法 ， 
检测 出 接受 外 源 胰 岛 素 的 病人 所 产生 的 胰岛 素 抗体 。 

一 一 J. 了 . Taylor, 了. S. Woods 和 WE. Hughes 最 旱 用 有 高 
分 辨 能 力 的 放射 自 显影 技术 中 ?了 标记 的 胸腺 喀 啶 赔 氧 核 背 ,来 
验证 蚕豆 染色 体 复 制 期 间 标记 物 的 半 保 留 分 配 。， 

一 一 V. M. Ingram. 报告 正常 血红 蛋白 与 镰刀 形 红 细胞 血红 和 蛋 
白 的 差异 ， 在 于 单个 氨基 酸 的 代 换 。 

- 一 A. Todd 因 核 苷 与 核 昔 酸 结构 的 研究 而 获得 诺 贝 尔 奖金 。 

1958 ，E. Jacob 和 E. 二 .Wollman 证 明 大 肠 杆 草 的 单个 连锁 群 
是 环 状 的 ， 指 出 不 同 高 频 重 组 菌株 ( 互 灵 ) 的 ,不同 连锁 群 是 由 
使 环 开裂 的 插入 因子 作用 在 环 状 连锁 群 的 不 同位 点 所 致 。 

一 一 FF. H. C. Crick 提出 蛋白 质 合成 期 间 氨基 酸 被 一 个 含有 核 
苷 酸 的 衔接 分 子 带 到 模板 上 ， 衔 接 体 正 是 适合 RNA 模 板 上 的 那 
部 分 。 因 此 ，Crick .预言 了 转移 RNA 《人 tRNA) 的 发 现 。 

-tRNA 复合 体 的 


特性 。 
-一 于 G. Callan 和 也 G. MacGregor 证 明 两 栖 动物 条 刷 染 
” 色 体 的 染色 单 体 ， 是 靠 DNA 而 不 是 靠 蛋白 质保 持 其 直线 的 完 
整 性 。 
一 一 M. Okamoto; R. Riley 和 V。 ES AR 
现 控制 部 分 同 源 妆 色 体 配对 的 基因 。 
一 一 JR. Raper 与 其 同事 搞 清 了 .Scjpizopjpy1IU Core A 
”和 3 不 亲 和 因 子 的 双 位 点 复 等 位 基因 的 结构 。 
一 FF.C. Steward, MO. Mapes 和 -KMealrs 成 荔 是 蜂 肢 证 
胡 葛 下 (Doxcxs carota) 根 的 次 生 亏 皮 部 的 单个 二 倍 体 细 胞 ， 
贡 养 成 性 成 训 的 植株 。 他 们 认为 多 细 朋 机 体 的 每 个 细胞 都 有 形 
成 完整 有 机 体 所 需要 的 全 部 成 分 。 


4 


-MI Meselson 和 FwW， Stahl 用 密度 梯度 平衡 离心 技术 
证 明 ， 大 肠 杆 菌 在 DNA 复 制 期 间 ， 密 度 标 记 呈 半 保 留 分 布 。 
-~--- G, 双 . Beadle,E. .Tatum 和 本 Lederberg 因为 对 遗传 
学 的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 奖 。 
一 一 FE. Sanger 因为 对 蛋白 质 化 学 的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 奖 。 
1959 本 Lejeune, M。Ganutier 和 R， Turpin 证 明 唐 氏 先天 愚 
' 症 是 由 一 个 端 着 丝 粒 小 染色 体 的 三 体 性 引起 的 ， 是 一 种 染色 体 
畸变 。 
二 CE. Forfd, KW. Jones，P. 王 ，Polani, J. C, de Almeida 
和 本 也 Briggs 发 现 女 性 唐 氏 先天 愚 症 是 和 O 型 。 
一 一 P. A. Jacobs 和 J. A. Strfong 发 现 男性 玉 linefelter 氏 综 
合 症 〈 精 细 管 发 育 不 全 ) 是 XXY 型 。 
一 一 S. JSinger 将 铁 蛋 白 与 免疫 球 蛋 白 结 合 而 形成 带 标记 抗 
体 ， 易 于 在 电镜 下 识别 。 
一 一 有. 工 .Sinsheimer 证 实 大 肠 杆菌 的 叭 菌 体 phiX174 含 有 单 
链 DNA 分 子 。 
一 一 ER MBurnet 提出 抗原 只 刺 激 合 成 其 互补 的 抗体 的 那些 
细胞 繁殖 六 从 而 完善 了 -Jerne 氏 抗 体形 成 的 选择 学 说 。 
一 一 G. MEdelman 将 免疫 球 和 蛋白 G 分 解 为 重 链 和 轻 链 。 
-一 ALima-de-Faria 用 放射 自 显影 技术 证 明 异 染色 质 的 复 
制 在 常 染色 质 之 后 。 
一 一 M. Chsvremoft，S.Chavremont-Comhaire 和 . Baeck- 
eland 用 放射 自 显影 与 福 尔 根 染 色相 结合 的 方法 证 实 了 线粒体 
里 的 PDNA。 
一 一 区. McQtillen,，R. B- Roberts 和 R. 机 BrFitten 用 大 肠 杆 
菌 为 材料 证 明 核糖 体 是 蛋白 质 合 成 的 场所 。 
一 一 了 Freese 提出 DNA 中 单一 碱 基 对 的 变化 可 以 引起 突变 。 
他 杜撰 了 新 词 “ 转 换 ” (transition) ， 指 哇 叭 或 喀 啶 被 同型 碱 
基 置 换 ; “ 颠 换 ”(transversion)i， 指 叮 叭 或 喀 喧 被 异型 碱 基 置 
. 换 。 


@- 35 @- 


-一 C Pelling 发 现 多 线 染色 体 在 含有 互 尿 苷 的 营养 液 中 培 
养 之 后 ， 它 的 膨 愉 区 被 选择 性 地 标记 。 

一 有 .再 Whittaker 建议 将 生物 分 成 五 大 界 ; 细菌 、 真 核 微 
生物 、 动 物 、 植 物 及 真菌 。 

一 一 5. Ochoa 和 A. Kornberg 因为 离 体 合 成 核酸 的 研究 而 获 
得 诺 贝尔 奖金 。 

1960 了 P. Nowell 发 现 了 植物 凝血 素 (phytohemagglutinin) ， 
它 用 在 人 白细胞 培养 中 激发 有 丝 分 裂 。 

一 一 五 . E. Huxley 和 G. 直 . Zubay 为 亚 细 胞 粒子 的 电子 显微镜 
技术 发 展 了 负 染 色 操 作法 。 

= ， P. Siekevitz 和 G. 下 Palade 记述 了 分 泌 蛋 自在 邻接 对 
的 核糖 体 上 合成 。 

一 -了 P. Dotyj J Marmur, JJ Eigner 和 C. Schildkraut 证 明 
DNA 分 子 的 互补 链 可 以 被 分 离 和 重新 结合 。 

一 一 G. Batski，S.Sorieul 和 E. Corfnefetrt 报告 首次 成 功 地 

行 了 哺乳 动物 细胞 的 离 体 杂 交 。 

一 一 U. Clevefr 和 P. Karlson 将 晓 皮 激素 注入 摇 蚊 (Ciropo- 
1V3S) 幼虫 ， 人工 诱发 了 多 线 染 色 体 特异 的 膨 松 模式 。 

一 一 了. B. Medawar 和 E. M. Burnet 因为 免疫 耐 受 性 的 研究 
而 获得 诺 贝 尔 奖金 。 

1961 E. Jacob 和 本 Monod 认为 核糖 体 不 含有 负责 氨基 酸 顺 
序 装 配 的 模板 。 他 们 提出 ， 每 个 DNA 顺 反 子 引 起 寿命 有 限 的 
RNA 分 子 的 合成 ， 在 这 RNA 的 核 苷 酸 序列 中 ， 包 含 着 氨基 酸 
序列 的 信息 。 随 后 这 个 分 子 与 核糖 体会 合 ， 给 核糖 体 以 合成 某 

”一 蛋白 质 的 能 力 。 这 种 信使 RNA(CmRNA) 以 后 为 S. Btennet， 
F。Jacob 和 M. Meselson 以 及 E.Gros，W. Gilbett， 瓦 . 
Hiatt，C. G. Kutfland 和 J D，Watson 所 证 实 有 

一 M. F.Lyon 和 L，B，Russell 分 别提 出 证 据 表 明 ,) 哺乳 
“动物 的 部 分 胚胎 细胞 及 其 后 代 中 ,一 对 X 染 色 体 中 有 一 条 不 活 
化 ， 而 另 一 部 分 细胞 则 另 一 条 染色体 不 活化 ， 因 而 只 性 哺乳 


ec56 -7 


动物 是 X 染 色 体 的 诬 合 体 。 

-一 V. M， Ingram 提出 学 说 认为 ， 四 类 已 知 的 血红 蛋白 链 是 
-出 一 个 原始 的 肌 红 和 蛋白 状 血红 素 蛋 白 通 过 基因 的 重复 与 移 位 进 
化 而 成 的 。 

~ 一 B。D，Hall 和 S，Spiegelmann 用 实验 证 实 ， 一 条 单 链 - 
DNA 与 一 条 RNA 可 以 形成 杂种 分 子 ， 它 们 的 碱 基 序 列 是 互补 
的 。 该 技术 为 分 离 信使 RNA 及 阐明 其 特性 开辟 了 道路 。 

一 一 5 B，Weiss 和 IT. Nakamoto 分 离 了 RNA 聚 合 酶 。 

一 一 G, von Ehrenstein 和 FE. Lipmann 将 免 网 织 红 细胞 的 信 
使 RNA 和 核糖 体 ， 与 大 肠 杆菌 的 氨基 酸 -转移 RNA 复合 物 相 
结合 。 这 个 无 细胞 体系 合成 了 与 免 血 红 蛋 白 相 同 前 蛋白 质 ， 因 
而 他 们 断言 遗传 密码 是 通用 的 。 

一 一 了. 再 .C. Crick,，L. Barnhett; SBrenner 和 R. JWatts 一 
Tobin 提出 遗传 的 语言 由 三 体 密码 组 成 。 

一 一 E. Jacob 和 J. Monod 提出 操纵 子 (operon) 的 概念 。 

一 WwW，Beermann 证 明 摇 蚊 多 线 染色 体 上 的 一 个 膨 松 位 点 是 
孟 德 尔 方式 遗传 的 。 

一 一 M W. Nirenberg 和 J,.H，Matthaei 发 展 了 大 肠 杆 菌 的 
无 细胞 体系 ， 当 给 予 模板 RNA 制剂 时 ， 氨 基 酸 就 结合 成 蛋白 
质 。 他 们 证 明 ， 用 人 造 的 多 核 音 酸 一 一 多 育 尿 背 屋 ， 指 令 合成 
了 类 似 育 苯 丙 氨 酸 的 蛋白 质 。 

一 - ” M. Meselson 和 本 JJ Weigle 用 入 鸣 菌 体 证 实 ， 重 组 包括 
染色 体 的 断裂 和 复合 ， 而 不 包括 复制 。 

一 - 也 Dintzis 前 明 血 红 蛋 白 的 合成 方向 是 从 氨基 端 到 羧基 
端 。 

-一 ~- HH Moorf，K， Muhlenthaler， 瑞 ，Waldner 和 A. Frey- 
Wyssling 发 展 了 第 一 个 冰冻 断裂 法 ， 可 用 以 观察 常规 切片 法 
所 不 能 看 到 的 超 微 结构 。 

-- U. ZLittauer 证 明 核糖 体 只 包含 两 种 高 分 子 量 的 RNA， 
细菌 核糖 体 RNA 的 沉降 值 为 16S 和 23S， 动 物 的 是 18S 和 28S。 


起 且 7 更 : 


一 “CTokun aga 证 实 黑 腹 果 蝇 的 eagrailed 基因 习 起 发 育 预 
-型 (developmental prepattern) 的 转变 。 

一 -JP，Waller 和 械 工 _ Harris 发 现 细 芒 糖 体 含有 大 量 不 
同 的 蛋白 质 。 

1962 HRis 和 W. Plaut 用 电子 显 答 错 技术 证 明 叶 归 体 让 全 有 
DNA 。 

一 一 了.. Zuckerkandl 和 ， Pauling 计算 出 真 核 生 物 进 楷 期 
间 ， 不 同 的 血红 蛋 自 链 从 它们 的 共同 祖先 衍生 出 的 大 致 时 间 。 

一 一 F. M. Ritossa 发 现 果 蝇 D. brskii 的 巧 腺 染色 体 在 热 休克 
时 的 膨 松 反应 。 

一 本 F. A. P. Miller 和 R。A. Good 等 ;， N. 工 Wartrner 等 阐 
明了 TI 与 B 洒 巴 细胞 间 的 区 别 。 

一 一 R. R. Porter 用 酶 裂解 免疫 球 蛋 白 分 子 。 他 证 实 每 个 分 子 
含有 两 个 连接 抗原 的 部 分 (Fab) 和 一 个 不 连接 抗原 的 可 结 唱 
部 分 (Fc) 。 并 证 明 重 链 与 轻 链 的 比例 是 1:1， 提 出 了 四 链 模 式 。 

一 一 D. A. Rodgers 和 G. 卫 ，Mcclearn 发 现 小 芯 品 系 间 对 酒 
狂 选 择 的 差异 。 

一 U. Henning 和 C. Yanofsky 证 明 三 诡 伺 (密码 ) 内 的 交 
换 可 引起 氨基 酸 置 换 。 

一 本 了 B. Gutrdon 报道 将 肠 细胞 核 注 入 去 核 的 蛙 卵 中 ， 可 发 


育成 正常 可 育 的 峙 。 该 实验 证 明 体 细 胞 核 7 
- 上 是 相同 的 。 

一 一 A. Gierer; JJ R。Warpnef, A。Rich 和 C， 下 Hall; T. 
Staehelin 和 互 . Noll 三 个 实验 室 各 自 玫 、 二 全 本 全 
ribosome) 。 

一 一 W. Fiers, 和 R. 二， Shinsheimey 报道 唆 菌 体 bX174 是 闭 
锁 的 环 状 ， 这 对 后 来 发 现 种 种 的 环 状 DNA 是 重要 的 。 

一 一 A. M，(Campbell 提出 与 真 核 生物 联 会 的 环 状 或 杆 状 染 色 
体 间 的 变化 相似 ， 游 离 基因 〈episome) 可 通过 交换 而 并 入 寄 
主 的 染色 体 。. 


:8 了 8 


一 二 卫 。 Watson, F. H。C, Crick 和 M. H. FE- Wilkins 因 他 
们 对 DNA 结 构 的 研究 而 获得 诺 贝 尔 奖 金 。 

一 M. F. Perutz 和 工 C. Kendrew 因 他 们 对 血红 蛋 自 和 肌 
红 蛋 白 结 构 的 研究 而 获得 诺 贝 尔 奖 金 。 

1963，”B. B. Levine; A. Ojida 和 B. Benacerraf 首次 发 表 论 这 
豚鼠 基因 免疫 反应 的 文章 。 

一 一 人 . Rosset 和 及. Monier 发 现 5SRNA。 

一 一 了 Okamoto 和 M. Takanami 证 实 mRNA 人 结合 到 核糖 体 
的 小 亚 单位 上 。 

一 一 了 H. Noll, IT.:Staehelin 和 F. O， Wettstein 用 实验 证 实 蛋 
白质 合成 的 转录 机 制 〈tape mechanism) 。 

一 了 丁 G. Gall 证 明灯 刷 染 色 单 体 含 有 单一 的 DNA 双 螺旋 。 

一 B. J Mccarthy 和 了 工 Bolton 用 他 们 的 DNA 一 琼脂 
技术 测定 各 生物 种 间 的 遗传 亲缘 关系 。 

一 一 了 E. Hadorn 证 实 了 培养 的 果 蝇 成 虫 盘 的 异型 分 化 。 

一 一 休 Monod 和 S$. Brenner 发 表 复 制 子 (feplicon) 的 模型 。 

一 一 R. Sager 和 M. R. IShida 从 衣 营 (Chliarmmydorzopas) 分 
离 出 叶绿体 DNA。 

一 一 人 R. 瑟 Epstein 和 R. S. Edgar 等 采用 T4 噬 菌 体 的 条 件 致 
和 死 突 变 来 研究 必需 基因 的 机 能 。 

一 一 本 Cairns 用 放射 自 显影 技术 证 明 大 肠 杆 菌 的 基因 带 是 环 
状 的 ， 并 证 明 在 半 保 留 复 制 期 间 一 个 Y 状 的 复制 叉 从 出 发 点 开 

-” 始 ， 产 生 两 个 环 状 的 子 基 因 带 。 

一 上 Margoliash 测定 了 很 多 种 生物 的 细胞 色素 C 的 氟 基 酸 
序列 ， 为 这 一 特异 的 基因 产物 制作 了 第 一 个 系统 树 。 

一 王 B Russell 证 明 当 小 鼠 体 细胞 含有 易 位 常 染色 体 片断 的 
和 染色体 失 活 后 ， 紧 靠 断裂 点 的 常 染色 体 基 因 也 失 活 。 亦 即 ， 
X 染 色 体 失 活 能 扩散 到 附着 的 常 染色 体 片断 上 。 

一 了 Mayr 发 表 “动物 种 与 进化 "。 该 书 综合 了 有 关 物 种 形 

”成 机 制 的 现代 概念 ,对 于 这 一 领域 的 科学 工作 者 有 深远 的 影响 。 


吧 39 二 


1i964:-R. B. Setlow 和 又 . 站. Carrier; 素 . P. Boyce 和 P. Hos: 
ward-Flianders 分 别论 述 了 细菌 切 补 修复 (excisionrepair) 
的 机 制 ; 

一 一 A. S. Sarabhai，A. O. W. Stretton，S.， Brenner 和 入. 
Bolle 根据 包 衰 大肠 杆菌 了 4 病毒 头 的 蛋白 质 ， 确 证 了 基因 与 蛋 
白质 产物 的 线性 对 应 关系 (colinearity) 。 

一 一 C. Yanofsky，B.、C，Carlton, 本 R. Guest, D. RHelinski 
和 U. Henning 就 大 肠 杆 菌 的 色 氨 酸 合成 酶 确证 了 基因 与 蛋白 
质 产 物 的 线性 对 应 关系 。 

一 一 M. S. Fox 和 M. 玉 . .Allen :证明 肺炎 双 球 昔 的 转化 与 
单 链 供 体 DNA 片 断 并 入 受 体 DNA 有 关 。 

一 一 ， 王 . T. Mertz, 工 . S.。 Bates 和 0. E. Nelgon 证 明 “opaque 
-2” 突 变 改 变 了 成 熟 胚乳 的 氟 基 酸 成 分 ， 显 著 改 良 了 玉米 种 籽 
的 营养 品质 。 

一 一 JJ G. Gorfman, V. J. Frfeda 和 W。. Pollack 证 明 在 第 一 
个 Rh 阳性 的 婴孩 分 娩 之 后 立即 给 与 Rh 抗体 ， 可 以 防止 Rh 本 
.的 母亲 的 致 敏 作 用 。 

一 一 D. J. 站、 Luck 和 王 ，Reich 从 Nervrospora 分 离线 粒 体 
DNA。 以 后 (1966) 还 证 明 这 种 DNA 是 按 典 型 的 半 保 留 机 制 
复制 的 。 

一 一 G. Matrbaix 和 A. Burny 从 gc 

RNA， 认 为 它 可 能 是 mRNA。 

AR Holliday 提出 一 个 模型 ， 来 解释 同 源 染色 体 DNA 分 子 
闻 的 交换 期 间 必 然 会 发 生 的 一 系列 断裂 愈合 事件 。 

一 一 工 . W. Littlefield 发 展 了 一 种 方法 ,利用 培养 在 HAT 培 养 
基 上 的 了 GPRI- 和 TIK- 成 纤维 细胞 选择 体 细 胞 杂 

一 一 D. D. Browna 和 J. B. Gurdon 证 明 核 仁 组 成 中 心 纯 合 缺 
失 的 爪 桨 师 星 不 合成 188S 和 28S TRNA。 闪 

一 一 W. D. Hamilton 提出 社会 行为 的 遗传 理论 。 

一- W. Gilbert 发 现 新 生 的 蛋白 质 像 RNA 一 样 ， 连 接 在 核糖 


人 


_ 体 的 大 亚 单位 上 。 

1965 D. D. Sabatini, Y, Tashiro 和 G, E. Palade 证 明 核 糖 体 
的 大 亚 单位 连接 在 内 质 网 肛 上 。 

一 L.， Hayflick 发 现 人 的 双 倍 体 细 胞 组 织 培养 时 的 离 体 寿命 
大 约 是 50 个 加 倍 周期 。 

一 - R. W.， Holley 与 其 同事 测定 了 酵母 两 氨 酸 转移 RNA 的 全 
部 序列 。 

一 一 N. Hilschmann 和 工 . Craig 报道 免疫 球 蛋 白 分 子 是 由 所 
基 酸 成 分 不 变 的 羧基 端 部 分 ， 和 变化 的 氨基 端 部 分 所 组 成 。 该 
发 现 提出 了 一 个 问题 ， 基 因 是 如 何 编码 氨基 酸 成 分 变化 的 那 部 
分 蛋白 质 的 。 

一 一 PP.Karlson, 百 . Hoffmeister，H. Hummel，P。 Hocks 和 G. 

。 Spiteller 测定 了 晓 皮 素 完整 的 结构 构 型 。 

一 一 9S. 9Spiegelman, II Haruna, I. B. Holland，:.G. Beaudteau 
和 D.R. Mills 用 纯化 的 Q8B 复 制 酶 ， 成 功 地 离 体 合成 一 个 自体 
繁殖 的 感染 性 RNA (大 肠 杆 菌 吻 菌 体 Q8 的 RNA)。 

一 一 8. Brennef,，A.O.W.Stretton 和 S$. Kaplan 推断 UAG 和 
UAA 是 标志 多 肽 合成 终止 的 密码 子 。 

一 一 上 下.M.Ritossa 和 S$.Spiegelman 证 明 产 生 果 蝇 核 糖 体 RNA 
的 多 重 顺 友子， 存在 于 每 个 & 和 并 染色体 的 核 仁 组 织 中 心 区 

一 一 了 卫 .Harris 和 J.F.Watkins 用 仙 合 病毒 使 大 与 小 好 的 休 人 
胞 融合 ， 产 生 人 工种 间 异 核 体 。 

一 一 A.J.Clark 和 A. D. Margulies 报道 有 重组 负 陷 的 许多 大 
肠 杆 菌 突变 体 对 紫外 线 照 射 也 异常 敏感 。 该 发 现 表 明 DNA 的 
修复 和 重组 是 由 同样 的 酶 体系 起 作用 。 

一 -一 了 .Sanger,G.G.Brownlee 和 B. C. Bartrell 阐述 了 一 种 方 
法 能 从 部 分 水 解 的 RNA 制 品 得 到 低 聚 核 音 酸 的 指纹 图 谱 。 

一 一 _R.Rothman 证 实 人 鸣 菌 体 在 大 肠 杆菌 染 色 体 上 有 一 个 特异 
的 接触 位 点 。 

一 一 W.J.Dreyer 和 J.C. Bennett 提出 抗体 的 轻 链 是 由 两 条 不 


8 4 。， 


同 的 DNA 序列 编码 的 ， 一 条 为 可 变 区 编码 ， 另 一 条 为 不 变 区 
编码 。 他 们 指出 不 变 区 只 有 一 个 ， 而 可 变 区 则 包含 儿 百 个 不 同 
的 微 基 因 (minigene) 。 

一 -~ F.Jacob, 本 Monod 和 A.Lwoff 因 他 们 对 微 生 允 遗 传 学 所 
作 的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 奖 金 。 

1966  B.Weiss 和 C.C.Richatdson 分 离 到 DNA 连 接 酶 。 

一 一 M,M.K.Nass 报道 线粒体 DNA 是 一 个 环 状 双 线 分 子 。 

一 E.H.C.Crick 提出 变 位 假说 来 解释 遗传 密码 中 所 见 到 的 简 
并 的 一 般 模式 。 

一 一 J. Adams 和 M. Cappecchi 证 明 N- 甲 酰 甲 硫 氢 栈 tRNA 
是 核糖 体 上 多 肽 链 合 成 的 起 始点 。 

-一 W.Giliert 和 ”了 B:MUuller-Hill 证 明 大 及 丁香 缚 交 阻 通 
是 一 种 蛋白 质 。 

一 二 M. Ptashne 证 明 4 鸣 菌 体 的 阻 遏 物 是 一 种 蛋白 质 ， 它 直接 
与 4 DNA 分 子 相 结合 。 

一 H.Roller, K.H.Dahm，C.C.Sweely 和 B.M.Trost 确定 了 

ByaIoppnora cecfropia 保 幼 激素 的 结构 式 。 

-  M.Watring 和 有 R. JEBfitten eg 5 
核 昔 酸 序列 。 

一 一 上 .F:J.Van Bruggen 等 ; J.H.Sinclair 和 B.J. Stevens 分 
别 证 实 动 物 线粒体 DNA 是 周 长 约 5 微米 的 环 状 分 子 。 

一 - R.S.Edgafr 和 W. B. Wood 分 析 了 T4 噬 菌 体 装配 过 程 的 
遗传 控制 程序 。 

一 一 V.A. McKusick 发 表 “ 人 的 孟 德 尔 遗 传 ”， 附 录 列 举 了 大 
约 1500 种 人 类 的 遗传 性 异常 。 

一 一 . Tefzaghi，Y.Okada，G. Streisinger，J. 三 mtiichy M. 
Inouye 和 A.Tsugita 进一步 证 实 T4 鸣 菌 体 溶菌 酶 的 遗传 密码 
是 通过 从 某 一 定点 开始 顺序 地 读 三 联 碱 基 而 翻 释 过 来 的 。 

----  ,H.Wallace 和 M.L.Birnstiel 证 明 滑 爪 网 无 核 仁 药 铀 天 体 
消除 了 99%% 以 上 的 rDNA。 


8 42 e 


一 R.C.Lewontin 和 了 工 工 . Hubby 用 电泳 法 概括 研究 了 果 蝇 
D. pserdoobseura 自然 群体 中 基因 控制 的 蛋白 质变 异 。 他 们 证 
实 ， 按 个 体 基 因 组 平均 ， 杂 合 状态 占 全 部 位 点 的 8% 到 15%。 
H.Harris 用 同样 的 技术 证 实 人 和 群 中 存在 着 广泛 的 酶 多 态 性 。 
一 P.Rous 因 他 对 致癌 病毒 的 研究 而 获得 诺 贝尔 奖金 。 

1967 S.Spiegelman, D. R. Mills 和 R,L, Peterson 报道 一 系列 
转移 实验 的 结果 ， 实 验 中 他 们 选择 体外 复制 最 快 的 那些 Q8 噬 菌 
体 分 子 。 随 着 这 细胞 外 进化 实验 的 进行 ， 它 的 复制 速度 增 快 ， 
分 子 也 变 得 更 小 。 经 过 第 74 次 转移 ， 复 制 的 RNA 分 子 只 是 原 
来 长 度 的 20% ， 这 是 已 知 的 最 小 的 自体 复制 的 分 子 。 

一 一 HH. G. Khorana 和 其 同事 用 带 有 已 知 的 2- 或 3- 重 复核 苷 酸 
序列 的 多 核 苷 酸 来 解读 遗传 密码 。 

一 一 .Taylor, Z.Hradecna 和 W.Szybalski 证 明 DNA 的 两 
条 链 都 可 以 发 生 mRNA。 

-一 B. Mintz 用 蔡 合 体 小 鼠 证 明 提供 小 鼠 毛皮 颜色 的 黑 素 细 
胞 起 源 于 34 个 胚胎 发 生 早 期 已 被 确定 的 细胞 。 

一 一 相 B. Gurdon 将 体 细胞 核 移植 到 不 同 发 育 阶段 的 蛙 卵 里 。 
移植 核 的 RNA 和 DNA 的 合成 特性 变 成 宿主 细胞 核 的 类 型 。 

一 一 工 .Goldstein 和 D. M. Prescott 进行 变形 虫 的 核 移 植 。 实 
验 表 明 有 一 种 特异 的 蛋白 质 从 细胞 质 进 入 细胞 核 ， 并 可 能 控制 
子 该 细胞 核 的 核酸 代谢 。 

一 一 C.B.Jacobson 和 R. 有 .Barter 报道 用 羊膜 穿刺 作 富 内 诊 
断 及 控制 遗传 缺失 。 


一 一 M. Goulian，A. 人 ornberg 和 R. 直 . Sinsheimet 成 功 地 ， 


离 体 合 成 了 有 生物 学 活性 的 DNA。 他 们 为 大 肠 杆 万 DNA 聚 合 
酶 提供 的 模板 来 自 phiX174 的 单 链 DNA。 

一 一 ML. Birnstiel 报道 从 滑 爪 蟾 (Xenopws Iaeyis) 分 离 出 - 
纯 IDNA。 

一 一 工 9. Diener 和 WwW。 B，Raymer 证 明 土 豆 纺 锤 块 葵 病 是 
由 一 种 类 病毒 引起 的 。 


4 他 


一 M. C.Weiss 和 百 . Green 发 展 了 HAT 选择 程序 ， 并 对 胸 
苷 激酶 基因 定位 。 这 是 第 一 次 用 体 细 胞 遗传 学 方法 定位 人 的 基 
因 。 

cr SG.Wald 因 他 对 视觉 生化 的 研究 而 获得 生理 学 诺 贝 尔 奖金 
此 工作 对 遗传 色盲 的 生化 理解 作出 了 重要 贡献 。 

_ 1968 R. TOkazaki 与 四 位 同事 报道 新 合成 的 NA 含有 许 
多 断 片 。 这 表明 得 链 DNA 是 间断 地 复制 ， 然 后 拼接 在 一 起 的 。 

”一 一 JJ Morgan，D. P. Mckenzie 和 X.Le Pinchon 提 出 了 板块 构 
造 的 概念 来 解释 大 陆 漂移 。 

-- 本 G. Gall;D. D; Brown 和 LI. B. Dawid 分 别 报道 两 栖 动 物 
卵子 发 生 时 核糖 体 DNA 基 因 的 特异 合成 。 

-  M. Kimura 提 出 分 子 进 化 的 中 性 基因 学 说 。 

一 一 “了 H. 0. Smith, KW. Wilcox 和 T. 械 玉 Kelley 分 离 出 第 一 个 
特异 的 限制 性 核酸 内 切 酶 EindIT, 并 阐明 其 特性 。 

一 一 D. Y. Thomas 和 了 D. Wikie 证 实 了 酵母 线粒体 基因 的 重组 。 

一 一 R. P. Donahue，W. B. Bias, 工 H. Renwick 和 V。A。McK - 
usick 确 定 Duffy 血 型 在 人 第 一 染色 体 上 的 位 置 。 这 是 在 特定 的 
常 染色 体 上 最 早 的 基因 定位 。 

一 一 本 A. Huberman 和 A. D. Riggs 证 实 哺乳 动物 染色 体 含 有 连 
续 排 列 的 独立 复制 单位 ， 每 个 长 约 30 微 米 。 

一 一 王 . H. Davidson. M. Crippa 和 A:, 王 Mirsky 证 明 滑 爪 歇 卯 
子 发 生 时 60% se 并 在 卵 母 
细胞 成 熟 的 后 几 个 月 里 贮藏 起 来 。 这 种 "NA 推测 是 用 在 胚胎 发 
生 早 期 的 长 命 mDRNA。 

一 一 ”0. Hess 和 G. Meyer 广 泛 研 究 了 各 种 果 蝇 了 染色 体 的 结构 变 
异 ， 证 明了 染色 体 含 有 对 精子 发 生 的 各 个 阶段 进行 控制 的 基因 。 

一 一 SAH. enderson 和 R. G. Edwards 证 实 小 鼠 每 个 卵 母 细胞 
的 交叉 数 随 母体 年 龄 的 增加 而 减少 ,单价 体 数 则 随 年 龄 而 增加 。 
“如果 人 的 情况 与 此 相同 的 话 ， 五 可 以 预料 非 整 倍 体 的 后 代数 会 随 
母亲 年 龄 的 增加 而 增加 (这 已 被 证 实 )。 


ms 44 本 


-JE. Cleaver 证 明 着 色 性 干 皮 症 患 者 的 DNA 修 复 复制 是 不 
完全 的 。 

一 一 R.W. Holley，H. G. Khorana 和 M。、W. Nirenbetfg 由 放 痢 
明 遗 传 密码 及 其 在 蛋白 质 合 成 中 的 机 能 而 获得 诺 贝 尔 医 学 生理 
学 奖 。 

1969 械 Abelsgon,L. Batrnett,S. Brennef，M. Gefter, A Landyi 
R. Rssell 和 械 D. Smith 确 定 了 突变 体 酪 氨 酸 tRNA 的 核 苷 酸 序 
列 ， 证 明 无 意义 突变 抑制 机 构 的 存在 。 

-一 -本 G. Gall 和 M. L. Pardue; 互 . John，M. L. Birnstiel 和 开 . 
W. Jones 发 展 原 位 杂交 技术 来 作 特定 核 苷 酸 序列 的 细胞 学 定 
位 。 

一 一 B. C. Westmotreland;，W. Szybalski 和 五 . Ris 开 发 电镜 技 
术 作 4 鸣 菌 体 基 因 的 物理 图 谱 。 他 们 将 亲本 一 方 的 1- 染 色 分 体 与 
另 一 方 有 缺失 、 反 入 、 置 换 或 倒 位 的 Y- 染 色 分 体 退 火 ， 给 所 得 
的 异 源 双 链 DNA 分 子 照相 。 

共 R。 Burgess,， A. A. Tiravers; J. J Dunn:. 和 王 . 信 . -Bautz 分 

离 并 鉴定 了 RNA 育 合 酶 的 转录 起 始 因子 (a 因 子 )。 


一 0. L. Miller 和 B. R. Beatty 发 表 电 镜 照 片 ， 显 示 RNA 分 子 、 


转录 过 程 中 两 栖 动 物 的 基因 。 

一 一 JR,， Beckwith 等 报道 分 离 出 了 大 肠 杆菌 纯粹 的 乳 糖 操纵 
子 DNA 

一 一， G. M. Edelman 等 最 早 发 表 人 Y-G; 免 疫 球 蛋 白 的 完整 氨基 
酸 序列 。 

一 一 YY. Hotta, S. Benzer，W. 工 . Pak 和 本 Grossfield 各 人 独立 
地 诱发 了 有 果 蝇 的 神经 突变 体 并 阐明 其 生理 学 特性 。 

一 一 CC. Boon 和 F. Ruddle 显 示 了 在 含有 人 和 鼠 染 色 体 的 杂种 体 
细胞 系 中 ， 特 定 的 染色 体 丢失 与 特定 的 表 型 性 状 委 失 相 关 。 通 
过 此 途经 可 确定 某 些 人 染色 体 上 特定 基因 的 位 点 。 

一 - R, E. Lockard 和 本 B. Lingrel 纯 化 了 从 小 遍 网 织 红细胞 多 
核糖 体 得 到 的 9S RNA 部 分 ， 证 明 它 指令 小 鼠 血 红 和 蛋 册 8B 链 的 合 


9 5 


成 。 从 而 证 实 了 Marbaix 和 Burny(1964) 的 观点 。 

一 - A. Ammermann 报 道 纤 毛虫 Sty1onycpia mytiluSs 的 大 核 原 
基 经 历 核 内 有 丝 分 裂 的 DNA 复 制 ， 形 成 多 线 染 色 体 。 随 后 它们 

的 大 部 分 被 毁坏 ，90% 以 上 的 大 核 DNA 降解 并 被 排 到 培养 基 

蛙 。 半 : 

一 一 R. I. Huebner 和 G. I. Todaro 提 出 致 瘤 基 因 学 说 。 

一 一 互 . A. Lubs 描 述 了 人 染色体 上 的 一 个 脆性 位 点 * 证 实 它 存 
在 於 男性 精神 呆滞 证 患者 。 后 来 证 实 这 个 位 点 (Xg27) 是 同 藉 - 
连锁 的 精神 呆滞 的 总 体 结 构 相 联系 的 。 

一 一 M.Delbruck,S. 王 . Luria 和 A.D. Hershey 因 他 们 对 病毒 遗 
传 学 的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 奖金 。 

1970 “B. M。 Alberts 和 L。 Erey 分 离 T4 喉 菌 体 基因 32 的 蛋白 质 产 
物 ， 证 明 这 种 蛋白 质 协 调 地 连接 在 单 链 DNA 上 。 他 们 认为 这 种 
32 和 蛋白 质 的 机 能 是 启动 DNA 分 子 解 链 ， 使 复制 能 够 开始 。 

一 一 “HH. G. Khorana 等 报道 酵母 两 氨 酸 tRNA 基因 的 全 合成 。 

一 一 本 Yournoi 工 Kohno 和 JJ R. Roth 成 功 地 将 两 种 细菌 酶 融 
合 为 一 个 大 蛋白 质 分 子 ， 它 兼备 两 种 酶 的 功能 。 这 种 酶 的 融合 
是 利用 一 对 移 码 突变 ， 活 放 门 开 识 组 各 区 可 全 
基因 结合 起 来 而 得 到 成 功 的 。 

一 一 D. Baltimore 和 互 ，M. Temin 报 告 在 两 种 致 冶 的 RNA 痪 毒 
( 劳 舍 尔 氏 小 鼠 白血病 和 劳 氏 家 禽 肉 瘤 ) 中 存在 着 依赖 RN 人 A 的 
DNA 多 聚 酶 。 

一， M.L. Pardue 和 本 G. Gall 证 实 中 心 粒 周 围 的 异 当 色 质 含有 
丰富 的 重复 DNA。 

一 一 D. E. Wimber 和 D， ML ROLE 
反 子 定位 在 第 2 染色 体 的 右 臂 上 。 

”一 一 了 工 Caspersson, 工 _ Zech 和 (人 C. Johansson 将 唆 咱 因 桨 料 用 认 
染色 体 细胞 学 ， 证 实 人 染色 体 上 特异 的 荧光 带 谱 。 

第 一 个 非 孟 德尔 基因 的 遗传 图 。 

这 从 个 基因 的 基因 组 存在 於 衣 滴 虫 叶绿体 的 染色 体 上 。 


9 了 6 。 


二 放 


-_ ， R.T.Johnson 和 P.N.Rao 将 有 丝 分 裂 活性 细胞 与 间 期 细胞 

”进行 体外 融合 引起 染色 体 过 早 的 浓缩 。 

1971 _ M.L.O'Riotrdan,J.A.Robinson, 开 . 下 .Buckton 和 也 :J. 卫 vans 
报告 人 的 22 对 常 染色 体 在 盐酸 叶 叶 因 (quinacrine hydzyochlor- 
ide) 染色 之 后 ,， 全 部 可 以 用 视 党 鉴别 。 他 们 证 明 Philadelphia 染 
色 体 是 中 间 缺 失 的 第 22 染 色 体 。 

一 一 Y.Hotta 和 互 .Stefn 阐 明 百 合 减 数 分 裂 前 期 合成 的 DNA 的 特 
性 。 偶 线 期 的 合成 是 前 面 的 合成 期 未 能 复制 的 小 片断 DNA 的 延 
迟 复制 。 粗 线 期 合成 的 DNA 具 有 修复 合成 的 特性 。 

一 一 8S.H.Howell 和 Stern 证 实 小 孢子 中 内 切 核酸 酶 在 粗 线 期 的 
早期 达到 最 高 水 平 ， 一 般 认 为 交叉 发 生 在 这 个 时 期 ; 

一 一 B.Dudock，C.Di-Peri, 上 .Scileppi 和 R.Reszelbach 提 供 证 担 
证 明 葵 丙 氨 酰 妇 NA 合成 酶 的 识别 部 位 ,邻接 於 二 氢 尿 喀 啶 核 苷 
环 。 

一 一 C.R.Merrlli M.R.Geier 和 J.C.Petricciani 将 带 有 半 有 乳糖 操 
纵 子 转 导 的 4 鸣 菌 体 ， 感 染 半 乳糖 血 证 患者 的 培养 成 纤维 细 
胞 。 这 些 细胞 制造 了 失去 的 转移 酶 ， 全 才 纹 于 人 的 
半 乳 糖 血 证 细胞 更 长 命 。 

一 一 及 .J. 和 onopka 和 S.Benzer 报 道 诱发 的 果 蝇 时 计 突 变 体 (clock 
mutant) 的 恢复 。 

一 一 D.I.Suzuki, 工 Grigliatti 和 及 Williamson 分 离 果 蝇 温 度 
敏感 的 闪 痪 突变 体 。 

一 一 本 也 .Manning 和 Q.C.Richatds 在 裸 薄 叶绿体 的 溶解 产物 中 ， 
发 现 环 状 的 叶绿体 DNA 分 子 。 

一 一 (CC.Kung 诱 发 并 分 离 了 草 履 果 (Parameciwma atrel1ia) 的 行为 
突变 体 ， 证 明 许多 突变 体 的 质 膜 有 电 生 理 的 缺陷 。 

一 天.DPana 和 D.Nathans 用 限制 性 核酸 内 切 酶 将 猿 猴 病 毒 40 切 

成 一 系列 片断 ， 然 后 推断 其 物理 的 顺序 。 
972 了 .Lobban 和 D.Kaiset 发 展 了 连接 任何 两 个 DNA 人 分子 的 一 
般 方 法 ， 用 末端 转移 酶 在 两 段 DNA 末 端 各 接 上 互补 的 碱 基 辐 到 


。 47 ， 


物 尾 巴 。 

一 一 A.FE.Zakhafov 和 N.A.Egolina 发 展 了 BODR 标 记 授 术 产 生 
深浅 不 一 的 染色 体 。 

一- G.H.Pigott 和 N.G. Carr 显 示 蓝 细菌 (cyapxobpacterirm) 的 核 
沁 人体 RNA 与 裸 菠 (Euglena gracilis) 叶 绿 体 DNA 的 杂交 。 这 种 
Rapbpoaineoiiiiesiso 
了 强 有 力 的 证 据 。 

一 一 S.J.Singer 和 G.L.Nicholson 提 出 细胞 膜 构造 的 流动 镶嵌 模 

一 ，B.Benacerraf 和 也.O.McDevitt 证 明 小 鼠 的 开 基 因 有 连接 在 互 2 
复合 体 上 。 

一 一 Y.Suzuki 和 D.D.Brown 分 离 鉴定 了 家 乔 丝 纤 蛋 自 的 
mRNA。.Y.Suzuki,L.P.Gage 和 D.D.Brown 阐 明了 丝 纤 蛋白 基因 
的 特性 。 

一 - N.Eldredge 和 $.J.Gould 提 出 标点 平衡 模型 (punctuated eq - 
uilibrium model) 来 解释 主要 的 进化 变异 的 速度 。 

一 一 R.Silber,V.G.Malathi 和 J.Hurwitz 发 现 RNA 有 连接 酶 。 

一 一 D.A.Jackson, R.H.Symons 和 P.Berg 将 SV40 病 毒 的 DNA 拼 
接 到 大 肠 杆菌 4 病毒 的 DNA 上 。 因 而 是 他 们 首次 将 两 种 不 同 生 
物 的 DNA 进 行 体外 连接 。 

一 一 本 Mend'ewicz, J.L. Fleiss 和 R.R.Fieve 证 实 躁 狂 抑郁 性 精 
神 病 是 通过 X 染 色 体 短 臂 上 的 一 个 显 性 基因 遗传 的 。 

一 一 G.J.Bargman，B.Mackler 和 了 T.H.Shepard 报 告 免 胎 仔 性 软 肯 
异常 营养 证 的 生化 原因 是 酸化 磷酸 化 系统 的 遗传 缺失 。 

一 一 ML.Pardue, 了 卫 .Weinbefg, 工 , 互 .Kedes 和 M.L.Birfrnstiel 报 道 
黑 腹 果 蝇 的 组 蛋白 基因 在 第 二 染色 体 上 。 

一 一 了 P.S.Carlson, 互 .H.Smith 和 及 .D.Dearing 用 拟 有 性 方法 得 到 
植物 种 间 杂 种 。 

一 一 J.Hedgpeth, 吾 .M.Goodman 和 H.W.Boyer 通过 特异 的 核酸 
内 切 酶 识别 的 方法 验 明 了 4 大 肠 杆菌 史 菌 体 DNA 的 核 背 酸 序列 。 


e:- 48 。 


一 一 G.M.Edelman 和 及 .R.Porter 因 他 们 对 抗体 化 学 结构 的 研究 
而 获得 诺 贝 尔 医学 生理 学 奖 。 

1973 ”D.R.Mills, 了 .R.Kramer 和 S.Spiegelman 发 表 一 个 复制 型 
RNA 分 子 的 218 个 核 苷 酸 序列 。 该 分 子 是 MDV-1， 是 Q8 噬 菌 体 
的 RNA 经 实验 选拔 ， 因 而 是 被 迫 经历 了 “细胞 外 进化 ?而 缩短 长 
度 的 变异 分 子 ( 见 本 年 表 1967 年 第 一 条 )。 

一 一 S.H.Kim，G.J.Quigley，F.L.Suddath，A.McPherson，D 了 . 
Sneden, J.J.Kim, J.Weinzierl 和 A.Rich 提 出 酵母 葵 丙 氨 酸 
tRNA 的 三 维 结构 。 

一 一 R.Kavenoff 和 B.H.Zimm 用 新 发 展 的 粘 弹性 的 方法， 测 定 
由 各 种 果 部 的 细胞 分 离 出 来 的 DNA 分 子 的 分 子 量 。 他 们 得 出 结 
论 ， 染 色 体 含有 一 个 DNA 的 长 分 子 ， 在 中 心 粒 区 没有 中 断 。 

一 一 P.Debergh 和 C.Nitsch 成 功 地 从 小 孢子 直接 培养 成 单 倍 体 蕃 
茄 植株 。 

一 一 W.G.Hunt 和 R.K.Selander 用 儿 胶 电泳 跟踪 界面 ,分析 了 两 
个 家 鼠 亚 种 间 的 杂交 区 。 

一 - P.J.Ford 和 E.M. Southern 证 明 滑 爪 将 的 各 种 5SRNA 基 因 ， 

_ 在 卵 母 细胞 而 不 是 在 体 细胞 转录 。 

一 一 W.Fiersg，W.M.Jou, G.Haegerman 和 M.Ysebaert 最 时 为 编 
码 蛋 白质 (雄性 专 一 吹 菌 体 MS2 的 外 壳 蛋 白 ) 的 基因 排序 。 

一 一 B.E 了 .Roberts 和 B.M.Patterson 报 道 用 小 麦 胚芽 无 细胞 体系 ， 


“供给 mRNA 作 体 外 翻译 实验 。 
一 A.Garcia-Bellido,P.Ripol 和 G.Morata 报 道 果 蝇 志 盘 发 育 
的 区 域 化 。 


一 - S.N.Cohen,A.C.Y.Chang, H.W.Boyer 和 R.B.Helling 将 不 
同 质粒 的 限制 性 内 切片 断 在 体外 连接 ， 构 建 了 第 一 个 有 生物 学 
机 能 的 杂交 细菌 质粒 。 

1974 J.Shine 和 L.Dalgarno 证 明 大 肠 杆 菌 16STRNA 的 34 端 含有 
一 段 核 苷 酸 链 ， 它 与 各 种 大 肠 杆菌 鸣 菌 体 mRNA 的 核 烷 体 连接 
部 位 互补 。 他 们 提出 16S fRNA 的 这 个 区 域 可 能 是 在 蛋白 质 合 

mo 49 ww 


成 (在 mRNA 上 ) 的 终止 和 起 始 中 起 碱 基 配 对 的 作用 。 

一 -一 IZaenen,，N.vana Larfebeke, 吾 .Teuchy,M.van Montaga 和 
J.Schel1 在 冠 疗 瘤 细菌 中 发 现 致 瘤 质 粒 。 

一 KM.Murray 和 N.E.Murray 用 限制 性 核酸 内 切 酶 的 识别 位 
点 对 4 噬菌体 进行 操作 ， 使 它 的 染色 体 可 用 作 外 源 DNA 内 切记 
段 的 受 体 部 位 。4 史 菌 体 因而 成 为 一 个 无 性 繁殖 的 载体 。 

一 一 A.Tissieres, 吾 . 久 .Mitchell 和 U.M.Ttracy 发 现 热 体 克 导致 
军 蝇 合成 六 种 新 的 蛋白 质 。 售 成 它们 的 组 织 没 有 多 线 业 色 体 。 

一 一 B.Dujon;， P.P.Sionimski 和 LIL.Weill 提 出 酵母 (Saccparofy- 
ccS cereyisae) 线 粒 体 基因 组 的 重组 与 分 离 模型 。 根 据 这 个 模型 ， 
线粒体 DNA 以 多 重 找 贝 的 形式 存在 於 受 精 卵 细胞 中 。 它们 随机 
配对 ,在 任何 配对 周期 中 ,亲本 一 方 的 片段 可 以 与 另 一 方 线粒体 
DNA 的 片段 交换 ， 产 生 重 组 体 单位 。 

一 一 R.D.Kornberg 提 出 染色 质 是 一 种 重复 结构 ， 每 个 结构 单位 
包含 DNA 分 子 的 200 个 碱 基 对 与 四 种 组 蛋白 (H2A, H2B, H3 和 
豆 4) 中 的 两 种 。 后 来 称 这 种 结构 单位 为 核 小 体 ， 被 M.Noll 分 离 


出 来 。A.L.Olins 和 D.E.Olins 发 表 了 红细胞 核 染 色 质 束 的 最 早 、 


的 电镜 照片 ， 显 示 了 核 小 体 。 
一 一 B.Ames 发 展 了 快速 的 筛选 试验 法 ， 检 测 诱 变 的 及 可 能 致 瘤 
的 化 合 物 。 
一 一 S$.Brenner 记 述 线虫 Caenorphabditis elega1s 突 变 的 诱发 分 
离 及 制图 的 方法 。 

-- 一 A.Claude, C.de Duve 和 G.Palade 因 为 对 细胞 生物 学 所 作出 
的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 奖 金 。 
1975 G.K6hler 和 C.Milstein 用 小 鼠 细胞 做 实验 。 证 明 体 细胞 杂 ， 

变 可 用 来 产生 连续 的 杂种 瘤 ? 细 胞 系 , 生 产 单 克隆 抗体 。 
一 一 ”全 世界 的 分 子 生物 学 家 汇集 在 加 利 福 尼 亚 州 Asilomar， 编 
写 一 部 有 历史 意义 的 章程 以 指导 重组 DNA 实 验 。 ， 
一 -NIH 重 组 DNA 委 员 会 出 版 了 准则 ， 虽 在 消除 或 尽力 减少 重 
组 DNA 研 究 的 危险 性 。 


0 


二 M.Grunstein 和 D.S.Hogness 发 展 了 菌落 杂交 方法 ; 来 分 离 
含有 特定 DNA 片 段 或 基因 的 克隆 DNA。 

- _  D.Pribnow 测 定 了 只 菌 体 T7 的 两 个 独立 启动 子 的 核 苷 酸 序 
列 ， 将 其 与 别 的 启动 子 序列 进行 比较 ， 二 人 二 绝 扫 与 机 
能 的 模型 。 

一 一 E.M.Souttern 记 述 了 将 DNA 片 段 从 琼脂 糖 凝 胶 转 移 到 硝 
化 纤维 素 滤 膜 上 的 方法 。 滤 网 再 与 放射 性 RNA 杂 交 ， 杂 种 分 子 
用 放射 自 显影 检测 。 

一 一 W.D.Benton 和 R.VW. Davis 记 述 一 种 快速 而 直接 的 方法 ,来 
筛选 重组 1gt 鸣 菌 体 的 噬 菌 班 。 即 ， 将 叭 菌 体 DNA 转 移 到 硝 化 
纤维 素 滤 蝶 上 ， 用 互补 的 标记 核酸 杂交 ， 来 鉴别 特定 的 DNA 订 
列 。 

二 一 ”FE.Sanger 和 A.R.Coulson 发 展 了 第 一 个 快速 的 测定 法 测 定 
注入 DNA 娟 合 酶 而 合成 的 DNA 的 序列 。 第 二 个 广泛 应 用 的 方 
法 是 由 A.M.Maxam 和 W:Gilbert 在 1977 年 报道 的 。 

一 G.Morata 和 P.A.Lawrence 证 实 果 蝇 “4 缺 刻 "(engrailed) 突变 
允许 后 翅 区 的 细胞 与 前 翅 区 的 细胞 相 混 。 因 此 它 的 正常 等 位 基 
因 的 功能 ， 是 规定 发 育 翅 姐 妹 区 之 间 的 边界 条 件 。 

一 一 B.Minty 和 K.Illmensee 将 小 鼠 恶 性 的 畸 胎 瘤 XY 双 倍 体 细 
胞 ;注入 水 鼠 肥 胎 细胞 中 ， 然 后 移植 到 母体 中 养育 。 某 些 子 一 
代 雄 鼠 的 体 细胞 及 生殖 细胞 中 出 现 瘤 细胞 . 当 这 些 雄 鼠 交 配 后 ， 
某 些 子 二 代 鼠 含有 畸 胎 瘤 的 标记 基因 。 实 验证 明 畸 胎 瘤 的 细胞 
核 保 留 了 发 育 的 全 能 性 ， 即 使 几 百 代 以 后 ， 它 们 还 有 恶性 瘤 的 
机 能 。 

= S.L.Mckenzie， S.Henikoff 和 M.Meselson 分 离 热 休 友和 蛋白 
质 的 mRNA， 并 证 明 它 们 与 果 蝇 多 线 染 色 体 特定 的 膨 松 位 点 杂 
更; 

一 一 上 上. 瓦 .Wangi 了 .了 .Duesbergi 下 .Beemon 和 P. 玉 .Vogt 确 定 了 
致 瘤 活性 片段 在 劳 氏 肉瘤 病毒 RNA 基 因 组 中 的 位 置 。 

一 一 人 .Dulbecco, 瓦 .Temin 和 D.Baltimore 因 他 们 对 致 瘤 病毒 的 


es 呆 。 


研究 而 获得 诺 贝 尔 奖金 。 

1976 ”五 .R.B.Pelham 和 及 .J.Jackson 用 免 网 状 细 胞 溶 胞 产物 ,建立 
一 个 简便 有 效 的 依赖 mRNA 的 体外 翻译 系统 。 

一 一 R.V.Dippel 证 明 草 履 虫 的 动 体 含 有 RNA 而 不 是 DNA ,伴随 
动 体 复 制 的 是 RNA 合 成 而 不 是 合成 DNA。 

一 一 N.HEozumi 和 S.ITonegawa 证 实 编码 免疫 球 蛋 站 链 的 可 变 区 - 
与 稳定 区 的 DNA 片 段 在 鼠 胚 的 染色 体 上 是 远离 的 ， 而 在 小 鼠 浆 
细胞 瘤 的 染色 体 上 是 邻接 的 。 他 们 断定 B 淋 巴 细胞 分 化 期 间 ， 体 
细胞 的 重组 使 不 变 区 与 可 变 区 的 基因 片段 靠 到 一 起 。 

一 一 W.Y.Chooi 证 明 抗 大 鼠 核 糖 体 蛋白 药 铁 蛋白 标记 抗体， 结 
合 在 “ 米 勤 树 ”( 从 果 蝇 滋 卵 细胞 分 离 出 来 的 ) 延 伸 纤 维 的 端 球 
上 。 这 观察 证 明 米 勤 树 是 核糖 体 RNA 的 转录 单位 ,并 证 明 至 少 
部 分 核糖 体 蛋白 质 在 其 转录 完成 之 前 是 连接 在 核 糖 体 RNA 的 
前 体 分 子 上 。 

一 一 B.G.Burrell,G.M.Air 和 C.A.Hutchinson 报 道 噬菌体 Bi 
174 含 有 重 玲 基因 。 

一 一 ”美国 国家 健康 协会 发 表 正 规 的 准则 来 管理 包括 重组 DNA 
在 内 的 研究 工作 。 

一 一 ”建立 第 一 个 遗传 工程 公司 ， 命 名 为 “Genentech”。 

一 一 A.Efstratiadis，F.C.Kafatos，A.Maxam 和 了 T. Maniatis 首 次 
离 体 酶 促 产 生 真 核 的 基因 片段 。 他 们 合成 的 双 线 DNA 分 子 含有 
编码 免 血 红 蛋 白 w 和 8 链 的 序列 。 

一 一 JI.Finch 和 A.KRlug 提 出 ， 破 到 染色 质 的 电镜 图 片 中 所 看 
到 的 直径 为 300A 的 丝 状 体 是 由 DNA 核 小 体 丝 折 县 而 成 的 螺 线 
1977 A.Knoll 和 BE.S.Barghoorn 在 34 亿 年 前 的 呈 石 中 发 现 经 历 细 
胞 分 到 的 微 体 化 石 。 该 发 现 将 地 球 上 生命 的 年 龄 推 回 到 太古 代 
的 早期 。 

一 一 C.Jacdq, J.R.Miller 和 G.G.Brownlee 记述 了 滑 爪 将 卯 母 细 
胞 的 6$ DNA 群 中 存在 着 “ 拟 基因 ”( pseudogene”)。 


52 e- 


am 


ES J.C.Alwine,D.J.Kemp， 和 G.R.Stark 制 备 了 重 氮 革 氧 甲 基 


纸 (diazobenzyloxymethyl paper), 并 记述 了 将 电泳 分 离 的 RNA 
带 从 琼脂 糖 凝 胶 转 移 到 DBM 纸 上 的 方法 。 然 后 与 放射 活性 的 
DNA 探 针 杂 交 ， 进 行 放 射 自 显影 来 检测 特异 的 RNA 带 。 因 为 ， 
这 个 方法 与 Southern(1975) 的 方法 相反 ， 是 将 RNA 转 移 到 固体 
上 ， 而 不 是 转移 PNA， 所 以 被 称 为 nortthern” 印 迹 法 

一 一 F.Sanger 与 8 位 同事 报道 喉 菌 体 pPiX174 的 DNA 基 因 组 的 全 
部 核 苷 酸 序列 。 

一 M.Leffak, R.Graingef 和 豆 .Weinhtraub 证 明 DNA 复 制 期 间 
原来 的 组 蛋白 八 体 (octamer) 保 持 完整 ,而 新 的 八 体 完 全 由 复制 
期 间 合 成 的 蛋白 质 所 组 成 。 

一， W.Gilbert 诱 导 细菌 合成 有 用 的 非 细 菌 蛋白 质 (胰岛 素 和 干 
扰 素 ) 

一 一 人 .人 W.0ld,H.G.Callan 和 KK.W.Gross 利 用 标记 的 海胆 组 蛋白 
克隆 基因 ， 通 过 原 位 杂交 来 检测 屿 晨 卵 母 细胞 灯 刷 染色 体 上 正 
在 转录 的 组 蛋白 mRNA。 

= 一 了 D.SHognhess,D.M.Gloverfz 和 R.L.White 报 道 黑 腹 果 蝇 的 一 
些 28S 核 猪 体 RNA 基 因 中 存在 插入 的 片段 。 于 是 内 含 子 (intron) 
被 用 来 指 编码 蛋白 质 的 基因 ， 即 免 球 蛋白 基因 (A.Jetfreys 和 R. 
A.Flavell) 和 鸡 卵 清 蛋 白 基 因 (R.Breathnach, J.L.Mandel 和 P， 
chambon) 。 

一 一 J.F.Pardon 与 五 个 同事 利用 中 子 反 差 配 比 技术 (neutron 
contrast matching .technique) 证 明 核 小 体 中 ， 与 组 蛋白 八 体 连 
接 的 PNA 片 段 是 在 颗粒 的 外 面 。 

二 了 Sulston 和 吾 .R,Horvitz 完 成 Caenorjabditis elegaps 胚 胎 
后 期 的 细胞 谱系 。 

一 人 .5.Yalow 因 为 发 展 放 射 免疫 测定 法 (RIA) 而 获得 诺 贝 尔 
奖金 。 

1978 及 .M.Schwartz 和 M:O.Dayhoff 比 较 了 原核 生物 、 真 核 生 有 物 ， 
线粒体 和 叶绿体 的 各 种 进化 类 群 中 各 种 蛋白 质 和 核酸 的 序列 次 


和 


料 。 他 们 用 电子 计算 机 算出 的 进化 椅 验 明了 原始 真 核 生 物 进 化 ， 
”到 与 线粒体 和 叶绿体 共生 生物 的 时 间 ， 大 约 分 别 为 20 亿 年 和 10 
亿 年 前 。 

一 一 W.Gilbert 杜 撰 “ 内 含 子 ”(intfon) 和 外 显 子 ” 9 
两 词 。 

se 和 在 英国 诞生 ， 这 是 体外 受精 后 将 胚 
胎 移入 母体 子宫 的 结 让 

-一 一 工 Maniatis ， ， 守 训 刘 到 罗 EE.Lacyi J LatetC.O'Con- 
nell, D.Quon, G.K.Sim 和 A.Efsttatiadis 发 展 了 基因 分 离 的 程 
序 ， 包 括 构 建 克 隆 的 真 核 DNA 库 ， 用 上 和 人 全 村 全 人 全 全 汪 
“里 撕 出 独特 的 序列 。 

一 ~ D.JFinnegan，G.M.Rubin， 汪汪 各 证 才 
果 鹿 分 散 的 重复 DNA 作 了 详细 的 分 析 。 他 们 的 发 现 是 子 解 真 核 
生物 突变 可 能 性 、 转 位 .转化 .杂种 不 育 和 还 原 病毒 前 新 竟 起 点 。 

一 一 V.B.Reddy 与 八 位 同事 发 表 狼 猴 病 毒 40 的 全 部 核 苷 酸 序列 ， 
并 将 该 序列 与 已 知 的 病毒 基因 和 mRNA 联系 起 来 。“ 

一 一 Y.W.Kan 和 A.M. Dozy 证 实 站 和 全 

儿 状 细胞 贫 血 证 产 前 诊断 的 标记 。 

一 一 “又 .Arber,，HO.Smith 和 D. Naafans 因 他 们 作 展 了 用 入 区 
切 酶 技术 研究 遗传 体系 的 结构 而 获得 诺 贝 尔 奖金 。 
1979 ”JJ. G-Sutcl life 测定 了 克 隆 的 载体 质粒 PR3 22 全 部 的 4， 362 

个 核 背 酸 顺序 。 

二 一， 工 C.Avise, R.A, Lansman 和 R.， O. Shade 成 荔 地 利用 限制 性 
核酸 内 切 酶 测定 自然 群体 中 线 料 体 DNA 的 序列 。 

一 一 B.G.Baffell, A.T.Bankier 和 本. 人 
密码 有 一 些 特有 的 不 通用 的 特征 。 

二 i 卫 .F.Fritsch,，R.M.Lawn 和 T. waniatis 用 DNA 间 组 技 术 机 
定 人 珠 蛋 白 基 因 的 染色 体 排列 结构 。 

一 入.Wang, A.Rich 和 季 们 的 同事 发 现 Z 形 的 DNA， 

1980 L.Gfsson 和 H.S. Kaplan 制 造 了 第 二 个 人 的 厅 种 瘤 ,它们 在 


4 54。 


实验 室 培 养 中 生产 纯 抗 体 。 

一 2 美国 联 尾 最 高 法 院 裁定 ， 遗传 修饰 的 微生物 可 非得 专利 。 
电气 总 公司 (General Electric company) 获得 了 一 项 专利 ,是 
一 种 能 消耗 油 戏 的 遗传 工程 微生物 。 

一 - JW.GozdonG.A.Scangos,D.J. Plotkin;, J. A. Barbosa 和 
FERaddle 得 到 了 转移 基因 的 小 扇 (transgenic) 。 

一 一 | AR.Templeton 用 “建立 者 "原则 提出 物种 形成 的 新 理论 。 

一 一 M,. R. Capsecchi 记 述 了 用 玻璃 微细 管 将 DNA 直 接 注入 细胞 

呈 ”的 方法 ， 使 哺乳 动物 的 培养 细胞 高 效率 转化 。 

一 GD.Snell, J. Dausset 和 了 B. Benacefra 央 他 们 对 免疫 遗传 学 
的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 医 学 生理 学 奖 。 

= 三 二 人 卫 : 也 erg， WiGilbert 和 F， Sanger 因 他 们 对 DNA 的 实验 操作 

具 _ 庆 作 出 的 贡献 而 获得 诺 贝 尔 化 学 奖 。 

1981  P.C.Parker,，H.E.Varmus 和 J.M.Bishop 证 实 劳 氏 肉 冶 病 毒 

ji- 的 致 瘤 特 性 是 由 于 一 个 受 v-src 基 因 编 码 的 蛋白 质 * 各 种 养 椎 动 
物 的 细胞 都 含有 一 个 同 源 的 基因 ; c=-src 基 因 。 这 两 个 基因 的 区 
别 在 于 -src 有 连续 的 编码 序列 ， 而 c-src 有 7 个 外 显 子 被 6 个 内 
含 子 分 割 开 。 

一 河 瑟 . Margulis 出 版 (细胞 进化 中 的 共生 现象 (Symbiosis in 
celi Eyolution)。 她 在 书 中 概述 了 她 的 理论 根据 ， 认 为 像 线 粒 

1 体 , 叶绿体 与 动 体 那样 的 细胞 器 是 由 现代 真 核 生物 祖先 的 内 共 
生体 一 一 原核 生物 进化 而 来 的 。 

二 一 人 有. Lande 基 于 多 基因 性 状 的 性 选择 ， 提 出 新 的 物种 形成 模 
式 员 重新 引起 人 们 对 性 选择 的 兴 

希 洛 薄 工 . 瑟 ， Wagner 首次 在 哺 屯 动物 种 间 成 功 地 转移 有 功能 的 中 
传 物质 ， 免 血 的 一 种 蛋白 质 在 小 鼠 中 形成 。 

一 一 了 .DiKemD 和 T. HH.Hal 通 过 根 癌 土 壤 杆 菌 4grobacterirrm 

虽 妃 克 ejociezs3 的 质粒 将 豆 类 主要 贮藏 蛋白 (《 沫 豆 蛋 特 ) 的 基因 转 
移 到 向 月 府 里 ， 创造 了 太阴 豆 "。 

-一 MD.Edge 获 配 514 对 核 苷 酸 而 合成 了 于 殷 素 基因 ， 这 是 至 


g 559 


今 拼合 最 长 的 基因 。 

一 一 S$. Anderson，B.G. Barrfel1,F.Sangef 等 完成 人 线粒体 基因 组 
的 全 部 核 苷 酸 序列 和 遗传 结构 的 分 析 。 

一 一 “M.E.Harper 和 G.F.Saunders 证 明 用 改良 的 原 位 杂交 技术 ， 
可 在 大 有 丝 分 裂 的 闪 色 体 上 作 单 拷贝 基因 图 。 

一 一 J. Banerji，S，Rusconi 和 $.Schaffner 证 骨 当 和 = 珠 蛋 自 基因 
与 某 种 SV40 的 核 苷 酸 序列 连接 时 ， 转 录 增 强 了 几 百 倍 。 他 们 称 
这 种 序列 为 强化 因子 序列 。 

一 一 M.Chalfie 和 J. Sulston 在 Caemorpabditis elegazas 的 触 党 迟 
钝 突变 体 中 鉴别 出 5 个 基因 ， 它 们 影响 一 套 特 定 的 6 个 感觉 神经 
7 

一 一 IT.R.Cech, A.J.Zaug 和 了 P.J. Gri55wad 肌 后天 机 丙 灾 于 归 汪 
ribozyme 的 功能 。( 注 ，Tribozyme 是 一 个 RNA 片 断 , 它 本 寺 具 
有 断 慢 及 形成 共 价 键 的 能 力 )。 

一 一 玫 .E.Steinbeck,，L.Mcintosh, 工 . Bogorad 和 C.J. Arntzen 证 
实 野 田 古 (4marapntpxs jybridys) 对 三 氮 杂 葵 除 鞠 剂 的 抗 性 是 
受 一 个 叶绿体 基因 控制 的 ,该 基因 编码 一 个 多 肽 , 它 与 除 基 剂 结 
合 。 野 田 古 的 突变 体 改变 了 基因 产物 ， 不 能 与 三 氮 杂 节 结 合 。 

1982 Eli Lilly 跨 国 公 司 首次 销售 重组 DNA 技 术 制 造 出 的 药物 

一 一 人 的 胰岛 素 ， 高 品名 是 “Humulin 。 

人 Scott 与 其 同事 证 实 重 组 PNA 技 术 生 产 的 于 扰 素 阻 过 了 
感冒 病毒 。 

-一 卫 .P.Reddy, 人 R.K.Reynolds, 下 .Santos 和 M.Barbacid 报 道人 
膀胱 癌 细 胞 中 的 致癌 基因 被 激活 的 遗传 变异 是 基于 该 基因 单个 
碱 基 的 置换 ， Res 
被 顷 氮 酸 所 取代 。 

一 一 P.M.Bingham，M.G.KidwelH 和 G.M.Rubin 证 明 P 品 系 果 蝇 
的 每 个 P 转 位 因子 基因 组 含有 30~~50 个 拷贝 。 这 是 杂种 不 育 的 
原因 。 后 来 A.C. Spradling 和 Rubin 证 实 ， 将 克隆 的 P 因 子 最 微 
注射 到 果 蝇 胚胎 中 ， 它 就 整合 到 种 系 的 染色 体 上 。 因 而 了 因子 可 


5 6 。 


以 用 作 载 体 ， 将 有 意义 的 DNA 片 段 带 入 果 蝇 的 种 质 里 。 

一 JJG.Sutciiffe, 信 .JMilner,E, 王 . Bloom 和 有 R.A.Lerfner 报 道 
分 离 了 ID 序列 ， 这 是 唯一 在 神经 组 织 中 表达 的 基因 。 

一 一 A.Klug 由 于 发 展 了 晶体 的 电子 显微镜 ， 并 冰 明 了 核酸 复合 
物 的 构造 而 获得 诺 贝 尔 奖 金 。 

1983 王 .A.Miele, D.R.Mills 和 F.R. Kramer 成 功 地 构建 第 一 个 重 
组 RNA 分 子 ， 包括 将 一 个 合成 的 十 腺 苷 酸 通过 小 细菌 病毒 复制 
酶 的 作用 ， 插 入 到 该 病毒 RNA 基 因 组 的 变异 体 中 。 

-一 S.Altman，N,.Pace 和 他 们 的 同事 发 现 一 个 被 叫做 核糖 核酸 
酶 了 的 细菌 酶 ， 此 酶 的 活性 只 取决 于 它 的 RNA 组 分 。 这 是 第 一 
例 有 这 种 特性 的 RNA 分 子 

一 五 .J. Jacobs 和 6 位 同事 报告 在 海胆 卵 中 存在 “混杂 ”DNA 
(pITomiscuous DNA) 。( 注 :混杂 DNA 指 的 是 在 细胞 器 之 间或 由 


细胞 器 到 细胞 核 转 移 的 DNA 片 断 ， 可 能 是 由 于 几 百 万 年 以 前 发 - 


生 了 转 位 的 结果 ) 。 

-一 一 RDoolittle 和 六 位 同事 证 明 负责 首 攻 肉瘤 病毒 致 痪 活性 的 
基因 ， 起 源 于 一 个 编码 生长 因子 (正常 由 血小板 合成 ) 的 基因 。 

一 一 工 $. Greenwald，P. W. Sternberg 和 五 .R. Horvitz 证 明 
Caezorhabditis 的 1in-12 突 变 体 是 作为 一 个 发 育 的 控制 基因 起 
作用 的 。 

一 B.MeClintock 因 为 发 现 转 位 遗传 因子 而 获得 诺 贝 尔 奖 金 。 

1984 A.E 上 . Willams 等 ，Yasuke 等 及 S$. M. Hedric 等 各 自 独 立地 
通过 T- 细 胞 受 体 基因 的 分 析 发 现 ， 在 对 组 织 移植 、 感 染 源 及 肿 
瘤 的 体内 应 答 中 起 重要 作用 的 一 种 特殊 蛋 自 . 质 与 抗体 极其 相 
似 。 

一 B.Robert 等 证 明 抗 生 素 的 遗传 工程 植株 能 将 获得 的 性 状 传 
; 递 给 后 代 。 

一 一 ” 险 佛 医学 院 Philip 领 导 的 小 组 将 致癌 基因 的 遗传 “开关 ” 置 
入 小 鼠 ， 能 控制 小 鼠 肿 瘤 发 生 的 时 间 与 部 位 。 

一 一 William MecGinnis 等 从 昆虫 .其它 分 节 的 无 状 椎 动物 及 关 


se 97 e 


椎 动物 中 警 别 出 了 一 个 同 源 异 形 序列 (homeotic sedusnce) 的 基 
“ 国 片段 。 认 为 包含 该 片段 的 基因 ， 在 胚胎 发 育 过 程 中 起 主导 作 
用 。 


,Gallo 领 导 的 小 组 与 Luc ”Meotagnier 领 导 的 小 组 
同时 发 现 ， 获 得 性 免疫 缺损 综合 症 (AIDS) 的 病因 是 一 种 引起 
罕见 的 白血病 的 逆转 录 病 毒 的 变异 体 。 

一 一 N. K.Jerne,，G.Kohler 和 C. Ta 全 全 于 村 全 于 全 
获得 诺 贝 尔 医 学 奖 。 

1985 “Thomas Sudhof 等 人 对 低 密度 脂 蛋 白 LDL) 受 体 基因 的 
“分 析 提供 了 强 有 力 的 证 据 证 明 ， 基 因 是 通过 一 系列 不 同 的 原 妈 
基因 灸 嵌 整 入 拷贝 而 进化 的 。 

全 一 s Hiorowitz 等 人 妆 现 -- 世间 细 动 的 基因 密生 通用 
遗传 密码 不 同 。 

一 一 B.- Brickson 等 用 蛋白 质 工程 技术 改造 已 知 的 酶 ， 构 建 了 一 
个 新 的 酶 分 子 。E.Paoletti 等 利用 遗传 工程 重新 构建 天 花 疫苗 ， 
为 抵抗 其 它 疾病 提供 免疫 性 。 

一 一 美国 M. Brown 和 本. Goidstein 由 于 对 胆固醇 代谢 及 有 关 疾 
病 的 研究 作出 了 卓越 的 贡献 而 获得 诺 贝尔 医学 奖 。 

1986”A.G.Amit 等 人 用 X- 射 线 结晶 学 方法 首次 获得 抗原 -抗体 复 
合 物 结构 的 详细 三 维 图 象 ， 支 持 了 传统 的 “ 锁 钥 ?理论 。 

一 “人 A. 了 Mason 等 用 基因 疗法 使 生殖 激素 基因 缺失 的 小 忌 恢 复 
了 生育 能 力 。 

-一 ”APenn 等 将 动物 粥 样 硬化 组 织 的 基因 转移 到 一 个 细胞 系 
中 ， 使 该 细胞 系 象 瘤 细 胞 那样 生长 。 把 这 种 细胞 注入 小 鼠 ， 小 
鼠 便 产 生 肿 瘤 ， 说 明 上 述 动脉 粥 样 硬化 的 遗传 物质 与 正常 细胞 
生长 和 分 裂 竟 控制 有 关 。 汪 

-一 CCoken 与 Levi-Montaleini 因 有 关 生长 因 于 的 研究 工作 而 
“获得 诺 员 尔 奖 爹 。 

1987 遗传 改变 的 细菌 被 首次 批准 在 美国 的 加 利 福 尼 亚 进行 室外 
实验 。 此 细菌 是 由 美国 高 级 遗传 公司 (AGS) 的 科学 家 研制 成 


Se 


的 遗传 工程 抗 霜 菌 。 
一 一 ，R.， Charles 及 他 领导 的 小 组 完成 了 普通 大 肠 杆菌 基因 组 的 


示意 图 。 


Helef Doms-Kellet 答 人 测 定 了 分 布 在 46 条 染色体 上 的 
400 多 个 遗传 标记 间 的 相对 位 置 ,从 而 绘制 了 第 一 张 人 的 基因 组 
的 连续 图 谱 。 

一 一 本 P.Simsons 等 人 报道 ， 他 们 利用 基因 转移 技术 ,已 成 功 地 
繁殖 了 携带 羊 8B- 乳 球 和 蛋白 的 小 鼠 。 波音 企 是 的 系 沪 齐 计 涝 工学 

28- 乳 球 和 蛋白。 

= 一 S.C.Woo 小 组 及 R. Garver Jr 等 人 分 别 成 功 地 对 培养 的 小 
鼠 肝 细胞 和 肺 细 胞 进行 了 基因 转移 。 它 使 将 来 利用 基因 转移 来 

二 和 伐 殖 某 些 器 官 和 组 织 的 移植 成 为 可 能 。 

一 一 全 ID.Pallela 及 W. N. Kelley 领 导 的 小 组 利用 疱疹 病毒 作 载 
体 ， 将 基因 直接 转移 到 猫 的 中 枢 神 经 系统 。 

一 C.Readhead 与 B. Popko 等 将 编码 神经 鞘 蛋白 的 正常 基因 ，,” 
注 闪 患 先 天 性 痉挛 症 的 小 鼠 的 受精 夕 中 ， 使 该 受精 外 发 育成 正 
”党 小 鼠 。 

一 一 NGrimsley 和 T. Hohn 等 首次 利用 土壤 农 杆菌 Ti 系统 将 病 
毒 PDNA 转 移 到 玉米 中 。 

一 一 美国 麻 省 理工 学 院 的 日 本 分 子 生 物 学 家 利根 川 进 由 于 解释 
生计 罗 条 
奖金 。 


( 孙 勇 如 ) 


59 。 


第 三 节 “站 传 学 大 会 与 遗传 学 会 


(一 ) 历 届 国 际 遗 传 学 大 会 简介 


国际 遗传 学 大 会 从 1899 年 开始 至 今 已 召开 了 16 次 。 第 一 次 大 
会 是 1899 年 7 月 11 日 一 12 日 在 英国 伦敦 召开 的 。 第 二 次 大 会 于 1902 
年 9 月 30 日 一 10 月 2 日 在 美国 纽约 召开 。 这 两 次 大 会 都 是 以 “植物 
杂交 工作 国际 会 议 ”的 名 义 召 开 的 。 直 到 1906 年 7 月 30 旧 一 8 月 3 日 
在 英国 伦敦 召开 的 第 三 次 大 会 仍然 称 为 “杂交 与 植物 育种 国际 会 
议 "。 但 大 会 主席 、 英 国 的 W ,Bateson 在 发 表演 说 中 提出 : 我 们 大 
家 所 致力 研究 的 新 科学 还 没有 一 个 正式 的 名 称 ， 我 建议 称 宅 为 
“Genetics””。 因 此 大 会 闭幕 后 就 名 正言 顺 的 称 为 “第 三 属国 际 遗 伟 
学 大 会 ”> 了。 这 次 会 议 录 题 为 “第 三 届 国 际 遗 传 学 会 议 报 告 书 ”。 以 
后 每 隔 五 年 , 尖 国 际 形 势 允许 时 ,就 召开 一 次 国际 会 议 .1911 年 9 月 
18 一 23 日 在 法 国 巴黎 召开 了 第 四 届 大 会 。 会 议 主席 是 Ivcs.Delage 
这 以 后 由 于 爆发 了 第 一 次 世界 大 战 ， 第 五 届 大 会 直到 芭 927 年 9 月 
11 一 17 日 才 得 以 在 德国 柏林 召开 。 会 议 主席 是 ETwin。Barer。1932 
年 8 月 24 一 31 日 在 美国 纽约 召开 第 六 届 大 会 ,主席 是 著名 的 遗传 学 
家 IT.H.Mct gan。 他 在 大 会 发 表演 说 时 提出 ,要 注意 寻找 对 发 展 遗 
传 学 更 为 有 利 的 材料 。 大 家 知道 ， 作 为 遗传 学 理论 研究 的 著名 材 


料 那 时 已 有 :， 蔓 豆 、 玉 米 、 果 蝇 。 而 一 种 新 的 研究 材料 正在 第 五 - 


居 大 会 上 展览 ,这 就 是 美国 C.C.Lindegren 用 以 进行 工作 的 红色 链 
孢 霉 。 红 色 链 孢 霉 与 生化 遗传 在 遗传 学 发 展 忠 上 所 占 地 位 之 所 以 
不 容 忽视 ， 是 因为 这 一 研究 促使 我 们 更 深入 地 了 解 基因 的 功能 以 
及 基因 与 酶 合成 的 关系 。 当 然 ， 在 当时 的 条 件 下 ， 由 于 缺乏 新 的 
方法 技术 ， 使 遗传 学 研究 受到 限制 ， 但 遗传 学 的 发 展 和 突破 却 在 
孕育 之 中 。 第 七 届 大 会 于 1939 年 8 月 23 一 30 日 在 苏格兰 爱丁堡 召 - 


SS 60 


开 。 大 会 主席 是 F.A.Crew。 由 于 第 二 次 世界 大 战 的 影响 ,相隔 九 年 
以 后 ，1948 年 7 月 7 日 一 14 日 才 在 瑞典 斯 德 哥 尔 摩 召 开 了 第 八 届 大 
会 ,大 会 主席 是 五.J.Muller。 谈 家 杆 教 授 出 席 了 大 会 , 这 是 第 一 次 
有 中 国学 者 参加 的 国际 遗传 学 大 会 。 

1953 年 8 月 24 一 31 日 在 意大利 Bellagro 召 开 第 九 届 大 会 。 大 会 


主席 是 R.B.Goldschmijidt 。 就 在 这 一 年 J.D.Watson 和 REF.H.C.Crick 


发 现 了 脱氧 核糖 核酸 的 双 螺 旋 结构 , 揭 开 了 遗传 学 历史 的 新 篇 章 。 
DNA 作 为 基因 的 载体 逐渐 为 遗传 学 家 所 公认 。 从 那 时 起 ,遗传 学 
中 的 许多 基本 概念 得 到 不 断 的 发 展 、 补 充 和 更 新 ， 其 速度 之 快 ， 
为 其 它 学 科 所 罕见 。 

第 十 届 大 会 于 1958 年 8 月 20 一 27 日 在 加 拿 大 蒙特 利 尔 召开 ， 
与 历届 大 会 不 同 的 是 : 以 往 大 会 的 组 织 者 均 为 东道 国 遗 传 学 会 或 
有 关 的 学 术 团 体 ， 但 第 十 届 大 会 却 由 美国 遗传 学 会 和 北美 的 十 一 
个 生物 学 研究 机 构 联 合 组 织 。 这 从 一 个 侧面 反映 出 50 年 代 初 开始 
的 遗传 学 革命 所 引起 的 广泛 重视 。 这 个 革命 方兴未艾 ， 不 其 取得 
新 的 成 果 。1958 年 以 后 对 遗传 学 发 展 作出 重要 贡献 的 有 :J. 五 .Tay- 
lor 证 明了 脱氧 核糖 核酸 分 子 复 制 的 机 理 .P.C.Zamecnik 等 研究 了 
氨 酰 基 tRNA 的 性 质 。1961 年 F.Jacob 和 J.Monad 阐 明了 乳糖 操纵 
于 的 调节 机 制 , 随 后 又 发 现 了 信息 RNA(CmRNA)。M.W.Nivenbe- 
Tg 等 找 出 了 mRNA 所 携带 的 密码 .G.Von Ehvenstein 和 FE.Lipma- 
nm 证 明了 遗传 密码 的 普遍 性 。1962 年 F.H.C.Crick 指 出 了 核 酸 中 
的 碱 基 顺 序 是 以 三 联 体 的 方式 决定 着 蛋白 质 中 氨基 酸 的 顺序 的 ， 
遗传 学 的 研究 逐渐 进入 全 盛 时 期 。 

1963 年 9 月 2 一 10 日 在 荷兰 海牙 召开 第 十 一 届 国 际 遗 传 学 大 
会 ,大 会 主席 是 E.Hadom。 会 议 录 由 英国 Pergamop 出 版 社 以 < 今 昌 
遗传 学 ?为 书 名 分 三 卷 出 版 。 这 也 是 一 个 显著 变化 ,因为 直到 第 九 ， 
届 大 会 ， 会 议 的 论文 集 均 以 有 关 杂 志 的 增刊 形式 出 版 的 。 这 说 明 
遗传 学 日 葡 为 人 们 所 重视 ,遗传 学 的 研究 队伍 也 逐步 壮大 。 从 1953 
年 至 1963 年 这 十 年 中 ， 分 子 遗 传 学 得 到 迅猛 的 发 展 ， 其 中 的 两 项 
主要 成 就 为 ， 遗传 密码 及 遗传 信息 转移 规律 的 阐明 。 


.61 。， 


第 十 二 届 大 会 于 1968 年 8 月 19 一 23 日 在 日 本 东京 召开 。 大 会 
主席 是 了 .Kibhara。 在 这 一 段 时 间 内 ， 分 子 遗 传 学 的 研究 逐步 深入 。 
诸如 核酸 的 分 子 构 型 ， 脱 氧 核糖 核酸 的 复制 基因 的 直线 排列 以 及 
蛋白 质 在 细胞 内 的 合成 都 有 所 突破 。1973 年 8 月 20 一 29 日 在 美国 相 
克 菜 召开 第 十 三 届 大 会 ， 大 会 主席 是 Curt'Stern。 这 一 时 期 较 重 要 
的 贡献 有 :了 互 .M.Temin 发 现在 某 些 致癌 的 动物 病毒 中 ， 遗 传 信息 
流 是 “ 关 向 ”的 一 一 从 核糖 核酸 到 脱氧 核糖 核酸 。 这 一 发 现 对 研 
究 人 类 癌症 具有 重要 意义 。 另 外 ，D.A.Jackson 和 及 .再 .SyYmons 及 
P.Barg 发 现 了 切割 脱氧 核糖 核酸 分 子 的 生化 方法 。 接 着 ,也 :Boyer 
和 S.Copen 用 酶 把 基因 拼接 到 质粒 载体 上 ， 创 建 了 重组 PDNA 技 术 。 

”1978 年 8 月 21 一 30 日 在 苏联 莫斯科 召开 第 十 四 届 大 会 大 会 主 
席 是 B.IHIIBH。 这 次 大 会 的 会 议 录 分 三 卷 出 版 。 书 名 分 别 为 ， 
1. 遗 传 学 与 人 类 福利 ; 2. 遗 传 过 程 的 分 子 学 基础 3. 普通 遗传 学 
问题 。 这 次 大 会 是 继 1977 年 11 月 遗传 工程 取得 第 一 项 成 果 以 后 召 
开 的 ， 至 1980 年 通过 此 技术 已 获得 九 个 基因 的 产物 。 遗 传 工程 的 
研究 蓬勃 发 展 。 遗 传 学 进入 了 一 个 新 的 历史 时 期 。 和 
”1983 年 12 月 12 一 21 昌 在 印度 新 德里 召开 第 十 五 届 厌 会。 天 会 

主席 是 M.S.Swaminathan。 谈 家 横 教 授 为 大 佟 副 主席 。 中 国 遗 传 学 - 
会 代表 闭 第 一 次 出 席 了 大 会 ， 站 向 大 会 提交 和 2 篇 论文 ， 展 出 了 16 
篇 墙报 。 这 一 时 期 ， 千 传 学 工作 者 在 分 子 生 物 学 和 绸 采 生 办学 表 
理论 基础 上 ， 综 合 采用 了 基因 重组 、 杂 交 瘤 、 固 定 化 酶 和 动 植物 
细胞 大 规模 组 织 培养 等 技术 ,建立 起 一 个 现代 化 生物 工程 的 体系 。 
中 国 的 植物 组 织 培养 技术 已 跻身 于 世界 先进 行列 。 生 物 工程 的 愉 
起 ;标志 着 现代 遗传 学 已 发 展 到 人 们 可 以 定向 控制 遗传 性 状 的 新 
阶段 。 它 和 微 电 子 、 村 和 症 记 和 为 二 下 克基 本 二 本 二 二 全 
柱 。 


第 填 六 届 天 会 于 1988 年 8 月 20 一 27 日 在 加 拿 大 多 伦 多 召开 :大 
会 主席 由 R: 瑟 .Haynes 担 任 。 谈 家 桢 教授 为 大 会 名 誉 副 主 席 。 中 国 
学 者 近 60 人 出 席 了 感 会 。 ee 

目前 ， 遗 传 学 已 渗入 到 科学 和 社会 的 众多 领域 ， 成 勇 二 种 促 、 
te 62 


9 


使 自然 科学 和 社会 科学 结合 的 力量 ， 在 解决 当代 科学 和 实践 的 各 ; 
种 尖端 课题 中 发 挥 着 巨大 的 作用 。 国 际 遗 传 学 大 会 作为 世界 遗传 ; 
学 家 学 术 交 流 的 场所 ， 为 推动 得 传 学 的 发 展 作出 了 贡献 。 


(二 ) .中 国 遗 传 学 会 


中 国 遗传 学 的 发 展 经 历 了 曲折 的 过 程 。 ya 
地 学 习 苏 联 ， 使 我 国 的 遗传 学 工作 受到 巨大 的 损失 。1956 年 党 提 
出 百花 齐 放 4 百家争鸣 方针 以 后 ， 召 开 了 著名 的 “青岛 会 议 ”。 这 
次 会 议 推动 了 我 国 遗 传 学 的 发 展 ) 是 我 国 遗传 学 发 展 历史 上 的 一 
并 汪 大 本 探 源 : 全 过 罕 慰 生 庆 号 克 及 岳 只 按 进 看 晰 的 喧 洽 放下 
文化 大 革命 又 使 遗传 学 险 遭 灭顶 之 灾 。 

文革 以 后 ， 专家 和 开始 酝酿 成 立 中 国 的 遗传 学 学 术 组 织 z1978 
年 3 月 31 日 ， 李 涩 祺 、 童 第 周 、 谈 家 桢 、 祖 德 明 等 19 位 科学 家 在 北 
京 集会 寺 他 们 一 致 倡议 成 立 中 国 遗 传 学 会 。 推 选 李 汝 祺 , 祖 德 明 、 
谈 家 桢 、 鲍 文 奉 、 李 竞 雄 ， 吴 时 、 钟 志雄 、 胡 含 ;， 邵 启 全 , - 许 运 
天 、 吴 蕉 龄 、 叶 晓 等 同志 组 成 中 国 遗 传 学 会 筹备 组 。 

1978 年 10 月 7 日 ， 来 自 全国 各 地 的 230 名 遗传 学 工作 者 在 南京 
育 会 ， 庆 祝 中 国 遗传 学 会 成 立 。 我 国 著名 的 遗传 学 家 、 教 育 家 李 
法 祺 教授 在 开幕 词 中 号 召 我 国 遗传 学 工作 者 在 新 的 历史 时 期 ,加 
强 团 结 ， 共 同 担负 起 发 展 我 国 遗传 学 的 重任 。 这 次 大 会 共 收 到 论 


交 200 余 篇 ， 经 过 审查 有 153 篇 收集 在 遗传 学 报 论文 摘要 专辑 中 。 
这 些 论 文 课题 广 冰 ， 涉 及 到 动物 、 植 物 、 微 生物 与 人 类 ， 包 括 医 


学 以 及 分 子 遗 传 学 和 遗传 工程 等 各 个 领域 植物 遗传 和 育种 方面 ， 
较为 突出 的 例子 如 从 花粉 培养 中 培育 出 单 倍 体 的 纯 品 种 小 考 ， 从 
杂交 中 创造 出 高 产 的 异 源 多 倍 体 的 新 品种 。 动 物 育种 、 数 量 遗 伟 
的 研究 和 胚胎 移植 的 工作 填补 了 我 国 空白 。 人 类 和 医学 遗传 学 的 
研究 在 我 国 处 于 起 步 阶段 ， 在 分 子 病 、 辐 射 站 传 学 和 遗传 病 的 研 
究 方面 均 有 了 进展 。 

这 次 大 会 认真 贯彻 了 “ 双 百 方针 ” ,结束 了 国内 所 谓 米 丘 林 ， 
摩尔 根 两 个 学 派 老死 不 相 往来 的 局 面 ， 在 实践 是 检验 真理 的 唯一 、 


e 6 林 ,。 


标准 的 原则 下 ， 共 同 携手 为 发 展 中 国 的 遗传 学 竟 尽 全 力 。 夫 会 经 
民主 协商 选 出 由 70 位 理事 组 成 的 第 一 届 理 事 会 。 理 事 会 选举 李 汝 
祺 为 理事 长 ， 谈 家 顶 、 祖 德 明 、 人 金光 祖 \、 钟 志雄 、 胡 含 、 卢 惠 过 
沈 善 烟 、 奚 元 龄 、 方 宗 申 为 副 理事 长 。 邵 启 全 为 秘书 长 ， 吴 螺 、 
吴 芍 龄 、 李 致 肌 为 副 秘书 长 。 上 址 决定 建立 中 国 遗 传 学 会 办 公 室 ; 
安 锡 培 为 秘书 。 

中 国 遗传 学 会 成 立 以 后 ， 在 1979 年 召开 了 两 次 重要 会 议 。 
1979 年 16 月 6 日 一 12 日 在 成 都 召开 了 “作物 遗传 学 未 报告 会 % 出 
席 会 议 的 有 来 自 全 国 139 个 单位 的 224 位 代表 。 从 会 议 收 到 的 131 篇 
论文 看 出 我 国 在 育种 、 杂 种 优势 和 组 织 培养 方面 广泛 开展 了 遗传 
研究 。 在 作物 抗 毒性 、 早 熟 性 和 光合 效能 的 遗传 . 穆 花 腺 体 遗 传 、 
细菌 固 氨 性 的 遗传 、 不 同 作物 多 途径 地 利用 杂种 优势 ， 诱 发 狐 肉 
生殖 以 及 一 些 作物 远 缘 杂 交 的 研究 ， 均 取得 了 一 些 进展 ， 数 量 遗 
传 学 的 研究 也 得 到 了 一 定 重 视 。 桨 色 体 分 带 技术 、 同 工 酶 分 析 等 
新 技术 开始 应 用 于 遗传 资源 和 遗传 育种 的 研究 。 代 表 们 认为 ， 今 
后 要 加 强 作物 遗传 资源 的 研究 ， 与 育种 目标 有 关 的 各 种 性 状 、 特 
性 的 遗传 规律 的 研究 ， 以 提高 育种 的 主动 性 和 效率 。 并 建议 组 织 
一 部 分 力量 ， 应 用 常规 技术 ， 开 展 细胞 遗传 工程 研究 ;进一步 为 
育种 技术 的 不 断 创 新 打下 坚实 的 基础 。 这 次 会 议 的 直接 效益 是 组 
织 了 全 国 的 植物 遗传 研究 队伍 ， 为 解决 国内 植物 遗传 研究 课题 重 
复 ， 培 养 后 继 人 材 ， 编 写 适 用 教材 等 方面 提出 了 具体 意见 ， 并 在 
有 关 部 门 的 支持 下 逐步 加 以 实施 ， 推 动 了 植物 遗传 学 的 研究 和 教 
学 工作 。 

询 册 人 友基 的 得 补 志 施 15H9 和 和 
论文 报告 会 有 340 人 出 席 ， 收 到 论文 400 余 篇 。 这 是 建国 以 来 召开 
的 第 一 次 大 型 专题 会 议 。 这 次 会 议 突 破 了 禁区 ， 在 卢 惠 过 教 授 的 
支持 与 鼓励 下 ， 吴 旦 教授 提出 在 我 国 一 定 要 重视 计划 生育 工作 
要 开始 并 抓紧 优生 学 的 研究 ， 他 还 提出 了 具体 实施 措施 ; 这 个 建 
议 引起 了 秦 动 ， 光 明日 报 、 新 华 社 作 了 报道 ， 在 全 国 引起 反响 。 
这 以 后 蓬勃 展 开 的 优生 优育 工作 和 大 规模 的 遗传 性 疾病 调查 不 能 

6 


不 说 是 这 次 会 议 的 巨大 收获 。 例 如 ， 染 色 体 分 带 技术 已 普遍 推 
广 ， 带 型 的 清晰 度 有 很 大 改进 ,从 而 推动 了 染色 体 病 研究 的 深入 ， 
棍 高 了 诊断 的 正确 和 程度。 血红蛋白 分 子 病 的 研究 方面 发 现 了 一 些 
新 的 锯 红 蛋白 异常 ， 作 了 肽 链 的 一 级 结构 分 析 。 另 外 ， 绒 毛细 胞 
培养 和 多 基因 病 的 调查 ， 也 有 了 良好 的 开端 。 临 床 遗传 学 研究 也 
发 现 了 国内 外 未 见报 道 的 罕见 病例 。 这 一 切 标志 着 我 国人 类 和 医 
学 遗传 学 正 进 入 一 个 大 规模 地 普及 和 取得 更 大 成 果 的 新 阶段 。 

1980 年 1 月 4 日 一 7 日 在 北京 召开 了 中 国 遗 传 学 会 科普 工 作 会 
议 ， 这 次 会 议 指 出 了 普及 遗传 学 的 重要 性 和 迫切 性 。 与 会 代表 认 
为 ,遗传 学 基本 知识 的 普及 是 为 了 解答 人 民 关 心 的 有 关 问 题 ， 如 
科学 种 田 。 近亲 结婚 ， 遗 传 病 防 治 等 ， 是 为 了 澄清 遗传 学 基本 问 
题 长 期 存在 的 混乱 思想 。 会 议决 定 为 解决 师资 水 平 低下 及 遗传 学 
教材 中 存在 的 问题 ， 在 1980 年 和 1981 年 分 别 举 办 中 学 生物 教师 和 遗 
传 学 学 习 班 和 开办 大 专 院 粹 生物 学 中 青年 教师 高 级 训练 班 。 

1980 年 9 月 14 日 18 日 ， 中 国 遗 传 学 会 在 北戴河 召开 * 微 生 物 
遗传 学 和 分 子 遗 传 学 论文 报告 会 %% 这 次 会 议 组 织 了 8 位 专家 介绍 
了 国外 分 子 遗传 学 和 基因 工程 的 研究 进展 和 国内 初步 工作 结果 。 
会 议 收 到 的 108 篇 论文 涉及 到 微生物 遗传 和 分 子 遗传 学 的 基础 理 
论 和 方法 以 及 应 用 遗传 学 方法 解决 工农 业 生 产 和 医疗 实践 问题 等 
内 容 。 

中 国 遗传 学 会 “动物 遗传 学 术 讨 论 会 > 于 1980 年 12 月 15 日 一 20 
日 在 昆明 召开 。 通 过 会 议 交 流 和 讨论 使 大 家 看 到 ， 我 国 的 动物 遗 
传 学 教研 工作 虽然 比较 落后 ， 但 仍 有 一 定 的 基础 ， 增 强 了 我 们 的 
信心 。 我 们 已 在 一 些 工作 中 结合 生产 实践 取得 了 可 喜 的 成 绩 。 例 
如 利用 激素 处 理 XY 基 因 型 雄 鱼 的 方法 ， 使 其 得 到 的 后 代 全 是 雄 
鱼 。 由 于 雄 鱼 生长 快 ， 体 重大 ， 可 以 较 快 地 提供 市 场 需要 ， 在 生 
产 上 有 重要 的 实践 意义 。 另 外 在 低 等 峭 椎 动物 的 细胞 培养 及 染色 
体 组 型 的 分 析 方 面 以 及 数量 和 遗传、 哺乳 类 动物 和 实验 动物 等 遗传 
研究 方面 也 商定 了 基础 。 

中 国 遗 传 学 会 于 1981 年 5 月 28 日 二 6 月 3 日 在 杭州 召开 了 “全 国 


允 65 习 


遗传 学 教学 讨论 会 "这 次 会 议 上 ， 综合 大 学 师范 院 校 。 医 学 院 
校 、 农林 代 校 以 及 部 分 中 学 教师 交流 了 经 验 ， 针 对 当前 遗传 学 教 
学 提出 了 大 量 的 意见 和 建议 。 其 中 在 医学 院 校 设立 遗传 教研 组 
《 室 )》 的 建议 得 到 于 生 部 、 解 放 军 后 勤 部 的 采纳 和 支持 。 我 国 相 
继 在 一 些 医学 院 校 、 军 医大 学 配备 了 师资 ,设立 子 遗 传 学 教研 组 
( 室 )。 二 机 
通过 以 上 一 系列 学 术 会 议和 工作 会 议 的 召开 ， 不 仅 全 面 扒 
了 我 国 遗 传 学 的 发 展 ， 机 且 也 为 建立 健全 学 会 组 织 作 了 必要 的 准 
备 。 至 1981 年 ， 中 国 遗传 学 会 成 立 了 以 奚 元 龄 教授 为 主任 的 植物 
全 站 让 1 袖 千本 汪 作 二 四 关 各 帮 全 种 交 和 

方 系 黑 教 授 为 主任 的 科普 委员 会 ， 以 李 汝 祺 教授 为 主任 的 列 物 遗 
传 委员 会 ， 以 盛 祖 嘉 教授 为 主任 的 微生物 和 分 子 遗 传 委 员 会 ,以 
季 道 藩 教 授 为 主任 的 教育 委员 会 。 内 蒙 、 土 海 、 广东 *- 淹 南 、 江 
苏 、 海 南 等 24 个 地 方 遗传 学 会 也 相继 成 立 ， 拥 有 会 员 近 4000 名 。 
各 专业 委员 会 和 各 地 遗传 学 会 的 设立 ， 促 进 了 学 术 交 流 和 科教 卫 
生 事 业 的 发 展 ， 取 得 了 较 好 的 社会 效益 。 

在 国际 交流 方面 ， 中 国 但 传 学 会 与 美国 。 英 国 。 法 国 。 意 大 
利 。 日 本 等 同行 进行 了 学 术 探讨 ， 交 换 了 刊物 。1980 年 7 月 ,经 国 
务 院 批准 ， 中 国 遗 传 学 会 正式 加 入 国际 遗传 学 联合 会 x) 成 为 第 32 
个 会 员 国 。 

中 国 遗 传 学 会 健全 和 巩固 了 组 织 建设 后 ,各 专业 委员 会 积极 
活动 ， 在 各 个 领域 取得 了 可 这 的 成 绩 。 人 类 和 医学 遗传 委员 会 所 
属 8 个 协作 组 在 全 国 各 地 开展 了 工作 。 血红 蛋白 协作 组 在 海南 塌 
进行 子 近 3 万 人 的 血红 蛋白 病 的 调查 ,掌握 了 大 量 的 第 一 手 材 料 ， 
相继 发 现 了 新 的 血红 蛋白 病 。 在 产 前 诊断 和 染色 体 协 作 组 的 推动 
王 ， 几 个 大 城市 初步 开展 了 遗传 咨询 门诊 。 植 物 遗传 委员会 在 
1982 年 4 月 召开 了 ， 植 物体 细胞 遗传 和 染 色 体 工 程 讨论 会 2。 这 次 
会 议 显示 了 我 国 植物 遗传 研究 工作 在 短 短 几 年 内 取得 了 巨大 成 
果 。 沦 粉 育种 与 常规 育种 和 其 它 方法 结合 起 来 ， 为 应 用 玫 生 产 开 
性 了 美好 的 前 景 。 在 染色 体 工 程 研究 中 ， 蓝 粒 单 体 人 小麦 揭 工作 为 


21 00 3 


IT 


本 考 基 因 定 位 等 遗传 研究 提供 了 可 靠 手 狼 ， 推 动 了 水 麦 染 色 体 工 
程 欧 研究 和 进展 ， 花 培 小 麦 新 品种 也 获得 了 好 评 。 这 两 项 工作 都 
获得 国家 重大 成 果 奖 。 这 说 明 我 国 的 植物 遗传 研究 工作 已 经 形成 
了 自己 的 特点 9 这 次 会 议 组 成 了 染色 体 工程 协作 组 和 体 细胞 遗传 
协作 组 ， 以 进一步 深入 研究 。 

中 国 遗 传 学 会 第 二 次 代表 大 会 研学 求 讨论 会 于 1983 年 1 月 5 日 
去世 日 在 福 剂 市 租 开 。 这 次 大 会 共 收 到 论文 近 千 篇 ， 在 11 企 分 组 
会 击 共 宣读 了 238 篇 论文 。 这 些 论文 表明 了 在 1978 一 1982 年 遗传 
学 各 领域 的 进展 。 其 中 人 类 及 医学 遗传 学 发 展 较 快 。 如 人 血红 蛋 自 
芬 子 病 欧 研究 和 普查 工作 ， 包 括 胎儿 血红 蛋白 的 分 型 和 定量 ， 地 


中 海 贫血 家 系 调查 ，16 个 省 〈 市 、 区 ) 异常 血红 蛋 自 研究 ,170 个 


家 系 异 常 血 红 蛋 白 的 化 学 结构 分 析 等 。 血 红 蛋 白 病 调查 协作 组 在 
全 国 抽样 调查 了 几 十 万 人 ， 十 多 个 民族 。 据 调查 资料 ， 全 国 异 党 
血红 蛋 昌 的 发 生 率 为 0.29%。 其 它 还 有 人 鼠 杂 种 细胞 的 形成 和 鉴 
定 ， 云南 省 欧 族 400 例 皮 纹 正常 值 研 究 , 中 国 11 个 少数 民族 的 肤 纹 
学 研究 ， 乙 型 肝炎 患者 外 周 血 淋 巴 细胞 扑 NA 基因 活性 的 研究 ， 
头 体 鼻 咽 癌 上 皮 苇 CNE 一 2 的 细胞 遗传 学 研究 ， 口 服 吕 孕 药 妇女 、 
正常 妇女 、 孕 妇 姐 妹 染色 单 体 交 换 频 率 的 研究 、 手 畸 型 的 细胞 遗 
传 学 研究 ， 河 北 省 畴 型 儿 抽 样 调 查 报 告 以 及 1167 例 遗传 咨询 门诊 


病人 药 染 名 体 分 析 等 工作 都 反映 了 人 类 和 医学 遗传 学 在 基础 工作 


和 实验 技术 下 作 方 面 做 了 大 量 扎 实 的 工作 ， 加 上 社会 的 支持 和 重 
视 ， 使 这 个 学 科 取得 了 显著 的 进展 。 

是 植物 遗传 学 方面 进展 较 快 的 仍 在 花药 培养 工作 ,茶叶 、 三 吐 橡 
胶 三 柑 桔 等 经 济 作物 的 花药 培养 取得 了 较 大 成 绩 。 据 不 完全 统计 ， 
已 有 16 个 单位 先后 选 育 出 20 多 个 小 麦 新 品种 《品系 )。 北 京 市 农 科 
院 选 育 的 * 训 范 一 号 "1981 年 平均 产量 为 705 斤 ， 比 对 照 农 大 139 增 
产 16.9%s 一 些 单位 在 未 授粉 子 房 培养 方面 获得 成 功 。 单 倍 体育 
种 与 常规 育种 等 方法 相 结 合 ， 为 植物 遗传 学 面 癌 生 产 开 辟 了 美好 
的 前 景 。 我 国 在 领先 的 杂交 水 稻 研 究 方面 ,这 两 年 开展 了 杂交 水 
舟 细 胞 质 效 应 及 遗传 问题 前 研究 ，- 取 得 了 进展 。 汪 人 和， 植物 试管 


多 7 是 


无 性 杂交 方法 获得 了 几 种 嫁接 组 合 的 无 性 杂种 。 天 津 地 区 浪 海 盐 
硫 地 结合 育种 工作 ， 发 展 了 粳稻 半 禾 秆 性 状 遗 传 和 应 用 的 研究 ， 
选 育 出 早熟 的 半 矮 守 品 系 4152， 在 污水 地 区 亩 产 900--1000 帮 .在 
烟草 、 油 菜 时 绿 体 DNA 的 电镜 观察 中 发 现 有 小 型 环 图 结构 ; 称 之 
为 “ 花 盘 状 结构 "。 从 得 到 的 叶绿体 DNA 电 镜 图 象 可 以 清晰 地 看 到 
这 种 结构 。 这 种 结构 可 能 同 叶绿体 DNA 重 组 有 关 5 这 届 太 会 有 关 
数量 遗传 学 的 内 容 明 显 增多 ， 其 中 有 作物 数量 遗传 电子 计算 机 程 
序 、 数 量 遗 传 应 用 在 水 稻 育种 上 的 初步 研究 以 及 作物 农艺 性 状 遗 
传 参数 的 测定 及 其 在 育种 上 的 应 用 等。 

国内 的 分 子 及 微生物 遗传 的 研究 日 趋 活跃 。 在 乙 型 肝炎 病毒 
基因 工程 的 研究 、 固 氨基 因 的 遗传 互补 和 它 的 结构 分 析 。 重 氨 华 
氧 甲 基 纤 维 素 的 制备 方法 和 应 用 、 真 核 生 物 DNA 重 复 序 列 的 分 
析 研 究 工作 方面 ， 都 取得 了 一 定 的 成 绩 。 

动物 遗传 学 研究 工作 在 国内 是 薄弱 环节 ， 近 年 来 在 生产 应 用 
方面 做 出 了 一 定 成 绩 。 新 疆 21 型 白猪 的 染色 体 畏 变 的 研究 ， 发 现 
妆 色 体 畸 变 的 检 出 率 因 年 龄 而 异 。 在 动物 数量 遗传 、 行 为 遗传 ， 
群体 遗传 、 家 等 遗传 以 及 动物 染色 体 组 型 ， 同 工 酶 谱 和 激光 显 微 
照射 后 对 微 核 仁 形成 的 研究 等 方面 ， 也 做 了 许多 工作 。 

这 届 大 会 上 由 鲍 文 硅 教 授 、 吴 县 教授 、 李 载 平 教授 分 别 作 了 
题 为 “植物 育种 中 的 遗传 学 问题 ">“ 遗 传 学 与 医学 实践 2; 基因 工 
程 ”的 专题 报告 。 谈 家 桢 教授 作 了 “关于 造 传 学 在 我 国 社会 主义 
现代 化 建设 中 的 地 位 和 作用 ”的 长 篇 发 言 ,阐述 了 遗传 学 和 农业 、 
工业 、 医 药 卫生 、 生 态 学 以 及 哲学 、 社 会 科学 、 政 治 经 济 学 的 密 - 
切 关系 。 加 拿 大 华裔 科学 家 黄 兆 泉 博 士 在 大 会 上 作 了 “血红 蛋白 
的 产 前 诊断 ”的 学 术 报告。 

这 届 大 会 是 在 党 的 十 二 大 以 后 召开 的 ， 会 议 的 基调 为 “振兴 
经 济 必 须 依靠 科学 技术 的 进步 ， 科 技工 作 必须 面向 经 济 建设 ”这 
也 是 以 后 多年 学 会 工作 的 重点 。 

中 国 遗 传 学 会 第 二 次 代表 大 会 选举 产生 了 第 二 届 理 事 会 。 理 
事 会 由 59 位 同志 组 成 ， 理 事 长 为 谈 家 桢 , 副 理 事 长 为 衣 含 \ 吴 曼 。 


四 68 9 


李 载 平 、 秘 书 长 邵 启 全 ， 副 秘书 长 为 吴 稚 龄 、 李 致 助 、 李 现 。 各 
专业 委员 会 进行 了 调整 ， 鲍 文 枝 教授 任 植物 遗传 委员 会 主任 ， 刘 
祖 洞 教授 任 人 类 和 医学 遗传 委员 会 主任 ， 吴 仲 贤 教授 任 动物 遗传 
委员 会 主任 。 盛 祖 嘉 、 方 宗 哑 、 季 道 藩 教 授 分 别 继续 担任 分 子 和 
微生物 遗传 委员 会 、 普 及 委员 会 、 教 育 委员 会 主任 。 第 二 次 代表 
大 会 后 成 立 环境 诱 变 剂 委员 会 ， 谈 家 桢 教授 兼任 委员 会 主任 。 

第 二 次 代表 大 会 以 后 ， 学 会 工作 重点 围绕 面向 经 济 建设 。 例 
如 为 贯彻 计划 生育 这 项 基本 国策 ，1983 年 学 会 召开 “计划 生育 中 
的 遗传 学 问题 讨论 会 ,对 我 国 制 定 优生 法 提出 了 具体 意见 ， 并 和 希 
望 有 关 部 门 重 视 遗 传 咨询 工作 。 这 次 会 议 的 资料 表明 ， 我 国 遗传 
病 揭发 病情 况 是 严重 的 ， 因 此 在 全 国 范围 内 组 织 大 规模 的 普查 是 
必要 的 。 光 明日 报 为 此 次 会 议 发 了 内 参 ， 不 久 以 后 国家 计划 生育 
委员 会 拨 出 专款 用 于 三 项 项 目的 调查 。1984 年 我 会 召开 “全 国花 
卉 遗传 学 讨论 会 ?。 代 表 们 建议 把 花卉 生产 纳入 国民 经 济 计 划 ， 并 
统筹 解决 花卉 良种 化 及 研究 、 生 产 、 贸 易 等 事宜 ,应 该 特别 重视 球 
根 与 花卉 种 子 的 研究 、 生 产 和 供销 等 问题 。 

第 二 次 代表 大 会 以 后 ， 加 强 了 国际 交流 。1983 年 春 ， 中 国 遗 
传 学 会 和 上 海 科 协 在 上 海 举办 了 致癌 、 致 畸 、 致 突变 讲习 班 ， 应 
邀 讲学 的 有 11 个 国家 的 33 位 学 者 ,200 多 位 国内 学 者 参加 了 讲习 
班 。 通 过 交流 ， 可 以 看 到 我 国 在 这 些 新 兴 领 域内 的 工作 已 初 具 规 
模 并 达到 或 接近 世界 水 平 。1983 年 冬 ， 中 国 遗传 学 会 代表 团 出 席 
了 在 印度 新 德里 召开 的 第 15 届 国际 遗传 学 大 会 。 这 是 我 国 加 入 国 
际 遗 传 学 联合 会 以 后 首次 参加 的 国际 大 型 会 议 ， 我 国 代表 团 向 大 
会 提交 论文 42 篇 ， 展 出 墙报 16 篇 .参加 国际 会 议 扩大 了 我 国 影响 ， 
加 强 了 交流 和 合作 。1984 年 10 月 在 北京 召开 了 国际 作物 遗传 操作 
学 术 讨论 会 。 

遗传 学 经 历 了 80 多 年 的 发 展 ， 成 长 为 一 个 重要 的 领域 。 如 果 
把 它 比喻 成 一 棵 根深 叶 茂 的 大 树 ， 那 么 孟 德 尔 法 则 便 是 具有 顽强 
生命 力 的 种 子 ，1984 年 1 月 6 日 ， 是 孟 德 尔 逝 世 一 百 周 年 ， 中 国 遗 
传 学 会 在 全 国 各 地 举行 了 隆重 的 纪 从 活 动 ， 并 出 版 了 孟 德 尔 逝 世 


69 


一 百 周 年 纪念 文集 。 

启 好 年 5 及 者 站 总 声 主 市 曾 站 传 章 旁 在 价 入 市 罕 庆 演 次 全 国 
代表 夫 会 临 学 术 讨论 会 。 全 国 各 地 代表 近 700 人 出 席 了 大 会 。 香 港 
中 文 天 学 和 美国 Waltar 研 究 所 前 专家 也 应 邀 参加 大 会 并 做 了 专题 
报告 。 这 次 大 会 检阅 了 自 1983 年 以 来 遗传 学 各 领域 丙 药 研究 进 
展 。 从 大 

我 国 微生物 与 分 子 遗传 学 研究 、 遗 传 工程 与 基础 研究 方面 都 
取得 了 较 快 进展 。 癌 基因 的 研究 和 分 子 遗 传 线 粒 体 研究 有 了 银 好 
的 开端 ， 致 病菌 遗传 工程 疫苗 的 研究 正 向 纵深 发 展 。 值 得 提 到 的 
是 己 型 肝炎 及 生 猪 腹 演 疤 苗 的 工作 即将 应 用 于 生产 ， 为 我 国 遗 做 
工程 开创 了 先例 。 另 外 ， 已 经 弄 展 揭 高 温 细菌 的 遗传 学 研究 及 酵 
母 遗 传 工 程 体系 的 研究 都 是 意义 重大 的 项 目 。 在 基础 理论 研究 方 
面 ， 也 已 发 现 了 核 六 体 蛋白 质 对 不 同 的 mRNA 有 选择 性 ， 得 到 了 
具有 开创 性 的 结果 ; 

: 电 胸 适 村 学 的 久光 :这儿 车 未 论 套 厅 交大 黄 硬 肯 症 证 县 多 这 
的 水 平 上 都 有 了 较 大 的 发 展 与 提高 染色体 研究 技术 有 了 新 突破 :4 
值得 提 到 前 是 联 会 复合 体 的 工作 已 成 为 研究 染色 体 结 梅 变异 的 有 
为 手段 ， 光 学 和 电子 显微镜 相 结合 提高 了 分 辨 能 力 。 鱼 类 妇 色 体 
高 区 辩 G 带 的 研究 也 取得 了 显著 进展 ， 对 鱼 类 遗传 的 深 民 研究 里 
ee 
究 也 有 了 新 前 开端 。 

于 物 遗 传 学 分 10 个 专题 进行 -了 学 术 交 流 瑟 讨论 鄙 友 病 宁 远 元 
年 素 我 国 植 驳 遗传 学 研究 的 进展 。@ 实 验 研 究 技术 取得 了 新 的 突 
破 。G 带 高 分 辨 技术 的 应 用 与 改进 ， 使 成 本 降低 、 方 法 简化 计 并 
沟 著 提高 了 效果 。 动 胸 遗 传 的 联 会 复合 体 研究 技术 已 经 应 用 打 
植物 遗传 研究 。 回 与 生产 密切 联系 的 生物 技术 蓬勃 发 展 。 永 称 与 
豆 科 作物 原生 质 体 再 生 的 研究 已 处 于 世界 先进 行列 。 花 药 正 养 、 
体 细 胞 禾 选 等 研究 都 取得 了 可 喜 的 成 果 。 小 麦 兰 单 体 的 研究 是 染 
名 体 工程 研究 的 一 项 突破 性 进展 ， 并 已 经 作 了 21 个 基因 定位 回 
应 用 研究 取得 了 显著 成 果 5 光敏 核 不 青 及 广 亲 和 系 研 究 使 杂交 

0 


育种 工作 进入 了 新 的 阶段 ， 它 将 对 农业 生产 作出 重要 贡献 ;另外 ， 
各 类 作 物 抗 病 狂 的 车 传 研究 也 正 向 纵深 发 展 。@ 植 多 分 子叶 传 学 
的 研究 受到 普遍 重视 。 

医学 遗传 学 进行 了 十 三 个 项 目的 学 术 交流 ， 其 中 新 技术 的 发 
展 讨论 会 引起 了 代表 的 极 大 兴趣 ， 人 精子 细胞 染色 体 的 显示 以 及 
减 数 分 裂 染色 体 行为 的 观察 ， 促 进 了 男性 不 育 及 其 各 种 因素 遗传 
效应 的 研究 。 产 前 诊断 近年 来 发 展 迅速 ， 早 孕 绒毛 的 检查 国内 已 
普遍 开展 ;一 个 新 的 突破 是 采用 胎儿 标本 进行 胎儿 质量 的 预测 研 
究 ， 为 产 前 诊断 开辟 了 新 的 途径 。 我 国 已 发 现 的 180 种 染 色 体 异 
常 在 国际 上 尚未 见 到 报道 。 高 分 辩 显 带 技术 已 广泛 应 用 ， 并 且 在 
产 前 诊断 羊水 细胞 标本 中 能 稳定 地 显示 。 这 些 研究 在 一 些 单位 已 
达到 世界 先进 水 平 。 在 基因 诊断 方面 ， 国 内 有 五 个 单 位 采用 了 

DNA 限 制 性 酶 谱 技术 点 突变 ， 限 制 性 片断 连锁 分 析 ， 寡 核 音 酸 

探 针 等 技术 。 在 出 生前 诊断 出 c，8 地 中 海 贫血 ， 血 友 病 ;: 共 丙 本 
尿 症 等 下 种 发 病 率 较 高 的 遗传 病 。 缩 得 了 同 世界 先进 国家 的 差距 。 
基因 定位 也 有 了 进展 ， 不 少 实 允 室 具备 了 一 定 的 技术 力量 ， 为 定 
位 新 的 基因 提供 了 条 件 。 

;中国 遗传 学 会 与 所 属地 方 遗 传 学 会 经 过 了 广泛 及 较 长 时 间 的 
本 本 和 讨论 、 和 出 了 59 位 同志 组 成 的 第 三 届 理 事 会 
， 志 谈 家 桢 教授 当选 为 理事 长 ， 吴 昊 、 李 载 平 ， 胡 合 为 天 理事 长， 
李振声 当选 为 秘书 长， 副 秘书 长 为 吴 位 具 李 现 、 赵 寿 元 、 陈 对 
程 。 

中 国 遗 传 学 会 在 推动 我 国 遗传 学 次 展 ,加 强国 际 间 的 联络 和 
合作 方面 发 挥 了 一 定 的 作用 ， 在 全 体会 员 的 努力 下 ， 中 国 遗传 学 
会 正 逐步 建设 成 一 个 活跃 的 学 术 团体 。 


《 安 锡 培 ) 


人 


第 一 节 ”基因 概念 的 演变 


遗传 学 作为 一 门 实验 性 学 科 , 在 研究 方法 上 ,自始至终 着 眼 于 
对 基因 一 一 遗传 物质 的 结构 和 功能 的 研究 。 在 不 同 历史 时 期 ,基因 
的 概念 赋予 不 同 的 内 容 。 可 以 这 样 说 ， 一 部 遗传 学 发 展 史 ， 渗 透 
和 贯穿 着 人 们 对 基因 认识 的 不 断 深 化 过 程 ， 基 因 收 念 在 科学 实践 
中 不 断 得 到 充实 和 完善 。 


(一 ) 生物 性 状 的 符号 


格 利 戈 * 重 德尔 被 认为 是 近代 遗传 学 的 疯 基 人 。 重 德尔 从 1856 
年 开始 ， 连 续 七 年 以 或 豆 做 实验 材料 ， 进 行 一 系列 的 杂交 试验 ， 
和 孜孜以求 地 探索 生物 遗传 的 规律 。 

备 德 尔 把 两 个 可 区 分 相对 性 状 的 植株 ， 通 过 杂交 授粉 ， 产 生 
第 一 代 (Fi) 杂 种 。 他 发 现在 每 一 组 中 杂种 的 性 状 表现 ， 都 完全 象 
或 几乎 完全 象 两 个 亲本 中 的 一 个 。 重 德尔 把 在 杂交 时 保持 不 变 或 
几乎 不 变 地 传 给 后 代 的 那些 性 状 称 为 显 性 ;而 在 杂种 中 隐 而 不 现 ， 


人 70 。 


或 潜伏 起 来 的 性 状 称 为 隐 性 。 当 Fi 自 花 授精 产生 第 二 代 (Fi) 时 ， 
孟 德 尔 发 现 原先 隐 而 不 见 的 隐 性 性 状 得 到 了 表现 ， 统 计 显 性 植株 
与 耻 性 植株 的 比率 ， 得 到 3:1 的 比 数 。 

为 了 证 明 这 个 试验 的 结果 ， 重 德尔 提出 这 样 一 个 假设 ， 在 每 . 
一 个 植株 中 ， 每 一 个 相对 性 状 都 受 两 个 相同 的 “基因 ”( 和 孟 德 尔 当 
时 称 为 “遗传 因子 ) 控 制 ， 感 性 遗传 因子 使 之 表现 为 显 性 性 状 ， 
隐 性 遗传 因子 使 之 表现 为 隐 性 性 状 。 例 如 红 花 与 白花 这 一 对 相对 
性 状 灶 株 杂交 ， 亲 代为 纯 系 的 红 花 植 株 ; 它 的 基因 型 为 CC;， 亲 代 
为 纯 系 的 白花 植株 ， 它 的 基因 型 为 cc， 在 杂交 过 程 中 , CC 提供 一 
个 C 配 子 ; cc 提供 一 个 c 配 子 ， 受 精 时 肉 玲 生殖 细胞 结合 为 合子 ， 
基因 型 为 Cc， 因 C 对 ec 是 显 性 ,所 以 产生 杂种 第 一 代 (EFi ) 的 表现 型 
为 全 红 花 。 当 Fi 自 花 授粉 ， 即 Cc x Cc 时 ， 肉 雄 各 有 两 种 配子 ， 一 
种 是 C， 一 种 是 c， 两 种 配子 之 比 是 1:13 受 精 时 产生 四 种 不 同 的 组 
合 ， 即 四 种 不 同 的 基因 型 为 CC，Cc,，cC，cc。 同样 C 对 c 是 显 性 ， 
在 表现 型 上 CC 与 Cc、eC 的 基因 型 植株 都 表现 为 红 花 , 而 ec 植株 表 
现 为 自 花 ， 所 以 在 子 二 代 (F;) 植 株 中 ， 表 现 红 花 与 白花 之 比 为 
3234 

和 孟 德 尔 再 进行 回 交 试验 ， 试 验 结 果 又 与 预期 的 假设 相符 ， 从 
而 验证 了 他 的 假设 的 正确 性 。 在 此 基础 上 ， 备 德尔 建立 了 遗传 学 
第 一 定律 ， 即 “分 离 规律 ? :一 对 基因 在 异 质 接合 状态 下 并 不 相互 
影响 ， 和 相互 沾染 ， 而 在 配子 形成 时 ， 完 全 按照 原样 分 离 到 不 同 的 
配子 中 去 。 在 一 般 情 况 下 ， 配 子 分 离 是 1:1, 子 二 代 共 同 基 因 型 分 
离 为 1:2:1， 表 现 型 分 离 为 3:1。 分 离 出 来 的 隐 性 同 质 接合 和 原来 
隐 性 亲本 在 表现 型 上 是 完全 一 样 的 ， 隐 性 基因 并 不 因为 曾 与 显 性 
基因 处 于 同一 个 体内 而 发 生 沾染 或 影响 ， 仍 保持 它 的 性 质 。 

备 德 尔 在 进行 了 一 对 相对 性 状 杂交 试验 后 ， 又 通过 杂交 把 几 
对 相对 性 状 结合 在 一 个 杂种 体 上 ， 观 察 性 状 传递 规律 。 他 认为 ， 
无 论 多 么 复杂 的 多 对 性 状 植株 杂交 ， 对 于 每 一 对 相对 性 状 来 说 ， 
它们 同样 服从 于 分 离 规律 。 孟 德尔 在 多 对 相对 性 状 植株 杂交 试验 
基础 上 推论 出 遗传 学 的 又 一 规律 ， 即 “独立 分 配 规律 ,又 称 自由 


。73 。 


组 合 规律 。- 这 个 规律 琢 明 ， 当 两 对 或 多 对 基因 处 于 异 质 接 舍 状态 
时， 它们 对 配子 中 的 分 离 是 彼此 独立 互 不 替 连 的 。 沁 同样 ) 备 德尔 
用 回 交 试 验 来 验证 这 个 假设 的 可 靠 性 ， 结 果 证 明理 论 分 析 与 斌 验 
;区 果 符合 ， 从 而 证 实 卫 这 个 规律 的 正确 性 , - 

孟 德尔 揭示 的 遗 寺 规律 玫 明 ;上 生 易 的 每 一 不 性 并 ; ;本 基 用 站 
传 因子 的 基本 单元 来 分 析 。 从 亲 素 到 子 代 ， 是 由 颗粒 性 遗传 国 子 
-负责 传递 的 。 颗 粒 性 遗传 因子 存在 乎 细 胸 ， 荆 成 双 存 在 于 体 细胞 
里， 而 在 性 细胞 里 是 成 单 存在 的 。 杂 交 时 ， 颗粒 性 因子 保持 独立 
-性 汪 它 们 之 间 不 相 融 合 ; 在 杂 秆 产生 配子 时 ,不 同 的 遗传 因子 仍 
然 保 持 相对 的 独立 性 ， 瑟 不 感染 地 各 自分 配 在 不 同 的 配子 里 ， 完 
整地 传 给 下 一 代 。 这 就 是 备 德 尔 用 颗粒 性 遗传 因子 对 生 览 和 遗 传 现 
象 所 作 的 解释 。 

1865 年 2 月 2 月 和 3 月 8 旧 , 备 德 尔 在 布 隆 由 自然 科学 研究 学 会 
召开 的 讨论 会 上 宣 谈 了 他 的 《植物 杂交 试验 ?论文 ， 遗 袜 的 是 孟 德 
尔 这 篇 具有 划时代 意义 的 论文 ， 在 以 后 35 年 里 正 象 他 本 人 二 样 ， 
很 少 有 人 问津。 直到 1900 年 ， 荷 兰 的 休 和 区， 德 弗 里 斯 、 德 国 的 卡 
尔 . 柯 仓 斯 和 奥地利 和 丘 歇 马克 三 位 植物 学 家 根据 他 们 各 自 独 立 
的 植物 杂交 试验 ， 在 几 个 星期 里 接 是 发 表 的 研究 论文 中 ， 确 认 他 
们 在 进行 各 自 的 试验 之 前 是 完全 不 知道 孟 德尔 的 工作 ， 而 只 基 在 
-论文 发 表 前 ，: 在 查阅 以 前 有 关 文 献 时 才 发 现 自 己 论 文 的 结果 觉 导 
' 备 德尔 论文 的 中 心思 想 不 谋 而 合 。 三 位 科学 家 的 研究 卫 作 恰恰 证 
' 实 了 备 德尔 所 发 现 的 遗传 规律 的 正确 性 。 由 此 ， 备 德尔 的 经 典 性 
: 开 作 才 得 到 科学 界 的 承认 。 

了 熏 德 尔 提 出 的 “ 遗 2 广 j 学 家 约翰 壕 在 1909 
年 提出 的 “基因 ”一 词 代替 。 早 期 的 基因 与 “遗传 因子 ”的 概 
念 ， 在 实质 上 是 一 致 的 , : 它 只 是 一 种 逻辑 推理 的 产物 非 为 一 种 
遗传 性 状 的 符号 并 没有 任何 物质 内 容 。 随 着 遗传 学 的 和 研 究 进 二 步 
深入 ， 基 因 的 概念 不 断 地 改变 其 内 容 与 形式 ， 进 一 步 推动 遗传 学 
的 发 展 。 


。 274 。 


(二 ) 位 于 染色 体 上 的 遗传 功能 单位 

”托马斯 。 享 特 。 摩 尔 根 是 二 十 世纪 最 著名 的 生物 学 家 之 一 。 
他 是 一 位 优秀 的 博物 学 家 。 他 的 研究 兴趣 极为 广泛 ， 在 实验 胚胎 
学 、 进 化 论 、 细 胞 学 、 遗 传 学 等 领域 进行 大 量 的 研究 工作 。 

摩尔 根 从 1909 年 开始 ,与 他 的 学 生 一 起 用 果 蝇 作为 实验 材料 ， 
在 前 人 研究 的 基础 上 根据 大 量 的 实验 结果 ， 证 明 位 于 同一 条 染色 
条 上 的 某 些 性 状 的 基因 , “连锁 在 一 起 不 易 分 开 的 连锁 和 交换 现 
象 y 并 进而 阐明 它 的 规律 和 本 质 ， 提 出 了 遗传 学 的 另 一 重要 规律 
一 一 连锁 交换 规律 。 让 和 全 生生 自由 组 


本 卫 明 骸 有 些 苍 列 和 该 效 共 弄 的 详 册 过 程 5 | 鬼 观 旨 各 村 


0 为 与 
基因 行为 存在 着 一 种 平行 现象 ， 从 的 物质 才 
;基因 在 染色 体 上 作 直 线 排 丈 成 
0 
年 ， 为 表彰 他 在 遗传 学 上 的 杰出 贡献 ， 被 授予 此 年 度 的 生理 学 和 
-医学 方面 的 诺 贝尔 奖金 。 

1910 年 ;天 尔 根 在 进行 大量 的 果 章 撑 素 杂交 试验 中 ， 在 许多 
野生 型 红眼 果 蝇 中， 偶然 发 现 了 一 只 白眼 雄 蝇 ， 它 与 红色 野生 型 
时 申 有 着 细 水 然而 明晰 的 不 同 。 他 用 那 只 白眼 雁 蝇 和 一 只 没有 交 
“ 柄 过 的 红眼 肉 蝇 杂 交 ， 因 天后， 发 现 所 有 后 代 都 是 红眼 果 岂 = 再 
进行 隆 一 代 自 交 产 生子 三 代 ， 这 一 代 果 蝇 检 查 发 现 ， 呈 现 三 种 表 
- 现 型 5? 即 红眼 肉 岂 交 红眼 雄 蝇 和 白眼 雄 蝇 。 摩 尔 根 注意 到 ,在 红眼 
-和 由 了 眼 的 分 配 比率 上 ， 它 们 基本 上 符合 孟 德 尔 分 配 定律 所 表明 的 
3:1 关 系 ， es 
尔 式 的 遗传 因子 决定 的 。 

本 机 闪 咎 外 式 通 从 的 可 址 5 诊所 让 的 四 共 冯 53 砷 由 二 
的 四 分 之 一 应 表现 出 隐 性 性 状 。 可 是 ， 在 摩尔 根 的 观察 结果 中 ， 
雄 昭 中 半数 是 红 了 眼睛 ， 半 数 是 白眼 贿 》 在 肉 蝇 中 却 没 有 一 只 是 自 


5 


眼睛 的 ， 即 肉 蝇 全 部 是 正常 的 红眼 睛 。 这 种 现象 在 其 后 的 交配 中 
说 明 为 什么 白眼 睛 果 蝇 基本 上 为 雄 的 理由 。 摩 尔 根 是 这 样 说 明 的 ， 
将 白眼 睛 雄 蝇 同 正 常 崔 蝇 交配 时 ， 子 代 中 半数 为 白眼 睛 ，; 并 且 都 
是 雄 的 。 和 白眼 哺 因 子 (不 久 用 基因 术语 称呼 之 ) 明确 地 与 其 它 的 
备 德 尔 遗传 的 隐 性 因子 不 同 ， 归 根 到 底 受 性 别 的 影响 * 即 认 为 眼 
色 基 因 (R) 和 性 别 决 定 因子 (X) 是 结合 在 一 起 的 。 也 就 是 说 (R) 与 
(X) 连锁 在 一 起 。 当 这 些 连 锁 在 一 起 的 基因 在 同一 条 娄 色 体 上 ， 
减 数 分 裂 时 作为 一 个 整体 而 遗传 给 后 代 。 摩 尔 根 把 这 种 遗传 方式 
称 为 伴 性 肚 传 。 不 久 ， 搞 清 了 基因 组 成 群 ， 基 因 群 也 称 为 “连锁 
群 ?, 它 的 数目 刚好 等 于 染色 体 的 对 数 ,同一 群 内 的 基因 一 起 遗传 ， 
由 此 推论 基因 是 娄 色 体 的 一 部 分 。 依 据 摩尔 根 首创 的 连锁 学 说 ， 
连锁 遗传 是 由 于 连锁 基因 位 于 同一 染色 体 上 的 结果 。 如 果 染 色 体 
在 遗传 过 程 中 保持 原来 状态 ， 位 于 同一 染色 体 上 的 两 个 基因 应 该 
在 所 有 情况 下 保持 在 一 起 ， 也 就 是 说 ， 应 该 是 完全 连锁 。 进 一 步 
研究 认为 ， 在 同一 连锁 群 中 的 基因 ， 并 非 永 远 “ 抱 紧 ” 在 一 起 ， 
通常 的 连锁 只 是 部 分 的 ， 连 锁 基 因 有 时 会 分 开 ， 连 锁 程度 或 强度 
有 赖 于 染色 体 上 连锁 基因 间 的 距离 。 通 过 细胞 学 观察 ， 发 现在 第 
一 次 减 数 分 裂 前 期 中 ， 在 同 源 染色 体 配 对 期 ， 两 条 染色 体 单 体 之 
闻 会 发 生 交叉 现象 ， 这 标志 着 两 个 相对 连锁 群 的 基因 之 间 ， 随 着 
染色 体 的 交叉 而 发 生 基因 有 秩序 的 交换 ， 使 基因 重新 组 合 ， 从 而 
增加 了 遗传 的 变异 性 | 同时 研究 表明 ， 在 同一 染色 体 上 的 连锁 基 
因 之 间 发 生 的 交换 ， 基 因 上 距离 着 丝 点 愈 远 ， 基 因 和 着 丝 点 之 间 的 
交换 机 会 就 愈 大 ， 也 就 是 说 ， 交 换 率 傅 大 ， 它 们 的 分 离 机 会 也 就 
二 有 区 机 村 最 呈 疾 人 芝 小 二 吉本 术 
可 以 衡量 两 个 基因 之 间 的 相对 距离 ， 进 而 推算 出 紧 靠 着 的 基因 之 
间 的 图 距 ， 综 合 大 量 综 计 资料 就 可 能 绘制 成 染色 体 遗 传 图 。， 

色 法 遗传 图 或 染色 体 连 锁 图 是 证 明基 因 在 染色 体 上 直线 排 _ 
,到 学 说 的 基础 。 因 为 染色 体 遗 传 图 和 表明， 每 个 物种 的 许多 基因 ， 
形成 与 染色 体 数 相等 的 连锁 群 ， 每 群 成 为 一 个 直线 系统 ;在 这 直 
线 系统 上 用 基因 之 间 的 交换 百分数 来 表示 它们 之 间 的 相对 距离 


诅 206 4 


这 就 有 力 地 证 明了 基因 在 染色 体 上 的 相对 位 置 ， 并 依 一 定 的 顺序 
作 直 线 排列 。 

麻 汞 根 在 果 鹿 遗传 研究 的 基础 上 发 展 了 前 人 的 染色 体 遗 传 理 
论 ， 创 立 了 新 的 遗传 理论 ， 即 基因 理论 。 他 主张 遗传 是 由 遗传 物 
质 一 一 基因 起 作用 ， 基因 在 染色 体 上 作 直 线 排列 以 及 在 遗传 传递 
中 ， 基 因 表 现 分 离 规律 .自由 组 合 规律 及 备 德 尔 式 遗 传 例 外 的 ” 


机 和 梓 信和 交 注 了 村 禾 拓 : 和 南瓜 上 
这 个 理论 几 十 年 来 成 为 遗传 学 研 
究 前 理论 基础 ， 并 在 实 牙 中 不 断 得 到 充实 ， 修 正和 发 展 ， 成 为 现 
代 生 物 学 的 基本 理论 之 一 。 


1926 年 ， 摩 尔 根 发 表 了 《基因 论 》”， 这 是 摩尔 根 和 他 药 助 手 在 
1910 年 到 1916 年 期 间 的 研究 工作 的 总 结 。 基 因 论 揭示 了 基因 与 性 


状 之 间 种 种 联系 和 规律 。 限 于 当时 的 科学 水 平和 认识 能 力 ， 还 不 _ 


可 能 对 基因 赋予 实体 的 内 容 。 但 是 ， 摩 尔 根 科 学 地 预见 了 基因 将 
是 一 个 化 学 实体 。 他 说 :我们 仍然 很 难 放弃 这 个 可 爱 的 假设 ， 基 
因 之 所 以 稳定 ， 是 因为 它 代 表 着 一 个 有 机 的 化 学 实体 。 这 个 预见 
被 日 后 的 研究 所 证 实 。 可 以 说 基因 论 的 创立 标志 着 经 典 遗 传 学 发 
展 到 了 细胞 遗传 学 阶段 ， 并 在 这 个 基础 上 展现 了 现代 生化 遗传 学 
和 分 子 遗传 学 的 前 景 。 
(三 ) 有 功能 的 DNA 片断 卫 
二 自 摩 尔 根 以 后 ， 一 些 科学 家 为 证 实 基因 并 不 是 形式 上 的 符号 
而 是 一 个 实体 ， 做 了 大 量 的 工作 。 科 斯 夫 、 海 交 和 鲍 尔 等 人 证 实 
了 巨 染色 体 〈 多 线 染 色 体 ) 与 生殖 细胞 染色 体 之 间 的 对 应 关系 ， 
并 提出 巨 染 色 体 上 的 横 纹 就 是 基因 的 假设 。 在 此 基础 上 ， 贾 德 等 
在 一 个 具有 15 条 横 纹 的 广 染 色 体 上 识别 出 16 个 基因 ”又 在 约 33 一 
50 条 横 纹 的 第 4 号 染色 体 上 识别 出 43 个 基因 。 这 样 , 一 个 基因 一 横 
纹 的 假说 便 得 到 了 证 实 , ,从 而 把 形式 上 的 基因 推 向 实体 。 
1928 年 ， 英 国 科 学 家 格 里 费 斯 用 肺炎 双 球 菌 对 小 家 鼠 的 感染 


BE 了 


做 了 实验 。 这 个 实验 表明 ， 高 温 杀 死 的 有 致 病 力 的 S 品 系 细 菌 , 虎 
有 改变 无 致 病 力 的 R 品系 ， 使 它 成 为 有 致 病 力 细 万 的 效应 。 这 种 
改变 遗传 性 状 的 现象 称 为 细菌 转化 。 这 个 实验 的 意义 在 于 它 为 确 
定 遗 传 物质 的 化 学 性 质 的 研究 开 凡 了 道路 。 

1944 年 ， 美 国 三 位 化 学 家 艾 弗 里 、 麦 克 劳 德 和 麦卡锡 为 了 乔 
清楚 这 种 引起 遗传 性 状 改变 的 转化 因子 的 化 学 本 质 ， 通 过 化 学 方 
-法 ， 把 这 种 提取 物 进 一 步 纯化 以 后 ， 一 样 一 样 分 离 ， 结 果 证 明 转 
-化 因子 不 是 蛋白 质 ， 也 不 是 各 种 有 机 物质 和 无 机 物质 而 是 脱氧 
核糖 核酸 (DNA)。 这 个 实验 的 重要 意义 在 于 第 一 次 有 效 地 证 明了 
DNA 是 遗传 物质 ,冲击 了 当时 所 流行 的 蛋白 质 是 遗传 物质 的 观 
点 。 这 个 实验 在 当时 并 没有 引起 大 们 的 足够 重视 ,因为 在 这 之 前 ， 
虽然 已 有 不 少 科 学 家 怀疑 DNA 在 遗传 过 程 中 可 能 具有 一 定 的 功 
-能 ， gaotp 

直到 1953 年 ， 沃 森 和 克 里 克 提出 : 汗 构 的 双 曝 让 
模型 ， 雄 辩 地 证 明了 基因 就 是 DNA 分 子 ， 基因 的 传递 和 表达 同 生 
物体 两 的 生化 代谢 过 程 密切 相关 ; 

按照 沃 森 、 克 里 况 半 述 的 DNA 分 子 结构 ，- 它 是 由 两 条 脱氧 
核糖 核 苷 酸 链 所 组 成 ， 这 两 条 链 呈 右 旋 ， 反 走向 ， 环 绕 同 一 个 轴 
盘 绕 ， 形 成 一 个 双 螺 旋 结 构 。 这 两 条 链 的 两 边 由 脱氧 核糖 和 磷酸 
间隔 地 连接 起 来 ， 每 一 级 的 阶梯 是 由 每 一 边 内 侧 的 碱 基 通 过 氧 键 
相连 。 每 个 阶梯 之 间 相 距 3.4A ， 每 10 个 阶梯 绕 轴 一 周 站 长 度 为 
3 碟 5 
DNA 分 子 的 更 种 碱 基 组 合 是 由 一 定 需 律 的 ,在 空间 士 四 种 碱 
基 配 对 ， 一 个 嗓 叭 世 与 一 个 只 啶 配 成 一 对 。 而 且 腺 嗓 上 (A) 总 是 
和 胸腺 喀 院 (T) 配 对 鸟 叮 叭 (G) 必 与 胞 喀 喧 (C) 配 对 5 国 而 两 条 
链 是 互补 的 ， 只 要 确定 一 条 链 的 碱 基 顺 序 ， 根 据 互 补 配对 原则 ? 
另 一 条 链 的 碱 基 项 序 也 就 确定 下 来 。 一 脖 

在 完善 DNA 分 子 结构 基础 上 上 ， 沃 森 和 克 里 克 进 一 步 深入 生 


究 ， 明 确 了 DNA 在 活体 内 的 复制 方式 .d957 年 由 克 里 克 最 早 提 出 
遗传 信息 在 细胞 内 前 生物 大 分 子 间 的 转移 的 基本 法 则 一 一 中 心 法 


， 78 


: 则 :好 而 在 1961 年 , 克 里 克 又 提出 了 三 联 遗 传 密码 。 这 样 ，DNA 
耸 子 不 仅 具有 独特 的 双 螺 旋 结构 ， 而 且 还 有 主要 的 生物 学 功能 ， 
;项 而 把 结构 与 功能 有 机 地 统一 一 起 来 。 

@ 复 制 

DNRA 分 子 能 精确 地 复制 自己 ， 通过 素 代 DNA 分 子 复制 子 代 
DNA 分 子 。 复 制 的 结果 形成 完全 与 原先 一 样 的 DNA 分 子 。 这 样 使 
得 DNA 所 贮藏 的 遗传 信息 准确 地 一 代 一 一 代 传递 下 去 。 

四 指导 蛋 自 质 合成 

研究 表明 ， 基 因 是 DNA 的 一 个 片断 ， 它 是 苯 传 信息 的 载 体 。 
在 子 代 发 育 中 ， 亲 代 DNA 分 子 中 的 遗传 信息 转录 为 RNA， RNA 
在 核糖 体 上 通过 翻译 ， 把 核酸 和 核 昔 酸 顺序 解读 为 蛋白 质 和 氨基 
酸 顺 序 ， 从 而 合成 蛋白 质 ， 使 得 亲 代 的 各 种 遗传 性 状 在 子 代 中 得 
到 表达 。 这 就 是 沃 森 和 克 里 克 用 来 表明 遗传 信息 流 向 的 “中 心 
和 


分 工 ， 谍 本 的 切 甬 在 于 关 冬 各 1 和 蛋 日 二 


加 遗传 密码 

训 讲 训 和 关 相关 大 本 省 作 t 市 才 检 这 汶 疆 吓 骨 在 共和 质 
成 中 ， 组 成 蛋白 质 中 氨基 琶 顺 序 和 每 个 氨基 酸 在 蛋白 质 分 子 中 的 
非 列 顺序 是 由 密码 子 所 决定 。 一 个 密码 子 是 由 相 仓 的、 连续 的 术 


省 酸 所 构成 。 这 种 由 三 个 连 
. 传 密码 。 由 于 DNA 或 RNA 都 分 别 含有 四 种 碱 基 ， 每 三 种 碱 基 组 
成 一 个 密码 子 ， 这 样 密码 子 共 有 4 = -64 种， 这 吝 足 够 由 它 决定 蛋 
白质 的 20 种 氨基 酸 。1966 年 ， 对 组 成 蛋白 质 的 20 种 氨基 酸 的 遗传 
密码 字 典 已 全 部 阐明 ,证 明了 遗传 密码 在 生物 界 里 是 普遍 适用 的 。 

“DNA 双 则 旋 模 型 的 建立 ,表明 生物 遗传 性 状 的 表现 是 通过 核 
酸 和 和 蛋 自 质 之 间 的 复杂 关系 而 实现 的 4 DNA 分 子 所 以 有 千 差 万 
别 ， 就 在 于 四 种 组 成 DNA 的 核 苷 酸 顺 序 有 千变万化 ; 蛋白 质 所 以 
有 千变万化 ， 就 在 于 组 成 蛋白 质 的 氨基 酸 排 列 有 千变万化 。 与 此 

和 79 


同时 ， 基 因 表 达 的 全 部 过 程 都 在 严格 的 调节 与 控制 之 下 ,这 就 使 
生物 系统 中 各 种 生命 活动 有 条 不 率 地 进行 。 同 时 ， DNA 双 螺旋 模 
型 的 建立 ， 标 志 着 遗传 学 由 经 典 遗 传 学 发 展 到 分 子 遗 传 学 的 新 阶 
段 ， 在 此 以 后 ， 人 们 对 基因 本 质 的 认识 取得 了 前 所 未 有 的 进展 。 


(四 ) 顺 反 子 是 一 个 基因 一 条 多 肽 


早期 的 遗传 学 理论 ， 把 基因 看 作 是 位 于 染色 体 上 的 念珠 状 晒 
粒 ， 它 们 之 间 由 非 遗 传 的 物质 连接 在 一 起 。 基 因 之 间 会 发 生 交换 。 
总 之 ， 把 基因 看 作 是 决定 遗传 性 状 差别 的 功能 单位 ;同时 也 是 重 
组 和 突变 的 三 位 一 体 的 最 小 单位 。 

到 了 二 十 年 代 ， 发 现 果 蝇 的 染色 体 断 裂 后 再 重新 组 合 ， 会 使 
生物 体 出 现 新 的 性 状 ， 染 色 体 断裂 位 置 不 同 造成 的 性 状 也 不 同 。 
根据 这 种 “位 置 效应 ?” 有 人 认为 决定 遗传 性 状 的 不 是 单个 基因 ， 
而 是 一 段 染 色 体 。 这 样 对 “三 位 一 体 ” 的 基因 概念 提出 了 挑战 。 
四 十 年 代 ， 又 发 现 “ 拟 等 位 基因 ?， 说 明基 因 是 可 分 的 ,不 是 决 
定性 状 的 最 小 单位 ; 五 十 年 代 ，DNA 双 螺旋 结构 的 建立 ， 对 基因 
的 结构 和 功能 的 本 质 了 解 达到 了 一 个 新 的 水 平 。 

1937 年 ， 本 泽 尔 以 T4 哈 苗 体 为 材料 ， 在 DNA 分 巴结 构 水 平 
上 ， 分 析 研 究 基 因 内 部 的 精细 结构 ， 提 出 了 顺 反 子 学 说 5 

分 子 短 传 孚 研究 霄 明 ， 特 定 噬 菌 体 可 感染 特定 的 寄主 细菌 
《寄主 细胞 )， 有 的 会 使 肌 解 ;能 产生 裂解 作用 的 物质 是 由 噬菌体 
DNA 分 子 上 一 定 区 域 的 核 苷 酸 序列 控制 的 。 如 果 这 有 段 区 域 的 核 戎 
区 序列 闫 全 实 赤 ,: 庆 可 能 影响 这 种 多 质 的 产生 ,即使 主 细 六 
染 了 这 种 噬菌体 ,也 不 会 裂解 。 

本 泽 尔 使 用 一 类 通称 为 rI 突 变型 的 T4 噬 蓝 体 为 材料 进 行 本 
究 。T4 鸣 菌 体 可 引起 大 肠 杆菌 迅速 裂解 ， 肥 解 大 肠 杆 菌 的 物质 ， 
是 在 T4DNA 的 TI 区 。 这 个 区 有 1000 多 个 突变 型 ， 它 们 裂解 大 肠 
杆菌 后 形成 的 哈 菌 班 的 大 小 、 形 态 各 不 相同 ， 裂 解 的 细菌 品系 和 
条 件 也 不 一 样 。 按 照 基因 是 突变 和 重组 的 基本 单位 的 概念 二 可 用 
杂交 方法 来 测量 这 些 突变 型 是 否 为 等 位 基因 。 实 验 结果 表明 ;YII 


9 80 9 


区 的 突变 型 可 分 别 归 入 rI 区 上 前 后 相连 的 A、B 两 个 亚 区 里 。 此 
两 亚 区 本 身 的 突变 似 保持 等 位 性 ， 彼 此 间 则 经 常 出 现 一 定 频率 的 
重组 后 代 。 这 样 II 区 好 象 包含 A、B 两 个 基 因 。 可 是 ， 如 果 重 
组 试验 的 规模 扩大 ， 却 发 现 两 个 亚 区 本 身 突 变 之 间 ， 也 有 重组 发 
生 ， 只 是 频率 较 低 。 因 此 ， 也 很 难说 A 或 B 是 一 个 基因 。 本 泽 尔 
根据 这 些 资料 ， 形 成 了 基因 结构 的 顺 反 子 学 说 ， 提 出 了 顺 反 子 、 
突变 子 和 重组 子 三 个 概念 。 

顺 反 子 是 功能 单位 。 一 个 顺 反 子 就 是 一 段 核 苷 酸 顺 序 ， 它 纺 
码 一 种 完全 的 多 肽 链 。 如 TH 区 的 信 、B 亚 区 是 两 个 顺 反 子 ， 两 个 
功能 单位 ， 分 别 产生 两 种 物质 。 细 胞 里 同时 出 现 这 两 种 物质 时 ， 
or 人 当 A 亚 区 里 有 两 个 地 方 发 生 突 变 (a、b), 如 果 


是 顺 式 (:22 ) 仍 能 引起 细 苗 裂解， 如 果 是 反 式 (一 上 - )A 亚 区 就 不 


十 十 / 


能 产生 其 物质 ， 因 而 不 能 裂解 细菌 。 这 说 明 a 和 b 虽 是 突变 的 单 
位 ， 本 身 却 不 是 一 个 基因 。 能 产生 一 定 物质 的 顺 反 子 相当 于 一 个 
基因 。 一 个 顺 反 子 可 以 包含 一 系 现 立 一 一 突变 子 。 突 变 子 
是 构成 基因 的 DNA 片 断 中 一 个 或 几 个 核 苷 酸 。 核 苷 酸 的 改变 ， 将 
使 密码 发 生 改 变 ; 生 物性 状 也 随 之 发 生 改 变 。 由 于 基因 里 各 个 突 
变 子 之 间 都 有 一 定 距 离 ， 所 以 彼此 间 能 发 生 重 组 ， 重 组 频率 随 相 
隔 距 离 而 改变 。 重 组 子 代 表 一 个 空间 单位 ， 它 有 起 点 和 终点 ， 它 
可 以 是 几 个 密码 子 的 重组 ， 也 可 以 是 一 个 核 苷 酸 的 互 换 。 根 据 本 
泽 尔 的 计算 ， 在 功能 DNA 中 的 最 小 交换 单位 约 为 1 一 3 对 核 苷 酸 ， 
这 同 理论 上 的 最 低 值 一 个 核 苷 酸 对 极为 相似 。 所 以 顺 反 子 中 的 最 
小 交换 单位 《重组 子 ) 和 最 小 的 突变 单位 〈 突 变 子 ) 都 应 是 DNA 
分 子 中 的 一 对 核 音 酸 。 只 有 在 这 种 情况 下 ,交换 子 才 等 于 突变 子 。 
顺 反 手 学 说 打破 了 “三 位 二 体 ” 的 基因 概念 ， 把 基因 具体 化 
为 DNA 分 子 上 的 一 段 顺序 。 它 负责 传递 遗传 信息 ， 是 决定 一 条 多 
排列 ， 可 以 独自 发 生 突变 或 重组 。 而 且 基 因 同 基因 之 间 还 有 相 
下 作用 ， 排 列 的 位 置 不 同 ， 会 产生 不 同 的 效应 。 在 分 子 遗 传 学 文 
9 8 。 


了 献 利 ， 顺 反 子 和 基因 这 两 个 术语 是 相互 通用 的 ， 二 般 说 来 忆 个 
顺 反 子 即 一 个 基因 ， 大 约 含 有 一 下 对 以 上 的 核 音 酸 ， 是 南 一 一 群 突 
变 单位 和 重组 单位 组 成 的 线性 总 和 。 


(五 九 操 纵 子 是 遗传 信息 传递 和 表达 的 统 过 
分 子 遗 传 学 的 深入 研究 ,使 得 人 们 对 细胞 核 内 部 的 结 攀 与 功 
能 有 了 更 充分 的 认识 “并 由 此 揭示 了 一 系列 普遍 现象 和 规律 ， 其 
中 最 为 重要 的 是 遗传 信息 的 转移 闪 律 及 基因 的 控制 与 表达 。 在 这 
些 规律 支配 下 ， 生 命 有 机 体 在 分 子 水 平 上 的 各 种 分 子 有 规律 、 有 
秩序 地 进行 着 工作 ， 表 现 出 各 种 生命 活动 的 和 谐 性 。 同 时 ,使 基 
因 概 念 又 进一步 获得 新 的 内 容 。 
1961 年 ， 法 国 遗 传 学 家 雅克 和 葛 诺 基本 上 阐明 了 原核 类 基因 
表达 的 调节 控制 机 制 一 一 大 肠 杆 菌 乳 贸 操 纵 子 模型 。 
基因 依 其 功能 可 分 为 调节 基因 、 操 纵 基因 和 结 术 基 办. 三 大 
类 。 通 过 这 些 基因 的 密切 协作 ， 细 胞 才能 表现 出 和 谐 的 功能 。 细 
胞 将 功能 是 由 细胞 中 各 种 蛋 自 质 来 表现 的 。 结 构 基 因 负 责 谷 成 这 
些 蛋白 质 ,而 调节 基因 和 操纵 基因 则 是 负责 控制 结构 基因 的 动向 ， 
操纵 各 种 蛋白 质 谷 成 的 质 和 量 。 
“在 乳糖 操纵 子 上 有 三 处 结构 基因 ， 分 别 携带 一 种 梅 的 遗传 信 
息 。 三 个 结构 基因 前 面 有 一 个 操纵 基因 ， 上 面 留 有 同 阻 光 牺 缚 合 
的 位 置 ， 当 隔 示 物 附 着 时 ， 结 构 基 因 失 去 活性 ;不 能 合成 三 种 酶 。 
在 操纵 基因 前 面 有 二 个 启动 基因 ， 当 操纵 基因 上 没 有 阻 遏 物 时 ， 
同 启动 基因 结合 的 RNA 聚 合 酶 向 操纵 基因 和 结 $ 构 基因 移动 ， 于 是 
合成 出 三 种 酶 。 启动 基因 以 外 还 有 一 个 调节 基因 ， 它 为 阻 蜗 物 编 
码 ”， 调节 结 梅 基因 的 活性 。 操 纵 基因 同一 个 或 几 个 结构 基因 联合 
起 来 :在 结构 上 与 灿 能 上 形成 一 个 协同 活动 的 整体 ， 称 称 为 一 个 操 
织 子 。 调节 基因 通过 产生 阻 遏 物 来 调节 人 
基因 的 功能 。 这 洋 ， 这 些 基因 形成 了 一 整套 调节 控制 机 构 。 正 因 
为 生命 省 机 体 中 有 着 一 沁 硬 宙 家、 记 作 内 二 且 二 本 
才 合 年 三 系统 在 功能 上 是 有 序 的 和 开放 的 。 这 二 点 也 是 奉命 系统 


人 82 3 


上 与 非 生 谷 系统 的 根本 性 区 别 。 

记 换 锥 子 模型 天 大 让 当 了 基因 概念 。 基 因 是 可 分 的 ; 不 仅 在 结 
午 十， 它 是 由 许多 可 以 单独 发 生 突变 ;重组 的 核 疹 酸 所 组 成 ; 而 
本 和 二 二 和 衣 E、 ， 
有 同 环境 因 ,调控 泪 传 信息 转化 为 具体 性 状 的 调节 基因 

并 不 决定 蛋白 质 而 在 功能 上 却 广 攻 不 可 霄 让 和 启动 
基因。 基因 不 仅 是 传递 遗传 信息 的 狂 立 单位 ， 而 是 各 不 基因 间 又 
形成 了 相互 制约 的 统一 整体 ， 每 一 基因 是 这 个 整体 中 的 二 个 组 成 
部 分 3 洞 时 ， 有 些 基因 可 以 有 某 种 产物 ， 有 些 基因 却 没有 产物 。 
由 下 可 见 天 和 对 基因 的 认识 又 达到 了 一 个 新 的 高 度 和 深度 。 


一 一 -一 一 


CA 基因 是 实现- 定 遗 传 效应 的 核 昔 酸 顺序 


也 近 十 多 年 来 ， 随 着 分 子 生 物 学 和 分 子 遗 传 学 的 实验 手段 愈加 
丰富 ， 诸如 发 展 了 DNA 纯 系 增 殖 技术 和 快速 准确 的 核 苷 酸 序列 分 
述 法 ， 以 及 分 子 杂 交 等 实验 技术 ， 使 人 们 对 基因 在 结构 和 功能 十 
的 认识 又 深 了 一 层 ， 发 现 了 “ Ra 

困 ”、“ 重 复 基 因 ? 及 “ 假 基 因 ” 等 新 现象 。 

并 E 

-下 1 一般 认 为 ， 基 因 除 非 发 生 突变 ， 破坏 其 隐 定 状态 否则 不 会 
改变 基因 的 功能 ， 也 不 会 随意 地 插入 其 它 染色 体 上 。1956 年 ， 麦 
吉林 托 克 在 研究 玉米 籽粒 的 色素 斑点 时 ， 首 先 提出 了 有 一 外 可 在 
染色 体 主 移动 的 “控制 因子 ?>， 一 个 控制 因子 整合 到 一 个 基 因 位 点 
三 关 可 产生 一 种 新 的 突变 型 。 如 果 把 控制 因子 准确 地 切除 下 来 ， 
车 因 亿 点 的 表 型 也 恢复 正常 ， 这 此 可 移 劲 的 PNA 片 斯， 则 做 跳 昧 
基 网 

-七 十 年 代 初 , 在 研究 天 肠 杆 菌 弛 精 操 级 子 和 半 弛 糖 操纵 子 时 ， 

发 现 由 于 操纵 子 里 播 入 了 一 段 DNA 顺 序 ， 出 现 了 一 组 不 常见 的 突 
变种 ， 这 一 播 六 因子 :(S) 就 是 一 类 跳跃 基因 。 现 在 已 弄 清 楚 至 
少 有 五 种 DNA 捅 入 因子 ， 即 II 、IS，、1sSs、IS, 和 1IS5 这 些 揪 
六 因子 都 很 得 ， 二 般 只 有 700 一 1400 个 核 苷 酸 对 ,二 即 胡 当 于 1 一 2 


人 


En 


个 基因 。IS 插 入 因子 不 仅 破坏 了 它 插入 位 置 上 的 基因 功能 吉 而 且 
也 使 处 在 IS 转 录 方 向 “下 游 ” 的 其 它 基 因 的 活性 降低 。 它 们 可 到 
处 移动 ， 几 乎 能 插入 大 肠 杆菌 染色 体 组 的 任何 位 置 。 捅 入 的 方向 
不 同 ， 产 生 不 同 的 效应 。 它 可 作为 基因 活性 的 一 个 简单 “开关 。 
Is 引起 的 突变 可 以 自发 回 变 ， "频率 为 10- 7"， 这 可 能 是 IS 被 切 下 的 
结果 。 同 时 由 于 切割 不 精确 ， 会 在 插入 位 置 附近 造成 缺失 。 不 同 
的 缺失 有 其 特定 频率 。 例 如 IS1 引 起 的 缺失 ,都 是 从 IISi 一 端 开始 : 
扩展 到 染色 体 其 它 领域 。 

转 座 子 也 是 一 种 跳跃 基因 。 它 是 由 几 个 基因 组 成 的 一 段 DNA， 
两 端 各 有 一 段 相同 的 核 音 酸 顺 序 ， 顺 序 的 排列 或 是 按 同 一 方向 ， 
或 取 相 反方 向 。 转 座 子 可 从 一 个 位 置 转 座 到 另 一 个 位 置 。 在 高 等 
生物 中 也 有 跳 妈 基 因 。 

了 TI 
上 是 -不 单独 的 遗传 单位 ， 它 可 以 通过 自 雪 活 
性 。 丽 陛 说 ， 基 因 是 可 动 的 。 
人 2. 断裂 基因 

本 
连续 不 断 地 排列 在 一 起 ， 形 成 一 条 没有 间隔 的 完整 的 基因 实体 。 
也 就 是 说 ， 基 因 表 达 从 DNA 的 起 始 信号 开始 ， 沿 着 PNA 分 子 转 
录 ， 直至 转录 成 mRNA 直接 翻译 成 蛋白 质 分 子 。 编 码 构成 生物 体 


的 蛋白 质 和 花 蛋 电 的 结构 基因 是 一 段 独立 的 而 其 内 部 又 是 连续 的 
DNA 片 有 侦 。mRNA 同 由 它 同村 冰 成 的 棋 DNACCDNA)- 杂交 实 


六 归 度 mRNA 的 由 风 。 

1978 年 ， 吉 和 尔 伯 畴 认为 基因 是 一 个 嵌 合 体 , 它 包含 两 个 区 段 ， 

一 是 在 mRNA 中 丢失 的 片 外 称 内 含 子 ， 一 是 将 表达 的 片段 称 外 显 

子 ， 表 达 顺 序 分 别处 在 内 合子 之 间 。 泉 本 发 现 鸡 的 卵 清 蛋白 基因 

DNA 片 段 被 分 成 15 个 小 片 有 侦 ， 其 中 8 个 〈(L，1，2，23， 生 5，6y 

7) 能 转录 转译 ， 称 之 为 外 显 子 ; 7 个 (A、B、C、DN ES EPE、 9) 
a。 84 ， 


Ci 
达 的 内 含 子 一 一 隔 开 ， 故 有 断 裂 基因 克 称 。 

示爱 幻 的 断 要 基因 的 表达 程序 是 ， 外 显 子 和 内 含 子 在 细胞 核 
内 一 并 转录 成 前 体 mRNA， 然 后 加 帽 接 尾 后， 切除 用 不 着 的 间隔 

DNA 的 装 录 物 ， 所 有 的 外 显 子 转录 物 按照 顺序 连接 成 成 熟 的 

人 

现 已 陆续 报导 真 核 细 胞 转录 mRNA 的 结构 基因 ， 确 实 有 
mRNA 中 未 包含 的 “间隔 区 ”顺序 。 例 如 果 剖 的 TDNA 中 ，28Sr 
DNA 和 18SrDNA 是 反复 出 现 的 ， 除 了 在 28S 和 18S 基 因 之 间 有 间 
隔 区 外 ，28S 基 因 本 身 也 分 成 两 部 分 ， 中 间 插 入 了 功能 不 明 的 
5400 个 核 寿 酸 。 结 构 基因 中 插 有 间隔 顺序 是 普 刘 的 ， 它 的 功能 还 
不 清楚 。 


基因 的 不 连续 现象 的 发 现 ， 说 明 功 能 上 相关 的 各 个 ， 


一 证 紧密 连锁 成 操纵 子 形式 ， 它 们 不 但 可 分 散在 不 同 染色 仁 
一 染色 体 的 不 同位 置 上 ， 而 且 同 一 基因 还 可 分 成 几 个 部 分 ， 

3. 重 登基 因 

研究 者 在 一 些 噬 菌 体 和 动物 病毒 中 发 现 ， 不 同 基因 的 核 替 酸 
序列 有 时 是 可 以 共同 的 ， 即 它们 的 核 苷 酸 序列 彼此 重 玲 ， 这 样 的 
基因 称 为 重 仅 基 因 。 

1977 年 ， 条 稿 等 天 埋 击 证 和 175 驯 曾 体 5R 人 的 杭 普 琶 序 区 上 
发 现 ， 同 一 部 分 的 DNA 能 编 色 两 种 不 同 的 蛋白 质 。 发 现 基 因 重 等 
有 两 种 情况 。 一 是 一 个 基因 的 密码 子 完 全 包含 在 另 一 个 基因 里 ， 
如 了 基因 在 A 基 因 里 ，E 基 因 在 D 基 因 里 ， 但 它们 的 密码 子 的 码 组 
不 同 。 另 一 种 情况 是 两 个 基因 只 有 一 个 核 背 酸 重 闪 。 如 D 基 因 的 


终止 密码 子 的 第 三 个 核 苷 酸 ， 是 J 了 基因 起 译 密码 子 的 第 一 个 核 音 


酸 。 在 G4 病 毒 的 单 链 环 状 DNA 中 ， 还 发 现 一 段 DNA 参 与 三 个 基 
因 的 组 成 ， 出 现 三 层 重 迭 基因 。G4 史 菌 体 的 单 链 环 状 DNA 共 有 十 
个 基因 。 其 中 编码 K 蛋白 的 KK 基因 的 核 苷 酸 序列 有 两 个 位 置 重合 
着 三 个 基因 。 头 一 个 位 置 是 同 A 基 因 和 了 B 基 因 的 序列 重 琵 ， 重 县 
部 分 的 五 个 核 背 酸 是 TGATG， 它 们 分 别 为 三 个 基因 (K、A、B) 


8 895 9 


的 编码 。 另 一 个 重生 位 置 是 同 编码 蛋 自 质 A 和 的 基因 重 如 重 
和 登 部 分 是 四 个 核 苷 酸 ATGA。 

重 私 基因 现象 在 病毒 中 已 确信 无 疑 ， 近 来 在 细菌 和 果 蝇 中 ， 
也 已 发 现 有 基因 重 到 的 现象 。 基因 重生 现象 的 发 更， 修正 了 传统 
地 认为 各 个 基因 的 核 苷 立 的 观念 。 进 一 步 推 起 ， 如 
果 重 琶 基 因 是 生物 界 的 普遍 现象 ， 生 物体 是 这 样 合理 而 又 经 济 地 
利用 自己 的 DNA， 那 末 , 迄 今 为 止 对 基因 功能 和 结构 上 所 作出 的 
结论 ， 将 要 重新 给 予 估价 。 

忌 4. 重 复 基 因 

高 等 生物 中 ,给 核糖 体 组 成 成 分 18SrYRNA 和 28SrRNA 编 码 的 
基因 ， 位 于 核 仁 组 织 表 区 内 。 峙 的 每 一 个 核 仁 组 织 表 区 里 ， 这 两 
种 基因 各 有 450 个 。5SrRNA 基 因 ， 共 有 24000 份 拷贝 ， 分 布 于 整 
个 染色 体 组 里 ，18SrRNA 基 因 和 28SrRNA 基 因 ， 果 蝇 中 有 100 份 
拷贝 ， 烟 草 中 有 750 份 拷贝 。 

5.. 假 基因 

研究 者 对 哺乳 动物 珠 蛋 白 基因 从 的 核 昔 酸 序列 分 析 发 现 ， 除 
正常 功能 基因 之 外 ， 还 有 一 些 基因 的 核 昔 酸 序列 同 相 应 的 正常 基 
因 相 比 约 有 75 一 80% 部 分 是 同 源 的 ， 但 由 于 许多 突变 而 阻碍 了 目 
身 的 表达 ， 这 一 类 功能 失 活 的 基因 称 为 假 基 因 。 

1977 年 ， 杰 奎 等 人 对 非洲 丰 巧 5S 基 因 系统 研究 中 ， 首先 提出 
假 基因 的 概念 。 已 经 分 析 过 的 假 基因 ， 如 免 8 假 基因 〈B2) 、Lo 假 
基因 (xl1)、 小 鼠 f 假 基因 及 小 鼠 c 假 因 等 ， 由 于 在 这 些 假 基因 中 
存在 着 小 的 核 苷 酸 缺 失 或 插入 ， 结 果 导 致 翻译 结构 的 改变 〈 即 移 ， 
码 突变 )， 使 它们 没有 一 个 能 编码 具有 功能 的 珠 蛋白 多 肽 链 。 另 一 
种 情况 ， 如 在 免 则 2、 小 鼠 BH 和 al 等 假 基因 中 ， 都 有 一 个 或 郊 
个 间隔 子 一 表达 子 的 接点 是 异常 的 。 因 此 ， 即 使 这 些 假 基因 都 被 
转录 ， 也 不 可 能 产生 正常 的 mRNA。 在 哺乳 动物 珠 蛋 白 基 因 中 
其 胚胎 基因 和 成 体 基 因 之 间 都 有 一 个 假 基 因 ， 究 竟 这 个 假 基 因 对 
豚 胎 和 成 体 发 育 有 何 功能 正 待 进一步 的 研究 。 

从 备 德 尔 提出 遗传 因子 假设 以 来 ， 一 百 余年 时 间 里 ， 大 们 对 


e_ 86 e 


人 
分 子 遗 传 学 的 一 个 


本 和 瑟 和 
遗传 因子 ， 它 不 是 固定 不 变 在 染色 体 上 的 静止 结构 ， 基 因 本 身 在 
结构 和 功能 上 也 存在 着 差异 。 随 着 遗传 学 研究 的 深入 ， 基 因 的 概 
念 也 必定 典 有 新 的 内 容 ， 人 们 也 将 更 准确 、 全 面 地 揭示 生物 遗传 
和 变异 的 规律 。 


( 赵 功 民 ) 


第 二 节 ”基因 的 表达 与 调控 


(一 ) 原 核 生物 基因 的 表达 与 调控 

原核 生物 与 真 核 生 物 的 差别 也 表现 在 尖 控 方面 。 
就 细 肖 来 说 部 因 表达 的 调控 主要 使 这 些 单 细胞 得 以 适应 环境 的 
过 汉 疡 从 作 扩 
原生 动物 的 有 些 基因 也 可 对 环 绝 化 庆生 直接 度 和 。 但 在 


真 核 生 物 中 ， 基 因 调 控 最 富 特 人 和 北林 则 是 旺 有 
发 育 和 组 织 分 化 上 遗传 程序 的 调节 。 


原核 生物 的 转录 和 转译 表现 出 明显 的 偶 联 性 与 共 线 性 
(图 2-1)。 在 mRNA 尚未 完成 它 的 转录 之 前 就 开始 了 蛋白 质 合成 ， 
核 蛋 白 体 及 其 它 蛋 白质 合成 机 构 的 成 分 在 mRNA 形成 期 间 就 附着 
其 上 。 大 家 知道 ，DNA 转 录 成 RNA 是 以 5 一 >3/ 方 向 进行 , 核 蛋 
白 体 mRNA 转 译 也 遵循 同样 的 方向 。 因 此 ， 细 菌 细胞 中 ，IRNA 


ie 887 


一 ce 吁 


分 子 在 转译 前 不 发 生化 学 修饰 。 转 录 与 转译 个 联 在 一起 ;在原 
“生物 某 些 类 型 的 基因 调节 中 ， 转 录 机 构 与 转译 机 构 的 相互 作用 是 
“很 重要 的 。 


图 2-1 原核 细胞 和 真 核 细胞 具有 功能 的 mRNA 的 形成 差别 很 
大 。 原 核 生 物 中 ， 有 人 NA 转 录 物 直接 作为 mRNA 被 使 用 ， 转 译 在 转 
录 未 完成 前 就 已 开始 ， 即 两 种 过 程 是 耦 联 的 。 真 核 细胞 的 初始 转 录 
物 必须 在 细胞 入 内 经 过 修饰 才 成 为 DRNA。 畦 详 受 在 全 风 后 
并 运转 到 细胞 质 中 才 开始 


一 旦 mRNA 上 形成 了 第 一 个 核 蛋 白 体 结 合 位 点 ， 核 蛋白 体 即 
附着 在 正在 转录 的 mRNA 分 子 上 并 开始 了 转译 过 程 。 原 核 基因 表 
达 调 控 的 临界 点 即 为 转录 的 起 始 。 但 是 ， 一 个 基因 指 编 码 序列 沿 
未 被 完全 转录 之 前 ， 也 会 发 生 转 录 受 控制 的 终 业 ; 有 时 ， 蓝 录 可 
终止 在 两 个 基因 之 间 。 因 此 ， 转 录 终 止 与 转录 起 始 同样 重要 。 这 
种 受 控制 的 终止 反应 使 细菌 避免 产生 不 必要 的 mRNA。 

细胞 内 特定 mRNA 的 浓度 不 仅 取决 于 它 的 合成 速率 ， 也 取决 
于 它 的 降解 速率 ， 也 即 mRNA 的 代谢 稳定 性 。 一 般 说 来 ， 细 菌 的 
mRNA 的 寿命 比 细胞 增 代 的 时 间 短 。 随 着 特定 mRNA 形成 的 停止， 
特定 蛋白 质 的 合成 也 停止 了 。 细菌 中 人 有 一些 nRN 二 的 汪汪 术 本 
即使 这 样 ， 也 具有 增 代 时 间 的 一 半 。 

纤 上 所 述 ; 构成 原核 生物 基因 调控 的 控制 要 素 有 三 个 ， 即 转 
录 起 始 ， 转 录 终 止 和 mRNA 的 迅速 更 新 。 

1 .原核 生物 转录 起 始 的 调节 


9 8B8 


下 


(1) 原核 生物 转录 的 起 始 需要 RNA 聚 合 酶 对 序列 的 识别 


细菌 中 PNA 的 一 切 转录 都 由 单一 种 RNA 聚 合 酶 来 催化 .这 个 
酶 的 全 酶 含有 5 条 肽 钴 ， 两 条 % 链 (分 子 量 367512) ;一 条 B 链 (分 子 
量 150,619); 一 条 8“ 链 (分 子 量 155,162); 及 一 条 5 链 (分 子 量 70， 
236)。8 链 和 8“ 链 各 含有 一 个 催化 活性 所 必需 的 锌 离子 。 酶 反应 需 
要 所 有 四 种 核 背 三 磷酸 和 一 种 二 价 金 属 离子 (体内 需要 Mg2+， 离 
体 条 件 下 需要 Mg” 或 Mn?*)。 分 离 纯化 后 的 酶 制剂 是 一 种 全 酶 和 
仿 心 酶 的 混合 物 。 所 谓 核心 酶 ， 即 c 链 (一 般 称 为 c 因 子 ) 已 于 失 。 
仿 心 酶 是 酶 的 催化 成 分 ， 它 一 般 具 有 结合 DNA 的 能 力 , 如 果 DNA 
有 缺口 , 它 可 以 从 缺口 开始 合成 RNA, 但 不 能 催化 专 一 性 的 起 始 。 
5 因子 加 成 到 核心 酶 后 ， 则 重建 成 具有 全 部 活性 的 全 酶 ,从 而 降低 
工 气 非 专 一 性 DNA 序 列 的 亲和力 ,大 大 增加 与 特异 的 识别 序列 的 
内 和 力 。 换 句 话 说，RNA 聚 合 酶 能 眼 双 链 DNA 的 任何 区 域 结合 。 
大 忆 杆 菌 染 色 体 上 具有 约 4x 10* 个 非 专 一 性 结合 位 点 , RNA 聚 合 
酶 二 这 些 位 点 结合 的 结合 常数 是 2 x 10:1M-:; 这 种 结合 仍然 使 


| 这 S 卫 二 国生 全 
到 启动 区 六 


党 到 合 琵 解 开 DNA， 
训 全。 转录 开 奴 


图 2-2 大 肠 杆 菌 的 RNA 聚 合 酶 通过 与 DNA 松散 地 结合 而 沿 
下 最 后 定位 在 户 动 区 ， 并 牢固 结合 之 ，RNA 于 是 开 
合成 。 


9 89 。 


DNA 保 持 双 链 封 闭 状 态 。 松 散 地 结合 -一 偶而 脱 开 一 再 一 次 结 
合 ，RNA 聚 合 酶 如 此 反复 地 在 DNA 上 进行 搜索 (图 2-2)。 借 助 于 
辅 多 肽 即 c 因 子 ，RNA 到 合 酶 识别 出 专 一 性 的 DNA 序 列 ， 并 与 这 
些 序列 紧密 结合 ， 结 合 常数 可 增加 至 101? 至 10!4M-1，3 引 起 双 链 
DNA 解 链 ， 使 之 处 于 开放 状态 ， 由 此 开始 合成 mRN 玉 。 这 种 专 一 
性 DNA 序 列 就 是 启动 区 *。 

大 肠 杆菌 的 RNA 聚 合 酶 可 以 保护 启动 区 免 受 核酸 酶 的 破坏 。 
其 所 保护 的 片段 长 度 因 核酸 酶 和 水 解 条 件 不 同 而 有 所 差别 ， 但 显 
然 该 酶 是 非 对 称 地 结合 在 转录 起 始 位 点 的 二 侧 ， 即 覆盖 基因 的 5” 
侧 贾 的 约 50 个 核 苷 酸 及 延伸 至 基因 内 20 个 核 苷 酸 的 部 分 。 在 此 保 
护 区 的 5“ 端 一 侧 中 ， 围 绕 在 第 - 10 和 第 - 35 核 昔 酸 处 ， 有 两 个 片 
段 是 高 度 保守 的 序列 ， 即 鞠 全 酶 结合 的 启动 区 。`- 10 区 的 序列 一 
般 称 为 Pfibnow 框 (Pribncw box)。 并非 所 有 启动 区 的 Eribnow 
框 都 具有 完全 相同 的 序列 ， 但 都 有 相似 于 TATAAT 的 序列 ， 而 且 
所 有 细菌 启 动 区 的 Pribnow 框 交 最 后 一 个 残 基尼 为 胸腺 喀 院 核 昔 
酸 ， 其 余 的 核 昔 酸 有 60% 以 上 对 应 一 致 。 这 样 一 种 近似 的 序列 称 
为 契合 序列 (consensus sequence) 。- 35 区 的 契合 序列 是 IIGACA。 
任何 启动 子 都 只 是 这 种 契合 序列 的 固定 少数 玫 个 核 苷 发 生变 化 。 

(2) 契合 序列 对 转录 起 着 重要 的 作用 

启动 区 发 生 突变 ， 既 有 可 能 提高 ， 又 有 可 能 降低 启动 区 的 转 
录 作 用 ,因而 有 所 谓 升 , 降 突变 株 之 分 。 经 对 98 种 大 肠 杆菌 突变 株 
的 分 析 表 明 ， 一 般 的 规律 是 降 突变 株 的 契合 序列 相似 程度 减少 ， 
升 突变 株 则 增加 。 

RNA 聚 合 酶 与 启动 区 的 结合 位 点 可 以 通过 皇 迹 满 (Footpria- 
ting) 来 研究 。 将 纯化 的 含有 启动 区 的 DNA 片 段 与 RNA 聚 合 酶 混 
合 ， 使 RNA 聚 合 酶 结合 到 DNA 的 某 些 碱 基 上 ， 然后 进行 如 序列 
分 析 中 的 化 学 修饰 ， 久 破坏 那些 不 受 该 酶 保护 的 部 位 。 结 果 经 凝 
* 启 动 区 一 词 出 自 英文 promotor 或 Promoter， 以 前 一 般 译 为 启动 子 ; 译 有 无 可 非 


议 ， 但 为 了 使 “ 子 ” 称 让 给 较 复 杂 的 结构 如 操纵 子 等 ， 用 启动 区 称谓 可 更 好 区 别 它 的 
结构 与 功能 的 层次 。 有 的 人 译作 启动 基因 ， 则 似 欠 妥 ， 苦 因 不 说 也 可 自明 。 


ea 900 。 


胶 电 泳 后 ， 在 序列 “阶梯 ”上 ， 受 聚合 酶 扼 蔽 的 碱 基 就 会 留 下 某 
些 室 隙 (图 223)。 由 于 这 种 方法 ， 可 以 检测 到 蛋白 质 在 DNA 链 上 
的 “落脚 ”点 , 故 得 名 “足迹 法 ”。 实 验 结果 表明 ， 结 合 位 点 大 多 数 
是 在 非 编 码 链 上 ， 人 集中 在 -35 和 ~- 10 的 契合 序列 中 。 在 -16 区 域 
也 有 结合 点 。 但 是 结合 点 并 非 总 是 那些 高 度 保守 的 碱 基 。 因 此 ， 
DNA 的 空间 结构 及 氨 键 型 式 对 于 序列 识别 也 是 很 重要 的 。 而 且 改 
变 户 动 区 活性 《增加 或 减少 ) 的 DNA, 其 受 聚 合 酶 保护 的 位 点 也 


有 变化 。 这 些 结果 均 说 明 ， 启动 区 与 聚合 酶 之 间 的 专 一 性 结合 对 


~!L00bp 


G 尼 
Opera 二 2 这 3 
-80 ~30 
无 RNA 到 该 作 、 加 RNA 聚 合 酶 
G G G_ 到 


-80 ) 一 80 


在 G 处 作 化 学 化 学 断裂 RNA 聚 合 酶 
凝 胶 电 泳 


在 -80 处 断裂 形成 的 带 
在 -30 处 断裂 形成 的 带 


图 2-3 是 迹 法 图 解 。 显 示 如 何 测定 DNA 与 蛋白 质 的 相互 作用 
位 点 。 纯 化 的 DNA 片 段 经 在 一 条 链 的 5“ 端 标记 后 ， 再 使 之 与 基 种 
蛋 曰 质 ( 如 RNA 聚 合 酶 ) 相 互 作 用 。 由 于 蛋白 质 结合 的 部 位 在 某 种 
人 

扩 。 


于 一 个 具有 活性 的 复合 物 的 形式 是 很 重要 的 。 


RNA 涌 合 酶 与 DNA 的 接触 看 来 是 非 对 称 的 。 也 就 是 说 , 如 果 
把 双 螺 旋 作 为 一 个 圆柱 体 而 俯视 之 ， 则 接触 位 点 一 般 落 在 其 中 的 
一 个 180 断面 上 。RNA 聚 合 酶 结合 时 ， 螺 旋 扭 转 ， 从 Pribnow 杠 
中 心 打开 2 一 3 个 碱 基 对 直至 转录 起 点 (图 2-2)。 

43) 操纵 子 的 一 组 基因 维持 着 结构 与 调控 的 协调 


人 
1 名 


细菌 在 利用 各 种 物质 以 适应 其 新 陈 代谢 的 需要 时 ， 具 有 很 大 
的 伸缩 性 ， 而 这 种 伸缩 性 又 往往 与 它们 的 “不 需要 则 不 生产 ”的 
节俭 原则 互 为 一 体 ， 以 适应 环境 的 变化 和 调控 其 基因 表达 。 细 菌 、 
的 这 种 适应 能 力 是 通过 将 某 些 在 功能 上 有 关 的 蛋白 的 基因 ， 诸 如 
某 一 代谢 途径 中 有 关 酶 系 的 基因 连锁 成 从 ， 进 行 协调 的 表达 。 这 
就 是 所 谓 操纵 子 (operon) (图 2-4) 。 操 纵 子 一 般 是 在 单一 个 启动 区 
的 控制 之 下 (但 并 非 绝对 如 此 )， 由 此 去 转录 操纵 子 中 的 各 个 基因 
成 为 单一 这 失 维 于 的 名 企 业内 邦 休 更 玫 证 富村 作 鸭 本 


所 动 区 基 因 A 基因 B 基因 C 
TI 
DNA 


7 人 训 RS UGA AUG WA 


网 2-4 杀菌 的 操纵 子 转录 形成 单一 的 多 顺 序 mRNA 分 子 。 

该 mRNA 的 每 一 段 都 有 其 自己 的 核糖 核 蛋 白 体 结 合 位 点 、 起 始 密 

码 (AUG) 和 终止 密码 (如 UGA).30S 和 50S 亚 基 附 着 在 mRNA 的 各 

起 始 位 点 ， 即 转译 出 该 分 子 所 编码 的 各 个 肽 链 。 
mRNA 的 各 个 部 份 则 独立 转译 。 因 为 一 般 这 种 mRNA 编码 不 下 一 
条 多 肽 链 ， 因 而 称 为 多 顺 反 子 mRNA (polycistronic mRNA) (图 
9 冲 风 

在 一 个 特定 的 操纵 子 中 ， 所 有 基因 都 同等 地 被 转录 ， 换 句 话 
说 ， 它 们 或 者 惨 转录 ， 或 者 皆 不 转录 。 为 了 行使 某 一 代谢 功能 ， 
往往 需要 若干 种 酶 ， 这 些 酶 通常 被 编码 在 同一 个 操纵 子 内 。 当 其 
中 有 一 个 酶 生成 ， 操 纵 子 中 的 其 它 酶 也 都 一 起 合成 了 。 人 得 是 地 如 
上 所 述 ， 由 于 多 顺 反 子 mRNA 中 的 各 编码 部 份 是 独立 转译 的 〈 也 


二 


FT 


就 是 说 有 多 个 转译 起 点 和 终点 )， 因 此 ,mRNA 的 某 些 部 份 可 能 转 
译 得 快 些 ， 另 一 些 部 份 可 能 慢 些 。 转 译 速度 很 大 程度 上 受 mRNA 


的 起 始 位 点 附近 的 序列 的 二 级 结构 〈 如 发 卡 结构 ) 所 控制 。 


在 细菌 的 生命 周期 中 ,并 非 折 有 洪 在 的 启动 区 都 在 时 刻 使 用 。 
选择 哪 一 个 启动 区 (并 因此 而 哪 一 个 操纵 子 ) 主 要 由 细菌 生长 环境 
的 营养 成 份 所 决定 。 例 如 ， 某 些 糖 类 转换 成 葡萄 糖 〈( 易 于 代谢 的 
碳 源 ) 时 ， 需 要 特定 的 一 组 酶 。 将 半 乳 糖 转换 成 葡萄 糖 需要 的 是 
一 组 酶 ! 乳糖 转换 成 葡萄 糖 时 则 是 另外 一 组 酶 ;而 转换 阿拉 们 糖 
的 是 第 三 组 酶 。 编 码 不 同 种 酶 的 基因 丛 集 在 不 同 的 操纵 子 内 ， 它 
们 分 别 是 乳糖 操纵 子 (ac operon)， 半 乳 糖 操纵 子 〈8gQl operon) 
和 阿拉 伯 糖 操纵 子 (ara operon) 。 细 菌 从 环境 中 摄取 某 种 糖 进行 新 
陈 代谢 时 ， 只 使 用 相应 的 启动 区 ， 生 产 相应 的 酶 。 酶 的 合成 是 由 
它们 的 底 物 〈 此 处 为 糖 ) 来 诱发 的 ， 这 种 特定 的 应 答 称 为 酶 诱导 
(enzyme induction)。 

营养 缺乏 也 能 诱导 酶 的 合成 。 许 多 细菌 均 能 合成 生长 所 必需 
的 氨基 酸 。 但 只 在 它们 需要 某 种 氨基 酸 时 ， 生 成 该 氨基酸 所 需 的 
酶 才 会 出 现 。 例 如 假定 需要 细菌 合成 色 氨 酸 ， 则 将 它们 培养 在 不 
含 色 氮 酸 的 培养 基 中 ， 这 时 细菌 以 最 高 速度 合成 色 氮 酸 生 产 所 必 
需 的 五 种 酶 ， 以 致 这 些 酶 达到 最 大 浓度 。 另 一 方面 ， 如 果 培 养 基 
中 含有 足够 量 的 色 氛 酸 ， 则 细胞 从 培养 基 中 摄取 其 所 需 的 量 ， 而 
不 去 制造 为 催化 合成 这 种 氨基 酸 所 需 的 酶 ， 原 有 的 酶 则 在 生长 过 
程 中 务 释 。 这 时 色 氨 酸 的 生成 处 于 受 抑制 状态 。 这 种 新 的 酶 分 子 
合成 受 代谢 物 抑 制 与 反馈 抑制 是 两 回 事 ， 反 馈 抑制 是 代谢 途径 药 
终 产物 抑制 原 有 酶 分 子 的 作用 。 

《4 调节 蛋白 控制 RNA 聚 合 酶 与 细菌 PNA 中 启动 区 

细菌 内 的 蛋 白 质 及 编码 这 些 蛋白 质 的 基因 可 以 分 为 两 大 类 。 
绝 大 多 数 蛋白 质 都 不 参 予 转录 的 调节 , 这 类 蛋白 质 包括 各 种 酶 系 、 
膜 蛋 白 及 核 蛋 白 体 组 分 。 编 码 这 类 蛋白 的 基因 称 为 结构 基因 。 有 
些 结构 基因 的 RNA 合 成 速率 是 受 调节 和 控制 的 。 但 有 许多 结构 基 
因 连 续 不 断 地 ， 或 多 或 少 地 以 某 些 速率 转 录 。 这 种 非 调节 的 基因 


和 9 _。e 


表现 出 一 种 定制 型 (constitutive) 功 能 。 

另 一 类 重要 蛋白 质 是 调节 蛋白 。 它 们 的 作用 是 帮助 细胞 去 感 
党 环境 ， 并 通过 与 DNA 的 结合 来 调节 结构 基因 的 圭 录 速率 , 编码 
调节 蛋白 的 基因 称 为 调节 基因 (Tegulatory gene)。 

调节 蛋白 有 两 种 类 型 ,根据 它们 是 提高 RNA 聚合 酶 与 启动 区 
结合 的 效率 还 是 根本 上 阻碍 这 两 者 之 间 的 结合 来 区 分 ， 前 者 称 为 
活化 物 或 活化 蛋白 ， 后 者 称 为 阻 遏 物 或 阻 过 和 蛋白， 在 启动 区 旁 或 
附近 ， 往 往 分 别 存在 着 与 阻 过 蛋白 或 活化 蛋白 结合 的 位 点 。 阻 遇 
物 的 结合 位 点 就 是 操纵 序列 或 称 操 纵 区 (operator)*。 操纵 序列 总 
是 靠近 启动 区 序列 并 且 往 往 互 相 重 琶 (两 者 共用 一 些 同样 的 核 首 
酸 )。 2 

有 些小 分 子 可 以 与 阻 歇 蛋白 结合 起 来 ， 从 而 影响 阻 遏 物 与 操 
纵 序列 的 结合 亲和力 。 这 种 小 分 子 称 为 效应 物 (effector)s 有 两 种 
效果 绝 然 不 同 的 效应 物 。 一 种 是 诱导 物 (inducerj5 另 一 种 是 协 阻 
歇 物 (corepressor)。 诱 导 物 与 阻 过 蛋白 结合 ， 则 降低 阻 遏 蛋白 与 
_DNA 结 合 的 亲和力 ,从 而 使 阻 遏 蛋白 改变 其 形状 ， 从 DNA 链 上 
脱离 下 来 ， 让 位 于 RNA 聚 合 酶 ， 使 转录 得 以 进行 。 例 如 ， 弛 糖 操 
纵 子 中 的 阻 过 蛋白 ， 如 果 环 境 中 没有 乳糖 ， 或 者 体内 没有 代谢 产 
物 ， 就 一 直 与 乳糖 操纵 子 上 的 操纵 区 结合 着 ;直到 有 了 屯 糖 或 其 
代谢 产物 (作为 诱导 物 ) 与 阻 过 蛋白 结合 ， 从 而 使 隆 允 蛋白 构 每 发 
生变 化 ， 降 低 它 与 操纵 区 的 亲和力 ， 从 操纵 区 上 脱离 下 来 ， 使 乳 
糖 代谢 所 需 酶 的 基因 得 以 转录 。 协 阻 遏 物 的 在 它 可 与 那 
些 缺 乏 协 阻 过 物 则 不 具 功能 的 阻 台 蛋 下 结合， 从 而 提高 阻 遏 牺 与 
_ 操 织 区 的 亲和力 。 例 如 ， 色 氨 醒 可 区 承 名 气 酸 操纵 子 的 阻 过 蛋白 
结合 。 该 阻 巡 蛋白 只 有 眼色 氮 酸 结合 以 后 才 可 以 与 操纵 区 紧 紧 地 
绪 合 ， 抑 制 生成 色 氨 酸 所 需 酶 系 的 基因 的 转录 。 因 此 ，' 色 氨 酸 即 
起 着 协 阻 过 物 的 作用 ， 终 止 生成 色 氨 酸 所 需 酶 的 合成 (图 25)4 

活化 蛋白 是 二 类 与 阻 过 蛋白 作用 相反 的 调节 蛋 自 。 它们 在 
DNA 上 的 结合 位 点 称 为 活化 蛋 自 位 点 (图 2-6)。 有 些 活化 蛋白 也 

“ 操 纪 序 列 或 操纵 区 严格 地 说 并 非 基 因 ， 因 此 称 之 为 操纵 基因 似 欠 有 对。 


94 。 


有 其 相应 的 效应 物 。 研 究 得 最 详细 的 是 阿拉 伯 糖 操纵 子 上 的 活化 
蛋白 ， 即 Arac 蛋 白 。 我 们 将 在 后 面 加 以 描述 。 

有 些 操 纵 子 只 有 阻 歇 蛋白， 有 些 操纵 子 则 只 有 活化 蛋 日 ， 但 
许多 操纵 子 则 两 者 兼备 。 对 于 这 种 受 双重 调节 的 基因 ， 只 有 在 某 
种 诱导 物 导 致 阻 遇 蛋白 失效 而 又 有 活化 蛋白 结合 到 PNA 上 时 ， 转 
录 mRNA 才 可 能 达到 最 大 速率 。 

目前 对 细菌 及 噬菌体 的 调节 蛋白 结合 DNA 的 物理 机 制 的 研 


(al) b) 
无 诱导 物 存在 “卷轴 物 存在 
启动 区 、 操纵 区 启动 区 、_ 7 操纵 区 


二 
阻 巡 物 - 入 


阻 巡 物 功 -> 阻 过 科 坚 独 存在 


二 | 时 下 发 生 结合 
者 无 转录 
= 彤 1 CN 少 


SRNA 聚 合 本 
一 RNA 末 合 酶 
诱导 和 C | 协 阻 过 物 存 在 


图 2-5 ”两 种 效应 物 一 诱导 物 与 协 阻 遏 物 一 作用 示意 图 。(a) 有 些 
阻 遏 物 在 自然 状态 下 结合 到 DNA 上 ， 因 此 ， 无 诱导 物 存在 时 ,该 蛋 
白 与 操纵 区 相 结合 ， 从 而 阻碍 RNA 到 合 酶 进入 启动 区 ,mRNA 合成 
成 为 不 可 能 。 而 有 诱导 物 存在 时 ， 诱 导 物 则 与 阻 过 蛋白 结合 ,使 其 
形状 发 生变 化 ， 阻 过 蛋白 即 从 DNA 分 子 上 脱离 下 来 ，RNA 聚合 酶 
即 可 进入 启动 区 。(b) 另 一 类 阻 巡 蛋 白 只 在 协 阻 遏 物 存在 时 才 起 作 
用 。 这 种 情况 下 ， 阻 巡 和 蛋白 不 能 单独 与 操纵 区 结合 ,因而 无 法 停止 
RNA 的 合成 。 当 协 阻 遏 物 与 阻 坎 蛋白 结合 后 ,这 种 复合 物 与 操纵 区 
紧 紧 结合 ， 而 使 RNA 无 法 合成 。 


1 


无 效应 物 存在 或 活化 蛋白 浓度 低 、、 
局 劲 区 活化 蛋白 位 虑 


IN 帮 LA 
人 在 
一 转录 其 事 低 
Po 


效应 物 存在 且 也 必需 活化 蛋白 浓度 高 ， 
- 效应 物 为 不 必需 


效应 物色 一 


图 2-6 调节 可 能 依赖 于 正 调 节 和 蛋白 即 活 化 蛋白 ; 某 些 活化 蛋白 还 

需要 效应 物 。 当 某 种 效应 物 与 活化 蛋白 结合 时 (或 者 ， 当 效应 物 不 

存在 而 活化 蛋白 浓度 足够 高 时 ) ,活化 蛋白 与 DNA 结 合 吸引 了 RNA 

聚合 酶 结合 到 基因 上 而 促进 转录 
究 已 取得 很 大 进展 。 迄 今 有 三 种 具有 调节 功能 的 蛋白 质 已 经 获得 
结晶 :一 种 是 唉 菌 体 的 阻 遏 物 一 一 Cro 蛋 白 ; 另 一 种 是 细菌 的 分 解 
代谢 物 活 化 蛋白 一 一 CAP 和 蛋白 (catabolite activator protein)f 
再 一 种 是 叭 菌 体 的 cI 阻 过 蛋白 。cI 阻 过 蛋白 对 它 本 身 基 因 的 转录 
起 着 活化 蛋白 的 作用 ,而 对 其 它 人 的 基因 的 转录 则 有 阻 过 蛋白 的 作 
用 。 这 三 种 蛋白 质 的 三 维 结构 具有 尺 人 的 相似 性 ， 它 们 都 是 以 二 
体 的 形式 与 DNA 结 合 ， 单 体 都 有 三 个 x- 螺 旋 区 。 根 据 PDNA 与 这 些 
蛋白 质 结 构建 立 的 模型 表明 ， 这 些 蛋 白质 的 每 一 单 体 中 的 一 个 %- 
螺旋 与 DNA 结 构 中 的 大 沟 吻 合 得 相当 好 ， 比 如 ，Croc 蛋 白 与 DNA 
结合 的 空间 吻合 模型 ， 说 明 Cro 蛋白 的 二 体 与 DNA 双 螺旋 的 两 个 
相 邻 大 沟 结合 的 严密 程度 

2 . 负 调节 系 统 ， 屯 糖 操纵 子 〈1oc operon) ， 


区 


7 


大 肠 杆 菌 乳 糖 操纵 子 是 细菌 的 操纵 子 受阻 过 蛋白 负 调 节 的 一 


”个 经 典 例子 。 它 给 人 们 揭示 了 细菌 通过 什么 样 的 机 制 在 正常 情况 


下 不 生产 乳糖 代谢 所 需 的 酶 系 ， 但 当 环境 摄取 不 到 葡萄 糖 而 代 之 
以 乳糖 时 ， 依 然 具有 合成 这 些 酶 的 能 力 。 这 种 机 制 的 认识 过 程 代 
表 了 人 们 对 基因 调控 知识 的 历史 发 展 。 
细菌 结构 基因 上 发 生 突变 ， 就 会 改变 酶 的 活力 # 而 调节 基因 
上 发 生 突变 就 会 改变 细菌 对 环境 变化 的 应 答 能 力 。 为 要 了 解 正常 


细菌 的 基因 苦 和 名 ， 对 细菌 中 突变 的 调节 基因 的 鉴别 是 不 可 缺 的 。 


合 、 转 导 和 转化 的 方法 使 在 大 肠 杆菌 中 进行 基因 转移 得 以 工程 


化 ， 从 而 能 够 考察 结构 基因 和 调节 基因 突变 的 效应 。 


从 历史 上 说 ， 细 菌 基因 调控 的 最 重要 研究 都 集中 在 大 肠 杆菌 
及 其 乳糖 代谢 途径 方面 。 乳 糖 是 哺乳 类 奶 汁 中 的 一 种 双 糖 。 大 肠 
杆菌 如 果 在 有 乳 灶 的 环境 中 生长 ， 细 胞 中 有 三 种 蛋白 质 会 急剧 
增加 ， 它 们 是 ，B- 半 屯 扩 谋 酶 ，B- 半 乳 铺 间 汉 和 除 和 乙 栈 转移 
酶 (图 2-7)。 


油 节 基因 控制 点 …” 结构 基因 
-RE 


一 -一 -一 
0 启动 区 “8 - 半 乳 糖苷 栈 2 


操纵 区 
图 2-7 大 肠 杆菌 负责 乳糖 代 济 的 有 关 基 因 。 


其 中 8- 半 必 糖 昔 酶 的 作用 是 催化 乳糖 分 解 成 葡萄 糖 和 半 乳 糖 ， 浴 
透 酶 是 细胞 内 刚 上 的 一 种 蛋白 质 ， 它 可 以 增加 弛 精 的 摄 入 量 ， 乙 
酰 转 移 酶 的 作用 尚未 了 解 。 所 有 这 三 种 酶 的 基因 都 是 乳糖 操纵 子 
结构 的 一 部 分 ， 在 染色 体 上 的 排列 顺序 是 ，Z 基 因 ， 编 码 B- 半 虱 
糖 音 酶 ，Y 基 因 ， 编 码 渗透 酶 ， A 基 因 ， 编 码 乙酰 转移 酶 乳糖 或 
胰 糖 的 某 种 代谢 物 对 操纵 子 的 转录 起 诱导 作用 ， 屯 糖 操纵 子 转录 
起 妈 的 抽调 节 《 即 由 阻 过 蛋白质 控制) 是 经 册 直 传 学 和 生物 化 学 
研究 的 基础 上 提出 的 。 

正常 细菌 乳糖 操纵 子 的 特征 可 以 写成 Z*Y+A+， 这 表示 该 细菌 
可 以 正常 产生 具有 活性 的 这 三 种 蛋白 。 其 中 任 一 基因 上 有 突变 都 


s 9D7 


可 导致 相应 蛋白 质 失 活 ， 或 根本 不 合成 ， 例 如 ， Z-Y+A+ 突 变 株 ， 
对 乳糖 存在 时 的 反应 是 合成 渗透 酶 和 乙酰 转移 酶 ， 但 B- 绊 乳糖 音 
酶 则 没有 活性 。 有 些 突变 株 这 三 种 酶 的 结构 基因 都 正常 ， 但 对 这 
三 种 基因 不 具 正 常 调节 能 力 ， 即 为 调节 基因 突变 株 。 它 们 当中 有 
许多 是 在 没有 诱导 物 存在 时 也 能 合成 这 三 种 酶 ， 而 相反 正常 细 
菌 具有 在 乳糖 存在 时 才 诱 导 合 成 这 种 酶 。 这 样 的 突变 检 就 是 定制 
突变 株 (ccnstitutive mutant) 。 引起 B- 半 乳糖 定制 式 合成 的 突变 
有 些 是 发 生 在 起 调节 作用 的 基因 〈 即 I 基 因 ) 上 (图 2-7 半 两 此 让 
第 的 ， 可 诱导 的 细菌 可 以 用 于 表示 ， 定 制 突变 株 则 用 下 表示 . 

50 年 代 末 期 ， 法 国 巴 斯 德 研究 所 的 Franccis Jacob 和 Jacques 
Moncd 在 进行 接合 试验 时 首先 注意 到 I 基 因 的 属 几 ， 以 正常 蓝 〈I+ 
2Z ) 作 供 体 ， 突 变 菌 (TZ-) 作 受 体 进 行 接合 ， 结 果 受 体 菌 公克 
含有 两 套 基 因 ， 即 变 成 部 份 合子 (merozygotes) 。 其 遗传 构 车 可 
用 玉 2*AT-Z- ( 供 体 / 受 体 ) 表示 。 

接合 开始 前 ， 供 体 细胞 由 于 培养 基 中 无 诱导 物 (乳糖 )》 而 示 
合成 8- 半 屯 糖 苷 酶 ; 受 体 细胞 也 不 生成 8- 半 乳糖 苷 杖 ， 这 是 由 于 
虽然 它们 可 以 不 需要 诱导 物 ， 但 Z 基 因 是 有 缺陷 的 。DNA 转 移 后 
个 久 ， 不 管 诱导 物 是 否 存在 ， 开 始 都 会 形成 6- 半 乳 糖苷 酶 ， 但 车 
无 诱导 物 存 在 ， 酶 合成 约 2 小 时 后 ， 即 复 停止 。 因 为 TI 基因 和 Z 基 
因 鞠 移 后 ， 供 体 细胞 一 旦 死去 ， 合 成 8- 半 屯 糖 苷 酶 的 受 体 细胞 也 
当即 停止 其 合成 。 
- “scob 和 Monod 在 解释 这 种 事实 时 是 这 样 认 为 的 号 即 在 没 青 
诱导 物 时 ， 供 体 细胞 六 基因 有 一 种 产物 妨碍 Z+ 基 因 的 表达 .因此 
当 和 基因 由 供 体 进入 到 受 体 细胞 时 ， 由 于 受 体 细胞 内 的 环 壕 候 译 
该 " 基因 产物 ，2 基因 则 不 受 约束 地 指令 B- 半 弛 糖 背 酶 的 合成 ， 
但 也 同样 供给 了 受 体 细胞 ， 在 没有 诱导 物 的 那 段 时 刻 ，L 基 因 
产物 也 在 受 体 细胞 内 累积 ，Z+ 基 因 活 动 再 一 次 受到 抑制 ， 册 此 ， 
他 们 提出 了 起 着 阻 过 作用 的 是 基因 产物 (IT 基因 产物 ) 前 概 意 

盟 过 蛋白 的 作用 在 用 屯 糖 操纵 子 的 各 基因 作 的 另 二 此 这 本 中 
得 到 了 充分 的 阐明 。 可 以 将 乳糖 操纵 子 和 I 基 因 上 的 突 杰 作 各 种 组 

as 98 。 


合 ， 揪 入 质粒 中 , 然后 引入 到 具有 一 个 乳糖 操纵 子 和 一 个 I 基 因 的 
大 肠 杆 菌 中 ， 构 成 一 种 所 谓 部 分 二 倍 体 的 细胞 。 在 这 些 细胞 中 ， 
阻 遏 物 要 表现 其 功能 必须 结合 在 DNA 的 特定 位 置 上 ， 而 且 这 种 位 
置 必 须 与 受 控 的 Z 基 因 相 邻近 。 

表 工 给 出 了 这 种 实验 的 结果 ， 说 明了 含有 不 同 组 合 的 突变 的 


表 1 不 同 品系 的 大 肠 杆 蓝 的 g- 半 乳糖 芒 酸 含量 
酶 含量 
菌株 诱导 “不 诱导 结论 
O2 了 这 六 二 上 最 大 最 大 定制 式 酶 合成 
9 于 光 生 7 最 大 低 可 扩散 的 跨 域 作用 阻 歇 
蛋白 *I+ 相 对 于 I 工 为 显 性 
OcI+( 或 I-)Z+ 最 大 接近 最 大 ”操纵 区 为 定制 式 ， 显 性; 
阻 遏 蛋白 不 能 起 作用 


OCTI+( 或 I-)Z+/O+I+Z+ 最 大 最 大 的 一 半 95 显 性 ， 同 域 作 用 * 
O5I+ (或 二 )Z*/O:IZ” 最 大 的 一 半 “ 最 大 的 一 半 “05" 显 任 ,-- 同 域 作用 

* ”路 域 作用 意味 着 在 另 一 “染色 体 ” 上 起 作用 ; 同 域 作用 意 指 在 同一 兴 色 体 上 
起 作用 ; 突变 总 是 同 域 起 作用 的 ， 它 必定 是 发 生 在 受 影 响 基 因 的 附近 。 


Fac 基 因 的 各 种 菌株 的 酶 活 。 首 先 在 I-Z /2 的 细胞 中 ，8- 半 乳 
糖苷 酶 合成 依然 需要 诱导 物 。 这 表明 阻 遏 物 基因 位 于 另 一 染色 体 
上 。9O9 序 列 〈 即 操纵 区 或 操纵 序列 ) 突变 的 发 现 表 明 ， 阻 遏 蛋白 
作用 在 与 Z 基 因 很 靠近 的 位 点 上 ,2 序列 上 的 突变 引起 邻近 的 Z 基 
因 活 化 ， 即 使 没有 诱导 物 存在 。 这 种 突变 以 0 表明， 意思 是 操纵 
区 定制 化 〈cperataci constitutive) 。 当 具有 一 个 活化 Z+ 基 因 的 O5 
突变 株 用 来 产生 一 种 部 分 二 倍 体 (0"I-Z*/O"IZ-) 时 ， 这 时 ， 
细胞 依然 是 部 份 定制 化 。 因 此 ， 即 使 有 I 基 因 产 物 形成 ,'Q 仍 继续 
引起 邻近 2 表达 。 

由 此 ， 我 们 可 以 区 分 导致 B- 半 乳糖 苷 酶 定制 化 合成 的 两 种 类 
型 的 突变 ， 即 I 基 因 上 的 突变 和 操纵 区 上 的 突变 。 操 纵 区 中 的 突变 
是 同 域 起 作用 的 〈cis-active)5 渡 。 也 就 是 说 ,只 对 同一 染色 体 上 


“9 099 


的 Z 基 因 发 生 影响 。 但 II 基因 中 的 突变 则 是 跨 域 起 作用 的 《tramis- 
actiVe) 5 注 ] 意味 痢 既 可 能 对 同一 染色 体 上 的 民 基 因 也 可 能 对 另 一 
染色 体 上 的 Z 基 因 发 生 影响 。 由 此 可 以 得 出 结论 ，Z 基 因 附 近 的 某 
一 位 点 上 受到 一 种 驯 扩 散 产 物 (I 基 因 产 物 ) 的 作用 。 对 工 基 因 产 
物 的 温 敏 突变 的 研究 表明 ， 其 产物 是 一 种 蛋白 质 ， 因 为 蛋白 质 对 
热 比 核酸 更 敏感 。I 基 因 上 会 发 生 可 抑制 突变 〈 也 就 是 说 , 突变 可 
被 抑制 基因 tRNA 来 校正 )。 这 为 阻 过 物 是 蛋白 质 的 看 法 提供 了 强 
有 力 的 证 据 。 

基于 这 些 事实 ，Jaccob 和 Mocncd 在 1961 年 提出 了 操纵 子 学 说 。 
乳糖 操纵 子 的 基本 特征 目前 已 得 到 很 好 的 了 解 ， 归 纳 起 来 有 : 

(i) 编码 三 种 酶 的 结构 基因 在 DNA 上 相互 毗邻 并 使 用 同一 
个 启动 区 ， 转 录 成 一 种 多 顺 反 子 mRNA。 

( 计 ) DNA 上 的 I 区 域 为 调节 基因 ， 使 用 单一 的 启动 区 转录 ， 
产生 [mRNA。I mRNA 转译 成 分 子 量 为 38,000 的 多 肽 。 阻 遏 蛋白 
是 由 这 种 多 肽 组 成 的 四 聚 体 。 在 无 诱导 物 时 ， 阻 过 蛋白 结合 在 操 
纵 区 上 ， 阻 止 结 构 基 因 的 转录 (图 2-8a) 。 上 面 提 到 的 I 其 因 突 变 导 
致 突变 阻 遏 蛋 白 的 形成 。 突 变 阻 遇 蛋白 不 能 与 操纵 区 结合 ， 也 就 
不 能 阻止 转录 。 操 纵 区 上 的 突变 也 会 得 出 相似 的 定制 化 突变 株 。 

(iii) 有 乳糖 存在 时 ， 诱 导 物 (乳糖 ) 与 阻 过 蛋白 相互 形成 
一 种 复合 物 。 这 种 复合 物 使 阻 过 蛋白 丧失 了 与 操纵 区 结合 的 能 力 ， 
结构 基因 得 以 进行 转录 (图 2-8b) 。 天 然 的 诱导 物 并 非 乳 糖 ， 而 是 
由 乳糖 通过 转 糖苷 作用 形成 的 异 乳 糖 (allolactcse)。 实 验 室 中 用 
的 是 一 种 不 可 代谢 的 诱导 物 一 一 异 两 基 硫 代 半 乳糖 苷 〈 下 5G) 


[ 注 〗 英文 的 cis-acting 和 trans-acting 等 词 ， 目 前 见于 中 文书 刊 中 常 
被 译 为 “ 顺 式 作用 ”和 “ 反 式 作用 ”等 。 这 种 译 法 ， 沿 用 化 学 结构 上 顺 式 、 
反 式 的 概念 ; 意 列 颇 为 含 多 。 作 者 不 揣 冒 味 ， 亡 译 为 “ 同 域 作 用 ”和 “路 域 
作用 ”等 ， 以 抛 砖 于 各 届 同 行 和 专家 。 实 际 上 cis 和 trans 有 纵 癌 和 横 癌 之 意 。 
cis-acting 是 纵向 作用 或 纵向 效应 ;trans-acting 是 横向 作用 或 横 回 效应 。 
此 地 译作 “ 同 域 ” 者 ， 含 有 在 结构 上 共 线 性 的 意思 ,“ 跨 域 ” 则 相反 。 而 且 跨 
域 作用 因子 是 《往往 ) 由 位 于 别 的 染色 体 编码 的 蛋白 质 。 人 


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可 以 达到 极 理想 的 族 导 效果 。 

(iy) 该 启动 区 的 3/ 部 分 在 原核 启动 区 中 或 多 或 少 地 具 有 典 
型 性 ， 而 其 5 部 分 ， 在 分 解 代谢 物 阻 遏 中 起 作用 ， 这 是 又 一 种 调 
控 机 制 ， 当 乳糖 和 葡萄 糖 均 可 作为 底 物 被 利用 时 ， 则 通过 这 种 机 
制 去 抑制 乳糖 操纵 子 的 诱导 作用 。 

乳糖 操纵 子 的 阻 过 蛋白 是 第 一 个 分 离 到 的 细 落 阻 过 蛋白 。 在 
野生 型 大 肠 杆 菌 中 ， 该 阻 歇 蛋白 只 占 总 蛋白 的 0.001% 左 右 , 将 它 
加 以 分 离 纯化 ， 曾 经 是 一 个 极 棘手 的 问题 。Gibert 和 Miiller-Hill 
用 遗传 学 方法 得 到 了 一 个 启动 区 突变 株 ， 产 量 增加 了 近 10 倍 ; 然 
后 他 们 把 突变 的 DNA 插入 叭 万 体 中 ， 该 蛋白 的 合成 上 千 倍 地 增 
加 。 利 用 该 阻 过 蛋白 与 IPTG 具有 的 亲 和 性 ， 纯 化 工作 迎刃而解 
果 

这 一 阻 遏 蛋白 是 一 种 酸性 蛋白 ， 分 子 量 是 150，000， 由 四 个 
相同 的 亚 基 组 成 ! 已 经 搞 清 了 亚 基 全 部 的 360 个 氨基 酸 序列 。 每 一 


A 


个 亚 基 与 一 个 诱导 物 分 子 结合 ,但 只 有 阳 聚 你 与 操纵 基因 结合 。 当 
诱导 物 结合 到 阻 过 蛋白 上 时 ， 引 起 了 其 构象 上 的 一 种 变 构 变化 ， 
降低 了 其 与 操纵 区 的 亲和力 。 


该 阻 遏 蛋白 与 操纵 区 的 结合 比 之 与 非 专 一 的 DNA 的 亲和力 
大 4XI0” 音 , 前 一 种 结合 的 解 离 常数 kd~10- 1 M。 基 于 这 一 点 , 阻 
遏 蛋白 与 操纵 基因 所 形成 的 复合 物 则 有 可 能 停留 在 硝酸 纤维 素 滤 
膜 上 ， 而 不 形成 这 种 复合 物 的 DNA 会 通过 它 ， 从 而 使 得 含 操纵 区 
的 片段 得 以 纯化 。 由 于 这 种 结合 防止 了 DNase I 的 水 解 ,然后 分 离 
出 的 DNA 片 段 即 是 盟 遏 蛋白 结合 时 所 保护 的 序列 。 然 后 用 序列 分 
本 方法 ， 则 得 到 前 面 所 说 的 足迹 法 的 结果 。 阻 遏 蛋白 结合 所 保护 
有 人 全。 和 和 基 让 1 生生 生生 
这 也 表明 ， 这 些 核 背 酸 在 阻 遏 物 与 操纵 区 的 相互 作用 中 是 很 重要 
的 .RNA 聚 合 酶 也 结合 在 这 一 区 域 ,因为 启动 区 与 操纵 区 有 重合 。 
这 种 重 琶 说 明了 为 什么 阻 遏 蛋白 与 操纵 区 结合 就 妨碍 了 RNA 聚 
合 酶 在 启动 区 上 的 结合 ， 因 而 阻止 B- 半 乳糖 苷 酶 mRNA 合成 的 起 
始 。 


02。 


3. 色 氨 酸 操纵 子 | (trp 9peron) 的 阻 允 作用 

大 肠 杆菌 具有 合成 为 蛋白 质 合成 所 必需 的 各 种 氨 基 酸 的 能 
力 。 但 在 许多 情况 下 ， 只 有 外 源 缺 乏 某 种 氨基酸 时 才 去 合成 为 生 
成 该 氨基 酸 所 需 的 酶 。 色 氨 酸 操纵 子 这 二 系统 就 是 很 好 的 例子 。 
它 由 五 个 结构 基因 组 成 ， 编 码 合 成 色 氮 酸 所 需 的 三 种 酶 的 五 个 多 
肽 键 。 该 操纵 子 也 是 由 单一 个 启动 区 控制 ， 转 录 成 一 种 多 顺 反 子 
mRNA 并 且 也 受到 与 其 操纵 区 结 谷 的 阻 遏 蛋白 的 控制 (图 2-9)。 
但 是 它们 的 调节 基因 远离 操纵 子 的 其 余部 分 。 它 们 所 编码 形成 的 
阻 遏 蛋 自 是 没有 活性 的 ， 若 无 色 氨 酸 存在 ,不 能 结合 到 操纵 区 上 ， 
但 若 有 色 氨 酸 存在 ， 色 氨 酸 即 与 之 结合 并 使 其 激活 阻 遇 蛋白 。 这 
了 时 阻 歇 蛋白 即 可 与 操纵 区 结合 并 阻止 转录 。 在 这 里 ， 色 氨 酸 是 一 
种 协 阻 过 物 。 在 乳糖 操纵 子 中 是 乳酸 降低 阻 遏 物 与 操纵 区 的 亲 和 
力 纪 而 色 氨 酸 则 大 大 增加 色 氮 酸 操纵 子 的 阻 巡 蛋白 与 其 操纵 区 的 
亲和力 。 但 是 ， 这 两 种 操纵 子 都 属于 负 调 节 ， 因 为 具有 活性 的 阻 
远 蛋 白 都 是 阻止 转录 。 色 氮 酸 操纵 子 的 转录 中 止 也 是 一 种 调控 办 
法 ， 我 们 后 面 将 谈 到 。 

4,. 正 、 负 双 元 调节 系统 一 一 阿拉 但 糖 提 纵 子 (ara oberon ) 

大 肠 杆菌 以 阿拉 伯 糖 作 其 能 源 时 ， 它 们 就 合成 三 种 酶 来 将 阿 
拉 伯 糖 转换 成 木 糖 5 磷 酸 。 这 三 种 酶 (一 种 异 构 酶 ， 一 种 激酶 ， 一 
种 表 异 构 酶 ) 分 别 是 三 个 基因 〈(B，A 和 D) 的 产物 ， 辐 属于 单个 
纵 子 〈 图 2-10)。 造 酶 来 利用 糖 ， 这 一 点 与 


全 4 N : t2 
< 启 AN 才 
调节 基因 人 区 后 终止 位 点 

玫 
图 2-9 色 气 酸 操纵 子 示意 因 


ce 所 村 人 araC O [ .araB araA ara 
阿拉 伯 糖 摄取 有 关 条 济 节 基因 控制 区 阿拉 伯 糖 代谢 酶 系 基因 | 
′ 白质 的 基因 - 
.图 2-10 阿拉 伯 糖 调节 子 示意 图 
,9 103 局 


乳糖 操纵 子 是 共同 的 。 但 它们 的 调节 “线路 却 角 然 不 同 。 

在 研究 阿拉 伯 糖 时 发 现 大 肠 杆菌 的 一 种 突变 株 ， 其 三 个 酶 的 
结构 基因 都 正常 ， 但 不 能 利用 阿拉 伯 糖 。 这 种 突变 株 是 调节 基因 
( 即 ara C 基 因 ) 上 的 突变 。ara C 产 物 也 与 乳糖 操纵 子 的 阻 歇 蛋 和 
一 样 ， 是 一 种 调节 蛋白 ， 但 作用 不 一 样 。 在 没有 阿拉 伯 糖 的 条 件 
下 ，Ara C 蛋白 与 操纵 区 结合 则 抑制 mRNA 的 生成 ， 因 此 对 阿拉 
伯 糖 代谢 酶 的 结构 基因 行使 的 是 负 调节 。 但 在 阿拉 伯 糖 存在 的 条 
件 下 ,Ara C 和 蛋白 则 对 这 些 结构 基因 行使 正 调 节 , 即 与 启动 区 结合 
成 一 个 单位 ， 促 进 有 效 的 转录 。 当 AraC 与 阿拉 伯 糖 结合 后 ， 蛋 自 
构象 发 生变 化 ， 亦 即 异 位 变化 ， 从 而 不 与 操纵 区 结合 而 与 启动 
区 结合 。 这 一 点 与 乳糖 操纵 子 阻 遏 蛋白 相反 ， 因 为 后 者 在 乳糖 存 
在 时 ， 与 启动 区 脱离 接触 。 

在 没有 阿拉 伯 糖 的 条 件 下 ,AraC 蛋 白 对 阿拉 伯 糖 操纵 子 也 行 
使 负 调 节 的 功能 。 但 在 这 时 ,，AraC 的 作用 部 位 并 非 紧 挨 转 录 起 始 
点 的 上 游 ,而 是 作用 在 上 游 约 距 28 碱 基 对 的 地 方 的 另 一 操纵 区 上 ， 
造成 DNA 弯 曲 ， 结 果 ， 阻 过 蛋白 同时 与 两 个 操纵 区 结合 , 阻止 B， 
A,D mRNA 的 转录 ， 这 一 例子 说 明 ， 参 与 调节 的 DNA 位 点 ,并 非 
都 是 紧邻 在 转录 起 始点 。 

值得 指出 的 是 ， 参 与 阿拉 伯 糖 代谢 的 除了 上 述 三 个 酶 结构 基 
因 外 ， 还 包括 另外 两 个 为 阿拉 伯 糖 摄取 的 蛋白 编码 的 基因 ， 这 两 
个 基因 远离 操纵 子 ， 但 受到 同样 的 调节 。 这 种 散在 的 控制 单位 ， 
称 为 调节 子 。 

大 肠 杆菌 生长 在 葡萄 糖 和 乳糖 均 存在 的 条 件 下 ， 它 只 选择 葡 
萄 糖 进 行 代谢 。 所 需 的 酶 不 能 诱导 合成 代谢 其 它 糖 ( 如 乳 糖 )。 显 
然 ， 葡 萄 糖 或 其 分 解 产物 妨碍 了 其 它 种 类 糖 代谢 所 需 酶 的 mRNA 
的 合成 。 这 种 现象 就 是 分 解 代谢 物 阻 过 (catabolite fepression) 。 
因此 ， 在 研究 其 它 糖 的 掠 弘 子 诱导 作用 时 ， 需 要 不 含 葡萄 糖 的 培 
养 基 ， 以 防止 分 解 代谢 物 阻 遏 的 发 生 。 后 来 发 现 ， 在 葡萄 糖 饥 峨 
时 ,大 肠 杆 菌 合成 的 环 腺 背 酸 (AMP) 明 显 增加 。cAMP 量 的 增加 


光 104。 


是 代谢 胁迫 时 的 一 种 “警戒 ”信号 ， 也 与 基因 调控 有 关 。 将 大 肠 
杆菌 培养 在 同时 含有 葡萄 糖 和 乳糖 的 培养 基 中 ， 并 加 入 cAMP， 


(a) 无 葡萄 糖 ,cAMP 高 无 乳糖 
-cecAMP 


一 


人 无 lacmRNA 


阻 过 蛋白 
《〈b) 有 葡萄 糖 'eAMP 低 :无 乳糖 
CAPC 


站 人 | 
| 无 lae mRNA 


(ec) 有 葡萄 糖 cAMP 低 ;有 乳糖 


人 


和 项 各 mRNA 
诱导 物 - 
已 和 


( d) 无 葡萄 粮 jcAMP 高 ;有 乳糖 
忆 cAMP 


RE 
人 大 量 ac mRNA 
图 2-11， 屯 糖 操纵 子 受到 两 种 蛋白 质 〈LacL 阻 过 蛋白 和 cAMP- 结 
合 蛋 白 ，CAP) 的 控制 。(a)，(b) 不 管 有 无 葡萄 糖 存 在 ,无 乳糖 则 
无 Lac mRNA 形成 ,因为 操纵 区 被 阻 过 蛋白 结合 。(c) 乳糖 的 存在 
可 以 除去 阻 歇 蛋白， 但 当 cAMP 含 量 低 时 ，CAP 和 蛋白 不 跟 启 动 区 结 
合 ， 只 合成 最 低 限 度 的 mRNA。(d) 当 有 乳糖 而 无 葡萄 糖 时 ，1ac 
操纵 子 转录 最 旺盛 ， 这 是 因为 乳糖 可 驱 去 阻 过 蛋白 ,而 无 葡萄 糖 则 
CAME 含 量 增 加 。cAMP 与 CAP 结合 形成 复合 物 ， 结 合 到 启动 区 而 
促进 转录 。 


“105 s 


这 时 8- 半 乳糖 苷 酶 的 诱导 并 不 像 无 cAMF 时 那样 受到 抑制 。 阿 拉 
伯 糖 代谢 酶 的 诱导 也 有 同样 的 结果 。 显 然 cAMP 在 克服 分 解 代 谢 
物 阻 遏 中 起 着 直接 的 作用 。 事 实 上 ,现在 知道 ，cAMP 不 仅 在 原核 
生物 中 ,而 且 在 真 核 生 物 中 也 参与 各 种 不 同 基因 转录 起 始 的 调节 。 

从 正常 的 大 肠 杆菌 中 可 以 分 离 到 一 种 与 AMP 结合 前 蛋白 
质 ， 这 就 是 分 解 代谢 物 激活 蛋白 (CAP)， 亦 称 cAMP 受 体 蛋 自 
(CRP)。CAP 只 跟 cAMP 结 合 才 会 被 激活 。CAP 和 cAMP 形成 一 
种 复合 物 ， 在 乳糖 操纵 子 5/ 区 (一 72 至 一 52) 有 其 作用 部 位 。 它 
与 这 一 作用 位 点 的 结合 ,有 助 于 RNA 聚 合 酶 起 始 转录 过 程 。 因 此 ， 
乳糖 操纵 子 事实 上 既 受到 阻 过 蛋白 的 负 调 节 ， 又 受到 CAP- 
“AMP 复合 物 药 正 调 节 〈 图 2-11)。 而 阿拉 伯 糖 操纵 子 ， 则 受到 
Ara C 和 CAP 这 两 种 蛋白 的 双重 正 调节 。 

像 乳糖 操纵 子 和 阿拉 伯 糖 操纵 子 这 种 转录 的 复杂 调控 ， 对 大 
肠 杆 菌 的 生存 显然 是 很 有 价值 的 。 如 果 可 以 从 环境 中 大 量 获得 葡 
萄 糖 ， 则 cAMP 量 就 很 少 ， 这 时 不 激活 CAP， 无 需 动员 其 它 糖 代 
谢 的 操纵 子 的 表达 ， 也 就 不 会 诱导 产生 其 它 糖 代谢 所 需 的 酶 ;在 
缺乏 葡萄 糖 而 可 利用 其 它 糖 的 情况 下 ， 才 能 进行 其 它 糖 代 谢 。 

6. 半 屯 糖 操纵 子 ， 双 启动 区 

生长 在 含有 半 乳 糖 条 件 下 的 细菌 会 导致 半 乳 糖 代谢 酶 系 的 增 
加 ， 把 半 乳 糖 转换 成 葡萄 糖 1- 磷 酸 。 这 些 酶 是 半 乳 糖 激酶 、 磷 酸 
转移 酶 和 UDP 半 乳 糖 4- 表 异 构 酶 。 它 们 分 别 由 gal K，gal T 和 gal 
E 三 个 基因 编码 。 这 三 个 基因 所 构成 的 操纵 子 即 半 乳 糖 操纵 子 ， 
受到 两 个 启动 区 的 调节 。 

在 大 肠 杆菌 中 ， 两 个 启动 区 在 操纵 子 的 5/ 端 互相 有 所 重 丢 
(图 2-12 中 的 P1，P2)。 了 P1 受 CAP-cAMP 复 合 物 的 正 调节 ， 这 时 
P2 则 受 抑 制 。P1 和 P2 两 个 启动 区 都 受到 gal 阻 过 物 的 负 调 节 。 但 在 
CAP 和 cAMP 含 量 少 的 情况 下 ，P2 也 可 使 基因 得 以 转录 记 也 就 是 
说 ， 它 是 一 个 负责 这 些 酶 的 定制 型 转录 的 位 点 。 因 此 ， 葡 萄 糖 的 
存在 虽然 也 抑制 诱导 生成 半 乳 糖 代谢 所 需 的 各 种 酶 ， 但 非 诱 导 生 
成 的 酶 总 是 在 一 个 基本 的 水 平 上 。 相 反 ，P1 则 是 一 个 调节 型 的 


。 TO06。 


启动 区 ， 它 需要 cAMP 和 CAP 的 参与 ， 以 便 RNA 聚 合 酶 的 结合 而 
进行 转录 。 显 然 P1 与 RNA 聚 合 酶 的 亲和力 要 比 P2 的 大 得 多 。 因 而 
在 cAMP 量 高 而 利用 P1 时 ，RNA 链 起 始 的 速率 亦 较 大 , 产生 的 


mRNA 也 更 多 。 
Met-Arg -Leu.… 
Pi NE 2 汪 二 

区 昌 二 | mRNA1 人 - 
f OCTTETTEATACCATAAGCCTAATGGAGCGAAT ATGACAC 
KRRAARSS EECAAITAAAGTATGGTATT9GGATTACCT9 CTTAATACTCTCAA 
20 1， 本 十 20 

上 


Pribnow 框 ”一 


图 2-12 半 乳 糖 操 纵 子 具有 两 个 转录 起 始 位 点 ， 各 自 有 其 本 身 的 

RNA 聚 合 酶 的 结合 位 〈Pi 和 Pz)。P: 是 定制 型 活动 状态 甚至 有 葡 

萄 糖 存在 的 时 候 )， 因 此 它 不 需要 CAP 或 cAMP。 另 一 个 结合 位 点 世 a 

则 需要 半 乳 糖 ，CAP 和 高 含量 的 cCAMP 〈 无 葡萄 糖 时 启用 )。 

但 在 streptomyces lividans 这 种 链 霉菌 中 ， 半 乳糖 操纵 子 的 
两 个 启动 子 各 自 位 于 不 同 部 位 。 其 中 的 一 个 (P1) 是 在 操纵 子 的 
57 端 ， 而 另 一 个 (P2) 与 操纵 子 的 第 一 个 基因 的 3“ 端 有 所 重 丢 ， 
在 第 一 和 第 二 基因 的 交界 处 。 而 且 ， 这 两 个 启动 区 在 转录 起 始点 
上 游 的 序列 彼此 之 间 没 有 明显 的 同 源 性 。 因 此 ， 它 们 可 能 是 由 不 

。 同 的 RNA 聚 合 酶 全 酶 有 区 别 地 加 以 识别 。 启 动 区 这 种 机 构 上 的 
变化 ， 也 使 基因 的 布局 发 生 了 改变 。 大 肠 社 菌 中 ， 这 三 个 基因 的 
顺序 是 gc!_E->gal T->gal 开 ; 而 在 这 种 链 霉菌 中 ,基因 的 顺序 则 
是 gal_T->gol E->8ga! K。 启 动 区 P1 负 责 全 部 三 个 酶 基因 转 录 成 
单个 多 顺 反 子 mRNA 的 转录 ， 是 调节 型 的 ， 即 其 起 始 的 转录 受到 
半 乳 糖 所 诱导 。P2 只 负责 ga! 王 和 gal K 这 两 个 基因 的 多 顺 反 于 
mRNA 的 转录 ， 在 无 半 乳 糖 的 非 诱 导 条 件 下 ， 维 持 其 转录 的 基本 
水 平 。 因 此 P 2 为 定制 型 启动 区 。 

从 比较 可 以 看 出 ， 不 管 大 肠 杆 菌 或 是 前 面 提 及 的 链 霉菌 ， 其 
定制 型 启动 区 都 是 在 gc! E 基 因 的 上 游 . 这 种 布局 可 能 与 半 乳 糖 的 
利用 有 重要 的 关系 。 这 两 种 细菌 的 UDP- 半 乳糖 -4- 表 异 构 酶 都 是 
定制 型 表达 ， 因 为 其 定制 型 户 动 区 都 紧 挨 在 go! 下 的 上 游 。 在 大 肠 


5 107 


杆菌 中 ， 不 管 其 碳 源 是 否 为 半 乳 糖 ， 细 胞 壁 的 生物 合成 总 是 需要 
UDP 半 乳 糖 全 表 异 构 酶 。 在 链 霉 菌 中 ， 存 在 着 一 个 内 部 的 定制 型 
启动 区 P2， 可 能 也 是 为 了 满足 类 似 的 需要 。 
arginine regulon)， 一 种 阻 遏 物 有 多 个 作 

用 位 点 

上 面 所 描述 的 操纵 子 ， 如 乳糖 操纵 子 ， 阿 拉 伯 糖 操纵 子 和 半 
乳 糖 操纵 子 ， 在 细菌 的 转录 起 始 调控 中 都 是 很 富 弹 性 和 精致 的 。 
“所 有 这 些 糖 代谢 所 需 酶 系 的 基因 均 作 为 一 个 转录 单位 而 受到 控 
制 。 真 核 细胞 中 ， 一 个 特定 代谢 途径 所 牵涉 的 基因 并 不 集合 在 一 
个 操纵 子 内 。 大 肠 杆 菌 精 氮 酸 生物 合成 所 需 酶 系 的 基因 是 研究 真 
核 生 物 转录 调控 的 一 个 珍贵 的 模型 。 这 些 基因 分 散在 大 肠 杆 菌 染 
色 体 的 许多 位 点 上 ， 互 不 毗邻 。 当 精 氮 酸 来 源 丰 富 时 ， 所 有 这 些 
基因 的 转录 都 受 单一 种 阻 过 蛋白 分 子 所 阻 遇 。 这 种 散在 的 、 调 节 
协调 的 基因 群 即 称 为 精 氨 酸 调节 子 。 

8 .歧路 转录 

大 肠 杆 菌 的 生物 素 操纵 子 (biotin opfron) 含 5 个 结构 基因 
(A，B，F，C 和 D)， 编 码 生 物 素 合 成 所 需 的 各 种 酶 ! 在 A 和 B 基 
因 间 有 一 个 区 域 包含 着 操纵 区 和 启动 区 。 基 因 A 从 当中 的 一 个 启 
动 区 向 左 转录 ， 而 其 余 四 个 基因 则 由 另外 一 个 启动 区 向 右 转 录 。 
位 于 这 两 个 启动 区 之 间 的 操纵 区 看 来 具有 单个 结合 位 点 去 结合 阻 
遏 蛋 白 - 生 物 素 复合 物 ， 对 整个 操纵 子 行使 负 调节 。 操 级 区 的 序 
列 部 份 地 为 迎 文 式 对 称 ， 与 两 个 启动 区 均 有 重合 。 在 精 氨 酸 调节 
子 中 也 发 现 这 种 二 元 启动 区 。 这 种 系统 可 能 是 不 同 基因 有 不 同 表 
达 速 率 的 基础 。 

9 .调节 蛋白 本 身 的 调控 方式 


调节 蛋白 本 身 的 表达 是 如 何 调控 的 呢 ? 在 大 肠 杆 菌 中 发 现 了 


两 种 不 同 的 情形 ， 四 调节 蛋 自 为 定制 型 合成 @ 调 节 蛋 白 通 过 一 种 
所 谓 自生 调节 机 制 控制 其 本 身 的 合成 。 

(1) 有 些 调节 蛋白 持续 地 合成 

乳糖 操纵 子 的 阻 过 蛋白 是 1ec I 医 因 的 产物 。 这 个 基因 不 是 定 


2T082 


并 总 是 有 RNA 聚 合 酶 结合 着 。 阻 遏 蛋白 的 mRNA 在 这 一 独立 转录 
单位 上 合成 是 不 受 调节 的 ， 而 总 是 以 一 定 的 速率 进行 转录 。 看 来 ， 
有 可 能 许多 负 调 节 的 阻 巡 蛋 白 都 定制 地 少量 地 合成 。 

(2)》 有 些 调节 蛋 自 控制 自身 的 合成 一 一 自生 调节 

组 氨 酸 利用 操纵 子 (Put opeton) 的 阻 过 蛋白 的 合成 是 调节 蛋 
白 自 生 调 节 的 一 个 例证 。 编 码 阻 过 蛋白 的 基因 是 该 操纵 子 三 个 基 
因 当 中 的 一 个 ， 可 看 成 是 自生 调节 。 此 外 ， 还 有 4 叭 菌 体 中 的 阻 
遏 蛋白 “〈 见 后 ) 和 前 面 提 到 的 Ara C 和 蛋白 也 是 由 单个 基因 编码 ， 
使 用 自己 的 启动 区 和 操纵 区 〈 也 即 ， 它 们 是 只 合成 一 种 蛋白 的 操 
纵 子 )， 各 自控 制 本 身 mRNA 的 合成 。 我 们 在 这 里 先 讨 论 zxuit 操 纵 
子 的 调控 。 后 面 再 另 辟 章 节 讨 论 和 吹 菌 体 的 调控 系统 。 因 为 实际 
上 ， 各 种 调控 机 制 在 人 鸣 菌 体 中 都 得 到 体现 , 它 是 转录 调节 的 一 个 
综合 系统 。 

(3) Hut 操 纵 子 四 

[天 IebsieI1a aerogenes]、 上 鼠 沙 门 氏 菌 与 大 肠 杆菌 的 亲缘 关 
系 很 近 。 它 们 能 够 把 组 氨 酸 降解 为 氮 、 谷 氨 酸 和 甲 酰胺 .这 些 降 解 
产物 均 为 可 利用 的 碳 源 与 氮 源 .因此 ,组 氨 酸 可 以 作为 这 些 细胞 培 
养 基 的 唯一 能 源 。 降 解 组 氨 酸 需要 两 组 酶 , 称 为 Pu&t 酶 , 即 组 氮 酸 利 
用 酶 Put 酶 分 别 由 两 个 操纵 子 编码 ,每 个 操纵 子 有 其 自己 的 操纵 
区 和 启动 区 。 在 无 组 氨 酸 的 条 件 下 ,这 两 个 hxut 操 纵 子 的 转录 受到 
单一 种 阻 过 蛋白 的 阻碍 ， 也 就 是 说 两 个 操纵 子 的 操纵 区 都 被 同一 
种 阻 遏 蛋白 分 子 所 结合 。 以 组 氨 酸 作为 诱导 物 ， 它 则 与 阻 遏 蛋白 
结合 。 阻 过 蛋白 被 组 氮 酸 结合 后 ， 就 再 不 能 与 操纵 区 结合 ， 从 而 
不 能 起 始 转录 过 程 。 

jut 阻 遏 蛋白 本 身 则 由 操纵 子 三 个 基因 当中 的 一 个 编码 ,因此 
Put 阻 遏 蛋白 的 合成 也 在 组 氨 酸 (诱导 物 ) .的 控制 下 合成 。 当 组 所 
酸 耗 尽 时 则 累积 游离 的 阻 遇 蛋白 ， 从 而 减少 更 多 的 阻 过 蛋白 的 合 
成 。 所 以 阻 遏 蛋白 的 合成 是 由 阻 过 蛋白 本 身 所 控制 。 

需要 指出 的 是 ，Put 操 纵 子 不 仅 对 组 氮 酸 的 存在 有 反应 ,而 且 


0 


它 也 像 Iace，cfa 和 8a1 操 纵 子 一 样 ， 对 葡萄 糖 很 敏感 ， 因 为 在 离 体 


， 转 录 系统 中 jxt mRNA 合成 也 需要 有 cAMP 和 CAP 的 参与。 


10. 入 吧 菌 体 示 和 蛋白 


症 本 证 可 旺 多 关 证 拓 可 生 的 畦 末了 


入 喉 菌 到 体 和 噬菌体 全 部 DNA 约 为 50kbj 她 生 丰 50 
个 以 上 不 同 的 基因 。 其 中 包括 调节 噬菌体 DNA 本 身 转 录 的 特异 性 


蛋白 的 编码 基因 。 

入 噬菌体 表现 出 两 种 不 同 的 生活 方式 ， 或 两 种 不 同 的 生 命 历 
程 。 一 种 是 裂解 周期 ， 即 鸣 菌 体 中 的 各 种 基因 得 以 表达 ， 产 生 许 
多 鸣 万 体 子 代 ， 最 后 使 细菌 细胞 裂解 ,而 将 这 些 鸣 菌 体 释 放出 来 。 
另 一 种 方式 是 维持 其 湾 源 状态 。 这 时 ADNA 整 合 到 宿主 基因 组 中 
并 与 之 一 道 复制 而 代 代 相传 下 去 ， 不 形成 叭 菌 体 去 裂解 细胞 。 但 
在 某 些 情况 下 (如 紫外 光照 射 )， 则 导致 结束 湾 原 状态 进入 裂解 状 
态 ， 产 生出 上 百 个 新 的 噬菌体 ， 将 宿主 杀 死 。 溶 源 状态 的 确立 和 
维持 如 何 处 于 一 种 精巧 的 平衡 呢 ? 

(1) 溶 源 状态 的 维持 ” 鸣 菌 体感 汪 宿 主 后 ， 维 持 溶 源 状 态 取 
决 于 一 个 主要 的 转录 调控 蛋白 一 盖 阻 遇 和 蛋白。 这 一 阻 过 和 蛋 自 是 忆 
基因 的 产物 。 具 有 活性 的 阻 遏 蛋白 是 二 个 同样 的 多 肽 形成 的 两 聚 
体 ; 每 一 多 肽 的 分 子 量 为 27,000。 

阻 遏 蛋白 抑制 噬菌体 裂解 周期 发 生 的 机 制 可 以 简单 归纳 如 下 
(图 2-13 ); 

四 了 菌 体 DNA 有 两 个 操纵 区 即 Or 和 oO， 它们 缘分 别 可 以 区 
分 出 三 个 同属 于 同一 契合 序列 的 、 由 17 对 了 碱 基 组 成 的 阻 遏 蛋白 结 
合 位 点 即 0L1，0OL2，0OL3 和 OnR1，OR2，OR3 (图 2=13)。 每 一 结合 
位 点 都 会 与 两 聚 体 阻 过 蛋白 的 N 端 区 结合 。 

四 结合 位 点 O 上 1 和 .Orgl 与 阻 遏 蛋白 的 亲和力 最 大 。 它 们 分 别 与 
PL 和 Pa 两 个 启动 区 在 结构 上 有 所 重 登 。 阻 过 蛋白 因此 优先 与 这 两 
个 位 点 结合 而 使 这 两 个 启动 区 指 转 录 受 到 抑制 ， 从 而 阻碍 了 史 菌 
体 进 入 裂 解 周期 所 需 蛋 白质 的 合成 。 


sa 110O。 


四 阻 过 蛋白 在 OL1 和 Ot 的 结合 进一步 刺激 阻 遏 蛋白 在 0 和 
OR2 上 的 结合 。 当 阻 过 蛋白 占据 Oe1 和 On2 时 ， 又 引发 RNA 聚 合 酶 
Pw 启 动 区 的 结合 ， 使 编码 阻 如 蛋白 的 cI 基 因 得 以 转录 。 因 此， 这 
个 阻 过 蛋 自 对 PR 和 Pi 行使 的 是 负 调 节 , 而 对 Pa 启动 区 及 其 本 身 的 
合成 则 行使 的 是 自生 的 正 调节 。 

由 953 和 On3 这 两 个 结合 位 点 对 阻 遏 物 的 亲和力 比较 低 , 一 般 
情况 下 则 空 着 不 用 。 但 一 旦 阻 过 蛋白 大 量 累积 ，OR3 被 占据 ，Pnx 
也 会 被 堵 塞 ， 于 是 阻 过 蛋白 合成 也 就 停止 。 在 这 里 ， 人 阻 如 蛋 白 对 
本 身 的 合成 又 行使 着 一 种 自生 的 负 调 节 。 


侵 染 的 性 质 取 决 于 
操 级 区 是 由 阻 过 蛋 


4 Pn Fr 由 ero 所 占据 


民 人 
《 区 1 守 UL 2 
世 IOUHIONIODI 二 二 IORIO 阳 遇 白话 角 
让 结合 于 01g 阻 和 


不 人 ; 人 
烦人 于 0; 的 AAA ;有 关 要 自  / 向 区 


本 激活 了 Pw 启 动 区 
(a) 
Pd 有 巴 时 
站 IO OORTOM 
cl 
站 
二 纸 全 于 03 的 阻 过 蛋白 
阻塞 了 启动 区 Pw 而 终 


_ 业 7 因 和 多 人 成 


图 2=13 和 噬菌体 阻 过 蛋白 的 作用 方式 。(a) 深 原 ;(b) 进 入 裂解 周 
期 ;!〈c) 阻 遇 蛋白 合成 的 自生 控制 。 


(2) 溶 源 状 态 向 裂解 状态 的 转变 “” 溶 源 状态 的 原 噬菌体 保留 
着 转变 到 和 裂 解 生长 的 能 力 。 在 实验 室 条 件 下 ， 可 以 通过 一 定 的 方 
法 “〈 如 紫外 光照 射 或 化 学 诱 变 剂 ) 损伤 宿主 DNA, 使 原 叭 菌 体 转 
变 到 有 裂解 生长 周期 。 这 种 物理 的 或 化 学 的 刺激 会 导致 所 谓 SOS 功 


e 了 11。 


能 的 一 系列 反应 ， 其 中 包括 激活 RecA 蛋 白 〈 正 常 荔 能 是 参与 遗传 
重组 ) 的 蛋白 酶 活性 。RecA 蛋 白 的 这 种 激活 是 由 受 损伤 所 产生 的 
单 链 DNA 结 合 到 RecA 蛋 白 上 引起 的 。 被 激活 的 RecA 蛋 自 将 XeI 阻 
遏 蛋白 分 解 而 使 之 失 活 ， 因 此 解除 了 P 操纵 基因 的 受阻 过 状态 
(去 阻 过 )。 了 Pa 操纵 基因 的 去 阻 遏 要 先 于 PL， 因 为 后 者 与 阻 遏 蛋白 
的 亲和力 较 高 。PR 的 去 阻 过 会 导致 Cro 蛋 白 的 生成 。Cro 蛋 白 也 是 
一 种 两 聚 体 ， 与 阻 遇 蛋白 相似 》， 但 它 与 OA1，OR2 和 Og3 的 亲 和 力 
与 阻 遏 蛋白 的 正好 相反 ， 即 在 Cro 蛋 白 浓 度 较 低 时 ， 优 先 与 Ox3 畦 
合 ， 阻 塞 Pw 启 动 区 ， 随 着 浓度 的 不 断 增加 ,Cro 蛋 自 逐 渐 占 据 OR2 
和 OR1， 从 而 抑制 cI 的 转录 。 这 是 所 有 为 进入 裂解 周期 所 需要 的 
各 种 蛋白 合成 的 必 备 条 件 。 

(3) 溶 源 状态 的 确立 和 进入 裂解 状态 ”从 前 面 指 讨论 中 ， 我 
们 知道 ，eI 基因 的 产物 即 阻 遏 蛋白 的 浓度 在 决定 噬菌体 究竟 是 
“进入 溶 源 状 态 还 是 裂解 周期 中 起 着 关键 的 作用 。 如 果 鸣 菌 体 进 入 
宿主 细胞 后 合成 了 足够 的 5I 阻 过 蛋白 》 细胞 则 变 成 溶 源 菌 ;如 果 
这 二 合 城 受到 破坏 或 供应 示 居 一 人 开始 旨 解 生长 

实际 上 ， 和 噬菌体 感染 宿主 细胞 时 ， 并 无 cI 阻 过 蛋白 可 言 。 这 
时 ， 阻 遏 物 的 合成 则 受到 另 一 组 基因 的 控制 。 开 始 是 从 PL 和 PR 引 
发 的 转录 因为 这 时 无 cI 阻 遏 蛋白 存在 ， 因 此 ， 这 是 非 调节 性 转 
录 。 这 种 早期 转录 的 产物 是 N 蛋白 和 Cro 蛋 白 的 mRNA。N 蛋白 实 
际 上 是 一 个 反 终止 蛋白 (后 详 )， 它 的 出 现 可 使 cI 和 elIII 基因 得 以 
转录 。 首 先 需要 指出 的 是 cTII 下 游 的 各 基因 的 转录 可 使 IDNA 得 
以 整合 到 宿主 DNA 中 而 cI 下 游 各 基因 的 转录 则 引起 MXDNA 复 
制 并 产生 只 菌 体 颗粒 。 但 cII 和 cTI 产 物 即 这 两 种 蛋白 又 产生 一 种 
综合 效应 从 而 导致 使 用 Ps 启动 区 来 进行 合成 cI 阻 遏 蛋白 。 由 PE 启 
动 区 的 转录 是 定制 型 转录 ， 它 所 产生 的 mRNA 比 由 Pw 所 产生 的 可 
能 更 有 效 地 转译 成 阻 过 蛋白 。 此 外 ，elIII 基 因 产 物 还 会 减少 cIT 基 
因 的 活动 。 所 有 这 些 反应 综合 平衡 的 结果 是 导致 cII 基 因 活 动 的 增 
加 而 使 在 感染 后 数 分 钟 cI 阻 歇 蛋白 又 然 增 加 。cI 阻 遏 物 的 不 断 供 
应 则 又 剥夺 了 对 Pr 和 Pa 的 使 用 权 ， 从 而 停止 了 由 它们 引起 的 转录 


下 JJZ。 


3 
和 


作用 。 相 反 ， 如 果 由 Pr 和 Pa 而 起 的 转录 得 以 继续 下 去 ， 则 Cro 蛋 
白 ，N 蛋 白 连同 cII 和 <cUI 和 蛋白 一 道 ， 又 会 阻 断 cI 阻 坎 蛋 白 的 合 成 ， 
结果 就 会 进入 裂 钾 生长 状态 。 

11。 原 核 生 物 转录 终止 的 调控 

原核 生物 DNA 的 转录 起 始 组 庸 置 辩 地 是 处 于 基因 调控 首 当 
其 冲 的 位 置 ， 在 细胞 对 环境 的 适应 中 ， 起 着 重要 的 作用 。 转 录 控 
制 的 另 一 个 层面 可 能 是 RNA 合成 的 受 控 终 止 ( 或 不 终止 ) 的 形式 
展开 的 。 下 面 是 终止 或 不 终止 三 种 可 能 的 情况 〈 图 2-14): 

@@ 如 果 转 录 过 程 过 早 终 止 于 RNA 了 聚合 酶 到 达 操 纵 子 的 每 一 
基因 之 前 ， 这 可 能 构成 否决 mRNA 生成 的 次 级 调节 。 

@ 终 止 作 用 受 控 地 发 生 在 操纵 子 的 各 基因 之 间 ， 则 会 导致 一 
种 " 极 性 效应 ”>， 即 靠近 启动 区 的 DNA 比 远离 它 的 DNA 有 更 多 的 
转录 。 

加 如 果 RNA 聚合 酶 持续 不 断 地 从 一 个 操纵 子 行进 到 下 一 个 
人 的 重 表 ， 风 到 
能 是 一 种 有 控制 的 “越位 ” (图 2-14) 

与 转录 起 始 相 比 ,对 转录 终止 分 子 机 制 的 认识 还 远 远 不 够 。 但 
上 述 三 种 情况 ， 每 一 种 都 可 能 在 原核 生物 的 基因 表达 调控 中 起 着 
某 种 作用 。 


站 


可 能 的 终止 位 点 


图 2-14 细菌 可 以 将 转录 停止 在 三 种 不 同 部 位 : (1) 在 一 个 操纵 子 的 
结构 基因 之 前 ，(〈2) 在 操纵 子 的 基因 之 间 ， 产 生 某 种 极 性 效应 ，(3) 在 一 
个 操纵 子 的 末端 。 如 果 在 第 三 种 部 位 不 停止 ，RNA 聚合 酶 可 能 串 读 到 下 
一 个 操纵 子 。 


转录 终止 可 能 有 两 种 类 型 ， 一 种 是 因子 依赖 型 ， 另 一 种 非 因 
.2 了 2 


子 依 赖 型 。 

(1) 因子 依 藏 型 终止 ”需要 某 种 蛋白 的 存在 。 第 一 个 认识 的 
这 种 转录 终止 因子 是 所 谓 (p 因 委 。 它 是 在 对 4 DNA 的 离 体 转录 
研究 中 从 大 肠 杆菌 中 发 现 的 。 在 离 体 条 件 下 ， 将 大 肠 杆菌 RNA 
聚合 酶 与 SDNA 混 合 ，RNA 则 从 Pr 和 PR 启动 区 向 左右 两 个 方向 
开始 转录 ， 所 产生 的 转录 物 竞 长 达 几 千 碱 基 ， 在 感染 早期 阶段 ， 
细胞 内 不 会 合成 这 样 长 的 RNA。 

若 将 不 曾 感染 过 的 细胞 提取 物 加 入 上 述 的 无 细胞 转录 系统 
中 , 可 形成 两 个 不 同 的 产物 ,一 个 含 约 500 核 苷 酸 , 另 一 个 约 1000 核 
音 酸 。 它 们 分 别 是 从 Pz 和 PR 启动 区 延伸 到 特异 的 终止 位 点 所 形成 
的 。 从 细胞 提取 物 中 纯化 到 的 一 种 蛋白 质 与 这 种 正确 的 链 终 止 有 
关 。 已 经 知道 这 种 称 为 p 因 子 的 蛋白 质 在 XDNA 和 大 肠 杆 菌 DNA 
中 的 一 些 作 用 区 域 ， 但 这 些 区 域 前 序列 之 间 没 有 明显 的 相似 性 。 
计生 二 计生， 
通读 ， 说 明 它 在 RNA 链 终止 中 起 着 重要 的 作用 。 疝 不 精 
RE 

(2) 非 因子 依赖 型 终止 在 细 胞 内 或 在 离休 条 件 下 都 可 发 
生 . 例 如 ，trp mRNA 的 合成 在 超出 mRNA 最 后 一 个 编码 区 的 35 
个 碱 基 处 停止 。 该 位 点 连续 出 现 4 个 U 残 基 ， 在 它 之 前 是 一 个 所 谓 
“发 卡 型 ”结构 。 对 30 个 以 上 这 种 非 因子 依赖 位 点 进行 比较 ， 它 
们 的 共同 特征 是 ，GC 含 量 高 ，U 成 串 出 现 ， 序列 闪 互 补 配对 而 成 
发 卡 结构 。 

这 种 区 域 如 何 造成 链 终 止 尚 不 明确 ,但 有 一 个 合理 的 假说 。 这 
一 假说 认为 ， 当 生长 着 的 mRNA 链 已 经 合成 到 半 互 补 区 ， 它 们 的 
碱 基 彼此 配对 ， 引 起 聚合 酶 行进 停止 。RNA 聚合 酶 后 面 的 DNA 
这 时 自行 复 性 ， 人 迫使 聚合 酶 从 模板 上 脱落 并 释放 出 mRNA 
87 衰减 作用 人 一 色 氨 酸 操 纵 子 的 次 级 调控 “关于 色 氨 酸 操 
人 转录 起 始 调节 前 面 已 作 了 介绍 。 但 大 肠 杆菌 色 氨 酸 操纵 子 
的 表达 的 变化 摆动 达 600 倍 。 这 种 表达 上 的 差异 不 能 完全 用 阻 
遏 蛋 白 一 辅 三 物 一 操纵 基因 之 亲 的 相互 作用 来 解释 。 阻 遏 作用 


。 1 了 4。 


可 以 使 转录 减少 70 倍 ， 而 受 控制 的 转 采 终 止 即 所 谓 训 减 作 用 ， 
可 使 转录 减少 8 一 10 倍 ， 两 者 的 综合 影响 ， 逐 使 其 有 600 倍 的 变 
化 。 

人 们 发 现 有 一 些 大 肠 杆菌 突变 株 ， 色 氨 酸 合成 酶 的 合成 比 正 
常 的 要 大 。 其 中 有 的 突变 株 能 生成 正常 的 阻 过 蛋白 ， 其 操纵 基因 
也 属 正常 但 色 氨 酸 合成 酶 比 正常 的 要 高 ， 且 在 缺乏 色 氨 酸 时 ， 转 
录 速 率 也 较 高 。 于 是 大 们 将 这 种 突变 株 的 色 氨 酸 操 纵 子 的 序列 与 
野生 型 《正常 ) 的 进行 比较 ， 发 现在 突变 株 中 ， 启 动 区 一 操纵 
区 避 面 和 第 一 个 结构 基因 之 前 有 50 对 碱 基 缺 失 。 正 是 这 一 短 
序列 的 缺失 造成 了 色 氨 酸 合成 酶 mRNA 合成 的 非 转录 调节 〈 定 制 
型 转录 )。 在 分 析 野 生 型 和 突变 株 大 肠 杆 菌 中 色 氨 酸 操纵 子 的 
maNA 的 开头 部 份 及 靠近 启动 区 的 DNA 时 ， 发 现 了 细菌 转录 的 
一 种 新 的 调节 机 制 。 原 来 ， 在 色 氨 酸 操 纵 子 的 第 一 个 结构 基因 的 
蛋白 质 合 成 起 始 位 点 (AUG) 上 游 ， 还 转录 有 一 段 含 162 核 苷 酸 的 
mRNA， 称 为 先导 序列 。 在 色 氨 酸 含量 丰富 时 ， 野 生 型 细胞 也 转 
录 少 量 的 先导 mRNA5; -在 色 氨 酸 医 缺 时 ， 转 录 的 则 是 包括 先导 序 ， 
列 在 内 的 操纵 子 全 部 编码 序列 。 当 色 氢 酸 来 源 丰 富 时 ， 终 止 作 用 
的 控制 发 生 在 全 长 度 mRNA 的 第 140 个 核 苷 酸 上 。 即 使 在 全 长 度 的 
mRNA 大 量 转录 时 ,先导 序列 的 分 子 也 比 全 长 度 的 mRNA 来 得 多 。 
这 种 情况 说 明 ， 先 导 序 列 含有 一 个 衰减 区 ， 对 其 后 面 一 定 距离 的 
转录 行使 “否决 取 ”。 当 色 氨 酸 匮 缺 时 ， 只 有 25 一 50% 的 RNA 聚 
合 酶 得 以 越过 训 减 区 ， 而 在 色 氨 酸 丰 富 时 ， 也 出 现 一 些 转录 ， 但 
转录 物 全 部 是 短 的 。 

因此 ， 当 色 氨 酸 供应 充足 时 ， 该 操纵 子 不 仅 受 控 于 阻 晕 物 对 
操纵 基因 的 作用 ， 也 受 控 于 离 起 始 位 点 140 个 核 苷 酸 处 的 RNA 合 
成 所 引起 的 衰减 效应 。 越过 衰减 区 的 RNA 聚合 酶 的 分 子 的 数目 
精确 地 取决 于 培养 基 中 色 氨 酸 的 浓度 。 这 可 以 用 一 个 “微调 钮 ， 
来 作 比喻 。 通过 这 种 微调 ， 将 色 氨 酸 合成 酶 的 生成 量 和 色 氨 酸 的 
需要 量 平衡 了 起 来 。 在 上 面 提 到 的 突变 株 中 ， 人 缺失 了 衰减 区 ， 因 


此 不 管 是 什么 条 件 都 有 更 多 的 全 长 度 mRNA 的 合成 。 


9? 省 J5 9 


这 种 衰减 弱 作 用 显然 与 mRNA 先导 序列 的 分 子 内 相互 作用 有 
关 。 色 氨 酸 操纵 子 的 全 部 序列 已 经 搞 清 ， 先 导 序列 可 以 广泛 地 进 
行 分 子 内 的 碱 基 配 对 。 如 图 (2-15) 中 1 区 可 以 和 2 区 进行 碱 基 配 
对 ， 而 3 区 和 4 区 也 可 以 配对 形成 非 因子 依赖 的 终 正 位 点 ( 见 前 )， 
即 GC 含 量 高 、 发 卡 结构 和 U 成 吕 出 现 。 但 是 先导 序列 也 有 另外 的 
碱 基 配 对 方式 ， 即 2 区 与 3 区 配对 ， 形 成 一 种 防止 形成 典型 的 终止 
位 点 的 结构 。 这 即 预示 着 先导 序列 的 转录 可 能 采用 两 种 构 型 当中 
的 一 种 进行 :一 种 情况 是 ， 转 录 在 先导 序列 末端 终止 ， 另 三 种 情 
况 则 允许 转录 整个 操纵 子 的 mRNA。 这 是 一 个 广泛 被 接受 的 模型 : 

根据 这 一 模型 可 以 看 出 ， 选 择 哪 一 种 构 型 进行 转录 将 取决 于 
色 氨 酸 的 浓度 。 因 为 在 先导 序列 转录 物 的 1 区 中 含有 两 个 连续 的 
UGG 码 组 ， 这 在 大 肠 社 菌 基因 组 内 是 很 为 罕见 的 一 种 码 组 。 人 们 
注意 到 ， 当 色 氨 酸 供应 充足 ， 载 荷 后 的 色 氨 酸 训 NA 将 会 与 UGG 
码 组 发 生 作 用 而 不 致 延误 核 蛋白 体 的 转译 进程 。 先 导 序 列 将 迅速 
被 转译 ， 而 且 核 蛋白 体 将 紧 紧 地 尾随 在 RNA 到 合 酶 后 面 ， 使 转录 
有 多 快 ， 转 译 也 有 多 快 。 这 样 当 1 区 转译 完 后 ，2 区 也 处 于 转译 过 
程 而 不 容 2 区 与 3 区 进行 配对 。 这 种 情况 下 ，3 区 和 4 区 的 碱 基 配 
对 就 没有 任何 障碍 ， 因 而 使 转录 停止 。 因 此 ， 如 果 色 氮 酸 含量 充 
足 ， 将 只 有 先导 序列 的 162 个 核 昔 酸 得 以 转录 ;， 而 色 氨 酸 短缺 则 
是 另外 的 一 种 情况 。 因 为 色 氨 酸 tRNA 无 荷 可 载 (或 具有 少量 载 
荷 的 色 氨 酸 tRNA)， 核 蛋白 体 的 行进 放 慢 ， 使 它 停止 在 双 连 的 色 
氨 酸 码 组 上 ， 而 远 远 落后 于 RNA 育 合 酶 ， 并 腾 出 时 间 让 2 区 与 3 区 
进行 配对 。 次 后 的 情形 是 3 区 与 4 区 不 能 配对 而 形成 衰减 结构 ， 将 
RNA 聚 合 酶 放行 越过 先导 区 进入 结构 基因 上。 

显然 ， 这 个 模型 赖 以 根据 的 是 原核 生物 中 转录 和 转译 之 间 的 
看 联 关 系 。 它 也 依据 着 核 蛋 白 体 停止 位 点 与 2 区 和 3 区 之 间 的 空间 
关系 。 已 经 积累 了 许多 例证 支持 这 一 模型 。 例 如 ,先导 序列 碱 基 药 
改变 或 缺失 突变 可 以 改变 彼此 指 碱 基 配 对 能 力 # 先导 序列 对 核糖 
核酸 酶 敏感 等 等 ,都 与 先导 序列 内 有 碱 基 配对 的 预测 是 相 吻 合 的 。 
其 它 种 属 细 菌 中 ， 色 氨 酸 操纵 子 先导 序列 也 保留 着 相 毗 邻 的 色 氨 


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:继续 转录 
作用 :天 


侠 2-15- 《ay) 色 所 酸 操 纵 子 mRNA 的 先导 序列 可 以 通过 1 和 ?2 区， 也 
导 可 以 通过 3 和 4 区 ;或 ?和 3 区 之 间 形 成 发 卡 型 结构 (b) 在 防止 3 和 4 
区 之 间 的 发 卡 型 结构 的 形成 中 ， 核 蛋 白 体 显然 起 着 重要 的 作用 ,当先 
go 3 和 14 区 之 间 不 形成 配对 , 则 转录 得 以 钨 续 


e 了 7 。 


酸 码 组 。 但 是 最 重要 的 证 据 可 能 是 来 自 对 其 它 氨 基 酸 合成 的 操纵 
子 的 研究 。 例 如 ,组 氨 酸 操纵 子 的 先导 序列 具有 6 个 紧 挨 在 一 起 的 
组 氨 酸 码 组 ， 亮 氮 酸 操纵 子 的 先导 序列 有 4 个 这 联 着 的 亮 氨 酸 码 
组 ;而 苯 丙 氨 酸 操 纵 子 的 先导 序列 中 ， 有 一 眉 9 个 码 组 的 序列 中 
竟 有 7 个 码 组 是 蘑 丙 氨 酸 的 。 受 苏 氨 酸 和 异 亮 氨 酸 调节 的 苏 氨 酸 
操纵 子 的 先导 序列 中 一 段 13 个 码 组 的 序列 中 竟 包 括 8 个 苏 氨 酸 码 
组 和 4 个 异 亮 氨 酸 码 组 。 同 样 受 亮 氨 酸 、 顷 氨 酸 和 蜡 亮 氨 酸 调节 的 
异 亮 氮 酸 操纵 子 中 ， 其 先导 序列 的 一 段 17 个 码 组 竟 序 列 分 别 也 包 
含 着 4 个 亮 氮 酸 码 组 ,5 个 异 亮 氨 酸 码 组 和 6 个 妥 氨 酸 码 组 。 所 有 这 
些 操纵 子 都 保有 如 像 色 氨 酸 操纵 子 先导 序列 中 的 那 种 次 级 结构 。 

(4) 反 终 止 作 用 因子 (antitermination factor) 如 果 不 考 
虑 核 蛋白 体 防 止 先导 序列 3 区 和 4 区 的 RNA-RNA 配对 结构 的 
形成 ， 那 未 衰减 作 用 则 是 由 DNA 序列 本 身 所 决定 的 ， 或 多 或 少 
带 有 一 些 自发 的 色彩 。 相 反 ， 反 终止 作用 是 由 蛋白 质 调 节 的 。 
在 和 鸣 菌 体 的 裂解 周期 中 ， 病 毒 的 许多 基因 顺 次 表达 ， 这 个 过 程 
的 初级 调节 发 生 在 转录 终止 的 层次 ， 是 由 反 衰 减 蛋 自行 使 的 调 
节 。 
前 面 已 经 提 到 ， 和 叭 菌 体 乍 一 感染 细胞 ， 宿主 的 RNA 聚合 
酶 就 从 Pg 和 Pi 这 两 个 启动 区 往 相反 两 个 方向 去 转录 cro 和 N 这 两 
个 基因 。 cro 编码 的 蛋 折 是 抑制 阻 过 蛋白 的 作用 N 蛋白 则 是 一 
种 次 止 蛋 白 。 它 们 都 属 极 早期 基因 。N 蛋白 的 出 现 ， 使 得 下 一 组 
基因 〈 晚 早期 基因 ) 得 以 接着 表达 。 

(5) 赫 录 作用 的 反 终止 蛋白 “” 当 》 噬 苗 体 或 其 它 噬菌体 进行 
异 解 感染 后 ， 病 毒 基 因 便 按 四 裂 解 的 级 联 过 程 开 始 依次 表达 。 这 
一 过 程 的 基本 控制 发 生 在 转录 终止 上 ， 这 时 转录 终止 受 反 终 正 蛋 
白 抑制 。 

入 喉 菌 体 一 旦 感染 一 个 细胞 ，cro 和 N 基 因 便 由 寄主 RNA 聚 合 
了 酶 以 相对 方向 从 启动 区 Pg 和 Pi 转录 ， 这 两 个 基因 即 所 谓 早 时 期 基 
因 。 他 们 编码 反 阻 遏 蛋 白 cro 和 反 终 止 蛋 白 N 蛋 白 。N 蛋 自 能 合 列 
解 周期 继续 下 去 ， 即 允许 下 一 组 基因 即 晚 早期 基因 得 以 表达 。 具 


。T18。 


体 细节 录 下 ， 首先 ，N 蛋 白 的 存在 ， 使 RNA 聚 合 酶 得 以 通过 分 别 


位 于 N 和 Cro 基 因 37 端 依赖 于 p 的 终止 区 。(tr 和 ta) 进行 转录 有 晚 时 
期 基因 ， 它 们 包括 cI 和 ceIII 蛋白 ， 加 上 两 种 涉及 病毒 基因 组 复制 
的 蛋白 ， 一 系列 重组 功能 的 蛋白 以 及 另 一 个 反 终 止 蛋白 ，Q 因 子 。 
蛋白 Q 启动 叹 菌 体 最 后 的 一 段 基因 :所谓 晚期 基因 ， 它 们 编码 病 
毒 的 头 、 尾 蛋白 ， 这 两 个 蛋白 造成 宿主 细胞 裂解 。 晚 期 基因 的 转 
录 使 用 的 是 独立 的 启动 区 即 PEg。RNA 聚合 酶 一 般 情 况 下 也 使 用 
这 个 启动 区 定制 性 地 合成 RNA， 但 却 在 邻近 的 依赖 p 的 终止 区 名 
处 终止 ， 释 放出 6SRNA 的 194 个 核 背 酸 RNA。Q 蛋白 阻止 在 tf 处 
的 终止 作用 ， 多 许 RNA 聚 合 酶 通过 它 直 至 晚期 基因 的 转录 。 

N 蛋白 参与 中 期 早 基因 的 反 终 止 作 用 是 研究 得 最 广 泛 的 反 
终止 系统 。N 基因 编码 一 个 分 子 量 为 12000 的 蛋白 ， 它 对 4 基因 
是 高 度 专 一 的 反 终 止 蛋白 。 相 似 的 噬菌体 也 有 相应 的 蛋白 ， 但 它 
们 之 间 是 不 可 互 换 的 。 这 种 专 一 性 说 明了 该 蛋白 识别 ADNA 上 独 
特 的 位 点 ， 这 些 位 点 已 通过 使 功能 丧失 的 突变 作用 得 到 鉴别 。 它 
们 就 是 所 谓 N 蛋 白 利 用 位 点 CnutL 和 mutR)， 即 在 MXDNA 链 左 例 
E 和 和 之 间 和 链 右 侧 PR 和 她 之 间 的 17 个 bp 的 序列 ， 两 者 之 间 有 16 
个 bp 是 相同 的 ， 其 中 含有 5bp 反 向 对 称 : 


ABCGcToAAPpl AIAGGGCA 
TreeeeAcarraya TGecaer 
Re 忆 ee 


\ 


个 一 


这 一 序列 的 功能 也 已 得 到 证 明 ， 将 含 nutR 的 片段 置 于 非 和 启动 区 
和 终 焉 信号 之 间 进 行 克隆 。 这 时 ， 转 录 可 不 受阻 碍 地 进行 。N 与 
nut 一 道 可 使 转录 通过 任何 依赖 于 p 的 终止 区 。 

用 其 它 大 肠 杆菌 突变 体 可 以 说 明 ， 至 少 有 五 个 宿主 蛋白 即 所 
谓 N 利 用 物 基 因 (mas) 参 与 反 终止 作用 即 nusA 至 已 。 其 中 mxsD 编 码 
p 蛋 白 ，2uwsC 编 码 RNA 聚 合 酶 的 8 亚 基 ,说明 N 蛋 白 和 聚合 酶 的 这 
一 部 份 相互 作用 。nausA，masB 和 nsE 作 用 的 重要 性 也 已 得 到 证 
明 ， 因 为 在 离 体 转录 反 终止 系统 中 ， 都 需要 这 三 个 蛋白 质 ， 但 是 
它们 作用 的 模式 尚 不 清楚 。zssA 基 因 编 码 一 个 分 子 量 为 69000 与 N 


o 虽 了 JO9 。 


人 


蛋白 结合 的 蛋白 质 。 它 也 能 与 释放 出 5 因子 之 后 的 RNA 育 合 酶 核 
心 酶 等 分 子 量 地 结合 ， 但 不 是 取代 cs 因 了 于 。 对 于 RNA 育 合 酶 全 醇 
的 亲和力 要 低 得 多 ， 但 是 最 近 证 明 ， 它 特异 性 地 与 p 结合 。 这 个 
蛋白 质 的 DNA 结 合 位 点 即 所 谓 和 框 的 契合 序列 是 ; 


C 
5 


但 最 近 的 结果 有 些 矛 盾 , 即 证 明 该 蛋白 更 多 地 与 该 MmRNA 结 合 
而 不 是 与 DNA 结 合 。 

另 一 个 反 终 止 蛋 白 即 Q 和 蛋白 ,分子量 为 23000， 看 来 依赖 于 较 
少 药 宿主 蛋 急 质 。 在 离 体系 统 中 ， 它 与 RNA 聚合 酶 及 pus 可 以 读 
过 tx 终止 区 。mss 蛋 白 是 唯一 的 附加 蛋白 因子 ;在 pwsA 存 在 下 , Q 
蛋白 与 RNA 聚 合 酶 结合 ， 引 起 它 通读 1 晚期 基因 操纵 子 中 早期 的 
一 个 终 业 位 置 。 

E. cofi TRNA 基因 也 有 反 终 止 作用 ， 前 面 说 过 ， 转 录 和 转 
译 的 去 偶 联 造成 了 衰减 作用 而 使 得 转录 过 早 终止 ， 新 生 的 转录 物 
可 以 折 琶 成 二 级 结构 诱导 终止 作用 。 显 然 ， 非 转译 操纵 子 例如 编 
玛 职 NA 的 操纵 子 ， 必 定 不 包含 早期 终止 作用 位 点 ， 另 一 方面 必 
定 含 有 一 些 其 它 的 反 终 止 作用 机 制 。 事 实证 明 ， 将 终 砷 信号 引 六 
rDNA 是 不 起 作用 的 。TDNA 的 启动 区 与 先导 序列 能 够 修饰 NA 
聚合 酶 ， 使 它 可 通读 转录 终止 作用 信和 号。 ”各 

12 一 RNA 聚 合 酶 的 修饰 _ 

前 面 说 过 ，RNA 聚 合 酶 核心 酶 与 DNA 结 合 是 非 专 一 性 的 ,只 
有 在 因子 参与 时 才 专 一 性 地 与 启动 区 结合 而 起 始 转录 ,换言之 ， 
原核 生 有 物 转 录 起 始 的 特异 性 是 由 oa 因子 与 民 NA 聚合 酶 核心 酶 的 结 
谷 所 决定 的 。 不 同 种 类 启动 区 是 由 一 系列 启动 区 特异 的 co 因子 所 
识别 。 枯 草 社 菌 有 一 系列 的 c 因 子 与 其 RNA 聚合 酶 结合 其 中 的 
一 个 与 大 肠 杆菌 c 因子 相当 , 称 为 055, 原 定 其 分 子 量 为 55000 于 该 
酶 的 序列 已 搞 清 ， 含 371 个 氨基 酸 ， 淮 确 的 分 子 量 为 4000， 因 此 
改称 为 543。 它 和 了 .coti 的 5 因子 同 源 ， 同 样 识别 启动 区 的 序列 从 
~10 到 -- 35 区。 3 


20。 


除了 6 以 外 ， 枯 草 杆菌 的 营养 细胞 起 码 含有 三 个 c 因 子 ， 同 
样 根据 分 子 量 称 为 23，c3? ，03 。 它们 中 的 一 些 在 细 草 从 对 数 
生长 期 转 到 静 引 期 后 其 含量 升 高 。a2: ?还 可 在 孢子 形成 时 出 现 , 以 
应 答 营 养 枯竭 。 这 些 因子 都 能 改变 RNA 聚 合 酶 对 局 动 区 识别 的 特 
异性 而 指令 不 同 基 因 前 表达 ( 表 2)。 

0 因子 看 来 在 绍 菌 生长 的 静止 期 起 着 某 种 作用 。 在 晚 对 数 期 
63 的 酶 含量 增加 ， 在 离 体 条 件 下 ， 指导 着 在 静止 期 才 表 达 的 基 
因 药 转录 。 男 一 个 在 生长 期 和 旱 静 止 期 都 表达 的 基因 含有 a”“ 和 
0 "识别 的 启动 区 ， 说 明了 该 基因 的 表达 在 细菌 快速 生长 时 志 a”… 
了 NA 育 合 酶 调控 ,而 当 细菌 准备 孢子 形成 时 ， 则 由 0"* "RNA 娟 合 
酶 调控 ;同样 在 开始 孢子 形成 时 ， 激 活 的 spoVG 基因 也 有 二 个 局 
动 区 ， 各 含 c2 7 和 as8: 的 识别 序列 .spoVG 调控 很 复杂 ,还 不 知道 这 
种 双重 启动 区 如 何 起 作用 。 含 c2:* 的 RNA 聚合 酶 也 是 营养 细胞 的 
稀有 成 份 ， 它 在 孢子 形成 的 一 个 小 时 内 突然 消失 ， 因 此 看 来 ， 它 
对 于 少数 基因 的 转录 作用 是 特异 的 。 0 "可 能 参与 从 营养 生长 到 
孢子 形成 这 一 转变 过 程 。 相 反 ，0:? "是 孢子 形成 所 特异 的 RNA 到 
合 酶 成 分 ， 人 性 转 
录 因 子 。 


表 2 ”枯草 杆菌 的 5 因子 


具 :。 ,区 全 让 上 和 
0 因子 来 源 及 使 用 


-35 区 - 10 区 
”axatos5) 汗 长 红 胞 TTGACA TATAAT 
.028 生长 细胞 CTAAA CCGATAT 
aa33 革 长 细 隐 AAATC GT 
as17 村 长 细胞 2 
029 莉 子 形成 草 陷 一 一 TT-AAA CATATT 
09528 受 感 染 绸 胞 让 入 GE 大 GEAY 末 下 TT TIE 


09pssr84 受 匡 桨 细胞 CGTTAGA GATATT 


枯草 杆菌 鸣 菌 体 Spol 本 身 的 繁殖 则 利用 构 型 可 变 的 细菌 RNA 
“121。 


育 合 酶 进行 控制 。 它 的 三 个 基因 :基因 28、33 和 34， 编 码 5 多 肽 。 
这 类 co 多 肽 利用 宿主 细胞 聚合 酶 去 改变 对 启动 区 的 识别 作用 :正如 
在 和 只 菌 体 中 所 看 到 的 那样 ， 病 毒 基 因 可 分 成 三 个 转录 区 : 一 个 
在 感染 的 早期 表达 ， 第 二 个 在 裂解 周期 的 中 期 转录 ; 第 三 则 在 肥 
解 晚期 转录 。 病毒 早期 基因 的 启 动 区 被 带 有 a48 多 肽 的 宿主 聚合 
酶 识别 。 早 期 基因 之 一 的 基因 28 所 编码 的 类 ao 蛋白 ,分 子 量 26000， 
可 导致 宿主 RNA 聚 合 酶 去 识别 并 开始 中 期 基因 的 转录 。 另 外 中 期 
基因 即 基 因 33 和 34 所 编码 的 类 蛋白 (os 和 oses4) 则 指导 宿主 聚 
合 酶 转录 晚期 基因 有。 

RNA 聚合 棍 全 酶 有 多 种 型 式 控制 特异 基因 表达 的 例子 不 胜 
枚 举 。 不 久 前 还 认为 了 .coli 整 个 基因 组 的 转录 起 始 的 特异 性 是 由 
5 因子 所 控制 。 然而 ， 现在 知道 对 热 激 蛋白 调节 子 起 调节 作用 的 
htpR 基因 产物 是 一 种 类 c 蛋白 。 同样 ， 形态 复杂 的 丝 状 链 霉 菌 
(Streptomyces coelicolor) 中 也 至 少 有 两 种 独特 的 含 不 同 a 因 子 的 
RNA 聚 合 酶 全 酶 。 它 们 识别 不 同 的 启动 区 ， 也 许 还 参与 细菌 复杂 
的 分 化 。 根 瘤 菌 的 固氮 基因 之 一 的 HtrA 基 因 产 物 也 是 ac 因子 。 

:对 BE. coli 的 c" "因子 ， 枯 草 杆菌 中 的 ac4s 因 子 ，E. coli 热 激 类 
蛋白 Htpr 和 枯草 杆菌 诱导 孢子 形成 的 蛋白 SpclIG 〈 也 许 与 c28 相 
同 ) 进行 比较 后 发 现 ,所 有 这 四 种 蛋白 内 部 都 具有 一 个 高 度 保守 
区 域 ;:-c 因 子 可 能 通过 它 击 结合 到 RNA 聚合 酶 士 。 -这 四 个 蛋白 的 
.C 端 区 都 呈现 出 与 前 面 所 说 的 阻 过 蛋白 和 活化 蛋 自 中 o 螺旋 - 福 
片 -2 螺旋 的 那 种 构象 。 而 这 正 是 识别 有 关 驾 基因 启动 区 的 叙 自 
质 中 DNA 结 合 区 的 特征 。 

全 全 过 

和 子 操纵 子 中 各 基因 相对 性 表达 的 调控 

原核 生物 中 ， 功 能 相关 的 一 些 基因 往往 有 机 地 组 织 成 为 多 顺 
反 子 的 操纵 子 。 这 种 基因 布局 使 得 这 些 基 因 的 诱导 和 阻 过 很 容易 
协调 一 致 ， 但 却 使 其 中 各 个 基因 的 相对 性 表达 造成 了 困难 。 由 于 
操纵 子 中 各 个 基因 都 是 由 同一 个 启动 区 负责 转录 ， 因 此 相对 性 表 
达 必 定 伴 随 闭 转 录 终 止 于 操纵 子 中 间 ， 或 者 各 个 基因 转译 成 蛋白 
质 时 效率 上 的 不 同 ， 两 者 必 居 其 一 。 转 译 效 率 上 的 差别 可 能 有 两 


2 TZ22。 


种 原因 ， 一 是 各 mRNA 的 核 蛋 
mRNA 降解 速度 的 不 同 。 


人 
最 近 3 一 4 年 间 ，mRNA 稳 定性 的 差别 在 决定 基因 表达 上 的 重 


要 性 已 经 越 来 越 看 得 清楚 了 。 不 同 的 mRNA 具有 不 同 的 衰变 速率 。 
在 许多 情况 下 。 特 定 mRNA 的 半衰期 是 随 着 环境 的 变化 而 变化 ,而 
这 种 变化 在 某 种 方式 上 是 与 nRNA 的 稳定 性 在 基因 表达 调控 中 的 
作用 是 相 一 致 的 。 但 是 ,决定 RNA 稳 定性 的 因素 及 其 在 调控 基 因 
的 表达 中 的 精确 作用 还 是 极 不 明了 。 

在 大 肠 杆 菌 中 ， 存 在 着 两 种 与 npRNA 降 解 有 关 的 酶 ， 即 核 炉 


:核酸 酶 I(RNaseJI) 和 多 核 苷 酸 构 酸化 酶 。 这 两 个 酶 都 是 37->5/ 


处 切 核 糖 核酸 酶 。 大 肠 杆 菌 中 尚未 鉴别 出 5 一 3 外 切 活 性 的 核糖 


:核酸 酶 。 因 此 ,对 这 些 3 一 5“ 外 切 酶 具有 阻碍 作用 的 序列 结构 ( 倒 


如 mRNA 中 稳定 的 二 级 结构 一 一 茎 环 结构 或 称 发 卡 式 结构 ) 有 可 
能 专 一 性 地 使 RNA 上 游 得 以 稳定 。 
洪 它 因子 也 可 以 影响 mRNA 的 衰变 。 例 如 ， 核 蛋白 体 的 有 无 


-及 转译 速率 等 都 可 改变 mRNA 的 稳定 性 ， 这 可 能 是 由 于 核糖 体 可 
也 防止 mRNA 被 核糖 核酸 酶 水 解 的 缘故 。 内 切 酶 的 专 一 性 切割 可 


以 暴露 出 新 的 3“ 端 而 引起 3 一 5 外 切 酶 的 进一步 水 解 。 最 好 的 例 


了 村 是 i 史 菌 体 的 整合 酶 (integrase)mRNA 被 核糖 核酸 酶 II (RNase 


II) 的 切割 。 前 面 说 过 ， 在 4 感染 早期 ，N 和 蛋白 的 出 现 可 引起 反 终 
业 作 用 。 实 际 十， 这 时 从 Pi 开始 的 转录 一 直 疝 左 进行 ， 通 过 it 基 
因 ( 整 合 酶 基因 )， 六 且 遇 到 it 基因 的 终止 区 (TD 也 不 终 业 。 这 一 
通读 的 转录 物 在 3′ 端 非 转译 区 形成 一 个 很 大 的 发 卡 式 结构， 被 
RNaselII 识 别 和 切割 。 经 此 切割 后 , 这 个 转录 物 被 笨 主 的 外 切 核酸 
酶 迅速 水解 。 只 有 到 感染 晚期 ， 整 合 酶 基因 才 由 另 一 个 启动 区 转 
录 而 终止 手 Tr， 形成 具有 功能 的 mRNA。 这 一 mRNA 所 形成 的 发 
卡 式 结构 较 小 ， 不 被 RNaseITI 切 割 ， 从 而 增加 了 该 mRNA 的 稳 定 
性 。 在 大 肠 杆 菌 的 Iac 操纵 子 和 8a7 操纵 子 中 ， 多 顺 反 子 mRNA 内 
部 也 有 内 切 酶 的 特异 性 位 点 。 它 们 对 mRNA 的 衰变 也 具有 起 始 的 
作用 ， 从 而 影响 它们 的 转译 。 


es 


那 末 ， 在 一 个 多 顺 反 子 操纵 子 中 不 同 基因 的 mRNA 片 外 的 稳 
定性 的 差别 是 否 可 以 决定 基因 的 相对 性 表达 呢 ? 在 许多 操 织 子 中 ， 
各 个 基因 的 mRNA 片段 已 经 发 现 有 稳定 性 指 差异 ;站 许 多 场合 下 ， 
mRNA 的 不 同 片 仆 的 稳定 性 与 其 所 产生 的 各 蛋 自 质 相对 量 之 间 也 
aosqmiaippatpitnajic ae 
可 以 调控 基因 的 相对 性 表达 。- 

笑 面 所 说 的 发 卡 型 秒 构 导致 了 mRNA 对 内 切 核酸 茧 的 向 大 
性 。 相 反 的 情况 也 存在 。 在 大 肠 杆 菌 和 水 门 氏 菌 中 发现 了 一 种 
高 麻 保 守 的 反 向 重复 序列 〈 简 称 REP) 对 mRNA 的 稳定 性 起 着 重 
要 的 决定 作用 。 在 大 肠 杆菌 染色 体 中 ， 这 种 REP 信 计 含 有 500 至 
1000 找 贝 ， 它 们 和 mRNA 一 道 被 转录 ; 或 者 出 现在 转录 物 的 3 请 
的 非 转录 序列 中 ， 或 是 在 基因 间 的 区 域 。 它 们 有 着 形成 发 未 式 结 
构 的 潜在 可 能 。 它 们 的 存在 可 以 增加 mRNA 上 游 部 芬 的 半衰期 ; 
而 对 下 游 部 分 则 无 甚 影 响 。 由 此 看 来 ,它们 可 以 防 出 3 人 >54 因 切 
酶 的 降解 作用 。 因 此 ，REP 序 列 在 一 个 多 顺 反 子 操纵 子 的 基因 间 
出 现 ， 可 以 专 一 性 地 使 上 游 mRNA 稳定 而 得 以 积 景 。 和 例如 大 肠 杆 
菌 mo1EFG 操 纵 子 的 mafE 和 mofF 基因 之 间 存 在 两 个 了 REP 序列 。 
mofE 基 因 所 编码 的 蛋白 在 细胞 外 周 存在 ,一 般 比 与 网 结合 指示 CIF 
和 malG 蛋 白 含量 多 20 一 40 倍 。 如 果 这 两 个 REP 序 列 在 染色 体 王 矶 
失 ; 不 仅 造成 上 游 的 malERNA 不 稳定 ， 而 且 使 molE 蛋 自 的 痊 成 
减少 9 倍 -REP 以 及 其 它 能 使 土 游 mRNA 稳定 性 增加 药 序 列 的 广泛 
存在 ， 说 明 这 种 基因 调控 机 制 可 能 是 相当 普遍 的 。 


(二 ) 真 核 生物 基因 的 表达 与 调控 


真 核 生 物 基因 调控 的 分 子 基础 是 当今 生物 学 研究 最 活跃 药 额 
域 。 纵 观 经 典 遗 传 学 的 整个 发 展 史 ， 其 宗 尼 正 是 期 望 揭示 基因 如 
和 何 参与 导致 动 植物 发 育 的 一 系列 控制 程序 。 分 子 生 物 学 ,尤其 是 
基因 工程 的 兴起 使 对 基因 调控 的 认识 无 论 在 深度 和 广度 土 都 取得 
了 很 大 的 进展 。 当 然 尚 有 许多 问题 或 难题 有 待 解决 训 这 一 部 分 ， 
我 们 想 要 重 温 一 下 所 取得 的 进 层 和 检 林 一 上 握 采 居 棋 本 全 合生 

。124 。 


枚 = 
2 

真 核 基因 调控 的 研究 范围 

基因 调控 是 牵制 和 确保 不 同 细胞 各 种 蛋白 质 合成 在 速率 上 的 
差别 的 一 套 复杂 的 相互 作用 。 这 种 有 差别 的 基因 表达 是 在 分 子 水 
平 上 的 不 同 层次 调节 mRNA 形成 和 利用 的 结果 s - 蛋 自 质 合成 的 不 
同 主要 源 于 转录 的 不 同 。 换 句 话说 基因 表达 的 调节 很 大 一 部 分 是 
在 转录 水 平 上 。 当 然 ， 真 核 生物 基因 调控 的 因素 中 还 可 能 包括 ; 


镶 细 胞 核 内 RNA j 的 加 工人 胞 质 中 mRNA 不 同 的 稳定 
竹 必 mRNA 有 差别 地 转译 威 蛋 白质 。 此 外 ” 影响 基因 表达 的 还 


有 染色 体 局 部 的 放大 或 重 排 。 
。 我 们 现在 对 基因 调控 的 分 子 细节 的 认识 以 及 对 调节 线路 的 逻 
辑 看 法 大 多 来 源 于 对 原核 生物 的 研究 。 与 真 核 生物 相 比 ， 原 核 生 
物 基因 表达 的 调控 要 简单 得 多 。 它 们 在 有 限 的 生命 周期 中 ， 所 要 
完 减 的 功能 也 有 限 。 细 菌 面 对 着 直接 的 营养 环境 和 自然 环境 ， 调 
节 着 各 种 酶 的 机 构 ， 通 过 转录 调控 ， 基 因 可 送 地 关闭 或 打开 ， 以 
便 更 好 地 生长 和 繁殖 。 也 难怪 ， 这 就 是 它们 的 生活 目的 ! 

有 些 真 核 细胞 ， 比 如 酵母 细胞 ， 看 来 也 主要 是 为 了 生长 而 花 
费 许 多 基因 去 调节 对 环境 的 适应 。 高 等 动 植物 的 - 些 器 官 〈 比 如 
肝脏 ) 中 的 -- 些 基因 也 可 着 地 对 外 部 刺激 进行 反应 。 但 是 外 界 影 
响 对 它们 来 说 是 比较 间接 的 ， 许 多 细胞 所 经 受 的 是 一 种 严格 控制 
的 环境 。 因 此 在 多 细胞 生物 中 ， 负 责 对 外 部 环境 变化 进行 反应 是 
少数 的 基因 。 它 们 的 基因 调控 最 大 的 特征 和 最 主要 的 方面 是 去 实 
现 某 个 受 控 的 发 育 途 径 ， 以 使 在 正确 的 时 间 里 在 正确 的 细胞 中 激 
活 正 确 的 基因 。 大 多 数 情况 下 ， 这 种 发 育 程 序 在 某 一 细胞 中 是 不 
可 逆 和 不 可 重复 的 ， 许 多 分 化 了 的 细胞 〈 例 如 皮肤 细胞 ,红细胞 ， 
眼球 的 晶状体 细胞 ， 抗 体 生成 细胞 等 等 ) 沿 着 一 条 道 走 下 去 ， 直 
至 死亡 且 不 生 后 三 。 显 然 ， 导 致 分 化 的 基因 调控 的 一 定 程式 是 服 
从 于 整体 的 需要 ， 而 与 由 环境 刺激 的 基因 调控 不 同 ， 后 者 是 保证 
每 个 细胞 生长 和 增殖 之 所 必需 。 

因此 ， 高 签 生物 基因 表达 的 调控 往往 有 着 严格 的 不 可 倒 ; 
时 序 性 ， 或 者 说 时 间 特 异性 。 这 种 时 间 特 异性 表达 往往 又 在 某 种 

-TO5 


形式 上 从 空间 特异 性 反映 出 来 。 肝 脏 组 织 所 表达 的 二 些 基 因 ， 在 
脑 组 织 中 可 能 一 生 一 世 不 会 合用 一 次 ,反之 亦 然 。 从 微观 角度 说 ， 
核 中 以 染色 质 形式 存在 的 DNA 所 结合 的 蛋白 质 与 基因 表达 密切 相 
关 ， 细 胞 核 内 RNA 的 合成 与 转运 ， 细 胞 质 中 的 RNA 加 工 与 转译 
等 ， 这 些 空间 上 的 差异 ， 甚 至 于 转录 结构 之 一 的 各 个 增强 区 的 使 
用 ， 既 有 时 序 性 ， 又 有 组 织 特 异性 的 特征 。 而 基因 调控 在 发 育 分 
化 上 的 时 序 性 常常 富 于 空间 特异 性 《组 织 或 细胞 特异 性 ) 之 中 ， 
或 者 更 简单 地 说 ， 时 间 差 寅 于 空间 差 之 中 。 我 们 一 开始 就 引入 差 
别 转录 、 差 别 表达 或 差别 加 工 等 词语 ， 并 不 是 在 修辞 上 的 故 弄 玄 
虚 。 

原核 生物 基因 旋 控 各 级 水 平 的 机 制 是 由 于 调节 基因 的 发 现 及 
对 其 突变 的 分 析 研 究 才 得 以 阑 明 的 。 通 过 转 导 、 接 合 以 及 最 新 的 
DNA 重 组 技术 将 突变 的 调节 基因 重 排 、 重 组 等 ,这 些 手 段 对 了 解 
调节 基因 的 突变 如 何 影响 基因 活动 的 分 子 细节 有 着 重要 的 贡献 。 
有 的 调节 性 突变 只 在 同 域内 起 作用 (act in ecis)， 也 即 这 种 突 
变 必 须 与 受 调节 的 基因 很 靠近 ; 这 种 突变 是 影响 参与 RNA 合 成 调 
控 的 关键 序列 。 另 一 些 调节 性 突变 是 跨 域 起 作用 (act in traes) 
即 突 变 不 - 定 靠近 受 调节 的 基因 。 跨 域 作 用 的 调节 成 分 (trans-ac- 
ting regulatory element) 是 独立 编码 调节 蛋白 的 基因 ， 而 调节 蛋 
自 可 以 在 细胞 间 扩 散 ， 作 用 在 敏感 的 基因 上 。 前 面 我 们 提 到 过 的 
note RE 


击 册 四 妥 计 机 税 最 宙 用 到 济 在 各 二 丙 并 训 节 和 基 因 (如 增 强 
区 ) 。 真 核 生 物 转录 也 受到 跨 域 作用 因子 的 影响 ;虽然 如 何 起 作用 
的 机 制 知之 甚 少 ， 但 有 越 来 越 多 的 证 据说 明 ， 跨 域 作 用 因子 在 激 ， 
活 基因 时 总 伴随 着 染色 质 构 象 的 改变 、 染 色 质 所 结合 的 蛋 日 质 的 
变化 、 染 色 质 的 DNA 酶 敏感 度 增加 等 等 .细胞 核 本 身 就 是 原核 生 
牺 所 不 可 能 具有 的 特点 ， 何 况 染 色 质 高 度 复杂 的 结构 是 真 核 基因 
活动 的 重要 场所 ， 更 是 几乎 处 于 裸露 状态 的 原核 遗传 物质 所 规定 


126 


的 各 种 机 制 难以 比拟 的 。 
为 了 要 了 解 真 核 生 物 中 接 制 mRNA 的 浓度 及 其 利用 的 分 子 机 


制 ， 有 三 个 基本 问题 必须 贯 串 于 基因 调控 研究 过 程 的 始终 (图 2 一 
16)， 即 ， 


图 2-16 研究 基因 调控 的 三 个 问题 


钙 特 定 基因 的 表达 是 由 什么 信号 触发 的 ? 

@ 从 DNA 转 录 直 至 mRNA 被 利用 来 合成 蛋白 质 的 整个 连锁 反 
应 过 程 中 ， 对 特定 基因 行使 的 调控 发 生 在 哪 - 级 水 平 ， 亦 即 哪 一 
( 些 ) 步 又 上 ? - 

图 各 级 基因 调控 的 分 子 机 制 是 什么 ? 也 就 是 说 ， 哪 一 种 分 子 
或 细胞 结构 参与 基因 调控 ? 它们 如 何 行使 其 影响 ? 

对 这 些 问 题目 前 尚 难以 作出 完整 的 问答 ， 但 最 近 的 研究 已 经 
勾画 出 一 些 基 本 规律 。 的 天 省 让 我 们 怀 必 特有 本 基 寺 下 
题 答案 的 线索 去 综述 一 些 研究 资料 。 

1 . 真 核 生 物 基 因 调 控 的 信和 号 

这 里 所 说 的 基因 调控 信号 , 指 的 是 触发 基因 表达 的 一 些 物质 。 
这 些 基 因 表 达 的 触发 剂 ， 在 原核 生物 中 ， 诱 导 物 就 是 我 们 所 熟悉 
的 例子 。 真 核 生 物 中 ， 基 因 调 控 信 号 除了 细胞 外 的 诱导 物 之 外 克 
大 量 的 和 主要 的 是 机 体内 产生 的 一 些 引起 基因 表达 的 物质 ， 它 们 


SA 铺 罗 有 本 
攻 

站 

] 


本 身 也 就 是 机 体 生 长 、 发 育 和 分 化 期 间 的 产物 。 弄 清 它们 作用 机 
制 的 研究 对 阐明 真 核 基 因 调 控 机 制 可 能 起 着 重要 的 作用 ( 表 3)。 

(1)( 司 素 } 小 分 子 的 或 多 歇 的 一 均 可 能 发 基因 的 表达 

在 动物 中 ， 激 素 是 已 知 的 最 大 的 一 类 基因 信号 物 ， 尖 们 对 成 
年 机 体 和 生物 发 育 期 间 的 细胞 都 具有 深远 的 影响 。 有 一 些 激素 的 
作用 是 控制 某 些 基因 ， 有 的 则 影响 酶 和 细胞 结构 的 功能 。 每 一 种 
激素 都 是 由 一 种 细胞 类 型 产生 ， 通 过 血 流 分 泌 到 靶 细 胞 。 有 些 靶 
细胞 分 散在 许多 组 织 ， 而 有 些 则 集中 在 单一 的 组 织 中 。 许 多 激素 
(如 甲状 腺 激素 和 肾上腺 皮质 激素 ) 在 其 靶 组 织 中 影响 着 上 十 个 基 
因而 不 是 单个 基因 。 许 多 细胞 都 可 接受 来 自 这 些 激素 的 信和 号。 蛋白 
质 激素 (如 胰岛 素 和 生长 激素 ) 对 许多 细胞 类 型 有 类 似 的 影响 。 相 
反 ， 冲 乳 激素 只 刺激 乳房 组 织 的 腺 泡 细 胞 (acinar cell) 产 生 乳 蛋 
和 白质。 另外 有 一 些 激素 则 对 一 种 细胞 类 型 是 这 种 效应 ， 对 另 一 细 
胞 类 型 则 产生 另 一 种 影响 。 

除了 循环 系统 中 熟知 的 蛋白 质 和 国 丁 类 激素 外 ， 普 稚 动 物 中 
还 有 许多 蛋 和 白质， 它们 由 一 种 细胞 分 涛 ， 而 对 另 一 种 细胞 具有 强 
烈 的 影响 。 神 经 生长 因子 和 表皮 生长 因子 就 是 这 方面 的 例子 。 尚 
有 许多 其 它 的 蛋白 质 因 子 具 有 类 似 的 对 细胞 起 着 刺激 和 阻 滞 生 长 
的 效应 。 

还 有 一 些 蛋白 质 因子 有 更 特殊 的 功能 。 干 扰 素 就 是 一 例 。 二 
扰 素 是 一 蛋白 质 家 族 ， 包 括 20 至 25 种 低 分 子 量 蛋 白质 ;可 以 使 细 
胞 能 防止 各 种 病毒 的 生长 。 王 扰 素 处 理 过 的 细胞 会 产生 出 一 些 新 
合成 的 蛋白 质 ， 显 然 这 是 研究 基因 激活 的 很 好 模型 。 

已 知 可 作为 信号 分 子 的 激素 和 生长 因子 可 分 为 两 种 类 型 区 了 
可 以 进入 细胞 而 引起 效应 的 小 分 子 ， 如 类 国 醇 和 里 状 腺 激素 红 29 
与 细胞 表面 特异 的 受 体 结合 的 多 肽 或 蛋白 质 ， 它 们 大 多 在 未 进入 
细胞 之 前 即 发 生 作 用 。 当 然 ， 在 生物 学 中 一 件 东 西 可 以 使 用 两 个 
以 上 的 机 制 来 达到 同一 目的 是 屡见不鲜 的 。 因 此 毫 不 奇怪 有些 
蛋白 质 看 来 是 与 细胞 表面 结合 ， 后 来 则 转运 到 细胞 内 部 ， 而 它们 
或 它 们 的 旨 解 产物 即 成 为 触发 基因 活动 的 信号 因子: 


汪汪 


真 核 生物 中 某 些 基因 激活 信号 


举例 靶 位 

生长 激素 多 种 细胞 

沁 屯 激素 乳房 组 织 的 分 泌 细 及 

将 回 本 难 激素 肝 ; 嘛 。 生 殖 器 官 
亩 ， 责 肌肉 、 上 骨骼 皮肤 
.生殖 器 官 

循环 或 分 泌 神经 生长 因子 ，“ 轴 罕 《 分 化 中 的 神经 细胞 
前 蛋白 质 表皮 生长 因子 “多 种 表面 组 织 〈 皮 肤 、 眼 隧 等 ) 
以 及 所 有 类 型 的 培养 细胞 


白介素 (淋巴 介 素 ) ”白细胞 
造 红 血 素 元 红细胞 前 体 
干扰 素 大 多 数 表皮 细胞 、 白 细胞 
PDGFs (血小板 多 种 类 型 的 成 纤维 细胞 
来 源 的 生长 因子 ) 
-环境 
营养 信和 号， 
低 等 真 核 生 物 “负责 合 成 活动 〈 氨 基 酸 。 核 酸 组 
分 ) 的 基因 和 水 解 作 用 的 基因 
(磷酸 酶 、 糖 分 解 酶 ) 
动物 细胞 饥饿 时 糖 元 分 解 酶 
某 些 负责 合成 的 基因 (产物 过 量 


有 阻 过 作用 
热 刺激 特定 蛋白 质 〈 诱 导 的 ) 基 因 广 泛 
存在 于 动 、 植 物 中 
有 考 物 质 
药物 ,和 致癌 物 ”“ 肝 中 的 细胞 色 素 p-450 蛋白 ， 
重金 属 肝 、 肾 等 组 织 中 及 单 细胞 真 核 生 
物 中 盘 金 履 结 合 和 蛋白 
应 血 或 发 炎 白细胞 
的 产物 


汪汪 


(2) 细胞 之 间 的 接触 也 起 着 基因 调控 信号 的 作用 

多 数 激 素 和 一 些 生长 因子 要 达到 靶 细 胞 需 先 释 放 到 循环 系 
统 中 。 另 一 些 基 因 激 活 信号 则 需要 细胞 之 间 的 直接 接触 。 例 如 ， 
大 部 分 特 化 细胞 的 胚胎 决定 期 间 , 不 同类 型 的 细胞 必须 有 所 接触 ， 
这 些 相互 接触 的 细胞 分 别 来 自 不同 的 原 基 细胞 层 ， 如 间 质 (mess- 
enchymal) 细胞 (来 自 中 胚层 ) 与 内 胚层 或 外 胚层 细胞 间 的 相互 接 
触 。 细 胞 之 间接 触 所 传递 的 信息 的 性 质 尚 不 清楚 ， 但 表面 信号 可 
能 是 以 细胞 表面 蛋白 之 间 的 接触 为 媒介 导致 基因 的 调控 。 

相互 作用 也 可 能 是 更 为 间接 地 进行 ， 即 一 种 类 型 的 细胞 生成 
某 种 细胞 外 介质 ， 而 这 种 介质 与 另 一 类 型 细胞 接触 而 成 为 后 者 的 
信号 物 。 无 论 是 直接 接触 或 间接 接触 ， 都 意味 着 细胞 外 的 信息 向 
细胞 内 的 传递 。 

去 庸 讳言， 真 核 细 胞 基因 调控 信号 前 鉴别 是 远 远 不 够 。 已 经 
发 现 的 可 能 仅仅 是 具有 强烈 效应 的 信号 。 而 对 已 经 鉴别 的 信号 来 
说 ， 它 们 焉 和 纲 胞 相互 作用 后 如 何 起 到 凋 次 基因 前 作用 伪 称 项 妥 
花 大 气力 去 研究 。 

(3) 环境 和 营养 信号 

上 面 提 型 的 真 核 生 物 基 因 调 控 信 号 一 一 激素 、 生 长 因子 、 细 
胞 之 间 的 接触 等 等 一 一 跟 原 核 生物 所 碰 到 并 发 生 应 答 的 环境 信和 号 
是 绝 然 不 同 的 。 低 等 真 核 生 物 如 酵母 、 霉 菌 也 对 营养 环境 信号 发 
生 反 应 ， 并 且 其 糖 代 谢 、 无 机 盐 的 利用 和 氨基 酸 生物 合成 的 代谢 
途径 也 有 可 诱导 的 相应 酶 系 。 但 酵母 细胞 饥 饿 时 所 诱导 的 生物 合 
成 酶 系 与 原核 生物 饥饿 时 所 诱导 的 程度 并 不 相同 。 例 如 ， 酵 母 细 
胞 在 色 氨 酸 、 组 氮 酸 、 异 亮 氨 酸 和 纺 氨 酸 饥 饿 时， 这 些 氨基 可 的 
合成 酶 的 水 平 只 有 比 正常 水 平 高 2 一 10 倍 。 同 是 这 种 情况 ,大 肠 杆 
菌 则 会 高 出 上 百倍 。 

高 等 真 核 生 物 昌 然 也 有 一 些 基 因 负 责 对 营养 胁迫 进行 应 答 ， 
但 也 只 是 很 有 限 ， 许 多 基因 则 对 营养 要 求 毫 无 反应 。 哺 乳 动 物 的 
培养 细胞 对 不 同 营养 条 件 的 应 答 是 很 不 一 致 的 。 例 如 ， 大 多 数 哺 
乳 动 物 培养 细胞 可 以 合成 味 叭 和 喀 院 ， 无 需 在 培养 基 中 加 入 这 些 


。 T30 ， 


nm 


碱 基 。 但 是 如 果 加 入 腺 嗓 叭 ,经 过 几 代 之 后 , 则 细胞 中 DNA 和 RNA 
中 的 腺 嘎 吟 和 鸟 味 叭 100% 来 自 培养 基 中 的 腺 味 聆 而 如 果 加 入 尿 
喀 喧 作为 喀 啶 的 来 源 ， 则 只 有 50% 的 尿 将 和 胞 苷 是 来 自 培养 基 。 
显然 ， 腺 嗓 叭 或 其 衍生 物 成 为 一 种 信号 ， 导 致 味 叭 合成 途径 中 的 
至 少 某 种 酶 的 抑制 。 而 相反 ， 喀 啶 合成 则 继续 以 -- 种 比较 不 受 抑 
制 的 方式 进行 。 丝 氨 酸 和 甘氨酸 的 生物 合成 也 有 同样 情况 ， 即 使 
培养 基 中 有 这 些 氨基 酸 存在 ， 纲 胞 依然 合成 它们 。 因 些 ， 哺 乳 动 
物 细 胞 并 不 总 是 抑制 不 必需 的 酶 的 合成 。 

这 些 细胞 也 不 总 是 对 代谢 需要 作出 反应 ， 尽 管 它们 具有 必要 
的 基因 。 例 如 ， 肝 细胞 含有 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 (这 种 酶 将 葵 丙 氨 酸 
转换 成 酷 氨 酸 )。 但 培养 的 细胞 (包括 肝 细 胞 ) 即 使 在 酷 氨 酸 饥 狐 时 
也 不 能 把 茶 丙 氨 酸 转换 成 酷 气 酸 。 因 此 ， 营 养 条 件 并 非 一 定 是 哺 
乳 动 物 细 胞 的 信号 ， 像 细菌 和 酵母 那样 ， 调 整 它们 的 生物 合成 机 
构 合 成 其 需要 的 养分 和 抑制 不 需要 的 养分 的 生成 。 

动物 个 体 对 于 营养 的 变动 也 可 通过 蛋白 质 合成 来 作出 反应 ! 
例如 ， 如 果 一 个 大 白鼠 用 低糖 饲料 喂养 ， 则 其 肝脏 内 合成 葡萄 糖 
的 酶 (将 氨基 酸 转 换 成 葡萄 糖 ) 就 会 急剧 增加 ;而 如 果 再 喂 以 正 
常 含量 的 葡萄 糖 ， 则 这 些 酶 也 跟着 减少 。 肝 脏 内 为 满足 代谢 需要 
的 许多 应 答 性 反应 都 是 通过 影响 特定 mRNA 合成 和 稳定 性 的 激素 
来 调节 的 。 

肝脏 通过 从 胃 经 门静脉 而 来 的 血液 所 得 到 的 供应 不 仅 有 养分 
而 且 也 有 有 毒物 质 。 肝 细胞 对 许多 有 害 物质 有 去 毒 作用 ;它们 能 
产生 一 些 特殊 的 蛋白 质 来 代谢 这 些 有 害 物质 。 例 如 ， 锅 或 其 它 金 
属 的 存在 可 以 使 肝脏 金属 结合 蛋白 (metallcthionin) 增 加 。 金 属 结 
合 蛋 白 有 两 种 ,它们 都 是 分 子 量 小 的 蛋白 质 ( 每 一 种 都 是 由 61 个 氨 
基 酸 残 基 组 成 ， 其 中 包括 20 个 半 胱 氨 酸 残 基 ) ， 能 跟 重 金属 离子 
结合 而 对 其 毒性 有 上 防护 作用 。 在 肝 细 胞 网 中 ,有 一 组 称 为 细胞 色素 
P450 的 酶 有 时 会 增加 上 百倍 ， 以 帮助 机 体 清除 一 些 有 毒物 质 如 ， 
葵 巴 比 妥 ,可 待 因 和 吗啡 ,以 及 致癌 药物 等 。P450 酶 是 一 个 很 大 的 
家 族 ,分 别 由 不 同 的 基因 编码 ,分 别 对 不 同 的 有 毒物 质 作 出 反应 。 


9 1 了 。 


动物 中 大 多 数 细胞 如 果 遇 到 异常 物 则 不 仅 代谢 上 不 能 适应 ， 
而 且 车 营养 环境 变化 很 大 则 会 受到 损伤 。 例 如 ， 正 常情 况 下 , 输 “ 


送 到 大 脑 的 主要 是 葡萄 糖 ， 脑 细胞 利用 它 作 为 能 源 汪 天 类 有 一 种 
遗传 病 叫 半 乳 糖 血 定 。 这 种 病人 的 脑 细 胞 遇 到 半 入 糖 即 会 受 损 伤 
而 不 能 利用 它 。 奶 汁 中 主要 的 糖 是 乳糖 。 婴 儿 的 小 肠 与 肝脏 可 以 
把 乳糖 分 解 成 葡萄 糖 和 半 乳 糖 。 患 有 半 乳 糖 血 症 的 婴儿 不 能 代谢 
半 乳 糖 ， 致 使 血液 中 半 乳 糖 浓度 增加 ， 接 着 造成 严重 的 脑 损伤 。 

上 述 的 例子 说 明 ， 在 应 答 环境 信号 时 ， 培 养 细胞 和 动物 个 体 
内 的 细胞 中 有 一 些 基 因 是 可 被 调控 的 ， 但 并 不 是 所 有 组 织 的 所 有 
细胞 对 这 些 信号 有 同等 的 反应 性 ! 

总 而 言 之 ， 导 致 细菌 基因 表达 变化 的 许多 简单 的 环境 信号 也 
引起 单 细胞 真 核 生 物 基因 表达 的 变化 。 但 是 ， 多 细胞 生物 二 般 来 
说 对 这 类 信号 并 不 作出 反应 。 这 也 许 是 由 于 整个 机 体内 维持 着 稳 
定 的 正常 环境 。 即 使 哺乳 动物 对 环境 变化 的 应 答 偶 尔 也 是 通过 基 
因 调控 的 方式 ， 但 像 氨 基 酸 饥 俄 和 糖 供 给 的 改变 等 一 般 并 不 导致 
基因 调控 的 变化 以 适应 新 的 情况 。 

引起 基因 有 差别 表达 的 大 多 数 信号 一 般 是 使 细胞 去 完成 特殊 


的 任务 。 许 多 细胞 通过 它们 分 别 完成 的 特殊 任务 ， 将 导致 器 官 和 


整个 机 体 的 形成 。 这 些 信号 包括 激素 、 生 长 因子 。 尚 待 发 现 帮 汶 
信号 的 还 有 许多 其 它 的 分 子 ， 这 当中 包括 两 种 细胞 类 型 相互 枯 用 
表面 的 特定 分 子 。 

2 : 真 核 生物 RNA 的 合成 与 加 工 从 才 疝 训 江 昌 
机 而 有 和 RNRCG 拓 村 格 和 NA 转移 RNA 
和 信使 RNA) 的 合成 都 是 由 单一 的 RNA 聚 合 酶 所 催化 。 这 
作用 的 控制 决定 着 合成 哪 一 种 RNA ,因而 也 决定 着 合成 哪 -种 沟 
自 质 ， 因 为 mRNA 的 转译 是 紧 跟 在 其 转录 起 始 后 不 从 即 开始 。 磋 


” 核 生物 基因 的 表达 跟 原 核 生 物 的 有 显著 差别 (图 2 一 17): 


首先 ,大 多 数 真 核 生 物 DNA 都 处 于 眼 组 蛋白 捆 束 在 一 起 的 形 
式 形成 高 度 有 序 的 染色 质 结构 *DNA 与 组 蛋白 的 结合 使 它 较 不 容 
易 甚 至 很 难 进行 转 示 。 一 般 认为 ， 当 色 质 构造 的 变化 是 真 核 基因 


se JJ 了 2Q 


5 


邯 录 之 所 必需 。 这 与 原核 生物 DNA 容 易 进 入 转 录 状 态 形成 强烈 的 

对 照 。 在 细菌 中 ，DNA 不 与 蛋白 质 结合 成 一 种 严密 的 形式 ,特定 

基因 转录 的 起 始 与 停止 是 瞬间 可 就 的 事 。 在 单 细胞 真 核 生 物 中 ， 

许多 基因 转录 的 起 始 与 停止 也 可 能 采取 同样 迅速 的 反应 ， 但 多 细 

胞 生物 的 基因 调控 一 般 对 外 界 刺激 不 具备 快速 反应 的 性 质 。 
染色 质 本 


初始 RNA 
转录 物 | 核 RNA 的 加 工 
ee 


向 细胞 质 转送 
转译 ， 


图 2-17_ 真 核 生 物 mRNA 的 生成 有 四 个 方面 不 同 于 原核 生物 ; (1) 
被 转录 的 DNA 绕 在 一 个 组 蛋白 的 核心 上 。(2) 转录 时 选择 三 种 RNA 
聚合 酶 中 指 一 种 。(3) 初始 转录 物 都 不 是 TRNA、tRNA 或 mRNA 的 一 
种 完成 的 形式 ， 它 必须 在 细胞 核 内 加 工 成 其 最 后 的 形式 。(4) 只 有 向 
细胞 质 转送 后 ，mRNA 才 得 以 被 转译 。 


其 次 ， 真 核 生 物 中 ， 某 一 基因 乍 一 转录 时 ， 大 多 数 情 况 下 ， 
不 管 它 是 FRNA。tRNA 或 mRNA,， 其 初 各 各 和 所 有 光 
形式 ， 而 是 在 细胞 核 内 先 形成 一 种 前 体 RNA 分 子 , 并 在 那 里 受到 
一 些 化 学 修饰 ， 然 后 才 作 为 某 种 rFRNA .tRNA 或 mRNA 分 子 进入 
到 细胞 质 中 。( 实 际 上 ， 细 菌 的 rRNA 和 tRNA 也 是 由 前 体 RNA 分 
子 所 形成 》 真 核 mRNA 形成 时 的 修饰 通常 包括 拼接 。 由 于 编码 一 
种 蛋 自 质 的 基因 序列 往往 是 各 异 其 处 ， 因 此 ，mRNA 的 形成 必需 
将 各 部 分 的 转录 物 连 接 在 一 道 并 删除 其 间 揪 序列 。 

第 三 , 真 核 RNA 合 成 是 分 别 由 三 种 不 同 的 RNA 聚合 酶 来 执行 


2 要 洒 了 六 a 


CO 
间 
1 


的 。RNA 袁 合 酶 I 在 核 仁 中 负责 四 种 冰 NA 中 的 三 种 (28S;5.8S 和 
18SrRNA) 前 体 的 形成 。mRNA 的 前 体 分 子 的 合成 则 由 RNA 到 合 
酶 II 担任 。 而 RNA 聚合 酶 II 负责 一 些小 分 子 RNA (tRNA 及 5S 
rRNA) 或 其 前 体 的 合成 。 

第 四 ， 真 核 生物 的 转录 与 转译 不 像 原 核 生物 中 的 那 桩 偶 联 在 
一 道 进 行 。 真 核 生物 中 mRNA 合成 的 位 置 在 细胞 核 内 ;而 mRNA 转 
译 成 蛋白 质 则 在 细胞 质 中 进行 。 

真 核 生物 与 原核 生物 之 间 在 染色 体 结构 和 RNA 生成 上 的 这 
些 基 本 差别 表明 它们 前 基因 表达 调控 机 制 也 有 不 同 。 

(1) 真 核 生 物 的 RNA 聚 合 酶 

前 面 提 到 的 三 种 RNA 聚合 酶 均 是 在 细胞 核 内 完成 它们 的 转 
录 作 用 ， 聚 合 酶 I 在 核 仁 内 ， 另 外 两 种 酶 在 核 质 部 分 。 所 有 这 三 种 


酶 都 以 -DNA 模板 来 合成 RNA， 并 需要 某 种 二 价 离子 (Mg2* 或 、 


Mn )。 离 体 条 件 下 ， 用 Mn 时， 聚合 酶 开 活力 更 大 聚合 酶 II 
也 有 这 种 趋势 。 但 一 般 认 为 ， 在 活 机 体内 ，Mmn2 浓度 低 ， 因 此 ， 
在 具体 条 件 下 ， 利 用 Mn” 可 能 改变 了 酶 的 结合 性 质 。 

这 三 种 酶 对 x- 鹅 膏 草 碱 〈 一 种 真菌 所 产 的 毒素 ) 的 敏感 性 也 
不 一 样 。 换 句 话说 ,这 三 种 酶 可 根据 它们 对 o- 鹅 膏 草 碱 的 敏感 性 
而 加 与 区 别 : 育 合 酶 I 极 不 敏感 ， 聚 合 酶 贡 最 为 敏感 而 聚合 酶 III 居 
中 5; RNA 育 合 酶 联 在 c 一 狐 膏 草 碱 为 50ug/ml 即 被 抑制 ,RNA 聚 合 
酶 II 则 不 甚 敏感 5ug/ml 的 浓度 可 抑 制 聚 合 酶 II， 但 聚合 酶 联 
对 此 浓度 则 不 敏感 。 

所 有 这 三 种 酶 的 分 子 量 都 很 大 ， 约 500,000 至 600,0007 大 约 
由 十 多 个 亚 基 组 成 ， 其 中 有 两 个 亚 基 的 分 子 量 在 120,000 一 200， 
000 之 间 ， 另 外 的 亚 基 分 子 量 小 于 50,000， 但 聚合 酶 II 的 小 亚 基 中 
有 一 个 则 在 80;,000 一 90,000 之 间 。 

除了 RNA 聚 人 台 酶 是 多 亚 基 蛋 白 这 一 点 之 外 ,起 始 RNA 链 的 合 
成 还 需要 有 三 个 以 上 的 转录 因子 的 参 予 ;而 对 不 同 的 聚合 酶 ， 其 
必需 的 转录 因子 也 不 同 。 

陈 于 二 二 在 呈 用 可 让 存在 的 本 神 RNA 聚 合 酶 之 外 ， 真 核 生 物 


134。 


的 RNA 索 合 酶 还 包括 在 线粒体 和 叶绿体 中 存在 的 RNA 聚 合 酶 。 线 . 
粒 体 的 RNA 聚 合 酶 很 难 溶解 ， 可 能 是 与 肛 结 合 在 一 道 ; 它 是 单一 
的 多 肽 链 ， 分 子 量 在 45,000( 爪 风 和 酵母 ) 与 60,000 〈 鼠 肝 ) 的 范 
围 .具有 活性 的 酶 可 能 是 一 种 多 聚 体 结构 -高 等 植物 叶绿体 的 RNA 
聚合 酶 有 些 像 细胞 核 中 的 RNA 聚 合 酶 I， 有 两 个 大 亚 基 和 若干 个 
小 亚 基 ， 但 两 者 在 肽 图 上 有 差别 。 此 外 ， 在 眼 虫 和 高 等 植物 中 ， 
都 发 现 叶 绿 体 不 止 含有 一 种 RNA 聚 合 酶 ， 其 中 一 种 是 催化 FTRNA 
基因 的 甘 录 。 另 一 种 是 负责 tRNA 的 合成 。 

(2) RNA 聚 合 酶 I 的 起 始 作 用 

在 芬 部 分 离 研 究 时 ， 人 们 可 以 将 核 仁 与 细胞 核 的 其 余部 分 分 
开 。 提 到 各 部 分 RNA 时 ， 在 核 仁 部 分 发 现 了 一 种 45S RNA .化 学 
个 析 表 明 ， 这 种 核 仁 RNA 与 核 蛋白 体 RNA( 简 称 FRNA) 有 某 种 关 
系 。 它 的 核 苷 酸 组 成 及 甲 基 化 的 寡 核 苷 酸 序列 与 核 IRNA 极 其 相 
似 。 实 际 上 ,，45S 分 子 是 TRNA 的 前 体 ， 称 前 rRNA， 它 最 终 可 以 
形成 28S; 18S 和 5.8S TRNA 顺便 要 说 的 是 , 刚 合成 的 45S RNA 


nemiAR 生活 本 的 村 到 
的 PNA 区 域 称 为 转录 单位 。 这 两 个 术语 ,在 往 后 的 讨论 中 我 们 
党 常用 到 。 

许多 真 核 细 胞 的 核 蛋 白 体 RNA 的 转录 单位 〈 或 称 FDNA) 已 
经 得 以 纯化 并 克隆 。 由 此 而 得 到 有 关 这 些 基因 的 知识 ,加 上 对 动 、 
植物 及 单 细 胞 真 核 生物 核 仁 RNA 合成 研究 所 获得 的 资料 使 人 们 
对 rRNA 形成 有 了 较 全 面 的 认识 。 

在 各 种 真 核 细 胞 中 的 FDNA 序 列 都 有 很 大 的 相似 性 。 但 各 物种 
之 间 也 有 很 大 的 差别 ， 其 中 最 令 人 感 兴趣 的 是 围绕 前 rRNA 附近 
的 核 背 酸 序列 。 举 例 来 说 ， 通 过 对 人 和 大 鼠 、 小 鼠 前 rDNA 的 比 
较 ， 说 明 这 三 种 生物 的 前 rRNA 转录 物 的 头 19 个 碱 基 极 为 相似 ,而 
从 转录 起 始 位 点 外 5 “ 端 一 侧 的 序列 来 看 ， 人 与 嗣 齿 类 之 间 倒 没 
有 很 大 的 保守 性 。 但 在 -16 至 -20 和 -33 至- 44 之 间 有 较 强 的 同 
源 性 ， 以 及 一 些 散在 的 碱 基 如 -7，-16 和 - 25 的 G 及 - 34 附 近 
的 TII 三 联 子 。 这 些 情 况 说 明 RNA 聚 合 酶 I 启 动 区 有 较 大 的 变异 。 


9 JTJ 了 5 。 


这 种 序列 上 的 变化 上 距离 体 条 件 下 前 rRNA 合 成 的 结果 是 相符 的 : 


小 鼠 或 人 的 育 合 酶 I 均 可 以 既 转 录 小 鼠 的 又 可 以 转录 人 的 rDNA， 
但 却 需 要 一 种 种 属 特异 的 转录 因子 (和 蛋白质)。 这 种 蛋 幅 质 结合 位 
点 是 在 序列 变化 较 大 的 5“ 侧 的 上 游 。 

(3) RNA 聚 合 酶 I 的 起 始 作 用 


这 不 酶 所 合成 的 分 子 都 是 一 些 长 度 小 于 300 个 核 背 酸 的 小 分 、 


子 RNA} 包括 tRNA 和 5S TRNA。 由 RNA 和 聚合 酶 II 转录 的 基因 的 
启动 区 并 不 在 5/ 侧 机 序列 而 是 在 基因 本 身 ,这 是 由 D. D.， Brown 
及 其 合作 者 在 研究 爪 奖 5S rRNA 的 表达 时 意外 的 发 现 3 他 们 发 
现 该 基因 的 5/ 侧 要 序列 可 以 全 部 除去 而 不 影响 5S IRNA 的 转录 。 


而 且 ， 当 编码 区 的 5“ 端 缺失 时 ， 依 然 合 成 5$ 大 小 的 RNA ,直至 这 : 
种 缺失 达到 50 个 核 苷 酸 时 ， 转 录 效 率 才 下 降 ， 基因 的 3“ 端 的 缺失 


也 有 相似 的 情况 。 这 说 明 5S rRNA( 或 5S 大 小 的 RNA) 的 合成 是 由 
+ 50 至 + 80 碱 基 所 构成 的 启动 区 所 控制 的 。 这 一 启动 区 又 称 为 内 


部 控制 区 (Internal control rtegion， 或 简称 ICR)。 但 它 不 是 被 
RNA 聚 合 酶 II 识别 ， 而 是 由 一 种 40kd 的 转录 因子 即 TFIIA 所 识 


别 。TEFIIA 结 合 到 ICR 后 ， 接 着 又 有 TEIIIC 和 TEIIIB 与 之 结 谷 
形成 一 个 完整 的 复合 体 ， 然 后 才 被 RNA 聚 合 酶 II 所 识别 。 后 者 的 
识别 位 即 是 在 转录 起 始 位 点 处 (图 2- 18)。 

已 经 详细 分 析 了 5S 基 因 内 部 控制 区 的 精细 结构 ; 它 含有 两 个 
保守 的 序列 要 素 ， 即 A 框 和 (人 C 框 。5SA 框 与 下 面 说 到 的 银 N 人 A 的 人 
框 在 结构 和 功能 上 是 可 以 相互 交换 的 。C 框 则 是 5S 基因 所 特异 
的 。 它 们 与 转录 因子 的 相互 作用 也 基本 上 已 经 得 到 较 详 细 子 解 。 

tRNA 基因 也 有 一 个 内 部 启动 区 ,但 它 分 开 成 两 个 坪 块 即 A 框 


和 B 框 〈 也 称 D 和 T 框 或 5 和 3“ 块 块 )。A 框 从 第 8 个 核 苷 酸 至 第 19 


个 ， 包 括 4 个 保守 的 核 苷 酸 。B 框 从 第 52 至 第 62 核 苷 酸 ， 包括 5 全 
保守 的 核 苷 酸 。 由 此 看 来 ， 这 些 保守 的 核 背 酸 对 于 tRNA 的 三 级 
结构 和 tRNA 合成 的 起 始 是 很 重要 的 。 由 于 tRNA 可 变 区 的 长 短 不 
一 及 其 中 有 些 tNA 基 因 在 此 部 分 有 某 些 插入 碱 基 ， 因 此 A 框 和 也 
框 之 间 的 距离 一 般 在 30 至 74bp. 之 间 。tBNA 基 因 的 57 侧翼 序列 


5 17136。 


1 


Ps ee ev ea oo ， ai 


对 于 保证 达到 景 大 的 转录 效率 也 是 重要 的 ,而 且 眼 5SrRNA 基 闪 一 
样 ， 转 录 起 始 复合 体 的 形成 看 来 也 需要 转录 因子 TFIITC 的 参与 。 
(al) 


| 全 5S 基 因 
长 121 芒 音 酸 


| 转录 因子 
47 X 了 


人 1 
maineutd 
人 YU 一 


3 3 
2 二 


aooeoniaeSDsntn 


5SrRNA? 人 或 


111 十 十 十 十 十 十 十 十 


0 -全 Hor120 
5SrRNA - 


中 十 ,二 全 上 上 


一 一 


图 2-18(a)5S rRNA 基因 上 RNA 聚合 酶 III 与 转录 因子 结合 位 之 间 
的 关系 。:(b) 蛙 5S TRNA 在 蛙 细胞 提取 液 中 精确 起 始 转录 的 必需 区 
域 。 方 框 表 示 5S rRNA 的 编码 区 的 120 核 苷 酸 。 左 右 两 侧 的 正 号 (+ ) 
表示 该 段 缺 失 有 的 水 溯 绩 均 需 不 和 响 接 术 。 线 端的 数 
表示 该 缺失 的 端点 。 


.才学 三 和 


| 


7S RNA 、 腺 病毒 VA 及 05 光 0 本人 人 罗 和 半 人 
合 酶 II 转录 的 基因 其 启动 区 与 尽 NA 相 似 。 

(4)RNA 聚 合 酶 II 在 帽子 位 点 起 始 mRNA 合成 

现在 人 们 都 已 知道 ， 真 核 生 物 细胞 质 中 的 mRNA 是 细胞 核 中 
的 一 种 前 体 分 子 的 成 熟 产 物 。 它 的 前 体 分 子 是 细胞 核 中 一 种 高 分 
子 量 的 RNA， 称 为 异 质 核 RNA (hnRNA)。 但 一 开始 ， 人 们 对 这 
两 种 分 子 之 间 的 关系 却 有 些 捉 摸 不 定 。 最 大 的 问 题 是 ， 这 两 种 
RNA 大 小 悬 珠 。hnRNA 的 沉降 值 达 100S ,相当 于 50，000 核 苷 酸 ， 
而 一 个 大 分 子 mRNA， 例 如 卵黄 前 体 蛋白 的 mRNA， 只 不 过 6700 
核 音 酸 。 对 于 这 样 一 种 前 体 - 产 物 伴 廖 ， 人 们 曾 给 出 过 多 种 的 解 
释 。 其 中 一 种 推测 是 认为 一 个 hnRNA 含 有 多 个 mRNA; 另 一 类 意 
见 是 认为 hnRNA 可 能 经 过 分 解 和 水 解 而 最 终 保 留 一 个 mRNA。 交 
今 为 止 ， 除 了 在 非洲 锥 虫 中 发 现在 一 个 转录 单位 中 存在 着 多 顺 反 
子 mRNA 之 外 ， 其 它 真 核 生物 尚 无 多 顺 反 子 mRNA 的 证 据 ，hn 
RNA 在 细胞 核 内 也 没有 更 新 的 事实 。 至 于 第 二 种 解释 , 则 hnRNA 
有 一 端 会 被 破坏 ， 而 在 mRNA 上 需要 合成 新 的 5 帽子 或 3/ 聚 核 苷 
酸 。 

事实 上 ， 真 核 生 物 以 及 它们 的 大 多 数 病毒 的 mnRNA 和 mRNA 
前 体 在 其 5 末端 都 被 一 个 甲 基 化 的 鸟 背 酸 帽 子 所 封闭 ， 这 个 帽子 
是 转录 后 加 上 去 的 。 它 通过 一 个 5“ 一 5“ 焦 磷酸 桥 将 岛 苷 酸 连 接 到 
初始 转录 物 的 5 末端 的 核 苷 酸 上 并 使 7 位 的 碳 原子 上 甲 基 化 而 形 
成 帽子 0。 进 一 步 的 修饰 还 可 能 包括 在 转录 物 的 头 一 个 或 头 两 个 核 
童 酸 的 2 位 的 氧 原子 上 甲 基 化 而 分 别 形 成 帽子 1 和 帽子 2 (图 2- 
19 ) 。 

RNA 聚 合 酶 开 起 苔 转录 的 起 点 正 是 被 扣 上 帽子 的 那个 核 苷 
酸 上 ， 证 据 如 下 : 

首先 ,在 hnRNA 中 没有 发 现在 帽子 上 游 有 任何 序列 可 与 DNA 
序列 互补 。 其 次 ， 幅 子 结构 〈 简 化 为 m"GpppNmp) 理论 土 可 由 
两 种 方式 形成 ， 

CORNA 链 先 断裂 ， 然 后 加 上 帽子 ， 


? 138。 


人 


”ss 


一 NpNpPNPNDpPNp 一 
| 
一 NDNDP NDPNPNP 
或 
NDPN ppPNPNDPNP 

+Gppp 加 成 并 甲 基 化 

mIGpppNmpNPNP 或 

m"GpppNmpPNPNPD 


并 
二 
全 


图 2-19 真 核 mRNA 的 5 甲 基 帽 子 的 结构 。 其 最 明显 的 特征 是 : 7 


: -= 甲 基 鸟 苷 与 nRNA 分 子 的 第 一 核 背 酸 〈 碱 基 1》 通过 5/-5” 磷 酸 键 


连接 和 所 有 动 植物 细胞 中 第 一 核 背 酸 的 核糖 的 2“ 羟基 上 的 甲 基 。 酵 
母 则 无 此 甲 基 基 团 。 在 肴 椎 动物 中 ， 第 二 核 背 酸 的 核糖 也 被 甲 基 
化 。 


39。 


仿 帽 子 加 到 RNA 链 的 第 一 个 核 苷 酸 上 而 保留 该 链 的 两 个 末 
端 磷 酸 ， 
pppNDPNPNPNP 
+ 加 Gpppy 甲 基 化 
m GpppNmpNPNPNP+ Pi +ppi 
实验 证 明 ， 在 细胞 核 中 所 发 生 的 是 第 二 种 情况 。 
@) 而 且 是 最 重要 的 一 点 ， 用 纯化 的 RNA 聚 合 酶 工 在 离 体 条 件 
下 合成 RNA， 其 起 始点 是 在 帽子 位 点 。 
(5) RNA 绒 人 了 酶 I[ 所 使 用 的 启动 区 序列 
指令 RNA 了 合 酶 开 在 幅 子 位 点 上 起 始 转录 的 信号 是 什么 ? 对 
各 种 不 同 的 转录 单位 的 BDNA 序 列 的 考察 表明 ，, 在 帽子 位 点 上 游 天 
约 30bp 处 有 一 短 的 契合 序列 。 这 一 高 度 保守 的 序列 即 称 为 TAIA 
框 ( 图 2-20)( 或 称 Goldberg-Hogness 框 ) 


~34 妆 26 


人 40 人 人 一 
地 。 1711 81712121013 804 58 020lll6l9l4t 18 t 
710181522171016 8491566l226207 986107 b 
|- 碱 基 频率 6 171818141020302332,L1 1 Un00 0 823291416261914 至 225P 下 


C 162016131511 9 8 1416 0 0 30 1 2101122221016 
更 全 所 -1GGLTAT 人 全 AAA -G ~ :部 年 术 
全 U-~ 25 多 


图 2-20 走 核 生 斩 DNA 的 TATA 权 (起 线 方 柜 所 示 ) 位 于 有 蛋白质 编 
码 基因 5 端的 上 游 。 这 里 是 对 60 个 不 同 基 因 始 于 约 -40 碱 基 处 〈 即 
mRNA 起 始 位 碱 基 + 1 上 游 40 个 碱 基 处 》 取 相 同 的 5 一 3“ 极 性 进行 
比较 的 结果 。 给 出 的 数字 是 各 碱 基 在 各 位 点 出 现 的 频率 〈 总 数 为 
60)。 最 大 的 同 源 区 约 从 -35 到 -20 处 , 据 此 得 出 一 段 7 碱 基 的 自 合 序 
列 ， 其 开头 的 4 个 碱 基 为 TATA， 一 般 是 在 距 起 始 位 点 30 个 磊 基 处 
于 了 冲 + 光 
在 离 体 条 件 下 ，TATA 框 对 于 RNA 聚 合 酶 正确 取 位 的 重要 性 
已 为 重组 DNA 的 实验 所 证 明 。 例 如 ， 腺 病毒 晚期 基因 转录 单位 的 
TATA 框 上 游 的 序列 一 旦 被 其 它 序列 所 代替 ， 聚 合 酶 起 始 转 录 依 
然 在 下 游 约 30bp 处 的 核 苷 酸 开始 。 但 若 TATA 框 中 只 要 有 一 个 碱 


基 的 变化 则 转录 作用 会 急剧 减少 。 在 TATA 框 指令 RNA 聚合 酶 开 


2 了 40 


侍 合 以 后 ， 选择 那 类 核 音 酸 作为 RNA 合 成 的 起 始 位 则 多 少 有 点 不 
移 二 格 了 。 聚 合 酶 下 通常 以 一 个 顺 叭 来 起 始 ;》 但 喀 啶 也 可 以 作为 
第 二 个 核 霸 酸 〈 哺 乳 动 物 细 胞 有 25%% 的 可 能 性 ， 低 等 真 核 细 胞 则 
较 消 有 )P 
真 核 药 TATA 框 颇 令 人 想起 原核 的 Pribrow 种 即 细 菌 基 因 中 
的 -10 区 附近 的 保守 序列 它们 之 间 极 为 相似 。 但 它们 的 差别 也 是 
不 言 而 喻 的 〈 图 2 一 21)。 首 先 ，Pribnow 框 距 转 录 起 点 约 10bp， 
DNA 螺 旋转 了 一 圈 ， 而 TATA 框 则 远 在 三 个 螺旋 圈 处 。 其 次 ， 原 
核 生物 的 起 始 位 点 的 序列 有 某 种 程度 的 保守 性 ， 而 真 核 生 物 则 有 
更 大 的 可 变性 。 大 多 数 由 RNA 聚 合 酶 II 所 转录 的 基因 前 面 都 具有 
TATA 框 ， 但 也 有 一 些 如 SV40 的 晚期 基因 和 UI snRNA ( 细 胞 
核 内 的 水 分 子 RNA) 基因 所 含 的 等 价 序列 与 TATA 框 契合 序列 相 
去 甚 远 ， 充 其 量 也 只 能 称 作 TATA 类 序列 。 
原核 写 动 区 
正 调 节 蛋 白质 ， 贷 谓 节 蛋白 质 


78 缩合 区 30 20 攻 口 萎 TRNA 
有 NA 聚合 酶 


TTGACA 主要 接触 点 TATA 愉 工 。 
区 酷 


熏 要 -~7 至 -10 
次 核 启 动 区 
于 1mRNA 
wm 


Sa 1 
1 
1GGGccE 全 
; 


上 
C 


图 2-21 .天 核 生 旷 与 真 核 生物 中 影 咯 转 录 的 DNA 序 列 要 素 的 比 
较 。 


前 面 说 过 ， 在 原核 生物 中 ， 转 录 起 始 位 点 上 游 的 -~ 35 区 也 有 
助 于 聚合 酶 的 结合 。 真 核 DNA 的 离 体 转录 实验 足以 说 明 TATA 杠 
的 重要 性 ;而 其 上 游 序列 则 对 离 体 反应 无 多 大 影响 。 但 当 把 DNA 


574F， 


经 质粒 或 病毒 引入 到 细胞 内 ， 或 病毒 整合 到 细胞 的 染色 体 时 ， 要 
使 RNA 得 以 合成 尚 需 另 外 的 序列 。 例 如 ， 单纯 疱疹 病毒 胸腺 喀 院 
激酶 基因 和 大 的 B- 珠 蛋白 基因 的 转录 都 需要 位 于 - 100 至 -40 上 的 
一 些 序列 要 素 ， 即 所 谓 上 游 启 动 区 要 素 (upstream promotor el- 
“ment， 简写 为 UPEs)， 它 们 一 般 由 8 一 12 个 碱 对 组 成 一 特定 单 
元 。 因 此 ， 一 个 典型 的 真 核 生 物 启 动 区 包括 TATA 框 和 一 个 以 上 
的 UPEs。 
TATA 框 的 基本 作用 是 确保 转录 的 精确 起 始 , 而 UPEs 的 作用 
是 增加 转录 的 速率 。 目 前 已 经 鉴别 出 许多 UPEs (图 2-21)。; 它们 
距 转 录 起 始 位 点 参差 不 齐 〈- 40 至 - 110 之 间 )， 它 们 对 于 促进 有 
效 的 起 始 作 用 是 很 重要 的 ， 但 对 决定 其 精确 性 作用 不 大 。 其 中 有 
一 个 所 谓 CAAT 框 〈 或 CCAAT 框 ) 与 原核 的 一 35 区 颇 有 些 相似 ， 
其 契合 序列 为 
5/GGCCAARCT3/ 
它 一 般 出 现在 起 始 位 点 上 游 70 - 90bp 处 。 另 一 个 是 富 于 GC 的 序 
列 ， 或 称 GC 框 ， 通 式 是 
5/CCGCCC 
或 其 互补 序列 
57GGGCGG 
它 可 能 以 多 拷贝 的 形式 出 现在 -100 处 。 诱 变 研究 的 结果 说 明 , 启 
动 区 的 强度 是 由 OPEs 的 数量 与 类 型 所 决定 。 此 外 ;UPE 的 作用 与 
它 跟 TATA 框 的 相对 方向 无 关 。 但 是 有 例子 说 明 在 UPE 与 TATA 杠 
之 间 搬 入 核 背 酸 会 降低 转录 水 平 。 例 如 ,， 揪 入 的 核 苷 酸 数 若 是 
DNA 螺 旋 盘 转 半 圈 的 奇数 倍 比 揪 入 数 为 偶数 倍 更 多 有 害 。 这 种 情 
况 说 明 与 TATA 框 结合 的 蛋白 与 跟 UPEs 结 合 的 蛋白 之 间 发 生 相互 
作用 ?这 种 相互 作用 需要 蛋白 质 在 DNA 双 螺 旋 上 有 特异 疯 空 间 配 
置 。 
除了 TATA 框 和 上 面 提 到 的 UPE 之 外 ， 真 核 生 物 RNA 素 合 酶 
H 要 有 效 地 起 始 转录 还 要 有 第 三 种 DNA 区 域 ， 即 增强 区 。 增 强 区 
是 首先 在 病毒 中 发 现 的 ， 其 后 在 包括 哺乳 动物 和 高 等 植物 在 内 的 


2 


许多 基因 中 都 发 现 普遍 存在 着 增强 区 。 它 们 看 来 对 真 核 生物 的 转 
录 起 始 也 起 着 调制 作用 。 我 们 将 在 基因 表达 的 调控 中 集中 加 以 讨 
(6)RNA 袁 合 酶 II 转录 作用 的 终止 “一旦 RNA 聚 合 酶 贡 转 录 
作用 起 始 后 ， 会 在 什么 地 方 终止 呢 ? 初始 转录 物 在 终止 转录 前 一 
般 都 要 延续 通过 聚 A 加 成 位 。 用 标记 的 新 生 细 胞 核 RNA 与 接近 到 
A 加 成 位 上 、 下 游 区 域 的 DNA 杂 交 可 以 印证 这 一 点 。 无 论 是 腺 病 
毒 、 猿 猴 病 毒 SV40 的 转录 单位 ， 还 是 背 椎 动物 的 转录 单位 (例如 
小 鼠 的 8 珠 蛋白 ; 淀粉 酶 基因 ) ,所 得 到 的 结果 都 说 明 转 录 一 般 都 
通过 聚 A 位 点 。 所 有 这 些 细胞 的 基因 ,转录 都 延伸 至 聚 A 位 点 后 约 
0.5 至 ?kb。 但 是 看 不 到 终止 是 发 生 在 某 一 特定 位 点 。 如 果 将 小 鼠 
染色 体 中 B 珠 蛋白 基因 负责 终止 转录 的 序列 转移 到 另外 的 基因 ,也 
可 引起 该 基因 终止 转录 。 因 此 可 能 存在 着 确保 真 核 基因 转录 终止 
的 保守 序列 。 
如 果 转 录 不 负责 产生 mRNA 的 3/ 端 ， 它 又 是 如 何 形成 的 呢 ? 
用 重组 DNA 实验 研究 mRNA 的 37 端 上 的 序列 提供 了 令 人 信服 的 
答案 。 聚 A 位 上 游 大 约 15 至 30 核 苷 酸 处 有 一 保守 性 很 强 的 契合 序 
列 ， 即 AAUAAA， 除 去 这 一 序列 会 妨碍 由 转录 单位 合成 RNA。 在 
AAUAAA 中 发 本 突变 〈 比 如 变 成 AAGAAA) ,或 除去 上 述 下 游 序 
列 ， 这 两 种 情况 中 均 可 看 到 它们 是 延伸 至 聚 A 位 点 之 后 的 长 RNA 
分 子 。 这 些 转录 物 偶而 也 产生 具有 聚 A 正 确 加 成 的 mRNA。 实验 
说 明 ，AAUAAA 序 列 和 聚 A 下 游 序列 共同 作用 确定 了 聚 A 位 点 的 
位 置 而 导致 初始 转录 物 的 切割 和 聚 A 的 加 成 。 
在 聚 A 位 点 上 的 切割 及 250 个 左右 腺 苷 酸 残 基 的 加 成 , 这 两 件 
事 玫 乎 是 同时 但 又 是 独立 发 生 的 。 将 3- 去 氧 腺 苷 酸 加 进 细 胞 培 
养 物 则 完全 停止 细胞 内 聚 A 的 加 成 ， 但 初始 转录 物 依然 可 以 正确 
地 切割 。 攻 至 在 并 不 接纳 聚 A 的 组 蛋白 mRNA 中 ， 其 3/ 端 也 是 通 
过 初始 转录 物 的 切割 所 产生 的 。 而 且 也 需要 切割 位 点 下 游 的 序列 
并 借助 于 特定 的 细胞 核 小 RNP 〈 有 别 于 01，02 等 ) 
RNA 聚 合 酶 II 所 合成 的 5SRNA 转 录 物 的 终止 是 发 生 在 单一 


。T43 


的 契合 序列 即 在 非 编码 链 上 富 GC 序列 中 的 4 个 以 上 连续 出 : 现 的 了 
残 基 上 。tRNA 的 终止 信号 也 与 此 相似 ,但 它 是 紧 挨 在 编码 区 之 后 
出 现 。 

RNA 聚 合 酶 I 合 成 TRNA 转录 物 的 终止 看 来 与 基因 的 37 端 成 从 
出 现 的 攻 残 基 有 关 。 只 有 3 个 I 仍 可 终止 转录 ， 减 至 2 个 就 严重 受到 
影响 。 

(7)》 转录 物 的 剪接 

mRNA 的 剪接 .编码 蛋白 质 的 mRNA 都 在 细胞 核 内 前 接 就 
绪 ， 然 后 进入 细胞 质 ， 因为 在 细胞 质 内 从 未 发 现 :有 未 剪接 的 
mRNA 前 体 。 分 离 核 也 可 用 作 剪 接 试验 。 但 目前 尚未 纯化 到 负责 
剪接 的 酶 或 有 关 因 子 。 

细 雹 对 初始 转录 物 的 划 接 只 具有 有 限 的 种 属 特异 性 。 例如 ， 

其 mRNA 的 形成 需 经 剪接 的 某 种 病毒 可 以 在 各 种 各 样 的 哺乳 动物 
细胞 中 生长 。 此 外 ，, 含有 兔子 或 小 鸡 的 基因 组 DNA 的 重组 分 子 可 
以 在 小 鼠 或 蛙 卵 母 细 胞 中 转录 ， 其 转录 物 也 得 到 正确 的 剪接。 这 
些 情况 说 明 ， 剪 接 的 生化 机 制 可 能 是 普遍 适用 的 ， 至 少 在 哺乳 动 
物 细 胞 中 是 如 此 。 

对 同一 生物 和 不 同 生 物 的 许多 不 同 秀 mRNA 剪接 位 点 附近 的 
序列 进行 分 析 表 明 , 在 剪接 部 位 只 有 一 种 中 良 保 守 的 契合 序列 (图 
2- 22)。 而 唯一 普遍 保守 的 核 苷 酸 是 在 内 衣 子 的 头 2 个 和 未 2 个 衔 


内 会 区 外 显 区 


太 TEJIAEIT7EOEREE 陆 博 : TIE 1 17 80 0 2922 四 
个 28 10 1917 01399 H 78730 36 的 57 67 75 62 62.57 57.73.75 38 40 0.0 1148 .37 
C 4260168001383 3172830 128 35 27.303842354646.36288050 0 232842 
G 27 13 16102139 0 41 16 11712 25 和 2 1 13 9 9 6 6 31 1 013067 32 26 
人 下 生 是 宙 全 司 术 三 计 汪汪 汪汪 汪 : 入 


图 2-22 时 明 质 编码 基因 外 显 区 与 内 侣 ;区 之 间 的 边界 序列 的 务 因 、 

所 分 析 的 例子 来 自 各 种 生物 ， 包 播 病毒 、 大 豆 、 海 胆 、 有 蝇 、 小 鼠 
以 及 人 类 。 结 果 表 明 契 合 最 佳 的 序列 在 内 含 子 的 两 喘 * 所 有 例子 的 ; 
5“ 端 两 个 碱 基 都 是 GT， 其 次 第 3 至 第 6 位 碱 基 保 守 程度 也 较 大 ! 3“ 
端 则 在 一 串 喀 哇 磊 基 之 后 最 后 的 两 个 碱 基尼 为 AT。 和 
基 相 似 程度 则 较 弱 


2 了 344， 


“se ET 


Eight an ae-。 全 


表 4  ” 真 核 生物 的 小 分 子 RNA 
种 类 | 长， 融 || 直 记 插 由 | 严 如 中 定 他 | ”六 NA | 。 57 测 
U1l 165 1 兴 于 08 核 ; 党 浆 | II IaGpopp 
U2 196 5x105- | 核 桨 开 ms Goppp 
U3 210 一 215 St 让 核 . 本 II | msGnppp 
Ud4 和 28 1X105 核 . 桨 5 ma 人 ppp 
U5 118 2X105 核 浆 II mas Gppp 
二 区 108 3x105 | 核 浆 | 可 能 是 II | 修饰 的 appN 
U7 56 一 65 SR 站“ 村 入 牧 II masGppy 
U8 141 2.5X104 核 “ 仁 工 maGppp 
U9 一 130 未 知 未 知 上 ma Gppp 
U10 人 65 未 加 未 知 开 ma ppp 
7S 或 7SL_ .195 一 300 5xI05 症 , 胞 质 工 
7SM 5 xin0s- 让 杭 =: 在 II 
7 2 0 ) 
7.。3 或 7SK | 331 0.5-1x105 1 核 浆 工 和 
小 鼠 Y 1 一 110 | 105 -108 胞 ， 质 I 开 
基 量 一 95 06 胞 . 质 III SN 二 
人 类 工 I 一 110 105 -106 胞 一 质 III 
YY 一 110 105 - 106 胞 质 了 
Y3 一 110 105 - 106 胞 质 II 
Y4 一 95 105 一 108 胞 质 III 
Y5 一 230 | 105 一 106 胞 质 I 开 
4.53 | 90 一 99 3X105 核 桨 II 
5。.8S 158 5X105 胞 “ 质 I 5 “磷酸 
5S 年 于 人 于 02 胞 质 III 5“Nppp 
tRNA| 74 一 95 1x10s8 | 胞 ” 质 下 


目前 尚未 分 离 到 参与 nRNA 前 接 的 酶 。 正 确 剪接 的 反应 途径 
第 一 步 是 在 5 外 显 子 -内 涵 子 衔接 处 进行 切割 ， 在 第 一 个 外 显 
子 的 3 端 核 音 酸 圭 保留 3 凑 基 ， 而 在 内 涵 子 的 5“ 核 背 酸 即 鸟 背 酸 


ye 145 


上 保留 5 磷酸 (图 2-23)。 这 一 步 是 在 UT snRNP 的 参与 下 进行 的 : 
下 一 步 是 分 枝 核 苷 酸 结构 的 形成 ,需要 U2 snRNA 的 参与 .分 枝 上 
上 的 核 背 酸 不 仅 有 常见 的 3 ->5/ 的 连 键 与 该 链 下 一 核 音 酸 连接 ， 
而 且 它 也 以 2 ~57 的 连 键 与 内 显 子 5/ 端的 鸟 音 酸 连接 。 分 枝 点 上 
的 核 背 酸 几 乎 总 是 腺 苷 酸 ， 一 般 距 离 内 涵 子 -外 显 子 接合 处 约 10 
至 30 核 背 处 。 在 分 枝 点 区 的 契合 序列 为 


GNE2 息 
cU(A)A(U) 
其 中 A 为 分 枝 点 。 人 迄今 所 考查 过 的 葫 椎 动物 mRNA 均 是 这 样 的 序 
列 。 背 椎 动物 分 枝 点 的 契合 序列 CUAAC 与 酵母 序列 的 后 5 个 核 
苷 酸 很 相似 ， 
UACUAAC 


[ 


图 2-23 mRNA 的 前 接 过 程 示意 
这 一 序列 出 现在 酵母 所 有 mRNA 内 涵 子 的 3 内 涵 子 - 外 显 子 
接合 处 的 上 游 约 50 核 苷 酸 处 。 由 此 可 知 从 所 有 mRNA 前 体 中 除 
去 内 涵 子 所 进行 的 反应 都 牵涉 到 相 类 似 的 识别 序列 ， 
至 于 3 侧 的 内 涵 子 -外 显 子 接合 处 的 定位 以 及 切割 与 连接 的 
最 后 一 步 的 完成 ， 其 机 制 尚未 搞 清 。 在 迄今 研究 过 的 mRNA 让 ， 
。146。 


分 枝 点 下 游 的 第 一 个 AG 双核 背 酸 就 是 这 第 二 次 切割 的 位 点 。 因 
为 所 有 内 涵 子 的 3 端 都 是 富 于 喀 啶 碱 基 ， 在 较 长 范围 内 缺 乏 AG 
序列 ， 因 此 ， 推 测 在 CU(Pu)A(Py) 序列 中 形成 分 枝 点 之 后 ， 要 
完成 剪接 反应 ,就 需要 某 种 机 制 沿 着 向 下 涛 方向 搜索 出 下 一 个 AG 
序列 ， 经 切割 第 一 个 外 显 子 的 3 羟基 即 被 连接 到 AG 之 后 的 第 一 
个 核 背 酸 的 5/ 磷酸 上 。 

剪接 体 .: 异 质 核 RNA- 蛋 白质 复合 物 与 核 小 分 子 RNA 复 合 物 
上 一 节 是 关于 mRNA 剪接 过 程 的 生物 化 学 的 基本 方面 。 实 际 上 ， 
前 接 过 程 替 涉 到 包括 RNA 和 蛋白 质 在 内 的 许多 因子 。 

在 细胞 核 内 ， 蜡 质 核 RNA( 简 称 hnRNA) 和 前 mRNA 这 两 个 
词 往往 可 以 互 用 ， 尽 管 实际 上 只 有 一 部 分 hnRNA 是 mRNA 前 体 。 
在 细胞 内 hnRNA 并 不 是 裸露 的 多 核 背 酸 ， 而 是 与 特定 的 蛋白 质 形 
成 复合 物 ， 而 且 这 种 复合 物 的 形成 早 在 RNA 新 生 链 尚未 完成 时 就 
已 开始 。 习 

初步 的 但 比较 详细 的 分 析 表 明 ， 人 类 HeLa 细 胞 的 bnRNA- 蛋 
白质 复合 物 ( 简 称 hnRNA 复 合 物 或 hnRNA 颗粒 ) 中 大 致 可 分 辨 出 
24 种 不 同 的 多 肽 ， 它 们 的 分 子 量 在 34KD 至 120KD 之 间 。 这 些 蛋 白 
质 共 同 组 成 一 种 约 200 埃 的 颗粒 〈 沉 降 常 数 约 30-40S)。 它 们 与 
hnRNA 结 合 ， 有 点 像 组 蛋白 与 DNA 形成 的 核 小 体 一 样 。 经 核酸 
酶 水 解 后 ， 从 每 一 单 体 颗 粒 中 可 以 回收 的 RNA 链 长 度 约 在 125- 
800 核 背 酸 之 间 。 显然 这 些 hnRNP 复 合 物 沿 着 RNA 链 也 具有 某 种 
程度 的 周期 性 ( 相 域 )。 因 此 ， 这 些 bnRNP 显 然 在 mRNA 的 形 
中 可 能 提供 了 一 种 基本 的 结构 基础 。 

RNA; 前 接 过 程 中 ， 内 含 区 序列 的 精确 切 出 是 一 种 高 度 专 一 
的 作用 。 它 需要 mRNA 前 体 中 的 特异 识别 信号 ， 也 需要 细胞 中 识 
别 这 些 信 号 的 特定 因子 。 识 别 这 种 信号 的 因子 最 有 可 能 是 细胞 核 
内 的 小 分 子 RNA( 人 简称 snRNA) 及 其 蛋白 质 复合 物 。 真 核 生物 的 
细胞 核 和 细胞 质 中 存在 着 多 种 类 型 的 小 分 子 RNA ( 见 表 4)， 它 们 
的 功能 尚 待 进一步 研究 。 但 有 一 点 可 以 肯定 ， 它 们 本 身 具 有 酶 的 
性 质 。 大 和 允 数 小 分 子 RNA 都 跟 特 定 的 蛋白 质 相互 作用 形成 复合 物 


es。 T47。 


(简称 RNP) ,根据 其 来 源 或 分 布 可 以 分 为 细胞 核 的 玉 NP( 简 称 sn- 
RNP) 和 细胞 质 的 RNP( 人 简称 ScRNP ) 。 现 已 发 更 有 多 种 SnRNPs 
人 参与 剪接 作用 。 这 并 不 奇怪 ， 不 同 的 saRNA 都 有 一 些 序列 分 别 
可 与 前 接 衔接 处 的 序列 或 分 枝 结构 序列 相互 配对 。 最 明 最 指 例 子 
是 U1 snaRNA。 而 snRNA 可 跟 8 种 蛋 刍 专 一 凡 屯 结 各 ;形成 
U1 snRNP。Ul 与 剪接 衔接 序列 之 间 有 明显 的 碱 基 配 对 的 可 能 性 
而 U1 snRNA 补 偿 性 的 变化 可 以 校正 前 mRNA5” 剪接 位 药 突 变 这 
一 事实 , 则 说 明 Ui snRNA 是 5 剪接 位 的 切割 所 必需 将 .但 这 种 
碱 基 配 对 对 于 正确 切割 是 不 充分 的 ， 因 为 在 第 3 位 上 碱 基 的 变换 
并 不 能 被 校正 。 某 种 蛋白 质 -RNA 的 相互 作用 可 能 需要, 即 sn- 
RNP 与 前 miRNA 的 结合 所 导致 的 某 些 作用 才 是 正确 剪接 将 真 详 。 
这 一 一 点 对 于 3 剪接 位 可 能 更 为 重要 ， 因 为 在 那里 没有 明显 的 碱 基 
配对 关系 。 

综 上 所 述 ，hnRNP 蛋 白质 对 hnRNA 的 结构 上 所 起 的 作用 
在 某 种 程度 上 兆 如 染色 质 中 的 DNA 被 组 蛋白 所 包装 紧缩 .这 种 包 
装 紧 缩 会 伴 之 以 前 mRNA 折 释 成 可 被 剪接 的 某 种 结构 ， 从 而 有 利 
于 snRNP 的 进一步 参与 ， 而 完成 剪接 过 程 〈 见 图 2 一 2 和 。- 

GOtRNA 的 剪接 人 RNA 的 长 度 平 均 为 70 一 80 核 背 酸 。 而 
tRNA 前 体 要 比 其 终 产 牺 长 ， 因 此 tRNA 前 体 需 要 缩短 ,还 需要 有 
许多 化 学 修饰 ， 比 如 加 上 甲 基 和 异 友基 基 团 ， 以 及 将 尿 喀 啶 转换 
成 俱 尿 喀 喧 等 等 ;事实 上 ， 一 个 tRNA 分 子 中 ， 每 10 个 核 音 酸 就 
有 习 不 破 基 发 生 某 种 形式 的 修饰 。 

真 核 生 物 交 某 些 tRNA 基 因 并 不 是 作为 一 自 连 贯 的 DNA 形式 
” 存在。 例如， 酵母 在 形成 其 蒜 丙 氮 酸 tRNA 和 酷 氨 酸 名 NA 时， 
必需 除去 初始 转录 物 的 中 眉 ， 并 将 两 端的 片段 剪接 在 三 起 果 前 兰 
步 不 需要 ATP， 后 一 步 则 需 ATP( 图 2-25)，ATP 提 供 三 个 磷酸 以 
使 两 端 片 锚 连 接 起 来 ， 连 接 完 成 后 在 拼接 处 不 仅 有 二 肯 竟 3 全 5 
磷酸 二 丁 键 ， 而 且 有 一 异乎 寻常 的 2 -磷酸 单 醋 鱼 ， 

@IRNA 的 剪接 ， 第 三 种 RNA 剪 接 反 应 牵涉 到 某 些 核 蛋 和 体 
_ RNA 内 涵 子 的 去 除 。 实 际 上 ， 在 mRNA 剪接 过 程 明 了 之 前 就 已 经 


esT48。 


亿 - 1 
人 人 =-AG smRNPS 
1VS 了 


AAAAA 


MP 珍 站 质 

图 2-24 前 接 体 装配 及 其 参与 前 mRNP 拼接 的 模型 。 前 接 体 简化 为 
hnRNP 颗 粒 和 snRNP 颗粒 组 合 而 成 。snRNP 的 双向 箭头 玫 示 snRNPs 
可 能 在 hpRNE 和 蛋白 参加 之 前 或 之 后 参加 进去 。U1 和 U5 snRNP 首先 分 
别 与 5 和 3 前 接 位 结合 ,而 hnRN 蛋 白 这 时 可 能 处 于 随机 的 位 置 。 然 后 
U2 snRNP 与 分 枝 点 结合 ,和 随 之 与 U4.U5 和 U6 snRPN 的 参与 ,与 hnRN 
一道 形 成 一 个 套 索 结构 。 最 后 在 3 前 接 位 切割 ， 并 同时 将 外 显 区 连接 。 
内 含 区 则 以 套 环 的 形式 游离 出 来 。 


。149。 


前 体 URNA 


CS2 5 5 
RM 全 Fe 


图 2-25 tRNA 内 含 区 的 切 出 模型 。 这 是 酵母 的 部 分 纯化 提取 物 
所 进行 的 tRNA 剪接 的 两 步 反 应 ， (1) 前 体 tRNA 在 两 个 位 点 上 
被 精确 切割 (2) tRNA 的 两 个 外 显 区 随 着 磷酸 的 掺 入 而 被 连接 
起 来 。 切 割 后 5“ 端 外 显 区 保有 一 个 2“,3“- 环 磷酸 单 酯 ，3′ 端 外 
显 区 则 是 一 个 暴露 的 羟基 。 激 酶 和 连接 酶 使 用 两 个 AIP 分 子 形 
成 一 个 磷酸 醉 键 〈AP-P-) 而 与 暴露 的 羟基 键 连 起 来 。 两 个 外 
显 区 的 相互 作用 尚 不 明确 ， 但 已 确定 具 有 2 -磷酸 单 酯 键 和 
3 一 5 键 连 方式 


发 现 了 TRNA 的 甬 接 过 程 ， 无 需 蛋 白质 的 参与 , 纯 RNA 即 可 发 生 ， 
最 为 人 们 煞 悉 的 例子 是 四 餐 虫 核 体 RNA 前 体 的 剪接 。 在 无 蛋白 质 


的 条 件 下 ， 将 包含 413 碱 基 对 的 内 涵 子 长 约 1000 核 背 酸 的 四 膜 虫 
TRNA 片段 保温 (图 2-26)， 第 一 步 即 可 在 5“ 侧 药 外 显 子 - 内 涵 子 


es。 150。， 


”接合 处 上 切 开 ， 这 种 切割 是 通过 鸟 背 酸 辅 因子 所 引起 〈 概 因 其 核 


糖 2/ 和 3 羟基 的 化 学 活性 )。RNA 上 的 切割 诱导 了 鸟 背 酸 的 游离 
3 羟基 连接 到 内 涵 子 5” 端 核 童 酸 的 磷酸 基 团 上 ， 而 第 一 个 外 显 
子 的 3 端 核 苷 酸 还 保留 着 3 羟基 。 这 个 羟基 则 与 连接 内 涵 子 3“ 端 
核 苷 酸 和 第 二 个 外 显 子 5/ 端 核 苷 酸 的 磷酸 进行 转 酯 作用 ， 释 放出 
内 涵 子 ， 通 过 链 中 已 经 存在 的 磷酸 将 两 个 外 显 子 连 接 起 来 。 内 涵 
子 本 身 再 进行 切割 与 连接 反应 ， 释放 出 一 个 小片 肛 的 赛 核 音 酸 并 
将 余下 的 片段 环 化 。 


有 


| 一 一 ~1000 岂 其 一 于 
外 显 区 “内 含 区 (408 碱 基 ) 外 显 区 
85/ 3 


BEEA ] 
16 
393 


图 2-26 四 膜 哑 核 蛋 白 体 RNA 序列 在 无 蛋白 质 参 与 下 的 自 前 

- 接 。 含 有 部 分 fRNA 前 体 编码 序列 的 重组 DNA 分 子 经 转录 后 得 

到 约 售 1000 碱 基 的 RNA 分 子 〈 两 个 外 显 区 和 一 个 408 碱 基 的 内 
1 合 区 )。 此 转录 物 可 在 无 蛋白 质 参与 下 进行 前 接 。 在 前 接 反应 中 ,， 

鸟 背 是 必需 的 辅 因子 

”三 种 RNA 的 剪接 机 制 在 细节 上 显然 是 不 相同 的 。 但 表面 上 也 
有 相似 之 处 ,这 可 能 表明 进化 上 的 一 定 亲 缘 人 性 。 例 如 mRNA 和 
tRNA 的 拼接 ， 两 者 都 牵涉 到 当中 的 一 个 核 苷 酸 的 2 一 5 和 37 一 
5 的 键 连 。 又 如 ，mRNA 和 无 细胞 体系 中 TRNA 的 拼接 。 两 者 都 
形成 一 个 环 状 的 中 间 产 物 ， 连接 外 显 子 的 磷酸 是 RNA 中 已 经 存 


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在 的 5 
(8) 真 核 生物 mRNA 的 转录 单位 “我 们 已 经 考查 了 mRNA 
加 工 中 的 每 一 程序 。 但 在 变 成 一 个 有 功能 的 分 子 之 前 ， 并 非 所 有 

的 转录 单位 产生 的 初始 转录 物 都 需要 通过 加 工 的 每 一 步 又。 
根据 初始 转录 物 的 蛋白 质 编码 能 力 ， 可 以 将 转录 单位 分 成 两 

种 类 型 ， 一 种 是 简单 的 转录 单位 ， 另 一 种 是 复杂 的 转录 童 位 。 
“简单 的 转录 单位 产生 的 初始 转录 物 只 形成 一 种 编码 一 种 蛋白 
质 的 mRNA (图 55)。 简 单 的 转录 单位 在 细胞核 内 的 RNA 产 物 有 
的 需要 ， 有 的 不 需要 所 有 的 RNA 加 工程 序 。 所 有 这 些 产物 都 冠 
之 以 帽子 ， 但 许多 mRNA 都 不 进行 剪接 。 大 多 数组 蛋白 mRNA 既 
不 剪接 也 不 进行 聚 A 的 加 成 ， 不 少 mRNA 〈 例 如， 干扰 素 以 及 有 
些 病毒 和 大 多 数 酵 母 ) 都 具有 帽子 和 聚 A， 但 不 需要 拼接 。 珠 蛋 

白 和 卵 清 蛋 白 基因 的 初始 转录 物 则 既 需 剪接 又 需 聚 A 的 加 成 。 
杂 的 转录 单位 的 初始 转录 物 可 以 形成 两 个 或 两 个 以 上 不 同 
的 mRNA, 各 自 编码 不 同 的 蛋白 质 ( 图 2-27)。 复 杂 转 录 单 位 还 可 以 


分 成 几 种 类 型 .其 一 ?初始 转录 物 可 能 有 两 个 或 两 个 以 上 药 聚 A 位 


点 ,各 自 产 生 一 个 核 RNA 分 子 , 需 经 剪接 才 成 为 一 个 nRNA; 其 二 ， 
初始 转录 狗 可 以 只 有 一 个 聚 A 位 点 ， 但 其 剪接 可 能 有 两 种 或 两 种 
以 上 的 排列 方式 ,每 种 剪接 方式 会 导致 形成 一 种 mRNA 其 三 ,前 
两 种 类 型 同时 存在 ， 即 多 个 聚 人 位 点 和 多 种 剪接 方式 。 大 多 数 腺 
病毒 的 转录 单位 ， 以 及 SV40 及 反 向 病毒 的 所 有 转录 单位 都 属 复 
杂 转 录 单 位 这 一 类 型 。 此 外 在 养 椎 动物 和 无 养 椎 动物 中 也 报导 了 
其 它 种 类 细胞 中 编码 蛋 吝 质 的 复杂 转录 单位 。 最 后 ， 也 是 新 近 在 
寄生 原生 动物 即 非洲 锥 体 虫 (Trypanosoma brusei) 中 发 现 的 一 
类 多 顺 反 子 转录 单位 ， 这 种 多 顺 反 子 的 RNA 前 人 短 是 由 RNA 聚合 
酶 1 转录 然后 加 工 成 为 若 于 种 RNA， 各 自 编码 成 不 同 的 蛋白 质 ， 
如 变异 体 表面 糖 蛋 白 :(YSG) 及 其 表达 的 有 关 基 因 。 这 种 多 顺 反 
子 转录 单位 既 不 同 于 上 述 三 种 ， 也 有 别 于 原核 生物 的 多 顺 反 子 的 
转录 单位 ， 比 如 VSG 基 因 221 所 在 的 多 顺 反 子 转录 单位 ,转录 起 始 
于 该 基因 的 上 游 大 约 60kb 处 ， 转 录 形 成 一 个 很 大 的 前 体 转录 物 ; 


e 这 92 ze 


组 蛋 白 mRNA ) 
8 端 依然 需 切 割 ) 


恤 白 质 区 , 腺 病毒 ，” 
干扰 素 及 多 种 单 细 腑 
真 核 生 物 的 mRNA 


区 


习 严 出 关上 弄 浴 “他 荆 济 淋 扫 下 


世 
ERNA 


许多 病毒 的 mRNA 
(病毒 可 以 整合 者 ) 
腺 病 大 ,'SV40 多 瘤 病 毒 ， 


承 肌 球 蛋 自 的 mRNA 


于 王 嘲 下 局 丙 藉 语 攻 池 档 六 涪 


图 2-27 _ 编码 mRNA 的 简单 转录 单位 和 复杂 转录 单位 的 图 蟹 与 
实例 。 图 解 显示 了 DNA 上 的 起 始 (i) 和 终止 (t) 位 点 3 初始 转录 物 
的 方向 与 范围 箭头 )。 由 初始 转录 有 物 衍生 的 mRNA 用 齿 状 线 表 
示 。 人 为 聚 A 位 点 ;全 为 剪接 位 点 。 


和 和 3 外 端 进行 聚 A 加 成 ， 在 5′ 端的 加 工 则 是 通过 称 汶 跨 接 
(trans-splicing) 的 方式 将 一 个 带 有 帽子 含 35 个 核 苷 酸 的 序列 ( 称 
为 涉外 显 区 ) 接 上 去 。 而 这 一 5 端的 小 外 显 区 则 是 来 自 一 个 :140 
芒 苷 酸 的 RN 前 体 的 5" 端 。 这 种 加 工 在 多 个 位 点 上 进行 ， 因 而 形 
成 多 个 mRNA; 车 看 起 来 ， 这 个 由 RNA 聚合 酶 I 转 录 的 多 顺 反 子 
RNA 是 有 些 不 可 思议 的 ， 因 为 RNA 聚合 酶 I 转 录 的 RNA 不 具 由 
子 ， 而 真 核 mRNA 必 需 有 个 帽子 。 但 是 由 于 5/ 端 带 帽 的 小 外 显 子 


ee 


的 加 成 ， 所 有 成 熟 的 mRNA 的 5 端 都 是 相同 的 结构 。 由 此 看 来 ， 
编码 蛋 直 质 药 基 因 能 被 RNA 又 合 酶 II 以 外 的 RNA 聚合 酶 转录 -路 
接 可 能 是 一 个 关键 的 机 制 。 

3.mRNA 代 谢 各 级 水 平 上 的 调节 

我 们 知道 不 同 条 件 下 生长 的 各 种 组 织 和 细胞 ， 其 蛋白 质 成 分 
是 有 差别 的 。 一 般 说 来 ， 真 核 生 物 正 是 通过 合成 不 同 数量 的 不 同 
蛋白 质 来 对 各 种 信号 分 子 作 出 反应 。 要 了 解 基因 调控 的 分 子 基 础 ， 
另 一 件 事 就 是 要 明确 基因 调控 究竟 在 铀 一 级 水 平 上 进行 。 

对 特定 mRNA 代谢 的 研究 ， 人 们 可 以 使 用 与 之 互补 的 DNA 
( 即 cDNA) 的 克隆 而 得 到 足够 量 纯 DNA。 通 过 RNA-DNA 杂交 ， 
人 们 可 以 区 分 出 调控 在 三 个 水 平 上 发 生 ，@ 细 胞 核 中 RNA- 的 合 
成 ，@ 初 始 转录 物 的 使 用 ，@ 细 胞 质 中 mRNA 的 稳定 性 ; 

对 各 种 例子 进行 逐一 分 析 表 明 ， 真 核 生 物 mRN 六 交 调 节 是 在 
上 述 三 个 水 平 上 进行 的 ， 但 是 并 非 每 一 种 基因 都 在 所 有 三 个 水 平 
上 调控 。 而 且 有 一 些 基因 则 是 在 mRNA 转译 水 平 上 调控 的 避让 

转录 水 平 上 的 调控 及 其 确证 方法 某 个 真 核 基 因 的 表达 在 转录 
水 平 上 受到 调控 ， 意 味 着 细胞 核 中 某 二 初始 转录 牺 的 合成 受 挖 地 
增 减 ,构成 了 某 一 特定 蛋白 质 合成 速率 变化 的 原因 。 转 录 起 始 与 转 
录 终 止 都 潜在 地 受到 控制 ,但 转录 起 始 的 调控 看 来 却 是 最 为 重要 。 
初始 转录 物 的 起 始 与 终止 位 点 被 确定 后 ,就 可 以 测定 其 合成 速率 。 

最 简单 而 且 是 最 直接 的 测定 转录 速率 的 方法 是 将 所 要 研究 的 
细胞 暴露 在 某 种 作 标记 共 RNA 前 体 中 片刻 (例如 5 分钟 )， 测 定 其 
挨 入 量 。 但 对 于 完整 的 动物 来 涪 ， 这 种 方法 是 不 实用 的 。 纵 然 是 
培养 细胞 ， 用 另外 一 种 RNA 标 记 方 法 则 常常 更 为 简易 即 用 分 离 
核 来 进行 。 在 反应 体系 中 加 入 s2?P 标 记 的 核 苷 三 磷酸 使 之 直接 挨 
入 到 分 离 核 的 RNA 新 生 链 中 可 以 得 到 标记 强度 很 高 的 RNA 制 剂 。 
和 遗憾 的 是 ， 细 胞 核 内 各 种 RNA 聚 合 酶 依然 仍 具 活 性 ,在 保温 进行 
反应 期 间 会 有 儿 百 个 核 苷 酸 加 成 到 业已 起 始 的 RNA 链 中 。; 当然 ， 


用 特异 的 DNA 与 此 方式 标记 的 RNA 杂 交 , 可 以 精确 地 测 出 不 同 基 “ 


因 的 转录 速率 。 
154。 


表 5 给 出 的 是 用 上 述 两 种 方法 讨 记 mRNA 进行 杂交 实验 所 
得 的 结果 。 不 管 是 丰 度 高 的 转录 物 还 是 稀少 的 转录 物 ， 在 细胞 核 
和 完整 细胞 中 都 以 相同 比例 形成 。 因 此 ， 分 离 核 显 然 是 直接 测定 
转录 速率 的 手段 。 

(1) 哺乳 动物 DNA 病 毒 的 转录 控制 ”若干 种 动物 DNA 病毒 
在 感染 过 程 中 病毒 特有 的 蛋白 (和 mRNA) 的 形成 都 遵循 着 一 种 
有 秩序 的 程式 :首先 检查 到 的 是 一 组 早期 蛋白 (和 mRNA); 然后 
出 现 病 毒 DNA 复 制 : 最 后 是 大 量 形成 一 组 晚期 蛋 甩 (和 mRNA)， 
包括 结构 蛋白 或 外 壳 蛋 白 。 

无 论 用 全 细胞 作 脉 冲 标记 还 是 用 分 离 核 作 离 体 合成 ,， 所 得 到 
的 标记 RNA 与 DNA 杂 交 都 证 明 病毒 转录 单位 使 用 的 不 同 程式 是 
早期 和 晚期 基因 表达 这 一 程序 的 依据 。 

DNA 病 毒 ,尤其 是 腺 病毒 的 这 些 特定 的 转录 程式 可 以 归纳 如 
下 ， 

首先 ,病毒 进入 细胞 后 ,立即 激活 其 中 的 一 个 转录 单位 〈 编 码 
蛋白 E1A)( 图 2-28)。 这 一 激活 不 需要 有 新 合成 的 蛋白 质 ， 因 而 必 
定 由 细胞 中 原 有 的 蛋白 完成 。EI1A 转 录 单 位 的 蛋白 质 产物 形成 之 
后 ,只 激活 另 一 组 早期 转录 单位 (主要 是 E1B,2,3 和 4)。E1A 蛋 和 白 的 
合成 也 引起 晚期 主要 的 启动 区 P 16 所 起 始 的 转录 的 低速 率 进行 。 

其 次 ,在 腺 病毒 感染 期 间 , 一 些 进行 着 的 转录 也 发 生 特定 的 减 
少 。 例 如 转录 单位 4 先是 被 强烈 地 激活 ， 然 后 是 去 激活 (图 2-28a)。 
但 是 转录 单 位 2 编码 蛋白 发 生 突变 的 病毒 却 不 会 使 转录 单位 4 去 
激活 。 因 此 ， 整 个 转录 调控 程序 中 ， 起 码 有 部 分 是 由 各 转录 单位 
产物 之 间 相 互 作 用 的 结果 。 

第 三 ，DNA 复 制 是 特定 启动 区 转录 被 激活 的 前 提 。 例 如 腺 病 
毒 基因 组 的 - 左 ? 侧 的 一 段 4kb 区 域 有 三 个 转录 单位 即 1A，1B 和 II 
(图 2-28b)。 前 面 已 经 提 到 1A 的 转录 先 于 1B， 并 为 1B 的 激活 所 必 
需 . 感 染 后 5 小 时 左右 ，1B 转 录 单 位 已 充分 被 激活 ;但 蛋白 质 IX 的 
转录 单位 虽然 也 同 处 于 一 个 区 域 ， 在 早期 并 不 被 激 活 〈 图 2-28c) 

蛋白 1X 的 转录 单位 只 有 在 DNA 复 制 开 始 后 才 被 激活 。DNA 


155 。 


复制 看 来 为 这 一 受 限 制 的 “晚期 ”转录 模式 准备 了 一 种 DNA 模 
板 。 转 录 要 求 模 板 复 制 这 一 事实 可 通过 原 有 病毒 开始 复制 后 再 引 
入 另 一 类 型 的 腺 病毒 来 加 以 证 明 。 因 为 另 一 类 型 的 晚期 mRNA 可 
与 原先 的 病毒 的 晚期 mRNA 区 别 开 ， 因 此 可 以 确定 只 有 复制 了 的 
DNA 分 子 才 产生 大 量 的 IXRNA 和 在 P16 起 始 的 RNA。 而 另 一 类 型 
的 病毒 也 需要 复制 才能 使 它 的 IX 和 P16 启 动 区 活化 。 


表 5 测定 转录 速率 的 杂交 实验 所 用 的 两 种 标记 细胞 
核 RNA 的 方法 的 比较 

杂交 时 所 用 标记 RNA 杂 交 的 百分数 

的 DNA 序 列 全 细胞 分 离 核 

腺 病毒 基因 组 
感染 早期 的 细胞 0.75 0.53 
感染 晚期 的 细胞 5 14。4 

B- 珠 蛋白 0.01 0.01 

由 8 种 中 国 仓 鼠 mRNA 

制备 的 cDNA 0.0001 一 0.001 “0.6001 一 0.001 

卵 洁 蛋 白 cCDNA:* 0.00018 0.00024 


伴 和 白 和 蛋白 各 0.00015 0.09022 
三 珊 酸 〈 包 括 32P- 一 UTP) 
s.*# 这 两 种 cDNA 可 代 老 鸡 的 入 白 蛋 白质 ， 全 细 炮 的 只 NA 款 江 是 采用 培养 的 
给 孵 管 小 块 ， 标 记 20 分 钟 。 
资料 来 源 ， J: 卫 .ECarnell - Jf，1982，Ratufe -297; 
365; 和 G.S.Mcknight 芭 及 .D.,Palmiter 297 和 无 
Biol.ckem，254: -9050 
因此 ， 腺 病毒 提供 了 一 系列 转录 调节 事件 来 进行 研究 ， 其 审 
转录 速率 的 增 减 及 取决 于 模板 状态 (复制 前 或 复制 后 ) 的 不 同 转录 
激活 。 它 提供 了 一 个 模型 来 研究 和 鉴别 引起 转录 变化 的 有 关 蛋 自 
质 的 作用 。 
(2) 组 织 特异 和 细胞 特异 的 基因 调控 ”重组 DNA 技术 的 
发 展 ， 使 研究 工作 者 得 以 对 某 些 分 化 细胞 中 编码 为 数 众 多 的 蛋 让 
质 的 mRNA 进行 研究 。 通 过 互补 于 这 些 mRNA 的 cDNA 的 克隆 ,并 


156 8 


防毒 DNAI 30-509% 
枚 圭 此 期 间 ! 161X 一 ' 一 | 


病毒 习 另 的 mRNA 
和 《上 总 最 的 9 E 


转录 单 TIE 。 民 过 3 了 
早期 ;位 中 P4 
注 动 区 Ri 人 PEB 了 下 


图 单位 
1 = 
性 P16 

4 如 


二 生 各 


1A 


晚期 
图 2-28 腺 病毒 的 生命 周期 及 其 基因 表达 程序 
标记 分 离 核 中 RNA 从 而 证 明 ， 只 有 在 形成 特定 的 分 化 组 织 中 的 
那些 mRNA 时 ， 转录 才 是 基因 调控 的 基本 方面 。 现 举例 予以 说 明 。 
包 珠 蛋白 ”在 分 化 的 最 后 阶段 ， 特定 基因 会 变 得 很 活跃 。 这 
种 现象 的 一 个 经 典 例子 就 是 脊椎 动物 成 红细胞 的 珠 蛋 白 基 因 。 在 


ef73Z。 


和 RE 


成 年 时 ， 成 红细胞 的 分 化 主要 发 生 在 骨 通 中 ， 而 在 胚胎 期 ， 则 发 
生 在 胚 外 组 织 即 血 岛 和 胚胎 肝脏 内 。 成 红细胞 分 化 为 红细胞 的 过 
程 中 ， 珠 蛋白 的 形成 是 在 细胞 变 成 成 熟 的 不 再 分 裂 的 红细胞 之 前 
的 最 后 4 一 5 次 分 裂 才 开始 的 。 

珠 蛋 白 基 因 在 这 一 分 化 过 程 中 的 调控 主要 发 生 在 转录 起 始 的 
水 平 上 。 在 胚胎 形成 期 间 和 成 年 时 ,活动 的 珠 蛋白 基因 是 不 同 的 ， 
例如 在 鸡 第 5 天 的 胚胎 中 ,红细胞 前 体 的 细胞 核 上 只 形成 胚胎 期 珠 蛋 
白 mRNA 序 列 ;12 天 后 则 其 mRNA 序列 与 成 体 小 鸡 所 制造 的 相同 。 
其 它 组 织 的 细胞 核 则 不 制造 珠 蛋白 mRNA。 值 得 注意 的 是 ， 同 是 
前 体 细胞 ， 其 分 化 并 非 先是 形成 胚胎 期 珠 蛋白 ， 然 后 形成 成 年 的 
珠 蛋 白 ; 而 是 5 天 前 所 有 的 前 体 细胞 都 分 化 生成 胚胎 期 珠 蛋白 ， 而 
12 天 后 ,全 部 (或 大 多 数 ) 生 成 成 年 珠 蛋 白 * 最 后 ,也 是 重要 的 一 点 ， 
虽然 在 红细胞 发 育 的 最 后 阶段 ， 珠 蛋白 的 合成 占 总 蛋 自 的 50 一 90 
外 ， 但 珠 蛋 白 基 因 转 录 只 占 总 异 质 核 RNA 的 0.01 一 0.04% ,所 有 
其 它 mRNA 序 列 正 继续 在 细胞 核 内 合成 。 

@ 小 鼠 肝 脏 mRNAs  。 状 椎 动物 肝脏 合成 数 十 种 其 它 器 官 
所 不 合成 的 蛋白 质 ， 包 括 酶 和 分 泌 到 血液 中 的 蛋 和 白质。 其 中 有 的 
蛋白 质 占 很 大 比例 ， 如 血清 蛋白 组 分 工 占 全 部 肝脏 蛋白 质 合 成 药 
1% ,但 许多 肝脏 特异 的 蛋白 数量 要 小 得 多 。 肝 脏 mRNA 无 论 含量 
多 少 都 克隆 了 其 cDNA 。 因而 知道 其 它 组织 如 脑 、 肾 、 脾 、 等 不 合 
成 这 些 mRNA。 那 么 是 在 哪 一 级 水 平 上 来 调节 这 许 许多 多 含量 参 
差 各 异 的 蛋白 质 的 组 织 特 异性 表达 呢 ? 

用 肝脏 的 12 个 不 同 mRNA 的 cDNA 克隆 进行 分 离 核 RNA 合 成 
的 分 析 表 明 , 肝 细 胞 核 所 生成 的 新 生 RNA 量 是 其 它 组 织 细胞 核 的 
20 一 500 倍 。 因 此 ,各 种 以 组 织 特异 性 方式 表达 的 基因 ， 主 要 在 转 
录 水 平 上 调控 。 在 这 一 杂交 实验 中 ， 还 包括 肌 动 蛋白 基因 和 微 管 
蛋白 基因 ， 但 其 新 生 RNA 的 合成 在 各 种 组 织 中 是 相似 的 。 由 于 这 
些 蛋 自 质 (及 其 mRNA) 在 不 同 的 组 织 中 也 有 差异 ， 这 些 15 公 有 
基因 的 调控 必定 涉及 某 些 转录 后 机 制 。 

回 鸡 的 卵 清 蛋 白质 “在 某 些 情况 下 ， 诱 导 某 一 转录 增加 的 


。158。 


信号 是 已 知 的。 例如 肉 性 激素 引起 鸡 输卵管 里 的 表皮 细胞 在 数量 
与 大 水 上 的 增加 和 分 泌 一 些 蛋白 质 ; 这 些 细胞 分 裂 时 ， 开 始 产生 6 
一 7 种 孵 白 蛋白 质 ,其 中 以 卵 清 蛋白 的 量 最 大 (Oralbumin) 。 待 到 这 
一 过 程 终 了 ， 和 输卵管 细胞 合成 的 总 蛋白 有 一 半 是 卵 清 蛋白 质 。 肉 
性 激素 也 刺激 卵黄 原 蛋白 (vifellogenjn) 的 合成 ， 它 是 一 种 卵黄 蛋 
白质 ， 通 常 在 肉 性 的 肝脏 中 合成 然后 通过 多 清 输送 至 输卵管 并 进 
入 卵 中 。 

与 不 作 处 理 的 比较 ， 雌 性 激素 处 理 的 小 鸡 细胞 中 ， 这 些 基因 
的 转录 速率 急剧 增加 。 

在 肉 性 激素 处 理 的 输 孵 管 细胞 内 , 卵 清 蛋白 基因 的 RNA 只 占 
总 核 RNA 的 0.05% ， 但 是 这 些 细胞 中 总 蛋白 的 30% 是 孵 清 蛋白 
(其 它 卵 白 蛋 白 占 20%%)。 看 来 雌性 激素 引起 的 转 录 增 加 不 是 卵 清 
蛋白 mRNA 大 量 增 加 的 唯一 决定 因素 。 其 它 mRNA 的 累积 必定 
以 某 种 方式 减少 ; 卵 清 蛋白 mRNA 的 半衰期 在 肉 性 激素 刺激 期 间 
也 有 所 延长 ,关于 类 固 醇 引起 mRNA 稳定 性 的 增加 已 经 知道 的 还 
有 几 例 ， 后 面 再 加 讨论 。 

(3) 组 蛋白 生成 的 转录 控制 和 转录 后 控制 。 组 蛋白 基因 的 
例子 代表 了 另 一 种 情况 ; 即 其 中 转录 控制 起 着 重要 作用 ， 但 并 非 
是 唯一 的 作用 。 首 先 ， 在 动物 中 (如 海胆 ) 至 少 有 两 大 组 的 组 蛋白 
基因 。 这 两 组 基因 各 自 都 是 以 串 列 重复 的 形式 出 现 。 其 中 一 组 在 
卵 中 合成 ， 受 精 之 后 其 组 蛋白 mRNA 则 由 另 一 组 基因 来 合成 ， 并 
在 以 后 的 生长 发 育 中 继续 使 用 这 一 组 基因 ， 因 此 这 两 组 不 同 的 基 . 
因 在 胚胎 形成 早期 和 晚期 的 表达 受 转录 水 平 上 的 控制 。 

图 2-29a 的 模型 简单 说 明了 海胆 组 蛋白 基因 表达 的 和 情况; 成熟 
个 体 这 一 组 组 蛋白 起 码 含 有 略微 不 同 的 组 蛋白 的 晚期 基因 从 。 此 
外 ， 在 早期 胚胎 形成 期 间 ， 组 蛋白 的 早 mRNA 的 转译 也 有 一 定 的 
选择 性 。 虽 然 如 此 ， 总 可 以 说 ， 组 蛋白 早晚 两 组 基因 的 表达 主要 
属于 转录 控制 。 

组 蛋白 基因 也 呈现 有 另 一 水 平 的 调控 。 在 哺乳 动物 的 培养 细 
胞 中 ， 组 蛋白 mRNA 主要 出 现在 细胞 周期 的 S 期 ， 组 蛋白 的 合成 


159。 


也 发 生 在 这 个 时 候 ， 但 在 整个 细胞 周期 ， 组 蛋白 基因 都 以 低速 度 


进行 转录 。 组 蛋白 转录 在 S 期 约 增加 4 倍 ,而 同期 组 蛋白 mRNA 的 : 
量 却 增 加 16 倍 (图 2-29b)。 因 此 组 蛋白 mRNA 的 稳定 性 在 此 时 期 也 
必定 有 所 增加 。 这 一 基因 家 族 在 不 同 情况 下 看 来 采用 不 同 的 基因 8 


调控 模式 。 并 
(a) ”组 蛋白 
ImRNA es 一 
育 阶段 
日 六 古人 人 
二 训 了 1 500 800 
圳 踪 期 “” 原 肠 期 
了 生肖 由 成 也 关 翰 疯 本 下 乏 
ab TS 
0 有 丝 分 裂 有 丝 分 裂 
G S G2 


组 蛋白 DNA 下 


图 2-29 组 蛋白 基因 的 调控 (a) 在 海胆 的 生命 周期 中 ,不 同时 间 使 用 不 同 的 组 


蛋白 基因 。 其 它 动 物 亦 然 。mRNA 的 合成 是 在 转录 水 平 上 受到 控制 。(b) 在 培 
养 的 HeLa 细 胞 的 细胞 周期 中 ,对 其 组 蛋白 及 组 蛋白 mRNA 合成 的 分 析 玫 明 ， 
在 35 期， 转录 增 加 4 倍 ， 但 mRNA 浓度 则 增加 16 倍 ， 说 明 组 蛋白 mRNA 也 在 
积累 水 平 土 受到 控制 。 


单 细 胞 真 核 生 物 的 转录 控制 ”长 期 以 来 一 直 都 有 这 样 的 很 
定 ， 即 酵母 中 蛋白 质 合 成 速率 的 变化 的 主要 依据 是 转录 控制 由 


于 从 酸 母 细胞 难以 分 离 出 RNA 不 受 破坏 的 细胞 核 ， 同 时 也 由 于 


ee 160 


ATUEREER 


分 离 核 在 离 体 转录 期 间 其 功能 很 差 ， 因 此 盖 直 没 有 对 其 细胞核 
RNA 合 成 进行 过 直接 的 测定 。 但 是 也 用 酵母 细胞 的 总 RNA 与 克隆 
了 的 基因 进行 过 杂交 实验 〈 如 核 蛋 白 体 蛋白 基因 和 和 乳 清 酸 脱羧 酶 

orotic acid :decarboxylase 基 因 )。 结 果 表 明 ，mRNA 浓 度 增 加 
时 ,， “了 尿 喀 啶 在 特定 的 ,mRNA 中 的 挫 入 量 也 增加 。 因 此 极 有 可 
能 酵母 基因 的 控制 是 在 转录 水 平 上 。 后 面 我 们 将 看 到 ， 许 多 酵母 
基因 是 由 蛋白 质 调节 的 ,这 些 蛋 白质 通过 与 DNA 结合 这 种 方式 而 
发 生 作 用 。 

就 烙 霉 菌 (Dictyostelium discoideum) 而 言 ， 已 经 用 分 离 核 
来 说 明 其 生命 周期 的 不 同时 期 起 作用 的 许多 基因 是 转录 水 平 的 控 
制 ， 时 鳃 访 业 法 的 识 核 生物 的 芭 加 凋 芝 泪 来 雹 是 标 录 开怀 上 上 间 

(多 mRNA 加 工 水 平 上 的 控制 

自从 发 现 异 质 核 RNA(hnRNA) 及 推断 其 作为 mRNA 前 体 的 
作用 以 来 ,分子 生 物 学 家 就 认为 RNA 的 选择 性 加 工 可 能 是 基因 
调控 的 一 种 因素 。 鉴 于 现在 已 经 知道 了 真 核 生 物 转录 单位 的 结构 
及 其 转录 后 修饰 《〈 加 幅 子 ， 甲 基 化 ， 聚 A 加 成 及 剪接 等 初始 
转录 物 选择 性 加 工 的 机 制 则 可 以 精确 地 加 以 说 明 ， 目 前 也 已 有 许 
多 关于 RNA 加 工 水 平 上 基因 调控 的 例子 。 复 杂 的 转录 单位 至 少 有 
两 种 类 型 的 初始 转录 物 ， 即 

四 初始 转录 物 可 能 有 两 个 或 两 个 以 上 可 选择 的 聚 A 位 点 ， 而 
在 mRNA 形成 中 ， 一 种 分 子 只 使 用 其 中 的 一 个 位 点 3 

四 初始 转录 物 可 能 只 有 一 个 聚 A 位 点 ， 但 可 以 剪接 成 两 个 或 

两 个 以 上 不 同 的 mRNA。 
”细胞 在 同样 的 初始 转录 物 中 可 以 在 聚 A 位 点 或 剪接 位 点 之 间 
随意 抉择 即 梅 成 由 RNA 有 区 别 地 加 工 所 行使 的 基因 调控 。 
了 另 一 种 调 性 节选 择 也 可 以 在 转录 后 水 平 上 起 作用 。 假 设 初始 
转录 物 在 某 一 生理 条 件 下 或 茶 一 细胞 类 型 中 被 正确 地 加 工 ， 而 在 
另 一 条 件 下 或 另 一 细胞 类 型 中 却 按 弃 不 用 ， 这 种 选择 即 称 为 加 工 
一 找 弃 选择 。 

认为 有 加 工 一 接 弃 选择 的 理由 是 :细胞 核 中 的 许多 RNA 分 子 


e 161。 


显然 不 被 用 来 生成 mRNA， 也 就 是 说 它们 的 序列 在 细胞 质 中 并 


.不 出 现 。 例 如 ， 表 6 中 是 用 仓鼠 培养 细胞 进行 的 一 次 实验 结果 ， 含 


育 A 的 总 核 RNA 中 ，, 含 mRNA 序列 的 占 25%， 而 其 余 的 75% 中 含 
mRNA 序列 的 浓度 极 低 。 正 如 前 面 提 到 过 的 那样 ”除了 组 蛋白 


mRNA， 目 前 尚未 发 现 缺 乏 聚 人 的 mRNA,， 加 工 - 按 弃 选择 的 说 法 


可 能 有 助 于 探寻 缺失 聚 A 的 异 核 RNA， 是 否 它们 以 接 弃 的 方式 被 
转录 。 加 工 - 接 弃 选择 可 能 是 加 工 调控 的 一 种 开关 形式 ;被 接 弃 的 
转录 物 可 能 只 是 暂时 被 关闭 ， 或 者 ， 它 们 可 能 代表 着 进化 过 程 申 
已 经 变 成 假 基因 的 那些 基因 。 

最 近 已 经 有 了 两 个 关于 激素 控制 的 加 工 - - 摸 弃 选择 的 例子 ， 肯 
上 腺 类 转 醇 激素 引起 肝 细 胞 累积 一 种 糖 蛋白 〈%1) 的 mRNA;， 甲 
状 腺 激素 引起 肝 细 胞 积累 一 种 未 知 功 能 的 蛋白 质 〈 根 据 电 泳 行为 ， 
称 为 阵 点 12 的 蛋白 ) 的 mRNA。 由 于 在 这 两 个 例子 中 ， 各 自 的 转 
录 速 率 没 有 差别 ， 而 细胞 核 RNA 的 稳 态 合成 却 有 所 增加 ， 因 此 这 
些 mRNA 的 增加 可 能 是 由 于 在 另外 的 情况 下 被 按 去 不 用 的 那些 核 
转录 物 得 以 保留 。 目 前 尚 不 知道 这 种 “选择 ”机 制 是 否 在 于 育 A 的 


加 成 。 
表 6 仓鼠 培养 细胞 中 异 核 RNA 的 比较 
在 聚 A+ 部 分 在 育 A- 部 分 
异 核 RNA 种 类 的 百分比 的 百分比 
总 标记 异 核 RNA 25 75 
含 帽 子 的 异 核 RNA* -和 75 
具有 mRNA 序列 的 异 核 RNA 70 一 90 10 一 30 


根据 这 些 百分比 ， 所 有 蜡 核 RNA 都 是 有 帽 子 的 ， 这 就 意味 着 主要 是 转录 后 
收 作 决 定 着 预 将 变 为 细胞 质 中 稳定 的 卫 RNA 和 将 不 含 聚 A 的 序列 分 野 s 


四 细胞 核 RNA 的 差异 加 工 方式 腺 病毒 mRNA 形成 的 研 
究 启 迪 了 证 明 mRNA 转 录 后 调 市 的 方法 。 第 一 个 关于 聚 信 的 不 同 


选择 和 不 同 剪接 的 例子 是 在 腺 病毒 的 侵 染 周期 中 观察 到 的 二 有 天 


量 的 例子 说 明细 胞 内 基因 的 有 差异 加 工 〈 表 7)。 
聚 A 的 不 同 选择 导致 剪接 的 不 同 排列 时 ， 正 是 育 A 的 不 同 选 


。 162。 


择 测 指令 着 前 接 的 不 同 排列 。 

果 蝇 原 肌 球 蛋 白 〈tropomyosin JU mRNA 的 形成 是 差异 前 接 
的 一 个 清晰 的 例子 (图 2-30) ， 在 胚胎 和 成 虫 中 , 这 一 mRNA 的 3/ 
端 与 5“ 端 是 相同 的 ， 但 成 虫 DRNA 中 有 一 个 外 显 子 是 胚胎 mRNA 
中 所 没有 的 。 因 为 在 每 一 种 情况 下 ， 转 译 终止 在 第 三 个 外 显 子 ， 
因此 ， 这 两 种 蛋白 质 的 羧基 端 有 27 个 氨基 酸 的 差别 。 

尽管 有 许多 细胞 的 mRNA 都 表现 出 来 自 同 一 转录 单位 ， 却 有 
着 不 同 的 外 显 子 和 不 同 的 聚 A 位 点 。 但 要 想 对 核 RNA 的 研究 来 直 


图 2-30 果 晶 原 肌 球 蛋白 I 基 因 差 别 表达 中 的 剪接 。 原 肌 球 蛋白 I 转 
录 单 位 有 四 个 外 显 区 。 胚 胎 肌肉 中 的 mRNA 含有 外 显 区 1，2 和 4， 
而 成 虫 胸肌 中 的 mRNA 则 含 全 部 的 四 个 外 显 区 。 由 这 两 种 mRNA 转 
录 的 蛋白 质 在 前 面 的 一 段 257 氨 基 酸 是 相同 的 ， 最 后 的 27 个 氨基 酸 
则 不 同 。 


的 差异 ， 总 是 不 大 容易 的 。 然 而 , 表 7 中 所 列 的 例子 看 来 几乎 可 以 
肯定 是 加 工 上 的 差异 ， 因 为 这 些 产物 在 组 织 中 只 可 能 含 一 .两 种 
由 于 mRNA 稳定 性 的 差别 是 以 一 种 全 或 无 的 方式 起 作用 ， 因 此 ， 
产生 这 种 结果 似乎 不 大 可 能 是 不 同 的 稳定 性 所 造成 。 

包 加 工 差异 的 可 能 宙 制 目前 尚 不 知道 有 什么 因子 控制 着 


163， 


人 


袁 7 由 差异 加 工控 制 的 基因 
不 同 控制 的 依据 


向 机 人 :关于 个 网， 机 本 时 对 :一 
聚 A 选 择 “ 剪接 变 晃 

-哺乳 类 
怖 注 留 素 〈 大 鼠 ) 两 种 蛋白 ， 钙 滞留 素 (Ca++ + 
调节 激素 ) 和 与 钙 湾 留 素 亲 

缘 的 神经 肽 , 它们 的 羧基 端 
有 差别 
激 肽 原 〈 牛 ) 均 生 成 控制 血压 的 舒缓 激 + 
( 孜 ininogens) 肽 (bradykinin) 的 两 种 前 

激素 ， 对 和 蛋白酶 具 不 辐 的 

敏感 性 
免疫 球 蛋 和 白 重 链 ”在 不 同 的 抗体 分 子 中 具有 不 
〈 小 鼠 ) 同 的 羧基 端 十 
肌 镍 蛋白 《〈 大 鼠 ) “在 大 鼠 骨 骼 肌 中 两 种 不 同 的 
(Tiroronin) 肌肉 有 蛋白质 十 
肌 红 电 白 轻 链 长 度 分 别 为 140 和 180 个 氨基 
〈 大 鼠 )* 酸 的 两 种 和 蛋白质， 在 急促 痉 

疼 的 肌肉 中 汪 
前 原 连 激 肽 〈 牛 ) 生成 两 种 前 激素 炙 放 物质 了 / 
(Freprotachykinin) (一 种 影 啊 平滑 肌 的 神经 肽 ); 和 


较 大 的 一 种 前 激素 还 释放 物 
质 K( 一 种 未 知 功能 的 神经 肽 ) 


CA 


纤维 连结 蛋白 (大 鼠 ) 具有 三 种 形式 的 结构 蛋白 
(FEibronectiny) 
革 蝇 
原 肌 球 蛋 昌 在 胚胎 和 成 虫 中 呈现 差异 的 
(IropFcmycsiny) 两 种 肌肉 蛋白质 十 


肌 红 和 蛋白 重 链 胚胎 和 成 虫 间 星 现 差异 的 两 
种 肌肉 蛋白 质 ; 在 是 和 成 虫 由 二 


还 发 现 第 三 种 
bx 关 攻 区区 在 早期 豚 胎 和 幼虫 中 控制 胸 二 
肌 发 育 的 不 同 基因 产物 
甘 氨 咪 核 背 酸 转 由 一 种 长 mRNA 编码 的 酶 ; 放 
四 酰 酶 - 较 得 的 mRNA 编码 另 一 种 肽 ; 


(Glycinamide 其 中 有 岂 个 外 显 子 是 相同 的 。 
ribotide trang- 
fcrmyjlasey: 
* 大 鼠 肌 红 蛋 自前 公 链 蛋 自 由 在 5/ 端 有 差别 的 两 个 不 同 的 重 登 转录 物 加 工 而 成 ， 


所 生成 的 mRNA 在 重 又 区 报 虽 也 合 企 国 的 外 显 于 电钻 的 用 机 外 本 王国 本 二 鸡 的 
肌 红 蛋 自 基因 指 忆 况 几 予 相 朵 。: ， 污 


2 164 


站 
UL “wen andeweakwcaeaei es 二 


全 


清太 的 不 同 选 择 和 加 工 差异 。 我 们 前 面 提 到 过 初始 转录 物 终止 在 


聚 A 位 点 下 游 ， 但 一 旦 在 RNA 聚 合 酶 通过 聚 A 位 点 后 ，RNA 马 上 
被 切割 。 我 们 现在 尚 不 清楚 想像 中 的 识别 因子 是 否 通过 与 新 生 的 
核 RNA 结 合 而 决定 聚 太 的 位 置 , 或 者 是 否 它们 与 DNA 结 合 而 为 使 
用 某 一 特定 聚 A 位 点 提供 某 种 信和 号。 

在 加 工 差 异 欧 例子 中 ， 细 胞 核 中 的 RNA 小 分 子 (snRNA) 与 
蛋白 质 相 结合 (snRNP) 可 能 起 着 某 种 作用 。 如 前 所 过 ,，UI snRNA 
有 些 序 列 至 少 是 互补 于 许多 剪接 位 的 5 衔接 处 ,因此 snRNPE 的 作 
用 可 能 是 把 转录 物 的 两 个 部 分 挂 起 来 。 如 果 不 同 的 snRNP 具 有 不 - 
同 移 专 一 性 ， 那 末 它 们 在 浓度 上 的 差异 可 能 会 导致 剪接 药 差 异 。 

加 工 差 异 的 另 一 个 可 能 的 机 制 是 细胞 核 RNA 甲 基 化 于 的 差 
异 守 例如 在 未 剪接 时 ， 如 果 核 RNA 被 mm*A 残 基 (在 碱 基 的 6 位 碳 
上 上 甲 基 化 的 腺 苷 酸 残 基 ) 所 加 成 ， 则 育 A 位 点 的 选择 上 可 能 起 着 
某 种 攻 用 ;， 或 者 这 种 甲 基 化 会 保护 某 些 剪接 位 点 却 导 致 利用 另外 
的 位 点 。 这 些 都 是 很 有 兴趣 的 问题 ， 吸 引 着 许多 研究 工作 者 。 相 . 
信和 在 不 和 久 的 将 来 会 得 到 解答 。 

1@ 重 鸽 转 录 单 位 

容易 与 加 工 调 控 相 混淆 的 是 一 个 转录 单位 的 排列 所 导致 一 种 
精细 的 转录 控制 。x- 淀 粉 酶 是 在 肝 胜 和 三 液 腺 中 水 解 淀 粉 的 酶 。 
在 这 两 种 组 织 中 ， 这 种 酶 具有 相同 的 氮 基 酸 序 列 , 但 在 茬 液 腺 中 ， 
浓度 要 高 100 人 税 。 淀 粉 酶 的 编码 序列 是 相同 的 ， 但 两 种 mRNA 在 
5“ 端 有 所 不 同 。 它 们 的 帽子 位 点 不 同 ， 在 基因 组 DNA 中 ,两 者 相 
距 2.8kb 不 同 的 帽子 位 点 产生 不 同 的 5 外 显 子 〈 两 种 情况 下 ，5” 
外 显 子 均 不 转译 ) 。 因 此 ， 转 录 的 起 始点 与 转录 的 速率 是 组 织 特异 
性 的 。 这 两 种 mRNA 的 第 一 个 剪接 的 3 接合 点 相同 ， 其 余部 分 也 
相同 。 这 两 种 mRNA 实际 上 是 来 自 两 个 不 同 而 且 重叠 的 转录 单位 。 
其 组 织 特异 性 在 于 各 自选 择 不 同 的 转录 起 始 位 点 。 
酵母 中 的 转化 酶 〈invertase， 分 解 蔗糖 的 双 糖 酶 ) 也 具有 相 
似 萝 情形 。 该 酶 的 转录 单位 也 有 两 个 不 同 的 转录 起 始 位 点 ; 一 个 
是 定制 型 转录 时 所 用 ， 另 一 个 则 是 酶 被 蔗糖 诱导 时 所 用 。 现 在 尚 


es TI65 。 


不 知道 其 可 诱导 位 点 是 属 正 调节 抑或 负 调 节 进一步 研究 这 一 癌 
题 倒 是 贷 有 兴趣 的 。 

(5) 细胞 质 中 的 基因 调控 

在 这 之 前 我 们 廊 讨 论 的 是 在 细胞 核 中 特定 mRNA 生成 的 调节 
事件 。 真 核 生 物 的 大 多 数 基 因 可 能 归属 于 细胞 核 中 的 调节 ， 但 细 
胞 质 中 的 调节 也 是 重要 的 。 蛋 白质 合成 的 速率 受到 mRNA 进入 细 
胞 质 的 速率 的 影响 ， 也 受到 mRNA 在 细胞 质 中 的 寿命 及 转译 频率 - 
的 影响 。 最 后 甚至 转译 后 的 事件 也 起 着 调控 基因 表达 的 作用 。 不 
过 在 这 一 节 里 ,我 们 仅 限 于 讨论 紧 接 着 转录 后 的 控制 : 即 mRNA 稳 
定性 的 差异 和 转译 差异 。 

mRNA 稳定 性 二 的 变化 所 引起 的 基因 调控 

在 肴 推动 物 中 ， 作 用 于 组 织 特异 性 的 一 些 激 素 常 常 造成 mR= 
NA 稳定 性 的 差异 。 这 类 调控 往往 伴随 有 转录 的 增加 ， 结 果 会 是 
特定 蛋白 质 合 成 量 的 增加 。 目 前 尚 不 明 上 陈 mRNA 在 代谢 上 不 稳定 
的 原因 ， 因 此 对 mRNA 稳定 性 的 变化 几乎 是 一 无 所 知 。 

巴 沙 乳 激 素 在 延长 酪 蛋白 mRNA 半衰期 中 的 作用 “ 酪 蛋白 
在 乳汁 中 含量 丰富 。 它 是 在 激素 (包括 多 肽 激素 泌乳 激素 ) 的 作 
用 下 在 乳房 组 织 的 表皮 细胞 中 合成 。 将 小 块 的 乳房 组 织 培养 在 不 
含 泌 乳 激 系 的 培养 基 中 ， 这 时 每 一 细胞 只 含 大 约 300 个 : 酷 蛋 白 
mRNA， 而 在 加 入 泌乳 激素 时 ， 每 个 细胞 酪 蛋白 mRNA 分 子 达 
30,000 个 ， 但 是 培养 的 乳房 组 织 细 胞 的 细胞 核 中 ， 在 贞 志 机 称 铺 
况 下 ， 栈 蛋白 mRNA 序列 数 只 有 3 倍 之 差 。 

泌乳 激素 的 存在 会 使 酷 蛋 白 mRNA 的 半衰期 增长 30 倍 至 50: 
倍 ， 这 也 就 是 酷 蛋 白 mRNA 浓 度 在 泌乳 激素 作用 下 增加 100 信 的 
主要 原因 。 图 2-31 所 给 出 的 实验 结果 充分 说 明了 这 一 点 ， 即 泌 我 
激素 诱导 下 酪 蛋白 mRNA 量 上 的 增加 与 其 说 是 合成 量 的 增加 ， 毋 
宁 说 是 由 于 mRNA 稳定 性 的 增加 。 

四 肝脏 中 卵黄 原 蛋白 mRNA 稳定 性 取决 于 肉 性 激素 前 面 
曾 说 过 ， 孵 黄 原 蛋白 是 在 内 性 鸡 和 峙 的 肝脏 中 被 肉 性 激素 诱导 合 
成 的 。 合 成 后 即 转运 到 输卵管 。 在 肉 性 鸡 的 肝脏 中 ， 它 也 对 实验 


“166。 


中 加 入 的 内 性 激素 〈 划 estradicl) 有 所 应 答 。， 但 不 作 肉 性 激素 实 
验 处 理 。 雌 性 个 体 中 ， 卵 黄 原 蛋白 的 半衰期 大 约 是 24 小 时 。 和 急 肥 
除去 肉 性 激素 ， 孵 黄 原 蛋白 的 浓度 很 快 减少 ,这 时 半衰期 不 到 ?小 
时 。 因 此 ， 这 种 蛋白 的 激素 控制 显然 是 在 两 个 水 平 上 一 一 转录 起 
始 和 mRNA 稳定 性 。 


= 多 
2 18 4 3973624228 


图 2-31 泌乳 激素 引起 乳房 纪 胞 中 酪 蛋白 mRNA 稳 定 。 将 泌乳 的 大 
鼠 乳 房 组 织 放 入 缺 泌 乳 激 素 的 培养 基 中 4 小 时 后 ， 取 一 份 加 入 滥 乳 
激素 并 用 3 互 尿 喀 喧 标记， 另 一 份 作 用 样 标记 但 不 加 泌乳 激素 。3 小 
时 后 除去 标记 物 ， 再 加 入 无 同位 素 标记 的 核 音 酸 进 行 “ 追 补 ，， 然 
后 隔 一 定时 间 提 取 RNA， 用 杂交 法 测定 酷 蛋 白 mRNA 的 量 。 培 养 
基 无 泌乳 激素 时 ,最 高 值 是 在 标记 物 撤除 之 后 但 标记 的 mRNA 迅速 
衰减 “不 到 1 小 时 即 衰 减 一 半 )。 有 泌乳 激素 存在 的 情况 下 标记 mR- 
NA 的 累积 持续 若干 时 候 〈 由 于 追 补 失效 )， 且 衰减 较 慢 (衰减 一 半 
高 40 小 时 )。 因 此， 泌乳 激素 大 大 减 小 了 酷 蛋 白 mRNA 的 更 新 ， 其 
稳定 主要 跟 乳 房 细胞 中 酷 蛋 白 mRNA 含量 高 有 关 。 


加 其 它 mRNA 半 误 期 的 变化 “前 夯 的 例子 说 明 mRNA 稳 定 
性 可 以 被 蛋白 质 类 激素 或 类 固 醇 类 激素 调和 六。 可 使 npRNA 稳 定性 
增加 和 减 小 的 还 有 其 它 一 些 因素 〈 表 8) 。 使 半衰期 变化 的 精确 信 
号 往往 不 清楚 ,病毒 蛋白 质 在 侵 染 晚期 的 累积 可 以 使 腺 病毒 某 些 
早期 mRNA 增加 稳定 性 。 

细胞 骨架 成 分 的 mRNA 浓度 的 变化 甚至 在 转录 速率 不 变 的 情 
况 王 也 可 检查 出 。 例 如 肌 动 蛋白 和 微 管 蛋白 mRNA 在 再 生 肝 中 浓 
度 的 增加 不 是 由 于 转录 量 的 增加 。 同 样 ,在 转录 速率 没有 明显 变化 
的 情况 下 ， 这 些 mRNA 的 浓度 在 不 同 组 织 细胞 之 间 却 有 差异 。 这 
种 变化 很 可 能 由 RNA 加 工 所 导致 的 mRNA 稳定 性 的 差异 所 造成 。 


es。 JJ67。 


mRNA 稳定 性 呈现 受 调节 的 生物 系统 


表 8 
mRNA 半衰期” 

mRNA 组 织 或 细胞 ， 调节 信号 具 效 应 物 “不 具 效 应 物 
卵黄 原 蛋 电 峙 肝脏 肉 性 激素 500h 16h 
卵黄 原 蛋白 雄 鸡 肝脏 肉 性 激素 一 24h <3h 
卵 清 蛋白 鸡 输卵管 内 性 激素 一 一 之 24h 2-5h 
伴 久 清和 蛋白 孕 娠 激素 
酷 蛋 白 大 鼠 乳 腺 泌乳 激素 ”92h . 2-5h 

前 列 腺 类 固 醇 ”大 鼠 前 列 腺 ”雄性 激素 “增加 30 倍 - 
结 百 合 和 蛋白 | 
组 蛋白 Hela 细 胞 DNA 复 制 30 一 60 分 钟 : 10 分 钟 
组 蛋白 酵母， DNA 复 制 “ 即 DNA 复 制 即 复制 后 ， 

期 间 之 15 分 钟 ”5 分 钟 

腺 病毒 1A 和 1B HeLa 细 胞 病毒 晚 蛋白 ，” 即 侵 染 晚期 “” 即 盆 染 早期 
( 早 mRNA) 60 一 100 分 钟 6 一 10 分 印 
细胞 质 肌 动 蛋白 肝 再 生 肝 增加 10 仿 


细胞 质 B 微 管 蛋白 肝 再 生 肝 “增加 10 售 
细胞 质 B 微 管 蛋 白 小 鼠 培 养 细胞 解 聚 微 管 蛋 白 减少 >10 倍 


尤其 需要 指出 的 是 ， 微 管 蛋白 亚 基 可 能 在 调节 微 管 蛋白 
mRNA 稳定 性 上 起 着 某 种 作用 。 当 微 管 在 秋水 仙 素 作用 下 解 聚 时 ， 
微 管 mRNA 迅速 减少 。 显 然 ， 微 管 解 聚 使 微 管 蛋白 趋向 不 稳定 ， 
这 意味 着 正常 情况 下 ， 微 管 蛋白 在 稳定 其 本 身 的 maRNA 起 着 某 种 
作用 。 这 一 机 制 即 构成 了 某 种 基因 在 细胞 质 趾 的 自动 调 责 。 

四 特定 mRNA 转录 效率 的 控制 3 

如 前 所 述 ，mRNA 更 新 的 差异 是 细胞 质 中 基因 调控 中 的 二 种 
类 型 .转译 的 差异 也 能 大 大 影响 基因 表达 。 转 译 调控 的 发 现 首先 是 
与 观察 到 卵细胞 中 贮存 的 所 谓 “ 母 亲 ?mRNA 的 延迟 使 用 这 种 现象 
有 关 。 在 许多 着 椎 动物 和 无 冰 椎 动物 的 未 受精 卯 细胞 质 中 贮存 的 
RNA 有 着 mRNA 药 特 征 ， 即 正确 的 长 度 ，5“ 帽 子 和 3 聚 太 在 帅 
未 受精 时 ， 蛋 白质 谷 成 很 慢 ;， 受精 后 ， 蛋 白质 合成 急剧 增 胃 司 由 
于 这 时 蛋白 质 合成 的 增加 是 在 没有 任何 新 mRNA 形成 的 情况 下 


“168 


发 生 的 ， 因 此 ， 肯 定 与 转译 控制 有 关 。 

蛋 由 质 合 成 的 这 种 变化 不 但 是 量 的 而 且 也 是 质 的 。 例 如 ， 圾 
贝 (Spisula solidissima) 卵 中 ， 受 精 前 形成 的 某 些 蛋白 质 在 受 
精 后 的 合成 几乎 都 不 是 那样 快 。 而 其 它 蛋 白质 在 受精 后 则 大 量 出 ; 
现 。 但 是 ， 从 受精 孵 和 非 受精 卵 提 取 总 RNA 并 用 细胞 提取 液 进 行 
转译 时 , 却 可 以 看 到 受精 前 、 后 都 存在 同样 的 mRNA。 原 先 转译 “ 暂 
停 ”的 某 些 蛋白 在 胚胎 发 生 的 某 一 时 期 看 来 得 以 起 始 ， 因 为 不 管 
是 受精 孵 和 非 受 精 卵 ， 其 不 转译 的 mRNA 是 不 与 核糖 体 结合 的 。 

哺乳 动物 的 核糖 体 蛋白 也 呈现 转译 调控 。 若 将 培养 细胞 置 于 
无 蛋白 培养 基 中 而 使 生长 暂停 ， 核 糖 体 蛋 白 的 mRNA 则 不 与 多 聚 
核糖 体 结合 ， 因 而 不 再 转译 。 若 培养 基 中 再 补充 血清 ，mRNA 则 
再 次 被 核糖 体 结合 而 转译 。 

HeLa 细 胞 被 腺 病毒 侵 染 后 ， 晚 期 也 呈现 转译 调控 。 细 胞 的 原 
有 mRNA 依然 存在 但 不 转译 ;病毒 的 晚期 mRNA 转译 构成 了 所 合 
成 的 蛋白 质 90% 以 上 。 除 了 病毒 mRNA 之 外 ,病毒 基因 组 还 编码 
一 种 小 RNA (160 核 背 酸 )， 它 是 由 RNA 聚 合 酶 III 所 合成 。 这 一 ， 
RNA 称 为 VA RNA。 在 细胞 内 ，VA RNA 是 细胞 质 和 细胞 核 中 
均 存在 的 核糖 核 蛋白 颗粒 的 一 部 分 。 若 编码 VA RNA 的 病毒 序列 
负 失 ， 所 合成 的 病毒 RNA 与 正常 病毒 侵 染 时 所 合成 的 相同 , 但 病 
毒 mRNA 的 转译 都 减少 10 倍 。 这 种 情况 说 明 , 这 种 小 的 核糖 核 蛋 白 
颗粒 在 转译 中 起 着 某 种 直接 的 作用 。 推 而 广 之 ， 看 来 有 可 能 各 种 
mRNA 也 需要 某 些 小 的 核糖 核 蛋白 颗粒 来 帮助 其 有 效 的 转译 。 

( 6 ) 转 译 总 速率 的 控制 

只 有 为 数 很 少 的 特定 蛋白 质 行使 转译 控制 。 但 各 种 细胞 要 使 
蛋白 质 合成 正常 速率 发 生变 化 ， 所 有 mRNA 都 行使 转译 控制 的 机 
制 。 例 如 ， 如 果 将 温度 升 到 40C 以 上 ， 哺 乳 类 和 昆虫 培养 细胞 的 
大 多 数 转译 起 始 都 被 抑制 ， 但 却 刺 激 了 热 激 蛋白 的 形成 。 热 激 蛋 
白质 基因 的 转录 的 增加 有 利于 热 激 mRNA 的 转译 。 

蛋白 质 合成 普遍 抑制 的 另 一 个 例子 是 发 生 在 各 细胞 周期 。 当 
细胞 进入 有 丝 分 裂 期 ， 转 译 起 始 则 降低 速度 ， 蛋 白质 合成 速度 比 


e 169。 


二 
人 


正常 情况 下 降 30% 。 起 始 频率 下 降 是 由 于 多 育 核 糖 体 数量 减少 ，… 
即 每 个 mRNA 得 到 较 少 的 核糖 体 。 虽 然 有 丝 分 裂 期 间 RNA. 合 成 
大 幅度 下 降 ， 但 mRNA 数目 的 减少 尚 不 足 于 成 为 蛋白 质 合 成 减少 
的 原因 ， 显然 转译 控制 也 是 一 个 因素 。 

细胞 也 采用 抑制 总 蛋白 合成 的 机 制 。 其 中 的 一 种 机 制 可 能 是 - 
蛋 自 质 激酶 使 起 始 因子 磷酸 化 这些 激 酶 将 磷酸 加 到 丝氨酸 , 苏 所 
酸 和 酷 氨 酸 残 基 上 ， 即 ， 

0 

AmP ， 旷 忆 乓 “0 下 齐全 二 中 二 下 商人 人 枚 丰 加 二 
例如 ， 当 蛋白 质 起 始 因子 eIF。( 真 核 的 起 始 因子 2 的 负 写 六 被 
酸化 时 ， 它 就 处 于 失 活 状态 。 在 图 2-32 所 描述 的 实验 系统 中 蛋白 
质 激酶 在 缺乏 血红 素 或 有 双 键 RNA 片段 存在 时 可 以 触发 磷酸 伦 


血红 素 阻 断 


血红 素 控制 的 AS 
反应 匆 ws 反应 物 


RN 减少 蛋 折 . 


elF2z (OO) 一 汪 质 质 合成 


重 月 关 活 
双 链 光环 


路 oanaa， 加 


图 2-32 红细胞 蛋白 质 的 转译 总 速率 控制 机 制 ， 其 校生 物 转 译 起 
始 因子 2(eLF2) 可 以 通过 两 种 可 能 的 机 制 被 磷酸 化 ,致使 在 促进 蛋 

白质 合成 的 起 始 时 活性 很 低 。 血 红 素 控制 的 反应 物 是 - 种 含 激 酶 - 
的 抑制 性 复合 物 , 只 在 血红 素 缺 乏 时 被 激活 。 因 此 ,在 有 双 链 RNA 

存在 时 ， 或 缺乏 血红 素 时 ， 才 导致 <LEF2 的 磷酸 化 而 减少 蛋白 质 合 

成 的 起 始 。 


+ 相 T70 


作用 。 央 为 血红 蛋白 含 血 红 素 和 珠 蛋 白 ， 两 者 的 平衡 由 转译 控制 
来 维持 ;血红 素 药 减少 导致 珠 蛋 月 mRNA 转译 前 减少 。 所 有 细胞 “ 
都 可 能 含有 这 些 蛋 白质 激酶 ， 除 了 血红 素 和 双 键 RNA 之 外 ,许多 
因子 也 可 以 影响 它们 的 活性 。 

(7) rRNA 与 tRNA 的 调控 

前 面 各 节 讨 论 的 是 蛋白 质 编码 基因 的 调控 。 当然 重 白质 编码 
基因 比 其 它 类 型 基因 来 得 多 ， 而 且 大 多 数 细 胞 的 特异 性 富 于 蛋白 
质 编 码 基因 的 调控 。 虽 然 如 此 ， 细 胞 生长 与 发 育 中 的 一 个 重要 因 
素 是 RNA 育 合 酶 I 所 转录 的 核糖 体 基因 和 由 RNA 聚 合 酶 TI 所 转录 
的 小 RNA 基 因 的 调控 。 

核 炉 体 .RNA 合成 的 调控 在 各 种 细 跑 类 型 和 各 种 生物 中 并 不 
在 同样 的 水 平 上 。 在 营养 物 贫 乏 ， 如 缺乏 氨基 酸 的 培 养 基 中 的 
细菌 比 在 丰富 培养 基 中 的 生长 要 慢 得 多 。 这 时 生长 缓慢 延 伴随 着 
前 TRNA 合成 的 停止 。 细 菌 中 前 TRNA 合成 的 控制 要 有 多 聚 酸 
5“ppGpp， 在 不 生长 的 细胞 中 ， 这 种 物质 的 浓度 会 增 加 。ppGpp 
在 抑制 核糖 体 基 因 转 录 的 起 始 中 起 着 直接 的 作用 。 这 种 所 谓 即 时 
的 “严谨 型 ”应 答 引 起 核糖 体形 成 的 大 量 减 少 。 酵 母 细胞 也 有 这 
种 停止 核糖 体形 成 的 严谨 型 应 答 。 饥 饿 或 孢子 形成 时 ,核糖 体 RNA 
的 形成 至 少 减 少 80% 。 

但 在 哺乳 类 的 培养 细胞 中 ， 在 必需 氮 基 酸 饥 饿 时， 前 INA 
继续 合成 ， 并 维持 在 正常 速率 的 30 一 50% 的 水 平 。 这 时 没有 新 的 
核糖 体 蛋白 的 合成 ， 因 此 没有 新 的 核糖 体 的 装配 ;前 TRNA 甚至 
也 降解 。 现 在 已 知 在 肴 椎 动物 中 发 生 的 一 些 核糖 体 基 因 转 录 的 调 
控 。 例 如 ， 峙 的 胚胎 在 受精 后 16 小 时 才 开始 前 TRNA 的 合成 〈 图 
2-33)。 在 形成 夕 期 间 ,核糖 体 的 各 种 基因 上 千 倍 地 放大 ,前 IRNA 
合成 和 核糖 体 的 形成 也 相应 增加 。 这 时 核糖 体 贮存 在 卵 中 ， 在 肥 
胎 早期 前 细胞 分 裂 时 ， 这 些 核 糖 体 随 之 分 配 到 各 子 细胞 中 ， 直 到 
大 约 12 一 14 次 分 裂 之 后 ， 前 FIRNA 的 合成 才 激 活 。 但 哺乳 动物 的 
卵 中 ， 核 蛋白 体 并 不 大 量 贮存 ， 前 I 芭 NA 转录 在 两 个 细胞 期 即 开 
始 。 


JJ7T。| 


前 fRNA 的 合成 
细胞 生长 时 ，， 氮 基 酸 饥饿 〈 无 细胞 生长 ) 时 


细菌 - 
酵母 + 一 
Hela 细 胞 〈 及 
哺乳 类 的 其 它 + ~ 《但 无 新 的 核 蛋白 体形 成 ) | 
培养 细胞 ) 
二 二 夭 浊 克 
蛙 生命 周期 受精 孵 一 > 早期 细胞 分 裂 一 > 奢 古 中 期 一 > 成 时 一 一 一 六 
(4000 一 16;000 纲 腹 》 故 种 细胞 

过 并 人 
小 鼠 生 命 周期 ， 受 精 卵 两 细胞 期 .胚胎 “组织 《了 时: 脑 、 脾 、 肾 7 

? 一 十 十 - 
肝 再 生 ， 正常 肝 再 生 肝 

- + (前 rRNA 加 1 增加 > 核 氏 体形 成 增加 ) 


图 2-33 不 同 生物 中 前 7RNA 合 成 的 控制 型 式 

也 许 大 部 份 哺乳 动物 细胞 对 前 5RNA 合 成 行使 佼 小 的 转录 闪 
制 。 各 种 组 织 的 细胞 中 ,前 zRNA 的 合成 却 处 于 大 致 相同 的 速率 ， 
它们 的 差别 则 在 于 细胞 更 新 的 速率 。 有 些 情况 下 ,前 rRNA 加 工 的 
效率 显然 调节 着 核糖 体 的 形成 。 例 如 , -哺乳 动物 在 肾 切 除 后 ， 璋 
下 的 肾 有 一 种 代 偿 性 异常 肥大 〈 生 长 ) ,重量 至 少 增加 50%。 华 之 
以 这 种 重量 增加 ， 核 糖 体 形成 量 也 增加 ， 但 核 仁 RN 人 的 合成 并 不 
增加 。 显 然 ， 前 rRNA 是 被 有 效 地 加 工 。 

再 生 导 也 有 同样 的 现象 。 哺 列 动 物 在 拓 去 大 量 曾 肝 组 山 一 一 
如 手术 ， 感 染 或 化 学 中 毒 时 ， 余 下 的 肝 组 织 在 数 天 内 再 生成 正常 
大 量 的 肝 。 这 时 细胞 质 中 新 的 核糖 体 也 增加 ,但 细胞 核 内 前 zRNA 
合成 并 不 增加 。 因 此 在 成 年 哺乳 动物 细胞 中 ， 控 制 TRNA 形成 的 
方式 看 来 是 前 CRNA 的 这 种 差 动 式 加 I。 当 然 ， 再 生 期 间 新 的 核糖 
体 蛋白 也 需要 使 同样 量 的 mRNA 转译 增加 。 

4. 转 录 调 控 的 机 制 
关于 真 核 基因 调控 的 大 多 数 实验 及 其 推理 都 是 围绕 和 集中 在 
转录 调控 。 这 是 不 无 道理 的 。 因 为 转录 起 始 及 其 发 生 的 频率 是 基 


9 J72 9 


因 调控 最 基本 的 。 相 当 多 的 蛋白 质 编码 基因 可 能 正 是 在 这 一 水 平 
上 ， 而 不 是 其 它 水 平 上 进行 的 调控 。 

在 考察 真 核 生 物 的 转录 调控 的 机 制 时 ， 有 两 个 主要 的 层面 需 
要 着 重 加 以 分 析 。 首 先 ， 如 前 所 述 ， 真 核 生 物 没有 像 原 核 生物 那 
样 的 操纵 子 及 与 其 紧密 结合 在 一 道 的 调节 基因 。 真 核 生 物 的 转录 
受到 特定 的 同 域 作 用 序列 〈cis 一 acting element of DNA) 的 影 
响 ， 这 些 同 域 作 用 序列 有 些 可 能 与 受 它 调 节 的 基因 保持 一 定 的 距 
离 (如 增强 区 或 类 增强 区 ); 同 时 也 受到 所 谓 跨 域 作用 因子 (tramns 
-acting factor) 的 调控 ， 这 些 跨 域 作用 因子 是 一 些 可 扩散 物质 ， 
诸如 蛋白 质 或 激素 -蛋白 质 复合 物 。 很 多 场合 下 ,转录 调控 是 通过 
同 域 作用 序列 和 路 域 作用 因子 复杂 的 相互 作用 而 实现 的 。 汪 正 斋 
与 RNA 聚合 酶 结合 也 可 能 改变 其 活力 瑟 畴 看 体 > -研究 这 些 特异 
性 的 序列 要 素 及 与 之 作用 的 调节 物 的 特异 性 及 其 分 子 细节 是 弄 清 
真 核 基因 调控 机 制 最 基本 也 是 至 关 重 要 的 一 个 内 容 。 

其 次 ， 真 核 生 物 的 转录 是 在 真 核 染色 质 上 进行 的 位 点 专 一 的 
作用 ， 它 取决 于 染色 质 结构 在 特定 区 域 中 松 缉 或 解 盘 绕 而 游离 出 
特定 的 DNA。 这 种 变化 可 能 包括 核 小 体 的 消除 和 结构 的 改变 ， 或 
DNA 本 身 局 部 结构 的 变化 ， 如 螺旋 的 转 开 ， 正 常 的 右手 螺旋 转换 
成 左手 婴 旋 即 己 DNA 交 形 式 ， 或 DNA 的 局 部 超 盘 绕 等 等 《图 2 一 
33) .DNA 拓 扑 学 上 这 许多 的 变化 可 能 通过 拓扑 异 构 酶 (改变 DNA 
盘 绕 程度 的 酶 广 的 作用 。 染 色 质 上 结构 的 变 化 或 许 导致 “裸露 ? 
出 蕊 基因 的 自动 转录 ;， 或许 这 些 “裸露 ”的 基因 进一步 受到 特异 
伺 因 子 的 正 调节 或 负 调节 。 确 实 ， 活 动 着 的 基因 与 不 活动 的 基因 
之 间 在 染色 质 结 构 上 有 着 很 多 药 差 异 。 研 究 这 种 变化 的 细节 及 其 
所 达到 的 境界 《结构 上 的 和 功能 上 的 ) 丽 怕 也 是 弄 清 真 核 生 物 基 
因 调控 机 制 所 不 可 或 缺 的 一 个 方面 。 

真 核 基 因 的 转录 调节 区 

真 核 生物 基因 前 转录 调节 区 要 比 原 核 生物 的 复杂 得 多 。 一 个 
真 核 基 因 的 转录 调节 区 有 三 个 层面 的 组 织 结构 。 在 第 一 个 组 织 层 
而 于 它 可 以 分 成 近 兹 启动 区 (包括 TATA 框 、CCAAT 框 等 序列 要 


人 汪 X 袜 电 


素 ) 和 增强 区 ， 这 两 种 结构 要 素 之 间 的 距离 有 时 可 达 10Kb 尚 可 激 
活 转录 。 增 强 区 也 有 其 结交 层次 。 首 先 ， 它 是 由 二 些 相互 距离 不 
到 100bp 的 能 增强 转录 作用 此 序 列 要 素 或 简称 增强 区 要 素 (enhan- 
“er element) 组 织 而 成 的 ;而 增强 区 (序列 ) 要 素 则 是 由 一 些 成 
对 出 现 且 紧 挨 在 一 起 的 序列 亚 单位 组 织 而 成 。 这 种 序列 亚 单位 看 
来 是 增强 区 最 基本 的 结构 元 素 ， 因 此 称 为 增强 元 (enhanson) 所 
有 这 些 结构 成 分 统称 为 真 核 生 物 基 因 转 录 调 控 的 同 域 作用 成 分 

它们 之 间 的 相互 关系 可 用 图 2-34 来 表示 。 

得 病 区 近江 关 


增强 区 1 启动 区 


A <j1005 
近 端 序列 要 素 二 到 近 端 序列 要 素 
增强 区 <100bp ”增强 区 二 
序列 要 素 失 - 一 痉 - 序 列 要 素 


<5b 
增强 元 -< >- 增强 元 


图 2-34: 真 核 生物 调 节 区 中 的 三 种 层次 的 组 织 

RNA 育 合 酶 开启 动 区 的 多 元 性 

通过 详细 的 分 子 遗传 学 分 析 ， 现 在 已 经 揭示 出 各 种 不 同 的 真 
核 基 因 启 动 区 具有 一 种 共同 的 结构 形式 。 扼 要 地 说 ， 一 个 典型 的 
启动 区 包括 一 个 AT 富 集 的 区 域 即 所 谓 TATA 框 ， 和 一 个 在 起 始点 
上 游 近 端 由 8 至 12bp 组 成 的 序列 要 素 ， 即 近 端 启动 区 要 素 (prox 计 
mal Promotor elements ) 。 

根据 一 般 的 定义 ， 所 谓 启 动 区 ， 就 是 确保 转录 精确 而 有 效 地 
起 始 的 序列 成 分 。 前 面 已 经 介绍 了 启动 区 的 基本 构造 ,这 里 我 们 只 
讨论 启动 区 的 界定 问题 。 

大 多 数 真 核 生物 编码 mRNA 的 基因 都 具有 一 个 TATA 框 。 无 
疑 , 它 是 启动 区 的 关键 序列 ,因为 在 离 体 转录 系统 中 ， 它 可 以 使 转 
录 得 以 精确 地 起 始 ， 将 它 除 去 ， 起 始 依然 可 继续 进行 ， 但 转录 起 
点 则 会 有 所 疆 移 。 另 外 的 两 个 区 域 ， 即 大 约 在 -50 与 一 70 之 间 和 


全 174 龟 


r- 和 
攻 


-80 至 -110 之 间 抑 两 个 上 游 启动 区 序列 ， 也 是 有 效 起 始 所 必需 
的 。 图 2-35 所 示 是 利用 点 突变 来 研究 上 游 的 近 端 启动 区 要 素 对 有 
效 转 录 的 影响 。 在 这 三 个 启动 区 序列 要 素 中 ， 任 一 碱 基 的 突变 都 
导致 在 Hela 细 胞 中 转录 下 降 3 一 5 倍 ， 而 其 它 部 分 的 碱 基 鞭 换 则 没 
有 什 妇 影 响 ; 在 CAAT 框 中 ， 取 代 两 个 不 同 的 碱 基 则 导致 转录 增 
加 3 一 3:5 倍 ; 这 可 能 况 明 这 些 变化 有 助 于 蛋 自 质 与 之 相 作 用 。 


及 六 了 
7 .5 
上 游 自动 区 序列 要 素 [ATA 3 


一 1!00bp 
一 GGGGCGG 
ECcahaees 
IC 一]GcCACACCC 
ATGCAAAT 4 一 训 GGcCAATC RTATAA 


图 2 一 35 (a) 上 游 启 动 区 的 位 置 及 代表 性 序列 。 Mb)8- 珠 蛋 日 
基因 启动 区 点 突变 的 生物 效应 。 图 中 每 一 直线 的 高 度 代表 羊 一 碱 基 
突变 所 得 到 的 相对 于 野生 型 启动 区 药 转 录 量 。 黑 圆 点 则 表示 在 该 处 
的 突变 不 能 成 功 。 


我 们 把 近 端 启动 区 各 要 素 统 归 入 启动 区 这 一 范畴 ， 这 是 因为 
一 个 启动 区 的 强度 一 般 是 由 这 些 序列 要 素 的 数目 与 类 型 靳 决定 
的 。 近 端 启 动 区 序列 要 素 相对 于 TATA 框 的 取向 虽然 并 不 影响 转 
录 的 起 始 特 性 〈 这 一 点 与 增强 区 相似 ， 见 后 ), 但 如 果 在 两 者 之 间 
插 六 核 苷 酸 则 会 使 转录 有 所 减弱 ， 例 如 ,插入 的 核 酸 是 PNA 双 
螺旋 半 圈 的 奇数 倍 比 之 偶数 倍 对 转录 有 更 大 的 损害 。 在 疱疹 病毒 
的 胸 昔 激酶 〈TK) 基因 和 人 的 8- 珠 蛋白 基因 的 启动 区 的 两 个 上 
游 要素 之 间 插 入 15 个 以 上 的 碱 基 ， 则 局 动 区 就 失去 功能 ; 当 它 们 
与 ITATA 框 的 距离 大 于 30bp 时 ， 启 动 区 的 功能 也 受到 影响 。 


3 儿 炬 nn 由 


二 个 启动 区 既然 由 若干 独立 的 序列 要 素 组 成 而 它们 所 草 延 的 “ 


距离 远大 于 RNA 到 合 酶 所 能 覆盖 的 范围 。 那 末 RNA 聚 合 酶 如 何 利 


1) 朋 它 们 来 起 始 转录 呢 ? 一 种 可 能 的 解释 是 RNA 聚 合 本 先 与 上 游 较 


远 的 位 点 接触 ， 然 后 移 向 靠近 起 始点 的 位 点 。 另 一 种 可 能 是 ， 生 
物体 内 :DNA 并 非 以 直线 的 形式 展开 ， 亦 即 染色 质 式 的 紧缩 构造 
可 能 使 一 些 位 点 并 置 在 一 起 。RNA 育 合 酶 的 结合 位 可 能 是 由 茶 


[5 全 


些 不 相 部 近 前 序列 组 成 但 可 以 通过 与 DNA 结 人 的 蛋白 质 使 它 


们 靠拢 起 来 。 这 种 情况 也 进一步 说 明 启动 区 的 各 麻 列 要 素 间 的 距 
离 是 很 重要 的 。 

上 述 的 这 两 种 可 能 性 中 ， 不 管 是 哪 一 种 ， 都 说 明 距 起 始点 较 
远 药 近 端 要 素 对 RNA 聚 合 酶 的 最 初 结合 是 重要 的 ， 而 上 离 较 近 的 
近 端 要 素 则 是 使 该 酶 维持 着 某 种 构象 以 便 能 正确 识别 转录 起 始点 
所 必需 的 。 因 此 , 当 缺 乏 远 近 端 的 序列 要 素 时 ，RNA 聚 合 酶 的 结合 
能 力 就 会 大 大 减低 ;但 由 于 TATA 的 存在 ， 结 合 上 的 酶 还 是 能 够 
精确 地 起 始 。 另 一 方面 ， 如 果 TATA 框 缺 失 ， 这 时 它 仍然 可 跟 近 
端 序列 要 素 有 效 地 结合 ， 只 是 围绕 起 点 的 接触 部 分 不 太 精 殉 ， 而 
导致 起 始 位 发 生 球 移 。 

增强 区 的 结构 层次 

增强 区 是 能 使 汪 志 过 倘 的 基因 性 训 区 作 二 需 呈 识 区 征询 
SV40 增 强 区 是 一 个 很 好 的 例子 。 它 是 在 缺失 突变 研究 中 发 现 的 第 
-- 个 增强 区 ,是 位 于 SV40 早 期 转录 单位 上 游 的 一 朋 140bg 的 序列 ， 
实际 上 是 两 个 72 磊 基 对 的 串 列 重复 。 最初 的 实验 是 将 这 二 六 列 与 
6- 珠 蛋白 基因 或 SV40 的 IT 抗原 基因 连锁 在 一 起 ;不 管 它 以 村 次 方 
向 排列 《57-~>3/ 或 3 一 57)》 甚至 与 基因 相距 3000 碱 基 对 以 上 ; 
或 是 把 它 置 于 基因 的 下 游 ， 均 可 使 基因 的 转录 增加 达 2 个 数 上 级 
之 多 。 这 是 有 史 以 来 首次 发 现 的 增强 区 效应 。 简 单 地 说 ,增强 区 
有 了 两 不 显著 的 特性 :第 一 ,增强 区 对 特定 启动 区 有 一 种 远程 效应 ， 
且 这 种 效应 与 其 位 置 和 取向 无 关 ， 第 二 ， 增 强攻 前 生物 学 效应 需 
要 特定 的 蛋 各 质 因子 的 参与 。 

离休 诱 变 实 验 才 明 ,SV40 启 动 区 是 由 三 处 有 功能 的 序列 要 崇 
或 称 主 区 A，B 和 C 构 成 (图 2-36) A 或 B 或 C 序列 要 素 单 独 存在 
时 ， 其 增强 区 活性 会 减弱 ;但 每 一 序列 要 素 的 单纯 黎 加 或 性 两 种 
序列 要 素 组 合 起 来 则 使 活性 提高 ， 这 种 协同 效应 也 与 它们 位 置 和 
取向 无 关 。 突 变 分 析 还 表明 这 三 种 序列 要 素 中 的 任 二 全 的 突变 都 
可 使 增强 区 失 活 ， 但 这 时 若 将 其 余 两 个 当中 的 一 个 序列 要 素 倍 加 
又 可 使 其 活性 复原 。 虽 然 每 种 序列 要 素 中 药 序 列 彼 此 不 相同 得 


多 176 本 


Was eeeciesm aa ae cass sascs es -ar waneaane we ass na Dw 2 


9 


有 它们 有 着 相似 的 作用 ， 因 为 只 要 有 足够 数量 的 野生 型 序 列 要 素 
(不 管 娜 一 种 或 什么 样 的 组 合 ) 都 可 产生 增强 区 活性 。 


基本 了 
四 和 


< ETES5 [一 6/533 
闪 二 
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广 -全 Fr- 一 一 天 一 
jeaascasccaGcreTGcaars STGTGTCAGTTAGSGTGTCGAAAGTC CCCCAGGCTOCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCA 
bdpae dpm2AG， 
上 
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四 See 和 9 
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dm 国 四 - 


上 过 careA 
frd9 AGCTGTGGAATGTGTGGAATGGcGcTc 


dpm. 126 revertants 


由 ”图 2-36 SV40 早 期 基因 的 启动 区 、 增 强 区 

a.SVYV40 早 期 启动 区 的 示意 图 。 自 右 至 左 ， 

转录 起 点 、 复 制 起 点 、IAIA 框 、 三 个 完整 的 21 碱 基于 重复 序列 (其 
申 两 个 有 完全 相同 的 序列 ) ,和 一 拷贝 的 72 狂 基 对 的 重复 序列 。 下 方 
的 A,B 和 C 方 框 代表 三 个 增强 区 序列 要 素 及 其 相应 位 置 。 增 强 区 的 
核 苷 酸 序列 〈179 一 284) 下 方 三 个 点 突变 〈dpm1l，dpm2 和 dim6) 
的 磊 基 变化 和 三 个 序列 要 素 的 位 置 ; 上 方 标明 了 一 些 重要 序列 图 式 
即 增强 元 的 名 称 。b. 野 后 型 A 序 列 要 素 及 其 侧 辟 部 分 的 序列 .圆圈 
的 字母 表示 dmp1 突 变 s rd9 的 结构 是 在 dpm125 的 三 个 回 变 株 即 rd 
51， rdl10 和 rd136 中 发 现 的 coreA 倍 加 。 


这 种 倍加 效应 反 证 了 增强 区 在 序列 要 素 的 层次 上 分 成 两 个 部 
分 药 状 态 ， 或 者 说 ， 它 们 是 一 分 为 二 的 。 这 种 属性 在 增强 区 序列 
要 素 低 一 蛙 的 序列 亚 单位 中 又 一 次 瑚 现 。SV40 增强 区 缺陷 型 突 
变 株 dpmi26 是 A，B 和 C 序 列 要 素 的 三 联 突变 。 通 过 core A 这 种 
序列 亚 闽 位 的 渐次 倍加 可 以 得 到 回 变 株 , 第 一 次 倍加 得 到 了 9 bp 
的 core 人 的 倍加 ,第 二 次 倍加 则 得 到 两 个 拷贝 的 18 bp 的 新 片段 。 
两 次 倍加 的 结果 说 明 ，, core A 的 倍加 产生 出 一 种 新 的 增强 区 序列 
要 素 。SV40 增 强 区 序列 要 素 A 和 B 都 是 含有 亚 单位 的 (core A 或 


e II7 


sph 序 列 图 式 ， 见 图 2-36b) ,而 且 都 是 双 元 的 咏 这 些 亚 单位 的 同 种 : 
倍加 或 是 不 同 种 的 组 合 都 可 以 产生 新 的 增强 区 序列 要 素 。 但 与 增 
强 区 序列 要 素 不 同 的 是 ， 这 些 亚 单位 之 间 如 果 被 其 它 碱 基 隔 开 一 
定 距离 ,或 者 即使 含 多 个 单位 但 却 分 立地 存在 ,其 作用 就 会 减少 或 
消失 序列 要 素 之 间 的 距离 则 可 大 至 100bp。 这 些 序列 亚 单位 是 
增强 区 最 基本 的 结构 ， 称 为 增强 元 。 
” 综 上 所 述 ，SV40 这 一 原型 的 增强 区 结构 上 是 可 分 的 ;包括 
两 个 层面 上 的 组 织 ， 每 一 层面 上 的 结构 要 素 都 需要 有 一 定 的 数量 
才 有 可 能 表现 出 其 功能 。 我 们 尚 不 知道 这 种 组 织 原则 是 否 适用 于 
各 种 增强 区 ， 这 需要 对 其 它 增 强 区 进行 进一步 的 研究 。 但 一 般 说 
来 ， 对 特定 信号 发 生 应 答 的 增强 区 的 序列 要 素 都 很 短 ; 而 且 每 个 
基因 都 含有 若 于 拷贝 的 这 种 应 答 序 列 要 素 。 调 节 序 列 的 这 种 证 列 
重复 的 赤 加 效应 看 来 是 一 种 普遍 现象 。 

还 应 指出 的 是 ， 元 论 是 病毒 型 的 还 是 细 肥 型 区 十 莉 区 许 区 不 
同 功能 特征 的 序列 要 素 ， 诸 如 正 调节 和 负 调 节 的 序列 要 素 ， 定 制 
型 表达 和 诱导 型 表达 的 序列 要 素 ， 除 此 以 外 ， 细 胞 型 的 增强 区 还 
可 能 包括 拓扑 醇 结合 的 序列 要 素 和 核 基质 附着 的 序列 要 素 等 等 ， 
所 有 这 些 序列 要 素 都 是 特定 基因 指 表 达 所 必需 的 。 

路 域 作用 因子 (trans-acting factor) 

如 上 所 述 ， 转 录 调 节 区 是 与 特定 的 蛋白 质 编码 区 连锁 在 一 起 
的 DNA 序列 成 分 ， 因 此 称 共 同 域 作 用 成 分 (cis-acting ele- 
meat) .它们 是 有 组 织 的、 由 特定 序列 要 素 有 机 组 成 的 ， 虽 然 不 同 
的 同 域 作 用 成 分 具有 不 同 的 结构 要 素 。 同 域 作 用 成 分 的 作用 模式 
尚 有 许多 未 知 的 内 容 ， 需 要 进一步 深入 研究 。 但 是 有 一 和 件 事 是 明 
显 的 ， 这 就 是 这 些 序列 要 素 是 作为 一 些 可 扩散 的 ， 与 DNA 结 合 的 
分 子 的 靶 位 ; 它们 正 是 通过 与 这 些 DNA 结 合 分 子 相互 作用 而 表现 
其 特定 的 功能 。 这 些 DNA 结 合 分 子 则 统称 为 跨 域 作用 因子 。 其 中 
有 一 些 如 类 固 蕉 激素 受 体 蛋 白 复合 物 早 已 有 过 不 少 研 究 并 已 加 以 
纯化 。 当 然 有 些 消 等 发现 。 

跨 纸 作用 因子 再 它 所 作用 的 基因 以 外 的 基因 编码 


nEO 


跨 域 作用 因子 包括 与 各 种 RNA 聚 合 酶 所 使 用 的 启动 区 相 互 


作用 的 蛋白 质 因子 。 最 熟知 的 一 个 例子 是 与 原核 生物 中 阻 过 物 - 操 
纵 区 相互 作用 极为 相似 的 酵母 SAL 基 因 的 转录 的 正 负 调节 蛋白 
“〈 见 图 2 一 37) .酵母 具有 一 套 酶 系 来 将 半 乳 糖 转换 成 葡萄 糖 磷酸 。 


其 下 三 个 村 的 基因 位 于 染色 体 上 上 # 第 四 个 酶 与 学 乳糖 运转 有 关 ， 
细胞 外 部 ” 尘 弛 糖 : 


em 


> 葡萄 糖 -I- 磷 酸 
代谢 “UDP=- 半 驰 糖 


| ( 玫 异 构 酶 ) 


UDP 一 葡萄 糖 ， 


图 2-37 酵母 半 乳 糖 酶 系 的 诱导 。 诱 导 物 是 gal3 基 因 产 物 ， 尚 未 提取 鉴定 。 诱 
导 物 引起 gal4 基 因 转 录 mRNA。gal4 的 缺失 突变 导致 不 能 形成 半 乳 糖 代 谢 途 
径 所 需 的 酶 系 ， 即 基因 1，2，3，7 编码 的 酶 和 半 乳 糖 音 酶 。 基 因 4 本 身 则 受 
gal80 产 物 的 负 调 节 。 

其 基因 位 于 染色 体 XII 第 五 个 基因 编码 xz- 半 乳 跨 苷 酶 ， 则 位 于 
另外 的 染色 体 上 。 所 有 这 五 个 基因 都 被 半 乳 糖 的 代谢 物 所 诱导 ， 

但 这 种 诱导 需要 第 六 个 基因 产物 (gal4) 的 人 参与。 因此 GAL4 和 蛋白 
是 一 种 正 调节 蛋白 。GAL4 基因 已 被 克隆 和 测序 ， 蛋白 质 序列 也 
已 知道 。GAL4 蛋 白 作 用 在 距 各 mRNA 起 始 位 点 上 游 150 至 250 碱 
基 处 ， 即 类 似 增 强 区 的 所 谓 上 游 激活 序列 〈upstream activating 


179。， 


sequence， 简 写 UAS) ,引起 各 酶 mRNA 的 增加 5GAL4 蛋 和 本身 则 
受到 另 一 基因 产物 (gal 80) 鸭 和 提交 和 但 目 前 交 丰 证 罗 全 c 全 0 
蛋白 是 否 与 DNA 结 合 。 

专 一 性 地 与 同 域 作用 序列 要 素 相 结合 的 跨 域 作 用 因子 

如 前 所 述 ， 真 核 生 物 基因 的 启动 区 与 增强 区 是 由 若干 各 自 可 
以 区 分 的 序列 要 素 所 组 成 。 离 体 转录 研究 表 明 ， 由 RNA 聚 合 酶 
开 转 录 的 基因 〈 亦 即 五 类 基因 ) 转录 的 精确 起 始 需要 一 些 可 洲 性 
关子， 如 TATA 框 识 别 因 子 (TFIHD) 。 这 种 因子 直接 结 侣 在 启 


ea 
一 三 二 二 一 -一 二 二 二 一 二 二 二 二 二 一 二 全 二 一 一 一 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 一- 一 一 


LKHVAESGG) 188 
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276 


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KEKCPRPKRSLASRLTGYIPPKSKEK 贸 A 3 


2， SVvscaTEKTDSLVKNKPSGTET 四 csLvLDKLTTIQ) 3 坷 
(5 了 
Re 才 


图 2-38 (〈a) 爪 效 转录 因子 TEIIA 的 氨基 酸 序列 。 注 意 9 外 大致 相 似 欧 重复 
单位 ; 上 方 的 方 框 给 出 了 这 9 个 重复 单位 的 契合 序列 ， 其 中 8 和 13 位 的 半 胱 氢 
酸 和 25 和 30 位 的 组 所 酸 与 笑 离 子 (Zn2 ) 络 人 台 成 如 〈(b) 全 〈c) 
IEIIH 人 的 结构 特征 及 其 与 DNA 相 互 作用 的 模型 。 


5 了 80， 


ES 


勒 区 的 近 端 序列 要 索 上 上 。 此 外 还 有 各 种 各 样 的 蛋白 质 结合 到 增强 
区 或 启动 区 的 远 端 ;参与 基因 转录 的 调节 。 在 已 知 的 转录 因子 中 ， 
有 些 是 大 多 数 基因 表达 所 必需 的 ， 苑 Spl，CTF 等 〈 表 9)， 而 大 多 
数 因子 则 其 限于 在 特定 的 基因 上 起 作用 如 HSTFE，USE/MELTEF 
获 上 还 有 一 些 则 参与 特定 基因 对 特定 生理 条 件 和 发 育 程序 中 其 它 
基因 产物 欧 应答 中 诱导 基因 的 表达 。 

既然 转录 因子 是 专 一 地 与 DNA 上 特定 的 序列 要 素 相 结合 而 


表 9. 某 些 转录 因子 及 其 所 结合 的 序列 要 素 


因子 ，， 种 馈 ， - ， 启 动 区 识别 位 点 
酒 ， 二 “第 电 ” 月 动 区 TATA 框 “ 和 TATA 框 /起 直 
TEIID 人  ” 腺 病毒 TOATA 杠 
CTEJCBP 人 1， 腺 病毒 ， 珠 给 白 ，TK -ICAAT 杠 
USEF]JMLTF 人 腺 病毒 ， 晚 基因 GGCCACGTGACC 
二 SFl 六 福 动 区 GC 框 SGGa CG6GAAS 
HSTF 。。 果 蜗 热 注 蛋白 基因 热 激 通 式 序列 
OTF-1 天 记忆 绯 营 白 攻 2b ATTTGCAT 
IOTE-23 1 类， 免疫 球 蛋 白 ATGCAAAT 
4B 细 胞 特异) SV40 
人 EBDp 大，” cfcs 增 强 区 “GATGTCCATATTAGGACATC 
ApI 人 佛 波 酯 诱导 增强 区 
GCN4 ”酵母 氨基酸 生物 合成 基因 | TGACTCA 
Jo"19 “ ， 人 ，:: 原 瘤 基因 
,.GAL4 “本 转 。， 醇 母 基因 上 游 激活 序列 “CGG (Nit) CCG 
Ap2 METT EEC 
本 人 
有 -小 遍 ，， 白 腹 身 启 动 区 TGG CN5GCCAA 
NFY 陈 MHCTI 类 Fa 基 T 工人 和 六 
ee TeGcTGATTGG cr ec 
co 鸡 伴 白 蛋白 基因 上 游 启动 区 GGTGTCAAAGGTCAAACT 
到 人 腺 痢 毒 了 2 启动 区 TTTCGCGS 


ImycPCF “人 ， 原 瘤 基因 c-myc 启 动 区 ” AGAAAGGGAAAGAA 


TB81， 


起 作用 ， 那 末 , 蛋 凰 质 分 子 上 的 DNA 结 合 区 的 特性 将 是 有 趣味 的 
问题 。 对 爪 蚁 的 5S RNA 的 转录 因子 TEIIA 的 分 析 表 明 交 这 种 蛋 
白 陆 具有 9 个 相似 的 串 列 重复 单位 (图 238a) 纪 每 二 单位 夫 约 由 
30 个 残 基 组 成 ， 其 中 有 两 对 固定 位 置 的 半 胱 氛 酸 和 组 氮 酸 残 基 与 
锌 离子 络 合 而 令 其 间 的 三 些 残 基 回 折 成 为 一 种 指 状 结构 而 有 匀 指 
区 (Zinc finger) 之 称 (图 2-38b) 。 sosaracoaa 
配 于 DNA 双 螺旋 的 大 沟 螺 程 (图 2-38c) 。 

ITEIIA 含 有 这 样 多 的 锌 指 区 ， 从 进化 的 角度 上 说 可 能 是 通过 
基因 的 倍增 而 来 的 ; 而 由 于 锋 指 区 是 具有 核酸 结 合 能 力 的 一 种 自 
我 完善 的 小 区 域 ， 就 有 可 能 出 现 于 其 它 有 类 似 功 能 的 蛋白 质 中 。 
事实 上 ， 自 从 1985 年 TFIIA 这 种 锌 指 结构 得 以 确认 以 来 ， 忆 -经 
发 现 了 许多 蛋白 质 具 有 这 种 结构 特征 ， 表 10 所 列 的 只 是 其 中 一 “部 
分 。 

需要 指出 的 是 ， 以 锌 为 重要 成 分 的 蛋白 质 折 兰 未 区 的 这 种 三 
级 结构 与 原核 生物 的 调节 蛋 由 的 结构 图 式 有 明显 的 不 同 。' 后 者 
常常 形成 一 种 较 大 的 蛋白 质 二 聚 体 ， 旦 对称 的 形态 与 DNA 土 的 回 
文 序列 结合 。 相 反 ， 和 锌 指 结构 无 需 参 比 DNA 的 对 称 性 ， 它 以 串 列 
重复 单位 的 形式 识别 不 同 长 度 的 DNA (或 RNA) 序列 各 和 单位 
有 大 致 相似 的 框架 与 少量 的 碱 基 对 (就 TFIIIA 而 言 约 为 5 对 ) 租 互 
作用 。 其 作用 的 强度 、 和 锌 指 区 的 数目 及 它们 之 间隔 距离 等 使 识别 
和 结合 达到 高 修 的 专 一 。 

类 固 醇 和 甲状 腺 激素 受 体 和 蛋白 集 乡 种 功能 于 一 身 

类 固 醇 和 甲状 腺 激素 本 上 盘 造成 允 种 多 样 的 刺激 而 导致 在 发 
育 、 分 化 和 生理 上 一 系列 复杂 而 协调 的 反应 。 这 些 激素 分 子 通过 
与 细胞 内 特定 的 受 体 蛋白 分 子 相 结合 而 激活 特定 的 基因 网 络 ， 在 
生理 乃至 行为 的 舞台 上 导演 出 有 声 有 色 揭 戏剧 来 。 

这 些 相 对 说 来 比较 简单 的 激素 分 子 是 如 何 诱导 出 种 类 如 此 繁 
多 的 应 答 呢 ? 早 在 70 年 代 ， 人 们 将 激素 加 以 同位 素 标记 ， 发 现 它 
可 以 使 受 体 蛋 帕 产生 某 种 变化 ， 使 后 者 能 结合 在 染色 体 的 一 些 高 
度 亲 和 的 位 点 上 ， 进 而 导致 一 些 基 因 (每 细胞 中 50 一 1007 的 ; 表 


32， 


含有 与 TFIIIA 锌 指 区 同 源 序列 的 一 部 分 蛋白 下 


质 或 DNA 序 列 . 
序列 或 蛋白 质 名 称 类 型 和 和 
” 爪 闪 TFIIA CC-HH 2Zn,DNA/ARNA 
8 刘 Xfin CC-HH 
果 蝇 (one _CC-HC) 
Sererdi' ity CC-HH 
KrUBEel CC- 瓦 瓦 
HunchEack ” ”CC- 百 也 
mki,mK2 CC-HH 
小 鼠 - SB1 CC-HH ”-DNA 
哺乳 类 细胞 
:CSV40 ， -ADR1 CC-HH __DNA 
“ 母 SW15 CC-HH ”Zn:DNA 
(cne CC-HC) 
GAL4 CCCGC ZnDNA 
PPR1 人 EC 
上 了 ARGRII CGrCR 
FRR 大 肉 激 素 ， 受 体 GeGe :Znz DBDNA 


葡萄 糖 皮 质 类 激素 受 体 CC-CC __DNA 
C-erbA( 甲 状 腺 激素 受 体 ) CC-CC 


大 鼠 葡萄 糖 皮质 类 激素 受 体 “CC-CC “-DNA 
一 鸡 雌 激 素 受 体 ee 
乓 孚 酮 受 体 CCzCC 
大肠 杆菌 :， _ UvrA CC=CC Zn?,DNA 
逆转 承 病 毒 ， 核 酸 结合 蛋白 CC-HC RNA 
E 大 肠 杆菌 基因 32 和 蛋白 _。 CH-CC Zn,SSDNA， 
和 - SSRNA 


达 或 受 抑制 。 到 80 年 代 初 , 许 多 激素 的 受 体 蛋 白 已 得 以 分 离 纯 化 ; 
随 之 也 鉴定 出 了 许多 糖 皮 质 类 激素 的 应 答 基因 ， 并 证 明 它们 的 转 
录 是 受 激素 调节 的 。 这 些 基 因 都 含有 一 段 大 约 20 对 碱 基 的 同 域 作 
:用 序列 ,: 是 转录 激活 所 必需 的 。 这 些 序 列 ， 或 者 称 为 激素 应 管 序 


e 83 了 3。 


列 要 素 (简称 HRE)， 具 有 类 似 于 增强 区 的 特性 ， 即 它们 不 管 是 处 
于 什么 位 置 或 取 什 么 方向 均 可 起 作用 。 所 不 同 的 是 它们 的 活性 受 
到 激素 有 无 的 制约 。 这 些 结果 表明 ,转录 调节 源 出 于 激素 - 受 体 蛋 


上 白 复 合 物 结合 在 DNA 的 HRE 上 。 足 迹 法 分 析 确 证 了 许多 激素 


(包括 糖 皮质 类 激素 、 肉 激素 、 孕 酮 及 甲状 腺 激素 等 ) 的 受 体 蛋 
白 分 子 与 应 答 基因 的 HRE 所 结合 的 序列 具有 双 价 对 称 性 ， 说 明 它 
们 可 能 是 跟 二 聚 体形 式 的 受 体 蛋 白 相互 作用 。 

从 上 述 这 些 经 典 的 研究 中 大 们 认识 到 ， 要 了 解 这 种 复杂 的 调 
节 系 统 的 根 底 及 其 赋予 生物 体 的 “养生 之 道 "* 关 键 的 是 要 分 析 研 
究 激素 受 体 蛋 白 分 子 。 因为 根据 类 固 醇 /甲状 腺 激素 作用 的 .经典 
模型 ， 激 素 配 体 与 受 体 蛋 所 分 子 的 结合 引起 了 某 种 异 构 变 化 ， 而 
使 受 体 激素 复合 物 得 以 与 应 答 基 因 启 动 区 上 的 应 答 序列 线 合 。 正 
是 这 种 结合 导致 了 基因 表达 的 调节 。 最 近 几 年 ， 由 于 受 体 有 蛋 和 白 
cDNA 的 克隆 ， 为 闹 明 激素 作用 的 分 子 基 础 提供 了 可 能 。 

首先 ， 人 们 利用 两 种 表达 载体 来 共同 转 染 培养 细胞 的 方法 ， 
鉴别 了 受 体 蛋 白 分子 的 三 种 功能 区 ， 即 激素 结合 区 、DNA 结 合 区 
和 转录 激活 区 (图 2-39) 。 这 两 种 表达 载体 ,i=- 种 是 跨 域 载体 
(Trans-vector)， 它 可 以 使 正常 情况 下 不 表达 受 体 蛋 自 基因 的 细 
胞 有 效 地 产生 受 体 蛋 白 分 子 ， 另 一 种 是 同 域 载体 (cis-vector)， 


这 种 载体 的 构建 是 将 某 种 激素 应 答 的 启动 区 与 虫 发 光 素 酶 (Luei- 


ferase) 基因 (或 是 任 一 种 功能 便于 监测 的 基因 ) 连锁 在 一 起 。 这 
样 ， 利 用 激素 可 将 虫 发 光 素 酶 基因 激活 ， 而 使 细胞 提取 液 发 出 光 
来 。 如 果 要 分 析 糖 皮质 类 激素 ， 同 域 载体 可 使 用 乳房 瘤 病毒 的 启 
动 区 ， 因 为 这 种 启动 区 有 该 激素 的 应 答 序列 要 素 。 共 转 灶 后 ， 同 
域 载体 的 表达 在 激素 诱导 下 大 约会 提高 500 售 。 通 过 这 稳 双 表达 载 
体 共 转 染 的 方法 ， 可 以 研究 突变 对 受 体 蛋 自 活性 的 影响 。 

通过 功能 分 析 租 序列 比较 ， 现 在 已 经 意外 地 发 现 类 固 醇 激素 
甚至 甲状 腺 激素 的 受 体 蛋白 分 子 都 有 同样 的 结构 框架 去 并 县 从 突 
变 研究 得 出 的 结果 意外 发 现 了 糖 皮质 类 激素 蛋 自 的 激素 结合 区 5 


”如 果 和 于 失 某 一 部 分 就 会 使 它 变 成 一 种 定制 型 的 活性 分 子 ,， 也 就 十 


8 e 


说 这 时 无 需 有 激素 的 诱导 也 会 有 刺激 转录 的 活性 。 这 些 结果 使 人 
们 对 它们 的 转录 激活 机 制 有 了 初步 的 了 解 : 无 论 是 受 体 蛋白 的 激 
素 结合 区 还 是 激素 本 身 ， 都 不 是 DNA 结 合 和 转录 激活 这 两 种 功能 
所 必需 。 和 或 者 从 另 角 度 说 ， 激 素 结合 区 在 正常 情况 会 妨碍 PNA 结 
: 合 区 和 蕊 录 激 活 区 发 挥 其 功能 。 而 要 冲破 这 种 妨碍 ， 则 需要 有 汲 
素 的 人 参与。 


RSV_ FT RU 


图 2-39 共 苇 染 测 活 系统 ， 培 养 细 胞 用 含 受 体 蛋 白 cCDNA 的 表达 载体 转 染 。 
受 体 蛋 白 这 一 转录 因子 的 功能 可 以 通过 连锁 着 适当 的 激素 应 答 启动 区 的 监测 
基因 〈 如 虫 发 光 素 酶 基因 ) 的 活性 来 测定 。 此 图 作为 例子 ，GRE ( 糖 皮质 类 
激素 应 答 序列 要 素 ) 可 以 来 自 小 鼠 乳 房 瘤 病毒 〈 带 有 GRE 增 强 区 ) 


功能 区 这 种 结构 上 的 可 分 割 性 不 仅 于 上 此。 人们 开始 推测 受 体 ， 
蛋 自分 子 中 段 高 度 保守 的 序列 是 DNA 结 合 区 ， 因 为 它 有 三 个 特征 
可 以 附和 这 种 看 法 ， 即 :(1) 存在 着 半 胱 氨 酸 富 集 区 的 结构 图 式 ; 
《2) 各 种 受 体 蛋白 的 这 一 中 段 序列 高 度 同 源 ; 《3) 具有 成 从 的 可 
能 与 DNA 相 互 作用 的 碱 性 氨基 酸 。 有 些 突变 体 可 以 跟 激素 结合 ， 
说 明 蛋 白质 结构 是 完整 的 ， 但 不 能 与 DNA 结 合 -将 大 的 肉 激 素 受 
体 蛋 自 中 推测 指 DNA 结 合 区 换 成 人 的 糖 皮质 类 激素 受 体 蛋 白 的 
相应 部 盆 ， 则 发 现 模板 特异 性 也 发 生 了 预料 的 改变 。 这 种 置换 法 ， 
即 苏 谓 换 指法 (The finger Swap) ( 见 图 2-40) 。 利 用 这 种 技术 ,人 
作 可 以 探寻 和 确定 新 的 激素 受 体 蛋 白 。 

通过 各 种 激素 受 体 蛋白 的 DNA 结 合 区 氮 基 酸 序列 进行 比较 
后 发 现 ;虽然 这 些 受 体 蛋白 分 子 在 进化 上 有 很 大 趋 异 ,但 DNA 结 
合 区 却 有 明显 的 相似 。 它 们 的 氨基 酸 序列 特征 使 大 们 想起 了 转录 
因 于 IEA 它们 显然 和 和 锌 离子 形成 指 状 结构 。 定 位 突变 也 证 明 


。 IT85 。 


半 胱 氨 酸 残 基 的 这 些 保 留 位 置 是 DNA 结 合 能 态 所 必需 的 。 第 三 东 
锌 指 区 亲 水 性 更 大 ， 预 期 与 DNA 结 合 的 碱 性 残 基 则 少见 ; 第 三 个 
镍 指 区 富 含 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 等 碱 性 残 基 。 虽 然 一 般 比 较 注意 锌 指 
区 本 身 ， 但 两 个 指 区 之 间 的 残 基 及 紧 靠 第 二 个 指 区 之 后 的 残 基 也 
有 较 高 的 保守 性 。 因 此 这 些 中 介 的 残 基 很 有 可 能 是 DNA 结 合 功能 
所 不 可 缺少 的 。 


2 Cortisol 汪 > : 渤 hGR 


DNA-binding domain Switch 
LN 了 BUG ne 
hot | Xxhe1 区 


Chimerfic receptor 


TI 可 ZI 克 jaa 


图 2-40 换 指 法 示意 图 。 类 固 醇 激素 受 体 蛋 白 调 节 结 构 可 以 互相 交换 而 
产生 一 种 具有 功能 的 内 合 分 子 。 因 此 , 若 某 一 受 体 蛋白 的 DNA 结 合 区 被 糖 
皮质 类 激素 受 体 的 相应 区 域 所 置换 ， 则 和 骸 合 的 受 体 分 子 就 会 在 相应 的 糖 皮 
质 类 激素 存在 时 激活 所 换 上 的 启动 区 。 


要 确定 激素 受 体 蛋白 分 子 DNA 结 合 和 转录 活性 功能 是 否 可 
分 还 需要 进一步 深入 研究 。 跟 高 度 保 守 的 DNA 结 合 区 相反 ，, 受 体 
蛋白 分 子 N 端 部 分 的 序列 在 长 度 和 氨基 酸 组 成 上 是 高 度 可 变 的 。 
虽然 如 此 ， 它 是 具 功能 的 。 例 如 糖 皮 质 类 激素 受 体 这 一 区 域 有 所 
缺失 ,其 活性 会 减少 10 一 20 倍 。 有 一 种 天 然 的 受 体 蛋 自 突变 体 NT， 
其 N 端 有 417 个 氨基 酸 的 缺失 ,能 与 激素 及 DNA 相 结合 ,但 却 无 转 
录 活 性 。 然 而 野生 型 受 体 蛋 白 在 相应 部 分 的 缺失 并 不 失去 转录 活 
性 。 可 能 NT 尚 有 另外 的 突变 导致 DNA 结 合 和 转录 激活 这 两 种 功 
能 无 法 稍 联 。 或 者 换 和 名 话说 ，DNA 结 合 和 转录 激活 这 两 种 功能 的 
耦 联 可 能 需要 某 些 中 介 的 序列 或 结构 。 因 此 转录 激活 与 DNA 结 合 
这 两 个 荔 能 区 是 否 可 以 分 割 尚 有 待 去 确定 。 但 在 其 它 转录 因子 如 
醉 母 的 GAL4 和 GCN4 中 ， 这 两 种 功能 是 可 分 的 。 如 果 受 体 蛋 自 也 


5 786。 


DER 国人 4 


《 
0 ff 
4 


是 这 种 情况 ， 就 有 可 能 鉴定 出 能 与 DNA 正 常 结合 ,但 失去 转录 活 
性 的 受 体 蛋 自 突 变 体 。 然 后 也 会 有 可 能 根据 这 些 知识 去 建立 分 析 
转录 激活 过 程 的 有 效 方法 。 
于 启动 区 与 增强 区 的 结合 蛋白 通过 其 它 蛋 白质 的 修饰 起 作用 ?1 
有 些 蛋 白质 的 调节 作用 可 能 不 是 直接 与 特定 的 DNA 序列 相 
互 作 用 ， 而 是 通过 对 启动 区 或 增强 区 的 结合 蛋白 进行 修饰 而 起 作 
用 。 前 已 提 及 ， 腺 病毒 的 早期 转录 单位 E1B、E2A、E2B、E3 和 
下 避 如果 没有 EL1A 蛋 白 的 出 现 ， 它 们 不 会 迅速 转录 : 这 些 转录 单 
位 的 上 游 区 域 没 有 明显 的 辐 源 序列 表明 它们 能 与 EIA 蛋白 相 结 
合 玉 纯化 的 E1A 和 蛋白 确实 也 不 结合 到 纯化 的 病毒 DNA 上 。 了 EIA 蛋 
自 还 可 以 激活 某 些 细胞 的 基因 ， 如 有 珠 蛋 白 、 热 激 蛋白 基因 也 不 
是 通过 与 特定 的 DNA 序 列 结合 而 起 作用 。 这 说 明 E1A 和 蛋白 激活 其 
它 旱 期 转录 单位 并 非 通过 与 它们 的 序列 要 素 结合 的 方式 来 实现 。 
最 近 从 Hela 细 胞 中 分 离 到 一 种 启动 区 结合 蛋白 〈E2F)， 在 野 
生 型 腺 病毒 感染 细胞 的 情况 下 ，E2E 与 启动 区 的 结合 能 力 明 显 提 
高 》 得 在 失 活 EIA 基 因 指 突变 病毒 感染 细胞 时 , 则 没有 结合 活性 。 
在 不 受 腺 病毒 感染 的 未 分 化 胚胎 肿瘤 (EC) 细 胞 中 ， 也 有 使 E2F 与 
启动 区 结 区 提高 的 现象 。 显 然 ,未 分 化 的 EC 细胞 有 某 些 与 EIA 蛋 
白 相 似 的 成 分 。 这 种 细胞 基因 产物 与 病毒 基因 产物 E1A 的 相似 性 
还 表现 在 它们 对 依赖 于 增强 区 的 转录 作用 有 阻 过 作用 。: 许 多 病毒 
增强 区 既 受 EIA 的 阻 过 ， 也 受 未 分 化 的 小 谍 EC 细 胞 某 种 因子 的 阻 
过 在 后 一 种 情况 下 ， 当 细胞 被 诱导 分 化 时 , 阻 巡 作用 则 被 消除 。 
这 说 明 分 化 可 能 导致 某 种 与 增强 区 直接 作用 的 阻 遏 物 的 失 活 。 
正 述 例子 说 明 ， 对 一 些 与 启动 区 和 增强 区 相互 作用 的 因子 的 
修饰 可 以 实现 基因 调控 中 的 正 调节 和 负 调 节 。 这 种 因子 修饰 作用 
还 可 以 通过 佛 波 醇 酯 (bhorbol esters) 处 理 细 胞 时 ，Sv40 和 多 瘤 
病毒 增强 区 活性 提高 的 情况 得 到 说 明 。 佛 波 醇 酯 可 以 激 话 一 些 蛋 
白 激 酶 的 活力 。 这 说 明 增 强 区 的 结合 因子 或 是 与 这 些 因子 相互 作 
用 的 蛋白 质 可 能 通过 磷酸 化 作用 来 修饰 。 就 目前 所 知 ， 转 录 因 子 
Apl Ap2， Ap3 和 NE 一 x&B 都 可 介入 对 佛 波 醇 醋 的 反应 。 这 就 提 


13S7。 


出 这 样 的 可 能 ,通过 蛋 髓 质 激 藤 C 激 活 是 许多 增强 区 结 奉 蛋白 的 
调节 模式 。 免 疫 球 蛋白 x 链 增强 区 药 转 录 因 子 NF=-xB 葛 转 译 后 禾 
| 饰 可 以 提高 其 结合 亲和力 是 结合 因子 本 身 修饰 的 二 种 例子 访 链 基 
因 卉 强 区 有 两 个 不 同 的 位 点 ,分别 由 两 种 不 同 的 因 诗 当 之 结合 。 
其 中 的 一 种 因子 存在 于 所 有 的 细胞 ， 而 另 一 种 因 取 则 上 只 在 成 熟 的 
| 。” 吾 细 胞 中 可 测 到 。 原来 以 为 这 后 一 种 因子 具 存在 于 了 细胞 中 , 玖 称 
NEF=xB. 但 后 来 发 现 它 在 许多 细 胞 中 是 以 一 种 失 活 的 形式 存在 .只 
是 需 经 过 某 种 修饰 才能 与 x 链 基因 增强 区 专 一 性 地 结合 : 币 如 早期 
前 了 细胞 的 提取 物 捍 及 其 它 类 型 非 淋巴 细胞 趾 均 测 不 到 枫 F-KBi 
但 用 脂 多 糖 、 佛 波 莅 脂 或 环 已 亚 胺 这 些 x 基因 表达 诱导 剂 处 理 前 
B 细 胞 时 ， 即 可 在 其 细胞 核 提 取 物 中 测 出 NE-xB: 更 奇怪 的 是 了 细 
胞 和 HeLa 细 胞 经 佛 波 醇 酯 处 理 也 可 以 诱导 出 NF-KB 的 结合 活性 ， 
而 这 两 种 细胞 一 般 并 不 表达 Kx 链 基因 。 显 然 ，NF-xB 在 这 些 细胞 
让 的 活性 及 至 在 网 郊 满 节 中 的 作用 学 受到 化 疏 王 硬 贡 的 攻 自 了 
C 这 种 信号 传导 系统 的 调控 的 。 

有 旦 转录 因子 不 止 受到 -种 而 是 两 种 以 上 的 信号 传导 芭 统 前 
控制 。 例 如 转录 因子 Ap2 除 了 受 佛 波 醇 酯 -蛋白 激酶 C 的 入 制 外 ， 
还 受到 cAMp- 蛋 白 激酶 A 的 控制 ， 也 就 是 说 它 能 够 应 答 观 种 环 
同 的 第 二 信使 :能 与 不 止 单一 个 信号 传导 系统 发 生 联系 的 转录 因 
子 ， 可 能 成 为 不 同系 统 之 间 的 桥梁 而 协调 它们 的 效应 ; 从 而 确保 
细胞 生长 时 必需 的 一 些 基因 在 应 答 许多 不 同 的 信号 时 得 以 表达 ; 
瑟 外 ， 能 被 几 种 不 同 的 第 二 信使 激活 〈 不 同 途 径 进行 修饰 六 的 因 
子 可 能 要 比 只 对 单一 信号 作出 反应 的 因子 有 更 持久 的 圭 录 应 答 ; 
因 因 它们 可 能 是 连续 地 被 某 种 级 联 的 第 二 信使 和 蛋 自 激酶 所 修饰 
和 激活 。 

转录 调节 因子 通过 修 作 而 激活 药 这 种 方式 可 能 对 , 回 : 竺 ,发表 
期 间 的 调节 回归 问题 给 人 们 某 种 启迪 。 所 谓 调节 回归 问题 ; 恭 是 
调控 基因 本 身 的 表达 是 如 何 调控 的 ? 如 果 全 都 是 通过 埋 录 水 平 上 
的 调控 而 实现 ， 那 未 跨 域 作 用 因子 本 身 的 基因 指 渐 次 激活 就 必定 
牵涉 到 一 些 调节 性 的 级 联 反应 。 另 一 方面 ， 根 据 转 译 后 修饰 的 激 


188， 


这- 下 EU 共和 让 -ET 二 二 CS 二 各 全 下 二 工 3 


区 


TFT 


YA 


要 ee 


本 
0 


活 机 制 ， 组 织 特异 性 表达 所 需 的 各 种 因子 存在 于 未 成 熟 的 前 体 细 : 
胞 申 , 只 是 没有 活性 : 这 时 ， 在 新 的 转录 作用 未 开始 之 前 ， 细 胞 
分 化 的 诱导 物 会 发 生 作用 ， 全 村 率 因 本 如 全 汪 汰 丰 7 和 人 
全 汪 的 由 形 圳 ， 

7 加 域 作用 序列 要 素 ， 与 路 域 作用 因 季 的 相互 作用 
“一 启动 区 与 增强 区 等 同 域 作用 序列 要 素 是 真 核 转录 单位 的 转录 
所 需 的 模板 结 移 要 素 之 一 ， 跨 域 作 用 因子 是 与 这 些 结构 要 素 有 高 
度 亲 和 力 的 调制 成 分 。 显 然 ， 研 究 跨 域 作用 因子 之 间 及 其 与 同 天 
作用 序列 要 素 之 间 的 相互 作用 的 分 子 过 程 是 了 解 真 核 基因 调控 机 
中队 < 

.我 们 前 面 提 到 ,个 调节 区 是 多 层面 的 双 元 组 织 , 增 强 区 序列 
要 素 是 由 增强 元 的 同 质 或 异 质 熏 加 。 这 就 意味 着 有 限 的 跨 域 作用 
因子 有 着 很 大 的 调节 自由 度 .例如 ,由 coreAy/ceore 人 和 SphII/SphII 
所 构成 的 一 个 增强 区 只 可 能 应 答 两 种 不 同 的 增强 元 特异 的 转录 因 
A 康 ， 人 (2) (3) 0 
怪 刚 安 率 甸 有 二 


有 浅 , 王 区 
.人 有 人 站 人 全 
演 讶 2 本 本 


雯 弓 施 


车 折 戈 各 ji 过 端 局 动 区 序列 此 素 
图 2-41 增强 区 、 增 强 区 弃 列 要素 及 增强 元 的 组 织 层次 及 其 与 转录 因子 的 相 
互 作用 模型 :(a) 跨 域 作 用 因子 与 增强 元 之 间 可 能 形成 的 有 功能 的 和 无 功能 的 
复合 物 。(b) 示例 两 个 有 坟 能 的 增强 区 序列 要 素 和 路 域 作用 因子 复合 物 与 一 
个 近 端 启动 区 因子 复合 物 的 相互 作用 。 双向 竺 头 表示 这 两 种 因子 在 转录 过 程 
中 可 脱离 和 再 接触 。 


89 mw 


子 ; 但 core A/sphT 这 样 的 序列 要 素 就 可 以 仰 顽 于 这 两 种 转录 因 
子 了 (图 2-41) 。 在 丙种 增强 元 所 组 成 的 单一 层次 双 元 序列 要 素 和 
两 种 因子 (A 和 B) 组 合 的 简单 情况 下 ,就 可 产生 四 种 不 同 的 调节 组 
合 (AA，BB，AB 和 BA) ,而 如 果 是 两 个 层次 的 双 元 组 织 , 则 会 有 
六 种 不 同 的 可 能 组 合 〈 即 AA-AA，AA-AB，A 六 -BA 等 如果 
再 加 上 这 两 种 因子 的 活性 状态 ， 出 现 的 时 间 和 空间 、 以 及 它们 之 
闻 可 能 有 的 互相 排斥 或 功能 到 加 等 等 ， 则 会 出 现 细胞 特异 或 阶段 ， 
特异 的 不 同调 控 形 式 。 

增强 区 作用 的 三 种 模型 

第 一 个 增强 区 的 鉴别 至 今 尚 不 足 一 个 年 代 但 含 增强 区 的 基 
因 的 数目 在 文献 中 却 急 剧 增加 。 对 增强 区 作用 机 制 的 解释 也 各 种 
各 样 。 其 中 有 三 种 概念 是 比较 流行 的 ， 而 且 各 自 都 有 一定 的 代表 
性 ,这 三 种 概念 是 : 〈1) 增强 区 可 以 影响 DNA 结 梅 的 拓扑 学 型 式 ， 
并 因此 而 影响 转录 因子 的 活性 ;(2) 增强 区 可 以 通过 DNA 的 回 折 ， 
而 与 启动 区 相互 作用 ， 尽 管 它们 之 间距 离 很 远 ; (3) 增强 区 可 能 
是 放行 必要 的 转录 因子 的 报关 站 。 图 2-42 是 这 三 种 模型 的 示意 图 。 
下 面 仅 就 此 示意 图 作 些 说 明 

坝 汪 浊 区 的 扣 扑 长 型 ， 这 二 直 训 尖 : 表 夭 二 革 记 语法 四 


在 增强 区 上 结合 可 能 使 DNA 发 生 扭 曲 或 使 其 构象 发 生 改 变 ， 而 导 


致 其 它 因子 在 启动 区 上 发 生 作 用 而 促进 转录 。 换 言 之 ， 增 强 区 可 
能 作为 拓扑 学 的 特 化 结构 〈* 开 放 或 解 旋 ” 的 DNA) 而 被 某 些 转 
录 因 子 所 识别 。 这 一 模型 表明 ,调节 性 蛋 自 质 先 在 增强 区 上 与 
DNA 起 作用 ， 而 一 旦 蛋白 质 因 子 与 载 强 区 发 生 接触 , 就 能 使 “ 开 
放 或 解 旋 的 构象 在 整个 分 子 上 发 生 一 种 扭力 的 蔓延 而 影响 转录 。 
@ 弯 卷 模型 ”这 一 模型 认为 ， 与 增强 区 结合 的 调节 性 蛋白 质 
可 以 通过 DNA 的 弯曲 而 到 达 转 录 起 始点 。 在 有 调节 性 蛋白 质 存 
在 的 情况 下 DNA 弯 曲折 回 的 例子 是 不 乏 见 的 ,例如 位 点 特异 重 
组 和 DNA 复 制 起 始 等 这 些 较 高 的 分 子 精度 的 事件 都 利用 DNA 的 
弯曲 折 回 而 使 DNA 与 蛋白 质 相 互 作用 。 而 且 从 热力 学 的 观点 来 看 . 
这 在 能 量 上 是 比较 “合算 的 >。 这 一 模型 预言 了 一 不 增强 区 和 写 
。 190。 


| 。 其 反应 的 启动 区 的 相互 作用 比较 不 受 它们 之 间 的 线性 距离 大 小 的 ， 


影响 。 
《1 拓扑 模型 . | 
叶 苞 ， 米 站 店 动 区 穴 订 < 下 反 言 增强 区 AL 1 ,和 户 翅 区 
Er 
二 启动 区 ce 全 as 
人 
蛋白 质 

《3) 滑动 模型 
2 | 转录 复 侈 

增强 区 。 岂 动 区 ET 

一 一 


增强 区 一 一 一 启动 区 
图 2-42 增强 区 作用 的 三 种 模型 


加 清 动 模型 “此 模型 的 要 点 是 蛋白 质 因子 可 以 与 增强 区 的. 
TANA 序 列 结合 ,然后 沿 着 DNA 滑 动 到 转录 起 始点 。 人 们 认为 。 增 
强 区 的 专 一 性 取决 于 增强 区 结合 蛋白 识别 的 正确 性 ， 也 取决 于 阁 
所 产生 的 效果 传送 到 所 作用 的 启动 区 的 精确 性 。 由 于 增强 区 和 启 
动 区 有 着 一 定 的 空间 距离 ， 因 而 可 以 想象 增强 区 激活 转录 通过 两 
个 不 同 的 步骤 进行 事实 上 前 面 两 个 模型 也 是 把 两 种 作用 分 开 的 。 
在 此 模型 中 ， 第 一 步 的 反应 即 蛋白 质 与 DNA 相 结合 ,与 前 两 个 模 
全 相同 ， 但 一 下 结合 之 后 ,蛋白质 因子 则 是 线性 地 滑 向 附近 的 记 
动 区 而 影响 转录 。 

上 上述 这 三 种 模型 ， 各 自 都 有 一 些 支 持 的 证 据 ， 也 有 -一些 反 对 
罗 证 据 。 自 然 ， 蚂 然 转录 机 构 的 成 分 无 论 是 结构 上 或 功能 上 都 是 
多 种 多 样 的 %i 那 末 增 强 区 的 作用 机 制 就 没有 理由 是 单一 的 。 上 述 . 
> 二 信 开 所 代表 的 增强 区 作用 模式 ， 在 任 一 场合 下 ， 有 既 可 以 是 单 
独 起 作用 ， 也 可 能 是 与 另 一 种 机 制 同时 起 作用 。 

(3) 可 诱导 增强 区 的 调节 作用 

可 浮 导 增强 区 包括 那些 对 热 激 、 重 金属 ， 病 毒 感染 以 及 对 生 


下 9 


”长 因子 和 类 固 醇 激素 等 信号 发 生 应 答 的 增强 区 。 许 多 基因 包括 热 : 


激 蛋白 基因 、 人 金属 结合 蛋白 基因 、p8- 干 扰 素 基 因 和 c-fos 基 因 的 增 二 
强 区 已 有 详细 的 了 解 。 类 固 醉 应 答 性 增强 区 在 小 鼠 乳 房 瘤 病 毒 和 
肉瘤 病毒 ,及 许多 细胞 的 基因 中 有 过 不 少 研究 引 = 般 说 来 ， 对 特 
定 信 号 发 生 应 答 的 增强 区 都 有 特定 的 信和 号 应 答 的 -序列 要 素 《 表 
11) 。 可 诱导 增强 区 负责 应 答 信 号 的 序列 要 素 一 般 很 短 ， 而 且 每 个 
基因 都 含有 若干 拷贝 的 这 种 应 答 序 列 要 素 。 调 节 序 列 的 这 种 串 列 
重复 药 登 加 效应 看 来 是 二 种 普遍 现象 ， 因 为 热 激 蛋白 基因 、 王 扰 
素 基 因 以 及 葡萄 糖 皮质 类 激素 应 答 序列 要 素 都 有 类 似 的 现象 。 当 
然 不 同 细胞 种 类 之 间 重 复 的 数 且 也 有 差异 ， 这 可 能 是 这 些 细 胞 中 
跨 域 作用 因子 的 含量 和 种 类 上 有 所 不 同 。 于 

可 诱导 增强 区 序列 要 素 对 异 源 的 启动 区 具有 激活 的 能 力 ， 拓 
此 ， 原 则 上 说 它 起 着 正 调节 的 作用 。 这 种 正 调节 可 能 通过 多 种 不 
同 机 制 达 到 ， 包 括 正 调节 因子 的 合成 或 激活 ， 或 是 负 调节 因子 的 
和 
正 调节 因子 激活 的 结 

国生 也 记 计 汪 种 自 调 避 因子 : 
激活 的 简单 例子 。 已 从 果 蝇 中 分 离 到 二 种 因子 邹 蔽 激 转 尿 洒 也 
(HSTF 这 种 蛋 自 不 是 由 热 激 蛋白 基因 编码 ),[ 它 能 够 以 果 坚 、 瑟 
母 及 人 的 热 激 应 答 序 列 CHSE)7 相 结合 而 促进 转录 作用 .虽然 在 未 : 
作 热 诱导 的 细胞 提取 物 中 ,- 这 种 因子 是 具 活 力 的 ， 但 诱 学 后 却 大 
大 增加 它 与 HSE 的 结合 活力 。 无 论 在 活体 内 或 在 离 体 条 件 下 ,ESTE 
常常 占据 不 止 一 个 HSE 结 合 位 点 ,而 且 在 多 个 位 点 上 结合 的 了 STE 
可 以 相互 配合 。 第 一 个 HSTF 分 子 结合 后 ;引起 DNA 弯曲 ,这 可 能 
有 助 于 第 三 个 HSTF 因子 的 结合 ， 而 第 二 个 HSTF 因子 结合 后 使 
[NA 再 发 生 另 外 的 构象 变化 这 种 构象 上 的 变化 双 拓 有 村 孙 是 很 
重要 的 。 

干扰 素 基 因 的 调控 则 基本 上 是 种 负 调 节 机 制 凡 干 搞 素 的 人 
成 一 般 在 正常 生长 的 培养 细胞 或 在 动物 体内 是 容 测 示 到 前 纪 但 车 
遇 到 诱导 物 如 病毒 或 双 链 RNA， 则 ] 类 干扰 素 即 xc 和 B 干 护 素 含量 

e。 了 了 92 。 


攻 : ) 


”就 套 增 加 。 诱 导 主要 是 促进 转录 。 干 扰 素 基 因 的 调节 区 〈VRE) 
直 两 下 调节 区 要 素 组 成 ， 二 个 为 负 调 节 序列 要 素 ， 另 一 个 为 定制 
型 转录 序列 要 素 ， 两 者 序列 略 有 重 春 。 负 调节 序列 要 素 的 缺失 突 
恋 僚 导致 在 不 存在 诱导 物 的 情况 下 也 会 夫 量 转录 。 若 将 负 调 节 区 
醒 异 源 的 启动 区 组 合 起 来 ， 则 会 抑制 转录 ?7 而 将 定制 型 序列 要 素 
与 异 源 典 动 区 组 合 则 它 可 起 着 定制 型 增强 区 的 作用 ， 即 无 诱导 
驳 存 春 时 也 和 促进 转录 帮 用 。 足 迹 法 分 析 也 表明 负 调 节 区 在 诱导 
前 不 被 脱氧 核糖 核酸 醇 I 的 水 解 ， 而 诱导 后 则 被 水 解 。 当 然 定 
制 型 转录 区 也 可 能 对 诱导 产生 应 答 。 因 为 车 将 它 置 于 异 源 启 动 区 
扯 游 也 有 上 才 量 的 诱导 效应 ;综合 以 上 结果 可 以 说 明 ， 干 扰 素 基因 
的 激活 既 筷 揪 在 负 调节 区 上 阻 过 物 的 驱除 ， 也 包括 正 调 节 的 转录 


- 表 11 ”可 诱导 增强 区 的 一 些 信号 应 答 序列 要 素 
所 属 基 因 应 答 信号 序列 要 素 
二 MMTW -- . 1 
PMSVC 
， 人 生长 液 素 
小 鼠 金 属 结合 蛋白 IT。 糖 皮质 GGTACANNNTGTTCT 
酷 抒 酸 转 氨 酶 酸 类 激素 
和 旬 氨 酸 加 氧 酶 
鸡 溶菌 酶 
大 鼠 泌 乳 激素 
见 蛤 卵黄 原 蛋 白 : 醉 GGTCAGNG NGTGTCCT 
鸡 卵 黄 原 蛋 白 3 
于 和 白 蛋 白 
MHC I 类 各 TTCNCNACCTCNGC- 
干扰 素 
LAEA3 ] AGTTTCTCTTCT-CT 
金属 结合 蛋白 “全 二 -ScGc-ccc66c 
痢 检 - 二 克 本 深化 了 光 CATTATATATAGC 
者 激 鼻 白 果 量 } 站 激 CT-GAA-TTC_AG 
大豆 CCAGAAAGTTCCAG 


-cfog cAMP TGACGTCA 


7 


因子 的 激活 了 

(47》 组 织 | 或 细 闻 特异 性 表达 中 路 城 作用 因 手 与 同城 作用 序列 
要 素 的 相互 作用 

在 同 域 作用 序列 要 素 控制 下 的 组 织 特异 性 表达 需要 -一 些 只 在 
分 化 了 的 细胞 中 才 存 在 或 激活 的 起 正 调 节 作 用 的 跨 域 因子 与 之 相 
互 作用 。 在 非特 异性 的 组 织 或 细胞 中 ,或 者 没 激活 或 者 被 “熄火 2”。 
全力 呈 性 嵌入 的 狗 痪 记 潮 基 直 全 划 寺 本 本 各 亲生 和 
兼 有 之 。 

本 二 上 通 在 允 关 二 内 六 者 出 交 家 半 六 玉生 机 生 生生 
调节 的 方式 。 在 成 年 个 体 中 ;， 白 蛋 帕 〈 主 要 的 凶 清 蛋白质 关 册 用 
细胞 合成 , 胎 疙 发 育 早期 其 浓度 处 于 低 水 平 , 出 生 后 则 很 快 达到 高 
而 稳定 的 水 平 。 上 租 儿 的 所 管 或 孵 黄 宫 也 少量 合成 白 蛋 白 ,, 但 是 成 
年 个 体 则 豪 无 例外 地 是 在 肝 细 胞 中 合成 。 记 尖 

确 肯 类 许 蓄 发 言 中 以 及 在 不 同 的 于 疙 如 丰 标 于 
起 始 这 一 层面 上 调节 白 蛋 白 的 合成 。 组 织 特 异性 所 涉及 的 DN 太 六 
列 则 位 于 帽子 位 点 上 游 的 约 170 碱 基 对 内 。 这 个 区 域 的 序列 在 大 
鼠 、 小 鼠 和 人 之 间 保 守 程 度 很 高 ， 在 大 鼠 中 这 个 区 域 可 以 界定 出 
两 个 启动 区 近 端 序列 要 素 即 PE 和 CCAAT 区 ， 及 及 三 个 远 端 序列 要 
素 即 DEI，DEH 和 DEIHI (图 2-43 见 捅 页 )。 足 迹 法 分 析 表 明 5 这 
些 序 列 要 素 都 有 特定 的 蛋白 质 (或 蛋白 质 复合 物 ) 与 立 碍 结 各 ， 
在 大 鼠 中 ,这 段 约 50bp 区 域 同样 也 可 以 界定 出 近 端 的 A 和 也 两 个 
序列 要 素 ， 及 远 端的 C、D、E 和 F 四 个 序列 要 素 。 这 些 序列 要 素 
也 都 有 特定 的 蛋白 质 (或 蛋白 质 复合 物 ) 与 之 相 结合 。 大 鼠 与 小 
鼠 的 情况 惊人 地 相 他 ; 自 蛋白 基因 启动 区 上 几乎 每 二 个 核 蔡 本 部 
被 调节 因子 所 占据 而 形成 一 个 多 蛋白 质 DNA 复 合 物 圳 于 全 于 页 全 

在 小 鼠 白 蛋白 基因 的 近 端 启动 区 ， 来 自 肝 脏 的 和 其 它 非特 异 
性 组 织 的 白 蛋 白 的 结合 方式 与 范围 有 所 不 同 ， 如 肾脏 没有 任何 蛋 
白 与 之 结合 ,脾脏 与 肝脏 相 比 y* 有 不 同 的 结合 形式 ， 脑 来 源 的 蛋白 
比 肝 脏 的 结合 范围 要 大 等 等 ;而 在 远 区 DEII 约 -100 处 ， 脑 、 肾 的 
蛋 自 没有 明显 的 结合 。 在 PE 了 ( 约 .-120) ,区 ， 肝 及 蛋白 因子 比 其 


“194 。 


它 组 织 的 结 谷 得 更 完全 。 分 化 的 肝 瘤 细胞 (CH4I) 及 其 去 分 化 细 
胞 《H5) 相 比 , 也 有 明显 不 同 。 前 者 可 以 有 效 地 转录 白 蛋 白 基因 ，. 
如 腻 脏 二 样 习 后 者 则 不 能 转录 该 基因 5H4 的 提取 物 与 启动 区 的 结 
谷 型 式 与 肝 提 取 物 相同 。 而 H5 提 取 物 虽 也 能 结合 ,但 在 远 端 区 的 
结合 则 有 明显 的 差别 。 这 些 蛋 白 结合 (尤其 与 DE1 和 了 DE2 的 结合 ) 
与 转录 之 间 的 关系 说 明 这 些 因 子 起 着 正 调 节 的 作用 ， 但 也 不 排除 
有 负 调 节 , 若 将 分 化 的 肝 瘤 细胞 与 成 纤维 细胞 或 去 分 化 细胞 融合 ， 
则 白 蛋白 基因 《及 其 它 肝 功能 基因 六 转录 就 会 停止 。 这 说 明 非 肝 
细胞 有 某 种 负 调 节 因子 ,防止 正 调节 因子 的 作用 (通过 千 扰 其 合 
成 或 干扰 其 结合 ) .H5 细 胞 确实 有 某 种 蛋白 与 DEI，I 和 IT 区 结合 
的 因子 ， 而 与 H 的 结 侣 足迹 明显 不 同 。 

与 水 遍 情 况 相 似 ;5 大 鼠 自 蛋 和 白 基因 5 侧 的 一 172 至 二 58 之 间 
的 序列 也 为 有 效 的 肝 特 异性 表达 所 必需 。 其 中 C 区 〈 即 相当 于 小 
鼠 近 端 的 CCAAT 区 ) 也 都 可 以 与 肝脏 及 非 肝 组 织 的 蛋 帕 质 结合 : 
而 结 和 从 在 这 端 韵 四 外 位 点 中 的 三 个 ， 即 D, 下 和 BF 位 点 王 的 因子 ,在 
肝脏 中 比 其 它 组 织 《 如 脾 与 脑 ) 浓度 更 高 。 忆 区 ( 约 一 120 处 )》 与 
小 鼠 前 DEI ( 约 一 120 区 ) 一 样 也 可 与 NE1 及 其 修饰 型 因子 结合 8 
NEI1 和 FEF1 修 饰 型 因子 均 存 在 于 肝 中 ， 它 们 的 含量 明显 地 比 其 它 
组 织 中 的 含量 要 高 ， 目 前 尚 不 知道 与 大 鼠 耻 位 点 (或 小 鼠 的 DEIT) 
相 结合 的 不 同 蛋 帕 形式 是 一 种 或 同 种 蛋白 的 衍生 物 还 是 具有 同 种 
结合 专 二 性 的 不 同 蛋 和 白质。 但 是 两 种 情况 都 是 有 案 可 查 的 。X 鸣 菌 
体 的 cro 蛋 白 与 阻 遏 物 就 是 两 种 不 同调 节 和 蛋白 的 最 好 征 子 。 而 免疫 
球 蛋 白 x 链 增强 区 的 转录 因子 NF-xB 的 转译 后 黎 饰 可 以 提高 其 结 
合 亲 和 方 则 说 明了 另外 的 一 种 可 能 性 ( 详 见 修饰 作用 一 节 ) : 

白 蛋 白 或 免疫 球 蛋白 基因 都 是 只 在 一 种 组 织 或 细胞 中 表达 。 
许多 基因 则 是 在 若干 组 织 中 或 在 发 育 前 不 同时 间 表 达 的 。 这 是 更 
复杂 的 基因 调控 .根据 现 在 的 认识 水 平 , 关 竹 基因 在 多 种 组 织 四 有 
区 别 表 达 药 调控 机 制 ， 可 能 想像 到 的 大 致 有 两 种 可 能 性 ， 或 者 说 
两 种 模型 。 一 种 模型 是 ， 某 一 基因 在 不 同 组 织 的 表达 受到 不 同 的 
跨 域 作用 因子 所 控制 。 换 句 话说， 组 织 特异 表达 的 依据 是 组 织 特 


8 林 99 


异 的 跨 域 作用 因子 ， 这 种 组 织 特 绰 的 因子 或 者 与 各 别 的 增强 区 或 
者 与 同一 启动 区 发 生 作 用 。 在 后 一 种 情况 下 不 同 的 因子 识别 同 
一 增强 区 中 特征 各 蜡 的 序列 成 份 ， 就 像 SV401I 增 强 区 中 的 情形 那 
样 。 这 些 组 织 特 异 的 跨 域 作用 因子 对 某 一 特殊 组 织 捉 许多 基因 的 
表达 进行 绸 控 。 六 

另 一 种 模型 认为 : 在 一 基因 得 以 表达 的 各 种 类 型 的 细胞 中 存 
在 着 共同 的 对 该 基因 行使 控制 的 跨 域 作用 因子 ， 这些 因 子 在 各 种 
类 型 的 细胞 中 ， 也 同样 的 方式 与 同志 增强 区 相 作 用 

对 采 蝇 的 一 些 基 因 调 节 区 域 所 进行 的 缺失 突变 研究 表明 六 同 
一 基因 在 不 同 组 织 中 的 表达 需要 不 同 的 DNA 序 列 ， 从 而 说 明 特定 
一 个 基因 在 不 同 组 织 中 的 表达 是 由 不 同 的 跨 域 作用 因子 进行 调控 
的 ; 果 电 中 战 路 转录 的 卵黄 蛋白 基因 yp1 和 yp2》 在 脂肪 体 和 儿 巢 
中 的 表达 都 受到 5“ 侧 同一 和 和 才 虎 在册 愉 保 乓 而 区 棕 本 本本 起 和 
”两 个 同 域 作用 序列 是 不 同 的 ; 

果 蝇 (D.Mulleri) 幼 虫 乙醇 脱氧 酶 基因 Adhl 在 脂 脑 体 中 的 表 
达 是 更 为 复杂 的 组 织 特异 性 表达 。 该 基因 经 转化 到 果 电 D,; mela- 
nogaster 后 ， 在 脂肪 体 ， 马 氏 小 管 、 前 中 胃 和 中 胃 都 得 到 表达 。 
在 这 四 种 组 织 中 ; 该 基因 的 最 佳 表达 至 少 需要 三 种 序列 要 素 的 控 
制 。 其 中 的 两 种 序列 要 素 位 于 5 侧 的 300 对 碱 基 中 ， 另 一 个 则 在 转 
录 起 始 的 3“ 和 侗 。 但 若 用 34 侧 的 序列 要 素 再 加 上 5“4 侧 的 当中 一 个 ， 
则 在 这 四 种 组 织 中 的 表达 都 处 于 较 低 水 平局 不 同 细 胞 类 型 中 六 使 
用 不 同 的 序列 要 素 可 能 反映 出 四 种 组 织 中 不 同 的 因子 有 着 不 同 的 
浓度 ， 或 者 每 一 组 织 中 不 同 的 因子 以 不 同 的 方式 与 这 三 册 人 开本 
素 相 作 用 。 

5: 染 色 质 结构 与 转录 调控 

由 于 内 色 体 的 许多 区 域 中 染色 质 的 斤 聚 性 质 ;大 们 - 直 认 为 ， 
转录 需要 染色 质 的 “束缚 ”状态 有 所 “ 讼 弛 ” (图 24 引 训 旱 已 知 
道 ， 离 体 条 件 下 ， 组 蛋白 能 以 一 种 非 专 一 的 方式 对 DNA 的 任何 
转录 都 具 抑制 作用 号 而 核 小 体 以 一 种 有 序 的 螺旋 状态 形成 的 螺 管 
结构 ;可 以 防止 参与 转录 作用 的 各 种 成 份 接近 转录 起 始点 可 许多 


e JJ96 。 


研究 结果 表明 ， 处 于 转录 活动 状态 的 基因 与 处 于 不 活动 状态 的 基 
因 : 无论 在 DNA 寺 的 蛋 自 质 束缚 还 是 DNA- 蛋 睛 质 结构 的 进一步 
折 疮 和 超 楷 绕 上 都 表现 出 明显 的 差别 。 

GD 转录 活性 中 心 对 脱氧 核糖 核酸 酶 的 级 感性 增加 用 胰腺 
的 脱氧 核糖 核酸 酶 处 理 各 种 组 织 的 完整 细胞 核 时 ,可 以 看 到 活动 
状态 基因 止 DNA:- 蛋 白质 结构 发 生 某 种 变化 。 这 种 酶 可 以 在 纯 的 
DNA 上 的 大 多 数 区 域 进行 切割 ， 但 对 完整 核 内 的 DNA， 则 其 结 
构 有 所 不 同 。 例 如 红细胞 的 前 体 即 成 红细胞 的 细胞 核 中 , - 珠 蛋 自 
基因 的 DNA 则 比 其 它 DNA 序 列 更 多 受到 脱氧 核糖 核酸 酶 的 切割 。 


_ZDNA 形 成 


， 
《 
Y 
其 它 未 知 的 
结构 变化 


“蛋白质 骨架 


.图 2-44、， 染 色 质 解 盘 绕 的 可 能 导致 的 结果 


一 一 个 核 小 体 的 失去 可 能 导致 DNA 额外 的 超 盘 绕 。 超 盘 绕 的 能 量 可 能 引起 
EDNA 的 一 些 区 域 的 局 部 解 链 或 变星 Z 构 型 ， 或 者 还 有 其 它 构 型 些 变化 


而 另 -- < 较 鸡 输卵管 细胞 核 中 ， 币 清 蛋 白 基 因 的 DNA 序 列 又 比 
珠 蛋 和 白 基 因 的 DNA 更 敏感 。 活 动 状 态 的 基因 对 核酸 酶 敏感 性 增 
加 ， 说 明 它 们 所 结合 的 蛋白 质 比 之 不 活动 基因 站 的 蛋白 质 是 处 于 


Ti97 。 


一 种 保护 性 较 差 的 构 型 。 


活动 状态 的 基因 所 在 的 染色 质 存 在 着 对 脱氧 核糖 核酸 酶 的 过 | 
敏 位 (hypersensifive site)。 这 就 是 那些 首先 受到 核酸 酶 水 解 的 : 


部 位 ,一 般 是 在 转录 起 点 附近 。 实 际 上 这 些 过 敏 位 的 出 现在 转录 
开始 之 前 。 看 来 在 这 些 位 点 上 ， 蛋 白质 与 DNA 之 间 的 相互 作用 的 


性 质 与 其 它 部 位 会 有 所 不 同 。 鸡 的 B- 珠 蛋白 基因 54 侧 近邻 约 200 核 


苷 酸 对 中 有 着 组 织 特异 的 过 敏 位 。 已 经 从 鸡 的 红细胞 中 纯化 出 一 


种 蛋白 质 , 这 种 蛋白 质 能 专 一 性 地 与 这 个 区 域 相 结合 ， 而 这 DNA 


区 域 也 正 是 成 红细胞 中 对 核酸 酶 敏感 的 位 点 。 离 体 条 件 下 的 模拟 
人 当 这 种 纯化 的 蛋白 质 附 着 在 克隆 的 DNA 的 结合 位 点 

， 再 加 上 组 蛋白 而 装配 成 核 小 体 。 则 该 蛋白 质 结合 的 部 位 将 变 
En 因此 ， 一 规 所 指 的 就 是 特异 性 蛋白 质 城 者 说 路 拓 
用 因子 与 之 相 作 用 的 区 域 。 

(2) 转录 状态 的 染色 质 上 核 小 体 相 域 的 变化 既 处 转录 的 基 
因 所 在 部 位 有 特异 性 蛋白 质 相 结合 ， 那 末 ， 这 部 份 的 杂 色 质 上 核 
小 体 是 处 于 什么 状态 呢 ? 它们 是 否 全 部 被 除去 ? 在 电镜 下 看 到 有 
新 生 RNA 链 附着 的 染色 质 ,其 核 小 体 是 在 聚合 酶 结合 部 位 的 前 后 。 
但 核 蛋白 体 基 因 所 在 的 染色 质 ( 注 意 :这 是 一 个 转录 单位 ! 被 RNA 
聚合 酶 致密 地 东 缚 着 》 上 ， 核 小 体 则 比 不 转录 部 位 要 称 少 ， 或 者 
说 松散 得 多 。 

但 是 核 小 体 的 相 域 框 架 (phasing frame) 看 来 是 恒定 的 .不管 
基因 是 否 处 于 转录 或 准备 转录 的 状态 。 倒 如 ， 不 管 是 在 造血 细胞 
中 还 是 在 非 造血 细胞 中 ， 小 鼠 珠 蛋 白 序列 上 都 具有 相同 框架 的 核 
小 体 相 域 。 在 红 和 白血病 细胞 中 ， 诱 导 珠 蛋 白 基因 表达 前 后 ， 在 启 
动 区 处 看 来 只 除去 四 个 核 小 体 ， 但 与 成 纤维 细胞 比较 ， 并 不 扰乱 
附近 的 相 域 框架 。 由 于 例子 有 限 ,要 归纳 出 一 般 规律 尚 为 时 过 早 ， 
但 看 来 , 核 小 体 所 处 位 置 有 利于 跨 域 作 用 因子 与 其 所 和 二 二 中 
列 可 逆 的 相互 作用 。 

本 为 商 世 人 前 让 动 刚 来 在 末 各 体 网 玫 颖 村 乓 于 示 报 节 机 大 


“作为 RNA 聚 合 酶 分 子 的 进入 位 ， 比 较 容 易 想像 启动 区 的 ` 开 


.198 。 


aa 


帮 * 铸 态 如 何 导 致 染色 质 向 转录 状态 的 转变 .但 增强 区 有 时 距离 启 
动 区 包 百 对 碱 基 之 外 ， 也 具有 其 核酸 酶 过 敏 点 。 这 可 能 是 通过 结 


“ 合 玫 过敏 点 土 的 跨 域 作用 因子 之 间 的 相互 作用 和 梧 增 强 区 与 启动 区 


相互 接触 ， 而 导致 增强 区 与 启动 区 之 间 的 间隔 序列 向 外 形成 侧 环 
(looping out)。 在 这 种 侧 环 的 基部 十 的 多 蛋白 复合 体会 强烈 吸引 


RNA 育 合 酶 而 起 始 转录 。 


最 近 的 研究 已 明确 了 这 种 侧 环 的 附 着 基 部 必 primary loop 
achorage) 有 一 类 很 特异 的 序列 ， 称 为 核 基质 结合 区 (matrix 
association reginy 缩 写 MAR) 或 染色 体 骨 架 附 着 区 (scaffold att- 
ached regiony 缩写 SAR) 。 有 趣 的 是 岂 这 些 序列 一 般 都 靠近 增强 
区 ， :而 且 它们 都 包含 着 与 拓扑 异 构 酶 开 相 互 作用 的 序列 。 免 疫 球 
蛋 自 的 重 链 :GIgHE) 基因 的 增强 区 就 是 一 个 很 好 的 说 明 。Ig 瑟 增强 
区 大 致 可 分 为 三 个 主要 的 区 有 段 (图 2-45)， 中央 的 增强 区 区 自在 淋 
本 尝 确 虽 可 关 正 克 玫 作用 deepg 两 翼 


从 -一 必 的 4 一 = 届 蒜 jahibitcrs 
4- 一 - non- Specific activator 
2 lg8 enhancer 
{ INI ER 1 N2 992 
Xbal ”了 HI “EcoRI Xbal 
上 5MAR 32MAR 
o e topoj 11 consensus 
他 凶 MAR Sequence homologies 
省 二 in vitro Protein binding site3 
< 二 旋 universally protected G 
入 了 phrussi motits 
1 dc-dctamer motif 


有 motifs 


工 图 二 45 IgE 增强 区 的 正 、 负 调 节 序 列 要 素 及 有 关 序 列 要 素 分 布 一 
效 。 这 段 997 的 XbaI 片 段 是 IgH 的 内 会 区 部 分 、 含 有 两 个 负 调节 序 
列 要 素 (INI 和 IN2)， 它 们 在 成 纤维 细胞 中 具有 活性 ,但 在 骨 骨 瘤 细 
胞 中 却 无 呈 中 心 部 分 (+ ) 为 在 也 细胞 转 异 的 正 调节 区 。 同 时 给 出 了 
(i 拓 扑 异 构 酶 的 契合 序列 ，(ii) 核 基 质 附 着 序列 ; (iii) 跨 域 作用 
因子 离 体 条 件 下 与 IN1 和 IN2 结 合 部 位 ! 〈iv)G 保 护 区 y 《〈V) 普 遍 存 

) “在 于 许多 增强 区 的 GT-oore 序 列 要 素 等 的 相应 位 置 。 


"199。， 


的 两 个 区 段 IN1 和 IN2 首 先是 在 非 汶 巴 细胞 中 鉴别 出 来 , 它们 半 非 
淋巴 细胞 的 跨 域 作用 因子 相 结合 ， 连 同 中 央 区 有 段 药 中 忌 部 分 在 淋 
巴 细胞 中 起 着 负 调 节 的 作用 是 由 于 HI 和 IN2 上 结合 葛 恒 自 质 分 
子 对 中 央 增 强 区 所 造成 的 空间 障碍 所 致 ， 因 为 ， 它 们 之 闻 的 更 离 
达 150 碱 基 对 。 毋 宁 说 ，IN2 和 INI 所 结合 药 蛋 自 质 相 互 作 用 而 形 
成 一 个 侧 环 ， 而 把 起 正 调节 作用 的 增强 区 夹带 其 间 ， 众 而 防 焉 增 
强 区 与 启动 区 之 间 形 成 侧 环 结构 。JN1 和 IN2 部 分 确实 也 含有 核 
基质 结合 区 的 同 源 序列 ATATTT。 这 就 产生 这 样 的 可 能 手 ; 邵 
IN1 或 IN2 能 与 核 基质 结合 。 此 外 在 IN1 和 JIN2 也 存在 着 拓扑 异 构 
酶 五 识别 的 契合 序列 。 从 而 也 说 明 在 侧 环 基部 的 杂 色 质 区 域 可 能 
引入 扭曲 张力 。 需 要 指出 的 是 ， 淋 巴 细胞 和 非 淋巴 细胞 揭 节 瑟 的 
MAR 都 附着 于 核 基质 ， 并 且 与 增强 区 或 与 IN1 和 ?42 结合 的 许多 
蛋 自 质 因 子 是 共同 的 ， 但 省 册 三 洒 丰 项 二 3 

6. 化 学 修饰 调控 

(1) DNA 的 甲 基 化 与 脱 甲 基 作 用 分 子 和 遗传 学 认为 ， DNA 
中 存在 着 细胞 行使 各 种 功能 所 需要 的 各 种 信息 ;而 各 种 细胞 在 行 
使 不 同 的 功能 时 ， 又 需要 在 DNA 上 引入 或 消除 有 关 的 信息 。 基 因 
组 DNA 的 可 逆 性 甲 基 化 提供 了 信息 引入 或 消除 的 可 能 性 。 动 物 细 
胞 的 DNA 中 ， 在 CpG 位 点 上 发 生 的 胞 喀 院 残 基 的 甲 基 化 是 一 种 复 
制 后 的 加 工 形 式 ， 其 型 式 与 范围 在 各 种 组 织 之 间 和 物种 之 间 都 是 
独特 的 。 在 发 育 过 程 中 ，DNA 甲 基 化 的 型 式 也 变化 万 千 。 在 某 些 
和 情况 下 ，DNA 的 甲 基 化 与 脱 甲 基 化 是 与 基因 表达 相关 的 。 在 一 些 
不 表达 的 基因 中 ， 启 动 区 的 甲 基 化 程度 很 高 ， 而 基因 处 于 活动 状 
态 时 ， 则 处 于 低 度 甲 基 化 。 例 如 受 肉 二 酮 诱导 的 卵黄 原 蛋白 开 基 
因 ， 其 5 侧 的 调节 区 含有 四 个 CpG 位 点 ,[ 即 在 一 525(A)。， 一 587 
(B)， 二 612(C) 和 - 618(D)， 图 2-463,C 和 D 答 点 这 部 荷 DNA 是 
具 二 酮 - 受 体 蛋白 复合 物 的 结合 部 位 。 在 肉 激 素 处 理 后 ， 在 - 612 
(C) 的 HpaiI 位 点 处 于 低 度 甲 基 化 。 红 绍 胞 DNA 的 两 条 链 上 所 有 这 
些 CpG 位 点 多 部 甲 基 化 。 但 在 肝 DNA 中 , 只 在 了 B 位 点 处 的 上 一 自 
链 全 部 甲 基 化 ， 下 一 股 链 则 具有 50% 甲 基 化 。 经 肉 二 酮 处 理 后 数 


ss Li00。 


小 时 内 ， 肝 DNA 甲 基 化 的 型 式 发生 和 急剧 变化: 上 一 股 链 中 所 有 四 
个 CpG 位 点 变 成 脱 甲 基 ， 与 卵黄 蛋白 mRNA 的 出 现 相 吻合 。 而 另 
一 股 链 上 与 之 互补 的 CpG 位 点 揭 脱 甲 基 化 则 延 后 大 约 24 小 时 。 这 
一 结果 提供 了 一 个 基因 受到 激活 时 甲 基 化 型 式 变化 的 具体 细节 。 
它 异 乎 寻常 地 告诉 人 们 ， 肝 DNA 在 正常 情况 下 ,卵黄 蛋白 基因 的 
5 侧翼 区 域 具 有 部 委 的 半 甲 基 化 位 点 ， 而 激素 处 理 则 只 引起 其 中 
调节 区 中 一 段 DNA 链 迅速 脱 甲 基 作 用 ， 而 保留 另 一 股 链 上 的 甲 
基 ， 处 于 半 甲 基 化 状态 。 

小 鼠 8- 珠 蛋白 基因 5 ' 侧 机 区 的 甲 基 化 型 式 是 在 离 体 条 件 下 用 
唉 些 类 红 白 血 瘤 细胞 部 分 纯化 的 DNA 甲 基 转 移 酶 所 进行 实验 的 
结果 。 其 5 侧翼 区 的 - 307 位 上 有 一 个 单独 的 CpG 位 点 。 另 外 四 个 
比较 集中 出 现 〈 图 2 二 6) 。 离 体 甲 基 化 结果 表明 ,， -307 位 上 的 
CpG 不 发 生 甲 基 化 ,而 四 个 集中 出 现 的 CpG 中 ，a, a' 和 d' 甲 基 化 
程度 不 显著 ， 而 b,b' cvc' 稍 有 甲 基 化 , 大 量 的 甲 基 化 则 出 现在 d， 
在 -153 位 上 产生 半 甲 基 化 。 无 论 用 从 诱导 的 或 不 诱导 的 细胞 所 得 
到 的 纯化 酶 或 粗 制 酶 其 结果 都 是 一 样 的 。 这 一 结果 表明 , 酶 对 CpG 
位 点 的 甲 基 化 是 有 选择 性 的 ， 对 链 的 要 求 也 是 有 差别 的 。 

(2) mRNA 帽子 的 修饰 mRNA 的 5 端 幅 子 的 存在 ， 可 以 防 
止 外 切 酶 药水 解 ， 估 而 增加 了 转录 物 的 稳定 性 。 此 外 ， 帽 子 的 存 
在 不 但 可 增加 前 mRNA 剪接 的 效率 和 精确 性 ,而 且 mRNA 3“ 端的 
有 效 加 工 也 是 由 帽子 决定 的 .帽子 对 mRNA 本 成 在 稳定 性 、 剪 接 和 
末端 决定 上 的 多 重 效应 可 能 是 与 帽子 参与 了 DNA- 蛋 白质 复合 物 
有 关 ， 而 这 种 RNA- 蛋 自 质 是 前 RNA 变 成 有 功能 的 mRNA 的 过 程 
所 必需 的 。 

帽子 对 mRNA 的 转译 也 有 显著 影响 。 在 蛋白质 合成 起 始 时 ， 
核 蛋 白 体 的 40S 亚 基 与 mRNA 的 结合 是 由 凯 子 推动 的 ， 因 为 如 果 
将 帽子 结构 换 成 m7Gs“p 或 其 它 类 似 结构 ， 则 这 种 结合 就 会 受到 
抑制 。 现 已 从 网 织 红 细胞 中 纯化 了 一 种 帽子 结合 蛋白 cap 一 bin- 
ding protein)， 分 子 量 约 24KD。 离 体 条 件 下 ， 这 一 蛋白 可 以 有 
区 别 地 促进 有 帽子 的 mRNA 的 转译 。 帽 子 还 可 以 与 一 个 220KD 的 


e。 2Z07。 


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1893 - 059 一 


江 电 亚当 站 类 人 敏 《〈V) 


人 
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@， 


蛋 自 质 (p220) 及 一 个 45KD( 的 多 肽 相当 于 转译 起 始 因 于 eIF--4A) 
结合 而 形成 稳定 的 复合 物 。Hela 细胞 被 峭 散 灰质 炎 病 毒 (polivi- 
rus) 感染 后 ， 这 一 帽子 结合 蛋白 复合 物 被 修饰 而 失去 功能 。 这 是 
鼎 为 耐人寻味 的 ， 因为 宿主 细胞 被 感染 后 ，mRNA 的 转译 是 被 关 
闭 的 ， 而 肴 散 灰 质 炎 病 毒 的 RNA 是 罕见 见 的 不 戴 帽 子 的 天 然 信使 。 
”了 .基因 表达 的 RNA 调 控 
(1) 反 义 RNA(antisense RNA) 所 谓 反 义 RNA 就 是 其 序列 
噩 补 于 mRNA 的 二 种 RNA。 显 然 具 有 洪 在 的 调控 基因 表达 的 可 能 
性 。 在 活 机 体内 。 其 调制 程度 有 多 大 尚 难 肯 定 ， 但 无 论 在 原核 生 
物 或 是 真 核 生 物 都 有 一 些 例 于 。 
其 中 的 一 个 例子 就 是 在 大 肠 杆菌 基因 组 中 可 以 随机 嵌入 的 可 
转 位 成 分 Tn10、Tn1l0 长 约 9300bp， 其 嵌入 序列 〈IS10) 两 端 是 反 
向 重复 序列 。IS10 的 右 侧 序列 负责 编码 转 座 酶 (催化 该 成 分 整合 
到 染色 体 中 ) 。 这 个 基因 具有 两 个 启动 区 ,其 中 一 个 负责 转录 该 酶 
的 mRNA 另 二 个 启动 区 所 起 始 的 转录 从 编码 区 内 开始 ， 往 上 游 
方向 行进 ， 形 成 一 段 与 酶 mRNA 的 5 端 互补 的 RNA (图 2-47)。 看 
来 DRNA 与 反 义 RNA 之 间 形 成 的 一 股 双 链 对 酶 蛋白 的 转译 行使 负 
调节 。 二 
天 区 本 曾 - .二 上 ， 转 应 了 基 因 转录 
全 反 义 RNA_A pOUT 
图 2-47 ”人 嵌入 序列 TS10 的 转录 .PIN 为 转 座 酶 基因 的 启动 区 ，POUTI 


是 一 个 强 启动 区 ， 其 负责 合成 的 一 段 含 36 个 核 背 酸 的 反 义 RN 人 可 
蒙 巩 转 座 酶 基因 的 起 始 部 分 的 码 组 。 


四 和 霉 素 抗 性 
基因 


真 核 生 物 中 的 例子 是 小 鼠 的 二 氧 叶酸 还 原 酶 基因 。 该 基因 的 
吧 侧 要 区 以 相反 的 方向 取向 ， 转 录 时 产生 一 段 180 一 240 个 核 苷 酸 
的 反 链 RNA， 在 细胞 核 中 ， 其 含量 很 丰富 ， 不 具 聚 人 结构， 尚 不 
知 是 否 对 三 所 叶酸 还 原 酶 基因 的 表达 行使 调控 作用 。 

(2) 标识 序列 (idenfifier) 最 初 在 大 鼠 的 基因 组 中 发 现 一 


es。 Z03 


种 82bp 的 序列 ， 它 以 多 拷贝 的 形式 存在 。 可 被 RNA 聚 合 酶 工 有 I 


转录。 其 转录 物 占 脑 细胞 核 转录 物 的 62% 。 这 种 RNA 序 列 ， 命 名 
为 标识 序列 (简称 ID 序列 ) 。 原 来 以 为 它 是 脑 特异 性 表达 的 调控 
成 分 ， 但 最 近 在 肝 、 肾 、 肌 肉 等 组 织 中 也 发 现 了 ， 并 且 存 在 于 不 
同 基因 的 mRNA 的 3“ 端 ， 以 重复 形式 存在 。 处 于 静止 状态 的 成 纤 
维 细胞 ， 用 生长 因子 诱导 后 ,这 种 mRNA 可 达到 生长 状态 的 水 平 ; 
用 肴 通 灰 质 炎 病毒 及 ras 和 myc 癌 基因 转化 后 ， 也 看 到 同样 现象。 
ID 序列 可 能 是 一 个 决定 性 因素 ， 因 为 在 兔子 8- 珠 蛋白 基因 的 3" 非 
编码 区 插入 的 一 个 单元 的 这 种 序列 ， 在 SV40 启 动 区 的 控制 下 ,也 
发 现 类 似 的 表达 形式 。ID 序 列 的 位 置 除了 在 3 非 编码 区 外 ， 还 有 
车主 例子 说 明 它们 也 可 能 存在 于 内 涵 区 。 它 们 如 何 对 基因 表达 实 
行 调控 ， 目 前 尚 属 推测 。 一 种 意见 认为 ， 是 在 RNA 拼 接 的 水 平 上 
进行 调控 含有 ID 序列 的 基因 。 其 转录 物 的 天 小 是 参差 不 齐 的 ， 大 
致 可 分 为 两 类 ， 一 种 是 大 的 mRNA 分 子 ， 另 一 类 是 异 质 北 分 子 
转录 牺 ， 前 者 由 RNA 聚合 酶 转录， 后 者 可 能 为 RNA 聚 合 酶 III 
所 转录 。 会 不 会 由 于 RNA 聚 合 酶 II 转录 的 为 RNA 分 子 的 调节 ， 
导致 会 有 同 种 序列 的 大 分 子 mRNA 加 工 的 圭 化 呢 7 本 


( 劳 为 德 ) 


”第 三 节 “基因 定位 


基因 定位 《gene_mapping) 包括 将 基因 定位 于 某 一 特异 的 染 
色 体 上 产 凡 及 测定 基因 在 染色 体 上 线性 排列 的 顺序 与 距离 这 两 企 
内 容 。 直 至 六 十 年 代 未 ， 除 了 极 少数 遗传 学 的 经 典 实验 材料 外 ，- 


绝 大 允 数 生物 种 的 基因 定位 工作 进展 相当 缓慢 ;- 随 着 染色 体 分 状 


922Z04。? 


路 


技 采 、 蛋 白质 分 析 技 术 、 体 细胞 遗传 操作 技术 以 及 重组 DNA 技 术 
的 发 展 基因 定位 的 方法 不 断 增多 。 有 目前 已 且 千 个 左右 的 基因 
被 定位 在 人 的 染色 体 上 。 

站 由 于 此 闫 型 条 多 所 用 的 革 定位 方法 也 各 有 外 和 入 


用 起 来 较为 方便 ， 但 是 下 有 交 款 、 重 夏 -要 对 定位 方法 的 允 上 
例如 只 是 将 基因 定位 在 某 一 特殊 的 染色 体 上 ， 还 是 测定 基因 问 的 
相对 或 绝对 虐 离 ， 也 可 以 将 基因 定位 方法 分 成 三 大 类 。 这 种 分 类 
访 法 比较 清楚 ， 但 不 够 精细 ， 反 映 不 出 基因 定位 的 原理 。 本 文 结 
合 定位 的 原理 和 方法 揭 特 点 将 基因 定位 分 成 七 大 类 : 遗传 重组 值 _ 
定位 ， 家 系 分 析 定位 ， 利 用 非 整 信 体 定位 ， 细 胞 学 定位 ， 体 细胞 
杂种 定位 基因 转移 定位 和 物理 学 定位 。 
_， 通 过 遗传 重组 所 得 到 的 基因 线性 排列 图 称 挫 传 图 谱 (Gene- 
生 c map)。 如 将 遗传 重组 值 作为 基因 间 揭 距离 ， 所 得 到 的 基因 线 
性 排列 图 称 为 连锁 图 (Linkage "map)。 而 用 和 遗传 重组 以 外 的 基因 
定位 方法 所得 到 丽 基因 线性 排列 图 称 光 物 理 图 讲 (physical map)。 
根据 这 些 图 谱 的 结果 综合 绘制 成 的 基因 在 染色 体 上 的 线性 排列 图 
称 为 基因 图 -(Gene map)。 应 当 指出 ， 有 些 定位 方法 用 来 表示 基 
因 间距 离 的 单位 是 不 同 的 ， 它 们 之 间 的 转换 并 非 易 事 。 如 分 摩 即 
CNEX 重 情 单位 ) 与 破 基 对 之 间 的 换算 ， 在 不 同 的 基因 组 及 基因 
组 的 不 同 部 位 是 不 一 样 的 。 


浊 6 一 遗传 重组 值 定位 


中野 和 一 条 染色 体 实际 上 都 是 一 个 连锁 的 基因 群 。 实 台 表 明 ， 位 
于 同一 染色 体 上 的 连锁 基因 并 不 总 是 作为 一 个 完 整 单位 和 
只 是 具有 一 起 遗传 的 趋势 而 已 。 据 此 ， 摩 尔 根 所 出 子 肥 连锁 的 强 
韶 依 赖 于 染色 体 上 连锁 基因 的 位 置 ”的 假说 ;这 一 假说 导致 了 基 
国 在 染色体 于 呈 直 线 排 列 的 理论 。A. H Sturtevant (1913) 进 而 
提出 以 基因 重组 的 交换 值 〈 又 称 重组 值 或 重组 频率 ) 帮 为 染色 体 


和 多 人 3 


上 基因 间距 离 的 标准 ， 从 而 奠定 了 遗传 重组 值 定位 工作 的 基础 。 
重组 频率 定位 是 应 用 很 广泛 的 一 类 方法 ， 它 可 应 用 于 各 种 未 同 的 
生物 材料 中 。 它 的 基本 原理 就 是 ， 成 对 的 染色 体 在 减 数 分 裂 过 程 
中 发 生 交 换 ， 交 换 的 结果 使 染色 体 上 的 基因 发 生 重组 。 两 个 基因 


之 间 发 生 重 组 的 频率 取现 于 它们 之 问 的 相对 距离 。 因 因而 可 以 重组 
率 来 才 示 它们 之 间 的 和 对 距离 。 下 面 共 馈 元 种 利用 重组 频率 进行 
定位 的 方法 。 

了 过 点 测 交 


本 方法 适用 于 通过 有 性 杂交 过 程 产 生 二 倍 体 的 真 核 生 物 。， 

以 果 蝇 为 例 ， 首 先 要 得 到 突变 基因 型 二 二 的 杂 合 子 。 符 号 a\b 
分 别 为 一 条 染色 体 上 的 两 个 突变 基因 ， 而 + 、+ 为 相应 的 两 个 正 
常 基因 。 将 待定 位 的 显 性 纯 合 的 生物 个 体 (十 十 ) 与 此 位 点 为 隐 性 


的 另 一 纯 合 子 个 体 (二 ) 杂 交 ， 其 Fi 代 便 是 十 圭 的 杂 合 子 ;这 种 双 
杂 合 子 在 减 邓 分 型 中 ， 人 下 十 0 + 和 ab, 发 生 
重组 的 配子 是 +b 和 a+ .将 此 双 杂 合子 的 个 体 与 隐 竹 纯 合 于 (3 


或 半 合 子 (二 人 2 ) 的 不 体 测 交 (这 里 -二 > 表示 Y 染 色 体 ) 时 ， 由 于 这 


些 纯 合 子 或 半 合 子 果 蝇 产生 的 配子 只 携带 隐 性 的 ab 或 只 携 代 有 工 
染色 体 ， 所 以 显 性 性 状 在 后 代 中 充分 表现 。 在 未 发 生 重组 的 情况 
下 ， 后 代 个 体 均 为 双 显 性 或 双 隐 性 性 状 。 如 有 非 亲 本 性 状 出 现 ， 
则 表明 发 生 了 重组 。 这 样 ， 根 据 显 隐 岂 关系 就 可 知道 发 生 重组 的 
配子 数 ; 从 而 推算 出 重组 值 。 重 组 值 的 大 小 反映 了 两 个 基因 间 的 
相对 距离 。 二 二 

和 .三 点 测 交 

一 点 测 交 法 ， 虽 可 以 推算 出 基因 间 的 距离 ， 然 而 并 不 清 臣 基 
因 间 的 相对 位 置 。 三 点 测 交 因 可 直接 反应 出 基因 位 点 的 顺序 ， 故 
更 适用 于 基因 定位 。 


“206。 


有 


了 on 


Ra 


往 _ 叶 
上 及 

FE 

交 

， 


经 典 的 果 蝇 三 点 测 交 实 验 是 用 三 个 性 连锁 的 基因 来 做 的 。 所 
用 的 瞧 性 纯 合 子 是 ， 黄 体 (y)、 吉 眼 (ec) 、 和 残 翅 (ct) 。 它 与 野生 


型 的 雄 果 蝇 杂交 ， Fi 代 肉 果 蝇 的 表 型 为 野生 型 的 杂 合 子 汪 ee 。 


将 它 与 了 eet 的 雄 果 蝇 杂 交 时 ， 这 种 肉 果 蝇 共 产生 八 种 不 同 基因 


型 的 配子 ，yecct， 寺 十 十 ，y+ 二 Tecct 了 ee+ 二 十 ct y 十 


ct 和 + cct。 由 于 半 合 子 工 和 的 雄 果 电 只 携带 隐 性 的 尺 ec ct 


二 和 y 染 色 体 ,这 八 种 配子 都 可 在 后 代 中 充分 地 表现 出 来 。 根 据 后 


代 的 表 型 ， 可 统计 出 F; 唆 果 蝇 产生 的 各 类 配子 的 比例 ,从 而 求 出 
重组 频率 参见 教学 实验 五 )。 

用 电泳 方法 及 酶 的 染色 技术 ， 可 以 分 辨 等 位 基因 编码 的 酶 ， 
在 用 酶 作为 遗传 标记 的 基因 定位 工作 中 ， 同 功 酶 是 用 得 最 多 的 。 
同 功 酶 是 指 同一 种 酶 的 多 种 形式 ， 它 们 催化 同样 的 反应 ， 只 是 反 
应 的 最 适 PH 和 最 适 底 物 浓度 不 同 ， 同 功 酶 是 由 不 同 的 多 肽 亚 单 
位 形成 的 复合 蛋白 质 。 构 成 同 功 酶 的 不 同 单 体 是 由 不 同 的 基因 位 


-点 编码 的 : 

在 大 明 的 表 型 标记 已 被 定位 的 物种 中 ， 通 过 同 功 酶 位 把 与 已 
知 位 点 的 标记 基因 进行 二 点 、 三 点 实验 ， 便 能 将 同 功 酶 定位 在 特 
定 的 染色 体 上 。 


即使 没有 已 被 定位 的 标记 基因 ， 同 样 可 以 测定 编码 酶 的 基因 
间 的 连锁 关系 。 这 需要 将 不 同 种 类 的 同 功 酶 位 点 配对 组 合 加 以 检 
测 。 与 玫 型 标记 不 同 的 是 ， 同 功 酶 位 点 的 等 位 基因 通常 是 共 显 性 
的 ， 因 此 从 理论 上 来 说 ， 如 果 能 够 得 到 对 于 足够 多 的 同 功 酶 位 点 
均 为 异 质 的 Fi 代 ， 便 能 得 出 多 个 位 点 间 的 连锁 关系 。 

4: 殷 制 性 内 切 酶 片段 长 度 多 态 性 (RFLP) 标记 定位 

经 典 的 连锁 分 析 ， 只 能 对 表 型 突变 的 位 点 进行 定位 ， 同 功 酶 
标记 定位 虽然 突破 了 这 个 障碍 ， 但 同 功 酶 标记 位 点 的 数目 有 限 ， 
而 且 只 分 布 在 染色 体 组 的 部 分 染色 体 上 。RFLP 是 一 种 更 广泛 的 


207 > 


遗传 将 记 ; 用 它 来 定位 的 原理 与 于 述 同 功 酶 定位 的 原理; 党 全 一 
致 。 Se 


列 ,这 种 差异 能 以 限制 性 内 切 酶 片段 长 度 的 多 态 性 (RFLP) 表 现 出 
来 。 这 种 DNA 的 多 态 性 也 可 能 具有 表 型 效应 ,但 许多 DNA 的 多 态 
性 并 没有 任何 典型 的 形态 学 表现 。 用 Southern 印 迹 法 《〈 见 基因 工 
程 的 基本 技术 一 章 ) 很 容易 鉴定 出 这 种 四 DNA 序 列 差异 而 导致 的 
多 态 性 从 而 得 出 大 量 的 多 态 性 标记 位 点 。 

一 般 情 况 下 ，RELP 与 同 功 酶 标记 位 点 宇 样 ， 是 技 孟 德尔 式 江 
显 性 称 记 遗 传 的 。 在 用 RFLP 标记 定位 时 ,并 不 需要 知道 有 疾 性 状 
的 任何 生化 性 质 ， 也 不 必 分 离 特 定 的 基因 ,只 要 有 有: 单 三 顺序 胸 
即 可 。 由 于 能 够 得 到 大 量 的 这 种 DNA 顺 序 标记 ; 嘱 以 对 不 同 物 种 
CDNA 来 说 ， 利 用 其 它 位 点 与 RFLP 位 点 的 连锁 耸 析 ; 终 可 以 得 
出 整个 基因 组 的 基因 连锁 图 弯 。 有 人 推测 ,对 于 大 的 基因 组 来 说， 
只 需 150 多 不 RFLP 标记 位 点 ， 即 可 得 到 大 基 因 组 完整 的 基因 图 谐 。 

5. 人 缺失 重组 定位 

具有 不 同 缺 失 突变 位 点 的 材料 也 可 通过 DNRA 重组 来 进行 定 
位 。 含 有 缺失 突变 的 两 个 个 体重 组 时 ， 若 缺失 部 分 重 琶 》 贝 语 二 
代 让 不 可 能 有 产生 野生 型 的 重组 子 。 图 2-48 是 Benzer 描 述 的 噬 蓝 
体 T4rT 区 域 的 一 系列 缺失 体 ， 每 一 缺失 均 用 特 完 的 数字 表示 避 用 
该 系列 突变 体 , 可 以 很 容易 地 测定 任何 一 个 在 rII 区 域 的 突变 位 置 。 
例如 将 一 个 其 位 点 突变 尚 不 确 知 的 突变 体 与 七 株 带 有 七 不 大 缺失 
片 眉 〈( 疯 图 2-48 上 部 六 的 突变 体重 组 。 若 点 突变 发 本 在 Ase 片 段 ， 
则 此 突变 体 就 不 可 能 与 阅 ayi， rd ye 发 生 重 组 产生 野生 型 的 
重组 体 , 因为 这 三 种 突变 体 也 存在 着 和 3e 的 缺失 。 据 此 可 和 确定 该 
点 突变 发 生 在 本 和 PT; 馈 失 之 间 做 进一步 再 用 小 的 鳞 失 突变 体 动 
riysl Ti 旭 s 和 Co 与 Ase 点 突变 的 突变 体重 组 疫 现 只 有 
zzsi 不 能 与 此 点 突变 体 产 生 野 生 型 重组 体 ; 而 其 它 突变 体 均 能 
与 突变 体 莉 组 产生 野生 型 重组 体 。 这 样 便 可 将 此 突变 位 点 定位 在 
Ass 片 身上 丘 .最 后 ， 可 将 此 点 突变 与 :Ase 片段 的 其 它 点 突变 体重 


”208” 


在 分 子 水 平 上 ， 同 一 位 点 的 不 同等 位 基因 有 着 不 同 的 DNA 序 


FOR 


Eee ww ee aa wa uusee oa 


2 闪 一 = 到 = 民 世 人 呈 基 人 和 全 和 人 人 员 人 并 人 人 一 -| 
As Ps ec osEPCET 一 
人 并 

4 基因 ( 舌 乓 .也 基 本 ( 顾 反 子 ) 


SR : 


图 2-48， 隆 菌 体 工 ,的 FII 区 侧 失 突 变型 的 突变 部 位 


组 ， 检 测 野生 型 的 重组 体 ， 从 而 构建 出 此 基因 的 精细 结构 图 。 

6. 利 用 孵 巢 畸 胎 瘤 进行 基因 定位 、 

前 天 的 研究 表明 ， 历 形 卵 梨 畸 胎 瘤 是 由 胚 性 细胞 形成 的 & 通 
过 分 析 发 现 $ 宿主 妇女 的 核 型 是 异 质 的 ， 而 蝴 胎 瘤 细 胞 的 核 型 却 
是 纯 谷 萝 这 有 两 种 解释 (图 2:49)， 可 能 是 第 二 次 减 数 分 裂 被 抑 
制 ， 或 是 卵细胞 核 与 第 二 极 体 融合 产生 二 倍 体 细胞 。 

“既然 在 畸 胎 瘤 中 ， 每 个 染色 体 对 的 着 丝 粒 是 由 单一 的 母性 宿 
主 染色 体 而 来 ， 那 么 ， 靠 近 着 丝 粒 的 染色 体 标 记 和 基因 位 点 很 可 
能 是 纯 谷 的 让 离 着 丝 点 远 的 位 点 则 由 于 交换 的 缘故 很 可 能 是 异 质 
的 蕊 这 样 我 们 可 以 测定 出 基因 与 着 丝 粒 的 距离 。 

:假定 一 宿主 母体 13 号 当 色 体 上 的 着 丝 粒 是 异 质 的， 并 且 酯 酶 
也 也 是 异 质 的 《此 基因 已 定位 在 13 号 染色 体 上 )。 分 析 来 源 于 该 母 


209.。 


体 的 畴 贻 瘤 ， 发 现 荧 光标 记 的 着 丝 粒 区 是 同 质 的 ， 而 酯 酶 D 同 功 
酶 或 是 同 质 或 由 于 交换 而 是 异 质 的 。 统计 同 质 和 异 质 同 功 酶 出 现 
的 频率 ; 便 可 定位 出 酯 酶 D 与 着 丝 粒 的 相对 距离 ， 随 着 分 析 数 目 
的 载 多， 定位 也 将 愈 精确 。 


了- 
二 村 


第 一 次 减 数 分 裂 


图 2-49 形成 外 梨 畸 险 瘤 的 假说 


此 施法 是 和 前 基 因 定位 的 特殊 分 析 方法 : 其 优点 是 通过 单一 
的 宿主 一 一 随 胞 痪 分 析 ， 便 能 知道 基 周 与 着 经 粒 间 的 距离 ， 但 不 
能 定位 与 着 丝 粒 相距 较 远 的 基因 。 

7. 近 端 着 丝 粒 染 色 体 分 析 琴 省 

要 想得到 一 个 完整 的 基因 图 ， 必 须知 道 基因 与 着 丝 粒 之 间 的 
距离 。 因 着 丝 粒 并 不 是 一 个 基因 ， 不 能 从 表 型 测 知 ， 故 三 点 测验 
是 无 法 达到 此 目的 的 。 在 某 些 植物 材料 〈 如 小 麦 ) 申 风 某 些 正常 
染色 体 在 着 丝 粒 附近 断 肥 形 成 异常 染色 体 ， 即 顶端 (或 近 端 六 着 
丝 粒 染 色 体 。 小 麦 有 42 条 染色 体 ， 目 前 已 获得 全 部 条 染色 体 的 
近 端 着 丝 粒 染色 体 。 agency 
基因 与 着 丝 粒 的 距 离 进 行 定 位 。 

将 带 隐 杜 基因 aa 的 近 端 着 丝 志 染 色 体 个 体 作 母 体 而 正常 
色 体 上 带 显 性 基因 于 A 的 个 体 作为 父 本 ， 二 者 杂交 后 得 到 基 条 带 
从 基因 的 正常 染色 体 和 一 条 带 a 基 因 的 近 端 着 丝 粒 染 色 体 的 | 杂 合 
个 体 ， 将 此 杂 合 体 作 父 本 再 与 携带 aa 双 隐 性 基因 的 母 本 同 交 史 如 


。270。 


果 未 发 生 交换 , 则 产生 图 2-50 中 四 与 @ 二 种 基因 型 的 后 代 ; 如 发 生 
交换 汪 则 新 产生 的 后 代 的 基因 型 为 图 2-50 中 的 @ 与 白 。 由 于 端 着 
丝 点 业 色 体 的 花粉 无 法 与 正常 花粉 竞争 ， 故 在 上 上述 实验 中 ， 只 存 
在 没有 发 生 交换 作用 的 后 代 Aa (图 中 的 @) 和 A 与 着 丝 粒 发 生 过 
鸡 换 的 后 代 aa( 图 中 的 @ )。 将 发 生 交 换 的 后 代数 目 除 以 总 后 代数 


WE 
而 5 一 
二 和 
A 与 着 丝 点 没 发 生 A 与 着 丝 点 发 生 交 5 
下 扫 要 和 a 区 作用 的 表现 型 了 
人 


四 二 a 
图 2-50 近 端 着 丝 点 染色 体 分 析 确 定 基因 与 着 丝 点 的 距离 


目 ， 人 

8 .四 分 体 分 析 

所 谓 四 分 体 〈tetrad) 分 析 ， 就 是 分 析 单 一 减 数 分 裂 后 所 形成 
的 四 个 单 倍 体 产 物 。 许 多 较 低 等 的 单 倍 体 生 物 均 能 产生 四 分 体 。 
由 于 四 分 体 是 单 倍 体 ， 不 存在 显 隐 性 的 问题 ， 基 因 型 可 直接 从 表 
型 得 知 ， 因 此 非常 适用 于 基因 定位 的 工作 。 通 过 对 四 分 体 分 析 ， 
我 们 不 仅 可 以 确定 基因 之 间 的 距离 ， 还 可 以 得 知 基因 与 着 丝 点 之 
间 的 距离 。 

〈1) 二 连锁 基因 的 定位 

此 法 与 二 点 测 交 的 原理 一 样 ， 但 不 需要 测 交 实 验 ， 而 只 需 分 
析 四 分 体 ， 即 可 推 知 重组 值 。 

十 国 2.55 天 见 ， 对 于 含 Ab 基因 的 二 条 同 源 双 价 染 包 体 及 全 


e 2ZTT。 


a、 引 基因 的 二 条 同 涯 双 价 染色 体 来 说 ,， 有 三 种 可 能 务 离 药方 式 三 
一 种 是 Ab、Ab、aB、aB 盖 即 亲 本 二 型 (PD)3 另 二 种 是 Ab, 凑巧: 
aB、ab， 这 是 由 于 二 条 染色 体 发 生 交换 的 结果 ， 即 下 型 T)， 还 


有 一 种 是 AB、AB、ab、ab， Ri 
和 化 果 ， 即 非 亲 本 二 型 (NPD)。. er 


8Tg YEg + aTg 二 已 Tg+ 生 合十 
+ 吕 pab. + 下 从 pab 合 pab 
arg T8f 二 
+ 攻 放 
员 ! 丙 上] 民 下 一 


2 
pah 
arg 上 Targ + 和 量 羡 + 

人 人 和 + 下 让 pab 

| arg 1， 。 - 
+ Dab papb 
二 
覆 沁 ) 节 本 | ditype(PD) (b) Tetratype( 双 ， 


《cj Nonpafent al _ditype( NPD) 


图 2-51 二 连锁 基因 的 四 分 体 分 析 。 chtamy elamonas 中 arE+ 
X+pab 所 产生 的 四 分 体 ，I 和 II 代表 二 次 减 数 分 列 


。 2ZT2。 


当 两 个 基因 的 标记 性 状 为 非 连锁 遗传 时 ， 则 PD 与 NPD 四 分 
体 前 比值 为 131， 而 两 个 基因 “〈 如 图 所 示 ) 为 连锁 遗 传 时 , 则 PD: 
NEDy1。 例 如 在 chlamy elamonas reinhardi 的 arg+ 与 +pab 
(这 里 Arg 为 精 氨 酸 需要 型 ，Pab 为 对 氨基 安 上 香 酸 需要 型 ) 的 杂 
交 中 ， 可 得 到 如 下 的 四 分 体 : 


PPD | NPD ，| T 
arg 十 arg bab arg 十 
ar7g 十 arg bab arg Pab 
上 +Pab 十 二 + 一 pab 
+ 三 ab 十 一 士 “十 
19 1 二 


总 数 ，191 
重组 值 可 根据 上 述 数 值 用 两 种 方法 推算 出 来 。 一 种 方法 是 将 
所 得 子 代 作为 个 体 来 分 析 。 这 样 共 191 个 四 分 体 , 则 有 4XI91 个 , 即 
764 个 子 代 细胞 ， 其 中 4 个 是 NPD 类 ， 全 是 重组 体 ，284 个 IT 类， 一 
半 是 重组 体 。 根 据 公 式 : 


RE 重组 子 代数 
总 子 代 数 
办 ” 
得 ， Rere'pee= 一 764 二 19.1% 


另 二 较为 简单 的 方法 是 将 四 分 体 作 为 一 个 整体 来 考虑 。 
利用 公式 : 
这 


NPDT+ 一 工 
0 
PDTNPD TI 
得 ， 
1 4 X* 7 平 
2 一 2 0 
一 19 19.106 


即 ，arg 与 pab 的 图 距 为 19.1 
根据 同 桩 的 原理 ， 可 以 进行 三 连锁 基因 的 定位 w 


5 总 六 


(27 基因 一 一 着 丝 粒 距离 的 测定 

四 分 体 分 析 的 一 个 特殊 用 途 便 是 测定 基因 二 二 

离 。 _ 般 情况 下 ， 同 源 染 色 体 的 着 丝 粒 分 离 总 是 发 征 在 第 一 次 减 : 

数 分 有 裂 时 期 。 如 果 基 因 b 离 着 丝 粒 非常 近 ， 则 b 将 在 第 一 次 分 裂 时 ， 

与 其 等 位 基因 相 分 离 , 产 生 的 四 分 体 均 是 + 寸 bb 的 四 分 体 避 然而 > 
如 果 基 因 b 离 着 丝 粒 较 远 ， 由 于 基因 b 与 着 丝 粒 点 闻 会 发 生 交换 ， 
第 二 次 分 裂 的 结果 将 产生 +b+b 的 分 离 四 分 体 。 因 为 每 次 交换 时 ， 
在 配对 的 双 价 染色 体 中 只 有 四 条 中 的 二 条 参加 了 交换 ， 所 以 基因 


与 着 丝 粕 间 的 重组 频率 是 分 离 四 分 体 出 现 频率 的 


十 述 重组 定位 技术 尚 有 许多 不 足 之 处 ， 例 如 -不同 遗传 因子 
的 重组 频率 是 不 同 的 ， 重 组 频率 受 环境 影响 换算 长 度 单位 时 不 
够 准确 ,必须 有 名 的 突变 体 ， 但 来 色 体 的 某 些 部 分 很 请 导 克 
变 ， 等 等 。 0 


(二 ) 家 系 分 析 CCPedigree studies) 


宁 示 分 析 定 位 是 高 区 生 物 非 常 有 效 的 基因 定位 方法 在 建立 
体 细胞 遗传 学 定位 方法 之 前 ， 吊 乳 动物 的 基因 定位 乡 是 用 此 法 完 
成 的 。 

1 .性 连锁 

RE 如 某 
_ 性 状 只 出 现在 雄性 中 ， 就 可 将 控制 此 性 状 的 基因 定位 在 Y 染 色 
体 上 ， 现 在 已 定位 在 Y 染 色 体 上 的 基因 是 相当 少 的 。 

因为 雄性 的 X 染 色 体 总 来 自 于 中 性 ，X 连 锁 的 最 明显 标志 ， 
不 存在 ， * 认 性 一 帮 性 ?的 传递 志 式 。 所 以 通过 传闻 方式 这 可 以 
定 ， 基 因 是 否 在 X 染 色 体 上 。 

? .基因 一 染色 体 连 锁 

局 过 闸 胃 标记 六 色 傈 与 基因 的 连 锁 关 系 ， 圾 以 将 基因 定位 
在 该 特定 的 染色 体 上 。 从 原理 上 说 ， 这 与 二 点 测 交 没有 什么 不 同 
之 处 ， 因 为 标记 的 染色 体 可 蛋 作 过 镇 群 中 的 一 个 入 信 阁 于 式 实 中 


*。21#。 


上 感 - 明 型 的 位 点 六 用 此 法 定位 在 人 常 染 色 条 上 的 第 一 个 基因 生 

en 
Daffy 血 型 是 单 基因 控制 的 位 点 ， 通 常 此 基因 是 fy* 和 fy"。 

5 细胞 学 观察 发 现 , 某 一 临床 正常 人 的 一 条 1 号 染色 体 的 长 臂 ， 

在 靠近 着 丝 粒 的 区 域 变 长 了 ， 进 一 步 的 研究 表明 此 区 域 变 长 不 是 

额外 染色 体 的 插入 引起 的 ， 而 可 能 是 DNA 双 螺旋 数 改 变 所 致 。 家 

系 分 析 证 明 ， 此 染色 体 结 梅 的 变化 是 遗传 的 。 由 图 2-52 所 示 的 家 

系 图 可 见 此 染色 体 异 常 的 Daffy 库 型 位 点 的 遗传 情况 4 与 此 同时 3 

另外 元 个 家 族 亦 有 类 似 的 情况 。 将 Dafty 血型 位 点 与 此 变化 区 域 

《将 此 变化 区 域 当 作 一 基因 位 点 处 理 ) 进行 遗传 分 析 时 证 明 , 二 兰 
办 由 此 ， 将” 省 可 基因 全 N 过 位 在 : 1 号 染 色 体 十 。 


口 O 无 变异 的 1 号 桨 名 休 

国 @ 变 异 的 1 号 染色 体 

: 国 “ 推测 含有 变异 的 4 号 染色 条 
+ 已 死 亡 

二 bl 报 六 四 bb 泛 / 直 7 让 先 现 浊 各 上 变异 的 1 号 

巢 色 


a/b a/b a/b 
图 2-52， 进 行 连锁 实验 的 窒 系 分 析 a、b 分 别 
代表 人 a 和 fy 等 位 基因 


3 .基因 一 基因 连锁 

对 于 实验 生物 来 说 ， 建 立 基因 一 基因 连锁 的 最 常用 方法 ， 是 
前 述 揭 二 点 乃 三 点 测 交 。 对 人 来 说 ; 票 建 立 基因 一 基因 连锁 ， 其 
原理 和 具 笨 方法 均 与 止 述 的 :Patty 血型 位 点 的 定位 一 致 。 具 是 用 
嚼 二 多 态 性 基因 蔡 代 了 标记 染色 体 上 的 拉 长 区 。 用 此 法 可 计算 出 
两 个 基因 间 的 交换 值 并 得 出 基因 间 的 相对 距离 。 

4. 杂 种 蛋白 质 的 氨基 酸 顺 序 分 析 定 位 
中 | 迁 传 分 析 表 明 ; 两 个 相 上 距 很 近 的 基因 位 点 ; 有 可 能 发 生 非 同 
源 配 对 和 不 等 交换 ， 从 而 产生 杂种 蛋 自 质 。 通 过 对 一 些 特 异 蛋 自 


e。 ZJ5 。 


质 氨 基 酸 序列 分 析 ， 可 以 间接 地 推测 基因 是 否 连锁 。 例 如 ， 分 析 
异常 血红 蛋白 tetpore 的 氨基 酸 顺 序 时 发 现 ， 此 蛋白 有 一 条 血红 蛋 
白 8 和 0 链 融 合 形成 的 杂种 链 。 由 此 推测 ， 决 定 8 和 6 链 的 基因 症 紧 
密 连 锁 的 。 另 一 种 异常 的 血红 蛋白 Kenya 有 一 条 5 和 Y 链 融 合 的 杂 
种 链 。 所 以 B、5, 和 Y 的 基因 很 可 能 是 紧密 连锁 的 。， 

5 连锁 不 平衡 的 分 析 定 位 

与 杂种 蛋白 的 氨基 酸 序列 分 析 一 样 ， 连 锁 不 平 衔 的 分 析 只 能 
间接 地 推测 出 基因 是 否 紧 密 连 锁 。 

在 某 一 群体 中 ， 每 一 性 状 的 出 现 频率 是 一 定 的 。 当 两 个 多 态 
性 状 同时 出 现 的 频率 远大 于 或 小 于 它们 单独 出 现 揭 频率 推测 值 
时 ， 就 可 以 推测 这 两 个 多 态 性 状 的 基因 座位 是 紧密 连锁 的 。 

连锁 不 平衡 意味 着 :二 个 通过 有 性 杂交 随机 分 布 的 基因 座位 ， 
多 代 没 有 分 离 。 

六 十 年 代 初 ，Boyer 等 根据 镰刀 型 血红 蛋白 基因 和 HbxA: 或 
B，* 基 因 的 连锁 不 平 街 现象 ， 推 断 8 和 60 球 蛋 白 基 因 是 紧密 连锁 的 。 
人 的 主要 组 织 相 容 性 复合 物 (MHC) 基因 定位 ， 主 要 是 用 此 法 完 . 
成 的 。 

确定 基因 一 基因 连锁 后 ， 便 可 问 续 地 将 某 _ 基 因 定位 在 一 特 
定 的 染色 体 上 。 例 如 已 知 c- 结 合 球 蛋白 基因 是 在 16 号 染色 体 上 ， 
现 测 知 LCAT ( 卯 磷脂 、 嚼 人 当 醇 酰基 转移 酶 ) 基因 与 之 连锁 ， 就 
可 知 LCAT 基 因 也 是 在 16 号 染色 体 上 。 


(三 ) 非 整 倍 体 定 莹 


利用 非 整 倍 体 可 有 两 种 不 同 的 定位 方法 。 一 是 经 典 的 非 整 信 
体 分 析 定 位 ， 它 是 通过 计数 非 整 倍 体 与 正常 个 体 杂 交 后 的 后 代 分 
离 比 来 定位 基因 的 。 另 一 类 定位 方法 是 用 酶 作 标记 ， 测 定 非 整 倍 
体 杂 合子 后 代 中 的 等 位 剂量 ， 从 而 定位 酶 基因 。 

1. 非 整 倍 体 分 析 定 位 法 

许多 植物 的 基因 定位 是 用 非 整 倍 体 分 析 完 成 的 : 非 整 倍 体 包 
括 单 体 、 缺 体 和 三 体 。 由 于 二 倍 体 植物 中 , 单 体 和 缺 体 无 法 存活 ， 


-216。 


ee 
门 4 于 
届 5 


-所 以 单 体 、 缺 体 的 分 析 上 只 适用 于 诸如 小 麦 、 烟草 之 类 的 多 倍 体 村 


物 ， 耐 机 时 于 半 信 优生 相同 基因 层 信 < 
(1) 单 体 分 析 3 
单 体 (2n. 1) 是 指正 党 的 双 体 (2n) 中 ， 少 了 一 条 染色 体 。 用 


- 单 体 分 析 法 定位 基因 时 ， 首 先 要 得 到 -- 一 整套 单 体 材 料 。 如 小 考 


1(2n542) 中 现 有 231 个 单 体 材料 ,而 则 这 些 材料 都 易于 保存 。 


如 果 是 隐 性 基因 的 定位 ， 则 将 带 隐 性 基因 的 个 体 分 别 与 带 显 


,性 基因 的 整套 单 体 杂 交 。 如 果 Fi 代 出 现 的 隐 性 个 体 均 为 单 体 ， 而 


显 性 个 体 均 为 正常 的 双 体 ,并 且 PFi 单 体 自 交 所 得 的 Ex 几 乎 100 久 为 
隐 性 ， 而 Ri: 双 体 自 交 后 却 出 现 3:1 的 显 隐 性 比 时 ， 则 可 将 待 测 的 
基因 定位 在 此 杂交 组 合 所 含有 的 单 体 染 色 体 上 。 现 略 加 说 明 如 
下 : 

假定 在 小 麦 中 发 现 带 有 a 的 隐 性 基因 植株 ， 并 需 将 a 基 因 定 位 
在 特定 的 染色 体 上 时 ,可 将 此 带 隐 性 基因 a 的 正常 双 体 小 麦 与 21 个 
单 体 逐个 进行 杂交 ， 结 果 将 有 两 种 情况 。 

一 是 正确 的 交配 ,就 是 说 欲 定位 的 基因 恰好 在 所 测试 的 单 体 


的 巡 色 体 上 ， 如 图 2-583 所 示 。 


| 
20n 一 工人 个 体 


je， 


[一 双 体 ! DR 242 1 


P wm 


单 体 


| 


73% ; 


oi| 二 到 | 关 > 人 


缺 体 / ) 3% 
图 2-53 正确 交配 法 的 单 体 定 位 


e 2T7 2 


结果 Fi 中; 单 体 植物 全 为 隐 性 二 其 单价 染色 体 均 来 自 隐 往 的 父 
本 ) , 双 体 植物 全 为 显 杜 囚 合子 。F ;的 单 体 自 交 时 ,所 得 FF 仍 全 为 
隐 人 性， 而 Fi 杂 合 双 体 自 交 所 得 F:, 中 ， 显 隐 性 分 离 比 为 3:1。 

需要 说 明 的 是 图 2-53 中 ， 巨 , 单 体 自 交 之 所 以 出 现 单 体 73%， 
双 体 24% ， 缺 体 3% 的 比例 ,是 因为 单 体 在 减 数 分 裂 时 可 形成 6 和 
n ~- 1 两 种 配子 。 根 据 正 常 双 体 小 麦 与 单 体 小 麦 的 正 反 交 测 定 知 
道 ，n 和 ma- 1 的 几 配 子 传递 率 是 不 同 的 。n=~1 卵 的 传递 率 平均 为 
75 闻 ，a 负 细胞 为 25%， 而 mn 1 礁 配 子 传递 率 平 均 为 45， " 奴 本 
子 为 96 又 (其 下 示 ) 。 


雄 配子 本 言 刘 和合 慰 雪 寄 
肉 配 子 960% 4% 
必 2 2n-1 
n_254 240 10% 
IE 站 证 DY 二 人 
加 0 
n -1 75 儿 3% 


另 一 种 结果 是 非 正 确 交 配 所 致 ,， 叮 谓 非 正确 交配 是 指 欲 定位 
的 基因 不 位 于 所 测试 的 单 体 染 色 体 上 。 此 交配 的 结果 是 Fi 不 论 是 
单 体 或 双 体 ， 其 表 型 均 显 性 ， 而 Fi 单 体 或 双 体 自 交 所 得 的 F，。, 均 
出 现 3:1 的 分 离 比 。 

如 果 待 定位 的 基因 是 显 性 基因 ， 则 将 带 此 显 性 基因 的 植株 作 
父 本 ， 分 别 与 具 隐 性 基因 的 21 个 单 体 杂 交 。 如 果 Fi 代 的 单 体 植株 ， 
自 交 所 得 的 F, 基 本 上 为 显 性 个 体 , 而 Fi 的 双 体 自 交 所 得 的 FE 出 现 
3:1 的 显 隐 性 分 离 的 话 ， 则 可 将 该 基因 定位 在 测试 的 单 体 上。 如 
果 F1 单 体 和 双 体 的 自 交 后 代 均 出 现 3:1 的 显 隐 性 分 离 ， 则 表明 该 
基因 不 在 所 测试 的 单 体 上 。 

(2) 缺 体 分 本 

才 一 对 同和 何人 人 区 二 人 Con-。 则 音信 
体 暑 料 。 


e 世 。 


入 


@ 隐 性 基因 分 析 
用 一 隐 性 纯 合 小 麦 个体 ， 分 别 与 21 个 小 麦 缺 体 交配 ， 如 下 1 单 


体 是 隐 性 的 ， 便 可 将 该 基因 定位 在 此 负 失 的 染色 体 上 上 。 假 定 某 一 
隐 性 基因 为 a， 带 此 双 隐 性 基因 a 的 个 体 与 21 个 缺 体 杂交 时 ， 将 有 


两 种 结果 ， 如 果 Fl 代 全 为 隐 竹 ,说 明 a 基 因 正 好 位 于 该 缺 体 所 缺 的 
染色 体 上 ;如 果 F; 代 全 表现 为 显 伍 人 性 状 , 则 表明 a 基 因 不 在 该 缺 体 
所 缺 染色 体 上 。 

四 显 性 基因 分 析 

用 显 性 纯 合 个 体 与 所 有 21 个 缺 体 材 料 杂 交 ， 然 后 将 Fi: 的 单 体 
自 交 ， 如 果 后 代 的 97 双 为 显 性 ”而 具有 3% 为 隐 性 ? 则 此 基因 就 可 


和 定位 在 该 缺 体 所 缺 的 染色 体 上 3; 但 如 果 Fi 单 体 的 自 交 后 代为 3:1 的 


显 隐 人 性 分 离 比 ， 则 此 基因 就 不 在 此 缺 体 所 缺 的 染色 体 上 。 
四 隐 性 基因 在 单 剂 量 时 不 表现 其 性 状 

”由 性 基因 在 单 剂 量 时 不 表现 其 性 状 是 指 : 当 某 一 隐 性 基因 单 
独 存在 时 ， 无 论 显 性 基因 存在 与 否 ， 均 不 表现 隐 性 基因 的 性 状 。 
例如 根据 小 麦 单 体 n 一 1，n 肉 雄 配 子 的 传递 频率 ,可 推测 出 ,用 双 隐 
性 双 体 与 显 性 缺 体 杂交 所 得 的 Pi: 单 体 自 交 时 ， 所 得 的 FE: 将 是 737 
单 体 ，3% 缺 体 和 24% 双 体 。 在 正常 交配 时 ， 单 体 、 缺 体 均 为 显 
性 性 状 ， 双 体 为 隐 性 性 状 ， 而 在 不 正常 交配 时 ， 其 双 体 、 单 体 、 
缺 体 均 呈 现 3: 的 显 隐 性 比 。 换 句 话 来 说 ,如 双 隐 性 双 体 与 显 性 缺 
体 杂 交 所 得 Fi 单 体 的 自 交 F: 中 ， 单 体 、 缺 体 均 为 显 性 性 状 , 则 此 
基因 就 可 定位 在 该 缺 你 所 缺 的 染色 体 上 上， 但 如 果 其 双 体 、 单 体 、 


缺 体 鸥 呈现 3:1 的 显 隐 性 比 , 则 可 断定 ， 此 基因 不 在 此 缺 体 所 缺 的 


染色 体 上 。 

(3) 三 体 分 析 
三 体 分 为 初级 三 体 ， 次 级 三 体 , 三 级 三 体 及 近 端 着 丝 点 三 体 。 
通过 对 它们 的 分 析 可 将 基因 定位 于 某 一 染色 体 ， 甚 至 染色 体 的 特 
定 片 段 上 ， 现 简 述 如 下 ， 

二 初级 三 体 分 析 

初级 三 体 是 指正 常 粱 色 体 组 中 多 了 一 条 与 某 对 染色 体 同 源 的 


ae LTJT9。， 


染色 体 。 三 体 在 作 母 本 或 父 本 时 分 离 比 率 不 同 。 以 三 福 为 初 , 当 
作 母 本 时 ， 配 子 的 比率 为 1AA:2Aa:2A:la; 用 作 父 示 时， 由 于 、 
n+ 1 的 雄 配子 通常 不 能 存活 故 其 配子 比 为 2A:1a。 若 A 对 a 是 完全 
显 性 ， 则 此 三 体 自 交 后 的 表 型 比率 将 是 17A:la， 如 下 表 所 示 : 


雄 配 子 瞧 配 子 1AA 2Aa 2A 1a 
2A 2AAA 4AAa 4AA 2Aa : 


18 1AAa “2Aaa 2Aa - 1aa 


由 于 三 价 体 肉 配子 之 中 有 一 条 往往 会 在 减 数 分 弄 过 程 中 丢失 ,六 
以 实际 观察 到 的 分 离 比 常常 不 同 于 期 望 的 分 离 比 。 一 全 二 三 
在 应 用 补 级 三 体 决定 基因 与 染色 体 的 关系 时 可 作 如 下 处 理 ， 
将 双 隐 性 突变 体 分 别 与 所 有 的 三 体 逐 个 杂交 ，Fi 初 级 三 体 自 交 或 
与 隐 性 亲本 回 交 ， 然 后 检测 F: 代 或 画 交 后 代 的 显 隐 性 分 离 比 。 如 
果 所 得 的 自 交 或 测 交 后 代 的 显 隐 福 为 3:1 或 1:1I 时 ， 则 证 明 此 基因 
不 位 于 新 测试 的 三 体 上 ,如 果 自 交 或 测 交 的 分 离 比 不 是 3:1 或 1:1， 
则 就 可 将 此 基因 定位 在 此 杂交 组 合 的 三 体 染 色 体 上 。 ”和 
@ 次 级 三 体 分 析 
次 级 染色 体 三 体 又 称 同 辟 染色体 三 体 ， 即 所 增加 的 妆 色 体 是 


同 辟 染色体。 如 图 于 2 用 它 来 定位 时 ， 可 将 双 隐 性 二 售 体 与 三 显 


性 尝 三 体 杂交 ， 所 得 Fi 自 交 后 代 中 ， 如 双 体 显 隐 比 为 351 而 三 体 
全 为 显 性 性 状 ; 测 交 后 代 双 体 的 显 隐 比 为 1:1, 而 三 体 全 为 最 性 性 
状 时 ， 就 可 将 此 基因 定位 在 所 测试 的 次 级 染色 体 申 。: 但 由 于 同 辟 
aaiggiaietiadkwiiey 
ra 
三 级 三 体 分 析 

村 四 和 总 福 站 半 尖 的 二 的 包 作 记 ER 肌 生生 

体 分 析 方 法 确定 该 基因 在 此 染色 体 的 哪 一 条 臂 上 。 


e ZLZZ0。 


时 
二 
e、 


1 了 三 级 三 体 所 增加 的 染色 体 为 一 易 位 的 染色 体 。 由 于 易 位 染色 
体 本 身 有 部 分 铅 失 ， 任何 只 含 三 级 三 体 染色 体 而 不 含 正常 染色 体 
的 配子 是 不 能 存活 的 。 在 用 三 级 三 体 分 析 定 位 基因 时 ， 先 用 双 隐 
性 个 体 与 所 有 的 三 级 三 体 杂 交 ， 再 将 Ri 三 级 三 体 自 交 或 与 隐 性 素 
本 回 交 ; 统计 B; 或 回 交 后 代 中 三 级 三 体 的 表 型 。 如 果 P; 或 回 交 后 


了 


0 A- 一 
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由 DEFEo2n -3A:1aa 测 交 后 代 ;2n 1Aailaa 
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2n 十 上 3A-:1aa 2n 十 1 1A_-:1l1aa 
”三 级 三 体 三 级 三 体 


， 虱 2-54 ”三 级 三 体 分 析 定 位 
ai 表示 正 稀 的 配对 ,, 即 待定 位 的 基因 在 此 三 级 三 体 的 易 位 染色 体 忌 
二 
b: 表 示 不 正确 的 配对 , 即 待定 位 的 基因 不 在 此 三 级 三 体 的 易 位 染色 体 民 


e 22T。 


全 
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相 
全 


代 的 三 级 三 体 全 为 显 性 ， 则 表明 该 基因 必定 位 于 该 易 位 染色体 的 
臂 上 。 反 之 ， 如 果 了 :或 回 交 后 代 的 三 级 三 体 中 显 隐 性 比 为 3:1 或 
1:1， 则 证 明 该 基因 不 在 该 染色 体 的 臂 上 。 ( 见 图 2-54) 、 

外 顶端 着 丝 点 三 体 分 析 定 位 

顶端 着 丝 点 三 体 是 指 增加 的 一 条 染色 体 为 顶端 着 丝 点 妆 人 色 : 
体 ， 此 分 析 法 亦 可 将 基因 定位 在 某 一 特定 染色 体 的 哪 一 条 染色 体 
辟 上 。 现 简 述 如 下 ; 


双 隐 性 正常 双 体 与 整套 的 顶端 着 丝 点 三 体 杂交 后 ;所 得 Fi 顶 


端 着 丝 点 三 体 进 行 自 交 或 与 双 隐 性 亲本 回 交 。 如 果 PF， 的 双 体 显 隐 


-性 比 为 3:1， 三 体 的 显 隐 性 比 也 为 3:1 时 ， 就 表明 待定 位 的 基因 不 


在 这 个 顶端 着 丝 点 三 体 的 额外 染色 体 臂 上 。 如 果 F， 的 双 体 中 ， 显 
隐 比 为 3:1， 而 三 体 全 为 显 性 ; 回 交 后 代 的 双 体 中 显 隐 比 为 1:1， 
而 三 体 全 为 显 性 时 , 则 此 基因 就 可 定位 在 顶端 着 丝 点 的 染色 体 上 。 
进一步 观察 此 顶端 着 丝 点 是 长 臂 还 是 短 臂 ， 便 可 确定 此 基因 在 哪 
一 条 劈 上 。 

2 . 非 整 倍 体 剂量 定位 

大 多 数 酶 的 基因 位 点 是 共 显 性 的 ， 每 个 等 位 基因 所 产生 的 酶 
量 也 可 以 定量 测定 ， 因 此 可 以 进行 非 整 倍 体 剂量 定位 。 

(1) 三 体 剂量 定位 

在 许多 情况 下 ， 只 需要 对 由 一 系列 三 体 个 体 与 正常 个 体 杂交 


”所 得 的 后 代 进 行 简单 的 分 析 ， 便 能 将 酶 基因 定位 在 特定 的 染色 体 


上 ， 与 杀 典 的 三 体 分 析 相 比 ， 不 仅 节省 了 大 量 的 时 间 ， 而 且 可 以 
缩减 所 需 检测 的 个 体 数 目 。 

前 面 说 过 ， 三 体 包 括 初级 三 体 、 次 级 三 体 、 三 级 三 体 及 顶端 
着 丝 粒 三 体 ， 现 以 初级 三 体 为 例 来 加 以 说 明 。 

同 经 典 的 三 体 分 析 定 位 一 样 ， 进 行 三 体 剂量 定位 时 ， 首 先 也 
是 将 合适 基因 型 的 二 倍 体 个 体 作 母体 ， 并 和 整套 的 三 体 ( 作 父 本 ) 
逐个 杂交 ， 如 果 待 定位 的 酶 基因 正好 在 所 测试 的 三 体 止 ， 则 分 析 
Fi 代 中 三 体 个 体 的 酶 剂量 就 可 以 得 知 。 用 此 方法 已 定位 了 不 少 的 
基因 。 人 3 
。 222 。 


(2) 单 体 、 缺 体 和 其它 非 整 倍 体 剂量 定位 

多 倍 体 植物 的 基因 定位 ， 主 要 是 用 三 体 之 外 的 非 整 倍 体 基 因 
剂量 定位 来 完成 的 ; 在 六 倍 体 的 小 麦 中 ,利用 每 一 条 染色 体 均 含 
0 到 二 的 系列 材料 交 检 测 这 些 非 整 倍 体 奢 料 中 某 一 特定 的 酶 是 否 
存在 , 从 而 将 编码 酶 的 基因 定位 在 特定 染色 体 上 。 

在 异 源 多 倍 体 的 烟草 (Nicotiana tobacum) 中 ， 利 用 从 单 体 植 
株 的 花粉 培养 获得 的 缺 体 作 为 材料 ， 通 过 酶 剂量 分 析 ， 便 可 定位 
酶 的 编码 基因 。 


(四 ) 细 胞 学 定位 (Cytological mapping) 


当 细 胞 学 观察 的 染色 体 异 常 与 某 一 基因 所 表达 的 异常 同时 出 
现时 ， 此 基因 就 可 定位 于 这 一 染色 体 的 异常 区 。 此 法 一 般 用 于 对 
果 蝇 和 哺乳 动物 的 基因 定位 。 

工 .缺陷 定位 

果 蝇 在 纯 合 子 或 半 合 子 的 条 件 下 , 绝 大 多 数 缺 陷 型 是 致死 的 ， 

所 以 缺陷 型 只 能 在 杂 合 子 的 果 蝇 中 存在 。 若 果 蝇 的 一 条 奖 色 体 有 
缺 哆 ， 而 同 源 染色 体 的 同一 位 点 上 是 隐 性 非 致死 的 突变 ， 则 此 隐 
性 突变 就 会 表现 出 来 。 此 现象 被 称 为 假 显 性 。 这 样 便 可 以 将 缺陷 
的 位 点 与 遗传 标记 基因 联系 起 来 。 
志 友 缺陷 定位 的 二 个 例子 是 果 蝇 染色 体 的 分 析 图 2-55a 是 多 线 x 染 
色 体 的 非 着 丝 粒 末 端 。 若 果 蝇 扒 有 末端 缺陷 的 X 染 色 体 , 则 其 多 丝 
染色 体 如 图 2-55b 和 c 所 示 。 正 常 X 染 色 体 在 此 部 分 含有 一 系列 带 
状 结构 ， 按 透视 作 图 法 可 知 缺 陷 型 的 结构 。 

从 图 中 可 见 (b) 染 色 体 缺少 正常 当 人 双 体 (a) 中 当 现 的 一 条 
206 一 1( 见 图 2-55a)5 7 用 带 有 隐 性 标记 的 y (黄体 六 ac (影响 体 
节 数 目 ) 、 和 sc (影响 小 盾 紧 形成 ) 的 果 蝇 与 此 缺陷 体 杂 交 构 戈 
杂 人 台子 所 有 的 三 隐 性 基因 均 能 表达 , 故 可 将 此 三 基因 定位 于 此 
染色 体 末 端 寺 当 此 突变 体 与 图 2-55c 所 示 的 缺陷 体 (图 2-55a 中 所 
用 片段 206 一 2 表示 的 八条 带 缺 失 庆 构成 杂 合 子 时 ， 只 有 y 和 ac 表 
达 ， 因 此 可 将 sc 基因 定位 在 (c) 染 色 体 上 而 (b) 染色 体 中 不 存在 的 


9 人 克 


到 二 “二 ET 


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儿 条 带 上 上 。 
“2 .病毒 影响 定位 

某 显 病毒 能 使 特 染 色 体 区 域 产生 持久 的 雪 型 变 伦 。 储 关 由 
腺 病毒 -12 产 生 的 大 的 第 1 和 17 号 染色 体 的 变化 /次 似 耶 昆 虎 和 
某 些 其 它 生物 染色 体 上 上 观察 到 前 “疏松 ”(Puffing 刀 这 些 变 化 区 域 
代表 了 激活 的 基因 位 点 六 主要 是 与 核酸 有 关 的 激酶 。 用 体 细胞 杂 
Joanthhuonsgnonynisdeponot 
激 梅 前 位 点 在 此 变化 的 区 域 。 


,A5,6B1 23.43.6 5， 6 B1 2;3. 


(b) (e) 
图 2=55 缺陷 定位 ， Ca 正常 果 蝇 的 和 多 线 染 色 体 言 〈《o9 相 (c) 缺 陷 
杂 合子 的 X 多 线 染色 体 。 
3. 基 因 剂 量 定 位 


利用 基因 剂量 数 应 来 定位 可 分 为 两 类 ， 即 质量 剂量 效应 定位 


和 数量 剂量 效应 定位 。 所 谓 质量 剂量 效应 定位 是 通过 对 等 位 基因 
的 数目 与 其 表达 产物 的 关系 的 比较 来 定位 基因 + 数量 基因 效应 定 
Airport 
(1) 质量 剂量 效应 定位 
此 方法 主要 依据 以 下 的 假说 : 同时 出 现 的 罕 苑 的 遗传 现象 常 
常 是 相关 的 * 如 果 某 一 个 体 , 应 有 的 两 个 不 同等 位 基因 位 点 申 ， 只 


发 现 一 个 等 位 基因 ， 而 同时 此 个 体 中 有 染色 体 的 缺失 我 们 就 可 


将 此 位 点 定位 在 此 缺失 的 片 眉 之 中 。 当然 一 这 里 必须 小 尼 地 排除 
另外 一 种 可 能 ， 即 出 现 单一 的 等 位 基因 并 非 由 于 候 失 ， 而 是 由 于 
此 基因 位 氮 含 有 一 个 不 起 作用 的 等 位 基因 。 :32 下 中 车 国 


5 Z24 5 


我们 还 可 以 从 另 二 个 角度 来 利用 质量 剂量 效应 的 定位 方法 。 
车 某 仙 天 个 体 中 有 二 异 质 位 点 ， 则 此 异 质 位 点 显然 不 在 缺失 区 。- 
这 种 排除 定位 (exclasion mapping) 对 检测 基因 是 否 连 锁 是 很 有 用 
的 < 通过 排除 基因 在 一 定位 点 的 可 能 性 ， 可 以 将 此 基因 定位 在 下 
确 的 位 置 上 。 

-种 特殊 前 质 量 剂量 方法 可 以 用 来 定位 X 染 色 体 圭 的 基因 ,此 
定位 的 原理 基于 如 下 撮 假 设 ， 即 遗传 异 质 的 雌性 个 体 六 在 任何 一 
个 体 细胞 或 由 其 衍生 而 来 的 无 性 后 代 中 ， 只 有 一 条 X 染色 体 是 有 - 
活性 的 。 例 如 :有 一 府 鸭 叭 性 化 患者 , 当 追 踪 其 家 系 时 ,发 现 患者 的 
母亲 在 和 皖 丸 肉 性 化 基因 (二 氢 皖 丸 酮 受 体 基因 ) 位 点 上 是 异 质 的 5 
进一步 的 检测 发 现 ， 从 患者 母亲 来 源 的 二 个 细胞 群 中 ;一 个 细胞 
群 具有 二 氨 这 丸 酮 受 体 ， 另 一 个 不 具有 。 这 样 就 排除 了 此 性 状 是 
由 染色 体 显 性 基因 控制 的 可 能 性 ， 从 而 将 其 定位 在 X 染 色 体 上 。 

(2) 数量 剂量 效应 

利用 数量 剂量 效应 来 进行 基因 定位 是 基于 如 王 的 假定 ; 基因 
表达 的 量 与 此 基因 的 拷贝 数 成 正比 。 已 用 此 方法 定位 了 不 少 基 因 有 8 
例如 在 人 的 2 号 染色 体 三 体 的 部 分 细胞 中 ， 观 察 到 酸性 磷酸 酥 酶 2 
的 量 增 多， 从 而 将 此 基因 定位 在 2 号 染色 体 上 。 但 是 用 此 方法 定位 
的 基因 ， 还 需 用 其 它 的 方法 加 以 验证 。 


(五 ) 体 细胞 杂种 定位 


素 缘 关系 较 远 的 动物 或 植物 细胞 融合 后 ， 往 往 会 出 现 染 色 硒 
丢失 的 现象 。 二 般 说 来 ， 总 是 某 一 方 的 染色体 容易 丢失 ， 特 别 是 
在 大 二 一 鼠 杂 种 细胞 中 ， 常 专 一 性 地 丢失 人 的 染色 体 。 目前 已 发 
现 甚 它 种 类 的 许多 体 细 胞 杂种 ， 也 有 专 一 性 地 丢失 二 种 亲本 染色 
体 前 更 象 ， 这 为 基因 定位 工作 带 来 了 许多 方便 。 估 及 哺乳 动物 的 
许多 基因 就 是 用 此 方法 定位 的 。 

夺 . 同 线性 测验 CSynteny Testing) 

连锁 (Linkage) 最 早 是 指 减 数 分 裂 时 非 随 机 分 离 的 类 群 ,后 
来 也 用 于 将 基因 定位 在 性 染色 体 〈X 一 连锁 ) 或 常 薪 色 体 上 ,( 常 


e 225。 


染色 栖 连 钱 )。Renwick(1969) 建议 用 同 线性 《Syantenta)1 来 描述 


同一 条 染色 体 上 的 基因 间 关 系 。 这 些 基因 无 需 用 减 数 分 虱 重组 值 : 


来 表明 连锁 。 


同 线性 实验 基于 如 下 的 假设 。 在 杂种 细胞 中 ,位 于 同 二 染色 
体 上 的 基因 将 同时 出 现 或 消失 。 在 染色 体 分 辨 技术 建立 前 ,通过 


对 杂种 细胞 袜 中 ， 不 同 基因 共同 册 现 或 消失 的 观察 已 确定 了 不 少 


的 同 线性 群 。 如 果 一 个 基因 被 定位 在 菜 一 案 色 体 士 ” 则 与 此 基因 


同一 线性 群 笃 其 它 基因 也 可 被 定位 在 此 染色 体 上 上。 但 由 也 体 细 胞 . 
杂种 中 ， 广 泛 存 在 着 染色 体重 排 的 现象 ， 所 味香 居 儿 多 本 格 种 束 
同 线性 测验 的 结果 加 以 检验 。 

2. 选 择 定 位 拥 
” 荐 喘 此 动 临 一 一 大 散 杂 种 颖 胞 征 往 能 第 一 个 人 前 基因 TKd 
胸腺 喀 啶 激 本 基 因 ) ,就 是 通过 选择 定位 来 完成 的 3 8 

TE&( 胸 腺 旷 啶 激酶 缺陷 型 ) 的 小 鼠 与 大 的 体 细胞 杂交 后 ， 兴 
HDI 《次 黄 螺 叭 ,氨基 哇 叭 ， 胸 腺 喀 啶 ) 培 养 基 中 选择 杂种 细胞 ， 
由 于 IIK&- 细 胞 不 能 在 含 HAT 的 培养 基 中 生存 ， 故 存活 的 杂种 细胞 
一 定 含 有 人 的 TK 基 因 。 选 择 出 来 的 杂种 细胞 培养 用 代 后 ? 绝 大 多 
数 只 剩 下 一 条 人 的 染色 体 ， 鉴 定 证 明 剩 下 的 这 条 娄 色 体 是 大 的 切 
号 染色 体 ， 而 且 还 发 现 ，17 号 染色 体 丢 失 时 >ITK 基 因 迹 不 表达 站 
由 此 将 TK 基 因 定 位 在 17 号 染色 体 上 。 

由 于 非 选 择 标记 北 基 因 ， 可 与 其 同 线性 的 选择 性 标记 基因 夫 
同 保留 或 消失 ， 所 以 选择 定位 的 方法 可 以 闻 接 地 对 非 选择 标记 基 
因 定位 。 在 以 TK 为 选择 压力 下 ,- 半 乳 糖苷 激酶 汪 TK 基 因 同 时 ,出 
现 ， 而 去 掉 对 了 KK 的 选择 压力 + 两 者 便 同 时 消失 ss 
背 激 酶 基因 定位 在 17 号 染色 体 上 。 

负 选 择 同样 可 用 于 基因 定位 ，Creagan 等 619757) 对 自 唤 毒 
素 敏 感 基因 定 了 位 。 实 验 发 现 ， 在 月 喉 毒 素 处 理 的 频率 较 高 二 而 
毒素 处 理 后 ， 存活 的 杂种 细胞 全 部 雪 关 了 5 号 染色 体 。 人 
毒素 敏感 基因 乍 位 在 5 号 染色 体 上 。 让 

3. 易 位 定位 


ee ZL6。， 


。 易 位 业 色 体 可 通过 染色 体 的 长 度 和 带 型 的 改变 识别 出 来 。 如 
图 2-56a 中 一 大 段 和 染色 体 易 位 到 了 第 14 号 染色 体 上 。 当 杂种 细胞 
丢 天 了 此 易 位 染色 体 时 ,Hgprt( 酶 HGPRT)Pgk.( 得 酸 肯 油 激酶 )， 


G6Pd. (6 一 磷酸 殴 糖 脱氧 酶 )》 和 Np ( 核 霸 磷酸 激酶 ) 等 便 不 能 表 


达 。 已 知 位 于 和 染色 体 上 ， 后 一 标记 在 14 号 染色 体 上 ， 据 此 可 以 推 


知 7 前 三 个 基因 位 点 是 在 X 染 色 体 qis 带 以 远 的 片段 内 。 


(hb) 1 


图 2-56: a 为 易 位 .b 为 缺失 


”全 失 定位 - 


图 2-- 56b 中 ,一 未 种 细胞 系 于 失 了 间 色 体 9 . 带 必 远 的 片 肛 ， 


这 个 细胞 系 能 表达 大 的 PgK 基 因 ， 但 缺失 了 Hgprt 和 G6F6 标 记 ， 


将 此 结果 与 上 面 的 易 位 定位 所 得 的 结果 比较 ， 就 可 知 PgK 基 因 位 


点 在 dfs 与 qz4 带 之 间 ， 而 五 8prt 和 G6Fd 则 位 于 qs 4 可 束 汪 让 和 6 


5. 蛋 蝗 质 的 分 析 定 位 
此 方法 是 把 杂种 细胞 中 多 余 药 一 -条 染色 体 与 蛋白 质 凝 胶 电 沪 


委 合 起 来 分 析 。 例 如 Cox 等 制备 了 一 对 人 一 一 鼠 杂 种 细胞 系 ， 其 


中 兰 不 杂种 细 晒 系 比 嚼 一 个 多 了 二 条 大 的 X 染 色 体 ， 分 别提 取 此 


-两 各 末 种 细胞 药 蛋 白质 ， 二 龙 被 凝 胶 电 汶 的 结果 ， 发 现 人 染色 
- 体 的 杂种 细胞 多 五 种 蛋白 质 , 经 鉴定 其 中 两 种 为 G6PD 和 HGPRT。 


和 Z2O7 


这 样 便 将 G6PD 和 HGPRT 定 位 在 人 的 X 染 色 体 上 。 

6. 点 杂交 定位 

上 述 的 杂种 细胞 定位 方法 ,只 适用 于 在 培养 细胞 中 能 够 表达 ， 
并 且 能 通过 表 型 实验 测 出 来 的 那些 基因 定位 。 但 并 不 是 所 有 的 情 
剖 均 是 如 此 ， 例 如 血红 蛋白 的 基因 。 

点 杂交 的 方法 即 可 为 这 类 基因 定位 。 例 如 用 克隆 的 人 8 一 球 
蛋白 的 DNA 作 探 针 ， 与 含有 人 的 各 种 桨 色 体 的 杂种 细胞 杂交 ， 发 
现 只 有 含 11 号 染色 体 的 杂种 细胞 为 杂交 阳性 反应 ， 这 样 便 将 此 基 
因 定 位 在 人 的 11 号 染色 体 上 。 

证 


Eee sea， La 


和 人 


_ 卫 .Housman 等 用 只 含 11 号 染色 体 的 Cho 细 胞 系 作 原始 材料 ,， 
诱 变 处 理 后 ， 选 出 了 5 个 亚 克 隆 ,这 些 亚 克 隆 分 别 丢 失 了 11 号 染色 
体 上 不 局 片段 ， 然 后 从 这 5 个 亚 克 降 中 分 离 PDNA， 用 上 述 的 人 8- 
球 蛋 白 DNA 作 探 针 杂交 ， 发 现 其 中 三 个 亚 克 隆 的 DNA 杂 交 为 阳 
性 反应 ， 其 它 二 个 亚 克 隆 为 阴性 反应 ， 经 与 这 些 亚 克 隆 的 染色 体 
缺失 片段 相 比 较 ， 便 可 将 8 一 球 蛋 白 基 因 定 位 在 一 个 小 片段 内 。 

随 着 克隆 DNA 技 术 的 发 展 ， 克 噬 的 基因 不 断 增多 ， 定 位 的 基 
因 也 愈 来 愈 多 ， 从 原理 上 说 这 种 方法 同样 适用 于 其 它 生物 材料 的 
基因 定位 。 

7.Southein blot 定 位 

点 杂交 定位 基因 的 方法 依赖 于 基因 探 针 的 特异 性 ,如果 受 体 
细胞 PNA 中 ， 有 与 此 探 针 间 源 的 序列 ， 即 不 适用 此 法 。 这 时 可 以 
利用 杂种 细胞 中 ,两 亲本 的 DNA 在 此 基因 位 点 或 其 周围 的 限制 性 
内 切 酶 位 点 的 差异 〈 见 前 面 遗 传 重组 值 定 位 的 了 RELPS 定位 ) 汕 
Southern blot 技 术 来 解决 。 将 小 鼠 的 。 和 和 重 链 复 合 物 基 因 分别 
定位 在 6.18， 和 12 号 染色 体 上 的 。 

8. 利 用 放射 性 处 理 细胞 来 定位 。 

Goss 等 用 适量 的 + 一 射线 处 理 人 的 正常 二 倍 体 体 细胞 ,然后 将 
这 些 细 胞 立即 与 小 鼠 HGERI 细 胞 融合 ， 在 EAI 选择 培养 基 上 ,从 
的 HGPRT 基 因 将 被 选择 ,由 于 已 知 HGPRT 是 在 X 间 色 体 上 ,所 以 昌 
染色 体 的 其 它 基 因 能 否 保留 在 杂种 细胞 中 取决 于 二 个 因素 ;了 业 . 此 


228。 


wa 。 


证 CergroteAOPAOGCLS ri 


下 TS -二 TREE 本 人 节 全 一 一 一 本 


区 5 下 于 


基因 位 点 与 HGERT 位 点 的 距离 ，2 . 辐射 的 剂量 。 由 此 便 可 得 到 区 
染色 体 上 的 基因 与 HGPRT 的 距离 图 谱 ， 从 原理 上 说 ,只 要 找到 合 


适 的 选 拌 标记 ， 此 方法 也 适用 于 其 它 连 锁 群 的 基因 定位 。 


(六 ) 基因 转移 定位 


基因 转移 的 方法 很 多 ， 如 染色 体 介 导 的 基因 转移 (GMGT )， 
裸 DNA 介 导 的 基因 转移 (DMGT) 及 载体 介 导 的 基因 转移 (如 Ti 
质粒 作 载体 的 植物 基因 转移 ) 等 。 这 些 均 可 用 来 进行 基因 定位 工 
作 。 
1 .染色 体 介 吧 的 基因 转移 定位 
有 关 的 经 典 实验 是 : 将 处 在 细胞 分 裂 中 期 的 人 培养 细胞 ， 用 
秋水 仙 素 处 理 ” 机 械 法 破裂 细胞 分 离 染 色 体 ， 再 将 此 染色 体 转 化 
受 体 细胞 。 

转化 细胞 有 两 种 类 型 ,一 是 不 稳定 的 转化 体 , 此 转化 体 中 被 转 
移 的 染色 体 或 染色 体 片 朋 很 快 会 从 受 体 基因 组 中 技 失 。 共 同 转化 
并 在 以 后 的 培养 过 程 中 同时 丢失 的 基因 ， 可 能 是 连锁 在 一 起 的 ， 
可 用 此 体系 进行 连锁 定位 。 转 化 的 第 二 种 类 型 是 稳定 的 转化 体 , 即 
供 体 的 染色 体 片 段 已 插入 到 受 体 细 胞 的 基因 组 中 。 在 以 人 的 染色 
体 作 供 体 ， 小 鼠 的 细胞 作 受 体 所 得 的 稳定 转化 体 中 ， 由 于 人 的 染 
色 体 片段 颜色 较 浅 ， 鼠 的 染色 体 颜 色 较 深 ， 细 胞 学 观察 可 见 人 的 
染色 体 片 段 或 者 搬入 在 着 丝 粒 附近 或 者 连接 在 染色 体 的 末端 。 例 
如 此 杂种 染色 体 中 所 携带 的 人 的 染色 体 片 段 均 含有 Te 基因 ， 分 析 
与 此 基因 连锁 的 其 它 基 因 Cx( 半 乳糖 苷 激酶) 和 PsI (TI 型 原 胶原 肽 
眉 ) 的 表达 情况 时 ， 发 现 携带 最 短 的 人 染色 体 片 段 的 三 个 细胞 系 
丢失 了 Ci 基因 ， 但 仍 含有 P.I 基 因 。 带 型 分 析 表 明 所 丢失 的 包含 
Gr 基 因 的 染色 体 片段 是 紧 靠 17 号 染色 体 着 丝 粒 的 部 分 。 这 样 便 可 
得 到 如 下 的 基因 顺序 排列 : 着 丝 粒 一 (Te，BPeI) 一 Gk。 

2 .载体 介 导 的 基因 转移 定位 

-由 于 述 可 知 ，CMGT 定 位 方法 ， 只 能 将 基因 大 致 定 位 在 某 一 

染色 体 上 ， 但 用 载体 介 导 的 基因 定位 方法 ， 则 可 得 到 精细 的 基因 


eZ29 = 


缚 构图 。DMGT 定 位 方法 与 此 原理 一 样 ， 只 是 基因 转移 的 方法 有 
差异 。 下 面 以 小 麦 的 叶绿素 ab 结合 蛋 由 一 1 (Cab 二 1) 基因 的 光 
调 区 的 定位 来 加 以 说 明 ， 

原 有 的 研究 表明 ，Cab_1 基 因 的 表达 是 受 光 调节 的 ， 但 是 基 
因 的 哪 一 部 分 起 光 调 作用 呢 ? Ference Na 等 将 此 基因 的 上 游 序 列 
(一 T816 到 + 21) 与 细菌 的 氯 霉 素 转移 酶 基因 (CAT) 连 接 起 来 ， 然 
后 将 连接 好 的 镶嵌 基因 转移 到 Ti 质粒 上 去 ， 并 用 此 Ti 质粒 转 楷 烟 
章 。: 结 果 在 转化 的 烟草 中 发 现 ， CAT 基 因 的 表达 是 受 光 调控 的 5 
这 样 便 可 将 Cab 一 1 基因 的 上 游 序列 定 为 光 调 区 。 实 际 上 ， 用 园 样 
的 思路 已 定位 了 许多 组 织 特异 性 作用 的 控制 区 位 点 

3. 细 菌 接合 转移 定位 
”2 细菌 进行 基因 转移 有 三 种 途径 : 转化 Cn : 转 
导 (Transduction) 和 接合 转移 (Conjugation)。 此 三 | 
用 于 基因 定位 。 
3 村 枚 王 明生 水 间 和 二 二 二 条 训 相 二 和 
方 接受 另 一 方 的 遗传 物质 的 现象 。 在 细菌 的 接合 转移 中 ， 供 体 细 
胞 称雄 性 细胞 ， 受 体 细胞 称 肉 性 细胞 。 这 种 “性 别 * 差异 是 根据 
它们 是 否 具 有 FEF 因 子 而 区 分 的 ， 划 凋 梓 撒 
.07 因 子 亦 称 可 育 因 子 。 它 在 细菌 中 以 丙种 状态 存在 ,一 是 独立 
于 娄 色 体外 的 游离 状态 ,此 时 的 细胞 称 为 F+ 细 胞 .ER* 细 胞 可 通过 接 
合 转移 将 FE 因 子 转移 到 R- 受 体 细胞 。E 因 子 亦 可 整合 在 细菌 的 染色 
体 上 ， 即 以 整合 状态 存在 ， 此 时 它 能 将 细菌 的 染色 体高 频 地 转移 
-到 F- 受 体 细 胞 中 , 故 称 此 细胞 为 高 频 重组 -(Hfr) 细胞 号 革 开 二 
RARgapaomipinaby at 
定位: 转移 梯度 定位 ， 时 间 单位 定位 与 计数 重组 体 定位 。 
二 台式 1 圭 移 梯度 定位 续 半 

先 将 Hfr 友 性 细胞 与 E- 只 性 细胞 在 流体 培养 基 中 混 侣 25 分 名 
(所 用 Hfr 及 F- 细 胞 特性 和 表 12), 然 后 将 此 混合 液 涂 布 于 含有 链 堆 
素 的 合成 培养 基 中 5Hfr 细 胞 因为 有 str 一 s， 故 不 能 在 含 链 霉 素 的 一 
接 养 基 中 生长 ; FE- 细胞 由 于 不 能 合成 亮 氨 酸 和 丝氨酸 , 故 不 能 在 ” 


e230。 


是 / 
讽 


-2 
六 
。 


2 缺失 亮 氮 酸 和 丝氨酸 的 合成 培养 基 中 生长 具有 那些 thr 5 :lew' 
(来 自 了 fi) 与 str (来 自 F-) 的 重组 体 汪 式 能 在 str5 leu- ，Thzr- 
的 增 养 基 上 生长 。 将 土 述 丰 组 伟 芒 红 合 着 格 生 各 抽 P 菌 体 了 


) 案 12 -Hfr 与 FE- 细胞 的 特性 - 
性 质 Hfr 细 胞 :二 了 王 > 细 胞 
丝 氮 酸 合成 thri thr- 
亮 氨 酸 合成 leats 、， 3 
登 氮 化 钠 敏 感性 人 
“只 菌 体 T; 敏 感性 人 
乳糖 发 酵 lact+ 1 二 lag- 
半 乃 糖 发 酵 gal* 天 1 
链 霉 素 敏 感性 Str: : Str: 


得 业 以 及 屯 糖 或 半 屯 糖 作为 唯一 糖 源 的 合成 培养 基 中 生长 。 结 果 
表明 ， 在 所 有 的 thr*，1leu':，str-r 的 阳性 充 隆 中 90 色 是 azi 号 
70% 是 Ti 一 s，40%% 是 lac*，25% 是 ga 其 百分比 正好 代表 了 和 连 
锁 强 度 ， 据 此 可 作出 连锁 图 。 


]eu ati-s 工 i-s ]ac” ga 二 
- : 


(2 六 时 间 单 位 定位 

遗传 梯度 定位 科 后 面 将 要 谈 到 的 计数 重组 体 定位 ， 只 能 得 出 
湛 因 在 染色 休止 的 相对 位 置 * 为 了 得 到 特定 基因 在 染色 体 上 排列 
[ 欧 绝 对 位 置 ， 可 用 时 间 单 位 定位 法 所 将 七 述 的 Hfr 和 F- 细 胞 在 液 


表 13 二 光 nt 击 细胞 所 需 时 间 间 隔 


允 竺 和 《 袁 人 

PN NE 二 : 二 于 二 0 。 
ne 5 Se 

人 thr-leu+ 

9 thf*leu+azi-gs 

人 thr*teu+azi-s TI1-s 
TS thbrtTIeura 责 -SS TI2S Iacz 
25 Ethbrelea azi-s TI-5 lac+g 到 + 


as ZL3F。 


体 培养 基 中 混 谷 ;每 隔 - 定 时间 放样 ， 并 用 提 磋 中 抽 拌 以 中 断 接 合 
闽 移 ， 然 后 涂 布 于 特殊 的 选择 于 
洲 基 上 上， 检测 哪些 基因 已 从 供 体 
整 入 到 受 体 染 色 体 中 。 未 13 的 结 
果 表 明 ， 供 体 染色 体 是 线性 地 进 
入 受 条 细胞 的 ; 假定 供 体 染色 体 “， 
的 转移 速率 是 定 值 ， 则 表 中 的 数 ， 
据 代 表 了 基因 的 确切 位 置 ， 可 用 
来 作 细菌 染色 体 的 细胞 学 图 。 实 
验 表 明 ，27D 时， 大 肠 杆 菌 整 个 


染色 体 的 转移 需要 90 分 钟 。 已 知 于 介 
头 肠 杆菌 染色 体 为 环 状 * 故 可 以 “图 2-57  E,Coli kl12 的 环 状 连锁 图 
时 间 为 单位 作出 下 图 。 (以 时 间 为 单位 全 


《3) 计数 重组 值 基因 定位 
通过 计数 重组 信 来 推算 基因 的 重组 值 ， 从 而 进行 基因 定位 的 
方法 称 为 计数 重组 值 定 位 。 在 细菌 接合 转移 中 ， 只 有 部 分 染色 体 
呈 暂 时 的 二 倍 体 状 态 ， 为 了 保证 转移 的 染色 体 部 分 包含 所 需 研究 
的 基因 ， 所 选择 的 供 体 染 色 体 必须 包含 - 个 已 知 位 点 的 基因 上。 
例如 ,将 thr+ leu+ 的 Ttfr 细 胞 与 tbr- leu- 的 FE= 细 胞 融合 ,从 上 
面 的 时 间 图 谱 数 据 得 知 ，leu 基 因 在 thr 基 因 之 后 进入 RE- 细 胞 ,所 以 
任何 leu* 的 重组 体 均 有 可 能 是 thr+ 如 果 这 两 个 基因 之 间 没 有 发 本 
交换 , 则 将 出 现 tbhrt leu+ 的 重组 体 。 若 两 个 基因 发 生 重组 ) 则 重组 


体 是 thr- leu'*e 我 们 可 以 从 计算 重组 体 (thr” leu') 与 非 重 组 体 加 


重组 体 的 总 数 (thr+ leu+ +thr- leu+) 的 比值 来 推测 二 基因 间 的 
重组 频率 。 对 于 thr~ leu ,其 比值 为 0.10, 或 者 说 重组 频率 为 10%。 

将 重组 单位 与 时 间 单 位 相 比较 ， 可 以 发 现 一 个 时 间 单 位 相当 
于 20 个 重组 单位 。 一 般 来 说 ， 当 基因 间 的 距离 少 于 3 个 时 间 单 位 
时 ， 用 重组 频率 能 得 到 很 好 的 结果 ， 若 大 于 3 个 时 间 单 位 ， 即 天 
于 60 个 重组 单位 时 ， 两 个 连锁 基因 重组 分 析 的 结果 会 不 连锁 。 所 
以 ， 在 这 样 情况 下 不 能 用 重组 频率 的 分 析 方 法 来 定位 。 


ZL s 


ii -sw ，，，  - 


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醋 恒 
1 


“( 毛 ) 物理 学 定位 

志 沁 渍 抑 以 下 的 圾 法 对 汶 声明 学 妆 避 汪 因 秃 它 向 东 凡生 放 诈 
的 任何 一 类 定位 方法 ， 用 放下 古本 生 下 全 全 全 和 

人 变性 定位 

、 东 用 于 方法 采 对 分 拉 盟 较 小 的 杰 因 胡 如 1DNA 的 基因 定 
科 宗 浴 : 2 

雪村 拱 PhB 光 ， 便 AT 中 疹 区 过 性 劳 珊 ; 而 氨 键 
为 绪 强 前 GC 区 郝 不 变性 5 在 电 锁 下 即 可 观察 到 DNA 的 AT 丰富 区 
形式 “ 泡 ? 状 结构 。 这 种 “ 光 ” 状 结构 可 作为 物理 标记 位 点 。 在 进 
行 实 际 定位 时 ， 首 先 用 野 革 型 染色 体 作 材料 ， 测 量 “ 泡 ” 状 结构 
间 的 距离 ， 然 后 与 不 同 缺 失 突变 的 泡 间 距离 比较 ， 从 而 对 缺失 部 
位 基因 位 点 的 物理 位 置 和 不 同 缺失 片段 的 长 度 作出 推断 。 

2 .转录 有 一 环 定 位 

这 是 一 种 在 电镜 下 观察 真 核 特异 性 RNA 与 双 链 DNA- 片 段 互 
和 RNA 一 DNA 杂 交 区 多 出 一 条 DNA 链 ， 形 成 环 状 结 

本 
AN 


\ R 一 环 (CDNA 反 义 链 ) 
图 2-58- 及 - 环 定位 a,. 没有 插入 序列 “b, 含有 一 个 插入 序列 


构 ， 因 此 叫 R 一 环 定位 。( 见 图 2-58a) 在 电镜 下 双 链 区 似乎 比 单 链 
区 更 粗 ， 由 于 内 含 子 不 能 与 成 熟 的 mRNA 杂交 ， 因 此 一 个 内 合子 
导致 2 个 R 一 环 结构 (图 2-58b)， 二 个 内 含 子 产 生 3 个 R 一 环 。 

5 上 般 来 说 及 一 环 定位 主要 用 于 上 述 实 核 基因 前 内 合子 定位 ， 
但 也 可 用 以 定位 染色 体 的 活性 区 域 . 如 图 2-59 是 一 个 完整 的 4 染色 
体 ， 体 外 转录 八 分 钟 后 将 DNA 变性 ， 使 新 合成 的 RNA 与 模 杠 
DNA 杂 交 ， 形 成 DNA 一 RNA 杂 种 分 子 守 产生 的 R 一 环 《 泡 ? 由 箭 


日 尼 33 


头 标 出 ， 此 箭头 所 标 出 的 位 置 便 是 4 基因 组 中 三 个 主要 的 启动 子 
的 精确 位 点 。 

3. 有 异 源 双 链 定位 ， 

此 法 常用 于 分 辨 染色 体 或 DNA 片段 的 非 同 源 区 。 例如 二 条 4 
染色 体 ， 一 条 带 有 长 的 b: 缺 失 ， 但 含有 bs 序列 另 立 条 是 bz， 并 
带 有 于 序列 ， 工 不 同 于 bs。 为 了 构建 变性 图 谱 ， 首 先 将 二 条 染色 
体 变性 成 单 链 ， 然 后 混合 ， 复 性 。 形 成 的 杂种 链 明 显 地 含有 二 个 
不 连续 的 区 域 ( 如 图 2-60)。 非 同 源 的 和 bs 不 能 退火 。 故 形成 对 
称 揭 “ 泡 ”; 而 bj 在 b: 缺 失 区 形成 不 对 称 的 “ 泡 习 形 成 不 对 称 的 
“ 泡 2。 此 种 方法 可 以 精确 地 测定 缺失 片 投 和 非 同 源 区 的 位 置 


本 六 过 心术 8 


: 


各 
FS 


图 2-59 ”转录 及 一 环 图 “图 2-60 -入 染色 体 的 异 源 双 链 定 答 。 图 中 第 一 个 不 
和 gwES，NCDNA 人 体外， 连续 区 是 1 与 bs 非 同 源 区 ， 第 二 个 不 连续 区 是 b: 缺 
转录 八 分 钟 后 的 人 一 环 失 区 。 

网 。PR， 有 人 -和 mt 启动 

子 定 位 在 箭头 所 指 的 

环 的 位 置 


4， 限制 性 肉 切 栈 分 析 证 位 
。23f 。 


es 


以 SV40 为 例 来 说 明 .SV40DNA 是 环 状 双 链 DNA .K.J Daniia 
是 首先 用 限制 性 内 切 酶 作出 SV40 限 制 性 贺 谱 的 学 者 之 一 。 他 首先 
用 HindII 消 化 SV40DNA 得 到 11 个 片段 (如 图 2-61)。 其 中 互 in-A 


Bottom KJIH _ GFEDC B  A To0p 


JS 


”图 2-61 HindII 消 化 后 SV40 染 色 体形 成 的 片段 

片段 最 大 ，Hin 一 KK 最小。 怎样 重建 这 11 个 片段 呢 ? 一 种 设想 是 ， 
用 二 种 内 尺 酶 同时 作用 或 先后 作用 于 SV40DNA。 例 如 SV40DNA 
的 Hind1l 内 切 酶 片段 用 EcoR1 酶 切 后 进行 电泳 时 ， 发 现 F 片 段 消 
失 ， 而 出 现 了 二 个 较 小 的 片 侦 ， 此 二 小 片段 相 加 正好 与 片段 F 相 
等 。 这 表明 片段 FE 含有 EcoR1 位 点 。 另 一 办 法 是 首先 用 HpaI 消 化 
SV40DNA， 产 生 Hpa 一 A，Hpa 一 B，Hpa 一 C 三 大 片段 ， 将 此 三 
片段 分 别 从 凝 胶 中 分 离 出 来 。 用 Hind- 开 酶 切 ， 然 后 电泳 ， 从 片 
朋 的 迁移 率 推出 片 朋 的 大 小 。 例如 了 pa 一 C 片 自用 HindII 酶 切 后 发 
现 Hin-B 和 Hin-I， 这 表明 Hin-B 及 Hin-I 片 段 在 染色 体 上 紧 连 在 
一 起 。 用 此 方法 构建 的 SV40 限制 图 谱 如 图 2-62 所 示 。 将 单一 的 
BcoRI 位 点 定 为 “0”， 其 它 位 点 于 环 上 的 0 与 1 之 间 。 一 
将 限制 性 图 谱 转 化 为 功能 图 谱 即 基因 排列 图 ， 最 常用 的 方法 


BEpa 一 人 A 


”图 2-62 SV40 基 因 组 的 早期 限制 性 图 谱 。 图 距 由 下 列 计 算得 出 : 
到 EcoRI 位 点 的 距离 rmF_T mm PP， 头 标 
RN 沿 上 一 J 一 G 一 B…… 方 向 ， 箭头 标明 内 切 酶 萎 

割 位 点 (Hind-TI，Hin-2， 百 Fa-I，:…… ) 字 母 表示 所 产生 的 片段 ， 内 图 
是 11 个 HindHII 片 段 (A 一 区) 的 位 置 ， 外 圈 是 3 个 Hia 片 段 (A 一 C) 


从 和 己 


是 Soutteru blot( 见 基因 工程 找 术 )。 酶 切片 段 电泳 后 与 特殊 基因 
DNA 或 其 RNA 探 针 杂交 ， 从 而 将 此 基因 定位 于 二 定 的 酶 切片 自 
上 。 Southern blot 是 一 种 非常 有 效 的 定位 方法 ， 目前 已 广泛 应 用 
于 各 种 不 同 生 物 材料 的 基因 定位 z- 一 

5. 揪 入 失 活 定位 

插入 失 活 定位 的 原理 是 :将 额 处 的 DNA 揪 六 到 次 名 体 或 DNA 
的 编码 区 或 控制 区 ,致使 出 现 突变 ， 根 据 突 变 的 类 型 鉴定 出 此 失 


活 的 基因 。 进 一 步 利 用 此 插入 DNA 作为 标记 物 ， 将 失 活 的 基因 


定位 在 特异 的 染色 体 上 。 

此 定位 的 方法 应 用 得 很 广 ， 既 可 对 转 座 子 质粒。 细菌 的 基 
因 定位 ,; 也 可 对 高 等 动 植物 的 基因 定位 。 

(1) 接头 (Linker) 插 入 突变 定位 

以 Tn3 转 座 子 的 基因 定位 为 例 来 加 以 说 明 。 已 知 Tn3 在 一 质 粕 
上 ， 在 合适 的 条 件 下 用 DNaseI 处 理 此 质粒 ， 使 得 此 质粒 正好 在 革 


一 随机 的 位 点 被 切割 成 线 状 分 子 。 然 后 用 EcoRI 甲 基 化 酶 处 理 此 


线 状 DNA 分 子 ， 以 封闭 此 质粒 原来 的 EcoRI 位 点 ， 再 用 DNA 合 成 
酶 I 将 线 状 DNA 的 两 端 合 成 为 平头 ， 用 连接 酶 将 EcoRI 接头 与 此 


平 末端 连 接 ,进一步 用 EcoRI 酶 消化 ,加 连接 梅 使 此 质粒 重新 环 化 ， 


这 样 便 将 EcoRI 接头 随机 地 插入 到 此 质粒 的 某 一 位 点 。 这 八 个 核 
苷 酸 的 小 捅 入 片段 将 使 编码 蛋白 质 的 结构 基因 或 DNA 识别 位 点 
失 活 。 更 重要 的 是 ， 此 接头 的 位 置 可 以 通过 限制 性 内 切 酶 降解 后 
电泳 得 知 ， 就 是 说 ， 一 旦 发 现 某 种 结构 基因 或 DNA 的 识别 位 点 
失 活 了 ， 便 可 知道 ， 此 失 活 的 基因 在 In3 内 ， 并 可 将 其 定位 在 In3 
的 特异 区 段 上 。 

《2) 转移 因子 搬入 突变 定位 

上 述 方法 ， 对 于 小 分 子 DNA， 如 转 座 子 、 质 粒 之 类 是 很 方便 
的 。 但 对 于 大 分 了 于 PNA， 特别 是 高 等 生物 的 淋 色 体 定位 则 相当 因 
难 或 根本 办 不 到 。 

自然 界 中 。 有 一 种 DNA 片 朋 可 以 重复 鱼 入 到 生 因 组 的 许多 
位 点 上 ， 它 可 以 从 基因 组 的 一 个 位 点 转移 到 另 一 位 点 , 从 一 个 复 


236 。 


人 We 


夺 
ri 一 


1 
1 
间 


制 子 转移 到 另 一 个 复制 子 ， 我 们 称 之 为 转移 -因子 =(Ctransposable 
element)。 转 移 因子 在 低 等 生物 如 细菌 ， 在 高 等 生物 如 果 蝇 、 玉 
米 中 均 存 在 。 当 转移 因子 转 入 到 新 的 位 点 时 ， 会 使 其 插入 位 点 的 
基因 失 活 ， 利 用 此 插入 因子 作为 标记 物 , 便 可 定位 此 失 活 的 基因 。 

利用 转移 因子 对 细菌 、 质 粒 及 噬菌体 DNA 定 位 时 ， 首 先 鉴定 
出 转移 因子 插入 后 引起 了 何 种 基因 失 活 ， 进 一 步 用 此 插入 因子 作 
探 针 ,，, 通 过 Seuthern blot 技 术 便 可 很 快 地 定位 此 失 活 基因 。 

二 所 真 核 生 物 有 多 条 染色 体 ;所 以 无 法 象 上 上 述 的 细菌 :质粒 及 
吗 菌 你 DNA 定 位 那样 ， 直接 将 失 活 的 基因 定位 在 某 一 特定 的 位 点 
上 。 但 由 手 儿 入 因子 可 作为 标记 位 点 ,因此 可 以 通过 二 点 $ 三 点 刘 
交 来 对 此 基因 定位 ( 见 遗 作 重组 值 定位 )， 而 且 也 可 用 原 位 杂交 的 
方法 4 见 下 节 ) 加 以 定位 。 当 然 也 可 用 此 转移 因子 作为 标记 物 , 克 隆 
此 失 活 的 基因 ,然后 用 二 点 .三 点 测 交 及 原 位 杂 交 法 来 定位 此 基因 

6: 原 位 杂交 (insitu hybridisatiou) 定位 

原 位 杂交 可 以 将 基因 直接 定位 在 染色 体 上 ， 它 是 随 着 染色 体 
分 辨 技术 及 分 子 杂 交 技 术 的 产生 而 出 现 的 。 开 始 时 原 位 杂交 主要 
用 于 人 的 基因 定位 ， 后 来 才 逐 渐 用 于 动物 及 植物 的 基因 定位 。 

首先 用 秋水 仙 素 处 理 组织 培 养 的 细胞 ， 使 其 停止 在 细胞 分 裂 
的 中 期 ， 然 后 将 这 些 细 胸 固定 。 由 于 细胞 核 中 的 染色 体会 有 RNA， 
所 以 用 RNase 去 掉 所 有 的 可 能 干扰 杂交 反应 的 内 源 RNA。 

细胞 固定 后 ， 用 碱 、 热 、 强 酸 或 某 些 有 机 溶剂 进行 处 理 ， 使 
染色 体 的 :DNA. 变性 成 单 链 。 然 后 将 区 变 性 的 样品 固定 在 裁 玻 片 
上 (而 不 是 象 滤 膜 杂交 那样 ,将 待 杂 交 指 变 注 样品 固定 在 硝酸 纤 
维 素 膜 上 )。 用 合适 的 放射 性 探 针 ， 如 已 克隆 的 基因 及 特异 性 的 
mRNA， 与 变性 染色 体 杂 交 ， 通 过 放射 自 显影 重 可 将 基因 定位 在 
某 染色 体 区 及 染色 体 藻 某 一 区 段 上 。 

已 用 原 位 杂交 方法 定位 了 不 少 的 基 因 位 点 ;如 多 拷 贝 药 
TRNA 基因 及 卫 是 PNA 的 定位 ， 单 拷贝 基因 的 定位 亦 有 报道 。 但 
原 位 杂交 并 不 能 确定 基因 在 染色 体 上 的 精确 位 点 ， 更 由 于 检测 的 
敏感 性 问题 ， 对 于 单 找 贝 基因 的 定位 尚 育 不 少 困 难 。 


。 2Z3 了 7。 


( 八 ) 基因 图 与 基因 符号 
1 .一 4. 见 播 页 
5. 人 的 基因 图 


沁 


国 | 下 


人 DLL 下 本 


了 
导入 


Ptef 
IF2 HLA-A 二 HFE 
A 一 C 


HEA-- 
2 这 BF 十 CA21 时 


CS 


HLA 一 
ARc8 站 HLA--D 卫 和 
只 HLA--SB 
刀 R ovomere 
| DHFR 4 
PC 
LDLR 
和 1 
5 q xp 工 | 
C4 有 P 
疏 8 瑟 R14， BR1B 
失 汶 上 BR24. 了 R2B，etc。 
FS MRBC EA 《 
-| RNTAML 
t 全 2 一 CHR KR4S4TF< 可 
ADC 这 因 / ， 
| -BEVI 让 . 测 
1 (全 PLT1 
9 MERWW 


es 238 。 


了 BLVR 


UP 
21401 


C 站 [CN 


上 L4/ 
所 了. 杀 


CM 
瑟 1GH 用 人 二 
GL78 Wi 人 
二 


*，239。 


DGS 
1D 寺 Vv(many) 
1S1 Cn 
4GLBREEC、(>61 
CMiL 本 上 


站 


6 . 


Al2MI1 
Al2M2 


人 的 基因 符号 索引 


- 腺 病毒 -12 染 色 体 修饰 位 点 -1C 
腺 病毒 -12 染 色 体 修饰 位 点 -IA 
租 病 毒 -12 染 色 体 修饰 位 点 -1 了 
腺 病毒 -12 染 色 体 修饰 位 点 17 
肾脏 运输 的 B- 氮 基 酸 

致癌 基因 : 鼠 白细胞 病毒 的 
Abelson 株 

ABO 血 型 

心脏 肌 c 肌 动 蛋白 

可 溶性 乌 头 酸 酶 
线粒体 上 乌 头 酸 酶 

酸性 磷酸 酶 1 

酸性 磁 酸 酶 2 

骨 有 骆 肌 c 肌 动 蛋白 

酰 化 氨基 酸 水 解 酶 
腺 萌 脱 氢 酶 

腺 苷 脱 氨 酶 复合 蛋白 -1 

腺 苷 脱 氢 酶 复合 蛋白 -2 

1 类 乙醇 脱 氢 酶 


六 x 
HYe A 
HYOQ 
STS 二 
| 
OC 
including | Xk~-]? 
DAi 
Y < 
,1 
1 
41 四 
14 3 
1. 二 
ff 
1 


1942-43 
1p36 
1921 

二 921-22 
?21 

9934 


9q34 
15q11-q 端 
9P22-13 
22911-?3 
2B23 OF 2D25 
11p12- 着 丝 粒 
1p12-q 端 


”3pP 端 -q13 


20q13-9 端 
?6 
2D23-q32 


e。 .24 


ADH? 
ADK 
ADRPD 
AF8 工 

AFP 
AG(HBAC) 
AHCY 


ASL 
ASMD 


乙醇 脱 氢 酶 -2 
腺 昔 激 酶 

B- 肾 上 了 腺 素 受 体 
温度 敏感 (AFS) 组 份 
a- 胎 儿 球 蛋白 

a- 珠 蛋白 基因 族 
见 SAHH 

芳香 基 碳 氢化 合 物 羟 化 酶 
Aicardi 综 合 王 

可 洲 性 腺 苷 酸 激酶 
线粒体 上 腺 苷 酸 激酶 
腺 音 酸 激酶 -3 


5- 氨 基 乙酰 丙 酸 脱 氢 酶 


白 蛋 让 
肾 土 腺 脑 白质 营养 不 良 


1 唾 媒 淀粉 酶 
胰腺 淀粉 酶 
1 型 无 虹膜 : 


无 虹膜 -2 

陪 辅 基 脂 蛋 自 全 - 
脱 辅 基 脂 蛋白 -CH 

脱 输 基 脂 蛋 白 CHI 
脱 辅 基 脂 蛋 白 -AIY 
陪 辅 基 脂 蛋白 也 

腺 哇 叭 磷酸 核 音 酸 转移 酶 
芳香 基 硫酸 琵 酶 入 
芳香 基 硫 酸 酯 酶 B 
房 隔 缺 陷 

不 产生 精子 因 于 


， 精 氢 基 玉 珀 酸 裂 解 酶 


前 段 间 质 产生 异常 


ASNRS(NARS) 英 冬 氨 酰 -tRNA 合 忒 酶 


ASNS 


242。 


天 冬 酰 胶合 成 酶 


1P23 


D JU 全 


1D 端 -?23 
10q11-24 
5 

3 
4q11-13 


an6B5 


SS 
2pPEB 
?XP22 
9934 
15 引 

9Dp24-13 

9q34 

4q11213 

Xq28 站 


1P2 

2 

?1] 了 13 
Fllp13-q13 
?11p11-q13 
lpP11-313 
11p11-q13 
?11p11-q13 
16g12-22 
22q1331-q 端 
5 


TV 


?1B13 oO 1925i 1， 
7P21-q22 
和 

18 


7B11-q11 1HGA 


避 


上 


ASS 精 氨 基 瑟 珀 酸 合成 酶 99q314 

ASSP2 精 氨基 琥珀 酸 合成 酶 假 基因 -2 6- 

AT3 抗 硫 腕 素 III 世 27.1-23。9 

ATN 酷 氨 酸 酶 缺陷 白化 病 ?11P 

ATPM 见 OMR 

AVR(CIEFR) 抗 病毒 状态 调节 物 生 信 世 16 

AVRR. 抗 病毒 状态 阻 遏 物 调节 物 ?5p 

B2M 8B=2- 小 球 蛋 自 15321-22 

PA2R BALB/C 3T3 ts2 温 度 敏 感 补充 xd13-27 

BAS 对 有- 肾上腺 素 刺 激 反应 ?时 ] 

BCTI1 支 链 氨 基 酸 转移 酶 -1 12B 端 -q12 

BCT2 支 链 氨基 酸 转移 酶 -2 19 

BEV1 Baboon MI17 病 毒 感 染 6 

BF 备 解 素 因 子 B 6p213 

BLVR : 朋 绿 素 还 原 酶 7P1l4- 着 丝 粒 

BLYMI1 ; 致癌 基因 BLYMI1 : 鸡 囊 淋巴 癌 ”1p5。? 

BRIA ,BRIB 对 特异 性 合成 的 多 肽 的 胚 变 应 答 6p21.3 

BVIN N- 向 性 BALB 病 毒 诱 导 15 

BVIX 异 向 性 BALB 病 毒 和 导 11 

BWsS Besekwitch-Wiedemann 综 合 症 ?11DpP13-15 

C2 01 圳 体 -2 6p21.3 

C3 5 补体 -3 192 端 -q13.。2 

C3BR c3b 受 体 6P21 .3 

C3DTr c3d 受 体 ”6p21 .3 

C4BP 补体 -4 结合 蛋白 : ?6 

C4F 快速 补体 -4 6 

C4S 定 一 慢 速 补体 -4 6 

CS 补体 -8 1pP， 

CA2 一 碳酸 栈 酶 I 8 

CAE 小 带 粉 状 白内障 1 春 丝 粒 -q21 
.CAHICCA3HHEY 先天 人 性 肾上腺 畸形 生长 6P21 


es 2if3 。 


CHE1 
CHR 
CKPBB 
_CLGN(CIG) 
CML 
CMNMT1 
CO 
COI 
COL1A1 
COL1A2 ， 
COL3A1 
COL4A1 
COLM 
CP 
CPA 
CPRO 


“过 氧化 物 酶 


柯 萨 奇 病毒 B3 病 毒 感受 性 
蓝 单 色光 色 言 
绿色 育 

红色 育 

胱 硫 醚 B- 合 成 酶 

绒 动脉 瘤 ， 
先天 性 白内障 


x- 连 锁 的 软骨 营养 障碍 斑点 


猫眼 综合 症 


11p13 

19 

?xd23 
xd28 

Xq28 

2 

?13d34 
?16d 
?22。32 
?22P 端 -qd11 


绒毛 腺 促 性 腺 激素 (? 非 结构 基因 ) ?10 5 卫 


a- 链 绒毛 腺 促 性 腺 激素 


6B11-q21(18PI1) 


pB- 链 绒毛 了 株 促 性 腺 激素 19 
慢性 肉芽 肿 病 XP22 
拟 胆 碱 酯 酶 -1 g 襄 
铬 酸 盐 抗 性 5335 
脑 型 肌 酸 激酶 1432-9 端 
胶原 酶 ( 隐 性 营养 不 良 表皮 水 郊 王 》 11 
慢性 通 样 白 迄 病 22311。3 
Chatrcot-Matie- 牙 病 于 娃 下 - 

5 Colton 星 型 2 
虹 疏 缺失 ?2D25.1-?P 端 

.胶原 蛋白 1a-1 链 17d210-220 

胶原 蛋白 1c-2 链 7q21-22 
胶原 蛋 扯 IIca-1 链 
胶 兰 蛋白 IVa-1 链 和 
类 似 a-1(I) 胶 原 蛋 曰 化 
血球 铀 蓝 蛋 昌 3 
羧基 肽 酶 人 7422-3 端 
类 是 啉 原 氧化 酶 9 
组 织 蛋 白 酶 D 11p 端 -q12 
c= 反 应 和 蛋 明 13 
组 粒 体 上 的 柠 泳 酸 合 成 酶 12p11-d3 端 


CSC1 
CSA,CSB 
(CHHI! ,2) 
CSL 

CTH 

CITRB 

CVS 


D1S3 

D4S10 

D14S1 

DB 瓦 

DC1 

DCE 

DGII1 

DGS 

DHEFR 
DHPR(QDPR) 
DHTR 
DIAl 


DIA2 

D1IA4 
D1IP1LCVD1) 
DJS 

DLX1 

DMD 


皮质 酮 侧 链 异 构 酶 
绒毛 膜 生长 催乳 激素 


类 绒毛 膜 生 长 催乳 激素 
胱 硫酸 酶 
凝 乳 酶 原 B 
玩 形 病毒 229E 敏 感性 


见 SK 
DNA 片 段 G8 
DNA 片 段 

多 巴 胶 B- 羟 化 酶 


DC1 特 异性 的 免疫 反应 抗原 : 
2; 脱 氢 胆 固 醇 > 胆 竹 醉 酶 : 


齿 质 形成 不 完全 陪 
DiGeorge 综 合 定 

二 氢 叶 酸 还 原 酶 

醒 式 二 氢 唆 喧 还原 酶 


工 氢 睾丸 酮 受 体 即 TEM 


179q210-220 


I7q210-220 


1 6 
了 6 


15G11-9 端 


《4 
14932 

5 
j6p2105-23 

220E 


;还 原型 烟 酰胺 腺 味 叭 三 核 背 酸 ;22q1331-q 端 


磷酸 心肌 黄 酶 
心肌 黄 酶 2 
心 有 黄 酶 4 


Dubin-Johnson 综 合 症 


读 字 困难 -1 : 


Puchenne 肌 肉 行为 异常 
1 肌 强 直 功 能 行为 异常 ; 


细胞 质 膜 DNA 
深 酶 体 DNA 酶 
Dombrock 血 型 群 
白喉 毒素 敏感 


是 1 


1 并 何 12-21 
缺 损 性 干扰 颗粒 诱导 的 控制 
1 


工 6.: 3 


5 
?XP12-21 

荔 

ggh 

多 .二 


了 


19 


e。 245 


二 让 二 Ecoholl 人 敏感 性 19q 


EBR1 见 CLGN 
CBS1 Ogan 型 风 性 表皮 松 解 ?16 
EF2 延伸 因子 -2 I9 
EGFR 表皮 生长 因子 的 受 体 7p13-pP22 
EL1 椭圆 红血球 病 -1 1P 
EL2 椭圆 红血球 病 -2 就 
ELAI1 弹性 蛋白 -1 12 
EMTB(RPS14) 吐 根 碱 抗 性 (核糖 体 蛋白 S14) 5931-35 
ENO1 烯 醉 酶 -1 1p36-D 端 
ENO2 烯 醇 酶 -2 12p11-12 
ERBA 致癌 基因 ， 鸟 红血球 母 细 胞 白 17 
壬 病 病 毒 

ERBB 致 痛 基 因 ERBB 7D 端 -q22 
ERV1 内 源 性 逆转 录 病 毒 -I 18 
ESA4 酯 酶 -A4 11q13-22 
ESAT 酯 酶 活性 因子 I4 

ESB3 酯 酶 B3 16 
ESD 酯 酶 D 13d14.1 

EXT 多 样 性 外 生 骨 风 ?99q3 

F7 凝血 因子 VII 13q34 

F7 忆 凝血 因子 VII 表 达 8 
F8C 促 凝 剂 组 份 凝固 因子 VII 

即 HEMA 

F9 凝血 因子 IX 即 HEMB 

F10 凝血 因子 入 I13d34 
Fl12(HAE) 凝血 因子 XII(Hogeman 因 于 ) 6D23-? 端 
F13A 组 份 A 的 因子 XIII  : 6p 
FCP FE- 细 胞 产物 11P 
FDH 甲醛 脱 氢 酶 4p14-q 端 

FEA F9 胚 胎 抗 原 ?6p 

FES 致癌 基因 ， 猪 肉瘤 病毒 15q25-26 

= 246。 

时 


FGA 
”下 G3B 
FGG 
FH 

FHCCOHC) 
FMC 


FN1 
上 0OS - 


FS 


FTH 
FTL 
FUCAI1 
FUCA2” 
FUSE 
Fy 


GAA 
GALB 
GALE 
GALK 
GALT 
GANAB 


a- 链 纤维 蛋白 原 


8- 链 纤维 蛋白 原 


Y- 链 纤维 蛋白 原 
延 胡 索 酸 水 合 酶 
家 族 性 高 胆 男 醇 症 


4q94-31 
4921I-31 
4 

1q42.1 
19P 端 -q13 


致癌 基因 FMS (McDonough 5q34 


猪肉 瘤 病 毒 ) 
纤维 结合 素 


委 


致 瘤 基因 FOS:，FBJ 骨肉 瘤 瘤 


病毒 

有 或 没有 叶酸 盐 或 BrdU 
的 培养 基 中 ， 在 培养 细胞 
中 观察 到 的 脆 点 。 


铁 蛋 白 重 链 
铁 蛋 白 轻 链 
x-L- 墨 角 藻 糖苷 酶 -1 
a- 工 - 墨 角 藻 糖苷 酶 -2 
多 核 细 胞 化 诱导 物 
Duffy 血 型 


aq 葡萄 糖 酸 苷 酶 

o- 半 乳糖 苷 酶 也 

半 乳 糖 4- 差 向 异 构 酶 
半 乳 糖 激 酶 


? 
2pP11.2， 2q13; 3p14。2 
6p23; 6q26; 7D11.2; 
8q2q22。3; 9p21.13 
9q31， 10q23.。3; 
10q25.2; 11q13.。3， 
11q23.3; 12q13。1; 
16p22.3; 16q22.1 
169gq23; 17q123; 
20p11.23; Xxq26; 
Xq27 .3 

19 

19 

1pP32-34 

?4 

10 

1q12-21 


17 
22q13-q 端 
1p32-D 端 
17q21-22 


半 乳 糖 -1- 磷 酸 尿 苷 酰 转 移 酶 9p13-21 


中 伺 q- 葡 精 背 酶 AB 


11q13-q 端 


5 247， 


人 


ef 


7 
下 


中 性 o- 葡 糖 背 酶 C ， - :: 
“甘油 醛 -3- 弯 酸 脱 气 酶 ， 
甘 氨 栈 胺 核 背 酸 合成 酶 
-_B- 糖 酸 背 栈 

-组 特异 性 组 份 
生长 速率 控制 网 子 -1 .7 1 


生产 速率 控制 因 了 于 -2 、 
胰 高 血糖 素 


Greig 颅 与 多 并 指 幅 畸 形 综合 


证 


-入 谷 氨 酰 环 化 转移 酶 注 - 


葡萄 糖 脱 氢 酶 


生产 激素 /胎盘 乳业 基因 家 族 


正常 的 生长 激素 


Goldenhar 综 合 症 


变异 的 生长 激素 

a- 半 乳糖 背 酶 全 

半 乳 糖 十 活性 因 于 
先天 性 青光眼 -1 

B- 半 乳糖 背 酶 -1 

pB- 半 乳糖 背 酶 -2 

乙 二 醛 酶 1 


仓 电 互 补 的 甘氨酸 自 养 3 。 


可 溶性 谷 草 转 氨 酶 


可 深 性 线粒体 上 的 谷 草 ， 


转氨酶 
葡萄 精 -6- 磷 酸 脱 氢 本 
a- 磷 酸 甘油 酸 脱氧 酶 
精 肽 激素 6- 族 
磅 酸 葡 萄 情 差 向 异 构 酶 
可 溶性 红细胞 谷 丙 


并 转氨酶 =- 
可 溶性 肝脏 谷 两， 


16 
2D36-37 


?3p21。.1 of 7D13 =- - 


7P14-? 端 
1p 端 -p36.13 
17q210-220 
17q210-220 
?7 
17q210-220 
XQq22-24 

23 

于 于 
3p21- 着 丝 粒 


. 22q13-Q 端 


GB8Hi3=2 > 


109g925.。3-26 。1 


1631 2-Q22 


XQq28 


12 
19 
19p13-=q13 


?16p 端 -P13 


38q13-3 端 二 AT 


GPX1 
GRL 
GRP78 
GRS 
GSAS 
GSR 
GoST3 
GUK1 和 2 
GUSB 
GUSM 


转氨酶 


谷 胱 甘 肽 过 氧化 物 酶 -1 
淋巴 细胞 糖 皮质 激素 受 体 _ 
GRE78 葡 萄 糖 调节 蛋白 
zxGardner 综 合 症 
谷 氨 酸 -Y- 半 醛 合 成 酶 

谷 胱 甘 肽 还 原 酶 

谷 胱 甘 肽 S- 转 移 酶 -3 

-了 马 苷 酸 激 酶 1 和 2 

B- 葡 萄 糖 酸 苷 酶 

pB- 葡 萄 糖 酸 苷 酶 调节 物 - 


组 蛋 自 基因 家 族 (H，BH;A， 
HB，H3，H4) 
羟基 辅酶 2 赔 氢 酶 : 
2 去 于 
乙 醛 酶 22 ( 凑 基 
= 做 了 栈 ) “ 隐 系 上 -| 
血红 蛋白 wx- 链 


见 AG: 
血红 蛋白 8- 链 
见 NAG 
血红 蛋白 6- 链 


第 136 个 氨基 酸 为 丙 氨 酸 的 


血红 蛋白 Y- 链 


第 136 个 氨基 酸 为 甘氨酸 的 


血红 蛋白 Y- 链 


二 多 红 蛋 白 Y 调 节 物 
血红 蛋白 五 相关 的 金属 迟 组 


血红 蛋白 s 链 
血红 蛋白 z 链 ， 


血红 有 蛋白 假 基 因 


见 FHGC 


谷 胰 甘 肘 水 


3P13-9q12 
5 


:9 着 丝 粒 -q 端 - ， 


Y294。3=21 .3 
此 0 王 
8D21 .1 


“ 卫 1913=-22 


王 g32=42 

7 着 丝 粒 >q25 
19 

7q32=36 
(和 


16 


16p12-DP 端 


11P15 


11P15 


革 1Dp1i5 
11P15 
11pP15 


?16P 
11P1200-1203 


| 也 6P12-Pp 端 
16P12-p 端 


&Z49 8。 


二 
HCVS 见 CVS 
HD Huntington 病 
HEMA(F8C) ”典型 的 血 友 病 〈 血 友 病 及) 。 xq28 
HEMB(F9) B 血 友 病 Xq27 
HEXA 己 糖 胺 酶 入 15q22-25.1 | 
HEXB 己 靖 胺 酶 了 5q13 
HEFE 清 铜 色 糖尿 病 6 
Hh Bombay 表 型 19 “下 | 
HK1 己 糖 激酶 -1 10P 端 -11 
HLA-A，B, C 人 白细胞 抗原 6p21.3 ” 测 
HLA-D/DR D 相 关 的 人 白细胞 抗原 6p21.3 
HLA-DC DC 型 人 白细胞 抗原 6p21.3 | 
HLA-SB SB 型 人 白细胞 抗原 6p21.3 9 
HP 结合 组 蛋白 16d22 
HPA1 HpaI 限 制 性 内 切 酶 多 态 型 112P1205-1208 
HPRTI 次 黄 嘎 聆 鸟 嗓 叭 磷酸 核糖 转 xq20-27 
移 酶 - 恒 | 
HRAS1(RASH1) Harvey 大 鼠 肉瘤 -1 原 瘤 ”11P15.5-151 
基因 
HRAS2(RASH2) Harvey 大 启 肉瘤 -2 原 瘤 式 
基因 
HTO 妈 5- 羟 色 胺 氧化 酶 调节 物 21 
HVIS 疱疹 病毒 敏感 ?3 
HYA 位 点 AY 组 织 相 容 性 基因 了: 
HYB 位 点 BY 组 织 相 容 性 基因 。 式 
HYC 位 点 CY 组 织 相 容 性 基因 蕊 
IDA(LIDVA) 。 a-I- 女 杜 糖 醋酸 本 22D 端 -dl1 
IDDM 依赖 胰岛 素 的 糖尿 病 ?6 
IDH1 可 溶性 的 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 2p32-Q 端 
IDH2 线粒体 上 的 异 柠檬 酸 脱 氢 酶 15q21-9q 端 
IF1 -于 扰 素 1 和 


之 于 扰 素 2 ?5 


IFF(IFB) 
IFI(IFG ) 
IFLOIFA) 
IFR 
IFRC 
IGAS 
IGEP 
IGH 
IGHA1I 


IGHA2>2 


IGHD 


IGHE 


IGHG1 


IGHG2 


IGHG3 


IGHG4 


IGHJ 
IGHM 


IGHYV 
IGK 
IGKC 
IGKJ 
IGKV 
IGL 


成 纤细 胞 干扰 素 

免疫 干扰 素 
白细胞 干扰 素 基因 族 

见 AVR 

干扰 素 受 体 〈 抗 病毒 蛋白 ) 
免疫 球 蛋白 重 链 结合 位 点 
免疫 球 蛋白 E 假 基因 
免疫 球 蛋白 重 链 基 因 
免疫 球 蛋 白 Al 重 链 的 恒定 
区 基因 

免疫 球 蛋 白 Az 重 链 的 恒定 
区 基因 

免疫 球 蛋 白 D 重 链 恒定 区 
基因 

免疫 球 蛋 白 E 重 链 恒 定 区 
基因 

免疫 球 蛋白 G1 重 链 便 定 区 
基因 

免疫 球 蛋白 G2 重 链 恒定 区 
基因 

免疫 球 蛋 白 G3 重 链 恒定 区 
基因 
免疫 球 蛋白 G4 重 链 恒定 区 
基因 

重 链 连接 区 〈 多 ) 基因 
免疫 球 蛋白 M 重 链 恒 定 区 
基因 

重 链 可 变 区 的 〈 多 ) 基因 )' 
免疫 球 蛋白 K 轻 链 基 因 组 
k- 轻 链 恒 定 区 基因 

k- 轻 链 连接 区 基因 

K- 轻 链 可 变 区 〈 多 ) 基因 
免疫 球 蛋 白 N 轻 链 基 因 族 


9p24-13 
12gq24。1 
99q 端 =-p13 


219231-dq 端 
2 

9 g 
14q32.。3 
14932 
14q32 
14q32 
14932 
I49q32 
14932 
14932 
14932 


14 
14 


14 
2D 
2DP 
2D 
2P 


.22 


251。 


1 
中 IGEC N 轻 链 不 变 区 基因 ”22 
中 IGLJ :3N 轻 链 连 接 区 基因 22 
| icLV :IN 轻 链 可 变 区 《多 ) 基因 下 224 
IHG 对 合成 多 肽 的 免疫 应 管 。 6p 邓 .3 
| 藉 P-2EGAL 人 由 得 潍 淹 六 二 汪 
| IL? 见 TcGE- 总 瘟 会 
1 INS 胰岛 素 四; 证 p15-15.。5 
1 INSL - 类 胰岛 素 DNA 序 列 6p23-ql12 
下 INTI 致癌 基 因 INT， 推测 的 鼠 ” 12D 端 -q14 
类 忆 腺 瘤 致癌 基因 
IRDN 胰 高 血糖 素 相关 的 DNA 风 者 性 11p13-q15.5 和 
IR 兄 BRI1A，BR1B 6p2105-2300 
IS 免疫 抑制 : 重 C 咎 六 抑 的 让 3 sd。 
ITG(BRIA， ”对 合成 多 肽 的 免疫 应 答 
了 RBIB) STGMAL，- 二 20p - HH9I 1 
FTPP 次 黄 味 叭 三 磷酸 栈 2 
JK Kidd 币 型 12 S 
， 
KAR 萤 族 o- 酮 酸 还 原 酶 开导 2 全 DSD3 
KRAS1(RASK1)Kirsten 鼠 肉瘤 原 致 瘤 基 6D23=q12 
因 间 总 二 
KRAS2(RASK2)Kirsten 鼠 肉瘤 原 致 交 基 。 12 
二 2 
LAG5 白细胞 5 号 抗原 群 4 
LAE ， 只 收 缚 肌 麻 兽 》 全 习 实 呈 6 
LARS(RNTLS) 亮 毛 酰 -tRNA 合成 本 次 : 
LCATLI 久 磷 脂 - 胆 周 醇 转 酰 酶 16d22 
LCH 粘 合 基 状 体 凝 集 素 人 
LDHA 乳酸 脱 氢 酶 人 1i1p1203-1208 
LDHB 乳酸 脱 气 酶 B 1P121-122 
”这 50 


LDHC 
Le 


LEU7 


LGS 
LHB 
LIPA 
LIPB 
LSD 
Lu 


M130 
M]195 
M7VS1 


MANA 一 


MANB 
MAP9%7(M 
MAR 
MARS 
MADHI1 
MAPDH2 
MDI1 
MDLS 


MEF1 
ME2 
MEN2 
MHC 
MIC7 


MLRW 
MMC 
MN 


乳酸 脱氧 酶 C 
Lewis 血 型 


-中 性 杀伤 白细胞 的 Leu-7 


膜 抗原 
Langer-Giedion 综 合 症 : 


促 黄体 生 成 激素 8- 亚 单位 


溶 酶 体 酸性 脂 酶 A 
溶 酶 体 酸 性 脂 酶 也 
Letterer-Siwe 病 


-Lutheran 血 型 


外 膜 蛋 白 -130 
外 膜 蛋白 -195 
Baboon'M7 人 敏感 -1 


“细胞 质 ac-D- 甘 露 糖苷 酶 


溶 酶 体 c-D- 甘 露 精 苷 酶 
哇 色 素 瘤 相关 抗原 p97 
难 治 的 巨细 胞 性 贫血 


” 见 MTRNS 
“可 溶性 的 华 果 酸 脱 氢 酶 
线粒体 上 的 苹果 酸 脱 氢 酶 


狂躁 抑郁 人 性 疾病 


Miller-Dicker 脑 因 发 育 不 


完全 综合 症 


二 柯 溶 性 苹果 酸 酶 


线粒体 上 苹果 酸 酶 


. 工 型 多 内 分 沁 瘤 形成 
”主要 组 织 相 容 性 复合 物 
由 Imperial 瘤 单 克 隆 检 查 


的 并 连 细 胞 抗原 28-3-7 
弱 混 合 淋巴 细胞 反应 
皮肤 恶性 黑色 素 瘤 


MIN 血 型 


顺 316 


13914-31 
T9 


10 
这 

19 
15q11-q 端 
19pP 端 -q13 
3 


-59 


2p23 
7PE22-q22 
全 6 洒 
?17Pp13 


6q12， 
?11 


2 和 0 下 2 


6P2105-23 


MOS 致 痛 基 因 ， 莫 络 尼 氏 鼠 类 。 8q22 


肉瘤 病毒 3 
MDPI 甘露 糖 磷酸 异 构 酶 15d422-q 端 
MRBC 猴 红 细胞 的 B 细 胞 受 体 6 ] 
MS Menker 综 合 症 XD11-21 
MTR 5- 甲 基 四 氢 叶 酸 ，LL- 高 胱 1 .于 
氨 酸 s- 甲 基 转移 酶 
MTRNS 甲 硫 所 酰 -tRNA 合成 酶 12 
(MARS) 
MY 了 。 致癌 基因 ， 马 成 骨 骨 母 网 “6P21-22 
胞 瘤 病 毒 
MYC 致 六 基因 ， 成 骨 散 母 细胞 ”89q24 
瘤 病 毒 
MYHS 骨骼 肌 肌 纤 凝 蛋白 重 链 基因 族 17p11-? 端 
MYHSAI1 成 年 -1 骨骼 肌 肌 纤 凝 蛋白 重 链 17p11-Dp 端 
基因 族 
MYHSA2 成 年 -2 骨骼 肌 肌 纤 凝 蛋 自 重 链 17p11-p? 端 
MYHSE1 胚 性 -1 骨骼 肌 肌 纤 凝 蛋白 重 链 ， 17p11-? 端 
NAG(HBBC) 非 -a 珠 蛋白 族 11p1205-1208 
〈 迄 红 蛋 白 B- 族 ) 
NAGA N_-Z. 酸 基 -a-D- 氨 基 半 乳 ”22913 
NARS 见 ASNRS 
NB 成 神经 细胞 瘤 1p32-? 端 FM 上 
NDF 哮 中 性 分 化 因 了 于 -6 治本 
NEUI 神经 氨 [ 糖 ] 酸 背 酶 -1 ?6p2105-2300 
NGEF 神经 生长 因子 ”1p21-? 端 
NHCP1 非 组 蛋白 染色 体 蛋 白质 -1 7 
NHCPE2 非 组 蛋白 染色 体 蛋 白质 -2 16 


本 过 
NEF1 神经 纤维 痪 ?19 
NF2 神经 纤维 瘤 宙 六 
NEF3 : 家 覆 性 肠 神 经 纤维 瘤 ?12q21-24。2 失语 


OIAS 
OMPD 


OMR(ATPM) 
OPRT 


ORM 
OTC 


PAH(PKU) 
PAIS 
PBGD(UPS) 
PDB 
PDGF 
PEPA 
PEPB 
PEPC 
PEPD 
PEPS 
PFGS 


装 生 类 淋巴 组 织 增 生 -1 ?8q24。3 
闭 生 类 淋巴 组 织 增生 -2 ?18q24 


哮 中 人 性 迁移 7q22-q 端 
成 神经 细胞 瘤 MYC 致 瘤 -2D 
基因 

核 苷 磷酸 化 酶 ,， 胺 骨 发 14q13 
育 不 全 综合 症 
甲 -膝盖 骨 综 合 定 9q3 
致 瘤 基 因 NRAS 1p 

眼 白 化 -1 xp22 
眼 白 化 -2 XpPD22 
KKjer 型 视觉 减 缩 ?23 

2 ，5/- 异 腺 苷 酸 合成 酶 -11 
乳 清 酸 核 背 单 磷酸 脱羧 酶 

见 BPRT 


赛 霉 素 抗 性 (线粒体 ATP 酶 ) .10 


乳 清 酸 磷 酸 核糖 转移 酶 -q21 


-OMPE 脱 羟 酶 3 着 丝 粒 -q21 
血清 类 粘 蛋 白 9q34 

乌 氮 酸 转 氨 甲 酰 酶 XpD21 

苯 丙 所 酸 羟 化 酶 12 

氨基 咪唑 核 苷 酸 合成 酶 1 321 

胆 色 素 原 脱 氨基 酶 11q23-q 端 
Pagen 骨 病 ?6 
血小板 衍生 生长 因子 见 SIS 

肽 酶 从 18q13 

肽 酶 也 12424 

肽 酶 C 开 了 6 

肽 酶 D 19P 端 -ql13 
肽 酶 $ 4PI12-q12 


磷酸 核糖 甲 酰 甘 氨 酸 合成 酶 14. 
昌 芭 35 


PEFKL 

PEFKM 
PFKP(PFKF) 
PG 

PGAML 

PGDP 

用人 FE 


PGK 
PGMI 
PGM2 
PGM3 
PP 
了 I 
PKM2 
PKU 
PL 


-肝脏 磷酸 果糖 激酶 


肌 心 磷酸 果糖 激酶 
血小板 磷酸 果糖 激酶 

胃 有 蛋白酶 原 
磷酸 甘油 酸 变 位 酶 人 
6- 磷 酸 葡萄 糖 酸 脱 氨 酶 
磷酸 核糖 甘 氨 酰 胺 里 酰 
转移 

磷酸 甘油 酸 激酶 
葡萄 糖 磷酸 变 位 酶 -1 
葡萄 糖 磷 酸 变 位 酶 -2 
葡萄 糖 磷酸 变 位 酶 -3 
磷酸 烯 醇 式 丙酮 酸 磷酸 酶 
ax-1- 抗 胰 蛋 自 酶 
丙酮 酸 激酶 -3 

见 PAHL 

胎盘 催乳 激素 〈 同 CSA， 
CBB) 

血 纤维 蛋白 溶 酶 原 激活 物 
血 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 
原始 淋巴 细胞 实验 -1 

无 机 焦 磷 酸 酶 

磷酸 核糖 焦 磷 酸 氨基 转移 酶 
磷酸 核糖 甘 氨 酰 胺 合成 酶 


开 催 乳 素 


磷酸 丝氨酸 磷酸 酶 
磷酸 丝氨酸 磷酸 酶 
甲状 旁 腺 激素 

示 北 麻将 病毒 敏感 性 
pradef-Willi 综 合 证 


长 蔷 中 央 蜡 染色 质 片段 
长 璧 中 央 异 染色 质 片 段 “ 


时 qd22 
1 浅 比 粒 -q32 


10P 端 -pl11.1 
宛若 , 冰 
109q25 @ 3-20 


产 


1p36.13-?P 端 


14q22-q 端 


xdql3: 
1p221 
4p14-dqd12 
6q12 
16p13-12 


和 7 14d， 
15d22-q 端 


179210-220 


6 


4 
6p2105-23 
10q11.1-24 
4b 端 =dq21 
2L1922 
SR232Q12 汪 忆 ， 
入 
79q 端 -9q22 

H1] 和 端 -pl11 
19d 
15ql1-12 


13 
9 


:网 DHPR 


乙酰 胆 碱 酯 酶 调节 物 : 


RACH 23 
RAF1 致癌 基因 RAFI1 :3P25 
RAEF2 致癌 基因 RAFy》 人 
RB1 成 视网膜 细胞 癌 =- 工 - 13q1 和 1 
RCC 肾 细 胞 癌 ?3P211 
Rd Radia 血 型 1pP32-34 
REN 血管 紧张 肽 原 酶 IP21-9 端 
Rh Rh 而 型 1p32=36.11 
RGS Riegatr 综 合 症 . ?4q23=27 
RN5S 5SRNA 基 因 19g 下 2=43 
RNTMI1 起 始 甲 硫 tRNA 6p23=912 
(IRM1，2) 
RNR 核糖 体 RNA 1381 2 14p12，15p12j 
红 DP123 22p12 
RNU1 UI 小 分 子 核 RNA 1]p36 
RP1 色素 性 视网膜 炎 竹 庆 习 
RPE 核 酮 糖 5- 磷 酸 汉 - 差 向 异 ” 2q32-9 端 
构 酶 
RPS14 核糖 体 蛋 白 S14 即 EMTB 
RS 视网膜 先天 人 性 裂 ”Xp22 
RWS Ragweed 敏 感性 : 6 
S7 表面 抗原 7， 见 EGFR 
SAHHIAHCY) S- 腺 苷 半 胱 氨 酸 水 解 酶 20 着 丝 粒 -ql13 .1 
SC Scianna 血型 半 1P32-34 
SCA1 痛 艇 与 小 脑 的 次 济 失调 -11 6 
SCCL 肺 小 细胞 瘤 3p14-23 
SDH 琥珀 酸 脱氧 酶 1P221-q 端 
Se 分 说 腺 19 
Sf Stoltzfus 血 型 49 
SGP75 糖 蛋白 7500 表 面 抗原 业 和 寺 : 


257， 


SHMT 丝氨酸 羟 甲 基 转 移 酶 12q12-14 
SIS(PDGF) 。 致癌 基 因 :， 猿 肉瘤 病毒 22 


SK(D1S3) 致 次 基 因 ，Sloan= 1dqd12-q 端 
Ketteting 病 毒 
SOD1 可 溶性 过 氧化 物 岐 化 酶 “21q211 
SOD: 线粒体 上 过 氧化 物 岐 化 酶 621 
SORD 山梨 醇 脱 氢 酶 15D 端 -q21 
SP3 精子 发 生 因子 -3 ?yql1: 
SA2，SPA5 无 名 的 表面 多 肽 分 别 在 2 与 5 
SPC 唾液 蛋白 复合 物 ?6D 
SPH -球形 红细胞 [贫血 ] 证 8pll, ?14q 
SRC 致 冯 基 因 SRC( 劳 氏 肉 瘤 )” 20 
Ss Ss 了 血型 4q28-31 
SST 生长 激素 释放 抑制 因子 3q27-28 
STA- 身高 y 
STS 类 固 醉 硫酸 酯 酶 xp23 
ITCN2 反 式 维生素 Bi， ?16 of 17 
TCGEF(IL2) F- 细 胞 生产 因子 〈 间 月 4 
细胞 -2) 
TDS 皖 丸 决定 因子 y 
尝 末 转移 蛋 电 3 
TFM(DHTR) ” 皖 丸 内 性 化 综合 症 江 二 氢 xdq1l1:13 
学 丸 酮 受 体 ) 
TEFR 转移 蛋白 受 体 8 河 资 
TG |! 甲状 腺 球 蛋 扯 8 A > 于 遇 
THC 初级 血小板 增多 2 和 2 史 
TK1 可 溶性 胸 竹 喀 啶 激酶 17d21-22 天 作 2 
工 K2 线粒体 上 胸腺 喀 啶 激酶 16 
TKCR Goeminne TKCR 综 合 定 ?xd28 
TEPI1 和 2 磷酸 丙酮 酸 异 构 酶 -1 12q28 
TPR1 胰 蛋 白 -1 妊 贞 7922-q 端 
TS 牙齿 天 小 ?xgqll 


呈 和 了 到 


2586 


以 RS 


人 
注 : p 与 9 分 别 表 
表示 营 上 的 位 置 


硬 腾 用 


尿 苷 二 磷酸 葡萄 糖 焦 磷酸 化 1q21-23 


1- 酶 

尿 苷 二 磷酸 葡萄 糖 焦 态 酸化 2 
酶 -2 

尿 苷 单 磷酸 激酶 1p32 
尿 苷 磷酸 酶 7 

尿 中 啉 原 1 合 成 酶 即 PBGD 

紫外 损伤 修复 13 
见 DIPI 

非典 型 的 卵黄 状 斑点 营养 ?16P 
不 良 你 


_Willms 交 /无 虹膜 /性 及 11p13 


真性 瘤 /迟钝 
色 氨 酰 -tRNA 合成 酶 4q21-q 端 
Warardenburg 综 合 症 -1 ?99q34 


xg 血 型 Xp22.3 
kel11 面 型 前 体 :Xp22.3 
着 色 性 于 皮 病 A 互 补 1q 
X- 射 线 敏 感 ?13q14 
〈 陈 炬 ) 


示 染 色 体 上 的 短 臂 与 长 辟 ， 前 面 的 数字 表示 几 号 染色 体 后 面 数字 


9 259。 


实验 ] 。 果 蝇 的 培养 与 观察 


果 蝇 属于 昆虫 岗 、 双 翅 目 ， 与 家 蝇 是 不 同 的 种 。 它 的 生活 史 


与 一 般 的 昆虫 一 样 ， 孵 一 幼虫 一 晴 一 成 虫 。 果 蝇 具 有 生活 史 短 ， 
繁殖 率 高 ， 饲 养 简便 及 突变 性 状 多 等 特点 ， 是 研究 得 传 学 的 经 典 
材料 。 证 


四 机 产生 理 ， 了 全 全 仙人 
及 几 种 常用 的 突变 类 型 。 


二 、 实 验 材料 中 是 
野生 型 和 儿 种 常见 的 突变 型 果 蝇 。 
乙醚 酒精 琼脂 玉米 粉 红糖 酵母 粉 银子 ”放大镜 
解剖 镜 ”毛笔 ， 白 瓷 板 石棉 网 酒精 灯 麻醉 瓶 广 只 瓶 丈 
菌 指 管 ”培养 四 消毒 滤纸 等 
、 实 验 步骤 
(一 ) 果 蝇 培养 


“沿用 的 玉米 饲料 配方 如 下 蔗糖 138 玉米 粉 17g -琼脂 二 


260 


所 care 


”一 25 酵母 粉 1.4g ” 丙 酸 或 乙酸 Iml 水 150g 

饲料 配制 步 又，(1) 琼脂 和 芒 糖 中 加 入 80ml 水 ， 烧 开 至 琼脂 
深化。(2) 玉米 粉 和 酵母 粉 中 加 入 80ml! 水 ， 烧 开 调 义 ; 〈3) 将 
(1) 与 (2) 混 合 后 ， 加 入 lml 丙 酸 盖 分 装 到 灭 菌 的 饲料 瓶 或 指 管 中 ， 
用 纱布 包 训 的 棉花 球 作 瓶 塞 。 饲料 冷却 后 插入 经 灭 菌 的 滤纸 ， 作 
幼虫 化 晴 时 的 干燥 场所 。 

果 蝇 一 般 培 养 在 恒温 箱 内 ， 最 适 温 度 为 20 一 25。30"C 以 上 
能 使 果 蝇 不 育 和 死亡 ， 低 温 则 使 它 的 生活 周期 延长 ,生活 力 降低 。 
在 25* 时 ， 从 孵 到 成 虫 约 需 10 天 ， 成 虫 存 活 约 15 天 。 培养 产 上 应 
贴 上 标签 ， 写 明 名 称 和 培养 日 期 。 

(二 ) 果 蝇 的 观察 : 训 

工时 蝇 的 麻 醇 ， 将 果 蝇 倒 入 麻 莅 瓶 中 进行 麻醉 。 注 意 掌 握 麻 
醉 的 时 间 ， 一 定 程度 时 把 果 蝇 倒 在 自 瓷 板 上 。 当 果 蝇 翅 膀 外 展 45” 
角 时 ， 表 示 已 经 死亡 。 

2 . 果 蝇 外 部 形态 的 观察 ， 果 蝇 分 头 、 胸 、 腹 三 部 。 头 部 有 一 
对 大 抑 复 眼 汪 三 个 单眼 和 一 对 触角 ， 胸 部 有 三 对 足 、 一 对 翅 ， 在 
最 后 一 对 足 和 翅 之 间 有 一 对 平衡 棒 ， 腹部 表 面 有 黑色 条 纹 ， 上 腹面 
有 腹 片 * 处 生殖 器 在 腹部 末端 。 


3 . 崔 雄性 的 鉴别 ; 
届 司 :腹部 未 端 | 有 部 条 纹 | -外 生殖， 器 性 ， 杭 
大 | 元 色 . 端 大 | 可 抑 5 条 | 阴道 板 。 应 寺 板 等 无 


3 | 水 | 黑色 钝 圆 | 可 见 3 条 | 生殖 弧 、 肛 上 板 、 阴 蔡 等 | 在 前 足 只 节 上 
未 企 必 


-4. 妃 种 突变 类 型 的 观察 ， 观察 野 生 型 和 黑 擅 体 、 黄 体 、 残 翅 、 
白眼 、 棒 眼 、 焦 刚毛 等 几 种 突变 型 的 体 色 、 眼 色 、 眼 形 、 翅 形 及 
刚毛 ， 将 观察 结果 列表 填写 。 


261 。 


实验 2 。 采 曲 单 因 子 杂交 实验 ， 


验证 分 离 定律 。 
二 、 实 验 材料 


野生 型 果 蝇 ， 残 地 果 蝇 。 
”。 双 简 解剖 锁 牛奶 瓶 ” 麻 醉 瓶 ， 白 瓷 板 “海绵 板 “ 解 齐名 
毛笔 银子 琼脂 藤 糖 ”玉米 粉 ”酵母 粉 丙 酸 


三 、 实 验 步 最 


1 选 葡 过 果 蝇 (vg/vg) 和 野生 型 果 昭 (+ /+ 1) 为 亲本 ， 进 行 杂 
交 ( 正 交 或 反 交 )。 但 母体 一 定 要 选用 处 女 蝇 ， 培养 两 瓶 ， 每 瓶 
5 一 6 对 。 贴 上 标签 ， 记 上 “p?( 亲 本 )、 交配 日 期 和 实验 者 姓名 。 

2.7 一 8 天 后 移 去 亲本 果 蝇 。 中 

3. 待 Fl 成 虫 出 来 后 ， 观察 子 代 (Fi) 翅 膀 。 一 

4 .在 一 个 新 鲜 培 养 瓶 内 ， 放 5 或 6 对 Fi 果 蝇 ， 这 里 肉 蝇 无 须 处 
女 照 。 贴 上 标签 ， 记 上 “F”。 

5.7~8 天 后 移 去 Fl。 

6 .在 第 二 代 (F:) 果 蝇 出 现 后 ， 鉴定 有 多 少 是 野生 型 ， 有 多 少 
是 残 示 。 连 续 统 计 7 一 8 天 ， 被 统计 过 的 果 蝇 立即 放 到 死 蝇 盛 器 中 。 


四 、 实 验 记 录 


按 下 列 格式 记录 所 得 的 结果 : 
试验 编号 ”开始 日 期 
P ” 残 世 (vg/vg) x 野 生 型 (+/+) 


mo 262 9 


妓生 型 果 蝇 〈+ ) 的 数目 


东 
冰 


野生 型 (+) 残 翅 (Vg) .-。 
次 验 观 察 数 (0 ) 
理论 数 (3:1)(c) 


偏差 (0 -ec) 


(0-c)2 
C 


。，263， 


二 果 晶 二 对 因子 杂 交 实验 


一 、 实 验 目的 和 
验证 自由 组 合 定律 。 
、 实 验 原 理 


二 和 染色 体 上 的 _ 对 等 位 
基因 + /vg 所 控制 ， 正 常 考 为 显 性 。 灰 体 和 黑 擅 体 是 另 一 对 相对 
性 状 ， 由 第 三 染色 体 上 的 一 对 等 位 基因 + /e 所 控制 , 灰 体 为 显 性 。 
所 以 将 黑 擅 体 (正常 薄 ) 果 晶 与 残 退 〈 灰 体 ) 果 蝇 杂交 ， 下 : 代 全 
部 是 正常 还 灰 体 。F; 代 瞧 雄 蝇 互 交 ，EF, 代 产生 性 状 分 离 , 出 现 四 
种 表 型 正常 还 球 体 ， 正 常 到 黑体， 残 好 灰 体 ， 残 地 黑体 ， 其 比 
机 时 贡 奖 帮 于 刺 天 八条 生生 
自由 组 合 的 。 


三、 实验 材 料 
黑 擂 体 果 蜗 与 残 迎 果 蝇 ， 其 余 用 品 与 实验 2 相同 。 


四 、 实 验 步 又 
除 本 材料 和 观察 统计 的 表 型 外 ， 其 余 均 与 实验 二 相同 5 


五 实验 记录 与 数据 处 理 


”试验 编号 开始 日 期 
P 黑 擅 体 (+ +ee) x 残 世 (VgVS8 十 十) 
F, 的 表现 型 ， -| 


F, 的 表 型 统计 :， ， 
26#。 


本 人 六 FS 和 汪 语 “ 煞 ， 目 


统计 日 期 、、、| 常 迎 灰 体 | 常 地 黑体 | 残 迎 灰 体 | 残 迎 黑体 
本 
将 


用 x:?( 卡 平方 ) 法 测定 统计 F, 所 得 结果 ; 
人 
3 
式 中 0 为 观察 个 体 数 ，c 为 理论 个 体 数 ， 马 示 各 项 之 和 ， 为 
自由 度 〈 即 分 离 类 型 数 减 1)。 求 得 X: 值 后 ， 根 据 自由 度 (ID) 查 Xs 


者， 得 概率 P。P>0.05 时 ,实验 结果 符合 理论 比例 P<0.05 时 ， 
实验 结果 不 符合 理论 比例 。 


实验 4 果 曲 的 伴 性 租 伟 


本 \… 实 验 目的 
了 解 伴 性 遗传 的 规律 及 伴 性 基因 在 正 反 交 中 的 差异 。' 


二 、 实 验 原理 


性 染色 体 上 的 基因 随 性 染色 体 而 传递 ， 所 以 它们 所 决定 的 性 
状 与 性 别 相 联系 ， 这 种 遗传 方式 称 为 伴 性 遗传 。 
果 蝇 红眼 与 白眼 是 一 对 相对 性 状 ， 分 别 由 X 染 色 体 上 的 基因 


065 。 


X-“ 和 X" 决 定 ，X* 对 X" 是 显 人 性 。 因 为 崔 邵 的 性 染色 体 组 成 是 XX， 
而 雄 蝇 是 XY，Y 染 色 体 上 没有 相对 应 的 基因 。 所 以 红眼 果 蝇 与 白 
眼 果 蝇 杂交 时 ， 正 交 与 反 交 的 结果 不 同 。 

了 攻 - = 杰 一 汪 


P X+X+ xXwY XwYwxX+ 了 
K 洁 队 ， NO 
w YY 3 
二 全 sx||- 生 一 一 汪 
1 X+| X+XW_X+Y XW | X+XW XWTY 
时 红 。 op 红 时 红 , -oz 自 


由 上 图 可 见 ， 正 交 子 一 代 的 肉 雄 蝇 都 是 红眼 ， 而 挨 交 子 一 代 
的 肉 蝇 是 红眼 ， 雄 蝇 是 白眼 。 当 Fl 代 峻 雄 个 体 互 交 时 ,F: 的 分 离 
比 也 随 之 而 异 。 


起 
全 -ad 和 neediw 


三 、 实 验 材料 
野生 型 果 蝇 和 白眼 果 蝇 ， 其 余 同 实验 2。 


hv 


四 、 实 验 步 最 


1. 选 取 红 眼 (野生 型 ) 和 白眼 处 女 蝇 , 分 别 做 正 反 交 , 各 二 瓶 。 ， 

2 ,每 瓶 放 果 蝇 3 一 5 对 ， 正 交 红 眼 ?X 和 白眼 3 : 反 交 白眼? x 
红眼 和， 培养 在 23Y 的 恒温 箱 中 。 

3 .一 周 后 倒 去 亲本 。 

4. 观 察 Fi 代 了 眼色 ， 记 载 正 反 交 结 果 (总 数 和 百分数 )。 

5. 从 各 瓶 中 选取 崔 、 纪 果 电 若 干 对 ， 移 入 新 鲜 寺 养 其 进行 杂 
交 ， 置 23 忆 温 箱 培养 。 

6 .一 周 后 倒 去 Fl 代 果 蝇 。 

7 ,观察 FE, 代 果 蝇 ， 鉴 别 肉 雄 蝇 。 


五 、 实 验 报告 人 
1. 列 表 统 计 记 载 Fi 代 正 反 交 与 FE: 代 正 反 交 的 各 类 时 蝇 数目 。， 


266 。 


2. 对 实验 观察 数据 进行 X: 检 验 ， 验 证 是 否 与 理论 比值 相符 。 
3.。 解 释 所 得 到 的 结果 。 


实验 9 。 果 晶 的 三 点 测 交 


一 


一 实验 目的 
兆 握 用 “三 点 测 交 ? 进 行 基因 定位 的 方法 。 
二 ,实验 原理 


位 于 不 同 染色 体 上 的 两 对 基因 ， 它 全 所 次 定 的 两 邓 相 对 性 关 
在 F: 代 是 自由 组 合 的 。 而 同一 条 染色 体 上 的 基因 则 是 连锁 的 , 但 
. 同 源 染色 体 的 基因 之 间 可 以 发 生 交换 ,交换 的 百分率 即 为 重组 值 。 
重组 值 去 掉 百 分 符号 后 就 是 基因 在 染色 体 上 的 相对 距离 ， 即 基因 
间 的 图 距 。 三 点 测 交 就 是 通过 三 对 连锁 基因 的 交换 行为 ， 确 定 三 
对 基因 在 染色 体 上 的 相对 位 置 。 

已 知 白 眼 (w)， 短 翅 (m) 和 焦 刚 毛 (sSn?) 都 是 X 染 色 体 上 的 隐 
性 突变 。 先 将 三 隐 和 性 体 作 为 母 本 ， 与 野生 型 雄 蝇 杂交 ， 


m sn3 W 十 十 十 
和 ae 者， 


Im Sn3 W m Sns W 
十 十 十 


测 交 后 代 
Fi 代 如 图 所 示 得 到 三 杂 合 体 肉 蝇 (wmsn */ + + + ) 和 三 隐 性 
体 的 雄 蝇 (wmsn*/Y)。 将 三 杂 合 体 肉 蝇 与 三 隐 人 性 体 的 雄 蝇 测 交 ， 
观察 测 交 后 代 的 表 型 ,将 数据 按 下 表格 式 填 写 , 并 计算 重组 值 , 作 
连锁 图 。 


267w 


示例 ， 


基因 间 是 否 重组 


测 交 后 代表 型 


W Sns8 Im 


+ 十 二 


W 十 十 
二 sns Im 
W Sna 十 

二 


+ 二 mm 


王 ”S523” 十 
W -于 im 


总 ， 计 
重组 值 15.1% 133.5% 


由 此 得 wsns m 三 个 基因 的 连锁 图 
:的 苞 Sn， 20 全 二 
HesrT3TETTTERDR3OIETE EC 全 二 二 全 本末 


三 、 实 验 材 料 
三 隐 性 采 蝇 瑟 野 生 型 果 天 为 实 允 素 本 材料 ， 其 剑 辣 实 验 二 。 


四 、 实 验 步 野 ， 
1. 将 三 隐 性 处 女 蝇 与 野生 型 礁 蝇 杂 交 。， 
HE 
培养 。 放 国 矿 乔 问 
3 .一 周 后 除去 Fi 成虫。 
4. 自 EF: 羽 化 之 日 起 每 隔 一 寺村 双 六 生出 线 坝 二 机 
观察 其 表 型 。 首 先 按 眼 色 翅 形 分 为 四 类 ， 白 短 、 白 长 、 红 短 写 红 ， 


208 


6 二 . 条 下 汗 SWEET ae Ar 


。 亦 。 然 后 仔细 观察 四 类 中 的 个 体 ， 将 焦 刚 毛 与 直 刚 稳 分 开 ， 连 续 
-5 按 示 个 方法 计 企 重组 值 ， 给 抽 连 锁国。 


可 。 ， 卖 验 G， 果 晶 的 哈 腺 染色 体 


果 电 幼虫 期 面 腺 的 细胞 核 非常 大 ， 三 腺 染色 体 比 其 他 细胞 染 
色 体 大 200 多 倍 。 它 们 是 通过 核 内 有 丝 分 裂 形 成 的 多 线 染 色 体 ,一 
条 染色 体内 含有 染色 线 多 达 千 条 以 上 ， 故 也 称 巨 大 染色 体 。 在 唾 
腺 染色 体 上 也 可 看 到 重复 、 倒 位 、 易 位 、 缺 失 等 染 名 体 瑚 变 ， 是 
研究 畸变 的 好 材料 。 


一 、 实 验 目的 


观察 果 蝇 的 唾 腺 染色 体 ， 练 习 果 蝇 幼 虫 唾 腺 分 离 技术 及 吐 腺 
染色 体 的 制 片 方法 。 


二 、 实 验 材料 


有 果 蝇 三 龄 幼虫 亩 对 : 沫 嫌 浆 

解剖 镜 ”显微镜 ” 狠 子 解剖 针 载 玻 片 ” 盖 玻 片 ”吸水 纸 
石蜡 

酷 酸 洋红 村 生理 盐水 (0， 7 妈 的 所 化 钠 ) IN HCI 
共 售 水 


\ 实 验 步 骤 


1 .幼虫 的 解剖 ， 将 载 玻 片 置 于 解剖 镜 下 , 滴 上 二 渍 生理 盐水 。 
将 幼虫 置 于 生理 盐水 内 ， 一 手持 解剖 针 按 住 幼 时 未 端的 173 处 ,以 
固定 幼虫 。 另 一 手持 针 揪 住 幼虫 头 部 正中 ， 用力 向 前 拉 ， 把 头 部 


人 53 。 


从 身体 拉 开 ， 腺 体 即 随 之 而 出 。 腺 体 半 透明 ， 呈 棍棒 状 ， 位 于 食 
道 两 侧 ， 中 间 夹 有 神经 球 。 尽 可 能 把 腺 体 边 上 的 脂肪 剔除 。 

2 .染色 前 处 理 ， 清除 残 体 ， 使 载 片上 只 留 下 唾 腺 ,然后 滴 一 
滴 1N HCL， 解 离 2 一 3 分 钟 ， 用 吸水 纸 吸 干 HC1， 再 用 蒸 饮水 洗 二 
次 ， 用 吸水 纸 吸 净 四 周 水 份 。 

3 .染色 ， 滴 上 一 滴 栈 酸 洋红 ，1 一 2 分 钟 后 吸 干 。 再 滴 一 滴 新 ， 
染 液 ， 染 色 20 分 钟 以 上 。 也 可 用 其 它 染 液 如 卡 宝 品 红 、 龙 胆 紫 。 

4. 压 片 : 在 载 片 上 加 一 滴 醋 酸 ， 加 盖 玻 片 ， 盖 片上 覆盖 一 吸 
水 纸 ， 加 压 后 可 用 螨 将 盖 玻 片 四 周 封 住 ， 以 防 干 燥 。 

5. 显 微 镜 下 观察 ， 好 的 片子 ， 可 做 永 入 片 。 


四 、 永 久 片 的 制作 法 


1. 用 冰 栈 酸 脱 去 盖 片 。 

2 .在 无 水 酒精 中 浸 1 工分 钟 ， 用 吸水 纸 吸 干 余 液 。 
3. 再 在 无 水 酒精 中 浸 IL 分 钟 。 

4. 二 甲苯 5 分 钟 。 

5 .一 甲 茉 5 分 钟 。 

6 .中 性 树胶 择 片 。 


五 .作业 
绘制 果 蝇 唾 腺 染色 体 图 。 


入 
站 

污 
不 

玖 
王 
二 
汪 


实验 1 ”粗糙 链 苞 霉 的 分 离 和 交换 


一 、 实 验 目的 


通过 对 链 孢 略 杂 交 所 产生 的 子 襄 孢 子 的 观察 ， 了 解 分 离 和 交 
换 现 象 ， 进 而 计算 出 基因 与 着 丝 粒 之 间 的 距离 ,作为 其 遗传 图 距 。 


esZ70。 - 


二、 实验 原理 

链 钨 霉 又 称 红色 面包 霉 , 是 一 种 子囊 菌 , 已 知 有 人 -5 种 。 它 的 营 
养 体 是 单 倍 的 (mn = 7)， 由 多 核 菌 丝 构成 。 生 殖 方式 有 有 性 和 无 
性 两 种 。 菌 丝 经 有 丝 分 裂 直 接 发 育成 菌 丝 体 ， 称 无 性 生殖 # 而 两 
种 不 同 接合 型 结合 产生 有 性 孢子 的 过 程 称 有 性 生殖 。 有 性 生殖 可 
通过 两 种 方式 进行 ， 分 生 孢 子 落 在 另 一 接合 型 的 原子 囊 果 的 受精 
丝 上 ， 可 形成 合子 ， 不 同 接合 型 菌 丝 中 的 核 融合 成 合子 ， 产 生子 
圳 果 。 


二 售 体 的 合子 经 过 二 次 减 数 分 裂 成 四 合子 ， 每 个 核 又 进行 一 


次 有 丝 分 裂 ， 发 育成 以 一 定 顺 序 排 列 的 八 个 子囊 孢子 。 若 两 个 亲 
代 菌 株 有 某 一 遗传 性 状 的 差异 ， 那 么 杂交 形成 的 每 一 子宫 必 有 四 
个 子 赛 钨 子 属于 一 种 类 型 ， 其 他 四 个 子囊 孢子 属于 另 一 类 型 。 成 
熟 的 子 诈 孢 子 在 适当 的 条 件 下 可 发 育成 菌 丝 ， 形 成 新 的 一 代 。 子 
赛 钨 子 的 性 状 分 离 是 严格 的 1:1, 而 且 有 一 定 顺序 。 因 此 可 以 直接 
观察 分 离 现 象 和 交换 现象 。 


三 、 实 验 材料 


野生 型 (1ys”) 和 赖 氨 酸 缺 陷 型 (1ys-) 

普通 显微镜 钟表 银子 解剖 针 _ 接种 针 载 玻 片 ”试管 
三 角 烧 瓶 等 

培养 基 的 各 种 试剂 5% 的 次 氯 酸 钠 ; 5% 石 碳酸 。 

四 、 实 验 步 又 


(一 ) 培 养 基 的 配制 

1. 基 本 培养 基 ( 野 生 型 可 生长 ,缺陷 型 不 长 ): 蔗 糖 108，CaCl， 
0:1gyNaGCl 0:18，NH4NOs:1g， 酒 石 酸 5g, 生 物 素 如 g,M8gSO， 
s7H2O0.5g,KH,PO,1g, 微 量 元 素 溶 液 (NaB,O0;)。10H2O88mg， 
CUSO。5H:O0393mg,Fe:(SO,)s。。6H2O910mg，ZnSO:7H2O8807 
mg， 蒸 饮水 1000ml)1ml。 将 这 些 成 份 溶 于 1000ml1 蒸 饮水 中 ， pH = 
5.5 信 6.5。 固 体 培 养 基 则 另 加 2%% 琼 脂 。 


s 271。 


2 .补充 培养 基 ， 每 100ml 的 基本 培养 基 中 加 入 泛酸 钙 0.2mg 


叶酸 0.2mg 此 哆 醇 0.05mg 硫 胺 素 0.1mg 氯 化 服 碱 0.2mg 
肌 醇 0.4mg ”对 氨基 葵 酸 0.05mg 核 黄 素 0105mg 
3. 玉 米 琼 脂 培养 基 :( 供 杂交 实验 用 )， 将 玉米 粒 在 水 中 浸泡 
， 了 脉 干 ， 每 试管 放 2 一 3 粒 ， par 
0 (长 度 3 一 4m)， 加 上 棉 塞 ， 和 生生 村。 
(二 ) 菌 种 的 活化 
为 使 菌 种 生长 得 好 ， 先 要 进行 菌 种 活化 。 所 野生 班 和 疙 所 本 


陷 型 菌 种 从 冰箱 中 取出 ,分 别 接种 在 基本 培 人 养 基 圭 y 


在 25 人 恒温 箱 中 培养 3 一 4 天 。 
(三 ) 杂 交 
长 好 的 菌株 在 菌 丝 的 上 部 有 红粉 状 苞 子 ， 将 两 个 菌 各 (lys” 
”， 广 1》s-) 接种 在 同一 玉米 培养 基 鞋 ， 贴 上 标签 ， 培 养 在 25 字 恒温 
箱 中 1 一 3 周 ， 直 至 有 棕 黑 色 的 子宫 果 出 现 为 止 。 并 非 所 有 的 子囊 


果 )。 
四) 观察 
1. 在 长 有 黑色 子囊 果 的 试管 中 ， 加 少量 无 菌 水 ， 灸 动 片刻， 
倒 在 空 三 角 瓶 中 ， 加 热 煮 沸 ， 以 防 分 生 孢 子 飞 扬 。 
2. 在 载 片上 滴 一 滴 5% 次 氯 酸 钠 溶液 ， 用 接种 针 挑 出 几 个 子 训 
果 放 在 次 氯 酸 钠 中 5 分 钟 。 
3. 取 另 一 载 片 ， 把 一 个 子 训 果 压 碎 , 在 10x15 们 的 显微镜 下 ， 


子 麦 类 型 观察 ” 数 
+ 和 尘 忆 二 一 二 站 一 
一 交 人 三 一 一 一 十 十 干 寺 
十 十 二 二 二 .十 二 二 
L 站 
交 |, 换 型 + 十 一 一 一 一 十 二 


一 一 十 十 十 十 一 二 


合 计 - 


“272 。 


果 都 有 用 ， 因 为 未 受精 的 分 生 和 孢子 也 能 形成 空 的 子囊 壳 (原子 历 


We 四 有 
0 
生 二 了 和 ES 的 = Di We、 ateac 4 3 


ww 


的 不 村 列 顺序 ， 和 全 开 合生 


情 说 3 中 
《五 ) 计 算 交 换 值 


观察 若干 子囊 果 ， 记 录 每 个 完整 的 子 历 型 。 
按 下 列 公式 计算 交换 值 : 


二 1 交换 型 子 春 数 :1 
“观察 到 的 子 要 总 类” 2 


rs 

二 实验 用 过 的 接种 针 要 过 火 灭 苗 。 

? .儿子 放 入 次 氧 酸 钠 中 浸泡 5 分 钟 后 洗 桨 。 

#- 三角 拓 中 的 流体 才 沸 9 分 名 后， 才能 例 掉 (不 要 把 未 者 


的 黄 液 倒 六 水 槽 中 )， 洗 净 瓶 子 。 
看 用 过 的 裁 玻 片 随即 放 入 石 迪 酸 缸 中 浸泡 ， 以 杀 死 子 可 允 子 


思考 题 


1. 链 孢 霉 杂交 后 ， 减 数 分裂 过 程 如 何 ? 


2. 链 苞 霉 的 分 离 现 象 与 高 等 动 、 植 物 是 否 不 同 ? 


3 结合 课堂 内 容 ， 说 明 什么 是 交换 ? 
4. 计 算 交 换 值 时 ， 为 什么 要 除 以 2? 


实验 8 酵母 菌 的 杂交 实验 


一 、 实 验 原 理 
酬 母 菌 是 单 细胞 的 真菌 ， 一 般 以 出 芽 方 式 繁殖 。 许 多 酵母 菌 


还 能 形成 有 性 孢子 ， 是 减 数 分 裂 的 产物 。 对 于 能 产生 孢子 的 酵母 ; 
还 可 用 杂交 的 方法 进行 遗传 分 析 或 选 育 。 用 两 种 不 同 的 接合 型 酵 


aa 273 ww 


和 
钊 


母 (各 具有 不 同 的 营养 缺 陷 型 标志 ) 进 行 杂交 。 它 税 自 碳 在 基本 培 
养 基 上 都 不 能 形成 菌落 ， 只 有 当 这 两 种 缺陷 型 杂交 后 ， 细 胞 中 的 
遗传 物质 发 生 重组 ， 产 生 的 杂种 细胞 才能 在 基本 培养 基 上 生长 。 

二 、 实 验 材 料 

1. 酵 母 菌 单 倍 体 的 腺 味 叭 缺陷 型 和 赖 氨 酸 缺陷 型 。 

2 .生理 盐 水 :0.85gNaCl 溶 于 100ml 蒸 饮水 ,15 磅 灭 菌 15 分 钟 。 

3. 完 全 培养 基 间 站 入 2 和 生生 于 机 技 相生 全 仆人 全 全 于 外 和 
pH6 .0 固体 培养 基 则 另 加 2g 琼 脂 15 磅 灭 菌 15 分 钟 

4. 基 本 培养 基 ;葡萄 糖 108,(NH,);SO,1000mg 天 HPO,125 
mg，KH,PO,875mg,MgSO,。7H 了 ;CO500mgyCaCl,。2 了 9100mg， 
NaCll00mg，KI0.1mg， 微 量 元 素 母 液 〈 每 100ml 含 HEO,imSg、 
ZnSo,.7H,O7mg、 CuSO,。5H,Olmg、CoCcl: 6HO5mg) 151， 
维生素 母液 〈 每 100ml 含 烟 酸 40mg、 硫 胺 素 40mg、 册 醇 200mg 、 核 
黄 素 20mg、 对 -氨基 葵 甲 酸 20mg 盐酸 吡 哆 醇 40mg、 泛 酸 40mg、 
生物 素 0.2mg) 1ml， 水 1000ml pH5 .3 固体 培养 基 另 加 2 骂 玉 脂 。 
8 磅 灭 菌 .15 分 钟 

5 . 产 孢 子 培 养 基 : 无 水 醋酸 钠 0.82%，,(CHsCOONa) KCl 
0.186%, 吡 哆 醇 0.2mg/1 泛 酸 0.2mg/ 生 物 素 0.02mg/1, 琼 脂 2% 。 


三 、 实 验 步 聂 
1. 两 菌 种 各 接种 二 支 完全 培养 基 斜 面 ，307 恒温 箱 中 培养 24 
” 小 时 。 
2. 用 5ml 生 理 盐 水 将 斜面 洗 下 ， 制 成 10s/ml 的 菌 液 。 
3. 将 两 亲本 菌 液 各 0.5ml, 分 别 放 入 5ml 液 体 的 完全 培养 基 中 ， 
307 静 止 培养 2 小时。 
4.3000rpm 离 心 3 分 钟 ，30 静 止 培 养 半 小 时 。 


5. 倒 去 上 清 液 ， 打 匀 管 底 菌 块 ， 再 加 入 6ml 新 鲜 的 液体 完全 


培养 基 ，30C 培养 8 小 时 。 
6. 离心 ， 倒 去 上 清 液 。 再 加 6ml 液 体 完 全 培养 基 ， 洗 一 次 ， 


6274。 


离心 ， 倒 去 上 清 液 。 

7. 将 两 个 离心 管 中 的 沉淀 物 ， 接 种 于 同一 产 孢 子 培养 基 斜 面 
上 ，307 培 养 7 一 10 天 。 在 显微镜 下 观察 杂交 形成 的 子囊 孢子 , 计 
算 子 事 抱 子 的 百分数 。 


四、 测定 杂交 种 
1. 在 长 有 子囊 孢子 的 斜面 上 ， 加 基本 培养 液 2m1， 用 接种 环 


将 子 监 疱 子 刮 下 来 ， 倒 入 无 菌 离心 管 中 。 


2. 在 60 立 的 恒温 水 浴 中 加 热 15 分 钟 ， 杀 死 酵母 菌 的 营养 体 。 


离心 ， 倒 去 上 清 液 ， 加 生理 盐水 到 原 体积 。 


3. 孢子 悬 液 经 纤维 素 酶 或 蜗牛 酶 处 理 ， 除 去 子宫 壳 ， ps 
石英 砂 振 划 ， 使 其 中 的 抱 子 散 开 。 

4. 取 钨 子 悬 液 涂 在 完全 培养 基 的 平板 上 ，30 立 培养 48 小 时 。 

5. 影 印 培养 ， 以 上 面 的 平板 为 母 板 ， 依 次 影印 在 以 下 的 平板 
培养 基 上 ， 基本 培养 基 ! 基本 培养 基 加 腺 嘎 吟 ! 基本 培养 基 加 赖 


氨 酸 ;完全 培养 基 。30T 培养 48 小 时 。 


6. 分 析 杂 交 种 的 基因 型 。 


| 基本 培养 基 | 基本 培养 基 单 倍 体 的 
基本 培养 基 完全 培养 基 
加 腺 嗓 叭 加 赖 氨 酸 基 因 型 
卫 2 二 
一 十 一 二 
4 au 中 玫 轴 
一 二 十 十 


7. 从 母 平板 挑 取 各 个 已 经 初步 鉴定 的 菌落 ， 分 别 接种 在 完全 
培养 基 斜 面 上 及 盛 有 完全 培养 液 的 离心 管 中 ,307 中 培养 48 小 时 ， 
以 作 生长 谱 鉴定 。 


。275 


实验 9 “大 肠 杆 芙 的 杂交 实 划 


一 、 实 验 诛 理 


大 肠 杆菌 中 存在 着 致 育 因子 FE， 有 F 因 子 的 并 肪 祥 菌 为 FE+ , 没 
有 了 F 因 子 的 为 E-。 而 F 因 子 又 有 两 种 状态 存在 ,游离 状态 和 整 合 
状态 〈EF 因 子 揪 在 染色 体 一 定 的 位 置 上 ); 前 者 称 F+ 细 苞 ， 后 者 称 
HEr 细 胞 。Hfr 的 重组 频率 一 般 为 10-*， 比 EF+ 高 1000 倍 ;- 称 高 频 重 
组 。 大 肠 杆菌 的 接合 ， 实 质 上 是 FE 因子 的 转移 ,所 以 寻 和 Hfr 被 称 
为 供 体 细菌 3 而 E- 为 受 体 菌 ， 将 供 体 凋 与 受 体 苗 混合 后 霸 养 ， 由 
于 F 因 子 转移 而 发 生 遗 传 重 组 ， 产生 了 杂种 细胞 习 先 永 


二 、 实 验 材 料 风 

1. 大 肠 杆 菌 . ( 卫 .Coli); Ri2pro-(4)E ，WTashis- 这 VEFE+， 
Wiiyythr-leu-thi-xyl-gal-afarmtli-malrlac-stt JP ，HfrC 
met-try- 。 请 司 
2. 用具: 培养 四 (直径 9cm) 三 角 瓶 (150ml) 吸管 (1ml、5ml 
及 10ml) 离心 管 灭 菌 空 试管 2 

3. 基 本 培养 基 ; MgSO,。，7H,O20mg 柠檬 酸 200mg 
NaNH,HPO, .4H,0350mg，K,HPO,.2H,0O1288mg， 葡 萄 糖 2g， 
了 琼脂 2g， 加 蒸馏 水 至 100m1，pH7.0 ,高 压 灭 菌 8 磅 30 分 钟 - 

4. 肉 汤 培 养 基 : 羊肉 膏 0.5g， 和 蛋白 肪 1g8;，NaCl0.5g， 水 100 
ml，pH7.2 半 男 体 培养 基 另 加 1% 琼 脂 ， 固 体 培养 基 则 加 2% 琼 脂 ， 
高 廷 灭 郑 15 磅 15 分 钟 

5. 生 理 盐 水 : .0,85%NaCl， 高 压 灭 菌 15 磅 15 分 钟 ， 


三 、 实 验 步 聂 


1. 从 保存 于 冰箱 中 的 斜面 菌 种 上 ， 挑 一 环 菌 接种 在 5ml 液体 是 


276。 


工 肉 汤 培 养 基 的 三 角 瓶 中 ， 每 个 菌株 接 一 瓶 ， 置 377 培养 过 夜 。 
2 .每 一 瓶 中 各 加 入 5ml 新 鲜 的 内 汤 培养 液 ， 充 分 既 匀 后 ,等 量 


了 分 成 两 瓶 ，37 下 继续 培养 3 一 5 小 时 。 


3.3000rpm 离 心 10 分 钟 。 

竺 倒 去 上 清 液 ， 打 匀 沉 淀 ， 离 心 洗 洗 二 次 ， 再 加 无 菌 水 到 原 
体积 。， 

(二 ) 杂 交 一 一 混合 培养 

1. 取 12 支 灭 菌 试管 ， 各 加 入 3ml 融 化 的 半 固 体 培 养 基 ， 保 温 
在 457 。 

2. 三 个 杂交 组 合 为 ，WilyyXKispro-v Wilyy7XWi4iss、 
WilyyxHfrC。 每 个 组 合 四 支 试管 ， 其 中 二 文 作 对 照 。 

3. 除 对 照 组 试管 吸 F+ 供 体 菌 液 1ml 外 ， 其 余 各 杂交 组 合唱 分 
别 吸 供 体 和 受 体 菌 液 0.5ml1， 充 分 混 匀 。 
4. 将 苗 液 倒 在 基本 培养 基 的 平板 上 ， 播 匀 待 上 蜂 ，377 培养 ， 

48 小 时 后 观察 。 


四 ， 实 验 记录 
SR wazrx Wan 1 WU7 评 对 照 - 
和 阳 号 、、| Kizpro- | ;wiiss | HfrC K :pro- | ws | HfrC 
一 - ay 量 spre 
IT 了 三重 
实验 10 。” 大肠 杆 菌 的 基因 驮 许 分 析 
一 、 实 验 原理 


在 大 肠 杆 菌 的 Hir 与 FE 接合 过 程 中 ， 供 体 Htr 细 菌 的 遗传 物质 
s。 277。 


9 ie， 
和 0 


转移 到 受 钵 菌 中 。 用 影印 培养 法 测定 重组 子 出 现 的 所 
组 百分数 就 可 以 确定 基因 在 染色 体 上 的 顺序 。 

为 抑制 供 体 亲 本 细菌 的 生长 ， 供 体 要 用 不 同 于 受 体 ” 《BR- 修 的 
营养 喘 陷 型 苗 株 ， 或 对 某 种 抗菌 素 丝 感 的 菌 多 ， 和 
状 。 二 

杂交 在 液体 培养 基 中 进行 ， 常 以 全 X 10sjmm 的 开 FF- - 细 和 2 
X 10 的 晴 的 旭 1 生计 和 yeignwwe 村 


江 妆 人 珊 5 瑟 
1 大 肠 桂 菌 (三 :coli)， Wiiyytihr-leazthi 区 人 afar-mtl- 
inal-lac-strr( 人 DEF- 再 位 Cmetrtryr Da 笛 于 站 基 sr 中 
2. 用 具 : 与 实验 9 相同 5 天 区 生 明 时 包 
3. 肉 汤 堵 养 基 ， 与 实验 9 相同 。 疼 对 受 玫 装 扒 节 人 
4. 平 板 用 基本 培养 基 ;， 同 实验 9 时 区 议案 汪 
5.EMB 培 养 基 : 深 季 诅 簿 水 外 


每 100 毫升 培养 基 中 含 糖 "1g 蛋白 肪 0.8g NaCl10.58 
K,HPO,0.2g 伊 红 0.04g8 美 蓝 0.00658 琼脂 2g > 8 磅 


灭 苗 20 代 钟 ” 人 
6:NaNs 培 养 基 : 
牛肉 这 0.5% “蛋白 肛 1% ”NaC10.5%% NaN 0， 002 汶 一 琼 
E2%， 车 饮水 1roml pH7.2 灭 菌 15 磅 15 分 钟 学 
7. 半 固体 培养 基 ; 本 


琼脂 1g 水 100ml 高 讨 元 苗 匡 磋 分 全 
8 .生理 盐水 ，0.85%NaCl 


三 实验 步 最 OA 
(一 ) 菌 液 制 备 
1 . 挑 出 保存 的 菌 种 一 环 ， 秆 于 认 有 5m 内 汤 寺 关 革 的 关 中 ， 


* 此 处 糖分 别 为 森 糖 (xy1) 、 半 乳糖 〈gal)、 阿拉 伯 粮 (ara)、 攻 露 枝 (mtD)、 考 
芽 精 (mal)、 乳 精 《lac); 配 成 六 种 不 同 的 EMB 培 养 基 。。 二 村， 头 于 


e -278。。 


千 习 培养 过 夜 。 

2 .第 二 天 添加 5ml 新 鲜 的 肉 汤 培 养 基 ， 充 分 扬 匀 ,等 量 分 成 
两 瓶 ， 继 续 培养 3 一 5 小 时 。 

3; 分 别 倒 六 灭 菌 的 离心 管 一 3000rpm 离 心 10 分 钟 。 
| 出 . 倒 去 上 清 液 ， 打 匀 沉 淀 ， 各 加 入 新 鲜 的 肉 汤 培 养 基 至 原 体 
积 。 

5. 从 Wiiy7 与 HfrC 中 分 别 吸取 4.5ml1 和 0.5ml 菌 液 , 放 入 一 个 
灭 菌 的 经 37C 予 热 的 三 角 瓶 中 ， 充 分 播 匀 。 

(二 ) 液 穆 培 养 

IT. 实验 前 ， 将 水 浴 温 度 调 节 到 37。 

2 .将 感 有 混合 菌 液 的 三 角 瓶 置 于 水 浴 中 保温 90 分 钟 。 

3. 融 化 半 固 体 培养 基 ， 取 4 支 灭 菌 空 试管 ， 每 支 吸 入 2ml 半 固 
体 培 养 基 ，451 保温 。 

4. 吸 取 1ml 保温 后 的 混合 菌 液 ， 放 入 装 有 半 固 体 培养 基 的 试 
管 下 ， 共 接种 2 管 ， 摇 与 分 别 倒 在 7 只 基本 培养 基 平 板 上 ， 摇 
匀 ， 凝 固 后 37 立 培养 48 小 时 ， 观 察 出 现 的 重组 子 。 

5. 取 HfrC 菌 离心 沉淀 ， 倒 去 上 清 液 ， 再 离心 洗涤 二 次 , 打 匀 ， 
加 六 灭 菌 生理 盐水 到 原 体积 ， 用 1ml 吸 管 吸取 lmlHfrC 菌 液 ， 放 入 
半 周 体 培养 基 中 ,: 以 下 做 法 同 4， 观 察 是 否 长 菌落 ， 作 为 对 照 。 

(三 ) 影 印 培养 操作 

1. 倒 二 只 基本 培养 基 平 板 ， 待 凝 后 ， 用 接种 针 挑 取 重 组 子 菌 
落 ， 依 次 接种 到 基本 培养 基 平板 上 “〈 每 甫 80 个 菌落 ,37 培养 24 
小 时 ， 作 影印 培养 的 母 平板 。 

2. 融 化 6 种 糖 原 的 EMB 培 养 基 和 NaN。 堵 养 基 ， 每 种 培养 基 倒 
二 只 增 养 下， 共 14 个 平板 ， 再 倒 二 只 基本 培养 基 平板 ， 以 备 作 影 
印 培养 用 。 

3 到 灭 菌 的 丝绒 一 块 ， 固 定 在 圆柱 形 木 块 上 ， 将 母 平板 倒置 
覆盖 在 丝绒 上 ， 用 铅笔 轻 散 画 底 7 然后 拿 下 来 ， 将 《三 )2 中 的 平 
板 ， 倒 置 于 覆盖 的 丝绒 上 。 一 次 复制 二 只 相同 培养 基 的 平板 。 影 
印 不 同 前 壤 养 基 平 板 时 ， 应 另 换 灭 菌 的 丝绒 。 重 复 操 作 ， 直 至 全 


2279 


部 影印 完毕 。 影 印 后 的 平板 ， 放 在 37C 下 培养 24 小 时 ;观察 各 种 
性 状 出 现 的 比例 。 人 
(四 ) 重 组 子 的 遗传 分 析 


根据 重组 百分数 写 出 这 些 基因 在 染色 体 上 的 顺序 。 


实验 上。 孝 理 因素 请 六 营养 纪 舍 浊 六 


六 用 某 些 物理 或 化 学 因素 处 理 细菌 ,使 其 基因 发 生 突变 ;丧失 合 
成 某 一 物质 〈 如 氨基 酸 ， 维 生 素 ， 核 童 酸 等 ) 的 能 力 ,因而 它们 
在 基本 培养 基 上 不 能 生长 ， 必 须 补充 某 些 物 质 才能 生长 。 这 样 从 
野生 型 经 诱 变 得 到 的 菌株 ， 称 为 营养 菊 陷 型 。 钊 选 营养 缺陷 型 落 
株 必须 经 过 以 下 几 个 步骤 ， 诱 变 处 理 、 营 养 读 陷 型 的 检 出 、 划 线 
复 证 、 生 长 谱 鉴定 、 缺 陷 型 菌株 纯化 。 


本 实验 用 汉 外 线 来 诱发 突变 ， 并 用 青 过 素 法 淘汰 野生 理 ， 最 


*。 ZLZ80。 


后 经 生长 谱 法 鉴定 细菌 的 营养 缺陷 型 。 隐 


二 、 实 验 材 料 


1. 大 肠 杆 菌 ， 玉 :SF 。 

2. 用 具 。， 与 实验 9 相同 。 

3. 肉 汤 液 体 培养 基 ， 与 实验 6 相同 。 

4. 加 倍 肉 汤 培 养 液 其 剑 与 肉 汤 液 体 培养 基 
相同 。 

5 . 蓝本 液体 培养 基 除 无 琼 月 外 ， 与 实验 9 的 基本 培养 基 相 
同 。- 

6: 基本 固体 培养 基 同 实验 9 基本 培养 基 。 

7. 无 N 基 本 液体 培养 基 ，K,HPO,0.7g KH,PO.0.3g 从 
檬 酸 钠 3H500.5g MgSO,。7HO0.01g8 ”葡萄 糖 28 水 100ml 
pH7.0 高 压 灭 菌 3 磅 20 一 30 分 钟 

8.2N 基 本 液体 培养 基 ，100ml 无 N 基 本 液体 培养 基 中 加 入 
(CNH4):SO40.2g。 

9 .混合 揽 基 酸 和 混合 维生素 的 配制 ， 氨 基 酸 分 为 七 组 ， 除 且 
所 酸 易 潮解 单列 为 一 组 外 ， 其 余 六 组 各 有 六 种 氨基 酸 ， 每 种 氨基 
酸 等 量 研 细 充分 混合 ，DL 型 的 氨基 酸 用 量 加 倍 。 

了 热 氨 酸 精 - 一 DO “ 甲 硫 一 ， 半 胱 一 ， 胱 一 ， 味 只 
组 一 精 瑟 ) 苏 一 ， 谷 一 ， 天 冬 一 喀 陀 
和 一 1 光一 

:JIV'、 亮 一 : 半 胱 二 谷 一 羚 且 一 “ 异 亮 一 统一 
人 正太 一: 甘 一 和 异 亮 一 酷 久 

YI 名 一 哇 叭 - 喀 啶 丝 一 ， 纺 一 ” 酯 一 

”YIT 有 哺 一 

0 把 维生素 B,、B，、 了 Be。、 泛 酸 ， 对 氨基 茶 甲酸 (BAPA)， 烟 
酸 及 生物 素 等 量 研 细 ， 充 分 混合 ， 配 成 混合 维生素 。 


@ 电 省 癌 号 “一 ”都 代表 “ 氨 酸 ?。. 
281。 


三 、 实 验 步 骤 


(一 ) 菌 液 制备 ， 

第 1，2，3 步 与 实验 10 相 同 。 

4， 倒 去 上 清 液 ， 打 勾 沉 洗 。 其 中 一 管 吸 入 5ml 生 理 盐 水 ， 然 
后 倒 入 另 一 离心 管 ， 两 管 并 一 管 。 

(二 ) 诱 变 处 理 中 

1 . 吸 上 述 菌 液 3ml 于 培养 亚 ,将 培养 咀 放 在 15 瓦 的 紫外 光 灯 
下 ， 距 离 28.5cm。 

”处 理 前 先 开 紫外 光 灯 稳定 10 分 钟 以 上 ， 放 入 培养 亚 后 ， 连 
善 一 起 在 灯 下 灭 菌 1 分 ; 钟 然后 开 盖 处 理 1 分 钟 。 照射 后 先 盖 亚 盖 ， 
再 关 紫 外 条 。 

3. 吸 3ml 加 倍 肉 汤 培 养 液 到 上 述 处 理 后 的 培养 亚 中 。 37 的 
温 箱 内 吕 光 培养 12 小 时 以 上 。 下 人 计 

(三 ) 用 青霉素 法 淘汰 野生 型 

1 . 吸 5ml 处 理 过 的 菌 液 于 灭 菌 离心 管 中 ，3500rpm 离 心 10 分 
钟 。 

2; 倒 去 上 清 液 ， 打 勾 沉 省 ， 加 入 生理 盐水 ， 离心 洗涤 三 次 ， 
吸入 生理 盐水 到 原 体积 。 

3 吸取 0.1ml 洗 涤 过 的 菌 液 到 5ml 无 N 基 本 培养 液 中 ， 37C 下 
培养 12 小 时 。 吕 -- 役 

4. 培 养 12 小 时 后 ， 按 1:1 加 入 2N 基 本 培养 液 5ml, 称 取 青 霉 素 
钠 盐 ， 使 青霉素 在 菌 液 中 的 最 终 浓度 为 500 单 位 /mm -再 放 入 37 C 
温 箱 中 培养 。 下 

5 从 培养 12，16，24 小 时 的 菌 液 中 ， 各 吸取 0.1m。 到 无 菌 培 
养 中 ， 再 分 别 倒 入 经 融化 并 冷却 到 40 一 50 0 的 基本 和 完全 培养 
基 ， 播 匀 放 平 ， 待 凝 后 ， 放 入 37C 温 箱 中 培养 (培养 下 上 注 明 培 
养 时 间 )。 二 


@@ 诱 变 处 理 时 间 是 根据 70% 的 杀菌 率 而 定 的 。， 
。 282。， 


从 。 草 


(四 ?缺陷 型 的 检 出 ， 
:以 上 平板 培养 36 一 48 小 时 后 ， 进 行 菌落 计数 。 选 用 完全 培 
养 基 上 长 出 的 菌落 数 大 大 超过 基本 培养 基 的 那 开 组 ， 用 接种 针 挑 
取 完 全 培养 基 上 长 出 的 菌落 80 个 ,分 别 点 种 于 基本 和 完全 培养 基 
平板 上 〈 先 基本 后 完全 )， 党 举 居 委 八 到 质地 入 娄 和 
排 著 上 ds 的 栅 粮 在 基本 培养 基 的 平板 上 划 线 ,37 避 温 箱 培养 
24 小 时 后 不 生长 的 可 能 是 营养 缺陷 型 。 

(五 ) 生 长 谱 鉴 定 ， 

1 .将 可 能 是 缺陷 型 的 菌落 接种 于 感 有 5ml 将 汤 培 养 液 的 离心 
管 中 ，377 培养 14 一 16 小 时 。 
2. 培养 16 小 时 后 ， 以 3500rpm 离心 10 分 钟 ， 全 去 上 清 液 ， 打 
匀 沉 淀 ， 然 后 离心 洗涤 三 次 ， 最 后 加 生理 盐水 到 原 体积 。 

3. 吸 取 1lml 离 心 洗涤 过 的 菌 液 于 一 灭 菌 的 培养 下 中 ,然后 倒 入 
融化 后 冷 至 40 一 50 的 基本 培养 基 ， 揪 匀 放 平 待 凝 ， 共 两 烟 。 

4. 将 两 只 培养 下 的 亚 底 ， 各 等 分 八 格 * 依 次 放 入 混合 氨基 酸 ， 
混合 维生素 和 且 氨 酸 。 在 37 温 箱 培养 24 一 28 小 时 * 观 察 生 长 图 ， 
从 而 确定 是 负 种 营养 缺陷 型 。 


实验 12 。 化 学 因素 诱发 营养 缺陷 型 菌株 


一、 实验 原理 
同 实验 11， 但 本 实验 是 用 化 学 因素 亚 硝 基 听 (NTG) 处 理 本 
母 菌 。 
二 、 实 验 材料 
1 酵母 菌 单 倍 体 26 一 4 或 143 一 2。 
283。 


2. 用 只 ， 同 实验 9。 

3 .基本 培养 基 :， 除 KI 改 为 1mg、 生生 下 20 
生 物 素 改 为 ?mg 外 ， 其 余 与 实验 8 的 基本 增 养 基 完 全 相同 。 

4. 完 全 培养 基 : ee 下 

5. 生 理 盐 水 。 

6. 介 酸 缓冲 液 : pH6:0(0.2MNa:HPO412 50 0 
PO,87.7mi) 涅 订 主 . 

7 . 诱 变 剂 ，NTG 〈 亚 硝 基 县 ) (nitrosguanidineys 


、 实 验 步 最 

(一 ) 准 备 菌 液 ， 

1. 将 酵母 菌 单 倍 体 菌 株 26 一 4 wii- 动 吉 全 部 凡 用 本 
种 环 挑 一 些 菌 ， 接 种 到 盛 有 5 训 升 基本 波 体 丧 养 基 的 离心 管 中 ， 28 

一 3050 中 培养 16 一 18 小 时 ， 共 接 2 文 。 本 
2 .将 培养 过 的 菌 液 倒 入 感 有 玻璃 珠 的 灭 菌 三 有 涛 中 1 
分 全 ， 使 栈 苹 篆 均匀 分 散 。 

3. 将 上 述 菌 液 倒 入 离心 管 中 离 心 ce 量 肪 多 和 向 去 十 
清 液 。 将 管 底 菌 岂 打 匀 ， 加 无 菌 水 到 原 往 积 ， 关 看 放 在 别 忆 未 洽 
中 备用 。 

(二 ) 对 照 处 理 

1. 将 土 述 菌 液 4ml 加 1ml 生 理 盐水 。， 
”2 .吸取 菌 液 ( 来 自 1)1ml， 用 生理 盐水 玫 富 日 蕉 寺 订 员 

3. 从 10- 或 10- 5 稀释 菌 液 中 吸取 0.1 及 0.5ml 于 培养 下 中 ， 各 
做 二 只 ， 共 四 只 培养 亚 。 

4 将 融化 的 完全 培养 基 1012n0 加 入 堵 养 和 所 多 居于 
凝 ，30C 培 养 两 天 后 计数 。 1 二 和 9 

(三 ) 诱 变 处 理 

1. 释 取 NTG1.5mg 于 灭 菌 的 离心 管 中 ， 加 入 lmlpH6， 0 的 磋 本 
缓冲 液 ， 使 完全 溶解 ， 并 保存 在 30C 水 浴 箱 中 。 

2. 取 存放 在 30C 水 浴 中 备用 的 菌 液 4ml， 放 入 上 述 有 NTG 诱 


284” 


ee 


恋 剂 的 离心 管 中 (此 时 NTG 最 后 浓度 300kg/ml) ， 充 分 混 匀 ，, 立 ， 
刻 放 入 30C 水 浴 箱 中 ， 同 时 计算 时 间 ，30 分 钟 后 取出 ;立即 离心 
(3000rpm)y 将 止 面 刻 液 倒 入 NaOH 中 。 打 匀 管 底 菌 块 ， 加 入 生理 
盐水 ， 再 离 忆 洗 活 元 次 ， 加 水 到 原 体积 。 

3. 将 融化 而 不 观 手 的 完全 培养 基 倒 入 灭 菌 的 培养 焉 中 .每 亚 

倒 12 一 15ml1， 共 倒 20 严 。 

4. 将 经 NG 处 理 的 菌 液 ， 稀 释 成 107* 取 样 0.1ml 及 0.05ml 倒 
入 上 述 培养 四 中 。 和 希望 每 只 培养 下 中 长 50 个 左右 的 菌落 ， 所 以 稀 
释 度 可 视 具 体 情况 作 适 当 调整 。 

5. 用 灭 菌 的 玻璃 涂 棒 将 菌 液 涂 飞 ，30 已 培养 3 天 。 

几 6 计算 对 照 组 和 诱 变 组 的 培养 到 中 的 菌落 数 ， 算出 杀菌 此 及 
存活 率 。 


亚 号 | 稀 释 | 取 样 (ml)| 菌 数 / 严 | 菌 数 /ml 


(四 ) 平 板 影印 此 请 训 
让 工 : 影 印 用 丝绒 布 经 高 压 灭 菌 后 ， 在 干燥 箱 内 烘 干 备 用 。 
:2; 在 诱 变 组 中 选 出 不 污染 ， 兰 落 分 布 均匀 ， 菌 数 适中 的 培养 
。 根 据 选 到 的 母 平板 数量 准备 基本 培养 基 和 完全 培养 基 平 板 。 
以 一 个 母 平板 、 一 个 基本 平板 、 一 个 完全 平板 作为 一 组 , 编 上 号 ， 
并 在 每 个 平板 的 底 上 作 上 箭头 标记 。 
3. 影 印 : 将 灭 菌 的 丝绒 布 放 在 水 柱 上 ; 用 橡皮 筋 扣 住 中 先 取 
母 平板 倒 覆 在 绒 面 上 ， 焉 上 用 铅笔 轻 而 均 匀 地 融 玫 下 ， 取 下 母 平 
板 ( 母 平板 保存 起 来 )， 立 即 把 基本 培养 基 平板 (MM) 按 相同 的 


we 285.w 


标记 方向 复印 ,同样 殴 几 下 ， Wigdaae 
上 复印 ， 印 毕 ，30C 培养 2 一 3 天 。 

半生 考 和 阐 的 完 认 平板 卢 知 示 平移 与 大 洗 的 旺 于 李 最 条 

“个 标记 方向 进行 比较 。 找 册 CM 平 板 主 和 从 长 前 而 在 MM 和 平板 上 不 长 

goldapiebigitigifaaaicy 

(五 ) 点 种 复 证 

f: 准备 MM 及 CM 平 板 ， 于 设 玫 生 根 所 南 攻 多 少 而 是- 一 个 严 
可 划 36 个 碟 右 。 

交 信号 的 间 基 分 别 在 MM 珊 全 的 置 上 接 
种 ，30 闻 培养 2 一 3 天 。 

了 只 能 在 CM 上 生长 而 不 能 在 MM 上 秆 次 丽 可 能 是 陷 届 菌 
落 。 语 CM 汪 杭 上 指 玉 这 样 的 站 藻 六 条 了 人 30 习 培养 
2 天 后 ， 供 生长 谱 鉴定 用 。 - 


(六 ) 生 长 谱 鉴 定 ” 同 实验 11 
实验 13 ”村 草 杆菌 红 菌 体 普 记性 苇 导 


以 唆 菌 体 为 媒介 ,将 供 体 细胞 的 遗传 物质 传递 给 受 体 细胞 ， 攻 
而 改变 受 体 细胞 的 基因 型 和 表 型 的 过 程 称 为 转 导 《transducetion) 
当前 转 导 已 成 为 分 子 遗传 学 研究 的 一 种 常规 方法 ， 用 来 转移 异 源 
基因 及 研究 基因 的 分 子 结构 。 dh 人 
和 局 限 性 转 导 。 


、 实 验 原理 


由 于 入 病 到 ao 风 凋 作 全 各 年 站 和 村 寺 半 林 过 十 硬 生 和 和 
普罗 性 转 导 。PBS1 噬 菌 体 从 溶 源 菌 SB19 中 裂解 出 来 ,偶而 包 衷 了 
染色 体 的 tryrthy* 基 因 , 当 噬菌体 感染 营养 缺陷 型 受 体 菌 168(thy 

e2806 we 


3 EECeu ee 了 


“rp)，; 就 能 在 基本 培养 基 平板 上 长 出 稳定 转 导 子 。?PBS1 叭 菌 体 转 
导 只 能 在 游 动 的 受 体 细胞 中 进行 ， 它 转 导 的 DNA 片断 可 达 1s7 
X10" 转 导 频 率 只 有 10"5 =- 10- /感染 细胞 。PBS1 的 自发 裂解 频 
率 较 高 ， 感 染 了 敏感 菌 SB19 之 后 ， 不 需要 紫外 线 诱导 裂解 ， 


1 实验 材料 


可 枯 章 杆菌 ， 受 体 菌 Bisubtilis; 168.tryr-thy-str5 溶 源 菌 卫 . 
subtilis，SB19(PBS17)。 

2. 用 具 ， 与 实验 9 相同 。 

3. 鸣 菌 体 培养 液 :， 牛肉 喜 8g ,酵母 襄 28 NaCl4g，MgSO，。 

7 了 :00.25 “KKH:PO4:1.5g Na:HPO, ,7Hi05.7g :2 燕 饮 水 加 至 
1000ml 氧 氧化 钠 调 pH 至 7.5。 上 和 儿 

4. 鸣 菌 , 体 稀释 液 ; -NaCl20g -KiSO25g ，KH,POL7.5g 
NasHEO,"12H5O1818g ,MgSOiv 7H20056g;， 燕 饮水 加 至 1000ml 
使 用 时 加 久 1%GCacl:50m1 和 0.5%FeCl。( 过 滤 灭 菌 ) 10ml。 

5. 肉 汤 培 养 基 ， 胰 蛋白 肪 10g ' 稚 母 提出 物 55 NaCll0g 葡 
萄 糖 18 和 机 228 磅 下 i 灭 菌 20 
分 钟 。 本 到 
半 内 以 : 肉 汤 固体 接 养 ， 另 加 2 % 琼 脂 。 
臣 了 于 汤 半 固体 培养 基 另 加 0 Pa.% 琼 脂 贡 

8&. 肉 汤 软 舟 脂 培养 基 ， 另 加 0.38 叹 琼脂 ! 

习 . 胸 腺 喀 啶 、 色 氨 酸 的 10 叉 最低 盐 深 液 记 在 亲信 水 电 依 次 洗 
解 下 述 记 份 K:HEO414g KH:PO,6g (NH):SO,2g . 
NasCeHs07 2H:O (柠檬 酸 钠 )1g MgSOis7HsOos2g;， 然后 继 
续 ， 加 蒸馏 水 至 100ml ”葡萄糖 0.25g 胸腺 喀 吁 1mg L- 色 氨 酸 
[se .5mg， 国体 消 养 基 另 加 ? 人 


三 、 实 验 步 又 


司 本 本 大 本 哩 吨 枯 和 昌 
| 工 ,将 溶 源 菌 SB19 接 种 于 感 有 7ml 新 鲜 噬 菌 体 培养 液 的 150ml 


9 287， 


三 角 瓶 内 ，37 振 划 培养 3 外 时， 然后 在 37 台 下 衣 下 16 永 时 

2 .将 塔 养 后 的 菌 液 经 3000rpm 离 心 10 分 钟 ， 弃 沉 演 寺 正清 液 
用 孔径 0.45um 的 滤 膜 过 滤 。 滤液 就 是 FBS1 委 解 液 ” 在 裂解 液 中 加 
入 儿 滴 氯仿 ， 置 47 保存 。 

(二 )PBS1 叭 菌 体 裂 解 液 的 效 价 测定 

由 于 在 转 导 时 要 求 鸣 菌 体 与 细菌 感染 指数 之 比 (好 MOD) 大 
约 为 三 所 以 在 转 导 实验 之 前 需 对 鸣 菌 体 进行 效 价 测定 。 

1 . 接 一 环 敏感 菌 SB19 于 3ml 内 汤 流 种 各 下 下 
377 振 划 培 养 16 小 时 。 | 

2 . 取 培 养 后 的 SB19 菌 液 0， ina 多 中 和 坟 这 
中 ，371 振 划 培养 5 小 时 。 | 

3. 将 培养 后 的 菌 液 倒 入 离心 管 中 ，3000fp 问 交办 各 弃 
让 清流 ， 将 沉淀 的 菌 块 巧 浮 在 7.5ml 史 菌 体 稀释 液 中 避 

4. 将 PBS1 裂 解 液 用 叭 菌 体 稀释 液 作 10 倍 递 赠 稀释 至 10- 2 

5. 了 到 若干 支 试 管 ， 各 加 入 已 融化 的 0 有 本 全 本 于， 和 
3mt; 然 后 放 在 50 字 恒温 水 浴 中 保温 竺 用。 和 

所 取 SB19 菌 液 0.5ml 和 PBS1 列 解 液 10- 了 外 下 和 和 演 、 引 0 
10-8) lml， 分 别 加 在 4 个 肉 汤 固体 培养 基 平 板 上 ， 随 之 立刻 俏 文 
0.8% 肉 汤 半 固 体 培 养 基 3ml(45T 六 迅速 播 针 , 辅 平 固 另 取 2 作 肉 汤 
培养 基 平 板 , 只 加 菌 液 0.5ml, 不 加 吹 菌 体 友 解 液 岂 作为 对 照 组 。 以 
上 平板 待 半 固 体 琼 脂 培养 基 凝 固 后 ” 置 28 和 证 培养 46 水 时 昌 
ANAL Rs: 入 PBS1 遇 人 
的 效 价 。: 于 
耕 筷 三) 第 选 游 动 性 受 体 苗 3 工具 类 替 吉 】 Qi 


5 288。4 


CA 


1. 用 灭 菌 滴 管 吸 0.3% 肉 汤 软 琼脂 一 滴 , 滴 在 肉 汤 培 养 基 平板 
的 不 同位 置 上 。 用 接种 针 挑 几 个 受 体 菌 菌 落 , 直 刺 各 滴 软 琼脂 中 。 
置 37C 培 养 48 小 时 。 

2 .在 软 琼 脂 中 筛选 游离 距离 最 远 的 菌 作为 转 导 的 受 体 菌 。 

(四 ) 转 导 

1. 接 一 环 游 动 性 受 体 菌 株 168 于 盛 有 3m1 肉 汤 间 养 液 的 三 角 瓶 
内 ， 置 37C 下 培养 16 小 时 。 

2. 取 培养 后 的 菌 液 0.15ml， 加 入 到 3ml 新 鲜 的 肉 汤 培养 液 中 ， 
继续 振荡 培养 5 小 时 ， 细 菌 达 到 对 数 生 长 期 。 
3. 取 若 干支 试管 ,各 加 入 以 上 菌 液 0.9m1 和 PBS1 裂 解 液 (10?， 
10-1.10- 2 1 天 2 0.1m1， 混 侣 后 置 37 人 下 振 萝 培养 30 分 钟 。 

-二 . 振 葛 培养 后 的 混合 液 分 别 倒 入 4 支 离 心 管 中 ，3000rpm 离 心 
10 分 钟 ， 弃 上 清流 ， 将 沉淀 菌 块 再 悬浮 于 lml 含 胸腺 喀 喧 + 色 氢 
酸 的 10x 最 低 盐 溶液 中 。 

5. 各 取 0.1ml 混 合 液 ， 分 别 涂 布 在 4 个 含 胸 腺 喀 啶 、 色 氨 酸 的 
10 x 基 低 盐 溶 液 固体 培养 基 平板 土 占 田 取 2 个 平板 作对 照 ,一 个 平 
es 液 0.1ml， 另 一 个 平板 加 史 菌 体 玫 解 液 (10” )0.1 

二 也 二 平板 全 部 置 37 尼 培养 让 水 时 

6. 观察 和 统计 每 个 平板 号 好 了 予 ， 衬 算 转 叶 频 率 ， 


解 了 汶 j 浓 =- 放 雪 


oa 


| 

| 受 体 范 对 照 十 裂解 滚 对 赂 

seenats 
习 吉 cx 光 


”了 南 导 于 数 
转 导 频率 = -说 黄体 要 惰 液 的 效 价 X100% 


289。， 


实验 14 大肠 杆 著 X 噬 菌 体 局 限 性 装配 ” 


、 实 验 原理 


大 肠 杆菌 六 咯 苗 体 的 原 噬 苗 体 队 着 在 寄主 染色 体 的 半 她 糖 和 
生物 素 基 因 之 间 ， 当 深 源 菌 中 的 原 噬 菌 体 人 被 紫外 线 诱导 出 来 时 p 
大约 108 个 4 只 菌 体 中 会 有 一 个 携带 半 惫 糖 或 生物 素 基 因而 脱离 寄 
主 染色 体 ， 这 种 j 鸣 菌 体 被 称 为 缺陷 型 洲 乳 糖 转 号 噬菌体 《Adg)s 
由 jdg 鸣 菌 体 转 导 是 一 种 局 限 性 转 导 ， 特 时 攻 央 抬 从 打 吉 多 主语 
基因 村 。 岂 


二、 实验 材料 


1 大肠 杆 菌 菌株 ， 深 源 菌 K12(4)8aE 休 衣 isSent- 

2 明 具 ， 与 实验 9 相同 。 

3 .培养 基 : 肉 汤 堵 养 基 见 实验 9。 中 信和 内 汤 见 实验 
半 乳 糖 EMB 堪 养 基 见 实验 10。 


: 怀 


4 二 间作 这 最 1% 玉 版 ”用 胡 候 水 全 
5 磷酸 缓冲 液 ，KHPO, 2g 开 .HPOL7g Mgso7H20 
0.25g8 蒸馏 水 1000ml 0 乙 如 玫 于 | 
6 仙人 Re 
_ 三、 实验 步骤 | 


(一 ) 唉 菌 体 的 诱导 和 裂解 液 的 制备 二 3 

1 . 取 一 环 供 体 菌 接种 于 肉 汤 培 养 液 ,37 下 二 生 训 汪 吸取 
0 .5ml 菌 液 ， 接 种 于 感 有 4,5ml 肉 汤 培 养 液 的 三 角 瓶 中 ， 继 续 在 
37 下 培养 4 一 6 小 时 。 

2 . 将 培养 后 的 菌 液 倒 入 离心 管 ， 以 3500Ipm 离 心 10 分 钟 。 除 


290， 


村 air SS 永 


去 上 清 液 ， 加 4ml 磷 酸 缓冲 液 ， 制 备 成 悬浮 芮 波 。 

每 - 取 悬 浮 苗 液 3aml 于 灭 菌 培 养 中 中 ， 经 紫外 线 处 理 (15W， 上 - 
离 40cm)， 诱 导 10 秒 钟 。 

4. 处 理 后 加 入 3ml 加 售 肉 汤 培 养 基 ，377 避 光 培养 2? 一 3 小 时 。 
.5. 移 六 离心 管 中 ， 以 3500rpm 离 心 10 分 钟 ， 将 上 清 液 移入 另 
一 企 灭 菌 的 离心 管 中 ,， 再 加 入 0.2ml 氯仿 〈4 一 5 滴 )， 剧 烈 振 苏 
半分 钟 。 静 止 5 分 钟 ， 外 心地 把 上 清 液 用 无 北 滴 人 移 到 另 一 灭 菌 
试管 ， 这 就 是 噬菌体 \4) 的 裂解 液 。 

本 )1 哈 菌 体 裂解 液 的 效 价 测定 
sw 1 .可 一 环 K; :Sgal- 本 语 语 本 全 肉 汤 培 养 液 的 三 角 瓶 
内 ， 37 培 养 16 小 时 。 

2. 了 吸取 0.5mil 菌 液 ， 放 入 盛 有 4.5ml 肉 汤 培养 液 的 三 角 瓶 内 
(剩余 的 菌 液 在 转 导 试 台中 用 )，37 人 继续 培养 4 小 时 。 

3. 取 4 支 试 管 ， 各 加 入 已 融化 的 半 固 体 玩 脂 3ml， 将 试管 放 在 
5070 恒 温水 浴 中 保温 。 

4. 取 吹 菌 体 裂 解 液 0.5ml， 族人 入 感 有 4 5ml 肉 汤 培 养 液 ， 依次 
稀释 到 10-7。 
下地 全 志 疾 4 时 后 的 烛 淹 0 .cn 列宁 站 
(10-s10-7)0,.5ml, 加 在 肉 汤 固 体 培 养 基 平板 上 《每 个 稀释 度 2 个 
平板 ) , 随 之 立刻 倾倒 半 固 体 于 脂 3ml ， 迅 速 摇 勾 ， 铺 王 ， 凝固 后 
置 37YC 培养 24 小 时 。 

6 .观察 出 现 的 鸣 菌 斑 数 ， 并 计算 吻 菌 体 裂 解 液 的 效 价 。 


娩 信 裂解 液 
人 信人 浓度 10-s 16=7 
平板 数 ~、 (0.5ml) 《0.5 如 1) 


e。 29T。 


(1) 取 ?2 个 半 乳 糖 EMB 培 养 基 平板 ,用 殖 
璃 蜡笔 按 右 图 所 示 在 培养 下 底部 做 上 标记 。 

(2) 取 一 环 培养 过 夜 的 受 体 菌 K:*Ssal- 菌 . 
液 ， 在 EMB 平板 上 涂 一 条 菌 带 ， 置 37C 培 养 
1 小 时 。 

〈3) 待 菌 液 渗 干 后 ， 用 接 太 环 和 在 小 回 男 内 满 一 满 噬菌体 裂 
解 液 ， 然 后 在 涂 有 蓝 带 的 方 格 处 请 加 避 解 六 ， 待 甫 波 深 于 后 ， 
置 37C 培养 48 小 时 。 下 

2 . 涂 布 法 

取 6 个 半 乳 糖 EMB 培 养 基 平板 ， 其 中 2 个 只 加 0. [ 避 妥 地 流 ， 
作为 叭 菌 体 对 照 。 另 2 个 只 加 受 体 菌 菌 液 0.1ml， 作为 受 体 菌 的 对 
照 。 剩 余 2 个 平板 加 噬菌体 裂解 液 和 受 体 菌 液 各 0.05ml。 6 个 EMB 
培养 基 平 板 涂 布 后 ,， 置 37 培 养 48 小 时 。 

(四 ) 结 果 观 察 


4 革 导 重 数 :和 车 向 
古人 笨 要 解 液 前 获 价 “1 


实验 15 。 化 学 诱 变 剂 的 细菌 术 测 浊 
(Ames 法 ) 


一 、 实 验 原理 
Ames 等 人 用 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 〈Salrmmomel1a tyDRinnzr 记 7 的 


4 492 。 


AAA 


组 氨 酸 营养 缺陷 型 突变 株 建 立 了 化 学 诱 变 旗 的 检测 系统 。 

组 氨 酸 营养 缺陷 突变 菌株 在 不 含 组 氨 酸 和 生物 素 指 基 本 培养 
基 中 是 不 能 生存 的 。 当 待 测 的 化 学 物质 加 入 培养 基 中 ”组 氨 酸 党 
养 缺 陷 突 变 菌株 发 生 了 回复 突变 时 ， 才 在 基本 培养 基 平板 上 长 出 
菌落 。 当 诱发 回复 突变 的 菌落 数 超过 自发 回复 突变 菌落 数 一 倍 以 . 
上 时 为 阳性 反应 ， 即 该 化 学 物质 是 一 种 化 学 诱 变 剂 。 

许多 化 学 物质 在 体外 检测 时 是 阴性 反应 ;= 但 经 过 体内 肝脏 某 
些 酶 的 作用 可 以 转变 为 诱 变 剂 所 以 在 检测 过 程 中 加 入 大 鼠 肝 
脏 提 取 液 (S-9)， 就 能 大 大 提高 检测 的 准确 性 。 这 种 鼠 伤寒 沙门 
氏 菌 - - 微 炮 体系 统 已 成 为 国际 上 公关 的 化 学 请 变 检测 溃 规 方法 ， 简 
称 Ames 法 。 


一 、 实 验 材 料 


1. 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 ， 
TA98， 移 码 突 恋 (tfa AUVTrB is D3052AP27) 
TA100: 碱 基 置 换 (rfa AUVIB his G46AP7) 
2 .用 具 : 同 实验 9。， 
. 3. 平板 用 基本 培养 基 : 同 实验 gs 
4. 半 固体 培养 基 ， 琼 脂 0.75g， 水 90ml， 二 
钟 。 
5. 上层 半 固体 培养 基 ， 生 物 素 ; 1.2mg; 组 氨 酸 0.24mg，, 水 
10ml， 15 磅 高 压 灭 菌 15 分 钟 。 配制 后 加 入 上 述 半 固 体 培 养 基 。 
6 .液体 及 固体 完全 培养 基 ， 同 实验 9。 : 
7. 生 理 盐 水 ， 同 实验 9。 
8. 其 他 试剂 : 
亚 硝 基 县 (NIG)1mg/ml( 用 无 菌 水 配制 )。 
结晶 紫 1mg/ml( 用 无 菌 水 配制 )。 
氨 共 青霉素 smg/ml( 用 无 菌 的 0.02N NaOH 配 制 )。 
9. 大 鼠 肝 脏 酶 系 提取 液 (S-9 提 取 液 ): 成 年 雄性 大 白鼠 三 只 ， 
按 每 公斤 体 重 2 .5ml 的 剂量 腹腔 注射 五 氯 联 苯 油 溶液 (200mg/ml， 


ea 293。 


用 玉米 泪 配 制 ) 。 注 射 后 第 五 天 杀 鼠 取 肝 〈 杀 前 奉 食 24 小 时 )。 
从 肝 门 静脉 处 注入 冰冷 的 0.15M KCI 溶 液 洗 许 肝脏 三 次 ， 称 重 后 
剪 碎 。 每 克 肝 ( 湿 重 ) 加 冰冷 的 0.15M KClI 溶液 3ml， 制 成 匀 浆 。 
义 效 经 9,000 x g( 相 对 离心 力 ) 离 心 10 分 钟 ， 取 上 清 液 ;分 装 小 管 ， 
每 管 1 二 2ml) 二 207 低温 保存 。 的 
下 进行 。 

10 大 鼠 肝 脏 提 和 到 液 (9- 9) 视 音 波 区 向 儿 

(1) 盐 溶 液 ， MgCl53.88，KC112.378g， 若水 类 至 100l 
高 压 灭 菌 15 磅 1 分 钟 。 

(2) 0.2M pH7. 14 磷酸 缓 剖 液 ，Na:HPO4。12H; 亲朋 .15 
KH,PO,2 .72g， 加 水 至 100ml， 高 压 灭 获 。 

(3) 0.025M 辅 酶 II(NADP): is3me 国 产生 本 (氧化 理 ) 用 
无 菌 水 稀释 至 5ml( 进 口 的 辅酶 II 用 93mg)。 

(4) 0.05M 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 (G-6-P); 165m8sG-6-P》 用 无 菌 
水 稀释 至 5ml。 

(5) S-9 混 合 液 配 制 ; S-9 提 取 液 10ml， 盐 溶液 2m1)0.2M 磷 
酸 缓冲 液 (DH7.4)50ml，0.025M 辅 酶 了 OINADP)16mly 0.05MG- 
6-P 10ml， 无 菌 水 加 至 100ml。 混 合 液 用 时 现 配 ， 置 冰 浴 中 ， 实 
验 后 将 多 余 溶 液 弃 去 。 

11。10mM 组 氨 酸 ， 称 取 L- 组 氨 酸 20mg， 罗汉。 定 
容 至 10ml， 高 压 灭 菌 8 磅 20 分 钟 。 


三 、 实 验 步 最 


(一 ) 菌 株 的 生物 学 性 状 鉴 定 

1. 组 氮 酸 营养 缺陷 的 鉴定 

(1) 用 接种 环 分 别 接种 TIA98 与 ITA100 菌株 于 感 有 5mi 肉 汤 培 
养 液 的 三 角 瓶 中 ，37T 培 养 14 一 16 小 时 ， 浓度 达 10?* 一 108/ml。 

(2)-3500rpm 离 心 10 分 钟 ， 弃 上 清 液 ， 用 无 菌 生理 盐水 离心 
洗涤 三 次 ， 最 后 加 5ml 灭 菌 生理 盐水 ， 制 成 悬浮 的 菌 液 。” 

(3) 取 8 支 试管 ， 各 加 5mnt 上 层 半 固体 增 养 基 (45) 其 中 4 支 


294 


另 加 0， 2mliomM 组 气 酸 ， 


(4) 到 8 个 基本 培养 基 平 板 ， 分 别 加 止 0:1ml，TA98 和 TA100 
的 菌 液 (各 4 个 平板 )， 随 之 将 以 上 8 支 试管 内 的 上 层 半 固体 培养 基 
颌 倒 在 二 面 ? 迅 速 摇 匀 , 待 凝 后 置 37 人 培养 24 小 时 。 次 日 观察 各 个 
平板 上 菌落 的 生长 情况 ， 计 算 对 照 组 平板 (未 加 组 氮 酸 溶液 ) 上 目 
发 回复 菌落 数 。 
2 . 脂 多 糖 屏 障 缺 陷 (rfa) 的 鉴定 ; 
《1T) 取 2 个 肉 汤 培养 基 平 板 ， 各 加 0. iml 测 试 菌 液 , 随 之 各 全 
久 5mt 直 层 半 固 体 撞 养 基 -450) 迅速 揪 匀 ， 待 凝固 。 
(CD 灭 菌 的 圆 滤纸 片 ( 直 径 4mm) 士 滴 一 滴 结 唱 紫 (tmg/ ml) 
或 脱氧 胆 酸 钠 盐 (2mg/ml)》 置 于 平板 的 .中 央 。37 它 培养 12 小 时 
后 ， 在 滤纸 片 周 围 出 现 一 个 透亮 的 抑 菌 圈 ， 表 明 菌 株 . 存 在 ?ia 突 
变 , 这 种 突变 允许 象 结晶 紫 这 样 的 大 分 子 进入 细菌 并 抑制 其 生长 。 
53. 抗 性 转移 因子 !(R 因 子 ) 鉴 定 : 
41) 在 肉 汤 培养 基 平 板 上 ， 和 和 了 证 全 村 共 吉 各 表 放 让 
平行 涂 两 条 者 线 。 
( 芒 : 待 海流 二 后 后 ， 在 人 条 直线 上 秋 直 地 接生 条 测 试 六 ， 
37 培 养 24 小 时 。 
(3)28 第 二 天 观 察 在 佐 此 青 和 素 贡 的 周 图 有 没有 生长 拖 区 ， 
:有 R 央 杯 的 菌株 就 没有 生长 抑制 区 。 关 
2 取 : 紫 外 线 修复 缺陷 鉴定 ，， 本 过 
用 接种 环 取 测 试 菌 液 ， 平 行 地 涂 二 条 于 肉 汤 培 养 基 平板 赴 s 
j 关 板 全 沼 导 黑 纸 不 盖 , 更 一 半 置 和 于 紫外 灯 下 ， 距离 33cm， 照射 
员 三 切 秒 ;在 3878 培养 24 小 时 后 观察 生长 情况 。 对 紫外 线 敏 感 的 菌 
[在线 种 彩 杀 过 的 水 过 平 板 止 生长 。 
于 ”人 过) 诱 变 剂 测试 
| 到 世 . 点 试 法 : 
_IG) 取 一 环 测试 菌 ， 加 在 5ml 肉 汤 培养 液 内 ， 5 
| 6 本 了 时。 村 3 
放 海王 0 iml 上 述 的 菌 让 ， eg 随 之 


ojiA05 


将 5ml 上 层 半 固 体 培 养 基 (45YT ) 倾 于 平板 上 ， 淄 速 播 匀 待 凝 由己 

(3) 取 数 张 直 各 为 4 毫米 的 灭 菌 圆 滤纸 片 ， 放 在 平板 内 。 

(4) 吸 亚 硝 基 有 (NTG) 待 测 物 ， 生 理 盐 水 各 1T0uD 分 别 滴 
在 圆 形 滤 纸 片上 。 待 滤纸 片 稍稍 吸收 样品 后 ， 置 37 增 状 48 小 
时 ， 观 察 各 滤纸 片 周围 的 回复 菌落 数 。 

2 : 挫 入 法 (平板 法 ): 

(1) 测定 S-9 混 合 物 的 酶 活性 

取 4 个 基本 培养 基 平板 ， 各 加 0 . im 测试 菌 液 和 亚 硝 基 肛 ， 其 
中 2 个 平板 另 加 0.2mIS-9 混 谷 液 。 随 之 在 各 平板 上 慑 特 5ml 中 层 
半 国 体 培 养 基 (46C )， 迅 速 摇 匀 。 凝 固 拓 37 圈养 凶 小 时 。 如 果 
加 S-9 混 合 液 的 回复 突 SN -7 台 9 提取 
液 有 酶 的 活性 。 

(2) 待 渴 样 草 浓 度 的 配制 ， 证 夺 

将 样品 配 成 不 同 浓度 后 *: 竹 取 0! ing 在 基于 者 病 寺 囊 攻 上 
再 分 别 加 入 0.iml 测试 苗 液 ， 最 后 铺 止 层 半 固体 培养 基 ， 辕 377T 
培养 48 小 时 。 第 三 天 在 显微镜 下 观察 各 个 平板 的 背景 和 司 测 试 化 
株 的 背景 消失 的 浓度 为 待 测 物 的 最 高 浓度 。 
将 待 测 物 配 制 成 五 种 不 同 的 浓度 。 和 谨 菩 

沁 39 待 测 样品 诱 变性 的 答 测 8 

取 若 干 基本 培 六 基 平板 ， 每 沾 平 板 芋 加 0 1 本村 精 洒 0 氏 
ml 不 同 浓度 的 街 浊 牧 和 0.2m S- 和 0 
养 基 ， 3S7iC 培 养 48 本 时。 

每 痪 实 一 的 需 作 亚 硝 基 隋 和 空白 对 早 ， 还 要 比较 加 S: 9 混合 液 
和 不 加 S-9 混 合 深交 区 回复 突变 亩 满 涩 。 第 三 和 本 本 全 于 于 


落 数 。 
,根据 实验 结果 判定 竺 测 物 的 诱 变性 ， 并 绘制 和 汕 二 
应 的 曲线 图 。 


实验 16 粘 草 杆菌 感受 态 细胞 的 转化 


j 尖 个 细菌 品系 由 于 吸收 也 另 一 个 细 闭 品系 的 DNA ( 称 为 转化 


因子 ) 而 发 生 遗 传 性 状 的 改变 ， 这 个 过 程 称 为 转化 。 通 过 转化 获得 


的 转化 细胞 称 为 转化 子 。 


:转化 过 程 在 细菌 中 有 几 种 形式 ?(1) 染色 体 DNA 转 化 感受 态 
细胞 ， 例 如 肺炎 双 球 菌 、 术 草 杆 菌 、 哮 血 流 感 菌 等 称 为 经 典 转化 。 
(2) 据 粒 DNA 转 化 感受 态 细 胞 ， 如 大 肠 肝 菌 转化 。(3) 原生 质 球 


转化 。 沁 2 


一 、 实 验 原理 

枯草 杆菌 的 一 些 菌株 (主要 是 168 的 街 从 菌株) 本 
条 件 下 能 出 现 感受 态 。 来 自 其 他 菌株 的 染色 体 DNA 可 进入 感受 
细胞 并 整合 到 宿主 的 风色 体 上 。 的 基 可 在 向 表 过 ， 
性 直 5 


1 实验 材料 
四 和 赴 .枯草 杆 万 : 供 体 菌 SBI9' 受 体 菌 BR15ttry et Jys 
2. 用品 : 机 Re 
谱 计 ， pH 计 。: 
3.110X 最 | K 5HPOidl 0g,， ，  KH， .BOUBE， 
(NH,) ,SO,20g， 柠 杰 酸 钠 108，MgSO.*7HyO 2g， Way 
依次 溶解 上 述 成 分 ， 然 后 加 水 至 1000ml。 


97 二 


4 1x 最 低 盐 溶液 。 

5 1.8% 基 本 固体 培养 基 : fy 最低 六 流 000mH188 
50% 葡 萄 糖 10ml， 高 压 灭 菌 8 磅 20 分 钟 。 

6. 2mg/mlL- 色 氨 酸 溶液 ， 贮 于 棕色 瓶 内 ， 用 电 统 本 

7. 10mg/ml 工 - 赖 氨 酸 溶液 。 

8. 10mg/ml 工 - 甲 硫 氨 酸 溶 液 。 

以 主 气 基 酸 溶液 均 在 8 磅 下 压 菌 。 

9.5% 水 解 酷 蛋 白 或 水 解 乳 蛋白 。 

10. 生长 培养 基 (GM) :1x 最 低 盐 溶液 100m1，1M MS8S024。 
7H,0;0.5ml,50% 葡 萄 糖 1mnl,5% 水 解 乳 蛋 自 汉 ; Wi 
取 物 1ml 受 体 菌 所 需 氨 基 酸 50ug/ ml15 33 帮 区 竺 ( 超 得 

11. 转 化 培养 基 (IM)， 1x 最 低 盐 溶液 100mH 1 MsS0i。 
7H59.0: ;5m0550% 葡 殴 精 100 二 和 2tml; 氨基 酸 5hg 
j mle 二 全 人间 

1 让 三 各 各 牛肉 高 5 看 贞 陈 10g; 0 国产 酵母 
5 葡萄 糖 55， 蒸 馏 水 1000ml1， 用 NaOH 将 pH 调 至 7.5。 了 

产 酵 母 裔 需 净 化 处 理 ， 称 58g， 湾 于 少量 水 中 者 沸 ， 冷却 
sooomm 必 名， 上 清 液 再 老弟 离心 一 泥 忆 且 


IN 车 洪 一 盯 菌 漠 答 肖 
全 训 和 谍 狼 和夫 辣 
实验 此 | 本 区 2 人 十 富有 天 和 二 刘 
本 作物 谍 性 攻 本 和 主 守 出 


枯草 杆菌 BR151 有 三 重 营 养 缺 陷 ， 色 氨 酸 (trp)。 甲 硫 氨 酸 
”emet) 和 赖 氨 酸 (lys)。 鉴 定 营养 缺陷 型 可 确定 其 缘 度 。 取 8 个 基 
本 培养 基 平 板 ,， 在 一 企 平板 纪 同 时 加 土 三 种 氨基 琶洲 液 : 色 氨 酸 
Oilml 靳 氨 酸 0502ml1) 和 和 硫 氨 酸 (0:02m083 洪 余 平板 则 分 别 
加 一 种 或 二 种 氨基 酸 溶液 ， 留 一 空白 平板 。 用 玻璃 棒 涂 铭 后 接种 
受 体 菌 BR1517 37C 培 养 铝 外 时 。 真 卫 胸 R 有 1 只 在 加 了 王 种 所 
基 酸 溶液 的 平板 耻 生 长 。 aoc Oe CH 

(二 ) 受 体 菌 感受 态 细胞 的 培养 与 转 枇 ” 怀 生 禾 王 二 和 大 


a 2098 。 


站 

和 
本 

但 


1. 将 受 体 菌 接种 于 BY 培养 液 中 ,37?7 振 葛 培养 到 对 数 生 长 早 
中 期 ， 在 620nm 处 的 O. D. 值 为 0.4 左 右 ( 培 养 4 一 5 小 时 )。 

2 .离心 ， 去 上 清 液 ,用 GM 液 洗 一 次 ;重新 悬 浮 手 等 体积 的 GM 
液 中 ， 测 0. D. 值 。377 继 续 振 葛 培养 到 对 数 生长 后 期 ， 620nm 
处 的 9. D. 值 为 0.6 一 0.9〈3 一 5 小 时 )。 

1 73. 取 0. 各 1 商 液 加 入 到 下 8ml TM 液 中 ， 在 试管 中 377 振 葛 培 
养 90 分 钟 。 

了. 炉 入 供 体 DNA， 至 最 终 浓 度 lug/ml， 并 : 设 受 体 菌 对 照 组 
(不 加 DNA) 和 DNA 对 照 组 (不 加 菌 液 )。 分 别 置 试管 中 ,377 振 苏 
培养 30 分 钟 。 

5. 黎 释 并 涂 布 固体 培养 基 ， 检 出 转化 子 。 因 为 BR151 具 有 三 
重负 陷 型 ， 所 以 测定 某 氨 基 酸 基因 的 转化 率 ， 需 在 基本 培养 基 上 
加 上 另 两 种 氨基 酸 各 30ng/ml， 作 为 转化 子 检 出 娃 养 基 。 测 定 两 
个 基因 的 共 转 化 率 ， 则 在 培养 基 上 添加 另 一 种 氨基 酸 30kg/ml。 测 
定 三 个 基因 的 共 转 化 率 ， 则 用 基本 培养 基 作 检 出 培养 基 。 

上 述 转 化 组 用 ITM 液 稀释 ， 稀 释 度 为 10" 一 103。 受 体 菌 对 照 
组 和 DNA 对 照 组 不 稀释 。 各 取 0.1ml 接种 于 检 出 培养 基 上 ，. 377C 
培养 48 小 时 后 观察 转化 子 数目 。 

1 一 另 取 0.2ml 菌 液 ，10 倍 递增 稀释 至 10-*。 取 0.02ml10-430.02 
和 0.05mll10-*，0.4mll0- 稀释 液 ,接种 于 基本 培养 基 + trp+ met 
+1ys 的 平板 上 。 各 接 两 个 平板 ，37% 培 养 铝 小 时 后 作 活 菌 计数 。 

6 .计算 转化 率 ， 有 两 种 表示 方法 。 


(i) 转化 率 = 芋 化 于 名 数 = 转化 子 /hg DNA 


2) 转化 率 = 款 化 于 数 x 10036， 此 为 细菌 转化 的 百分数 。 


99 


实验 全 7 大 肠 杆菌 转化 


，， 由 于 基因 工程 中 许多 载体 质粒 来 自 大 肠 杆菌 ， 而 且 大 肠 杆菌 
又 是 基因 工程 中 最 常用 的 受 体 细胞 ， 因 此 了 解 大 肠 杆菌 的 转化 过 
程 是 十 分 有 用 的 。 本 实验 是 用 大 局 杆菌 质粒 DNA 转 化 大 肠 杆菌 细 
胞 。 


大 肠 杆菌 细胞 在 对 数 生长 的 早 中 期 ， 用 一 定 浓度 的 CaCcls* 处 
理 ， 并 辅 以 短 时 间 的 高 温 处 理 ， 就 出 现 一 种 特殊 的 生理 状态 ， 称 
为 感受 态 。 外 源 DNA 可 以 进入 感受 态 细胞 ， 并 在 宿主 细胞 中 复制 
与 表达 。 质 粒 PBR322 带 有 氮 人 西林 和 四 环 素 的 抗 性 基因 ， 因 此 在 
塔 养 基 中 加 所 葵 西 林 和 四 环 素 就 可 以 检 出 转化 入 。 


二 、 实 验 材料 
1, 大肠 杆菌 Ecoli) 菌 株 ， 供 体 菌 ,， SF8 (pBR322)。 受 体 
万 : RRI FEF- pro jet 乌 i:lac 汪 - 俩 下 表 - 旺 本 
2 .器 材 用 具 : - 同 实验 16。 
3. 肉 汤 培养 基 ， 同 实验 9。 
4. 加 抗生素 肉 汤 固体 培养 基 ; 其 中 人 革 西林 20hB/aml 四 环 
素 20ng/ml。 
5.2- 肉 汤 培 养 基 : 蛋白 肪 208， 和 牛肉 高 68， 葡萄 糖 28， 蒸 饮 
水 1000ml1， 用 NaOH 调 pH 至 7.5。 委 
6.0.3M 及 0.03M CaCcl,，0.01M NaCl， 


三 、 实 验 步 到 
(一 ) 受 体 菌株 生长 曲线 的 测定 
“300。 


(二 二 在 


1. 把 受 体 菌 划 线 接种 在 肉 汤 尘 养 基 平板 上 ， 37 忆 培养 过 夜 。 


-再 重复 划 线 培养 一 次 。 


2. 在 平板 上 选取 20 一 30 个 菌落 ， 悬 浮 于 1.5ml 肉 汤 培 养 液 中 。 
另 取 12 个 100ml 三 角 瓶 ， 各 加 5ml 肉 汤 培 养 液 ， 再 加 入 上 述 菌 液 


0.1mlb .37 忆 振 划 培 养 ， 每 小 时 取 一 瓶 ， 测 9. D. 值 。 


一 3: 在 620nm 处 0 D, 值 为 0:6` 0:7、-0:8 时 分别 取 菌 液 稀释 


1 至 切 ” 二 取 称 释 度 为 10-4、10-5、10- 的 苗 液 各 0. 和 涂 在 肉 


汤 培 养 基 平板 上 ， 每 个 稀释 度 接 种 两 个 平板 。 
下 本 377 培 养 24 小 时 后 计算 活 菌 数 。 为 做 转化 实验 ，5xX 10/ml 
为 合适 的 生长 时 期 。 

(二 ) 大 肠 杆菌 的 转化 

1. 从 经 过 两 次 过 夜 培 养 的 肉 汤 培养 基 平 板 上 ， 挑 取 1 一 2 个 大 
菌落 ， 接 种 于 11ml 肉 汤 培 养 液 中 ，37 振 划 培 养 至 对 数 生 长 早 中 
RE E 

行 下 面 实验 的 同时 ， 测 定 活 菌 数 。 方法 同 实验 16， 稀 克 
克基 平板 用 肉 汤 固 体 培 养 基 。 

3 .已 培养 好 的 细 蓝 需 迅 速 冷 却 , 取 10ml 悬 泽 菌 液 于 0C 下 4000 
rpm 离 心 10 分 钟 ， 弃 去 培养 液 。 

4 用 5alo.0tMUNacl 洗 菌 体 二 次 ， 离 心 ， 允 菌 体 晤 浮 于 5ml 
0.03M CacCcl 中 ， 置 冰 水 中 20 分 钟 。 离 心 ， 把 菌 体 再 悬浮 于 lml 
冷 的 0.03M Cacl, 中 ， 此 为 感受 态 细 菌 的 悬 液 。 

5. 用 预 冷 的 移 液 管 , 取 0.2ml 感 受 态 细菌 悬 液 , 加 预 冷 的 DNA 
样品 及 0.3M CaCcly*， 使 DNA 的 浓度 为 1 一 3u8]/ml，CaCl; 的 终 浓 
度 为 0.03M。 


习 同时 设 对 照 1. 受 体 细菌 悬 液 0.2ml， 对 照 2: DNA+ CaCl， 


液 0.2ml。 
6 .把 这 些 样 靖 置 于 0OYC 〈 冰 水 中 ) 60 分 钟 ，42 和 

迅速 将 其 冷却 。 

: .7 了 .用 2Z- 肉 汤 培 养 液 以 1:10 稀 释 ，377 静 置 培养 90 分 钟 。 
8 . 按 下 表 用 肉 汤 培 养 液 稀释 并 涂 布 于 肉 汤 培 养 基 平 板 上 。 


了 了 07T。 


肉 汤 国体 堵 养 基 
不 含 和 抗生素 


10-5 一 10-7 
ES 
不 稀释 


100 一 10- 半 如 
不 稀释 
不 稀 炙 


每 个 平板 接种 05lml,s 371 培养 24 小 时 (不 人 抗 菌 素平 板 生 
48 小 时 ( 含 抗生素 平板 ) 后 统计 菌落 数 ， 并 选取 转化 也 5 二 寺 时 
.0 9. 转化 频率 的 计算 方法 同 实验 165 ;转化 子 总 数 等 于 苇 兹 菌落 
数 x 稀释 倍数 x 转化 反应 液体 积 。 时 壕 淮 


实验 18 切片 制作 法 


、 实 验 目 的 
了 旬 大 切 上 的 基本 过 程 ， 人 所 上 的 和 方法 


二 、 实 验 材料 


1. 蚕 豆 根 尖 或 洋葱 根 尖 等 。 

2. 用 具 :， 小 标本 瓶 “ 指 管 “ 眼 科 狠 子 ” 螨 杯 ) 量 铲 已 十 ; 
毛笔 ” 载 玻 片 ”10ml 量 简 漏斗 滴 管 酒精 灯 熔 蜡 箱 ， 水 未 
块 ， 解 前 针 ” 吸水 纸 切片 机 展 片 台 。 需 要 强调 的 是 载 玻 片 必 
须 事先 氛 洗 得 很 干净 。 sj 
353.70%、 -85%、95%、100% 酒 精 及 工 甲 茉 当 石蜡 听 
-< 4. 固定 液 ， 将 冰 酷 酸 与 纯 酒 精 以 1:3 混 合 ， 现 配 现 用 沁 

5. 甘油 蛋 电 : : 取 鸡 蛋 的 蛋白 加 入 等 量 的 甘油 ， 搅拌 均匀 ， 按 
1% 量 加 入 麻 香 酚 小 块 ， 放 入 冰箱 备用 。 


e。 了 02 。 


号 。 实验 步 又 


1 .取材 固定 ， 发 芽 的 蚕豆 ， 当 根 尖 长 到 一 粒 米 大 小 时 ，: 用 刀 
片 切 下 来 ， 立 即 投入 盛 有 固定 液 的 标本 瓶 中 ， 贴 上 标签 ,固定 4 一 
12 小 时 。 

2 .洗涤 保存 : 倒 出 固定 液 ， 加 人 20% 酒 克 ， 隔 数 小 时 再 换 1 一 
2 次 酒精 ， 放 冰箱 保存 。 

3 .脱水 与 透明 :将 材料 从 70% 酒 精 中 取出 ， 依次 转 入 85% 酒 
精 、95% 酒 精 、100% 酒 精 .100% 酒 精 、 二 甲 葵 与 纯 酒 精 1:4 混 合 
液 、2:1 混 合 液 、4:1 混 合 液 、 二 甲苯 。 每 步 间隔 10 分 钟 ， 在 二 甲 
到 中 停留 到 组 织 块 透 明 。 注 意 每 次 换 液 需 用 吸水 纸 把 余 液 吸 干 。 

4. 透 蜡 :. 将 石 螨 熔化， 分 装 在 三 个 编号 的 蜡 杯 内 ， 舅 准备 一 
杯 石蜡 供 包 埋 用 。 蜡 标 都 放 在 55 一 60T 的 熔 蜡 箱 内 。 

忆 骏 三 甲 茶 中 取出 透明 的 根 尖 ， 依 次 放 入 蜡 杯 (1)， (2)，(3) 各 
半 小 时 。 

5. 包 埋 : 用 温 热 的 吸管 吸取 热 石 螨 ， 注 入 预制 的 纸 盒 内 ， 用 
温 人 银子 淆 了 可 组 织 块 放 入 纸 盒 的 中 央 位 置 。 用 冷水 冷却 纸 盒 的 底部 ， 
待 石 螨 表面 凝 成 一 层 膜 后 ， 迅 速 将 纸 盒 全 部 浸入 冷水 中 ， 待 石 螨 
全 部 凝结 变 硬 后 取出 。 

6. 修 切 螨 块 ， 去 掉 纸 盒 ， 用 刀片 将 虹 块 修成 长 方形 ; 注意 由 
块 两 边 必须 修成 平行 的 直线 。 

7. 困 定 螨 块 ， 取 小 木 块 ， 用 虹 铲 加 上 热 石 螨 ， 再 熔化 蜡 块 底 
面 ， 粘 于 小 木板 上 ， 冷 却 后 装 在 切片 机 上 。， 

8 切片: 按 20 一 30 度 倾斜 角 装 土 切片 刀 ， 调整 刻度 指针 到 5 
5 微米 处 ,二 手 均匀 地 播 切片 机 转 轮 ， 一 手持 毛笔 托 住 螨 带 ， 平 放 
在 平板 上 上。 切片 时 要 注意 刀口 清洁 ， 室 温 适 宜 。 

9. 展 片 、 贴 片 ， 用 玻 禄 尖端 稍稍 疗 取 一 滴 甘 油 蛋白 ， 滴 于 载 
玻 片 上 (不 宜 太 多 )。 用 洗 净 的 手指 涂 布 ， 涂 布 面 取 决 于 要 贴 附 的 
蜡 片 面积 。 再 滴 上 二 滴 燕 馅 水 。 用 刀片 将 螨 带 切 成 适当 长 度 的 片 
段 ， 以 小 锰 子 夹 取 螨 带 ， 铺 在 玻 片 的 水 面 上 ， 摆 正 位 置 后 置 于 预 


5 了 303 


热 到 48 左 右 的 展 片 台 上 。 待 蜡 片 完全 展 平 后 ， 用 吸水 纸 吸 去 多 | 
余 的 水 份 ， 清 除 切片 与 载 玻 片 之 间 的 气泡 。 然 后 平 旋 在 载 片 加 上 F， 
待 其 干燥 后 即 可 染色 。 


实验 19 平泉 根 (Feulgen) 娄 色 法 


一 、 实 验 原 理 


这 是 Feulgen 于 1924 年 提出 的 一 种 鉴别 细胞 中 DNS 前 组 织 
化 学 方法 。 细 胞 中 的 DNA 在 60"@ 下 用 1NHCGCI 酸 解 ， 使 去 氧 核 粮 
与 味 吟 碱 之 间 的 糖苷 键 破坏 ， 味 叭 碱 赔 掉 ， 从 而 使 脱氧 核糖 下 潜 
在 的 醛 基 游 离 。 游 离 的 醛 基 与 Schift 试剂 结合 ,形成 二 种 紫色 的 
复合 物 。 

酸 解 的 条 件 很 重要 。 若 温度 低 \ 酸度 不 够 ) 醋 基 暴 露 不 充分 ， 
染色 会 过 浅 ， 相 反 ， 若 酸 解 过 分 ， 会 造成 DNA 完全 解 聚 ,从 而 使 
水 解 液 中 Schi 任 反应 增强 ， 而 染色 体 的 染色 反应 减弱 。 而 RNA 在 
酸 的 作用 下 比 DNA 稳 定 ， 醛 基 难 以 被 游离 ， 所 以 不 能 被 着 色 ; 这 
就 是 孚 尔 根 反应 对 DNA 有 特异 性 染色 反应 的 原因 。 


二 、 实 验 材 料 


1. 上 次 实验 制 成 的 石蜡 切片 。 二 出 

2. 用 具 :: 立 式 妆 色 仙 一 套 ” 狠 子 ” 盖 玻 片 二 小 漏 阅 .5 铁 架 
毛 边 纸 守 玻 斑 棒 于 显微镜 恒温 水 洽 锅 温度 计 忆 烧杯 本 换 人 
黑 纸 

3 各 种 浓度 的 乙醇 ( 见 实验 18)、 二 甲苯、 加 拿 大 中 作料 驳 。 

4.1N HCl 机 

5. Schiff 试剂 : 0.58g 碱 性 品 红 ， 加 到 已 老 沸 的 100ml 车 信 
水 中 ， 再 煮沸 3 一 4 分 钟 ， 待 冷却 到 50% 时 过 滤 ， 继 续 冷 却 到 25 


% 304。 


和 


-以 下 时 再 加 10ml 1N HCL 和 1.5g 偏 重 亚 硫 枉 钠 ， 装 入 棕色 瓶 ， 盖 


紧 ， 训 上 黑 纸 ， 保 存 暗 处 。 偏 重 亚硫酸钠 与 IN HC1 反应 ， 放 出 
SO。，SO ,与 碱 性 品 红 反 应 ， 生 成 碱 性 品 红 - 亚 硫酸 溶液 ， 无 色 。 
6. 漂染 液 :, 10ml10%% 亚 硫酸 钠 溶 液 加 200ml 蒸 饮水 ， 再 加 
10ml1NHC1。 必 须 现 配 现 用 。 


三、 实验 步 最 


1 脱 蜡 , 石 旺 切 片 经 下 列 步骤 脱 寻 。 纯 二 甲 苯 (1) -0 分钟 -> 
纯 二 甲 芋 (2) 5 分钟 “100% 乙 醇 2 分 钟 _-95% 乙 醇 2 分 名 -85% 
乙醇 2 分 钟 -70% 乙醇 2 分 钟 -50% 乙醇 二 分 钟 -30% 乙 梅 
2 分 名 -> 蒋 水 (1) 工分 部 > 茶 饮水 (2 ) 

2 水 解 ，1NHCL2 2 分 种 -60。 CI1NHCL8 一 10 分 钟 > 染色。 

8 染色 ， 在 Scfiff 试 剂 的 梁 色 缸 中 染色 3 小 时 以 上 。 最 好 在 
10 习 左右 的 黑暗 条 件 下 进行 

4。 漂洗 镜 检 ， 漂 染 液 (1) 2 分 名 -> 漂染 液 (2) 二 分 名 -= 菩 
鸟 水 (1) 2 分 钟 _> 燕 饮 水 (2) 2 分 钟 _~ 显 微 镜 下 检查 。 

5 透明 ，50% 乙 醇 2 分 钟 “70% 乙 醇 2 分 钟 _ -85% 乙 醇 
3 分 冲 -95% 乙 醇 巨 分钟-100% 乙 醇 (1)5 分 钟 “100% 乙 醇 (2) 
各 分 吕 汪 一 甲 丝 (T) 瑟 分 钟 -二 甲 花 ( 汪 分 锅 -= 针 片 ; 

6.， 封 片 ， 从 二 甲 华 中 取出 碟 玻 片 ， 用 毛 边 纸 鹃 干 余 液 。 用 
玻璃 棒 药 取 树 胶 滴 于 载 玻 片 上 。 然 后 钴 取 盖 玻 片 ， 先 将 一 边 落 于 


载 玻 片 土 ， 徐 徐 放 下 ， 使 树胶 布 满 盖 玻 片 与 裁 玻 片 之 间 ， 赶 除 气 
泡 ， 证 其 自然 干燥 。 


305 。 


实验 20 ， 花粉 母 细胞 的 制 片 技术 : 


、 实 验 目 的 学 习 植 物 花粉 母 细胞 的 制 片 转 术 ， 了 胡 减 数 
施 的 过 程 


二 、 实 验 材料 


1. 等 豆 、 玉 米 与 小 考 现 茧 孕穗 植株 
2. 用 具 :， 显微镜 银子 解剖 针 。” 盖 玻 片 ” 载 玻 片 ， 吸 水 
纸 ” 培 养 四 ”酒精 灯 
3. Carnoy 固定 液 ， 无 水 乙醇 3 份 ， 冰 酷 酸 1 份 ， 现 配 现 用 。 
4， 酷 酸 洋红 ，45% 醋 酸 100m1l 加 胭脂 红粉 (Carmine)1g， 者 
省， 冷却 后 再 加 1 一 ?2% 的 铁 明 矶 水 溶液 5 一 10 满 ,过 让 后 凡生 于 丢 
色 瓶 中 。 


三 、 实 验 步骤 


1. 取材 与 固定 : 

(1) 短 豆 : 在 和 蛋 豆 刚 现 蕾 时 ， 取 蔡 顶 幼小 花束 ， 去 掉 周 围 洒 
叶 ， 将 长 约 Imm 左 右 的 花苞 ， 在 国定 液 中 国定 8 小 时 后 , 换 入 70% 
的 酒精 中 。 到 诸 时 间 以 下 午 2 上 为 宣 。 

(2) 玉米 : 在 亚 米 孕 入 初期 ， 即 检 基 需 夹 前 42LOSR 村 
部 略 现 膨 软 。 先 用 手 从 出 以 口 往 下 坦 时 鞘 ， 感 觉 松 软 的 部 位 用 习 
片 划 开 。 取 出 4~6mm 长 的 幼 穗 ， 固 定 在 固定 液 内 ;冰箱 内 保存 ， 
或 24 小 时 后 转 入 70% 酒 精 中 保存 。 取 材 时 间 以 上 午 7 一 9 点 为 宜 。 

(3) 小 麦 : 植株 开始 挑 旗 , 花 药 长 1.5~2mm , 呈 黄 绿色 时 取 
材 最 合适 ， 取 材 时 间 以 上 午 10 时 至 下 午 1 点 为 宜 。 男 定 保 存 方法 
同上 。 


6306。 


iD 


人 


2. 制 片 染色 ; 到 出 国定 好 的 花 穗 ;和 剥 开花 昔 ; -取出 花药 ， 
放 在 载 玻 片上 。 滴 一 滴 醋 酸 洋红 在 花药 上 。 用 解剖 针 横 断 花药 ， 
轻 轻 压 挤 ， 使 花粉 母 细 胞 散 出 。 用 锰 子 仔细 地 将 所 有 的 药 壁 残 酒 
清除 干净 以 后 ， 加 盖 玻 片 在 低 倍 镜 下 作 初 步 检 查 。 若 材料 可 用 ， 
则 将 载 片 移 置 酒精 灯 上 微微 加 热 ， 注 意 切 勿 使 染 液 沸腾 ， 不 可 烧 
市 5 把 片子 放 在 毛 边 纸 下 ，: 用 拇指 匀 力 下 压 ， 使 材料 分 开 ， 并 把 
周围 的 染色 液 吸 干 。 若 染色 太 浅 ， 在 盖 片 边 上 稍 加 染色 液 再 烘 ， 
再 压 5j 薪 染色 过 深 可 用 冰 栈 酸 退 色 。 

3 二 永久 性 封 片 : 将 片子 浸入 1:1 的 95% 酒 精 冰 醋酸 溶液 中 ， 
并 加 六 滴 正 于 醇 。 轻 轻 揭 开 盖 片 ， 浸 5 一 6 分 钟 。 转 入 95% 酒 精 与 
: 正 丁 醇 1:1 的 溶液 中 1 一 2 分 钟 - 再 转 入 纯正 于 醇 透 明 1 一 2 分 钟 。 用 
滤纸 吸 去 多 疹 溶 液 ， 打 开 盖 片 ; 加 1 一 2 滴 树 胶 封 片 ; 赶 除 气泡 后 ， 
-保存 在 较 检 的 温度 下 。 


四 、 作 业 . 


. 了 解 植物 花粉 形成 中 的 减 数 分 裂 过 程 。 
2. 绘制 观察 到 的 分 裂 图 ， 注 明 是 什么 时 期 。 


实验 21 。 植物 染色 体 组 再 外 析 ; 


核 型 是 指 染色 体 组 在 有 丝 分 裂 中 期 的 表 型 ,包括 染色 体 数目 、 
大 小 、 形 态 特征 的 总 和 。 核 型 分 析 是 在 对 染色 体 进 行 测量 计算 的 
基础 上 ， 进 行 分 组 、 排 队 : 配对 并 进行 形态 分 析 的 过 程 。 由 于 染 
' 公 体 是 遗传 物质 单位 一 一 基因 的 载体 , 核 型 代表 了 种 属 的 特征 。 所 
以 组 型 分 析 对 于 探讨 人 类 遗传 病 的 机 制 、 动 植物 起 源 、 物 种 间 亲 
缘 关 系 、 鉴 定 远 缘 杂 种 等 方面 都 具有 重要 的 意义 。 


。 3 了 07 。 


-、 实 验 目 的 : 掌握 染色 体 组 型 的 分 析 方 法 。 


二 、 实 验 材料 


1， 大麦 种 籽 及 天 麦 染色 体 示 范 图 片 。 

2 显微镜 “冰箱 ， 温 箱 “ 显 微 摄影 设备 ” 测 微 尺 “剪刀 
缀 子 “ 培 养 中 ”小 烧杯 ， 玻 棒 ， 载 玻 片 “ 盖 玻 片 “ 酒 精 灯 ;滤纸 
等 区 过 俏 人 
饱和 的 对 二 毛茶 溶液 ”0.075MKCI 溶液 “2% 国 产 纤维 
过 机 9 本 人 pH7.2 的 磷酸 缓冲 液 
加拿大 树胶 。 

ioaua 允 对 和 且 利和 市 二 网 二 和 
研磨 ， 至 无 颗粒 时 ， 加 入 33ml 甘 油 ， 放 在 56"C 水 浴 中 90 分 钟 。 再 
加 入 33ml 甲醇 ， 热 过 滤 ， 倒 入 棕色 瓶 中 , : 置 4 冰箱 中 存放 半 个 
月 后 使 用 。 用 时 用 磷酸 缓冲 液 以 1:10 黎 释 。 


三 、 实 验 步骤 


(一 ) 大 麦 染 色 体 标本 制作 

1.， 材料 培养 ， 种 籽 在 25"C 下 发 菠 至 根 长 Im 左右 ， 洗 净 。 

2， 预 处 理 ， 剪 下 2mm 左 右 的 根 尖 ， 室 温 下 用 对 二 氧 苯 饱 和 
液 处 理 3 小 时 左右 , 洗 净 。 

3， 前 低 渗 ， 室 温 下 用 0.075M 氧化 钾 溶液 处 理 30 分 钟 ， 洗 
净 。 

4. 酶 解 ，25" 下 酶 液 处 理 3 小 时 左右 。 

5. 后 低 渗 : 水 洗 2~3 次 后 ， 在 蒸馏 水 中 停留 30 分 钟 。 ”二 

6. .固定 :固定 液 处 理 30 分 钟 左右 。 记 

7. 制备 细胞 悬 液 : 倒 去 大 部 分 固定 液 ， 半 汪 全 
再 加 适量 固定 液 ， 制 成 巧 液 。 

8. 制 片 ,吸取 少 许 悬 液 ， 滴 于 冰冻 的 载 玻 片 于 二 轻 轻 哆 等 
后 在 酒精 灯 上 加 热 和 干燥 。 

9， 染色 ， 用 磷酸 缓冲 液 稀释 的 Giemsa 染 液 染 色 5 分 钟 ， 


。 308。 


洗 净 。 
10. 封 片 ， 显微镜 下 检查 ， 将 染色 体 分 散 好 、 清 晰 的 片 子 用 
二 甲苯 透明 后 ， 用 加 拿 大 胶 封 固 。 

(二 ) 大 麦 染色 体 组 型 分 析 

1， 染色 体 计 数 : 选取 一 百 个 以 上 染色 体 分 散 好 的 细胞， 进 
行 染 色 体 计数 ， 得 出 大 麦 的 染色 体 数目 。 

2. 染色 体 测 量 和 计算 : 在 染色 体 标 本 中 选取 5 一 10 个 梁 色 体 
平 直 、 收 缩 适 度 、 着 丝 点 清楚 的 细胞 ， 进 行 拍照 放大 ， 并 按 下 表 
进行 测量 和 计算 。 


， ”染色体 长 度 
上 宝生 色 体 组 总 长 讶 ”0 


3.， 染色 体 配 对 和 排队 

(1) 根据 染色 体 的 相对 长 度 、 臂 比 和 形态 特征 ， 将 同 源 染 色 
体 相配 成 对 。 

(2) 按 和 由 长 至 短 的 顺序 将 各 对 染色 体 依次 排队 。 长 度 相同 的 
染色 体 则 将 短 臂 长 的 染色 体 排 在 前 面 ， 随 体 染 色 体 排 在 最 后 。 

4. 求 臂 比 和 相对 长 度 的 平均 值 ， 并 根据 臂 比值 将 染色 体 分 
类 ， 

臂 比 1.0~1.7 为 中 部 着 丝 点 染色 体 (M); 
” 臂 比 1.7 一 3.0 为 近 中 部 着 丝 点 染色 体 (SM) ， 

臂 比 3.0 一 7.0 为 近 端 部 着 丝 点 染色 体 (ST); 

臂 比 7.0 以 上 为 端 部 着 丝 点 染色 体 (T) 。 

5. 染色 体 组 型 标准 图 像 的 制备 ， 选 择 最 理想 的 放大 照片 ， 
根据 染色 体 的 分 类 排队 情况 进行 剪贴 。 剪贴 后 再 进行 翻拍 ， 并 给 


“309。 


如 员 


制 大 麦 染 色 体 组 型 模式 图 。 


实验 CC ”物化 因素 对 染色 体 的 影响 


一 、 实 验 目的 


了 解 诱 发 植物 多 倍 体 细胞 的 方法 ， 观 察 物化 因素 引起 的 染色 
体 变异 及 产生 的 微 核 ， 检 验 诱 变 州 量 与 诱 变 效 应 的 相关 性 。 


二 、 实 验 原理 


物化 因素 可 以 对 染色 体 发 生 影响 ， 从 而 使 生物 体 的 性 状 产生 
变异 。 它 们 可 以 引起 染色 体 在 数量 与 做 构 上 发 生变 化 ， 还 可 导致 
微 核 的 产生 。 所 产生 的 变异 频率 与 物化 因素 的 剂量 相关 ， 因 而 在 
致癌 畸变 物质 的 检测 方面 ， 可 以 运用 染色 体 畸 变 分 析 法 和 微 核 测 
定 法 。 


染色 体 畸 变 分 析 法 ， 是 在 一 定数 目的 有 丝 分 裂 中 、 后 期 细胞 


中 ， 统 计 染 色 体 桥 和 断 片 的 方法 。 染 色 体 在 物化 因素 作用 下 断 盈 ， 
同一 染色 体 或 不 同 染 色 体 的 两 条 单 体重 新 食 合 ， 从 而 形成 双 着 丝 


点 的 染色 体 ， 在 后 期 就 会 出 现 染 色 体 笑 和 断 上 请。 这 是 较为 准确 的 ， 
检测 方法 。 微 核 则 是 在 物化 因素 作用 下 细胞 质 内 形成 的 一 种 小 核 ， 


它 可 能 是 染色 体 断 片 ， 或 因 纺 锤 丝 受 损 后 个 别 落后 的 染色 体形 成 
的 ， 也 有 人 认为 是 主 核 出 萄 的 结果 。 由 于 微 核 可 以 在 细胞 周期 的 
各 个 时 期 内 被 观察 到 ， 而 不 必 考 虑 材料 中 分 裂 相 的 多 少 ,所 以 微 
核 测 定 法 已 是 一 种 被 广泛 接受 的 简便 敏感 的 检测 方法 。 

秋水 仙 碱 的 作用 在 于 直接 或 间接 地 破坏 了 纺锤 丝 的 形成 ， 而 
对 染色 体 的 千 构 与 复制 无 显著 影响 ， 从 而 造成 细胞 中 的 染色 体 加 


倍 。 


2 


三 、 实 验 材料 


1. 大 麦 种 籽 、 等 豆 及 洋葱 等 。 
2. 显微镜 、 银 子 、 解 训 针 、 刀 片 、 载 玻 片 、 盖 玻 片 、 吸 水 
3. 酷 酸 洋红 、 秋 水 仙 素 、1NHC1。 


四 、 实 验 步 骤 

(一 ) 材 料 处 理 

1. 物理 因素 处 理 大 麦 种 籽 。 物 理 因素 采用 电子 束 (提高 了 
一 定 能 量 ,并 经 聚焦 的 8B- 射 线 ) ， 辐 射 剂量 用 1.8x104、2.5X10* 
与 3.9x10^rad( 拉 德 )， 照 射 后 的 种 籽 按 常规 方法 发 芽 、 剪 根 和 国 
定 。 

2. 化 学 因素 (秋水 仙 碱 ) 处 理 蚕豆 、 洋 葱 根 尖 。 

(1) 先 剪 去 洋葱 的 老 根 ， 然 后 置 于 盛 满 水 的 广 口 瓶 上 ， 等 长 
出 新 根 后 ， 再 移 到 感 有 0.01~0.1% 秋 水 仙 素 的 器 血 中 ,直到 根 尖 
膨大 为 止 。 

(2) 和 愉 豆 种 籽 在 沙盘 中 发 菠 ， 当 根 长 1cm 左 右 时 ， 取 出 洗 净 ， 
将 水 吸 干 ， 用 0.1% 秋 水 仙 素 处 理 , 以 药 液 浸 没 根部 为 准 。 在 25 
下 培养 ， 直 到 根 尖 膨 大 为 止 。 

(二 ) 染 色 、 制 片 

1. 将 根 尖 放 在 1NHCI 解 离 液 中 ， 置 30 水 浴 锅 中 解 离 10 分 
钟 左右 ， 用 水 洗 净 。 

2， 将 根 尖 置 于 载 玻 片 上 ， 滴 上 -二 滴 栈 酸 洋红 ， 5 分 钟 后 
压 片 。 

3. 用 解剖 针 的 碎 组 织 ， 盖 上 盖 片 ， 边 散 击 ， 边 在 酒精 灯 上 
微微 加 热 。 最 后 用 拇指 用 力 一 压 ， 注 意 勿 使 盖 片 移动 。 

(三 ) 观 察 统计 

1. 观 罕 秋水 仙 素 处 理 的 根 尖 压 片 ， 寻 找 理想 的 中 期 相 ， 观 
察 染 色 体 数目 的 加 倍 情 况 ， 并 与 对 照 比 较 。 


是 


2， 观察 电子 束 处 理 的 根 尖 压 片 中 ,染色 体 桥 和 断 片 的 情况 。 
调查 20 条 主根 ， 每 条 根 检查 25 个 有 丝 分 裂 中 、 后 期 细胞 ,: 黎 计 这 
500 个 细胞 中 桥 和 断 片 的 频率 。 

3. 观 察 秋水 仙 素 和 电子 束 处 理 后 的 根 尖 压 片 中 微 核 的 情 
况 。 调 查 20 条 主根 ， 每 条 根 尖 观 察 200 一 250 个 细胞 ， 统 计 这 4000 


人 5000 个 细胞 中 微 核 出 现 的 频率 。 


实验 23 植物 的 有 性 杂交 


一 、 实 验 目 的 

初步 学 握 一 些 作 物 的 杂交 方法 ， 了 解 杂 交 后 代 的 一 般 遗 传 现 
象 和 它们 的 规律 。 

二 、 实 验 原理 


两 个 具有 不 同 基 因 型 的 品种 或 类 型 ， 通 过 肉 雁 细胞 的 结合 ， 
产生 新 类 型 ， 称 为 杂交 。 
在 有 性 杂交 中 把 接受 花粉 的 植株 叫做 母 本 ， 用 符号 “?” 表 


2 


1 区 傣 世 


本 
四 站 
了 


示 ;， 供给 花粉 的 植株 称 父 本 ， 用 “ 3 "表示 。 父 母 本 统称 亲本 ， 用 


“P” 表 示 ， 杂 交 符 号 用 “ x "表示 ， 自 交 符 号 用 “@ "表示 ， 杂 种 一 
代用 “Fi 表示 ， 杂 种 二 代用 “F，, ?表示 ， 依 此 类 推 。 


三 、 实 验 材料 


1. 不 同 品种 的 小 麦 和 水 稻 。 
2. 剪刀 小 锰 子 ”酒精 棉花 纸牌 “透明 纸袋 曲 别 针 
铅笔 ”小 热水瓶 ”温度计 


四 、 实 验 步 又 


(一 ) 小 麦 

1. 选 穗 、 整 穗 : 选择 生长 壮 健 的 植株 主 穗 作 母 本 ， 一 般 用 
抽出 剑 叶 半 二 左右 的 穗 子 。 用 狠 子 将 上 部 和 基部 的 小 穗 去 择 ， 留 
下 中 部 10 个 小 穗 (两 边 各 5 个 ) ,每 个 小 穗 只 留 基部 两 休 花 ， 母 本 有 
芒 时 ， 把 芒 剪 去 。 

2. 去 雄 : 用 手指 轻 正 小 花 ， 用 银子 从 内 、 外 颖 中 间 取 出 花 
药 ， 注 意 不 要 夹 破 花 药 ， 也 不 要 碰 伤 柱头 。 若 严 破 了 花药 ， 则 应 
去 掉 这 条 小 花 。 每 次 去 雄 后 的 锰 子 要 用 酒精 棉 控 洗 。 

去 雄 要 有 顺序 ， 最 好 一 侧 一 便 、 自 上 而 下 地 进行 。 去 雄 后 将 


每 沙 小 花 的 颖 壳 剪 去 二 一 了。 

去 雄 后 要 立即 套 袋 ， 把 袋 口 折 倒 好， 用 曲 别针 别 住 ， 并 挂 上 
纸牌 。 纸 牌 上 用 铅笔 注 明 母 本 名 称 ， 去 雄 日 期 。 

3 采集 花粉 ， 选 取 即 将 开花 或 中 部 已 开 1 一 2 薪 花 的 父 本 入 
子 ， 将 它们 剪 下 ， 用 手 上 下 抹 几 次 ， 以 刺激 开花 。 然 后 把 小 穗 前 
成 作 形 ， 稍 等 片刻 ， 花 药 就 会 陆续 伸 出 颖 壳 。 

4. 授粉 ， 一 般 在 去 雄 第 二 天 ， 当 去 雄花 淋 的 柱头 呈 丽 毛 状 
并 带 有 光泽 时 ， 是 授粉 的 最 好 机 会 。 授 粉 后 ， 再 套 上 纸袋 ， 用 铝 
笔 在 纸牌 上 标记 父 本 名 称 及 授粉 日 期 。 

5 收获。 杂 交 种 籽 成 熟 后 ， 按 穗 收获 ， 同 一 组 合 的 穗 子 混 


sj3T3.。 


合 脱粒 后 ， 按 组 合 装 入 纸袋 ， 并 注 明 组 合 名 称 、 种 籽粒 数 。 

二) 水生 

1. 选 株 选 德 ， 确 定 杂交 组 合 后 ， 应 选择 形态 特征 典型 的 、 
生长 健壮 无 病虫害 的 植株 ， 一 般 用 主 穗 或 第 一 分 穗 。 选 穗 的 具体 
标准 因 品 种 而 有 所 不 同 。 早 中 籼稻 品种 以 穗 部 的 3/4 专 右 已 抽出 
叶 辅 到 全 穗 刚 抽出 为 好 ， 早 中 加 品 种 则 以 全 穗 抽出 叶鞘 为 佳 晚 
称 则 以 穗 抽出 后 ， 入 横 已 露出 的 ， 去 雄 效果 好 。 

2. 去 雄 ， 去 雄 的 方法 有 剪 颖 去 雄 法 、 套 袋 机 械 去 雁 法 和 温 
汐 去 雄 法 。 剪 颖 去 雄 法 是 将 颖 壳 剪 去 1/3~1/4, 用 锰 子 除去 雄蕊 ， 
这 种 方法 易 伤 花 器 ， 结 实 率 低 。 套 袋 机 械 去 雄 法 ， 是 在 开花 前 一 
小 时 ， 用 黑色 纸袋 套 在 穗 上 ， 促 使 提早 开花 而 花药 未 届 开 ， 便 于 
去 雄 ， 但 套 袋 时 间 不 易 掌握 。 所 以 目前 一 般 用 温 汤 去 雄 法 。 

利用 花粉 不 耐 高 温 而 雌 世 耐 高 温 较 强 的 特点 ， 在 开花 前 半 小 
时 至 1 小 时 左右 ,将 选 好 的 舟 穗 插 进 热水瓶 。 一 般 籼 称 在 43" 温 水 
中 浸 5 分 钟 左 右 ， 粳 称 在 45\C 温 水 中 浸 5 分 钟 左 右 。 经 温 汤 处 理 后 ， 
这 种 已 经 开放 或 稍 等 片刻 就 开放 的 颖 花花 粉 被 温 汤 杀 死 。 前 去 没 
有 开花 的 全 部 颖 花 ， 套 上 纸袋 ， 挂 上 纸牌。 

3.， 授粉， 在 每 天 的 开花 盛 期 ， 采 集 发 育 完全 且 刚刚 破 虱 的 
花药 作 授粉 用 。 用 铺子 夹 取 花 药 2 个 , 轻 轻 塞 进 已 去 雄 的 小 穗 内 ， 
套 上 纸 余 ， 挂 牌 。 

4， 以 后 检查 结实 情况 。 


实验 C4 。” 秆 物 花药 培养 


一 、 实 验 目的 
学 会 鉴定 花粉 发 育 时 期 ,初步 掌握 作物 花药 堵 养 的 基本 操作 。 
。 了 14。 


二、 实验 材料 


1， 小 麦 

2. 试管 烧杯 量 简 - 吸 量 管 ”前 刀 杀 子 ”棉花 纱布 
精密 试纸 ”酒精 灯 培养 四 ”接种 针 “试管 架 等 

3. 显微镜 ; 天平“ 培养 箱 ” 灭 菌 锅 

4 MS 培 养 基 成 份 ( 见 下 表 ) ”漂白粉 ”酒精 等 


MS 培 养 基 ” 
大 量 元 素 mg/1 微量 元 素 mg/L 有 机 成 分 ”mg/1 


一 


NH,NO， 1650 MnSO.4H;O 22.3 甘氨酸 2 
KNO， 1900 “ZnSO4。7H2O 8.。6 盐酸 硫 胺 素 0.4 
CaCl,-2H:O 440 HasBO。 , 渴 ， 盐酸 吡 哆 素 “0.5 
KH,PO,， 3 0.83 ” 烟 酸 0.。5 
MgSO,,7H;O 370 “Na,Mo0Oi.2HO 0.25 ， 肌 醇 100 
铁 盐 母液 * 5ml/1 CuS94.5H2O 0.025 ”蔗糖 90000 

CecGl .6HyO. 广 梧 动 255 藉 脂 . : 8000 

* p 耳 为 5.8 


* *# 铁 盐 母 流 配 制 ， 称 7.47g NayEDTA.2H,O 深 于 500m1 双 莱 水 中 ， 称 5.57g 


FeSO4i.7H2O 深 于 500ml 双 燕 水 中 。 然 后 将 它们 混合 ， 再 放 在 沸水 浴 中 煮 半 小 时 以 
上 。 


三 、 实 验 步 又 

(一 ) 配 制 培养 基 

1. 配制 培养 基 的 母液 ， 培养 基 中 用 量 极 少 的 微量 元 素 、 生 
长 素 类 物质 及 维生素 需 先 配 成 母液 。 

(1) 微量 元 素 按 培养 基 配 方 100 倍 的 浓度 配 成 混合 母液 。 

(2) 维生素 按 培养 基 配 方 100 倍 的 浓度 配 成 混合 母液 。 

(3) 生长 素 类 物质 单独 配 成 母液 。2,4 一 D， 蔡 乙酸 、 叫 吃 乙 


酸 配 制 母液 时 先 用 少量 95% 酒精 溶解 ;激动 素 、.6- 葵 基 腺 味 叭 需 先 
用 1NHCI 或 KOH 溶 解 。 


《4) 铁 盐 母液 需 单独 配制 ， 见 表 注 。 


了 15 。 


2. 配制 培养 基 

按 培养 基 配 方 的 量 称 取 大 量 元 素 ， 逐 项 溶解 于 700ml 双 共 水 
中 ， 然 后 分 别 吸取 铁 盐 、 微 量 元 素 、 生长 素 母 滚 、 加 入 蔗糖 后 定 
容 到 1000mi， 用 1NKOH 溶 液 调 节 p 甘 全 5.8， 再 加 入 琼脂 。 

3， 培 养 基 的 灭 菌 与 分 装 

培养 基 容 器 盖 上 棉花 塞 ， 用 臣 潮 纸 包扎 后 旗 关 丈 著 锅 中 ， 15 
磋 下 灭 菌 20 分 钟 ， 然 后 分 装 在 灭 菌 的 试管 中 ， 一 般 培 养 基 占 试 管 
-容积 的 1/5 一 1/4 为 宜 。 

2 

花粉 发 育 时 期 的 镜 检 ， 花粉 发 育 的 时 期 是 花药 培养 的 重 
证 在 小 麦 和 水 稻 ， 一 般 用 花粉 处 于 单 核 中 、 晚 期 的 花药 进 _ 

行 培养 。 先 将 花 世 取 吾 ， _ 置 于 载 玻 片 上， 轻 轻 压 碎 。 滴 一 滴 酯 酸 
且 下 盖 上 盖 玻 片 ， 在 显微镜 下 观察 。 

小 麦 花 粉 的 单 核 期 开始 时 ， 细 胞 核 位 于 中 央 ， 为 单 核 早期 。 
细胞 核 偏离 中 央 ， 逐 步 出 现 小 液 泡 ， 为 章 筷 向 其 。 细 胞 中 央 形 成 
大 液 泡 ， 细 胞 核 被 拼 到 萌发 孔 对 面 ， 则 为 章 核 晚期 。 花粉 处 于 单 
核 中 、 晚 期 的 小 专 ， 剑 叶 叶鞘 上 羊 部 明显 脱 大 ， 但 叶鞘 未 张 开 ， 

Ce 
看 不 到 纪 穗 。 必 

银 据 植株 的 外 部 形态 取材 ， 再 根据 镜 检 结果 ， 油 沐 较 老 或 科 
人 留 下 的 准备 接种 。 

. 划 药 接种 : 将 选 出 的 小 入 放 在 亿 和 漂白 粉 的 上 清 液 中 温 
ee 再 用 无 菌 水 冲洗 2 一 3 次 。 用 灭 过 菌 的 剪子 把 花药 
上 端的 颖 壳 剪 去 ， 并 用 凶 子 将 花药 剔 在 无 菌 纸 上 ， 然后 倒 入 装 有 
培养 基 的 试管 所， 每 管 20 盖 30 个 花药 。 接种 后 放 在 26 一 28xC 的 条 “ 
件 下 培养 。 

3; 愈 伤 组 织 的 诱导 

从 小 麦 花 药 诱导 铺 伤 组 织 的 培养 基 可 用 MS 培 养 基 ( 见 实验 材 
料 附 表 )， 附 加 2mg/12 ,4-D，0.5mg/] 激 动 素 ， 以 及 水 解 乳 蛋 白 
500mg/1。 小 麦 花 药 在 培养 基 上 由 黄 绿色 变 为 黄白 色 ， 半 个 月 后 
陆续 长 出 愈 伤 组 织 。 当 愈 伤 组 织 长 到 2 一 3mm 时 ， 转移 到 诱导 分 化 


6 


es 和 


4、 凋 的 分 化 与 和 坟 


苗 分 化 培养 基 与 诱导 愈 伤 组 织 的 培养 基 略 有 不 同 。 不 加 2，4- 
D， 而 用 吗 吃 乙酸 0.2~1.0mg/1，Kinetin 0.5~1.0mg/1， 蕊 糖 
浓度 为 5~8% 。 此 时 需要 用 日 光 灯 照明 ， 两 周 后 可 看 到 愈 伤 组 织 
会 分 化 出 芽 或 根 。 当 植株 长 到 2 一 3 寸 时 即 可 移 栽 。 移 栽 前 先 将 根 
部 的 培养 基 洗 去 ， 然 后 裁 在 土 中 ， 用 烧杯 单 住 幼苗 ， 防 止 水 分 类 
发 而 造成 死 苗 。 


四 、 作 业 
统计 愈 伤 组 织 的 诱导 频率 及 苗 的 分 化 频率 ， 写 出 实验 报告 。 


实验 CD 和 遗传 力 的 估算 


一 、 实 验 目 的 
通过 实验 ， 初 步 掌 握 遗 传 力 的 估算 方法 。 
二 、 实 验 原理 


数量 性 状 受 多 基因 的 支配 ， 多 基因 的 作用 有 累加 性 ， 因 而 Fl 
往往 表现 为 两 个 亲本 的 中 间 类 型 ，EF: 代 的 分 离 表 现 为 接近 常态 分 
布 的 连续 变异 。 根 据 数量 性 状 的 研究 方法 ， 遗 传 性 状 变异 的 量 值 
用 方差 表示 ， 并 在 方差 分 解 的 基础 上 定义 了 遗传 力 。 

遗传 力 是 指 亲 本 传递 某 一 性 状 的 能 力 ， 有 广义 遗传 力 和 狭义 
遗传 力 之 分 。 广 义 遗 传 力 (hs) 是 指 遗 传 方差 (Yc) 在 总 的 表 型 方差 
(Yp) 中 所 占 的 比例 。 狭 义 遗 传 力 (hx) 是 指 遗 传 方差 中 基因 加 性 效 
应 方差 (VA) 对 表 型 方差 的 比值 。 

由 于 基因 型 一 致 的 世代 (Pi:、P;:、Fi) 不 提供 基因 方差 ,所 以 


了 17 。 


有。 第 估算 遗传 力 ， 即 : 


- (二 Ve + Vei + ER ) 


了 X1000% 
(广义 遗传 力 ) 
也 三 站 100% (狭义 遗 传 力 ) 


式 中 Bl: (Fl xPr) 与 B:(Fl xP,) 是 Fl 回 交 后 伐 ，EzCGFIE) 为 
Fil 自 交 后 代 。 


三 、 实 验 步 最 


1.， 准备 材料 

小 麦 品 种 及 各 种 杂种 后 代 ，Pli、P,、Fi、F:(FIQ@)、Bli(EFi 
多 

2. 田间 设计 

不 分 离世 代 Pli、Ps。、Fi 各 种 1 单行 (5 米 行 长 ) 水 区 ， 回 交 世 
代 各 种 5 个 小 区 ， 分 离世 代 F: 种 15 个 小 区 。 

3.， 抽样 考 种 调查 

抽穗 前 随机 取样 。Pi、P:、F1 各 20 株 : BI、B: 各 50 株 ; F， 
100 诛 ,分 别 挂牌 编号 ， 然 后 对 所 测 的 性 状 进 行 调查 。 

4.， 资料 处 理 

(1) 整理 数据 

将 调查 结果 登记 在 下 页 表 中 ， 并 计算 整理 。 

42) 计算 二 亲本 及 各 杂种 的 表 型 方差 


( 开 X) 
三 二 汪 ] 2 于 nm 
人 雪 全 51 
(3) 估算 遗传 力 ， 
代入 公式 求 ha 和 HA 
四 、 作 业 


1. 以 小 组 为 单位 取 一 组 数据 。 
= 了 18 “ 


例 ( 株 高 ) 


义 遗 传 力 。 


号 


2. 每 个 同学 在 整理 数据 的 基础 上 ， 求 出 该 性 状 的 广义 和 狭 


实验 26 。” 人 的 外 周 血 淋巴 细胞 培养 


及 染色 体 标本 制作 


站 实验 目 的 : 


初步 学 握 人 外 周 血 白 细胞 的 悬浮 培养 法 ， 以 及 染色 体 标 本 制 


入 
区 


八大 党 从 


备 的 技术 ， 学 会 正常 人 染色 体 的 组 型 分 析 。 


二 、 实 验 材料 


1. 显微镜 ” 载 玻 片 ( 预 冻 保 存 ) 培养 瓶 滴 管 ”离心 管 
离心 机 “ 针 简 (10ml, 5ml 与 Iml) pH 试纸 酒精 灯 温 箱 

2. M199 培 养 基 水 解 乳 蛋白 ”肝素 小 牛 血 清 “青霉素 
链 霉 素 ， 植 物性 血球 凝集 素 (PHA) 3.5%6NaHCO:。 0.1NHCI 


秋水 仙 素 ， 低 渗 用 蒸馏 水 “固定 液 (甲醇 : 冰 栈 酸 为 3:1) 染色 液 


(Giemsa 原液 15 滴 ， 加 入 10ml pH7.4 一 7.6 的 磷酸 缓冲 液 ) 加 拿 
大 树胶 ”酒精 棉 


、 实 验 步 又 

1. 分 装 培养 液 ， 无 菌 条 件 下 将 培养 液 及 附加 成 分 装 入 培养 
瓶 ， 培养 液 M199 4ml， 小 牛 血 清 1m1， 青 霉 素 (5000 单 位 /mbD 与 
链 霉 素 (5000 单 位 /ml) 各 0.1ml;, PHA0.2ml， 肝 素 1 小 滴 , 用 3.5%% 
NaHCO , 调 pH 至 7.0 一 7.4。 

2， 采血 培养 ， 取 灭 菌 的 10ml 针 简 ， 用 肝素 湿润 。 用 碘 酒 和 
酒精 消毒 皮肤 ， 抽 取 静 脉 血 1ml， 立即 接种 于 培养 瓶 内 ， 每 瓶 约 
0 .3ml， 轻 轻 摇 动 几 下 后 置 37*C 温 箱 内 培养 66 一 72 小 时 。 “ 

3， 秋 水 介 素 处 理 ， 取 6ug/ml 的 秋水 仙 素 溶液 0.05 一 0.Iml， 
加 入 培养 瓶 ， 置 37*C 温 箱 中 处 理 2 一 4 小 时 。 

4， 低 渗 处 理 ， 小 心 地 从 温 箱 取出 培养 瓶 ， 用 滴 管 吸 弃 上 清 
液 ， 加 入 5ml 温 育 的 低 渗 溶 液 后 ， 用 滴 管 轻 轻 冲 打 成 细胞 悬 液 , 移 
入 离心 管 中 置 37"C 温 箱 处 理 20 分 钟 ， 使 红细胞 破碎 ,白细胞 膨胀 。 

5， 离 心 固 定 ，1000rpim 离 心 5 分 钟 后 弃 去 上 清 液 。2 加 入 固定 
液 2 一 4ml， 片 刻 后 用 滴 管 轻 轻 冲 打 成 细胞 悬 液 ， 室 温 下 固定 15 分 
钟 后 再 离心 ， 吸 去 上 清 液 。 再 加 入 固定 液 2ml， 用 吸管 轻 轻 打 散 ， 
室温 下 继续 固定 15 分 钟 以 上 (可 过 夜 )。 

6. 制 片 ， 离 心 去 上 清 液 后 加 入 固定 液 0.5ml， 用 泣 管 小 心 
冲 打 成 悬 液 。 从 冰箱 的 冰 格 中 取出 载 玻 片 , 每 片 滴 加 悬 液 1 一 3? 滴 ， 


人 


ny 
史 
局 史 由 
@ 


和 了 


用 嘴 轻 轻 吹 散 ， 用 电 吹风 吹 干 ， 或 在 酒精 灯 上 微 火 烤 干 。 

7. 染色 Giemsa 染 液 染色 30 分 钟 后 倒 去 多 余 染 液 ,并 用 蒸 
饮水 轻 轻 冲洗 。 

8. 镜 检 封 片 ” 待 稍 干 后 ， 在 显微镜 下 检查 。 经 二 甲 葵 透 明 5 
分 钟 后 用 加 拿 大 树胶 封 片 。 

9. 组 型 分 析 “ 显 微 摄 影 、 冲 洗 、 放 大 后 ,参照 实验 21 的 方法 
进行 组 型 分 析 。 人 类 体 细 胞 有 46 条 染色 体 ， 即 22 对 常 染色 体 和 一 
对 性 染色 体 ， 男 子 是 XY， 女 子 是 XX。 


实验 27 。” 骨 峙 细胞 染色 体制 片 技术 


一 、 实 验 目的 


骨 艇 细胞 具有 高 度 分 裂 活动 能 力 ， 是 研究 哺乳 动物 染色 体 的 _ 
良好 材料 。 通 过 实验 ， 初 步 掌握 制 片 及 染色 技术 。 


二 、 实 验 材 料 


1. 大 白鼠 (2n = 42) 或 小 白鼠 (2n = 40) 

2. 显微镜 ”离心 机 离心 管 ” 载 玻 片 ( 预 冻 保 存 ) 5ml 针 
简 吸管 ”天平 ”试管 架 量 筒 温度 计 温 箱 恒温 水 浴 锅 
冰箱 ”解剖 刀 解剖 前 ”眼科 杀 子 培养 下 烧杯 酒精 灯 

3. 秋水 仙 素 溶液 (0.1%) 柠檬 酸 钠 溶 玻 (2.2% ) 或 0.75M 
KCI] 溶 液 ”甲醇 冰 栈 酸 蒸 饮 水 pH7.2~7.4 的 磷酸 缓冲 液 
Giemsa 染 液 ”生理 盐水 


三 、 实 验 步 最 


1 秋水 仙 素 处 理 ”取材 前 2~3 小 时 ， 在 大 白鼠 腹腔 内 注射 
0.1 为 的 秋水 仙 素 溶液 ,注射 剂量 为 每 公斤 动物 体重 4mg。 
e。 了 2ZT。 


2. 了 到 骨 散 细胞 用 断 颈 法 处 死 动物 ,立即 前 取 后 肢 ， 去 除 肌 
肉 ， 剥 出 后 肢 股 骨 。 用 75% 酒 精 氛 去 残余 肌肉 碎 酒 ， 剪 开 股 肯 一 
端 。 用 注射 器 吸取 5m1l37"C 预 温 的 0.075M KC1， 捅 入 剪 开 的 小 孔 
中 ， 反 复 将 骨髓 细胞 冲 出 ，1200rpm 离 心 10 分 钟 。 

3. 低 渗 处 理 ”去 上 清 液 , 加 5mlo.075 MKCl， 经 轻 打 成 细胞 
悬 液 ， 放 在 37" 温 箱 中 低 渗 处 理 30 分 钟 。 

4， 预 固定 ”加 5 滴 新 配 的 甲醇 - 冰 栈 酸 固 定 液 (3:1)， 了 立即 混 
名 。1200rpm 离 心 10 分 钟 ， 弃 上 清 液 。 

5. 固定 : 加 入 新 配 甲醇 - 冰 酷 酸 固定 液 4ml， 立 即 用 吸管 打 
成 细胞 悬 液 ， 固 定 20 分 钟 。 离 心 去 上 清 液 后 再 用 4ml 固定 液 固定 
20 分 钟 。 离 心 去 上 清 液 后 ， 在 0.1~0.3ml 的 沉淀 物 中 再 加 0.2~~ 
0 .5ml 固 定 液 ， 用 吸管 打 匀 备用 。 

6. 滴 片 ” 取 预 先 冰冻 的 干净 载 片 ， 甩 掉 冰 水 后 迅速 泣 上 2~~ 
3 滴 细 胞 悬 液 ， 立 即 用 嘴 在 载 片 上 吹 气 ,使 悬浮 细胞 均匀 分 散 。 将 
载 片 掠 过 酒精 灯 几 次 ， 以 助 染色 体 分 散 和 展开 ， 室 温 下 于 燥 。 

7. 染色 用 1:10Giemsa 稀释 液 染 色 30 分 钟 ， 自 来 水 冲洗 ， 
室 气 干 煤 。 

8 镜 检 封 片 ”将 分 裂 相 多 而 图 象 清晰 的 涂 片 在 二 甲苯 中 透 
明 后 ， 用 加 拿 大 树胶 封 片 。 


制作 与 观察 


一 、 实 验 目 的 


初步 掌握 X- 染 色 质 标本 的 制作 方法 ,熟悉 人 体 细胞 和 -染色 质 
的 形态 特征 及 所 在 位 置 。 


3 了 320 wa 


二 、 实 验 原 理 


X- 染 色 质 是 异 染 色 质 化 的 失 活 的 X- 染 色 体 。 正常 男性 的 细 用 
中 没有 X-: 染 色 质 。 正 常 女 性 的 细胞 中 有 两 个 X- 染 色 体 , 其 中 一 个 
异 染色 质 化 ， 成 为 X- 染 色 质 。 因 而 通过 和 XX- 染 色 质 的 检查 可 鉴别 胎 
儿 性 别 ， 并 为 诊断 性 染色 体 异 常 引起 的 遗传 病 提 供 参考 资料 。 


三 、 实 验 材料 


1. 口腔 类 部 粘 细 胞 。( 羊 水 、 皮 肤 、 结 缔 组 织 、 宫 颈 、 尿 
道 等 组 织 细胞 的 间 期 细胞 核 均 可 检查 ) 

2. 显微镜 ”离心 机 。 

3. 85% 生 理 盐水 ， 固 定 液 (2 甲醇 :1 冰 酯 酸 )， 95% 酒 精 。 

4. 0.2% 甲 苯胺 蓝 染 色 液 取 甲 茶 腕 蓝 0. 2g8, 加 入 少量 丙酮 ， 
溶解 后 加 入 双 蒸 水 至 100ml。 

5. 硫 曹 染色 液 

(1) 硫 昔 饱和 液 。 基 20g 破 董 洛 于 500ml50% 的 酒精 市， 在 与 
缓冲 液 混 合 前 先 过 滤 。 

(2) 缓冲 液 ”醋酸 钠 9.714g， 巴 比 妥 钠 14.714g,. 双 燕 水 
500mle。 

(3) 染色 液 的 配制 ”缓冲 液 28ml, 0.1NHC1L 32ml， 硫 董 饱和 
溶液 40ml1， 将 pH 调 到 5.7， 放 冰箱 保存 备用 。 


四 、 实 验 步 又 


(一 ) 取 诸 与 固定 

方法 I 

1。 取 10ml 离 心 管 ， 吸 入 0:85% 生 理 盐 水 5ml。 

2， 用 水 汶 口 后 ,以 牙签 刊 取 口 腔 类 部 粘膜 ， 将 其 洗 入 生理 盐 
水 中 (注意 将 第 一 次 刊 取 物 弃 去 ) ， 轻 轻 播 散 细胞 ，1000rpm 离心 
10 分 钟 ， 弃 去 上 清 液 。 

3. 加 入 新 配 的 甲醇 - - 冰 酷 酸 固定 液 4ml， 用 吸管 轻 轻 将 细胞 


了 2 


打 勾 ， 固 定 10 分 钟 。 
4。1000rpm 离 心 10 分 钟 ， 去 上 清 液 。 
5. 加 固定 液 至 0.3~0.5ml, 制 成 细胞 悬 液 。 
6. 将 载 片 倾 斜 40" 左 右 , 滴 上 二 滴 细 胞 悬 液 ， 空 气 干 燥 。 
方法 开 
1。 用 消毒 牙签 刮 取 口 腔 粘 戏 ， 直 接 涂 于 载 玻 片 上 。 
2. 立即 滴 加 95% 酒 精 ， 固 定 30 一 60 分 钟 ， 放 置 空气 干燥 。 
(二 ) 染 色 
1。 将 制 片 放 入 蒸 饮水 冲洗 数 分 钟 。 
. 用 5NHCI1 在 室温 下 水 解 10 分 钟 。 
自来水 冲洗 数 分钟 ， 再 用 蒸馏 水 冲洗 。 
. 硫 曹 染色 液 妆 色 30 分 钟 ， 或 0.2% 甲 茶 胺 蓝 染 色 1 一 1.5 分 


RS 


5. 水 冲洗 后 ， 用 吹风 机 吹 于 (或 晾 干 ) 即 可 进行 镜 检 。 

(三 ) 观 察 

用 油 镜 头 进行 观察 。 细 胞 的 胞 质 着 色 浅 ， 胞 核 着 色 深 。 买 - 染 
色 质 很 小 ， 约 1~1.5um， 位 于 核 膜 内 侧 边缘 ， 浓 妆 而 轮廓 清楚 ， 
呈 圆 形 、 平 凸 形 、 扁 平 形 或 三 角形 。 

观 宗 计 数 时 要 注意 : (1) 为 避免 与 核 内 其 它 物质 混淆 ， 玉 位 
于 核 中 间 的 浓 染 小 体 都 不 计数 。 (2) 计数 细胞 的 细胞 核 必须 完整 
无 缺 、 无 皱 袜 ， 核 染色 均匀 。 

正常 人 口 舱 粘 细 胞 X- 染 色 质 出 现 率 一 一 季 男 性 平均 为 1. 5%， 
女性 平均 为 28.5%。 


实验 &9 “二 倍 体 细胞 株 的 培养 
及 染色 体制 上 厂 技 术 


一 、 实 验 目 的 


细胞 株 培养 是 一 种 应 用 广泛 的 基础 性 实验 技术 。 通 过 实验 初 


。324 。 


步 掌握 培养 技术 及 染色 体制 片 技术 。 
二 、 实 验 材 料 
1. 培养 瓶 (30~100ml) ” 移 液 答 (1,5,10ml) 滴 管 “培养 
血 “容量 瓶 “小 指 管 ” 大 套 管 ” 载 玻 片 ” 盖 玻 片 ” 针 简 烧杯 
量 简 量 杯 直 柄 虹 颈 前 ” 虹 蜡 锰 ( 直 、 弯 ) 解剖 杀 - (尖端 内 面 
有 沧 ) 白内障 刀 分 离 针 动脉 钳 ”试管 架 
2. 0.85%6NaCl 5%%NaHCOs。 0.5% 水 解 乳 蛋白 
3. 0:-1M 磷 酸 缓冲 液 : 
pH7 .4 一 7.6 Na,HPO, .12H,O 28.8g 
KH,>,PO ， 2.678 
溶解 于 1000ml 双 菩 水 中 。 
pH6.8 Na HPO， 6.97g 
NaH,PO,。.H;O 6.73g 
溶解 于 1000ml 双 蒸 水 中 。 
4. 1%% 酚 红 : 称 酚 红 18g8 置 于 研 钵 内 ， 量 取 0.1N NaOH28ml， 
逐 滴 加 入 研 钵 ， 尽 量 磨 细 ， 溶 解 后 再 全 部 加 入 。 再 加 双 燕 水 至 
100ml1，4s 保 存 。 
5，Hank's 母液 (10 倍 ) 


甲 液 ， Nav HPO,。2H,O 0.6g KH.PO， 0.6g 
KCIl 二.0g MgSO,。7H:;O 2.0g 
NaCl 80g 葡萄 糖 10.0g 

溶 于 900m1 双 蒸 水 中 。 

乙 液 :CaCl:。6H:O 1.48 

溶 于 100ml 双 蒸 水 中 。 


待 转 、 乙 二 液 都 溶解 后 ， 将 其 混在 一 起 ， 成 为 母液 。 用 时 稀 
释 ， 取 100ml 母 液 加 900m1! 双 蒸 水 ,加 2ml1% 酚 红 。 高 压 消毒 ，8 
磅 20 分 钟 。 

6. D-Hank's 液 10 倍 母液 〈 即 无 Ca:+ 无 Mg2+ 的 Hank's 液 ) 

NaCl ”80g Na HPO,.12H2O 0.128 


es。 3 了 25 


fw 首 


KCI1 4 mg 和 HG9 
葡 菊 糖 10.08g 


0.68g 


以 上 药品 溶 于 1000m1 双 燕 水 中 ， 使 用 时 间 Hank s 液 。 


7. 0.25% 胰 酶 


D_Hank's 1000ml， 胰 酶 2.5g8; 1%% 酚 红 ， 用 5% NaHCO : 调 


节 pH 到 7.4~7.6， 过 滤 灭 菌 。 
8. 台 队 蓝 染 液 


称 取 台 有 队 蓝 2g 置 研 钵 中 加 入 几 滴 双 燕 水 ， 研 细 ， 湾 于 100ml 
双 葵 水 中 。 活 细胞 染色 后 是 白色 透明 的 ， 死 细胞 呈 深 蓝 色 。 


9_ Giemsa 染 液 “” 见 实验 21。 


10.， 秋 水仙 素 称 取 6mg, 溶解 于 100m10.85%NaCl 中 。 用 时 


最 终 浓 度 为 0.2 一 2ug/ml。 
11， 低 渗 液 


(1) 1 份 Hank's 液 + 3 份 蒸馏 水 。 


(2) 0.075MKCl。 

12， Eaglec's 液 

甲 液 ， 获 精 氨 酸 174.2m8 
L- 异 亮 氮 酸 262 .0mg 
L- 赖 氨 酸 292.3mg 
L-- 苏 氮 栈 238.0mg 
LI- 一 有 氨 酸 234.0mg 
溶 于 100ml 双 蒸 水 中 。 

乙 液 ，I 一 有 拢 氨 酸 11.0m8 
IL-- 蛋 氨 酸 7.5mg 
溶 于 100ml 双 共 水 中 。 

丙 液 ，I 谷 酰 胶 2.938 

丁 液 ， 盐酸 硫 胺 素 3.4mg 


泛酸 人 钙 4.8mg 
烟 酰 胺 1.2mg 
壬 物 素 2.4mg 


全 了 26。 


IL-- 盐 酸 组 氨 酸 “78mg 
I 一 亮 氮 酸 262 .0mg 
L- 茶 两 氨 酸 “165.2mg 
I 一 色 氨 酸 40.8mg 


I 一 酷 氨 酸 18.1mg 


演 于 100ml 双 燕 水 中 。 
核 黄 素 0.38mg 
维生素 Ba 1.9mg 
氯 化 胆 碱 1.4mg 
环 已 六 醇 5.4mg 


人 


eyoueosraeesawsaeen 


叶 栈 4.4mg 
溶 于 100ml 双 菩 水 中 。 

取 甲 液 100ml1， 乙 液 1000ml， 丁 液 100ml 加 双 菩 水 3700ml, 然 
后 再 加 2 x Hank's 溶液 5000ml， 120Y 下 高 压 灭 菌 15 分 钟 。 待 冷却 
后 加 入 无 菌 丙 液 100ml， 使 总 量 为 10000ml。 用 无 菌 的 5%NaHCO， 
调节 pH 至 7.0 左 右 。 

注意 除 丙 液 需要 过 滤 灭 菌 外 ， 其 余 溶 液 均 可 高 压 灭 菌 ， 冷 却 
后 分 别 贮藏 在 -207C 前 冰箱 中 。 

13.RPMI 1640 

(1) 称 取 1640 粉 剂 10.5g ,溶解 于 1000ml1 双 燕 水 中 。 

(2) 补 加 1% 酚 红 lml， 

(2) 通 入 Co， ,使 呈 桔 红色 ， 使 各 种 药品 完全 溶解 。 

《4) 用 细菌 漏斗 过 滤 。 

14. 大 鼠 的 肝 和 肺 细胞 ， 及 流产 胎 鼠 的 组 织 。 


三 、 实 验 步骤 


(一 ) 原 代 培 养 

1. 用 铁 棒 殴 击 大 白鼠 的 头 致死 ， 四 肢 钉 在 蜡 板 上 。 

2 ,用 酒精 擦 遍 腹 部 ， 然 后 用 一 薄 层 浸透 70% 酒 精 的 棉花 覆盖 
在 腹部 。 

3 . 剪 开 腹部 表皮 ; 打开 胸腔 。 

生前 开 内 皮 ， 取 出 胚胎 ， 去 外 驱 ， 把 胚胎 放 在 培养 四 中 。 

5 在 无 菌 室 用 Hank's 液 洗 胎 鼠 数 次 ， 痢 开 胎 鼠 胸 腹 腔 ,前 取 
肝 、. 肺 、 皮 肤 等 组 织 。 

6 .所 取 的 组 织 用 Hank' s 液 洗 几 次 ， 再 用 培养 液 洗 二 次 。 

7. 将 组 织 前 成 1 这 2mm 大 小 的 碎 块 ， 再 用 培养 液 洗 二 次 。 

8 .用 从 头 吸管 将 组 织 块 吸入 小 方 瓶 中 ,并 贴 在 瓶 壁 上 ,组 织 块 
密度 大 些 为 宜 。 吸 去 多 余 的 液体 , 立 直 放 在 37C 温 箱 1 一 2 小 时 ， 然 
后 加 六 培 养 液 ， 轻 轻 地 使 组 织 块 浸入 培养 液 放 37 避 温 箱 中 培养 ， 

9.3 天 后 ， 皮 肤 组 织 伸展 出 细 胞 ， 长 成 单 层 。 过 一 周 ， 肝 组 


327。， 


织 伸展 出 细胞 ， 长 成 单 层 。 过 二 周 ， 肺 组 织 伸展 出 细胞 ， 长 成 单 


层 。 

(二 ) 传 代 培 养 

1 待 原 代 培养 的 细胞 贴 瓶 48 小 时 后 ， 换 一 次 新 鲜 培 养 液 。 到 
第 4 天 ， 细 胞 清晰 ， 呈 单 层 状 ， 而 且 都 已 长 满 时 ; 就 可 传代 。 
2 . 倒 去 培养 液 ,加 入 0.25%% 胰 酶 (p 开 7.6)9 在 室温 中 让 细胞 浸 

在 酶 液 中 3 一 4 分 钟 。 把 瓶子 竖 起 来 ， 若 细 胞 呈 自 色 一 片 ， 而 且 细 

胞 间 出 现 针 孔 状 时 ， 可 倒 去 酶 液 ， 停 止 滑 化 。 

3 .加 入 少量 Hank' s 液 ， 轻 轻 晃 一 下 ， 倒 去 。 

4. 加 入 5ml 培 养 液 ， 轻 轻 吹 打 ， 使 细胞 从 瓶 辟 上 脱 下 ， 呈 均 
匀 的 单 细 胞 。 

5 .再 补 加 培养 液 ， 一 瓶 传 二 瓶 。 


(细胞 尖 存 离 体 细胞 有 一 定 的 世代 ， _ 般 繁殖 到 50~60 


代 ， 就 老化 衰亡 。 为 减轻 工作 量 ， 防 止 细 胞 变异 ， 可 将 细胞 冻 存 
起 来 。 

1 . 冻 存 细胞 的 培养 方法 与 传代 培养 一 样 。 待 细胞 长 成 单 层 ， 
略 密 些 , 加 入 胰 酶 , 待 细胞 间 出 现 针 孔 状 时 ,去 掉 胰 酶 ， 加 入 Hank's 
液 进 行 吹 打 -然后 收集 细胞 悬 液 ,在 离心 管 中 1500rpm 离 心 5 分 钟 。 

2 冻 液 配制 “Eagle's 液 + 15%% 小 牛 备 清二 1% 浓 度 为 5% 的 
碳酸 氢 钠 ， 再 加 1% 双 抗 液 (1ml Hank 液 中 含 青霉素 1 万 单位 和 链 
画素 1 万 凤 ) 及 10% 二 甲 基 亚 砚 (DMSO) ,pH7:0。 

3 细胞 离心 后 去 掉 上 清 液 ， 然 后 加 少量 冻 液 制 成 细胞 悬 液 。 
计数 细胞 郊 用 冻 液 稀 杰 ， 使 细胞 浓度 成 为 300 一 40 万 个 /mm1。 

4 用 针 简 将 细胞 悬 液 注 入 安 颜 瓶 ， 每 瓶 1 一 2ml1, 火焰 上 封口 ， 
编号 。 在 4 的 冰箱 内 过 夜 。 

5 第 二 天 将 安 略 瓶 先 在 液 所 上 面 5 一 6cm 处 停留 10 一 20 分 钟 ， 
然后 迅速 放 入 液 氮 中 。 

6 复苏 时 将 安 襄 瓶 自 液 所 中 取出 ， 立 刻 放 在 40 也 的 温水 中 ， 
使 其 在 1 分 锦 内 溶解 。 然 后 在 无 菌 室 打开 安 谍 瓶 ， 吸取 细胞 惹 液 
到 培养 瓶 中 ， 加 入 培养 液 培养 。 


s。 了 28， 


(四 ) 染 色 体 制 片 

1. 传 代 后 20 小 时 进行 细胞 观察 ， 如 细胞 之 间 有 空 除 ， 呈 现 为 
许多 球状 透亮 的 圆 细 胞 ， 这 时 相当 于 生长 对 数 期 。 

2 .加 秋水 他 素 ， 浓 度 为 0.2~2 邮 /ml， 处 理 4 小 时 。 

3 . 倒 去 培养 液 , 加 入 0.25% 胰 酶 (pH7.8), 放 在 377 温 箱 中 消 


”化 细胞 ,看 到 细胞 间 有 针 孔 状 出 现时 倒 去 胰 酶 ,用 Hank 液 洗 一 次 。 


4. 加 入 低 渗 液 (1 份 Hank 液 和 3 份 蒸 饱 水) ,用 滴 管 吹 打 细胞 ， 
使 其 分 散 ， 置 37T 温 箱 中 低 渗 处 理 30 分 钟 。 

5 .细胞 悬 液 中 加 入 0.5~ Iml 的 固定 液 (1 份 冰 酷 酸 和 3 份 甲 
醇 ) , 吹 打 一 下 ， 立 即 1000rpm 离 心 5 分 钟 。 

6. 去 上 清 液 ， 加 入 3 一 4ml 固 定 液 ， 打 散 细 胞 ， 固 定 15 分 钟 。 
如 此 重复 ， 固 定 三 次 。 注 意 固定 液 要 新 鲜 配 制 ， 否 则 影响 效果 。 

7. 第 三 次 固定 后 ， 离 心 ， 去 上 清 液 ,加 入 0.3~0.5ml 新 鲜 固 
定 液 ， 制 成 细胞 悬 液 。 
8 制 片 ， 同 实验 27。 

9 .用 1:4Giemsa 染 液 染色 10 分 钟 (Giemsa 染 液 用 pH6.8 磷 酸 
缓冲 液 稀释 )。 

10 .显微镜 下 观察 分 裂 相 ， 挑 选 分 散 度 好 ,染色 清晰 的 图 像 昭 
相 ， 进 行 核 型 分 析 。 

(五 )G 分 带 染 色 法 

1. 制 片 后 一 周 ， 将 片子 放 在 60~~65 闻 温 箱 中 处 理 15 分 钟 ， 若 
片子 超过 一 周 ， 要 适当 延长 处 理 时 间 。 

2. 用 D -Hank 溶 液 配 制 0.3% 胰 酶 ， 配 好 后 放置 37 水 浴 中 1 
小 时 ，pH7 .4 左右 。 

3 .将 保温 过 的 片子 放置 胰 酶 中 处 理 ， 一 般 组 织 培养 细胞 用 
15 一 30 秒 ， 淋 巴 细胞 用 60 一 90 秘 。 

4. 取 出 片子 ， 放 入 燕 饮水 中 冲洗 。 

5. 用 1:4Gemsa 液 染色 。 

6. 镜 检 后 ， 将 片子 放 在 二 甲苯 中 透明 5 分 钟 ,然后 用 加 拿 大 树 
胶 封 片 。 

9 了 2Z9。 


注意 ,染色 显 带 与 气温 有 很 大 关系 。 气 温 高 ， 用 0.15% 胰 酶 
处 理 ， 可 在 5 秒 内 显 带 ;气温 低 ， 则 用 0.3% 胰 酶 在 37 水 浴 中 处 
理 ， 才 可 在 30 秒 内 显 带 。 


实验 30 ”人群 中 P.T.C. 味 言 基 因 频 率 的 分 析 


一 、 实 验 目 的 


通过 对 人 体 遗 传 性 状 的 分 析 及 基因 频率 的 计算 ， 了 解 选 择 对 
改变 基因 频率 的 作用 。 


二 、 实 验 原 理 


人 体 对 葵 硫 脲 (PITC) 学 s 味 的 能 力 是 由 一 对 等 位 基因 (Tt) 所 决 
定 的 遗传 性 状 ， 其 中 工 对 t 为 不 完全 显 性 。 正 常 尝 味 者 的 基因 型 
为 TT ,能 党 出 1/750,000~1/6,000,000 的 PIC 溶液 的 苦味 ; 具有 
基因 Tt 的 人 尝 味 能 力 较 低 ， 只 能 党 出 1/480,000~1/380,000 的 
PTC 溶 液 角 着 味 ;而 基因 型 为 tt 的 人 只 能 尝 出 二 17/24,000 的 PIC 
溶液 的 苦味 ， 甚 至 对 ETC 的 结晶 物 也 学 不 出 苦味 来 ， 在 遗传 学 上 
被 称 为 味 盲 。 

有 人 曾 测定 我 国 黑 龙 江 省 1050 人 的 PIC 党 味 能 力 ， 其 中 味 
共 99 人 ， 占 9.43% ,在 所 测定 的 人 群 中 tt 的 基因 频率 为 


t 基 因 频 率 为 
q=wq2=v0.0943=0.3070=0.31 
因此 ，I 基 因 频 率 为 
p=1=-q=1-0.31=0.69 
根据 群体 遗传 学 的 哈代 - 温 伯 格 氏 定律 ， 如 果 没 有 其 他 因素 


“330 


全 二 A 


3 


的 和 干扰， 人 群 中 基因 t 的 频率 也 将 会 世代 相传 而 不 发 生变 化 。 

如 果 我 们 假定 ， 某 种 选择 作用 对 隐 性 纯 合 子 tt 不 利 ， 使 其 适 
应 和 值 =0 时 ( 即 100% 被 淘汰 )， 则 基因 t 冰 率 将 会 发 生 改 变 ， 如 下 表 
所 示 : 


选择 后 基因 t 的 频率 为 ， 
| =1/2X2pod。 -_ pod。 人 (1) 
poYyY2poqu po(po+2qo) 1T+gn 
选择 后 基因 t+ 冰 率 的 改变 量 为 : 
人 
昌 三 避 1 一 昌 0 tt ga go 玉 直 二 人 


根据 (1) 式 可 以 预计 ， 若 基因 型 tt 的 个 体 的 适应 值 = 0, 下 一 代 
群体 中 基因 t 的 频率 降 为 ， 
qi=go/1+dgo=0.31/(1+0.31)=0.2366=0,.24 
根据 (2) 可 计算 基因 t 冰 率 的 改变 量 : 
AU = 二 一 9 一 (0.31)- 
1+dgn OA 
以 上 分 析 表 明 ， 选 择 的 强 有 力 的 作用 ， 它 使 群体 的 基因 频率 
的 平衡 受到 破坏 ， 生 物体 便 会 产生 某 种 方式 的 进化 。 


= 一 0.07 


三 、 实 验 材料 


， 


1ETC 溶 液 的 配制 - 
原液 ， 取 PIC 结晶 1.3g, 加 燕 饮 水 1000ml ， 时 时 播 有 网 ， 在 室 


8 了 331 


温 (20C 左 右 ) 下 1 一 2 日 即 完全 溶解 原液 的 PTC 浓 度 约 为 起 750， 
原液 稀释 1 倍 为 ?号 液 ，? 号 液 稀释 1 代为 3 号 液 ， 以 此 类 推 ， 直 至 


配 成 14 号 液 ,浓度 为 1/6,000,000。 将 配 好 的 14 种 PIC 溶液 分 别 置 . 


于 消毒 好 的 滴 瓶 中 。 
2 .若干 毫升 燕 饮 水 及 洁净 滴 管 


四 、 实 验 步骤 


1. 让 受 试 者 坐 于 椅子 上 ， 侧 头 张嘴 。 用 滴 管 滴 5~~10 滴 14 号 
液 于 受 试 者 舌根 部 ， 让 受 试 者 徐徐 下 咽 品 味 , 然 后 用 共 人 饮水 作 同 
样 的 试验 。 

2. 询 问 受 试 者 能 否 鉴别 此 两 种 溶液 的 味道 ， 若 不 能 鉴别 或 鉴 
别 不 准确 ， 则 依次 用 13 号 ，12 号 …… 溶 液 重复 试验 ， 直 至 能 明确 
ee 

受 试 者 鉴别 出 茶 一 号 溶液 时 ， 应 当 再 用 此 号 溶液 重复 党 
味 三 次 ， ee 才 是 可 靠 的 。 


4. 测 定时 应 将 PTC 溶 液 与 蒸馏 水 反复 交替 给 受 试 者 ， 也 免 由 


于 受 试 者 的 猜想 及 其 他 心理 作用 而 影响 结果 的 准确 性 。 


5 .tt 基因 型 的 阔 值 范围 为 1~6 号 液 ，Tt 基 因 型 的 阔 值 范围 为 


7 一 10 号 液 , TI 基因 型 的 闵 值 范围 为 11~14 号 液 。 根 据 测 试 结果 ， 
记录 亚 统 计 所 调查 人 和 群 中 的 基因 型 。 
实验 报告 


1. 根 据 实验 结果 ， 算出 味 育 者 !t 基 因 型 的 频率 。 

2 , 求 出 基因 t+ 与 基因 了 T 的 频率 。 

3 .假定 tt 基因 型 的 适应 值 = 0， 求 出 选 择 户 莓 提请 入 人， 
及 改变 量 Aq 的 值 。 


( 孙 勇 如 ) 


Tig32 e 


用 
， 


类 
站 
到 
可 
昌 


第 一 节 “第 用 生化 技术 


一) 离心 技术 


1. 原 理 

信心 分 离 技术 是 根据 颗粒 〈 如 各 种 细胞 器 、 蛋 白质 和 DNA 大 
分 子 等 ) 在 一 个 离心 场 中 的 行为 发 展 起 来 的 。 它 们 被 悬浮 于 特殊 
的 介质 中 ， 然 后 装 入 离心 管 中 在 离心 机 上 离心 。 

不 同 密度 ,大 小 或 形状 的 颖 粒 以 不 同 的 速度 在 离心 场 中 沉降 。 
沉降 的 速度 还 决定 于 所 使 用 的 离心 场 。 而 离心 场 又 决定 于 转 头 的 
角速度 和 颗粒 离 旋转 轴 的 直线 距离 离心 场 一 般 以 重力 常数 g(980 
厘米 / 秘 ) 的 倍数 来 表示 ， 如 下 面 公式 所 示 : 

RCF=1.11 色 10-5( 转 数 / 分 )2r 

RCE 为 相对 离心 场 

7 为 离心 半径 

实际 应 用 时 ,可 根据 计算 离心 力 的 列 线 图 而 得 到 所 需 的 数据 。 


《〈 列 线 图 见 附 表 ) 


当然 ,一 个 球 心 颗粒 的 沉降 速度 不 仅 取决 于 所 提供 的 离心 场 ， 
电 还 取决 于 颗粒 的 半径 和 密度 ， 以 及 悬浮 这 些 颗 粒 记 用 介质 的 粘 


- 度 。 它 们 之 间 的 关系 可 从 下 面 的 公式 看 出 ， 


党 - 


1 = 沉降 所 需 时间 ( 秒 ) 

I= 巧 浮 介 质 的 粘度 

ra= 颗粒 的 半径 

po= 颗粒 的 密度 

p= 介质 的 密度 

六 = 从 旋转 轴 心 到 液体 弯 月 面 的 距离 

7h 三 从 旋转 轴 到 管 底 的 距离 

0= 转子 的 角速度 

从 以 上 的 方程 式 可 以 看 出 ， 在 一 定 的 转速 下 ， 沉 降 一 组 均匀 
的 球形 颗粒 所 需要 的 时 间 是 与 这 些 颗 粒 的 半径 平方 (ri) 以 及 它 
们 的 密度 与 悬浮 介质 的 密度 之 差 成 反比 ， 而 与 介质 的 粘度 成 正比 
的 。 所 以 ， 我 们 可 以 利用 这 些 性 质 把 一 个 非 均 一 的 球形 颗粒 混合 
物 通 过 总 心 的 方法 ， 根 据 它 们 在 一 个 固定 的 离心 场 中 完全 沉降 的 
时 间 ， 或 根据 它们 在 一 个 固定 的 离心 场 中 经 过 一 段 时 间 的 沉降 的 
程度 把 它们 分 离开 。 

但 上 述 公式 不 适用 于 非 球形 颗粒 ， 因 为 质量 相同 但 形状 不 同 
的 颗粒 ， 沉 降 速 度 是 不 同 的 。 

通常 ， 我 们 利用 离心 的 方法 ， 从 组 织 匀 浆 中 分 离 细 胞 器 。 它 
们 的 沉降 顺序 一 般 是 :细胞 和 细胞 碎片 、 核 、 时 绿 体 、 线 粒 体 、 
溶 酶 体 、 微 粒 体 、 核 蛋白 体 等 。 

离心 技术 又 可 分 为 制备 性 离心 和 分 析 性 离心 。 制 备 性 离心 是 
比较 常用 的 ， 因 此 ， 我 们 将 主要 介绍 几 种 制备 性 离心 的 技术 及 其 
应 用 实例 。 

2 . 几 种 离心 技术 

(1) 差 级 离心 

这 种 离心 技术 是 建立 在 不 同 大 小 和 密度 的 颗粒 在 沉降 速度 方 
面 存 在 着 差异 的 基础 上 的 。 应 用 差 级 离心 从 组 织 匀 浆 中 分 离 细胞 
器 是 一 种 最 常用 的 方法 。 在 分 离 那 些 在 大 小 和 密度 上 有 显著 差别 


。 了 3 了 4。 


人 


“ 苗 细 胞 器 时 ， 这 种 方法 最 为 简便 和 适用 .样品 〈 如 组 织 匀 浆 ) 通 


过 一 个 逐渐 增加 (或 者 分 步 ) 的 离心 场 就 可 以 分 成 很 多 组 分 。 每 
一 步 的 离心 场 应 选择 能 使 某 一 种 特殊 类 型 的 物质 在 预定 的 离心 时 
间 内 沉降 ， 这 样 我 们 就 能 得 到 一 个 沉淀 。 将 这 种 沉淀 反复 车 浮 和 
离心 2 至 3 次 就 可 以 得 到 一 个 相当 纯 的 组 分 。 

(2) 分 级 区 带 离心 (密度 梯度 离心 ) 

使 用 差 级 离心 时 ， 分 离 得 的 组 分 并 不 是 绝对 均一 的 。 为 了 获 
得 更 加 纯 二 的 组 分 可 利用 连续 的 或 不 连续 的 液体 密度 梯度 来 代替 


均匀 的 悬浮 介质 。 这 种 分 离 方法 利用 了 细胞 器 在 密度 上 的 差别 ， 


因而 效果 更 好 。 这 种 方法 的 关键 是 要 将 离心 的 时 间 掌 握 在 足以 使 
各 种 颗粒 在 梯度 中 移动 并 形成 不 连续 的 区 带 ， 但 颗粒 又 尚未 完全 


沉降 之 前 。 密 度 梯度 技术 可 防止 区 带 因 对 流 而 造成 混合 ， 因 而 分 


离 效果 更 佳 。 本 方法 可 用 于 RNA 一 DNA 混 合 物 、 核 蛋白 亚 单位 和 
其 它 细胞 成 份 的 分 离 。 

(3) 等 密度 离心 

等 密度 分 离 既 可 用 密度 梯度 ， 也 可 以 不 用 密度 梯度 。 不 用 密 
度 梯 度 时 ， 先 可 用 较 重 颗粒 的 沉降 速度 离心 分 离 并 除去 样品 中 的 
较 重 颗粒 。 再 把 样品 中 的 所 需 颗粒 悬浮 在 与 被 分 离 的 部 分 有 相等 
密度 的 介质 中 ， 离 心 至 所 需 物 质 沉 降 为 止 ， 而 密度 低 于 所 需 物 质 
的 颗粒 则 漂浮 于 弯 月 面 处 。 如 采用 密度 梯度 ， 则 此 梯度 需 包括 所 
要 分 离 颗粒 的 密度 范围 。 离 心 时 ， 把 样品 铺 放 在 密度 梯度 顶部 ， 
离心 到 颗粒 的 漂浮 密度 与 梯度 的 密度 相等 时 ， 颗 粒 才 会 出 现 沉降 
并 排列 成 带 。 这 种 沉降 只 取决 于 能 使 颗粒 浮 起 的 密度 ， 而 与 颗粒 
的 天 小 与 形状 无 关 。 使 用 这 种 技术 时 ， 线 粒 体 、 溶 酶 体 和 微粒 体 
分 别 排列 于 好 %、47%、27%% 的 蔗糖 梯度 中 。 

(4) 平衡 等 密度 离心 

这 种 技术 一 般 使 用 重金 属 盐 《如 氧化 鸳 ) 来 制备 梯度 ， 但 也 
可 以 用 蔗糖 。 把 样品 (如 DNA) 和 和 氯 化 馅 的 浓 深 液 均 匀 混 合 


此 浓 溶 液 离心 就 可 产生 氯 化 饮 的 连续 密度 梯度 ， 其 中 DNA 分 子 
进行 重 分 配 ， 在 离心 力 的 作用 下 它们 迁移 到 一 定 的 区 域 中 ， 在 此 


3 了 3 了 325。 


区 域 中 ， 溶 液 的 密度 等 于 DNA 分 子 本 身 的 或 浮 密度 。 在 纯化 时 绿 
体 和 线粒体 DNA 时 ， 常 用 此 法 。 

(5) 梯度 的 制备 

制备 液体 密度 梯度 最 常用 的 介质 是 蔗糖 溶液 ， 它 可 用 缓冲 深 
或 非 缓冲 液 配制 .需要 高 密度 和 低 渗 透 压 的 梯度 时 ， 可 以 用 Ficoll 
代替 蔗糖 ， 它 的 优点 是 不 会 渗入 细胞 。 

梯度 可 分 为 连续 的 和 不 连续 的 。 不 连续 梯 误 的 制 备 法 为 先 配 
制 各 种 不 同 浓度 的 介质 溶液 (如 蔗糖 溶液 )， 用 移 波 管 把 溶液 一 层 
覆盖 一 层 铺 到 离心 管 中 。 连 续 梯 度 的 制备 则 通常 利 冰 梯度 仪 。 凡 
度 仪 是 由 二 个 具有 相同 半径 的 圆柱 腔 组 成 ,通常 用 有 机 玻璃 制作 。 
它们 的 底部 通过 一 有 控制 阀 的 玻璃 管 而 内 部 连接 。 将 有 较 高 密度 
溶液 的 圆柱 腔 称 之 为 混合 腔 ， 内 有 一 个 搅拌 器 ， 并 有 一 个 出 日 可 
通 向 离心 管 。 另 一 圆柱 腔 感 有 密度 较 低 的 溶液 。 开 始 时 ， 将 二 个 
腔 的 溶液 高 度 调 节 到 具有 相等 的 静 力 压 ， 打 开 混 合 腔 的 出 口 使 其 
流入 离心 管 ， 同 时 打开 控制 闪 ， 这 时 较 低 密度 的 深 液 就 不 停 地 补 
充 到 混合 腔 。 混 合 腔 中 的 溶液 由 于 不 停 地 搅拌 而 保持 均匀 ， 密 度 
也 随 之 下 降 。 从 而 在 离心 管 中 形 成 一 个 连续 的 线性 梯度 。 

(6) 从 离心 管 中 取 出 梯度 溶液 

常用 的 方法 是 把 离心 管 底部 用 一 根 细 的 空 忆 针 刺 穿 。 梯 度 溶 
液 不 断 地 从 针管 滴 出 ， 用 部 分 收集 器 收集 并 作 进 一 步 的 分 析 。 

另 一 种 方法 是 用 带 有 长 针头 的 注射 器 ， 小 心地 把 所 需 梯 度 溶 
液 吸 出 再 做 进一步 分 析 。 

此 外 ， 还 有 一 种 取代 法 , 即 把 一 种 很 稠密 的 介质 ,如 60 一 70%% 
的 蔗糖 溶液 慢 慢 地 注入 离心 管 的 底部 。 梯 度 溶 液 就 从 土 面 被 取代 
册 来 ， 然 后 用 一 个 注射 器 或 移 液 管 逐个 移出 各 部 分 而 分 析 之 。 

3 .应 用 实例 

(1) 水 稻 线 粒 体 (mt)DNA 的 提取 和 纯化 

生物 的 线粒体 是 细胞 的 一 种 重要 细胞 器 。 它 具有 自身 的 
DNA， 编 码 着 一 些 蛋 白质 ,因而 影响 生物 的 某 些 代谢 活动 。 近 年 
来 有 关 植 物 雄 性 不 育 的 研究 表明 ， 不 育 基 因 可 能 在 mtDNA 上 ， 因 


336. 


Y 
相 


此 ， 详 细 地 介绍 mtDNA 的 提取 和 纯化 是 十 分 有 意义 的 。 

忆 材 料 准 备 

100g 水 稻 种 子 ， 用 1% 升 冬 表 面 灭 菌 15 分 钟 后 ， 流 水 冲洗 4 小 
时 。 在 暗 处 ，28C 下 发 菠 ，10 一 15 天 后 前 取 黄 化 苗 100g8， 蒸 饮水 
洗 二 次 ， 无 菌 水 洗 二 次 ， 用 干净 纱布 包 好 ， 放 入 液 所 中 过 夜 。 
”加 试剂 配制 

.， A 液 :0.5M 巷 糖 Mria -CI 级 汪 光 
5mMEDTA 3mM 芒 基 乙 醇 pH7 .5 
B 液 ，0.3M 芒 糖 ，50mMTris HCl 缓冲 液 “pH7 .5 
_QG 液 : B 液 +60mMMgC1， 50Ug/ml DNaseI 

也 液 : 0.6M 基 糖 ”20mMEDTA，10mMTris 一 HCL pH7.5 

裂解 液 ，10mMTris 一 HCL pH7.8 5mMEDTA 

饱和 酚 : 用 Tris 使 重 敬 酚 饱 和 ， 加 入 0.1%8- 羟 基 哮 啉 。 

TA 王 液 ， 40mMTris-- 栈 酸 ，2mMEDTA，PpH7 .5 

四 试 骆 步 驴 

a. 从 液 氮 中 取出 堵 料 ， 待 液 氮 蒸发 后 和 液 ， 在 
组 织 提 碎 机 中 勾 浆 ， 低 速 5 秒 ， 高 速 5 秒 ， 再 重复 一 次 。 匀 浆 液 用 
六 层 纱布 过 滤 。 滤 漆 再 加 100 一 150mlA 液 悬浮 后 ， 再 次 高 速 5 秒 匀 
浆 ， 过 滤 后 将 两 次 滤液 混合 

b . 泪液 用 1500g 离 心 10 分 钟 ,去 沉 学 上 清 液 用 10,000g8， 离 
心 20 分 钟 。 用 25mjB 液 悬浮 沉 演 ( 即 成 线粒体 悬 泽 液 )。 

5. 悬浮 液 用 1,000g ,离心 10 分 钟 , 去 沉淀 。 上 清 液 加 入 5mlC 
液 在 4C 下 保温 1 小 时 以 去 掉 mt 外 的 核 DNA 污 染 。 

d4. 洗 去 DNA 酶 : 先 在 离心 管 中 加 入 6mlD 液 ， 然 后 再 加 入 酶 
处 理 后 的 悬浮 液 ，12,000g， 离 心 20 分 钟 。 沉 淀 用 30mlD 液 悬浮 ， 
150008， 议 心 15 分 钟 ， 再 一 次 洗 去 DNA 酶 。 

e.， 有 解 ， 将 上 述 沉 演 (mt)， 加 入 2 一 3 倍 体积 的 含 蛋 白 酶 1 
mg/ ml 的 有 裂解 液 ， 在 37C 下 保温 1 一 2 小 时 。 加 入 SDS 使 终 浓 度 达 
到 0.5%， 在 37C 下 再 保温 3 小 时 以 上 。 

工 抽 提 (去 蛋白 )， 加 入 等 体积 的 饱和 酚 ， 小 心 摇动 ,使 其 乳 


2 


化 ，7000g8， 离 心 5 分 钟 。 

将 上 清 液 再 加 入 等 体积 的 饱和 酚 : 氯 仿 (1:1) 乳化 5 分 钟 ， 
1000g， 离 心 5 分 钟 。 
将 所 得 上 清 液 加 入 等 体积 的 饱和 酚 : 异 友 醇 (24:1)， 乳 化 5 分 
钟 ，7000g， 离 心 5 分 钟 。 

最 后 ,将 上 清 液 加 入 等 体积 的 水 饱和 乙醚 ,乳化 5 分 钟 ,70008g， 
离心 5 分 钟 。 如 此 重复 二 次 。 吸 去 上 部 的 乙 栈 ， 将 下 部 液体 ,放置 
在 65C 下 ， 燕 发 10 分 钟 以 除 掉 乙 醚 。 


g， 酒精 沉淀: 加 入 于 体积 的 3M 乙酸 钠 ， 再 加 入 2 倍 体积 的 


-25095% 乙 醇 ， 置 于 -~ 257 冰 箱 中 过 夜 以 沉 淀 DNA 。 

h. 离心 收集 PNA :8000g, 离心 10 分 钟 收 集 沉 演 。 再 加 入 70% 
乙醇 ， 置 于 4C15 分 钟 ， 然 后 离心 收集 DNA，8,000g，10 分 钟 。 
即 可 在 冰冻 干燥 器 内 干燥 几 分 钟 后 , 溶 于 TE，SSC 或 水 中 , 以 便 进 
行 下 一 步 工作 。 用 上 述 方法 可 从 1g 填料 中 获得 18gmtDNA。 

(2) 氧化 饮 密 度 梯度 离心 纯化 植物 DNA 

植物 来 源 的 DNA 制 品 ， 虽 经 茶 酚 、 氧 仿 抽 提 ， 常 还 残留 一 些 
RNA、 蛋 白质 和 色素 ， 这 些 杂质 的 存在 会 影响 以 后 的 内 切 本 消 
化 。 利 用 氯 化 饮 密度 梯度 离心 , 可 以 使 DNA 粗 制品 进一步 纯化 。 
在 离心 过 程 中 ， 由 于 离心 力 场 的 作用 ， 毛 化 饱 溶液 形成 一 种 密度 
梯度 ， 当 沉降 平衡 时 ， 所 和 欲 分 离 的 DNA 即 分 布 在 与 其 等 密度 的 区 
带 内 。 

氧化 饮 密度 梯度 超速 离心 分 离 核酸 时 ， 溶 液 中 要 加 入 EB (省 
化 乙 锭 )。EB 能 专 一 地 与 双 链 核酸 结合 ， 但 它 与 不 同 构 型 核酸 的 
结合 数 却 不 相同 。 与 共 价 闭合 环 状 NA 的 结合 数 为 0.11 一 0.13， 
与 线形 DNA 的 结合 数 是 0.2。 在 高 浓度 氧化 饱 溶液 中 ， 当 EB 过 量 
的 情况 下 ，EB-DNA 混 合 物 的 浮力 密度 有 所 改变 ， 改 变 的 天 小 与 
EB 结 合 量 成 反比 。 因 此 ， 用 氧化 馅 密度 梯度 超速 离心 法 ， 即 可 分 
离 双 链 DNA 与 单 链 RNA, 又 可 分 离 共 价 闭 合 环 状 DNA 与 带 缺 口 的 
环 状 DNA。 另 外 ，EB-DNA 络 合 物 在 紫外 光 下 能 产生 荧光 ， 便于 


e。 了 36。 


检测 。 具 体操 作 如 下 : 

四 将 植物 DNA 的 粗 制 品 溶解 于 10ml1TE 缓冲 液 中 ( 即 10mM 
Tris-HCIpH8.0，1mMEDTA)。 

四 每 毫升 上 述 的 DNA 溶 液 中 加 入 1g 固 体 的 CsCl, 最 终 的 密度 
为 1.55g/ml。 用 蜡 忠 封口 ,小心 倒 转 离心 管 使 CsCIl 溶 解 。 

四 加 0.8mlEB(10mg/ml) 到 离心 管 中 ， 混 合 均匀 。 

外 用 液体 石蜡 油 灌 满 离 心 管 。 

@@ 细 心平 衡 ， 封 口 。 

@@ 用 超速 离心 机 ，40,000g 离 心 44 小 时 。 

@ 取 出 离心 管 ， 在 紫外 灯 下 即 可 观察 到 明显 的 DNA 区 带 。 

@ 用 注射 器 将 DNA 带 收集 转移 到 小 试管 中 ， 加 等 体 积 正 丁 
， 醇 ， 振 蓝 2 分钟， 吸 去 上 层 有 色 液 。 再 加 入 等 体积 正 丁 醇 , 如 此 反 
复 三 次 以 去 掉 EB。 

四 将 去 掉 EB 的 DNA 溶 液 置 于 透析 袋 中 ， 在 IT 了 溶液 (10mM 
Tris-HCIpH8.0，1mMEDTA) 中 透析 24 小 时 ， 每 隔 6 一 8 小 时 更 换 
-一 次 透析 液 。 
通过 以 上 的 步骤 即 可 得 到 纯化 的 植物 DNA。 


(二 ) 电 泳 技 术 


1 .原理 

带电 的 颗粒 在 电场 中 ， 向 着 与 其 电荷 相反 的 电极 移动 ， 称 为 
电泳 (electrophoresis)。 很 多 生物 学 上 有 重要 意义 的 分 子 ,， 如 氮 基 
酸 、 多 肽 、 蛋 白质 和 核酸 ， 因 具有 可 电离 的 基 团 ， 因 此 ， 在 溶液 
中 能 够 形成 带电 荷 的 阴离子 (- ) 或 阳离子 (+ )。 而 具有 相同 电荷 
的 分 子 ， 由 于 它们 在 分 子 量 上 的 区 别 而 有 不 同 的 荷 质 比 。 这 些 差 
异 的 存在 ， 足 以 使 得 溶液 中 的 离子 在 电场 中 有 不 同 的 迁移 率 ， 这 
就 是 电泳 的 原理 。 

带电 化 合 物 在 电场 中 的 泳 动 速 度 大 小 ， 用 迁移 率 ( 或 泳 动 度 ) 
来 表示 。 迁 移 率 的 定义 为 带电 质点 在 单位 电场 强度 下 的 泳 动 速 度 。 


e 了 739 2 


/ 
m = 卫 = 9 在 = - 兄 -( 厘 米 ?/ 伏 特 . 移 ) 


1 为 迁移 率 〈 厘 米 2/ 伏 特 。 秒 ); 为 颗粒 的 泳 动 速 厌 (厘米 / 
秒 ); 忆 为 电场 强度 (伏特 /厘米 ); 9 为 颗粒 泳 动 距离 (厘米 ) ;1 为 支 
“ 持 介 质 的 有 效 长 度 ( 厘 米 ); TV 为 实际 电压 ; ;为 通常 对 间 。 

迁移 率 首 先 取 决 于 带电 质点 〈 颗 粒 ) 的 性 质 ， 即 质点 所 带 净 
电荷 的 量 ， 质 点 的 大 小 和 质点 的 形状 。 一 般 来 说 ， 质 点 所 带 净 电 
荷 越 多 ， 直 径 越 小 ， 越 近 于 球形 , 它 在 电场 中 的 泳 动 速度 就 越 快 ， 
反之 则 越 慢 。 

”除了 带电 质点 本 身 的 固有 特性 以 外 ， 迁 移 率 还 受 电场 强度 、 
溶液 的 pDH 值 、 溶 液 的 离子 强度 和 电 活 现 象 所 左右 。 

电场 强度 是 指 每 1 厘米 的 电压 降 , 它 对 泳 动 速 度 起 着 十 分 重要 
的 作用 。 显 而 易 见 ， 电 场 强 度 越 高 ， 带 电 质 点 移动 速度 越 快 。 根 
据 电 场 强度 的 大 小 ， 可 将 电泳 分 为 常 压 (100 一 500 伏 ) 和 高 压 4500 
一 1000 伏 ) 电泳 。 常 压 电 泳 的 电场 强度 一 般 为 2 一 10 伏 特 / 厘 米 ， 
电泳 分 离 所 需 的 时 间 较 长 "需要 几 小 时 到 几 天 ); 高 压 电泳 的 电场 
强度 为 20 一 200 伏 / 厘米 ， 电 泳 分 离 的 时 间 比 较 短 ， 有 时 仅 需 几 分 
钟 就 能 完成 。 常 压 电 泳 多 用 于 分 离 蛋 白质 等 大 分 子 物 质 ， 而 高 压 
电泳 则 常用 于 分 离 小 肽 、 氨 基 酸 、 核 苷 酸 等 小 分 子 物质 。 


溶液 的 pH 值 决定 寿 亚 电 质 点 解 离 的 程度 , 也 决 宪 它 们 所 带 净 


电荷 的 多 少 。 对 于 和 蛋白质、 氮 基 酸 等 两 性 电解 质 而 言 ，PH 值 距 其 
等 电 点 越 远 时 ， 它 们 所 带 的 净 电 荷 就 越 多 ， 泳 动 的 速 度 也 越 快 ， 
反之 ， 则 越 慢 。 为 使 溶液 的 pH 值 保持 恒定 ， 应 使 用 缓冲 溶液 。 

溶液 的 离子 强度 

离子 强度 系 指 溶液 中 所 有 类 型 的 离子 所 产生 的 静电 力 ， 也 就 
是 全 部 的 离子 效应 ， 它 取决 于 离子 电荷 的 总 数 。 溶 液 的 离子 强度 
越 高 ， 带 电 质 点 的 泳 动 速度 越 慢 ;， 离子 强度 越 低 ， 质 点 泳 动 的 速 
度 越 快 。 一 般 最 适合 的 离子 强度 在 0.02 一 0.2 之 间 。 

电 渗 现象 

电 渗 现象 系 指 液体 在 电场 中 对 固体 支持 物 的 相对 移动 。 如 在 


。340。 


了 本 


省 KAN 攻 0 


纸 电 泳 时 ， 由 于 纸 上 带 有 负电 荷 ， 而 与 纸 接触 的 水 溶液 因 静 电感 
应 带 有 正 电 荷 ， 在 电场 的 作用 下 溶液 便 连 带 着 质点 同时 都 向 负极 
移动 ， 因 而 对 迁移 率 有 一 定 影响 。 所 以 ， 电 泳 时 应 尽量 训 免 使 用 
具有 高 电 渗 作 用 的 支持 物 。 

2. 儿 种 常用 的 电泳 技术 

(i) 纸 电 沪 

纸 电 泳 是 最 简单 的 ， 也 是 最 广泛 使 用 的 一 种 电泳 技术 。 它 以 
滩 纸 作为 支持 物 。 整 个 装置 包括 两 部 分 ， 电 泳 仪 和 电泳 槽 。 电 沪 
仪 能 输出 稳定 电压 和 稳定 电流 的 直流 电 。 低 压 电 泳 仪 的 电压 为 100 
一 500 伏 特 , 电 流 为 0 一 150 毫 安 。 高 压 电 泳 仪 的 电压 为 500 一 10,000 
伏特 ， 电 流 为 50 一 400 毫 安 。 电 泳 槽 则 包括 电极 、 缓 冲 液 槽 、 介 质 
(滤纸 ) 的 支持 物 和 防 燕 发 的 透明 单子 。 电 泳 前 先 用 组 冲 液 把 滤纸 
饱和 ， 然 后 小 心地 把 样品 点 在 滤纸 的 恰当 位 置 ， 接 通电 源 开 始 电 
泳 。 一 般 分 离 蛋白 质 用 低压 电泳 时 ，1 一 2 小 时 可 结束 ， 高 压 电泳 
则 在 1 小 时 内 结束 。 

(2) 醋酸 纤维 素 电 泳 

由 于 滤纸 有 一 定 的 吸附 作用 和 电 渗 现象 ， 所 以 分 辩 力 不 够 理 
想 。 高 纯度 的 醋酸 纤维 素 可 以 制 成 薄 而 均匀 的 纸 带 并 用 作 电 泳 的 
支持 介质 。 它 对 样品 的 吸附 非常 小 。 因 此 ， 对 于 小 量 的 祥 品 ， 甚 
至 对 于 大 分 子 都 能 得 到 很 高 的 分 辨 率 。 同 时 ， 由 于 醋酸 纤维 素 的 
闲 水 性 比 纸 小 ， 它 所 容纳 揭 缓 冲 液 也 较 少 ， 因 而 电流 的 大 部 分 由 
样品 传导 ， 所 以 分 离 很 快 。 但 使 用 时 要 注意 入 止 由 于 蒸发 而 使 纸 
条 于 酒 。 

(3) 薄 层 电泳 

以 硅胶 、 硅 营 土 、 氧 化 铝 或 纤维 素 为 原料 在 玻璃 板 上 制 成 薄 
层 】 以 其 为 支持 介质 进行 电泳 时 ， 称 之 为 薄 层 电泳 。 落 层 电泳 很 
还 速 ， 并 且 有 很 好 的 分 辩 率 和 很 高 的 灵敏 度 。 它 还 可 以 进行 双向 
分 离 ， 先 在 一 个 方向 上 进行 电泳 ,然后 在 另 一 个 方向 上 进行 层 析 。 
这 样 就 为 分 析 核 苷 酸 和 氨基 酸 提 供 了 一 个 很 有 价值 前 手段 。 

藉 层 的 厚度 一 般 为 250kUm(0.25mim) 。 


。341。 


(4) 琼脂 糖 (agarfose) 凝 胶 电 泳 
以 凝 胶 为 支持 物 ， 首 先 广 泛 地 用 于 电泳 的 是 天 脂 电泳 。 琼 脂 
(agar) 的 主要 成 份 是 琼脂 糖 和 琼脂 胶 ， 因 为 琼脂 胶 是 一 种 含有 硫 
酸根 和 羟基 的 多 糖 ， 这 些 基 团 带 有 电荷 ,能 产生 较 强 的 电 活 现象 ， 


因而 会 影响 电泳 分 离 的 效果 。 此 外 ， 硫 酸根 又 能 与 某 些 蛋白 质 根 


互 作 用 ， 使 电泳 速度 受到 较 大 影响 。 内 此 ， 月 前 已 应 用 琼脂 六 代 
替 琼 脂 作为 电泳 的 支持 介质 。 

琼脂 糖 凝 胶 电泳 的 操作 方法 简便 ， 电 泳 速度 快 ， 分 析 的 样品 
_ 可 不 必 襄 先 经 过 处 理 。 琼 脂 糖 凝 胶结 构 均 匀 ， 液 体 含量 大 〈 占 98 
-一 99%)， 在 这 种 凝 胶 中 电泳 ， 近 似 自由 界面 电泳 ， 但 样品 扩散 又 
- 比 自由 界面 电泳 小 。 它 对 蛋白 质 吸附 极 微 ， 电 泳 图 谱 清 晰 ， 分 辩 
率 高 ， 重 复 性 好 。 琼 脂 糖 透明 而 不 吸附 紫外 光 ， 因 此 ， 可 以 直接 
利用 紫外 光 吸 收 法 做 定量 测定 。 电 泳 所 得 的 区 带 易 染 色 ， 和 样品 也 
易 洗 脱 ， 又 可 制 成 干 板 长 期 保存 。 它 与 免疫 化 学 反应 相 结合 而 发 
展 成 的 免疫 电泳 技术 ， 能 用 于 鉴别 其 它 方法 所 不 能 鉴别 的 复杂 体 
系 。 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 一 般 采 用 平板 式 。 

(5) 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 沪 

聚 再 烯 酰胺 凝 胶 是 由 丙烯 酰胺 单 体 〈 简 称 为 ACr) 与 交 联 剂 
N、N'- 甲 又 双 丙 烯 酰胺 (BiS) 在 催化 剂 的 作用 下 到 合 成 含有 酰 
胺 基 侧 链 的 脂肪 几 长 链 。 相 邻 的 两 个 链 通 过 甲 又 桥 交 联 起 来 形成 
了 三 维 网 状 结构 。 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 具有 电泳 和 分 子 筛 的 双重 
作用 。 它 可 根据 被 分 离 物 质 所 带 的 电荷 多 少 、 分 子 大 小 和 形状 的 
不 同 ， 在 电场 下 产生 不 同 移动 速度 而 把 它们 分 离开 。 

(6) 等 电 点 聚焦 电泳 

在 自 让 溶液 中 ， 离 子 和 溶液 之 间 的 摩擦 力 最 小 ， 故 离子 能 迅 
速 地 迁移 。 由 于 相同 分 子 的 电荷 特性 十 分 相似 ， 因 此 ， ;它们 移动 
时 紧密 地 形成 一 条 带 , 与 电泳 迁移 率 不 同 的 物质 之 间 形 成 了 界面 。 
这 种 技术 称 作 自由 界面 电泳 。 等 电 聚 焦 电 泳 就 是 建立 在 自由 界面 
电泳 基础 上 的 一 种 区 别 于 区 带电 泳 的 技术 。 

在 制 符 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 时 ， 加 入 一 定 pH 范围 的 两 性 电解 质 ， 


2 了 342 。 


和 对 


在 电场 作用 下 ， 就 形成 了 一 个 pH 的 连续 梯度 。 两 性 物质 〈 如 氨基 
酸 和 多 肽 ) 在 这 样 -- 个 有 pH 和 电泳 梯度 的 垂直 柱 或 永 平板 中 进 


行 芬 离 时 ， 每 一 种 化 合 物 移 向 与 其 等 电 点 相 一 致 的 p 蔚 位 置 , 并 在 


那里 不 再 移动 。 

等 电 聚 焦 对 于 进一步 分 离 、 纯 化 ， 和 鉴别 蛋白 质 是 十 分 有 用 
的 ， 它 能 得 到 很 高 的 分 辨 率 。 因 为 在 等 电 点 只 要 有 0.02pH 单 位 的 
差别 就 足够 被 分 离开 。 本 方法 尤其 适用 于 蛋白 质 的 微量 分 析 ， 分 
离 时 间 也 短 ， 一 般 只 需 1 一 3 小 时 即 可 完成 。 

还 有 一 些 与 上 述 电 泳 技术 有 关 或 与 其 它 生 化 技术 相 结 合 的 电 
泳 技术 ， 如 SDS 一 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ， 免 疫 电 泳 , 双 向 电泳 等 ， 
这 里 就 不 一 一 介绍 了 。 
电泳 结束 后 ， 还 要 经 过 一 系列 的 处 理 才 能 鉴别 被 分 离 物质 。 
如 蛋白 质 要 用 考 马 斯 亮 蓝 染 色 ， 各 种 不 同 的 同 工 酶 有 各 自 不 同 的 
染色 液 ， 而 核酸 则 要 用 省 化 乙 锭 处 理 后 ， 在 紫外 灯 的 照 身 下 才能 
检测 ， 这 些 方法 将 在 电泳 技术 实例 中 作 简单 介绍 。 

电泳 技术 不 仅 可 用 来 分 析 、 鉴 定 一 些 物 质 ， 而 且 还 可 以 分 离 
较 大 量 的 物质 ， 并 在 分 离 后 进行 回收 ， 这 种 电泳 又 可 称 之 为 制备 
电泳 。 如 制备 一 些 比较 纯 的 线粒体 DNA 等 。 这 种 电泳 在 基因 工程 
的 研究 中 也 很 重要 , 经 过 限制 性 内 切 酶 处 理 的 DNA 片 段 要 用 电泳 
方法 把 它们 分 离开 。 回 收 这 些 片 段 后 ， 进 一 步 做 成 分 子 克隆 并 构 
建 基因 文库 。 为 基因 重组 做 准备 。 因 此 ， 在 遗传 学 的 研究 中 ， 它 
是 一 种 很 重要 的 技术 。 

3. 电 泳 技 术 应 用 实例 

(1) 血清 蛋白 质 的 纸 上 电 泳 

四 样品 和 试剂 的 准备 

血清 : 按 常规 方法 制备 血清 样品 ; 

缓冲 液 ， 硼酸 缓冲 液 ( 离 子 强度 0.05，pH9.0): 称 取 7.638g 四 


-硼酸 钠 (Na,B,O;。10H,O) 和 0.62g 硼 酸 ， 用 水 溶解 后 ， 定 容 至 


1000ml; 
”省 酚 蓝 染色 液 ， 将 33g 毛 化 高 汞 溶 于 95% 乙醇 中 ， 黎 释 到 100 


了 4 


ml， 再 把 18 溴 酚 蓝 溶 于 上 述 用 氧化 高 汞 也 和 的 95% 乙 醇 中 。 

四 滤纸 的 准备 

用 锋利 的 刀片 将 WhatmanNo， 1 号 滤纸 或 新 华 滤纸 ， 裁 成 28 
cm 长 ，3em 宽 的 滤纸 条 ， 在 港 纸 的 两 端 用 铅笔 写成 正 负 标 记 。 ， 

@ 点 样 

位 置 和 形状 ， 对 于 未 知 样品 ， 点 样 的 位 置 应 选 在 滤纸 条 的 中 
央 ， 以 观察 区 带 向 两 极 泳 动 的 情况 ， 进 而 选 出 合适 的 点 样 位 置 。 
如 实验 样品 为 血清 ， 则 将 样品 点 在 负极 一 侧 距 中 线 3cm 处 。 

样品 可 点 成 长 条 形 ， 这 样 分 离 的 效果 较 好 。 祥 品 量 少时 ， 可 
点 成 圆 点 ， 这 样 由 于 样品 集中 ， 便 于 显 色 。 

点 样 量 一 般 以 5u] 为 宜 。 可 用 湿 点 法 或 干 点 法 。 湿 点 法 就 是 点 
样 前 先 把 滤纸 用 缓冲 液 湿润 ， 再 用 点 样 管 点 样 。 干 点 法 则 是 先 点 
样 ， 可 以 点 几 次 ， 每 一 次 要 待 前 一 次 的 样品 晾 干 或 用 吹风 机 “【 切 
记 要 用 冷风 ) 吹 干 后 再 点 ， 点 完 样 后 ， 再 用 缓冲 液 湿润 滤纸 准备 
电泳 。 

四 电泳 

将 滤纸 放 入 电泳 祠 ， 标 有 正 号 的 一 端 放 在 正极 槽 内 ， 另 一 端 
则 放 在 负极 槽 内 。 滤 纸 要 拉平 ， 整 个 滤纸 条 要 平展 。 把 玻璃 盖 盖 
好 ， 打 开 电 源 开 关 ， 调 整 电压 到 250Y，4 一 5 小 时 电泳 结束 。 

人 二 与 染色 


结束 后 ， 记 下 实际 电泳 的 滤纸 长 度 〈 以 滤纸 与 缓冲 液 的 


人 
把 滤纸 浸入 氯 化 高 汞 饱和 的 1% 溴 酚 蓝 乙醇 溶液 中 染色 10 分 钟 。 

@@ 洗 洗 和 分 析 

将 浴 色 后 的 滤 红 用 0.5% 乙 酸 洗涤 三 次 ， 每 次 用 200ml， 浸泡 
10 分 钟 ， 以 洗 去 吸附 在 滤纸 上 的 颜色 。 有 蛋白 存在 的 部 分 即 出 现 
有 蓝 绿 色 的 区 带 ， 根 据 颜 色 的 深浅 可 判断 蛋白 含量 的 多 少 。 精 确 
的 含量 则 可 将 各 区 带 的 蛋白 洗 脱 下 来 。 再 用 比 色 法 测定 ， 或 用 自 
动 反 描 光 密度 仪 来 直接 测定 。 各 种 蛋白 的 迁移 率 可 以 很 据 滤 纸 的 
长 度 ，: 电 流 的 电压 ， 时 间 和 和 种蛋 魏 汪 动 的 下 离 分 划 过 算出 来。 


344。， 


.二 


(2) DNA 的 琼脂 糖 凝 胶 电 沪 

DNA 分 子 在 碱 性 环境 中 带 负 电荷 ， 在 电场 作用 下 向 正极 移 
动 。 不 同 的 DNA 片 段 由 于 其 电荷 ,分子量 和 构 型 各 异 ， 迁 移 率 也 
各 不 相同 ， 从 而 可 以 区 分 出 不 同 的 区 带 。 当 它们 用 溴 化 乙 锭 染色 
后 ， 在 紫外 光 下 DNA 显 红色 。 

四 样品 与 试剂 准备 

样品 ， mtDNA 

试剂 Tris 一 硼酸 缓冲 液 “89mMIris，89mM 码 酸 ，2 .5mM 
EDTA，pH8.3。 

省 化 乙 锭 (EB) 染 色 液 : 用 共 饮 水 配制 成 Ing/ml 的 溢 液 ( 先 配 ， 
成 母液 lmg/ml， 在 4 保存 ， 使 用 时 稀 杰 1,000 倍 )。 光 

溴 酚 蓝 滚 4(0.05% 溴 酚 蓝 一 一 50% 甘 油 湾 液 ) ; 先 配 制 0.1%% 溴 
酚 蔓 水 溶液 ， 然 后 加 等 体积 的 甘油 即 可 。 

@ 琼 脂 糖 凝 胶 板 的 制作 

采用 卧 式 电 泳 槽 ， 水 平板 。 先 把 止 形 有 机 玻璃 板 的 两 边 用 胶 
布 封 住 ， 置 于 水 平面 。 配 0.8% 浓 度 的 琼脂 糖 胶 液 ( 取 0.8g 琼 脂 糖 ， 
加 入 100ml 电 泳 缓 冲 液 ， 老 沸 ， 使 琼脂 糖 全 部 融化 )。 倒 入 四 形 有 
机 玻璃 槽 ， 使 其 成 2mm 左 右 的 凝 胶 板 。 在 其 未 凝固 前 将 样品 楼 模 
板 迅速 垂直 播 入 胶 板 的 负极 一 侧 ， 待 全 部 凝固 后 ， 取 出 样品 槽 模 
板 ， 并 去 掉 丙 边 的 胶布 ， 将 琼 板 与 凹 形 扳 一 起 放 入 卧 式 电泳 模 
中 ， 将 有 样品 槽 的 一 边 置 于 负极 一 出， 两 边 槽 内 倒 入 电泳 液 〈 即 
缓冲 液 ), 使 于 脂 糖 能 完全 接触 电泳 液 , 电 泳 液 以 没 过 琼脂 板 为 好 。 

@@ 加 样 ， 把 样品 与 省 酚 蓝 液 按 4:1 的 比例 混合 ,用 微量 注射 器 
把 样品 加 到 样品 槽 中 ， 点 样 量 为 5 一 10b。 

四 电泳 : 电泳 开始 时 ， 可 用 较 高 的 电压 ， 如 100 伏 特 。 这 样 可 
使 样品 很 快 进入 胶 内 ， 而 减少 样品 的 扩散 。 待 样品 进入 胶 内 ， 即 
可 保持 在 每 厘米 5 伏特 左右 的 电压 降 情 况 下 电泳 。 

当 溴 酚 蓝 的 区 带 移 至 距 凝 胶 底 部 1 一 2cm 时 ， 断 电 并 停止 电 
泳 。 当 胶 板 为 10 一 15cm 的 长 度 时 ， 电 泳 时 间 一 般 为 ?小 时 左右 。 
思 业 色 和 观察 : 电泳 结束 后 ， 将 凝 胶 浸 入 溴 化 乙 锭 溶液 中 染 


。345 。 


夺 、 
让 


色 ， 半 小 时 后 取出 凝 胶 ， 并 用 水 洗 去 胶 面 的 溴 化 乙 锭 溶液 ,于 254 
nm 波长 的 紫外 灯 下 观察 。 有 DNA 存在 的 地 方 呈现 栖 红 色 的 荧光 “本 
条 带 。 记 录 电 泳 图 谱 可 采用 照相 方法 ， 照相 机 可 加 上 近 摄 镜片 和 
橙 红色 滤 色 镜头 拍摄 。 

注意 事项 溴 化 乙 锭 是 一 种 DNA 诱 变 剂 ; 配制 和 使 用 时 要 戴 
上 手套 ， 勿 使 省 化 乙 锭 沾 上 皮肤 。 

(3) sDS 一 聚 丙烯 栈 胶 斤 胶 电 泳 法 测定 蛋白 质 务 子 量 

SDS 是 阴离子 去 污 剂 十 二 烧 基 硫 酸 钠 的 简称 。SDS 和 莹 基 乙 
醉 加 入 到 蛋白 质 溶液 后 ， 和 一 基 乙 醇 能 使 蛋白 质 分 子 申 的 二 硫 键 还 
原 ; SDS 则 能 使 蛋白 质 的 氨 键 、 下 水 键 打开 ， 并 结合 到 蛋白 质 分 
子 上 ， 形 成 蛋白 质 -SDS 复 合 物 。 在 一 定 条 件 下 ,，SDS 与 大 多 数 蛋 
白质 的 结合 比 为 1.4 克 SDS/1 交 蛋白 质 。 由 于 十 二 烷 基 硫酸 根 带 负 
” 电 ， 使 各 种 蛋白 质 的 SDS 复合 物 都 带 上 相同 密度 的 负电 荷 ， 它 的 
量 大 大 超过 了 蛋白 质 分 子 原 替 的 电荷 量 ， 因 而 掩盖 了 不 同 种 类 蛋 
白质 原 有 的 电荷 差别 。 

蛋白 质 与 SDS 结合 后 ， 还 引起 了 蛋白 质 构 象 的 改变 。 它 科 在 
水 溶液 中 的 形状 , 近似 于 雪茄 烟 形 的 长 棋 圆 棒 ,不 同 蛋 自 质 的 SDS 
复合 物 的 得 轴 长 度 都 一 样 ， 约 为 18A ， 而 长 轴 则 随 蛋白 质 揭 分 子 
量 成 正比 的 变化 。 在 这 种 情况 下 ， 蛋 白质 的 电泳 迁移 率 主要 取决 
于 它 的 分 子 量 ， 而 与 所 带电 荷 和 形状 无 关 。 在 二 定 条 件 下 ， 蛋 白 
质 的 分 子 量 与 电泳 迁移 率 的 关系 ， 可 用 下 列 公式 表示 ; 

MT = 开 (10- 嫩 ) 
ljgMW= lg 开 一 bm = 天 ;一 1 

M 为 分 子 量 ; 天 ， 开 1 为 常数 ; zt 为 斜率 网 为 迁移 率 。 

因此 ， 要 测定 某 个 蛋白 质 的 分 子 量 ， 只 需 将 它 和 二 系列 已 知 
分 子 量 的 蛋白 质 在 SDS 一 凝 胶 电 泳 时 的 迁移 率 进行 比较 就 可 以 
了 。 一 般 以 同一 次 电泳 中 ， 标 准 蛋白 质 的 相对 迁移 率 〈 蛋 白质 的 
电泳 迁移 距离 除 以 染料 迁移 距离 ) 与 分 子 量 对 数 画 出 标准 有 曲线， 星 
根据 所 测 蛋白 样品 的 相对 迁移 率 即 可 在 标准 曲线 中 查 出 对 应 的 分 ， 
玫 量 。 SR 。 


。346” 


四 样品 制备 

将 蛋白 质 溶 解 于 样品 溶解 液 中 ( 见 试剂 配制 )。 在 100% 水 浴 
中 加 热 2 一 5 分 钟 。 样 品 浓度 可 在 0.05~~1mg/1 之 间 。 样 品 溶液 浓度 
太 稀 时 要 浓缩 ， 含 盐 量 高 则 要 先行 透析 。 

标准 蛋白 样品 的 制备 ， 称 取 细 胞 色素 C、 胰 凝 乳 蛋白 酶 元 A、 
胃 和 蛋白 酶 、 卵 清 蛋白 、 牛 血清 自 蛋 白 各 0.2mg 左右 ， 混 合 一 起 ， 
按 每 0.5mg 蛋 白质 加 1ml 样 品 溶解 液 的 比例 ， 将 其 溶解 于 样品 溶解 
液 中 ， 然 后 在 沸水 中 加 热 3 分 钟 ， 冷 至 室温 时 用 。 

待 测 样 品 的 制备 ， 待 测 样 品 如 为 固体 ， 则 和 标准 蛋白 质 样 品 
作 同 样 处 理 * 如 为 液体 则 用 2 倍 浓度 的 样品 溶解 液 5 其 党 体积 混 

合 , 在 沸水 中 加 热 3 分 钟 ， 冷 至 室温 待 用 。 

加 试剂 配制 

0.2M pH7,:2 磷 酸 盐 缓 冲 液 : 取 280ml 0， 2M 磷 酸 二 氢 钠 溶液 ， 
加 入 720ml 0;2M 磷 酸 氢 二 钠 溶液 ， 混 匀 后 后 调 至 pDH7 2?。 用 此 溶液 
进一步 配制 凝 胶 缓 冲 液 ， 电 极 缓冲 液 和 样品 溶解 液 。 

样品 溶解 液 : 0.01M pH7 .2 磷酸 缓冲 液 , 内 含 1%SDS，,1% 芒 
基 乙 醇 ，10% 甘 涉及 0.02% 溴 酚 蓝 。 

电极 缓 神 液 即 0.1%SDS，0.1M pH7.2 磷 酸 盐 缓 冲 液 : 取 18g 
SDS,， 加 入 500m10.2M,， pH7.2 的 磷酸 盐 绥 冲 液 ， 用 蒸馏 水 定 容 
至 1000ml]。 

染色 液 : :0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250， 加 入 454ml150% 甲醇 水 溶 
液 和 46ml1 冰 乙酸 。 

脱色 液 :” 75ml 冰 乙酸 ,，875ml 蒸 饮水 与 50ml 甲 醇 混 合 。 

甸 贮 液 及 凝 胶 的 配制 

贮 液 的 配制 

ArC 30g 
4- 有 有 该] Bi 0.8g 
加 蒸 饮水 至 100ml 


5 基 胶 缓 评 波 02 
加 0,2M pH7 .2 磷酸 盐 缓冲 液 至 100ml 


。 347。 


TEMED 1ml 

加 燕 饮 水 至 100ml 

d.10% 过 硫酸 物 : 过 硫酸 秉 1g 溶 于 10ml 蒜 饮水 
Arc:， 丙烯 酰胺 

Bis， 甲 又 双 丙 烽 酰 胺 

TEMED， NIN,N' ,N' -四 甲 基 乙 二 腕 

10%% 过 硫酸 锭 必须 二 周 新 配 一 次 

以 上 贮 液 配制 好 后 ， 放 置 冰 箱 内 备用 。 


c .1%TEMED | 


每 20ml 活 胶 溶液 的 混合 比 ， 

5%% 凝 胶 10% 北 胶 
贮 液 (1) 3.33ml 6.67ml 
贮 液 (2) 10 .00ml 10 .00ml 
贮 : 液 (3) 2 .00ml 2 .00ml 
燕 饮水 4.57ml 1.23ml 


以 上 溶液 混 匀 后 放 入 抽 滤 三 角 瓶 中 抽 气 10 分 钟 ， 以 防止 凝 有 
中 出 现 气泡 而 影响 电泳 。 上 述 溶液 抽 气 后 加 入 0， 1m 过 硫酸 按 , 立 
即 制 板 或 装 柱 。 

由 本 试验 采用 圆 盘 电 泳 ， 垂 直 柱 型 。 操 作 步 又 如 下 : 

将 凝 胶 玻 璃 管 插入 电泳 槽 上 槽 底部 的 圆 孔 中 ， 使 其 垂直 。 正 
璃 管 底部 套 上 小 玻 耽 塞 ， 套 前 在 小 玻璃 塞 的 表面 可 均匀 地 涂 上 一 
薄 层 50% 甘 油 。 上 述 准 备 工作 应 在 凝 胶 液 加 过 硫酸 园 之 前 完成 。 
将 已 加 过 硫酸 猴 的 10% 凝 胶 液 用 细 沈 管 加 入 凝 胶 玻 璃 管 中 ， 注 意 
使 各 个 管 的 凝 胶 高 度 一 致 。 加 完 凝 胶 液 以 后 ， 立 即 用 带 有 细 针 头 
的 注射 器 沿 管 壁 缓慢 地 注入 3 一 4mm 高 的 蒸 饮水 ,目的 在 于 将 凝 胶 
面 用 水 压 平 。20 分 钟 左 右 可 出 现 明 显 的 水 胶 界面 ， 再 过 20 一 30 分 
钟 后 即 可 将 蒸 饮水 吸出 并 加 样 。 

待 测 的 蛋白 样品 在 加 样 前 要 进行 处 理 。 一 般 是 将 蛋白 样品 溶 
于 1%SDPS、1% 的 综 基 乙醇 、0.01M 的 磷酸 缓冲 液 (pPH7.2) 等 中 。 
将 蛋白 质 的 最 后 浓度 调整 到 每 升 含 0.05mg 至 1mg。 将 样品 溶液 
与 2 倍 浓度 的 样品 溶解 液 等 量 混 合 后 在 沸水 中 加 热 3 一 5 分 钟 ， 淮 


“了 48。 


全 va 


辐 避 9 


0 和 ee | 所 苦 订 5 


2 区 


。 雾 后 即 可 加 样 。 直 径 为 6emm 的 凝 胶 柱 ， 每 管 加 10ug 蛋 白 即 可 得 到 
。 清晰 的 区 条 。 


为 了 测定 样品 蛋白 的 分 子 量 ， 以 标准 蛋白 质 作 对 照 。 将 标准 
蛋白 与 待 测 样品 进行 相同 的 处 理 ， 冷 却 后 加 样 。 

待 测 样品 与 标准 蛋白 质 样品 制备 好 了 以 后 ， 即 可 将 圆 盘 电泳 
全 部 装配 好 。 首 先 轻 轻 取 下 凝 胶管 底部 的 小 玻璃 塞 。 将 玻 管 垂 直 
装置 在 电泳 槽 上 ， 将 电极 液 注入 下 槽 ， 将 上 槽 轻 轻 放下 ， 如 凝 胶 
管 底 部 有 气泡 ， 要 用 带 弯 针 头 管 的 注射 器 将 气泡 吸出 ， 再 将 电极 
缓冲 和 夜 注入 上 槽 并 没 过 管 口 。 

用 微量 注射 器 向 凝 胶管 中 小 心 加 样 。 每 管 一 种 样品 ， 根 据 样 
襄 浓 度 来 确定 加 样 量 ， 加 样 体积 可 由 10U1 至 150U1。 

加 样 完毕 后 ， 打 开 直流 稳 压 电源 (负极 接 上 覃 ,正极 接 下 槽 )， 
将 电流 强度 稳定 在 每 管 8 毫 安 ， 待 溴 酚 蓝 迁 移 到 距 下 口 lcm 左 右 
处 ， 停 止 电 泳 ， 电 泳 时 间 大 约 为 5 小 时 。 

小 心地 取出 凝 胶 ， 按 编号 放 入 试管 中 ， 加 入 染色 液 ,染色 4 一 
5 小 时 后 倾 出 染色 液 ， 将 凝 胶 先 用 蒸馏 水 洗 几 次 ,再 用 脱色 液 脱 
色 ， 玫 小 时 换 一 次 脱色 液 ， 脱 色 到 背景 清晰 、 区 带 清楚 为 止 。 

最 后 的 步 又 是 计算 分 子 量 ， 用 标准 蛋白 质 分 子 量 的 对 数 对 相 
对 挝 移 率 做 图 ， 画 出 标准 曲线 。 根 据 待 测 桩 品 的 相对 迁移 率 ， 可 
从 标准 曲线 图 上 查 出 其 分 子 量 。 


附 乌 准 蛋白 质 及 其 分 子 量 ; 

细胞 色素 C 12y500 

胰 凝 乳 蛋 白 酶 元 A 25,000 

胃 蛋白 酶 35,000 

孵 清 蛋白 43，000 

牛 血清 白 蛋 白 67y000 

(三 ) 层 析 技术 

1 .原理 

在 遗传 学 的 研究 中 ， 常 常 需要 从 一 个 混合 物 中 分 离 和 纯化 出 


"349。 


一 种 或 几 种 化 合 物 。 要 进行 这 样 的 分 离 和 纯化 ， 通 常 可 采用 层 检 
技术 。 它 是 利用 混合 物 中 的 各 种 物质 在 互 不 相 容 的 两 不 相 中 分 本 
的 不 同 而 把 它们 分 离开 。 这 两 个 相 中 一 个 是 固定 不 动 的 称 为 固定 
相 ， 另 一 个 是 可 以 移动 〈 流 动 ) 的 称 为 移动 相 。 如 在 固 相 一 液 外 
系统 中 ,， 固 相 为 固定 相 ， 液 相 为 移动 相 。 分 配 系数 的 概 意 是 层 析 
法 的 基本 原理 。“ 分 配 系数 ”这 个 术语 通常 被 用 来 叙述 二 种 化 侣 物 
在 互 不 相 溶 的 两 个 相 中 被 分 配 的 状况 。 当 二 个 化 合 物 在 两 个 特定 
的 溶剂 中 分 配 时 ， 可 用 下 列 公式 表示 
在 溶剂 A 中 的 浓度 _ 党 数 
在 溶剂 3 让 的 浓度 

这 个 公式 也 可 以 用 来 描述 在 两 个 相 中 的 分 配 。 对 于 层 析 来 说 
分 配 系数 可 以 定义 为 移动 相 中 的 浓度 除 以 固定 相 中 的 浓度 。 

“有 效 分 配 系数 "的 定义 是 物质 在 一 个 相 的 总 量 除 以 在 另 一 相 
中 的 总 量 。 实 际 上 是 分 配 系数 乘 以 两 个 相 的 体积 比 ; 

由 于 移动 相 不 停 地 通过 固定 相 ， 混 合 物 中 的 各 种 物质 根据 其 
各 自 的 分 配 系数 ， 一 次 又 一 次 地 在 两 个 相 中 平衡 ， 从 而 使 其 集中 
于 固定 相 的 一 定位 置 上 。 在 这 个 位 置 上 ， 又 由 于 各 种 物质 的 分 配 
系数 各 不 相同 ， 集 中 的 位 置 也 就 各 异 ,因而 可 以 将 它们 分 离开 来 。 

2 . 层 析 的 分 类 

根据 各 种 层 析 的 特点 和 性 质 ， 可 以 将 层 析 分 为 以 下 玫 种 ， 中 
附 层 析 ， 分 配 层 析 ， 逆流 分 盗 ， 离 子 交换 层 析 ; 气 - 液 层 析 ; 通 


透 层 析 和 订 和 层 析 等 。 一 般 常用 的 是 吸附 层 析 ， 分 配 层 桥 离子 


交换 层 析 ， 通 透 层 析 和 亲 和 层 析 。 下 面 对 儿 种 常用 层 析 前 特点 进 
行 简单 介绍 。 

(1) 吸附 层 析 : 

吸附 层 析 固 定 相 的 表面 具有 吸 办 分 子 的 特 全 这 各 吸 附 党 为 
特异 性 的 ,以 致 于 可 以 从 一 个 混合 物 中 选择 性 地 吸附 某 一 种 溶质 。 
根据 混合 物 中 各 种 成 分 ， 被 吸附 剂 所 吸附 交 程 度 不 同 以 及 它们 在 
溶剂 中 的 溶解 度 差异 就 可 以 把 它们 分 离开 了 。 吸 附 层 析 又 可 以 分 
为 柱 吸附 层 析 和 薄 层 层 析 ， 前 者 适用 于 较 大 量 的 分 离 ， 而 后 者 特 


4 了 3501 


别 适用 于 分 离 很 少量 的 物质 。 

(2) 分 配 层 析 

这 种 技术 的 原理 是 以 一 种 化 合 物 在 两 种 液 相 中 进行 分 配 为 基 
础 的 。 一 些 分 配 层 析 的 支持 物 可 以 吸附 水 。 这 时 水 被 看 成 是 一 种 
溶剂 ， 是 固定 相 。 而 另 一 种 不 含水 的 溶剂 《如 有 机 湾 剂 ) 为 移动 
相 ， 竺 分离 的 溶质 分 子 将 按照 它们 的 分 配 系数 的 比率 在 两 个 相 之 
间 进 行 分 配 ， 溶 质 在 移动 相 中 的 溶解 度 越 大 ， 这 种 物质 在 支持 物 
上 移动 的 越 远 。 洲 解 度 越 小 ， 移 动 的 距离 就 越 小 。 以 纸 片 做 为 支 
持 物 的 称 为 纸 层 析 。 纸 层 析 不 但 可 以 进行 单方 向 分 离 ， 还 可 以 移 
动 90 进行 双向 分 离 ， 这 样 效果 更 佳 。 把 支持 物 如 纤维 素 ， 硅 胶 ， 
淀粉 装 入 玻璃 柱 中 ， 再 进行 分 配 层 析 的 称 为 分 配 柱 层 本 。 

(3) 离子 交换 层 析 

很 多 生物 物质 ， 如 氨基 酸 和 和 蛋 白质, 具有 能 够 离子 化 的 基 团 。 
它们 可 带 净 正 电 荷 或 净 负 电荷 。 根 据 这 一 特点 可 将 这 些 化 合 物 的 
混合 物 进行 分 离 。 

离子 的 分 离 是 在 装 有 离子 交换 剂 〈 树 脂 ) 的 柱 中 进行 的 。 离 
子 交 换 剂 分 为 阳离子 交换 树脂 和 阴离子 交换 树 此 。 阳 离子 交换 树 
脂 上 有 负电 荷 基 团 ， 它 们 能 吸引 带 正 电 荷 的 分 子 。 阴 离子 交换 树 
脂 具 有 带 正 电荷 的 基 团 ， 它 们 只 能 吸引 带 负 电荷 的 分 子 。 

树脂 装 桩 后 需 用 碱 〈 阴 离子 交换 剂 ) 或 酸 〈 阳 离子 交换 剂 ) 
平衡 ， 然 后 把 需 分 离 的 化 合 物 铺 在 柱 上 ， 离子 化 基 团 将 逐步 取代 
树脂 上 的 正 或 负离子 。 随 着 含有 离子 化 化 合 物 的 缓冲 液 不 断 从 柱 
上 流 过 ， 这 种 交换 反复 地 进行 。 当 pH、 离 子 强 度 、 缓 冲 液 过 柱 的 
流速 以 及 温度 条 件 等 都 合适 时 ， 这 种 离子 化 的 化 合 物 就 可 以 以 一 
条 很 窗 的 带 被 结合 在 树脂 上 。 

为 了 把 这 种 化 合 物 从 柱 上 洗 脱 下 来 ， 可 以 改变 缓冲 液 的 pH， 
也 可 增加 离子 强度 ”或 pH 和 离子 强度 不 变 , 但 采用 比 这 种 化 合 物 
离子 交换 材料 的 亲和力 更 大 的 离子 。 

(4) 通 透 层 析 

通 透 层 析 的 原理 是 利用 各 种 多 和 孔 材 料 的 分 子 筛 特 性， 按照 分 


se 了 3 了 51 。 


子 的 大 小 和 形状 对 分 子 进 行 分 离 。 最 常用 的 材料 是 一 组 聚合 的 有 


机 化 合 物 ， 它 们 具有 立体 的 孔 型 网 状 结构 ， 以 致 它们 具有 凝 胶 的 _ 


特性 。 多 和 孔 的 玻璃 珠 也 可 用 来 做 通 透 层 本 的 分 子 筛 。 凝 胶 颗 粒 或 
多 和 孔 玻璃 珠 的 柱 与 相应 的 溶剂 处 于 平衡 状态 。 完 全 被 排 阻 在 孔 外 
的 大 分 子 将 从 颗粒 间隙 的 空间 通过 ， 而 较 小 的 分 子 在 分 子 筛 的 外 
部 和 内 部 溶剂 中 进行 分 配 ， 因 此 以 一 个 较 慢 的 速度 通过 柱 。 

通 透 层 析 常 用 的 材 料 包括 : 交 联 葡 聚 糖 (Sephadex)， 琼 脂 糖 
(Sepharose)， 聚 丙 烽 酰 腕 ， 聚 茶 乙 烯 、 多 孔 玻璃 珠 (Bio-G:as)、 
多 孔 硅 胶 (Porasil) 等 。 

各 种 型 号 的 葡 聚 糖 都 有 一 一 定 的 分 离 范围 〈 见 表 13) 


表 13 Sephadex 凝 胶 的 特性 
高 分 级 分 离 范 围 吸 水 值 床 体积 
( 道 尔 顿 ) ( 克 水 / 充 干 胶 ) | (毫升 / 克 王 胶 ) 
G 一 10 达 700 1.0 2 
1 达 1500 隐 3 
G_-25 | 100 5000 
| 1,000 一 5,000 2.5 5 
G_50 500 一 10,000 
1,500 一 30,000 2.0 10 
G 一 75 1 ,00( 一 30,000 二 
3 ,000- 80,000 ， 
G 一 100 1 000 一 100,000 
4,000-150,000 1.0 19 一 20 
G- -150 “| 1000-150,000 村 
| 5,000 一 300,000 1.5 20 一 30 
G 一 200 1,000 一 200,000 汉 和 让 


5,000 一 600 ,000 


注 : 1. 对 任意 卷曲 的 多 糖 测 得 的 结果 。 
2. 对 多 肽 和 球 蛋 白 测 得 的 结果 。 


各 种 型 号 Sepharcse 凝 胶 的 排 阻 值 也 不 同 .Sepnafcse 凝 胶 可 以 
用 来 分 离 分 子 量 为 几 百 万 的 分 子 和 颗粒 〈 表 14)。 


。352。 


Ca 


9 
本 rm 


表 14 Sepharose 北 胶 的 特性 

近似 的 排 盟 极限 ( 道 尔 顿 ) 
多 糖 | 蛋白 质 
20 Xx105 40X 105 


5 Xx 105 20 X 105 
1X105 4X105 


近似 的 琼脂 糖 浓 度 


SepEharose 2B 


Serharcse 4B 
Serharcse 6B 


AAAaiaggiheb 
还 具备 如 下 一 些 特 有 的 优点 : 

除了 对 强 碱 和 所 化 气 外 ,它们 对 所 有 的 化 学 物质 都 是 惰性 的 ; 

它们 的 排 盟 极 限 很 窗 ， 因 而 分 辨 率 和 产 率 都 较 高 

因 不 需要 膨 胀 ， 柱 的 制备 较 容 易 ; 

不 会 被 压缩 ， 所 以 溶剂 流速 可 以 很 高 

溶剂 系统 和 它 的 离子 强度 不 会 影响 孔 的 大 小 ; 

易于 清洗 和 消毒 等 。 

通 透 层 析 可 用 于 生物 大 分 子 如 病毒 、 蛋 白质 、 酶 、 激 素 、 
体 、 核 酸 和 多 糖 等 的 纯化 ， 此 外 还 可 用 于 脱盐 、 入 站 和 分 
子 量 的 测定 等 。 

(5) 亲 和 层 析 ， 

这 种 技术 主要 用 于 蛋白 质 的 纯化 。 它 利用 了 生物 大 分 子 最 独 
特 的 特性 ， 即 生物 学 特异 性 来 进行 纯化 。 从 理论 上 讲 ， 它 比 通 透 
层 析 、 电 泳 等 纯化 效果 更 好 。 

生物 反应 中 存在 着 很 多 的 性 质 各 异 的 酶 ， 它 们 也 是 蛋白 质 ， 
根据 它 的 立体 结构 ， 只 有 很 少数 的 化 合 物 〈 配 位 体 ) 能 达到 它 的 
活性 位 置 和 调节 位 置 。 这 些 化 合 物 可 能 是 酶 反应 的 底 物 或 是 一 种 
可 逆 的 或 不 可 逆 型 的 效应 物 。 它 们 能 特异 地 识别 活性 位 置 或 调节 
位 置 ， 此 帮 酶 亲 和 层 析 的 基础 。 这 种 技术 通过 一 种 方式 把 配 位 体 
(通常 是 一 种 可 逆 的 竞争 抑制 剂 ) 共 价 结合 到 一 种 适宜 的 不 溶性 基 
质 上 ， 而 又 不 损伤 它 与 酶 的 结合 能 力 。 把 未 经 纯化 的 酶 加 在 经 适 
当 经 冲 液 浸 泡 过 并 经 配 位 体 结合 过 的 基质 柱 上 ， 这 种 酶 被 选择 性 

*。353 。 


地 留 在 柱 上 ， 而 不 结合 的 杂质 被 洗 脱 。 随 后 ， 再 用 一 一 种 不 同 pH 和 


不 同 离子 强度 的 洗 脱 波 把 酶 取代 下 来 。 
3. 柱 层 桥 法 的 一 般 技 术 
吸附 层 析 、 离 子 交 换 层 析 、 通 透 层 析 以 及 亲 和 层 析 等 操作 方 


式 均 采 用 柱 型 。 所 以 柱 层 析 是 一 种 最 常用 的 方法 ， 有 必要 较 详 尽 “ 


地 介绍 。 

G) 层 析 柱 - 一 

层 析 柱 通常 是 玻璃 的 。 一 般 来 说 ， 长 柱 的 分 辩 力 好 ， 需 分 析 
的 物质 数量 较 大 时 则 采用 较 粗 的 柱 。 

(2) 层 析 材 料 的 准备 抽 

各 种 层 析 材料 在 使 用 前 都 要 作 预 处 理 。 如 用 凝 胶 做 层 桥 材 料 
时 ， 需 要 先 溶 胀 ， 吸 附 层 析 的 材料 要 预先 加 热 或 酸 处 理 来 活化 ， 
而 离子 交换 树脂 则 需要 用 酸 碱 处理 来 得 到 所 需 的 电离 形式 。 

用 溶剂 进行 平衡 时 ， 先 使 材料 沉淀 ， 去 掉 悬 浮 的 细 颗 粒 ， 否 
则 由 于 细 颗 粒 的 堵塞 ， 将 显著 降低 溶剂 的 流速 。 

(3) 装 柱 

装 柱 的 好 坏 将 直接 影响 层 析 的 效果 。 关 键 在 于 要 使 层 析 床 和 
支持 板 下 的 “ 死 体 积 ” 不 存 有 气泡 ! 装 柱 时 首先 关闭 出 马 … 用 溶 
剂 灌 至 1/3 体 积 ， 并 使 支持 板 下 的 死 体积 不 存 有 气泡 ,再 慢 慢 地 向 
溶剂 中 加 浆 状 展 析 材 料 。 沿 着 玻璃 棒 小 心地 倾注 ， 不 时 地 轻 轻 吨 
柱 以 便 填 装 均匀 和 赶 走 气泡 。 让 悬浮 液 沉淀 ， 放 出 过 多 的 溶剂 。 
最 好 一 次 装填 好 ， 这 样 可 以 避免 分 层 。 如 需 分 数 次 装填 沁 那 来 在 
第 二 次 装 填 前 应 把 前 次 装填 的 表面 用 玻璃 棒 搅 动 后 再 装填 ， 下 一 
次 再 重复 这 个 过 程 ,， 直 装 到 所 需 的 高 度 。 用 溶剂 彻底 洗涤 层 析 桩 
后 使 液 面 降 到 略 高 于 层 析 床 表面 ; 覆盖 上 一 张 圆 形 的 滤纸 或 尼龙 
布 ， 以 免 加 样 时 扰乱 层 析 床 表面 。 

(4) 加 样 

样品 上 柱 前 ， 先 溶解 在 溶剂 里 或 用 洗 脱 液 透 析 。 ,样品 的 溶液 
浓度 应 尽 可 能 高 些 ， 以 减少 样品 溶液 的 体积 ， 使 区 带 狭 窒 。 将 样 
品 仔细 加 到 层 析 床 的 表面 ， 打 开 旋 塞 至 液 面 与 床 面 齐 ， 然 后 与 深 


9 3 了 354 se 


称 
到 


人 


剂 池 连 接 ， 保 持 一 定 的 液 面 高 度 ， 调 节 好 流速 后 即 可 开始 洗 脱 。 

(5) 洗 脱 

用 适当 的 洗 脱 液 把 各 组 分 依次 从 柱 上 冲洗 下 来 称 之 为 洗 脱 。 
洗 脱 时 溶剂 与 柱 的 相互 作用 应 比 溶质 与 柱 的 相互 作用 强 。 这 样 ， 
溶剂 流 过 层 析 柱 时 ， 就 逐渐 将 它们 从 柱 上 冲洗 下 来 。 各 种 组 分 因 
为 吸附 力 不 同 而 被 逐渐 分 离 。 在 一 个 组 分 洗 脱 下 来 后 ， 可 改换 洗 
脱 液 ， 这 种 方法 叫 分 步 洗 脱 。 另 外 一 种 是 逐渐 改变 溶剂 的 性 质 ， 
使 其 形成 一 个 离子 强度 ，pH 或 极 性 递增 的 梯度 ， 从 而 使 各 组 分 依 
次 被 洗 脱 。 这 就 是 梯度 洗 脱 。 

(6) 收集 

层 析 桩 的 流出 液 可 用 部 分 收集 器 来 收集 。 还 可 以 用 紫外 监测 
仪 对 流出 液 进行 连续 监测 。 因 为 监测 仪 有 自动 记录 装置 ， 可 以 划 


出 洗 脱 曲 线 ， 根 据 洗 脱 曲线 即 可 以 找 出 哪些 收集 管 中 有 所 需 的 分 


离 物 。 

4. 应 用 实例 

LDH (乳酸 脱氧 酶 ) 同 功 酶 的 亲 和 层 析 。 

LD 下 同 工 酶 是 由 两 种 不 同 的 亚 基 组 成 的 四 聚 体 ， 且 受 着 不 同 
基因 的 控制 。 以 心肌 (8B4) 为 代表 的 8 亚 基 和 以 骨骼 肌 (ca ) 为 代 
表 的 5 亚 基 。 它 们 的 氨基 酸 组 成 和 序列 都 是 各 不 相同 的 。 因 此 ， 分 
人 
条 件 。 

(1) 试剂 准备 

包 省 化 氰 (BITCN) 

_@Sepharose 4B (瑞典 LKB 公 司 出 品 ) 

@2M NaOH 

多 0.1M 碳 酸 盐 缓冲 液 pDH9.5 一 10， 并 含有 100 微克 分 子 的 还 
原型 辅酶 I 

@ 乙 二 腕 

G@IM KCl 

加 草酸 钾 


匡 “=P 好 ， 


@ 醋酸 缓冲 液 ，pH4.7 

@ 水 溶性 关 二 亚 胺 

只 3% 三 硝 基 葵 磺 酸 盐 

四 还 原型 辅酶 INADHE) 

@ 丙 酮 酸 钠 

四 0.1M 磷 酸 缓冲 液 PpPH9.5 一 10 

曲 0.02M 磷 酸 缓冲 液 pH6.8 

(2) 实验 步 又 

Gsephatrcse 4B 的 活化 及 尿 基 的 偶 联 

A.， 取 10ml 沉 积 体积 的 Sepharose 4B 加 入 等 体积 的 双 蒸 水 。 
在 电磁 搅拌 下 ， 徐 徐 加 入 预先 溶解 于 4ml 双 藻 水 中 的 3 克 溴 化 氰 
(BICN)， 不 时 用 2N NaOH 调节 pH， 保 持 pH= 11， 反 应 进行 8 


一 12 分 钟 ， 迅 速 转 移 至 砂 芯 漏斗 中 ， 立 即 用 10 倍 于 Sepharose 4B 


_ 体积 的 预 冷 的 0.1M 碳 酸 盐 缓冲 液 (pH9.5 一 10.0) 淋 洗 ， 以 除去 
未 结合 的 BrCN 在 反应 过 程 中 所 产生 的 NaBr。 

B .Sepharcse 4B 一 aminohexyl 的 制备 

将 溶 于 1ml 预 冷 的 碳酸 盐 缓冲 液 中 的 1 克 乙 二 胺 在 磁力 搅拌 
下 与 活化 的 Sepharose 4B 迅 速 结合 。pH9.5 一 10， 反 应 90 秒 ， 马 
上 抽 气 ， 勿 使 于 裂 ， 然 后 用 6000ml 1MKCI 淋 洗 以 保证 Sepharcse 
4B 一 aminche xy1 衍 生物 形成 。 然 后 转移 至 烧杯 ,4 下 继续 搅拌 
10 一 20 小 时 。 反 应 过 程 可 用 下 图 来 说 明 。 


2 
百 = 
二 


本 (过 量 ) 


NH 和 CH N 
NT 订 机 和 生息 和 和 
ES 


C=NE-(CH,),-NH,+NH。 
1 


人 制 备 Sepharose-aminohexy1-cl 不 溶性 axamate 衍 生 匠 


356 。。 


Hi 


His 


四 
0 


A . 在 每 毫升 含有 5 一 10 微克 分 子 的 aminohexyl 基 团 的 
Sepharose 中 ， 加 进 预先 溶 于 2ml 双 蒸 水 中 的 140 毫 克 草 酸 钾 ， 用 
醋酸 缓冲 液 将 pH 调 至 4.7， 逐 滴 加 入 事先 溶解 好 的 状 二 亚 胺 (1 毫 
升 双 蒸 水 中 加 370 毫克 )。 室 温 下 搅拌 并 催化 反应 20 小 时 ， 促 使 
Sepharose 上 aminchexyl 基 团 的 末端 氨基 与 草酸 盐 通 过 酰胺 键 
(amiae) 连接 而 产生 不 溶性 oxamate 衍 生物 。 

B ， 偶 联 最 终 产 物 的 鉴定 ;用 3% 三 硝 基 苯 磺 避 盐 的 水 溶液 鉴 
定 尿 基 的 连接 情况 。 室 温 下 胶 用 染料 染 2 小 时 胶 未 连接 取代 基 者 
呈 黄 色 ，%- 氨 基 为 桔 黄 色 ， 芳 香 族 基 为 桔 红 色 。 上 述 尿 基 与 染料 


反应 时 表现 为 橙黄 色 ， 而 对 照 为 黄色 ， 差 异 明显 ， 极 易 分 辩 。 


C .Sepharcse-aminchexyl-cl- 不 溶性 cxamate 亲 和 剂 的 应 
用 

i 组 织 处 理 ， 将 待 分 离 的 组 织 ， 用 等 体积 的 0.02M 磷 酸 缓冲 
液 (pH6 一 8) 匀 浆 ，13,000gx 离 心 30 分 钟 ， 上 清 液 用 于 亲 和 层 析 。 

ii 亲 和 柱 装置 , 将 上 述 交 联 尿 基 的 Sepharcse 装 入 一 个 内 径 为 
0.7 厘米 的 玻璃 柱 内 。 床 体积 为 4 毫升 ， 柱 用 不 含 氯 化 钠 但 含有 
NADH 的 0.02M 磷 酸 缓冲 液 平衡 .上 样 量 为 床 体积 的 1/10, 在 15YC 
下 层 析 ， 流 体 静 压 一 般 为 76 厘 米 液压 为 了 达到 较 好 的 分 离 效果 ， 
洗 脱 液 除 含有 与 平衡 缓冲 液 同样 浓度 的 NADH 外 ， 还 加 入 0.5M 
NaCl。 进行 分 步 洗 脱 ,以 完全 排除 非特 异性 离子 交换 效应 的 于 扰 。 
分 步 洗 脱 的 条 件 为 。 先 用 含有 NADH 的 磷酸 缓冲 液 洗 脱 。 当 用 280 
nm 紫外 光 检 测 ， 其 吸收 值 低 于 0.03 时 ， 换 用 0.5MNaCl 的 NADH 
磷酸 缓冲 液 洗 脱 。 

(3) 酶 活性 的 测定 

根据 NADH 在 340nm 时 的 特异 吸收 值 ， 以 及 乳酸 脱 氢 酶 酶 促 
反应 时 ，NADE 转 化 为 NAD+ 的 情况 , 酶 活性 可 直接 在 340nm 的 光 
吸收 值 中 反应 出 来 ， 如 果 加 进 反应 体系 中 的 NADH 的 光 吸 收 值 作 
为 100%% 的 话 ， 那 么 ， 在 酶 促 反 应 过 程 中 ,340nm 光 吸收 值 下 降 愈 
多 ， 表 明 酶 的 活性 愈 高 ， 反 之 则 活性 低 。 测 定 洗 脱 液 中 LDH 同 工 
酶 的 活性 时 ， 可 对 酶 促 反应 前 后 进行 比较 ， 如 果 340nm 处 的 光 吸 


-3 


收 值 没有 发 生变 化 或 变化 很 小 ， 则 表明 洗 脱 液 中 没有 酶 的 活性 或 
者 有 极 低 的 LDH 同 工 酶 活性 。 因 此 ， 根 据 280nm 下 紫外 吸收 的 
变化 及 340nm 下 光 吸 收 的 变化 ， 便 可 以 了 解 该 亲 和 柱 对 乳酸 脱氧 
酶 同 工 酶 的 纯化 效果 。 检 测 步骤 如 下 :在 25*C 下 ， 取 光 程 为 1 厘 
米 的 石英 杯 ， 加 入 3 毫升 0.1M 磷 酸 缓冲 液 (PH7.0)，0:25 毫 殉 的 
丙酮 酸 钠 和 0.35 毫 克 NADH。 然 后 将 亲 和 柱 的 洗 脱 液 按 收集 管 的 
顺序 ， 依 次 取 0.05 毫 升 ， 并 分 别 加 在 上 述 体系 中 进行 反应 ， 以 上 
述 反 应 体系 中 不 加 酶 的 光 吸 收 值 为 对 照 。 测 定 340nm 波 长 下 的 光 
豚 收 值 ， 它 们 的 降低 值 即 可 表示 rDH 同 工 酶 的 活性 。 

(四 ) 放射 性 同位 素 技 术 

放射 性 同位 素 技术 在 生物 科学 研究 中 应 用 很 庆 ， 如 在 生物 化 
学 、 分 子 生 物 学 、 分 子 遗传 学 等 诸 方面 。 在 遗传 工程 研究 中 尤为 
重要 。 

1 .原理 

原子 由 一 个 送 正 电荷 的 核 和 力 绕 关 核 的 带 员 证 着 疝 记 子 层 组 
成 。 而 核 又 由 带 正 电荷 的 质子 和 不 带电 的 粒 
原子 中 ,轨道 电子 的 数目 必须 等 于 核 中 的 质子 数目 ， 这 个 数 称 之 为 
原子 序数 (Z)。 而 质子 数 和 中 子 数 的 总 和 称 为 质量 数 (人 )。 所 以 

A=Z+N; N = 中 子 数 。 

在 原子 核 中 ， 由 于 中 子 数 与 原子 序数 无 关 ， 所 以 它 不 影响 原 
子 的 化 学 性 质 。 在 某 种 元 素 中 ， 原 子 不 一 定 含有 相同 的 中 子 数 。 
具有 不 同 质量 的 同类 元 素 的 各 种 原子 称 为 同位 素 。 每 一 种 元 素 的 
同位 素数 目 是 不 同 的 。 氨 有 三 个 同位 素 : :H,? 再 ，* 互 。 而 碳 有 七 
个 ， 从 :"C 到 !*C。 在 一 些 高 原子 序数 的 元 素 中 ， 同位素 的 数目 可 
多 达 20 个 以 上 。 自 然 界 中 一 种 元 素 只 有 很 少儿 种 同位 素 是 稳定 的 ， 
称 为 稳定 性 同位 素 。 而 其 它 一 些 同 位 素 是 不 稳定 的 ， 并 以 一 个 固 
有 的 速度 晓 变 成 稳定 性 同位 素 。 在 晓 变 的 过 程 中 则 发 射 粒子 和 电 
磁 辐 射 ， 而 这 些 辐 射 可 以 使 X 光 片 感光 并 用 仪器 测量 到 。 芍 于 同 
位 素 的 以 上 特点 ， 经 常 使 用 它们 进行 遗传 学 有 关 分 子 合 成 、 代 谢 ， 
活动 的 研究 。 当 然 ， 利 用 它们 的 放射 性 还 可 以 对 生物 尤其 是 微 生 

9 3588 


物 进 行 诱发 突变 的 研究 。 
2 .放射 性 衰变 的 类 型 
(1) 发 射 负 电子 的 衰变 
在 这 种 过 程 中 ， 一 个 中 子 发 射出 一 个 带 负 电荷 的 B 粒子 ， 并 
转变 为 一 个 质子 。 负 电子 即 是 电子 。 
中 子 一 质子 + 负电 子 
这 样 原子 核 失去 一 个 中 子 而 得 到 一 个 质子 ， 原 子 序数 增加 了 
1， 质 量 数 不 变 ， 如 ， 同 位 素 !“C 的 训 变 。 
EC 一 NB (负电 子 ) 
(2) 发 射 正 电子 的 衰变 
在 这 一 类 衰变 中 ,同位 素 通过 发 射 带 正 电 荷 的 8 粒子 ( 正 电子 ) 
而 衰变 。 在 这 个 过 程 中 一 个 质子 转变 为 一 个 中 子 。 
质子 一 中 子 + 正 电子 
由 于 一 个 质子 变 成 了 中 子 ， 使 原子 序数 减少 1, 质 量 数 保持 不 
变 。 如 : “Na 的 衰变 。 
:1Na 一 >:INa+B+( 正 电子 ) 


(3) & 误 变 : 

高 原子 序数 同位 素 的 衰变 是 通过 发 射 粒 子 来 表现 的 。2& 粒 子 
是 氨 的 原子 核 ， 由 2 个 质子 和 二 个 中 子 (46872 ) 组 成 。 

(4)Y 训 变 

Y 射 线 不 同 于 w 和 8 粒子 的 发 射 , 它 是 一 种 电磁 辐射 ， 是 原子 
核 内 转化 的 结果 ,经 常 伴随 着 w 和 8 粒子 的 发 射 。Y 发 射 的 本 身 并 
不 引起 原子 序数 或 质量 的 变化 。 

3. 放 射 性 衰变 率 

放射 性 同位 素 的 放射 性 是 随时 间 而 下 降 的 ， 这 种 下 降 有 其 自 
已 固有 的 速度 。 每 种 放射 性 同位 素 都 有 误 变 常数 ， 常 用 “ 半 误 邯 ” 
来 表示 。 它 的 定义 是 :放射 性 从 一 个 值 下 降 加 这 个 值 的 一 半 时 所 
需 的 时 间 ， 用 I3 表示， 未 种 放射 性 园 也 素 ， 乞 过 一 个 半衰期 放射 
性 降 为 原 有 活性 的 50% ， 经 过 两 个 半衰期 ， 活 性 仅 为 原 有 活性 的 


359。 


25% ， 经 过 四 个 半衰期 就 只 有 原 有 活性 :的 6.25% 了 ， 所 以 在 记 用 


放射 性 园 位 素 时 特别 要 注意 到 这 一 点 。 下 面 介绍 一 下 遗传 学 研究 


中 常用 同位 素 的 半衰期 。 
同位 素 半衰期 
3 了 12.26 年 
1 5730 年 : 
YY 沁 5589 
3 于 和 
5 二 87 .9 天 
3 12.40 小 时 
4. 放 射 性 的 单位 


放射 性 的 单位 是 居 里 ， 它 是 一 克 镭 每 秒 钟 的 晓 变数 ， 即 为 
3.7X 10!"。 由 于 这 个 单位 太 大 ,生物 学 中 实际 应 用 的 单位 是 微 居 
里 (CiD) 各 居 里 (mCi)。 

5. 使 用 放射 性 同位 素 的 安全 问题 

辐射 对 人 体 是 有 害 的 ， 使 用 放射 性 同位 素 时 一 定 要 注意 安全 
和 防护 。 在 放射 性 同位 素 的 操作 中 ， 要 防止 对 环境 和 人 体 的 污 

*， 要 戴 乳 胶 手 套 ， 必 要 时 还 要 穿 防护 服 。 禁 止 用 嘴 吸 吸管 ， 在 


同位 素 实验 室 严禁 饮食 和 吸烟 。 沾 有 放射 狂 的 材料 和 弃 物 不 能 随 


便 处 理 ， 要 放 入 塑料 袋 内 统一 处 理 等 等 。 
6. 放 射 性 藤 探 测 和 测量 


探测 和 定量 放射 性 有 三 种 主要 的 方法 : 一 是 建立 在 气体 电离 


基础 上 的 盖 革 计数 器 测定 ; 另 一 种 是 固体 或 液体 激发 基础 上 的 内 


烁 计数 器 测定 ， 以 上 方法 都 能 进行 定量 测定 ; 第 三 种 是 以 放射 性 


能 使 照相 乳胶 为 基础 的 照相 法 ， 虽 然 此 法 不 能 定量 但 在 分 子 杂 交 
和 离 体 合 成 测定 时 是 必 不 可 少 的 。 

7. 放 射 性 同位 素 在 遗传 研究 中 的 应 用 

放射 性 同位 素 在 生物 科学 中 应 用 很 广泛 ， 如 代谢 途径 的 研 
究 ， 代 谢 周转 期 的 测定 ， 物 质 被 动 植物 吸收 和 竺 移 揭 机 制 和 速记 
的 研究 以 及 植物 、 微 生物 的 诱 变 育 种 竺 。 分 子 杂交 是 放射 竹 同 位 


360 


站 


素 在 遗传 研究 中 很 重要 的 应 用 ， 这 方面 的 情况 将 在 有 关 章 节 详 细 
介绍 。 在 研究 离 体 合 成 时 也 必须 使 用 放射 性 同位 素 。 
8 .放射 性 同位 素 的 应 用 实例 
(1) 离 体 线粒体 翻译 产物 的 分 析 
线粒体 含有 整套 的 遗传 系统 ， 因 而 离 体 的 线粒体 能 够 独立 地 
合成 蛋白 质 。 用 同位 素 标 记 的 氮 基 酸 扒 入 到 离 体 线粒体 合成 的 多 
肽 中 ， 用 凝 胶 电 泳 分 离 及 放射 自 显 影 方法 即 可 分 离 鉴定 出 线粒体 
基因 组 编码 合成 的 蛋白 质 。 
也 试剂 
提取 液 ，50ml Tris HCI 缓冲 液 pH 7.5 0.35M 甘 露 醇 
ImMEDTA 5mMKCIL 3mM 芒 基 乙 醇 0.1% 牛 射 
清 蛋 白 。 
洗涤 液 : 不 含 琉 基 乙 醇 的 提取 液 
蔗糖 溶液 ， 用 10mMTris-HCI pH 7.5 1mMEDTA 
0.1% 和牛 血清 蛋白 的 缓冲 液 配 制 0.6M 1.2M、 
1,45M 和 1.8M 蔗 糖 溶 液 。 
酶 解 液 ，0.35M 甘 露 醇 ”10mM MgCI， 50ug/mlDNase 
50mMTiis 一 HCL pH 7.5 
尘 酶 液 ， 0.35M 甘 露 醇 ”20mMEDTA 25mMTTris 一 HCl 
人 
悬浮 液 ，0.35M 甘 露 醇 ”lmMEDTA 10mMTris 一 HCl 
pH 7.2 
反应 液 ，10mMTTicipe DH7，2 0.26M 甘 露 醇 
10mMKkCl 20mM MgC1， lmMEDTA 6mMATP 
1mMGTP 2mMDTT 8.4mM 磷 酸 肌 酸 
0.1mg/ml 们 酸 肌 酸 激酶 ”0.1mM19 种 氨基 酸 ( 蛋 氢 
酸 除外 )，50UCir "5sS 蛋氨酸 ， 用 前 配制 。 
终止 液 ，0.35M 甘 露 醇 ImMEDTA 12mM 和 蛋氨酸 ， 
10mMTIricine pH7.2。 
裂解 液 ，10mMTris 一 HCL pHR6.8，lmMEDTA 


6: 


@ 实 验 程 序 并 ， 

按 水 稻 线粒体 DNA 的 提取 与 纯化 方法 提取 线粒体 ， 得 到 粗 
线粒体 后 ， 用 蔗糖 密度 梯度 离心 进行 纯化 。 具 体操 作 如 下 : 

在 一 个 36ml 离 心 管 中 ， 制 备 不 连续 的 蔗糖 审 度 梯度 ，0.6M 
蔗糖 溶液 bml1，1.2M 的 10ml，1.45M 的 12ml 1.8M 的 6ml。 

在 蔗糖 梯度 的 顶部 ， 加 2m1 线 粒 体 悬浮 液 ， 用 水 平 转 头 ， 以 
40000g 离 心 60 分 钟 。 

纯化 的 线粒体 分 布 在 1.2M 与 1.45M 的 界面 上 ， 用 直 和 弯 头 
的 注射 器 将 线粒体 取出 。 用 10mMTris pH7.2，lmMEDTA 缓 冲 
液 将 取出 的 线粒体 悬浮 液 稀 释 至 0.4M 攻 糖 浓度 ( 药 需 稀释 3.5 
倍 )。 用 10000g 离 心 20 分 钟 ， 沉 淀 纯化 的 线粒体 ， 加 5mi 酶 解 液 ， 
在 4C 下 保温 1 小 时 以 除去 线粒体 外 的 污染 的 核 DNA。 

离心 收集 线粒体 ， 用 洗 酶 液 洗 2 次 。 用 10000g 离 心 20 分 钟 ， 
收集 线粒体 。 用 1ml 悬 浮 线粒体 。 上 述 各 步 允 需 在 4C 王 进行 
所 有 器 亚 及 溶液 均 需 灭 菌 。 

离 体 线粒体 蛋白 质 的 合成 : 取 50ml 线粒体 悬浮 液 ( 均 含 
10004g 蛋 白质 )， 在 无 菌 条 件 下 转 入 950 由 反应 液 中 。 在 25 孔 下 保温 
90 分 钟 ， 轻 轻 摇动 。 保 温 结 束 后 ， 立 即 加 入 2ml 终 止 液 ， 然 后 用 
洗涤 液 洗 2 一 3 次 (离心 收集 )， 除 去 游离 的 标记 氨基 酸 于 

用 lml 和 肥 解 液 悬 浮 线粒体 。 

线粒体 翻译 产 名 的 分 离 鉴 

用 IEE-P4AGE 双 询 中 分 离线 粒 体 蛋 护 质 。( 见 电泳 技术 一 
当 5 : 了 
放射 目 显 元 业 汪 
凝 胶 电 泳 板 于 燥 后 ， 将 x 光 胶片 紧 贴 电泳 兹 胶 狐 ， 放 在 路 
中 ， 置 =707C 冰 箱 中 ， 阳 光 2 3 周 。 的 区 二 
离 体 翻 译 的 产物 。 

(2) 利用 :a4T 标 记 5 一 砚 尿 旷 喧 以 研究 细菌 DNA 的 复制 

5 一 碘 屎 喀 喧 (5 一 媚 ) 是 胸腺 旷 喧 的 结构 类 似 物 ， 虽 然 它 不 是 
天 然 碱 基 成 分 ， 但 能 部 分 地 为 某 些 细菌 利用 ， 与 胸腺 喀 啶 一样 ， 


了 62 


它 参 与 核酸 的 合成 。 由 于 I :放射 出 的 Y 射 线 ， 放 射 强 度 高 ， 穿 
透 力 强 ， 易 于 检 出 ， 所 以 用 它 来 研究 细菌 DNA 的 复制 。 

四 菌株 : 大 肠 杆菌 匡 .coli15T- 是 甲 硫 氨 酸 、 精 氨 酸 、 色 人 氢 
酸 、 胸 腺 喀 啶 缺陷 变异 株 。 

加 基础 培养 基 : 1000ml 培 养 基 中 含 Na*HEPO, 12 了 :017"6g， 


KKH:PO,3g5，NaCl0.5g，NH,C11g，CaCcl,0.02g5，MgSO, .7H,O 


0.41g， 和 葡萄 糖 48。pH7 .0 一 7.2。 

@ 挫 入 培养 和 同步 培养 : 基础 培养 基 中 补 加 甲 硫 氨 酸 、 色 氢 
酸 各 20Ug/ml，377 摇 床 培养 。 生 长 至 对 数 期 ( 取 菌 悬 液 测 光 密 度 
0.0I 读 数 为 0.4 一 0.6 的 菌 悬 液 ， 在 35007pm 下 离心 10 分 钟 以 收 
集 菌 体 。 菌 体 用 基础 培养 基 洗 一 次 ， 然 后 将 菌 体 悬浮 于 补 加 了 缺 
陷 氢 基 酸 ( 甲 硫 氨 酸 ， 色 氨 酸 ,. 精 氨 酸 ) 的 基础 培养 基 中 ， 再 加 入 
5 一 Is1u 或 5 一 1 23: 尿 喀 喧 脱氧 核 江 (5 一 1s:udR) 或 CH3 一 Thy 
〈( 互 ] 一 胸腺 喀 啶 )。 一 般 情 况 下 ， 加 入 5 一 二 5 或 5 一 辣 :udR 
的 量 为 每 毫升 培养 液 0.5mCi, 加 入 [ 互 33 一 Thy 的 量 为 7.54Ci/ml， 
实验 在 37C 水浴 中 振 划 进 行 。 

细菌 生长 的 同步 蕴 养 采用 氮 基 酸 饥饿 法 ， 即 将 菌 体 悬浮 于 不 
补 加 上 述 三 种 缺陷 氨基 酸 ， 而 补 加 胸腺 喀 喧 的 基础 培养 基 中 ， 然 
后 振 划 培养 。 一般 饥 饿 时 间 为 120 分 钟 。 

由 样品 中 放射 性 摊 入 计数 前 测定 : 测定 用 样品 菌 液 lml， 取 
样 后 立即 用 2ml 冰 冷 的 15% 三 氯 乙 酸 (简称 TCA， 内 含 0.02M 焦 磷 
酸 钠 ，5 一 惠 100Ug/ml 沉 演 。 在 冰 浴 或 冰箱 中 放置 30 分 钟 后 离心 
35007pmy,10 分 钟 ;: 沉 淀 分 别 用 2ml 上 述 的 冰冷 15%6TCA( 含 0.02M 
焦 磷 酸 钠 )、2ml15%TCA( 含 0.02M 焦 磷酸 钠 ) 以 及 2ml5%6TCA 各 
洗 一 次 ， 最 后 得 到 的 沉淀 用 井 型 Y 闪 烁 探头 和 计数 器 测定 。 

G@TCA 沉 演 物 的 碱 水 解 : . 取 上 述 沉 演 ， 立 即 用 0.5ml10.33N 
(或 1N)KOH 溶 解 ， 在 37C 水 浴 中 保温 水 解 18 小 时 。 水 解 结束 后 ， 
先 用 2N HCI 中 和 ， 然 后 加 入 lml 冰 冷 的 15%TCA ( 含 0.02M 焦 磷 
酸 钠 ) 即 产生 沉淀 。 离 心 后 沉淀 用 5%TCA 洗 一 次 ， 所 得 沉淀 和 上 
清 液 都 可 直接 在 并 型 Y 闪 烁 探头 和 计数 器 测定 。 


。 了 6 了 


@ 上 述 的 实验 可 得 到 如 下 结果 : 

a.5 一 Isiu 的 摊 入 和 保温 时 间 有 正 相 关 关 系 ， 即 保温 时 间 越 
多 ， 挨 入 量 越 高 。 

b .5 一 1 siu 仅 能 摊 入 大 肠 杆 菌 DNA 而 不 挫 入 RNA。 因 为 当 核 
酸 (CDNA 和 RNA) 用 碱 水 解 时 ， 在 一 定 条 件 下 只 有 RNA 发 生 水 解 
而 DNA 不 被 水 解 。 利 用 DNA 和 RNA 的 这 种 化 学 上 的 差异 ， 可 以 
区 分 5 一 Isiu 是 摊 入 DNA 还 是 RNA 此 外 ， 用 DNA 酶 和 RNA 酶 水 
解 ，TCA 沉 淀 的 结果 也 证 明 5 一 Isiu 是 摊 入 DNA 而 不 挨 入 RNA。 

c. 应 用 5 一 I siu 的 摊 入 来 测定 大 肠 杆菌 DNA 复 制 的 起 步 。 培 
养 的 大 肠 杆菌 E.coli sST- 经 氨基 酸 饥 狐 120 分 钟 后 ， 5 一 siu 挨 
入 DNA 的 过 程 逐 渐 停 止 ， 这 表示 DNA 复 制 过 程 的 停止 。 当 饥饿 
一 段 时 间 (80 分 钟 或 180 分 钟 ) 后 再 给 与 其 缺陷 氨基 酸 时 ，DNA 复 
制 由 于 又 有 了 新 的 蛋白 质 被 合成 而 重新 起 步 。 


( 赵 世 民 ) 
二 节 ”微生物 基本 操作 


微生物 包括 亚 细 胞 结构 的 病毒 、 细 胞 结构 的 细菌 和 多 细胞 结 
构 的 高 等 真菌 等 。 这 些 以 细胞 构造 为 基础 的 简单 生物 ， 是 研究 生 
物 构造 和 生命 活动 的 基本 模型 。 以 它们 为 材料 进行 遗传 学 研究 以 
及 近代 的 生化 遗传 学 、 分 子 遗 传 学 和 遗传 工程 的 研究 。 主 要 是 在 
微生物 遗传 的 研究 基础 上 发 展 起 来 的 。 

为 使 研究 工作 顺利 进行 ， 能 够 得 到 预期 的 结果 ， 要 注意 微 生 
物 操 作 技 术 。 


(一 ) 纯 种 分 离 


要 将 所 需 的 微生物 从 其 它 微 生物 中 分 离 出 来 ， 首 先 要 考察 它 
364。 


们 所 需 的 环境 ， 选 定 具 备 这 种 环境 的 分 离 条 件 。 从 分 离 的 方法 、 
培养 基 的 设计 、 培 养 条 件 的 控制 、 添 加 特殊 的 抑制 剂 等 措施 着 
手 ， 才 能 有 效 地 进行 分 离 。 要 测定 并 检验 株 系 的 基因 型 ， 防 止 染 
上 杂 菌 及 遗传 标志 的 丧失 。 当 一 切 检 验 完成 ， 确 认 是 所 需 的 菌株 
后 ， 进 一 步 进 行 单 菌落 分 离 ， 准 备 工作 用 菌 。 

1. 单 菌 分 离 

稀释 样品 : 

菌 种 分 离 一 般 在 培养 下 中 进行 。 用 无 菌 生理 盐水 ,无 菌 磷 酸 组 
冲 液 等 将 样品 稀释 ， 使 微生物 在 平 亚 培养 基 上 形成 孤立 的 菌落 。 
然后 从 这 上 面 选 择 所 需要 的 菌落 ， 转 接 到 斜面 上 。 

为 了 使 培养 四 上 的 菌落 数目 合适 ， 能 够 使 菌落 充分 分 散 开 ， 
必须 选择 适宜 的 稀释 度 。 这 应 根据 不 同 的 菌株 ， 灵 活 掌握 。 

划 线 纯化 ， 

用 灭 过 菌 航 牙签 或 接种 环 在 稀释 过 的 菌 液 中 沾 一 下 ， 涂 在 表 
面 较 干 的 平板 培养 基 的 一 角 ， 必 须 记 住 ， 今 后 所 取 的 菌落 ， 应 是 
所 划 线 上 的 菌落 ， 离 开 涂 布线 的 ， 可 能 是 污染 的 杂 菌 。 牙 签 开始 
。 涂 的 地 方 因 菌 液 较 浓 ， 难 以 划 成 单 菌 落 。 所 以 另 取 一 支 牙 签 在 第 
一 次 划 线 的 一 端 通过 一 次 ， 划 一 条 曲线 ， 可 再 在 第 二 次 划 的 线 的 
一 端 再 划 线 。 这 样 ， 经 适当 温度 培养 ， 就 可 在 培养 了 上 看 到 单个 
的 菌落 。 

2. 生 长 与 保存 

17 培养 

培养 细菌 ， 一 般 都 不 直接 从 琼脂 斜面 接种 到 试验 培养 基 中 。 
而 是 先 选 择 单 菌落 ， 转 接 到 液体 培养 基 中 ， 再 将 培养 好 的 菌 液 作 
为 接种 液 ， 经 几 次 转 接 ， 使 其 能 保持 在 对 数 期 。 因 为 少量 的 细胞 
接种 到 合适 的 新 鲜 液体 培养 基 中 ， 在 适宜 的 条 件 下 培养 时 ， 其 生 
长 过 程 具 有 一 定 的 规律 性 ， 即 调整 期 、 对 数 期 、 稳 定期 和 训 老 
”期 。 将 对 数 期 细胞 接种 到 培养 液 中 ,细胞 几乎 不 需要 经 过 调整 期 ， 
就 可 以 对 数 的 速度 增殖 。 因 此 如 要 在 短 时 间 内 获得 大 量 细胞 ， 最 
好 接种 对 数 期 细胞 。 


了 63。 


细胞 增 养 的 时 间 ， 应 根据 研究 目的 不 同 、 细 胞 的 生长 速度 、， 


通气 情况 、 温 度 等 来 决定 。 一 般 都 是 在 对 数 生长 初期 ， 或 在 对 数 
生长 期 到 稳定 期 之 间 。 如 果 是 形成 孢子 的 一 些 细菌 ， 它 们 在 对 数 
生长 期 后 期 开始 形成 孢子 到 稳定 期 时 绝 大 多 数 形成 了 游离 子 。 
因此 ， 要 收集 它们 的 营养 细胞 ， 最 好 是 在 对 数 期 初期 。 


a 接种 稳定 期 细胞 时 所 得 的 曲线 
b 接种 对 数 期 细胞 时 所 得 的 曲线 


细胞 数 的 对 数 


要 想 确切 知道 某 一 菌株 的 生长 速度 ， 最 常用 的 检测 方法 ， 就 
是 在 培养 物 生 长 过 程 中 ， 间 隔 一 定时 间 取 一 次 样 。 在 600nm 波 长 
处 测定 其 光 密 度 (OD)， 直 到 OD 值 最 大 ， 平 稳 而 不 再 升 高 。 根 据 
擅 得 的 数据 绘制 出 生长 的 标准 曲线 。 在 测定 光 密 度 的 同时 ， 可 测 
定 培养 物 所 含 的 细胞 数 。 即 进行 活 菌 计数 : 通过 合适 的 稀释 度 在 
乎 亚 培 养 基 上 计算 出 每 毫升 中 含 多 少 菌 。 一 般 1OD8x10: 细 
胞 /ml。 

《2) 菌 种 的 保藏 

传代 培养 保藏 是 被 广泛 采用 和 最 基本 的 保藏 方法 。 但 由 于 是 
定期 传代 ， 菌 种 的 生存 期 得， 频繁 转 接 会 通过 棉 塞 而 引起 污染 。 
除 此 之 外 还 存在 菌 种 性 状 不 稳定 ， 发 生变 异 和 退化 的 危险 性 。 所 
-有 以 一 般 采 用 降低 代谢 速度 的 保藏 方法 。 

A .液体 甘油 保藏 

待 保藏 的 菌 种 过 夜 培 养 ， 按 15%% 的 比例 加 灭 苗 甘 油 ， 放 人 入 带 
帽 的 小 瓶 中 ， 在 -20 和 冰箱 中 至 少 可 存放 一 年 。 每 一 株 菌 最 好 多 
制备 几 瓶 ， 以 免 仅 有 一 支 在 多 次 冻 溶 后 会 减少 活力 。 

了 B. 软 洋 荣 穿刺 法 


e。 了 00. 


在 带 帽 的 小 瓶 中 放 入 含 3%% 琼 脂 的 培养 基 ， 不 要 装 得 候 满 ,应 
留 一 定 的 空间 。 用 牙签 沾 一 点 纯化 过 的 菌 体 ， 刺 入 培养 基 中 ， 在 
适当 温度 下 培养 过 夜 。 封 好 瓶 口 ， 在 室温 或 冰箱 中 可 存放 数 年 。 

C .冷冻 干燥 法 

此 方法 是 预先 将 细胞 冷冻 ， 使 水 冻结 。 然 后 在 真空 下 通过 冰 
的 升华 除去 大 部 分 水 。 残 留 的 水 通过 燕 发 也 从 细胞 中 除去 。 

将 灭 菌 的 脱脂 牛奶 (20% 浓度 ) 与 细菌 制 成 菌 悬 液 ， 装 入 灭 菌 
的 安 阁 瓶 中 ， 置 冰箱 过 夜 ， 以 预 冻 。 次 日 放 入 冰冻 干燥 机 抽 王 成 
白色 粉 未 ， 封 好 瓶 口 ， 放 低温 中 可 保藏 数 年 。 


(二 ) 噬 菌 体 啦 菌 斑 的 纯化 、 和 噬菌体 的 制备 


鸣 菌 玫 是 喉 菌 体 存在 的 明确 指标 。 用 双 层 琼脂 法 来 形成 吻 菌 
班 ， 如 男 是 液体 样品 ， 要 进行 一 次 离心 ， 除 去 细菌 菌 体 ， 上 清 液 
则 用 来 测定 吹 菌 体 。 以 溶 源 菌 的 溶菌 液 作为 样品 时 ， 要 考虑 到 产 
生 噬 菌 体 的 可 能 性 。 因 此 ， 先 用 紫外 线 、 丝 裂 霉 素 或 热 诱 导 处 
理 ， 再 进行 培养 离心 ， 用 双 层 琼脂 法 使 在 平 了 下 上 形成 哗 菌 斑 。 

1. 鸣 菌 斑 的 纯化 

用 吸管 在 有 了 史 菌 斑 的 培养 下 上 抠 下 一 单独 吹 菌 斑 ， 连 同 琼脂 
一 起 抠 下 ， 将 其 吹 到 1mI1 液 体 肉 汤 培 养 基 中 。 室 温 下 静止 1 一 ?小 
时 ， 使 吹 菌 体 颗粒 从 琼脂 碎片 中 扩散 出 来 。 经 过 适当 稀释 ， 再 在 
双 层 琼脂 平 亚 上 形成 噬 菌 斑 。 如 此 反复 操作 ， 直 至 证 实 纯 的 鸣 菌 
体 。 

为 了 制备 高 效 价 的 哈 菌 体液 ， 可 将 纯化 过 的 噬菌体 液 ， 进 行 
适 当 稀释 ， lml 吻 菌 体 稀释 液 加 0.1ml 敏 感 菌 液 ， 加 1.5ml0.7% 
的 琼脂 ， 混 合 均 匀 后 倒 在 底层 琼脂 平 耻 上 ， 适 温 培 养 过 夜 ， 直 到 
裂解 融合 ， 产 生成 片 的 噬 菌 斑 。 培 养 亚 中 加 入 肉 汤 培 养 基 ， 执 碎 
上 层 琼脂 ， 放 冰箱 中 过 夜 。 第 二 天 吸出 肉 汤 ， 加 几 滴 氯仿 ， 离 
心 ， 回 收 上 清 液 ， 无 菌 过 滤 。 此 鸣 菌 液 可 贮存 在 4C 下 滴 度 不 变 。 

2.) 鸣 菌 体 的 大 量 制备 

此 方法 通过 细菌 连续 感染 使 噬菌体 大 量 产生 ， 最 后 使 培养 物 


。367。 


完全 裂解 。 

感染 ， 

(1) 取 20ml 经 过 衣 培 养 的 菌 液 ， 加 入 0.05ml1 制 备 好 的 4 叭 菌 
体液 。 些 混合物 的 浓度 大 约 是 5x 10s 噬 菌 体液 ，2.5X10:!" 细 
胞 /ml 的 菌 液 。 这 样 可 以 保证 每 个 叭 菌 体 都 有 感染 细菌 的 机 会 。 当 
然 细 菌 与 叭 万 体 为 比例 要 根据 兢 菌 体 的 不 同 株 系 和 菌株 的 差异 而 
有 所 不 同 ， 可 通过 实验 寻找 出 最 佳 的 感染 系数 。 

(2) 327 下 培养 5 分 钟 ， 使 噬菌体 吸附 。 

(3) 把 混合 液 转移 到 预 热 的 液体 培养 基 中 ， 体 积 为 1 升 , 同 时 
加 入 10mMMsgSO,，。 

(4) 在 38 一 39C 播 床上 强烈 振 划 。 一 般 5 一 8 小 时 ， 就 可 明显 
溶菌 ， 最 长 为 10 小 时 。 

(5) 把 深 菌 液 冷却 到 室温 ， 加 入 NaCl 使 浓度 为 0.5M， 加 1ml 
氯仿 ， 振 蔓 30 分 钟 。 

(6) 4,0007pm 离 心 15 分 钟 ， 去 除 细胞 碎片 御 氯 仿 。 

(7) 加 入 固体 聚 已 二 醇 6000(PEG)， 使 重量 体积 比 为 10% 。 
溶解 后 ， 在 室温 下 处 置 1 小 时 ， 使 吹 菌 体 颗 粒 沉 演 。 

(8) 60007pm 离 心 10 分 钟 ，4C 下 回收 沉淀 。 

(9) 把 沉淀 悬浮 在 5 一 10ml (每 升 溶菌 液 ) TM 液 中 (50mM 
Tris、10mMM8SO,:) 加 入 等 体积 的 氯仿 ， 混 匀 后 置 室温 下 1 分 
钟 。 

(10) 40007pm 离 心 5 分 钟 ， 吸 出 水 相 。 

(11) 在 硝酸 纤维 素 离心 管 中 制 备 甘 油分 布 梯度 .将 3ml 含 402 
甘油 的 TM 组 冲 液 放 在 管 底 小 心 覆盖 上 4ml1 含 5% 甘 铀 的 ITM 缓冲 
液 ， 再 在 甘油 悬 液 上 小 心地 加 上 叹 菌 体液 ， 最 后 以 TM 缓 冲 液 补 
满 全 管 。 

(12)4C 下 ，35000rpm 离 心 60 分 钟 。 

(13) 弃 去 上 清 液 ， 按 每 升 培养 物 加 1mIITM 液 的 比例 ， 将 沉 演 
物 重 新 悬浮 。 


。368 。 


和 
车 全 
下 


(14) 分 别 加 入 RNase(504g/ml) 和 DNase(14g/ml)377 保温 30 
分 钟 。 

DNA 的 提取 : 

(15) 在 提纯 的 上 述 溶 液 中 加 五 分 之 一 体积 的 5xSIEP 缓 冲 
液 (5xSTEP=0.5%SDS， 50mMTris， pH7.5 0.4MEDTA， 
1mg/ml 和 蛋白酶 久 ， 用 时 现 配 ) 保 温 30 分 钟 。 

《16) 加 等 体积 的 饱 合 酚 进 行 抽 提 ，5000rpm 离 心 5 分 钟 。 吸 
出 水 粗 ， 再 用 氯仿 : 异 成 秩 (24:1) 抽 提 一 次 。 

(17) 将 水 相 转 移 到 透析 袋 中 ,用 TE 缓冲 液 (10mM Tris-HCl1 
pH8.0，lmM EDTA) 透 析 过 夜 。 


(王玮 ) 


(三 ) 酵母 的 遗传 操作 

酵母 是 真 核 微生物 ， 结 构 要 比 原 该 生物 的 大 肠 杆菌 复 杂 。 但 
酵母 又 有 很 多 地 方 与 细菌 相似 ， 如 ， 酵 母 也 是 单 细 胞 的 ,生长 快 ， 
能 形成 单个 菌落 ， 容 易 进行 平板 复制 和 突变 体 的 分 离 。 同 时 ， 酵 
母 的 单 倍 体 和 二 倍 体 在 遗传 上 都 是 稳定 的 ， 具 有 许多 遗传 标记 ， 
能 进行 子宫 孢子 的 分 析 ， 还 能 进行 细胞 的 DNA 苇 化 等 ， 这 些 都 是 
用 酵母 为 材料 ， 进 行 遗传 学 和 分 子 生 物 学 研究 的 有 利 因 素 。 而 且 ， 
酵母 单 倍 体 的 DNA 只 比 大 肠 宪 菌 双 三 倍 半 ,培养 又 很 容 易 ， 既 简 
便 ， 又 省 钱 ， 所 以 ， 酵 母 在 各 种 研究 工作 中 被 广泛 采用 。 

下 面 以 啤酒 酵母 为 例 ， 介 绍 有 关 酵 母 遗 传 操 作 的 一 些 基 本 技 
术 ， 其 中 包括 酵母 菌 种 的 分 离 和 保藏 ， 遗 传 操 作 方 法 和 酵母 分 子 
遗传 学 常用 的 载体 种 类 ，DNA 提 取 和 遗传 转化 的 具体 步骤 。 

1 .酵母 的 分 离 与 保藏 

到 1970 年 为 止 ， 已 发 现 的 酵母 有 39 个 属 共 349 和 种。 生产 上 最 常 


用 、 研究 得 也 最 多 的 是 啤酒 醇 母 (Saccharomyces cerevlsiae) 。 酝 


母 是 真菌 ， 但 它 是 单 细 胞 的 ， 所 以 它 的 生长 、 分 离 和 保藏 可 借鉴 
其 它 单 细胞 微生物 (如 ， 细 菌 ) 的 经 验 。 


(1) 分 离 程序 

村 母 可 在 固体 培养 基 上 生长 ， 所 以 ， 通 过 样品 的 涂 布 分 离 ， 
可 以 从 混杂 有 低 浓 度 细菌 或 丝 状 真菌 的 样品 中 把 酵母 分 离 出 来 。 
-一 般 在 YPD 培 养 基 上 即 可 做 到 。 

如 果 混 杂 有 很 多 细菌 和 丝 状 真菌 ， 则 可 在 培养 基 中 加 入 稀 盐 
酸 或 稀 磷 酸 来 降低 DH。 在 pH3.5 一 4.0 的 条 件 下 ， 酵 号 能 生长 好 ， 
而 细菌 和 丝 状 真菌 的 生长 则 受 抑 制 。 也 有 人 提倡 使 用 乳酸 和 丙 酸 
【5 的 了 人 六 宙 

近年 来 ， 分 离 酵 母 的 培养 基 常 加 抗菌 素来 抑制 细菌 生长 。 广 
谱 性 抗菌 素 ， 如 ， 氧 霉 素 、 四 环 素 ， 被 广泛 应 用 。 抗 走 菌 素 也 能 
作用 于 配 母 ， 故 在 分 离 酵母 时 不 能 用 。 

从 混杂 有 丝 状 真菌 的 混合 物 中 分 离 酵母 的 方法 是 ， 把 培养 基 
调 到 pH3 .4 一 4.0， 接 种 后 ， 在 25*C 下, 振 葛 培 养 48 小 时 。 丝 状 真 
菌 的 菌 丝 长 成 大 的 团 块 ， 而 酵母 则 是 分 散 的 单 细胞 ， 可 涂 布 分 离 
出 酵母 细胞 。 

当 实验 室 或 工业 生产 中 使 用 的 某 种 酵母 被 其 它 种 或 菌株 的 酵 
母 污染 时 ， 可 根据 该 酵母 的 生理 学 特性 和 营养 标记 来 分 离 ， 如 ， 
碳 源 要 求 、 营 养 要求 和 生长 温度 等 等 。 

(2) 酵母 的 保藏 

实验 室 保 存 酵母 ， 多 数 是 把 酵母 菌 种 接种 在 YPD 斜面 上 ,0 
一 4C 下 ， 可 保存 一 个 月 .如 果 注 意 瓶 口 的 封闭 ， 使 培养 基 不 至 于 
干掉 ， 在 冰箱 中 可 保存 1 一 2 年 。 反 复 的 传代 容易 产生 遗传 变异 ; 
故 在 保存 时 要 避免 频繁 转 接 。 

使 用 液 氮 在 - 196，10%(v/v) 甘油 中 保存 酵母 ， 效 果 好 ， 
存活 率 高 ， 代 谢 特 征 的 变异 也 少 。 

为 长 期 保存 菌 种 ， 可 以 把 干 酵母 和 硅胶 混合 后 ， 和 保存 在 冰箱 
中 。 如 果 ， 在 转 到 硅胶 中 以 前 ， 先 把 酵母 悬 在 灭 菌 的 牛奶 中 ， 效 


”和 采 更 佳 。 


2 .酵母 的 生长 和 符 活 周期 
了 母 的 生长 速度 很 快 ， 在 30C，YPD 培 养 液 中 通气 培养 ， 世 


本 


代 时 间 一 般 为 70 一 90 分 钟 。 接 种 10 “一 105 细 胞 /ml, 过 夜 培养 后 可 
达 10* 一 107 细 胞 /ml 以 上 。 ， 
《1) 酵母 的 生长 
曲 培 养 基 
YPD: 是 最 常用 的 生长 和 保存 菌 种 用 的 培养 基 。 含 1%% 酵 
母 提 取 物 ，2% 蛋白 肛 ， 和 2% 葡萄 糖 。 
YPG: 用 3% 甘 油 代 奉 葡萄 糖 做 碳 源 。 
YPE: 用 3% 乙 醇 代 替 葡 萄 糖 做 碳 源 。 
”， ，SD 合 成 培养 基 : 含 0.17% 酵母 基本 所 源 [无 氨基 酸 和 
(CNH)zS90i]，0.5%(NH4)2 SO ， 和 2% 葡 萄 糖 。 野 生 型 菌株 能 
在 此 培养 基 上 生长 。 
SD 合 成 完全 培养 基 : 带 营 养 缺陷 记号 的 菌株 ,只 有 在 SP 培养 
基 中 加 上 所 需 的 某 种 或 某 几 种 氮 基 酸 或 维生素 时 才能 生长 。 此 培 
养 基 可 用 于 测定 营养 缺陷 记号 。 一 般 补 充 的 氮 基 酸 达 10 一 20mg/1， 
就 可 以 了 。 但 有 些 种 类 要 加 得 多 一 些 ， 如 ， 
tyr，leu，ile，1ys 要 加 30mg/1 phen 要 加 50mg/1 val 要 加 
100mg/1。 
以 上 各 种 培养 基 如 要 做 成 国体 时 ， 可 加 1.7 一 2% 的 琼脂 。 
生 犯 子 前 培养 基 : 0.8% 酵 母 提取 物 ，0.3% 和 蛋白 肪 ，10%% 葡 
萄 糖 ， 和 2% 琼 脂 。 
生 和 孢子 培养 基 : 1% 醋 酸 钊 ，0.1% 酵 母 提 取 物 ，0,05% 葡 萄 
糖 ， 和 2% 琼 脂 。 
包 培 养 条 件 : 酵母 一 般 要 求 通气 培养 ， 温 度 为 25 一 30"2， 不 
超过 32*C。pH 值 为 3.0 一 8.0， 最 适 pH 为 4.5 一 6.5。 
”外 细胞 的 收集 : 酵母 细胞 可 用 离心 法 收集 ， 一 般 2000 一 3000 
rpm，5 分 钟 。 收 集 后 的 细胞 ， 在 0 下，24 小 时 内 ， 不 会 失去 生 
活力 和 体内 的 酶 活性 。 
(2) 酵母 的 生活 史 
-四 酵母 的 营养 生长 : 酵母 可 以 出 芽 繁 殖 ， 具 体 过 程 是 : 母 细 
胞 长 出 一 个 突起 ， 同 时 ， 母 细胞 有 丝 分 裂 ,一 组 染色 体 进 入 突起 ， 


s 37T。 


细胞 壁 形成 分 隔 。 最 后 ,体形 较 小 的 子 细 胞 从 母 细胞 上 脱落 下 来 ， 
子 细胞 再 长 大 和 出 芽 繁 殖 。 在 最 适 条 件 下 ， 这 个 过 程 只 需要 70 分 
钟 。 一 个 母 细 胞 一 生 最 丢 形 成 20 一 30 个 萄 孢 。 不 论 单 倍 体 或 二 倍 
体 细胞 ， 在 营养 丰富 时 ， 都 不 断 地 以 这 种 方式 生长 和 分 裂 。 

思 酵母 的 交配 类 型 和 杂交 :， 啤酒 苹 母 有 xc 和 a 两 种 交配 类 型 ， 
它 是 由 基因 遗传 控制 的 。 

杂交 只 在 一 个 xc 型 和 一 个 a 型 菌株 之 间 发 生 。 杂交 分 两 步 ， 第 
一 步 先 聚合 ， 二 种 交配 型 细胞 阳 在 一 起 ，c 型 细胞 能 分 泌 一 种 “外 
激素 ”(13 个 氨基 酸 组 成 的 短 肽 )， 能 促使 与 a 型 细胞 聚合 ,并 防止 
启动 芽 殖 和 DNA 合 成 。a 型 细胞 则 产生 一 个 a- 因子 (11 个 氨基 酸 的 
短 肽 )》， 与 < 型 细胞 受 体 结合 。 第 二 步 , 配 对 的 二 个 细胞 的 细胞 网 
5 合子 可 以 芽 殖 。 

二 倍 体 的 形成 和 分 离 ， 把 正在 生长 期 的 二 种 交配 类 型 的 单 
Ia 便 可 形 
成 二 倍 体 的 合子 。 合 子 是 旺 铃 形 的 ， 可 用 显 微 操作 器 ,: 在 显 微 锁 
下 将 它 分 离 出 来 ， 并 在 平板 上 形成 单个 菌 洲 。 

分 离 二 倍 体 最 简便 的 方法 是 ， 当 二 种 单 倍 体 带 有 不 同 的 营养 

缺陷 记号 时 ， 二 倍 体 可 在 不 含 这 些 营养 的 无 机 培养 基 芋 生长 ， 而 
二 种 单 倍 体 各 自 却 是 不 能 生长 药 。 
当 二 个 单 倍 体 都 是 原 养 型 ， 要 分 离 它们 形成 的 二 倍 体 时 ， 最 
常用 的 方法 是 ， 先 在 无 机 培养 基 上 划 线 ， 注 意 那 些 生长 快 的 大 菌 
落 。 它 们 如 果 是 可 以 形成 孢子 的 ， 就 可 确认 它们 是 二 倍 体 。 

@ 子 训 和 子囊 苞 子 的 形成 ， 在 营养 不 足 时 ， 二 倍 体 细 胞 经 过 
减 数 分 裂 ， 产 生 四 个 单 倍 体 的 后 代 一 一 子 讲 苞 子 。 这 四 个 子 吉 孢 
子 包 在 同一 个 子 吉 中 ， 子 吉 呈 四 面体 ， 有 厚 壁 。 产 生 苑 子 的 具体 
做 法 是 ， 将 处 于 生长 期 的 二 种 不 同 交配 型 前 单 倍 体 细 胞 ， 在 生 苑 
子 前 培养 基 上 均匀 地 混合 。 在 30" 下 ， 堆 放 1 一 2 天 后 ， 再 转 到 生 
抱 子 培养 基 上 ，2 一 5 天 。 通 常 有 10 一 20% 的 细胞 形成 子囊 ， 有 的 
菌株 可 高 达 70% 以 上 。 这 可 用 显微镜 来 检查 。 子 豆 孢 子 通常 是 四 
个 ， 也 有 的 只 有 三 个 或 更 少 的 ， 这 可 能 是 减 数 分 裂 使 有 怠 钨 子 不 


呈 了 4 


setnieowLsesua as 


re 


条 ou oa 


“能 成 洛 所 车 成 的 ”最 后， 子 妻 开 妥 ， 葡 子 释 放出 来 ， 驳 子 萌发 后 

长 成 单 倍 体 的 酵母 。 

- 一 -3 酵母 的 遗传 分 析 
， 《1 诱发 突变 和 突 亦 体 分 析 
除了 碱 基 类 似 物 外 ;- 藉 多 数 用 于 细菌 的 诱 变 剂 ， 也 可 用 于 娠 

母 ， 只 是 处 理 方法 路 有 不 同 。 对 人 危害 较 低 的 紫外 线 、 亚 硝酸 、 
瑟 MS 是 最 常用 的 ， 可 用 于 突变 和 回复 突变 的 研究 。 诱 变 处 理 后 ， 
细胞 可 在 完全 培养 切 :b 作 短 时 间 的 培养 ， 使 突变 能 够 表达 。 

-从 酵母 中 已 经 分 离 出 很 多 类 型 的 ,与 不 同 乌 状 有 关 的 突变 体 。 
其 中 ,很 条 是 基因 产物 和 击 缺 失 的 突变 体 ， 并 对 它们 作 工 让 传 连 
击 岳 条- : 汪 关 股 
(2) 基因 的 显 性 和 隐 性 
用 单 格 体 航 时 和 型 和 单 倍 体 的 突变 体形 成 二 售 栖 琳 丛 子 ， 再 
记 定 亲信 于 的 表现 型 ， 就 可 以 确定 该 基因 十 显 性 的 ， 或 是 隐 性 的 
如 松村 袍 演 计 

:8 半 逢 数 分 型 产物 的 分 析 

电 单 个 了 于 枝 的 四 分 体 分 析 ， 先 用 蜗牛 醇 (高 品 名 GIlusulasg) 
居 麻 处理 韦 屠 (3 一 37 15 二 30 分 钟 六: 在 光学 显微镜 下 ， 要 有 看 
到 全 部 子宫 训 已 经 消 北 记 而 内 含 欧 四 在 鸡 子 仍 结 侣 在 二 起 。 要 避 
免 查 处 理 过 度 和 过 分 握 动 。 另 取 一 块 灭 葛 载 玻 片 ， 放 上 一 氛 琼 脂 
片 〈2% 玉 脂 ， 大 小 为 13x 30x 1mm) 。 用 小 接种 环 将 去 球 酶 处 
理 过 的 子囊 悬 液 ， 涂 在 琼脂 片 的 一 仙 。 把 载 玻 片 放 在 二 个 玻璃 或 
塑料 的 回 形 架 二 元 琼 脂 面 朝 焉 ,组 或 一 个 小 室 。 用 显 铂 操作 器 
4150 二 300 xj) 的 解剖 针 将 有 四 个 孢子 的 子 豆 移 到 一 定 的 地 方 外 以 
二 毫米 葛 间 距 ， 将 孢子 一 个 个 地 直线 排列 .5 这 样 洲 一 烘 琼 脂 片上 上 
就 可 解剖 10 一 12 企 耶 吉 ,解剖 完 后 用 灭 菌 小 刃 揭 下 琼 三 片 ， 有 
移 矛 的 一 面 朝 上 ;， 放 在 YPD 平 板 上 培养 。 待 每 个 孢子 部 长 成 一 个 
菌落 大 5 再 进一步 测定 它们 的 营养 记号 或 其 它 性 状 。 

根据 四 分 体 表 现 型 的 分 离 情况 员 可 以 得 知 杂 合 予 的 基因 型 。 

旧 表 中 列 出 四 种 基本 情况 。 后 工种 洛克 表明 的 旦 一 个 性 状 与 工 

o 3 


四 分 体 的 基因 型 


咎 传导 解 刀 三 释 : 
(+ 麦 示 野 生 型 ， -表示 突变 型 ) 


- 个 


“ 子 代 不 才 现 突变 性 状 ， 
一 般 为 这 各 变异 是 所 隐 质 闪 灾 


2 一 个 基因 发 生 窗 变 “ 


1 另 一 个 基因 突变 ,影响 了 该 基因 表达 ; 
或 另 一 个 基因 影响 了 突变 基因 的 表达 


个 基因 有 关 。 有 时 一 个 性 状 与 多 个 基因 有 着 复杂 的 关系 ， 情 癌 更 
为 复杂 。 

@) 随 机 苑 子 分 析 : 人 黎 法 基本 如 上 述 ， 但 不 用 显 微 操作 坟 采用 
此 方法 时 ， 要 检测 大 量 的 苑 子 ， 才 比较 容易 检测 出 相近 基因 间 发 
生 的 低频 度 重 组 .还 要 避免 因 其 中 混 有 未 形成 孢子 的 二 倍 体 细 胞 ， 
和 因 和 允 了 分 散 不 好 而 造成 的 误差 。 要 采用 物理 学 和 遗传 学 的 手段 
来 避免 。 

以 土 二 种 方法 中 ,由 单个 移 子 长 成 的 历 落 的 大型 测定 方法 是 ， 
先 让 这 些 芒 落 长 在 完全 基 养 基 上 ， 成 主 平板 。 用 平板 复制 法 ， 
把 菌落 转 到 放生 十 汪 六 蕙 的 扣 纪 是 你 计 再 根据 生长 情况 ， 记 录 

它们 的 表 型 。 

(和 连锁 分 析 

两 个 基因 的 杂种 AByab 的 后 代 能 产生 以 下 三 种 类 列 的 四 耸 体 
后 代 ， 亲 代 双 型 (ED 型 )，AB，AB aby'ab; 非 素 代 观 型 %NP 
D 型 ) ， Ab,- Ab，aB，aB; 四 型 (IT 和 型) ，AB，Ab,naB，ab。 
各 类 子 面 出 现 竟 频率 之 比 (PD :NPD:T) 则 做 四 分 体 分 布 ?* 这 基 
确定 基因 连锁 图 的 基本 根据 。 如 果 PD:NBD:T=1:1:4 盖 表示 三 
个 基因 不 存在 连锁 。 如 果 PD:NPD 二 1/6， 了 TI 忆 示 67 表示 全 B 两 个 
基因 属于 不 同 的 连锁 群 ， 而 且 与 各 自 的 着 丝 点 连锁 已 如 果 PD>N 
PP， 工 <<4/6， 表 示 AB 二 个 基因 直线 连锁 。 如 果 确 定 了 一 个 基因 


。37 了 。 


是 连锁 的 ,， 那么 ， cgoereaprotoe 人 分 摩 "， 以 
和 和 汪 : 


汪汪 和 考 汪 下 100 CTF6NPD) 


; (PD+NPPD+T) 
大 们 使 用 四 分 体 分 析 的 方法 ， 把 新 发 现 的 突变 基因 排列 在 连 

锁 群 染色体) 土 ， 然 后 根据 它 与 着 丝 点 和 同 条 染色 体 上 其 它 基 
因 药 关系 来 作 图 ) 单 倍 体 酵 母 共有 17 条 染色 体 ) 总 长 2600cm。 目 
前 沁 忆 为 16 条 染色 体 作 了 图， 已 作 图 的 基因 超过 560 个 , 约 为 大 易 
杆菌 基因 数 的 一 半 。 
1 5 本 瑟 的 原生 质 球 融合 

了 原生 质 球 融 合 是 研究 植物 细胞 和 包括 酵母 在 内 的 微生物 细胞 
-杂交 的 方法 之 一 。 特 别 是 聚 乙 二 醇 的 使 用 ， 它 可 有 效 地 引起 原生 
质 凝 聚 和 机 械 结 合 。 

中 酵母 原生 质 球 的 获得 和 细胞 壁 再 生 方 法 :1 通常 用 酶 溶解 细 
胞 璧 ,得 到 原生 质 球 。 把 酵母 的 原生 质 球 置 于 37" 熔 化 的 2% 和 琼脂 
-或 < 20% 的 明胶 培养 基 中 ,再 倒 在 含 同 样 成 份 的 培养 基 的 平板 上 。 
这 样 ， 细胞 壁 就 会 有 效 地 再 生 ， 再 生 率 为 50 一 70% 。 而 琼 骨 浓 度 
相 于 15% 或 明胶 浓度 小 于 15% 时 ， 再 生 率 仅 5% 。 另 外 ， 接 养 基 中 
必须 加 渗透 压 稳定 剂 (1M 的 山梨 醇 ) 。 

外 原生 质 球 融 合 : 取 等 量 的 双亲 原生 质 球 ,在 含有 1M 人 山梨 醇 、 
iomMCacCli 的 30% 聚 乙 二 醇 (4000) 中 ， 处 理 30 分 钟 。 项 生 质 球 
发 生 凝 谓 后 ， 去 掉 聚 乙 工 醇 ， 或 用 培养 基 稀 释 ， 才 能 融合 。 整个 
过 程 可 通过 显微镜 来 观察 。 

包 上 原生 质 球 融合 的 应 用 : 原生 质 球 融 合 中 ， 姑 交 并 不 总 是 发 
生 在 两 个 细 胞 之 间 ， 也 可 能 得 到 才 售 体 的 杂种 。 原 生 质 球 融 合 还 
可 成 功 地 用 于 没有 性 过 程 的 酵母 的 杂交 ， 并 为 更 远 缘 的 酵母 进行 
杂交 提供 了 可 能 ， 扩 大 了 酵母 的 种 属 杂交 范围 。 但 也 观察 到 ， 越 
是 远 缘 的 种 ,， 得 到 稳定 杂种 组 合 的 可 能 性 成 小 。 因 此 ， 如 能 得 到 
稳定 的 杂种 就 可 认为 用 于 融合 的 二 种 酵母 之 间 具 有 末 缘 关系 。 

4. 本 母 的 遗传 转化 


队 母 的 遗传 转 和 人 首 先是 用 细菌 质粒 ColE1 获 得 成 功 的 本 该 质 
粒 带 有 酵母 染色 体 HIT 芍 正 常 等 位 基因 Leu2。 实 验 中 依赖 亮 氮 酸 
多 酵母 细胞 原生 质 球 的 转化 絮 1 交 -下 面 简 述 芋 母 转化 的 
基本 技术 。 

(IT) 郡 母 苇 化 的 载体 计 个 对 [ 计 。 

降 酒 藤 嫩 有 两 种 类 型 的 转化 : 钙 整 合 和 凶 目 主 复 制 & 带 在 质 
类 上 指 一 盘 丁 母 顺 序 ; 能 与 在 染色 体 上 的 同 源 顺序 交换 寺 这 是 因 
同 源 重 组 而 发 生 的 整合 。 整 合 有 二 种 方式 站 一 是 在 同 源 位 训 填 中 
连同 载体 整合 进 基因 组 ;二 是 质粒 上 的 酵母 顺序 取 找 染 名 体 击 的 
同 源 源 序 ， 载 体 不 整合 进去 。 这 两 种 转化 ; 使 用 系 能 自主 复制 的 
环 状 分 子 ， 转 化 频率 都 很 低 (一 1 一 10 个 转化 乌 ABDNA 略 07 细 
隐 )- 。 高 频 转 化 (10* 一 104 个 转化 体 /ugDNA7/10 I 纲 胞 ) 效 生 
在 当 质 粒 带 有 染色 体 的 arfs (autonomously teplicating segment ) 
顺序 ， 或 部 分 28um 环 状 DNA 时 ,这 些 质粒 能 自主 复制 和 高 频 转 化 。 
素 有 染色 体 的 ars 的 质粒 是 不 稳定 的 ,在 非 选择 条 件 下 培养 10 伐 时 ， 
含 质料 的 细胞 少 于 5%5 带 有 部 份 2km 环 状 DNA 的 质粒 要 相对 稳定 
些 ， 在 非 选 译 条 件 下 培养 10 代 后 ,860 一 95% 的 细胞 带 有 里 粒 这 
和 缁 胞 中 的 质粒 都 是 高 迭 贝 数 的 (20 一 50 拷 贝 / 细 胞 )。 
24m 末 中， 能 增加 人 酵母 质粒 稳定 性 所 必需 的 最 小 长 度 是 ep3 区 城 
和 一 段 反 回 重复 的 599 个 碱 基 对 的 DINA 顺 序 5 

把 苹 母 着 丝 点 加 到 带 染 色 体 ars 的 质粒 上 8 能 增加 质粒 的 稳定 
性 ， 培 养 10 代 后 ,90% 的 细胞 带 质 粒 玉 但 质粒 拷贝 数 和 下降 为 单 持 
贝 。 把 着 丝 点 韶 到 带 2Um 环 ) ng 其 狼 定 性 的 增加 不 如 
乔 族 站 

最 近 ， 有 人 人 把 端 粒 顷 序 克隆 到 质粒 中 ， 得 到 了 能 自主 复制 的 
线 状 分 子 。 这 种 质粒 稳定 性 不 如 环 状 带 着 丝 点 的 质粒 引 30 代 后 ， 
约 40% 苗 细胞 带 有 质粒 ， 有 20 一 40 个 拷贝 。 熏 线性 分 子 进 三 步 稳 
定 的 办 法 是 加 土 醇 母 的 着 丝 点 顺序 ， 这 使 质粒 增 夫 , . 得 到 单 硅 页 
的 小 染色 体 。 它 是 各 种 质粒 中 最 稳定 前 ， Wasanianipngoopa 
定性 低 二 个 数量 级 。 二 


大 各 有 


有 的 载体 能 让 蛋白 质 基因 在 酵母 中 表达 和 /或 分 汾 。 骨 于 表 
达 的 质粒 有 的 带 有 很 强 的 组 成 型 启动 子 , 有 的 启动 子 是 调节 型 的 。 
有 的 载体 上 带 有 机 和 本 了 处 肖 来 4 因 于 由 售 呈 了 和 你 条 轩 。 用 来 
分 泌 杂 种 蛋白 。 

. 表 瑟 列举 了 多 种 酵母 裁 体 ， 它们 各 自 的 组 成 和 性 质 。 

(3 酵 租 DNA 的 分 离 ， 

首先 使 脱 壁 形 成 原生 质 球 ， 再 从 中 提取 酵母 DNA。 具 体 步 又 
如 下 : 
.四 酵母 培养 在 40ml1YPD 培 养 液 中 ， 至 对 数 后 期 。， 

一 全 离心 收集 细胞 〈5'"000Tm，5 分 印 ) 。 用 TE 

(10mMTris 二 RCI，pH7.4;， 1mMEDTA) 洗 一 次 。 

四 细胞 再 悬 在 3. 2m 的 HM 山 梨 蕊 ，0.1MEDTA 和 14mMAp8- 琉 
基 乙 醇 中 ， p 也 为 7.4。 

@ 朋 0 : 钙 1zymolyase 60,000(15mg/ml) 消 化 细胞 壁 ，37'C 
下 ，5 分 钟 。 如 酶 的 浓度 较 低 〈 如 2mg/ml); 就 要 消化 长 一 点 的 时 
闻 - 
售 取 -50kRLE 述 处 理 细胞 加 200U1M 山 梨 醇和 200ul10%% 的 S 
DsS。 在 光学 显微镜 下 检查 ， 如 有 果 90% 以 上 的 细胞 已 形成 原生 质 
球 ， 即 可 。 

国 离 心 沉 泛 原生质 球 〈5'000rpm，5 分 钟 ) 。 

马 重 新 巧 浮 在 3. 2m1 的 IE 中 .加 入 0.3ml0.5MEDTA 和 0.3ml 
1MTris=HCL，DH7.4， 混 合 均匀 。 再 加 0.16ml10%SDS。 

四 转动 组 忠 悬 液 使 与 SDS 混 合 ， 置 656" 下 ，30 分 钟 。 

四 加 1ml 的 4M 酯 酸 钾 ， 是 冰 浴 中 1 小 村。 

四 15:000rpm 离 心 25 分 轴 ， 小 心地 将 上 清 液 倒 入 干净 试管。 

人 电 上 清 液 中 加 入 12ml195% 酒精 ， 混 合 。 然 后 离心 (15,000 
rpm 15 分钟， 室温 ) ， 去 掉 上 清 液 ， 将 沉淀 自然 于 燥 。 
”- 思 把 沉淀 重 悬 于 3mlTE 中 。 如 果 碎 片 混杂 ， 可 将 溶液 在 
10,000rpm 离 心 10 分 钟 ， 去 掉 碎 片 。 

一 全 把 士 清 液 转 到 容量 为 ttml 的 硬 塑料 离心 管内 ”加 150u1 的 腊 


as377。 


衷 15 Learnaeseoen 某 党 


让 本 本 藉 王 洗 问 训 首 


: 合 型 | YIp5 | 了 愉 322 载 体 多 光 信人 
， 
共有 1 < 区 刘 选 反 记 叶 | 的 URA3 等 位 基因 重组 
率 很 低 。 同 源 重组 发 生 
在 吕 计 全 二 相 基因 与 其 
-| 在 风色 条 上 将 位 点 之 
| F 次 
| ERas 


YEh13 分 别 十 EBR322 或 eg 棋 

可 组 县 ， 全 自主 复制 。 一 般 于 轩 

个 可 园 择 的 记 学 BEUz 这 到 补 建 衬 因 庆 ， 
+. 和 28m 环 的 自主 复 | : 2Hm 

卫 局 仿生 咎 一 些 载体 


自主 高 拷 忠 
-28m | | PJDB219 


制 部 份 


Ka rr 
自主 高 拷贝 YRP7 .| pbBR322 墙 体 ， 谷 丰 | 这 不 或 体 点 电 必 化 
- 染 鱼 体 YRpl7 | TRP1+ 基 因 和 相连 的 | -月 主 槛 制 ， 多 拷 山 。 转 : 
攻 El ， 化 体 相对 不 稳定 。 
工具 7 和 
基因 库 


自主 商 拓 由， 自主 高 持 由 | _YLPl 2 高 插 由 数 质粒 。 转 化 
| 


于 带 有 四 膜 虫 大 分 子 政体 相 对 不 稳定 认可 用 于 
让 让 


这 了 择 j 记 荆 三 避 2 | 小 


一 一 


自主 低 播 册 YGCP19 -一 环 状 质粒 ,， 带 粒 ， 带 寿 


-着 丝 点 p| | BR322 和 二 个 可 选 却 |， 稳定 。 逢 末 攻 全 多 
| 记号 TRP17 和 URA3 -| 和 吉 作 每 处 细胞 内 多 于 
全 汪 名 作 ars 和 间 凶 所 个 畦 由 训 会 到 珠 风 攻 
体 TV 的 着 至 点“ 下 加 
二 人 
自主 低 拷 贝 | YLp21 -| 采 自 缆 状 质粒 YI 国 “区 拷 员 ， 转 碟 便 相对 
-小 染色 体 -。 外 加 哈 北 体 的 屈 计 和 稳定。 用 手 研究 革 些 染 


的 着 丝 | 色 功能 需 的 慰 序 


-表达 - 非 调节 |;-PAAH5 ，， 环 状 质粒 ， 带 有 乙 这 用 二 并 母 全 采 由 5 
醇 脱 氢 酶 的 启动 子 和 不 基因 产物 的 过 量 守 还 。 
适当 的 克隆 位 点 的 


| 不 天 


* 3 了 378。 


带 有 7 下 全 交 与 MTeI 基 因 
(MFcl) 的 信号 部 分 融合 在 一 
1 的 小 蛋白 质 的 分 泌 


四 Clmgy/na) ， 374C 下 ， 30 分 钟 。 

.- 罗 用 酚 : 氯 仿 : 异 成 醇 (25:24:1) 提 取 一 次 。 
;0 因 取 上 层 * 把 盐 浓度 调 到 0.3M， 加 二 倍 体积 能 95% 乙醇， 混 
人 置 门 202C ,ff2 小 时 以 土 。 

因 用 10， 000rpm， 4 下 ， 离 心 30 分 钠 ， 以 沉淀 DINA。 
汗 殉 全 倒 挤 土 清 液 ，: 将 沉淀 室 气 于 燥 。 再 县 在 0.5ml 的 TE 中 ， 待 
用 。 

ij 按 此 方法 ,从 40m1 培 养 液 中 ， 了 提取 出 10 一 20k8 的 DNA. 也 可 
减少 从 从 5m: 培养 液 中 提取 DNA。 如 时 细胞 中 已 带 有 质粒 寺 用 此 方 
法 能 得 的 DNA 可 用 于 质粒 的 再 分 离 。 

兴 29 -质粒 的 再 分 离 

从 带 有 自主 复制 质粒 的 酵母 中 分 离 质粒 ; 可 将 用 上 述 方法 分 
离 到 的 PNA， ,直接 转化 细菌 ,再 从 细菌 中 分 离 质 粒 。 用 100 一 300 
ng 的 总 酵母 DNA， 能 得 到 10 一 300 个 转化 体 , -其 数目 依 绸 菌 菌株 
的 感受 态 和 质粒 的 拷 册 数 而 定 s 
JJ 招 整 合 型 质粒 从 酵母 中 分 离 出 来 的 方法 是 : 用 适当 的 限制 性 
内 切 酶 处 理 酵母 DNA( 一 300ng) 。 然 后 ， 把 反应 物 稀 释 到 1.0ml5 
加 芋 AIP 和 工 4 连接 酶 洛 15 得 保 昌 过 夜 。 连 接 后 的 PNA 再 去 转化 感 
受 态 的 细菌 。 

《42 酵母 的 遗传 转化 

"379， 


酵母 的 转化 主要 有 原生 质 球 转化 和 锂 盐 法 转化 二 各 方法 。 
;@ 原 生 质 球 转化 类 大 和 
个 方法 建立 较 早 , 使 用 较 普遍 。 操 作 的 前 二 步 是 用 8- 区 素 糖 
册 谢 蛤 cas+ 处 理 原生 质 球 和 DNA。 最 后 用 对 乙 二 本 4000 浆 蝇 。 
处 理 这 的 细胞 多 清 洗 后 ， 埋 在 活 透 压 稳定 的 再 生 琼 脂 中 ， 使 细胞 
壁 再 生 。 用 自主 复制 质粒 ， 原 此 质 球 转化 交 频 率 为 100 一 100;000 
转化 体 /ugDNA/10 7 细胞。 原生 质 球 转化 的 步 又 是 ， 

a. 细 胞 在 50mlYPD 培 养 液 中 培养 到 1 -2 X107/ml。 

b. 用 10ml1M 的 山梨 醇 把 细胞 洗 三 次 。 共 光 尖 ， 志 

c. 细 胞 悬浮 在 5ml 的 1M 山 梨 醇 中 ， 加 5018- 王 基 乙醇 。 

d. 取 少量 进行 希 释 涂 布 (10-*，10005， 作 活 菌 生 数 2 

e .加 150 忆 葡 阳 糖 醇 20glusulase，Endo Laboratorigs ,TInc- 7， 
30"C 保 温 ,组 缓 振 葛 ， 约 80 分 钟 * 对 每 个 菌 样 都 应 测定 在 酶 中 保温 
的 确切 时 间 。 一 般 根据 : 大 约 99 关 形成 原生 质 浓 并且 10 一 2 
的 原生 质 球 能 再 生 。 

“了 . 取 少量 进行 稀释 涂 布 (10-5 1000)， 以 测定 原生 质 球形 成 
后 的 存活 百分数 。 

g .离心 收集 沉淀 〈2500rpm，7 分 钟 ) 。 轻 轻 地 再 悬 在 ?ml 的 
1M 山 梨 醇 中 ， 加 1M 了 山梨 蕉 至 10mi。 沉 淀 细胞 。 重 复 二 次 。 

h .把 细胞 再 县 在 2ml 的 1M 山 梨 醇 中 ,用 1M 山 梨 苹 把 体积 调 到 
9ml。 加 1ml 的 0.1MTTris-HCL (pH7 .4)》 0: 1IMCaCl, 沉淀 原 生 
质 球 ， 再 县 在 1.6ml 的 1M 山 课 配 ，IomMCacL 中， 

i. 将 细胞 分 装 成 0. 2ml， 进 行 转 尼 。 加 下 人 -1 加 入 
了 了 NA 的 体积 要 小 于 20 凯 。 HA 

j. 细 胞 和 DNA 一 起 在 室温 下 放 10 分 钟 ， 充 分 再 悬 细胞 。 细 入 
2m1 的 50% WwW/v) PEG4000,0.2m1 航 0 . IMTris 一 HOCKPH7， 4)， 
0.1MCaCl:， 使 之 混合 

K 剖 温 下 放 10 分 钟 后 ， 离心 沉淀 原 生 质 球 ( 如 步骤 7?)。 把 沉 浣 
重 悬 浮 在 0.5ml 的 1M 山 梨 醇 ，10mMTris-HCI (DH7 EL7 5 10mM 
Cacl, 中 。 加 10ml 的 再 生 琼 脂 “〈 温 度 淄 人 5 二 50xC7 RNC 再 本 凉 脂 为 ; 


ss 3 了 80。 


含 1M 山 梨 醇 的 SD 培 养 基 ， 加 0.5% 的 YPD。 按 菌株 或 转化 体 的 营 
养 记 号 ， 按 合成 的 完全 培养 基 所 需 的 浓度 ， 做 适当 的 营养 增补 ， 
并 加 3% 琼 脂 ) ， 浇 在 相应 的 合成 完全 萎 养 基 做 底层 的 平板 上 。 
@@ 锂 盐 法 转化 
最 近 ， 有 一 转化 程序 ， 可 不 需要 凡 细 胞 辟 ， 而 是 用 锂 盐 处 理 
组 胞 。 可 直接 在 固体 琼 此 表 面 选 择 得 到 的 转化 体 。 但 有 的 苗 株 不 
能 夸 少 这 种 访 法 。 当 同样 使 用 自主 复制 质粒 来 转化 时 ， 这 种 方法 
的 转化 频率 要 比 原 生 质 球 法 低 10 一 100 倍 。 据 报道 ,线性 分 子 的 质 
粒 用 这 种 方法 来 转化 效果 好 。 锂 盐 法 转化 的 具体 步骤 是 : 
a. 苹 母 在 100ml 的 液体 YPD 中 培养 至 9D600 汶 一 04( 和 1 一 2 
x 10 细 腹 /ml)。 
b.2,500rpm 离 心 7 分 钟 ， 细 胞 再 悬 在 TBE 中 * 重复 一 次 。 
是 三 co 细胞 重 悬 在 1. 5mli 的 含 0.1M 氯 化 锂 《〈 或 0.3M 醋 酸 锂 》 的 TE 
中 。4C 下 ，3 一 8 小 时 。 
di0.201 的 上 述 细 胞 加 土 DNA。 每 管 使 用 1 -Tong 的 DNAL 
划 入 的 DNA 体 积 不 能 超过 总 体积 的 Hi0。 细 胞 和 DNA 的 混合 物 
置 室温 下 30 分 钟 。 不 时 轻 轻 地 摇动 一 下 。 
“ e, 把 细胞 再 悬 起 来 ， 加 1.5ml 的 40 %PEG4000， 充 分 混合 , 置 
室温 TH 小 时 。 
“ 娃 . 热 击 细 胞 (428，5 分 钟 )。 
gJ1500rpama) 7 分 钟 。 用 水 把 细胞 沉淀 洗 二 次 ， 
Ph. 最 后 把 细胞 再 悬 在 0.1ml 水 中 ， 涂 布 在 适当 的 、 供 选择 用 
的 、 合 成 的 完全 培养 基 平 板 上 。 
(5) 克隆 DNA 的 操作 
有 了 适当 前 载体 和 酵母 DNA， 的 克隆 和 亚 克 隆 是 与 
大 电 杆 菌 一 样 的 。 
一 个 克隆 的 DNA 片 眉 名 鉴定 后 ,常常 把 它 : 放 回 厌 基 因 组 中 去 
研究 其 表达 。 证 


( 翁 曼 丽 ) 


9 了 8 。 


第 三 节 “ 免 流 技 术 


免疫 学 方法 特异 性 强 、 灵敏 度 高 ， 这 里 仅 介 绍 基本 免疫 试剂 
:的 制备 和 两 种 组 织 相 容 性 抗原 的 检测 方法。 


(一 ) 免 疫 球 蛋 白 制 备 


1 .抗原 制备 

GL)》 材料 及 设备 

饱和 硫 散 铁 将 硫酸 匀 9008 深 于 预 热 到 50T 的 1006my? 共 信 
水 疯 ， 项 置 过 夜 ， 用 氢 氧 化 铵 将 pH 调 至 7.2 

4 生理 盐水 :0.85%NaCl 洲 液 7 吻 酸 组 溃 盐水 (了 PBS) ,0i 有 
5H7.3:0:25MNav HPC ,835ml，0.25M 天 HPOUL5m1; 和 区 
衣 蒜 饮水 至 250ml。 

透析 袋 : 取笑 当 长 放生 执 在 亲信 水 中 乓 党, 和 于 
0.01MEDTA 中 浸泡 10 分 钟 。 蒸 饮水 充分 清洗 后 即 司 使 用 下 

奈 氏 试剂 ， 碘 化 示 115g， 囊 化 卯 80g 洲 于 500 亚 ! 素 馅 永 中 ， 过 
滤 。 在 滤液 中 加 六 500m120%NaCH 淤 液 ， ret 一 泣 
泰 长 试剂 后 ， 如 无 苇 红 色 出 现 六 说 明 无 氮 。 花 衣 叔 

氧化 饥 试 剂 “ 称 18BaCl， 济 于 Hi00 毫 乔 燕 稀 水 审 。 丰 人 言 册 加 

紫外 分 光 光 度 计 。 IAXG 者 坎 【《 避 

离 忆 机 0 
烧杯 、 离 心 管 、 搅 棒 等 。 
去 时 中 员 蓉 法 

马 用 于 固定 小 鼠 ， 取 剪 刀 剪 断 其 腋 下 血管 放 面 ;4 将 血液 收集 
于 离心 管内 。 室 温 下 荐 置 ， 待 血液 凝固 后 ， 放 入 冰箱 内 过 夜 ， 次 
肛 用 解剖 针 将 血 岂 自 管 壁 剥离 ,3000rpm 离 心 15 分 钟 ,收集 血清 。 


8 3 省 22 


虽 
蝇 
局 


加 二 - 念 用 生理 盐水 将 血清 稀释 一 倍 边 搅 动 溶液 边 滴 加 人 饱和 硫酸 
坟 馆 至 最 终 浓度 为 359% (Y/Y 中 - 滴 毕 继续 搅拌 溶液 30 分 名 ， 室温 
、 静 轩 ， 忆 小 时 后 ，4000rpm 离 心 30 分 钟 ， 
全 久 奔 去 二 清 液 ; 用 原 馆 清 一 半 体 积 的 PBS 深 解 沉 流 ; 滴 加 他 
区 和 硫酸 铵 至 355% (YY 总 静 置 并 离心 同上 述 。 
外 弃 上 清 液 ,重复 以 上 过 程 两 次 。. 
全 白色 沉淀 用 最 小 体积 生理 基 水 或 PBS 深 解 即 为 IgG 粗 提 
液 。 
@ 将 IgG 粗 提 物 装 入 透析 袋 内 ,用 生理 盐水 或 EBS 于 4C 透析 
K 滞 歧 变 3 每 且 换 液 三 次 s 透析 时 最 好 在 磁力 搅拌 器 上 搅动 。 
二 @ 取 5m: 透 析 液 ， 用 奈 氏 试剂 租 氨 化 钮 洛 液 检 查 有 无 六 卫 
-或 sg :号 当 . 奈 左 试 剂 六 透析 液 而 无 棕 黄 色 沉 淀 时， 说明 无 
NE 。 氧化 包 溶 液 滴 入 透析 液 ， 生生 大 
S94-。 这 时 ， 透 析 即 完成 5 荆 
@IgG 含 量 测 定 ， 在 d = lcm 出 色 和 可 咯 ， 于 从 280PmircCmg/ 
1) 三 和 280/1.4。 
2. 抗 血清 制备 
抗原 进入 异种 动物 体内 二 洒 加 把 由 扩 角 后 5 二 六 反 名 
过 湾 伏 期 ， 抗体 含量 逐渐 升 高 ， 到 达 高 峰 后 ， 抗体 含量 忆 和 逐步 下 
降 。 若 同一 抗原 再 次 刺激 机 体 ， 入 休 人 基 才 痪 起 玛 机 于 于 光一 


是: ee 过 程 中 ， 若 入 和 和 其 秀 此 使 其 达到 所 至 伯 和 认 计算 
方法 为 : 


aa 导 二 全， 
学 证 风光 后 


天 体积 
“0 为 原 溶 液体 积 
5 稳 人 计生 区 
Si 汶 诛 深 芒 他 和 度 
若 不 希 痛 六 流体 积 增 大 ， 可 用 可 入 芷 休 硫 酸 饶 的 方法 w 规 六 是 沪 8 
_G (5:-5D) 
本 5 1=452 有 
Ji 值 是 将 1000ml 饱 和 度 为 :的 湾流 提高 到 人 饱和 度 z 时 ,所 需 的 硫酸 评 克 数 。 
, 契 和 轧 为 旬 狼 7 0OC 了 有 G 为 707， 砧 汐 0.27; 20 忆 时 G 为 1756)， 上 A 为 0.29。 
注 ; @IgG 可 在 硫酸 猎 粒 内 保存 ， 使 用 时 对 生理 盐水 和 析 除去 NH4+ 及 SO42 -离子 。 


。 了 8 了 3 了。 


入 次 刺激 时 更 高 的 峰值 ， 延 续 时 间 也 更 长 抗原 剂量 要 适当 ， 剂 量 


过 大 会 造成 仑 疫 麻 癣 ， 剂 量 过 小 则 无 反应 ' 多 次 低 剂量 注射 僚 千 
成 严重 的 免疫 摩 将。 免疫 用 动物 可 依 抗 原来 沽 向 选择 不 同 种 动物 ， 
习 如 羊 或 免 敌 如 本 实验 使 用 9-24 个 月 蹲 ?公斤 老者 健康 镍 性 家 免 
免疫 途径 可 选用 表 脉 ， 肌 周 ER 济 巴 针 、 肝 间或 大 腊肉 > 为 
加 强 反应 ， 常 使 用 竺 剂 。 
:117 村 料 秋 设备 
锡 汪 帘 
小 鼠 E5G 工 4mgy/ ml 二 玫 。 3 8 
完全 福 氏 佐 剂 (CFA 常用 8 体积 无 菌 液体 石 瞳 .2 体积 无 苗 
-羊毛 腊 加 攻 混 多 后 ， 以 1magymil 比例 加 入 活 疏 介 蓝 。 加 入 等 体积 抗 
原 溶液 ， 用 研 钵 或 两 支 注 射 器 丰 对 儿 吸 本 之 纪 化 ， 直 至 乳液 汪 在 水 
面 不 再 扩散 为 止 。CFA 会 引起 慢性 炎症 ， 切 不 可 识 入 限 内 ; 如 在 人 
可 由 不 加 为 分 村 行 黄 世 全 村 晨光 机 多 
注射 器 3 6# .79* 针 腾 站 
紫外 分 光 光 度 计 
饱和 硫酸 针 ，pH7 .2 
vBPBS 及 生理 盐水 《0. 全 业 放 于。 
二 透析 八 
某 基 罗 1 访 洪 了 所 本 阳 
将 已 这 拆 过 肯 小 民 18G， 千 外 分 光 光 记 计 调 定 江 后， 
生理 盐 永 将 浓度 调整 为 mg 7m1l。 
四 肌肉 内 注射 免疫 将 4mgjml 的 水 虞 到 9 与 每 蚌 CEA 屯 化 。 
将 2mi 屯 剂 分 作 4 份 lmg 蛋 白质 / 份 )， 给 每 只 兔子 背部 的 4 个 部 
位 肌肉 注射 。 一 个 月 后 重复 注射 。 第 二 次 注射 后 3 一 4 周 ， 从 免疫 
兔 回收 血清 样品 ， 测 定 滴 度 〈 效 价 )。 若 已 合 要 求 则 可 放血 。 车 候 
不 满意 ， 再 次 免疫 3 一 4 周 后 测试 效 价 。 
四 静脉 注射 免疫 ”每 次 可 注射 抗原 Img/ml。 第 一 针 自 耳 尖 静 
且 注 射 ， 第 二 针 位置 向 下 移 ， 余 类 推 。 注 射 四 次 ， 每 次 间隔 三 天 。 
一 般 一 周 后 即 可 测 效 价 。 无 需 使 用 佐 剂 。 


。384， 


国 皮 下 注射 免疫 “ 兔 后 肢 一 只 脚掌 内 注入 15mg 卡介苗 贰 10 
天 后 检查 胭 窝 淋巴 结 ， 如 已 肿 大 , 则 页 浆 巴 结 内 注射 20b@ 儿 .5z] 
用 CFA 乳 化 的 抗原 。 一 周 后 背 尝 皮下 多 点 〈2 一 3 点 ) 赴 射 不 完全 
着 剂 乳 楷 的 抗 源 项 40Bg7 人 天 间 肾 一 周 后 违 庄 6028/ mt 此 此 后 两 周 
劳 别 注射 久 跑 力 1 和 100 吕 ml 最 后 世 次 免疫 注射 是 3 一 法 上 月末 测 
op 0 车 匀 合 要 求 ,# 用 2008Egj 加强 锡 疫 - 次 。 划 党 
的 抗 横 清 巩 收集 om5 in 了 全 对 时 ) 天 1 语 寺 者 志和 锭 请 
(法 -用 采 过 1 锡 炸 妹 国 定 。 在 胸 泪 左 侧 自 正面 引 第 8-4 肋 上 间 ， 
手感 忘 脏 搏 动 最 明显 处 兽 毛 ) 稼 用 碘 酥 及 759% 乙 醉 消 毒 皮肤 。 
用 9 针头 及 30ml 注 射 器 ， 沿 与 表皮 成 459 角 进 针 三 车 未 见 几 可 抽 
出 再 行 穿 刺 ， 进 针 后 不 可 左右 拨 动 ， 每 谢 息 刘 疾 半 者 员 了 者 多 天 
存活 了 霹 
己 于 ' 耳 静 读 旅 星 芝 :在 温暖 室内 将 免 国 定 和 在 竟 配 舟 肪 和 直 干 丙 上 选 
择 切 口 部 位 用 刀片 割 破 静脉 后 ， 血 液 自然 滴 落 收集 。 出 现 凝 集 
时 天 至 禄 球 拭 去 8 每 次 旗 血 25mil。 四 周 后 加 强 免 疫 ， 又 可 区 高 效 
价 抗 血清 。 
帅 二 左 动 脉 放 临 京 锡 萎 竺 辐 定 光 绒 部 剪 毛 消 毒 ， 前 开 皮 肤 ; 暴露 
肛 部 肝 狐 ,用 种 术 刀 柄 分离 肌 层 ，: 牧 到 挝 过 草 全 称 脉 上 站 分 离 出 动 
脉 5czmm 长 二 八 离 出 兽 盐 脉 远 必 端 用 丝线 结 托 全 近 它 端 用 动脉 钳 夹 
住 5r 商 端 忘 间 用 虹 卉 前 前 一 V 形 站 言 众 昌 站 出 心 方向 揪 六 直 低 
155mm 塑 料 管 翅 管 的 另 一 端 放 六 收集 容器 。 松 开动 脉 钳 让 血 流 即 
流 闪 收集 回 钩 去 免 流 租 死 亡 5 可 收集 血液 80 一 120mlo， 所 
组团 收集 的 血 演 自然 凝固 ， 室 深 下 放置 击 小 时 光 然 后 放 入 J47 沪 
箱 过 夜 , 汶 次 县 分 离 必 集 黄色 透明 撑 清 上 30007pms 20 分 钟 ) 检查 
血清 效 价 和 纯度 。 抗 迁 清 分 装 并 冷 江 保 存 ， 或 用 饱和 硫 酸 饶 这 
淀 ，4?7 和 保存 。 
3. 抗 血清 效 价 测定 
(1) 试管 法 
四 材料 及 设备 妇 和 | 
试管 如 “小 试管 ”涵管 温 箱 ;生理 盐水 ， 免 抗 鼠 IgG 抗 
。385。 


血清 
鼠 IsG 深 液 CI1mg/ml) 订 识 天 
@) 方 法 -7 和 了 可 
试管 架 十 依次 排放 全 一 18 只 相 试 管 。 每 只 管 丙 禾 放 5ml 
生理 盐水 。 肯 取 0.5mi 抗 血清 放 入 第 一 管 ) 混 多 后 吸 卫 明 5mE 放 
入 第 二 管 ， 依 此 法 稀 杰 至 最 后 一 管 时 , 混 色 后 奔 去 0.5m8 旦 合 液 。 
沿 每 支 试管 管 壁 加 入 抗原 〈 鼠 IgG) 0.5ml。 加 毕 ， 将 试 算 架 放 
入 3780 温 箱 内 过 夜 ,次 日 观察 .不 年 成 抗原 抗体 沉淀 反 孙 的 管 号 ， 
inadpnhageocnmgrpaphsiosase 人 
的 效 价 应 该 达到 1:1024。 
(2) 免疫 扩散 法 
申 材 料及 设备 
巴 比 妥 钠 盐 酸 缓冲 液 0.1M，pH8:6 ( 巴 比 妥 销 185 中 INHGl 
18ml， 加 蒸 饮水 至 1000mly 。 
琼脂 糖 “NaNs。1 载 芯片 吸管 由 鼠 IgG 和 免 抗 晨 IgG 抗 血清 
@@ 方 法 
100m10.1M，PpH8-6 的 巴 : 比 有 盐酸 缓冲 液 肉 ， 加 六 琼脂 糖 
0.8g。 加 热 溶解 至 透明 (加 热 后 若 有 液 量 损失 则 补足 容积 至 
100ml) 加 入 百 分 之 荆 NaNi 趁 热 将 琼脂 糙 洲 液 浇 到 载 玻 片 二 3 
每 片约 需 3ml。 冷 却 后 ,用 豚 管 在 琼脂 糖 上 本 站 打 孔 ( 直 径 Smmy) 
一 般 为 梅花 型 ， 即 中 央 一 个 孔 ， 周围 6 个 孔 ， 孔 距 2mm。 中 天 孔 
内 加 入 1ob1 抗 原 : (和 鼠 18G)， 四周 蕊 内 从 次 加 六 连续 稀释 药 搞 血清 
各 10pL (稀释 方法 参见 试管 法 ) 加 毕 ， 放 从 混 伪 ,在 37 平 保温 
4 小 时 或 室温 放置 过 夜 。 观 察 时 ， 可 根据 出 现 沉 淀 线 药 孔 而 判定 
抗 粤 清 效 价 。 例 如 ,沉淀 线 出 现在 第 6 孔 , 则 该 抗 租 清 效 价 为 1: 64。 
用 此 法 测定 抗 血 清 效 价 时 ， 一 般 要 求 效 价 为 1:64。 
4. 抗 血清 的 纯度 鉴定 
免疫 电泳 
四 诸 料 与 设备 
缓冲 液 与 琼脂 糖 见 前 免疫 扩散 法 
。 了 86。 


载 片 (7.5x225cm) ， 电 乌 仪 电泳 档 ” 粗 滤 纸 解剖 刀 
吸管 
@ 方 法 
1 用 0.1M;pH8 .6 巴 比 妥 钠 盐 酸 缓 训 液 加 热 融 解 的 琼脂 糖 浇 到 
清洁 载 玻 片 上 ， 凝 固 后 开 槽 和 打 孔 ,但 槽 内 琼脂 糖 在 电 汶 结束 前 
不 移 去 。 我 内 加 样品 ;本 例 中 样品 为 免 抗 小 鼠 IgG 血 清 。 样 品 在 
电 场 叶 向 负极 移动 , s 此 孔 开 在 偏 正 极端 .电泳 槽 内 加 巴 比 妥 钠 
盐酸 组 种 液 。 载 片 置 于 电泳 槽 凹 处 ， 以 缓冲 液 湿润 钊 粗 滤 纸 为 盐 
桥 搭 在 载 片 两 端 。 接 通电 流 , 电 压 120V。 室 漫 下 ,电泳 1 小 时 结束 : 
取 下 载 片 ， 除 去 槽 中 的 琼脂 糖 条 ， 加 和 六 小 民 I8G。 载 片 放 在 湿 盒 
内 ，37D，4 小 时 或 4 冰箱 内 过 夜 后 ， 即 显现 沉 省 线 。 根 据 沉淀 
线 的 条 带 形状 双 位 置 可 判定 抗 血 清纯 度 。 在 本 实验 中 ， 若 靠近 负 
极端 呈 单 一 弧 状 沉淀 线 则 表明 纯度 高 。 
5. 从 抗 血 清 中 提取 免疫 球 蛋 白 
因 各 种 免疫 学 技术 之 需 ， 可 从 抗 血 清 中 提取 IgG。 方 法 除 前 
已 述 及 的 小 鼠 IigG 槐 和 硫酸 铁 提 取 法 外 ， 还 可 使 用 硫酸 钠 盐 析 或 
冷 己 醇 法 》 此外， 进一步 纯化 抗 血 清 还 可 采用 各 种 层 析 方 法 ， 例 
如 葡 聚 糖 凝 胶 层 析 、 凝 胶 过 滤 或 离子 交换 纤维 素 层 析 等 。 
(1) 用 PEAE- 纤 维 素 分 离 IEG 
电 材 料 和 设备 
DEAE (二 乙 基 氨基 乙 基 ) 纯 维 素 ， 人 DE-52 
PBS0.005M pH7.0 一 7.3 _ INNacH 1NHCIL 布 氏 涡 
斗 或 砂 芯 漏斗 “ 层 析 柱 “分 部 收集 器 ”紫外 分 光 光 度 计 
名 方法 
a. 取 适量 〈 依 柱 大 小 而 定 ) DE 一 52 干 品 放 在 1N Na0 理 深 
液 内 (15mlNaOH 洲 液 /8DE-52), 混 匀 轻 轻 挠 拌 30 分 钟 疏 用 布 氏 
漏斗 抽 滤 ， 反 复 用 NacCH 洗 至 无 色 。 用 蒸 馆 水 充分 洗 滤 三 次 。 将 
滤 销 加 入 1NHCI 中 搅拌 均匀 后 过 滤 .用 蒸 饮 水 充分 洗 滤 以 除去 游 
离 酸 。 再 将 滤 饼 悬浮 于 1NNaOH 中 搅拌 均匀 过 滤 ,并 用 燕 馆 水 充 
分 洗 滤 直 至 滤液 旺 中 性 。 将 离子 交换 纤维 素 悬 泽 在 缓 训 液 内 


“87 。 


(38/100ml1) 静 置 。 若 上 部 液体 混浊 ， 则 明 缓 名 液 倾 洗 数 次 ， 直 、 
至 把 不 下 沉 药 过 细 颗 粒 去 掉 为 止 。 下 
b . 装 柱 
柱 也 可 自制 。 柱 直径 1 一 2cm， 与 高 度 之 比 可 为 10:1。 柱 的 
下 只 放 一 层 尼 龙 绢 ， 只 允许 缓冲 液 通过 ， 而 纤维 素 不 能 通过 。 
柱 底部 接 细 塑 料 管 ， 用 夹子 夹 住 后 ， 将 缓冲 液 加 六 柱 肉 。 松 
开 夹 子 ， 排 出 气泡 后 ， 再 严 住 塑料 管 ; 将 帘子 交换 剂 混 色 加 满 层 
桥 柱 。 待 底部 形成 芍 5cm 指 沉积 层 ( 柱 床 ) 时 ， 弄 局 赤 子 ” 使 组 
冲 液 流 出 ， 逐 步 加 入 纤维 素 悬 浮 液 。 注 意 桂 床 要 连续 ， 不 可 形成 
界面 ， 直 至 柱 床 达 到 要 求 高 度 WwwRheghud 上 
c. 加 样 
加 样 前 ?过 柱 缓 冲 液 的 PH 值 应 符合 要 求 。 为 机 正如 翌 蛙 多 
床 面 ， 可 加 滤纸 片 或 葡 聚 六 凝 胶 ， 如 样 量 与 柱 床 天 小 有 关 呈 会 换 
柱 床 吸附 样 显 后 形成 的 带 不 应 超过 柱头 体积 的 10%f, 这 有 利于 洗 
脱 过 程 中 的 再 吸附 。 盐 析 法 提取 葛 免 疫 球 蛋白 25 一 100m8g， 一 般 
用 ITx 30cm ( 干 重 3 一 48) 的 DE-52 即 可 得 到 满 仿 的 分 离 效果 <。 
若 从 全 血清 中 分 离 T5G, 每 克 DEAE- 纤 维 素 往 约 可 分 离 HmnlE 清 
样品 在 上 和 柱 之 前 ， 需 对 洗 脱 用 缓冲 液 作 平 衡 透 机 。 透 析 需 24 
小 时 ， 中 间 换 液 数 次 ， 以 除去 禅师 中 的 NH 和 和 SG。 门 
加 样 菌 ， 开 局 夹子 ， 使 柱 的 液 面 下 降 到 桩 闲 表 面 下 1 一 2cm。 
这 时 ， 小 心 把 样品 加 到 和 柱 厌 表面 ， 符 拜 唱 进入 柱 床 后 开始 加 水 量 
绥 冲 液 进入 柱 床 。 然 后 用 连 有 细 塑 类 管 的 橡皮 塞 加 在 杜 顶 。 亨 料 
管 连接 洗 陪 省 瓶 ， 往 柱 册 加 适量 缓冲 液 ， 浒 开始 尝 脱 
d. 洗 脱 ” 洗 赔 液 流速 20ml/ 小 时 ， 可 用 电动 友 或 埠 夫 昌 夹 进 
e. 收 集 和 检测 全 Ds 4 医 
洗 脱 液 可 用 育 动 分 部 收集 器 收集 ; 二 窒 客 和 大作 各 帮 汪 
杨 酸 或 紫外 监测 仪 。 本 峰 即 了 完 量 答 测 柯 用 迪 
外 分 光 光 度 计 。 
了 汪峰 收集 完毕 后 ; 若 无 需 回 收 其 余生 泊 : 质 部 分 订 用 
*。388。 


1NNaCl 洗 脱 ， 然 后 再 用 缓冲 液 平衡 备用 。 
(2) 凝 胶 过 滤 分 离 IgG 
凝 胶 过 滤 技 术 中 ,最 常用 的 斤 胶 是 不 同 交 联 度 的 葡 桶 鳍 凝 及 
即 Sephadex。 在 分 离 IEG 中 可 用 G-7 二 旭 00 。 
四 材料 和 设备 
Sephadex G-100 
缓冲 液 等 与 离子 交换 纤维 素 所 用 相同 
@ 方 法 
8 肇 胶 准备 称 取 适量 Sephadex'.G-100 放 入 500ml 烧 杯 中 4 
加 入 绥 冲 液 为 凝 胶 量 的 5 一 10 税 )， 用 玻 棒 搅拌 混 悬 。 在 沸水 浴 
中 将 悬浮 液 加 热 近 沸 5 小 时 ， 或 在 冰箱 中 (4C 7 自然 洲 胀 72 小 时 。 
上 柱 前 反复 倾 去 微细 颗粒 ， 直 至 上 部 澄清 为 止 
-bb. 装 柱 可 采用 1.3x54cm 柱 。 柱 垂直 装 在 铁 架 上 注入 173 
柱 高 的 缓冲 液 。 将 膨胀 好 前 凝 胶 沿 管 壁 倒 入 ,使 其 自然 下 沉 。 同 时 
打开 柱 作 塑 料 管 夹 使 缓冲 液 流 出 。 凝 胶 自然 沉积 至 距 柱 顶 10cm 处 。 
凝 胶 表 面 可 放 一 滤纸 以 备 加 样 用 。 开 启 柱 顶 部 的 缓冲 液 使 之 通过 
柱 床 ， 使 柱 床 平衡 。 
c. 加 样 ”小心 吸 去 柱 床 顶部 的 缓冲 液 ， 然 后 把 经 过 透析 指 样 
品 组 组 加 入 ， 不 可 扰乱 床 面 。 样 品 加 毕 ， 开 启 出 液 日 使 样品 进入 杜 
床 ， 待 桩 品 一 进入 柱 床 ; 即 开启 洗 脱 缓冲 液 进 口 ， 开 始 洗 脱 。 
d. 洗 脱 “， 可 通过 紫外 监测 仪 或 20% 磺 基 水 杨 酸 对 洗 脱 物 作 定 
性 检查 。:- 分 部 收集 。I8gG 在 第 一 峰 出 现 。 样 品 洗 脱 完毕 ,进行 凝 
. 胶 再 生 ， 可 重复 使 用 多 次 。 将 收集 的 IgG 装 入 透析 袋 ， 用 没 风 软 
或 用 高 纯 蔗 糖 或 聚 乙 二 醇 使 之 脱水 浓缩 保存 。 


(二 ) 微 量 湛 已 细胞 于 试验 


检验 细胞 表面 组 织 相 容 性 抗原 可 以 用 补体 介质 细胞 毒性 测验 
方法 。 作 为 常规 方法 ， 其 灵敏 度 及 重复 性 均 较 满 意 。 现 介绍 一 种 
改良 的 Terasaki 方 法 ， 供 检测 淋巴 细胞 表面 抗原 。 

(1) 材料 和 设备 


es. 了 89 站 


培养 液 ， 等 量 199 路 养 液 和 PBS 液 混合 ， 添 加 5 色 胎生 和 面 清 
(PBS，Na,HP2I,0.7255，NaH,PO .HE500.180g NaCl9.08 溶 
于 共 饮 水 中 至 1 升 )。 殉 

麻醉 剂 ，15g 三 省 乙醇 济 于 异 及 醇 至 10ml。 用 闵 移 水 稀释 
80x，470 保存 。 可 存放 二 个 月 。 

抗 血 清 ;， 用 于 细胞 毒性 试验 的 抗 H .2 看 清 按 NIH 目录 中 的 免 
疫 方案 制备 

补体 ， 从 20 只 免 〈2 一 3 周 龄 ) 收 集 香 请 ， 检 查 补 体 活 注 。 
将 高 效 价 低 本 底 的 血清 分 装 ， 每 份 100u&L 贮 于 -70D。 一 旦 者 东 
不 要 再 冷冻 。 区 三 莫 下 本 人 

固定 液 ， 用 含 20% 甘 油 药 蒸 饱 水， 将 成 三 醛 稀释 为 1% 浓 度 ， 
用 作 固 定 液 。 该 液 不 能 贮存 。 

板 型 滴 度 板 的 制作 如 下 ;5mm 厚 丙烯 酸 酯 板 切割 成 50 x 40 
mm。 每 板 的 表面 刻 为 48 个 小 方块 。0.5m 厚 韵 塑料 框 粘 在 塑料 
. 板 边 缘 。 盖 玻 板 大 小 与 渍 着 板 相同 ，2Bmm 厚 。 经 充分 洗涤 可 重复 
使 用 。 

增 湿 器 ， 电 动 增 湿 器 通过 超声 波 产 生冷 雾 并 覆盖 板 面 ， 防 十 
升温 和 干燥 : et 

“淋巴 结 细胞 悬 液 制备 :给 小 鼠 体 内 注射. 三 省 艺 醇 〈10 一 
15kg/g 和 体重 ) 进行 麻醉 。i 分 钟 后 ， 剪 开 左 侧 或 右 侧 材 盖 在 鼠 蹊 
部 或 筑 部 污 表 淋巴 结 上 的 皮 肌 ， 移 出 淋巴 结 , 放 入 盛 有 199 一 FBS 
一 5%FCS 的 器 血 内 。 小 鼠 经 素 合 伤口 可 继续 生存 。 把 淋巴 结 破 
和 碎 .过 滤 , 使 成 单 细 胞 县 攻 .离心 洗涤 ,调节 细胞 密度 为 ?x 10?7m1。 
用 0.8% 台 盼 蓝 检 查 细胞 存活 率 应 为 85 一 90%% 之 间 。 

(2) 方法 

四 约 含 2000 个 细胞 的 1h1 悬 液 滴 加 到 滴 度 板 的 每 个 方 格 内 。 

:在 滴 度 板 示 加 覆盖 前 ， 全 部 操作 均 应 在 电子 增 湿 器 下 进行 ,防止 
流 漓 干燥 。 攻 

G@PBS 稀释 散 抗 血清 加 到 彼 上 的 细胞 悬 液 内 : 可 用 IRIEBS 

代替 抗 血 清 作 空白 对 照 。 加 盖 后 ，377 温 刘 10 分 钟 。 


。 了 90” 


WTAogenaSEEENWSEShe3aeoee ta -一 


四 10 分 钟 后 开 盖 ， 加 入 1b1 补 体 ， 覆 盖 盖 板 ， 在 377 下 培养 
60 分 钟 。 

狼 培 养 后 ,除去 盖 板 ,在 每 在 方 格 内 加 入 也 1 固定 液 ; 加 盖 板 并 
以 乙烯 基 胶 带 封 固 边缘 。 该 板 可 在 10 x 物 锁 的 相差 显微镜 下 检查 。 

. 全 在 10X 物 镜 下 调整 相差 。 活 细胞 明亮 、 死 细胞 墨 暗 ， 容 易 
让 -次 史 于 3 

fi 细胞 死亡 率 计 算 : 全 检查 200-- 300 个 细 欧 ， 让 和 《 表 细 隐 
, 数 ,全 细胞 数 ) xl00 
，- 该 法 前 主要 缺点 是 需 信用 增 湿 器 。; 关 便 用 国产 72 了 HLA 斌 验 
盒 出 可 简化 .这 种 方法 是 在 每 蕊 中 加 入 5H 医 用 石 暴 油 ,然后 依次 
:加 入 1u1 抗 血清 1N 淋 巴 细胞 ， 温 育 后 加 入 补体 5pl， 再 次 温 育 后 
加 520 伊 红 !iCEosiny) ;水 溶液 3A1。5 一 10 分 钟 后 ， 加 六 中 性 甲 
, 登 8hl - 静 置 2 小 时 后 读数 。 可 用 普通 显 微 管 判定 结 杂 ， 死 细胞 呈 
晤 4 括 包 相亲 人 二 村 北 隐 为 天 各 


三) 植皮 


-| 批 选 15r-20 克 左右 的 小 好 ; | 称 重 ;| 编号: 麻 醇 ， 前 乒 。 将 小 
鼠 背 部 朝 上 四 肢 固定 于 手术 板 汪 ,选择 沙 鼠 躯体 背部 西 侧 为 手 
术 区 ， 进 行 皮肤 消毒 。 然 后 左手 用 弯 银 取 一 小 处 皮肤 提升 成 圆锥 
状 ， 在 手 用 弯 头 剪 剪 一 圆 形 或 酉 圆 形 工 厘 米 左 右 大 小 的 皮 块 ， 放 
入 经 过 消毒 盛 有 生理 盐水 和 下 铺 泪 纸 的 培养 亚 的 7 将 植 片 的 真皮 
潭 朝 上 上, 展 平江 以 同 法 处 理 另 一 小 展 的 植 片 。 除去 植 片 的 盘 哩 ， 
然后 将 两 块 植 片 交换 ， 分 别 移植 至 另 一 同系 小 展 预 定 手术 部 位 ， 
用 上 几 士 袜 纱 布 覆盖 及 石膏 绷带 固定 s 相交 检 天 并 本 机 和 进行 观 
察 。 


( 户 琴 华 )- 


。 39] 。 


第 四 桩 11 电 竹 扯 狼 错 技 术 站 半 二 有 训 关 十、 


17 世 纪 英 国人 Hooke (1635- 于 而 3 用 蝇 伍 区 观 归 到 细胞 | 
抒 疼 了 微观 世界 的 天门。 大 们 借助 显微镜 能 直观 的 看 到 内 眼 所 看 
不 到 的 微细 结构 世界 。 目 前 光学 显微镜 的 发 展 它 达 到 平 从 完善 的 
:处 度 ， 而 且 应 用 也 相当 善 志 ， 然 而 要 想 借 光学 显微镜 观察 更 币 小 
前 物体 ， 比 痪 细胞 内 的 微细 结构 ， 光 学 显微镜 就 受到 限制 .后 来 ， 
德国 理论 光学 家 挨 贝 从 理论 上 证 明 : 申明 光波 的 小 长 是 限 出 光学 
最 微 镜 分 装 力 的 报 率 因素 。* 人 和 们 为 了 进 全 步 提高 分 辨 办 寻求 新 
的 光源 。1931 年 德国 前 RusKka 等 研制 成 世界 上 第 侍 各 电子 显 微 针 ， 
当时 放大 率 仅 12 倍 1 1940 年 第 一 批 商 品 电 氏 - 蜡 现 ;5 从 状 滨 为 25 
入， 大 大 延 但 了 人 们 的 观察 力 。 到 现在 虽 只 有 多 年 ， 但 电子 显 微 
镜 的 发 展 是 相当 惊人 的 。 随 着 电子 显微镜 的 发 展 和 制 样 丢 术 的 不 
昕 改进 ， 信 们 不 仅 能 看 到 细胞 肉 兹 刍 构 还 能 观察 生 牺 类 分 子 和 
原子 结构 。 电 锐 已 成 为 生物 学 和 其 李 学 科 中 不 可 缺少 | 的 有 力 工 


具 。 R 详 区 ' 瘟 
《= ) 电子 显微镜 黎阳 1 | 
1 . 透 庄 式 电镜 装置 简介 证 训 日 世人 多 人 


图 4-2 是 电镜 的 织 前 面 示意 图 ”最 主 端 是 电子 枪 元 底 语 是 提 
纵 台 痢 抽 气 机 所 在 的 地 方 。 标 本 效 进 标本 室 之 后 ， 必 须 将 空气 折 
看 才能 进行 工作 。 显 微 镜 本 身 呈 圆柱 形 结 档 。 从 队 极 发 射 的 电 
子 ， 飞 向 阳 角 。 在 阴极 秆 阳极 之 间 的 均匀 电场 中 被 加 速 ， 这 全 电 
场 有 数 万 伏特 的 电压 。 用 作 会 聚 透 镜 的 是 一 磁场 ， 它 使 电子 流 聚 
成 一 细 窗 的 束 ， 把 发 散 的 射 东 引 到 标本 室 中 的 样品 上 , 观察 的 样 
本 镶 在 用 福 尔 瓦 (Formvar) 制 的 薄膜 上 。 碟 附 在 没有 磁性 的 铀 
网 上 。 福 尔 丰 话 能 透 电子 。 电 子 的 射线 穿 过 标本 后 散射 开 来 ,前 进 
到 磁 广 物镜， 通过 禾 镜 形成 思 步 放大 的 像 。 在 物镜 中 放置 一 个 孔 _ 


aa 了 92。 


穴 光 阔 ， 筷 穴 具 有 一 定 的 直径 ， 当 以 一 定 和 度 获 射 的 电子 处 于 光 
漳 孔 六 之 外 时 ,就 会 被 光 冰 挡 住 ,而 不 参与 造像 。 样 品 的 初级 像 再 
i 轰 过 扫 庙 镜 放大 才干 倍 ， 形 成 终端 像 。 终 端 像 可 在 电子 显 微 筑 的 
: 振 大 出 视 观 察 到 。- 握 时 还 是 定 影 在 照相 彤 片上 。 为 了 获得 较 大 的 
豆 像 ; 六 自如 地 调节 放大 率 ， 通 常 还 在 物镜 与 投射 镜 之 间 放 置 一 
人 整个 仪 奖 在 让 宝 让 进 行 ， 强 的 肥 活 的 本 呈 不 能 观 


[委员 浊 潮 中 呈 尖 人 曲子 检 阴 科 | 
册 和 1 
< 
六艺 会 宁 进 蚀 和 
1 接 物 镜 
中 间 透 镜 扎 穴 光 栏 
观察 屏幕 
ES 一 一 照相 底板 


图 4-2 ”电子 显微镜 成 象 的 模式 图 
2. 电子 昌 生 镇 中 党 用 的 长 虚 单 位 


1 电子 显 微 术 中 ,常用 的 长 度 单 位 是 以 微米 (km)3? 训 微米 (nma) 
禾 洒 IIA) 来 表示 的 。 它 们 之 间 的 换算 关系 划 下 ， 
mm=IL0O0nm Inm=I10A 
所 以 ， : 事 
1mm=1000km=1,000,000nm =107000， 000 人 起 
即 TJmnm=103km=10snm=107A 

1A=10-:nm=10 340 


3 :电子 显微镜 研究 的 技术 方法 ; 让 ， 冯 一 言 虽 二 诺 “ 半 深交 

(样品 载 片 (金属 载 网 ) ,在 光学 显 微 嵌 其 作 中 样品 是 小 在 
载 臣 片上 的 。 而 在 电子 显微镜 中 ， 超 幕 切片 和 细菌 5 噬 苗 体 : 注 
毒 等 时 波 的 样品 是 放 在 一 种 特制 的 透明 蓝 伐 十 ,| 这 种 茧 肛 附 闭 在 
爹 属 网 上 上， 金属 网 被 称 为 铀 网 。 铀 网 二 般 是 用 很 薄 的 铀 生 腐 钼 而 
成 ;也 有 用 镍 : 铬 、 银 和 白金 等 稀有 金属 制作 的 5 - 带 用 的 钢 网 分 
为 直径 2mm 和 3mm 两 种 ; 其 网 孔 的 式样 随 制作 方法 和 观察 样品 竟 
不 同 而 各 异 。 饥 网 应 光洁 、 者 与 | (图 4-3)。 


31? 


区 4-3， 透 负电 了 活 显 微 镜 常 用 载 网 


(2) 铀 网 的 清洗 电镜 所 用 的 铀 网 需 非常 清洁 ， 即 使 是 新 钢 
网 也 要 加 以 清洗 。 常 用 的 清洗 方法 是 ， 将 钢 网 放 在 外 烧杯 肉 ， 放 
入 少许 硫酸 或 硝酸 ,用 玻 棒 经 轻 搅 动 ,3 分 钟 左 者 ,使 茜 网 发 亮 即 


倾 去 酸 ， 用 水 洗 数 次 ， 氨 水 中 和 旦 淡 蓝 色 时 中 东 洗 数 次 ， 王涛 重 


燕 水 洗 几 次 ， 从 酒精 中 取出 后 干燥 备用 。* 使 用 过 的 铜 网 先 用 氯仿 
或 醋酸 异 成 酯 浸泡 以 去 掉 支 持 膜 ， 再 按 上 述 清 洗 法 处 理 。 

(3) 样品 文 持 膜 :电镜 的 样品 是 附着 在 很 薄 透 明 支 持 鸡 上 的 ， 
支持 膜 则 附着 在 铜 网上。 支持 腊 的 厚度 不 得 超过 200A5s 因为 赂 大 
厚 会 增加 电子 的 角 散 射 ， 使 样品 图 像 的 反差 及 其 结构 的 分 辨 率 显 


ee 39 了 。 


汪 w ee 


| 


;3 洲 降 想 。 制作 支持 矣 的 材料 各 异 ， 制 作 方法 也 很 多 ， 这 里 仅 就 最 
澡 潮 的 一 种 方法 进行 介绍 ， 最 常用 的 是 聚 乙烯 醇 缩 甲醛 ， 即 For- 
责 Yar， 为 一 种 透明 塑胶 , 它 制 成 的 膜 比较 结实 。 它 可 被 二 氧 乙烯 、 
这 上 氧 六 环 和 和 氧 仿 洲 解 ， 常 用 的 浓度 为 0.2 二 0.5%5 

制 膜 方 法 ， 主 要 有 二 个 步 又， 先 设 法 将 塑料 薄膜 浮 在 清洁 的 
永 面 土 ， 鞭 次 是 将 永 面 土 的 支持 膜 沾 附 到 金属 网 上 ， 用 一 块 表面 
光洁 葛 载 改 片 ;浸入 塑料 溶剂 中 ， 慢 覃 直立 提出 ， 稍 待 一 会 ， 溶 
剂 挥发 后 ,玻璃 片上 就 形成 一 层 泗 膜 ， 用 刀片 沿 玻 片 边缘 将 碟 划 
痕 ， 然 后 用 叙 子 夹 住 玻 片 的 一 边 , 以 垂 真 或 与 水 面 星 45" 角 缓 缓 压 
信永 中 ?此 时 玻 片 上 的 塑料 薄 借 助 水 的 表面 张力 与 玻 片 脱离 
而 漂浮 于 水 面 上 。 将 洗 净 的 铜 网 平 放 在 支持 膜 上 上， 然后 用 相应 大 
小 的 一 张 涝 纸 盖 在 铀 网上。 此 时 由 于 滤纸 吸水 作用 很 快 吸 到 全 部 
铜 网 及 下 面 的 支持 膜 。 再 逊 簿 将 沾 有 铜 网 的 滤纸 提起 ， 放 在 培养 
亚 内 干燥 待 用 。 

4. 生 物 样 晶 的 超 薄 切片 的 制备 

在 作 电 子 显微镜 观察 时 ,， 首先 需 将 生物 材料 制 成 薄 的 标本 ， 
以 便 电 子 能 穿 透 ， 同 时 ， 还 要 保存 生物 材料 的 原 有 结构 。 这 就 要 
针对 取材 、 国 定 、 浸 酯 . 包 埋 切 片 等 一 系列 程序 提出 严格 要 求 。 

(GT) 取材 : 为 了 尽量 保持 所 取材 料 的 生活 时 状态 ， 从 动 植物 
组 织 上 取材 时 必须 迅速 准确 可 靠 ， 争 取 在 几 秒 钟 之 内 将 奢 料 放 进 
固定 液 中 。 材 料 放 在 0 一 4"C 低 温 条 件 下 操作 ,组 织 块 应 切 成 1mms 
或 更 小 。 

(2) 面 定 ， 为 了 使 固定 剂 尽快 到 达 每 个 细 聊 ， 并 及 时 起 到 因 
定 和 作用， 除了 陨 烤 快 ， 组 织 芭 小 ;温度 低 外 ， 还 要 求 固 定 剂 的 穿 
透 速度 快 。 就 目前 所 知 ， 猴 酸 (四 氧化 铁 ) 和 醛 类 是 比较 好 的 因 
定 剂 。 铁 酸 是 一 种 金属 盐 类 , 它 的 水 溶液 是 中 性 的 (PH7.2 一 7.4 )， 
它 主要 对 生物 组 织 起 氧化 作用 ， 与 蛋 自 质 化 学 结合 形成 交 链 而 能 
稳定 蛋白 质 。 它 与 不 饱和 脂肪 酸 及 脂 肪 链 结合 形成 复合 物 。 它 与 
绍 胞 旭 、 绕 粒 体 、 细 胞 浆 的 某 些 是 和 粒 的 亲和力 较 强 ， 能 较 完满 地 
和 哥 奔 微细 结构 。 但 对 碳水 化 合 物 的 保存 较 差 ， 对 核酸 指 保护 也 很 

6 了 了 ”> 


差 ， 而 对 核 蛋 包 保护 很 好 。 四 氧化 雏 儿 乎 能 与 所 有 的 细胞 成 分 化 
竺 合并 使 其 稳定 。 因 其 分 子 密 度 高 故 电子 染色 作用 产生 了 息 好 
的 反差 。 但 由 于 分 子 较 大 ， 在 组 织 内 扩散 很 慢 。 第 用 的 固定 液 是 
0.5 一 2% 铁 酸 。 铁 酸 毒 性 大 ， 对 眼睛 和 是 吸 系统 有 影响 ”操作 时 
应 在 通风 橱 内 进行 。 

醛 类 国定 剂 以 成 二 办 较 好 。 隆 类 固定 剂 穿 适 力 较 强 ， 固 定 速 
度 快 。 虽 然 它 不 与 糖 元 起 化 学 结合 作用 ， 但 能 稳定 广元 成 二 醛 
臣 定 组 织 时 ， 可 保存 两 周 时 间 。 

也 两 种 常用 固定 剂 的 配制 法 

A， 铁 酸 。 用 醋酸 巴 比 妥 缓冲 波 配 成 1% 的 旋 酸 回 定 液 是 公 Y 认 
较 好 的 配方 。 巴 酷 绥 冲 液 配制 方法 

全 液 :, 巴 比 妥 钠 -25948 
栈 酸 钠 3H2OQ .1.948g 
双 共 水 加 至 100ml 
B 液 ， 氯 化 钠 8.06g 
毛 化 锝 0.42g 
氧化 钙 0.18g 
双 蒸 水 加 至 100ml 
巴 囊 绥 圳 流 配 制 1% 的 钱 酸 固定 波 的 方法 如 十 :1 


A 液 10ml 
B 流 3_4mli; 
0.1N 盐 酿 11ml 
双 共 求 加 至 50ml 
调 pH 至 7.2 一 7.4， .0 一 4"C 冰 箱 保 存 ， 用 时 加 ?站 和 本 35mls， 
2%% 铁 酸 原 液 ， 
GOsO,， 作用 
双 阁 水 50ml 1 
B , 噬 世 醛 固 定 液 : 


a. 3 用 0.2M 二 甲 碑 酸 盐 缓 冲 液 配 戊 三 醛 园 定 液 : 先 配制 0。 2M 
三 甲 碑 屋 销 缓 冲 液 (NaCH;AsO:.3H:O): 二 申 砷 酸 钠 428g 加 


“396 。 


人 大 


训 


驱 菜 水 180ml， 用 0.1N 盐 酸 调 pH 对 7.2 一 7.4。 在 0 一 4? C 下 保存 。 
本 


_ 友 二 村 最 多 当 度 C%) TIRE 


0.2M 之 甲 态 辽 朋 冲 液 (ml) 1 站 5 全 宙 二 并 引 


E | 0 


25 谊 管 原装 太一 醛 人 ml) 和 | 下 本 区 164 站 殉 


| 千本 二 = 


利生 纯 冯 二 ON 可 拓 人 可 卫 人 中 38 | 34 小 的 


3 师 港 消 


50 本 0 策 太 | .5 


国定 组 织 时 可 用 2.5 一 5%% 指 上 友 二 醋 。 冲 征 本 条 本 区 用 1 
一 2.5% 皮 一 三 固定 液 。 

b. 用 花 酸 绥 冲 波 配 制 蕊 二 醛 固 定 剂 

将 336 至 40.5m 的 0.2M 磷 酸 氨 二 销 加 14 至 9. 5ml 的 0， 2NM 磅 
酸 二 和 氢 销 ， 配 成 0.2M 磁 酸 缓 冲 液 。 


碳酸 绿 冲 洁 配 制 不 周 浓 度 竟 成一 登 男 定 液 


芭 二 醚 最 终 浓度 (9 ) | 5 于 -5 
25 闻 城 三 全 原 装 液 (mL | 4 6 | 8251aocl2 | 167 20 
一 一 -一 -一 一 一 一 一 一 - 
0.2M 了 磷酸 组 赣 流 (mLD) 50 | 50 |， 5) 50. (| 50 | 50 
重 区 水 (ml) | 

@ 固 定 方法 


”国定 戎 和 国定 方法 很 多 。 目 前 公认 戊 盖 醛 -. 狐 酸 双 固定 较 好 ， 
即 缓冲 欧 1 一 5%% 的 戊 二 醛 固 定 后 * 再 经 1% 组 冲 的 针 酸 固定 液 做 后 
国定 。 二 者 互相 取长补短 ， 使 细胞 的 超 微 结 沟 得 到 良好 的 保存 。 

固定 时 用 锋利 苞 刀 片 将 材料 切 成 0.5 一 Imms3 左 右 的 小 块 ， 逊 
速 放 入 友 二 酶 固定 液 中 ， 封 料 要 下 沉 ， 植 物 硅 料 必 须 进 行 抽 气 。 
在 48C 下 固定 1 一 5 小 时 。 固 定 后 的 材料 用 缓冲 液 彻底 清洗 2 小 时 以 
上 或 过 夜 。 然 后 在 铁 酸 中 进行 后 固定 2 一 3 小 时 。 再 用 组 冲 液 清洗 
2 一 3 次 或 过 夜 。 重 燕 水 洗 一 次 后 ”脱水 。 脱水 试剂 一 般 采 用 浓度 
逐渐 增加 药 丙 一 或 酒精 系列 。 


”3 彻 7， 


二 (37 沙 透 与 包 埋 : 涂 透 的 方法 取决 于 最 后 包 夫 用 的 树脂 , 3 用 " 
环 氧 树脂 Epon 或 Araldite 作 包 埋 剂 时 ， 最 好 先 用 逐渐 升级 的 乙醇 
脱水 ,然后 再 用 环 氧 丙烷 和 乙醇 混合 液 _(1:1) 置换 乙醇 ,然后 换 

入 东 氧 丙烷 ， 再 用 环 氧 丙 烷 和 环 氧 树脂 〈1:1) 及 (1:2》 的 混 谷 液 
渗透 。 在 每 种 混合 液 中 停留 2 小 时 以 上 ， 也 可 过 夜 $ :最后 转 i 六 . 纯 
环 氧 树脂 包 埋 剂 过 夜 ， 第 二 天 再 转换 一 次 。 包 埋 剂 浸透 的 时 间 ， 
根据 所 取材 料 的 渗透 性 能 ， 可 以 放置 1 一 6 天 ， 但 要 每 天 换 新 鲜 - 
的 包 埋 剂 。 下 面 介绍 几 种 包 埋 齐 的 配方 。 


申 环 氧 树脂 也 pon812 
A 液 ，Epong81l2 62n 
DDSA (十 二 烷 基 下 珀 酸 栈 坎 化 剂 ) 10ml 
.1 卫 液 ,Epon8l2 2 0 3 中 
MNA (六 甲酸 醋 周 化 剂 ) 区 . 9 号 
将 A 与 B 按 以 玉 比 例 混合 
隐 一 软 


入 0 3 5 了 10 


加 入 总 体积 1 一 2% 的 DMPE 一 30 加 速 剂 - (246 二 四 基 葵 酚 )。- 
边 加 边 挠 .A 液 与 B 液 的 比例 应 根据 气候 不 同 而 变动 *A 液 多 则 软 ， 
B 液 多 则 硬 。 通 常 冬天 使 用 A:B=34:4， 夏 天 使 用 A:B=139 或 2 : 
8。 ,以 上 四 种 包 埋 剂 ， 篆 忌 潮 气 。 配 制 前 ”所 用 器 材 均 需 烧 十 5 

包 埋 前 ， 如 是 用 酒精 脱水 ,得 在 转 入 Epon 包 前 经 环 氧 丙 烷 三 
次 ， 每 次 30 分 钟 ， 然 后 再 换 六 环 氧 丙 烷 和 环 氧 树脂 , flHd2 的 混合 
液 中 ,停留 2 小 时 或 过 夜 ， 让 环 氧 丙烷 慢 慢 蒸发 掉 引 酒 用 环 氧 ; 树 
脂 三 pon312 混 合 液 换 2 一 6 次 。 在 37 一 -457 下 聚合 12 小 时 习 漫 后 在 
60C 下 聚合 48 小 时 。 启 符 : 二 、 有 

包 环 氧 树 脂 Araldity502 或 cy212 的 配方 5 伐 

Araldity5(2 人 


we 了 SS。 


DDSA 18ml 
MNA -ml 
DMP=-30 (296 ) 0.8ml 
用 酒精 脱 永 后 ;逐渐 换 入 环 氧 丙 烷 ， 最 后 省 纯 混 合 桂 昌 中 过 
夜 。 在 80C 下 聚合 48 小 时 。 


” 环 氧 树脂 618 | 5 ml 
顺 丁 烯 三 酸 本 〈 固 化 剂 ) o5 站 兰 识 所 过 公 g 太 | 
茶 三 甲酸 二 丁 酯 〈 人 简称 DBP 增 
塑 剂 )》 于 1.5 一 2m] 
二 己基 苯胺 (diethy' aniline 加 速 刘 ) 0.4dml 


| 桨 6 世 让 在 30mi 的 小 烧杯 册 加 热 至 807Z 备用 。 加 入 顺 丁 笑 二 
酸 栈 ， 在 807 温 箱 中 继续 放 5 一 10 分 钟 . 使 其 溶解 并 搅拌 均匀 。 冷 
却 到 守 温 :加 入 DBP， 搅 拌 5 分 钟 备 用 。 用 前 半 小 时 逐 滴 加 入 二 
乙 基 茶 胶 ， 加 完 后 继续 搅拌 5 一 10 分 钟 ， 即 可 使 用 。 和 包 埋 和 烤 料 在 
:37C 和 45C 下 各 也 小 时 ) 最 后 在 60C 下 聚合 148 小 时 。- 

三 ”@@Spurr 氏 环 氧 树 脂 : 是 一 种 长 粘度 的 环 氧 树脂 。 化 学 名 称 
为 Viny7l cycloherene dioxide (YCD) 


Spurr“s 环 氧 树脂 配制 比例 
了 硬度 (g 或 mT) 
“名 称 二 

| 标准 | 征 3 
VCD(CVYinyl cyclohcxene 昌 鲜 禾 院 前 全 10 区 10 
DER736(Diglycidyl 和 最 间 of EolypTopylene 人 om 4 | 

slycol)( 增 塑 剂 ) 

NSAINonenyl Suceinic anhydride( 因 化 剂 ) 6 26 


| 
DMAE(Dimiethyl aminoethanol)( 加 速 剂 ) 


0 .1 0.4 [0.4 


酒精 脱水 之 后 ， 逐 渐 加 大 Spurr 氏 混合 液 的 浓度 。 最 后 在 宇 
脂 混 侣 液 中 停留 一 夜 。 在 70C 温度 下 聚 侣 了 2 小 时 即 可 。 


。 了 99 。 


超 藩 切片 技术 是 电镜 错 技 术 中 应 用 得 最 多 和 景 重要 的 一 个 环 
节 。 它 为 电子 显微镜 观察 提供 极 莫 的 样品 万 片 寺 齐 癌 二 机 在 500 
一 1000 久 左右。 这 矶 太 98 森 x 葡 

1 .切片 机 民品 

主要 分 孝 及 胀 式 和 机 械 淮 进 式 两 种 。 前 者 以 ERB 型 号 的 超 小 
切片 机 为 代表 ， 后 者 以 Porter 一 Bum 型 号 为 代表 ， 两 种 仪器 性 
能 都 很 好 ， 都 有 一 个 装 样品 抉 指 活 动 臂 , 臂 .可 下 运动 时 通过 刀刃 。 
在 每 次 切 莉 冲程 的 同时 ， 样 品 臂 对 着 刀刃 作出 微小 的 推进 ， 切 片 
得 以 从 样品 抉 揭 表面 上 赔 落 下 来 o 国 上 装 有 一 个 含 液体 的 小 水 槽 ， 
切片 离开 刀 刃 就 漂浮 在 水 槽 竟 液 面 上 。 858 邵 ， - 

23 玻 璃 刀 

至 璃 刀 是 目前 使 用 得 最 普遍 的 一 种 超 活 切 六 刀 了 近年 来 全 用 
钻石 刀 的 也 不 少 。 虽 使 用 寿命 长 但 价 线 较 贵 5 玻璃 夯 制 作 方便 价 
格 剑 定 ， 可 用 制 五 机 侈 刃 。.EEE 制 九 机 将 玻 耽 条 世 成 站 5X2 55cm 
的 小 方志 ， 再 制 成 不 闻 角 度 的 玻璃 刀 。 一 把 好 刀 为 刃 必 须 平 直 ， 
冲 入 要 小 。 在 聚光灯 下 用 双 简 立体 晶 微 镜 可 以 检查 习 刃 的 好 坏 去 
在 高 倍 镜 下 ， 最 佳 部 分 的 刃 刃 是 一 条 平 喜 的 亮 线 。 拒 折光 粗 有 名 
此 的 刀 慷 部 分 一 不 能 用 来 切片 7 一般 选 内 左 便 的 帮 口 人 可 用 太刀 


占 整个 刀 辣 前 二 二。 刀 上 装 上 一 个 不 漏水 的 永和 异 。 它 于 常用 爹 


局 条 或 胶带 制 遍 ， 再 用 清洁 的 石 赋 封 住 金属 或 胶带 与 牙 斑 的 结合 
口 ， 以 咏 漏 水 。 水 槽 液 一 般 用 重 蒸 人 饮水 。 和 这 短 训 AQ 
3. 样 品 块 :QT 

直通 村 类 若 吉 所 而 一 瑞 失 站 椒 导 并 术 革 汪汪 全 
修 块 的 目的 龙 除 去 组 织 周 围 志 余 的 双 埋 介质 或 不 需要 的 部 分 5 使 
切片 尽 可 能 被 所 观察 的 材料 所 占有 。 样 品 决 表面 的 形状 可 根据 包 
埋 材 料 的 形状 而 定 ， 通 常 修成 梯形 ， 也 可 修成 长 方形 卉 璋 彩 的 项 
这 与 底 边 平 行 ， 底 边 应 稍 长 于 页 边 ， 这 样 才 易 切 出 连续 前 亏 生 5 


。400。 


本 本 六 
WE 本 


SECtaosreceamisroeoergs Segagigageesweercue 和 sa aecipar 全 


ricewaaibiion 坟 人 


-Re 


Asoh 


也 有 利于 切片 离开 刀刃， 避免 同 片 粘 住 万 丸 的 毛病 。 ， 

4 样品 块 与 刀 尺 的 调整 
“把 标本 和 刀 分 别 安 装 好 ， 使 包 晶 当面 的 平行 边 与 刀口 平 行 ， 
-向 前 转动 切片 机 粗 调 旋钮 ， 慢 慢 把 刀 推 进 标本 ， 再 用 细 调 节 推进 ， 
直至 在 双 目 解 齐 镜 下 观察 时 ， 刀 和 它 的 反射 光 之 问 的 黑色 间 破 消 
失 为 止 , 这 时 样品 与 刀 的 距离 已 很 近 了 。 当 样品 与 刀 对 准 后 ,就 要 
进 的 行 切片 ,每 一 冲程 切 下 一 片 切片 - 切 于 来 的 切片 一 般 应 为 连续 
切片 带 ， 如 不 成 带 ， 出 应 重新 修整 块 面 ; 使 上 下 边 调 平行 ， 切 束 
适当 慢 些 ， 或 换 一 把 径 利 的 刀 。 切 片 的 厚度 可 用 仪表 调节 ， 但 所 
指 的 是 样品 艾 的 热 进 尺 厚度 ， 并 非 代 表 切 片 的 实际 厚度 志 切 片 厚 
庆 一 般 根据 水 模 内 切片 的 表面 和 下 表面 反射 的 光 所 产生 的 干涉 色 
来 判断 。 银灰 色 和 白色 时 切片 大 约 是 500 一 700 入 ， 金 色 及 紫色 的 
切片 太 厚 ,无 法 进行 观察 。 一 般 切片 15 一 20 分 钟 后 即 可 停机 进行 捞 
片 操作 。 这 时 ， 开 动 切片 机 上 的 冷却 扇 江 使 样品 车 冷却 。 约 10 分 
钟 关 电扇 ,再 重新 调整 祥 品 块 的 距离 ,继续 切片 。 捞 取 切 片 时 ， 先 
用 睫毛 笔 将 切片 带 分 成 小 段 。 用 锰 子 夹 住 铜 网 的 边缘 ， 直 接 贴 在 
水 槽 中 的 贡 片 上 轻 轻 提 走 即 可 。 贴 有 样品 的 铜 网 ， 放 在 洁净 的 滤 
纸 上 , 于 后 保存 或 进行 娄 色 。 ， 

5. 制 备 优良 切片 的 条 件 及 切片 中 的 问题 

(1) 切片 的 成 功 与 否 多 数 依赖 于 包 埋 组 织 和 包 埋 树 脂 的 硬度 
搭配， 但 脱水 与 浸透 也 是 很 重要 的 。 在 配制 包 埋 剂 时 ， 应 确保 树 
脂 充分 混合 ;样品 浸透 完全 ， 以 及 聚合 时 均匀 一 致 ， 软 硬度 要 适 
市。 和 包 翰 硬度 大 ， 可 以 切 较 薄 的 切片 ， 包 进 顽 比较 坎 多 则 可 以 切 
出 较 天 的 切片 。(2) 样品 块 的 切削 面积 大 小 对 切片 也 有 影响 ， 要 
蕊 薄片 时 , .应 把 样品 块 顶 端 修得 细小 。(3) 刃 的 角度 也 很 重要 ， 
一 般 适 中 指 组 织 块 选 用 45。 左右 的 划 痕 和 角 ,3 一 5 的 间隙 角 。(4) 东 
槽 中 的 水 面 应 与 刀口 在 同一 平 而 上 》 或 略 低 于 刀口 s 5) 册 速 慢 
可 得 到 较 大 切片 ， 切 速 快 可 得 到 较 薄 的 切片 。 要 切 出 没有 刀 痕 3 
空洞 及 其 它 疫病 的 ， 平 整 并 粘连 成 直 带 的 切片 ， 是 电子 显 微 技术 
中 最 难 操作 的 。 


。401。 


在 切片 过 程 中 会 出 现 闸 痛 、 刀 痕 、 跳 片 及 切片 带 水 等 问题 。 
影响 切片 质量 及 观察 效果 ， 产 生 有 缺陷 的 切片 ;所 乎 总 是 因为 刀 、 
刀 角 、 渗 透 、 聚 合 有 问题 或 者 技术 操作 不 熟练 而 几乎 可 以 忽略 
正 代 化 切片 机 发 生 故 障 而 造成 切片 的 缺陷 。 切 入 中 的 薇 障 很 难 列 
表 分 类 5 因为 在 切片 过 程 中 存在 许多 相互 关连 的 变量 。 切 片 时 产 
生 与 万 日 平行 的 有 规则 的 厚度 不 匀 的 带 ， 这 川 闸 痕 ， 多 是 由 于 切 
速 过 高 或 振动 引起 的 ， 可 减低 切 速 ， 减 小 刀 角 并 排除 引起 铂 动 的 
因素 。 如 果 切 片 粘 在 块 的 上 边缘 并 随 着 块 的 下 降 而 消失 ， 这 主要 
是 因为 用 钝 刀片 修 桩 品 块 所 致 ， 样 品 块 的 边缘 必须 修得 你 镜子 般 
光滑 平整 ， 还 有 一 个 可 能 是 块 面 湿 了 。 也 可 能 切 册 厚薄 交替 的 切 
片 ， 原 因 是 刀 太 钝 、 样 品 渗透 不 好 或 树脂 成 分 混合 不 久 引 起 的 不 
规则 聚合 。 切 片 时 二 次 切 上 一 次 没有 切 寺 称 为 跳 片 现象 。 这 时 切 
片 厚 度 是 预期 的 两 倍 。 造 成 此 现象 的 一 种 可 能 是 预定 进 刀 的 量 太 
小 ,这 种 情况 下 切片 是 灰色 的 ， 可 以 加 大 芍 进 尺 , 直 到 切 到 切片 为 
止 。 大 果 交 替 切 片 星 紫色 或 更 厚 时 ， 可 以 换 一 把 万 。 当 样品 块 过 
软 或 修得 过 陡 时 ， 也 易 产 生 跳 片 现象 。 块 软 时 ， 可 在 60C 下 燃 一 
夜 ， 使 之 变 硬 , 太 陡 的 块 则 应 重新 修整 。 由 于 刀刃 上 有 缺口 ,在 切 
片上 形成 一 种 垂直 于 刀刃 的 纹路 叫 万 疗 ， 纠 正 的 方法 是 使 用 刀刃 
的 不 同 部 分 。 切 片 时 ， 如 果 永 构 液 面 杰 高 ， 样品 通过 刀刃 时 会 将 
液体 带 过 刃 背 ， 出 现 这 种 情况 时 ， 可 用 滤纸 小 心地 将 祥 品 块 面 及 
万 背 上 的 水 吸 干 : 当然 在 要 片 过 程 中 示 会 过 到 吉 问 题 ， 那 就 要 
在 长 期 实践 中 ， 掌 扣 各 种 程序 的 训 领 ,才能 排除 各 种 故障 ， 技 出 
补 落 的 办 法 ， 切 出 理 起 的 超 落 切片 。 

6 .染色 

目的 是 增加 样品 的 反差 ， 使 超 微 结 $ 鬼 能 充分 暴露 并 便于 观 
察 。 

(1) 组 织 块 染色 : 在 脱水 期 间 进 行 * 色 。 二 地 琵 用 前 过 名 
有 0.1 一 1% 磷 钨 酸 (ETA) 的 70% 的 酒精 溶液 ,组 织 去 染 30 分 钟 ， 
主要 染 蛋 和 白质。 另外 最 常用 的 妆 液 是 1 一 2% 醋 酸 双 氧 钠 的 75%% 酒 
精 溶液 ,组 织 在 染 液 中 停留 玫 小 时 ,也 可 以 过 夜 。 组 织 艾 也 司 枯 1 


02 


一 2%% 栈 酸 铀 的 无 水 酒精 中 染 1 一 2 小 时 ， 安防 也 交大 评 称 放 友 再 入 
了 
Ca) 本目 下 凶 ， 通 人 用 的 到 方 法 是 采 用 了 村 和 村 
苹 钳 双 染 和 法 。 这 里 仅 介 绍 一 种 染色 方法 。 

外 铀 染 液 配方 : 醋酸 双 氧 ? 殉 加 502 (到 本 hl 充分 浊 们 
拌 ， 用 NaOH 将 p 瑟 调 至 4 一 5。 

全 钳 数 液 ， 也 叫 三 铅 染 液 。 用 硝酸 铅 、 酷 酸 铝 ， 柠 衬 酸 语 各 18 
加 蒸 改 水 60ml. 以 上 混合 液 在 407 下 搅拌 数 分 钟 . 加 2g 柠 榜 酸 钠 : 
搅拌 数 分 钟 江 然后 加 .4%NaOH16ml， 再 加 蒸 馆 水 使 总 体积 为 ; 
100mB 蛋 标 色 瓶 保存 。 此 液 在 室温 下 可 保存 一 年 "用 时 将 产 液 /天 
重 蒜 水 稀 才 ; (1:7)7z 

个 深 人 双方 法: 用 吸管 吸取 染 液 ， 滴 数 江 至 培养 严 内 的 蜡 盘 或 
螨 纸 上 .用 狠 子 取 载 网 漂浮 在 染 液 上 染色 :切片 面向 下 ,: 业 3 一 5 
分 名 后 /用 重 蒸 未 洗 数 次 过 用 杀 子 取 载 网 轻 轻 接触 滤纸 亏 忆 了 极 去 
多 剑 的 水 ,用 铀 染 过 的 载 网 放 在 滴 有 铅 染 液 的 液 滴 上 ， 包 面 朝 下 
约 10 分 钟 ,取出 后 用 重 蒜 水 选 数 次 ,2 用 滤纸 琢 去 参 余 的 水 ， 干 后 
名 可 观 等 或 保存 备用 。 


《三 ) 电子 显微镜 细胞 化 学 技术 ， 


下 韦 子 显微镜 细胞 化 学 技术 也 叫 电 镜 组 织 化 学 或 超 微 化 学 。60 
年 代 国 际 上 把 电子 显微镜 技术 与 组 织 化 学 结合 起 来 成 为 电子 显 微 
镜 的 组 织 化 学 技术 : 电镜 细胞 化 学 技术 发 展 很 快 ， 应 用 范围 日 益 
扩大， 技术 方法 不 断 改 进 和 增多 。 它 的 目的 是 将 形态 结构 、 化 学 
成 分 和 功能 联系 起 来 研究 ， 对 在 超 微 结构 中 的 化 学 物质 进行 定位 
研究 。 咀 壹 : 

电镜 细胞 化 学 显示 的 方法 是 从 光学 显微镜 艾 组 织 化 学 演化 而 
来 ， 倡 与 光 镜 组 织 化 学 不 同 ， 电 镜 的 组 织 化 学 不 是 以 产生 颜色 反 
应 为 依据 ， 而 是 利用 细胞 化 学 产物 的 电子 不 透明 度 来 进行 识别 和 
定位 的 它 不 用 染色 也 能 看 得 见 。 所 以 电镜 样品 制备 的 主要 特点 
是 利用 特异 的 化 学 反应 :产生 不 洲 性 电子 致密 沉淀 物 。 在 显示 细 


“403。 


胞 琴 吡 学 物质 的 定位 时 要 求 :@ 保 持 组 织 和 细胞 兰 好 的 形态 结构 
如 果 结 构 失 真 ， 则 定位 困难 。@ 具 有 高 度 的 特异 性 ， 易 于 鉴别 所 ; 
示 物 质 竟 属 类 ， 才 能 对 实验 结果 作 正 确 分 析 。 人 @@ 应 有 一 定 的 灵敏 
度 ， 才 能 显示 极 微 的 含量 。@ 生 成 的 反应 产物 必须 在 原 位 沉淀 9 
保证 定位 的 精确 性 及 稳定 性 。 
1. 电 锐 细 胞 化 学 的 几 个 步 驰 8X 衣 :条 
电镜 细胞 化 学 要 求 保 存 细胞 组 织 的 形态 ， 材 料 须 经 固定 、 脱 
水 、 包 埋 和 切片 等 处 理 。 醛 类 和 四 氧化 铁 可 作 保 存 细胞 微细 结构 
的 男 定 剂 5 最 常用 的 醛 为 友 二 醛 和 多 聚 甲醛 册 它 们 可 尼 保 存 微细 
结构 及 酶 活性 ， 有 时 也 可 用 二 者 的 混合 液 作 固 定 剂 5 用 中 性 的 二 
甲 砷 酸 钠 缓 冲 液 配制 醛 溶液 。 醛 的 浓度 为 0.2 一 2%， 浓度 术 高 会 
破坏 酶 的 活性 ， 损 伤 细胞 的 微细 结 榴 固定 后 料 品 块 要 用 冷 的 组 
冲 液 神 洗 开 次 ， 一 般 在 工 小 时 以 上 ,也 可 以 过 夜 赋 以 上 步骤 应 在 
40C 下 进行 。 材料 经 戊 二 醛 初 固定 后 ， 要 冷冻 切 成 40 二 1004 本 的 菏 
片 ， 然 后 进行 邬 化 反应 。 用 铁 酸 作 后 固定 。 后 固定 能 稳定 已 被 醛 
保存 前 微细 结构 ， 可 经 受 脱水 包 埋 的 处 理 。 用 猴 酸 作 后 固定 是 电 
党 细胞 化 学 必须 步骤 。 
2 . 酶 的 细胞 化 学 
酶 的 细胞 化 学 方法 是 研究 酶 在 细胞 内 的 分 布 。 酶 活性 是 靠 对 
底 物 的 作用 来 显示 的 。 所 以 对 于 梅 的 最 示 ， 所 用 试剂 应 比较 纯 ， 
钱 育 的 温度 和 保温 方法 要 得 当 。 让: 
(1 5 核 音 酸 酶 能 众 化 核 六 核 音 和 去 氧 核糖 核 音 的 5 磋 位 上 
的 磷酸 。 它 可 被 镁 离子 和 锰 离 子 激活 5 而 为 所 化 钠 C0.IMD 引 确 酸 销 
(0.08MD 所 抑制 。 中 性 5- 核 音 酸 酶 的 最 适 pH 为 71581 该 酶 常 
与 膜 结 合 ， 存 在 于 许多 不 同类 型 的 细胞 上 。 在 植物 中 ， 主 要 存在 
于 核 噶 、 质 有 谍 及 内 质 网 上 ， 而 在 动物 中 则 多 在 浆 驱 如 肝 细 胸 的 胆 
毛细 管区 域 的 浆 蝶 ， 内 皮 细 胞 近 血 守 的 浆 膜 上 。 它 与 环 腺 昔 一 磷 
酸 CAMBP) 系统 有 关 ， 影 响 细 胞 功能 的 调 沾 太 核酸 的 降解 . 电 
镜 显 示 5- 核 苷 酸 酶 的 方法 ， 是 以 腺 苷 一 磷酸 为 廊 特 中 在 pH7.2 的 
情况 下 分 解 出 磷酸 ,磷酸 立即 与 铬 结合 形成 磷酸 铬 沉淀 物 5 曲 镜 细 
“404。， 


胞 化 学 采用 Wachstein 及 Meisel (1957) 提出 的 方法 .操作 步 又 如 
下 ， 

全 固定 ， 迅 速 切 下 组 织 ， 切 成 lmms 的 小 块 ， 放 入 0.1M 二 甲 
砷 酸 缓 冲 液 配制 的 2% 戊 二 醛 中 。 在 4C 下 ， 动 物 组织 固 定 1 小 时 ， 
植物 组 织 固定 2 小 时 。 

@@ 洗 洗 : 在 40C 下， 用 0.1M 二 甲 砷 酸 缓 冲 液 冲 洗 组 织 2 小 时 
以 上 或 过 夜 ， 中 间 换 2 一 3 次 。0.1M 砷 酸 缓冲 液 中 含 5 % 蔗 糖 及 
10% 二 甲 基 亚 硕 。 

四 在 低温 下 ， 将 样品 块 切 成 40 一 100km 的 薄片 。 在 37C 下 久 
育 30 分 钟 。 

对 照 则 应 在 是 育 前 ， 将 样品 加 热 ， 使 酶 失 活 ， 并 应 去 掉 多 育 
波 中 的 底 物 5- 核 背 酸 酶 。 


钱 育 液 的 配制 方法 : 
0.2M Tris 一 malecate pH7.4 4m1l 
5- 核 香 酸 钢 5 mg 
重 燕 水 4ml 
2%% 硝 酸 铅 0.6ml 
2.5% 和 毛 化 锰 1.0ml 


由 艇 育 后 ， 用 0.1M 二 甲 砷 酸 缓冲 液 冲 洗 2 一 3 次 。 

回 用 0.1M 砷 酸 缓冲 液 配 成 的 1% 猴 酸 固 定 2 小 时 。 

加 后 固定 后 用 重 燕 水 冲洗 几 次 。 

@@ 用 各 级 浓度 酒精 脱水 ， 在 脱 永 过 程 中 可 用 栈 酸 双 氧 铀 染 
色 。 

轿 按 常规 方法 浸 酯 、 包 埋 。 聚 侣 后 作 超 东 切 片 ， 用 铀 染 不 用 
锁 染 即 可 进行 电镜 观察 。 

(2) 葡萄 糖 -6- 克 酸 酶 (G6PFase) 

动物 体内 的 肝 、 茎 和 肠 烙 网 细胞 中 ， 均 含 葡萄 精 -6- 磷 酸 酶 ， 
它 与 微粒 体 结合 ， 定 位 于 光 面 内 质 网 上 。 它 能 将 糖 原 分 解 为 葡萄 
糖 ， 进 入 循环 而 维持 血糖 ， 因 此 是 精 代 谢 的 关键 酶 ， 此 酶 的 亿 损 
可 导致 一 些 肝 糖 原 储存 的 疾病 。 在 植物 中 ,对 该 酶 还 未 作 过 大 晤 


。405 。 


研 窜 : Hall (1977 年 ) 等 人 交 竺 猎 菜 的 细胞 质 膜 和 液 泡 膜 上 发 现 
有 该 本 竟 定位 。 

葡萄 猪 -6- 磷 酸 酶 在 pH6 时 活性 最 强 ， 在 PH8 时 景 稳定， 机 在 
pH5 时 就 会 变性 。 细 胞 化 学 反应 药 最 适 pH 为 8.5 一 6.72 此 时 葡萄 
糖 -6- 磅 酸 水 解 并 释 出 磷酸 。 它 与 钳 结 合 可 生成 不 运 明 的 颗 往 沉 
淀 。 操作 步骤 如 下 : 

他 用 0.1M 二 甲 砷 酸 绥 冲 液 配制 的 2% 友 二 酝 ， 内 全 8 兴 蔗 锋 ， 
在 47 下 固定 30 分 钟 。 

加 二 甲 砷 酸 组 种 液 (0.13M;pH7:2， 含 蕊 注 8 办 ) 4 神 尝 1 小 
时 。 

轩 洽 汇 切 成 100km 左 右 。 

四 在 下 述 溶液 中 钱 化 30 分 钟 ，37T 。 

葡萄 糖 -6-- 磷 酸 钠 (或 钊 ) 盐 .12.5tmg 


燕 饮 求 13.5iml 
0_ 2M 一 Tris 一 maleate 缓 冲 滚 〈DH6.7) 10m1 - 
2% 硝 酸 销 发 计 5 
莽 “ 糖 | 8 


回 用 0 J1HM 砷 酸 缓冲 液 冲 洗 2 一 3 次 

用 15 全 酸 二 时 下 本 组 入 液 轩 定 1 一 ?小 时 | 4 全 

加 各 级 浓度 活 精 赔 水 ;然后 浸 酯 。 

@ 环 氧 树 酯 包 埋 。 ee 

(3) 腺 昔 酸 环 化 酶 (Acase) or 

腺 苷 酸 环 化 酶 能 使 ATP 转 变 为 CAME， ,CAMP 进 入 茵 胞 质 中 ， 
使 胞 质 中 CAMP 浓度 增高 ， 而 引起 各 种 特异 反应 。 因 此 ，CANME 
被 称 为 第 二 信使 。CAMP 与 激素 有 关 ， 与 分 化 和 细胞 分 发 也 有 交 a 
腺 苷 酸 环 化 酶 和 哺乳 类 组 织 细 胞 浆 戏 有 关 。 它 存在 于 动物 浆 戏 上 ， 
控制 着 细胞 内 酶 反应 的 速率 。 廊 物 中 它 定位 在 质 膜 核 腊 和 内 质 网 
下 它 的 最 适 pH 为 7.4。 可 被 Mg 离子 激活 ， 常用 Reik(1970) 


等 大 的 方法 进行 电镜 观察 。 
加 站 1% 戊 二 醛 (0.5M 二 甲 砷 酸 一 硝酸 缓冲 液 半 BE7. 42 售 


es 06。 


-局 ewaWTs m 
0 
1 和 eahesaocaeyonn 上 全 


省 


人 


3 4.5 站 的 葡萄 糖 ) 中 园 征 1 一 2 小 时 。 玫 组 种 波 :( 含 4.5% 和 葡萄糖 ) 


” 洗 一 夜 后 ， 切 成 小 块 。 


，-@ 在 80 有 : 育 介质 中 温 育 30 一 -60 分钟 。 


温 育 液 航 成 分 如 下 : 
DBH7.4 的 Tris 一 maleatic 缓 冲 液 80mM 
茶 碱 琵 可 王 下 呈 9mnM 
,1 硫酸 匀 4mM 
,ATP 《或 AMP-ENP) 035mM 
兰 司 硝酸 铅 18mM 
这 葡萄 糖 8% 


:@@ 缓 冲 液 洗 2 一 3 次 。 狐 酸 图 征 1 一 2 小 时 。 脱水 后 ; 树 脂 包 


(4) 酸性 磷酸 酶 (ACP) 引 

酸性 磷酸 酶 为 非特 异性 酶 ;六 泛 分 布 于 动物 组 织 中 , 如 前 列 
蛛 、 肚 及 肝 等 ， 红 血球 里 也 有 。 大 部 人 芬 组 织 中 定位 于 深 酶 体内 ， 
在 植物 组 织 中 则 主要 分 布 在 细胞 壁 、 该 泡 和 核 中 。 洲 酶 体 的 细 跑 
化 学 研究 ， 对 了 解 宪 病 的 免疫 反应 和 细胞 损伤 的 影响 有 一 征 意 

它 药 最 适 BBS 为 4.5 一 5.5。 大 多 数组 织 的 酸性 磷酸 了 酶 能 变 氛 化 
钠 记 抑制 。 

国 固 定 ， 在 4C 条 件 下 , 用 2% 戊 二 醛 〈0.1M 二 甲 砷 酸 盐 缓冲 
液 配 制 ，5H7.4) 国定 1 一 2 小 时 5 

四 洗 漂 ， 用 二 里 砷 酸 缓 冲 液 冲洗 。 样 品 切 成 50Um 隐 小 块 。 

四 钱 育 :- 在 378 条 件 下 角 育 30 分 钟 ，pH5.0 一 5.3。 钥 育 流 


,的 成 分 如 干 : 
B- 甘 油 磷 酸 钠 〈 用 1NHCI 调 pH 友 5.0) 12 :5mS 
12% 硝 酸 销 ( 终 浓度 3 .3mM ) 0.Janl 
蒜 饮水 .0ml 
0.2M Tris-maleate 绥 冲 液 : (PH5.0) 2jJ0ml 
0.2% 硝 酸 铅 ( 终 浓 度 2.4mM) 2.0ml 


外 缓冲 波 冲 洗 后 再 用 重 共 水 洗 。 脱 水 、 包 埋 等 按 常规 方法 进 


-一 


行 。 
对 照 组 的 是 育 液 ， 应 免 去 底 物 8B- 甘 油 克 酸 销 ， 而 加 入 氟 化 钠 
(0.01M )。 


(四 ) 扫描 电子 显微镜 


1965 年 开始 生产 高 品 的 扫描 电子 显微镜 。 这 种 仪器 的 最 大 特 
点 ， 就 是 能 使 物体 的 图 像 呈 现 出 明显 的 三 维 结 梅 特征， 而 透射 电 
锐 的 图 像 是 二 维 的 。 近 年 来 ,扫描 电镜 已 广泛 应 用 于 生 牺 学 、 医 学 、 
古生物 学 、 地 质 学 、 物 理学 以 及 治 金 学 、 半 导体 工 王 \、 痪 瓷 工 
业 、 化 学 工业 等 学 科 领 域 及 生产 部 门 ， 从 而 促进 了 各 有 关 学 科 的 
发 展 。 

1 .扫描 电镜 的 - - 般 结 构 及 原理 


扫描 电镜 一 般 可 分 为 三 个 重要 的 组 成 部 分 (图 4-4)。 
灯丝 = 


<- 信 号 放大 和 处 理 系统 
探测 器 3 


图 4-4 ”扫描 电镜 前 结构 原理 
(1) 用 以 产生 扫描 运动 的 电子 束 〈 即 电子 探 针 ) 系统 ， 兴 包 
括 三 疹 分 ， 电子 枪 、 电 磁 透 镜 和 扫描 线圈 。 
电子 枪 发 射出 来 的 电子 束 ， 在 加 速 电 压 的 作用 十 〈 从 2 于 伏 
到 3 千 伏 之 间 ), 经 过 三 个 电磁 透镜 ， 会 聚 成 30 一 50A 的 电子 束 。 
在 位 于 物镜 上 部 的 打 描 绕 圈 的 作用 下 ， 电 子 束 聚焦 于 样品 表面 ， 
作 光 栅 状 扫描 又 击 。 


。408 。 


圭 ” 《2) 电子 束 射 入 样品 表面 ， 就 可 以 发 生 二 次 电子 。 二 次 电子 
的 多 办 随 入 射 点 的 止 凸 状态 而 变化 。 利 用 这 种 现象 ， 就 可 以 得 到 
样品 表面 的 各 种 信息 〈 如 图 4 一 5) 
在 扫描 电镜 中 ， 用 来 成 像 的 信号 主要 是 二 次 电子 ， 其 次 是 背 
反射 电子 , .这 是 因为 二 次 电子 像 的 分 辨 率 较 高 所 用 作 晶 体 学 分 析 
电子 探 针 。 答 。 


透射 电子 “ 
图 4-5 “电子 对 桩 品 激发 产生 的 信息 
的 信号 主要 是 背 反 射电 子 和 二 次 电子 。 因 这 两 种 信和 号 能 产生 电子 
通道 效应 。 用 来 分 析 成 份 的 信号 主要 是 X- 射 线 和 俄 歌 电子 。 因 这 
两 种 信号 的 能 量 直 接 表征 元 素 的 性 质 。 

(3) 对 样品 产生 的 信号 的 收集 、 处 理 和 显示 ， 首 先决 定 于 信 
号 本 身 的 类 型 和 实验 目的 ， 在 观察 样品 形 艇 的 实验 中 ， 收 集 的 主 
要 是 二 次 电子 及 部 分 背 反 射电 子 。 扫 描 电 镜 的 成 像 系 统 如 图 4-6 
所 示 。 电 子 束 从 样品 表面 擅 激 发 出 的 信号 ,被 检测 器 所 俘获 .检测 

电子 探 针 


图 4-6 成 象 过 程 示 意图 


上 


器 包括 一 个 闪烁 器 积 紧 接着 的 光 导 管 。 电 子 信号 通过 检测 器 转换 
成 光子 ， 再 经 过 光电 倍增 系统 和 放大 器 转换 成 电 正信 号 届 最 后 孝 
送 到 显 象 管 的 栅 极 土 。 显 象 管 中 揭 电子 东 在 管 面 击 也 作 光 栅 状 扫 
找 ， 而 且 与 电子 探 针 在 样品 表面 上 的 扫描 运动 同步 江 加 到 糯 极 上 
的 电压 信号 ， 可 以 对 显 象 管 面 上 的 光 点 亮度 进行 控制 。 其 而 就 可 
以 获得 甚 衬 度 与 所 接收 电子 信号 的 强 谍 有 对 应 关系 的 扫描 电子 
象 ， 直接 显示 样品 的 外 和 狐 ， 最 终 的 成 像 具 有 突出 的 三 维特 征 。 如 
乓 要 得 到 一 幅 较 好 的 图 像 ， 可 利用 电磁 透镜 将 电子 东 事 得 绍 些 ， 
使 电子 扫描 形成 的 水 平 线条 允 些 ， 照 像 的 阳 光 时 间 要 长 一 些 。 

2 .生物 样品 前 制作 方法 送 每 

生物 样品 不 同 于 全 物 和 人 金属， 它 具 有 和 柔软 含水 份 多 的 特征 。 
在 高 真空 的 电子 显 俭 锁 中 观察 样 晶 时 ， 必 须 进 行 相 应 散 前 处 理 。 
件 品 制作 方法 按 国定 、 脱 水 、 临 界 点 干燥 及 路 镀 等 顺序 进行 。 

(1L) 清洗 : 样品 表面 的 污染 物 用 生理 盐水 进行 清洗 。 样 尼 切 

好 放 六 0.2M 二 甲 砷 酶 缓冲 液 中 放 1 一 2 分 印 。 

(2) 图 定 : 样 显 放 入 2% 的 成 二 醛 和 2 % 多 聚 甲 醛 混合 液 中 (用 
0.1M 二 甲 碍 或 销 缓冲 液 瑟 )， 男 定 2 小 时 以 上 或 过 夜 。 用 缓冲 流 
冲洗 2 一 3 次 。 

用 1% 匆 配 二 四 碑 酸 缓冲 流 后 固定 2 淋 时 . RE 
动 ] - 六 

(3) 冲淡 : 用 冷 的 二 四 砷 酸 钠 缓冲 液 评 洗 3 总， 再 用 需 燕 水 洗 

wa 

(4)》 脱 永 ， 用 30 一 100% 的 上 升 系 列 酒 糖 脱水 。 

(5) 晓 水 之 后 进行 痢 界 终点 干 烛 。 

临界 点 干燥 的 原理 是 ， 液 体 在 某 一 温度 和 压力 之 下 !( 即 在 临 
界 点 时 )* 界 画 就 会 消失 。 利 用 这 种 现 旬 ， 将 生物 样品 放 在 这 种 液 
体 之 中 ， 加 热 到 界面 消失 的 状态 时 ， 再 慢 怪 旋 出 气体 ， 使 之 与 外 
界 气 压 相 等 ， 在 没有 表面 张力 作用 的 情况 下 ， 使 样品 于 燥 。 这 就 


中 赂 异 点 二 焊 法 。 - 般 用 作 临 界 点 的 处 理 波 头 COs、 氢 立 哩 、 液 


氮 。 有 临界 点 干燥 的 具体 方法 如 于 


s。 4]0， 


和 oa 


@@ 无 水 酒精 脱水 之 后 ， 把 样品 在 醋酸 异 友 酯 中 浸泡 ?0 分钟 至 
1 小 时 。 

@@ 用 滤纸 吸 去 样品 上 多 余 的 醋酸 异 戊 酯 ,把 它 装 入 样品 笼 中 ， 
笼 内 事先 要 放 上 一 层 泪 纸 。 为 防止 样品 和 干燥， 最 好 把 滤纸 用 醋酸 
蜡 戊 酯 浸 湿 。 然 后 把 样品 笼 放 入 有 临界 点 干 巢 器 的 样品 室 中 ， 迅 速 
盖 好 。 

图 注 入 液体 CO;: 向 样品 室 中 注入 液体 CO。 事先 应 将 样品 
室 冷 却 到 比 室温 低 10C， 这 样 CO，, 易 进入 样品 室 。 有 的 人 在 样品 
笼 韵 上面 放 三 小 块 如 方块 糖 大 小 的 于 冰 ， 使 祥 品 室 降 到 - 207C 左 
在 。 然 后 注入 液体 CO:。 注 入 液体 Cos 后 的 压力 比 一 般 60 一 70 坏 
气压 略 低 。 但 是 样品 室 恢 复 到 室温 时 ,压力 就 常常 升 到 100 企 大 气 
压 以 上 。 这 时 ， 应 稍 放 点 气 ， 使 气压 下 降 到 保险 阅 不 开 药 程度 。 

样品 室 中 液体 CO.: 的 充 鳃 程度 ， 可 从 梓 品 室 盖 上 面 的 歌 璃 窗 
查看 。 

也 在 室温 下 着 置 和 液体 CO: 的 更换 ， 打 开 加 热 器 开关 在 207 
放置 15 一 20 分 钟 。 样 品 中 的 酷 酸 异 戊 酯 向 液体 CQ, 中 扩散 。 打 开 
放 气 阅 ， 放 出 含有 醋酸 异 友 酯 的 液体 CO9,， 使 得 液 往 CO 的 界面 
达到 刚好 淖 没 样品 短 的 部 位 。 从 钢瓶 注入 新 的 液体 CQ:。 如 果 有 必 
要 ， 这 一 步骤 可 以 反复 数 次 。 如 果 气 温 过 高 ， 这 一 步 则 可 省 路 ， 
因为 第 二 次 注入 液体 CQ: 不 易 作 好 。 

念 期 温 : 将 祥 品 室 加 温 至 临界 点 盘 育 〈31.4D ) 以 上 《例如 
各 忆 7 这 时 样品 室 的 液体 C9，* 界 而 消失 ， 全 部 变 成 气体 状态 .将 
恒温 器 的 刻 育 调 到 40C， 桩 品 室 就 可 由 动 加 温 。40C 时 蚂 力 表 一 
季 应 达到 110 个 大 气压 以 上 ， 如 果 气 压低 于 110， 说 明 注 入 的 液体 
CO: 少 了 ， 痢 界 点 于 烛 就 会 失败 。 

国 气体 的 放出 : 在 样品 室 加 温和 前 状态 下 ， 放 出 CSG: 气 。 放 出 
的 流量 一 般 是 1.0 一 1.5L/min。 放出 全 部 气体 需要 40 分 名 左 右 。 
压力 表 园 到 零 对 ， 打 开 样 品 室 ， 取 出 样品 。 

加 人 金属 路 镀 : 干燥 后 的 生物 样品 要 进行 真空 暑 涂 ”使 生物 样 
品 表面 具有 导电 性 。 金 属 在 真空 中 名 热 到 某 种 程度 时 ， 就 会 急 出 


9 子 了 了 9 


蒸发 ， 蒸 发 的 金属 在 真空 中 就 会 落 在 〈 附 着 在 ) 样品 表面 。 样 品 
应 放 在 金属 喷 度 源 的 对 面 。 

一 般 的 真空 喷 度 仪 ， 是 在 抽 到 10- 5 一 10- 毛 的 真空 室 ( 钟 
墨 ) 里 ， 插 有 几 根 电极 ， 把 加 热 器 连 在 电极 上 ,将 磺 镀 料 料 加 热 。 
由 於 扫描 电镜 样品 的 表面 凹凸 不 平 ， 真 空 喷涂 时 ， 要 将 样品 进行 
倾斜 旋转 ， 每 分 钟 约 自动 旋转 100 转 左右 。 加 热 器 一 般 用 直径 为 
0*5 一 1Lmm 的 钨 丝 。 扫 描 电 镜 用 的 喷涂 材料 为 0.1 一 0:5mm 的 金 丝 
或 金 一 色 合 金 丝 (Au+Pd，6:4)。 一 般 的 金属 阳 厚 度 为 3 一 30nm。 
喷涂 的 速度 越 快 ， 喷 镀 戏 的 颗粒 就 越 细 。 样 品 倾斜 旋转 的 时 间 需 
要 工分 钟 左右 。 哮 涂 后 先 等 几 分 钟 ， 使 喷涂 稳 定 ， 再 向 真空 室 
( 钟 罩 ) 内 放 入 室 气 ， 恢 复 大 气压 。 

表面 极度 四 凸 不 平 而 形态 微细 的 禅 品 ， 在 喷涂 金属 以 前 最 好 
先 暑 镀 一 层 碳 。 喷 碳 的 方法 是 ， 把 一 对 前 端 齐 成 铬 笔 状 的 石墨 碳 
棒 ， 用 弹 筑 轻 轻 地 顶 着 对 在 一 起 ， 先 加 热 到 接触 点 变 红 ， 以 使 污 
染 物 飞 掉 (此 时 用 挡 短 遗 住 样品 表 商 ) ,然后 很 快 增 夫 屯 流 ， 做 两 
三 次 瞬间 喷 镀 。 碳 蝎 交 厚 度 为 5 一 10nm。 也 有 在 石 墅 矶 棒 的 尖端 
沾 上 和 白金 丝 将 碳 和 白金 同时 路 镀 的 方法 。 

金属 喷涂 之 后 ， 即 可 进行 扫 摘 电镜 观察 。 

(6) 扫描 制 样 失 败 的 原因 

@@ 脱 水 不 充分 时 ， 酶 酸 异 友 酷 和 液体 CO: 就 置换 不 好 ， 于 燥 
出 不 会 完全 。 

@ 液 体 CD: 没 装 满 样 品 室 ， 而 禅 品 室 加 时 。C9; 液 面 穿 过 
样品 ， 由 于 表面 张力 的 作用 ， 就 会 使 微细 结 攀 变形 。 

1 图 垫 圈 不 好 ， 样 品 室 不 能 密闭 ， 样 品 室 癌 外 漏 气 ， 而 使 实 验 
失败 。 和 

3 .生物 样 唱 的 断裂 法 

断 异 法 也 骨 割 断 法 ， 是 利用 扫描 电镜 观察 细胞 和 组 织 前 内 部 
结构 而 采用 的 断 肥 方 法 .目前 断 允 方法 很 多 ,这 里 简单 介绍 两 种 ” 

(1) 环 氧 树脂 断 懈 法 ， 用 环 氧 树脂 Epon812 或 Araldite Gy- 
260 均 可 .- 环 氧 树脂 812 必 须 冷 至 -807 才 能 国 化 ,Araldite 天 约 在 


一 3070 左 右 固 化 。 

电 取 新 鲜 样 品 切 成 细 长 棒状 1x1x5mm。' 

@@ 放 入 固定 液 中 ， 冲 洗 后 用 各 级 酒精 脱水 。 

四 样品 换 入 环 氧 丙烷 中 30 分 钟 。 再 侵入 1:1 的 环 氧 丙烷 和 树 
脂 的 混合 液 内 数 小 时 。 容 器 不 要 盖 上 ， 使 环 氧 丙烷 慢 慢 挥 发 掉 。 

也 包 埋 : 胶 襄 里 装 满 树脂 ， 将 样品 插入 其 中 ， 放 置 一 夜 , 但 
不 能 把 聚 和 剂 放 入 树脂 里 。 样 品 浸 透 不 一 定 要 很 充分 。 

@@ 固 化 , 用 低温 恒温 器 和 低温 冰箱 将 Araldite 冷 却 到 - 30D， 
环 氧 树脂 812 要 冷却 至 -80C。 冷 冻 剂 用 乙 栈 和 干冰 或 液 氮 。 如 用 
液 所， 则 用 TF 一 1 割断 器 (Eikd 厂 出 )。 

@ 上 断裂 用 刀具 和 小 机 将 样品 断裂 。 刀 具 可 用 单 刃 的 刊 脸 刀 
片 ， 刀 片 夹 在 两 个 竹 板 之 间 。 制 断 台 可 用 木板 ， 在 上 面 做 一 个 放 
胶 塞 的 浅 槽 。 

割断 时 将 刀具 放 在 装 有 样品 的 胶 圳 上， 用 小 檀 散 击 ， 用 力 要 
适当 ， 使 样品 不 发 声音 就 被 敲 断 ， 其 断面 似 玻 璃 一 样 光 洁 。 

巴 除 去 树脂 : 将 割断 的 样品 投入 环 氧 丙烷 中 。 树 脂 被 溢 去 后 ， 
样品 沉 六 溶 器 底部 。 用 银子 将 胶 襄 取出。 2 小 时 后 ， 更 换 见 次 环 
氧 两 烷 ， 使 样品 里 浸入 的 树脂 完全 除去 。 如 树脂 没 被 完全 去 掉 ， 
样品 就 得 不 到 良好 结构 。 

四 临界 点 和 干燥， 将 样品 移入 醋酸 蜡 成 栈 中 进行 临界 点 于 燥 。 

(2) 酒精 断裂 法 : 将 70% 酒 精 滴 在 液 所 中 就 会 冻结 固化 ， 自 
然 出 现 裂 除 。 本 方法 就 是 利用 这 一 原理 。 

四 将 液 氮 装 入 葵 乙 烯 泡沫 塑料 制 成 的 杯子 中 ， 上 面 套 一 个 带 
孔 的 铝 腊 盘 。 液 氮 通 过 盘 孔 上 升 , 铝 鸡 盘 上 面 放 一 个 铝 夸 , 铝 开 里 
也 装 满 液 氮 。 

@@ 用 滴 管 吸入 70% 的 酒精 ， 同 时 也 吸入 已 固定 好 的 组 织 ， 将 
它们 滴 入 馈 夸 里 的 液 氮 中 。 

@@ 滴 下 的 酒精 立即 冻结 ， 并 在 液 面 上 来 回旋 转 ,2 一 3 秒 钟 后 ， 
就 沉 入 碟 底 自然 断裂 。 

@@ 将 断裂 的 样品 连同 铝 碟 放 入 冷冻 干燥 器 中 干燥 。 


。41 了 3 


用 这 种 方法 所 做 出 的 断裂 面 是 不 定向 的 ， 断 在 件 玄 方位 ， 事 
先 无 法 奖 定 。 如 果 不 要 求 断 裂 在 一 定 的 地 方 ， 可 使 用 本 方法 ， 样 
品 以 水 为 宣 。 

有 些 生物 材料 如 木材 、 牙 齿 、 毛 发 .骨骼 和 指甲 等 硬 的 组 织 ， 
只 要 去 掉 表 面 的 尘土 和 粘液 ， 不 要 作 任 何 处 理 即 可 进行 观察 。 但 
观察 前 必须 晓 上 一 层 导电 物质 。 许 多 单 细胞 .培养 细胞 ,游离 细胞 
及 血细胞 等 对 固定 液 的 渗透 性 特别 敏感 ， 固 定时 要 特别 注意 调节 
缓冲 液 及 国定 液 揭 浓度 。 wo 

4. 扫 挠 电镜 在 生物 学 上 的 应 用 

扫描 电镜 技术 的 应 用 ， 丰 富 了 生物 学 科 的 研究 实 戌 ， 扫 描 昌 
镜 能 显示 整体 生物 的 整个 轮廓 。 细 菌 、 单 细胞 、 癌 细胞 及 微生物 
等 在 扫描 电镜 下 拍 成 的 图 片 除 具 吝 立 体感 外 ， 还 可 以 看 到 细致 的 
体形 及 表面 结构 ， 如 鞭毛 、 伪 足 、 纤 毛 及 表面 上 的 花 八 图 型 等 。 
在 肿瘤 生物 学 研究 中 ， 扫 描 电 镜 可 以 显示 正常 细胞 和 读 瘤 细胞 在 
整体 形态 和 表面 结构 等 方面 的 差异 ， 可 以 找到 正常 细胞 如 何 变 成 
肿瘤 细胞 的 线索 。 例 如 有 人 发 现 肿 瘤 细 胞 的 体积 要 比 正 常 的 大 。 
表面 的 微 突 及 小 泡 等 数目 长 得、 大 小 以 及 其 他 特征 都 显示 吊 串 瘤 
细胞 的 代谢 特别 旺盛 。 植 匠 学 中 可 用 扫描 电镜 观察 古代 及 现代 花 
粉 粒 的 结构 。 对 植物 器 官 建成 的 研究 ， 可 以 清晰 地 了 解 植物 某 一 
器 官 的 形成 过 程 。 如 对 小 麦 和 玉米 穗 分 化 的 观察 ， 可 为 农业 生产 
所 供 有 益 的 参考 资料 。 农 业 上 研究 植物 揭 病 起 害 、 良 种 裁 绕 、 植 
牺 的 生长 发 言 渴 律 等 都 离 不 开 对 它们 的 花粉 、 种 子 ， 生 长 维 、 根 ， 
荃 、 叶 以 及 它们 的 细胞 变异 和 形态 差异 进行 观察 。 这 些 可 通过 扫 


的 电镜 来 取得 清晰 的 图 像 和 丰富 的 细节 。 使 用 扫描 电镜 除了 可 以 


本 生生 休 四 名 外 区 人 可 的 检 记 让， 二， 和 生生 全 于 
性质 了 根 价值 ， 

(五 ) 核酸 分 子 的 电镜 技术 

利用 电子 显微镜 观察 10* 疙 左右 的 核酸 分 子 是 完全 可 以 的 ,但 


人 4] 也 


至 要 的 问题 是 ， 这 类 大 分 子 的 反差 弱 ， 所 以 要 象 在 溶液 中 那样 ， 
保持 完整 核酸 分 子 的 构 型 而 不 断裂 ， 是 不 容易 的 。 自 从 kleinsch- 
miat (1962 ) 提出 核酸 分 子 蛋白 质 单 分 子 则 技术 以 来 ， 这 人 一 方法 
已 得 到 广泛 的 应 用 。 其 优点 在 于 ， 应 用 了 和 蛋白质 单 分 子 瞳 作为 核 
酸 分 子 的 基 肛 ， 在 二 定 程度 上 保证 了 核酸 分 子 的 完整 性 。 这 种 方 
法 又 得 到 了 进一步 发 展 ， 迄 今 用 于 电子 显微镜 观察 的 已 有 多 种 方 
法 ， 这 里 介绍 最 常用 的 儿 种 隐 酸 样品 制备 的 方法 。 

核酸 分 子 蛋白 质 单 分 子 膜 技术 可 分 为 三 种 ， 展 开 法 .扩散 法 、 
一 步 释 放 法 。 其 原理 是 :很 多 球状 蛋白 质 能 在 水 溶液 和 盐 深 液 的 
表面 形成 不 深 性 的 变性 功 膜 ， 在 适当 条 件 下 这 一 省 哎 可 形成 单 分 
子 层 。 核 酸 分 子 在 蛋白 质 的 氨基 酸 碱 性 侧 链 基因 的 作用 下 ， 可 吸 
附 在 蛋 外 质 单 分 子 层 上 。 人 然后 转移 到 发 网 上 ， 利 用 旋转 投影 增加 
反差 。 最 常用 的 蛋白 质 是 细胞 色素 C、 也 可 使 用 及 诫 乃 蛋 由 酶 、 
牙 蛋 由 酶 、 核 糖 核酸 酶 、 溶 菌 酶 等 。 

1. 铺 鸡 展 开 法 

未 方法 适用 于 已 提纯 的 DNA。 将 提纯 的 DNA 样 品 与 碱 性 蛋 
自 细 胞 色素 C 制 成 混合 液 ， 然 后 在 下 相 深 液 液 面 上 铺 成 单 分 子 层 ， 
再 用 具有 了 膜 的 铜 网 捞 出 DNA 相 碱 狂 蛋 白 的 单 分 子 层 ,干燥 后 进行 


塌 葛 喷涂 。 


(1) 破 性 蛋 自 单 分 子 层 铺 制 法 
他 展 开 湾 深 ， 0.1 毫 克 / 毫 升 的 细胞 色素 C，0 .5 一 2 稚 训 /毫升 
前 CDNA 深 液 。 禾 剂 为 0.5 一 1M 的 醋酸 狂 溶 液 , 并 含有 ImaM 的 乙 二 
膀 四 亏 栈 二 销 ， 整 个 溶液 欧 PH 为 7.5 一 8.0。 

砚 下 相 溶 液 ， 为 醋酸 镑 溶液 ， 浓 度 为 0.25M。 下 相 溶 液 的 琵 
酸 狗 浓 度 要 比 展开 溶液 低 . 下 相 溶液 也 可 使 用 1 %% 的 甲醛 肪 的 盐 深 
液 。 

合 展 开 分 子 层 ， 取 直径 10 厘 米 的 培养 轩 ， 洗 净 烘 干 后 ， 在 其 
内 壁 丁 周 淋 上 石 畏 磨 光 ， 注 满 0.25M 酷 酸性 下 相 溶 液 。 将 洗 渔 的 
湿 哉 坡 片 慑 斜 15* 左 右 浸入 培养 田 下 相 深 液 中 , 另 二 端 放 在 培养 蝇 
边缘 上 - . 云 交流 表 而 上 撒 上 少许 滑石 粉 。 用 微量 注射 如 政权 10 一 


9 0 


20 微 天 的 展开 液 一 在 离 下 相 湾 液 表面 约 工 厘米 左右 指 载 玻 片 上 济 
下 ， 并 令 其 流 到 下 相 溶液 表面 ， 使 之 展开 铺 成 DNA 及 蛋白 质 的 单 
分 子 层 ， 此 时 滑石 粉 颗 粒 被 推 疝 四 周 。 荐 置 2 一 ?分 钟 后 ，) 用 具有 
哎 之 载 网 ， 膜 面向 下 粘 起 单 分 子 层 。 

外 染色 : 单 分 子 层 取 出 后 ， 先后 在 85 2 半天 水 汪 枚 一 地 玉生 
约 20 秘 左右 。 取 出 后 ， 用 下 纸 吸 去 留 在 表面 上 的 酒精 使 之 于 爆 。 
为 了 增加 样品 的 反差 ， 在 捞取 单 分 子 膜 后 ,用 2% 醋 酸 双 氧 秽 酒 精 
液 染色 1 分 钟 汪 然后 风 于 。 

人 旋转 投影 ， 将 捞 有 核酸 单 分 子 层 的 载 网 放 入 真空 缆 膜 仪 中 。 
在 真空 10- = 壬 条 件 下 ;， 载 加 台 以 30 一 60tpm 的 速度 旋转 ;同时 将 
30 一 50A 厚 的 一 层 金属 龟 久 合 金 蒸发 到 载 网 土 的 核酸 单 分 子 层 
上 。 投 影 时 ， 义 发 源 到 样品 载 贺 的 距离 应 大 于 8cmo。 投影 角 -5 一 7 
度 蝶 涂 工分 钟 。 投 影 后 的 样品 即 可 进行 电镜 观察 。 

(2) 甲醛 胺 技术 

用 40% 的 甲 酰 腕 作 展 开 深 滚 ， 其 中 含 0.5ugyjinLDNA,，0.02 
一 0.1mg/ml 的 细胞 色素 C 及 0.1MTris 绥 冲 液 一 (内 含 10mM EDTA 
一 Na*，PH8.5)。 溶 液 在 用 前 1 一 2 小 时 内 配制 。 

下 相 溶液 。 为 1omM Tris 和 1mM EDTA-Na,， (PH8.5》 淤 在 
10% 的 甲 酰 胺 中 。 制 片 方法 同上 。 

(3)》 G- 胺 盐 法 

上 相 洲 液 ，0.2M_ Tris 缓冲 液 加 EDTA_Nas (PH 
8.5)。 每 mm 组 冲 液 加 G- 胺 盐 0 .log。EINA 样 品 40u1， 训 1002LG- 
胶 盐 溶液 。 也 可 接 样 品 : .G- 有 盐 =50:100 或 者 100:100 的 比例 配 
制 。 

“于 胡 溶 液 为 重 蒸 水 。 

炸 片 后 用 2%% 的 酷 吉 交 双 氧 钠 的 90% 酒 精液 桨 2 分 钟 ， 可 不 必 叶 
涂 : 

G- 胺 盐 有 二 种 ; 即 省 代 十 六 烷 基 三 甲 膀 (Cre Hey BIN)， 


其 特点 是 展 层 快 ， 另 一 种 为 溴 代 十 八 烷 基 三 甲 胺 ,特点 是 展 层 慢 。 


一 般 常 用 省 代 十 六 烷 三 甲 胺 。 


416。， 


(4) DNA 水 滴 展 层 法 这 

DNA 水 滴 展 层 法 是 把 上 相 溶 波 在 一 沉 蒸 饮水 上 展开 。 聚 四 和 握 
乙 稀 板 上 刻 有 和 孔径 从 2mm 一 1cm， 深 1mm 的 太 小 不 等 的 孔 穴 - 酸 洗 
准 后 ， 每 个 孔 中 放 一 滴 重 蒸 水 或 下 相 溶 液 ， 液 面 呈 圆 球 状 。 在 球 
状 液 上 ， 揪 入 0.1lcm 直 径 的 玻璃 棒 ， 用 微量 注射 器 吸取 10UI 含 有 
DNA 样 品 的 上 相 溶 液 , 将 之 顺 着 清洁 的 玻璃 棒 流 下 ，DNA 分 子 蛋 
白质 复 就 在 水 滴 表 面 上 展开 。 然 后 小 心地 从 水 滴 侧 面 把 玻璃 棒 移 
开 ， 用 注射 器 吸出 0.1 凤 的 水 或 下 相 溶液 ， 以 压缩 单 分 子 层 ， 再 用 
具 膜 铜 网 捞取 。 然 后 进行 脱水 、 娄 色 、 及 王后 旋转 投影 。 本 方法 
的 优点 在 于 同时 可 制作 几 个 样品 。 

(5) 水 展 层 

上 相 溶 液 为 醋酸 贸 。 酷 酸 铵 的 浓度 为 6M 取 10Uu1 酷 酸 猴 加 5 X 
10-:Mtris-HCI 缓 冲 液 和 5 x10-sM EDTA pH8.5 各 105l DINA 
0.2 一 20g/ml; 细胞 色素 C 2mg/ml 10ul 最 后 加 三 燕 水 使 总 体积 
为 60Ul。 

下 相 溶 液 为 2M 酷 酸 镁 或 蒸 馆 水 

铜 网 捞取 单 分 子 层 后 用 2% 的 醋酸 双 氧 锁 90% 酒 精液 染 10 秒 
钟 ， 酒 精 脱水 二 次 ， 滤 纸 吸 干 多 余 水 份 。 用 铀 久 〈(Pt-Pd) 合金 
在 8 角 下 投影 。 

2 .扩展 法 也 叫 扩 散 法 

先 将 奏 性 蛋白 在 液 面 铺 成 单 分 子 层 ， 而 后 将 此 单 分 子 层 移 至 
核酸 深 液 的 液 面 ， 令 核酸 分 子 扩 散 并 吸附 到 蛋白 质 单 分 子 膜 上 。 
采用 此 法 时 须 有 特制 的 小 液 槽 , 槽 中 的 隔 板 将 液 槽 分 成 两 个 部 分 ， 
一 边 放 权 液 ， 另 一 边 放 核 酸 溶液 。 先 将 两 条 干净 的 有 机 玻璃 条 放 
于 槽 液 一 边 。 铺 蛋白 质 单 分 子 层 后 ， 用 这 两 条 有 机 玻璃 将 薄膜 移 
至 核酸 溶液 的 一 边 ， 使 核酸 分 子 扩散 到 单 分 子 层 并 吸附 在 上 面 。 
扩散 法 适用 于 RNA 或 分 子 量 较 小 的 核酸 分 子 ， 也 即 链 较 短 的 
DNA。 单 分 子 层 在 核酸 溶液 表面 需 停 较 长 时 间 ， 一 般 需 要 10 分 鲜 
至 3 个 小 时 以 上 。 

展 层 时 槽 液 可 用 0.05M 柄 酸 匀 (PH7)， 铺 制 蛋 白质 单 分 子 层 


。417。 


用 1M 栈 酸 锭 。 细 胞 色素 C 药 浓度 为 100mB/ 名 下 清和 全 和 05 
ng/mB0.65M 栈 琶 猴 溶液 。 aa RE 
5. 一 步 大 放 法 也 电 屎 素 释 放 法 合击 浸 
利用 上 大 涛 液 和 下 相 湾 液 问 项 浓度 将 巨大 差 绎 ， 产生 浴 透 民 ， 
的 变化 ， 在 蛋 昕 质 单 分 子 膜 销 开 的 过 程 中 局 时 使 核酸 直接 从 渍 
毒 、 叭 菌 体 、 细 菌 、: 兰 生 质 体 , 或 含有 核酸 的 细胞 回 中 酸 旗 出 来 ; 
从 而 简化 了 核酸 的 分 高 和 提纯 工作 。 具 体 方法 是 订 取 0.5ml52 
10? 噬 万 体 T4/ml 加 到 1.5ml 的 5M 尿 素 溶液 中 ,室温 放置 知 分 钵 后 ; 
加 入 0.5mlL2M 的 醋酸 匀 洲 波 ， eggsgpisiupisiasusoooca 
成 展 层 深 液 。 
展 层 方法 与 上 面 的 核酸 样品 展开 法 同 。 
有 人 用 葵 基 二 甲烷 基 匀 毛 BAC) 低 分 子 化 合 物 所 形成 的 分 
子 朵 来 代替 蛋白 质 单 分 子 膜 ， 获 得 较 好 结果 人 
相同 。 不 同 之 处 在 于 电 BAC 代 蔡 细 有 跑 色 素 Cs 芷 
在 观察 某 一 核酸 分 子 时 ， 应 加 入 已 知 下 态 和 长 度 的 核 玖 分 了 
作为 对 早 。 


过 昌 说 


第 五 节 ， 染 色 体 显 带 方法 


染色 体 显 带 是 细胞 遗传 学 研究 指 主 要 方法 之 一 .在 ,Gaspersos 
(1971) 介 绍 荧光 显 带 (Q 带 ) 方 法 之 前 ， 较 型 分 析 主 要 是 根据 染色 
体形 态 和 着 丝 点 位 置 的 差别 来 进行 的 。 Q 带 和 以 后 发 展 竟 G 带 WCG 
带 、Ag 带 (NORs) 及 Cd 带 等 显 带 方法 ， Gegpanc io， 。 
出 明确 的 友 定 。 铬 刘 


(一 )Q 带 
用 时 放 因 染 料 染 色 的 中 期 染色 体 ， 会 由 现 恬 征 竹 的 荧光 这 带 


= 418 。 


和 陪 带 ， 一 般 富 AT-DNA 才 现 为 亮 带 ， 富 GC-DNA 则 荧光 较 旷 。 
当然 ， 染 色 体 蛋白 质 、 染 色 质 状态 等 其 它 因 素 ， 对 明 赔 带 了 岂 有 影 
栅 。Q 带 显示 方法 ， 简 单 迅速 ， 园 一 制 片 还 可 以 再 用 其 它 革 二 放 
潜 芝 多 只 这 和 祥 方 法 对 于 人 类 染色 体 长 营 远 端 区 的 妆 色 是 特异 竹 
的 。 该 法 的 缺点 是 嫉 色 后 不 能 保存 ， 人 
观察 时 ， 此 须 使 用 荧光 显微镜 。 
- 1 .芥子 庵 而 因 人 (Quinacrlne mustard，QM) 显 示 Q 带 

(1 试剂 

作 生 榜 酸 磷酸 缓冲 液 

0 .RE 柠檬 各 湾 液 70ml 与 0.2M 磷 酸 氢 二 钠 溶液 300m1 混 合 
pH7.0。 

名 用 上 述 缓冲 液 配制 0.05mg/mL QM 溶 液 ， 5 条 件 下 可 
保存 6 个 月 。 

(2) 操作 步骤 

届 窑 芝 于 操 法 制备 的 染色 体 标 本 ,依次 通过 95% .70% 笨 502 
乙 芒 溶液 ， 经 燕 饮水 后 ， 转 入 符 檬 酸 缓冲 液 。 

四 在 QM 洲 液 内 染色 20 分 钟 。 

外 用 组 证 液 漂 洗 三 次 ， 加 盖 后 在 荧光 显微镜 下 检查 。 根 据 欧 
光 强 弱 可 延长 或 缩短 在 磷酸 缓冲 液 中 的 漂洗 时 间 。 

四 欧 光 最 微 锁 检 查 : HBO 200w/4 水 银 灯 垂直 照明 。 用 BG12 
激发 滤 片 和 1 个 510mm 屏 项 滤 片 ， 

2 .盐酸 唑 因 (Quinacrine GiFydrcchlioride) 

(1) 空 气 干燥 的 染色 体制 片 在 0.5% (wy/v) 盐酸 喉 昨 因 水 溶液 
中 ，DH5.5 和 .0 室温 染色 6 一 8 分 钟 。 

(2)》 自 求 水 冲洗 2 一 3 分 钟 后 ,用 无 离子 水 漂洗 ,加 盖 片 镜 检 。 
若 发 现 过 度 闪 光 可 取 下 重 盖 。 

(3 Q 带 摄影 可 参考 下 列 条 件 ，KodaK -Sol15 胶卷 ， 感 光度 

19" ， 了 上 阳光 1 分 钟 左右 ， 显 影 液 D19， 显 影 时 间 6 分 钟 . 放 大 纸 选 用 
Gekko V-3， 高 反差 显影 液 显 影 。 


a 4]9 3 


(二 )G 带 


用 蛋白 质 水 解 酶 .NaOH 柠檬 酸 盐 或 尿素 等 处 理 中 期 染色 体 


制 片 均 可 显示 G 带 。 这 可 能 和 染色 体 蛋 白质 的 修改 或 染色 体 DNA 
的 变性 与 复 性 有 关 .一般 来 说 ,G 带 与 Q 带 带 型 相符 ,但 也 有 讽 外 ， 
如 Q 带 显示 的 人 体 半 染色体 的 特异 荧光 ， 在 G 带 带 型 上 并 不 出 现 。 


理 ， 瑟 


1 了 人 法 
(1) 试剂 
NaCl :185 Na HRDi 16S oORG 
深 于 1000ml 共 饱 水中， 即 为 磷酸 缓冲 盐水 (PBsS)。 
四 用 PBS 配制 0.25%% 胰 醇 溶液 。 
G@GiemsSa 染 液 。 
(2) 损 作 步骤 
四 空气 干燥 的 染色 体制 片 ， 用 0.25% 或 稀释 过 的 胰 梅 溶液 处 
可 在 室温 或 4 条 件 下 进行 。 根 据 温 庆 ，、 酶 浓度 和 片 龄 等 事 


先 作 试验 ， 寻 找 最 佳 处 理 时 间 。 


仑 胰 酶 处 理 后 在 等 渗 盐 溶液 中 漂洗 5 分 钟 ， 或 免 去 此 步骤 。 
加 双 蒜 水 漂洗 。 
由 用 磷酸 缓冲 液 〈pH 6.8)10:1 稀 释 的 Giemsa 染 色 10 一 15 分 


2.ASG 法 
(1) 试剂 

@2xSScC 溶 液 ， 0 .3M NaCcl 和 0.03M 柠檬 酸 国 ? 

G@Ci Giemsa 光 液 。 

(2) 操作 步骤 

中 新 制备 的 中 期 染色 体制 片 训 入 60 一 865 2xSSC 中 1 一 2 小 


闷 二 


人 BGiemsa 染 色 (5H7.0、 夭 释 50 售 )1 小 时 。， 


旬 和 00m 


二 2 2 人 9 


3 .尿素 法 
(1) 试剂 2M NaCl 和 5M 尿 素 混 合 液 ，pH7.0。 
(2) 操作 步 又 
包 制 片 放 入 上 述 混合 液 内 ，37 和 小 时 。 
外 双 燕 水 漂洗 。 
@@ Giemsa 染 色 20 分 钟 (稀释 40 倍 ，pH6.8)。 


《三 儿 带 


在 C 显 带 方法 中 ，Giemsa 可 将 结构 异 当 色 质 和 高 重复 仁 DNA 
的 区 域 染 色 。 在 人 类 染色 体 上 ， 这 些 区 城 处 于 着 丝 点 和 工 妆 色 体 
长 蔷 贱 ; 

1.Ariighi 和 Xu 的 C 显 带 方法 

(1) 试剂 

GD0.2N HCI 

G@0.07N NaOH 

G@70%、95% 乙 醇 

图 2xXSSC ( 见 ASG 法 ) 

G@6XxSSC 

NaCl 52.58g 

本 柑 酸 钠 26.468g 

燕 馆 水 1000ml 

(2) 操作 步骤 

饥 空 气 干燥 法 制备 的 中 期 染色 体 标本 在 室温 下 ,用 0.2N _HCI 
处 再 15 分 钟 , 蒸 饮水 冲洗 3 次 。 
攻 QNaOH(0.07N) 处 理 标本 2 分 钟 ,用 75% .95%% 乙醇 测 洗 3 次 ， 
册 每 次 5 分 钟 。 车 染色 体 过 于 肿胀 ， 可 换 用 0.02N 或 0.01N NaOH， 

或 缩短 处 理 时 间 (1 分 钟 ，30 秒 或 15 秒 )。 
图 在 玻 片 上 滴 加 2 x 或 6x SSC， 然 后 置 于 湿 僵 中 60 一 65 民 温 
” 背 16 一 20 小 时 。 
外 在 2x ”或 6x SSC 液 中 测 洗 。 


。427， 


昌 在 车 饱 水 中 测 洗 。 
@@70、95%% 乙 醇 测 洗 、 气 干 ; 
人 Giemsa 染色 15 分 钟 。 
2 .改良 方法 
(1 》 试剂 
四 天 XSSC 
GBa(OH): 佑 和 湾流 
直 座 酸 缓 证 液 ，pH6.8 
(2) 操 作 步 又 、 
由 在 BaCc8H)， 饱和 洲 液 中 处 理 3 一 5 分 钟 。 
包 茶 饮 水 种 尝 。 
@@ 在 60xC 2 x SSC 中 处 理 1 小 时 。 
二 蒜 馆 水 冲洗 。 
七 琵 酸 绥 冲 液 配制 的 2%Giemsa 染色 液 染 色 10 分 钊 。 
@@ 燕 饮水 冲洗 。 


(四 ) 妥 带 


及 带 带 型 痊 与 G 带 的 相反 。 

1 .试剂 
0.06M 磷酸 缓冲 注 ，pH6.8 
Giemsa 涂 液 

2 .操作 步 又 

(空气 干 曲 法 制备 染色 体 片 。 


(2) 用 85 一 100Y 药 0.06M 央 酸 组 证 液 走 理 抽 片 5 一 10 分 。 


(3) 再 用 65 包 的 0.06M 联 酸 缓 囊 液 处 理 10 小 时 
(4) 燕 饮水 冲洗 ， 防 干 。 
(5)Giemsa 当 色 。 


9 4202。 


( 豆 )A8g 带 (NORS) 


DNA 一 RNA 分 子 杂交 技术 证 明 ，18 一 28S 核 糖 体 DNALrD- 
NAD) 基 因 ) 即 为 TRNA 编码 的 基因 ， 位 于 NOR 上 ( 核 仁 形成 区 ) 。 应 
用 银 染 技术 ， 可 使 NOR 特 蜡 游 色 。 一 项 斌 为 "只 有 在 !RNA 基因 - 
有 转录 活性 的 NOR 才 能 银 染 着 色 ， 无 转录 活性 的 NOR 不 着 色 。 并 
认为 ， 银 染 的 不 是 核糖 体 基 因 自 身 ， 而 是 和 ITDNA 转 录 有 关 的 酸 
性 蛋白 5 可 见 订 银 桨 显示 的 是 有 转录 活性 的 NOR， 故 可 用 于 研 
| 完 fRNA 前 初 态 变 化 。 应 当 指 出 ， 在 一 些 物种 中 ， 银 妆 阳 性 区 不 
一 定 是 188+28S TDNA 的 位 置 ， 其 生物 学 意义 还 不 清楚 。 该 法 
可 各 其 官 显 带 方 法 联合 使 用 ， 并 可 用 于 着 丝 点 、 中 心 粒 等 研究 。 

T.Ag 一 AS 法 

(1) 试 剂 

中 50%AgNO: 水 溶液 (w/v)。 

四 所 银 液 (AsS): 48-AsNOs 党 于 5ml1 蒸 人 饮水 加 5ml 沪 
NH,OH。 

@@10% 甲醛 ，10ml 甲 醛 ，2g 无 水 乙酸 钠 * 燕 和 伪 水 加 至 100ml， 
用 甲酸 调整 pH 至 5 一 6。 

溶液 中 和 四 贮 于 棕色 瓶 中 ， 冰 箱 内 保存 不 起 过 一 周 。 

(2) 操 作 步 又 

是 在 空气 于 爆 制备 的 染色 体 标本 上 上， 浦 加 AsNDs 液 4 议 ， 
覆 以 盖 片 或 擦 镜 纸 片 。 温 室内 60 温 育 过 夜 。 
四 水 洗 、 于 爆 ， 加 4 潢 As 和 :4 注 10%% 甲 酸 。 

图 加 盖 片 , 镜 检 。 当 染色 体 呈 淡 黄 色 , 着 丝 点 星 棕色 ,NOR 
为 黑色 上 时， 立即 用 水 洗 并 干燥 。 

2 .Ag 一 I 法 

G) 将 新 配制 的 50%AgNOQs, 溢 液 滴 在 焉 片上 上 ， 谢 总 残片 ， 置 
于 温 盒 内 。 

(2)37sC ,二 8 小 时 或 50%2，2 一 5 小 时 ， 进 行 温 育 。 

(3) 水 洗 。 


(4)Giemsa 洛 色 。 


(六 )EudR -- Giemsa 显示 姐妹 染色 体 单 体 的 方法 


在 细胞 培养 过 程 中 ， 加 入 一 定量 的 BadR (5- 省 脱氧 尿 喀 喧 
核 背 ) 后 ,在 DNA 复 制 过程 中 ，BudR 会 取代 胸腺 喀 啶 核 背 而 挫 入 
新 复制 的 DNA 核 背 酸 链 中 。 因 此 ,处 于 第 二 分 裂 周期 的 细胞 中 ， 
同一 染色 体 的 两 条 姐妹 染色 单 体 ,一 条 由 双 股 都 含有 BudR 的 DNA 
链 构成 。 由 于 双 股 均 含 BudR 的 DNA 螺 旋 化 程度 较 低 , 故 对 效 色 剂 
亲 合 力 降 低 。 在 用 Giemsa 染 色 时 , 双 股 均 含 BudR 的 DNA 链 组 成 的 
单 体 着 色 浅 ， 只 有 单 股 含 BidR 的 DNA 链 组 成 的 单 体 则 着 色 深 。 利 
用 这 种 分 化 着 色 特 点 ,可 以 检查 姐妹 染色 单 体 的 交换 情况 CSCE)。 


SCE 方 法 比 染色 体 畸 变 敏感 得 多 。 已 被 用 作 研 究 致 突变 剂 和 致癌 ， 


物 的 细胞 遗传 学 效应 的 一 种 分 析 方 法 。 

操作 步骤 

(1) 绍 忠 进行 培养 ， 以 适当 细胞 浓 关 人 传代。 培养 24 小 时 后 于 
培养 液 内 加 入 BudR5 一 154g/ml， 在 避 光 条 件 下 继续 培养 。 

(2) 细 胞 经 过 两 个 生长 周期 (48 小 时 ) ,培养 终 ne 
入 秋水 仙 素 0.4g/ml( 或 更 低 )。 

(3) 常 规 空气 干燥 法 制 片 。 

(4) 70 烤箱 中 加 热 2 小 时 。 或 将 制 片 放置 1 一 2 天 后 ， 经 1M 
Na:HPO, .12H20，pH82 0，85 处 理 10 分 钟 ， 共 饮 水 漂洗 、 防 
二 号 著 对 要 

(5)Giemsa 潍 和 色 。 


(七 ) 高 分 辨 染色 体 标 本 制备 


通常 使 用 的 染色 体 中 期 分 裂 相 显 带 方法 ， 在 单 倍 体 人 起 只 能 显 

示 大 约 320 条 带 , 较 难 分 析 染 色 体 细微 结构 的 异常 ，1976 年 Yunis 

等 用 氨 甲 喉 叭 使 培养 的 细胞 同步 化 后 ， 再 用 秋水 仙 胺 短暂 处 理 ， 

获得 大 量 前 期 、 前 中 期 和 早 中 期 分 裂 相 。 这 些 时 相 的 染色 体 比 正 

中 期 染色 体 长 ， 显 带 后 可 得 到 更 多 更 细 的 带 纹 ,有 助 于 发 现 细微 
e 424。 


的 染色 体 异 常 和 定位 。 目 前 ， 从 早 前 期 或 更 前 的 时 期 得 到 的 染色 
体 标本 可 显示 3000 一 10,000 条 可 分 辨 的 带 型 。 ISCN(1981) 发 表 了 
人 类 高 分 辨 带 550 一 850 条 带 高 分 辩 模 式 。 

操作 步骤 : 

(1)REMI1640 培 养 液 , 添 加 25% 小 牛 血 清 ， 培 养 外 周 血 72 小 
时 。 

《2) 加 入 胸腺 喀 啶 核 苷 0.3mg/ml1，37*C ， 培 养 17 小 时 后 ， 用 
REMI1640 洗 去 过 量 的 胸腺 喀 啶 。 

(3) 用 5ml 添 加 25% 小 生 血 清 的 RPMI 1640,37S 培 养 5 小 时 。 

(4) 加 入 放 线 菌 素 D ，6g/ml1，60 分 钟 。 

(5) 加 入 秋水 仙 胺 0 .4mg/ml，10 分 钟 。 

(6) 细 胞 移入 10ml 离 心 管 ，3000rpm，10 分钟。 

去 上 清 液 ， 加 入 8ml,37C 的 0.4%KCI 与 0.4% 府 尝 酸 钠 13:1 
混合 液 ， 在 37"C 下 温 育 15 分 钟 : 

(7) 在 低 涂 液 中 加 入 3 :1 甲醇 冰 栈 酸 固 定 液 lIml1， 轻 轻 混 匀 ， 
3000rpm，10 分 钟离 心 。 固 定 和 离心 重复 两 次 。 

(8) 过 夜 后 制 片 ， 在 滴 片 前 离心 ， 去 上 清 液 ， 加 入 新 固定 剂 
8 一 10 注 ， 把 细胞 团 打 散 成 悬 液 。 每 片 1 一 2 滴 ， 滴 在 预 冷 的 载 片 
上 ,在 酒精 灯 上 过 火焰 一 次 (不 要 燃烧 )。 

(9)70S 烤 箱 中 保温 2 一 3 小 时 ， 自 然 冷 却 。 

410) 用 37 辫 的 生理 盐水 配制 的 0.025% 胰 酶 溶液 ，pH7.4， 
处 理 1 一 3 分 钟 。 

(11)Giemsa 染色 15 分 钟 。- 


( 白 棱 华 ) 


ea 425。 


第 五 章 
细胞 工程 技术 


第 一 节 ” 语 物 体 姑 欧 章 传 溪 作 


植物 细胞 工程 包括 植物 细胞 前 离 体 培养 .细胞 突变 体 前 筛选 、 
用 培养 细胞 生产 次 生 代 谢 产物 、 植 蚁 原生 质 注 再 生 、 往 细胞 厅 交 
及 遗传 转化 等 几 方面 的 内 容 。 由 于 这 些 技术 都 以 模 物 离 体 绍 胞 为 
术 料 ， 所 以 也 统称 鞠 植 物体 细 了 胸 遗 传 操 作 。 该 领域 的 研究 在 作 易 
改良 上 有 巨大 药 潜 力 ， 又 是 遗传 学 基础 理论 研究 的 重要 方面 , 因 
而 受到 了 国内 外 专家 的 广泛 重视 .目前 ,以 该 技术 为 基础 的 植 斩 条 
缁 胞 遗传 学 已 成 为 遗传 学 研究 中 发 展 极为 迅速 的 一 门 分 支 学 科 。 

在 本 韦 第 三 章 的 遗传 学 教学 实验 的 第 24 节 中 ， 已 介绍 了 花药 
培养 的 操作 ， 本 节 将 着 重 介绍 原生 质 体 培养 、 体 细胞 杂交 与 细胞 
转化 。 同 时 也 简略 地 介绍 细胞 突变 体 的 铸 选 、 用 培养 细胞 生产 次 
生 代 谢 产物 等 其 他 几 种 技术 。 


(一 ) 原先 质 体 培 养 与 植 力 再 生 
原生 质 体 是 除去 了 细胞 璧 的 裸体 细胞 ,在 适宜 的 培养 条 件 下 ， 


人 426 e 


放 能 青 生 细胞 壁 ， 进 行 细胞 分 裂 ， 并 最 终 再 生 完整 的 植株 。 原 生 


质 体 培 养 是 在 有 限 的 容积 中 集中 了 很 大 的 群体 ， 通 过 原生 质 体 人 
养 ， 选 出 有 益 变 异 前 机 会 也 就 大 大 超过 天 然 变异 。 原 生 质 体 由 于 
去 捧 了 细胞 壁 ， 可 以 互相 融合 ， 使 不 能 有 性 杂交 的 亲本 之 问 可 以 
进行 遗传 物质 重组 ， 辐 时 也 便于 导入 外 源 基 因 ， 在 培养 成 再 生 植 
获 后 ， 外 源 基 因 所 深 制 的 性 状 有 可 能 得 到 表 这 。 所 以 原生 质 体操 、 
作 技 术 已 成 为 镍 物 遗 传 操作 指 重 要 组 成 部 分 ， 为 作物 改良 展示 了 
美好 的 前 景 。 

自从 1971 年 首次 从 祷 草 原生 质 体 再 生出 完整 植株 了 以来， 已 有 
百 余 种 植物 的 原生 质 体 再 生 了 利 株 。 但 很 多 重要 的 经 济 作物 与 粮 
食 厢 物 的 原生 质 体 再 生还 有 困难 ， 培 养 的 技术 还 在 不 断 改 进 。 最 
近 ， 从 水 舟 与 玉米 的 原生 质 体 再 生 了 完整 的 植株 ， 标 志 着 该 项 技 
术 指 巨大 进步 。 原 生 质 体 培 养 大 致 可 分 为 以 下 三 个 步 又， 原生 质 
体 欧 游离、 培养 及 植株 再 生 。 

1 .原生 质 体 前 游离 

(GI) 游离 原生 质 体 欧 起 始 材 料 

灯 物 揭 叶 片 、 花 瓣 、 蔡 散 、 子 叶 、 下 胚 轴 、 幼 根 、 四 分 体 花 
粉 等 各 秘 组 织 都 有 可 能 游离 出 原生 质 体 。 此 外 ， 盒 衔 组 织 与 悬浮 
接 养 药 细 胞 也 是 游离 原生 质 体 常 用 的 诸 料 。 为 了 能 使 原生 质 体 培 
养 获得 成 荔 ， 选 择 适 宜 的 基因 型 与 起 始 组 织 是 非常 重要 的 。 

基因 型 是 决定 培养 效果 的 重要 因素 。 对 培养 的 反映 在 同一 种 
内 的 不 同 品 种 、 品 系 之 间 ， 存 在 着 吸 显 著 的 盖 异 。 所 以 在 尝试 一 
个 新 种 的 原生 质 体 培 养 时 ， 一 定 要 考虑 到 选取 多 种 不 同 揭 亲 本 来 
涯 。 增 加 成 功 的 机 会 。 不 同 的 组 织 来 源 对 原生 质 体 再 生 也 有 显著 
的 影响 ， 量 常用 而 简便 的 著 料 是 叶片 、 子 时 与 下 胚 轴 等 。 但 在 单 
子叶 植物 用 这 些 材 料 就 难以 成 功 ， 木 本 植物 也 未 见 从 针 片 原生 质 
体 再 生 植 株 的 报道 。 愈 伤 组 织 或 悬浮 培养 的 细胞 则 是 被 广泛 地 用 


亚洲 离 原生 质 体 。 


全 叶片 
天 然 生 长 植 栋 的 幼 嫩 叶 片 是 游离 原生 质 体 的 好 诗 料 。 植 江 的 


*。 427 ， 


生长 条 件 对 叶肉 原 生 质 体 的 游离 有 重大 影响 。 一 般 来 说 ， 有 利于 
植株 快速 生长 的 因素 可 以 增加 谤 离 活性 强 的 原生 质 体 的 机 率 。 光 
照 、 温 度 及 水 肥 等 条 件 明 显影 响 原 生 质 体 的 游离 。 此 外， 选取 时 
片 时 还 需 注意 叶片 的 幼 嫩 程 度 与 植株 的 年 龄 ， 一 般 选 用 旺 感 生长 
株 上 的 幼 嫩 而 完全 展开 的 叶片。 

在 游离 原生 质 体 以 前 ， 可 用 一 些 特殊 的 条 件 对 植株 或 叶片 进 
行 前 处 理 。 倒 如 将 土豆 的 试管 苗 先 培养 在 高 光照 条 件 下 ， 游 离 前 
4 一 10 天 转移 到 低 光 照 条 件 下 ， 明 显 提高 了 原生 质 体 的 和 坦率。 植株 
的 前 处 理 还 包括 如 15 的 低温 ，80% 的 高 湿 ， 施 狭 肥 等 。 了 地 有 报 
道 叶 片 在 去 下 表皮 后 ， 用 培养 基 培 养 36 一 48 小 时 ， 人 和 促进 了 原生 质 
体 的 游离 。 还 有 用 4 的 盐 溶 液 、20mM 的 半 肛 氨 酸 溶液 ， 以 及 精 
氨 酸 或 丁 二 胺 等 在 游离 前 处 理 叶 片 。 

@ 无 菌 苗 的 子叶 与 下 肥 轴 

先 将 种 子 经 70% 酒 精 ( 几 秒 钟 ) 与 0.1%% 升 冬 溶 液 (5 二 10 分 钟 ) 
表面 消毒 ， 无 菌 水 漂洗 之 后 播种 在 不 含 激素 的 琼脂 培养 基 上 。 在 
人 工控 制 的 光照 与 温度 条 件 下 培养 几 天 或 十 几 天 之 后 ， 取 其 子叶 
或 下 有 驮 轴 游 离 原生 质 体 。 这 种 材料 的 优点 是 无 需 再 经 表面 灭 菌 的 
处 理 ， 从 而 避免 了 灭 菌 剂 对 材料 的 伤害 。 同 时 ， 子 苗 严 格 地 控制 
征 人 工 的 条 件 下 ， 可 以 比较 培养 基 成 分 、 光 照 与 温度 条 件 对 原生 
质 体 游离 的 影响 ， 得 到 的 实验 结果 容易 重复 。 由 于 材料 并 非 取 自 
田间 ， 受 季节 的 影响 也 降低 到 最 小 程度 。 在 用 这 种 奢 料 时 ， 要 注 
意 子 苗 的 日 龄 、 子 时 的 状态 对 游离 的 效果 有 很 天 的 影响 。 

@@ 外 植 体 来 源 的 愈 伤 组 织 及 晤 浮 培 养 细胞 

幼 德 、 荟 尖 及 幼 时 的 基部 是 常用 的 外 植 体 。 将 它们 表面 消毒 
后 接种 在 含 2 一 5mg/L2，4- 卫 的 MS 或 Ne 培养 基 ( 见 附录 ) 上 ， 愈 伤 
组 织 长 出 忆 后 ， 每 隔 4 一 6 周 继 代 一 次 。 一 般 需 要 继 代 若干 次 后 才 
能 达到 适合 原生 质 体 游 高 的 状态 。 野 浮 细 胞 培养 往往 是 从 盒 伤 组 
织 奢 料 开始 的 ， 组 织 块 放 在 液体 培养 基 中 进行 振 葛 正 养 ， 每 周 继 
代 4 二 2 区 ; 

愈 伤 组 织 或 悬浮 细 胞 前 生长 条 件 对 于 原生 质 体 前 游离 与 再 生 

。428。 


有 重大 影响 。 一 般 来 说 ， 对 数 生长 后 期 的 培养 物 最 适宜 于 游离 原 
生 质 体 。 培 养 基 的 成 分 ， 包 括 各 种 氮 源 、 芯 糖 与 激素 的 含量 都 会 
显著 影响 原生 质 体 的 游离 及 以 后 的 生长 。 这 方面 不 同 的 植物 来 源 
会 有 不 同 的 要 求 。 继 代 培 养 的 间隔 时 间 也 是 重要 的 影响 因素 ， 有 
些 悬 浮 材 料 超 过 3 天 ， 原 生 质 体 的 产量 就 明显 下 降 。 

培养 细胞 游离 原生 质 体 的 不 利 因素 是 染色 体 数 的 不 稳定 性 。 
大 多 数 长 期 培养 的 细胞 培养 物 是 整 倍 体 与 非 整 倍 体 的 混合 物 ， 使 
植株 的 再 生 率 显著 降低 。 建 立 染 色 体 稳定 的 细胞 培养 物 取 决 子 三 
个 条 件 ， sa .外 植 体 的 来 源 ， 例 如 叶 组 织 或 幼 茎 组 织 来 源 的 培养 细 
胞 比 艇 组 织 的 更 稳定 。b. 生 长 调节 剂 的 浓度 ， 例 如 高 激素 的 含量 
往往 与 多 倍 体 相 联系 。c .一 旦 建立 了 二 倍 体 培 养 物 ， 保 持 选 择 压 
力 是 重要 的 ,如 缩短 继 代 培养 的 间隔 时 间 。 从 稳定 的 培养 细胞 游 
离 原 生 质 体 将 有 利于 植株 再 生 。, 

(2) 酶 液 的 组 成 

细胞 壁 由 三 种 基本 成 分 组 成 纤维 素 、 半 纤维 素 及 果 胶 。 这 
三 种 成 分 的 百分比 随 细胞 或 植物 的 种 类 不 同 而 不 同 。 用 来 降解 细 
胞 壁 的 酶 制剂 也 有 三 类 : 纤维 素 醇 、 半 纤维 素 酶 及 黑 胶 酶 。 常 用 
的 酶 可 见 附 录 ， 最 常用 的 纤维 素 酶 与 果 胶 酶 是 Qnozuka R 一 10 与 
Macefozyme 有 一 10 ,而 PectolyaseY23 上 有 具有 高 得 多 的 时 胶 裂 解 栈 
及 多 聚 半 乳糖 醛 酸 酶 的 活性 。 通 常 在 游离 原生 质 体 时 ， 将 几 种 酶 
混合 在 一 起 ， 配 成 混合 酶 液 使 用 。 

去 壁 时 培养 基 的 渗透 压 必 须 与 细胞 质 的 渗透 压 相 平 衡 。 通 常 
靠 糖 或 糖 醇 来 保持 培养 基 的 渗透 压 。 甘 露 醇 与 山梨 醇 是 最 常用 的 
糖 醇 ， 一 般 用 来 游离 叶肉 原生 质 体 。 葡 萄 糖 则 是 常用 作 游 离 培养 
细胞 的 等 活 剂 。 酶 液 或 培养 基 所 需要 的 渗透 浓度 随 原 始 衬 料 的 不 
同 而 不 同 ， 一 般 在 0.3 一 0.7M 之 间 。 要 获得 有 活力 的 原生 质 体 ， 
必须 首先 摸索 最 适宜 的 渗透 浓度 。 

酶 液 中 还 加 入 一 些 无 机 盐 类 或 其 他 化 合 物 ， 如 CaCls， 
&H PoO,、 葡 育 糖 硫酸 钾 等 ， 提 高 原生 质 体 的 稳定 性 和 活力 ， 降 
低 其 破碎 程 度 。 酶 液 的 p 也 值 一 般 在 5.6 左 右 。 


(3) 游离 原生 质 体 前 条 件 

除 酶 液 的 组 成 以 外 ， 要 莫 得 大 量 活性 高 的 原生 质 体 ， 还 必须 
满足 游离 原生 质 体 的 其 他 条 件 。 首 先是 原始 材料 与 酶 液 的 比例 要 
Ce 贤 像 去 掉 下 表皮 的 叶片 或 子叶 这 类 易于 游离 原 具 质 体 的 
村 料 ， 所 需要 的 酶 液 量 相 对 也 少 ， 而 像 愈 伤 组 织 、 基 浮 培 养 细胞 
pe 
激 离 的 温度 控制 在 25 左 右 ， 但 也 有 人 用 低 得 多 前 温度 ;如 世 习 
来 游离 玉米 的 原生 质 体 。 叶 肉 原生 质 体 的 游离 常用 静止 培育 的 方 
法 ， 而 在 游离 培养 细胞 的 原生 质 体 时 往往 需要 轻微 的 操 葛 。 游 离 
的 时 间 原 则 上 是 尽 可 能 得 为 好 。 

引信 居 生 才 估 的 统 松 

通常 用 过 滤 、 离 心 与 漂洗 的 程序 纯化 原生 质 体 。 含 原生 质 体 

的 梅 液 经 孔径 406okm 的 镍 丝 网 过 港 ,| 除去 未 被 酶 消化 的 组 织 
或 细胞 团 。 经 低速 离心 收集 原生 质 体 ， 用 洗 活 液 丙 有 泽 ， 可 离心 
沉淀 ， 反 复 3 一 4 次 ， 洗 去 残存 的 酶 液 与 细胞 碎片 。 泊 浊 济 风 友 分 
通常 与 酶 溶液 中 除 划 以 让 药 成 分 相同 。 

蔗糖 溶液 漂浮 法 能 使 得 到 的 原生 质 体 更 加 纯正 一 致 。 将 锋 丝 
网 过 滤 的 酶 液 与 蔗糖 溶液 混合 ， 使 蔗糖 的 最 终 浓度 达 15 一 202%， 
100xg 离 心 7 一 10 分 钟 ， 完 好 的 原生 质 体 漂浮 在 溶液 表面 。 用 吧 管 
吸出 后 ， 再 用 常规 的 洗 海 液 漂洗 。EFicoll 或 Percel 组 成 的 等 渗 梯 
度 深 容 液 也 被 用 来 纯化 原生 质 体 。 


2 .原生 质 体 培养 

(1) 原生 质 体 的 营养 需要 

不 届 来 汪 的 原生 质 体 有 不 同 的 六 养 需要 。 一 般 来 说 ， 原 生 质 
饰 培养 基 约 基 这 成 放生 恪 关押 用 的 壤 关 大 启 外 机 由 本 攻 生 呈 玲 本 
基 可 见 本 书 的 谢 录 。 


培养 基 中 渗透 浓度 和 钙 含 量 常 与 路 滚 相似 。 不 同 原生 质 体 对 
氨 涯 与 总 氮 量 前 需求 变化 较 大 ， 狂 态 氮 对 有 些 原生 质 体 有 利 ， 面 
对 另 一 些 则 有 害 。 所 以 有 些 培养 基 中 折 态 氮 含 量 降低 而 代 之 以 硬 
- 态 所 或 氨基 酸 。 最 党 :用 的 正 肖 是 区 祝 铺 与 蘑 靖 ， 痪 攻 扩 还 常用 作 


“430。 


Spot 


等 渗 剂 ， 而 莽 糖 作 等 渗 剂 的 浓度 会 对 一 些 原生 质 体 产生 毒害 。 有 


小 焙 养 基 中 还 用 了 其 他 碳 涯 ， 如 木 糖 .纤维 二 糖 及 一 些 有 机 酸 等 ， 
:促进 壁 的 形成 及 原生 质 体 生 长 。 培 养 基 中 生长 调节 剂 的 变化 也 较 


失 ， ;最 常用 的 生长 素 有 2,4 一 D、 蔡 乙酸 (NAA 入 叫 只 乙酸 (IAA) 
等 ， 激 动 素 、 华 基 腺 天 叭 (BAP ) 与 玉米 素 是 最 常用 的 细胞 激素 ， 
浓 庆 一 般 为 0.1 一 2mg/1。 
1 在 培养 一 些 难度 大 的 原生 质 体 时 ， 往 往 在 培养 基 中 加 入 椰子 
证 :未 解 我 蛋 折 等 有 机 物质 。 在 水 称 原 生 质 体 培 养 中 ， 还 附加 了 
本 牛 曾 清 , 蜂 台 桨 等 ， 疏 到 了 浪 好 的 效果 。 墙 养 基 的 pH 值 一 般 为 ， 
5.5 一 5.7， 也 有 特殊 的 例外 。 

(2》 接 养 方法 

人 液体 培养 
5 该 体 潜 层 培养 是 目前 用 得 最 普遍 的 一 种 方法 。 将 原生 质 体 以 
3 一 55105/ml 的 密度 悬浮 在 液体 培养 基 中 ， 用 吸管 将 蕙 液 移 到 
平 阻 惠 ， 再 用 封口 则 封 住 ， 进 行 静 止 培 养 。 要 注意 的 是 液 层 不 宜 
夫 厚 ) 药 二 毫米 为 宜 ， 便 于 氧 的 供应 ; 该 培养 方法 便于 对 原生 质 
体 揭 生长 进行 观察 .照相 ) 同 时 在 培养 过 程 中 便于 降低 培养 基 渗 
站 浓度 等 操作 。 

液体 幸 养 的 另 一 种 方式 是 进行 法 演 或 县 渤 培 养 。 将 悬浮 了 原 
生 质 体 的 液体 堵 养 基 滴 在 平 理 的 盖 上 ， 人 然后 将 盟 盖 翻转 扣 在 亚 底 
上 ， 再 用 封口 膜 封 住 。 液 流 大 小 一 般 为 40 一 100nis 如 果 用 的 不 是 


平王 ,而 是 盖 片 与 带 六 的 载 片 ， 用 矿物 油封 口 , 则 称 为 微 室 培养 。 


如 采用 转制 够 带 多 个 编号 小 穴 的 平 型 进行 培养 ， 称 为 微 半 培养， 


滚 洞天 未 在 0.25 一 0.5U1. 这 些 培养 方法 适宜 于 培养 少量 的 原生 质 
秋 忆 要 注意 菌 是 必须 保持 培养 的 温度， 以 免 培 养 过 程 中 墙 养 基 和 由 


于 蒜 发 而 使 渗透 浓度 发 生 激 剧 变化 。 

加 国体 培 养 

最 带 用 的 国体 培 养 是 用 琼脂 培养 基 。 先 将 琼脂 培养 基 加 热 融 
侦 下 保持 在 43 一 45"C， 然 后 与 等 体积 的 原生 质 体 悬浮 培养 液 混 合 
均 乌 。 混 春 后 琼 刚 的 最 终 浓度 控制 在 0.6% 以 下 ,以 得 到 松软 的 国 


.3431 。 


体 培 养 。 

其 他 的 固化 剂 还 有 琼脂 糖 、 角 又 划 聚 铺 ， 党 酸 盐 。 有 明胶 与 
丙烯 酰胺 等 。 近 来 发 现 琼 脂 糖 的 效果 明显 比 琼 脂 好 。 和 琼脂 糖 与 琼 
脂 的 主要 区 别 是 琼脂 有 更 多 的 负电 荷 ， 琼 脂 糖 对 原生 质 体 培养 特 
别 适 宜 ， 可 能 与 它 的 中 性 特性 有 关 。 

@ 国体 与 液体 转换 的 培养 方法 

固体 培养 如 果 用 藻 酸 盐 或 低 融 点 琼脂 糖 作 凝 胶 剂 。 在 原生 质 
体 发 育成 细胞 团 之 后 ， 将 培养 物 放 在 40 民 中 保温 1 一 2 小 时 ， 培 养 
基 就 会 液化 而 不 伤害 细 驳 ,便于 将 细胞 画 转 移 到 新 鲜 的 培养 基 上 。 

@，” 固体 与 液体 相 结合 的 培养 方法 

将 固体 各 养 的 原生 质 体 平板 ， 切 成 小 块 ， 转 移 到 流体 培养 基 
中 ， 在 振 苏 器 上 缓和 地 振 功 培养 。 这 种 培养 方法 的 优点 是 可 以 通 
过 换 液 的 办 法 ， 满 足 原生 质 体 不 同 发 育 阶 段 的 营养 需要 ， 适 时 地 
降低 渗透 浓 度 ， 并 排除 有 些 原生 质 体 在 培养 过 程 中 生 的 有 毒物 
原 。 在 这 种 方法 中 ， 琢 脂 糖 作 凝 胶 剂 也 比 琼脂 好 。 

这 种 培养 方法 还 可 以 变换 一 种 形式 ， 这 就 是 最 近 发 展 的 斑 脂 
糖 珠 培养 方法 。 将 原生 质 体 悬 液 与 琼脂 糖 培养 基 混 合 之 后 ， 逐 满 

地 闹 在 平 严 底 面 上 ， 待 此 固 后 在 其 周围 加 入 液体 培养 基 ; 在 振 葛 
上 
想 的 饲养 培养 方式 。 

@ 饲养 塔 养 技 术 


在 常规 的 培养 条 件 下 ,原生 质 体 生 长 需要 有 一 定 的 接种 密度 。 


饲养 培养 技术 则 用 来 培养 接种 密度 很 低 的 原生 质 体 ， 如 融合 处 理 
后 挑选 出 来 的 少量 杂种 细胞 等 。 作 饲养 层 的 细胞 或 原生 质 体 先 用 
x 射线 照射 ， 它 们 在 照射 后 仍然 存活 ， 但 形 失 了 分 改 能 为 ” 与 琼 
培养 基 混 合 后 铺 在 平 亚 底面 上 。 待 饲养 层 凝 固 后 $ 将 要 培养 的 
原生 质 体 以 固体 培养 或 液体 培养 的 方法 铺 在 饲养 层 上 面 。 在 两 层 
之 间 可 以 放 一 层 赛 璐 共 ， 便 于 以 后 的 转移 。 饲 养 层 的 作用 没有 种 
的 特异 性 , 即 饲养 层 细胞 与 所 培养 的 原生 质 体 可 以 来 自 不 同 的 种 。 
上 面 已 提 到 ， 琼 脂 糖 珠 培养 是 饲养 培养 的 一 种 理想 方法 。 


。432 


避 ， 
有 


相 


证 
人 | 


xs 


桐 养 培养 的 另 一 用 途 是 减轻 原生 质 体 的 褐 化 程度 。 有 些 原 生 
质 体 在 发 育 过 程 中 产生 酚 类 化 合 物 等 有 毒物 质 ， 它 们 使 发 育 的 细 
胞 自身 遭受 毒害 ， 产 生 褐 化 现象 ， 最 终 导致 死亡 。 液 体 培 养 原 生 
质 体 时 ， 减 轻 褐 化 可 采用 常 换 培养 液 或 在 培养 液 中 直接 加 六 活性 
炭 的 方法 。 用 饲养 技术 减轻 神化 可 采用 和 平板 法 或 滤纸 盘 法 。 将 
培养 亚 十 字 分 隔 ， 在 对 角 的 两 块 注入 含 活性 炭 的 琼脂 培养 基 ， 符 
凝固 后 在 剩余 的 两 块 接种 含 原生 质 体 的 琼脂 培养 基 。 这 种 方法 就 
称 为 和 平板 法 ， 在 临近 活性 炭 培 养 基 的 边缘 部 位 ,原生质 体 往往 
能 避免 神化 而 正常 发 育 。 在 含 活性 类 的 琼脂 培养 基 上 铺 上 滤纸 盘 ， 
再 在 其 上 面 接种 菏 层 含 原 生 质 体 的 培养 液 ,就 是 所 谓 的 滤纸 盘 法 ， 
这 种 方法 的 优点 是 操作 简便 ， 缺 点 是 因 滤 纸 不 透明 而 不 易 观 察 、 
照相 。 

《3) 培养 条 件 

原生 质 体 的 密度 与 光照 、 温 度 等 环境 因素 对 原生 质 体 的 培养 
效果 有 明显 的 影响 。 

原生 质 体 在 培养 时 要 求 有 一 定 萝 密度 高 国术 在 培养 基 中 加 
了 多 种 维生素 、 氮 基 酸 与 有 机 酸 等 ， 低 密度 培养 原生 质 体 取得 了 
成 功 。 这 说 明 密 度 要 求实 质 上 反映 了 原生 质 体 复 杂 的 营养 要 求 ， 
有 些 细胞 竟 代 谢 产 物 正 是 细胞 本 身 的 发 育 所 必需 的 。 不 同 来 源 药 
原生 质 体 对 接种 密度 的 要 求 也 有 所 不 同 ， 常 用 的 密度 为 10 -5x 
.057/ml。 

原生 质 体 在 培养 的 初期 对 光照 条 件 有 严格 的 要 求 。 所 报道 的 
最 适 光 照 条 件 在 不 同 来 源 的 原生 质 体 之 间 有 很 大 差异 。 一 般 来 说 ， 
强 光 照 对 新 游离 的 原生 质 体 是 有 害 的 。 多 数 在 培养 的 头 几 天 需要 
黑 瞳 或 微弱 的 散射 光 ， 以 后 再 转移 到 2000 一 5000lux 的 光照 下 培 
养 ， 但 也 有 连续 全 黑暗 或 强 光 照 的 报道 。 

原生 质 体 的 培养 温度 一 般 在 22 一 28* ,但 在 种 间 有 很 大 差异 。 
有 些 原生 质 体 需要 更 高 的 温度 ， 如 白薯 原生 质 体 培养 能 最 逢 温度 
为 28 一 302， 其 他 像 西红柿 、 棉 花 等 的 原生 质 体 也 部 需要 较 高 的 
培养 温度 。 


。433。 


3. 植 株 再 生 

从 砷 竺 质 体 培养 再 生 的 细胞 与 细胞 团 ， 有 两 条 途径 再 生 植 枯 ， 
形成 不 定 芽 与 根 ， 或 者 形成 胚 状 结 移 后 直接 发 言 成 植株 六 

一 般 来 说 ， 原 生 质 体 再 生 的 细胞 团 先 形成 极 性 元 然后 可 见 次 
绿色 的 芽 原 基 ， 表 面 呈 扁平 或 半球 状 的 结构 ; 最 后 长 出 绿 对 记 再 
生 的 能 力 与 植物 的 种 类 及 组 织 来 漂 都 有 密切 的 关系 。 培 养 基 的 成 
分 与 培养 条 件 则 在 分 化 过 程 中 起 着 关键 的 作 玫 5 泽 扔 

为 了 芽 的 分 化 ， 要 及 时 地 将 细胞 园 转 移 到 分 化 培养 基 上 ， 转 
ppapajoenogha 则 Need 

发 生前 关系 ， 通 常 使 用 药 分 化 培养 基 是 添加 了 一 些 有 机 附 

Rovereonaaeagtr 精 氮 酸 、 合 氨 醋 膀 、 
天 冬 避 肪 、 水 解 酷 蛋白 或 夯 子 汁 等 有 机 氮 尖 是 常用 的 添加 物 寺 诺 
分 化 英 养 基 中 也 往往 增加 一 些 维生素 的 含量 。 瀑 重要 的 是 激素 成 
分 3 6- 节 基 趴 野 哈 、 玉 米 素 与 激动 素 是 最 常用 药 细 胞 激 素 ， 应 
用 的 浓度 范围 在 0.03 一 10M 之 间 ， 种 间 的 差异 很 大 5 在 有 些 种 8 
茅 的 分 化 还 需要 少量 的 生长 素 ， 常 用 的 有 蘑 乙 酸 、 本 吃 jiZ 酸 或 
2, 4 一 PP。 光 焉 是 最 重要 的 环境 因素 ， 分 化 时 ， 由 黑 瞳 或 低 光 黑 变 
为 强 光 申 ， 有 出 图 和 家 交 着 沙 类 代 其 和 乱 沁 是 肌 温 呈 各 人 于 二 
仁 鸭 必要 因素 。 

“ 册 再 生 茸 发 根 是 容易 ;一 般 用 无 激素 培养 基站 或 者 用 具 售 
少量 呀 吹 乙 屋 或 茜 乙 酸 的 培养 基 莽 糖 浓度 降 到 1% 对 根 指 分 化 有 
促进 作 前 。 pagepapipics 
素 配 合 使 用 能 促进 根 药 分 从 。 起 

形成 豚 状 结 攀 是 逢 株 再 生 指 另 一 途径 。 已 有 不 少 种 鹉 物 通过 
航 揭 发 生 著 得 了 再 生 植 柑 。 诱 导 豚 发 生 的 最 重要 因素 是 在 培养 原 
生 质 体 与 细胞 团 时 用 含有 2,4- 一 D 的 培养 基 。 2 和 4 二 款 六 玫 
地 与 王 ] nt 私 及 小 植株 的 发 育 。 
生 质 钵 培养 的 操作 程序 (实例 ) 
apeer in 
人 :植物 料 料 ; 盆 裁 烟草 充分 伸展 的 鲜嫩 时 片 。 


。3434 。 


@ 器 材 仪 器 ; 

趣 净 工作 台 ， 人 台式 离心 机 ， 倒 署 显 微 镀 。 

灭 菌 过 滤 装 置 及 0.2 一 0.45um 的 细菌 滤 膜 ， 300 目 镍 丝 网 ， 
10ml 带 塞 的 刻度 离心 管 ， 带 皮 头 的 玻璃 吸管 ， 培 养 焉 ， 镖 子 与 吸 
水 滤 红 等 ， 在 实验 前 高 讨 屎 菌 。 

曲 ” 试 剂 ; 

70% 酒 精 ，0.1% 升 示 ， 无 菌 水 。 

选 淋 液 ， 革 器 醇 0.6M，CacCcl:。2H,0 3.5mM， 

KH PoOL0 .7mAT，pHE5.6。 
混合 酶 液 : 纤维 素 酶 Cnozuka 有 一 10 2%， 
果 胶 酶 mmacefozyme 及 一 10 1 
本 本 区 人 你 
培养 基 : D: 菩 养 基 (也 附录 

轴承 革 二 竹 闻 车 记 基 寺 并 六 到 前 用 六 计 汪 泪 灭 菌 。 

(2)》 操作 步 又 

四” 将 时 片 用 踊 赣 水 洗 兆 后 ， 自 来 水 冲洗 。 

名 在 超 净 台 内 (以 下 步 又 同 ) 将 时 片 浸 在 70% 酒 精 中 2 一 3 秒 
后 ， 立 即 取出 用 无 菌 水 漂洗 2 一 3 次 。 

时 将 叶 乒 受 泡 在 0.1% 升 永 溶 液 中 :分钟 ， 用 狠 子 小 心地 赶 
去 叶 面 土 的 气泡 ， 然 后 用 无 草 水 漂洗 3 次 ， 余 液 用 滤纸 驭 干 。 

申 “ 将 时 上 并 平 放 在 滤纸 上 ， 时 青 赤土 ， 小 心地 用 儿子 除去 下 
表皮 。 

”@-” 用 吸管 将 4 一 5mil 梅 液 移 到 直径 6cm 的 乎 理 中 ， 再 将 去 掉 
下 表皮 的 叶片 放 在 酶 液 上 。 去 掉 下 表皮 的 那 面 朝 下 ， 人 和 使 酶 液 与 叶 
肉 细胞 充分 接触 。 
 、， @ 平 严 用 封口 脆 封 住 ， 置 25 民 左右 的 黑 瞳 条 件 下 酶 解 。 
@@ 一 般 在 3 一 4 小 时 后 ， 在 倒置 显微镜 下 观察 ; 待 足 草 的 原 


U 生 质 体 游 离 下 来 以 后 即 可 丝 纺 进行 下 面 的 操作 。 
> w 于 养 基 的 涂 渤 当 度 要 与 洗涤 液 一 致 ， 或 格 币 降低 一 些 。 
各 


人 昌 用 上 头 吸管 将 含有 原生 质 体 的 酶 液 通 过 300 目 镍 丝 网 ,过 
滤 到 10ml 离 心 管 中 ， 除 去 未 被 酶 消化 的 叶 组 织 。 

曲 “滤液 用 台式 离心 机 离心 ， 每 分 钟 500 转 ， 0 使 
完整 的 原生 质 体 沉 淀 。 

@ 中 用 吸管 去 除 酶 液 ， 添加 洗涤 深 ， 小 心地 将 原生 质 体 悬 肖 
起 来 ， 待 悬 液 充 分 混 匀 之 后 ， 再 一 次 离心 。 这 样 反复 操作 2 一 3 次 ， 
洗 净 酶 液 与 残余 的 细胞 碎片 。- 

申 加 入 适量 的 原生 质 体 培养 基 ， 小 心地 将 原生 质 体 有 其 浮 起 
来 ， 用 血球 计数 板 计 数 ， 将 原生 质 体 的 密度 调节 到 104-5 
X1047mle 

四 用 吸管 将 上 述 原 生 质 体 巧 液 移 到 平 下 内， 控制 液体 的 厚 
度 在 1mm 左 右 。 盖 好 王蕾 ， 用 封口 路 封 住 。 置 黑暗 或 微 光 下 25% 
恒温 培养 。 

辐 ， 培 养 后 10 天 左右 ， 在 侧 置 显微镜 下 统计 再 生 细胞 的 分 裂 
频率 。 

曲 ” 当 大 部 分 原生 质 体 再 生子 细胞 壁 并 有 部 分 发 育成 小 细胞 
团 隐 < 约 二 周 左 右 )， 添 加 渗透 浓度 降低 了 的 新 鲜 培 养 基 。 

田 ” 当 大 部 分 原生 质 体 发 谨 成 小 细胞 团 时 江苏 养 于 UL 个 月 之 
后) 以 1: 的 比例 加 入 40 一 45C 融 化 的 固体 培养 基 ， 充分 混 匀 ， 
使 琼脂 的 最 终 浓度 在 0.6% 以 下 。 

四 .: 当 细 胞 团 长 到 直径 1.5 一 2mm 大 小 时 ,将 其 挑 出 接种 在 分 
化 芽 的 培养 基 上 。 

加 “统计 芽 分 化 的 频率 ， 并 将 分 化 出 来 的 芽 从 愈 伤 组 织 上 取 
十 来， 转移 到 分 化 根 的 培养 基 土 。 

蝎 ”统计 植株 的 再 生 频 率 。 将 再 生 的 小 植株 移 到 花 盆 内 ,为 
使 新 移植 的 小 植株 不 枯 装 ， 需 要 在 花 盆 上 扣 上 烧杯 或 塑料 单 ， 保 
持 一 定 的 湿度 ， 让 再 生 植 株 逐 步 适 应 外 界 条 件 。 


(二 ) 核 物 体 缅 胸 杂 交 
植物 体 纺 胞 杂交 就 是 把 植物 的 原生 质 体 分 离 下 来 ， 在 人 工控 


。#36。 


制 的 条 件 下 ， 使 不 同 亲 本 之 间 的 原生 质 体 像 性 细胞 受精 过 程 那样 
互相 融合 ， 继 而 把 融合 的 细胞 培养 成 杂种 植株 。 1960 年 Cocking 
发 明 用 酶 液 去 除 植物 细胞 的 细胞 壁 ,为 植物 细胞 杂交 商定 了 基础 。 
植物 细胞 融合 不 仅 是 研究 细胞 生物 学 、 植 物 遗 传 学 的 重要 工具 ， 
而 且 还 可 创建 遗传 构成 全 新 的 细胞 ， 获 得 靠 有 性 过 程 得 不 到 的 远 
缘 杂 种 为 改良 作物 提供 了 新 的 途 径 。 可 以 设想 ， 借 助 于 体 细 胞 
杂交 ,可 把 玉米 等 高 光 效 作物 与 小 麦 、. 大 豆 等 低 光 效 作物 杂交 , 培 
肯 出 光合 能 力 强 、 产 量 高 的 小 麦 或 大 豆 新 品种 ， 或 者 把 优质 高 产 
的 作物 品种 与 抗 病 的 野生 种 杂交 ， 获 得 抗 病 的 新 品种 。 也 有 人 设 
想 通过 体 细 胞 杂交 转移 豆 科 植物 的 因 氨 能 力 。 正 是 由 于 体 细 胞 杂 
交 具 有 诱 人 的 应 用 前 景 ， 该 项 遗传 操作 受到 了 国内 外 研究 着 的 广 
泛 重 视 J 至 今 已 有 40 多 种 种 间 与 属 间 原生 质 体 的 融合 ， 再 生 了 体 
细胞 杂种 植株 ， 建 立 了 多 种 融合 技术 、 杂 种 细 跑 选择 及 杂种 鉴定 
技术 

植物 栖 细胞 杂交 包括 下 列 几 个 环节 : 选 泽 亲本 ， 游 离 原生 质 
体 ， 诱 导 原 生 质 体 融合 ， 选 择 杂 种 细胞 ,诱导 杂种 细胞 再 生 植 株 ， 
杂种 植株 的 分 桥 鉴 定 ， 后 代 遗 传 分析 等 。 由 于 其 中 有 些 环节 已 在 
“原生 质 体 培养 与 植株 再 生 ? 中 叙述 ， 这 里 着 重 介绍 体 细胞 杂交 过 
程 中 几 项 特殊 的 关键 技术 。 

1. 类 生 质 体 融合 技术 

(1) 无 机 盐 作 融合 剂 

去 掉 细 胞 壁 的 植物 原生 质 体 就 能 像 动物 细胞 一 样 ， 在 人 工控 
制 的 条 件 玉 互相 融合 ， 首 先 被 应 用 的 融合 剂 是 硝酸 钠 湾 液 ， 
Catlson 在 1972 年 首次 用 它 融 合 烟草 的 原生 质 体 ,获得 了 种 间 杂 种 
古 株 。 :和 但 硝酸 钠 作 融合 剂 所 需要 汐 浓 度 (0.25M) 对 细胞 本 身 有 毒 
害 而 且 和 融合 频率 比 自发 融合 频率 增加 不 多 ， 所 以 以 后 很 少 再 有 
大 继续 用 硝酸 钠 作 融合 剂 。 

另 一 个 较为 成 荔 的 无 机 盐 融 合剂 是 高 p 工 值 的 司 离 子 溶液 。 将 
混合 的 双亲 原生 质 体 低 速 离心 后 ， 培 育 在 含有 0.05M CaCl, 与 
0.4M 甘 需 酬 ,，p 了 值 为 10 .5 的 缓冲 液 中 ， 在 37" 下 保温 ， 融 合 频 


。437。 


率 超 过 了 25% 。 目 前 这 个 方法 已 很 少 单独 使 用 ， 而 是 与 融合 剂 
PEG 联 合 应 用 。 

(2) 水 溶性 聚合 物 诱 导 融 合 

聚 乙 二 醇 (PEG) 是 目前 最 常用 的 融合 剂 。 当 25 亿 30% 的 PEG 
溶液 加 到 混合 的 原生 质 体 悬 液 上 ， 就 引起 原生 质 体 凝 集 ， 再 用 高 
pH 值 的 钙 溶 液 稀释 时 ， 就 产生 了 高 频率 的 融合 。PEG 的 分 子 量 
一 般 选 用 1540，4000 或 6000， 用 PEG6000 的 人 更 多 一 些 。. 

由 于 高 品 PEG 的 纯度 不 同 一 些 学 者 用 再 沉淀 及 透析 等 方法 
纯化 PEG， 发 现 纯化 后 其 融合 活性 也 降低 ， 这 可 能 是 由 于 亲 脂 
的 杂质 对 融合 有 促进 作用 ， 后 来 证 实 一 些 亲 脂 揭 添 加 物 能 促进 融 
合 。 最 近 高 国术 用 离子 交换 树脂 纯 化 PEG， 消 除了 对 细胞 的 毒 
性 ， 取 得 了 良好 的 效果 。 因 而 他 认为 商品 PEG 对 细胞 的 毒性 是 
由 杂质 引起 的 ， 而 不 是 PEG 本 身 。 

除 PEG 本 身 的 纯度 以 外 ，PEG 的 浓度 ， 原 生 质 体 指 密度 、 纯 
度 ， 原 生 质 体 的 生理 条 件 等 因素 都 影响 原生 质 体 的 融合 频率 。 有 
人 用 混合 的 盐 溶 液 在 融合 前 处 理 原 生 质 体 ， 提 高 了 融合 频率 。 在 
PEG 溶 液 中 添加 某 些 其 他 物质 ， 也 能 促进 融合 。 如 伴 刀 豆 球 蛋 昌 
A(ConA) 能 加 强 PEG 引 起 的 原生 质 体 粘连 ,从 而 提高 融合 率 ， 添 
加 15% 的 二 甲 基 亚 大 (PPMSO)， 也 可 使 融合 率 显 著 提高 喜 最 近 有 
人 报道 ， 在 融合 剂 中 加 入 蛋白 酶 或 链 霉 蛋白 酶 ， 使 烟草 苦 生 质 体 
的 融合 率 提高 三 倍 。 其 他 添加 的 促进 剂 有 胰 蛋 有 酶 、 精 胺 \) 亚 精 
胺 等 。 

除 PEG 外 ,用 作 融 合剂 的 水 溶性 聚合 物 还 有 聚 已 烯 醇 人 (PVA) 
它 是 非 离子 的 表面 活化 剂 。 分 子 量 为 500 的 PVA， 诱导 融合 的 效 
果 比 PVA1400 或 PVA2000 的 诱导 效果 好 。 通 常用 15% 的 PYA 洲 
液 ， 加 上 0.05MCaCl， 及 等 渗 剂 甘露 醇 ， 制 成 融合 液 融合 植物 原 
生 质 体 。 葡 聚 糖 硫酸 盐 也 被 用 来 作 融 合剂 ， 但 由 于 其 本 髓 对 植物 
纪 胞 的 毒性 ， 没 有 被 继续 采用 。 

(3》 电 融合 技术 

电 融 合 是 近期 发 展 起 来 的 一 种 融合 技术 。 最 早 是 在 1979 年 ， 


。438。 


ka 


人 


有 大 将 两 个 玻璃 微 电 极 通 以 短暂 的 电流 ， 使 与 电极 接触 的 原生 质 
体 互 相 融 合 。 目 前 ， 电 融合 技术 已 逐渐 完善 ， 已 有 上 家 公司 将 电 
融合 仪 投放 市 场 ， 国 内 也 有 同类 产品 问世 。 这 种 技术 的 优点 在 于 : 
它 避 免 了 PEG、 高 pH 溶液 等 强加 于 原生 质 体 的 生理 非常 条 件 ， 
同时 融合 的 条 件 更 加 数据 化 ， 便 于 控制 与 相互 比较 。 

电 融 合 通常 是 在 特制 的 融合 板 上 进行 ， 两 个 平行 电极 之 间 的 
上 离 一 般 为 1 一 2mmes 在 双 电 极 之 间 滴 加 少量 原生 质 体 悬 液 。 悬 
液 中 除了 含有 保持 渗透 浓度 的 甘露 醇 外 ， 尚 需 加 入 少量 的 CaCl， 
( 约 0.01M) ， 使 溶液 保持 一 定 的 导电 率 。 

电 融合 处 理 一 般 可 分 为 两 步 进行 。 先 给 两 极 以 交 变 电流 ， 电 
压 每 毫米 约 2 一 4 伏特 ， 频 率 为 0.5 一 1M 赫 效 。 这 时 就 产生 了 电泳 
效应 ， 使 原生 质 体 沿 着 电场 的 方向 排列 成 串珠 状 。 这 时 再 给 予 瞬 
间 的 高 强度 的 电 脉冲 ， 使 原生 质 体 膜 局 部 破损 而 导致 融合 。 一 
用 的 脉冲 强度 为 500 一 1000 伏 特 /cm， 脉 冲 期 宽 为 20 一 50 微 秒 。 通 
常 一 次 融合 处 理 给 予 几 个 脉冲 ， 脉 冲 间隔 约 1 一 2 秘 。 

目前 电 融合 技术 尚 处 于 不 断 地 改进 的 阶段 ， 所 以 文献 上 报道 
的 处 理 条 件 常 有 显著 的 差异 。 现 已 知道 ， 原 生 质 体 的 密度 对 融合 
的 效果 有 显著 的 影响 ， 当 密度 低 于 104/ml 时 ， 显 著 降 低 了 融合 频 
率 交 当 密 度 高 于 10s/ml 时 ， 则 使 原生 质 体 成 团 地 融合 ， 达 不 到 巴 
期 的 效果 。 一 般 认 为 2- 8x104/ml 的 原生 质 体 密度 是 适宜 的 。 悬 
液 中 CaCl; 的 浓度 不 仅 影响 悬 液 的 导电 率 , 也 影响 原生 质 体 的 完整 
程度 ， 一 般 认 为 钙 离 子 对 原生 质 体 膜 有 保护 作用 。 此 外 ， 交 变 电 
流 的 强 弱 、 处 理 的 长 短 、 电 脉冲 的 大 小 等 因素 对 融合 的 效果 都 有 
明显 的 影响 ， 来 源 不 同 的 原生 质 体 对 融合 的 条 件 也 会 有 不 同 的 要 
求 。 所 以 在 研究 每 一 个 新 材料 时 ， 对 上 述 诸 因素 都 需要 有 一 个 摸 
索 的 过 程 。 电 融合 仪 也 在 逐步 改进 之 中 ， 例 如 如 何 使 融合 过 程 更 
便于 在 无 菌 条 件 下 进行 ， 如 何 使 一 次 电 融 合 能 处 理 更 多 的 原生 质 
体 等 等 ， 都 是 需要 进一步 解决 的 问题 。 

2. 杂 种 细胞 的 选择 

融合 处 理 后 ， 原 生 质 体 在 培养 基 中 再 生 细 胞 壁 ， 进 行 有 丝 分 


。 4 了 39。 


烈 ， 产 生 了 由 亲本 细胞 、 同 源 融 合 细胞 及 杂种 细胞 组 成 的 温 人 各 和 群 
体 。 尽 管 为 增加 原生 质 体 的 融合 频率 作 了 不 少 努 为， 但 真正 异 源 
双核 体 (A+ B) 的 比例 不 会 很 高 。 所 以 将 杂种 细胞 与 未 融合 的 及 
同 涯 融合 的 亲本 细胞 个 开 是 很 必要 的 。 选 择 杂种 细胞 三 般 是 基于 
遗传 标记 的 表达 或 生长 的 生理 需要 。 虽 然 已 经 报道 了 很 多 选择 方 
法 ， 但 迄今 尚 无 一 个 普遍 适用 的 技术 。 在 新 将 融合 组 台面 前 ， 必 
须根 据 亲 本 的 特点 ， 借 鉴 已 报道 过 的 选择 方法 六 设计 新 前 选择 广 
案 。 这 显然 是 体 细胞 杂交 技术 中 的 一 道 难 关 ， 所 以 有 必要 对 惧 竺 
用 之 有 效 的 选择 方法 作 一 概述 。 

(1) 叶绿素 缺失 互补 全 省 未 

当 非 等 位 隐 人 性 基因 控制 的 两 个 突变 体 融 侣 后 ， 击 了 每 至 亲本 
贡献 一 个 功能 正常 的 等 位 基因 ， 纠 正 了 另 二 亲 未 指 缺 陷 习 使 杂种 
细胞 表现 正常 ， 这 就 是 互补 选择 的 基本 原理 5 种 内 叶绿素 缺 天 的 
互补 作用 首先 是 由 Melchers(1974) 证 实 的 ,他 用 烟草 前 两 个 光敏 
感 的 叶绿素 缺失 突变 体 融 侣 后, 选 出 表 型 正常 的 体 姻 腹 才 种 烟草 。 
这 种 方法 在 曼 陀 罗 及 其 他 烟草 种 间 体 细胞 杂交 息 也 取得 了 成 功 。 

这 种 选择 方法 需要 有 二 个 非 等 位 基因 的 白化 突变 体 租 点 该 
强调 ， 单 一 的 隐 性 白花 突变 体 也 是 非常 有 用 的 ， 它 可 以 同 形态 特 
征 、 生 化 突变 体 或 生长 反应 结合 起 来 ,分离 出 体 蚀 胞 性 攻 植株。 
例如 ， 我 们 可 以 设计 三 种 培养 基 ， 可 便 刍 华 体 吾 能 寺 而 另 三 亲 素 
的 绿色 种 不 能 再 生 ， 这 样 所 得 到 竟 全 部 绿色 的 愈 伤 组 织 或 植株 都 
可 以 认为 是 体 细胞 杂种 。 用 这 种 方法 已 经 选 册 了 几 种 种 间 及 属 间 
的 体 细胞 杂种 。 在 双亲 都 能 再 生 的 情况 下 ， 形 态 完 克 类 同 自 花 体 
的 绿色 再 生 植株 ， 也 可 作 关 体 细胞 杂种 选 出 来 ， 再 进行 其 配 三 系 
列 前 鉴定 ; 用 灶 显 性 的 白化 罕 变 体 与 另 一 绿色 素 本 融合 得 到 浅 
绿色 指 中 间 型 杂种 植株 ,可 明显 地 与 ; 自 化 休 及 绿色 素 本 区 区 开 汪 。 
用 这 种 方法 也 已 得 到 九 秩 烟 草 的 种 间 体 细胞 杂 丢 让 3 于 豆 

(2) 营养 缺陷 型 互补 

最 旱 思 来 选择 杂种 细胞 的 营养 缺陷 型 是 硝酸 慧 还 晨 本 缺 天 
(NR-) 的 细胞 ， 它 缺乏 硝酸 盐 还 原 酶 的 活性 ， 因 而 必需 有 还 原 氨 


5 3440。， 


。 计 能 成 活 3 它 可 能 是 NR 脱 辅 基 牙 的 缺失 (nia 型 )， 也 可 能 是 钼 辅 、 
””. 助 因子 的 缺失 (cnx 型 )。 这 两 种 类 型 融合 后 可 以 互补 》 而 且 同 一 
类 型 的 非 等 位 基因 之 间 也 能 互补 ， 从 而 能 在 硝 酶 盐 为 唯一 氮 源 的 
选择 培养 基 土生 长 。 用 这 种 选择 系统 已 经 选 量 种 内 、 种 间 及 属 间 
的 体 细 雹 杂种 。 同 时 ， 柄 合 互补 作用 也 已 被 用 来 分 析 NR- 株 系 的 

等 位 性 。 了 三 
个 近来 ， 其 他 一 系列 的 营养 使 陷 型 突变 体 也 已 用 来 选择 杂种 细 
胞 ， 包 括 需要 组 氨 酸 、 色 氨 酸 或 烟 酸 膀 的 各 种 株 系 ;都 已 取得 了 
理想 韵 效果 。 这 种 选择 体系 的 局 限 性 在 于 要 得 到 这 些 人 缺陷 型 突变 
体 并 不 容易 。， 

忆 处 132- 抗 性 互补 选择 

对 抗生素 。 除 芜 剂 或 其 它 毒 性 物质 的 抗 性 等 显 性 性 状 也 已 用 
来 选择 杂种 细胞 / 营 本 原理 与 上 述 隐 性 性 状 揭 互 补 选择 相似 。. 当 
酚 个 抗 性 系 的 原生 质 体 融合 时 ， 每 个 亲本 的 药物 敏感 性 分 别 波 另 

一 亲本 的 抗 性 掩盖 ， 因 而 单 抗 的 双亲 细胞 融合 后 可 以 产生 双 抗 萌 
融合 杂种 很 容易 明 选 择 培养 基 选 出 来 。 用 这 个 原理 ， 大 们 将 搞 
后 - 甲 基色 所 酸 658E TO 起 5S- 氨 乙 基 半 胱 氨 酸 (AEC) 的 亲本 细胞 
避 合 x 浴 ' 别 选 出 村 双 抗 的 烟草 与 胡 莫 小 的 体 绀 胞 杂种 。 这 蔚 杂 
细胞 系 韵 抗 性 表现 非常 稳定 近 求 大 们 将 抗 5MT 的 胡萝卜 与 入 
AEC 的 烟草 以 及 相反 的 组 合 进行 细胞 融合 ， 也 痢 选 出 了 双 流 的 科 
闻 体 细胞 杂种 。 

-对 脑 揽 酸 类 似 物 铃 兰 所 酸 (A2C) 的 抗 性 ， 在 胡 葛 卡 的 种 内 杂 

种 细 欧 里 武钢 为 半 显 性 。 杂种 细胞 内 过 量 产生 的 及 氨 酸 水 平 居于 
突变 体 与 正常 型 的 中 间 。 此 外 ， 抗 卡 那 稚 素 ; 抗 钾 霉 素 等 突变 体 
,也 都 已 用 来 选择 杂种 细胞 。 

二 抗 性 互补 选择 可 以 利用 自然 存在 的 抗 性 差异 ， 还 可 与 其 他 地 
择 方法 结合 起 来 应 用 。 例 如 1mg/1 放 线 菌 素 P 抑 制 了 杂 替 牛 的 细胞 
和 分裂， 而 不 能 抑制 拟 斤 达 后 涯 生 质 体 的 分 裂 。 在 斤 幸 牛 能 再 生 而 
; 批 敌 幸 牛 不 能 再 生 的 限定 培养 基 上 ， 加 1lmg 省 放 线 菌 素 D， 就 先 
出 了 抗 放 线 菌 素 D 的 体 细 胞 杂种 植株 。 


。4341 。 


一 般 来 说 ， 我 们 在 实际 操作 中 ， 往 往 面临 无 任何 选择 标记 的 
对 象 。 为 解决 这 个 问题 ,这 里 特别 介绍 一 个 显 隐 双 突变 体 的 例子 。 
Hamill 等 人 (1983) 通 过 有 性 杂交 , 将 硝酸 盐 还 原 酶 缺陷 突变 与 抗 
链 霉 素 突变 综合 在 一 个 突变 系 中 ， 建 立 了 烟草 的 双 突 变 系 。 这 种 
双 突 变 体 可 以 与 任何 无 选择 标记 的 其 他 植物 融合 ， 由 于 对 方 亲 本 
对 链 堆 素 敏感 ， 而 双 突变 体 有 特殊 的 营养 需要 (这 里 是 还 原 氮 六 
所 以 很 容易 用 选择 培养 基 将 杂种 细胞 选 出 来 。 应 该 说 ,这 有 是 一 个 
极为 巧妙 的 设计 ， 对 选择 杂种 细胞 技术 是 一 个 重要 的 贡献 。 ， 

(4) 利用 物理 特性 选择 

亲本 原生 质 体 的 物理 性 状 ， 如 大 小 、 颜 色 、 漂 泽 密度 、 电 泳 
迁移 率 等 如 有 差异 ， 也 能 用 来 选择 杂种 细胞 。 例 如 盖 叶 上 内 细胞 与 
培养 细胞 的 原生 质 体 融 合 后 ， 产 生 的 异 核 体 是 容易 与 亲本 的 原生 
质 体 区 别 开 的 ， 所 以 可 在 融合 处 理 后 及 时 在 显微镜 下 将 杂种 细胞 
拣 出 ， 单 独 进 行 培养 。 这 种 方法 的 缺点 是 效率 低 ， 由 于 挑 出 的 杂 
种 细胞 有 限 ， 还 必需 进行 低 密 度 培 养 。 为 此 ， 有 大 发 展 了 用 作 低 
密度 培养 的 培养 基 ， 也 有 人 应 用 了 看 护 培养 技术 。 但 对 于 多 数 杆 
物 来 说 ， 这 仍 是 难以 解决 的 问题 。 同 类 细胞 的 原生 质 条 难以 靠 视 
觉 来 识别、 分离 。 遇 到 这 种 情况 ， 需 在 融合 前 用 不 同 的 荧光 染料 
分 别处 理 两 个 亲本 的 原生 质 体 ， 双 荧光 标记 的 融合 产物 可 在 荧光 
显微镜 下 识别 、 分 离 。 近 来 已 有 人 用 荧光 活性 胞 分 类 装置 
(FACS) 将 双 荧光 标记 的 融合 产物 与 亲本 原生 质 体 自动 分 离 $ 这 
种 自动 分 类 装置 价格 昂贵 ， 但 目前 国内 已 有 多 人 台 ， 可 供 使 用 。 

再 生 念 伤 组 织 形态 与 颜色 的 差异 也 可 用 来 选择 杂种 细胞 ”我 
们 将 粉 蓝 烟 草 与 线 幸 牛 交 原生 质 体 融合 后 培养 ， 再 生 了 三 种 类 型 
的 愈 伤 组 织 ， 一 类 是 白色 松软 的 愈 伤 组 织 , 与 亲本 粉 蓝 烟 草 三 致 ， 
另 一 类 是 深 绿色 致富 的 扁平 状 愈 伤 组 织 ， 与 亲 订 矮 牵 董 将 守 致 。 
此 外 ,还 出 现 了 少量 与 上 述 二 类 愈 伤 组 织 有 显著 差异 的 中 间 类 型 。 
将 这 中 间 类 型 的 愈 伤 组 织 拣 出 进行 培养 ， 鉴 定 再 生 的 和 植株， 证明 
是 体 细 胞 杂种 。 这 种 选择 方法 简便 易 行 ， 但 需要 对 亲本 细胞 在 培 
养 中 的 特性 有 清楚 的 了 解 。 


。442 。 3 


和 
训 
局 
了 
4 
当 
地 
1 


原生 质 体 浮力 密度 的 差异 也 已 用 来 选择 杂种 细胞 。 不 同类 型 
的 原生 质 体 ， 其 浮力 密度 不 同 ， 因 而 在 等 涂 密 度 梯 度 中 的 沉降 行 : 
汶 也 有 差异 。 将 融合 后 的 混合 原生 质 体 在 含 钾 、 镁 、 钙 离子 的 六 
糖 密度 梯度 中 离心 ， 可 以 使 异 核 体 分 离 出 来 。 其 他 还 有 一 些 物 理 
性 状 ， 如 电泳 迁移 率 、 粘 度 梯 度 或 磁性 分 类 等 ， 至 今 还 没有 被 深 
入 地 研究 。 

(5) 利用 生长 特性 选择 

原生 质 体 对 培养 基 成 分 的 要 求 与 反映 存在 着 差异 ， 这 种 差异 
被 广泛 地 用 来 选择 杂种 细胞 。 对 生长 激素 需求 的 差异 就 是 一 例 。 
粉 蓝 烟草 与 朗 氏 烟草 的 原生 质 体 都 需要 外 源 激素 ， 但 它们 间 的 杂 
种 细胞 能 疡 生 内 源 激 素 ， 所 以 用 无 激素 的 培养 基 就 能 把 杂种 细胞 
选 出 来 。 当 然 ， 这 是 一 个 特殊 的 例子 ， 没 有 广泛 应 用 的 价值 。 利 
用 同样 的 原理 ， 有 人 用 烟草 瘤 细 胞 作 素 本 的 一 方 ， 它 是 激素 自 养 
的 自 化 细胞 ， 当 它 与 其 他 原生 质 体 融合 后 ， 用 无 激素 的 培养 基 选 
出 绿色 的 愈 伤 组 织 即 为 杂种 细胞 。 

细胞 在 培养 基 上 的 生长 反映 也 是 选择 的 依据 。 在 曼 陀 罗 及 烟 
草 的 种 间 体 细胞 杂交 中 发 现 ， 杂 种 的 愈 伤 组 织 比 它们 亲本 的 愈 伤 
组 织 生 长 更 快 ， 只 要 挑选 生长 最 快 、 长 得 最 大 的 愈 伤 组 织 进行 分 
化 ， 就 得 到 了 体 细胞 杂种 植株 。 

原生 质 体 再 生 植株 的 能 力 是 广泛 应 用 的 选择 依据 。 至 今 还 没 
有 大 把 这 种 能 力 归 因 计 某 个 基因 或 基因 群 。 但 包括 种 内 、 种 间 与 
属 间 的 所 有 体 细胞 杂交 实验 中 ， 只 要 一 方 亲本 能 再 生 植 株 ， 杂 种 
细胞 就 能 再 生 植株 。 所 以 我 们 可 以 把 原生 质 体 的 再 生 行 为 看 作 是 
显 性 性 状 ， 这 在 体 细 胞 杂交 中 非常 有 用 。 首 先 ， 无 需 亲 本 双方 都 
能 再 生 植 株 ， 大 大 扩大 了 体 细 胞 杂交 的 应 用 范围 。 其 次 ， 再 生 行 
为 可 以 作为 选择 多 一 个 依据 ， 将 无 再 生 能 力 的 一 方 亲本 淘汰 。 只 


”要 该 方 有 某 个 遗传 标记 ， 就 可 根据 该 遗传 标记 淘汰 有 再 生 能 力 的 


另 一 方 亲 本 。 这 样 就 能 依次 淘汰 二 个 亲本 ,从 而 得 到 体 细胞 杂种 。 
细胞 在 培养 基 上 生长 的 差异 也 可 人 为 地 创造 。 用 不 可 道 的 生 
化 抑制 剂 处 理 亲 本 细胞 ， 阻 塞 了 它们 的 代谢 机 能 ， 从 而 使 它们 不 


“443。 


能 在 培养 基 上 生长 ， 而 只 有 杂种 细胞 重 建 了 必要 的 代谢 支 路 能 


在 培养 基 上 正常 生长 只 奉 人 用 碘 乙 酸 盐 处 理 烟草 原生 质 体 小 已 经 
得 到 几 个 种 间 的 体 细 胞 杂种 。 由 于 这 个 方法 适用 于 无 遗传 标记 区 
原生 质 体 ， 受 到 广泛 重视 ; 

3.: 体 细胞 杂种 的 鉴定 


杂种 鉴定 是 体 细胞 杂交 的 重要 一 直人 芭 二 
择 径 序 永 身 ， 就 为 所 选 圭 料 的 杂种 性 质 提供 了 证 据 , 但 -- 般 来 说 ， 


不 管用 什么 方法 选 出 来 的 全 种 植株 都 需要 经 过 鉴定 。 要 清楚 地 证 
明 选 出 的 硅 料 中 ， 融 合 亲 村 的 双方 都 贡献 了 遗传 成 分 。 可 荆 
(1) 形态 学 鉴定 
一 旦 原生 质 体 的 歌 合 产 履 再生 了 植株 计 高 等 植物 户 泛 的 形态 
学 特征 上 的 差异 可 以 用 来 鉴定 杂种 。 叶 片 的 大 少 与 形状 、 花 的 形 


态 与 色彩 、 以 及 时 柱 、 花 梗 与 表皮 毛 状 体 的 长 得 等 等 都 已 被 用 来 


措 述 体 细 胞 杂种 。 从 已 有 的 大 量 报道 来 看 ， 在 种 间 的 体 骨 胞 杂种 
中 ， 这 些 特 性 或 多 或 少 居于 融合 亲本 双方 的 中 间 岂 而 在 属 间 的 体 
细胞 杂种 ， 着 兰 情 执 的 于 华 沪 得 关 全 拓 : 天 年 的 /和 乔 委 玫 和 
方 。 


在 应 用 这 些 特性 时 需要 十 分 小 心 , 因为 它 们 党 党 是 要 色 基 因 


控制 的 。 为 得 到 有 意义 的 结论 ， 必 须 局 时 观察 个 独立 的 性 状 。 
同 讨 还 需 注 意 ， 不 要 将 体 细胞 杂种 的 形态 变异 与 非 整 倍 体 或 培养 
条 件 产 生 的 变异 相 混 淆 ， 对 于 非 整 信 体 杂种 变 旱 菌 多 释 必 须 十 分 
齐 慎 ， 一 般 来 说 如 只 有 整 倍 体 杂 入 晤 类 作 洪 淹 当量 客 和 

(2) 细胞 学 观察 

染色 体 数 量 、 大 小 与 形态 的 变化 在 植物 牺 禹 形 址 与 过 化 中 四 
着 重要 的 作用 ， 各 和 囊 植 物 的 染色 体 是 相对 稳定 韵 ， 因 而 继 胞 学 观 
察 是 证 明 杂 种 细胞 的 简便 而 又 可 靠 的 方法 。 凡 竹 项 涛 | 


细胞 学 观察 提供 了 细胞 的 倍 性 情况 。 一 般 用 作 体 细胞 杂交 的 


原生 质 体 是 二 倍 体 ;， 因 而 期 望 体 细胞 杂种 是 四 倍 体 。 实 际 七 ,所 
报道 的 种 内 与 种 间 的 体 细胞 杂种 允 数 是 异 源 四 信 体 6 双 二 和 售 体 D， 


但 也 有 倍 性 更 高 5 的 或 在 整 售 体 。 六 售 体 可 能 是 三 个 原生 质 体 融 含 “ 轩 


.44 


ma 


疡 生 的 ， 非 整 倍 体 可 能 与 原生 质 体 来 自 不 规则 分 裂 的 培养 细胞 有 


关 。 

由 于 业 色 体 的 差异 在 远 缘 种 间 更 大 ， 所 以 远 缘 种 间 杂 种 比 近 
缘 的 更 易 鉴定 。 标 记 梁 色 体 的 存在 大 大 有 利于 杂种 细胞 的 遗传 分 
析 ， 染 色 体 显 带 技术 被 广泛 地 用 来 鉴定 特异 的 染色 体 ， 研 究 体 细 
胞 杂种 中 染色 体 的 重 排 。 在 远 缘 的 体 细胞 杂种 中 往往 亲本 一 方 
的 染色 体 部 分 地 消失 ， 例 如 大 豆 与 粉 蓝 烟 草 的 组 合 中 ， 粉 蓝 烟草 
中 较 大 的 染色 体 大 部 分 消失 ， 也 有 双方 都 有 部 分 染色 体 消 失 的 例 

(3) 生化 分 析 

虽然 不 是 双亲 的 所 有 基因 都 能 在 体 细 胞 杂种 里 表达 ， 但 它们 
的 表达 往往 给 杂种 鉴定 提供 良好 的 指 诗 。 同 功 酶 的 电泳 图 谱 常 被 
用 作 夫 种 的 证 据 ， 也 可 以 分 术 非 酶 的 结 沟 蛋白 及 次 生 代谢 产物 。 

电 . 同 功 梅 
1 同 功 酶 是 同 功能 酶 的 多重 分 子 形态 。 体 细胞 杂种 的 同 功 酶 谱 
往往 是 双亲 酶 谱 的 总 和 ， 既 表现 某 方 特 有 的 酶 带 ， 也 表现 双方 藉 
有 竟 酶 带 。 有 时 体 细 胞 杂种 还 表现 双方 都 没有 的 新 揭 杂 种 带 。 杂 
种 站 辣 功 酶 谱 还 会 随 着 染色 体 的 逐渐 丢失 而 发 生变 化 s 有 大 用 细 
胞 学 观察 与 同 功 酶 分 析 结 合 起 来 研究 大 豆 与 粉 蓝 烟草 的 杂种 细 
胞 困 确 定 天 冬 氮 酸 氨基 转移 酶 的 合成 在 某 个 特异 的 染色 体 上 成 
为 用 体 细 胞 杂交 进行 基因 完 位 的 先例 。 

四 ”部 分 I 蛋 自 权 

部 分 I 蛋 和 白 是 叶绿体 中 最 丰富 的 可 溶性 蛋白 , 它 有 核 酮 糖 1, 5- 
双 砍 酸 酯 羧 化 酶 与 加 氧 酶 的 双重 酶 活性 ， 由 叶绿体 DNA 编码 的 
大 亚 基 与 核 DNA 编码 的 小 亚 基 组 成 。 因 而 部 分 I 蛋 白 的 亚 基 和 多肽 


| 构成 的 分 析 同 时 提供 了 叶绿体 与 核 基因 组 表达 上 的 信息 。 


Re 


从 迄今 所 报道 的 许多 体 细 胞 杂种 的 实例 来 看 ， 部 分 I 蛋 归 分 
析 的 结果 是 基 计 一 致 的 。 杂 种 中 存在 着 亲本 双方 的 小 亚 基 多 肽 ， 


而 大 亚 基 多 肽 只 来 目 素 本 的 一 方 。 也 有 个 别 报 道 ,- 在 杂种 里 同时 


存在 两 类 大 亚 基 允 肽 ， 这 很 可 能 是 出 蒋 合 细胞 造成 的 。 与 同 世 酶 


4 秆 条 。 


的 情况 不 同 , 杂种 的 部 分 I 蛋 白 亚 基 多 肽 从 未 出 现 过 不 同 于 亲本 的 
新 带 或 居间 的 酶 带 。 

@@ 次 生 代谢 鹅 

亲本 在 产生 次 生 代谢 物 上 的 差异 ， 像 挥发 性 化 合 物 、 生 物 碱 
及 类 胡 葛 小 素 等 ， 也 已 用 来 鉴定 体 细胞 桨 种 。 由 于 这 些 化 谷物 的 
合成 步骤 多 而 复杂 ， 不 受 基 因 直 接 控制 ， 常 常 受到 生理 与 发 育 条 
件 的 影响 而 变化 ， 所 以 作为 鉴定 杂种 的 价值 不 高 岂 次 生 代 谢 物 的 
分 析 可 以 为 杂种 提供 旁证 ， 但 不 能 作为 排 全 性 的 证 据 证 实体 细胞 
杂种 。 

(4) 分 子 生 物 学 鉴定 

分 子 生 物 学 技术 的 进展 对 于 分 析 体 细胞 杂种 的 遗传 梅 成 是 重 
大 的 促进 。 叶 绿 体 与 线粒体 DNA 的 特异 内 切 图 谱 已 用 来 鉴定 体 
细胞 杂种 或 胞 质 杂 种 的 质 体 基因 组 与 线粒体 基因 组 。 对 杂种 叶 绿 
体 DNA 的 分 析 表 明 ， 在 叶绿体 DNA 之 间 不 会 发 生 重组 ; 遗传 上 
不 同 的 叶绿体 不 能 保持 在 共同 的 细胞 质 中 ， 在 融合 产物 中 ， 叶 绿 
体 迅 速 随 机 地 分 离 , 直 至 只 剩 下 同 质 的 叶绿体 。 分 析 还 表明 ,杂种 
抗 链 霉 素 特性 是 与 抗 性 亲本 一 方 的 叶绿体 存在 有 关 ， 胞 质 雄 性 不 
育 与 叶绿体 无 关 ， 而 与 不 育 亲 本 的 线粒体 相关 。 在 体 细 胞 杂种 里 ， 
线粒体 DNA 发 生 广泛 的 重 排 ， 出 现 新 的 线粒体 DNA 内 切 谱 带 。 
它 可 能 发 生 在 两 个 亲本 的 线粒体 DNA 之 间 ， 也 可 能 来 自 亲 本 线 
粒 体 DNA 的 分 子 内 重 排 ， 所 以 在 确定 线粒体 DNA 是 否 重组 时 必 
需 遵 慎 。 

新 近 Saul 等 发 展 了 另 一 种 技术 ， 用 种 特异 的 高 重复 的 核 DNA 
作 探 针 ， 鉴 定 了 天 仙子 与 烟草 属 间 融 合 杂种 的 亲 本 DNA。 在 融 
合 前 ， 用 强 X 光 消除 烟草 原生 质 体 的 核 ， 发 现在 融合 杂种 里 仍 有 
适量 的 烟草 DNA。Soeuthern 印迹 技术 与 杂种 细胞 的 原 位 杂交 证 
实 ， 烟 草 DNA 散 布 在 天 仙子 的 基因 组 上 。 

(5) 遗传 分 析 

产生 可 育 花 的 体 细 胞 植株 可 用 常规 的 遗传 方法 分 析 。 自 交 F， 
代 分 离 的 结果 与 期 望 值 的 一 致 性 可 为 植株 的 杂种 性 质 提供 可 靠 的 


46。 


ES 


证 据 。 由 于 非 整 倍 体 及 高 度 不 平衡 的 杂种 〈 如 带 奇数 基 因 组 或 不 
亲 和 的 远 缘 融合 组 合 ) 都 会 不 育 ， 所 以 用 有 性 杂交 进行 遗传 分 析 
仅 限 于 同属 的 种 内 与 种 间 的 体 细 胞 杂种 。 

花粉 活力 的 高 低 是 衡量 杂种 基因 组 亲 和 性 的 有 力 依 据 。 与 有 
性 亲 和 药 体 细 胞 杂种 相 比 ， 有 性 不 亲 和 、 更 远 缘 的 融合 组 合 ， 
粉 的 活力 降低 。 但 在 解 杰 这 些 现象 时 必须 谨慎 ， 因 为 非 整 倍 体 的 
全 粉 活力 也 降低 ， 而 大 部 分 这 类 杂种 实际 上 是 非 整 倍 体 。 

花药 培养 已 作为 体 细胞 杂种 遗传 鉴定 的 另 一 种 方法 用 来 鉴定 
曼 陀 罗 、 烟 草 的 体 细胞 杂种 。 在 花药 再 生 的 后 代 中 ， 核 编码 标记 
的 分 离 为 花药 供 体 植株 的 杂种 性 质 提 供 了 明确 的 证 据 。 同 时 ， 花 
药 培养 还 有 利于 降低 体 细胞 杂种 的 倍 性 ， 发 现 并 稳定 由 减 数 重组 
产生 前 新 基因 组 合 。 

4. 原 生 质 体 融 合 的 操作 程序 

(1) 实验 材料 的 准备 

GO 植物 材料 ， 

温室 栽培 的 大 麦 幼 苗 叶 片 ; 

巧 浮 培养 的 大 豆 细 胞 ， 每 两 天 继 代 一 次 。 

@ 器材 仪 器 ; 

与 原生 质 体 培 养 相 同 

@ 试剂 : . 

70% 酒 精 、0.1% 升 和 于、 无 菌 水 ; 

酶 液 志 洗涤 液 及 培养 基 与 原生 质 体 培 养 的 相同 。 

酶 液 I，2% 纤 维 素 酶 Onozuka 有 R 人 一 10，0.5%Driselase， 
1%Pectinase，0.5% 半 纤维 素 酶 了 hozymeHP150， 
0.1% 了 BectolyaseY23， 湾 于 泪 洗 液 内 。 

稀释 液 : 0.5M 葡 萄 糖 ,0.05MCaCl,。2H;O;0.7mMKH,PO,， 
BEH10.55 

孙 乙 二 醇 (PEG) 湾 液 ，1g8PEG(1540) 溶解 到 2ml 含 有 0.1M 
葡萄 糖 ，10.5mMCaCl, 与 0.7mMKH:PO ,的 溶液 中 ，pH5 .8。 

(2) 操作 程序 


447。 


@ ”游离 大 豆 原 生 质 体 ， 取 0.5ml 继 代 后 两 天 的 悬浮 大 豆 细 
与 4o 酶 液 匡 混 合 ，24C 下 培育 17 一 20 小 时 , 绥 慢 地 在 振 苏 器 十 


胞 
援 型 


地 


@ 大 麦 时 片 原生 质 体 游 离 ， 见 原生 质 体 培养 的 操作 顺序 。 
@@， 将 两 种 原生 质 体 混 在 一 起 ， 镍 丝 网 过 滤 让 离心 收集 区 用 
洗涤 液 洗 一 次 ( 见 培养 操作 )， 重 新 悬浮 在 洗涤 液 中 ”原生质 体 密 
度 调 到 105 一 2X105/ml。 

四 了 将 土 述 混合 液 滴 在 平 亚 底部 ，6cm 开本 机 大 捕 此 六 着 

每 消 药 150pl1, :静止 5 分 钟 。 

四 村 在 击 述 液 滴 止 ， 用 细 口 臣 管 慨 地 加 入 PEG 深 这 450t 
再 静 卫 10 一 20 分 钟 。 

@ - 慢 慢 地 加 入 稀 套 液 ， 在 10- -一 15 分 钟 期 间 5 每 液 注目 加 055 
一 1m! 黎 苦 液 。 使 平 亚 内 液体 连 成 一 片 。 和 

〇 O 倾斜 平 严 ， 吸 去 上 清 液 ， 再 缓慢 地 加 六 3 一 4ml 稀释 液 ， 
尽量 勿 使 烙 在 底部 的 原生 质 体 漂浮 起 来 ， 再 借 斜 平 严 ) 吸 去 上 清 

@ 按照 上 述 办 法 ， 用 培养 养 基 洗 一 次 s 

@ 加 入 2 一 3m] 培 养 基 ， 轻 经 晃动 平 严 ， 让 原生 质 体 悬 浮 在 
培养 液 内 。 
四 用 时 口 及 时 位 二 养 在 25 避 的 低 入 作 下 


(三 ) 植物 组 隐 转 化 


“转化 ?一 词 原来 指 的 是 一 个 细菌 品系 由 于 吸收 了 另 一 个 细菌 
品系 的 DNA 而 发 生 和 遗传 性 状 改变 的 现象 。 这 个 概念 后 来 也 通用 
于 高 等 生物 ,表示 外 源 基因 整 入 受 体 的 基因 组 并 得 以 表达 的 现象 。 
尽管 走 斯 等 人 早 就 做 了 大 量 的 高 等 植物 转化 实验 ,但 由 于 钠 乏 有 
效 指 实验 体系 及 可 靠 的 证 据 而 未 获 成 效 。 自 从 发 现 了 农 杆菌 的 Ti 
质粒 以 后 ， 高 等 植物 的 遗传 转化 研究 得 到 了 迅速 发 展 s_ Ti 质粒 能 
促进 外 涯 基因 离 体 转移 ， 闪 整 入 双子 时 植物 的 基因 组 中 得 ,到 ; 表 
达 。 在 Ti 质粒 的 基础 上 ， 发 展 了 各 种 载体 系统 ， 有 些 载体 系统 已 


。f48 。 


光 学 


eaeowe av ea opiracrac  n 


人 | We 


人 有 
亲 、 
多 
年 
了 
区 


去 除了 T-DNA 的 致 瘤 基因 ， 代 之 以 显 性 选择 标记 ， 便 于 选择 转 
人 最 近 ， 用 这 类 载体 系统 转化 单子 叶 箱 物 也 获得 了 成 功 。 
-目前 高 等 植物 的 遗传 转化 已 发 展 为 一 整套 完整 的 技术 ;包括 
目的 基因 的 分 离 、 载 体 修饰 、 转 化 操作 及 转化 体 的 鉴定 分 析 。 转 
化 操作 的 方法 多 种 多 样 ， 如 整 株 水 平 上 注射 、 人 为 创伤 上 接种 、 
胚胎 注射 以 及 根 尖 用 纤维 素 酶 处 理 后 感染 等 ， 但 最 有 效 的 方法 还 
是 利用 组 织 培 养 前 技 术 , 在 细胞 水 平 上 进行 转化 。 植 物 组 织 培养 ， 
特别 是 原生 质 体 技术 的 发 展 ， 为 高 等 植物 的 遗传 工程 提供 了 理想 
的 受 体系 统 。 目 的 基因 转化 的 细胞 或 原生 质 体 可 以 再 生 完 整 植株 ， 


不 仅 为 转化 体 的 遗传 分 析 提 供 了 条 件 ; 而 且 为 遗传 工程 直接 用 于 


作物 改良 开辟 了 新 路 。 本 文 着 重 介绍 几 种 行 之 有 效 的 转化 操作 技 
术 ， 遗 传 转化 研究 的 其 他 几 项 内 容 可 以 参见 本 书 的 遗传 工程 基本 
操作 技术 。 

1， 致 瘤 农 杆菌 接种 无 菌 苗 或 外 植 体 而 诱发 肿瘤 
“ “大 多 数 植物 诱发 肿瘤 药 最 适宜 材料 是 试管 繁殖 的 无 菌 苗 。 为 
和 避免 其 他 微生物 的 污染 ， 转 化 研究 中 用 无 菌 的 植物 材料 是 非常 重 
要 的 。 因 为 沾染 物 有 可 能 杀 死 植物 细胞 ， 也 会 干扰 对 转化 材料 的 
生化 或 分 子 笃 驳 学 分 析 。 温 室 栽培 植株 的 外 植 体 经 严格 的 灭 菌 以 
后 也 可 成 功 地 诱发 肿瘤 。 

GD) 实 骆 导 料 的 准备 

G@ 天 养 基 
“MMS 培养 基 〈 见 附录 )5 

MSIC， 在 融化 后 保持 在 45 吕 的 MS 培养 基 中 加 入 过 滤 灭 菌 


欧 羧 茶 青 霉 素 溶液 ， 使 其 最 终 浓 度 为 1mg/ml。 


@ “抗菌 素 
羧 葵 青 霉 素 ，100mg/ml 的 蒸 馅 水 溶液 ， 过 滤 灭 菌 ，47 或 
一 207C 下 贮存 ， 


下 Cefotaxime:， 50mg/ml 的 蒸 饮水 溶液 ， 过 让 灭 菌 ，- 207 下 


贮存 。 
卡 那 霉 素 ，10mg/ml 的 蒸 饮 水 溶液 ,过滤 灭 亢 ， 4 或 -207 


。449 。 


下 贮存 。 
利 福 霉 素 ，20mgy/ml 的 甲醇 溶液 ，- 20C 下 贮存 。 
四 环 素 ，10mg/ml 的 燕 馅 水溶液， 过滤 灭 菌 ， 4 或 -207 

二 贮存 。 

使” 无 菌 苗 

种 子 用 10%(v/v) 的 次 氧 酸 钠 溶液 浸泡 10 一 30 分 钟 ， 用 无 

菌 水 洗 5 次 ， 接 种 在 NMS 固体 培养 基 上 发 芽 ， 培 育 在 25C， 慨 叫 

等 光照 强度 (1000lux)。 

由 外 植 体 

从 温室 裁 培 植株 切取 幼 嫩 枝条 ， 用 10%(v/v 次 氯 酸 钠 溶液 
进行 表面 灭 菌 20 一 30 分 钟 。 用 无 菌 水 洗 5 次 。 去 掉 漂 白 剂 伤害 的 
部 位 ， 修 去 基部 大 时 ， 切 成 4cm 长 的 茎 段 。 基 部 向 下 搬 在 MsS 恩 
体 培 养 基 上 。 

(2) 操作 步 葬 

@ 用 灭 过 菌 的 刀片 切 去 离 体 繁殖 植株 或 无 菌 子 苗 的 顶部 。 

@ 在 切割 表面 接 上 培养 过 夜 的 致 瘤 农 杆菌 。 或 者 用 皮 王 注 
射 针 头 沾 菌 后 刺 伤 植株 的 茎 。 

国 在 257C 的 低 光 昭 〈600 一 1000lux) 下 丧 搂 种 植株 3 一 8 
周 。 

Q@ 当 用 癌 长 到 直径 为 ?一 10mm 时 ,3 到 :下 肿瘤 ， 移植 在 
。，MSIC 培 养 基 上 。 培 养 基 中 加 lmg/m! 羧 葵 青 霉 素 ; 也 可 用 Cefo- 
taxime (500ug/ml)、 万 古 霉 素 (100ug/ml)、 或 利 福 霉 素 (50ug/ 
mj) 加 四 环 素 (1cug/ ml 取代， 以 杀 死 农 杆 万 。 

B@ 根据 由 瘤 的 生长 状态 ，3 一 6 周 后 转移 到 羧 茶 青霉素 含量 
为 0.5mg/ml 的 MS 培 养 基 上 ， 然后 在 次 从 青 才 素 为 0 25mg/ml 的 
NMS 培 养 基 上 继 代 保持 。 如 用 其 他 抗生素 ， 则 浓度 也 相应 降低 。 

@ 定期 地 取 少 量 肿瘤 ,接种 在 25C 的 营养 肉 汤 中 振 蔓 培养。 
当 肿 瘤 组 织 上 不 再 有 存留 组 效 时 ， 转 移 到 不 含 抗生素 的 MS 培养 
基 上 培养 。 

2. 烟草 叶 盘 感 闪 农 杆菌 


50。 


外 振 基 因 通 过 农 杆 菌 质 粒 导 入 植物 需要 一 个 组 织 培养 系统 ， 
使 转化 的 组 织 能 再 生 植株 。 叶 片 是 最 常用 的 起 始 材料 ， 对 于 原生 
质 体 再 生还 有 困难 的 种 ， 叶 盘 感染 转化 是 最 简便 而 有 效 的 转化 方 
法 。 

(1) 实验 材料 的 准备 

@ ”农村 菌株 系 

C58C1IRif: (DGV2260) 

C58CIRif (pGV2260::pGV1503) 

C58CIHRif (pGV2260::pGV941) 

@ 植物 奢 料 

烟草 SR 无 菌 苗 培养 在 24C 下 ， 用 16/8 小 时 光 周 期 中 等 强度 
光照 。 在 Al 培养 基 上 6 一 8 周 后 取 叶 片 。 

@@ 植物 培养 基 

《i) Al (无 菌 苗 培养 基 ) 

1/2MS 培 养 基 的 盐 浓度 ，1% 蔗 糖 ，0.8% 琼脂， 

(ii) A,， (感染 培养 基 ) 

B ,培养 基 加 250mg/IINH,NO,，3%% 芒 精 ，0.5g/1 MES， 
(pH5.5)。 

(iii) A。( 诱 导 愈 伤 组 织 培养 基 ) 

B。 培 养 基 加 以 ，250mg/1 NH.NO。，2% 葡 萄 糖 ，0.587/1 
MES (pH5.7)，40mg/1 腺 嘎 叭 ，0.8% 琼 脂 ，1mg/1 6- 革 基 腺 
厅 叭 (BAP)，0.1img/1 呵 唆 乙 酸 (IAA)，500mg/ Cefotaxime， 
50 一 100mg/1 卡 那 霉 素 。 

(iv) Av (诱导 苗 培 养 基 ) 

A, 培 养 基 ，200mg/1 Cefotaxime， 去 掉 IAA。 

(CV) As ( 根 分 化 培养 基 ) 

1/2MS 培 养 基 盐 浓度 ， 加 3% 蔗 糖 ，0.5g/1 MES(CpI15.7)， 
0.8% 和 琼脂 ，100mg/1 Cefotaxime 


四 细菌 培养 基 ， minA。 


3451T97 


7:5mM (NH4): SO 1.7mM 柠檬 酸 钠 

ImM Mg8SO， 2g/1 葡萄 糖 

50mg/L 维 生 素 Bl。 

(2) 操作 步 又 

中 取 叶 片 ， 去 除 中 脉 ， 切 成 0.25cm” 左右 的 小 片 ， 叶 面 朝 
下 放 在 A, 培 养 基 上 。9cm 平 四 盛 10m1 培 养 基 ， 大 约 放 12 小 片 。 

加 加 2581 对 数 生 长 晚期 的 农 杆菌 ， 低 光照 下 培育 2 天 。 

四 ”去掉 培 养 基 ， 用 含 500mg/1 Cefotaxime 的 Az* 培 养 基 洗 
一 次 。 

四 用 无 菌 滤纸 将 时 盘 吸 干 ， 移 到 含 适量 选择 剂 的 A ,培养 基 

上 ， 诱 导 生 苗 。 

@。 每 周 用 新 鲜 A, 培 养 基 继 代 一 次 。 

@ 3 一 4 周 后 从 叶 盘 分 离 再 生前 您 伤 组 织 ， 将 僵 伤 组 织 移 到 
加 选择 剂 的 A, 培 养 基 上 。 

@ 2 一 3 周 后 ， 从 愈 伤 组 织 上 切 下 小 苗 ， 转移 到 生根 增 养 基 
As 上 ， 根 在 两 周 内 形成 。 

测定 新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 (NPT 一 工 ) 的 活性 或 将 叶片 放 
在 含 100mg/1 卡 那 霉 素 的 As 培养 基 上 ， 来 鉴定 转化 植株 。 

@ 将 再 生 的 转化 植株 在 Ai 培养 基 上 作 无 菌 苗 培养 ,或 者 移 
植 到 温室 的 花 盆 中 。 

3， 植 物 细胞 与 农 杆 菌 共 培养 

游离 的 植物 原生 质 体 在 适宜 的 培养 条 件 下 形成 细胞 壁 ， 然后 
进行 缁 胞 分 裂 。 将 分 裂 之 前 形成 了 新 壁 的 细胞 与 农 杆菌 共 培养 ， 
就 能 成 功 地 转化 。 实 验证 明 ， 原 生 质 体 在 形成 新 壁 之 前 ， 或 经 十 
多 天 培养 之 后 都 不 易 被 农 杆菌 转化 。 说 明 转 化 与 原生 质 体 新 壁 的 
成 分 有 关 。 

所 过 养 闪 琵 扑 全 二 是 二 六 夹 下 本 届 A 天 可 误 全 得 到 很 多 
转化 体 。 转 化 频率 一 般 在 0.1 一 1%， 高 的 甚至 可 达 20%s .由 共 培 
养 产生 的 转化 体 都 源 自 单个 细胞 ， 对 于 转化 体 的 分 子 生 物 学 分 析 
极 有 价值 ， 也 便于 对 TI 一 DNA 整 合 及 表达 的 特性 进行 分 析 。 当 然 ， 


a& 452 。 


再 生 。 


为 得 到 转化 的 植株 ， 共 培养 转化 的 前 提 是 原生 质 体能 再 生 完 整 植 
株 昌 全 出 
(1) 实 骆 圭 料 的 准备 

中 植物 材料 

烟草 SRi 无 菌 苗 ， 人 参见 @。 

@， 培养 基 

KK。 培 养 基 ， 参 见 附 录 。 

(2) 操作 步 又 

中 植物 原生 质 体 的 游离 及 纯化 ， 人 参见 原 生 质 体 培 养 及 植株 


@， 将 含有 0.4M 芒 糖 、0.1mg/1 莹 乙酸 及 0:2mg/1 激动 素 的 
KK ,培养 基 重 新 悬浮 纯化 的 原生 质 体 ， 使 原生 质 体 的 最 终 密 度 为 
1 一 2X10*/ml， 每 9 公分 的 平 严 中 放 入 5ml 原 生 质 体 悬 浮 液 ,用 者 
口 膜 封 住 平 严 。 放 在 低 光 照 (400lux) 下 培养 。 

国 “培养 3 天 后 ， 几 乎 所 有 的 原生 质 体 都 再 生 了 细胞 壁 ， 呈 袖 
圆 形 。 此 时 ， 加 入 50ul 对 数 生 长 后 期 药 农 杆 亩 ， 使 最 终 比 贫 约 为 
1:100 (原生 质 体 : 农 杆 亢 )。 

四 在 室温 王 共 培养 32 一 48 小 时 。 

@@ ” 移 到 离心 管内 离心 ， 去 除 上 清 液 ， 用 KK。 培养 基 重 新 悬 
浮 , 再 离心 。 这 样 反复 洗 2 一 5 次 ,然后 重新 悬浮 在 KK 培养 基 中 培 
养 ， 加 入 Cetfoetaxime， 使 最 终 浓 度 为 500kg/ml。 细 0 
6X104/ml。 

@ 10 一 苹 天 后 ， 加 入 新 鲜 的 K。 培养 基 , 抗 生 素 含量 同上 。 
继续 培养 10 天 。 

@ 离心 收集 小 细胞 团 ,加 入 选择 培养 基 。 对 于 致 瘤 农 杆菌 ， 
可 用 无 激素 的 培养 基 作 选择 塔 养 基 ， 对 于 非 致 瘤 而 含有 像 抗 卡 那 
霉 素 那样 显 性 选择 标记 的 农 杆菌 ， 可 在 培养 基 中 加 100mg/1 的 卡 
那 霉 素来 选择 转化 体 。 

@@ 用 固体 选择 培养 基 制 成 平板 (参见 原生 质 往 搓 养 ), 使 小 
细胞 团 的 密度 为 200 一 5001mal。 

。 453 。 


@ 再 培养 4 一 5 周 以 后 , 挑 出 直径 为 2mm 以 上 的 小 剑 伤 组 织 ， 


转移 到 不 含 抗体 的 :培养 基 上 ， 或 者 转移 到 含 2mg/1 革 基 跟 味 叭 
的 MS 培 养 基 上 分 化 苗 。 

4. 上 EG 法 转化 植物 原生 质 体 

前 面 介绍 的 几 种 转化 方法 极为 有 效 ， 但 也 有 一 定 的 局 限 性 。 
首先 ， 单 子叶 植物 对 农 杆 菌 不 敏感 ， 因 而 不 宜 用 土 述 转化 方法 。 
第 二 ， 还 有 许多 像 豆 科 那 样 的 作物 ， 它 们 的 原生 质 体 经 不 起 共 培 
养 的 处 理 。 第 三 ， 农 杆菌 往往 会 污染 转化 组 织 的 抽 提 物 ， 于 扰 转 
化 基因 的 转录 与 翻译 的 研究 ， 从 而 导致 人 为 的 结果 。 因 此 ， 新 的 
转化 技术 还 在 不 断 的 探索 之 中 。 这 些 技 术 包 括 ， 钙 化 学 法 促进 原 
生 质 体 摄取 裸体 DNA， 外 原生 质 体 摄取 含 Ti 质粒 的 脂 质 体 ， 包 
原生 质 体 与 细菌 原生 质 球 融 合 ;， 外 微 注 射 法 直接 将 外 源 DNA 导 
入 原生 质 体 。 至 今 最 成 功 的 还 是 用 PEG 方 法 将 TI 质粒 的 DNA 寻 
入 原生 质 体 ， 脂 质 体 与 细菌 原生 质 球 的 导入 技术 也 基本 相同 。 

(1) 实验 讨 料 的 准备 

中 Ti 质粒 ， 分 离 方法 见 基因 工程 基本 操作 技术 辟 使 用 前 24 
小 时 ， 加 几 滴 氯仿 灭 菌 。 

@ 烟草 SRi 的 原生 质 体 ， eaaer 
与 植株 再 生 。 

全 天 :培养 基 ， 人 参见 3。 

四 “了 培养 基 ，NaCll140mM;  KCIL5mM;， NasHPOL0.75 
IDM; 葡萄 糖 5mM; CaCl 2HOl25mM。 配 制 时 ， 将 Cacls 
溶 在 40ml 双 蒸 水 中 ， 其 余 成 分 溶 在 另 一 份 双 蒸 水 中 ,两 份 合 并 
后 ， 调 pH 到 7.0。 加 双 蒸 水 到 100m1， 这 时 出 现 的 沉淀 状 物质 不 
要 去 掉 。 

加 EP 培 养 基 : wjgnetrgre 使 PEG 的 
最 终 深 度 达 到 40% ， 热 压 灭 菌 。 

(2) 操作 步骤 

四 ”将 原生 质 体 悬 浮 在 :培养 基 中 ， 密 度 为 5x 10"/ml， 取 
lml 到 离心 管 中 。 


es 454。 


区 on 


RE ay 2 


呆 


Q@ 加 10ugTi 质 粒 DNA (体积 往往 是 25 一 50h1) 。 

四 加 50kl (1mg/ml) 的 小 牛 胸腺 DNA， 事 先 加 几 滴 氧 仿 
灭 菌 。 

@@ 加 0.5mlFP 培 养 基 。 在 26 光 照 下 培育 30 分 钟 。 
司 印 | 加 2mlF 培 养 基 ， 室 温 下 《21"C)5 分 钟 ， 如 此 重复 4 一 5 
次 ， 使 PEG 浓 度 由 原来 的 13.3% 降 到 1.6%，Ca" 浓度 由 原来 的 
40mM 上 升 到 115mM 。 

@ .600 转 /分 离心 ， 去 除 上 清 液 。 

@ 将 原生 质 体 重新 悬浮 在 含 激素 与 250mg/I 羧 革 青霉素 的 
KK 培养 基 (蔗糖 0.4M) 上 。 经 上 述 转 化 程序 处 理 后 存活 的 原 生 
质 体 约 为 50%。 

@@ 将 原生 质 体 悬 液 移入 平 阵 ， 封 口 后 培养 在 26* 的 黑暗 条 
件 下 24 小 时 。 

@ “将 平 阻 移 到 每 天 12 小 时 光照 (2000Iux) 下 培养 两 周 。 

将 平 血 中 悬 液 分 成 两 严 ， 各 以 1:1 加 入 新 鲜 的 KK。 培养 
基 。 

@ 曙 ”两 周 后 用 蔗糖 为 0.3M， 琼 脂 为 0.3% 的 和 :培养 基 稀 释 10 
倍 。 培 养 4 周 。 

-四 “ 挑 出 小 愈 伤 组 织 ， 放 在 固体 培养 基 上 选择 并 分 化 苗 。 

5. 植物 原生 质 体 的 电 激 法 转化 

细胞 膜 在 瞬间 的 强 电场 中 会 形成 小 孔 ， 这 足以 让 蛋白 质 或 核 
酸 这 样 的 大 分 子 通过 。 现 在 这 种 电 激 技术 已 用 来 转化 动物 细胞 或 
植物 原生 质 体 。 在 实验 的 条 件 下 ， 大 豆 的 原生 质 体 大 约 吸 收 ?2 
XI10- 逢 液体， 如 果 培 养 基 中 含 50ug&DNA/m1， 和 那么 一 个 细胞 吸 
六 大 约 100 个 DNA 分 子 。 绝 大 多 数 DNA 将 最 终 被 降解 ， 但 是 ， 如 
果 在 选择 条 件 下 培养 细胞 ， 获 得 转化 的 愈 伤 组 织 的 频率 约 为 10" 


0 25 


(1) 实验 材料 的 准备 
申 ” 酶 深 液 
Bs 培 养 基 的 无 机 盐 ( 见 附 录 )3 0.4M 蔗 糖 ; 0.5% 纤 维 素 酶 


= 455 


R10; 0.2% 果 立户 及 一 10; DH5.6。 
OU 洗 活 液 ， 
Bu 无 宙 盐 0.4M 蔗 糖 : pH5 .6。 
@ . 5 培 养 基 
Bus 无 机 盐 ; 0.4M 蔗糖 和 750mg/1 cacli 250g/1 木 糖 ? 半 
250mg/HNNHINO,。 .35 
@ 了 EP 缓 冲 液 
0.4M 蔗 糖 ;》 4mM CaCl,;， 10mM Hepesi (pHZ.2)。 
@，K3 培 养 基 
K3 培 养 基 ! 0.2m8g/1 6- 某 基 腺 茜 吟 ! 0.1mg/1 莹 乙酸 。 
GD 抽 提 缓冲 液 
50mM Tris 〈 三 羟 申 基 氨 基 甲 烷 ) 
0.12mg/l leupeptin 
1% B-EtSH 
OD 23M NaCl 溶 液 。 
@ 0.7% 了 琼脂 糖 。 
(20) 操作 步 又 
由 常规 方法 游离 原生 质 体 。 
-四 酶 液 通过 50um 和 孔径 的 滤 网 ， 室温 下 每 分 钟 600 转 离心 9 
分 钟 ， 使 原生 质 体 漂 在 液 面 。 
四 ,用 细 管 吸 去 下 层 液 体 ， 加 入 K5 培 养 基 , 外 心地 冲洗 管 
壁 ， 用 手 滚动 离心 管 , :使 原生 质 体 与 液体 混合 ， 有 再 离 尼 ， 吸 去 十 
层 液 体 。 
四 加 EP 缓 冲 液 ,同上 操作 ， 尽 可 能 吸 净 下 层 液体 ,使 原生 
 ; 质 体 密度 达 6.25x .10*/ml。 
Q@ 了 到 200ul 原 生 质 体 巧 液 ， op agri 
将 管 放 在 冰 上 。 
@ 加 10ugDNA; 11ul NaCIl 溶 液 立 使 最 终 次 诬 坟 160inM 
ie 
状态 


2 才 560 4 


ee 5 


@ “将 电极 在 95%EtOH 中 洗 ， 再 用 EP 缓 冲 液 洗 2 一 3 次 ， 插 


”次 试管 (试管 仍 在 冰 上 )。 过 


= 
FF 室 和 人 了 
全 
必 
和 


7Q@ 1 给 以 400v/cm 电 场 (电压 200Y， 电 容 200kE) 50 毫 秒 。 移 
去 电极 
@ 1 分 名 后 ， 将 原生 质 体 移 到 平 亚 中 ， 加 Ki 培 养 基 ， 封口 
局 在 22 一 247 的 低 光 照 下 培养 。 
@ 沪 原生 质 体 培养 及 植株 再 竺 可 参见 由。 在 烟草 原生 质 体 转 
化 实验 中 ， 可 在 电 激 处 理 后 45 一 55 小 时 测试 基因 药 瞬 间 表 达 。 
5 将 原生 质 体 基 液 移 到 离心 管 中 ，600 转 /分 离心 5 分 钟 。 
@ ” 尽 可 能 地 除去 清 液 ， 留 下 不 多 ,于 75 一 120bl 转移 到 
Epipendotf 离心 管 中 ， 放 在 冰 上 。 
了 加 芭 3 体 积 的 抽 提 缓冲 液 ， 超 声 处 理 5 一 6 秒 。 发 声 器 的 
针头 应 恰好 放 在 液 面 下 ，: 功 率 用 12 一 15&， 即 中 间 值 。 
1 1@3 沉淀 45 一 60 秒 ， 将 上 清 液 移 到 新 管 。 
[@ 沁 取 10ul， 移 到 塑料 试管 中 ， 加 800k] 冰 及 200hLBiorad 蛋 
白质 测定 剂 ， 播 2 次 。 让 反应 继续 5 一 60 分 钟 。 
四 站 测定 在 595nm 的 吸光 率 ， 在 丙烯 醋 腕 凝 胶 上 ， 每 个 样品 
加 100kg 左 右 韵 蛋白质 (4 一 6 个 单位 )。 
@ .电泳 ; 测 新 霉 素 磷 酸 转移 酶 开 的 活性 。 


(四 ) 从 培养 细胞 分 离 突变 体 
基因 结 必 的 改变 称 为 突变 ， 由 此 产生 表 型 变 录 的 细胞 称 为 突 


总 体 细胞 。 基 因 在 表达 上 的 变化 也 能 产生 表 型 变化 ， 在 搞 清 变化 


的 遗传 基础 之 前 ， 一 般 通称 表 型 变异 体 或 细胞 系 。 在 分 离 突 变 体 
的 研究 中 ,分 清 突变 体 与 变异 体 两 种 不 同 的 概念 是 重要 的 。 确 定 
突变 体 可 通过 两 种 途径 .第 一 ， 从 变异 细胞 再 生 可 育 的 植株 ， 再 
通过 有 性 杂交 观察 变异 特性 的 传递 ,， 如 果 符 合 经 典 的 遗传 规律 ， 
即 可 肯定 是 突变 体 。 核 突变 体 以 孟 德 尔 方式 分 离 ， 细 胞 质 突变 体 
则 表现 为 单一 的 母性 遗传 。 第 二 ,在 变异 的 细胞 中 证 明 有 一 个 发 
生变 化 的 基因 产物 ， 例 如 发 现 一 种 酶 的 氨基 酸 顺 序 发 生 了 变化 ， 


@ 457 ee 


就 可 看 作 是 突变 的 证 据 。 

从 高 等 植物 培养 细胞 分 离 突 变 体 是 近 十 才 年 发 展 起 来 的 一 项 
生物 技术 。 利 用 植物 组 织 培 养 选 择 突变 体 有 明显 的 优越 性 ， 它 可 
以 在 有 限 的 时 间 与 空间 操作 大 量 的 细胞 ， 便 于 使 用 生化 选择 剂 ， 

而 且 培 养 的 细胞 有 可 能 再 生 完整 的 植株 。 与 愈 伤 组 织 及 悬浮 培养 


细胞 相 比 ， 原 生 质 体 培 养 体系 更 有 利于 选择 突变 体 ， 尤 其 是 单 倍 


体 的 原生 质 体 。 由 于 原生 质 体 不 易 持 久 地 保持 单 倍 体 状 态 ， 用 单 
倍 体 原 生 质 体 作 选择 体系 时 ， 需 要 及 时 进行 诱 变 处理 ， 并 诱导 形 
态 发 生 。 成 功 地 选择 突变 体 不 仅 需 要 适宜 的 培养 材料 , 诱 变 因素 、 
诱 变 时 机 及 适宜 的 选择 方法 都 是 重要 的 因素 。 

1， 诱 变 因 素 及 诱 变 处 理 

诱 变 剂 已 成 功 地 用 于 微生物 、 动 物 细胞 及 高 等 植物 来 提高 突 
变 体 的 频率 。 但 用 植物 的 培养 细胞 时 ， 诱 变 剂 提高 了 突变 频率 的 
证 据 还 很 少 。 有 些 实验 缺乏 自发 突变 频率 的 对 照 ， 在 有 些 实验 中 
筛选 的 药剂 有 诱 变 剂 的 作用 ， 选 择 效应 与 诱 变 效 应 不 能 区 分 开 ， 
而 且 已 有 证 明 离 体 条 件 的 本 身 有 时 就 有 诱 变 的 作用 ， 给 诱 变 剂 作 
用 的 分 析 增 训 了 困难 。 尽 管 如 此 ， 应 用 在 其 他 体系 的 理化 诱 变 因 


素 也 都 已 用 来 诱发 培养 细胞 的 突变 体 。 至 今 ， 诱 变 剂 的 选择 、 诱 


变 剂 的 剂量 以 及 诱 变 处 理 的 时 机 还 有 很 大 的 随意 性 。 
诱 变 作用 的 机 制 目前 还 不 很 清楚 。 诱 变 剂 最 初 可 能 作用 于 同 
源 染色 体 的 一 条 DNA 链 ,而 另 一 条 保持 非 突变 状态 。 这 种 单线 突 


变 的 假说 在 真 商 的 颜色 突变 中 得 到 了 验证 ，DNA 复 制 前 诱 变 产 


生 1/2 的 扇 状 突变 体 ， 而 复制 后 的 细胞 中 诱 变 产生 1/4 的 肩 状 突变 
体 。 由 此 推断， 在 植物 原生 质 体 前 诱 变 中 ，G:1 与 G* 细胞 的 比例 


对 诱 变 效 应 会 有 重大 的 影响 。 对 于 显 性 突变 来 说 ， 矢 合群 落 的 产 ， 
生 无 关 紧 要 ， 但 至 今 还 没有 技术 分 离 嵌 合群 落 中 的 营养 缺陷 型 细 : 


胞 。 纯 突变 体 的 产生 不 仅 与 诱 变 时 细胞 或 原生 质 体 的 状态 有 关 ， 
还 随 着 诱 变 剂 的 种 类 及 诱 变 剂 的 剂量 不 同 而 发 生变 化 。 这 里 将 分 
别 介绍 几 种 主要 诱 变 因素 的 使 用 。 

(1) 化 学 诱 变 剂 


。 458。 


人 


@ 甲 基 磺 酸 乙 酯 (EMS ) 

像 EMS 这 样 的 烷 化 剂 构 成 了 最 大 的 诱 变 剂 拜 ， 它 们 引起 点 突 
变 、 妆 色 体 断 裂 及 染色 体 突 变 。 点 突变 主要 是 鸟 味 叭 烷 基 化 引起 
GC/AT 转 换 的 结果 

EMS 处 理 啤 酒 酵母 S，cerevisiae 主要 产生 镶嵌 型 克隆 ， 表 
明 是 单 链 突变 ， 靠 复制 固定 。 它 在 半 致 死 剂量 时 对 大 麦 种子 有 较 
高 的 诱 变 率 ， 而 对 其 他 植物 的 生长 有 明显 的 毒害 效应 。 

EMS 在 水 中 比较 稳定 ， 半 存留 期 为 11.5 小 时 ， 但 挥发 很 快 。 
在 培养 细胞 实验 中 一 般 应 用 浓度 为 0.05 一 0.5% ， 处 理 时 间 为 1 一 
1.5 小 时 。 虽 然 EMS 已 频繁 地 用 作 植 物 培养 细胞 或 原生 质 体 的 诱 
变 剂 ， 但 还 没有 明确 的 证 据 证 明 它 的 诱 变 效 应 。 

思 N- 甲 基 一 硝 基 一 亚 硝 基 妥 (MNNG ) 

MNNG 通 过 错 配 〈 引 起 转换 ) 或 错误 的 修复 引起 突变 。 它 使 
SS pombe 产生 相等 的 纯 克 隆 与 镶 媒 克隆 ， 因 而 在 DNA 复制 前 处 
isofAApolaget 有 Caialayehc2 人 an 
发 大 麦 突变 。 

MNNG 虽 在 植物 中 未 被 广泛 使 用 ， 却 是 各 种 细胞 体系 中 最 有 
潜力 的 一 种 诱 变 剂 。 它 比 EMS 更 不 稳定 ,pH7 时 的 半 存 留 期 为 7.5 
小 时 ， 最 稳定 的 pH 值 为 4.5 一 6， 在 高 pH 或 低 pH 的 溶液 中 迅速 变 
性 ， 也 易 被 光 分 解 。 处 理 原 生 质 体 的 使 用 浓度 为 5 一 20mg/1， 处 
理 时 间 为 0.5 小 时 。 它 使 天 仙子 营养 缺陷 型 与 温度 敏感 系 的 回收 率 
由 对 照 2x 10-*4 提 高 到 1.1x10-:， 还 诱发 了 抗 顷 氨 酸 的 二 售 体 烟 
草 及 色素 变化 的 曼 陀 罗 细 胞 系 。 

MNNG 是 强 有 力 的 致癌 剂 ， 使 用 时 必须 十 分 小 心 。 

N- 乙 基 -N- 亚 硝 基 脲 (NEU ) 

NEU 也 是 一 种 烷 化 剂 ， 在 大 麦 的 测试 系统 中 ， 诱 变 效率 远 比 
MNNG 高 。 它 与 其 甲 基 类 似 物 一 起 常 被 归 为 超 诱 变 剂 。 

NEU 在 水 溶液 中 不 稳定 ，48 小 时 内 完全 衰变 ， 因 而 用 它 处 理 
的 细胞 不 用 洗 。 它 的 使 用 浓度 一 般 不 高 于 0.1mM， 否 则 会 引起 再 
生 株 的 不 育 。NEU 显 著 增 加 了 单 倍 体 烟 草 N, plumbaginifolia 原 


。459。 


生 质 体 抗 林 肯 均 素 、 狂 霉 素 及 氨 酸 盐 的 突变 体 回收 率 
@， 其 他 化 学 物 反 
在 原生 质 体 实验 体系 中 应 用 的 诱 变 剂 仅 有 上 述 三 种 烷 化 剂 s 


而 甲 基 甲 烷 磺 酸 酯 与 琵 氮 化 钠 已 成 功 地 应 用 在 其 他 类 型 的 植物 细 
胞 培养 体系 。 另 有 一 些 植物 与 生生 物 的 诱 变 剂 /还 有 待 在 培养 细 


胞 体系 中 进行 研究 。 

(2) 辐射 

紫外线 照射 

紫外 线 :(UVY) 是 使 用 最 方便 的 一 种 诱 变 因素 。 它 主要 是 产 
生 错 误 的 斜 切 与 修复 ， 从 而 引起 不 连续 的 基因 突变 ， 其 精确 前 生 
化 机 制 还 不 清楚 。UYV 处 理 啤 酒 酵母 S. cereyvisiae 主要 产生 纯 突 
变 克 隆 ， 表 明 是 DNA 复 制 前 的 双 链 突变 。 所 以 ， UV 宣 于 作 非 分 
又 期 细胞 及 新 游离 的 原生 质 体 的 诱 变 剂 。 在 大 多 数 生 物 中 发 现 ， 
UVY 引 起 的 PNA 损 伤 有 迅速 的 光 致 复活 作用 ， 押 以 细胞 在 UY 处 理 
以 后 ， 需 要 在 黑 瞳 中 培养 一 些 时 候 。 由 于 QUV 使 用 方便 而 安全 ?使 
用 后 不 需要 清洗 ， 是 原生 质 体系 统 的 理想 诱 变 剂 。 

用 UV 作 诱 变 剂 ,已 在 原生 质 体 系统 选 出 了 各 种 抗 性 窗 变 体 及 
营养 缺陷 型 突变 体 。 通 常用 UVY 照 射 平 了 亚 中 的 原生 质 体 悬 液 , 剂 量 
率 为 33 尔 格 /mm? * 秒 ， 照 射 剂量 约 为 1000 一 1500 尔 格 /mm?。 实 
验 已 证 明 UVY 照 射 显 著 地 提高 了 突变 频率 。 

通过 直接 麦 击 胶 水 组 织 的 DNA， 或 含水 组 织 产 生 的 反应 基 团 


间接 地 使 DNA 碱 基 发 生变 化 或 释放 ， 及 主 链 断 裂 ， 电 离 辐射 下 


起 非 活性 DNA 的 变化 。 因 而 X 射 线 很 少 引起 点 突变 ;而 往往 是 引 
起 单 链 或 双 链 断裂 ， 通 过 交换 反应 的 修复 ， 造 成 染色 体 突变 或 侧 
失 。 电离 辑 射 后 修复 所 需要 的 DNA 合 成 能 力 在 不 同 的 植物 组 织 间 
存在 着 差异 。X 射 线 诱发 突变 的 效率 还 随 所 分 压 及 温 诬 变化 而 
变化 。: 

xX 射 线 穿 适 力 强 ， 更 适用 于 多 细胞 有 机 体 ， 由 于 重复 性 好 。 
诱发 率 高 而 一 直 受 到 育种 工作 者 角 重 视 % 在 单 组 胞 或 原生 质 体 培 


-4460 


和 we 


is 


上 胞 系 5 


”六 体 系 ，X 射 线 诱发 点 突变 还 不 如 UV 或 化 学 物质 。 区 


在 原生 质 体 培养 体系 中 常用 刚 游离 的 原生 质 体 作 封 料 ， 照 射 
剂量 从 750 伦 厌 到 1500 伦 琴 。 单 倍 体 的 原生 质 体 明 显 比 二 倍 体 原生 
质 体 更 敏感 ， 这 种 差异 在 高 剂量 时 更 显著 。 用 射线 已 在 曼 陀 罗 
选 出 色素 变化 的 突变 植株 ， 还 分 离 出 矮 牵 牛 硝酸 还 原 酶 缺失 的 细 


57Y 射 线 

” Y 射 线 已 在 植物 育种 中 广泛 地 用 来 诱 流 突变。 原生质 体 的 辐 
射 敏 感性 研究 表明 ， 在 原生 质 体 游离 后 不 入， 恰恰 在 DNA 复制 
开始 之 前 ,细胞 处 在 最 敏感 的 时 期 。 已 经 在 ""Co 的 Y 射 线 照 射 后 ， 
选 出 子 各 种 突变 体 ， 实 验证 明 Y 半 线 黑 射 提高 了 突变 频率 。 

.产生 质 体 以 1 一 5x 105/ml 的 密度 悬浮 在 培养 液 中 ， 装 在 带 幅 
塑料 管 中 照 射 一 般 用 0.04 一 0.1Gy/ 秒 的 剂量 率 。50Gy 的 剂量 
就 能 使 从 种 烟草 原生 质 体 失 活 。 押 以 诱发 变异 的 剂量 要 低 于 这 个 
1 包 Go 处 理 后 的 原生 质 体 按 常规 程序 离心、 收集 与 培养 。 

:选择 ,， 

正 选 择 

正 选 择 就 是 将 对 细胞 有 毒害 浓度 前 药 剂 加 六 培养 基 ， 海 汰 未 
经 突变 的 亲本 细胞 ， 将 存活 的 或 相对 未 受 影 响 的 细胞 后 代 分 离 出 
来 ;进一步 作 抗 性 实验 这 是 一 般 抗 药 突 变 体 揭 分 离 方法 。 用 这 
种 方法 风 已 从 多 种 烟草 的 原生 质 体 及 妈 浮 细胞 体系 分 离 出 氨基 酿 
类 似 物 去 抗生素 ; 激素 及 除 苦 剂 的 抗 性 细胞 系 。 大 允 数 再 生 了 植 
株 更 研究 了 抗 性 的 遗传 特性 。 

在 原生 质 体 培养 体系 选择 突变 体 也 是 在 原生 质 体 再 生 了 细 跑 
之 后 ， 而 不 是 直接 选择 原生 质 体 本 身 。 大 多 数 情况 下 利用 悬浮 培 
养 进行 选择 呈 在 悬浮 培养 液 中 加 入 选择 剂 ， 经 多 次 继 代 ， 然 后 埋 
在 洋 荣 中 进行 纯 系 繁殖 ”只 有 抗 性 细胞 能 够 分 亦 ,形成 愈 伤 组 织 。 
例如 单 倍 体 烟草 原生 质 体 在 紫外 光照 射 后 1 一 2 天 ， 在 培养 基 中 加 
入 2mM 顷 氨 酸 ， 选 出 了 抗 顷 氨 酸 的 突变 体 。 在 紫外 线 照 射 后 1 个 
凡凡 移 到 含 氨 基 酸 的 培养 基 中 ， 选 出 了 抗 赖 氨 酸 与 苏 氨 酸 混合 物 


*。 461。 


(LT) 的 突变 体 ， 其 茎 外 植 体能 在 含有 lmM 草 氨 酸 及 1mM 苏 所 可 
的 培养 基 上 正常 生长 。 用 及 氢 酸 抗 性 为 标记 ， 发 现 影响 突变 体 回 
收 的 因素 包括 ， 细 胞 密度 、 加 顷 氛 酸 的 时 间 以 及 季节 变化 对 原生 
质 体 亲 本 植株 的 影响 。 

(2)》 负 选 择 

条 件 致死 突变 体 ， 如 营养 缺陷 型 及 温度 敏感 突 赤 体 ， 在 法 
型 表达 的 条 件 下 死亡 或 不 分 裂 ， 所 以 不 能 用 正 选择 的 方法 直接 选 
择 。 用 氯 酸 盐 选 择 硝酸 盐 还 原 酶 缺失 突变 体 是 一 个 例外 。 条 件 致 
死 突变 体 通 常用 克隆 测试 法 分 离 ， 即 所 谓 的 全 数 分 离 品 三 

四 ”全数 分 离 

来 自 单 倍 体 培 养 细胞 或 叶肉 原生 质 体 的 克隆 ;到 逐 个 测试 已 
得 到 了 一 些 营养 缺陷 型 或 温度 敏感 的 细胞 系 。 基 杰 程 序 包 括 : 将 
原生 质 体 或 细胞 培养 在 许可 条 件 下 ， 直 到 细胞 团 达 到 可 用 狠 子 夹 
出 的 大 小 ;将 克隆 转移 到 固体 培养 基 上 ,一 且 细 胞 团 长 得 足够 大 ， 
将 其 切 开 ， 分 别 培养 在 许可 条 件 与 限制 性 条 件 下 ;将 限制 性 条 件 
下 生长 受 抑制 的 克隆 挑 出 ， 作 进一步 的 检验 。 为 简化 这 个 程序 ， 
有 人 直接 把 克隆 培养 在 限制 性 条 件 下 ， 将 生长 不 好 的 克隆 挑 出 作 
进一步 的 检验 。 这 种 直接 测试 法 可 用 9cm 兹 平 正 ， 先 铺 上 限制 性 
国体 培养 基 ， 然 后 将 小 愈 伤 组 织 规则 地 排列 在 培养 基 上 上 ， 为 避免 
可 能 发 生 的 交叉 饲 喂 现象 ， 可 用 多 穴 的 平 严 。 这 种 方法 的 缺点 是 
不 能 父 现 迅速 致死 的 克隆 。 用 上 述 程序 挑 出 突变 体 的 性 质 是 不 清 
楚 的 ， 还 需要 进一步 实验 测试 其 许可 条 件 。 由 此 可见， 这 种 选择 
过 程 时 间 长 、 工 作 量 大 ， 所 以 要 挑选 最 有 效 的 诱 变 剂 ， 同 时 要 尽 
旱 采用 再 生 植 株 的 培养 基 ， 以 免 天 撩 形态 发 生 的 能 2 

@ 突变 体 浓 缩 法 

为 减少 分 离 突变 体 的 工作 量 ， 已 广泛 采用 5 省 脱氧 尿 酶 辽 来 
提高 细胞 群体 中 营养 缺陷 型 前 比例 。5- 溴 脱氧 尿 喀 隆 (BudR ) 
能 代替 胸腺 喀 啶 抄 入 DNA， 使 其 失 活 。 sa 
胞 ,，BudR 不 能 挫 入 ， 所 以 不 受 其 毒害 。 

深 缩 法 的 基本 程序 是 : 在 诱 变 剂 处 理 后 ， 先 将 原生 质 体 培养 


462， 


es 


有 上 站 
了 ， 和 二 征用 
2 


5 


:在 许 可 条 件 下 ， 让 突变 表达 ， 然后 将 原生 质 体 再 生 的 细胞 转移 到 


罗 


限制 性 条 件 下 # 过 一 段 时 间 ， 让 突变 细胞 停止 生 长 之 后 加 人 入 
BudRy BudR 处 理 的 时 间 至 少 相当 于 1.5 个 细胞 周期 ， 以 保证 所 
有 的 分 裂 细胞 都 挫 入 了 一 些 BudR， 将 BudR 洗 去 之 后 ， 将 细胞 移 
到 许可 条 件 下 培养 。 在 理论 上 ,只 有 突变 体 因 胞 能 够 形成 细胞 团 。 
但 实际 上 这 种 方法 并 不 能 完全 将 突变 细胞 与 未 突变 细胞 分 开 ， 而 
且 还 没有 严格 的 对 照 实验 明确 地 证 明 BudR 浓 缩 了 突变 体 细胞 。 

另 一 个 潜在 的 浓缩 剂 是 砷 酸 盐 。 它 的 作用 非常 像 磷酸 盐 的 类 
似 物 ， 使 底 物 与 氧化 磷酸 化 脱节 。 在 生长 的 细胞 里 ， 它 使 ATP 迅 
速 道 转 ， 引 起 能 晤 电荷 剧烈 下 降 。 当 能 量 电荷 降 到 阔 值 以 下 时 ， 
细胞 就 不 能 复原 。 但 不 生长 的 细胞 减少 了 ATP 的 送 转 ， 以 致 在 砷 
酸 盐 处 理 后 有 是 够 的 AIP， 在 条 件 许可 时 就 能 开始 生长 。 用 砷 可 
盐 作 负 选 择 剂 的 程序 与 BUdR 相同 ， 砷 酸 盐 在 负 选 择 过 程 中 一 般 
使 用 的 浓度 为 1 一 2mM。 

总 之 ， 用 负 选 择 剂 有 效 地 杀害 正常 生长 的 细胞 ， 而 不 伤害 缺 
失 突 变 的 细胞 ， 是 选择 缺失 突变 细胞 的 理想 途径 。 但 至 今 这 条 和 途 
径 还 不 成 熟 ， 尚 需要 进一步 完善 。 


(五 ) 利用 组 织 培养 生产 有 用 物质 


许多 药品 、 染 料及 香料 等 工业 用 材料 来 源 于 植物 ， 植 物 细 胞 
培养 技术 的 进展 ， 使 人 们 考虑 用 细胞 培养 的 途径 对 这 些 物 质 进行 
工业 化 生产 。 与 常规 的 农业 生产 相 比 ， 工 业 化 生产 有 很 多 优点 : 
电 它 不 受 好 理 区 域 的 限制 及 季节 变化 的 支配 。 包 它 不 受气 修 等 环 
境 因 素 的 影响 ， 可 以 避免 自然 灾害 。 四 大 大 地 闻 省 土地 ， 同 时 产 


品 的 质量 也 远 比 大 田 植物 来 源 的 整齐 一 致 。 四 对 于 难以 栽培 的 野 


生 植 禾 奢 料 ， 工 业 化 生产 就 更 为 重要 。 经 多 年 的 研究 探索 ， 这 方 
面 的 技术 已 取得 了 很 大 的 进展 。 已 经 培养 过 的 植物 达 百 种 以 上 ， 
所 取得 的 次 生物 质 有 30 多 类 ， 超 过 300 种 成 分 ， 特 别 在 药 用 成 分 
方面 更 为 突出 ， 例 如 人 人 参 皂 苷 、 薯 划 皂 首 、 奎 宁 、 毛 地 黄 苷 视 长 


。 春 新 碱 等 。 


.463。， 


但 是 ， 目 前 要 达到 工业 化 生产 的 水 平 ， 还 有 许多 问题 需要 解 
决 吕 最 主要 的 是 Alan 
领域 研究 中 的 途径 与 方法 。 

1 筛选 高 产 细 胞 系 

近来 的 研究 表明 ， 二 闪 如 肥 产 生 才 用 牺 需 国 陋 池 本 二 风 
产生 某 一 物质 的 细胞 总 是 与 不 产生 该 物质 的 细胞 混合 在 一 起 55 兴 
实 鸡 材料 中 筛选 出 高 产 的 细胞 系 是 提高 生产 紊 降低 生产 成 本 前 
重要 方面 ;目前 常用 的 得 选 方法 有 两 种 : 单 细胞 纯 系 化 选择 及 细 
量 团 纯 系 化 选择 。 

(1) 单 细 胞 纯 系 化 选择 

从 秸 牺 料 料 训 毕 养 至 织 旷 高 原生 质 村 起 单 师 中 清二 科 识 关 
成 细 胸 团 或 愈 伤 组 织 ， 然 后 分 别 测定 各 个 单 细 胞 克隆 的 目的 物 含 
量 ， 选 出 高 产 的 单 细胞 纯 系 。 在 理论 上 ， 单 细胞 克隆 在 苏 离 高 产 
有 用 物质 的 细胞 系 上 是 最 理想 的 方法 ， 但 实际 上 许多 蔓 细 胞 融和 作 
的 细胞 在 有 用 物质 的 生产 外 力 二 仍 是 异 质 的 :因而 这 种 选择 程 

需要 反复 进行 多 次 才能 凑 效 。 

(2) 细胞 园 纯 系 化 选择 

高 当 和 什 移 是 真 核 的 多 细胞 生 雹 ， 特 异 的 次 生 代 调 声 声 在 特 掉 
的 器 官 中 形成 。 实 践 证 明 ， 从 已 建立 的 细胞 系 中 反复 地 选择 10 一 
100 个 细胞 的 小 细胞 团 ， 能 有 效 地 选 出 稳 宠 高 产 的 细胞 系 司 

区 选择 高 产 的 花 青 素 单 区 糖苷 细 胞 系 光 例 ， 先 次 产生 该 物质 
的 铁 海棠 (Eupkorbia milli) 的 时 片 诱发 您 和 益 组 织 。 它 们 有 是 杂 色 
的 ;， 泡 括 红 、 白 、 浅 绿 等 几 种 颜色 。 将 每 个 愈 竹 组 织 毛 成 许多 小 
片 ， 放 在 修改 的 MS 培 养 基 上 ， 在 28"C 洛 照 下 堵 养 ,0 天 局 将 海 ， 
岁 组 架 切 成 两 小 块 ， 一 半 继 续 培养 ， 一 半 作 色素 含量 分 新 避 | 赵 山 “ 
最 红 的 细胞 团 : 再 切 成 小 块 〈H0 一 100 不 级 胞 ) 进行 培养 涡 芝 种 
程序 反复 地 进行 ， 当 重复 到 23 次 时 ， 红 色素 的 平均 蛋 间 高 洒 3，， 
最 高 增加 了 12 倍 ， 这 些 细胞 系 在 停止 选择 后 能 :继续 增产 。 用 这 种 
技术 还 选 出 了 辅酶 Q10 及 生物 素 的 高 产 绍 胞 系 。 “人民 资 装 

上 述 选 择 高 产 细 胞 系 的 程序 并 不 复杂 ， 但 必须 有 二 个 有 而 


8 6 对 二 
世 沁 


5 
SS 


:简便 的 检 测 手段 。 目 的 烙 不 同 ， 容 出 竹 眉 了 岂 不 相同 ， 上述 避 用 和 色 
素 抱 例子 最 鞠 简 单 ， 用 肉 良 就 能 看 到 ;荧光 化 合 物 可 用 英 光 显 向 
镜 间 蒂 选 择 。 有 些 无 色 的 化 合 牺 通过 改 恋 DH 值 或 涨 加 革 种 化 人 
物 ， 可 以 形成 有 色 的 化 侣 和 ， 从 而 得 以 检测 ， 常 用 的 区 测 分 析 技 
未 包括 薄 层 层 析 法 CTLC)N 高 压 液 相 色谱 法 (HPLCJ、 气 相 和 色谱， 
-法 〈GC 刀 与 质 潜 仪 苍 析 《MS) 等 。 近 年 来 发 展 的 放射 免 疼 法 
(RIA)》 及 酶 连锁 免疫 吸收 测试 法 使 高 产 细胞 系 的 选 泽 速 度 大 藉 
加 快 。 
”不 2 控制 培养 条 件 ， 改 进 培养 方法 
6C1) 镶 养 基 成 分 与 培养 条 件 的 影响 
二 十 年 来 一 系列 试验 表明 ， 培 养 基 的 成 分 以 及 培养 条 件 的 恋 
化 ， 对 次 生 代谢 有 显著 的 影响 。 目 前 研制 培养 基 ，-_- 般 是 依靠 经 
验 。 有 人 发 现 培养 基 中 芒 糖 的 浓度 比 通常 高 2 一 3%， 合 成 的 次 和 
代谢 物 就 会 显著 增加 。 激 素 被 公认 为 次 生产 物 形成 的 启动 因子 ， 
有 人 测试 了 近 200 种 生长 素 型 物质 对 次 生物 质 产生 的 影响 ,发现 激 
素 的 类 型 对 次 生产 物 的 形成 者 巨大 的 作用 。 在 含 o Img/1 泰 乙酸 
而 不 含 激动 素 的 培养 基 上 ， 烟 章 培养 细胞 的 烟 态 浓 度 最 高 ， 当 激 
动 素 含量 增 至 5meg/1l 时 ， 生 物 祯 完全 消 尖 。 在 长 春花 的 细胞 培养 
中 ， 用 83 种 取代 模式 不 同 的 茶 氧 之 酸 ， 只 有 六 种 化 分 物 比 标 淮 引 
长 素 引 起 更 高 的 利 血 平 浓度 ， 而 2 ,二 了 使 利 血 平 的 含量 降低 。 培 
养 基 的 其 他 成 分 也 在 不 同 的 程度 上 影响 细胞 次 村 产物 的 产量 . 
除 化 学 成 分 外 ， 光 和 温度 等 物理 因素 也 都 影响 培养 细胞 的 次 
生 代谢 产物 。 例 如 ， 长 春花 细胞 培养 物 的 利 血 平 浓度 在 光照 下 比 
墨 瞳 中 高 ， 草 陀 罗 培养 细胞 在 强 光 下 产生 的 生物 碱 比 弱 光 下 兄 ， 
《2) 二 步 培 养 法 
卓然 状态 下 ， 一 般 植物 生长 不 活 革 的 部 分 9 例 妇 洒 时 。， 果实 
忌 种 子 中 ”倾向 于 积累 次 生 代谢 移 》 而 像 分 生 组 织 那 样 的 芯 速 上 
公 部 分 ， 次 生物 质 的 含量 航 低 。 实 验 也 证 明 ， 生 长 旺盛 的 培养 纳 
胞 不 是 次 生产 物 的 良好 来 源 ， 当 培养 物 接近 于 衰老 时 ， 才 趋 沿 各 
汉 次 生产 物 。 从 烟草 悬浮 堵 养 细胞 产生 生 网 碱 ， 茶 树 僵 伤 组 织 声 


46565。， 


生 获 啡 破 ， 以 及 可 可 细胞 培养 产生 巧克力 芳香 产物 等 ， 都 证 明 次 
_ 生 代谢 物 的 产生 与 细胞 分 裂 速 度 减 缓 的 对 数 期 末 、 六 止 期 初 紧密 
相关 。 细 胞 生长 与 次 生物 质 产生 对 培养 基 与 培养 条 件 的 要 求 是 不 
同 的 。 因 而 采用 二 步 培养 法 ， 使 细胞 生长 与 物质 生产 分 开 进行 s 
在 细胞 的 指数 生长 静止 前 后 更 换 培养 基 ， 使 之 有 利于 次 生物 质 的 
积累 ， 从 而 大 大 提高 了 次 生物 质 的 产量 ,; 苦 草 宁 的 二 步 法 生产 就 
是 成 功 的 例子 。 

(3) 控制 培养 细胞 的 代谢 途径 

根据 已 有 的 知识 ， 将 生物 碱 的 前 体 饲 虽 培 养 细胞 就 有 可 能 提 
高 生物 碱 的 产量 。 有 人 在 萤 陀 罗 的 细胞 培养 中 加 入 鸟 氨 酸 、 共 丙 
氨 酸 、 酷 氨 酸 与 苯 丙 酮 酸 钠 ， 提 高 了 生物 碱 的 产量 ， 在 这 里 氨基 
酸 既 是 形成 生物 碱 的 前 体 ， 又 是 诱导 物 。 用 马 钱 子 些 饲 喂 长 春花 
细胞 也 增加 了 利 血 平 的 产量 ， 但 添加 其 他 几 种 前 体 ; 则 未 见 有 类 


似 的 效果 。 所 以 通过 饲 喂 前 体 来 控制 代谢 途径 ， 增 加 次 生 代 谢 产 


物 的 产量 ， 需 要 对 细胞 的 代谢 过 程 有 深入 的 了 解 。 

另 一 类 控制 细胞 代谢 途径 的 方法 是 促进 培养 细胞 的 器 官 分 
化 。 有 些 生物 碱 、 天 然 胶 等 次 生物 质 只 贮存 在 特殊 的 器 官 中 , 种 
进 器 官 的 分 化 能 大 大 提高 次 生物 质 的 产量 。 例 如 ， 团 粟 在 乳 管 中 
贮存 着 含有 了 吗啡 和 可 待 因 的 鸦片 生物 碱 ， 但 器 桶 的 愈 伤 组 织 不 含 
吗啡 型 生物 碱 。 通 过 调整 培养 基 和 光照 ， 从 愈 伤 组 织 分 化 芽 原 基 
与 胚 状 体 ， 再 用 低温 培养 并 调整 光 周 期 ， 分 化 成 苗 ; 最 后 在 无 激 
素 培 养 基 上 长 成 15 厘 米 高 的 幼 株 。 测 定 各 个 阶段 的 生物 碱 含 旦 ， 
只 这 这 种 幼 株 的 生物 碱 含量 达到 正常 水 平 。 同 样 ， 大 红 回 票 组 织 
必须 借助 于 乳 管 的 分 化 才能 生成 吗啡 碱 ， 朝鲜 参 愈 伤 组 织 必 须 再 
分 化 才能 大 批量 生产 皂 化 苷 。 

(4 六 植物 细胞 固 相 化 培养 与 渗透 处 理 

植物 固 相 化 培养 的 优点 是 可 将 细胞 保护 好 ， 提高 操作 效率 ; 
便于 工业 上 应 用 ， 同 时 可 保持 细胞 闻 的 紧密 的 相互 作用 ， 稳 定 代 


谢 能 力 ， 提 高 次 生物 质 的 产量 。 一 般 是 利用 藻 酸 钙 等 材料 进行 平 
床 培 养 或 柱 式 培养 ， 动 物 细 胞 培养 中 应 用 的 中 空 纤维 培养 技术 也 


二 


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外 


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在 开发 之 中 。 固 相 化 培养 除了 能 增加 次 生物 质 的 积累 外 ， 还 比 液 
体 培 养 持 续 更 长 的 生长 时 间 。 例 如 ， 利 用 固 相 培养 的 器 桶 细胞 进 
行 可 待 因 酮 还 原 可 待 因 的 反应 ， 比 游离 细胞 长 期 保持 更 高 的 转换 
能 力 。 

用 有 机 溶剂 进行 细胞 的 活 透 处 理 ， 使 其 成 分 放出 的 技术 能 提 
高 固 相 化 培养 细胞 的 利用 率 。 例 如 甘草 固 相 培养 细胞 ， 在 培养 后 
一 周 用 5%% 的 二 甲 基 亚 硕 处 理 30 分 钟 ， 可 显著 地 释放 出 查 耳 酮 ,再 
培养 一 周 后 用 10% 的 二 甲 基 亚 砚 处 理 ， 还 能 再 释放 出 一 些 来 。 而 
游离 细胞 经 最 初 的 5% 二 甲 基 亚 砚 处 理 , 异 黄酮 在 释放 后 完全 停止 
生成 。 

上 面 介绍 的 细胞 系 选 择 及 改进 培养 条 件 与 方法 两 个 方面 的 研 
究 进展 ， 目 的 就 是 使 产量 提高 、 成 本 降低 ， 从 而 能 实用 于 商业 生 
产 。 在 工业 生产 实践 中 ， 尚 有 许多 工艺 上 的 问题 需要 解决 。 首 先 
是 涉及 生产 规模 的 问题 ， 由 于 植物 细胞 比 微生物 大 30 到 100 倍 ,所 
以 大 规模 培养 植物 细胞 就 有 特异 的 工艺 上 的 问题 。 例 如 培养 细胞 
与 营养 物 充 分 混合 的 问题 ， 气 体 从 气相 向 液 相 运送 的 问题 等 。 其 
次 ， 还 有 像 长 期 保持 无 菌 状 态 的 问题 及 多 余 的 营养 物 及 培养 细胞 
的 去 除 等 。 目 前 植物 细胞 大 规模 培养 系统 一 般 用 玻璃 或 不 锈 钢 作 
材料 ,大 小 从 2 到 20,000L 不 等 。 结 构 上 也 已 发 展 了 多 种 类 型 ， 除 
常规 的 搅拌 反应 饶 外 ， 还 有 人 应 用 起 泡 塔 及 各 种 空气 运送 装置 。 
总 之 ， 工 艺 上 的 问题 随 着 研究 的 进展 而 不 断 改进 与 变化 。 利 用 组 
织 玉 养 条 产 有 用 临 质 ， 尽 管 还 有 重重 困难 ， 但 已 经 可 以 预料 在 不 


远 的 将 来 ， 这 方面 的 研究 将 会 产生 实用 的 效果 。 


( 孙 勇 如 ) 


。467。， 


二 节 ”动物 体 细胞 遗传 操作 


前 发 展 了 五 种 系统 可 在 细胞 亲 转 移 遗 传 匠 质 ， 即 完整 细胞 
、 细胞 碎片 ( 核 质 或 细胞 质 ) 融 合 、 微 小 细胞 中 分 基因 转移 、 
ES 


《一 ) 完 整 细 胞 融合 


| 人 类 桨 色 体 扩散 丢失 


Ji 


; 你 贸 7 个 同 数 量 人 类 染色 体 的 杂种 细 购 
图 5=1 完整 细胞 的 融合 


完整 细胞 融合 后 ， 可 形成 包含 有 两 种 或 多 种 过 未 细 吃 的 完整 
基因 组 的 混 核 体 或 单 核 体 。 种 间 细 胞 的 杂种 ， 在 可 能 保留 亲本 细 
胞 的 完整 染色 体 组 ， 但 也有 可 能 选择 性 排除 亲本 之 一 的 染色 体 。 
利用 选择 性 排除 一 方 灯 本 染色 体 的 这 一 特性 ， 可 比较 杂种 细胞 表 
型 和 染色 体 组 型 ， 确 定 基 因 连 锁 群 ， 进 行 基因 定位 并 绘制 染色 体 
基因 图 。 不 同 种 的 、 具 有 某 种 特性 的 亲本 细胞 , 梅 成 杂种 细胞 后 ， 
可 研究 基因 结构 功能 及 调控 。 

1. 仙 人 台 病 毒 中 介 的 细胞 融合 

(1) 材料 


468。 


Sa3ne G， 葡 萄 糖 1.1g8 NaCcl18.0g KCI0.48 Na HPO 


”7H59.0.29g HPO。0.1548g 0.12% 酚 红 Iml MgSO，0.1548 
Lacacls*HsO 0.016g ， 重 蒸 水 加 至 1000ml， 高 压 灭 菌 后 贮 于 
区 
PFBS，@ONaCcl18.0g8 KCI0.28 NazHPO,1.15g KH:FO， 
0.2g 重 蒸 水 900ml :@CacCcl:2H,00.17g 重 蒸 水 1000ml  @ 
Mgcl6HO 0.1g1000mlO2M HEPS 2ml@0.12% 酚 红 1ml。g 
一 人 @ 浴 液 混合 ， 用 10NNaOH 调 至 pH7 .6。 
Tris-NHaCl， ONH4C10.83g 重 蒸 水 100ml DTITis2.05948g 
重 蒸 水 100ml 用 浓 盐 酸 调 整 pH 至 7.65。 
(2》 融合 用 细胞 及 病毒 准备 
人 @@ 中 国 合 鼠 成 纤维 炙 胞 WwWg3-h(OHGPRT-)， 培 养 于 含有 8- 毛 
鸟 野 叭 (30kg/mlD 和 10% 小 牛 血 清 的 REMI1640 培 养 液 内 ,至 对 数 
生长 期 ;用 0.25% 胰 酶 消化 。. 取 1x10* 细 胞 悬 液 离心 , 弃 去 上 清 液 ， 
加 5ml SalineG。 离 心 弃 上 清 , 加 入 0.2mlPFBS， 置 还 浴 中 待 用 。 
四 正常 人 淋巴 细胞 。 取 静脉 血 3ml, 加 15miTris 一 NH4C1， 置 
377C 水 浴 中 10 分 钟 。1000rpm 离 心 10 分 钟 。 弃 上 清 ， 重 复 温 育 离 
心 2 一 3 次 。 加 SalineG 后 计数 , 取 1x 10* 细 胞 巧 液 离 心 ， 加 入 0 .2 
ml PFBS， 置 冰 浴 待 用 。 
四 病毒 制备 将 0.1ml 稀释 成 10 的 仙台 病毒 注入 9 日 龄 鸡 
胚 ;347C 下 培养 48 小 时 后 , 鸡 胚 置 于 4 ,24 小 时 .收集 尿 讲 液 , 经 所 
凝 和 无 菌 试验 后 ， 分 装 并 冻 存 于 -~ 80Z 。 使 用 时 ， 将 冻 存 的 他 人 台 
病毒 融化 ， 用 8W 紫 外 灯 ( 灯 距 10cm， 预 热 15 分 钟 3 灭 活 5 分 钟 。 在 
9 份 NH4CI 溶液 中 加 1 和 份 Tris 洲 液 ， 用 浓 盐 酸 调 理 pH 至 7.2。 
《32) 细胞 融合 和 杂种 细胞 的 选择 
@ 两 亲本 的 细胞 各 0.2ml 在 指 管内 混和 。 加 入 0.1ml 仙 人 台 病 毒 
置 冰 浴 内 20 分 钟 ， 然 后 移入 37T 水 浴 30 分 钟 。 
四 以 1x 105 的 浓度 将 细胞 接种 于 小 方 瓶 (12cm2) 内 。 各 瓶 加 
六 5ml HATC20%% 小 牛 血 清 的 RPMI1640 中 含 1x 10“M 次 黄 嗓 叭 
(HA 和 4X10723M 氮 基 嗓 哈 (A)、1.6x 10“M 胸 腺 喀 啶 核 背 (T)、 


| 。 3469。， 
着 


rr 
温 ， 
4 


1X1075MH 甘 氨 酸 ]， 置 377 培养 箱 中 静 置 培养 。 
-四 培养 四 周 后 ， 待 肉眼 可 见 细胞 克隆 时 ， 用 长 针 将 长 成 克隆 
的 细胞 分 别 挑 出 ， 接 种 于 另 一 瓶 中 继续 用 HAT 培 养 液 培养 5 待 细 
胞 铺 满 瓶 壁 后 作 常 规 传 代 培养 ， 并 继续 用 了 AT 选择 培养 。 
(4)》 杂种 细胞 鉴定 
@ 可 按 细 胞 形态 和 生长 特性 作 初 步 判 定 。 
Q@Giemsa 一 11 分 化 染色 ”常规 制备 的 室 气 于 燥 制 片 〈 细 胞 悬 
液 浓度 应 低 于 2 x 10: 细 胞 / 微 升 )， 室 温 下 放置 2 一 5 目 后 y” 置 607C 
燕 饮水 内 浸 2 小时。 再 用 预 温 到 3780 的 5%:Giemsa 0.05 M 
Na,HFO,，pH1 1 配制 )- 染 色 10 一 20 分 钟 合 70 )。 天 类 妆 色 和 体 除 
异 染 区 染 为 红色 外 ， 其 余部 分 为 淡 蓝 色 y 则 齿 类 染色 体 均 深 染 为 
品 红色 。 
@@ 同 工 酶 分 析 制备 细胞 抽 提 液 ， 作 醋酸 纤维 哎 电 泳 分 析 人 
类 和 蛋白质。 鉴定 杂种 细胞 审 残 留 的 人 类 染色 体 ， 与 同 工 酶 电泳 分 
析 结 果 相 结合 就 有 可 能 将 蛋白 质 结 枚 基因 定位 于 人 类 特定 的 桨 色 
体 上 。 
2 . 聚 乙 二 醇 (PEG) 中 介 的 细胞 融合 
参见 第 五 章 第 三 节 有 关内 容 。 
(二 ) 细 胞 质 与 细胞 核 融合 
这 种 方法 已 用 于 线粒体 的 基因 作 图 和 研究 在 不 同 细胞 质 环境 
中 核 基因 的 表达 调节 。 
1. 细 胞 去 核 技 术 
用 塑料 盖 片 单 层 培养 细胞 群体 。 盖 片 可 用 紫外 线 照 射 或 70%% 
乙醇 浸泡 灭 菌 。 细 胞 数目 依 盖 片 大 小 而 定 。 去 核 时 ， 骏 正常 培养 
液 内 移出 铺 满 细胞 的 盖 片 ， 转 入 含有 细胞 松弛 素 B 培 养 液 的 离 心 
管内 。 注 意 将 生长 有 细胞 的 一 面 朝 向 管 底 。 直 爸 吧 一 25mm 的 盖 
片 可 使 用 容积 为 40ml 的 圆 底 塑 料 离 心 管 。 在 预 热 的 转子 中 ，15000 
Tp 交 离心 30 分 钟 。 若 使 用 L929 细 胞 ,在 培 送 液 内 添加 10&g/ml1 细 胞 


松弛 素 B，35 一 37C 下 ，176008 离 心 20 分 钟 。 离 心 后 ， 用 无 菌 儒 


。470 。 


7 
dt 
丙 


0 


回收 盖 片 细胞 生长 面向 上 放 入 普通 培养 液 内 ,10 一 30 分 钟 后 细胞 
恢复 正常 形态 。 为 检查 去 核 百分率 ,可 用 无 水 乙醇 或 无 水 己 醇 - 冰 
乙酸 (3:1) 溶 液 园 定 。 在 相差 显微镜 下 检查 ， 或 经 Giemsa 染 色 . 后 
观察 ， 求 出 400 个 细胞 的 去 核 百 分 率 。 去 核 过 程 受 细胞 共 弛 素 浓 


0 离心 时 间 和 温度 的 影响 ， 人 


\i 一 CS RE 
1 纲 胞 1 细 跑 2 
在 细 朋 8 松弛 素 B 存 在 条 件 下 次 


、 | 

mi 

AN PR 
侈 


本 
细胞 质 


ay 
d 
a 和 D 融 合 记 
由 细 隐 ! 的 细胞 质 和 细胞 2 的 技 形成 杂种 细胞 
国 5 呈 细胞 质 和 核 质 感 合 


2 . 核 质 制备 

核 质 可 从 细胞 松弛 素 培养 注 内 回收 。 它 们 与 细胞 其 它 成 分 一 
起 沉淀 在 离心 管 底部 。 将 沉淀 物 在 含有 细胞 讼 弛 素 的 培养 液 内 混 
匀 ， 移 入 锥 形 离心 管内 离心 收集 沉 尝 物 。 沉 演 物 中 混 有 核 质 、 完 
整 细 胞 及 胞 质 碎 片 ， 需 要 纯化 。 完 整 细胞 用 “ 平 严 "法 清除 ， 在 正 
常生 长 温度 下 堵 养 约 90 分 钟 ， 它 们 便 会 粘 附 在 基质 上 。 上 清 液 中 
含 核 质 和 细胞 质 碎片 。 这 时 ， 可 制备 1 一 6% 又 蔗糖 梯度 ， 或 1 一 


3% 陡 清 梯度 ,在 27Cy5%CO，。 条 件 下 培养 90 分 钟 后 出 现 两 条 带 ， 


上 面 一 条 含 细胞 质 碎 片 ， 下 边 一 条 含 核 质 。 可 用 生长 培养 基 离 必 


”| 吝 涤 并 用 新 鲜 培 养 基 制 成 悬 液 。 


关 
本 


| 


用 5.% 聚 蔗糖 溶液 将 活 的 核 质 与 死 的 核 质 分 离 。 将 核 质 制 成 
。 47]。 


1 10 /ml 最 液 ， 加 在 5ml1 分 层 液 顶层 ， 然 后 再 加 一 层 1 包 ] 揭 路 养 
液 。 试 管 离心 ，130815 分 钟 。 这 时 ， 在 培养 滚 和 分 晨 液 之 间 形 成 
一 条 带 。 台 有 盼 蓝 排除 试验 表明 ，98% 核 质 是 活 的 。 

3 .细胞 质 与 核 质 的 融合 

外 他 人 台 病 毒 “ 制 备 参见 完整 细胞 融合 部 分 。 

@@ 融 合 过程 ”用 冷 Earle 平 衡 盐 溶 液 (EBS) 将 塑料 片上 的 单 
层 去 核 绍 胞 质 洗 涤 两 次 。0.5mlEBS 稀 释 的 仙人 台 病 毒 〈 约 400 血 凝 
单位 /ml) 加 入 放 有 上 述 塑 料 片 的 培养 于 中 。15 分 钟 后 ， 病 毒 吸附 
到 细胞 质 上 。 除 去 多 余 的 病毒 ， 加 入 0.25ml 核 质 悬 液 (1 一 5X1077 
ml]) 。 平 四 置 于 冰 盘 上 15 分 钟 ， 使 核 质 吸 附 到 细胞 质 上 。 其 间 ， 可 
轻 播 平 血 3 一 5 分 钟 以 帮助 吸附 ， 然 后 移入 37D 培养 箱 使 之 融合 。 
45 分 铀 后 ， 用 EBS 洗涤 数 次 ,并 在 相差 显微镜 下 观察 ， 如 发 现 有 
泊 离 的 核 质 则 可 增加 洗涤 次 数 。 最 后 加 入 生长 培养 液 。 可 通过 染色 
佑 计 无 核 细 胞 的 百分率 。 杂 交 细 胞 可 用 前 述 密 度 梯 度 方 法 分 离 。 


(三 ) 微 组 胞 中 介 的 基因 转移 


微细 胞 (或 微 核 质 ) 中 介 的 基因 转移 方法 ， 可 把 少量 染色 体 转 
移 给 受 体 细胞 。 这 种 染色 体 有 核 肛 包围 ， 融 合 时 ， 有 少量 细胞 质 
和 质 用 一 起 转 入 受 体 细胞 。 用 有 丝 分 裂 抑制 剂 或 其 它 方法 处 理 细 
_ 胞 ， 数 天 后 可 发 生 微细 胞 。 可 以 用 控制 微细 胞 大 水 的 亦 法 ， 调节 

转移 基因 物质 的 量 。 这 一 方法 可 用 于 基因 作 图 和 基因 调节 的 分 析 。 
操作 程序 ， 

@ 培 养 瓶 内 细胞 生长 密度 约 2x 104jcmzs。 

国 加 入 秋水 仙 胺 ， 最 终 浓 度 0.02 二 0 .2bg/ml( 因 所 用 细胞 系 
而 异 )。 

四 根据 细胞 倍增 时 间 ，37T 条 件 下 培养 24 一 36 小 时 。 

人 四 倒置 显微镜 观察 ， 弃 去 有 丝 分 裂 指数 正常 的 培养 瓶 s 

@ 细 胞 在 含 秋 水 仙 腕 的 培养 液 内 培养 24 一 36 小 时 ,直至 有 173 


的 细胞 形成 似 在 进行 有 丝 分 裂 的 小 串 细 胞 碎片 。 用 吸管 打 散 细 胞 。 


碎片 ， 并 把 细胞 碎片 连同 完整 细胞 倒 入 15ml 的 离心 管内 。 


。472。 


冲 ! 
辣 


和 


本 
司 虽 


国 室 温 条 件 下 ， 800g 离心 3 分 钟 。 沉 淀 物 用 不 含 秋 未 仙 胺 的 
完全 培养 液 洗涤 两 次 。 


延长 有 丝 分 裂 其 
多 
代 微 核 细胞 


RN 
受 体 (全 人 
微细 胞 
人 国 


微细 胞 杂种 


图 5 一 3， 微 细胞 杂种 形成 示意 图 


思 用 直径 47mm， 和 孔径 3um 的 滤 谍 过 滤 纯 化 微 核 细 胞 。 

加 微细 胞 族 在 18x18mm 的 无 菌 盖 片 上 ， 密 度 为 1.0 一 1.5x 
104/cms: 

37 忆 培养 了 2 一 24 小 时 直至 贴 壁 并 伸展 。 

曙 在 pH7 .4 的 磷酸 缓冲 液 中 测 洗 盖 片 。 

四 用 PBS(pPH7 .4) 配 制 3% 的 utaraldebyde 或 其 它 适 当 固 定 液 
固定 细胞 。 用 生理 盐水 配制 的 Hoceckst 33258(20kg/ml) 染 色 5 分 
钟 。 


@ 用 湿 盖 片 封 固 。 

四 计算 微 核 细胞 百分比 的 公式 ， 
，， 微 核 细胞 未 经 处 理 的 对 照 组 
亿 核 细胞 % = 总 细胞 儿 关 100 一 中 多 核 细胞 百分数 


@ 略 上 述 纯 化 的 微 核 细 胞 ， 与 胰 蛋 白 酶 消化 下 来 的 受 体 细胞 按 
10:1 大 体 比 例 混 合 。 
四 室温 下 离心 混合 波 ，800g，2 分 钟 。 


。473。 


四 除 去 塔 养 液 ,小 心 加 入 lml 融 合 液 ( 用 完全 培养 液 配 制 的 5% 


的 400MW 聚 乙 二 醇 )。 
@@ 用 吸管 搅动 细胞 团 块 1 分 钟 。 
四 迅速 加 入 10ml 完 全 培养 液 ， 不 打 散 团 块 ，800g 离 心 2 分 钟 。 
田 弃 去 上 清 ， 缓 慢 加 入 2m1 完 全 培养 液 ， 离 心 。 重 复 同 一 过 
程 后 ， 在 37:C 培 养 30 一 45 分 钟 。 
四 用 骨 豚 管 轻 轻 制备 悬 液 并 低 密 度 培养 。 


(四 ) 染 色 体 中 介 的 基因 转移 


用 分 离 的 中 期 染色 体 ， 可 以 把 基因 转移 到 真 核 细 胞 中 。 因 转 
移 频 率 仅 约 10-5 到 10- ?7, 故 需 有 敏感 的 选择 系统 。 转 入 的 基因 需要 
依 殖 选择 系统 维持 ， 和 否则 每 代 会 以 2 一 10% 速 率 丢 失 。 稳 定 的 基因 
转移 频率 极 低 ， 但 可 整合 到 受 体 细胞 的 染色 体 上 。 转 移 的 片断 可 
用 细胞 学 方法 检 出 ， 还 可 以 用 遗传 学 方法 和 核酸 杂交 方法 来 估计 
转移 片断 揭 大 小 片断 天 小 的 范围 在 单 倍 体 基因 组 为 0.1%% 到 1%， 
雪 当 于 3000 到 30000Kb 的 DNA。 这 项 技术 包括 中 期 染色 栖 分 离 、 
染色 体 污 移 和 条件、 转移 受 体 的 分 离 选 择 及 分 析 方 法 。 

1. 在 pH 3 条件 下 分 离 染 色 体 

(1) HAG :10-sM 氮 甲 史 哈 、10M 次 黄 呆 难 LI10 4M 寺 所 
酸 ) 在 S 祖 郴 G-S 临 界 期 阻 抑 细 胞 ， 使 每 代 闻 中 相等 ”减少 5 相 的 
持续 时 间 。 1 

(2) 加 和 ITdR(5x10-sM TdR +0:2bci/mlCsH]ITdR) 同 时 用 
秋水 但 胺 处 理 细胞 。 

(3) 在 与 S 相 和 G。， 的 持续 时 间 同 样 时间 后 收获 细胞 。 500g 离 
心 。 用 冷 PES 洗 洗 细 胞 。 测 定 细 胞 密度 ,有丝分裂 指数 及 cpm/ 细 胆 。 

(4) 用 0.075M C1, 在 室温 处 理 细胞 (2 一 上 10.7m1) 10 一 
20 分 钟 。 用 相差 显微镜 监视 细胞 膨胀 。 以 下 步骤 于 5 操作 。 

(5) 220g 离 心 5 分 钟 。 

(6) 移出 沉淀 物 (10-7 细 胞 /ml)， 在 缓冲 液 江 0005M_NaCl 
0.05M 乙 酸 ,0.1M 薛 糖 ,1mM CaCcl，l1mM MgCl ，DH3. 0 内 混 


。 .47 了。 


长 
二 


iceCA ee -eewunx 5 


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全 
4 

可 
起 


站 


过， 
站 


(7) 用 电动 匀 浆 器 匀 浆 15 秒 ， 直 至 细胞 破碎 ， 可 用 相 荆 显 微 
镜 监 视 。 

(8) 将 匀 浆 放 入 聚 丙烯 试管 1000g 离 心 30 分 钟 。 

(9) 在 pH3 的 缓 阐 液 内 分 散 沉淀 物 . 加 75ml 85%% 芒 糖 (98.6g) 
一 pH3 绥 冲 液 ， 混 匀 。 

(10)100000g 离 心 2 小 时 ， 除 去 碎片 。 

(11) 在 0.02M Tris-HCLDpH7.0) -- 3mMCaCl, 中 ,把 沉淀 物 混 
义 ，1000g 离 心 30 分 钟 除去 蔗糖 。 

(12) 在 50ml10.02M Tris-HCLpPH7.0) -~- 3mM Cacis 中 悬浮 沉 
淀 物 (相当 于 2X108 细 胞 /ml1)。 
(13) 在 密度 梯度 中 分 离 染 色 体 (蔗糖 密度 梯度 , 含 0.02M Tris 


HGl (DH7) -2mM. CaCcl -0.05%!g Trilon X 一 上 00)4 一 6 小 时 。 


《14) 分 部 收集 闪烁 计数 。 

局 15)10008 离 心 悬 液 30 分 钟 。 收 集 沉 淀 并 洗涤 ， 从 每 分 钟 的 计 
数 来 估计 染色 体 浓度 。 

“2 .在 pH 条件 下 分 离 染 色 体 

(1 细胞 用 [CsH]ITdR 标 记 。 

42》 用 秋水 仙 素 处 理 细胞 。 收 集 细 胞 后 用 冷 PBS 洗 涤 。 测 定 
有 丝 分 裂 指数 ， 细 胞 浓度 及 cpm/ 细 胞 。 

(3) 在 0502M Tiis-HCI(DPH7 0) 一 3mM CaCl, 中 调整 细胞 浓 
度 至 1 一 2 x 107。 膨 胀 细胞 20 一 30 分 钟 (0 一 5C ) .加 入 1%8Tiiton x 
一 100， 用 匀 浆 器 破碎 细胞 并 在 相 显 微 镜 下 检查 。 

(4) 匀 浆 及 测 洗 液 一 起 离心 ，1000g8，30 分 钟 。 

(5). 密度 梯度 分 离 染 色 体 ,在 无 Triton x 一 100 的 分 离 缓冲 液 
中 回收 。 

3. 中 期 染色 体 的 导入 

(1) 导入 悬浮 细胞 

四 将 受 体 细胞 离心 ，220g8，5 分 钟 。 弃 去 上 清流 。 

外 在 完全 MEM 培 养 液 (10% 胎 牛 血 清 ) 内 ， 基 浮 纯 兹 的 桨 色 


。A475。 


体 ，1000g 离 心 30 分 钟 ， 弃 上 清 液 。 ws 完 全 培 
prokdierwm 
染色 体 悬 液 移 入 含有 受 体 细胞 的 管内 。 

ed ml 应 -E- 乌 氮 酸 (分 子 量 70000) 
到 试管 内 。 用 吸管 混 匀 细 胞 , 5%CO: 平 衡 ， 37"C 保温 90 一 120 分 钟 。 
转动 试管 ， 保 持 悬 浮 状 态 。 

加 培养 的 混合 物 内 含有 6x 10* 受 体 细胞 /ml。 

@ 用 完全 培养 液 稀释 后 ， 把 悬 液 转 入 塑料 培养 亚 二 待 细 胞 生 
长 三 代 后 ， 使 用 选择 培养 基 。 

(2) 磷酸 镍 沉淀 染色 体 的 导入 

四 导入 前 ， 在 10cm 培 养 亚 中 培养 2 x 10* 受 体 细胞 ， 使 用 前 除 
去 培养 液 。 

@ 在 HEPES 缓 冲 液 (2mM HEPES pH7.1\137mM Nacl 5m 
MKCL 0.7mM Na.HPD,，28mM 蕨 糖 ) 内 悬浮 染色 体 ， 其 浓度 相 
当 于 2.5X10s 细 胞 rm 加 和 六 1/16 容 积 的 2M Cacla ,形成 染色 体 与 
磷酸 铬 的 共同 沉淀 物 。 

四 培养 10 分 钟 后 ， 每 个 单 细胞 层 ( 约 5 10" 细胞 》 加 入 2ml 
染色 体 悬 液 ， 室 温 培 养 30 分 钟 。 

四 每 二 增 养 四 内 加 入 20ml 完 全 培养 注 (MEN 合 10%% 朋 生 和 
清 )。CO,，, 培 养 箱 内 培养 4 小 时 ，37C。 

四 加 5ml 50%DMSO 或 10ml 30%DMSO( 用 培养 液 称 释 )， 室 
温 王 培养 30 分 钟 。 
@ 侨 去 培养 液 ， 加 10ml 新 鲜 培 养 液 ， 培 养 亚 转 入 培养 箱 培养 
18 小 时 。 

加 人 屈 去 培养 液 , 用 胰 酶 处 理 细胞 并 转 入 选择 培养 液 。 

据 报 道 ， 该 方法 比 前 一 方法 的 转移 率 提高 10 售 。 

(3) 涂 色 体 导入 受 体 细胞 后 的 分 析 

@ 使 用 HAT 培 养 基 选 择 特殊 遗传 慰 记 

@ 表 面 抗原 

四 对 药物 抗 性 


。476。 


攻 
机 学 
3 
要 
间 


外 核酸 杂交 或 同 功 酶 分 析 
呈 :加 细胞 遗传 学 方法 


(五 )DNA 中 介 的 基因 转移 


一 上 .载体 DNA 的 分 离 
将 50mgDNA 悬 浮 于 100ml 含 50mM Tris,250mM NaCl1，5mM 
EDIA，pfH8.3 的 无 菌 溶 液 内 。 水 平 摇 床 ，37C 下 缓慢 摇动 过 夜 。 
溶解 后 ， 将 加 热 到 90C (10 分 钟 ) 的 RNaseA50ug/ml， 加 入 到 深 


解 的 DNA 内 ，3770 培养 1 小 时 。 其 后 ， 分 别 加 入 半 消 化 的 链 霉 蛋 


和 白 酶 和 SDS 至 500ug7zml 和 0.2%(w/v)， 在 37 培养 2 小 时 。 此 时 ， 
加 入 等 体积 重 蒸 酚 , 内 含 0.1% 羟 基 唆 啉 并 以 10mM Tris 缓 名 ，pH 
8.1,-1mM EDIA， 绥 慢 搅 拌 直至 形成 乳 浊 液 后 ,再 继续 搅拌 10 分 
钟 。 离 心 ,使 含有 DNA 的 水 相 与 有 机 溶剂 分 离 ， 并 用 吸管 吸出 。 
水 相 以 酚 : 氧 仿 : 异 友 醇 (50:48:2) 抽 提 再 以 氯仿 : 异 友 醇 (24:1) 
抽 提 。 最 后 移出 水 相 ， 并 浓缩 DNA， 添 加 二 售 容 积 的 乙醇 。 高 分 
子 量 DNA 在 添加 乙醇 后 沉淀 ， 用 无 菌 塑 料 管 移 入 无 菌 聚 丙烯 试 管 
中 。 加 入 蒸 饮 水 ，377 播 床 过 夜 ， 使 DNA 溶 解 。 测 定 DNA 浓 度 ， 
并 可 在 4C 下 无 菌 储 存 DNA， 直 至 鉴定 。 

2 .细胞 DNA 的 制备 

收获 培养 细胞 ,以 等 渗 (10mM Tris，140mM NaCl，pH8.0) 
溶液 洗涤 。 沉 演 物 悬浮 于 DNA 抽 提 组 冲 液 内 ,细胞 浓度 不 超 过 1 
X10 /ml。 加 入 SDS 至 0.2%， 然 后 如 前 节 所 述 加 入 500kg/ml 半 消 
化 链 霉 蛋白 酶 ,经 酚 和 和 氯仿 抽 提 后 ,用 DNA 抽 提 绥 冲 液 透 析 过 夜 。 
用 热处理 过 的 RNase A 50ug/ml 在 37C 下 消化 1 小 时 。 加 六 链 霉 蛋 
白 酶 至 25 呈 gml，SDS 至 0.2%(w/v)， 再 培养 ?小 时 。 如 前 述 对 
DNA 进 行 抽 提 ， 乙醇 沉 演 ,并 悬浮 于 蒸 饮水 中 。 按 这 一 程序 分 离 
的 DNA ,通常 大 于 100kb。 可 参照 0.3% 的 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 中 ， 噬 菌 
枯 允 50kb) 和 HSV -1(160kb)DNA 的 迁移 率 来 判断 。 这 种 DNA 在 
转移 实验 中 作为 供 体 DNA 的 来 源 是 合适 的 。 DNA 前 浓 度 可 调节 
至 500g/ml。 


ea id77 。 


3 .磷酸 钙 DNA 沉 淀 和 转移 缓冲 液 的 制备 

制备 高 转移 活性 的 磷酸 钙 DNA 沉淀 需 明 仔细 调节 过 的 
HEPES 缓 冲 。 常 规制 备 2 x HEPES 缓 冲 的 磷酸 盐 批 量 溶液 ,用 玻璃 
电极 调节 pH 至 7.10 芋 0.05( 一 些许 准 电极 往往 不 能 精确 测定 EEP 
ES 缓冲 液 OQHBS) 的 pH 值 )。 制 备 2 xHBS( 含 50mMHEPES; 280mM 


Nacl,1.5mM 磷 酸 钠 )。 溶 液 经 孔径 为 0.228a 的 滤 紧 过 滤 。 二 207C 


下 储存 在 聚 丙烯 管内 。2 x HBS 用 时 解冻 ,对 pH 值 进行 核 对 调节 到 
所 需 之 值 ， 一 次 性 使 用 ， 

典型 的 CaPO-DNA 沉 淀 ， 是 加 10ul 供 体 走 核 细胞 DNA 到 230 
ul 无 菌 水 中 ， 苏 倒 试 管 使 DNA 缓 慢 混 合 ， 然 后 加 六 等 容积 的 250 
mMCaCl, ,使 之 混合 。 将 一 支 无 菌 的 1ml 塑 料 吸管 插入 到 含 2xHBS 
的 管内 ， 将 DNA-CaCl; 混 合 溶液 滴 加 到 含 等 容积 的 2 HBS 的 管 
内 , 演 加 同时 用 塑料 吸管 缓慢 吹 泡 。 在 室温 中 放置 30 一 45 分 钟 后 ， 
即 形成 磷酸 钙 DNA 沉 淀 物 。 

4. 受 体 细 胞 的 制备 和 转移 

受 体 细胞 是 在 无 选择 压力 下 培养 的 2 日 瞪 细 胞 ， 例如 ,0 要 使 
LTK-，APR1T- 细 胞 接受 并 转 为 阳性 表现 型 时 ， 是 把 正常 维持 在 
502g/m: 氨 甲 喉 叭 的 细胞 转 入 没有 添加 药剂 的 料 养 基 内 培养 在 转 
移 的 前 一 天 ,将 5x105 细 胞 /ml 接种 到 含 10% 小 牛 血 清 的 jomlDu- 
lbecco 氏 改良 的 Eagle 培养 液 (DME) 内 。 次 日 晨 ; 把 Iml 斐 酸 钙 一 
DNA 沉 演 物 直接 加 入 10ml 生 长 培养 液 内 ， 履 盖 住 受 体 细胞 交 轻 轻 
摇动 平 耿 后 ， 放 入 36 吕 ，6%CO; 培 养 箱 内 5 4 一 12 小 时 扩 更 换 培 
养 液 后 ， 再 培养 21 小 时 。 此 后 ， 施 加 选择 压力 ， 使 转化 体 表达 。 

5. 选 择 系统 


对 于 受 体 细 胞 群体 中 罕见 的 转化 体 来 说 ， 生 化 选择 是 有 力 工 二 


具 。 各 种 选择 培养 茎 和 适当 的 DNA 源 ,对 表达 供 体 基 因 细 胞 的 ' 鉴 
定 提 供 了 条 件 。 如 ，APRT，HPRT 或 TK 基 因 均 可 用 适当 的 选择 
培养 蕉 进行 选择 .APRT 细胞 可 在 含 50M 氮 丝氨酸 和 100&M 腺 嗓 
聆 的 培养 基 中 成 活 。 HPRT- 细胞 则 可 在 HAT 培 养 基于 生长 (HSAE 
次 黄 味 叭 15bg/ml， 氮 基 喉 叭 1ug/ml， 胸 苷 5ug/ml 天 当 将 突变 


478。 


dhfir 基 因 转 移 到 对 MI 位 〈 氮 里 只 叭 ) 敏感 的 小 鼠 工 细胞 中 时 ， 最 
初 可 在 0.1ug/m] 氨 甲 哄 叭 中 选择 ， 继 之 在 大 量 成 活 的 克隆 中 再 增 
加 剂量 水 平 。 

原 位 杂交 和 基因 探 针 方法 是 检 出 外 源 DNA 序 列 更 加 敏感 的 
流 法 光 .3 章 


. (六 ) 细 胞 或 罗 胎 内 微量 注射 外 源 物质 
向 细胞 内 导入 外 源 物 质 的 技术 ， 除 融合 和 化 学 方法 外 ， 显 微 
注射 技术 作为 一 种 物理 方法 已 成 为 有 力 工 具 。 现 以 哺乳 类 受精 卵 
为 例 进 行 介绍 。 
“长 显 微 操作 器 
SSEeitz 显 微 操作 器 包括 左右 手 各 一 操作 单元 并 配置 有 显 微 镜 。 
其 中 ， 一 个 单元 控制 持 卵 器 ， 另 一 单元 控制 注射 器 。 
(1) 持 卵 器 
持 卵 器 或 称 持 卵 管 是 一 支 吸管 ， 外 径 70 一 100km， 类 部 内 径 
汶 10 一 15um。 可 用 直径 为 Imm 的 玻璃 毛细 管 手 工 拉 制 , 再 用 电炉 
丝 加 热 顶 端 而 形成 所 需 内 径 。 持 卵 管 连接 塑料 管 ， 管 内 充 以 矿物 
” 狂 计 系统 中 不 得 有 气泡 。 持 卵 器 固定 在 显 微 操 作 单元 上 。 为 了 能 
够 接触 培养 下 底部 ， 持 卵 管 距 尖 端 2 一 3mm 处 应 呈 15 一 20" 角 。 
持 卵 管 经 干 热 灭 菌 后 无 菌 保 存 。 
1 (2) 注射 管 
: 广 射 管用 沙 壁 玻璃 毛 细 管 拉 制 。 通 过 对 加 热 温 度 的 控制 ， 制 
成 尖端 为 J 吕 am 的 注射 管 。 在 毛细 管内 壁 附 有 细 丝 ， 这 有 助 于 迅 
速 吸 入 液体 。 灭 菌 和 保存 条 件 均 与 持 卵 管 同 ， 但 最 好 当日 拉 制 。 
注射 时 有 两 种 方法 可 供 选用 。 一 种 是 连续 液 流 系统 。 注 射 液 充 
满 注 射 管 后 ;注射 管 与 压缩 空气 钢瓶 连接 ， 将 压力 调节 至 合理 流 
汉 最 低 限 度 ， 并 用 卵 进行 试 验 得 出 压力 上 限 。 这 种 方法 可 避免 注 
- 射 系统 由 现 负 压 ， 但 不 易 掌 握 。 另 一 方法 是 正 压 注射 ， 共 有 三 种 
方 式 . 一 是 用 大 注射 器 (例如 50ml)， 用 塑料 管 连接 注射 管 和 注射 
2 沁 射 器 活塞 放 在 回程 一 半 处 ， 注 射 管内 充 以 注射 深 体 ， 对 活 
。479 。 


芝 


塞 加 压 后 ， 液 流速 率 取 决 于 注射 管 的 孔径 大 小 。 当 放松 压力 后 ， 
活塞 迅速 回 弹 到 原来 位 置 ， 防 止 了 系统 中 产生 负 压 。 另 一 种 方法 
是 使 用 连续 液 流 装置 ， 但 在 细 调 节 器 的 位 置 上 放 一 个 IT 形 管 ,将 它 
的 一 个 分 枝 开放 ,用 手 堵 住 这 个 开放 的 口 时 ;气流 压力 使 注射 管内 
液体 排出 。 封 闭 开 口 的 大 小 和 时 间 决 定 了 液体 的 排出 量 。 第 三 种 
装置 与 控制 持 卵 管 机 械 装 置 的 原理 相同 ,用 微 动 尺 或 100b1 微 量 进 
样 呈 提供 正 压 ， 系 统 中 充 以 硅油 或 有 机 硅 溶 液 。 注 争 流 则 从 注射 
管 辣 这 组 组 吸 六 沁 

(3) 注 计 小 室 

稍 加 硅化 的 四 形 载 片 的 止 穴 内 放 一 滴 卵 培养 液 1 (用 25mM 
HEPES,pH7.5， 代 替 瑞 酸根 离子 ， 保 证 在 室 沽 下 pH 值 移 定 )， 在 
波 注 上 铺盖 矿物 油 。 硅 化 有 助 于 液 滴 保持 圆 形 。 另 一 种 小 室 是 塑 
料 培 养 亚 盖 ， 它 不 适用 於 Nomarski DIC 透 镜 。 

2 .操作 步 又 

(1) 水 鼠 卵 的 回 收 

从 自然 交配 或 经 促 性 腺 激素 超 排 后 交配 的 盯 鼠 中 回收 单 细胞 
受精 卵 。 先 诈 磷 琶 缓 冲 液 从 和 输卵管 中 冲 出 卵 。 再 用 透 明 质 酸 酶 
(300IUV/mlD 除 去 附着 在 卵 上 的 孵 丘 细胞 。 将 卯 回收 并 用 新 鲜 培 养 
液 洗涤 盖 放 在 5%COi 忆 37 培养 箱 内 。 

(2) DNA 深 液 的 制备 

用 于 显 微 注射 的 DNA 溶 液 应 是 无 菌 、 元 颗粒 的 ; 并 应 彻底 除 
去 酚 、 乙 醇和 氯仿。 超 螺 旋 质 粒 DNA 应 在 溴 化 乙 锭 / 氯 化 饮 的 梯 
度 上 分 带 两 次 ， 以 内 切 酶 消 第 的 线性 片段 记 放大 洲 关 从 二 活 硕 训 : 
一 步 以 凝 胶 纯 化 并 作 透 析 。 

纯化 后 的 DNA 沉 淀 物 , 深 于 注射 缓冲 液 内 ; 各 研究 者 使 用 的 
缓冲 液 包 括 从 燕 馆 水 到 等 离子 强度 的 磷酸 缓冲 液 或 盐水 ， 尚 没有 
证 据 能 说 明 哪 种 更 好 些 。 但 是 发 现 0.1 一 0:3mM 的 EDTA 能 促进 整 
合 率 。 注 射 用 缓冲 液 可 参考 两 种 配方 :(a)10mM Iris-HCI0.25m 
MEDTA;,pH7.5; (b)5mMNaCl75mM Tris-HC1, DH7.4， 0.1mM 
EDTA。 加 入 DNA 样 品 内 所 有 的 溶液 均 应 过 滤 踪 菌 并 且 最 后 离心 


ee 480 


站 地 
天 
和 


上 一 30 分 钟 除去 所 有 颗粒 物质 。 
有 (3) 原核 注射 


将 注射 小 室 放 在 显微镜 上 , 低 倍 物镜 聚焦 到 培养 液 滴 的 边缘 。 

持 卵 器 低位 进入 液 注 ， 使 其 端 部 刚好 接触 小 室 底部 。 在 高 倍 镜 下 
检查 卵 的 原核 。 若 卵 可 供 注射 ， 就 将 充 有 DNA 液 的 注射 管 在 低 信 
。 镜 下 伸 进 液 滴 ， 其 尖端 处 于 卵 的 焦点 位 置 。 用 注射 管 把 卵 移 至 持 
孵 管 的 端 部 。 换 高 倍 镜头 ， 定 位 唆 性 和 雄性 原核 ， 雄 性 原核 较 大 
故 易 于 注射 。 用 注射 管 把 卵 定位 ， 使 雄性 原核 处 于 注射 位 置 ， 持 
卵 管 缓 缓 抽 吸 ， 将 卵 吸 附 固定 在 持 卵 器 上 。 若 位 置 不 合适 ， 可 释 
放 卵 后， 再 次 定位 吸附 。 注 射 管 的 尖端 以 正确 方位 接近 卵 ， 用 操 
纵 杆 把 注射 器 推 入 透明 带 和 质 网 并 进入 原核 。 原 核 和 注射 器 尖端 
应 保持 在 焦点 位 置 上 。 注 射 管 尖 端 应 避免 接触 核 仁 ， 和 否则 它们 会 
牢固 地 烙 附 于 尖端 。 若 采用 连续 液 流 方法 ， 注 射 管 尖 端 在 原核 内 
时 就 能 观察 到 原核 迅速 膨 卫 。 当 原核 容积 增加 30 一 50% 时 ， 应 向 
反方 问 推动 操纵 杆 ， 以 尽快 抽出 注射 管 。 使 用 其 它 注 射 系 统 时 ， 
也 可 用 同样 的 标准 掌握 。 注 射 时 原核 若 不 膨胀 则 有 两 种 可 能 一 
是 注射 管 堵 塞 ， 因 而 没有 液 流 ， 需 更 换 另 一 支 充 以 DNA 的 注射 
管 ， 二 是 注射 管 未 能 刺 穿 质 膜 ,只 是 把 高 度 徙 性 的 质 膜 压 入 卵 内 ， 
这 种 情况 的 出 现 可 根据 注射 管 端 加 压 点 上 的 质 哎 会 形成 两 个 90? 
角 和 注射 管 尖 端 会 出 现 DNA 溶 液 泡 来 判断 .原核 膨胀 乃 是 DNA 注 
入 成 功 的 最 终 指标 。 
”。” 钊 的 细胞 质 晒 粒 如 在 注射 管 抽出 时 外 流 ， 孵 将 解体 死亡 。 注 
射 过 与 未 注射 过 的 卵 应 彼此 分 开 。 注 射 过 的 卵 原核 较 大 。 全 部 井 
作 完毕 后 ， 小 室 移入 37C ,5%CO:。 培 养 箱 内 培养 ， 再 开始 另 一 批 
卵 的 操作 。 最 后 ， 在 解剖 镜 下 对 全 部 注射 过 的 卵 进行 检查 ， 剔 除 
解体 者 。 一 般 60 一 80% 经 过 注射 的 卵 可 供 移植 到 同步 的 受 体 输 久 
管内 。 

(4) 小 鼠 蝇 系 的 选择 

Fl 代 的 杂种 作为 供 体 时 ， 往 往 回收 更 多 的 卵子 ,这 些 卵 的 成 
活力 和 体外 操作 耐 受 性 较 好 ， 整 合 外 源 PNA 的 效率 也 较 高 。 可 用 


48T。， 


SJL、CBA、C3H 品 系 与 C57BL/6 厅 交 而 提供 F, 杂种 丰 鼠 .车 希望 
遗传 背景 单纯 ， 只 有 C57BL/6 曾 用 于 这 类 实验 

(5) 移植 小 鼠 的 鉴定 

从 小 鼠 尾 部 分 离 的 高 分 子 量 DNA 作 班 点 装 移 并 司 导 人 前 昌国 
顺序 的 特异 探 针 杂 交 。 含 有 这 些 顺序 的 小 鼠 能 提供 正 结果 。 另 二 
方法 是 将 基因 组 DNA 经 内 切 酶 消化 ， 通 过 Southernblot 筛 选 目的 
基因 。 为 考察 基因 是 否 已 稳定 地 整 谷 到 受 体 动物 的 基因 组 内 ， 可 
对 这 些 动物 的 后 代 作 同样 的 杂交 试验 筛选 。 


(扬琴 华 ) 


第 三 节 “ 单 克隆 抗体 技术 


单 浆 抗体 是 未 世纪 二 二 年 代 中 期 以 后 受 蝴 四 采光 二 需 下 
-工程 新 技术 。1975 年 ， Kahler 和 Milstein 用 聚 乙 二 本 (PEG7 成 
功 地 将 小 民 悄 甸 痪 细胞 与 绵羊 红 细 了 免疫 的 小 忌 阵 汶 巴 甸 克 了 

， 经 过 筛选 和 分 离 纯 系 ， 得 到 了 既 能 产生 和 分 滥 抗 体 、 又 能 在 
体外 博 养 条 件 下 无 原生 长 、 长 期 传 代 的 细胞 系 , 称 之 为 “杂交 瘤 ”。 


由 杂交 奖 细 胞 系 分 泌 的 针对 预定 免疫 原 的 抗体 ， 称 为 人 


体 ”。 

与 传统 的 多 克隆 抗 血 清 相 比 ， 单 克隆 抗体 有 下 述 优点 ， 

单 克 隆 抗体 是 针对 单一 抗原 决定 秘 的 ， 专 一 性 很 强 。 应 用 经 
过 严格 筛选 的 仅 与 预定 抗原 决定 负 结 合 的 单 克隆 抗体 ， 可 以 检 
测 出 类 似 抗原 间 的 微小 差异 而 很 少 发 生 交叉 反应 ， 这 是 常规 抗 和 
清 所 办 不 到 的 。 

用 常规 抗 血 清 方法 制备 的 抗体 ， 其 质 与 量 往往 随 动 暂 、 甚 至 
随同 一 动物 的 不 同 放 血 期 而 异 ， 很 难 标准 化 。 运 用 杂交 瘤 技 术 制 
得 的 单 克 隆 抗体 ， 不 仅 纯度 高 ， 特 异性 强 ， 作 为 标准 化 试剂 便于 

4 482 。 


2 的 


不 同 地 区 的 实验 室 相互 比较 ， 而 且 可 在 体外 大 量 生产 ,不 易 污染 。 


(一 ) 单 克隆 抗体 的 产生 与 纯化 


正常 脾 绸 胞 在 人 工 培养 条 件 下 一 般 存 活期 不 超过 两 周 ， 骨 甬 
瘤 细 胞 别 可 长 期 培养 。 而 融合 用 的 骨 人 瘤 细胞 通常 为 缺失 次 黄 嗓 
叭 鸟 叮 叭 磷酸 核糖 转移 酶 (HGERT) 或 胸腺 喀 喧 核 苷 激酶 (IK) 
的 突变 系 ， 因 而 不 能 利用 外 源 性 次 黄 味 叭 或 胸腺 喀 陡 核 苷 。 在 补 
加 了 次 黄 呆 叭 . 氨 基 喉 叭 和 胸腺 喀 啶 核 音 的 选择 培养 基 中 培养 时 ， 
直 于 氮 基 碟 叭 封闭 了 DNA 的 正常 合成 途径 , 骨 能 瘤 细 胞 也 将 无 法 
增殖 。 通 过 选择 培养 基 的 选择 ， 只 有 骨 散 瘤 细 胞 与 脾 细 胞 融合 后 
产生 的 杂交 瘤 细 胞 得 以 生存 下 来 ， 这 是 因为 杂交 瘤 自 骨 髓 瘤 细胞 
获得 了 在 组 织 培养 中 无 限 生长 的 能 力 ， 而 脾 细胞 则 提供 了 克服 所 
基 啼 叭 阻 断 DNA 合 成 所 必需 的 HGPRT。 杂 交 瘤 细胞 同时 表达 两 
种 亲 代 细胞 的 某 些 基因 型 及 表 型 特征 。 
产生 鼠 类 杂交 瘤 单 克隆 抗体 的 常规 步 又 如 图 5-4 所 示 。 所 必 
需 的 主要 仪器 设备 如 表 16 所 列 。 
1 .动物 和 绍 胞 系 的 选择 
动物 的 选择 取决 于 融合 所 用 的 细胞 系 。 迄 今 用 得 最 普遍 的 是 
表 16 生产 杂交 瘤 所 怖 主要 仪器 设备 
主要 设备 “377 一 CO 培养 箱 
高 压 灭 苑 锅 
带 紫 外 光 的 超 净 工作 台 
低温 冰箱 -20C，-707 
液 氨 贮存 饶 
离心 机 
倒置 相差 显微镜 
实验 动物 饲养 设备 
恒温 水 浴 
微量 吸管 1-20k1，50-200u1 
小 件 玻 璃 或 塑料 器 血 ”微量 滴定 板 24 孔 ，96 和 孔 
组 织 培养 眶 25cm2，80cm2  ， 


。483。 


国 
站 机 

= 
0 


岁 
脾 IPv 全 基 Rn 
eeeeeeeee PEG |< 一 oooooooooo 
产生 正常 抗体 的 细胞 肯 莲 瘤 纲 胞 
@ee SS38S8S8S ooo 


未 融合 脾 细 胞 融合 细胞 未 融合 骨 钥 瘤 细 了 胞 


HAT 培养 基 


入 调 天 杯 开 当 : 
培养 中 死亡 BOG@D 死 于 HAT 培 养 基 
杂交 瘤 

= 部 分 冷冻 保存 


用 有 限 稀释 法 克隆 


6 CO OO OO 
o BOBB CO 600 所 也 
克隆 A ”克隆 B “克隆 C 克隆 D 克隆 刁 


增殖 部 分 冻 存 


泗 : ) 一 一 
证 ] 天 量 结 隐 。 和 


上 请 特 异 抗体 ( 一 10kg/mD “内江 志 伐 入 10m8 m| ，， 厅 交 痪 细 


和 多 5-4 产生 鼠 类 单 克 隆 抗 体 的 常规 方案 


-二 一 一 


。484。 


ALB/e 小 鼠 ， 因 为 所 有 小 鼠 骨 骨 交 细胞 系 均 来 自 这 一 品系 。 大 
也 由 于 个 体 大 \ 产 让 水 比 小 鼠 多 等 优点 ;也 经 常 被 选 作 免疫 对 象 


主要 是 ou 大 鼠 。 
现 有 的 路 齿 类 骨 骨 瘤 细胞 系 见 表 17。 
束 17 融合 用 的 咕 具 类 骨髓 瘤 细 胞 系 


细胞 系 染色 体 数 ”表达 的 免疫 球 重 息 来 j) 源 ， 


小 鼠 细 胞 系 
Ps-X63/As8 65 ?1 K MOPC-21 
NSIT/A1.Ag4.1 65 细胞 内 k MOEC=-21 
入 63-Ag8 .653 59 无 久 63-Ag8 
SP2/0-Asgl4 72 无 (X63-Ag8xBALB/C) 
FO 72 无 SP2/0-Agl4 的 克隆 
MPCI1-45.6TG1.7 62 ?2by KK BALB7C 
S194/5XXOBU,I 无 : BALB/C 
大 鼠 细 胞 系 
YE-Asl。.2。3 39 K Lou 
YB2/3Ag20 无 (Loux AO)EF， 
TIR983F 无 Lou 
2 .免疫 
免疫 方案 往往 随 经 验 及 实验 室 的 习惯 而 异 。 下 面 根 据 抗 原 种 
类 列 出 两 种 方案 。 


人 1) 可 溶性 抗原 、 细 菌 及 病毒 的 免疫 方案 
四 给 6 一 12 周 龄 小 记 或 大 鼠 注 射 1 一 10ug 纯 糖 类 抗 原 ， 10 一 
50ug 纯 蛋白 质 抗 原 或 大 量 的 不 纯 抗 原 〈 通 常 不 超过 1mg)。 抗 原 需 
与 弗 氏 完全 佐 剂 充分 混合 、 乳 化 ， 通 过 皮下 或 皮 内 多 点 注射 。 
@2 一 3 周 后 ， 腹 腔 注射 同样 剂量 或 较 前 剂量 稍 高 的 抗原 〈 一 
般 用 弗 氏 不 完全 佐 剂 乳化 )。4 一 6 天 后 采血 测定 抗体 滴 度 。 
四 融合 前 3 一 4 天 ， 给 抗 血 清 滴 度 高 的 动物 静脉 注射 剂量 较 大 
的 抗原 盐水 溶液 〈 不 加 短 剂 )。 
《2) 细胞 作 抗原 时 的 免疫 方案 


ed85。 


四 用 PBS (磷酸 盐 缓冲 液 ) 洗涤 细胞 3 次 ;给 4 一 12 周 龄 的 小 
鼠 或 大 鼠 静 脉 或 厌 腔 注射 1 一 5x 107 个 细胞 ， 不 加 佐 剂 。 

@3 周 后 ， 重 复 上 述 步 又。 再 过 4 一 6 天 ， 采 血 测 滴 度 二 

四 给 滴 度 较 高 的 动物 静脉 注射 2 倍 于 前 述 剂量 的 细 ; 胞 了 B5 悬 
液 。3 一 4 天 后 融合 s 

32. 培养 液 和 细胞 悬 液 的 制备 

(1) 了 AT 培养 基 贮 存 液 的 制备 

@100xHT(IOmM 次 黄 喷 叭 一 0 
称 取 136. 1mg 次 黄 味 吟 和 38.8mg 胸 腺 喀 啶 核 苷 ， 溶 于 100m150 一 
507 的 双 蒸 水 中 ， 微 孔 滤 膜 过 滤 后 按 需 要 量 分 装 ,-20 忌 贮存。 

@100xA (4x10-5M 氮 基 喉 叭 ) 贮存 液 ， 

称 1.76mg 氨基 喉 叭 ， 加 入 约 90ml 双 燕 水 ， 向 其 中 滴 加 JIN 
NaOH 至 氨基 唆 叭 溶解 。 然 后 用 1N HC1 调 pH 至 7.5; 用 双 燕 水 
定 容 至 100ml; 过 滤 灭 菌 ， 分 装 并 避 光 保存 于 -20C。: 

(2) 培养 液 的 制备 


四 完全 培养 基 : 

DMEM (改良 的 Eagle?s 培 养 基 ) 或 
RPMI 一 1640 培 养 基 00 
100mM 丙 一 酶 铀 | 
青 一 链 零 素 溶 液 (青霉素 5000IU/ml， 链 霉 素 5mg/ mm1)5ml 
200mML- 谷 氨 酰 胺 5 和 过 兴 
灭 活 的 胎 牛 血清 -50mj 

4 和 保存 。 

人 HT 培养 基 : 


每 100ml 完 全 培养 基 中 ， 加 入 1ml100x HT 贮存 液 即 成 品 

@@HAT 培 养 基 : 

每 100m1 完 全 培 养 基 中 各 加 入 lml HT 贮存 液 和 ml 入 贮存 波 
( 均 为 100X ) 即 成 。 

(3) 50% (W/V) PEG 的 配制 

将 固体 PEG (MW1i1500 或 400) 高 压 灭 菌 ，PEG 即 融化 ， 冷却 


6486。 


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至 50C (在 此 温度 下 仍 为 液体 )。 加 入 等 体积 无 血清 的 DMEM 或 


了 PMI-1640 培 养 基 。- 20 立 贮存 。 


(4)》 细胞 悬 液 的 制备 

外 小 鼠 脾 细胞 

用 颈椎 脱位 法 处 死 小 鼠 。70% 洒 精 消毒 皮肤 后 ， 用 无 菌 手术 
器 械 剪 开 皮肤 和 腹膜 ， 取 出 脾脏 ， 移 到 盛 有 5ml 无 血清 PDMEM 或 
RPMI-1640 的 培养 四 中 。 乔 梳 或 剪 碎 脾 脏 ， 将 脾 细胞 挤 压 至 培 
养 基 中 。 将 细胞 吸 至 一 无 菌 管 中 ， 静 置 使 组 织 块 沉降 。 将 无 团 块 
的 脾 细 胞 悬 液 吸入 另 一 试管 ，500g 离 心 5 分 钟 . 用 无 血清 堵 养 基 洗 
涤 脾 细胞 2 次 ,再 悬浮 于 5ml 培 养 基 中 。 用 3%% 乙 酸 作 稀释 液 , 除 去 红 
称 球 。 计 算 每 ml 悬 液 中 的 有 核 细 胞 数 。 一 般 每 只 小 记 的 脾脏 可 得 
10 细胞 。 每 只 夫 鼠 的 脾脏 可 得 2x 10* 细 胞 ， 的 入 小 也 榴 2 铺 : 

四 小 鼠 腹 腔 巨 唆 细 胞 

东 死 未 鼠 ， 消 毒 皮肤 。 向 腹腔 内 注入 2 一 3ml 培 养 基 ， 轻 压 腹 
部 使 细胞 混 悬 。 打 开 腹 壁 皮肤 ,暴露 降 膜 ， 提 起 腹膜 中 心 ， 搬 入 
注射 器 针头 吸出 全 部 细胞 悬 液 。 保 持 低 温 ， 防 止 巨 唆 细 胞 成 团 
和 粘连 。500g 离 心 5 分 钟 ， 用 PBS 洗 涤 2 次 ， 再 离心 而 后 计 数 。 一 
只 水 鼠 约 可 获得 3x 10* 个 细胞 。 用 加 有 10%% 胎 后 血 清和 抗生素 的 
培养 基 制 成 105/ml 的 细胞 悬 液 。 

4. 融 合 程序 

(1) 将 融合 用 器 材 全 部 灭 苗 。 将 胎 牛 血清 、HT 和 A 贮 存 液 化 
冻 ， 连 同 其 它 培养 基 成 分 和 PEG 溶 液 置 于 37C 水浴 中 预 热 。 

(2) -收获 处 于 对 数 生长 期 的 骨 通 瘤 细 胞 。 计 数 密度 范围 应 
在 108/ml)， 检 查 活 力 【〈 应 高 于 95%) 后 ,悬浮 于 RPMI 或 DMEM 
培养 基 中 。 

(3) 将 洗涤 过 的 小 鼠 脾 细胞 和 骨 艇 瘤 细 胞 按 5:I 的 比例 混合 。 
通常 约 用 102 脾 细胞 和 2 x 107 骨 和 髓 瘤 细 胞 。 

《4) 500g 离 心 5 分 钟 ， 吸 出 上 清 液 。 

(5) 轻 弹 离心 管 使 细胞 沉淀 松散 。 半 分 钟 内 边 播 划 边 逐 滴 加 
入 1.5ml 50% 的 PEG 溶 液 。 用 吸管 将 细胞 悬 液 小 心地 打 勾 ， 随 后 


s 87“。 


关于 半分 钟 。 

(6) 在 2 分 钟 内 ， 边 皮 播 试管 边 注 加 5ml 无 血清 堵 关 基 接着 
再 训 5m1。 

(7) 静 置 约 3 分 钟 ，500g 离 心 5 分 钟 。 

(8) 分 装 于 24 孔 培养 板 。 用 50ml1 加 有 2XxHATI 的 完全 培养 基 
制备 融合 细胞 悬 液 ， 每 孔 加 入 0.5ml ( 约 10s 细 胞 ) 板 内 每 孔 已 矛 
先 装 有 经 过 温 育 的 5x 10:4 个 腹腔 巨 噬 细 胞 -( 作 饲养 层 )。 如 果 不 铺 
饲养 层 ， 就 在 细胞 沉淀 中 加 100m1 含 1 x HAT 的 完全 培养 基 制 成 县 
六 ， 于 每 孔 中 加 入 lml。 收 获 108 细 胞 的 1 只 脾 ， 约 需 4 二 5 抉 搁 养 
板 : 每 块 板 的 最 后 一 行 最 好 设 对 照 。 

(9) 对 照 用 的 牌 细胞 和 骨 体 败 细 胞 应 不 少 于 5 x 108 个 。 500g 
离心 5 分 钟 ， 同 桩 用 培养 基 制 成 细胞 悬 液 。24 和 孔 板 上 每 孔 加 10* 细 
胞 ， 最 好 每 块 板 上 都 有 两 种 细胞 的 对 照 孔 。 

设 对 照 除 有 助 于 监测 两 种 亲 代 绍 胞 系 的 死 玄 情 况 外 ， 脾 细 胞 
对 照 还 可 监测 分 泌 功 能 何 时 丧失 ， 骨 和 介 瘤 对 黑 则 可 检查 氨基 唆 叭 
的 效力 。 洗 晤 也 还 有 利于 分 折 和 查 明 就 验 串 出 珊 妖 是 各 要 要 中 
采取 补救 措施 。 

(10) 将 培养 板 置 于 377 、 一 定 湿度 和 5%CO; 的 培养 箱 内 培 
养 。 

(11) 4 一 5 天 后 检查 细胞 。 此 时 大 量 细胞 死亡 ,试验 孔 中 可 能 一 
有 一 些 活 细胞 ， 但 对 照 孔 则 全 无 ， 此 时 不 要 加 培养 基 。 如果 对 照 
骨髓 瘤 仍 正常 ， 就 应 加 含有 新 鲜 氮 基 哎 叭 的 HAT+ 完 全 培养 基 ; 

(12) 7 一 10 天 后 加 HTI+ 扣 全 培养 基 ， 每 孔 加 入 lml。 
照 细 胞 没有 完全 死亡 ， 则 也 要 加 氮 基 哄 叭 。 研 

(13) 在 8 一 14 天 间 ， 就 可 以 看 到 杂交 细胞 的 克隆 。 当 克 隆 长 
到 1mm 直 径 左右 时 ， 即 可 检查 孔 中 培养 基 的 抗体 含量 。 从 培养 孔 
取出 1ml 测 定 抗 体 ， 同 时 再 补充 1ml 完 全 培养 基 + 了 IT。 
14 天 时 还 看 不 到 克隆 ， 就 应 更 换 新 鲜 培 养 基 。 

(14) 将 选 出 的 阳性 孔 中 的 细胞 扩大 培养 ， 和 深 保存 -都 分 ， 
另 一 部 分 予以 克隆 化 。 和 


ea tt8S。 


关上 鼠 的 细胞 融合 方法 与 小 鼠 相 似 。 只 是 脾 细 胞 与 骨骼 痪 细胞 
的 比例 以 2:1 为 宜 。 因 出 现 的 克隆 容易 扩散 ， 故 较 难 检测 。 

5. 杂 交 瘤 克隆 化 

(1) 有 限 稀释 法 

@@ 于 克隆 前 1 天 或 当天 ， 向 96 孔 培养 板 中 加 入 巨 鸣 细胞 饲养 
晨 ; 每 孔 加 入 0.1ml。 在 CO 培养 箱 中 温 育 。 

局 人 @ 从 阳性 培养 孔 中 吸取 和 欲 克隆 的 细胞 ， 计 数 ， 一 次 克隆 化 约 
” 需 1000 个 细胞 。 多 余 的 细胞 可 小 心地 放 回 24 孔 板 中 。 

四 用 完全 培养 基 兢 杰 细 胞 成 30 个 /ml， 加 入 两 块 96 孔 板 中 ,每 
孔 加 0.1mlI (和 孔 内 已 预 加 饲养 层 )。 

四 将 剩 下 的 细胞 再 度 稀 释 成 10 个 /ml, 然后 再 取 两 块 销 了 饲养 
层 的 96 孔 板 ， 每 孔 中 加 入 0.1ml。 

”全 再 制备 3 个 /ml 的 细胞 悬 液 ， 加 到 另外 两 块 板 上 。 
轿 将 培养 板 置 CO, 培 养 箱 中 (37C ) 培 育 ，2 一 3 周 可 出 现 可 见 
集落 。 
” “人 检测 上 清 液 的 抗体 活性 ,， 选 出 阴性 孔 ， 进 行 扩大 培养 和 再 
吉隆 全: 
“图 冻 存 1 二 5x108 细 胞 ， 

(2) 在 软 了 琼脂 中 克隆 化 

此 种 方法 与 有 限 稀有 释 法 相 比 ， 存 在 较 多 的 技术 困难 ; 故 从 略 。 

6. 杂 交 瘤 细胞 的 冻 存 

在 细胞 克隆 化 前 后 ， 都 应 冻 存 少量 〈1 二 5x 10s) 细胞 ,以 防 
不 测 。 
冷冻 保存 液 ， 在 含 20% 胎 牛 血清 的 基础 培养 液 中 ， 逐 滴 加 入 
二 甲 基 亚 硕 ， 边 加 边 搅 拌 ， 使 终 浓度 为 10%。4T 保存 。 

竺 冷冻 的 细胞 在 4C 下 以 300g 离 心 沉 汪 ， 吸 去 上 清 液 ， 约 5X 
10s 细 胞 团 中 加 1ml 予 冷 的 冷冻 保存 液 。 分 装 于 灭 菌 安 瓶 中 ， 火 焰 
封口 ， 放 在 塑料 盒 中 置 于 - 707 冰箱 中 过 夜 ,次 日 转 到 液 氮 饶 中 。 

复苏 细胞 时 ， 从 液 氨 中 取出 细胞 ， 在 37C 水 浴 中 迅速 化 冻 ， 
二 虽 液 状 立 即将 细胞 吸入 10m1 不 含 小 牛 押 清 的 培养 液 中 ， 离 心 洗 
789" 


涤 2 次 ,， 弃 去 上 清 , 有 困 完 全 培养 基 制 成 细胞 悬 液 ， 以 备 培 养 。 
7. 杂 交 瘤 的 扩大 墙 养 0 

(1) 离 体 扩大 培养 

当 培养 孔 底部 长 满 细胞 时 ， 应 及 时 转移 至 25cm? 培 养 瓶 中 扩 
大 培养 。 根 据 细胞 的 生长 情况 ,以 后 可 逐渐 移 至 80cm 175cm 的 
培养 瓶 中 培养 ， 使 细胞 密度 保持 在 105 一 10*/ml 之 间 吉 搞 大 培养 
初始 时 ， 加 饲养 细胞 是 有 益 的 ， 有 有 
浓度 亦 可 逐渐 降 至 5%。 

(2) 体内 扩大 培养 

当 需 要 大 量 抗体 时 ， 通 常用 的 还 是 避 休 全 天 性 汪 来 计生 杂 
交 瘤 细胞 以 腹水 形式 在 BALB/C 小 鼠 或 ou 大 鼠 等 组 织 相 容 性 动 
移 体 内 生长 时 ， 产 生 的 抗体 浓度 约 六 5 培养 细胞 的 1000 倍 *- 先 给 动 
物 蝇 腔 内 注射 0.5ml 降 植 烷 或 液体 石 腊 使 动物 致 敏 ， 8 一 10 天 后 给 
动物 腹腔 内 接 称 10* 一 107 杂 交 瘤 细胞 。 随后 注意 观察 动物 腹部 胀 
”大 情况 ， 一 般 在 2 一 4 周 内 可 见 腹部 明显 胀 大 。 用 70%% 酒 精 消毒 腹 
部 皮肤 ， 揪 入 针头 抽取 腹水 。 如 动 电 健 壮 ， 可 多 次 反复 东 集 ， 也 
可 杀 死 后 一 次 抽取 。 一 只 小 鼠 有 可 能 产生 10ml 腹 水 ， 而 大 鼠 则 得 
50ml 或 更 多 量 。 将 抽取 的 腹水 离心 ， 去 陈 纲 胞 及 其 碎 必 局， 加 
0.02% 的 等 所 钠 ，47 或 -207C 冰 箱 保 存 。 

8 .抗体 前 纯化 

(1) 硫酸 铵 沉淀 与 阴离子 交换 层 折 法 

电 腹 水 在 40 CC 下 ，20000g 离心 20 分 钟 ， 以 去 除 脂 肪 和 沉 注 
物 。 

@ 向 放水 中 缓慢 加 入 饱和 (NHA) :30 边 加 边 搅 拌 ， 至 终 浓 
度 达 40%， 搅拌 30 分 钟 。 
Q@2000 一 10000g 离 心 5 分 钟 , 奔 去 上 清 。 
四 将 沉淀 悬 浮 于 原 体积 的 405%(NT 4)2S9 中， 再 次 离心 or 
加 重复 步 又 全 
回 将 沉淀 悬浮 于 磷酸 缓 训 浸 中 。 8 

个 在 4C 下 ， 用 1 升 10mM Tris 一 HCI CR 二 全 其 间 


490。 


更 换 透 析 液 1 一 2 次 。 
@@ 取 100ul 透 析 过 的 蛋白 ， 用 磷酸 缓冲 液 稀释 10 倍 。 在 280nm 
测定 光 密度 ， lmg/ml 深 液 的 光 密 度 约 为 1.44 计算 出 蛋白 总 量 。 
“加 制备 DEAE 一 Sephace 离子 交换 柱 ， 每 100mg 和 蛋白 用 10ml 纤 
维 素 。DEAE 一 Sephacel 预先 用 10mM Tris 一 HCI (pH8) 平衡 。 
-加 加 样 。 用 10mM Tris 一 再 C1 (pH8.0) 缓冲 液 洗 柱 ， 直 至 流 
出 液 的 As 二 0.01。 
加 用 芋 述 Tris 缓 冲 液 的 0 一 300mM NaCl 直线 梯度 ， 收 集 最 早 
出 现 的 第 一 个 峰 。 每 ml 腹水 或 血清 的 免疫 球 蛋 白 (Ig)G 收 率 约 为 3 
一 10mg， 纯 度 在 95% 以 上 。 
(2) 蛋 站 人 A 一 Sepharose 亲 和 层 析 法 
人 电 取 1g 蛋 白 A 一 Sepharose CL 一 4B， 巧 浮 于 200ml 磷 酸 缓冲 
液 (PH8.0) 中 ， 至 少 吸 胀 30 分 钟 。 
@@ 装 往 〈( 约 4ml)。 先 后 用 100ml 磷 酸 缓冲 潜 (pH8) 和 100ml 
0.1M 柠 榜 酸 钠 (pH3) 洗 柱 , 然 后 用 前 一 种 缓冲 液 重 新 平衡 。 
四 腹水 或 培养 上 清 液 对 pH8 的 磷酸 缓冲 液 透 析 ( 如 先 用 
(CNH4)sSC, 沉 淀 后 再 透析 效果 更 好 ) 平衡 。 
”图 上 柱 ( 每 ml 胶 可 与 20 一 25mgIgG 结 合 )) 流 速 为 0.5-1ml/ 分 。 
思 用 5ml 10mM 磷 酸 缓冲 液 (pH8) 洗 往 。 监 测 流出 液 的 A280 
Fnm， 按 0.5m 级 分 收集 流出 液 。 开 始 九 管 应 该 是 没有 蛋白 的 ， 如 
果 是 强 阴性， 抗体 就 没有 与 蛋白 A 结 合 ; 如 果 是 弱 阳性 ， 可 能 古 
上 样 过 多 了 。 
@ 再 用 上 述 缓 冲 液 (不 少 于 5iml) 洗 柱 ， 大 多 数 I18A、1JIgM 和 
IgG: 洗 在 这 一 级 分 内 。 
包 用 5ml0.1M 柠 檬 酸 钠 (p 也 6) 洗 脱 IsG, 抗 体 。 
@ 用 5ml 0.1M 柠 榜 酸 钠 缓 冲 液 (pH4.5) 洗 脱 1g5G2a。 
” 图 用 pH3 .5 的 同类 绥 冲 液 洗 脱 IgG2b。 
@ 四 将 步骤 人 @、@、@ 收 上 集 的 级 分 ,分 别 用 1M NaHCOs 幸 p 也 至 
7.4。 测 定 蛋 白 浓度 。 浓 缩 后 ， 保存 。 
二 全 用 50mM 柠 襟 酸 清洗 用 过 的 柱子 。 再 用 pH8 .0 的 磷酸 缓冲 液 
491， 


平衡 ，47 保存 ， 以 备 再 用 。 

(3) IsSM 单 死 隆 抗 体 的 纯化 ; 

在 低 离 子 强度 下 沉淀 IEM 是 最 方便 的 纯化 方法 。 用 2mM 和 磷酸 
缓冲 液 (pH6) 透析 ， 即 可 得 到 沉淀 。 离 心 后 ， 用 上 述 缓冲 液 洗 
涤 ， 再 悬浮 于 10mM Tris 一 HCL1,， 0.15M NaCI(pH7.2)。 为 防止 


IgG 混杂 ， 可 进一步 上 Sepharose 6B 柱 层 析 ， 洗 说 液 的 第 1 峰 中 便 


含 IEM 〈1gG 在 其 后 洗 脱 )。 


另 一 种 方法 是 用 硫酸 馆 沉 淀 后 ， 离 心 ， 将 沉淀 溶 于 磷酸 缓冲 


液 中 。 使 液体 通过 Sephadex G 一 200 柱 。 收 集 第 1 峰 ， 对 5mM 
Tris-HCI(CpPH7.5》 进行 充分 透析 。 取 沉淀 ， 用 冷 透 析 液 洗涤 ， 离 
心 。 再 将 沉淀 溶 于 0.1M Tris-HCICDpPH8.6) 中 ， 对 磷酸 缓冲 液 透 
析 ， 取 其 沉淀。 

9 . 单 克隆 抗体 的 保存 

首先 应 鉴定 免疫 球 蛋 白 的 种 类 。 大 多 数 单 克隆 抗体 和 血清 一 
样 是 不 宜 反复 冻 融 的 。 有 很 多 IsM 抗 体 反复 冻 融 后 ;会 失去 与 抗 
原 结合 的 能 力 “〈 但 也 有 很 多 IgM 与 之 相反 )。 无 论 何 种 形 式 的 单 
抗 ， 最 好 以 小 包装 冻 存 。 

(1) 腹水 与 血清 : - 70 或 -20C 下 冻 存 。 撑 清 可 加 入 等 体 
- 积 硫 酸 贸 ，470 保存 。 

(2) 培养 的 上 清 液 ，- 707 冻 存 ,或 加 0.1% 叠 握 钠 4 保存 。 
(3) 纯化 的 IgG 和 IgM:， pH 中 性 ， 盐 浓度 100 一 200mM， 蛋 月 
浓度 1 一 10mg/ml 下 ， 加 0.1% 和 又 氮 钠 47 保存 ， 或 -70C 冻 存 。 

(4) 与 生物 素 或 荧光 素 等 物 偶合 的 抗体 :47C 保存 或 加 入 50% 
甘 酒 后 -207 保存 。 

(二 ) 抗体 的 测定 

抗体 检测 是 制备 杂交 瘤 的 重要 一 环 。 融 合 开始 后 *; 在 显微镜 
下 一 经 发 现 杂 交 细 胞 集落 生长 或 pH 指示 剂 变 黄 ， 就 应 立即 作 上 清 


液 的 抗体 活性 初 筛 。 一 且 测 出 某 一 孔 中 有 抗体 活性 ， 就 应 尽早 将 
此 细胞 克隆 化 ， 并 再 次 检测 。 在 产生 杂交 瘤 的 全 过 程 中 ， 筛 选 工 


。 492。 


作 可 能 要 持续 几 周 。 

选择 检测 方法 时 要 考虑 的 重要 因素 有 ， 试 验 的 灵 铀 性 、 精 确 
性 3 速度 ,费用 .人 力 与 安全 性 等 .同时 也 要 考虑 所 需 抗体 的 类 型 与 
相应 抗原 的 性 质 ， 以 及 融合 过 程 不 同 阶段 的 实际 需要 。 初 得 时 ， 
要 从 上 百 个 样品 中 选 出 阳性 杂交 瘤 并 予以 克隆 化 ， 因 此 应 选用 快 
速 、 灵 人 敏 、 简 便 的 检测 方法 。 后 阶段 的 筛选 ， 因 与 抗体 的 实际 应 
用 有 关 ， 获 测定 的 条 件 和 方法 也 应 与 抗原 抗体 实际 反应 的 要 求 尽 
量 一 致 ， 或 使 之 尽量 相似 。 

细胞 试验 是 使 用 最 早 的 测定 手段 。 近 几 年 来 ， 固 相 测 定 系 统 
已 成 为 最 常用 的 方法 。 此 外 经 常 使 用 的 还 有 液 相 测定 法 ， 如 放射 
免疫 测定 。 茜 物 学 测定 法 用 得 较 少 。 

实验 室 应 在 融合 工作 开始 前 , 先 建立 标准 化 的 抗体 检测 方法 ， 
可 以 用 免 次 动物 的 血清 作为 抗体 来 源 。 

1. 固 相 试验 

国 条 试验 系统 几乎 适用 于 任何 抗原 与 任何 抗体 。 这 些 方法 ， 
泡 其 是 酶 联 免疫 吸附 试验 (ELISA)， 由 于 具有 灵敏 、 快 速 、 经 济 、 
易 行 以 及 适 于 测试 大 量 样品 等 优点 ， 已 成 为 使 用 最 普遍 的 检测 手 
有 段 。 

有 两 类 固 相 试验 ; 一 类 是 ELISA 或 放射 结合 试验 。 其 原理 是 
将 已 知 抗原 结合 于 固 相 载 体 上 ， 然 后 加 入 含有 待 测 单 克 隆 抗体 的 
样品， 二 起 温 青 后 ,在 固 相 裁 体 表 面 形成 抗原 抗体 复合 物 。 再 加 入 
握 酶 或 同位 素 偶 联 的 第 二 抗体 , 与 上 述 抗原 抗体 复合 物 和 丰 结 合 。 最 
后 通过 放射 测定 或 用 酶 催化 底 物 后 测定 光 密 度 的 方法 来 检测 第 三 
抗体 。 另 一 类 是 夹心 法 或 免疫 放射 测定 试验 (下 MA)。 其 原理 是 
允 单 克隆 或 不 是 单 克隆 的 抗体 结合 到 固 相 支持 物 上 ,再 加 入 抗原 ， 
温 育 徒 形 成 复合 物 。 然 后 加 入 用 酶 或 放射 性 标记 的 、 针 对 抗原 的 不 
同 能 原 决 定 部 位 的 第 二 抗体 ， 以 检测 被 结合 的 抗原 。 前 一 类 通常 
用 于 筛选 抗体 并 对 其 定量 ， 后 者 则 用 以 定量 抗原 。 

最 常用 的 固 相 载 体 是 以 聚 葵 乙 烯 或 聚 氯 乙烯 为 材料 的 96 孔 微 
若 滴 定 板 。 大 多 数 可 溶性 蛋白 和 核酸 抗原 都 能 吸附 在 这 种 板 上 。 


ed493。 


可 溶性 蛋白 抗原 通常 用 100 争 的 1 一 104g/ml 溶 统 包 被 半 当 抗原 是 
染色 体 % 病毒 、 细 菌 、 寄 生 虫 或 者 完整 细胞 时 ， 一 般 用 10 一 50ug 
/ml 的 多 育 工 - 赖 氨 酸 在 室温 下 予 包 被 1 小时， 然后 加 100 岂 细胞 悬 
液 45x104 一 5 x105/ml) 温 育 45 一 60 分 钟 ， 再 用 0.1 一 0.25%% 戊 
二 醛 固 定 3 一 5 分 钟 。 如 不 马上 使 用 # 重读 过 盾 直 和 介 生 下 全 2 
存 数 周 ，: 不 会 失去 免疫 活性 : 

常用 的 第 二 抗体 是 嵩 羊 (山羊 ) 抗 鼠 或 家 免 抗 鼠 免 疫 球 蛋 自 : 
用 来 标 和 7 全 
用 邻 茶 二 朋 。 

(1) 测定 最 佳 试 验 条 件 的 ELISA 

这 是 在 正式 筛选 前 ， 用 免疫 药 动 效 稚 清和 免疫 原 所 做 的 预备 
试验 。 用 以 测定 抗原 包 证 的 最 佳 条 和 件 、 血 清 效 价 ” 并 检验 阴性 对 
照 系 统 。 

对 可 深 性 抗原 用 如 下 方法 : 

外 用 抗原 免疫 大 鼠 或 小 鼠 ， 衣 强 注射 后 全 怀 天 采 送 (不 要 让 这 
动物 )0,1 一 0.2ml， 离 心 取 壬 清 待 用 。 用 合唱 科 这 芝 乏 光 芝 代 轴 
物 的 血清 作 阴 性 对 照 。 

@ 用 磷酸 缓冲 液 (PBS ) 制 备 2 . 4m1 浓 度 约 为 50ugjml 的 抗原 洲 
液 。 用 倍 量 稀 赤 法 做 6 个 稀释 度 ， 每 管 1.2mls 最 后 工 管 的 浓度 为 
第 工 管 的 1/62， 

四 在 96 孔 医 量 滴定 板 第 工 排 的 12 个 孔 中 ， 分 别 加 入 100 岂 最 浓 
的 抗原 ， 第 2 排 各 孔 中 加 入 100 由 稀释 2 倍 的 抗原 ; : 依 此 类 推 ; 直 
至 第 7 排 12 孔 中 加 匈 释 64 倍 的 抗原 。 第 8 排 中 加 入 PBS。4 CD 过 
夜 。 
四 用 含 0.5mg/ml 牛 血清 白 蛋白 (ESA) 的 PES,” 配制 1/100 称 
释 度 的 鼠 血 清 1.6ml， 用 倍 量 稀释 法 再 作 10 个 稀释 度 寺 最 后 1 管 
应 为 1 :10000， 每 管 0.8ml。 用 5 同 币 征 和 本 全 全 于 全 和 本 于 潮 
清 0.8ml。 ， 

加 有 思 去 湾 定 板 中 的 抗原 液 ， 用 包 补 组 训 让 洗 概 一 次 用 去 和 
中 液体 ，， 控 干 。 


94。 


轿 每 孔 加 入 100 岂 含 BSA(10mg/ml) 或 牛 血 清 (1%) 的 包 被 组 
冲 液 ， 室 温 下 温 育 1 小 时 。 用 含 0.05% 吐 温 20 的 PBS 洗 3 次 ， 甩 
呈 

@@ 在 从 左 数 第 1 行 的 各 孔 中 加 入 100 刀 稀释 100 倍 药 抗 血清; 
第 2 行 中 加 稀释 200 倍 的 ,以 此 类 推 直 至 第 11 行 。 第 12 行 加 黎 释 100 
倍 揭 阴性 血清 ,室温 下 温 育 1 一 2 小 时 。 用 PBS 洗 涤 液 〈 含 吐 温 20) 
尝 3. 次 ， 甩 干 。 

加 每 孔 加 入 100 同 稀释 200 一 500 倍 的 辣 根 过 氧化 物 酶 抗 小 也 
…( 或 大 忌 九 免 疼 球 蛋 自 结合 物 〈 可 用 PBS+ 0.05% 吐 温 20 作 稀释 
液 )。 室 温 下 温 育 .2 小 时 。 用 PBS 洗 涤 液 洗 3 次 ， 甩 于 

四 加 入 -100 以 新 鲜 刘 制 的 0.04msg/ml 邻 茶 二 胺 溶液 ( 洲 于 
0.05M 柠檬 酸 钠 一 0.15M 磷酸 钠 一 0.01% 吾 :CO, 液 中 :pH6)。 室 
温 下 温 育 工 小 时 。 然 后 加 504 4 N 硫酸 以 终止 反应 。 用 酶 标 分 光 
光度 计 测 读 492nm 波 长 下 的 光 吸 收 率 。 如 用 肉 良 观察 ， 作 为 对 照 
的 底 排 (未 加 抗原 ) 各 孔 和 右 近 第 一 行 ( 加 阴性 租 清 ) 各 筷 应 近乎 无 
色 。 颜 色 最 深 的 孔 应 在 左上 角 ， 沿 帮 下 角 方 向 颜色 渐 弱 。 与 对 照 
孔 相 比 ; 天 始 出 现 颜 色 的 血清 的 最 高 稳 释 度 ， 即 为 迎 清 菌 效 价 。 与 
此 相对 应 的 最 低 抗 原 浓 上 度 可 供 筛 选 时 选用 。 

对 细胞 抗原 可 挝 下 述 步 骤 进 行 : 

中 同 前 法 全 。 

四 用 PBS 配 制 10ugs/ml 浓 度 的 乡 育 直 - 赖 氨 酸 。 每 孔 加 100ul， 
室温 下 作用 .2 小 时 。 岂 去 孔 中 流体， 用 PBS 洗 两 次 。 

四 配制 2. 4ml 密 度 为 5x 10* 细 胞 /ml 的 抗原 液 . 镜 检 应 无 细 胞 
碎 块 。 用 小 塑料 离心 管 作 6 个 倍 量 稀释 ， 最 后 一 管 的 细胞 密度 为 
7.5X10“ 细 胞 /ml。 

外 第 1 排 各 孔 中 加 第 1 管 ( 未 经 稀释 的 ?细胞 惹 浮 液 ， 每 孔 加 
100U; 第 2 排 加 第 2 管 ( 稀 释 2 售 ) 抗 原液 ， 依次 类 推 ! 第 8 排 的 每 孔 
加 1004PBS 作 对 照 。 室 温 下 项 置 45 分 钟 。 

@ 用 PBS 洗 板 。 在 0.25% 戊 二 醛 中 浸 5 分 钟 。 用 PBS 洗 3 次 ， 
用 干 。 加 100ul 含 BSA(10mg/ml) 或 牛 血 清 (1%) 的 PBS (加 有 


。495 。 


0.02% 释 氮 钠 和 100mM 甘 氛 酸 )，4 他 过夜。 

@ 同 前 法 由。 

@ 用 加 有 0.05% 吐 温 20 的 PBS 洗 3 次 ， 甩 干 。 

@ 同 前 法 @。 

曙 同 前 法 四 ， 

@ 同 前 法 @。 

(2) 筛选 用 ELISA 

也 于 96 扎 微量 注定 板 的 每 个 蕊 牛 加 入 100 岂 适当 浓度 的 抗原 
溶液 (可 用 0.02M PBS+0.15M NaCl，pH7.2 配 制 )， 4 过夜 或 
37C 1 一 2 小 时 。 包 被 过 的 板 如 暂时 不 用 ,可 在 4 下 但 请 各 
0.1% NaNs)。 

外 轻 思 消 定 板 ， 控 干 孔 中 液体 ， 用 包 被 缓冲 液 洗 工 次 。 

司 孔 中 加 入 包 被 缓冲 液 配制 的 100U1BSA (10mg/ml) ,室温 下 
0.5 一 1 小 时 。 

外 用 洗涤 液 (PBS + 0.05% 吐 温 20) 洗 三 次 。 

加 孔 中 加 50 一 100 岂 融合 细胞 的 培养 液 上 清 ，377 或 室温 下 
1 一 2 小 时 。 同 时 设 对 照 , 阳 性 对 黑 最 好 加 适当 稀释 前 小 鼠 ( 或 大 鼠 ) 
特异 性 抗 直 浅 ， 阴 性 对 照 则 用 PBS、 无 关 抗 体 或 培养 液 及 未 免疫 
小 忌 的 和 皇 清 。 

@ 同 外 。 

@ 孔 中 加 100 岂 用 洗涤 滚 稀 释 200 倍 到 500 倍 (最 好 事先 测 出 适 
当 稀 释 度 ) 的 酶 款 抗 小 鼠 ( 或 大 鼠 )I 溶 液 。3771 小 时 。 

@ 辣 直 。 

田 每 孔 加 入 10041 新 配 的 底 物 溶液 ，37C 下 温 育 0.5 一 1 小 时 。 
加 入 50 以 4NHiSO9， 测 量 Aisyan。 

细胞 性 抗原 的 测定 程序 如 下 ， 

四 每 孔 加 100 忆 允 训 工 - 赖 氮 酸 (100g/ml) ,室温 下 预 包 被 2 小 时 
后 ， 用 PBS 洗 两 次 。 

四 蕊 中 加 入 100M4 适 当 密 度 的 细胞 悬 液 ， 室 温 下 静 置 1 一 蕊 5 小 


@ .496 。 


2 4 肖 


2 


由 ”本 新 细 胸 可 在 4 已 下 离心 5 分 名 (200 一 008。 
上 全 有 思 去 孔 中 流体。 将 滴定 板 浸 入 用 PBS 新 配制 的 0.25%% 成 二 
”” 苹 让 5 一 7 分 钟 ， 注 意 操 作 过 程 中 不 要 产生 气泡 。 

由 甩 去 板 上 液体 ,用 PBS 洗 三 次 .加 PBs 配 制 的 BSA(10mg/ml) 
+0.02% NaNs+ 100mM 甘 氨 酸 ，4 尼 过 夜 。 

@ 以 下 步骤 与 可 溶性 抗原 检测 法 的 @@ 一 四 相同 。 
“二 (3) 小 点 免疫 结合 试验 

选择 最 佳 试验 条 件 时 的 方案 ， 

巴 用 抗原 免疫 大 鼠 或 小 扇 。 加 强 注 射 4 一 7 天 后 采血 ， 分 离 出 
0.1 一 0.2ml 的 阳性 血清 和 未 免疫 小 鼠 的 正常 (阴性 ) 血 清 。 

思 在 一 张 硝酸 纤维 素 惕 上 划 出 9mm 见 方 的 6 x 6 小 格 。 用 蒸 馅 
水 洗 膜 ， 室 温 下 及 干 (不 少 于 1 小 时 ) 。 按 下 述 浓度 制备 抗原 倍 量 稀 
释 液 :1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml;0.125 mg/ml 和 0.063mg/ 
ml。 最 后 一 行 不 加 抗原 作对 照 。 

图 在 第 一 行 每 一 小 方 格 的 中 心 加 1 岂 1mg/ml 的 抗原 液 成 一 小 
点 所 第 三 行 加 号 5mg/iml 的 抗原 ; 依次 类 推 。 多 数 抗原 可 在 干 膜 上 
保存 相当 长 时 间 。 

四 将 膜 置 于 96 孔 板 盖 上 ,加 10mg/mal BSA 或 1% 和 牛 血 清和 邬 育 15 
分 钟 。 晾 干 。 

@@ 制 备 1/50、1V100、1/200、1/500、1/1000 的 抗 血 清 溶 液 
_ 和 1/50 的 阴性 扎 清 。 在 硝酸 纯 维 素 膜 第 一 排 的 每 个 抗原 小 点 上 加 
1 一 2 岂 1/50 抗 血清 ; 第 二 排 加 1/100 浓 度 ; 余 类 推 。 第 六 排 加 阴性 
血清 。 九 育 3 一 5 分 钟 。 

@ 用 PBS 洗 膜 五 次 。 

@ 用 含 0.5msg/inl BSA 的 PBS 将 辣 根 过 氧化 物 酶 标 抗 小 鼠 ( 或 
大 鼠 )IgG 稀 释 100 倍 ， 与 膜 一 起 孵育 。 

@ 重 复 @。 

@ 加 显 色 液 ， 显 色 液 的 配 法 为 ， 取 1 份 4- 毛 -1- 蒙 酚 贮 存 液 
《3mg/ml， 深 于 甲醇 中 ， 暗 处 保存 ) ,与 5 倍 体积 的 PBS (加 0.01 色 
于 :95 混合 而 成 -5 一 15 分 钟 后 ,结合 了 抗体 的 复合 物 将 显示 蓝 色 


6 497。 


| 章 
国人 
和 A 
上 
中 
人 


像 ELISA 一 样 ， 膜 的 左上 方 色 最 深 ， 右 下 角 无 色 。 

用 土 述 方法 测定 抗 血清 。 既 灵敏 又 简便 , 亦 适 于 大 量 筛 选 。' 
用 它 来 测定 单 克隆 抗体 杂交 瘤 上 清 时 ， 效 果 下 如 血清 。 筛 选 时 如 
果 用 12 抗 原 而 浓度 偏 低 时 ， 可 加 几 次 稀释 液 ,每 次 加 后 都 让 膜 干 
燥 一 本 


. 液 相 系统 

na 波 相 系统 是 放射 免 缀 测定， 也 即 前 述 用 
放射 性 标记 第 二 抗体 而 进行 前 放 射 结合 试验 寺 其 优点 是 简单 、 灵 
敏 、 准 确 ,， 本 底 任 ， 瑞 点 则 是 需要 大 量 同 位 素 标记 抗原 。 

(1) 可溶性 抗原 的 放射 免疫 测定 (RIA) 

四 回 96 孔 软 质 型 聚 氯 乙烯 微量 滴定 板 蓝 各 和 陛 中 加 入 50 凡 抗原 
《10-504g/jiml， 用 pH7.4 的 PBS 溶 解 ) ,室温 或 87C2 小 时 。 去 二 清 
(本 重复 使 用 数 次 )。 

四 每 和 孔 加 100U PBS-0.5% BSA, 室 温 下 30 分 钟 。 然后 用 PBS 
-0.1% BSA 洗 三 次 , : 

四 向 孔 中 加 入 50 岂 培养 上 清 液 ,室温 或 37 有 铸 育 2 小 时 5 去 上 
清 。 ， 

四 用 PBS-0.1% BSA 洗 三 次 。 

@ 加 10000cpm :5I 标 记 药 第 二 -抗体 (1ouciyug) 或 as 标记 
的 蛋白 A(404Ci/ug) ,室温 或 37D 2 小时。 将 孔 中 的 放射 性 溶液 吸 
出 。 


下 
8 
名 


,6 


@ 剪 下 各 孔 ， 用 7 计数 器 计数 。 抗 原 纯 准时 ， 典型 的 阳 际 孔 
可 达 3,000cpm， 而 胃 性 孔 应 低 于 100cpm。 即 使 抗原 砂 纯 本 底 也 
不 会 显著 增高 ， 但 阳性 孔 数值 将 降低 。 各 二 宙 作 和 
情况 下 ，2 一 3 倍 于 本 : 底 的 孔 可 视 为 阳性 我 ; 
(2) 适用 于 细胞 表面 抗原 和 病毒 的 RIA 和 
四 每 孔 加 100 多 育 - 赖 氨 酸 (1048/ml) ,室温 下 了 预 包 六 本 滞 
时 。 用 PBS 洗 工 次 。 半 
四 加 入 100 岂 细胞 悬 液 (用 PBS 一 0.1% BSA, pH7 .4 配 成 ] 一 洗 


“498。 


信 ” 潮 
加 重复 @。 和 
痢 


人 用 或 在 本 位 下，400g 离 心 5 分 钟 。 轻 轻 
弃 去 上 清 。 

四 将 滴定 板 尖 入 新 配制 的 0.25% 友 二 醚 一 PBS 波 中 5 分 钟 
国 用 PBS 一 0.1%-BSA 洗 三 次 。 

@@ 每 孔 加 50 岂 培养 液 上 清 ，4 孵 育 1 小 时 。 

@ 同 @@。:. 

加 各 孔 加 50 岂 含 10000cpm 的 :TI 标 记 的 第 二 抗体 或 蛋 宾 .A， 


和 TI 小 时 ; 吸 去 未 被 结合 的 放射 性 抗体 。 


1 @ 重 复 介 ， 
”图 剪 下 各 孔 ， 用 r 计 数 器 计数 。 阴 性 孔 一 般 低 于 200cpm， 阴 
性 孔 多 为 500 一 3000cpi。 

3. 细 胞 试验 

与 细胞 表面 抗原 结合 的 抗体 ， 通 常 可 以 通过 固 相 试验 选择 。 
但 对 某 些 单 克 隆 抗体 ， 我 们 不 仅 需 要 测定 它 全 生生 汪 全 
而 昌 需 检测 其 有 无 某 些 特 殊 功 能 。 例 如 测定 抗体 有 无 细胞 毒 闪 ， 
对 不 同 血型 的 细胞 有 无 特异 性 等 ， 这 本 需 要 通过 顷 几 试验 波 行 
由 于 这 类 筛选 系统 一 般 不 大 敏感 ， 因 此 通常 先 用 固 相 试验 将 感 兴 
趣 的 抗体 粗 分 出 来 ， 再 用 少量 抗体 作 细胞 试验 。 

《1) 玫瑰 花 试验 

能 与 红细胞 偶 联 的 抗原 ， 可 选用 此 法 。 

@ :制备 绵羊 红细胞 (SREC), 床 盐水 (0:9%NaCl) 悬浮 后 ， 在 
500g8 下 离心 洗涤 3 次 。 去 上 清 。 

@ 抗 原 (lmgy/ml; 溶 于 盐水 中 ) 与 SRBC 沉 淀 以 等 体积 混合 ( 抗 
原 预 先 透 析 过 ,不 含 磷酸 根 离子 )。 

四 用 乙酸 缓冲 液 (0.9%NaCcl，0.01M 乙 酸 钠 ，pH5.5) 新 鲜 
配制 浓度 为 mg/mli 的 CTCl: "6H5iO 溶液 ， 取 与 抗原 等 体积 的 量 加 
入 上 述 混 合 物 中 。 室 温 下 轻 摇 5 分 钟 。 

四 加 入 大 量 冷 盐水 中 止 反 应 。400g 离 心 10 分 钟 , 将 SRBC 沉 洗 
洗 两 次。 与 抗原 偶合 的 SREC 在 含 3% 胎 牛 血清 的 盐水 中 ， 于 4 
下 可 贮存 数 周 。 


@ 取 杂 交 净 细胞， 悬浮 于 玫瑰 花 培养 基 (Eagley s 培 养 基 ， 补 
加 5% 胎 牛 血清 、0.01M HEPES，pH7.3) 中 ， 使 细胞 波 度 欧 为 
5x10 /inl。 在 96 孔 U 形 板 的 也 中 加 入 50 细 胞 巧 液 。 

@ 用 玫瑰 花 培 养 基 稀 赤 抗 原 包 被 过 的 SRBC, 使 每 ml 含 4X 10” 
绍 胞 ， 每 孔 中 加 50 咎 。 

@ 〇 400g 离 心 15 分 钟 。30 分 钟 后 将 沉 深 细胞 制 成 巧 浮 液 ， 转 移 
到 平底 孔 中 。 

@@ 用 倒 轩 显微镜 观测 形成 玫瑰 花 环 的 杂交 瘤 细胞 数 ) 周围 有 
5 个 以 上 SRBC 的 属于 阳性 。 阳 性 细胞 超过 10%% 的 为 阴 胆 丧 养 上 
清 

(2) 细胞 毒性 试验 

可 检测 固定 补体 多 抗 细 玖 考 面 抗 志 钓 抗体 。 

四 将 带 有 靶 抗 原 的 105 一 10 细 胞 与 10 一 100 耻 培养 上 清 混 合 ， 
置 于 4 下 30 一 60 分 钟 使 与 抗体 结合 。 然 后 洗 1 2 次 。 

四 加 入 适当 稀释 (本 底 低 而 活性 高 ) 移 豚鼠 秋 清 或 幼 免 迄 清 。 
37C 下 孵育 30 分 钟 使 细胞 分 解 。 含 补体 欧 血 清 需 快速 操作 ， 涉 量 
分 装 的 低温 冻 存 。 一 旦 化 冻 应 立即 使 用 ， 祭 者 废弃 ， 避免 及 复 江 
融 招致 撩 活 。 一 般 病 释 比 为 1:10 一 1:20。 

包 用 PS 配制 染 液 ， 0.2% 台 阶 蓝 。 从 可 细胞 活 态 时 ， 在 裁 片 


3 


和 


人 PS 人 


上 沉 一 漓 细 胞 悬 液 ， 再 加 一 滴 染 液 ， 盖 上 盖 玻 片 ， 在 显微镜 下 观 


察 。 也 可 四 咱 院 栓 和 省 化 乙 锭 ( 百 万 分 之 二 的 赔 存 液 ) 桨 名 。 加 滤 
光 片 用 荧光 显微镜 观察 时 ， 活 细胞 染 成 鲜 绿 色 ， 而 死 细胞 呈 鲜 栖 
色 。 咱 喧 栖 或 省 化 乙 锭 妆 色 法 的 准确 性 较 高 ， ro 
致癌 剂 ， 操 作 时 需 小 心 。 

补体 的 最 适 稀释 度 因 提 供 丰 清 的 动物 个 休 而 蛋 ， 应 事先 测定 
5 一 10%% 的 细胞 分 解 本 底 是 不 可 避免 的 。 

(3) 直接 血 凝 集 试验 与 间接 丘 凝 集 试验 : 

直接 和 所 凝 集 试验 的 一 般 操作 程序 是 :用 含 1%BSA 的 PBS 制 备 
1%(v/w 红 细胞 悬浮 液 ， 取 25 所 加 入 孔 内 ， 随 后 再 加 入 50 切 单 克 
隆 抗 体 ， 室 温 下 孵育 1 一 2 小 时 后 观察 凝集 情况 。 间 接 和 撕 凝 集 试验 


00 


和 锅 将 细胞 洗 桨 后 ， 悬 浮 于 50u1 抗 小 鼠 IgG 抗体 中 ， 孵 育 1 小 时 后 观 
， 宕 。 血 凝集 试验 大 多 用 于 红细胞 民 抗 原 。 

4. 免 疫 细胞 化 学 试验 

这 种 方法 的 优点 是 可 以 检测 针对 亚 细 胞 结构 或 细胞 亚 群 的 搞 

体 。- 

本 (1) 用 50kg/ml 多 聚 工 - 赖 氨 酸 预 处 理 多 孔 载 玻 片 ， 然 后 在 已 
内 加 入 靶 细 胞 ， 温 育 30 分 钟 。 也 可 以 让 细胞 在 多 和 孔 载 片 上 生长 过 
夜 以 固 定 细 胞 。 

(2) 加 一 滴 1%BSA 以 封 阻 多 育 赖 氨 酸 的 过 剩 结合 力 。 

63) 载 片 在 甲醇 或 乙醇 中 固定 15 分 钟 。 随 即将 固定 的 载 片 移 
至 PBS+1% BSA 中 彻底 清洗 ， 换 液 3 次 ， 历 时 1 小 时 。 

(4) 将 载 片 水 平 置 于 潮湿 的 塑料 盒 内 ， 加 入 一 滴 杂 交 瘤 上 清 
液 ， 饪 育 0 .5 一 1 小 时 。 用 PBS 冲 去 过 剩 的 抗体 。 

(5)》 用 PBS+1%BSA 洗 三 次 。 

(6) 加 一 滴 荧 光标 记 或 过 氧化 物 酶 标记 的 第 二 抗体 ， 在 潮湿 
的 盒 内 温 育 30 分 钟 。 

MY) 间 人 7》。 

(68)》 如 (6) 焙 的 是 荧光 标记 二 抗 ， 则 将 载 片 置 于 显微镜 下 观 
察 ， 如 用 酶 标 二 抗 ， 则 在 0.05% 的 3,3“ 一 二 氨基 联 苯 腕 〈 溶 于 含 ， 
0.03 邓 百 ,0, 的 PBS 中 ) 溶 液 中 温 育 载 片 30 分 钟 。PBS 洗 后 ,显微镜 
下 观察 。 


三 ) 单 克隆 抗体 的 鉴定 


1 .抗体 类 和 亚 类 的 测定 

有 多 种 测定 抗体 类 型 的 方法 ,如 ELISA、.SDS 和 等 电 聚 焦 聚 丙 
和 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 等 5 这 些 方法 各 具 特 点 ,但 共同 缺点 是 不 便 测 定 亚 
类 。 测 征 Ig 类 与 亚 类 的 最 简单 方法 是 琼脂 扩散 试验 ， 其 操作 步 又 


如 下 : 


四 
1 本 

纲 
， 
让 


(1) 培养 上 清 液 的 浓缩 ， 在 0.5ml 上 清 液 中 缓慢 加 入 等 体积 
的 饱和 (CNH4): So， 等 第 一 滴 散 开 之 后 再 加 第 二 滴 。3 小 时 后 在 


这 了 位 下 


4 人 、10000g8 下 离心 10 分 钟 - 用 40% (NH4)5SO, 洗 沉淀 2 一 3 次 。 
最 后 用 5041PBS 将 沉淀 溶解 ,再 对 PBS 透 析 过 夜 以 去 除 
(NH,),SO， 

(2) 制备 琼脂 扩散 板 ， 用 0.01M pH7.4 的 PBS 制 备 1% 的 琼脂 
溶液 (沸水 浴 加 热 使 琼脂 完全 溶解 ) ,吸取 约 3ml] 溶 液 ， 浇 在 水 平 放 
置 的 盖 玻 片上 。 琼 脂 凝 固 后 ， 用 直径 2 一 3mm 的 模具 打 扎 ,使 中 央 


小 孔 与 周围 环 状 排列 的 6 个 小 孔 间 的 距离 为 4 一 tmm， 用 针头 将 孔 


中 了 玉 脂 去 掉 。 

(3) 加 样 ， 在 中 央 小 孔 内 加 入 10 一 20U1 浓缩 的 上 清 或 适当 稀 
释 的 腹水 或 血清 ， 周 围 各 孔 中 加 入 10 一 20U4 标准 试剂 : 家 免 抗 小 
鼠 IgG1; 、IgG,。、IsG,、IgGs 和 IgM 等 抗体 ， 

(4) 将 盖 片 置 子 底部 销 有 湿 纱布 或 棉花 的 塑料 盒 或 平 由 内 ， 
室温 下 放置 12 一 24 小 时 。 观 察 并 记录 中 央 孔 与 外 周 孔 间 出 现 沉 族 
线 的 位 置 。 用 0.25% 考 马 氏 蓝 ( 溶 于 甲醇 :乙酸 : 共 馅 水 为 5:1:5 的 
人 

， 对 抗体 所 针对 的 抗原 决定 基 进行 行 分 析 

分 新 太 动 了 友和 趣 扩 二 大 未 关 关 革 村 二 生生 人 
从 而 能 节省 很 多 组 织 培养 时 间 。Westefn 印 迹 法 是 有 特殊 价值 的 一 
种 分 析 技 术 。 一 般 步 又 如 下 : 

(1) 用 SDS- 或 尿素 -PAGE( 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ) 分 离 纯化 
抗原 。 留 下 一 部 分 胶 板 待 转 移 后 染色 。 

(2) 其 余部 分 胶 板 铺 在 一 张 同 样 大 小 的 湿 硝酸 纤维 素 膜 〈 孔 
径 0.45Um) 上 ， 操 作 时 不 要 在 凝 胶 面 与 膜 之 间 形 成 气泡 。- 胶 面 与 


膜 的 外 侧面 各 垫 一 张 湿 的 Whatmam 3mm 滤纸 。 滤 纸 外 面 再 加 一 


块 约 0.5cm 厚 的 泡沫 塑料 垫 片 ， 然 后 用 两 块 多 孔 的 有 机 玻璃 夹 住 ， 
有 机 玻璃 上 的 孔 ， 便 于 电解 质 进 入 夹 在 中 间 的 凝 胶 内 ， 并 使 电流 
容易 通过 。 用 橡皮 筋 将 之 捆 紧 ， 垂 直播 入 电泳 槽 中 间 。 电 泳 模 的 
两 极 由 不 锈 钢 制 成 。 如 果 转 移 的 是 SDS-PAGE 胶 板 ， 由 于 胶 上 的 
蛋白 质 带 负电 荷 ， 则 需 将 硝酸 纤维 素 膜 置 于 靠近 阳极 一 边 : 如 采 
转移 的 是 尿素 -PAGE 板 ， 就 使 硝酸 纤维 素 膜 面向 阴极 。 


。 502。 


人 和 
站 
机 
人 
YY 
二 


4 


4 全 CO 


(3) SDS 胶 所 用 的 转移 缓冲 液 为 25mM Tris.HC1,192mM 甘 
氨 酸 (pH8.3)、20%(v/v) 甲 醇和 0.002%SDS。 尿素 胶 的 缓冲 液 为 
0.7%% 乙 酸 。 电 泳 的 电压 梯度 以 6V/cm/ 小 时 为 宜 ， 也 可 再 高 些 ， 
但 在 电压 高 、 转 移 时 间 长 时 ， 最 好 有 致 冷 条 件 以 减少 扩散 。 转 移 
所 需 时 间 取 决 于 胶 的 浓度 和 蛋白 分 子 的 大 小 ， 分 子 量 在 100000 以 
上 的 蛋白 质 印迹 特别 困难 ,除非 胶 的 浓度 很 低 ， 或 者 用 5%% 一 20% 
的 梯度 PAGE。 一 般 分 子 量 为 50000 的 蛋白 在 10% 的 胶 中 约 需 转 
瑰 2 小 时 。 

(4) 电泳 结束 后 ， 取 下 硝酸 纤维 素 膜 ， 前 下 一 小 条 ,用 0.1% 
氨基 黑 ( 溶 于 10%Y/v 乙 酸 -45%v/v 甲 醇 ) 染色 工分 钟 。 继 而 用 
70%V/v 甲 醇 、4%V/v 乙 酸 脱色 ， 以 观察 转移 的 多 肽 区 带 。 其 余 
的 硝酸 纤维 素 膜 浸 于 0.01M PBS-0.3% 吐 温 20 中 ( 当 分 析 的 是 血 
清 抗 体 时 ) ,或 者 浸 在 50mM Tris HC1，150mM NaCl，3% BSA， 
5% 成 年 绵羊 .山羊 或 牛 的 血清 和 0.05%NaNs(pH7.4) (抗体 来 源 
为 杂交 瘤 上 清 时 ) 中 温 育 1 一 ?2 小时， 以 饱和 其 余 的 结合 部 位 。 

(5) 对 步骤 (1) 中 留 下 的 没有 印迹 处 理 过 的 那 部 分 胶 板 ， 以 及 
作 过 印迹 转移 的 凝 胶 ， 用 0.25% 考 马 斯 蓝 ( 用 甲醇 :乙酸 :水 为 5:1 
:5 的 溶剂 配制 ) 染 液 桨 色 。 

(6) 另 取 一 条 未 染色 的 硝酸 纤维 素 膜 单独 处 理 作为 对 照 ， 处 
理 方 法 除 温 育 时 不 加 单 抗 而 加 培养 基 外 ， 其 余 步 又 与 下 述 膜 的 处 
理 步 骤 一 样 。 将 步骤 (4) 中 作 过 封闭 处 理 的 膜 与 单 克 隆 抗 体 一 起 温 
育 4 一 16 小 时 ， 绥 冲 液 为 50mM Tris HCI、150mMNaCl 3%BSA、 


:0.05% NaN。(DH7 .4) 。 如 单 抗 样品 为 杂交 瘤 上 清 液 ， 则 需 事先 作 


:浓缩 处 理 以 提高 效 价 ， 腹 水 或 抗 血 清 可 适当 稀释 。 
(7) 用 50mM Tris HCLI、150mMNaCl(pH7 .4) 摇 浴 洗 活 硝 酿 


“纤维 素 膜 ， 换 液 三 次 。 


(8) 将 膜 放 入 过 氧化 物 酶 标记 的 编 羊 或 家 免 抗 小 鼠 第 二 抗体 
稀释 液 ( 一 般 用 1:100 稀 释 度 或 经 测定 最 适 于 ELISA 的 浓度 ， 黎 释 


芝 为 0H7 .4 的 0.01M PBS) ,室温 下 浸泡 1 小 时 。 


《9) 同 (7)。 


。 350 了 37。 


A 


(10) 将 噶 于 黑暗 中 放 入 底 物 溶液 中 旷 育 约 10 分 钟 ， 深 液 应 在 


临 用 前 新 鲜 配 制 ， 方 法 是 将 溶 于 甲醇 中 的 3mg/ml 4- 氧 -1- - 某 醒 驻 
存 液 与 PBS 按 1:5 混 合 ， 再 加 上 Hi0,(0.01%)。 

(GD 硝酸 纤维 未 膜 上 与 抗原 对 应 的 蛋白 带 应 显示 温 蓝 色 。 显 
色 后 用 蒸 馅 水 洗 膜 以 终止 反应 。 

(12) 给 显 色 后 的 膜 照相 (不 要 晚 于 1 周 , 否 则 会 逐渐 褪色 ) ,并 
Sand 子 对 照 ， 以 确定 与 单 克 隆 抗体 特异 

合 的 区 带 。 

也 有 用 同位 素 标记 的 第 二 抗体 代替 酶 标 三 抗 的 ,其 结果 更 佳 ， 
但 同时 亦 伴 有 设备 复杂 、 延 时 、 费 事 等 矶 点 。 


(四 ) 单 克隆 抗体 的 应 胃 


单 克隆 抗体 一 问世 ， 便 显示 出 巨大 潜力 。 十 风 年 来 这 一 技术 
已 由 免疫 学 范畴 迅速 渗透 到 生命 科学 的 各 个 领域 ， 其 应 用 范围 几 
乎 遍及 生物 基础 科学 、 医 药学 和 农学 的 各 个 分 支 学 科 ， 如 遗传 学 、 
分 子 生 物 学 、 病 毒 学 、 细 菌 学 、 寄 生 虫 学 、 肿 瘤 学 、 药 物 学 、 血 
清 学 、 临 床 诊断 与 治疗 学 、 普 医学 、 农 业 植物 病理 学 等 。 目 前 ， 
全 世界 已 有 上 千 个 实验 室 从事 杂 交 瘤 和 单 克隆 抗体 技术 的 研究 ， 
几乎 每 个 月 都 有 成 百 篇 文章 发 表 。 专 门生 产 和 研究 杂交 瘤 单 克隆 
抗体 的 公司 也 在 不 断 增加 ， 随 时 都 有 新 的 研究 进展 出 现 。 杂 交 瘤 
数据 库 的 内 容 越 来 越 多 ， 因 此 用 短 短 的 篇 幅 全 面 论述 它 的 现状 、 
发 展 与 应 用 前 景 是 比较 困难 的 ， 这 里 只 能 简略 地 作 些 一 般 介绍 。 

单 抗 在 人 类 疾病 诊断 方面 所 取得 的 进展 十 分 引 人 注 目 。 现 在 
已 制备 出 大 量 的 针对 各 种 病毒 的 单 克 隆 抗 体 ， 如 流感 病毒 .肝炎 、 
背 通 灰质 炎 、 呼 肠 病毒 、 爱 小 斯 坦 一 巴尔 病毒 (EB 病 毒 ) 等 的 单 
抗 。 这 些 单 抗 具有 很 高 的 特异 性 ， 可 以 准确 地 区 别 鉴定 抗原 决定 | 
和 十 分 相近 的 病毒 株 系 ， 如 单纯 郊 疹 病毒 I 型 与 II 型 。 ,对 肿瘤 的 诊 、 
断 是 现时 最 感 兴趣 的 应 用 领域 ， 尤 其 是 仅 与 肿瘤 相关 抗原 反应 的 
单 抗 。 已 制备 出 抗 各 种 淋巴 细胞 表面 抗原 和 上 上 皮 细 胞 的 单 抗 。 针 


对 人 胃 肠 癌 、 绒 有 蝶 癌 、 家 颈 癌 、 卵 巢 上 皮 腺 瘤 、 各 种 类 型 肺癌 三 


0 人 多 。 


和 遇 ， 
- 和 二 
才 


h 
忆 


aa 


”以 及 畴 胎 瘤 的 单 抗 的 专利 也 已 陆续 形成 。 具 有 高 度 专 一 性 与 亲 和 
、 力 的 单 抗 加 上 同位 素 标记 ， 可 以 对 肿瘤 患者 作 体内 定位 诊断 ， 通 
， 过 闪烁 扫描 仪 描 出 肿瘤 图 象 ， 这 不 仅 可 用 来 早期 检测 原 发 肿瘤 ， 
而 且 可 根据 特异 性 抗体 集中 于 肿瘤 组 织 的 量 与 存 积 时 间 ， 研 究 药 
物 的 半衰期 ， 监 测 病情 和 检验 治疗 的 效果 ， 制 订 出 适宜 的 治疗 措 
施 。 这 些 单 抗 同 样 可 检测 肿瘤 患者 血清 中 的 肿瘤 标志 ， 随 着 有 关 
技术 的 发 展 ， 自 然 也 可 以 用 来 研究 有 异常 组 织 成 分 和 血清 成 分 出 
现 的 疾病 ， 如 心血 管 病 、 自 身 免疫 病 等 。 对 寄生 虫 病 如 半 疾 、 利 
什 曼 原虫 病 、 血 吸虫 病 ， 以 及 某 些 细菌 性 疾病 ， 单 抗 同样 有 巨大 
由 的 开发 潜力 ， 不 仅 可 作出 准确 的 诊断 ， 而 且 可 深入 研究 疾病 的 病 
， 理 机 制 和 病原 体 的 抗原 差异 。 

在 疾病 的 治疗 方面 ， 单 抗 同样 有 广阔 的 应 用 前 景 。 各 种 肿瘤 
的 导向 药物 的 研制 ， 便 与 单 抗 密切 相关 :， 单 抗 本 身 能 与 特异 性 肿 
瘤 组 织 结合 ， 具 有 一 定 的 抗 肿瘤 作用 ， 只 是 作用 有 限 ， 如 果 将 单 
抗 与 抗 肿瘤 药物 如 干扰 素 、 葛 麻 毒 素 、 白 喉 毒素 等 免疫 调节 剂 连 ， 
结 在 一 起 ， 抗 体 就 可 以 把 抗 肿瘤 药物 定向 转移 到 肿瘤 组 织 中 杀伤 
癌 细 胞 ,而 周围 的 正常 细胞 则 不 受 影响 。 将 单 抗 与 组 织 血 纤维 蛋白 
溶 酶 原 活化 剂 或 尿 激酶 连结 在 一 起 ， 研 制 出 可 防止 体内 形成 血栓 
和 治疗 血栓 病 的 导向 药物 ,这 对 心血 管 患者 无 疑 是 一 福音 。 单 抗 对 
心脏 移植 、 肾 脏 移植 以 及 骨 散 移植 时 受 体 免疫 抑制 的 形成 亦 大 有 
用 武之 地 ， 能 抑制 肾脏 移植 排斥 反应 的 小 鼠 单 抗 已 有 高 品 问世 。 
病毒 病 如 2 型 肝炎 的 疫苗 单 抗 也 已 商业 化 生产 。 不 过 ， 迄 今 为 止 研 
究 治 疗 用 的 单 抗 多 数 来 自 小 鼠 ， 种 间 宿 主 效应 便 成 为 普遍 存在 的 
问题 。 现 在 对 大 一 人 单 抗 以 及 人 一 鼠 媒 合 抗体 的 研究 越 来 越 受 到 
重视 。 由 患者 自身 的 病原 组 织 成 分 作 抗原 ， 经 过 免疫 后 获得 的 抗 
个 体 基因 型 单 抗 有 可 能 给 自身 免疫 病 患 者 的 特异 性 免疫 治疗 带 来 
希望 。 

单 克 隆 抗体 在 兽医 以 及 农作物 病害 防治 方面 的 研究 昌 不 及 医 
学 那样 活跃 ， 但 同样 迈 出 了 探索 的 步伐 。 现 已 研制 出 家 畜 、 家 禽 
和 笃 类 多 种 病原 微生物 的 单 克隆 抗体 ， 如 牛 和 羊 布 氏 宇 菌 、 大 肠 

9505 。 


4 人 


Le 1 从- 促 机 
让 , 调 
- 


杆菌 K99 纤 毛 抗原 、 猪 传染 性 胃 疡 炎 病 毒 。 鸡 球 瑟 、 鱼 流行 性 坏 
死 性 沙门 氏 菌 ， 狂犬 病 病 毒 等 的 单 抗 。 这 些 单 抗 的 高 度 特异 性 
可 以 解决 过 去 用 常规 抗 血清 很 难 解决 的 一 些 问题 ， 如 某 些 疾病 的 
野 毒 感染 ( 强 毒 株 ) 和 人 工 接种 疫苗 (弱毒 株 ) 的 鉴别 诊断 间 题 ， 方 
便 了 流行 病 学 的 调查 。 此 外 ， 在 家 畜 姓 娠 诊断 、 胚 胎 性 别 鉴定 单 
抗 的 研究 方面 也 取得 了 一 定 进展 。 对 某 些 畜 禽 疾 病 如 牛 揭 腹 海 和 
细菌 性 乳房 炎 ， 用 专 一 性 单 抗 治 疗 也 收 到 明显 效果 。* 在 植物 保护 
方面 ， 己 分别 以 植物 病毒 、 昆 虫 病毒 、 植 物 细菌 、 植 物 类 菌 质 体 
和 螺 原 体 等 病原 作为 抗原 ， 开 展 有 关 单 克 败 抗体 鉴别 诊断 试剂 的 
研究 。 在 这 些 病 原 方面 ， 同 样 以 病毒 作出 的 成 绩 最 多 ， 邵 已 研制 
出 抗 马 铃 薯 丫 病毒 、 玉 米 矮 缩 花 叶 病毒 、 厌 麦 黄 帮 病 毒 由 大 豆花 
叶 病 毒 。 香 石竹 饮 纹 环 病毒 等 数 十 种 病毒 的 单 克隆 抗体 们 所 有 这 
些 针 对 植物 病原 体 的 单 克 隆 抗体 不 仅 可 用 于 植 病 的 诊断 二 还 可 用 
于 病害 的 流行 病 学 调查 ， 开 展 生物 防治 ， 以 及 了 解 不同 农 作物 间 
的 各 种 病害 的 相互 关系 。 

在 生物 产业 方面 ， 单 克隆 抗体 尤其 拥有 难以 估量 的 潜力 。 
1980 年 ，Secher 和 了 Burke 用 干扰 素 粗 制品 免疫 水 鼠 ,到 其 有 细 胞 与 
小 鼠 骨 骼 瘤 细 胞 融合 后 得 到 杂交 瘤 ， 将 所 分 泌 的 单 克隆 抗 寺 扰 素 
抗体 制 成 免疫 亲 和 吸 附 柱 ， 纯 化 了 大 的 5 干扰 素 。 这 是 用 单 克隆 搞 
体制 备 生 物 活性 物质 的 一 个 最 早 实 现 的 成 功 例证 。 从 原则 午 讲 ， 
只 要 把 任何 针对 预定 抗原 的 单 克隆 抗体 固定 到 亲 和 柱 上 ， 都 有 可 
能 从 粗 制 混合 物 中 大 量 提纯 所 需 的 抗原 。 

利用 单 克 隆 抗 体 纯化 抗原 和 抗体 并 作 生 物 学 特性 椎 定 前 手 
有 段 ， 在 实验 室 里 亦 大 有 可 为 。 如 利用 单 克隆 抗体 纯化 信使 RNA 以 
研究 基因 结构 ;可 以 纯化 生长 激素 和 尿 激 酶 原 、 胰 岛 素 等 有 重要 
生物 学 功能 的 分 子 , 再 通过 DNA 重 组 技术 使 其 在 其 它 系 统 中 表达 。 
如 今 ， 单 克隆 抗体 和 杂交 瘤 技术 已 被 作为 一 种 重要 的 工具 ,六 泛 量 
应 用 于 酶 、 蛋 白质 及 核酸 、 激 素 等 生物 大 分 子 的 纯 兹 ) 以 及 结构 旺 
与 功能 酌 研 究 方面 。 单 抗 还 可 能 成 为 对 决定 细胞 表 型 的 染色 体 蛋 
自 质 进 行 分 析 的 一 种 理 乡 研究 手段 。 对 没有 抗原 性 或 仅 有 举 抗原 ， 


55069 


性 的 小 分 子 物质 ， 也 可 以 将 其 结合 于 大 分 子 的 蛋白 质 载 体 上 ， 使 
”其 表现 出 抗原 性 ， 然 后 再 用 杂交 瘤 技术 研究 。 单 克隆 抗体 还 广泛 


用 于 各 种 遗传 学 ， 特 别 是 免疫 遗传 学 的 研究 ， 如 免疫 球 蛋 髓 结构 
的 分 析 、 免 疫 球 蛋 白 基 因 的 表达 、 定 位 和 多 样 性 等 。 

总 之 ， 可 以 毫 不 夸张 地 说 ， 单 克隆 抗体 技术 的 应 用 潜力 是 难 
以 估量 的 。 任 何 从 事 生 物 学 、 医 学 和 农学 的 科研 人 员 ， 都 有 可 能 
直接 或 间接 地 因 接 触 或 利用 这 一 技术 而 受益 。 当 然 ， 单 克隆 抗体 
的 研究 仍 存在 不 少 有 待 解 决 的 问题 : 如 生产 与 克隆 过 程 中 工作 量 
过 于 繁重 ;制备 鼠 类 以 外 动物 、 特 别 是 家 兔 和 人 的 单 克 隆 抗 体 时 


。 存在 着 较 大 的 困难 ， 人 制备 针对 免疫 原 性 差 的 抗原 的 单 克 隆 搞 体 人 


闻 
人 


是 一 个 需要 深入 研究 的 课题 。 


( 魏 兔 ) 


as 07。 


第 六 章 
遗传 工程 


第 一 节 ”遗传 工程 的 现状 


从 50 年 代 开 始 ， 科 学 家 陆续 发 现 了 各 种 不 同 的 特异 性 蛋白 质 
酶 。 一 种 称 为 限制 性 内 切 本 ， 它 可 以 识别 DNA 分 子 链 上 的 特定 
′ 区域 ,同时 可 切断 DNA 链 上 的 不 同 部 位 ,这 样 就 可 以 把 个 别 基因 从 


一 条 DNA 链 上 分 离 出 来 ,然后 用 一 种 称 为 连接 酶 的 酶 把 分 离 出 来 时 


的 基因 拼接 到 载体 DNA 链 上 。 这 种 工具 酶 的 制备 成 功 ， 为 生物 技 
未 峰 供 了 有 力 的 武器 .同时 ,进一步 为 特定 基因 前 DNA 片 断 进 入 受 
体 得 到 增殖 和 表达 提供 了 保证 .1972 年 ,由 美国 斯 坦 福 大 学 生化 系 
P. 伯 格 首次 用 类 人 猿 病 毒 SV40 的 DNA 与 噬菌体 P22 的 DNA 连 接 
在 一 起 ， 构 成 了 第 一 批 重组 DNA 分 子 。 这 是 生物 学 史上 第 一 次 将 
，” 两 种 不 同 的 基因 在 体外 拼接 在 一 起 .1973 年 ， 美 国 斯 坦 福 大 学 S 。 


科恩 博士 和 加 州 大 学 旧金山 分 校 的 博 耶 博 士 又 进一步 发 展 了 这 项 。 
技术 。 同 年 ,在 美国 的 一 次 分 子 生 物 学 会 议 上 ,他们 共同 报道 了 体 。 


外 组 建 的 重组 质 粕 在 细菌 中 繁殖 成 功 ， 引 起 学 术 界 的 震动 。 自 此 ， 
DNA 重组 技术 迅速 发 展 。70 年 代 后 期 ， 人 们 在 分 子 生物 学 和 细 


508 ， 


漠 


入 


时 
和 
了 


站 


狗 生 物 学 理论 基础 上 ， 综 合 采用 了 基因 重组 、 杂 交 瘤 、 国 定 化 酶 
和 动 植物 细胞 大 规模 培养 等 技 礁 ， 建 立 起 一 个 现代 生物 工程 的 技 
” 术 体 系 。 

一 般 计 为， 生物 工程 技术 主要 包括 ， 遗传 工程 、 细 胞 工程 、 
| 酶 工程 和 发 酵 工 程 。 在 这 些 技术 体系 中 ， 最 基本 的 核心 体系 是 得 
传 工程 。 也 就 是 说 ， 只 有 通过 对 基因 进行 剪裁 、 拼 接 的 改造 和 加 
上 工 ， 才 能 按时 人 们 预先 设计 的 蓝图 产生 特定 的 生物 性 状 、 物 种 和 
量 制品 。 估 物质 层次 上 来 说 ;生物 工程 可 以 在 四 种 水 平 上 进行 ， 即 
分 子 水 平 S 妆 色 体 水 平 、 细 胞 水 平 、 个 体 水 平 。 遗 传 工程 是 在 分 
是 子 水 平 上 的 生物 工程 。 广 义 的 生物 工程 包括 以 上 四 种 水 平 的 生物 
重工 程 ; 狭义 的 生物 工程 是 指 分 子 水 平 上 的 基因 的 外 科 操 作 ， 即 遗 
传 工程 。 


(一 ) 遗 传 工程 及 其 特点 


遗传 工程 又 称 DNA 重 组 。 就 是 拨 照 人 们 预先 设计 好 的 生物 蓝 
图? :在 分 子 水 平 上 对 基因 进行 外 科 手术 。 大 为 地 将 不 同 生 物 的 遗 
和 装 物 质 ( 营 因 7) 进行 人 工 ' 剪裁 ，“ 组 合 、“ 拼 接 "， 使 遗传 物质 得 
上 岂 于 新 组 合 。 然 后 通过 载体 或 直接 转 入 受 体 ， 进 行 无 性 繁殖 ， 并 
使 新 的 基因 在 受 体 细胞 内 表达 ， 产 生出 人 类 所 需要 的 物质 ， 或 组 
建 出 新 的 生物 类 型 ， 以 达到 定向 改变 生物 性 状 的 目的 。 

L 中 传 工程 的 特点 是 ， 第 一 ,分 子 生 物 学 研究 表明 ,所 有 生物 都 
有 共同 的 遗传 密码 | (目前 发 现 例外 的 情况 是 线粒体 和 一 些 原生 动 
下 物 的 个 别 遗 传 密码 有 不 同 的 翻译 方式 )。 这 就 为 生物 的 基因 在 四 大 
ji 洪 生 物 j 即 大 类 : 动物、 植物 和 微生物 之 问 进行 交流 和 转移 提供 
末了 可 行 性 。 也 就 是 说 ， 人 或 动物 的 基因 可 以 在 微生物 一 一 大 肠 杆 


5 0 入 本 4/ 六 


1 


， 菌 中 得 到 表达 ; 细菌 里 的 基因 可 以 在 人 类 或 植物 细胞 里 得 到 表达 ， 
打破 了 物种 长 期 进化 中 不 同 的 物种 之 间 形 成 的 生物 屏障 ， 使 得 亲 
缘 关 系 很 远 的 物种 之 间 转 移 遗 传 物 质 成 为 可 能 ， 为 后 代 和 遗传 性 更 
| 大 改变 和 创建 新 类 型 开拓 了 广阔 的 前 景 。 第 二 ， 后 代 遗 传 性 的 改 
岂 变 是 完全 处 于 大 们 有 目的 和 有 计划 的 控制 之 下 ， 因 而 可 以 定向 地 
本 。 。509 。 


本 
所 和 二 NE 


-一 郑 ~- 一- 一 一 NE 


改造 生物 的 遗传 特性 ， 获 得 所 需要 的 变异 ， 甚 至 创造 新 的 生 笛 类 
型 ， 这 是 育种 工作 上 的 一 次 重大 突破 。 第 三 ， 由 于 直接 操作 遗 和 传 
物质 ， 较 之 于 第 规 育 种 获 得 新 品种 的 速 彰 快 得 多 ， 而 且 后 代 生 物 1 
性 状 能 快速 稳定 ， 避 免 常 痢 的 有 性 杂交 青 种 中 的 生物 性状 长 期 分 
离 ， 并 学 需 多 代 重 复 选择 。 


(二 ) 让 传 工程 的 施工 程序 


完成 基因 或 DBNA 片 断 的 转移 和 重组 ， 干 分 重要 的 是 要 有 人 向 
体 、 载 体 各 受 体 三 种 生物 体 。 遗 传 工程 的 施工 程序 可 分 为 三 个 步 


4 总 
二 
| 
ww 
9 


:目的 基因 的 获得 

在 DNA 长 链 上 分 离 出 目的 基因 ， 通 过 限制 性 内 切 酶 检 特 完 和 
的 位 点 上 切割 DNA ,使 之 切 成 许多 相当 于 或 大 于 一 个 基因 的 独特 时 
的 DNA 片 断 。 这 样 从 供 体 细胞 的 丰富 的 基因 库 中 ， 分 离 出 不 同 的 是 
基因 。 
1969 年 扩 ， 美 国学 者 夏 皮 罗 等 第 一 次 从 大 肠 杆 菌 中 分 离 出 部 轩 
分 乳酸 操纵 子 DNA 以 来 ， 不 少 科学 家 通过 生物 学 方法 ,物理 兹 学 四 
方法 ， 如 分 子 杂 交 技 术 和 密度 榜 度 超速 离心 等 技术 方法 ， 已 分离 
了 许多 纯化 的 基因 。 但 总 的 说 来 ， 数 旱 还 是 不 多 ，: 江 启 因 是 分 离 是 
困难 。 在 原核 生 牺 中， 虽然 只 有 一 个 简单 的 细胞 ， 但 最 简单 的 病 量 
毒 也 有 近 三 、 四 个 基因 到 数 百 个 基因 。 更 不 要 说 实 炉 本物， 其 基 刷 
因数 更 大 。 而 要 分 离 许 多 量 大 但 性 质 差异 俭 小 的 基因 :用 物理 和 
-化 学 方法 进行 有 很 大 的 困难 。 再 加 上 每 一 种 基因 含量 又 梢 ， 基 血 时 
红 蛋 贞 前 珠 蛋 白 基 因 ， 约 有 五 百 对 碱 基 ， 它 在 细胞 总 的 RNA 的 时 
2.9XTI0" 个 大 基 对 中 只 些 千 万 分 之 一 。 这 站 全 让 人 
的 困难 程度 。 

有 提取 不 同 基 国人 另 一 个 考 法 是 这 从 人才 法 天 
-有 一 定 碱 基 硕 序 的 基因 。 玖 

美称 印度 血统 学 者 科 纳 拉 在 人 工 侣 眠 基 因 广 面 戌 昔 齐 著 。 
1970 年 ,他 合成 了 77 对 了 碱 基 的 酵母 丙 氨 酸 的 结构 基因 续 瑟 ?3 年 怨 


"57T0?。 


又 合成 了 126 对 碱 基 的 大 肠 丁 苗 酷 氨 酸 tRNA 的 结构 基因 。 但 是 
。 在 上 述 两 次 合成 的 基因 都 不 能 得 到 表达 。1976 年 8 月 ， 科 纳 拉 成 
功 地 合成 了 具有 表达 功能 的 人 工 基因 一 一 193 对 碱 基 的 大 肠 杆 菌 
酷 氨 酸 tRNA 的 基因 。 自 此 以 后 ， 在 世界 范围 内 ， 人 工 合成 基因 
的 报道 不 断 出 现 。 研 究 者 认为 ， 人 工 合成 基因 比分 离 提取 基因 的 
优越 之 处 在 于 合成 的 随意 性 ， 只 需 根 据 人 们 的 意愿 ， 就 可 以 任意 
地 合成 目的 基因 ， 也 可 改变 、 增 加 或 减少 基因 中 的 一 个 或 几 个 核 
芒 和 和 
2 .目的 基因 与 载体 的 体外 重组 
任何 一 种 生命 类 型 ， 都 是 长 期 历史 进化 的 产物 。 它 们 都 具有 
一 种 不 受 外 来 异种 生物 侵入 而 稳定 地 延续 其 种 族 的 特性 。 当 处 源 
DDNA 一 旦 侵入 受 体 细胞 内 ， 就 会 受到 受 体 细胞 内 的 限制 性 核酸 
内 切 酶 的 破坏 。 这 种 酶 的 特性 是 专门 破坏 外 源 DNA， 但 不 破坏 自 
已 细胞 中 的 DNA。 其 原因 是 因为 在 细胞 中 还 有 一 种 与 限制 性 核酸 
内 切 酶 共存 的 但 作用 相反 的 一 种 称 为 修饰 酶 的 存在 。 修 饰 酶 的 作 
用 在 于 保卫 自身 的 DNA。 这 两 种 酶 形成 相互 关联 又 相互 制约 的 限 
， 制 修饰 酶 系统 。 由 于 修饰 酶 的 作用 ， 它 能 够 使 限制 性 核酸 内 切 酶 
要 切断 的 碱 基 甲 基 化 ， 使 内 切 酶 失去 “识别 ”这 些 碱 基 的 作用 。 
目前 发 现 ， 只 有 少数 的 细菌 质粒 、 噬 菌 体 和 某 些 病毒 可 作为 
基因 的 载体 。 而 其 中 质粒 的 作用 更 大 。 所 以 有 人 称 质粒 是 遗传 工 
程 的 主角 。 
质粒 是 细菌 细胞 中 染色 体外 的 遗传 成 分 。 它 存在 于 细菌 细胞 
中 ,是 细胞 质 中 的 共 价 键 闭合 环 状 双 链 DNA 分 子 ， 它 并 能 .自主 
地 复制 。 质 粒 的 大 小 范围 约 从 1kb 至 300kb。 具 有 复合 特性 (如 
在 接合 作用 中 指导 基因 转移 的 能 力 ) 的 质粒 ， 一 般 为 6kb 或 更 大 
叶 一 些 。 属 于 严 紧 型 的 较 大 质粒 ， 它 的 复制 取决 于 蛋白 质 的 继续 合 
几 成 ， 而 与 DNA 聚 合 酶 的 功能 无 关 ， 属于 松 驰 型 的 较 小 质粒 ， 它 
的 复制 取决 于 聚合 酶 的 活力 ， 而 与 蛋白 质 的 继续 合成 无 关 ,。 随 
着 质粒 大 小 的 增加 ， 拷 贝 数 成 比例 地 减少 。 以 小 质粒 ColE1 质 粒 
而 言 ， 当 加 入 氧 霉 素 以 阻止 蛋白 质 合成 和 染色 体 复制 ， 可 得 到 每 


ER 


2 


个 细胞 含有 1000 一 3000 拷 贝 数 ， 它 约 为 DNA 总 量 的 40 一 50 %%m 
而 较 大 质粒 大 概 只 有 1 一 3 个 拷贝 。 

原则 上 ， 项 量 无 诺 村 需 站 休 吧 全 新 区 测 届 时 和 呈 ， 这 种 复 
制 功能 不 会 因 质 粒 中 的 一 些 单一 酶 切 位 点 的 捅 入 DNA 而 失 活 。 
还 要 求 质粒 含有 这 样 一 个 基因 ， 通 过 它 能 从 大 量 细胞 群体 〈 其 大 
多 数 细 胞 缺少 这 种 质粒 ) 中 选择 出 带 有 该 种 质粒 的 细胞 。 现 已 检 
定 了 数 种 这 样 的 质粒 ,其 中 FSCol 已 用 于 首次 分 子 无 性 繁殖 实 验 。 
后 来 ， 大 多 数 质粒 中 的 基因 无 性 繁殖 实验 都 是 用 waMB9 .质粒 和 dv 
及 ColE1 或 它们 的 某 一 种 衍生 物 。 


和 


质粒 一 般 带 有 抗 药性 基因 ， 因 而 当 它 进入 细菌 后 ， 使 原来 不 时 


带 抗 药性 的 细菌 也 变 成 了 抗 药性 的 菌 种 ， 这 一 特性 成 为 测 知 质粒 
是 否 进 入 其 它 不 具有 抗 药 性 菌 体内 的 识别 标志 。 
除 质粒 以 外 ， 有 些 病毒 如 噬菌体 和 SV40 也 被 用 作 基 因 的 裁 
体 。 目 的 基因 与 载体 是 靠 一 种 连接 力 很 强 指 T4 连 接 酶 的 作用 ， 把 
两 者 联系 在 二 起 ， 成 为 重组 DNA 分 子 的 。 其 连接 方式 可 分 成 粘性 
末端 连接 和 平 端 连 接 两 种 。 所 谓 粘 性 末端 连接 是 指 通过 互补 单 链 
的 烙 接 末端 ， 将 DNA 片 断 接合 ， 并 由 DNA 连 接 酶 以 共 价 键 将 其 
闭合 。 互 补 未 端 可 由 两 种 不 局 途径 形成 ， 一 是 加 和 接 二 定单 链 顺 序 
( 同 聚 体 接 尾 ) ， 二 是 用 限制 性 内 切 酶 切断 ; 形成 错开 的 切口 ， 


产生 粘性 未 端 ， 将 其 相同 又 互补 的 来 端 连 接 起 来 。 随 后， 可 用 和 


DNA 连 接 酶 将 接头 牢 委 地 闭合 .而 平 端 连 接 是 指 连 接 无 单 链 化 


的 平整 末端 的 双 链 DNA。T4 连 接 酶 就 具有 连接 碱 基 完 全 成 对 的 上 


平 端 DNA 的 能 力 。 这 样 ， 限 制 性 内 切 酶 切 肥 所 得 到 的 DNA 片 外 ， 蜂 
都 不 必 加 接 单 链 的 “ 接 尾 ”， 可 先 用 DNA 聚 合 酶 将 未 端 不 平 齐 的 昌 


双 链 补 齐 ， 然 后 由 连接 酶 加 以 连接 。 
3. 杂 种 重组 DNA 分 子 引 入 受 体 细 胞 并 正确 表达 
由 于 大 肠 桂 菌 在 适 温 摄 氏 37 度 以 下 ， 每 30 多 分 钵 即 可 党 殖 一 


代 ， 目 前 一 般 把 大 肠 杆 菌 系统 作为 受 体 。 除 此 以 外 ， 还 有 芋 瑟 系 


统 和 枯草 杆菌 系统 。 


重组 DNA 分 子 进入 受 体 后 进行 筛选 ， 挑 出 含 目 的 基因 的 菌落 | 


es 12。 


了 了 


/于 全 2. 


。 或 细胞 壳 隆 。 如 果 目 的 基因 与 载体 的 启动 子 插入 的 方向 一 致 ， 搬 


六 的 位 置 又 合适 ， 那 么 目的 基因 在 受 体 细胞 中 能 够 得 到 正确 的 表 . 
达 。 基 因 在 受 体 细 胞 中 能 否 得 到 表达 成 为 遗传 工程 成 败 的 关键 。 
目前 看 来 ， 克 隆 系统 的 表达 效率 及 表达 产物 的 分 离 纯化 是 一 
个 大 问题 .要 使 外 源 基 因 在 微生物 载体 系统 中 得 到 高 水 平 的 表达 ， 
必须 有 两 个 步骤 : 一 是 有 效 地 转录 ;二 是 有 效 地 翻译 。 转 录 主 要 
取决 于 基因 的 伺 动 子 ， 这 是 一 个 能 被 宿主 DNA 聚 合 酶 识别 的 局 
动 子 ; 而 有 效 翻 译 关 键 是 要 有 一 个 核糖 体 的 结合 位 点 。 
工交 动 子 是 一 段 DNA， 不 同 局 动 子 对 转录 的 效率 不 同 ， 强 局 
动 子 能 高 频率 地 起 始 mRNA 的 合成 。 研 究 表明 ， 大 肠 杆菌 的 lac、 
trp、AXpe、trp 与 lac 司 动 子 杂 合 的 tac 及 酵母 系统 中 的 PSK 、ADHe、 
suci 和 PHO。 等 均 为 较 强 的 局 动 子 。 此 外 ， 还 可 利用 局 动 子 的 调 


节 因 素 ， 如 利用 诱导 物 ， 调 节 温 度 等 条 件 来 加 强 外 源 基因 的 表 


达 。 

影响 翻译 效率 的 原因 可 能 涉及 到 核糖 体 的 结合 位 点 的 结 侣 
效率 问题 。 在 大 肠 杆 菌 中 核糖 体 结合 位 点 包括 基因 起 始 密 码 AU 
G 及 SD 顺 序 。 此 外 SD 顺 序 和 AUG 之 间 的 核糖 酸 长 度 也 影响 表达 。 
目前 研究 者 已 合成 了 核糖 体 结 合 位 点 的 共同 顺序 ， 它 在 大 肠 杆 做 
中 有 效 地 引导 了 从 哺乳 动物 来 的 外 源 基因 的 表达 。 

此 外 ， 提 高 表达 效率 还 需 解决 外 源 基 因 的 载体 在 受 体 中 的 稳 


-定性 问题 。 载 体 是 一 个 自主 性 复制 系统 。 在 细胞 分 裂 过 程 中 很 容 


易 被 丢失 。 这 主要 是 由 载体 的 复制 能 力 和 细胞 分 裂 时 载体 分 配 的 
均匀 性 等 因素 所 决定 。 如 果 能 乔 清楚 质粒 的 复制 及 分 配 机 制 ， 就 
可 望 提 出 载体 稳定 性 措施 。 

大 量 的 表达 产物 对 宿主 细胞 来 说 是 不 正常 的 ， 这 些 表达 产物 
常常 影响 宿主 细胞 的 生长 ， 甚 至 使 其 致死 。 要 克服 表达 产物 对 宿 


_ 诗 细 胞 的 和 良 作用 ， 对 于 一 个 未 知 基 因 先 被 克隆 于 可 诱导 的 系统 


中 ， 如 果 产 物 对 宿主 无 害 ， 可 以 再 克隆 进 组 成 型 系统 ” 这 样 可 防 
止 由 于 兰 物 对 宿主 的 有 害 作用 而 影响 表达 的 检测 。 
如 何 控制 宿主 的 蛋白 酶 对 表达 产物 的 破坏 作用 又 不 影响 宿主 


s513 。 


正常 生命 活动 ， 这 也 是 提高 珍 达 水 平 的 一 个 方面 。 在 雪 达 分 子 量 、 


小 的 多 肽 〈 如 肽 岛 素 ) 时 ， 有 人 试验 筛选 蛋白 酶 活性 低 的 菌株 作 
为 受 体 。 有 人 则 用 造成 不 溶性 的 融合 蛋白 来 防止 体内 蛋 自 酶 的 永 
解 作 用 ， 一 般 说 是 很 有 用 的 。 


建立 能 使 表达 产物 分 泌 到 细胞 外 的 载体 受 栖 系 统 】 不仅 可 以 


防止 产物 积累 在 细胞 内 影响 正常 生长 ， 从 而 提高 表达 水 平 。 另 外 ， 
这 样 还 可 以 大 大 简化 产物 的 提纯 步骤。 因为 此 时 可 不 必 破 碎 细 胞 
来 提取 表达 产物 ， 只 要 把 产物 与 培养 基 的 成 分 相互 分 离 就 行 了 。 
在 培养 基 中 只 有 少数 几 种 蛋白 ， 分 离 产 物 相 对 地 较 容 易 。 瑞 士 有 
人 利用 Bacillus amyloliquefaciens 中 得 到 的 ao 一 淀粉 酶 基 国 克 
隆 ， 建 立 了 分 泌 载 体 ， 把 人 白细胞 和 干扰 素 基因 直接 连接 于 一 演 
粉 酶 基因 的 信号 顺序 之 后 ， 干 扰 素 的 产量 达 105 单 位 /毫升 ， 其 中 
90%% 以 上 已 分 泌 在 培养 基 中 。 

在 重组 DNA 受 体 细 胞 ， 又 称 表达 系统 中 ， 一 般 把 大 肠 杆菌 5 
枯草 杆菌 和 酵母 菌 等 的 表达 系统 称 为 第 一 代表 达 系 统 。 第 二 代表 
达 系 统 为 动物 细胞 和 植物 细胞 等 真 核 细 胞 。 目 前 ， 对 第 一 代表 达 
系统 研究 比较 成 熟 。 真 核 生 物 的 基因 比 原 核 生 物 复 杂 得 多 ， 如 果 
蝇 的 每 个 细胞 中 ， 大 约 有 2 亿 个 核 背 酸 对 ， 而 人 和 哺乳 动物 含有 
30 一 40 亿 个 核 苷 酸 对 ， 其 基因 数 在 一 万 到 十 万 之 间 。 在 真 核 生物 
的 DNA 结 构 中 ， 有 高 度 重 复 的 顺序 、 中 度 重 复 顺序 和 单 拷 贝 顺 
序 的 安排 ， 所 以 它 的 分 子 大 小 和 结构 都 是 十 分 复杂 的 。 尽 管 如 此 ， 
哺乳 动物 细胞 作为 重组 DNA 表 达 系 统 其 表达 蛋白 质 产 量 比 原核 
细胞 表达 系统 高 ， 还 可 以 简化 提纯 工序 ， 降 低 成 本 。 因 此 ， 随 着 
遗传 工程 研究 的 深入 ， 使 用 哺乳 动物 细胞 表达 系统 来 生产 遗传 工 
程 产 品 展 现 着 深远 的 前 景 。 

此 外 ， 国 外 还 正在 探索 建立 其 它 的 表达 系统 ， 如 伤寒 宇 菌 、 
巨大 芽孢 杆菌 、 多 角 病 毒 、 昆 虫 卵 巢 细 胞 链 霉 菌 等 ， 站 
性 广 、 产 量 高 且 无 毒 的 表达 系统 。 

总 之 ， 微 生物 载体 受 体 系统 的 研究 是 遗传 工程 的 重要 环节 之 
一 。 最 终 的 目标 是 使 外 源 基 因 在 微生物 载体 受 体 中 得 到 高 效率 的 


* 514。 


We 


| 


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” 计 达 。 解决 这 些 课题 ， 无 懈 将 推动 遗传 工程 向 更 高 一 层次 发 展 ; 


(三 ) 第 二 代 遗 传 工 程 一 一 蛋白 质 工 程 
蛋白 质 工程 是 遗传 工程 和 和 蛋白质 结构 的 研究 相互 渗透 的 产 


驳 。 它 把 核酸 研究 和 蛋白质 研 究 结合 起 来 ;把 基础 研究 和 应 用 研究 


结合 起 来 ,从 而 把 认识 生命 与 改造 生命 两 者 统一 起 来 .蛋白 质 工 程 
的 研究 是 在 蛋 自 质 空间 结构 和 结构 与 功能 研究 基础 上 ， 借 助 计 算 
机 图 每 显示 和 分 子 辅助 设计 提出 对 某 一 蛋白 质 分 子 的 改造 方案 。 
学 者 斌 为， 开展 蛋白 质 工 程 研究 必须 避免 以 下 两 种 混淆 ; 
(1) 一 般 遗 传 工程 与 蛋白 质 工程 。 不 能 将 任何 定义 上 的 基 
因 改 造 〈 修 饰 》 都 称 为 蛋白 质 工程 。 蛋 白质 工程 必须 是 在 空间 结 


- 罗 ， 至 少 在 良好 结构 功能 干 进行 的 ， 它 不 是 分 子 的 随机 突变 。 


(2 六 蛋白 质 合成 、 化 学 修饰 与 蛋白 质 工 程 。 研 究 表明 ， 对 
20 一 30 个 氨基 酸 以 下 的 小 肽 结构 研究 的 最 优选 择 是 多 肽 合成 ， 它 


易于 获得 各 种 类 似 物 。 目 前 已 合成 出 数 千 种 脑 非 肽 类 似 物 。 而 这 
-类 小 肽 表达 产物 的 稳定 性 有 很 大 问题 ， 因 此 ， 企 图 通过 蛋白 质 工 


程 来 研究 这 类 小 肽 的 结构 与 功能 问题 无 疑 是 小 题 大 作 ， 事 倍 功 半 。 

目前 蛋白 质 工 程 研究 最 彻底 的 酶 之 一 是 酷 氨 酸 .tRNA 合成 酶 
(TyrTs) 。 这 个 酶 催化 在 ATP 存 在 下 酷 氨 酸 的 活化 和 转移 活化 
的 酷 氨 酰 到 tRNA7 的 3 末端 .从 嗜 热 芽 抱 杆菌 来 源 的 TyrTs 的 空 
间 结 构 已 解析 到 3.1 和 A， 它 与 底 物 酷 氨 酰 腺 苷 复合 体 的 空间 结构 
也 已 测定 。 这 些 研究 揭示 酶 与 底 物 之 间 可 能 形成 11 对 氢 键 ， 其 
中 8 对 来 自 氨 基 酸 侧 链 。 

在 实际 应 用 方面 ,一 批 将 给 国民 经 济 带 来 重要 影响 的 蛋白 质 ， 
已 被 列 入 蛋 帕 质 工程 的 候选 名 单 。 有 的 在 研究 上 已 取得 注目 的 成 
果 ， 展 示 出 广阔 的 应 用 前 景 。 在 医药 方面 有 可 能 通过 单 克隆 抗体 
免疫 球 蛋 白 基 因 与 毒素 肽 基因 融合 起 来 创造 “生物 导弹 ”药物 ， 
用 于 肿瘤 及 其 它 疾病 的 治疗 。 通 过 蛋白 质 工程 研究 消除 或 减少 控 
制 光合 作用 的 核 酮 糖 一 1.5 一 二 磷酸 羧 化 酶 的 活力 ， 就 能 提 高 光 


合作 用 的 效率 。 这 种 效率 的 提高 将 直接 影响 农业 的 增产 及 全 球 范 


5515。 


转 内 人 类 对 太阳 能 的 贮藏 和 利用 。 至 今 人 们 已 经 发 现 并 鉴定 了 数 
千 种 酶 ， 但 真正 有 高 业 价值 的 酶 仅 儿 种 。 通 过 蛋 自 质 工程 对 酶 的 


性质 的 改造 将 大 大 提高 现 有 酶 的 工业 实用 性 7 从 而 本 巨大 的 
经 济 效益 。 

为 六 寺 乔 自 质 工 程 研究 商 这 全 导 FF 车 尖 法 为 夫 六 各 纤 册 有 
解 次 两 个 问题 。 

的 多 风 tag 
工程 必须 借助 于 精确 分 子 三 维 结构 的 信息 ， 有 目前 对 构象 研究 的 唯 
一 手段 是 X 一 射线 单 昌 结构 分 析 , 它 又 受到 单 唱 培养 的 严重 制约 ， 
“正在 发 展 的 电子 衔 射 三 维 重组 、 二 维 核 厂 共 振 以 及 分 子 动力 学 研 
究 可 望 弥 补 这 -一 缺陷 。 

(2) 基因 高 速度 表达 及 有 效 后 处 理 (下 游 ) 技 术 ; 是 蛋白 质 工 
程 的 另 一 个 限 速 因素 。 欲 用 丸 可 能 小 的 工作 量 得 到 尽 可 能 多 的 突 
变 体 蛋白 质 以 开展 其 结构 以 及 性 质 测 试 ， 从 而 尽快 提出 预期 性 质 
与 测试 性 质 差 异 ， 并 寻求 其 结构 上 的 原因 ,为 制定 新 的 改造 方案 
提供 反馈 信息 均 有 赖 于 产物 的 高 效 表 达 和 分 离 : 因此; :高 效 表达 
载体 ， 分 泌 性 寄主 系统 以 及 各 种 高 效 批量 分 离 技术 无 恬 是 今后 主 
要 探 党 目标 。 


(四 ) 遗 传 工程 的 开发 及 其 进展 


近 一 十 年 来 ， 遗 传 工程 技术 已 从 实验 室 开始 走向 流通 领域 ， 
根据 基因 表达 产物 ,有 的 已 投放 市 场 ,有 的 水 批 基 生产 试验 产品 ; 
有 的 是 正 处 于 实验 室 阶段 的 遗传 工程 产品 。 可 分 以 平 光 庆 方 面 8 

瓦 重组 DNA 活 性 蛋 帕 质 和 多 肽 

在 国外 ， 重 组 DNA 活 性 蛋白 质 和 多肽 研究 起 步 早 、 种 类 多 
进展 快 .目前 已 有 50 一 60 种 产品 已 取得 不 同 程度 下 提 重 要 进展 这 
些 产品 大 多 数 是 生化 药物 或 生物 制品 , ;对 大 体 具有 调节 生理 动能 
-和 免疫 功能 的 新 疼 苗 ， 在 医药 及 轻 工 \# 食 品 等 方面 有 很 大 价值 。 

膜 岛 素 是 治疗 糖尿 病 的 有 效 药 物 ， 它 是 由 51 泵 氨基 酸 连 接 而 
成 的 一 种 蛋白 质 。1982 年 ， 美 国 最 先 开 始 用 “工程 菌 * 生 产 ， 目前 


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性 已 商品 生产 。1983 年 ， 中 国 科学 院 细胞 研究 所 科学 家 j 利用 人 工 


构建 的 合成 胰岛 索 的 多 功能 质 立 做 载体 ， 在 大 肠 杆 菌 表达 胰岛 


。 素 的 效率 高 达 30-40%， 大 大 超过 当时 美国 、 日 本 的 10%% 的 实验 


室 最 高 水 胖 ' 但 其 产业 化 进程 则 比 国 际 水 平 差 。 加 拿 大 科学 家 改 
变 以 往 直 接生 产 胰 岛 素 方法 ， 而 将 人 胰岛 素 原 (proinsulin) 的 基 
因 引 入 大 肠 杆 菌 ， 生 产 胰 岛 素 原 ， Was 此 方法 比 直 
接生 产 的 胰岛 素 浓度 高 一 倍 。 

“大 的 生长 激素 (HGH7 和 人 的 绒毛 民生 长 激素 (HCS) 的 基因 
已 在 大 世 杆 苗 中 获得 表达 。 人 生长 激素 是 脑 下 垂体 分 泌 的 一 种 蛋 


: 自 质 * 由 191 个 氨基 酸 组 成 ! 由 重组 DNA 已 生产 松 驰 素 。 美 国 应 用 


分 子 遗 传 公司 从 鸡 脑 垂体 中 获得 鸡 生 长 激素 (CGH) 的 mRNA , 通 ， 
过 cDNA 与 pBR322-…-SV40 杂 合 运载 体 在 大 肠 杆 菌 中 克隆 并 表 
达 。 另 外 ， 一 大 批 活性 蛋白 质 和 多 肽 ， 如 苇 -1.3 集 落 刺激 :因子 
XCSF)、B3 细 胞 生长 因子 (BCGF)、 巨 叭 细胞 活 国 子 (MAR)、 免 疫 
球 蛋 白 ( 节 )、 表 皮 蛙 张 因 子 (EGE)、 火 受孕 激素 类 、 肾 素 . 心 纳 素 
台 管 紧张 素 、 降 钙 素 、 内 啡 状 、 消 花 酶 类 、 雍 血 VHI 因 子 、 红 细 
胞 生长 成 素 (EPO) 等 的 重组 DNA 研 究 正 处 于 实验 室 阶 段 。 
于 扰 素 是 人 体 细 了 胞 分 泌 的 类 活 狂 多 肽 ， 有 wpB.Y、 三 种 类 型 。 


-它们 具有 广 谱 的 抗 毒 、 抗 肿瘤 和 免疫 调节 活性 。 它 对 乙 型 肝炎 病 


毒 在 人 体内 的 繁殖 有 明显 的 抑制 作用 。1980 年 以 来 ， 美 国 已 用 重 
组 DNA 的 w- 干 扰 素 临床 试验 ， 用 于 病毒 病 和 有 恶 性 肿瘤 .FDA 已 于 
1986 秆 10 月 批准 美国 基因 公司 生产 的 cA, 型 于 扰 素 投放 市 场 .日 本 


已 批准 8- 于 扰 素 投放 市 场 。 预 计 其 它 类 型 于 扰 素 将 于 1988 年 后 陆 


续 投 放 市 场 。 
由 于 遗传 工程 生产 干扰 素 单 位 产量 高 ， 这 样 有 可 能 在 临床 试 
验 中 有 足够 量 来 进行 正确 评价 。 芬 兰 利 用 xc- 干扰 素 治 疗 多 发 性 看 


张 症 病 ， 发 现 有 发 热 、 疲劳 等 副作用 。 法 国 用 -干扰 素 治 疗 转移 “ 


性 肾 肿 瘤 ， 有 不 同 程度 的 缓解 和 萎缩 。 英 国 认 为 用 以 做 用 腔 旷 射 
预防 感 骨 效 果 好 ， 但 美国 报道 有 头痛 、 充 血 等 副作用 。 看 来 %- 于 


， 扰 索 的 临床 应 用 还 需 有 待 进一步 的 改进 、8- 王 拢 索 据 报道 认为 用 


。. 5717。 


于 治疗 带 状 疱 疮 效果 较 好 。 

折 细 胞 介 素 x(IL-a) 是 一 种 淋巴 因子 , 它 具 有 增强 数 种 免疫 细 
胞 ， 如 细胞 毒性 T 淋 巴 细 胞 (CTL)、 自 然 杀伤 细胞 (INK 细胞 ) 和 杀 
伤 细胞 (细胞 ) 的 活性 。1983 年 ,美国 重组 DNA 苇 -o 的 研究 首次 
获得 成 功 。1984 年 3 月 ， 日 本 发 表 了 利用 重组 DNA 方法 将 白细胞 
介 素 -% 克 隆 并 在 大 肠 杆菌 中 表达 ， 它 可 和 刺激 IT 细胞 杀 死 肿瘤 细胞 
或 治疗 免疫 缺陷 病 , 如 麻 疯 病 。 重 组 DNA 于 -的 临床 试验 还 表明 ， 
仅 用 一 次 剂量 就 可 使 爱滋病 的 一 个 重要 病症 一 一 Kaposis 肉 瘤 、 慢 
性 白血病 、 卵 巢 癌 和 黑色 瘤 等 缩小 或 消失 ， 显 示 其 良好 的 抗 癌 作 
用 。 国 外 还 致力 于 重组 DNA 的 IL-1 和 IL-3 的 研究 ?并 已 获得 表达 。 
也 -1 能 诱导 产生 蕊 -2， 并 能 刺激 表皮 细胞 的 生长 ， 有 可 能 用 于 治 
疗 创 伤 和 炎 性 疾病 。IL-3 能 诱导 某 些 IT 细胞 产生 特殊 酶 类 , 正 试 用 
于 治疗 贫血 症 。 

组 织 血 纤 维 蛋白 深 酶 原 激 活 剂 (TPA) 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 已 获 
得 克隆 表达 。 目 前 还 准备 在 酵母 和 哺乳 动物 细胞 中 生产 。 科 学 家 
发 现 IPA 溶解 血栓 的 作用 比 尿 激 酶 、 链 激酶 更 好 更 安全 。IPA 还 
可 用 于 抢救 因 出 血性 休克 而 产生 的 血管 内 弥漫 性 凝血 。 国 外 己 充 
隆 出 TPA 的 换 制 物 ， 可 用 它 来 治疗 出 血性 疾病 。 

治疗 血 友 病 的 因子 VHI 已 被 克隆 表达 ,目前 正 进行 水 批量 生 
关 

1981 年 克 ， 美 国 发 表 口 蹄 疫苗 病毒 表面 抗原 在 大 肠 杆菌 中 得 
-到 表达 。 并 经 免疫 试验 产生 高 效 价 的 中 和 抗体 。 正 准备 大 规模 生 

1980 年 ， 法 国 科学 家 首先 发 表 乙 型 肝炎 病毒 表面 抗原 在 大 肠 
杆菌 中 得 到 表达 ， 但 表达 水 平 不 高 ， 免 疫 原 性 也 差 ，; 许多 实验 室 
已 转身 酵母 系统 。1984 年 初 , 日 本 发 表 已 在 酵母 系统 中 得 到 表达 。 
产量 可 达 5x 105 分 子 / 细 胞 ,并 能 形成 似 天 然 病毒 一 样 具有 免疫 性 
-的 颗粒 。 为 提高 亚 基 疫 苗 的 免疫 原 性 ,美国 已 将 表面 抗原 基因 捅 到 
咎 瘟病 毒 TK 基因 位 置 上 ， 其 抗体 效 价 很 高 。 将 流感 病毒 血 凝 素 
(HA) 基因 ， 用 同样 方法 捅 入 牛 冶 病 毒 也 得 到 较 好 的 免疫 反应 。 


人 , 交 


其 它 如 幼 畜 腹泻 亚 基 疫苗 、 间 炒 病毒 II 疫苗 、 咎 的 烂 舌 病 疫 
苗 等 都 处 于 小 批量 生产 和 试验 中 。 霍 乱 菌 的 肠 道 毒素 B- 亚 基 也 已 
被 克隆 ， 并 在 大 肠 杆菌 中 表达 。 肿 瘤 坏死 因子 (TNF) 已 获得 表 
达 并 在 临床 上 进行 预备 试验 。 具 有 利 纳 、 利 尿 ， 抗 扩 氨 管 , 降 低 
氨 压 和 抗 心 律 失常 作用 的 心 纳 素 及 红细胞 造血 系统 的 特异 性 调节 
因子 一 一 红 细胞 生长 素 (EPO)， 目 前 还 处 于 实验 室 研 究 阶 段 。 

2. 次 级 代谢 产物 

氨基 酸 、 抗生素 等 都 不 是 基因 直接 表达 产物 ， 而 是 许多 酶 协 
辣 作用 殉 成 区 作物 质 代谢 产物 的 遗传 工程 已 在 生产 中 发 挥 积 
极 作用 。 

二 抗菌 素 是 一 类 很 重要 的 常用 药 。 目 前 ， 抗 菌 素 的 遗传 工程 已 
初 具 条 件 。 人 们 已 经 发 现 ， 可 作为 链 霉菌 的 载体 有 质粒 (如 变 青 
链 霉 素 的 SLP、 委 内 瑞 拉链 霉菌 的 PUC。 质 粒 等 ) 和 叭 菌 体 ( 如 R4、 
SHI Csi 等 温和 鸣 菌 体 )。 灰 色 链 霉菌 和 卡 那 链 霉菌 可 以 用 
DNA 直 接 转化 ? 鸣 菌 体 DNA 可 转 染 其 原生 质 体 ， 且 已 有 几 个 链 霉 
素 抗 性 基因 克隆 化 。 最 近 研 究 表明 ， 有 七 种 抗生素 的 结构 基因 不 
是 分 散 ， 而 是 以 基因 篮 的 形式 存在 ， 这 就 有 可 能 一 起 转移 到 载体 
上 进行 克隆 化 。 同 时 ,还 发 现 某 些 抗生素 合成 基因 就 位 于 质粒 上 ， 
如 含 次 甲 基 霉 素 基 因 的 SCP，(PSV1) 和 含 庆 丰 霉 素 基 因 的 SQP， 
等 ， 这 些 抗生素 的 遗传 工程 方面 相对 地 简单 。 

应 用 遗传 工程 使 氨基 酸 产 量 大 幅度 提高 ， 自 1980 年 以 来 已 有 
陆续 报道 。 

苏联 的 氨基 酸 遗 传 工程 是 利用 抗 持 物 筛 选 菌 株 , 获得 了 thrA 
基因 产物 对 Thzr 不 敏感 变种 和 Thr-ILe 途径 即 分 阻 断 的 变种 ， 然 
后 对 h? 操 纵 子 进行 活化 ,并 将 thr 操 纵 子 由 pBR322 载 入 Thr- 变 种 ， 
经 这 样 改 造 的 菌 株 ， 发 酵 48 小 时 ， 苏 所 酸 的 产量 可 达 30g/1。 也 
以 同样 步骤 获得 工 - 高 丝氨酸 生产 株 , 其 最 高 产量 在 70 一 90 小 时 发 
酵 ， 产 量 可 达 60 g/1 。 

1978 年 ， 美 国 和 法 国 分 别 研究 成 功 ， 将 鸡 的 卵 清 蛋白 的 基因 
引入 大 肠 杆 菌 得 到 表达 。 这 就 意味 着 ， 人 们 可 利用 发 酵 技 术 ， 培 


六 


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养 出 含 卵 清 蛋 和 白 的 菌 体 。1980 年 ， 法 国 巴 斯 德 研究 所 又 成 功 地 将 


卵 清 蛋白 的 基因 转 入 酵母 内 ， 并 得 到 表达 。 这 种 酵 琵 营养 成 份 丰 


语 ， 含 有 维生素 、 消 化 酶 类 和 和 蛋白质 ， 又 加 上 了 路 清 蛋 月 ， 适 用 
于 人 类 食用 蛋白 质 和 家 畜 高 级 饲料 蛋白 。 


法 国 Ricnaud 等 与 康 保 尔 大 学 合作 ， 进 行 重组 DNA 的 赖 氨 酸 


研究 工作 。 他 们 对 参与 赖 氨 酸 合成 的 头 六 个 基因 进行 分离 与 鉴定 ; 
并 分 别 在 具有 高 拷贝 数 的 质粒 DBR322 上 进行 基因 护 增 ,和合 拷贝 数 
达 50 个 以 上 。 再 用 这 些 杂 合 质粒 去 转化 大 肠 杆菌 开 GQCR5 菌株 (这 
个 菌株 由 于 经 过 突变 处 理 ， 改 恋 了 天 冬 氨 酸 激酶 交 反 应 ， 能 生产 
赖 氨 酸 ) 。 他 们 发 现 ， 只 有 携带 daPA 基 因 ( 编 码 二 氧 二 吡啶 羧 酸 合 
成 酶 ) 的 杂 合 质粒 ， 才 能 使 均 氨 酸 的 产量 增高 ， 重组 PNA 技 术 使 
TOCR， ,的 产量 提高 了 五 倍 。 

3 .基因 元 件 

基因 元 件 的 遗传 工程 ， 即 利用 基因 无 性 繁殖 技术 ， 把 所 需 大 
量 扩 增 的 目的 基因 的 片断 重组 入 载体 ， 通 过 宿主 细胞 大 量 复制 出 
目的 基因 片断 。 基 因 元 件 不 仅 可 作为 构建 各 种 遗传 工程 工作 系统 
的 部 件 ， 还 可 作为 基因 分 析 的 探 针 ， 它 在 对 基因 结构 的 分 析 交 基 
_ 因 定 位 和 医学 诊断 中 都 极为 有 用 。 在 遗传 病 和 病毒 病 的 诊断 上 已 
显示 出 专 一 的 灵敏 的 优越 性 。 

可 作为 疾病 诊断 和 基础 研究 的 DNA 杂交 探 针 ， 是 国外 遗传 工 
程 研究 的 一 个 重要 领域 。 其 兰 理 是 根据 单 股 DNA 具有 特异 的 互 
补 性 结合 作用 ,标记 上 同位 素 或 生物 素 的 单 股 DNA 互补 性 结合 后 
”可 显示 荧光 。 因 此 用 它 可 欠 测 病人 血清 、 痰 、 娄 或 肝 细 胞 标本 ， 
缩短 诊断 时 间 。 美 国 基因 探 针 公司 已 研 制 出 检验 军团 菌 病 的 DNA 
杂交 探 针 。 细 胞 间 mRNA 特 异 的 (如 Src 癌 基因 mRNA)DNA 杂交 
探 针 还 可 测 出 哪个 癌 基 因 已 开启 ， 利 于 癌症 的 临床 诊断 。 另 外 已 
有 用 于 血型 和 器 官 移植 的 CMC 探 针 和 前 列 腺 瘤 的 DNA 杂 交 探 针 
已 投放 市 场 。 

4. 改 良和 创建 生物 性 状 


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遗传 工程 技术 在 定向 改良 农作物 和 家 畜 品 种 ， 甚 至 创建 自然 
520 


界 中 没有 的 生物 新 品种 的 研究 工作 中 ， 均 具有 很 大 的 实践 意义 和 
经 济 价值 。 虽 然 这 个 领域 的 研究 难度 很 大 ， 但 也 已 取得 了 很 大 的 
进展 。 

1982 年 ， 美 国 乔 山 度 公司 和 比利时 根 特 大 学 的 学 者 成 功 地 把 
细菌 的 新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基因 (NPTII) 转 入 向 日 划 、 烟 草 、 胡 
葛 下 等 细胞 中 ， 结 果 使 培养 出 来 的 植物 抗 卡 那 霉 素 能 力 比 同类 植 
物 强 八 倍 以 上 。 这 是 细菌 基因 在 高 等 植物 中 获得 表达 的 第 一 个 实 
- 例 。 

除草 剂 草 甘 磷 是 一 种 广 谱 除 草 剂 ， 它 抑制 植物 细胞 的 5- 烯 醇 
磷酸 莽 草 酸 -3- 磷 酸 (EPSP) 合 成 酶 ， 使 得 植物 细胞 不 能 获得 芳香 
族 氨 基 酸 ， 进 而 使 莽 草 酸 积累 而 导致 细胞 死亡 。1985 年 ，Comai 
等 将 伤寒 杆菌 中 缩 码 EFSP 合 成 酶 的 一 种 突变 基因 aroA， 拼 接 上 
能 在 植物 中 起 作用 的 5“ 启 动 序列 及 3“ 加 尾 序 列 ， 然 后 引入 烟草 细 
胞 ,， 再 生 的 烟草 转化 株 对 草 甘 宁 有 明显 的 抗 性 。1986 年 Shah 等 以 
大 量 产生 EPSP 合 成 酶 的 矮 牵 牛 细胞 中 分 离 出 编码 EPSP 合成 酶 
cDNA，; 并 将 此 DNA 置 于 花椰菜 花 叶 病毒 (CaMV) 的 35S 启 动 子 
控制 之 下 ， 然 后 将 此 镶嵌 基因 导入 狠 牵 牛 细 胞 ， 也 得 到 了 抗 草 甘 
宁 的 转化 植株 。 

.植物 固氮 问题 是 一 个 诱 人 的 课题 。 研 究 人 员 企 图 通过 遗传 工 
程 使 根瘤 菌 的 固 氨 能力 提高 ， 或 使 它 和 非 豆 科 植物 也 能 共生 。 具 
有 固 扎 的 其 它 细 菌 ， 科 学 家 们 想 找 到 能 和 作物 共生 ， 而 作物 可 以 
从 中 得 利 的 固氮 菌 。 他 们 也 想 把 固氮 能 力 转 给 和 作物 一 起 生活 ， 
但 没有 固氮 能 力 的 细菌 。 如 果 把 克 氏 肺炎 杆菌 的 17 个 固氮 基因 转 
给 太 肠 杆菌 ， 大 肠 杆菌 就 能 固氮 。 但 是 ， 固 所 问题 异常 复杂 ， 要 
把 固氮 基因 转 给 作物 ， 看 来 还 为 期 过 早 。 

在 植物 抗 病毒 方面 ,利用 遗传 工程 技术 也 取得 了 重要 的 进展 。 
Prowell*.Abel 等 将 烟草 花 叶 病毒 (TMYV) 的 外 壳 蛋 白 基 因 的 cDNA 
置 于 CaMYV 的 35S 的 启动 子 下 ， 然 后 将 此 灸 谋 基 因 导入 烟草 及 西 红 
柿 细胞 中 ， 从 而 获得 抗 TMV 病 毒 的 烟草 及 西红柿 植株 。 所 获得 的 
抗 性 能 稳定 地 遗传 。 利 用 同样 的 方法 ，Bryaan 等 将 黄瓜 花 叶 病 毒 


ss 5521 。， 


(CMV) 卫 星 RNA 的 DNA 找 由 导入 烟草 细胞 中 ,使 得 在 转化 的 类 


草 及 其 有 性 后 代 中 ; CMV 复制 天 大 降低 了 。 在 植物 的 抗 出 育种 方 
面 ， 取 得 了 一 项 重要 的 成 果 ， 即 抗 虫 植株 的 获得 。 苏 云 金 芽 隆 杆 
菌 :(BT) 是 一 种 在 形成 孢子 时 产生 毒性 蛋白 质 晶体 的 杀 虫 菌 ， 将 
编码 此 蛋白 的 基因 装 上 能 在 植物 中 起 作用 的 5 及 3' 调节 信号 后 ; 
导入 烟草 及 西红柿 细胞 ， 从 而 获得 了 抗 虫 的 烟草 及 西红柿 植 糕 。 

在 动物 方面 ， 利 用 遗传 工程 技术 也 取得 了 重要 的 进展 。 动物 
遗传 工程 的 成 功 取决 于 外 来 基因 是 否 植 入 精子 .卵子 或 接合 子 中 
把 外 来 基因 植 入 动物 染色 体 有 几 种 方法 ， 其 一 是 用 微 注 射 法 把 外 
源 基因 注入 已 经 受精 ， 但 精 核 孵 核 尚 未 结合 的 精 核 中 。 在 最 竺 的 
实验 条 件 下 ,在 出 生 的 小 动物 中 有 10 一 30% ,其 种 系 细胞 中 有 外 源 
DNA。 另 一 种 方法 是 用 反 转 录 病 毒 作 为 载体 ;把 外 源 DNA 转 给 动 
物 。 反 转录 病毒 能 把 它 的 DNA 植 入 细胞 DNA 中 ;能 使 动物 或 人 长 
癌 。 经 过 遗传 工程 操作 ， 法 掉 它 的 致癌 基因 ， 换 上 我 们 所 铭 传 弟 
的 基因 ， 就 可 作为 载体 

1993 年 ， 美 国 的 一 所 大 学 和 赛 克 尔 研究 所 成 功 呈 培育 出 所 谓 
的 超级 鼠 。 他 们 将 大 白鼠 的 生长 激素 基因 注入 到 不 白 鼠 的 受精 细 
胞 中 ， 将 注射 的 受精 孵 移 植 到 母体 中 ， 由 此 发 育 而 来 的 小 评 春 体 
型 上 比 一 般 小 鼠 大 二 倍 ， 而 且 生 长 速度 很 快 。1987 年 ，J.Paul 
Sinons 等 将 羊 的 B- 虱 球 蛋白 基因 导入 小 妃 的 受精 卵 中 ， 然 后 将 此 
受精 卵 植 入 母体 中 ， 由 此 受精 卵 发 育 的 瞧 性 小 鼠 乳 汁 趾 ， 充 满 了 
羊 的 8-. 乳 球 蛋白 。 这 些 研究 成 果 为 动物 遗传 育种 开拓 了 办 新 的 途 
径 。 

研究 发 现 , 编 码 促 性 腺 释放 激素 〈GnRH) 的 基因 厂 失 突变 ， 
将 导致 小 鼠 的 不 育 。Anth6uy J.， 等 将 正常 小 鼠 含 GaR 瑟 基因 的 
DNA 片 段 导 入 含 此 突变 基因 的 同 质 小 鼠 受 精 卵 中 ， 使 该 受精 卵 发 
育成 正常 的 小 鼠 ， 并 能 繁殖 后 代 。 另 一 类 似 的 研究 是 :Readtiead 


C 等 用 编码 通 攻 质 基础 蛋白 (MBP) 的 正常 基因 治愈 了 患 颜 抖 及 . 
痉挛 症 的 小 鼠 。 携 带 有 隐 性 突变 的 “ 颜 抖 ”基因 的 同 质 小 忌 ， 由 


于 不 能 产生 传导 信息 必需 的 钥 蒜 质 基础 蛋白 ， 而 导致 宇 期 死亡 。 
522 6 


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用 上 述 正常 的 MBP 编 码 基因 导入 患 此 病 的 小 鼠 受 精 卵 中 ， 由 此 发 
育 而 来 的 小 鼠 成 为 正常 的 小 鼠 。Saviol 等 利用 重组 的 道 转录 病毒 
感染 培养 的 肝 细 胞 ;使 转化 的 肝 细 胞 产生 一 种 新 的 蛋白 ,这 为 遗传 
合 陷 的 肝 细 胞 产生 正常 的 蛋 自 质 成 为 可 能 。 上 述 这 些 研究 表明 , 利 
用 遗传 工程 技术 治疗 遗传 性 疾病 的 年 代 已 为 时 不 远 了 。 

遗传 工程 用 于 遗传 病 的 治疗 ， 也 称 为 “基因 治疗 "5 这 种 治疗 
为 控制 及 治疗 人 类 遗传 病 开 尽 了 广阔 的 前 景 。 

基于 科学 和 伦理 学 的 考虑 ， 可 以 把 基因 治疗 分 成 二 类 。 第 一 
种 类 型 是 体 细胞 基因 治疗 ， 即 把 单个 基因 植 入 病人 一 小 块 组 织 的 
细胞 中 ， 用 以 缓解 病情 。 植 入 基因 不 会 扩散 ， 也 不 会 传代 ， 不 存 
在 伦理 方面 的 问题 。 

已 知 单 基 因 遗 传 病 病 有 200 多 种 ,如 肌肉 萎缩 、 镰 状 细胞 贫血 、 
氨 友 病 、 本 性 纤维 变性 和 自 席 容 狐 症 …… 等 。 办 法 是 取出 一 部 分 
病人 骨 通 ， 用 重组 DNA 转 化 ， 再 放 回 去 。 转 化 的 方法 有 微 注射， 
用 北 学 或 电导 闪 反 转录 病毒 。 这 些 技术 都 已 经 过 关 。 此 法 的 基因 
植 入 位 置 不 定 ， 要 求 植 入 基因 相对 稳定 ， 表 达 适 度 ， 恰 好 足以 组 
解 病情 ， 且 无 害 的 副作用 。 但 这 些 问 题 尚未 解决 ; 

;第 二 类 是 种 系 基因 治疗 。 即 把 外 源 基 因 植 入 种 系 细胞 中 ， 并 
传 之 后 伐 ， 但 要 用 于 人 ， 近 期 还 有 不 少 困 难 。 一 是 治愈 成 功率 不 
高 呈 三 是 基因 植 入 的 位 置 无 法 控制 ， 如 植 入 位 置 不 当 ， 表 达 当 然 
不 当 ， 后 果 不 堪 设 想 。 斯 以 近期 不 会 进行 人 的 种 系 基因 治疗 。 

至 于 优生 遗传 工程 的 问题 ， 更 为 复杂 ， 目 前 只 是 一 种 设想 。 


( 赵 功 民 ) 


第 二 节 ”遗传 工程 基本 操作 扩 术 


重组 DNA 技 术 ， 又 称 基因 操作 。 其 意义 可 概括 为 : 包 它 可 改 
。 523 了。 


变 生 物体 的 基因 型 ，@ 可 作为 研究 前 工具 。 应 用 这 种 技术 可 以 分 
离 和 扩 增 基因 ， 研 究 基 因 的 结构 与 功能 ， 研 究 基 因 指 高 效 表达 。 
它 药 发 展 巨大 地 推动 了 生物 学 药理 论 研究 和 实际 应 用 ;在 现代 生 
物 工程 的 发 展 和 利用 中 占有 中 心地 位 ， 使 生物 工程 显现 当前 渐 未 
有 的 光 采 。 重 组 DNA 技 术 的 基本 含意 是 在 离 体 条 件 下 ， 将 非 同 源 ， 
的 DNA 片 豚 前 接 ， 再 把 离 体重 组 的 DNA 分 子 转 久 活 细 胞 内 ,合成 
DNA 分 子 擂 编码 的 蛋白 质 产物 ， 从 而 创造 在 自然 条 件 下 所 不 能 出 
现 葛 新 的 生物 个 体 。 

一 个 典型 的 重组 DNA 裤 难 和 包括 : 

@@ 外 涛 DNA 片 疏 ， 也 称 目的 基因 。 

四 载体 分 子 ， 它 可 以 是 质粒 或 哈 莲 体 。 

国 限 制 性 核酸 内 切 酶 。 

Q@DNA 连 接 酶 。 

加 作为 转化 受 林 的 原核 或 真 核 细 隐 ““ 

质粒 是 一 类 双 装 穴 欢 的 小 浮尘 DA5 尼 和 适 丰 生生 基本 于 
能 够 独立 复制 。 大 多 数 作为 克隆 载 林 的 质粒 都 是 经 过 改造 的 ”使 
之 更 符合 实验 的 要 求 。 二 般 作为 载体 的 质粒 有 下 列 一 些 特 性 :@ 
质粒 应 尽 可 能 小 ， 因 为 质粒 愈 天 往往 转化 效率 愈 低 。 名 应 该 知道 
质粒 止 基因 的 位 置 ， 限 制 性 内 声 酶 的 切 点 ， 甚 至 核 替 酸 顺序 。 轩 
容易 在 宿主 中 增 欧 ， 便 于 获得 天 量 的 质粒 和 重组 DNA 分 子 。@ 具 
有 选择 标志 以 便 区 分 质粒 转 伦 的 细胞 与 非 转 化 的 细胞 。 回 一 外 好 
的 载体 应 具有 一 个 能 被 外 源 片段 插入 失 活 的 标志 基因 根据 表 型 


”的 改变 就 可 将 重组 分 子 和 非 重 组 分 子 区 分 开 。@ 有 尽 可 能 多 的 限 


制 性 内 地 了 酶 单 切 点 ， 有 利于 插入 不 同类 型 的 限制 性 片段 。 

一 旦 分 离 出 外 源 DNA 和 载体 ， 便 用 相同 的 限制 性 内 切 酶 处 
理 ， 产 生 互 补 的 特异 末端 ， 当 两 种 DNA 片 段 配对 时 ， 便 产生 重组 
DNA 分 子 , 留 下 未 连接 的 3 一 5 磷酸 二 酝 键 利用 DNA 连 接 酶 连接 ， 
通过 转化 或 微量 注射 将 重组 的 DNA 分 子 导 入 适宜 的 受 体 细胞 , 选 
择 含 有 外 源 DNA 的 转化 体 并 测定 外 源 DNA 的 表达 。 


“5234。 


(一 ) 染色 体 DNA 的 制备 


分 离 不 同 来 源 的 细胞 染色 体 DNA,， 有 多 种 方法 ， 但 基本 原理 
和 主要 步骤 是 相同 的 。@ 首 先 要 破碎 细胞 壁 和 戏 ， 释 放出 可 溶 的 
高 分 子 量 DNA; @ 因 为 DNA 和 蛋白 质 是 结合 在 一 起 的 ， 要 通过 变 
性 和 蛋白 酶 处 理 将 蛋白 质 与 DNA 分 开 , 除 去 蛋 白 质 ， 四 再 将 DNA 
与 其 它 大 分 子 分 开 ， 如 用 RNase 处 理 去 除 RNA 等 。 

根据 材料 的 不 同 ， 可 采用 不 同 的 破碎 细胞 的 方法 ,它们 包括 ， 
先 用 溶菌 酶 处 理 细胞 ， 形 成 原生 质 体 ,而 后 在 有 去 污 剂 的 条 件 下 ， 
如 SDS， 使 原生 质 体 破 裂 ; 少量 的 细胞 可 用 超声 波 破碎 反复 冻 
融 细 胞 也 可 破碎 细胞 ， 对 动 植物 细胞 可 采用 研磨 法 ,组 织 匀 浆 法 。 
将 上 述 方法 结合 使 用 ， 效 果 更 好 。 除 用 有 蛋白酶 降解 蛋白 质 外 ， 党 
用 的 简便 方法 是 用 茶 酚 或 苯酚 和 和 氧 仿 的 混合 液 反复 抽 提 去 除 变性 


蛋白质。RNase 处 理 可 水 解 RNA。 当 用 乙醇 沉 省 DNA 时 ,DNA 呈 


现 丝 状 物 ， 可 缠绕 在 玻璃 棒 上 。 乙 醇 沉 淀 DNA 既 可 浓缩 高 分 子 量 
的 DNA， 又 可 去 除 RNA、 宿 核 苷 酸 、 去 污 剂 和 有 机 湾 剂 。 最 终 
DNA 洲 液 对 缓冲 液 透析 ， 可 除去 盐 和 残存 的 有 机 溶剂 。 

提取 过 程 中 要 避免 强烈 和 过 度 药 山 拌 ， 这 会 使 DNA 链 断裂 ， 
降低 DNA 的 平均 分 子 量 。 当 DNA 从 细胞 释放 时 ,组 冲 液 含有 10 一 
25% 的 蔗糖 ， 可 减少 DNA 分 子 的 断 肥 。 

1 .分 离 细 菌 细胞 DNA 的 一 般 方法 

@@ 用 一 个 菌落 接种 100mlLB 培 养 液 ，377 培养 过 充 。 

-四 离心 20008，20 分 钟 , 收 集 细 胞 。 

人 将 细胞 基 浮 在 5ml 50mM Tris-HCI，pH3.0, 50mM EDTIA 
缓冲 液 中 ， 放 -207 冷冻 。 

四 制备 新 的 溶菌 酶 液 (10mg/ml 深 在 0.25M Tris- 了 CI 中 ， 
pH8.0)。 细 胞 冻结 后 加 入 0.5ml 溶 菌 酶 液 ， 融 化 混合 ， 融 化 后 六 
浴 45 分 钟 。 

@ 加 入 1ml STEP 深 液 ， 充 分 混合 后 于 50 了 保温 60 分 钟 , 随 即 
温和 振 蔓 。 


STEP 液 ，0.5% SDS,50mM Tris_HCl,pH7 5,0 4MEDTA ， 
放 在 室温 ， 用 前 加 入 proteinase K(lmg/ml) 5 

@@ 加 6ml 用 水 饱和 的 苯酚 ， 缓 慢 混合 5 分 钟 。 
@@ 离 心 ，1000g，15 分 钟 。 
加 将 水 相 转移 到 另 一 管 里 。 加 入 0.1 体 积 3M NaAc (pH5.2) 
缓慢 混合 。 

@ 加 2 倍 体积 乙醇 ， 用 细 樟 缠绕 DNA， 除去 过 多 的 乙醇 ( 靠 管 
壁 旋转 玻璃 棒 ) 。 

四 将 DNA 溶 解 在 iml 50mM Tris-HCI pH7.5,1mM EDTA， 
200Ug/ml RNase A 中 ， 为 溶解 完全 ， 放 4 过 夜 s 

@DNA 完 全 溶解 是 重要 的 ,如 未 完全 溶解 可 再 加 一 些 缓冲 液 ，- 
而 后 加 入 等 体积 氯仿 ， 倒 置 数 次 混合 。 

四 离心 ，1000g8，15 分 钟 。 

四 将 水 相 转移 到 新 管 ， 加 0.1 体 积 3M NaAc， 再 加 2 倍 体积 冷 
乙醇 ， 倒 置 混合 ，DNA 呈 长 丝 状 沉淀 。 

四 用 细 棒 缠绕 DNA， 溶 于 2ml 50mMTris-HCLpH7.5， 
EDTA 溶 液 中 。 贮 存在 4 。 

2 .分 离 枯草 杆菌 染色 体 DNA 

电离 心 收集 1g 对 数 生 长 期 细胞 。 si 

Q@ 用 20mlTEN 绥 冲 液 (10mM Tris-HClpH7.6,1mMEDTIA， 
10mM NacCl) 洗 细胞 ， 离 心 6500rpm，4C5y* 分 钟 。 

四 将 细胞 悬浮 在 10ml SET 缓冲 液 (20% 芒 糖 ,， 50mM Tris， 
pH7.6,50mM EDTA) 中 ,加 1ml 溶 蓝 酶 液 15mg/ml 深 在 TEN 中 )， 
377 保温 30 分 钟 。 用 相差 显微镜 检测 原生 质 体 的 形成 。 如 数量 少 
可 适当 延长 保温 时 间 。 

四 加 入 10ml TEN 缓冲 液 和 1lml 25%SDS， 混 合 。 

@ 加 入 2ml 5M NaCl 和 等 体积 用 缓冲 液 饱和 的 葵 酚 。 混 合 5.， 
分 钟 。 

@@ 离 心 6500rpm 5 分 钟 ，4TC 。 

@ 将 上 层 液 转移 到 新 管 中 ， 加 入 等 体积 的 氯仿 - 异 戊 醇 (24: 


。 526 > 


1， 混合 5 分 钟 后 ， 离 心 。 

@ 吸 出 寺 层 液 ， 加 入 2 倍 体积 9%5% 冷 乙醇 ， 混 合 溶液 。 

@@ 用 玻璃 棒 颖 绕 DNA， 并 悬浮 在 10ml TEN 缓冲 液 中 , 放 47 
过 夜 ， 使 DNA 溶 解 。 

人 @ 申 加 0.05ml RNase 溶 液 (10mg/ml RNase 溶 在 0.1M NaAc， 
0.3M EDTA，pH4.8，80TC 处 理 10 分 钟 ) 。377 保温 ?2 小时， 再 加 
0.5mt pronase 液 (2mg/ml 溶 在 TEN 中 ，377 预 处 理 15 分 钟 ) 继 续 
保温 1 小 时 。 

曲 加 5ml 饱 和 缓冲 液 的 葵 酚 和 5ml 毛 仿 - 异 戊 醇 ， 绥 慢 混 合 5 
分 钟 ， 离 心 。 

四 再 用 10ml 氧 仿 - 异 戊 醇 重复 抽 提 一 次 ， 离 心 。 

-@ 对 上 相 液 加 入 2 倍 体积 095% 冷 乙醇 ， 沉 演 用 95% 乙醇 汗 测 

， 洲 解 在 2 一 4ml TEN 缓冲 液 中 。 

3 .分 离 大 分 子 量 大 肠 杆 菌 DNA 

巴 离 心 收集 5ml1 对 数 生 长 期 细胞 培养 液 。 

外 将 细胞 悬浮 在 25ml 1M NaCl 中 ，47 振 划 1 小 时 。 

加 离心 ， 再 悬浮 在 25ml 冷 TES(5mM EDTA，50mM Tris 
-pH8.0，50mM NacCl) 绥 冲 液 中 。 

四 离心 ， 将 沉淀 悬浮 在 5ml TE(50mM Tris, pPH38.0，20mM 
EDTA) 中 

加 加 入 0.5ml 洲 万 酶 (2mg/ml 溶 在 TE 缓 冲 液 中 ) ,小 心 混合 ， 
置 377 保温 15 分 钟 。 

@ 加 入 0.6ml Sarcosyl-pronase 溶 液 (10 %Sarcosyl,5mgy/ml 
promase 溶 在 TE 组 冲 液 中 ),377 保温 1 小 时 。 

名 加 5ml 葵 酚 ， 重 复 抽 提 2 一 3 次 ， 再 加 5ml 氯 仿 抽 提 一 次 。 

图 加 入 NH4Ac 至 0.3M， 加 0.54 倍 体积 异 丙 醇 。 

四 离心 ， 用 70% 乙醇 洗 一 次 。 

四 将 DNA 沉 省 溶解 在 1 一 2mlI TE 中 ， 放 47C 过 夜 。 

曲 用 0.5% 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 测 DNA 大 小 (Tris-HAC 绥 冲 液 ， 
pH7.8)。 


。 527。 


4. 酵 母 DNA 的 分 离 

四 将 酵母 菌 接种 在 YEPD (每 升 含 蛋白 肪 208) 人 酵母 粉 108， 
葡萄 糖 20g8) 中 ， 于 307 生长 至 静止 期 ， 离 心 收集 1000m]1 培 养 液 中 
的 细胞 ，6500rpm，4C ，5 分 钟 。 

包 将 细胞 悬浮 在 60ml 蒸 饮水 中 ， 离 心 ，6500rpm，4TD，5 分 
钟 。 

@ 将 细胞 悬浮 在 SB 原生 质 体 缓冲 液 (0.2M Tris-HCbDpH7.5， 
1M 山 梨 醇 ，0.1M EDTA，0 .1M 2?- 琉 基 乙 醇 ) 中 ， 浓 度 为 0.25g/ 
ml (一 40ml) .加 入 2ml Zymolyase(1mg/ml 深 在 TEN 中 ),307 保 
温 1 小 时 ， 不 时 摇动 混合 。 

四 加 入 等 体积 TEN 缓冲 液 10mM Tris-HCH pH7.6，1mM 
EDTA,，10mM NaCl),2ml SLS( 终 浓度 为 1%) 0.5ml RNase 溶 
液 . (10mg/ml) ,缓慢 混合 ，377 保温 2 小 时 。 再 加 1ml(2mg)pTO- 
nase， 继 续 保 温 2 小 时 ， 不 时 混合 。 

名 于 657 加 热处理 30 分 钟 ， 再 冷却 至 室温 。 

电 加 入 等 体积 苯酚 -氯仿 (1:1) ,混合 振 划 5 分 钟 。 

@ 离 心 使 两 相 分 离 ，6500rpm，4C，15 分 钟 。 

四 将 水 相 用 移 液 管 移出 ， 再 用 氯仿 - 异 友 醇 抽 提 , 重复 @@ 步 
骤 。 

@ 加 入 1/25 体 积 的 5M NaCl, 加 入 2 倍 体积 的 95% 冷 乙醇 ， 用 
玻璃 棒 缠 绕 DNA， 并 深 于 50ml TEN 缓冲 液 。 

四 加 0.1ml RNase 液 ，377 保温 1 小 时 。 

四 重复 步骤 @ 和 @， 去 除 RNase 和 残留 蛋白 质 。 加 1/25 体 积 
的 5M NaCl， 2 倍 体积 的 95% 冷 乙醇 ， 绥 慢 混 合 后 冰 浴 放置 5 分 
钟 。 

@ 用 玻 棒 缠 上 化 DNA， 溶 在 1 一 ml TEN 缓冲 液 中 ， 存放 在 
5 

5 .分 离 真 核 细 胞 高 分 子 量 DNA 

@@ 将 组 织 用 小 刀 切 碎 。 

@ 把 液 氮 倒 入 Waring Blendor 色 浆 器 里 。 


。 528。 


TY 
”。，  @@ 加 入 碎 组 织 盐 ， 粉 碎 1 一 5 分 钟 ， 直 至 组 织 变 成 细 业 。 
外 让 液 所 蒸发 找 ， 加 10 倍 体积 的 裂解 液 L(0.5M EDIA (pH 
8 .07》100Rg7ml Proteinaase 区 ，0.5o%fsarco3y 避 
回 晤 浮 后 50 忆 水 浴 3 小 时 。 

@ 加 入 等 体积 苯酚 ， 重 复 抽 提 3 次 .由 于 样品 中 盐 的 浓度 高 ， 
离心 后 的 酚 相 一 般 为 上 相 ， 除 去 苯酚， 合并 水 相 。 

@3 次 铀 提 后 ， 水 相对 4 升 透析 液 (50mM Tris-HCICDH8 .0)， 
10mMEDTA,， 10mM NaCl) 透析 。 更 换 几 次 透析 液 ， 至 0D?270 
<0.05 使 样品 在 体积 上 增加 3 倍 。 

@@ 放 入 100ug/ml RNase，37 居 处 理 3 小 时 。 

@ 用 苯酚 一 氯仿 温和 抽 提 ?次 。 

四 对 TE 缓 冲 液 充分 透析 。 

四 测量 DNA 浓 度 并 在 0.3% 屯 脂 糖 凝 胶 上 电泳 ，DNA 应 大 于 
100Kb， 比 完整 的 入 DNA 移 动 的 更 慢 。DNA 溶 液 存放 在 47 。 

6 .乙醇 沉淀 DNA 

四 将 DNA 溶 解 在 T 王 缓冲 液 中 (10mM Tris-HCI PH7.6,1mM 
”EDTA)- 
@ 加 入 0.1 体 积 的 3M KAc(DH5 .2) 混 合 。 
图 加 入 2 倍 体 积 的 95% 冷 乙醇 ， 混 合 。 
多 将 管 置 -20 立 冰柜 或 干冰 乙 醉 洽 中 5 分 钟 。 
名 离心 收集 DNA 沉 泛 。 
图 弃 掉 上 清 液 ， 将 管 倒 置 在 滤纸 上 ， 空 二 乙醇 溶液 。 
马 去 掉 残 存 的 少量 乙醇 ， 将 管 放 在 于 燥 器 中 1 一 2 分 钟 。 
@@ 将 DNA 沉 演 溶 解 在 所 需 的 缓冲 液 中 。 
为 了 防止 污染 DNA， 纯 化 时 最 好 带 手套 。 加 乙醇 前 必须 加 入 
一 定量 的 单价 阳离子 ， 浓 度 可 以 在 0.1 一 0.4M 之 间 。 如 果 DNA 溶 
液 的 浓度 水 于 0.1mg/ml， 为 帮助 DNA 沉 淀 可 加 入 1ul 酵 母 RNA 
(10mg/mI 湾 解 在 水 中 并 煮沸 5 分 钟 ) ,也 可 延长 放置 在 干冰 乙醇 洽 
市 或 -70 字 冰 模 中 的 时 间 直 至 几 个 小 时 。 如 果 沉 淀 的 DNA 片 段 较 
是 小 ， 则 可 用 Beckman Sw41 或 相当 的 转子 于 35000 ITpm 离心 半 小 


529 


ER ee ee ee ee ee ee ee 如 


时 ， 收集 沉淀 。 

人 用 冷冻 干燥 的 植物 材料 制备 DNA 

分 离 植物 DNA 的 一 个 主要 问题 是 要 有 效 地 破坏 植物 细胞 辟 ， 
一 些 破 碎 细胞 壁 的 方法 同时 会 剪断 DNA 分 子 。 实 验证 明 ， 用 冷冻 
于 燥 的 植物 组 织 制 备 DNA 可 克服 上 述 问 题 。 将 收集 的 植物 组 织 洗 
净 ， 冷 冻 干 燥 ， 在 干燥 器 中 贮存 儿 年 ， 而 不 会 影响 DNA 的 质 量 。 

@ 对 1.0g 冻 干 植物 材料 加 入 4.0g 氧 化 铝 (Sigma type305) ,在 
研 鲸 中 研 成 细 粉 。 这 不 但 能 有 效 地 破碎 细胞 壁 ,也 会 提高 DNA 的 
得 率 

@ 将 粉末 倒 入 50ml 聚 丙烯 离心 管 中 ， 加 15ml 提 : 取 ' 缓 冲 液 
(EB), 用 塑料 搅 棒 温 和 搅拌 ， 使 粉末 均匀 分 散 开 。 

@ 盖 上 离心 管 盖 ， 于 567 水浴 中 保温 20 分 钟 , 不 时 轻微 振 葛 ， 
保持 提取 液 处 于 混合 状态 。 

由 将 保温 混合 物 冷 至 室温 ， 千 万 不 要 使 温度 降 至 15C 以 下 ， 
因为 省 化 十 六 烷 基 三 乙 胺 (CTAB) 将 会 沉淀 

加 加 15ml 氧 仿 - 辛 醇 (24:1v/v) ,加 盖 温和 地 反复 倒置 离心 
管 ， 形 成 乳化 相 。 在 通气 柜 中 进行 ， 不 时 松 盖 减 压 。 

@ 用 Sorval ss-34 转 子 (80008，207 ) 离 心 ，10000rpm，10 
分 钟 。 

四 将 水 相 (上 层 ) 转 到 一 个 干净 的 50ml] 离 心 管 中 ， 避 免 吸 取 
界面 处 的 变性 蛋白 。 

四 加 1/10 体 积 〈 一 1 5mD10%(w/vyCTAB 深 深 (用 0.7M 
NaC] 配 制 ), 缓 慢 混 合 后 ， 重 复 用 氯仿 : 辛 醇 抽 提 。 

四 将 水 相 转 至 合适 的 无 菌 玻璃 管 中 ， 如 16x125mm 管 。 

四 加 入 等 体积 的 沉淀 缓冲 液 ， 温 和 混 匀 ， 室 温 放置 30 分 钟 至 
沉淀 形成 。 

四 于 室温 离心 1500g8，10 一 15 分 钟 ， 不 要 使 沉 演变 得 太 结 实 ， 
以 致 难以 重新 溶解 ， 一 个 好 的 制品 沉淀 应 该 是 白色 的 或 淡白 色 。 

四 将 离心 管 倒 置 于 吸水 纸 上 ， 空 干 沉淀 。 此 时 可 将 沉淀 放置 
4 人 过夜， 或 继续 做 梯度 离心 分 离 。 

530。 


提取 缓冲 液 (EB).:50mM Tris-HCI，pH8 .0， 0 .7M NacC1， 


1l0mMEDTA, 1%(w/v)CTAB(Sigma H5882),1%(v/v)2- 葡 基 
”乙醇 。 配 制 该 溶液 时 先 不 加 一 基 乙 醇 ， 将 溶液 加 热 搅 拌 ， 避 免 形 


成 泡 末 ， 而 后 灭 菌 ， 冷 至 室温 后 加 入 综 基 乙醇 。 

沉 演 缓冲 液 ， 50mM Tris-HCI，pH8.0，10mM EDTA，1% 
(WwW/v)CTITAB。 

8. 用 新 鲜 植 物 组织 提 取 DNA 

@ 用 70%% 酒 精 处 理 材 料 表 面 ， pw w ca 
放 液 氮 中 冷冻 。 

四 将 冷冻 的 组 织 放 在 预 冷 的 研 钵 中 ， 中 环 大 二 讨 料 加 入 1 所 
化 铝 ， 迅 速 研磨 成 细 粉 末 。 

图 将 匀 浆 转 入 50ml 离 心 管 ， 加 0.2ml 琉 基 乙 醇 ，10ml 2x 提 取 
缓 训 液 〈 预 先 加 热 至 95 ) ,立即 用 塑料 搅拌 棒 混 合 。 

四 盖 住 离心 管 ， 放 567C 水 洽 保 温 20 分 钟 ， 以 后 操作 同上 述 实 
验 7- 外 以 后 步 又。 

9. 植 物 DNA 的 区 带 离 心 

@ 通 过 5670 水 浴 加 热 第 12 步 得 到 的 沉淀 溶解 在 2.4ml1M 
CsCl/EtBr (NM CsCl1,50mM Tris-HCI，pH8.0，10mM EDTA， 
0.2mg/ml EtBr) 中 ， 澳 化 乙 锭 将 显示 贴 在 管 壁 上 的 核酸 。 虽 然 在 
加 入 1M CsCI/EtBr 后 ， 大 部 分 不 透明 的 CTAB 沉 诞 会 很 快 溶解 ， 
核酸 的 溶解 则 需要 更 长 的 时 间 。 

加 将 溶解 了 的 核酸 转 入 Beckman VTi65 超 离心 管 或 与 之 相应 
的 管子 ， 加 入 2.9ml7M CsC1/EtBI (7M CsCI，0.1%Sarfcosy]， 
0.2mg/ml EtBr)， 将 管 口 封 好 ， 轻 轻 倒置 混合 。 

图 离心 ，58000rpm4 小 时 或 40000rpm 过 夜 〈16 小 时 )。 

鲜 用 长 波 紫外 线 (320nm) 照射 ， 可 见 DNA 带 ， 用 人 带 19 号 
针头 的 Iml 注 射 器 穿 进 管 壁 ， 吸 出 DNA， 由 于 RNA 正 被 离 到 管 壁 
上 ， 所 以 必须 小 心 ， 勿 吸出 RNA。 

@ 用 NaCl 饱和 的 异 两 醇 抽 提 5 次 ， 去 除 省 化 乙 逛 〈 溴 化 乙 镁 


进入 有 机 相 )。 


和 


四 对 2 升 蒸馏 水 透析 。4C， 去 除 CsCle 菩 力 说 撞 迁 析 24 人 时 
内 ， 最 少 换 水 3 次 。 

@ 于 260nm 测 DNA 浓 度 (1 00D 值 =50pg/ml)s 

田 加 17/10 体 积 3M 己 酸 钠 ， 入 后生 全 二 20j 过 
夜 沉淀 DNA。 

@@ 用 台式 离心 机 离心 3 分 钟 沉 深 DNA， 真空 干燥 沉 泛 ， 重新 
” 洲 于 无 菌 水 中 ， 至 所 需 浓度 。DNA 可 在 -= 207 保存 兆 年 保持 得 
定 。 也 可 保存 在 80% 乙醇 中 。 

10 .为 Socuthern 印 迹 法 制备 少量 DNA 

四 将 0.1 克 冻 干 的 愈 伤 组 织 或 0.07 克 冻 干 的 已 去 掉 中 脉 的 叶 
片 材 料 ， 放 在 小 研 钵 中 (9cm 直 径 ), 加 入 0:3 克 氧化 馈 将 组 织 研 碎 。 
也 可 以 研磨 更 多 揭 样品 ， 然 后 再 称 出 所 需 量 ， 提 取 DNA。 

四 将 研 成 闪 末 前 植物 组 织 转 入 台式 小 离心 机 管 中 ,， 加 入 600 
由 提取 缓冲 液 (EB), 用 塑料 搅 棒 温 和 搅拌 :567 保温 10 分 钟 

四 加 入 600u1 氧 仿 - 辛 醇 (24:1)， 振 菏 后 离心 两 分 钟 ， 将 水 相 
(上 层 ) 转 至 一 洁净 离心 管 。 

四 用 100uUDEB 洗 原 管 中 的 变性 蛋白 界面 ， 离 心 * 合 并 水 相 。 

@ 训 入 1/10 体积 10% CTAB (70p) 到 合并 的 水 相 中 ， 混 
名 。 重 复 氯 仿 - 辛 薛 抽 提 。 

-@@ 将 水 相 转 至 一 洁净 的 硅化 离心 管 中 〈16X125 印 I 为 关 等 
体积 的 沉淀 缓冲 液 (600b1)， 混 匀 , 室温 放置 20 分 钙 c 

四 用 人 台式 离心 机 收集 沉淀 (2000g，15 分 钟 )， 弃 二 请 液 ， 
罕 干 沉淀 5 如 果 沉 淀 沉 降 不 好 ， 再 在 硅化 管 中 ,， 20C， 80008 高 
心 15 分 钟 。 

四 将 核酸 /CTAB 沉 淀 次 于 400WTM NAG 为 溶解 可 加 热 至 
56， 将 该 溶液 转 至 无 菌 的 离心 管 中 。 

四 核酸 /CTAB 沉 淀 完全 溶解 后 ， 加 2 售 体积 乙醇 (800ul)， 混 
句 ，--207 放置 过 夜 。 


四 用 台式 离心 机 离心 分钟。 加 lml 65% 乙醇 洗 1 分 钟 ， 弃 乙 ， 


醇 ， 重 复 洗 举 两 次 ， 再 用 85% 乙醇 洗涤 一 次 ， 如 果 沉 渔 被 冲 起 ， 


9 5530 


4 


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5 机 二 


RAR 和 放生 6 本条 6 让 3- 


寺 


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下 
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“出 应 离心 沉降 。 乙 醇 洗涤 将 洗 掉 核 酸 中 的 CTAB， 使 DNA 易 于 被 
限制 性 内 切 本 消化 。 


@@ 真 空 干燥 沉 光 后 ;溶解 在 85U1 无 菌 水 中 。 
六 2 @ 取 104 核 酸 溶液 ， 用 二 苯胺 法 测定 DNA 浓 度 。 

@@ 相 应 地 稀 释 或 浓缩 至 所 需 DNA 浓 度 (例如 200-500pkg/ml)5 
按 此 法 制 答 的 DNA 可 用 手眼 制 性 内 切 酶 分 析 及 Southern 印迹 技 
术 ， 样 品 中 的 RNA 不 会 影响 分 析 ， 因 为 绝 大 多 数 情况 下 ,电泳 时 
和 

11) 三 蘑 腕 法 定量 测定 DNA 

汪 2 配 制 下 列 溶液 : 

GD3N 高 氯 酸 : 取 49 . 2ml 高 氧 酸 ; 加 攻 饮 水 至 200ml, 混 匀 ， 保 
存 接 加 塞 的 瓶 忠 。3N 高 氧 酸 具 有 极 强 的 腐蚀 性 。 该 溶液 可 在 室 
本 到 在 枯 大 有 

7 四 三 葵 胸 溶液 ， 用 含有 0.01% 三 聚 乙 醛 (Pataldehyae) 的 六 
醋酸 配制 4% 的 一 某 腕 深 波 ， 以 上 成 分 均 有 和 危险 性 ， 尤 其 是 .三 葵 
胺 专 因 此 应 在 通风 局 中 操作 。 
人 将 如 吗 邓 素 己 了 酶 (分 析 纯 ) 加 到 198ml 冰 醋酸 中 (分 析 纯 )。 

(让 ) 称 取 8 克 二 苯胺 〈 分 析 纯 ， 戴 手套 ) 加 到 冰 栈 【 酸 深 深 中 
AD Gin 
温 保 存 6 周 。: 
王权 检 相通 项 属 让 运行 寺 殿 次 特 生 短 往 加 和 全 
小 离 必 管 中 。 
妆 140 山 无 菌 蒸 饮水 


3 OWDN 太 溶液 


150bl 3N 高 氯 栈 
汉 塌 司 舍 下 沁 留 呈 1 二 业 有 虫 溶液 
,入 方 盖 上 高 心 管 )3 反 复 倒置 混 刍 ， 置 暗 处 30 尼 保温 16 一 20 本 


村 订 每 次 测定 必须 严格 控制 在 相同 的 温度 和 时 间 ， 否 则 每 次 测定 
” 都 需 用 标准 DNA 样 品 建立 标准 曲线 。 


由 汪 4) 玉 600nm 测 光 密 度 ， 通 过 标准 曲线 计算 浓度 ， 每 次 测定 
"1533 。 


都 需 空白 对 照 〈 燕 篇 水 ， 不 加 DNA) 以 调 零 战 ; 在 35oueDNA 
/1 范围 内 ，0.D.eoo 与 DNA 浓 上 度 呈 线性 关系 。 

12. 从 新 鲜 叶 片 或 愈 伤 组 织 中 分 离 核 DNA 

直 称 取 200 克 组 织 ， 用 27 蒸 饮水 洗涤 ， 其 后 扣 入 均 需 六 洽 进 
行 (2224C)， 最 好 在 浆 室 中 操作 

四 如 叶片 要 去 掉 审 脉 ， 全 一个 大 二 关中 用 万 上 将 
碎片 。 
1 ”四 将 组 织 放 在 1000m1 烧 标 中 ， 加 一 乙 芒 要 关 丽 扩 反 训 风 

四 弃 二 乙 醛 ， 用 冷 无 菌 燕 馆 水 洗 ， 加 入 400ml 预 冷 的 分 离 核 

缓冲 液 A， 中 速 匀 效 1 分 钟 ， 瑟 可 用 Polytron 多 逆 器 或 用 人 

拌 器 ， 忒 2 企 5 秒 脉 证 中 速 玻 碎 组 织 。， 

@@ 用 不 层 无 蓝 平 终 纱 布 加 一 层 Miifaclofhy 扩 杀 流 过 天 
菌 的 1000ml 烧 杯 中 。 民 二 下 过 恩 琶 

nine 
分 钟 ， 收 集 粗 制 组 胞 核 。 者 三 全 世 

加 其 细胞 核 于 25ml 洗 核 缓 冲 液 B 种 】 用 元 全 准 禁 离 志 和 在 尖 
平 转子 中 离心 2000g8)540，10 分 希 人 
不 再 有 绍 胞 碎片 〈 洗 3 一 4 次 )。5 

@ 如 需要 高 纯度 制 昂 ， 可 用 非 连 续 的 Perol 样 束 训 让 细 有 核 : 
将 细胞 核 悬 于 7ml 分 离 核 缓冲 液 A 中 ， 铺 到 非 连续 Percol 密 度 梯 度 
上 ， 该 梯度 由 7ml135%Percol 和 7ml 80%%Petcol 制 成 /用 分 离 核 组 
冲 液 A 配 制 在 无 菌 硅化 离心 管 中 。 水 平 转子 80008，4f; 离 已 30 
分 鱼 ， 两 层 之 间 的 区 带 含 有 核 ， 取 出 该 区 带 ， 用 25ml 分 离 核 缓冲 
液 A 稀 大 ， 离 心 沉 降 核 ，20008， 用 相同 缓冲 液 洗 志 次 (水 平 转 
子 ) ,纯化 的 核 哥 在 核 贮 存 缓冲 液 中 二 70 存放 凤 本 3 

@ 冰 沧 中 将 核 县 于 5ml 核 裂 解 缓冲 液 中 (该 溶液 不 含 渗透 压 
稳定 剂 ); 将 细胞 核 在 Vortex 振 划 器 卡 振 划 16 次 ;每 次 5 秒 钟 ， 其 
间 闵 浴 冷 却 民 也 再 将 核 冷冻 融化 ， 悬 在 5ml 含 有 500hg/ ma 预 消 
的 Pronase 的 核 有 裂解 液 中 ，37 人 保温 30 分 钟 只 二 和 束 硬 由 村 和 


外衣 0. Imnl B= - 绽 基 忆 醉 45ml 巴 热 至 95 忆 的 2 依 提 取 缓 六 液 ( 见 昌 


3 


由 
间 
旭 
和 
本 


” 实 间 1.77; 立刻 用 塑料 铣 棒 混 匀 ， 以 后 操作 则 近 从 冷冻 干燥 的 植 


季 材 料 制备 DNA 的 步骤 四 进行 。 

人 离 核 缓 冲 液 A，1M 蔗糖 ，10mM Tris-HCI，pH7.2,5mM 
MgCcl:，2mM B8- 琉 基 乙 醇 (2OME)， 除 2ME 以 外 缓冲 液 应 灭 菌 ， 
使 用 前 加 入 2ME。 

洗 核 缓冲 液 B; 与 分 离 核 缓冲 液 相 同 , 只 是 加 有 0.5%- Triton 


4 及 -1 00。 


核 贮 存 组 冲 液 ，250mM 蔗糖 ，20mM Hepes，pH 7.8，5mM 

MgCl  ，LmM 二 硫 苏 糖 醇 ，50% 葡 萄 糖 。 
苇 更 解 液 。TompM Tris-HCIL， pH1.2，10mMEDTA，5 mM 

2ME,， 0.5% Triton 文 -100。 

13. 叶 绿 体 DNA 的 分 离 

轩 授 实验 12:@O 一 @ 步 又 ， 用 细胞 器 提取 液 F 代替 核 提 取 液 
A， 匀 浆 200 克 植物 款 料 。 
加 于 4o，100g 离 心 10 分 钟 去 细胞 核 ,1800g 离 心 10 分 钴 (47 ) 
收集 叶 绿 条 。 将 正清 液 滤 入 一 洁净 管 中 ， 将 叶绿体 离心 沉淀 置 六 


洽 。 


人 多 将 此 种 细胞 器 最 于 25ml DNase 缓 冲 液 G 中 ， 冰 浴 1 小 时 ,不 

时 摇动 起义 消除 核 DNA 片段 污染 纪 胞 器 DNA， 此 保温 过 程 中 的 
DNasE 浓 度 需 靠 经 台 确 定 ， 可 参考 使 用 150 一 500ug/ml 药 浓度 。 
5G@ 机 入 ED' 避 《pHB;0) 至 终 浓度 10mM， 终 赴 DNase 活 性 。 
国人 ， 瑟 800 离 心 15 分 钟 收集 计 绿 体 。 

二 轿 将 此 种 细胞 器 悬浮 于 7ml 细 胞 器 提取 液 E 中 ， 按 实验 12.@ 
步 ;用 非 连 绩 Pereol 密 度 梯度 离心 纯化 细胞 器 制品 。 
-XGO 用 25ml 细 网 器 提取 液 F 稀 释 所 得 叶绿体 4 邓 在 1800g 离 心 15 
分 钟 。 汪 
导 汪 儿 重 悬 在 5ml 细 胞 器 洗涤 液 互 中 ,再 离心 洗涤 细胞 器 。 
区 将 离 必 滴 降 的 时 稼 体 在 干冰 /乙醇 浴 中 冷冻 ,然后 在 22 避 水 
浴 中 融化 ， 重 复 冻 融 3 痰 后 ， 悬 于 5ml 核 邓 解 缓 症 波 中 。 
“1@ 凡 下 损 作 按 实 骆 12-@、 罗 步骤 进行 。 


和 535 


细胞 器 提取 液 F，300mM 甘 露 醇 ，50mMTris-HC1,pH8 .0，} 
3mM EDIA，0.1% 小 牛 血清 蛋白 (BSAD)，1lmMB- 莹 基 乙 本 
(2ME)。 配 制 该 溶液 时 先 不 衣 入 BSA 和 2ME， 该 深 液 灭 菌 后 、 
使 用 前 再 加 入 BSA 和 2ME。 

DNase 缓 冲 液 ， 与 细胞 器 提取 液 相同 ， 只 是 用 前 加 入 MgCcl， 强 
和 DNase 分 别 至 终 浓度 13mM 和 150 一 500ug/ml。 

细胞 器 洗涤 液 H，150mM NaCl，100mM EDTA ,pH8 0。 


(二 ) RNA 的 制备 


研究 RNA 的 合成 和 功能 ，mRNA 指 导 的 蛋 自 质 合 成 和 cDNA 
的 制备 ， 都 需要 分 离 提纯 RNA。 细 胞 中 的 及 NA 有 多 种 ，mRNA 


仅 占 RNA 的 1 一 5%， 且 分 子 量 不 同 。RNA 大 多 同 蛋 白质 结合 在 . 


一 起 ， 因 此 提取 RNA 需要 把 RNA: 与 蛋白 质 分 开 ， 连 续 去 除 蛋 
白质 ， 同 时 要 避免 在 抽 提 过 程 中 RNA 的 降解 ”最 重要 的 是 抑制 
RNase 的 活性， 这 是 操作 成 败 的 关键 。 RNase 不 仅 在 细胞 中 
有 ， 在 培养 液 和 汗 里 也 有 ， 必 须 尽 可 能 迅速 而 有 效 的 抑制 它 这 
就 是 为 什么 许多 实验 要 用 去 污 剂 ， 例 如 SDS， 它 可 使 RNase 变 
隆 。 当 路 去 去 污 剂 后 ，RNase 可 复 性 而 再 次 激活 。 为 避免 RNA 降 
解 ， 必 须 注 意 以 下 操作 :，@ 要 在 清洁 的 条 件 下 操作 ， 带 上 手套 。 
四 全 部 玻璃 器 严 需 高 温 灭 菌 ,最 好 将 它们 浸泡 在 0.5%% 三 五 基 焦 碳 
酸 〈diethylpytfocarbonate， 一 种 很 强 的 蛋白 质变 性 剂 ) 中 ， 100 姜 
保温 5 分 钟 ， 再 清洗 干净 灭 菌 。@ 溶 液 要 高 于 灭 菌 。 配 制 溶液 的 
水 可 用 DEPC 处 理 ， 每 升水 加 1 毫升 PEPC, 搅拌 1 小 时 脓 高 压 灭 
菌 。 包 应 用 高 纯度 的 化 学 试剂 。 使 用 RNase 换 制 剂 如 特制 是 士 、 
RNasine。 人 的 置 -2070 或 .800 存放, 这 
种 条 件 可 维持 RNA 二 级 结构 ， 阻 止 核酸 梅 降解 。 时 
庆 刘 要 庆 庆 同 ， 对 RNase 演 其 敏感 海 比 分 元 和 提 
特异 mRNA 基 最 成 功 的 例子 是 从 含有 大 量 特 异 mRN 人 的 细胞 中 提 
纯 。 但 所 有 mRNA 的 制备 ， 都 需 把 mRNA 同 DNAN ERNAJIRNA 和 
分 开 ， 采 用 选择 性 抽 提 , 分 级 分 离 与 亲 和 层 析 s 在 许多 情况 下 ,从 下 


3536 9 


屠 


总 的 RNA 里 分 离 特殊 mRNA 是 根据 分 子 大 小 ， 以 芒 糖 密度 梯度 
” 珊 司 工 制 备 泊 胶 电泳 分 离 。 


由 于 细胞 来 源 和 细胞 内 RNase 浓 度 的 不 同 ， 提 取 RNA 有 多 种 
操作 穆 序 ， 下 叙 面 述 果 蝇 提 取 RNA 的 方法 ， 可 作为 提取 RNA 的 
一 般 指 导 。 

: 工 . 抽 提 果 蝇 成 体 总 RNA 

@@ 在 85ml 的 匀 浆 杯 中 ， 室 温 ; 放 入 30mlRNA 抽 提 缓冲 液 
(0- 15MNaAc,)50mM Tris- 卫 Cl1,pH9.0,5mM EDTA,1%SDS， 
Eu 匀 浆 前 加 入 二 乙 基 焦 碳 酸 (PEPC) 到 芋 % 
沈 交 8. 

痪 这 罗 半 3 欣 | 每 次 30 秒 ， 每 这 间隔 80 秘 冰 浴 交友 : 

四 加 入 25ml 用 抽 提 缓冲 液 饱和 的 蒸 酚 (4C ) 继续 匀 浆 45 秒 
钟 于 -以 下 架 作 于 4 下 进行 并 将 所 有 溶液 预 冷 到 4*C。 

-的 将 匀 浆 液 倒 大 离心 管 , 振 葛 10 分 钟 , 而 后 离心 ，10000 xg， 


0 


5 用 10 一 15ml 抽 提 缓 冲 液 (省 去 DEPC) 再 抽 提 ， 离心 。 

四 合并 两 次 离心 的 上 清 液 ， 同 上 述 用 苯酚 抽 提 ?2 一 3 次 。 

沁 台 用 等 体积 前 伍 酚 - 氯 仿 - 异 戊 醇 -(24:2 丰 工 ) 牛 提 水 jz 二 离 

， 玻 出 扎 清 该 所 
电 本 随后 加 入 2.5 倍 体积 
的 95% (= 一 2070) 准 瑟 醇 沉淀 RNA， 于 -207 置 ?小 时 ,离心 收 
集 RN 志 这 演 ,2105000Xg，10 分 钟 。 

四 将 RNA 悬 浮 在 10ml10mM Tris-HCL PH7.6,1mMEDTA， 
oTSDS 深 液 中 让 转移 到 经 DEPC 处 理 的 离心 管 里 ， 痪 心 沉淀 多 
糖 ，250007poi (Backrman SW50 .1 转子 )》 45 分 钟 ) 2 一 4 ， 
Za 吸取 十 清 液 ,加 蛋白 酶 攻 为 100kgyml，37T7 保温 20 分 钟 ， 
之 后 用 苯酚 抽 提 溶液 2 次 ， 用 苯酚 -氯仿 - 异 戊 醇 抽 提 一 次 ,同上 述 
加 六 NaAc 并 用 乙醇 沉淀 RNA， 再 用 70% 己 醇 狂 RNA 辣 次 ， 将 
RNA 存 放 在 95 只 本 醇 中 放 入 =-20D 冰 箱 。 

2 .提取 果 蝇 胚 胎 的 多 聚 核 炉 体 RNA 


上 es。 537。 


台 将 肥 胎 在 0.7%NaCl，0.01% Triton 和 -100 中 清 刷 ， 而 后 
在 2 倍 稀释 的 5.25% 次氯酸钠 中 浸 2 分 钟 ， 再 用 NaCl-Triton 溶 液 
洗 豚 胎 ， 除 去 大 部 分 次 氧 酸 。- 

加 将 10g 肥 肥 巧 浮 在 25 一 50ml 的 多 聚 核糖 体 抽 提 液 中 缓慢 匀 
浆 破 碎 细 胞 。 

多 聚 核 糖 体 抽 提 液 ，0.25MKCI; 0.05M Tris-HC1;0.025M 
MgCl:，0.25M Sucrose，PIH7 .6。 

四 用 尼龙 布 或 几 层 纱布 过 滤 匀 浆液 ， 然 后 离心 y*10000X g，20 
分 钟 。 
由 在 Beckman SW25.2 离心 管 (预先 用 0.2% 二 乙 基 焦 碳酸 
处 理 和 无 菌 水 洗刷 ) 中 ， 放 入 15ml 无 菌 的 含有 50% (wv) 莽 炉 的 
多 育 核 糖 体 抽 提 液 ， 其 上 加 离心 后 的 上 清 液 。， 

@ 于 40 的 SW25.2 转子 中 离心 ， 沉 降 多 聚 核糖 体 瑟 25000 
rpm5 小 时 ， 倒 出 上 清 液 ， 迅 速 用 冰冷 的 多 素 核 糖 体 抽 提 液 洗涤 多 
聚 核糖 体 ， 然 后 弃 掉 缓冲 液 。 

@@ 将 沉淀 县 溯 在 RNA 抽 提 液 中 ， -085 朋 惩 100 在 室 
温 振 蔓 几 小 时 方 可 完全 晤 浮 。 

RNA 抽 提 绥 冲 液 ，0.15M NaAc, 0.05XNETIris2HC1I， 0.005M 
EDTA，1%SDsS,20Hg/ml 聚 乙 燃 硫酸， 混合 后 用 瑟 C1 调 p 且 为 9.0。 

@ 用 等 体积 饱和 缓冲 液 -苯酚 抽 提 3 次 ， 用 葵 酚 -氯仿 - 异 忆 醇 
抽 提 1 次 。 

四 将 土 层 液 移 入 DEEPC 处 理 的 离心 管 下 用 SW0 Wi 各 于 
40000rpm 离 心 45 分 钟 ，20 一 257。 

@ 加 NaAc 至 终 浓度 0.15M， 用 2， 5 人 体积 的 95% 淮 忆 检 这 
RNA,， 在 -20CE 放置 至 少 2 小 时 。 、 4 全 

四 离心 10000 X g, 10 分 钟 ， 空 于 后 用 70% 乙醇 洗 2 大; RNA 
在 95%% 乙醇 中 ， 置 一 207 存放 。 艺 
3. 植 物 总 RNA 的 制备 和 记 汪 式 撞 


包 称 取 新 鲜 植 物 材 料 oh 局 可 能 人 的 在 沪 和 中 光 


冻 ， 保 存在 波 气 中 。 
5 538 ， 


四 取 5 二 10 克 冷冻 的 叶片 材料 ， 在 一 个 液 氮 笃 冷 的 研 钵 中 研 


”成 细 未 ;不 时 添加 液 氨 使 组 织 处 于 冰冻 状态 。 


加 加 50ml 匀 浆 缓冲 液 ; 缓慢 研磨 ， 然 后 用 4 层 无 菌 平纹 纱布 
过 滤 妨 滤液 放 入 250ml 三 角 瓶 中 。 

四 将 匀 浆 液 转 至 无 菌 的 30ml 离心 管 中 ，4C ，8000g 离心 10 
分 钟 (8X50 转 子 )。 

@ 上 清 深 通过 4 层 无 菌 的 平纹 纱布 过 滤 。 

加 加 1/20 体 积 的 10%SDS， 使 终 浓度 达 0.5% 。, 

1@O 加 等 体积 的 水 侈 和 酚 ， 再 加 等 体积 的 氯仿 - 绎 成 本 (24:1)， 
室温 下 磁力 搅拌 20 分 钟 。 

上 加 转移 温 合 物 到 无 菌 的 50ml 离 心 管 中 ,2500g 离 心 ,10 分 钟 。 

2@ 将 水 相 (上 层 ) 和 界面 部 分 一 起 转 入 汗 洁净 的 250ml 三 角 
瓶 中 ,加 等 体积 氯仿 )， 混 匀 10 分 钟 ， 离 心 分 相 ， 只 吸取 水 相 。 

@ 重 复 氯仿 抽 提 ,直至 能 见 到 很 薄 的 一 层 蛋白 (通常 只 需 重复 | 
一 次 关 避 开 变 性 蛋白 ; 将 水 相 转 至 无 菌 的 30m] 离 心 管 中 ， 加 1/20 
体积 交 3M 乙 酸 钠 ,， 再 加 2 倍 体积 乙醇 =- 20C ， 过 夜 沉 演 核 酸 。 

GO4C 让 8000rpm 离心 20 分 钟 ， 收集 核酸 (Sorval .SS 一 34 转 
0a 呈 
1@ 用 1 一 2ml3MZ 酸 钠 ，pH6.0,40 洗 涤 沉 淀 2 次 以 去 除 乙 本 
与 DNA。 

1 四 用 合 001M 乙 酸 钾 的 80% 乙醇 洗 沉 淀 2 次 ， 并 贮存 在 这 种 溶 
液 中 (- 20C )。 将 RNA 干 燥 ， 深 于 蒸 馅 水， 用 分 光 ; 光度 计 : 测 ; 
RNA 合 量 涪 0O.Dyeoia= 40uUg/ml， 纯净 的 RNA 的 9.Dyei/OD，sn。 
站 庆 0。 上 

et 0.2M Tris-HCL pH8.5，0.2M 蔗糖 (去 除 
RNase 活性 )，30mM Mg(Ac)，，60mM KCl1， 或 者 用 新 鲜 的 灭 菌 
溶液 ,或 者 灭 菌 后 保存 于 - 202; 用 前 加 1% 聚 乙 科 聚 吡咯 烷 酮 和 
0 和 于 %%(v/v)B- 静 基 乙 醇 。 

外 提纯 PolyA-mRNA 

凡人 类 真 核 细 胞 抽 提 的 RNA 大 部 分 是 核糖 体 RNA、tRNA 和 各 种 


。 9539。 


核 RNA， 只 有 一 本部 分 是 mRNA， 通 常 低 于 5%3 这 些 mRNA 儿 
乎 都 在 3 末端 含有 PolyA， 因 此 可 用 Oligo(dT)-celulose 
分 离 mRNA， 当 抽 提 的 如 胞 RNA 通 过 柱 时 ， 王 alyA :mRNA 千 
在 柱 上 ， 然后 用 洗 脱 绥 冲 液 洗 脱 ， 回收 结合 在 柱 生 的 PobA- 
mRNA_ 
除 明 确 指 出 外 ， 所 有 操作 在 室温 进行 
由 将 RNA 沉 泛 去 除 乙 醇 ， 溶 解 在 oliso: Cam 池 有 坟 中 ， 
测量 Axseo 和 Ayxso 的 吸收 ?使 Axeeo/Azsi 之 2。 
IOligo (dT3 洗 脱 组 种 液 :10mMETIiS- 且 Cl et 6 1mM 
EDTA,，0.1%SDS。 版 人 9 和 证 ( 壕 开 请 乏 
四 用 洗 脱 缓冲 液 把 RNA 湾 液 调 成 5 一 10mB/mm 防 下 65 写 加 热 5 
分 钟 ， 迅 速 冷 友 ， 用 等 体积 的 2x Ofige (dT) 六 结合 缆 种 液 混合 
2xOligol faT) 笋 合 绥 种 液 四 tm Tris- BR 这 DH7.6， RN 
EDTA， 0:8M NaCl，02-1%SDS。: 和 和 
”四 使 KRNA 深 液 通过 Oljigo (dT) 才 维 素 村 6 FE 污 在 到 个 
0.9 厘 米 直径 的 柱子 中 ) ,柱子 预先 用 5 倍 体积 萝 1LXGligovkdT7 结 
含 缓冲 液 洗涤 。 也 可 用 第 水 前 柱子 ” 邵 移 液 器 头 (在 底部 丰 上 人 小 
量 和 硅化 的 玻璃 丝 )。 柱 子 的 流速 是 10 一 15ml/ 小 时 5 茂生 
江 xOiigo(dT) 结 合 绥 种 液 : 10mMTITris-=HCGIJRDH715 1mM 
EDTA 王 0.4MNaCl，0.1%SDS。 轧 MC 
- 鸭 将 出 液 再 返回 柱子 ， 循环 一 次 ， 仿 束 缚 存 隐 pog RN 人 
能 第 二 次 结合 在 柱 上 。 这 人 1 和 诬 芒 宙 贡 ) 逢 
的 用 5 一 8 倍 柱 体积 前 1X9ligo(dT) 结 合 组 受 冲 液 尖 柱 也 ,再 用 2 
倍 柱 体 积 的 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 mRNA， 分 部 收集 洗 脱 液 ,每 部 
ee 35 滴 ; air 付 莱 区 
@ 测 定 吸收 值 ,* 合并 紫外 吸收 部 分 品 4 末 本 于 江 才 下 SS 
: 信 再 层 桩 沁 在 @ 步 以 后 ， 测 定 合并 部 分 郊 体 用 全 在 6570 海 滚 
被 加 热 5 分 钟 ， 迅 速 冷却 ， 用 等 体积 的 2XQi 证 oo (CdTy 结 们 组 间 
液 夭 释 ， 将 样品 通过 同一 个 柱 〈 柱 子 已 用 史 倍 体 各 的 涪 缓冲 液 
和 玫 倍 体积 竟 结合 缓 冲 液 狂 涤 )， 重 复 @ 一 @ 步 又 中 最 拓 如 入 


= 40 


要 = 四 = 


FF- 二 站 


二 


Da 


NaAc 到 0.3M 和 2?.5 倍 体积 的 95% 冷 乙 和 沉淀 RNA， 置 20 水 
时， 离心 10)000xg，15 分 钟 ， 用 70%% 乙醇 洗 2 次 ， 空 干 。 


的 用 2 一 3 倍 体 积 的 0.1NKOH 洗 过 的 oligo (dT) 纤维 素 柱 ， 
再 用 5 和-7 倍 体 积 前 1x Oligo (dT) 结合 缓冲 液 ( 含 有 0.02% 
NaN;) 洗 后 将 柱 放 在 室温 备用 。 


(三 ) 质粒 DNA 的 分 离 


有 些 重要 的 细菌 基因 不 是 定位 在 染色 体 DNA 上 ,而 是 位 于 独 
立 复制 的 环 状 双 链 质料 DNA 上 ,分 子 克隆 的 主要 兴趣 不 是 研究 质 
粒 未 身 的 复制 和 表达 ， 而 是 把 质粒 作为 插入 外 源 DNA 片段 的 载 
体 。 居 多 数 用 作 载体 的 质粒 不 是 天 然 质粒 ， 都 经 过 人 工 修 禾 。 质 


粒 的 表示 方法 ， 如 pPAB123，p? 为 plasmid，“AB?” 为 分 离 质 粒 的 人 


或 实验 室 ， 数 字 则 表示 实验 室 对 质粒 的 编号 。 

根据 复制 模型 可 将 质粒 分 为 两 类 ， 即 严 紧 型 质粒 和 失 弛 型 质 
粒 。 严 紧 型 质粒 在 细胞 中 的 拷贝 数 只 有 几 个 或 十 几 个 ,这 类 质粒 的 
复制 依赖 于 宿主 蛋 站 质 的 合成 。 遗 传 工 程 最 常用 的 质粒 是 松弛 型 
质粒 ?它们 在 细胞 审 的 拷贝 数 一 般 有 用 十 个 ,而 且 它们 的 复制 不 依 
赖 于 宿主 的 蛋白 质 合成 ， 在 抑制 宿主 蛋白 质 合成 的 情况 下 ， 质 粒 
继续 复制 ， 拷 贝 数 增 加 10 一 20 倍 。 利 用 这 种 特性 ， 比 较 容 易 提取 
大 量 质粒 DNA，, 也 同样 可 以 合成 大 量 质粒 编 枉 的 产物 。 因 此 通过 
使 细菌 生长 在 丰富 培养 基 中 ， 当 细胞 浓度 达 5x108/ml 时 ， 加 入 
氧 霉 素 〈150ug/ml) 或 奇 放 线 菌 素 〈Spectinomycin，300Ug/ ma) 
继续 培养 12 一 15 小 时 ， 可 增加 质粒 DNA 量 。 

”质粒 DBNA 有 三 种 不 同 的 构 型 ， 即 线 状 双 链 形式 ， 开 环形 式 ， 
即 一 条 DNA 链 完整 ， 而 另 一 条 有 侧 口 ， 共 价 闭合 环 状 分 子 。 基 因 
操作 要 求 分 离 共 价 闭合 环 状 分 子 ， 根 据 它们 物理 行为 的 不 同 ， 一 
般 采 用 氧化 饮 - 省 化 乙 锭 密度 梯度 离心 法 分 离 , 快 速 小 规模 的 分 离 
可 用 碱 抽 提 法 。 

在 氯 化 驳 密 并 梯度 中 加 入 省 化 乙 锭 ， 可 对 不 同 构 型 的 质粒 有 


人 不同 的 影响 。 省 化 乙 锭 可 在 邻近 碱 基 对 间 产 生 相 也 丈 合 作用 ， 而 


。547 ， 


偶 展 DNA 双 螺 旋 ， 从 而 可 降低 分 子 密度 。 环 状 分 子 由 于 超 螺 旋 
构 型 可 限制 这 种 作用 ,结果 线性 和 开 环 DNA 营 合 省 化 乙 锭 多 于 环 
状 DNA 分 子 ， 故 在 氯 化 饮 -省 化 乙 锭 梯度 里 ， 环 状 DNA 分 子 成 带 
在 更 高 密度 ， 可 与 线性 和 开 环 DNA 分 开 。 另 外 由 于 省 化 乙 锭 结合 
DNA， 在 紫外 光照 射 下 ，DNA 吸收 交 能 量 转 给 省 化 乙 锭 会 显著 
增强 荧光 ,便于 观察 。 但 要 注意 ,短波 紫外 线 会 损 伤 DNA， 破 坏 
- 它 的 功能 ， 一 定 要 用 长 波 紫外 线 照 射 离 忆 管 来 观察 ; 


碱 抽 提 方法 是 基于 环 状 、 开 环 和 线性 DNA 在 碱 性 条 件 下 的 


行为 不 同 。 碱 处 理 使 DNA 氧 键 破 裂 仅 在 很 小 的 p 也 范围 内 ，DpHI12 
一 12.5， 在 此 范围 内 ， 只 有 线性 和 开 环 分 子 的 互 键 分 开 ， 而 超 螺 
旋 环 状 PNA 保 持原 样 ， 以 致 粗细 胞 抽 提 液 的 pH 为 12 一 12.5 时 ， 
淀 除去 它 。 从 上 清 液 里 用 乙醇 沉淀 环 状 质粒 DNA。 

一 般 允 解 细胞 的 方法 是 用 溶菌 酶 处 理 含 质粒 的 细胞 ， 形 成 原 
生 质 体 ， 同 时 缓冲 液 中 含有 蔗糖 ， 阻 止 原生 质 体 的 有 裂 解 。 完 全 和 裂 
解 需 加 入 一 种 去 污 剂 。 去 污 剂 有 离子 型 去 污 剂 , 如 SDS ,Sarcosyl， 
可 使 细胞 释放 出 总 DNA， 而 后 用 切 剪 力 〈 而 使 溶液 多 次 通过 注射 
针头 ) 使 染色 体 DNA 断 成 片段 ， 质 粒 DNA 由 于 小 和 超 螺 旋 构 型 而 
保持 完整 。 也 可 用 非 离子 型 去 污 剂 ， 如 Triton X-100，Brir58， 
使 大 部 分 染色 体 DNA 吸 附 在 细胞 成 分 上 ,在 低速 离心 时 同 细 胞 碎 
片 一 起 沉淀 。 高 分 子 量 的 质粒 会 某 种 程度 地 共 沉 淀 ， 因 此 这 种 方 
法 主要 用 于 分 离 多 拷贝 的 小 质粒 。 

1. 大 量 制备 大 肠 杆菌 质粒 DNA 

外 取 单 菌落 接种 于 60mlLB 培 养 液 (每 升 含 蛋白 肛 10g， 酵 母 
膏 5g,NaCl5g8，pH7.5， 含 有 适量 的 抗生素 Ap 20ug/ml， 或 Tc25 
hg/ml，Kan 10khg/m]j)。37C， 振 蔓 培 养 过 夜 。 

@ 次 日 ， 将 10ml 过 夜 培养 液 接 入 1 升 LB 培 养 液 ,含有 适量 的 抗 
生 素 。37C ， 培 养 至 ODeo。=0.8-1.0。 

Q@ 为 扩 增 质粒 拷贝 数 ， 加 入 300uhg/ml 奇 放 线 菌 素 (Spectino- 
mycin) 或 150ng/ml 氯 霉 素 。37C， 振 荔 培 养 16 小 时 。 


2 32 


-人 也 


AR es ac ecaass  - 罗 


” 轩 离 心 收集 细胞 ，4500g8，15 分 钟 ，4 。 

回 将 细胞 悬 泽 在 30ml 50mM Tris-HCI，pH8.0 和 25% 蔗 粮 
溶液 里 。 

@@ 加 入 10ml] 溶 菌 酶 (5mg/ml, 深 在 0.25M Tris-HCLI，pH8 .0) 
和 10mlEDTA (0.25M，pH8.0)， 混 合 冰 浴 保 温 15 分 钟 。 

加 加 入 50ml 去 污 剂 混 合 液 。 

去 污 剂 混合 液 ，5m110% Triten-X 100 〈 溶 在 0.25M Tris- 
HCI，pH8.0)， 125ml 0.25M EDTA; 25ml1.0M Tris-HCl， 
pH8.0; 加 H,O 到 500ml. 

轿 冰 浴 保 温 30 分 钟 。 

-9 用 Beckman SW27 转子 离心 ，27000 rpm，15 筷 ，1.5 小 
时 。 上 清 液 含 有 质粒 DNA。 

@@ 将 已 处 理 过 的 蛋白 酶 (prenase) 加 入 到 上 清 液 中 , 终 浓度 
为 250kg/ml (procnase 需 在 37T 预 保温 30 分 钟 ) 。 

@37T7 保温 30 分 钟 。 

四 加 入 0.5 倍 体积 用 50mM Tris=HCI (pH8:0) 侈 和 的 苯酚 ， 
混合 ， 离 心 1000g，10 分 钟 ，47 。 

四 吸出 水 相 ， 加 入 0.1 倍 体积 的 3M NaAc 和 2 倍 体积 的 95%% 
冷 乙 醇 ， 混 合 后 -20 过夜， 或 -70C ，30 分 钟 。 

@ 离 心 收 集 沉 淀 ，6000 xg，20 分 钟 ，47 。 

因 除 去 乙醇 , 干 辽 后 将 沉淀 溶 在 18ml 20mM Tris-HC1,10mM 
EDTA (pH8.0) 缓冲 液 中 。 

四 加 入 18g 固 体毛 化 饱和 0.1ml 省 化 乙 锋 溶液 (30mgy/ml 洲 在 
水 中 ) ,混合 均匀 。 

四 把 氧化 锡 溶 液 转 到 适合 的 离心 管 中 ， 管 的 上 部 用 液体 石 腊 

将 。 

四 离心 ，65000 TDm，15" 至 少 16 小 时 或 40000 fpm 155 48 
小 时 。 

四 离心 完毕 ， 在 光照 下 可 见 二 条 DNA 带 ， 较 上 部 的 带 由 线 状 
细菌 DNA 和 开 环 的 质粒 DNA 组 成 , 靠 下 面 的 带 则 是 闭合 环 状 质粒 


6 543 3 


DNA 。 

” 团 打 开 离 心 管 盖 ， 一 个 注射 针头 从 离心 管 侧 面 刺 六 澳 粒 
DNA 带 下 部 〈 针 口 平面 朝向 DNA 带 )， 收集 到 玻璃 或 塑料 离心 管 
中 。 

@@ 除 去 省 化 百 锭 。 步 又 如 下 : 

a .加 等 体积 水 饱和 的 异 丁 醇 或 异 友 醇 。- 

室温 离心 15008，3 分 钟 。 

d ea 重复 以 上 步骤 4 一 6 次 ， 直 到 
水 相 中 粉红 颜色 消失 。 

四 水 相对 TE 缓 冲 液 CL0mM is_HCL 1mM EDIA ,pH8_ 0) 
透析 数 次 。 

四 用 乙醇 沉 演 DNA。 

因 将 质粒 DNA 溶 在 少量 IE 缓冲 液 中 。 

2 .大 量 制备 枯草 宇 菌 质粒 PNA 

ti 

加 将 菌 体 悬浮 于 0.1 倍 体积 的 25%% 莽 糖 ，0.1M NaCl 和 0.05M 
Tris- 了 CI1，pH7.5。 

@ 加 入 溶菌 酶 0.5mg/ml， 混 合 ,37`C 保 温 20 分 钟 。 

四 对 每 20m] 悬 液 依次 加 入 4.8ml5M NaCl;1.2m10， 5MEDTA 
(pH8.5);26ml12%SDS 一 0.7M Nacl。 

回 缓慢 倒置 混合 一 次 ， 置 4C， 18 小 时 。 

加 离心 ，15000Xg，45 分 钟 。 

加 向 上 层 液 加 入 0.3MNaAc。 

国 加 2 倍 体积 的 冷 乙醇 ， 于 一 20 CC 至 少 放 2 小 时 。 

@@ 离 心 50008,30 分 钟 。 用 5 ml TES 液 (30mM Tris-HC1，pH 
7_.5,50mMNaCl,5mM EDTA) 深 解 沉淀 。 

四 加 RNase A(50hg/ml)， RNaseT(1un/ml) ， 混合 后 置 37sC ， 


30 分 钟 。 
加 加 预 处 理 过 的 Pronase(500hg/ml),37"C 保温 至 溶液 清早 5 


8 54 


四 进行 CsCI、BEB 离 心 。 方 法 同 前 。 

3.Ti 质 粒 DNA 的 制备 

@ 用 10ml 前 培养 液 接种 于 1000mlPA 培 养 基 中 〈 每 升 含 蛋白 
及 45，MgSO.2mM,pH7.2)。28sC 通 气 培养 24 一 48 小 时 。 

四 离心 收集 菌 体 ， 用 200ml TE 缓冲 液 洗 菌 ， 最 后 悬浮 在 80 
mlTE 缓 冲 液 中 。 加 入 10ml Pronase(5ms/ml, 深 在 TE 绥 冲 液 中 ， 
37% 预 保温 1 小 时 )，10mlSDS (10%% 溶 在 TE 缓 冲 液 中 )， 缓 慢 混 
侣 后 ，87'C 保 漫 1 小 时 或 直到 溶液 变 清 。 

加 将 裂解 液 转移 到 250ml 烧杯 中 ， 边 缓慢 搅拌 边 加 入 3M 
NaOH 调 pH 到 12.4 (用 pH 计 调 准 )， 室 温 下 慢 慢 搅拌 30 分 钟 ， 再 


加 2M Tris-HCI(pH7.0)， 调 溶液 pH 为 8.5, 此 时 溶液 粘性 消失 ,如 


果 溶 液 仍然 粘 ， 则 重复 上 述 变性 一 复 性 步骤 。 

四 将 裂解 液 转移 到 250ml 离 心 管 中 , 加 5M NaCl 至 终 浓 度 为 1 
M， 人 缓慢 倒 置 混合 ， 放 冰 洽 至少 4 小 时 。 

加 离心 沉淀 淮 色 体 DNA， 和 蛋 日 质 和 细胞 碎片 10000fpm， 4 
20 分 钟 “〈 日 立 高 速 离心 机 ) 。 将 上 层 液 转移 到 一 个 新 管 中 ， 加 入 
50%PEG6000 至 终 浓 度 为 10% ， 缓 慢 混 合 ， 放 冰 浴 过 夜 。 

加 离心 沉淀 DNA，7000rpm，4"C，15 分 钟 。 弃 上 清 液 ， 将 
DNA 悬 浮 在 2.5mlTE 缓 冲 液 ， 操 作 要 温和 ， 避 免 大 质粒 断裂 , 取 
0 .2ml 进 行 琼脂 糖 锋 胶 电 泳 ， 鉴 定 质粒 的 存在 。 

加 对 其 余 2.3ml1 加 入 5.7mlTE 缓 冲 液 , 加 8.6g 氧 化 侈 和 0.5mi 
省 化 乙 锭 溶液 110mg/ml， 缓 慢 混 合 后 , 转移 到 离心 管 中 ， 用 507Ti 
转子 离心 ，38000rPmy,15"C，42 小 时 。 

四 在 紫外 线 下 (366nm) 下 观察 质粒 DNA 带 ,用 注射 针头 刺 入 ， 
吸出 质粒 DNA。 

回 用 1 倍 体 积 饱和 TE 缓 冲 液 的 异 丁 醇 连 续 抽 提 5 次 ， 去 除 溃 化 
乙 锭 ， 再 用 2 倍 体积 的 TE 缓冲 液 稀 释 质 粒 DNA， 加 2 倍 体积 的 乙 
酵 ， 置 ~ 20*C 过 夜 。 

四 离心 收集 DNA 沉 淀 ，10000rpmy, 20 分 钟 。 沉 淀 干 燥 后 ， 惹 
浮 在 0.5mlTE 缓 冲 液 ， 转 入 1,5ml 小 离心 管 , 再 加 乙醇 沉 诈 。1000 

5 545 


ml 培养 液 大 约 得 到 50UngTi 质 粒 DNA。 

4. 快 速 分 离 少 量 质粒 DNA 的 方法 

(1) 碱 抽 提 法 

下 到 [全 下 国王 瑟 各 齐 9 后 二 3 本- 二 
培养 过 夜 。 

@@ 离 心 妆 集 菌 体 ，1500 xg，10 分 钟 。 

四 细胞 被 悬浮 在 0.2mI 溶 菌 酶 溶液 (50mM 葡 萄 糙 ，10mM ED- 
IAA，25mM Iris 一 互 Cl，pH8.0， 贮 存在 4*C， 临 用 前 加 六 溶菌 酶 ， 
浓度 为 5ng/ml)， 将 菌 液 转 移 到 1.5ml 塑 料 离心 管 ， 冰 浴 5 分 钟 。 

外 加 0.4ml NaOH-SDS 溶 液 (0.2N NaOH+1%SDS， 此 溶液 
应 从 10N NaOH 和 20%SDS 贮 备 液 配制 )。 混 合 ,， 置 冰 浴 5 分 钟 , 溶 
液 变 成 半 透 明 。 

@ 加 入 0.:3ml 酷 酸 钾 溶液 (60ml5M 开 Ac，11.5ml HAe， 
28 .5miHs9,pH4.8，* 放 室温 )， 混 合 后 出 现 沉 淀 物 ， 冰 浴 10 分 钟 或 
-20xC 放 5 分 钟 。 

@ 用 小 型 台式 离心 机 离心 收集 沉淀 ， 一 12000g 

@ 小 心 吸出 0.75ml 上 清 液 ， 转 移 到 一 个 新 的 小 离心 管 里 ， 加 
入 0.45ml 异 丙 醇 ， 混 合 。 置 - 20"C5 分 钟 。， ，- 

轿 转 至 室温 后 ， 离 心 5 分 钟 收 集 DNA 沉淀。 

加 除去 上 清 液 ， 用 lml170% 乙醇 洗 沉 诈 ， 离 心 -2 分 钟 。 

加 真空 干燥 DNA 沉 淀 ， 加 50hl TE 缓 冲 液 溶解 质粒 DNA, 用 2? 
ul 做 限制 性 内 切 酶 分 析 。 

此 方法 适宜 提取 大 肠 杆菌 * 芽孢 杆菌 等 质粒 DNA。 也 可 以 扩 
大 提取 规模 ， 从 1 升 培养 液 中 提取 质粒 。 开 始 步骤 是 将 细胞 溶 在 
20ml 溶 蓝 酶 溶液 中 ， 而 后 相应 按 比例 加 入 其 它 试 剂 。 质 粒 DNA 会 
含有 部 分 RNA， 电 咏 分 析 时 ，RNA 会 随同 小 分 子 量 的 PDNA 片段 
移动 ， 故 必要 时 需 用 RNase 处 理 ， 经 苯酚 一 氯仿 抽 提 后 ， 用 乙醇 
沉淀 DNA 

(2) Triton X-100 列 解法 

四 离心 5ml1 过 夜 培养 物 ，8000rpmy5"C，10 分 钟 。 


。546。 


着 
了 
0 


四 将 菌 体 悬 浮 于 100h1 20% 蔗糖 溶液 (制备 在 40mM Tris- 
， HCl 中 ，pHs.0)， 再 转移 到 1.5ml 小 离心 管 里 ， 冰 浴 5 分 钟 。 
图 加 入 20MI 浓 度 为 1bmgy/ml 的 溶菌 酶 ， 冰 浴 10 分 钟 。 
四 加 和 Il0bEo.5M EDTA，pH8 .0，0%C 10 分 钟 。 
@ 加 入 100 由 裂解 液 (50mM Tris-HCI,pH8.0,10mM EDTA， 
1%Triton X-_100) 。 
， @ 离 心 30,000g 30 分 钟 ，4sC 。 
关 ee 加 100 了 :oO 和 100ul 饱和 10mM 
ER 0) 的 苯酚 ，j 心 3 分 钟 。 
te ,离心 。 
@ 吸 出 水 相 加 1ml 冷 乙醇 ， 置 -70"5 分 钟 。 
四 离心 ， 沉 洽 用 70% 冷 乙醇 洗 2 次 。 
四 干燥 后 溶 在 50uw1 TE 缓 冲 液 里 。 
恒 (3) 煮沸 裂解 法 
@ 在 含有 适当 抗生素 的 平 血 上 划 线 培养 含 质粒 的 菌株 。 
了 四 用 牙签 刮 部 分 细胞 ， 悬 浮 在 50k1 冷 STET 溶 液 里 。 混 合 , 置 
二 冰 浴 。 
SITET，8% 莽 糖 ，5%Triton X 一 100,50mM EDTA，50mM 
Tris_HCI,pH8 0。 
加 加 籽 i 新 制备 的 湾 菌 酶 (10mg/ml, 制备 在 水 中 )。 
外 将 小 离心 管 放 在 沸水 中 处 理 40 一 60 秘 。 
0 ” 工 回 室温 离心 10 分 钟 。 
加 用 牙签 挑 出 沉淀 物 ， 保 留 上 层 液 。 
@ 加 入 40u 异 丙 醇 。 
@ 于 -= 20" 放 5 分 钟 。 
@@ 离 心 收 集 沉 淀 。， 
四 弃 上 层 液 ， 真空 干燥 沉淀 后 ， 将 其 溶 在 15hl 水 里 。 
渍 这 种 方法 简便 ， 可 以 抽 提 一 个 菌落 的 质粒 , 但 质粒 DNA 会 污 
染 有 染色 体 DNA。 
悬浮 细胞 前 应 将 离心 管 和 STET 溶 液 预 冷 。 
和 


5 .酵母 质粒 DNA 的 分 离 

中 离心 40ml 醇 母 培 养 液 (5x 10"* 细 胸 1m) 

四 将 菌 体 悬 泽 在 40m1 双 蒸 起 中 ， 洗 淋 、 离 心 v 和 | 

@@ 将 沉淀 悬 泽 村 天 这 
几 。 
预 处 理 缓 冲 液 ，0.2M Tris-HCI,，pH9.1，,1， 大国 于 1M 和 
EDTA,0.1MpB- 药 基 乙 醉 要 

由 细胞 被 巧 泽 在 25ml SCE 缓冲 液 中 连续 洗涤 2 次。 SCE 缓 冲 。 
液 ，1.0M 山 梨 醇 ，0.1M 柠 檬 酸 钠 ，pH5.8) 60mM EDTA。 

@ 加 25ml SCE 缓 冲 液 悬 浮 细胞 (细胞 密度 不 超过 10s/ml) ,加 ” 
Zymolyase 60000 至 终 浓 度 100ukg/mls 

@37C 保 温 25 分 钟 。 

@O 离 心 5 分 钟 ， 收 集 原生 质 体 。 

@ 将 原生 质 体 缓慢 悬浮 在 0.5ml ST 组 种 液 中 导 三 

ST 绥 冲 液 ，25% 巷 糖 ，50mM Tris-HCl,pH8.0， 

国 在 磁力 搅拌 的 同时 滴 入 9.5ml 裂 解 缓 冲 液 ,搅拌 1.5 分 钟 。 
裂解 缓冲 液 :50mM Tris-HC1,20mM EDTA ,1%SDS,pH 为 12348 
信号 关 交 

@37:C 保 温 裂 解 液 2 分钟 。 

由 通过 搅拌 加 2M Tris-HCICDPH7 .0) 缓 冲 液 ， 将 PH 调 至 8.5 一 旺 
9 

四 测量 体积 ， 加 入 固体 NaCl 至 终 浓 度 为 3%;GWAy 记 室温 了 
保温 30 分 钟 。 

曲 加 入 等 体积 NaCl 饱 和 的 苯 琴 ， 搅拌 混合 2 分 钟 。 

曲 离 心 回 收 水 相 ， 加 入 2 倍 体积 9%5% 冷 匹 和 醇 。 

四 置 -20"C2 小 时 。 

电离 心 收 集 沉 演 (6500rpm，- 5，30 分 钟 ) 

加 用 10ml70%% 乙 醇 洗 沉 淀 ， 除 去 过 多 芍 盐 ， 离心 /真空 干 操 
沉淀 后 ， 将 其 溶 在 50k1TE 缓冲 液 中 ， 放 置 4C8 

6,. 从 质粒 DNA 中 去 除 RNA 


548。 


本 “村 显 举 临 〈 如 Bal 31 酶 切 或 用 多 核 董 酸 激 降 标 记 限 制 性 内 切 
0 要 求 DNA 制剂 不 带 小 分 子 
RNA， 尽管 经 氯 化 饮 超 离 心 制 取 的 质粒 DNA 和 
潮 但 还 是 有 影 唤 的 。 可 用 下 列 两 种 方法 去 除 RNA。 
'， E (1) IMNaCl 离 心 法 ， 

“ 巴 测 是 DNA 济 液 的 体积 加 入 0.1 倍 体积 的 3 M NaAa 
(pH5， 2 六 入 2 售 体积 的 乙醇 ， 混 匀 放 = 20"C。 

四 离心 收集 DNA， 弃 乙 配 ， 在 真空 干燥 器 中 抽 于 DNA 沉 淀 : 

四 将 DNA 沉淀 溶 于 TE 缓 冲 液 ， 浓 度 至 少 为 100kg/ml。 

由 加 无 DNase 的 RNase 终 浓度 为 10ug/ml， 室 温 保 温 1 小 时 。 

加 在 适合 的 离心 答 中 ,加 入 用 TE 缓 冲 液 配 制 的 HIM Nacli4ml， 
在 其 二 加 1ml RNase 处 理 过 的 质粒 DNA 溶 液 , 如 有 必要 ， 用 TIE 充 
满 离 心 管 ， 离 心 40000 rpm，20*C6 小 时 (Beckman SW50 一 1 转 
子 )。 质 粒 DNA 沉 到 管 底 ， 朝 聚 核 苷 酸 仍 留 在 上 清 液 中 。 

@ 弃 上 清 液 ， 把 质粒 DNA 重新 湾 于 所 需 体 积 的 TE 中 。 

(2) Bio-GelA-150 层 析 : 

四 按 上 述 方法 中 一 由 步 又 ， 用 RNase 处 理 质粒 DNA。 

@@ 用 等 体积 的 苯酚 抽 提 一 次 。 

G@Bio-GelA-150 柱 (lcmx1l0cm) 用 TE(pH8.0) 和 0. 人 
溶液 平衡 后 ， 加 1ml 质 粒 BDNA 湾 液 到 柱 上 。 

由 用 含 0.1%SDS 的 TE 组 冲 液 洗 脱 ， 以 0.5ml 分 部 收集 。 

二 @@ 当 收集 到 15 管 时 ， 停 止 层 析 ,每 部 分 取 10u1 在 0.7%% 琼 脂 精 

凝 胺 电泳 上 分 析 ， 确 定 质粒 DNA 的 位 置 。 
| 四 将 含有 质粒 DNA 的 部 分 合并 ， 按 前 述 方法 @ 一 轿 步 所 述 ， 
和 抽 


人 0 


站 hr 


天 : (四 ) 限制 性 内 切 酶 和 DNA 连 接 酶 的 应 用 


台 细菌 有 限制 和 修饰 系统 ， 每 个 系统 都 有 一 种 甲 基 化 酶 和 一 种 
限制 性 内 切 酶 。 甲 基 化 酶 识别 一 种 特异 的 碱 基 顺 序 ， 甲 基 化 该 顺 
序 中 的 腺 叶 叭 或 胞 喀 啶 。 相 应 的 限制 性 内 切 酶 识别 这 段 相应 的 顺 


。549。 


序 ， 当 这 个 顺序 未 被 里 基 化 酶 甲 基 化 时 ， 则 切断 DNA. 双 链 ， 产 
生 等 摩尔 DNA 片 段 。 限 制 和 修饰 系统 可 以 在 外 源 DNA 的 某 些 位 
点 切断 DNA， 从 而 终止 外 源 DNA 的 功能 。 

在 限制 和 修饰 系统 中 ， 只 有 第 二 类 限制 性 内 切 栈 广泛 应 用 在 
重组 DNA 技术 中 ,目前 已 从 细菌 中 分 离 出 350 多 种 限制 性 内 切 酶 ， 
至 少 识别 85 种 不 同 的 识别 显 序 。 这 些 酶 识别 4 一 6 碱 基 对 的 特异 顺 
序 ， 切 断 双 链 DNA 可 产生 DNA 断 头 整齐 的 平 末端 或 DNA 断 头 互 
补 的 粘性 末端 。 如 ， 


(1 7) (27 


} 
一 GG35^ 5 CC 一 一 G3“ 5/ AATTC - 
-CC5′ 34GG- 一 CTTAA5′ 3 G- 


(3) -一 CTGCA3 .5/G- 
-G5'′ 3/ACGTC- 


典型 的 限制 性 内 切 酶 反应 是 使 DNA 和 酶 在 含有 Mg2+* 和 Na+， 
pH 接近 7.5 的 缓冲 液 中 反应 。 一 般 的 反应 条 件 见 表 18， 

在 实际 操作 中 ， 应 特别 注意 影响 限制 酶 活性 的 一 些 因素 ， 它 
们 包括 :四 限制 性 内 切 酶 的 反应 条 件 和 贮存 要 遵守 厂商 的 说 明 ， 
有 些 酶 要 求 特 异 的 反应 条 件 ,，pH 或 离子 强度 的 改变 会 严重 影响 酶 
的 活性 .@ 应 用 酶 级 试剂 并 用 双 蒸 水 配制 。@@ 一 些 试剂 像 乙 椎 、 
甘油 、 葵 酚 、 二 甲 基 亚 砚 会 改变 某 些 酶 的 裂解 特异 性 ， 净 其 对 
Bam HI，EcoRI，KpnI，Sau3A,SalI,Hba TI,PstT,PDdeI。 在 酶 
的 贮存 液 中 通常 含有 50% 甘 油 ， 以 防止 低温 贮存 时 冻结 ， 但 在 最 
终 酶 反应 液 中 ， 甘 油 浓度 不 要 超过 4% 。@ 在 建立 酶 反应 时 ,不 要 
认为 延长 反应 时 间 ， 可 以 减少 加 入 的 酶 量 。@ 酶 和 DNA 可 以 吸附 下 
在 管 壁 上 ,最 好 应 用 硅化 管 并 在 酶 介 中 加 入 小 牛 血 清 蛋白 或 明胶 
- @@ 加 免 重复 冷冻 和 融化 DNA.O 加 入 DNA 应 不 明显 改变 反应 液 的 


。550 。 


人生 限制 性 内 切 酶 的 一 般 反应 条 件 
反 应 类 型 


条 件 Joe gr 
| 全 本 2 

体 富 习 积 20 一 100 品 0.。5 一 5ml 

DNA 0 一 10ng 10 一 500hg 

酶 1 一 5u/ung DNA 1 一 5u/ug DNA 

Tris-HCICPH7 .5) 20 一 50mM 50mM 

MgC1， 5 一 I10OmM 10mM 

2 琉 基 乙醇 5 一 10mM 5 一 10mM 
”小 牛 血 清和 蛋白 50 一 500ug/ml 200 一 500ug/ml 

甘油 <4%(v/v) | <4%(v/v) 

NaLi 按 需 要 . 按 需 要 

时 _- 间 1 小 时 1 一 5 小 时 

温 度 37 站 47 习 


pH 和 盐 浓 度 。 四 避免 重金 属 离子 污染 DNA ,重金 属 可 抑制 酶 活性 。 

限制 性 内 切 酶 竟 选 择 依赖 于 DNA 分 子 上 裂解 位 点 的 存在 和 
位 置 。 一 些 内 切 酶 不 适用 ， 是 因为 它们 在 所 要 克隆 的 基因 之 内 或 
载体 并 不 含有 这 种 裂解 位 点 。 如 果 尚 不 清楚 所 要 克隆 基因 的 酶 切 
性 质 ， 应 优先 选择 应 用 那些 识别 6 个 碱 基 顺 序 的 内 切 酶 ,而 不 先 用 
识别 4 个 碱 基 硕 序 的 内 切 酶 。 因 为 根据 计算 推测 ,每 4096 个 碱 基 对 
有 一 个 6 核 音 酸 识别 顺序 ， 每 256 个 碱 基 对 有 一 个 4 核 苷 酸 识别 顺 
序 。 由 于 T4DNA 连 接 酶 连接 平 末端 效率 低 , 可 优先 使 用 产生 粘性 
未 端的 内 切 酶 。 连 接 时 如 果 DNA 末 端 GC 量 高 并 有 较 长 的 单 链 全 
展 ， 比 未 端 AT 量 高 、 单 链 伸展 较 短 的 DNA 片段 更 有 效 。 

分 子 克隆 实验 中 的 一 个 麻烦 问题 是 连接 时 载体 的 自身 环 化 ， 
由 于 没有 外 源 DNA 片 段 插入 ， 它 们 的 转化 效率 更 高 .因此 采取 一 
些 手 段 提 高 克隆 效率 十 分 重要 ， 这 里 简 述 三 种 方法 。 

@ 质 粒 经 内 切 酶 消化 后 ， 用 碱 性 碍 酸 酶 除去 5“- 未 端的 磷酸 
基 。 去 磷酸 基 的 5"-- 末 端 DNA 不 能 用 T4DNA 连 接 酶 连接 ,而 且 线 
性 质粒 分 子 转化 效率 很 低 。 只 有 外 源 DNA 片段 磷酸 化 的 5“- 末 端 


有 了 


才能 和 质粒 的 3"- 产 基 末 端 连接 ， 形 成 带 有 缺口 的 环 状 质 灶 , 当 这 
种 质 疗 苇 化 宿主 细胞 后 ， 体 内 修复 矶 口 构成 带 有 处 源 插 六 的 环 状 
质粒 分 子 。 


图 6-1 用 碱 性 磷酸 酶 阻止 载体 质粒 自身 环 化 的 示意 图 


@ 用 两 种 限制 性 内 切 酶 分 别处 理 载体 和 外 源 DNA,， 要 求 这 两 
种 酶 识别 不 同 的 顺序 ,但 可 产生 相同 的 单 链 末端 .如 质粒 用 BamHI 
裂解 ， 外 源 DNA 用 BCI I 裂 解 ， 前 者 识别 GGATCC ,产生 GATG 单 
链 末 端 ,后 者 识别 TGATCA 也 产生 GATC 单 链 末 端 。 连 接 酶 连接 两 
种 DNA 片 段 形 成 一 个 杂交 顺序 ， 这 个 顺序 再 不 为 Bam HI 或 BCII 虱 
所 识别 。 如 果 连 接 后 的 混合 液 再 用 Bam HI 处 理 , 则 可 裂解 自身 环 
化 的 质粒 分 子 ， 从 而 提高 克隆 效率 。 如 要 从 质粒 中 切 出 插入 的 慎 
DNA 片 段 ， 那 末 可 用 Sau3Al1 处 理 ， 它 识别 GATC 顺 序 。- 时 

@ 应 用 来 端 脱氧 核 背 酸 转 移 酶 在 DNA 分 子 的 34- 产 基 末端 加 了 
上 一 个 同 聚 核 背 酸 的 尾巴 。 如 将 polydG 加 在 载体 的 34- 未 端 ; 将 


-9552 9 


”Bolyde 加 在 外 源 PDNA 的 3 末端 ， 那 末 在 连接 时 载体 只 能 和 外 源 
。 DNA 环 化 。 选 择 适 宜 的 多 聚 末端 和 内 切 酶 ,可 以 重建 限制 性 内 切 
酶 切 点 。 如 对 Pst1 裂 解 的 DNA 加 上 PolydG， 则 可 恢复 Pstl 切 点 。 

T4DNA 连 接 酶 不 能 连接 具有 不 同 单 链 伸展 的 DNA 分 子 ， 或 
一头 为 单 链 伸展 ， 一 头 是 平 末端 的 DNA 分 子 , 这 些 末端 可 以 通过 
填充 或 去 除 单 链 尾巴 建立 平 末端 后 再 用 连接 酶 连接 。5/ 未 端 可 用 


T4DNA 聚 合 酶 或 DNA 聚 合 酶 I 的 Klenow 片 股 和 脱氧 核 背 三 磷酸 来 


。 填充， 伟 出 的 3- 未 端 可 用 特异 的 单 链 外 切 酶 或 内 切 酶 除去 。 

T4DNA 连 接 酶 是 T4 吻 菌 体 基因 30 的 产物 。 它 催化 的 连接 反应 
要 求生 TP 作 为 能 源 ; 可 连接 粘性 末端 或 平 末端 DNA 片 段 : 反应 机 
制 分 三 步 忆 ATP 中 的 AMP 转 移 到 酶 分 子 中 一 个 赖 氨 酸 的 E 一 NH， 
上 ; @AMP 从 酶 转移 到 DNA5' -未 端 硬 酸 上 ;， GDNA 的 34-OH 和 
AMP-5“- 了 末端 间 形 成 一 个 磷酸 二 脂 键 ， 并 释放 出 AMP。 


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虽然 T4DNA 连 接 酶 的 最 适 反应 温度 是 37C ,但 为 使 粘性 未 端 
配对 更 稳定 ， 一 般 连 接 粘性 末端 反应 是 在 10 一 16C。ATP 浓 度 为 
5mM 时 ， 会 完全 抑制 平 末端 DNA 的 连接 反应 。 为 7:5mM 时 ， 则 
完全 抑制 粘性 末端 DNA 的 连接 反应 ， 连 接 反应 的 最 适 ATP 浓 度 


站 旦 0.6mM。 


全 

全 
击 
户 ， 
“人 
四 


交 5 二 4 


大 局 杆菌 DNA 连 缀 栈 可 选择 性 过 过 次 巾 性 采 台 DNA 信 于 而 
不 连接 平 末端 DNA， 不 过 反应 需要 NAD- 催化。 

有 关连 接 反应 的 详细 理论 ， 请 读者 参见 Maniatis 等 (1982) 的 
叙述 。 一 般 地 讲 ， 相 对 于 载体 分 子 ， 要 用 过 量 的 DNA 片 段 ,以 便 
载体 DNA 优先 同 要 克隆 的 片段 形成 分 子 间 的 连接 。 

附 ，DNA 的 限制 性 内 切 酶 消化 和 连接 

酶 消化 DNA 反 应 一 般 用 0.2 一 1g&DNA ,反应 体积 20 一 50UI1 或 
更 小 。 每 HE&DNA 大 约 用 1 单位 限制 酶 消化 〈 般 常 把 一 个 单位 的 酶 : 


定义 为 在 一 定 反应 条 件 下 ， 保 温 1 小 时 ， 完 全 消化 1ug pBR322 或 - 


ADNA 所 需要 的 酶 量 ) 。 这 里 例 举 的 反应 仅 说 明 一 般 的 操作 程序 ， 
在 实际 研究 中 ， 使 用 的 材料 不 同 ， 目 的 不 同 ， 连 接 的 DNA 浓 度 、 
温度 、 时 间 等 也 不 相同 )。 
@ 用 合适 的 限制 性 内 切 酶 分 别 消化 质粒 载体 和 揪 入 DNA。 依 
次 将 下 列 溶液 加 入 1.5ml 塑 料 离心 管 中 ， 反 应 体积 20 一 50Hl。 
载体 反应 管 ” 捅 入 DNA 反 应 管 


和 XI XUl 
10Xx 缓 冲 液 5 ul 5 ul 
DNA XUI XUl 
”内 切 酶 XJUI XUl 
总 体积 50ul 50Uul 


H,O、DNA 和 了 酶 量 随 DNA 浓 度 和 内 切 酶 的 特异 活性 而 改变 。 
@ 于 37`" 水 洽 保 温 1 小 时 。 
人 @ 于 70"C 热 处 理 5 分钟 ， 使 酶 失 活 。 
四 加 入 等 体积 的 氯仿 ， 振 划 混 合 ， 离 心 1 分 钟 (42,000g)。 


回 将 载体 管 和 插入 DNA 管 的 水 相合 并 在 一 个 新 的 离心 管 中 ， 


加 入 1/10 体 积 的 3MNaAc。 
加 加 2.5 倍 体积 的 乙醇 ， 混 合 ， 置 - 20"C10 分 钟 。 
@ 离 心 5 分 钟 。 真 空 干燥 DNA 沉 深 。 


@@ 将 DNA 沉 淀 溶解 在 50kl 1 x 连接 缓冲 液 中 。10Xx 连接 缓冲 


液 ( 一 AIP) 


5 了 


和 
个 


Hom 六 交 训 0 SR 


660mM Tris_HCI，pH7 .5 
66mM “MgCl， 
100mM DTT 


应 用 前 取 10ul0.1MATP 加 入 90ul10 x 连接 缓冲 液 ,再 稀释 10 倍 。 制 


备 0.1MATP 时 ， 用 KOH 中 和 pH 至 7.0。 

四 取出 1 一 2 作为 未 连接 的 对 照 。 

@@ 加 入 lunlT4DNA 连 接 酶 (5 一 10 单 位 ) ， 缓 慢 混 合 。 

曲 保 温 在 12%C，6 一 18 小 时 ， 或 4*C1 一 2 天 。 

四 取出 1 一 2 连接 液 连同 上 述 对 照 液 ,用 0.7% 琼 脂 糖 凝 胶 电 
泳 鉴 定 连接 情况 。 

四 用 1 一 5ul 连 接 液 转化 感受 态 细胞 。 如 果 转 化 体 不 多 ， 可 用 


- 等 体积 的 乙醚 抽 提 连接 液 。 离 心 后 残留 的 乙醚 以 减 压 除 掉 。 


(五 )DNA 的 凝 胶 电泳 


凝 胶 电泳 技术 已 成 为 研究 DNA 分 子 的 有 力 工 具 * 这 种 方法 的 
特点 是 迅速 准确 、 省 钱 省 时 ， 需 DNA 量 少 。 按 分 子 量 大 小 和 构 


”型 ， 凝 胶 电 泳 可 迅速 地 将 各 种 DNA 包 括 质粒 DNA 和 DNA 片 段 分 


离开 ， 并 可 以 测定 完整 质粒 和 DNA 片 段 的 分 子 量 。 
DNA 电 泳 可 在 琼脂 糖 或 聚 丙烯 酰 腕 凝 有 掖 上 进行 ， 它 们 分离 
DNA 的 大 小 范围 见 表 19 与 20 中 数据 。 


表 19 琼脂 糖 凝 胶 分 离 DNA 大 小 范围 


凝 胶 中 琼脂 糖 量 (% ) 分 离线 性 DNA 大 小 范围 (kb) 

0.3 60 一 5 

0.。6 信 下 一 

0.。7 10 一 0.8 
0.9 7 一 :0。5 
区 6 一 0.4 
1.。5 4 一 0.。2 
2.0 3 一 0,1 


|， 。555 。 
业 
到 


- 束 20 聚 丙 疾 醚 肤 胶 分 离 DNA 大 小 范 轩 
凝 胸中 丙烯 酰胺 量 〈%%) 分 离 DNA 大 水 范围 ( 核 昔 酸 数 ) 
3 100 一 1000 
5.0 80 一 500 
8.0 60 一 400 
12.0 40 一 201 
20.0 10 一 100 


琼脂 糖 是 一 种 天 然 多 糖 , 是 以 1,3-8 半 弛 糖 苷 键 连接 而 成 的 二 
糖 聚 合 狗 ， 键 间 互 键 形成 交换 。 当 DNA 了 电泳 时 ，DNA 分 子 被 人 迫 通 
过 网 孔 走 向 阳极 ,分 子 移动 的 速率 决定 于 :DNA 分 子 量 `.DNA 的 构 
型 〈 环 状 闭合 、 开 环 、 线性 )、 潍 胶 孔 的 大 小 《 即 六 及 久 的 流 度 ) 
电泳 事 度 和 电泳 缓冲 波 。 方 法 的 般 指 导 是 ; 

@ 分 离 较 小 的 DNA 片段 ， 应 用 较 高 的 电压 。 

加 分 离 高 分 子 量 的 DNA， 应 用 较 低 的 电压 ， 分 辩 力 更 好 。 

@ 小 孔 胶 〈0.7 一 1% 和 琼脂 糙 ) 分 离 DNA 小 片 外 , 直 至 分 子 
量 10 x 10e。 

四 大 分 子 DNA (15 一 40x 104) 常用 ?0.5% 低 深度 琼脂 “ 
糖 凝 胶 。 
G 限 笨 性 内 切 酰 覃 解 衣 DNA， 脖 常用 Tris-HAc 缓 冲 液 。 

@ 分 离 部 分 提纯 的 质粒 DNA 可 以 用 Tris-HAc 或 位 二 -BO 
缓 冲 液 ( 依 赖 于 质粒 藤 大 小 ,小 于 20kb 用 Tris-HAc 缓 冲 液 )。 

琼脂 糖 的 浓度 范围 在 0.3 一 2% ,可 用 三 豆 板 和 水 平板 ? 当 凝 胶 
浓度 低 于 0:8 中 时 ， 用 水 平板 更 方便 和 稳定 。 用 垂直 板 会 得 到 更 罕 
的 带 。 做 胶 时 先 将 琼脂 糖 悬浮 在 电泳 缓冲 液 里 ， 煮 沸 至 溶液 变 得 ， 
均一 清亮 。 当 琼脂 糖 溶液 冷 到 50 一 607 时 制 板 。 为 了 增加 样品 的 
密度 ,样品 含有 甘油 或 蔗糖 (浓度 为 5--10% ) ,加 入 5 一 10%Ficoee 轩 
可 避免 形成 U 形 带 ， 加 染料 作为 可 见 标志 ， 通 常用 省 酚 蓝 ,浓度 恒 
为 0.025%。 用 省 化 乙 锭 染色 凝 胶 可 观察 DNA 带 ， 染 色 的 灵敏 度 国 

决定 于 DNA 量 和 片段 的 大 小 。 染 色 方 法 可 采用 将 省 化 乙 锭 加 在 凝 时 
胶 和 缓冲 液 里 同时 电泳 (对 DNA 移 动 度 稍 有 影响 ), 或 停止 电泳 后 ，” 


556 。 


as 5ug/ ml 的 省 化 乙 锭 溶液 中 ， 沫 色 30 一 60 分 钟 5 而 后 
”用 共 饮 水 脱色 ， 在 紫外 线 下 观察 DNA 带 。 
于 汪 涌 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 可 分 析 6 一 1000 对 碱 基 的 DNA 片 段 。 路 
] 胶 厚 度 一 般 为 1mm。 电 泳装 置 和 制 凝 胶 板 的 方法 与 蛋白 质 
。 和 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 相 同 。 贮 存 液 的 成 份 为 
本 A.40% 丙 烯 酰胺 
了 .2 冯 双 体 丙 烯 酰胺 
ITGC30S9MITris2H .BO 缓冲 液 ， 含 25 苹 MEDTALUPHS .3】 
Du. 四 甲 基 己 三 胺 . 
了 .10% 过 硫酸 胺 新 配制 的 ) 
”不 同和 孔径 的 凝 胶 是 依据 所 用 丙烯 酰胺 的 量 ， 改 变 B 液 也 可 改 
变 了 蕊 径 ， 信号 时 会 影响 胶 的 所 性 和 透明 度 。 凝 胶 幸 制 备 见 表 21 


人 
| 表 21 和 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 的 制备 

(mmET) te 

中 作 这 f 5 7 0 20 

A 12.5 30 50 
有 12.5 20 
2 村 和 0 
C 10 10 10 

D 0.05 0.05 0.05 
下 1 1 1 
95 38 .95 355 拘 


7 一 一 疼 体 积 为 100mt 一 - 一 - 


典型 的 非 变性 聚 丙 烯 可 胺 凝 胶 是 12 % 再 烯 栈 胺 ,0.4%% 双 丙烯 
栈 腾 ， 用 于 分 离 40 一 200 核 苷 酸 片 段 ; 电 让 在 10V/cm，18 小 时 。 
引 遂 则 固 绝 六 的 绿 再 焙 柳 腑 庶 胶 时 ， 凝 胶 会 了 过 必 其 网 
上 -5 到 斑 脂 本 并 加 强度 
3 DNA 伪 于 在 疾 胶 上 的 移动 度 在 一 完 范 围 内 是 分 字 的 通 娄 | 
人 


6757 1 


DN 人 的 移动 度 ， 可 测定 DNA 分 子 的 相对 分 子 量 : 通 常用 照片 来 测 
定 移动 距离 ， 精 确 的 方法 是 用 微量 密度 计 扫 描 照 片 ， 也 可 用 放 天 
的 照片 来 测量 ， 测 量 从 样品 到 每 条 带 顶 的 距离 刀 并 计算 相对 移动 “ 
率 。 分 子 量 的 log 值 对 相对 移动 度 画 一 条 曲线 ， 即 得 到 标准 曲线 。 
在 一 定 范围 内 有 线性 关系 ,然而 太 大 的 DNA 分 子 的 移动 度 不 再 依 一 
赖 于 其 分 子 大 小 ， 以 致 不 再 有 线性 关系 。 

电泳 测定 限制 性 内 切 酶 消化 后 的 DNA 片 | 朋 分 子 量 , 可 用 
EcoORI 消化 的 4DNA 上 片段，HindJI 消化 的 ADNA 片 段 或 EcoRL/ 
HindIIJ 双 消化 的 IDNA 片 段 作 为 电泳 标准 ， 计 算 分 子 大 小 。 

表 22 和 -DNA 的 限制 放 酶 切片 段 大 小 ( 按 碱 基 对 计 ) 

EcoRI 让 in 后 IT ”EcoRI/ 丰 indIiI 


0 1。 23,700 1。 21,800 
2。 7,540 2。 9,400 2。 5,240 
3。 5;930 3.。 6,660 3 5;050 7 间 
4。 5,540 4。 4,230 4。 4,210 
5。 47800 5。- 2;250 5737380 
6。 3,380 6。 1,960 6。- 1;,960 
7。 590 7. 19 戎 
8 100 8。 1;7620 
吧 0 
10。 “930 
1 和 号 环 国 区 
2 流 和 9 
-aaagaonecin 和 
了 
伟大 量 筛选 禽 质粒 细菌 的 方法 人 
下 述 三 种 方 统 适 于 纠 选 全 质粒 的 细 贡 ,也 可 用 于 分 子 量 测 


但 前 两 种 方法 与 第 三 种 方法 比 有 相当 大 的 缺点 55PS 裂 解法 简单 ， 
迅速 ， 由 于 这 种 方法 是 严重 的 剪 切 染 色 体 DNA; 斯 以 大 质粒 DNA 
同样 会 受到 损伤 , 故 这 种 方法 不 适 于 检测 大 于 50x 10* 的 质粒 或 低 
拷贝 数 的 小 质粒 。 第 二 种 方法 操作 比较 温和 ,可 角 选 分 子 量 达 300 


ss 558 。 


过 


On 


 X10* 的 大 质粒 ， 但 步骤 多 ， 费 时 间 。 第 三 种 方法 既 迅 速 又 简单 ， 
能 使 质粒 保持 完整 ， 并 形成 很 细 的 DNA 带 ,染色 体 DNA 仍 停留 在 
” 粳 孔 中 。 三 种 方法 不 仅 可 用 于 .eoli， 只 要 稍 加 改变 还 可 适用 于 
其 它 菌 。 


(1) SDS 裂 解法 : 

包 取 一 个 大 菌落 悬浮 在 100k1 含 20% 攻 糖 的 TES 液 中 。TES ， 
0.005M EDTIA 
0.05M -Tris 
0.05M NaCl，pH3.0 


1 @ 加 100 由 溶菌 酶 (5mg/ml) 室温 5 分 钟 。 


图 加 100 岂 0.25MEDTA， 室 温 5 分 钟 。 
四 加 100ul 2.5% SDS。 


”加 加 100 则 缓冲 液 饱 和 的 苯酚 。 


@@ 使 溶液 反复 通过 针 简 的 细 针 头 数 次 。 
人 @ 离 心 
@ 取 ?20 二 _50Ml 悬 液 进 行 琼脂 糖 凝 胶 电泳。 


(2) 第 选 拓 质 粒 的 方法 ， 


四 离心 收集 4mI1 对 数 期 细胞 液 。 
@ 基 浮 菌 体 在 150u1 蔗 糖 液 中 (25% 蔗 糖 溶 在 0.056M Tris， 


pH8.0)。 


四 加 100u1 湾 菌 酶 (5mg/ml 深 在 0.25M Tris，pH8.0) 反复 


倒置 离心 管 混合 ， 冰 浴 5 分 钟 。 
0 G 加 200U1 EDIA (0.25M pH8.0) 倒置 混合 ， 冰 浴 5 分 钟 。 


加 加 2504 SDS (20% 洲 于 TE 缓 冲 液 ) ,于 70D 热处理 5 分 钟 。 
@ 加 3M1NaoH， 使 PH 为 12.1 一 1213， 重 复 倒置 2 一 3 分 钟 。 


站 @ 再 加 XDH7.0 的 2M Tris， 降 从 DH 到 8 .5 工 9 .0。 


曙 加 入 250 岂 冷 的 NaCl， 充 分 混合 ， 冰 洽 4 小 时 或 更 长 。 
四 离心 ， 将 上 层 液 转移 到 新 管 中 ( 测 体 积 )。 
四 加 1/3 体 积 的 PEG 6,000 (42 % 了 PEG 溶 在 0.01M 磷 酸 钠 缓冲 


加 该 中 ， pHT7. 07。 


。 559。 


人 @ 缓 慢 混 合 ， 置 冰 浴 4 小 时 或 更 长 。 、 二 请 咕 1 
因 离 心 ; 5000rpmi 4C ，10 分 钟 。 2 
四 将 沉淀 溶 在 50 一 1000 10% 玉 精 和 省 酚 蓝 溶液 中 ， 取 10 一 
_ 40 由 加 在 0.7 一 0. 9%% 琼 脂 糖 凝 胶 上 ， 电泳 用 Tris 一 五 ; 和 
10v/cm，4 小 时 。 

(2a) Eckhardt 凝 胶 电 泳 法 ; 


“试剂 
A TBE 绥 冲 液 ，89mM Tris，;?89mM HBO:，2.5mM Na， 


一 了 EDTA ipHR Zi- 

B RNase 溶 液 . 2.5mg/ml RNase 深 在 TENG 绥 冲 液 - 50mM 
Tris，DH7.5，1mMEDTA，50mM NaCl 5% 甘 酒 ) 中 5907C 保 
温 20 分 钟 。 0 

C 工 瑟 8 0.05MCTPIS， 中 噩 RD3 0.02M EDTA。% 

D .溶菌 酶 液 ， 对 革 兰 氏 阴 性 菌 溶液 制备 在 TBBE 中 未 含 溶菌 酶 
7,500ug/mlRNase 0.3ug/ml.0.05%% 省 酚 蓝 和 20%Ficoll40,000.。 
对 草 兰 氏 阳 性 菌 除 含 溢 蓝 酶 75,00u4g/ml 外 ， 其它 成 份 相同 。 

， 卫 .SDS 湾 液 ， 对 划 兰 氏 阴 性 菌 为 含 022%SDS 需 吧 人 Ficoll 的 
TBE 湾 液 。 对 草 兰 氏 阳性 菌 为 含 2%SDS 兴 52%Eicol 的 TBE 深 液 。 
F.Ficel 溶 液 # 制备 含 2096Ficoll40;009 的 TBE 深 液 8 


操作 : 《0 8 
@ 培 养 5ml 生 长 至 对 数 中 期 或 戎 业 期 是 尖 的 硼 养 法 < 
加 调整 细胞 浓度 约 为 3x 10 /mls ; 售 吕 


四 离心 1ml 贡 液 # 用 0.5mI 含 有 0. Usarkosyl 的 TE8 访 。 二 
四 将 细胞 悬浮 在 508420 冯 Ficolls LO5S 
加 预先 制备 一 个 垂直 型 的 琼脂 糖 凝 胶 板 (0. 711 15036 斑 脂 业 3 
用 TBE 制 各 ， smm 厚 )， 在 每 个 样 上 :8 郭 训 2mm 机 的 交 曾 量 
液 。 和 所- 订 : 卫 : 让 
@ 再 加 10 和 细胞 液 ， 辣 洲 菌 本 液 混 多 吕 静 轩 5 分 钟 ; 呈 D 
@ 吉 盖 SDS 溶 液 100 屿 ， 不 要 同 溶菌 酶 液 混合 十 FF 
四 再 将 熔化 的 琼脂 精 加 在 SDS 深 液 之 十， 硅 住 模 孔 5 三 


s。 560 。 


”和 图 加 电泳 缓冲 液 ， 接 通电 源 ， 电 泳 在 0.4V/cm， 1 小 时 。 
王 多 增 加 电压 到 5V/cm， 继 续 电泳 几 小 时 。 
@ 四 取出 凝 胶 ， 染 色 30 分 钟 后 观察 质粒 DNA 带 。 
2. 限 制 性 内 切 酶 消化 和 DNA 的 凝 胶 电 泳 
(1) 酶 切 DNA 
四 把 平 列 溶 液 依次 加 入 1.5ml1 离 心 答 中 
蒸 饮水 ”直到 ?50 
”10X 组 冲 液 2.5nul 
DNA( 直 至 1ug) 2 .0Ul 
内 切 酶 (1 一 2U/UEDNA) 工 世 
总 林 积 个 记 防 丁 本 生 20 亿 
四 混 丰 后 ,，37?7 保温 1 小 时 。 
国 707 处 理 10 分 钟 ， 放 冰 浴 。 
(2) 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 〈 人 参考 第 四 章 第 一 节 ) 
中 用 20x EB 贮 存 液 制备 足够 量 的 电泳 缓冲 液 EB。 
20X 了 三 B: 800mM Tris，40mM Na EDTA，400mM NaAe。 
0 捞 兰 游 解 96.68. Tris，15.38g NasEDTA; 53.43g8 NaAc， 
| 用 HAcs 调 pH 至 7.9， 加 水 到 1000ml， 灭 震 后 放 室 温 。 
“加 用 EB 缓 冲 液 制备 0.7% 琼脂 说 凝 胶 深 液 ， 卷 济 迄 化 后 冷 却 
到 50C， 倒 入 电泳 槽 制 凝 胶 板 。 3 
四 在 小 离心 管 里 混合 下 列 溶液 : 2..5ul DNA 消 化 站， 5ul 加 
样 液 &G202fFEicoll 和 0 锁 Hf0 一 15HL EB 液 5 终 体 积 为 
20 人 5bES 
上 i ;加 加 稚 外 括 已 知 天 水 的 DNA 片 芭 帮 为 分 子 量 竺 准 。 
TO@ 接 通电 源 ，DNA 移 向 正极 ， 电 压 不 超过 5V/cI 
@ 用 溴 化 亏 锭 染色 ， 茹 馅 永 陪 色 后 ,在 紫外 灯 下 观察 , 照 像 。 
(CODNA 片 段 的 聚 丙烯 酰 胶 凝 胶 电 泳 : 
 。  @ 为 制备 50ml 丙 烯 酰胺 溶液 , 混合 下 列 溶液 ，5ml 10X 灾 BE 
， 梁 冲 液 光 .5ml 蔬 %% 丙烯 栈 腕 贮存 液 337.5ml 水 0.5ml10%% 过 硫酸 
答 “〈 新 配制 的 );50hl 四 甲 基 乙 二 腕 。 


se 6。 


10 xTBE ,500mM Tris ,500mM HBO:,,25mM Na EDTA ， 
即 称 量 60.55g Tris，30.90g 硼 酸 ,9.3g NazEDTA 加 水 搅拌 溶解 
成 1000ml， 放 室温 。 

丙烯 酰胺 贮存 液 ， 40g 丙 烯 酰胺 和 1. se 双 体 卫 类 本 肛 溶 于 水 
制 成 100ml， 存 放 在 47 。 

包 将 凝 胶 深 液 倒 入 电泳 装置 ， 制 成 凝 胶 板 。 按 上 述 配方 ， 应 
在 5 一 10 分 钟 聚 合 。 

外加 样 后 电泳 ，DNA 移 向 正极 ， 电 泳 缓冲 液 是 ExTBE ， 电 
压 为 1YVcm 和 8V/cm 之 间 。 

四 染色 凝 胶 ， 观 察 照 像 。 

(4) 限制 性 酶 切 DNA 片 段 的 分 子 量 测定 

OO1lug 质 粒 DNA 和 1 单位 内 切 酶 同 适 宜 的 酶 切 缓冲 液 混合 . 终 
体积 为 20 一 25u1。 

@ 按 推荐 的 温度 保温 60 分 钟 。 

四 于 70C 处 理 样 品 5 分 钟 ， 停 止 反应 。 

外 疝 样 品 加 入 1710 体 积 的 50% 甘 油 和 0. 25% 省 酚 兰 溶液。 

四 衬 品 和 作为 分 子 量 标准 的 酶 切入 DNA 片 外 ( 用 前 在 70C 处 
理 10 分 钟 后 迅速 冰冷 ), 同 时 电泳 在 Tris 一 HAC 缓 冲 液 系统 中 。 
@ 曙 妆 色 凝 胶 并 照 像 ， Reuse 

3. 从 琼脂 糖 凝 胶 上 回收 DNA 0 

<1) 低 熔 点 琼脂 糖 凝 胶 法 

申 将 CDNA 样品 电泳 在 低 熔 点 琼脂 糖 儿 胶 上 ， 电泳 后 用 刀片 把 长 
含有 所 要 回收 的 DNA 带 从 凝 胶 上 切 下 来 , 放 入 1.5ml 的 离 忘 管 里 。 

四 加 1 倍 体积 的 TE 组 冲 液 〈( 需 浸没 凝 胶 ， 否 且 有 韩文 直人 
的 TE 缓 冲 液 )。 中 旭 

四 置 657 保温 10 分 钟 ， 疑 胶 志 化 成 均 -- 液体 。 站 和 和 浊 
appsatampapieuempamaeoeoc 振 葛 混合 ,离心 
10 分 钟 。 聊 柜 了 | 

，@ 朋 出 上 层 组 村 和 全部 分 再 加入: 信 体 可 的 亲 振 药 全 

， 离 心 10 分 钟 。 证 襄 王 芝 三 


4 .562 。 


@ 用 乙醚 抽 提 上 述 缓冲 液 2 次 。 
@ 加 入 1/10 倍 体积 的 3M NaAc， 加 2 倍 体积 的 冷 乙 醇 ， 放 
~ 20T7 过 夜 。 
@@ 离 心 15 分 钟 ， 沉 省 DNA。 
@ 使 DNA 干 燥 后 ， 旺 浮 在 无 菌 水 中 ， 终 浓度 为 100kg/ml。 
“ 飞 20 电 洗 脱 法 
 @ 停 止 电 泳 后 ， 用 刀片 切 下 一 条 兹 胶 染 色 ， 在 uv 线 下 观察 
与 未 娄 色 的 凝 胶 相 配 ， 确定 所 需 回 收 的 DNA 条 带 ; 用 刀片 切 下 来 ， 
转移 到 透析 袋 中 ， 人 冲 液 (10mM 惠 时 1mM 
BA7 员 过 汪 从 区 
@ 在 一 个 电泳 槽 中 ， 放 入 汪 层 电 洒 缓 冲 液 将 封口 的 透析 级 
以 平行 电极 方向 放 入 槽 中 。 
加 于 100V， 电泳 2 一 3 水 时 ，DNA 移 出 凝 胶 ; 入 缓冲 液 ; 
外 逆向 电泳 30 秒 ， 以 使 附着 在 透析 袋 上 的 DNA 把 向 进 六 缓冲 
丢 。 冰 考区 二 品 痉 涪 员 
@ 打 开 透 析 袋 ， 小 心 吸出 袋 中 的 汤 有 缓冲 液 ， 再 用 少量 缓冲 
液 洗 袋 。 
@ 用 省 化 乙 锭 染色 袋 中 的 凝 胶 条 ， 在 uv 线 下 检查 是 否 DNA 
已 全 被 洗 脱 。 
@ 用 苯酚 -氯仿 抽 提 DNA。 
SG@ 加 乙醇 沉淀 DNA。 
@ 将 DNA 溶 解 在 少量 无 菌 水 中 ， 终 浓度 为 100ug/Imle。 
(3) 冷冻 抽 提 法 ; 
四 用 刀片 切 出 含 所 需 DNA 的 凝 胶 条 ， 切 成 小 瑞 后 ， 分 配 到 
.5mlI 小 离心 管 中 7 加 入 200U1 葵 酚 。 
四 振 功 混合 衬 品 '， 置 低温 冷冻 。 
加 离心 ，12,000xXg，15 分 钟 ;使 凝 胶 沉 演 。 
四 吸出 顶部 水 相 ， 这 种 从 凝 胶 中 排出 的 缓冲 液 含有 要 回收 的 
DNA。 
加 加 入 200hl TE 组 冲 液 到 管 中 ， 振 划 混 合 后 离心 ， 吸 出 水 相 
56 了 ， 


同 四 步 水 相合 并 。 后 3 村 

@@ 用 等 体积 的 北 酚 搬 提 2 次 。 NA 负 

@ 世 醇 沉淀 DNA。 了 

4 .制备 性 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 

四 制备 一 个 其 有 单 加 样 槽 芍 琼 脂 糖 放 胶 。 

琼脂 糖 清 度 ， 一 般 应 用 0.8% 一 1.4% 了 琼脂 竹 岂 决定 于 所 要 分 时 
离 DNA 片 段 的 大 小 :DNA 带 分 开 的 程度 和 所 分 离 的 DNA 量 "为 了 
减少 DNA 带 拖 尾 ， 通 常 选择 高 百分比 琼脂 糖 ; 龙 其 分 离 大量 DNA 
的 时 候 。 和 但 从 低 浓度 琼脂 糖 凝 胶 上 咨 蛇 抽 提 大 的 DR 六 上 译 航 -分 离 

人 aa 通常 用 1% 琼 脂 交 许 胸 ， 分 离 500bp 的 片 必用 9 的 

脂 糖 凝 胶 。 2 

凝 胶 大 小 ， 电泳 距离 愈 长 ， 分 高 科大 痢 和 通 带 误 鄙 板 引 
15cm 和 省 寅 功 夭 126m。 MieoRa 胶 厚 1 5 证 经 分 离 四 


100bg 以 土 DNA 为 4mm。 
@DNA 同 染料 -甘油 液 混合 ， 小心 地 加 在 树 蝇 术 部 ,- 不 
可 造成 DNA 染 料 液 同 电泳 缓冲 液 混合 
加 电泳 时 间 是 所 要 分 离 的 DNA 片 肛 天 水、 本 浓度 、 
厚度 和 所 用 地 压 药 函数 半 典型 条 件 是 : 3 
a.2.5kb DNA 片 段 ，1:1% 琼 脂 糖 ， EN 央 am 攻 ， 
150Vi(30 一 40mA) ,3 小 时 。。 二 项 尝 


b:500bp DNA 上 片段，1.14 % 琼 脂 糖 ， 板 攻 1 4mn 厚 ， 
80OV 6G40 一 50mAD 坟 小 时 5 志 全 

G@DNA 片 段 的 定位 车 

a: 用 切片 刃 在 北 胶 顶部 作 标记 。 “ 亩 ” 长 次 和 个 | 

b. 从 凝 胶 两 边 各 切 下 一 窄 条 凝 胶 90 放 在 4m8g7 本 1 漠 北 已 锋 海 
液 中 染色 ?2 分钟, 而 后 水 洗 腾 色 。 eapnged 革 
带 ， 并 确定 斋 需 BNA 片 段 药 位 置 。37000:07 二 休 丙 


Je 从 胶 上 上 切 出 所 需要 前 DNA 区 域 半 万 一 生 环 清 和 
@ 在 一 干 汐 的 玻璃 板 上 ， 忌 可 能 区 将 久富， RDNA 和 

盾 提 波 润 湿 凝 这 。 AN : 
e 56 和 


。 。 锋 将 切 碎 的 琼脂 糖 胶 块 放 入 一 个 4ml 离 心 管 里 ,( 可 轩 几 个 


” 管 帮 加 2 一 3ml DNA 抽 提 液 。 


DNA 抽 提 液 : 
NH4Ac 3.86g (0.5M) 
Mg(Ac)， 0.214g(10mMD) 
Na EDITA -3.728 (0.1mM) 
SDS 0.1g (0.1%) 
0 加 ddH,O 至 100ml 
[LNH.Ac 不 稳定 ， 需 将 于 燥 固 体 放 次 箱 里 .用 新 配制 的 缓冲 
液 。 
人 @ 用 无 菌 玻璃 棒 将 凝 胶 碎 片 悬 浮 在 缓冲 液 中 并 再 次 搞 碎 。 
@ 封 盖 离 心 管 ， 人 DNA 将 扩散 到 抽 提 
液 中 。. 
|- 轿 离 恬 必 如 Beckmarm sw5031 转 子 ，30,000rpm，30 分钟， 
207 ) ,移出 水 相 。 
图 将 沉 省 的 琼脂 糖 胶 悬 浮 在 3. 5ml 本本 本 65?7 保温 
1 一 2 小 时 ， 同 上 离心 。 
JIQ@ 合 并 DNA 溶 液 ， 加 入 2 倍 体积 的 95% 冷 乙醇 ,于 -207C 放 置 
至 少 1 小 时 。- 
四 离心 收集 DNA 沉 演 ，6,500fpm,5C1 小 时 。 
四 将 DNA 悬 浮 在 0 .5 一 1ml 无 菌 双 蒸 饮水 中 ,对 双 蒸 饮水 透析 
12 一 -24 小 时 (室温 为 以 除去 盐 和 SDS 。 
1@ 把 PNA 转 移 到 一 个 1.5ml 离 心 管 里 ， 离 心 2 分 钟 , 吸 出 上 清 
液 ， 再 加 六 0.2ml 双 燕 水 ， 离 心 ， 合 并 2 次 上 清 液 。 
加 加 入 0.1 体 积 2M NaCl， 加 2 倍 体积 095% 冷 乙醇 沉 证 PNA， 
最 终 & 将 DNA 湾 在 100Ul TE 绥 冲 液 中 。 
5.Southetrn 印 迹 转移 
DNA 可 从 琼脂 糖 凝 胶 上 转移 到 硝酸 纤维 素 滤 膜 上 或 有 化 学 洒 
惧 的 滤纸 上 (DBM 滤 纸 )， 而 后 滤 竟 可 用 放射 性 标记 DNA 或 PNA 


， 探 针 杂交 ， 用 放射 自 显影 法 显 出 图 象 。 


5065 


由 整个 操作 过 程 中 都 需 带 手套 。DNA 在 玉 脂 糖 凝 胶 圭 电 泳 
以 后 ， 用 省 化 乙 狂 〈5kg/ml) 染 凝 胶 ， 在 ay 线 下 照 像 5 

外 用 切片 切 去 凝 胶 边 缘 ， 使 凝 胶 边 缘 整 齐 ， 并 切 去 凝 胶 板 的 
一 角 ， 以 标记 凝 胶 的 方位 。 

包 将 凝 胶 放 在 一 个 玻璃 盘 或 糖 瓷 盘 内 ， 加 入 500ml 0.25M 
HCI 深 液 人 
泡 15 分 钟 后 ， 重 复 用 水 洗 。 

四 加 入 500ml 0.5M NaoH，1M NacCl 变性 缓冲 液 〈 即 称 取 
20g NaCOH 和 58.44g NaCl 加 水 至 1 升 )， 浸 泡 15 分 名 后 , 重复 用 水 
@ 加 入 500ml 1M_ Tris 一 HCL (DH8.0))0.6MNacCl 市 和 缓冲 
液 -( 即 称 取 121g8 Tris,34.8g NaCl,55m1 浓 互 C 呈 加 水 至 1600ml， 
用 NaOH 调 pH 为 8.0) ,浸泡 30 分 钟 ， 而 后 用 水 重复 洗涤 凝 胶 。5 

@ 取 一 个 搞 姿 盘 ,加 满 20 XSSC(SSCI 0.15M NaCl07015M 
Na-cittate pH7.0)， 把 一 个 玻璃 板 架 在 瓷 盘 上 ， 和 玻璃 产 要 比 活 
胶 大 坟 点 ; 放下 寺 全 全 上 全 汪汪 的 于 下 (或 ? 层 Wrat- 
man 3mm 滤 纸 ) ,不 能 有 气泡 出 
1 加 把 凝 胶 小 心 铺 在 滤纸 上 ， 把 相当 于 凝 胶 厚 
度 药 塑料 条 或 玻璃 条 放 在 凝 胶 的 四 周 ， 与 凝 胶 相 距 2 这 米 5 | 见 图 
示 。 

四 清除 凝 胶 表 面 过 量 抑 液 体 。 

@ 裁 取 一 块 硝酸 纤维 素 滤 膜 ， 比 凝 胶 长 和 宽 都 大 1 厘米 ,用 20 
xSSC 浸 泡 , 干 30 秒 后 平 铺 在 凝 胶 上 ,不 得 有 气泡 。( 和 保持 滤 民 清洁 
十 分 重要 ， 铺 泪 膜 时 要 使 用 锰 子 和 带 手 套 ， 一 号 铺 在 凝 胶 主 就 不 
要 再 改变 纸 的 位 置 ， 否 则 要 更 换 滤 膜 )。 

思 取 两 块 与 硝酸 纤维 素 滤 膜 辐 样 大 小 揭 滤 纸 ( 如 丈 hatmaz 
3MM 或 几 层 国产 滤纸 ) ,在 20x SSC 中 浸泡 一 下 ， 销 在 硝酸 纤维 未 
滤 腊 上， 避免 出 现 气 泡 。 

四 在 滤纸 上 旗 上 10cm 厚 的 普通 了 卫生纸， 其 大 小 要 比 滤 纸 稍 
小 。 再 在 纸 上 放 一 块 玻璃 板 ， 并 用 500g 的 重 物 压 在 玻璃 板 主 。 


0 


汪 本 二 
re 


@@ 室 温 转 移 12 一 24 小 时 ,转移 的 速率 决定 于 DNA 的 大 小 和 凝 
胶 的 浓度 。 在 0.8% 琼 脂 糖 凝 胶 上 转移 小 片段 DNA〈<<1000bp) 
“ 需 1 一 2 小 时 ， 而 转移 大 于 15kb 的 DNA 片 段 要 15 小 时 或 更 长 时 间 ， 

随 着 卫生 纸 变 湿 ， 要 更 换 新 的 卫生 纸 。 

四 转移 完毕 后 ， 去 掉 卫 生 纸 和 滤纸 ， 用 圆珠笔 或 软 心 铅笔 标 
出 凝 胶 和 硝酸 纤维 素 滤 膜 的 方位 。 

3 四 小 心 刮 起 硝酸 纤维 素 滤 膜 ,用 2 x SSC 充 分 漂洗 ， 洗 去 它 上 
面 的 任何 琼脂 糖 凝 胶 。 凝 胶 可 重新 用 溴 化 乙 锭 染色 ， 在 uvy 线 下 观 
察 转移 是 否 完 全 。 

加 湛 刚 被 清洗 后 ， 放 在 两 层 厚 滤纸 之 间 ， 吸 干 水 溶液 。 
四 再 把 滤 膜 放 在 两 层 新 滤纸 之 间 ， 置 真空 炉 中 ，80C2 小 时 
如 果 不 立 刻 用 于 杂交 ， 可 将 硝酸 纤维 素 滤 膜 密封 在 塑料 袋 中 。 


500 克 重 物 


十 es。 5067 9 


人 wareeeaaaaaia5iRpageiyeneeanurreo maeioeeaaE2m 二 一 一 一 


(六 ) 展 粒 的 转化 


在 一 些 天 然 转 化 系统 里 ， 细 菌 需要 进入 一 种 称 作 感 受 态 的 生 
长 时 期 ， 细 胞 才能 摄 入 DNA .感受 态 细胞 能 够 结合 DNA，, 使 DNA 
抵抗 核酸 酶 的 作用 。 这 些 功 能 是 通过 一 些 结合 DNA 的 蛋白 质 完 成 
的 。 进 入 细胞 的 DNA 通 过 重组 和 基因 表达 ， 产 生 转 化 体 。 大 肠 杆 
菌 没有 天 然 的 转化 机 制 ， 但 用 氯 化 钙 处 理 细 胞 ， 可 以 人 工 诱导 感 
受 态 。 在 低温 条 件 下 用 和 氯 化 钙 处 理 指 细胞 会 膨大 ， 形 成 一 种 能 抗 
DNase 的 复合 物 ， 当 在 427 热 击 细 胞 时 ，DNA 进 入 细胞 ， 环 状 质 
粒 DNA 的 转化 频率 要 比 线性 质粒 分 子 高 10 一 100 倍 。 由 于 受 体 存 
在 着 限制 和 修饰 系统 ， 以 及 为 避免 质粒 与 染色 体 同 源 部 分 重组 ， 
一 般 受 体 为 缺失 限制 修饰 系统 和 重组 缺陷 的 菌株 。 

为 了 提高 枯草 杆菌 的 质粒 转化 频率 ， 发 展 了 原生 质 体 转化 方 
法 。 它 包括 在 PEG 诱 导 下 ,原生 质 体 摄 入 质粒 DNA 和 在 再 生 培 养 
基 上 细菌 细胞 壁 的 再 生 。 缺 少 感 受 态 的 芽孢 杆菌 都 可 用 原生 质 体 
转化 方法 。 

酵母 细胞 也 可 用 酶 处 理 形 成 原生 质 体 ， 在 PEG 作 用 下 实现 质 
粒 转 化 ， 经 再 生 细 胞 壁 得 到 转化 体 。 最 近 木 村 光 〈(A.Kimura) 报 
告 了 用 阳离子 处 理 酵 母 细胞 ， 质 壮 可 转化 完整 细胞 的 方法 。 

1. 大 肠 杆 菌 的 质粒 转化 (IT) 

感受 态 细胞 的 制备 和 冷冻 贮存 

@ 用 前 培养 液 接种 50mlLB 培 养 液 ， 细胞 窗 度 约 107/anl 37 闻 
振 功 培养 。 

@ 当 培养 液 的 CDsso=0.5(~5x10s/ml) 时 将 培养 液 置 4C 

G@470 离 心 ，8000rpm，8 分 钟 〈 日 立 20 一 2 转子 ) 号 

四 将 细胞 悬浮 在 20ml 冰 冷 交 0.1MCaCcl, 中 ， 绥 慢 地 搅动 5 二 恒 
10 分 钟 ， 离 心 。 -于 

@ 再 将 沉 演 浮 在 20ml 冰 准 的 0.1MCact 中 汪 浴 保 将 列 共 痢 
钟 后 ， 离 心 。 - 


35068。 


和 


PP 


@@ 把 细胞 重新 悬浮 在 2ml0.1:MCaCl,，15% 甘油 液 里 ， 此 时 


】 可 将 细胞 液 按 0.2ml 分 成 若干 小 管 ， 贮 存在 -70G 或 80C 。 每 
。 次 转化 时 ， 取 出 小 管 置 冰 浴 融化 。 


转化 过 程 : 

四 取 100pl 感受 态 细胞 加 10UIDNA 溶 液 ， 绥 慢 混 合 。 

四 冰 浴 10 分 钟 后 ， 转 到 37C 5 分 钟 。 

四 加 入 2mlLB 培 养 液 ， 于 377 振 划 培养 1 小 时 。 

四 将 100u 培 养 液 涂 布 在 适当 的 选择 培养 基 上 ，37C 保温 过 


2: 大 肠 杆 菌 的 质粒 转化 (II) 

加 将 EvcoliHB101 接 种 到 25mlIN 培 养 液 中 ， 培 养 至 对 数 期 。 
N 培 养 液 成 分 (1000ml) 

蛋白 肪 108， 酵 母 膏 18，NaC188 

葡萄 糖 15，CaCls.2H:O0.3g8，pH7.0。 

加 将 细胞 培养 液 离 心 ，3000rpm，5 分 钟 ，2-4C。， 

图 将 细胞 重新 悬浮 在 2.5m150mMCaCls 中 ， 离 心 。 

外 重新 基 浮 细胞 沉 证 在 1.25m 150mMCaCl:z 中 ， 冰 浴 静 置 3 


小 时 。 


@@ 取 100u1 上 述 细 胞 液 与 100bl 转化 缓冲 液 混合 ， 加 入 10Rl 


DNA， 置 冰 浴 30 分 钟 。 


转化 缓冲 液 : 

10mMTris-HCI (pH8.0)，10mMCaCl。2H2O，| 
10% 甲 酰胺 ，10mMMgC1. ,10mMNaC1l。 

@ 从 07C 移入 4270 水 浴 处 理 40 秒 ， 立 即 加 0.8mlN 培 养 液 ( 预 


先 37 C 预 热 )。 


@371 轻微 振 蔓 90 分 钟 。 

四 将 细胞 涂 布 在 含有 不 同 抗生素 的 选择 培养 基 上 。, 

Q@377 保温 24 小 时 。 

3. 枯 草 杆菌 的 质粒 转化 

电 用 0.5ml 过 夜 培养 液 接种 50mlSPI 培养 基 ，377 强力 振 苏 


。 569。 


SFI 培养 基 : SPI 盐 液 100ml1， 葡 萄 糖 1ml (50%)，CAYE 
lml (水 解 酷 素 1g5， 醇 母 粉 5g， 加 ddH:O 至 50ml)。 

SPI 盐 液 的 配制 ，(NH,)。SO,1g，K,HPO,7g,KH， esdg:， 
MgSO,.7H;0O 0.18，Nacitrate. 2H;O (柠檬 酸 钠 ) 0.5g， 加 
ddH,O 到 500ml。 

@ 通 过 测 吸收 值 监 视 生 长 ， 直 至 对 数 末 期 

-图 加 5ml 上 述 培养 液 到 45ml1 预 温 的 SPII 培 养 液 中 ，37 组 慢 
振 蔓 90 分 钟 。 

SPII 培养 液 ， SPI 盐 液 100m1， 葡 萄 糖 1nl，CAYE1lml， 
CaCl,1ml(0.28g Cacl, 加 ddH,O 至 500ml)，MgClslm1(2.548g 
MgCl, 加 ddH,O 至 50ml) 。 

引 加 入 0.5mlEGTA ( 乙 二 醇 双 乙 胺 醚 -=-N，N7 -四 乙酸 )， 
377 继续 保温 5 一 10 分 钟 。 


@ 曙 取 0.1+ 一 0.5ml1 细 胞 液 加 1 一 3uU8DNA， We 5ml 无 菌 小 ” 


离心 管 里 ，37?7 振 葛 90 分 钟 。 

@ 取 0.05 一 0.1ml] 涂 布 在 选择 堵 养 基 上 ，37?7 保温 。 

@ 为 以 后 应 用 而 冷冻 贮存 细胞 液 , 则 在 第 外 步 不 加 入 EGTIA。 
冰 浴 冷却 细胞 后 离心 收集 。 

@ 将 细胞 悬浮 在 含 10% 甘 油 的 SPI 液 中 ， 分 成 若干 部 分 迅速 
冷冻 ， 放 -707 存放 。 
@ 转 化 时 ， 将 冷冻 细胞 液 于 42?7 迅速 融化 ， 每 毫升 细胞 加 入 
4ml SPII 。 

四 加 入 1/100 体 积 的 EGTA，5 分 钟 后 按 步 骤 @@@ 进 行 转化 。 

4. 桔 草 杆 菌 原 生 质 球 的 质粒 转化 

四 离心 收集 对 数 中 期 的 受 体 菌 (1 一 2 xX10 /ml)。 

@ 将 菌 体 悬 浮 在 1/10 体 积 的 SMMP 液 中 。 

SMMNMP:，4x 了 Penassay broth 或 LB， 

2XSMM 


两 个 溶液 等 体积 混合 喇 芝 


2 370 9 


SMM:，0.5M 藤 糖 
-0.02M 顺 丁 烯 二 酸 ” 
0.02M MgCl “用 NaOH 调 p 瑟 为 6.5。 

图 加 溶菌 酶 到 2mg/ml， 在 377 缓慢 振 划 30 分 钟 至 2 小 时 。 

四 离心 收集 细胞 〈2600g，15 分 钟 ) ,缓慢 好 悬浮 在 SMMP 中 ， 

”离心 洗涤 2 次 。 

@ 将 洗涤 的 原生 质 球 悬浮 在 1/10 一 1/15 起 始 体积 的 SMMP 液 

， 中， 此 时 形成 的 原生 质 球 在 室温 放 5 小 时 是 稳定 的 。 

，  @ 取 一 个 无 菌 管 ， 加 入 50hl2 xSMM 液 和 50bl 质 粒 DNATIBg 
5u8gDNA)， 混 合 后 加 入 0.5ml 原 生 质 球 液 ;再 立即 加 入 1.5ml400% 
PEG 深 液 ， 缓 慢 混合 。 

PEG 溶 液 ， 40g8PEG6000 和 50ml2 xSMM 深 液 加 水 至 100ml。 
@2 分 钟 以 后 ， 加 入 5mISMMP 溶 液 稀 释 PEG。 
国 离 心 收集 原生 质 球 ， 将 沉淀 悬浮 在 InISMMP 中 ,307 振 葛 

。 保温 1.5 沙 时 ， 使 质粒 基因 表达 。 

@ 适 当 稀 梳 PEG 处 理 的 原生 质 球 ， 涂 布 在 DM3 再 生 培 养 基 
上 ，377 保温 2 天 。 
DM3 再 生 培 养 基 : 每 升 含有 
200ml 4% 琼 有 哟 ，500ml 1M 琥 珀 酸 钠 (pH7.3) 
100ml 5% 水 解 酷 素 ，50ml 10% 酵母 粉 ， 
100ml 3.5%K>。 HPO 和 1.5%KH>PG， 
“25mL1 20% 葡 芍 精 ，20ml 1M MgCl， 
5mI 2%% 和 牛 航 清 蛋白 。 
四 在 适当 的 选择 培养 基 上 鉴定 转化 体 。 
5. 嗜 热 脂肪 芽孢 杆菌 的 质粒 转化 
@ 用 0.5ml 嗜 热 脂 肪 伞 孢 杆菌 (Bacillus stearothemophilus ) 
， 先 效 养 液 接种 50mlLGS 培 养 基 ，557 据 葛 培养 4 小 时 。 
LGS 培 养 基 ，10g 蛋 白 肛 “5g 酵 母 粉 
5g- NaCl 2.5g 葡 萄 糖 
0.15M 巷 糖 “ 加 水 至 1000mlpH7 .3 


沁 ee 57JT。 


@ 当 ODee。， 和 : 4 时 ， 离心 ， 470 收集 细 由 。， 
加 将 菌 体 悬 浮 在 2ml SMM 一 LG 液 中 (1 一 2x10syml)。 二 
SMM__LG， 等 体积 的 2 xSMM 和 2 XLG 混 合 液 。 
SMM 液 ，0.33M 莽 糖 ，0.02M 顺 丁 和 烯 二 酸 
0.02M MgC1 pH6.5 
LG 液 ， 每 升 含 10g 蛋 白 有 拒 ，5g 酵 母 粉 ， 
5gNaCl，2.5g 葡 萄 糖 ,pH7.3 二 
@ 加 入 溶菌 酶 (50kg/ml， 深 在 SMM 一 LG 液 中 )， 终 浓度 为 重 
1ng/mls 了 
@ 在 48C 缓慢 振 划 20 分 钟 。 
@ 离 心 ，4;,000xg，40，10 分 钟 。 
四 用 2ml SMM 一 LG 液 洗 一 次 ， 离心 同上。 
四 将 原生 质 体 县 在 2ml1 SMM 一 LG 液 中 。 
ONE 同 5 50ul2 xSMM 缓冲 液 
， 加 入 0.5mj 原 生 质 体液 ， 随后 加 入 1 5ml40%PEG( 制 备 在 时 
匡 sa， 预 热 到 48C。 
四 于 48C ， 缓 慢 混 合 2 分 钟 。 
国 加 入 5mlSMM 一 LG 液 。 
四 离心 4;000xg，40C，10 分 钟 。 
因 将 原生 质 体 悬浮 在 ImISMM 一 LG 和 0.01% 小 牛 血 清 蛋 昌 
中 ， 于 487 缓慢 振 划 1:5 小 时 。 
四 用 SMM 一 LG 液 〈 含 0.01% 小 牛 血清 蛋白 ) 适当 稀释 后 , 取 
100ut3mlRGTA 和 琼脂 〈50C ) 倒 在 含 25mlRGA 平 下 上 〈 平 亚 需 ， 
预 保 温 48C )， 如 直接 选择 抗 性 转化 体 ， 可 将 抗生素 加 在 RGA 和 
RGTA 中 ， 平 亚 放 48T 保温 5 天 。 
RGA (再 生 培 养 基 ): 
700ml 2.86% 和 琼脂 ，1.43% 蛋 月 及 
0:71%， 酵母 粉 .0.71% Nacl 
200ml 1M 蔗糖 ”50ml3% 下 再 :2PO， + 了 7 了 0% 玉 HPO， 
20ml125% 葡 萄 糖 10ml1% 水 解 酯 素 


0 


。 572 ? 


pH7 .3. 
RGTA:， 除 琼脂 浓度 为 0.85% 外 ， 与 RGA 相 同 。: 
6. 致 瘤 农 杆菌 的 转化 
[名 将 受 体 细 胞 A ,tamefaciens 按 种 在 YEB 培养 液 中 ，30C 培 
养 过 夜 ， 再 转 接 到 5mlIYEB 中 ， 细 胞 浓度 为 107/ml 
YEB 培 养 液 ， 每 升 含 牛肉 膏 13.3g8， 酵 母 高 1.0g 藤 糖 5g，， 

MgSO.。7H:O 0.24g。 

@307 振 划 培养 至 细胞 浓度 为 4x 102/ml 
轧 离心 收集 细胞 ，5,000rpm，4C 。 将 细胞 悬浮 在 YEB 中 。: 
由 离心 浓缩 细胞 ， 弃 去 上 清 液 。 
上 ” 因 将 细胞 悬浮 在 遗留 的 少量 液体 中 ， 冰 浴 之 后 在 干冰 上 冷冻 
2 分 钟 。 
@ 在 37C 融化 3 分 钟 ， 取 0 .2ml1 细 胞 转 入 1.5ml 无 菌 小 离心 管 
攻 里。 

@ 加 入 90UYEB 和 10RIDNA。 将 管 放 在 干冰 中 2 分钟, 而 后 放 
377C 25 分 钟 。 

@30T7 保温 1 小 时 ， 不 需 振 苏 。 

四 将 转化 细胞 液 加 到 5m1523 培 养 基 中 ,30? 振 葛 培养 1 小 时 。 
”523 培 养 基 、 每 升 含 蔗糖 108， 水 解 酷 素 8g5， 酵 母 襄 48， 
K;, HPO，28g”MgSO, .7H,OQ 0.15g，pH7 .1。 

@40 离 心 ， 弃 上 清 液 ， 将 细胞 悬浮 在 200k1523 培 养 液 中 。 
昌 取 100H1 涂 布 在 选择 培养 基 上 ，307 保温 48 小 时 。 
7 ;用 碱 性 阳离子 处 理 酵 母 细胞 的 转化 
GO 醇 母 细 胞 生长 在 100mlYPD 培 养 液 (1% 酵母 粉 ，2% 蛋 白 
有 陈 ，2% 葡 萄 糖 ，pH5.37 中 ， 于 307 振 划 培养 至 对 数 末 期 。 
和 四 离心 收集 细胞 ，10;000 xg，5 分 钟 。 
包 用 TE 缓冲 液 (10mMTris-HCI，pH8.0，1mMEDTA) 洗 
了 
四 沉淀 被 悬浮 在 TE 缓 冲 液 中 ， 浓 度 为 2x10* /ml 


上 
玫 


人 


ea。 573 。 


10ml2M MgCl， 10ml2% 小 牛 血 清 蛋白 (用 滤 膜 灭 菌 ) 


加 取 0， 5ml 转 入 一 支 试 答 ， 加 0.5ml0.2M 所 化 他 或 本 本 介 ， 
307 振 蔓 1 小 时 。 
四 取 0.1ml 转 入 1.5ml 小 离心 管 ， 加 15bI 质 粒 DNA(I 一 10ug) 

307C 静 置 30 分 钟 。 
@ 加 入 等 体积 70%PEG4,000 (PEG4,000 洲 在 水 中 ，120C 
充分 混合 。 :类 汪 
@ 于 307C 静止 1 小 时 。 

@ 将 1.5ml 小 离心 管 浸 在 427 水 浴 中 5 分 钟 ， 立即 在 室温 冷却 时 
细胞 。 
@ 用 水 将 细胞 洗涤 2 次 ， 最 后 悬浮 在 1ml 水 中 。 

申 取 0.1ml 涂 布 在 选择 培养 基 上 ，307 保 衣 。 


(七 ) 特 异 DNA 顺 序 的 检测 


鉴定 重组 转化 体 的 直接 方法 包括 质粒 DNA 的 物理 分 离 和 限 
制 性 内 切 酶 分 析 ， 应 用 放射 性 探 针 同 质粒 DNA 进行 离 体 或 原 位 是 
杂交 ， 利 用 免疫 方法 测定 质粒 DNA 所 合成 的 蛋白 质 产 愧 。 
首先 应 检测 重组 转化 体 的 选择 标志 。 提 取 转 化 体 的 重组 质量 
粒 ， 进 行 再 转化 ， 证 实 所 需 的 表 型 同 质粒 的 存在 有 关 。 作 重组 
DNA 的 限制 性 酶 切 物理 图 ， 既 可 以 了 解 插入 DNA 的 方向 ， 也 可 | 
为 进一步 进行 亚 克 隆 DNA 片 段 提供 依据 .在 含有 各 种 重组 分 子 的 
细菌 群体 中 ， 检 测 所 需 的 DNA 顺 序 ， 在 续 少 有 效 的 中 传 方法 时 ， 
则 可 采用 分 子 杂交 方法 ， 发 现 含有 特异 DNA 顺 序 药 重组 分 子 - 先 上 
使 变性 DNA 结 合 一 种 滤 膜 ， 如 硝酸 纤维 素 滤 膜 ,而 后 用 所 需 DNA 
顺序 的 特异 探 针 杂交 ,通过 放射 自 显影 检 出 含 所 需 DNA 顺 序 的 获 
落 。 有 时 可 用 免疫 方法 钥 选 基因 文库 中 的 特异 重组 质粒 ， 如 单 克 四 
隆 的 DNA 片 段 ， 能 在 体内 被 有 效 地 转录 和 翻译 ， Se 
白质 产物 ， 则 可 用 这 种 产物 的 抗体 来 检测 。 免 疫 测定 法 有 多 种 ， 
包括 抗体 和 产物 在 平 阵 上 形成 沉淀 带 ， 放 射 性 标记 抗体 法 和 酶 标 二 
记 抗体 法 等 。 通 常 将 抗体 或 抗体 片段 吸附 在 固体 支持 物 上 ， 如 聚 
两 乙 玫 、 又 氧 乙 烯 或 案 丙 烯 塑 料 薄 膜 上 ， 而 后 同 平 耿 上 虱 解 的 菌 一 


645746 了 


“ 落 接 触 ， 结合 抗原 的 位 点 可 再 用 放射 性 标记 或 酶 标记 抗体 结合 ， 
通过 放射 自 显影 或 酶 使 产物 变色 的 反应 检测 出 所 需 的 分 子 兄 隆 。 
这 个 过 程 可 用 图 5 一 3 没 括 ; 


十 IgG 


人 


图 6-3 免 关 测 定 法 示意 图 
-1 杂交 探 针 的 制备 一 负 口 平移 
试剂 :. 
DNA 0.5ug 
DNA 事 合 酶 LI (E,coli) 
前 dNTPs 巡 存 液 , "dCTP，dGTP  dTTP- 每 种 浓度 0.03M 深 
解 在 水 中 ， 置 207 存放 。 
10 x NT 缓冲 液 ; 
500mNME Tiis-HCL，pH7 ,8, 50mM MgCl。 10mM8- 琉 基 乙 
醇 ，500ug 小 牛 血 清 蛋 白 。 


4 AAS 


10x 洗 脱 组 冲 液 ， 
0:1M TIris- 了 CI，pH8.0，10mM EDTA, 

闪烁 液 ， 4g8PPO +0.28POPOP/ 升 工 甲 菜 访 

步骤 ， 

四 用 Parafilm 封 住 含 有 50kCi dATP (3:2P 标 记 % 磷酸 ) 的 
1.5ml 小 离心 管 志 进 行 真 空 干燥 。 

. 四 冰 洽 制备 反应 混合 液 ; 包括 0.5U8DNA,5hl10 xNTI 缓冲 
液 ，1hldNTPs 贮 存 液 ， 加 水 至 终 体 积 50bl。 

@@ 将 反应 混合 液 转 移 到 含有 s*?P-dATP 的 小 离心 管 中 , 混合 。 

@ 加 入 1hlL (5 个 单位 ) DNA 聚 合 酶 IT, 室温 保温 30 一 60 分 钟 ， 
或 保温 在 15Y 2 一 3 小 时 后 放 冰 浴 。 因 市 售 的 DNA 素 合 酶 I 常 污染 
有 少量 的 内 切 核酸 酶 活性 ， 故 不 另 加 DNaseI。 如 果 聚 合 酶 有 很 
低 的 内 切 酶 活性 ， 则 加 入 如] 稀释 的 DNaseI (DNasgeI 贮存 滚 浓 度 
为 Imgy/ml， 制备 在 0.15MNaCI 和 50% 甘 油 中 ， 贮 于 -207 。 稀 释 
液 是 10ELDNasel 贮 存 液 ， 加 入 1ml-IXNI 绥 冲 液 元 

回 除去 未 参 入 的 核 背 酸 。 用 一 个 移 液 管 ,建立 一 个 5mi 的 
Sephadex G5( 柱 ， 加 入 反应 混合 液 ， 用 TE 缓冲 液 洗 脱 ， 放 射 性 - 量 
DNA 首 先 流出 ， 以 0.5mil 《10 沉 ) 部 分 收集 ,一 般 开始 5 管 可 洗 陪 
放射 性 DNA。 

@ 测 定 放射 性 ,放射 性 活性 可 达 io0 x 10scpm7ag 测定 反应 
动力 学 的 方法 如 下 ， 在 反应 过 程 中 ,吸取 0; 5 反应 混合 液 加 到 冰 
浴 的 5% 三 氯 醋酸 中 ， 然 后 用 GE7C 下 闹 滤纸 过 滤 ， 用 3m15% 三 所 
醋酸 和 乙醇 洗涤 。 滤 纸 干 燥 后 ， 放 入 闪烁 狐 ， 加 入 10mi 亲 烁 液 ， 
计数 放射 性 。 

2.DNA 一 DNA 打 交 

@ 把 烘 干 的 硝酸 纤维 素 泸 膜 ( 兄 实验 5 6) 源 浮 在 6X SSC 流 
面 上 ， 滤 膜 湿润 后 再 使 滤 膜 完全 浸没 在 6x SSC 中 ?分钟 。 

@ 将 湿 站 膜 装 入 塑料 袋 中 〈 要 求 袋 不 透气 ， 不 和 水 )。 

四 对 每 平方 厘米 的 硝酸 纤维 素 沾 膜 加 入 0. 2m 温 热 到 6 687 的 
预 杂 交 液 。 


4 376。 


牢 杂 交 液 ，6x SSC，0 .5%SDS,5x Denhardt 溶 液 ,100hU/m 1 
变性 链 精 DNA。 
Denhardt 溶液 (50xX )， 
Ficoll 5g5， 聚 乙烯 吡咯 烷 酮 5g 小 牛 撑 清 蛋白 58 
加 叉 到 500ml， 贮 存在 -207 。 


带 。 杂 交 袋 浸泡 在 68 水 浴 中 ， 轻 轻 来 回 摆 动 ， 使 袋 中 预 杂 交 液 

能 够 流动 。 保温 2 一 4 小 时 。 

@@ 取 出 杂交 和 袋 , 在 袋 的 一 角 前 一 个 十 字 口 ， 挤 出 预 杂交 液 。 

@@ 把 杂交 液 加 到 袋 中 ， 加 入 杂交 液 的 量 ， 只 要 足以 使 滤 膜 保 

持 湿润 就 可 以 〈50ul/cm:? 滤 膜 :。 

杂交 液 ，6 xSSC，0,01MEDTA，0.5%SDS，5 xDetihardt 
溶液 “P- 标 记 的 变性 探 针 DNA ,1005g/ml 变性 链 
: 藉 DNA ( 先 将 探 针 DNA 和 变性 名 精 DNA 混 合 在 林 
管 中 ， 沸 水 老 沸 5 分 钟 ， 迅 速 冰 浴 冷却 ) 。 

RE 名 撞 田 杂交 瞄 中 的 气泡 ， 密 封 袋 。 

”于 图 于 685 水 浴 保 温 塑 料 代 ， 二 般 几 水 时 到 十 玫 术 了 时。 

@ 杂 交 完 后 ， 小 心地 将 放射 性 杂交 液 挤 到 一 个 试管 里 ， 迅 速 

取出 淡 膜 溯 不 要 证 尖 膜 干燥 ) ,立即 放 入 2xSSC 0.5%SDS 深 液 中 

《室温 成 40- 一 507 汶 缓慢 搅 薄 ，15 分 钟 后 重复 洗 一 次 。 

@ 将 滤 膜 放 在 2x SSC，0.1%SDS 溶液 中 洗 ， 不 时 搅拌 ， 室 

温 15 分 钟 。 重 复 洗 3 次 。 

四 再 用 0.1XxSSC，0.5%SDS 深 液 洗 ，687 保湿， 不 时 轻 轻 

搅动 ，2 小 时 后 更 换 溶液 ， 继 续 保 温 30 分 钟 。 

“ @ 洗 后 ， 用 普通 滤纸 吸 干 滤 膜 上 的 溶液 ， 把 渗 膜 包 在 塑料 膜 

中 ， 在 暗室 内 取 同 样 大 小 的 x 光 片 ， 进行 放射 自 显影 。 放 - 70 忆 上 曝 

光 二 用 小 时 到 一 周 。 

变性 链 精 DNA 的 制备 ; 

将 DNA (type-TI，Na 盐 ) 溶解 在 水 里 ， 浓 度 为 10mg/ml， 

需要 在 室温 下 磁力 搅拌 2 一 4 小 时 ， 促 进 DNA 溶 解 ， 将 DNA 溶液 


7 


人 和 
上 
1 2 


四 尽 可 能 从 杂交 袋 中 挤 出 所 有 气泡 ， 用 加 热 封口 器 密封 塑料 


. 通过 几 次 注射 针头 ， 煮 淖 10 分 钟 ， 分 成 小 份 后 ， 在 - 200 迪 存 。 

3. 原 位 噬 商 诬 杂 交 

中 将 适当 的 已 ,coli 菌 株 的 一 个 单 菌落 接种 在 5ml 含 有 0:2%% 考 
芽 糖 的 LB 培 养 液 中 ，37 振 划 培 养 过 夜 。 

@ 离 心 ， 将 细胞 悬浮 在 2.5ml 10mM MgSO, 溶 液 中 ,于 4C 贮 
存 。 

@@ 为 原 位 杂交 制备 哈 菌 资 。 吸 取 50b1 细 胞 液 同 稀释 的 坎 菌 体 
液 〈 每 平 四 约 产 生 10“ 噬 菌 夷 ) 混合 。 室 温 保温 5 分 钟 。 册 4ml 
45700.7% 的 软 了 琼脂。 浇灌 在 二 的 LB 平 血 上 。 

四 377 保温 平 秋 过夜 。 

加 将 含有 隐 菌 斑 的 平 血 置 4 冷却 1 小 时 ， 以 增加 平 血 上 层 软 
琼脂 的 硬度 。 

@ 放 一 块 于 的 与 平 下 大 小 相同 的 硝酸 纤维 素 滤 膜 在 平 严 琼脂 
上 ( 滤 膜 光滑 面 朝 下 )。 在 琼脂 和 滤 膜 间 不 得 留 有 气泡 。 一 旦 畏 上 
滤 膜 ， 则 不 可 再 揭 起 和 移动 位 置 。 

吕 把 铺 上 滤 膜 的 平 严 置 4C 族 15 分 钟 。 为 标记 滤 膜 和 平 亚 的 方 
位 ， 用 吸 有 蓝 墨 水 的 针头 在 滤 膜 的 边缘 穿刺 滤 膜 和 琼脂 (〈 黑 墨水 
可 混 含 有 1ug/mI 的 变性 未 标记 的 探 针 DNA)。 二 二 去。 
本 @ 应 用 一 种 国 头 钼 子 十 分 细心 而 组 击 地 将 尖 脐 提 起 记 绝 不 可 
损伤 屯 脂 表面 ， 提 起 后 的 滤 明 再 不 可 接触 琼脂 。 1 省 
塑料 东 谍 包 误 平 血 ， 室 温存 放 。 

四 取 3 个 玻璃 盘 ， 分 别 放 三 张 双 hatman 3MM 湿 纸 。 

四 用 0.5MNaOH，1. MT 人 沪 沪 侈 和 第 入 委 让 宝生 加 后天 
膜 放 在 纸 堆 上 10 分 钟 〈 滤 膜 的 喉 菌 畜 面 向 上 )。 

四 用 1MTTris-HCI，pH7.5，1.， EMC ME 
滤纸 ， 把 滤 膜 转移 到 这 个 纸 堆 上 ，10 分 钟 。 Re 

@ 用 2xSSC 深 液 饱和 第 三 个 盘 的 滤纸 ,把 滤 膜 从 第 二 个 盘 转 
移 到 第 三 个 盘 的 纸 堆 上 ， 处 理 5 分 钟 。 AT 
， 四 将 滤 膜 放 在 干净 的 3MM 纸 上 王 燥 。 放 80 人 
_ 国 巴 杂交 和 杂交 过 程 同 前 《 见 7.2) 


二 


578。 


 @@ 洗 涤 杂 交 滤 膜 , 将 它 铺 在 X 射 线 胶片 上 进行 放射 自 显影 , 方 ， 


四 1 一 2 天 后 冲洗 和 射线 疲 片 ， 确 定 特异 的 DNA 探 针 的 杂交 位 
年 。 

@ 重 登 胶片 和 原平 亚 的 位 置 ， 找 出 具有 杂交 活性 的 只 菌 斑 。 

四 将 有 杂交 反应 的 史 世 斑 挑 到 一 个 含有 宿主 菌 的 上 层 软 琼脂 
平 甫 上， 377C 盖 保温 平 严 过夜 。 

罗 铺 上 新 的 硝酸 纤维 素 滤 购 ， 重 复杂 交 实 验 。 

划 用 一 支 细 药 移 液 管 口 取出 含 噬 菌 资 的 琼脂 块 , 放 在 1mITMG 
液 中 ,存放 在 47 。 

TMG 液 :每 升 含 Tris1.21g,MgSO,.7H,O 1.20g, 明 胶 0.1g， 

用 了 CI 调 pH 到 7.4， 高 压 灭 菌 。 
包 纯 化 只 菌 表 ， 制 备 鸣 菌 体 贮存 液 。 


( 狼 ) 质 粒 编码 多 肽 的 合成 


细菌 染色 体 编码 几 千 种 多 肽 ， 鉴 定 哪 一 种 基因 产物 同 娃 一 个 
_ 基因 相配 是 困难 的 ， 或 者 说 是 不 可 能 的 ， 为 克服 这 种 困难 ， 发 展 
了 重组 DNA 技 术 ， 将 感 兴趣 的 基因 克隆 在 细菌 质粒 里 ， 而 后 利用 
一 些 方法 ， 检 定 质粒 编码 的 蛋白 质 。 

有 三 种 方法 ， 用 放射 性 氨基 酸 选 择 标记 质粒 决定 的 蛋白 质 : 

A .大 细胞 (maxicells ) 方 法 ， 

从 对 紫外 线 高 度 敏感 的 E.coli 可 以 得 到 大 细胞 ,这 是 由 于 E. 
coli 带 有 yworA,， phr， 和 rec4 基 因 突 变 ， 后 者 突变 使 得 细胞 被 照 
射 后 损伤 的 DNA 分 子 降解 。pir 突 变 允 许 实验 在 一 般 实 验 室 光照 
条 件 下 进行 ， 当 用 紫外 线 照 射 含有 质粒 的 大 细胞 时 ， 作 用 目标 有 
两 个 ,, 即 大 的 染色 体 和 小 质粒 DNA。 在 低 剂量 时 ,染色 体 将 受到 
巨大 冲击 ， 而 许多 小 质粒 分 子 不 会 受到 冲击 或 影响 不 大 。 因 此 照 
射 后 经 培养 ， 使 得 损伤 的 DNA 降 解 ,而 细胞 里 将 主要 含有 质粒 分 
子 . 这 些 质粒 继续 复制 并 指导 蛋白 质 合成 ,将 这 种 细胞 保温 在 含有 
放射 性 氨基 酸 的 培养 基 里 , 则 会 选择 性 的 标记 质粒 编码 的 蛋白 质 。 


4 5379 4 


下 


B .小 细胞 突变 体 是 细胞 分 裂 缺 失 突变 体 : 分 要 时 隔膜 的 形成 


是 在 细胞 的 极端 ， 结 果 产 生 一 个 正常 的 细胞 和 一 个 小 细胞 。 相 细 


胞 不 含 染色 体 ， 但 可 含有 质粒 ， 由 于 小 细胞 具有 正常 细胞 的 基本 
代谢 能 力 ， 亡 以 质粒 基因 可 以 表达 ， 能 用 放射 性 氨基 酸 标 记 含 成 
多 肽 。 

c 3 滑 们 疾 录 看 乔 说 仿 联 某 

除去 妇 色 体 DNA 的 细胞 抽 提 液 能 够 转录 翻译 外 源 DNA 外 还 
可 以 选择 标记 由 质粒 产生 的 蛋白 质 。 

1. 大 细胞 的 基因 表达 系统 操作 

包 将 Ecoli CSR603 和 含有 质粒 的 CSR603 分 别 接种 在 5ml 
培养 液 中 (M9 培 养 液 补 充 1%% 水 解 酷 素 )。 

37Y 振 划 培 养 过 夜 。 

鳃 第 二 天 用 0.5ml 过 夜 培养 液 接 种 10ml 新 鲜 培 养 液 ，37% 继 
续 培 养 到 OD590nm 为 0.6。 

外 将 培养 液 转移 到 培养 四 里 ， 用 UV 灯 照 射 (除去 严 盖 !，)260 
nm， 可 用 一 杀菌 灯 ， 使 细胞 存活 数 降 低 到 500 个 /ml( 应 在 实验 前 
进行 准确 地 测定 ) 。 2 

轧 取 0.1ml 涂 布 在 肉 汤 平 血 上 ， 监 测 杀 死 程度 。 

@ 将 照射 后 的 细胞 转 入 三 角 瓶 中 ，37%C 培 养 1 小 时 。 

加 加 200 忆 新 配制 的 D 一 环 丝氨酸 (20mg/ml) 继续 培养 过 夜 。 
环 丝 氨 酸 能 够 杀 死 那些 在 保温 时 继续 生长 的 活 细胞 和 能 够 合成 染 
色 体 蛋白 质 的 那些 细胞 。 

@@ 在 第 三 天 标记 大 细胞 的 时 期 ,制备 15%SDS- 了 
胶 。 用 去 污 剂 彻 底 清 洗 电泳 装置 的 玻璃 板 。 

四 配制 15% 分 离 胶 ， 混 合 下 列 溶液 ， 

缓冲 液 A:; 16.3ml(0.75MTris-HCI，pH8.8，0.2%SDS) 

丙烯 酰胺 ，11.1ml(44% 丙 烯 酰胺 ，0.8% 双 丙烯 酰胺 ) 

水 ， 4.4ml 

过 硫酸 铁 : 1.2ml(10mg/ml) 

TIemed:，100HI( 四 甲 基 乙 二 胺 ) 


580。 


渭 
了 
才 


名 司 


2 


， 全 混合 后 灌 胶 ， 直 到 距 梳 底 lcm， 盖 上 一 层 0.1%SDS; 聚合 30 
分 钟 。 


四 除去 SDS， 用 水 洗 胶 面 ， 用 滤纸 条 吸 于 玻璃 板 。 (小 心 不 


本 


四 制备 7%% 浓 和 胶 ， 混 合 下 述 溶液 

缓冲 液 B: 7.5ml1(0.25MTris-HCI，pH8.8，0.2%SDS) 

丙烯 酰胺 ，2.5ml 

水 :; 5.4ml 

过 硫酸 胺 , 0.38ml 

Temed: 30 岂 

混合 后 灌 在 分 离 胶 上 ， 把 梳子 安放 好 ， 聚 合 30 分 钟 ， 小 心 除 
去 梳子 。 

@@ 将 电泳 缓冲 液 倒 入 上 下 电泳 槽 中 ， 用 缓冲 液 洗 加 样 小 槽 。 

田 在 制备 SDS 凝 胶 时 ， 标 记 大 细胞 ， 方 法 如 下 ; 

离心 收集 照射 后 培养 的 细胞 ， 再 悬浮 在 5mlM9 培 养 液 中 ( 补 
充 有 苏 氨 酸 (0 .1mg/ml)， 亮 氨 酸 (0.1mg/ml)， 且 氨 酸 (0.2mg/ 
ml) 和 精 氮 酸 ) ，37'C 保 温 1 小 时 。 

曲 加 50UK*5S]- 蛋 氮 酸 (>100Ciy/mmole) 继续 培养 1 小 时 ， 
离心 收集 细胞 ， 弃 上 清 液 将 细胞 县 在 残留 的 液体 里 。 

@ 加 100 由 电泳 样品 缓冲 液 (0.125MTris-HCIL,pH6.8，4%SD 
SS，20% 甘 油 ，1.4M 芝 基 乙 醇 ，0.001% 省 酚 蓝 ) ， 煮 沸 3 分 钟 。 
取 20ml 样 品 进行 电泳 分 析 ， 同 时 在 一 个 电泳 孔 中 加 入 已 知 分 子 量 
的 :一 (C 一 标记 的 多 肽 。 

@ 曲 恒定 电流 3mA， 电 泳 4 小 时 ， 当 染料 到 达 胶 底 时 ， 停 止 电 
泳 ， 固 定 凝 胶 (用 30% 异 丙 醇 加 10% 醋酸 ) 。 

@@ 第 四 天 加 工 凝 胶 ， 进 行 放 射 自 显影 ， 如 下 : 弃 固 定 液 ， 加 
入 二 甲 基 亚 硕 ， 缓 慢 振 划 30 分 钟 。 

@ 用 新 的 二 甲 基 亚 硕 代 替 老 的 ， 继 续 缓慢 振 蔓 30 分 钟 。 
四 弃 二 甲 基 亚 硕 , 加 入 含有 22%(w/V)ppoK2.5-diphenyloxa- 


:zole] 的 二 甲 基 亚 硕 。 


”581 ， 


Eee ee 人 eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeea 


@1 小 时 后 ， 用 水 代替 上 述 溶液 ， 每 小 时 用 新 水 代 蕉 1 次 ， 基 
7 次 。 | 
田 把 凝 胶 放 在 滤纸 上 干燥 , 并 对 和 射线 底板 曝光 ,- 70 过 夜 
或 更 长 时 间 。 
四 冲洗 胶 板 ， 如 果 了 曝光 不 够 或 过 度 , 则 重复 进行 放射 自 显影 ， 
并 调整 曝光 时 间 。 
2 .小 细胞 的 基因 表达 系统 操作 
中 制备 小 细胞 产生 菌 的 感受 态 细胞 ， 用 待 测 和 质粒 DNA 转 化 ， 
涂 布 在 适宜 的 选择 平 阵 上 ，37" 保 温 。 
四 应 用 快速 抽 提 质粒 方法 ， 证 实 转化 体 含 有 质粒 。 
田 500ml 三 角 狂 装 有 250mlM9 培 养 液 ，1 瓶 接种 含有 质粒 的 转 
化 体 ,1 瓶 接种 小 细胞 产生 菌 ,作为 对 照 ，37 振 蔓 培 养 16 小 时 。 
外 制备 密度 梯度 离心 管 。 取 Beckman SW27 转 子 离心 答 ， 依 
次 分 别 加 入 12ml20%，12.5%， 和 5% 的 蔗糖 溶液 。 或 者 制备 20% 
一 5% 的 划 糖 梯度 ， 先 加 入 18nil20% 蔗糖 ， 再 加 入 18ml15%% 蕊 糖 ， 
而 后 重复 冷冻 、 融 化 3 次 。 (蔗糖 溶液 制备 在 50mM Tris-HC1， 
pH7.5，100mM NaCl，0.1mM EDTA 溶 液 中 ) 。 
@) 低速 离心 小 细胞 培养 液 ，2,500rpm，4s，10 分 钟 
all GSA 转 子 ) ， 保 留 上 层 液 ， 弃 沉淀 。 
四 高 速 离心 收集 小 细胞 8500rpm4*C，15 分 钟 《Sorval 1GSA 
转子 ) ， 弃 上 层 液 。 
名 将 小 细胞 沉淀 悬浮 在 2ml 冷 BSG 缓 冲 液 中 ， 加 在 藤 糖 樟 度 
上 ， 离 心 ，5,000rpm、4s"C，15 人 分钟 (Beckman SW27 转 子 ) 5 
BGS 缓冲 液 : NaCl4.25g; 开 再 ,PO,0.15g; 
Na HPO.0.38; 明胶 50mg; 加 双 燕 水 到 500ml( 灭 菌 )。 
@ 小 细胞 带 通常 位 于 5% 和 12.5% 蔗 糖 层 的 方面 ,特别 小 心地 
吸出 小 细胞 带 ， 移 到 一 个 50ml 离 心 管 里 。 
田 加 入 等 体积 的 冷 BGS 缓 冲 液 ， 将 管 倒置 混合 ， 离 心 沉 淀 小 
细胞 ，12,000rpm，4%C，15 分 钟 (Sofvall ss34 转 子 )。 
四 将 小 细胞 悬浮 在 10ml 含 有 lmg/ml 环 丝氨酸 的 M9 培 养 液 中 ，， 


582。， 


37 并 振 划 培 养 1 小 时 ， 环 丝氨酸 将 裂解 继续 生长 的 细胞 。 
，  @ 高 心 沉淀 小 细胞 (12,000rpm，4"C，15 分 钟 )， 再 悬浮 在 
2ml 冷 BGS 缓冲 液 中 。 
万?@ 将 小 细胞 进行 第 二 次 蔗糖 密度 梯度 离心 ， 重 复 步骤 @、@、 
E 风 80 渤 且 | 
四 基 浮 小 细胞 沉淀 在 1mlM9 标 记 培 养 液 中 ， 调 节 A260 为 0.2 
” 〈M9 标 记 培 养 液 为 M9+ 0.4% 葡 萄 糖 十 所 要 求 的 营养 补充 物 ， 但 
省 去 水 解 酷 素 和 和 蛋氨酸) 。 
@ 国 取 0.lml10-: 稀 炙 液 涂 布 在 LB 琼 脂 平 由 上 ，37% 保 温 。 这 
将 测 出 存活 细胞 的 污染 程度 * 如 果 每 毫升 制备 的 小 细胞 液 污 染 多 
于 105 活 细胞 ， 则 会 干 挠 小 细胞 蛋白 质 合 成 系统 。 
@ 曲 取 1ml 小 细胞 液 %: 放 入 一 个 15ml 的 离心 管 里 ，375 振 葛 保 
温 15 分 钟 。 
四 加 入 5-50UCiK5 ”<S 二 蛋氨酸 ，375C 继 续 保 温 30 分 钟 of 
@ 离 心 收 集 标 记 的 小 细胞 ，12,000rpm 4?C15 分 钟 ， 转 子 停 
转 后 ， 3 联 即 吸出 士 层 液 ， 如 停止 时 间 过 长 ， 小 细胞 将 迅速 大 浮 。 
的 水 是 液 。 
罗 加 入 40 岂 样品 缓冲 液 , 混合 均匀 ,用 台式 离心 机 离心 2 分 钟 ， 
吸出 样品 放 入 1..5ml1 离 心 管 ， 置 100 煮 沸 35 分 钟 。 
轩 取 5 一 15 岂 样品 加 在 12.5%SDS 育 丙烯 酰胺 狂 胶 上 进行 电 
泳 。 
外 电泳 和 放射 性 自 显影 同 前 。 
1 3s 细 菌 离 体 蛋 自 质 合 成 系统 操作 
应 用 离 体 蛋白 质 合成 可 在 转录 和 翻译 水 平 上 分 析 基 因 表 达 。 
， 这 里 叙述 大 肠 杆 菌 和 枯草 社 菌 依赖 于 mRNA 或 DNA 的 离 体 蛋白 质 
合成 系统 。 - 
人 《1) 细胞 抽 提 液 的 制备 
如 1 也.sSubtilis 168T+ 或 王 .coli-MRE600(RNase-) 生 长 在 CHTI 
|， 50 培养 基 中 ,, 37" 振 划 培养， (CHT50 培 养 基 成 分 为 0,125%% 水 解 


583。 


酷 素 ，0.2%(NH4) SO ,1.4%K: HPO.0.6%KH5PO， 0.1% 
柠檬 酸 钠 ，0.5% 葡 萄 糖 ，0.5mMCacl, ,0 .SmMNMgSO 50ug/ml 
色 氨 酸 )。 生 长 到 对 数 中 期 (A570 = 0.5) 将 菌 液 说 在 碎 瀛 盐 上 ， 
离心 收集 细胞 ， 用 缓冲 液 工 洗 ? 次 (缓冲 液 I: 06.01MTTiS 一 HCl， 
pH7.5，0.015MMgC1, ,1M KC1,5mMEDTA，10% 车 油 二 0.01M 
2- 储 基 乙醇 ) ， 再 用 缓冲 液 世 洗 一 次 “缓冲 液 也 ,缓冲 液 革 + 0.05 
MKCI) ,迅速 冷冻 细胞 并 贮存 在 - 80 。 在 收集 和 洗涤 细胞 过 程 中 ， 
永远 冰 浴 细胞 ， 所 用 缓冲 液 要 灭 效 后 放 在 45*G， 和 
琉 基 乙醇 。 

将 冷冻 的 B. subtilis 或 E. coli 细 胞 冰 浴 融化 ， 悬 浮 于 缓冲 液 
III( 缓 冲 液 IHI，0.01MTris 一 HC1,0 .015MMgCl, ,0;06MNH C1， 
10% 甘 油 ，5mM2- 琉 基 乙 醇 沁 3.45mMPMSE，10: 人 pH 
区) 本 

加 蛋白 酶 抑制 剂 到 缓冲 液 I 的 方法 如 下 全 品 

1 @ 将 缓冲 液 加 热 到 37"u5 如 潮 冻 外 高 人 

加 边 搅拌 缓冲 液 ， 边 加 入 PMSF 每 升 缓冲 浪 IIT 加 0:6gP 玖 SF 
( 溶 在 25ml 乙 醇 中 ) 。 移 液 管 头 浸没 在 液 面 之 下 防止 沉淀 出 
现 。 车 
:1 的 加 入 PMSF 后 调 pH 到 7:0s 

四 将 缓冲 液 冷 到 25"， 然后 加 2- - 苞 基 己 醇 (0. sn 

回调 p 卫 到 7.0。 

@ 加 1mlDFP ( 溶 于 异 丙 醇 的 0.2M 贮 存 液 ) 。 

@@ 最 终 在 4% 调 pH 到 7 .5。 间 

每 克 湿 菌 悬 浮 在 1.5ml 缓 冲 液 TII 除 特 别 指出 外 中 以 拓 的 悬 一 
浮 细胞 步骤 都 按 这 祥 的 体积 ”于 棒 破碎 细 胞 ， 使 细胞 ?次 通过 下 
French 压 熔 机 (16.000psi) ,将 变 解 液 冰 浴 搅 拌 30 分 锅 以 切断 DNA 
分 子 ， 离 心 ，13,000rpm，20 分 钟 (Sorvall SS-34 转 子 六 水 心 明 量 ， 
出 上 层 液 ， 再 离心 ， 上层 液 即 为 S 一 30 抽 提 液 。 如 将 S 一 30 抽 提 波导 
离心 45,000fpm，4.5 小 时 (4sCBeckman50Ti 转 子 )， 所 得 沉 演 为 汝 
核糖 体 ， 上 清 液 部 分 即 为 S 一 150 抽 提 液 。 将 S 一 150 抽 提 液 对 1 升 组 


“84 


冲 液 HI 透 析 4 小 时 〈( 换 4 次 透析 液 )， 分 成 若干 小 份 ， 迅 速 冷 冻 放 
= 80% 贮 存 。 
_ “离心 后 立即 将 核糖 体 沉 淀 ， 缓 慢 悬 浮 在 缓冲 液 II 中 ， 完 全 溶 
解 后 加 入 DNaseI 至 11g/ml， 于 4 搅拌 核糖 体 30 分 钟 ,以 降低 内 源 
DNA 活 性。 离心 核糖 体 溶 液 ，10,000rpm，10 分 钟 ， 去 除 膜 物质 。 
再 离心 溶液 ，45,000rpm，4.5 小 时 。 将 核糖 体 悬 浮 于 缓冲 液 IV( 即 
缓冲 液 II 的 NH4CI 浓 度 增 加 到 1M) ,缓慢 搅动 16 小 时 。 离 心 (10,000 
rpm，1I0 分 钟 )， 同 上 述 将 上 清 液 再 进行 超 离心 。 此 时 离心 后 所 得 
于 清 液 含有 起 始 因子 。 加 入 (NH4):*SO,(47g/100ml) 4C 搅 拌 1 小 
时 ， 离 心 收集 沉淀 (13,000rpm，20 分 钟 ) 将 沉淀 溶解 在 缓冲 液 工 
“中 【缓冲 液 L，0.02MTTis 一 了 CI，0 .02MNH,CI，5mMEDTA， 
5mM Mg8C1: ,5% 半 油 ， 0.2mMDEFP,5mM2- 琉 基 乙 醇 ,pH7.:0) 。 
每 100g 湿 菌 的 起 动因 子 悬 浮 在 5ml 缓 冲 液 L 中 ， 并 对 1 升 缓冲 液 工 透 
析 12 小 时 (更 换 透 术 液 4 次 )。 离心 13,000rpm，45 分 钟 ， 除 去 不 游 
物质 ， 将 溶液 分 成 水 份 ， 迅 速 冷 却 放 - 80 存 放 。 
“把 核糖 体 沉 演 悬 浮 在 缓冲 液 II 中 ， 铺 在 10m130% 杂 铀 (用 组 
冲 液 了 配制 ) 垫子 上 ， 离 心 45,000rpm，16 小 时 。 在 核糖 体 沉淀 
上 上 面 有 一 榜 色 层 ， 刊 去 奔 之 ， 将 核糖 体 悬 浮 在 缓冲 液 II 中 ， 流 度 
为 1000A260/ml， 分 成 小 份 ， 迅 速 冷 冻 在 一 80"。 
名 制备 核糖 体 亚 基 主要 根据 Cannon 和 Boit 方 法 CMGG; 174:149 
(1979)]。 从 制备 洗涤 的 70S 核 糖 体 的 第 一 次 超速 离心 步骤 起 ,将 
核糖 体 悬 于 SUBI 缓 冲 液 (SUBI，0.02MTTis 一 HCI， 0.02M Mg 
《Ac)。，0.1MNH4CI，pH7.8， 用 前 加 入 6mM2- 琉 基 乙 醇和 0.2m 
M DFP)， 每 克 湿 菌 用 0 .5ml 缓 冲 液 。12,000rpm,10 分 钟离 心 误 
清 ,， 对 SUBII 组 冲 液 透 杀 4 次 ， 每 次 1 升 SUBII 缓 冲 液 (SUBIT+ 0 .2 
mM Mg(Ac):) ,尔后 小 心 将 巧 液 铺 在 新 制备 的 冷 的 35ml10 一 30%% 
蔗糖 樟 度 上 ,离心 23,000rpm13 小 时 ,(Beckman SW28 转 子 ) ， 以 
1ml 分 部 收集 〈( 冰 浴 )， 测 260nm 了 吸收， 合并 峰值 。 将 Mg(Ac) , 浓 
度 提 高 到 20mM， 超 离心 收集 亚 基部 分 ，45，000rpm，8 小 时 。 
将 亚 基 沉 演 悬浮 在 SUBI 中 ， 对 SUBII 透 析 ， 重 复 进 行 蔗糖 梯度 离 


585。 


员 


心 。 最 终 30S 和 50S 亚 基 为 2000A260/mi。 各 种 缓冲 液 应 用 前 需 加 入 
DFP。 
(2) RNA 的 制备 
. 擂 用 玻璃 器 下 和 缓冲 液 都 要 灭 菌 。 细胞 生长 在 37ACCHTT50 寺 
养 液 中 ,于 对 数 中 期 收集 ,把 细胞 倒 在 碎 冰 上 ， 冰 上 撒 有 固 你 MgCl， 
和 NaNs, 使 终 浓度 分 别 为 ImnM 和 10mM 。 离心 收集 细胞 ， sp 80 记 沦 
冻 细 胞 后 再 冷冻 于 爆 。 在 一 个 研 钵 里 加 入 等 量 的 玻璃 球 175 一 0 
&m) 研磨 使 细胞 干 破裂 ， 共 处理 8 次 ， 每 次 1 分 钟 ,间隔 致 稚 30 秒 。 
破碎 的 细胞 和 玻璃 球 被 直接 加 入 到 新 制备 的 饱和 水 的 酚 里 (六 
浴 ) ， 每 克 干 细胞 加 15m] 酚 液 . 再 加 入 15ml 缓 冲 液 VIC0 .01MTTi 
一 HCl，pH7.5, 0.01MKCL5mMMgCl,0.01M NaN。( 灭 菌 门 和 
50mg Macaloid (一 种 特制 的 精细 皂 士 ) ，37 缓 慢 混 含 10 分 钟 ， 
离心 10, 000rpm, ,15 分 钟 。 将 水 相 移 入 无 菌 三 角 瓶 <( 冰 洽 )， 番 
下 的 一 层 再 用 等 体积 缓 训 液 VI 抽 提 10 分 钟 (37 CD 离心 后 合并 
两 次 水 相 ， 加 固体 NaCl 至 0.1M， 加 24 者 体积 伶 乙 防 帝 演 RNA, 生 
-20YC 至 少 3 小 时 。 离 心 ,将 RN 这 这 注 解 于 NaAe 组 刘波 ， (0.1 
MHAc 用 NaOH 调 pH 到 5 .0。 按 每 克 干 细胞 浅 于 15ml 绥 冲 波 ) ,用 等 
体积 的 酚 抽 提 ， 离 心 , 移 出 水 相 再 用 酚 抽 提 ， 让 到 界 曾 没 有 下 自沉 
淀 ， 将 水 相 转 移 到 干净 的 三 角 : 瓶 里 ， 加 固体 NaCl 到 2M， 乙醇 沉淀 
闻 前 。 沉淀 用 INE 缓 冲 液 40 1MTris 二 HCi ,DB7: 5 0 .1IMNaCl， 
70% 乙 醇 ) 洗 3 次 ,而 后 溶解 在 TNH 缓 冲 液 (0. 01MIris 一 二 Cl， pH 
7.0,0.1MNHsCD ,离心 12,000rpm， 40 分 钟 。 再 次 妃 区 沉淀 RNA， 
最 后 溶 在 无 茵 水中， 浓度 为 750A260/ml，- 20 CC 存放 。 
(3) DNA 的 制备 
以 不 同方 法 制备 的 多 种 来 源 DNA， 活 性 差别 不 大 。 -一般 质 粕 
DNA 分 离 可 按 配 Bacterial, 116:1064，(1973)， 了 只 菌 体 DNA 分 离 
按 J Bacterial .120:219，(1974)。、 
(4) 依赖 于 RNA 的 离 体 蛋白 质 合 成 系统 
制备 各 种 贮存 液 当 
Tris 一 AA: .19 种 氨基 酸 ( 每 种 0.3mM)， 省 去 革 丙 所 本 ,用 天 菌 重 


“586。 


的 0.3MTTris 一 HCI，pH7 . 4 溶液 制备 ， -20C 存 放 。 
Mg(Ac)。:， 0.5M 醋 酸 镁 ， 灭 菌 ，4C 存 放 。 


浊 NH4Ac: 3M 醋 酸 狠 ， 灭 效 ,14 4 存放 。 


DTIT: 0.1M 二 硫 苏 糖 醇 ，- 20 存放。 
苯 两 氨 酸 : 3.2mM，- 20 存放 。 
Iris 一 瑞 Cl:， 0.01M,pH7 .4 灭 菌 ,4 存放。 
DEFP: 0.2M 溶 在 异 丙 醇 中 ，- 20*C 存 放 。 
能 量 分 子 ，0.1M ATP,0.25MPEP( 磷 酸 烯 醇 两 酮 酸 )0.005M 
GITP， 用 NH4OH 中 和 ，-- 20 存放 。 
丙酮 酸 激酶 : 5000u/ml，4C 存 放 。 
叶酸 RN .20 存放 : 
EDTA 0.5M，PpH7.5， 灭 菌 ，4'C 存 放 。 
混合 液 制备 : 
抑制 剂 ，0.070ml Tris 一 HCl 
0.020ml1 EDTA 
0.010ml DEFP 
0.100ml 
预 保 温 混合 液 (PM) 
250ial 了 ris- 一 人 AA 
DLL25ml Mg(Ac)， 
0:025ml，NH4Ac 
0.025ml DPIT 
0.025ml 和 苯 丙 氮 酸 
0.010ml “抑制 剂 
0.277iml _ Tris 一 互 Cl 
0.625ml 
反应 混合 液 (RM， 可 供 20 管 测定 ) 
0.500ml Tris 一 AA 
0.050ml Mg(Ac)， 办 - 玫 
0.050ml NH，Ac 


587。 


0.050ml DTT 
0.050ml 能 量 
0.005ml “丙酮 酸 激酶 
0.050ml 叶酸 
0.001ml -DEFP 
0.050ml [14C]-Dphe( 每 ml 反应 液 为 Buci7 
0.200ml 粗 IF， 
0.500ml Tris 一 了 Cl 
1.506ml 
预 保 温 (ERE， 可 供 测定 20 管 ): 
0.250ml PM 
0.020ml 70S 核 糖 体 (1000A260/ml) 
0.080ml 缓冲 液 JI( 不 含 抑制 剂 ) 
0.150ml S-150 
0.500ml 
37Y 预 保温 15 分 钟 。 如 用 亚 基 则 混 合 0.067ml30S 和 0.033ml 
50S( 都 为 200A260/ml)， 在 37% 保 温 20 分 钟 ， 而 后 加 入 PM 和 S- 


SO 再 37 到 


保温 15 分 钟 。 
测定 方法 ， 
始终 将 各 种 溶液 和 混合 液 保持 冰 浴 。 核 糖 体 S-150 和 IE 因子 要 
在 用 前 融化 ， 不 可 再 冷冻 和 应 用 。 每 支 测定 管 含有 ， 
0.075ml 了 及 M 
0.010ml RNA(750A260/ml) 
0.015ml Tris-HCI1 
0.025ml 了 及 王 
0.125ml 


Tris 可 含有 抗生素 或 含有 其 它 影响 反应 的 底 物 ， 以 供 研 究 。 


将 测定 管 保温 在 37*C，30 分 钟 。 置 冷 浴 加 入 2ml5 %TCA ,90 民 潮 


处 理 15 分 钟 ， 用 玻璃 纤维 滤 膜 收集 沉淀 , 洗 膜 后 进行 放射 性 计数 。 


5588 


以 polyU 为 模板 时 ,每 测定 管用 100UgpolyU，, 且 RM 中 的 IEs 用 
亚 精 胺 (Spermidine,0.0625M 溶 在 0.01MTris--HC1，pH7 .4 溶液 
上 中) 代 符 。 
(5) 依赖 DNA 的 离 体 蛋 昌 质 合成 系统 
除 需 用 所 有 翻译 系统 溶液 外 ， 还 需 制 备 下 列 溶液 。 
PEP (磷酸 烯 醉 丙酮 酸 ):! 0.375M， 用 NH,OH 中 和， 置 
一 20 存放 。 
”XITP，17mMGTP，17mMUTP，17iMCTP5 20 存放 。} 
KKAc，1.25M，4% 存 放 。 
:也 一 UTP:， 加 闪 到 RM 中 代替 !*C-phe， 每 测定 管 需 4.2UCi 
让 3H -一 UTP 
混合 液 : PM 和 抑制 剂 的 混合 液 没 有 改变 。PREE( 供 20 个 测定 
5 管 ) 
1 05250ml _ PM 
0.050mE -708 核糖 体 
0.200ml S 一 150 
0.500ml 
RM( 供 20 个 测定 管 ) 
0.500ml _ Tris 一 AA 
0.050ml Mg(Ac)， 
0;050mL IJNHAc 
0.100ml 开 Ac 
0;.050ml DTT 
0.050ml “能 量 . 
0.050ml 叶酸 
0.020ml XTP 
0.020ml PEP 
0.005ml 丙酮 酸 激酶 
0.001mL DEFP 
0.050ml 14C 一 phe 


R 。 589。， 


0.200mf 烛 IFS 
0.355ml Tris 一 RCIl 各 人 
1.501ml 
测定 方法 ， 每 个 测定 管 含 
0.075ml1 及 M 
0.010ml1“DNAL170Pg]/ml) 
0.015ml Tris 一 HCl 
0.025nil PR 一， EX 
0.125ml 二 
当 反 应 用 !“C 一 phe 时 , 则 测 热处理 TCA 中 的 !…C 参 入 量 , 当 反 
应 用 "HH 一 UTP 时 ， 则 测 不 加 热处理 TCA 中 的 放射 量 。 
土 述 反应 的 各 种 成 分 是 采用 它们 的 最 适 浓度 但 正 s 和 -150 
可 以 改变 。 因 其 最 适量 依 每 次 制备 的 制剂 有 廊 变 化 ;这 系统 对 Mg 
浓度 十 分 敏感 ， 在 依照 RNA 或 DNA 的 系统 中 , 最 适 浓 度 可 能 不 
同 ， 依 系统 而 决定 。 绍 胞 抽 提 液 可 贮存 一 年 3 不 致 形 失 活性 。 


( 九 ) 真 核 细胞 离 体 炙 译 系统 


利用 离 体 蛋白 质 系统 ， 可 以 鉴定 克隆 的 基因 起 也 RNA; 各 完 
生长 和 发 育 过 程 mRNA 的 变化 研究 蛋白 质 合成 的 调节 和 翻译 后 
修饰 。 现 已 发 展 了 多 种 真 核 生物 离 体 蛋白 质 合成 系统 ， 最 通用 的 
有 妻 胚 系统 和 免 网 织 红细胞 系统 。 一 节 讲 真 核 细胞 的 mRNA 能 用 
其 它 真 核 细胞 离 体 蛋 白质 合成 系统 翻译 。 考 胚 手提 液 可 翻译 动物 
mRNA， 免 网 织 红细胞 系统 也 可 翻译 植物 的 mRNA。 因 为 它们 有 
相同 的 遗传 密码 ， 有 相似 的 识别 和 结合 核糖 体 的 核 苷 酸 顺 序 。 当 
然 也 有 少数 例外 ， 如 大 的 mRNA 分 池 ; 不 能 在 麦 胚 系统 中 得 到 有 
效 翻译 ， 产 生 肽 链 的 提前 终止 。 一 种 特异 的 mRNA 有 可 能 优先 在 
去 胚 系统 中 翻译 ， 而 不 在 网 织 红细胞 系统 中 ， 或 反之 。 

用 mRNA 微量 注射 峙 卵 ， 也 可 合成 蛋白 质 ， 研 究 基因 表达 和 
翻译 后 的 加 工 。 但 严格 讲 它 不 是 一 个 离休 蛋白 质 合成 系统 ， 由 于 
峙 卵 也 同样 合成 它 自身 的 蛋白 质 ， 使 对 结果 多 分 析 和 解释 带 来 复 


“590。 


2 


” 琳 性 。 如 果 研 究 的 是 一 种 可 识别 的 外 源 蛋白 质 ， 便 可 克服 这 个 问 
题 。 


离 体 蛋白 质 合成 的 一 般 图 式 
制备 大 肠 杆菌 、 麦 胚 或 兔 网 织 红细胞 ， 抽 提 和 纯化 RNA， 细 胞 总 RNA 或 多 


离 体 蛋 白质 合成 系统 聚 核糖 体 RNA， 或 上 olyAmRNA， 


叶绿体 和 线粒体 RNA 
将 所 用 缓冲 液 灭 菌 、 无 菌 操作 。 按 少 “ 在 抽 提 和 纯化 中 防 止 RNase 降解 
量 分 份 喧 存 的 抽 提 液 ， 最 好 放 在 液 所 “RNA， 除 去 DNA、 蛋 白质、 碳水 化 
里 。 抽 提 液 所 含 内 源 mRNA 应 尽量 地 ” 合 物 等 。RNA 作为 乙醇 沉淀 物 贮存 
少 ， 作 为 放射 性 标记 的 那些 氨基 酸 。 在 -207 
其 浓度 要 尽量 地 低 。 
| | 


冰 浴 融化 适宜 体积 的 抽 提 液 ， 加 入 放 用 80% 乙醇 洗 RNA 几 次 ， 去 除 离子 


射 人 性 氨基 酸 和 其 它 所 需 的 成 分 。 和 去 污 剂 ， 干 燥 后 RNA 被 溶解 在 无 


菌 蒸 饮水 中 、 或 冷冻 贮存 (- 207 或 
-80TC )。 


| y 
每 个 测定 管 的 终 体 积 为 10-50R1, 加 入 
适量 RNA， 于 所 需 温 度 保 温 30-90 分 


| 


终止 反应 ， 测 定 参 入 到 蛋白 质 中 的 放 


射 性 ， 如 要 进一步 研究 ， 可 分 离 放射 


性 蛋白 质 。 


. 离 体 麦 上 故 翻 译 系统 

(1) 试剂 : 

加 过 陡 应 取 自 硬 粒 冬 考 ， 并 非 每 种 冬 麦 都 有 活性 ， 且 不 同 批 
号 活性 也 不 同 。 贮 存 麦 胚 在 4T 真 空 条 件 下 ， 麦 胚 的 湿度 高 会 降 
低 翻 译 活性 。 


e 2971。 


@ 研 磨 缓冲 液 
20mM Hepes，pH7.6( 用 KOH 调 节 ) 
.1mM Mg(Ac)，。，100mM 天 C1， 
2mM CaCl ，6mM 2- 琉 基 乙 醉 。 
印 柱 层 析 缓 冲 液 : 
20mM Hepess，pH7.6( 用 KKOH 调 节 ) 
120mM 玉 CI1，5mM Mg(Ac),，，6mM2- 玉 基 乙 醇 
包 麦 胚 翻译 混合 液 〈 以 小 份 贮存 在 -707 ) 
100h1 10mM 的 各 种 氨基 酸 ( 缺 少 蛋 氢 酸 ) 
200U1 200mM ATP (用 KKOH 中 和 ) 
.10ul 100mM GIP，0.01M Hepes，pH7.2( 用 KOH 调 ) 
200ul1 1.6M 磷 酸 肌 酸 ，0.01M Hepes pH7 .2( 用 KOH 调 
他) 
80RL 1M DTT 
960b1 1M Hepss 用 KOH 调 pH7.2。， 
50M1L 200mM 亚 精 腕 (游离 碱 ) 
16001 燕 饮水 

总 体积 3， 2ml。 

@5.4mg/ml 磷 酸 肌 酸 激酶 (CPK)， 制 备 在 50% 甘 油 中 。 

《2) 麦 肥 抽 提 液 的 制备 : 

应 用 无 菌 的 玻璃 器 下 和 缓冲 液 . 许 多 缓冲 液 不 能 用 高 压 灭 菌 ， 
必须 应 用 滤 驱 过 滤 。 滤 戏 可 在 沸水 中 预先 煮沸 2 次， 以 除去 塑胶 
物 。 一 般 应 在 尽 可 能 低 的 温度 下 操作 。 

也 实验 在 不 高 于 47 的 冷 室 里 进行 。 将 研 钵 和 棒 预 冷 到 27， 
放 入 冰 浴 ， 加 入 12g 麦 豚 和 12g 石 英 砂 (预先 将 砂 洗 净 , 于 1007 以 
上 烘 烤 过 夜 )， 开 始 研磨 麦 豚 , 随 着 继续 研磨 缓慢 地 加 六 28ml 研 魔 
缓冲 液 (20 )， 持 续 15 人 分钟， 产生 一 种 粘 浆 。 

加 离心 30;0008，10 分 钟 ，2 (ss34Sorvall 转 子 ) 

轿 移 出 上 层 液 ， 避 免 吸 取 沉 泻 和 表面 脂肪 晨 。 大 约 得 到 10mi 
上 层 液 ， 加 入 磷酸 肌 酸 激酶 至 40kg/ml， 置 307 保温 15 分 名 


。592。 


外 制备 一 个 Sephadex G25 〈 中 等 粒度 ) 柱 〈3.5 x 35cm) ， 在 
47 淮 室 中 进行 层 析 。( 预 先 用 层 析 缓冲 液 将 柱 平衡 )。 把 抽 提 液 加 
在 柱 上 ， 流 速 每 分 钟 1 毫升 ， 按 1ml 分 部 收集 。 

回合 并 最 混浊 的 部 分 ， 用 无 菌 注射 器 将 抽 提 液 按 小 滴 滴 入 液 
氮 。 在 -707C 贮 存 抽 提 液 几 年 ， 不 会 失 活 。 

@ 如 对 照 实验 指出 抽 提 液 含 有 较 高 的 内 源 mRNA， 则 需 用 微 
球菌 核酸 酶 (Micrococcal nuclease) 处 理 抽 提 液 ,加 入 1mMCaCl，， 
， 对 每 毫升 抽 提 液 加 50 单 位 的 核酸 酶 ， 于 207 保温 10 分 钟 ， 加 入 

EGITA 到 2mM 后 ， 如 上 述 方法 冷冻 。 

(3) 翻译 反应 : 

巴 反应 在 1.5ml 小 离心 管 中 进 行 ， 将 管 置 冰 浴 , 加 入 0.1-1ug 
RNA( 如 RNA 溶 在 大 体积 的 水 中 ， 需 真空 蒸发 。RNA 溶液 含有 
盐 ， 则 需 沉 淀 RNA， 用 70% 的 乙醇 洗涤 )。 

四 加 入 2I 才 胚 翻 译 混 合 液 ，0.5nl125mM Mg(Ac)，，2RL 1M 
KAC,2 二 5ul(ssS) 蛋 氨 酸 (950 一 1300Ci/m mole;,5 一 6mCiyml) ， 
加 入 共 饮 水 ， 终 体积 至 17hl。 

四 于 227 保温 5 分 钟 ， 加 8hl 抽 提 液 ， 继 续 保温 1.5 一 3 小 时 。 
将 反应 管 置 冰 浴 停止 反应 ， 如 较 长 时 间 贮 存 需 冷 谍 反 应 液 。 

外 取 JuI 反 应 液 滴 到 直径 为 2.4cm 的 whatman 3mm 滤 纸 上 ， 放 
入 10% 三 氯 醋酸 (TCA) 中 ，47 浸泡 1 分 钟 ， 再 在 50ml1 5%TCA 中 
将 滤 膜 煮沸 10 分 钟 ， 然 后 用 乙醇 洗 ， 再 用 乙醚 洗 ， 滤 戏 干 燥 后 做 
放射 性 计数 。 

@@ 通 常 放 射 性 参 入 值 为 5000cpmy/ul。 高 活性 的 抽 提 液 参 入 可 
高 6 一 10 倍 。 如 翻译 产物 的 放射 性 达 100,000cpm, 则 可 用 聚 丙 焕 凝 
胶 电 泳 和 荧光 自 显影 分 析 ，1 天 后 可 观察 到 翻译 产物 。 

2. 离 体 网 织 红细胞 翻译 系统 

(1) 制备 网 织 红 细胞 抽 提 液 

加 为 致使 免 子 贫血 ， 先 用 乙酰 葵 肝 皮 下 注射 6 只 家 免 〈 每 只 
重 2 一 3 公斤 ) 。 乙 酰 苯 肝 注 射 液 为 1.2% 乙酰 苯 肝 (Acetylpheglhy- 

drazine， 湾 于 0.14M NaCl，1.5mM Mg(Ac) ，，5mMKCI 溶 液 ， 


， 
沁 


时 。593 。 


用 1M Hepes (pH7.0 调 到 pH7.5)。 第 1 天 注射 1ml， 第 ?天 注射 
1.6ml， 第 3 天 注射 1.2ml， 第 4 天 注射 1.6ml， 第 5 天 注射 2ml。 和 
@ 第 7 天 和 第 8 天 放血 。 先 用 二 甲 茶 棉 球 掠 净 一 只 耳 杀 ， 用 新 “ 
的 切片 万 做 耳 静 脉 切口 ， 每 只 兔子 放出 50 一 60ml 血 ,收集 在 50ml 
冷 的 含有 0.01%% 肝素 的 生理 盐水 里 。 

四 用 粗 棉 布 过 滤 ， 离 心 2,000xg，5 分 钟 。 用 生理 盐水 洗 细胞 
3 次 ， 最 后 一 次 离心 在 8,000xg。 

由 加 入 等 体积 的 冷水 (0C ) 裂 解 细胞 ,1 分 钟 后 离心 20,000Xg， 
20 分 钟 。 

回 将 抽 提 液 分 成 0.5ml 部 分 ， 存 放 在 - 70 习 ,在 几 个 月 内 是 稳 

(2) 用 微 球 菌 核酸 酶 处 理 抽 提 液 ， 

中 取 100 份 细胞 抽 提 液 加 20 份 50mM CaCcl ， 加 1 符 有 
Hemin( 氧 高 铁血 红 素 ， 将 20mg Hemin 深 于 0.4ml10.2M 上 OH， 
加 0.6ml 水 ， 混 售后 加 入 0.1ml 1M Tris-HCHpH7 8)， 并 用 HCl 
调 pH7.8， 最 后 加 4ml 乙 二 醇 )。 混 合 后 使 溶液 温 并 为 20C5 

@ 加 入 0.05 份 微 球菌 核酸 酶 (150,000u/ml 洲 在 50mM 甘 氛 酸 
(pH9.0)，2.5mM CaCls 中 ， 一 207 存放 )， 保 温 。 

四 加 入 2 份 100mM EGTA， 混 合 。 

四 加 入 0.4 份 40mg/ml 磷 酸 肌 酸 激酶 ， 混 合 。 

加 以 250-500u1 部 分 分 份 冷冻 在 -707C。 

保温 液 中 包含 Hemin， 如 缺少 Hemin， 会 在 保温 后 不 久 停 止 
蛋白 质 合 成 。 

〈3) 翻译 反应 : 

四 制备 翻译 混合 液 : 
100uL 100mM 亚 精 胺 ，400n1 800mM 和 磷酸 肌 酸 ， 200 同 5mM 各 种 
氨基 酸 (- Met)，80ulL 1M DTT，1600k1 50mM Hepes (PH7.4)， 
710 水 ， 总 体积 为 3200Rl。 

将 翻译 混合 液 久 50 一 100B 为 :一 份 ， 分 份 春 就 帮 FORG -上 
-四 标准 反应 液 


594。 


220 翻译 混合 液 ,2nl 1MKCI，0.5h132.5mM ME(Acj 
” 红 0RIE35S] -~ met(100MCil) 

”二 0410 由 微 球 兽 处理 的 抽 提 液 ，0.5ul 水 ，1UIRNA，37 忆 保温 60 
分钟。 

忆 KGCI 浓 度 随 砷 RNA 和 不 同 批 的 细胞 抽 提 液 而 改变 , 需要 测定 。 
总 RNA 可 加 到 直至 10bg 或 0.2ug poly A-RNA。 加 入 饱和 量 指 
mRNAEF | 将 会 提高 [25S] - met 参 入 10 一 25 倍 。 在 最 适 条 件 下 ， 
25h1 反 应 液 参 入 3X10* 一 5x10scpma。 如 需要 可 增加 放射 性 加 入 
量 ) 可 蒸发 浓缩 ES]- met 液 。 

及 也 图 反应 产物 可 用 免疫 沉 演 和 SDS 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 。 


(十 ) 蛋 白质 的 涛 胶 电 泳 分 析 


-而 现今 蜡 乎 每 个 实验 室 都 广泛 应 用 聚 丙烯 酰胺 凝 腕 电泳 分 析 蛋 
自 质 这 种 方法 简单 、 迅 速 、 样 品 用 量 少 ， 用 微克 量 蛋 白质 就 可 
测 知 蛋白. 谢 药 分 子 量 己 等 电 点 等 。- 

聚 再 燃 酰胺 凝 胶 的 三 维 结构 是 丙烯 酰胺 和 交 联 剂 双 体 丙 疾 栈 
胺 聚合 ， 形 成 具有 各 种 孔径 的 凝 胶 ， 其 实际 意义 就 像 一 个 竹子 ， 
阻止 大 分 子 的 移动 ， 特 异 的 孔径 适 于 分 辨 某 些 蛋白 质 混 合 物 ， 以 
致 控制 蕊 揭 赤 水 是 改进 电泳 效果 的 -个 重要 因素 (但 不 是 唯一 因 
素 )。 . 头 稚 着 
三 丙 烯 酰胺 和 双 体 丙烯 酰 胺 聚合 是 一 种 自由 基 成 链 反 应 。 通 常 
用 过 硫酸 答 (~0.3%w/v) 和 四 甲 基 乙 二 胶 (Temed~0.2%V/v) 
的 混合 液 启 动 反 应 。 过 硫酸 铵 激活 四 甲 基 己 二 胺 ， 使 之 产生 一 个 
未 配对 电子 ， 这 个 基 团 和 一 个 丙烯 酰 胺 分 子 反 应 ， 生 成 一 个 新 的 
基 团 ， 其 再 和 另 一 个 丙烯 酰胺 反应 ， 以 致 生成 一 种 聚合 物 ， 偶 尔 
双 体 丙烯 酰胺 分 子 的 一 端 连 到 一 个 聚合 物 中 ， 而 这 个 双 体 丙烯 栈 
有 胺 分 子 的 另 一 端 则 连 到 另 一 个 聚合 物 中 , 如 此 形成 一 种 网 状 结构 。 
由 去 个 时 ， 交 联 是 随机 的 ， 凝 胶 中 孔 的 实际 大 小 并 不 是 固定 的 ， 
必得 我 的 平均 大 小 却 决定 于 凝 胶 中 丙烯 酰胺 的 量 及 丙烯 酰 胶 和 双 体 
两 燃 酰 及 的 比例 。 凝 胶 中 丙烯 酰 胶 含 量 表示 为 %(w/v)， 即 在 北 
ea 95099 


人 


人 


靖 志 WE 


人 ] 


”RE 


胶 聚 合 前 每 100ml 混合 液 中 丙 奖 酰胺 和 双 体 丙烯 酰胺 的 总 克 数 ， 
交 联 剂 的 量 通 常 表示 为 交 联 剂 同 丙 烯 酰 腕 的 比 ,为 % 人 tw/w) 如果 
20% 的 凝 胶 和 15%% 的 凝 胶 含 有 相同 量 的 双 体 丙烯 酰胺 ， 则 20% 凝 
胶 的 平均 孔径 更 小 。 为 获得 小 的 平均 孔径 ， 最 适 双 体 丙 入 酰 腕 和 
丙烯 酰胺 比 是 5% (ww/T)， 比 5% 大 或 小 痢 会 产生 更 大 的 孔 ， 与 两 
烯 酰胺 量 关系 不 大 。 
市 售 丙烯 栈 肤 和 妈 体 丙 燃 栈 腑 放 在 室温 噶 站 是 相当 矢 定 的 国 
体 。 但 几 年 后 可 自发 地 聚合 和 水 解 。 应 用 贮存 液 制 备 凝 胶 十 分 方 
便 ， 将 贮存 液 放 在 42 ， 在 几 个 月 内 都 是 稳定 的 .小 胶 聚 谷 前 应 将 
溶液 抽 气 去 氧 ， 防 止 铸 胶 时 形成 气泡 以 及 氧化 掉 自 由 基 ， 抑制 聚 
合 反应 。 
现 已 发 展 了 多 种 台 丙 燃 栈 胶 莽 胶 志 这 | 包括 SDS 凝 胶 电 该 、 尿 
素 凝 胶 电 泳 、 缓 种 液 凝 胶 电 泳 、 梯 度 凝 胶 电 泳 ` 等 电 聚 焦 凝 胶 电 泳 ， 
双向 凝 胶 电 泳 等 ,读者 有 兴趣 了 解 详细 原理 和 操作 ,可 参考 二 M 
Walkez 等 Techniques in Molecular Biology 芝 1983) 和 J. 王 。 Celis 
Two-Dimensional .Gel 王 lectfrophoresis of We 
1.SDS 和 蛋白 质 抽 提 液 的 制备 了 
@ 制 备 5mlLB 培 养 液 。 二 国 : 
@ 接 种 所 要 分 析 菌 株 的 一 个 单 菌落 ， so 振 划 培 养 过 夜 了 .. 
@@ 豚 取 0.2ml 接 种 10mlLB 培 养 液 ，377 振 蔓 培养 。 
四 生长 到 对 数 末 期 。 测 定 细胞 密度 (ODiuo)， 按 照 下 列 公 式 


计算 抽 提 时 所 用 的 细胞 培养 液体 积 。 
Se 汪汪 


-如 ODaeoo =1.0 时 ， 则 应 用 4.8ml 细 胞 培养 液 。 
@@ 离 心 ，1500g8，10 分 钟 。 
@ 将 细胞 悬浮 在 0.35ml2xSDS 样 品 缓冲 液 里 。 
2xSDS 样 品 缓冲 液 、20% (w/v) 甘 油 ，10%(wJv)2- 斑 基本 ， 
醇 ，4.6%(w/v) SDS，0.125MTris-HC1，DH6;8，0.To 次 酚 玉 
蓝 。 
。 596。 


@@ 于 1007 煮沸 样品 5 分 钟 。 
四 离心 5 分 钟 。 
@ 取 30 一 35ul 进 行 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 。 
2.SDS- 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 析 蛋 白质 ， 
(1) 试剂 配制 : 5 
分 离 胶 缓冲 液 : 1.5M Tris-HCL，pH6.8，0.4%SDS。 
浓缩 胶 缓冲 液 : 0.5M Tris-HCI，pH6.8，0.4%SDS。 
两 烽 酰 胺 贮存 液 ，29.2% 丙 烯 酰胺 
0.8% 双 体 丙 烯 酰胺 
加 双 蒸 水 到 100m1。 溶 解 后 将 溶液 过 滤 ， 放 47 
存放 。 
10% 过 硫酸 欠 溶 液 : 0.1g 过 硫酸 猴 
0.95ml 双 茹 水 〈 每 次 新 配制 )。. 
电泳 缓冲 液 ， 0.25M Tris-HCI，pH8 .3 
0.192M 甘 氮 栈 
0.1%SDS 
样品 缓冲 液 : 20%(W/v) 甘 油 
10%(w/v)2- 劳 基 乙 醇 
4.6%(w/V)SDS 
0.125M Tris-HCI，pH6.8 
0.1% 溴 酚 蓝 
染色 液 ，5% (v/v) 冰 醋酸 
10% (v/v) 甲 醇 
染料 液 : 1% 考 马 斯 蓝 溶 解 在 双 蒸 水 里 
脱色 液 : 7%(v/v) 醋 酸 溶液 
(2) 操作 过 程 : 
G@1 个 152x152x0.8mm 的 板 凝 胶 需 要 按 下 表 配 制 15ml 分离 
胶 和 6ml 浓 缩 胶 。 将 凝 胶 溶 液 混合 后 ， 减 压 抽 气 ， 加 入 Temed( 四 
甲 基 乙 二 胺 ) 凝 胶 开 始 聚 合 


e 597 。 


4% 浓 缩 腕 


6| 159% 117 .50%% 


59% |7 .506 100%6 


一 一 | 一 


3a75.r3aralv3ac9 和 


一 一 -一 一 一 


分 离 胶 缓冲 液 3 Su7XS | 37 
浓缩 胶 缓 冲 液 一 es 一 Se 一 1。25 
丙烯 酰胺 贮存 液 | 2.50.| 3.75 | 5.00 | 6.25 | 7.50 | 8.75 0.80 
双 燕 水 8.7017.45|16.20 | 4.95 | 3.70|1 2. 生 于 司 了.93 
10% 过 硫酸 镑 0.05 0.05 | 0.05 | 0.05 |0.05 | 0.05 0.02 

轨 “是 1 减 压 抽 气 


0。.007| 0。007 0.007| 0.007| 0.007 0.007| 0.004 


@ 将 分 离 胶 漠 入 电泳 凝 胶 板 装置 ， 加 盖 ; 2 一 3mm 高 的 丁 醉 或 
水 。 

@@ 聚 合 后 ， 用 水 冲洗 除去 丁 醇 或 水 ， 而 后 灌 入 浓缩 胶 并 且 插 
入 梳子 

让 纳 术 束 全 后， 小 心 取出 术 子 ， 请 洗 伴 曲 村 了 除去 未 全 
的 丙烯 酰胺 。 

加 安装 好 电泳 装置 ， 倒 入 电泳 缓冲 液 。 

@ 用 样品 缓冲 液 制备 样品 ; 加 入 样品 槽 孔 。 


@ 电 泳 在 5 一 40mA 电流 ， 2 一 8 小 时 ， 或 直至 染料 达到 凝 胶 四 


前 沿 。 

@@ 拆 开 装 置 ,取出 凝 胶 进 行 染色 或 放 在 3MM 滤 纸 上 于 燥 进行 
放射 自 显影 。 

(3) 染色 操作 : 

染色 溶液 和 染色 方法 有 多 种 ， 下 述 方法 迅速 ， 重 现 性 好 。 

四 将 凝 胶 放 在 带 盖 扩 瓷 盘 中 ， 加 50ml 染色 液 盖 放 50 一 55C， 
15 分 钟 。 这 可 以 固定 蛋白 质 带 并 从 凝 胶 上 除去 SDSS 呈 05) 

四 倒 掉 染 色 液 ， wii GyWigsidiuai ， 和 5f85 芭 
15 一 20 分 钟 。 

加 倒 掉 染色 液 ， 加 入 100ml 脱色 各 ， 放 50 一 5 了 缓慢 报 贰 5 
分 钟 。 


es。 98。 


四 倒 掉 脱色 液 ， 加 入 100ml 新 的 脱色 液 ， 重 复 @ 步 又 。 

@ 重 复 @ 步 又 ， 一 般 可 在 5 一 15 分 钟 后 可 见 蛋白 质 带 。 完 全 脱 
色 需 2 一 24 小 时 ,， 它 决定 于 凝 胶 的 厚度 .用 小 体积 脱色 液 重复 洗涤 
比 用 大 体积 洗涤 效果 更 佳 。 脱 色温 度 可 用 20* 一 65 。 

3. 凝 胶 电 泳 分 离 蛋 白质 的 银 染 色 法 

染色 过 程 的 基本 步骤 包括 固定 、 洗 淋 、 染 色 、 漂 洗 、 还 原 、 
增色 、 观 察 。 所 有 溶液 用 双 蒸 水 配制 。 整 个 过 程 应 盖 住 凝 胶 盘 子 ， 
以 免 溶 液 蒸发 。 
人 @ 将 凝 胶 放 在 干净 的 搞 瓷 盘 内 ,加 入 500ml 固 定 液 (50%HAc 
和 502% 乙醇 )， 缓 慢 振 划 过 夜 。 

@@ 将 固定 液 吸 出 ， 加 500ml 新 固定 液 ， 振 划 2 小 时 。 

四 将 固定 液 吸 出 ， 加 双 燕 水 500m1， 缓 慢 振 划 ， 每 小 时 换 1 次 
水 ， 共 4 次 。 

外 将 水 吸出 ， 加 500ml 新 配制 的 AgNO: 溶 液 (1.9g8/L AgNO。 
溶 在 双 蒸 水 中 ， 用 前 减 压 除 氧 )， 振 功 2 小 时 。 

加 将 Ag8NOs 豚 出， 加 入 双 燕 水 〈 去 氧气 )， 洗 2 分 钟 。 
”@ 吸 取 3.75ml HCHO 加 到 500ml 去 氧 的 0.75N NaOH 党 液 中 ， 

然后 将 此 溶液 倒 入 凝 胶 盘 中 ， 振 蔓 10 分 钟 。 

@ 将 @ 还 原 溶液 吸出 , 加 500ml NavCOs(7.5g/I 溶 在 双 蒸 水 
中 ， 绥 慢 振 葛 1 小 时 ， 再 换 一 次 NaxCO: 液 以 除去 过 剩 的 NaOH。 
颜色 逐渐 显 出 ， 通 常 6 小 时 达到 最 高 效果 。 凝 胶 可 在 Na:CO。 中 贮 
存 数 日 。 可 见 到 黄 、 红 、 蓝 、 绿 染色 斑 。 


(十 一 ) 利 用 Cosmid 载 体 建立 基因 文库 


cosmid 是 一 种 质粒 载体 ,应 用 它 进行 克隆 实验 就 像 应 用 其 它 
质粒 载体 一 样 ， 不 过 它 含 有 4 鸣 菌 体 的 粘性 末端 (4cos) , 故 可 被 离 
体 包 装 在 4 噬菌体 头 中 ， 形 成 有 便 染 力 的 4 哗 菌 体 ， 通 过 侵 染 进入 
E. coli， 而 后 DNA 分 子 的 行为 又 如 同一 个 质粒 。 除 了 有 AMcos 外 ， 
被 包装 的 DNA， 其 长 度 必 须 是 在 野生 型 ADNA(49kb) 的 78% 《〈38 
kb) 到 105%(51kb) 范 围 内 。 由 于 通常 cosmid 质粒 的 大 小 仅 有 5- 


599 。 


由， ea 和 


10kb ,因此 只 有 含有 外 源 DNA 片 段 (40 一 45kb ) 的 cosmid 才 能 被 正 
常 包装 。cosmid 系 统 允 许 捅 入 大 的 DNA 片 段 ， 正 是 这 个 系统 的 特 
点 。4DNA 的 离 体 包装 是 基于 4 鸣 菌 体 头 部 的 形态 发 生 过 程 ， 这 是 
一 种 自我 装配 的 过 程 。 离 体 包 装 系 统 由 两 株 卫 .coli，BHB2688 和 
BHB2690 构 成 ,两 株 菌 携带 的 4 突变 体 各 不 相同 .BHB2688 的 4 突变 
体 缺 失 前 早期 蛋白 质 pE(Eam) 的 合成 ， 而 BHB2960 的 4 突变 体 缺 
失 晚 期 成 熟 蛋白 质 pD(Dam) 的 合成 。 同 时 两 种 原 吻 菌 体 都 是 可 
以 诱导 的 (CIts)， 而 且 还 是 裂解 缺陷 (sam)， 都 有 4 附着 位 点 缺失 
和 一 种 失 活 的 重组 系统 。 分 别 培养 两 株 菌 ,通过 热 诱 导 便 积累 4 蛋 
蝗 质 ， 然 后 把 它们 合并 ， 通 过 细胞 裂解 产生 一 种 包装 混合 液 ， 含 
有 完整 系列 的 1 蛋白质， 它们 可 以 在 加 ADNA 的 离 体 系统 里 ， 自 
身 包装 成 成 熟 的 4 颗粒 。 

cosmid 载体 容易 构建 ， 即 将 4 叭 菌 体 的 cos 区 插入 现成 前 质粒 
载体 ， 这 个 4 顺序 的 大 小 可 以 小 到 400bp， 因 此 构建 了 一 系列 的 
cosmid， 它 们 的 大 小 在 5 一 24kb， 克 隆 DNA 的 大 小 范围 在 28 一 46 
kb。 常 用 的 cosmidpHC79，6.4kb， 由 4 的 cos 区 和 PpBR322 构 成 。 


下 coRI HindIII 


BgsE 


图 6-4 DBPHC79 的 限制 性 内 切 酶 图 谐 
下 图 概括 了 建立 基因 文库 的 基本 步骤 ， 
让 600。 


AS 


AAA 


裂解 Sau3A 
给 体 菌 株 一 > 高 分 子 最 DNA 一 一 > 部 分 消化 DNA 


志 甸 分 黎 45kb， 
reos N_ . DNA 片 段 
: cosSmidl ， 3 
RE | 
人 Baam 45kbDNA | 
Lvww 


人 揣 提 DNA 


/ 


图 6-5 建立 基因 文库 的 基本 步骤 


噬 瑚 体质 粒 侵 染 了 ,coli 后 ， 为 避免 播 入 的 DNA 整 合 到 染色 体 
水 ， 通常 应 用 重组 缺陷 菌株 作为 受 体 。 侵 染 的 DNA 分 子 通过 ) 靖 
性 末 端 环 化 ， 由 于 含有 完整 态 的 cosmid 基 因 组 ， 故 可 作为 质粒 复 
制 以 及 用 抗菌 性 选择 重组 菌落 。 
我 们 可 以 用 下 面 的 公式 计算 建立 一 个 基因 文库 所 需要 的 克隆 
数量 。 
N=Jln(1--p)/In(i-f) 
p: 代表 任 一 顺序 在 基因 文库 中 存在 的 可 能 性 。 
N: 代表 克隆 的 数量 。 
于 为 克隆 片段 的 平均 大 小 和 基因 组 大 小 之 比 ， 假如 我 们 和 希 
望 克隆 片段 的 可 能 性 为 99%， 即 p= 0.99， 给 体 DNA 的 
分 子 量 为 10!"， 克 隆 片 侦 的 平均 大 小 为 8 x10s*， 那 末 
tt=8x108s/101"=0.0008 


601 


N=ln(1-0.99)/Iln(1-0.0008) = 5754 
于 是 建立 这 个 基因 文库 需 选 择 5754 个 菌落 。 
下 面 叙 述 用 cosmid pHC79 建 立 基因 文库 的 基本 操作 。 
1.Sau 3A 酶 部 分 消化 细菌 DNA 
巴 分 离 高 分 子 染 色 体 DNA 的 方法 参见 第 一 节 所 述 。 
@ 在 1.5ml 小 离心 管 里 ， 依 次 加 入 


H,O 至 终 体 积 150ul 
10 xsau 3A 绥 冲 液 15U1 
DNA 10Ug 


10 xSau 3A 缓 冲 液 ，500mM NaCl， 
60mM Tris-HCI，pH7 .5 
50mM MgC1， 
1mg/ml 小 牛 血 清 蛋白 

图 取 9 个 1.5ml 小 离心 管 ， 标 上 数字 ， 置 冰 浴 。 向 第 一 管 加 
入 30H1 步 骤 @ 混 合 液 , 向 2 一 8 管 依 次 加 入 15ul 混 合 液 ， 剩 余 的 混合 
液 放 入 第 9 管 。 

外 将 4 单位 的 Sau 3A 加 入 第 一 管 ， 混 合 ( 即 每 ug DNA 用 2 单位 
的 酶 )， 吸 取 15ul 加 入 第 二 管 ， 混 合 ， 吸 取 15u 加 六 第 三 管 ， 依 次 
加 到 第 8 管 ， 第 9 管 不 加 其 它 溶液 。 / 

回 置 各 管 在 37 下 保温 1 小 时 。 

@ 把 各 管 置 冰 浴 ， 加 入 EDTA 至 20mM 停 止 反应 。 

@@ 将 第 1 一 9 管 样品 和 已 知 分子 量 的 DNA 样 品 加 在 0.7% 了 琼脂 
粮 凝 胶 上 ， 电 泳 过 夜 (1 一 2v/cm) 。 

@ 乃 化 乙 狂 染 色 凝 胶 ， 蒸 饮水 洗涤 后 在 紫外 灯 下 观察 ， 根 
据 已 知 分 子 量 的 DNA 条 带 ， 确 定 哪 一 管 有 合适 的 反应 , 即 产生 最 
大 量 的 所 需 DNA 大 小 ， 计 算出 每 ug DNA 需要 多 少 酶 进行 反应 。 

Q@ 在 最 适 条 件 下 ， 消 化 200-500kg DNA。 

四 取 1lug 消 化 后 的 DNA， 电 泳 在 0.7% 琼脂 糖 凝 胶 上 ， 鉴 定 
PNA 片 段 的 大 小 。 

四 用 等 体积 氯仿 一 异 戊 莅 抽 提 DNA 一 次 ， 并 用 乙醇 沉 演 


602。 


6 


DNA ,将 DNA 深 解 在 200k1 TE 缓冲 液 (10mM Tris-HCI， 1mM 
EDTA，bpH8 0) 

@ 用 电泳 大 量 分 离 消 化 的 DNA 片 段 

2 .分 离 Sau 3A 部 分 消化 的 45kb DNA 片 段 

电 用 0.5%% 低 烷 点 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 Sau3A 部 分 消化 的 
DNA 片 段 CTris-HAc 电 泳 缓冲 液 ，30mA。，4D，20 小 时 ) 同时 电 
泳 40 一 50kb 的 标准 DNA 样 品 ， 例 如 未 消化 的 4DNA。 

Q@ 用 省 化 乙 锭 溶液 染色 含有 分 子 量 标准 的 凝 胶 条 ， 确 定 含 有 
45kb DNA 长 度 的 凝 胶 部 位 。 

国 用 刀片 切 出 相应 的 凝 胶 区 ， 并 转移 到 经 硅化 的 带 帽 玻璃 管 
望 四 滩 

外 以 后 步 又 参见 实验 5.4 

“ 回 测 定 DNA 浓 度 。 

3 .应 用 省 化 乙 锭 琼脂 糖 平 严 测定 DNA 浓 度 

四 制备 省 化 乙 锭 琼脂 糖 平 亚 : 用 蒸 馆 水 煮沸 溶解 1% 琼脂 糖 ， 
加 入 省 化 乙 淀 ， 终 浓度 为 5ug/ml。 于 每 个 平 严 中 倒 20ml1 琼 脂 糖 溶 
液 。 用 塑料 薄 磺 包 训 平 阵 ， 放 4?1 可 保存 几 周 。 应 用 前 将 平 血 开 盖 
置 377 保温 30 分 钟 ， 以 使 平 血 干燥。 

加 制备 标准 DNA 浓 度 溶液 ， 可 采用 链 精 DNA ,浓度 从 1ug/ zl 
到 30ukg/ml， 以 5ug/ml 量 逐 增 。 

图 取 5ul 不 同 浓度 的 标准 PNA 滴 在 测定 下 上 ， 将 待 测 DNA 适 


” 当 称 释 ， 取 5ul 不 同 稀 杰 度 的 待 测 DNA 也 滴 到 测定 亚 上 。 


外 将 平 亚 放 377 保温 ， 使 DNA 扩 散 10 一 15 分 钟 

名 将 平 亚 去 盖 ， 在 uvy 灯 下 观察 比较 待 测 DNA 与 标准 DNA 的 
菊 光 强度 ， 从 而 计算 测定 DNA 的 浓度 。 

4 .Cosmid 杂 交 分 子 的 形成 

四 用 BamHI 酶 在 标准 条 件 下 消化 cosmidpHC79DNA 

@ 通 过 1% 琢 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 完 全 消化 PHC79， 并 测 定 
DNA 浓 度 。 

要 取 2n8 搬 入 DNA 同 BanHI 消 化 的 pHC79DNA 混合 , 克 分 


003。 


子 比 为 1:3。 

四 用 乙醇 沉淀 ， 并 将 DNA 溶 解 在 连接 缓冲 液 中 , 计算 体积 使 
DNA 终 浓度 不 低 于 400ug/ ml。 

@@ 在 标准 条 件 下 连接 。 

@@ 连 接 混合 液 不 能 直接 用 于 包装 反应 ， 需 用 等 体积 的 氯 仿 - 
异 戊 醇 抽 提 ， 而 后 乙醇 沉淀 ， 再 溶解 在 适当 体积 的 了 410mM 
Tris-HCI，1mM EDTA，pH8.0) 缓 名 液 中 。 

5. 包 装 混合 液 的 制备 和 离 体 包装 反应 

(1) 冻 融 裂解 液 FTL 的 制备 

预 冷 全 部 试剂 ， 离 心 管 和 转子 。 

个 将 BHB 2688 的 一 个 单 菌落 在 2 个 LB 平 阵 上 划 线 ， 把 平 亚 分 
别 保 温 在 30C 和 42C ， 正 常 的 BHB 2688 只 在 30C 生 长 。 

@ 从 307C 的 平 阵 上 挑 几 个 菌落 接种 500ml ELB 培 养 液 〈 用 一 个 
2000ml 三 角 瓶 )。 

@g307C 振 划 培 养 4 一 5 小 时 ， 至 细胞 密度 约 为 3x10 7m 
(ODeuu=0.4--0.6)。 

四 将 培养 瓶 放 在 90C 水 浴 里 迅速 摇动 ， 使 培养 液 温 度 提高 到 
43 (用 一 个 酒精 消毒 的 温度 计 测定 7 而 后 立即 放 六 43C 水 洽 ， 
强力 振 划 15 分 钟 ， 再 放 入 38D 水 浴 强 力 振 划 2.5 小 时 。 

回 冰 浴 冷却 培养 狐 ， 将 培养 液 倒 入 2 个 离心 管 中 ， 高 心 
10,000g8，40 ，15 分 钟 。 弃 去 上 清 液 ， 除 尽 液 滴 ， 置 细胞 沉 深 于 
冰 洽 。 

加 向 一 个 离心 管 加 入 0.3ml 冰 冷 的 含 10% 芒 糖 的 50mM ITTis- 
HCI 溶 液 (pH7.4)， 悬 浮 细胞 (不 可 用 振 划 器 )， 将 悬 液 移入 另 一 
个 离心 管 ， 悬 浮 细胞 ， 用 0.3ml! 冰 冷 的 10% 芒 糖 ,50mM Tris-HGI 
溶液 (pH7 .4) 洗 刷 前 一 个 离心 管 ， 再 转移 到 后 一 个 离心 管 中 ， 用 
移 液 管 充 分 混合 菌 液 ， 使 之 不 再 有 细胞 团 。 

加 将 这 种 浆 状 菌 液 分 配 到 2 个 冰冷 的 10ml 超 速 离心 管 中 , 每 管 
0.5ml( 这 些 管 应 耐 液 氮 冷 冻 )。 

因 向 每 个 离心 管 加 入 30bl 所 制备 的 冷 溶菌 酶 液 (2mg/ml 党 


604。 


在 0.25M Tris-HC1，pH8.0)， 迅 速 混合 〈 不 可 用 振 划 器 )， 立 即 
放 液 所 里 冷冻 ， 维 持 15 分 钟 后 将 管 浸 冰 浴 慢 融化 ， 直 至 变 成 粘 笛 
液体 ， 加 入 125ul MI 缓冲 液 。 

MI 缓冲 液 ， 用 前 配制 ， 依 次 加 入 


H,O 110Ml 
8B- 琉 基 乙 醇 1 则 
0.5M Tris-HCI，pH7 .4 6ul 
0.05M 亚 精 胺 ，0.1M 丁 二 胺 300u1 
(用 1M Iris 调 p 瑟 为 7.0) 
1M MgC1l， 9UI1 
0.1M ATP( 用 KKOH 中 和 ) 75 则 


冰 浴 中 混合 ， 离 心 35,000rpm，25 分 钟 (2C Beckman 50Ti 转 子 )， 
而 后 将 离心 管 冰 浴 。 肯 取 25ul 分 别 加 入 冰 浴 的 75 个 带 帽 的 贮存 管 
-中 ， 立 即 盖 帽 ， 液 氮 冷 冻 ， 此 项 操作 越 快 越 好 。 

(2) 超声 波 抽 提 液 S 王 的 制备 

预 冷 全 部 试剂 ， 离 心 管 和 转子 。 

中 取 BHB2690 -个 单 菌落 在 2 个 LB 平 严 上 划 线 ， 分 别 在 307C 
和 421 。 

@ 一 @ 制 冻 融 裂解 液 步骤 同上 述 1 操 作 @ 一 @。 

， @ 用 3ml 冰 冷 缓 冲 液 A(20mM Tris-HCLpH8.0,3mMMSgCl1，， 
10mM 8- 葬 基 乙 醇 ，1mMEDTA) 悬浮 细胞 沉淀 ， 并 将 它 转 移 到 
一 个 冰冷 的 30ml 离 心 管 里 。 

@ 将 离心 管 放 在 冰 盐 水 中 ， 用 超声 波 处 理 细 胞 ， 每 次 3 秒 钟 ， 
调 至 最 大 检 出 值 ， 间 隔 冷 却 15 秒 ， 要 避免 产生 泡沫 ， 悬 液 变 得 很 
粘 ， 而 后 又 降 一 些 粘度 ， 呈 红色 ,处 理 8 一 20 次 后 最 终 溶液 为 奶油 
稠度 。 

@@ 离 心 ，6,000rpm，20，10 分 钟 ( 用 预 冷 的 sorvall ss-34 转 
子 )， 如 果 超 声波 处 理 的 很 合适 ， 沉 淀 则 少 。 向 上 层 液 加 入 0.6ml 
MI 缓冲 液 ， 以 每 管 25u1 量 将 抽 提 液 分 配 到 冰冷 带 帽 的 小 管 里 ， 立 
即 放 入 液 氮 或 -= 70 贮存。 存放 在 - 207 会 丧失 活性 。 


96058 


(3) 离 体 包 装 反 应 
@ 冰 浴 融 化 FTL 和 SE 需 15 一 30 分 钟 。 抽 提 液 很 粘 。 
加 室温 依次 缓慢 混合 S 三 、DNA、 和 FITL， 但 防止 起 泡 。 
SEE 5U 
DNA 直至 500ng8(DNA 体 积 不 得 超过 3HD) 
FTL 25b 
@@ 室 温 保 温 1 小 时 。 
四 加 入 300ul hdil 液 和 50ul 氯 仿 ， 振 蔓 混 合 ， 离 心 3 分 钟 分 相 ， 
吸出 小 相 转移 到 一 个 新 管 中 〈 和 氯仿 在 下 相 )5 
1dil， 每 升 含 Tris 1.21g8，MgSO4:。7H2O 1.20g 
明胶 0.1g， 用 HC1 调 pH 为 7.4 灭 菌 。 
ro 包装 效率 达 10“4 一 10 /bg 
DNA。 汉 
6 . 侵 染 和 重组 体 的 选择 寻 
Go .1ml 吻 菌 体 包装 液 同 1mlE， .coli 受 体 混合 例如 E. coli 


HB101( 应 用 含有 0.2% 麦 芽 糖 的 TB 培养 液 培养 受 体 , 了 B 培养 液 每 


升 含 蛋白 肪 10g NaCl 5g， 灭 菌 后 加 入 10ml1IM MgS94)。 

@377 保温 混合 液 30 一 60 分 钟 。 

四 离心 ， 洗 沉淀 后 再 悬 在 LB 培 养 液 中 。 

@ 四 涂 布 肉 汤 平 阵 〈 含 有 适当 的 抗生素 )， 筛 选 转 染 的 细胞 。 

回 计 算 每 ug 插入 DNA 所 产生 的 抗 氮 葵 青 霉 素 细 胞 数 。 

四 将 抗 氮 苯 青 霉 素 菌落 复制 到 含 四 环 素平 严 土 ， 测 定 polyeo- 
smids(AprTc") 百分数。 

每 Mg 连接 的 插入 DNA 应 得 到 104 重 组 体 ， 如 达 不 到 这 个 数值 
则 要 重新 制备 45kb 大 小 的 DNA 片 段 。 另 一 个 影响 因素 是 载体 和 搬 
入 DNA 的 克 分 子 比 和 连接 液 中 DNA 的 浓度 。 低 百分数 的 polycos- 
mids 说 明 建立 了 一 个 好 的 cosmid 基 因 文 库 。 进 一 步 应 测定 基因 文 
库 是 否 是 完整 的 ， 这 可 通过 转 染 营养 缺陷 突变 体 来 测定 。 


〈 白 应 林 ) ， 


旬 606。 


mm 科 2 攻 6 
已 Ba AS 
LA 一 一 一 一 一 一 一 一 一 


_ 一、 主要 的 遗传 学 期 刊 目录 


【说 明 ]】 


1. 本 目录 收编 了 国内 外 有 关 遗 传 学 期 刊 共 200 种 ， 中 文 刊 名 校 拉 丁 语 字 
母 顺序 排列 。 

2.。 未 目录 的 著录 项 目 包括 刊 名 译名。 创刊 年 、 出 版 编辑 机 构 、 国 别 、 
期 次 和 国际 刊 号 (ISSN )。 

:3。 刊 名 前 有 “#? 号 者 ; 系 指 遗传 学 核心 期 刊 呈 共 52 种 。: 首 先 按 4 文摘 法 ? 
分 析 了 “遗传 学 文摘 》(Genetics Abstrfacts) 1986 年 全 年 12 期 的 被 摘 文 摘 
8635 条 ， 涉 及 到 819 种 期 刊 ， 按 每 种 期 刊 被 摘 次 数 的 多 少 ， -排列 出 一 个 顺序 
胡 ， 摘自 此 表 前 46 种 期 刊 的 计 有 5202 条 ， 上 二 全 年 灾 摘 总 数 的 60%- 交 上， 故 是 
遗传 学 的 核 必 期刊。 根据 中 国 科 学 院 遗 传 研究 所 图 书 馈 近 三 年 的 借 出 率 排 列 
出 一 从 顺序 表 ， 与 核心 期 刊 对 照 、 比 较 、 出 借 率 最 高 的 期 刊 , 基 本 与 核心 期 
刊 相 吻 合 。 又 参考 中 国 科 学 院 生 物 学 口 各 研究 所 图 书馆 和 上 海 复旦 大 学 遗传 
所 图 书 室 的 期 刊 订购 情况 ， 又 筛选 出 6 种 期 刊 ， 连 同 前 4 种 期 刊 ， 共 选择 出 
送 传 学 核心 期 刊 52 种 ， 供 遗传 学 工作 者 参考 。 


es。607。 


Abstracts of the Annual Meeting of the Americafm Society for Mi- 
crobiology/ 美 国 微生物 学 会 年 会 文摘 
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ISSN 0564-3783 


(所 和 糙 翘 ) 


高 等 生物 的 染色 体 数 


自从 Sutton 和 Boveri 提 出 站 传 的 法 色 体 学 说 以 米 ， 梁 色 体 研究 发 放 很 
快 。 当 色 体 的 概念 是 泛 指 任何 一 种 基因 或 遗传 信息 的 特定 线性 序列 的 连续 结 
构 ， 是 一 切 生 物 遗 传 、 变 措 ， 生 长 .发育 和 进化 的 物质 基础 。 生 物 界 每 一 种 
生物 都 有 一 定数 目的 染色 体 ， 任何 染色 体 上 的 变化 都 将 导 至 生物 在 形态 学 ， 
解剖 学 ， 送 传 学 上 的 变异 。 因 此 ， 了 和 解 每 种 生物 的 染色 体 数目 ,并 进行 核 弄 
的 分 析 ， 将 会 对 遗传 学 ， 衣 种 学 和 细胞 工程 学 ， 提 供 达 要 和 有 盖 的 科学 
料 。 未 书 限 于 篇 幅 只 能 在 此 介绍 一 些 主要 农作物 、 经 济 作物 、 2 
些 家 言 、 家 人 备 、 实 验 动物 的 炭 色 体 数目 。 在 本 节 末 ， 提 供 了 有 关 染 色 体 数 的 
专著 上 有 目录， 便于 读者 查找 。 


2n= 22 
(一 ) 社 物 银 杉 属 Catpaya 
1, 裸 子 植物 银 杉 CargropPRyILa 
苏铁 属 Cycas 2n=2Xx= 24 
苏铁 Ce。reyrolgtg Thunp 福建 招 属 Fokienia 
2RA= 22 福建 柏 Foaginsii Henry et 
华南 苏铁 CrUTID7Ii NIig N\ Thormas 


s。637。 
、 6063 


2 三 24 


银 查 属 GinKgo 
银 查 G.biloba 
2 了 二 2 和 = 24 
落叶 松 属 艺 ari 
落 时 松 “ 工 .51ETini Rapr。 
2n 三 24 
黄花 落叶 松 三 .olgensis Henry 
2P=24 
水 杉 属 AMetaseauoia 
水 杉 M 81yptostroboides 
HE et Cheng 
2 拉 二 .22 
松 属 Pinus 
当 皮 松 卫 。.BHM1S5eQHG ZUCC 。eX 
Enal 
2n= 24 
红 松 卫 。Koraiersis Sieb。et 
ZUec 
2 三 24 
罗汉 松 属 Podocarpzs 
罗汉 松 了 .HRCrOD 瑚 7yITRS 
下 二 :有 二 38 
2。 被 子 植物 
《也 粮 食 作物 “ 
习 麦 属 A7ePa 
燕麦 ASatipyc 工 。 
28=6X= 42 
敬 麦 AnUda 工 。 
2 有 = 6X= 42 
野生 抗 儿 ”Asterilis 工 ， 
敬老 2n= 6X= 42 
暮 蔬 属 Dioscorea 
甘 暮 卫 .escHIePpta 


(Lour) BourEill 


638。 


2n= 40,60,90,100。 


大 者 属 了 orderpmm X= 7 
生生 人 大 瑟 arizonticon 和 
2 王 二 6 区 二 [421 
北美 洲 多 年 生 野 史 
生 四 信 体 大 者 GePTESST 
2 
六 二 汪 ， 本 二 吾 .cafiforianauza 
2 人 三 2 三 生 和 汪 
载 培 二 楼 大 麦 ”下 aisticHaifi 
Lemend .Lam。 
2 = 2 和 X= 工 : 
二 著 野 生 大 考 再 spotGHeHIH 
C.Koch 。 
2Dn= 2X= 4 
大 霉 百 .satiyum Jess。 
28= 2X= 开 4 
矮 生 大 考 五 .?U18a7e 
2n= 2X= 14 
称 属 Diy73” 天 大生 
普通 野生 稳 OO。perenPis NMotnc 
2n=2X=24 
种 稳 O.satiyG Subsp。SRiez- 一 
2 及 三 2X ER 
类 称 O.satiya subsp .Kem5 
2n=2X= 24 
夭 属 PalHiCH 到 工 有 = 7 浊 划 
委 也 .11iiacek 工 。 
狼 昆 草 属 Penmisetia 有 X= 7 
珍 表 栗 了 .SCHCHIE 《ianaeuU5s) 
R .Br 
2n=2X= IT4 
墨 麦 属 Secale 和 =7 
要 麦 SCEFPCIC、 开 。 


证 


si 和 下 河和 
狗 尾 章 属 Setarta x=9,19。 
Suitarica 工 .Beauy 
2n= 2X = 18 
DaRUI 


若 属 
对 生 四 倍 体 马铃薯 ”" ccatle Bitt， 
2n= 4X= 48 
早熟 马铃薯 5 .stenotomHL Jaz 
人 tt 二 
2Dpz 2 三 2: 
S .tuberosW 工 。 
2n=4X= 48 
Sorgpzn 文 =5 
9 .GTPzE1 


高 粱 _S 。yMISEaHFe 

2n0=4X=20 
小 麦 尽 工 rEEiCU X= 了 7 
野生 一 粒 小 麦 下 .aegilopodes 

2 三 2X 三 于 4 
一 粒 小 麦 工 .nzOHOCOCCHHE 工 。 
2 三 2X= 114 
和 rcu Jakubz 。 
ji2n=4x= 28 

一 葵 外 赤 工 。dicoccuH 《〈Schranky) 
Thef1l 
2n =i4X= 28 
了 .aeStiU - 工 。 
2n0=6X= 142 
了 .Gesti7Un1 SspuccmPat- 
Un (Host) MK 
2n=6X= 42 
工 。GETUL Dest 
.2n=' 4x= 28 


普通 小 才 


密 穗 小 考 


硬 粒 小 考 


TJperstcu Evav。 


波斯 路 考 


、2n=4X=28 
CR 作 术 ,下 ,poIaric1 工 ， 
3 2N =:4X=28 
类 下 尔 且 大 了 ,SPeItfa' 开 ， 
2Dn =-0X = 12 
印度 悉 生 小 者 下 .spPhaeroccccIH 
Perc 。 
2 =6X= 142 
提 莫 非 维 小 考 : 了 ,finiopheeyi Zhuk 
2 有 三 二 双 三 28 


末 廊 这 了 。tEFETGHUNNS 


2 = 4X 三 28 
小 黑 麦 属 TriticCz 
小 墨 麦 .Fri 在 cat 


2n=8X=56 
玉 蜀 乘 属 :Cea . 
玉米 “TSAVCXR = 也 
2n=2x=20 
(2) 经 济 作 物 
葱 属 A7 天 太 有 1 村 
洋 瓯 ， Acepa 3 
2n=2X= 16 
枇 AAA。.fiSstIosSHIn 工 。 
2n = 2X= 了 6 
大 蒜 Asatru 开 。 
28= 2X= 16 


芸 萌 属 媒 raSSica 
油菜 ”BJcampestris 了 工 ， 
2n0 = 40= 33( 染 色 体 组 :C+A) 
青菜 (白菜 型 油菜 》 5B,cRaihensis 工 。 
2n= 2X = 20 区 妆 色 体 组 ;:AA) 
芥菜 (芥菜 型 油菜 六 吾 肌 KECea 代 。) 
Coss . 
2n= 4X= 36( 染 色 体 组 :Br+ 信 ) 


ss 639， 


墨 芥子 了 .nigre (人 (L。) 开 。 民 ock 
2n0=2x=16 (染色 体 组 :BB) 
卷心菜 了 .bleiyere 7y6r .cabpitata 工 ， 
。 2n0=2X=18 (染色 体 组 :CC) 
瑟 。DEKIUeMSIS 及 upr。 
2n0=2x=20 (染色 体 组 ;AAA) 
黄麻 属 COrc1nOrUS 
黄麻 、C。CaDSV1OF7iS 工 。 


白 业 


2 三 2X，4X=14，28 
长 茧 黄麻 C。olitofrius 工 ， 
2 了 三 2X， 4X= 14，23 
棉 属 COSSYPILIN 
中 榨 Garbore 工 。 
2n=2X= 26 
海岛 棉 CC。barbaadense 工 。 
2 下 二 .4 着 三 悔 2 
草 棉 (非洲 棉 ) G.hnerbacerpz 工 。 
2n=2X=26 
陆地 棉 _ G,.Pirsut 如 mp 工 ， 
23=4X=52 - 
印度 棉 G. 记 Qickp Lam。 
2n 三 2X=26 
朋 拉 相 戈 斯 棉 G。klotschniaartn 
Anders。 
2n = 和 PXrs= 6 


癌 月 菇 属 厂 elian 妨 US 


癌 月 世 五 .anRUES 工 ; 
2 有 三 2 芒 一 首 
野生 菊 芋 ”五 ,如 nberosky 工 。 
28= 6X< 寺 02 
烟草 属 Nicotiana 
楞 兰 烟 草 ，N。g8LauccC 
2 卫 三 24 
二 氏 曾 草 和 Ngoodspeedii 
2 三 40 


。6f40。， 


郎 氏 烟草 NIaiESdOrfTi 
2n=18 

N .tabacu 工 。 
2n= 48 
NorSfica 工 。 
2B= 48 
Nesy1estris 


普通 烟草 
黄花 烟草 


群生 烟草 
2D = 12 
葵 属 TARea 
茶 Tsinehsis 工 。 
28=2X=30 


油 桐 属 AIerrites 


半 本 油 桐 4。cordata (Thunb) 及 ,Br。 


2n=2X=22 
油 桐 4.jfordii (Herm sley) Airy 
-SPhaw 
2n=2X=22 
木 油 桐 4.montand Lour。 
2 了 = 2X = 22 
(3) 果树 
多 钦 桃 属 Actipidid 
牛 华 莓 猴 桃 4.cjlinensig Planch 
2n=116，160。 


软 囊 儿 猴 桃 4A。.arguta Sieb.et BI- 
anch et mig 
2m= 4X=`116 
柑 桔 属 Citrus 
袖子 C。gsrkHnedis 人 (人世 。) OsbecK 
2n= 2X= 18 
棕 榜 CTinon 人 (人工 .) Burm 
2 三 2Xy,4X= 18.36 
概 子 C。reticHiata BlIanco 
2 了 三 2X= 工 8 
龙 腿 属 下 APDROFiG 
有 眼 “三 。1ongegB (Louz .) 95teud 


由 


2n0=2X=30 
荔枝 属 工 itcni 
若 枝 区 .chtinensis Sonn 
2Es2x =-28)30 
苹果 属 Ma1VMS 
沙 果 Muasiatict Nakai。 
2n=2X=314 
山 荆 子 M。.baccata 
2n=2X=34 
M .prunifofid Borkh。 
2n:= 2x= 34 


人 DBeorkhn 


蕴 果 MDpumiIa Mill 


2n = 3X 一 51 
李 属 PrUMUS 
李子 ;Pdomiestica 工 。 
2 了 这 1 有 = 48 
梅 P.7mume Sieb 
2n=2XxX=16 
桃 ， 三 ,persSica 
2n=2X=16 
樱桃 卫 。.psektdoceras 上 s Lindl， 
28 = 2X73X 二 1 入 524。 


( 玉 小 卫 acsch 


日 本 楼 花王 .yedoensis Matsum， 
YU 
2m= 2x=36 

梨 属 P?rUS 

杜 犁 P.betulifoid Bge 

2n0=2X=34 

白 旬 己 .bretscPnnaeide 请 
20=2X=34 

葡萄 属 Tifis 

山葵 葡 六.a1UHreSsis Bupz 

2n=2X=38 

美国 葡萄 六.Iabrusca 工 ， 

2Pn= 2X=38 


葡萄 V.yinifera 工 。 
2T= 2X，=4X=338,76， 
谈 属 ZiztpRUKS 
QZ ,7U1UDe Mill， 
2n = 2X,4X,5Xy,6X 8 和 = 24748， 
60;72,96。 
(4) 实 验 植 物 
山羊 草 属 Aegilops X=7 
拟 斯 摆 尔 脱 山 羊 草 


等 记 


ASpDeltoides 
2n=2X=1T4 
染色 体 组 = 了 BB 


人 .SaUGrr0Sa 工 。 


方 入 山 羊 草 
“( 节 节 才 ) 


20= 2X=14 染色 体 组 =DD 
半 凹 山羊 草 4。yentricosa 


2n = 三 4X= 28 
冰 草 属 A48gropyromr X=ITi 
水 生 冰 草 ” 4A.desertoram (Fisoh) 
Schult 
2n=2Xx=28 
天 兰 冰 草 Ainternmedirm 
2n=3X= 142 


聊 呈 草 属 CommteIina 
晃 踊 草 C .comaaunis 工 ， 
2n=4X 6X=48 90。 


单 冠 毛 菊 属 “ 瓦 apIopaPDUS 
纤细 单 冠 菊 ”Craciris 
2mn= 2X= 4 
纳 氏 单 冠 菊 ， 开 .reyen 计 
20=:4X=8 
欧 豆 属 。 Pisum 


孔 豆 P.Sati7AL 工 。 
2n=2X=14 

野 茧 豆 属 Vicia 

短 豆 faba 工 ， 


0 了 1 


28= 2X=14 
(二 ) 雪 物 
1 节肢 动物 
飞 蝗 属 ; 二 0OcUStG 
东西 飞 星 艺 .Imigrasorix 工 。 


2n=-23(09) 
稳 蝗 属 Oxya 
中 华 # 稻 星 O .cpPinensis Thunberg 
二 二 包 37 
2。 背 索 动 物 


文昌 鱼 属 Brafzcjiostomza 


文昌 鱼 ”了 .pefcjperi 
2n=24 
3. 兰 椎 动物 
(1? 鱼 类 
大 麻 哈 鱼 属 Oncorjyc1ts 
大 麻 哈 鱼 0O.keta WwWalbaum 
2Dn = 了 4 


Gray 


CtElLODRGryRSOGO 
C .idelIHs Guvier et Valen- 
clenciennes 
2 入 二 纯 8 
Mega1obramaa 


人 ) AM .a1mD1)7cepFalE Yikh 
2 了 = 48 

鳞 属 CirrpninsS 

儿 鱼 《CC .01itorellIa CUSicr et 
Valenhcienmnes 
2n=50 

鳃 属 CarasS1US 

危 下 2CU7ECLCS 二 让 去 
20=I00 

金鱼 C。atrGfUS:OUFat8S - 工 。 


”042 。 


28=jT00 
CyPripAS 
C。carp 这 工 : 
28=100 
鱼 属 AristcPptpys ”各 
缩 4.nobilis Richardson 
2n = 48 
五 yDopthafpzicRtpyS 
囊 。.1HLOLIriX -Guvier et 人 Wal- 
enciennus 
2D = 43 
罗 非 鱼 属 了 工 iLazi 
加 便 罗 非 鱼 了 .gafilaetS 
2D 三 44 
尼 罗 罗 非 锂 了 .Riota 工 。 
2 = 44 
(2) 鸟 类 
聘 属 Ancs 
聊 4A.5IatyTrpnyfPcFOS dc7TeSTiCcuS 
志 
2n=79( 蛙 ),80(Q) 
和 长 属 C7y8H10Sis 
蕉 Cu.cyghiopsis domesticus 荆 。- 
2n=81(?)?82(0) 
厚 鸡 属 CalIBRS 
鸡 G。galIus domesticah Brisson 
2n 了 7 信 浊 ) 7 诉 才 六 于 
COIUTEDG 
Ciyie Gmelin 
2n0=16 
Ci2iC do1iesfica 工 
2n=79( 茸 ),80( 桔 ) 
3 . 浦 乳 动物 
猪 能 属 Airopoda 
大 熊猫 及 .11ELaH1OIeLCQ Giant 


Tania 2n>=a0(C0》) 


2n = 42 家 猪 S。scrofa Gonestica Bfisson 
猎 属 Felis 2 =138 
家 薄 下 ,1 动 yeca domestica 了 risson 4 实验 动 鞠 
28= 38 等 属 有 DB7RDPy 
肢 牛 属 了 os 衣 虱 了 .mor 工 ， 
偶 牛 Btaurts 2 = 50( 早 ,和 0) 
2n= 60 仓 络 属 Cricetkyus 
加 和 牛 “了 ,grkntiehS 工 。 黑钱 仓鼠 ”C .parabensis 
2n=60 2 3 22 
水 牛 属 “BHUbaluS 果 蝇 属 “DrosopRiG 
水 牛 “ 书 .bkbaIus 工 。 美洲 果 蝇 了 b ,apzericanG 
2n 二 48 2n=8 
绵羊 属 OYS 。 豹 敏 果 蝇 ”也 .btuscki 
绵羊 ”，O.aries 工 。 2n=6 
2n=54 得 克 萨 斯 果 邵 “ 卫 ,tXqna 
山羊 属 《Capra 加 28= 10 
出 羊 “Chircus Linn'e 小 鼠 属 Ms 
2n= 60 小 鼠 M.SCHIUS 工 。 
犬 属 Canis 2n= 40 
本 小 各 鼠 。M.mHSCRIUS GDHIG Kish- 
狗 C。.familiaris L。 欠 
2n0=78(0) 2 这 和 
六 入 放 穴 免 属 OryCc1gHsS 
和 训 汪 的 的 可 和 家 各 O .cunicHIHUS do1aesticHS 
示人 Gmelia 
驴 > 五 .SinUS 工 。 - 0 
和 爪 电 尾 ，XenOp5S 
野猪 属 Sus 人 


爪 并 ” 筷 .Jaeyis GuentherT 
了 野猪， 9 .IJercomystax Temminck 2n0= 36 


et SeP1ege! 
参考 修 Benirschke, KK, and Hsu T，Gi; 


Chromosome atlas: fish，ambphibians，reptiles and birds， 
V ol.1:3 Springer-Verlag，Berlin, 1973 
@Darlin gton,C,D,.& ana Wylie，A, 了， 


643。 


Chraomasotfme 和 tileas cf Ftosvering Plants 
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7V, ilius Ref。 

和 外 MaKkinoe，Sa jire 


到 疝 ， 多 


An atlas of the chtfomosome umbers in anima1s. 
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Jowa, State College Press，C1957 

加 姚 世 泪 < 生物 的 染色 体 数 目 > 贵州 师 大 学 报答 刊 编辑 部 1987。 


《地 世 民 ) 
三 、 常 用 缓冲 液 的 配制 


一 些 生 物 反 应 常常 需要 在 一 你 PH 值 下 进行 , 而且 整 个 反应 需要 保持 ZI 
值 基本 不 变 。 所 以 要 在 一 定 的 级 冲 液 中 进行 。 下 面 介绍 几 种 常用 的 缓冲 波 的 
配制 。 


2 

\、_” 工 . 甘 轿 酸 -盐酸 缓冲 液 (0.05M) 了 

X ml0 .2M 甘 毛 酸 + 了 mlo.2NHBCI， 再 加 水 稀释 至 200m1 

pH X 7 PH 下 

2.2 | 8 es 三 .0 | 238 50 11.4 

2 50 32。4 | 3 .2 50 8.2 

2.6 50 24.2 中,D3 异 54: ， 6.4 

六 50 16 .8 36 50 5。0 


” 革 氨 酸 分 子 量 =75.07。 
0.2M 匡 氨 酸 蒂 液 含 15.018/ 上 上 。 


e644。 


2. 邻 荃 二 甲酸 -盐酸 继 冲 液 (0.05XM1) 
X ml10.2M 邻 某 二 甲酸 氧 钱 +ml0.2N HC1， 再 加 水 稀释 到 20ml 


PH(207 ) 蕉 es PH(2075 ) 筷 过 
1 5 和 和 
误 本 人 村 这 | 1.476 
2.4 5 3 .960 | 0.990 
2.6 5 三 5 0.597 
2.8 5 2 .642 3.8 5 0.263 
3.0 5 


邻 车 二审 酸 氢 钾 分 子 量 =204.23 
0.2M 邻 全 二 让 酸 答 狠 六 液 含 40.85g/ 工 


-< 旺 


3. 袍 发 氨 二 钠 - 柠 机 可 绥 冲 液 


于 


| 


这- oz2MNasHPO| 0.1M 符 机 酸 | HH 0.2M Na?HPO4 0.1M 符 样本 
(毫升 (毫升 ) | (毫升 ) | “( 毫 升 ) 
区 0.40 19:60 1 5.2 10.72 9.28 
2.4 1.24 18.76 | 5.4 11.15 | 8.85 
2.6 1.82 | 56| 160 “| 8540 
2.8 东 和 9 
和 用 15.89 | 6.0 12.63 | Y58 
3.2 4.94 | ”15.06 | 上 
3.4 1 
3.6 4 人 | 13158 | 6 
3 .8 7.10 1 人 376 15.45 455 
4.0 本 
玫 - 4 人 
4.4 8 .5 | 11.18 | 7 人 18。 切 本 
| 10.65 1 7.6 18GX 到 加 55 外 是 沁 
4.8 9 .86 10.14 日 让 王国 证 
5.0| ”10.30 9.70 50 上 一 1T9245 0.55 


NayzHPO4 分 子 量 =141.98; 0.2M 湾 液 为 28.40g8/ 工 。 
Nas HPO4,2H2O 分 子 量 =178.05; 0.2M 深 液 含 35.618/ 工 
Ci 再 :97 ,再 :O 人 分子量 =210,14; 0,1M 济 液 为 21,018/ 工 


645 


4. 柠 拓 酸 -包扎 化 销 -盐酸 摆 冰 流 
| 钠 离 于 波 讶 ， 后 各 (0| 所 化 二 


HaOl NaOH 97 史 


@ 使 用 时 可 以 每 升 中 加 入 1g 助 ， 若 最 后 p 匡 信 有 区 化 ， 再 用 少量 强 氢 氧 化 钢 
洲 液 或 浓 盐 到 浓 节 ，; 访 箱 保存 。 


5. 柠 机 酸 - 柠 德 酸 钠 绥 冲 液 (0.1M) 


DoH 0 .1M 柠 檬 酸 钠 | 在 0。1M 柠 榜 酸 |o.1M 柠 萨 酸 钠 

| 一 aa | (ml) (mi) 
人 [松本 让 11.8 
3.2|.5 17"2 2.8 5 7 12.7 
84 104. 站. 人 | 5 13.6 
3 14.9 训 5 .1 | 5.6 -5.5 7 
本 0 5 15.3 ， 
人 六 训 
4.2 二 坊 玉 (全 交 | | 近 
4 生 二 二- 站 世博 > 克 沁 6 运 示 世 2 站 
4.6 10.3 9.7 | 3 
3 | 


柠 要 酸 CeHsO7y*H2O 分 子 量 = 210.14; 0.1M 洲 液 为 21.01g/I。 
行 检 酸 销 NasCe 卫 507"2 也 :分 子 量 = 294.12; 0,1M 湾 液 为 29,418/ 工 


se。 646。 


有 ie 人 本 Vs 可 汉 人 = ~ Eee 


6， 乙酸 - 乙酸 销 艘 冲 液 (0.2M) 


peer Se3hemP 


(mi) 


3.6 0.75 交 尖 对 7 ao | 5 本 | 4 
3.8 1.20 | 8.80 5.0 7 本 114. 机 
4.0 1.80 8 | 8 | 7 10 
4 呈 0 | .2.68 1 
人 9. 疝 :| .0.9 
5 
NaAc.3 卫 >*O 〇 分子量 =136.09; 

052M 溶 液 为 27.22g/L 


SA 7 . 磅 王 盐 组 冲 液 
(1) 磷酸 取 二 销 - 先 酸 二 和 氢 钠 缓冲 液 (0.2M) 
天 | 
pH 0 0.2MNas*HPO4 0.2 开 NaH:PO4 


(ml) (mdl) 0 0 (mil ) 
5.8 8.0 92.0 | 本 中 王 品 630 时 冶 61.0 39.0 
5。9 10.0 90 .0 | 克 | 67 .4 330 
670 3 387.7 7 2 2870 
6 民 下 DX 15.0 85.0 3 让 4 2310 
6。2 | 18 .5 81 .5 [7 .4 81 .0 19 .0 
6.3 22.5 7 人 .5 1 84.0 16 ,0 
6 .4 26.5 4 73.5 [区 87.0 13.0 
你 :5 3 .5 68.5 上 7 89.5 10 .5 
6.6 | 3455 62.5 |7 .8 91 .5 8.5 
6576s 3 5653 3 9830 一 -之 ] 7 
6.8 本 汪汪 51.0 |s.0 站 5.3 
6 .9 55.0 45。0 1 
SO 

Na HPFO42H:O 分 了 是 =178.605; 0.2M 溶 液 为 35.61g/E 


NazHPO4。12H2O 分 子 旦 = :58.22; 0.2M 济 液 为 71.648g/ 
NaHzPO4 忆 Ho O 分 子 最 =128.01; 0.2M 济 液 为 27.6g/ 王 
NaH:PO4。,2H2O 分 子 量 = 6 从 3， 0.2M 深 液 为 31.218/ 


(2) 人 酸 氢 二 销 - 伦 酸 二 氧 钾 绥 冲 液 (1715MM) 


| 
| 
p 卫 iu 5Nasy 训 了 AM/15KH。 ma, pH IM/15Nay, HPO, MI/15KH:，PO, 


2 (ml) Cml) 
4。92 | 3 .00 
5.23 | 0.50 9.50 人 8.00 2.00 
5 时 | 0 | 9.00 2 9.09 1.00 
55 时 站 3200.5 | 1 ae 0 .50 
6 .47 3.。09 7 .00 4 9.75 0.20 
6 中 ,3540 | .766600 21005794 帮 站 全 二 
6.81 5.00 5200 一 一 :18| HOU 
6 4.00 这 二 


入 az 可 PO4。2 开 2O 〇 分子 量 =1f78.05; 1/15M 湾 液 为 霸 .876g/ 开 
HEFO4 分 子 量 =136.09; 1/15M 洲 液 为 9.078g/ 工 


8 . 确 酸 二 氨 钾 -和 氢 氧 化 钠 缓 冲 液 (0.05M) 
Xmli0.2MKH,PO, +Ymi0.2NNaOH 吉 水 稀 二 至 20m1 


| | 
Re Xml) 上 (ml) [meon 和 (ml) 了 (ml) 
| 
上 本 
5.8 5 6 5 开放 和 2。963 
6.0 5 0.570 7 .2 5 3.500 
和 0.860 | 7.4 5 3 .950 
| 
6。4 5 1.260 7..6 5 4.280 
6.6 5 1.780 7.8 5 4。520 
6 .8 5 2..36 上 到 外 25dgng 0 人: 汪汪 4.680 
“648 。 


9, 巴 比 买 钠 -盐酸 绥 冲 液 (187) 
0. 04M 巴 比 妥 钠 0.2N 盐 酸 | 本 0.04M 巴 比 妥 钠 | 0.2N 盐 酸 
P 


本 溶液 (ml) ml) | 溶液 (ml) (ml) 

ee 
6..8 100 18。4 | 8 4 100 5.21 
7.0 100 可 3 .82 
入 100 | | 沁 2 
mh | 100 0 | 950 | | 109 | 3,65 
7 .6 100 | 一 -9 | CA 人 
100 下 | 0.70 
8.0 100 889 | 06 计 - 证 了 0 0.35 
喜 : 100 | | 100 


巴 比 妥 钠 盐 分 子 量 =206.18; 0.04M 党 液 为 8,25g/ 工 


10 .Tris- 盐 酶 缓冲 液 (0.05M,25TC ) 
50m10 .1M 三 叛 甲 基 氮 基 甲 伐 (Iris) 溶 液 与 Xml0.1N 盐酸 混 匀 后 ， 加 
水 稀释 至 100ml 。 


EEC 

| Leica 
丽人 人 二 证 
7.20 0 1 
下 8.60 T2 
7 .40 42.0 和 10.3 
7.59 40 .3 8 .20 22.9 8 .80 8.5 
5 19.9 人 
区 
三 产 甲 基 氨 基 甲 烷 (Tris) HOCH。 “CH:OH 

CG 

分 子 量 = 121.14; HOCH,A、NH; 


0.1AM 深 液 为 12.114g/1。Tiis 溶液 可 从 空气 中 咀 收 二 氧化 碳 ， 使 用 时 注意 将 瓶 冲 
严 。 


E 2 Am 


3 ,. 玛 酸 -硼砂 缓冲 液 (0.2 虹 狂 避 概 ) 


PH P 0.2M 础 酸 | pH 0.05M 栅 砂 0.2 人 硼酸 


wwe “一 一 人 一 nm 一 


(ml) 人 m1T) (mi (ml) 
| 655 
人 825 | 8.4 他 5 5;5 
1 600 430 
本 | | 


两 砂 NazB407*10HsO， 分 子 量 = 381.43; 0.05M 湾 液 (= 0.2M 盔 酸根 ) 含 19.0” 
g/ 工 。 

珊 酸 百 :BOJ， 分 子 量 = 61,.84，0.2M 济 液 为 12.37g/ 工 。 

. 社 砂 易 失 去 结晶 水 ， 必 须 在 带 塞 的 瓶 中 保存 。 


12., 甘 氨 怕 -和 氢 氧化 销 杀 冲 液 (0.05MM) 
Xml0.28M 革 氨 酸 + 了 了 ml10.2NNaQH 雪 水 稀 芋 至 200m1 


1 


EN 7 pH 本 
2 | 

机 再 50 22.1 
8-8 50 6.0 9.8 50 
9.0 50 8.S .0 50 32.0 
| 2 .0 

本 :再 枉 这 
共 所 加 分 子 量 =75.07; 0.2M 深 深 含 15.01g/ 工 


13 . 形 砂 - 粤 氨 化 钠 缓 冲 液 (0.05M 珊 屋 根 ) 
Xmli0.05M 硼 砂 +Ymli0.2NNaON 加 水 稀 灵 至 200ml 


PH 党 et | 开 
人 
9 人 间 王 | 50 B9.0 
此 下 的 碌 洒 训 外 省 5 让 亲 和 和 洒 堆 oc 43.0 

9.6 二 | 10.1 0 人 人 全 站 


对 砂 NayB4,07*10H2O， 分 子 量 =381.43; 0.05M 溶 液 为 19.07g/ 工 。 


658 


1 . 碘 酸 钠 -碳酸 亿 铺 绎 冲 沪 (0.1M) 
Caz+: Mg21 存 在 时 不 得 使 用 


ER 后 ; 91AM NaiCoOs(ml)10.1M NaHCOs (ml1) 
| 
9 .16 本 六 7 1 9 
9.。40 9.。12 2 8 
9.51 9.。40 3 7 
9.78 198650 4 6 
9 .90. 9。72 5 5 
10.14 9.90 6 4 
10.。28 102.08 3 
10.53 10 .28 8 2 
10。83 10 .57 9 
NazCOa'10 了 2O 分 子 量 =286.2; 0.1M 溶 液 为 28.62g/ 工 。 
NaHECOs 分 子 量 = 84.0; 0,TM 湾 液 为 8.408/ 工 。 
( 赵 世 民 ) 


四 、 植 物 、 动 物 及 微生物 的 常用 培养 基 


目前 迅速 发 展 的 生物 技术 都 离 不 开 培 养 技术 。 培 养 基 种 类 繁多 ,并 在 不 
断 地 修改 发 展 之 中 。 这 里 汇集 一 些 目 前 常用 的 培养 基 ， 以 便 工 作 中 查阅 。 
(一 ) 模 物 材料 的 常用 培 芭 基 
1, 适 用 于 组 织 培养 的 培养 基 〈 表 中 培养 基 的 用 量 单位 均 为 mg/I) ， 
(1) 改良 怀特 (White) 培 养 基 (1963) 


MgSO， 7 CuSO .5H:O 0.001 
Ca NO: )， 300 ZnSO; 3 
Nay,SO， 200 Na,MoO，。，2H:O 0.0025 
居 NO。 80 KI 1 


* 65J。 


KCTE 
NaH,PO， 
HBO。 
RinSO;， 
Fe:(SO:)。 


生长 业 、 分 裂 业 另 吉 。 


BEHS5 


维 生 肆 了; ex 


维生素 电 * 0.1 
类 酸 0.3 
其 氨 酸 8 3.0 
蔗糖 20000 
了 肌 莅 100 

,人 一 5 到 


(2) NMS 培 匡 基 (Miurashige、Skocg) 1962 


NH4NO， 

上 NO。 
CaCl:。2H 2)O 
MEgSO:。7H2:O 
KH2PO， 
:16 

NMnSsol 4H,O 
Coclj,， 6H,O 
CUSO:。5H2O 
ZnSO。7H2O 


NasNMocoO。2H2G 


1650 KI 0.83 
1900 FesSoOl。 7H2:O 2728 
440 Na:EDTAi. 2H,O 3713 
370 维生素 了 ; 0.4 
170 维生素 了 Bs 0.5 
ev 色 英 酸 0.5 
22.3 上 肌 醇 100 
0.025 甘 扎 酸 二 
0.025 “、 巷 糖 30000 
8 .6 
9525 二 
DH5 .6 一 5.8 


(3) B5s 培 养 基 (Gamhborg，1968) 


NaH,PO,.H2:O 
KNO ， 
(CNH4)2SO， 
NigSO。7H,O 
CaCl。，2H2O 
HBOs 
MnSO，H;O 
1 
CuSO，5H:O 
ZnSO:。7H :9 


150 Na MoG:。2H.,O 0.25 
2500 KI 0.75 
134 Na-Fe-EDTA 28.0 
250 维生素 也 10.0 
1510 维生素 6 1.0 
3.0 茨 酸 1.0 
10.0 肌 醇 100 
0.025 
0.025， ” 莽 糖 20300 
2。0 
pH=5.5 


(4) Schenk，Hildebrandt 培 养 基 (1972) 


2508 


FeSO，7 开 2O 15.。0 


到 


MgSO,，7H:O 
CaCl:。2H:9 
NH,H,PO， 
MnSO:,。H2:O 
Ha BO， 

ZnSO+4 "7 五 :O 
KI 
Cus04。5H:O 


10 
5 人 
IT.0 
上 5 
伏 2 


| Na:AMoO， @ 2H2O 余 - 


KecGl ， 人 6H:O 


0.1 


NaiEDTA。 2H);O 
维生素 Bi 
维生素 Bs 

欧 酸 

肌 醇 

2，4 一 卫 

了 一 毛茶 氧 基 酶 酸 
激动 素 


了 59 


(5) Ne 培养 基 〈 北 京 植物 所 、 思 龙 江 省 农 科 院 ，1974) 


玫 NO;， 2830 ZusSO4。7H,:O 
(CNH4):504 463 HBO， 
KH,PO， 400 玉 I 
MgSO 。7H2:O 185 甘氨酸 
CaCl:。2H。O 166 维生素 Bl 
Eee OO 27.8 维生素 卫 。 
Na -EDTA 37。3 蒸 酸 
NMnoO。4H2O 4。4 蔗糖 
PH =5.8 
2. 适 于 仑 粉 和 花药 培养 的 培养 基 

Vasil 培 养 基 (1959) 

Mg950,。7H2O 360 Na: Mo0O4，2H:O 


二 


〈 赵 世 民 ) 


CatNO: )， 昌 4H Da- 0200 Co 人 1， 名 6 了 OO” 二 ,2303 人 025 


Naz:SO: 200 主 ”和 柠 样 酸 铁 ,，5HiO 1 sd0.0 
KNO， ， 80 二 甘氨酸 JR 5 
攻 Ci 6 人- 丸 酰 咏 7 Jan1525 
NaH,PO, ,HH2O 165 维生素 也 i 0E25 
MnSO, .48H2D 330 ,二 维 生 玉 B6 -HT var 和 25 
ZnSO:,。7fi59is : 085- 泛 琶 钙 0125 
HaBo9。 0.5 三 吗 呼 姜 酸 Hz ，,D2uz20 
CuSO,。5H;O 0.025 二 蔗糖 HeOiIE 000 


pH5.5 口 - 再 3 


Bourgin，Nitsch 培 养 基 《1967) 


No 550 “Fes0 ， 72O 的 
NH_NO。， 5 六 Na:EDIA ,2HiO 3.5 
Cacl,。2HiO ”166 维生素 Bi 0.5 
MgSO "7H:O 185 ， 维生素 Be 人 
KH;PO， 68 0: 藉 酸 | 下 
MnSO.，4H:O 2 2 及 
HaBO， 10.0 ”生长 素 2 
00， 7HO 10 5 于 贡 信人 
Na Mo0, .2H,O 0.235 ”有 了 肌 生 7 
Cuso, ,5H;O 0.025 “六 糖 20000 
PH5 .5 
Nitsch 镑 养 落 〈1974) 
- 苹 NO。 950 ”了 册 稚 5000 
NH ,NO， 720 ， 工 一 谷 氨 或 肪 800 
MgSO47H29 135 。 工 一 丝 氢 屋 ， 工 00 
Cacl， 166 ”玉米 素 0.01 
和 KH,PO， 68 是 骂 乙 酸 0.1 
FeNa; EDTA 10-3M 其 基 业 ， 20000 
| 


5 


655 


chu Wong Sun， Hsii，Yin，Chu，Bi 培 养 基 〈1975) 


一 攻 NOs 1 
(NH4)。SO,， 
CaCl,.2H,O 
MgSoO .7HO 
KH,PO， 
MnSO,.4H,O 
记 。BO， 
ZiiSO 7H2O 


到 eljlezf， 
KNO。 
CNH, ),SO， 
Cacl,.2H;O 
MgSO,,7H,O 
NaH,PO ,. 直 ,O 
MnSO,.4H,O 
HBO， 
ZnSoO 7HO 
0 
Na McO 2HO 
CUSO: .5H 


2834 :， 世 区 玉 

463 FeSoO4 7H2O 
166 ”NaBDTA,.2H,O 
185 ”维生素 B， 

400 维生素 Be 

4 RE 
1.6 ， 甘氨酸 

了 Mrg 天 ;1 匡 

PH5.8 


Rajhathy，Lacapra 培 养 基 (1975)， 


2500 Ceccl: ,6H;O 
13 专 ”国家 标准 330Fe 
750 (14.2% 三 氧化 
250 3 铁 王 egOa ) 
150 ”维生素 Bi 

10 维 生 过 了 6 

3.0 “区 酸 

也,0 “ 谷 氨 酰胺 
035.… 二 个 本 

0.25 “ 芒 ;， 糖 
0.025 

FEH5.。8 


马 铃 甘 -I 培 养 基 〈 庄 家 骏 、 欧 阳 俊 闻 等 ，1978) 


KCI 

KNO， 
Ca(NOs),,4H;O 
MgSO,.7H;O 
(NH1),SO， 
KH,PO， 


5 


1000 


100 
125 
108 
200 


FeSO 7H2O 
NasEDTIAv“2T:O 
琼脂 


1。0 
1.0 
8&06 
1006 


100004 


浆 取 定 重 的 马 铃 鞭 《每 并 培养 基 100 克 )， 洗 刘 ， 切 成 小 块 ， 加 一 定量 的 
燕 偏 水 煮沸 灶 小 时 ， 用 两 层 纱布 过 滤 ， 余 下 的 残 河 用 同 料 方法 再 者 一 次 , 过 
滤 、 两 次 液 加 在 一 起 不 要 超过 培养 基 总 体积 的 38%。 然 后 加 头 其 它 附加 成 
分 。 

本 堪 养 基 是 小 麦 花 培 最 佳 培养 基 。 


3. 适 于 胚 培养 的 培养 基 


Randaclph， Cox 培 养 基 (1943) 
KCl 65 Na(POos)na( 标 准 


NGOs。 85 等 级 的 磷酸 销 ) 10.00 
CaktNOs)， 236.8 MgSO 7 有 ,O 7 , 罗 6 
FeSoO,.7H;O 2.0，， 栗 已 炉 20000 

葡 ， 葡 糖 25000 

和 

本 

4 Rijven 培 养 基 〈1956) 

KH,EO， 3401 区 SO .7H2O 0.287 

和 ,HPO; 87 CuSO: ,5H,O 0.0214 

ESCI。 55  (NH4,)seMo7O:44H2O “0.12 

MsSO, ,7H,O 49 “和 柠 样 酸 铁 '5H:O 15 

MnSO， 0.45 ”只 ” 糖 120000 

HBO。 0.062 下 二 
FEH6.。0 

宙 

Erocoks，Hough 培 养 基 (1958) 

Ca(NO，)， 820 ”MnSO， et 0.69 
MgSO， 240” “ZIRSO， 0.25 
KK,SO， 348 CusSO， 0.25 
KH,PO， 5 0.015 
(INH,);,SO,， 132 ”FesSO, ,7H,O 1.36 
NaCl 58 ”Na,EDTA.2H;,O > 
HBO， 0。57 

:1656 


Raghavan，Torrfey 培 养 基 (1963) 


Ca(NOs): 4H2O 480 (IN 于 ,7)e6MorO:4 4 OO ”1.55 
MgSO, .7H,O 63 维生素 了 ,天 | 
KNO。 63 FeC:H3Os 3 .08 
KCl 42 ,维生素 Be 0.1 
KH,PO， 60 贡 酸 0.5 
He。BO，。 0.56 时 只 乙酸 0.1 
MtCl,.4H2O 0.36 激动 素 0.001 
ZnCl 0 。42 硫酸 腺 是 聆 0.001 
CuCcl, .2H,O 0.27 上 茧 机 20000 
TH4。.9 一 5.0 
Norstog 培 养 基 (1973》 
KH,PO， 910 ”维生素 Bi 0.。25 
KCl 750 维生素 Be 0。25 
MgSO: 7HO 740 “泛酸 咎 0.25 
Cacl,,2H,:O 740 ， 工 - 谷 氨 胜 胶 400 
MnSO, .H,O 3.0 ， 工 - 丙 氨 栈 50 
HBO。 0.5 工 - 半 胱 腕 酸 20 
.ZnSO,,7IH2O 0.5。 工 : 精 氨 酸 10 
CocCcl,.6H,O 0.025 工 - 亮 氢 酸 10 
cuSo, .5H:O 0.025 工 -= 苯 丙胺 酸 10 
Na,MoO， 05025 工 - 酷 氨 酸 10 
柠 榜 酸 铁 .5H2O 10.0， ” 革 果 了 酸 1000 
肌 羡 50.0 ”天 糖 34200 
* 苹 果 了 酸 深 在 30 毫 升水 中 ， 用 NH4OH 调 PH 至 5.0。 
< 
MiiteheH，Gildow 培 养 基 〈1978) 

Cacl, .2H;O 250 了 栈 有 水 解 物 的 全 部 氨基 酸 
KNO。 2500- ”天 门 冬 酸 80.00 
KH,PO， 170 谷 氨 酸 210.0 
MsgSO, .7H;:O 400 毕 轰 酸 64 .0 

和 沁 下 aa 


NH,NO， 1650 赖 氨 酸 


CoCl:'6H2O 0.1i.. - 亮 氨 酸 。 
CuSO4 ,5H:O 0.2 ， 且 氢 酸 

H: BO， 5.0. 甲 硫 氨 酸 
开工 1.0; ， 甘 所 酸 
MnSO.H,O 10.0 ”或 者 

Na, Mo0,2H;O 0.1 酷 上 肛 水 解 物 
ZnSo, .7H;O 开关 “用 于 继 代 组 织 培养 ) 
FeSoO ,7H2O 30 .0 2,4- 了 了 
Na;,EDTA.2H;O _ 40.0 ”激动 素 

六 酸 5.0.， ”蔗糖 
维生素 了 B， 5.0  ， 维生素 Ba 
肌 醇 100.0 


4. 适 于 细胞 悬浮 培养 的 培养 基 


Torrey，KReitiert 培 养 基 (1961) 


大 量 和 微量 元 素 与 组 氢 酸 
White 培养 基 同 异 白 氮 基 酸 
(1943) 亮 氮 酸 
维生素 Bi 0:1 ， 蛋氨酸 
维生素 了 Be 0.1 ， 人 葵 氛 基 丙 酸 
， 北 酸 0.5 ， 肺 氮 琶 
胆汁 素 1050 ， ” 酥 氨 屋 
维生素 B。 0.1， 名 氨 酸 
维生素 C 0.1 栈 氮 酸 
泛酸 千 0.1 ，， 顷 氨 酸 
生长 素 0.01 ”人 谷 氨 栈 胺 
肌 茧 180 天 冬 酰 胺 
天 门 冬 酸 6s0， 及 尘 崔 
精 氮 屋 7.8 2,4 一 了 
胱 氨 酸 lw 沪 杭 
胶 氛 酸 1450 


。 658。 


和 


甘 氢 酸 


10 .6 


L 了 56.0 门 统 


Graehe，Novelli 培 养 其 〈1966) 


Na:SO: 
NaH:,POH2:O 
民 NOa。 

玫 Cf 

MgSO, .7H:O 
Ca(NO:):,4H2O 


OHOBO， 


MnSO 要 4 和 > 怠 


和 烷 模 酸 铁 
CocCl ， “6 五 ) 


200 ZnSO, .7 也 :DO 055 
170 Na,Mo04:2H2O 0.025 
80 HSO4 (比重 1.83) 856(0,5ml) 
70 维生素 号 : 0iv25 
530 ”维生素 Bs 0.25 
330 ”说 酸 友 3 
0.5 ， 泛酸 秆 0z25 
3.0 ” 甘 氢 酸 多 7 
10.0， ”天 冬 荚 忱 2000 
0.0255 ”蔗糖 40000 
0.025 
BEH6 .0 


Gamhborg、Ereleigh，PRL--4 培 养 基 (1958) 


NaH,PO,,H;O 
Na HPO: 

KCl 
(NH)。SO: 
MsgsSO, ,7H2:O 
KNO， 

Cacl; ,2H2O 
HBO。 


MnSoO,,H;O 


CoC1l 本 6H2O 
CuSO, ,5H2O 
ZnhSO: 交 王 29 


90 
30 


Na MoO,2H2O 玫 ,25 
KI “着 75 
FeSO4 .7H2O 13.。9 
NayEDTA,2H2O 18 .6 
维生素 B: 10.0 
维生素 召 s 人 
蒜 酸 1.0 
由 酬 100 
“水解 酷 重 昌 20000 
2, 4 一 卫 0 
汞 糖 20000 


FE6。2 


和 有用 


YeTiky， 
(NH4): SO， 
《瑟瑟 3 瑟 DO5 
NH4 NO， 
NaNOa 
KNOa 
Ca(NOas) 4H2:O 
MgsCl:'6H:O 
Na MoO4 .2H,O 
CuUSO: .5H:O 
MnSO4: .HOC 
2ZmnS90O4 .7H;O 
CocCl，.6H 2:O 
HBOa 


Sinitp; 
Nay9O/ 
NaH>POH2O 
KNO， 
KCl 
MgSO: 
Ca(NOs )， 
HBO: 
MSO 
CocCl:.6H;O 


Rose71V 培 养 基 〈1973) 


147 开 
200 FEeSe4, .7H:O 
117 Nay EDTA.2H,O 
385 维生素 Bi 
2190| 维生素 Bs 
324- 忒 ” 酸 
210 泛酸 镍 
0 当 5f “其 5 析 
0525; “激动 素 
4.0 蔡 乙 酸 
] 寺 5 254E7 且 
0.25 “时 嘛 乙酸 
5.0 7 开 
EH5.0 
Stone 培 养 基 (1973) 
200 CuSO4 ,5H2O 
1600 “ZnSO47H2O 
80 维生素 Bl 
70 维生素 B 
360 忒 ， 酸 
200 ,泛酸 钙 
0.5 酵母 浸 提 物 
7 时 吧 乙酸 
kk7“ 0 和 | 情 
0.026 
pH5.5 


了 hiliips，SC 了 培养 基 (1974) 


300 
1I000 


Cocl,.6H,O 


0.05 
13.9 
181.6 
0.5 
0.5 
1.25 
1.0 
100 
0;25 
0.1 
lj.5 
1.0 
20090 


_NHNO。 起 二 1000 


鞭 氨 酸 
Ca(NO,)，'4H:O -500 坟 酸 
和 Cl : 汪 人 5 维生素 Bi 
MsgSO, ,7H;O 35 ”维生素 Be- 
MnSO,H2:O 4 了 册 ” 醇 
开 sBODs。 ,iu6、 1 2,4 一 了 D 
.ZnSO:,7 开 :9 5d1.5” 激动 素 
省 0.7518 项 FF 精 

Hi6。0 


KH,PO， 300 


Cocl ,68 0 
mrGacl:,2H2:O 100 Fe--Nas EDTA 
KCI1 65” 鞭 气 酸 
MgSO,,7H;:O 35-，: 素 酸 
MnSO, .H2O 4。5 维生素 虽 : 
H。BO， ,了 5; 维生素 B6 
ZnSoO:.7H,O 网 
Na,MoO ,2H,O 0。25 蔗 ”“ 糙 
区 00 
DH6.0 
Law-en Chu, -Lark SLCC 培 养 基 (1976) 
CacCl52H2O 440 ， 维生素 了 
NH;NO， 1654 ”维生素 也 
RNGOEeD 5 1900 ”有 册 ” 稚 
K 百 >POi; 170  ， 胆 汁 素 
MgSO,.7H2O 370 ” 维 生 窗 也。 
KI 蕊 和 维 生 床 人 
HBO， 6.0。 泛酸 狂 
Na,MoO.2H,O 0.,25 ， 生 长 素 
CoCcl: :5H2O 40.025，、 腺 芭 叭 
MnSO,,H2O 17.0 酷 甩 水 解 物 
CuSD, .5H2:O 0.025 激动 素 


PhilBips，SCN 培 养 基 (1974)》 


FeSO: 782O 27.8 ” 另 4P 
Na EDTA,2H,O 本 
次 ” 酸 0 

Shanmnton ELiu 培 冯 营 (1977) 
和 Navy9O， 200 CHSOde5HO 
KNO。 380 Cocl,.6H,O 
KCl] 654. BO。 
Ca(NOs)，.4H;O 347 Na Mo0O::.2H2O 
KHE,PO..H,O 165 ”柠檬 酸 铁 2 
MgSoO,.7H:O 530” 维生素 B) 
MnSO,.H,O 2723 天 办 
ZnSoi:7H:O 0.5 

BEH5 .0 一 6.0 
AAA 培养 基 
KCl 
CaCl,.2H,O 150 二 2 
MgSO7HO 250 
NaH,PO,。.H;:O 150 
微量 元 素 和 有 机 成 分 同 Be 培养 基 一 
氨基 琶 习 

谷 氮 酰 及 876 
天 冬 氮 了 酸 266 
精 氨 酸 174 
甘 氢 酸 7。9 
蔗糖 20 克 
2,4 一 了 1mg/ 工 
激动 素 0.2mg/ 代 
赤 截 素 0。.1mg/L 
本 培养 基 适 用 于 水 舟 细 胞 基 浮 培养 


*662 。 


10.0 叫 叹 乙酸 


2950 《mm 上 Cs 


.5 适 于 原生 质 体 培 养 的 培养 基 


Nagata，Takebhe，(NT) 培 养 世 *(1971) 


NHZNO。 825 CusOxi .5H.O 0.025 
KNO。 950 0CoSOi.7H:O 0.03 
CaGl:.2H:O 220 Na; EDTA,.2H,O 57 .3 
MgSOi ,7H,O -233 FeSO, .7H2O 玖 7 
RH2PO， 680 “ 肌 ， 醇 100 
囊 s8BO。 BRN2 维生素 B; 1.0 
MnSO: ,4H2O 22.3 1 蒜 忆 酸 3.0 
ZnSO4。4H,;O 856， “6 一 苯 基 毛 基 嘎 吟 1.0 
证 0.83 “ 蔗 糖 10000 
Na:MoO42H2O 0.25- 甘露 本 0357RM* 
pH5.8 


Nitsch，Ohyama， 找 养 其 (1971) 


CaCl， 1000 肌 醇 100 
KNOC。， 500 “车 酸 “5 .0 
.MgSO,.7H;O 250  ， 维 生 素 B。 JJ0 .5 
b 5 于 年 2PO， 25 ， 维 生 素 B 人 
MnSoO4 .4H,O 狂 ,5 叶酸 0.5 
H,BO， 1.0 1 生长 素 0.05 
ZnSo7H2O 1I.0 ， 革 氨 圳 2.0 
Na; Mo0..2H,O 0.025 2,4 一 D 1.。0 
CuaSO: .5H,O 0.0025 6 一 革 基 氮 基 味 聆 1.0 
下 eSO4 .7H:O 27.8 “” 鞭 露 醇 或 芒 糖 0.6NMi 
人 Naz-EDTA 37.3 
PH5。6 


* 甘露 醇 , 山 梨 醇 或 蔗糖 用 来 保持 一 定 的 渗透 压 ， 各 种 杆 物 或 同 种 覃 物 的 不 同 品 种 
癌 痢 可 能 有 差异 ， 此 处 用 量 仅 做 参考 。 


*。 663 。 


Ohyamal 和 旋 本 ， 这 莹 攻 避 952) 


KNO。 

KCI1 证 
GaCl: .2H2O 
NH,NO。 
MsSO ,7 了 :9 
KHPO， 
MnSO: .4H2O 
HBO。， 

ZnSoOi .7HO 
NazMoO 
EeSO47H29 
NEHLNO。 帮 这 
KENO。 
MgSoO7HO 
CaCl'2FoO 
KH,PO， 
BEEeBOas - 
Manso,.H;O 
ZnSOl .7H2:O 

9 下 I 

Na MeOl2H5O: 
Luso9O: 5H2:O 污 
Cocl .6H;,O 
FesO4 ,7 于:O 
KNO， 


<a7。3 


2000 Na:EDIA 
环 60 ; 综 年 过 了 可) 全 长 下 0.5 
5 二 0 “5 项 天 ) 这 ;了 ET6 
800 10 痪 - 酸 人 
100 “维生素 Be ee 忆 
200 “ 柏 状 素 CA 
50. 在 遇 二 酸 RE 
0 三 4- 卫 8 人 0 计 
20 “6 一 革 基 氨基 嘎 办 人 1.0 
055 “甘露 醇 或 昔 粮 1 10220370.6M 
2 项 8 人 
FH5.6 
Darand 培 养 基 (1973) 
短 失 襄 70 于 SEE 下 氏 六 全 3 
本 180 60 脐 本 es 
340 0 叶酸 0 人 4 人 3 
即 备 70 “0: 艾 酸 站 HTOc3N40 
运气 0 二 维 生 束 B， Oct 王 允 二 
2%0 “ 扒 生 素 Bs ss 
海 .0 1 生长 素 Sn 请 204 
长短 请-.5 1 . 攻 气 酸 GETOanSTO 
.25 5 到 丰 了 DoM54 人 让 
人 1 :6 一 革 基 氨基 呈 吃 ES 0.4 
0.015 “ 共 粮 DrHiS“RO 0 风 
0.01 工 半 露 醇 EM 
27 施 :总 
PEH5.6 
下 272da 洲 羡 基 (1973) 上 报请 作 
50 肌 筷 、 和 


,2 NENO。 725 5 匠 酸 


0 
MszSO,.vH2O 1998 村 氢 艇 要， 
CaC1， 1703aF9 维 生 素 了 Bs 0.5 
下 HzPQ， 攻 70 维生素 了 Bi 0.5 
Nin394 4H,O 12.5 叶酸 1 二: 
了 :BOa 20 站 证 生长 素 0.05 
ZnSO,.4H,O- 5.0 玉米 素 或 革 基 腺 嗓 瞧 1.0 
Na,Mo0O,.2H,O 0.125 
CuSo,.5H,O 0.0137 1 2,4- 了 或 茜 乙酸 1.0 
Na*EDTA 7 省 革 玉 - 芍 0.06XM 
HeSo .7H,O 27.8 ”甘露 醇 攻 63M 
谷 所 栈 胶 800 
(了 ao，RNiichayluk ) 洋 养 基 (1975) 
培养 原生 质 体 和 细胞 的 相同 成 份 
NH.NO， 600 肌 醇 100 
KNO， 13900 藉 酰 有 1。0 
cacl,.2H2O 600 ”了 维生素 Be 1。0 
MsgSO4 .7H2O 300 维生素 Bi 1.0 
RH, PO， 170 泛酸 钙 1.0 
KCl 300”“ 叶 “ 酸 0.4 
KI 0.75 ”和气 基 苯 甲 松 0.02 
卫 。BO， 320 生长 素 0.01 
MnSO,.H,O 10.0 氨 化 胆 碱 1.0 
Zno50:…7 孔 :O 20 0 维生素 了 B， 用 
Na Mo0: 2H,O 0525 维生素 C 2 
CuSO: ,5 ,9 0.025 维 生 开 信 0.01 
CoCcl,.6H,O 0.025 维生素 了 Ds 0.01 
FeSO,.7H2:O 2 3 健生 未 B，， 0.02 
绍 胞 培养 原生 质 体 培养 
2。4-~ 了 了 0.1 0.2 
玉米 素 0.。2 6.5 
藉 乙 酸 1.0 1.0 


5 0066” 


: 茧 糖 20600 :0D7 和 250 
葡萄 糖 10000 68400 
: PH5 .6 交 大夫 7 
为 了 使 得 率 低 的 细胞 和 原 符 质 体 扩 增 , ,培养 基 中 应 加 入 下 列 成 份 忆 
丙 一 酸 销 20 到 森 光 中 _Han OO 250 
柠檬 酸 40 “甘露 糖 Ci4550 
本 烯 二 酸 - 40 二 鼠 李 糖 DO:HiO2nS2540 
反 奖 二 栈 40 “ 竺 维 二 义 ICMzSAL250 
果糖 250 :山梨 薛 <U 25 
胞 核 入 250 ， 甘露 醇 TGS 拓 
五 胸 水 解 物 250 瑟 于 椰 屯 20 毫升 / 升 
pH545 肖 恬 百 
在 培养 基 中 还 需 如 入 21L 一 氨基 酸 〈 包 括 甘氨酸 ， 生气 了 和 精 所 本 ) 
浓 放 为 0. 1 毫克 / 升 ， 所 包 成 份 为 : 站 区 
谷 氨 栈 驻 .56 “和 谷 氨 酸 0.6 
两 氮 栈 0.6 ， 半 胱 胺 酸 :DeEH0。2 
了 腺 野 叭 g203 0 寿 5 列 20 台 升 / 升 
.: 鸟 嘎 聆 0503 2 6 一 二 氧 蛇 院 . 1， 0.03 
1 有史 腺 喀 院 0.03 “1 亚 黄 吓 叭 Di ic20.03 
五 须 水 解 牺 250 1 黄 味 叭 ,DieHNs08 - 
种 天 当 上 名人 全 江 基 的 量 可 二 庆 入 下 
[六 
Yon Arnol4， so LE 培养 基 (1977) :D8y 寺 水 
KH,PO， 攻 0 0MHSO, HE 可 cm 
.到 NO。 - 汐 欧 0014BD， 人 IT 0 
_NHNO。 1 和 00 ZaAEDTA Ms 和 全 
MgSO,.7H;O 370 NagEDTA.2H2D 网 
1 Gacl .2H;0 1760 “下 6S0,.7H,OD 0 1213.90 
“ft 了 了 0.75  ““ 工 一 精 氨 酸 .0i 役 况 / 升 
Na Mo0Ol.2H2O 05025 ，“ 工 一 亮 氢 酸 0.01 微 克 / 升 
ICuSO,. .5H,O 0.0025 工 一 葵 丙 氨 酸 0.04 伍 克 / 升 
-Cocl .6H,O 0.0025 “. 工 一 酷 氨 酸 0.01 微 克 / 升 
叶酸 0.5 “车 氮 酸 二 -2000 


蕉 ， 栈 及 术 2.0 莽 糖  ，Dz 7， 34000 


维生素 B。 1.0 ”葡萄糖 辣 Hg 184 

维生素 B， 4 5 150 

了 肌 ” 醇 引 100 ”阿拉 伯 糖 .HT .多 156 

工 一 谷 胺 酰胺 :0.4 微克 / 升 山梨 醇 Da_H 455000 

工 一 丙 氨 酸 .05 微克 / 升 2,4- 刀 怕 :H 1.0 

工 一 半 胱 腕 酸 “0.02 微 克 / 升 激动 素 品 0 
Bi5。8 


了 D: 培 养 基 。 李 向 辉 (1981，》 


成 份 - Dia 了 
NH4NO， 270  ， 贡 醉 100 10 
本 ROSA 10 烟 酸 这: 4。0 
CaGl:.2H5O 塘 900 :维生素 B， 458 三 二” 4.0 
MgSO4 .7H2:Q - 300 甘氨酸 1 .4 6 
2 机 克 89，、。 维生素 Be 0.7 0.7 
FASOie2H GUO E 27。83 叶 。” 避 0 要， 
NazEDTA 37.3 ， -生物 素 ， -0.04 0.04 
HBO。 了 交 250， NAA 135 1.5 
MnsSoO: 4H,O 5.0 6-BAP 0.6 0.6 
ZnosO:,4H2:O 1.5 … “椰子 乳 5%% 5 斩 
区 0.25 2.4.5-I 0.5 0.5 
Na MoO.2H,O 0.10 ”葡萄 糖 节 忆 丰 全 下 二 下 一 一 
乔 丰 CSD 必 5H5O5 - 0.015 了. 藤 : 粮 010.05M2 006NM 
“CoCl 6HO 05010 ”天 : 脂 一 4000 
e DBH5。S8 
Ka 培养 基 ， 
NHNOs 250 
KNO。. 2500 
CacCl, .2HsO 9040 闷 
MgSoO:.7HyO 250 
NaH, POH32O 151 
“667i。 


(NH4):SO， 134 

CaHPO,,H;O 50 

Na,EDTA 汪 人 者， 37。2 

ResOxv7 吾 , 己 27。8 

HBO， 3 

MnSoO,.H;O 10 

ZnSol,4H;O ,02 

二 0.75 

Na,Mo0,2H;O 0 .25 

CuSsoO, ,5H;O 册 证 0 .025 

CCCl 6 于 2O 0 .02355 

肌 醇 100 到， 

维生素 Bi 和 罗 ， 

维生素 Be 1 DJHs 区 的 

烟 酸 10.33 

本 ,二 本 2 

茧 ” 糖 137000 

NAA : 0.1 个 让 GE 

Kinctin DR 

FIHL5 .6 
过 滤 灭 菌 
芋 广 

(二 ) 微 生物 实验 的 常用 培养 基 EL 


实验 所 用 的 全 部 试剂 均 要 无 落 。 一 般 培 养 基 在 15 磅 /英寸 2 兢 力 下 灭 菌 
20 分 钟 。 葡 萄 精 、 氨 基 酸 、 生 物 素 等 物质 在 8 磅 /英寸 ?压力 正 灭 蔚 20 分 钟 。 
抗 万 素 和 酶 类 物质 在 无 苗条 件 下 用 灭 菌 水 配制 ， 或 者 用 涉 膜 过 滤 。 
L- 肉 汤 流体 培养 基 


胰 蛋 白 有 10 吕 
村 母 提出 物 
氧化 销 ，， 志 识 
葡萄 精 天 
蒜 沉 水 0 


上 述 成 分 完全 涛 解 后 ， 用 氨 氧 化 钥 (NaOHD 调 pH 至 Tv 


“068。 


_ 工 - 肉 汤 轩 体 培养 基 ， 
二 - 符 汤 
琼脂 
工 - 欠 汤 半 园 体 培养 基 ， 
工 - 肉 汤 
琼脂 
“7 0.3% 肉 汤 软 琼脂 ， 
工 - 肉 汤 
琼脂 
By 培养 基 ， 
牛肉 高 
* 酵 母 高 (国产 ) 
蛋白 采 
氯 化 锁 
葡 葡 丹 
蒸 饮 水 
用 惫 氧 化 钠 调 PH 至 7 。5 


“ 称 酵 母 帝 〈 国 产 ) 5 克 ， 溶 于 少量 水 中 ， 将 酵母 浸出 液 煮沸 ,， 待 浸出 深 
冷却 后 ， 以 3000r7cm 离心 5 分 钟 ， 弃 沉淀 ， 将 上 清流 再 煮沸 离 心 ， 经 过 净化 


后 的 醇 母 浸出 液 才 可 配制 By 培养 基 。 
By 闭 体 培养 基 : 
By 液体 培养 基 
琼脂 
乙 - 肉 汤 培 养 若 ， 
蛋白 肪 
牛肉 高 
葡萄 糖 
燕 饮水 
用 提 氧 化 钠 调 ? 瑟 至 7 .5 
10xA 缓 冲 液 ， 
太 酸 氧 二 饰 ( 人 :HEO,) 
磷酸 二 氧 钾 ( 上 HPO:) 
硫酸 签 (N 其 ,) :SO: 


AS 
厂 


本 


1000 训 升 
20 克 


1004 获 升 
8 克 


1000 毫 升 
3 克 


5 训 

10 充 

5 克 

5 区 

1000 毫 升 


1000 诸 升 
20 克 


20 克 

6 克 

2 充 
1000 苟 升 


103 死 
45 克 
10 欧 


a 5669。 


行 榜 酸 钠 (NasCoHsOr ,2H:OF 二 于 三 二 全 10 训 


如 偏 水 至 “1000 毫 逢 
pH7 .0 婕 和 
基本 团体 培养 基 ， ， :生养 认 革 车 半 策 家 全 
答 成 份 混 谷 比 例如 下 ; 二 
10 xA 缓 浏 液 ”100 台 逢 
20% 精 20 敬 升 
1 毫克 /毫升 硫 胺 素 (VB1) 吕 由 -4 吝 天 
0.25j[ 硫 酸 镁 (MgSO, .7H;O) 党 次 《毫升 
2% 琼 脂 二 了 80 亳 逢 
各 种 氨基 酸 (10 训 克 / 毫 升 ) 4 毫升 
链 霉 素 (50 毫 克 / 毫 升 ) 商 基 辐 “4 毫升 
* 利 福 平 (25 毫 克 / 豪 升 ) 一 4 毫升 
卡 那 霉 素 (5 毫 克 / 毫 升 ) 下 让 过 4 毫升 
和 
利 红 疾 蓝 (EMB ) 培 养 基 ; 肖 本 
祠 耻 间 人 0 况 
恒 任 腻 ( 项 稚 白 床 关 章 们 工 训 、， 砍 E 【全 四 三 千 兰 全 过、 
4 总机 台 策 师 二 祥 缉 人 高 md 的 时 二 语汇 时 用 
磅 酸 氢 二 钾 和 < 十 顶 而 友 诅 出 要 9 各 妥 避 荆 
伊 红 Y( 咽 红 ) 基 计 说 轩辕 5 全 坦 
曹 旭 0 负 蓝 二 忆 .065 责 
荡 哩 洒 ' 闪 26 这 
加 燕 饮水 . 基 关 洒 声 策 十 庆 
在 加 伊 红 了 和 美 蓝 前 调 BH 至 7.。2 本 
二 移 酸 盐 贮 备 液 Voge150 x ， 内 
磷酸 氢 饺 钠 (INaCNH, )HPO, ,4H,O 二 175 克 
芒 酸 铂 (MgSO, .7H2。O) 中 并 10 均 
柠 榜 酸 .了 鞋 拉 站 要 涝 要 别克 
加 蒸 饮水 至 二 00 毫升 
fT0x 景 低 盐 溶 液 ， 0 
磷酸 氢 二 钙 (K:HPO:) Ei 关 攻 王 140 过 


(区 ,HPDsHO18S 避 货 帮 着) :0QYXD 壮美 首 亏 衬 


关头 0 磷酸 二 氢 钾 村 计 芝 济 XI 60 克 
， 志 豆 2 硫酸 铵 热 有 MI 20 克 
人 柠 襟 酸 钠 (NasCeHs5O7 :2H2O) 缮 刻 评 识 人 5- 10 克 
托 误 ) 硫酸 铂 (MgSOw THEBO) 册 全 瑟 二 请 计 5 2 克 
全 冯 素 馏 水 加 至 二 六 41000 训 升 
FF 训 ;在 车 馏 水 中 依次 溶解 上 述 成 谷 ， 本 关 本 还 王 109 汪 并 。 
10x 最 低 盐 湾 液 土 色 氨 酸 上 + 胸腺 喀 啶 号 时 
于 章 010x 最 低 盐 浴 液 jj 从 鸡 录 "100 毫升 
反 壮 葡萄 糖 和 妆 箱 有 iD。25 克 
去 吉 :胸腺 喀 院 (thy) 半生 芭 微 壳 / 豪 升 
五 衰 2L 色 氨 酸 (trp) (二 永 芒 ; 当 重 攻 移 8 向 兖 /毫升 . 
、 万 0x 最 低 盐 溶液 固体 培养 基 ， 和 
10Xx 最 低 盐 溶液 : 卫 押 0 毫升 
202 芒 脂 淹 20 克 
本 ， 
fn 和 牛肉 高 * 汪 8 克 
本 本 2 克 
氧化 钠 和 渤 科 5 内 耻 4 死 
硫酸 镁 (MgSO4s THz9) 和 2 克 
2 “磷酸 二 氢 孵 满 125 克 
.; 酬 酸 气 二 钠 (NasHEFO,7H3O) 玉昌 527 痪 
蒜 馆 水 加 至 1000 毫 升 
”和 氢 氧 化 钠 调 FE 至 7.5 
叭 菌 体 稀 释 液 ( 枯 草 杆菌 峰 菌 体 )， 
毛 化 锁 1-20 克 
硫酸 钟 SS 25 克 
磷酸 二 氢 钾 755 殉 
磷酸 氢 二 销 (NazHPO:12H29) 证, 克 
硫酸 镁 (MgSO: 7H2?O) 4.6 克 
蒸 馅 水 1000 毫 升 
1% 毛 化 钙 CCaCl:)》 50 毫 升 ( 使 用 时 帮 入 ) 


0.5% 三 毛 化 铁 (FeCls)( 过 滤 灭 菌 ) 40 毫升 (使 用 前 加 入 》 


se 不 7 


生长 培养 基 (CM):， (使 用 时 混和 音 比 例 ) 


;1x 最 低 盐 溶 液 00 台 逢 
1M 硫 酸 镁 0.5 台 升 
50% 荫 菊 糖 人 1 训 和 天 
5 为 水 解 酷 息 白 (或 水 解 乳 蛋 自 》 0.4 豪 升 
受 体 蕊 廊 需 氨基 惑 ， 串 徽 克 / 豪 升 
土 19%% 酵 尽 提 出 物 “ “ 1 毫升 

苇 化 培养 基 (TM 培 养 基 ) 并 使 用 时 混合 比 位 ) 
1Xx 最 低 盐 洲 液 “00 台 升 
1M 了 硫酸 炙 “0.5 训 升 
502% 葡 葡 糖 必 时 车 TI 讲 天 
5 为 水 解 酷 蛋白 ( 或 水 解 乳 蛋白 ) 1 尼 下 04 毫升 
氨基 栈 E 5 微克 /这 升 

s#416 培 养 基 ， 
胰 和 蛋白 及 0 
梧 母 提出 物 只 记 关 请 各 这 
寺 化 盘 10 克 
去 离子 水 000 襄 逢 
用 10% 氧 氧化 销 调 pH 至 7。2? 

2x.SMM 滚 ， 人 
芒 义 (分 子 量 342。3) 342。3 克 
马 来 酸 (分 子 量 160) .64 克 
氧化 钦 (Mc<Cly*6H2O) . 8.13 克 


去 离子 水 加 到 970 训 升 
用 10% 氧 氧化 钢 调 BE 到 6.5( 一 30 误 升 ) 
2XxSMM( -2%BSA)， 


蔗糖 382.3 询 
马 来 栈 4.64 克 
所 化 饶 (MsC1: .6H2:O) 8.13 克 
去 离子 水 加 到 704 训 升 


用 10 儿 氧气 化 钠 调 PH 至 6.5( 一 32 训 升 ) 
灭 菌 后 加 入 无 昔 滤 膜 过 潜 的 牛 血 清 清 蛋白 (BSA) 
4XPAB(C4LXPenassay Brotph); 


“672。 


。 抗菌 素 培 养 基 (Antitictis Mediam)ae3， 稚 重 er 
Brothb。 KR 人 芷 独 纪 寺 
ntibiotioMediume33 一 Th 各 宙 时 hvT-70 克 
站 3F 去 离 了 于 水 了 000 毫 升 
审 人 江东 焉 洪 z 内:fBeaassay Broth 的 本 方 戎 TFT 


牛肉 宫 其 
本 瑟 提出 移 著 蓝 5155 遍 
所 重 日 及 旦 二 渤 交 和 5 高 
5 人 草草 计 类 和 1 克 
民 呆 ; 天 人 拓 关外 纯 站 计 习 业 六 站 蒜 放 坊 基 故 注 基 有 芝 人 全 因 到 让 
“ 砍 琢 受 二 滩 3463 党 .于 盏 册 
尖 si 二 演 训 汪 共 卫 王 气 银 中 中 惠 关 当局 可 , 间 克 催 媳 动 平手 范 区 四 避 
MRIP( :BSA)， 
下 SMM( + BSA) + 4x 间 人 到 六 头 演 进 冯 TI9o2CL 红 ) 
上 7 
5G) 琼 及 ee 
贡 芭 站 去 离子 水 1 天葬 天 不 好 砚 12 茵 总 葵 苞 -8 Mag 带 和 
隐 二 (2) TIT 入 磺 本 让 I7 3 人 599 剖 升 
56375 冯 水 解 酷 蛋白 (无 维生素 ) 必 划 0 吝 开 
2 人 们 及 0% 琵 母 提出 欧 ，) Ex 刘 580 毫 罚 味 撒 
已 了 《52 .3.5 私 磁 酸 气 二 钾 -155204 克 酸 三 气 钙 100 训 淹 ， 革 避 
(6) 50% 和 葡萄 六 b0 毫 判 访 直 ? 
6G》 1M 和 氧化 氏 (MgCl，) 20 训 和 
(8 26 牛 血清 清 蛋 白 (BSA) 已 .5 毫 逢 


后 血清 清 蛋白 无 菌 滤 允 过滤 灭 菌 
以 上 各 种 成 份 除 BSA 之 外 ， 各 分 别 丈 草 , 待 淮 却 至 50 ;552 时 混 勾 。 
氧化 炙 需 最 后 加 入 ， 如 倒 成 平板 ,否则 易 产 生 沉淀 品 根 据 受 体 菌 的 营养 缺陷 
型 情况 还 需 加 入 所 需 的 氨基 酸 20 微 克 / 堂 升 s 在 转化 平板 内 还 需 加 六 适当 关 
抗生素 ,用 于 选择 转化 子 。 但 在 任何 再 生 培 养 基 中 都 不 能 类 入 青 址 素 , 多 为 
再 稚 素 会 换 制 细 跟 整 的 再 生 。 


甘露 若 再 生 培 养 基 : 
第 I 部 分 : 
二 去 离子 水 3509 豪 升 
酷 避 白 氨基 酸 (Casamino acid) 5 讽 
各 酵 尝 提出 物 5 交 
陪 。675。 


防 脏 5 咏 汪 - 、， < 8 克 


第 开 部 份 ， 二 
1.4M 甘 露 薛 38 .1 一 8.2- 27500 豪 逢 
明胶 15 克 


以 上 两 部 份 分 别 灭 菌 , 待 冷却 到 50 一 55 蕊 ， 人 
在 元 亩 条 件 下 分 别 加 入 : 


: 5402 葡萄糖 一 0 宫 升 
5%% 玖 屋 氧 二 锦 ”00 毫升 
1 氯化镁 20 毫升 


此 外 还 需 加 入 受 体 菌 所 必需 的 质 基 酸 及 选择 转 。 一 混 气 
镜 平 板 。 
绸 生 培养 基 平 板 较 厚 为 宜 ， 每 一 塔 养 亚 中 用量 要 了 25 训 
升 。 
10% EcoRI 反 应 组 站 湾 旺 浙 
1000M Tris-HCLCODH7 。?) 
502 寻 氧化 乌 
20703M 2- 琢 其 乙醇 《可 以 不 灭 著 ) 
5000M 毛 化 锁 
注意 : 这 里 配 溶液 所 用 的 水 必须 是 重 洽 水 ， 不 要 用 中 于 未 
如 缓冲 液 离子 强度 低 ， 即 10 一 2070M Tris-HCIH 274M 氧 化 位 DBH 为 8。5 
左右 时 ，EcoRI 葛 识 Ai 在 这 条 件 王 起 作 
用 的 锌 称 为 EcoRI: 活 性 ， 
II0 > TDNA 连 接 绥 冲 液 ， 
0.1M 二 梳 苏 糙 醉 
0.2M Tris DH7 6 
0.13 氧 化 多 
572248 入 TP 
配 溶液 的 水 是 重 蒜 水 ， 不 要 用 去 离子 永 。 
和 IE 用 无 苗 重 燕 水 配制 ， 并 用 微 孔 滤 了 过 滤 。 上 过 有 六 和 AT? 于 和 


温 保 存 。 
将 酸 要 六 久 忆 和 at ) 
蓄 酸 氢 一下 7 讽 
文 酸 钥 (MzSO7H:O) 0.25 克 
蒜 馆 水 加 到 1000 训 升 


千 


(至 ) 动听 组 织 培养 党 用 绪 养 基 


生物 素 (1.0 毫 克 / 升 ) 也 常 包括 在 内 。 


Eagle 原 方 没有 ， 但 是 商 铝 培 


者 养 基 内 党 有 的 


下 agle 氏 培养 基 的 成 分 (毫克 / 升 ) 
( 括 弧 内 为 氨基 酸 的 训 克 分 子 当量 ) 
名 壹 
基础 培养 基 (1955 年 ) ee 
氨基 栈 
EL -盐酸 精 氢 酸 21(0.1) 123(0。6) 
工 - 胱 氨 栈 12(0505) 24(0.1) 
L- 麦 酰 岗 292(250) | 292(2s0) 
L- 盐 酸 组 所 酸 9.5(0.05) 38(0.2) 
工 - 异 亮 氨 酸 26(0.2) 52(0.。4]) 
EL- 亮 氨 栈 26(0.2) 52(0。4) 
工 -盐酸 融 握 酸 36(0.。2) 1 72(0.4) 
工 -蛋氨酸 7.5(0.05) 15 (人工 ) 
开 - 苯 两 氢 酸 | 18(0。1) 32(0.。2) 
EL- 苏 氨 酸 24(0:2)》 48(0。4》 
一- 色 氮 酸 4(0.02) 10(0.05) 
工 - 酷 氨 酸 18(0.1) 36(0。2) 
工 - 妥 氨 酸 24(0。2) 48(0。4) 
维生素 
氧化 胆 碱 1 1 
叶酸 1 汉 
肌 侠 2* 2 
烟 酸 1 
泛酸 钙 1 了 
盐酸 屁 哆 栈 | 1 
核 黄 素 6。1 0.1 
硫 胶 素 1 1 
盐 类 (Earle 的 BSS ) 
NaCl 6800 6800 
KCl 400 400 
CaCl: 200 200 
MgSO: .7H:O 200 208 
NaHpOi.2H2O | -150 150 
NaHCO。 2000 2000 
葡萄 粮 1000 1000 


下 1 短 3 念 攻 的 成 # 训 训 /我 -车 》 


Ce 
工 - 丙 氮 酸 9 人 生物 素 0.02 
I 盐 融 精 忌 酸 “211.00〔1.0) 泛酸 钙 ” 
工 - 门 冬 氨 酸 13。.30 (0.1) 所 化 胆 碱 和 澳 共 0 上 6] 
工 - 盐 酸 门 冬 酰 胺 ”15.00 (051) 叶酸 师 区 区 332 
工 -盐酸 半 胱 氨 酸 31.50 (0.2) 肌 醇 0.54 
1 L- 谷 氨 酸 14.70 (041) 烟 栈 胺 0.61 
二- 才 栈 肌 146.20 (0.1) 盐酸 吡 哆 醇 ”0.20 
” 甘氨酸 7.51 (0.1) 核 黄 素 Ce 
工 -盐酸 组 氨 酸 21.0] 0.1) 盐酸 硫 胺 素 ”1.01 
L- 异 亮 氨 酸 2.60 (0.02) 胸腺 喀 啶 核 彰 。 -全 0.73 
-~ 亮 氨 栈 有 维生素 Bi， 1.86 
L- 盐 酸 赖 氨 酸 29.30 (0.1) 录 跨 
L- 和 蛋氨酸 4.48 (0;03) “| 核酸 枉 生 物 结 迁 
- 工 - 葵 丙 氨 酸 4..56 〈0463)》 次 黄 茜 叭 民风 下 08 
工 -及 氨 酸 5 《021) 意 汶 可 
工 - 丝 氨 藤 10.50 (0.1 | 丹 类 
工 - 苏 柳 酸 3。.57 (0.03) 类 脂 0.20 
L- 双 ' 氨 酸 .0.60 (0.003) ai 训 
L- 酷 占 酸 ”1.81 (0.01) | 葡 欧 糖 之 外 的 碳水 化 物 “一 
L- 统 氨 酸 3.50 (0.03) 丙酮 酸 销 .10.0 
RS 7 2 
CuSOr5Hz9- 一 一 一 一 人 004 且 
| ZnSO4.7HIO 时 人 
NaCI 73400.00 
KCI 285.00 
Nav,HEPO， 1T53.60 
KBH,PO， 0 
WigSO :7H7G 中 生 5 实生 
CacCl， 33.30 
NaHCO。 120].00 _ 
和 葡 克 糖 1109.00 


。 576.。 


- -综合 培养 基 199 的 成 分 ( 圳 克 / 升 ) 


( 括 弧 内 为 氨基 酸 的 毫克 分 子 当 量 ) 
氧 基 酸 辅 酶 
工 -两 氮 酸 25.0 (0.30) 有 7 瑟 10.0 
L- 盐 酸 精 氨 酸 70.0 (0.40) 
工 - 门 冬 氨 酸 * 30.0 (0.25) 还 原 剂 
工 - 胱 氨 酸 20.0 〈0.75) 抗坏血酸 0.05 
L- 谷 氨 酸 * 75.0 (1.00) L- 盐 酸 半 胱 氨 酸 $ 注 
工 - 麦 酰 胶 100.0 (0.07) 谷 胱 甘 肽 0.05 
匡 壳 酸 50.0 (0.70) 
工 -= 盐酸 组 氨 酸 20.0 (0.10) 核酸 衍生 物 
- 工 - 凑 有 睛 氨 酸 10.0(G。75) 腺 嗓 叭 10.0 
工 = 蜡 亮 氨 酸 * 20.0 (0.15) 岛 野 险 1 用 
工 - 亮 氨 酸 * 60.0 (0.。45 ) 次 黄 靶 叭 0.3 
工 - 赖 氢 酸 CQ 207 1 | 胸腺 啶 0.3 
工 -蛋氨酸 * 15.0 (0.20) | 屎 喀 喧 0.3 
开 = 汪 丙 氨 酸 。 25.0 《0.05) | 黄 哇 聆 0.3 
工 - 且 氨 酸 [0.0 (9。35) 腺 董 酸 0.2 
工 - 丝 氨 酸 * 29.0 25) | | 
二 - 苏 氮 酸 * 30.0iK0.25) | 脂 
L- 色 氨 酸 * 10.0 (0.005) | ， 胆 轩 巷 0.2 
工 -~ 酪 氨 酸 Cg.20) | 吐 温 80 5 。0 
上 -上 氨 酸 55.0RX0s20) | 
葡 欧 糖 以 外 的 碳水 化 地 
维生素 2- 去 氧 -D- 核 糖 4.5 
对 氮 基 洽 甲 酸 0.05 IT)- 核 糖 4.5 
生物 素 0.01 酷 酸 销 50.0 
泛酸 钙 0.01 
氧化 胆 碱 0。5 盐 类 
叶酸 0.01 NacCl 6300.0 
肌 醇 0.05 KC1 400.0 
烟 酸 0.025 人 200.0 
烟 栈 腕 0.025 MgSO, 7H,O 200.0 
盐酸 吡 哆 醚 0.025 | ，NaH,PO， 140.。0 
盐酸 吡 哆 蕉 0.025 、| NaHCO。， 2200.0 
核 黄 素 0.01 : |，WEeeNo)s9H,O 鲁 | 
盐酸 硫 胶 素 0.01 
维生素 A 0.10 葡 菊 糖 1000.0 
维 生 率 卫 0.10 
维生素 忆 0.01 
维生素 上 0。.01 


和 
ON 


、- 


允 aymouth 民 化 学 诸 养 基 MB752/1 药 成 分 ( 圳 克 / 利 》 


( 括 弧 彤 为 氢 基 酸 的 毫 宛 分 子 当量 ) 
氨基 酸 ， 还 原 剂 送 
L- 盐 酸 精 氨 酸 ，、 75.0 (3.6) | 抗 环 血 酸 17 .5 
工 - 门 冬 氨 酸 60,0 (4,6) | ，， 工 -盐酸 半 觅 氨 酸 90.0 
工 - 胶 氨 酸 15.0 (0.06) |; ， 和 谷 胰 甘 肽 T5.0 
I- 谷 氨 酸 ”150.0(10.2) 全 
工 - 才 酰 肪 二 350.0(23.8) 部 
甘氨酸 50.0 (6.6) ，| 核酸 衍生 蝎 “ 谓 
工 -组 氨 酸 150.0 850 | 次 黄 味 队 1225.0 
王 - 异 亮 氨 酸 25 了 9 | 站 ,站 
工 - 亮 氢 酸 50.0 (3.8) * 缚 感 
I- 束 氨 酸 240.0(1 刀 2) ，， 盐 类 有 
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L- 色 氨 酸 40.0 (2.0) |， “MgSoO,:7H:O 看 下 细 0J0 
L- 酷 氨 酸 40.0 (2.2) | NaiHPO， 300.0 
LL- 顷 氨 酸 训 -6520 江 555) | KHIPOL ”- 荐 0 人 伟 
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I 门 冬 栈 胺 8.09 (0.6). ， 人 氯 化 胆 碱 1.25 
E- 门 冬 气 酸 9.91 (0.7) | 叶酸 0.025 
[L- 号 所 酸 10.49 0. 区 | “ 肋 醒 0.125 
“D- 竹 基 葡 萄 糖 ， 3.20 (0.2) 。， 。 烟 酸 0.0625 
和 谷 氧 酸 、， .8.26 (0.5)  ，“ 烟 栈 胺 ” 0.0625 
“ 工 - 考 酰 肪 ,， 135.73 (9.3) 。， ”盐酸 吡 哆 本 0.0625 
甘氨酸 13.51 (1。8) ， “盐酸 吡 哆 本 0.0625 
L- 组 氨 酸 19.73 (1.3)， | 三 核 黄 素 : 0.025 
于 - 产 睛 氨 酸 4.09.(0.。3) 盐酸 硫 胺 素 0.025 
工时 亮 氨 酸 18.04 《1。4) | ”维生素 A 0.025 
于 亮 氨 酸 :20.44 1.6)  ，，， 维生素 D 0.25 
下 工 - 赖 气 酸 ” ，30.75. (2.1) 。， 维生素 荆 0.025 
工 -蛋氨酸 4ad4 0 3) 维生素 天 0.25 
I- 鸟 氨 酸 7.38.《0.6) “| 维生素 Bis 10.00 
Ts 革 丙 气 酸 下 116.53. 人 lo 
一 工 < 腑 氨 酸 一 一 613- 40;5) ee 
1 丝氨酸 0 本 
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L- 午 磺 酸 9372 
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i 酷 氨 酸 16。44 (0.9) 本 认 
EL- 须 所 栈 23400921) 于 生生 再 人 
1.0 
， 还 原 齐 0 
抗坏血酸 9.9 
L- 盐 酸 半 胱 毛 酸 253.9 
| 谷 胸 甘 肽 10。1 
| 核酸 衍生 物 


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Cacl， 200.0 
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Na HPO， 1140。0 
NaHCos 2200.0 
”葡萄糖 “000.0 
五 、 酶 
(一 ) 插 备 灶 物 原生 质 体 常用 的 酶 
名 ” 称 常用 浓 启 度 (%) ”六 家 
Cellulases Rycwa Hakko 玉 ogyo 
Driselase 55 Co,(JaFan)， 


Plenum Scientific， 
再 ackensack  NJ， 
Ceiluilysin -Yakult_Honsha-CORKCIHASGRAY 


(Orezuka 及 一 10) 1 一 3 Calbiochem San 了 Dieso CA 


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Meicelase 代 一 4 Meiji Seika kaisha lta。， 
: Tokyo (Japan) 
Hemicellulas、 1 一 ? Corning Glass、 
Rhozyme HP150 Corning，NTY 
Hemicellulase 052-05 Sigma Chemical，S8 
Louis，MO 
和 名， 称 常用 剂量 FA 
; PRectinass 0.5 一 1.0 Yakult Honsha Co， 
Macerase 《JapFan) 
Macerazme Calbiochem 2 San Diego CA 。 
PectinclAC ?有 Cecrning Glass Covning 
村: Pectclyas3 工 --23 0。1 Kigkoman Shoyu- Co 。， 


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PATE | 于 coechst，Gezrmany 
(Pectic-acia- 
acetyltvans- 


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Zynmolyase 2 日 本 东京 都 中 央 区 
(制备 酵 瑟 涉 生 质 体 ) 生化 学 工业 株式 会 社 
洲 导 酶 1 一 1.5 广东 党 微生物 研究 所 
(制备 食用 菌 系 生 质 体 ) 


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(三 ) 重组 DNA 实 验 所 用 的 主要 歼 


Ecoli DNA 涌 合 酶 IT 依 顿 于 DNA 的 DNA | 
| 合成 ， 

37 一 5 外 切 酶 | 

1 5 一 3 外 切 酶 

Ecoli DNA 到 合 酶 I 依赖 于 DNA 的 DNA 合 
Klenow 片段 成 
| 3 一 5 外 切 酶 

T4 DNA 素 合 酶 依赖 于 DNA 的 DNA 合 | 
成 

二 才 主 至 章 移 /二 54 儿 均 击 

功 黄 小 球菌 DNA | 与 Ecoli DNA 聚 合 酶 工 


素 合 酶 相同 
未 端 赔 氧 核 芍 酸 转移 | 在 两 股 DNA 的 3 末端 加 
了 本 EdaNTEPs 2 
T4 DNA 连 接 酶 。。 | 在 两 股 DNA 分 子 的 5“ 磷 ， 
酸 基 和 3/'- 叛 基 间 形 成 太 
酸 二 路 键 
反应 要 求 有 ATP 
E coli DNA 连 接 栈 功能 同 TIDNA 注 该 杉 ，| 
反应 要 求 有 DPN 
T4 多 素 核 茜 酸 激酶 “| 将 ATP 的 磷酸 转移 到 多 | 
素 核 埋 酸 的 5 一 OH 末端 


AMY 逆转 录 酶 | 依赖 于 RNA 的 DNA 合 
| 成， 人妖 解 RNA，DNA 杂 | 
交 分 子 中 的 RNA 

Escolii RNA 聚 合 隧 | 依赖 于 DNA 的 RNA 合 | 
| 成 


多 聚 核 背 臣 磷 酸化 酶 可逆 的 醋酸 解 ! 多 聚 核 ， 
音 酸 的 合 


~ 一 


应 用 


合成 DNA; 
缺口 移 位 


DNA 的 序列 分 析 ; ) 

真 充 3 一 末端 ; 
CDNA 合 成 
填充 3 “一 末端 

3 一 来 端 标记 

C 一 DNA 生 成 
合 残 Pcly (qdA 一 dT) 一 
Poly(dA 一 dT) 

以 RNA 为 颈 板 的 PNA 合 
成 

3 一同 聚 物 加 尾 ; 合成 引 
物 ; 3 “一 末端 标记 粘性 
末端 连接 ， 平 端 连 接 ， 


DNA 和 RNA 的 82p 
未 吏 和 标记 
从 RNA 侣 成 CDNA 


离休 RNA 侣 成 


合成 多 桶 裕 精 校 邦 栈 


全 
GAN 
ay] 
1 

全 


了 站 


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E、 coli poly ( 太 ) 聚 ) | 将 A 加 在 RNA 的 3 -OHi 加 poly(A) 到 有 NA 号- 


二 丙 材 吉 生 3 汪 2 


合 物 来 端 成 CDNA 
细菌 或 小 牛 破 性 磷酸 ， RNA 和 PDNA 的 5!- 未 端  DNA 去 磅 酸 阻止 连接 ， 
蝴 | 去 磅 酸 。 十 来 端 标 记 前 去 磷酸 
S 1 酶 = “| 斩 异 的 单 链 核 酸 酶 ，， | 去 除 单 链 末 端 * 杂 交 研 究 | 
外 切 酶 II | 走 除 DNA 的 3/ 和 5/ 单 生产 DNA 束 合 酶 的 底 物 5 
| 核 音 酸 | DNA 序 列 分 析 诱 变 DNA 
核酸 酶 BAL-31 | 竣 丽 股 DNA 的 3 和 54 永 | 从 DNA 片 自 的 两 端 逐 步 
端 同时 降解 核 音 酸 “ | 缩短 DNA 
T4RNA 连 接 酶 ] 连接 RNA 或 DNA 的 3 全 | 人 
| OH 和 了 RNA 或 DNA 的 5-| ,连接 粘性 末端 “ 

Divx 磷酸 彤 会 村 
Ecoi 核 铺 核 酸 【“ | 降解 RNA，DNA 和 杂交 | 从 杂交 分 子 中 除去 RNA 
酶 也 | 分 子 中 的 RNA 从 mRNA 上 除 去 poly 

5 RNA 的 特异 们 点 

裂解 
下 站 下 -全 
“《 赵 世 民 ) - 


六 、 遗 传 工程 常用 的 菌株 和 质粒 


(一 ) 大 肠 丁 菌 克 隆 系统 
1 .常用 的 大 肠 杆 菌 菌 株 及 性 质 潍 ; 玉 当 计 > 


| 
| 
避 


6060 Frythi-I，tht-1,1euB6， | 此 菌株 又 称 CR34 


lacY1l， ton 太 21,SUDEE44) 和 - | = 和 
了 LEOY< 想 


LE392| 下-,hsdR514 ci mr)， sup 二 用 到 攻 休 及 其 重 


:|:E345sEp FE58 lac :全 吉 人 Atlasli 当 千 痪 入 
cIZY)6.galk2， gafT22,metBLl， 
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避 galK2,fPSL20(9mr )， Xy1-5y 
间 :IDatl-1， SUDE44， 入 - 


“二 


Cla ，， 守 生 型 菌株 


时， 


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了 DHI |， ErecAl,end Al,gyIA96， 
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RM-y met- 


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CSR 人 (lac [SU 也 :ER 


基 解 


此 菌株 是 E。coli k-12 与 E 
|eeliB 的 杂种 菌株 ， 通 常用 来 作 
转化 的 受 体 菌 ， 也 非常 适合 用 作 
天 规章 提取 和 纯化 质粒 的 宿主 。 


F-;， 除 recA- 外 与 HB101 相 | HB101 的 recA+ 衍 生体 , cDNA 


! 与 质粒 通过 词 源 多 聚 尾 退 火 后 能 
以 高 频 转化 此 受 体 菌 。 


| 大肠 古 菌 C 的 野生 型 菌株 ， 在 

| 含 成 培养 基 中 能 保持 玫 年 5 天 肠 

| 标 蓝 C 为 F-， 并 缺少 宿主 限制 -- 
修饰 话 性 。 它 是 用 来 化 虽 曾 体 
| 双 突 变 互补 测验 前 Su 宿主。 


用 来 检测 以 携带 Lac 基 因 的 噶 
_ 菌 体 X 作 载体 的 重组 体 。 这 些 坊 
| 体 在 其 填充 中 含有 -1lac 基 因 ， 因 
.此 在 x+gal 存 在 的 情况 下 ， 形 成 
| 兰 色 的 哄 菌 班 ， 由 于 在 重组 体 中 
外 源 DNA 片 段 代 玲 了 填充 片段 ， 


.| 故 在 xigal 的 墙 养 基 中 ， 它 形成 


| 白色 丽 古 贡 刘 。 

用 来 涂 布 和 生长 质粒 及 柯 斯 质 
粒 的 宿主 ， 它 是 MIM294 菌 株 与 
KL16-99 菌 株 杂 交 的 gyTA-， 
recA- 生 生体。 


用 来 涂 布 和 生长 柯 斯 质粒 的 
recA- 受 体 苗 。 


上 两 来 良 阁 [BEi01 交 是 株 一 


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1 
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| 
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| 
4 
| 
| 


87， 


SK1590| gal,thi,s 训 ,Bl5,jendA， | -一 高 频 转 化 蓝 
hsdR1 hsdM: 


JC9:55 ， recAgg,thr-ileu-6ythi-1, 在 十 x 检 测 方 法 中 用 末 测 量 噬 
lacvly salKy ,ataL14vxy1-5， | 菌 体 理 博 突 赤 折 币 基因 的 菌株 
mtl-TEreA2,his-4，arsE3，| 此 菌 是 含有 recA98 斑 薄 突 变 的 
stt-31,tsX-33 | AB1157 的 衔 生 体 ， 注意 J9156 

阳 是 Su， 订 AB1157 是 supE 


NK5486 | thyA-,rha ysmr,1acZam 在 TVX 检 测 方法 中 ， 用 来 测定 
琥珀 突变 抑制 基因 的 噬菌体 的 苗 . 


汪 | 株 ， 又 称 基 139 
802 | hsdRr RsdV galT Te-， 通常 用 来 增殖 噬菌体 和 载体 和 
下 他 们 的 重组 体 的 Su 菌株 。 
Wall0r | F-，hsdR-，hsdML 多吉 是 Ilede ss 的 王 1 天 
2 衍生 而 来 的 Sa 英 株 


的 人 二 Ra 
到 3110r- ， F-,hsdR-,hsdM+,ns[kanr,| 包 伟 有 PhHMas 来 源 的 双 突变 


放下 沪 三 天 二 体 - 办: 
再 《RE tets,amps (tetramyampramy) Rpi 质 灶 的 fa 突变 体 鸭 W3110 
m 衍生 体 。 


二 一 -= wmaaeemairevieeastitranAseiaiaeaiaineeiiareiietsraiaieeeeereyc waniapcir ai 


ae 一 一 -一 


人 pda pv eanaga 


疡 一 
而 31107- SR TD TY WwW3ll10-m: (FE37 的 街 生 体 ， 
mm3SCP3 计 ， 此 和 宿 生 体会 有 找 代 SupF 的 征 于 
CrVX) | (kanry tetryampz) 质粒 元 VX。 
Q358 aa | hsdRiry hsdMz ,supEb80v NI 洲 生 和 TESTSTTT 
ME 9 
| 和 了 用 检测 噬菌体 和 的 sfi 台 组 
Q35) ， 可 Ms。 ,中 80 ,五 志 体 的 Sur 帝 主 。 
BHEB | N205 TeeA-Dimmisat Clts,| ， 用 来 制备 包装 提 政 物 前 太 深 源 
2638 > 9 开 2am ,Samy/Y] [ 曾 
BHB ”| 205 recA-[Yimimistyelts，| “用 来 制备 包装 训 取 牺 配 X 党 源 
2630 b2,red- Dam， Sanmi/y] 万 


av 


JM103 | ， Ad(lac pre) ,thi,strA,supE， 时 来 生长 单 江 商 休 MI3 及 
endA .sbcB,hsdR-,F'traD36, 重组 体 的 宿主 。 
bpPICAB，,1lacIZAMI15。 


除 注 骨 外 ， 所 青 上 列 芒 洪 均 为 大 < 后生 黄玉- 12。 


。 688。 


PvaITI， Ball 


ee (1) 克隆 质粒 载体 _ 人 
载体 址 | 第 选 性 硕 ， 搬入 匀 活 位 点 于 注 角 
四 | po 
DBR329 1 1.3 | Apr,Ter | Apr-Pstl， | ”PBR3?2 是 应 用 最 为 
Tcr=BamH1， 广泛 的 克隆 载体 质粒 
Hindtll,Sall。 :| 
PR325 ez | 和 Pr=Fstl， 它 是 含 Sm 基因 的 
Tcr-BamH1l， _ PBR322 的 衍 生 质粒 
和 1 和 


Anpr JTer | 


| 
2 
区 is 
| 
Cmr_-EcceR1l， 


pBR327 | 3.3 Apr-Pstl， 它 是 PDBR322 缺 失 了 
TcrBamH1， -10389bp 非 必须 片段 的 
| 往生 质粒 
DBS3 字 ar .6 入 二 | Aa-F 7 ge 
| 下 藉 天 Sm 位 点 引入 pBR327 的 衍 
了 和 er 生 质 六 ，par 位 点 的 引 
| HinellI Sall 入 使 得 此 质粒 能 更 有 
效 地 进入 了 细胞 
DB 了 RS 二 让 师 907i Comr， Albr-Pstl， 为 PBR322 街 生 质 
AprIprwygerBanml ， 灶 ， 含 育 氨 霉 素 抗 性 
| indl11， Sall 。 基因 
Cmr-EccR1l， 
有 Bi 
RS2923 45 | 和 bryTcr ApPz-Pstl。 0 已 是 含有 它 是 含有 Cn 基因 
| Tcr-Bamil， | 的 EBR3;i2 衍 生 载 体 
是 Cmr -indl11T, Sall。 
时 Cmr-Ball， 
上 EcoR1,Pvull 
FATSHI13.6 UNA-ryTc Ai Ter | ABRLPstT Abr=Pstl， -多 措 贝 的 pBR322 


Te=-BarmHT ， 


Findldl ,Sall ， 的 宿 生 质粒 。 


RE 人 一 导 在 一 一- 一 研 nrs2ECRRRDMRNNRATacTa xu， sserna aas 


所 人 


F 吕 已 
人 


针 玫 下 一 
质 | 人 于 条 二 狂 入 失 活 位 点 同 E 中 解 ， 
DBSE3。， 5.16. Apr ,Tes Tcr-BamH1， RS 号 的 机 下 质 

FA | Sall “| 粒 。pBR322 中 包含 复 

APr-Pst]， ， 制 起 点 的 Thal 一 A 片 ， 

-其 efHH。 | 与 失 本 Ap 和 Te 井 

AVaI 至 Sau3A 片段 融 

] 

四 | 合 形成 3160bp 的 pxfs 

| | 质粒 
plink322 , 3,8 | Apr | Apr-Psti 和 包含 一 多 聚 接头 以 

; | | 
-增加 有 用 的 克隆 位 点 
的 PBR322 的 衍生 体 。 

pMKI16 ,4.6 ，Kmr,Ter| TerBamH1。 ， 帝 隆 Smiaf 或 Xhof 未 

Hincll,Sall 端的 外 源 DNA 的 最 合 

4 Kmr-Smal, Xhol .| 适 药 载体 ， 
本 | 飞 症 >， Ap Kmzr-Betl,BgH1， 外 源 DNA 备 入 BSgIHLE 

| A5r-Pvuli 卫 过 位 点 使 Kmz 基 因 失 活 
DACTCi84 490 Camr， Ca-Ee6R1: 此 质粒 的 特点 是 播 

| 条 cr TcrcBamHI， ， 入 EcoRI 位 点 使 Cn 


| | | 
indtT Safti.。 失 活 


一 -一 一 一 一 
一 -一 一 一 一 


| 检测 到 的 同 源 性 


--- -一 一 -一 -一 一 一 | 
TERT 7” 34 Kmnr KmrcHipdll | pCRI 与 PSC10I 没 有 
| 可 检测 到 的 同 源 性 

| | 本 

-| “此 质粒 包括 3 个 

EcoRI 片 段 ， 一 是 来 

-上 让 5MB1 的 50sbp 片 段 ， 


一 是 207bp 大工 合成 
的 酷 氨 酸 tRNA 抑制 
基因 和 -- 115bp 的 多 
聚 接 头 


| 
1 


上 让 G Hi 人 | -SCIOUSRCRI 没 有 可 划 


0 (2) 玫 达 质 竹 载 体 
和 人 es Ne 
地 2 
1 “和 6。 Ape [ER 3 个 载体 ，3 个 阅读 
各 - ， 框 名 ，4, 多 b 与 8- 半 虱 
人 业 童 酶 形成 相 嵌 蛋白 
下 | Apr | HindII1 | 44 个 载体 ， 与 B- 半 虱 
Ca 
启动 子 可 作为 一 整体 
1 | 分 离 下 来 
| AprvTcr | EEoRa “2 不 载体 ， 根 据 有 无 
宁国 CAE 位 点 形成 相 仍 或 
医生 ， 非 相让 蛋白 
# j : 
REC 了 列 ， lac ApoTes | BamH1,Clal,， | 9 个 载体 ，3 个 阅 次 
PSK 系 列 有 mr。 Pst1,EcoR1， 框架 ，9。9 一 10.1kb， 
pEFK 系 列 | Sacl，Sall， 能 与 B- 半 必 糖 童 酶 C- 
六 天 ,Hindlll,Smal， 来 端 形成 相 供 蛋 白 
_Xbal or Xhol ， 
pce alac 导 。 | Hindl11,Pstl ， 6 个 载体 ， 包 含 两 起 
DMI 着 世 二 | | EeeRl, BamHn 始 端的 3 个 阅读 框架 ， 
2 Smal,Sall | 可 与 XGal 发 生 颜 色 反应 
pUCi8 | ;las 1 下 同 pUC8(+ Sst1， 2 个 载体 ，2.7kb.。 
， PUC19 Spbh1l,Xbal,Kpnl) 
BDICI19 | 1ac | Anpr | 同 BUC9(+Bslil| “EUCs 衔 生物 ， 具有 
系列 Xhol,Nrul,Clal, 六 个 限制 内 切 位 点 的 
本 村 ; 蔡 - Sacl,EcoRYV) | 多 友 接 头 ， 克基 
) | 
上 Ap: RbcuatdBem1 pPUC19 衍 生物 ,具有 
一 了 Xhol,Nrul， ee 
必 | Clal ， SatT 人 限制 内 切 位 点 的 ?1 
罗 EccRV) 多 育 接 尖 、2 .7Kb 
| 


69 了， 


续 才 1 
六 | 
站 克隆 位 - 点 -一 储 钥 
TIC-MI9， Jaz | Ar  ， 同 pEMBL8(+Bslll ，EEMB28 衔 生 而 来 ， 
系列 Xhol ,NTU1， 有 具有 六 个 四 币 内 切 位 
Clal ,Sacl,EccRV) 吉 前 多 尼 接 尖 》2.7kb 
TBG16 | ,车 村 和 pr | PCCcs 低 持 内 ，FLC3 征 生 
| | | 便当 
PWR590 ， lac Ai | Sacl, EcoR1， 5GC18 生 生 而 来 ， 
| Smal，Hind111，| 可 与 B- 半 弛 糖 童 酶 成 
| | BamH17Xbal 于 |- 相 典 蛋 自 
PIN11 系 列 .1pp- | Apr 。 | EcoRl, Hindlll， 27 个 载体 ， 有 3 个 克 
LI | 呈 过 多 | _BamHl 谋 位 点 可 被 选择 ， 以 
sa 和 | 合 记 本 全、 分 让 本 站 。 
p PIN111 携 带 lac1， 
| Plcll1 扒 带 1acZ 
人 - 2 全 昌 
PNH7a oa 1ac Apr 上 CCR1 ,BamH1 oo 
EDR540 | taca | Apr BarmHT tac 六 制 ga 区 的 表达 
| 其 中 ga 薄 来 让 PKO-1 
| 黄 站 ， 启 动 子 能 作为 
| = 92-bp 框 架 被 切除 。 
| 些 质料 大 小 为 Skb 
DT 工 ac | taea 请 Pr 生 冯 于 于 页 GTTIT> 2 个 载体 ， 大 小 256 
系列 EccR1i 一 4.6kb， 克 隆 无 RBS 
的 基因 ,启动 子 可 作为 
0 一 整体 被 分 离 下 来 
PERK233: | taCa Apr Nicol 含 lac 及 BS 和 ATIG 
四 | 以 和 翻译 起 动 
pE 有 系列 lac Apr EcoRi ,Hindl1l1，| 与 B- 半 乳糖 苷 酝 相 
| | 
| | 1 


启 


续 表 2 


人 


1 ww | 启动 子 | ， 、 
下 一 妆 | 下 让: 十 一 充 隆 位 -; 眠 注 解 


pYEJ001 | Scp | Apr 多 种 不 一 由 pBR327 衍 生 而 来 ， 
世 E 包含 2 个 串联 的 乳糖 
操纵 子 和 一 含有 氯 霉 
素 乙 酰 转 移 酶 的 
Hindlll 片 段 


了 B. 带 有 被 色 氮 酸 启动 -操纵 区 控制 的 启动 子 的 表达 载体 
DTrPED | tp | Abr,Tcr| Hindlll,Sall ， | 3 个 载体 ， 大 小 6.7 
小 BamH1,EcoR1l 一 9.8kb, 与 trpD 航 


合 ， 为 trP 编 码 并 带 
有 衰减 子 


DYWT 系 列 | trp | ApryTcr | Hindil1，Sall， 3 个 载体 ， 大 小 4.。8 

RS | BamHI1 kb。 可 与 trpE 嵌 合 ， 
能 以 3 个 阅读 框架 克 
隆 ， 质 粒 带 有 衰减 子 


序列 ， 大 小 3 .7 一 3 .8kb 


一 一 一 一 一 一 一 

省 
-一 -一 一 一 一 一 一 
一 


BEP 系 列 | trp | Apr,Tcr | Hindl111,Bgll1 7 个 载体 ， 大 小 7。9 


PHP 系列 Sstl 一 18kb ,来 自 PBR313 
或 者 PDBR345， 擂 入 失 
活 位 点 在 色 氮 酸 结构 


基因 内 
Apr | clal 大 小 4.6Kb， 携 带 trEI 
并 | RBS 
了 人 iadpaldl> | 大 小 为 3.72kb， 携 
Tadl,Hindl1ll ， 带 具 有 有 RB5 的 合成 的 
瑟 BamHIl 色 氮 酸 启动 子 
条 


as 093。 


续 才 3 

启动 子 | 

质 粒 | 操纵 子 | 标 忆 | 充 - 他 -位 -点 注 解 

PDR720 | trp Apr BamH1,Sall 色 氨 酸 启动 子 引发 galk 

Smal， 的 表达 。 启 动 子 可 作为 

一 77kb 的 EcoR1 框 架 被 

切割 下 来 。 大 小 为 4kb 

pER103 | tr | ApryTcr | Hindl1l1l 携带 合成 的 启动 子 、 
操纵 子 和 RBsS， 调 控 区 

可 作为 一 整体 分 离 出 来 


了 KEYP | 加 | ApryTer | Hindlll,Sall | 此 系列 含有 2 或 3 不 
BamH1,Clal | 连接 的 色 氢 酸 启动 子 和 


RBs 的 4 个 载体 。 质 粒 带 
有 LDPDP 转 录 终 止 位 点 ， 启 
动 子 可 作为 一 整体 分 离 一 
下 来 ， 大 小 3 .7 一 9.35kb 
，C.。 温 度 诱 导 转 录 的 表达 载体 
EHUB pL |Kmr,Apr | EcoR1,BamH1 2 个 载体 ， 大 水 7<6 一 
系列 Sall ,或 HPal 6 .5kb。 携 带 或 不 携带 反 
终止 子 。 
PLc 系 列 | pPL | Apr Ball,EcoR1， 5 个 载体 ， 允 许 带 有 育 - 
pLa 系 列 Pst1,BamH1， 己 转 录 起 始 信号 的 基因 
Sall ,Acci 或 克隆 ， 或 者 与 MS2pol、 
Hindl11 bla 形 成 相 嵌 蛋白 ， 大 小 
2。8 一 3 .8kb 
pTL6 ”| | clal,Hinalll, | ”为 XCII 基 因 的 上 未 端 
BamHIi 编码 ， 并 且 携 带 一 非常 
有 效 的 转录 起 始 信号 
DAS1 BamHIi 允许 任 何 编码 序列 与 
和 cl11 翻 译 起 始 信号 形成 


融合 蛋白 大 小 5,8kb 


“69y 。 


琉球 记 上 | : 识 信 位 点 | : 注 : 己 ，， 旬 


Apr BamH1 此 系列 具 携带 AN 基因 
Aval ”上 的 生 不 载体 


两 个 载体 ， 均 包含 Fa 
壳 体 起 始点 ，OrEFr， 
ImatL,mutR,t,Nct1 和 


RBS5。 可 用 于 DNA 测 序 


EcoRi,BamHl，| 3 个 载体 ， 在 3 个 阅读 
Clal | 框架 中 表达 ， 包 含 RBS 


BamH1 


PEY -VITfE |: 


;系列 
IEMBTEX 下 EDE | Apr | Sall 包含 MS;， 复 制 酶 和 LacZ 
- EcoR1 的 RBS 大 小 4。4Kkb， 
咏 闻 直行 pP2MBL8 的 衍生 物 
测 TS 厅 汪 | Hpal 形成 非 融合 蛋白 


和 
Ai | Kpnl 形成 非 融合 蛋白 


| Bamii 形成 非 融合 蛋白 
Bam8H1 含有 -ATG 密 码 作为 翻 
2 人 有 
BFEMBLex3| BR |- Apr BamH1,Salil 含有 Xctfo 和 1lacZ 的 RBS， 
四 FEsti 大 小 4.9kb， 由 PDEMBEL8 
衍生 而 来 


Apr Pstl,Sall OREF DNA 表 达 载 体 ， 
BamH1， 同 Xcro 和 8B-Gal 形 成 相 藤 
Smal ， 蛋白 
上 coR1 


ORF DNA 表 达 载 体 ， 
同 Acro 和 有 8 Gal 形 成 相 骨 
蛋白 


jweeeeeepmamaeeeeapeeeeaeeaeeeeeeeem 用 一 eareeeeeeeengggpmgpeeeeeaeimereeme| 


忆 
D .组 成 型 亡 劲 乎 的 表达 载体 
续 表 5 0 
启 动 - 子 汪 训 | 罗 二 各 
pbSPA “| PprotA | Apr,Tezr | EcoR1， 两 个 载体 ， 大 小 6 一 
系列 Smal， 7.5kb, 同 葡萄 球菌 蛋白 - 
Sally 质 形成 相符 蛋白 
Accl， 
BamH1， 
Pst1 或 
Hincll 
一 aa 
FEJP1 T5P25” | Apr,Tcr | Hindil1 大 小 4.6kb, 含 有 早期 
合成 的 T5 的 Drormioter 代 
| E 和 巷 Tcr 的 Promoter 
2 PLDDB Apr EcoR1i， | 9 个 载体 ， 对 任何 阅读 
系列 Hindljl1， | 小 架 选择 克隆 ,合成 相 其 
BamRiI 蛋 日， 分 泌 蛋 请 
pXJ002 | SCP 一 | AprerCiaae|Hpall， 5BR 衍 生 而 来 * 有 强 - 
BamH1 ， | 烈 的 肝素 抗 性 。 
sa1ll1， 隐 SC 
下 人 : RE 吐 
PEY2? 罗 C 本 时 人 Dry cs bBR327 衍 生 而 来 。 扒 
cmr 带 cat 基 因 
bpSP SP6 Apr |BcoR1;Sacli - 携带 鸣 菌 体 SP6- 的 -一 
系列 smal,BamH1 promoter, 谷 成 ssRNA- 
Xbal, Sal1， 让 
也 St1; ELIIDGTE 了 下 
pPORE | -oOmpF 一 | Ap 一 一 人 Bgll7Smali| -ORF DNA 夫 达 载 体 
系列 Xmal,Aval， 同 OmpF 和 BGal 形 成 相 
Sall, BamH1l 候 和 蛋白 
| Pst1 


(3) 和 载 体 
载 人 标 记 注 解 
。 全 .构建 基因 文库 用 的 载体 
gt wes.XB | 40 .4 WwWam403,，Eaml1l100 | 此 载体 被 广泛 用 来 克隆 
2 Sam100,CI857ts 需 要 | 中 等 大 小 的 王 .coRI 片 段 
带 sSUBE 的 宿主 菌 


党 Chaton3 到 ， 48.。3 Aam32,Bam1l1，Lac- | 用 来 克隆 EcoRI 消 化 的 
汕 imm80 需 携带 SaII 的 | 真 核 片段 

宿主 菌 , 在 x-gal 平 亚 上 

形成 兰 色 噬 菌 斑 


ChazonA | 45.4 ee 此 载体 被 广泛 用 来 克隆 
司 0307 Vs “9 | 15.20k67 大 小 的 真 核 


NIN5,80QSR 
和 人 帮主 和 片 本 
| 色 哈 菌 更 | 
CHiaron2i| 一 127 WwWam403, Eaml100，| 此 载体 被 广泛 用 来 克隆 
温 imnm80,b1007,VYKH53| HindIII 片 段 ， 由 于 它 含 
VKH52，VNIN5 需 .| 有 琥珀 突变 ， 故 可 用 Tvx 
， SUBE 或 SapE 的 宿主 菌 | 检测 系统 来 进行 重组 体 
司 办 的 检测 
Charonm28 和 人 原 种 2221 | b1007,KH54;NIN5 | 用 来 克隆 BamHI1 及 Mboi 
“ 国 -39.。39 片段 ， 由 于 Chi 位 点 的 缺 
2 原 种 2270 失 ， 致 使 重组 体 出 现 大 
神 -40.29 小 不 一 的 叭 菌 斑 ， 由 此 
壮 大 大 限制 了 此 载体 的 使 
用 
7 1 40.6。 十 (srIM1-2)，imm434 | 被 广泛 用 来 克隆 大 的 
本 cIT-，NIN5， EcoRI，HindIII 和 
chiAl31 BamHI 片 段 


。 097 。 


六 记 注 ， 解 


体 
gtli0 | 43。34 | b5z7,imm434 此 载体 用 来 克隆 小 的 - 
DNA 片 段 及 cDNA( 最 


大 到 7 .6kb)， 在 cI 基 因 

有 一 单一 的 EcoRI 位 点 ， 
克隆 到 此 位 点 的 重组 体 

可 形成 明显 的 叹 菌 班 


B 克隆 和 表达 coNA 及 基因 组 DN 人 A 的 和 载体 


gtl1 


lac5 
biol 
bio256 
38tt80 
imm80 


4357 cI857，NIN5，.S100 | EcoRI 揪 入 位 点 在 lacE 
在 X-gal 平 下 上 形成 兰 | 基 内 ， 在 8B- 半 乳糖 苷 本 


CSRs' 


imm21 
int29 


色 噬 菌 斑 | 转录 终止 密码 的 上 游 ， 
外 源 基 因 表 达 或 相 骸 蛋 
白 ， 揪 入 的 外 源 基 因 最 
大 长 度 为 7。2kb 
注 ， 上 菌 体 和 载体 中 所 用 的 遗传 标记 
避风 Aowgt rs。 
来 自 噬 菌 体 $80 的 置换 
来 自 噬 菌 体 %21 的 置换 
来 自 哈 菌 体 b29 的 置换 


下 再 100 带 有 EcoRI 位 点 的 插入 - 


Pacl29 

卫 W1i 

bl 007 
玫 互 53 
下 HE54 
nin 5 


带 有 克隆 噬菌体 att 位 点 的 ColE1 质 粒 

引致 基因 OO 丧失 EcoRI 位 点 的 缺失 

引致 att 位 点 损伤 的 b 区 域 缺 失 ， 从 而 阻止 深 源 化 过 程 

噬菌体 几 80 中 类 似 于 和 cI 区 域 的 缺失 ， 能 有 效 地 阻止 济源 化 过 程 
TeX-CcI 区 域 的 缺失 ， 有 效 地 阻止 溶 源 化 

去 除 转录 终止 位 点 t 有 > 的 缺失 ， 因 而 导致 不 依赖 于 N 基因 产物 的 后 旱 
期 转录 


ninL44 去除 Tal 基 因 附 近 的 BamHI 位 点 的 缺失 
cI857 引致 CI 基因 产物 热 不 稳定 的 ts 突变 


chi 


698。 


促使 定向 重组 的 和 噬菌体 的 特异 性 位 点 


(4) 柯 斯 质粒 〈Cosmid) 
十 大 小 人 


BEBT1-1 | 11.1 | ApryTer | BamHl -| 一 鞭 克隆 容量 为 27 一 


41kb。 此 质粒 含有 酵 
母 来 源 的 lenI 基 因 和 
2a 环 状 DNA， 因 此 它 
可 以 大 肠 杆菌 和 酵母 
菌 作为 宿主 。 
PHC79 | 6.43 | Apr,Tcr | BamH1， | 克隆 容量 为 31 一 47kb 
Sall ,Pstl 
pJBs 5.4 | Apr BamH1l， 克隆 容量 为 31- 一 47Kkb 
HG Sadl 
DJC74. 15.8 | Apr EcoR1,BamH1， 克隆 容量 为 21 一 47kb 
Bgllil,Sall 


Kpnl,BamHI， 克隆 容量 为 30 一 46Kb 


FEJC81 Ter 
Hindl11l,Sall 


pJC74Km | 21 | Apr,Kmr| BamHl | 克隆 容量 为 16 一 32kb 


pTL5 中 届 区 吓 ， Bg1l11,Ball 克隆 容量 为 31 一 47Kb 


了 pal - 


2 


DMF7 


Apr EcoR1l,Sall 克隆 容量 为 82 一 48Kkb 


pHS262 2.8 | Kmr BamH1，EcoR1y， :| 克隆 容量 34 一 56kb 
Hincll 


699， 


M13 系 列 


ea 700。， 


(5) 单 链 载体 


总 


王 cCoOR1 


EcoR1 
EcoR1-Hind1i1l - EcoR1 
EcoR1- BamH1- 9all -Pstl 
-Sall -BamH1，EcoR1l 
EcoRI -Smal -BamH1L- Sal1 
一 Pstl1- 了 Hindi1lil 
Hind111- 了 Pstl-Sall -- 
BamHI1-- Smal 一 EcoR1 
AccT1-=-BamH1L- EcoR1-Hincll 
一 了 indl111- Psti 


-Xmal - Xbal-=- Sstl1=-Smal 一 


Smal 一 Smal 一 Salli -Pstl -- 
Hindl111- Hincll-- 了 coORI 

一 BamHI1- Accl 

EcoR1- 9st1=- Smal (Xmal) 


一 BamH1- Xbal-Sall (Accl， 


Hincll)-- Pstl 一 EcoR1l 
EcocRI 一 Pstl1-Sall (Accl - 
Xbal -BamH1-Smal (Xmal) 
Sstl1-- EcoR1l 

EcoR1- stl-- 玉 pnl -Simal 
(Xmal)-- BamHI 一 Xbadl 一 
Salli(Acc1，Hincll) = 
Pstl1- Spbphl -了 indlll 
Hindill- Sphl- 了 Pstl-Sall 
(Accl1，Hincll) -和 bal- 
BamH1- Smal (Xmal) 一 
Kpnl 一 9stl1-- EcoR1 


注 3 
一 方面 M13 叭 菌 体 
通过 双 链 复制 ， 因 
此 能 作为 一 般 的 双 
链 质粒 载体 处 理 ， 
另 一 方面 成 熟 的 Ml13 
只 菌 体 包含 单 链 环 ， 
状 PDNA, 因 此 可 用 
来 进行 DNA 测 序 。 
通过 将 B- 半 乳糖 背 
酶 互补 系统 和 多 克 
隆 位 点 导入 其 中 ， 
构建 了 一 系列 广泛 
克隆 和 测序 的 MI13 
系统 。 


乡 


Fi 


| 1 < 局 并 -六 当 FF 
人 2 Ra 
人 浊 
《全 2 二 
光 RS 
et 
有 
0 克隆 用 的 枯草 杆菌 菌株 
ER 株 性 :xs 质 
BRi51 trbC2，metB10 1ys-3? 
YBs86 triC2 metB10， Xin -1，9SPB” 
MII12 leuA8， arg-15， thr-5，TecE4， 
MI119 pleuB6。tT5C2，T- Im- 
MI120 JeaB6wzECE IF nz 
CU403 thyA，thyB，metB，divIVB1 
 BDl170 trpC2，:thr-5 
BD224 trBC2，thr-5，TecE4 
2。 克隆 用 的 质粒 枚 
质粒 来 源 分 子 量 1x 10-* “标记 
FEBC16 BacilIMS CereHS 了 人 让 
EAB124 B .stearothernaopRilas 2。9 了 C 
PPL10 如 。pVMLiTS FT4。4 bacteriocin - 
pPL7065 BJ.pzumailus 4。6 bacteriocin 
DIM13 了 .SULDEiIUS 1。5 王 1 
FLS28 再 .SUDEiIUS (Matto) 轩 一 
DBS1 也 .SQLDTEiTLS 5-5 一 
PEFETB14 B_amy1oliguefacians 5 有 一 
pBUB110 tapPyIococcMS QHFEIHS 3。0 玉 1CNH) 
pPE194 9 .OHTEHS 2 帮 Em 
DC194 9 。QGRTFEHS 洛 . Cm 
二 PT127 9 。GHTEHS 2.9 Te 
淹 训 FC221 > .auTets 3.0 CH 
223 9 。GHFEIS 3.0 C711 
油 _EBUB112 “ 呈 。GUTEHS 3:0 C11 
- 4501 9 .QHMTEHS 2.8 S71 
0 
4 ESA2100 Saureus 4。7 CH ，S7m 


(psScle4) 


3。 克隆 用 的 重组 质粒 天 志 蓝 扣 大 
质 粒 分 子 量 (x 10-9) 亲本 质粒 标记 


pPBD6 5。8 PSA501，pPUB110 AS ， 天 70 
pBD8 ” 芭 0 TDSA2100，PELUB110 SMWCmRm 
PBD9 5。4 pE194，PBUB110 E7， 天 也 
EBD64 34 之 pC194，pPUB110 C1， 开 1 
EHYV11 3.。3 PC194，PT127 Ci ，Tc 
PHV41 4。5 FEC194,DUB110.pPBR322 CHI， 天 11 
ELS103 的 DBUB110.。.B.pMiIUS 厅 D ”天 1， 女 D 
gene 
pPLS105 5。4 PUB110，B。Iicpeniforrais 下 他， 让 p 
太 D gene 
BTL10 9.4 pLS28,B.sUDtiTiSs 1e& anad 1ex,Tp 
工 D=-7 geneSs 
_BTL12 6.。4 pLS28,B。subiilis Teu and Teu,TD 
了 TD-7 genes 汪汪 
pTB90 4.4 pTB19 Km，Tc 
pPL608 3s5 pUB110,B.prrmmilus cat-86 


gene,0.3 kb 
SP02 Phage Promotter Km ,C711 
FPL703 PPL603 with linker from 天 1,C 肪 
娩 phage M13mF7 


4。 大 肠 杆菌 和 枯草 杆菌 中 均 能 复制 的 穿梭 载体 


质 粒 分 子 量 (x10-5) 亲本 质粒 标记 
DBHV14 4.6 FC194，FBR322 Cm， Ap。Cm 
pHV33 4。6 DC194,FBR322 Cr 4p TE CI 汪 
pHV23 6.1 ”PFC1l94,pBR322,pT127 Tc,Cm Ap;Cm 
pOG2165 5.。0 EC194,pUB110， 5 
了 .Jicpeniformis 
pen-r gene Ap ,Ca Ap,Cm 
pJK3 5.0 pBS161-1,PBR322 Tc ”4p,Tc 
ECPP-3 3。7 PEBR322,BUB110,EC194 Km KK 
5.pC194 及 pPUB110 的 物理 图 谱 


702。 


pPCI94 0.2 


心 


图 7-1 DC194 的 物理 图 谱 ， 箭 头 表示 阅读 框架 B 编码 氧 霉 素 乙酰 转 移 
“ 侠 ， 框 架 C 的 序列 与 质粒 复制 有 关 。 


2 


图 7-2 BUB110 物 理 图 谱 ，Bsg111 位 点 在 Kanr 基 因 内 ， 此 抗 性 基因 的 
界限 不 明 将 ， 复 制 起 始点 定位 在 3.2。 


703 9 


(三 ) 酵母 克隆 系统 


I. 酵 母 基 因 克 隆 常 用 的 细菌 和 酵母 株 系 
A, 细菌 CC600 KK12 1eB6 幼 i-1 雪 7=-1 1acY1 to1A21 
S1D 顾 44 


hisB463 K12 1isB463 FSdR+ PSsdM+ 
trpC9830 “到 12 W3110 女 pC117 
DB6656 ” ， 开 12 DT7F: : MU trpom lacZ。。PSsdaR- JsaM+ 


BAl 必 12 yeB6 rpC1117 PisB463 TA10: : ear 
71isB 她 7 坊 广 志 yA strrzsdR- jsdM-> 
B. 酵母 LL20 MATa 1ex2-3,， 112jis3-11，,15 
YNN281T MA4Ta his-3A trpl-Aira3-52 ade2-101 
17S2-801 


SR25-1A Mata jis4-912 Ura3-52 
W301-18A Mata ade2-1I trpl-l 1eu2-3,，112 jis3-11， 
15 Fa3-1 can-100 


2. 酵 母 基 因 克 隆 常 用 的 载体 


关 电 到 : 和 对. 例 和 说 明 性 质 


整 入 型 YIp5 pBR322 衍 生 载 体 , 具 | 此 质粒 以 较 低 的 频率 与 染 


有 一 选择 标记 URA 点 (〈 即 Ufa3-520F Ura 3- 


34 50) 重 组 .所 以 克隆 到 此 载 
体 的 酵母 序列 主要 是 通过 
同 源 重 组 而 整 入 染 色 体 
位 点 。 
自主 多 拷贝 | YEp13 | 分 别 是 pPBR322 和 pm | 这 些 质粒 以 高 频 转 化 酵母 
SR bpJDB2?19 | 3B9 的 衍生 载体 ， 这 些 | 并 在 酵母 中 自主 复制 ， 他 
载体 包含 可 选择 的 酵 | 们 通常 被 用 来 构建 基因 文 
母 标记 工 EU2 + 和 2uml| 库 ， 天 然 20m 的 环 状 DNA 
环 的 自主 复制 部 分 的 存在 增 的 
稳定 性 
自主 多 拷贝 | 工 Rp7 pBR322 衍生 的 质粒 -| 此 
-染色 体 含有 TRP-+ 基 因 和 | 并 
邻近 染色 体 ars 序 列 
胞 丢失 质粒 ， 保 留 质 
细胞 则 含有 多 拷贝 质 


9 70 了 


例 子 5 


站 到 YLp1 含有 Tetrahymena 巨 
中 - 端 粒 核 TDNA 来 源 的 端 料 
和 酵母 选择 标记 , 二 卫 
U2 + 的 DBR322 衍生 


性 质 


拉 = 
让 


多 拷贝 载体 。 和 
对 不 稳定 ， 在 无 选择 压力 
下 经 过 10 代 后 约 10% 的 细 
胞 含有 质粒 。 


”表达 非 调节 


此 类 载体 用 
线 状 质粒 来 克隆 酵母 的 端 粒 序列 和 
构建 微小 染色 体 。 


mm 
下 


pBR322 衡 生 的 环 状 


DAAH5 


一 一 -一 一 一 一- 一- 一 一 一 一 一 -- 一 一 -一 一 一 一 一 一 一 -一 


本 导致 与 MEFaI 基 
因 信 号 部 分 融合 的 小 蛋 自 
的 分 泌 


含有 a 因 子 基 因 MEai 
加 工 位 点 的 信号 序列 
的 环 状 质粒 


夷 达 与 调节 | pAB112 


(四 ) 植物 遗传 工程 中 常用 的 菌株 及 穿梭 载体 和 Ti 质粒 的 衍生 载体 


菌株 性 质 
大 肠 杆菌 菌株 
HB101 FE-，rB-，mp”"，RccA，arfa，PpProA，1lacY，galk，j 
stz，Xy15，Imt1，SuUPE 
GJ23 含有 DGJ28 和 R64drdl1l 的 AB115 的 RecA 的 衍生 体 
JM83 中 80 上 的 LacZAM15 整 入 到 染色 体 上 的 K12 


(ara，Alac 一 pfo，StrfA，thi， 只 80dlacZAM15) 


9 7095 2 


续 才 人 


菌株 了 性 , 质 、 1 
农 杆 菌 菌株 
Al136 Ti 质粒 治愈 的 C58rifr 
LA4404 含有 FEAL4404 的 Al136 
GV3102 与 A136 等 价 
质粒 
PBR322 Apzr，Tcr 
5GJ28 携带 有 ColElmob 和 bom 的 kmr，Nmzr，Cda+，Ida+ 
colD 复 制 子 
R64drdll Tcr，SmarIa 型 质粒 ， 它 是 及 64 的 转移 功能 被 解除 抑制 
的 衡 生体 
pGV3850 携带 有 5BR322 序 列 的 noFaline pGV3856 质 粒 的 
X Apzronc- 衍 生体 
PFAL4404 T 一 DNA 区 缺失 的 octopine pTiAch5 质 粒 的 衍生 体 ”- 
pLGVneol103 具有 hos-heo 网 合 基因 的 AprKnrpBR322 衍 生体 
pRK2013 具有 RK2 trfa 基 因 的 人 mrzColE1 衡 生体 
pGV2215 octopine 型 Ti 质粒 PTiB6s3 的 Kmrtms 突 变 体 。 
DpGV3851 携带 有 pBR322 序 列 的 nopaline 型 "i 质 粒 C48 的 Aprtms” 
衍生 体 
pPMEP61 由 pEC79 揪 入 到 pGV3105 的 nos 基 因 衍生 而 来 的 Trac 
hocc ou+ 载 体 2 
pHC79 AprTcr 的 柯 斯 质粒 


706， 


0 GENE 


人 


Ja cross 一 

N__ ovepmieve 

攻 - 测 Ve Rent 
牙 wz - 


> Tivector 
pGV3850 


目的 基因 首先 被 克隆 到 大 肠 杆菌 的 PBR322 型 的 载体 上 ， 然 后 
将 此 质粒 泳 动 到 农 杆菌 中 ,通过 一 次 单 交 换 此 包含 有 外 源 基因 
的 重组 质粒 将 整 入 到 pPGV3850 上 。 实 心 三 角 表 示 Apz 外 的 其 
它 抗 性 基因 。pGV3850 上 的 PBR322 序 列 〈 用 全 表示 ) 两 侧 是 
包含 左 、 右 边界 系列 和 nos 基 因 的 IT 一 DNA。 


707.。 


v 


aceap 呈 证 32 or 
SNPTIgere(Tng03)》 
NPTIgene(Tr5) 


图 7-4,PLGVneel1103 的 限制 性 内 切 酶 图 谱 。PLGVnaeol103 是 一 
能 整 入 到 pGV3850 上 去 的 质粒 ， 其 上 携带 有 植物 转化 体 的 选择 - 


标记 卡 那 霉 素 抗 性 标记 。 


2.SEV (SpLit End Vectory 承 谢 


ee PN 
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- 
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708。 0 
主 7 二 av 生 
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5 二 记 -人 所 
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了 PR 名 号 六 四 
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六 RN : 六 
SEV _ system 
人 A 
ds 了 
S 人 全 
B jMON vector 
人 Coiftegration 


Ti lasmid: :PNON Yeetor ， 


| Cocujtiyatiom 


ES ES 一 上 


4Long transfer 


“Short transfer” 


匡 LIHEKanr 


图 7=5，SEV(SPLit End vector) 系 统 。 箭 头 代 表 T-DNA 的 边 - 
界 序列 ，LIH 是 DNA 重 组 的 同 源 区 ， 癌 基因 用 tms, tmr 表 示 ; 
OCS 和 NOS 分 别 代表 章鱼 碱 和 烟 酯 破 合 成 酶 基因 ， 人 局 合 的 卡 那 
霉 素 抗 性 基因 用 Kanr 表 示 ， 用 来 筛选 共 整 合体 的 壮观 霉 素 和 链 
” 霉 素 细菌 抗 性 用 Spc/Strr* 表 示 。Ti 质 粒 DTiB653(A) 与 DMONI120 
”衍生 体 pMON128(B) 重组 产生 共 整 合体 (C)pTiB65 - 3 PMON 
1283 将 带 此 共 整 合 质粒 的 农 杆 菌 与 植物 共 培 养 并 用 kan 抗 性 选 
择 后 ;- 或 者 是 整个 T-=DNA(D) ,或 者 是 无 瘤 基因 的 短 的 T-DNA 
( 卫 ) 转 移 到 植物 基因 组 中 


es。 709 。 


3. 双 亲 载 体系 统 


PAL4404 


pTiAch5 


图 7-6,pTiAch5 的 物理 图 谱 。 四 和 一 分 别 考 示 存在 于 DAL4404 和 DAL 
1050 上 的 Ti 质粒 片段 。 包 含 Vir 区 的 pPAL4404 作 为 辅助 质粒 将 另 - 
一 复制 子 上 的 工区 转移 到 植物 的 基因 组 上 去 。I-DNA 区 克隆 到 

一 广泛 寄主 范围 的 质粒 上 ， 它 具有 如 下 特点 。(1) 具 有 质 粒 PK2 

的 复制 功能 使 得 此 质粒 能 在 大 肠 杆菌 和 农 杆菌 中 复制 ,并 与 Ti 质 


粒 相 容 (2) 含 有 ITn903 来 源 的 人 an 基因 (nptl1) 作 为 细菌 的 选择 
标记 ;:(3)Octopine 型 的 Ti 质粒 的 左 ， 右 边界 序列 使 得 外 源 DNA 
能 转移 到 植物 中 去 ; (4) 左 ,右边 界 内 含有 选择 植物 转化 体 的 久 ans 
的 相 徐 基因 。 另 外 还 包括 从 PUC18 来 的 在 8- 半 乳糖 酶 基因 内 有 
多 聚 接头 的 了 aell 片 段 。 


(五 ) 哺 乳 动物 遗传 工程 的 载体 
1.pSV2 载 体 


图 7-7，PpSV2 载 体 ,许多 哺乳 动物 
的 载体 均 是 此 质粒 的 衍生 体 。a.SV40 
早期 表达 区 的 启动 子 ?b。pBR322 来 源 
的 细菌 启动 子 和 ampr 基 因 jc.SV40 来 
源 的 polyA 位 点 和 小 的 内 含 子 ; d. 在 
SV40 早 期 表达 的 启动 子 控制 下 的 目的 
基因 。 


“71J10。 


图 7-8, 利用 劳 氏 肉瘤 病毒 的 长 的 末端 重复 序列 ( 即 RSVLTR) 作 
启动 子 的 载体 。A, pRSVcat 是 瞬间 表达 载体 。B, PRSVgpt 和 
了 CC,pRSVneo 是 显 性 选择 标记 的 载体 。D, PRSVbeta-globim 是 

一 很 容易 将 任何 目的 基因 置 于 RSVLTR 控 制 下 的 载体 。cat- 氧 
和 霉 素 乙 酰 转 移 酶 基因 ;gpt 一 次 黄 味 叭 磷酸 核糖 转移 酶 基因 ;neo- 
新 霉 素 磷酸 转移 酶 基因 ，B-globin 一 8 一 珠 蛋 白 基 因 。, 


《 陈 炬 ) 


所 用 抗 性 标记 
要 Tc: 四 环 素 ， Cm 氧 伦 素 ，Sm 链 伦 素 ，Km:， 卡 那 谷 素 ，Tp: 三 甲 氧 苹 


“二 氨 喀 是，Ap， 气 华 青 霉 素 ”“Em， 红 堆 素 ，Nm 新 霉 素 。 


7TTTe 


七 、 常 用 的 同 工 酶 检验 法 


同 工 酶 常用 于 遗传 分 析 。- 一 些 遗 传 上 的 变异 也 常 引起 同 工 酶 的 改 恋 . 因 


而 可 以 使 用 同 工 酶 来 检验 遗传 上 的 变异 。 各 种 同 工 酶 都 需 使 用 特有 的 染色 剂 


来 染色 、 而 且 显 色 的 条 件 也 各 不 相同 在 这 里 介绍 一 下 常用 的 同 工 贾 的 检验 


法 ， 以 供 参 考 。 

(一 ) 乳 酸 脱 氢 酶 Lactic dehydrogenase(LDH) 

1 .染色 液 ;NAD*+〈 氧 化 型 辅酶 I) 50mg，NBT《〈 氧 代 硝 基 四 氮 吨 蓝 ) 
30mg，PMS (只 哄 二 甲 酯 硫酸 盐 ) 2mg，1M 乳 酸 钠 液 (PH.7.0)10ml，0.1 
M 和 氧化 钠 5ml，0.5MTris 五 CI 缓冲 液 (PH7。1)15 毫 升 和 秦 馏 水 70ml。 临 用 
前 配制 。 

2.。 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 〈 板 ) 浸入 染色 液 , 于 37 了 保温 30 一 60 分 钟 即 
可 显示 蓝 紫色 区 带 。 可 用 无 离子 水 漂洗 ， 再 用 7% 醋酸 固定 , 世 终 止 酶 促 反 
荡 。 

(二 ) 芋 果 酸 脱 氨 酶 Malate defhydrogenase(MDH) 


1. 染 色 液 ;NAD-50mg,NBT30mg,PMS2mg,1ML- 苹 果 酸 钠 (pH.7.0) 


10m10.5M'Tris/HC1 组 冲 液 (pH7。1) 和 蒸馏 水 70ml。 
1M 苹 果 酸 钠 (DH7 .0) ,也 可 以 用 工 - 苹 果 酸 13， 7 .H2O(248 
克 / 升 ) 49ml， 加 蒸 馆 水 到 11 配 制 。 


2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 浸 入 缆 色 液 ， 让 克 让 入 是 风 天 罗 村 吕 河 
示 深 蓝 色 区 带 。 用 无 离子 水 漂洗 ,再 用 7.5% 栈 酸 《〈 或 7。 5 和 醋酸 一 30% 乙 本 调 


一 15% 甘 油 ) 固定 保存 。 


6-PDH) 


DTA) 62.5m1， 蒸 馏 水 37.5m1。 临 用 前 15 分 钟 配 制 。 


2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 漫 入 染色 液 ， sz 人 90 外 


深蓝 色 区 带 。 用 无 离子 水 漂洗 ，7.5% 醋酸 固定 保存 。 
(四 ) 谷 氨 酸 脱 氨 酶 slutamate dehydrogenase(GDH) 


1. 染 色 液 :NAD 60mg，NBIT30mg, 了 MS2mg,IM 谷 氨 酸 钠 液 (PH7 .0) 汪 本 


于 712 。 


(三 ) 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氨 酶 glucosze-6-phosphate dehydrogenase (G- -时 


1. 染 色 液 :NADP*( 氧 化 型 辅酶 I)30mg,NBT20mg,PMS20mg,GeP( 葡 ， 
萄 糖 -6- 磷 酸 ) 187.5mg，0。01MTris/HC1 缓 冲 液 (pDH8.6, 内 含 0.004 ME- 


< 


; 雹 人 

辐 “i5M 再 酸 缓冲 站 (PET7.0)25m1, 蒸 饮水 70ml。 

“1M 和 谷 氨 酸 钠 液 《〈PH7 .0) 0 ?2 答 气 由 全 济济 贡 0 0 5M 磷 酸 绥 
WOE7.0) 中 配制 。 

2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 浸 入 染色 液 ,于 37T 保温 ， 直 至 显示 深蓝 
元 区 带 ; 用 无 离子 水 漂洗 ，7.5% 栈 酸 固定 保存 。 

(五 ) 异 柠 要 酸 脱 氢 酶 lsocitric dehydrogenase(IDH) 

汉 1。 染 色 液 :NADP-*30mg，NBTI30mg， PMS2mg， MgC1,100mg,0。.1M 异 
。 柠 机 酸 钠 液 (PH7.0)16ml,0， 2MTris/HC1 缓 冲 液 (PH8:0)20m1, 燕 伺 水 64 
1。 


权 


2 显 色 和 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) ,浸入 染色 液 ,于 37Y 保温 直至 显示 深蓝 色 区 
。 带 。 用 7.5% 了 醋酸 周 定 保存 。 
飞 六 ) 醇 脱氧 酶 Alcohol dehydrogenase(ADHI) 
工 .染色 液 ” NAD-50mg,NBT30mg，PMS2mg，95% 乙 醉 侠 关 它 醇 
类 ) 4ml 052MTris/HC1 缓 冲 液 (pDH8.0)14m1 和 阁 馏 水 82ml。 
2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 浸 入 染色 液 ,于 377 保温 直至 显示 深蓝 色 
区 带 。 用 无 离子 水 漂洗 ， 国 定 保 存 于 7.5% 醋 酸 中 。 
(七 ) 酯 酶 (esterase) 
1. 染 色 液 :1gx- 醋 酸 蒜 酯 和 1g8- 栈 酸 蔡 酯 ， 溶 于 50m1 丙 酮 和 50ml 蒸馏 
”来 中 ， 配制 成 1%cx，8- 酷 酸 蔡 酯 。 取 1%c，8- 栈 酸 茜 酯 3ml， 坚 牢 蓝 RRI100 
mg，0.5MTTris/HC1 缓 冲 液 (PH7.1)10ml， 加 蒸馏 水 至 100ml。 
2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 浸 入 染色 液 ， 于 377 保温 约 40 分 钟 ,或 室 
温 下 直至 显 出 棕色 “或 红 棕 色 ) 的 区 带 。 用 无 离子 水 漂洗 ,固定 保存 于 7.5%1 
栈 酸 -30% 乙 醇 -15% 甘油 中 。 
( 八 ) 胆 碱 丁 酶 (choline esterase) 
1 .染色 液 : 3,2mM 乙 酰 硫 代 胆 碱 或 于 酰 硫 代 胆 碱 。3M 硫 酸 胺 液 。 二 六 
。 代 草 酰胺 饱和 的 3M 硫 酸 胺 液 。 
于 2。 显 色 ， 先 将 电泳 后 凝 蒋 条 ( 板 ) 放 在 1/15M 大 酸 盐 缓 神 液 (pH6 .1) 中 ; 
于 227C 下 预 温 30 分 钟 。 取 出 后 浸入 3.2mM 乙 酰 硫 代 胆 碱 或 丁 栈 硫 代 胆 碱 中 ， 
220 下 保温 90 分 钟 。 然后 移 至 3M 硫 酸 胺 中 ， 在 47 冰箱 放置 24 小 时 ， 再 移入 
亲 三 硫 代 草本 爱人 和 的 3M 三 酸 胶 洲 液 中 ， 在 4 忆 放 轩 24 小 时 显 色 。 将 显 色 后 的 
汪 北 胶 条 放 入 7.5% 栈 酸 固定 保存 。 
。( 九 ) 过 氧化 物 酶 (peroxidase) 
下 1 染色 液 ;(A)0.1% 联 苯胺 〈 在 0。.1M ,PH5。6 醋 酸 缓冲 液 100m1l 中 含 0。1 


下 
鄙 - 有 


。 联 胺 ) 100ml， 3% 也 :20:1mI， 临 用 前 混合 了 3)2% 联 苯胺 (2g 联 闲 胺 深 
于 18mI 冰 醋酸 ， 加 蒸馏水 到 100m1) 20m1， 抗 坏 血 酸 70.4mg，0.6%H :9 
20ml1 和 燕 馅 水 60m1， 临 用 时 混合 。 注 意 ， seoiiiorsec 和 


或 微 温 热 冰 醋 酸 可 起 助 溶 作用。 


2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 浸 入 染色 液 ， 定时 量 0 故人 寻 
区 带 。 用 无 离子 水 漂洗 ， 固 定 保存 于 甲醇 - 冰 醋 酸 溶液 (甲醇 : 冰 栈 酸 * 水 =5: 


1:5)， 区 带 渐渐 变 成 棕色 。 

(十 ) 过 氧化 氨 酶 (Catalase) 

1. 染 色 贮 液 :(A)20 份 0 05M 磷 酸 钱 缓 刘 液 CDH7 8) 5 份 二 氨基 联 苯 _ 
胺 (4mg/ml) 水 溶液 和 1 份 过 氧化 物 酶 (Img/ml) 水 溶液 混合 :(B) 合 有 0.6% 
H2:O: 的 0.05M 磷 酸 钾 缓 冲 液 (PH7 .0)。 SS 

2., 显 色 ( 负 带 ) :电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 经 无 离子 水 漂洗 ; 浸 闪 A 凤 液 ; 子 237 


下 放置 5 分 钟 ， 再 用 无 离子 水 漂洗 ， 随 后 浸 在 B 液 中 ,室温 下 直至 棕色 凝 胶 背 


景 上 出 现 白色 区 带 。 用 无 离子 水 漂洗 ， 保 存 于 甲醇 =- 亲本 酸 沪 液 ( 下 本 ?六 天 
- 酸 : 水 =5:1:5)。 
(十 一 ) 细 胞 色素 氧化 酶 (Cytcchrcme cxidase) 


1. 染 色 液 ，1% 二 甲 基 对 葵 二 腕 1m1，1%vw- 蒜 酚 1mly 混 侣 后 再 加 入 25 


ml10.1M 磷 酸 盐 缓冲 液 (pDH7 。4)。 


2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 )》 浸入 染色 液 中 ， 室温 下 放置 直至 显示 划 油 


色 区 带 。 不 宜 久 存 。 浸 在 水 中 ， 仅 保存 几 天 不 褪色 。 

(十 二 )c-=- 淀 粉 酶 (xc-amylase) 

1. 染 色 贮 液 ， (A) 淀 粉 溶液 ， 可 溶性 淀粉 1g 溶 于 100m1 的 1。 2XNaCI 深 
液 中 ，(B) 5% 酷 酸 ;(C) 碘 溶液 ,每 升 含 KI30g 和 I213g。 


2. 显 色 { 负 带 ) ;将 电泳 后 的 凝 胶 条 ( 板 ) 浸 六 六 液 ， 37 蕊 保 但 加 -50 天 河 


圩 。 取 出 胶 条 ( 板 ) 用 无 离子 水 洗 去 残留 淀粉 液 ， 然后 在 卫 液 中 浸泡 5 分 钟 ， 
再 用 C 液 显 色 ， 在 上 暗 蓝 色 的 背景 上 可 见 到 浅黄 色 或 透明 的 区 带 。 倒 寺 C 液 ， 
用 水 洗 后 固定 保存 于 7.5% 醋酸 一 30% 乙醇 二 15%% 甘 油 中 。 


(十 三 ) 肌 酸 磷 酸 激 酶 
1 .染色 液 ， 磷 酸 肌 酸 300mM，ADP2.81M，AMPI12M，NADP122 


WiLM , 谷 胱 甘 肽 9。9mM; 葡萄 糖 22mM,MgSO44.17M，G-6-PDH20ugy/ml， 
己 糖 激酶 20ug/m1， 和 县 氮 钠 10mM，PMS0.05mg/ml，NBT0.24mgyjmls 
2. 显 色 ， 电 泳 后 凝 胶 条 ( 板 )， 浸 入 染色 液 ，377 保温 直至 蓝 名 区 带 。 


FT 


号 


汪 Se 加) 最 从 二 二 和 A 直 :iine 0 
上 “ 工 .染色 贮 液 ，( 入 ) 底 物 溶液 ，v 或 8 苯酚 矶 酸 盐 2m8 溶 于 1 m10.2M 硼 酸 
过 角 细 六 深 (pH10)(B) 染色 剂 , 固 兰 RR 或 固 兰 BBlmg 深 于 1m10.2M 确 酸 组 
(pHI10)。(C) 硼酸 缓冲 液 (BFH10)，0.2M 硼 酸 -0。3MKCI 混 合 液 200 
匠 与 0。 2NNaOH 深 液 100m1 混 合 
潭 2. 显 色 ， 将 电泳 后 的 凝 胶 条 ( 板 浸入 底 物 溶液 ， 置 37T 保温 1 一 2 小 时 
后， 再 换 上 染色 剂 温 育 直 至 红色 区 带 。 
汉 (十 五 ) 酸性 磷酸 酶 Acid phosphatse 
1 来 色 液 ,0.1%c- 茜 酚 亚 酸 钠 和 0.1% 固 紫 GBC 深 于 50mM 研 酸 钠 缓冲 
液 (pH5) 中 。 
汪 2。 显 色 ， 将 电泳 后 比 胶 条 ( 板 ) 浸泡 在 50mM 栈 酸 销 缓 证 液 (FH5.0) 中 
”30 分 钟 ， 然 后 浸入 染色 液 ， 室 温 下 放置 60 分 钟 显 色 。 在 7.5% 醋 酸 溶液 中 固 
人 
(十 六 ) 肽 酶 (peptidase) 
1. 染 色 液 ， 邻 联 ( 二 ) 茄 香 胺 (0-dianisidine) 10mg, 工 -氨基 酸 氧化 酶 

10mg， 过 氧化 物 酶 20mg，0.1M 磷 酸 盐 级 冲 液 (PH7.5) 100m1，0.1MMn 
Cl:lm1l， 甘 氨 酰 - 亮 氨 酸 〈 二 肽 ) 20ms。 
2 , 显 色 ， 将 电泳 凝 胶 条 ( 板 ) 浸入 妆 色 液 中 ， 于 37 口 保温 直至 显 色 。 
(十 七 ) 醛 缩 酶 (Aidoiase) 
1. 染 色 液 ,果糖 -1,6- 二 磷酸 钠 545mg ,甘油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 (167u/ml) 
0.6ml，NAD+50mg，PMS2mg，0.5Mtris/HC1 缓冲 液 (DH7。1)， 砷 酸 钠 
(Na,As0,。7HsO) 150mg 和 燕 饮水 90ml。 
2. 显 色 ， 将 电泳 后 凝 胶 条 ( 板 ) 浸入 染色 液 ， 于 37Y 保温 直至 显 蓝 色 区 
， 。 带 。 用 无 离子 水 浸 洗 ，7。5% 酷 酸 固定 。 


7 了 15 


证 和 
名 来 = 
五 洲 蓝 孜 ACTH 
激 在 胰 蛋白 酶 ”: 
豆 血清 清 蛋白 。 
可 剖 6 - 脂 蛋 白 
溶 昌 甩 球 蛋白 
攻 y 一 球 蛋 白 
着 纤维 重 白 原 
座 < 过 氧化 气 醇 二 
多 核 
[总 短信 20 巨 于 蛋白 
全 0 二 和 
白 体 核 蛋 白 体 
人 用 80 多 核 蛋 眼 体 
计生 青 骸 亦 质 炎 ”三 
| 赣 和 西 红 杭 禾 村 
k 及 马 脑 炎 再 
。 噬 鸡 肉瘤 
. 蓝 上 虹 流感 疡 
亚 | 体 .“Tz 哎 庆 笨  S 
号 人 5 人 体 : 
分 | 
本 
位 体 胸 菜 的 腊 
， = 


7T16 。 


离心 世 转 数 与 离心 力 的 列 线 国 、， 


+ 为 离心 礼 头 的 半径 〈 角 头 为 或 离心 管 中 轴 底部 内 壁 到 离心 机 转轴 中 
让 的 距离 〈 甩 平头 )， 单 位 为 厘米 。 江 这 
。  Tpm 为 离心 机 每 分 钟 的 转速 。 
及 CE 为 相对 离心 力 ， 以 地 心 引力 即 重力 加 速度 的 倍数 来 表示 ,一 般 用 
g 《或 数字 x 多 表示 。 
附 图 是 由 下 述 公式 计算 而 来 的 ; 
RCE=1.119x10-5xrx(tpm)2 
将 离心 机 转 数 换算 为 离心 力 时 ， 首 先 ， 在 IT 标 尺 上 了 到 已 知 的 半径 和 在 
rpim 标 尺 上 取 已 知 的 离心 机 转 数 ， 然 后 ， 允 这 两 点 间 划 一 条 直线 ,在 图 中 间 
及 CE 标尺 上 的 交叉 点 即 为 相应 的 离心 力 数 值 。 注 意 , 若 已 知 的 转 数 值 处 于 


Ypm 标 尺 的 右边 ， 则 应 读 取 及 CE 标尺 右边 的 数值 。 同 祥 , 转 数值 处 于 fpam 标 
尺 左 边 ， 则 读 取 了 CEF 标 尺 左边 的 数值 。 


e IT 天 


八 、 其 它 有 关 的 生化 数据 SR 
层 析 法 常用 至 据 玫 0 
常用 的 离子 交换 纤维 素 列 于 下 雪 二 


离子 交换 剂 | 游 六 音 := 生 夯 | -二 贡 避 9 二 和 
明 离子 交换 齐 


等 残 性 
AE 氨基 乙 基 | 一 CH2CH2NH2 
强 碱 性 
DEAE 二 乙 基 氨基 乙 基 一 CH2:CH2NCC2H5)> 
TEAE 三 乙 基 氨基 乙 基 一 CHzCH2NCC2H5)s 
GE 股 基 乙 基 
帮 一 CH:CHNHC 一 NH， 
PAB 对 氨基 茶 甲 基 一 CH 人 2 一 NE 
中 等 碱 性 
王 CITEOLA 三 乙醇 胺 经 甘油 和 多 育 甘油 链 偶 联 
于 纤维 素 的 混合 基 团 ( 混 合 胺 类 ) 
DBD 茶 甲 基 化 的 DEAE 纤 维 素 
BND 苯 甲 基 化 蔡 酚 化 的 DEAE 纤 维 素 
PEL 聚 艺 烯 亚 胺 吸附 于 纤维 素 或 较 弱 磅 
酰 化 的 纤维 素 
阳离子 交 换 剂 
弱酸 性 
CM 羧 甲 基 一 CHzCOOH 
中 等 酸性 二 二 
吕 磷酸 一 PO 互 
o 
强酸 性 j 
SEE 磺 酸 乙 基 一 CH:CH。， 区 
1 
SP-Sephadex| 磺 酸 丙 基 人 
O 
ER 二 乙 基 (2- 羟 再 基 ) 季 用 一 C2H4N+(CzH5)2 
-Sephadex CR 
OH 


s。 718。 


型 号 | 排 盟 的 下 限 分 级 分 离 的 范围 “| 膨胀 后 的 床 体积 | 及 胀 所 需 最 少时 间 


《分 子 量 ) 《人 分子量 (毫升 / 克 干 凝 胶 )| 《室温 ， 小时) 
Bio-gel-E-2 | 1,600 2 二 2. 困 0 
Bic-gel-P-4 | 3,600 500 一 上, 000 5.8 2 一 4 
Bio-gel-P-6 4,600 | 1,000 一 5,000 8.8 2 一 4 
了 Bio-gel-P-10 | 10,000 | 5,000 一 17,000 12.4 2 一 4 
Bio-gel-P-30:| 30,000 | 20,000 一 50,000 14.9 10 一 12 
本 ie-gel-P-60 60,000 | 30,000 一 -70,000 19.0 10 一 12 
Bio-gel-P-100| 100,000 | 40,000 一 100,000 19.0 24 
Bio-gel-P=150| 150,000 50,000 一 150,000 24.0 24 
Bio-gel-P-200| 200,000 80,000 一 300,000 34.0 48 
Blo-gcl-P-300| 300,000 | 100,000 一 400,000 40.0 48 


一: -天 < mc 一- Te- 二 全 人 下 -rar 人 Te 
注 : 上 述 各 种 型 号 的 凝 胶 都 是 亲 水 性 的 多 孔 蜂 粒 ， 在 水 和 缓冲 溶液 中 很 容易 膨胀 - 


竺 产 厂 为 Bio-Rad Latoratories,Richmond, California,U.S.A， 


琼脂 糖 受 胶 的 技术 数据 
《琼脂 糖 是 琼脂 内 非 离子 型 的 组 分 ， 它 在 0" 一 4C，pPH4 一 9 范围 内 是 稳定 的 ) 


1 | 
和 名称， 型 导 ”| 爱 胶 内 琉 脂 | 排 阻 的 下 限 | 分 级 分 离 的 范围 || -生产 - 广 商 


器 百 分 含 量 | 〈 分 子 量 ) 〈 分 子 量 ) 
和 
Sepharose 4B 4 0.3x106 一 3x 106 | Phafrmacia,LPD- 

Sepharose 2B 2 2Xx106 一 25 X106| sala,Sweden， 
jSagavac 10- | 三 10 2.5x105 | 三 1XI104 一 2.5x10:|  Ssravac Iaborato- 
Sagavac 8 8 7X105 |2.5X104 一 7x 105 | Ties, Maidenhead ， 
Sagavac 6 6 2x106 上 5Xx104 一 2x106 | 汪 ngland， 
Sagavac 4 4 15x106 | 2X105 一 15x 106 
SagaVvac 2 2 150x1065 | 5x105 一 15Xx107 
Bio-GelA-0.5M 10 0.5x106 |<Lx1l104 一 0.5x106| _Bio-Rad Labora- 


Bio-GelA-1.5M 8 1.5x 106 |<1x 104 一 1.5x106| ;tories, California 
Bio-GelA-5M 6 5X106 | 1x104 一 5X106 | US.A。 
Bio-GelA-15M 4 15x106 | 4x104 一 15xI06 

Bio-GelA-50M 2 50x106 | 1x105 一 50x106 

Bio-GelA-150M 1 150x106 | 1x106 一 150X105 


本 宝林 了 GRANTRreirlR -了 二 mr 古 Ti 二、 、 一 一 一 一 一 一 一 -一 一 一 一 一 < em 一 -一 mm mc- 一 -~ 一。 一 


ws 7T9， 


站 - 曾 | 酸 上 
000“0T 00 生 05 二、 上 亢 [ 评 抽 阁 沁 


0 一 005 一 0095T 
008 一 00T 效 恕 
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0 一 0T 崩 姓 
( 目 007 一 00z 王 ) 
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Z 9 习 220 于 9"7 9 一 了 一 00T 一 000*T 09T 一 09 “和 效 中 
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720。 


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00T- 口 X9pedJdasS 


晓 群 


9/-D X3speBUdsgS 


三 线 电 二 4 


e 72J 。 


国内 产品 型 号 相 ，“ 岂 二 开机 研 人 汪汪 各 二 


Zeo Karb 215 ， Ambasrlite IR 
华东 强酸 阳 42” | 2erolit 215 | Zso Karb 315-: | AmbErliteIRL100 


或 732(1x7) 
华东 弱酸 阳 122# | Zerolit 216 | Zeo 有 arfb 216 


弱酸 101 x 1 一 20 
或 724(101Xx4) 


强大 0 Zerolit FF| De Acidite FF | Amberlite IR-400 


强 碱 202 x 1 一 24 


强酸 1x1 一 24 Zerolit 225 | Zeo Karb 225 | Amberlite IR-120 


Zerolit 226 | Zeo Karb 226， | Amberlite IRC-59 


Ambarlite IR_-410| 


或 704 
弱 碱 . 301 Zerolit H | De Acidite G 


[Amberiite IIR-48 
Amberlite .IR-45 


弱 碱 311(311Xx2)| Zerolit G | De Acidite H | Amterlite TIR-45 


弱 碱 . 320 Zerolit 王 | De Acidite: 王 


弱 碱 330 或 701 


”脱色 树脂 1 号 
或 通用 1 号 
中 国生 产 (1) 

(2)(S)(4) 等 


Decolorite 


生产 三 名 : 

(1) 上 海 树 脂 请 

(2) 南开 大 学 树脂 厂 

《3) 华北 制药 厂 式 


(4) 大 连 化 工厂 
(5) 及 chm and Haas Co. 〈 美 ) 


(6) Dow Chemical Co,. 〈 美 ) 

(7) Permutit Co. ( 英 ) 

《8) Unitod Water Softeners， 〈 英 ) 
(9) Permnutit AG ( 西 德 ) 


as 722。 


一 一 一 一 一 一 一 一- 一 一 一 一 一 
人 Wofatit 下 
。 Dowex 30 | Wofatit P 日 本 神 胶 | 苏联 | 磺 化 酚醛 型 
2 Wofatit 开 S 
本 
Dowex 50 | Wofatit KPS 200 | 神 胶 1 号 | KY-2 本 
”一 一 一 一 LEE 


Wofatit C 


用 了 -4 


Wofatit CP 300 


丙烯 酸 型 弱酸 


区 Dowex 1 


神 胶 800 | AB-17 . 


证 生 浊 生机 汪汪 葵 乙 烯 型 强 碱 
Dowex 2 神 胶 801 | AB-18 
Dowex 3 AH-22 苯 乙 烯 型 弱 碱 
AH-18 
人 
Wofatit N AH-21 | 酚醛 型 
Wofatit 工 150 3A3-10r | 环 氧 型 弱 碱 
多 和 孔 弱 碱 


西 德 生产 
(10) 


苏联 生产 


(10)Wolfetr Fatrben ( 西 德 ) 
(11) 也， Reeve-Angel &. Co. Ltd. ( 英 ) 
(12) Carl-Schloicher 友 . Schuell Co.(〈 美 ) 
(13)Serva-Entwicklungs. lacor, Heidelborg. ( 西 德 ) 
14) 华东 化 工学 院 
(15) 上 海 有 机 所 
《16)Fhatfmacia (瑞典 . Uppsala) ， 
如 s 除 上 海 树 脂 厂 产品 外 ， 国 内 产品 多 以 绕 一 型 号 编号 : 阳离子 交换 树脂 强酸 性 
各 为 1 一 100， 弱酸 性 为 101 一 200， 阴 离子 交换 树脂 强 碱 性 为 201 一 300。 弱 碱 性 为 301 一 
400。x3 则 表明 交 联 度 为 3%。 


.人 


e7C3F。 


各 种 凝 胶 所 允许 的 最 大 操作 压 。 - ; 本 


凝 胶 建议 的 最 大 静水 压 
(与 炎 联 2O) 
SePhadeXx 

G-10 100 

G-15 100 

G-25 100 

G-50 100 
Sephadex G-75 50 
Sephadex G-100 3 所 
Sephadex G-150 15 
Sephadex G-200 10 
Bic-Gel 

已 => 100 

| 100 

P-6 人 

P-10 100 

P-30 100 

P=60 I00 
Bio-Gel 互 -100 60 
Bio-Gel P=150 30 
Bio-Gel 了 -200 20 
Bio-Gel P-300 15 
SepFarose 

2 了 坟 - 

4 也 8 1 
Bio_-Gel 
A-0.5M 100 
A-1l1.5M 100 
A-5M 100 
Bio-Gel A-15M 90 
Bio-Gel A-50M 50 _ 

Bio-Gel A-150M 30 


人 
a。 每 厘米 将 胶 浓 度 。 


。724 。 


sr 人 
| 
中 
半 
这 
F 
汪 
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侈 | 
中 
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本 


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帮 


人 2 中 科 院 植物 所 图 书馆 


INIEINILLE 


S0014579 


和 
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中 1 人 
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5295 215 


封面 设计 ， 郑 大 正 


ISBN 7 一 5357 一 0568 一 5 
Q。15 定价 ，11.50 元