Biochemische Zeitschrift 123.1921

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Biochemische Zeitschrift

Beiträge
zur chemischen Physiologie und Pathologie

Herausgegeben von
F. Hofmeister - Würzburg, C. von Noorden- Frankfurt a. M.,
E. Salkowski-Berlin, A. von Wassermann- Berlin

unter Mitwirkung von

M. Ascoll-Catania, L. Asher-Bern, M. Bergmann-Berlin-Dahlem, G. Bertrand-Paris,
A. Biokel-Berlin, F. Blumenthal- Berlin, A. Bonanni-Rom, F. Bottazzi-Neapel, Q. Bredig-
Karlsruhe i. B., A. Durig-Wien, F. Ebriich-Breslau, H. v. Euler-Stockholm, J. Felgl-
Hamburg, S. Flexner-New York, J. Forssman-Lund, 8. Fränkel-Wien, E. Freund-Wien,
H. Freundlich - Berlin - Dahlem, E. Friedberger- Greifswald, E. Friedmann - Berlin,
Q. v. Fürth-Wien, F. Haber-Berlin-Dahlem, H. J. Hampburger-Groningen, P. Härl-
Budapest, E. Hägglund-Åbo, A. Heffter- Berlin, V. Henri-Paris, V. Henriques-Kopen-
hagen, R. 0. Herzog- Berlin-Dahlem, W. Heubner-Göttingen, R. Höber-Kiel, M. Jacoby-
Berlin, A. Koeh-Göttingen, F. Landolf- Buenos Aires, L. Langstein-Berlin, E. Laqueur-
Amsterdam, P. A. Levene-New York, L. v. Liebermann-Budapest, J. Loeb-New York,
8. Loewe-Dorpat, A. Loewy-Berlin, A. Magnus- Levy-Berlin, J. A. Mandel-New York,
L. Marehlewski-Krakau, P. Mayer-Karlsbad, J. Melsenheimer-Greifswald, L. Michaelis-
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W,Ostwald-Leipzig, W. Palladin-St. Petersburg, J. K. Parnas-Lemberg, W. Pauli-Wien,
R. Pfeifter-Breslau, E. P. Plok-Wien, J. Pohl-Breslau, Ch. Porcher-Lyon P. Rona-
Berlin, H. Sachs- Heidelberg, 8. Salaskin-St. Petersburg, T. Sasakl-Tokio, A. Scheunert-
Berlin, A. Schloßmann-Düsseldorf, S$. P. L. Sörensen-Kopenhagen, K. Spiro-Basel,
E. H. Starling-London, J. Stoklasa-Prag, W. Straub-Freiburg i. B., A. Stutzer- Königs-
berg i. Pr., K. Suto-Kanazawa, H.v.Tappeiner- München, K.Thomas-Leipzig. H. Thonis-
Berlin, P. Trendelenburg-Rostock, O0. Warburg-Berlin, E. Widmark-Lund,
W. Wiechowski-Prag, A. Wohbl-Danzig, J. Wohlgemuth-Berlin.

Redigiert von
C. Neuberg-Berlin

Hundertdreiundzwanzigster Band

Berlin

Verlag von Julius Springer
1921

Druck der Spamerschen Buchdruecekerei in Leipzig

Inhaltsverzeichnis.

Runnström, J. Die Einwirkung einiger Elektrolvte und Anelek-
trolvte auf die un der roten E
des Pferdes . i EEE

Asher, Leon. Beiträge zur Physiologie der Drüsen. NLVIL. Mit-
teilung. Die Beziehungen zwischen Thymus, Milz und Knochen-
mark. Von Gengo Matsuno denen SÉ DN E

Hess, Leo und Rudolf Reitler. Uber die Einwirkung von Metallen
auf Sera ee al ee ee ey rs ee Ba es Ta Ni

Grab, Max v. Brenztraubensäure als Zwischenprodukt der alko-
holischen Zuckerspaltung

Heller, Ludwig. Quantitative Untersuchungen über die Einwirkung
einiger Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes

Takei, Takeo. Uber die Analyse einer Volumkurve von Blut-
körperehen in hypertonischen Lösungen, welche zugleich die
Differenzierung von osmotischen und kolloidehemischen Volum-
änderungen ermöglicht x % j

Dienes, L. Über den Stickstoffansatz bei "Fleisch- und Mehlkost ;

Doerr, R. und W. Berger. Interferometrische Analyse der Immun-
präcipitation . . . En en EE

de Haan, J. und S. van Creveld. Über die Wechselbeziehungen
zwischen Blutplasma und Gewebeflüssirkeiten, insbesondere
Kammerwasser und CGerebrospinalflüssiekeit . .

Starlinger, Wilhelm. Über das Flockungsvermögen des mensch-
lichen Blutplasmas . .. 0 a a

Kumagawa, H. Uber die Dismutation verschiedener Aldehyde
durch Hefe . . Dia, eis Talente sat Al dein de ef

Tomita, M. Über das Verhalten der inaktiven Ian im Orga-
nismus des [Tundes und Kaninchens . . .

Kollmann, Gustav. Über Harnsäuresynthese im mense chlichen (ron:
nismus `,

Dernby, K. G. und B. Allander. Studien über den Einfluß der
Wasserstoffionenkonzentration auf das Wachstum und die Toxin-
bildung der Tetanusbacillen e Sr ar ee A e

Pedotti, Fausto. Untersuchungen über den Einfluß des Calcium-
mangels in der Nahrung auf den respiratorisehen Grundunsatz

Kahho, Hugo. lin Beitrax zur Permeabilität des Pflanzenplasinas
für die Neutralsäalze. IV. Mitteilung .. Ne E g

Creveld, S. van. Über die C hlorverteilung im Blute

Berichtigung E. Freudenberg und P. György

Autorenverzeichnis. ..

Seite

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Dr. Phil. Urin Hermann

Biochemische Zeitschrift

Beiträge
zur chemischen Physiologie und Pathl© MEDICAL CENTER Ur:

Herausgegeben von R
F, Hofmeister - Würzburg, C. von Noorden- Frankfurt a MN £ 1962

E. Salkowski-Berlin, A. von Wassermann-Berlin
San Francisco, 22

unter Mitwirkung von nn;
BI. Ascoll-Catania, L. Asher-Bern, M. Bergmann-Berlin-Dahlem, G. Bertrand-Paris,
A. Biokel-Berlin, F. Blumenthal- Berlin, A. Bonanni-Rom, F. Bottazzi-Neapel, G. Bredig-
Karlsruhe i. B., A. Durig-Wien, F. Ehrlich-Breslau, H. v. Euler-Stockholm, J. Feigl-
Hamburg, 8. Flexner- Noe York, J. Forssman-Lund, $. Fränkel-Wien, E. Freund- Wien,
H. Freundlich - Berlin - Dahlem, E. Friedberger - Greifswald, E. Friedmann e Benin,
d, v. Fürth-Wien, F. Haber-Berlin-Dahblem, H. J. Hawnburger-Groningen, P. Härl-
Budapest, E. Hägglund-Äbo, A. Hefiter-Berlin, V. Henri-Paris, V. Henriques-Kopen-
hagen, R. 0. Herzog-Berlin-Dahlem, W. Heubner-Göttingen, R. Höber-Kiel, M. Jacoby-
Berlin, A. Koch-Göttingen, F. Landolf-Buenos Aires, L. Langstein-Berlin, E. Laqueur-
Amsterdam, P. A. Levene-New York, L. v. Liebermann-Budapest, J. Loeb-New York,
8. Loewe-Dorpat, A. Loewy-Berlin, A, Magnus- Levy-Berliu, J. A. Mandei-New York,
L. Marchlewski-Krakau, P. Mayer-Karlsbad, J. Meisenheimer-Greilswald, L. Michaelis-
Berlin, H. Molisch-Wien, J. Morgenroth-Berlin, E. Münzer-Prug, W. Nernst-Berlin,
W. Ostwald-Leipzig, W. Palladin-St. Petersburg, J. K. Parnas-Lemberg, W. Pauli-Wien,
R. Pfeiffer- Breslau, E. P. Piek-Wien, J. Pohl-Bresiau, Ch. Poreher-Lyon P. Rona»
Berlin, H. Sachs-Heidelberg, 8. Salaskin-St. Petersburg, T. Sasaki-Tokio, A. Scheunert-
Berlin, A. Schloßmann-Düsseldorf, S. P. L. Sörensen-Kopenhagen, K. Spiro-Basel,
E. H. Starling-London, J. Stoklasa-Prag, W. Straub-Freiburg i. B., A. Stutzer- Königs-
berg L Pr., K.Buto-Kanazawa, H.v.Tappeiner- München, K. Thomas-Leipzig, H. Thoms-
Berlin, P. Trendelenburg-Rostock, 0. Warburg-Berlin, E. Widmark-Lund,
W. Wlechowski-Prag, A. Wohl-Danzig, J. Wohlgemuth-Berlin.

Redigiert von
C. Neuberg-Berlin |
Hundertdreiundzwanzigster Band i
; Erstes bis viertes Heft
Ausgegeben am 25. Oktober 1921

Berlin
Verlag von Julius Springer
1921

Biochemische Zeitschrift. Bd. 128, Heft 1/4.

_—.

De Biochemische Zeitschrift

erscheint in zwanglosen Heften, die in kurzer Folge zur Aus-
gabe gelangen; je sechs Hefte bilden einen Band. Der Preis
eines jeden Bandes beträgt M. 64.—. Die Biochemische Zeit-
schrift ist durch jede Buchhandlung sowie durch die unter-
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In der Regel können Originalarbeiten nur Aufnahme finden, wenn sie
nicht mehr als 77 Druckbogen umfassen. Sie werden mit dem Datum des
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werden nur dann zugelassen, wenn sie eine tatsächliche Richtigstelung ent-
halten und höchstens 2 Druckseiten einnehmen.

Manuskriptsendungen sind an den Redakteur,

Herrn Prof. Dr. C. Neuberg, Berlin-Dahlem, Hittorfatr. 18,
zu richten.

Die Verfasser erhalten 60 Sonderabdrücke ihrer Abhandlungen kosten-
frei, weitere gegen Berechnung. Für.den 16seitigen Druckbogen wird ein
Honorar von M. 40.— gezah.

Verlagsbuchhandlung Julius Springer
Berlin W 9, Linkstraße 23/24.

123. Band. Inhaltsverzeichnis. Heft 1/4.
Seite

Runnström, J. Die Einwirkung einiger Elektrolyte und Anelektrolyte
auf die Senkungsgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen des
Pierdes: u... w 5 Wen a we EE EEN l
Asher, Leon. Beiträge zur Physiologie der Drüsen. XLVII. Mit-
teilung. Die Beziehungen zwischen Thymus, Milz und Knochen-
mark, Von Gengo Matsuno . . . 2. 2. 22 2 22 een Sr
Hess, Leo und Rudolf Reiler, Uber die Einwirkung von Metallen
auf Sera. I. Serumfällung durch Metalle. II. Komplement und
Metallwirkung. III. Keimtötung im Serum. (Ein chemothera-

peutischer Versuch)... 1... aa. a u 2. Bean 51
v. Grab, Max. Brenztraubensäure als Zwischenprodukt der alkoho-
lischen Zuckerspaltung . oaaae a a a 69

Heller, Ludwig. (Quantitative Untersuchungen über die Einwirkung
einiger Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes „. . . 90
Takei, Takeo. Über die Analyse einer Volumkurve von Blutkörper-
chen in hypertonischen Lösungen, welche zugleich die Differen-
zierung von osmotischen und kolloidehemischen Volumänderungen
EINOBLICHL a m a ne A E A e E ee 104
Dienes, L. Uber den Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost . 128
Doerr, R. und W. Berger. Interferometrische Analyse der Immun-
präcipitation. `... ER 144
de Haan, J. und S. van Creveld. Über die Wechselbeziehungen
zwischen PBlutplasma und Gewebeflüssigkeiten, insbesondere

und die Frage des gebundenen Zuckers . 2 2 2 2 2 2 2 rn 190
S 215

Kumagawa, H. Über die Dismutation verschiedener Aldehyde durch
Hefe y 995

$ M .
FE free re Bo neo e e e we e e ew e 2. 0.

Die Einwirkung einiger Elektrolyte und Anelektrolyte auf
die Senkungsgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen
des Pferdes.

Von
J. Runnström.

(Zootomisches Institut Stockholm.)
(Eingegangen am 8. Juli 1921.)

Abkürzungen: Aggl. = Agglutination, K. = Kontrolle, R. = rote
Blutkörperchen, Sed. = Sedimentierung, S.G. = Sedimentierungsgesch win-
digkeit, St. = Stunde.

Die wichtigen Untersuchungen von Fährsus!) haben die Aufmerk-
samkeit auf die Tatsache gelenkt, daß die Stabilität der R. bei der Schwanger-
schaft und bei verschiedenen pathologischen Zuständen vermindert wird.
Fàhræus bestimmt die Stabilität der R., indem er nach gewissen Zeiten
die Höhe der Schicht von R.-freiem Plasma oder Serum mißt, die sich bei
der Sed. der R. bildet. Den Arbeiten Fährsus gesellen sich schon eine
Reihe von Veröffentlichungen von Linzenmeyer?), Kürten?®), Abder-
halden*) usw. bei. In einer umfangreichen Arbeit hat Fåhræus 5) neuer-
dings auf vielseitigste Weise das Problem der Suspensionsstabilität des
Blutes beleuchtet. Man findet hier auch eine eingehende Berücksichtigung
der älteren Literatur.

Von der Arbeit Fährzus angeregt, habe ich mir die Aufgabe gestellt,
den Einfluß verschiedener Elektrolyte und den der Narkotica auf die Sed.
der R. zu studieren.

Meinem Freunde, Dr. Fåhræus, sage ich meinen herzlichsten Dank
wegen vielfacher Anregungen bei gemeinsamen Überlegungen. Ich habe
auch den Vorteil gehabt, der Entwicklung der Arbeit Fährx»us sozusagen
Stufe für Stufe folgen zu dürfen. Die Planlegung meiner Untersuchung wurde
vor allem von der Hoffnung geleitet, zur Kenntnis der Eigenschaften der

1) Hygiea 1918; diese Zeitschr. 89. 1918. Vortrag Tagung d. Dtsch.
Physiol. Ges. 1920.

2) Pflügers Arch f. d. ges. Physiol. 181, 169. 1920 u. 186, 272. 1921.

3) Pflügers Arch f. d. ges. Physiol. 185, 248. 1920.

4) Fermentforschung 4, 230. 1921.

5) The Suspension Stability of the Blood. Acta medica 55. 1921.

Biochemische Zeitschrift Band 123. 1

2 J. Runnström : Einwirkung von Elektrolyten und

Oberflächenschicht der Zelle einen Beitrag geben zu können. Die Unter-
suchung über den Einfluß der Narkotica wurde schon im Jahre 1918 im
Seruminstitut des dänischen Staates beinahe zu Ende geführt. Hier wurden
auch im selben Jahre die Beobachtungen über den Einfluß der Elektrolyte
angefangen. Ich benutze die Gelegenheit, dem Direktor des Instituts,
Dr. Th. Madsen, meinen herzlichen Dank zu sagen. Die Untersuchungen
wurden an der physiologisch-chemischen Abteilung des Karolinischen
Instituts Stockholm fortgesetzt. Dem Direktor der Abteilung, Professor
Dr. Sjöquist, sowie Dr. E. Hammarsten danke ich wegen ihrer freund-
lichen Unterstützung meiner Arbeit. Dem Chef der staatsmedizinischen
Anstalt in Stockholm, Dr. C. Kling, bin ich auch zu Dank verpflichtet.

Bei den Untersuchungen wurde fast durchweg defibriniertes Pferdeblut
verwendet. Das Serum wurde abzentrifugiert und die R. 2 mal mit 0,9 proz.
NaCl- oder gewöhnlich mit Ringerlösung (NaCl) 0,9%, RO 0,02% , CaCl,
0,02%, NaHCO, 0,0195) gewaschen. Für besondere Zwecke wurde auch
in isotonischer Rohrzucker- oder Mannitlösung gewaschen.

Im folgenden wird der Ausdruck Flockung sowohl die Geldrollenbildung
als die stärkere mehr unregelmäßige Flockung bezeichnen. Der Ausdruck
„Agglutination“ (Aggl.) wird dagegen nur in der Bedeutung starker Flockung
benutzt. Damit wird aber kein prinzipieller Unterschied zwischen Geld-
rollenbildung und Aggl. gezogen.

I. Einfluß der Ionenreihen auf die Sedimentierung der roten Blut-
körperchen.

Radsma!) hat schon den Einfluß verschiedener Ionen auf
die Aggl. der R. in Glucose untersucht. Die Salzkonz. sowie die
Menge der zugesetzten R. waren sehr klein. Er hat dabei die
folgenden Reihen gefunden:

Cl > NO,, Br > J> SCN und K > Na>Li.

Bei der Versuchsanordnung Radsmas habe ich bei den R.
des Pferdes keine gut reproduzierbaren Ergebnisse erhalten.
Die von Radsma angegebene Reihe ist aber mehrmals hervor-
getreten. Im folgenden gebe ich eine Übersicht meiner Resultate.

In einer Mischung 3 cem l proz. Gelatine in 5,3% Mannit
+ 1,75ccm 5,3% Mannit + 0,25 cem Salzlösung + l cem R.
(mannitgewaschen) tritt Aggl. nach der Reihe (K-Salze) ein:
(1) SCN > J> NO,>Br>C1>S0O,.

Nach 1 Minute ist in einem Versuch die Höhe der Boden-
schicht von agglutinierten Blutkörperchen in Millimetern die
folgende gewesen:

13, 10, 8, 3, 0, 0.
1) Diese Zeitschr. 89. 1918.

Anelektrolyten auf die Senkungseeschw. der roten Blutkörperchen. 3

Es liegt also im Vergleich mit den Versuchen Radsmas
eine Umkehrung der Reihe vor. Bisweilen fällt aber SO, aus der
Reihe heraus. Die Aggl. ist dabei ebenso stark wie in SCN oder
NO,. Bei einer Senkung des Gelatinegehaltes auf ein Drittel
ist eine Umkehrung der Ionenreihe eingetreten. Die Aggl. ist am
stärksten in SO, und Cl, am geringsten in SCN gewesen.

Die starke Aggl. in den angeführten Versuchen ist vor allem
als eine Wirkung der Gelatine zu betrachten. Die aggl. Wirkung
ist schon von verschiedenen Forschern beobachtet worden!).
Unser Versuch lehrt aber, daß die Wirkung der Gelatine in salz-
armen Lösungen viel stärker als in salzreicheren ist. Gelatine
derselben Konz. in 0,9proz. NaCl- oder Ringerlösung hat nicht
so starke Wirkung wie bei den oben angegebenen Salzkonz.
Dasselbe gilt auch von anderen die Sed. der R. befördernden
organischen Kolloiden, auch von dem Serum; 1 ccm Serum
Leem Mannit hat z. B. eine stärkere Wirkung als 3 ccm Serum
+ 2 ccm Ringerlösung. J

Die Sed. der R. wurde in der folgenden Mischung gemessen:
3 ccm lproz. Gelatine in 5,3%, Mannit + 1 ccm 5,3%, Mannit
+ l ccm isot. Salzlösung + 1 cem R.:

(2) K,S0, KO è KBr è KNO, KJ KSCN Cal],
42’ 24 65 84 69 83 59 86
Die Zahlen geben hier nach dem Vorgange von Fährzus

die Höhe der R.-freien Schicht wieder.

Durch Zusatz von 0,4 ccm DL, HCl zu jeder Röhre beschleu-
nigt man die Flockung der R. und man kann nun wiederum die
Reihe

SCN > J > NO, > Br > Cl1> 50,
finden.

Erhöht man den Salzgehalt noch weiter, findet man bei
Zusatz von HCl nicht mehr diese Reihe, die deutlicherweise nur
bei sehr instabilen Suspensionen zur Geltung kommt, vgl. unten.

Die Sed. wurde in gelatinehaltigen isotonischen Salzlösungen
(K-Salzen) untersucht. Es wurde sehr konstant eine Reihe ge-
funden, die von folgendem Versuche veranschaulicht wird:

5ccm isotonischer Salzlösung mit 0,2%, Gelatine + 1 ccm R.

(3) So, CA Br NO, J SCN
20 38 An 68 An U 1

1) Vgl. Landsteiner, Handbuch der Biochemie, Bd. IT, S. 399.
1*

4 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

Auffallend ist die starke Stabilisierung in KSCN. Am stärk-
sten ist die Sed. in Br.

Bei Senkung des Salzgehaltes wird die Reihenfolge etwas
verändert, wie durch einen Vergleich mit Tabelle (2) hervorgeht.
Die relative S.G. nimmt in KNO,, KJ und KSCN zu, in SO,
dagegen ab.

Wir führen noch den folgenden Versuch an:

21/,ccm isotonischer Mannit- + 2?/,ccm isotonischer Salzlösung,
Konz. der Gelatine 0,54% + lccm R.

(4) sc, A Br NO J SON
25° 25 52,5 64 62 60 21,5

Eine ähnliche Wirkung wie durch Senkung des Salzgehaltes erhält
man durch Zusatz von HCl.

5 ccm isotonische Salzlösung mit 0,29% Gelatine + 1 cem R. + 0,4ccm
Dia HCI.

(5) SO, Cl Br NO, J SCN
30° 30 65 69 45 68 10

Etwa dieselbe Anionenreihe wie in den Versuchen mit Gela-
tine-Salzlösungen wurde auch in Versuchen gefunden, bei denen
2 ccm isot. Salzlösung zu 3 ccm Serum + 1 cem R. gesetzt wurden:
(6) Sc, A Br NO, J ` SCH

20 51 69 71 48 4l 9

Am auffallendsten ist wiederum die Wirkung von SCN.
Variationen in der Reihenfolge kommen aber vor. Es ist
nicht ohne Interesse zu konstatieren, daß die beobachteten
Abweichungen in dieselbe Richtung gehen wie bei der Senkung
des Salzgehaltes in den Gelatineversuchen, d. h. die relative S.G.
in SCN, J und NO, nimmt zu. Wir führen folgendes Beispiel an:
(7) SO, OU Br NO, J SCN

21’ 58 Hl Hl "0 89 29

Wahrscheinlich können physiologische und pathologische
Variationen des Serums auf die Salzreihen einwirken (zu den
Versuchen wurde das Blut von verschiedenen Pferden verwendet,
u. a. von solchen, die zur Herstellung von Antidiphtherie- oder
Antitetanusserum benutzt wurden).

Zusatz von HCI zu der Serum-Salzmischung wirkt etwa wie
in den Gelatineversuchen. Unten wird die Sed. nach 30 Minuten
in 3 Serum- + 2 isot. Salzl. (obere Reihe) 4- leem R. und in

derselben Mischung -}- 0.5 cem "Ao HCI (untere Reihe) angegeben:

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 5

(8) sc, QO Br NO, J SON
15 19,5 20 20 17 5,5
10,5 12,5 15 17 19 H

Es ist zu berücksichtigen, daß durch den Zusatz von 0,5 ccm
HCl eine Verdünnung des Serums eintritt, die an und für sich
schon stabilisierend wirkt. Die S.G. ist in SO,, Cl, Br vermindert,
in NO, fast unverändert und in J und SCN beschleunigt.

Bei Zusatz von 0,9 cem Ble HCl zu je 5ccm der Mischungen
ist eine weitere Verschiebung eingetreten:

(9) SO oO Br NO, J SON
2St. 33 3l 36 42 50 39

Einleitung von CO, wirkt auf dieselbe Weise wie der Zusatz
von HCl.

Die Wirkung von HCl wird noch von den beiden folgenden
Versuchen beleuchtet:

3ccm Serum + 2ccm NaCl + 1 cem R.

(10) K 02 03 04 ` Be HO
1 St. 20 70 67 60 59

3 cem Serum + 2KSCN + 1 ccem R.

(11) K 01 02 03 04 "hyHC
1St.9 24 24 25,5 31,5 37
18 St. 69 70 77,5 86,5 90,5

In (10) Verminderung, in (11) Beschleunigung der S.G. als
Folge des HCI-Zusatzes. Ähnliche Resultate wurden in Gelatine-
lösungen erreicht.

In den reinen Salzlösungen (5 ccm isot. Salzl. + 1 cem R.),
wo die Stabilität bekanntlich sehr groß ist, erkennt man etwa
dieselbe Reihenfolge wie in Gelatinesalzlösung:

(12) So A Br NO J SON
12 St. 29,5 35,5 30 30 23 17,5

Folgender Versuch gibt ein Beispiel der Resultate in einer
Mischung 4 cem Mannit + Leem isot. Salzlösung + Leem R.:
(13) SO, o Br NO, J SON

14 St. 33 93,5 89 87 54 30

Die S.G. ist bei dem niedrigeren Salzgehalt größer als bei
dem höheren, besonders wenn man berücksichtigt, daß das spez.
Gewicht der Suspensionsflüssigkeit in dem ersten Falle größer
als in dem letztgenannten ist.

Die Reihenfolge stimmt in (13) besser mit dem Versuch mit
Gelatine in reiner isot. Salzlösung (3) als mit dem, wo die Gelatine

6 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

in der Mischung 4 cem Mannit + 1 ccm isot. Salzlösung (2) gelöst
wurde. Man kann sagen, daß Zusatz von Gelatine zu der Salz-
lösung ungefähr wie eine Senkung des Salzgehaltes wirkt.

In einigen anderen Versuchsreihen wurden die Na-Salze
noch einiger Anionen in ihrer Einwirkung auf die Sed. geprüft:

4ccm l0proz. Rohrzuckerlösung + l ccm isotonischer Salzlösung,
Gelatine etwa in der Konzentration 0,2%, zugefügt + 1l cem R.

(14) Citrat SO, GO, GO, OO CO,
11,5 12 6 70 87 10

Während die Sed. in der Acetat- und Chloridlösung schnell
geht, findet man bei den übrigen Anionen eine beträchtliche
Stabilisierung. Die Reihenfolge zwischen Cl und C,O,H, ist in
einigen Fällen die umgekehrte gewesen. Der Unterschied zwischen
der Wirkung der beiden Ionen ist aber nicht groß.

Bei Versuchen mit 5 ccm isot. Salzl. mit 0,2%, Gelatine +
l cem R. findet man immer eine größere S.G. in Acetat und Chlorid
im Vergleich mit SO, oder Citrat; das Citrat wirkt hier aber viel
weniger stabilisierend als das Sulfat:

(15) Citrat SO, 60H, C
49 3 70 62

Es besteht kein großer Unterschied zwischen den Wirkungen
der Kalium- und Natriumsalze. Dagegen verhalten sich Ca- und
Ba-Salze auf eine abweichende Weise. Im großen und ganzen
darf man wohl sagen, daß in den Lösungen dieser Salze die Sus-
pensionen der R. instabiler als in den Lösungen von K- und Na-
Salzen sind.

In Versuchen mit kleineren Salzgehalten [0,25 ccm -+ 4,75 ccm
Gelatinemannitlösung, vgl. (1) S. 2] ist im allgemeinen die
Aggl. früher in CaCl, und BaCl, als in KCI eingetreten (Ba > Ca).
Aus Versuch (2), S. 3, geht es hervor, daß auch bei Erhöhung des
Salzgehaltes (l ccm isot. Salzl.+4ccm Mannit) Ca >K. In
einem Versuch 2?/,cem isot. Salzlösung + 21/;, ccm Mannit,
0,54% Gelatine + 1l ccm R.:

(16) KOL CaCl,
35 52,5 sl

D

In 5ccm isot. Salzlösung, Gelatine 0,5—1°, ist dagegen die
Suspension der R. etwas stabiler in CaCl, als in KOL In 3 ccm
Serum + 2cem isot. Salzlösung + l] cem R. liest man bci den

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 7

zweiwertigen Kationen eine ganz beträchtlich geringere Sed. als
bei den einwertigen ab.
(17) KCl NaCl CaCl, BaCl,
50 68 58 20 18

In Ca und Ba ist hier die Geldrollenbildung schwächer als
in K und Na; in den erstgenannten sind die R. eher glockenförmig
als bikonkav, die Flockung mehr unregelmäßig.

In 4ccm Mannit + l ccm isot. Salzlösung (ohne Gelatine)
+ lccm R. ist die Bed in Ca > Na, K:
(18) NaCl Call,

18 St. 22 38,5

In isotonischen CaCl,- und BaCl,-Lösungen (5 cem Salzl.
+ l cem R.) tritt keine stärkere Sed. in Vergleich mit den NaCl-
und KCl-Lösungen hervor. Bei mikroskopischer Beobachtung
findet man aber, daß in Ba Aggl. auf dem Objektträger eintritt.
(19) Nach Erwärmung auf 37° z. B. 12 St. tritt starke Aggl. in CaCl,,
dagegen nicht in NaCl-, KCl- oder Ringerlösung ein. Hier ist im
Gegenteil die von Fährz»us!) entdeckte interessante Stabilisierung
der R. eingetreten. In 3ccm Serum + 2 cem NaCl + lccm R.
ist Hämolyse der CaCl,-vorbehandelten R. eingetreten. Ringer-
und NaCl-R. aus 37° zeigen nach 33 Minuten eine Sed. von 15,
. während die K., nichtgewärmte R., schon die Sed. 98 erreicht

haben.

Noch einige Erfahrungen bezüglich der Wirkung der Erwärmung
von R. seien hier mitgeteilt.

Erwärmung in Rohrzuckerlösung wirkt nicht stabilisierend. Solche R.
zeigen im Gegenteil in 3ccm Serum + 2 NaCl geschwemmt eine schnellere
Sed. als die K. auf.

In 4 cem Rohrzucker + 1 cem Ringerlösung tritt dagegen die Stabili-
sierung ein und ist hier stärker als bei höherem Salzgehalt der Suspensions-
flüssigkeit. Die Stabilität der vorbehandelten R. wurde in 3cem Serum
+ 2cem NaCl + l ccm R. beobachtet. Die folgenden Zahlen geben die
Sed. in 3ccm Serum + 2 ccm NaCl nach Vorbehandlung während 12 St.
bzw. mit

(20) l cem Ringerlösung + 4cem Rohrzuckerlösung 10
2.3 ve TE GR e 11
4 y e TR Ze ge 38
5 „ Pe vw y e 55

Die Schwermetallsalze bzw. die Salze der seltenen Erden be-
wirken bekanntlich auch in relativ niedrigen Konz. die Aggl. der R.

1) Hamburger Vortrag 1920. Suspension stability of the blood. Part IV.

8 J. Runuström: Einwirkung von Klektrolyten und

Ich führe hier nur einige Ergebnisse meiner Studien über die Einwirkung
der Schwermetallsalze an. Bei Zusatz von CdCl, und in etwas weniger aus-
gesprochenem Maße von ZnSO, zu 3 ccm Serum + 2ccm NaCl (1 ccm R.)
beobachtet man zuerst eine Zone schwach gesteigerter S.G. (bei CdCl,
0,02—0,2 Millimol); dann folgt ein Konzentrationsbereich (CdCl, 0,4—2,8
Millimol) von ausgesprochen stabilisierender Wirkung (Sed. z. B. in K. 50,
in 1 Millimol CdCl, 7); das stabilisierende Bereich erstreckt sich bei CdCl,
ungefähr von 0,4—3 Millimol. Bei noch höherer Konzentration tritt die
starke Aggl. ein. In ZnSO, ist die Stabilisierung weder so stark (höchstens
l] : 2), noch streckt sich dieselbe über ein so großes Konzentrationsbereich
(etwa 0,6—1,5 Millimol); die starke Aggl. tritt hier etwa bei 2 Millimol ein.
Eine noch weniger ausgesprochene stabilisierende Zone darf man vielleicht
auch FeCl, zuschreiben.

Wenn man die Wirkung der Schwermetallsalze in NaCl- und in Mannit-
lösung vergleicht, findet man eine ungleich viel stärkere aggl. Wirkung in
der letztgenannten Lösung. Arrhenius!) bemerkt schon, daß NaCl die
Aggl. durch Schwermetallsalze hindert. Zu je 5ocm 0,02 Millimol CdCl,
enthaltende 5,3 proz. Mannit- und 5 ccm 0,9 proz. NaCl-Lösung und 5 ccm
Mischungen von diesen 0,05 com R. In Mannit nach 2’ eintretende Flockung.
Mit steigendem NaCl-Gehalt Steigerung der Stabilität (in 3 NaCl + 2 Mannit
z. B. erst nach 20° feine Flockung). Werden die in Mannit gewaschenen R.
während etwa 48 St. in Mannit aufbewahrt, ändert sich das Verhalten
der R. auf eine radikale Weise. Nun tritt bald in dem geschilderten Versuche
eine grobe Flockung bei den höheren NaCl-Konzentrationen ein; in Mannit
und den 0,2—0,5ccm NaCl enthaltenden Mischungen ist dagegen die
Aggl. verzögert (ist z. B. in einem Versuche erst nach 40° eingetreten).
Eine ähnliche Beobachtung wie die soeben geschilderte ist von Kürten
(l. c. oben S. 1) erwähnt worden.

U. Einfluß der Salze auf die Säureagglutination der roten Blut-
körperchen.

Es ist oben erwähnt worden, daß die flockende Wirkung der
Kolloide (Gelatine, Serum) bei Abnahme des Salzgehaltes der
Suspensionsflüssigkeit wächst. Dasselbe gilt, wie erwähnt, auch
für die flockende Wirkung der Schwermetallsalze. Ein ähnliches
Verhältnis findet man bei der Flockung durch Säure, wie schon
Rohonyi?) beiläufig erwähnt hat.

Wir haben vor allem die Einwirkung von NaCl untersucht. Ver-
schiedene Mischungen von isotonischer Rohrzucker- und Natl-Lösung
wurden hergestellt, zu je 5ccm der Mischungen wurden 0,2 ecem %/,0-NaHCO,
und wechselnde Mengen Poo HCI gesetzt; Du wurde elektrometrisch
bestimmt. In jede Röhre wurde dann lcem gewaschener R. gesetzt.
Die Aggl. wurde an ausgenommenen Proben mikroskopisch beobachtet.

1) Meddel. K. Vetensk.-Akad. s. Nobelinst. 1. 1909.
2) Kolloidehem. Beih. 8, 337. 1916.

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 9

Die [H.], bei der die geflockten R. mittels Druck des Deckglases spindel-
förmig ausgezogen werden konnten, wurde als die agglutinierende be-
trachtet.

(1) 0,9% NaCl ....5 3 1 0,5 ccm
10% Rohrzucker. . 0 2 4 4,5 „
De bei der Aggl.. . 2,76 2,925 3,21 3,91 ,,
Dieselbe Gesetzmäßigkeit wurde bei Gelatinezusatz beobachtet
In einem Versuche mit 0,1% Gelatine in NaCl-Mannit-
mischungen wurde die Aggl. bei Zufügung der me HCl-
Mengen beobachtet:

(2) 0,9% NaCl ee, 4 2 l 0,25 ccm
5,3% Mannit ..... 1 3 4 4,75 „
nfo HC ....... 0,5 0,4 0,3 0,2 ,„

Der pp-Wert der Aggl. ist verschieden bei Zusatz von Gela-
tine und ohne diesen Zusatz.

4 com NaCl + Leem Rohrzucker + Gelatine + HCI + 1 cem R.

(3) °% Gelatine. . . . 0,6 0,4 0
Py bei der Aggl. . 3,93 3,345 2,86

Gelatinezusatz bringt die R. der Aggl. näher. Es ist deshalb
wahrscheinlich, daß die Geldrollenbildung, die schon in den Gela-
tinelösungen stattfindet, nur dem Grade nach von der Aggl.
durch Säure verschieden ist. Vielleicht muß man doch bei dem
letztangeführten Versuche berücksichtigen, daß die Gelatine-
lösung durch den Säurezusatz verändert wird, Veränderungen,
die eine Verstärkung der Flockung möglicherweise herbeiführen
könnten.

Bei der hier angewendeten R.-Konzentration ist bei An-
wesenheit der Salze der einwertigen Kationen keine nach 2 Seiten
begrenzte Flockungszone bei Zusatz von HCl vorhanden. Bei
Erhöhung der [H.] über die eben agglutinierende tritt nur eine
Verstärkung der Aggl. und Hämolyse ein. In BaCl, und CaCl,
zeigen die R. dagegen eine allerdings nicht sehr scharf abgegrenzte
Zone maximaler Flockung. Sowohl bei Senkung als Erhöhung
der [H] tritt Stabilisierung ein.

III. Sedimentierungsgeschwindigkeit und Resistenz der Blutkörper.

Es hat sich herausgestellt, daß eine auffallende berein-
stimmung zwischen der S.G. und der Hämolyse der R. durch
starke Hypotonie besteht. Je schneller die Sed., desto geringer
ist die Resistenz. Die R. (0,2—0,6 cem) wurden in 5cem Salz-

10 J. Ruunström: Einwirkung von Elektrolyten und

lösung von A = 0,28° geschwemmt. In den Salzlösungen wurde
etwas Gelatine (1%) gelöst, die als Puffer dient.

Hämolyse:
(1) KBr > KCI > KNO, > KJ `> KSCN > KSO,
vollst. nach vollst. nach 20 St. etwa 20 St.
2—3 5-7 70% <50%

Die anfangende Hämolyse ist in NO, und J zum erstenmal
nach 55 Minuten, in SCN und SO, nach 2 St. notiert worden.

Die höhere Resistenz in SO, als in Cl ist schon seit den Unter-
suchungen Willerdings!) ein bekanntes Verhältnis.

Ganz dieselbe Reihenfolge wie die oben angegebene findet
man in den Salzlösungen ohne Gelatine; die Hämolyse geht hier
etwas langsamer als bei Gelatinezusatz.

Die colorimetrische Verfolgung der Hämolyse wurde bisweilen
durch Zählung der Blutkörperchen nach einer gewissen Zeit
in einer Zählkammer kontrolliert. Es wurde z. B. in einem Ver-
such mit Salzlösungen ohne Gelatine gefunden, daß die KSCN-
Lösung nach 25 Minuten rund 3mal so viele Blutkörperchen
wie die KBr-Lösung nach 8 Min. enthielt.

Bei schwächerer Hypotonie als die in den angeführten Ver-
suchen herrschende ist die Reihenfolge bei der Hämolyse eine
andere. In Salzlösungen von A = 0,45
(2) SCn > J > NO,, Br > SO, > Cl (2—3 Tage im Eisschrank).
Diese Reihe stimmt gut mit derjenigen, die Höber?) bei derselben
Versuchsanordnung bei Rinderblutkörperchen erhalten hat.

Von Na-Salzen wurde die Wirkung hypotonischer (4 = 0,28),
Acetat- und SO,-Lösung mit 1%,Gelatine) geprüft. Die Reihe ist hier:
(3) Acetat> CIZSO,.

Die Kationen ordnen sich bei der Hämolyse durch starke
Hypotonie in der Reihe: Ba > Ca > Mg> K.

Ähnliche Salzreihen wurden bei Hämolyse durch NH,Cl
beohachtet.

2ccm 0,9proz. NH,Cl mit 19% Gelatine + 3 cem isotonischer Salz-
lösung + 0,5 cem R., Hämolyse:

(4) KBr > KO > N0,>J > SCN > SO,
vollst. nach 8025 nach sichtbar nach 20 St.
25 42’ 85’ schwach

1) Tnaug.-Diss. Gießen 1897.
2) Diese Zeitschr. 14, 209. 1908.

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 11

(5) BaCi, > CaCl, > KCl > NaCl
vollst. nach vollst. nach 85%, nach 75% nach
17’ 327 65’ 65’

Die angeführten Versuche (4) und (5) mit An- und Kationen
sind mit Blut von 2 verschiedenen Aderlässen gemacht.

Versuch mit Na-Salzen 4ccm isotonische Salzlösung mit Gelatine
+ 2 com NH,CI + 0,2ccm R.

(6) Acetat > Cl > SO,, Citrat
vollst. nach 5’ 1 St. 70% 20 St. keine Hämolyse.

Auch in Oxalatlösung geht die Hämolyse bei derselben
Versuchsanordnung sehr langsam.

Zu den mitgeteilten Versuchen ist zu bemerken, daß die R.
in SO, resistenter sind, als bei vollkommenem Parallelismus von
Hämolyse und S.G. zu erwarten wäre; Acetat gibt im Verhältnis
zu Cl eine geringere Resistenz als zu erwarten.

Die Erwärmung der Blutkörperchen bei 37° stabilisiert, wie
schon erwähnt, nach Fåhræus höchst bedeutend, vgl. I (19),
S. 7. Ebenso ist die Hämolyse durch Hypotonie und durch Zu-
satz von NH,CI stark verzögert.

(7) Blutkörperchen wurden in Ringer- und NaCl-Lösung
bei 37° 12 St. (ohne Schütteln) gehalten. Die Hämolyse der. ab-
zentrifugierten und in 0,45proz. NaCl geschwemmten Blut-
körperchen wurde mit der Hämolyse in 0,45proz. NaCl der im
Eisschrank aufbewahrten Blutkörperchen von demselben Ader-
lasse verglichen. Bei den letztgenannten nach 5 Min. 30 Sek.
vollständige Hämolyse; nach 70 Min. war die Hämolyse bei den
wärmebehandelten Blutkörperchen noch nicht vollständig.

(8) In einem ähnlichen Versuche wurden die Blutkörperchen
in 0,95proz. KBr (4 = 0,28) geschwemmt. Nach 30 Min. K.,
nach 45 Min. die wärmebehandelten Blutkörperchen gezählt
(je 30 Felder der Zählkammer). Mittel im ersten Falle 3, im
zweiten 51.

Nach Brinkman und van Damm!) sind die Blutkörperchen
in einer equilibrierten Salzlösung resistenter gegen Hypotonie als
in Serum. Ich habe dieselbe Erfahrung wie die zitierten Verfasser
mehrfach gemacht.

(9) Im Gegensatz zu diesen bin ich der Ansicht, daß auch Gelatine die
Resistenz erniedrigt; 0,2 cem R. in 5cem 0,6 proz. NaCl- und in 0,6 proz.

1) Diese Zeitschr. 108, 35. 1920.

12 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

NaCl-Lösung mit 0,5% Gelatine. Nach 4 St. 30’ 0,5 ccm der geschüttelten
Suspensionen in 5 cem isotonischer K,SO,. Je 100 Felder einer Zählkammer

ergab das Verhältnis SE zwischen der Zahl der R. in den beiden Fällen. In

einem Versuch wurde 0,2ccm NaHCO, sowohl zu der Salz- wie zu der
Gelatine-Salzlösung gesetzt. Das Verhältnis war hier sehr nahe S . Nun

ist es zuzugeben, daß die angewendete Gelatine trotz mehrwöchentlicher
Waschung noch Spuren von Ca enthielt. Bei der NaCl-Konzentration
0,6% beschleunigt aber Zusatz von 0,008 — 0,0250, CaCl, die Hämolyse nicht.

Bei niederer NaCl-Konzentration (z. B. 0,45°,) wirken dagegen diese
CaCl,-Konzentrationen schon beschleunigend.

IV. Besprechung der Ergebnisse über Elektrolyteneinwirkung.

Die Wirkungen der Elektrolyte auf die Stabilität der R. sind viel-
leicht am besten auf Grund der elektrischen Theorie der Aggl. verständlich.
Die Ladung der R. ist demnach in elektrolytarmen Lösungen schwach,
dieselbe nimmt aber mit dem Gehalt der Lösung an Alkalisalzen zu. Auf
diese Weise können die Beobachtungen Rohonyis!), Radsmas?) und
unsere oben mitgeteilten Versuche über die Wirkung der [H] auf die Aggl.
der R. in verschiedenen NaCl-Konzentrationen gedeutet werden.

Zur Erklärung der Wirkungen der Alkalisalze auf die Stabilität der
R. liegen 2 Möglichkeiten vor. Die R. sind permeabel für die Anionen,
nicht aber für die Kationen der untersuchten Elektrolyte. Es entsteht hier-
durch eine elektrische Doppelschicht in der Zellenoberfläche. Die Anionen-
permeabilität ist ja durch zahlreiche Untersuchungen (vgl. Höber, Physi-
kalische Chemie der Zelle usw., 4. Aufl. S. 603—605) wahrscheinlich
gemacht. Besonders nach CO,-Einleitung soll die Anionenpermeabilität
erhöht sein. Bei der zweiten Erklärung (Rohonyi, l. c.) nimmt man eine
Adsorption der Elektrolyte, speziell der Anionen, an die Oberfläche der R.
an. Es scheint, daß die letztgenannte Annahme unsere Ergebnisse am
besten unter einen Gesichtspunkt bringen. Die folgenden Überlegungen
beanspruchen nur einen Beitrag zur Diskussion des Problems zu bringen;
eine vollständige Theorie dürfte es noch unmöglich zu geben sein.

Die höhere Resistenz gegen H Aen), bei Erhöhung des NaCl-Gehaltes
[Abt. II, Versuch (1)] hängt nach der Auffassung, der wir folgen, mit einer
Erhöhung der negativen Ladung der R. durch Anionenadsorption zusammen.

Höber (zit. nach S. 601 Höber, Physikalische Chemie der Zelle usw.,
4. Aufl.) hat gefunden, daß die R. in schwachen NaCl-Lösungen bei Einlei-
tung von CO, umgeladen werden. Bei Erhöhung des Salzgehaltes (0,8%,
NaCl) tritt die Umladung nicht ein. Diese Tatsache stimmt prinzipiell
mit unseren Ergebnissen über die Wirkung der [H] auf die Aggl. überein.
Bei den höheren Salzkonzentrationen ist wahrscheinlich eine höhere [H]
als bei den niederen zur Umladung der R. notwendig. Höber hat die Änionen-

1) Kolloidehem. Beih. 8, 337. 1916.
2) Diese Zeitschr. 89. 1918.

Anelektrolvten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 13

permeabilität als Erklärung des Verhaltens der R. herangezogen. Die
Erscheinung wird aber einfacher erklärt, wenn man die negative Ladung
der R. als Folge einer Anionenadsorption betrachtet. Bei Erhöhung der
NaCl-Konzentration wird die Ladung der R. erhöht.

Eine sehr auffallende Ähnlichkeit mit dem Verhalten der R. zeigt
nach den Untersuchungen von Michaelis und Rona?) die Wirkung fremder
Elektrolyte auf die Flockung von hitzedenaturiertem Serumalbumin durch
H. Die [H] der Flockung kann durch Salzzusätze verschoben werden.
Alle Anionen, die überhaupt verschieben, erhöhen die H'-Ionenkonzentration
bei der die optimale Flockung eintritt, vgl. die Einwirkung von NaCl auf
die Säureaggl. der R.

Verschiedene Anionen haben nach Michaelis und Rona eine ver-
schiedene Wirkung auf die Lage des Flockungsoptimums des hitzedena-
turierten Serumalbumins; man findet die Reihe: Cl < Br, ClO} <J,
NO, <CNS. Ich habe bei R. Versuche auch mit KSCN ausgeführt. Wenn
ich von den salzärmeren Mischungen absehe, ist die Aggl. bei derselben
HCI-Zusatz wie in NaCl-Versuchen schwächer geworden.

Die soeben angegebene Anionenreihe aus den Versuchen von Rona
und Michaelis stimmt sehr gut mit den Reihen, die dieselben Verfasser
(ib.) bei Versuchen über die Adsorption von Elektrolyten durch Kohle
gefunden haben. Sie geben hier für die Anionen die folgende Reihe an:

SO, < HPO, < CI < Br < NO, <J <CNS < OH.

Wenn die Anionenpermeabilität für die Stabilität der R. verantwort-
lich wäre, sollte man einen Parallelismus zwischen der Permeabilität und
der stabilisierenden Wirkung der Ionen finden.

Ege?) hat neuerdings die Permeabilität verschiedener NH,-Salze
untersucht. Bezüglich der Eindringungsgeschwindigkeit verschiedener
Anionen kommt er (S. 165) zu dem folgenden durch relative Zahlen aus-
gedrückten Resultate: SO, 1, (COO); 2,5, CrO, 10,8, NO, 10,5, Br’ 13,5,
HCO, 20, CT 30. CH,COO` > CI, Tartrat- und Citrationen dringen überhaupt
nicht ein. Leider fehlen hier mehrere für einen Vergleich mit unseren Resul-
taten wichtige Ionen. Man findet jedoch, daß die Permeabilität und die
stabilisierende Wirkung gar nicht parallel gehen, eher herrscht zwischen
beiden ein umgekehrtes Verhältnis. Die Anionen stabilisieren in den salz-
reicheren Lösungen etwa nach der Reihe: SCN > J > NO,> O> Br,
Acetat [I (3), (15)]. Für die Permeabilität findet man nach den angeführten
Ergebnissen Eges die Reihe: Acetat > Cl > Br > NO,. BO, (COO,
Citrat (und nach einigen Versuchen) auch Tartrat, die nicht oder sehr lang-
sam eindringen, wirken auch stabilisierend [I (14)] [bei höherem Salzgehalt
tritt in Citrat eine relativ stärkere S.G. ein I (15)]; CrO, dringt nach Ege
10 mal schneller als SO, ein, hat aber etwa dieselbe stabilisierende Wirkung.
Es wäre von Interesse, die Permeabilität der SCN- und J-Ionen zu kennen,
von denen vor allem der erstgenannte eine so ausgeprägte Wirkung auf

1) Diese Zeitschr. 94, 225. 1918.

2) Studier over Glukosens Fordeling ect. Disp. Köbenhavn 1919.

14 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

die S.G. hat. Jedenfalls haben sie nach unseren Versuchen eine stark
hemmende Wirkung auf die Permeabilität für Wasser, vgl. IIL

Wenn die Anionenpermeabilität für die Stabilisierung der R. verant-
wortlich ist, sollen Säuren eine stabilisierende Wirkung ausüben. Dies
scheint nun in der Tat nach einigen Angaben von Linzenmeiert) (CO,- Ein-
leitung) und Fährsus (Stability S. 151, Zusatz von HSC) zu sein. Ein-
leitung von CO, in defibriniertes Ziegenblut wirkt nach eigener Erfahrung
zu einem gewissen Grade stabilisierend. Nach 24 St. K. 7, CO,-Blut 5,8 mm.
In diesen Versuchen sind die Verhältnisse sehr kompliziert.

Die Wirkung des Zusatzes von HCl zu Gelatinelösung oder Serum
ist durch die Versuche I (5), (8). (9), (10), (11) beleuchtet worden. Es geht
aus diesen hervor, daß die R. bei der Gegenwart verschiedener Anionen
ein verschiedenes Verhalten zeigen; in SO,, Cl, Br tritt Stabilisierung, in
J, SCN Beschleunigung der S.G. ein; in NO, ist die Veränderung gering.
Die Verhältnisse können nicht durch die Anionenpermeabilität einheitlich
erklärt werden.

Man findet eine nicht zu verkennende Übereinstimmung zwischen
stabilisierender Wirkung und Adsorption der Anionen durch Koble, wie
diese durch die zitierte Untersuchung von Rona und Michaelis (l. c. oben
S. 13) bekannt ist. Einige Divergenzen zwischen Adsorptions- und Stabili-
sierungsreihen sind doch vorhanden. In der letzteren hat SO, und überhaupt
die zweiwertigen (und dreiwertigen: Citrat), soweit sie untersucht sind,
eine andere Stellung als in der erstgenannten Reihe. Auf Grund der elek-
trischen Theorie der Flockung ist dies ja nicht schwer verständlich. Diese
höherwertigen Anionen vermögen es der R.-Oberfläche eine relativ höhere
Ladung zu geben, auch wenn sie weniger stark als die einwertigen adsorbiert
werden. Die hohe Resistenz gegen Hypotonie und NH,ClI-Wirkung in SO,.
Oxalat usw. deuten daraufhin, daß diese Ionen eine verdichtende Wirkung
auf die R.-Oberfläche ausüben. Es ist wohl möglich, daß eine solche Ver-
änderung sekundär auf das Potential der Oberfläche erhöhend wirken kann.
Die unten mitgeteilten Versuche über die Wirkung der Narkotica geben
ebenfalls zu dieser Vorstellung Veranlassung. Der Unterschied zwischen
der S.G. in 4cem Mannit + 1 ccm KCI und in 4 cem Mannit + 1 ccm KSCN
ist sehr groß I(13). Werden die Suspensionen wiederholt aufgeschüttelt,
gleicht sich der Unterschied in den beiden Salzen aus. Wahrscheinlich werden
die R. auf eine solche Weise verändert, daß die Adsorption von SCN in der
Oberflächenschicht allmählich schwächer wird.

S. Schou (unveröffentlicht) hat durch direkte Analysen gefunden,
daB aus den Mischungen 4 cem Mannit + l cem KCI bzw. 4ccm Mannit
+ 1 cem KSCN etwas mehr SCN als CI von den zugesetzten R. aufgenommen
wird.

Rohonyi (l. e oben S. 12) hat die Einwirkung verschiedener Anionen
auf die Permeabilität der R. für NaNO, untersucht und findet dabei die
Reihe:

SO, OI. J < NO, < Oxalat < SCN.

1) Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 186, 272. 1921, vgl. S. 280.

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 15

Rohonyi deutet die Wirkung der Änionen als Folge einer Verdrän-
gung der NO,-Ionen von der Zelloberfläche.

Die verschiedenen Anionen haben auch eine verschiedene Wirkung auf
die R.-Form; 0,5 ccm R. in 5ccm Salzlösung; Untersuchung der Form auf
in der Flamme entladenen Objektgläsern, vgl. Brinkman und e Damm!),
nach denen die Reibungselektrizität des Glases die Ursache der Entstehung
der Kugel- oder Stechapfelform in einer NaCl- oder equilibrierten Salzlösung
ist. In KSCN findet man aber die Kugelform (oder Stechapfelform). Dies
gilt sowohl für Pferde- wie Menschen-R. In KJ (Versuche an Pferde-R.)
herrscht die Stechapfelform vor (wenige plump bikonkave R.), in KNO,
ist die Zahl der plump bikonkaven R. größer; in KBr die größte Anzahl
der R. schön bikonkav < KCI, nur wenige R. sternförmig < K,SO,,
bikonkave oder glockenförmige R. Bezüglich der R.-Form wirken die
Anionen deutlicherweise nach der Reihe SCN > J > NO, > Br > 01> S50,-

Nicht nur eine Reibung (Glas +), sondern auch eine Aufladung des
Glases von einem Elektrophor bewirkt die Veränderung der R. in NaCl,
KCL oder Ringerlösung. Es ist also wirklich die Frage von einer Wirkung
der elektrischen Ladung. Positive und negative Ladung haben aber dieselbe
Wirkung. Es ist sicher nicht die Frage von einer direkten Aufladung der
R. durch die Elektrizität des Glases. Wahrscheinlich handelt es sich um
eine kolloidchemische Veränderung der R.-Oberfläche, die, wie soeben
gezeigt, unter der Einwirkung gewisser Ionen direkt eintritt. Auch in der
Ringerlösung findet man manchmal zahlreiche stechapfelförmige Pferde-R.
auf ungeladenem Glase. Verminderung der R.-Konzentration scheint die
Veränderung zu begünstigen. Interessant ist, daB eine Erhöhung der
Ladung (sowohl + als —) des Glases (Ladung von einer Elektrizitäts-
maschine) eine Tendenz zur Aggl. der gewaschenen Pferde-R. bewirken
kann. Diese Aggl., die wohl ebenfalls als der Ausdruck einer kolloidchemi-
schen Veränderung der R.-Oberfläche aufzufassen ist, tritt nicht in Na,SO,
oder K,SO, (auch nicht in Oxalat, Tartrat, Citrat) ein. Man stelle diese
Beobachtung mit unserer Schlußfolgerung (S. 14) zusammen, daß SO, die
Oberfläche der R. verdichtet. KSCN scheint dagegen nicht gegen diese
Aggl. zu schützen.

Die aggl. Wirkung der Schwermetallsalze, der H, Bea" usw. wäre gemäß
der hier vertretenen Auffassung als die Folge einer Adsorption der positiven
Ionen an die R.-Oberfläche aufzufassen. Rona und Michaelis (l. c. S. 13)
geben folgende Reihe für die Adsorption der Kationen an:

K, Na, NH, <Ca, Mg < Zn <Cu <Al<H.
Bezüglich der Aggl. durch Schwermetalle habe ich die Reihe: Al, Cu > Zn
> Cd beobachtet. |

Zwischen den flockenden Kolloiden und den Salzen besteht eine
Konkurrenz um die Oberfläche der R. Je mehr man den Salzgehalt senkt,
desto stärker tritt die Kolloidwirkung hervor [I (1)].

Ich teile noch folgendes mit. In einer 0.4 proz. Gelatinelösung
in 0,9%, NaCl tritt nur eine spärliche Geldrollenbildung ein. Bei derselben

1) Diese Zeitschr. 108, 52. 1920.

16 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

Gelatinekonzentration in 2 cem NaCl + 3ccm Mannit ist eine sehr schöne
Geldrollenbildung eingetreten. In ł cem NaCl + 4ccm Mannit mit 0,4%,
Gelatine ist die Geldrollenbildung sehr stark mit einer Tendenz zur Klumpen-
bildung überzugehen, die man bei starker Aggl. findet.

Erhöhung der Kolloidkonzentration (z. B. Gelatine) wirkt wie eine
Senkung des Salzgehaltes. Es ist aus den angeführten Tatsachen wahr-
scheinlich, daß die Kolloide stärker als die Salze an der’R.-Oberfläche
adsorbiert werden und dabei die Salze von dieser verdrängen; eine Ver-
minderung der Ladung und damit der Stabilität wird die Folge. Auf eine
verminderte Ladung deuten die zahlreichen Kataphoreseversuche von
Linzenmeier (l. c. oben 8. 1). Ebenso unsere Ergebnisse über den Ein-
fluB von Gelatine auf die Säureagel.

Coulton!) findet, daß die negative Ladung, die von sensibilisierten
R. getragen wird, kleiner ist als die der nichtsensibilisierten.

Bei der von uns vertretenen Auffassung braucht man nicht eine
Entladung nur durch die Wirkung positiv geladener Kolloide anzunehmen
(vgl. Linzenmeyer). Nach Fährzus (Stability S. 148) hat z. B. Na-
Caseinat eine stark beschleunigende Wirkung auf die S.G. der R.

Fährzus?) hat nachgewiesen, daß die verschiedenen Eiweißfraktionen
des Plasmas eine sehr verschiedene Wirkung auf die S.G. der R. ausüben:
Fibrinogen > Globulin > Albumin.

Es scheint durch die Versuche und Überlegungen von Fährxus
wahrscheinlich, daß die Eiweißfraktionen als solche und nicht als Träger
von „Agglutininen“ wirken. Es besteht doch eine allzu auffallende Analogie
zwischen der Wirkung der viscöseren Eiweißfraktionen des Plasmas und
der von Kolloiden wie Gelatine, Na-Caseinat, Na-Nucleinsäure; von der
letzteren habe ich wie Fährzus eine stark flockende Wirkung beobachtet.
Unerklärt bleibt immerhin noch die von Fåhræus untersuchte Stabilisie-
rung in dem Gebiet der Körpertemperatur. — Es ist nicht ausgeschlossen,
daB auch andere stark adsorbierbare Kolloide als die Eiweißstoffe eine
Beschleunigung der S.G. bewirken. Bezüglich der Bedeutung des von
Kürten?) untersuchten Cholesterins sei bemerkt, daß dieser Stoff in einer
großen Zahl der pathologischen Zustände mit beschleunigter S.G., nicht
vermehrt ist?).

Wenn unsere Auffassung über die Wirkungsweise der Kolloide richtig
ist, soll eine stärkere Adsorbierbarkeit der stärker hydralisierten Eiweiß-
stoffe vorliegen. Ich kann nur auf eine Angabe von J. Christiansen?)
hinweisen, nach der das ionische (hydratisierte) Eiweiß eine verstärkte
Adsorbierbarkeit an Filtrierpapier zeigt.

21) Journ. of gen. physiol. 3. 309. 1921.
2) Hamburger Tagung d. Dtsch. physiol. Ges. 1920, Stability S. 114 u. f.
3) Pflügers Arch. f. d. ges. Phvsiol. 185, 248. 1920.
t) B. Majola, Fol. med. 6. 1920. Zit. nach Ber. üb. d. ges. Physiol.
6, 526. 1921.

5) Diese Zeitschr. 47, 226. 1912.

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 17

Mehrere der unter I. genannten Versuche haben die Aufgabe gehabt,
den Gedanken Fährsus’ von der Bedeutung der Hydratation der Eiweiß-
stoffe für ihre Wirkung auf die S.G. zu prüfen. Man kann aber nie zwischen
der Wirkung auf die Kolloide außerhalb der R. und der Wirkung auf die
R. selbst sicher unterscheiden (vgl. V.). Bei Zusatz von kleinen Salzmengen
[I (1)] zu einer Gelatine-Mannitlösung erhält man zwar die Reihe SCN > J
> NO, > Br > Cl > S0O,, die mit der Einwirkung auf die Hydratation
stimmt. Bei dem Vergleich zwischen Ca und Ba und K stimmt die S.G.
nicht länger mit der Wirkung auf die Hydratation der Gelatinelösung.
Wahrscheinlich hat man hier schon eine direkte Wirkung der entladenden
zweiwertigen Kationen, die sich zur Wirkung der Gelatine addiert.

Zusatz von CaCl, und BaCl, zu dem Serum stabilisiert mehr als der
Zusatz von NaCl oder RO [I (17)]. Hier liegt wahrscheinlich vor allem eine
Wirkung auf das Serum vor.

In ziemlich umfassenden Versuchsreihen habe ich die Wirkung von
dem Zusatz kleiner Mengen Ziegenserum zu Pferdeserum auf die S.G. der
R. des Pferdes geprüft.

3ccm Pferdeserum + Ziegenserum + 2ccm NaCl + 1,5 cem R.

0 0,01 0,025 0,05 0,1 0,15 ccm Ziegenserum
43’ 50 62 61 78 98 D `

Die S.G. nimmt durch den Zusatz des Ziegenserums bedeutend zu.

Steigert man den Gehalt an diesem noch mehr, nimmt die S.G. weiter zu.
0 0,25 0,6 0,9 ccm Ziegenserum
32° 31 76 78 78

Ein ganz anderes Resultat erhält man bei Aufbewahrung der Mi-
schungen in 36— 37°, im folgenden Versuch während 19 St. Man findet nun
eine ausgeprägt stabilisierende Wirkung des Zusatzes von Ziegenserum.

K. 0° K. 37° 0,3 0,6. 0,9ccm Ziegenserum

8 St. > 110 21,5 11,5 105 5,5
Die S.G. wurde bei 18° beobachtet.

Auch wenn man kleine Mengen Ziegenblut dem Pferdeblut zusetzt,
findet man nach der Wärmebehandlung eine stabilisierende Wirkung des
abzentrifugierten Pferdeserums + Ziegenserum, wenn frische R. darin
geschwemmt werden. Eine ganz ähnliche Wirkung wie das Ziegenserum
hat der Zusatz von Diphtherietoxin.

Wir haben uns oben auf den Boden der elektrischen Theorie der
Flockung der R. gestellt. Tatsächlich hat diese ja eine experimentelle
Stütze in den Arbeiten von Höber!),,ManginundHenri?),Landsteiner?),
Kozawat®), Fährzus°), Linzenmeier®). Es liegt aber in der Kompliziert-

1) Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 101, 627. 1904; vgl. Physik.
Chemie d. Zelle usw. S. 600. |

2) Cpt. rend. des séances de la soc. de biol. 56, 866. 1904.

3) Diese Zeitschr. 50, 176. 1913.

4) ib. 60, 146. 1914.

5) ib. 98, 355. 1918.

6) Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 181, 169. 1920; 186, 272. 1921.

Biochemische Zeitschrift Band 123. R

18 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

heit der Erscheinung, daß mehrere Gesichtspunkte für das Problem in Betracht
gezogen werden können. Die Ladung muB doch von außerordentlich wichtiger
Bedeutung sein, da diese teils direkt, teils indirekt, durch Wirkung auf
Oberflächenspannung und Bildung der Hydrathülle (vgl. Fährzus,
Stability S. 153), das Phänomen beeinflußt. Die Bedeutung der Hydrat-
hülle ist von Herzfeld und Klinger!) und von Fåhræus betont
worden. Der Beweis für die Existenz der Hydrathülle ist der Einfluß der
R. auf die Viscosität des Blutes (Fährzsus, Stability S. 153). Es ist nun
zuzugeben, daß die Hydrathülle auch durch andere Faktoren als die Ladung
beeinflußt werden kann. Es ist z. B. denkbar, daß eine Änderung der
chemischen Zusammensetzung der Oberfläche der R. einen Einfluß aus-
üben könnte.

Brinkman und v. Damm (l. c. oben S. 11) geben an, daß durch
eine physiologisch equilibrierte Salzlösung (NaCl 0,7, NaHCO, 0,18%,
KO 0,02%, CaCl, 6 aq. 0,02°,) Lecithin aus den R. ausgewaschen wird.
Die Versuchsergebnisse der Verfasser, wie sie vorgelegt sind, berechtigen
aber zu dieser Schlußfolgerung nicht. Die von den Verfassern versprochenen
quantitativen Ergebnisse müssen abgewartet werden. Ich bezweifle aber
nicht, daß durch ein wiederholtes gründliches Auswaschen die R. allmählich
verändert werden, wie aus den Ergebnissen Atkins?) zu schließen ist.
Atkins hat eine Aggl. der gut gewaschenen R. verschiedener Tiere in
0,9%, NaCl (1% Suspension 37°, 3 St.) beobachtet. An den R. des Pferdes
habe ich diese Angaben nachgeprüft und bestätigt. Die R. sind in diesem Fall
bikonkav oder glockenförmig. Es ist eine Veränderung der R. eingetreten,
die wahrscheinlich ähnlicher Natur ist wie diejenige, die bei Aufbewahrung
in Mannit eintritt (vgl. oben S. 8).

In einer Hinsicht haben die Kolloide eine, wie es scheint, ihnen eigene
Wirkung. Nur bei der Gegenwart von Kolloiden, wie Plasma, Serum,
Gelatine, tritt eine Geldrollenbildung ein. In einer kolloidfreien Lösung
tritt die Flockung unter der Form von Klumpen auf. Dieser Unterschied
kann ja nicht durch die Ladungshypothese erklärt werden.

Linzenmeier kommt in seiner letzten Abhandlung (l.c. oben S. 1)
„zu einer anderen und zwar geringeren Bewertung der elektrischen Ladung
der R. für ihr Sedimentierungsvermögen als früher“. Aus seinen Versuchen
geht wohl doch hervor, daß Gelatine die Ladung der R. herabsetzt. Albumin
setzt zwar die Ladung der R. herab, aber wahrscheinlich in geringerem
rade als Gelatine (vergleichende Versuche über die Entladung durch H
müssen hier gemacht werden. In Linzenmeiers Versuchen mit La’
kennt man bei Anwesenheit von Kolloiden nicht die Konzentration der
freien La `). Am wichtigsten ist der Stärkeversuch Linzenmeiers (S. 284),
worin höhere S.G. aber unveränderte Ladung festgestellt wird. Hier ist an
eine Beeinflussung der Hydrathülle zu denken, vielleicht in dem Sinne,
wie sich Fährzus die Sache vorstellt (vgl. Stability S. 153).

1) Diese Zeitschr. 87, 37. 1918.

2) Zeitschr. f. Immunitätsforsch. u. exp. Therap. I. 1909.

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 19

V. Über den Einfluß einiger Narkotica auf die Senkungs-
geschwindigkeit der Blutkörper.

Durch die folgenden Tabellen erhält man einen Vergleich
zwischen der Wirkung einiger verschiedener Alkohole.
(1) Methylalkohol. 3ccm Serum + 2 ccm NaCl + 2 cem R.
Zeit K 0,05 0,1 04 0,7 1 13 16 19 22n
32 34 42 32 21 085 5 22 2
1St. 68 70 57 40,5 22 19 12,6 11 61 5,4
(2) Äthylalkohol. 3ccm Serum + 2 cem NaCl + 2ccm R.
Zeit K 0,033 0,05 01 04 07 1 13 16 22n
3l’ 30 25 23 21 6 4 2 1 08 03
1 St. 63 53,4 51,6 46,8 14,7 10,8 45 32 19 1
(3) Propylalkohol. 3ccm Serum + 2 ccm NaCl + 2ccm R.
Zeit K 0,025 0,05 0,066 0,1 0,2 04 0,5 0,7 1 Län
20° 17 14 12 II 92 4 12 12 12 0 0
1 St. 50° 63 5 494 4 39 19 57 5,7 56 17 1,7
(4) Butylalkohol. 3 ccm Serum + 2ccm NaCl + 2 cem R.
Zeit K 0,025 0,05 0,066 0,1 0,15 02 0,3 0,4n
l St. 28 34 34,8 32 33 25 22 6 0
2 St. 41° 63 68 68 65 64 53 459 9 11
(5) Amylalkohol. 3ccm Serum + 2 cem NaCl + 2 ccm R.
Zeit, K 0,0125 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15n

11’ 29 37 28 35 25 14 0 d
19 63 69 64 72 62 33 0 0

Die Versuche sind an verschiedenen Tagen und mit dem Blut
von verschiedenen Pferden ausgeführt und zeigen zugleich, wie
stark die S.G. der Pferde-R. variieren kann. Es kommt aber
nicht auf die absoluten, sondern auf die relativen Werte an. Wenn
man sich die Resultate graphisch darstellt, indem man die S.G.
als Ordinate, die Normalität der Alkohole als Abscisse wählt und
dabei die Versuche mit der Sed. der K. = 63 verwendet, findet
man eine ganz ausgesprochene Gesetzmäßigkeit der Resultate.
Je größer die Anzahl der Kohlenstoffatome des Alkohols, desto
steiler ist der Anfangsteil der Kurve, d. h. desto früher tritt die
Stabilisierung ein. Man findet an den Kurven einen Knick, rechts
von diesem verläuft die Kurve der X-Achse fast parallel. Je höher
der Alkohol, desto ausgeprägter der Knick. Die Normalität,
bei der der Knick eintritt, wird bei steigender Kohlenstoffzahl
immer niedriger. Nur der Butylalkohol scheint etwas aus der

IE

20 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

Reihe zu fallen, wenn man die Konzentration unter 0,3n berück-
sichtigt. Die Stabilisierung nimmt bis gegen die hämolytische
Konzentration zu. In der Nähe von dieser tritt eine Quellung
der Blutkörperchen ein, die unzweifelhaft die S.G. verzögert.

(6) Methylalkohol. 3 cem Serum + 2ccm NaCl + 2ccm R.
Zeit K l 2 4 6n
2 St. AR 30 4,2 2 0,5 Hämolyse.
Gewisse Variationen sind zu verzeichnen. Oben ist die starke
Stabilisierung in 0,l n-Amylalkohol noch nicht eingetreten. In
anderen Versuchen ist das der Fall gewesen. Isoamylalkohol ver-
hält sich ungefähr wie der n-Amylalkohol.

(7) Isoamylalkohol. 3ccm Serum + 2ccm NaCl + 2ccm R.
Zeit K 0,0125 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,l5n
1 St. 28’ 62 70 69 66 48 4% 0, 0,1
In dem Anfang meiner Studien habe ich die O,1n-Werte
der verschiedenen Alkohole ermittelt. Das Resultat ist aus
obigem vorauszusehen: Zunehmende Stabilisierung in der homo-
logen Reihe, wobei der Butylalkohol herausfällt. Dasselbe ist
bei dem Isopropyl- und dem Isobutylalkohol der Fall.
K. Methyl- Äthyl- Propyl- Isopropyl- Butyl- Isobutyl- Amyl- Isoamyl-
69 64 52 33 52 58 58 6 3,5
Wenn die R. statt wie in den vorangehenden Versuchen
in 3 cem Serum + 2 ccm NaCl in reines Serum geschwemmt
werden, ändert sich das Bild der Versuche nicht. Die Alkohole
hemmen auch die Sed. der R. des Pferdes in Ziegenserum, die
sonst schneller als in Pferdeserum geht.
Von anderen Narkotica habe ich Äthylurethan und Aceton
geprüft.
(8) Äthylurethan. 3 cem Serum + 2 cem NaCl -+ 1 cem R.
Zeit K 0,0125 0.025 0,05 0075 0,1 0,2 (An
2St.8° 63 62 58 46 34 25 18 16

(9) Aceton. 3cem Serum + 2cem NaCl -+ 1 ccm R.
Zeit K 0.012 0,024 0,048 0072 0.096 012 024 0,48n
LS 18^ 63 71 86 68 TT KI 71l 60 42
Zeit K 0,72 096 12 144 1.68n
I St. 18° 63 14 2.3. 052 d 0

In Aceton tritt bei den niedrigeren Konzentrationen eine Verstärkung
der S.G. ein. Dasselbe findet man in den oben wiedergegebenen Versuchen
mit Methyl-, Butyl-, Amyl- und Isoamylalkohol wieder. In einigen Ver-

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 21

suchen ist dasselbe bei Äthylalkohol und bei Äthylurethan beobachtet
worden.

Auch in Gelatinelösungen findet eine stabilisierende Wirkung
der Alkohole statt.
3ccm lproz. Gelatinelösung in 0,9%, NaCl + 2ccm 0,9proz. NaCl

+ Äthylalkohol + Leem R.
(10) K 0,35 0,7 1 1,25 2,45n
27° 63 15,5 7 4 2 1

In Na-Nucleinsäure, die mir von Dr. E. Hammarsten
gütigst zur Verfügung gestellt wurde, tritt, wie schon Fährzus
erwähnt, eine starke Flockung der R. ein. Der folgende Versuch
zeigt die Wirkung von Äthylalkohol.

Leem Na-Nucleinsäure 1 proz. in 0,99% NaCl + 3,5 ccm 0,9 proz. NaCl
+ Äthylalkohol + 1 cem R.
(11) K 0,35 0,7 1,4 1,75 2,45n
2 St. 30° 63 11,8 6 4,2 2 1,5

Wie schon aus Abt. I hervorgeht, spielen die Salze im Serum
eine große Rolle für die S.G. der R. Die Salze üben auch einen
ausgesprochenen Einfluß auf die Alkoholstabilisation der R. aus.
Je geringer der Salzgehalt der Suspension der R., desto geringer
die Stabilisation durch Alkohol. In dem folgenden Versuch wurde
Serum (S) teils mit 0,9 proz. NaCl, teils mit 5,3 proz. Mannit (M)
gemischt. Zu Beem Leem R.

(12) K 0,35 0,7 ln
3 S +2 NaCl 63 22 10 5
2S+3M 63 26 14 9
1S+4M 63 58,3 42,9 57,2

In einem Versuch mit Na-Nucleinsäure wurde der Kolloid-
gehalt der Mischungen konstant gehalten. Der Elektrolytgehalt
wurde hier durch 10,3 proz. Rohrzuckerlösung (Rz.) vermindert.
l ccm R.

(13) K 035 07 14 Län 245n
3 NaCl+2 Rz. 62 20 12 13 19 3l
De 61,5 31 27 27,5 73 T
0,5 „ +45, 68 70 64 66 80 94

Die Tabelle ist mit (11) direkt vergleichbar, wobei man die
Werte für Beem NaCl + Ocem Rohrzucker erhält. Schon in
3 ccm NaCl + 2ccm Rohrzucker steigt die S. G. in den beiden
höchsten Konzentrationen, ein Verhalten, das wiederholt gefunden
wurde In Beem NaCl findet man dieses Verhalten nicht.

292 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

In reiner Rohrzuckerlösung (Mannitlösung) tritt, wie von Rohonyi
(l. c. oben S. 12) und Radsma (l. c. oben S. 2) beobachtet, Aggl. leicht ein.
Diese Aggl. wird nicht durch Alkohol verhindert und ebenso nicht die Aggl.
durch Säurezusatz zu den Suspensionen der R. in Salzlösungen.

In Mannitlösung tritt sogar oft eine beschleunigte Aggl. der R.
zufolge Alkoholzusatz ein. Dasselbe beobachtet man bei Schwemmung
von 0,2 ccm R. in 1 cem Serum + 4 ccm 10,3 proz. Rohrzucker oder 5,3 proz.
Mannit. Bei den Äthylalkoholkonzentrationen 0,35, 0,7, 1, 1,4, 1,7n ist
eine stärkere Aggl. als in der K. eingetreten. Auch bei Versuchen mit der
soeben erwähnten R.-Konzentration beobachtet man deutlich, daß bei
Erhöhung des Serumgehaltes eine stabilisierende Wirkung der Alkohole
eintritt. `

Beiläufig erwähne ich hier eine Beobachtung über die Hämolyse
durch Alkohol, die ich wiederholt gemacht habe. Eine Reihe von Mischungen
isotonischer Mannit- und NaCl-Lösungen wurde hergestellt. Bei einer
Konzentration von 1,62n Propylalkohol ist nach 7’ vollständige Hämolyse
in der reinen Salz- und nach 27’ in der reinen Mannitlösung eingetreten.
Dann kommt die Reihe an die Mischung 4 ccm NaCl + l ccm Mannit und
3 cem NaCl + 2 ccm Mannit (nach 35’ ungefähr 70°,,). Am meisten resistent
gegen die Alkoholhämolyse sind die R. in den Mischungen 2 ccm NaCl —
3cem Mannit und 1l cem NaCl + 4ccm Mannit.

Die S.G. wurde auch in 0,9 proz. NaCl- und in Ringerlösung
bei Zusatz verschiedener Alkohole untersucht. Wie bekannt, ist
die Stabilität der R. des Pferdes in diesen Salzlösungen sehr groß.
Die Ablesungen werden zweckmäßig erst nach 12—24 St. gemacht.

(14) Äthylalkoholversuch; 5cem Ringerlösung + 1 cem R.
K 0,09 0,175 0,35 0,7 In
21 St. 335 26 23,5 21 2] 18

Zum Vergleich führen wir die entsprechenden Werte in 3 ccm Serum
+ 2cem Ringerlösung + l cem R. desselben Aderlasses an.

(15) Set: 65 5l 40 10,5 2,5 1,5

In Ringerlösung tritt keine Flockung der R. ein. Während
im Serum die Sed. vor allem von der Größe der Flocken abhängt,
wird in der Ringer- oder NaCl-Lösung die Größe der einzelnen
R. eine Rolle spielen. Nach v. Knaffl- Lenz!) wissen wir,
daß die R. in der Tat unter der Einwirkung der Narkotica eine
Volumenverminderung erleiden. Wenn man aber auch mit
der höchsten von v. Knaffl- Lenz beobachteten Volumen-
veränderung rechnet, findet man nach Stokes Formel, daß die
Stabilisierung nicht durch die Volumenveränderung völlig erklärt

werden kann. Ein anderer Faktor, der zu der Stabilisierung mit-

1) Pflürers Arch. f. d. ges. Physiol. 121.

Anelektrolyten auf die Senkungsreschw. der roten Blutkörperchen. 23

wirken könnte, ist die Formveränderung der R. unter dem Ein-
fluß der Alkohole. |

Die R. des Pferdes sind in der Ringerlösung im allgemeinen
bikonkav (bei ungeladenem Objektträger beobachtet, vgl. Brink-
man und v. Damm, l. c. S. 15; die R. des Pferdes nehmen aber
viel eher die Stechapfelform als die R. des Menschen oder des
Kaninchens an). Schon in der 0,09n-Äthylalkohollösung findet
man aber, daß die R. ihren Durchmesser verkürzen, wobei die
Oberfläche stachelig wird. In den Konzentrationen 0,7—1n
sind die R. aber vollkommen rund. Trotzdem ist die Stabilität
hier am größten. Bei den bikonkaven R. ist das Verhältnis

Oberfläche
—— —— ungefähr 0,66, bei den runden sinkt es auf 0,49.
Volumen

Die Stabilisierung der R. in Serum oder Serum + NaCl oder
Ringerlösung bei Alkoholzusatz hängt von einer verminderten
Flockung der R. ab. Bei steigender Alkoholkonzentration nimmt
die Geldrollenbildung ab und gleichzeitig fangen die R. an, stern-
förmig zu werden. In 0,175n-Äthylalkohol sind die Geldrollen
noch zahlreich, obgleich deutlich kürzer, als in der K. Die freien
R. haben oft Sternform. In 0,35n sind die Geldrollen sehr spär-
lich. Sternförmige R. bilden aber kleine mehr unregelmäßige
Flocken. In 0,7n findet man noch solche Flocken, aber spärlicher.
Von l:n an hört praktisch jegliche Flockung auf.

Wenn man das Serum mit z. B. 0,9proz. NaCl verdünnt,
erhält man bekanntlich eine ähnliche Abnahme der Geldrollen-
bildung, wobei gleichzeitig die S.G. abnimmt. Man hat den Ein-
druck, daß die Narkotica die Wirkung der Kolloide ausschalten.

VL Besprechung der Ergebnisse über die Einwirkung der Narkotica.

Trotz der auffallenden Wirkung der Narkotica ist es doch schwer,
eine einfache Erklärung ihrer Wirkung zu geben.

Nach Höber!) und Linzenmeyer?) verdrängen die Narkotica die
„agglutinierenden Körper‘ (L., S. 182) aus der Oberfläche der R. Diese
Erklärung ist ja schr wahrscheinlich und naheliegend. Eigentümlich ist
aber dabei folgendes. Pferdeserum ist ein sehr guter Schutzkolloid für
Kaolin. Zusatz von Alkohol verstärkt diese Wirkung. Beieiner Verdrängung
würde die schützende Wirkung geschwächt werden.

Wahrscheinlich spielen noch andere Momente als eine Verdrängung ein.

1) Hamburger Tagung d. Dtsch. physiol. Ges. 1920.

2) Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 181, 169. 1920.

24 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und

Simon!) hat gezeigt, daß Zusatz von Alkohol die Hitzekoagulations-
temperatur des Serums erniedrigt, was wohl als Ausdruck einer dehydrie-
renden Wirkung der Alkohole aufzufassen ist. Ich habe in mehreren Fällen
die Hitzekoagulationsgeschwindigkeit des Serums nach Alkoholzusatz be-
stimmt; eine unverkennbare Korrelation mit der S.G. der R. ist dabei
beobachtet worden. Je größer die Geschwindigkeit der Koagulation, desto
stabiler die R. in derselben Mischung. Angesichts dieser Tatsachen muß
man mit einer Zustandsänderung der Kolloide als einem Faktor bei der
Stabilisierung durch Alkohole rechnen. Wie oben schon genannt, setzt
Fåhræus (Stability S. 153) die Wirkung der Kolloide mit ihrer Hydratation
in Verbindung. Durch die Alkohole wird wahrscheinlich eine Dehydratation
bewirkt.

Die oben dargelegte Tatsache, daß die stabilisierende Wirkung der
Alkohole bei Verminderung des Salzgehaltes der Mischungen abnimmt,
deutet auch daran, daß es sich um Wirkungen auf den Zustand der Kolloide
handelt. Man wird an die Einwirkung der Salze auf die Fällbarkeit des
Säurealbumins durch Alkohol erinnert [Schorr?)], wobei ich den großen
Unterschied der beiden Fälle natürlich nicht übersehe.

Die Ergebnisse v. K.naffls (l. c. oben S. 22) zeigen, daß die Narkotica
eine dehydrierende Wirkung auf die R.-Kolloide ausüben. Nach Beobach-
tungen über die R.-Form scheint es mir wahrscheinlich, daß die dehydrie-
rende Wirkung bei Senkung des Salzgehaltes erst bei höherer Alkohol-
konzentration eintritt. Wie oben genannt, tritt die Stechapfelform in
Ringerlösung (oder 0,9 proz. NaCl) schon in der Äthylalkoholkonzentration
0,09n ein. In einer Mischung 4,5 ccm Rohrzuckerlösung + 0,5 ccm 0,9 proz.
NaCl treten zackige Formen erst bei 0,525n Äthylalkohol auf. Bei den
niederen Konzentrationen glockenförmige R.

Es ist möglich, daß auch die Veränderung der Oberfläche der R.
einen Einfluß auf deren Stabilität ausüben kann. Wir haben ja oben einen
auffallenden Parallelismus zwischen Stabilität und Resistenz gegen Hypo-
tonie gefunden (III). Diese Übereinstimmung kehrt hier zurück. Die
stabilisierenden Alkoholkonzentrationen üben, wie schon aus den Ver-
suchen von Arrheniusund Bubanovic?) zu entnehmen ist, eine erhöhende
Wirkung auf die Resistenz der R. gegen Hypotonie aus.

Aus V (1), (2), (3), (4), (5) kann man die Konzentration der Alkohole
herauslesen, die gleiche Sed. geben. Man wird z. B. finden, daß die folgenden
molaren Konzentrationen die Sed. 30 mm bei einer Sed. der K. von 63 mm
geben: Methyl- 0,58, Äthyl- 0,25, Propyl- 0,15, Butyl- 0.24, Amylalkohol
0,11. Wenn man die Konzentrationen als Ordinaten absctzt, erhält man
eine abfallende Kurve, wo doch der Wert für Butylalkohol herausfällt.
Wählt man dagegen die Sed. 5,4 mm bei einer Sed. der K. von 63 mm,
erhält man folgende Werte der Konzentrationen: Methyl- 2,2, Äthyl- 0,957,
Propyl- 0,396, Butyl- 0,24 und Amylalkohoi O,11n.

1) Arch. di fisiol. 5. 1908.
2) Diese Zeitschr. 37, 424. 1911.
3) Meddel. K. Vetensk. Akad. Nobelinst. 2. 1913.

Anelektrolyten auf die Senkungsgeschw. der roten Blutkörperchen. 25

Die Kurve ist hier steiler als in dem oben herausgelesenen Fall. Man
wird finden, daß die Werte sehr genau denjenigen proportional sind, die
nach Fühner und Neubauer!) eben Hämolyse hervorrufen. Wenn man
sich die Verhältnisse durch Kurven veranschaulicht, wird man finden,
daß diese sehr nahe parallel verlaufen. Dasselbe gilt, wenn man mit den
Konzentrationen der verschiedenen Alkohole vergleicht, die nach War-
burg?) die Oxydation in den Erythrocyten der Gans hemmen, die nach
Warburg und Wiesel?) fast vollständige Gärungshemmung der Aceton-
dauerhefe bewirken. Eine ähnliche Kurve bilden auch die Werte der
Konzentrationen, die nach Meyerhof?) 30%, Hemmung der Rohrzucker-
inversion durch Invertase bei 29° bewirken. Spiro?) hat die fällende
Wirkung der Alkohole auf Eiereiweiß untersucht. Die Fällungskonzen-
trationen in Mol ausgedrückt, bilden eine sehr ähnliche Kurve wie in den
oben angeführten Fällen (Methyl- 6,2, Äthyl- 3,8, Propyl- 2,1, Butyl 0,7,
Amylalkohol 0,43. Ebenso besteht Parallelismus mit den von Overton
ermittelten narkotischen Konzentrationen für Kaulquappen®). Warburg
und Wiesel heben die fällende Wirkung der Narkotica hervor. Bei ihren
Versuchen liegt sicher keine „lipoidlösende‘“‘ Wirkung vor. Bei den oben-
genannten Versuchen Meyerhofs über die Wirkung der Narkotica auf
die Invertase geben die Werte der prozentischen Hemmung Kurven, die
an Adsorptionskurven erinnern. Sie werden mit der Zunahme der Kohlen-
stoffatome immer steiler. Wenn wir unsere Resultate statt in Millimeter
Sed. als prozentische Hemmung derselben ausdrücken wollen, erhalten wir
Kurven, die ganz außerordentlich an die Kurven Meyerhofs erinnern.
Sie haben dieselbe Ähnlichkeit mit Adsorptionskurven und verändern auf
dieselbe Weise ihre Form mit steigender Kohlenstoffanzahl. Es handelt
sich in unseren Versuchen um eine Bindung teils an die Serumkolloide
(bzw. Gelatine usw.), teils an die R.

Zusammenfassung einiger Ergebnisse.

Die S.G. der R. wird in verschiedenen Salzen und bei ver-
schiedenen Konzentrationen derselben untersucht. Die Reihen-
folge der Ionen wird u. a. von der Konzentration bestimmt.
Zusatz von HCl kann die Reihenfolge der Anionen verändern.

Bei Erhöhung der Konzentration des Suspensionsmittels
der R. an Alkalisalzen steigt die zur Aggl. der R. notwendigen [H].

1) Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. 56. 1907; zit. nach Höber,
Physikalische Chemie der Zelle usw. 4. Aufl., S. 408. 1914.

2) Zeitschr. f. physiol. Chem. 70. 1911.

3) Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 144. 1912.

4) ib. 157. 1914.

5) Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 4. 1903.

€) Zit. nach Höber, Physikalische Chemie der Zelle usw. 4. Aufl.,
S. 459. 1914.

26 J. Runnström: Einwirkung von Elektrolyten und Anelektrolyten usw.

Eine ähnliche Gesetzmäßigkeit findet man bei Aggl. durch Schwer-
metallsalze.

Es besteht eine unverkennbare Beziehung zwischen Resistenz
der R. gegen starke Hypotonie (4 der Lösungen = 0,28) und der
S.G. Je stabiler die R., desto größer ihre Resistenz.

Es hat sich als wahrscheinlich herausgestellt, daß die Wirkung
der Ionen als Folge von einer Adsorption derselben an die R.-Ober-
fläche aufzufassen ist. Die Wirkung der Kolloide (Serum, Gela-
tine usw.) wird als eine ‚Konkurrenz‘ derselben mit den Elektro-
lyten um die Oberfläche der R. aufgefaßt. Bei Senkung der
Konzentration von Alkalisalzen in der Suspensionsflüssigkeit
der R. wird die flockende Wirkung der Kolloide verstärkt.

Bei der Wirkung der Narkotica auf die S.G. besteht dasselbe
Verhältnis zwischen der Wirkung der Glieder homologer Reihen
wie früher bei verschiedenen Vorgängen (Narkose, Atmungs-
hemmung usw.) beobachtet.

Die stabilisierende Wirkung der Alkohole nimmt bei Senkung
der Konzentration von Alkalisalzen in der Suspensionsflüssigkeit
ab. Bei sehr geringer Elcktrolytenkonzentration können die
Alkohole sogar die Flockung beschleunigen.

Beiträge zur Physiologie der Drüsen.
XLVII. Mitteilung.

Von
Leon Asher.

(Aus dem Physiologischen Institut der Universität Bern.)

Die Beziehungen zwischen Thymus, Milz und Knochenmark.

Von

Gengo Matsuno (Nagoya, Japan).
(Eingegangen am 21. Juni 1921.)
Mit 13 Abbildungen im Text.

Die Thymus wird herkömmlich zu dem System des lympha-
tischen Apparates gerechnet und in dieser Bezeichnung liegt auch
eine funktionelle Deutung, denn man meint, daß die Thymus
in Beziehung zur Entstehung der Iymphatischen Elemente des
Körpers steht. Mehr auf dem Gebiete der Pathologie als auf dem-
jenigen der Physiologie sind die Stützen für diese Auffassung
einer funktionellen Bedeutung der Thymus erwachsen. Die
funktionelle Stellung der Thymus im Organismus ist trotz be-
merkenswerter und aufklärender Arbeiten der letzten Jahre
durchaus nicht eindeutig festgelegt. Es liegt wahrscheinlich in
den Tatsachen begründet, daß diese eindeutige Festlegung nicht
stattfinden kann, weil die Thymusdrüse keine einheitliche Funk-
tion besitzt. Gerade die Arbeiten aus dem Berner Physiologischen
Institut, denen sich die meinige anschließt, haben hierauf hin-
gewiesen. Sowohl H. Müller wie auch del Campo zeigten, daß
die Thymusdrüse in Beziehung zur Muskeltätigkeit stehen kann,
indem sie nachwiesen, daß. Injektion von Thymusextrakten die
Muskelermüdung verzögerte. Während diese neuen Tatsachen
völlig außerhalb des Rahmens der herkömmlichen Betrachtungs-

28 G. Matsuno:

weise der Thymusfunktion liegen, schließt sich die bemerkens-
werte von Ruchti gefundene Tatsache, daß Fehlen der Thymus-
drüse die Ausfallserscheinungen der Schilddrüse ganz wesentlich
steigert, der Fragestellung an, die namentlich in der Pathologie
vielfach diskutiert worden ist. Auch die hieran anschließende
Arbeit von Nyffenegger brachte neue Tatsachen in dieser
Richtung zutage.

Im Anschluß an diese Arbeit schien es geraten, die Beziehung
zwischen Thymus und Knochenmark einer erneuten Untersuchung
zu unterziehen. Da durch die bekannten Arbeiten von Bache,
Klose und Matti sehr auffallende Beziehungen zwischen
Thymus und Knochengewebe aufgedeckt worden waren, mußte
auch daran gedacht werden, daß das Knochenmark auch in Be-
ziehung zur Thymus gesetzt sei. Beziehungen zwischen Knochen-
mark und Drüsen mit innerer Sekretion sind schon früher im Berner
Physiologischen Institut untersucht worden. Am umfassendsten
von Marcel Dubois (diese Zeitschr. 31, 141. 1917). Dubois
untersuchte das Zusammenwirken von Milz, Schilddrüse und
Knochenmark. Er bediente sich als Prüfungsmittel für die Lei-
stungsfähigkeit des Knochenmarks der Untersuchung des sog.
relativen weißen Blutbildes, daneben auch der Hämoglobin-
bestimmung. Seine Ergebnisse führten ihn zu der Auffassung,
daß in bezug auf das Knochenmark ein Antagonismus zwischen
Milz und Schilddrüse bestände. Es liegt in der Natur der ange-
wandten Methode, daß die erhaltenen Ergebnisse nicht jenen
Grad von Eindeutigkeit besitzen können, welcher anderen Me-
thoden zukommt. Hier muß die Variierung der Gesichtspunkte
dazu verhelfen, die Möglichkeit des Einblickes zu vertiefen. Aus
diesem Grunde folgte ich gern der Aufforderung von Prof. Asher,
die Beziehung zwischen Thymus und Knochenmark mit Hilfe
von Blutuntersuchungen experimentell zu erforschen. Das wich-
tigste Verfahren war von vornherein gegeben. Die Untersuchung
des relativen weißen Blutbildes sowie des Hämoglobingehaltes
vor und nach der Thymusexstirpation. Nun liegen schon viele
Erfahrungen vor, welche lehren, daß die bloße Entfernung eines
Organs vom Charakter der Thymus an und für sich keine weiter-
gehenden Aufschlüsse zu erteilen vermag. Es gehört dazu noch,
daß man neue experimentelle Bedingungen schafft, welche nicht
leicht erkennbare, aber tatsächlich vorhandene Ausfallssymptome

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 29

aufzudecken vermögen. Hierzu empfahlen sich 2 Eingriffe, die
schon in den Arbeiten von Sollberger (Asher und Sollberger,
diese Zeitschr. 55, 13) sowie von Dubois angewandt wurden,
nämlich der Blutentzug und experimentelle Anämie durch ein
chemisches Gift herbeigeführt, z. B. Cyanwasserstoff. Sowohl
der Blutentzug wie auch der Sauerstoffmangel wirkten als ein
Reiz auf das Knochenmark. Wenn wir demnach diese beiden
Eingriffe vor und nach der Thymusexstirpation anwenden, prüfen
wir gewissermaßen die Reaktionsfähigkeit des Knochenmarks auf
einen dosierbaren Reiz in 2 verschiedenen Zuständen. Ich habe
auch einige Untersuchungen an Tieren ausgeführt, denen nicht
nur die Thymus, sondern auch die Milz exstirpiert worden war.

Für meine Experimente wählte ich das Kaninchen. Es wurden mög-
lichst gleichalte und gleichgroße Tiere gewählt und diese unter den gleichen
Bedingungen gehalten. Eine besondere Diät brauchte nicht beobachtet
zu werden.

Da bekannt ist, daß sich das weiße Blutbild nach der Nahrungsauf-
nahme ändert, erfolgte die Blutentnahme möglichst zu gleichen Zeiten,
um derartige Fehler auszuschließen. Zu jedem neuen Eingriff wurden frische
Tiere benutzt. |

Zur Hämoglobinbestimmung diente das Hämometer nach Sahli,
zur Zählung von Erythro- und Leukocyten der Thomasche Apparat.
Als Verdünnungsmittel diente Hayernsche Lösung für die roten und eine
Lösung von Essigsäure und Gentianaviolett für die weißen Blutkörperchen.

Das histologische Blutbild wurde an Ausstrichpräparaten auf Objekt-
trägern untersucht. Ein Blutstropfen kam auf das gut gereinigte Glas
und wurde mit dem Rande eines Deckgläschens möglichst gleichmäßig
verstrichen. Ich wählte, um die Resultate sicherer zu gestalten, verschiedene
Färbungsmethoden, so nach Ehrlich (Triacid), nach Germer-May,
nach May-Grünwald und nach Romanowsky-Giemsa. Es wurde
Doppelfärbung benutzt. Letztere bewährte sich mit der Zeit besonders,
und die Erfahrung lehrte, daß sie sich in folgender Modifikation für das
Kaninchen eignete: Die lufttrockenen Präparate wurden während 3 Minuten
in Methylalkohol fixiert. Im Verhältnis von einem Tropfen Farbe zu l cem
dest. Wasser wurde die Farblösung jedesmal frisch bereitet. Die fixierten
und getrockneten Präparate kamen während 20—25 Minuten mit der
Farbe in Berührung, nachher wurden sie in Brunnenwasser kurz abgrespült,
dann getrocknet und vermittels eines Immersionssystems untersucht.

Zählung derLeukocyten: Die Zählung erfolgte jedesmal so lange,
bis mindestens 800—1000 Leukocyten differenziert waren. Diese Zahl
erwies sich als genügend, um sichere Resultate im relativen Blutbilde zu
erhalten, was sich gelegentlich durch größere Zählung bestätigte.

Das Blut entnahm ich den Ohrvenen, nachdem ich vorher das Ohr
sorgfältig mit Alkohol und Äther gereinigt hatte. Die Öffnung der Venen

30 G. Matsuno:

erfolgte durch schräges Einstechen mit einer sterilen Stecknadel, dann
wurde das hervorquellende Blut ohne Druck aufgefangen. Mit dieser ein-
fachen Methode ließen sich bessere Resultate erzielen als mit den üblichen
Schneppern. Die Gefäßverletzung konnte so auf ein Minimum beschränkt
bleiben, die kleine Wunde schloß sich jeweilen sehr rasch und spurlos.
Das war für fortgesetzte Untersuchungen sehr wünschenswert im Interesse
einer möglichst geringen Trübung des Blutbildes.

Vor allem galt es, an den Tieren Voruntersuchungen anzustellen,
um von den physiologischen Schwankungen Kenntnis zu nehmen und um
vor allem das weiße Blutbild des Kaninchens, das ich in keiner Literatur-
angabe fand, festzuhalten. Während der ganzen Dauer der Versuche
wurden selbstverständlich Kontrolltiere unter den gleichen Bedingungen
beobachtet.

Die Operationen.

Für die Untersuchungen wurden mehrere Tiere operiert, um möglichst
sichere Resultate zu erhalten. Eine halbe Stunde vor der Operation be-
kamen die Kaninchen 2°, Morphium muriat. subcutan injiziert.

Selbstverständlich erfolgte die Operation unter streng aseptischen
Kautelen, wobei auch die Desinfektion des Kaninchenfelles in gehöriger
Weise erfolgte, galt es doch, auch die geringste Infektion auszuschließen.

Die Blutentnahme.

Haare abrasiert; starke Hautdesinfektion; mit Jodtinktur gepinselt,
an der Mittellinie: Längsschnitt von 15 cm, auf der rechten Seite den Muskel
mit einer Pinzette weggenommen, dann kann man die rechte Carotis sehen.
Oberer Teil der Carotis abgebunden; mit geknickter Kanüle Blutentzug
von 30— 40 g.

Die Splenektomie.

Kurzer Schnitt in der Linea alba vom Processus xiphoideus sterni an
nach abwärts. Eröffnung des Peritoneums. Eingehen auf die Milz an der
großen Kurvatur des Magens vorbei. Sorgfältiges Fassen der Milzgefäße
mit Arterienklemmen. Unterbindungen. Exstirpation des Organs. Repo-
sition der prolabierten Eingeweide. Schließen der Bauchdecken durch
Knopfnähte. Blutverlust fast Null.

Die Thymusektomie.

Durch einen 3 em langen von Mitte Hals bis Manubrium sterni reichen-
den Schnitt durch Hautfascie und Muskulatur wird die Trachea freigelegt.
Mittels stumpfen Hakens wird das Brustbein in die Höhe gehoben und die
neutrale Halsmuskulatur leicht seitwärts gezogen. Ventral der Gabelung
derVena cava cranii ist der vordere Zipfel der Thymus als gräuliches, fett-
ähnliches Gewebe sichtbar, umgeben von einer dünnen Bindegewebskapsel.
In dieser Gegend weist die Drüse ziemlich schwer lösbare Verbindungen
mit den Gefäßen auf. Die Kapsel wird sorgfältig angeschnitten, die Thymus
mit breiten Pinzetten gefaßt und durch leichten Zug entwickelt. Zur voll-

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 31

ständigen Exstirpation erfordert das äußerst leicht zerreißbare Organ neben
großer Vorsicht, fast im Widerspruch zur Größe der Drüse stehend, breite
Pinzetten. Die beiden Lappen lösen sich im allgemeinen sehr leicht. Eine
allfällige venöse Blutung ist durch Aufdrücken eines Tupfers sofort stillbar,
hat übrigens bei aseptischem Vorgehen nichts zu bedeuten.

An den Folgen der verschiedenen Operationen sind von 10 Tieren
die 4 erstoperierten eingegangen. Todesursache war einmal beiderseitiger
Pneumothorax, einmal beiderseitige Pneumonie, wahrscheinlich infolge
Pleuraverletzung, noch 2 mal eitrige Pleuritis infolge Wundvereiterung.

Im übrigen heilten alle Wunden per primam ab: Später ausgeführte
Sektionen bewiesen die sowohl vollständige Entfernung der Thymus als
auch der Milz. Verdächtige Gewebspartien, im besonderen größere Fettpartien
wurden jeweilen mikroskopisch untersucht. Von Krause wird das Gewicht
der Thymus beim Kaninchen mit 1,1g angegeben. Klose und Vogt
haben nach eigenen Bestimmungen bei Tieren im Alter bis zu 7 Wochen
ein durchschnittliches Thymusgewicht von 2,6 g festgestellt. Nach Sönder-
lund und Backmann beträgt das Thymusgewicht von 4—6 Wochen
alten Kaninchen 1,07 g und steigt auf maximal 2,49 g bei 4 Monate
alten Kaninchen. Die von mir operierten Tiere standen in einem mittleren
Alter von 15 Wochen und wogen 1500—2000 g, im Mittel 1780 g. Das
Gewicht der exstirpierten Drüsen schwankte von 1,50—2,95 g.

Die Ergebnisse meiner Untersuchungen habe ich in den
nachfolgenden Protokollen und in Kurven niedergelegt. Ich
will in großen Zügen die Tatsachen, die ich gefunden habe, be-
schreiben. i

Die Exstirpation der Thymusdrüse führt zu Änderungen im
Blutbild, welche ziemlich ausgesprochen sind, wenngleich indi-
viduell der Betrag derselben schwankend sein kann. Ich finde
zunächst, daß kurze Zeit nach der Exstirpation eine kleine Ver-
minderung der Hämoglobinmenge eintritt, die sich aber bald
wieder ausgleicht. Etwas ausgesprochener sind die Veränderungen
im weißen Blutbild. Die Zahl der Lymphocyten steigt, während
die Zahl der Leukooyten sinkt. Sehr viel ausgesprochener sind die
Ergebnisse bei Anwendung der beiden Reizmittel des Knochen-
marks, dem Blutentzug und der Injektion einer kleinen Menge
von Cyanwasserstoff. Was das normale Tier anbetrifft, so sind
meine Befunde die gleichen wie diejenigen früherer Autoren. Die
Hämoglobinmenge sinkt sofort nach dem Eingriff und kehrt all-
mählich zur Norm zurück. Schr deutlich sind die Erscheinungen
hinsichtlich des relativen weißen Blutbildes. Sofort nach dem
Blutentzug kommt es zu einem tiefen Sturz der Lymphocyten
und einer noch starken Steigerung der Leukocytenzahl. Genau

32 G. Matsuno:

die gleichen Erscheinungen sieht man nach Injektion von Cyan-
wasserstoff. Ganz anders gestaltet sich das Verhalten nach Ent-
fernung der Thymusdrüse. Der Blutentzug hat sowohl eine ganz
geringfügige Verminderung der Hämoglobinmenge, ein kaum
merkliches Steigen der Leukocytenzahl und nur eine sehr gering-
fügige Veränderung in der Menge der Lymphocyten zur Folge.
Genau das gleiche gilt für die Wirkungen des Cyans.

Was nun die Entfernung der Milz bei Tieren anbetrifft,
denen vorher die Thymusdrüse entfernt worden war, so hat dieser
Eingriff kaum irgendwelche bemerkenswerten Folgen. Nament-
lich tritt nicht die Erscheinung ein, die Dubois bei der bloßen
Entfernung der Milz beschrieben hat, eine Abnahme der Lympho-
cytenzahl und eine Zunahme der Leukocyten; höchstens letzteres
kann angedeutet sein. Die Reaktion auf Blutentzug und auf
Cyanwasserstoff wird durch die nachfolgende Exstirpation der
Milz nicht beeinflußt. Man muß daraus schließen, daß im Sym-
‘ptomenbild das Fehlen der Thymusdrüse überwiegt. Ich glaube
nicht fehlzugehen, wenn ich die von mir gefundenen Tatsachen
als einen Ausdruck des Einflusses der Thymusdrüse auf das Kno-
chenmark ansehe. Fehlen der Thymusdrüse mindert die Reaktions-
fähigkeit des Knochenmarks. Daraus kann der Schluß gezogen
werden, daß bei Vorhandensein der Thymusdrüse diese einen
fördernden Einfluß auf das Knochenmark ausübt. Welches auch
der Einfluß der Milz sei — daß ein solcher vorhanden ist, wurde
durch die Arbeiten von Sollberger und Dubois bewiesen —,
die Thymus, solange sie in funktionsfähigem Zustande sich be-
findet, übt einen größeren Einfluß aus.

Der wesentlichste Inhalt der vorstehenden Arbeit ist der
nachfolgende:

Um die Beziehung zwischen Thymus und Knochenmark zu
prüfen, wurde Hämoglobingehalt und relatives weißes Blutbild
vor und nach Exstirpation der Thymus untersucht, wobei haupt-
sächlich die Reaktion auf Blutentzug und auch durch Cyanwasser-
stoff herbeigeführter Sauerstoffmangel als Prüfungsmittel benutzt
wurde. Die Untersuchung ergab, daß die Thymusdrüse einen
fördernden Einfluß auf das Knochenmark ausübt, der wegfällt,
wenn die Thymusdrüse fehlt.

Die Entfernung der Milz vermag an dem Symptomenbild
des Thymusausfalles nichts Wesentliches zu ändern.

bei dieser Arbeit meinen herzlichen Dank auszusprechen.

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark.

33

Zum Schlusse sei mir gestattet, meinem verehrten Chef,
Herrn Prof. Leon Asher für seine Anregung und Leitung und
Herrn Prof. K. Sugi für seine liebenswürdige Unterstützung

Leukocyten

9 900
9 600
8 700
9 200

12 000
10 200
9 000

8 800.
9 200,0

2,5
3,75
3,5

2,75

Tabelle I.
Kontrolltier.
Datum Hämoglobin Erythrocyten
16.X.20 ..... 76 4 600 000
E, 5 ee 78 4 859 000
> RD. A E, A 2 76 4 578 000
26: Ray .. 2 78 4 298 000
27. X. 20 Blutentzug (ca. 35 g).
Körpergewicht 2100 g.
28: Ae REECH 64 2 580 000
WERE ar 68 3 780 000
XD, 2 2 E 69 3 960 000
DIRT a 2-20 72 4 680 000
e er re er 74 4 855 000,0
Kontroller.

Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc. Myelo.
16.X.20 53,3 34,0 0,75 3,75 4,0
18. X. „ 55,75 34,75 0,5 2,25 3,5
21.X. „ 58,0 30,0 0,5 2,7 3,7
26. X. „ 53,5 38,5 0,5 1,75 3,25

27. X. 20 Blutentzug (ca. 35 g).

Körpergewicht 2100 g.

X. 20 40,0 52,75 1,0 1,0 1,0
X. „ 43,0 47,50 1,75 1,5 2,5
X. „ 44,075 45,45 1,5 2,0 3,75
XI. „ 56,5 37,25 1,0
XI. „ 51,5 40,5 1,25
XI. „ 575 35,0 1,5

o per E-E-E-

fen
F

ante
sa

leukocyten
& e

Abb. la. Abb. Ib.

Biochemische Zeitschrift Band 12%.

34 G. Matsuno:

Tabelle II. Kontrolltier.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
18.X.20 ..... 12 4 225 000 8 600,0
EE e Sie z 76 5 700 000 7 800,0
DO Re: N E 72 4 370 000,0 8 000,0
ZINN u Eee 73 4 495 000,0 7 700,0
DIR Ei 77 5 051 000 8 700
e GE N 74 4 953 000 9 200,0
DER nase Je méie, ID 4 894 000 9 700

1. XI. 20 Blutentzug (aus rechter Carotis).
Körpergewicht 2020 g.

2. XI. 20% 0 0 65 3 200 000 12 000

SALE 69 3 750 000 13 000

4: Als Sa: 69 3 950 000 9 200

e En, éi DEE 72 4 045 000 8 700

O. C En EE T74 4 630 000 9 200

TAL o EEE 73 4 730 000 8 600
Kontrolltier.

Datum Lymphoc. XNeutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc. Myelo.
18. X. 20 63,25 28,5 1,0 2,0 2,75 2,5 —
19. X. „ 57,25 34,0 0,75 2,75 3,0 2,25 —
20. X. - 67,75 24,5 0,5 2,0 2,5 2,5 0,25
21.X. „ 56,0 32,0 0,75 3,0 5,25 3,0 —
25. X. „ 56,75 34,25 1,0 1,75 2,75 3,0 --
2T: As ys 58,75 34,25 0,5 1,75 2,75 2,0 —
28. Ae y 55,5 37,0 0,5 1,0 4,0 2,0 —

1. XI. 20 Blutentzug (aus rechter Carotis).
Kërpergewicht 2020 g.

2. XI. 20 39,75 51,0 1,0 2,0 3,5 2,0 0,75
3. XI. „ 42,0 52,5 0,5 0,5 2,0 2,0 0,5
4. XI. „ 42,25 49,0 0,25 1,25 4,0 2,5 0,75
D AL, 585 32,5 0,75 2,25 3,5 2,0 0,5
8. XI. „585 33,25 1,25 2,75 3,29 1,0 —
9. XI. „ 58,75 32,75 1,0 1,75 3,25 2,5 —

GA = -
| - |
d

S
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Diuropt

.--+--

Abb. 2a. Abb. 2b.

28. IV.
EK
IV.

See

anna

Lymphoc. Neutr.

60,25
58,0
59,0
60,75
55,25

54,75
59,5
61,0
63,0
62,0
63,0
64,25
60,0
59,5
58,75

59,75

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 35
Tabelle III.
Kaninchen grau.
Körpergewicht 2100 g. Normale Tiere.

Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.

.. 70 4 140 000 10 200

.-. 70 4 120 000 9 000

Zë 4 225 000 9 500

=a T3 4 725 000 8 600

u al 4 560 000 8 400

23. IV. 21 Entfernung von Thymus.

, , 70 4 560 000 8 700

.. 174 4 675 000 8 100

.. 73 4 825 000 9 700

a d2 4 606 000 10 100

.. 70 4 030 000 9 000

T 78 4 630 000 8 700

.. 73 4 725 000 9 100

e de E 4 525 000 9 200

.. 73 4 825 000 9 800

a 712 4 435 000 10 100

Ee 4 830 000 9010

.. 74 5 130 000 8 600

Körpergewicht 2100 g. Normale Tiere.
Eosino.. Basophil. Überg. Monoc.
34,0 0,75 1,5 1,5 2,0
33,0 0,75 2,75 3,0 2,5
36,25 0,25 1,0 2,5 1,0
32,25 0,5 3,0 2,25 1,25
36,75 0,25 2,5 2,5 2,75
23. IV. 21 Entfernung von Thymus.

39,0 0,5 1,5 2,75 1,5
31,0 0,75 3,25 2,0 3,9
32,25 1,0 1,0 2,25 1,75
31,0 0,75 1,25 2,0 2,0
32,0 0,25 1,75 2.29 2,0
30,25 1,0 2,0 2,75 1,0
30,75 6,5 1,25 1,0 1,25
32,25 0,5 3,5 2,25 3,5
33,25 0,75 2,75 2,0 1,75
33,0 0,75 2,25 3,0 2,0
33,0 0,25 2,0 2,5 1,0
33,5 1,0 3,25 3,0 3,25

56,0

Eh

Lvmphocyten

Leuxocytr

Abb. 8a.

G. Matsuno:

Tabelle IV.

Kaninchen grau.

Abb. 8b.

Körpergewicht 2400 g. Normale Blutkörperchen.

Datum

22.

II. 21

SE e
SE e
NG GER

Hämoglobin
75
77
73
73

Erythrocyten
4 730 000,0
5 700 000,0
4 370 000,0
4 495 000,0

Weiße Blutkörp.
8 400,0
7 800,0
8 000,0
7 700,0

26. II. 21 Entfernung von Thymus.

26. II. 21 Entfernung von

1. III. 21.
Ss EE 42%
d RE -
3.11, 5
ER GE GE
11. IH. ,„ .
15. MI. „.
14 HUE ya
Datum Lymphoc.
22. 11. 21 59,25
a E 60,75
sl 2 55,25
A E ES? 58,0
1.111. 21 61,25
2.1112; 64.50
4. Ill. - 62,5
5.111. „ 63,75
1.111: s 60,0
USH -s 61,0
15. III. ,, 58,75
CR E DE 59.25

76 5 200 000,0
70 3 570 000,0
73 4 450 000,0
73 4 575 000,0
75 4 855 000,0
73 4 425 000,0
14 4 625 000.0
73 4 465 000,0
Neutr. Eosino. Basophil.
31,0 1,0 2,25
33,25 0,75 1,25
39,0 1,0 2,0
38,25 0,75 0,75

32,75

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30,25 (

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9 900,0
9 800,0
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9 600,0

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9 700,0

berg. Monoc.
2,0 3,5
2,25 1,75
1,0 1,75
1,0 1,25

Thymus.

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Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 37

mphocyren

iv
K

n U
(in

Leukocyten

Tabelle V. Kaninchen grau.
Körpergewicht 1700 g. Normaltiere.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
11. XI. 20..... 72 4 325 000 8 000
(E: Se d Ren re 72 4 230 000 8 100
lD Xi ap a a 70 4 100 000 9 600
16: d GEES 72 4 220 000 8 700
26. XI. 20 Entfernung von Thymus. l
29. XI. 20 .... 72 4 100 000 7 800
LAXI on, aaa l 4 430 000 6 500
4. XIL „ . . . 70 4 200 000 10 100
4 XIL 45 ei a 72 4 425 000 8 700
6 XM ve, ës e ie T 4 625 000 9 600
XI e aaa 2 4 465 000 9 700
16. XI. „p =. ën 72 4 230 000 10 100
18. XII. 20 Entfernung der Milz am früher enthymierten Tiere.
25. XII.20 .... 73 4 345 000 9 400
Sr SE, 2 Wu 2 4 210 000 8 700
29. XIL a 4. u 78 5 425 000 9 200
30. XII. 2 .... 70 4 125 000 10 100
SE 21... . 74 4 830 000 9 700
Tl a eue da 4 525 000 9 100
Datum Lymphoc. XNeutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.

11. XI. 20 55,75 34,0 0,75 2,75 4,5 2,25

13. XI. „ 57,75 32,75 0,5 2,5 3,75 2,75

15. SL, 54,75 36,25 1,0 2,75 3,75 1,0

16. XI. „ 60,25 31,75 0,75 2,0 2,25 3,0

| 26. XI. 20 Entfernung von Thymus.

29. XI. 20 58,25 34,5 0,75 1,75 1,5 3,25
1. XII. ;, 56,75 35.75 0,5 2,75 3.0 1.25
4. XII. „ 60,0 31,5 1,0 3,25 2,0 2,25
6. XII. „ 62,75 30,75 0,75 4,5 1,0 0,75

11. XII. ,, 63,25 32,75 1,0 2,5 0,25 0,25

16. XII. „, 60,5 31,25 0,5 3,25 2,75 1,75

20. XII. , 58,75 34,0 0,25 3,0

38

G. Matsuno:

22. XII. 20 Entfernung der Milzam früherexthymierten Tiere.
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino.. Basophil. Überg. Überg.

25. XII. 20
27. XII. ,
29. XII. ,
30. XII.

57,25 34,25 0,5 1,25 2,5 4,25
59,25 30,5 1,5 2,0 3,75 3,0
55,75 36,25 0,75 1,25 3,0 3,0
60,75 32,0 1,5, 2,25 1,25 2,25
55,25 39,25 0,5 1,5 1,0 2,0
59,25 31,0 1,0 3,25 2,0 3,5
58,0 38,25 0,75 0,75 1,0 1,25
60,75 33,25 0,75 1,25 2,25 1,75
PE 79 24 28 32 38 39 45 50 Tage
8255
y5
40
Za
830
S25

RES
LNA

Abb. 5b.

Tabelle VI. Kaninchen schwarz.
Körpergewicht 1800 g. Normaltiere.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
21. 111.21... E 70 4 150 000 7 700
22.11. 5 x 2% 2 74 4 825 000 8 800
23: Ill eu a 0-2. 0 "ek 4 120 000 8 000
ZI IH: ie, Zë ër 12 4 425 000 9 600

26. IIT. 21 Entfernung von Thymus
HEEN EEN 70 4 150 000 9 000
Lisani neag 7l 4 205 000 8 900
SE, ee ee $ 73 4 930 000 10 200
IN: wë A 0 72 4 820 000 10 000
Iye ke eaa 70 4 130 000 9 800

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 39

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
14. IV. 21... .. 71 4 230 000 9 000
TIV a a 72 4 625 000 12 000
19. IV eaae Ae 71 4 325 000 10 100
23. IV Zong d 8 A 71,5 4 240 000 9 100

27. IV. 21 Entfernungder Milzam früherexthymierten Tiere.
BN Ek 4... 9% 70 4 225 000 8 800
DIV os Ee, 71 4 330 000 9 400

BEN... 30.6 e 70 4 025 000 9 000
ER "EE E E 71 4 230 000 8 200
l0: Ve apa iy 72 4 325 000 8 000
E: e, EE EE 71 4 130 000 9 100

Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.

21. III. 21 55,25 36,25 0,75 2,0 2,0 2,75

22. III. „ 59,0 36,0 0,5 0,75 1,0 2,25

23. III. „, 58,0 34,0 0,75 1,75 3,0 2,5

24. III. „ 60,0 34,0 0,5 2,0 1,25 2,25
26. III. 21 Entfernung von Thymus.

30. III. 21 58,75 33,75 0,5 3,0 2,5 1,5
ER 57,75 34,25 0,75 2,25 2,75 2,25
4. IV. „ 59,5 32,25 1,0 2,5 1,75 3,0
Ze IVe 60,75 31,75 0,75 1,5 3,25 2,0
E HK, 5 61,25 30,25 0,5 2,19 2,5 2,75

ef
560
55
350
u
e"

%

leuko
[OR

N
Q

Abb. 6b.

40 G. Matsuno:

Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.
14. IV. 21 62,5 32,75 0,25 1,5 2,0 2,0
17. IV. „ 60,75 31,5 0,5 3,25 1,0 0,25
19. IV. „ 58,5 36,75 0,75 1,75 1,25 1,0
23. IV. „ 59,25 32,25 0,25 2,25 3,0 3,0

27. IV. 21 Entfernung der Milz am früher exthymierten Tiere.

27. IV. 21 59,0 36,0 0,5 0,75 1,5 2,25
29. IV. „ 55,25 39,75 0,5 1,5 1,0 2,0
3. V. e 57,25 34,25 0,5 1,25 2,5 4,25
TV. y 58,0 38,0 0,75 1,0 1,0 1,25
10. V. „ 60,0 34,0 0,75 1,25 2,25 1,75
15.V. ,„ 61,0 33,0 — 2,25 2,0 1,75
Tabelle VII.
Kaninchen schwarz (jung).
Körpergewicht 2400 g. Normalzustand.
Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
7. IV.21..... 70 4 240 000 10 600
Sr $ EES 70 4 120 000 9 000
IL IN, 72 4 325 000 9 600
12:19: wg, e e 74 4 652 000 8 900
EEN e éier a 70 4 560 000 8 400
13. IV. 21 Blutentzug (aus rechter Carotis).
14. IV.21..... 64 3 715 000 10 900
15. IV. - 67 3 725 000 9 100
16. IV. „, 69 4 540 000 12 000
18. IV. „, 71 4 400 000 9 900
19. IV. „ 71 4 230 000 8 300
20. IV. „ 73 4 750 000 9 600
21. IV. - 72 4 430 000 7 600
21. IV. 21 Entfernung von beiden Thymuslappen.
26.IV.21..... 70 4 560 000 8 900
27. IV. „ 13 4 675000 8 000
28. IV. - 12 4 625 000 8 100
30: Va 5. 74 5 250 000 9 600
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc. Myeloc.
7.1V.21 60,25 34,0 0,75 1,0 2,0 2.0 =
8.1V. „ 58,0 34,0 0,75 1,75 3.0 2,5 =
11. IV. „ 59,25 36,25 1,0 25 1,0 _
12. IV. 4, 62,75 32,25 0,5 1,0 2.95 1,25 —
13. IV. e 55,25 37,75 0,25 1,5 2,5 2,75 —

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 41

13. IV. 21 Blutentzug (aus rechter Carotis).
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc. Myeloc.

14. 1IV.21 53,25 40,5 0,5 1,25 2,25 2,25 —
15. IV. „ 49,75 37,5 0,15 2,25 4,5 3,75 1.5
16. IV. „ 48,75 43,25 0,25 1,5 3,0 2,25 1,0
18. IV. „ 51,5 40,75 — 1,5 3,0 2,25 1,25
19. IV. „ 63,0 30,5 0,5 1,25 2,25 1,75 0,75
20. IV. „ 60,0 34,0 — 1,25 2,25 2,0 0,25

21. IV. „ 60,95 32,0 0,75 2,25 3,25 1,0 —
21. IV. 21 Entfernung von Thymus.

26. IV.21 54,75 39,0 0,5 1,5 2,75 1,5 —
27. IV. „ 56,0 33,5 1,0 3,25 3,0 3,25 —
28. IV. „ 58,0 33,5 0,5 2,75 3,75 1,5 —
30. IV. „ 59,25 31,75 0,5 2,5 4,25 1,75 —
Schwarzfleck.
Körpergewicht 2400 g. 1. V.21 Blutentzug.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.

EV 21 5 42 0% 70 4 430 000 9 000

EECH 67 3 630 000 10 500

n P up e 69 3 825 000 9 100

NEEN 70 3 985 000 10 200

Vans, Wehe en 73 4 605 000 10 200

TVo Sat ee 73 4 445 000 10 000

Ee ETS 73 4 375 000 10 600

7 Zeg 56 7 8 H GO WG WM MI 20 21 24 25 26 27 283 30 31 33

$. = Rare
R | EE CEET
N

>

E

D

Abb. Tb.

42

G. Matsuno:

Körpergewicht 2400 g. 1. V.21 Blutentzug. Thy muslos.
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc. Myeloc.

1. V. 21 60,5 31,0 1,25 2,25 2,25 2,75 —
e, E 53,5 39,25 0,5 1,75 2,0 2,75 0,5
3. V. p» 57,75 33,5 0,75 1,25 3,0 2,0 1,5
4.V. „ 56,25 35,5 0,5 2,25 2,75 2,5 20,25
6: V: y 53,75 37,5 1,0 1,5 3,0 3,25 —
Ze Vea 59,5 34,0 0,5 1,5 2,5 2,0 —
NV. 5 53,5 38,5 0,5 1,75 3,25 2,5 —

Cyanwasserstoff. I.
Einfluß von Cyanwasserstoff auf Kontroll- und Versuchstiere.

Es ist bekannt, daß der Sauerstoffmangel ein Mittel ist, die blutbilden-
den Organe zu erregen. Dieser kann auf verschiedene Weise erzeugt werden.
Hier wurde die experimentelle Dyspnöe durch das Cyan hervorgerufen.
Ich wurde speziell auf dessen Verwendung geführt, weil sowohl Mansfeld
als auch Sollberger sich seiner u. a. bedient haben. Durch die Blausäure
wird der normale Gaswechsel im Körper zerstört. Das Blut, das die Capil-
laren passiert, gibt nicht wie sonst seinen Sauerstoff ab, sondern behält
auch in den Venen je nach der zugeführten Dosis mehr oder weniger seine
hellrote Farbe. Die Gewebe sind wahrscheinlich durch Fermentlähmung
nicht mehr imstande, den Sauerstoff in normaler Weise aufzunehmen.

In Form von Acqua amygdalarum amarum kann Cyanwasserstoff
genau dosiert werden, und deshalb wurde auch hier dieses Präparat benutzt.
Acqua amygdalarum amarum enthält 0%, HCN. Der Cyanwasserstoff wirkt
auch auf das Knochenmark vorübergehend sauerstoffentziehend. Da nun
einerseits der Bestand besonders der roten Blutkörperchen durch eine sehr
feine Regulation ziemlich konstant erhalten wird, da der Untergang roter
Blutkörperchen selber einen Reiz für das erythroplastische System dar-
stellt, wir aber andererseits gesehen haben, daß sowohl die Milz als auch
die Thymusdrüse einen Einfluß auf dieses System haben, erschien es inter-
essant, den Sauerstoffmangel als Reiz zu benutzen, um so mehr als die
Mansfeldsche Arbeit direkt den Angriffspunkt des Sauerstoffmangels
für die Wirkung auf das Knochenmark in die Schilddrüse verlegt hatte.

Es ist aber vielleicht zunächst vorsichtiger, um nichts zu präjudizieren,
die Fragestellung neutraler zu fassen und sie in folgender Weise zu stellen:
Wie reagiert das Blutbild eines normalen Tieres, eines thymuslosen, eines
milzlosen und eines doppeltoperierten Tieres auf geringe Mengen Cyan-
wasserstoff ?

Wie schon oben erwähnt, wurde Acqua amygdalarum amarum benutzt.

Tabelle I. Kaninchen, silberfarbig.
Körpergewicht 1800 g Normaltiere.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
IE EE Er a EI 4 130 000 9 800
Se AN aan e e a d 4 330 000 9 000

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark.

Datum Lymphoc.

26. IV. 21 57,75
27. IV. „ 58,75
29. IV. „ 59,0
30. IV. - 58,5
IV. 5

42,25

43,0

Abb. 8a.

43

Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.

50

Abb. Sb.

70 4 205 000 8 700
12 4 430 000 10 000
SE Injektion von 1 mg HCN
5 Stunden nach der Injektion
55 2.060 000 13 000
10 Stunden nach der Injektion
60 2 700 000 12 000
30 Stunden nach der Injektion
65 3 005 000 10 700
60 Stunden nach der Injektion
70 4 005 000 10 000
Nach 3 Tagen
eg, TL 4 230 000 8 500
||; 4 125 000 9 100
Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.
32,75 0,75 2,25 2,75 3,75
35,25 — 1,5 1,75 2,75
37,0 0,75 1,25 1,0 1,0
33,25 0,5 2,25 3,25 2,25
Injektion von Img HCN
5 Stunden nach der Injektion
49,5 0,5 1,5 2,0 4,25
10 Stunden nach der Injektion
47,25 0,25 1,5 4,0 4,0
30 Stunden nach der Injektion
43,75 0,75 2,0 3,5 3.0
60 Stunden nach der Injektion
36,25 0,5 1,5 3,5 2,5
Nach 3 Tagen
36,5 0,5 1,5 1.0 ZA
35,25 0,5 2,5 2,0 2,3

rach Zb oh 30h 62A 3727n

44 G. Matsuno:

Tabelle II.
Normalkaninchen.
Körpergewicht 2200 g. Normalkaninchen.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
3.1.21..... 74 4 640 000 8 000
DI: er wei 13 4 400 000 11 000
BIr 35.3 2.0.00 75 4 825 000 8 000
DI. ee 75 4 775 000 9 800

Injektion von Img HCN

5 Stunden nach der Injektion

62 3 645 000 10 500
10 Stunden nach der Injektion
66 3 850 000 9 900
30 Stunden nach der Injektion
71 4 225 000 10 200
60 Stunden nach der Injektion
73 4 521 500 10 000
5 Tage nach der Injektion
73 4 400 000 8 600
8 Tage nach der Injektion
72 4 235 000 10 200
| Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.
3.1.21 5925 310 050435 1,75 30
3.1. „ 60,25 31,5 0,25 2,0 4,0 2,0
8.11. „, 57,25 34,75 1,0 1,75 3,25 2,0
9. II. 58,0 34,0 5,0 2,75 3,75 1.0

Injektion von 1 mg HCN

5 Stunden nach der Injektion

52,25 39,75 0,75 2,25 2,25 2,75
10 Stunden nach der Injektion

58,25 33,75 0,25 3,0 2,0 2,75
30 Stunden nach der Injektion

59,0 325 0,5 2,5 3,5 2,0
60 Stunden nach der Injektion

58,25 32,75 0,5 1,75 3,5 3,25

5 Tage nach der Injektion

14. IT. 21 60.25 32,0 0,25 1,75 3,0 2,75
(rg E SEH 59,75 32,75 — 3,25 1,75 2,5

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark.
80
„65
so 70
Ce
€
50
g 60
Ces dee
nach 5% 10" 30" 60" Slagen
Abb. 9b.
Tabelle III.
Kaninchen, grau.
Körpergewicht 2400 g. Thymuslos.
Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
7. III. 21 75 4 835 000 8 900
11. III. - 73 4 425 000 9 600
15. III. „, 74 4 625 000 10 100
17. III. „ 73 4 465 000 H 700
Injektion von Img HCN
5 Stunden nach der Injektion
70 4005 000 . 12 000
10 Stunden nach der Injektion
72 4 170 000 10 100
30 Stunden nach der Injektion
74 4 625 000 8 000
60 Stunden nach der Injektion
72 4 250 000 8 800
5 Tage nach der Injektion
22. III. 21 75 4 820 000 7 700
24. III. „ 74 4 700 000 7 900
26. III. „ 75 4 950 000 8 500
29. III. „ 74 4 780 000 9 500
31. III. „ 75 4 850 000 8 700
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.
7. III. 21 60,0 32,25 0,75 3,25 2,0 3,75
11. III. „ 61,0 31,75 1,0 2,75 2,5 1,0
15. III. „, 58,75 33,25 0,75 2,0 2,5 2,5
17. III. „ 59,25 34,5 0,75 1,75 2,0 1,75
Injektion von Img HCN
5 Stunden nach der Injektion
58,0 36,75 0,25 1,5 1,25 2,25
10 Stunden nach der Injektion
58,75 32,25 0,75 2.25 2,50 3,5

46 G. Matsuno:

30 Stunden nach der Injektion
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.

62,0 33,25 1,0 2,5 0,5 1,0
60 Stunden nach der Injektion
61,25 30,25 0,5 1,25 3,75 3,0
5 Tage nach der Injektion

22. III. 21 63,25 30,0 0,75 1,5 2,25 2,25
24. UL „ 62,25 27,75 0,5 2,0 3,5 4,0
26. III. „ 55,75 36,25 0,75 1,25 3,0 3,0
29. III. „ 61,0 32,75 0,75 1,25 2,25 2,0
31. III. ,, 59,25 30,5 1,5

70
Ze
269
Bas

50

u5

E
St
E

©
SÉ

Abb. 10a.. Abb. 10b.

Tabelle IV.
Kaninchen, grau.
Körpergewicht 2100 g. Thymuslos.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
Iy 21.3.5 een, 272 4 525 000 9 200
13... Ee: 4 825 000 9 800
VE Ma mei 2.8 der %: 92 4 435 000 10 100
URN ee ae A 4 830 000 9010
Bb ag, RE TA 5 130 000 8 600
Dee. are ee a Injektion von Img HCN

5 Stunden nach der Injektion

67 4 205 000 12 000

10 Stunden nach der Injektion

OU 4.330 000 10 100

30 Stunden nach der Injektion

13 4940 OW) 8 700

60 Stunden nach der Injektion

15 5010 000 8400

Nach 3 Tagen

Me Ne We ee 4.430 000 9 200
DIN g re E 4 120 000 9000
KE 13 4525 000 9 800

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knochenmark. 47

Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Moncoc.

11. V. 21 60,0 32,25 0,5 3,5 2,25 3,5
15.V. „, 59,5 33,25 0,75 2,75 2,0 1,75
18.V. „ 58,75 33,0 0,75 2,25 3,0 2,0
20.V. „ 59,75 35,0 0,25 2,0 2,5 1,0
23. V. 55 56,0 33,5 0,1 3,25 3,0 3,25
25.V. „ Injektion von 1 mg HCN
5 Stunden nach der Injektion
56,25 35,75 0,5 2,5 2,75 2,25
10 Stunden nach der Injektion
58,75 32,25 0,75 3,0 2,25 4,0
30 Stunden nach der Injektion
59,5 32,0 0,5 3,5 2,5 2,0
60 Stunden nach der Injektion
57,75 33,25 0,5 2,75 2,5 3,25
Nach 3 Tagen
28. V. 21 60,75 31,5 0,25 2,75 2,0 2,75
29. V. 5 59,25 32,75 0,5 3,75 1,25 2,5
T. VL ,„ 59,25 31,0 0,75 4,25 1,75 3,0
80

Abb. ila. Abb. 11 b.
Tabelle V.
Kaninchen, grau.
Körpergewicht 1950 g. Milzlose und exthymierte Tiere.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
26.19.21 co a 70 4 430 000 12 000
7AN A E 5 71 4 125 000 11 800
28. TV: ua 69 4 130 000 9 600
ZU. IV le Ae 2 Ze 7l 4 400 000 9 900
LS KEEN Injektion von Img HCN

5 Stunden nach der Injektion
70 4 225 000 8 900
10 Ntunden nach der Injektion
70 4 120 000 9 600

48 G. Matsuno:

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
30 Stunden nach der Injektion
72 4 430 000 9 500
60 Stunden nach der Injektion
73 4 640 000 9 800
Nach 3 Tagen
3:19.21. a 00° 4 325 000 9 700
EN e re 22 4 120 000 10 100
EN a 5 228 a a 4 825 000 9 600
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. (berg. Monoc.
26. IV. 21 54,75 35,75 0,75 2,25 2,75 3,75
27. IV. „ 58,0 34,0 0,75 1,75 3,0 2,5
28. IV. „ 55,75 38,25 -— 1,5 1,75 2,75
29. IV. „ 57,5 37,0 0,5 2,0 1,5 1,5
30. IV. - Injektion von Img HCN
5 Stunden nach der Injektion
55,25 36,0 0,75 2,0 3,25 2,75
10 Stunden nach der Injektion
56,0 35,0 1,0 2,0 3,25 2,75
30 Stunden nach der Injektion
57,0 35,25 0,75 1,75 2,25 3,0
60 Stunden nach der Injektion
55,0 36,0 0,75 2,5 4,25 1,5
Xach 3 Tagen
3. V. 21 60,0 34,0 0,75 1,0 2.25 2,0
4.V. „ 57.5 35,0 0,25 1,5 2.20 1,5
En, NEE 8,0 38,25 0,75 0,75 1,0 1,75

307 6904 3 Tagen
Abb. 12a. Abb. 12b.

Tabelle VI. Kaninchen. schwarz.
p]

Körpergewicht 1800 g. Milzlose und exthymierte Tiere.

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
Aal we it Suë SCH 4 230 000 8 200

10, Na Zë ei. D 4 325 000 8 000

Beziehung zwischen Thymus, Milz und Knocheninark. 49

Datum Hämoglobin Erythrocyten Weiße Blutkörp.
IS N. ei e 71 4 130 000 9 100
20. V. po a Injektion von 1 mg HCN
5 Stunden nach der Injektion
70 4 225 000 8 900
10 Stunden nach der Injektion
71 4 310 000 9 600
30 Stunden nach der Injektion
72 4 825 000 8 000
60 Stunden nach der Injektion
72 4 405 000 8 700
Nach 3 Tagen
23 V 2E ue a 72 ` 4 640 000 9 000
BON: ee nee y 71 4 330 000 9 600
DTe Veg ra ge 71 4 130 000 10 100
Datum Lymphoc. Neutr. Eosino. Basophil. Überg. Monoc.
7. V. 21 58,0 38,0 0,75 1,0 1,0 1,25
10. V. „ 60,0 34,0 0,75 1,25 2,25 1,75
15. KG 61,0 33,0 — 2,25 2,0 1,75
20.V. „ Injektion von Img HcN
i 5 Stunden nach der Injektion .
57,75 37,25 0,75 2,25 1,25 0,75
10 Stunden nach der Injektion
59,25 34,5 0,5 3,0 1,75 1,0
30 Stunden nach der Injektion
58,75 33,0 1,0 2,0 2,75 2,5
60 Stunden nach der Injektion
60,0 35,75 0,75 1,5 1,0 1,0 `
Nach 3 Tagen
23. V. 21 59,25 34,25 0,75 1,75 2,0 2,0
29: Va ah 57,5 36,0 0,75 ; 2,0 1,75 3,0

Se Vep 58,75 37,0 0,5 0,75 1,5 1,5

EE

Seet 2
nach 5A JOR 30% 60% 3 Tagen
Abb. 13a. Abb. 18b.

Biochemische Zeitschrift Band 123. A

50 G. Matsuno: Beziehung zwischen Thymus usw.

Literatur.

Asher und Dubois, diese Zeitschr. 82. — Asher und Hermann
Messerli, diese Zeitschr. 9%, 1 u. 2. — Waser, Alois, Zeitschr. f. Biol.
71. — Aschoff, Pathologische Anatomie, 1919, S. 180. — Biedl, Arthur,
Physiologie der Thymus (innere Sekretion). 2. u. 3. Aufl. — Friedleben,
Die Physiologie der Thymusdrüse in Gesundheit und Krankheit vom Stand-
punkte experimenteller und klinischer Erforschung. — Krause, Die
Anatomie des Kaninchens, Leipzig. — Klose und Vogt, Klinik und Bio-
logie der Thymusdrüse. Bruns Beitr. z. klin. Chirurg. 69. 1910. — Fischer,
Experimentelle Beiträge zur Frage der Bedeutung der Thymusexstirpation
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1912. — Matti, Die Altersveränderung der Thymusdrüse beim Kaninchen.
Arch. f. mikroskop. Anat. 73. 1909. Zit. — Naegeli, Blutkrankheiten
und Blutdiagnostik 1919. — Sahli, Klinische Untersuchungsmethode. —
Söderlund und Backmann, Studien über die Thymusinvolution. —
Weidenreich, Die Leukocyten und verwandte Zellformen. — Tongu,
Über die Funktionen der Thymusdrüse vom Standpunkte ihrer Ausfalls-
erscheinungen. Mitt. a. d. med. Fak. d. kais. Univ. zu Tokio 15, H. 3. 1917.
— Tongu, Beiträge zum Exstirpationsversuch der Thymus bei Hunden.
Mitt. a. d. med. Fak. d. kais. Univ. zu Tokio 17, H.3. 1919.

Über die Einwirkung von Metallen auf Sera.

I. Serumfällung durch Metalle.
U. Komplement und Metallwirkung.
IM. Keimtötung im Serum. (Ein chemotherapeutischer Versuch.)

Von
Leo Hess und Rudolf Reitler.

(Aus der III. Medizinischen Klinik der Universität in Wien.)

(Eingegangen am 10. Juli 1921.)

I.

Werden Aufschwemmungen von roten Blutkörperchen in
geeigneter Konzentration in isotonische Kochsalzlösungen, welche
vorher durch bestimmte Zeit mit Metallen in Kontakt gestanden
waren, eingetragen, so erfolgt Hämolyse, deren Bedingungen und
Gesetzmäßigkeiten in einer vorhergehenden Mitteilung!) erörtert
wurden. Werden die Erythrocyten statt in Kochsalzlösung in Serum
suspendiert, so hemmt dieses die Hämolyse, ebenso bleibt dieselbe
aus, wenn nicht ,,Metall-Kochsalzlösung“, sondern ‚‚Metall-Serum“
zur Suspension verwendet wird. Bei der letztgenannten Versuchs-
anordnung konnten Fällungen des Serums durch das Metall
festgestellt werden, deren Bedingungen nachzugehen uns von
Interesse erschien, da wir in ihnen den Schlüssel für die Erklärung
der erwähnten Hemmung der Hämolyse vermuteten. Inzwischen
haben diese Studien weitere interessante Befunde ergeben, die
aus 2 Gründen der Mitteilung wert sein mögen: Fürs erste ergab
sich eine Ausfällbarkeit von Serumeiweiß mit Hilfe von blanken
Metallen, die ganz eigenartigen Gesetzen folgt. Diese physikalisch-
chemische Zustandsänderung des Serums durch Metalle dürfte,

1) L. Hess und R. Reitler, Über Hämolyse durch oligodynamische
Metallwirkung. Med. Klin. 1920, Nr. 38.
A

52 L. Hess und R. Reitler:

wie wir im folgenden zeigen werden, von Bedeutung sein für unsere
Auffassung des Komplements frischer Sera. Endlich haben uns
diese Experimente einen Weg zur therapeutischen Anwendung
der oligodynamischen Metallwirkung gewiesen, der bisher nicht
beschritten wurde und der, soweit unsere Eprouvettenversuche
einen Schluß gestatten, aussichtsreich erscheint.

Das Mengenverhältnis zwischen Serum und Metall betrug
stets l ccm Serum auf 1l qcm Metalloberfläche. Beiden im
folgenden mitgeteilten Versuchen wurde als Paradigma für
die Fällung durch Metalle Kupfer verwendet, jedoch stehen
uns analog verlaufende Kontrollversuche mit anderen Metallen
zur Verfügung.

Blanke Metallstreifen unter aseptischen Bedingungen in
unverdünntes natives Serum gebracht, rufen nach einigen Tagen
bei Null Grad oder Zimmertemperatur Niederschläge hervor.
Die Niederschläge sind von weißlicher Farbe, grobflockig und
haften an der Metalloberfläche, in Lipoidlösungsmitteln sind sie
unlöslich. Bei längerem Stehen steigert sich die Menge des Nieder-
schlages, schließlich tritt überdies infolge von Bildung des lös-
lichen Kupferalbuminates eine grünliche Verfärbung der ganzen
Flüssigkeit auf. Der Versuch, statt mit konzentriertem mit
verdünntem Serum angestellt, ergibt ein überraschendes Resultat.
Es erfolgt in den verdünnten Seris die Ausfällung rascher als in
den unverdünnten, bei höhergradiger Verdünnung (5—10%)
makroskopisch schon nach wenigen Minuten, während die Aus-
fällung höher konzentrierter Sera längere Zeit erfordert. Dabei
verdient hervorgehoben zu werden, daß kein strenger Parallelismus
zwischen Serumkonzentration und der zur Ausfällung notwendigen
Zeit besteht, da stark verdünnte Sera unverhältnismäßig rascher
ausgefällt werden als konzentriertere. Als Beispiel diene folgender
Versuch:

Menschliches Serum wird zu 10%,, 15°,, 20% usw. mit
physiologischer NaCl-Lösung verdünnt, mit Kupfer versetzt und
im Eisschrank stehengelassen; nach 2 Stunden beobachtet man
Ausfällungen bloß bei 10 und 15%,, nach 24 Stunden ist die
Fällung bis zu 30°, Verdünnung vorgeschritten. Die Grünfärbung
durch Kupferalbuminat tritt auch bei verdüünnten Seris erst nach
einigen Tagen auf. — Die besprochenen Niederschläge werden
nur beobachtet bei Kontakt des blanken Metalls mit dem Serum;

Einwirkung von Metallen auf Sera. 53

„Kupferwasser“, d. h. mit Kupfer vorbehandelte NaCl-Lösung
erzeugt auch im stark verdünnten Serum keine Fällung —
Durch mikroskopische Beobachtung des Fällungsvorganges konn-
ten wir uns überzeugen, daß die Fällung bei niedrigerer Konzen-
tration augenblicklich eintritt, wobei der Niederschlag selbst
kompakter erscheint bei Verwendung von etwas höherer Serum-
konzentration, während verdünntere Sera lockerer ausfallen.
Diese Beobachtung erscheint uns deshalb nicht unwichtig, weil
sie die oben erwähnte langsamere Fällung höherer Serumkonzen-
trationen verständlich macht. — Oxydiertes Kupfer bewirkt
weder makroskopisch noch mikroskopisch nachweisbare Fällung.

Unterwirft man Sera in verschiedenen Konzentrationen der
Metallwirkung, so zeigt sich, daß unter sonst gleichen Bedingungen
die Fällungsgrenze frischer Sera bei höheren Konzentrationen
gelegen ist als diejenige älterer Sera. Die Fällbarkeit geht
also bei längerem Stehen des Serums zurück. Die Ver- .
suche wurden derart angestellt, daß menschliches Serum, steril
aufbewahrt, an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen in einer
von 5 zu 5 steigenden Konzentrationsreihe der Metallfällung
unterworfen wurde. Dabei ergab sich, daß die mit der Zeit ein-
tretende Abnahme der Fällbarkeit von der Konzentration, in
welcher das Serum aufbewahrt wurde, unabhängig ist.

Versuch: Menschliches Serum wird A. konzentriert, B. in 50 proz.
Verdünnung steril im Eisschrank aufbewahrt und an 4 aufeinanderfolgenden
Tagen ausgefällt. Ablesen nach 24 Stunden Eisschrank.

A. 12 36 60 84 Stunden nach Entnahme d. Serums
Höchste fällb. Kon-
zentration in Proz. 20 20 15 15

B. 12 36 60 84 Stunden nach Entnahme d. Serums
Höchste fällb. Kon-
zentration in Proz. 40 40 30 30

Die Fällungsgrenze des frischen Serums und der Rückgang
der Fällbarkeit nach längerem Stehen variieren individuell. Für
die erstere mag der Eiweißgehalt des Serums von Bedeutung
sein, der letztere ist, wie der eben erwähnte Versuch lehrt, hiervon
unabhängig.

Unsere Beobachtungen über die maximale Fällbarkeit des
Serums verschiedener Kranker und deren Rückgang ergaben

folgende Zahlen:

54 L. Hess und R. Reitler:

Höchste nach 12 Stdn. Eisschrank noch
ausgefällte Serumkonzentration

Nummer Diagnose 12 Stdn. 80 Stdn.
nach Entnahme
l. inkomp. Vit. cordis 20°, 1529
2. a e y 20. l5,
3. Ca ventriculi 40 „ 30,
4. Neurasthenie 20. =
5. Ca ventr. 40 „ 30 „
6. Aneurysma aortae 15, =
7. Gonorrhöe 20 ,, 15 „
8. Trigem. Neuralgie 20 „ ==
9. Subphr. Absceß 15, =
10. Ca pancreatis 30 „ 29.4
ll. inkomp. Vit. cordis 20 „ =
12. Scleros. multipl. 15 „, =
13. Ule. ventr. (Ca?) E IER
14. Gesund 20 „ ES
15. Enterit. ulcer. (Ca recti?) 35 —
16. Alte Hemiplegie ID. =
17. kardiale Insuff. (Stauung) 25, —
18. Neurose 20. 15 „,
19. Poliomyelit. ant. acut. 20 „ =
20. Ca vesic. felleac 30 „ =
21. Vit. cordis 20 „ 10 „
22. Cirrhos. hepatis 15 „ =
23. Vit. cord. (subfebril) 10 „ =
24. Nephritis (leicht. Ödem) 20. 15 „
25. Hochgrad. kard. Stauung 203 15 „
26. Apicitis, Lues latens 20 „ 10,
27. Kard. Insuff. hochgrad.
Stauung 15., =

Ein Urteil über eine diagnostische Verwertbarkeit dieser
Untersuchungsmethode kann wohl erst aus einer großen Zahl
von Untersuchungen gewonnen werden, nachdem vorerst der
Einfluß physiologischer Vorgänge auf das Verhalten des Serums
in der in Rede stehenden Bezichung festgestellt worden ist. Doch
wäre eine solche Verwertbarkeit — der absoluten Fällungs-
grenze im Zusammenhalt mit dem jeweiligen Eiweißgehalt des
Serums oder des Rückganges der Fällbarkeit für sich allein —
a priori nicht unwahrscheinlich. Jedenfallsistdiedeutlich
erhöhte Fällbarkeit des Serums Carcinomatöser
bemerkenswert und fordert zu weiteren Unter-
suchungen nach dieser Richtung hin auf.

ot
St

Einwirkung von Metallen auf Sera.

Il.

Es erhebt sich nun die Frage nach dem Grund der Abnahme
der Fällbarkeit bei längerem Stehen des Serums. Die einzig
bekannte Veränderung, welche Sera schon bald nach ihrer Ge-
winnung erleiden, ist die Verminderung resp. der Verlust ihrer
komplettierenden Fähigkeit bei Immunitätsversuchen. Wir sahen
uns daher veranlaßt, native, komplementhaltige und inaktivierte,
durch halbstündiges Erwärmen auf 56° ihres Komplements
beraubte Sera hinsichtlich ihrer Fällbarkeit miteinander zu ver-
gleichen.

A. Menschliches Serum wird sofort nach der Entnahme zum
Teil inaktiviert, zum Teil aktiv in steigenden Konzentrationen
wie oben der Fällung unterworfen. Ablesen nach 2 und 24 Stunden
Eisschrank.

2 Stdn. 24 Stdn. Kontaktdauer
Fällungsgrenze aktiv 15% 30%
e inaktiv 15 „ 25 ,

B. Versuchsanordnung wie oben. Die Differenz in den
Serumkonzentrationen beträgt jedoch bloß 1%. Ablesen nach
24 Stunden Eisschrank.

Fällungsgrenze aktiv 32%,
5 inaktiv 25,

Inaktivierte Sera sind somit schwerer fällbar als
aktive. Am klarsten tritt dieser Unterschied zutage, wenn die
Kontaktdauer zwischen Serum und Metallwasser etwa 24 Stunden
beträgt. Nach 48stündigem Kontakt ist der Unterschied wieder
verschwunden, wie folgender Versuch zeigt:

Versuchsanordnung wie oben, jedoch längere Kontaktdauer.

Kontaktdauer
12 Stdn. 24 Stdn. 36 Stdn. 48 Stdn.
Fällungsgrenze aktiv 20% 20%, 2595 25%
H inaktiv IER 15 „, 20 „ 25,

Eine Bedingung für die Abnahme der Fällbarkeit des Serums
bei längerem Stehen ist daher in dem Verschwinden des Kom-
plements zu suchen; daß aber außerdem noch andere Faktoren
mitspielen, beweist der Umstand, daß auch inaktives Serum bei
längerem Stehen in seiner Fällbarkeit zurückgeht.

A. Aktives Serum wird 1. eine Stunde, 2. 24 Stunden,

3. 48 Stunden nach Entnahme in üblicher Weise der Fällung

56 L. Hess und R. Reitler:

unterworfen. Ablesung nach 12, 24, 36 Stunden Eisschrank. Die
Fällungsgrenze beträgt:

12 Stdn. 24 Stdn. 36 Stdn.

1 Stunde nach Entnahme 20% 25% 35%
24 Stunden ,, se 15 „ 20 „ 35 „
48 99 99 LE) 10 LA) 20 LE 25 LA)

B. Ein Teil desselben Serums inaktiviert wird analog be-
handelt. Hierbei beträgt die Fällungsgrenze:

Kontaktdauer
12 Stdn. 24 Stdn. 36 Stdn.
l Stunde nach Entnahme 20% 20% 30%
24 Stunden ` Ge LP. 20 „ 30 „
48 S Ge i 10 „ 20. 25 „

Weiter geht aus diesem Versuch hervor, daß der Unterschied
zwischen aktivem und inaktivem Serum um so früher auftritt,
je frischer das Serum ist und nach 48 Stunden gänzlich
schwindet.

In den vorstehenden Versuchen wurde stillschweigend die
Annahme gemacht, daß die einzige derzeit nachweisbare Ver-
änderung, welche Sera durch Stehenlassen unter aseptischen
Bedingungen, sowie durch das Erwärmen auf 56° erleiden, im
Verschwinden des sog. Komplements bestehe und daher die
Abnahme der Fällbarkeit der Sera durch Metalle nach längerem
Stehen oder Erwärmen mit diesem Komplementverlust in Be-
ziehung gebracht werden müsse. Eine Stütze für diese Annahme
scheint uns folgende Versuchsanordnung zu bieten: Der Zusatz
einer geringen Menge von frischem, komplementfreiem Serum
(Meerschweinchen) zu inaktiviertem Menschenserum verbürgt
die Gegenwart von Komplement, ohne den Eiweißgehalt wesent-
lich zu verändern. Würde unserer bisherigen Annahme ent-
sprechend zwischen Fällbarkeit und Komplementgehalt des
Serums ein Konnex bestehen, so würde der eben erwähnte Zusatz
die Fällbarkeit des inaktiven Serums steigern müssen. Der
folgende Versuch bestätigt diese Voraussetzung:

Frisch gewonnenes Menschenserum wird zum Teil inaktiv,
zum Teil aktiv belassen, einer dritten inaktiven Portion wird
2/, frisches Meerschweinchenserum zugesetzt, jede Portion wird
nun wie üblich der Fällung unterworfen. Ablesung nach 24 Stun-
den Eisschrank.

Einwirkung von Metallen auf Sera. 57

Letzte Fällung bei: 34%, aktiv,

27 „ inaktiv,
29 „ reaktiviert.

Daß die durch Zusatz von 2% Meerschweinchenserum be-
wirkte geringfügige Veränderung des Eiweißgehaltes nicht maß-
gebend ist für die Änderung der Fällbarkeit, lehrt der Kontroll-
versuch, in welchem unter sonst gleichen Bedingungen der Zusatz
von 2% inaktivem Meerschweinchenserum zum gleichen inaktiven
Menschenserum keine Änderung der Fällbarkeit hervorrief.

Letzte Fällung bei: 34% aktiv,

26 ,„, inaktiv,

26 ,, inaktiv + inaktivem Meerschweinchen-
gerum,

30, reaktiviert.

Wir glauben uns somit zu dem Schlusse berechtigt:

Der bisher nur im biologischen Versuch zutage
tretende Unterschied zwischen nativem und er-
wärmtem oder stehengelassenem Serum, das sog.
Komplement, hat sein physikalisch-chemisches
Seitenstück im differenten Verhalten gegenüber
der fällenden Wirkung blanker Metalle Komple-
"menthaltige Sera sind leichter fällbar als komple-
mentfreie. |

In dem vorhergehenden Abschnitt wurde gezeigt, daß die
Niederschlagsbildung durch blankes Metall in komplement-
haltigem Serum bei gleicher Kontaktdauer bis zu höheren Kon-
zentrationsgraden fortschreitet als in komplementfreiem. Es fällt
somit dem Komplement eine gewisse Rolle bei der Ausfällung zu,
sei es, daß die Fällung im allgemeinen begünstigt, sei es, daß
die Differenz der Fällungsgrenzen zwischen aktivem und inaktivem
Serum durch ausgefälltes Komplement selbst hervorgerufen wird.
In beiden Fällen muß eine innigere Beziehung zwischen Komple-
ment und Metall angenommen werden, und es entsteht die
Frage, ob bei Bestehen einer solchen Beziehung die komplettierende
Eigenschaft des aktiven Serums in irgendeiner Weise beeinflußt
werde. Zur Erörterung dieses Problems wäre ein doppelter Weg
möglich gewesen: Es konnten blanke Metallstreifen mit dem zu
prüfenden Serum stehengelassen und dieses sodann auf seine
komplettierende Fähigkeit geprüft werden; oder aber war aktives

58 L. Hess und R. Reitler:

Serum in abgestufter Konzentration mit Kochsalzlösung, welche
mit Kupfer vorbehandelt worden war, zu mischen und hierauf
die in Rede stehende Auswertung durchzuführen. Wir wählten
die letztere Alternative, da bei der erstgenannten Versuchsordnung
quantitativ unkontrollierbare Serumveränderungen verschiedener
Art (Änderungen des Eiweißgehaltes usw.) infolge der beschriebe-
nen Fällung den Versuch beeinträchtigt hätten, während die
Mischung von Serum mit Kupfer-Kochsalzlösung, wie erwähnt,
keinen Niederschlag gibt. Die Kupfer-Kochsalzlösung war stets
derart hergestellt, daß Leem Flüssigkeit auf lqcm Kupfer-
oberfläche 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen
worden war.

1. Komplement wird 1: 20 mit Kupferwasser verdünnt durch 6 Stunden
stehengelassen, sodann zu einem hämolytischen System mit fallenden
Komplementmengen aufgefüllt. Zur Vermeidung der Kupferhämolyse,
welche übrigens stets erst nach mehrstündiger Latenzzeit eintritt, wird
überall gleichviel inaktiviertes Pferdeserum zugesetzt. Schließlich wird
zur Herstellung vollständig gleicher Bedingungen überall die entsprechende
Menge NaClI-Lösung hinzugefügt. Ablesung nach !/, Stunde Brutschrank.

Gekupfertes Meerschweinchenserum Lysis
0,1 ccm . | komplett
0,08 „ ge
0,06 , nn
0,04 „ LEI
0,02 „ inkomplett
Natives Meerschweinchenserum Lysis
0,1 ccm komplett
0,08 „ "
0,06 , >
0,04 39 ??
0,02 ,, =

2. Komplement wird 1: 50 mit Kupferwasser verdünnt und in gleicher
Weise behandelt. Ablesung nach 2 Stunden Brutschrank.

Gekupfertes Meerschweinchenserum Lysis

0,14 ccm komplett
0,12 — H

0.10 ,, ss

0,08 ,, e

0,06 ,, Aë

0,04 , sé

0,02 — inkomplett
0,01 „ kompett

0,005 ,, d

Einwirkung von Metallen auf Sera. 59

Natives Meerschweinchenserum Lysis
0,l4 cem > komplett
0,12 „ 5
0,10 , »
0,08 „ FF
0,06 ,, »
0,04 „ e
0,02 „ ze
0,01 „ ER
0,005 ,„ inkomplett
0,0025 ccm wë
0,0013 ,„, 0

3. Komplement wird 1:100 mit Kupferwasser verdünnt und in
gleicher Weise behandelt. Ablesung nach 2 Stunden Brutschrank.

Gekupfertes Meerschweinchenserum Lysis
0,05 ccm 0
0,04 , 0
0,03 , 0
0,022 , 0
0,01 „ 0
0,005 , 0
0,0025 ‚, 0

Natives Meerschweinchenserum Lysis

0,05 ccm komplett
0,04 „ sn
0,03 „ »
0,02 ,, zs
0,01 „ e
0,005 ,, sn
0,0025 cem i3
0,001 ,, inkomplett
0,0005 ,, Spuren
0,00025 ,„ 0

4. Komplement wird mit Kupferwasser 1 : 100 verdünnt, geschüttelt
und sofort mit Erythrocyten und Amboceptor in den üblichen Mengen-
verhältnissen versetzt und durch 2 Stunden im Brutschrank belassen:
Komplette Hemmung. — Die Kontrolle, d. i. ungekupfertes Komplement
1 : 100 verdünnt, ergibt komplette Lysis.

Es ergibt sich somit aus den mitgeteilten Versuchen, daß
in einem hämolytischen System, dessen Komple-
ment der Kupferwirkung ausgesetzt war, die Lysis
unterbleibt. Die komplettierende Eigenschaft des aktiven
Serums geht also unter den angeführten Versuchsbedingungen
verloren, wenn die oben supponierte Beziehung zwischen Serum

60 L. Hess und R. Reitler:

und Metall hergestellt wird. Dabei konnten wir eine obere Grenze
der Komplementkonzentration feststellen, bis zu der die Zerstö-
rung des Komplements praktisch vollständig ist (Versuch 3),
während bei Anwendung höherer Konzentrationen die Lysis nur
unvollständig gehemmt wird. Da in allen diesen Versuchen die
Amboceptormenge stets die gleiche war, kommt als Angriffspunkt
der Metallwirkung aller Wahrscheinlichkeit nach nur das Kom-
plement in Frage. Immerhin bleibt zu erörtern, ob nicht auch
die anderen Glieder des hämolytischen Systems eine Änderung
durch das Metallwasser erfahren.

5. 0,05 ccm einer 20 proz. Aufschwemmung von Hammelerythrocyten
werden mit 2 cem Cu-Wasser geschüttelt, sodann eine halbe Stunde lang
im Brutschrank stehengelassen, abzentrifugiert, gewaschen und endlich der
hämolytische Versuch angestellt.

0,05 ccm gekupferte Erythrocyten + 1,0 cem NaCl-Lösung + 0,01 ccm

Komplement + 0,002 ccm Amboceptor: Lysis.

0,05 ccm normale Erythrocyten + 1,0 ccm NaCl-Lösung + 0,01 eem Kom-
plement + 0,002 ccm Amboceptor: Lysis.

Die Löslichkeit der Erythrocytenerfährt durch
den Kontakt mit Cu-Wasser somit keine Änderung.

6a. Amboceptor wird im Verhältnis 1 : 500 mit Cu-Wasser durch
6 Stunden im Eisschrank stehengelassen. Um eine eventuelle Abgabe
von überschüssigem Cu an zugesetztes Komplement zu vermeiden, wurde
der gekupferte Amboceptor mit Erythrocytenaufschwemmung 1: 0,05
eine halbe Stunde im Brutschrank stehengelassen, die Erythrocyten wurden
sodann abzentrifugiert. gewaschen und mit Komplement versetzt: Komplette
Lysis.

6b. Bis 1:1600 ausgewerteter Amboceptor wird mit Cu-Wasser
1 : 500, 1 : 1000, 1 : 1500 gemischt, sodann nach 6 Stunden Stehen im Eis-
schrank mit Blutkörperchenaufschwemmung 1 :0,05 versetzt, nach
1/3 Stunde Brutschrank abzentrifugiert. Die Erythrocyten wurden hierauf
gewaschen und der Einwirkung von Komplement unterworfen. Als Kon-
trolle dient ebenso verdünnter, nichtgekupferter Amboceptor bei sonst
gleicher Versuchsanordnung.

Gekupferter Amboceptor Lysis Ungekupferter Amboceptor Lysis
1 : 500 komplett 1: 500 komplett.
1 : 1000 inkomplett l : 1000 =
1: 1500 1: 1500 Se
Der Amboceptor hingegen erleidet bei hoch-
gradiger Verdünnung bis nahe an die Titergrenze
eine gewisse Abschwächung, die sich in unkom-

mmm EIERE EE

Einwirkung von Metallen auf Sera. 61

pletter Lysis manifestiert, docherscheintesunmög-
lich, seine Wirkung vollständig aufzuheben wie es
beim Komplement der Fall war.

Die komplettierende Eigenschaft des aktiven Serums zerfällt
bekanntlich in 2 Komponenten: Die Bindungsfähigkeit an den
Amboceptor (Mittelstück) und die lytische Wirksamkeit (End-
stück). Daß das Metall nur die letztgenannte Komponente be-
einflußt, ist nach folgendem Versuch wahrscheinlich:

7. Amboceptor wird 1:50 mit NaCl-Lösung verdünnt, zu gleichen
Teilen mit nativem Meerschweinchenserum gemischt, !/, Stunde im Brut-
schrank stehengelassen, das Gemisch hierauf 1 : 100 a) mit Cu- Wasser,
b) mit gewöhnlicher NaCl-Lösung verdünnt, 6 Stunden stehengelassen,
sodann zu je l ccm der angegebenen Verdünnung 0,05 Erythrocyten-
aufschwemmung zugesetzt und 2 Stunden im Brutschrank gelassen.

Ergebnis: a) 0,
b) komplette Lysis.

HI.

Überblickt man die Versuche, die zum Zwecke der
inneren Antisepsis von den verschiedensten Autoren angestellt
worden sind, so erklären sich, wenn man von der Bekämpfung
der Spirillosen durch P. Ehrlich und vielleicht noch der Chinin-
wirkung bei Malaria und der Wirkung des Emetins auf die Amöben
der Dysenterie absieht, die Mißerfolge dieser Bemühungen im
wesentlichen aus 2 Momenten: Entweder ist es die hohe Organo-
tropie des Desinfiziens, welche die Anwendung geeigneter Quan-
titäten desselben und damit die Erreichung einer zur Desinfektion
nötigen Konzentration verbietet, oder es erleidet die bactericide
Kraft des Arzneistoffes im kolloidalen Medium des Serums oder
der Gewebsflüssigkeiten eine so weitgehende Abschwächung, daß
der Erfolg vereitelt wird. Praktisch kommen zumeist beide
Faktoren gleichzeitig in Betracht. Diese Erwägungen gelten nicht
nur für die chemischen Desinfektionsmittel (Chemotherapie im
engeren Sinne), sondern auch für die zum Teil physikalischen
Kräfte, welche die photodynamischen Mittel entfalten, deren
praktische Anwendung bisher keinen Erfolg brachte. Demgegen-
über zeigen die Erfahrungen über die komplexen, im Serum
immunisierter Tiere vorhandenen Lysine, daß Körper dieser
Kategorie in ihrer Wirkung durch Serum nicht beeinträchtigt
werden: Hier handelt es sich eben um so hohe Grade der Spezifität,

62 L. Hess u. R. Reitler:

daß eine Ablenkung, sei es durch Serum, sei es durch die Körper-
zellen, nicht in Betracht kommt. Wollte man die bactericide
Funktion oligodynamisch wirksamer Flüssigkeiten zur inneren
Antisepsis heranziehen, so wäre zunächst die Frage der Organo-
tropie zu erörtern. InVersuchen, welche früher mitgeteilt wurden!),
konnte gezeigt werden, daß Hämolyse durch solche Flüssigkeiten
erzielt werden kann. Eine Alteration sowohl der Erythrocyten
als auch anderer Körperzellen in vivo wäre daher immerhin im Be-
reiche der Möglichkeit gelegen. Freilich zeigten schon die Studien
über Hämolyse, daß die Lysis durch oligodynamische Metallwirkung
im kolloiden Medium des Serums in vitro eine beträchtliche Ein-
schränkung erfährt. Um diesbezügliche Klarheit zu gewinnen,
haben wir an Ratten durch Wochen hindurch Tag für Tag Injek-
tionen mit oligodynamischen Cu-Lösungen vorgenommen; injiziert
wurden, je nach Größe der Tiere 2—5 ccm täglich. Zur Kontrolle
dienten Injektionen gleicher Quantitäten physiologischer NaCl-
Lösung. Die histologische Untersuchung der Organe ergab in
keinem Falle wesentliche Veränderungen. Ebenso blieb jede
Hämolyse aus. Eine Zellschädigung durch oligodynamische
Flüssigkeiten kommt somit nicht in Betracht, hingegen haben
Salus?), Baumgartenu. Luger?), Saxl?) u. a. darauf hinge-
wiesen, daß in vitro die Gegenwart von Serum die bactericide Wir-
kung solcher Flüssigkeiten weitgehend abschwächt. Ebenso hat uns
das Studium der Hämolyse, wie schon mehrmals bemerkt wurde,
ergeben, daß zwar Suspensionen von Erythrocyten in NaCl-Lösung
durch oligodynamische Flüssigkeiten hämolysiert werden, daß je-
doch Serum statt NaCl-Lösung als Suspensionsmittel verwendet, die
Hämolyse hemmt. Dieser hemmende Einfluß des Serums auf die bac-
tericide und hämolysierende Fähigkeit oligodynamischer Lösungen
läßt sich in Parallele stellen zu der erwähnten Absch wächung anderer
Desinfizientien durch Serum. Dabei muß aber betont werden,
daß diese Abschwächung bei oligodynamischen Flüssigkeiten im

1) L. Hess und R. Reitler, Le
2) G. Salus, oligodysammische Metallwirkungen. Wiener Klin. Wochen-
schrift 1919 Nr. 51.

3) A. Baumgarten und A. Luger, Über die Wirkung verdünnter
Metallsalzlösungen auf Diastose. KEbenda, 1917 Nr. 39.

1) P. Saxl, Wiener Klin. Wochenschr. 1917 Nr. 23 u. 31; 1919
Nr. 40, Mediz. Klinik 1917 Nr. 28 u. 46 (daselbst ausgiebige Literatur-
nachweise).

Einwirkung von Metallen auf Sera. 63

Gegensatze zu der anderer Antiseptica so hochgradig ist, daß sie
zur fast völligen Aufhebung der Bactericidie führt.

Wenn somit oligodynamische Lösungen im Tierexperiment
keine ÖOrganotropie zeigen, anderseits ihre Bactericidie fast
völlig einbüßen, kommt für die Zwecke der inneren
Desinfektion nur der eine Weg in Betracht, die wirk-
samen Metallteilchen durch Fixierung an Zwischen-
körper, deren Ablenkbarkeit durch Serum infolge
ihrer Spezifität gleich Nullist, an die Bakterien heran-
zubringen. Es würde in diesem Versuchsplan nach den Vor-
stellungen, welche Ehrlich entwickelt hat, der Zwischenkörper
die Schiene sein, welche das Metall in oligodynamischer Ver-
dünnung an den Erreger heranträgt. Naturgemäß muß die Bin-
dung zwischen Metall und Zwischenkörper vor Einwirkung auf
etwaige im Serum suspendierte Erreger erfolgen. Für die Rolle
eines derartigen Zwischenkörpers käme in erster Linie ein
spezifischer Amboceptor in Betracht.

Unsere Versuche über die Beeinflussung des komplexen
hämolytischen Systems haben jedoch gelehrt, daß eine Bindung
des Cu an den Amboceptor nicht stattfinden dürfte (vgl. Ver-
such 6a). Mit Sicherheit beweist dieser Versuch das Fehlen einer
derartigen Bindung nicht, da diese bestehen könnte, auch ohne
sich in Hemmung der Hämolyse zu äußern. Immerhin schien
es ratsamer, jenen Körper zur Fixation des Metalls zu verwenden,
dessen Bindungsfähigkeit an dasselbe feststeht: das Komplement.
Zwecks Bindung des mit Metall beladenen Komplementes an
die Bakterienzellen mußte der entsprechende Amboceptor zwischen-
geschaltet werden!). Es war also eine Kette: Antigen-Ambo-
ceptor-Komplement-Metall herzustellen, wobei dem Immun-
körpersystem die Funktion der Schiene im Sinne Ehrlichs
zufiel. Unsere Versuche sollten erweisen, ob sich eine keimtötende
Wirkung oligodynamischer Lösungen trotz der zwischengeschal-
teten Eiweißkörper geltend macht.

Versuch: Polyvalentes Streptokokkenserum (Paltauf) wird mit
frischem Meerschweinchenserum (d. i. Komplement) zu gleichen Teilen
gemischt und
| ` 1 Mit Rücksicht auf die oben beschriebene hemmende Wirkung des
Metallwassers auf die Iytische Funktion des Komplements kommt eine
Addition des oligodyvnamischen und spezifisch bakteriolytischen Effcktes
kaum in Betracht.

64 L. Hess u. R. Reitler:

a) mit l2tägigem „Kupferwasser‘‘,
b) mit physiologischer Kochsalzlösung,
beide Male im Verhältnis 1 : 50 verdünnt, ferner werden
c) polyvalentes Streptokokkenserum allein (d. i. Amboceptor),
d) Meerschweinchenserum (d. i. Komplement) allein,
beide Male im Verhältnis 1 : 100 mit „Kupferwasser‘“ verdünnt. Als Kon-
trolle dient
e) l2tägiges Kupferwasser,
f) physiologische Kochsalzlösung,
beide ohne weiteren Zusatz.
Zu je l cem dieser Lösungen werden 0,1l cem einer Streptokokken-
aufschwemmung in Kochsalzlösung hinzugefügt und
I. 24 Stunden im Brutschrank,
II. 24 Së „ Eisschrank
stehengelassen. Hierauf wird je 1 Öse auf einer Agarplatte ausgestrichen
und nach 24 Stunden Brutschrank die Kolonienzahl festgestellt.

I.a) 0
b) 0
c) d
d) 0
e) 0
f) +++

D e % D e e r
Sowohl das im Überschusse vorhandene oligodynamisch wirksame Kupfer-
wasser (a, c, d, e) als auch das bakteriolytische System (b) haben in dieser
Versuchsanordnung das Bakterienwachstum komplett gehemmt.

II. a) 213 Kolonien

b) 643 zu
c) 6 D
d) 711 5
e) 25 e,

f) 1020 ss

Die intensivste Wachstumshemmung ergibt somit Kupfer-
wasser allein (e). Von diesem bereits bekannten oligodynamischen
Effekt soll weiter hier nicht mehr die Rede sein. Die Mischung
von Kupferwasser mit amboceptorhaltigem Serum (c) zeigt nur
eine geringe Verminderung der bacterieiden Kupferwirkung. Diese
Verminderung wird hinreichend erklärt durch die jedem Serum
zukommende Fähigkeit, die Wirkung aller Desinfizientien, ins-
besondere die oligodynamische Wirkung abzuschwächen. Dem-
gegenüber fällt auf,daßkomplementhaltiges Meer-
schweinchenserum in gleicher Verdünnung die
Kupferwirkung in ganz erheblichem Maße ein-

Einwirkung von Metallen auf Sera. 65

schränkt) d). Diese große Differenz kann wohl kaum auf
die verschiedene Herkunft der beiden Sera allein zurück-
geführt werden. Sie gemahnt uns an die in den früheren Ab-
schnitten besprochene differente Fällbarkeit aktiver und inaktiver
Sera, sowie an die Aufhebung der Komplementwirkung durch
Kupferwasser. Vielleicht könnte man an eine Ablenkung der
Kupferwirkung durch das Komplement denken. Wir kommen
auf die Frage noch einmal zurück. Bei Gegenwart von Kupfer-
wasserkomplement und Amboceptor, d. h. wenn eine Bindung
des ‚‚gekupferten“ Komplements an die Keime anzunehmen ist,
tritt die Kupferwirkung wieder deutlicher hervor (a) und über-
trifft sogar die keimtötende Kraft des bakteriolytischen Systems
allein (b). Dieser Effekt (a) kann nicht der Ausdruck einer addi-
tiven Wirkung zweier Desinfizientien, nämlich der keimtötenden
Kraft des Cu-Wassers vermehrt um die bakteriolytische Kraft
des Immunserums sein. Die Versuche, über welche im Abschnitt II
berichtet wurde, haben ja gezeigt, daß bei einer Mischung von
Kupferwasser mit Komplement und Amboceptor eine Zerstörung
der Immunkörperwirkung eintritt. Damit werden wir zu
der Annahme gedrängt, daß bei der Kombination:
Kupfer-Komplement-Amboceptor keine Immun-
körper-, sondern bloß eine Kupferwirkung zur Gel-
tung kommt. Doch wäre zu erwarten, daß die Kupferwir-
kung bei diesem Versuch gegenüber Versuch e) (Kupferwasser
allein) im gleichen Maße vermindert würde wie im Versuch d)
(Kupfer - Komplementmischung), da in beiden Versuchen die
gleiche Menge Komplement und Kupfer verwendet wurde und
somit die gleiche Menge überschüssigen, nicht an das Komple-
ment gebundenen Kupfers zur Wirkung kommen mußte. Die
stärkere Keimtötung im Versuch a) gegenüber Versuch d) bedarf
somit einer Erklärung. Die Versuchsanordnungen d) und a) unter-
scheiden sich voneinander bloß durch die Gegenwart des Ambo-
ceptors im letzteren Falle. Somit kann nur dieses Moment die
Erhöhung der bactericiden Wirkung erklären. Wir stellen uns
daher vor, daß nicht bloß das überschüssige Cu
zur Wirkung gelangt, sondern auch das an das
Komplement gebundene mit Hilfe des Ambo-
ceptors zum Teil wenigstens auf die Keime über-
tragen wurde.

Biochemische Zeitschrift Band 128. 5

66 L. Iless u. R. Reitler:

Ungeklärt bleibt einstweilen, wie schon angedeutet wurde,
die Tatsache der Hemmung der bactericiden Cu-Wirkung durch
Komplement. Überdies spielen aber in der soeben mitgeteilten
Versuchsanordnung der oligodynamische Effekt des überschüssigen
Kupfers und die hypothetische Wirkung des mit Hilfe des Immuni-
tätskörpersystems auf die Bakterien übertragenen Cu in so ver-
wickelter Weise ineinander, daß eine klarere und übersichtlichere
Anordnung der Versuchsbedingungen geboten erscheint.

Komplement- und Kupferwirkung.

Frisches Meerschweinchenserum wird zur Hälfte aktiv, zur
Hälfte inaktiv im Verhältnis 1 : 100 mit Stägigem Kupferwasser
verdünnt, mit Streptococcus brevis gleichmäßig beimpft und durch
24 Stunden im Eisschrank stehengelassen. Sodann wird von
jedem Röhrchen je 1 Öse auf 4 Agarplatten ausgestrichen und
diese durch 24 Stunden im Brutschrank belassen. Die durch-
schnittliche Kolonienzahl betrug:

Inaktives Serum 48 Kolonien
aktives ge 68 e
Kontrolle in phys. NaCl-Lösung 116 ee

Kupferwasser hat somit in Gegenwart von aktivem wie
inaktivem Serum das Bakterienwachstum eingeschränkt. Da
aber die Kolonienzahl bei Gegenwart von aktivem Serum um
Il größer war als bei Gegenwart von inaktivem Serum, hat das
aktive Serum die bactericide Wirkung des Kupferwassers mehr
eingeschränkt.

Der zweiten der oben aufgestellten Forderungen glauben wir
in folgender Weise Genüge geleistet zu haben: Um vorerst eine
Bindung zwischen Immunkörpersystem und Kupfer herzustellen,
wurde eine Mischung von polyvalentem Streptokokkenserum
und frischem Meerschweinchenserum (2 : 1) mit Stägigem Kupfer-
wasser im Verhältnis 1 : 20 verdünnt. Um die oligodynamische
Wirkung des überschüssigen Kupfers, d. h. des nicht an Komple-
ment gebundenen, auszuschalten, wurde die 10fache Menge
inaktiven normalen Kupferserums zugesetzt. Wir nähern uns durch
diesen Vorgang den in vivo gegebenen Verhältnissen. Als Kontrolle
dienten reines Kupferwasser + inaktives Pferdeserum (1:10),
sowie das erwähnte Komplement-Amboceptorgemisch mit gewöhn-
licher Kochsalzlösung 1:20 verdünnt und ebenfalls mit der

Einwirkung von Metallen auf Sera. 67

1Ofachen Menge des Pferdeserums versetzt. Alle Röhrchen mit
Streptococcus brevis beimpft, verblieben bei 37° im Brutschrank.
Nach 6 und 12 Stunden wurden auf Agarplatten in der üblichen
Weise Kulturen angelegt und die Kolonien ausgezählt. Wir
teilen als Beispiel mit:
A. Nach 6 Stunden:
Cu-Wasser . ..... 96 Kolonien

Immunkörpersystem . . _(verunreinigt)
Cu-Immunkörpersystem 132 Kolonien

B. Nach 12 Stunden:
Cu-Wasser . . .... 269 u
Immunkörpersystem . 535 ey
Cu-Immunkörpersystem 32 en

Längere Verweildauer der Röhrchen im Brutschrank ver-
wischt wieder die nach 12 Stunden hervorgetretenen Differenzen.
Wir sehen von der detaillierten Wiedergabe der bezüglichen
Protokolle ab.

Weitere analoge Versuche mit verschieden dichter Beimpfung
der Röhrchen zeigten naturgemäß Differenzen im prozentuellen
Verhältnis der Kolonienzahl von Kupferwasser zum Immun-
körpersystem und gekupfertem Immunkörpersystem. Ein Opti-
mum gaben die Versuche mit mitteldichter Beimpfung und bei
der Verweildauer von 12 Stunden. Im Prinzip fielen aber alle
Versuche gleichsinnig aus, wie die Durchschnittszahlen aus sämt-
lichen Versuchen nach 12 Stunden zeigen:

Kupferwaser ..... 977 Kolonien

Immunkörpersystem. . . 1126 d
Cu-Immunkörpersystem . 362 H

Es scheint uns somit erwiesen, daß die oligodynamische
Cu-Wirkung im Serum nach vorhergehender Bin-
dunganein spezifischesImmunkörpersystem merk-
lich besser zur Geltung kommtalsohnedieses. Die
Zahl der entwicklungsfähigen Keime wurde stets, mitunter so-
gar außerordentlich stark verringert, doch konnte eine völlige
Desinfektion bisher nicht erreicht werden. Der Grund hierfür
dürfte ein doppelter sein: Fürs erste wird sicherlich nicht das
gesamte Cu an das Komplement gebunden, sondern ein Teil von
den übrigen kolloiden Substanzen des komplementhaltigen Serums
abgelenkt. Zweitens aber ist eine gewisse Abschwächung der

D

68 L. Hess u. R. Reitler: Einwirkung von Metallen auf Sera.

bactericiden Kraft des Metalls durch die Zwischenschaltung des
Immunkörpersystems mit großer Wahrscheinlichkeit anzunehmen.

Die entwicklungshemmende Wirkung der an ein Immun-
körpersystem gebundenen Cu-Teilchen auf Bakterien unter Be-
dingungen, welche den in vivo gegebenen ziemlich nahe kommen,
stellt ein Paradigma dar, nach welchem im Prinzip auch andere
Desinfizientien im Serum in hoher Verdünnung zur Wirkung
gebracht werden könnten.

Weitere Versuche haben demnach zu lehren:

1. Ob das von uns eingeführte Prinzip bloß für oligodynamische
Lösungen oder aber auch für chemisch anders geartete Desinfek-
tionsmittel Geltung besitzt und

2. Ob die in vitro angestellten Beobachtungen sich auch in vivo
erheben lassen. Wir behalten uns vor, über die Ergebnisse dieser
Untersuchungen zu berichten.

Brenztraubensäure als Zwischenprodukt der alkoho-
lischen Zuckerspaltung.

Von
Max v. Grab, Prag.

(Eingegangen am 21. Juni 1921.)

Ganz zu Beginn des Jahres 1911 haben C. Neuberg und
H. Wastenson mitgeteilt und demonstriert!), daß die Brenz-
traubensäure von Hefe vergoren wird. Kurze Zeit darauf haben
den Gedanken, daß eine solche Umsetzung möglich sein könne, auch
O. Neubauer und K. Fromherz?) im Verlauf ihrer Studien
über den physiologischen Abbau der Aminosäuren, namentlich
betreffs der Umwandlungen von Alanin, geäußert, nachdem
O. E. Ashdown und J. Th. Hewitt?) bereits eine Beziehung
dieser Aminopropionsäure zur alkoholischen Gärung angenommen
hatten. Während nun in dem verflossenen Jahrzehnt keiner der
letztgenannten Autoren auf den betreffenden Gegenstand zurück-
gekommen ist, hat Neuberg in ausführlichen Untersuchungen
der Brenztraubensäure-vergärung seine Beobachtung verfolgt
und die dadurch aufgeworfenen Fragen aufgeklärt ®).

Es ergab sich, daß diese &-Ketonsäure zu Acetaldehyd und Kohlendioxyd
vergoren wird, und es zeigte sich weiterhin, daß für diese Reaktion ein
besonderes Ferment verantwortlich gemacht werden muß, das wegen seiner
sinnfälligsten Wirkung, der Kraft zur glatten Abspaltung von Kohlensäure,
den Namen Carboxylase erhalten hat. Sodann wurde festgestellt, daß
die Temperaturgrenzen — soweit frische Hefen in Betracht gezogen werden
— für den gewöhnlichen alkoholischen Zuckerzerfall und für die Brenz-

traubensäuregärung gleich sind und daß die Mengenverhältnisse, in denen
die Hefen wirken, beidemal einander entsprechen.

1) C. Neuberg und H. Wastenson, Sitzungsber. d. Berl. physiol.
Ges. vom 20. I. 1911.

2) O. Neubauer und K. Fromherz, H. 70, 349. 1911 (erschienen
am 30. I. 1911).

3) O. E. Ashdown und J. Th. Hewitt, Journ. of the chem. soc.
97, 1636. 1910.

1) C. Neuberg und Mitarbeiter, diese Zeitschr. 1911— 1920.

70 M. v. Grah: Brenztraubensäure

Die Vergärbarkeit der Brenztraubensäure ist ein lehrreiches
Beispiel für die Bedenklichkeit von Voraussagen; hat doch
Ad. Mayer!) in seinem bekannten Lehrbuche der Gärungs-
chemie gerade die Brenztraubensäure unter den Substanzen an-
geführt, die niemals gärfähig sein sollten!

Auf Grund weiterer Befunde auf diesem Gebiete, insbesondere der
Erkenntnis, daß wie die Zymasegärung des Zuckers sich ebenso die carboxy-
latische Zerlegung der Brenztraubensäure von der lebenden Zelle abtrennen
läßt, mit anderen Worten, daß sowohl Trockenhefen wie Aceton- und Alko-
hol-Ätherpräparate als auch Macerations- und Preßsäfte Carboxylase ent-
halten, sowie aus anderen Gesichtspunkten heraus erwuchs die Vorstellung,
daß die Brenztraubensäure ein Zwischenprodukt bei der alko-
holischen Gärung ist und daß die Carboxylase ein Teilferment des
Zymasekomplexes darstellt. Gefördert wurde diese Anschauung durch das
Ergebnis, daß bei der Brenztraubensäuregärung unter Umständen nicht
nur Acetaldehyd, sondern auch Alkohol auftritt. An Tatsächlichem ist
sicher, daß — ganz abgesehen vom Kohlendioxyd — der Acetaldehyd dem
typischen Produkte der normalen Gärung, dem Äthylalkohol, ganz wesent-
lich näher steht als irgendeine Substanz, die bisher bei Spekulationen über
die Gärungsfrage als Zwischenglied in Betracht gezogen war. Denn ver-
gegenwärtigt man sich, daß der Oxydationshub, der wahrscheinlich am
Gliede des Methylglyoxals ansetzt und diesen Ketonaldehyd auf die Brenz-
traubensäurestufe hinaufführt, anaerob, ohne Beteiligung atmosphärischen
Sauerstoffs, geleistet wird, so muß auf der Kaskade der Zuckerzerfalls-
produkte irgendwo und in irgendeiner Form ein Äquivalent „Wasserstoff“
disponibel werden, der schließlich durch eine gekoppelte Reaktion den bei
der carboxylatischen Spaltung der Brenztraubensäure erzeugten Acetaldehyd
in Weingeist zu verwandeln vermag. Da diese Reaktion eines jeden Mole-
küls Brenztraubensäure die Bereitstellung eines Moleküls „Gärungswasser-
stoff‘ in sich schließt, so sicht man, daß die intermolekular zu denkenden
Oxydations- und Reduktionsvorgänge einander genau die Wage halten
und daß jene glatte Korrelation bestehen kann, die in der üblichen Gärungs-
gleichung: CH, Oe = 2 CO, + 2C,H, : OH den Wechsel von Oxydation
und Reduktion gar nicht zum Ausdruck kommen läßt. Den Grund, warum
die Natur diesen scheinbaren Umweg einschlägt, darf man wohl darin suchen,
daß letzten Endes die Kohlendioxydloslösung nur aus einer Carbonsäure
erfolgen kann, nicht dagegen aus Gebilden, die wie die Sechs-Kohlenstoff-
zucker (oder allenfalls die Triosen bzw. das wasserärmere Methylglyoxal)
keinen Kohlensäurerest in sich bergen. Alle Substanzen, an die man früher
als Durchgangsprodukte gedacht hatte, kommen hierbei nicht in Betracht,
auch nicht die Milchsäure, deren Carboxyl bekanntlich sehr fest im Molekül
haftet und die keinerlei Neigung zu unmittelbarem Zerfall in Kohlendioxyd
und Äthylalkohol bekundet; J. U. Nef?) hat den Nachweis geliefert, daß

1) Ad. Mayer, Gärungschemie, IV. Auflage, S. 209. 1895.

2) J. U. Nef, Ann. 335, 279 u. 298. 1904; vgl. auch A. Slator, Chem.
Centralblatt 1906. I. 383 u. 1034.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 711

Milchsäure unter keinen Umständen als direktes Gärungszwischenprodukt
gelten darf; dagegen hat auch dieser Autor auf Grund seiner bekannten Unter-
suchungen über die Dissoziationsvorgänge in der Zuckerreihe dem Methyl-
glyoxal in Übereinstimmung mit den etwas anders formulierten Hinweisen
von Windaus und Knoop!), Erlen meyer?) und namentlich von Woh)
eine bedeutende Rolle für den Zuckerabbau zugeschrieben.

Das gesamte Tatsachenmaterial hat dann Neuberg im Jahre 1913
zur Aufstellung seiner neuen Gärungstheorie gedient; sie enthält als Voraus-
setzung im wesentlichen die intermediäre Entstehung von Methylglyoxal,
die durch chemische Erfahrungen wahrscheinlich gemacht ist. Dieser Stoff
vermag nun durch eine Reihe von Dismutationen (Cannizzaroschen
Reaktionen) in alle die Zwischenglieder überzugehen, die für den Ablauf
des Gärungsvorganges zu fordern sind. Zunächst könnte eine Disproportio-
nierung das als ständiges Nebenprodukt beobachtete Glycerin einerseits
und die Brenztraubensäure andererseits hervorbringen. Von letzterer
führen bekannte Wege zum Acetaldehyd und zum Weingeist, und man
braucht sich nur vorzustellen, daß durch Eintritt der ersten Dismutation
aus einer der mannigfachen Methylglyoxalformen auch nur 1 Molekül
Brenztraubensäure hervorgeht, um sodann das große Schwungrad der
Dekomposition im Gang zu halten. Nunmehr bedarf es nämlich nur einer
gemischten Dismutation zwischen den beiden Aldehyden Methyl-
glyoxal und Acetaldehyd, die stets zu weiter vergärbarer Brenztraubensäure
und dem nicht mehr veränderlichen Endprodukte Äthylalkohol führt.
Eine experimentelle Begründung erfuhr dieser Teil der Neubergschen
Gärungstheorie durch den von Nord erbrachten Nachweis?), daß in der
Tat eine gemischte Dismutation zwischen ungleichen Aldehyden der
aliphatischen Reihe möglich ist. Als willkürliche Annahme bleibt demnach
das Auftreten von Brenztraubensäure und Methylglyoxal bestehen. Daß
man letzteres selbst bisher nicht mit Sicherheit?) hat vergären können, mag
daran liegen, daß von den zahlreich möglichen Isomeren dieser vielgestaltigen
Verbindung, unter denen sich auch optisch-aktive Konstruktionen befinden,
in vitro nur ein einziges Gebilde darstellbar ist, dessen feineren Bau wir nicht
kennen, das wir aber wohl als die beständigste, somit für die biologische
Weiterverarbeitung am wenigsten geeignete Form betrachten dürfen. Da
das Methylglyoxal in letzter Linie nichts anderes darstellt als ein Anhydrid
der Hexosen, so wird man sich mit der Hypothese abfinden können, daß
der Weg des Abbaues über eine zerfallsbereite Modifikation dieses Brenz-

1) A. Windaus und F. Knoop, B. 38, 1166. 1905.

2) E. Erlenmeyer jun., Chem. Centralblatt 1905. I. 1533.

3) A. Wohl, diese Zeitschr. 5, 45. 1907.

4) F. F. Nord, diese Zeitschr. 106, 275. 1920.

5) Früher hat A. v. Lebedew angegeben (diese Zeitschr. 46, 489.
1912), daß Methylglyoxal unter bestimmten Bedingungen alkoholische
Zuckerspaltung erleide; später hat er diese Behauptung (B. 47, 967. 1914)
zurückgezogen, neuerdings (Ch. C. 1918, II. 52) will er sie wieder
gelten lassen.

72 M. v. Grab: Brenztraubensäure

traubensäurealdebyds führt. Obgleich betreffs der Vergärbarkeit der zu-
gehörigen Säure, der Brenztraubensäure, kein Zweifel besteht, erschien es
als eine lohnende Aufgabe, die intermediäre Bildung dieser Substanz bei
der alkoholischen Zuckerspaltung durch Versuche zu beweisen.

Die seit Neubergs Entdeckung der Pyruvinatgärung für die
physiologische Rolle der Brenztraubensäure angeführten Gründe
sind allerdings bereits von erheblichem Gewichte gewesen.

Der Umstand, daß außer den Hefen eine ganze Anzahl anderer Mikro-
organismen sowie höherer Pflanzen, welche Kohlenhydrate veratmen,
Carboxylase enthalten, sprach sehr für die Bedeutung ihres spezifischen
Substrates, eben der Brenztraubensäure. In dieser Richtung verweise ich
auf die Mitteilungen von Zaleski und Marx!), Palladin, Gromoff
und Monteverde?), Bau?), Bodnart), Boast), Peterson und Fred®$)
sowie Nagayama’). H. von Euler und E. Löwenhamm®) fanden, daß
Brenztraubensäure ein ebenso gutes Bildungsmaterial für das Enzym
Invertase abgibt wie Zucker, und M. Jacoby) hat das gleiche bezüglich
der Urease gezeigt; ferner hat F. Ehrlich!®) mitgeteilt, daß die genannte
&-Ketonsäure den verschiedenen Kultur- und Kahmhefen als ein leicht aus-
nutzbarer Kraft- und Kohlenstoffspender dienen kann. Von G.Wagner!!)
rührt die wichtige Feststellung her, daß Brenztraubensäure auch in den
üblichen Nährböden zur Heranzüchtung zuckerzehrender Organismen das
Kohlenhydrat glatt zu vertreten vermag. Für den tierischen Organismus
liegt gleichfalls eine Reihe von Beobachtungen (P. Mayer, Tscherno-
rutzki, Röna, Neukirch und Wacker) vor, die darauf hindeuten, daß
Brenztraubensäure als Glykogenbildner sich betätigen und besser als viele
in dieser Richtung geprüfte Substanzen die Zucker der 6-Kohlenstoffreihe
(vgl. Isaac und Adler) als Quelle energetischer Leistungen ersetzen
und zugleich synthetischen Zwecken (Emden und Schmitz, Fellner,
Knop und Kertess) dienen kann.

1) W. Zaleski und E. Marx, diese Zeitschr. 48, 175. 1913; Chem.
Centralblatt 1914. I. 1961 u. 1962.

2) W.Palladin, N. Gro moff und N.N. Monteverde, diese Zeitschr.
62, 137. 1914.

3) A. Bau, diese Zeitschr. 73, 340. 1916.

4) J. Bodnar, diese Zeitschr. 73, 193. 1916.

5) Fr. Boas, Chem. Centralblatt 1916. I. 431.

6) W. H. Petersonund E. B. Fred, Journ. of biol. chem. 44, 41.
1920. '
7) T. Nagayama, diese Zeitschr. 116, 303. 1920.

) v. Euler und E. Löwenhamm, H. 9, 2%. 1913.
SIM Jacobv, diese Zeitschr. 79, 41. 1917.
) F. Ehrlich, diese Zeitschr. 36. 496. 1911.

11) G. Wagner, Zentralbl. f. Bakteriol., Parasitenk. u. Infektions-
krankh., Abt. I. 71, 33. 1913; Zeitschr. f. Hyg. u. Infektionskrankh.
90, 58. 1920.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 73

Somit war es gerechtfertigt, daß Neuberg!) und in neuerer
Zeit auch Abderhalden?) die Brenztraubensäure in den Mittel-
punkt physiologischer Reaktionsfolgen gerückt haben. Immerhin
sind die angeführten Argumente nur indirekter Natur, und der posi-
tive Nachweis des Auftretens von Brenztraubensäure beim Vorgange
der alkoholischen Gärung hat bisher gefehlt. Es erschien daher
als ein großer Fortschritt, als Fernbach und Schoen?) behaup-
teten, das Vorkommen der Brenztraubensäure unter den Pro-
dukten der Zuckerspaltung gefunden zu haben. Leider betreffen,
wie aus dem folgenden hervorgeht, ihre Angaben nicht die typische
Hefengärung.

Die erwähnten Autoren teilten mit, daß ein einfacher Zusatz von kohlen-
saurem Kalk genüge, um bei der Hefengärung die intermediäre Bildung
der Brenztraubensäure manifest werden zu lassen und die genannte a-Keton-
säure in nicht unbeträchtlichen Mengen anzuhäufen. Sie soll nämlich (neben
anderen atypischen Produkten sauren Charakters) in Form ihres Kalksalzes
in einer Ausbeute von 8,04% bei der Vergärung des Zuckers in Gegenwart
von Kreide entstehen. Joh. Kerbt) hat die Angaben der genannten
Forscher jedoch nicht bestätigen können. Während die Fixation nennens-
werter Mengen von Pyruvinat (und anderen Salzen) den Ertrag an Sprit
ersichtlich hätte herabdrücken müssen, fand Kerb vielmehr praktisch die
normalen Alkoholausbeuten bei der Vergärung in Gegenwart von Calcium-
carbonat und nur eine geringfügige Vermehrung des Gehaltes an Acetaldehyd
sowie Essigsäure, deren Quantität erfahrungsgemäß stets etwas gesteigert ist,
sobald man die Hefe durch Verminderung der natürlichen Acidität zwingt,
sich selbst durch Zersetzung von Zucker eine für ihr Fortkommen geeignete
H-Ionen-Konzentration in der Maische zu schaffen. Aber auch wenn man
für einen Augenblick die uneingeschränkte Richtigkeit der Angaben von
Fernbach und Schoen annehmen wollte, so gelangt man doch zu dem
Schluß, daß diese nicht auf die Vorgänge der eigentlichen alkoholischen
Zuckerspaltung bezogen werden dürfen. Während nämlich die Autoren
anfangs die Brenztraubensäurebildung auch für die Umsetzung von Zucker
durch beliebige Hefen behauptet hatten, sprechen sie später nur von einer
diesbezüglichen Tätigkeit zweier Spezialrassen, der „Mykolevure‘‘ und
der „Champagne-Hefe‘“; letztere soll überdies nach ihrer jüngsten Angabe
wesentlich schwächer wirken. Nach Auskunft des Handbuchs von Lafar
stellt der erste Erreger eine wilde, auf Opuntien wachsende Hefe dar,

1) C. Neuberg, Le

2) E. Abderhalden, Lehrbuch der physiol. Chemie 1920/21, Bd. I,
S. 139, 229, 437, 629; Bd. II, S. 261, 385.

3) A. Fernbach und M. Schoen, Cpt. rend. 157, 1478. 1913;
158, 1719. 1914; 190, 764. 1920.

4) J. Kerb, B. 52, 1795. 1919; vgl. A. v. Lebedew, Biochem.

Journ. 11, 189. 1919.

74 M.v. Grab: Brenztraubensäure

während der zweite Pilz wohl zu den Weinhefen, also gleichfalls zu den
wilden Hefen, gehört. Ohne daß ich Genaueres über die Stellung dieser
beiden besonderen Erreger angeben kann, scheint es sicher, daß sie in ihrem
Verhalten von dem der Kulturhefen, der Erzeuger der richtigen alkoholischen
Gärung, wesentlich abweichen und (nach Duclaux) eher den oxydierenden
Organismen verwandt sein dürften, zumal die Autoren eine Luftzufuhr
nicht ausgeschlossen haben. Daß eine derartige Annahme wohl das richtige
trifft, geht zunächst aus den Untersuchungen von Beijerinck und
Folpmers!) sowie aus denen von Mazé und R uot?) hervor. Die genannten
Forscher haben nämlich dargetan, daß eine größere Anzahl von Mikro-
organismen imstande ist, verschiedene Substrate unter Mitwirkung
des atmosphärischen Sauerstoffs zu Brenztraubensäure zu ver-
brennen. Mazé und Ruot haben auch insbesondere eine solche Umwand-
lung des Calciumlactats festgestellt; sie betonen, daß dieselbe aber nur bei
Nahrungsmangel sowie unter Aeration erfolgt, und sie bezeichnen diese
Art von Brenztraubensäurebildung als Äußerung einer unge-
mein erschwerten Lebensführung, als ‚conditions de vie tres
pénibles“. Neuerdings ziehen denn auch Fernbach und Schoen eine
oxydative Bildung der mit ihren Erregern erzielten Brenztraubensäure-
entstehung aus Milchsäure in Betracht und betonen, daß sie völlig aus-
bleibe, wenn ihre Pilze ausreichend ernährt werden. Lediglich auf
einer mineralischen Lösung, die sogar an anorganischen Stickstoffver-
bindungen ziemlich arm ist, fanden sie Pyruvinat, und sie heben zu-
gleich hervor, daß schon die übliche Anwendung von Bierwürze oder
von ähnlichen, gewöhnliche organische Stickstoffquellen enthaltenden
Substraten genügt, um das Auftreten jeglicher Menge von Brenztrauben-
säure zu vereiteln; das befindet sich allerdings mit ihrer früheren Angabe
nicht ganz im Einklange, daß sie auch Pepton zur Kulturflüssigkeit gefügt
hätten. Weiter ergibt sich aus ihrer Beschreibung, daß die anfangs gebildete
Alkoholmenge bald (nach 10 Tagen) wieder abnimmt und in 24 Tagen
auf O sinkt. Das ist ın gleicher Weise bei Ansätzen mit und ohne Kreide
der Fall; selbst in ihren Gärgemischen ohne CaCO, erreichte der Alkohol-
ertrag niemals auch nur angenähert den theoretischen Wert (= ca. 50%
des verbrauchten Zuckers). Ein solches Verhalten kommt nun keineswegs
den echten Kulturhefen zu, sondern ist dem Kahm oder verwandten Mikro-
organismen eigen; jedenfalls bezeugt es die Einmischung oxydativer Vor-
gänge. Die Autoren selbst nehmen nunmehr eine nicht unwesentliche Ein-
schränkung auch durch die Angabe vor, daß nicht allein Zuckerarten,
sondern andere Verbindungen — also wohl von Hefe nicht vergärbare
Substanzen — ebenfalls Quellen ihres Pyruvinats sein können.

Als weitere Bedingung für die Entstehung von Brenztraubensäure
wird eine minimale Aussaat bezeichnet. Nun ist seit den grundlegenden

1) M. W. Beijerinck und T. Folpmers, Koningl. Akad. van Weten-
schap. Amst. 18, 1198. 1916.

2) P. Mazé und M. Ruot, Cpt. rend. des séances de la soc. de biol.
28, 706. 1916; 79, 336. 1917.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 75

Untersuchungen Pasteurs sowie seit den Forschungen Adolf Mayers
u. a. bekannt, daß die Kulturhefen in einer Nährflüssigkeit ohne organische
Stickstofformen zwar eine vita minima fristen, aber nicht gärfähig sind.
N. Pringsheim!) hat gezeigt, daß ein Gehalt an freien oder gebundenen
Aminosäuren bzw. von Stoffen mit der Atomgruppierung — CO—CH—NH —

in den Nährsubstraten für die Entwicklung der eigentlichen zymatischen
Leistungen der Hefezellen erforderlich ist, während der Aufbau gärfähigen
Plasmas aus Ammonsalzen nur schwierig und erst nach erfolgter Anpassung
vonstatten gehen kann. Zudem ist es auch eine alte Erfahrung der Praxis,
daß gärfähige Hefen nicht bei Ausschluß organischer Stickstoffnahrung
herangezüchtet werden können; nur ein bestimmter Teil der letzteren
darf durch mineralische Stickstoffsubstanzen substituiert sein?). Übrigens
hat ganz kürzlich in Henriques Institut zu Kopenhagen R. Ege?) dar-
getan, daß selbst bei Anwesenheit von anorganischem und organischem
Nahrungsmaterial sogar kleine Zuckermengen durch wenig Hefe nicht
vergoren werden können (Vitaminmangel?). Somit geht aus den eigenen
Angaben der französischen Autoren hervor, daß sie, ganz abgesehen von
der fraglichen Zugehörigkeit ihrer Erreger zur Klasse der Kulturhefen,
gar nicht unter Bedingungen gearbeitet haben, unter denen überhaupt
eine echte alkoholische Zuckerspaltung eintreten kann, und daß ihre Befunde
gleich den früher erwähnten von Beijerinck, Folpmers sowie denen
von Mazé und Ruot zu werten sind als der Ausdruck irgendwelcher
oxydativer Leistungen. Gerade diese aber spielen bekanntlich bei der wahren
geistigen Gärung keine Rolle. Die alkoholische Zuckerspaltung mittels
Hefe ist nicht nur ein in sich äquilibrierter Prozeß, der ohne äußere Auf-
nahme von Sauerstoff verläuft und bekanntlich zu einem unvollkommen
oxydierten Endprodukte, dem Sprit, führt, sondern es steht fest, daß selbst
Lüftung die alkoholische Gärung als solche nicht beeinträchtigt, vielmehr
nur mittelbar beeinflußt, indem sie ein größeres Hefenwachstum und damit
einen Verbrauch gärfähigen Zuckers für den Aufbau der Hefenleibes-
substanz nach sich ziehen kann‘). Dagegen ist nach S. Kostytschew°)
bei Mucoraceen, wie Mucor stolonifer, der bei Luftabschluß schnell zugrunde
geht, der Eintritt einer der alkoholischen Gärung ähnlichen Umsetzung
unter Beteiligung des Sauerstoffs eine gelegentliche, in ihrem Aus-
maße wechselnde Erscheinung; die gewisse Analogie mit der Fernbach-
Schoenschen Beobachtung wird dadurch verstärkt, daß die letztgenannten
angeben, daß gerade eine Mucorart, der Amylomyces Rouxii, weit besser
als ihre ‚„‚Hefen‘‘ in ihrem Sinne tätig sein könne.

Zu einem beweiskräftigen Ergebnis konnte man bei dieser

1) N. Pringsheim, B. 39, 4048. 1906; diese Zeitschr. 3, 121. 1907.

2) Vgl. A. Wohl und S. Scherdel, Chem. Centralblatt 1919. II. 358.

3) R. Ege, diese Zeitschr. 107, 236. 1920; vgl. auch A. Costan-
tino, 1920.

4) Vgl. F. Czapek, Biochemie der Pflanzen, Bd. I, S. 337. 1913.

5) S. Kostytschew, H. 111, 155. 1920.

6 M. v. Grab: Brenztraubensäure

Sachlage also nur durch eine Versuchsanordnung gelangen, die
unter Verwendung der typischen Erreger der alkoholischen
Gärung und bei Bedingungen, unter denen sich nachweislich die
zymatische Zuckerspaltung vollzieht, d. h. namentlich unter an-
aeroben Verhältnissen, eine Isolierung von Brenztraubensäure er-
möglicht.

Die bisherigen Methoden zum Eingriff in die alkoholische
Zuckerspaltung haben nicht zu einer Fixierung der Brenztrauben-
säure geführt, weder das erste von Neuberg, Färber und Rein-
furth!) ausgearbeitete Abfangverfahren, das in der Anwendung
sekundärer sch wefligsaurer Salze besteht, noch die spätere Dimedon-
methode von Neuberg und Reinfurth?), noch auch die Ein-
leitung der sogenannten dritten Vergärungsform, die Neuberg
und Hirsch?) durch Vornahme der Gärung in Gegenwart alkalisch
reagierender Salze bewerkstelligt haben.

In allen den genannten Fällen wird lediglich das Spaltungsprodukt
der Brenztraubensäure, der Acetaldehyd, charakterisiert, nicht aber die
Ketonsäure selber. Die Ursachen dafür sind darin gelegen, daß das zugefügte
Reagens sich entweder nicht mit Brenztraubensäure kondensiert, wie das
für das Dimedon (Dimethyldihydroresorcin) feststeht, oder daß die Ver-
bindungen zwischen schwefligsauren Salzen und Brenztraubensäure noch
glatt zu Kohlendioxyd und dem Aldehyd-Sulfit-Komplex vergoren werden,
und zwar tritt diese Reaktion bis zu eben dem Gehalte der Brenztrauben-
säurelösung an schwefligsauren Salzen ein, der vollkommen dem anwend-
baren maximalen Verhältnis zwischen Zucker und sekundären Sulfiten
entspricht®).

Somit findet man, daß selbst unter erschwerten Umsetzungs-
bedingungen sich Brenztraubensäure nicht anhäuft, sondern wie
Neuberg seit Auffindung der Brenztraubensäuregärung vielfach
betont hat, das Bestreben zeigt, ebenso wie ihre Salze im Momente
der passageren Entstehung sofort von der Hefe gespalten zu
werden. Es mußte daher nach einem Verfahren gesucht werden,
das eine radikalere Umwandlung der Brenztraubensäure zu Wege
bringt, als es Salzbildung oder die erwähnten Kondensations-
reaktionen tun; eine solche Möglichkeit fand sich in der Ver-

DC Neuberg und E. Färber, diese Zeitschr. 78, 238. 1916. —
C. Neuberg und E. Reinfurth, diese Zeitschr. 89, 365. 1918; 92, 234. 1918.
2) C. Neuberg und E. Reinfurth, diese Zeitschr. 106, 281. 1920.
3) C. Neuberg und J. Hirsch, diese Zeitschr. 96, 175. 1918; 106,
304. 1919; vgl. C. Neuberg und W. Ursu m, diese Zeitschr. 110, 193. 1920.
4) C. Neuberg und E. Reinfurth, B. 53, 1050. 1920.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 17

wirklichung der Döbnerschen Synthese!). Bekanntlich beruht
diese darauf, daß molekulare Mengen von einem aromatischen
Amin, z. B. Anilin, Brenztraubensäure, und einem beliebigen
Aldehyd sich zu substituierten Cinchoninsäuren kon-
densieren, gemäß dem Schema:

R - CHO R-C:N
| N
er + EN- GH, = 2 H,0 + H, + C,H,
CH, : C(OH) - COOH HC: C. COOH.

Döbner?) hat nun auch gezeigt, daß, wenn kein Aldehyd zugegen
ist, die Brenztraubensäure selbst zur Entstehung solcher Cinchonin-
säureabkömmlinge Anlaß gibt, indem ein Teil bei der Umsetzung
als Carboxy-acetaldehyd reagiert und unter Kohlensäureverlust
das gleiche Produkt liefert, welches entstehen würde, wenn man das
betreffende Amin mit je einem Molekül Brenztraubensäure und
Acetaldehyd zusammengebracht hätte. Diese Synthese verläuft,
und das ist im Lichte der vorangegangenen Darstellung ebenfalls
von Wichtigkeit, ohne jede Sauerstoffzufuhr, ja sogar unter Abgabe
freien Wasserstoffes, also anaerob, und sie ließ sich schließlich unter
solchen biologischen Bedingungen verwirklichen, bei denen ein
oxydativer Stoffwechsel der Hefe kaum in Betracht kommt,
nämlich bei zellfreier Vergärung mit Hilfe von Hefensaft. Döb-
ner hat die Darstellung der verschiedensten Cinchoninsäuren auf
der genannten Grundlage ausgeführt und gefunden, daß sie zwar
alle nach derselben Regel, aber doch unter abweichenden experimen-
tellen Bedingungen entstehen, indem bald ein längeres Erhitzen
der Komponenten in einem geeigneten Solvens nötig ist, bald ein
Zusammenbringen in der Kälte genügt. Für den beabsichtigten
physiologischen Zweck konnten nur der letztgenannte Verlauf
sowie Reagentien in Betracht kommen, die mit dem Zucker selbst
sich nicht umsetzen; dementsprechend habe ich auf die Pro-
duktion der a&-Methyl-f-naphtho-cinchoninsäure hinge-
arbeitet. Diese Verbindung bildet sich nämlich, wie Döbner (l. c.)
erwähnt, schon durch Zusammentreffen der Komponenten (1 Mol.
£-Naphthylamin, 1 Mol. Brenztraubensäure und 1 Mol. Acetalde-
hyd bzw. 1 Mol. 5-Naphthylamin + 2 Mol. Brenztraubensäure)
bei Zimmertemperatur in ätherischer Lösung. Um letztere an-

1) O. Döbner, Ann. 242, 265. 1887.
2) O. Döbner, B. 27, 352 u. 2020. 1894.

8 M. v. Grab: Brenztraubensäure

wenden und die reagierenden Bestandteile in innigsten Kontakt
bringen zu können, war das Arbeiten mit Hefepreßsaft notwendig,
um so mehr als lebende Hefe nicht die Berührung mit einer
ätherischen ß-Naphthylaminlösung aushält, wenngleich sie in
Suspension zugesetztes festes 8-Naphthylamin verträgt. Durch
Vornahme der ganzen Prozedur in energisch wirkenden Schüttel-
apparaten habe ich eine intensive Durchmischung erzielt und in
der Tat alsdann die Bildung von a-Methyl-ß-naphthocinchonin-
säure feststellen können. Ihr Entstehen!) ist nicht anders als
durch intermediäre Bildung von Brenztraubensäure zu erklären.
Es muß dahingestellt bleiben, ob sich an der Synthese außer
Brenztraubensäure carboxylatisch abgespaltener Acetaldehyd oder
lediglich 2 Mol. Brenztraubensäure beteiligen, ein Punkt jedoch, der
für die beabsichtigte Beweisführung ohne Belang ist. Am meisten
Mühe hat die Aufarbeitung des Reaktionsproduktes verursacht;
es waren Schwierigkeiten zu überwinden, die in der alkaloidähn-
lichen Natur der Methylnaphthocinchoninsäure begründet sind und
die sich deshalb geltend machen, weil unvermeidlicherweise bei
der Digestion mit Hefepreßsaft infolge proteolytischer Vorgänge
ein Teil des zunächst koagulablen Eiweißes zu löslichen Proteosen
und wohl auch zu Aminosäuren abgebaut wird und Spaltungs-
produkte der Nucleoproteide auftraten. Wie im Versuchs-
teile näher dargelegt wird, ging ich so vor, daß ich nach voll-
kommener, durch Anwendung reichlicher Mengen Hefensaft be-
wirkter Vergärung des Zuckers den als Lösungsmittel für das
ö-Naphthylamin benutzten Äther verdunsten ließ, alsdann das
gesamte Gemisch bei etwa 36° auf ein kleines Volumen brachte und
den Rückstand mit Alkohol, dem einige Tropfen starken Am-
moniaks zugesetzt waren, einige Zeit unter Rückfluß im siedenden
Wasserbad erwärmte. Hierdurch wird die Entfernung noch vor-
handenen gerinnungsfähigen Eiweißes herbeigeführt und gleich-
zeitig die Methylnaphthocinchoninsäure als Ammonsalz in Lösung
gehalten. Das Eiweißkoagulum wurde dann nochmals mit schwach
ammoniakalischem Alkohol ausgezogen. Die filtrierten weingei-

d Es ist schematisch durch die Formulierung

C Hi0 + CioH; © NH; = 2 H,O + CO, + 3 H; + Cis H1102N
auszudrücken. Auf ein zu erwartendes Reduktionsprodukt, etwa Glycerin
konnte ich wegen der komplizierten experimentellen Bedingungen (s. später)
nicht fahnden.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 79

stigen Auszüge wurden verdampft und der Rückstand mit 5 proz.
wässerigem Ammoniak aufgenommen, wobei ein Teil der in den
Alkohol übergegangenen fremden Bestandteile, ferner auch nicht
in Reaktion getretenes f-Naphthylamin unlöslich zurückblieb.
Die abermals filtrierte Flüssigkeit wurde von neuem im Vakuum
eingeengt und mit wenig Ammoniak enthaltendem Sprit auf-
genommen, wobei sie wiederum alkoholunlösliche Beimischungen
hinterließ, leider aber neben dem Ammonsalz der Methyl-naphtho-
cinchoninsäure auch braun gefärbte, aus dem Hefesaft hervor-
gegangene Substanzen sich auflösten. Der Alkoholextrakt wurde
darauf vom Weingeist befreit und das Residuum in ganz ver-
dünntem wässerigen Ammoniak aufgenommen. Nach Filtration
von Verunreinigungen erfolgte alsdann eine Fällung mit Zinkacetat.
Dieses schlug im wesentlichen das Zinksalz der Methyl-naphtho-
cinchoninsäure nieder. Durch Zerlegung mit Salzsäure konnte
daraus die Verbindung selbst in freiem Zustande abgeschieden,
durch Umkrystallisieren aus 50proz. Alkohol gereinigt, durch
Schmelzpunkt, Analyse sowie Überführung in das Silbersalz und
schließlich durch Umwandlung in $-Naphtho-chinaldin!)

CH; s C = N
N
Get,
Z
HC = CH

identifiziert werden.

Was die Ausbeute anlangt, so ist zu bemerken, daß ich bei
Verarbeitung von 180g Rohrzucker, der vollständig umgesetzt
war, im Höchstfalle 7,3 g der &-Methyl-3-naphthocinchoninsäure
erhielt. Dieser Ertrag ist nicht groß?), aber die Entstehung des
Produktes zeigt unzweifelhaft das intermediäre Auftreten von
Brenztraubensäure bei der zymatischen Zuckerspaltung an. Daß
nicht erheblichere Mengen angehäuft werden können, hängt wohl
mit der beträchtlichen Vergärungsgeschwindigkeit der Brenz-
traubensäure zusammen, die als Zwischenprodukt sogar schneller
als der Zucker selbst wieder umgewandelt wird. Hinzu kommt,
daß zwar die Synthese der Methylnaphthocinchoninsäure aus den

1) O. Döbner und W. v. Miller, B. 17, 1711. 1884.

2) Beiden mehr als Oxydationsgärungen (s. vorherS.74)abzuschätzenden
Versuchen haben Fernbach und Schoen (laut Chem. Centralblatt 1914.
H. 423) nur 1,23%% Brenztraubensäure vom Gewichte des angewendeten
Zuckers in wirklich reiner Form isoliert.

80 M. v. Grab: Brenztraubensäure

Komponenten beim Stehen erfolgt, daß aber die Verdünnung
sowie die niedere Temperatur ungünstig wirken. Außerdem ist
die Isolierungsmethode wohl keine quantitative, auch können
(nach Döbners Erfahrungen!) die reagierenden Komponenten
teilweise noch in anderer Richtung als zum Cinchoninsäurederivat
zusammentreten.

Des weiteren habe ich nochmals die Angaben von Fernbach
und Schoen mit zwei reinen Kulturhefen, und zwar mit einer
obergärigen und mit einer untergärigen Rasse, nachgeprüft;
dabei habe ich mich in allen Einzelheiten an die Vorschriften der
genannten gehalten und auch den von ihnen als ganz wesentlich
hervorgehobenen Gesichtspunkt einer minimalen Aussaat berück-
sichtigt. Wie ebenfalls aus den experimentellen Belegen hervorgeht,
ist es mir nicht geglückt, Brenztraubensäure bei der Kultivierung
dieser typischen Erreger in einer ganz mineralischen, mit Kreide ver-
setzten Lösung von Traubenzucker festzustellen. Zwar erhielt ich
eine Legalsche Probe, aber sie war in den Ansätzen mit und
ohne CaCO, fast gleich schwach, wennzwar manchmal, aber ohne
Regelmäßigkeit, vielleicht ein wenig deutlicher in den calcium-
carbonathaltigen Maischen. Aber die allein wesentliche Aus-
fällung des im Weingeist unlöslichen Calciumpyruvinats, welche
die französischen Autoren beschreiben, gelang mir nicht. Die
niedergeschlagenen Salze gaben nicht im geringsten eine Reaktion
auf Brenztraubensäure, nicht einmal die außerordentlich scharfe
Reduktionsprobe mit Tollenscher Silberlösung. Die Unterhefe
verbrauchte in der mineralischen Lösung überhaupt nur kleine
Mengen Zucker, während die obergärige Rasse davon mehr um-
setzte, aber ebenfalls keine Brenztraubensäure erzeugte. Ver-
wendet wurden als Erreger die nach strengen Regeln der Bakte-
riologie hergestellte Reinzuchtunterhefe der Schultheißbrauerei
sowie eine ebensolche von obergäriger Hefe Engelhardt. Auch
meine Befunde zeigen, daß mit reinen Erregern der typischen
alkoholischen Gärung das Fernbach-Schoensche Phänomen
nicht erhalten werden konnte und daß bedauerlicherweise nach
ihrem so einfachen Vorgehen die zymatische Bildung von Brenz-
traubensäure nicht nachweisbar war.

1) Vgl. auch R. Ciusa und G. Zerbini, Gazz. chim. ital. 50 (II),
317. 1920.

als Zwischenprodukt der alkohplischen Zuckerspaltung. 81

Versuche.
I.

1. Vorversuche.

9 g Zucker, in 100 ccm Wasser von 40° gelöst, wurden mit 10 g ober-
gäriger Hefe versetzt und bei 37° in einen Brutschrank gestellt; 30 Minuten
später, nachdem die Kohlensäureentwicklung begonnen hatte, wurden
7g ß-Naphthylamin zugefügt. Nach 24 Stunden war die Gärung nicht
erheblich fortgeschritten, so daß noch 20 g Hefe zugegeben wurden; weder
diese Nachfüllung noch weitere führten zur vollständigen Umsetzung.

Es wurde also ein neuer Versuch vorgenommen, und zwar wurden
27 g Zucker in 300 ccm Wasser mit 90 g ganz frischer Hefe zusammen-
gebracht. Nach halbstündigem Verweilen im Thermostaten wurden 21 g
ß-Naphthylamin hinzugegeben. Nach 2 Tagen war der Zucker vergoren
(keine Reduktion von Fehlingscher Lösung). Das Gärgut wurde filtriert;
aus dem vorsichtig eingedampften Filtrat konnte aber keine &-Methyl-
f-naphthocinchoninsäure erhalten werden. Der unlösliche Rückstand
wurde mit 5proz. Ammoniak 10 Minuten auf dem Wasserbad digeriert,
darauf wurde von festen Hefebestandteilen abfiltriert, das Filtrat eingeengt
und Salzsäure bis zur kongosauren Reaktion zugesetzt. Der dadurch aus-
gefällte Körper wurde abgesaugt und in warmem, schwach ammonia-
kalischem Wasser gelöst; dabei blieb $-Napthylamin zurück, dessen Ab-
‚scheidung durch längeres Stehen im Eisschrank vervollständigt wurde.
Alsdann wurde filtriert, das Filtrat mit Tierkohle entfärbt und eingeengt.
‚Die auf kleines Volumen konzentrierte Flüssigkeit ergab jedoch durch
Ansäuern nicht den gesuchten Körper. Das f-Naphthylamin hatte also
unter diesen Bedingungen — wohl namentlich wegen seiner Unlöslichkeit
— nicht nachweisbar in die Vorgänge beim Gärungsverlauf eingegriffen.

So wurde ein neuer Weg beschritten, der nach vielen vergeblichen
Versuchen schließlich zu einem Ziele geführt hat, nämlich die Verwendung
von Hefesaft und $-Naphthylamin in ätherischer Lösung.

Bezüglich des Hefesaftes bemerke ich, daß er aus einem ursprünglich
in Amsterdam heimischen und im Pfefferbergbetriebe weitergezüchtetem
Material gewonnen wurde, für dessen Abgabe ich dem Herrn Direktor
Sterzbach sehr zu Dank verpflichtet bin. Diese Rasse liefert, was deutsche
Hefen bekanntlich nicht allgemein tun, einen gärfähigen Saft; zumal
gegenwärtig sind viele Sorten zur Bereitung dieses Gärungsmittels un-
geeignet, wohl infolge veränderter, insbesondere eiweißärmerer Ernährung.
Mein Saft wies ein besonders gutes Gärvermögen auf. Die Bestimmung
der Gärkraft ergab nach der üblichen Methode den Wert 3,03, während
Buchner sowie v. Lebedew ehemals 1,87 bzw. 2,67 als selten erreichte
Höchstziffern gefunden haben.

Was dieses Material aber vor Zymaselösungen anderer Herkunft,
namentlich vor Säften aus leichter autolysierenden Hefen auszeichnete,
war seine vergleichsweise geringe proteo- und nucleolytische Betätigung;
infolgedessen konnte die Entstehung löslicher Stickstoffverbindungen ver-
hältnismäßig eingeschränkt werden. Ä

Biochemische Zeitschrift Band 123. 6

82 M. v. Grab: Brenztraubensäure

Zunächst ließ ich 10 g Zucker mit 180 ccm Saft im Brutschrank
angären und das nach Zugabe von 2g ß-Naphthylamin in 30 ccm Äther
entstehende Gemenge bei Zimmertemperatur mechanisch stark schütteln.
Die Apparatur war dabei so einzurichten, daß die vom gebildeten Kohlen-
dioxyd mitgerissenen Ätherdämpfe leichten Abzug fanden. Dies erreichte
ich, indem ich die Gärgefäße (Standflaschen) mit einem durch Gummi-
stopfen aufzusetzenden und entsprechend gebogenen Glasrohr verband,
das an der Spitze capillar ausgezogen war. Diese Vorrichtung verbinderte
zugleich ein Herausschleudern des Gärgemisches.

Nach 2 Tagen wurde auf Zucker gefahndet. In allen eiweißreichen
T.ösungen ist, wie Buchner!) bestätigt hat, Zucker in Hefesäften nicht
ohne weiteres, nach seinen Angaben oft überhaupt nicht nachweisbar.
Daher verfuhr ich folgendermaßen: 5cem Flüssigkeit wurden herauspipettiert,
mit einigen Tropfen Essigsäure versetzt und solange auf dem Wasserbade
erwärmt, bis alles Protein koaguliert war. Dann wurde abgesaugt und das
Filtrat nach Neubergs Methode mit Mercuriacetat?) von löslichen Abbau-
produkten des Eiweißes usw. befreit, entquecksilbert und nach Weg-
kochen des Schwefelwasserstoffes nunmehr mit Fehlingscher Lösung
untersucht. Die Probe reduzierte noch stark; deshalb wurden zu
dem Ansatz weitere 170 ccm frisch bereiteter Saft gefügt, außerdem
10 ccm Äther nachgefüllt, um das f-Naphthylamin in Lösung zu
halten; darauf wurde weiter geschüttelt. Nach 3 Tagen war dann kein
Zucker mehr nachweisbar. Nun wurde die Flüssigkeit bei etwa 36°
eingedampft und der Rückstand nach Koagulation des Eiweißes, die beim
Erwärmen im Wasserbade erfolgte, mit 5proz. Ammoniak übergossen ;
nach dem Erkalten wurde vom Niederschlage abfiltriert. Das Filtrat wurde
eingeengt, mit Essigsäure versetzt und ohne Berücksichtigung von Aus-
scheidungen im Vakuum bis fast zur Trockene konzentriert. Der Rückstand
wurde mit 75 proz. Alkohol am Rückflußkühler ausgezogen, um das eventuell
gebildete Cinchoninsäurederivat in Lösung zu bekommen. Beim Einengen,
dem Filtrieren vorausging, fiel ein fester Körper aus; dieser wurde
abgesaugt. Das Filtrat ergab nichts. Der Rückstand wurde in 10 proz.
Ammoniak gelöst, mit Tierkohle gereinigt, abermals filtriert und dann mit
Essigsäure gefällt; es entstand eine bräunliche Substanz, die nach dem
Trocknen den Schmelzpunkt 291° zeigte. (Reine A-Methyl-d-naphtho-
einchoninsäure schmilzt bei 310°.) Wiederholtes Umlösen aus 50 proz.
Alkohol führte zu keinem einwandfreien Produkt. Jedenfalls aber wies
bereits dieser Versuch daraufhin, daß der eingeschlagene Weg wohl zum
Erfolge führen könnte, die Methode aber verbesserungsbedürftig sei. Ich
machte also 2 neue Ansätze mit verschiedenen Mengenverhältnissen, um
gleichzeitig die erforderliche Quantität $-Naphthylamin festzustellen.

Versuch a): 18 g Zucker in 280 ccm Saft wurden nach erfolgtem
Gäreintritt mit 3,6 g ö-Naphthylamin, in 55 cem Äther gelöst, geschüttelt.

Versuch bi: 18 g Zucker in 280 cem Saft wurden mit der doppelten

1) Buchner und Hahn, Zymasegärung, S. 211 u. 212.

2) Siehe bei C. Neuberg, Der Harn, Handbuch. S. 328.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 83

Menge, d. h. mit 7,2g f-Naphthylamin in 110 ccm Äther, behandelt.
Nach 2 Tagen mußten noch je 180 ccm Saft zugesetzt werden, aber auch
dann ergab sich nach weiteren 3 Tagen bei Versuch b), daß die große Menge
ß-Naphthylamin und Äther schädlich gewesen und die Gärung nicht zu
Ende gegangen war. Ansatz a) war ausgegoren und wurde bei ca. 35°
eingedampft. Der Rückstand wurde in 75proz. Alkohol aufgeschwemmt
und mehrmals am Rückflußkühler extrahiert. Die so erhaltenen alko-
holischen Auszüge wurden vom Lösungsmittel befreit; der Rückstand wurde
in proz. Ammoniak verteilt, am Wasserbad zur Herauslösung des
Reaktionsproduktes kurz erwärmt und über Nacht im Eisschrank belassen.
Dann wurde zentrifugiert; die abgegossene klare Flüssigkeit wurde mit
Essigsäure versetzt und bei niederer Temperatur eingeengt. Hierbei fiel
wieder ein bräunlich gefärbter Körper aus, dessen Reinigung nun auf andere
Weise versucht wurde, und zwar mit Bleiacetat. 0,3 g Substanz wurden
heiß in 50 ccm 92proz. Alkohol unter Zusatz von etwas Ammoniak gelöst,
dann mit Eisessig sauer gemacht, mit einer hinreichenden Menge Bleiacetat
versetzt und filtriert. Unter der Annahme, daß Bleiacetat in essigsaurer
Lösung nur Verunreinigungen entferne, &-Methyl--naphthocinchoninsäure
jedoch in Lösung bleibe, wurde der Niederschlag abgesaugt und aus-
gewaschen, das Filtrat alsdann mit Schwefelwasserstoff gesättigt. Nach
Entfernung des Bleisulfids wurde eingeengt, jedoch kein Reaktionsprodukt
erhalten.

Bei einem weiteren Versuche wurden 18 g Zucker mit 760 ccm Saft
unter Zusatz von 3,6 g f-Naphthylamin in 55ccm Äther vergoren. Nach
dem Verschwinden des Zuckers und entsprechender Eindickung wurde die
zurückgebliebene Masse mit verdünnter Essigsäure (1,5ccm Essigsäure
+ 75 ccm Wasser) im Wasserbad erhitzt, um das Eiweiß auszukoagulieren;
darauf wurden Flüssigkeit samt Niederschlag ohne weitere Trennung mit
geglühtem Seesand zur Trockene gebracht und in einem Soxlethapparat mit
Amylalkohol ausgezogen. Der Amylalkohol wurde im Vakuum abdestilliert
und der Rückstand erst mit Äthylalkohol, dann mit wässerigem Ammo-
niak usw. behandelt. Es resultierte ein harziges, unbrauchbares Präparat.

Ein anderer Versuch mit Benzolals Extraktionsmittel schlug ebenfalls
fehl. |

Der nächste Ansatz wurde mit gleichen Mengen wie früher angestellt
und das Gärgut im Perkolator mit gewöhnlichem Sprit ausgezogen. Der
nach Abtreiben des Weingeistes verbliebene Rückstand wurde mit warmem
5 proz. Ammoniak digeriert und in der beschriebenen Weise gereinigt. Nach
abermaliger Lösung in Alkohol schied sich beim Verdampfen im Vakuum-
exsiccator eine kleine Menge Substanz krystallinisch aus. Nun wurde
versucht, diese Verbindung zu verestern; denn wie Döbner und Kuntze!)
angeben, ist die nahestehende a-Phenylnaphthoeinchoninsäure unter diesen
Bedingungen in den Äthylester überführbar. Der Körper wurde in die
50fache Menge absoluten Alkohols eingetragen und getrocknetes Chlor-
wasserstoffgas bis zur Sättigung eingeleitet. Das Material löste sich dabei

1) O. Döbner und P. Kuntze, Ann. 249, 109. 1888.
6*

84 M. v. Grab: Brenztraubensäure

bis auf einen spärlichen Rückstand; hierauf wurde eine halbe Stunde am
Wasserbad unter Rückfluß gekocht, wobei alles in Lösung ging. Über
Nacht krystallisierte eine Substanz aus, die jedoch nicht der gesuchte Ester
war; auch aus der tiefdunklen Mutterlauge war er nicht erhältlich.

2. Hauptversuche.

Ich übergehe eine längere Reihe weiterer negativer Experi-
mente und wende mich zur Schilderung der Arbeitsweise, mit der
endlich ein Resultat zu verzeichnen war. 18 g Zucker wurden auf
die zuvor beschriebene Art mit 1620 ccm Saft unter Zusatz von
3,6 g $-Naphtylamin in 75 cem Äther vergoren. Nach Verschwinden
des Zuckers wurde das Gärgut kurze Zeit im Wasserbade erhitzt
und dann bei niederer Temperatur eingeengt; der verbliebene
Rückstand wurde mit einem halben Liter absolutem Alkohol, der
5ccm Ammoniak enthielt, eine Stunde auf dem Wasserbad am
Rückflußkühler ausgezogen. Der filtrierte Extrakt, der die Methyl-
naphtocinchoninsäure enthalten mußte, wurde vom Alkohol be-
freit und mit 5proz. wässerigem Ammoniak digeriert. Bei Eis-
kühlung schied sich dann das überschüssige -Naphtylamin prak-
tisch vollständig aus und konnte abgesaugt werden. Die Mutter-
lauge wurde wieder eingedampft und ihr Rückstand mit alkoholi-
schem 5proz. Ammoniak aufgenommen; von Ausscheidungen
filtrierte manab. Die weitere Reinigung erfolgte sodann über das
Zinksalz. Zu dem Zweck wurde die alkoholisch ammoniakalische
Flüssigkeit eingedampft und der Rückstand mitschwachammoniak-
haltigem Wasser in Lösung gebracht. Die Ausfällung geschah
durch eine Lösung von 15g Zinkacetat in 50 ccm Wasser und
wurde über Nacht stehen gelassen. Der abgesaugte Niederschlag
und die Mutterlauge wurden gesondert verarbeitet.

a) Das feste Zinksalz, das gut mit kaltem Wasser ausgewaschen
war,. wurde in eine Reibschale überführt und mit verdünnter
Salzsäure (bis zur Bläuung von Kongopapier) zerlegt. Der jetzt
vorhandene Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser ge-
waschen und aus 50 proz. Alkohol unter Beigabe von Knochen-
kohle umkrystallisiert. Daslangsam sich ausscheidende Produkt war
farblos und schön krystallisiert. Es wurde abgesaugt, mit schwa-
chem Alkohol gewaschen und im Vakuum-Exsiccator getrocknet.

p) Die Mutterlauge wurde konzentriert und nochmals nach
Zugabe einiger Tropfen Ammoniak mit Zinkacetat versetzt. Der
nunmehr entstandene Niederschlag wurde wie Niederschlag &) mit

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 85

Salzsäure zerlegt; die weitere Behandlung war gleich. Es schied
sich abermals ein krystallisiertes Produkt ab.

y) Die beim Umkrystallisieren aus 50 proz. Alkohol erhalte-
nen Mutterlaugen wurden eingeengt, mit Tierkohle aufgekocht
und wiederum zur Krystallisation hingestellt, wobei noch etwas
Substanz ausfiel. Insgesamt erhielt ich so 0,63 g reine Verbindung,
welche den Schmelzpunkt 310° zeigte. (Die Bestimmung des
Schmelzpunktes erfordert Vorsichtsmaßregeln; es gelangte ein
Paraffinbad zur Anwendung, welches durch Rühren gleichmäßig
erwärmt werden muß. Hauptsächlich aber ist die Schnelligkeit
der Erhitzung maßgebend, da bei zu langsamem Erwärmen Zer-
setzung eintritt, bei zu raschem keine gleichmäßige Temperatur
erzielt wird; ich ging so vor, daß das Thermometer in je 3 Sek.
nur 1° stieg.) R. Wegscheider!) hat den. Schmelzpunkt 290°
beobachtet und darauf aufmerksam gemacht, daß außer der Ge-
schwindigkeit des Erwärmens ein eventueller Krystallwasser-
gehalt eine Rolle spielen kann. Die frisch dargestellte «-Methyl-
ß-naphtocinchoninsäure enthält nämlich 1 Mol. H,O, das Döbner
nicht erwähnt; das Krystallwasser entweicht jedoch bereits bei
längerem Aufbewahren der Substanz im Vakuum.

Die Elementaranalyse ergab folgendes Resultat:

0,1436 g Substanz: 0,3993 g CO, und 0,0620 g H,O.

C,H,NO,. Ber.: C = 75,92, H = 4,68%, ,

gef.: C = 75,86, H = 4,83%.

Es war also kaum ein Zweifel mehr, daß das erhaltene Pro-
dukt als &-Methyl-ß-naphtocinchoninsäure anzusprechen ist. Zur
weiteren analytischen Sicherstellung wurde das Silbersalz be-
reitet. 0,24 g Substanz wurden in 5cem Wasser aufgeschlemmt
und in der Hitze mit tropfenweise zugefügtem Ammoniak in
Lösung gebracht. Letztere wurde filtriert und mit Silbernitrat
ausgefällt, nachdem der Überschuß von Ammoniak zuvor aus-
getrieben war. Das Silbersalz fiel sofort aus, wurde abgesaugt und
so lange gewaschen, bis Diphenylamin keinen Nitratgehalt der
festen Substanz mehr anzeigte; dann wurde letztere im braunen
Exsiccator getrocknet. Zur Analyse wurde sie nach Erlangung
konstanten Gewichtes in einem Tiegel verglüht.

0,1902 g Substanz gaben 0,0602 g Ag.

1) R. Wegscheider, M. 17, 115. 1896.

86 M. v. Grab: Brenztraubensäure

Um nun die Richtigkeit dieser Resultate nochmals zu über-
prüfen, wurde derselbe Versuch mit zehnfach größeren Mengen an-
gestellt und a-Methyl-3-naphtocinchoninsäure erhalten. Vergoren
wurden also 180 g Zucker usw. Die Aufarbeitung erfolgte in der
gleichen Weise wie beim vorigen Ansatz nur mit der Vorsichts-
maßregel, daß die auskoagulierte Eiweißsubstanz noch ein zweites
Mal mit ammoniakalischem Alkohol extrahiert wurde, um mög-
lichst das gesamte Cinchoninsäurederivat in Lösung überzuführen,
Dieser Ansatz lieferte 7,3 g einer bei 308° schmelzenden &-Methyl-
ß-naphtocinchoninsäure.

0,1606 g Substanz: 0,4450 g CO, und 0,0689 g H,O.

0,1856 g Substanz: 9,4 cem N (18°, 779 mm).

C,H,NO,. Ber.: C = 75,920), H = 4,68%, N = 5,90°,;

gef.: C = 75,59%, H = 4,80%, N = 5,999,.

Zur weiteren Identifizierung wurde die &-Methyl-ß-naphto-
cinchoninsäure in das -Naphtochinaldin!) übergeführt. Zu
diesem Behufe wurden 1,5 g Substanz mit 4,5 g geglühtem Calcium-
oxyd gemengt und aus einem kleinen Kolben mit niedrig an-
gesetztem Abflußrohr destilliert; dabei ging ein bald erstarrendes
Öl über. Aus verdünntem Alkohol wurde die Base in schönen
Krystallen rein erhalten ; Schmelzpunkt 81°, während für 3-Naphto-
chinaldin 82° verzeichnet wird.

0,1527 g Substanz: 0,4863 g CO,, 0,0792 g H,O.

CHiN. Ber.: C = 87,02°%,, H = 5,7405;

gef.: C = 86,88°%,, H = 5,80%.

Schließlich wurde aus dem so gewonnenen Naphtochinaldin
das Chromat hergestellt, indem die Base mit verdünnter Schwe-
felsäure in der Wärme klar gelöst und mit wässerigem Kalium-
bichromat gefällt wurde. Nach kurzem Stehen wurde das sofort
abgeschiedene gelbe Salz abgesaugt und gut gewaschen, bis im
Spülwasser keine Schwefelsäure mehr nachweisbar war, dann im
Dunkelexsiccator bis zum gleichbleibenden Gewicht getrocknet.
Eine Probe wurde im Tiegel verascht und als Cr,O, zur Wägung
gebracht.

(Cafas hH CHO. Ber: Cr,O, = 25,22%;
gef.: Cr,O, = 25,10%.

1) Döbner und v. Miller, l. c.

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 87

II.

Obgleich, wie in der Einleitung hervorgehoben ist, Kerb die
Angaben von Fernbach und Schoen über die zymochemische
Bildung von Brenztraubensäure in mineralisierten und mit kohlen-
saurem Kalk versetzten Zuckerlösungen nicht hat bestätigen können,
habe ich mit anderen rein gezüchteten Hefestämmen die Versuche
wiederholt; dabei folgte ich genau den Angaben der französischen
Autoren, insbesondere auch hinsichtlich der Mineralbestandteile
sowie der Hefemengen, die sie klein wählten und in der Kultur-
flüssigkeit wachsen ließen. Verwendet wurde:

l. die untergärige Hefe der Schultheißbrauerei und
2. eine Reinkultur der obergärigen Hefe Engelhardt.

Die angestellten Gäransätze hatten folgende Zusammen-
setzung:

ol 46,5 g Traubenzucker waren mit 2 g Ammoniumnitrat,
0,5 g Magnesiumsulfat, 0,4 g KH,PO,, 0,4 g Ammoniumphosphat,
ferner mit Spuren von Zinksulfat, Eisensulfat nebst Kaliumsilicat
in 500 ccm Wasser gelöst;

ß) in einem anderen Kolben befanden sich 55g Calcium-
carbonat und 500 ccm Wasser.

y) Der Kontrollansatz enthielt 46,5 g Traubenzucker und, bis
auf die Kreide, dieselben anorganischen Salze in 11 Wasser.

Nach der üblichen Entkeimung wurde der Inhalt der geson-
dert sterilisierten Kolben o) und f) vereinigt und mit drei Ösen
der auf Würzeagar gezüchteten Hefe beimpft. Während in der
calciumcarbonatfreien Kontrollprobe y im Brutschrank bei 29
bis 30° kein Entweichen von Gas zu beobachten war, bemerkte
man in Ansätzen mit Calciumcarbonat in der Regel nach 24 Stun-
den eine geringe Kohlensäureentwickelung. Sie kann aber nach
dem Ausfall der weiter unten mitgeteilten Zuckerbestimmung
nicht als ein sicheres Zeichen eingetretener Gärung gelten, sondern
ist zurückzuführen auf eine partielle Umsetzung des Calcium-
carbonats mit den angewandten Ammonsalzen, bei der Ammo-
niumcarbonat auftritt und infolge Dissoziation etwas Kohlen-
dioxyd abgibt.

Angeführt seien aus der Zahl der vorgenommenen Bestimmun-
gen einige Zuckeranalysen in Ansätzen mit Oberhefe wie Unter-
hefe, und zwar für die kreidehaltigen und kreidefreien Proben.

88 M. v. Grab: Brenztraubensäure

1. Ansatz mit Schultheißhefe + CaCO,.

- Zuekergehalt zu Beginn. . . . 4,5 %
de nach 2 Tagen . . 4,5 „
IA) 99 6 a $ s 4,45 IK)
„ » 10 , .. 45 „
u „14 ,„ . . 4,35 ,
29 LU 22 38 s ® 4,35 99
2. Ansatz mit Schultheißhefe ohne CaCO,.
Zuckergehalt zu Beginn. . . . 44%
2 nach 2 Tagen . . 4,4 „
OI 99 6 ag e oœ 4,3 a
Ge „ 10 „ . . 4,35,
3 „1 ,„ e . 3,95,
5 ed - e EE
3. Ansatz mit Engelhardthefe + CaCO,.
Zuckergehalt zu Beginn. . . . 4,6 %
d nach 2 Tagen . . 4,5 -
„ 99 4 „ e o 3,8 en
ve » 8 „ NEG, ei Lr
= Re) A RE eg Gr
39 99 21 KE z ai 0,8 99
4. Ansatz mit Engelhardthefe ohne CaCO}.
Zuckergehalt zu Beginn. . . . 4,6505
W nach 2 Tagen . . 4,55,
LE) LA 4 79 d ® 3,3 39
e SEN Bo oi a
S ge AE Lg TEES E a
> ée "SL 5 sat Koby

Alle 24 Stunden wurden steril 2—3 ccm entnommen und mit
der Nitroprussidnatriumreaktion auf gebildete Brenztraubensäure
untersucht: eine bräunliche Färbung, die auf Essigsäurezusatz in
ein schwaches und schnell vergängliches Violett umschlug, trat
bei der Oberhefe etwa am elften Tage auf, während sie bei den
Kolben mit Unterhefe vollkommen ausblieb. Aber auch bei der
erstgenannten Serie war die Reaktion ungemein schwach. Eine
zum Vergleich hergestellte Lösung von 0,088 g Brenztraubensäure
als Kalksalz in 100 ccm Wasser zeigt eine im Verhältnis dazu
starke Legalsche Probe. Hinzu kommt, daß auch in den An-
sätzen mit Oberhefe, aber ohne Calciumcarbonat, eine wenn auch
vielleicht etwas geringere Farbenreaktion zu erzielen war. Ob-
gleich es bereits danach äußerst zweifelhaft erscheinen mußte, ob

als Zwischenprodukt der alkoholischen Zuckerspaltung. 89

wirklich Brenztraubensäure gebildet wäre, wurden doch 800 ccm
(37,2g angewendetem Zucker entsprechend) eines Ansatzes mit
Kreide und Oberhefe nach klarer Filtration im Vakuum auf ein
kleines Volumen eingeengt und die restierende, von Ausscheidun-
gen durch Filtration befreite Lösung unter starkem Rühren in
absoluten Alkohol (20faches Volumen) eingetropft, ähnlich wie
Fernbach und Schoen vorgehen. Es fiel ein im ersten Augen-
blick gallertiges Calciumsalz !) aus, das beim Stehen konsistenter
wurde und nach 24 Stunden abgesaugt werden konnte. Beim Aus-
waschen mit Alkohol hinterblieb eine gelblichweiße Verbindung,
die Calcium, aber auch keine Spur von Pyruvinat enthielt. Die
filtrierte wässerige Lösung der Substanz lieferte weder eine Farben-
reaktion mit Nitroprussidnatrium noch reduzierte sie ammoniakali-
sche Silberlösung, wozu brenztraubensaure Salze noch in großer
Verdünnung befähigt sind. Ein die Legalsche Reaktion geben-
der Körper fand sich dagegen in der alkoholischen Mutterlauge.
Da aber Calciumpyruvinat bei der vorausgegangenen Fällung mit
Alkohol hätte niedergeschlagen sein müssen, ist es zweifelhaft, ob
der Eintritt dieser Nitroprussidnatriumreaktion überhaupt auf
Brenztraubensäure zu beziehen ist. Nicht unerwähnt bleibe, daß
ich in dem abgedampften alkoholischen Auszug auch die von
Fletcher und Hopkins angegebene Reaktion erhalten habe
(Kirschrotfärbung bei Behandlung mit konzentrierter Schwefel-
säure, Kupfersulfat und mit alkoholischer Thiophenlösung). Es
dürfte sich um Milchsäure (vgl. vorher S. 74) handeln, ohne daß
ich deren Vorliegen mit Sicherheit behaupten möchte, da die
genannte Probe auch mit anderen Substanzen, wie Apfelsäure,
Glykolsäure, Arabonsäure, Gluconsäure, Glucoheptonsäure u. dgl.,
mehr oder minder deutlich positiv ausfällt, ähnlich übrigens auch
mit Brenztraubensäure.

Somit habe ich auch unter Bedingungen einer vita minima,
die an sich — wie zuvor auseinandergesetzt worden ist — gar
nichts mit der alkoholischen Gärung zu tun hätte, leider keine
Bildung von Brenztraubensäure aus Glucose unter der Einwirkung
zweier Kulturhefen nachweisen können.

1) Ziemlich ebenso verhält sich Calciumacetat.

Quantitative Untersuchungen über die Einwirkung einiger
Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes.

Von
Ludwig Heller.
(Aus der Dermatologischen Abteilung des Wilhelminenspitals in Wien.)

(Eingegangen am 13. Juli 1921.)

I.

Es ist in der Physiologie allgemein bekannt, daß infolge
Verdünnung des Blutes die Gerinnung ausbleibt. Obzwar diese
Erscheinung zu einer näheren Analyse des Mechanismus der
Blutgerinnung geeignet ist, wurde zu diesem Zwecke bis jetzt nicht
benützt. Dies ist in erster Linie darauf zurückzuführen, daß man
bis zu den letzten Jahren bestrebt war, für die Blutgerinnung eine
chemische Erklärung zu geben. Diese Erscheinung weist aber
vielmehr auf den Einfluß von physikalisch-chemischen Faktoren
bei der Blutgerinnung hin. Sie zeigt nämlich, daß die Blutgerin-
nung von der Konzentration der wirksamen Substanzen abhängt.
Danach war zu allererst zu entscheiden, welche Substanzen bei
der Verdünnung des Blutes das Ausbleiben der Gerinnung ver-
ursachen. Zunächst habe ich die Wirkung von Ca und von NaCl
untersucht, da diese die chemisch charakteristischsten Gerinnungs-
faktoren darstellen. Es hat sich auch herausgestellt, daß diese
beiden Faktoren von ihrer Konzentration abhängig, sehr stark
die Gerinnung des Blutes beeinflussen.

Die allererste Aufgabe mußte sein, beim Menschenblut die
Wirkung der Verdünnung auf die Gerinnung zu untersuchen,
da diesbezüglich quantitative Daten nicht vorlagen. Ich habe
meine Versuche hauptsächlich aus dem Grunde mit menschlichem
Blute ausgeführt, weil diese Erscheinung zur Klärung mancher
pathologischen Frage beitragen kann. Bis jetzt hat man ins-
besondere in der Pathologie ziemlich einseitig immer nur die
Gerinnungszeit bestimmt. Auf Grund der hier mitgeteilten Ver-

L. Heller: Einwirkung einig. Gerinnungsfaktoren a. d. Gerinnung usw.

91

suche wird man erst die mit diesen Methoden beobachteten Diffe-

renzen erklären können.

Die Einteilung der Versuche, je nachdem, welcher der er-
wähnten Faktoren variabel oder konstant gehalten wurde, zeigt

Tabelle I.
Tabelle L
en — a
a | Bestimmung der Variabel | Konstant
EE an les TEEN EN E E DEE
A | zur Gerinnung notwendigen Blut- Physiol. NaCl
i minimalen : Konzentration
B | desgl. CaCl- NaCl: 0,5 °/
| Konzentration 1: 150
1: 200
Blut | 1: 400
1: 600
C | zur Gerinnung günstigen: NaCl- CaC1,:0,01%,
Konzentration ; Blut: 1: 200
D zur Gerinnung notwendigen Blut- CaCl: 0,05 %/,
minimalen: Konzentration NaCl: 0,5%
l

IL Methodik.

A. Versuche nach der Versuchsanordnung A. (Versuche 1, 2, 3.)

Der Versuch 1 wurde folgendermaßen durchgeführt: Das Blut, ca.
2—3 ccm, wurde mittels einer ca. 5 cm langen Punktionsnadel, deren Lumen
einen Durchmesser von ca. 1 mm besaß, aus der Vena mediana in üblicher
Weise gewonnen, in einer ca. 6—7 ccm fassenden Eprouvette aufgefangen.
Gleich nach der Entnahme wurde das Blut in die schon vorher mit den
notwendigen Mengen von physiologischer NaCl-Lösung beschickten Eprou-
vetten eingefüllt. Die Ablesung der Resultate ist nach 24 Stunden langem
Stehen bei Zimmertemperatur erfolgt. In den mit + bezeichneten Röhrchen
war ein in der Flüssigkeit suspendiertes Gerinnselnetz, bestehend aus roten
Blutkörperchen und aus ausgefallenem Fibrin, wahrnehmbar. Der andere
Teil der roten Blutkörperchen hat sich gesetzt, war aber durch Schütteln
wieder vollkommen zu suspendieren. In den mit — bezeichneten Röhrchen
haben sich sämtliche rote Blutkörperchen gesetzt und waren durch Schütteln
restlos zu suspendieren. Alles andere ist aus der Tabelle ersichtlich.

Die Ausführung des 2. Versuches unterscheidet sich von der des 1.
dadurch, daß bei dem 2. statt des unverdünnten Blutes ein mit physiolo-
gischer NaCl-Lösung im Verhältnis von 1 : 4 verdünntes Blut als Ausgangs-
lösung verwendet wurde. Die Ergänzung folgte gleichfalls mit physiolo-
gischer NaCl-Lösung.

Der 3. Versuch unterscheidet sich von dem 1. dadurch, daß bei dem
erstgenannten ein mit physiologischer NaCl-Lösung in einem Verhältnis
von 1:9 verdünntes Blut als Ausgangslösung verwendet wurde. In dieser

92 L. Heller: Einwirkung

Verdünnung verweilten die Blute vor der Einfüllung nicht alle gleichlange
Zeit hindurch, ca. Zi, Stunden.

B. Versuche nach der Versuchsanordnung B. (Versuche 14, 22, 23,
24, 29, 30.)

Der 14. Versuch wurde folgendermaßen durchgeführt: Das Blut,
ca. 2ccm, wurde mittels einer schon beschriebenen Punktiernadel aus der
Vena mediana entnommen und in einer einparaffinierten kleinen Serum-
eprouvette aufgefangen. Ein Teil des Blutes wurde dann mit einer ein-
paraffinierten Pipette mit physiologischer NaCl-Lösung im Verhältnis 1 : 75
verdünnt. Noch vor der Blutentnahme wurden für jedes Blut, das zur
Untersuchung gelangte, 12 kleine, ca. 8 ccm beinhaltende Serumröhrchen
folgendermaßen vorbereitet: Jeder der 12 Eprouvetten enthielt 2ccm
Flüssigkeit. In dieser Flüssigkeit waren NaCl und CaCl, gelöst enthalten.
Während die Konzentration des NaCl in allen Eprouvetten gleich blieb,
war CaCl, in den 12 Eprouvetten in absteigender Konzentration gelöst.
Die Konzentrationswerte von CaCl, waren folgende: 0,0005%, 0,00195,
0,002%,, 0,004%, 0,006% , 0,008%, 0,01%, 0,012%, 0,014%, 0,016%,
0,018% , 0,02%,. — Die Konzentrationswerte der entsprechenden Tabelle
sind nur halb so groß, da zu den Lösungen von 2 ccm, wie später noch aus-
einandergesetzt wird, noch 2 ccm verdünnte Blutlösung hinzugefügt werden.
In jede der 12 Eprouvetten wurden nun je 2 ccm der soeben 1 : 75 verdünn-
ten Blute eingefüllt. (Vor der Einfüllung wurde das verdünnte Blut durch
Zustopfen und Umdrehen der Eprouvette gut gemischt.) Zur Verdünnung
der einzelnen Blutproben wurde dieselbe paraffinierte Pipette, nach dem
Gebrauch mit Oleum paraffini durchgespült, verwendet. Die Ablesung der
Versuchsresultate erfolgte nach 24 Stunden langem Stehen bei Zimmer-
temperatur. In den mit + bezeichneten Röhrchen befand sich ein aus
Fibrin und roten Blutkörperchen bestehendes Gerinnselnetz. In dem mit
+o bezeichneten Röhrchen hat das Gerinnselnetz keine roten Blutkörperchen
enthalten. Da ist die Gerinnung also erst nach der vollständigen Senkung
der roten Blutkörperchen eingetreten, was, eine gleichmäßige Senkungszeit
angenommen, den späteren Eintritt der Gerinnung bedeutet. (Es ist dabei
zu bemerken, daß bei Lues die Sedimentierung der roten Blutkörperchen
schneller vor sich gehen soll.) In den mit — bezeichneten Röhrchen war
kein Gerinnsel zu finden.

Die Versuche 22, 23 und 24 wurden wie folgt durchgeführt: Vorberei-
tungen: Die Eprouvetten, kleine Serumröhrchen mit ca. 8ccm Inbalt,
die zum Auffangen des Blutes dienen sollten, wurden mit ca. 2ccm Oleum
oliv. steril. beschickt. Das Öl wurde durch Umgießen in ein anderes Röhr-
chen nebst ständigem Drehen der Eprouvette an der Wand derselben ver-
teilt. Nachher setzt sich der größte Teil des Öles ab, die Wand des Gefäßes
wird aber mit einer dünnen Schicht Öl überzogen. Auf diese Weise wurden
so viele Röhrchen präpariert als Blute bei dem betreffenden Versuche
zur Untersuchung kamen. FEbensoviel große Eprouvetten, mit einem
Inhalt von über 30 eem, wurden mit je 29,7 ccm destilliertem Wasser
beschickt.

einiger Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes. 93

Ebensovielmal 10 kleine Röhrchen (die beschriebenen Serumröhrchen
oder auch Wassermannröhrchen) wurden folgendermaßen mit Lösungen
beschickt: Aus einer Lösung, die 0,02%, CaCl, und 1% NaCl beinhaltete,
wurden folgende, auch in der Tabelle ersichtliche Mengen, 0,6, 0,7, 0,8,
0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 und 1,5ccm eingefüllt. Diese wurden dann mit
einer l proz. NaCl-Lösung auf 2 ccm ergänzt. Dann wurden 2 ccm Pipetten
(0,01 grad.) in genügender Zahl (als Blute zur Untersuchung kamen) !/,Stunde
vor dem Anfang der Blutentnahme in dem Zwischenfenster des Zimmers
aufbewahrt. (Die Temperatur betrug da ca. 10— 15° C.) Das Zwischenfenster
sollte mangels eines Eisschrankes, diesen ersetzen. Die zur Blutentnahme
verwendete Strausssche Kanüle wurde mit destilliertem Wasser und mit
Alkohol gereinigt und in destilliertem Wasser ausgekocht. Auf Abkühlen-
lassen der Kanülen vor dem Gebrauch auf Zimmertemperatur wurde ge-
achtet. Die Kanüle wurde vor dem Gebrauch von den darin noch haftenden
Weassertröpfchen durch energisches Schütteln befreit. Die zum Auffangen
des Blutes verwendeten, mit Öl beschickten Röhrchen wurden unmittelbar
vor dem Gebrauch mit ihrer Längsachse in der Horizontalen gehalten, über
ihre Längsachse herumgedreht, damit ihre Wand mit einer Ölschicht
bedeckt würde. Das Blut, ca. 2—3 ccm, wurde dann aus der Vena mediana
cubiti entnommen und in der geölten Eprouvette aufgefangen. Es wurde
nur Blut, das gleich aus dem ersten Stich ausgeflossen ist, verwendet.
Bei einer eventuell mißglückten Punktion, wenn z. B. das Blut nach
1—2 Tropfen aufhörte zu fließen, wurde die Punktion an anderer Stelle,
eventuell an dem anderen Arm, wiederholt. Die Punktion hat natürlich
mittels der Straussschen Kanüle nur einige Sekunden lang gedauert.
Aus dem frischgewonnenen Blute wurde sogleich in eine aus dem Zwischen-
fenster herausgeholte Pipette bis zum Zeichen 1,7 (0,3ccm) aufgezogen
(behutsam, damit keine störenden Luftblasen entstehen und kein Öl mit
aufgezogen werden kann) und der entsprechenden großen Eprouvette,
die 29,7 ccm destilliertes Wasser enthalten hat, zugeführt. Dabei ist das
Blut mit der Wand der Eprouvette nicht in Berührung gekommen, sondern
direkt in das dest. Wasser geraten. Nachher wurde das in solcher Weise
in einem Verhältnis von 1 : 100 verdünnte Blut durch Zustopfen und Um-
drehen der großen Eprouvette gut gemischt. Aus diesem verdünnten Blut
wurden dann in die 12 obenbeschriebener Weise vorbehandelten Eprou-
vetten je 2ccm eingefüllt.e. Die Versuchsanordnung ist aus der Tabelle
ebenfalls klar ersichtlich. Die in der Tabelle angegebenen Konzentrations-
werte beziehen sich einerseits auf das Reaktionsvolumen, andererseits auf
die zugegebene Menge von NaCl bzw. CaCl,. Bei diesen Zahlenwerten
ist also der Inhalt des Blutes an NaCl und CaCl, nicht in Betracht gezogen.
Die Art der Blutentnahme durch Strausssche Kanülen, Auffangen des
Blutes in geölten Eprouvetten usw. sind bei allen folgenden Versuchen
in obengeschilderter Weise durchgeführt worden.

Eventuelle Differenzen sind an der betreffenden Stelle betont.

Die Ablesung der Versuche erfolgte nach 24 Stunden Jangem Stehen
bei Zimmertemperatur, und zwar in folgender Weise: Das betreffende
Röhrchen wurde mit einem Gummistöpsel zugestopft und 2 mal umgedreht.

94 L. Heller: Einwirkung

Während und nach diesem Umwerfen wurde der Inhalt der Eprouvette
beobachtet. In dem mit + bezeichneten Röhrchen haben sich die auf die
Stromata der roten Blutkörperchen ausgefallenen Fibrinfäden zu einem
Gerinnselstückchen zusammengeballt. Es ist dabei zu bemerken, daß bei
den Versuchen, wo Serumröhrchen, die einen kleinen Durchmesser besaßen
und nicht Wassermannröhrchen, angewendet wurden, dieses Herausspringen
und Zusammenballen der Fibrinfäden besser und schöner zur Beobachtung
kam. Diese Differenz wäre so zu erklären, daß in den langen, schmalen
Röhrchen bei einer gleichen Flüssigkeitsmenge die Stromata eine längere
Zeit zur Senkung brauchen als in den breiteren Wassermannröhrchen.
Infolgedessen werden sie in größeren Massen in das Gerinnsel miteingeführt.
In den mit 4- bezeichneten Röhrchen war das Gerinnsel bedeutend kleiner.
in den mit _® bezeichneten Röhrchen waren nur Spuren von Fibrinfäden
zu sehen. Eventuelle Verunreinigungen können bei präziser Beobachtung
leicht von den Fibrinfäden unterschieden werden. In den mit — bezeich-
neten Röhrchen waren keine Fibrinfäden zu finden.

Die Blutentnahme und Ablesung bei den Versuchen 29 und 30 (Blut-
verdünnung 1 : 400 bzw. 1: 600) erfolgte auch in der obengeschilderten
Weise. Die Blutproben stammen bei den genannten 2 Versuchen von den-
selben 3 Patienten.

C. Versuch nach der Versuchsanordnung C. (Versuch 26.)

Der 26. Versuch bezweckt, festzustellen, innerhalb welcher NaCl-Kon-
zentration bei einer CaCl,-Konzentration von 0,01% und bei einer Blut-
konzentration von 0,5°, (1 : 200) die Gerinnung stattfindet. Der Versuch
wurde mit einer Mischung von 1: 100 verdünntem Blute (destilliertem Wasser)
von 3 hämatologisch gesunden Patienten durchgeführt. Blutentnahme wie
früher. Die Blutproben verweilten im verdünnten Zustande (l : 100)
3 Stunden lang bei Zimmertemperatur.

D. Versuche nach der Versuchsanordnung D. (Versuche 31, 32, 33, 34.\

Nachdem in dem Stadium der Untersuchungen, wo das Blut mit
physiologischer NaCl-Lösung verdünnt wurde, festgestellt werden konnte,
daß das normale Blut nebst Zugabe von 0,05°, CaCl bis zu einer Verdün-
nung von ca. l : 800 Gerinnung zeigt, wurden die Blutkonzentrationen
bei den hier mitgeteilten Versuchen (31, 32, 33, 34) in der Nähe dieser Grenze
gewählt. Diese Versuche sind untereinander in dem Sinne, wie es z. B. bei
dem 22., 23. und 24. Versuche möglich ist, nicht zu vergleichen. Das wurde
bei diesen auch nicht angestrebt. Es sind nämlich in der Ausführung genann-
ter Versuche Differenzen, die Vergleiche unmöglich machen. Die Blutproben
der einzelnen Versuche verweilten verschieden lange Zeit, 1—3 Stunden,
hindurch in verdünntem, und zwar auch in verschiedenem Grade verdünntem
(1:100, 1:200) Zustand bei Zwischenfenstertemperatur. Die Ausgangs-
verdünnung ist auch eine verschiedene gewesen (1 : 100, 1 : 200). Es waren
auch in der Reihenfolge der Einfüllung der einzelnen Reagentien bei den
verschiedenen Versuchen Differenzen. Selbstverständlich waren all die
genannten Umstände innerhalb desselben Versuches vollständig gleich.

einiger Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes. 95

Blutentnahme, Ablesung usw. wie früher. Die Versuchsanordnung ist aus
der Tabelle ersichtlich.

IH. Ergebnisse.
A. Bestimmung der zur 6Gerinnung notwendigen minimalen Blut-

konzentration.
Tabelle II.
Versuch 1.
zz Die Menge des eingefüllten Blutes in Gem
Diagnose | _—
| 006. | or oi | o2 | o4 | o
ES reum + Lus l. E = + Ea
Pediculosis ........... | + + | +
Versuch 2,
u Die Menge des eingefüllten Blutes in ccm
Diagnose I
| 01 | aw | 02 0,24
Nihil E E EE E | = = | È E?
ET EE L — = | Be slk
Versuch 3.
2 | Die Menge des eingefüllten Blutes in cem
Diagnose oe
0,1 u | om2 | | o4 | 0,16 | ons |o a
In Observatione EE I = "E Je JL ei Ss | > ul ae
Lues latens .......... | — = == + un ek
Impetigo cont. ......., | — = = = ie
Sklerose `... E So = a 2 =
Scabies . oc cccceee en | — = = | = — | +
Ekzem `... - = | = SE | Se

Bei diesen drei Versuchen wurden die angegebenen Blutmengen mit
phys. NaCl-Lösung auf 2 ccm ergänzt.

Das normale Blut gerinnt bis zu einer Verdünnung von
ca. 1:10, bei weiterer Verdünnung nicht mehr.

Die zur Gerinnung notwendige minimale Blutkonzentration
ist also, angenommen daß die Gerinnung, nach 24stündigem
Aufenthalt bei Zimmertemperatur, bei der angegebenen Versuchs-
anordnung vollständig abläuft, ca. 10%. (Daß in dem 3. Ver-
suche einige Blutproben in der Verdünnung 1:10 nicht mehr
gerinnungsfähig waren, ist nach meiner Erfahrung dadurch zu
erklären, daß durch längeren Aufenthalt bei Zimmertemperatur
in verdünnten Lösungen die Gerinnungsfaktoren abgeschwächt
werden.)

96 L. Heller: Einwirkung

B. Bestimmung der zur Gerinnung notwendigen minimalen CaCl,-

Konzentration. l
Tabelle III (Versuche Nr. 14, 22, 23, 24, 29, 30).
Versuch 14.
Diagnose .
> 0,00025 | 0,0005 | 0,001 | ag

Lues L. . . 2.2 202. + | + + | +
Lues ll ...2...: 4 + + 1 +
Lues l. + Ikterus — = ge "kt
Lues L... h.h.. + + + +
Nibil ` bg AN +e + + +
Lues II ....... + Tt | + +

Da wurde zur Lösung von CaCl, (von entsprechender Konzentration)
je 2 ccm 1:75 verdünntes Blut zugefügt.

Versuch 22.
| Konzentration des Cal, in Prozentzahl
Diagnose i= ope WR.
| 0,004 !.0,0046 | 0,006 | 0,0055 | 0,006 , 0,0065 | 0,007 | 0,0075
Epididymitis gon. `. — — | +i + neg.
Sklerose . . . ... — — |! + = e
Epididymitis gon. `, — _ | -+ + E
Scabies, Lues |. . SIS ee + e
Lues H ..... e E a? T pos.
Phimose ...... | -- S Uu, "de neg.
Lues H ..... LI- | -|I+|+,+ pos.
Versueh 23
Ikterus + Lues l. . — — _ — zz | — | +| —
Aortitis luetica . . — = SS T + | A F Sec hee
Sklerose... .. u ee EE 0 RE
Nihil el +|- + | = '+ A 2 "bs e
Lues H ..... gë ` e +o +j +, + + RES:
Gonorrhöc .... — = pe T SÉ + i +: + [neg
Scabies ..... — — un al re ae a SE á
Scorbut `, — m a EE EK e ee a a nn
Versuch 24.
Ulcus molle, Bubo. — nl (E a EES n le neg.
Dues ge = te N E I En E E - e
Lues l. Reste von |
Ikterus... 5. = el el | +| + pos
Lues ...2.. — | — È + +o + + a
Tues I ..... I el ei E It AH) —
Ekzem ...... =, ber a Eeer, e a neg.
Gonorrhoe . ... = a s It) + | e a + e
Eues 2... 3% ENEE e +] + + + pos.
In Observatione ı - 1 - — >: + + 4- + neg.
Scabies ..... u E — + + + + i $

0,8—1.5 cem Lösung A., mit 1 proz. NaCl-Lösung auf 2 cem ergänzt
+2 cem 1:100 verdünntes Blut. Lösung A ist auf CaCl, 0,02 proz., auf
NaCl 1 proz.

einiger Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnunge des Blutes. 97

Versuch 29.
Konzentration des CaCl, in Prozentzahl
Diagnose (ee ee rm EEE
0015 | 002 "um | 003 | om ` 004 | 0,045 ı 0,08
Ikterus + Lues . . De SE — = A | + + +
Lues I Papulae . . — = e SE E, ae E Se | + j pos
Scabies ... der ees? | = 2 =. Eee,

0,3—1 cem aus Lösung C mit einer 1 proz. NaCl-Lösung auf 2 cem
erränzt + 2 cem 1:200 verdünntes Blut.

Versuch 30.

Konzentration des CaCl, in Prozentzahl

Diagnose ae Be "ege?
0,015 | 0,02 | 0,05 1,08 | 0,035

0,04 | 0,045 | 0,05

EE
i Gorgen SR Gë
Versuchsanordnung wie bei Versuch 29, mit dem Unterschiede, daß
da 2 ccm 1:300 verdünntes Blut eingefüllt wurde. Lösung C ist auf
CaCl 0,2 proz., auf NaCl 1 proz..

Das Prinzip der Versuchsanordnung: Bei gleicher Blut- und
NaCl-Konzentration ist die zur Gerinnung notwendige minimale
CaCl,- Konzentration zu bestimmen. Diese gleiche Blutkonzen-
tration kann, wie aus den Versuchen zur Versuchsanordnung A.
ersichtlich ist, von der Verdünnung 1:10 an bis, wie das aus
später mitzuteilenden Versuchen (s. Tabelle IV) ersichtlich, zu einer
Verdünnung von ca. 1 : 800 frei gewählt werden. Innerhalb enger
Grenzen kann auch die NaCl-Konzentration frei gewählt werden.

Derzeit verfüge ich über Versuche, bei welchen die Blutkonzen-
tration 1 : 150, 1 : 200, 1 : 400 und 1 : 600 betrug. Am ausführ-
lichsten sind unter diesen die Versuche bei der Blutverdünnung
1 : 200, nebst einer NaCl-Konzentration von 0,5%, durchgeführt
worden.

Ergebnisse des 14. Versuches:

l. Die minimale CaCl,-Konzentration, die bei der angegebenen
Versuchsanordnung nebst Zufügung von 0,5%, NaCl zu dem
normalen, 1 : 150 verdünntem Blut zugefügt werden muß, damit
eine Gerinnung eintreten kann, beträgt weniger als 0,00025°%
des Reaktionsvolumens.

2. Bei den untersuchten 5 luischen Blutproben ist die Gerin-
nung früher eingetreten als bei dem Normalblut. Bei den luischen
Blutproben haben sämtliche Röhrchen ein Gerinnsel aus Fibrin

Biochemis.he Zeitschrift Band 123. fi

98 L. Heller: Einwirkung

und aus roten Blutkörperchen bestehend enthalten. In dem
ersten Röhrchen von minimaler CaCl,-Konzentration bei Blut
einer gesunden Person dagegen wurden keine roten Blutkörperchen
in dem Gerinnsel mitgefaßt.

= 8. Bei dem Fall von hochgradigem Ikterus + Lues latens
macht die zur Gerinnung notwendige minimale CaCl,-Konzen-
tration 0,001 aus, bei allen anderen dagegen ist sie kleiner als
0,00025°%%.

Ergebnisse der Versuche 22, 23, 24.

Die Ergebnisse dieser 3 an verschiedenen Tagen mit Blut-
proben von Patienten verschiedenen Alters beider Geschlechter
und zu verschiedenen Tageszeiten (von 11 bis 1 Uhr mittags) an-
gestellten Versuche können folgenderweise zusammengefaßt werden:

1. Die minimale CaCl,-Konzentration, die bei der angegebeneı.
Versuchsanordnung nebst Zufügung von 0,5% NaCl zu dem
normalen, 1 : 200 verdünnten Blut zugefügt werden muß, damit
eine Gerinnung eintreten kann, beträgt 0,005—0,006°%, des
Reaktionsvolumens. Obzwar die äußeren Umstände wegen Mangels
an Thermostat und Eisschrank nicht vollständig gleich einzustellen
waren, ist es doch möglich gewesen, eine ziemlich scharfe Grenze
festzustellen. Es ist anzunehmen, daß bei gleichbleibenden
äußeren Umständen gleiche Werte für die Gerinnungsfähigkeit
des normalen Blutes festzustellen wären. Gleiche Umstände
könnte man dadurch schaffen, daß man zur Verdünnung des
Blutes eine auf 0° abgekühlte Pipette gebrauchen und den Ver-
such bis zum vollständigen Ablauf desselben bei konstanter, für
die Gerinnung günstiger Temperatur durchführen würde.

2. In einem Falle von langdauerndem Ikterus ist bedeutende
Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit konstatiert worden (Ver-
such 23). Die zur Gerinnung notwendige minimale CaCl,-Konzen-
tration ist in einem Falle von Ikterus bei Lues latens 0,0075°%5 ,
bei normalem Blut 0,0055°%..

Ergebnisse des 29. Versuches:

l. Die zur Gerinnung notwendige minimale CaCl,-Konzen-
tration bei einer Blutverdünnung von 1: 400 nebst der angegebenen
Versuchsanorednung beträgt beim Normalblut ca. 0,035°5 des
Reaktionsvolumens.

2. Die zur Gerinnung notwendige minimale CaCl,-Konzen-

einiger Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes. 99

tration bei dem luetischen Blut (Lues II-Papeln, WaR. pos.)
beträgt 0,025%, des Reaktionsvolumens.

Ergebnisse des 30. Versuches:

l. Die zur Gerinnung notwendige minimale CaCl,-Konzen-
tration bei einer Blutverdünnung 1 : 600 nebst der angegebenen
Versuchsanordnung beträgt bei dem Normalblut mehr als 0,05%
des Reaktionsvolumens, dieselbe bei dem luischen Blut 0,035°% .

C. Bestimmung der zur Gerinnung günstigen NaCl-Konzentration.
Tabelle IV.

Versuch 26.
Konzentration des NaCl in Pruzentzahl
o | oil 02 | 03 04 05 ns lor nn on 10
| | Fi | | Tr | |
| N D! j \
F,F!G|G,G|G)|G |Tr|Tr|Tr|Tr
l ; l |

0,0—1,0 cem Lösung A ergänzt mit einer 0,02 proz. CaCl,-Lösung
auf 3 cem + 3 cem 1:100 verdünntes Blut. Lösung A ist auf NaCl
6 proz., auf CaCl; 0,02 proz. F = Fällung; G = Gerinnsel; Tr = Trübung.

Ergebnisse des 26. Versuches:

Nebst einer 0,5 proz. Blut- und nebst einer 0,01 proz. CaCl,-
Konzentration findet die Gerinnung bei einer NaCl-Konzentration
von 0,2% bis 0,6% statt. Dieses Ergebnis stimmt mit folgender
Beobachtung überein: Bei den Versuchen, die ich zur Methode B,
bei einer Blutverdünnung von 1 : 200 und bei CaCl,-Konzentration,
wie in den Versuchen 22, 23, 24, weiter bei NaCl-Konzentration
von 1% aufgestellt habe, ist keine Gerinnung eingetreten.

D. Bestimmung der zur Gerinnung notwendigen minimalen Blut-

konzentrationen bei gleichbleibender und zur Gerinnung ausreichender
NaCl- und CaCl,- Konzentration.

Tabelle V.
Versuch 31.

| Blutverdünnung
Diagnose DEE a er

1: 800 1:727 | 1:666 1:615) 1:5711 1:583 1:500 ELEN
— | = neg.
Se Zb | + | q4 pos.

ner.

li
Ikterus+Luesl. | — ef |
Lues HI ... — |= + ko ZE ie
Scabies. . . . Me Së Se" ës — = | +
0,5—0,9 cem 1:100 vertlünntes Blut mit destillierten Wasser auf
2 ccm ergänzt + 2 cem aus einer Lösung, die auf Call, 0,1 proz, auf NaCl
l proz. war.

gd.

100 L. Heller: Einwirkung

Versuch 32.

PER Zei A HE e EE e e e

Blutverdünnung

Diagne se leie S 3 zla e o
ana al galgje g sie“
ler EE Sa E
ET EEE rn) === it e + lpo.
Ikterus + Dies: E ee E
Gonorrhöe ` — — l=] es seis st sik E + +f -
Sklerose . ....!-|- -.- +t A ++ - = | pos.
Versuch 33.
Rec. Lues Papulae . | Q+- = | Fr Se) a
Roseola syphil. .. -—'- | + + +t|+ + +i+ +|+ I+] s
Impetigo capitis . . — -'—.- -|- +i— | + + +! +j ne.
Lues l. Gonorrhöe . — Ä — =i - + l+., +|+1+ e
Scabies. - - » ». == =i tt LL EI „
Versuch 34.
Impetigo cont.. . ». —- —- — — | —- Is zk TI — | +I + [| neg.
Scabies. . . e.V ee = | — | — ' l] + a
Lues II Papulae d en ee ee ee
Portiosklerose . . ..- '- — =~ — — —' — +1-|-1|+lfraerl
| | | pos

0,2—1,3 cem 1:200 verdünntes Blut, mit destilliertem Wasser auf2 cem er-
gänzt + 2 cem aus einer Lösung. die auf CaCl, 0,1 proz., auf NaCl I proz. war-

Vor Besprechung der Versuchsresultate sollen hier die Ver-
dünnungsgrenzen, bis zu welchen noch Gerinnung bei den ver-
schiedenen Blutproben eingetreten ist, angeführt werden.

Verdünnung, bei welcher

Diagnose noch Gerinnung eintritt
Versuch 31: 1. Ikterus, Lues latens weiter als bis 1 : 444
2. Scabies . .. A 1 : 500

3. Lues II. Papulse W ak pos.
Versuch 32: 1. Gonorrhöe ;
2. Ikterus, Lues latens .
3. Lues latens WaR. pos.
4
1
2

. Sklerose, Lymph. ingu. WaR. pos.
Versuch 33: 1. Impetigo capitis.
. Scabies e
3. Lues I, Gonorrhöe. i
4. Roseola syphilitica WaR. pos.
5. Rec. Lues Papulae ad genitale

WaR. pos. .

bel p ` bad p p p p p pt
keet
Ai
Eai
Le

Versuch 34: 1. Impetigo contagiosa .

kent ` kent ` bei ` Fei

j [9 e)
9c
00

3. Portiosklerose d aR. fraalich pos.
. Lucs Il. Papulae WaR. nicht
untersucht . 2. a 2 2 2 2 2 02. 1 : 1000

1
2. Scabies. .
3
4

einieer Gerinnungsfaktoren auf die (rerinnung des Blutes. 101

Ergebnisse:

l. Wie aus der obigen Zusammenstellung ersichtlich, sind die
Verdünnungswerte, bei welchen noch bei den Normalblutproben
(von Patienten herstammend, die weder Lues noch Ikterus
gehabt haben) Gerinnung eingetreten ist, folgende: 1 : 500, 1 : 800,
1 : 1000, 1 : 1143, 1 : 888, 1 : 666. Bei den Luesfällen (mit Er-
scheinungen und mit positiver WaR.) sind die entsprechenden
Werte: 1 : 666, 1 : 1332, 1 : 2000, 1 :2000, 1 :1000. Minimale
bzw. maximale Werte bei Normalblut: 1 : 500 bzw. 1:1143;
bei Lues: 1 : 666 bzw. 1 : 2000. Durchschnittswerte bei Normal-
blut: 1 : 821; bei Lues: 1 : 1333. Das Verhältnis der Durch-
schnittswerte: 1,62.

2. Bei 2 Fällen von leichterem Ikterus + Lues latens ist
der Verdünnungswert, bei welchem noch Gerinnung eingetreten
ist, etwas niedriger als bei Normalblutproben des entsprechenden
Versuches. (Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit bei Ikterus.)

3. In den Versuchen 31, 32, 33, 34 zeigt sich mit einer ziemlich
großen Regelmäßigkeit eine paradoxe Erscheinung; die stufenweise
Herabsetzung bzw. Ausbleiben der Gerinnung in den Röhrchen,
die etwas höhere Blutkonzentration enthalten, als die zur Gerinnung
notwendige minimale ist. Wodurch diese Erscheinung hervor-
gerufen wird, ist mir bisher unklar geblieben. (Es käme die Mög-
lichkeit in Betracht, daß die Gerinnung auch in diesen Röhrchen
eingetreten, aber bis zur Ablesungszeit wieder aufgelöst worden
ist. Es müßten da natürlich zur Auflösung des Gerinnsels die
günstigsten Verhältnisse vorhanden sein.)

Zusammenfassung.

oi Normalblut.

Es wurde die zur Gerinnung notwendige minimale Blut-,
CaCl,- und die zur Gerinnung ausreichende NaCl-Konzentration
bestimmt, weiters die zur Gerinnung notwendige minimale Blut-
konzentration bei gleicher und zur Gerinnung ausreichender
CaCl,- und NaCl-Konzentration festgestellt. Dabei hat sich
ergeben:

a) Die zur Gerinnung notwendige minimale Blutkonzentration
ist ca. 10 proz.

b) Die zur Gerinnung notwendige minimale CaCl,-Konzen-
tration bei einer Blutverdünnung von 1 : 200 ist ca. 0,005 —0,006°,,

102 L. Heller: Einwirkung

Bei höherer Blutkonzentration ist die zur Gerinnung notwendige
minimale CaCl,-Konzentration niedriger, bei niederer Blutkonzen-
tration höher.

c) Nebst einer 0.5proz. Blut- und nebst 0,01 proz. CaCl,-
Konzentration findet die Gerinnung bei einer NaCl-Konzentration
von 0,2—0,6°,, statt.

d) Bei 0,05°, CaCl,- und 0,5", NaCl-Gehalt ist die Verdün-
nungsgrenze des Blutes, bei welcher noch Gerinnung eintritt,
ca. 1 : 800.

Selbstverständlich sind diese Werte keine ahsoluten Werte.
Bekanntlich üben auf die Gerinnung viele äußere Faktoren einen
bedeutenden Einfluß aus. Infolgedessen sind diese Werte von
der angewendeten Methodik abhängig. Durch die Versuchsanord-
nung B (Bestimmung der zur Gerinnung notwendigen minimalen
CaCl,-Konzentration) ist es doch gelungen, an den verschiedenen
Tagen ziemlich übereinstimmende Werte zu erhalten (siche Tab. II).

p) Ikterus.

Bei 2 Fällen von hochgradigem Ikterus waren bei der Ver-
suchsanordnung B. die zur Gerinnung notwendigen minimalen
CaCl,-Konzentrationswerte bedeutend höher als beim Normalblut.
Bei 2 leichteren Ikterusfällen war bei der Versuchsanordnung D.
die zur Gerinnung notwendige minimale Blutkonzentration etwas
höher als bei dem Normalblut. Die Versuchsanordnungen waren
also geeignet, die bekannte Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit
des ikterischen Blutes anzuzeigen |Übereinstimmung mit Pe-
trens!) Untersuchungen].

») Lues.

Bei den untersuchten Fällen von Lues II mit Erscheinungen
und mit positiver WaR. war bei der Versuchsanordnung D. die
zur Gerinnung notwendige minimale Blutkonzentration durch-
schnittlich 1,62 mal niedriger als die des Normalblutes. Winter-
nitz?) hat auf refraktometrischem Wege festgestellt, daß die
Fibrinogenmenge des luetischen Blutes vermehrt ist. Er hat aus
der Prüfung der Refraktionsfähirkeit des Serums und des Hirudin-
plasmas deren Eiweißgehalt in Prozentzahlen ausgerechnet und
angenommen. daß die Differenz dem Fibrinogengehalt entspricht.
Er ist zu folgenden Durchschnittsresultaten gekommen:

d Ge Petren, Bruns Beitr. z. klin. Chirurg. 120, 43. 1920.

2) A. Winternitz, Areh. f. Dermatol. u. Syphilis, Orig. 101. 1910.

einirer Gerinnungsfaktoren auf die Gerinnung des Blutes. 103

Serum Plasma Fibrinogen
0 o:
ʻO ʻO
NOMAL e a a a re 8,07 8,53 0,46
II. Inkubationsstadium . . . 8,64 9,15 0,50
Lues papulosa. ...... 8,92 9,62 0,7

Wenn ich nun 0,7 durch 0,46 dividiere, erhalte ich die Zahl 1,54.
Der von Winternitz festgestellte Durchschnittswert der Fibrino-
genvermehruug des luetischen Blutes stimmt mit dem oben aus-
gerechneten Durchschnittswert der Erhöhung der Gerinnungs-
fähigkeit des luetischen Blutes ziemlich überein. Die Versuchs-
anordnung D. (auch die Versuchsanordnung B. bei einer Blut-
verdünnung von 1 : 600) ist geeignet, die Vermehrung des Fibrino-
gengehaltes des luischen Blutes anzuzeigen.

ô) Schlußfolgerung:

Bekanntlich üben die Temperatur, Adhäsion, Beimischung
von Gewebssäften, folglich die Dauer der Blutentnahme, Form,
Stoff, Größe des Gefäßes und der Nadel usw. auf die Gerinnungs-
vorgänge großen Einfluß aus. Doch sprechen die obigen Resultate
dafür, daß bei genauer, gleicher Einstellung dieser störenden
äußeren Faktoren die obigen Versuchsanordnungen als Methoden
zwecks Bestimmung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes dienen
könnten. Diesbezüglich kommen folgende Verbesserungsmöglich-
keiten der Methodik in Betracht: Das Konstruieren einer Ver-
dünnungsspritze, mittels welcher das Blut sogleich bei der Ent-
nahme in der entsprechenden Weise verdünnt werden könnte.
Weiters das Ablaufenlassen der Reaktion im Thermostaten.

Eine solche Methode wäre exakter als die zeitbestimmenden
Methoden, die bekanntlich nur über die Geschwindigkeit des
Gerinnungsvorganges berichten. Außerdem könnte man dadurch
die Veränderungen der einzelnen Gerinnungsfaktoren anzeigen.
So glaube ich, aus dem Bisherigen annehmen zu können, daß die
Versuchsanordnung D. die Veränderungen des Fibrinogenfaktors
die Versuchsanordnung B. (nebst Blutverdünnung 1 : 200) dagegen
mehr die Veränderungen des Thrombinfaktors nachzuweisen
geeignet wäre.

Über die Analyse einer Volumkurve von Blutkörperchen

in hypertonischen Lösungen, welche zugleich die Differen-

zierung von osmotischen und kolloidchemischen Volum-
änderungen ermöglicht.

Von
Takeo Takei (Osaka, Japan).

(Aus dem Physiologischen Institut der Universität Groningen.)

(Eingegangen am 13. Juli 1921.)
Mit 5 Abbildungen im Text.

I. Einleitung.

Die physiko-chemische Beeinflussung der roten Körperchen
durch ihre Suspensionsmedien, wie sie in der experimentellen
Physiologie, Pharmakologie und Immunitätslehre verwendet
werden, ist ein wichtiges Thema, das speziell in der Immunitäts-
lehre nicht immer genügend berücksichtigt wurde. Ist es doch
einleuchtend, daß eine pharmakologische oder immunologische
Beeinflussung der Körperchen sich immer mit der Wirkung des
Suspensionsmediums an sich summieren wird und daß viele
dergleichen Agenzien in ihrer Wirkung ganz von der Zusammen-
setzung dieses Mediums abhängig sind.

Ein paar Beispiele mögen diese Erwägung erläutern.

l. Es ist in der letzten Zeit bekannt geworden, daß das
Waschen der Körperehen mit reiner Kochsalzlösung die osmotische
Resistenz dieser Körperchen beträchtlich erniedrigt, weil diese
Lösung ein verflüssigendes Effekt auf die Oberflächenkolloide
hat!). In der sog. äquilibrierten Salzlösung mit physiologischer
Wasserstoffionenkonzentration und Caleiumionenkonzentration?)
wird aber die Resistenz erheblich erhöht, weil das hämolytische
Blutleeithin von der Körperchenoberfläche abgespült wird.

1) Brinkman und van Dam, diese Zeitschr. 108, 35. 1920.
2) Brinkman, diese Zeitschr. 95, 101. 1919.

T. Takei: Analyse einer Volumkurve von Blutkörperchen usw. 105

2. Seit den Untersuchungen von H. Buchner, Ferrata,
Sachs und Teruuchi, Brand, Hecker usw.!) ist es bekannt,
daß das Komplement in salzfreier isotonischer Lösung nicht
imstande ist, hämolytische Amboceptoren zu aktivieren. Diese
Erscheinung der Komplementinaktivierung ist eingehend ana-
lysiert worden und hat zu der Spaltung des Komplementes in
Mittelstück (Globulinfraktion) und Endstück (Albuminfraktion)
geleitet. Guggenheimer?) stellte nun fest, daß Körperchen,
welche in Rohrzuckerlösung gewaschen wurden, schon mit dem
Mittelstück beladen und dadurch persensibilisiert sich zeigten,
d. h. durch Endstück allein hämolysierten. Andererseits haben
Brinkman und van Dam?) gefunden, daß Körperchen in Rohr-
zuckerlösung ihre Lecithinhülle behalten und diese nicht, wie bei
der Auswaschung in Salzlösung, verlieren.

Ein weiteres Beispiel dieses differenten Verhaltens der
Körperchen in Salzlösung und in Zuckerlösung findet man bei
der Kobragifthämolyse. Bang?) zeigte, daß Körperchen in Salz-
lösung nur durch Kobragift hämolysierten, wenn dieser Lösung
Lecithin zugesetzt wurde. In Zuckerlösung hämolysierten die
Körperchen auch ohne Lecithinzufügung, offenbar dadurch, daß in
Zuckerlösungdie Körperchen ihre eigene Lecithinhüllenoch besitzen.

3. Als Ursache der von Hamburger) und später auch von
anderen beschriebene Tatsache, daß die bikonkaven Blutkörper-
chen in Salzlösung über Stechapfelform die Kugelform annehmen,
fanden Brinkman und van Da mô) eine elektrische Umladung
der Blutkörperchen, welche von dem mittels Reibung geladenen
Objektglase herrührte. Im Serum erleidet das Blutkörperchen
von dieser Ladung keinen Einfluß, in der Salzlösung wird aber
die isolierende Körperchenhülle ausgespült. Die Substanz, welche
dieser adsorbierten Schicht ihre Eigenschaften gibt, ist das
Cholesterin, das von dem an der Körperchenoberfläche adsorbierten
Lecithin in kolloidaler Lösung gehalten wird.

1) Landsteiner, Handbuch der Biochemie Bd. II (I), S5. 395.

2) Guggenheimer, Zeitschr. f. Immunitätsforsch. u. exp. Therap.
8, 295. 1911.

3) Brinkman und van Dam, Le

4) Bang, Ergebn. d. Physiol. 8, 463. 1909.

5) Hamburger, Osmotischer Druck und Ionenlehre Bd. I, S. 199
bis 200.

6, Brinkman und van Dam, diese Zeitschr. 108, 52. 1920.

106 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

4. Schließlich sei noch an die Agglutination der Erythrocyten
in Rohrzuckerlösung oder Glucoselösung erinnert. Diese wurde
von vielen Untersuchern in hohem Grade gefunden, von anderen
Forschern aber gar nicht beobachtet. Die Ursache dieses diffe-
renten Verhaltens ist die geringe Konstanz der Wasserstoffionen-
konzentration der Anelektrolytlösung. Es wurde von Radsma!)
nachgewiesen, daß jede Körperchenart bei einer bestimmten [H]
agglutiniert in Zuckerlösung, und daß der isoelektrische Punkt
für jede Körperchenart etwas verschieden ist.

Es ist nun seit den Untersuchungen von Hedin?) u.a. und
in neuester Zeit von Ege?) bekannt geworden, daß das Körperchen-
volum in isoosmotischen Lösungen nicht das gleiche zu sein
braucht. 2 Theorien sind es, welche in der Erklärung dieses Medium-
einflusses auf das Körperchenvolum um den Vorrang streiten,
die osmotische und die kolloidchemische Theorie. |

Die klassische osmotische Theorie erfordert die Existenz einer
relativ semipermeablen Körperchenmembran und ist also innig
zusammengewoben mit den Permeabilitätstheorien, welche doch
schließlich alle auf kolloidcehemischer Basis stehen müssen. Die
rein kolloidehemische Auffassung will die Annahme dieser Mem-
bran nicht machen und die Erscheinungen der Volumänderung
und Hämolyse direkt auf Quellung und Adsorption beziehen.

Nun ist in letzterer Zeit die Existenz einer speziell differen-
zierten, durch Öberflächenkondensation entstandenen Körperchen-
hülle wohl schr wahrscheinlich geworden, und damit ist die osmo-
tische Theorie noch besser fundiert worden.

Zumal für diejenigen Erscheinungen der Volumänderung,
welche in kurzer Zeit sich abspielen, wird die initiale osmotische
Druckdifferenz wichtig sein; wenn aber die Körperchen längere
Zeit in Versuchsmedien verweilen, wird immer wieder die kolloid-
chemische Beeinflussung zutage treten. wie das seit Höbers®)
grundlegenden Experimenten bekannt worden ist. Wenn man
also osmotischen und kolloidehemischen Einfluß auf die Körper-
chen in einem und demselben Augenblick. jeden für sich, bestimmen

!) Radsma, Arch. neerland. de physiol. 3, 365. 1919..

2) Hedin, Skandinav. Arch. f. Physiol. 5, 1. 1805.

3) Ege, diese Zeitschr. 115, 109 u. 175. 1921.

3) Höber, Pflürers Arch. f. d. ges. Physiol. 134, 311. 1910.

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 107

will, so muß die Methode der Körperchenuntersuchung eine große
Genauigkeit besitzen [wie das z. B. bei der Analyse der osmotischen
Resistenz durch Brinkman und van Dam!) der Fall war], oder
müssen beide Faktoren in ihrer Wirkungsstärke vergrößert werden.

Diese letzgenannte Bedingung meinten wir erfüllen zu können
durch die Untersuchung des Körperchenvolums in stark hyper-
tonischer Lösung. In dieser Weise doch waren osmotische und
kolloidehemische Faktoren so sehr intensivisiert, daß ihre Wirkung
auf das Körperchenvolum gleichzeitig und fast augenblicklich
analysiert werden konnte. Vor allem ist diese momentane Unter-
suchungsmethode auch wertvoll, weil in dieser Weise die kompli-
zierenden Permeabilitätsänderungen auf den zweiten Platz ge-
drängt werden. Es ist die initiale Osmose bzw. Elektroendosmose ?),
welche hier primär wichtig ist. Längeres Verweilen in der Ver-
suchslösung, wie das z. B. bei Eges Experimenten der Fall war,
macht die Erscheinungen schon viel komplizierter.

II. Das Körperchenvolum in Glucoselösungen und in Salzlösungen.

Längeres Verweilen von Blutkörperchen in reinen Glucose-
lösungen (z. B. länger als eine Stunde) gibt Anlaß zu tiefgreifenden
Änderungen: die Körperchenhülle wird modifiziert und außer-
ordentlich empfindlich für Änderungen der [H']?), Agglutination
und Hämolyse können bald eintreten. Die Ionenpermeabilität
ist stark erhöht (siehe unten S. 117). Die normal bestehende
Permeabilität der Körperchen für Glucose ist nicht nachzuweisen 4);
untersucht man aber Körperchen in äquilibrierter Salzlösung, in
der das Kochsalz durch Glucose substituiert wurde, so ist das
Bestehen dieser Permeabilität unzweideutig nachzuweisen’),

Die schnellere Untersuchung des Körperchenvolums in Glucose-
lösung schaltet aber alle diese Komplikationen aus; hier ist nur
die initialosmotische Wasserentziehung maßgebend.

Die Methodik war folgende:

Hypertonische Rohrzuckerlösungen sind zur Untersuchung des Kör-
perchenvolums ungeeignet, weil ihr spezifisches Gewicht so hoch wird, daß

1) Brinkman und van Dam, diese Zeitschr. 108, 66. 1920.

"IB Jacques Loeb, Journ. of gen. physiol. 1, 717. 1919; auch
Science 53, 77. 1921.

3) Radsma, Le

1) Ege, Le

5) Brinkman u. van Dam, Arch. internat. de physiol. 15, 105. 1919.

108 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

die Körperchen nicht mehr gut auszentrifugiert werden können. Wir
haben uns deshalb zur Untersuchung des Körperchenvolums in Glucose-
lösungen beschränken müssen.

Es wurde gearbeitet mit defibriniertem Kaninchen- und Menschen-
blut; 0,08 ccm frisches Blut wurde in Hamburgerschen Chonohämato-
kriten, welche vorher mit l ccm Glucoselösung beschickt worden waren,

gefügt und gut gemischt und =

15 Minuten sich selbst über- N Lë br app
lassen. Dann wurde zentrifu- | u ;}
giert biszum konstanten Volum, 2

was besonders bei konzentrier- we o
ter Lösung mindestens eine | e o
Stunde dauern muß. Immer Be
wurden Doppelbestimmungen zept Ja
gemacht.

Die verwendeten Glucose- isn, £
lösungen wurden vor dem Ge- sis =
brauch immer mit ein wenig - i
Natriumbicarbonat genau neu- Kap g
tralisiert ( Kontrolle mit Neutral- SE E
rot, [H] = 0,45-10 "1. Die Re- $ z
sultate der Bestimmung sind in TE CE e
Tabelle I zusammengestellt. Das Š :
Körperchenvolum wurde immer ei P F
auf ein Normalvolum (im eignen S ©
Plasma) von 100 umgerechnet. 3 f

H
Man ersieht aus der Ta- — KR E
belle, daß das Körperchen- ei? SI S
Ku
Kl <
ei A S'E

K)
Ca
A
N
04

k D
X N N N =:
Jee E | | k
> C > D > C Q O O O E O OS
E A in, ei 26 E GG, WS, "ër "SS CSS "2
D déi CA IY E EE,

volum in hypotonischen, isotonischen und leicht hypertonischen
Lösungen regelmäßig kleiner wird bis zu einer sehr konstanten
Glucosekonzentration. Von dieser Konzentration an wird das
Körperchenvolum nicht mehr allmählich kleiner, sondern es ver-
größert sich plötzlich wieder, so daß in den nächsten hypertonischen
Konzentrationen ein Körperchenvolum erreicht wird, das nur sehr
wenig kleiner ist als das Volum in istonischer Glucoselösung oder
auch als das Normalvolumen der Körperchen.

109

chen Lösungen usw.

S
D

von Blutkörperchen in hypertoni

“(usdunsgT uay»stuoytsdäy ur oskjowmryssugguy) oskjourjJ-indg—= US

E'Z6 1926 |F'F6 976 E? G'I8| 8'22
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Relatives Körperehenvolumen

n
R
d

or ga | og d GE CH

.
110 T. Takei: Analvse einer Volumkurve

Diese Erscheinung der plötzlichen Volumvergrößerung der
Körperchen sobald ein gewisser Grad der Hypertonie erreicht
wird (osmotischer Druck der hypertonischen Lösung 4 mal so groß
wie der physiologische osmotische Druck des Plasmas), haben
wir immer wieder beobachten können, und stellt ein schr kon-
stantes Phänomen dar. Die beigefügten Kurven (Kurventafel I)
geben ein deutliches Bild dieser Tatsachen.

Um die Ursache dieser plötzlichen Volumzunahme auf die
Spur zu kommen, haben wir erstens untersuchen wollen, inwieweit
sich diese Erscheinung verallgemeinern läßt, m. a. W. ob sie nicht
nur in hypertonischen Glucoselösungen, sondern auch in hyper-
tonischen Salzlösungen gefunden werden kann. Dazu unter-

Tabelle Ila.

Chloridsalzlösungen isosmotisch mit Glucoselösungen in Prozenten.

Nummer

der Lösungen Glucose NaCl KO RbCl LiCl 2 aq

I. 4,2 0,9 1,2 1,9 1,2

II. 10,0 2,0 2,6 4,1 2,7

Ill. 15,0 3.4 — —— 4,6

IV. 17,5 3,8 4,9 7,9 5.1

V. 19,2 4,2 5.4 8,7 5,6

VI. 21,0 4,6 5,9 9,5 6,2

VH. 23,0 5,0 6,4 10,3 6,7

VII. 25,0 5,4 6,9 11,2 7,3

IX. 30,0 6.5 8,3 13,5 8,7

X. 40,0 8,7 9,4 18,0 11,7

XI. 50,0 10.0 — — 13,4

Tabelle IIb.
Sulfatsalzlösungen isosmotisch mit NaCl-Lösungen in Prozenten.

Nummer

der Lösungen NaCl K,SO, RbSO, CsS0, LiSO,aq

I. 0,9 2,0 3.0 4,2 1.5

11. Zu 4,5 6,8 93 3,3

IIT. 3.4 1.6 11,6 15,8 5,6

IV. 3,8 8,5 13,0 17,6 6.2

V. 4,2 94 14,4 19,5 6,9

VI. 4,6 10,3 15,7 21.4 7.6

VH. 5.0 11,2 17.1 23.2 8,2

VIH. 5.4 12.0 18.5 25.1 8,9

EX: 6.5 — 22 30,2. 10.7

X. 8.7 — 29,8 40,4 14,3

NI. 10,0 — 34,2 46.4 16,4

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 111

suchten wir das Körperchenvolum in Kochsalzlösungen und, zur Ver-
gleichung des kolloidchemischen Ioneneinflusses, auch in Lösungen
der Alkalisulfate. Die Resultate findet man in Tabelle III und IV.

Die verwendeten Konzentrationen der Chloride und Sulfate
sind mit Hilfe der isotonischen Koeffizienten aus den Konzentra-
tionen der Glucoselösungen (s. Tabelle I) berechnet worden.

Tabelle II(a und b) gibt eine Übersicht der isoosmotischen
Glucose- und Salzlösungen;; Tabelle III gibt das Volum in Chlorid-
lösungen, Tabelle IV das Volum in Sulfatlösungen.

Tabelle II.
Relatives Körperchenvolumen in Chloridsalzlösungen.
S.H. = Spur-Hämolyse, d.H. = deutliche Hämolyse.

Nummer
der Lösungen!) NaCl KO RbCl LiCl 2 aq
I. 101,2 100,0 97,0 97,8
I. 74,4 12,2 78,4 77,7
II. 68,4 — — —
IV. 65,1 60,6 64,9 67,4
V. 61,4 60,6 63,4 67,4S.H.
VI 68,4 S.H. 83,8 S.H. 74,6 S.H. 78,3 d.H.
VII. 172,3 5 86,9 „ 80,6 „ 82,1 „
VII. 94,0 „ 86,9 81,3 „ 87,5 -
IX. 100,0 d.H. 87,6 „ 88,8 „ 78,3 -
X. 89,2 „ 88,9 „ 82,8 „ d.H.
XI. 89,2 , d.H. 82,8 - we

Tabelle IV.

Relatives Körperchenvolumen in Sulfatsalzlösungen.

Nummer

der Lösungen K,SO, Rb,SO, Cs,SO, Li,SO, aq

L ` 99,5 100,0 96,5 97,7

11. 67,9 70,8 67,4 86,0

III. 67,9 70,8 66,3 69,8

IV. 67,4 69,7 65,1 69,8

V. 67,4 69,7 69,8 65,0

VI. 76,6 75,8 88,4 77,3

VII. 77T 83,7 — 82,0

VII. 90,8 89,3 — 85,5

IX. — 97,8 — 83,7

X. —_ — — 81,4

Keine Hämolyse.

1) Die Zusammensetzungen der Lösungen I—XI sind in Tabellen IIa
und IIb wiedergegeben worden.

112 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

Fassen wir nun die bisher erreichten Ergebnisse zusammen,
so ergibt sich qualitativ und auch quantitativ eine weitgehende
Übereinstimmung in dem Einflusse auf das Körperchenvolum
der Glucoselösungen, Alkalichlorid- und Alkalisulfatlösungen.

Betrachtet man die Kurven der Volumina in Glucoselösungen
(Kurve I), so sieht man, daß von der isotonischen Lösung an das
Körperchenvolum ziemlich genau proportional der Glucose-
konzentrationszunahme abnimmt, bis in der Konzentration von
18— 20°, Glucose das Minimalvolumen erreicht wird. In diesem
Konzentrationsgebiete ist allem Anschein nach das Körperchen-
volum ausschließlich von osmotischen Druckdifferenzen be-
herrscht.

Nimmt aber die Glucosekonzentration des Suspensions-
mediums über 18% Glucose allmählich zu, so erfolgt keine weitere
Volumabnahme, sondern fängt das Volumen sehr bald an, schnell
und beträchtlich zuzunehmen, bis ein Volum erreicht ist, das nur
wenig kleiner ist als das Normalvolumen; in Lösungen, welche
über 25°, Glucose enthalten, tritt eine immer stärker werdende
Hämolyse ein.

Menschen- und Kaninchenblutkörperchen benehmen sich in
dieser Hinsicht in genau gleicher Weise.

Dieselben Erscheinungen wurden nun auch in Lösungen
von Alkalichloriden, welche alle mit den verwendeten Glucose-
lösungen isoosmotisch waren, beobachtet.

Auch hier findet man in dem Gebiete von Isotonie (also
ungefähr 0,9%, NaCl, 1,2% KCl, 1,9% RbCl, 1,2% LiCl- 2 aq)
zu einem schr bestimmten Grade von Hypertonie eine Volum-
abnahme, welche ganz gut der osmotischen Drucksteigerung
entspricht. Bei einer hypertonischen Konzentration aber von
4.2°, NaCl, oder auch von 5,4% KCl, 8,7%, RbCl oder Dor,
LiCl-2aq wird das Minimalvolumen crreicht, und bei etwas
höheren Konzentrationen erfolgt wieder dieselbe plötzliche
Volumzunahme bis zu einem Volum, das dem Normalvolumen
nur wenig unterliegt. Hier tritt auch schon leichte Hämolyse ein,
die bei höheren Salzkonzentrationen immer stärker wird. Eine
Übersicht von diesen Erscheinungen gibt auch Kurve II.

Zur Vergleichung haben wir nun auch die Volumbestimmung
in Lösungen von Alkalısulfaten ausgeführt.

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 113

Die gewählten Konzentrationen waren nicht direkt äquivalent

mit den verwendeten Alkalichloridkonzentrationen, sondern
110

Lë
S

Korperchenvolum.
S

WY AEE x H

ge 07 08 093 70 WM 72 13 74 15 76 47
Pa og. d Glukosekonz.

Kurve II. Volumkurven in Alkalichloridlösungen. (Vgl. Tab. IIa u. III.)

wurden berechnet unter Berücksichtigung der isotonischen
Koeffizienten nach de Vries, ganz wie es auch in den klassischen
Versuchen Hamburgers über Anfangshämolyse in hypotonischen
Lösungen geschah, z. B.:
NaCl 0,9% = nn X um +2% K;,SO,.
58,5

Es zeigten sich auch hier wieder genau dieselben Volum-
änderungen in hypertonischen Lösungen, wie sie auch in Lösungen
von Glucose und Alkalichloriden gefunden wurden.

(Das NaSO,’ 10 aq war wegen seiner relativ geringen Lös-
lichkeit zu diesen Untersuchungen ungeeignet.)

00 >
8 arb,SO,

90 A, SO,
E —
E 80 ~ li S0, af
Š
d
Š
60
Z
50

06 07 08 090 WW I7 12 13 74 15 16
log d Giukosehonz.

Kurve III. Volumkurven in Alkalisulfatlösunzen. (Vgl. Tab. IED u. IV.)
Vergleicht man nun die Gefrierpunktserriedrigungen der-
jenigen Lösungen, in welchen das Minimalvolumen erreicht wurde,

Biochemische Zeitschrift Band 123. 8

114 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

so fanden wir in

Glucose 18°. ..... d = — 1,970
KOS% E E a 1= — 2,093
K,50, 9,5% 3... = E 1 = —2,120

Es zeigte sich also eine ganz gute Übereinstimmung im osmo-
tischen Druck dieser Lösungen von Substanzen, welche doch in
kolloidchemischer Hinsicht ganz verschiedene Einflüsse haben
sollten.

Wir können also schon aus diesem Befund nach Hamburger:
Vorgehen mit großer Wahrscheinlichkeit schließen, daß die initiale
Volumabnahme der Körperchen in hypertonischen Lösungen.
welche man in Lösungen findet, deren osmotischer Druck bis auf
das 4fache des osmotischen Serumdruckes gesteigert wird, fast
ausschließlich auf direkt osmotischer Wasserentziehung beruht
und nicht durch kolloidchemische Vorgänge beherrscht wird.

Man würde gegen die obengenannten Versuchsreihen, welche
auf die primäre Bedeutung der osmotischen Wasserentziehung
hinweisen, noch den Einwand erheben können, daß die Körperchen-
untersuchung immer in Lösungen geschah, welche kein physio-
logisch äquilibriertes Ionensystem enthielten. Ist es doch aus
zahlreichen Untersuchungen bekannt geworden, daß für die Erhal-
tung der normalen Dispersität (Viscosität, Oberflächenspannung,
Quellungsgrad) der Körperchenkolloide die Anwesenheit eines
genau äquilibrierten Ionensystems durchaus notwendig ist.

Wir untersuchten deshalb die Körperchen in einer Lösung
folgender Zusammensetzung: NaCl 0,7%, NaHCO, 0,29%, KC
0,02%, CaCl,-6aq 0,02%, [H] = 0,45 - 10 "'.

Diese equilibrierte Salzlösung ist fast isotonisch mit einer
4 proz. Glucoselösung, sodaß, wenn zur Erzielung der erforderten
Hypertonie Glucose zu dieser Lösung zugesetzt wird, eine solche
Salzlösung + z. B. 6%, Glucose isoosmotisch ist mit einer 10 proz.
Glucoselösung.

Es wurden nun equilibrierte Salzlösungen mit immer größer
werdenden Mengen Glucoselösung versetzt und dann in der be-
kannten Weise darin das Körperchenvolum bestimmt. Die Er-
gebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Auch aus dieser Tabelle ersieht man wieder, daß das Minimal-
volumen erreicht wird in einer Lösung, welche mit einer 18- bis

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 115

Tabelle V.
Nummer Glucose in 100 ccm Relatives Körperchen-
der Lösungen Ringerlösung volumen

I. 6g 82,4
II. Il, 69,4
III. 13 „, 67,6
IV. 16 „ 78,8
V. IER 82,9
VI. 19 „ 83,5
VII. 20 ,, 85,3
VIIL ` St 87,4

1X. 28. 87,4 5 H-

X. 36 ,, 87,45 ™

S. H. = Spur-Hämolyse.

20 proz. Glucoselösung isoosmotisch ist. In stärker konzentrierten
Lösungen findet man wieder genau dieselbe Volumzunahme,
welche in den vorigen Lösungen beschrieben wurde.

Noch mehr einwandfrei sind Versuche, in denen die Körper-
chen in ihrem eigenen Serum untersucht wurden, denn hier ist
nicht nur die Ionenbalancierung, sondern auch die kolloidchemische
Balancierung physiologisch. Deshalb untersuchten wir Körperchen
in Serum, worin Hypertonie erzielt wurde, durch Zufügung von
kleinen Mengen einer stark konzentrierten Glucoselösung; es
kamen 0,08 ccm Blut auf Leem hypertonischer Glucose-Serum-
lösung. In diesen Versuchen wurde mit defibriniertem Rinderblut
gearbeitet. Die Resultate ersieht man aus Tabelle VI.

Tabelle VI.
Nummer Glucose in 100cem Relatives Körperchen-
der Lösungen Serum volumen
I. 6g 91,7
11. Ils 82,7
III. 135 72,6
IV. 16 „ 86,9
V. 18 „ 86,9
VI 19 „ 86,9
VII. 20 ,, 87,5
VIII. SE 87,5
IX. 26 „ 88,1
X. 36 „ 88,1

Die Ergebnisse stimmen wieder weitgehend überein mit
den schon mitgeteilten Versuchen; das Minimalvolum wird wieder

NS

116 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

in derjenigen Lösung gefunden, welche isoosmotisch ist mit einer
18—20 proz. Glucoselösung.

Es ist aber noch darauf aufmerksam zu machen, daß in stärker
konzentrierten Lösungen die Volumzunahme nicht so beträchtlich
ist wie es in den kolloidfreien Lösungen beobachtet wurde. Weiter
bleibt auch das Volum in stärker konzentrierten Lösungen fast
konstant und ist auch keine Hämolyse zu verspüren, wie es in
stark konzentrierten Zucker- und Salzlösungen wohl immer der
Fall war. Auf die Bedeutung dieser letzten Tatsachen müssen
wir später zurückkommen (S. 122).

A
Glukose- Serum

NS / s 3 Gluñnase- Anger
o, \

I Z ma rr Q

QG) 0 AM 12 Ze 15 16
Log. d Giukosekont.

Co
Q

S

Korpercherwolum.
~
S

a
Q

Kurve IV. Volumkurven in Glukose-Ringer und in Glukose-Serum. (Vgl. Tab. V u. YL)

Wenn man, wie es oben auch für Salz- und Zuckerlösungen
gemacht wurde, nun wieder den Gefrierpunkt derjenigen äquili-
brierten Salzlösung oder des hypertonischen Serums bestimmt,
in denen das Minimalvolum auftrat, so finden wir wieder:

Eq. Salzlösung + 14°, Glucose . . 4 = —2,005
Serum + 14%, Glucose ..... Jr —2,075

Aus diesen Untersuchungen können wir also mit Sicherheit
schließen, daß für die Wasserentziehung der Körperchen in hyper-
tonischen Medien, bis zu einer auf das 4fache der normalen Isotonie
gesteigerten Hypertonie nur der osmotische Druck der Versuchs-
lösung maßgebend ist, und daß etwaige kolloidchemische Einflüsse
bei diesen initialen Prozessen völlig auszuschließen sind.

IH. Die Ursache der Volumzunahme von Blutkörperchen in Sus-
pensionsflüssigkeiten mit auf das Vierfache der normalen Isotonie
gesteigertem osmotischen Druck.

In den oben beschriebenen Versuchen wurde festgestellt, daß
die plötzliche Volumzunahme der Körperchen immer bei einem
und demselben osmotischen Druck der Lösung stattfindet,
welcher Art auch die gelöste Substanz sein möge. Die Volum-

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 117

zunahme der Körperchen geschieht also, wenn dem
Körperchen eine bestimmte Menge Wasser entzogen
worden ist. Zur Erklärung dieser interessanten Tatsache
könnten wir die folgende Hypothese aufstellen.

Die große Konstanz der Abhängigkeit von Körperchenvolum-
zunahme und maximaler Wasserentziehung weist auf die Bedeu-
tung des Körpercheninhaltes hin, denn die Konzentrierung dieses
Inhaltes ist das einzige, was die Körperchen in den verschiedenen
hypertonischen Lösungen gemeinsam haben. Man könnte nun
folgende 2 Voraussetzungen machen: Erstens wäre es möglich,
daß durch die erhebliche Konzentrierung des Körpercheninhaltes,
speziell der Innensalze, eine plötzliche absolute Permeabilität
der Körperchenmembran eintrat. Osmotische Druckdifferenzen
könnten dann nicht mehr bestehen und das Körperchenvolum
würde sich in den stark hypertonischen Lösungen nicht weiter
verkleinern. Diese Annahme könnte wohl erklären, daß das
Körperchenvolum nicht mehr kleiner wurde, aber nicht, daß es
sich wieder erheblich vergrößert, wie das doch tatsächlich der
Fall ist.

Zweitens könnte man sich vorstellen, daß durch die stärkere
Konzentrierung der Innensalze die Viscosität des Körperchen-
inhalts oder dessen Quellungsdruck ziemlich schnell so groß wurde,
daß eine Volumzunahme entgegen dem osmotischen Druckgefälle
resultierte, daß also die Volumzunahme verursacht wurde durch
eine Steigerung des kolloidchemisch gebundenen Körperchen-
wassers.

‚Um zwischen diesen beiden Auffassungen unterscheiden zu
können, haben wir erst die Ionenpermeabilität der Körperchen
in konzentrierteren Zuckerlösungen untersucht. Wir könnten
das leicht machen durch die Bestimmung der elektrischen Leit-
fähigkeit von Körperchensuspensionen in konzentrierten Zucker-
lösungen. Das Resultat ist in Tabelle VII zu erschen.

Tabelle VII.
Relatives Körperchen- 1312 1167 1000 833 573 563 55T 5M4 616 855
Glucoselösungen in % 2,5 3,0 AA 370 100 150 170 2)0 220 25,0
vermögen d'Ae un Aan 320 B309 4087 GHB TID a MS MITT am
Die Methodik war folgende: Frisches defibriniertes Kaninchen-

blut wurde mit 4,2 proz.Glucoselösung schnell 3 mal ausgewaschen,

118 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

bis die Chlorreaktion ganz verschwunden war. Die Körperchen-
konzentration wurde dann wieder der ursprünglichen Normalkon-
zentration gleichgemacht. Von diesem Gemische wurden je 0,5 ccm
zu 5ccm der Glucoselösungen zugefügt und dann die Leitfähig-
keit dieser Suspensionen in Gefäße nach Hamburger bestimmt.

Nach halbstündigem Verweilen hatte sich die Leitfähigkeit
dieser Glucosesuspensionen nur wenig geändert; wenn die Körper-
chen aber 1!/, Stunde in den Lösungen verweilt hatten, zeigte sich
eine bedeutende Zunahme der Leitfähigkeit, welche aber nicht
plötzlich bei der bekannten Konzentration von 18—209% Glucose
sich zeigte, sondern allmählich und proportional der steigenden
Glucosekonzentration auftrat!).

Das Auftreten dieser Ionenpermeabilität könnte also die
beobachtete Volumzunahme nicht erklären, da sie nicht plötzlich
auftrat, sondern proportional der Glucosekonzentration, und weil
sie sich erst nach 1!/,stündiger Einwirkung zeigte.

Wir hatten dann also weiter zu untersuchen, inwieweit sich
das Wasserbindungsvermögen der Körperchenkolloide unter dem
Einfluß einer Konzentrierung der Körpercheninnensalze ändern
konnte. Zur Messung des Quellungsvermögens der Körperchen-
kolloide benutzten wir ihre Viscosität.

Direkte Untersuchungen über Viscosität der Körperchen-
kolloide sind uns nicht bekannt, wohl aber bestehen zahlreiche
Untersuchungen von Koch?), Höber?), Handovskyt®) u. A PI.
welche den großen Einfluß von Ionen und Ionenkombinations-
systemen auf die Viscosität einer der wichtigsten Bestandteile
des Hämochroms [Bohr®)], nämlich auf das Lecithin, darstellen.

Zur Darstellung des kolloiden Körpercheninhaltes benutzten
wir die Methode Offringas’):

1) Bang zeigte schon früher, daß die osmotische Resistenz der Körper-
chen in 8proz. Rohrzuckerlösung größer wird, je länger die Körperchen
in der Lösung verweilen, durch die eintretende Ionenpermeabilität.

2) Koch und Mitarbeiter, S. Forbes und Keith, Phosphorus Com-
pounds in Animal Metabolism, Ohio Agricult. Station. Bull. n. 5. 1914.

3) Höber, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 11, 35. 1907.

4) Handovsky, diese Zeitschr. 31. 32. 1907.

5) Ss. Forbes und Keith, l. e. — Neuschlosz, Pflügers Arch. f. d.
ges. Physiol. 18, 17, 40. 1920.

6) Bohr, Handbuch der Physiol. Bd. I.

7) Offringa, diese Zeitschr. 28, 112. 1910.

ps Aë ege ee a EEN

~am -

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 119

Das Blut wird 3mal mit äquilibrierter Salzlösung gewaschen
und dann die scharf abzentrifugierten Körperchen mit gereinigter
Infusorienerde innig gemischt. Die Paste wird in gereinigte Watte
eingehüllt und in der Buchnerschen Presse unter 300 Atmo-
sphären ausgepreßt. Der Preßsaft wird durch Zentrifugieren
ganz von Körperchen befreit. Die Viscosität dieser Körperchen-
kolloide wird mittelst dem Viscostalagnometer nach Traube
gemessen bei genau konstanter Temperatur.

Die Abhängigkeit der Viscosität des Körperchenpreßsaftes
von der Konzentration der Innensalze läßt sich sehr deutlich durch
Dialyse dieses Preßsaftes erweisen.

Körperchenpreßsaft wurde in einer Extraktionshülse, die
mit Kollodium imprägniert worden war, gegen destilliertes Wasser
dialysiert. SC

Die Ausflußzeit des Viscostalagnometers war für Wasser
2 Min. 20 Sek.

Ausflußzeit für undialysierten Preßsaft. . . 17 Min. 2 Sek.

Si nach 20 Minuten Dialyse . . . 14 „ 49,2.,
e „40 SG e e Leer EE up 20
7 » DU ji 7 ... 12, re
2. e 3,5stündiger ,, e ep SB at, AE 5

» "ER 2 e vk Br JEE a
en e "Bt ` ji Ee GEET GE
ei » 24 A ji et O ay e e

Etwaige Trübung oder Fällung war nicht eingetreten.

Damit wir nun auch den Einfluß der Innensalzkonzentrierung
auf die Viscosität des Preßsaftes untersuchen konnten, verfuhren
wir in folgender Weise:

Blutkörperchen des Kaninchens wurden einmal schnell in
4,2 proz. Glucoselösung gewaschen und dann in gleichen Konzen-
trationen suspendiert in Lösungen von 4,2%, Glucose, 15%
Glucose, 18% Glucose und 21°, Glucose. Die Körperchen wurden
in diesen Lösungen während 10 Minuten sich selbst überlassen,
dann abzentrifugiert und in der oben angegebenen Weise aus-
gepreßt. Es zeigte sich nun, daß man von den Körperchen aus
18 proz. Glucose und 21 proz. Glucose ungleich weniger Preßsaft
bekommen konnte als von Körperchen aus isotonischer Lösung,
eine Erscheinung, die schon auf die vergrößerte Wasserbindung
durch Körperchenkolloide hinweist. Damit wir nun die Viscosität

120 T. Takei: Analyse einer Volunkurve

der Preßsäfte von Körperchen aus den oben angegebenen hyper-
tonischen Medien untereinander vergleichen konnten, war es
nötig, daß die Kolloidkonzentration aller Preßsäfte die gleiche
war. Deshalb fügten wir zu den stärkeren Konzentrationen
soviel der entsprechenden Glucoselösungen, bis die Farbeintensität
aller Preßsäfte die gleiche der Farbe des Preßsaftes der Körperchen
aus 2] proz. Glucoselösung war.
Die Viscositätsbestimmung zeigte dann folgendes:

Min. Sek.

1. Ausflußzeit v. Körperchenpreßsaft a. 4,2 proz. Glucoselüs. 2 58,3

LK) LE) 99 IK 15 99 an 3

LA 18 LE 9 4 17,6
WA 39 \ LA H 21 LE ” 4 23,6

GER
-<
-+
<-
-<
<
-+

Es war also durch die Konzentrierung der Innensalze in
Lösungen über 18%, Glucose eine erhebliche Zunahme der Viscosi-
tät entstanden: Die Auslaufszeit war bedeutend größer wie die
normale.

Zusammenfassend können wir also schließen, daß die Volum-
zunahme, welche man in Lösungen beobachtet, deren Hypertonie
das 4fache der normalen Isotonie überschreitet, durch Quellung
der Blutkörperchen entsteht. Ein intensiverer QuellungsprozeB
leitet dann schließlich zur Hämolyse.

Als Analogon dieser Körperchenquellung in stark hyper-
tonischen Medien erinnere man sich an das klassische Beispiel
Ludwigs: Eine gut getrocknete Schweinsblase, welche in sehr
konzentrierter NaCl-Lösung eingetaucht wird, quillt unter Auf-
nahme einer verdünnten Salzlösung, während Kochsalz aus-
krystallisiert.

Auch hier beim Blutkörperchen in einer Lösung mit genügen-
der Hypertonie wird der Qucellungsdruck des Körperchens so
hoch, daß die osmotische Druckdifferenz direkt überwunden wird.

IV. Über die Reversibilität der. Körperchenquellung in stark hyper-
tonischen Lösungen und über die Hämolyse.

Indem wir nun feststellten, daß die Volumzunahme von
Körperchen in hypertonischen Lösungen auf die Quellung des
Körpercheninhaltes beruht, wollten wir weiter versuchen, durch
Verringerung der hypertonischen Mediumkonzentration wieder
Entquellung zu erreichen. Die Verhältnisse werden hier aber sehr
kompliziert, weil der quellende Körpercheninhalt ein sehr kom-

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 121

ad

plexes Kolloid darstellt. Betrachten wir nur das Bohrsche
Hämochrom, also eine kolloide Hämoglobin-Lecithinverbindung,
so sieht man in allen Versuchen, wo die Quellung etwas stärker
wurde, Hämolyse auftreten, also Spaltung des Hämochroms.
Dadurch wird die Quellung nicht mehr meßbar.

Bechhold sagt in seinem bekannten Buche?) folgendes über
die Hämolyse in konzentrierter Neutralsalzlösung: ‚Solche Salz-
lösungen, welche das Stroma entquellen ohne Hämoglobin zu
koagulieren, werden Blutkörperchen hämolysieren. In der Tat
bewirkt konzentrierte Neutralsalzlösung Hämolyse. Die Blut-
farbstoffemulsion wird ausgepreßt .. "

Diese Auffassung ist aber sicher nicht richtig, denn wie wir
oben beschrieben, geht der Hämolyse immer eine beträchtliche
Quellung voran und ist von einer Auspressung durch Schrumpfung
nicht die Rede. Auch mikroskopisch läßt sich diese initiale
Quellung sehr leicht feststellen.

Vielmehr wird der Vorgang mit der von M. H. Fischer?)
beschriebenen Quellung des Carminfibrins übereinstimmen; auch
hier wurde das adsorbierte Carmin durch Quellung in Neutralsalz-
lösung wieder frei.

Es war nun für uns die Frage, ob wir die gequollenen Körper-
chenkolloide durch vorsichtige Verringerung des osmotischen
Außendruckes wieder entquellen konnten. Es zeigte sich, daß
innerhalb des ‚„osmotischen Gebietes“‘ der Volumzunahme eine
Reversion der Volumänderung sich gut herstellen ließ; daß aber,
sobald Quellungsvorgänge die Volumzunahme beherrschten, ein
Versuch zur Entquellung durch Wasservermehrung des Körper-
cheninhalts unmittelbar Hämolyse herbeiführte.

Bringt man nämlich gewaschene Körperchen von 5proz.
Glucoselösung in 10 proz. Glucoselösung, so erfolgt eine Volum-
abnahme von 66 auf 50 Hämatokritstriche. Saugt man dann die
10 proz. Glucoselösung ab und gießt wieder 5 proz. Glucoselösung
auf, so bekommen die Körperchen wieder ein Volum von 66 und
es tritt keine Hämolyse ein. Macht man aber dasselbe in Lösungen
von 17- und 20 proz. Glucose, so erfolgt beim Mediumaustausch
unmittelbar starke Hämolyse. Man konnte sich folgende Er-
klärung denken: Körperchen in 21 proz. Glucoselösung enthalten

1) Bechhold, Kolloide in Biologie und Medizin. 2. Aufl., S. 332.

2) M. H. Fischer, Das Odem. Dresden 1911.

122 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

nur eine sehr kleine Menge freies Wasser. Und eine minimale
Zunahme der Quellung auf Kosten des freien Körperchenwassers
wird die Konzentration der freigelösten Innensalze so sehr er-
höhen, daß unmittelbar Mediumwasser angezogen wird zum Kon-
zentrationsausgleich. Das Quellungswasser muß also indirekt
vom Medium geliefert werden und Gleichgewicht wird erreicht,
wenn Quellungsdruck der Körperchenkolloide und osmotischer
` Druck des Mediums einander aufheben. Wird der osmotische
Druck des Mediums nun plötzlich verringert, so wird die Quellung
zunehmen, bis schließlich Hämolyse eintritt.

Wenn aber auch im Suspensionsmedium das Wasser nicht
mehr frei, sondern in kolloidaler Bindung anwesend ist, wird
sich zu der osmotischen Wasseranziehung des Mediums noch der
Quellungsdruck des Mediums fügen. Das ist eben der Fall, wenn
Körperchen in mittelst Glucosekonzentrationen hypertonisch ge-
machtem Serum untersucht werden. Wir haben oben (S. 115)
schon vermeldet, daß Körperchen, welche in hypertonisches
Glucoseserum in kleinen Konzentrationen suspendiert werden,
nur wenig und nur bis zu einem bestimmten Volum quellen.
Viel deutlicher wird diese Erscheinung noch, wenn man die Glucose-
mengen direkt zu dem Plasma zusetzt und die Körperchen in
ursprünglicher Blutkonzentration untersucht, weil dann die
relative Menge freies Wasser schr viel kleiner wird. Die folgende
Tabelle gibt eine Übersicht über das Verhalten der Körperchen
in Blut, das mit Glucose hypertonisch gemacht wurde.

Tabelle VIII.

|

Zum Serum gesetzte Relatives Körperchen-

Glucose in Prozenten volumen
EN 74.0
16 71,0
17 TLO
18 70,5
19 69.5
20 69,0
21 68,7
22 68.4
2:3 68,0
24 GNO
2 67.8

67.2

and
m
—

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 123

Die Methodik war folgende:

Je l ccm defibriniertes Kaninchenblut wird !/, Stunde scharf zentri-
fugiert; das überstehende Serum wird vorsichtig gemessen und abgesaugt.
In diesem Serum löst man die berechnete Menge Glucose, fügt es dann wieder
zu den Körperchen und rührt schnell auf. e

Fügt man die feste Glucose zum Blute, so entsteht immer starke
Hämolyse; wird die Glucose aber im Serum gelöst, so unterbleibt die Hämo-
lyse. Man ersieht aus der Tabelle, daß jetzt die beschriebene Quellung
gar nicht auftritt, offenbar weil nur sehr wenig freies Wasser im Medium
anwesend ist.

Ob nun die Wasserentziehung zu einer Desäquilibrierung der
normalen Körperchenionenkonzentration und dadurch zur Quel-
lung leitet, oder daß eine Änderung des (Hl des Körpercheninnern
als Ursache angegeben werden muß, darüber können wir jetzt
noch wenig aussagen. Wir versuchten mittelst Kataphorese mit
mikroskopischer Beobachtung eine Ladungsänderung eventuell
eine Umladung der Körperchen in stark konzentrierten Glucose-
lösungen nachzuweisen, aber die Ladung der ‚Körperchen erschien
in allen Lösungen in gleicher Stärke negativ.

Eine Ionendesequilibrierung durch Wasserentziehung könnte
man sich in folgender Weise vorstellen: Die roten Körperchen
enthalten normalerweise eine physiologische Calciumionenkonzen-
H]

[HCO\]
gegeben ist. Nun konnten wir bei Körperchen in stark konzen-
trierter Zuckerlösung keine Änderung des [H'] feststellen, aber
die Bicarbonationenkonzentration muß sich erheblich vergrößert
haben, und daraus resultiert eine proportionelle Verringerung des
[Ca”]. Nun ist gerade diese [Ca] die wichtigste Ionenkonzen-
tration, welche die lyotrope, quellungsfördernde Wirkung der
Körperchenkaliumionen balancieren muß. Wenn wir z. B. zur

tration!), deren Größe von der Beziehung [Ca”] = K

Vergleichung die Quellungsverhältnisse beim Muskel anziehen,
welche ja dort viel besser bekannt sind als bei den Erythrocyten,
so sehen wir, daß für die Erhaltung der normalen Muskelquellung
das Verhältnis K :Ca von ausschlaggebender Bedeutung ist.
Im geöffneten Muskelfaser (wo also die osmotische Wasseranzie-
hung ausgeschlossen ist), verursachen Kalisalze starke Quellung.
aber sehr geringe Ca-Mengen genügen, um eine Entquellung von

!) Hamburger, Zeitschr. f. physikal. Chem. 69, 663. 1909. --
Brinkman, diese Zeitschr. 95, 101. 1919.

124 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

über 30°, zu bewirken!). Wenn also durch Wasserentziehung
die [Ca”] des Körpercheninhaltes bis zu einem bestimmten Grade
verringert ist, wird das Überwiegen der Kaliumionen von Quellung
der Körperchen erfolgt sein.

V. Über die mögliche klinische Bedeutung der Volumkurve.

Schließlich wollen wir noch einige Bemerkungen machen
über den eventuellen Gebrauch der beschriebenen Volumkurve
für die klinische Körperchenuntersuchung.

Weil doch die Volumkurve des normalen Blutes einen ganz
konstanten typischen Verlauf hat und bei Benutzung gut kali-
brierter Hämatokriten mit fast mathematischer Genauigkeit leicht
zu konstruieren ist, so können auch kleinere Abweichungen des nor-
malen Verlaufes gut verwertet werden. Die Volumkurve könnte
dann sozusagen eine Fortsetzung der osmotischen Resistenzkurve
bilden. Die Bedeutung der Volumkurve ist insoweit der der
Resistenzkurve überlegen, daß bei der osmotischen Hämolyse
immer auf der durch osmotische Kräfte bedingten Wasseranziehung
die kolloidehemische Hämochromolyse folgt, und daß zwischen
osmotischen und kolloidchemischen Prozessen nicht genügend zu
differenzieren ist. Bei der Volumkurve aber sind der osmotische
und kolloidchemische Teil der Kurve, oder Wasserentziehung
und Quellung, gut voneinander zu trennen. Gerade der Quellungs-
teil der Volumkurve möchte für die klinische Untersuchung wichtig
sein. Ist es doch eine erste Aufgabe dergleichen Kurven, uns
über das physiologische Alter der Körperchenkolloide zu orien-
tieren, und ist es doch die Quellungsfähigkeit dieser Kolloide,
die in physiko-chemischer Hinsicht einer der besten Indi-
katoren ist.

Folgender Versuch ist ein vorläufiger Bericht über die Form-
änderung der Kurve durch Blutungsanämie mit Körperchen-
regeneration.

Einem gut genährten Kaninchen wurden +40 eem Blut aus
der Ohrvene entnommen; das Blut wurde steril aufgefangen und
ascptisch bewahrt bei Zimmertemperatur.

Die Regeneration beim Kaninchen gestaltete sich folgender-

maßen:

1) Widmark, Skandinav. Arch. f. Physiol. 23. 421. 1910; 24, 13, 339.
1911.

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 125

Hämoglobin- Körperchen-

gehalt zahl
Vor der Blutentnahme . . 48 4 140 000
24 Stunden nach Aderlaß 38 3 110 000
48 SS Ge d 34 2 720 000
72 Se ge S 32 2 285 000
96 e i s 35 2 645 000
120 es a an 40 3 540 000
168 ge a m 47 3 920 000

Es wurde nun die Volumkurve dieser Körperchen in hyper-
tonischen Glucoselösungen bestimmt und zwar vor der Blut-
entnahme und 24, 48, 96 und 120 Stunden nachher. Zur
Vergleichung haben wir daneben Volumkurven des steril in
vitro aufbewahrten Blutes untersucht, damit das Altern der
Körperchen in vivo und in vitro nebeneinander gestellt werden
konnte.

Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt (siehe
auch Kurve V).

Tabelle IX.
H = Hämolyse. S. H = Spur-Hämolyse. d. H. = deutliche Hämolyse.

Körperchenvolumina

Glucose-

des aufbewahrten Blutes
lösungen GE

des frisch entnomm. Blutes
Zeit nach der Anämie
in Stunden

vor der
Aderlaß-

Zeit der Aufbewahrung
in Stunden

BR ER ER
23 | | H
25 | 120,6
3,0 111,1
3:5 107,9
40 | 98,4
4,5 97,
| 90,5
100 | 71,4
15,0 | | 70,6
16,0 | 69,8
17,0 | 690
18,0 64,3
19,0 65,9
20,0 64,98. #
21,0 65,938
22,0 | 90,58. MH
23,0 fi 91,3 8 H
240 ı 9219H
25,0 | GERT Kä
30,0 93,7 4H
40,0 , 90,54 MH
50,0 j 90,5% 1

126 T. Takei: Analyse einer Volumkurve

Man bemerkt folgendes:

1. Wenn Regeneration auftritt (nach 96 und 120 Stunden),
tritt der Quellungsumschlag später ein, offenbar weil die neu-
gebildeten Körperchen eine stärkere Wasserentziehung ertragen,
bevor Quellung eintritt.

160 2. Im Gegensatz zu dieser ersten Erschei-
nung wird durch den Alterungsprozeß die Quel-
lungsneigung erheblich befördert, wie das zu-
Sieg mal aus der Tabelle der in vitro aufbewahrten

N Körperchen zu ersehen ist.

Die normale Volumkurve stellt die mittlere
Linie dar zwischen der unteren Neubildungs-

110

Korperchemvolum.

|
d

e

KA
Q

LN
oO

05 06 07 08 09 10 11 72 13 Zë 75 16 47
Log. d. Glukosekonz.

EN
Le
S

$

Kurve V. Volunkurven: Alterung (120 Stunden) in vitro, normal und (130 Stunden) nach
Aderlaß, Regeneration.

kurve und der oberen Alterungskurve. Es ist also umgekehrt

die Möglichkeit gegeben, aus der Betrachtung einer willkürlichen

Volumkurve auf Regeneration oder Alterungsprozesse zu schließen.

Zusammenfassung.

1. Blutkörperchen des Menschen-, Kaninchen- oder Rinder-
blutes, welche in hypertonische Medien gebracht werden, schrump-
fen proportional des osmotischen Außendruckes, wenn dieser
Außendruck nicht das 4fache der normalen Isotonie (4 = y — 2°)
überschreitet.

2. Wird der osmotische Außendruck größer als das 4fache
der normalen Isotonie, so erfolgt eine plötzliche Volumzunahme
der Körperchen fast bis zum Isotonievolumen.

3. Diese Volumzunahme beruht auf Quellung der Körper-
chenkolloide, welche Quellung wahrscheinlich von Ionendesäqui-
librierung der Körpercheninnensalze verursacht wird.

von Blutkörperchen in hypertonischen Lösungen usw. 127

4. Die osmotische Schrumpfung ist reversibel, die Quellung
ist irreversibel, weil bei plötzlichem Zutritt von freiem Wasser
immer Hämolyse erfolgt.

5. Die Volumina von Körperchen in hypertonischen Medien
lassen sich zu einer Volumkurve zusammenstellen. Die Form
dieser Kurve ist konstant und typisch und nicht abhängig von
der chemischen Zusammensetzung des Mediums, sondern nur von
deren osmotischem Druck. Lösungen von Alkalichloriden oder
Alkalisulfaten, Glucoselösung oder Glucose-Ringerlösung, welche
isoosmotisch sind, geben eine und dieselbe Volumkurve.

6. In hypertonischem Glucoseserum erfolgt keine Quellung,
weil in diesem Medium das Wasser zum größten Teil kolloid-
chemisch gebunden ist.

7. Der Hämolyse in konzentrierter Neutralsalzlösung geht
immer eine erhebliche Quellung voran; von einer Schrumpfungs-
hämolyse nach Bechhold ist also nicht die Rede.

8. Es wurde darauf hingewiesen, daß diese Volumkurve,
zumal deren Quellungsteil, eine Bedeutung für die klinische
Blutuntersuchung haben kann, weil die älteren Körperchen
sich durch vergrößerte, die jungen Körperchen sich durch ver-
minderte Quellungsneigung auszeichnen.

Über den Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost.

Von
L. Dienes.

(Aus dem Hygienischen Institut der Universität Budapest.)
(Eingegangen am 18. Juli 1921.)

In den letzten Jahren wurden die Kenntnisse in der auch vom
praktischen Standpunkt wichtigen Frage, ob die Eiweißkörper
der verschiedenen Nahrungsmittel für die menschliche Ernährung
gleichwertig sind, durch die Versuche von Hindhede!), Abder-
halden, Rose u. a.?) erweitert. Die genannten Autoren haben im
Gegensatz zu früheren Arbeiten von Rubner?) und Thomas)
gefunden, daß bei langen Minimumversuchen die Eiweißkörper
der Kartoffel und des Brotes bei ungefähr gleichgeringen Werten
N-Gleichgewicht ergeben.

Die folgenden Versuche, die ich Herbst 1913 und Frühjahr
1914 durchführte, wollen dasselbe Problem von einer anderen
Seite erfassen.

Von der Ansicht ausgehend, daß die Unterschiede im Verhalten
der einzelnen Eiweißkörper, wenn solche überhaupt vorhanden
sind, am stärksten bei Ansatz größerer Eiweißmengen bemerkbar
sein müssen, da bei Minimumversuchen die Möglichkeit vorhanden
ist, daß die in der Nahrung eventuell fehlenden Eiweißkörper
von den abgebauten Körpersubstanzen ersetzt werden, habe ich
den Eiweißansatz nach einem vorhergehenden intensiven Eiweiß-
verlust untersucht, wobei das Eiweiß ausschließlich in einem ein-
zigen Nahrungsmittel gereicht wurde.

1) Skandinav. Arch. f. Physiol. 28.

2) E. Abderhalden, G. Ewald, A. Fodor und C. Rose, Pflügers
Arch. f. d. ges. Physiol. 160.

3) Volksernährungsfragen Bd. 115. 1908.

1) Arch. f. Anat. u. Physiol. 1909, S. 219.

L. Dienes: Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 129

Die Versuchsperson war ein 23jähriger junger Mann (Dr. med.), gesund,
von fast athletischem Körperbau. Seit seinen Kinderjahren neigte er zu
Fettleibigkeit und in seiner Familie waren mehrere Diabetesfälle zu ver-
zeichnen. Bei einer stark reduzierten Nahrungszufuhr hatte sein Körper-
gewicht vom 20. VIII. bis 7. X. 1913 (mit Kleidung gewogen) von 104 kg
auf 86 kg abgenommen. Die Diät bestand aus 100 g Emmenthaler Käse,
500 ccm Milchkaffee, 700 g Äpfel, 30 g Brot, 500 g Trauben und 0,4 Liter
Wein. In den letzten 2 Wochen der Abmagerungskur, in deren Verlauf
ich die Ausscheidungen untersucht habe, hatte der betreffende ungefähr
10 g Eiweiß pro Tag verloren. — Das ergibt für 48 Tage 480 g Eiweiß.
Wahrscheinlich war aber der Eiweißverlust in den ersten Tagen viel höher
und der Gesamtverlust bei weitem mehr als 480 g. Dieser Abmagerungskur
folgte sofort die erste Versuchsreihe. Ende November mußten wir wegen
Abreise der Versuchsperson die Versuche abbrechen und konnten diese
erst im März, wieder mit einer Abmagerungskur beginnend, von neuem auf-
nehmen.

Der Plan der Untersuchung war folgender: Zuerst wollten wir
das Eiweißminimum der Versuchsperson feststellen, damit wir
für den Vergleich des aufgenommenen und angesetzten Eiweißes
einen Anhaltspunkt erhielten. Dann sollte die Untersuchung
des Eiweißansatzes bei niedriger, später bei höherer Eiweißauf-
nahme folgen. Wir beabsichtigten den Ansatz bei Fleisch-,
Erbsen- und Weizenernährung zu vergleichen. Die 2. Versuchs-
reihe im März sollte zur Wiederholung der auf das Weizenmehl
bezüglichen Versuche dienen. — Die einzelnen Perioden hatten
wir mit 5—Ttägiger Zeitdauer festgesetzt. Der Caloriengehalt
der Kost wurde auf Wunsch der Versuchsperson niedrig gehalten,
da sie das verlorene Körpergewicht nicht zurückgewinnen wollte.
Während der ersten Perioden blieb der Caloriengehalt der Kost
wahrscheinlich unter dem Bedarf; vielleicht konnten wir darum
keinen Eiweißansatz beobachten (2700—2970 Cal.). In den
folgenden Perioden erreichte der Caloriengehalt der Nahrung
den Bedarf (3080—3280) oder blieb nur unwesentlich unter diesem.
Als Beweis dafür dient die Tatsache, daß sich das Gewicht der
Versuchsperson trotz Aufnahme von 600 g Eiweiß, welches etwas
über 2kg Muskel entspricht, nicht veränderte. Wäre ein Fett-
verlust dem angesetzten Eiweiß entsprechend vor sich gegangen,
so hätte dies in der ersten Hälfte der Versuchsreihe einem Verlust
von 500 Cal. pro Tag und 250 Cal. in der zweiten Hälfte der
Versuchsreihe entsprochen. Es ist jedoch unwahrscheinlich, daß
der Verlust so groß gewesen ist, da ja durch den besseren Er-

Biochemische Zeitschrift Band 1283. 9

130 L. Dienes:

nährungszustand auch der Wassergehalt des Organismus niedriger
sein mußte.

Die Schwankungen des Caloriengehaltes der Kost in den zu
vergleichenden Perioden waren gering (ausgenommen Periode 7),
so daß eine Vergleichung der Perioden trotz des etwas niedrigeren
Caloriengehalts der Nahrung berechtigt ist.

In bezug auf die technische Durchführung der Versuche
machen wir folgende Bemerkungen: Die einzelnen Nahrungs-
mittel wurden im großen eingekauft. Die Kartoffeln und Äpfel
waren von einer Sorte, ihr N-Gehalt hatte bei verschiedenen
Bestimmungen nur geringe Schwankungen gezeigt. Als Fleisch
haben wir mageren Rindslendenbraten und ÖOberschall verwendet,
von welchen bei der Verteilung soweit wie möglich Fett und
Sehnen entfernt wurden. Die Fleischportionen wurden gleich-
zeitig am Anfang der Periode abgewogen und bis zur Benutzung
bei —1° bis —6°C gefroren (im Frigoapparat) aufbewahrt.
Butter und Milch waren gleichfalls gefroren. Ebenso wurde der
Kleber für die ganze Periode auf einmal gewonnen, eingeteilt
und wie die anderen Nahrungsmittel gefroren aufbewahrt. Als
Mehl wurde das beste weiße ungarische Weizenmehl verwendet.
Fleisch und Kleber wurden von mir, die anderen Nahrungsmittel
von einem Laboranten abgewogen. Die Speisen haben wir im
Institut gekocht und die Versuchsperson hat sie quantitativ
aus dem zum Kochen benutzten Topf gegessen. Das Fleisch wurde
entweder als Braten oder als ‚Gulyas‘‘ zubereitet, das Fett, in
dem das Fleisch gebraten worden war, verwendeten wir zur Be-
reitung der Kartoffeln. Das Mehl und der Kleber wurden zu Grieß-
oder Marmeladennudeln verarbeitet, N- und Trockensubstanz-
gehalt des Wassers, in dem die Kartoffeln und Nudeln gekocht
wurden, bestimmten wir. In den Nahrungsmitteln stellten wir den
N-Gehalt nach Kjeldahl, die Trockensubstanz durch Trocknen
bei 100°C, den Fettgehalt nach Liebermann - Szekely fest.
In den Erbsen haben wir die Stärke, in den Datteln usw. den
Extraktgehalt bestimmt.

Die Versuchsperson hat sich während der ganzen Versuchs-
dauer, ausgenommen an den in der Tabelle bezeichneten Tagen,
vollkommen wohl gefühlt und Laboratoriumsarbeit verrichtet.
Der Urin wurde von 8 Uhr früh bis 8 Uhr früh des nächsten Tages
gesammelt und gleich verarbeitet; wurde er einige Tage auf-

Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 131

bewahrt, so versetzten wir ihn mit Salzsäure und stellten ihn in
den Eisschrank. Die Faeces wurden mit 10%, konzentrierter
Schwefelsäure gleichmäßig gemischt und der so erhaltene Brei
analysiert, der N-Gehalt wurde nach Kjeldahl, das Fett nach
Liebermann - Székely, die Stärke durch Verzuckerung mit
2%, HCl bestimmt. In einigen Fällen wurde der Fettgehalt der
Faeces auch durch Ätherextraktion bestimmt. Die Abgrenzung
des Kotes war durch die Reste der gegebenen Trauben und Feigen
nicht möglich. Dadurch konnten wir die Kotbestandteile nur
auf größere Zeitabschnitte verteilen und die Ausnutzung dieser
nur da für kleinere Perioden gesondert berechnen, wo die Berech-
nung durch die Entleerungszeiten des Kotes ermöglicht wurde.
Da die Ausnutzung der verabreichten Speisen eine gute war und
die Eiweißausnutzung bei Fleisch und Weißmehl annähernd die-
selbe ist, so ist der durch unser Verfahren verursachte Fehler
gering.

Die Nahrung setzte sich in den einzelnen Perioden folgender-
maßen zusammen:

P.1. 8. bis 9. X. zum Frühstück: 30 g Butter, 100 g Honig, 60 g Zwie-
back. Zum Mittag: 1 Maggi-Bouillonwürfel, 20 g Sago, 70g Fleisch, 100g Kar-
toffeln, 40 g Fett, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 30 g Zwieback. Zum Nacht-
mahl: 70 g Fleisch, 50 g Reis, 40 g Fett, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 30 g Zwie-
back. Der Zwieback wurde aus Kartoffelmehl und Cocosfett und etwas
Backpulver hergestellt. Diese Kost enthielt 40,4 g Eiweiß und 2825 Calorien.

10. bis 13. X. zum Frühstück: Tee und 15 g Zucker, 50 g Honig. Zum
Mittag: 1 Maggi-Bouillonwürfel, 20 g Sago, 70 g Fleisch, 40 g Fett, 100 g
Kartoffeln, 100 g Reis, 200 g Äpfel, 30 g Zucker. Zum Nachtmahl: 70 g
Fleisch, 40 g Fett, 50 g Reis, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 50 g Honig. Außer-
dem 60 g Zucker in Limonade genossen. Diese Nahrungszusammensetzung
enthielt 45,8 g Eiweiß und 2775 Calorien. Am 10. X. nahm die Versuchs-
person zufälligerweise 340 Calorien weniger.

P. 2. 14. bis 18. X. zum Frühstück: 150 ccm Milch, 50 ccm Kaffee, 50g
Honig, 30 g Zwieback aus Kartoffelmehl, 15 g Zucker. Zum Mittag:
100 g Kartoffeln, 70 g Fleisch, 40 g Fett, 110 g Weizenmehl, 20 g Grief,
200 g Äpfel, 15 g Zucker. Zum Nachtmahl: 70 g Fleisch, 40 g Fett, 100 g
Reis, 200 g Äpfel, 30 g Zucker. Außerdem 30 g Zucker. Die Kost enthielt
60,3 g Eiweiß und 2770 Calorien.

P. 3. 19. bis 23. X. zum Frühstück: 15 g Zucker, 30 g Zwieback aus
Erbsen, 50g Honig. Zum Mittag: 150g Erbsen, 60 gKartoffelmehl, 40 g Speck,
5g Fett, 200g Äpfel, 30g Zucker, 50g Aprikosenmarmelade. Zum Nachtmahl:
100 g Ernsen, 25g Fett, 35g Kartoffelmehl, 200 g Äpfel, 20 g Zucker,
50 g Honig. Außerdem 15g Zucker. Diese Kost enthielt 60,3 g Eiweiß,
2970 Calorien.

dh

132 L. Dienes:

P. 4. 24. bis 26. X. zum Frühstück: 15g Zucker, 50g Honig. Zum Mittag:
225g Erbsen, 40 g Speck, 30 g Kartoffelmehl, 200 g Äpfel, 15 g Zucker.
Zum Nachtmahl: 150 g Erbsen, 30 g Fett, 30 g Kartoffelmehl, 200 g Äpfel,
15g Zucker. Außerdem 150 g Erbsenzwieback. Der Zwieback wurde von
fein gemahlenem Erbsenmehl mit Zusatz von Butter, NaHCO, und Salz-
säure bereitet. Diese Kost enthielt 110g Eiweiß und 3170 Calorien.

P. 5. 27.bis31.X.zum Frühstück: 50 g Honig, 15g Zucker. Zum Mittag:
180 g Fleisch, 200 g Kartoffeln, 130 g Weizenmehl und Grief, 70 g Fett,
200 g Äpfel, 30 g Zucker, 50g Aprikosenmarmelade. Zum Nachtmahl:
155 g Fleisch, 65 g Fett, 150 g Reis, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 35 g Honig.
103,7 g Eiweiß, 3780 Calorien.

P. 6. 4. bis 7. XI. zum Frühstück: 50 g Honig, 15 g Zucker. Zum Mittag:
180 g Fleisch, 200 g Kartoffeln, 100 g Weizenmehl, 70 g Fett, 200 g Äpfel,
15 g Zucker, 50 g Aprikosenmarmelade. Zum Nachtmahl: 140 g Fleisch,
65 g Fett, 50 g Reis, 200 g Kartoffeln, 200 g Äpfel, 15 g Zucker, 40 g Honig.
Außerdem 15 g Zucker = 95 g Eiweiß, 3160 Calorien.

P.7 8.bis 10. XI. zum Frühstück: 50g Honig, 15g Zucker. Zum Mittag:
190 g Erbsen, 40 g Speck, 20g Fett, 30 g Kartoffelmehl, 200 g Äpfel,
30 g Zucker. Zum Nachtmahl: 150 g Erbsen, 40 g Fett, 30 g Kartoffelmehl,
200 g Äpfel. Außerdem 260 g Erbsenzwieback. 126 g Eiweiß, 3480 Calorien.
Am 8. XI. wurden nur 116g Eiweiß gegeben.

P. 8. 11. bis 14. XI. 300 g Weizenmehl mit 99 g feuchtem Kleber ge-
mischt, 50 g Fett, 100 g Mandeln, 100 g Trauben (trocken) oder Datteln, 600 g
Äpfel, 100 g Honig, 50 g Aprikosenmarmelade, 15 g Zucker. 15. bis 17. XI.
statt 100 g Mandeln 60 g Weizenmehl, 45 g feuchten Kleber, 50 g Datteln,
15g Fett. 88 g Eiweiß, 3280 Calorien, am 15. bis 17. XI. nur 84g
Eiweiß, 3350 Calorien.

Po 18. bis 24. XI. zum Frühstück: 50 g Honig, 15g Zucker. Zum Mittag:
180 g Fleisch, 400 g Kartoffeln, 56 g Fett, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 50g
Aprikosenmarmelade, 40 g Datteln. Zum Nachtmahl: 140 g Fleisch, 65 g
Fett, 50 g Reis, 200 g Kartoffeln, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 60 g Honig.
Dazu noch 15g Zucker = 91 g Eiweiß, 3200 Calorien.

P. 10. 25. bis 29. XI. zum Frühstück: 50 g Honig, 15 g Zucker. Zum Mit-
tag: 350 g Fleisch, 400 g Kartoffeln, 56 g Fett, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 50g
Aprikosenmarmelade. Zum Nachtmahl: 300 g Fleisch, 52 g Fett, 50 g Reis,
200 g Kartoffeln, 200 g Äpfel, 30 g Zucker, 40 g Datteln, 15g Zucker;
162 g Eiweiß, 3395 Calorien.

Die Versuchsresultate sind in der beigefügten Tabelle zu-
sammengestellt. Wie daraus zu ersehen ist, konnten wir unseren
Versuchsplan nicht vollständig durchführen. Die erste Periode
wurde durch Unwohlsein der Versuchsperson am 9. und 10. X.
gestört. Weil wir befürchteten, dies Unwohlsein stehe mit den
vorausgegangenen Eiweißverlusten in Zusammenhang, und da
der aus Kartoffelmehl gebackene Zwieback sehr ungern genommen
wurde, mußten wir einerseits den Eiweißgehalt der Kost etwas

Stiekstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 133

erhöhen und konnten andererseits die Periode nicht genügend
lange ausdehnen. Wegen des Unwohlseins der Versuchsperson
sind 2 Tage von den 6 Tagen nicht verwertbar. In den folgenden
3 Tagen (dem ersten Tag der folgenden Periode zugerechnet) war
die N-Ausscheidung auffallend gleichmäßig und der Durchschnitt
dieser 3 Tage (33,3 g Eiweiß entsprechend) liegt wahrscheinlich
dem Eiweißminimum näher als der Durchschnittswert der ganzen
Periode (38,4 g). Daß in den ersten Tagen der folgenden Periode
trotz steigender Harnmengen die N-Ausscheidung unverändert
blieb, spricht dafür, daß wir den Wert 33 g nicht zufälligerweise
erhalten haben. 33 g Eiweiß pro Tag bei einem 84 kg wiegenden
Mann ist ein auffallend niedriger Wert. Umgerechnet auf 70 kg
Körpergewicht ergeben sich 27,7 g, was schon den von Hindhede
gegebenen Werten nahesteht. Der Caloriengehalt der Kost war
während der Periode verhältnismäßig niedrig, und mit höheren
Caloriengehalt hätten wir wahrscheinlich niedrigere Eiweißwerte
bekommen.

Die folgenden 2 Perioden (2 und 3), durch die wir den Eiweiß-
ansatz bei niedrigerem Eiweißgehalt der Kost untersuchen
wollten, zeigen keine Eiweißretention. Wahrscheinlich war der
Caloriengehalt der Kost ungenügend. Die 3. Periode läßt immerhin
die Schlußfolgerung zu, daß man auch bei Erbsen mit weniger
als 50 g aufgenommenem Eiweiß N-Gleichgewicht erreichen kann.

In den folgenden Perioden enthielt die Nahrung mehr Eiweiß
und etwas mehr Calorien. Zum Vergleich dienen 3 Perioden, in
denen das Eiweiß größtenteils in Fleisch gegeben wurde (Per. 5, 6,9).
In der 5. Periode haben wir, durch ein Versehen, mehr Calorien
gegeben. Die Abgrenzung des Kotes ist gegen die vorangehende
Periode mit Erbsen ebenso wie gegen die nachfolgende Periode
unvollkommen. Die Traubenkerne, die zur Abgrenzung dienen
sollten, waren schon in dem charakteristischen Erbsenkot vor-
handen und auch in dem danach entleerten. Dieser Umstand
kann 1—2g Unterschied verursachen bei der Berechnung des
Koteiweißes. Ebenso haben wir den sehr geringen Eiweißwert
am 28. X., der von der Verminderung der Urinmenge herrührt,
bei der Berechnung ausgelassen. Bei Annahme von 8 g Koteiweiß
bekommen wir für diese Periode (Per. 5) einen täglichen Eiweiß-
ansatz von 28,3 g bei 95,7 g Eiweißaufnahme. In der 6. Periode
beträgt der Ansatz bei 85g Eiweißaufnahme und 3070 Netto-

134 L. Dienes:

calorien 21,1 g. Die Periode 9 wurde am 20. durch starken Kopf-
schmerz und Unwohlsein gestört, und den folgenden Tag war die
N-Ausscheidung eine erhöhte. Wenn wir den Tag des Unwohlseins
und den folgenden Tag auslassen (natürlich auch den ersten Tag
der Periode) bekommen wir eine 61,7 g Eiweiß entsprechende
N-Ausscheidung und 18,4 Apposition. Rechnen wir die erwähnten
2 Tage hinzu, so beträgt der Durchschnitt 63,3 g und der Ansatz
16,8 g bei 80g Eiweißaufnahme. Der wirkliche Eiweißansatz
variiert, vielleicht wegen der Unmöglichkeit der genauen Ab-
grenzung des Kotes, um l —2 g von dem angegebenen, wahrschein-
licherweise aber in positivem Sinne.

Die Perioden, in denen Erbsen in großer Menge aufgenommen
werden sollten, mußten wegen Überlastung des Magendarmsystems
der Versuchsperson kürzer bemessen werden. Die Überlastung
zeigte sich hauptsächlich in der Periode 7, in der die Versuchs-
person nur mit der größten Anstrengung die vorgeschriebene
Nahrung aufnehmen konnte, und am 3. Tag wurde auch die Aus-
nutzung verschlechtert. Die 2 letzten Tage der 4. Periode zeigen
einen Ansatz von 15,2 g bei 88 g Eiweißaufnahme und 2970 Netto-
calorien. Die Beurteilung der Periode 7 wird dadurch erschwert,
daß während dieser, Ausscheidung und Aufnahme nicht konstant
sind. In den 2 Kotentleerungen dieser Periode war 84 g Eiweiß
vorhanden, so mußten wir einen Teil (8 g) des Koteiweißes vom
12. (welches sichtlich mit viel Erbsen vermengt war) auch dazu-
nehmen, wir bekommen für diese Periode täglich 30,6 g Koteiweiß.
Als Durchschnitt der N-Ausscheidung von den Tagen 9—10
berechnet, ergibt sich 22,8g Ansatz bei 92,1g Eiweißaufnahme.
Die Ausnutzung des Caloriengehaltes der Nahrung war ent-
sprechend. In den ersten 2 Tagen gingen täglich 170, am 3.
400 Cal. im Kot verloren, so daß im Durchschnitt die Menge der
aufgenommenen Calorien etwas größer war (besonders am 2. Tag
der Periode) als in den entsprechenden Fleischperioden. —
Soweit man aus diesen beiden kurzen Perioden Folgerungen ziehen
darf, scheinen die Eiweißstoffe der Erbsen dem Fleischeiweiße
hinsichtlich des Eiweißansatzes gleichwertig zu sein.

Ausgesprochene Abweichung in der Verwertung des Eiweißes
gegenüber den Fleischperioden zeigt die Periode 8. In den ersten
4 Tagen wurde das Eiweiß durch Weizen und Mandeln geliefert
und zwar 25g in Mandeln und 57,5g in feinstem Weizenmehl.

Stiekstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 135

(Dazu kam noch der N-Gehalt der anderen Nahrungsmittel,
der 5,5 g Eiweiß entspricht.) In den.letzten 3 Tagen wurde aus-
schließlich Weizenmehl gegeben. Die Ausnutzung scheint in den
letzten Tagen etwas besser gewesen zu sein, wie zu erwarten war,
daß wir trotz der etwas geringeren Eiweißgabe der letzten 3 Tage
für die ganze Periode durchschnittlich 76 g Nettoeiweißaufnahme
annehmen können. Die N-Ausscheidung entspricht 73,5g, in
den letzten 3 Tagen 75,9 g. In der folgenden Fleischperiode ist
der Eiweißumsatz, trotz einer Mehraufnahme von 4g, 12g ge-
ringer. Die Harnmenge bewegt sich während der 8. Periode
innerhalb enger Grenzen und ist immer niedriger als während
der nachfolgenden Fleischperiode.

Sollte jemand geneigt sein, das Vorhandensein eines Unter-
schiedes zwischen der Periode 8 und 9 zu bezweifeln und glauben,
daß sich in der Periode 8 möglicherweise Abbauprodukte der
früheren Erbsenperiode entleerten, so spricht gegen diese Ein-
wendung einerseits die 2. Versuchsreihe, andererseits der Um-
stand, daß wir nie eine Verschiebung der N-Entleerung beobachten
konnten. Auch nach der 1. Erbsenperiode stellte sich die N-Aus-
scheidung, wie während der ganzen Versuchsreihe, schon am
2. Tage auf den Wert der folgenden Periode ein. Auch der Um-
stand, daß die N-Ausscheidung während der ganzen Erbsen-
periode hoch bleibt und in der folgenden Fleischperiode sofort
auf einen niedrigeren Wert fällt, zeigt, daß zwischen diesen
Perioden ein wirklicher und kein zufälliger Unterschied vor-
handen war.

In der 2. Versuchsreihe wollten wir die für Weizenmehl
erhaltenen Resultate kontrollieren. Während der 2. Abmagerungs-
kur hatte das Körpergewicht der Versuchsperson von 90 kg auf
78 kg abgenommen und 708g Eiweiß verloren. Aufnahme und
Abgabe wurden auch während der Hungerkur kontrolliert, da
wir auch diese Zeit für unsere Versuche ausnutzen wollten. Die
31 Tage der verminderten Kost waren in 3 Perioden eingeteilt:
14 Tage mit Fleischkost, 7 Tage Weizenmehlkost und 10 Tage
Fleischkost. Dieser Abmagerungskur folgt eine längere Fleisch-
periode, dieser eine 6tägige Periode mit Weizenmehl. Die nach-
folgende Fleischperiode war leider durch einen heftigen Dickdarm-
katarrh gestört, so daß wir sie nicht verwerten konnten. Da sich
der Dickdarmkatarrh nach Wiederaufnahme der Versuche wieder

136 L. Dienes:

zeigte, mußten wir ihre Fortsetzung aufgeben. Während der
Weizenmehlperiode und auch in den ersten Tagen der folgenden
Periode war das Wohlbefinden jedoch ein ungestörtes und die
diarrhöischen Stühle folgten den am 3. VI. entleerten größten-
teils normalen.

Die Zusammenstellung der Kost war folgende:

Periode X, 15 g Zucker, 30 g Fett, 200 g Fleisch, 10 g Sago, 300 g
Kartoffeln, 50 g Zwieback, 20 g Kren. 59,6g Eiweiß, 1447 Calorien.

Periode 11, 17. bis 23. IV.: 15g Zucker, 150 g Weizenmehl, 98,5 g
feuchter Kleber, 20 g Grief, 40 g Zwieback, 150 g Feigen, 56,1g Eiweiß,
1500 Calorien.

Periode 12, 27. IV. bis 3. V. wie Periode 10.

Periode 13, 4. bis 13. V. 30 g Zucker, 75 g Feigen, 75 g Malagatrauben,
150 g Datteln, 400 g Fleisch, 600g Kartoffeln, 120g Fett, 10g Mehl,
60 g Honig. 106,5 g Eiweiß, 3400 Calorien.

Periode 14, 14. bis 19. V. 300 g Weizenmehl, 215 g feuchter Kleber,
50 g Grieß, 85 g Fett, 150 g Kartoffeln, 150 g Datteln, 100 g Malagatrauben,
15g Zucker. 106,3 g Eiweiß, 3184 Calorien.

Die Calorienaufnahme war während der Perioden der Ab-
magerungskur ganz gleichmäßig. Doch scheint der Eiweißverlust
während der zwischen 2 Fleischperioden eingeschalteten Weizen-
mehlperiode bedeutend höher zu sein als in den Fleischperioden.
Infolge der Unsicherheit der Kotabgrenzung und je nachdem,
ob wir die Verluste der ersten Tage der Abmagerungskur bei der
Berechnung des Durchschnittes verwenden, sind die erhaltenen
Zahlen etwas schwankend.

Für die 1. Periode bekommen wir einen täglichen Verlust
von 19—24 g Eiweiß, für die 2. 30—32, für die 3. 16—17 g. Wir
wollen an diese Zahlen, die während einer intensiven Abmagerungs-
kur gewonnen wurden und bei deren Zustandekommen uns even-
tuell nicht bekannte Umstände mitgewirkt haben können, keine
weiteren Schlußfolgerungen knüpfen. Doch halten wir es für
bemerkenswert, daß sich bei unserer Versuchsperson, auch bei
einer Abmagerungskur, der große Unterschied zwischen Fleisch-
und Weizenmehleiweiß zeigte und können wir diese Tatsache als
Bekräftigung dafür anschen, daß wir unsere Versuchsergebnisse
für reelle halten dürfen.

Der Eiweißansatz in der folgenden Periode ist etwas geringer
als in den entsprechenden Fleischperioden der ersten Versuchs-
reihe. Nach Übergang auf die Weizenmehlkost steigt die N-Aus-
scheidung sofort und bleibt auch höher. Gegenüber dem Eiweiß-

Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 137

ansatz von 17,3 g der 14. Periode haben wir täglich 3,3 g Eiweiß-
verlust. Die N-Ausscheidung sinkt nur an einem Tage des Ver-
suches (am 15.), was durch den starken Abfall der Harnmenge
motiviert ist. Der N-Gehalt des Kotes wurde wegen der Un-
sicherheit der Abgrenzung gleichmäßig auf beide Perioden ver-
teilt. Soweit wir eine Abgrenzung auf Grund des Zeitpunktes
der Entleerungen vornehmen können, war in der Weizenmehl-
periode die Ausnützung etwas schlechter, jedenfalls nicht höher
als in der früheren. Die Verschiedenheit der Ausnützung mußte
die Differenz des Eiweißansatzes naturgemäß erhöhen.

Der Caloriengehalt der Weizenmehlperiode ist etwas geringer
als der der vorhergehenden Periode. Wenn wir den Calorienwert
des angesetzten Eiweißes bei der Fleischperiode in Abzug bringen,
beträgt der Unterschied zwischen dem Caloriengehalt der Perioden
140 Calorien pro Tag. Als Beweis dafür, daß nicht der Unter-
schied in dem Caloriengehalt die Ursache des Ausbleibens des
Eiweißansatzes in der Weizenmehlperiode ist, können wir die
Fleischperioden der ersten Versuchsreihe heranziehen. In der
4. Periode ist der Eiweißansatz im Vergleich mit den folgenden
Perioden nur unwesentlich erhöht, trotzdem die Kost in dieser
Periode 630 Calorien mehr enthält. In der letzten Periode, in der
der Caloriengehalt, nach Abzug des Calorienwertes des angesetzten
Eiweißes den anderen Perioden gleichkommt, wurde durch Stei-
gerung des Eiweißgehaltes der Kost der Ansatz stark gesteigert.

Die 2. Versuchsreihe, die zwar durch Wegbleiben der letzten
Fleischperiode gestört ist, zeigt eindeutig, daß bei unserer Ver-
suchsperson unter unseren Versuchsbedingungen, daß Weizenmehl
zum Eiweißansatz weniger geeignet war als das Fleisch.

Warum haben unsere Ansatzversuche andere Resultate
gegeben als die am Anfang zitierten Minimumversuche? Man
muß in erster Reihe die Unterschiede der Versuchsanordnungen
in Betracht ziehen. Wir halten es für ganz unwahrscheinlich,
daß unsere Daten durch Zufall zustande gekommen sind, welcher
Zufall durch die kurze Ausdehnung der Perioden bedingt wäre.
Die N- Ausscheidung stellt sich gewöhnlich am 2. Tage der Periode
auf den Durchschnittswert und abgesehen von einigen Tagen,
an denen die Versuchsperson sich unwohl gefühlt hat, ist die Aus-
scheidung regelmäßig und schwankt nur mit dem Fallen und
Steigen der täglichen Urinmenge. Ein Ansatzversuch läßt keine

138 L. Dienes:

Tabelle I.

Im Kot Auf-
az genommen
tum Periode Ei. = Ei- e?

Von lorlen| SÉ Si lorien

8. X. | SAS 40.4 g, | 2825 |) gog |158 | 184 | 342| 2770
92X. 3 32 |davon30,8g } 2770
10. X. SZb Fleischeiw, | 2485 2880
GE Ae 45,8 g 2775 89,6 | 2720
2.x.| 95 = [30g Fleisch-
18. X. | = M g eiweiß

Im Durchschnitt:
14. X.

Kost
(hauptsächl.
Fleisch)

=
pi
2, Gemischte

Im Durchschnitt:

218 | 180
80,8 g
Fleisch-
eiweiß

75 | 68

19. X. 68,0 g, da- | 2970
20. X. von 60,0 g
21. X. || 8. Erbsen Erbsen-

A eiweiß

Im Durchschnitt:
24. X. |

x. || 110,0 g, da- 123
a 4. Erbsen | yon 108,0 g
X. | Erbseneiw.

25. X
26
Im Durchschnitt:

27. X. | È 2110,78, da- | 8780 | 165
28. X 23g von 73g 103
29. X. || S GG & 5 | Fleischeiw. 292
80. AE 118
D. Sa S
Im Durchschnitt:
RALI 5 tA
2xL| S Ek
3.XL| Saz
d. XL BR 95,0 g, da- | 8160
5.XL| 522 | von 70,4g
6.XL| wb = Fleischeiw.
SE |
Im Durchschnitt:
8. XI. 116 g 8480 28,2 |
9. XI. || 7. Erbsen | 126 g, da-
10. XI. von 128,5 g | 87,8
Erbseneiw. |

Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost.

Da-

com Pe
z er En | um nennen
ILXL | 8. Wei-

12. | zen und |25g Mandel-
| Mandeln eiweiß und

13. XI.
14. XI.

16. XI.
16. XI.
17. XI.

Weizen

(hauptsächlich
Fleisch)

Ai
C
©
e
®
ba
Ë-
Q
ki
8
D
©
o

10. Gemischte
Kost (haupt-
sächl. Fleisch)

2
11. Gemischte Kost
(hauptsächlich Fleisch)

88 g, davon

57,5 g Wei-
zeneiweiß
84 g, davon
770g Wei-
zeneiweiß

Im Durchschnitt:

91,0 g,
davon 65,5g
Fleischeiw.

162 g, da-
von 148,0 g
Fleischeiw.

59,8 g, da-
von 450g
Fleischeiw.

Im Durchschnitt:

56,1 g, da-
von 51,6 g

Weizeneiw.

Im Durchschnitt:

In der täglichen
Kost

8282

8850

Eiweiß
ent-

Auf- 2 =
SE
E E sprechend
ba oe
sl

genommen

dem Harn

75 1876 | von | 715
10./16.

9,9

100 | 46,2 | 1400 78,2

Be-
merkungen

e Bilanz

Starkes
Kopfweh,
Unwohlsein

Le E

|- 320)

140 L. Dienes:

In der täglichen Im Kot

KÉ ` ` }
Anf- SS SE | S
Kost genommen | ZS 5 Sé å g | R
> een an R , TS sprechen = Le-
SSES e Kot Ei- e = $ dem Harn | Pi !merkunzer
Eiweiß i ewei Lä: N.
lorien e porien g g g
œ S |596 g, da- | 1447 795 66,9 |
ZS | von 450g 402 1470 | 77,0 |
Gei d Fleischeiw. 1280 61,2
IR 720! Gs
52 970 75,4
FR: 825 1240 | 66,1 |
+ Gi
, 62,2
cr 76 | 1605 68,2
£ 1875 64,8 |
Im Durchschnitt: 94| o | 50,2 | 1350 | ez |-170
>2 1165 g, da- 1300 | 629
2 2 I|von 86g Er 1020 | 76,2
Gel Ge Fleischeiw. 3300 | 80,7
E E 230 74,4 |
FRE 1155| 8838| `
z = 1880 | 78,0 |
53 1450 | 70,4
& 1: 74,2
“3 1700 | 83,2
E 1210 | 742 |
Im Durchschnitt: 92,9 el "mp Iva
106,3 g, da- 2005 91,1 |
von 979g 1470 738
15. |Weizeneiw. 529! 512 1400 | 1115| |
Weizen 1535 89,2 |
1140 | 1110| `
| 1220 GE |
|
Im Durchschnitt: von 13,6 | 144 | 92.7 | 3040 wo | -a3
4./18. von
14.19. | |

langen Perioden zu. Unsere Versuchsanordnung unterscheidet
sich in 2 Punkten wesentlich sowohl von den Versuchen von Hind-
hede als auch von Abderhalden, auch abgesehen vom prin-
zipiellen Unterschied. Erstens ist der Caloriengehalt der Kost
bei uns wesentlich niedriger. Es ist nicht ausgeschlossen, daß bei
sehr hoher Calorien- oder Kohlenhydratzufuhr der Organismus
die Eiweißstoffe anders verwertet als bei niedriger Calorienzufuhr.
Zweitens haben wir gut ausnutzbares Mehl benützt, während bei
den Versuchen beider Autoren, hauptsächlich aber bei den Frucht-
und Brotversuchen von Hindhede, die mit den Faeces abgehende
Eiweißmenge sehr hoch ist (30—40 g). Bei wesentlichem Unter-
schied in der Ausnützbarkeit kann der Zustand, in dem das Eiweiß

Stiekstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 141

aufgenommen wird, stark differieren und es ist auch möglich,
daß der Grund, warum das Eiweißminimum bei schlecht aus-
nützbarem Brot ebenso niedrig ist wie bei den Kartoffeln, darin
liegt, daß von den Eiweißstoffen, die mit den Faeces abgehen,
solche Bestandteile aufgenommen worden sind, die den Wert
des aufgesogenen Eiweißes erhöhen. Es ist zwar wahrscheinlich,
daß die erwähnten Umstände keine große Rolle spielen, doch
sicher ist dies nur experimentell zu entscheiden.

Aller Wahrscheinlichkeit nach unterscheiden sich die Resul-
tate wegen der Verschiedenheit der Fragestellung. Der Eiweiß-
ansatz ist wahrscheinlich eine andere Funktion des Organismus
als das Zurückhalten der Eiweißstoffe und stellt andere Ansprüche
gegenüber der Beschaffenheit der aufgenommenen Eiweißstoffe
und vielleicht auch gegenüber dem Organismus und deshalb
können die Unterschiede zwischen den einzelnen Eiweißstoffen
schärfer hervortreten als bei Minimumversuchen. Diese Annahme
bot uns die Anregung zur Ausführung der Versuche und eine
Möglichkeit dieser Annahme wird auch von Abderhalden
zugelassen!).

Endlich können wir auch die Möglichkeit nicht ausschließen,
daß bei der Verwertung der Eiweißstoffe zwischen den einzelnen
Individuen große individuelle Unterschiede vorhanden sein können
und daß die von uns gefundene Regel nicht für jeden Menschen
gültig ist. Vielleicht ist sie auch der Ausdruck einer Stoffwechsel-
anomalie, welche Annahme bei einem stark zu Fettleibigkeit
neigenden Individuum nicht fernliegend ist. Es ist gewiß
nicht zulässig, aus Resultaten, die bei einer einzigen Versuchs-
person gefunden worden sind, allgemeine Schlußfolgerungen
zu ziehen.

Außer den erwähnten Möglichkeiten, nach welchen der Grund
der Unterschiede in den Resultaten der Minimum- und Ansatz-
versuche selbst in den Eiweißstoffen liegt, bietet sich noch folgende.
Bekanntlich kommt der Eiweißansatz nur dann zustande, wenn
der Organismus das Eiweiß nötig hat. In den durch Hindhede
mitgeteilten Daten finden wir sehr interessante Hinweise darauf,
daß auch bei sehr geringer Eiweißzufuhr das Eiweißbedürfnis
die Richtung der Schwankungen um das Eiweißgleichgewicht
entscheidet und das Gleichgewicht stark beeinflußt. Wenn das

1) Lehrbuch der physiologischen Chemie, TI. Aufl., S. 1205.

142 L. Dienes:

Eiweißminimum erreicht ist, ist die Bilanz positiv oder negativ.
je nachdem das Körpergewicht steigt oder fällt. Z. B. bei den
Versuchen mit Gerste!) hält eine Versuchsperson (Landsmoe).
dessen Körpergewicht steigt, von 39,5 g täglicher Eiweißmenge
7,3g zurück, später, bei fallendem Körpergewicht, bei Aufnahme
von 50,9g täglicher Eiweißmenge (und 3500 Cal.) verliert sie
täglich 13g Eiweiß. Die andere Versuchsperson, Fr. Madsen.
die bei Kartoffel- und Brotkost mit 21 g täglicher Eiweißmenge
im Gleichgewicht war, verliert bei den Gerstenversuchen neben
50 g aufgenommenem Eiweiß täglich 2 g, während der Dauer des
Versuches 350g (der Caloriengehalt der Kost war ungefähr
4000 Calorien täglich). Wir haben das Bedürfnis des Eiweiß-
ansatzes dadurch gesichert, daß dem Ansatzversuch ein großer
Eiweißverlust folgt?). Doch kann man nicht ausschließen, daß die
Kost selbst die Neigung des Organismus, Eiweiß aufzunehmen,
stark beeinflußt. Es ist auffallend, daß, während bei Fleischkost
die Eiweißaufnahme hoch ist, bei der Weizenmehlkost die Auf-
nahme nicht nur geringer ist, sondern ganz aufhört. Es ist kaum
anzunehmen, daß 90 g Weizenmehleiweiß keine Möglichkeit zur
Eiweißaufnahme bieten sollte, während von gleicher Menge
Fleischeiweiß 17g zurückgehalten wurden, oder, wie bei der
l. Versuchsreihe, von 85g 21 g. Wir müssen daran denken, daß
dieser Unterschied nicht durch den Unterschied der Eiweißstoffe
verursacht ist, sondern daß wir in dem Ausbleiben des Eiweiß-
zusatzes dieselbe Erscheinung beobachten, die wir auch an den
mit reinen Nährstoffen ernährten jungen Tieren, bei welchen das
Wachstum ausbleibt, beobachten können. Der Organismus unserer
Versuchsperson ist während der Abmagerungsperiode, in welcher
er erst 18 kg, später 12 kg, verloren hat, wahrscheinlich an meh-
reren wichtigen Bestandteilen verarmt. Es ist möglich, daß der
Eiweißansatz nur mit der Aufnahme von gewissen, von dem Eiweiß
verschiedener Substanzen parallel gegangen ist und diese Stoffe,
trotzdem wir auf die Abwechslung der Zusammensetzung der Kost
großes Gewicht gelegt haben, in der Mehlkost nicht vorhanden
waren,

1) Skandinav. Arch. f. Physiol. 35.

2) Dieser Versuch ist auch nicht direkt mit unseren Ansatzversuchen
vergleichbar, weil die zum Vergleich dienende Fleischperiode fehlt und die
aufgenommenen Calorien viel höher sind als in unseren Versuchen.

|
Í
|

—-

Stickstoffansatz bei Fleisch- und Mehlkost. 143

Wir halten zwar unsere Versuche für richtig, wollen aber nicht
vergessen, daß sie nur an einer und auch nicht ganz normalen
Person und nur mit einer Nahrungszusammensetzung ausgeführt
wurden.

Zusammenfassung.

Wir haben gefunden, daß bei gleicher Stickstoff- und Calorien-
aufnahme (Resorption), nach starker Abmagerung, bei Fleisch-
kost bedeutend mehr Stickstoff angesetzt wird als bei einer Kost,
deren Eiweiß hauptsächlich aus Weizenmehl stammt.

Interferometrische Analyse der Immunpräeipitation.

Von
R. Doerr und W. Berger.

(Aus dem Hygienischen Institut der Universität Basel.)
(Eingegangen am 18. Juli 1921.)
Mit 1 Abbildung im Text.

Van Calcar hat im Jahre 1908 die Hypothese formuliert,
daß das Präcipitinein fermentartiger Stoff sei, welcher
die Fähigkeit besitzt, das zugehörige Eiweißantigen in vivo und in
vitro zu zerlegen; bei dieser Zerlegung sollen Säuren (Aminosäuren,
sauer reagierende Polypeptide) entstehen, welche die alkalischen
Substanzen des Serums neutralisieren und durch diese ‚indirekte
Alkalientziehung‘‘ das Globulin niederschlagen. Die akuten
Krankheitserscheinungen, welche nach wiederholten Injektionen
einer bestimmten Eiweißart auftreten, betrachtete van Calcar
als Ausdruck einer Vergiftung durch die im Organismus gebildeten
Zerfallsprodukte des eingespritzten Proteins; die Tatsache, daß
Eiweißspaltprodukte wie Albumosen, Aminosäuren ziemlich stark
toxisch wirken können und die Beobachtung, daß man durch die
Vitroreaktion von Präcipitinogen und Präcipitin Flüssigkeiten
erhält, welche beim normalen Tiere ähnliche Störungen auslösen
wie die Reinjektion des Antigens beim spezifisch vorbehandelten,
genügten ihm als Beweise für seine Auffassung von der Ursache
anaphylaktischer Prozesse.

In dieser Konzeption tritt der Antikörper als ein Agens
auf, welches imstande ist, am Antigenmolekül tiefgreifende che-
mische Veränderungen hervorzurufen. Wie Bordet in seinem
Werke ‚Traite de l’immunite“ erst vor kurzer Zeit nachdrück-
lichst betont hat, kennt man jedoch bisher keine einzige Wirkung
eines Antikörpers, die mit einer Antigenzersetzung verbunden
wäre. Daß das Antigen bei der Reaktion mit dem Antikörper

R. Doerr u. W. Berger: Interferometrische Analyse usw. 145

intakt bleibt, erhellt ja schon daraus, daß man den neutralen
Komplex auch nach langer Dauer seines Bestandes wieder disso-
ziieren und selbst sehr labile Antigene mit allen ihren ursprüng-
lichen Eigenschaften restituieren kann (Roux und Calmette,
Morgenroth und seine Mitarbeiter, Busson und Löwenstein).
Wählt man als Antigene empfindliche Zellarten wie Erythrocyten,
bei denen sich Änderungen im Eiweißbestand oder gar bis zu den
Aminosäuren reichende Verdauungsvorgänge sofort und selbst
für eine grobsinnliche Betrachtung verraten müßten, so vermag
man sich leicht zu überzeugen, daß ihre Verbindung mit einem
spezifischen Antikörper zu keiner Alteration führt, die sich mor-
phologisch oder chemisch fassen ließe. Erst die Intervention
des Komplementes bewirkt den Eintritt der Cytolyse oder anderer
cytotoxischer Effekte; aber auch die Lyse (Hämolyse, Bakterio-
lyse) darf nach dem derzeitigen Stand unserer Kenntnisse nicht
als Verdauung der antigenhaltigen Zellen aufgefaßt werden
(Nolf, Misch, Jobling und Petersen, Bordet, Doerr), und
es existiert keine sichergestellte Tatsache, die uns berechtigen
würde, dem ,Komplement“ die Funktionen einer Protease
zuzuschreiben (Bronfenbrenner, Bordet, Jobling und
Petersen, Lampl und Landsteiner).

Nun hat in den letzten Jahren P. Hirsch die Vorstellungen,
welche sich van Calcar über den Mechanismus der Immun-
präcipitation gebildet hatte, wieder aufgegriffen und sie in fast
unveränderter Form als ‚‚Arbeitshypothese‘“ übernommen. Hirsch
faßt die Präcipitation selbst als einen rein kolloidchemischen Prozeß
auf, der infolge einer Änderung der Wasserstoffionenkonzentration
in einem kolloidalen System (Gemisch von Antigen und Immun-
serum) zustande kommt. Die Änderung (Vermehrung) der Wasser-
stoffionenkonzentration soll dadurch entstehen, daß im Immun-
serum Abwehrfermente vorhanden sind, welche die Eiweißkörper
des Antigens zu sauer reagierenden Spaltprodukten abbauen. ,. Der
Kern des ganzen Vorganges ist also die chemische, fermentative
Spaltung von artfremden Proteinen, während die spezifische
Ausflockung geradezu als Folge, als ‚Nebenwirkung‘ erscheint‘
(Langenstrass).

Die von P. Hirsch für das quantitative Studium der „Ab-
wehrfermentreaktionen“ ausgearbeitete interferometrische Mce-
thode „mit ihrer außerordentlich feinen Ausdrucksfähigkeit für

Biochemische Zeitschrift Band 123. 10

146 R. Doerr u. W. Berger:

minimale Änderungen der Konzentration und der Refraktion
von Lösungen“ schien ihm geeignet, auch auf ‚diejenige Abwehr-
fermentreaktion, welche der spezifischen Präcipitation zugrunde
liegen dürfte, neues Licht zu werfen‘ (Langenstrass). In Ge-
meinschaft mit K. Langenstrass verwendete Hirsch zur Ana-
lyse der Immunpräcipitation eine Untersuchungstechnik, die
auf folgendem Gedankengange beruht:

Vermengt man 2 Lösungen von verschiedenem Refraktions-
(Interferometer-) Wert, welche chemisch miteinander nicht rea-
gieren, so läßt sich der Interferometerwert (abgekürzt IW.) des
Gemenges als additive Funktion der beiden Komponenten be-
rechnen. Besonders einfach liegt der Fall, wenn man gleiche Volu-
mina der beiden optisch differenten Flüssigkeiten vermischt;
dann erhält man den IW. des Gemenges, wenn man einfach das
arithmetische Mittel der IW. der Komponenten bestimmt.
Diesem errechneten oder Sollwert der Gemenge entspricht ihre
tatsächliche, direkt feststellbare Refraktion, zwar nicht mit
absoluter Genauigkeit, aber doch in einem sehr weit angenäherten
Grade.

Trifft jedoch die Voraussetzung nicht zu, d. h. reagieren die
Flüssigkeiten resp. die in denselben gelösten Stoffe miteinander,
so müssen die abgelesenen und die errechneten Werte der Gemenge
nicht mehr übereinstimmen. Je nach dem Refraktionswert der
neu entstehenden Substanzen kann der abgelesene Wert des
Gemenges niedriger oder höher sein als der berechnete. Es ist
aber selbstverständlich auch möglich, daß eine Übereinstimmung
trotz chemischer Umsetzung gefunden wird, z. B. dann, wenn
2 oder mehrere chemische Reaktionen nebeneinander ablaufen,
welche den IW. des Gemenges antagonistisch beeinflussen und
sich dabei gegenseitig im Endeffekt kompensieren.

Hirsch und Langenstrass scheinen!) anzunehmen, daß
eine Spaltung von Eiweißmolekülen eine Vermehrung der Refrak-
tion notwendig nach sich ziehen muß. Bei der Immunpräcipitation
müßte dann die Richtigkeit der Hypothese van Calcars dadurch
zum Ausdruck gelangen, daß ein Gemenge von Präcipitinogen
und Präcipitin einen IW. zeigt, der höher ist als das arithmetische
Mittel der IW. der beiden Reaktionskomponenten. Doch wäre dieses
Ergebnis nur in dem Falle zu erwarten, daß die Gesamtmasse

1) Fermentforschung 3, 8.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 147

aller Substanzen des Reaktionsgemisches in Lösung verharrt.
Bei der Präcipitation trifft das jedoch nicht zu, da das Eiweiß
zum Teil ausflockt, wodurch die Refraktion selbstverständlich
erniedrigt werden muß. Vom Standpunkte der Autoren, welche
an einen fermentativen Antigenabbau denken, sind daher, wie
Langenstrass auseinandersetzt, 3 Endresultate möglich:

L Die Refraktionsvermehrung (Folge der fermentativen
Spaltung) ist größer als die Verminderung (Folge der Aus-
füllung des Präcipitates), dann erhält man eine Zunahme der
Refraktion in der überstehenden Flüssigkeit gegenüber dem
berechneten arithmetischen Mittel der IW. von Präcipitinogen
und Präcipitin.

2. Die Refraktionsvermehrung ist gleich der Ver-
minderung. Dann ist der Refraktionswert der überstehenden
Flüssigkeit dem bezeichneten Mittel gleich, obwohl eine Substanz-
verarmung durch Absetzen des Niederschlages notwendigerweise
erfolgt sein mußte.

3. Die Vermehrung ist kleiner als die durch Aus-
flockung bedingte Verminderung. Dann weist die über-
stehende Flüssigkeit im Vergleich zum arithmetischen Mittel
der Reaktionskomponenten ein Refraktionsdefizit auf.

Die sub 1 und 2 bezeichneten Versuchsergebnisse wären
direkt im Sinne von van Calcar sowie von Hirsch und Langen-
strass verwertbar. P. Hirsch hat auch de facto derartige Be-
obachtungen gemacht, aber nicht oder nur ganz ausnahmsweise
bei der Immunpräcipitation, sondern bei einer anderen, mit der
Präcipitation nicht ohne weiteres identifizierbaren Versuchs-
anordnung, nämlich bei der spezifischen Ausflockung des
Fickerschen Typhusdiagnostikums durch Typhusimmunserum.
Doerr hat diese Angaben an anderer Stelle kritisch besprochen,
so daß wir hier nicht näher darauf einzugehen brauchen. Es sei
nur kurz betont, daß das Fickersche Diagnostikum verschiedene
Stoffe (Carbolsäure usw.) enthält, welche mit dem zugesetzten
Immunserum bzw. mit Bestandteilen desselben chemisch reagieren
und dadurch den Refraktionswert des Gemenges völlig unabhängig
von der Antigen-Antikörperreaktion modifizieren können. Es
hätten somit zum mindesten Kontrollversuche mit Normalserum
und mit einem heterologen Immunserum angesetzt werden müssen,
was jedoch verabsäumt wurde. Abgesehen von dieser Fehler-

10*

148 R. Doerr u. W. Berger:

quelle, deren Nichtbeachtung jede Deutung der Resultate von
vornherein ausschließt, fällt noch ins Gewicht, daß die normaler-
weise gehemmte Autoproteolyse verschiedener Sera durch Zusatz
von Phenol in Gang gebracht werden kann (Yamakawa und
Okubo).

Bei der Immunpräcipitation konstatierten Hirsch und
Langenstrass meist nur solche Refraktionswerte der über-
stehenden Flüssigkeiten, die sich unter dem arithmetischen
Mittel der Reaktionskomponenten hielten. Hier konnte der
Beweis für die Fermenthypothese auf direktem Wege nicht mehr
geführt werden. Wohl aber vermochten die Autoren eine in-
direkte Methode ausfindig zu machen, welche einen Schluß in
dieser Richtung zuließ. Sie versuchten den Nachweis zu erbringen,
daß die Verminderung der Refraktion der überstehenden Flüssig-
keit geringer ist als man nach der Masse bzw. nach dem Refraktions-
wert des Präcipitates erwarten würde. Es handelte sich somit
in technischer Hinsicht nur darum, den IW. des Präcipitates
zu messen, eine Forderung, die P. Hirsch erfüllte, indem er die
Präcipitate von der überstehenden Flüssigkeit absonderte, trock-
nete, mit destilliertem Wasser, Äther und Alkohol wusch und
dieselben schließlich in einer Flüssigkeit von bekanntem IW.,
in "ho NaOH, wieder auflöste. Die durch die Lösung des Präci-
pitates herbeigeführte Erhöhung des Refraktionswertes der
NaOH gibt den Refraktionswert des Präcipitates an, und um
diesen Betrag mußte sich eben der optische Wert der überstehen-
den Flüssigkeit vermindert haben, wenn bei der Präcipitation
nur physikalische Vorgänge intervenieren würden; läuft eine
Proteolyse ab, dann würde die Verminderung der Refraktion der
überstehenden Flüssigkeit kleiner sein als der durch die Nieder-
schlagsbildung involvierte Verlust an optischer Dichte. Hirsch
und Langenstrass berichten über Erfahrungen, welche für die
letztgenannte Alternative zu sprechen scheinen und die somit
im Sinne der ganzen Fragestellung als Beweise für die Ferment-
natur der Präcipitine zu gelten hätten. P. Hirsch und Langen-
strass sprechen sich allerdings nicht an allen Stellen ihrer Pu-
blikationen mit der wünschenswerten Klarheit darüber aus, ob
und in welchem Ausmaße sie durch ihre experimentellen Unter-
suchungen die Lehre von der Fermentnatur der Präcipitine als

verifiziert erachten. Indes hat doch Langenstrass (l. e. S. 42)

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 149

ausdrücklich hervorgehoben, daß eine reine Kolloidreaktion‘“ bei
der Präcipitation ‚sicher nicht in Frage kommt“. Vielmehr scheint
ihm festzustehen, daß spezifischen Kräften (Fermenten, Abwehr-
fermenten) die Hauptrolle zugeschrieben werden muß. Das Prä-
cipitin wirkt nach seiner Ansicht ‚zunächst abbauend, und zwar
spezifisch auf das Antigen. Dieser Vorgang ist ein rein chemischer.
Später, „vielleicht oder wahrscheinlich auch nebenher, tritt nun
die eigentliche Präcipitation auf",

Zu dieser Hypothese und ihrer experimentellen Begründung
durch Hirsch und Langenstrasshatdereine von uns (R. Doerr)
bereits vor Jahresfrist Stellung genommen und über interfero-
metrische Untersuchungen von 4 Immunpräcipitationen und ver-
schiedenen aspezifischen Kolloidflockungen berichtet, welche ihn
— abgesehen von anderen Erwägungen — zu einer entgegengesetz-
ten Ansicht führten. Nach Doerr zeigt die interfero metrische
Analyse der Immunpräcipitation dieselben Verhält-
nisse wie die Flockung von Eiweißlösungen durch
Thor- oder Cer - Salze, eine Sachlage, welche die Annahme
fermentativer Abbauprozesse des Eiweißantigens zur Erklärung
der Immunpräcipitation überflüssig macht.

Die von Doerr verwendeten Versuchsanordnungen gestatten
aber keinen vollkommen exakten Vergleich der Immunpräcipi-
tationen mit den als Pendants gewählten Kolloidmodellen; es
können sowohl gegen die Methodik wie auch gegen die rechnungs-
mäßige Verwertung der interferometrischen Ablesungen Ein-
wände erhoben werden, die allerdings an den mitgeteilten Resul-
taten wie an ihrer Interpretation nichts Wesentliches ändern
würden. In Anbetracht der prinzipiellen Bedeutung des zur
Diskussion stehenden Problems für die Auffassung der wichtigsten
Immunitätsreaktionen (Präcipitation, Anaphylaxie, Agglutination)
haben wir uns aber doch entschlossen, die Arbeiten fortzusetzen.
Um alle Fehlerquellen zu vermeiden, war zunächst eine gründ-
liche, auf eine breite Basis aufgebaute Voruntersuchung über die
Anwendungsweise und Anwendungsmöglichkeit des interfero-
metrischen Verfahrens notwendig. wenigstens in jenen Beziehungen,
welche für die Fragestellung Bedeutung besaßen; vor allem war
zu untersuchen, inwieweit aus Refraktionsänderungen
Rückschlüsse auf die chemisch -fermentative Natur

eines Vorganges gezogen werden dürfen. Dann aber galt

150 R. Doerr u. W. Berger:

es, die tatsächliche Beeinflussung der Refraktion durch
die Immunpräcipitation möglichst exakt festzustellen,
exakter und in zahlreicheren Versuchen, als das in Doerrs erster
Mitteilung der Fall war.

Wir konnten, wie die folgenden Ausführungen dartun werden,
die von Doerr vertretene Auffassung, daß sich die Refraktion
bei Immunpräcipitationen nicht anders verhält wie bei unspezi-
fischen Eiweißflockungen durch anorganische Kolloide, durch
weiteres Beweismaterial stützen. Darüber hinaus vermochten
wir mit einer ganz einfachen neuen Versuchsanordnung
(direkte Verfolgung des Präcipitationsvorganges im Interfero-
meter) einwandfrei zu zeigen, daß in der ersten Phase der
Präcipitation keine Refraktionsänderungeintritt. Nur
diese erste Phase der Präcipitation, welche vom Vermengen des
Präcipitinogens mit dem Präcipitin bis zum Beginne der Flockung
reicht, kann aber für die Ursachen des spezifischen Fällungspro-
zesses in Betracht gezogen werden.

I. Voruntersuchungen.

Bevor wir an die erneute interferometrische Analyse der
Immunpräcipitation herantraten, suchten wir uns durch eine
größere Reihe von Vorarbeiten über die Leistungsfähigkeit
des interferometrischen Verfahrens für die von uns ins
Auge gefaßten Zwecke Gewißheit zu verschaffen. Wir studierten
daher in erster Linie die Einzelheiten der Technik. Sodann
wurden interferometrische Messungen vorgenommen, und zwar
a) bei Gemengen von Flüssigkeiten ohne und mit wechsel-
seitigen chemischen Affinitäten, b) bei rein kolloidalen
Ausflockungen von Eiweißlösungen durch die Salze seltener
Erden und c) bei echten Fermentationen. So gewannen wir
eine Grundlage für die Beurteilung der Resultate der Haupt-
versuche, welche sich mit der spezifischen, durch Antigen-Anti-
körperreaktion bedingten Eiweißfällung beschäftigten.

1. Prinzip und Technik des interferometrischen Verfahrens.

Ihrem Wesen nach sind Messungen mit dem Interferometer
(Interferenzrefraktometer) Refraktionsbestimmungen.

Die Refraktion ist eine physikalische (optische) Eigenschaft der
Körper, wird aber durch ihre chemische Struktur entscheidend beeinflußt.
Sie hängt daher ab: von der Zahl, der Art und den gegenseitigen

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 151

Beziehungen (Bindungen) der die Moleküle aufbauenden Atome.
Daraus ergibt sich automatisch die doppelte Anwendung von Refraktions-
bestimmungen; man kann sie benutzen, um zu Aussagen über die Kon-
zentration eines Stoffes, z. B. einer Lösung von NaCl in destilliertem
Wasser, zu gelangen, oder man kann sie zu Rückschlüssen auf die chemische
Zusammensetzung der geprüften Stoffe verwenden. Da die Refraktion,
besonders bei Flüssigkeiten, eine sehr exakt und relativ rasch meßbare
Größe ist, zu deren Ermittlung man überdies nur kleine Flüssigkeits-
mengen benötigt, haben sich die Methoden der Refraktionsbestimmung
in den verschiedensten physikochemischen und medizinischen Arbeits-
gebieten eingebürgert.

Apparate zur Refraktionsbestimmung. Ursprünglich wurde
die Refraktion durch Messung des Grenzwinkels der totalen Reflexion
(Glanzwinkel) ermittelt. Darauf beruhen die verschiedenen Refraktometer-
modelle (Abbee, Pulfrich), von welchen sich besonders das Pulfrichsche
Eintauchrefraktometer in die medizinischen Laboratorien Eingang ver-
schaffte. Das Bedürfnis nach einer weiteren Steigerung der Empfindlichkeit
führte in der Folge zur Anwendung des Prinzips der Ablenkung des
Interferenzspektrums der zu prüfenden Lösung bzw. des zu unter-
suchenden Gases gegenüber dem Spektrum eines Vergleichsmediums.
Die ersten nach diesem Prinzip konstruierten Apparate stammten von
Jamin, Michelson und Lord Rayleigh. In Deutschland gab Loewe
dem Ra yleighschen Apparat im Laboratorium der Firma Zeiß eine andere,
die praktische Brauchbarkeit erhöhende Form und stellte 2 Typen her,
welche verschiedenen Zwecken dienen und von welchen die eine als Gas-
interferometer, die andere als Flüssigkeitsinterferometer be-
zeichnet wird. Mit dem letztgenannten Apparat wurden die optischen
Untersuchungen über die Immunpräcipitation angestellt, sowohl die von
Hirsch, Langenstrass und Doerr, als auch die Experimente, welche
den Inhalt der vorliegenden Mitteilung bilden. Barus in Amerika benutzt
seit 1911 für physikalische Studien ein von ihm selbst konstruiertes Instru-
mentarium, welches er nach dem zugrunde gelegten Meßprinzip ebenfalls
Interferometer nennt, das aber wesentlich von dem Loeweschen Flüssig-
keitsinterferometer abweicht.

Hinsichtlich der Technik der interferometrischen
Untersuchung verweisen wir im allgemeinen auf die in den
Publikationen von Loewe, Marc, Hirsch, Schmeel und
Langenstrass niedergelegten Gebrauchsanweisungen und Er-
fahrungen. Wir wollen hier auf methodologische Details nur so weit
eingehen, als wir das für die Bewertung unserer Versuchsergebnisse
für nötig erachten.

Daß man bei einer verhältnismäßig recht empfindlichen
Methode Fehlerquellen zu berücksichtigen hat, ist wie bei
allen feineren Messungen von vornherein zu erwarten. Die Exakt-

152 R. Doerr us W. Berger:

heit der interferometrischen Untersuchungen beruht auf der
Richtigkeit und Genauigkeit der optischen Messung einerseits
und auf der Zuverlässigkeit der Abmessung und der Erhaltung
der Reaktionsvolumina andererseits. Nach beiden Richtungen
muß die Größe, die Häufigkeit und die Vermeidbarkeit
der möglichen Fehler bekannt sein und bei der Deutung der
gewonnenen Resultate beachtet werden.

Um die vielen vermeidbaren Fehler auszuschalten, hielten
wir uns streng an die von den genannten Autoren mitgeteilten
Vorschriften und Ratschläge, von deren Richtigkeit und Not-
wendigkeit wir uns im großen ganzen selbst überzeugen konnten.
So verwendeten wir zur Verbesserung der Ablesung helles, nicht
zu grelles Licht (Anschluß der Lämpchen an die Lichtleitung
unter Vorschaltung eines von der Firma Zeiß gelieferten Wider-
standes) und dämpften die Beleuchtung des Laboratoriums
stark ab, wodurch sich die Empfindlichkeit des beobachtenden
Auges für feine Differenzen wesentlich erhöht.

Zur Auswahl (Einstellung) des richtigen Streifenpaares bedienten wir
uns der angegebenen Kautelen und Kunstgriffe (richtige, zentrale Augen-
haltung, Bewegung des Auges vor dem Okular, Drehung des Okulars,
Dunkeladaptation usw.). Die Ablesungen wurden erst nach vollzogenem
Temperaturausgleich vorgenommen; jede Einzelmessung gründete sich
ausnahmslos auf das Ergebnis wiederholter Ablesungen mit eingeschaltetem
Umschütteln des Kammerinhaltes. Untersuchungen mit höher konzen-
trierten, heterologen Lösungen wurden konform den Forderungen von
Langenstrass bei einer während des ganzen Experimentes konstanten
Temperatur durchgeführt.

Vor allem aber haben wir uns bemüht, die zu messenden Lösungen
und die Vergleichsflüssigkeiten so einzustellen, daß die abgelesenen Inter-
ferometerwerte (IW.) auch bei Verwendung der 4cm-Kammer um 1500
Trommelteilen (TT.), durchschnittlich sogar unter 1200 TT. lagen, wodurch
sie aus dem korrekturbedürftigen Bereich in das nichtkorrekturbedürftisre
gerückt wurden. (Die Aichkurve, die wir für unser Instrument mit Koch-
salzlösungen anlegten, zeigte Abweichungen der abgelesenen von den
berechneten Werten von 1300 TT. angefangen.)

Die XNullage (Einstellung bei Füllung beider Kammerhälften mit
der gleichen Flüssigkeit) wurde bei jedem Versuche neu ermittelt, obwohl
sie ziemlich konstant mit 25 (+0,5) TT. bestimmt werden konnte. Auf
die Vermeidung der Verdunstung der Versuchsflüssigkeiten innerhalb und
außerhalb der Kammern sowie auf die Hintanhaltung von bakteriellen
und anderweitigen Verunreinigungen, endlich auf die Ausschaltung
von Fehlern beim Pipettieren wurde selbstverständlich großes Gewicht
gelegt.

-— or gen

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 153

Trotz strenger Befolgung dieser Vorschriften haften jedoch
dem Verfahren noch einige weitere, nicht oder wenigstens
nichtimmer vermeidbare Fehler an, so daß bei der Deutung
der Befunde mit einer gewissen, noch zu fixierenden Fehlerbreiie
zu rechnen ist. Die hauptsächlichsten unvermeidbaren Fehler sind:

a) der Ablesungsfehler,

b) die unvermeidlichen Fehler beim volumetrischen
Arbeiten,

c) die Streifenverwechslung.

Die beiden erstgenannten Fehler können im Verhältnis zur
Empfindlichkeit des Apparates als gering taxiert werden.

Der Ablesungsfehler kommt gegenüber dem Einfluß anderer Fehler
fast gar nicht in Betracht; wir bemessen ihn gleich Schmeel auf +1 TT.

Auch die Fehler beim volumetrischen Arbeiten involvieren
keine bedeutenden. Fehlausschläge und werden naturgemäß sehr ein-
geschränkt, wenn die Refraktionen der in einem Versuche verwendeten
Flüssigkeiten nicht sehr erheblich differieren. Mischt man z. B. 2 Lösungen,
deren IW. nicht stark voneinander verschieden sind, zu gleichen Teilen,
so wird eine Ungenauigkeit in der Volumsabmessung den optischen Wert
des Gemenges nur wenig beeinflussen, während sich ein Fehler gleichen
Grades beim Vermengen von destillierttem Wasser mit 5% Kochsalzlösung
sehr unangenehm bemerkbar machen würde. Wir haben nun — wie erwähnt
— bei jedem einzelnen Versuch stets nur Flüssigkeiten benutzt, deren IW.
in einem Mebßintervall von 1400 TT. lagen; dadurch fielen nicht nur die
mißlichen Korrekturen weg, sondern es wurde der volumetrische Fehler
einem unvermeidlichen Minimum angenähert.

Über die effektive Größe der sub 2 genannten Fehler verschafften
wir uns in doppelter Weise Kenntnis: einmal durch Auswägen des Pipetten-
inhaltes, dann aber auch in der Weise, daß wir mehrere Proben eines Ge-
misches herstellten und jede von ihnen in der 4cm- und in der 2 cm-
Kammer ausmaßen. Nach diesem Schema wurde der nachstehende Ver-
such angestellt, welcher 3 Gemenge von 0,03%, mit 0,3 proz. Kochsalzlösung
zu gleichen Teilen betrifft:

IW. Mittlerer Differenz gegen
(4 cm-Kammer) Fehler den berechn. Wert
Gemenge a). . 2... 892 +1 —7
e Drane ca we Aë éi 893 +2 —6
a ee 888 —3 —11
IW. Mittlerer Differenz gegen
(2 cm-Kammer) Fehler den berechn. Wert
Gemenge a). . . 2... 460 +0,7 +5
s. Dee aaee 460 0,7 5

en Men 458 —1,3 +3

154 R. Doerr u. W. Berger:

Auf Grund unserer Erfahrungen beziffern wir den aus unver-
meidlichen volumetrischen Fehlern hervorgehenden mittleren
Messungsfehler mit +5 TT. — Bei sehr ungünstigen gegen-
seitigen Volums- und Konzentrationsverhältnissen der miteinander
zu mischenden Flüssigkeiten kann er höhere Werte annehmen;
unter den Bedingungen, die bei unseren Experimenten gegeben
waren, sehen wir aber, daß die Genauigkeit der Volumsabmes-
sungen der Genauigkeit der interferometrischen Refraktions-
bestimmung so ziemlich entspricht.

Der wichtigste, weil größte der unvermeidlichen Fehler ist
die Streifenverwechslung; man stellt ein falsches Streifen-
paar über das Minimum nullter Ordnung des fixen Spektrums.
Wir pflichten in dieser Beziehung Loewe, Hirsch und Langen-
strass insofern bei, als auch wir die Erfahrung gemacht haben,
daß die Einstellung des richtigen Streifenpaares bei entsprechender
Übung und Sorgfalt i n der Regel gelingt. Bei größeren Wertungs-
reihen mußten wir aber wiederholt konstatieren, daß die eine
oder die andere Ablesung offenbar um ein Streifenpaar zu hoch
oder zu niedrig ausgefallen war!), oder daß die Entscheidung.
welches von 2 benachbarten Streifenpaaren das richtige ist, nicht
mit Sicherheit gefällt werden konnte. Diesen Schwierigkeiten
bei der Auswahl des richtigen Streifenpaares sind nicht wir allein
begegnet; sonst hätten sich wohl nicht fast alle Autoren, die über
die Verwendung des Interferometers berichteten, so ausführlich
mit diesem Problem beschäftigt.

Marc hat 1911 die Ursache dieser Schwierigkeiten systematisch
untersucht. Er prüfte kolloidale Lösungen (Gelatine, Eiweiß) und ermittelte
zunächst eine Ausgangskonzentration, bei welcher eine Einstellung mit
völlig identischem oberen und unteren Streifenpaar möglich war. Wurde
nun die Konzentration des Hydrosols sukzessive erhöht, so gelang es alsbald
nicht mehr, im oberen Interferenzband ein Streifenpaar zu ermitteln,

welches mit dem unteren feststehenden Streifenpaar völlig identisch war.
Es zeigte sich folgende Erscheinung. Bei der Versuchsanordnung von

1) Solche Irrtümer wird man gewahr, wenn man einen und denselben
Versuch doppelt ansetzt und durchführt oder wenn man bei einem Versuch
alle Abmessungen in 2 Kammern (4 cm und 2 cm) vornimmt. Es kann sich
dann ereignen, daß im ersten Falle eine Messung offenkundig gerade um
eine Streifenbreite (etwa 20 TT.) aus der Reihe der anderen Ablesungen
herausspringt, oder daß im zweiten Falle die Ablesung in der einen Kammer
nicht dem mit der anderen Kammer gewonnenen Wert entspricht, sondern
ebenfalls um eine Streifenbreite abweicht.

nn

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 155

Marc ist die Konzentration der untersuchten Proben jeweils bekannt;
man kennt daher im voraus den jeder Konzentration entsprechenden IW.,
daher natürlich auch das „richtige“ Streifenpaar. Dieses wird aber —
wie gesagt — mit steigender Konzentration dem unteren immer un-
ähnlicher, während gleichzeitig das nächsthöhere Streifenpaar immer
ähnlicher wird, bis man schließlich zu einer Konzentration kommt, bei
welcher nicht das , richtige“, sondern das nächsthöhere Streifenpaar
mit dem unteren Streifenpaar identisch ist. Wäre diese Konzentration
unbekannt, so müßte der Beobachter notwendigerweise um eine Streifen-
breite zu hoch einstellen und dementsprechend auch die Konzentration
der Lösung zu hoch veranschlagen.

Steigert man die Konzentration des Kolloids noch weiter, so wiederholt
sich dieses Spiel von neuem. Die Länge dieser Perioden ist für verschiedene
Stoffe verschieden; für Albumin beträgt sie z. B. 270 TT. (in der 2 cm-
Kammer). Mehr als 2 Perioden mußte Marc in dem üblichen Meßintervall
in keinem Falle berücksichtigen. Entsprechend dem sprungweisen Vor-
rücken der Einstellung um ein Streifenpaar erhält man beim Anlegen von
Eichkurven für kolloide Lösungen Linien mit Knicken; das Intervall
zwischen 2 Knicken begrenzt immer eine Periode des geschilderten Streifen-
wechsels. Kristalloide Lösungen zeigendiese Erscheinung nicht,
wenigstens nicht bei niederen Konzentrationen; bei Hydro-
solen dagegen und bei Messungen, die sich in einem großen
Intervall bewegen, mußsie zur Geltung kommen undrepräsen-
tiert dann eine Quelle recht beträchtlicher Fehler. Man sucht
daher nach dem Vorgange von Marc für kolloidale Flüssigkeiten Eich-

kurven anzufertigen, welche es gestatten, die Unstetigkeiten in Rechnung

zu setzen. Leider ist das jedoch nicht immer möglich, wie z. B. bei Ver-
suchen mit ausflockenden Gemischen von Serum und Antiserum, und dann
bleibt eben nichts anderes übrig, als bei den Resultaten einen möglichen
Irrtum um eine Streifenbreite (bei unserem Apparat um 20 TT.) in Kauf
zu nehmen resp. bei der Deutung der Resultate zu berücksichtigen.
Gans und Bose sehen die Ursache der Marcschen Sprünge in der
verschiedenen Dispersion zwischen dem Kolloid (und zwar der Substanz
selbst, nicht ihrer Lösung) auf der einen Seite der Kammer und zwischen
dem Kompensator auf der anderen Seite.

Schmeel meint bezüglich des Einstellens, daß es sich oft nur um
das Aufsuchen einer „Optimalstellung‘‘ handle und daß die Schwierigkeiten
der Einstellung besonders groß werden, wenn zwischen den an einer be-
stimmten Lösung vorgenommenen Ablesungen Messungen anderer Flüssig-
keiten ausgeführt werden, ein Vorgang, den aber gerade unsere Versuchs-
anordnung erfordert.

P. Hirsch hat zwar anläßlich seiner ersten Bemühungen, die interfero-
metrische Methode in die Technik der Abwehrfermentstudien einzuführen,
von einer „Nullmethode‘‘ gesprochen, „die erfahrungsgemäß bei den ver-
schiedenen Beobachtern durch Ausschaltung aller subjektiven Beobach-
tungsfehler zu gleichmäßigen und genauen Resultaten führt“. Er hat aber
in der Folge mit seinem Mitarbeiter Langenstrass die Vorschriften über

156 R. Doerr u. W. Berger:

die Streifenwahl selbst teilweise geändert und zugegeben, daß es schließlich
darauf hinauskommt, „daß sich jeder Beobachter in einer Reihe von Vorver-
suchen diejenige Methode aussucht, mit derer die besten Ergebnisse erzielt.

Wir haben der Reihe nach alle Vorschriften für die Streifen-
wahl (Loewe, Marc, P. Hirsch, Schmeel, Langenstras;)
erprobt. In manchen Fällen lassen alle im Stich. Gut bewährte
sich das Aufsuchen der optimalen Nullstellung für eine bestimmte
Art von Lösungen und das Festhalten an der hierbei ermittelten,
durch die Farbsäume der Streifen charakterisierten Streifenstellung
bei allen weiteren Messungen desselben Experimentes. Von größter
Wichtigkeit erscheint uns ferner die Forderung nach streng zen-
traler Augenhaltung; die einzustellenden Streifenpaare sollen
genau in die Mitte des dunklen, kreisförmigen Gesichtsfeldes
zu liegen kommen. Das Anbringen einer Visiervorrichtung, etwa
eines Fadenkreuzes zwischen Okular und Spektrum ist leider nicht
möglich, weil eine Zylinderlinse als Okular dient (H a ber u. Loewe).

Nicht selten ist man bei fraglichen Einstellungen darauf
angewiesen, jene Einstellung zu wählen, welche dem bei einer
anderen Kammecrlänge erhaltenen Wert oder anderen Messungen,
die man zur Kontrolle heranzuziehen berechtigt ist, besser ent-
spricht. Daher erscheint es eben sehr ratsam, die Aufdeckung
und Korrektur derartiger Fehler durch die Anordnung der Ver-
suche a priori zu ermöglichen, indem man die Experimente
doppelt oder dreifach ansetzt und sämtliche Flüssigkeiten jedes
Versuches in 2 Kammern von verschiedener Länge (4 und 2cm
oder 2 und 0,5 cm) ausmißt. Die Versuche, die ohnehin schon ganz
beträchtliche Anforderungen an peinlich sauberes und gewissen-
haftes Arbeiten stellen, werden dadurch natürlich nicht leichter
und einfacher, wohl aber viel verläßlicher und überzeugender.

Die IW., welche sich für eine Flüssigkeit bei einfacher
und doppelter Länge der Kammer ergeben, verhalten sich theore-
tisch genau wie 1 :2; in praxi sind kleine Schwankungen bis zu
+5TT. häufig. Nähert sich aber die Differenz einer Streifen-
breite, so deutet das auf Fehler in der Streifenwahl. Bisweilen
begegnet man allerdings auch Differenzen, die eine halbe Streifen-
breite betragen. Es darf daher auch nicht überraschen, wenn
die in der 2cm- und in der 4 cm-Kammer gewonnenen End-
resultate eines komplizierten, von vielen Messungen abhängigen
Versuches nicht immer genau den Quotienten 2 ergeben.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 157

Im Hinblicke auf die von P. Hirsch zuerst angewendete
und von uns modifizierte Methodik der Analyse von Eiweiß-
fällungen müssen wir also nachdrücklichst darauf aufmerksam
machen, daß mit kolloidalen Lösungen keine so exakten
Ablesungen und somit auch keine so eindeutigen Ver-
suchsergebnisse zu erzielen sind wie mit Lösungen
von Kristalloiden; das gilt schon für den Fall, daß man nur
mit einem einzigen, bloß der Konzentration nach variierten
Hydrosol arbeitet, in weit höherem Ausmaße jedoch, wenn meh-
rere, verschieden zusammengesetzte Kolloidlösungen gemessen
werden müssen und das Endresultat beeinflussen. Den vor-
stehenden Ausführungen zufolge sollten eben für jedes einzelne
Hydrosol besondere Eichkurven nach Marc angelegt werden.
Das ist jedoch bei der von Hirsch benutzten Technik zum Stu-
dium der Immunpräcipitation nicht realisierbar, zum mindesten
nicht für das Gemisch von Präcipitinogen und Präcipitin. Eine
weitere Erschwerung der Messung liegt in der mehr weniger
rötlichen Eigenfarbe mancher leicht hämolytischen Sera. Unter
diesen Umständen muß man mitunter auch erheblichere Fehler
erhalten, als sie durch die fehlerhafte Ablesung und die unvermeid-
lichen Ungenauigkeiten der Volumetrie bedingt sind. Eine
Streifenverwechslung beim Ausmessen der Präcipitatlösung wird
z. B. im Endresultat einen Fehler von rund 20 TT. zur Folge
haben; Fehlablesungen bei Bestimmung der Ausgangslösungen
erscheinen wieder in dem daraus berechneten Sollwert der Mi-
schung von Antigen und Immunserum und können durch die
vielen Rechenoperationen, welche das Verfahren von Hirsch
erfordert, sowohl eine Vergrößerung als auch eine Verkleinerung
erfahren. Überhaupt liegt eine Schwäche der von Hirsch an-
gegebenen Methodik darin, daß der IW. des Gemisches von Antigen
und präcipitierendem Antiserum nur berechnet und nicht direkt
gemessen wird. Wir werden zeigen, wie man diesem Übelstande
abzuhelfen vermag.

2. Das Verhalten der Refraktion beim Mischen von Flüssigkeiten, die
miteinander nicht reagieren.

Wenn beim Vermengen von mischbaren Flüssigkeiten

Temperaturschwankungen, chemische Umsetzungen und solche

Volumsveränderungen, welche von der einfachen Addition der

158 R. Doerr u. W. Berger:

vermengten Volumina abweichen, nicht stattfinden, sind die
Beziehungen des Refraktionswertes des Gemenges zu den Re-
fraktionswerten seiner Komponenten relativ einfach. Die Re-
fraktion verhält sich dann rein additiv (Lorentz - Lorenz,
Gladstone, Landolt, Brühl u. a.) und das optische Ergebnis
des Mischungsvorganges läßt sich im voraus mit einer praktisch
ausreichenden Annäherung an den direkt feststellbaren Wert
berechnen. Da die Refraktion einer Flüssigkeit bei konstanter
Temperatur und innerhalb gewisser Grenzen der Konzentration
direkt proportional ist (Quincke, Robertson, Wintgen
u. a.), können wir uns bei der Berechnung des Refraktionswertes
eines Gemenges der bezeichneten Art der allgemein gebräuchlichen
Mischungsformel bedienen, die in Anwendung auf den vorliegen-
den Fall folgende Gestalt annimmt:
IW,-v, HIW tn t.

IW, = --- — SES E l
u ++. (t)

Allgemeine Mischungsformel

IW, und IW, bedeuten die Interferometerwerte der ver-
mischten Flüssigkeiten, ZW, den Interferometerwert des Ge-
misches und o, Ge, v, die zugehörigen Volumina. In dieser all-
gemeinen Fassung kann die Formel auf Mischungen in belie-
bigen Proportionen angewendet werden. Die Diskussion
der Formel lehrt, daß man mit ihrer Hilfe berechnen kann:

a) die Refraktion eines Gemenges, wenn die Komponenten
(nach Refraktion und Volumen) bekannt sind;

b) die Refraktion einer Komponente und

c) das Volumen des Gemenges oder einer Komponente,
falls alle übrigen Werte ziffernmäßig feststehen.

Von den beiden erstgenannten Möglichkeiten werden wir bei
unseren Versuchen Gebrauch machen.

In dem sehr häufigen Spezialfall des Vermengens gleicher
Volumina von 2 miteinander nichtreagierenden Flüssigkeiten
reduziert sich die allgemeine Misehungsformel auf die (auch von
P. Hirsch benutzte) Gleichung:

Me N (2)

>

Schließlich läßt sich die Formel auch auf die bloße Ver-
dünnung mit destilliertem Wasser anwenden, wobei ZW, gleich

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 159

Null wird und die Formel eine weitere Vereinfachung erfährt.
Für die n-fache Verdünnung lautet sie dann:

IW,

IW, = (3)

Verdünnungsformel

Sie drückt jetzt einfach die Tatsache aus, welche den Aus-
gangspunkt der ganzen Betrachtung bildet, daß nämlich die
Refraktion mit der Änderung der Konzentration eines gelösten
Stoffes steigt und fällt, daß also z. B. der doppelten Konzen-
tration einer wässerigen Lösung ein doppelter Refraktionswert
entspricht.

Von der Anwendbarkeit der allgemeinen Mischungsformel (1) kann
man sich überzeugen, indem man verschiedene Volumina von Kochsalz-
lösungen verschiedener Refraktion vermengt und den beobachteten Wert
des Gemisches mit seinem berechneten Sollwert vergleicht. Die Überein-
stimmung ist eine ganz bemerkenswerte, wenn man bedenkt, wie sehr die
Komponenten des Gemenges nach Volum und Refraktion differieren:

Versuch.

l cem 2proz. NaCl + 19 ccm 0,27 proz. NaCl werden gemengt.

IW (4cm - Kammer)
(berechnet als
20fache Ver-
dünnung einer
0,2 proz. Lös. !)

Ste: NaCl A WE EX a 10,920

0.279702. NaC 23 2 u ea it 1492

Gemenge beobachtet, Probe a) . . .»..... 1963

Gemenge beobachtet, Probe b) . . . .... 1964
9 ‘

Gemenge berechnet, IW, = en — 1963

Differenz (berechn. — beob. Wert) a) .... d

bh, l.

Aus einer größeren Anzahl solcher Mischungsversuche mit
indifferenten Flüssigkeiten läßt sich dann der durchschnitt-
liche Fehler dieser Versuchsanordnung bestimmen. Wir führen
zunächst noch einige Beispiele von Mischungen nichtreagierender
Ylüssigkeitspaare an, beschränken uns jedoch auf die Wiedergabe
der Differenz zwischen beobachtetem und berechnetem Wert,
wobei das negative Vorzeichen besagt, daß der beobachtete Wert
kleiner gefunden wurde als er der Rechnung nach hätte sein
sollen.

160 R. Doerr u. W. Berger:

Differenz in der Differenz ın der

Gemischte Flüssigkeiten: 2 cm-Kammer 0,5 cm-Kanımer
Kochsalzlösung -+ dest. Wasser . . . —7 +10
5 + Kochsalzlösung . . --1,3 +l
verd. NaOH + 5 g —6,5 +9
verd. Pferdeserum + Kochsalzlösung . —6 — 10
Thornitratlösung + 7 . —5 —9
= + dest. Wasser . . — H —
e + Cerchlorürlösung —11 —6

Eine absolute Identität der berechneten mit den
beobachteten Werten läßt sich daher nicht erzielen,
nicht einmal beim Verdünnen einer Salzlösung mit destilliertem
Wasser, obwohl hier chemische Umsetzungen gewiß nicht in Frage
kommen. Man könnte höchstens bei sehr starken Verdünnungen
an einen Einfluß der zunehmenden Dissoziation denken. Disso-
ziationen könnten jedoch nur in dem Falle Abweichungen von
der Verdünnungsregel bedingen, daß die Summe der Ionen-
refraktionen nicht gleich der spezifischen Molekularrefraktion
ist, daß also durch die Dissoziation chemische Bindungen auf-
gehoben werden, welche für die Refraktion des Gesamtmoleküls
in Betracht kommen. Wir können auf dieses Problem nicht
weiter eingehen und wollen nur bemerken, daß bei stärkeren
Kochsalzverdünnungen ein Einfluß der Dissoziation nicht zu
konstatieren war. Die Dissoziation müßte sich in einer Reihe
steigender Verdünnungen höheren Grades immer stärker bemerk-
bar machen, was aber nicht zutrifft. Vielmehr entsprechen die
Werte — von den irregulären kleinen Schwankungen abgesehen —
der Verdünnungsregel.

Konzentration IW. IW.
der NaCl-Lösung (4 cm-Kammer) (2 cm-Kammer)
0,020, 102 51
0,01% 50 26
0,05%, 25 14

Wir ziehen aus diesen und den schon früher besprochenen
Versuchen mit Parallelproben den Schluß, daß die beim Ver-
mengen von nichtreagierenden Flüssigkeiten erhaltenen End-
refraktionen der Gemenge mit großer Annäherung nach der
angegebenen Formel berechnet werden können; der mittlere Fehler
beträgt für diese Versuchsanordnung +10 TT. für die 2 cm- und
für die 0,5 cem-Kammer.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 161

3. Das Verhalten der Refraktion beim Vermengen von Flüssigkeiten,
die miteinander reagieren.

Die Refraktion hängt — wie bereits auseinandergesetzt
wurde — nicht nur von der Zahl der Moleküle, sondern auch von
der chemischen Zusammensetzung derselben ab.

Jedem Atom kommt eine ihm eigene, spezifische Refraktion (Atom-
refraktion) zu. Die spezifische Molekularrefraktion entspricht
gewöhnlich der Summe der Atomrefraktionen; bei manchen Molekülen
jedoch (besonders bei C-, O- und N-Verbindungen) erhöht sich die Summe
der Atomrefraktionen um bestimmte Werte, welche von gewissen Bindungen
der Atome abhängen („optisch aktive Bindungen‘), eine Tatsache, die
schon mit Erfolg zur Erforschung unbekannter chemischer Konstitutionen
benutzt wurde, z. B. von F. Pregl in seinen Untersuchungen über Abkömm-
linge der Gallensäuren. Auf Grund dieser Abhängigkeit der Refraktion
von der chemischen Struktur müssen wir bei Mischungen von Flüssigkeiten,
die von chemischen Umsetzungen begleitet sind, 3 Eventualitäten berück-
sichtigen:

a) Das Gleichbleiben der Refraktion, wenn durch die chemischen
Umsetzungen keine optisch aktiven Bindungen tangiert werden und wenn
bei den Umsetzungen kein Wasser austritt.

b) Die Erhöhung der Refraktion, wenn neue optisch aktive Bindungen
zustande kommen oder wenn Wasser zerlegt wird und dessen Ionen H und
OH in andere Verbindungen eintreten. Der Hydroxyl-O hat z. B. eine andere
Refraktion als der O in anderer Verkettung, z. B. in Carboxylgruppen.

c) Die Verringerung der Refraktion, wenn optisch aktive Bindungen
aufgehoben werden oder wenn Wasser austritt und sich in Lösungsmittel
verwandelt.

Das Freiwerden von Wasser spielt bei der Differenzmessung der
Refraktion, wie sie im Interferometer vorgenommen wird — abgesehen von
der verschiedenen Wertigkeit des O je nach der Art seiner Bindung — noch
eine besondere Rolle. Die H- und O-Atome des freiwerdenden Wassers
beteiligen sich, solange sie an andere Atome gebunden sind, mit ihrer
spezifischen Atomrefraktion an der Refraktion des Gemenges; zu dat.
liertem Wasser vereinigt kommen sie dagegen für das Meßergebnis gar nicht
in Betracht, da ja die Refraktion der in destilliertem Wasser gelösten
Stoffe gegen destilliertes Wasser als Vergleichsflüssigkeit gemessen
wird.

Während einfache Konzentrationsänderungen mit Hilfe der
Refraktion auch quantitativ leicht zu untersuchen sind, liegen die
Verhältnisse bei chemischen Reaktionen, speziell bei unvoll-
kommen verlaufenden und reversiblen Prozessen weit ungünstiger
und gestatten nicht ohne weiteres eine quantitative Analyse.
Einen chemischen Vorgang kann man mit dem Interferometer
nur dann messend verfolgen, wenn sich bloß wenige Komponenten

Biochemische Zeitschrift Band 123. 1l

162 R. Doerr u. W. Berger:

des Reaktionsgemisches ändern und wenn man außerdem sowohl
die Endprodukte der Reaktion als auch die Reste der Ausgangs-
stoffe nach Menge, chemischer Konstitution und spezifischer
Refraktion genau kennt. Wenn mehrere Reaktionen nebeneinander
verlaufen, stellt die Refraktionsbestimmung stets nur ein indirek-
tes, von sehr vielen Voraussetzungen abhängiges quantitatives
Verfahren dar.

Eine so vollkommene Einsicht in das chemische Geschehen,
wie sie hier gefordert werden muß, besitzen wir nun wohl bei zahl-
reichen chemischen, aber nur ausnahmsweise bei den sogenannten
biologischen Reaktionen. Für letztere bleibt daher die refrakto-
metrische Untersuchungsmethode ein vorwiegend qualitatives
Verfahren, d. h. man sucht einfach festzustellen, ob sich bei einem
bestimmten Vorgang überhaupt eine Refraktionsänderung voll-
zicht. Bei manchen ihrem Wesen nach vollständig ungeklärten
Prozessen, wie z. B. bei den Immunitätsreaktionen, könnte eine
derartige rein qualitative Methodik immerhin einen Forschritt
insofern bedeuten, als die Refraktionsänderung unter Umständen
der einzige Indicator sein kann, der eine Änderung der moleku-
laren Zusammensetzung überhaupt nachweisbar macht. Auf
Grund der soeben erörterten Beziehungen zwischen Refraktion
und chemischem Geschehen darf man allerdings bei solchen Ver-
suchen nur von einem positiven Befund, d. h. von einer Refrak-
tionsänderung einen Aufschluß erwarten. Ein negatives Resultat
d. h. das Gleichbleiben der Refraktion sagt nur aus, daß die Ge-
samtzahl der Atome dieselbe geblieben ist und daß etwaige
optisch aktive Bindungen intakt erhalten wurden; dabei können
jedoch große Moleküle in ihre Bausteine zerlegt worden sein
oder es braucht sich ebensogut gar kein chemischer Vorgang
abgespielt zu haben.

Die Richtigkeit dieser für das Verständnis unserer Unter-
suchungen notwendigen Überlegungen sei durch interferometrische
Analysen einer einfachen chemischen Reaktion und einiger
fermentativer Prozesse illustriert.

Versuch: Salzbildung mit Änderung (Verringerung) der
refraktion gegenüber dem berechneten Sollwert des Gemenges.
Entstehung von Kochsalz aus Salzsäure und Natronlauge.
Interferometerwerte in der $+ cm-Kammer gemessen mit destilliertem Wasser

als Vergleichsflüssigrkeit.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 163

Ko ajig Salzsäure 2. 2 2 uw mn ae ar 263 TT.
2. n/ioo- Natronlauge . . . o. 2 2 2 2 En 0 een nen 380 „
3. 1. + 2. aa berechnet nach der Mischungsformel . . . . . 3ll „
4. 1. + 2. aa beobachtet . . . 2: 2: 2 2 2 2 2 2 2 nn. 164 „
5. Differenz zwischen beobachtetem und berechneten: Wert —147 „
6. B/zoo-Natriumchlorid. . . . 2. 2 2 2 2 0 nn nn. 163 „
7. Differenz zwischen 4. und 6.. . :. : 2. 2 2 2 2 2 2 0. +1 „

Wäre nur bekannt, was bei der Vereinigung von HCl und NaOH
im allgemeinen vor sich geht, so bliebe es uns ganz unverständlich,
warum der beobachtete Wert (164 TT.) um so viel niedriger aus-
fällt als der nach der Berechnung zu erwartende (311 TT.). Trotz
der hohen Verdünnungen und der entsprechend niedrigen IW.
gegen destilliertes Wasser stoßen wir auf die große Differenz von
— 147 TT., die aber genau der Berechnung entspricht, wenn der in
diesem Falle bekannte chemische Vorgang zugrunde gelegt wird:

nio NaOH + Bloe HCl = "/z00. NaCl + H,O.

Bloe NaCl = 0,029% NaCl und für diese Konzentration liefert
die direkte Messung in der 4 cm-Kammer den IW. von 163 T.T.,
welcher mit dem beobachteten Wert übereinstimmt. Der Wasser-
austritt hat zu dieser erheblichen Refraktionsabnahme gegen-
über dem bei einfacher Mischung zu erwartendem IW. geführt.

4. Das Verhalten der Refraktion bei fermentativen Reaktionen.

Die ersten Untersuchungen auf diesem Gebiete wurden im Jahre 1906
von Obermayer und E. P. Pick angestellt. Sie arbeiteten mit einem
Pulfrichschen Refraktometer (Neukonstruktion 1895) und ordneten die
Fermentwirkungen in 3 Gruppen; in die erste Gruppe gehörten jene, bei
denen der Refraktionswert zunimmt (Beispiel: Trypsinfunktion), in die
zweite jene, bei welchen er gleichbleibt (Pepsin), und in die dritte solche,
bei denen er abnimmt (einige bakterielle Fermente). Die 3 Möglichkeiten
der Refraktionsbeeinflussung durch chemische Reaktionen, die wir auf
Grund der Kenntnisse über das Wesen der Refraktion theoretisch abgeleitet
haben, kommen somit in der Natur bei den enzymatischen Prozessen de
facto vor.

Um uns über die Größe und Geschwindigkeit enzymatisch
bedingter Refraktionsänderungen ein Urteil zu bilden, haben wir
die Wirkungen bekannter Fermente in den Bereich unserer Vor-
untersuchungen gezogen. Wir wählten mit Rücksicht auf unsere
speziellen Zwecke:

a) eine Fermentation, bei welcher (mit Ausnahme der Fer-
mentlösung) Ausgangs- und Endprodukte bekannte, chemisch
definierte Körper sind;

II?

164 R. Doerr u. W. Berger:

b) eine Wirkung eines Serumfermentes (der Lipase des
frischen Meersch weinchenserums);

c)ein klassisches proteolytisches Verdauungsferment (Trypsin).

Bei allen der 3 genannten Fermente läßt sich der Reaktions-
ablauf auch noch mit anderen Methoden verfolgen, wodurch eine
entsprechende Kontrolle ermöglicht war.

ad a). Urease ist ein in zahlreichen Bakterien und auch in
höheren Pflanzen vorkommendes Ferment, welches vom Zelleib
abgesondert werden kann und das Harnstoff in Ammoniak und
CO, zerlegt (O ppenheimer), CO, und NH, treten jedoch offenbar
sofort wieder zu Ammoniumcarbonat zusammen, denn es läßt
sich weder ein Entweichen von CO, (im Gärungskölbchen) noch
von NH, (durch den Geruch) feststellen; ferner nimmt die Re-
fraktion eines Gemenges von Urease und Harnstoff nach voll-
zogener Spaltung selbst bei offener Aufbewahrung nicht ab,
was bei einem Gehalt an flüchtigen Stoffen der Fall scin
müßte. Das Temperaturoptimum der Ureasefunktion liegt
bei 50°C; jedoch geht die Spaltung des Harnstoffs auch bei
Zimmertemperatur sehr rasch vor sich. Von einer wirksamen
Ureaselösung wird verlangt, daß in 15 Minuten der ganze N als
Ammoniak nachgewiesen werden kann. Wir verwendeten ?/ o- Harn-
stofflösungen und durch Zentrifugieren geklärte Fermentlösungen,
die wir der Freundlichkeit des Herrn Prof. W. Löffler (Med.
Klinik, Basel) verdankten und deren Brauchbarkeit jedesmal
durch den Ammoniaknachweis sichergestellt worden war. Be-
stimmend für die Wahl ‚„Urease-Harnstoff‘ war neben der genaueren
Einsicht in die Chemie der Fermentation die rasche Wirksamkeit,
da bei der Präcipitation sowohl als namentlich bei der Anaphy-
laxie — wenn überhaupt — nur sehr rasch wirkende Enzyme
als ursächliche Momente in Betracht gezogen werden dürfen.

Zur refraktometrischen Verfolgung der Ureasewirkung, die
beim Vermischen mit einer Harnstofflösung momentan und mit
maximaler Intensität einsetzt, eignet sich das Interferometer
besonders, da es eine relativ kurze Zeit für den Temperatur-
ausgleich erfordert und außerdem auch große, von Minute zu Minute
bequem ablesbare Ausschläge liefert.

Versuch: Die zu verwendenden Harnstoff- und Ureaselösungen
wurden zunächst interferometrisch ausgemessen und sodann auf die Tem-
peratur des Interferometerwasserbades vorzewärmt. Dann wurden sie

165

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation.

zu gleichen Teilen in ein Gefäß gebracht, rasch und gründlich vermischt
und mit tunlichster Beschleunigung in die Kammer gefüllt. Die erste Ab-
lesung konnte bereits 30 Sekunden nach dem Vermengen vorgenommen
werden. Schon nach diesem kurzen Intervall war der IW. regelmäßig
höher (z. B. 1190 TT. in der 2cm-Kammer) als der nach der Mischungs-
formel berechnete IW. (z. B, 1152 TT.) und im weiteren Verlauf der Be-
obachtung stieg er stetig (in dem hier zitierten Beispiel bis auf 1401 TT.)
innerhalb von 15 Minuten. Wir sahen demnach bei kontinuierlichem
Hineinblicken in das Okular des Instrumentes ein ausgiebiges, anfangs
rasches, nach wenigen Minuten sich verlangsamendes Wandern der Streifen
des Interferenzspektrums nach links (im Sinne eıner Zunahme der Refraktion).
Wegen der Schnelligkeit des Reaktionsablaufes gingen wir so vor, daß der
eine von uns in kurzen, be-
liebigen Intervallen die IW.
ablas, während der andere
die abgelesenen Werte no-
tierte und die korrespon-
dierenden Zeiten feststellte.
Die so erhaltenen Werte
wurden in ein Koordinaten- Se
system eingetragen,

wobei
sich nach mehrfachen Ver-
suchen ergab, daß die Ver-

bindungslinie der Werte mit
großer Annäherung eine Pa-
rabel darstellt. Für den in
der nebenstehenden Abbil-

PT
77.

90777775
Abb. I. Interferometrische Messung des Reaktions-

ablaufes bei der kinwirkung von Urease auf Harn-
stoff.

70

dung graphisch dargestellten

Versuch lautete die Formel der Kurve approximativ y? = 2 x . 4500. Mit
der Abschwächung der Fermentlösung verflacht die Kurve, ohne daß
sie den Charakter der Parabel einbüßt.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen dürfen wir die Tatsache
buchen, daß es rasch verlaufende fermentative Spaltungen gibt,
welche imstande sind, binnen 15 Minuten die Refraktion einer
Die, also relativ verdünnten Lösung des fermentesziblen Sub-
strates ganz beträchtlich (um 211 TT. in der 2 cm-Kammer des
Interferometers) zu erhöhen. Dabei muß es allerdings dahin-
gestellt bleiben, ob die Beeinflussung der Refraktion nur durch
die Umsetzung des Harnstoffes in Ammoniumcarbonat zustande
kommt oder ob an dem Gesamteffekt auch die Ureaselösung
partizipiert; Bestimmungen der Refraktion von Ammonium-
carbonat und zwar von Mengen, welche der verwendeten Harn-
stoffkonzentration äquivalent sind, haben wir noch nicht aus-
geführt, werden aber die Daten demnächst nachtragen.

166 R. Doerr u. W. Berger:

Zugleich lernten wir im interferometrischen Verfahren eine
vorzügliche, eines weiteren Ausbaues fähige Methode der Be-
obachtung der Wirkung der Urease und ähnlicher Fermente
kennen, eine Methode, bei welcher man den Reaktionsablauf
mit dem Auge kontrollieren und seine zeitlichen Bedingungen
in einer ebenso exakten wie einfachen Weise ermitteln kann.

Wir konstatieren jedoch abermals, daß die Hauptstärke
der optischen Untersuchung in ihrer Anwendung auf Reaktionen
liegt, deren Mechanismus uns so weit bekannt ist, daß wir wissen,
auf welchen stofflichen Veränderungen die einzelnen Phasen
der Refraktionsänderung beruhen. Bei der Urease würden die
Refraktionsbestimmungen wohl zu falschen, zumindest aber
zu sehr unvollkommenen Vorstellungen über die Fermentation
des Harnstoffs führen, wenn wir nicht wüßten, daß die Refraktion
trotz hydrolytischer Spaltung und Wasseraustritt zunehmen
kann, weil das entstehende Ammoniumcarbonat eine höhere
Molekularrefraktion besitzt, als das der Summe seiner Atom-
refraktionen entsprechen würde. Ganz geklärt sind die Beziehungen
zwischen optischem und chemischem Geschehen — wie schon
angedeutet — durch unsere hier angeführten Versuche über die
Harnstoffspaltung durch Urease nicht; aber sie sind jedenfalls
einer Klärung zugänglich, und es liegt sogar im Bereiche der
Möglichkeit, daß die optischen Vorgänge auf die Natur der che-
mischen Umsetzung Licht werfen. Wir kommen darauf an anderer
Stelle zurück. Wüßte man jedoch nicht, daß der fermenteszible
Körper Harnstoff ist und daß er in Ammoniumcarbonat um-
gesetzt wird, so wäre mit den Interferometerbefunden nicht viel
anzufangen; es bliebe dann eben bei der Aussage, daß eine un-
bekannte Alteration der chemischen Beschaffenheit des Reaktions-
gemisches eingetreten sein muß.

Bemerkenswert erscheint schließlich, daß die Urease, ein
isoliertes Bakterienferment, eine Refraktionsz unahme her-
vorruft. Aus den grundlegenden Untersuchungen von Ober-
mayer und E. P. Pick ging nur hervor, daß bakterielle Fermen-
tationen (Enzyme der Proteusbakterien, Kolibacillen, Cholera-
vibrionen) zu Refraktionsabnahmen führen; doch hat Hirsch
später angegeben, daß je nach der (von Hirsch nicht näher
bezeichneten) Bakterienart auch Zunahmen des Brechungs-
vermögens eintreten können, die im Interferometer ablesbar sind.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 167

ad b). Die Lipase des Meerschweinchenserums zogen wir
als Prototyp eines Serumfermentes heran, welches ebenfalls
rasch wirkt. Zur Kontrolle bedienten wir uns der von Rona
und Michaelis beschriebenen stalagmometrischen Methode.

Versuch: Interferometrische Beobachtung einer Lipolyse
durch Serumlipase. IO eem Tributyrinwasser, nach Vorschrift frisch
bereitet und im Verhältnis 1 : 10 mit Phosphatgemisch versetzt, werden
mit 0,4 ccm 10fach verdünnten, frischen Meerschweinchenserums vermengt.
Die Kontrolle mit inaktiviertem Serum zeigte weder interferometrisch noch
stalagmometrisch meßbare Ausschläge. Über den Ausfall der Proben bei
Verwendung von aktivem Serum orientiert nachstehende Tabelle:

Nach dem Vermen- IW. in der 2cm-Kammer. — Stalagmometrische
gen abgelaufene Zeit Vergleichsflüssigkeit: Destil- Methode.
in Minuten liertes Wasser in TT. Tropfenzahl!)
2 1438 213
10 1438,5 195
20 1438 180
30 1438 177
40 1438 176
60 1438 ` 176

Differenz zwischen
Beginn und Ende der
Lipolyse — 37

Die Abnahme der Oberflächenspannung um 37 Tropfen
entspricht ungefähr den von anderen Autoren (Michaelis,
Ohlsen u. a.) mit der gleichen Methode für die Lipase des Meer-
schweinchenserums gefundenen Zahlen und beweist, daß die
Reaktion tatsächlich in dem gewöhnlichen Umfang stattgefunden
hat. Trotzdem blieb der IW. unverändert.

ad c). Ein proteolytisches Ferment der enteralen Ver-
dauung, dessen Wirkung ebenso rasch verläuft wie die Immun-
präcipitation, ist unbekannt. Im übrigen wissen wir durch Ober-
mayer und E. P. Pick, daß die peptische Verdauung von Pro-
teinen die Refraktion der Verdauungsgemische trotz weitgehender
Aufspaltung unverändert läßt, wogegen Trypsin eine geringe
Refraktionserhöhung hervorruft. In neuerer Zeit berichtete
Hirsch, daß auch Pepsinverdauung Steigerungen der Refraktion
bewirken kann, die interferometrisch bei der Untersuchung mit
monochromatischem Licht wahrnehmbar werden.

1) Der von uns verwendete Tropfenzähler gab für destilliertes Wasser
ca. 160 Tropfen.

168 R. Doerr u. W. Berger:

Nach Obermayer und E. P. Pick hängt die refraktionssteigernde
Wirkung des Trypsins ab: a) von der Art des Ausgangsmateriales; sie tritt
z. B. bei dem weniger trypsinfesten Pferdeserum schon im nativen Zustande
auf, bei dem trypsinfesten Rinderserum erst nach vorausgegangener Dialyse
und Erwärmung auf 80°C; b) von der Konzentration des Materiales. In
Pferdeserum, welches man über die Hälfte hinaus verdünnt hat, ist die
Refraktionserhöhung nicht mehr nachweisbar. — Obermayer und E. P.
Pick konnten die refraktionserhöhende Wirkung überhaupt nur in der
ersten Phase der Trypsinverdauung beobachten; nach 24 Stunden kam sie
zum Stillstand, während die chemischen Analysen ein kräftiges Fort-
schreiten der Spaltungsprozesse bewiesen. Sie glauben daher, daß die
refraktionserhöhende Wirkung nur einer Komponente des Gesamt-
fermentes zuzuschreiben ist, welche nicht nur hydrolytische Spaltungen,
sondern auch tiefergehende, „konstitutive‘‘ Veränderungen herbeizuführen
vermag. In fallenden Konzentrationen von Witte-Pepton (10%, Dia,
2,5%, 1%, 0,5%) nahm die refraktionserhöhende Wirkung des Trypsins
ebenfalls rasch ab, in der 1l proz. Lösung war sie nur ganz gering und in
der 0,5proz. mit dem Refraktometer gar nicht mehr nachweisbar.

Auch bei der Messung mit dem empfindlicheren Interfero-
meter sind die Refraktionserhöhungen durch tryptische Spaltung
oft unbedeutend; bei der Einwirkung von Trypsin auf Pepton
lassen sie sich stets erst in Stunden nachweisen, wenigstens in
Konzentrationen unter 1°.

Bei Verwendung von Pepton Roche!) in 0,4—0,8proz.
wässeriger Lösung und einer durch Zentrifugieren geklärten
Solution von Trypsin Kahlbaum erhielten wir (bei der Unter-
suchung im achromatisierten weißen Licht) stets nur ganz
unbedeutende Ausschläge innerhalb 12—14 Stunden, während
die gleichzeitige Bestimmung?) der Umwandlung des N in Amino-N
jedesmal einen bedeutenden Abbau erkennen ließ. Die direkte
Beobachtung der Trypsinwirkung in der Interferometerkammer
ergab im Laufe der ersten Stunde überhaupt keine meßbare
Änderung der Refraktion.

D

1) Das benutzte neue „Pepton Roche‘ ist nach Angabe der Firma
Hoffmann-La Roche ein Polypeptid oder ein Gemisch von Polypeptiden,
das sich durch nahezu konstante Zusammensetzung und fast konstante physi-
kalische Eigenschaften auszeichnet. Es wird durch Pepsin wie durch Trypsin
gut abgebaut. -- Optisches Drehungsvermögen in 4 proz. wässeriger Lösung
—51,0 5; Acıdität: 1 g verbraucht bis zur Lackmusneutralität 0,8 cem Die:
KOH; Gesamt-N =. 13,41%, ; formoltitrierbarer N =- 3,36%, ; Asche = 1,62°,.

2) Diese Titrationen hat Dr. Guggenheim, dem wir auch an dieser
Stelle bestens danken, im Laboratorium der Firma Hoffmann-La Roche
(Basel) ausgeführt.

Interferometrische Analyse der Imimunpräcipitation. 169

Versuch: 0,8%, Pepton Roche gelöst in 0,4% Natriumcarbonat-
lösung + Trypsinlösung aa.
Formoltiter (100 ccm

Nach dem Vermengen IW. in der E E DEE beder
abgelaufene Zeit 2 cm-Kammer Ges
Formoltitration)
Einige Sekunden 1268 TT. 18,4 ccm ?/io KOH
12 Stunden bei 56°C 1286 „, 30,53 „ »
Zunahme | 18 „ 12,13 „ >

ö. Das Verhalten der Refraktion beim Vermengen von Eiweißlösungen
(Serum) mit Basen oder mit Säuren.

In seiner ersten Mitteilung über die interferometrische Ana-
lyse der Immunpräcipitation konstatierte Doerr, daß sich in
allen Versuchen, in welchen er die spezifischen Präcipitate in
l proz. Thorsulfat zur Wiederauflösung brachte, Minuswerte
(gegenüber den berechneten IW.) ergaben. Dies war übrigens auch
dann der Fall, wenn die Flockung nicht durch eine Antigen-
Antikörperreaktion, sondern kolloidchemisch durch Salze der
seltenen Erden hervorgerufen wurde; Minuswerte wurden endlich
selbst bei einfachem Vermengen von Serum mit 1% Thorsulfat
in solchen Proportionen erzielt, daß die Eiweißfällung infolge des
Überschusses einer Reaktionskomponente ganz ausblieb. Doerr
hat in Aussicht gestellt, auf die Ursachen des geschilderten Ver-
haltens an anderer Stelle zurückzukommen, was nun hier ge-
schehen soll.

Über das Verhalten der Refraktion von Eiweißlösungen beim
Vermengen mit Elektrolyten finden sich in der Literatur wider-
sprechende Angaben. W. Frei gab an, daß Alkalisieren und An-
säuern von Eiweißlösungen den Brechungsexponenten 2 proz. Gela-
tinelösungen herabsetze und daß Zusatz gewisser Ionen denselben
erhöhe. Herlitzka hatte schon früher beobachtet, daß die spezi-
fische Refraktion sich bei solchen Versuchen nicht ändere, und trat
Frei entgegen. Walpole sah bei Gelatinesolen und Gelen keine
Refraktionsänderung durch Basen-Säure-Salzzusätze. Uns kam
es hier zunächst nicht so sehr darauf an, das Verhalten der spezi-
fischen Refraktion im allgemeinen zu studieren, als vielmehr
einen Anhalt über das optische Mischungsergebnis bei den von
uns gewählten Versuchsbedingungen zu gewinnen.

Aus unseren Untersuchungen erhellt, daß die von Doerr
beobachteten Minuswerte auf einer Einwirkung der von Doerr
benutzten Auflösungsmittel auf die Präcipitate, speziell auf die

170 R. Doerr u. W. Berger:

Eiweißkörper der Präcipiate beruhen; wie schon Doerr betonte.
ist das Auflösen von Eiweißflockungen zum Zustandekommen
der Erscheinung nicht notwendig, vielmehr tritt dieselbe eher
jeder Niederschlagsbildung mit den Lösungen der Salze seltener
Erden vermengt. Diese Gemenge zeigen durchwegs einen niedri-
geren IW., als man nach der Mischungsformel erwarten würde.
also Refraktionsverminderung.

In den folgenden Versuchen wurden stets zwei vorher interfero-
metrisch gemessene Flüssigkeiten zu gleichen Teilen vermischt.
Der Abmessungsfehler wurde durch Verwendung derselben Pipette
für jedes Flüssigkeitspaar auf das Mindestmaß verringert. Die
Pipette spülten wir sorgfältig mit destilliertem Wasser und hierauf
mit der zweiten abzumessenden Flüssigkeit durch, indem wir in
verschiedene Gefäße die zu Spülzwecken erforderlichen Volumina
abfüllten, so daß die Stammlösung natürlich vor jeder Ver-
dünnung geschützt war. Die Unterschiede zwischen Parallel-
proben desselben Flüssigkeitspaares fielen — diesen Kautelen
entsprechend — mit einer einzigen Ausnahme sehr gering aus.
Man kann in Anbetracht dieser Sicherungsmaßnahmen und mit
Rücksicht auf die ziemlich gesetzmäßige Abstufung der Resultate
in Reihenversuchen die Möglichkeit sicher ausschließen, daß die
gefundenen Minuswerte auf Manipulationsfehlern beruhen; viel-
mehr muß die Ursache in Vorgängen gesucht werden.
die sich beim Vermengen von Serum mit Lösungen
saurer Salze abspielen. |

Bei Zusatz von ”/ioo-NaOH zeigten die Differenzen im Reihen-
versuch keine gesetzmäßige Abstufung und ließen nur in ihrer
Gesamtheit die Tendenz zu Minuswerten erkennen. Viele Diffe-
renzwerte in den Laugenversuchen entsprachen der Größe nach
dem durch Streifenverwechslung bedingten Fehler. Daß tatsächlich
geradchier solche Streifenverwechslungen vorgekommen sein mögen,
wird dadurch wahrscheinlich, daß die Wahl des richtigen Streifen-
paares wiederholt offenbleiben mußte, sei es nun für die Serum-
verdünnung selbst oder für das Gemenge derselben mit der Lauge;
im gleichen Sinne dürfte man einzelne Unstimmigkeiten zwischen
den Messungen in der 4cm- und in der 2cm-Kanmer auslegen.

Über die Größe der Refraktionsverminderungen geben die
folgenden Versuchsprotokolle Aufschluß; die Konzentrationen

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 171

der Natronlauge, des Thorsulfats und des Thornitrats wurden so
gewählt, wie sie in einem Teile der Hauptversuche über die Vor-
gänge bei der Immunpräcipitation zur Anwendung gelangten.

a) Serumverdünnungen + R/,00-NaOH aa.

Konzentration Differenzen in der Differenzen in der
des Serums 4 cm-Kammer 2 cm-Kammer

Ir —22 —20 —19 —3,5 —3,5 +0,5
Tia —20 —13 —l4 —10
WE —30 —8 —24 —24
Hio 0 +5 +4 +6

b) Serumverdünnungen + lproz. Thorsulfatlösung aa.
11, Fällung Fällung
Gg Fëllung Fëllung
Und —45 —43 —14 —13
WË — 21 —5

c) Serumverdünnungen + lproz. Thornitratlösung aa.
Die —233 — 233 —119 —117
RÉI —119 — 123 —48 —48
WE —125 —125 —5l —5l
WÉI — 101 —96 —31 —12

Der Grad der Refraktionsverminderung hängt also, wie wir
aus den angeführten und zahlreichen weiteren Messungen schließen
dürfen, in erster Linie von der Art und von der Reaktion der zum
Eiweißsol zugesetzten Lösung ab; daher der starke Effekt des
stets sehr sauer reagierenden Thornitrats im Vergleich zu dem
weit schwächer wirkenden und auch weniger sauer reagierenden
Thorsulfat. Die ”/ioo NaOH lieferten die kleinsten Minuswerte;
ob konzentriertere Lösungen, wie sie P. Hirsch benützte, z. B.
Die NaOH, die Refraktion der Gemenge nicht tiefer herabdrücken,
wurde vorläufig nicht untersucht.

An der Refraktionsverminderung beteiligen sich sowohl Reaktionen
der Säuren (resp. Basen) mit den Eiweißkörpernals auch solche mit den
dialysablen Stoffen der Sera, wie man durch Zerlegung einer Serum-
probe mittels Dialyse und gesonderte Prüfung des nichtdialysablen und des
dialysablen Anteiles feststellen kann. Für die Reaktion zwischen den
dialysablen Serumanteilen (Alkalien der Sera) und den sauren Salzen der
seltenen Erden kommen wohl Salzbildungen nach dem Typus HCI + NaOH
in Betracht. Die (dem absoluten Werte nach sogar größere) Refraktions-
verminderung, welche auch das salzarm dialysierte Eiweiß beim Vermischen
mit Thorlösungen zeigt, könnte ebenfalls auf einer Bindung zwischen
der abdissoziierten Säure der Thorsalze und dem als Base fungierenden
Serumeiweiß unter Freiwerden von Wasser (Hydratwasser des Eiweißes?)

172 H Doerr u. W. Butt:

beruhen; vielleicht kommt es auch zu konstitutiven Veränderungen der
Moleküle oder zu Volumsdilatationen. Zweifellos findet jedoch nicht nur
die Säure, sondern auch die Lauge im Serum chemische Angriffspunkte
(Alkalialbuminate, Racemisierung der Proteine); ob diese Laugenreaktionen
zu Refraktionsverminderungen Anlaß geben, müßten Experimente mit
höheren NaOH-Konzentrationen lehren.

Für die Verwendung von Natronlauge, Thorsulfat
und Thornitrat als Lösungsmittelfür Eiweißnieder-
schläge ergibt sich somit die Tatsache, daß solche Auflösungen
ausnahmslos mit Refraktionsverminderungen verknüpft
sind, die bei ?/,o-NaOH noch in die Fehlergrenze der Streifen-
verwechslung fallen, bei Thorsulfat jedoch erheblicher werden und
bei Thornitrat ganz bedeutend sein können. Thornitratlösungen
reagierten — wie erwähnt — stärker sauer als Thorsulfatlösungen
und von 2 von uns geprüften Thornitratpräparaten gab das eine
nicht nur viel sauerere Lösungen, sondern auch größere Minus-
abweichungen.

Nichtsdestoweniger haben wir in der vorliegenden Arbeit
neben stark verdünnten (ioo) Laugen auch wieder Salze der
seltenen Erden zur Lösung der Präcipitate verwendet, weil letztere
auf das Eiweißmolekül anders wie die Laugen und trotz der
größeren Minusabweichungen schonender einwirken; das durch
Thor gefällte Eiweiß löst sich im Überschuß einer Komponente
wieder, die Dispersion erfolgt also zweifellos rein physikalisch.
Das Auftreten der durch die abdissoziierte oder verunreinigende
Säure bedingten größeren Minuswerte stört den Vergleich einer
Thorfällung mit einer Immunpräcipitation, auf den Doerr
zunächst seine Beweisführung fundierte, nur wenig.

Aus der Abhängigkeit der Größe der Refraktionsverminde-
rung von der Eiweißkonzentration kann man eine technische
Konsequenz, welche die interferometrische Analyse der Eiweiß-
fällungen betrifft, ableiten. P. Hirsch sowohl als Doerr trennten
die Präcipitate von den überstehenden Flüssigkeiten ab, bevor
sie dieselben auflösten: das ist aber nicht unbedingt notwendig.
man kann das gesamte Reaktionsgemisch klären, die Präcipitation
also gewissermaßen wieder rückgängig machen, wenn man das
Dispersionsmittel (NaOH, Thorsulfat, Thornitrat) zu dem Reak-
tionsvolum (Präcipitat plus überstehende Flüssigkeit) zusetzt.
Im letzteren Falle sind die Manipulationsfehler. speziell die Fehler

der volumetrischen Abmessungen weit geringer; aber dieser Vorteil

et eg tg —

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 173

wird bisweilen durch sehr starke Minusabweichungen über-
kompensiert, da nicht nur die Eiweißkörper des Präcipitates,
sondern auch jene der überstehenden Flüssigkeiten an der zur
Refraktionsverminderung führenden Reaktion partizipieren.

6. Refraktionsbestimmungen bei kollold-chemischen Eiweißflockungen.

Wie bereits Doerr ausgeführt hat, liefert die refraktometrische
Untersuchung von rein physikochemischen Präcipitationen ein
wichtiges Korrelat des optischen Studiums der Immunpräcipi-
tation. Wenn der Mechanismus der letzteren de facto in einem
interferometrisch nachweisbaren fermentativen Eiweißabbau be-
stehen sollte, müßte man erwarten, daß sich zwischen den beiden
Arten der Eiweißflockung konstante und meßbare Unterschiede
feststellen lassen. Trifft das aber nicht zu, dann bleibt eben auch
für die Immunpräcipitation die Intervention einer Proteolyse
unbewiesen.

Doerr konnte zeigen, daß solche Unterschiede zwischen
rein kolloidaler Eiweißfällung und spezifischer Immunpräcipi-
tation nicht bestehen. Wir wiederholten diese Versuche mit der
vervollkommneten Methodik, wie wir sie für die Analyse der
Immunpräcipitationen benützten (siehe Abschnitt II), und konnten
die Befunde von Doerr bestätigen. Aus der großen Zahl neuer
Experimente über Eiweißfällungen durch seltene Erden, die sich
wegen der ausgezeichneten Reversibilität der Flockung für solche
Zwecke besonders eignen (Doerr), heben wir nur ein paar Beispiele
hervor. Der Wert des Präcipitates wurde in der in Abschnitt II
ausgeführten Weise berechnet (aus dem theoretischen Sollwert
des Gemenges von Serum und Thorsalz durch Abziehen des IW.
der nach eingetretener Flockung über dem Niederschlag stehenden
Flüssigkeit) und direkt nach Lösung des Präcipitates gemessen;
in den nachstehenden Tabellen wird nur die Differenz zwischen
berechnetem und beobachtetem IW. des Präecipitates angegeben.

Versuch: !/,, Pferdeserum + 0,05%, Thorsulfat. — Flockung. —
Auflösung des abgesonderten Präcipitates in 1proz. Thorsulfat. — A cm-
Kammer.

Probe a) Differenz = +11 TT.
an b) en = — 6 „
' +16 29
Versuch: Dieselbe Anordnung wie im vorigen Versuch.
Differenz = +17 TT.

O
~x
Il

174 R. Doerr u. W. Berger:

Versuch: !/,, Pferdeserum + 0,4 proz. Cerchlorürauflösung des Prä-
cipitates in 1l proz. Thornitrat.
Differenz bei Probe a) — 36 TT.
7 » » b äi „
e ge » c€) -25 „

Versuch: !/,, Pferdeserum + 0,05%, Thornitrat. — Das Präcipitat

D

wird nicht isoliert, sondern das ganze Reaktionsgemisch durch 1°, Thor-
nitrat geklärt.

Differenz in der 4cm-Kammer: Probe ai —7 TT.

UI 99 Sp 39 99 b) — 50 ”
53 a » 2cm-Kammer: Probe a) BA,
DI sp sp 99 29 b) —19 ,?

Versuch: !/,, Pferdeserum + 0,4% Cerchlorür, sonst wie der vor-
stehende Versuch.

Differenz in der 4cm-Kammer — 22 TT.
ag ag 99 2 cm-Kammer Ku 6 99

Die Differenzen sind also gering und liegen im Bereiche der
Fehlerquellen. Bei Flockungen von Eiweißsolen durch seltene
Erden erleidet das Reaktionsgemisch einen Substanzverlust, der
sich, soweit das Interferometer Aufschluß gibt, quantitativ im
Präcipitat wieder nachweisen läßt. Das ist das Ergebnis, auf

welches wir hier a priori rechnen dürfen. Wie steht es nun mit der .

Interferometrie der Immunpräcipitationen ?

I. Refraktionsbestimmungen bei Immunpräeipitationen.

Die Refraktionsbestimmungen bei der Immunpräcipitation
verfolgen im Rahmen der in dieser Arbeit diskutierten Probleme
den Zweck, festzustellen, ob sich nach dem Vermengen von
Präceipitinogen und Präcipitin und zwar noch vor Eintritt der
Flockung oder doch gleichzeitig mit derselben ein Prozeß abspielt,
der in einer Refraktionserhöhung des Gemisches zum Aus-
druck kommt. Es wird daher zunächst aus den gemessenen
Refraktionen der Antigen- und der Antiserumlösung der
SollwertihresGemenges nach der Mischungsformel berechnet,
jener Wert, den das Gemenge haben müßte, wenn sich seine beiden
Komponenten mischen lassen, ohne miteinander zu reagieren.
Mit diesem berechneten Sollwert wird dann der tatsächliche
Wert des Gemenges verglichen (beob. IW.). Das ist das Prinzip,
welches allen derartigen Untersuchungsmethoden gemein ist;

U

nn e m

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 175

die Differenzen derselben beruhen auf der besonderen Art und
Weise, wie der „beobachtete Refraktionswert‘‘ ermittelt wird.

Nach dem Ausfallen des Präcipitates kann der Refraktions-
wert des Gemenges nicht mehr direkt abgelesen werden. P. Hirsch
ging daher so vor, daß er das Reaktionsgemisch in Präcipitat und
überstehende Flüssigkeit sonderte und nun bestimmte: a) den
Refraktionswert der über dem Präcipitat stehenden Flüssigkeit
und b) die Refraktion des Präcipitates nach Auflösung desselben
mit "/,-NaOH, wobei die gleiche Laugenverdünnung als Ver-
gleichsflüssigkeit diente. Die Werte von a) und b) wurden addiert
und mit dem berechneten Sollwert verglichen.

Doerr hat diese Technik schon in seiner ersten Versuchsreihe
in wesentlichen Punkten modifiziert. Hirsch brachte die Antigen-
Antikörpergemenge für 24 Stunden in einen auf 38° C eingestellten
Thermostaten, und ebenso führte Langenstrass seine Ver-
suche aus. Dieses Vorgehen involviert jedoch eine ganz bedeu-
tende Erhöhung der Gefahr bakterieller Verunreinigungen und
gestattet nicht, den primären, bekanntlich sehr rasch ablaufenden
Prozeß der Antigen- Antikörperreaktion, der die Flockung auslöst,
von sekundären, durch die Bruttemperatur begünstigten Vor-
gängen auseinanderzuhalten. Solche sekundäre Vorgänge,
eventuell auch solche fermentativer Natur könnten leicht ein-
treten. Weiß man doch, daß frische Sera im Kontakt mit belie-
bigen Substraten (gekochten Organen, Kaolin usw.) dialysable,
mit Ninhydrin reagierende Stoffe bilden, wenn man sie stunden-
lang bei 37° C digeriert; nach de Waele genügt es, wenn man
frische Sera mit destilliertem Wasser verdünnt, bis Globulin-
flockung eintritt, um bei der nachfolgenden Bebrütung eine posi-
tive „Abderhalden-Reaktion‘‘ zu erzielen. Zudem haben weder
Hirsch noch Langenstrass Angaben gemacht, wie sich die
verwendeten Antigenlösungen und die Immunserumverdünnungen
unvermischt verhalten, d. h. man erfährt nicht, ob sich der inter-
ferometrische Wert der Reaktionskomponenten nicht schon an
sich durch die bloße Digestion verändert haben würde!).

1) Ferner vermißt man noch eine andere, vermutlich sehr wichtige
Kontrolle. Beim Ansetzen der Präcipitinrecaktionen vermischt man eine
Serumverdünnung, z. B. verdünntes Pferdeserum, als Antigen mit einem
Antiserum, welches vom Kaninchen stammt. Es wäre daher notwendig
gewesen, Pferdeserum und Normalkaninchenserum in den im Haupt-

176 R. Doerr u. W. Berger:

Die von Hirsch bewerkstelligte Trennung des Präcipitates
von der überstehenden Flüssigkeit mit nachfolgendem Trocknen,
Waschen und Wiederauflösen des Niederschlages kann selbst bei
peinlich genauem Arbeiten zu einer Quelle von Irrtümern werden.
Substanzverluste sind bei dieser Technik wohl nur schwer zu
vermeiden; in Wasser, Äther oder Alkohol lösliche Stoffe der
Präcipitate scheiden, da letztere mit diesen Solvenzien ge-
waschen werden, eo ipso aus; die Refraktion der Eiweißkörper
erleidet durch das scharfe Eintrocknen ebenso wie durch die
Auflösung in stärkerer Lauge (Oil NaOH) Veränderungen; end-

lich wird in der Berechnung der Befunde das Präcipitatvolum
vernachlässigt.

Bei unseren hier mitgeteilten Untersuchungen haben wir
daher nur zum Teil die von Hirsch eingeführte indirekte
Methode der Refraktionsbestimmung angewendet und
waren überdies bemüht, dieselbe in mehrfachen Beziehungen,
namentlich auch in der von Doerr eingeschlagenen Richtung
weiter auszubauen. Daneben benutzten wir aber eine prinzipiell
neue direkte Methode der interferometrischen Analyse
der Immunpräcipitation unter Ausschluß von Zusätzen

(Lösungsmitteln), und diese direkte Methode brachte die Ent-
scheidung der eingangs gestellten Frage.

versuch verwendeten Proportionen und unter Gleichhaltung aller übrigen
Bedingungen (gleiches Alter der Sera) zu vermengen, die Gemenge 24 Stun-
den bei 38° C zu halten und dieselben vor und nach der Digestion zu inter-
ferometrieren. — Auf eine Besprechung der ziffernmäßigen Befunde,
welche Hirsch und Langenstrass bei der interferometrischen Analyse
der Immunpräcipitation bekamen, soll hier verzichtet werden; eine Durch-
sicht der Tabellen, welche Langenstrass (Fermentforschung 3, 29— 32)
veröffentlicht hat, gibt über die Inkonstanz und die Widersprüche der
tesultate hinreichenden Aufschluß. Langenstrass bekam vielfach be-
deutende Refraktionsverminderungen ganz im Gegensatze zu der von ihm
vertretenen Theorie; und wo ausnahmsweise (6 unter 28 Fällen) Refraktions-
erhöhungen konstatiert wurden, die mehr als + 7 Trommelteile betrugen,
zeigten sie im Reihenversuch (mit fallenden Antigenkonzentrationen) eine
außerordentliche Regellosigkeit. Vor allem aber wurden sie eben erst
nach 24stündiger Bebrütung festgestellt und nicht nach der Zeit, zu
welcher die Präcipitation eben eingetreten oder gerade abgelaufen ist,
ein Umstand, welcher die Verwertbarkeit der Befunde von Hirsch
und Langenstrass für unsere Fragestellung, wie oben auseinander-
gesetzt, verhindert.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 177

1. Indirekte Refraktionsbestimmungen des ausgeflockten Antigen-
4 Antikörpergemenges.

Die von uns benützten Modifikationen. der indirekten
Methode bestehen:

1. Ineiner Abkürzung des Zeitintervalles zwischen dem Ansetzen
. der Reaktion und dem Ablesen der IW. auf durchschnittlich 1/,—3 Stunden.
Gleichzeitig schalteten wir höhere Temperaturen (25—38° C) völlig aus und
ließen die Reaktion bei Zimmertemperatur oder im Eisschrank
ablaufen. Bei einem wirksamen Präcipitin tritt die Flockung fast momentan
oder doch in wenigen Minuten und bei jeder Temperatur ein, was, nebenbei
bemerkt, schon an sich den Gedanken an eine bis zu den Aminosäuren
reichende Proteolyse fast ausschließt, da in diesem Falle das Eiweißmolekül
bei niedriger Temperatur förmlich explodieren müßte. Was Zeit erfordert,
ist nur die Vergrößerung und Sedimentierung der gebildeten Eiweiß-
flocken, ein Phänomen, dessen Eintritt man zur Refraktionsbestimmung
nicht erst abzuwarten braucht. Wir verzeichneten übrigens ganz gleiche
Ergebnisse, ob wir nun die optische Untersuchung vor oder erst nach der
spontanen Sedimentierung vornahmen. Bei längere Zeit beanspruchenden
Experimenten wurden die Ausgangslösungen zu Kontrollzwecken sowohl
am Anfang wie am Ende der interferometrischen Prüfungen ausgemessen.

- 2. In einer Einschränkung der mit dem Präcipitat vorgenommenen
Manipulationen. Das Präcipitat wurde nach vorsichtigem Abhebern
der überstehenden Flüssigkeit noch in feuchtem Zustande gelöst (Methode
der Auflösung des isolierten, feuchten Präcipitates) oder es
wurde das Präcipitat in der überstehenden Flüssigkeit dispergiert, indem
man das Dispersionsmittel dem ganzen Reaktionsgemisch zusetzte, so daß
letzteres wieder homogen und durchsichtig wurde (Methode der Klärung
des Reaktionsgemisches).

3. In der Anwendung mehrerer Lösungs- (Dispersions-)
Mittel (2/ioo- NaOH, 1% Thorsulfat, 1°, Thornitrat) nebeneinander,
d. h. bei einem und demselben Antigen-Antikörpergemisch.

4. In der exakten Berücksichtigung der Volumina bei An-
wendung der allgemeinen Mischungsformel zur Berechnung der Gemischt-
(Soll-) Werte der Gemenge. Es wurden also Präcipitate, überstehende
Flüssigkeiten und Auflösungsmittel mit ihrem wahren Volum ins Kalkül
eingestellt. Wenn in 20 ccm Reaktionsvolum ein Präcipitat entsteht,
welches nach Zentrifugenkompression den Raum von Leem einnimmt, so
darf man natürlich nicht mehr mit 20, sondern nur mit 19 ccm über-
stehender Flüssigkeit rechnen. Das Detail der Berechnung wird durch
die späteren Ausführungen noch klarer werden.

Durch diese Korrekturen erreichten wir eine größere An-
näherung der beobachteten an die berechneten Werte; sie ließen
sich noch nachträglich an den von Doerr in seiner ersten Arbeit
mitgeteilten Ziffern anbringen und führten auch dort zu einer
besseren Übereinstimmung zwischen Rechnung und Beobachtung.

Biochemische Zeitschrift Band 123. 12

178 R. Doerr u. W. Berger:

Das Reaktionsvolum wurde wieder möglichst groß, meist
zu 20 ccm gewählt, um alle Meß- und etwaigen Verdunstungs-
fehler tunlichst zu reduzieren. Ferner ermittelten wir durch
Vorversuche jene refraktometrische Einstellung der im eigentlichen
Experiment verwendeten Flüssigkeiten, bei welcher alle inter-
ferometrischen Ablesungen in das Intervall zwischen 25— 1300 TT.
fallen; auch wurde immer darauf geachtet, daß der IW. der über
dem Präcipitate stehenden Flüssigkeit nicht unter den IW. der
benützten Vergleichsflüssigkeit fällt, was aus mehreren Gründen
unerwünscht ist.

Zur Einführung in die Versuchsanordnungen sei nachstehend
ein Beispiel mit der Methode des isolierten Präcipitates und ein
zweites mit der Methode der Klärung des Reaktionsgemisches
ganz durchgerechnet; anschließend wollen wir die erzielten Er-
gebnisse besprechen.

Versuche mit Auflösung der nichtisolierten
Präcipitate. (Klärung der Reaktionsgemische.)
Manipulationen, Berechnung und Beweisführung sind weitaus am
einfachsten, wenn man die Niederschläge nicht isoliert, sondern das Disper-
sionsmittel (Lösungsmittel) zum gesamten Reaktionsvolum des ausgeflock-
ten Serum-Antiserumgemenges zusetzt. Zu diesem Behufe bringt man
zunächst gleiche Volumina Antigenverdünnung und Antiserumverdünnung

Beispiel für Untersuchungsgang und Berechnung
(Vergleichsflüssigkeit: 1,8% NaCl-Lösung).

ce SL f Interferometerwerte
Bestimmte Flüssigkeiten

2 ecm-Kammer | 0,5 cem-Kammer

1. Yooo-Pferdeserum . 2.2... 80.5 20
2. 15-Antipferdeserum v. Kan. Hag 159,5 36
3. /ioo- NaOH (Auflösungsmittel) 1239 29
4. (l + 2aa) + A aa berechneter,

Sollwert o a aaa a 129.2 28,5
5. Gemenge 4 beobachtet (Pferde- a) 128.5 Zu

serum + Antipferdeserum aa oder 108.5

10 eem; 30 Min. später (nach ein- b) 129.5 29

getretenerPriecipitation) kommen oder 114,5

dazu ?0 cem Lösungsmittel. Es re- c) 125:5 28

sultiert eine wasserklare Lösung. oder 116,9

Von diesem Versuch werden drei

vleichartive Proben a). b) und ci

angesetzt und gemessen. |
6. Differenz zwischen beobachte- a) — 07 Wi 1.5
ten und berechneten Werten. b +03 , — 14,7 = 0,5
— 34 2.9 0,5

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 179

in einem Gefäße zusammen, wartet die Flockung ab und fügt nun zu dem
Gemisch ein gleiches Volum Lösungsmittel hinzu. Der Gang der Berechnung
wird durch folgende, aus der Mischungsformel abgeleitete Gleichung
skizziert:
IW (Antigen) + IW (Antiserum) de IW (Lösungsmittel)
4 2
Sollwert des Gemenges: Antigen-Antiserum-Lösungsmittel.

= berechneter

Diese Gleichung kann natürlich nur dann gelten, wenn infolge der
Immunpräcipitation keine Refraktionsänderungen eintreten, wenn sich
also die Immunpräcipitation verhält wie eine rein kolloidale Eiweißflockung.

Die Differenzen der dreiParallelproben sind sowohl
untereinander (Manipulationsfehler) als auch gegenüber dem ,,be-
rechneten Sollwert“ in beiden Kammern ganz geringfügig.

Die Differenzen gegenüber dem berechneten Sollwert sind
nicht größer als mittlere Manipulationsfehler und geringer als
die Unregelmäßigkeiten, die sich bei Ablesung gleicher Flüssig-
keiten bei einfacher und doppelter Kammerlänge ergeben. Bei
den Messungen in der 2 cm-Kammer machte sich die Unsicherheit
der Streifenwahl geltend und zwar bei der Refraktionsbestimmung
der geklärten Gemenge; im Endresultat schwankt daher die
Differenz zwischen dem Glattwert (Null) und zwischen einem
Minuswert von ungefähr 20 TT. — Wir vermerken diesen Vorfall,
der insofern von Interesse ist, als man dieselbe Erscheinung bis-
weilen auch beobachtet, wenn man zu einem !/,-Kaninchenserum
das gleiche Volum "/,oo-NaOH zufügt; auch dann kann sich die
Schwierigkeit der Streifenwahl im selben Ausmaße einstellen
und die Differenzen zwischen dem beobachteten Wert des Ge-
menges und seinem Sollwert schwanken ebenfalls je nach der

Differenzen

| E zwischen beobachtetem und berechnetem Wert

| mE E
Inmüunserim | tration D ecm- -Kammer E em- Kammer g
; des `
Se "Bezeichnung der Proben
ee bg. at se
a | b | c | a b c
18.200. 129971 e
LI: Antıpferdeserum 1:200 1 — 07 | +03:.—301— 1,5 + 0,5: — 0,5
von Kaninchen Ha | 11:500 | -10,7 | — —|- 28 — | —
1:100| — 76 !'-146 — lr Zb 36 —
Li Antipferdeserum 1:10 — 12 — — 1:3. — —
von Kaninchen Hg, \, 1:400 pn, 0 ;—9 I-1 ~l 0
*) Ablesung vermutlich um eine Streifenbreite zu tief.
SE Ablesung unsicher; Differenz schwankend zwischen — 6 und — 26
bzw. zwischen O und — 20 bzw. — 9 und — 29.

127

180 R. Doerr u. W. Berger:

Ablesung zwischen Null und dem Wert einer Streifenbreite
(ca. 20 TT.). Mit der Präcipitation hat also dieses übrigens nicht
wesentliche Detail nichts zu schaffen.

Dieser Versuchsausfall ist von der verwendeten Antigen-
konzentration ganz unabhängig, wie Reihenversuche lehren,
von denen hier nur die Schlußresultate (Differenzen zwischen
beobachteten und berechneten Werten der geklärten Reaktions-
gemische wiedergegeben seien (siche vorstehende Tabelle S. 179).

Dagegen ändert sich derVersuchsausfall, wenn statt ”/ioo- NaOH
das stark refraktionsvermindernde Thornitrat in 1,2 proz. Lösung
zur Auflösung der Niederschläge verwendet wird. Es kommen
dann stärkere Minuswerte zur Beobachtung. |

Differenzen

|
Immunserum Konzentration i
des Antigens d cm-Kammer | 2em-Kamnier
. | e ( i TAR Ke si,

!/, Antipferdeserum von) | N 48 m ee
2 1 : 500 — 45.1 — 14,7
Kaninchen Hh- Ä 1: 1000 dee _191

GP | I

Versuche mit Auflösung der isolierten Präcipitate.

Dieses Verfahren lehnt sich unter den in dieser Arbeit ver-
wendeten Versuchsanordnungen am meisten an die von Hirsch
und Langenstrass geübte Technik an. Im einzelnen gingen wir
dabei in folgender Weise vor:

Das Präcipitat wurde nach — bei Zimmertemperatur oder
im Eisschrank — eingetretener Flockung und spontaner Sedimen-
tierung durch Ausschleudern komprimiert, von der überstehenden
Flüssigkeit durch Abhebern befreit, mit einem Lösungsmittel
bekannter Refraktion wieder dispergiert und im Interferometer
ausgemessen. Außerdem wurde der IW. der überstehenden
Flüssigkeit direkt bestimmt.

Die Berechnung, d. h. der Vergleich der Sollwerte mit den beobach-
teten Werten kann auf zweierlei Weise erfolgen:

a) Man vergleicht die beobachtete mit der berechneten Lösung des
Präcipitates.

Die Berechnung der Präcipitatlösung geschieht nach dem Schema:

IW (des Antigens) SN Immurserums) ` File (dar überstehenden

Flüssigkeit) + IW. (des Lösungsmittels) = berechnete Präcipitatlösung.
b) Man vergleicht die Summe der Refraktionen der Ausgangskompo-
nenten (Antigen- und Antiserumverdünnung, dividiert durch 2) mit der

Interferometrische Analyse der JIınmunpräcipitation. 181

Summe der Refraktionen der Endprodukte (IW. der überstehenden Flüssig-
keit und IW. des Präcipitates). Den IW. des Präcipitates erhält man,
wenn man vom IW. des gelösten Präcipitates den IW. des Lösungsmittels
abzieht.

Es ist jedoch klar, daß in diese Schemata nicht einfach die abgelesenen
IW. eingesetzt werden dürfen, sondern daß — wie an anderer Stelle bereits
erwähnt wurde — die Volumina der überstehenden Flüssigkeit, des Präcipi-
tates und des Lösungsmittels berücksichtigt werden müssen. Wenn das
Volumen des feuchten Präcipitates 1 ccm beträgt, muß selbstverständlich
ein verschiedener IW. resultieren, je nachdem das Präcipitat mit 20 ccm
Lösungsmittel auf das Volumen von 21 ccm oder mit 19 ccm auf das von
20 ccm gebracht wird. In unseren Versuchen wurden in der Regel 10 ccm
Antigenverdünnung mit 10 ccm Antiserumverdünnung versetzt; 20 ccm
würden somit dem Volum des Reaktionsgemisches, 19 ccm dem der über-
stehenden Flüssigkeit entsprechen (bei Leem Präcipitatvolum). Es erhellt
übrigens aus der bloßen Betrachtung der Mischungsformel, daß das Volum
bei allen Manipulationen und Rechnungen beachtet werden muß; von dieser
Regel ist nur der Fall ausgenommen, daß man 2 Flüssigkeiten zu gleichen
Teilen miteinander vermengt.

Auf Grund dieser Überlegungen haben wir das Volum der überstehen-
den Flüssigkeit jedesmal genau ausgemessen. Die Berechnung hat dann
so zu erfolgen, daß man die allgemeine Mischungsformel benützt, wobei
die Volumina eo ipso konsequent berücksichtigt werden müssen, oder daß
man sich der obigen Vergleichsschemata bedient, in dieselbe aber nicht die
abgelesenen IW., sondern die auf das gesamte Reaktionsvolum (in unseren
Versuchen auf 20 ccm) reduzierten IW. einsetzt. Die Reduktion des bei
einem Volum v, abgelesenen Interferometerwertes IW, auf das Volum v,

geschieht nach der Formel IW, = IW, e ; in unserem SE d.h. bei dem
Reaktionsvolum von 20 ccm ergibt sich IW,, = IW

ai Gë
Versuch (Berechnung nach a ma a). — Sämtliche Werte sind

durch Multiplikation mit dem Faktor Gr o auf dasVolum von 20ccm reduziert.
4 cm-Kammer): l

L Gemenge von Serum + Antiserum aa 10 ccm; berechnet 1630
2. Überstehende Flüssigkeit . . . . o. a 2 22.2.0... 1451
3. 1. minus 2. = berechneter Präcipitatwert. . . .....1%9
4. 1%, Thomitrat ..... nen KE
5. 3. und 4. = berechnete Präcipitetlosung acer Sal
6. Präcipitatlösung beobachtet . . . . 306
7. Differenz zwischen beobachtetem und Ge Tec EE tem w ei -5

Für größere Versuchsreihen erscheint es nicht vorteilhaft, jeden ab-
gelesenen Wert einzeln zu reduzieren. Man benützt dann besser eine durch
Einsetzen der Mischungsformel in Schema a)ableitbare Gleichung, in welcher
die Division durch 20 nur einmal vorgenommen werden muß:

E 3 , IW (Gemenge) - 20 ZW rcüberst.Flüssicek.) » dv, + /WıLösungsm.)» r.
EE E EE EE Se Se? ÖSUNESML.) + 7,

182 R. Doerr u. W. Berger:

Berechnung desselben Beispieles nach Schema b).

1. Refraktionssumme, berechnet aus den Ausgangskompo-

DENLEN Su: u EENEG OS
2. Überstehende Flüssigkeit . . . 2» 22.2.2 2.2.2.0. Ml
3. Präcipitatlösung beobachtet . . . » » 2 2.2.2.2.2..2...8306
4.195: Thornitrat a i 2.2.88 2 ea re ee ` SE
5. Refraktionssumme, berechnet aus den Endprodukten

Dee) a ee a ana 4623
6. Differenz zwischen 1 und 5 .. 2. 2 2 2 22 A

Skizziert wird die detaillierte Rechnung durch die Formeln:

Refraktionssumme der Ausgangskomponenten

SEN 2 H (1)

Refraktionssumme der Endprodukte (2)
IWeüberst. Flüssigkeit.) ev, + IW (Präcipitatlösung: « ir, + ra — IW Lösungsmittel) déi

et, tr: ;

wobei: v, = Volumen der überstehenden Flüssigkeit (im obigen Versuch

19,87 ccm),
ve := Volumen des Präcipitates (im obigen Versuch 0,33 ccm),
©, + ta = Reaktionsvolum = 20 ccm.

Die Genauigkeit der Volumsbestimmungen wurde durch Parallel-
versuche ermittelt; der maximale Fehler betrug + 0,02 ccm. Fehler dieser
(Größenordnung kommen aber in den Endresultaten nicht mehr störend
zum Ausdruck,. wie man sich durch Rechnung mit willkürlich angenom-
menen Volumina, die von den tatsächlich ermittelten um den angegebenen
Fehler abweichen, leicht überzeugen kann.

Auch bei dieser Methodik begegnen wir der völligen Unabhängigkeit
der Schlußdifferenzen von den verwendeten Antigenkonzentrationen, wie
folgender Reihenversuch lehrt:

Antiserum EE SES E EE
| Konzentration 4 em-Kammer 2cm-Kammer
| 1:50 —h +19 +9
1J Antimenschenserumn v. | 1:100 12 — +12
Kaninchen (ra ] : 200 — In +5
1 : 400 EC = +8

Ergebnisse des indirekten Verfahrens.
Fassen wir die mit diesem Verfahren in schr zahlreichen Einzel-
versuchen gewonnenen Resultate zusammen, so können wir sagen:
Bei Auflösung der nichtisolierten Präcipitate mit hochgradig
verdünnter Natronlauge verhielt sich die Refraktion genau so,
als ob man irgendeine nicht ausgeflockte Serumverdünnung
gleicher Konzentration mit der verdünnten NaOH vermengt hatte.

Interferometrische Analyse der Immunpräeipitation. 183

Es ergaben sich Glattwerte oder kleinere Minuswerte,
nie die nach den Hypothesen von Calcar und P Hirsch
zu fordernde Erhöhung.

Bei Auflösung nichtisolierter Präcipitate mit Thornitrat und
bei Verwendung einer stark sauer reagierenden Thorsalzlösung
bekamen wir Minuswerte; wurden die Präcipitate vor der Auf-
lösung isoliert und bewerkstelligte man die Auflösung in schwach
sauren Thorsalzlösungen, so resultierten Glattwerte innerhalb der
Fehlerbreite +10, doch hatte die Differenz mit einer einzigen
Ausnahme ein positives Vorzeichen.

Wir haben uns nun selbst den Einwand gemacht, daß man
in Anbetracht des stark refraktionsvermindernden Einflusses
saurer Thorsalzlösungen größere Minuswerte als die tatsächlich
erzielten fordern könnte und daß man daher ein gewisses Anrecht
zu Konstruieren vermag, aus den Glattwerten und den relativ zu
kleinen Minuswerten doch noch auf eine Refraktionserhöhung
zu schließen. Diesem Einwand dadurch zu begegnen, daß wir
die Refraktionsverminderung durch Thorsalze einfach mit einem
bestimmten Betrag in Rechnung stellten, war aus mehrfachen
Gründen unstatthaft. Erstens schwankte diese Refraktions-
abnahme auch unter gleichen Verhältnissen nicht unbeträchtlich
und zweitens darf man von den Versuchen mit Serum keinen
Rückschluß machen auf die Refraktionsabnahme mit Präcipitaten;
wie die Refraktion durch Lösung von Präcipitaten in sauren
Thorsalzen reduziert wird, läßt sich aber kaum feststellen.

Jedenfalls war der Gedanke an eine ‚maskierte‘‘ Refraktions-
erhöhung angesichts der ganz eindeutigen Experimente mit ”/1o-
NaOH als Lösungsmittel mit völliger Sicherheit auszuschließen.

Alle Verfahren, bei welchen das Präcipitat wieder aufgelöst
wird, arbeiten aber — das muß zugegeben werden — mit einem
seiner Natur nach nicht ganz bekannten und daher sehr unangeneh-
men Faktor: der Einführung eines Lösungsmittels in das Gemisch
von Antigen und Antikörper. Daraus müssen Fehlerquellen ent-
springen, die bei ”/ioo NaOH unbedeutend, bei ”/io NaOH und
l proz. Thorsulfat erheblicher und bei 1 proz. Thornitrat endlich
sehr groß sind.

Das Schwergewicht bei der Beurteilung der ganzen Angelegen-
heit muß daher auf ein Verfahren gelegt werden, welches jedes
Lösungsmittel entbehrlich macht.

154 R. Doerr u. W. Berger:

2. Direkte interferometrische Beobachtung der Immunpräcipitation.

Wenn die Immunpräcipitation die Folge einer mit Refrak-
tionserhöhung einhergehenden Antigenverdauung durch Abwehr-
fermente des Immunserums wäre, so müßte die Refraktions-
erhöhung auch eintreten, wenn man die Flockung durch Antigen-
überschuß verhindert. Denn die Refraktionserhöhung durch
Wirkung eines Fermentes z. B. Trypsin wird durch den Überschuß
des fermentesziblen Substrates nicht nur nicht gehindert, sondern
vielmehr gesteigert. Wir wollen nicht darauf eingehen, ob sich
das Phänomen der ‚unteren Hemmungszone‘“ der Präcipitation
mit den Fermenthypothesen von van Calcar und P. Hirsch
überhaupt verträgt; es sei eben nur betont, daß sich die Refrak-
tionserhöhung, über welche Hirsch, Köhler, Langenstrass
u. a. berichtet haben, auch bei ausbleibender Flockung zeigen
müßte, und diese Überlegung veranlaßte uns, die Immunpräcipi-
tation „sine praecipitatione‘, d. h. in der unteren Hemmungszone
direkt interferometrisch zu untersuchen.

Weiters liegen Beobachtungen von Marc vor, der schon
1911 sah, daß kolloidale Lösungen, z. B. länger aufbewahrte
Gelatinelösungen, bei spontan eintretender Trübung merk würdiger-
weise zunächst keine Verminderung ihrer Refraktion erfahren. In
der Folge haben noch Walpole, Wiegner und Wintgen auf
die Möglichkeit des Gleichbleibens der Refraktion bei Dispersitäts-
veränderungen kolloiddisperser Systeme hingewiesen. Ähnliche
Wahrnehmungen machte Doerr, wenn er Serum mit Thorsalz-
lösungen in solchen gegenseitigen Mengenverhältnissen vermischte,
daß homogene, stabile Trübungen leichten Grades (Opalescenzen)
auftraten; der Refraktionswert solcher Gemenge entsprach voll-
kommen dem theoretischen, mit der Mischungsformel berechneten
Sollwert. Auch wir können diese Erscheinung bestätigen; an
der Richtigkeit der Angaben von Mare, Walpole, Wiegner
und Doerr ließen systematische Untersuchungen an dauernden
oder transitorischen Trübungen leichter, ja sogar mittlerer Grade
keinen Zweifel aufkommen. Es mußte daher eine dirckte Be-
obachtung der JImmunpräcipitation mit dem Interferometer
nicht nur bei klarbleibenden Präcipitinogen-Präcipitingemischen
(untere Hemmungszone), sondern auch bei allmählich eintretender

Flockung möglich und theoretisch gerechtfertigt sein.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 185

Es liegt auf der Hand, daß ein derartiges Verfahren den ganzen
Modus procedendi auf die denkbar einfachste Form reduziert.
Die Wirkung des Auflösungsmittels fällt ganz weg, Manipulationen
und Berechnungen nehmen mit einem Schlage eine Gestalt an,
die alle Fehler a limine ausschließt. Auf diesem Wege mußte
sich die von Hirsch und Langenstrass angegebene Refraktions-
erhöhung in derselben Manier nachweisen lassen wie bei der
Zerlegung, welche Harnstoff in der Interferometerkammer durch
Urease erfährt, denn die Präcipitation trat bei unseren Immun-
sera innerhalb weniger Minuten ein; soll ein mit Refraktions-
erhöhung einhergehender Vorgang als Ursache der Immunpräcipi-
tation anerkannt werden, so muß er notwendigerweise mindestens
ebenso rasch verlaufen wie die von ihm hervorgerufene Flockung.
Bei der interferometrischen Messung der Ureasewirkung konsta-
tierten wir ja 1. schon bei der allerersten Ablesung (nach 30 Sek.)
einen gegenüber dem berechneten Sollwert deutlich erhöhten IW.
des Gemenges Urease-Harnstoff und 2. daran anschließend einen
raschen, im Interferometer gut verfolgbaren, weiteren Anstieg
der Refraktion.

Analoge Befunde konnten wir jedoch bei der Immunpräcipi-
tation nie erheben.

Bei direkter Beobachtung des Ablaufes der Immunpräeipitation
in der Interferometerkammer ohne Anwendung von Auflösungs-
mitteln haben wir nicht ein einziges Mal eine Refraktionser-
höhung festgestellt. |

Die Präcipitationen wurden mit 4 verschiedenen Immunsera
(1 Antimeerschweinchenserum M, und 3 Antipferdesera H,,,
H. und S,,) ausgeführt. Die Antigenkonzentrationen wech-
selten, das präcipitierende Immunserum wurde in solchen Men-
gen zugesetzt, daß sich die Konzentration im Gesamtvolum
des Reaktionsgemisches wie üblich auf 1:10 belief. Die Aus-
messungen erfolgten sowohl in der 4 cm- wie in der 2cm-Kammer
und lieferten gleichsinnige Resultate.

Jedes Experiment wurde so durchgeführt, daß das erzielte
Ergebnis als vierfacher Beweis für die Richtigkeit der Behauptung
gelten konnte, daß sich die Refraktion bei der Immunpräcipi-
tation nicht ändert.

l. Unmittelbar nach dem Vermengen entsprach nämlich

der IW. des Antigen-Antikörper- (Serum-Antiserum-) Gemenges

186 R. Doerr u. W. Berger:

dem Sollwert, d. h. jenem Wert, der ohne chemische Umsetzung
der beiden Komponenten zu erwarten war.

2. Vom Augenblick der ersten Ablesung im Interferometer
bis zum Eintritt der Trübung änderte sich die Refraktion nicht.
Gerade in dieser Phase müßte aber die Refraktionserhöhung
stattfinden, wenn sie als optischer Ausdruck eines Prozesses gelten
soll, welcher die Flockung verursacht.

3. Vom Beginne der Trübung an bis zu einem oft schon
ziemlich weit fortgeschrittenen Stadium der Flockung blieben
die anfänglich eingestellten Streifen des Interferenzspektrums
an Ort und Stelle, solange als die zunehmende Trübung überhaupt
noch eine Ablesung gestattete. Die Refraktion änderte sich somit
nicht einmal in den ersten Stadien der Agglomeration der unlöslich
gewordenen Teilchen, sondern erst mit dem Eintritte der Sedi-
mentierung und dann im Sinne einer Abnahme.

4. Das Gleichbleiben der Refraktion während der Zunahme
der Trübung kann nicht darauf zurückgeführt werden, daß sich
eine hypothetische Refraktionserhöhung durch Abbau und eine
Refraktionserniedrigung durch Ausfällen des Eiweißes gegenseitig
aufheben. Einerseits wissen wir, daß andere Eiweißfällungen, bei
denen Fermentationen ausgeschlossen sind, in ihren ersten Stadien
die Refraktion nicht alterieren (Marc, Walpole, Wiegner,
Doerr, unsere ad hoc angestellten Experimente) und andererseits
haben wir es ja in der Hand, das Präcipitat durch Zusatz von
n'o- NaOH wieder bis zur homogenen Lösung zu dispergieren:
dann müßte die supponierte Refraktionserhöhung zum Vorschein
kommen, was aber nicht zutrifft. Nach Klärung des trüben Reak-
tionsgemisches durch R/;g0- NaOH entsprach stets der beobachtete
Wert dem berechneten bis auf jene kleinen Minusdifferenzen, die
bei jeder Einwirkung von Lauge aufSerumeiweiß zustande kommen.
Abgeschen davon ist ja die Annahme, daß sich die hypothetische
Refraktionserhöhung und eine Refraktionserniedrigung durch Ei-
weißflockung in jedem Zeitmoment des spezifischen Präcipitations-
vorganges Null für Null aufheben, so unwahrscheinlich, daß sie
eigentlich überhaupt nicht diskutiert zu werden braucht.

Für die ausführliche Wiedergabe sei ein Versuch gewählt, ın
dem die spezifische Präcipitation so verzögert eintrat und ablief.
daß ihre optische Untersuchung durch längere Zeit hindurch
verfolgt werden konnte.

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 187

Versuch: Direkte interferometrische Untersuchung einer Immun-
präcipitation ohne Anwendung von Auflösungsmitteln: Temperatur 17,5° C,
Vergleichaflüssigkeit 1,8%, NaCl.

I. Beobachtung am Beginn des Versuches (vgl. Punkt 1).

Interferometrierte Interferometerwerte
Flüssigkeiten 4cm-Kammer 2cm-Kammer
1. 1/5 Antipferdeserum (S,,) : - . . . . 1138 563
2. 1/ioo Pferdeserum `... 421 208
3. 1. + 2. aa, berechnet `... 779 385,5
4. 1. + 2. aa, beobachtet . . ..... 768 384
5. Differenz zwischen beobachtetem und
berechnetem Wert . . .. 2 2 2.0. —11 —1,5

II. Beobachtung vom Vermengen bis zur Ausflockung (vgl.
Punkt 2 und 3).
Seit dem Vermengen

Aussehen des Interferometerwerte
abgelaufene Zeit
: i Reaktionsgemisches 4cm-Kammer 2cm-Kammer
in Minuten
d klar 719*) 385,5
2 771 384
3 768 385
4 e — 384
6 fast klar 769 —
7 beginn. Trübung 767 383
10 e 767 —
13 zunehm. Trübung unleserlich 384
23 kräftige Trübung ge 384
30 Flockung eg unleserlich

*) Ablesung vor völligem Temperaturausgleich.

HI. Wiederauflösung der Trübung mit %/,00-NaOH (vgl. Punkt 4).

2 cem-Kamnıer

4. Serum-Antiserumgemisch . . . ». 2 22 222000. 384
6: DE: NaOH 2. 5 Arc au a a a 85
7. 4. + 6. aa, berechnet . . . . 2. 2 2 2 2 0. Ba 234,5
8. 4. +6. aa ergibt eine klare Lösung mit dem IW. . . 22]
9. Differenz zwischen beobachtetem und berechnetem Wert —13

Vergleichsweise seien nun noch die Differenzen zwischen beobachtetem
IW. und berechneten Sollwerten gegenübergestellt, wie sie sich ergeben:

a) Bei dauerndem Ausbleiben der Trübung,

b) bei verzögerter und

c) bei sehr rascher Präcipitation.

Unterschiede, welche durch die verschiedene Reaktionsgeschwindig-
keit bedingt sein konnten, traten nicht zutage. Niemals konnte eine spätere
Erhöhung des erstabgelesenen Wertes konstatiert werden, auch nicht bei
der Ausdehnung der Beobachtungszeit über eine Stunde.

188 R. Doerr u. W. Berger:

i Antigen- Verlauf der Differenzen zw. beoh. u. Sollwert
Bez. d. Immunserums

konz. Präcip. 4cm-Kammer 2cm-K. (,5cm-K.
Antimeerschweinchenserum M, (Un kelne Flockung +11 +1 -1 —
Antipferdeserum ....... Hn ie vm D — +0,7 +55
m Ha» Fio VerzZzÖg. „ — -1t -10
Antimeerschweinchenserum M, (ee rasche e +14 -5 d —
Schlußfolgerungen.

Die mit dem hochempfindlichen Interferometer durchgeführten
Refraktionsbestimmungen bei Immunpräcipitationen haben mit
dem alten, der Methodik von Hirsch nachgebildeten, aber viel-
fach modifizierten indirekten Verfahren zum Teil absolute, zum
Teil annähernde Übereinstimmung der beobachteten Refraktion
der präcipitierten Antigen-Antikörpergemenge mit den berech-
neten Sollwerten (,‚Gemischtwerten‘‘) ergeben. Die Abweichungen
waren nach Zahl und Größe gering und beruhten, wie die darauf
gerichteten Kontrolluntersuchungen ergaben, entweder auf tech-
nischen Fehlern oder auf der Einwirkung der zur Lösung der
Präcipitate verwendeten Dispersionsmittel.

Die Messungen mit dem neuen direkten Verfahren ergaben
ausnahmslos eine nahezu absolute, d. h. die unter den
Bedingungen der Methodik überhaupt erreichbare
Übereinstimmung; die Refraktion der Präcipitinogen-
Präcipitingemenge hatte also den Wert, den man er-
warten muß, wenn keine chemische (molekulare) Um-

setzung stattfindet. Nie wurde eine Zunahme der
Refraktion mit fortschreitender Reaktionszeit be-
obachtet.

Damit steht fest, daß die Reaktion zwischen Eiweiß-
antigen und präcipitierendem Immunserum in der ersten bis
zur Flockung reichenden Phase die Refraktion nicht ändert;
die interferometrische Untersuchung erbringt keinen
Beweis für die hypothetische Auffassung derImmun-
präcipitation als einer „Abwehrfermentreaktion‘“.

Bei gleichbleibender Refraktion ist nach theoretischer Über-
legung und nach den Ergebnissen des Experimentes allerdings
sowohl ein weitgehender Abbau wie ein Ausbleiben jeglichen
chemischen Geschehens möglich. Die Entscheidung dieser Alter-
native ist jedoch mit Hilfe des Interferometers unmöglich; sie
stand auch nicht zur Diskussion, vielmehr handelte es sich nur
darum, ob die Aussage, daß Immunpräcipitationen mit Refrak-

Interferometrische Analyse der Immunpräcipitation. 189

tionserhöhungen verknüpft sind (Hirsch, Langenstrass), zu
Recht besteht oder nicht.

Da nun ein Beweis für einen Abbau auf refraktometrischem
(interferometrischem) Wege nicht erbracht werden konnte, ent-
behrt die Hypothese der fermentativen Spaltung der
Eiweißantigene durch ihre Antikörper jeder tatsäch-
lichen Stütze. Die bisherigen Anschauungen über das
Wesen und den Mechanismus der Immunpräcipitation
wie auch der Anaphylaxie bestehen zu Recht. Ihre Deu-
tung als rein physikalische Prozesse gewinnt durch die Resultate
der Interferometrie bedeutend an Boden. Auf dieses Kapitel
gedenken wir an anderer Stelle näher einzugehen.

.Literatur.

Van Calcar, R. P., Dialyse, Eiweißchemie und Immunität. Does-
burgh, Leiden und Barth, Leipzig 1908. — Bordet, J., Traité de !’immunite
dans les maladies infect. Masson Paris 1920. — Hirsch, P., Ferment-
studien. Fischer, Jena 1917. — Hirsch, P., Fermentforschung 2, 290. 1919.
— Hirsch, P., Zeitschr. f. angew. Chemie 33, 269. 1920. — Hirsch, P.,
Jenaische Zeitschr. f. Naturw. 56. 1920. — Langenstrass, Immunochem.
Studien von P. Hirsch III. Fermentforschung 3, 1. — Doerr, R., Kolloid-
Zeitschr. 27, 277. 1920. — Haber und Loewe, Zeitschr. f. angew. Chemie
23, 1393. 1910. — Loewe, Zeitschr. f. Instrumentenk. 30, 321. 1910. —
Loewe, Chemiker-Zeit. 45, 405. 1921. — Barus, C., Publications of the
Carnegie Institution of Washington 1911, 1912, 1913, Nr. 149 und 1915,
Nr. 229. — Marc, Chemiker-Zeit. 36, 357. 1912. — Schmeel, Diss.
Freiburg 1915. — Gans und Bose, Zeitschr. f. Instrumentenk. 36, 136.
1916. — Pregl, Zeitschr. f. physiol. Chem. 45, 166. 1905. — Herlitzka,
Kolloid-Zeitschr. 7, 251. 1910. — Frei, ebenda 6, 1913. 1910. — Walpole,
ebenda 13, 241. 1913. — Wintgen, Kolloidchem. Beih. 7, 251. 1915. —
Oppenheimer und Aron, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 4, 279. 1904.
— Obermayer und E. P. Pick, ebenda 7, 331. 1905. — Oppenheimer,
C., Die Fermente und ihre Wirkungen. Vogel, Leipzig 1913. — Rona und
Michaelis, diese Zeitschr. 31, 343. 1911. — Rona in Abderhaldens
Handbuch, Biochemische Arbeitsmethoden, Bd. 8, S. 301. — Olsen und
Goette, diese Zeitschr. 112, 189. 1920. — Wiegner, Kolloid-Zeitschr.
20, 7. 1917.

Bezüglich der sonstigen zitierten Literatur siche den demnächst er-
scheinenden Artikel: R. Doerr, Die Anaphylaxieforschung im Zeitraum
von 1914—1921. Weichhardts Ergebnisse der Hygiene, Bakteriol.,
Immunitätsforschung und exper. Ther. 5, 1921.

Über die Wechselbeziehungen zwischen Blutplasma und
Gewebeflüssigkeiten, insbesondere Kammerwasser und
Cerebrospinalflüssigkeit?).

I. Der Zuckergehalt und die Frage des gebundenen Zuckers.

Von

J. de Haan und S. van Creveld.
(Aus dem Physiologischen Institut der Universität Groningen.)

(Eingegangen am 19. Juli 1921.)

Einleitung.

Die Beziehungen zwischen Blutstrom und Lymphestrom,
die Wechselwirkung zwischen Blut und Gewebeflüssigkeiten sind
noch immer Objekt lebhafter Diskussion. Zwar ist festgestellt
worden, daß der Blutdruck nicht die einzig wirksame filtrierende
Kraft ist für die Lymphbildung; es ist dies von vornherein auch
darum unmöglich, weil im lebenden Körper die Abhängigkeits-
beziehungen zwischen den verschiedenen Lebenserscheinungen
nirgends derart sich gestalten, daß einzelne nur Ursache, andere
nur Folge sind. In dem letzten Jahrzehnt haben sich die Asher-
schen Anschauungen über den wichtigen Anteil der Arbeit der
Gewebszellen an der Lymphbildung immer mehr Bahn gebrochen;
es wäre jedoch verfehlt, wenn man darum die wichtigen Fragen,
vor welche die Zellarbeit uns stellt, mit dem Namen vitale Wirkung
und Sekretion bei Seite liegen ließe. Ist es ja Zweck aller Unter-
suchung, die Resultate letzterer Arbeit derart zu analysieren, dal
die dabei wirksamen Kräfte uns möglichst einfach vor Augen
stehen. Inwieweit spielen dabei Kräfte wie Filtration, Diffusion,
Adsorption usw. eine Rolle? Es ist wohl unzweifelhaft, daB dem
Blute hier vielfach eine führende Rolle zukommt. Die Weise,

1) Eine vorläufige Mitteilung über diesen Gegenstand erschien in dem
„Zittingsverslag Koninkl. Academie van Wetensch.“ vom 26. III. 1921.

J. de Haan und S. van Creveld: Blutplasma u. Gewebeflüssigkeiten. 191

in der die Blutzusammensetzung in den verschiedenen Körper-
flüssigkeiten sich wiederfindet, ist an erster Stelle eine Permeabili-
tätsfrage einer oder mehrerer trennenden Membrane, und zweitens
durch die Arbeit beeinflußt, welche die Zellen, sei es als deutliche
Membranen geordnet, sei es jede für sich, im fortwährenden Stoff-
wechselbetrieb ausüben. Wo diese Membranarbeit überaus groß
ist, manifestiert sich dies in einer völlig abweichenden Zusammen-
setzung der Flüssigkeiten, welche an der anderen Seite der Mem-
bran hervorquellen; der Anteil der direkten Diffusion tritt völlig
in "den Hintergrund; hier gibt es eine reine ‚Sekretion‘: Die
chemische Zusammensetzung des Magensaftes, des Harnes, der
Galle usw. ist der Ausdruck desjenigen, was die betreffenden
Organzellen auf den Reiz vom Blute her liefern.

In den sogenannten Gewebeflüssigkeiten jedoch können die
von der Zellenarbeit bewirkten Abänderungen nicht so schroff
hervortreten, indem sie fortwährend wieder vom Blute her aus-
geglichen werden: Die gebildete Flüssigkeit wird hier nicht fort-
geschafft, sondern bleibt mit dem Blute fortwährend in engster
Beziehung.

Wenn dennoch in chemischer Hinsicht Verschiedenheiten
diesseits und jenseits von den Gewebe und Blut trennenden
Membranen angetroffen werden, so müssen dieselben von 2 Fak-
toren beherrscht werden. Erstens können sie der Ausdruck sein
einer überaus starken modifizierenden Gewebsarbeit; zweitens
kann auch die abschließende Wirkung der Membran für bestimmte
Stoffe eine nahezu vollkommene sein; auch im letzten Falle wird
schon ein ziemlich geringfügiger Unterschied in der Produktions-
oder Verbrauchsschnelligkeit dieser Stoffe an beiden Seiten der
Membran eine größere Differenz in der Konzentration derselben
hervorrufen. An eine solche Undurchgängigkeit werden wir an
erster Stelle denken, wenn wir den großen Unterschied im Eiweiß-
gehalt zwischen Blut und Lymphe betrachten.

Von diesem chemischen Gesichtspunkte aus haben wir uns
mit Untersuchungen über die Verhältnisse zwischen dem Blute
und 2 typischen Organflüssigkeiten befaßt, dem Kammerwasser
der vorderen Augenkammer und der Cerebrospinalflüssigkeit,
welche beide in leichter Weise rein erhalten werden können.

Bis zum jetzigen Tage wird meistens für diese Flüssigkeiten
ein bestimmter Entstehungsort angegeben; die meisten Unter-

192 J. de Haan und S. van Creveld:

sucher sprechen nämlich von einer Sekretion, andere von einer
Filtration durch die Processus ciliaris für das Auge und durch
den Plexus chorioideus für das Gehirnwasser. Untersuchungen
der letzten Zeit (z. B. C. Hamburgers für das Auge) sprechen
einen berechtigten Zweifel aus, ob es hier unter normalen Verhält-
nissen eine ganz bestimmte Bildungsmembran gibt, und weiter, ob
hier von einer nennenswerten Flüssigkeitsbewegung die Rede sein
kann; allem Anschein nach sind es vielmehr statische Flüssig-
keiten, wobei der Diffusion eine größere Rolle zukommt als der
Wasserbewegung infolge des Blutdruckes. Wir wollen uns hier
nicht weiter mit der schwierigen Frage befassen, welches Verhält-
nis zwischen dem Drucke der gebildeten Flüssigkeit und dem Blut-
drucke besteht. Noch vor kurzem hat Becht!) betont, daß die
Lösung dieses Problems äußerst schwierig ist; dieser Autor kommt
auf Grund zahlreicher Experimente zu der Schlußfolgerung, daß
betreffs der Cerebrospinalflüssigkeit die zumal von Halliburton
und Dixon?) hervorgehobenen Argumente, welche eine aktive
vom Blutdruck unabhängige Sekretion beweisen sollten, sich ebenso
leicht in mechanischer Weise erklären lassen.

Die chemische Zusammensetzung der beiden Flüssigkeiten
ist sowohl für die mechanische als für die ‚‚sekretorische‘‘ Erklärung
als Beweismaterial verwendet. Auf Grund der großen Überein-
stimmung in der Zusammensetzung ist wiederholt betont worden,
daß eine enge Beziehung mit dem Blute bestehen soll; von anderen
ist jedoch, insbesondere für das Gehirnwasser, aber auch für das
Kammerwasser, auf bestimmte Diskongruenzen mit dem Blute
hingewiesen (Verschlossensein für Farbstoffe, Medikamente, Salze
(Jodiden) usw.), welche auf vitale Eigenschaften der Membran
bezogen werden. In einer zweiten Mitteilung hoffen wir diese
Frage näher ins Auge zu fassen, und über das All- oder Nicht-
verschlossenbleiben der Membran für derartige Stoffe zu berichten.

In dieser ersten Mitteilung haben wir uns mit der Durch-
gängigkeit für einen ganz physiologischen Stoff beschäftigt und
zwar mit der Glucose.

Wir haben untersucht, inwieweit der Zuckergehalt der oben-
genannten Gewebeflüssigrkeiten in normalen Verhältnissen von
dem im Blute verschieden ist; zweitens haben wir den Blut-

1) Amerie. ‚Journ. of physiol. 51, 1. 1920.

2) Journ. of physiol. 47, 215. 1913; 48, 128. 1914.

a a "ee ee FE ee

—

Blutplasma und Gewebeflüssigkeiten. 193

zuckergehalt für kurze Perioden künstlich abgeändert. Die
Schnelligkeit, womit dieser Wechsel von den Gewebeflüssigkeiten
befolgt wurde, konnte als Maß dienen für die Durchlässigkeit der
betreffenden Membranen für Glucose, und dadurch ließe sich
ein Anhaltspunkt gewinnen, inwieweit eine geringe Diffusibilität
für etwaige Verschiedenheiten zwischen dem Blute und den Ge-
webeflüssigkeiten verantwortlich gemacht werden konnte.

An erster Stelle haben wir als Leitmotiv die meist augen-
fällige Eigenschaft dieser Flüssigkeiten, nämlich ihr minimaler Ge-
halt an Eiweiß und anderen Kolloiden gelten lassen. Durch die
Entwicklung der physikalischen und der Kolloidchemie brauchen
wir wenigstens für dieses Zurückhalten von Kolloiden nicht mehr
den Ausdruck ‚vitale Eigenschaft“ zu verwenden; gibt es ja bei
der Dialyse und der Ultrafiltration Beispiele von nichtlebenden
Membranen, welche ebenso für Kolloide undurchgängig sind. Die
Cerebrospinalflüssigkeit ist dann auch von Mestrezat!), das
Kammerwasser von Magitot?) als ein Dialysat des Blutes be-
trachtet, wo die vorhandenen Stoffe nur nach Maßgabe ihrer
verschiedenen Diffusibilität vorhanden seien.

Auch wir haben uns das Ziel gestellt, zu untersuchen, inwie-
weit sich diese Flüssigkeiten wie ein Ultrafiltrat oder besser wie
ein Dialysat verhalten. Was den Zucker anbelangt, so hatten wir
in dieser Hinsicht einen speziellen Anhaltspunkt. Konnte ja
_ einer von uns?) nachweisen, daß beim Ultrafiltrieren von Blutserum
ein nicht unerheblicher Teil des Zuckers auf dem Filter zurück-
bleibt. Da der Zustand, in welchem die Glucose im Blute vor-
handen ist, in letzterer Zeit vielfach der Gegenstand einer Dis-
kussion gewesen ist, möchten wir zuerst eine kurz gefaßte Über-
sicht von den Änderungen, welche die Auffassungen über die Ver-
teilung und Bindung des Blutzuckers in den letzten Jahren
mitgemacht haben, hier mitteilen; waren ja selbstredend diese
Auffassungen für unsere Untersuchung von größter Wichtigkeit.

Neuere Ergebnisse über den Blutzucker.
l. Untersuchungen der letzten Jahre haben es wohl klar-
gelegt, daß beim Menschen und den bekannten Laboratoriums-

1) Le liquide cephalo-rachidien 1912.
2) Ann. d’oculist. 154. 1917.

3) S. van Creveld, Verslag Physiologendag 16. XII. 1920, Amster-
dam. Nederlandsch. Tijdsehr. v. Geneesk. 2. Hälfte, 783. 1921.

Biochemische Zeitschrift Band 123. 13

194 J. de Haan und SN. van Creveld:

tieren (Frosch, Kaninchen) im strömenden Blute die roten Blut-
körperchen höchstens winzige Quantitäten an Glucose enthalten
können und wahrscheinlich völlig zuckerfrei sind!). Zugleich
haben diese Untersuchungen gelehrt, daß schon durch gering-
fügige Manipulationen, wie Defibrinieren, Gerinnung, Zusatz
von gerinnungshemmenden Substanzen eine Änderung der
Permeabilität stattfindet, wodurch sehr schnell ein erheblicher
Teil des Plasmazuckers in die Blutkörperchen überwandert.

Aus diesem Grunde sind eigentlich alle früheren vergleichen-
den Bestimmungen des Zuckers im Blute und anderen Organ-
flüssigkeiten nur von sehr beschränktem Werte, indem dabei
diesen Fakten nicht genügend Rechnung getragen wurde. Es
wurde immer das Gesamtblut oder ein Blutplasma oder auch
Blutserum untersucht, dessen Zuckergehalt mehr oder weniger
geringer war als im strömenden Plasma. Wo die Größe der Ab-
nahme sehr verschieden ausfällt, ist es nicht möglich, dafür eine
Korrektion anzugeben. Und selbstredend kommt nur der wahre
Gehalt des Plasmas an Zucker für vergleichende Untersuchungen
mit anderen Organflüssigkeiten in Betracht. Nur mit dieser
wichtigen Einschränkung konnten wir die Angaben der Literatur,
welche wir im weiteren mitteilen werden, verwenden. Und selber
mußten wir möglichst dafür Sorge tragen, daß wir nur den richtigen
Plasmawert und nichts anderes bestimmten.

2. Dann ist der Blutzuckergehalt eines Tieres keine konstante
Größe, sondern sehr erheblichen Schwankungen in kurzer Zeit
(durch Nahrung, Schrecken usw.) ausgesetzt; es gibt also für ein
bestimmtes Tier keinen festen Blutzuckerwert, und möglichst
gleichzeitige Bestimmungen im Blute und den anderen Körper-
flüssigkeiten konnten deshalb für unseren Zweck nur in Betracht
kommen.

3. Das dritte in Betracht kommende Problem haben wir als
unseren Ausgangspunkt schon gestreift: Gibt es einen sogenannten
„gebundenen Blutzucker“ ? Steht ein größerer oder kleinerer
Teil des Blutzuckers im engeren Verhältnis zu einem oder mehreren
der Kolloide des Plasmas? — Die Frage des Bestehens eines

1) Siehe u. m. R. Brinkman und E. van Dam, Arch. internat. de
physiol. 15, 105. 1919. — S. van Creveld und R. Brinkman, Zittings-
verslag Koninkl. Acad. van Wetensch., 17. Dez. 1920. Daselbst auch weitere
Literaturangaben.

Blutplasma und Gewebeflüssigkeiten. 195

Sucre virtuel (Lépine u. a.) schien durch die Untersuchungen
von Abel!), von Hess und Mc Guigan?) und von Rona und
Michaelis?) gelöst in dem Sinne, daß der totale Plasmazucker
frei im Plasma vorhanden sei. Der Befund van Crevelds, zur
selben Zeit auch von Rusznyak®) beschrieben, zeigt jedoch, daß
dies nicht zutreffen kann; beide fanden, daß ein erheblicher Teil
des Zuckers im Serum nicht ultrafiltrierbar ist). Es besteht also
ein Unterschied in der Größe der totalen Reduktion (der Zucker
wurde mit der letzten Bangschen Methode bestimmt) des Plasmas
(Serums) und seines Ultrafiltrates, sei es, daß dieser wirklich von
Glucose oder von anderen reduzierenden Stoffen herrührt. Daß
weder v. Hess und Mc Guigan nach der Methode der Vivo-
diffusion von Abel, noch Michaelis und Rona ein damit über-
einstimmendes Resultat erhielten, ist nicht wunderlich. Haben
doch v. Hess und Mc Guigan mit ihrem Vivodialysat den Zucker-
gehalt des mittels NaF erhaltenen Blutplasmas verglichen. Aus
dem auf S. 193 gesagten folgt aber, daß der Zuckerwert des Fluorid-
plasmas höchstwahrscheinlich niedriger ausfallen wird als im
strömenden Blutplasma. Wenn also diese Autoren für den Zucker-
gehalt des Vivodialysates ungefähr denselben Betrag finden wie
im Fluoridplasma, so sollte man aus diesem Befunde eher auf
einen höheren Gehalt im Plasma des Körpers, d. h. also auf eine
Bindung eines Teiles des Zuckers schließen müssen. Und was die
Ergebnisse Michaelis und Ronas anbelangt, so garantiert die
Methodik eines 48stündigen Dialysierverfahrens sicher weniger
das Bestehenbleiben der Verhältnisse des strömenden Blutes
als die viel schneller wirkende Ultrafiltration. Die beim Ultra-
filtrieren erhaltenen Unterschiede waren meistens so erheblich,

1) Abel, Rowntreeand Turner, Journ. of pharmacol. a. exp. therap.
5, 275 u. 611. 1914.

2) Ibidem 6, 45. 1914.

3) Diese Zeitschr. 14, 476. 1908.

4) Diese Zeitschr. 113, 52. 1921.

5) Es möge in diesem Zusammenhange noch eine Mitteilung von Ham -
burger und Brink man (diese Zeitschr. 88, 103. 1918) Erwähnung finden.
Diese Autoren fanden im hiesigen Institut keine Differenz im Zuckergehalt
zwischen Serum und Ultrafiltrat. Es handelte sich hier jedoch nur um
vorläufige Experimente bei einer Untersuchung, deren Hauptzwecke in
anderer Richtung lagen. Zweifelsohne würden auch Hamburger und
Brinkman bei fortgesetzten Versuchen die meist vorhandene erhebliche
Differenz konstatiert haben.

ro”

196 J. de Haan und S. van Creveld!

daß an Versuchsfehler (Adsorption durch das Filter, Volum des
Eiweißes des Serums) nicht gedacht werden konnte; auch bleibt
der Unterschied nicht nur für die ersten, sondern auch für die
später filtrierten Portionen bestehen. Aus Tabelle I ersieht man,
daß z. B. beim Rinde etwa !/,—!/, des Totalzuckers gebunden ist.

Tabelle I.

E Zucke rgehalt :

Zuckergehalt des |

| ne

des Ultrafiltrates von ! Differenz ` .
Rinderserums Rinderserum | | Differenz

0.139 | 0.065 0,074

0,150 0,086 0.064 Ä

0,136 0,060 1 0,076 |? 0,064

0,128 0,072 0,056 |

0.130 0,081 0,049 |

Wir können vorläufig nicht mit Bestimmtheit sagen, daß der
gebundene Teil der Stoffe, welche die Totalreduktion bewirken,
wirklich Glucose betrifft. Nach den Untersuchungen von Ege!)
jedoch wäre hier kaum an eine andere Möglichkeit zu denken;
hat ja dieser Forscher festgestellt, daß von der Totalreduktion
nur ein winziger Teil auf Rechnung der Restreduktion gestellt
werden darf. Wir werden dann auch den nichtultrafiltrierbaren
Teil der Totalreduktion hier weiter mit dem Namen ‚‚gebundener
Zucker“ bezeichnen. Auch andere Untersucher haben neulich
auf die Wahrscheinlichkeit des Bestehens eines gebundenen
Zuckers hingewiesen, sei es auch nicht auf zwingende Gründe hin.
Kleiner?) verweist auf diese Möglichkeit, da er feststellte, daß
der Zucker aus diabetischem Blute langsamer dialysierte als aus
normalem, nachdem im letzteren durch Zuckerzusatz derselbe
Zuckergehalt hergestellt worden war als im ersten; und Allen?)
meint darauf schließen zu dürfen, weil eine hypodermale Gabe von
Glucose keine Glucosurie verursacht, während nach intravenösem
-Verfahren letztere sofort auftritt; in ersterem Falle sollte der
Zucker auf dem Wege zum Blute von den Gewebezellen in eine
Bindung überführt worden sein.

Da Kammerwasser und Cerebrospinalflüssigkeit fast alle
Eigenschaften eines natürlichen Ultrafiltrates zeigen, war es für

1) Diese Zeitschr. 107, 229. 1920.

2) Journ. of biol. chem. 34, 471. 1918.

3) Siche u. m. Mac Leod, Physiology and Biochemistry in modern
Medicine, 1920, S. 693.

Blutplasına und Gewebeflüssigkeiten. 197

uns angezeigt, beim Studium des Zuckerwechsels erst zu erforschen,
ob auch hinsichtlich des gebundenen Zuckers diese Flüssigkeiten
sich wie ein Ultrafiltrat des Blutes verhalten und ob umgekehrt
dadurch die Annahme eines gebundenen Zuckers auch im strömen-
den Plasma Bestätigung erhalten konnte. Diese Frage werden
wir für Kammerwasser und Cerebrospinalflüssigkeit gesondert
behandeln, aber erst im kurzen die von uns befolgte Methodik
angeben.

Methode.

Als Versuchstiere verwendeten wir Kaninchen. Das Kammer-
wasser wurde in leichter Weise durch direktes Einstechen eines capillar
zugespitzten Glasröhrchens durch die vorher cocainisierte Cornea erhalten.
Durch dieselbe Öffnung läßt sich auch nach einigen Minuten das eiweiß-
reiche sekundäre Kammierwasser, das die Kammer schnell wieder anfüllt,
entnehmen.

Schwieriger gestaltete sich die Abnahme der Cerebrospinalflüssigkeit.
Es handelte sich um einen Vergleich mit dem Blute unter verschiedenen
Umständen, und deshalb sollte vor allen Dingen die Entnahme am lebenden
Tier stattfinden, und zugleich das letztere infolge dieser Operation nicht
sofort eingehen. Eine gewöhnliche Lumbalpunktion ist beim Tiere aber
äußerst schwierig. Wir entschlossen uns für eine Operation, welche sich
unter Lokalanästhesie (ohne Adrenalin) anstellen läßt: Mittels Median-
schnitt werden die Haut und Muskulatur des Nackens beim auf dem Bauch
festgebundenen Tier in der Gegend des Atlas gespalten bis auf die Processus
spinosi der oberen Halswirbel; darauf wird mit einem der schon erwähnten
Glascapillaren das Ligament zwischen Atlas und Hinterhauptsbein durch-
gestochen, also in der Gegend des 4. Ventrikels; unter langsamem Zurück-
ziehen des Röhrchens sieht man meistens eine genügende Menge der Flüssig-
keit schneller oder langsamer in das Röhrchen emporsteigen. Es verdient
Empfehlung, erst durchzustechen, nachdem das Tier zuvor in eine Stellung
mit gehobenem Hinterkörper gebracht worden ist, damit mit mehr Sicher-
heit ein positiver Druck der Flüssigkeit erwartet werden kann. Nur selten
wurde als Folge der Operation eine vorübergehende Lähmung oder Ataxie
beobachtet. Wenn man nach der ersten Entnahme an einer oder 2 Stellen
die Haut vorläufig schließt, kann man nach bestimmter Zeit (z. B. unter
künstlich veränderten Umständen) die Punktion wiederholen.

Die Blutentnahme wurde möglichst zur selben Zeit als die Entnahme der
ebengenannten Flüssigkeit vorgenommen. Wir verfolgten dabei die Metho-
dik, wie sie einer von uns!) für das Erhalten eines einwandfreien Blutplasmas
verwendet hat: Nach Eröffnung einer Ohrvene durch Punktion füllt man
möglichst schnell ein kleines kurz vor dem Versuch paraffiniertes Gilas-
röhrchen von 0,5--0.75 cem Gehalt mit einigen Tropfen Blut und zentri-
fugiert unmittelbar während etwa einer Minute; das noch flüssige Plasma

1) S. van Creveld, Le

198 J. de Haan und S. van Creveld:

wird schnell mit einer paraffinierten Pipette abgesogen und in Doppel-
proben, ebenso wie das Kammerwasser und die Cerebrospinalflüssigkeit,
auf die vorher gewogenen Bangschen Papierstreifen gebracht; diese werden
sofort wieder gewogen und dann nach dem zuletzt beschriebenen Bangschen
Verfahren der Zuckergehalt bestimmt. Es scheint uns nicht überflüssig,
hier zu erwähnen, daß wir mit der Bangschen Methode immer gute Re-
sultate erreichten; es wurde jedoch bei jeder Serienbestimmung zugleich
eine Kontrollbestimmung von Glucose 0,1 proz. und auch eine Blindtiter-
bestimmung der Thiosulfatlösung ausgeführt; solches war nötig, weil der
Titer der Thiosulfatlösung nicht konstant bleibt.

In der Mehrzahl der Fälle wurde auch von allen Flüssigkeiten der
Eiweißgehalt refraktometrisch mittels des Abbeschen Refraktometers
bestimmt.

Eine Adrenalinhyperglykämie wurde dureh subeonjunctivale Injektion
meistens in 2 Tempos, von 0,5—0,75 cem einer l promill. Adrenalinlösung
hervorgerufen.

Für die Ultrafiltration kleiner Serummengen verwendeten wir immer
ein kleines Ultrafilter nach De Waard [siehe Arch. Neerl. de Physiol.
II, 530. 1918].

Zuckergehalt des Kammerwassers.

In der Literatur findet man mehrere Angaben über den
Zuckergehalt des Kammerwassers; meistens werden [so u. m. von
Osborne!)] Werte mitgeteilt, welche mit dem des Blutzuckers
übereinstimmen. Schon auf S. 194 haben wir mitgeteilt, daß der-
artige annähernde Angaben für uns keinen Wert hatten, indem
der Zuckergehalt des Blutplasmas, womit verglichen werden
sollte, niemals einwandfrei bestimmt wurde. Selbst die sehr aus-
führliche, vorzügliche Arbeit von Ask?), in welcher auch ver-
gleichende Untersuchungen über den Zuckergehalt im Blute und
Kammerwasser in normalem und künstlich geändertem Zustande
mitgeteilt werden, lieferte uns keine Ergebnisse, welche wir ohne
weiteres benützen konnten; weder das Prinzip des gebundenen
Zuckers, noch die Fehler, welche den Zuckergehalt des unter-
suchten Blutplasmas herabsetzen könnten, konnten damals berück-
sichtigt werden. Fernerhin werden wir schen, daß, wenn man diese
Fehler in Anspruch nimmt, die Ergebnisse Asks meistenteils
gut mit den unsrigen übereinstimmen, wenn auch dieser Autor
zu anderen Schlußfolgerungen kommt. Bei der Kritik unserer
Resultate werden wir Gelegenheit haben, darauf näher zurück-
zukommen.

D Journ. of physiol. 5%, 318. 1919.
2) Diese Zeitschr. 39, 1. 1914.

een

Blutplasma und Gewebeflüssigkeiten. 199

In Tabelle II finden sich sämtliche vergleichenden Zucker-
bestimmungen von Kammerwasser und gleichzeitig erhaltenem
Blutplasma (Zeitdifferenz höchstens etwa 10 Minuten) zusammen-
gestellt.

Tabelle II.
Zuckergehalt des Zuckergehalt des gleich- |
Blutplasmas zeitig abgenommenen Differenz Mittlere Differenz
(Ohrvene Kaninchen) Kammerwassers |
0,20 | 0,19 +001 N
0,28 | 0,19 +0,09
0,20 0,15 +0,05
0,20 0,19 +0,01
0,28 0,16 +0,12
0,27 0,21 | +0,06
0,24 0,22 +0,02
0,22 0.19 | +0,03
0,25 0,17 -+ 0,08 0.86
0,20 0,19 +0,01 Ke 0,045°/,
0.22 0.19 40,03
0,21 0,19 +0,02
0,26 | 0,24 +0,02
0,32 0,25 +0,07
0,22 0,18 +0,04
0,19 0,08 | +0,11
0,12 | 0,05 | +007
0,26 | 0,28 — 0,02
0.19 | 0.15 | +004

Es war von vornherein zu erwarten, daß man hier nicht den-
selben Unterschied im Zuckergehalt finden würde als zwischen
einem Serum (Plasma) und dessen Ultrafiltrat in vitro. Erstens
ist allem Anschein nach im Auge vielmehr von einem Dialysat
als von einem Ultrafiltrat die Rede, ist ja wahrscheinlich in nor-
malen Verhältnissen eine nennenswerte Flüssigkeitsströmung im
Auge kaum vorhanden [Weiss!), Hamburger?)]. Ein etwa vor-
handener Unterschied im Zuckergehalt zwischen Blut und Kammer-
wasser muß also durch Diffusion ausgeglichen werden. Der primär
sich ändernde Faktor ist hier der Blutzucker, der täglich und
stündlich hin und her schwankt; wir haben also kein konstantes,
sondern ein veränderliches Filtrans, und das Dialysat folgt durch
ausgleichende Diffusion diesen Änderungen von ferne nach.
Wo ziemlich große Schwankungen im Blutzuckergehalt sich in
kurzer Zeit vollziehen können, läßt sich erwarten, daß das Kammer-
wasser solchem schnellen Wechsel oft nicht sofort folgen kann.

1) Nagels Handbuch der Physiologie des Menschen III, S. 458 usw.
2) Die Ernährung des Auges. Leipzig 1914.

200 J. de Haan und S. van Creveld:

Es wird also Augenblicke geben, wo nach schneller Steigerung
des Blutzuckergehalts ein etwa vorhandener Durchschnittsunter-
schied mit dem Kammerwasser abnormal hoch ausfällt; bei
schneller Verringerung jedoch zeitweise völlig verschwinden kann,
ja selbst für kurze Zeit die umgekehrten Verhältnisse sich finden
können. Wenn jedoch ein konstanter Faktor vorhanden ist, der
dahin wirkt, daß der Zuckergehalt des Plasmas ein höherer sei
als der des Kammerwassers, so wird ein solches sofort aus den
Mittelwerten einer großen Zahl gesonderter Bestimmungen sich
zeigen müssen.

Aus der Tabelle II ersicht man, daß wirklich der mittlere
Wert des Kammerzuckers deutlich (um einen Betrag von etwa
0,045°,) hinter dem des Blutplasmas aus der Ohrvene zurückbleibt.
Wie auf S.192 hervorgehoben wurde, könnte solches sowohl von
einem Mangel an Diffusionsfähigkeit eines Teiles des Zuckers
(also vom gebundenen Zucker) als von einem Zuckerverbrauch
im Kammerwasser herrühren; dieser Verbrauch wird jedoch aller
Wahrscheinlichkeit nach bei der geringen Vitalität der Gewebe
um die Augenkammer herum nur unbedeutend sein.

Bei den zahlreichen Bestimmungen wurde nur einmal ein
(sehr wenig) höherer Gehalt im Kammerwasser gefunden; sämt-
liche andere Zahlen sind niedriger als im Blutplasma. Wir können
also sagen, daß dieser Befund die Auffassung, daß ein
Teil des Blutzuckers gebunden ist, verstärkt, und
umgekehrt für die Auffassung des Kammerwassers
als eines Dialysates des Blutes spricht.

Dieser Auffassung, daß der gebundene Teil des Blutzuckers
dem Kammerwasser fernbleibt, wird noch mehr Stütze gegeben,
wenn man mit dem Blutplasma auch das schnell sich regenerierende
sckundäre Kammerwasser vergleicht. Wie bekannt, steht diese
letzte Flüssigkeit, wenigstens beim Kaninchen, in einem viel direk-
terem Kontakt mit dem Blutplasma; sie zeigt schnelle Gerin-
nung, der Eiweißgehalt ist hoch. Wessely!) gibt dafür Werte
von 1—2°%,; wir fanden ebenso wie Hagen?) auf Grund unserer
refraktometrischen Bestimmungen viel höhere Beträge von etwa

1) Ergebn. d. Physiol. 4 (I), 565. 1905.

2) Klin. Monatsbl. f. Augenheilk. 64, 187. 1920. Über das abweichende
Verhalten des Menschenauges siehe auch Seidel, Graefes Arch. f. Ophthalm.
104, 162. 1921.

Blutplasma und (Gewebeflüssigkeiten. 201

3—5°%,; bei der dritten Punktion ist der Eiweißgehalt wiederum
im allgemeinen höher als bei der zweiten, wahrscheinlich dadurch,
daß nach der ersten Punktion die sich regenerierende Flüssigkeit
für einen nicht unwichtigen Teil durch Zuströmung aus der eiweiß-
freien Glaskörperflüssigkeit gebildet wird, während nach der
zweiten Punktion dies weniger der Fall sein wird. Offenbar wird
bei der plötzlich sich einstellenden großen Druckdifferenz das
Blutplasma durch die gelockerten Membrane hindurchgeschickt,
während nur die Formelemente zurückbleiben.

Es zeigt sich nun (Tabelle III), daß auch hinsichtlich seines
Zuckergehaltes dieses sekundäre Kammerwasser in schöner Weise
dem Blutplasmazuckergehalte sich nähert; daß also mit den

Tabelle III.

e i 1 Zei IT iv.

Sum: Blutplasma Zeit Foa Zeit re Blutplasma
mer deel am Anfang des [zwischen zn i zwischen] Sekundäres am Ende des
Kanin- Versuches e Versuches
chens [Zucker- Refrak- Í Zucker- | Refrak- Zucker- 'Refrak-
8 gehalt tion [Minuten | gehalt ' tion Minuten | gehalt | tion

nee Tine er E ee HI I - I L en

l 9,20 — _ —

RL 0,20 0,15 .1,33: 0,21 | 1,3458

3 — 0,19 1,33: 0,20 ! 1,3461

4 | 0,28 0,16 1; 0,21 ` —

5 1097 021 0,29 1,3472

t — OI 0,22 1,3468

T | 0,24 0,22 | 0,30 | 1,3472

s [019 0.08 11, 2,

9 0,12 0,05 `

BlutkolloidenauchdergebundeneZuckerinderregene-
rierten Flüssigkeit vorhanden ist.

Die in Tabelle III gegebenen Zahlen betrachtend, soll man
nicht vergessen, daß durch nervöse Reize (physiologische Sym-
pathicusreize nach Bang) während eines Versuches der Blut-
zuckergehalt beim Kaninchen nicht unerheblich zunimmt. Da
zwischen Spalte I und III meistens ein Zeitraum von 20—30 Min.
liegt, kann es nicht wundern, daß der Zuckergehalt im sekundären
Kammerwasser (Spalte III), wie auch die Tabelle deutlich aus-
weist, oft nicht mehr dem des ursprünglichen Blutplasmas
(Spalte I) gleichzustellen ist, sondern dem des nachher entnom-
menen Blutplasmas (Spalte IV).

Wenn wir nun fragen, wie der gefundene mittlere Unterschied
von etwa 0,045°,, sich zu dem Werte verhält, um welchen der

202 J. de Haan und S. van Creveld:

Zuckergehalt des Kaninchenserums höher ist als der des Ultra-
filtrates desselben, so sehen wir aus einigen in Tabelle IV gegebenen
Bestimmungen, daß der gebundene Zucker ziemlich großen
Schwankungen unterliegt, im Mittel jedoch etwa 0,075°%, beträgt;
wegen der nur wenig zahlreichen Bestimmungen und der großen
Abweichungen vom Mittelwert kann man letzteren jedoch nicht
als genau betrachten. Nach Analogie mit den Werten beim Ultra-
filtrieren von Rinderserum erhalten, wird dieser Wert jedoch
nicht zuviel von der Wirklichkeit abweichen und es scheint also,
als ob die auf Grund des Dialysates in vivo (Kammerwasser)
gefundene Zahl von 0,045 nicht unerheblich hinter dem beim
Ultrafiltrieren sich zeigendem Werte von 0,075 zurückbleibt.
Eine nähere Betrachtung lehrt jedoch, daß dieser Unterschied
nur scheinbar ist. Unsere mitgeteilten Plasmawerte stammen ja
von einem venösen Blute aus der Ohrvene, und bekannterweise
ist im allgemeinen der Blutzuckergehalt der Körpervenen niedriger
Tabelle IV.
Zuckergehalt des Zuekergehalt des |

Kaninchenserums Ultratiltrates | Differenz
(aus Plasma erhalten) | dieses Kaninchenserums

Mittlere Differenz

0,36 | 028 0.08

0,47 o4] 0.08 |

0,27 db 0.12 | 9,52 et
0.30 OS 0.12 = N
0.22 0,19 0.03 | y

024 0.22 (1) I

e 0,16 0.09

als der arterielle wegen des (variierenden) Zuckerverbrauches
in den verschiedenen Organen. Ein einfacher Versuch lehrte uns,
daß dies wirklich zutrifft, wie aus Tabelle V erhellt, wo in zur selben
Zeit entnommenen Blutvolumina aus A. carotis und der Vena
jugularis posterior des Kaninchens (mittels angebundener Kanüle
entleert) der Blutzuckergehalt bestimmt wurde.

Nebenbei zeigte sich dabei, daß sowohl im rein venösen als
im arteriellen Blut die Blutkörperchen zuckerfrei sind, und durch
gleichzeitige Untersuchung des Ultrafiltrates, daß
der verminderte Zuckergehalt des venösen Plasmas
nurdenfreien Zucker betrifft; die Werte für den gebundenen
Zucker sind cher erhöht. Daraus kann also geschlossen werden,
daß der freie Teil des Zuckers fortwährend verbraucht

wird.

Blutplasma und Gewebeflüssirkeiten. 203

Tabelle V.

Vergleichende Zuckerwerte für arterielles und venöses Blut.

Nummer Es eer Blut aus V. facialis | Blut aus A. carotis
3 des in beiden Bluta P post. (etwa l2ccm) | (etwa 12 ccm)
Kaninchens |' o o;
1 | Blutkörperehenvolumen 32 | 29
Blutzucker des totalen Blutes 0,24 | 0,31
| Plasmazucker daraus berechnet | 0,36 0,45
' Plasmazucker bestimmt | 0,36 0,45
i Zuckerrehalt des Serums aus 0,36 0,47
Plasma erhalten Ä |
Zucekergehalt des Ultrafiltrates 0,28 0,41
dieses Serums |
| Menge des gebundenen Zuckers | 0,08 0,00
' Refraktion des Serums 1,3449 1,3439
2 : Zuckergehalt des Serums aus 0,27 0,30
| Plasma erhalten |
Zuckerrehalt des Ultrafiltrates | 0,15 0,18
dieses Serums
Menge des gebundenen Zuckers | 0,12 0.12
3 . Zuckergehalt des Serums aus | 0,22 0,24
\ Plasma erhalten |
Zuckergehalt des Ultrafiltrates | 0,19 0,22
; dieses Serums | |
, Menge des gebundenen Zuckers | 0,03 | 0,02

Zwischen venösem und arteriellem Blute finden wir nun
0,11 + 0,03 +- 0,02
on =
ein Wert, welcher, wenn auch nicht genau, keineswegs zu vernach-
lässigen ist. Wo nun das arterielle (capillare) Blut sozusagen
den Stoß zum Auswechsel mit den Geweben gibt, und das venöse
Blut nur das Resultat dieser Wechselwirkung ist, sollte man
für den Vergleich mit dem Kammerwasser auch besser das arterielle
Blut nehmen; dieses ist an einem bestimmten Augenblick für
den ganzen Körper konstant, das venöse Blut variiert auch in
seinem Zuckergehalt nach den verschiedenen Organen, aus denen
es herstammt; das Blut aus einer Ohrvene hat zur selben Zeit
wahrscheinlich einen anderen Zuckergehalt als das venöse Nieren-

einen mittleren Unterschied von

= 0,05%;

blut, und könnte man das rein venöse Blut entnehmen, das nur
von den Geweben um die vordere Augenkammer herrührt, so
würde dessen Zuckergehalt der genaue Spiegel des (wahrscheinlich
geringen) Zuckerverbrauches dieser Gewebe sein. Wir müssen
also dem gefundenen Unterschied von 0,045°, zwischen Blut-

plasma- und Kammerwasserzucker den Betrag zufügen (sagen wir

204 J. de Haan und S. van Creveld:

0,05°,), um welchen der Zuckergehalt des venösen Blutes des
Ohres geringer ist als der des arteriellen, und bekommen dann
den Wert, um welchen der Kammerzuckergehalt hinter dem des
arteriellen Blutes, mit welchem es in Wechselwirkung steht,
zurückbleibt. Wir finden also bei der Ultrafiltration
in vitro und beim Dialysat in vivo gut übereinstim-
mende Beträge für den gebundenen Zucker.

Wie steht es nun mit der Diffusionsschnelligkeit des Plasma-
zuckers in das Kammerwasser hinein, wenn durch Adrenalin-
injektion eine starke Hyperglykämie hervorgerufen wird? Ein
Ultrafiltrationsversuch, in Tabelle VI zusammengefaßt, lehrt, daß
die Steigerung des Zuckergehaltes bei dieser Hyper-
glykämie nur den freien Zucker betrifft; die Menge des
gebundenen Zuckers ändert sich nicht nennenswert. In dem-
selben Versuch wurde auch die Zuckerzunahme im Vivodialysat
(Kammerwasser) nach dieser Adrenalininjektion bestimmt, und
man sieht, daß etwa 2 Stunden nach der ersten Injektion, also im
Augenblick, wo erfahrungsgemäß schon während längerer Zeit
die maximale Hyperglykämie besteht, der Zuckergehalt des
Kammerwassers zwar stark zugenommen hat, aber noch bedeutend
hinter dem eines Blutultrafiltrates zurückbleibt.

Tabelle VI.

Steigerung des Zuckergehaltes etwa 2 Stunden nach Adrenalininjek-
tion im Blutplasma, dessen Ultrafiltrate und im Kammerwasser.

Zuckergenhalt
etwa 2 Stunden nach
i der Adrenalininjektion

Untersuchte Flüssigkeit k Zuckergehalt vor

Blutserum e, 0.25 | uel
Ultrafiltrat dieses Blutserums . 0.16 | 0.54
Primäres Kammerwasser . .. 0.24 | 0,44

Aus Tabelle VII, wo aus einer größeren Versuchsreihe die
Werte für Kammerwasser und Plasma vor und etwa 2 Stunden
nach der Adrenalininjektion zusammengestellt sind, sehen wir im
allgemeinen dasselbe; es sei bemerkt, daß überall, wo in Spalte I
die Werte des Plasmazuckers nach der Adrenalininjektion nicht
angegeben sind, man statt deren ebensogut den Zuckergehalt des
wohlbestimmten sekundären Kammerwassers nehmen kann.
Wir schen, daß zwar der Zuckergehalt im Kammerwasser im

Blutplasma und (Grewebeflüssigkeiten. 205

allgemeinen schnell zunimmt, aber dennoch mehr hinter dem
des Plasmas zurückbleibt, als auf Grund der Menge des gebundenen
Zuckers erwartet werden konnte.

Tabelle VII.
Steigerung des Zuckergehaltes im Blutplasma und im Kammerwasser
etwa 2 Stunden nach Adrenalininjektion.

L II. :
Xum- Zuckergehalt des Zuckergehalt des pri- Zuckergehalt des sekun-
mer des Blutplasmas mären Kammerwassers dären Kammerwassers
Kanin- vor der | etwa 2 Std. vor der | etwa 2 Std. vor der etwa 2 Std.
chens | Adrenalin- | nach der Ad-| Adrenalin- . nach der Ad-| Adrenalin- | nach der Ad-
injektion | renalininjekt. injektion renalininjekt. injektion renalininjekt.
N 021 | 0682 0,19 | 0,40 — | 063
2 0,26 (,66 0,24 0,44 = =>
3 019 TI 08 | 02 0,15 | 08
4 0,19 | = 015 10 0,20 | 0,36
5 0,12 —- 0,05 | 0,20 0,15 | 0,39
6 0,26 eh 0,28 0,49 0,26 | 0,52

Zwar gibt es auch Fälle (Nr. 3 und 6), wo die Übereinstimmung
eine viel bessere ist. Daß die Resultate nicht immer genau über-
einstimmen, wird verständlich, wenn man bedenkt, daß die Verhalt, `
nisse nach Adrenalininjektion etwas kompliziert sind; es bildet
sich nicht nur eine Hyperglykämie, sondern zugleich tritt auch
eine maximale Gefäßverengerung auf während einer nicht immer
gleich langen Zeit; meistens dauert diese aber wahrscheinlich weni-
ger lang als die Hyperglykämie, was aus dem eigentümlichen Ver-
halten des Eiweißgehaltes im sekundären Kammerwasser ersichtlich
ist. Wessely!) wies schon nach, daß letzteres sich nach Adrenalin-
injektion durch sehr geringen Eiweißgehalt auszeichnet, und solches
infolge der Gefäßverengerung. Nun schen wir aus dem ausführlichen
Protokolle in TabelleVIII vomVerlauf einiger Adrenalininjektionen,
daß der Eiweißgehalt im sekundären Kammerwasser etwa eine halbe
Stunde nach der Adrenalininjektion noch minimal ist (Kaninchen 1),
jedoch an späteren Zeitpunkten, oft schon kurze Zeit nachher (Ka-
ninchen 2 usw.) schon wieder hoch ausfällt. In Einklang damit
können wir erwarten, daß während der (wechselnd langen) Dauer
der maximalen Gefäßverengung auch die Diffusionsschnelligkeit
eine sehr geringe sein wird; die noch sehr geringe Zunahme des
Kammerwasserzuckers im Fall 1, Tabelle VIII, wo schon längst
der Plasmazuckerwert sehr hoch ist, weist darauf auch hin.

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J.de Haan und S. van Creveld

206

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207

Blutplasma und Gewebeflüssigkeiten.

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~+

208 J. de Haan und S. van Creveld:

Durch eine wechselnd schnelle Diffusionsgeschwindigkeit, die
infolge der verschiedenen Dauer der Gefäßverengerung anzunehmen
ist, lassen sich unsere Resultate miteinander gut in Einklang bringen:
es wird nicht immer, ja nur selten, gelingen, den Zeitpunkt bei
der maximalen Hyperglykämie zu treffen, wo der Zuckergehalt des
Kammerwassers dem des Ultrafiltrates gleichgekommen ist.

Aus dem Protokoll in Tabelle VIII sieht man, daß die maxi-
male Hyperglykämie nach 2—3 Stunden wieder abzuklingen
anfängt; auch diese Abnahme wird etwas verspätet (Fall 6 und 7)
vom Kammerwasser befolgt, und im Fall 7 konnte der Moment
getroffen werden, wo infolgedessen für kurze Zeit der Plasma-
zuckergehalt schon niedriger war als im Kammerwasser.

Fall 3 und noch schöner Fall 4 illustrieren in frappanter Weise
den Einfluß der Diffusionsschnelligkeit. Im rechten Auge hatte
sich schon gerade vor der Adrenalininjektion ein sekundäres
Kammerwasser mit hohem Eiweißgehalt gebildet. Infolge der
Adrenalingabe diffundierte in dasselbe nun langsam der Zucker
aus dem hyperglykämischen Plasma hinein. Als 2 Stunden nach
der Adrenalininjektion (Fall 4) punktiert wurde, war im sekun
dären Kammerwasser des rechten Auges der Zuckergehalt deut-
lich höher als im primären Kammerwasser des linken Auges
(0,5 und 0,425), offenbar infolge des im rechten Auge vorhandenen
gebundenen Zuckers; dennoch blieb er deutlich hinter dem des
Plasmas (> 0,6) an diesem Augenblick zurück; daß dies wirklich
auf langsamer Diffusion beruhen muß, sieht man aus dem Werte
für das sekundäre Kammerwasser des linken Auges, welches, in
einigen Minuten hineingeströmt und in seinem Zuckergehalt mit
dem des gleichzeitigen Plasmas völlig übereinstimmt (0,63°,).

Zusammenfassend können wir also sagen, daß der mittlere
Zuckergehalt des normalen Kammerwassers um einen
ziemlich großen Betrag niedriger ist als der des Blut-
plasmas; daß aus Adrenalinversuchen ersichtlich ist,
daß eine Zunahme des Plasmazuckers schnell in das
Kammerwasser hineindiffundiert, aber in der ersten
Zeit infolge der durch Adrenalin hervorgerufenen
Gefäßverengerung wahrscheinlich langsamer als unter
normalen Verhältnissen. Der Zuckergehalt im sekun-
dären Kammerwasser ist ziemlich genau derselbe als
im Plasma zu gleicher Zeit.

Blutplasma und (ewebeflüssigkeiten. 209

gel

Wenn wir mit diesen Resultaten die Ergebnisse der schon er-
wähnten Arbeit von Ask vergleichen, so zeigen sich beim
ersten Blicke bemerkenswerte Unterschiede. Ask vermeldet
erstens, daß der Zuckergehalt des Kammerwassers dem des Blut-
plasmas gleichzustellen ist und höher ist als der des totalen
Blutes. Wir sind überzeugt, daß dieser Befund seinen Grund hat
in den zu niedrigen Plasmawerten Asks, wo der Zuckergehalt
zweifelsohne schon verringert war (siehe S. 198). Nicht beistimmen
können wir der zweiten Schlußfolgerung Asks, daß im sekundären
Kammerwasser der Zuckergehalt dem des primären gleich ist;
dafür sind unsere Zahlen in Tabelle III und auch in Tabelle VIII
zu deutlich; der Vergleich mit Plasmawerten, an verschiedenen
Zeitpunkten entnommen, macht es durchaus unmöglich, an eine
während des Versuches eintretende Hyperglykämie zu denken.
Es scheint uns von Bedeutung, dies zu betonen, da die Frage des
gebundenen Zuckers hiermit in engster Weise zusammenhängt;
wären primäres und sekundäres Kammerwasser von gleichem
Zuckergehalt, so würde solches dem Bestehen eines gebundenen
Zuckers eine Stütze nehmen.

Ebenso wie wir konnte auch Ask feststellen, daß der höhere
Zuckergehalt im Kammerwasser nach Adrenalininjektion meistens
deutlich hinter dem des Plasmas zurückbleibt. Ask läßt die
Möglichkeit offen, daß wir es hier mit einer zweckmäßigen Wirkung
zu tun haben, damit die höheren Plasmazuckerkonzentrationen
von den Augenflüssigkeiten fernbleiben. Wir haben klargelegt,
warum unseres Ersehens hier nur wechselnde Diffusionsverhält-
nisse in Betracht kommen werden.

Zuckergehalt der Cerebrospinalflüssigkeit.

Das Gehirnwasser ist gerade in der letzten Zeit vielfach unter-
sucht, insbesondere von amerikanischer Seite. Cullen und
Ellis!) zeigten die fast absolute Übereinstimmung zwischen dem
Ureumgehalt des Blutes und der Cerebrospinalflüssigkeit und
bestätigten dadurch den Befund früherer Autoren. Wasserstoff-
ionenkonzentration und Bicarbonatgehalt sind fast dieselben als
im Blute. Dagegen ist die Konzentration an Harnsäure eine viel
geringere als im Blute [Fine und Myers?), Gradwohl und

1) Journ. of biol. chem. 20, 511. 1915.
2) Proc. of the soc. f. exp. biol. a. med. 13, 126. 1916.

Biochemische Zeitschrift Band 123. 14

Zuckergehalt der normalen Cerebrospinalflüssigkeit im Vergleich mit dei

Num
mer d.
unter-
suchten KÉ li ee es E
Kanin- | Zucker- Refrak- ` [Zucker- Refrak-
chens f gehalt © tion [Minuten | gehalt tion | Minuten | gehalt , tion

-IJ I'he lim

210 J. de Haan und S. van Creveld:

Blaivas!)]. Dieselben Autoren und ebenso Weston?) teilen
auch für den Zuckergehalt des Gehirnwassers Werte mit, welche
nur etwa !/,—?/, von denen des Blutzuckers erreichen; wie andere
Autoren erwähnen sie dabei, daß bei tuberkulöser Meningitis der
Zucker in der Cerebrospinalflüssigkeit oft völlig fehlt; es betraf
hier immer Versuche an Menschen mit verschiedenen Krank-
heiten. Wo hier mit Blutzucker allem Anscheine nach der Zucker
des totalen Blutes gemeint wird, sollte aus diesen Zahlen folgen,
daß im Vergleich mit dem Plasmazucker der Zuckergehalt des
menschlichen Gehirnwassers sehr niedrig ist. Dies weist darauf hin,
daß zumal hier die einfache Angabe, daß der Zuckergehalt des
Gehirnwassers dem des Blutes entspricht [siehe u. m. Mc Leod?)].
gerechtem Zweifel unterliegt und näherer Untersuchung bedarf.
Unsere eigenen Untersuchungen bestätigen für das Kaninchen
den Befund der zuerst genannten Autoren, wie aus Tabelle IX
ersichtlich ist.
Tabelle IX.

des Blutplasmas.

SE u fm

i II e Differenz
Blutplasma Zeit ne Zeit Blutplasma Zwiachen
am Anfang des |zwischen| “Te ’TOSPINA" [zwischen] am Ende des Plasma und | Mittler
Versuches L und ESCH IL. und Versuches

nalflüssig-
keit

Zucker- ; Refrak-

— .— | — fon 1331| 15 [040 Lais 026 |
| — [wir na) 8 | 048 Lä 0,80 |

|

|

0.23 1,3464] Du 0,20 1,3341] 20 0.40 1.3456] 0,20

130 | — 35 0.20 133411 15 0,36 ‚1,3451] 0,16

0,19 | — 25 0.09 133531 — — u + 0.10 =
0,12 ,1,3435| 15 002 1.3334) — Sec 010 |
026 183444] 20 0,17 :1,3338| — 0.26 | — 0,09 |

Die vergleichende Untersuchung mit dem Plasmazucker
gestaltet sich hier etwas schwieriger als beim Kammerwasser;
es dauert ja der Eingriff immer längere Zeit, als die Entnahme des
Kammerwassers fordert: sehr oft finden wir deshalb am Ende
des Versuches einen abnormal hohen Plasmazuckerwert, was
um so mehr zu erwarten ist, als wir hier am Orte des Zucker-
stiches arbeiteten. Da es möglich wäre. daß dieser Zucker nur sehr

1) Newer methods of Blood and Urine Chemistry, 1920, S. 313.

2) Journ. of med. research. 35, 199.

3) Physiology and Biology in modern Medicine 1920.

Cerebrospi- | ` Dittetet?

|
|

Blutplasma und Gewebeflüssigkeiten. 211

langsam ins Gehirnwasser hineindiffundierte, möchten also die
im Fall 1—4 gefundenen Zuckerwerte zu hohe Unterschiede
vortäuschen. Fall 5—7 zeigt jedoch, daß auch im Augenblick,
wo niedrige Plasmawerte gefunden werden, der Zuckergehalt der
Cerebrospinalflüssigkeit viel geringer ist. Möchte auch die mittlere
Differenz ad 0,17%, infolge der zu hohen Werte der ersten Fälle
in Wirklichkeit zu hoch sein, so sieht man dennoch aus Tabelle X,
daß auch dem Kammerwasser gegenüber der Zuckergehalt des
Gehirnwassers deutlich zurückbleibt.

Tabelle X.

Vergleichende Zuckerwerte von Blutplasma, Kammerwasser und
Cerebrospinalflüssigkeit.

Nummer des ` Zuckergehalt | Zuckergehalt des Zuckergehalt der

Kaninchens | des Plasmas | Kammerwassers Cerebrospinalflüssigkeit
1 03 | 0% 0,20
2 012 | 0,05 0,02
3 ' 0,19 Ä 0,15 0,09
4 ‚0,26 0,28 | ‚017

- Für die Erklärung dieses niedrigen Prozentgehaltes würde
eine sehr geringe Diffusionsgeschwindigkeit des Zuckers in das
Gehirnwasser hinein verantwortlich gemacht werden können,
welche einem (selbst eventuell minimalen) Verbrauch nicht gleichen
Schritt halten möchte. Man könnte um so mehr daran denken, da
andere dem Plasma zugefügte krystalloiden Stoffe, wie z. B.
J-Salze, in die Cerebrospinalflüssigkeit im Gegensatz zum Kammer-
wasser gar nicht oder überaus langsam diffundieren?).

Versuche mit Adrenalinhyperglykämie jedoch, in derselben
Weise eingerichtet wie beim Kammerwasser, und auch jetzt gleich-
zeitig mit dem Kammerwasser vorgenommen, lassen keinen Zweifel
übrig, daß die Diffusion des Zuckers hier ebensowenig wie beim
Auge zu wünschen übrig läßt. Aus Tabelle XI ist dies ohne weiteres
deutlich. Wo nach der Adrenalingabe keine Plasmabestimmung
gemacht wurde, kann statt dessen wiederum der Zuckergehalt
- des sekundären Kammerwassers zum Vergleich gewählt werden.

Wir können also sagen, daß der mittlere Zuckergehalt
der Cerebrospinalflüssigkeit beträchtlich hinter den

1) Über die betreffenden Versuche wird in der zweiten Mitteilung
berichtet werden.

14*

212 J. de Haan und S. van Creveld:

Tabelle XI.
Einfluß von Adrenalininjektion auf den Zuckergehalt von Blut-
plasma, Kammerwasser und Cerebrospinalflüssigkeit.

Simmer i ‚ Zuckergehalt | Zuckergehalt etwa
des ii Untersuchte Flüssigkeit normal beim ,2>Stdn. nach Injektion
Kanincliens- ‘ Anfang des von cR. 0,75 cem
i Versuches Il promill. Adrenalin
l ' Blutplasına 0,19 —

© Sekundäres Kammerwasser ` 0,15 0.25

' Primäres Kammerwasser | 0,08 | (1,22

| ('erebrospinaltlüssigkeit | — | 0,18

2 Blutplasma 0,19 | —

1 Sekundäres Kammerwasser ` 0,20 | 0.36
Primäres Kammerwasser 0,15 | 0,25
Cerebrospinalfüssirrkeit 0,09 0,22

3 Blutplasma | 0,12 | —
Sekundäres Kammerwasser | 0,15 ' 0,39
Primäres Kammerwasser | 0.05 0,20
Cerebrospinaltlüssiekeit | 0,02 | 0,17

I

4 ‚, Blutplasma | 0.26 | —
Sekundäres Kammerwasser . v.>6 0.52
Primäres Kammerwasser 0.28 | 0.49
C'erebrospinalflüssigkeit 0,17 | 0,33

Werten des Plasmas und des Kammerwassers zurück-
bleibt. Kammerwasser und Gehirnwasser sind beide nahezu
eiweißfrei; in Salzgehalt, in fast allen Eigenschaften findet man
zwischen beiden die größte Übereinstimmung. Für dasabweichende
Betragen der Cercbrospinalflüssigkeit dem Zucker gegenüber
kann nicht eine geringere Diffusionsgeschwindigkeit des Zuckers
in die Flüssigkeit hinein verantwortlich gemacht werden. Wenn
wir annehmen, daß auf Grund des gebundenen Teiles des Plasma-
zuckers die Cerebrospinalflüssigkeit mit dem Kammerwasser
übereinstimmen sollte, so muß der gefundene Unterschied zwischen
Karmmerwasser und Gehirnwasser anderswo herrühren.

Unseres Ersehens kann die Erklärung keine andere sein als
diese, daß aus dem Gehirnwasser im Gegensatz zum
Kammerwasser der Zuckerverbrauch ein erheblicher
sein muß; es muß dies der Ausdruck der Organarbeit
des Gehirns sein. Die Cerebrospinalflüssigkeit ist ja gewisser-
maßen nichts anderes als die Gewebsflüssigkeit des Gehirnes
(man denke an die perivasculären Lyrmphräume), deren chemische
Zusammensetzung im allgemeinen und deren Zuckergehalt im
besonderen nur entweder von der Seite der einen Membran

Blutplasma und Gewebeflüssigkeiten. 213

(Trennungsmembran mit dem Blute) oder von der anderen Seite
(Gehirngewebe) beeinflußt werden kann. Ein Unterschied mit dem
Blute, der größer als die Menge des gebundenen Zuckers ist, kann
also nur vom Gehirngewebe herrühren; der Verbrauch des Zuckers
von dieser Seite muß so schnell vonstatten gehen, daß der fort-
währende Ersatz durch Diffusion von seiten des Blutes damit nur
im Gleichgewicht ist auf Kosten eines Abfalles in der Zucker-
konzentration. Der Zuckerspiegel in den Gewebeflüssig-
keiten der verschiedenen Organe muß ja unter sonst
gleichen Umständenim umgekehrten Verhältnisstehen
zur Intensität des Zuckerstoffwechsels in den betref-
fendenOrganen,geradeso wieesauch mitder Sauerstoffspannung
der Fall ist. Zwar gibt es über die Intensität des Stoffwechsels im
Gehirne keine feststehenden Daten, aber es wird im allgemeinen an-
genommen, daß derselbe relativ hochist ; jedenfalls aller Wahrschein-
lichkeit nach höher alsin den Geweben um das Kammerwasser herum.

Es wäre verfrüht, hier über die Bedeutung des gebundenen
Zuckers bei diesem Zuckerstoffwechsel viel zu sagen, solange nicht
die Natur des zuckerbindenden Kolloids (Adsorbens?) genauer
bekannt ist. Aus den Versuchen über das Verhalten des freien
und des gebundenen Zuckers im arteriellen und im venösen Blute
scheint hervorzugehen, daß die freie und nicht die gebundene
Fraktion in den Geweben verbraucht wird, oder besser gesagt,
zum fortwährenden Ersatz des fortwährend verbrauchten Zuckers
dient; es ist dies auch auf Grund der schnelleren Diffusion des freien
Zuckers von vornherein wahrscheinlich. Auf der anderen Seite
weist das Bestehen einer gebundenen Form des Zuckers an und für
sich daraufhin, daß auch in den Zellen selbst die gebundene Form
eine Rolle spielen muß, da ja die Kolloide des Blutplasmas cellulären
Ursprungs sind und meistenteils direkte Zellbestandteile sein
werden. Es wäre sehr gut möglich, daß im Gerüste der Zellstruktur
eine Bindung an gewisse Zellbestandteile den weiteren Umsatz (Spal-
tung oder Polymerisation) einleite nach Art einer Fermentwirkung.
Jedenfalls muß ein genaues Studium dieses gebundenen Zuckers
auch hinsichtlich der Diabetesfrage von großer Wichtigkeit sein.

Zusammenfassung.

Wir können die Resultate dieser Arbeit folgenderweise
zusammenfassen:

214 J.de Haan und S. van Creveld: Blutplasına u. Gewebeflüssigkeiten.

l. Bei Kaninchen bleibt der Gehaltan Glucosein Gewebe-
flüssigkeiten, welche nahezu keine Kolloide enthalten
(Humor aquaeus, Cerebrospinalflüssigkeit), als Regel mehr oder
weniger hinter dem des Blutplasmas zurück. Diese Er-
scheinung ist im Einklang mit der Auffassung, nach welcher
diese Flüssigkeiten sich wie ein Ultrafiltrat (Dialysat)
aus dem Blute verhalten, wobei ebenso wie beim Ultra-
filtratin vitroder gebundene Teil des Zuckersim Blute
zurückbleibt.

2. Versuche mit künstlicher Hyperglykämie mittels
Adrenalin zeigten, daß die Diffusionsgeschwindigkeit
des Plasmazuckers in die untersuchten Flüssigkeiten
hinein eine ziemlich rasche ist, und für die Cerebro-
spinalflüssigkeitund das Kammerwasser von derselben
Größenordnung.

3. Beim Kammerwasser ist der Unterschied im Zuckergehalt
dem Blutzucker gegenüber von derselben Größe wie beim Ultra-
filtrat in vitro gegenüber dem Serum. Dassekundäre Kammer-
wasser, das sich schnell nach der Punktion regeneriert, enthält
den größten Teil der Plasmakolloide, und zugleich damit
auch den gebundenen Zucker; sein Zuckergehalt ent-
spricht völlig dem des Plasmas im nämlichen Augen-
blick.

4. Der Zuckergehalt der Cerebrospinalflüssig-
keit ist erheblich niedriger als der des Blutplas-
mas und des Kammerwassers. Dieser Unterschied mit
dem Kammerwasser kann, wo die Diffusionsgeschwindigkeit des
Zuckers dieselbe ist, nur durch einen größeren Zucker-
verbrauch im Gehirne den vorderen Augengeweben
gegenüber erklärt werden.

3. Der Zuckergehalt des Blutes der Vena facialis posterior
ist niedriger als der des zur selben Zeit entnommenen arteriellen
Carotisblutes. Dieser Unterschied kommt ganz auf Rech-
nungdesfreien Zuckers, und daraus kann geschlossen werden,
daß letzterer in den Geweben verbraucht wird.

Auch die durch Adrenalininjektion hervorgerufene Zunahme
des Zuckergehaltes im Plasma ist ganz auf Rechnung des frei
vorhandenen Zuckers zu stellen.

Über das Flockungsvermögen des menschlichen
Blutplasmas.

Von
Wilhelm Starlinger.

(Aus der II. Medizinischen Universitätsklinik in Wien.)
(Eingegangen am 20. Juli 1921.)

Nachdem die Auffassung vom Wesen jener Vorgänge und
Phänomene, die wir im Rahmen der Serologie zusammenfassen,
durch die grundlegenden chemisch-physikalischen Arbeiten von
Landsteiner!), Hirschfeld und Klinger?) und namentlich
von Sachs und seinen Schülern?) in so vielfacher Weise auf
kolloidchemische Grundlagen gestellt wurde, muß es eigentlich
Wunder nehmen, daß bei der experimentellen Forschung zur
Klärung dieser auch heute noch dunklen Fragen nicht auch das
Blutplasma herangezogen wurde. Denn es ist doch ohne weiteres
verständlich, daß Verschiebungen im Rahmen der Eiweißkörper
des Blutes bei Anwesenheit der labilsten Fraktion derselben,
des Fibrinogens, einerseits in ihrem Verlaufe nach anderer Rich-
tung gelenkt werden können, andererseits aber auch in Anbetracht
der exquisiten Labilität dieses Bluteiweißkörpers bei seiner Ver-
wendung als Indicator besonders deutlich in Erscheinung treten
müssen.

Erst in jüngster Zeit haben Sachs und v. Oettingen?), von
ähnlichen Überlegungen ausgehend, das Plasma von schwangeren
und normalen Frauen und von Nabelschnurblut in den Bereich

1) Landsteiner, zusammenfassend, Wien. klin. Wochenschr. 47.
1909.

2) Hirschfeld und Klinger, zusammenfassend, Berl. klin. Wochen-
schr. 25. 1914.

3) Sachs, zusammenfassend, Kolloid-Zeitschr. 1919, S. 24, und Therap.
Halbmonatsh. 14. 1920.

4) Sachs und v. Dettingen, Münch. med. Wochenschr. 1921, S. 12.

216 W. Starlinger:

ihrer Untersuchungen gezogen und dabei Ergebnisse verzeichnet,
die zu weiterer Arbeit auf diesem Gebiete anregen müssen.

Im folgenden soll nun über Versuche berichtet werden, die
ihren Ausgang vom Studium des Agglutinations- und Senkungs-
phänomens der Erythrocyten genommen hatten, wo der EinfluB
des Blutplasmas besonders deutlich zum Ausdruck kommt,
und die geeignet erscheinen, einen Versuch zur Deutung des
Wesens der Fibrinogenflockung im Plasma zu rechtfertigen.

Bei Ausflockung des Plasmas von schwangeren und normalen Frauen
und von Nabelschnurblut durch die gebräuchlichen Methoden der Fibrino-
genfällung konnten Sachs und v. Oettingen ein durchaus differentes
Verhalten in dem Sinne beobachten, daß beim Schwangerenplasma meist
eine dichte und grobe Flockung auftrat, die beim Plasma der normalen
Frau bereits einer Trübung Platz machte und im Nabelschnurplasma
überhaupt völlig fehlte. Analog verhielt sich dazu die Senkungsgeschwindig-
keit der Erythrocyten im Vollblut und die Oberflächenspannung des Plasmas,
indem die Senkungsgeschwindigkeit vom Schwangerenblut über das Normal-
blut zum Nabelschnurblut sich verlangsamte und die Oberflächenspannung
in gleicher Richtung zunahm. Als Ursache dieser Phänomene wurde lediglich
ein labiler bzw. stabiler physikalisch-chemischer Zustand des Fibrinogens
angenommen und der Einfluß seiner Quantität als wenig bedeutungsvoll
von der Hand gewiesen.

So sehr nun für das Auftreten einer Fibrinogenflockung im
Plasma eine künstliche physikalisch-chemische Zustandsänderung
maßgebend werden kann, wie im folgenden noch eingehend
zu zeigen secin wird, so ist doch als von ausschlaggebendster Be-
deutung die Menge des in Reaktion tretenden Fibrinogens anzu-
sehen, namentlich was das unbeeinflußte Citratplasma anlangt,
dessen Verhalten uns die Verhältnisse des einer direkten Prüfung
nicht zugänglichen nativen Plasmas im großen und ganzen wohl
annähernd widerspiegelt. Darauf weist ja schon die Tatsache
hin, daß das Schwangerenplasma sehr viel Fibrinogen enthält,
während das Nabelschnurplasma eines solchen überhaupt fast
gänzlich entbehrt. Weiter ist die Senkung der roten Blutkörper-
chen unmittelbar abhängig von der Menge des Fibrinogens!), und
wenn also Sachs und v. Oettingen einen Parallelismus zwischen
Senkung und Flockungfestgestellt haben, welche Beobachtung auch
ich bei eigenen Untersuchungen machte?), so ist schon dadurch
der Nachweis für die ursächliche Bedeutung der Menge des

IW. Starlinger, diese Zeitschr. 114. 1921, I. Mitteilung.
2) W. Starlinger, diese Zeitschr., II. Mitteilung. Im Erscheinen.

m nn nn

Flockungsvermögen des menschlichen Blutplasmas. 217

Fibrinogens erbracht, ebenso wie auch die stark verminderte
Oberflächenspannung des Schwangerenplasmas für einen hohen
Gehalt an hochmolekularen Bestandteilen spricht.

Dieser Anschauung sollen nun die folgenden Versuche, die
an normalen und kranken Versuchspersonen durchgeführt wurden,
weitere Stützen verschaffen.

Methodik: Das Blut wurde mittels paraffinierter Spritze entnommen
und das Plasma durch Zusatz von 5proz. Natr. citr. im Verhältnis 1:4
(manchmal auch von l proz. Natr. oxal. 1:4) und scharfes Zentrifugieren
gewonnen. Die Ausfällung geschah durch die gebräuchlichen Methoden der
Fibrinogenfällung: durch Zusatz von gesättigter NaCl-Lösung zum Plasma
im Verhältnis von 1:1 oder von halbgesättigter (NH,),SO,-Lösung 1,5 : 3,5
oder durch Erwärmen auf 55° während 5 Minuten. Die Ablesung der Ver-
suchsergebnisse erfolgte in den ersten 5—10 Minuten, da bei weiterem
Warten sich die Unterschiede verwischen können.

Obwohl nun das Flockungsresultat bei allen Fällungsmethoden
analog im Sinne gleicher Differenzen in Erscheinung tritt, so ist doch
der Fällung durch NaCl bei weitem der Vorzug zu geben, da bei
seiner Anwendung die deutlichsten und daher zum Vergleich am
besten verwertbaren Unterschiede zur Beobachtung gelangen, was
seine Ursachen darin findet, daß bei (NH,),SO, und Erwärmen auf
55° die Fällung weit dichter, oft mehr schwaden- als flockenförmig
auftritt und so feinere Unterschiede weniger gut erkennbar
werden. Was die Verwendung des gerinnungshemmenden Salzes
anbelangt, so möchte ich dem Citrat den Vorrang vor dem Oxalat
einräumen, da bei Verwendung des letzteren die Flockung,
obwohl sie die gleichen Ausschläge anzeigt, absolut genommen in
geringerem Ausmaß ausgelöst wird und so ebenfalls weniger
deutlich beurteilt werden kann.

Wenn also tatsächlich das Ausmaß der auftretenden Flockung
einen Gradmesser des quantitativen Fibrinogengehaltes des
jeweiligen Plasmas geben soll, so muß in Reihenversuchen ein
ausgesprochener Parallelismus nachweisbar sein. Dies ist auch
der Fall, wie ich in vielen vergleichenden Bestimmungen des
Fibrinogengehaltes und Flockungsvermögens beobachten konnte.
Tabelle I soll eine solche Versuchsreihe als typisches Beispiel
wiedergeben.

Methodik: Die Blutentnahme erfolgte bei allen in jeweils einer

Versuchsreihe zur Prüfung gelangenden Personen im Verlaufe von 24 Stun-
den, innerhalb welcher Zeit die Fibrinogenbestimmung nach der Methode

218 W. Starlinger:

von Winternitz!) zur Durchführung kam, während die Ausflockung aller
Plasmaproben gleichzeitig nach der letzten Blutentnahme angestellt wurde,
da nur bei gleichzeitigem Vergleich sich feinere Unterschiede der Flockung
objektiv beurteilen lassen; eine spontane Änderung des Stabilisations-
zustandes bei einer Aufbewahrungszeit von höchstens 24 Stunden im Eis-
schrank kann wohl ausgeschlossen werden.

Tabelle I.
Eiweißwert des Eiweißwert des: Gë Ausfall der Flockung:
Nr. Plasmas in Serums in ` Fibrinogen In... 0,2 Citratplasma
% ' % ' o 0,2 ges. NaCl-Lösung
1 8,17 7,70 (0,47 +4
2 7,42 7.03 0,39 +++
3 8,60 8.28 0.32 ++
4 8.99 8.69 0.30 ++
5 8,15 7,85 0,30 +4
6 6,77 6,49 0,28 ++
7 7,70 7.48 (1,22 +
8 8,79 8,58 0,21 +
9 8,09 7,90 0,19 +
10 7,87 7,20 0.17 SS

Bei Betrachtung der Tabelle ist die ausgesprochene Ab-
hängigkeit der Flockung von der Menge des Fibrinogens ohne
weiteres ersichtlich. Bei einem Fibrinogengehalt von unter
0,2°%,, eine Menge, wie sie nach Untersuchungen an unserer
Klinik der Norm entspricht?), ist wohl eine Trübung (+), aber
noch keine Flockung nachweisbar; erst oberhalb dieser Grenze
tritt eine feine Körnelung der Trübung (+) auf, entsprechend
einem Fibrinogengehalte an der oberen Grenze der Norm, die als
deutliche Flockung (+ -+) erst oberhalb von ungefähr 0,3%, wo
also die pathologische Vermehrung des Fibrinogens beginnt, in
Erscheinung tritt, und zwar um so massiver, je gesteigerter der
Fibrinogengehalt sich erweist.

In voller Übereinstimmung mit diesem Ergebnis steht das
stufenweise Schwächerwerden der Flockung bei steigender Ver-
dünnung mit Serum von der gleichen Blutprobe. Denn da eine
physikalisch-chemische Zustandsänderung des Fibrinogens bei
Zusatz von Serum der gleichen Abkunft kaum angenommen
werden kann, andererseits aber sich das Flockungsvermögen
entsprechend den oben angegebenen Grenzen ändert, muß wohl

1) Winternitz, Arch. f. Dermatol. u. Syphilis, Orig. 106. 1910.
2) Frisch, Brauers Beitr. z. Klin. d. Tuberkul. 48. 1921.

Flockungsvermögen des menschlichen Blutplasmas. 219

als Ursache der veränderten Flockung die veränderte Menge des
Fibrinogens angesehen werden.

Tabelle II.

| Citratplasma 0,2 0,15 | O,l | 0,05; —
Versuchs- |} Serum — 005 |01 1015.02
anordnung Fibrinogengehalt in 24, 047 | 035 10,23 0,12) —

| ges. NaCl- SH 0,2 02 102 !02 |02
Ausfall der Flockung . . .....)+t++| ++] +i]

Ebenso gelingt es auch, die Flockung durch Ausschütteln des
Plasmas mit Adsorbentien, die vorzugsweise die grobdispersen
Eiweißkörper adsorbieren, zu verringern oder auch ganz aufzu-
heben, wofür folgender Versuch als Beleg dienen soll.

Methodik: Je 0,5ccm Citratplasma und Citratserum, letzteres aus
ersterem durch Erwärmen auf 55° während 10 Minuten und Abzentri-
fugieren des Fibrinogenniederschlages gewonnen, wurden mit je 0,005 g
Kaolin, Bolus alba und Tierkohle versetzt, mit der Hand gut durchgeschüt-
telt, eine Stunde lang scharf zentrifugiert und die daraufhin abgehobene
klare Flüssigkeit teils zur Anstellung der Flockung, teils zur Bestimmung
des Brechungsvermögens (Pulffrichsches Eintauchrefraktometer) ver-
wendet.

Tabelle III.

| | | Flockungsver-
Citrat- | Geschüttelt SEN ; Citrat- | Geschüttelt ` Brechungs- | mögen des Plas-
Soe mit vermögen | serum mit vermögen | mas: 0,2 Pl.
0,2 ges. NaCl
05 — ee 05l — i 559 ee
05 ` 0005 | 578 0,5 0,005 . 557 | }
Kaolin | | Kaolin
0.5 0.005 | 575 I 05 | 0.005 55,8 4
' Bol. alba l | Bol. alba |
05 | 0,005 57,8 i 0,5 0.005 558 | 4
| Tierkohle ` l Tierkohle |

Während also das Brechungsvermögen des Plasmas durch
Ausschütteln mit den erwähnten Adsorbentien wesentlich sinkt,
ändert sich das des Serums fast gar nicht, so daß es wohl berechtigt
ist, in diesen Substanzen hervorragende Fibrinogenadsorbentien
zu sehen und die verringerte .Flockung auf den verringerten
Fibrinogengehalt zu beziehen.

Nachdem durch diese Versuche die überragende Wichtigkeit
der Quantität des Fibrinogens wohl begründet erscheint, soll
der nun folgende zweite Teil der Untersuchung sich mit den

Gg Versuchs-

> Versuchs- |

Z anordnung

l

= ausedi

| Zusatz

mn
Zj] Citratplasma

ges. NaCl-Lösg
sfall d. Floekune

220 W. Starlinger:

Veränderungen der Flockung bei künstlicher Veränderung des
physikalisch-chemischen Zustandes des Fibrinogens befassen.

Zur Methodik im allgemeinen sei nur bemerkt, daß zwischen dem
flockungsändernden Zusatz und der eigentlichen Ausflockung im allgemeinen
eine Reaktionszeit von einer halben Stunde bei Zimmertemperatur ein-
gehalten wurde.

Ändert man die Reaktion des Plasmas nach der sauren oder
alkalischen Richtung, so erfolgt bei beiden Eingriffen eine aus-
gesprochene Abschwächung der Fällung — vorausgesetzt, daß
bei Zusatz von Säure dieser nicht so stark ist, um an sich schon
fällend zu wirken — und zwar um so ausgesprochener, je ener-
gischer die Reaktionsänderung einsetzt.

E IV.

| 02 | 02 ag
E 0.03 0,03 0.03

Citratplasma 0, 2 ef
"e HCL a/a HCL Se) EC Sait n

„22

ges. NaCl-Lösg. 0,2

Das gleiche Ergebnis ist durch Zusatz von Neutralsalzen
verschiedener Art zu erzielen.. Ich wählte dazu Salze, die in
ihren Kationen und Anionen Gegenpole der Hofmeisterschen
Reihen darstellen: einerseits NaCl und CaCl,, andererseits NaC]
und Na citr.; doch war eine Verschiedenheit der Wirkung nicht
zu beobachten, obwohl die spurenweise Alkalescenz des Plasmas
bekanntlich genügt, den Wirkungsmechanismus der Hofmeister-
schen Reihen in Erscheinung treten zu lassen; vielmehr bewirkten
alle 3 genannten Salze in gleicher Weise eine ausgesprochene Ab-
schwächung der Flockung und zwar um so ausgiebiger, in je höherer
Konzentration sie zur Anwendung gebracht wurden, wie Tabelle V
zeigen soll.

Tabelle V.

02.02 02:02 | 02 | 02 TI o
i 0.03 Uu"
5%, Na C1100, Na C15 CaCl 10°: ,CaC],5°/, Nalitr. 10%, Aa:

Hasa |— -0.03 003 "OI 0.03

0.

2
tt tt o + lat,

x
di
ol ++

Auch durch erhöhte Temperaturen, die einige Zeit vor
Anstellung der Flockungsreaktion auf das Plasma einwirken,
kann eine starke Stabilisierung des Fibrinogens zustande kommen,

i
03 i 3

d 0,2 0.2 0.2 SEH
usfall der Flockung ++ Es SÉ A a + + +

02 102.102 uä | 0.2 >

m on A et en o

e
1
3
l

|

1

il

Flockungsvermögen des menschlichen Blutplasmas. 221

‘ó ad

so daß von 3 Proben des gleichen Plasmas, von denen die erste
zwischen Blutentnahme und Ausflockung im Eisschrank, die zweite
bei Zimmertemperatur und die dritte im Brutschrank aufgehoben
wird, die stärkste Flockung bei der ersten, die schwächste bei der
dritten zu beobachten ist.

Tabelle VI.

| Citratplasma 0,2 0,2 0,2

Versuchs- |!) Einwirkende Tempera- 50 90° 370
anordnung ` tur durch 12 Stunden
ges. NaCl-Lösung 0,2 0,2 0,2

Ausfall der Flockune . ....... +++ FT T

Wenn nun darangegangen werden soll, ein ursächliches Moment
der Fibrinogenstabilisierung durch Säure, Alkali, Neutralsalz und
Wärme zu finden, so möchte ich in erster Linie auf den hydro-
lytischen Eiweißabbau hinweisen, der — schon an und für sich
in geringem Ausmaß im Serum?!) und ebenso auch im Plasma
vorhanden — sowohl im sauren und alkalischen Medium wie auch
im hypertonischen eine ausgesprochene Förderung erhält, ebenso
wie er auch unter dem jede chemische Reaktion begünstigenden
Einfluß erhöhter Temperatur eine Steigerung erfahren wird.
Daneben, aber von jedenfalls untergeordneter Bedeutung, mag
auch die durch den sicher nur geringen Fibrinogenabbau selbst
bedingte Verminderung des Fibrinogengehaltes in Betracht zu
ziehen sein. .

Wenn nun tatsächlich die dabei entstehenden Spaltprodukte
der Bluteiweißkörper die Fähigkeit besitzen, das Fibrinogen vor
dem Ausfallen zu schützen, so muß einerseits die Einwirkung
eines Agens von intensiver Abbauwirkung, andererseits der
unmittelbare Zusatz von Eiweißspaltstücken das gleiche Ergebnis
erkennen lassen. Zu diesem Zwecke brachte ich einerseits Pepsin
in Anwendung, andererseits setzte ich direkt Abbauprodukte
in Form von Witte-Pepton zu.

Das Versuchsergebnis war immer derart, daß beide Eingriffe
die Flockung entweder überhaupt aufhoben oder bei sehr fibrino-
genreichen Plasmen zum mindesten sehr stark abschwächten.

!y Lange, diese Zeitschr. 61. 1914. — Plaut, Münch. med. Wochen-
schr. 5. 1914. — Friedemann und Schönfeld, Berl. klin. Wochenschr.
8. 1914 u. a.

22) W. Starlineer:

Tabelle VII.
| g Citratplasına | 0.2 | 0,2 | 0.2
Versuchs- | ‚f 9.005 Pepsin, | 0.005
: | r | Zusatz 4 enthaltend IO ` rar
ne ] salzs. Betain °: Pepton-Witte
ges. NaCl-Lösung 0.2 o 0.2
Ausfall der Floekung . . . . . +. | + =

Haben nun im vorausgehenden Eingriffe, die mit einer
Anreicherung von Eiweißabbauprodukten verbunden sind, eine
erhebliche Hemmung derselben zur Folge gehabt, so bleibt es
übrig, Substanzen zu finden, die beim Zusatz zum Plasma eine
Labilisierung des Fibrinogens in Form einer verstärkten Flockung
desselben bedingen. Eine solche Wirksamkeit ließen vor allem
Agar-Agar, Gummi acaciae und Gelatine einerseits, Glykokoll,
als einfachster Vertreter der Aminosäuren, andererseits erkennen,
was ja hinsichtlich der Labilisierung der Serumglobuline für Agar-
Agar (Hirschfeld- Klinger) und Aminosäuren (Much-
Embden) längst bekannt ist.

Tabelle VII.

Citratplasına

|
0202 02 0.2 0,2
Mee BS ‘(| 0.005 0.005 | 0,005 0.005
anordnung | Zusatz | Gummi Gelatine) Agar | Gilvkokell
ges. NaCl-Lösune 0.2 | 0.2 0.2 0,2 | 2
Ausfall der Floekung ....44 tipt dobt | a e | Kerr

|
Die Methodik wurde für Gummi, Gelatine und Agar ent-

sprechend der in Tabelle III angegebenen Weise eingehalten.

Die Frage ist nun die, wie wir uns den Wirkungsmechanismus
dieser Stoffe vorzustellen haben, und zu diesem Zwecke wird es
sich als notwendig erweisen, eine theoretische Vorstellung, in
deren Rahmen sich die festgesetzten Resultate zwanglos einfügen
lassen, kurz auszuführen, ohne auf die anderen Anschauungen
über das Wesen des Flockungsvorganges an sich hier näher ein-
gehen zu können.

Nach Herzfeld und Klinger!) bilden die wasserlöslichen
niederen Eiweißabbauprodukte die Lösungsvermittler der an
sich unlöslichen, niedrigdispersen Eiweißkolloide, indem sie sich
an deren Oberflächen anlagern und durch ihr Wasserbindungs-
vermögen um jedes einzelne Teilchen gewissermaßen eine Wasser-
hülle schaffen, die die Aggregierung mit den anderen Teilchen

!) Herzfeld und Klinger, diese Zeitschr. 83. 1917.

Flockungsvermögren des menschlichen Blutplasınas. 223

verhindert. Alle Einflüsse, die die stabilisierenden Abbauprodukte
entfernen oder vermindern, flocken die Eiweißkörper aus, alle
Eingriffe, die diese Spaltstücke anreichern, fördern die Stabilität
der Lösung.

In voller Übereinstimmung damit konnten die im vorigen
ausgeführten Versuche die Stabilisierung des Fibrinogens durch
Anreicherung von Eiweißabbauprodukten zeigen, und wenn nun
an die Beantwortung der Frage nach der Wirkungsweise der
labilisierenden Eingriffe geschritten werden soll, so ist wohl die
Annahme am wahrscheinlichsten, daß Agar, Gummi und Gelatine
durch Adsorption eines Teiles der Eiweißspaltstücke an die eigenen
Oberflächen die Fibrinogenteilchen an solchen verarmen machen
und dadurch ihre Verklumpung fördern. Anders dürfte es sich
bei der Verstärkung der Flockung durch Glykokoll verhalten:
Da die Eiweißkolloide am besten durch die in der Abbaureihe
am nächsten stehenden Spaltstücke in Lösung erhalten werden,
also das kolloidale Eiweiß durch noch nicht dialysable Polypeptide,
diese durch dialysierbare, aber noch biurete Spaltstücke und diese
schließlich durch abiurete Peptide und Aminosäuren, so würde
die Annahme, daß ein hoher Gehalt an Aminosäuren die Löslich-
keit der zur Stabilisierung der grobdispersen Eiweißkolloide in
erster Linie notwendigen, noch relativ hochmolekularen Spalt-
stücke derart erhöht, daß sie nicht mehr an die Oberflächen der
groben Kolloide gehen und dadurch deren Stabilität nicht mehr
aufrechterhalten können, nicht unbegründet erscheinen.

Wie sehr nun auch auf diese Weise die Flockbarkeit des
Fibrinogens im Reagensglase durch Stabilitätsstörung verändert
werden kann, so soll doch nochmals betont werden, daß im
unbeeinflußten Plasma ein so differentes Verhalten der Fibrinogen-
stabilisierung unabhängig von der Quantität des Fibrinogens
nur sehr selten in Erscheinung tritt; dies geht daraus hervor, daß
nur in Ausnahmefällen ein fibrinogenreiches Plasma eine relativ
ungenügende Flockung oder umgekehrt ein fibrinogenarmes eine
zu ausgiebige Flockung beobachten läßt, so daß man auf eine
besonders starke oder schwache Stabilisierung schließen müßte.

Zusammenfassung.

l. Da die Ausflockung des Fibrinogens durch die gebräuch-
lichen Methoden erst beieinem Minimalgehalt von ca. 0,2", des Blut-

224 W. Starlinger: Flockungsvermögen des menschlichen Blutplasınas.

plasmas an solchem in Erscheinung tritt und parallel dem zu-
nehmenden Fibrinogengehalt an Intensität gewinnt, welches Ver-
hältnis auch bei steigender Verdünnung des Plasmas durch zu-
gehöriges Serum dargetan werden kann, ebenso wie die Fällung
durch teilweise Entfernung des Fibrinogens mittels exquisiter
Fibrinogenadsorbentien: Kaolin, Bolus alba, Tierkohle abge-
schwächt oder ganz aufgehoben wird, muß das Flockungsvermögen
des Blutplasmas als vor allem durch seinen quantitativen Gehalt
an Fibrinogen bedingt angesehen werden und kann daher als Maß
desselben gelten.

2. Damit steht in vollem Einklang, daß im nativen Plasma
Differenzen des Stabilitätszustandes in dem Sinne, daß ein
fibrinogenreiches Plasma cine zu geringe Flockbarkeit aufzuweisen
hätte und umgekehrt, nur ausnahmsweise zur Beobachtung
gelangen. Dagegen gelingt es bei künstlicher Beeinflussung durch
die verschiedensten Eingriffe die Stabilisierung des Plasmas
erheblich zu ändern, indem eine deutliche Hemmung der Flockung
auf Zusatz von Säure, Alkali, Neutralsalz einerseits, bei Anwendung
von erhöhter Temperatur, Pepsin, Witte-Pepton anderseits fest-
gestellt werden kann, während Agar, Gummi, Gelatine und
Glykokoll eine ausgesprochene Verstärkung der Flockung zur
Folge haben.

3. Da sich diese Ergebnisse zwanglos in den Rahmen der
Anschauungen Herzfelds und Klingers über den Lösungs-
vorgang kolloidalen Eiweißes einfügen lassen, wurde eine Deutung
auf dieser Basis versucht.

Nachtrag bei der Korrektur:

In diesem Zusammenhange sei auch auf die erst während
der Korrektur erschienene Arbeit v. Oettingens!) über die
Senkungsgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen hingewiesen,
auf die andernorts ausführlich zurückzukommen sein wird.

1) v. Dettingen, diese Zeitschrift 118. 1921.

Über die Dismutation verschiedener Aldehyde durch Hefe.
Von
H. Kumagawa.

(Aus der chemischen Abteilung des Kaiser Wilhelm-Instituts für experi-
mentelle Therapie in Berlin-Dahlem.)

(Eingegangen am 20. Juli 1921.)

Durch die Untersuchung von Battelli und Stern (1910)
ist bekannt geworden, daß tierische Organe die Fähigkeit be-
sitzen, Aldehyde nach dem Schema der Cannizzaroschen
Reaktion umzulagern;, Parnas zeigte die Verbreitung dieses
Vorgangs, der sich an verschiedenen einfachen aliphatischen und
aromatischen Aldehyden abspielen kann. Für die physiologisch
wichtigen Ketonaldehyde vom Typus des Methylglyoxals und
seiner Homologen taten Neuberg und Dakin dar, daß sie einer
ähnlichen Umwandlung unterliegen können, der Hydratation zur
entsprechenden Oxysäure; dies ist nichts anderes, als eine innere
C'annizzarosche Umlagerung. Während die vorerwähnten
Untersuchungen mit tierischem Material ausgeführt sind, war
ces von Interesse, zu untersuchen, ob auch Vegetabilien zur Ver-
wirklichung einer solchen Dismutation allgemeiner befähigt sind.
Neuberg und Kerb!) haben zuerst darauf hingewiesen, daß die
Hefe Acetaldehyd zu dismutieren vermöge, und zu dem gleichen
Ergebnis ist bald darauf S. Kostytschew?) gelangt. Die dis-
mutierende Wirkung der Hefe erstreckt sich aber nicht nur auf
künstlich zugefügte Aldehyde, sondern auch auf Carbonylverbin-
dungen, die im Stoffwechsel der Hefe entstehen. Denn die dritte
Vergärungsform, die Neuberg mit Hirsch aufgefunden und
mit Ursum als weitverbreitet nachgewiesen hat?), beruht darauf,
daß bei alkalischer Reaktion, d. h. wohl bei einer für die Ent-
faltung der Mutase günstigen Hydroxylionenkonzentration, der

1) C. Neuberg und Joh. Kerb, diese Zeitschr. 58, 169. 1913; Ch.
C. 1914. I. 279.

2) H. 89, 367. 1914; Ch. ©. 1914, I. 1514.

3) Diese Zeitschr. 86, 175 und 100, 304. 1919; 110, 193. 1920.

Biochemische Zeitschrift Band 123. 15

226 H. Kumagawa:

im Verlaufe der alkoholischen Zuckerspaltung auftretende Acet-
aldehyd zu Essigsäure und Äthylakohol disloziert wird. Dieselben
Autoren haben bereits beobachtet, daß auch die Disproportionie-
rung zugefügten Aldehyds bei bicarbonat-alkalischer Reaktion
schneller und vollständiger vonstatten gehen kann als bei dem
natürlichen sauren Milieu normaler Gäransätze. In Anbetracht
des biochemischen Interesses, das die Dismutationsreaktion somit
für den Ablauf animalischer und vegetabilischer Stoffwechsel-
vorgänge erlangt hat, schien es mir wünschenswert, andere Alde-
hyde auf die Fähigkeit zu prüfen, unter dem Einfluß der Hefe
in bicarbonat-alkalischer Umgebung eine Umlagerung zu erfahren.

Meine Untersuchungen erstrecken sich auf 3 aliphatische
und einen aromatischen Vertreter der Aldehyde: auf Isobutyl-
aldehyd, Isovaleraldehyd und Önanthol sowie auf Benzaldehyd.
Bekanntlich sind die Aldehyde der Fettreihe im allgemeinen nicht
oder nur spurenhaft zu einer Dismutation in wässeriger Lösung
befähigt; die Aldehyde der Benzolreihe gehen diese Reaktion,
wenigstens in ätzalkalischer Lösung, leicht ein. Es ergab sich, daB
die 4 genannten verschiedenen Aldehyde durch Hefe in Gegen-
wart von Natriumbicarbonat dismutiert werden. Die Umlagerung
des Benzaldehyds, die in einer wässerigen Lösung von doppelt-
kohlensaurem Natrium an sich nur geringfügig ist, wird durch
das Hefeferment wesentlich verstärkt.

Theoretisch hätte man zu erwarten, daß aus 2 Molekülen Alde-
hyd je 1 Molekül des entsprechenden Alkohols und der zugehörigen
Säure hervorgeht. Dieses Verhältnis kommt jedoch in den Ver-
suchen nicht ganz scharf zum Ausdruck. Es entstand zumeist
mehr Alkohol als Säure. Der Grund dafür ist leicht ersichtlich.
In einer größeren Zahl von Arbeiten haben Neuberg und Mit-
arbeiter vor Jahren festgestellt, daß in Gegenwart gärenden
Zuckers Aldehyde eine phytochemische Reduktion!) zu dem
entsprechenden Alkohol erleiden können, die nicht nach dem
Schema der Cannizzarroschen Reaktion erfolgt, indem gar keine
oder nur eine Spur Säure neben sehr viel Alkohol (bis 84%, der
Theorie) gebildet wird. Der für diese Hydrierung benötigte Wasser-
stoff wird in letzter Linie dem umgesetzten Zucker entnommen.
Neuberg hat mit Steenbock, Ringer und E. Kerb?) aber

1) C. Neuberg und Mitarbeiter, diese Zeitschr. 1912—1920.
2) Diese Zeitschr, 5%, 503. 1913; 91, 133; 92, 98, 99, 114. 1918,

n ren. mm E nn e

Disimutation verschiedener Aldehyde. 227

gefunden, daß auch ohne Ablauf einer eigentlichen Gärung phyto-
chemische Reduktionen vor sich gehen, indem reduktionstüchtige
Bestandteile der Hefe diese hydrierende Funktion übernehmen
können. Zum Teil handelt es sich dabei ebenfalls um Kohlen-
hydrate, die in Form von Polysacchariden (sog. Hefeglykogen
bzw. -gummi) in den Saccharomyceten vorgebildet sind und bei
der Digestion einer Selbstgärung unterliegen, z. T. aber auch um
andere Zellsubstanzen. Ich glaube, zumal ich reichlich Hefe an-
gewendet habe, damit eine genügende Erklärung für das Über-
wiegen der Alkohole bei der Dismutation der untersuchten Alde-
hyde geben zu können.

Versuchsteil.

Was die Ausführung der Versuche anlangt, so bin ich in allen
Fällen folgendermaßen vorgegangen:

Zu einer Suspension von 500 g Hefe in 1 Liter 1 proz. Natrium-
bicarbonatlösung wurde die zu untersuchende Aldehydmenge
(10g) gegeben und das Gemisch gründlich durchgeschüttelt.
Wegen der starken antiseptischen Kraft der verwendeten Aldehyde
erübrigte sich die Zugabe eines besonderen Desinfektionsmittels.
Das betreffende Gemenge blieb im Brutschrank bei 35° eine Reihe
von Tagen stehen, bis der Geruch des zugefügten Aldehyds ver-
schwunden oder schwach geworden war. Das Digestionsgemisch
wurde dann nach guter Durchschüttelung geteilt. Die eine Hälfte
diente unmittelbar zur Bestimmung des gebildeten Alkohols. Sie
wurde nicht filtriert, da der betreffende, in Wasser schwerlösliche
Alkohol in den Hefezellen verteilt sein konnte; sie wurde vielmehr
mit Wasserdampf destilliert und zwar bei der vorhandenen bicar-
bonat-alkalischen Reaktion. [Bei Benzaldehyd (siehe später)
mußte ich anders verfahren.] Aus der übergegangenen, durch Öl-
tropfen getrübten Flüssigkeit wurde durch wiederholte Rektifika-
tion der entstandene Alkohol angereichert und dann mit Äther ex-
trahiert. Der ätherische Auszug wurde mit Natriumsulfat ent-
wässert, in bekannter Weise vom Lösungsmittel befreit und am
Birektifikator destilliert. So wurde unmittelbar der aus dem
. Aldehyd entstandene Alkohol gewonnen und als solcher gewogen.

Für die Ermittelung der Säure mußte ich einen anderen Weg
einschlagen. Hier erwies sich eine Filtration als notwendig, weil beim
Abtreiben der aus dem Aldehyd gebildeten Säure mit Wasserdampf

(bh

228 H. Kumarawa:

vom hefehaltigen Rückstand stets fremde Säurebestandteile mit
übergehen. Die Filtration konnte auch unbedenklich vorgenommen
werden, weil ja die entstandene Säure als Natronsalz in Lösung
gegangen war oder übergeführt wurde. Ein aliquoter, durch
Filtration gewonnener Anteil wurde alsdann mit Schwefelsäure
kongosauer gemacht und mit Wasserdampf destilliert. Die Menge
der übergetriebenen flüchtigen Säure wurde durch Titration mit
Die Natronlauge angenähert festgestellt. Zur Identifizierung der
gebildeten Säure wurde das gesamte Wasserdampfdestillat nach
Zugabe von überschüssigem Natriumcarbonat auf dem Wasserbad
zur Trockene gedampft und der hinterbliebene Salzkuchen
erschöpfend mit Alkohol extrahiert. In allen Fällen war Formiat
in dieser Salzmasse vorhanden und mußte deshalb zerstört
werden. Hierzu wählte ich, da C'hromsäure auf verschiedene Fett-
säuren nicht ohne Einwirkung ist, das Quecksilbersulfatverfahren
von Neuberg und Brasch'!). Durch diese Behandlung wird
beim Kochen in schwach saurer Lösung am Rückflußkühler die
Ameisensäure oxydiert. Alsdann wurde die restierende, aus
dem Aldehyd entstandene Säure von neuem mit Wasserdampf
übergetrieben, wie vorher beschrieben, mit Natriumcarbonat in
das Alkalisalz verwandelt und nach völligem Eindampfen mit Al-
kohol ausgezogen. Beim Einengen der weingeistigen Extrakte
hinterblieb das Natriumsalz als weiße, mehr oder minder deutlich
krystallinische Masse, aus der dann durch Umsetzung mit Silber-
nitrat bei ganz schwach salpetersaurer Reaktion das Silbersalz
bereitet wurde. Nur bei diesem Vorgehen erhält man farblose.
sich nicht schwärzende Silberverbindungen, die dann bei der
Analyse befriedigend stimmende Werte lieferten. Bevor ich diese
Arbeitsweise ausprobiert hatte, erhielt ich zwar leicht die ent-
sprechenden Alkohole, aber nur ungenau stimmende Werte für
die zugehörigen Säuren. Ich beschränke mich darauf, die Versuche

zu beschreiben, die ich als gut gelungen bezeichnen kann.

1. Isovaleraldehyd.

1000 cem I proz. Lösung von doppeltkohlensaurem Natron,
500 g Hefe Senst, 10 g Isovaleraldehyd. Nach l4tägiger Digestion
hatte der Geruch des Valeraldehyds dem von Amylalkohol Platz
gemacht und die Lösung reagierte schwach sauer. Ihre Menge

1) C. Neuberg und W. Brasch, diese Zeitschr. 13, 302. 1908.

a pb

Dismutation verschiedener Aldehyde. 229

betrug 1430 ccm. 715 ccm wurden mit Sodalösung wieder alkali-
siert und mit Dampf destilliert. Isoliert wurden 1,72g Amyl-
alkohol vom Siedepunkt 126—134°, daneben waren kleine Mengen
niedriger und höher kochender Produkte vorhanden.

715 ccm wurden mit Natriumcarbonat erwärmt und filtriert
und der auf dem Filter bleibende Rückstand mit reichlich
warmem Wasser ausgewaschen. Das gesamte Filtrat, wurde mit
Schwefelsäure angesäuert und mit Wasserdampf auf 3830 cem
destilliert. Die Menge der flüchtigen Säure betrug berechnet als
Valeriansäure 3,50 g. Davon abzuziehen ist die Menge Säure,
welche die Hefe bekanntlich allein entwickelt. Zu ihrer Bestim-
mung wurde ein genau entsprechender Ansatz mit 500 g Hefe
in 1000 ccm lproz. Bicarbonatlösung unter -Zugabe von 10g
Toluol als Antisepticum vorgenommen. Auf die halbe Menge
berechnet sich eine Acidität = 52 cem Die Lauge, entsprechend
0,53g Valeriansäure.

Die wirklich als reines Silbersalz isolierte Menge Valerian-
säure war jedoch nach Beseitigung der Ameisensäure und nach
Vornahme der vorhin erwähnten Prozeduren geringer. Erhalten
wurden 1,23 g valeriansaures Silber. Das Vorliegen von Valerian-
säure ergibt sich aus der Silberanalyse:

0,2524 g Substanz: 0,1306 g Ag = 51,74”,: C,H,0,Ag: ber.
Ag = 51,67°,.

2. Isobutylaldehyd.

Ein genau gleicher Ansatz mit Isobutylaldehyd lieferte
0.86 g Isobutylalkohol!) und 1,04 g Isobuttersäure.

0,3023 g Substanz: 0,1683 g Ag = 55.64%; C,H.O,Ag: ber.
Ag = 55,38%.

8. Önanthol.

Isoliert wurden 1,72 g Heptylalkohol und 1,03 g Säure, die
jedoch nicht rein, sondern nach Zerstörung der Ameisensäure
allem Anschein nach mit Essigsäure verunreinigt gewesen ist.

4. Benzuldehyd.
Wegen der bekannten Empfindlichkeit des Benzaldehyds
gegen Alkali habe ich auch die Abdestillation des Benzylalkohols
erst nach der Ansäuerung mit Schwefelsäure vorgenommen. Es

1) Wegen der größeren Wasserlöslichkeit war hier die Ausbeute an
Isobutylalkohol geringer.

230 H. Kumagawa: Dismutation verschiedener Aldehyde.

ging dann ein Gemisch von Benzylalkohol mit Benzoesäure über.
Dasselbe wurde aus dem Wasserdampfdestillat mit Äther aus-
geschüttelt und mit Sodalösung gewaschen. Im Äther hinterblieb
der Benzylalkohol.

Zur genauen Bestimmung der Benzoesäure wurde das alka-
lische Digestionsgemisch filtriert, angesäuert und im Faust-
Heimschen Verdunstungskasten bei 30° eingetrocknet. Der
restierende Salzrückstand wurde, da die Extraktion mit Äther
zu starke Emulsion gab, mit etwas verdünntem Alkohol aus-
gezogen. Der nach vorsichtigem Verdampfen des Weingeistes
erhaltene Rückstand roch deutlich nach Benzoesäureestern
und wurde daher durch Kochen mit Natronlauge verseift. Durch
Ausschütteln nunmehr mit Äther wurden die alkoholischen Be-
standteile entfernt, und dann wurde durch erneute Extraktion
aus saurer Lösung die Benzoesäure abgetrennt, die durch vor-
sichtiges Verdampfen des Äthers bei niederer Temperatur zu-
rückblieb und durch Aufstreichen auf Ton von Spuren anhaften-
den Öls befreit werden konnte.

Bei diesem Vorgehen wurden gewonnen aus 10 g Benzaldehyd
2,21 g Benzylalkohol vom Siedepunkte 202—210° und 1,01g
Benzoesäure vom Schmelzpunkt 118°.

In einem Kontrollversuch, der mit gleichen Mengen, aber ohne
Hefe und unter Zugabe von Toluol als Antisepticum angestellt
war, konnte an Benzylalkohol keine bemerkenswerte Menge, von
Benzoesäure immerhin 0,5 g isoliert werden. Ob diese durch eine
Cannizzarosche Reaktion oder durch Autoxydation entstanden
sind, bleibe dahingestellt; jedenfalls war ihre Quantität geringer
als im Ansatz mit Hefe.

Über das Verhalten der inaktiven Äpfelsäure im Organis-
mus des Hundes und Kaninchens.

Von
M. Tomita.

(Aus der chemischen Abteilung des Kaiser Wilhelm-Instituts für experi-
mentelle Therapie in Berlin-Dahlem.)

(Eingegangen am 21. Juli 1921.)

Vor mehreren Jahren hat Ohta ermittelt, daß die Äpfelsäure
gleich anderen Pflanzensäuren entgegen den AnschauungenLiebigs
nicht vollständig im Organismus der Tiere verbrennt, sondern zum
Teil unverändert ausgeschieden wird.!) Zum Nachweis unange-
griffener Äpfelsäure im Harn bediente sich der genannte Autor des
Umstandes, daß die an sich schwach drehende Äpfelsäure ein starkes
Rotationsvermögen erlangt, wenn sie mit einer essigsauren Uran-
lösung im richtigen Verhältnis versetzt wird. Für die Besonder-
heiten des Verfahrens, welche durch die Bestandteile des Harns
bedingt sind, verweise ich auf die Angaben von Ohta und bemerke
noch, daß seine Ergebnisse von Wise?) bestätigt worden sind.

Da sich mit der Uranmethode sehr kleine Mengen optisch
aktiver Äpfelsäure im Harn erkennen und bestimmen lassen, be-
nutzte ich auf Veranlassung von Prof. Neuberg das Verfahren
zur Untersuchung der Frage, wie sich racemisch Äpfelsäure im
Organismus des Kaninchens und Hundes verhält, d.h. ob die
Verbindung asymmetrisch abgebaut wird, oder ob ihre Kompo-
nenten gleichmäßig angegriffen werden. Während nämlich viele
inaktive Substanzen im Tierkörper partielle Spaltung und damit
optische Aktivierung erfahren, sind auch die umgekehrten Fälle
bekannt, d. h. simultane Verarbeitung beider Antipoden. Meine
Untersuchungen haben ergeben, daß die Äpfelsäure zu den in ge-
wissem Umfange asymmetrisch zerlegbaren Verbindungen gehört.

1) K. Ohta, diese Zeitschr. 44, 481. 1912.
2) L. E. Wise, Chem. Centralbl, 191%. I. 894.

228 H. Kumarawa:

vom hefehaltigen Rückstand stets fremde Säurebestandteile mit
übergehen. Die Filtration konnte auch unbedenklich vorgenommen
werden, weil ja die entstandene Säure als Natronsalz in Lösung
gegangen war oder übergeführt wurde. Ein aliquoter, durch
Filtration gewonnener Anteil wurde alsdann mit Schwefelsäure
kongosauer gemacht und mit Wasserdampf destilliert. Die Menge
der übergetriebenen flüchtigen Säure wurde durch Titration mit
n’ o Natronlauge angenähert festgestellt. Zur Identifizierung der
gebildeten Säure wurde das gesamte Wasserdampfdestillat nach
Zugabe von überschüssigem Natriumcearbonat auf dem Wasserbad
zur Trockene gedampft und der hinterbliebene Salzkuchen
erschöpfend mit Alkohol extrahiert. In allen Fällen war Formiat
in dieser Salzmasse vorhanden und mußte deshalb zerstört
werden. Hierzu wählte ich, da Chromsäure auf verschiedene Fett-
säuren nicht ohne Einwirkung ist, das Quecksilbersulfatverfahren
von Neuberg und Brasch'!). Durch diese Behandlung wird
beim Kochen in schwach saurer Lösung am Rückflußkühler die
Ameisensäure oxydiert. Alsdann wurde die restierende, aus
dem Aldehyd entstandene Säure von neuem mit Wasserdampf
übergetrieben, wie vorher beschrieben, mit Natriumoarbonat in
das Alkalisalz verwandelt und nach völligem Eindampfen mit Al-
kohol ausgezogen. Beim Einengen der weingeistigen Extrakte
hinterblieb das Natriumsalz als weiße, mehr oder minder deutlich
krystallinische Masse, aus der dann durch Umsetzung mit Silber-
nitrat bei ganz schwach salpetersaurer Reaktion das Silbersalz
bereitet wurde. Nur bei diesem Vorgehen erhält man farblose.
sich nicht schwärzende Silberverbindungen, die dann bei der
Analyse befriedigend stimmende Werte lieferten. Bevor ich diese
Arbeitsweise ausprobiert hatte, erhielt ich zwar leicht die ent-
sprechenden Alkohole, aber nur ungenau stimmende Werte für
die zugehörigen Säuren. Ich beschränke mich darauf, die Versuche
zu beschreiben, die ich als gut gelungen bezeichnen kann.

1. Isovaleraldehyd.

1000 cem I proz. Lösung von doppeltkohlensaurem Natron.
500 g Hefe Senst, 10 g Isovaleraldehyd. Nach l4tägiger Digestion
hatte der Geruch des Valeraldehyes dem von Amylalkohol Platz
gemacht und die Lösung reagierte schwach sauer. Ihre Menge

1) C. Neuberg und W. Brasch, diese Zeitschr. 13, 302. 1908.

Dismutation verschiedener Aldehyde. 229

betrug 1430 ccm. 715 ccm wurden mit Sodalösung wieder alkali-
siert und mit Dampf destilliert. Isoliert wurden 1,72g Amyl-
alkohol vom Siedepunkt 126—134°, daneben waren kleine Mengen
niedriger und höher kochender Produkte vorhanden.

715 ccm wurden mit Natriumcarbonat erwärmt und filtriert
und der auf dem Filter bleibende Rückstand mit reichlich
warmem Wasser ausgewaschen. Das gesamte Filtrat, wurde mit
Schwefelsäure angesäuert und mit Wasserdampf auf 3830 ccm
‚destilliert. Die Menge der flüchtigen Säure betrug berechnet als
Valeriansäure 3,50 g. Davon abzuziehen ist die Menge Säure,
welche die Hefe bekanntlich allein entwickelt. Zu ihrer Bestim-
mung wurde ein genau entsprechender Ansatz mit 500g Hefe
in 1000 ccm 1proz. Bicarbonatlösung unter -Zugabe von 10g
Toluol als Antisepticum vorgenommen. Auf die halbe Menge
berechnet sich eine Acidität = 52 cem Die Lauge, entsprechend
0,53 g Valeriansäure.

Die wirklich als reines Silbersalz isolierte Menge Valerian-
säure war jedoch nach Beseitigung der Ameisensäure und nach
Vornahme der vorhin erwähnten Prozeduren geringer. Erhalten
wurden 1,23 g valeriansaures Silber. Das Vorliegen von Valerian-
säure ergibt sich aus der Silberanalyse:

0,2524 g Substanz: 0,1306 g Ag = 51,74%; C,H,O,Ag: ber.
Ag =.51,07°,-

2. Isobutylaldehyd.

er Ansatz mit Isobutylaldehyd lieferte
und 1,04 g Isobuttersäure.

Honds Ae = 55,64%; C,H,O,Ag: ber.

Ein genau
0,86 g Isobutyla

4 und 1,03 g Säure, die
ing der Ameisensäure
unreinigt gewesen ist.

les Benzaldeh yds
tes Benzylalkohols
Orgenommen. Es

"die Ausbeute an

230 H. Kumazawa: Dismutation verschiedener Aldehyde.

ging dann ein Gemisch von Benzylalkohol mit Benzoesäure über.
Dasselbe wurde aus dem Wasserdampfdestillat mit Äther aus-
geschüttelt und mit Sodalösung gewaschen. Im Äther hinterblieb
der Benzylalkohol.

Zur genauen Bestimmung der Benzoesäure wurde das alka-
lische Digestionsgemisch filtriert, angesäuert und im Faust-
Heimschen Verdunstungskasten bei 30° eingetrocknet. Der
restierende Salzrückstand wurde, da die Extraktion mit Äther
zu starke Emulsion gab, mit etwas verdünntem Alkohol aus-
gezogen. Der nach vorsichtigem Verdampfen des Weingeistes
erhaltene Rückstand roch deutlich nach Benzoesäureestern
und wurde daher durch Kochen mit Natronlauge verseift. Durch
Ausschütteln nunmehr mit Äther wurden die alkoholischen Be-
standteile entfernt, und dann wurde durch erneute Extraktion
aus saurer Lösung die Benzoesäure abgetrennt, die durch vor-
sichtiges Verdampfen des Äthers bei niederer Temperatur zu-
rückblieb und durch Aufstreichen auf Ton von Spuren anhaften-
den Öls befreit werden konnte.

Bei diesem Vorgehen wurden gewonnen aus 10 g Benzaldehyd
2,21 g Benzylalkohol vom Siedepunkte 202—210° und 1,01g
Benzoesäure vom Schmelzpunkt 118°.

In einem Kontrollversuch, der mit gleichen Mengen, aber ohne
Hefe und unter Zugabe von Toluol als Antisepticum angestellt
war, konnte an Benzylalkohol keine bemerkenswerte Menge, von
Benzoesäure immerhin 0,5 g isoliert werden. Ob diese durch eine
Cannizzarosche Reaktion oder durch Autoxydation entstanden
sind, bleibe dahingestellt; jedenfalls war ihre Quantität geringer
als im Ansatz mit Hefe.

Über das Verhalten der inaktiven Äpfelsäure im Organis-
mus des Hundes und Kaninchens.

Von
M. Tomita.

(Aus der chemischen Abteilung des Kaiser Wilhelm-Instituts für experi-
mentelle Therapie in Berlin-Dahlem.)

(Eingegangen am 21. Juli 1921.)

Vor mehreren Jahren hat Ohta ermittelt, daß die Äpfelsäure
gleich anderen Pflanzensäuren entgegen den AnschauungenLiebigs
nicht vollständig im Organismus der Tiere verbrennt, sondern zum
Teil unverändert ausgeschieden wird.!) Zum Nachweis unange-
griffener Äpfelsäure im Harn bediente sich der genannte Autor des
Umstandes, daß die ansich schwach drehende Apfelsäure ein starkes
Rotationsvermögen erlangt, wenn sie mit einer essigsauren Uran-
lösung im richtigen Verhältnis versetzt wird. Für die Besonder-
heiten des Verfahrens, welche durch die Bestandteile des Harns
bedingt sind, verweise ich auf die Angaben von Ohta und bemerke
noch, daß seine Ergebnisse von Wise?) bestätigt worden sind.

Da sich mit der Uranmethode sehr kleine Mengen optisch
aktiver Äpfelsäure im Harn erkennen und bestimmen lassen, be-
nutzte ich auf Veranlassung von Prof. Neuberg das Verfahren
zur Untersuchung der Frage, wie sich racemisch Äpfelsäure im
Organismus des Kaninchens und Hundes verhält, d.h. ob die
Verbindung asymmetrisch abgebaut wird, oder ob ihre Kompo-
nenten gleichmäßig angegriffen werden. Während nämlich viele
inaktive Substanzen im Tierkörper partielle Spaltung und damit
optische Aktivierung erfahren, sind auch die umgekehrten Fälle
bekannt, d. h. simultane Verarbeitung beider Antipoden. Meine
Untersuchungen haben ergeben, daß die Äpfelsäure zu den in ge-
wissem Umfange asymmetrisch zerlegbaren Verbindungen gehört.

1) K. Ohta, diese Zeitschr. 44, 481. 1912.
2) L. E. Wise, Chem. Centralbl, 191%, I. 89.

232 M. Tomita:

Die benötigte inaktive Äpfelsäure stellte ich aus Maleinsäure
nach der vortrefflichen Vorschrift von E. Biilmann!) her, und
zwar durch Mercurierung der Maleinsäure mittels Quecksilber-
oxydacetats und nachfolgende Zersetzung des Additionsproduk-
tes, wobei unter Wasseraufnahme d, l-Äpfelsäure entsteht. Zu
den Tierversuchen diente die reine krystallisierte Säure, welche
mit Sodalösung bzw. Natronlauge in das neutrale Salz verwandelt
worden war. Das Natriummalat wurde den Tieren subcutan
beigebracht.

Die Bestimmung der Äpfelsäure im Urin gestaltete sich dann
folgendermaßen:

Der Harn wurde zunächst auf Zucker geprüft, der als Folge
des Eingriffes bei Kaninchen mehrfach auftrat. Der Harn wurde
in diesen Fällen mit wenig Reinzuchthefe?) im Brutschrank ver-
goren, bis eine kleine Probe keine reduzierende Substanz mehr
aufwies. Alsdann wurden 10 cem des zuckerfreien Harns mit
einer durch Uranylacetat vollkommen gesättigten Essigsäure,
wie angegeben, versetzt. Die leicht filtrierende Lösung kann
sofort optisch geprüft werden. Der bei unmittelbarer Polari-
sation kaum drehende Harn nahm in allen Fällen unter dem
Einfluß des Uranylsalzes eine erhebliche Rotation an. Dieselbe
wurde in einem Quarzkeilapparat festgestellt, der bei Auerlicht
und im 2-dem-Rohr direkt Prozente Glucose anzeigte. Da die
spezifischen Drehungen von Uran-Äpfelsäure und Glucose bei
weißem Licht im Verhältnis von 515 : 52,6 stehen, so sind die
abgelesenen Werte durch 9.78 zu dividieren, um die in 100 cem
Flüssigkeit vorhandenen Gramme aktiver Äpfelsäure zu finden.

A. Versuche am Kaninchen.

Versuch i wurde zur Einübung des Verfahrens wit
natürlicher Äpfelsäure vorgenommen.” Das’ Versuchstier von
2.5 kg Gewicht erhielt 10 g l-Äpfelsäure als Natriumsalz in 30 ccm
Wasser unter die Haut gespritzt. Das Tier starb nach 3 Stunden.
Der freiwillig entleerte und aus der Blase ausgedrückte Harn
belief sich auf 100 cem. Die Drehung eines Gemisches von 10 cem
Harn. die mit Uranylacetat + Essigsäure auf 15 cem gebracht waren,
erwies sich unter den oben angegebenen Bedingungen = — 7,4%

1) E. Biilmann, Ber. 43. 578. 1910.

=) Sie war unter diesen Bedingungen ohne Einwirkung auf Äpfelsäure.

Verhalten der inaktiven Äpfelsäure im Organismus. 233

im 2-dem-Rohr. Daraus berechnet sich die Menge der l-Åpfelsäure
=
zu n i i l a = 1,135 g: sie betrug also 11.35°, der zu-

100 - 9,78 - 10 |
geführten Menge l-Apfelsäure.

Versuch 2. Einem Kaninchen von 2.2 kg führte ich unter
gleichen Bedingungen 10 g d.1-Äpfelsäure als Natriumverbindung zu.
Nach 3 Stunden wurden 55 cem Harn gesammelt. Ein Gemisch von
10 cem Harn plus Uranylacetat }- Essigsäure ad Leem drehte jetzt
rechts, und zwar = + 2.30° , im 2-dem-Rohr. Damit findet man
die Menge d-Äpfelsäure zu 0,194 dh zu 1,94°,, der darge-
reichten Quantität; die d-Form gelangte also in einem gewissen

Überschuß zur Ausscheidung.

Versuch 3. Einem 3 kg schweren Tier wurden 7 ed, ]-Äpfel-
siure als Natriumsalz in 30 com Wasser beigebracht. Das Tier
lebte ungefähr 8 Stunden und ließ 85 ccm Harn. Die Drehung
belief sich auf -}- 1,5° im 2-dem-Rohr, wenn 10 cem Urin mit
dem Uranreagens usw. auf 15 cem ergänzt waren. Daraus ergibt
sich ein Gehalt von 0,195 g d-Äpfelsäure — 2.201. der verabfolgten
Menge.

Versuch A Ein weiteres Kaninchen. das 2,7 kg schwer war,
erhielt wiederum 7 g inaktive Äpfelsäure als Natriumsalz. Harn-
menge nach 6 Stunden 62 cem mit einem Gehalt von 0,105 g
= 1,5", der eingespritzten Menge an d-Komponente.

B. Versuch am Hund.

Einem Tier von 7,5 kg Gewicht wurden um 1 Uhr mittags
13 g d, 1l-Äpfelsäure als Natriumsalz in 60 cem Wasser subcutan
appliziert. Das Tier lebte noch am Abend, wurde aber aın folgen-
den Morgen tot aufgefunden. Die Menge des freiwillig entleerten
Urins betrug 370 ccm. Der zuckerfreie und an sich nicht wahr-
nehmbar drehende Harn wurde durch die Uranbehandlung
rechtsdrehend, und zwar zeigten 10 ccm Urin, mit Uranylsalz und
Essigsäure auf 15 cem aufgefüllt, eine Deviation = + 0,50°,..
Daraus folgt die Menge Äpfelsäure zu 0.283 g oder — 2.18", des
verabfolgten Quantums. —

Es ergibt sich somit, daß zwar nach Körpergewicht der Ver-
suchstiere und nach Individualität Unterschiede hinsichtlich der
Ausnutzung von d, l-ÄApfelsäure bestehen: jedoch glaube ich zu-

sammenfassend aus meinen Versuchen folgern zu können, daß

234 M. Tomita: Verhalten der inaktiven Äpfelsäure im Organismus.

der Abbau der beiden Raumformen im Falle der Äpfelsäure nicht
in gleichem Schritt erfolgt, sondern daß die in der Natur auf-
tretende 1-Äpfelsäure etwas leichter angreifbar ist als ihr synthe-
tischer Antipode. Die Erfahrungen über das biologische Verhalten
der racemischen Äpfelsäure fügen sich also in dieser Hinsicht den
Feststellungen an, die Neuberg und Paul Mayer, Wohl-
gemuth, Rahel Hirsch sowie Abderhalden und Schitten-
helm u.a. gemacht haben und die besagen, daß im allgemeinen
die in der Natur vorkommende Komponente im Organismus der
höher entwickelten Tiere in größerem Umfange zerstört wird als
die ungewohnte Form. Andererseits erfolgt offenbar die Vor-
bereitung der beiden enantiomorphen Gebilde nicht sehr ver-
schieden, wie dem verhältnismäßig geringem Überwiegen von
d-Malat zu entnehmen ist; demnach ist das tierphysiologische
Schicksal von d, l-Äpfelsäure ähnlich dem, das Neuberg mit
Wohlgemuth undP. Mayer für d, 1-Arabonsäure und d, l-Man-
nonsäure, und Neuberg mit Saneyoshi, Färber und Nord
fürdie Dicarbonsäuren, d-Traubensäure, d, l-Zucker- und d, l-Man-
nonsäure beobachtet. hat.

] Ce: A

Biochemische Zeitschrift

Beiträge
zur chemischen Physiologie und Pathologie

Herausgegeben von
F. Hofmeister -Würzburg, C. von Noorden -Frankfurt a. M.,
E. Salkowski-Berlin, A. von Wassermann-BerjinMEDICAL CENTER Uran

Hir: `
unter Mitwirkung von

M. Ascoli-Catania, L. Asher-Bern, M. Borgmann-Berlin-Dahlem, G. Weste Ai Eé í
A. Bickel-Berlin, F. Blumentha:- Berlin, A. Bonanni-Rom, F. Bottazzi-Neapel, G: e 1962
Karlsruhe i. B., A. Durig-Wien, F. Ehriioh-Breslau, H. e, Euler-Stockholm, J. Felgl-
Hamburg, 8. Flexner-New York, J. Forssman-Lund, 8. Fränkel-Wien, E. Freund-Wien,

H. Freundlich - Berlin - Dahlem, E. Friedberger-Greifswald, E. Friedm .
0. v. Fürth-Wien, F. Haber-Berlin-Dahiem, H. J. Hamburger-Groniugem, Va 22
Budapest, E. Hägglund-Äbo, A. Hefter, Berlin, V. Henri-Paris, V. Henriques-Kopen- RE

hagen, R. 0. Herzog-Berlin-Dahlem, W. Heubner-Göttingen, R. Höber-Kiel, M. Jacoby-
Berlin, A. Koch-Göttingen, F. Landolt-Buenos Aires, L. Langsteln-Berlin, E. Laqueur»
Amsterdam, P. A. Levene- New York, L. v. Liebermann-Budapest, J. Loeb-New York,
8. Loewe-Dorpat, A. Loewy-Berlin, A. Magnus-Levy-Berlin, J. A. Mandel-New York,
L. Marchlewski-Krakau, P. Mayer-Karlsbad, J, Meisenhelmer-Greifswaid, L.e Michaelis-
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W. Ostwald- Leipzig, W. Palladin-St. Petersburg, J. K. Parnas-Lemberg, W. Paull -Wien,
R, Pfeifter-Breslau, E. P. Piok-Wien, J. Pohbl-Bresiau, Ch. Porcher-Lyon, P. Rona-
Berlin, H. Sachs- Heidelberg, 8. Salaskin-3t. Petersbr. x, T, Sasakl-Tokio, A. Scheunert-
Berlin, A. Schloßmann-Düsseldorf, §. P. L. Sörensen-Kopenliagen, K. Spiro-Basel,
E. H. Starling-London, J. Stoklasa-Prag, W. Straub-Freiburg i. B, A. Stutzer-Königs-
berg L Pr, K.Suto-Kanazawa, H. v. Tappeiner- München, K. Thomas-Leipzig, H. Thomse
Berlin, P. Trendelenburg-Rostock, 0O. Warburg-Berlin, E. Widmark-Lund,
‚W.Wiechowski-Prag, A. Wohl-Danzig, J. Wohlgemuth-Berlin.

Redigiert von
C. Neuberg-Berlin

Hundertdreiundzw. ızigster Band

Fünftes und sechs: s Heft

Ausgegeben am 5. November 1921

Berlin

Verlag von Julius Springer
1921

d

Biochemische Zeitschrift. Bd. 128, Heft 5/6.

De Biochemische Zeitschrift

erscheint in zwanglosen Heften, die in kurzer Folge zur Aus-
gabe gelangen; je sechs Hefte bilden einen Band. Der Preis
eines jeden Bandes beträgt M. 64.—. Die Biochemische Zeit-
schrift ist durch jede Buchhandlung sowie durch die unter-

zeichnete Verlagsbuchhandlung zu beziehen.

In der Regel können Originalarbeiten nur Aufnahme finden, wenn sie
nicht mehr als 1'/, Druckbogen umfassen. Sie werden mit dem Datum des
Eingangs versehen und der Reihe nach veröffentlicht, sofern die Verfasser
die Korrekturen rechtzeitig erledigen. — Mitteilungen polemischen Inhalts
werden nur dann zugelassen, wenn sie eine tatsächliche Richtigstellung ent-
halten und höchstens 2 Druckseiten einnehmen.

Manuskriptsendungen sind an den Redakteur,

Herrn Proj. Dr. C. Neuberg, Berlin-Dahlem, Hittorfeir. 18,

zu richten.
Die Verfasser erhalten 75 Sonderabdrücke ihrer Abhandlungen kosten-

frei, weitere gegen Berechnung. Für den 16 seitigen Druckbogen wird ein
Honorar von M. 40.— gezahli.

Verlagsbuchhandlung Julius Springer
Berlin W 9, Linkstraße 23/24.

Inhaltsverzeichnis. Heft 5/6.

Seite

123. Band.

Kollmann. Gustav. Über llarnsäuresynthese im menschlichen Orga-

nismus ee Ede ee sec
Dernby, K. G. und B. Allander, Studien über den Einfluß der
Wusserstolfionenkonzentration auf das Wachstum und die Toxin-
245

H

bildung der Tetanusbacillen . a a, ;
Pedotti, Fausto. Untersuchungen über den Einfluß des Calcium-
mangels in der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz 272

Kahho, Hugo. Lin Beitrag zur Perimeabilität des Pflanzenplasmas

für die Neutralsalze. LV. Mitteilung . 2 2 oo 2 oo 2 nn nn 284
Creveld, S. van. Über die Chlorverteilung im Blaute ,. , 304
"eric tion E. Freudenberg ur! I’. Gyürzy 315

316

GArEOGEA ME Gë Ärt

=

Über Harnsäuresynthese im menschlichen Organismus.

Von

Gustav Kollmann.

(Aus der Chemischen Abteilung des Wiener Physiologischen Universitäts-
Institutes und der I. Medizinischen Abteilung der Krankenanstalt Rudolf-
stiftung in Wien.)

(Eingegangen am 22. Juli 1921.)

L Das Problem der Harnsäuresynthese.

Im Verlaufe einer Untersuchung, deren Resultate ich kürz-
lich mitgeteilt habe!), war uns bei längerdauernder Ernährung
von Menschen mit purinarmer Nahrung die relativ reichliche
Harnsäureausscheidung aufgefallen. Die Tagesausscheidung an
Harnsäure lag meist zwischen 0,5—1,0 g, trotzdem unserer, wenn
auch nur groben, Schätzung nach die mit der Nahrung auf-
genommene Purinmenge 0,3—0,5 g kaum überschritten haben
dürfte. Diese Wahrnehmung hat uns veranlaßt, der viel dis-
kutierten Frage einer Harnsäuresynthese im Organismus des aus-
gewachsenen Menschen neuerlich unsere Aufmerksamkeit zuzu-
wenden.

Wie bekannt, kommt der Hauptanteil des N, der von Säuge-
tieren, Amphibien und Fischen als Harnstoff ausgeschieden wird,
bei Vögeln, Reptilien, sowie bei zahlreichen Wirbellosen in Form
von Harnsäure zum Vorschein, die zweifellos einer Synthese ihre
Entstehung verdankt. Jedoch auch in bezug auf den wachsen-
den Säugetierorganismus kann es keinem Zweifel unterliegen, daß
er Purinkomplexe auf synthetischem Wege neu zu bilden vermag,
um mit Hilfe derselben seine Nucleinsäuremoleküle aufzubauen.
Dies ist nicht nur für das Ei des Seidenspinners und des Huhns,

1) G. Kollmann, Über die Beziehungen der Harnsäureausscheidung
zur Durchblutung des Pfortadergebietes. Wien. med. Wochenschr. 1920,
Nr. 47.

Biochemische Zeitschrift Band 122. 16

236 G. Kollmann:

für den Lachs im Hungerzustand, sondern auch für die purinfrei
gefütterte Ratte und für den Säugling erwiesen?).

Es hat jedoch nicht an Stimmen gefehlt, die der Meinung
Ausdruck gegeben haben, die Fähigkeit, Harnsäure synthetisch
neu aufzubauen, sei auch dem Organismus des erwachsenen
Säugetieres und Menschen nicht gänzlich abhanden ge-
kommen.

So hat insbesondere H. Wiener?) sich dahin ausgesprochen: „Man
könnte sich die Vorstellung bilden, daß der Unterschied zwischen dem Stoff-
wechsel der Vögel und dem der Säugetiere in diesem Punkte kein prinzi-
pieller, sondern nur ein gradueller ist. Bei beiden Tierklassen dürfte die
Eiweißzersetzung bis zur Bildung von Harnstoff vor sich gehen, welcher
bei Vögeln zum geringsten Teil als solcher ausgeschieden wird, zum größten
Teil eine Synthese zur Harnsäure eingeht, während bei Säugetieren der
größte Teil unverändert zur Ausscheidung gelangt und nur ein kleiner
Bruchteil zur Harnsäuresynthese verwendet wird. Außerdem entsteht bei
beiden Tierklassen Harnsäure durch Oxydation der Xanthinbasen und bildet
bei den Vögeln einen kleinen, bei Säugetieren den größten Teil der aus-
geschiedenen Harnsäure.‘“

Demgegenüber spricht sich R. Burian?), nachdem er sich vergeblich
bemüht hatte, eine synthetische Harnsäurebildung in Rinderleberauszügen
neben der oxydativen festzustellen, dahin aus, es entfalle hiermit die einzige
experimentelle Begründung, die für die Annahme einer partiellen synthe-
tischen Entstehung der Säugetierharnsäure bisher beigebracht worden sei.
Recht skeptisch lautet auch das Urteil von W. Pfeiffer?) nach Nachprüfung
der einschlägigen Versuche Wieners. „Durch obige Versuche‘‘, sagt
Pfeiffer, „ist es noch unwahrscheinlicher geworden als es ohnehin war,
daß die pathologische Harnsäureanhäufung bei gewissen Krankheitszustän-
den von einer vermehrten synthetischen Bildung abhängig sei.“

Fürth?) resumierte seinerzeit den Stand der Frage dahin: ‚Für die
Annahme einer synthetischen Harnsäurebildung beim Säugetier und Men-
schen, welche neben der oxydativen einhergehe und dem Vorgange im
Vogelorganismus analog verlaufen sollte, liegt vorderhand gar kein Anhalts-
punkt vor.“

Hammarsten®) wollte die Möglichkeit einer Harnsäuresynthese
beim Säugetier nicht in Abrede stellen, wenn man auch nicht wisse, inwieweit
eine solche tatsächlich vorkommt.

1) Vgl. die einschlägige Literatur bei O. Fürth, Probleme der physio-
logischen und pathologischen Chemie. Bd. 11, S. 155. 1913.

2) H. Wiener, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 2, 79. 1902.
3) R. Burian, Zeitschr. f. physiol. Chem. 43, 530. 1904/05.
4) W. Pfeiffer, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 10, 324. 1907.
5) Loe 8.155.
6) Hammarsten, Lehrbuch der physiologischen Chemie, 8. Aufl.,
S. 166. 1914.

Harnsäuresynthese im ınenschlichen Organismus. 237

Schließlich sprach sich Abderhalden!) dahin aus, daß man keine
eindeutige Beobachtung kennt, die beweisen würde, daß auch der Mensch,
die Säugetiere, die Amphibien und Fische aus Eiweißabkömmlingen Purin-
substanzen zu bereiten vermöchten.

Da, wie erwähnt, eigene Beobachtungen mir den Gedanken
an eine sich im menschlichen Organismus vollziehende synthe-
tische Harnsäurebildung immerhin nahegelegt hatten, habe ich
versucht, mir auf möglichst einfachem und direktem Wege über
dieses Problem Aufschluß zu verschaffen.

Sollte es gelingen, während einer längeren Versuchsperiode
darzutun, daß die Menge ausgeschiedener Purinstoffe diejenige
der zugeführten Purinstoffe um ein Wesentliches übertreffe, ohne
daßdie Versuchspersonan Gewichtabgenommenhatte,
so müßte dies sehr im Sinne einer Harnsäuresynthese sprechen;
denn die Gewichtskonstanz würde in einem solchen Falle
jene Ausflucht hinfällig machen, mit der sich die Mehrzahl der
Beobachter bei derartigen Versuchen beruhigt haben: indem sie
meinten, das Plus an Harnsäure stamme aus zerfallenen Körper-
zellen.

U. Literaturangaben über Harnsäureausscheidung bei purinarmer
Ernährung.

Bevor ich an die Wiedergabe meiner eigenen Versuche gehe,
möchte ich die für unsere Fragestellung in Betracht kommenden
Literaturangaben kurz resumieren.

Trotz der ungeheuren, kaum übersehbaren Literatur des
Purinstoffwechsels vermochte ich nur wenige Arbeiten ausfindig
zu machen, die für unser Problem sich unmittelbar verwendbar
erwiesen. Vor allem war dies deshalb der Fall, weil nur länger-
dauernde Versuche mit purinfreier Ernährung und positiver
Stoffwechselbilanz für uns in Betracht kommen. Weitaus die
meisten Stoffwechselversuche waren von anderen Gesichtspunkten
aus unternommen und für uns nicht ohne weiteres verwertbar.
Auch die Hoffnung, die umfangreiche Literatur über den Stoff-
wechsel der Vegetarianer unseren Zwecken dienstbar zu machen,
hat sich nur zum geringsten Teil erfüllt. Abgesehen davon, daß
durchaus nicht alle Vegetarianer sich purinarm ernähren, wird
vielfach, insbesondere bei den Japanern, das Versuchsbild durch

1) Abderhalden, Lehrbuch der physiologischen Chemie, Bd. I,
S. 587. 1914.
16*

238 G. Kollmann:

reichlichen Teegenuß gestört. Wenn auch der Übergang!) der
methylierten Xanthine in Harnsäure nicht gerade wahrscheinlich
ist, mußten dieselben doch in unserem Falle als unerwünschte

Beigabe erscheinen. |

Nach Scheubes?) umfangreichen Beobachtungen beträgt die mittlere
tägliche Harnsäureausscheidung der Japaner 0,46 g, steht also der des
Europäers nicht viel nach?). In der militärischen Akademie zu Tokio
wird jedem Studenten in der Nahrung pro Tag ca. 83 g Eiweiß gegeben.
Von 83 g Eiweiß wird mehr als die Hälfte in Form von Reis geliefert, der
als außerordentlich purinarm gelten kann. So bleiben, wenn alles übrige
Eiweiß als animalisches geliefert würde, 35 g animalisches Eiweiß, was
etwa 140 g Fleisch und nur 0,16 g Harnsäure entspricht. Der Wert dieser
Beobachtungen wird allerdings durch den reichlich aufgenommenen Tee
beeinträchtigt.

Hirschfeld?) nahm in 2 Versuchen, die je 8 Tage dauerten, eine Nah-
rung zu sich, die nur aus Semmeln, Kartoffeln, Butter, Zucker, Kaffee,
Reis, Speck, Kognak und Wein bestand, also außer den im Kaffee enthal-
tenen Methylpurinen praktisch purinfrei war. Während der ersten 8tägigen
Periode schied er 22 g N durch Urin und Faeces mehr aus als er aufgenommen
hatte. 22g N entsprechen ca. 140 g Eiweiß und dieses wieder etwa 650 g
Muskelfleisch, wenn man annehmen wollte, daß der Eiweißverlust im wesent-
lichen auf Kosten von Muskeln gegangen wäre. Die Körpergewichts-
abnahme betrug im ganzen Zeitraume 1050 g. Die Gesamtsumme der
in 8 Tagen ausgeschiedenen Harnsäure betrug 3,338 g; nun kann der Purin-
gehalt von Fleisch mit rund 0,1%, veranschlagt werden"), Es müßten also
rund 3 kg Muskelfleisch umgesetzt werden, um eine Menge von Purinstoffen
in Freiheit zu setzen, die etwa 3 g Harnsäure entspricht. Tatsächlich konnten
nach der N-Bilanz nur 650 g umgesetzt worden sein. Eine analoge Um-
rechnung ergibt für die zweite Stägige Versuchsperiode eine Ausscheidung
von 3,6 g Harnsäure, wobei dem berechneten Umsatz von über 3 kg Muskel-
fleisch nur ein Gewichtsverlust von 400 g gegenübersteht.

Schreiber und Waldvogel®) ernährten einen Mann 8 Wochen lang
bloß mit „Eierspeisen“ und „vegetabilischer Kost“ und stellten während

1) Bezüglich des Überganges von Coffein und Theobromin in Harnsäure
vgl. Noorden, Ernährungslehre, Bd. I, S. 681. 1920. Nach Kaffee- und
Teegenuß haben Fauvel, Burian und Schur, Krüger und Schmid und
0O. Minkowski deutlichen Anstieg der Harnpurinbasen gefunden, dagegen
einen Einfluß auf die Harnsäurcausscheidung vermißt. Demgegenüber hat
A. Besser doch einen beachtenswerten Anstieg der Harnsäure gefunden.

2) Scheube, Arch. f. Hyg. I, 352. 1883.

3) Nakahama, Arch. f. Hvg. 8, 78. 1888.

4) Hirschfeld,Virchows Arch. f. pathol. Anat. u. Physiol. 114, 301.1888.

5) Schmid und Bessau, Therap. Monatshefte 1910, S. 116.

6) Schreiber und Waldvogel, Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmako!.
4%, 76. 1599.

Harnsäuresynthese im menschlichen Organismus. 239

dieser Zeit allerhand Versuche an. Unter Hinweglassung der durch Ein-
griffe geänderten Zahlen ergibt sich als Mittelwert 0,435 g Harnsäure
pro Tag. Leider sind die Kostangaben ungenau.

Wertvoll sind die sorgfältigen Selbstversuche von Burian und Schur?)
zur Bestimmung ihres endogenen Harnsäurewertes. Um so mehr,
als hier das erste Mal auch die Methylpurine gänzlich ausgeschaltet waren.
Leider fehlen genaue Gewichtsangaben. Im großen ganzen befand sich
jedoch Burian, an dem der Versuch gemacht wurde, im N-Gleichgewicht.
So wurde z. B. in der dritten Versuchsperiode bei annäherndem N-Gleich-
gewicht und bei einer Nahrung von 500 ccm Milch, 4 Eiern, 300 g Brot,
100 g Reis, 200 g Butter und 35 g Zucker täglich mehr als !/, g Harnsäure
ausgeschieden. Auch hier müßte, wenn man aus der Harnsäurenausscheidung
seinen Rückschluß auf den Zerfall von Körpereiweiß ziehe wollte, dieser
ein ganz gewaltiger gewesen sein. Betrug doch die Gesamtharnsäure in
12 purinfreien Tagen 6,7 g, was einem Fleischumsatz von rund 6kg ent-
sprechen würde.

Erwähnung verdient auch ein 20tägiger Versuch von Fauvel?):
Er findet bei einem „régime strictement veögetal et sans purines‘ als durch-
schnittliche Harnsäureausscheidung pro Tag 0,38 g. Das ist in 20 Tagen
7,6 g, was wiederum, wenn die Purine wirklich aus umgesetzten Körper-
zellen entstammen würden, einen Körperumsatz von rund 7 kg Muskel-
fleisch bedeuten würde. Leider liegt keine Gewichtsangabe vor. Doch
müßte bei einer Abnutzung, die 7 kg Muskelfleisch aufzehrt, die Körper-
gewichtsabnahme wohl sicherlich etwa 10 kg betragen (Fetteinschmelzung).
Fauvel hätte das bei dem 66 kg schweren Individuum sicher erwähnens-
wert gefunden. Auch erwähnt er, daß dasselbe Individuum im Anschluß
an den Versuch 65 km Radfahren im Tage ohne Ermüdung vertragen hat.

Interessant ist auch eine Angabe Umbers?): „Eine Gichtkranke,
bei der ich seit 2!/, Jahren völlig purinfreie Ernährung durchgeführt und
die dadurch erhebliche Besserung ihrer seit 15 Jahren progressiv verlaufen-
den, erblichen Gicht erfuhr, schied in der ersten Zeit der purinfreien Er-
nährung 0,162 g Purin-N im Durchschnitt aus, bei 9,38 g Gesamt-N, nach
2 monatiger purinfreier Ernährung 0,146 g Purin-N bei 8,61 g Gesamt-N
(Durchschnitt von 5 Tagen), nach 1!/, Jahren purinfreier Ernährung
0,122 g Purin-N bei 7,88 g Gesamt-N (6tägiger Durchschnitt) bei einer
calorisch ausreichenden Nahrung.“ Es liegt ja auf der Hand, daß eine der-
artige „purinfreie‘ Ernährung nicht wirklich als purinfrei gewertet werden
kann, worauf wir später noch zurückkommen werden und daß auch bei
einer solchen sicherlich nicht zu vernachlässigende Mengen von Purin
mit der Nahrung aufgenommen worden sind; doch dürften sich dieselben
innerhalb nicht allzuweiter Grenzen bewegt haben. Daß der Versuch bei
einer Gichtikerin vorgenommen wurde, daß auch Angaben über das Körper-

1) Burian und Schur, Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 80, 241. 1900

2) P. Fauvel, Cpt. rend. hebdom. des séances de Pacad. des sciences
142, 1292. 1906.

3) Umber, Therapie der Gegenwart, 1909, S. 75.

240 G. Kollmann:

gewicht fehlen, ist in diesem Falle wohl ziemlich belanglos. Denn in dem
langen Zeitraum von 2!/, Jahren hätte, wenn eine Synthese von Purin ganz
ausgeschlossen wäre, die Frau grober Schätzung nach wohl mitsamt einem
stattlichen in ihren etwaigen Tophi aufgestapelten Harnsäurevorrat vom
Erdboden verschwinden müssen.

Die Heranziehung von Hungerversuchen und Versuchen unter
zweifellos pathologischen Verhältnissen habe ich vermieden, da
ja bei solchen eine umfangreiche Einschmelzung von Körper-
gewebe tatsächlich nicht ausgeschlossen werden kann.

Immerhin konnte aus den angeführten Beispielen, die sich
ja gewiß durch weitere ähnliche leicht vermehren ließen, so viel
ersehen werden, daß die Harnsäureausscheidungbeilänger-
dauernder purinfreier Kost und erhaltenem N-Gleich-
gewicht nicht aufhört oder auch nur merklich absinkt.
Da aber die angeführten Versuche mehr oder minder von anderen
Gesichtspunkten und aus anderen Gründen unternommen worden
waren, da entweder die Versuchsdauer zu kurz oder das N-Gleich-
gewicht nicht einwandfrei erhalten oder auch die immerhin nicht
ganz unverdächtigen Methylpurine nicht ausgeschaltet waren
oder aber genaue Kostangaben mangelten oder aber endlich nicht
völlig physiologische Verhältnisse vorlagen, hielt ich es für eine
nicht undankbare Aufgabe, einen Versuch von langer Dauer
durchzuführen, bei dem derartige Fehlerquellen nach Tunlichkeit
vermieden werden sollten.

II. Eigene Versuche.

Als Versuchsobjekt diente mir ein 26jähriges, bis auf eine
alte Lungenspitzennarbe völlig gesundes Mädchen von blühendem
Aussehen, von 150 cm Körperlänge und 56,2 kg Anfangsgewicht.

Ich stellte bei einer durch 7 Wochen durchgeführten praktisch
purinfreien Ernährung die tägliche Harnsäureausscheidung fest.

Die Kost bestand aus 5 Eiern, 70 g Butter, 600 ccm Milch,
300 g weiches Biskuit, 150 g Apfelmus, 300 g Grießmilchspeise und
350 g Weißbrot. Grüne Gemüse, Kaffee, Tee, Kakao, Schokolade
und Suppe waren vollkommen ausgeschaltet. Die Patientin war
eine verläßliche und einsichtige Person, die überdies beständig
kontrolliert und durch Stichproben immer wieder überwacht
wurde und bei der unerlaubte Nahrungsaufnahme, soweit dies
überhaupt praktisch möglich ist, ausgeschlossen erschien.

Der Energiegehalt der Nahrung betrug ca. 2900 Calorien.

Harnsäuresynthese im menschlichen Organismus. 241

Nach den Analysen von Schmid und Bessau wäre der
Puringehalt der Nahrung mit Null zu bewerten.

Nach den Analysen von Fellenberg!) wäre derselbe un-
gefähr mit 0,1l g zu berechnen:

350 g Weißbrot

300 g Biskuit = 445g Weißmehl = 0,061 g Purin
5 Eier = 0,020, »
600 cem Milch = 0,018„ ` o

Summe = 0,099 g Purin

Der Vergleich der Tabellen von Schmid und Bessau mit
denen von Fellenberg ergibt für letztere auffallend hohe Werte.
Fellenberg hatte nach durchgeführter Hydrolyse die Kupfer-
Bisulfitfällung ausgeführt, den Niederschlag mit H,S zersetzt und
die Cu-Fällung noch einmal wiederholt. Dagegen haben Burian
und Schur und andere Autoren bei derartigen Untersuchungen
in der Regel zuerst mit CuSO, und NaHSO, gefällt, den Nieder-
schlag zerlegt und die zweite Fällung nach dem Vorgang von
Krüger und Schmid sowie von Salkowski mit ammoniakali-
scher Silberlösung resp. mit Silber-Magnesialösung vorgenommen,
so insbesondere auch Abderhalden und seine Mitarbeiter.

Wir haben selbst in folgender Art Stichproben vorgenommen:

500 g Weißbrot o. dgl. wurden mehrere Stunden lang mit 21
0,5% H,SO, lebhaft gekocht, das Ungelöste abfiltriert, das Filtrat
mit NaOH neutralisiert, der Neutralisationsniederschlag abfiltriert,
das neutrale Filtrat eingeengt, mit Essigsäure schwach angesäuert
und mit Kupfersulfat und Natriumbisulfit in üblicher Weise ge-
fällt, der Niederschlag filtriert, in heißem Wasser suspendiert und
unter wiederholtem Verreiben in der Reibschale tagelang mit
Schwefelwasserstoff zersetzt. Dann wurde der Niederschlag ab-
filtriert, das Filtrat bis zum völligen Entweichen von Schwefel-
wasserstoff gekocht und nun mit ammoniakalischer Silberlösung
resp. Silber-Magnesiumlösung gefällt. Der Niederschlag wurde auf
ein kleines aschefreies Filter gebracht, gut gewaschen und, um Am-
moniak zu vertreiben, mit MgOgekochtundschließlich kjehldalisiert.

Es ergaben sich schließlich:

für Weißbrot 0,0024°, Purin-N, was ca. 0.007°, Purin entspricht,
für Mehl 0,0048 „, 5 an an 0,014,» np
für Reis 0,0046 ‚, s3 ao u AE EE on

1) O. Fellenberg, diese Zeitschr. 88. 1918.

242 G. Kollmann:

Fellenberg hat für Weißmehl dieselbe Zahl gefunden, für
Reis dagegen 0,039°,, also fast den dreifachen Wert.

Auch Burian und Schur haben im Weißbrot nur minimale
Spuren von Purinen nachweisen können. Auch wenn wir die
hohen Zahlen Fellenbergs für Mehl, Milch und Eier zugrunde-
legen, so würde sich für unsere Kost nicht mehr wie höchstens
0,10 g Purin ergeben.

Die Harnsäurebestimmungen wurden nach der kolorimetrischen
Methode von Benedict und Hitchcock!) vorgenommen.

Tabelle I.
Urinmenge Harnsäure Urinmenge Harnsäure
ccm g cem g
1. Tag 700 0,36 27. Tag 1800 0,45
De i 1000 0,4 EEN 1700 0,5
S EN 1400 0,34 29: a 1000 0,44
4. „ 1500 0,34 30. p 1900 0,5
Din 45 1400 0,5 3l. p 1900 0,4
6. 56 1000 0,36 32. „ 1200 0,43
1. 900 0,3 33. ys 1100 0,39
Bi e 1000 0,32 34. „ 1800 0,47
H. a 1200 0,42 35- 35 1200 0,42
10. „ 1400 0,46 36. , 1500 0,42
Lie, eg 1300 0,39 BT: Le 1000 0,4
EZE 1000 0,45 WE EE 900 0,37
13.» 1200 0,51
14.3; 1500 0,5 39. a 1300 0,44
15. 5; 1300 0,5 40. ,„ 1100 0,4
16. , 1200 0,44 4l. „ 1700 0,43
IT. 4; 42. „ 1500 0,48
18. ,, Menses. 43. Ze 1400 0,41
19. 44. „ 1200 0,4
DV. 1200 0,4 45. „
2b ; 1400 0,46 46. „, Menses.
22 y 1500 0,38 Ai. „
Sch a 1500 0.37 48. „
24, ,„ 1900 0,39 49. ,, 1100 0,42
292.58 1700 0,32 50. 5 1000 0,46
26. , 1500 0,38 Ilep 1600 0,45

Am Ende des Versuches wog das Mädchen 60,1 kg, hatte
also 3,9 kg angesetzt, das Aussehen war ein sehr gutes. Die
Gesamtharnsäureausscheidung der Versuchszeit, mit Weglassung

1) Benedict and Hitchcock, Journ. of biol. chem. 20, 619. 1915.

Harnsäuresynthese im menschlichen Organisinus. 243

der Menstruationszeit, betrug 18,37 g. Die mittlere Tagesaus-
scheidung an Harnsäure betrug also in diesem Falle 0,42 g. Selbst
unter Annahme der hohen Zahlen Fellenbergs würde sich also
ein tägliches Plus von ca. 0,3 g ergeben, was für die 50tägige
Versuchsperiode 15 g mehr ausgeschiedene Purinsubstanz bedeutet.

Selbst wenn man, was offenbar zu hoch gerechnet ist, etwa
den Puringehalt der Muskelsubstanz, die ja die Hauptmenge des
lebenden Körperprotoplasmas ausmacht, mit 0,2%, Purin in
Rechnung bringt, so hätte die Versuchsperson 7,5 kg an Muskel-
substanz abbauen müssen. Es liegt wohl auf der Hand, daß dies
nicht ohne einen zumindest ebenso großen Gewichtsverlust hätte
geschehen können. Tatsächlich ist aber von einem Gewichts-
verlust keine Rede. Vielmehr ist eine erhebliche Gewichtszunahme
zu verzeichnen.

Dieser Versuch zusammen mit dem im voraus-
gehenden Kapitel angeführten Versuchsmaterial an-
derer Beobachter sprichtsehr zugunsten der Annahme,
daB tatsächlich eine synthetische Neubildung von
Purinsubstanz im Organismus stattgefunden hat.

Wenn wir nicht ohne weiteres den Schluß ziehen, daß dies
tatsächlich der Fall ist, so geschieht es aus dem Grunde, weil das
in bezug auf den Puringehalt von Nahrungsmitteln vorliegende
Beobachtungsmaterial in Wirklichkeit ein dürftiges ist. Abgesehen
von den Standardanalysen von Burian und Schur und den
unter Burians Aufsicht ausgeführten Analysen von Hall!) ,
liegen tatsächlich unseres Wissens systematische Untersuchungen
nur von Schmid und Bessau und von Fellenberg vor, außer-
dem eine Anzahl einzelner Befunde, wie insbesondere die Analyse
der Kartoffeln von AbderhaldenundseinenMitarbeitern?).
Alle diese Befunde weichen erheblich voneinander ab.

Wir halten es daher, bevor wir aus unseren Befunden weit-
gehende physiologische Schlüsse ziehen, für geboten, dieselben
auf eine festere Basis zu stellen und uns durch neuerliche
systematische Untersuchungen, über die wir bei späterer Ge-
legenheit zu berichten gedenken, die Gewißheit zu verschaffen,

1) J. W. Hall, Inaug.-Diss. Manchester 1902; Chem. Zentralblatt
1, 1169. 1902.

2) Abderhalden, Ewald, Fodor und Röse, Pflügers Arch. f. d.
ges. Physiol. 160, 513. 1915.

244 G. Kollmann: Harnsäuresynthese im menschlichen Organismus.

ob die bisher angewendeten Methoden der Purinbasenbestimmung
in den Nahrungsmitteln wirklich annähernd richtige Vorstellungen
über den wahren Puringehalt derselben geben und ob derselbe
nicht etwa bisher unterschätzt worden ist.

Zum Schlusse sei es mir gestattet, meinem verehrten Chef,
dem Vorstande der I. Medizinischen Abteilung der Kranken-
anstalt Rudolfstiftung in Wien, Herrn Professor Dr. Gustav
Singer, für die gütige Erlaubnis zur Ausführung des Versuches
meinen besten Dank auszusprechen.

Zusammenfassung.

Das in der Literatur vorliegende Material, insbesondere Be-
obachtungen von Hirschfeld, Schreiber und Waldvogel,
Burian und Schur, Fauvel und Umber legen den Gedanken
an die Möglichkeit einer synthetischen Harnsäurebildung auch
im Organismus des erwachsenen. Menschen nahe. Bei einer
50tägigen Beobachtung an einem 26jährigen gesunden Mädchen
bei konstanter Ernährung mit sehr purinarmer Nahrung wurde
bei Zunahme von fast 4 kg Körpergewicht eine Mehrausscheidung
von 15g Harnsäure über das mit der Nahrung aufgenommene
Quantum festgestellt, welche anscheinend nicht durch Abbau von
kernhaltigem körpereigenen Zellmaterial ausreichend erklärt wer-
den kann. Weitere methodische Untersuchungen über den tat-
sächlichen Puringehalt der wichtigsten Nährstoffe sollen Klarheit
darüber bringen, ob tatsächlich eine Purinsynthese aus purin-
freiem Material im Organismus stattgefunden hat.

Studien über den Einfluß der Wasserstoffionenkonzen-
tration auf das Wachstum und die Toxinbildung der
Tetanusbaeillen.

Von
K. G. Dernby und B. Allander.

(Aus dem Bakteriologischen Laboratorium des Schwedischen Staates
zu Stockholm.)

(Eingegangen am 25. Juli 1921.)
Mit 4 Abbildungen im Text.

Inhaltsverzeichnis:

I. Einleitung (S. 245).
II. Versuchsmethodik und Bemerkungen (S. 248).
a) Die Bakterien (S. 248).
b) Die Bereitung des Nährsubstrats (S. 248).
c) Der Einfluß der Sterilisation auf die Wasserstoffionenkonzen-
tration des Nährsubstrats (S. 250).
d) Die Bestimmung des Wachstums der Bacillen (S. 252).
e) Die Toxinprüfungen (S. 254).
f) Die Bestimmungen der Wasserstoffionenkonzentration (S. 254).
III. Das Wachstum der Tetanusbacillen in seiner Beziehung zur
Wasserstoffionenkonzentration (S. 255).
a) Das Wachstum der Tetanusbacillen (S. 255).
b) Die Veränderungen in der Wasserstoffionenkonzentration des
Substrates (S. 258).
c) Die Einwirkung von Phosphationen auf das Wachstum (S. 260).
IV. Die Stabilität des Tetanustoxins (S. 261).
V. Die Kontrollierung der Wasserstoffionenkonzentration bei Her-
stellung von Tetanustoxin im großen Maßstabe (S. 267).
VI. Schlußfolgerungen (S. 270).
Literaturverzeichnis (S. 271).

I. Einleitung.

Es ist eine altbekannte Tatsache, daß bei der Herstellung
von Tetanustoxin bisweilen große praktische Schwierigkeiten zu
überwinden sind. Es ist wohlbekannt, daß in diesem Falle zwischen

246 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

gei

üppigem Wachstum und starker Toxinproduktion nicht immer
Parallelismus besteht. In einer früheren Arbeit hat einer von
uns mit H. David zusammen die Bildung von Diphtherietoxin
studiert (Dernby und David 1921) und dabei gefunden, daß
die Wasserstoffionenkonzentration einer der wichtigsten Faktoren
dafür ist. Die Kurve des Wachstums und die der Toxinbildung
waren ziemlich parallel. Durch Regulierung der Wasserstoffionen-
konzentration des Nährsubstrates, so daß diese für das Wachstum
geeignet wird, daß sie nicht sauer wurde, konnte immer gutes
Toxin erhalten werden.

In der vorliegenden Arbeit haben wir die Frage aufgenommen,
unter welchen Bedingungen die Tetanusbacillen sich am günstig-
sten entwickeln und das beste Toxin produzieren.

Aber wenn es sich um die Tetanustoxindarstellung handelt,
wird das Problem komplizierter. Denn teils entwickeln sich die
meisten Tetanusstämme besser unter anaeroben als unter aeroben
Bedingungen, während der Diphtheriebacillus ein ausgeprägter
Aerobier ist, und teils scheint es, als ob das Tetanustoxin viel leichter
zerstört werden kann als das Diphtherietoxin (Reymann 1917,
v. Eisler und Pribram).

Über die chemische Natur des Tetanustoxins sind mehrere
Arbeiten veröffentlicht worden. Dies ist jedoch eine Frage, auf
die wir im folgenden gar nicht eingehen werden. Unser Endzweck
ist gewesen, das Wachstum der Tetanusbacillen und die Bildung
des Tetanustoxins in bezug auf die Wasserstoffionenkonzentration
zu studieren.

Wir müssen einen scharfen Unterschied zwischen Wachstum
und Toxinbildung aufstellen, und die beiden Vorgänge jeden für
sich studieren.

Wir wollen keineswegs behaupten, daß die Wasserstoffionen-
konzentration der einzige Faktor und auch nicht, daß sie der
wichtigste Faktor für das Wachstum und die Toxinbildung sein
sollte. Man kann eine ganze Reihe von anderen Faktoren auf-
stellen, wie z. B.:

besondere Eigenschaften der Mikroorganismen,

die Sauerstoffspannung,

die Zusammensetzung der Stiekstoffnahrung.

akzessorische Stoffe. wie Zucker, Salze usw.,

„yıtamıin'-Nubstanzen.

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 247

Was die besonderen Eigenschaften der Tetanusbacillen an-
belangt, so scheint es, als ob diese Mikroorganismen sich als sehr
unberechenbar erweisen könnten. Es kann vorkommen, daß ein
gewisser Stamm, der lange Zeit gutes Toxin gegeben hat, ganz
plötzlich diese Fähigkeit einbüßt. Aber diese Schwierigkeit kann
dadurch verringert werden, daß man stets mit einer Mischung
verschiedener Stämme aussät.

Früher war man der Ansicht, daß die Tetanusbacillen streng anaerob
seien und daß nur in gewissen Fällen, so z. B. durch Symbiose mit B. subtilis
oder anderen aeroben Mikroorganismen, Toxin auch durch aerobe Züchtung
gelingen könne (Debrand 1903). Aber seitdem Tetanusstämme gefunden
sind, die sowohl unter aeroben als anaeroben Bedingungen (siehe Rey mann
1917) gutes Toxin abgeben, ist man von dem vollständigen Sauerstoff-
abschluß nicht mehr ganz abhängig.

Ein wichtiger Faktor ist sicher die Zusammensetzung der Stickstoff-
nahrung, besonders das Verhältnis zwischen Eiweiß-, Peptid- und Amino-
stickstoff. Seitdem Kitasato die Tetanusbacillen reingezüchtet hatte,
verwendet man nach ihm Rinder- oder Kalbsbouillon. Und es scheint, als
ob die Tetanusbacillen in solchen Bouillons gut gedeihen, weshalb auch diese .
Frage einstweilen nicht zu den brennendsten gehört.

Unter den akzessorischen Nährsubstanzen spielen insbesondere
Traubenzucker und andere Zuckerarten eine große Rolle. Schon Kitasato
empfahl Zusatz von Zucker bis zu 2%. v. Eisler und Pribram haben
sowohl üppiges Wachstum als auch gute Toxinbildung bei Zuckerzusatz
beobachtet, doch fehlt es in der Literatur nicht an Angaben, wonach Zucker
besonders für die Toxinbildung nicht unbedingt günstig sein soll.

Aber wie bei der Arbeit über Diphtherietoxin (Dernby und David
1921) hängt auch hier die Zuckerfrage eng mit der Wasserstoffionenkonzen-
trationsfrage zusammen. Es ist wohl nicht so zu verstehen, daß der Zucker
an und für sich die Toxinbildung hemmt, vielmehr sind es die bei der Ver-
gärung des Zuckers gebildeten Säuren, die eine Vermehrung der Wasser-
stoffionen bewirken, welche das Toxin zerstören.

Erwähnt muß auch werden, daß man gefunden zu haben meint
(Brieger 1887), daß ein Zusatz von Chlornatrium von 2°, einen fördernden
Einfluß auf die Toxinbildung haben soll.

Die Diphtheriebacillen wachsen vorzüglich auf autolysierter oder
vergorener Bouillon, die Tetanusbacillen dagegen nicht oder nur spärlich.
Die meisten Autoren sind darin einig, daß die Tetanusbacillen frisch be-
reitete Bouillon verlangen und sowohl in alter als auch in zu stark auto-
elavierter Bouillon schlecht wachsen (siehe v. Eisler und Pribram); doch
muß erwähnt sein, daß Erfahrungen in entgegrengesetzter Richtung vor-
liegen. Im modernen Sinne könnte man es so erklären, daß es sich um eine
„Vitamin“-Frage handelte. Wie wichtig diese Frage auch ist, so ist sie doch
noch so in Dunkel gehüllt, daß wir sie hier im folgenden außer Betracht
lassen. In diesem Zusammenhang muß jedoch erwähnt werden, daß manche

248 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Autoren behaupten (Uschinsky, Buchner), bei Anwendung von nur
synthetischen Nährsubstraten gutes Tetanuswachstum erhalten zu haben.
Was den Einfluß der Wasserstoffionenkonzentrationen auf
Wachstum und Toxinbildung, studiert mit modernen Methoden,
anbelangt, so sind unseres Wissens keine Arbeiten, wenigstens
keine veröffentlichten, vorhanden. Über den Einfluß von Säuren
und Basen auf das Wachstum und die Toxinbildung liegen jedoch
viele ältere Angaben in der Literatur vor. Die allgemeine Schluß-
folgerung, die man aus diesen Arbeiten ziehen kann, ist, daß die
Tetanusbouillon neutral oder schwach alkalisch sein muß und
daß sowohl Säuren als Basen das Wachstum hemmen und das
Toxin zerstören. Besonders sollen stärkere Säuren in größeren
Konzentrationen das Toxin sehr schnell zerstören.

IL Versuchsmethodik und Bemerkungen.

Um die Darlegungen in den folgenden Abschnittennichtunnötig
zu belasten, werden wir hier einen kurzgefaßten Bericht über die
wichtigsten Versuchsmethoden, die wirangewendet haben, einfügen.

a) Die Bakterien.

Wir haben uns nur solcher Tetanusstämme bedient, die
sowohl unter aeroben wie anaeroben Bedingungen Toxin liefern.
Einer derselben stammt aus dem ‚„Danska Statens Seruminstitut‘,
Kopenhagen, und ist nach Angabe ursprünglich aus Rotterdam
gekommen, und wir bezeichnen diesen im folgenden als, Dänischer
Stamm“. Die anderen sind von Dr. Petrieam Lister Institut,
Elstree, England, zur Verfügung gestellt, wofür wir unsere größte
Dankbarkeit zum Ausdruck bringen. Diese sind als „Englische
Stämme“ bezeichnet. Über den ersten Ursprung dieser Kulturen
ist uns nichts Näheres bekannt.

Als Ausgangsmaterial für die Aussaat benutzten wir 48stün-
dige Agar- oder Bouillonkulturen.

Überall haben wir uns bei den wissenschaftlichen Experimen-
ten strenger Reinkulturen bedient. Die Kulturen wurden auf ihre
Reinheit geprüft.

b) Die Bereitung des Nährsubstrates.

Als Nährsubstrat haben wir gewöhnliche, mit Pepton versetzte
Kalbsbouillon angewendet. Wir haben verschiedene Bouillon-
typen geprüft, aber sind bei folgenden stehen geblieben.

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 249

Frisch geschlachtetes feines Kalbfleisch wird in der Hackmaschine
zerkleinert. Zu 5 kg Fleisch werden 10 Liter Wasserleitungswasser zugesetzt
und die Mischung während der Nacht im Eisschrank stehengelassen. Am
nächsten Tage wird die Mischung 1 Stunde lang bei 60° C erwärmt, worauf
filtriert wird. Zum Filtrat wird 1,5%, Pepton (Witte) und 0,5%, Kochsalz
zugesetzt. Alsdann wird die Bouillon mit Natriumhydrat oder Natrium-
carbonat, im gewöhnlichen Falle braucht man zu 10 Liter etwa 40 g Krystall-
soda, neutralisiert und die Alkalinität so bestimmt, daß sie etwa De = 8
entspricht. Die Bouillon wird 20—30 Minuten gekocht. Hierdurch entsteht
eine starke Trübung. Die Alkalinität wird nun in folgender Weise genau
justiert. Etwa 50 ccm werden herausgenommen, filtriert und abgekühlt.
Die Wasserstoffionenkonzentration wird in gewöhnlicher Weise in 10 ccm
Bouillon bestimm (siehe unten) unter Benutzung von Phenolsulphon-
phthalein als Indikator und Sörenschen Phosphatmischungen als Ver-
gleichsflüssigkeiten. Wenn die Probe nicht pe = 8 zeigt, setzt man soviel
2/0- NaOH oder HCI zu, daß pe = , genau = 8, wird. Eine einfache Rech-
nung ergibt nun, wieviel NaOH oder HCl zu der ganzen Bouillonmenge
zugesetzt werden muß, um die gewünschte Alkalinität zu erhalten.

Es versteht sich von selbst, daß diese Methode viel genauer
ist als die alte, wo man zuerst bis zum Phenolphthaleinumschlag
alkalisiert und dann eine mehr oder weniger beliebige Menge
Salzsäure zusetzt. Mit der modernen Methode kann man immer
eine Bouillon mit genau derselben Wasserstoffionenkonzentration
reproduzieren.

Von der Bouillon wurden in große Glasflaschen je 51 gegossen
und in 20 Minuten bei 108—110° C autoklaviert.

Die Bouillon muß 24 Stunden stehen und abkühlen und ist
dann fertig zum Gebrauch. Die in solcher Weise bereitete Bouillon
wird im folgenden als ‚ordinäre‘‘ Bouillon bezeichnet.

Außer dieser Bouillon haben wir in besonderen Fällen andere
Typen gebraucht. Eine derselben nennen wir ‚„autolysierte‘
Bouillon und diese unterscheidet sich von der vorigen nur da-
durch, daß das Kalbfleisch anstatt während der Nacht im Eis-
schrank zu stehen, im Thermostat bei 37° digeriert wird. Hierbei
wird teils der Zucker vergoren, teils findet cine teilweise Autolyse
statt, wodurch die Bouillon reicher an Aminostickstoff wird.

Einen dritten Typ bezeichnen wir kurzweg als „Trypsin-
bouillon“, welche zur Hälfte aus dänischer Bouillon besteht,
während die andere Hälfte ein Dekokt von mit Trypsin behandel-
tem Kalbfleisch ist.

Wie schon gesagt, haben wir jedoch vorwiegend die ordinäre
Bouillon gebraucht.

250 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Der Gehalt an Stickstoff in verschiedenen Formen kann sehr beträcht-
lich variieren. Wir haben in verschiedenen Bouillons sowohl den Total-
stickstoff (nach Kjeldahl) als auch den Aminostickstoff (Formolmethode
Sörensens) bestimmt. Die folgende Zusammenstellung zeigt die Zu-
sammensetzung zweier dieser Bouillons.

Total-N Amino-N Eiweiß-N
A. Ordinäre Bouillon. . 2,1 g/L 1595 +++

B. Trypsinbouillon. . . 2,1 g/L 849, Spuren

c) Der Einfluß der Sterilisation auf die Wasserstoff-
ionenkonzentration des Nährsubstrates.

Neuerdings ist der Frage, wie die Wasserstoffionenkonzentra-
tion eines Mediums sich bei Autoklavierung verändert, große Auf-
merksamkeit geschenkt worden. Einige amerikanische Autoren,
wie Mudge (1917) und Foster and Ra ndall (1921), haben dieses
Problem ausführlich behandelt und haben hervorgehoben, daß
das Medium speziell bei Zuckerzusatz nach Sterilisierung saurer
war. Da aber die Auffassung dieser Forscher von der Sache ein-
seitig und das Problem von besonderer Wichtigkeit ist, wollen
wir es hier näher erörtern.

Selbstredend spielen der Druck und die Temperatur bei der
Autoklavierung eine große Rolle. Im folgenden beschränken wir
uns nur auf mäßige Temperaturen und Drucke bis zu 120° C
und 2 Atm.

Wird das Medium bei Sterilisation saurer oder alkalischer ?
Diese Frage läßt sich nicht eindeutig beantworten. Sie ist viel
zu kompliziert. Wenn wir darüber nachdenken, welche Faktoren
hier einspielen können, können wir folgende ausfindig machen.

A. Veränderungen der Eiweißstoffe.

B. Den Zuckergehalt.

C. Das Gleichgewicht Kohlensäure-Bicarbonat-Carbonat.

D. Das Alkali des Glasgefäßes.

Was das letztere betrifft, so ist es wohlbekannt, daß wenn
man destilliertes Wasser von neutraler Reaktion in einem Glas-
kolben kocht, es bald so alkalisch wird, daß es Phenolphthalein
färbt, d.h. das Wasser hydrolysiert das Natriunsilicat des Glases.
Besonders wenn man neue Glasgefüäße anwendet, ist diese Wirkung
beträchtlich, aber doch, wenn die Gefäße älter und mehrmals ge-
braucht worden sind, werden sie resistenzfähiger gegen Wasser.
Man könnte daher erwarten, daß aus diesem Grunde die Nähr-

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 251

substrate nach Sterilisation alkalischer werden sollten. In der
Praxis haben wir jedoch nur gut ausgekochte Flaschen und
Retorten angewendet, und da auch die Autoklavierung bei so
niedriger Temperatur und in so kurzer Zeit erfolgt ist, können
wir demnach diesen Faktor nahezu ganz beiseite lassen.

Was die Veränderungen der Eiweißstoffe durch die Auto-
klavierung betrifft, so ist die vornehmste, daß besonders in Lösun-
gen alkalischer als pe =7 eine Ausfällung stattfindet. Hier-
durch wird Alkali frei und pe steigt. Man kann auch denken,
daß durch die Autoklavierung gewisse Eiweißstoffe zerfallen.
Wie py sich dabei verändert, ist unmöglich vorherzusagen. Wie
Dernby (1917) gezeigt, hängt dies von den Werten der Dissozia-
tionskonstanten der einzelnen Peptide und Aminosäuren ab.
Wenn z. B. Glycylglycin, dessen Dissoziationskonstante K, = 3,3
- 10-10 in alkalischer Lösung zu Glykokoll, dessen K, = 1,05: 10-?
ist, gespaltet wird, wird die Reaktion sich sehr beträchtlich in
alkalischer Richtung verändern.

Doch wenn man die Sterilisierung bei möglichst niedriger
Temperatur während kurzer Zeit vornimmt, spielen die Ver-
wandlungen der Eiweißstoffe nur eine untergeordnete Rolle be-
treffs der Veränderungen der Wasserstoffionenkonzentration.

Um so wichtiger sind die von vorhandenem Zucker her-
rührenden ?p-Veränderungen. Aus der Arbeit von Foster und
Randall entnehmen wir folgende Zusammenstellung:

a) b) c) d) e) f) g)
Py vor Autoklavierung . . 5,8 6,9 6,5 7,1 7,8 8,1 8,6
Py nach o .. 5,6 5,9 6,2 6,9 7,3 7,8 8,4

In diesem Fall war das Fleisch etwas zuckerhaltig und
kein extra Zucker zugesetzt. Wenn dies der Fall ist, werden die
Differenzen noch größer. Durch die Erhitzung wird der Zucker
zum Teil gespalten und liefert Säuren, die die Wasserstoffionen-
konzentration erhöhen. Wenn daher Zucker im Nährsubstrat
vorhanden ist, kann man erwarten, daß py sinkt.

Aber auch das Entgegengesetzte kann eintreffen, besonders
wenn kein oder nur schr wenig Zucker vorhanden ist. Dies konnten
wir in der erwähnten Arbeit über Diphtherietoxin von Dernby
und David (1921) beobachten, wo wir mit autolysierter oder
vergorener Bouillon arbeiteten. Folgende Zahlen beweisen dies:

Biochemische Zeitschrift Bd. 123. 17

252 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Pu-Veränderungen in autolysierter Bouillon.
a) b) c)
De vor Sterilisierung . . . . ..... 70 7,3 7,6
De unmittelbar nach Sterilisierung. . . 7,3 7,6 8,2
De 48 Stunden nach Sterilisierung . . 7,0 7,3 7,7

Hier haben wir also eine beträchtliche Erhöhung in pg un-
mittelbar nach der Autoklavierung, aber wenn die Kolben einige
Tage bei Zimmertemperatur stehen bleiben, dann sinkt pe
wieder und die ursprünglichen Werte werden erreicht.

Die Erklärung hierfür ist wohl, daß bei Zimmertemperatur
ein gewisses Gleichgewicht zwischen freier Kohlensäure, Bicarbo-
nationen und Carbonationen besteht, woraus ein bestimmtes pg
resultiert. Bei der kräftigen Temperatursteigerung während
der Sterilisierung wird dieses Gleichgewicht verschoben, Kohlen-
säure entweicht und die Reaktion wird daher alkalischer. Aber
wenn die Flüssigkeit bei Zimmertemperatur steht, absorbiert sie
allmählich Kohlensäure aus der Luft und das alte Gleichgewicht
wird wieder erreicht.

Man sieht jedoch gleich, daß man in solchen speziellen Fällen
das Nährsubstrat nicht gleich nach der Sterilisierung anwenden
kann, weil pu zu hoch geworden ist. Es ist am sichersten, es erst
zu inokulieren, nachdem es einige Tage gestanden hat.

Aus obigem geht hervor, daß py nach Autoklavierung sowohl
größer als kleiner sein kann. Mitunter ist es unmöglich voraus-
zusagen, welches der Fall sein wird. Es ist daher notwendig, die
Wasserstoffionenkonzentration nicht nur vor der Sterilisation,
sondern auch nach derselben genau zu justieren. Sollten die Ver-
änderungen zu groß werden, so kann man diese Justierung durch
Zusatz von etwas sterller Salzsäure bzw. Natronlauge ausführen.

d) Bestimmung des Wachstums der Tetanus-

bacillen.

Von der oben erwähnten ordinären Bouillon, mit der Modi-
fikation, daß sie schwach autolysiert war, um den Zuckergehalt
niederzubringen, wurden neun verschiedene Sätze gemacht, bei
denen verschiedene Mengen Salzsäure oder Natronlauge zugesetzt
wurden. um die gewünschte Wasserstoffionenkonzentration zu er-
reichen. In Tabelle I ist eine solche Präparation angegeben.

Wenn man Alkali hinzufügt und autoklaviert, entsteht eine

Trübung. Wir haben diese in der Weise beseitigt, daß wir eine

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 253

doppelte Sterilisation vorgenommen haben. Das erstemal bei
ca. 112°, dann filtriert, und eine zweite Sterilisierung bei etwa
105°. In gewöhnliche sterile Reagensgläser wurden je 20 ccm
Bouillon eingefüllt. Wir erhielten so eine Anzahl Sätze in neun
Reagensgläsern, alle neun mit verschiedenem pe, und in allen
war die Flüssigkeit ganz hell und durchsichtig.

Tabelle I.
Zusammensetzung der Standardbouillonmischungen.

10 ccm Bouillon + N-NaOH oder HCl + Wasser = 11 ccm. Schwach
autolysierte Bouillcn.

PH
Nr. j ccm n-NaOH | cem en ccm H,O |elektrometrisch
A BR gemessen
1i — | 060 oan | 367
In — | 08, 085 | 4,81
3 | Ze © — | 100 5,70
Al om € — | 095 | Gas
5 | 012 | — | 088 | Ju
Gil 020 TI — 0,80 7,44
7 | 0,25 1 | 08 782
8 | 040 I — 0,60 | 8,33
al 00 | — | 020 8.70

Selbstredend kann die Tabelle I nur als ein Beispiel an-
gesehen werden, denn bei jeder neuen Stammbouillon muß man
die Mengen von Salzsäure und Natronlauge wieder von neuem
bestimmen.

Das Wachstum der Tetanusbacillen wurde durch vergleichende
Abschätzung der Trübung festgestellt. Anstatt der gewöhnlichen
Zeichen +, ++ usw. haben wir Zahlen benutzt, welche folgende
Bedeutung haben:

0. kein Wachstum,
. beginnendes Wachstum,
. spärliches Wachstum,
. gutes Wachstum,
. üppiges Wachstum.

Wa Co Hä ra

Allerdings ist die Methode subjektiv, aber man erhält doch
gute Vergleichsresultate. Sowohl die Grenzen wie das Optimum
des Wachstums können sehr scharf beobachtet werden. Man
erhält eine sehr deutliche ‚„Wachstumskurve“, die graphisch re-
‚produziert werden kann, wie dies einer von uns demonstriert hat
(Dernby, 1921).

fe?

254 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

e) Die Toxinprüfungen.
Die Toxinprüfungen wurden in gewöhnlicher Weise ausgeführt.
Als Versuchstiere wurden weiße Mäuse von ca. 15 g Gewicht an-
gewendet und mit 1/100 Ange: ua ooo ccm usw. subcutan inokuliert.
Wenn eine Maus mit !/ioœọ ccm eingespritzt, keine Zeichen von
Tetanus zeigte, haben wir das Agens mit 0 Toxin bezeichnet.

f) Bestimmungen der Wasserstoffionenkonzentration.

Wir haben der Hauptsache nach die colorimetrische Methode
vonSörensen angewendet, um die Wasserstoffionenkonzentration
zu bestimmen. Doch haben wir als Indicatoren diejenigen von
Clark und Lubs hergestellt. Hier ist es unmöglich auf Einzel-
heiten einzugehen, wir verweisen vielmehr auf die ausgezeichnete
Originalarbeit der genannten Forscher (siehe Clark und Lubs,
1917), die Originalarbeit von Sörensen (Enzymstudien II, 1909),
Michaelis’ Monographie ‚Die Wasserstoffionenkonzentration“,
1914) und die Monographie von Clark (1920).

Die Indikatoren waren folgende und haben einen sehr kleinen sog.
„Eiweißfehler“:

Pu -Grenzen
Thymolblau . ....... 1,2 — 2,8
Brom-Phenolblau . . . . . . 2,8—4,6
Methylrot . . . 2.2.2.2... 4,4—6,6
Propylrot NN e 4,8—6,4
Brom-Cresolpurpur . . ... 5,2—6,8
Brom-Thymolblau ..... 6,0—7,6
Phenolrot . . ....... 6,8—8,4
Cresolrot . . . 2 2 2 2 2.2. 7,2—8,8
Cresolphthalein . . . 2... 8,2—9,8

Die Standardlösungen waren die von Sörensen vorgeschlagenen:

E EK, oa dn a a ot ia 1/io Mol
2. Natriumcitrat . . 2.2... Uia
gt EEN, aoad e h Br See e
4. Na,HPO,-2H,0...... ee
5. Natriumborat . . 2.2... tio p
DS NA0H.: o 2% 0 a a Hig

Um py elektrometrisch zu bestimmen, bedienten wir uns einer genauen
Kopie des Michaclisschen Apparats mit den von ihm angegebenen Elek-
troden. Für die Bestimmungen von py in den Tetanuskulturen haben wir
nur selten die elektrometrische Methode benutzt, unseres Erachtens ist
innerhalb des Gebietes py = 6 bis Du = 8 (Neutralzone) die colorimetrische
Methode mit den Clarkschen Indicatoren besser geeignet, um schnelle

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 255

und zuverlässige Resultate zu erhalten, wenn es sich um Bouillonkulturen
handelt. Die elektrometrische Methode hat uns gedient, um die Standard-
lösungen genau zu bestimmen. Man kann sicher sein, daß Differenzen von
0,1 in pe sehr deutlich wahrgenommen werden können.

In sämtlichen Fällen, wo pg in den Kulturen bestimmt werden soll,
sind diese entweder gefärbt oder trübe oder beides zugleich. Aber wenn
die Farbe oder Trübung nicht zu stark ist, kann dieser Umstand leicht
eliminiert werden durch Anwendung eines „Komparators‘‘ nach dem
Walpoleschen Prinzip. Sind die Lösungen sehr gefärbt oder trübe, so
können sie mit destilliertem Wasser bis auf das 3- oder 4fache ihres Volumens
verdünnt werden, ohne daß py sich beträchtlich verändert (siehe Clark
und Lu bs).

Abb. la gibt Walpoles Schema wieder und Abb. lb einen Kom-
parator, den wir mit sehr gutem Erfolg angewendet haben und bei dem
reflektiertes anstatt durchfallendes Licht gebraucht wird.

Man muß bei der Ausführung von colorimetrischen py-Be-
stimmungen stets daran denken, daß diese immer bei derselben

Temperatur, Zimmertemperatur, vorgenommen werden sollen.
Hat man z. B. eine Flüssigkeit, die bei 20° mit Phenolsulphon-
phthalein pg = 7,2 angibt und erwärmt dieselbe auf 50°, so wird
die Indicatorfarbe ein pg von etwa 7,6 angeben. Dies bedeutet
nicht, daß pe tatsächlich 7,6 ist, sondern daß die Dissoziations-
konstante des Indicators sich mit der Temperatur so verändert
hat, daß sie einen solchen Wert angibt. Man muß daher, bevor
man die Prüfung vornimmt, die Flüssigkeiten stets vorerst auf
Zimmertemperatur abkühlen.

II. Das Wachstum der Tetanusbaeillen in seiner Beziehung zur
Wasserstoffionenkonzentration.
a) Das Wachstum der Tetanusbacillen bei verschiedener
Wasserstoffionenkonzentration.
Die Frage, die zunächst zu studieren ist, ist die Beziehung
zwischen Wachstum und Wasserstoffionenkonzentration. Wie
gesagt, haben frühere Autoren geäußert, daß zwischen Wachstum

256 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

und Toxinproduktion kein bestimmtes Verhältnis besteht. Es
scheint im allgemeinen, als hätte man gefunden, daß es leichter
ist, gutes Wachstum zu erhalten als gutes Toxin. Weiter hat man
gefunden, daß sowohl Säuren als Basen auf das Wachstum ein-
wirken. Die Tetanusbacillen scheinen am besten in neutraler
oder schwach alkalischer Reaktion zu gedeihen.

Mit Benutzung der in der Abteilung ‚Methodik‘ angegebenen
Methode haben wir hier die ?y-Grenzen und das pg-Optimum
für das Wachstum verschiedener Stämme von Tetanusbacillen
untersucht. Die Züchtung ist sowohl unter aeroben wie anaeroben
Bedingungen ausgeführt worden. In allen Fällen wurde ordinäre,
schwach autolysierte Stammbouillon angewendet. Übrigens spre-
chen die Tabellen II, III und IV, in denen die Resultate einiger
solcher Versuche veranschaulicht werden, für sich selbst.

, Tabelle ll.
Optimales Wachstum der dänischen Bacillen.
Aerobe Züchtung. Schwach autolysierte Bouillon. Temp. 37°.

f f PH , sa f ze | za Wachstumsgrad nach =
Are Im Anfang | Nach 5 Tagen |18 Stunden | 2 Tage | 3 Tage | 5 Tage
CË eg ` -3t vo 10 010
2 4,8 | 4,8 #0 1 1
3 | 5,4 | 5,4 0 | 1 2 2
4 | 6,3 6,2 0 1 3 3
5 | 7,0 7,0 2 3 4 4
6 7,4 7,2 3 4 4 4
7 | 7,8 7,6 1 3 i q 4
8 8.3 8,0 0 2 4 | 4
y 8,6 8,6 0 0 0 | 0

Tabelle III.
Optimales Wachstum der dänischen Bacillen.

Anaerobe Züchtung. Schwach autolysierte Bouillon. Temp. 37°.
O o TI ` Wata OO O
We | Im Anfang | Nach 5 Tagen |18 Stunden 2 Tage 8 Tage | 5 Tage
1 3,7 | 3,7 GC | Sg dn 0
2 | 4,8 4,8 ' 0 0 Ä 0
3 | 5,4 | 5.4 0 0 2 | 3
4 6.3 6,3 Ve BE: 2. @
5 | 7,0 7,0 2 | 2 | 3 4
6 7.4 7.3 Ee nasi t T A
7 |l 7,8 7,6 3 | 4 4 | 4
8 | 8.3 | 8,1 2 i 3 3 | 3
9 |l 8,7 8,7 0 | 0 0 0

II-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 257

Tabelle IV.
Optimales Wachstum der englischen Bacillen.
Aerobe Züchtung. Schwach autolysierte Bouillon. Temp. 37°.

8 | S Pa Wachstumsgrad nach
Nr | Im Anfang | Nach 8 Tagen | 24 Stunden | 48 Stunden | 4 Tage | 6 Tage

1l ze 3,6 0 | o Ion o
2 48 48 0 In"
3. 57 56 ı © 2 | 3 4
4! 64 6,4 2 3 4 4
5| %0 70 3 4 1012024
6 74 72 3 4 1 4
zl 78 76 al 4 4 j 4
8 8.3 8.0 E Se de 4 4
9 87 87 o mool o

<
<

Die Ziffern von Tabelle IV haben wir benutzt, um eine graphi-
sche Darstellung von der Beziehung zwischen Wachstum und
Wasserstoffionenkonzentration zu demonstrieren, und diese Dar-
stellung liegt in Abb. 2
vor. Als Abszisse ist Do Su
gewählt, als Ordinate der 2;
Weachstumsgrad. N S

SowohlausdenTabel- $, |
len als auch aus der Abb. 2
geht hervor, daß die saure 7#.5
Grenze etwa um fo =5
bis 5,5, die alkalische um py = 8,5 liegt. Das Optimum fällt
in allen Fällen zwischen pe = 7,0 und Py = 7,6.

Wenn wir den Tetanusbacillus mit anderen Mikroorganismen
vergleichen (siehe Dernby, 1921), geht hervor, daß er in einer
geraden breiten Zone der Wasserstoffionenkonzentration wächst
und in dieser Hinsicht B. subtilis und gewissen anaeroben Bak-
terien, wie B. hi@tolyticus, B. sporogenes usw. ähnelt. Dagegen
unterscheidet er sich höchst bedeutend von B. diphtheria, Pneu-
mokokkus u. a. pathogenen Mikroorganismen, welche nur in einer
sehr engen Zone der Wasserstoffionenkonzentration leben können.

Die verschiedenen Stämme, sowohl die englischen als auch
die dänischen haben sich ähnlich so verhalten.

Aus dem Vorstehenden geht hervor, daß lediglich um gutes
Wachstum zu erhalten, die Weasserstoffionenkonzentration des
Substrates nicht allzu streng kontrolliert zu werden braucht, aber
es ist nicht das Wachstum sondern die Toxinbildung, welche die

Abb. 2,

258 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Hauptsache ist, und wie diese letztere sich zur Wasserstoffionen-
konzentration verhält, wird im nächsten Abschnitt gezeigt.

b) Die Veränderungen der Wasserstoffionenkonzentra-
tion des Substrates durch die Tetanusbacillen.
Viele Mikroorganismen haben die Fähigkeit Zuckerarten zu

vergären, bei welchem Prozeß Säuren entstehen, d. h. die Wasser-

stoffionenkonzentration erhöht wird.

Wie v. Eisler und Pribram nach den meisten Autoren
angeben, sollen Traubenzucker oder andere Zuckerarten sehr
günstig für das Wachstum sein.

Wir haben nachstehend einige Versuche gemacht, um die
Veränderung der Wasserstoffionenkonzentration sowohl in zucker-
freien wie in zuckerhaltigen Substraten zu verfolgen.

Die Tabelle V zeigt einen Versuch, wo wir autolysierte zucker-
freie Bouillon angewendet haben. Das Wachstum war gut aber
doch nicht so üppig wie in der zuckerhaltigen Bouillon.

Tabelle V.
Veränderungen des py in autolysierter Bouillon.
Aerobe Züchtung. Dänische Bazillen. Temperatur 37°.

Versuchsdauer | Pu | Wachstumsgrad
Im Anfang ' 75. | —
10 Std. "VAN 0
20 „ 7,5 1
2 Tage | T4 > 2
4 „ 7,4 3
8 Les 7,4 3
12 7,4 3

Tabelle V zeigt, daf in zuckerfreien Nährlösungen fast gar
keine Veränderung in der Wasserstoffionenkonzentration eintrat.
In Tabelle VI haben wir dieselbe Bouillon angewendet, aber mit

Tabelle VI.
Veränderungen des py in autolysierter Bouillon + — 0,5% Glucose.
Aerobe Züchtung. Dänische Bacillen. Temp. 37°,

Versuchsdauer | Pu | Wachstumsgrad
Im Anfang | 76 —
10 Std. | 76 | 0
SE 71 | 1
2 Tage | 6,8 | 2
4 a l 6,6 | 3
8, | 66 | 3
12. 2; D 3

DI

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 259

Zusatz von 0,5%, Glykose. Das Wachstum ist hier ungefähr
dasselbe wie im vorigen Fall, aber die Wasserstoffionenkonzen-
tration ist bedeutend mehr verändert. Nach 2 Tagen ist hier
Py = 6,8 geworden, und dann auf dem Endwert pg = 6,6 stehen
geblieben.

Tabelle VII zeigt einen ähnlichen Versuch, wo gewöhnliche,
frisch zubereitete ordinäre Bouillon angewendet wurde. Diese
enthält ja geringe Mengen Zucker. Auch hier sieht man, daß die
Wasserstoffionenkonzentration während des Wachstums erheblich
erhöht worden ist.

Tabelle VII.
Veränderungen des pg in ordinärer nicht autolysierter Bouillon.
Aerobe Züchtung. Englische Bacillen. Temp. 37°.

Versuchsdauer | De | Wachstumsgrad

Im Anfang 17,9 1
20 Std. 7,8 3
2 Tage 7,0 4
dw DÄ 4
Bb =; 6,8 | 4
10 „ | 68 4

Tabelle VIII zeigt eine Zusammenstellung der Resultate bei
einigen in großem Maßstab ausgeführten Versuchen.

Tabelle VII.
Py -Veränderungen in verschiedener Bouillons.

Nr. \
Im Anfang | Nach 12 Tagen
Li Ord. 7,6 7,0
2 | e 8,0 ‚7
3 | S 7,6 ca. 5
4 Trypsin 8,1 7,3
5 | Trypsin + — 0,1°/, Glykose 81 | 6,9
6| 8.0 6.2

Diese Tabelle VIII zeigt, daß in den meisten Fällen die
Bouillon saurer wird, und zwar in gewissen Fällen höchst be-
deutend. Mitunter ist das Substrat so sauer geworden wie etwa
Pg = 5.

Wir sind also berechtigt zu sagen, daß die Tetanusbacillen
in zuckerhaltigen Substraten die Wasserstoffionenkonzentration
erhöhen. Wir haben keinen wesentlichen Unterschied in diesem
Verhältnis bei aerober und anaerober Züchtung gefunden.

260 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Einige Autoren geben an, daß sich während des Wachstums
beträchtliche Mengen von Basen bilden. Das ist möglich,
allerdings haben wir während der ersten 14 Tage nie eine erhöhte
Alkalinität beobachtet. Nur in sehr alten Kulturen (mehr als
4 Wochen alt) haben wir eine Alkalinität von pe = 8 oder mehr
gefunden. Dies beruht wohl wahrscheinlich auf dem autolytischen
Zerfall der Bacillen und der Spaltung von Eiweißstoffen der
Bouillon durch die freigewordenen proteolytischen Enzyme.

Dies Verhältnis bemerkt man noch deutlicher und schneller
bei B. proteus oder B. subtilis. Ist das Ausgangs-?g = 7,5, so
sinkt es in den ersten Tagen auf etwa Dn = 7,0, aber gleichzeitig
damit, daß die Bakterien zerfallen, steigt pg und ist nach einigen
Tagen die Alkalinität etwa nu = 8—9 geworden.

Es ist eine seit lange bekannte Tatsache, daß Tetanusbacillen
Gelatine nur langsam verflüssigen. Wir haben einige Versuche
über die proteolytische Gruppe dieser Bacillen gemacht, und wenn
diese auch nachweisbar sind, zeigen sie doch außerordentlich
schwache proteolytische Wirkungen. Bei Tetanusbacillen haben
wir keine solche eiweißspaltenden Fermente, wie es der Fall mit
z. B. B. subtilis oder B. proteus ist.

c) Die Einwirkung von Phosphationen auf das Wachs-
tum der Tetanusbacillen.

Eine Methode, um die Wasserstoffionenkonzentration in bio-
logischen Flüssigkeiten konstant zu halten, ist, sogenannte Puffer-
mischungen zuzusetzen, so z. B. Phosphatlösungen, wie sie beim
Studium der Pneumokokken und der Diphtheriebacillen (Der nb y
und Avery (1918), Dernby und David (1921) angewendet
wurden.

Aber eine Bedingung ist selbstredend, daß die Phosphat-
lösungen nicht auf das Wachstum der Tetanusbacillen einwirken
dürfen. In Tabelle IX sind einige Resultate angegeben, wo ver-
schiedene Phosphatkonzentrationen angewendet worden sind.

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß auch relativ mäßige
Konzentrationen von Phosphaten das Wachstum hemmen. Und
um eine gute Pufferwirkung zu erzielen, muß man eine Konzen-
tration von mindestens Olm haben. Daher scheint es nicht
zweckmäßig, beim Studium der Tetanusbacillen mit Phosphat-
puffern zu arbeiten, und wir haben dies auch vermieden.

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbaeillen. 261

Tabelle IX.
Einfluß von Phosphationen auf das Wachstum der Tetanusbacillen.

Dänische Bacillen. pe = 7,6. Temp. 37°.

Phösphatkonzen- Wachstumsgrad nach Tagen

tration in Mol. 1 | o | 5
Ohne Phosphat O0 3 | 4
0,05 0 2; 4

0,1 Ö 1 3

0,2 0 0 3

0,5 0 0 0

IV. Die Stabilität des Tetanustoxins in bezug auf die Wasserstoff-
ionenkonzentration.

Im vorhergehenden Abschnitt haben wir das Wachstum der
Tetanusbacillen bei verschiedener Wasserstoffionenkonzentration
studiert, und dabei gefunden, daß das Optimum ziemlich breit ist.
Aber es ist eine schon lange bekannte Tatsache, daß gutes Wachs-
tum nicht mit guter Toxinbildung parallel geht. Wir wollten nun
die optimale Wasserstoffionenkonzentration für die Toxinbildung
ermitteln, und der direkte Weg wäre derselbe, den wir früher
betreten haben, um das Diphtherietoxin zu studieren (Dernby
und David, 1921), d.h. Tetanusbacillen in derselben Bouillon,
wo nur die Wasserstoffionenkonzentration variiert worden ist, zu
kultivieren, und nach gewissen Zeiten Proben zu entnehmen, um
den Toxingehalt zu bestimmen. In der Tat haben wir mehrere
solche Reihen versucht, aber auf Grund der bereits erwähnten
Schwierigkeiten, der Unmöglichkeit die Wasserstoffionenkonzen-
tration konstant zu erhalten, der ‚„Unberechenbarkeit‘‘ der Ba-
cillen usw., haben wir keine einwandfreien eindeutigen Resultate
erzielt, die wert wären publiziert zu werden.

Das Problem ist: Bei welcher Wasserstoffionenkonzentration
bekommt man das stärkste Toxin und nach welcher Zeit? Oder
mit anderen Worten, in welcher Zone der Wasserstoffionen-
konzentration ist das Toxin stabil unter denselben Bedingungen,
wie wenn das Toxin in der Praxis, d. h. bei 37° und im dunklen
Zimmer, dargestellt wird?

Um dieses Problem klarzulegen müßten wir einen indirekten
Weg einschlagen und von bereits fertigem, starkem Toxin aus-

gehen.

262 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Es ist eine altbekannte Tatsache, daß viele Faktoren das
Toxin zerstören. Vor allem wirken oxydierende Substanzen und
das Sonnenlicht zerstörend, wie Behring (1900), Sieber (1901)
und Loewenstein (1903) gezeigt haben. Aber diese Phasen des
Problems werden hier völlig außer Betracht gelassen und wir
wenden uns ausschließlich dem Einfluß der Wasserstoffionenkonzen-
tration zu. Schon Kitasato (1891) und Fermi und Pernossi
haben ausgesprochen, daß sowohl Säuren als Alkalien das Toxin
schwächen oder zerstören, am stärksten jedoch Säuren. Saure Reak-
tion wird überhaupt als schädlich für die Toxinbildung angesehen.

Unseres Wissens sind jedoch keine neueren Arbeiten ver-
öffentlicht, wo man die Stabilität in bezug auf Wasserstoffionen-
konzentration studiert hat.

Es versteht sich von selbst, daß die Wasserstoffionenkon-
zentration nicht der einzige Faktor ist, der die Toxinbildung
bestimmt, aber dennoch muß er als einer der allerwichtigsten
angesehen werden. Man könnte denken, daß sich in irgendeiner
Bouillon, die mißglückt war, irgendwelche andere Stoffe gebildet
hatten, welche das Toxin zerstören. Um dies in einfacher Weise
festzustellen, haben wir folgenden Kontrollversuch gemacht.

Zu einem schon fertigen starken Toxin wurde alte Bouillon
zugesetzt, welche kein Toxin gegeben hatte. Diese alten Kulturen
waren mit englischen Stämmen inokuliert und hatten 13 Tage
gestanden. py vor der Aussaat 8,2, nachher auf pe = 5,8 ge-
sunken. Diese Bouillon wurde durch Papier und Berkefeldfilter
filtriert und steril aufbewahrt. Zu lccm Probetoxin, welches
De = 7,8 aufwies, wurden in a) 9 ccm Kochsalzlösung, in b) und c)
zwei Proben von 9 ccm atoxischer Bouillon, die zuvor alkalisiert und
auf pg = 7,8 gesetzt waren, zugesetzt. Die Toxizität dieser
Mischungen wurde vorher geprüft, die Mischungen in Thermostaten
von 37° eingestellt. Nach in Tabelle X angegebenen Zeiten
wurden Toxinproben entnommen.

Tabelle X zeigt deutlich, daß in diesen zwei Bouillons, 368
und 369, keine spezielle toxinzerstörenden Substanzen vorhanden
waren. Wenn sie nur alkalinisiert worden waren, haben sie das
schon fertige Toxin ebensowenig wie die Kochsalzlösung beein-
flußt. Man kommt dann zu der Schlußfolgerung, daß wenn in
diesen Bouillons Toxin vorhanden war, es durch die gebildeten
Wasserstoffionen zerstört worden wäre.

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 263

Tabelle X.
Mischungen von atoxischen Bouillons mit gutem Toxin.
al 1 ccm Toxin Nr. 199 + 9 ccm Kochsalzlösung,
b) 1 ccm Toxin + 9 ccm Bouillon Nr. 368,
c) 1 ccm Toxin + 9 ccm Bouillon Nr. 369,
d) 10 ccm Bouillon 368 (atoxisch),
e) 10 ccm Bouillon 369 (atoxisch).

Temp. 37°. pg — 7,6.

` Maus tot nach Tagen

5 Tage im Thermostat.
0,01 ccm | 0,001 ccm

10
8

0,01 ccm 0,001 ccm
| Ph |
p2 | 4 3 9 2

i 2
| 0 Tetanus| 0 Tetanus
O Tetanus | 0 Tetanus

i 0 Tetanus
: 0 Tetanus

O Tetanus | 0 Tetanus
0 Tetanus | O Tetanus

nb, EA N m |

Von großer Bedeutung wird es daher sein, die Toleranz des
Toxins bei verschiedenen Wasserstoffionenkonzentrationen zu stu-
dieren. In Tabelle XI und XII sind ein paar derartige Versuche
angegeben. Die Versuche wurden teils mit einem Toxin Nr. 199,
das mehr als 3 Jahre im Eisschrank gestanden hatte, und konstant
an Stärke war, teils mit einem neuen Toxin, Nr. 375, ausgeführt.
Die Versuche wurden folgendermaßen ausgeführt: Zuerst wurde
ausprobiert, wieviel n-Alkali oder Säure zu 10 ccm Toxin zugesetzt
werden sollte, um eine gewünschte Wasserstoffionenkonzentration
zu erhalten. Dann wurde in fünf Probiergläser je 10 ccm Toxin
und so viel Säure oder Alkali gegossen, wie aus dem Versuch
hervorging, und dann mit steriler Kochsalzlösung bis auf 12 ccm
aufgefüllt. Die Säure und Natronlauge waren vorher sterilisiert.
Die Reagenzröhrchen waren mit einer 1cm dicken Schicht flüssigem
Paraffinöl versehen. Sämtliche Manipulationen waren unter
sterilen Bedingungen ausgeführt. Die Reagenzgläser wurden im
Dunkeln im Thermostat bei 37° aufgestellt. Nach den in der
Tabelle angegebenen Zeiten wurde l ccm herausgenommen und
Verdünnungen auf 1/100 1/1000 und !/10000 gemacht, die alsdann in
gewöhnlicher Weise an weißen Mäusen geprüft wurden.

In dem Versuch in Tabelle XI wurde die Wasserstoffionen-
konzentration von pe = 5,4 auf py = 8,5 variiert und die Toxizi-
tät nach 24 Stunden im Thermostat geprüft. Das ursprüngliche
Toxin hatte pg = 7,7.

264 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

Tabelle XI.
Optimales py für die Toxinstabilität.
IO cmm Toxin Nr. 199 + NaOH oder HCl + Wasser = 12 ccm. Unter

Paraffinschicht aufbewahrt im Termostat bei 37°. Versuchsdauer
20 Stunden.

Maus tot- nach Tagen

= | Pa v0 ccm Ges ccm

1! 5.4 lo Tetani | 0 EE

2 6,2 2 4

3: Tl 2 | 5

4 HI 2.2 Lebt noch 10 Tage,
d aber hat Tetanus

5 8,5 213 do.

0 Tetanus bedeutet, daß das Versuchstier keine Tetanussymptome zeigte.

Aus Tabelle XI geht hervor, daß sämtliche Mäuse, sowohl
die mit 0,01 als auch die mit 0,001 ccm eingespritzten starben
oder schweren Tetanus bekamen, außer in dem Falle, wo das
Toxin bei einer Wasserstoffionenkonzentration von py = 5,4 vor-
behandelt war. In diesem Falle scheint jede Spur von Giftigkeit
zerstört zu sein. Es ist also deutlich, daß Säurereaktion das Toxin
zerstört. In diesem Fall war die Zerstörungsgrenze auf der alkali-
schen Seite nicht erreicht, aber man sieht deutlich, daß in den
2 Fällen, wo pn 8,0 und 8,5 betrug, das Toxin geschwächt war.

Tabelle XII.
Optimales py für die Toxinstabilität.

10 ccm Toxin Nr. 375 + NaOH oder HCl + Wasser = 12 ccm.
Unter Paraffinschicht aufbewahrt im Thermostat bei 37°.

CG CW E RK ra `

Mau« tot nach Tagen oder Stunden

Kontrollprobe im Nach 2 Tagen im Nac h 6 Tagen im Nach 16 Tagen im
Du Anlang The rmostat Thermost at Thermostat

„O0 Tet.“ bedeutet, daß das Versuchstier keine Tetanussymptome zeigte.
„st. Tet“ bedeutet, daß das Versuchstier noch am zehnten Tage lebte,
aber doch starken Tetanus aufwies.

0,001 | 0,0001

001 I 0001 | oan | wa 0,01 | 0,001 | 001 | um ` 00001 | on

ccm cm $ ecm ccm | ecm | CCIU cem | cem | cem ccm i! ccm | ccm

5 | Tet. OTel oTt | — aa i — e | u e
| | O Tet. O Tet.: O Tet. [O Tet..0 Tet. 0 Tet. [0 Tet.: 0 Tet. | 0 Tet.

| I? St. Aua, B ı ln: 3 1 | 2 2y

, A D x 2 | 8
12 st. St, 80 St. 12 st. 3 | 4 IA, | 4 6 Di H st. Tet
5,1 | I2 st. 217, So 221.6 at Tet.| 8 | st. Tet.) 0 Tet

88 Ä 0 Tet. 0 Te L '0Tet. [0 Tet. s Tet. — 0 Tet. | — =

II-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 265

In Tabelle XII ist ein ähnlicher Versuch angegeben, wo ein
neues Toxin geprüft worden ist. Ein größerer Abschnitt in pyp,
von 4,5 bis 8,8 ist hier untersucht. Die Toxizität wurde, außer
gleich zu Anfang, nach 2, 6 und 14 Tagen geprüft.

Aus Tabelle XII geht mit aller Deutlichkeit sowohl die saure
als auch die alkalische Grenze für die Zerstörung des Toxins
hervor. Sowohl in dem Röhrchen, wo pp 8,8 war, als auch in den-
jenigen, wo pp 4,5 und 5,2 betrug, ist das Toxin nach 2 Tagen
fort. Das Stabilitätsgebiet für das Toxin liegt also zwischen
Pa = ô und De = 8.

Diese Zerstörung des Toxins scheint ziemlich rasch, d.h.
innerhalb ganz weniger Stunden zu erfolgen. Dagegen geht aus
der Tabelle hervor, daß das Toxin bei pe = 6,1 und py = 7,2
sich während der Zeit, welche der Versuch dauerte, nämlich
14 Tage, relativ unverändert an Stärke gehalten hat. Bei py = 8,1
ist das Toxin langsam geschwächt worden. Es hat nach dem
Versuch den Anschein, als ob die Zerstörungsgrenze auf der sauren
Seite schärfer markiert wäre als auf der alkalischen.

Da diese saure Grenze auch praktisch von größerer Bedeutung
ist als die alkalische, da die gewöhnlichste Ursache eines Miß-
lingens der Kulturen die ist, daß die Reaktion zu sauer geworden
ist, haben wir in Tabelle XIII einen Versuch relatiert, wo diese
Grenze näher studiert worden ist. Hierbei wurde als Ausgangs-
toxin das nämliche angewendet, das in Tabelle XII angegeben ist.
Ein ?y-Abschnitt von py = 4,5 bis py = 5,9 wurde untersucht.
Die Toxizität ist nach 5 Stunden und nach 2 Tagen geprüft.

Tabelle XIII.
Die Zerstörung des Toxins bei sauren Reabilien.
10 ccm Toxin Nr. 375 + HCl + Wasser = 12 ccm.

Maus tot nach Tagen
Nach 5 Stunden

Nr ! Pu een "im Thermostat Nach 8 an im Thermostat
0,01 cem j; 0,001 cem f 0,01 cem 0,001 ccm | 0,01 ccm 0,001 cem 0,001 cem
1, 45 0 Tet. | O Tet. | 0 Tet. | O Tet. | 0 Tet.
2° 53 1 o 0 Tet. | O Tet. | 0 Tet. 0 Tet. | O Tet.
3, 57 2 4 2, Te 8
4i 60 (Dt 3 2 | 217, 4

Wenn py = 4,5 und 5,3 ist, ist das Toxin schon nach 5 Stun-
den Behandlung im Thermostat bei 37° vernichtet, und in prak-
tischer Hinsicht kann dies als eine momentane Zerstörung an-

266 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

gesehen werden. In den 2 anderen Fällen, wo pg = 5,7 und 6,0
war, ist das Toxin nach 5 Stunden ein wenig und nach 2 Tagen
mehr geschwächt.

| Nach diesen Versuchen kann man also sagen, daß die ab-
solute Zerstörungsgrenze auf dem sauren Gebiet pe = 5,5 ist.
Selbstredend muß bei praktischen Arbeiten diese Grenze als
De = 6,0 gesetzt werden. Um Toxin in einer Bouillon erwarten
zu können, darf daher die Wasserstoffionenkonzentration nicht
größer sein als pe = 6,0.

Man könnte in Frage stellen, ob diese Zerstörung absolut
oder reversibel ist. Verschiedene Autoren haben diese Frage
studiert, und sind zu dem Resultat gekommen, daß die Zerstörung
irreversibel ist. In Tabelle XIV ist ein diesbezüglicher Versuch
angegeben, wo wir ein Toxin anwendeten, das ursprünglich ein
De von 7,7 hatte, einen Teil davon zur Kontrolle in ein Reagenzglas
füllten, zu zwei anderen b) und c) so viel sterile Säure zusetzten,
daß pe = 5,1 wurde und alle drei Reagenzgläser in das Thermostat
bei 37° einstellten. Nach 4 Stunden wurde das Röhrchen c durch
Alkali neutralisiert und pe wieder auf 7,7 gesetzt. Danach wurden
die Röhrchen wieder 20 Stunden in das Thermostat gestellt und
dann auf die Toxizität geprüft.

Tabelle XIV.
Die irreversible Zerstörung des Toxins.
a) Toxin Nr. 375. Pu = 7,6, b) Dasselbe + HCl, pe = 5,2. 4 Stunden
im Thermostat bei 37° gestellt, c) Probe b aus Thermostat genommen
nach 4 Stunden und durch Zusatz von NaOH wieder auf pu = 7,6
gebracht. Im Thermostat wieder gestellt 20 Stunden vor Toxinprüfung.

Maus gestorben nach Tage
b c
DOOL cem 0,01 cem | 0,001 cem 0,01 ccm | 0,001 cem

00l ecm
1
l2

Tabelle XIV zeigt deutlich, daß während die Probe a un-
geschwächte Toxizität zeigte, sowohl b als e ihr Toxin voll-
ständig verloren hatten. Dieser Versuch bestätigt also die von
früheren Verfassern hervorgchobene Irreversibilität der Toxin-
zerstörung.

r
-

l | 0 Tetanus ` O Tetanus lo Tetanus | 0 Tetanus

Die Stabilität des Tetanustoxins kann auch graphisch dar-
gestellt werden. Zu diesem Zweck haben wir die Zahlen aus

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 267

Tabelle XII genommen, welche sich auf 6 Tage Aufbewahrung
im Thermostat bei 37° beziehen. (Siehe Abb. 3.) Als Abszisse
ist De gewählt, als Ordinate die inverse Todeszeit der Mäuse,
wenn eine Todeszeit von 24 Stunden mit 1 bezeichnet wird.

Wachstumskur ve

TORIS robilitgtskurve
| |

Abb. 4.

Zuletzt ist in Abb. 4 eine Zusammenstellung von der Wachs-
tumskurve der Bacillen und der Stabilitätskurve des Toxins ge-
geben.

V. Die Kontrollierung der Wasserstoffionenkonzentration bei Her-
stellung von Tetanustoxin in großem Maßstabe.

Bei der Darstellung von Tetanustoxin in großem Maßstabe
hat sich oft gezeigt, daß in manchen Fällen die Kulturen, trotz
guten Wachstums und typischen Tetanusgeruches, kein Toxin
lieferten. Im Vorhergehenden war es auch vorgekommen, daß
während langer Perioden so gut wie jede Kultur mißlang. Wir
hatten zuvor dieselbe Erfahrung gemacht bei der Darstellung
von Diphtherietoxin. Vor der Kontrollierung der Wasserstoff-
ionenkonzentration kam es öfter vor, daß nur ganz wenige von
den gesäten Kulturen Toxin lieferten (siehe Dernby und David
1921), aber nachdem wir seit August 1919 konsequent die Wasser-
stoffionenkonzentration in sämtlichen Kulturen reguliert haben,
ist während dieser 2 Jahre nicht eine einzige Kultur fehlgeschlagen.

In Analogie hiermit könnte man möglicherweise denken, daß
eine konsequente Berücksichtigung der Wasserstoffionenkon-
zentration auch bei Tetanuskulturen zu einer konstanten Toxin-
bildung würde führen können. Doch muß nochmals hervor-
gehoben werden, was bereits in der Einleitung betont worden ist,
daß noch mancherlei andere Faktoren denkbar sind, die auf die
Toxinbildung einwirken können.

Welche Schlußfolgerungen können wir aus den Unter-
suchungen ziehen, die im vorhergehenden Kapitel in bezug auf

Biochemische Zeitschrift Band 128. 18

268 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

den Einfluß der Wasserstoffionenkonzentration auf die Toxin-
bildung besprochen wurden? Erstens ist es klar, daß die Tetanus-
bacillen sehr wohl bei einer Wasserstoffionenkonzentration leben
können, wo das Toxin nicht haltbar ist. Die Grenzen für diese
Haltbarkeit des Toxins haben wir nachgewiesen, und hieraus
können wir die wichtige Schlußfolgerung ziehen, daß es ein ab-
solut unweigerliches Erfordernis ist, daß die Woasserstoffionen-
konzentration in der Bouillon nicht größer sein darf als ent-
sprechend pe = 5,5. Es gilt demnach, darauf zu achten, daß die
Kulturen nicht so sauer werden, wie dieser Wert angibt, und
natürlich darf man in der Praxis nicht bis zum Grenzwert gehen,
sondern muß sich an pg = 6 als Minimum halten.

Nun haben wir zuvor gezeigt, daß die Tetanusbacillen nicht
gern in absolut zuckerfreier Bouillon wachsen. Im Gegenteil
scheint ein extra Zuckerzusatz das Wachstum zu fördern. Und
in zuckerhaltigen Bouillons pflegt fast immer pyg während des
Wachstums zu sinken. |

Tabelle XV.
Resultate aus der Herstellung von Toxin im großen Maßstabe.
Im Thermostat bei 37°. Toxin geprüft nach 12—14 Tagen.

eu besch

3 | | Pu Toxizität.
Nr: | au A Der Bouillon Ä So m | ` Nach ee Bemerkungen
i | Anfang | 14 Tagen
1, 330 | Aerob. Ord D | 79 | 63 [0 Toxin
2 : 336 Anaer. ge D. 7,6 6,6 0 ,
21 337 R i D. | 76 68 I0 ,
Ai 362 | f RS | E. 8,2 5,0 O: ,„
5 364 „ 1 E. 8,1 5,0 0 UW
6j 365 | no . | a | 81 50 In,
ann Eu | ts |o "` |} Sege
Hi 372 Si Trypsin | 3. 8,2 7,4 ER, i Wachstum
o 338 | > Ord D. | 78 72 | 0,0001
1| 339 e Tryps. + : -ı D. 8,2 7,0 0,001
0,1°/, Glykose |
12! 340 a Trypsin D. 8,2 75 0,0001
13! 373 — Aerob. | Tryps. + - E. 82 ı 72 0,0001
| | ‚0,1% Glykose ` |
14! 374 Anaer. ` Dsgl. ı E. 82 ı 70 0,0001
15.382 | = Ord. E. an 1,0 0,0001
16 383 ı i Se O E ‚l 7,0 0,0001 N
IT. an La B. | 82 | 80 | 0,0001 |} reanna
IS 376 | i D 8,2 8,0 0,0001 pans Pa ca. Bé
19.381 H NW E HU | 80 0,0001 war

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 269

Dies durch Pufferzusatz zu verhindern, ist auch nach unseren
Untersuchungen nicht möglich, da die Bacillen eine für ihren
Zweck hinreichend hohe Konzentration nicht vertragen können.

Daher sind wir bei einem einfacheren Verfahren stehen ge-
blieben, nämlich während des Verlaufes der Inkubationszeit die
Wasserstoffionenkonzentration zu kontrollieren und wenn pg zu
viel gesunken ist, eine erneuerte Alkalinisierung vorzunehmen,
was unten besprochen wird.

In Tabelle XV geben wir eine Zusammenstellung von einigen
der gewonnenen Resultate bei der Herstellung von Tetanustoxin
in großem Maßstabe, sowohl Kulturen, die Toxin geliefert haben,
als auch solche, die fehlgeschlagen sind. Fast sämtliche Kulturen
sind am 12. bis 14. Tage nach der Aussaat zur Toxinprüfung
genommen. ‚AÄnaer.‘‘ bedeutet anaerobe, ‚Aerob.‘‘ aerobe Züch-
tung. Die ordinäre, nach der in Abschnitt II angegebenen Me-
thode bereitete, Bouillon ist mit ‚Ord.‘“, die trypsinbehandelte
mit „Trypsin“ bezeichnet. Die Stärke des Toxins ist in ‚‚mini-
maler letaler Dosis?" gemessen, d. h. der kleinste Teil eines Kubik-
zentimeters, der erforderlich ist, eine weiße Maus zu töten. Wenn
kein Toxin gefunden wurde, haben wir dies durch 0 Toxin aus-
gedrückt.

In Nr. 1—9 sind solche Kulturen aufgenommen, die kein
Toxin abgegeben haben. In einigen derselben ist pyg so stark
gesunken wie bis pg = 5. Dagegen hat sich in einigen Fällen,
trotzdem die Reaktion immer noch alkalisch ist, dennoch kein
Toxin gebildet. In diesen Fällen glauben wir hierbei bemerkt zu
haben, daß die Tetanusbacillen nur spärlich gewachsen sind.

Doch haben wir auch bisweilen gefunden, daß trotzdem das
Wachstum gut war und die Reaktion alkalisch, kein Toxin ge-
bildet war; sowohl unter Anwendung von einem einzigen Stamm
als auch Mischungen von verschiedenen, welche alle als gute
Toxinbilder bekannt waren.

In Nr. 10—21 sind Kulturen angegeben, die Toxin geliefert
haben. Zu beachten ist, daß sowohl ordinäre als auch Trypsin-
bouillon Toxin gegeben hat und zwar sowohl unter aeroben als

‚anaeroben Bedingungen. Sowohl dänische wie englische Stämme
haben Toxin gegeben. Was das Interessanteste ist, ist daß in
sämtlichen Fällen der Endwert des pe alkalisch oder neutral ist.
Wir haben nie beobachtet, daß brauchbares Toxin gebildet war,

18*

270 K. G. Dernby und B. Allander: Einfluß der

wenn der Endwert niedriger als pg = 6,8 ist. Nach den Resul-
taten in Abschnitt IV, über die Stabilitätszone des Tetanustoxins,
sollte man glauben, daß das Toxin auch sehr wohl in einer pp-Zone
von 5,8 bis 6,8 gebildet werden könnte. Das praktische Resultat
deckt sich daher nicht völlig mit dem theoretisch erwarteten.
Möglicherweise könne dies auch der Fall sein, wenngleich wir seit-
her niemals eine gute Toxinbildung beobachtet haben, wenn das
Fond. pe niedriger als 6,8 gewesen ist.

Selbst wenn der Satz, daß falls das End. pe größer als 6,8 ist, To-
xin erwartet werden kann, nicht unbedingt stichhaltig ist, scheint die
Umkehrung: wenn man für Immunisierung genügend starkes Toxin
bekommt, ist der End-?g-Wert niemals sauer, ziemlich zutreffend.

Daher sind wir bei der Methode stehen geblieben, nach 2 Tagen
nach der Aussaat, wenn, wie in Abschnitt III gezeigt ist, py seinen
Minimalwert schon erreicht hat, eine Probe herauszunehmen,
py darin zu bestimmen, und wenn sich dann herausstellt, daß
De < 7,0 ist, bestimmen wir, wieviel Natriumhydroxyd zugesetzt
werden soll, um pe auf 7,5 bis 8,0 zu bringen. Die berechnete
Menge steriles Natriumhydroxyd wird vorsichtig und steril zur
Kultur gegeben, und dann muß diese weitere 10—12 Tage stehen,
bevor die Toxinprüfung erfolgt. DaB me wieder sinken sollte,
braucht man nicht zu befürchten.

In der Tabelle XV haben wir in Nr. 19, 20 und 21 Beispiele
von dergleichen erneuten Alkalinisierungen, und sie haben alle
guten Erfolg gezeigt.

Um ein endgültiges Urteil über die Zuverlässigkeit dieser
Realkalinisierungsmethode fällen zu können, sind natürlich Be-
obachtungen während einer langen Zeit von in großem Maßstabe
ausgeführten Kulturen erforderlich. Doch glauben wir schon jetzt
sagen zu können, daß die Methode besonders vielversprechend ist,
und selbst wenn dieselbe Präzision wie bei der Darstellung von
Diphtherietoxin nicht sollte erreicht werden können, dürfte das
Resultat doch bedeutend besser werden, als wenn man nach wie
vor die Kulturversuche ausführt ohne auf die Wasserstoffionen-
konzentration und ihre Veränderungen achtzugeben.

Schlußfolgerungen.
l. Die Tetanusbacillen können sich in einer verhältnismäßig
breiten Zune der Wasserstoffionenkonzentration, pg =5 bis

H-Ionenkonzentrat. a. Wachstum u. Toxinbildung d. Tetanusbacillen. 271

Un = 8,5 entwickeln. Das Wachstumsoptimum fällt zwischen
Pu = H bis 7,6.

2. Die Stabilitätszone des Tetanustoxins ist enger als die
des Wachstums und liegt zwischen pe = 5,8 und pe = 8. Bei
niedrigerem ?y-Werte als 5,8 (also im sauren Gebiet) stellt sich
eine vollständige, irreversible und sehr rasche Zerstörung des
Toxins ein. Bei einem py höher als 7,5 vollführt sich die Zer-
störung mehr allmählich. Das Stabilitätsoptimum liegt zwischen
Py = 6,0 und pe = 7,5.

3. Bei der Herstellung des Tetanustoxins in großem Maß-
stabe ist streng darauf zu achten, daß das Medium nicht sauer
wird (py nicht kleiner als 6,8).

4. Das Ausgangs-pg des Mediums soll 8 sein. Sollte bei
einer nach 2 Tagen vorzunehmenden Prüfung des Mediums das
Pa niedriger als 6,8 sein, ist eine erneuerte Alkalinisierung nötig.

Zuletzt ist es uns eine Freude, dem Direktor des Laboratoriums
Dr. Carl Kling, unseren Dank für die Anregung dieser Arbeit
und das Interesse, das er daran genommen hat, auszusprechen.

Literatur.

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5, 207. 1911.

Untersuchungen über den Einfluß des Caleiummangels
in der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz.

Von

Fausto Pedotti.
(Aus dem Physiologischen Institut der Universität Bern.)
(Eingegangen am 25. Juli 1921.)

Mit 2 Abbildungen im Text.

I. Einleitung.

Der Mineralstoffwechsel ist bisher um seiner selbst willen
untersucht worden, das heißt, man hat versucht, festzustellen.
wieviel ein Lebewesen von den einzelnen Mineralien braucht, um
gesund zu bleiben und, wenn es ein junges Tier ist, um zu wachsen.
Man hat ferner untersucht, welche Erscheinungen im Gesamt-
zustande des Tieres beobachtbar sind, wenn, soweit als es möglich
ist, die Nahrung vollständig derjenigen Mineralien entbehrte, welche
Gegenstand der jeweiligen Untersuchung waren. Im wesentlichen
handelte es sich bei der Untersuchung über den Mineralstoff-
wechsel um die Unentbehrlichkeit bestimmter anorganischer
Nährstoffe als Bausteine des Organismus.

Die Untersuchungen betrafen namentlich Eisen, Calcium,
Phosphor und Chlor. Bei allen diesen ist ihre Rolle als Baumaterial
ohne weiteres klar, aber es muß auch an andere Gesichtspunkte
gedacht werden als die bloße Erhaltung des Körperzustandes, wie
die Tatsache des Wachstums, die Ausbildung der einzelnen Gewebe
und ähnliches. Es muß auch daran gedacht werden, wie bei
Mangel und Überschuß sich an einzelnen Mineralien die Funktionen
des Körpers abspielen.

Seitdem durch die Arbeiten von Jacques Loeb das Pro-
blem der Ionenwirkung im Organismus ein bedeutsames Kapitel

biologischer Forschung geworden ist, müssen auch die Gesichts-

F. Pedotti: Einfluß des Caleciummangels der Nahrung usw. 9273

punkte, die dort sich eröffnet haben, auf die Untersuchungen
angewandt werden, die sich mit den Stoffwechselwirkungen der
einzelnen Mineralien befassen.

Es gibt aber noch ein anderes Gebiet biologischer Forschung,
welches neue Ausblicke auf die Fragestellungen der Bedeutung
des Mineralstoffwechsels wirft. Das sind Erfahrungen aus der
Lehre von der inneren Sekretion. Es sei hier daran erinnert, daß
gewisse Experimentaleingriffe, die man an Drüsen mit innerer
Sekretion macht, in ihrem Symptomenbild eine gewisse Ähnlich-
keit mit den Erscheinungen zeigen, die man bei Fehlen bestimmter
Mineralbestandteile beobachten kann. Ich erinnere hier an die
vielfach behauptete Ähnlichkeit der parathyreopriven Tetanie
mit den Erscheinungen, die man bei wirklichem oder angeblichem
Kalkmangel beobachten kann. Noch inniger fast sind die Be-
ziehungen, welche zwischen innerer Sekretion und Mineralstoff-
wechsel bestehen, bei der Lehre von der Milz, die einerseits eine
Rolle als Organ mit innerer Sekretion und andererseits eine recht
bedeutsame Rolle im Mineralstoffwechsel spielt.

Die Gedankengänge, welche ich einleitend kurz skizziert habe,
regten dazu an, den Einfluß des Mangels bestimmter Mineralien
in der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz zu unter-
suchen, und ich habe, dieser Anregung folgend, auf Professor
Ashers Rat den Einfluß des Kalkmangels in der Nahrung auf
den respiratorischen Umsatz untersucht.

Die Wahl des respiratorischen Umsatzes als Mittel, um tiefer
in das Verständnis der Bedeutung einzelner Mineralien für den
Organismus zu dringen, geschah aus verschiedenen Gründen:

l. Ist der Grundumsatz der Ausdruck der energetischen
Gesamtleistungen des ruhenden Organismus; die Leistungsfähig-
keit der Zellen drückt sich in verhältnismäßig leicht beobachtbarer
Weise sehr gut im Grundumsatz aus.

2. Ist der respiratorische Grundumsatz gerade diejenige
Funktion, an welcher die Leistungen der Drüsen mit innerer
Sekretion sich so vielfach haben untersuchen lassen.

Von den Mitteln, um beispielsweise die Rolle der Schilddrüse
oder der Hypophyse unter physiologischen Bedingungen im Or-
ganismus beurteilen zu können, gibt es wenige so geeignete und
zuverlässige wie die Beurteilung des respiratorischen Grund-
umsatzes.

274 F. Pedotti: Einfluß des

II. Methodik.

Zu meinen Untersuchungen bediente ich mich der Ratte und wandte
die Methodik der Feststellung des respiratorischen Stoffwechsels, wie sie
im Berner Physiologischen Institut üblich ist, an. Auf eine Beschreibung
dieser Methodik will ich verzichten, weil dieselbe von Prof. Ashers Schüler
N. Danoff sowie den anderen Benutzern derselben schon eingehend
dargelegt worden ist.

Kurz gesagt handelte es sich im Prinzip um die Halda n esche Methode.
welche gestattet, Kohlensäurebildung und Sauerstoffverbrauch sowie den
respiratorischen Quotienten genau zu ermitteln. Meine Arbeit befaßt sich
ausschließlich, als eine einleitende, der weitere Arbeiten mit gleichen Gesichts-
punkten folgen sollen, mit dem Einfluß des Calciummangels auf den respira-
torischen Grundumsatz. Unschwer wird man dabei auf zwei Gedanken-
gänge seine Aufmerksamkeit lenken.

Einmal wird vielfach behauptet, daß Calciummangel die Erregbarkeit
des Nervensystems, übrigens auch der Muskulatur, steigern soll. Da nun
der Stoffwechsel unter normalen Bedingungen der Herrschaft des Nerven-
systems unterstellt ist, darunter auch derjenigen des autonomen Nerven-
systems, von dem eine besondere Empfindlichkeit gegenüber dem Kalk-
mangel behauptet wird, könnte erwartet werden, daß der respiratorische
Grundumsatz den angeblich erhöhten Erregbarkeitszustand des Nerven-
systems widerspiegelt.

Sodann ist daran zu denken, daß, wenn Calciummangel im Organismus
herrscht, dieser sich ja auch auf die Drüsen mit innerer Sekretion würde
geltend machen können und es müßte somit auf diesem unmittelbaren
Wege der Grundumsatz beeinflußt werden. Diese Andeutungen mögen
genügen, um darauf hinzuweisen, daß von vornherein die Verwickeltheit
der Dinge ins Auge gefaßt werden muß, daß wir uns darüber klar sein müssen,
mit dem scheinbar einfachen Eingriff des Caleiummangels eine in sich
geschlossene Kette von Vorgängen gestört zu haben.

Meine Versuchstiere waren Ratten. Diese besitzen wegen ihrer Klein-
heit den Vorzug, daB keine großen Depotmengen von Mineralien auf-
gestapelt sein können, daß die Stoffwechselvorgänge verhältnismäßig rasch
in ihnen verlaufen, demnach Änderungen früher zum Ausdruck kommen
können als bei großen Tieren. Diesen Vorteilen steht der Nachteil gegenüber.
daß bei der Kleinheit dieser Tiere die Nahrung auf das sorgfältigste zu-
sammengesetzt sein muß, damit selbst die kleinen Mengen von Calcium
fehlen, welche für die Ratte schon genügend sind.

Da Untersuchungen vorliegen, welche zeigen, wie ganz allmählich
erst die Folgen einer unzureichenden Ernährung sich geltend machen —
ich erinnere an die Versuche von Martin Benno Schmidt über die Folgen
des Eisenmangels —, habe ich mich nicht mit dem bloßen Caleiummangel
in der Nahrung begnügt. Vielmehr habe ich versucht, noch auf eine andere
Weise den Calciumbestand des Organismus herunterzudrücken, und zwar
indem ich mich eines Verfahrens bediente, welches ich als ‚die Methode
der Erzeugung biologischer Unterwertirkeit des Caleiums' bezeichnen möchte.

Caleiunnmangels der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz. 275

Jacques Loeb hat gezeigt, daß die funktionelle Bedeutung der
einzelnen Ionen nicht bloß von der absoluten Konzentration derselben
abhängt, sondern von der relativen bei Gegenwart von anderen Ionen
„antagonistischer‘‘ oder, nach Karl Spiro, „pseudoantagonistischer‘“ Art.

Durch ihn und nachfolgende Forscher wissen wir, daB das Verhältnis

Cı
bei den verschiedensten Funktionen eine Rolle spielt. Ich habe daher der
von mir ausgewählten kalkarmen Nahrung — kalkfrei ist wohl nur ein

ideales unerfüllbares Postulat — Kalium in Form von Kalium sulfuricum
zugesetzt, um damit das nicht entfernbare Calcium biologisch zu entwerten.
Die von mir untersuchten Tiere erhielten zuerst in einer längeren Vor-
periode eine gewöhnliche Nahrung, um unter normalen Bedingungen ihren
Grundumsatz kennenzulernen. Nach Feststellung desselben ging ich zu
einer calciumarmen Nahrung über — feines Weißbrot, getrocknetes, mit
destilliertem Wasser ausgelaugtes Rindfleisch, reine Margarine, alles mit.
destilliertem Wasser gekocht.

_ Diese calciumarme Nahrung wurde zunächst 3 Wochen lang verab-
reicht, ehe die eigentlichen Versuche begannen. Um die Tiere an fort-
dauernde Respirationsversuche zu gewöhnen, wurden sie während dieser
3 Wochen mit blinden Respirationsversuchen im Respirationskasten ein-
geübt. Ich halte diesen Punkt methodisch für sehr wichtig. Erst dann
begannen, bei anhaltender caleiumarmer Nahrung, die eigentlichen Versuchs-
perioden. Im Verlaufe derselben setzte ich außerdem noch Kalium sulfu-
ricum in verschiedenen Konzentrationen hinzu, d. h. ich habe die Nahrung
mit verschiedenen Kaliumlösungen aufgeweicht und gekocht.

UL Ernährung der Versuchstiere.

Die Zusammensetzung der calciumarmen Nahrung gebe ich in der
nachfolgenden Tabelle.

Diese enthält die Nahrungsmenge, welche ich täglich gab, den Calcium-
gehalt der Nahrungsmittel. (Herr Dr. Liechti, Vorsteher der Schwei-
zerischen agrikultur-chemischen Anstalt in Liebefeld-Bern, hatte die Güte,
die Calciumanalysen von Weißbrot, Rindfleisch und Margarine für mich
durchzuführen.)

Sie enthält ferner die Berechnung der Ca-Gesamtmenge, welche das
Tier bekam, und die Calorienzahl, die in der Nahrung enthalten ist. Laut
dieser Tabelle erhielten die Tiere mindestens ?/ CaO weniger als sie nötig
hatten. Der Caloriengehalt der Nahrung sowie der Gehalt an organischen
Stoffen, an akzessorischen Nährstoffen und anderen Mineralien war ein
genügender. Ich glaube daher behaupten zu dürfen, daB die von mir
gegebene Nahrung allen Anforderungen an eine zureichende Nahrung
entsprach und nur calciumarm war. Alle älteren Versuche über mineral-
arme Nahrung sind nach dem jetzigen Stande unserer Kenntnisse mit
größter Wahrscheinlichkeit mit dem Fehler behaftet, daß sie auch in bezug
auf die akzessorischen Nährstoffe, deren Bedeutung früher unbekannt war,
unzureichend waren.

2,2

Vorversuche
(T-X)

276 F. Pedotti: Einfluß des

Tabelle I.
aus EE .
CaO-Gehalt in Nahrungsmenge pro Tag | Menge In der

100,0 Trockensubstanz | und pro Tier gegebenen calorien:
Nahrung zahl *)

ECH ECH
Feines Weißbrot . 0,0413 | Getrockn. Weißbrot.. 5,0 | 0,0020650 | 20,50
Rindfleisch . . . . 0,0283 „ Rindfleisch 0,75 | 0,0002123 : 3,07
Reine Margarine . 0,0098 | Margarine ...... 0,5 ` 0,0000490 "` 4,65

*) nach Mohr, Stoffwechseluntersuchungen.

Somit bekommt jedes Tier pro Tag und 100,0 g Körpergewicht
0,00153 g CaO statt wie normal 0,0034 g (Albu und Neuberg, Mineral-
stoffwechsel). Jedem Tiere kommen 18,81 Calorien pro 100,0 g Körper-
gewicht zu.

Zur Ergänzung des methodischen Teiles meiner Versuche habe ich
noch hinzuzufügen, daB bei einem meiner beiden Versuchstiere, nachdem
es hinreichend lange Zeit mit kalkarmer Nahrung ernährt worden war,
diese ausgesetzt wurde, indem zur bisherigen Grundnahrung, die für den
Bedarf des Tieres als notwendig ausgerechnete Caleiummenge in Form von
Calcium lacticum zugesetzt wurde, und später habe ich dann eine gewöhn-
liche Nahrung, bestehend aus grobem Brot, trockenem Rindfleisch, Kon-
densmilch und Wasser gegeben. Das andere Tier wurde, als nach einer
längeren Periode der calciumfreien Nahrung anscheinend ein gewisser
Endzustand eingetreten war, getötet, um einer genaueren pathologisch-
anatomischen Untersuchung unterzogen zu werden, auf welche ich später
eingehen werde.

Vorversuche Versuche

Abb. 1. Abb. 2.

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Calciummangels der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz.

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Caleiummangels der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz. 279

Tabelle IV.
Rotgezeichnete Ratte.

Mittelwerte.

RQ = respiratorischer Quotient. CO, = CO, in g pro kg u. Stunde.
Oe = O, in g pro kg u. Stunde.

Versuche XV—XXVII VII | Versuche Sech (tesamtabnahme

Vorversuche I—XIII SES ‚reg. d. \ d. Vorversuche

RQ = = Q, 0,7691011 10| 0, 7665186 0,73327 — 0,0357410
COz= 3,0544766 | 2,917061 2,4477 = 0,6067766
Oz = 2, 8528066 | 2, 766571 2,4265 — 0,4263066

Blaugezeichnete Ratte.

Vorversuche II—XIV vv Versuche XVI—XXVIII

Gesamtabnahme

Versuche XXX— XL geg. 4. Vorversuche

RQ = 0,175004 07230 0,729407 | —0,045597
CO, = 3,2255428 . 2,736204 2,32443 ` — 0,9011128
Oz = 3,022003 | 2,569957 2,31601 į — 0,705993

(Calcium lactic.. Zusatz) e S EEN
Versuche LIII—LV | RQ = 0,73206

(normale Nahrung) Go 5 u
2 —

Versuche XLII—LI f eo : 0,73157

IV. Ergebnisse der Untersuchung.

Die Ergebnisse meiner Untersuchungen, die an zwei für
derartige Versuche besonders geeigneten Tieren angestellt wurden,
lassen sich kurz mitteilen, da ich alles wesentliche in zwei, alle
Einzelheiten enthaltenden Tabellen und in einer zusammen-
fassenden Generaltabelle niedergelegt habe.

Tabelle II. (Rotgezeichnete Ratte.)
Tabelle III. (Blaugezeichnete Ratte.)
Tabelle IV. (Zusammenfassende Generaltabelle: Mittelwerte.)

Ehe ich auf die stofiwechselphysiolcgisch interessanten Tat-
sachen eingehe, sind ein paar Bemerkungen über das allgemeine
Verhalten der Tiere während der Stoffwechselversuche zu machen.

Die Tiere verhielten sich während der ganzen Versuchsdauer in der
Respirationskammer sehr ruhig; da alle Versuche nach 18stündigem Hunger
angestellt wurden, geben die erhaltenen Werte tatsächlich den ungestörten
Grundumsatz wieder. Eine gewisse Änderung der Tiere ließ sich erst nach
längerdauernder Ernährung mit caleiumarmer Nahrung beobachten;
besonders in der Zeit, wo sie gleichzeitig Kalium erbielten. Die Tiere waren

280 F. Pedotti: Einfluß des

im allgemeinen lebhafter, eine Beobachtung, welche während ihres Aufent-
haltes in ihren Käfigen außerhalb der Respirationskammer gemacht werden
konnte.

In der Respirationskammer ließ sich bemerken, daß die Tiere viel
mehr Flüssigkeit von sich gaben.

Der Wassergehalt in der Kammer war größer als inanderen Versuchen.

Diese Beobachtungen lassen sich am leichtesten deuten als Steigerung
der Erregbarkeit der Tiere und insofern würden meine Versuche einen
neuen Beitrag zu der behaupteten Erregbarkeitssteigerung infolge Calcium-
mangel liefern. Die Erregbarkeitssteigerung würde sowohl die Muskulatur
als auch autonome Gewebe betreffen. Wenn man aber auf Grund dieser
Beobachtungen gewisse Erwartungen auf das Verhalten des Stoffwechsels
knüpfen würde, so werden diese Erwartungen durch den tatsächlichen
Ausfall meiner Versuche enttäuscht.

In der Vorperiode zeigt sich bei beiden Versuchstieren an-
nähernd das gleiche Verhalten. Bei dem einen Tiere betrug die
CO,-Ausscheidung pro kg und Stunde 3,05, bei dem andern
3,23 g, der Sauerstoffverbrauch 2,85 bzw. 3,02g. Im Verlaufe
der längerdauernden Periode der calciumarmen Ernährung unter
Zuhilfenahme der biologischen Entwertung des Calciums durch
das Kalium trat nun eine fortschreitende Verminderung des
Grundumsatzes auf. Bei dem einen Tier (rotgezeichnete Ratte) sank
die CO,-Ausscheidung von 3,05 auf 2,45 g, bei der blaugezeich-
neten Ratte von 3,23 auf 2,33 g, der Sauerstoffverbrauch auf 2,43
bzw. 2,32 g pro kg Körpergewicht und Stunde. (Siehe Tabelle V.)

Es handelt sich also um eine ganz merkliche Abnahme in der
Größe des respiratorischen Grundumsatzes. Es sind Größenwerte,
wie sie etwa dem entsprechen, wie sie im Zustande der Unterwertig-
keit der Schilddrüse oder der Hypophyse zur Beobachtung gelangen.

Ich bemerke, daß die Unterschiede in der Vor- und der Ver-
suchsperiode viel größer sind als etwa individuelle Unterschiede,
wie sic zwei verschiedene Tiere unter sonst gleichen Bedingungen
zeigen können. Ferner handelt es sich in meinen Versuchen um
eine Veränderung in den quantitativen Verhältnissen des Grund-
umsatzes, nieht aber um solche qualitativer Art. Dafür sprechen
die Zahlenwerte des respiratorischen Quotienten. In der Vor-
periode betrug derselbe 0.77 bzw. 0,78. in der eigentlichen Versuchs-
periode 0,73 bzw. 0,73. Diese Unterschiede dieser Vor- und Versuchs-
periode sind so außerordentlich klein, daß man nicht mit der Behaup-
tung fehlgehen wird, daß der Anteil von Eiweiß, Fett und Kohlen-
hydratenam Stoffwechsel in beiden Perioden der gleiche geblieben sei.

Caleiummangels der Nahrung auf den respiratorischen Grundunisatz. 281

Wie ich schon oben erwähnt habe, wurde bei dem zweiten
Tiere (blaugezeichnete Ratte) zum Schluß der Nahrung Calcium
in Form von Calcium lacticum zugesetzt und schließlich eine
normale, das Calcium in den nötigen Mengen enthaltend, gegeben.

Der Erfolg war, daß der Grundumsatz wieder in die Höhe
ging, allerdings erst nach längerer Zeit, und es wurden auch nicht
in der mir zur Verfügung stehenden Zeit die ursprünglichen
Werte wieder erreicht. Schließlich ist noch anzuführen, daß das
Körpergewicht der Tiere während der ganzen Versuchszeit die
Tendenz hatte, etwas in die Höhe zu gehen; allerdings handelte
es sich um nur kleine Beträge. Diese Tatsache spricht, meiner
Meinung nach, entscheidend dafür, daß die von mir gewählte
Nahrung in jeder Beziehung bis auf den Calciummangel eine
zureichende war; andererseits sind die Zunahmen des Körper-
gewichtes von einem so kleinen Betrage, daß auf diese die Min-
derung des Grundumsatzes nicht zurückgeführt werden kann.
Auch von den Temperaturverhältnissen während meiner Versuche
sind die Ergebnisse nicht abhängig. Bekanntlich treten bei Ver-
minderung der Außentemperatur Erhöhungen des Grundumsatzes
auf. Während meiner Versuche war zeitweilig, wegen ungenügen-
der Heizung, die Temperatur des Versuchsraumes niedriger als
in der Vorperiode; dieser Umstand hinderte aber nicht, daß unter
dem Einfluß des Caleciummangels der Grundumsatz sich weiter
senkte.

Als Hauptergebnis meiner Untersuchungsreihen muß die
Minderung des Grundumsatzes bezeichnet werden.

Diese Tatsache ist so klar, daß sie jede Möglichkeit aus-
schließt, dem Caleiummangel, wie er durch Entzug des Caleiums
in der Nahrung herbeigeführt werden kann, einen fördernden
Einfluß auf den Stoffwechsel zuzuschreiben. Will man daran
festhalten, daß die nervöse Erregbarkeit durch Calciummangel
gesteigert wird (Andeutungen, die hierauf hinzuweisen scheinen,
habe ich selbst beobachtet und oben beschrieben), so hat doch
diese Erregbarkeitssteigerung laut Aussage meiner Versuche keinen
Einfluß auf den respiratorischen Stoffwechsel.

Man könnte natürlich Hilfshypothesen ersinnen, um den
Widerspruch zwischen nervöser Erregbarkeitssteigerung infolge
Caleiummangel und Stoffwechselverminderung in Einklang zu
bringen, doch verzichte ich auf eine Mitteilung solcher Hilfs-

282 F. Pedotti: Einfluß des

hypothesen, weil eine experimentelle Prüfung derselben außerhalb
des Rahmens meiner Arbeit liegt. l

Die Verminderung des Stoffwechsels ist etwa von der gleichen
Größenordnung wie diejenige nach Entfernung der Schilddrüse.
Wir sehen demnach, daß zwei anscheinend verschiedene Eingriffe,
namentlich der Wegfall eines inneren Sekretes und der Mangel
an einem Mineralbestandteil der Nahrung, symptomatisch nach
dem Stoffwechsel beurteilt, zu dem gleichen Bilde führen kann.

Der Gedanke, daß die Brücken, welche zwischen der Lehre
von der inneren Sekretion und der Lehre von dem Einfluß von
Ionen auf den funktionellen Zustand des Organismus vorhanden
sind, einer Berücksichtigung wohl wert sind, gewinnt aus Er-
gebnissen, wie sie meine Versuche gezeigt haben, eine Bedeutung.
Man könnte sogar daran denken, ob nicht Calciummangel in der
Nahrung im ungünstigen Sinne gewisse Drüsen mit innerer
Sekretion beeinflußt, diese vielleicht früher als irgendwelche
andere Organe in dem Körper. Am ersten wird man natürlich
an die Schilddrüse denken. Deswegen habe ich, als bei dem einen
Tiere der Stoffwechsel seinen Tiefstand erreicht hatte, die Sektion
ausgeführt. Herr Professor Dr. Wegelin, Direktor des Berni-
schen Pathologisch-anatomischen Instituts, hatte die große Güte,
folgenden Sektionsbefund mir mitzuteilen:

„Die in Serienschnitten untersuchte Schilddrüse zeigt ganz
normales Bild; ebenso die Epithelkörperchen.

Die Knochen sind sehr hart und lassen sich ohne Entkalkung
nicht schneiden.

An den Extremitätenknochen sind die Epiphysenlinien noch
vorhanden, zeigen normale Beschaffenheit, ebenso zeigen die Gelenk-
knorpel und der periostal gebildete Knochen nichts besonderes.“

Aus dem Berichte ergibt sich, daß weder an der Thyreoidea
noch an der Parathyreoidea irgendeine morphologisch konstatier-
bare Veränderung vorhanden war.

Auch der Knochen erwies sich bei der mikroskopischen
Untersuchung als normal. Leider habe ich versäumt, bei der
Sektion die Hypophyse zu entnehmen, so daß ich darüber keine
Angabe machen kann. Insofern die Tiere während der Versuchs-
periode eine geringe Körpergewichtszunahme aufwiesen, könnte
man an eine Insuffizienz der Hypophyse denken. Doch ist diese
vorläufig eine reine Hypothese!

Calciummangel der Nahrung auf den respiratorischen Grundumsatz. 283

Eine andere Annahme, die gemacht werden kann, ist die
einer kompensatorischen Abnahme des Stoffwechsels im Hinblick
auf die erhöhte Nervenerregbarkeit infolge des Calciummangels.
Es lassen sich hier nur Probleme aufstellen, keine Lösungen brin-
gen. Es bleibt aber als bedeutsame Tatsache, unabhängig von
jeder Erklärung bestehen, daß eine calciumarme, somit aber in
jeder Beziehung zureichende Ernährung den Grundumsatz er-
heblich vermindern kann.

Zusammengefaßt

ist der wesentliche Inhalt meiner Arbeit der nachfolgende:

1. Es wurde Ratten eine calciumarme Nahrung gegeben
und das im Körper vorhandene Calcium durch Kalium biologisch
zu entwerten versucht; im übrigen aber war die Nahrung in jeder
Beziehung eine zureichende. l

2. An so ernährten Tieren wurden respiratorische Stoff-
wechselversuche angestellt, deren Ergebnis war, daß der Grund-
umsatz unter dem Einfluß des Calciummangels sich erheblich
verminderte.

3. Die histologische Untersuchung ergab keine erkennbare
Veränderung an Thyreoidea, Parathyreoidea und Knochen.

Literatur.

Tiegerstedt, Handbuch der physiolog. Methodik. — Haldane, J.,
A new form of Apparatus for measuring the Respiratory Exchange of
Animals. (Journ. of Physiol 12, 419.) — Dan off, N., diese Zeitschr. 191$,
Sonderabdruck aus Bd. 93, H. 1l u. 2. — Frey, v., Physiologie. Vorlesungen.
Springer, Berlin. — Hofmeister, Frz., Über qualitativ unzureichende
Ernährung. Asher und Spiros Ergebn. 1916. — Mohr, Die Methodik der
Stoffwechseluntersuchungen. — Koenig, J., Chemie der menschlichen
Nahrungs- und Genußmittel. Berlin 1904. — Albu und Neuberg, Physio-
logie und Pathologie des Mineralstoffwechsels. Springer, Berlin. — The
Laboratory of physiological Chemistry 1917/18 (Sheffield Scien-
tific School Yale University). Studies in Ca- und Mg-Metabolism.
I. The effects of Base and Acids. By M. H. Givens and Lafayette B. Mendel
1917. (From the Journ. of biol. chem. 1917/18.) — Idem II. The effects of
Diets Poor in Calcium. By Id. 1917. The Influence of the administration
of Ca spon Blood Sugar Content in Rabbits with Guanidine Hypoglycaemia.
By C. K. Watanabe 1918. (From the Journ. of physiol. chem. 1918.) The
Change of Phosphate and Calcium Content in Serum in Guanidine Tetany
and the Relation between the Ca Content and Sugar in the Blood. By
Idem 1918. |

Biochemische Zeitschrift Band 123. 19

im Beitrag zur Permeabilität des Pflanzenplasmas für
die Neutralsalze.

IV. Mitteilung.

Von
Hugo Kahho (Dorpat, Estland).

(Eingegangen am 26. Juli 1921.)

Ich habe früher!) gezeigt, daß die Giftwirkung der Neutral-
salze auf das Pflanzenplasma der lyotropen Reihenfolge SO, > CNS
nach zunimmt, wobei die Alkalisalze eine viel größere Aktivität
besitzen als die Erdalkalien.

In den vorliegenden Versuchen wird über die Permeabilitäts-
verhältnisse der Neutralsalze mit Bezugnahme auf die Gift-
wirkung berichtet.

Methodisches.

Die Versuche wurden an jungen Wurzeln der gelben Lupine aus-
geführt.

Die von Haage und Schmidt (Erfurt) bezogenen Samen wurden
24 —48 Stunden in destilliertem Wasser eingequollen und nachher in feuchten
Sägespänen gezogen.

Zu den Versuchen wurden 25--40 mm lange Hauptwurzeln verwendet.
Vor dem Versuch wurden die Wurzeln 30 Min. in destilliertes Wasser gelegt.

Zur Permeabilitätsbestimmung wurde Lundegärdhs?) Gewebe-
spannungsmethode angewandt.

Eine abgeschnittene Wurzelspitze (ca. 1,0—1,5cm), auf welcher
2 Marken mit Kienruß (bzw. Tusche) angebracht sind — die eine gleich an
der Spitze, die andere in der Entfernung von etwa 6 mm von der ersteren —,
wird mittels einer dünnen Glasnadel in einer Schale in Wasser an einen
Paraffinblock so befestigt, daß das freie Ende der Wurzel auf einer Paraffin-
unterlage liegt. Später, im Laufe der Arbeit, empfahl es sich, um die Wurzel
streng in horizontaler Lage zu erhalten, statt der zweiten Paraffinstütze
neben dem Paraffinblock eine gleichhohe Glasplatte daneben zu legen,

1) Diese Zeitschr. 120, 125, 1921; II. Mitt.
2) K. Svenska Vet. Akad. Handl. 47, Nr. 3. 1911; vgl. Stälfeldt,
ebenda 62, Nr. 1, 5.78. 1921; Delf, Ann. of Botany 30, 283. 1916.

H. Kahho: Permeabilität des Pflanzenplasmas usw. 285

auf welcher der Spitzenteil der Wurzel ruhte. Der Abstand zwischen den
Marken wurde zuerst in Wasser wiederholt gemessen und dann das Wasser
mit einer schwach hypertonischen Salzlösung vertauscht.

Die Messungen wurden mittels eines Okularmikrometers — Okular II,
Objektiv 1, Leitz — ausgeführt. Es sei hier beispielsweise eine Messung
vorgeführt. Eine Wurzelspitze in KCl 0,22 Mol zeigte folgende Werte in
Mikrometerstrichen:

Zeit in Minuten 0 3 6 8 32 60
Mikrometerstriche 135 126 120 120 123 125
Verkürzung — K = 11,11°5; Ausdehnung — D = 3,70%.

© Der Abstand zwischen den Marken auf der Wurzel beträgt ursprüng-
lich in Wasser 135 Mikrometerstriche. In KCl-Lösung tritt eine Verkürzung
ein, die nach 6 Minuten das Maximum erreicht (15 Mikrometerstriche
= 11,1190). Nach 8 Minuten beginnt die Wiederausdehnung, die nach
60 Minuten vom Beginn des Versuches 5 Mikrometerstriche (= 3,709, der
beobachteten Länge) erlangt.

Es ist begreiflich, daß je größer die Hypertonie einer Lösung ist, desto
länger die Zeit zwischen dem Moment, wo die maximale Verkürzung er-
reicht wird und dem Beginn der Wiederausdehnung wird. In stark hyper-
tonischen Lösungen wird das Plasma von der Zellwand völlig abgehoben,
was äußerlich dadurch in Erscheinung tritt, daß die Länge der markierten
Stelle der Wurzel nach der maximalen Verkürzung lange Zeit unverändert
bleibt. Infolgedessen sind bei diesen Versuchen nur schwach hypertonische
Lösungen angewandt, d. h. solche, bei denen die erwähnte Zwischenzeit
nur wenige Minuten dauert und der Plasmaschlauch vermutlich von der
Zellwand nicht abgehoben!) und die organische Verbindung der Plasma-
oberflächenschichten mit der Zellwand nicht zerstört wird?). Ferner ist
es von großer Wichtigkeit, den Wendepunkt von der Kontraktion zur
Expansion der Wurzeln exakt zu bestimmen. Dazu wurden die Versuchs-
objekte stets solange kontinuierlich beobachtet, bis dieser Punkt erreicht
war, und danach wurden die Messungen in größeren Zeitabschnitten (5 bis
10 Minuten) gemacht, da die Wiederausdehnung der Wurzeln ziemlich
gleichmäßig vor sich ging.

Bei allen Versuchen sind isotonische Lösungen der Salze (Merck,
pro Analysi; Lösungen volumnormal) angewandt.

Für die Mehrzahl der Salze wurden die isotonischen Lösungen nach
den Fittingschen Koeffizienten berechnet). Für NaJ und NaBr wurde
der isotonische Koeffizient dem des NaNO, gleich angenommen.

Da reine Neutralsalzlösungen mehr oder weniger giftig sind, so habe
ich die Versuche nur eine Stunde dauern lassen und nach der Beendigung
eines jeden Versuches die Wurzeln auf die Ausdehnungsfähigkeit in Wasser
geprüft, um sicher zu sein, daß die Zellen noch lebend waren.

1) Vgl. Lundegärdh, L e. S. 120.

2) Vgl. Hansteen-Cranner, Ber. d. Dtsch. Bot. Ges. 37, 380. 1919.

3) Jahrb. f. wiss. Botan. 57, 553. 1917.

197

286 H. Kahho:

Bei der näheren Untersuchung zeigte sich, daß gewisse äußere Be-
dingungen schon bei der Aufzucht der Wurzeln einen viel größeren Einfluß
auf die Permeabilität derselben ausüben als man hätte erwarten können.
Eine etwas zu große oder zu geringe Feuchtigkeit der Sägespäne, Schwan-
kungen in Temperatur usw. setzen die Durchlässigkeit erheblich herab.

Infolgedessen stammen die zum Vergleich genommenen Keimlinge
immer aus derselben Kultur. Da nun ferner die äußeren Bedingungen,
wie die Temperatur und Belichtung, während der Arbeit im Laboratorium
beträchtlich schwankten, so sind die Ergebnisse der Versuche nur innerhalb
der Grenzen einer jeden Serie, wo diese Bedingungen relativ gleich waren,
vergleichbar.

Da uns hier hauptsächlich die Wiederausdehnungen der Wurzeln
in verschiedenen Salzlösungeen interessieren, so ist für die vorhergehenden
Verkürzungen (A) derselben der Mittelwert der Prozente aus allen Ver-
kürzungen einer jeden Versuchsserie angeführt. In den Tabellen ist dieser
Mittelwert durch M.K. bezeichnet. Die übrigen Zahlen der Tabellen sind
l. die Wiederausdehnungen der Wurzelspitzen (D) im Laufe einer Stunde
(vom Beginn des Versuches an gemessen) in Prozenten der beobachteten
Länge ausgedrückt, 2. das Verhältnis (E) der Wiederausdehnungen zur
vorhergehenden Verkürzung ee e e

Die Beeinflussung der Permesabilität durch Anionen.
a) Natriumsalze.

Tabelle I.

UL Serie

I. Serie II. Serie

i Konzen- | yx.-68%, | M.E. = 57% | Konzen | M.K. = 97%,
Salz ‚ traton f- = _. d ern tration |_. — Sc CS
in Mol D E D E in Mol. D E
==: BAR = ` z So "i ei Ko DEER 26 "a
NaBr. 0,15 4,6 018 I 61 | oe
NaJ . 0,15 1.5 0,18 5I 43
NaNO; 0,15 — 0,18 KÉ 50
NaCl. .. . 015 1.4 0,18 3.6 29
Na-Tartrat .; 0,118 OT 0.141 1,5 2
NA), -, 0.113 0,7 0,135 | OT a
Temperatur C° 20—21° 20—22°
IV. Serie V. Serie VL Serie
Konzen- Tv ze, [Konzen- | M K. = 105% | M.E. = 919%
Salz tration = a | tration . e, Dee GC
in Mol. D E in Mol. D E D E
o: , o o u o o
NaBr... . 018 4,0 12 0,20 3.6 | zo 5,0 7
Naj... 0.1018 4.3 65 0.20 DR | 45 4.7 39
NaNO... OIX 3.0 25 0,20 217» 1,9 CH
NaCl 2. a 018 2.2 20 0,20 3.3 33 3,0 | 30
Na-Tartrat .: 0,141 1.5 25 0.157 0,8 14 d 0
NaSO. "015 | 07 | w Poolo olo | o

Temperatur UC"

Permeabilität des Pflanzenplasmas für Neutralsalze. IV. 287

Nach den Daten der Tabelle I nimmt die Salzaufnahme-
geschwindigkeit von Plasma nach folgenden Reihenfolgen ab:

I. und II. Serie — Br > J, NO, > Cl > Tartrat, SO,.
II. „ —Br>NO,>J> Cl> Tartrat > S50,
IV. „ —J>Br> NO,> Cl> Tartrat > SO,
V. „ —J>Br>Cl>NO, > Tartrat > BO,
VI. „ —Br>J>tC>NO,> Tartrat, SO,.

Einige Versuche mit Na-Citrat zeigten, daß es ebenso schwer
permeiert, als das Sulfat.

Wie man aus dieser Gegenüberstellung sieht, haben alle
Reihenfolgen ungefähr denselben lyotropen Charakter. Viele
andere derartige Versuche ergaben etwa dieselben Resultate.
Die Wiederausdehnung der Wurzeln ist in den Lösungen von
Jodid und Bromid bzw. auch Nitrat stets schneller als in der
NaCl; in den Lösungen der Na-Salze mit den mehrwertigen An-
ionen ist sie mit dieser Methode kaum nachzuweisen.

Den nicht völlig übereinstimmenden Stellungen der ersten
drei Anionen (J, Br, NO,) in den Reihenfolgen ist kein großer
Wert beizulegen, denn bei diesen gutpermeierenden Salzen wird
die Eindringungsfähigkeit sehr leicht von verschiedenen Faktoren,
die sich nicht übersehen lassen, beeinflußt.

Ferner ist zu bemerken, daß die Unterschiede in der Auf-
nahmegeschwindigkeit bei den Na-Salzen besser hervortreten als
bei den K-Salzen. l

b) Kaliumsalze.

Die vier ersten in der Tabelle II angeführten Salze zeigen
durchschnittlich eine ziemlich gleiche Durchdringungsfähigkeit.
Doch bei einigen Versuchen macht sich die geringere Permeabilität
für KCl bemerkbar. Das K-Citrat verhält sich etwa wie das Sulfat.

Im allgemeinen läßt sich für die Kaliumsalze diese Per-
meabilitätsreihenfolge aufstellen : — Br, NO, > Cl > Tartrat > BO,
Citrat. Sie ist ungefähr dieselbe, wie bei den Natriumsalzen. Wie
bekannt, sind zuerst von Troendle!) für die Plasmapermea-
bilität für Neutralsalze folgende Ionenrcihen aufgestellt worden.
Anionen: — SO, <CI < NO, und Cl < Br, J. Kationen: —
Ca < Sr < Ba < Mg < li < Na < K < Rb.

1) A. Troendle, Arch. de sciences phys. et nat. 45, 125. 1918.

288 H. Kahho:

Tabelle II.

III. Serie

Konzen-

Salz tration EEE RER EN

in Mol. D E
RB. 2,4 0,180 48 55
ARNO, & ze 0,185 5.5 TT
KC... 0,181 4,8 54
K-Tartrat. . 0,127 0,143 d u
KSO, : - . ' 0,123 (1,138 0 0
K-Citrat . ., 0,101 0,114 0

Temperatur C° | 20—21°

S IN. Serie e
onzen- ge onzen-
M. K. = 7,0%
Salz tration LL 2> “e | tration
in Mol. D E in Mol.
o ' oi
"0 9

KBr.... 0,180 5,
KNO, ... 0,185 3
KCI... Kn. OII 5
K-Tartrat . . 0,143 ]
K,S0, . . . O38 0 0
K-Citrat . .: 0,114 0

Temperatur ('° | 18—19° | 19—20 °

Die Beeinflussung der Permeabilität durch Kationen.

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, ist die Aufnahme der
Erdalkalien so gering, daß sie mit dieser Methode gar nicht nach-
zuweisen ist!). Die Ausdehnung der Wurzeln bleibt nach der
Kontraktion aus, nur für das Magnesiumchlorid ist in einigen
Versuchen eine geringe Expansion zu konstatieren.

Tabelle III.

e I. Serie II. Serie
| onzen- .K. = o M. K. = 95%
Salz ` tration ME E 96% Kia
in Mol, D E D | E
Oo: | 07 0/ i o:
E EE
Kl... 0,190 7 68 5,8 | 60
Naar. 2 0,193 A 83 ‚3 40
MgCl .. . 0,133

Temperatur C°

1) Vgl. Fitting, Jahrb. f. wiss. Botan. 56, 1. 1915.

Permeabilität des Pfanzenplasinas für Neutralsalze. IV. 289

Tabelle III (Fortsetzung).

m. Serie IV. Serie
` Konzen- | M.K. -= =79% | AE
Salz tration RE ed —

in Mol. D E D E

to SÉ o Is

KCL... 0210 3.1 H 3,4 An
NaCl. ... 0.214 2.1 25 1.7 24
LICE 5% 0,204 1,3 2 0,9 13
MgCh ... 0,148 0,9 8 U9. B
BaCl. ee 0,152 0 0 d 0
Sr. . . 0,149 0 0 0 d

Dreams C° | 20—21° (as `

Nach abnehmender Eindringungsfähigkeit geordnet, haben
wir hier folgende Kationenreihe: —K > Na > Li > Mg > Ba, Ca.
Die Permeabilitätsbeschaffenheit der letzteren zwei Erdalkali-
kationen werden wir später in Salzgemischen näher kennen lernen.

Gegenseitige Beeinflussung der Aufnahmegeschwindigkeit durch
Salze.
a) Kationen.

Untersuchen wir zunächst die Beeinflussung der KNO,-
Aufnahme durch Erdalkalikationen.

Tabelle IV.

L Serie LL. Serie

Salz M.K. = 96% M. K. = 8.1°5
(Konzentration in Mol.) = D E > = D E
KNO,0, 18 e dÉ Zenn e e ai 44 47 A vw 85
kim, Ip + MgCl 0.020 3.6 at 40 ©
KNO,0,15 + BaCl, 0,021. .. 1.6 w 0.8 7
KNO, 0,15 + CaCl 0.020. .. 0 , |
Temperatur C° | 19° 19— 20°
o nn ! lI. Serie IV. Serie u
Salz M. K = Ian, M. K. = 10,1%
(Konzentration in Mol.) = D E D E
Kä. AA v Su 52
KNO; 0,202 + Mel 10019... 3,7 41 ER 40
KNO; 0.202 + Bat! 1, 0,020 8 ‚3 15 1,9 In

KNO; 0,207 + CaCl; 0.019

Temperatur C° 20° 20°

290 H. Kahho:

Wie aus der Tabelle IV ersichtlich ist, wird die Eindringungs-
fähigkeit des Salpeters in ausgedehntem Maße von den Erdalkali-
kationen beeinflußt. Alle Erdalkalien hemmen mehr oder weniger
die Aufnahme von KNO,.

Dieselben Resultate ergaben die Versuche mit KCl + Erd-
alkalien.

Bemerkenswert ist hier die Tatsache, daß die Hemmungs-
fähigkeit der zweiwertigen Kationen im umgekehrten Verhältnisse
zur Permeabilität für diese Salze steht.

Von den angeführten Erdalkalien dringt das Magnesium-
chlorid selbst am besten in das Plasma ein und setzt demgemäß
im Vergleich mit Barium und Calcium die Durchlässigkeit für
KNO, am wenigsten herab. Dagegen hemmt ein kleiner Zusatz
von CaCl, die Aufnahme von Salpeter sehr beträchtlich. Etwas
weniger hemmend als CaCl, wirkt das Bariumchlorid. Aus der
letzteren Tatsache läßt sich eine relativ größere Eindringungs-
fähigkeit des BaCl, im Vergleich mit der des CaCl, ableiten.

Es ist klar, daß diese aufnahmehemmende Wirkung der Erd-
alkalien der sog. ‚„entgiftenden Wirkung‘ dieser Salze direkt
proportional ist.

Aber auch die Alkalisalze können die Aufnahmegesch windig-
keit gegenseitig beeinflussen, wie das aus der folgenden Tabelle V

zu ersehen ist.
Tabelle vV.

E 1. Serie lI. Serie

Salz 0 M. K. = SE 5% M. K. = 58%
(Konzentration in Mol.) ` 7 D E u D = E j
KNO, 0,20 . are Ali © 39,06
Lil (A 194: a8: % 15 | 13 LU ©
KNO, D 17 + Lit 10,028 1.9 42 18 : z2
LiCI 0,17 + KNO,0021 19 | 3 | |
Temperatur C° l 20° | 20°
i nn f ım. Serie mW. Serie D
Salz Ah zs DÄI M. K. = 6,1°,
(Konzentration in Mol.) D E D E
Do Sc % s
KNO, 020 . San. 30h 321 A
Lu" 10, lusi 09 ; 2% Oto 8
KNO; 0. IT +1. iC 10,0: IX ax ı 8 LI ı 2
1401017. KN0,0.021 , 12 18% 07 o

Temperatur (°.... 1 19--20° | 10 un

Permeabilitit des Pllanzenplasmas für Neutralsalze. IV. 291

Tabelle V (Fortsetzung).

Salz

M. 2; Ka
(Konzentration in Mol.) D. p gp
EE EE ER "o ` | o % U H d É Za l
Kinn... | 35 elAun o
at KE, e E I 14 mm 19; A
KC1 0,15 + LiC10,048. | 1,6 26 o
LiCl 0,15 + KC10,043. | 19 23 5

Temperatur C°

Nach den Daten der Tabelle V setzt ein Zusatz von LiCl zu
KNO, bzw. KCI die Permeabilität des Plasmas für diese Salze
immer mehr oder minder herab. Dagegen haben umgekehrt
dieselben Mengen von KNO, bzw. KO keinen hemmenden Ein-
fluß auf die Aufnahme von Lithiumchlorid, ja in einigen Fällen
sogar scheinen sie den Durchtritt von LiC] zu fördern.

Auf Grund des Gesagten kommt auch dem Lithium eine ‚ent-
giftende Wirkung‘ in bezug auf andere Alkalisalze zu.

Zusammenfassend läßt sich über die gegenseitige Beein-
flussung der Aufnahmegeschwindigkeit durch die Kationen fol-
gende Regel aufstellen:

Ein jedes Kation der Permeabilitätsreihe: K> Na >
Li > Mg > Ba > Ca wird von den von ihm rechtsstehen-
den Kationen bei der Aufnahme gehemmt, und um so
mehr,jeweiterdasKationrechtssteht. Diezweiwertigen
Kationen haben gemäß ihrer größeren Kolloidaktivität
eine bedeutend größere Hemmungskraft.

b) Anionen.

Bei den aufnahmehemmenden Wirkungen der Kationen,
haben wir die Rolle des Anions nicht in Betracht gezogen. Die
Anionen waren hier so gewählt, daß sie mit dem betreffenden
Kation etwa gleich permeable Salze bilden, wie z. B. KNO, und
KCl, deren Anionen in den Permeabilitätsreihenfolgen fast immer
nebeneinander stehen. Kombinieren wir aber Salze mit den weit-
stehenden Anionen in der Permeabilitätsreihe, so können sie
gegenseitig die Aufnahmegeschwindigkeit mehr oder minder stark
beeinflussen, wie das aus der Tabelle IV zu ersehen ist.

Hier ist als Hauptsalz KO gewählt (siehe Tabelle VI), das
ungefähr in der Mitte der Permeabilitätsreihe J > Br > NO, >C

292 H. Kahlıv:

Tabelle VI.
E | C cherie | IL Serie
Salz MK - 10,5%,
(Konzentration in Mol.) —— E éi
0,20 KCI -+ 0,0200 KJ. ... 59 o
0,20 KCI +- 0,0205 KNO .. 49 y
0,22 KCI (Kontrollversuch). . : 41 4
0,20 KCI + 0,0153 KaSO, - - 38:8
0,20 KCI + 0,0126 K-citrat. . 08 |

Temperatur C°

| 111. Serie IV. Serie
Salz M.K. = 8,8°%, M.K. = ann,
(Konzentration in Mol.) D | u E u np | E

0,20 KC + 0,0200 KBr... 6,5 S
0,22 KCI (Kontrollversuch) . . . 83,8 | 55
0,20 KCI + 0,0153 K504 3

0,20 KCI + 0,0128 K-Citrat. .

Temperatur C°

Tartrat > SO, > Citrat steht, und zu ihm sind Kalisalze mit den
links- und rechtsstehenden Anionen in isotonischen Mengen zu-
gefügt. Wie das aus den Daten der Tabelle VI folgt, wird dic
Aufnahme von KCl von den rechtsstehenden Änionen
— Sulfat und Citrat -— etwas gehemmt, während ein
Zusatz von Salzen mit den linksstehenden Anionen
(J, Br, NO,) die Aufnahme ganz deutlich fördert und
umso besser, je weiter das Anionlinkssteht. Der Durch-
tritt der Salze durch das Plasma wird von Änionen
nach derselben Regel beeinflußt, wie das bei den Kat-
ionen der Fall ist. |

Dieselben Beziehungen haben wir auch bei den Salzen mit
verschiedenen Kationen.

Die Tabelle VII zeigt, daß die Aufnahme von Natriumsulfat
und -chlorid durch einen Zusatz von KBr gefördert wird, während
ein Zusatz von Na,SO, zur überwiegenden Menge des Kalium-
bromids die Permeabilität des Plasmas für das letztere Salz
herabsetzt.

Wie schon oben erwähnt, wurden die Wurzeln nach jedem
Versuch auf die Wiederausdehnung in Wasser geprüft. In den

Permeabilität des Pflanzenplasmas für Neutralsalze. IV. 293

Tabelle VII.

il $ Serie LL Serie

Salz ` M.K. =88% | M.K. = 72°,

(Konzentration in Mol.) = D ` E DD. E `

020 KB 2. 2 u 88-8 4 4,1 | 40 4,1 45
0,154 N, S0, - 2.2... OU i o0 O `. o
0,125 NasSO, + 0,037 KBr. 3.2 31 Lë Im
0,16 KBr + 0,030 Na,S0, 2,6 | 3» 1,7 w
0,20 Nach -e e 2 Sea 3,2 | 46 28 | A
0,17 NaCl + 0,029 KBr . 4l i a 35 | mm

meisten Fällen erreichten sie ihre ursprüngliche Länge, und be-
sonders nach der Behandlung mit langsam permeierenden Salzen
wie die Sulfate, Tartrate, Citrate, CaCl, und BaCl,. Nach Aufent-
halt in Lösungen von Jodiden, Bromiden, zuweilen auch von
Nitraten und Chloriden der Alkalisalze, ferner in MgCl,- Lösung
blieben die Wurzeln nach Wiederausdehnung in Wasser um
1—2 Mikrometerstriche hinter der ursprünglichen Länge zurück.
Diese Salze, insbesondere die Jodide und Bromide, sind wegen
ihrer leichten Eindringungsfähigkeit sehr giftig, wie wir das schon
früher gezeigt haben!). Die nachherige Deplasmolyse in Wasser
bringt das geschädigte Plasma in einigen Zellen zu einer irre-
versiblen Zusammenschrumpfung, die die Ursache der unvoll-
ständigen Ausdehnung ist.

Besprechung der Resultate.

Diese Versuche haben einen weiteren Beweis für die Annahme
gebracht, daß die Giftwirkung der Neutralsalze im engsten Zu-
sammenhange mit der Fähigkeit dieser Salze in das Plasma ein-
zudringen steht. Das geht ohne weiteres aus den gleichen Reihen-
folgen der Anionen und Kationen hervor, die bei der Koagulation
des Plasmas durch Salze und bei den Permeabilitätsversuchen
auftreten. Die Giftigkeit der Salze nimmt parallel der Permeabili-
tät nach der lyotropen Anionenreihe SO, <... Br <J zu!). Für
die Kationen gilt die Reihe: — Erdalkalien < Na < K. Alle
Faktoren, die die Permeabilität für die Neutralsalze fördern,
wirken auch gleichzeitig die Giftigkeit steigernd und umgekehrt,
EEN Agenzien und Faktoren setzen im allgemeinen, mit

294 H. Kahho:

Ausnahme einiger, die später erörtert werden, immer die Durch-
lässigkeit des Plasmas für die giftigen Salze herab!).

Wenden wir uns zuerst der Rolle der Ionen bei Durchtritt
eines Neutralsalzes zu.

Die Tatsache, daß gleiche Anionen mit verschiedenen Kat-
ionen verschiedene Eindringungsfähigkeit besitzen, zeigt auf die
Kationenwirkung hin. Die verschiedene Durchlässigkeit des Plas-
mas für die Salze mit demselben Kation und verschiedenen An-
ionen zeigt uns dagegen, daß hier den Änionen eine nicht minder
wichtige Bedeutung als den Kationen zukomnit.

Wir haben es also bei der Aufnahme von Neutral-
salzen durch das Plasma mit einer additiven Wirkung
der Salze zu tun.

Es entsteht nun die interessante Frage: haben die beiden
Ionen eines Salzes bei der Aufnahme eine identische Wirkung.
wenigstens qualitativ, oder ist sie verschieden? Kurz gesagt,
wirken die beiden Ionen permeabilitätsfördernd ?

Um dieses zu verstehen, müssen wir die Kolloidwirkung der
Salze näher besprechen.

Wir haben früher?), im Anschluß an die Untersuchungen von
Hansteen-Cranner?°), die Vermutung ausgesprochen, daß die
Salzaufnahme durch die Ausfällung der Lipoide auf der Plasma-
oberfläche reguliert werden kann. Die starkfällenden Salze ver-
dichten die Oberflächenschicht des Plasmas und gelangen infolge-
dessen sehr langsam in das Innere. Aus diesem Grunde resultiert
auch die ]yotrope Anionenreihe bei der Giftwirkung der Salze.

Als beweisend erschien von unseren eigenen Beobachtungen
dabei die Unmöglichkeit, die der Salzwirkung ausgesetzte Ober-
flächenschicht des Plasmas durch Säuren umzuladen. Die An-
ionenreihe blieb im sauren Medium dieselbe wie im neutralen.

Zugunsten des überwiegenden Lipoidgehaltes in Plasmaober-
flächenschichten spricht noch eine andere Tatsache, auf die wir
später zu sprechen kommen.

Daß die Ausfällung bzw. Verdichtung der Oberflächenkolloide
des Plasmas bei den Permeabilitätsverhältnissen der Neutralsalze
eine hervorragende Rolle spielt, dafür haben die kurz veröffent-

1) Vgl. Szücs, Jahrb. f. wiss. Botan. 52, 85. 1913.
Zu Le

Sr l. e.

Permeabilität des Pflanzenplasmas für Neutralzalze. IV. 295

lichten Untersuchungen von Spek!) über die Wirkung der Salze
auf die Biokolloide von Actinospaerium cinen guten Beweis ge-
liefert.

Der erwähnte Autor gelangte auf Grund ausgedehnter Versuche zum
‚Resultate, daß „Fällungsveımögen und Eindringungsvermögen zueinander
umgekehrt proportional sind‘ und „daß um so höhere Konzentrationen
eines Salzes vertragen werden, je schwerer das betreffende Salz eindringt‘“ 2).

Die für das Heliozoenplasma aufgestellte Fällungsreihe der
Kationen ist folgende: K < Na < Li < Ca. Die für die Per-
meabilität des Pflanzenplasmas gefundene Kationenreihe stimmt
vollständig mit dieser Reihe überein; es ist gezeigt, daß ein Salz,
welches das schwächste Kolloidfällungsvermögen besitzt, am
besten eindringt.

Unsere Versuche bestätigen den Parallelismus zwischen
Kolloidfällungsvermögen und Eindringungsfähigkeit in bester
Weise. Es gilt auch beim Pflanzenplasma der Satz, daß je
kolloidaktiverein Neutralsalz, desto geringer sein Ein-
dringungsvermögen ist und umgekehrt.

Der schon früher angedeuteten Ansicht über die Beziehungen
zwischen dem Lipoidfällungsvermögen und Eindringungsfähigkeit
der Neutralsalze können wir jetzt auf Grund der vorliegenden
Versuche folgendes zufügen:

Die Tatsache, daß ein kleiner Zusatz eines gut permeierenden
Salzes, wie das Kaliumbromid, zu einem schwer permeierenden,
wie das Natriumsulfat, das Eindringungsvermögen des letzteren
erhöht (siehe Tabelle VII), weist darauf hin, daß das Kalium-
bromid die kolloidfällende Wirkung des Natriumsulfats zu einem
gewissen Grade paralysiert, d. h. eine lösende Wirkung aufzeigt.
Daß aber von zwei Kaliumsalzen das eine lösend, das andere
fällend wirkt, kann nur dann möglich sein, wenn das Kation
fällend, das Anion aber fällungshemmend bzw. lösend
wirkt. Damit kommen wir zur Tatsache, die bei den Neutral-
salzwirkungen auf Eiweißkörper und Lipoide bekannt ist?), näm-
lich, daß die additive Wirkung eines Neutralsalzes hier
als die algebraische Summa aufzufassen ist, die aus

1) Acta zoologica 165. 1921.

2) Auf die weiteren Ergebnisse dieser höchst interessanten Arbeit
sei hier hingewiesen.

3) Pauli, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 3, 226. 1902; 5, 27. 1903.
— Porges und Neubauer, diese Zeitschr. 7, 152. 1907.

296 H. Kahho:

zwei Summanden mit verschiedenen Vorzeichen re-
sultiert.

Bekanntlich kommen beim Plasma hauptsächlich negative
Kolloide in Betracht, gegebenenfalls — Lipoide !), und sie werden
durch die entgegengesetzt geladenen Ionen, — Kationen ausge-
flockt, dagegen wirken die Anionen, die mit Plasma gleiche
Ladung haben, fällungshemmend.

Unter diesem Gesichtspunkt nimmt die Fähigkeit der Kat-
ionen, die Lipoide auf der Plasmaoberfläche auszuflocken, nach der
Reihenfolge K < Na < Li < Mg < Ba < Ca zu, wobei die Fäl-
lungskraft der zweiwertigen Kationen die der einwertigen be-
deutend überwiegt. Die fällungshemmende Wirkung der Anionen
wächst nach der lyotropen Reihenfolge Citrat < SO, < Tar-
trat < CI < NO, < Br <J. Ein jedes Kation in Verbindung mit
den Anionen dieser Reihenfolge hat die stärkste Fällungskraft mit
dem Citrat, weil dieses Anion den schwächsten fällungshemmen-
den Einfluß ausübt und infolgedessen die Koagulationsenergie
des Kations sehr wenig verringert wird. Die Folge davon ist,
daß Citrate schr schwer durch die verdichtete Plasmaoberfläche
ins Innere gelangen. Bei den anderen Anionen, wie z. B. beim
Tartrat, ist die hemmende Wirkung schon größer und demgemäß
die Ausflockungskraft des Kations geringer. Tartrate zeigen auch
ganz deutlich die Eindiingunsgfähigkeit. Das Chlorion kann schon
in einigen Fällen, wie z.B. bei KC], etwa die Fällungskraft des
Kations kompensieren, was mit dem großen Eindringungsver-
mögen dieses Salzes im Einklang steht.

Bei den Nitraten, insbesondere aber bei den Bromiden und
Jodiden, kann die hemmende (resp. lösende) Wirkung des Anions
die fällende des Kations überwiegen. Diese Salze dringen je nach
dem Kation sehr rasch in das Plasma ein und entfalten aus diesem
Grunde eine große Giftwirkung. Zu den schwer eindringenden
Salzen, wie den Sulfaten der Alkalien, zugefügt, fördern sie die
Aufnahme der letzteren, weil die lösende Wirkung der zugesetzten
Anionen die Erzeugung einer dichten Haptogenmembran hindert.

Ein Antagonismus zwischen beiden Ionen eines Salzes wurde
auch von Spek?), insbesondere deutlich beim Magnesiumsulfat,
beobachtet.

1) Vgl. Porges und Neubauer, lL c.
2) l e. S. 176, 177.

Permeabilität des Planzenplasmas für Neutralsalze. IV. 297

Dieses Salz zeigt im Gegensatz zum Mel, das leicht in Actino-
sphaerien eindringt und daher sehr giftig ist, mehrere Stunden, sogar Tage
lang keine schädliche Wirkung auf die Heliozoen. Der Autor meint, daß beim
MgSO, ein auffälliger starker Antagonismus zwischen beiden Ionen existiert,
„der bewirkt, daB keines der beiden seine charakteristischen spezifischen
Wirkungen entfalten kann und der dadurch verursacht wird, daß die beiden
Ionen, wenn sie zusammenwirken, die Permeabilität der Zelle jedenfalls
durch gegenseitige Steigerung ihrer Fällungswirkung verringern, so daß
sie selbst nicht mehr in die Zelle hineingelangen können‘.

Zusammenfassend können wir über die Permeabilitätsver-
hältnisse sagen, da B die Anionennachder|yotropen Reihe
J `> Br > NO, > Cl > Tartrat > SO, >Citrat die Aufnahme
eines Salzes fördern, die Kationen der Reihenfolge
K < Na < Li < Mg < Ba < Ca nach sie hindern.

Gehen wir nun zu den sog. antagonistischen Salzwirkungen.

Auf Grund unserer Versuche können wir diese Wirkungen bei
den Neutralsalzen auf die Permeabilitätsverminderung des Plas-
mas zurückführen, die durch das entgiftend wirkende Salz be-
wirkt wird.

Bekanntlich wurde diese Tatsache auch von Szücs!) bei den
antagonistischen Wirkungen Cu + Al und Chininhydrochlorid
- - Neutralsalze festgestellt.

In Salzgemischen gelten Calciumsalze als unentbehrliche Be-
standteile der physiologisch ausgeglichenen Lösungen?). Ein
kleiner Zusatz von Calciumsalz zu einer Salzlösung, die allein
giftig ist, hebt die schädliche Wirkung völlig auf.

Nun haben diese Versuche gezeigt, daß kleine Mengen cines
Calciumsalzes das Eindringungsvermögen eines gut permeierenden
Salzes vollständig herabsetzt. Dieselbe Fähigkeit in etwas ge-
ringerem Maße besitzen auch andere Erdalkalien, wie Barium,

vermutlich auch Strontium?) und weniger das Magnesium.

1) l e.

2) Osterhout, Botan. Gaz. 42, 127. 1906; 44, 259. 1907. — Wo.
Ostwald, Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 106, 568. 1905. -- Benecke,

zer. d. Dtsch. Bot. Ges. 25, 322. 1907. -- Höber, Physikalische Chemie
der Zelle usw. 1914, S. 524 fi.

3) Dieses Salz wurde von uns nicht auf seine Eindringungsfähigkeit
untersucht. In der Tröndleschen Permeabilitätsreihe steht Sr zwischen
Ca und Ba. Da nun unsere Ergebnisse mit denen von Tröndle völlig über-
einstimmen, so dürfte auch die Hemmungsregel für dieses Salz seine Kraft
haben.

298 H. Kalıho:

In allen diesen Fällen ist die entgiftende Wirkung eines Salzes
durch die hohe Aktivität des zweiwertigen Kations bedingt, die
die lösende Wirkung des Anions weit überwiegt. Das antagonistisch
wirkende Salz dringt selbst schwer oder gar nicht in das Plasma
ein und erschwert infolge der erzeugten Schutzschicht auch den
Durchtritt eines gut permeierenden Salzes. Es kann in einigen
Fällen die entgiftende Wirkung des zweiwertigen Kations durch
das einwertige Kation, welches entgiftet wird, noch verstärkt
werden, wenn das letztere Salz auch eine schwache Kolloidaktivität
besitzt, wie z.B. NaCl, bei welchem die fällende Wirkung des
Kations, die des Anions etwas überwiegt. Beim Zusammenwirken
eines solchen schwach fällenden Salzes mit einem stark fällenden
füllt das erstere, wie das S pek meint, ‚‚mit seiner feineren Fällung
gewissermaßen die ‚Löcher‘ der groben aus und verzögert eine
Weile das Eindringen der Salzflut‘“!).

Nach der oben entwickelten Theorie über die antagonistische
Wirkung zwischen dem Kation und Anion eines Neutralsalzes
kann ein beliebiges Salz entgiftend wirken, wenn das Fällungs-
vermögen seines Kations größer ist als die entgegengesetzte
Wirkung des Anions. Bei den Alkalisalzen ist diese entgiftende
Wirkung im allgemeinen verhältnismäßig schwach, in einigen
Fällen kann sie nur eine kurze Zeit dauern. Sie kommt besser
zum Vorschein in relativ hohen Konzentrationen der Salzlösungen
(in schwach hypertonischen bzw. hypotonischen) infolge des
schwachen Kations.

Wir haben gesehen, daß die Aufnahme von Kaliumnitrat und
-chlorid durch das Lithiumchlorid bzw. Kaliumsulfat und -citrat
verzögert wird (siehe Tabelle V, VI, VII). Diese Salze haben
entweder sehr schwache fällungshemmende Anionen, wie das
Sulfat- und Citration, welche die kolloidfällende Kraft des Kat-
ions wenig verringern, oder das von den Alkalikationen am stärk-
sten kolloidaktive Kation, wie das Lithiumion. Daß ein Alkali-
sulfat, welches die Eindringungsfähigkeit eines gut permeierenden
Salzes etwas herabsetzt, damit auch die Giftwirkung des letzteren
vermindert, geht aus dem folgenden Versuch hervor.

Kleine viereckige Epidermisschnitte von Tradescantia zebrina
(Blattunterseite) wurden parallel in Lösungen von KJ 0,1 Mol.
und KJ 0,1 + Na,SO, 0,05 Mol. (Gesamtkonzentration 0,15 Mol.)

1) 1]. e. N. 190.

Perimeabilität des Pflanzenplasmas für Neutralsalze. IV. 299

gelegt und nach bestimmten Zeitabschnitten je 10 herausgenon-
men und wieviele Zellen noch lebendig waren mittels Plasmolyse
in Zuckerlösung bestimmt!).

Die Zeit des Aufenthalts der Schnitte in Lösungen
2 St.| 4 St. | 8 St. |12 St. 148t.| 16 St.
Das Mittelprozent der plasmolysierten Zellen in 10 Schnitten

KJ... ...| 987; 910| 880, 385 37,1
KJ + NaSO, . 1000 100,0 | 101.0 961 77,8

2,3

43,1

Wie man aus diesem Versuch sicht, sterben in der reinen
Kaliumjodidlösung nach 16 Stunden fast alle Zellen ab, während
im Gemisch mit Natriumsulat nach dieser Zeit fast die Hälfte
der Zellen noch lebend bleibt.

In diesem Falle haben wir also eine schwache entgiftende
Wirkung durch das Sulfat, die theoretisch vorausgesagt werden
konnte. In anderen Fällen kann aber eine schwach antagonistische
Wirkung bei den Alkalisalzen auch schon dadurch zustande
kommen, daß zwei Salze in der Lösung ein gemeinsames Ion
haben, wie z. B. KCl und NaCl, denn dadurch wird die Dissoziation
etwas zurückgedrängt; hauptsächlich kommen hier die Ionen als
die wirksamen Anteile der Salze in Betracht. Bei den Erdalkalien
wurde aber diese Dissoziationsbeeinflussung im Vergleich mit der
spezifischen Wirkung dieser Salze zu gering sein.

Einen guten Beweis für den Zusammenhang zwischen den
Permeabilitätsverhältnissen und der Kolloidwirkung der Neutral-
salze liefern uns auch die Versuche von Brenner?). Er unter-
suchte die Säureresistenz von Rotkraut-Hypodermiszellen bei
Anwesenheit von Neutralsalzen und fand, daß die letzteren in
weitem Maße die Giftigkeit der H-Ionen beeinflussen.

Greifen wir aus den Daten von Brenner einige heraus. Die kritische
Konzentration von HCI bei Anwesenheit von isotonischen Kaliumsalz-
lösungen (Salze isoton. 3,75%, KNO,) ist bei NO, "/gon; CH Tea: SU "/s0o-
Die Giftigkeit der Salzsäure wird hier also nach der lyotropen Reihenfolge
NO, < CI < BO, verringert. Bei Anwesenheit von Kationen der Chloride
ist die kritische Konzentration bei Na “/iooo; K iaa? Mg “aoo; Ca “oso:
also Na < K < Mg < Ca.

Man sieht, daß hier etwa dieselben Anionen- und Kationen-
reihenfolgen von Bedeutung sind wie bei der Permeabilität bzw.

1) Dieser Versuch ist gleichzeitig mit denen der II. Mitteilung gemacht.
2) Ber. d Dtsch. Bot. Ges. 38, 277. 1920.

Biochemische Zeitschrift Band 123. 20

300 H. Kahho:

Kolloidfällung. Daß die Säure bei Anwesenheit des Salzes viel
schwerer in die Zelle eindringt, das hat Brenner bei den kolloid-
aktiven K,SO,, MgSO,, CaCl, unmittelbar beobachtet!).

Es ist noch ferner zu bemerken, daß aucn die Nichtelektrolyte
die Eindringungsfähigkeit von Säuren bzw. Salzen herabsetzen
können. Bekanntlich wird nach den Beobachtungen von Küster?)
auf der Plasmaoberfläche durch die Behandlung mit Zuckerlösung
eine Haptogenmembran erzeugt.

Fragen wir nun, welches sind die Beweise für die Annahme,
daß bei den Neutralsalzwirkungen gerade die Lipoide die wichtige
regulatorische Rolle spielen.

Zugunsten der Lipoide sprechen folgende Tatsachen: 1. Die
Nichtumladbarkeit der Oberflächenkolloide. 2. Die große Fällungs-
kraft der Erdalkalien, welche sich in dem ausgesprochenen Ent-
giftungsvermögen dieser Salze widerspiegelt. Bekanntlich ist die
Ausflockungsenergie der Erdalkalien in bezug auf die Lipoide in
verdünnten Lösungen (?/,. bis normal) ebenso groß, wie in kon-
zıntrierteren (l bis normal und höher)?). Bei den Eiweißfällungen
durch die Erdalkalien liegen aber die Werte viel höher, z. B. wird
das Alkalieiweiß erst durch die vier- bis siebenfach normale CaCl,-
Lösung gefällt). Auch die Koagulation des nativen Eiweißes
bedarf starker Erdalkalilösungen?).

Es sei hier noch hervorgehoben, daß die Tatsache, daß sich
das Magnesium nach seiner Aktivität beim nativen Eiweiß an die
Alkalisalze anschließt, bei der Lipoidfällung sich dagegen wie ein
typisches Erdalkalisalz verhält, kein entscheidendes Kriterium
dafür liefert, ob Lipoide vorliegen, wie das manche Autoren ver-
muten, wenn nämlich die Aktivität des Magnesiums in bezug auf
die Biokolloide mit der des Ca, Ba und Sr übereinstimmt. Die
Eiweißkörper des Protoplasmas besitzen die Eigenschaften des
ionischen Eiweißes bzw. Alkalieiweißes und hier schließt sich das
Magnesium nach seiner Kolloidaktivität an die Gruppe der Erd-
alkalien an, während die Alkalisalze bedeutend schwächer wirken?).
HL $. 282.
2) Zeitschr. f. Botan. 2, 689. 1910.
3) Porgesund Neubauer,l.c. Vol, auch Hansteen - Cranner,l.c.
4) Pauli und Handowsky, diese Zeitschr. 24, 246. 1910.
5) Hofmeister, Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. 24, 247. 1888;
25, 3. 1889. — Pauli, Le 1902, 1903.

6) Pauli und Handowsky, 1. ce. S. 241, 250.

Permeabilität des Pflanzenplasmas für Neutralsalze. IV. 301

3. In schwach alkalischen Lösungen ist die Verkürzung der
Wurzeln, sowie auch die Wiederausdehnung immer etwas größer
als parallel im neutralen Medium (siehe Tabelle VIII).

Tabelle VIII.
Temperatur 18—20°.

I. Serie II. Serie
Salz S DR

NaCl 000.4 2.2. 1,5 | A| 46 | 20 | 435
NaCl 0,1975 + NaOH 0,0025 . | 32 | 372 | 75 | 33 | 44,0
NaCl 0,190 + NaCO; 0,005 . 3,2 7,7 4,6 i 597

Aus dieser Gegenüberstellung ist ersichtlich, daß die Ver-
kürzung und auch die Ausdehnung der Wurzelspitzen in den
alkalisch reagierenden Lösungen sehr deutlich begünstigt wird.

Dieser Befund stimmt in allerbester Weise mit den von
Hansteen-Cranner?) entwickelten Vorstellungen über den Bau
der Zellwand und Plasmaoberflächenschichten. Nach diesem
Autor ist die Zellwand aller lebenden Zellen ein kolloidales Netz-
werk, dessen festes Gerüst aus Cellulose und Hemicellulose ge-
bildet ist, dessen Maschen aber die Lipoide der plasmatischen
Grenzschichten enthalten“.

Von dieser Anschauung ausgehend, läßt sich die größere
Kontraktion bzw. Ausdehnung der Wurzeln im alkalischen Me-
dium dadurch erklären, daß die Kolloidstränge, welche von der
Plasmaoberfläche in die Maschen des Wandnetzwerkes eingelagert
sind, durch Lauge aufgelockert oder ganz aufgelöst werden und
infolgedessen die Zellwand mehr contractil wird.

Durch schwach alkalische Lösungen können aber eher fett-
ähnliche Körper als Eiweißstoffe gelöst werden und so spricht
diese Beobachtung zugunsten des überwiegenden Lipoidgehaltes
in den plasmatischen Oberflächenschichten. Durch die Auflösung
bzw. Aufquellen der Lipoide auf der Plasmaoberfläche und in der
Zellwand wird auch der Durchtritt der Salze gefördert. Ferner
zeigt die größere Contractilität der Zellwand im alkalischen Me-
dium, daß die regulatorische Funktion bei der Stoffaufnahme
auch auf die Zellwand übergeht, die mit den Plasmaoberflächen-
schichten in engster organischer Verbindung steht?).

DLG

2) Vgl. Hansteen - Cranner, Le

6,1
8,6
8,0

20°

302 II. Kalıho:

Die Beziehungen zwischen den Neutralsalzwirkungen werden
im alkalischen Medium von der qualitativen Seite nicht geändert,
sie bleiben hier dieselben wie im neutralen, es treten dieselben
Permeabilitätsreihenfolgen der Anionen und Kationen auf.

Welche Bedeutung hier den CO,-Ionen zukommt, die fast
immer in den alkalischen Lösungen vorhanden sind, muß vor-
läufig dahingestellt bleiben. Vermutlich spielen hier die OH-
Ionen eine Hauptrolle.

Außer der permeabilitätsfördernden Wirkung infolge der
Lipoidverseifung auf der Plasmaoberfläche haben schwache
Laugen noch eine äußerst wichtige biologische Bedeutung.

Es wurde schon oben erwähnt, daß Faktoren, welche die
Permeabilität des Plasmas für Neutralsalze erhöhen, auch die
Giftwirkung derselben steigern!). Nun ist aber die Giftigkeit der
Salze im alkalischen Medium viel geringer, als im neutralen.
Dieser scheinbare Widerspruch erklärt sich durch die besondere
kolloidchemische Wirkung der OH-Ionen.

Es wurde früher bemerkt, daß im lebenden Plasma ionisierte
Eiweißkörper in Betracht kommen. Nach Paulis und Loebs
Anschauungen können die anorganischen Stoffe im Plasma nur
in Verbindung mit organischen Zellbestandteilen vorkommen?).
Die Reaktion des Protoplasmas ist in den meisten Fällen alkalisch,
was auf eine Alkalieiweißverbindung hinweist?). Die Unter-
suchungen von Pauli und Handowsky?) haben gezeigt, daß
beim Alkalieiweiß (bzw. Säureeiweiß) gewaltige Unterschiede im
Vergleich mit dem nativen auftreten. Bei gewissem Laugengehalt
wird die Hitzegerinnbarkeit vollständig aufgehoben, gleichzeitig
geht auch die Alkoholfällbarkeit verloren. Ein solcher großer
Widerstand gegen koagulierende Einflüsse wird durch die starke
Hydratation der Eiweißionen bedingt). Alle Faktoren, die die
Ionisation zurückdrängen, machen auch Proteine gegen koagu-

1) Vgl. meine II. Mitteilung.

2) Pauli, Kolloidehemie der Muskelkontraktion. 1912, S. 8.

3) Pfeffer, Untersuchungen. Tübingen 1886, S. 293 ff. Physiologie I,
S. 491. Vgl. Szücs, Sitzungsber. d. Wien. Akad. 119 (I), 737. 1910.

4) l. e., vgl. auch diese Zeitschr. 18, 340. 1909. — Pauli, Pflügers
Arch. f. d. ges. Physiol. 136, 483. 1910.

5) Pauli, Kolloidehemie der Eiweißkörper, 1920, S. 89ff. — Han-
dowsky, Fortschritte in der Kolloidehemie der Eiweißkörper, 1911, S. 19ff.

Permeabilität des Pflanzenplasinas für Neutralsalze. IV. 303

lierende Einflüsse instabil, dagegen wird bei der Erhöhung der
Ionisation die Stabilität der Eiweißstoffe gesteigert.

Daß ionisierte Eiweißkörper im Pflanzenplasma vorhanden
sind, das folgt schon daraus, daß die Temperatur der Hitze-
koagulation des Plasmas bei höheren Pflanzen viel höher liegt
als beim nativen Eiweiß). So koaguliert die Plasmamembran von
Tradescantia discolor ungefähr bei 72° C, die von Ampelopsis und
Rotkrautzellen!) durchschnittlich bei 70°. Das amphotere Eiweiß
aber etwa bei 62° C2).

Im alkalischen Medium ist die Koagulationstemperatur des
Protoplasmas höher als im neutralen, ebenso wird Plasma bei
Anwesenheit von OH-Ionen viel resistenter gegen andere koa-
gulierende Einflüsse?).

Alles das erklärt sich dadurch, daß im schwachalkalischen
Medium die Ionisation bzw. Hydratation des Alkalieiweißes des
Plasmas erhöht wird und daher die Stabilität kommt. Dagegen
im schwachsauren?) Medium, wie das auch theoretisch voraus-
gesagt werden kann, koaguliert Plasma viel leichter als im neu-
tralen?).

Die antagonistische Wirkung der Laugen in bezug auf die
Neutralsalze ist ein kolloidchemischer Vorgang ganz anderer Art,
als die entgiftende Wirkung der Neutralsalze. Bei den letzteren
tritt das Lipoidfällungsvermögen in den Vordergrund. Die Wir-
kung der OH-Ionen ist aber viel komplizierter. Einerseits können
sie durch die Lipoidlösung die Permeabilität des Plasmas für
Salze erhöhen und damit ncutralisierend bzw. dehydratisierend
auf ionisches Eiweiß der lebenden Substanz wirken. Andererseits
hat aber die Lauge die Tendenz die Ionisation bzw. Hydratation
des Plasmaeiweißes zu erhöhen. Der Gleichgewichtszustand wird
vermutlich die erste Zeit zugunsten der überwiegenden Ionisation
bestehen, da schwache Laugen eine weitgehend entgiftende Wir-
kung entfalten.

1) Blattepidermiszellen.

2) Vgl. Lepeschkin, Ber. d. Dtsch. Bot. Ges 29, 256. 1911.

3) Lepeschkin, Ber. d. Dtsch. Bot. Ges. 28, 94. 1910.

4) Hier kommen nur solche niedrige Konzentrationen der Lauren und
Säuren in Betracht, die für das Leben des Plasmas nicht gefährlich sind.

Über die Chlorverteilung im Blute.

Von
S. van Creveld.

(Aus dem physiologischen Institut der Universität Groningen.)
(Eingegangen am 2. August 1921.)

Die theoretisch wie praktisch so wichtigen Fragen nach der Permeabi-
lität der roten Blutkörperchen für Chlor und der Chlorbindung im Plasma
(Serum) sind in den letzten Jahren mehrfach behandelt worden. Eine
Reihe eigener Beobachtungen, die ich über diesen Gegenstand machte,
sollen im folgenden mitgeteilt werden. Gleichzeitig mögen einige
kritische Bemerkungen zu einigen neueren Arbeiten angefügt werden.

I. Die Chlorpermeabilität der roten Blutkörperchen.

Seitdem Hamburger mit dieser Frage das Problem der Permeabili-
tät tierischer Zellen zuerst zur Diskussion gestellt hat?), ist sie in der
Literatur sehr oft behandelt worden.

In der letzten Zeit haben unter anderen Falta und Richter- Quittner?),
Straub und Meier?), Siebeck®) und in einer sehr rezenten Arbeit auch Wiech-
mann) über die Chlorpermeabilität der Blutkörperchen Mitteilungen gemacht.
Die erstgenannten Autoren schließen auf Grund einer großen Anzahl von Chlor-
bestimmungen, daß im strömenden Blute bei Menschen und verschiedenen Tieren
-die Blutkörperchen chlorfrei sind. Dieses fast allen Ergebnissen früherer Unter-
suchungen widersprechende Resultat führen sie auf die besondere Vorsorge, die
sie bei der Gewinnung des Plasmas getroffen haben, zurück. Diese bestand in
der Verwendung des Hirudins, dem Vermeiden von Na-Oxalat und NaF zur
Ungerinnbarhaltung des Blutes; ferner im sofortigen Zentrifugieren und Ver-
meiden starker Abkühlung des Blutes. Trotzdem möchten wir bezweifeln, daß
auch Falta und Richter - Quittner damit Verhältnisse studiert haben, wie
sieim strömenden Blute bestehen. So haben sie einem Verlust von CO, beim
Auffangen des Blutes nicht vorgebeugt; aus den Versuchen von Hamburger),

1) Hamburger, Zeitschr. f. Biol. 1899, S. 414.

2) Falta und Richter- Quittner, diese Zeitschr. 100, 180. 1920.
3) Straub und Meier, diese Zeitschr. 98, 205. 1919.

4) Siebeck, Arch. f. exp. Pathol. u. Pharmakol. 85, 214. 1919.

5) Wiechmann, Archiv f. Physiologie 189, 109. 1921.

6) Hamburger, Zeitschr. f. Biol. 28, 405. 1892.

S. van Creveld: Chlorverteilung im Blute. 305

Snapper!), Fridericia?), van Slyke und Cullen?) und anderen geht aber
der große Einfluß der CO,-Spannung auf die Chlorverteilung im Blute hervor.
Schon kleine Veränderungen in dieser Spannung können wichtige Änderungen in
der Chloıiverteilung hervorbringen. Denselben Effekt verursacht Zu- oder Ab-
nahme des Sauerstoffsättigungsgrades des Blutes indirekt, indem die CO,-Kapa-
zıtät des Blutes bei Sättigung mit Sauerstoff abnimmt, bei Reduktion zunimmt!®).
Tatsächlich wird diese Sauerstoffsättigung von venösem Blute beim Auffangen
(und Schütteln?) in offenen Röhrchen, wie Falta und Richter- Quittner
getan haben, verändert). Ob weiter das von ihnen verwendete Hirudin im Ver-
gleich mit Na-Oxalat oder NaF für die normale Durchlässigkeit der Blutkörperchen
so harmlos ist wie die genannten Autoren hervorheben, erscheint uns auf Grund
von Erfahrungen im hiesigen Laboratorium bei Studien über die Glucosepermea-
bilität der Blutzellen höchst zweifelhaft. Nur wenn der Beginn der Gerinnung
des Blutes hintenangehalten worden war, wurden die Blutkörperchen in osmo-
tischen und direkt chemischen Versuchen glucosefrei gefunden. Die sog. ungerinn-
bar machenden Agerzien wie Hirudin, Oxalat, NaF waren gleich schädlich ®).
Straub und Meier?) haben sich bei ihren Versuchen über die Permeabilität der
Blutzellen für Chlor noch weiter von den physiologischen Verhältnissen entfernt.
Sie haben die CO,-Bindungskurve von in 0,9% NaCl suspendierten Körperchen
festg estellt bei allmählicher Zunahme der CO,-Spannung. Bei einer bestimmten
Wasser stoffionenkonzentration der Suspensionsflüssigkeit konstatierten sie eine
plötzliche Zunahme der CO,-Bindung. Die Autoren meinen dies dadurch erklären
zu sollen, daß bei dieser Wasserstoffionenkonzentration die Körperchen plötzlich
permeabel für Chlor werden. Dieses verbindet sich nämlich mit dem Hämoglobin,
wodurch dasselbe mehr CO, aufnehmen könne. Die plötzliche Permeabilitäts-
änderung der Körperchen würde auf eine bei der bestimmten Wasserstoffzahl
(pr = 6,67) zustande kommende Änderung des Kolloidzustandes dieser Membran
beruhen.

Diese Annahme — daß die Ionendurchlässigkeit der Zellen abhängig
ist von den kolloiden Eigenschaften der Zellmembran — wird tat-
sächlich gestützt durch viele neuere Untersuchungen. Straub und
Meier arbeiten aber mit Blutkörperchen, die mit 0,9 proz. NaCl ge-
waschen worden waren. Wie aus Untersuchungen im hiesigen Labora-
torium 8) hervorgeht, bleibt dabei aber die Konstitution der Zellmembran-
kolloide nicht intakt; die für eine normale Permeabilität notwendigen
Bestandteile werden vielmehr teilweise entfernt. Weiter spielen die
Plasmabestandteile eine so wichtige Rolle bei der Verteilung des
CO, — und deshalb auch bei der Cl-Wanderung — zwischen Plasma

!) Snapper, diese Zeitschr. 51, 62. 1913.

2) Fridericia, Journ. of biol. chem. 4%, 245. 1920.

3) v. Slyke und Cullen, Journ. of biol. chem. 30, 343. 1917; siehe auch
v. Slyke, Physiological Reviews 1, 161. 1921.

4) Christiansen, Douglas und Haldane, Journ. of physiol. 48, 244. 1914.
— Joffe und Poulton, Journ. of physiol. 54, 129. 1920.

5) Siehe weitere Notiz S. 306.

8€) Brinkman und Frl. v. Dam, Arch. internat. de physiol. 15, 105. 1919.
— v. Creveld und Brinkman, diese Zeitschr. 119, 65. 1921.

"Le

8) Brinkman und Frl. v. Dam, diese Zeitschr. 108, 35. 1920.

306 S. van Creveld:

und Körperchen !), daß Untersuchungen über die Chlorpermeabiltät.
angestellt in dem Suspensionsmedium 0,9 proz. NaCl, Verhältnisse
behandeln, die weit von den physiologischen abweichen.

Wir meinen deshalb, daß weder die Untersuchungen von Straub
und Meier, noch die von Falta und Richter - Quittner Aufschlub
geben über die Chlorpermeabilität der Körperchen im strömenden Blhite.
Auch aus den Untersuchungen von Siebeck?) und Wiech mann 3) darf
man u. E. keine Schlüsse ziehen betreffs der physiologischen Chlorperme-
abilität. Diese Autoren arbeiteten zuerst mit defibriniertem oder Citrat-
oder Hirudinblut, das ohne Vorbeugung der CO,-Ent weichung aufgefangen
wurde®). Für die Chlorverteilung auf Plasma (Serum) und Körper-
chen erhielten sie fast dasselbe Verhältnis wie Snapper®) schon vor
einigen Jahren bei derartigen Versuchen im hiesigen Institut gefunden
hat. Weiter untersuchten sie die Permeabilität von Körperchen suspen-
dert, in einer isotonischen Lösung von NaCl oder Na,SO, oder Rohr-
zucker. Die Ionenpermeabilitätsverhältnisse von Körperchen in solchen
Lösungen untersucht, sind jetzt als abnorm zu betrachten, wo wir
wissen, daß diese Lösungen die Körperchenoberfläche nicht intakt
halten. Die Bestandteile, die entfernt werden, sind in Rohrzucker-
und Salzlösungen nicht dieselben.

In bezug auf eine mögliche Erklärung der Ergebnisse, die in diesen und der-
gleichen Untersuchungen erhalten wurden®), sei weiter hingewiesen auf eine neulich
in dieser Zeitschrift erschienene Arbeit aus dem hiesigen Institut von Takeo
Takei über osmotische und kolloidehemische Volumveränderungen.

Das Bestehen einer Chlorpermeabilität der Erythrocyten schien
uns schon deutlich angezeigt durch die genannten Untersuchungen über
den Einfluß von CO, auf die Chlorverteilung im Blute. Die Aktualität
der Frage und der Gedanke, daß diese mangelhafte Übereinstimmung
in den direkten Analysen anderer Autoren auf methodische Fehler
zurückzuführen war, rechtfertigen u. E. neue, unter physiologischen
Verhältnissen ausgeführte Untersuchungen über die Chlorverteilung.
Von den methodischen Fehlern haben wir die wichtigsten schon be-
sprochen. Den Gerinnungsfaktor hat man auch bei der Feststellung

1) Joffe und Poulton, Le
2) l.c
ae E o
4) Von Wiechmann wurde die CO, durch halbstündiges Durchleiten von
O, ausgetrieben. Kine solche Überventilation des Blutes zur Entfernung der CO;
verursacht aber eine irreversible Veränderung im Kohlensäurebindungsvermögen
und deshalb auch indirekt eine Änderung im Cl-Gehalt und Cl-Aufnahmefähigkeit
der Erythrocyten (H. W. Haggard und Yandell Henderson, Journ. of biol.
chem. 45. 209 u. 219. 1920; siehe auch B. 6, 404 u. 405. 1921).

5) Snapper, diese Zeitschr. 51, 53. 1913.

6) Rohonyi, Kolloidehem. Beih. 8, 337. 1916. — Rohonyi und Loränt,
Kolloidehem. Beih. 8, 377. 1916.

— ` kenge
D

Chlorverteilung im Blute. 307

von dem CO,-Einfluß vernachlässigt. Nur Hamburger hat dazu
Experimente in vivo ausgeführt an Pferdeblut, das ganz flüssig geblieben
war).

Eine Wiederholung von diesen Experimenten bei einer anderen Tierart konnte
jetzt nicht als überflüssig betrachtet werden, weil das Pferdeblut sich wie be-
kanntlich durch die viel größere Senkungsgeschwindigkeit der Blutkörperchen von
den anderen Blutarten unterscheidet?). Diese Eigenschaft ist neulich in Beziehung
gebracht worden zu dem Verhältnis Cholesterin : Lecithin im Gesamtblut ?), von
welchem Verhältnis aber auch die Ionenpermeabilität der Zelloberfläche abhängig
ist). Deshalb war es angezeigt, die Chlorpermeabilität jetzt bei Körperchen
von einer anderen Tierart zu untersuchen. Wir benutzten Kaninchen.

Methodik.

Die Chlorverteilung zwischen Plasma und Körperchen wurde untersucht im
arteriellen und venösen Blut (Art. carotis und V. jugularis ext.). Hierzu wurde
das Blut mittels einer paraifinierten Kanüle in kurz vor dem Versuch paraffi-
nierten Röhrchen unter Paraffinöl aufgefangen und sofort schnell zentrifugiert,
nachdem die vollen Röhrchen noch mit einem eingeschliffenen Stöpfel oder mit
einem paraffinierten Korken geschlossen waren. Nach einigen Minuten Zentri-
fugieren wurde das flüssig gebliebene Plasma mittels einer paraffinierten Pipette
abgehoben. Eine Cl-Bestimmung wurde ausgeführt im Plasma, im Gesamtblut,
und endlich wurde das relative Volum der Körperchen bestimmt.

Für die Chlorbestimmung wurde die Veraschungsmethode nach v. Koränyi
mit der Modifikation von Visser angewendet). Wenn nur kleine Mengen Blut
oder Plasma zur Verfügung standen, benutzten wir die von Rusznyák ange-
gebene Mikroveraschungsmethode®), die prinzipiell mit der Makromethode gleich
ist. Die Anwendung einer vertrauenswerten Veraschungsmethode schließt die Mög-
lichkeit aus, daß ein Teil des Chlors nicht bestimmt wird, wie es bei der Chlor-
bestimmung im Plasma mittels verschiedener Niederschlagsmethoden der Fall zu
sein scheint. ?). Dieses gilt aber sicherlich nicht für alle Niederschlagsmethoden 8).
Der Cl-Gehalt ist ausgedrückt in Vol.-%, NaCl. Immer ist das Mittel von 2 Be-
stimmungen angegeben worden.

Die Versuche mit arteriellem und venösem Blute sind in neben-
stehender Tabelle zusammengestellt; man sieht, daß die Blutkörper-
chen im strömenden Blute immer Chlor enthalten. Weiter
lehrt die Tabelle den Unterschied in der Chlorverteilung auf Körperchen
und Plasma, der zwischen arteriellem und venösem Blute besteht.
Die von Hamburger bei seinen Versuchen in vivo mit Pferdeblut

1) Hamburger, Arch. f. Anat. u. Physiol. 1893, S. 157.

2) Siehe u.a. de Haan, diese Zeitschr. 86, 298. 1918.

3) Kürten, Arch. f. Phys. 185, 248. 1920. — Brinkman und Frl. Wastl,
neulich in dieser Zeitschr. erschienen.

4) Brinkman und Frl. v. Dam, diese Zeitschr. 108, 35. 1920.

5) Siche Snapper, diese Zeitschr. 51, 56. 1913.

6) Rusznyák, diese Zeitschr. 114, 23. 1921.

7) Rusznyák, diese Zeitschr. 110, 60. 1921. — Falta und Richter-
Quittner, diese Zeitschr. 91, 381. 1918.

8) Siehe z. B. Smith, Journ. of biol. chem. 45, 437. 1921. — Whitehorn,
Journ. of biol. chem. 45, 449. 1921.

308 S. van Creveld:

erhaltenen Resultate wurden hier ganz bestätigt gefunden. Bei dem
Übergang von arteriellem in venöses Blut findet also eine Chlorwan-
derung zwischen Plasma und Blutzellen statt und nicht allein zwischen
den einzelnen Plasmabestandteilen!). Wie aus den Werten für das
Gesamtblut, in Versuchen 1 und 2 erhalten, hervorgeht, muß daneben
noch ein Cl-Austausch zwischen Blut und Gewebe stattfinden.

Tabelle I.
Prozentualer Chlorgehalt (in % NaCl) des Gesamtblutes und des Plas-
mas von arteriellem und venösem Blute nebst dem relativen Volumen

der Blutkörperchen und dem Verhältnis Cl-Blutkörperchen ,

Cl-Plasma

o a Relat. Volumen lo \-Blutkörperchen _ Gs
Kanin- Gesamtblut Plasma der Zn ~ CL- Plasma Im"
SEH venös £ arteriell venös Ä arteriell | venös | arteriell venös | arteriell
1 o| 0,568 | 0,562 | 0,614 0649 | aa, | 20% 3197
2 ı 0,527 | 0,537 0,582 | 0,608 | 33⁄4, | 3il T 62

3 1055| — [|0623] — | 33%, | — 82 _

4 > 0,537 — 0,607 | — 381/2 — 70 —
5,0489 | — Ion — 3l | — 68 —
6, — | 0513 | 0o59% | — | 33 = 58,7

. Körperchen-Cl
Das Verhältnis — — —— BE ist auch unter normalen Verhältnissen

- P asma-Cl
nicht konstant ?). Auf dieses Verhältnis kommen wir noch weiter unten
zu sprechen.
Daß die Vernachlässigung des Einflusses von CO,-Verlust tatsächlich
so bedeutend für die Chlorverteilung ist, geht aus den Ergebnissen der
folgenden Tabelle II hervor. In dieser sind die Resultate von Versuchen

1) In bezug auf den Unterschied im C1-Gehalt des Plasmas (Serums) von
arteriellem und venösem Blute sei erinnert an die Untersuchungen über die Wechsel-
beziehung zwischen den Werten des Blutes, welche respiratorischen Schwan-
kungen unterworfen sind. Nach einer rezenten Mitteilung von L. J. Henderson
(Journ. of biol. chem. 46, 411; 1921) ist. diese Korrelation für wenigstens die fol-
genden 6 Werte anzunehmen: freie und gebundene O, und CO,, Wasserstoffionen-
konzentration des Serums und C1-Gehalt des Serums, und bei einer für zwei an-
genommene Wert sind die anderen vier bestimmt. Mit Hilfe einer geometrischen
Darstellung von den Ergebnissen von ihm und früheren Autoren erhalten, lassen
sich weiter nach Henderson für jeden Fall alle Werte leicht berechnen. Wie
der Autor aber ausdrücklich hervorhebt, sind die Ergebnisse alle erhalten in Ver-
suchen, die mit defibriniertem Blute in vitro ausgeführt wurden. Daß diese
Warnung nicht überflüssig ist. geht unter anderem daraus hervor, daß Henderson
berechnet, daß unter normalen Verhältnissen bei dem Übergang von arteriellem
zu venösem Blute kein Austausch von Elektrolyten zwischen Serum und Körper-
chen stattfindet. Wir fanden aber in den Versuchen in vivo, daß eine solche
Wanderung wohl geschieht.

H

2) Siche auch Fridericia Le

Chlorverteilung im Blute.

309

vereinigt, bei denen das rasch aus einer Ohrvene tropfende Blut in
offenen paraffinierten Röhrchen aufgefangen wurde. Die Röhrchen
wurden dann schnell zentrifugiert. Auf diese Weise wurde Plasma erhal-
ten von Blut, das kurze Zeit in Kontakt mit der Luft gewesen war,
dessen Gerinnung aber auf einwandfreie Weise vorgebeugt war.

Tabelle II.

Kaninchen Gesamt- Plasma Rel. Vol. d. But EE
blut Körperchen C1-Plasma

l 0,5074 0,5897 31!/, 559%,
2 0,4455 0,5198 41!/, 65%
3 0,5031 0,5805 32 580,
4 0,4663 0,6201 241), Körperchen chlorfrei
5 0,4929 0,5733 36 61%,
6 0,3979 0,5792 3l Körperchen chlorfrei
7 0,4680 0,6260 36 3605
8 0,4914 0,6084 291/, 43,10%,
9 0.4995 0,5800 21 340,

10 0,4446 0,6377 237, Körperchen chlorfrei

Natürlich war die Verringerung der CO,-Spannung und die Ver-

ımehrung der O,-Sättigung bei diesen Versuchen in den einzelnen Fällen
sehr verschieden. Das geht auch aus den Werten für das Verhältnis
Körperchen-Cl
Plasma-Cl

von Chlor gefunden; während in den anderen Experimenten das
Verhältnis im Vergleich mit den Werten für das venöse Blut in den
Versuchen von Tabelle I erhalten niedriger, also zugunsten des Plasmas,
war. Die Vernachlässigung von den Gasfaktoren allein genügt also,
um ein Resultat zu erhalten, das nähert oder übereinstimmt mit dem
das Falta und Richter - Quittner für physiologisch ansehen. a `

hervor. Dreimal wurden die Körperchen frei

Die Cl-Wanderung kam in den letzten Versuchen mit offenen Röhr-
chen hauptsächlich während des Auffangens des Blutes zustande.
Das geht m. E. aus Versuchen hervor, bei denen dem Kontakt mit der
Luft während des Zentrifugierens durch Verschließen der vollen Röhr-
chen vorgebeugt wurde.

Tabelle III.

Kaninchen Gesamt- Plasma Rel. Vol. d. Cl- Blutkörperchen
blut Körperchen Cl-Plasma

l 0.5207 0.6143 33 53,80,

2 0,4817 0.6527 301/3 Körperch. fast chlorfrei
3 0.4950 0,5955 341/, 60,6%,

4 0,4505 0,5850 281 200,

5 0,5517 0.6423 32 56%

6 0,5636 0,6592 On, SEAN

310 S. van Creveld:

Auch hier wurden also auseinandergehende Werte für das Verhältnis
Cl-Körperchen
Cl-Plasma
relativ hoch, und einmal waren die Körperchen fast frei von Chlor.

erhalten. Meistens waren die Plasmawerte aber wieder

Eine Konsequenz für die klinischen Chlorbestimmungen.

Es mag noch auf eine Konsequenz dieser Ergebnisse für die klinischen
Chlorbestimmungen im Blute hingewiesen werden. Meistens werden
diese noch in Serum angestellt, das ohne Berücksichtigung von einem
der genannten, die Cl-Verteilung beeinflussenden Faktoren erhalten ist.
Auch der Einfluß der Gerinnung wird vernachlässigt. Daß ein solcher
Einfluß tatsächlich besteht, geht aus dem Folgenden hervor. Wenn man
Plasma und Körperchen sofort nach der Gewinnung des Blutes trennt,
mit Vorbeugung der Gerinnung (Paraffinmethode), dann findet man
in den Körperchen, wie aus unseren Versuchen hervorgeht, schwankende
Mengen, bisweilen gar kein Chlor. Trennt man beide aber, nachdem
Gerinnung vollständig oder teilweise eingetreten ist, dann findet man,
daß zwischen Cl-Gehalt von Körperchen und Serum ein ziemlich kon-
stantes Verhältnis besteht. Nach den Angaben von Abderhalden!)

— dann ca. 30%, nach denen von Sna pper?) ist dieses

Verhältnis ca. 40%. In vivo ist, wie wir sahen, dieses Verhältnis nicht
konstant und im venösen Blute jedenfalls viel höher. Um den ‚‚wahren“
C1-Gehalt des Plasmas zu bestimmen, würde es notwendig sein, das Blut
mit Vorbeugung der CO,-Entweichung in paraffinierten Röhrchen
aufzufangen und sofort zu zentrifugieren. Beim Menschen hat man
dann immer die Beschwerde, daß die CO,-Spannung des venösen Blutes
bei der für eine gut ausführbare Venaepunctio notwendigen Abklemmung
des Blutgefäßes verändert sein wird. Auch wird die richtige Plasma-
gewinnung in der Klinik nicht immer gut ausführbar sein. Es fragt sich
dann, ob man nicht einen geringeren Fehler macht durch Vornahme
der Cl-Bestimmung im Gesamtblut statt wie heute im Serum. Nament-
lich in den pathologischen Fällen, wo der CO,-Gehalt des Plasmas
oder einer mit diesem korrelierenden Wert des Blutes stark verändert
ist, wird der Fehler im letzten Falle groß sein können. Wenn man bei
denselben Individuum mehrere Bestimmungen hintereinander macht.
könnte man dann, um den Faktor der Schwankung des relativen Körper-
chenvolums zu umgehen, eine Bestimmung von diesem Volum mit der
Ul-Bestimmung im Blute verbinden.

1) Abderhalden, Zeitschr. f. physiol. Chemie. 25, 106. 1898.
2) Snapper, diese Zeitschr. 51, 56. 1913. — Siehe auch Veil, diese Zeitschr.
91, 272. 1918 u. Siebeck, Le. u. Wiechmann, l. c.

m m c

Chlorverteilung im Blute. 311

II. Die Frage der Chlorbindung im Plasma.

Was die Frage der Chlorbindung im Serum anlangt, so ist die
Meinung der meisten Autoren, daß der größte Teil des Chlors im Serum
sicherlich nicht gebunden ist!). Das Verhältnis zwischen der kleinen,
nicht.diffusiblen OC). Menge und der diffusiblen Cl-Menge soll aber abhängig
sein von der Wasserstoffionenkonzentration des Serums?).

Eine Möglichkeit, die man früher nicht näher berücksichtigt hat,
ist in den letzten Jahren hervorgehoben worden, und zwar diese, daß
im Serum fast alles Chlor frei vorhanden ist, daß aber im Plasma ein
belangreicher Teil chemisch gebunden ist. Als eine solche im Plasma
bestehende CL Verbindung wurde von Falta und Richter - Quittner
eine Chlor-Fibrinogenverbindung angenommen?). Diese Annahme beruhte
hauptsächlich auf einen Unterschied, der bei der Cl-Bestimmung im
Plasma gefunden wurde, je nachdem diese nach einer Veraschungs-
oder nach einer Fällungsmethode ausgeführt worden war. Im Serum
wurde ein solcher Unterschied nicht gefunden. Von ihrer ursprünglichen
Meinung, daß wir es hier mit einer sehr stabilen und salzreichen Ver-
bindung zu tun haben, sind die genannten Autoren in einer in neuester
Zeit erschienenen Arbeit abgekommen®). Die von ihnen wie auch von
Rusznyák) beobachtete Differenz im Plasma-Cl bei Verwendung
von verschiedenen Methoden wird jetzt als durch den Dispersitätsgrad
der untersuchten Flüssigkeit bedingt angesehen. Rusznyak will die
Differenz zwischen Plasma und Serum auf den größeren Eiweißgehalt
des Plasmas zurückführen und stützt sich dabei auf Ultrafiltrations-

versuche, die aber von Falta und Richter - Quittner nicht bestätigt
worden sind. Die Möglichkeit des Vorhandenseins einer Fibrinogen-
Cl-Verbindung wird von den Autoren noch offengehalten.

Es ist von vornherein wahrscheinlich, daß auf eine eventuell be-
stehende Verbindung von Fibrinogen und Chlor im Blute verschiedene
Faktoren Einfluß haben werden. Das darf für die CO,-Spannung z. B. aus
den von Ha mburger®) mit Serum gemachten Ultrafiltrationsversuchen
konkludiert werden. In Experimenten in vitro ist diesen teils nicht
gut zu beherrschenden Faktoren nicht immer genügend Rechnung
getragen. Auch arbeitet man dann immer mit Hirudin- oder Oxalat-
plasma; die kolloidiehemischen Eigenschaften des Fibrogens in diesem
Plasma können ganz verschieden sein von denen im natürlichen Plasma.

1) Höber, Physik. Chemie d. Zelle u. Gew. A Aufl. S. 175. 1914.

2) Rona und György, diese Zeitschr. 56, 416. 1913. — Hamburger,
diese Zeitschr. 86, 309. 1918.

8) Falta und Richter- Quittner, diese Zeitschr. 91, 381. 1918.

4) Falta und Richter- Quittner, diese Zeitschr. 114, 310. 1921.

5) Rusznyák, diese Zeitschr. 110. 60. 1921.

6) Le

312 S. van Creveld:

Versuche in vivo zur Lösung der vorliegenden Frage waren deshalb
m. E. gerechtfertigt.

Als ein physiologisches Ultrafiltrat oder besser Dialysat von dem
natürlichen Blutplasma meinen wir auf Grund von rezenten Unter-
suchungen das Augenkammerwasser betrachten zu dürfen!). Zwar hat
man schon oft seine Zusammensetzung mit dem des Blutplasmas ver-
glichen, das letztere war dann aber niemals unter den früher erwähnten
Kautelen erhalten worden. Für die Beurteilung des Bestehens einer
Fibrinogen-Cl-Verbindung schien uns eine Vergleichung des Kammer-
wassers und mit dem mit bestimmten Vorsorgen erhaltenen Blut plasma
sehr geeignet. Das Kammerwasser enthält nur winzige Mengen Eiweib.
aber keine Spur Fibrinogen. Die Vergleichung mit dem Blutplasma
kann entweder geschehen durch Gewinnung von Plasma direkt aus dem
Blute, oder man kann das primäre fibrinogenfreie Kammerwasser ver-
gleichen mit dem nach einer ersten resp. zweiten Punktion der Augen-
kammer regenerierten sekundären resp. tertiären Kammerwasser. Das
neugebildete Kammerwasser ist wenigstens beim Kaninchen fibrinogen-
reich und nähert sich in Zusammensetzung dem echten Blutplasma.
wie nach den rezenten experimentellen Untersuchungen von Seidel?)
begreiflich ist.

Wir bemerken nebenbei, daß man unseres Erachtens Kammerwasser durch
die Veränderungen, die darin in Eiweißmenge und Eiweißarten nach einer Punktion
der Augenkammer auftreten, gut benutzen kann, um die Eiweißhypothesen
von Herzfeld und Klinger?) und die Erklärungen, die sie mit diesen Hypo-
thesen von verschiedenen biochemischen Problemen gegeben haben), zu unter-
suchen.

Tabelle IV>).
Vergleichung von Cl-Gehalt (ausgedrückt in °/, NaCl) und Refraktion
von primärem und sekundärem Kammerwasser.

Cl-Gehalt Refraktion
pr Nennen, p nn
prim. K.-W. sek. K.-W. pim. K.-W. sek. K.-W.
] 0,6494 0,6230 1,3350 1,3449
2 0,6319 0,6116 1.3339 1,3431
3 0,6650 0,6560 1.3341 1,3412
4 0,5872 0.5499 1.3341 1,3431
5 0,6603 0,6467 1,3339 1,3438

Wie aus diesen Versuchen hervorgeht, enthielt das sekundäre
Kammerwasser immer weniger Chlor als das primäre. Die zweite Punk-

1) de Haan und v. Creveld, neulich in dieser Zeitschr. erschienen —
Seidel, Graefes Arch. f. Ophthalmol. 104, 162. 1921.

ZK Le

3) Herzfeld und Klinger, diese Zeitschr. 82, 228. 1917 u. f.

4) Siche auch Starlinger, diese Zeitschr. 114, 129. 1921.

5) Für die Methodik der Punktion siche de Haan und v. Creveld L c.

Chlorverteilung im Blute. 313

tıon geschah, sobald die Vorderkammer des Auges sich wieder angefüllt
hatte, d.h. meistens nach einigen Minuten. Der Unterschied im Cl-Gehalt
von primärem und sekundärem Kammerwasser wurde gegen Erwartung
in unseren Fällen ziemlich konstant gefunden. Die Schwankungen im
NaCl-Gehalt von Plasma durch Fütterung usw. scheinen sich also schnell
mit dem Kammerwasser auszugleichen.

Der gesamte Eiweißgehalt des. sekundären Kammerwassers war in
unseren Fällen 2—5%, wie aus der Refraktion berechnet werden kann,
Mit Berücksichtigung dieses Gehaltes wird man dennoch sagen müssen,
daß das Auftreten von Fibrinogen im Kammerwasser
nicht zusammengegangen ist mit einer Vermehrung des
Cl - Gehaltes.

Man könnte einwenden, daß die Vergleichung nur mit dem Blut-
plasma geschehen darf. Deshalb geben wir hier die Werte für den
C1-Gehalt vom Kammerwasser in den Fällen, wo wir früher arterielles
und venöses Blut untersucht haben (Tabelle I).

Tabelle V.
Blutplasma Prim. Kammerwasser
arter. venös
0,649 0,614 0,6650
0,608 0,582 0,6344
— 0,544 0,5872
0,594 -— 0,6314

Man wird hier bedenken, daß das Kammerwasser eher als ein Ultra-
filtrat (Dialysat) von dem arteriellen als von dem venösen Blute zu
betrachten ist. Immerhin geben auch diese Bestimmungen keinerlei
Anhaltspunkte für das Bestehen einer Fibrinogen -Cl - Ver-
bindungim Blute. Im besten Falle kann es sich handeln um eine
so kleine mit dem Fibrinogen verbundene Chlormenge als mit der hier
verwendeten Methode nicht bestimmt werden kann. Ob es möglich
sein wird, eine so kleine Menge dann noch durch vergleichende Be-
stimmung der Chlorionenkonzentration im Plasma und Ultrafiltrat
(Kammerwasser) zu entdecken, scheint uns auf Grund der Erfahrung
anderer Untersucher bei derartigen Problemen fraglich?).

Eine nähere Erklärung wird noch die Tatsache brauchen, daß wir
in vivo im Plasma mit der befolgten Methodik kein gebundenes Chlor
nachweisen konnten, daß aber im Serum bei Einwirkung von CO,
unter einem Druck, der innerhalb der physiologischen Grenzen bleibt,
deutlich Cl an das Serumeiweiß gebunden gefunden wurde?).

1) Siehe hierzu z. B. Brown und Hill, Journ. of physiol. 54, CXXI. 1921. —
Manabe und Matula, diese Zeitschr. 5%, 369. 1913.
2) Hamburger, l. e. — Rona und György, Le

314 S. van Creveld: Chlorverteilunge im Blute.

Zusammenfassung.

Es wurde auseinandergesetzt, weshalb die neueren Arbeiten über die
Chlorpermeabilität der Blutkörperchen (Falta und Richter - Quitt-
ner, Straub und Meier u. a.) keinen Aufschluß geben über die Ver-
hältnisse im strömenden Blute. Durch direkte Bestimmungen wurde
das Bestehen einer solchen Permeabilität in vivo nachgewiesen. Weiter
wurde hingewiesen auf eine Konsequenz, die aus den erhaltenen Resul-
taten für die Methodik der klinischen Chlorbestimmungen im Blute
folgen muß.

Die in der letzten Zeit umstrittene Frage von dem Bestehen einer
Chlorfibrinogenverbindung im Plasma wurde durch vergleichende
Bestimmungen im Plasma und dem als ein Ultrafiltrat (Dialysat) des
Blutes sich verhaltendes Augenkammnerwasser, im negativen Sinne ent-
scheiden.

DEE EE, Steen EEE, nn, Auger, — -

Berichtigung

zu der Arbeit E. Freudenberg und P. György: Über
Kalkbildung durch tierische Gewebe, diese Zeit-
schrift 118. 1921.

(Eingegangen am 6. Oktober 1921.)

Seite 54 wird zweimal der Ausdruck Phosphatgemisch Lä

sung von saurem Phosphat gebraucht, welche durch Phosphor-
säurezusatz auf pe 3,0 gebracht war. Da das Wort Phosphat-
gemisch für Gemische von primärem und sekundärem Phosphat
vorbehalten bleiben muß, so wird die unzweckmäßige Anwendung
dieses Ausdruckes hiermit richtig gestellt.

U

Biochemische Zeitschrift Band 123. 21

Autorenverzeichnis.

Allander, B. s. Dernby.

Asher, Leon. Beiträge zur Phy-
siologie der Drüsen. XLVII. Mit-
teilung. S. 27.

Berger, W. s. Doerr.

van Creveld, S. Über die Chlor-
verteilung im Blute. S. 304.

— s. de Haan.

Dernby, K. G. und B. Allander.
Studien über den Einfluß der
Wasserstoffionenkonzentration auf
das Wachstum und die Toxin-
bildung der Tetanusbacillen. S. 245.

Dienes, L. Über den Stickstoff- `

ansatz bei Fleisch- und Mehlkost.
S. 128.

Doerr, R. und W. Berger. Inter-
ferometrische Analyse der Immun-
präcipitation. S. 144.

Grab, Max v. Brenztraubensäure
als Zwischenprodukt der alko-
holischen Zuckerspaltung. 8. 69.

de Haan, J. und S. van Creveld.
Über die Wechselbeziehungen
zwischen Blutplasma und Ge-
webeflüssipkeiten, insbesondere
Kanmmerwasser und Cerebrospinal-
flüssirkeit. S. 190.

Heller, Ludwig. Quantitative
Untersuchungen über die Ein-

Gerinnungsfak-
Gerinnung des

wirkung einiger
toren auf die
Blutes. S. 90.

Hess, Leo und Rudolf Reitler.
Über die Einwirkung von Metallen
auf Sera. 8. 5l.

Kahho, Hugo. Ein Beitrag zur
Permeabilität des Pflanzenplasmas
für die Neutralsalze. IV. Mit-
teilung. S. 284.

Kollmann, Gustav. Über Harn-
säuresynthese im menschlichen
Organismus. S. 235.

Kumagawa, H. Über die Dis-
mutation verschiedener Aldehyde
durch Hefe. S. 225.

Matsuno, G. a Asher.

Pedotti, Fausto. Untersuchungen
über den Einfluß des Calcium-
mangels in der Nahrung auf den
respirațorischen Grundumsatz.

S. 272.

Reitler, Rudolf s. Hess.

Runnström, J. Die Einwirkung
einiger Elektrolyte und Anelektro-
lyte auf die Senkungsgeschwindig-
keit der roten Blutkörperchen des
Pferdes. S. 1

Starlinger, Wilhelm. Über das
Flockungsvermögen des mensch-
lichen Blutplasmas. S. 215.

Takei, Takeo. Über die Ana-
Ivse einer Volumkurve von Blut-
körperchen in hypertonischen Lö-
sungen, welche zugleich die
Differenzierung von osmotischen
und kolloidchemischen Volum-
änderungen ermöglicht. S. 104.

Tomita, M. Über das Verhalten
der inaktiven Äpfelsäure im Or-
ganismus des Hundes und des
Kaninchens. S. 231.

Biochemische. Zeitschrift. Bd. 128, Heft 56.

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Technische Gasanalyse: Prof. Dr. Ernst Berl, Darmstadt. — Mikrochemische
Arbeitsmethoden: Dr. U. F. Blumer, Zurich. — Elektroanalysc: Prof. Dr.-
Ing. W. Moldenhauer, Darmstadt. — Feste und flüssige Brenustoftfe: Dr.
D. Aufhäuser, Hamburg. — Die Prüfung des Wassers für Keyselspeisung
und andere technische Zwecke: Dipl.-Jue. A. Zsehlmmer, München. —
Trink- und Brauchwasser: Prof. Dr. L. W. Winkler, Budapest. — Abwässer:
Prof. Dr. E.Haselhoff, Caasel. — Die Luft: Prof. Dr. K. B. Lehmann, Würzburg.
— Fabrikation der schwefligen Säure, Salpetersäure und Schwefelsäure: Pror.

Dr. Ernst Berl, Darmstadt. — Suliat- und Salzeäurelabrikatiun: Prof. Dr.
Ernst Berl, Darmstadt. — Fabrikation der Soda: Pror. Dr. Ernst Berl,
Darınstadt. — Die Industrie des Chlors: Prof. Dr. Ernst Berl, Dursustadt. —

Verflüssigte und komprimierte Gase: Prof. Dr. Ernst Berl, Darmstadi. --
Kalisalze: Dr. L. Tietjens, Berlin.

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