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UNIVERSITY OF CALIFORNIA |
MEDICAL CENTER LIBRARY |
SAN FRANCISCO |
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UNIVERSITY OF CALIFORNIA
MEDICAL CENTER LIBRARY
i SAN FRANCISCO )
Biochemische Zeitschrift
Unter Mitwirkung von
M. Ascoli-Catania, L. Asher-Bern, A. Bach-Moskau, M. Bergmann-Dresden, G. Bertrand-
Paris, A. Bickel- Berlin, F. Blumenthal-Berlin, Fr. Boas- Weihenstephan, A. Bonanni-Rom,
F. Bottazzi- Neapel, 6. Bredig- Karlsruhe i. B., Wl. Butkewitsch - Moskau, M. Cromer-
Berlin, R. Doerr-Basel, A. Durig- Wien, F. Ehrlich- Breslau, H.v. Euler-Stockholm, S. Flexner-
New York, J. Forssman-Lund, S. Fränkel-Wien, E. Freund-Wien, H. Freundlich-Berlin,
E. Friedberger - Greifswald, E. Friedmann - Berlin, E. Fromm - Wien, 0. Fürth - Wien,
F. Haber - Berlin, M. Hahn-Berlin, P. Hári- Budapest, F. Hayduck - Berlin, E. Hägg-
luad - Abo, V. Henri- Paris, V. Henriques- Kopenhagen, R. 0. Herzog - Berlin, K. Hess-
Berlin, W. Heubner - Göttingen, R. Höber-Kiel, M. Jacoby - Berlin, P. Karrer - Zürich,
M. Kochmann - Halle a. S., R. Krimberg- Riga, F. Landolf - Buenos Aires, L. Langstein-
Berlin, E. Laqueur - Amsterdam, 0. Lemmermann - Berlin, E. J. Lesser - Mannheim,
P.A.Levene-New York, L. v. Liebermann - Budapest, S. Loewe - Dorpat, A. Loewy - Davos,
H. Lilers - München, Th. Madsen - Kopenhagen, A. Magnus- Lery-Berlin, J. A. Mandel-
New York, E. Mangold - Berlin, L. Marchlewski- Krakau, P. Mayer - Karlsbad, J. Meisen-
heimer- Tübingen, 0. Meyerhof-Berlin, L. Michaelis- Nagoya, H. Molisch - Wien, H. Mursch-
hauser - Düsseldorfi, W. Nernst - Berlin, C. v. Noorden - Frankfurt a M., W. Omelianski-
Leningrad, W. Ostwald - Leipzig, A. Palladin -Charkow, J. K. Parnas - Lemberg, Th. Panl-
München, W. Pauli-Wien, R. Pfeiffer - Breslau, BE. P. Pick-Wien, L. Pincussen - Berlin,
J. Pohl-Breslau, Ch. Porcher-Lyon, D. N. Prianischnikow-Moskau, H. Pringsheim- Berlin,
P. Rona-Berlin, H. Sachs-Heidelberg, S. Salaskin-Leningrad, T. Sasaki-Tokio, B.Sbarsky-
Moskau, A. Scheunert - Leipzig, A. Schlossmann - Düsseldorf, E. Schmitz - Breslau,
8. P. L. Sörensen - Kopenhagen, K. Spiro - Basel, E. H. Starling - London, J. Stoklasa - Prag,
W. Straub- München, K. Suto- Kanazawa, U. Suzuki- Tokio, H.v. Tappeiner - München,
K. Thomas - Leipzig, H. Thoms - Berlin, C. Tigerstedt - Helsingfors, P. Trendelenburg -
Freiburg i. Br, 0. Warburg - Berlin, @. v. Wendt- Helsingfors, E. Widmark - Lund,
W. Wichowski - Prag, A. Wohl - Danzig, J. Wohlgemuth - Berlin, N. Zelinsky- Moskau.
herausgegeben von
C. Neuberg-Berlin
Hundertzweiundsechzigster Band
Berlin
Verlag von Julius Springer
1925
Sieger, PA
Druck von Friedr. Vieweg € Sohn Akt..Ges., Braunschweig.
Inhalt.
Seite
Karczag, L. und L. Németh. Über Elektropie. VIII. RE Vital-
chemoskopie unter verschiedenen Einflüssen l
Karczag, L. und N. Zilahy. Über die na der Zellpermenbiict
durch den Sympathicus . 18
Karczag, L. und P. Roboz. Über kinetische Erscheinungen an
Flüssigkeitsoberflächen . TE Sg e , , 22
Karezag, L. und G. v. Farkas. e o ae an GET
schen Organen. I.. ee d ee er en a Meet e
Bing, H. I. und H. Heckscher. Untersuchungen über Fett-Cholesterin-
mengen im Blute bei Adipositas und Myxödem. 32
Meyerhof, Otto. Über den Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische
Gärung der Hefe. f 43
Rona, P., E. Mislowitzer und S. Seidenberg. Untersuchung über TA
lyse. V. GER 87
Faludi, Franz. Über die Botelhosche Reaktion. . 116
Aszódi, Zoltán. Tierische Kalorimetrie. VI. eech Milzexstir-
pation und Energieumsatz 3 ; . 128
— — Das Blutbild der snlenektemierten, weien Ratte . 152
Koväcs-Zorköczy, Etelka von. en zur en, ach
Pyrogallol . 161
Dold, H. und E. Fröidenbarg: Bemerkungen zur Mitteilung Er Sal.
kowski über die Herstellung eiweißfreier Antitoxinlösungen . . 169
Kondo, Seigo. Der Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien.
VI. Mitteilung: Über den Einfluß der Wasserstoffionenkonzen-
tration auf das Wachstum der säurefesten Bakterien in einfachen
künstlichen Nährböden . PE . 171
Bloch, Br. und F. Schaaf. Pigmentstudien. re ee ER
Jendrassik, L. und E. Annau. Beiträge zu einer Pharmakologie der
Konzentrationsänderungen. III. Mitteilung: Weitere Versuche
über Kationenwirkungen N We ae A ZO
Syniewski, Viktor. Untersuchungen über Diastase. II. Mitteilung:
Wirkt a-Diastase auch Ba und N Be
auch a-diastatisch?. . . . . VI 228
— — Untersuchungen über Diastase. Ila. Mitteilung: Uber dio Ge-
schwindigkeit der unter Vermittlung von a-Diastase verlaufenden
Stärkehydrolyse x- er aa we 5.2 we O . 236
Fujita, Akiji. Untersuchungen über elektrische Erscheinungen und
Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. Mitteilung: Die Figen-
schaften der Membranen von amphoterem Charakter . 245
Michaelis, L. und Sh. Dokan. Untersuchungen über elektrische Er-
scheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. VI. Mit-
teilung: Membranen aus Paraffin, Wachs, Mastix, Kautschuk
US
258
IV Inhalt
Smorodinzew, J. A. und C. S. Lemberg. Über den Einfluß verschiedener
Präparate der Chiningruppe auf die fermentativen Funktionen des
Organismus. IV. Mitteilung: Über den Einfluß der Chininsalze auf
das Magenpepsin . ¿
Popper, Hans. Über die Einwirkung von Adrenalin dad aa
| Substanzen auf die Selbstgárung der Hefe . . š
Lieben, Fritz und Daniel Lászlo. Über den Einfluß einiger onen De die
Zuckerassimilation durch sauerstoffgeschüttelte Hefe
Kolthoft, J. M. Die Dissoziationskonstante, das a und
die Titrierbarkeit von Alkaloiden a Ne N i
Lorber, L. Allgemeines Prinzip zur Bestimmung Ee Sub-
stanzen in den Körperflüssigkeiten . N ée A A
Kriss, Leonia. Über die Deu AOS von Calcium SE
Magnesium. II..
Grafe, V. und H. Magistris. Zur Chemie er Physiologie Äer Planzen.
phosphatide. II. ne Die wasserlöslichen NS aus
Aspergillus oryzae . Sp
Szent-Györgyi, A. v. Zallatmune: IV. Mitteilung: Uber den Or
dationsmechanismus der Kartoffeln K
Suzuki, U. und T. Mori. Über einen durch Hydrolyse v von Adenyl-
thiozucker der Hefe entstehenden schwefelhaltigen Zucker .
Iwanoft, Nicolaus N. Über den Ursprung des von Schimmelpilzen aus-
geschiedenen Harnstoffs d ARA DAR Wa
— — Über den Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten .
— — Über die Trehalose und Trehalase bei Myxomyceten
Laubender, WW. ` Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Rain.
I. Mitteilung: Gaswechsel und Eiweißstoffwechsel . EA
Sabetay, S. und L. Rosenfeld. Über Glucose-phosphorsäure. a
Neuberg, Carl und Sebastian Sabetay. Die enzymatische Spaltung der
SE in Fruchtzucker und er
säure .
Neuberg, Carl Get A. "Gottschalk. Über das. ahy Bielasiche Verhalten
des Acetoins. II. Mitteilung. Über das Verhalten des Acetoins
It LIETKÖTDOr s: s a a u a er VE E A E
Neuberg, Carl und 0. Dalmer. Notiz über das ee des
Methyl-glyoxals . .
Neuberg, Carl und G. Gorr. Uber SE Mechanismus ER Milchsäure-
bildung bei Bakterien .
Neuberg, Carl und M. Kobel. Über eine Reaktion der Se mit: DES Sr
Autorenverzeichnis .
Seite
Biochemische Zeitschrift
M. Ascoll-Catania, L. Asher-Bern, A. Bach-Moskau, M. Bergmann-Dresden, G. Bertrand- JAN Z E
Paris, A. Bickel- Berlin, F. Blumenthal-Berlin, Fr. Boas-Weihenstephan, A. Bonanni-Rom,
F. Bottazzi- Neapel, G. Bredig - Karlsruhe i. B., WI. Butkewitsch- Moskau, M. Cromer»
Berlin, E. Doerr- Basel, A. Durig- Wien, F. Ehrlich- Breslau, H.v. Euler-Stockholm, S. Flexner» =.
New York, J. Forssman-Lund, $. Fränkel-Wien, E. Freund-Wien, H. Freandlich-Berlin, San Francisco,
E. Friedberger - Greifswald, E. Friedmann - Berlin, E. Fromm - Wien, O. Fürth - Wien, Zu
F. Haber - Berlin, M. Hahn- Berlin, P. Häri- Budapest, F. Hayduck - Berlin, E. Hägg-
luad - Abo, V. Henri- Paris, Y. Henriques - Kopenhagen, R. 0. Herzog, Berlin, K. Hess-
Berlin, W. Heubner -Göttingen, R. Höber-Kiel, M. Jacoby - Berlin, P. Karrer - Zürich,
M. Kochmann - Halle a, S, R. Krimberg- Riga, F. Landolf - Buenos Aires, L. Langstein-
Berlin, E. Laquear - Amsterdam, 0. Lemmermann - Berlin, E. J. Lesser- Mannheim,
P.A.Levene-Now York, L. v. Liebermann - Budapest, 8. Loewe - Dorpat, A. Loewy - Davos,
H. Lüers - München, Th. Madsen - Kopenbagen, A. Magnas- Levy-Berlin, J. A. Mandel-
New York, E. Mangold - Berlin, L. Marchlewski- Krakau, P. Mayer - Karlsbad, J. Meisen-
heimer-Tübingen, 0. Meyerbof-Berlín, L. Michaelis-Nagoya, Il. Molisch -Wien, H. Mursch-
hsuser - Düsseldorf, W. Nernst - Berlin, C. v. Noorden - Frankfurt a M., W. Omellanski-
Leningrad, W. Ostwald - Leipzig, A. Palladin-Charkow, J. K. Parnas - Lemberg, Th. Paul-
München, W, Pauli-Wien, R. Pfeiffer - Breslau, E. P. Pick-Wien, L. Pincussen - Berlin,
d, Pohl-Breslau, Ch. Porcher-Lyon, D. N. Prianischnikow-Moskau, H. Pringshein-Berlin,
P. Rona-Berlin, H. Sachs-Heidelberg, 8. Salaskin-Leningrad, T.Sasaki-Tokio, B. Sbarsky-
Moskau, A. Scheunert - Leipzig, A. Schlossmann - Düsseldorf, EB. Schmitz - Breslau,
B. P. L. Sörensen - Kopenhagen, K. Spiro - Basel, E. H. Starling - London, J. Stoklasa - Prag,
W. Straub-Múzchen, K. Suto- Kanazawa, U. Sazuki- Tokio, H. y. Tappeiner - München,
K. Thomas - Leipzig, H. Thoms- Berlin, C. Tigerstedt- Helsingfors, P.Trendelenburg -
Freiburg L Br, 0. Warburg- Berlin, @. v. Wendt- Helsingiors, B. Widmark - Lund,
W. Wichowski - Prag, A. Wohl - Danzig, J. Wohlgemuth - Berlin, N. Zelinsky- Moskau.
herausgegeben von
C. Neuberg-Berlin
a D
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Hundertzweiundsechzigster Band
Erstes und zweites Heft
Abgeschlossen am 23. September 1925
Berlin
Verlag von Julius Springer
1925
Biochemische Zeitschrift. Bd. 162, Heft 1/2.
Die
Biochemische Zeitschrift
erscheint in zwanglosen Heften, die in kurzer Folge zur Aus;
gabe gelangen; je sechs Hefte bilden einen Band. Der Preis
des Bandes beträgt A 28,—.
In der Regel können Originalarbeiten nur Aufnahme finden, wenn
sie nicht mehr als Tea Druckbogen umfassen. Sie werden mit dem
Datum des Eingangs versehen und der Reihe nach veröffentlicht, sofern
die Verfasser die Korrekturen rechtzeitig erledigen. — Mitteilungen
polemischen Inhalts werden nur dann zugelassen, wenn sieeine tatsáchliche
Richtigstellung enthalten und höchstens zwei Druckseiten einnehmen.
Manuskriptsendungen sind an den Herausgeber,
Herrn Prof. Dr. C. Neuberg, Berlin-Dahlem, Hittorfstr. 18,
zu richten.
Das Honorar beträgt M 40,— für den 16seitigen Druckbogen.
Die Verfasser erhalten bis 100 Sonderabdrucke ihrer Abhandlungen
kostenfreibis zueinemUmfang von 1'/, Druckbogen, von größerenArbeiten
nur bis 75. Doch bittet derVerlag, nur die zur tatsächlichen Verwendung
benötigten Exemplare zu bestellen. Über die Freiexemplare hinaus bestellte
Sonderdrucke werden berechnet. Die Herren Mitarbeiter werden jedoch in
ihrem eigenen Interesse dringend gebeten, sich, wenn irgend möglich, mit
der kostenfrei zur Verfügung gestellten Anzahl zu begnügen, und falls
nehr Exemplare unbedingt erforderlich sind, deren Kosten vorher vom
Verlage zu erfragen, um unliebsame Überraschungen zu vermeiden.
Verlagsbuchhandlung Julius Springer
Berlin W 9, Linkstraße 23/24.
162. Band. Inhaltsverzeichnis. Heft 1/2
Seite
Karczag, L. und L. Németh. Über Elektropie. VIII. Mitteilung: Vital-
chemoskopie unter verschiedenen Einflüssen . . . . +. +. +. +. + 1
Karezag, L. und N. Zilahy. Über die Beeinflussung der Zellpermeabi-
lität durch den Sympathicus . . . s sos e s e e sas os eo 18
Karczag, L. und P. Roboz. Über kinetische Erscheinungen an Flüssig-
keitsoberflächen . . . . 2: 2 2 N e 2 rn e ... e 22
Karczag, L. und G. v. Farkas. Kataphoreseversuche an patholo-
gischen Organen. I.. sosoo e 28
Fortsetzung des Inhaltsverzeichnisses siehe 3. Umschlagselte.
Über Elektropie.
VIII. Mitteilung:
Vitalchemoskopie unter verschiedenen Einflüssen.
Von
L. Karczag und L. Németh.
(Aus der III. medizinischen Klinik der k. ungar. Universität Budapest.)
(Eingegangen am 25. Juni 1925.)
1. Einflu8 der Temperatur.
Um zu prüfen, inwiefern die Temperatur die Zellpotentiale zu
beeinflussen imstande ist, haben wir Frösche verwendet, welche wir
einerseits bei tiefen, bis zu 0° reichenden, andererseits bei Zimmer-
temperatur (220 C) gehalten haben. Die Tiere wurden mit Wasserblau
behandelt bzw. chemoskopiert und nach Ablauf der Versuchsfrist
getötet und die Organe nach der üblichen Methodik sowohl makro-
skopisch wie mikroskopisch untersucht.
Wir möchten Ergebnisse dieser Versuchsreihe antizipieren und
zusammenfassend folgendes hervorheben:
In sämtlichen Organen der abgekühlten Tiere zeigte sich eine
schwächere Färbung wie beim Kontrolltier (bei Zimmertemperatur).
In einem einzigen Falle wies die Leber des abgekühlten Tieres eine
stärkere Färbung auf. Besonders auffallend ist der Unterschied bei den
Nieren, indem diese bei Zimmertemperatur in den gewundenen Kanäl-
chen eine schöne körnige Färbung erkennen ließen, wogegen eine solche
bei 0°C nie zustande kam. Als ein weiterer Unterschied ist folgendes
zu verzeichnen: Bei Zimmertemperatur sind die Glomeruli der Niere
ganz farblos, dagegen zeigen sie bei 0% C stets eine blaBblaue Färbung.
Auch die subkutanen Bindegewebe und das Interstitium der Par-
enchymorgane zeigen auffallende Differenzen in der Intensität ihrer
Färbungen. Wichtige Resultate ergaben die Untersuchungen der ein-
zelnen Organe im frischen Zustande. Bei 0°C sind die mikroskopischen
Bilder ganz farblos, und sie bleiben nach erfolgter Regeneration ent-
weder unverändert oder nur ganz schwach blau tingiert. Diese Organe
Biochemische Zeitschrift Band 162. l
2 L. Karczag u. L. Németh:
binden also kaum das Carbinol. Der Einwand, daß sich die Farbstoffe
nicht in Carbinole umgewandelt haben, ist nicht berechtigt, da das
farblose Carbinol im Serum der Tiere durch Salzsäurezusatz leicht
nachweisbar ist. Die Organe des Kontrolltieres (bei 22% C) erscheinen
im frischen Zustande unter dem Mikroskop ebenfalls farblos, hingegen
regenerierten aber die Farbstoffe mit starker, bis + +, ++ + reichender
Intensität.
Über das Verhalten des Urins ist zu verzeichnen, daß derselbe
sowohl in farblosem wie in gefärbtem Zustande ausgeleert wurde.
Wir möchten als Beispiele folgende Versuche anführen:
1. Versuche bei 0°,
a) Kälteversuch 1.
20. April 1924. Frosch Nr. 1. Im Eisschrank (0°) gehalten. Gewicht 70g.
Um 8% vormittags 0,5 cem 2,5proz. Wasserblau subkutan.
79 10 (E) 0,5 IA) 2,5 39 E) ag
KE) 12 99 0,5 E) 2,5 E) LE ,9
A 2 nachmittags 0,5 „ 25 , de ER
Das Tier ist ganz erstarrt.
Um 4% nachmittags 0,5 ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan.
99 6 KE) 0,5 99 2,5 2] 99 99
» 8 = das Tier ist ganz starr, lebt und reagiert auf
Berührung, Decapitation, Sektion.
| In frischem | Im frischen Zustande | Nach Fixierung
Organe | Zustande |
, makroskopisch | mikroskopisch mikroskopisch
Herzvorkammer . | = a | Ge
Herzkammer .. > SE | _
Leber... ee: E Farblos, regeneriert: das In den Leberkapillaren, in
Interstitium blaß blau» den Bindegeweben und in
lich tingiert den Kupfferschen Zellen
eine blasse blaue Farbung
Darm ...... | en e | D
Lunge. . 2... | — = | SS
Genitalien . . .. ` Se Se | un
Niere ...... | S Rinde nativ: farblos, | In den gewunden Kanálchen
regeneriert: mittels keine Färbung, Glomeruli
sind mittelmäßig blau tins
| maßig diffus tingiert
giert.
b) Versuch.
Frosch Nr, 2. Im Eisschrank (0°C) gehalten. Gewicht 65 g.
Um 8% vormittags 0,5ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan.
LE 10 LE 0,5 LE) 2,5 99 3, LE)
39 12 33 0,5 39 2,5 33 LE) LE
» 2 nachmittag 0,5 „ 23,5 „ S S
Das Tier ist ganz erstarrt.
Um 4% nachmittags 0,5 ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan.
29 6 LU 0,5 LE 2,5 LE LE) LE
» 8 AR Decapitation, Sektion.
E Er
Elektropie. VIII. 3
| In frischem | In frischem |
Zustande | Zustande Nach Fixierung mikroskopisch
|
Organe
makroskopisch mikroskopisch
Herzvorkammer . ' — — | —
Herzkammer .. ` — | Se | a
Leber ...... farblos | farblos ' In den Leberkapillaren eine
| | | blasse blaue Färbung
Darm ...... | — | — | ‚-
Lunge. . — | | —
Genitalien | — — | o
Niere ...... d — | — | Glomeruli sind blau gefärbt
ro
Versuch bei 29 C.
a) Versuch.
Frosch Nr. 1. Bei Zimmertemperatur (22°C) gehalten. Gewicht 60 g.
Um 8% vormittags 0,5ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan.
LN 10 LE 0,5 39 2,5 TE 99 LE
29 12 29 0,5 99 2,5 LEI 33 LA
À 2 nachmittags 0,5 „ 25 „ e „
33 d 39 0,5 LE) 2,5 LE LA LE)
LA 6 LE 0,5 39 2,5 LE LA) 9
39 8 LEI 0,5 9 2,5 LE LA) 39
» 8 e Decapitation, Sektion.
—— —— e
| In frischem In frischem Zustande | Nach Fixierung
SSES i N mikroskopisch mikroskopisch
en wen TA A A nn | b Sak SE S i ne e ==’ Se
Herzvorkammer . ++ — ( —
Herzkammer ++ — —
Leber . ..... ++ Eine sehr blasse blaue | Sehr schöne körnige Färbung
| Färbung, regeneriert in den Kupfferschen Zellen
| ++++ (diffus)
Darm ...... u | S | =
Lunge. ..... +++ ` === | >
b) Versuch.
Frosch Nr. 2. Bei Zimmertemperatur (22°C) gehalten, Gewicht 65 g.
Um 8% vormittags 0,5ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan.
9> 10 39 0,5 LE) 2,5 19 LE 39
12 Se 0,5 „ 25 ,„ 5 e
» 2 nachmittags 0,5 „ 2,5 „ 5 Kg
s "2 e 0,5 „ 25 „ er 2
» 6 an 0,5 „ 2,5 55 2 e
» 8 ci Decapitation, Sektion.
1*
4 L. Karczag u. L. Nemeth:
In frischem Zustande Gefrierschnitte
e i a frischem
a: | ech mikroskopisch | mikroskopisch
Herzvorkammer . | ++ | Ez | 22
Herzkammer .. ` ++ | — E
Leber ...... + Farblos, regeneriert: Schrstarke, körnige Färbung
++, fleckige blaue in den Leberkapillaren und
f Tinktion | Kupfferschen Zellen
Darm ...... | Js | Fr ==
Lunge...... | +++ | => | =
Genitalien . . . . ++ | ==
Sebr schöne köm'ge Färbung
blaue, diffuse Färbung.
in den ann Kanal.
chen;
Niere ...... | +++ | Nicht re eneriert: blaß- |
lomeruli sind farb»
| regeneriert: starke,
blaue diffuse Färbung los
Auf Grund der angegebenen Resultate dürfen wir wohl annehmen,
daß bei der Abkühlung im allgemeinen in den Organen eine Erhöhung
der Potentiale stattfindet. Nur die Glomeruli der Niere zeigen eine
Potentialabnahme. Ausführliche Versuche, welche von Karczag und
Paunz über die Regulierung der Zellpotentiale ausgeführt wurden,
ergaben, daß in diesen der Sauerstoff eine wichtige Rolle spielt, und
es war daher naheliegend, die durch Abkühlung erzielten Potential-
abnahmen mit dem Sauerstoffwechsel in Zusammenhang zu bringen.
Bei der Abkühlung wird in der Tat Sauerstoff gespeichert, wie unter
anderen die Versuche von Fischer gezeigt haben, bei welchen der Ischiadicus
während der Abkühlung Sauerstoff speicherte. Diese Tatsache läßt sich
mit den vitalchemoskopischen Befunden gut in Einklang bringen, welche
somit als Stütze für die Hypothese, welche für die Erhöhung des negativen
Zellpotentials den Sauerstoff verantwortlich machen, dienen. Um dies-
bezüglich auch durch Reagenzglasversuche eine Unterlage zu schaffen,
haben wir Experimente ausgeführt, in denen wir in gesonderten Proben
reinen Sauerstoff bzw. Kohlensäure durch 0,lprom. Lösungen unsere
Farbstoffe streichen ließen. Das kurze Ergebnis dieser Versuche: der
Sauerstoff entfärbt die elektropen Farbstoffe (Fuchsin S, Lichtgrün, Wasser-
blau) und Kohlensäure regeneriert die Carbinole.
Es ist hier nicht der Ort, auf die Einzelheiten der sich abspielenden
chemischen Erscheinungen näher einzugehen, es genügt ein Hinweis auf
die Tatsache, daß der molekulare Sauerstoff eine Umlagerung der Sulfo-
säurefarbstoffe zu bewirken vermag, und daß die Kohlensäure in vitro
als Antagonist wirkt. >
Inwieweit bei den bezeichneten Versuchen die Wasserstoffionen-
konzentration der Zell- und Gewebssäfte eine Rolle spielt, wird in
späteren Mitteilungen mitberücksichtigt.
Was im speziellen die mikroskopischen Nierenbilder betrifft, bei
denen bei der Abkühlung eine Inversion des vitalfärberischen Bildes
erzielt wurde, so möchten wir hervorheben, daß wir dieselben Er-
scheinungen auch bei der Splanchnicusreizung, sowie bei der höchsten
Sauerstoffarmut des Organismus (Agonie, Narkose) beobachtet haben,
E A
rn op o
Elektropie. VIII. 5
und daß wir diese mit der Potentialabnahme der Glomeruli in Zu-
sammenhang bringen konnten (s. spáter).
2. Vitalchemoskopie und innere Sekretion.
Um den Einfluß, welcher auf die Zellpotentiale durch die inner-
sekretorischen Organe ausgeúbt wird, zu prifen, gingen wir wie folgt vor.
a) Einfluß der Schilddrüsenexstirpation.
In einem Versuche untersuchten wir einen thyreoidectomisierten
Hund. In einer weiteren Versuchsserie wurde die Vitalchemoskopie
unter künstlicher Adrenalinwirkung ausgeführt.
Mittelgroßer schwarzer Hund, wiegt etwa 6kg. Schilddrüse am
20. April 1924 total entfernt (mit Hinterlassung von zwei Epithel-
körpern).
Eintagsversuch mit Wasserblau. Begonnen am 29. Juli 1924 (also
2 Monate nach der Operation).
Um Bb vormittags 100 eem 2,5proz. Wasserblau subkutan.
LE 10 99 100 39 2,5 29 ’ LE)
> 12 3) 100 29 2,5 > LE) 99
„ 2 nachmittags 100 „ 2,5 „ = S
LA 4 33 100 39 2,5 > LA 33
33 6 33 100 > 2,5 3, > 29
29 8 39 100 99 2,5 33 29 LEI
Sektion. |
Mikroskopisch untersuchte Organe: Niere, Leber, Milz, Genitaldrüsen,
Blutgefäße, Bindegewebe, Peritoneum, Nebennieren, Knochenmark, Gehirn,
Herz, Lungen.
Alle diese Organe zeigen keine Abweichung weder in bezug auf
die Verteilung noch auf die Intensität der Färbung. Wir haben be-
sonderes Augenmerk auf die Färbung der myxödematösen Binde-
gewebe gerichtet. Die Bindegewebe färben sich wie gewöhnlich mit
Wasserblau sehr gut, bzw. beluden sich reichlich mit Wasserblau-
carbinol, welches gut zu regenerieren war.
b) Versuche mit Adrenalin.
Meerschweinchen Nr. 1. Gewicht 600 g. Datum des Versuchs 19. Juni
1924. Farbstoff Wasserblau.
Um 10530’ 1,0ccm 2,5proz. Wasserblau + 0,00001g Adrenalin intravenös.
„ 1045 1,0 , 25 „ SS + 0,00001g Se
„ 1100 10 „ 25 „ S + 0,00001g si
„ 1115 10 , 25 „ e + 0,00001g =
„ 1130 10 „ 25 „ ne + 0,00001g NM e
„ 1215 10 „ 25 „ $ + 0,00001 g 3
„ 12 30 1,0 „ 25 „ S + 0,00001g j
„ 12 40 Exitus. Sektion.
6 L. Karczag u. L. Nemeth:
Harn: gelblich gefärbt, durch Salzsäurezusatz nicht regeneriert.
Niere (makroskopisch): Rinde blaßblau, granwiert. Die Marksubstanz
ist in der äußeren Zone ungefärbt, in der inneren deutlich blau gefärbt.
Die fixierten und regenerierten Gefrierschnitte zeigten folgendes Bild:
die Glomeruli diffus, undeutlich blaßblau tingiert, die gewundenen Kanálchen
der Rinde ungefärbt, ebenso diejenigen der Marksubstanz. In den übrigen
Organen des Tieres (Leber, Lunge, Milz, Niere, Genitaldrüsen, Blutgefäße,
Bindegewebe, Peritoneum, Nebennieren, Knochenmark, Gehirn, Herz) waren
keine Abweichung von der Norm bezüglich Verteilung und Intensität der
erzielten Färbungen nachweisbar.
Meerschweinchen Nr. 2. Gewicht 550 g. Beginn des Versuchs 20. Juni
1924. Farbstoff Wasserblau.
Um 8545’ 2,0 ccm 2,5proz. Wasserblau + 0,01 cem 1prom. Adrenalin intrav.
,> 9 00 2,0 LEI 2,5 LA 39 Se 0,01 HI 1 H >> LA)
?9 9 15 2,0 LE 2,5 LE 29 + 0,01 LE 1 >, 39 ?9
E 9 30 2,0 LE 2,5 ,, >, SC 0,01 99 1 LEI LE LI
LE H 45 2,0 39 2,5 LEI LA) + 0,01 LE 1 ?9 LEI LE)
„10 05 Exitus. Sektion.
Harn; farblos, auf Salzsäurezusatz bläulich gefärbt.
Niere (makroskopisch): Rindensubstanz ++, Marksubstanz ++
gefärbt.
Der fixierte und regenerierte Gefrierschnitt zeigte folgendes mikro-
skopische Bild: Glomeruli stärker blau tingiert, die Rindenkanälchen
schwach blau gefärbt. Die Harnkanälchen der Marksubstanz ungefärbt.
Die übrigen Organe des Tieres zeigten ebenso wie diejenigen des
vorigen Versuchs keine Abweichung von der Norm?),
Diese Versuche ergaben also nur bezüglich der Niere ein auf-
fallendes Ergebnis, welches nicht als zufälliges gedeutet werden kann.
Karczag und Paunz haben bereits in eingehenden Versuchen über die
Biologie der Nieren den Nachweis dafür erbracht, daß die Reizung
des Splanchnicus eine Inversion des mikroskopischen Bildes bewirkt.
Normalerweise besitzen die Glomeruli keine Carbinolotropie, und nur
die Tubuli besitzen eine elektive carbinolotrope Eigenschaft, wodurch
in regenerierten Präparaten die Glomeruli ungefärbt, die Tubuli intensiv
gefärbt erscheinen. Bei der Splanchnicusreizung entsteht aber ein
Inversionsbild, die Tubuli verlieren ihre carbinolotropen Eigenschaften,
sie erscheinen unter dem Mikroskop als kaum gefärbte oder ungefärbte
Elemente, wogegen die Glomeruli im mikroskopischen Bilde eine deut-
liche intensive Färbung aufweisen. Dieses Verhalten der Nierenelemente
bei der Splanchnicusreizung wurde mit dem Sauerstoffwechsel in Zu-
sammenhang gebracht, und in gleichem Sinne möchten wir auch die
Ergebnisse unserer Adrenalinversuche an den Nieren deuten.
1) Die Tiere besitzen eine verschiedene Adrenalinempfindlichkeit.
Acht Meerschweinchenversuche ergaben zweimal ein positives Resultat.
Vier Kaninchenversuche verliefen zweimal negativ und zweimal waren in
den Glomerulis embolische Prozesse nachweisbar (Farbstoffkörner).
Elektropie. VIII. 7
Mit Ausnahme der Niere läßt sich also unter Adrenalinwirkung
in den übrigen Organen bzw. in der Verteilung und Intensität der
Färbungen keine Abweichung von der Norm beobachten. Die ge-
wonnenen mikroskopischen Nierenbilder sind mit denjenigen der
Splanchnicusreizung identisch, und es ist demnach anzunehmen, daß
das Adrenalin die Potentiale der Nierenelemente durch Beeinflussung
ihres Sauerstoffwechsels verändert.
c) Versuche mit Insulin.
Diese Versuche sollten über zwei Fragestellungen Aufschluß geben:
1. Wie beeinflußt die chronische Behandlung der Versuchstiere
mit Wasserblau die nach Insulininjektion auftretende Zuckerverarmung
des Blutes und der Organe.
2. Ist eine vitalfärberische Änderung des insulinbehandelten
Tieres im Stadium der Hypoglykämie zu beobachten ?
Zu l. Versuch am chronisch vitalgefärbten Tiere,
7. November 1924. Hund, 8kg, weiblich, wird 3 Monate lang mit
2,5proz. Wasserblau behandelt. Am oben angegebenen Tage erhielt das
hungernde Tier nachmittags um 5 Uhr 15 Einheiten Insulin Lilly. Eine
Stunde nachher wurde der Blutzucker bestimmt und das Tier durch Ver-
blutung getötet, sofort seziert und die Organzuckerbestimmungen nach
Hetényi- Barát vorgenommen.
Blutzucker . . . . . . . 0,011 Proz.
Leberzucker. . . . . . . 0,503 „
Muskelzucker . . . . . . 0,094 „
Herzzucker . . . .. . . 0,117 „
Das hungernde Kontrolltier (7 kg, weiblich) erhielt dieselbe Insulin-
dosis in derselben Tagesstunde und zeigte folgende Analysenwerte:
Blutzucker . . . . . . . 0,035 Proz.
Leberzucker. . . . . . . 0,818 „
Muskelzucker . . . . . . 0,187 p
Herzzucker . . . .. . . 0,222 ,,
Wie aus diesem Versuch zu ersehen ist, ist das mit Wasserblau
chronisch vitalgefárbte Tier gegen Insulin sensibilisiert.
Diese Versuche stehen im guten Einklang mit denjenigen, welche
in Toronto von M.D.Orr und L. Karczag an vitalgefärbten Tieren
vorgenommen wurden und auf deren Analyse andernorts eingegangen
wird.
Zu 2. Diese Versuche wurden an Kaninchen vorgenommen. Ein
Versuch wurde zur Entscheidung der Frage angeführt, ob 2 Stunden
nach Verabreichung einer großen Insulindosis die Vitalfärbung des
Tieres eine Änderung erleidet,
Das Tier (1,5kg, weiblich) erhielt am 9. Oktober 1924, nachmittags
um 4 Uhr 25 Einheiten Insulin Lilly subkutan. Um 6 Uhr wurde ein
S L. Karczag u. L. Németh:
Stundenversuch vorgenommen. Die makro- und mikroskopische Unter-
suchung der Organe ergab keine vitalfärberische Abweichung von der Norm,
Ein zweiter Versuch wurde mit einem chronisch mit Wasserblau
gefärbten Tiere vorgenommen, um zu sehen, ob eine Verschiebung der
Vitalfärbungsbilder unter Einwirkung einer großen Insulindosis zu beob-
achten ist.
Das Tier (1,5kg, weiblich) erhielt vom 14. bis 18. Oktober 1924
täglich 20 ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan injiziert. Am 18. Oktoker,
nachmittags um 4 Uhr erhielt das Tier subkutan 100 Einheiten Insulin
Chinin. Nachmittags um 6 Uhr, also 2 Stunden nach erfolgter Insulin-
einspritzung, Verblutung, Sektion. Die makro- und mikroskopische Färbung
der Organe ergab keine Abweichung von der Norm.
Kurze Zusammenfassung.
Versuch 1 zeigt, daß das chronisch mit Wasserblau vital gefärbte
Tier gegen Insulin sensibilisiert ist.
Versuch 2 zeigt, daß 2 Stunden nach einer großen Insulindosis
(25 Einheiten) keine makro- und mikroskopische Änderung des vital-
färberischen Bildes mit Wasserblau im Stundenversuch stattfindet.
Versuch 3 zeigt, daß eine große Insulindosis (100 Einheiten)
Vitalfärbung eines chronisch mit Wasserblau gefärbten Tieres nicht
verändert.
8. Einfluß der Röntgenstrahlen.
Halberstädter und O. Wolfsberg!) konnten bereits nachweisen, daß
die vitale Färbbarkeit der Gewebe bei Mäusen gegen Trypanblau eire
Änderung erleidet, und daß diese sich vornehmlich in einer Änderung
der Färbungsintensität erkenntlich macht. Schmidt?) fand, daß sich
die Kupfferschen Zellen des Bindegewebes nach der Bestrahlung mit
Trypanblau intensiver färben. Nach Schmidt zeigen die bestrahlten
Tiere eine granulierte Färbungsart entgegen der diffusen der normalen
Tiere.
Wir machten es zur Aufgabe, die Potentialänderungen, welche
durch die Röntgenstrahlen zweifelsohne erzeugt werden, vitalchemo-
skopisch nachzuweisen. Die Versuche, bei denen uns Herr Assistent
Ratköczi eine gefällige Hilfe leistete, wurden wie folgt ausgeführt.
Versuch 1.
Meerschweinchen, Gewicht 420g.
Röntgenbestrahlung am 2. Juni 1924, nachmittags um 4 Uhr, 10 Mi-
nuten lang. (Radiotransverter, Metrorröhre, 170kW. M.A. 4, Fokus-
weite 35 cm, ohne Filter.)
1) Halberstädter und O. Wolfsberg, Zeitschr. f. ges. exper. Med. 82/88,
1923; Fortschr. a. d. Geb. d. Röntgenstr. 1922.
2) Schmidt, Strahlentherapie 12, 1921.
Elektropie. VIII.
9
Färbung am 3. Juni 1924, morgens (50,4ccm Wasserblaulósung
während 12 Stunden injiziert).
Um 6 30 vormittags 8,5ccm Wasserblau subkutan.
LI 8 30 37 8,5 ,>
» 10 30 > 8,5 „
„ 12 30 nachmittags 8,5 „,
LEI 2 30 LE 8,0 LE
» 430 H 8,4 ,,
Das Tier fühlt sich ziemlich gut. Um 6 Uhr 30 Min. nachmittags wurde
das Tier getötet, nachher sofort Sektion.
1 ` Haut
2 "Bindegewebe . |
4
5 |Fascien . CHE i
6 | Peritoneum . .
7 | Pleura ....
8 ' Perikardium
9 |Herzmuskel. .
Endokardium .
'Herzklappen .
Aorta ascen-
deng ....
Aorta pulmo- |
nalis . . . .
Aorta descen-
dens...
Lunge
Bronchien
Trachea KS
18 || Larynx. . . .|
19 | Schilddrüre . .
20 Zune ....
21 || Radien . . ..
= | Oesophagus .
24 |Magenpylorus . |
25 |Duodenum .
26 || Jejunum . .
27 | Deum .
28 Colon. .
29 | Leber
|
x
H+ + + Ten ++?
Magen-cardia Hi
H
|
|
In frischem
Zustande
makroskopisch
CH
++
In frischem
Zustande
mikros
skopisch
Makroskopisch
fixiert und
regeneriert
Fixierte Gefrierschnitte
+
+
Normales Bild: Elastische Fasern
mittelstark gefárbt, Muskulatur
ungefärbt
Lungenparenchym und die als
veolaren Epithelzellen sind
farblos. Perichondrium u. Subs
mukosa sind schwach gefärbt.
Bindegewebe gefärbt. Epitbels
zellen farblos
Normales Bild: Auf der Alaun»
karminkontrastfärbung ist
sichtbar, daß die Leberzellen
ganz intakt sind. Sie weisen
weder eine parenchymatöse
Degeneration, .noch andere
Entartungen auf
10 L. Karczag u. L. Németh.
D
a 79
Së i |
232 en Makroskopisch
Nr | Organe 2 23 ken fixiert und | Fixierte Gefrierschnitte
ESE | akopisch regenenert
A en A
30 Gallenblase . . ++ ` AS
31 Pankreas... + | +
32 Mila... ..l + | +
33 Nierenmark. . diffuse | +t
T i
+++ Normales Bild: Die yewundenen
. (stellenweise Kanalchen der Rinde sind stark
gel getarbt. ` Glormeruli Mark»
radiare Streiten) | kanalchen sind farblos. Die
34 Nierenrinde. .
|
|
|
35 | Ureter .... ++ |
Bowmansche Kapsel ist teils
weise halomondtormig getarbt.
+7
36 | Harnblase +++ +++ `
37 Ovarium .... | + y + | Bindegewebe ist stark gefarbt,
| | | | Parenchym blaßblau tingiert
38 [¡Tuba-..... ++ sie 5
39 'Gebármutter `. ++ rt
40 Nebenniere „ . ++ +++
41 Hypophysis 0 | 0
42 Carotisdrüse .! 0 | 0
43 Knochen.. | 0 | 0 |
44 Periosteum .. + ++
45 Knochenmark. 0. 0
48 Gehin.... 0 ' +`
47 Dura. ....: + ++
48 Augen (retina) 0
PT
50 Liquor cerebro- ;
0
49 Augen (sklera) +
spinalis ..i 0
0
l
|
| regeniert |
|
52 || Galle. .... ++ regeniert
ie +++ |
Harn. . . . . kl regenicrt
| pa!
51 Humoraquaeus: regeniert |
Diese Untersuchungen ergaben also in bezug auf die Vitalchemo-
skopie folgendes:
Die biologische Wirkung der Róntgenstrahlen lieB sich nach unserer
Methodik mit Wasserblau, trotzdem die Tiere eine deletáre Strahlen-
dosis erhielten, nicht nachweisen. In der Leber und Niere und selbst
in den gegen Röntgenstrahlen empfindlichen Eierstöcken der Ver-
suchstiere waren keine histologische Veränderungen nachweisbar.
Die Versuchsergebnisse von Schmidt, wonach die Färbung bei
den bestrahlten Tieren körnig ist, bei nicht bestrahlten diffus,
konnten wir nicht bestätigen, wir fanden die Färbung auch der
normalen nicht bestrahlten Kontrolltiere (Wasserblau, Trypanblau)
granuliert.
Elektropie. VIII. 11
Nach den Versuchen von Hajós und Németh!) treten in der Leber
während des anaphylaktischen Zustandes der Meerschweinchen vaskuläre
Erscheinungen, wie Stauung, Nekrose, auf, welche einerseits zu normaler-
weise nicht vorhandener körniger Färbung der Parenchymzellen,
andererseits zur Färbung der nekrotischen Partien führen.
4. Einfluß des intravenös einverleibten Chinins.
(Gemeinschaftlich mit Dr. Roboz und v. Zilahy.)
Es war wichtig, die Frage einer experimentellen Prüfung zu unter-
ziehen, ob die Wirkung des Chinins im zellchemoskopischen Versuch
zum Vorschein kommt, ob somit die Zellpotentiale durch den Chinin-
einfluß eine nachweisbare Änderung erleiden. Folgende zwei Versuche
wurden ausgeführt.
a) Versuch.
Meerschweinchen, Gewicht 440 g, wurde mit Sáurefuchsin und Chinin
intravenös injiziert.
8b15’ vormittags 0,5cem 1,5proz. Chininum-hydrochlor.-Lösung intrav.
8 45 ys 8,0 , Sáurefuchsinlósung subkutan injiziert.
10 15 e 0,5 „ 1,5proz. Chininum-hydrochlor.-Lösung intrav.
10 30 e 8,0 , Sáurefuchsinlósung subkutan injiziert.
12 15 i 0,5 ,, 1,5proz. Chininum-hydrochlor.-Lósung intrav.
12 30 u 8,0 , Säurefuchsinlösung subkutan injiziert.
1 15 nachmittags 0,5 ,, 1,5proz. Chininum-hydrochlor.-Lösung intrav.
2 00 j 8,0 , Sáurefuchsinlósung subkutan injiziert.
4 30 ,> 10,0 „ „ „ ,
4 30 S 1,0 „ 1,5proz. Chininum-hydrochlor.-Lösung intrav.
5 30 En 10 , 15 „ së sp vn Subkut.
5 30 Ge 10,0 ,, Sáurefuchsinlósung subkutan injiziert.
6 30 sp 10,0 WI „ „ „
6 30 N 1,0 „ 1,5proz. Chininum-hydrochlor.-Lösung intrav.
7 30 sn 1,0 29 1,5 an ,, » „ „
T 45 sn 1,0 sn 1,5 ” „ sn , „
8 30 5 Sektion.
Versuchsresultat; Weder makroskopisch noch mikroskopisch keine
Abweichung vom Normalen.
b) Versuch.
Meerschweinchen, Gewicht 500 g, erhielt Wasserblau mit Chinin,
&500’ vormittags 10,0ccm 2,5proz. Wasserblau subkutan injiziert.
8 35 SE » 0,5 ,, Chinin.hydrochlor. intravenös injiziert.
10 00 E 10,0 , 2,5 ,, Wasserblau subkutan injiziert.
10 35 z 0,4 „ 0,5 ,, Chinin.hydrochlor. intravenös injiziert,
12 00 er 10,0 „ 2,5 ,, Wasserblau subkutan injiziert.
12 35 nachmittags 0,4 „ 0,5 ,, Chinin. hydrochlor. intravenös injiziert.
3 45 9 0,4 IT 0,5 29 >) 29 ,> Wi
1) K. Hajós und L. Németh, Zeitschr. f. ges. exper. Med. 45, 1925,
12 L. Karczag u. L. Németh:
4h 00° nachmittags 15,0 cem 2,5proz. Wasserblau subkutan injiziert.
4 45 = 0,4 „ 0,5 ,, Chinin.hydrochlor. intravenös injiziert.
5 30 me 15,0 „ 2,5 , Wasserblau subkutan injiziert.
9 00 ” Sektion (nach Entblutung).
| SC e y
| Gefrierschnitte in frischem | Gefrierschnitte nach
Organe | Marko Zustande | des Fixierung
H
lA A ES —KXÁ ¿Es _—— tn See A sen E
Haut. .... |
+
+
ooo+ocoaH| | II +f++oort+
| Hülse, Bindegewebe +
| Dasselbe
: Blaue Färbung in Tubuli contorti ;
| Dasselbe
Leber ....
Nierenrinde
Nierenmark . `
Nieren . . . . | Normales Bild
Dasselbe
Endo» u. Pericardium +
Schilddrüse . . |
Nebenniere . .
Knochen `, . .
Muskel. .. .
Fascien. . . .
Gehirn (dura).
Hypophysis. .
Auge... +...
Das Ergebnis dieses Versuchs war also dasselbe wie im vorigen
Versuch, daß das intravenös verabreichte Chinin das indirekt vital-
gefärbte Bild nicht zu beeinflussen vermochte.
Anhang.
Versuche zum Ausbau der Vilalchemoskopie.
(In Gemeinschaft mit Dr. Roboz und v. Zilahy.)
Der Zweck dieser Untersuchungen war, unsere Chemoskopreihe mit
neuen Farbstoffen zu bereichern, und wir haben deshalb neue, bisher nicht
geprüfte Farbstoffe, welche sich in Vitroversuchen als elektrope Ver-
bindungen erwiesen, zu unseren Untersuchungen herangezogen. Diese
Verbindungen werden folgende Triphenylmethanfarbstoffe sein:
. Alkaliviolett,
Brillantreinblau,
Brillantwalkgrün,
. Echtlichtgrün,
. Nachtgrün,
. Neublau.
Die Substanzen wurden zuerst an Mäusen, sodann an Meerschweinchen
auf ihre Fähigkeit, ob sie sich als Carbinole in bestimmten Zellen anhäufen,
Elektropie. VIII. 13
geprüft. Die befolgte Methodik war mit derjenigen identisch, welche von
Karczag und Paunz bereits mitgeteilt wurde.
Im folgenden möchten wir unsere Versuchsprotokolle mitteilen:
1. Versuche mit Nachtgrün.
Maus, Gewicht 240 g, wurde mit Nachtgrün behandelt.
Um 7% vormittags 0,5ccm 2,5proz. Nachtgrün subkutan injiziert.
9 9 99 0,5 99 2, 99 LE , 29
KE) il 99 1,0 E) 2,5 39 39 P 99
vn 1 nachmittags 1,0 „ 25 „ > e ep
99 3 99 1,0 33 2,5 99 LE LE) 99
99 5 LE 1,0 LE 2,5 99 (E) 99 99
w 1 Rs Chloroformnarkose. Sektion.
Meerschweinchen, Gewicht 250 g.
Um 915’ vormittags Leem lproz. Nachtgrün intravenös injiziert.
9 12 00 „ 2 sn 1 „ » ,, „
Sp 1 00 nachmittags 2 „ 1 nm à „ ,) „
» 130 > Sektion.
Blase ++, Lunge 0, Herz 0, Trachea +, Ösophagus +, Aorta +,
Darm ++, Nierenrinde + +, Nierenmark +, Nebenniere +, Magen + +.
Kurze Zusammenfassung: Keine nennenswerte mikroskopische Färbung
der Organe.
| 2. Versuche mit Alkaliviolett.
Meerschweinchen, Gewicht 250g.
Um 9% vormittags Leem lproz. Alkaliviolett intravenös injiziert.
99 1 1 99 1 HM 1 (E) 99 LE TE
99 1 2 99 2 38 1 LA LE LE 99
vn 4 nachmittags 2 „ l „ Se ss sd
o 5 Se Sektion (die Venen sind unbrauchbar).
EE
In frischem In frischem Nach Fixierung
e 3 S
SES en En mikroskopisch
Bauchhaut. . . .... | + l
Dünndarm. ...... 0 + |
Dickdarm . ...... ! +
Magen. ........ | T 0
Leber e e e e ew o ew e ew | t 0
Peritoneum . ..... | ++ | — =
Leber 4. 2. halha’. | + | — —
Milz. .... ee E y +? 0 —
Dünndarm. ...... | ++? 0 —
Dickdarm . ....... i ++ — —
Magen... ....... | + — —
Nierenrinde ...... ++ — —
Nierenmark . .... . | 0 == Kam
Lunge. ... 2.2... | 0 +? —
Herz. o e 1.20 u: 8% | 0 0 —
Blase e e ; + 0 —
Kurze Zusammenfassung; Keine nennenswerte mikroskopische Fárbung
der Organe.
14 L. Karczag u. L. Németh:
Maus, Gewicht 25 g.
8200” vormittags 0,5ccm 2,5proz. Alkaliviolettlósung subkutan injiziert.
10 00 29 0,5 99 2,5 LA) 3) 99 LE
12 30 nachmittags 1,0 „ 25 ,, e SN gy
3 00 39 1,0 33 2,5 A) 33 99 LE
5 00 39 1,5 LE 2,5 ,> 3, 29 LE
6 30 39 1,0 99 l 2,5 99? LE LA LE
8 00 a Chloroformnarkose. Sektion.
Organe | Makroskopisch pio | Gefrierschnitte
Peritoneum . ..... k Ss
Dünndarm. ...... | + 0
Dickdarm `... + | 0
Magen. ....... | Az |
Leber. 2... %.0.8:% 4 | 0 0
Pankreas ....... | =
Milz 2 ca o a ds a 0 |
Nierenrinde . . .... | Nicht zu beurteilen 0 72
Nierenmark ...... | 0 |
Lunge. «dis « | 0
Herz u. 2 ww a 0
Uterus. ........ 0
Harnblase . ...... | 0 |
Hoden. ........ | 0
Muskel ...... a ef 0 |
Kurze Zusammenfassung: Keine Färbung der Organe unter dem
Mikroskop.
3. Versuche mit Brillantreinblau.
Maus, Gewicht 25 g.
7% vormittags 0,5 ccm 2,5proz. Brillantreinblau subkutan injiziert.
9 99 0,5 99 2,5 LE) 39 ?9 LE)
11 39 1,0 38 2,5 EA) , 99 LE)
l nachmittags 1,0 „ 25 „ kp SA se
3 99 1,0 IA 2,5 3, 99 LE) 99
5 LA 2,0 99 2,5 99 99 99 (E
7 is Chloroformnarkose,. Sektion.
Kurze Zusammenfassung: Es ist weder eine makroskopische noch
mikroskopische Färbung der Organe sichtbar.
4. Versuch mit Brillantwalkgrün.
Maus, Gewicht 25 g.
72 vormittags 0,5 ccm 2,5proz. Brillantwalkgrün subkutan injiziert.
9 59 05 „ 25 ,, 2 vg Si
11 Sé 05 , 25 „ Ge on ze
l nachmittags 1,0 „ 25 „ j e »
3 ne 05 „ 25 „ ge 5 >
5 des LO e 29 -3 Rn e „
6 d Exitus. Sektion.
nen
Elektropie. VII. 15
Organe | Makroskopisch | Unter dem Mikroskop | Getrierschnitte mikroskopisch
Haut... .. ? Kollagene Fasen ++, ER
R | ++ SE diffus +
Darm ++ er =
Blase `, . .. . | ++ — ==
i 0 In See eech Ange
| ebe dunkelgrüne ovale
| Hecke |
Leber. ... + — | ==
Milz ....,. Ä + | Hülse, Bindegewebe ++, | =
8 sonst 0 |
Unter... .' ++ | — | SCH
Lunge T | — | =
Herz. uns. | 0 == EN
Oesophagus. . ++ — =
N + an =
Niere... . . l + diffus In den Markkanälchen teil-
| | weise dunkelgrüneZylinder,
l | Bindegewebstaser teilweise
| hellgrün
Muskel... jl + | zz da
Kurze Zusammenfassung: Brillantwalkgrün weist in einigen Organen
schwache elektive Färbungen auf.
5. Versuch mit Echtlichtgrün.
Maus, Gewicht 25g.
8 00 vormittags 0,5ccm 2,5proz. Echtlichtgrün subkutan injiziert,
10 00 29 9” 99 2,5 LÉI 29 29 39
12 00 P 1,0 „ 25 ,' m D „
3 00 nachmittags 1,0 „ 2,5 ,, NA e D
5 00 ek 15 , 25 „ e 55 e
6 30 OI 1,0 sp 1,0 29 , 39 `
7 30 En Chlorformnarkose. Sektion.
a E E
Organe Makroskopisch Getrierschnitte | Regeneriert | Mirko
Peritoneum . . . . . ` ++ |
| + |
Dünndarm . . .. . | +
Dickdarm. . `... . ++
e ebe i +
Leber. ....... d + 0 + +
Mis e, |! 0
Nierenrinde . . . . . | $ 0 0 0
Nierenmark. . . . . | 0 0 + 0
. . . . ’ ə oœ 0 | 0
Herz... ..... 0 0
Uterus ....... | 0 |
Pankreas . ..... Ä 0 |
Muskel... 2... + |
Fascien. ...... 8 + |
Aorta. TA ea 1? tr
N Elastisch Fasern
Kurze Zusammenfassung: Dieser Farbstoff besitzt eine ausgesprochene
Elektivität zu den elastischen Fasern der Aorta, im übrigen sind die er-
zelten Effekte nicht nennenswert.
16 L. Karczag u. L. Nemeth:
6. Versuch mit Neublau. We
Maus, Gewicht 25 g. p
Um 8b vormittags 0,5ccm 2,5proz. Nachtblau subkutan jn. ziert‘
„ 10 an 0,5 en 2,5 an 5 =. ARE: a
9 12 ?9 1,0 LE 2,5 9 39 99 SS
» 3 nachmittags 1,0 „ 25 „ er Ge
Zwischen 2 und 5 Uhr Exitus. Sektion um 5 Uhr.
Organe | Makroskopisch | Unter dem Mikroskop | Gefrierschnitte
== EE
Niere. ....... | + Diffus +?
Lunge BËSCH | 0, mit sehr starker brauner
Se Pigmentation
Leber ....... | + +? mit starker brauner
Pigmentation
Herz... ..... 0 0 |
E A | + | Bindegewebe +? |
Kurze Zusammenfassung: Neublau weist keine nennenswerte Färbung
in den Organen auf.
Weitere Versuche mit vorsichtigen Dosen dieses Farbstoffes zeigten,
daß dieser auch in kleinen Dosen giftig ist und deshalb zur Anstellung
von weiteren Versuchen ungeeignet.
Zusammenfassung.
Die Vitalchemoskopie wurde an einer Anzahl von Versuchstieren
unter den verschiedensten Einflüssen ausgeführt, um zu sehen, welche
Faktoren die Potentiale der Zell- und Gewebskolloide in solchem Grade
zu verändern imstande sind, daß dadurch Veränderungen in vital.
färberischem Bilde zum Ausdruck kommen. Die Abkühlung erwies
sich in den Froschversuchen im allgemeinen als ein die Potentiale
erhöhender Faktor. Nur die Glomeruli der Niere zeigten eine Potential-
abnahme und dementsprechend eine Inversion des histologischen
Bildes, eine Erscheinung, welche sonst im Stadium der höchsten Sauer-
` stoffverarmung des Organismus (Agonie, Narkose), ferner bei Splanch-
nicusreizung der Niere, und schließlich nach unseren intravenösen
Adrenalineinspritzungen beobachten konnten. Das Adrenalin beein-
flußte sonst nicht das vitalfärberische Bild, ebenso bewirkte die
Thyreoidectomie sowie das intravenös injizierte Insulin keine Ab-
weichung des makroskopischen und auch des mikroskopischen Bildes
von der Norm. Wasserblau vermochte aber, in Übereinstimmung mit
den Versuchen von Orr und Karczag, die Versuchstiere gegen Insulin
zu sensibilisieren.
Unter denjenigen Faktoren, welche keine vitalchemoskopisch
nachweisbare Änderung der Organe hervorzurufen imstande war. .,,
sind die Röntgenstrahlen und das intravenös injizierte Chinin zu nennen
Elektropie. VIII. 17
Schließlich werden im Anhang Versuche angegeben, welche die
tindung der elektropen Farbstoffe zu den vitalchemoskopisch-
Alf. - rischen Versuchen betreffen. Diese erwiesen sich in den Tier-
“er,ucuen als giftige und somit unbrauchbare Verbindungen.
Echtlichtgrün, Brillantreinblau, Alkaliviolett, Nachtgrün sind
weniger giftig, kommen jedoch praktisch wegen der erzielten un-
bedeutenden Färbungseffekte auch nicht in Betracht.
Als das einzig brauchbare Glied der Reihe konnte nur Brillant-
walkgrün erkannt werden, welches jedoch — bezüglich des Färbungs-
effektes — im Vergleich zu unserem bereits gut bewährten Fuchsin S,
Lichtgrün und Wasserblau keinen Vorteil bietet.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 2
Über die Beeinflussung der Zellpermeabilität
durch den Sympathicus.:
Von
L. Karezag und N. Zilahy.
(Aus der III. medizinischen Klinik der k. ungar. Universität Budapest.)
(Eingegangen am 25. Juni 1925.)
Es ist das Verdienst von Asher und seiner Schule, die Beeinflußbar-
keit der Zellpermeabilität durch den Sympathicus bewiesen zu haben. -
Jungmann und Meyer!) haben vor allem bezüglich der Niere experi-
mentell nachgewiesen, daß die Ausscheidungsfunktion dieses Organs bei
Hunden nach erfolgter Durchschneidung des Sympathicus eine erhebliche
Veränderung erleidet. Die einseitige Splanchnicotomie bewirkt auf der
verletzten Seite eine Vermehrung der Urinmenge und Zunahme der pro-
zentualen Kochsalzausscheidung. Nach der Piqure, welche an und für sich
eine Ausscheidung der dreifachen Urinmenge und der vierfachen Kochsalz-
menge nach sich zieht, steigt auf der Seite mit erhaltenem Splanchnicus
sowohl die Urin- wie die Kochsalzmenge, wogegen auf der durchschnitteren
Seite keine Veränderungen mehr eintreten.
In Versuchen neueren Datums hatte Asher?) diesbezüglich der Speichel-
drüse der Katze den Nachweis erbracht, daß die einseitige Sympathektomie
eine Störung der Kochsalzausscheidung auffallend beeinflußt, indem an
der sympathektomierten Seite weniger Kochsalz ausgeschieden wird als
an der unverletzten.
Aus der Asherschen Schule gingen sodann Versuche hervor, in deren
das Erscheinen von Farbstoffen in dem vorderen Kammerwasser nach
erfolgter Sympathektomie untersucht wurde.
Y. Hara?) fand, daß intraperitoneal einverleibtes Fluorescein an der
operierten Seite viel später erschien als an der nicht operierten Seite.
Kajikawa*) hatte übrigens diesen Befund Haras nach intraperitorealer
Injektion des Fluoresceins ebenfalls bestätigen können. Yamamoto?) in-
jizierte nach erfolgter einseitiger Sympathektomie das Fluorescein beider-
seits subkutan.
1) Jungmann und Meyer, Arch. f. exper. Path. u. Pharm. 73, 49, 1913,
2) Asher, Abelin und Scheinfinkel, diese Zeitschr. 151, 112, 1924.
3) Y. Hara, diese Zeitschr. 126, 281, 1921/22.
1) Kajikawa, ebendaselbst 183, 391, 1922.
5) Yamamoto, ebendaselbst 145, 201, 1924.
L. Karczag u. N. Zilahy: Beeinflussung der. Zellpermeabilität usw. 19
Anläßlich der neuen indirekten Vitalfärbungsversuche von Karczag
und Paunz!) konnte die funktionelle Abhängigkeit der Sekretion und
Zellpotentiale der Nierenelemente vitalfärberisch erkannt werden.
Normalerweise binden die Nierenepithelien das Triphenylmethan-
sulfosäurecarbinol, wogegen die Glomeruli keine Bindungsfähigkeit
gegenüber dieser Substanzen besitzen. Dementsprechend erscheinen
in den behandelten mikroskopischen Präparaten die Tubuli gefärbt,
die Glomeruli ungefárbt. Wird nun der Sympathicus einseitig stark
gereizt und führt man die indirekte Vitalfärbung unter solchen Verhält-
nissen aus, so findet man unter dem Mikroskop eine vollständige In-
version des Bildes, indem sich — im Gegensatz zum Normalen — die
Glomeruli als carbinolbeladene, die Tubuli als carbinolfreie Elemente
erweisen. Diese Inversion ist nach den Untersuchungen obiger Autoren
auf einen Potentialwechsel der betreffenden Stellen zurückzuführen.
Schon diese einfachen vitalfärberischen Befunde konnten mit denjenigen
von Asher über die Beeinflußbarkeit der Nierensekretion durch den
Sympathicus in guten Einklang gebracht werden.
Die zu diesen Versuchen verwendeten Verbindungen (Fuchsin S,
Lichtgrün, Wasserblau) gehören zu den Triphenylmethansulfosäure-
farbstoffen, welche sich innerhalb des Tierkörpers in die farblose
Carbinolform umwandeln. Diese Farbstoffe unterschieden sich physi-
kalisch unter vielen anderen durch ihre Dispersität, wie dies von
Mollendorf nachgewiesen werden konnte. Fuchsin S ist feindispers,
Wasserblau grobdispers, während Lichtgrün eine Mittelstellung
einnimmt.
Karczag und Paunz haben sodann in Tierversuchen zeigen können,
daß die genannten Sulfosäurecarbinole der Triphenylmethanfarbstoffe
auch im Liquor cerebrospinalis und im Humor aquaeus der Versuchs-
tiere (Kaninchen, Hunde) erscheinen.
Es fragte sich nun, ob die von Asher gefundene Permeabilitáts-
änderung in der vorderen Augenkammer nach erfolgter Sympathektomie
auch hinsichtlich der Farbstoffe bzw. Carbinole nachgewiesen werden
kann. Wir zogen zu unseren Versuchen das feindisperse Fuchsin, ins-
besondere aber das grobdisperse Wasserblau zu und haben im nächsten
mitgeteilte Versuche ausgeführt.
Versuch 1.
Kaninchen, Gewicht 1780 g.
Versuch am 11. Juni 1924, um 12 Uhr. Operation: An der linken
Seite Vagus isoliert. Sympathicus bis zum zentralen Ast des Gangl. cervic.
sup. freigelegt, durchgeschnitten und alle Äste des Ganglions entfernt.
Am 13. Juni 1924, um 5 Uhr, befindet sich das Tier wohl. Linke
Pupille etwas enger als die rechte.
1) Karczag und Paunz, Zeitschr. f. klin. Med. 98, 311, 1924.
Tt
20 L. Karczag u. N. Zilahy:
5 Uhr 15 Min. bis 5 Uhr 23 Min. 10,00 ccm 2,5proz. Sáurefuchsin
intravenös.
5 Uhr 53 Min. Punktion der rechten Augenkammer: ungefärbtes
Punktat. Nach Salzsäurezusatz leichte Rotfärbung (+).
Punktion der linken Augenkammer: etwas gelblich tingiertes Punktat.
Nach Salzsäurezusatz leichte Rotfärbung (+).
Am 16. Juni 1924, 11 Uhr 10,0 ccm 2,5proz. Wasserblaulösung intra-
venös injiziert.
11 Uhr 30 Min. Punktion der rechten Augenkammer: farbloses Punktat.
Regenerationsprobe + +.
Punktion der linken Augenkammer: farbloses Punktat. Regene-
rationsprobe + +.
11 Uhr 40 Minuten Punktion der rechten Augenkammer: farbloses
Resultat. Regenerationsprobe +++.
Versuch 2.
Kaninchen, Gewicht 1700 g.
Am 12. Juni 1924, um 12 Uhr Operation an der linken Seite wie im
vorigen Versuch.
Am 13. Juni 1924 befindet sich das Tier wohl. Bedeutende Anisochorie,
linke Pupille verengt.
6 Uhr 12 Min. bis 6 Uhr 20 Min. 10,0 ccm 2,5proz. Wasserblaulösung
intravenös injiziert.
6 Uhr 50 Min. Punktion der rechten Augenkammer: farbloses Punktat.
Durch Salzsäure regeneriert +.
Punktion der linken Augenkammer: leicht graugefärbtes Punktat.
Durch Salzsáurezusatz regeneriert ++.
Versuch 3.
Kaninchen, Gewicht 750g.
Am 18. Juni 1924 um 11 Uhr Operation an der linken Seite wie in
den Versuchen 1 und 2.
Am 19. Juni 1924 keine nennenswerte Anisochorie,
Um 11 Uhr 30 Min. 5,0ccm 2,5proz. Wasserblaulósung intravenös
injiziert.
Um 12 Uhr Punktion der rechten Augenkammer: farbloses Punktat.
Regeneration durch Salzsäurezusatz +.
Punktion der linken Augenkammer: leicht blaugefärbtes Punktat.
Regeneration durch Salzsäure +++.
12 Uhr 10 Min. Punktion der rechten Augenkammer: farbloses Punktat.
Regeneration durch Salzsäure ++.
Versuch 4.
Kaninchen, Gewicht 850 g.
Am 20. Juni 1924 um 12 Uhr 45 Min. Operation an der linken Seite
wie in den Versuchen 1, 2, 3.
Am 21. Juni 1924 keine Pupillendifferenz.
9 Uhr 50 Min. 5,0 ccm 2,5proz. Wasserblaulösung subkutan injiziert.
10 Uhr 2 Min. Punktion der linken Augenkammer: leicht blaugefärbtes
Punktat. Durch Salzsäurezusatz intensiv blau +++.
10 Uhr 5 Min. Punktion der rechten Augenkammer: farbloses Punktat.
Durch Salzsäurezusatz minimal gefärbt +?
Beinflussung der Zellpermeabilität durch den Sympathicus. 2]
In folgender Tabelle möchten wir die Wasserblauversuche 2, 3, 4
kurz zusammenfassen und nur hervorheben, daß dieintravenösen Wasser-
blauinjektionen 24 Stunden nach der Exstirpation des linken Ganglion
cervic. sup. verabreicht wurden, und daß die Punktion der Augen-
kammer einige Minuten nach der Farbstoffinjektion erfolgte.
| 2 3 4
Auge | Regeneration (nach | Regeneration(nach | Regeneration (nach
"go (| Min): 2 30 Min.): + 15 Min.): +!
ass li Punktat: blaßgrau. | Punktat: blaßblau. | Punktat: blaßblau.
|
Busse l Punktat: farblos. Puuktat: farblos. Punktat: farblos.
Regeneration (nach | Regeneration (nach | Regeneration (nach
Auge 30 Min): ++ 30 Min.): +++ 15 Min.) +++
Aus diesen Versuchen am Humor aquaeus ist ohne weiteres zu
ersehen, daß
l. die von Asher gefundene Abhängigkeit der Zellpermeabilität
vom Sympathikus zu Recht besteht,
2. daß die Sekretionsstörungen in einer gesteigerten Durchlässig-
keit für den zugeführten Farbstoff bzw. Carbinol an der sympathekto-
mierten Seite bestehen,
3. daß in dieser Hinsicht ein konträres Verhalten bezüglich Koch-
salz (Asher) und Farbstoff-, Carbinolausscheidung beobachtet wurde.
4. daß das feindisperse, intraperitoneal und subkutan verabreichte
Fluorescein (Asher, Hara, Yamamoto, Kajikawa) sich anders verhält
als das intravenös einverleibte, grobdisperse Wasserblau. Ersteres
wird verzögert, letzteres schneller in dem Kammerwasser der sym-
pathektomierten Seite ausgeschieden.
Über kinetische Erscheinungen an Flüssigkeitsoberflächen.
Von
L. Karczag und P. Roboz.
(Aus der III. medizinischen Klinik der k. ungar. Universität in Budapest.)
(Eingegangen am 25. Juni 1925.)
Es gibt eine Reihe von Substanzen, welche, auf die Wasserober-
fläche gestreut, Tanzbewegungen ausführen; außer dem Campher hat
Geppert mehrere Substanzen angegeben, welche auf der Wasserober-
fläche Tanzbewegungen ausführen: buttersaures Natrium, Chloral-
hydrat, Phenol, Antipyrin, Menthol, Thymol, salzsaures Chinin,
schwefelsaures Atropin, Acetanilid, Sulfonal, Dionin, frisch gefälltes
Chinin, Phthalsäure. Frische Präparate tanzen stark, ältere überhaupt
nicht.
Wir haben eine lange Reihe von Substanzen auf die Wasserober-
fläche einer Petrischale gestreut und beobachteten nun die sich ein-
stellenden Bewegungserscheinungen. Unsere Versuche betreffen die
Bewegungserscheinungen ohne Gestaltveränderung, und zwar l. auf
der Scheidefläche von Luft und Wasser sowie anderer Flüssigkeiten
als Dielektrika, 2. auf der Scheidefläche zweier flüssiger dielektrischer
Medien.
Die Bewegungserscheinungen konnten im allgemeinen in zwei
Haupttypen geschieden werden:
l. in den kinetischen Typus ohne Ordnungsformen, bei denen die
Substanzen Rotationsbewegungen ausführen, welche denjenigen der
Kokken, Spirillen, Bazillen unter dem Mikroskop ähnlich sind;
2. in den statischen Typus, welchen Ordnungsfiguren aufweisen,
bei denen die Bewegungen nach einer bestimmten Zeit still (bzw. fast
still) stehen und bei denen die aufgestreuten Substanzen einen be-
stimmten, konstant sich wiederholenden Ordnungstypus darstellen.
Als eine gesonderte Gruppe von Substanzen können diejenigen
betrachtet werden, welche nach Aufstreuen auf die Wasseroberfläche
zu Boden sinken. Diese Substanzen nennen wir deszendierende Sub-
stanzen. Streut man also die verschiedenen Substanzen auf die Wasser-
oberfläche einer Petrischale, so erweisen sich diese Substanzen
23
Kinetische Erscheinungen usw.
L. Karczag u. P. Roboz:
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24 L. Karczag u. P. Roboz:
Tabelle II.
Anorganische Substanzen.
1. Metalle und Metalloide in fein- und grobeenulverter Form.
——_—————
Zentrifugaler EEE Deszendierende
ee e Zentripetaler Ordnungstypus Kinetisch Substanzen
Arsenium metallicum
Aluminium (Spähne)
Kupfer
PILLE a En En 170
j
PILI ET]
LIPPI En En 1100
Tabelle Ill.
Anorganische Substanzen.
2. Anorganische Verbindungen.
en ler Zentripetaler Ordnungstypus Kinetisch Deszendierende Substanzen
Ammoniumsulfat
Ammoniumbromat
Ammoniumoxalat
Ammoniumchlorid
Ammoniumrhodanid
Ammoniumnitrat
Ammoniumbichromat
Bariumsulfat
Bariumchlorid
Acidum arsenicum
Calciumchlorid
Calciumcarbonat
Ferrisulfat
Kaliumchlorid
Kaliumnitrat
Kaliumbromid
Kaliumphosphat
Kal. stib. tartarat
Kaliumjodid
Kal. al. sulfat
Lithiumcarbonat
Lithiumchlorid
Natriumnitrat
Natriumbromat
Natriumfluorid
Natriumsulfat
Natriumtellurat
Natriumbicarbonat
Kaolin Ac. boricum
Talcum Calomel
Cupr. oxyd. nigr.
Hydr. oxydul.
Magn. carbonat.
Plumb. carbonat.
Bism. subgallic.
Plumb. oxalicum
Mennige
Natriumoxalat
re
Kinetische Erscheinungen an Flüssigkeitsoberflächen. 25
als der einen oder anderen Gruppe angehörig, wobei bemerkt werden
soll, daß für das Gelingen der Versuche — und dies wurde schon von
Geppert betont — Reinheit des benutzten destillierten Wassers bzw.
dessen Oberfläche, Reinheit des benutzten Gefäßes und chemische
Reinheit der Substanzen erforderlich ist. Es muß auch darauf geachtet
werden, daß die Petrischalen keinen Luftströmungen ausgesetzt werden,
da durch die einseitige Abkühlung entstehende Kühlströme störend
einwirken.
Aus den Tabellen sind folgende Hauptergebnisse der Streu-
versuche zu ersehen.
1. Kinetische Substanzen befinden sich nur unter den organischen
Substanzen.
2. Die organischen Substanzen können die verschiedensten Typen
aufweisen, wogegen sich die anorganischen Verbindungen vornehmlich
deszendierend verhalten und die Metalle und Metalloide ausschließlich
eine Zugehörigkeit zum zentripetalen Ordnungstypus aufweisen.
Um die Natur der kinetischen Bewegungserscheinungen näher
kennenzulernen, haben wir die kinetischen Erscheinungen durch
Aufstreuen der verschiedensten Substanzen zu beeinflussen gesucht.
Geprüft wurde die Beeinflußbarkeit der Bewegungen von Paratoluidin,
Vanillin, Orcin, Naphthol.
Zunächst wurden organische Substanzen geprüft. Es zeigte sich,
daß nur Substanzen von zentrifugalem Ordnungstypus zu hemmen im-
stande sind: Aleuronat, Casein, Diastase, Inulin, Nuclein, Pepsin, Pepton,
Glykogen, Pulv. gummi arabicum, Papayotin, Ricin. Als Ausnahmen
sind zu nennen: Acidum gallicum, Protocatechusäure, Theobromin. —
Die Substanzen vom zentripetalen Ordnungstypus hemmen nicht die
kinetischen, beeinflussen sich im Ablauf der Anfangserscheinungen gegen-
seitig nicht, die deszendierenden Substanzen hemmen die Bewegungen
ebenfalls nicht. `
Sodann kamen die anorganischen Substanzen zur Verwendung; weder
die Metalle und Metalloide in Pulverform, noch die anorganischen Ver-
bindungen beeinflußten die kinetischen Erscheinungen.
Es gingen also aus den Versuchen folgende Hauptergebnisse hervor:
l. Die kinetischen Bewegungen werden durch anorganische Sub-
stanzen nicht beeinflußt.
2. Die Hemmungsstoffe sind unter den organischen zu finden,
und par excellence lassen sich diese unter denjenigen mit zentrifugalem
Ordnungstypus finden.
Bewegungserscheinungen in verschiedenen dielektrischen Medien.
Wir streuten in diesen Versuchen die Substanzen anstatt auf
Wasseroberflächen, auf diejenige von anderen flüssigen dielektrischen
Medien, welche sich in den peinlich gereinigten Petrischalen befanden.
26 L. Karczag u. P. Roboz:
Versuche mit Anilinól. DK = 7,2.
Substanz | en | Veränderung
Casein zentrifugal assoziiert und sinkt nieder
Orcin kinetisch sinkt nieder
Schwefelblume zentripetal assoziiert und haftet an der Oberfläche
Versuche mit Olivenöl. DK = 3,0.
Casein zentrifugal assoziiert und sinkt langsam nieder
. Orcin kinetisch assoziiert und sinkt sofort nieder
Flor. sulf. zentripetal einkt langsam nieder
Versuche mit Paraffinöl. DK = 2,1.
Casein zentrifugal assoziiert und sinkt nieder
Orcin kinetisch sinkt nieder
Flor. sulf. zentripetal assoziiert und sinkt nieder
Pepton zentrifugal immobil
Versuche mit Äther. DK = 4,3.
Casein zentrifugal sinkt nieder
Pepton = assoziiert und rinkt nieder
Flor. sulf. zentripetal sinkt nieder
Natr. salicyl. kinetisch 5 j
Paratoluidin © e Se
Vanillin = E E
Orcin 3 S A
Versuche mit Alkohol. DK = 2,6.
Casein zentrifugal | sinkt nieder
Flor. sulf. zentripetal e
Orcin kinetisch S u
Paratoluidin e $ £
Natr. salicyl. © Bi a
Pepton zentrifugal | s S
Versuche mit Chloroform. DK = 5,02..
Casein zentrifugal assoziiert
Pepton 2 assoziiert und bleibt an Oberfläche
Orcin kinetisch assoziiert
Schwefelblume zentripetal sinkt nieder
Versuche mit Terpentinöl. DK = 2,23.
Casein zentrifugal sinkt sofort nieder
Orcin kinetisch deszendierend
Natr. salicyl. 7 e
Paratoluidin A A
Pepten zentrifugal assoziiert und sinkt nieder
Versuche mit Toluol. DK = 2,3.
Orcin kinetisch sinkt nieder
Natr. salicyl. 2 deszendierend
Paratoluidin S sinkt nieder
Pepton zentrifugal assoziiert und sinkt nieder
Kinetische Erscheinungen an Flüssigkeitsoberflächen. 27
Diese Versuche lehren, daß
1. an den Oberflächen der geprüften dielektrischen Medien, welche
eine geringere DK als Wasser besitzen, eine sehr starke Bewegungs-
hemmung aller typischen Vertreter stattfindet,
2. die zentrifugale Bewegung vieler Substanzen auf Wasser eine
Umkehr des Ordnungstypus aufweisen, und schließlich
3. viele zentrifugale und kinetische Substanzen wie inerte Körper
immobil auf der Oberfläche des Dielektrikums kürzer oder länger ver-
harren, um sich nachher zu Boden des Gefäßes zu senken.
Die beschriebenen Versuche dürften auf den Einfluß der DK,
welcher außer der Umkehr der Bewegungsrichtung und dem Ordnungs-
typus in dem Assoziationsvermögen der dielektrischen Oberflächen
mit abnehmender DK bestehen könnte, hinweisen.
Bewegungserscheinungen an der Oberfläche zweier flüssiger
dielektrischer Medien.
Die Bewegungserscheinungen gehen auch dann vor sich, falls
anstatt des dielektrischen Systems Wasser— Luft, zwei flüssige dielek-
trische Medien gewählt werden. Man muß natürlich bei Ausführung
der Versuche darauf bedacht sein, daß die Substanz in keiner der beiden
Phasen ein schnelles Auflösungsvermögen zeigt. Es erweist sich als
ein lehrreiches System Toluol und Wasser bzw. Xylol und Wasser,
welche in einen mittelweiten Becherglas übereinandergeschichtet
werden. Zur besseren Sichtbarmachung kann auf das Toluol Schwefel-
pulver gestreut werden, welches schnell bis zur Grenzfläche sinkt und
sich nach dem bekannten Ordnungstypus ausbreitet. Sodann streut
man verschiedene kinetische Substanzen auf: Paratoluidin, Vanillin,
Orcin, welche ebenfalls sofort bis zur Grenzfláche sinken und dort
plötzlich die Bewegungen so wuchtig beginnen, daß die Schwefelschicht
auseinandergesprengt und aufgewirbelt wird. Dieser Versuch demon-
striert besonders schön die kolossale Bewegungsenergie der kinetischen
Substanzen und zeigt zugleich, daß auch auf inneren Grenzflächen
zweier flüssiger dielektrischer Medien ohne Rücksicht auf den hydro-
statischen Druck kinetische Erscheinungen mit unveränderter Energie
zustandekommen, ebenso wie auf der Grenzfläche Wasser— Luft.
Kataphoreseversuche an pathologischen Organen. I.
Von
L. Karczag und G. v. Farkas.
(Aus der III. medizinischen Klinik der k. ungar. Universität in Budapest.)
(Eingegangen am 25. Juni 1925.)
Es haben bereits unsere Versuche über die Messung der elektro-
statischen Ladungen von gesunden und pathologischen Zellen und
Geweben mit Hilfe der Vitalchemoskopie ergeben, daß wir überall im
Organismus ausschließlich negativen elektrostatischen Ladungen be-
gegnen, und daß positive weder nach dem Tode noch unter den ver-
schiedensten entzündlichen, nekrobiotischen und nekrotischen Prozessen
aufzufinden sind. Es ist also im absoluten Sinne von einer Umladung
der Kolloide im Tierkörper keine Rede, eine Umladung der Organ-
kolloide kommt nie zustande.
So haben wir an den Nierenelementen künstlich tiefgreifende patho-
logische Veränderungen hervorgerufen, um die mikroskopischen Kennzeichen
der pathologischen Zellpotentiale zu studieren. Es genügte für uns zu
diesem Zwecke die Erzeugung einer schweren Nierenentzündung mit
Uran und Chromsalzen. Wir hielten uns, was die experimentelle Technik
` anbelangt, im allgemeinen an die Versuche Kiyonos aus Aschoffs Institut.
| Unsere Versuche zeigten nach erfolgter Vitalchemoskopie, daß die
Nekrose der Nierenepithelien die stärkste Potentialabnahme verursacht, welche
noch größer ist als die Potentialabnahme durch den Tod bei normalen
Tieren. Bei pathologisch unveränderter Niere wurde nie eine Kernfärbung
der Nierenepithelien beobachtet; diese traten erst in den nekrotisierten
Zellen auf. Die Zellkerne besitzen, falle keine pathologisch-histologischen
Veränderungen der Zellen vorhanden sind, auch kurz nach dem Tode
starke negative Ladungen, welche jedoch verschwinden, falls die Zelle
früher der Nekrose anheimgefallen ist.
Ein anderes Kennzeichen der Nekrose ist die stark erhöhte Carbinolo-
tropie der Nierentubuli, welche solche Grade annimmt, wie sie ebenfalls
unter postmortalen Verhältnissen bei höchstem Sauerstoffschwund zu
beobachten sind.
Das Potential der nekrotisierten Zellen fällt nicht zu tief unterhalb das-
jenige der Sulfosäuren, weil eine stärkere Abnahme zu einer spontanen
Regeneration der Carbinole führen müßte, was jedoch nie beobachtet.
werden konnte.
L. Karczag u. G. v. Farkas: Kataphoreseversuche usw. I. 29
Von den experimentell erzeugbaren pathologischen Zuständen des
Bindegewebes wandten wir uns sodann der künstlichen Amyloidose zu.
Wir bedienten uns der Methodik Kuczynskis, welche in einer mehrere
Wochen lang fortgesetzten subkutanen Zufuhr einer Nutroselösung besteht.
Wir haben sodann an künstlich mit Tuberkulose infizierten Meer-
schweinchen die elektrostatischen Ladungsverhältnisse des tuberkulösen
Granulationsgewebes studiert und haben nach erfolgter Vitalchemoskopie
feststellen können, daß die zelligen Elemente durch die Nekrose eine
Potentialabnahme erleiden, wodurch sie zur Aufnahme der Carbinole im
hohen Grade befähigt werden. Die Chemoskopie des tuberkulösen Gewebes
zeigte also in Anbetracht seines durch die Nekrobiose bedingten chemischen
Verhaltens, daß die elektrostatische Ladung der nicht nekrotisierten Teile
eine wesentlich höhere ist als die der nekrotisierten.
Die Makrophagen bzw. die Epitheloidzellen Goldmanns besitzen eine
andere, und zwar geringere elektrostatische Ladung als die hämatogen-
zelligen Elemente des Tuberculums, welche selbst stärker negativ als die
Sulfosäuren geladen sind. Frische Lymphozytärtuberkel zeigen dem-
entsprechend keine vitale Carbinolotropie.
Schließlich haben wir auch an Carcinommäusen eine Vitalchemo-
skopie vorgenommen und festgestellt, daß die nekrotischen Anteile der
Tumoren eine große Carbinolophilie besitzen. Das Carcinomgewebe selbst
besitzt kein vitales Attraktionsvermögen für Carbinolbasen des Fuchsins S,
Lichtgrüns und Wasserblaus.
Die übrigen Befunde über die Potentiale der pathologischen Verände-
rungen haben wir an mehreren vereinzelten Versuchen festgestellt.
Die Ergebnisse dieser pathochemoskopischen Versuche sind in der
folgenden Tabelle zusammengestellt.
Sehr stark negativ | Stärker negativ | Mittelstark negativ | Schwach negativ
Tropfige Entmischung Sulfosäure- Nicht nekrotisierte
farbstoffe Nierenepithel-
Nekrotisierte zellen
Nierenepithelien
Fettige Degeneration
Trübe Schwellung
Akut entzündliches
Gewebe
Mäusecarcinomzellen | Amyloidde- | Nekrose des Mäuse-| Gewisse Nekrosen
generation | carcinoms der Mäusecar-
Hämatogene Elemente Nekrose des cinome
des Tuberkels Tuberkels Makrophagen und
Frisches Lymphozy- Hyalinde- Epitheloidzellen
tártuberkel generation Goldmanns
Eiter
Wir müssen bei diesen Versuchen als einen auffallenden Befund hervor-
heben, daß die Degenerationen trotz der tiefgreifenden chemischen und
kolloidchemischen Umwandlungen keine experimentell nachweisbare
Potentialabnahme zeigen. Als eine Ursache dieser Erscheinung könnte
das konstante Potential der Zelle beobachtet werden, welches die Zelle
unter allen Umständen aufrecht zu erhalten trachtet und bei dem die
degenerativen Prozesse ablaufen. Wichtige Anhaltspunkte sprachen dafür,
daß die Wasserstoffionenkonzentration des Milieus in der Aufrechterhaltung
a
30 L. Karczag u. G. v. Farkas:
des Zellpotentials eine wichtige Rolle spielt und daß wir diese als Potential-
regulierung und erhaltenden Faktor betrachten müssen!).
Unterwerfen wir die verschiedensten frischen und feinverriebenen
Organe von getöteten Tieren einer Kataphorese, so beobachten wir,
daß sie alle die bereits bekannte anodische Konvektion aufweisen. Es
ist uns nicht bekannt, ob Versuche diesbezüglich mit pathologischen
menschlichen Organen vorgenommen wurden. Da diese Organe erst
im Stadium einer postmortalen Säuerung und oft sogar 3 bis 4 Tage
nach erfolgtem Tode des Patienten aus den Leichen gewonnen werden
können, so bieten sie die extremsten Verhältnisse zur Untersuchung
der Frage, ob der Wanderungssinn der pathologisch betroffenen Organe
eine kathaphoretische Richtungsänderung erleidet. In folgender Tabelle
Suspension | Na Cl H,O
Aörtenwand.: e A ta RE we Bi f —
Lunge, ödematös ...... d O | =
Lunge, ind. brunca . . s.s s s s s ss eso —
Gehirn, ödematös . . 2 2 s e s e s s s o s eo | -=
Leber, indur. cvanoticAa . . 2: 2 e e a a | —
Niere, indur. cyanotica . 2 2 2 2 . . . .« ee | =
Leber. deg. adiposa . . . » 2: 2 222.00. . | —
Leber, indur. brunea . ............ | —
Herz, deg. parenth. . ......... .... A —
Herz, atrophia fusca. . . . . +... 2 e e e e | —
Milz, septisch . . ....... RE e e Ee ep —
Milz, atrophiseh . . ma mia e a a "ée 28 —
Lymphdrüsen, anthracotisch . . . . 2 e ee —
Niere, deg. adiposa . . 2 2 . v2 2 ern... | —
Aorta, atheromatös . . 2. es. BE aa re —
Aorta, selerotiech . . . 2 2 2 2 2 2 . en ne. | —
Leber, Chloroformnekrose . . . 2 2 2 2 2 2.02. | —
Nebenniere, nekrotisch. . . : 2... DA AS | —
Haemorrhagia cerebri . . . - e s 2 220200. ` —
GlomerulonephritiS . . 2 2 2 2 2 2 2 2 een. | —
Pneumonia hypostatica . . 2 2 . .... .. . o. | —
Pneumonia caseosa . . . 2 222er. | —
Tbe. pulmonum ......-. . da eet Ga —
Lymphknotentuberkuloso . . 22 222200. | —
Lymphknotentuberkulose, kúsig . . . . . .. +. i —
Carcinoma ventriculi. . . 2 22.220. DEE —
Carcinoma metast. im Gehirn . ........ | — =
Carcinoma metast., käsig e ne’ ' —
Carcinoma uteri . ee sos soe 000 e o | =
Carcinoma uteri Lungenmet.. ......... | — —
Carcinoma hepatiS. . . 2.2... > e ee dd I —
1) L. Karezag und L. Paunz, Zeitschr. f. klin. Med. 98, H. 5/6, 1924;
L. Karczag, L. Teschler und L. Barok, Zeitschr. f. Krebsforschung 21, H. 4,
1924; L. Karczag und L. Barok, Beitr. z. Klin. d. Tuberkulose 60, H. 2,
1924; L. Karczag, L. Paunz und L. Németh, Zeitschr. f. d. ges. exper. Med.
41, H. 1/3, 1924; L. Karczag, L. Paunz und N. Zilahy, ebendaselbst 41,
H. 1/3, 1924; L. Karczag, L. Paunz und P. Roboz, ebendaselbst 41, H. 13,
1924; L. Karczag, L. Paunz und G. Barok, ebendaselbst 41, H. 1/3, 1924.
Kataphoreseversuche an pathologischen Organen. I. 31
sind unsere Versuchsresultate zusammengestellt, wozu bemerkt werden
soll, daß der benutzte Kataphoresenapparat dem von Szent-Györgyi
empfohlenen entsprach, und daß die Organemulsionen sofort nach der
Sektion durch Verreiben derselben in einem Porzellanmörser (falls
nötig mit gewaschenem Sand) hergestellt wurden.
Zusammenfassung.
Es ist also aus den Versuchen eindeutig zu konstatieren, daß
l. weder postmortale autolytische, Fäulnisprozesse usw. imstande
sind, den Ladungssinn von Zell- und Gewebskolloiden zu ändern,
2. kein pathologischer, entzündlicher, nekrobiotischer oder nekro-
tischer Prozeß imstande ist, eine Umladung der Organkolloide zu
bewirken,
3. die Versuche die von uns bereits aufgestellte These bekräftigten,
daß pathologische Vorgänge nur Änderung der negativen Potentiale
hervorrufen, nie aber einen Wechsel des Ladungssinns.
Untersuchungen über Fett-Cholesterinmengen im Blute
bei Adipositas und Myxódem.
Von
H. I. Bing und H. Heckscher.
(Mitteilung aus der II. Abteilung des Kommunehospitals und aus dem
Blegdamshospital, Kopenhagen, Dänemark.)
(Eingegangen am 25. Juni 1925.)
Wir haben früher (1) (2) gezeigt, daß die Fett-Cholesterinmengen,
d. h. der primäre Ätherextrakt, im Blute von Patienten mit morbus
Basedowii niedrig sind, und daß die Werte steigen, wenn sich der Zustand
der Patienten infolge medizinischer oder chirurgischer Behandlung
bessert. Außerdem hat Heckscher (3) darauf aufmerksam gemacht,
daß Thyreoidektomie den Fett-Cholesteringehalt des Blutes bei Pferden
vergrößert. Wir haben auch (1) zeigen können, daß die Ätherextrakt-
menge bei Adipositaspatienten durch Behandlung mit Thyreoidin er-
niedrigt wird, wenn diese vorher erhöht war. Dieser letzte Befund hat
sich uns nach dem Erscheinen unserer ersten Mitteilung an einer Reihe
von Fällen bestätigt. Doch findet man nicht immer einen vermehrten
Fett-Cholesteringehalt bei Adipositas, bei gut der Hälfte unserer Fälle
sind die Werte normal. Unsere Untersuchungen hierüber sind jedoch
noch nicht so weit fortgeschritten, als daß es uns möglich ist, bestimmte
klinisch-charakteristische Gruppen aufzustellen, wenn dies auch
vielleicht später möglich werden wird.
Die erwähnte Einwirkung von Thyreoidin auf die Extraktmenge
des Blutes bei Adipositas haben wir also wieder festzustellen Ge-
legenheit gehabt. Wir möchten hierfür ein Beispiel anführen:
Adipositaspatient, A. A. T. H. H., 2, 48 Jahre alt (204/24). Diagnose:
Adipositas dolorosa, Klimakterium. In der II. medizinischen Abteilung des
Kommunehospitals vom 19. Februar bis zum 16. April 1924 behandelt.
Früher immer gesund. Vom 16. Jahre an menstruiert, früher immer regel-
mäßig. Einmal Abort, vier normal verlaufene Schwangerschaften, die
letzte vor 12 Jahren. In dem letzten halben Jahre längere Zwischenräume
zwischen den einzelnen Menstruationsperioden und während derselben
H. I. Bing u. H. Heckscher: Fett-Cholesterinmengen im Blute usw. 33
schwächere Blutungen als gewöhnlich. Begann r.ach dem letzten Partus
sehr fett zu werden, doch ist die Fettleibigkeit erst in den allerletzten
Jahren so außergewöhnlich geworden. Während mehrerer Jahre chronische
Diarrhöea. In den letzten Monaten einzelne plötzliche nächtliche Anfälle
von Atemnot und Kurzatmigkeit, Cyanose und Herzklopfen. Obj. Ist
kolossal fett, mit großem, hängendem Abdomen. Größe 159 cm, Gewicht
122,6kg, Haut und Haar normal, reichlicher Schweiß, kein Zeichen von
Myxödem. Stethoskopie normal, kein objektives Zeichen von Herz-
insuffizienz. W.-R. und ER negativ.
|
Fetts
Datum Gewicht eek m Kost Medikamente Bemerkungen
|| kg Proz |
11
am | 1226 ou Las g Milch | Lebhaft und
23. II. | 0.11 | | natürlich
25.1I. || 120,7 0,12 | | 300 g Gemüse, |
26. TI. 0,12 | 20 g Butter, |
27.11. 0,14! | Kaffee und Tee |
28.11. | 009 | |
29. 11. | | | in? 100 g Brot, |
L ITI. | | AH 100 g Fleisch
3, IIl. | | 0141 | 20 g Butter Thyreoidin 4 Einheiten
| täglich |
4, III. | 118,6 | 0,11 | Ohne Brot, Sepon. Thyreoidin
6, III | 0,131 || 200g Gemüse Thyreoidin 4 Einheiten
8. IlI 0.16! 4 8 | Blutzucker
9. ÍI. | | 0,183! er u: 0,095 Proz.
10,111. | 118,7 0,13! e _ a
11, ITI | 013! 8 A S re a
12, ITI 0,11 A + 2 o
13. TTE. | 0,08 e el 2 e EE
14. TIT. | ou „Entfettungsk ost“, 8
7 600—800 Kalorien A 4
15. IIJ. | |- 0,08 Gaich e É. 2
16. ITI. | 1183 | 0,11 a. KL 98
17, ITI. | ou dx ffr
18. ITI. | 117,1 0,09 p O g
19, TIL | 0,08 ur é
20. III. | 115,7 0,05 * Br 15
21. III. 0,07 > - ES |
22, III. 0,07*) 4 $ ` |
25. III. 0,07 5 S a |
26. ITI. | 1130 | 0/05 | > E: og
27. III. 004 | ”» 8 y
29, III. 0,09 a A
30. ITI. 0,04 a $
1. IV. 111,4 0,09 y, 8
3. IV. 0,07 - Sepon. Thyreoidia
8. IV. 110,5 0,09
10. IV. | 0.09
12. IV, 110,8 | 0,09
14. IV. | 1108 | 0,09**)
15. IV, | 0,11
16. IV, | 0,18!
22. IV. || 0,08
*) (Funktionsprobe: 0,07, 0,12, 0,14, 0,14, 0,14, 0,17, 007.
+*+) (Funktionsprobe: 0,09, 0,10, 0,13, 0,13, 0,14, 0,13, 0,09),
Biochemische Zeitschrift Band 162. 3
34 H. 1. Bing u. H. Heckscher:
Man sieht, daß die Einwirkung des Thyreoidins sowohl auf das
Gewicht, wie auf die Fett-Cholesterinmenge unverkennbar war. Nach
dem initialen Gewichtsverlust, der vermutlich von dem Flüssigkeits-
verlust herrührte, hielt sich das Gewicht praktisch gesprochen vom
4. bis 16. März konstant, obgleich der Patient in dieser Zeit eine sehr
kalorienarme Kost (500 Kalorien täglich) bekam. Erst nachher, unter
dem Einfluß des Thyreoidins, fiel das Gewicht wieder und dies, obwohl
die tägliche Kalorienmenge bis auf 800 erhöht wurde. Nachdem die
Thyreoidindosierung eingestellt war, stockte der Gewichtsverlust. Die
Tabelle über die Fett-Cholesterinmengen zeigt deutlich die Wirkung
des Thyreoidins.
Im Anschluß an diese Beobachtungen haben wir untersucht, ob
sich auch bei einer anderen Krankheit, bei der die Extraktmenge
im Blute erhöht ist, bei Nephrose, eine Thyreoidinwirkung nach-
weisen läßt.
Wir behandelten einen Patienten, dessen Krankengeschichte wir
früher mitgeteilt haben (1) (den letzten der vier Nephrosepatienten, 1149/23),
ein achtjähriges kleines Mädchen, das eine reine Nephrose hatte, mit Thy-
reoidin in drei Reprisen. Hier wurde konstant ein Fett-Cholesteringehalt
von 0,90 bis 1,20 Proz., also eine sehr bedeutende Vermehrung (etwa zehnmal
mehr als bei Normalen) gefunden. Wir untersuchten sie mit wenigen Tagen
Zwischenraum über ein Jahr, von Oktober 1923 bis November 1924. Die
Werte variierten innerhalb sehr enger Grenzen. Zu drei verschiedenen
Zeitpunkten: 20. bis 23. November 1923, 1. bis 21. Januar und 3. April
bis 1. Mai 1924, bekam die Patientin Thyreoidin, in der ersten Periode
zwei Einheiten täglich, in der zweiten und dritten Periode bzw. vier und
acht Einheiten, also besonders große Dosen. Eine Wirkung auf die Fett-
Cholesterinmengen war nicht festzustellen, weder was die Höhe noch was
die täglichen Variationen anbetraf. Dasselbe galt übrigens sowohl für die
Ödeme als auch für ihren sonstigen Zustand, Diurese usw.
Diese verschiedenen Beobachtungen mußten uns natürlich dahin
führen, das Verhalten des Thyreoidins bei Myxódem aufzuklären,
und wir wollen hier das Resultat einiger Untersuchungen mitteilen, die
an drei Myzödempatienten vorgenommen wurden.
Die bisher in der Literatur vorliegenden Untersuchungen über
die Menge der ,,Fettstoffe'" im Blute bei Myxródempatienten sind
recht gering und spärlich. Das größte Interesse bieten gewiß die Ar-
beiten von Luden (4) und Blix (5). Der erste Autor teilt eine Reihe
gleichzeitiger Untersuchungen über den Standardstoffwechsel und
den Cholesteringehalt des Blutes bei einem Patienten mit, der mit
Thyroxin (Kendall) behandelt wurde. Vor der Behandlung betrug
der Cholesteringehalt 0,44 Proz., d.h. vier- bis fünfmal so groß als bei
Normalen, und der Standardstoffwechsel war um etwa 30 Proz. herab-
Fett-Cholesterinmengen im Blute bei Adipositas und Myxödem. 35
gesetzt. Am 3. Dezember 1917 wurden 15 mg Thyroxin gegeben; in
den darauf folgenden Tagen sank die Cholesterinmenge, während
der Standardstoffwechsel in gerader Linie erhöht wurde, so daß der
Cholesteringehalt am 10. und am 14. Dezember 0,10 bzw. 0,09 Proz.
(normale Werte) betrug, während die entsprechenden Werte für den
Stoffwechsel etwa 10 und 20 Proz. über der Norm lagen. Noch am
21. Dezember ist die Cholesterinmenge normal; der Standardstoff-
wechsel weist eine 5 Proz. über der Norm liegende Erhöhung auf. Blix
berichtet, daß er bei einem Myxödempatienten sowohl die Menge
des Neutralfettes als auch die Cholesterinmenge im Blute vergrößert
fand, d.h. 0,14 bis 0,17 Proz. Neutralfett und 0,16 bis 0,18 Proz.
Cholesterin, im ganzen also einen Fett-Cholsteringehalt von 0,30 bis
0,35 Proz.
Unsere eigenen Resultate sind folgende:
Myzxödempatient I, M. A. L., $, 32 Jahre alt. Im Blegdamshospital
vom 15. bis 22. März 1924 sowie in der II. medizinischen Abteilung des
Kommunehospitals vom 22. März bis 1. Juli 1924 (342/24) behandelt.
Als Kind und während des Wachstums gesund. Vom 13. Jahre an men-
struiert, mit vier normal verlaufenen Schwangerschaften vor 15, 13, 12
und 11 Jahren. Die drei ersten Kinder wurden gestillt, das letzte Kind
nicht, denn die letzte Geburt war mit großem Blutverlust verbunden
und durch Wochenfieber kompliziert. Seit der Zeit keine Menstruation
mehr. In der Zeit nach dieser letzten Geburt hat die Patientin an zu-
nehmender Müdigkeit, Abgestumpftheit, Gedächtnisschwäche und an
Appetitlosigkeit sehr gelitten. Ihr Aussehen hat sich sehr verändert, das
Gesicht ist aufgedunsen geworden, das Haar glanzlos, die Augenbrauen
und Pubes sind ausgefallen, und die Patientin hat aufgehört zu schwitzen.
Die letzten drei Jahre hat sie nicht arbeiten können. Wurde vom 12. No-
vember 1921 bis 31. Januar 1922 in der medizinischen Abteilung III des
Kommunehospitals unter der Diagnose: Myxödem behandelt, hat später
kein Thyreoidin bekommen. Wurde in das Blegdamshospital wegen eines
urticariellen Exanthems gebracht. Obj.: 15. März 1924: ist sehr stumpf,
gleichgültig, indolent, das Gedächtnis schwach, die Stimme meckernd,
die Sprache langsam. Die Hautfarbe gelblichbleich, wachsartig. Die Haut
überall, besonders jedoch im Gesicht und auf den Beinen teigartig infiltriert.
Das Kopfhaar glanzlos, aber nicht besonders dünn. Die Augenbrauen
fehlen ganz, die Augenhaare sind spärlich, keine Achselhaare, äußerst
wenige Pubeshaare. Die Haut ist überall trocken, an einzelnen Stellen
leicht schuppend. Glandula thyreoidea wird nicht gefühlt. Stethoskopia
normal. Abdomen und Glieder normal. Hämoglobin (Sahli) 86 Proz.
Erythrocytenzahl 35000000. Weiße Blutkörperchen 10000 (Neutrof.,
polynucl. 62 Proz., kleine mononucl. 33 Proz., große mononucl. 2 Proz.,
eosinif. 3 Proz.). Systolischer Blutdruck 99mm Hg. WR und ER.
negativ.
Dreimal wurde die Bestimmung des Ansteigens der Fett-Cholesterin-
menge im Blute nach dem Eingeben von Fett ausgeführt. (Funktions-
probe: der Patient ißt einen großen Zwieback nebst 5g Margarine und
trinkt dazu 3g Schlagsahne (d. h. 1g Milchfett) pro Kilogramm Körper-
9s
36
1. IV.
ORDINARIO o D D OO D E D S D On O RO m D oo nI O m
STREET NS
en
EE EE
51,8
53,5
46,0
H. I. Bing u. H. Heckscher:
fettfreie
N.arme
d. plena.
Name
d. plena.
Nsarme
d. plena.
| Standardstoffwechse!
— 35 Proz.
|
|
" Guter Appetit
Geringer Appetit
Standardstoffwechsel
z Proz.
|
| Gemütlich, froh
Leichtes Schwitzen
Tabl. Oophorini 1 x 2
n D 1 x 2
S „ 1x2
n „ 1x2
» „ 1x2
n DW l x 2
» „ 1x2
n n l x 2
n n 1 x 2
= e Beponat.
Thyreotdín 4 Einheiten |
n 4 n |
n Le
n 4 n
” 4 ”
n 4 ,
n 4 „
” 2 ”
n 2 e
n 2 ”
n 2 ,
n 4 n
n 4 e
n D ,
D 6 n
H 6 ”
n 6 n
n»n D e
” seponat
|
||
|
Standardstoffwechsel
+ 3 Pros.
Müde, liegt im Bette,
duselt, ißt wenig
Fett-Cholesterinmengen im Blute bei Adipositas und Myxódem. 37
2. VI. 45,3 0,08 d. plena, 150 g
Schlagsabne
extra
3, VI 0,08
4. VI 0,08
5. VI 0,07 Noch im Bette,
6. VI 0,06 duselt, ohn.A ppetit
7. VI. 0,08
9. VI. 45,4 0,08 Will nicht essen,
11. VI 0,171 schr abgespannt
12. VI. 0,12
13. VI. ` 0,18! Besserer Appetit,
14. VI. | 0,181 Bet: ist außer
16. VI. | 464 | 0,281 g
17. VI. 0,26! Ganz guter Appetit,
18. VI. 0,86! d. plena en m. besser
19. VI. i 0,41!
20. VI. 0,67! Standardstoffwechsel
21. VT. Thyreoidin 2 Einheiten || - 21! Proz.
22. VI. 47,2 a 2 Befindet sich wohl
23. VI. 0,831 > 2 „
24. VI. 0,821 S 2 A
25. VI. 0,14! e 2 o
27. VI. 0,131 i 2. 5
28. VI. 0,12 8 2: 5
29 VI. 0,11 | A 2 ,
30. VI. 45,8 0,11 | N 2 ý
1. VII. 0,10 | S 2 » Objekt mehr normal
| | als früher
gewicht. Die Blutproben werden nach 1, 2, 3 usw. bis 6 Stunden nach dem
Eingeben der Nahrungsmittel entnommen.)
| | Stunden nach der Mahlzeit
Datum | Fastend | 1 5 | 6
| l Fett.Cholesterinmenge in Proz.
Im as pas = S PA e AA nn ee
EE el |
17. III. j 012 | — = 0,23 = 039 | 0,28
22.IV. | 030 | oan | 023 0,23 0,31 033 | 034
17. V. | 011 | 012 0,15 0,27 0.21 0,31 0,22
Myzödempatient II, H. K.C., 2, 57 Jahre alt (5/24). Soll gesund
und ganz normal im Kindesalter, während des Wachstums und bis zu
ihrem 30. Lebensjahre gewesen sein, wo Menostase eintrat. Allerdings
niemals schwanger gewesen. Mit 21 Jahren mit Syphilis infiziert, bekam
eine ungenügende Behandlung, im ganzen nur 60 Schmierkuren. Die
anamnestischen Auskünfte sind durchweg sehr mangelhaft; man weiß
nicht recht, wann und wie ihr Myzödem sich entwickelt hat. Die letzten
10 Jahre hat sie beinahe ständig in Krankenhäusern oder im Siechenhause
zugebracht, hat nur ein vereinzeltes Mal und dann nur während eines
kürzeren Zeitraums Thyreoidin bekommen. Wird am 2. November 1924
38 H. I. Bing u. H. Heckscher:
in die Abteilung VI für Nerven- und Geisteskrankheiten des Kommune-
hospitals gebracht. War dort sehr still, schlaff, deprimiert und hat vielleicht
etwas halluziniert. Ihr Äußeres war für eine ältere, magere Myxödem-
patientin ganz typisch. Glandula thyreoidea nicht zu fühlen. W.-R. und
E.-R. negativ. Standardstoffwechsel vor der Thyreoidinbehandlung
27 Proz. unter der Norm.
28. XL Thyreoidin 12 Einb. täglich |
12. XII. Sepon. Thyreoidin Abgespannt, debil, mit Übelkeit,
22. XII. 0,05 j appetitios
24. XII 0,08
1924
4. I. 49,3 0,05 |
6.1. 0,06 Sehr debil, duselt
7.1. 49,5 0,04 Übelkeit, Erbrechen
8.1. 0,06 Thyreoidin 4 Einh. täglich || Etwas besser
11.1. 0,07 a 4 „ >
14.1. 48,6 0,09 2 4 „
15.1. | 0,05 = d. » || Mehr lebendig
16.1. | 0,06 N H , a
17.1. | 0,11*)
19. 1. l 0,11 Sepon. Thyreoidin Deprimiert, weinend
21.1. | 476 0,04 Schwermütig, halluziniert
23.1. | 0,06
28.1. | 0,05
29. I. | 48,0 0,08**)
30.1. 0,08 ' Ihr AuBeres mehr myxódematós
1. TI. 0,06 Thyreoidin 4 Einh. täglich
3. II. 0,08 S 4 „ e
4. IT. 47,9 0,08 = 4 „ 3
5I | 0,04 MERA:
7. II. | 0,09 Sepon. Thyreoidin | Verwirrt, halluziniert, weinend
11.11. : 48,0 0,161
en: elt | Pe,
18. II. 0,10 À Thyreoidin Gebees wird ES
13.XT. | 0,161 | In neun Monaten kein Thyreoidin
21. XI. | 0,12 | bekommen
e) (Funktionsprobe: 0,11, 0,11, 0,11, 0,11, 0,12, 0,13, 0,09).
++) (Funktionsprobe: 0,08, 0,09, 0,12, 0,12, 0,17, 0,13, 0,12).
Myzxödempatient III, A. L., O, 4 Jahre alt (XCV). In der Abteilung G
für Kinderkrankheiten des Rigshospitals vom 20. November 1924 bis
9. März 1925 behandelt. Diagnose: Myzoedema congenita, Hernia umbili-
calis, Prolapsus recti. Ist das siebente von acht Geschwistern und das
letzte Zwillingskind. Die anderen Kinder nebst Eltern lebend und gesund.
Bereits als Säugling in der Entwicklung, mit dem Zwillingsbruder ver-
glichen, zurückgeblieben. Im Alter von 4 Monaten begann die Zunge aus
dem Munde herauszuhängen. Die Haut ist immer sehr trocken gewesen.
Guter Appetit. Muß noch gepäppelt werden. Stuhlgang immer träge.
Rectalprolapsus im letzten halben Jahr. Kann weder gehen noch stehen.
Objekt: Kopfumfang 50cm, Brustumfang 52,5cm, Unterleibsumfang 50 cm,
Fett-Cholesterinmengen im Blute bei Adipositas und Myxödem.
39
1925
. II.
. ITI.
EETTISET E
|
|
12,8
12,3
12,3
12,5
12,2
12,2
Bemerkungen
Gemischte
Sehr fettreiche
(Butter, Sahne)
Fettarme
(Buttermilch)
Gemischte. (Dies
selbe bis zu Ende
der Behandlung)
Thyreoidin 2 Einh. tägl.
n n n || Pulsfrequenz 115
Pulsfrequenz 130, mehr
lebendig als früher,
Zunge kleiner
Pulsfrequenz 105,
schwitzt, dieHaut nicht
so kühl wie früber
n n
Sepon. Thyreoidin
Pulsfrequenz 75, schwitzt
weniger
Pulsfrequenz W
Pulsfrequenz 90, gemütl.,
lebendig
Pulsfrequenz 80, spielt
|
| Pulstrequenz 90, ist wies
| Thyreoidin 2 Einh. tägl.| ce e Aa
n Za n | Zunge größer
n 2 n n
g i ” TV Pulzfrequenz 130, ist
zfrequenz 130, un»
á 1 ” TJ ruhig m. stärk. Schwitz.
D n n
1 Pulsfrequenz 120, Zunge
, DA kleiner, i.mehrlebendi
” ” n
P Lo a | Pulsfrequenz 108
2 a | Die Besserung aufgehalt.
Übelkeit, Erbrechen,
Sepon. Thyreoidin
schuppt überall
Thyreoidin !!, Einh.tägl.|| Pulsfrequenz 100
Pulsfrequenz 90
n 2 n n
` e e Pulsfrequenz 100
a SE Pulsfrequenz 100
9. III. Verträgt die Thyreoidindosis sehr gut, ist lebendig und spielt
gern, die Zunge ist noch ein wenig vergrößert, aber das typische
Myxödemaussehen ist sonst beinahe verschwunden. Wird nun nach Hause
geschickt, um die Thyreoidinbehandlung zu Hause fortzusetzen.
40 H. I. Bing u. H. Heckscher:
Länge 74cm, Spannweite 75cm, Gewicht 12550g. Aussehen typisch
myxödematös, das Gesicht aufgedunsen, der Mund wird durch die dicke,
geschwollene Zunge, die zwischen den Lippen heraushängt, offen gehalten.
Die Augenlider sind geschwollen, die Haut überall trocken und fein ge-
runzelt. Der Haarwuchs ganz gut. Viereckige Fontanella offen, etwa
zweimal 2 cm. Die Glieder plump und kurz. Keine Geschwulst der Glandula
thyreoidea. Brustorgane normal. Das Abdomen groß und aufgetrieben
mit einer etwa walnußgroßen Hernia umbilicalis. Beide Testes im Scrotum.
Bei der Röntgenuntersuchung des Handgelenks lassen sich weit geringere
Verknöcherungskerne als in diesem Alter normal konstatieren. Die Meta-
carpalknochen sind kurz und plump, die distalen Enden von Radius und
Ulna zeigen eine ungleiche Epiphysenlinie und eine leichte Verdickung in
der Knochenstruktur. Hämoglobin (Sahli) 60 Proz. v. Pirquets Reaktion
negativ.
, (Dem Direktor der Abteilung für Kinderkrankheiten des Rigshospitals,
Herrn Prof. Dr. C. E. Bloch, sprechen wir unseren besten Dank aus für
die Erlaubnis, den Patienten zu untersuchen und die Krankengeschichte
zu publizieren.)
Was die erste dieser Patienten anbetrifft, so sind die Verhältnisse
recht klar, sie ähneln im übrigen sehr denen bei dem Falle Luden’s.
Wir finden bis zum Anfang der Thyreoidindosierung Fett-Cholesterin-
werte, die zwischen 0,13 und 0,62 Proz. variieren, also konstante Ver-
mehrung. Der Grad dieser Vermehrung schwankt allerdings stark
zu den verschiedenen Zeitpunkten, aber dies kann vielleicht mit der
wechselnden Kost erklärt werden, denn die größten Werte wurden
dann gefunden, wenn reichliche Kost (auch an Fett), d. plena,
gegeben worden war, während die niedrigsten Werte einer ärmeren
Kost entsprechen. Etwas Sicheres läßt sich jedoch kaum darüber
sagen, dazu sind die einzelnen Diätphasen von zu kurzer Dauer, vielleicht
spielen auch andere Faktoren dabei eine Rolle. Doch bemerken wir
hier eine konstante und zeitweise recht bedeutende Vermehrung, die ver-
schwindet, sobald die Patientin Thyreoidin bekommt. 9 Tage nachdem
die Thyreoidinbehandlung begonnen wurde, werden die Werte normal,
und während der fortgesetzten Dosierung sinken die Werte immer
mehr, bis der niedrigste: 0,04 Proz. (d.h. ein abnorm niedriger) ge-
funden wird, zu einem Zeitpunkt, wo das Thyreoidin wegen drohender
Vergiftungssymptome seponiert ist. Danach steigen sie wieder, so
daß man 19 Tage nach dem Aufhören der Thyreoidindosierung wieder
abnorm vermehrte Werte findet. 7 Tage später ist der Wert der größte,
der überhaupt bei dieser Patientin gefunden wurde: 0,67 Proz. Be-
trachtet man die Angaben der Gewicht- und Stoffwechselzahlen an
den verschiedenen Zeitpunkten, so wird man auch hier die Wirkung
des Thyreoidins feststellen können.
Daß Schwierigkeiten bei den Untersuchungen wie den hier mit-
geteilten auftreten können, die von der prolongierten Wirkung des
Fett-Cholesterinmengen im Blute bei Adipositas und Myxödem. 41
Thyreoidins herrühren, ergibt sich, wenn wir die Verhältnisse bei der
anderen Myxödempatientin betrachten. Der erste und größte Teil der
Untersuchungen, die wir an dieser Patientin vorgenommen haben,
wurde bereits früher von uns veröffentlicht (1). Wir schrieben darüber:
„Bei ihr fanden wir wider Erwarten durchgehend niedrige Werte,
nur gegen Schluß der Kurve, nach Thyreoidinbehandlung in zwei
kürzeren Perioden, stiegen die Werte, so daß wir Vermehrung sowohl
der Fastenwerte als auch der alimentären Schwingungen fanden.“ Es
scheint, als ob wir, als dies geschrieben wurde, nicht vollauf die unseren
Untersuchungen vorausgehende, sehr kräftige Thyreoidinbehandlung
in Betracht gezogen haben. Es unterliegt für uns keinem Zweifel mehr,
daß die Patientin, als wir unsere Untersuchungen begannen, noch
unter einer sehr kräftigen Thyreoidineinwirkung stand, daß sie realiter
der Gegenstand für eine Hyperthyreose war, ähnlich der, die wir bei
der ersten Patientin im Zeitraum vom 25. Mai bis 9. Juni fanden.
Wenn wir auch bei der zweiten Patientin Gelegenheit gehabt hätten,
die Werte zu bestimmen, ehe die Thyreoidinbehandlung überhaupt
begonnen wurde, wären die Verhältnisse uns sicher klarer geworden.
Wir halten es für wahrscheinlich, daß die Werte, die wir dann gefunden
hätten, ebenso hoch gewesen sein würden wie die, die wir später, nach
einer thyreoidinfreien Periode von 9 Monaten gefunden haben (0,16!
und 0,12), d.h., daß wir wahrscheinlich auch damals eine (leichtere)
Vermehrung über das Normale hinaus hätten konstatieren können.
Dann würde sich ja auch die Thyreoidinwirkung unverkennbar gezeigt
haben. |
Diese Untersuchungen an der Patientin II sind gewiß von sehr
bedingtem Werte, und wir haben sie nur so ausführlich hier besprochen,
weil wir früher darüber etwas mitgeteilt haben.
Auch was den dritten Myxödempatienten anbetrifft, so sind die
Schwingungen nicht so groß wie bei der ersten. Doch kann man mit
einiger Sicherheit zwischen folgenden verschiedenen Perioden unter-
scheiden: 1. die Zeit bis zum 27. November, wo der Patient eine sehr
fettreiche Kost bekam und die Fett-Cholesterinmenge über das Normale
vergrößert war, 2. vom 27. November bis zum 2. Dezember, während
die Ernährung fettarm und die Werte niedriger (normal) waren, 3. der
Zeitraum vom 3. bis zum 29. Dezember, als die Werte unter dem Einfluß
des Thyreoidins bis zur niedrigsten Grenze des Normalen (0,06 Proz.)
fielen, um (nachdem die Thyreoidinwirkung schwächer wurde) wieder
etwas zu steigen, 4. die Zeit zwischen dem 29. Dezember und 21. Ja-
nuar, wo die Werte recht konstant in der Mitte der normalen Zone
gefunden wurden, und endlich 5. die Zeit danach, als die Werte unter
der Wirkung der erneuten Thyreoidinbehandlung wieder niedriger
wurden.
42 HL Bing u. H. Heckscher: Fett-Cholesterinmengen im Blute usw.
Aus diesen Untersuchungen glauben wir folgendes schließen zu
können:
1. Eine Vermehrung der Fett-Cholesterinwerte (des primären
Ätherextrakts) des Blutes war bei drei Myxödempatienten zu Zeit-
punkten nachweisbar, wo eine künstliche Thyreoidinwirkung aus-
geschlossen werden kann.
2. Der Grad der Vermehrung war sehr schwankend, sowohl unter
den verschiedenen Patienten als auch bei jedem einzelnen (Myxödem-
patient I).
3. Es scheint, als ob die Menge dieser Stoffe im Blute von dem
Fettgehalt der Nahrung abhängig ist.
4. Das Eingeben von Thyreoidin verringerte die Fett-Cholesterin-
werte des Blutes bei diesen Patienten. Eine Überdosierung, die klinische
Hyperthyreose hervorrief, verkleinerte die Werte in solchem Grade
daß subnormale Werte erreicht wurden, die sonst nur bei Morbus
Basedowii gefunden worden sind.
5. Die früher besprochene Wirkung von Thyreoidin auf die Fett.
Cholesterinmengen im Blute bei Adipositaspatienten ist durch spätere
Untersuchungen bestätigt worden.
6. Dagegen war keine Einwirkung des Thyreoidins auf die Fett-
Cholesterinwerte bei Nephrose nachweisbar.
(Thyreoideapräparat: Tablettae Glandulae Thyreoideae, ,,Medici-
nalco‘‘).
Literatur.
1) Bing und Heckscher, diese Zeitschr. 149, 90, 1924. — 2) Dieselben.
ebendaselbst 158, 403, 1925. — 3) H. Heckscher, ebendaselbst 158. 417.
1925. — 4) Luden, Coll. papers of the Mayo Clinic. 10, 429, 470. —
5) @. Blix, Studies on diabetic lipemia. Lund (Schweden) 1925.
Über den Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung
der Hefe.
Von
Otto Meyerhof.
(Aus dem Kaiser Wilhelm-Institut für Biologie in Berlin-Dahlem.)
(Eingegangen am 26. Juni 1925.)
Mit 5 Abbildungen im Text.
Inhalt.
Ha
A. Methodik . . . . . SA A e A da a E
B. Berechnung der Versuche. EE , . 48
II. Atmungs- und Gärungsversuche an serschiedenen Heferassen. . . 50
A. Versuche an Preßhefen. . . . . 22 2 +... . DU
B. Versuche mit Brauereiunterhefe . . . . 2.2.0. 55
C. Versuche mit obergáriger Brauereihefe und Weinhefe ae wn
D. Wilde Hefen . . . . . 59
E. Über den Stoffwechseltypus der verschiedenen Heferassen. . . 62
F. Umstimmung des Stoffwechseltypus . . . . +... +... Dé
III. Über den Mechanismus des Sauerstoffeinflusses . . . 67
IV. Besteht der Einfluß des Sauerstoffs auch bei der Gárung getöteten
Elter. Ce sta u EE E IE se a
Zusammenfassung . . 2 2 2 m m m rennen. 83
I. Einleitung.
Mit der berühmten These ,La fermentation est la vie sans air"
faßt Pasteur den Sinn seiner Gärungstheorie zusammen!). Kämpfte
er selbst noch um jedes Wort dieses inhaltsschweren Satzes, so gilt
für die Nachwelt unbestritten, daß die Gärung als Lebensprozeß der
Hefe und anderer Mikroorganismen anzusehen ist (wie schon Schwann
vor Pasteur entdeckte), daß sie zu ihrem Ablauf des Sauerstoffs der
Luft nicht bedarf und daß mit ihr als energieliefernder Reaktion Hefen
und Spaltpilze in Abwesenheit von Luft zu leben und zu wachsen ver-
mögen. Daß also die verschiedenen Gärungen anaerobe Atmungs-
prozesse sind, ist als ein gesicherter Besitz der Wissenschaft anzusehen.
1) Pasteur, Études sur la bière. Paris 1876.
44 O. Meyerhof:
Anders steht es mit der speziellen Ausgestaltung der Lehre, die Pasteur
ihr zu tieferer Begründung angedeihen ließ: die Abwesenheit des Sauer-
stoffs sollte die notwendige Bedingung für das Eintreten der Gärung
sein, während in Luft die Sauerstoffatmung alternierend hierfür ein-
träte. Dieser Zusammenhang aber sollte seinen letzten Grund in ein
und derselben Sauerstoffaffinität der Zelle haben: In Abwesenheit des
molekularen Sauerstoffs der Atmosphäre entreißt die Zelle ihn den
gelösten chemischen Verbindungen und oxydiert vermittelst der
Reduktion eines Teiles der Nährstoffmoleküle den anderen Teil. Wie
diese geistreiche Konzeption der Gärung als Oxydoreduktion wenigstens
für die alkoholische Gärung einen tiefen Sinn hat, haben die Forschungen
der späteren Zeit, wie z. B. die Feststellung, daß der Zuckerzerfall über
die sauerstoffreichere Brenztraubensäure führt!), zur Genüge gelehrt.
Wie steht es aber mit dem alternierenden Charakter der Gärung
als anaerober Atmung ? Daß gerade die alkoholische Gärung der Hefe,
die Gärung sot Zorn, auch in Gegenwart von Luft stattfinden kann,
war zu augenscheinlich, um von Pasteur übersehen oder geleugnet
werden zu können. Dieser Sachverhalt rief daher die hartnäckigsten
Anstrengungen des großen Forschers hervor, um ihn seiner These
gefügig zu machen. Er zeigte dafür insbesondere, daß für den Zuwachs
ein und derselben Hefemenge in Sauerstoff ein geringerer Aufwand
an Zucker und ein viel geringerer Gärungsumsatz nötig ist als in Stick-
stoff. Die Hefe wächst also in Sauerstoff besser. Indes werden wir
einer solchen Beweisführung, daß die ‚Arbeitsleistung‘ der Gärung
als eine von der Zeit unabhängige Größe aus dem Verhältnis des Hefe-
zuwachses zum Zuckerumsatz zu bestimmen sei, keinesfalls zustimmen
können. Welche Rolle der Sauerstoff auch für das Wachstum spielen
mag, so messen wir in der Größe des Stoffwechsels weder Arbeiten noch
Kräfte, sondern Geschwindigkeiten. Die Kritiker Pasteurs, vor allem
Schützenberger?) und Hans Buchner und Rapp?) sind also darin im
Recht, daß sie seine Beweisführung ablehnen und das Problem dahin
fassen, ob der Sauerstoff einen Einfluß auf die Gärgeschwindigkeit
einer gegebenen Hefemenge hat. Diese bestimmte Frage ist von den
letztgenannten Forschern ebenso bestimmt mit nein beantwortet
worden, und angesichts ihrer umfassenden Versuche könnte man
1) C. Neuberg und Karczag, diese Zeitschr. 36, 60, 1911.
2) La Fermentation. Paris 1875. Abdruck: London 1876.
3) Zeitschr. f. Biol. 87, 82, 1898; auch Zymasegärung, S. 350 (München
1903). Weitere Literatur hierzu: Nägeli, Theorie der Gárung 1879.; Gilta y
und Aberson, Jahrb. f. wiss. Bot. 26, 543, 1894; Chudiakow, Preuß. landw.
Jahrb. 23, 391, 1894. Die scheinbar im Sinne Pasteurs sprechenden Resultate
von Chudiakow an Brauereihefe sind von Buchner und Rapp als fehlerhaft
nachgewiesen.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 45
glauben, daß damit eine endgültige Antwort gefunden sei. In der Tat
sind die Resultate von Buchner und Rapp allgemein akzeptiert worden,
unabhängig von dem verwickelten Anpassungsphänomen, ob der Sauer-
stoff eine allmähliche Änderung der Heferasse im Sinne geringerer
Gärkraft und größerer Atmung herbeiführen könnte bzw. seine Ab-
wesenheit in umgekehrter Richtung wirksam seit).
Der Einfluß der Sauerstoffatmung auf die Milchsäurespaltung des
Zuckers, der sich mit außerordentlicher Regelmäßigkeit in allen darin
untersuchten Fällen ergeben hatte, veranlaßte mich jedoch, die Frage
einer erneuten Prüfung zu unterziehen. Nicht nur beim Muskel von
Kalt- und Warmblütern, bei den verschiedenen glykolysierenden
Säugetierorganen, auch bei der Milchsäuregärung der Bakterien hatte
sich gezeigt?), daß der Sauerstoff ein bestimmtes Vielfaches derjenigen
Menge Spaltprodukte, die er oxydieren könnte, zum Verschwinden
bringt, und zwar, wie für den Fall des Muskels jedenfalls mit Sicherheit
bewiesen werden konnte, durch Rückverwandlung der Milchsäure in
Kohlehydrat, also durch Rückgängigmachung des Spaltungsstoff-
wechsels. Es lag daher die Frage nahe, ob nicht die Sauerstoffatmung
auf die alkoholische Gärung des Zuckers den gleichen Einfluß hat.
Da es sich hier nicht um eine Wirkung der vorhandenen Sauerstoff-
konzentration, sondern um eine solche der Atmungsgröße auf die
Gärgeschwindigkeit handeln mußte, war sofort klar, daß die Versuche
von Buchner und Rapp nicht beweisend sein konnten. Die Atmungs-
größe der Brauereiunterhefe, mit der sie arbeiteten, ist nämlich im
Vergleich zur Gärung so außerordentlich klein, daß es mit den den
Autoren zur Verfügung stehenden Mitteln unmöglich gelingen konnte,
einen solchen Einfluß der Atmung, wenn er vorhanden war, an diesem
Objekt nachzuweisen. Obendrein aber haben sie die Atmung nicht
gemessen und zumeist die gebildete Kohlensäure ohne weiteres als
Gärungskohlensäure angesprochen. Da bei der Verbrennung von
1 Mol. Zucker 6, bei der Vergárung nur 2 Mol. Kohlensäure entstehen,
so würde sogar eine vollständige Gleichheit der Kohlensäure in beiden
Fällen bedeuten, daß weniger Zucker vergoren wäre. Doch sind die
Versuche der Autoren bei weitem nicht genau genug, um einen be-
stimmten Schluß in dieser Richtung zu ziehen; obendrein war die
Versuchsdauer viel zu lang. Denn der Einfluß der Atmung soll ein
unmittelbarer sein, während die im Verlaufe von Tagen hinzukommende
1) Zu dieser letzteren Frage siehe auch Hayduck und Haehn, diese
Zeitschr. 128, 587, 1922.
2) Zusammenfass. Ergebn. d. Physiol. 22, 328, 1923. Ferner
O. Meyerhof und H. E. Himwich, Pflügers Arch. 205, 415, 1924; Otto Warburg,
Posener und Negelein, diese Zeitschr. 152, 309, 1924; O. Meyerhof und
P. Finkle, Chemie der Zelle und Gewebe 19, 157, 1925.
46 O. Meyerhof:
nützliche oder schädliche Einwirkung des Sauerstoffs in Verbindung
mit dem Milieu, dem Nährmaterial usw. die Resultate verwischen muß.
Um ein wesentliches Ergebnis der folgenden Versuche vorweg-
zunehmen, so ergibt sich mit großer Genauigkeit, daß die Sauerstoff-
atmung auf die alkoholische Gärung des Zuckers ebenso einwirkt wie
auf die Milchsäurespaltung, und zwar nicht nur in qualitativer, sondern
auch quantitativer Übereinstimmung mit dieser. Dort waren auf
l oxydiertes Mol. Glucose (= 2 Mol. Milchsäure) etwa 3 bis 6 Mol.
Zucker am Zerfall verhindert bzw. aus Milchsäure wieder resynthetisiert
worden. Hier aber finden wir, daß auf 1 oxydiertes Mol. Glucose im Durch-
schnitt 3 bis 6 Mol. Zucker an der Gärung gehindert werden. Der Zahlen-
rückgängig gemachter Spaltungsstoffwechsel
E Oxydations-Stoffwechsel
ist also in beiden Fällen genau der gleiche. Und diese Gesetzmäßigkeit
ist unabhängig von dem Verhältnis der Atmungsgröße zur Gärungs-
wert des Verhältnisses
größe, das bei den verschiedenen von mir benutzten Heferassen um `
den 30fachen Betrag schwanken kann!).
In der folgenden Arbeit werden zunächst die Resultate an den
verschiedensten Heferassen mitgeteilt, die biologische Eigenart der
Kulturhefe im Gegensatz zu den natürlichen wilden Hefen aus ihrem
Stoffwechseltypus erklärt und schließlich der Mechanismus dieses
Zusammenhangs von Atmung und Gärung durch Versuche mit Inter-
mediärprodukten, sowie mit getöteter Hefe und Hefeextrakt klar-
zustellen versucht.
A. Methodik.
Da es sich im Verlauf der Arbeit als nötig herausstellte, möglichst
verschiedene Heferassen zu untersuchen, wurden die folgenden
verwandt:
käufliche obergärige Bäckerhefe (Wulff),
obergärige Brennerei-Preßhefe M und XII (Institut für Gárungs-
gewerbe),
obergärige Reinzucht-Bierhefe der Hochschulbrauerei,
untergärige Reinzucht-Bierhefe der Hochschulbrauerei,
untergärige Bierhefe der Tempelhof-Brauerei,
Weinhefe Winningen (Moselwein),
Weinhefe Steinberg (Rheinwein),
Mycoderma variabilis (Kahm-Hefe),
Torula (Mineralhefe).
Die letzten vier erhielt ich durch die Freundlichkeit von Herrn
Dr. Haehn aus dem Institut für Gárungsgewerbe. Die genannten
Brauerei-Reinzuchthefen, sowie Hefe M dienten ferner zur Herstellung
1) Dies ist bereits kurz von mir mitgeteilt in einem Vortrag vor der
Deutsch. chem. Ges. 29. April 1925; Chem. Ber. 58, 991, 1925, Heft 6 (Juni).
E Á
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 47
von Acetonhefe nach der Vorschrift von Buchner und Rapp!) sowie
zur Herstellung von Mazerationssaft nach Vorschrift von Lebedeff?).
Für die Messungen wurde eine abgewogene Hefemenge in der Zentrifuge
mehrmals in 1,5proz. KH,PO,-Lösung gewaschen und dann je nach dem
bestimmten Zweck entweder in reiner Kaliumphosphat- oder in Kalium-
phosphat-Traubenzuckerlösung auf ein bestimmtes Volumen aufgefüllt.
In einem aliquoten Teil der mit Glasperlen aufgeschüttelten Suspension
wurden dann Atmung und Gärung für den Zeitraum von %, bis 1 Stunde
bestimmt, entweder direkt oder nach Zusatz weiterer Substanzen.
Für die Hauptversuche wurde die Hefe in 2,5- bis 5proz. Traubenzucker-
Phosphatlösung (in einigen Fällen verdünnterer Traubenzucker) aufge-
schwemmt und in aliquoten Teilen Kohlensäurebildung in Stickstoff,
Kohlensáurebildung in Sauerstoff und Sauerstoffverbrauch für den Zeit-
raum von 30 oder 40 Minuten gemessen. Zur gleichzeitigen Messung von
Sauerstoffverbrauch und Kohlensäurebildung diente vielfach das von
Warburg kürzlich beschriebene Verfahren ‚Verbesserte Methode zur Messung
von Atmung und Glykolyse'* (Kástchenmethode)?), bei dem Sauerstoff
und Kohlensäure in zwei gleich beschickten Gefäßen, aber mit verschiedenen
Flüssigkeitsvolumina auf Grund der verschiedenen Löslichkeit beider Gase
bestimmt werden. Da in meinem Falle nicht wie bei der Glykolyse die durch
fixe Säuren ausgetriebene, sondern die gebildete Kohlensäure zu bestimmen
war, wurde statt der Ringer-Bicarbonatlösung einbasisches Phosphat benutzt.
Dies Meßverfahren setzt voraus, daß der Stoffumsatz einer gegebenen Zell-
menge vom Volumen der Suspensionsflüssigkeit vollkommen unabhängig
ist. Bei Versuchen mit gärender Hefe trifft dies aber, wie sich ergab,
nicht genau zu, hauptsächlich wegen der verschiedenen Konzentrationen
der in kleinen Mengen entstandenen Gärprodukte. Diese Fehlerquelle
ließ sich durch Benutzung angegorener Zuckerlösung als Suspensions-.
flüssigkeit ausschalten. Dabei überwiegt der Einfluß der vorhandenen
Gärprodukte so sehr die geringe Menge der neu hinzutretenden, daß der
Einfluß des Volumens wegfállt. Es wurden dafür zunächst stets 50 ccm
einer Traubenzucker-Phosphatlösung 20 Minuten lang mit lg Preßhefe
angegoren, diese durch wiederholtes Zentrifugieren und Filtrieren entfernt
und die angegorene Lösung zur Füllung der Kästchengefäße und zur Auf-
schwemmung der Stammsuspension der Versuchshefe benutzt. Unter
diesen Umständen arbeitete die Methode bei Preßhefe vorzüglich. Dagegen
ist das Verfahren für Versuche mit Acetonhefe oder Mazerationssaft nicht
anwendbar, weil hier der Umsatz wegen der verschiedenen Konzentration
des löslichen Koferments direkt vom Volumen abhängig ist. Ferner wird
das Verfahren bei sehr kleiner Atmung im Vergleich zur Gärung zu ungenau.
Schließlich versagt es auch in gewissen anderen Fällen. So war bei der
„umgestimmten‘ Hefe (Kapitel II) die Gárung im größeren Volumen stets
erhöht, wahrscheinlich in Zusammenhang mit einer geänderten Durch-
lässigkeit der Zellwand für gärungsbeeinflussende Zellprodukte. In all
diesen Fällen wurde die früher verwandte kombinierte Methode benutzt,
wobei der Sauerstoffverbrauch für sich allein bestimmt wird unter Füllung
des Gasraumes mit reinem Sauerstoff und Absorption der Kohlensäure in
starker Natronlauge. In einem zweiten Gefäß wird unter Füllung des
1) Zymasegärung, S. 255.
2) Zeitschr. f. physiol. Chem. 73, 447, 1911.
3) Diese Zeitschr. 152, 51, 1924.
48 O. Meyerhof:
Gasraums mit Sauerstoff-Kohlensäure (ohne Natronlauge) der Gesamtdruck
bestimmt und unter Berücksichtigung des Sauerstoffverbrauchs in Gefäß 1
die Kohlensäurebildung berechnet. In einem dritten Gefäß, das genau gleich
beschickt, aber mit Stickstoff-Kohlensäure gefüllt ist, wird die anaerobe
Gärung gemessen. Häufig wurden beide Methoden kombiniert und außer
den drei Kästchengefäßen (Sauerstoff-Kohlensäure mit kleinem Flüssigkeits-
volumen, Sauerstoff-Kohlensäure mit großem Flüssigkeitsvolumen, Stick-
stoff-Kohlensäure) noch ein viertes Gefäß verwandt, in dem unter Absorption
der Kohlensäure allein der Sauerstoffverbrauch bestimmt wird. Dies ergab
eine sehr erwünschte Kontrolle der Messungen. Tatsächlich stimmte in
dem größeren Teil der Versuche (mit Ausnahme der oben genannten Fälle)
der nach beiden Methoden gemessene Sauerstoffverbrauch auch bei gleich-
zeitiger erheblicher Gärungsgröße nahezu überein, häufig innerhalb der
Meßgenauigkeit vollständig. Erwies sich infolge eines zu großen Mißver-
hältnisses zwischen Gärung und Atmung die Ausrechnung nach der neuen
Warburgschen Methode als zu ungenau, so konnte die Rechnung aus der
Atmungskontrolle allein durchgeführt werden. Zur raschen Absorption
der Kohlensäure dienten in diesen Fällen Gefäße mit breitem Einsatz von
1.2 cm Durchmesser, der reichlich mit Capillaren und 0,4 cem n Natronlauge
gefüllt wurde. Daß die Geschwindigkeit der Absorption der Kohlensäure
für die Messung ausreicht, muß durch besondere Versuche mit wechselnder
Versuchsmenge ausprobiert werden ; ebenso, daß die Schüttelgeschwindigkeit
zur Herstellung des Absorptionsgleichgewichts genügt. Sie betrug meist
95 bis 100 pro Minute. Alle Versuche wurden im Thermostaten von 280
ausgeführt. Als Gasgemische dienten nach Warburg Sauerstoff und Stick-
stoff mit je 4 bis 5 Vol.-Proz. Kohlensäure. Das Stickstoffgemisch wurde
durch Überleitung über glühendes Kupfer sorgfältig von Sauerstoffspuren
befreit (bei dem Gehalt des käuflichen Stickstoffs an etwa 1 Proz. Sauerstoff
von größter Wichtigkeit!) und die Flüssigkeit gründlich mit dem Gemisch
gesättigt.
In einzelnen Fällen wurden die Versuche durch Alkoholbestimmungen
ergänzt, die Herr Dr. Lohmann ausführte. Zur Messung des Alkohols in
kleinen Mengen von 0,1 bis Img bedienten wir uns eines Verfahrens, das
sich an das von Widmarck beschriebene anlehnte1). Nur wurde nicht wie
dort der Alkohol in geschlossenem Gefüß bei 60° in die Schwefelsäure
destilliert. Wir füllten vielmehr, nachdem die Hefe herauszentrifugiert
war, 1 oder 2ccm der klaren Zucker - Salzlösung in einen 5 bis 10 ccm
fassenden, mit Kühler versehenen Destillierkolben und destillierten den
Alkohol mit kleiner Flamme in eine Vorlage über, die 5 mg Kaliumbichromat
in 3ccm konzentrierter Schwefelsäure enthielt. Nach teilweiser Neutrali-
sation der Schwefelsäure wurde nach Zugabe von Jodkali die nicht reduzierte
Chromsäure mit n/100 Thiosulfat titriert.
B. Berechnung der Versuche.
Atmet die Hefe ohne Zucker, so ist ihr respiratorischer Quotient
ungefähr 0,85 (s. später Versuch 1 u. 2, Tabelle XVI). In Gegenwart von
Zucker, zumal wenn die Atmung dadurch stark erhöht wird, darf man
jedoch annehmen, daß vorwiegend, wenn nicht ausschließlich, Zucker
verbrennt. Die Berechtigung für diese Annahme wird späterhin diskutiert
1) Diese Zaitschr. 131, 473, 1922.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 49
werden (s. Kap. III). Bei der Messung erhalten wir zunächst die Gesamt-
kohlensäure, berechnen aber die Gärungskohlensäure in Sauerstoff
neben der Atmungskohlensäure, indem wir den respiratorischen
Quotienten = 1 ansetzen und eine Kohlensäuremenge in Kubikmilli-
meter von der Gesamtkohlensäure abziehen, die gleich dem verbrauchten
Sauerstoff in Kubikmillimeter ist.
Wir berechnen zunächst für jede Versuchsserie, in der stets aliquote
Teile derselben Hefesuspension benutzt werden, den Sauerstoffverbrauch
in Kubikmillimeter, die anaerobe Kohlensäure in Kubikmillimeter,
die aerobe Gesamtkohlensäure in Kubikmillimeter und unter Abzug
der Atmungskohlensäure die aerobe Gärungskohlensäure!) in Kubik-
millimeter für die Versuchszeit. Um hieraus absolute Werte zu er-
halten, rechnen wir die Zahlen nach dem Vorschlag Warburgs auf Qo,
und Qco, um, gleich Kubikmillimeter Gas pro Milligramm Trocken.
substanz und Stunde, stets für die Versuchstemperatur von 28%, Das
Trockengewicht wurde für jeden benutzten Hefestamm durch Trocknung
bei 100° bis zur Gewichtskonstanz bestimmt. Doch wurde kein be-
sonderes Gewicht auf Erhalten genauer absoluter Werte gelegt, da
diese natürlich von dem Alter und der Aufbewahrung der abgepreßten
Hefeproben etwas abhängig sein mußten. Es wurde daher auch die
für jede Versuchsserie dienende Hefemenge auf der Handwage ab-
gewogen. Dagegen ist allerdings die Größenordnung der Q-Werte bei
den verschiedenen Heferassen von großem, Interesse wegen der hier
bestehenden starken Differenzen, die auf den spezifischen Stoffwechsel-
typus der Kulturhefe ein sehr bezeichnendes Licht werfen.
Wir bestimmen den vergorenen Zucker in Milligramm, indem
L emm Gärungskohlensäure = 0,004 mg Zucker ist, ferner den oxy-
dierten Zucker in Milligramm, indem 1 cmm O, oder 1 cmm Atmungs-
kohlensäure = 0,001 33 mg veratmeten Zuckers ist. Das Verhältnis
des durch den Sauerstoff an der Vergärung gehinderten Zuckers
zum oxydierten Zucker stimmt zahlenmäßig mit dem von
mir in früheren Arbeiten berechneten Oxydationsquotienten der
Milchsäure überein, der ebenfalls in der Formel geschrieben werden
kann:
Vor der Spaltung bewahrte bzw. zurückverwandelte Zuckermoleküle
Oxydierte Zuckermoleküle
Der von O. Warburg, Posener und Negelein in der angeführten Arbeit
verschwundene Mol. Milchsäure
aleae Mol Sta EES
benutzte Ausdruck:
1) Unter ‚aerober Girung'* wird hier stets die Gärung in Anwesenheit
von Sauerstoff verstanden.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 4
50 O. Meyerhof:
„ Meyerhof- Quotienten‘“ bezeichnen, ist gleich !/, der von mir be-
rechneten Zahl und entspricht in unserem jetzigen Falle dem Ausdruck:
eer Ba el (da aus 1 Mol. Zucker 2 Mol.
Gärungskohlensäure, im obigen Falle 2 Mol. Milchsäure entstehen).
Daneben interessiert uns noch das Verhältnis der aeroben und
anaeroben Gärungsgröße zur Atmungsgröße:
anaerob vergorene Zuckermoleküle
~ veratmete Zuckermoleküle
und aerob vergorene Zuckermoleküle l
veratmete Zuckermoleküle
Diese Werte sind in den folgenden Tabellen aufgeführt.
II. Atmungs- und Gärungsversuche an verschiedenen Heferassen.
In den folgenden Abschnitten werden zunächst die Versuche mit
den angeführten Heferassen beschrieben. Zum Schluß wird eine Über-
sicht über die physiologischen Unterschiede gegeben. Wir beginnen
mit den Versuchen an Preßhefe, käuflicher Bäckerhefe (Wulff) und
Reinzucht-Preßhefe M und XII, weil hier die Atmung so groß und
ihre Wirkung daher so eklatant ist, daß sie sehr genau analysiert werden
kann, während allerdings an dem Buchnerschen Objekt der Brauerei-
Unterhefe die Atmung in Zuckerlösung meist so klein ist, daß man
ihre Wirkung vermissen würde, wenn man sie nicht besti nmt sucht.
A. Versuche an Preßhejen ( Bäckerei- und Spiritushefe).
Bestimmen wir in der angegebenen Weise an gewaschener Preßhefe
in reiner Kaliumphosphatlösung ohne Zucker oder andere Zusätze die
Atmungsgröße, so finden wir ein Qo, von etwa 10 (10 cmm CL Verbrauch
pro Milligramm Trockengewicht und Stunde bei 28%). Besonders genau
ergibt sich bei Rasse M an verschiedenen Proben ein Wert von fast
genau 10.: Diese Atmungsgröße wird durch Änderung der Reaktion
nach dem Neutralpunkt zu kaum beeinflußt. Bestimmen wir anderer-
seits in 5 Proz. Traubenzucker-Phosphat die Gärung in Stickstoff,
so finden wir im allgemeinen einen Qco,-Wert von 250 bis 300. Wir
erwarten daher zunächst nur einen geringfügigen Einfluß der Atmung
auf die Gärungsgröße, finden aber zu unserer Überraschung, daß die
Geschwindigkeit der Gärung in Sauerstoff im allgemeinen auf !/, bis
Du, ja in einzelnen Präparaten auf den zehnten Teil sinkt. Daß es sich
hierbei um einen Einfluß der Atmung handeln muß, geht aus Ver-
suchen mit Zusatz von n/500 bis n/1000 Blausáure hervor. Hierbei
steigt die Gärungsgröße in Sauerstoff auf etwa das Dreifache, während
andererseits die Gärung in Stickstoff um etwa 10 Proz. gehemmt wird,
die Atmung um etwa 90 Proz. Verhinderung der Atmung durch Blau-
Einfluß des Sauerstofís auf die alkoholische Gärung der Hefe. 51l
säure wirkt also wie Sauerstoffmangel. Die Erklärung für diesen
Einfluß der Atmung finden wir aber, wenn wir den Sauerstoffverbrauch
nicht in reiner Phosphatlösung, sondern in Traubenzucker-Phosphat
messen. Die Atmung wird dadurch ungeheuer gesteigert, und zwar
beträgt sie bei käuflicher Bäckerhefe das 8-, bei Heferasse M und XII
das 9- bis 12fache der Atmung in reiner Salzlösung. Der Oo, Wert in
Zucker ist für die erstere 60 bis 80 und für die letzteren etwa 100.
Beispiele hierfür sind in Tabelle I angeführt, aus der gleichzeitig zu
sehen ist, daß Fructose und Saccharose auf die Atmung wirken wie
Glucose, während Maltose nur eine halb so große Atmungssteigerung
verursacht, Galaktose sogar nur 60 Proz. steigert und Hexose-
phosphorsäure und Glykogen wirkungslos sind. Diese Atmungswirksam-
keit entspricht vollständig der Gärungswirksamkeit derselben Zucker
auf die Preßhefe; Hexosephosphorsäure und Glykogen werden nämlich
nicht vergoren, Galaktose schwach, Maltose knapp mit halber Ge-
schwindigkeit wie Traubenzucker, Saccharose und Fructose ebenso
schnell wie dieser.
Tabelle I.
Steigerung der Atmung der Preßhefe in Zuckerlösungen (2 bis 5 Proz.).
Nr. 1 bis 5: Bäckerhefe. Nr. 6 bis 12: Rasse M. Nr. 13: Rasse XII.
zu Token | | ay tomo h |
S 8 . O m 2 Vi ls
NE Zuckerart l nn Zeit Phosphat o Qo: l Qo . faches
E eg Min. Ee cmm | Phosphat | Zucker |!” Zucker
1 Glucose . . | 93 | 30 | 39 | ag 84 | 69 82
2, > , 1 6,8 60 | 64 475 9,7 72 7,4
3 | | 315 | 60 | 36 243 11,2 77 6,9
4 | Fructose | 6,0 45 42 298 | 93 6 | 71
5 |" Galaktose | 60 | 30 | 31 | 55 | 103 | 183 | Lë
6 | Glucose . | 2,6 60 | 285 | 254 11,0 | 98 8,9
7 | | 174 | 40 | 120 | 106 103 | 90 8,7
> | Saccharose 94 | 106 11,2
| Matoso ; 9,4 40 4,2
10 | Galaktose . || 2,9 60 30 455 | 103 15,8 1,5
| Hexose-
| Phosphors. į 2,9 60 30 34 10,3 11 1
12 | Glykogen . , 21 | 60 | 195 | 182 | 94 | 87 | 1
Gel Glucose 3proz. | 2,64 | 40 | 12 151,5 6,8 | 86 | 12,5
13b! ` . 03proz | 2/64 169 955 | 14
Unter Nr. 13 der Tabelle I sind zwei Versuche mit zwei ver-
schiedenen Zuckerkonzentrationen, 3 und 0,3 Proz., mitgeteilt, aus
denen hervorgeht, daß die Atmung in der schwächeren Konzentration
noch mehr gesteigert wird. Das gleiche ergeben auch die Versuche
mit anderen Heferassen. Doch wurden für die Mehrzahl der folgenden
Versuche Zuckerkonzentrationen von 2 bis 5 Proz. benutzt.
4 +
52 O. Meyerhof:
Messen und berechnen wir auf die in den vorhergehenden Ab-
schnitten angegebene Weise in aliquoten Teilen der in Zucker-Phosphat-
lösung aufgeschwemmten Hefesuspensionen Kohlensäure und Sauerstoff,
so finden wir: für irgend einen Oo, Wert = a wird die Gárungskohlen-
säure in Sauerstoff gegenüber Stickstoff um den Betrag von etwa 2a
verringert. Pro 1cmm O, (bzw. 1 Mol.) werden 2 cmm Gärungskohlen-
säure (bzw. 2 Mol.) in Sauerstoff eingespart; dementsprechend pro
Aufwand von 1 Mol. Sauerstoff oder Oxydation eines Sechstel Zucker-
moleküls 1 Zuckermolekül vor der Vergärung bewahrt. Genauer ergibt
sich für die Bäckerhefe das Verhältnis
verschwundene Gärungskohlensäure
aufgewandter Sauerstoff
zu 2,2 bis 2,8, für die Hefen M und XII ein solches von 1,7 bis 2.2.
Daß der in Sauerstoff zum Verschwinden gebrachte Gärungs-
umsatz, nicht aber etwa der übriggebliebene Rest in unmittelbarer
Beziehung zur Atmungsgröße steht, geht schlagend aus Versuchen
mit zwei zu verschiedenen Zeiten bezogenen Proben der Rasse M hervor?).
Bei beiden betrug der Qo,-Wert fast genau 100, dagegen bei der ersten
der Qco, Wert in Stickstoff 280, bei der zweiten 230. Der Qco,-Wert
der Gärung in Sauerstoff war aber bei der ersten 100, bei der zweiten
nur 20. Dagegen war das Verhältnis
verschwundene Gärungskohlensäure
verbrauchter Sauerstoff
in beiden Fällen dasselbe.
In den folgenden beiden Tabellen sind die Versuche mit käuf-
licher Bäckerhefe und mit Reinzuchtpreßhefe zusammengestellt
(Tabelle II und III). Eine Reihe der Versuche ist mit der älteren
kombinierten Methode ausgeführt worden, wobei der Sauerstoff unter
Absorption der Kohlensäure gemessen wird. Denn die Notwendigkeit,
im anderen Falle bei der Preßhefe für genaue Versuche angegorene
Zuckerlösung zu benutzen, bedeutet natürlich eine Komplikation;
ferner verhindert sie die gleichzeitige Bestimmung des gebildeten
Alkohols. Da jedoch diese Methode in vielen Fällen noch genauere
Resultate gibt, wurde sie späterhin häufig angewandt, meist zur
Kontrolle noch eine Atmungsmessung mit Absorption der Kohlensäure
vorgenommen. Das Resultat dieser letzteren ist in der Tabelle II
(Atmung in Kubikmillimeter O,) in Klammern mitgeteilt. Angesichts
der Schwierigkeit der Messungen war die Übereinstimmung befriedigend.
1) Nach Auskunft von Herrn Dr. Hachn besteht. die Hefe M aus dem
Gemisch von vier verschiedenen obergärigen Hefearten.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 53
(Versuch 1 und 2 sind mit der Kastenmethode mit gewöhnlicher Zucker-
lösung angestellt.)
Unter A sind die Versuchsdaten angegeben, unter B die Zahlen
auf Zuckermoleküle umgerechnet.
Tabelle II.
A. Sauerstoffverbrauch, aerobe und anaerobe Gärungsgröße.
(5 Proz. Traubenzucker-Phosphat.)
Versuche 1 bis 6: Búckerhefe. 7 bis 11: Rasse M. 12: Rasse XII.
de Lay
z
Trocken»
gewicht
Kästchen-
= Versuchs»
dauer
goren (a), nicht
methode
ite Metho
' angegoren (n)
. Zucker ange»
E == ad e
|
30
32 | 60
40
8 | 30
E (64) Durchschnitt | 2,46
|
|
|
gu
e |
a
DO NN ra
PODIAS
pi ad ud bd Y NN
VERRAT
VS,
©
clala dala
Ti 8 | 112, 40 | K 68 |208 | 615| 91 | 279 | 82 | 2,17
(68)
8' a 145 | 20 K 49,2 | 143 57,3| 98 286 | 114,5 | 1,74
92 a 1,22 | 60 | K 81 236,5 | 67 | 100 291 83 2,10
| (67)
0 a | 15 | 40 | K |104 |232 | 20,5|104 | 232 | 205| 204
(105,5)
Mon |234| 40 | A |219 |438 | 58 |137 | 274 | 37 1178
12 | a 1,66 | 40 A 99 344 |121 92,4| 310 | 104,5 | 2,24
l * A >-_G AAA A SEE
` Gs (73)*) Durchschnitt | 2,00
*) Kästchenversuch, ungenauer.
Tabelle IIB.
Zuckerumsatz.
| i ;
Nr | ga Bäcker Ozydationsquotient anaerob vergorener Zucker | aerob vergorener Zucker
` M = Rasse M | unvergorener Zucker oxydierter Zucker oxydierter Zucker
| XII oxydierter Zucker
A GE m 5 = WA RR
l | B ; 8,7 12,6
2 | B j 6,6 10,75
3| B i 6,3 9,3
4. B 'i 6,9 8,2
5 |! B | 8,7 12,7
61 B ' 7,1 9,7
Il M 6,5 9,2
BI M | 5,2 8,8
9 M | 6,3 8,5
10° M | 6,12 6,7
Zi Mo 5,2 6,0
2| om | oi 10,0
54 O. Meyerhof:
Einen Beleg fiir die Wirkung der Blausáure gibt der folgende
Versuch?).
In 30 Minuten: Gárung in Stickstoff ohne Blausáure 229 cmm CO,,
mit n/600 Blausáure 210 cmm CO,, Gárung in Sauerstoff ohne Blau-
sáure 59 cmm CO, mit n/600 Blausáure 170 emm CO,.
Die Hemmung der Atmung in Zuckerlósung betrágt mit n/600 Blau-
sáure 80 bis 90 Proz.
Nachdem festgestellt war, daß die Gárungskohlensáure durch die
Sauerstoffatmung in einem bestimmten Umfange verschwindet, er-
schien es notwendig zu untersuchen, ob das gleiche fúr den Alkohol
zutreffend ist, und ob das Verhältnis der verschwundenen Kohlensäure
zum verschwundenen Alkohol der Gärungsgleichung entspricht. Denn
wie die Erörterung des nächsten Kapitels zeigen wird, hängt die Deutung
des Atmungseinflusses von der Beantwortung dieser Frage ab. Und
in der Tat wird der Alkohol in gleichem Umfang am Auftreten ver-
hindert wie die Gärungskohlensäure.
Tabelle III.
Kohlensäure- und Alkoholbildung in Sauerstoff und Stickstoff (Rasse M).
A. Vergleich von Kohlensäure und Alkohol.
| Anaerobe Gärung | Aerobe Garung
Nr. de Gesamts | Zeit des I ee Zë Gärungs. | daraus
r. der eebe Atmungs», CO, Alkoholin' Alkohol i KS" ' Alkoholin | Alkohol
PAISUR zeit versuchs |; gemessen , ¡Relacion Ee Goen Belunden
| cmm mg mg cmm ` mg mg
2 | 1220 | 30 I 107 | 0896 | 0,617 | 412 | 0227 | 028
3 |121 | 40 231 0,985 | 111 73 0,307 | 0,10
4 | 137 | 40 | 2185 | 111 | 097 | 610 0.264 | 0,824
11 55 | 40 | 438 | 12% | 116 | 58 017 | 012
B. Sauerstoffverbrauch und Alkoholschwund.
Oz in O, in [Alkobolschwund Alkohol” Mol. Alkohols | Mol. Alkohol»
Nr. der ||Atmungs-| Gesamtzeit aus CO” schwund schwund : Mol. | schwund : MoL
Tabelle II zeit berechnet | Messung ber. ¡ gefunden Sauerstoff« Kohlensäure»
cmm mg mg i mg verbrauch schwund
2 | 298 | 0,113 0,369 0,386 206 | 09
3 175 | 0217 0.678 0.71 2:27 1.06
4 69,6 | 0,241 0,856 0:65 187 0,77
11 || 219 0.43 1.09 1,04 1.68 0,96
Da fiir diese Versuche keine angegorene Zuckerlósung benutzt
werden konnte, ferner die Respirationsmessungen von 30 bis 40 Minuten
auf die Gesamtzeit umgerechnet werden mußten — die Sättigung der
Lösung mit den Gasen, der Temperaturausgleich, das Abzentrifugieren
der Hefesuspension erforderte in den verschiedenen Versuchen 15 bis
1) Siehe auch Tabelle IX, Versuch 4 und 7.
E
A a
A e e rara
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 55
45 Minuten —, so sind keine ganz genauen Übereinstimmungen zwischen
Alkohol- und Kohlensäurebildung zu erwarten. Innerhalb der Ver-
suchsgenauigkeit läßt sich aber keine Änderung der Gärungsgleichung
durch den Sauerstoff beobachten (vgl. Tabelle IIIB). Es ergibt sich
vielmehr, daß 1 Mol. Sauerstoff neben 2 Mol. CO, etwa 2 Mol. Alkohol
am Auftreten verhindert. Damit ist auch die Berechnungsart der
Tabelle IIB gerechtfertigt, den Überschuß der aeroben Kohlensäure
über die Atmungskohlensäure auf vergorenen Zucker umzurechnen.
Der Alkohol wurde stets in zwei Dritteln der für die Gasmessungen
benutzten Flüssigkeitsmenge bestimmt, meist in 2 von 3 ccm, in ein-
zelnen Fällen in 1 von 1,5ccm. In der Tabelle III sind die Werte in
Milligramm bereits auf die ganze Lösung umgerechnet. Für 44 mg CO,
sind 46,1 mg Alkohol zu erwarten.
B. Versuche mit Brauereiunterhefe.
Stellen wir orientierende Versuche mit Brauereiunterhefe an, so
ergibt sich zunächst, daß die Atmung in zuckerfreier Lösung und
andererseits die anaerobe Gärung in Zucker-Phosphat ähnlich groß sind
wie bei der Preßhefe. Allerdings waren beide Größen bei den von mir
untersuchten Proben der Unterhefen öfters etwas geringer. Der Go, Wert
betrug 6 bis 10, der Qco,-Wert etwa 200. Doch variiert dieses mit der
speziellen Hefeart und auch mit dem Zustande der Hefen und bedeutet
keinen prinzipiellen Unterschied. Messen wir nun die aerobe Gärung,
so ist ihre Größe nahezu ebenso groß wie die anaerobe und in manchen
Fällen von dieser kaum zu unterscheiden. Dieses vom Verhalten der
Preßhefe völlig abweichende Resultat erklärt sich nun einfach dadurch,
daß bei der Unterhefe der Zuckerzusatz die Atmung entweder gar nicht
oder (bei der Hefe der Hochschulbrauerei) recht geringfügig steigert.
Auch diese Steigerung (auf Qo, 10 bis 20) rührt zum Teil noch davon
her, daß die Atmung in Zuckerlösung mit der Zeit zunimmt, dagegen
ohne Zucker die Tendenz hat zu sinken. Der Umstand, daß die
Brauereihefe weitgehend das Vermögen verloren hat, in Gegenwart
von Zucker ihre Atmung zu steigern, ist nun, wie das folgende noch
deutlicher macht, für das biologische Problem von der Bedeutung der
Gärung der Kulturhefen von größter Wichtigkeit.
Über den Einfluß des Zuckers auf die Atmung orientiert die kleine
Tabelle IV. Wir messen nunmehr nach der gleichen Methode Atmung,
aerobe und anaerobe Gärung nebeneinander und erhalten die in der.
Tabelle V angegebenen Resultate. Zu den Zahlen derselben ist zu
bemerken, daß es natürlich schwierig ist, die genaue Größe einer sehr
kleinen Atmung neben einer großen Gärung zu messen, daß ferner
die prozentuale Genauigkeit für die Bestimmung der Differenz der
aeroben und anaeroben Gärung um so geringer wird, je weniger ver-
56 O. Meyerhof:
Tabelle IV.
Einfluß von Traubenzucker auf die Atmung der Unterhefe.
Oz
Zučker Qo:
lösung in
¿ma Phosphat Zucker Zucker
Trocken»
ewicht
er Hefe
Zucker:
Zeit Ze
cmm
59 48 | 63 | 51| 10
34 65 | 57 | 109| 19
40 | 545 | 9 | 10 | 171 175
545 | 9 | 10 | 1756| 175
— |122| 10 | 225| 22%
24 54 | 114 | 255 | 225
Tabelle V A.
Sauerstoffverbrauch, aerobe und anaerobe Gärungsgröße der Unterhefe.
(5 Proz. Traubenzucker-Phosphat.)
Versuche 1 bis 2: Brauerei Tempelhof. Versuche 3 bis 4: Hochschulbrauerei.
Ei ` ki ke D e?
DOVE 1. e Bes
Ee 33 EE SE Sc
AB "os 23 | 299 am
Nr.i ses $3 | E3 | 8223 g-
LF aa | 2 ER S
3 G% > 1838 =
| SE mg Min az
1 D
2| n
3 n
4 | n
Tabelle V B.
a Tee an se u
N i Hefeart 0. anaerob vergorener Zucker | acrob vergorener Zucker
e EE oxydierter Zucker oxydierter Zucker
oxydierter Zucker
1 j Tempelhof 7,6 90 82
2 | 9,9 90 80
= Hochschule 5,3 33 28
A brauerei 2,25 55 52,5
schieden beide sind. Nun ist das Verháltnis der Gesamtkohlensáure
zum Sauerstoff, der ,scheinbare respiratorische Quotient“, bei der
Preßhefe im allgemeinen gegen 2, bei der schwächer gärenden Probe
der Rasse M sogar nur 1,2 bis 1,3, dagegen bei der Brauereiunterhefe 10
bis 30. Innerhalb der Versuchsgenauigkeit bringt aber diese geringe
Atmung annähernd das gleiche Vielfache an Gärungsumsatz zum Ver-
schwinden. Auch hier verschwinden etwa 2 Mol. Kohlensäure beim
Aufwand von 1 Mol. Sauerstoff. Allerdings ist die Fehlergrenze dieser
Versuche recht groß, und es erscheint wohl möglich, daß ebenso wie bei
den im folgenden Abschnitt betrachteten Wein- und Bierhefen der
Oxydationsquotient ein kleinerer ist als bei der Preßhefe. In
re reg
a a ES
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 57
diesem Falle wird auch bei Benutzung angegorener Zuckerlösung das
Resultat nicht genauer. Denn schon Fehler von 1 bis 2 Proz. in den
Messungen oder Eichungen beeinflussen das Resultat aufs stärkste.
C. Versuche mit obergäriger Brauereihefe und Weinhefe.
Wir betrachten nunmehr im Zusammenhang das Verhalten der
obergärigen Brauereihefe und der Weinhefe. Diese gleichen fast ganz
der untergärigen Bierhefe. Aller- 50
dings ist die Atmungsgröße der
1 2
Abb. 1. Weinhefe, Steinberg. Abb. 2, Obergärige Bierhefe.
Oxydationsgeschwindigkeit Oxydationsgeschwindigkeit.
(O2»Verbrauch pro 15 Minuten).
Oberhefe in Zucker wenig- «o
stens in einzelnen Proben!)
größer (manchmal auch
kleiner) als bei der Unter-
hefe bei gleicher Gärungs-
größe, so daßdas Verhältnis
der anaerob vergorenen zu
den veratmeten Zucker- 5
molekülen im allgemeinen
kleiner ist als bei dieser.
Die Atmung wird auch
bei diesen Hefen durch Abb. 3. Obergärige en 30. WG
Zuckerzusatz am Anfang a en
nur unbedeutend gesteigert, oft sogar verringert, doch nimmt die
Steigerung mit der Zeit stark zu; dies gilt sowohl für die obergärige
Bierhefe wie die Weinhefe. Der Unterschied mit und ohne Zucker
wird also dauernd größer, zumal die Atmung in zuckerfreier Lösung
ziemlich rasch sinkt, s. Abb. 1, 2 und 3. In Abb. 1 ist außerdem noch
cmm pro 30°
N
S
1) Als „Reinzuchtoberhefe‘ liefert die Hochschulbrauerei, wie eine
spätere Nachfrage ergab, mehrere verschiedene Rassen.
58 O. Meyerhof:
die Wirkung des milchsauren Natriums, in Abb. 3 des Äthylalkohols,
dargestellt, hierüber s. Kap. III. Außer indem Verhältnis von Gárungs-
und Atmungsgröße ähneln sich Bierhefe und Weinhefe noch in einem
anderen Punkte: der Sauerstoff bringt hier offenbar auch eine ver-
hältnismäßig geringere Menge Gärungskohlensäure als bei der PreBhefe
zum Verschwinden. Statt gut 2 Mol. Kohlensäure verschwindet meist
nur 1 bis 11, unter dem Aufwand von 1 Mol. Sauerstoff. Der ‚scheinbare
respiratorische Quotient‘‘ wird hier 6 bis 10, während er bei den Unter-
hefen 10 bis 30 war. Übrigens ist die Atmungsgröße besonders der
Bieroberhefe sehr schwankend, indem sich der Zustand der Hefe beim
Aufbewahren der abgepreßten Proben im Eisschrank stark verändert.
Tabelle VI. Einfluß von Traubenzucker (2 bis 5 Proz.) auf die Atmung
der Oberhefe und Weinhefe.
T Zucker. Trocken» ER O o] Viel
i ; Oz 2 | 1e
Nr. | Hefeart | konzene | gewicht | zo (rien KE T o Gm
: i Proz. mg cmm cmm Phosphat | Zucker | Zucker
E: "e a2 | 35 | 47 | wa | 15,0 | 15
2 | Ober 3 (ma 1 |16 (177 ¡ 101 155| 15
3 gärige 2 ı 29 1,255 27 8,8 | 9,4 1,1
4\{ Bir- 02 ' 29 1,2355 | 31 88 : 10,7 | 12
sl bebe = ı 156 | 1 | 30 43 55 78| 14
6 1 04 1 35 äm 112 | 112| 64 ; 64 | 10
e steet Risia m a E G
| ee GER 1 8 345 ` 20 20 | 49 | 17,5 | 234 186
8 | E | | | | ' |
wie 13 38 np | 22 |445| 67 |135, 20
Atmungs- und Gärungsvergleich wurde wieder in den ersten Ver-
suchen mit gewöhnlicher Zuckerlösung, in den späteren mit angegorener
Zuckerlösung gemacht.
Tabelle VII.
A. AUN: und EE mit Bieroberhefe und Weinhefen.
Ze ER D | E Eë P
| 23 | d E- a f a E | n ð EC)
Nr.) Hefecart BE Zen E £| E Gë $ ¡100,1 | 65 151 -
| > PI ae ara
séier SC cmm : cmm cmm Ss =
5 | on | mg Mim gé A Oz ,COz! CO, | = = E
1. 158 40 |n A! 164 |178 11585 15,0 | 170 (151,5 1,19
2 [lObergárige 265 30 | n'K/36,3*)/252 224 (274); 190 1169 |078
3 ¡( Bierhefe 198,30 n A 15,7 |199 '154,5| 15,8 | 201 |155 |27
A aa 0 je A] ES 12 | 168 167 os
5 Weinhefe ` | |
| Steinberg | 1,73 40 a K 195 147 mg 17 |128 ‚118 [068
| | 15,5)
6 || Weinhefe 33 30 a A 17 be 5 170,5 | 10,3 | 112 1103 [0,825
7 j Winnigen ¡25 40 a K 10,5 |180 170 6,3 | 108 GE 0,95
` | (20,5) |
*) Der Sauerstoffverbrauch ist hier jedenfalls zu groß gefunden.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 59
B. Zuckerumsatz.
Oxydationsquotient
|| ;
anserob vergorener Zucker | aerob vergorener Zucker
did | Kleferamse | ümyergofener Zucker, T oxydierter Zucker | oxydierter Zucker
| ' oxydierter Zucker
1 | Ober- 3,6 | 34 | 30,3
2 || gärige 2,35 d | 18,7
3 1 Bier- 8,1 38 | 30
dh hefe 2,7 42 39
5 , Weinhefe |
| Steinberg 2.04 22,6 | 20,5
DJ Weinhefe . 2,5 33 | 30,4
7 || Winnigen | 2,84 i Sl | 48,5
D. Wilde Hefen.
Den Schlüssel für die eigentümlichen Unterschiede bei den ver-
schiedenen Kulturhefen liefert uns das Verhalten der wilden Hefen,
von denen zwei, die Kahmhefe Mycoderma variabilis und eine Torula
untersucht wurden. In absolutem Maße war Atmungsgröße und
Gärungsgröße bei der Kahmhefe besonders klein, sei es, daß die un-
gleichmäßigen Zellen von sehr verschiedener Größe und Gestalt nur
zum Teil leben oder von sehr verschiedener Aktivität sind, oder
schließlich, daB der Stoffwechsel im ganzen bei dieser Hefe sehr niedrig
ist. Abgesehen hiervon aber gleichen sich die beiden Hefearten darin
vollständig, daß die Atmungsgröße in Zuckerlösung im Vergleich zur
Gärung derart groß ist, daß in Sauerstoff der Gärungsstoffwechsel
nahezu ganz verschwindet. Am übersichtlichsten liegen die Verhältnisse
bei der Torula, da wir es hier mit morphologisch einheitlichen Zellen
zu tun haben und wir wohl obendrein die Torula als die Stammutter
der Kulturhefe auffassen können. Die Gärungsgröße der Torula in
Stickstoff war größer als bei den Bier- und Weinhefen und der der
Preßhefe gleich. Qco, in Stickstoff gleich 250 bis 300. Die Atmungs-
größe der Torula ist nun aber schon in zuckerfreier Lösung gut doppelt
so groß als die der Preßhefe, Qo, gleich 19 bis 25, und dieser Punkt ist
für ihr Verhalten entscheidend, denn in Zucker wird diese Atmung
nunmehr wie bei der Preßhefe um das 8fache gesteigert, so daß der
Qo,-Wert in Zucker 160 bis 200 ist. Von der Größe dieser Atmung
erhalten wir einen Begriff, wenn wir sie mit der Gewebsatmung kleiner
Säugetiere vergleichen. Qo, ist bei 38° für die meisten Gewebe junger
Ratten etwa 10, die größte Atmung findet sich nach Warburg in der
Retina mit einem do, von 30. Die Atmung der Torula würde bei 38°
annähernd 400 sein, wenn diese Temperatur nicht für die Zellen schädlich
wäre. Mit einer so großen Atmung aber kann die Gärung in Sauerstoff
nahezu vollständig verschwinden. Ja, in verdünnteren Zuckerlösungen
steigt die Atmung noch etwas stärker an, und es lassen sich wahr-
60 O. Meyerhof:
scheinlich Milieubedingungen finden, durch die in Sauerstoff der
Spaltungsumsatz restlos aufgehoben wird.
Wir sehen auf Grund dieser Ergebnisse, daß Pasteur völlig im
Recht war, wenn er den Stoffwechseltypus der wilden Hefen dem der
Schimmelpilze verglich, welche ohne Gärung an der Luft wachsen,
und sie als ein besonders deutliches Beispiel für den Einfluß des Sauer-
stoffs auf die Gärung ansah. Nur die Bedeutung, die die Atmungs-
größe im Verhältnis zur Größe der Gärung in diesem Zusammenhang
spielt, war ihm unbekannt geblieben.
Trotz der Verschiedenheit der absoluten Größe des Stoffwechsels ent-
spricht das Verhalten der Kahmhefe genau dem der Torula. Auch hier
haben wir die 8- bis 10fache Steigerung der Atmung in Zucker und
ein Verschwinden des Gärungsstoffwechsels in Sauerstoff oft bis zu
nicht mehr nachweisbarer Größe. Das Verhältnis der verschwundenen
Gärungskohlensäure zum aufgewandten Sauerstoff ist bei der Torula 1,4;
bei der Kahmhefe etwa 0,7. Bei der letzteren ist es also besonders
klein; doch kann es nicht größer sein, weil ja schon so der Sauerstoff
den Gärungsumsatz völlig beseitigt. Die wahre Größe des Oxydations-
quotienten kann nur in Erscheinung treten, wenn die Atmung im
Verhältnis zum Spaltungsumsatz nicht so groß ist, um ein vólliges
Verschwinden desselben herbeizuführen. Sonst berechnet man nur
den unteren Grenzwert des Quotienten. Allerdings sollte man erwarten,
daß bei der Kahmhefe durch teilweise Hemmung der Atmung der
Quotient anwächst und seine eigentliche Größe dann erreicht, wenn
die Atmung so klein ist, daß noch ein Rest von Spaltungsstoffwechsel
in Sauerstoff bestehen bleibt. Dies ist nun doch nicht der Fall. Man
kann durch Vergiftung der Hefe mit n/1000 Blausäure die Atmung so
weit hemmen, daß nunmehr auch in Sauerstoff ein Teil des
anaeroben Spaltungsstoffwechsels wieder erscheint. Der Quotient
war jedoch unter diesen Umständen derselbe. Entweder haben
wir also bei der Kahmhefe wirklich einen so niedrigen Oxydations-
quotienten, oder die Verschiedenartigkeit der Zellen führt Kompli-
kationen herbei.
In der Tabelle VIII ist zunächst wieder der Einfluß des Zuckers
auf die Atmung und in Tabelle IX der Einfluß des Sauerstoffs auf
die Gärung bei der Kahmhefe und Torula behandelt. Bei jeder dieser
Hefearten ist je ein Versuch mit Blausäurezusatz in die Tabelle auf-
genommen.
Es sei noch anhangsweise erwähnt, daß bei der Kahmhefe auch
fixe Säuren neben der Kohlensäure gebildet werden, deren Menge für
unsere Verhältnisse schon in Betracht kommt. Läßt man die Gärung
sich in Bicarbonat-Ringerlösung vollziehen und bestimmt durch An-
säuern nach dem Versuch den Bicarbonatgehalt, außerdem in einer
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gárung der Hefe. 6l
Tabelle VIII.
Steigerung der Atmung in Traubenzucker bei wilden Hefen.
: Oz in
O» In 2 j
Zeit | Phosphat | Tsung
cmm cmm
d Zuckers
‚| Trocken»
Nr. | ı Hefeart ere gewicht
| Proz
l `. Mycoderma 2,5
2 = 2,5
"Lass
4 | Torula . | 4
5 y ” | 4
6aj , | 5
6b, ı 05
E N" ” | ’
oo. > : 0,66
Tabelle IX A.
Einfluß des Sauerstoffs auf die Gärung (2 bis 5 Proz. Traubenzucker).
| ú I
d a Ai s S a DÉ —
| lic
o S B a Z O EN
Nr. | Hefeart | 5 Së 3 3 B GP 58 Ss Ss $? Elle
d E z pz | sé |. E O
y cmm cmm | cmm ES =
| d mg |>| Oz | CO, | CO; | za
S zéi GES i - ==
1 | Mycoderma | n | 15,0 40 K| 215 |206 | 46 21,5) 206| 46/07
| (256)
Ch A 'alıs |30|A!| 248 | 179 3 |275| 198| 03|071
gé ä ja 15 |35| Kj 214 | 147 | 12 | 24,5) 16,8| 1,4| 0,58
l (214
4; ¡a 120 [30 KI 136 | 129 | 41 |136| 129| 41/0564
ld + n/500 KCN | A De an, 5 |
ER E -a| 22/30 EI 197 | 296,5 20 |179 E | 18 14
| y (193) |
SE e KS 2,2 30| K 177 | 278 | 19,5 161 253 | 17,5| 1,46
e O a A
7‘ Torula | E | | | | |
| 40/1000 KCN | a KI 1405| 294 | 182,5) 95,5 202 ¡124 0,8
, Torula*). |n | 1,6 16/40" AL 208 ¡264 | 19 ji95 /248 | 18 |1,18
e) 0,3 Proz. Traubenzucker.
Tabelle IX B.
Nr.. l Hefeart | zen a Anaerob verg. Zucker | Aerob vergorener Zucker
IE AA Sage Sn
quotient _oxydierter Zucker oxydierter Zucker `
= PA b E a ,
1 1) Myeoderma | ser 2.25 29 | 0,63
As u 213 215 | 0.03
3. S | = 1,75 | 2,0 0,18
4 “Mycoderma! aan KCN! 1,92 | 2,9 a 0,92
5 Torula. . | — 4,2 4,5 0,3
6 | l | > 44 47 0/32
g Torula. . [n100 KCN) 24 | 63 I Ai `
8 | Torula. . | — A8 | 3,8 | 0,28
62 O. Meyerhof:
Kontrolle zu Beginn des Versuchs, so zeigt sich, daß der Bicarbonat-
gehalt in Sauerstoff nicht unbeträchtlich, in Stickstoff geringfügig
abgenommen hat. In einem derartigen Versuch waren in Stickstoff
bei einer Gärungsgröße von 171cmm CO, 6cmm CO, durch Säure
ausgetrieben, in Sauerstoff bei einer AtmungsgróBe von 205 cmm O,
und einer Gärungsgröße von 46cmm CO, waren noch Al cmm CO,
durch Säure ausgetrieben. Bei den anderen Hefen spielt indes die
Bildung fixer Säuren eine geringere Rolle, und auch bei der
Kahmhefe kommt sie wohl für die Frage nach dem Ursprung
des Oxydationsquotienten nicht in Betracht, da die Säuren jeden-
falls zur Hauptsache durch Weiteroxydation des Alkohols ent-
stehen dürften.
E. Über den Stoffwechseltypus der verschiedenen Heferassen.
Für die Auffassung der Gärung als anaerober Atmung bildete
das Verhalten der Kulturhefen immer einen Anstoß, weil diese auch
in Sauerstoff gären, was vom Standpunkt der Energielieferung über-
flüssig erscheint. Die Ergebnisse des vorigen Abschnitts beseitigen
diesen Anstoß. Das Verhalten der Kulturhefen erscheint als Ergebnis
menschlicher Züchtung, die, ohne es zu wissen, einseitig darauf hinaus
lief, die Atmung der Hefe herabzudrücken ohne ihre Gärkraft zu
schwächen, was offenbar für die technische Leistung der Hefe von
Bedeutung ist. Es ist kaum zweifelhaft, daß die wilde Hefe, von der
die Kulturhefen abstammen, in ihrem Stoffwechseltypus der Torula
geglichen hat oder selbst eine Torula war. Die Gärungsgröße der Torula
in Stickstoff entspricht der größten von mir gemessenen Gärungs-
größe der Kulturhefen, Qco, : 250 bis 300. Trotzdem gärt die Torula
in Sauerstoff nicht. Die Torula verhält sich also genau so, wie sich
nach unseren Versuchen der Kaltblüter- und Warmblütermuskel oder
nach Warburg das embryonale Gewebe hinsichtlich der Milchsäure-
spaltung des Zuckers verhält: die Sauerstoffatmung reicht gerade aus,
den in Stickstoff beträchtlich großen Spaltungsstoffwechsel rückgängig
zu machen. Nur ist beides, Spaltung wie Atmung, in der Torula bei 280
etwa l5mal so groß wie im Warmblütergewebe bei 38% Das Zucht-
ergebnis besteht nun nicht darin, daß die Hefe neue Fähigkeiten er-
worben hätte, sie hat vielmehr vorher bestehende eingebüßt, die Sauer-
stoffatmung ist — gleichsam in zwei Etappen — heruntergegangen.
Der ersten Etappe entspricht das Verhalten der Brennereihefe: die
Atmungsgröße ist, sowohl in reiner Salzlösung wie in Zucker, auf etwa
die Hälfte gesunken, während die Gärung unverändert blieb. Als
Folge ergibt sich, daß in Sauerstoff neben einem veratmeten Zucker-
molekül im allgemeinen 3 bis 4 vergoren werden, während bei der
Torula pro 1 veratmetes Zuckermolekül höchstens 0,3 Mol. vergoren
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 63
wird. Noch bedeutsamer erscheint die andere Etappe. Eine Hefe
von der Atmungsgröße der Preßhefe büßt die Fähigkeit weitgehend
ein, ihre Atmung in Zuckerlösung zu steigern. Allerdings ist diese
Einbuße nicht gefestigt, denn wie wir gleich sehen werden, steigt,
speziell in verdünnter Zuckerlösung, die Atmung allmählich mehr und
mehr an. Legen wir jedoch unsere bisher mitgeteilten Versuche zu-
grunde, so werden von der Weinhefe und obergärigen Bierhefe pro
1 Mol. oxydierten Zuckers 20 bis 50 aerob vergoren. Die extremste
Stellung nehmen die Brauereiunterhefen ein, bei denen pro 1 ver-
atmetes Zuckermolekül 30 bis 80 aerob vergoren werden. Es ist sehr
bemerkenswert, daß bei allen Kulturhefen die Atmungsgröße in reiner
Phosphatlösung ziemlich gleich ist, Qo, etwa 8 bis 10. Die enormen
Unterschiede zwischen der Brennerei- und Brauereihefe entstehen nur
durch die Beeinflussung der Atmung durch Zucker. Während wir oben
das Verhalten der Torula analogisiert haben mit dem embryonalen
Gewebe, können wir den Stoffwechseltypus der Kulturhefen dem
Carcinom vergleichen*). Nach Warburg werden in Sauerstoff vom
Carcinom etwa 10 Zuckermoleküle gespalten, während 1 oxydiert wird.
Es gelang ihm, den embryonalen Stoffwechsel durch Sauerstoffmangel
oder Blausäurevergiftung so umzuwandeln, daß er dem des Carcinoms
ähnlich wurde. Daß dies für die Torula auch möglich ist, ist in dem
obigen Versuch (Tabelle IX, Nr. 7) gezeigt worden. In der Tat ist in
diesem Versuch das Verhältnis der aerob vergorenen zu den veratmeten
Zuckermolekülen 4 und entspricht dem der Preßhefe.
Interessanter aber, besonders im Hinblick auf die Analogie mit
dem Carcinom, ist offenbar die umgekehrte Umstimmung des Stoff-
wechsels, nämlich die Atmung der Kulturhefe so zu steigern, daß sie
der der Torula gleicht und nunmehr das Verhalten von Gärung und
Atmung zu studieren. Eine solche Umstimmung gelingt nun wirklich
bis zu einem gewissen Grade.
F. Umstimmung des Stoffwechseltypus.
Schon oben wurde erwähnt, daß besonders die Atmung der
Brauereioberhefe in Zuckerlösung dauernd steigt. Die Gärung
dagegen steigt nicht, sondern fällt sogar in längerer Zeit in Zucker-
Phosphatlösung ab, so daß das Verhältnis zwischen Atmungs-
und Gärungsgröße sich mehr und mehr zugunsten der ersteren ver-
schiebt; dies ist viel stärker ausgeprägt in verdünnten Zuckerlösungen.
Abb. 2 gibt ein deutliches Bild dieser Verhältnisse. Die Atmung der
Brauereiunterhefe steigt langsamer, erreicht aber ebenfalls mit der
1) Diesen Vergleich von ('arcinom und Kulturhefe hat schon O. Warburg
selbst gezogen.
64 O. Meyerhof:
Zeit das Vielfache des Anfangswertes. Auf diese allmähliche Atmungs-
steigerung hat der Sauerstoff einen geringen Einfluß. Auch bei der
Gärung in Stickstoff ändert sich die Hefe im gleichen Sinne. Zum
Studium dieser Umstimmung des Stoffwechseltypus wurde die Hefe
anfänglich für 3 bis 5 Stunden, später meist für etwa 15 Stunden in
der Zuckerlösung gären gelassen. Es wurde hierfür wenig Hefe (0,2 g)
in 50 ccm Zucker-Phosphatlösung gebracht und ganz langsam weiter
aus einer Bürette noch etwa 50 ccm lproz. Zuckerlósung mit solcher
Geschwindigkeit zutropfen gelassen, daß der vergorene Zucker etwa
ersetzt wurde. In 15 Stunden war dann die ganze Zuckermenge an-
nähernd verbraucht. Meist wurde Sauerstoff, manchmal Stickstoff
durch die Gefäße geleitet. Obwohl der Anstieg in höherer Zucker-
konzentration langsamer erfolgt, wurde doch auch hier ungefähr der-
selbe Endwert der Atmung erreicht. Dagegen sind wohl nicht alle
Brauereihefen gleich gut für diese Umstimmung geeignet.
Zur Messung der Gärungs- und Atmungsgröße wurde ebenfalls
eine schwächere Zuckerlösung gebraucht als in den oben mitgeteilten
Versuchen, 0,5 bis 1 Proz. Hierin ist die Atmung schon an und für sich
etwa 20 Proz. höher als in 5 Proz. Traubenzucker. Man sieht aber aus
der Tabelle XIB, daß, während am Anfang der Quotient:
aerob vergorener Zucker
oxydierter Zucker
bei der hier benutzten Oberhefe 58, bei der hier benutzten Unterhefe 27
ist!), er am Schluß der Umstimmung im ersten Falle 3,7 und 3,9, im
zweiten Falle 4,7 und 5,0 ist. Es entspricht dies ungefähr dem Stoff-
wechseltypus der käuflichen Bäckerhefe, bei der das Verhältnis 2,5
bis 4,6 war. Doch sind vielleicht noch nicht die optimalen Bedingungen
für die Umstimmung erreicht worden.
Im folgenden sind zunächst die Anfangs- und Endwerte für die
Atmung und für die anaerobe Gärung zusammengestellt (Tabelle X).
Weiterhin ist der Oxydationsquotient der umgestimmten Hefen und
daneben der des Anfangszustandes untersucht. Wiederum finden wir
eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit der eingangs aufgestellten
These. War bei der kleinen Atmung der Brauereihefe die Wirkung
des Sauerstoffs am Anfang so gering, daB sie kaum noch quantitativ
genau zu bestimmen war und der Quotient entsprechend stark
schwankend, so finden wir jetzt nach der Umstimmung, daß mit großer
Regelmäßigkeit 1 Mol. Sauerstoff 11, Mol. Gärungskohlensäure zum
Verschwinden bringt.
1) Siehe Anmerkung $, 57.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 65
l Tabelle X.
Umstimmung des Stoffwechseltypus der Brauereihefe.
E Anserob vergor.
| aes j ,! HOA Zucker
, Hefe EE P | Qoz I SCH | veratmeter Zucker
: Netes 2 ou AAA ch De Se re E
Nr. | art Art der Umstimmung 13 a? | vor | nach | vor | nach vor | nach
i NICH: | Ums | Ums | Um» | Um: Ums | Um»
| stim- | stime stim» | stin, | stim» | stim»
l Proz. | mung | mung | mung | mung | mung , mung
la! | 5h in 0,5 proz. Zucker | 0,8 | 5,5 (93) 8
i! i u 8 |
1b | | 5h in 0,5 proz. Zucker (93) 14
| N,. 280
2a! | £ '2hin0,5 proz. Zucker 66 20
E O,. 28°
Zb: E 5h in 2proz. Zucker 66 25
© A 280
3 " 15h in 0,5 proz. Zucker ? 7
| (Zus. 2 Proz.). O,. 28
4 15h in 0,5 proz. Zucker 45 6,7
(Zus. 1 Proz.). O,. 28° |
D ` 15h in 0,5 proz. Zucker | 32 9
ı (Zus. 2 Proz.). O,. 20° | |
6 | 15h in 0,5 proz. Zucker j — 7
'1.2 || (Zus. 1 Proz.). O,. 20° | | i
7al | £ |15hin 0,5 proz. Zucker | 0,5 |25 |48 138 | — | 86
, $ (Zus. 1 Proz.). O,. 20° | |
7b [£ 15h in 0,5 proz. Zucker | 0,5 | 25 49 | 143 — 1.89
| > | (Zus. 1 Proz.). N,. 20° li |
Sai 15bin 0,5 proz. Zucker | 0,5 |25 | 48 138 | — , 87
(Zue. 1 Proz.).0, 200 | | | | |
8b, l 15b in 5proz. Zucker | 0,5 ¡25 ; 49 | 142 — | 87
In diesen Fällen versagte die Warburgsche Kästchenmethode zur
gleichzeitigen Messung von Atmung und Gárung, weil unter allen Umstánden
die Gárung in groBem Volumen stárker war, gleicherweise in Sauerstoff wie
in Stickstoff. Die Atmung dagegen blieb gleich. Es ist daher fiir die Aus-
rechnung der Versuche ausschließlich die Kombinationsmethode (A. M.)
verwandt worden, wo die Gárung stets im gleichen Volumen stattfand.
In einzelnen Fállen, wo mit der Kástchenmethode ein áhnlicher Wert
erhalten wurde, ist dieser in Klammern angegeben.
Die Anfangswerte fúr die Atmung der Oberhefe sind ziemlich
undefiniert, weil sie mit einer sehr kleinen Geschwindigkeit einsetzt,
die unter der der zuckerfreien Lösung liegt und dann rasch ansteigt.
Die angegebenen Qo,-Werte gelten nur für die Versuchszeit von
30 Minuten bis 1 Stunde.
In der Tabelle XI ist der Oxydationsquotient der umgestimmten
Hefe und in je einem Versuch mit gleichen Proben der Unter- und
Oberhefe auch für den Anfangszustand unter identischen Bedingungen
bestimmt worden.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 5
66 O. Meyerhof:
Tabelle XI A.
Oxvdationsquotient umgestimmter Bierhefen.
8”)
` S ot ob |
he N 3 > N e e
31313] 3 AI 328i 3 fs
Nr. Hefeart d E: 3 E ¿31/52 S Sr | Ss kiia
| 5 | cmm | cmm | cmm | > = jg Ga
Proz. mg > i 2 CO: i
Unterhefe, Ai l ras 30' 16,4 | 153,51 142,5 212 211 |196 | 0,7
a (1 5)
e Unterhefe, | 1 |29 | 40 140,5 | 373 |209 | 73 | 193 |113 | 1,10
Endzustand, `
15h Umstimm.
2 Unterhefe, | l | 2,651 A0) 94 1331 |165 | 54 | 189 | 90 ¡ 1,76
15h Umstimm. m. | | | | |
3 Oberhefe, ` (1 DA en 102 ¡348 | 188,5| 27 95 ¡ 51,5! 1,6
5h Umstimm. , (81,5) ;
4a Oberhefe, + 04 76 E 15 ¿325 | 288 6,4| 140 | 124 | 2,45
nfangszustand,
4b Oberhete, 04.35. so; 45 EI 210 | 193| 114 | 87 | 1,47
3h Umstimm.
5 | Oberhefe, | 1 : 58/40, 109 |282 [141 ¡28 | 73| 36 | 1,29
| 98 |
15h Umstimm. ! | | |
6 Oberhefe, | 1 Dä a 234 |107 ¡245| 66: 30 | 1148
'15b Umstimm. ` ) e SH |
*) Die eingeklammerten Zahlen sind die Atmungswerte der „Kästchenmethode*“.
Tabelle XT B.
| | Oxydationsquotient | `
| Hefe, anaerob verg. Zucker | aerob verg. Zucker |
na rasse _unvengorener Zucker _oxydierter Zucker | oxydierter Zucker | Bomerkungen
| , oxydierter Zucker | `
ENEE 7 Fee E EEE TEE A ee N i Se Kee
la | Sr | au 20 27 | Vor Umstimm.
1b E | 3.3 8 4,7 | 5h.
2 (EN 5,3 10,5 5,0 | 15h ¿
3 | e | 4,8 | 10,5 6,7 ' Sh Umstimm
4a | Do. 7,2 | 67 58 ı Vor :
Ge UN 4,4 17,5 13,6 a.
5 || | 3,9 7,9 3,9 ¡14h `
6 ¡JO | 44 ¡ 8.0 | 37 ha `
Welche Faktoren für die Umstimmung maßgebend sind, ist bisher
nicht genauer studiert worden. Da auch die Atmung in Gegenwart
von Alkohol, Milchsäure und anderen atmungswirksamen Stoffen mit
der Zeit ansteigt, können diese möglicherweise den Zucker er-
setzen. Für die Berechnung in absoluten Werten ist ferner zu berück-
sichtigen, daß das Gewicht der Hefe in Zuckerlösung, vor allem in
Sauerstoff, durch die Assimilation von Kohlehydrat zunimmt, während
für die Berechnung der Q-Werte das Anfangsgewicht zugrunde gelegt
wurde. Ob der Kohlehydratassimilation eine besondere Bedeutung
für die Umstimmung zukommt, erscheint fraglich, da diese ja in
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung d. Hefe. 67
Stickstoff ebensogut erfolgt, während die Assimilation hier viel kleiner
ist. Die umgestimmten Bierhefezellen zeigen zahlreiche Körnchen
und andere Konturen im Protoplasma, das bei der frischen Bierhefe
ziemlich homogen ist. Die Umstimmung betrifft, wie weitere Ver-
suche zeigen, hauptsächlich die Atmungsgröße in Zuckerlösung, jedoch
ist auch die Atmung in reinem Phosphat nachher deutlich erhöht.
Schließlich wurden Versuche gemacht, auch die Preßhefe noch
weiter in der Richtung der wilden Hefen abzuändern. In der Tat wirkt
auch hier der Aufenthalt in verdünnter Zuckerlösung im Sinne einer
Erhöhung der Atmung und Herabsetzung der Gärung, doch war diese
aerob vergorener Zucker
= veratmeter Zucker
sank von 2,55 auf 1,57. Dies zeigt der folgende Versuch.
Verschiebung nur geringfúgig. Das Verháltnis
Tabelle XII A. |
Umstimmung der M-Hefe in 1 Proz. Traubenzucker.
> E o SE
a N S os aa se el d
Nr. Zustand 23 3 | < 210 a | S Š | SI _
| E cmm | cmm | cmm | S | = = o”
E O E E SA O EE E
I Anfanpirustand E 167 30 229 | 63 | 90| 275| 76 | 22
2 | Umstimmung . | 1,67 | 30' 132 310 | 75 | 105 | 248 | 55 | 1,8
Tabelle XII B.
Ee: Oxydations» | Anaerob vergorener Zucker vergorener Zucker erob vergorener Zucker
By i quotient UN coxydiertet Zi Zucker Bee oxydierter ' Zucker Zil Bemerkung Bemerkungen
] | 66 | 92 | 2,55 | Vor Uat
2 54 | 7,1 | 1,67 | Nach .
IM. Über den Mechanismus des Sauerstoffeinflusses.
Im vorigen sind über den Mechanismus der Sauerstoffwirkung
keinerlei Annahmen gemacht worden. Auf Grund des Zusammenhanges
von Spaltungsstoffwechsel und Atmung im Muskel werden wir indessen
vermuten, daß auch in der alkoholischen Gärung ein Kreislauf besteht
derart, daß die End- oder Zwischenprodukte unter Aufwand von
Oxydationsenergie in die Ausgangsstufe zurückverwandelt werden.
In der Tat läßt sich diese Annahme durch eine Reihe verschiedener
Versuchsserien aufs äußerste wahrscheinlich machen.
Bereits Fürth und seine Mitarbeiter Lieben und Lundin!) haben an
Versuchen mit Bickerhefe festgestellt, daß bei starker Sauerstoffdurch-
1) Fürth und Lieben, diese Zeitschr. 128, 144, 1922; Lieben, ebendaselbst
135, 240, 1923; Lundin. ebendaselbst 141, 310, 1923; 142, 454, 1923.
ba
68 O. Meyerhof:
lüftung die folgenden Substanzen zu Kohlehydrat assimiliert werden
können: Milchsäure, Brenztraubensäure, Alkohol, Acetessigsäure, während
Acetaldehyd ohne Wirkung war. Die Versuche dauerten etwa 10 bis 20 Stun-
den bei Zimmertemperatur. Bei der Vergärung von Zucker in Sauerstoff
verschwand der gebildete Alkohol nachträglich ebenfalls unter Bildung
von Hefenleibessubstanz, zur Hauptsache höherer Kohlehydrate?).
Nun zeigen aber alle diejenigen Stoffe, von denen bekannt ist,
daß sie als Intermediär- oder Endprodukte der Gärung vorkommen,
und einige weitere, die in engster Beziehung zu diesen stehen, eine
äußerst auffällige Wirkung auf die Atmung der Hefe: sie verhalten
sich nämlich genau wie Zucker, d. h. sie steigern die Atmung der PreB-
hefe und ähnlich auch der wilden Hefe auf das Fünf- bis Achtfache,
beeinflussen die Atmung der Bier- und Weinhefe zunächst entweder gar
nicht oder nur geringfügig, aber mit der Zeit langsam zunehmend.
Die Atmungssteigerung bei der Preßhefe ist nur ein wenig geringer
als durch Zucker, am stärksten durch Äthylalkohol, der aufs 6,5- bis
9fache steigert. Dann folgen Brenztraubensáure, Acetaldehyd, Methyl-
glyoxal, Milchsäure und Essigsäure, die die Atmung auf das Fünf-
bis Siebenfache steigern. Daß es sich bei dieser Steigerung um eine
spezifische Wirkung handelt, geht klar daraus hervor, daß die nächst ver-
wandten und homologen Verbindungen völlig unwirksam sind. Essigsäure
und Milchsäure stehen Propionsäure und Buttersäure gegenüber, die in
der gleichen Konzentration überhaupt nicht wirken oder höchstens
hemmen. Dasselbe gilt für Formaldehyd und Propionaldehyd im Vergleich
zum Acetaldehyd. Der erste hemmt komplett in derselben Konzentration,
in der Acetaldehyd die Atmung um das Sechs- bis Siebenfache steigert.
Propionaldehyd ist unwirksam. Ebenso sind Methylalkohol und Propyl-
alkohol im Gegensatz zu Äthylalkohol wirkungslos. Ohne Wirkung
sind ferner eine Reihe von Substanzen, die bei der Gärung als Zwischen-
produkte auftreten oder bei Nebenreaktionen vorkommen können, so
Glycerin, Glycerinaldehyd, Aceton, Bernsteinsäure, Asparagin, Amino-
sáuren. Dioxyaceton wirkt schwach, steigert bei Brennereihefe bis
auf das Doppelte, bei Torula annähernd auf das Dreifache. Unwirksam
ist ferner Acetoin CH,.CO.CHOH.CH,, das nach Neuberg aus
der Kondensation eines Acetaldehydmoleküls in statu nascendi mit schon
2) Diese Tatsache bleibt richtig, wenngleich die von Lundin berechneten
Kohlenstoffbilanzen an dem Fehler leiden, die über eine zuckerfreie Kontrolle
hinaus in Sauerstoff gebildete Kohlensäure einfach als Gärungskohlensäure
anzusprechen und Zucker- und Alkoholumsatz hierauf zu berechnen. Wegen
der in Zuckerlösung ums Achtfache gesteigerten Atmung ist aber tatsächlich
die Hälfte dieser Kohlensäure Atmungskohlensäure. Die Abweichung von
der theoretischen Gärungsformel ist daher bei weitem nicht so groß, wie von
Lundin angenommen wird. Andererseits sind diese Experimente wegen
der die totale Vergärung des Zuckers weit übertreffenden Versuchsdauer
mit den meinigen nicht direkt zu vergleichen.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 69
gebildetem Acetaldehyd entsteht!). Ebenso unwirksam ist Acetaldol, der
Aldehyd der 8-Oxybuttersäure CH,.CO.CH,.COH und diese selbst.
Wir können genauer sagen, daß von den Gärprodukten diejenigen
wirken, die in dem Neubergschen Schema?) aus dem Molekül Methyl- -
glyoxal entstehen, das den Abbau über die Brenztraubensäure erleidet,
und ferner die durch Dismutation hieraus gebildeten Substanzen
(Methylglyoxal = Milchsäure, Acetaldehyd <> Alkohol + Essig-
säure). Auch spricht für die unmittelbar spezifische Wirkung dieser
Stoffe, daß die Atmungssteigerung von der Konzentration nahezu
unabhängig ist bis hinab zu m/200 Lösung und mit der Verdünnung
eher zu- als abnimmt.
Die Mehrzahl der Stoffe wurde an käuflicher Bäckerhefe und
Preßhefe Rasse M ausprobiert. Das Verhalten der charakteristischen
atmungswirksamen sowie einiger unwirksamer Stoffe wurde dann in
Stichproben bei allen anderen Hefen untersucht. Die Substanzen
waren alle Kahlbaumsche Präparate mit Ausnahme von Dioxyaceton,
das von der Firma Schering hergestellt war, Acetoin synth., das Herr
Neuberg mir zur Verfügung stellte, und Acetaldol, das Herr Dr. Lohmann
mir aus Acetaldehyd nach der Vorschrift von Orndruff und Neuberg?)
mit Kaliumcarbonat herstellte. Das mit Äther ausgeschüttelte Präparat
wurde zweimal im Vakuum (14 mm) bei 77 bis 78% destilliert.
Für die Versuche mit $-Oxybuttersáure verwandte ich anfangs das
Kahlbaumsche Präparat, das zur Entfernung etwa vorhandener flüchtiger
(Essigsäure) sowie in Äther weniger leicht löslicher Säuren (Milchsäure)
durch Ausschütteln der wässerigen Lösung mit Äther, Abdestillieren des
Äthers und längeres Erwärmen des Rückstandes auf 80° gereinigt wurde.
Tatsächlich steigerte nicht nur das ursprüngliche Präparat, sondern
auch das so weiter gereinigte die Atmung ums fünf- bis sechsfache.
Es erregte jedoch Verdacht, daß ein zweites Präparat auch nach der
Reinigung viel weniger wirksam war. Infolgedessen stellte Herr
Dr. Lohmann in unserem Laboratorium nach der Vorschrift von
Wislicenus B-oxybuttersaures Natrium aus Acetessigester her durch
Reduktion mit Natriumamalgam in der Kálte*). Die alkalische Lösung
wurde nach der Reduktion ausgeäthert, nach Ansäuern mit Salzsäure mit
Soda überneutralisiert, eingedampft, der Rückstand bei 110 bis 120% ge-
trocknet, mit heißem Alkohol extrahiert und das sich beim Erkalten aus-
scheidende $-oxybuttersaure Natrium dreimal aus Alkohol umkristal-
lisiert. Die Identifizierung geschah durch Überführung in Crotonsäure
und Schmelzpunkt;bestimmung. Das so hergestellte und gereinigte
1) Neuberg, diese Zeitschr. 148, 553, 1923.
2) Neuberg, Der Zuckerumsatz der Zelle. Jena 1913.
3) Monatshefte für Chemie 18, 516.
*) Liebigs Ann. 149, 207.
70 O. Meyerhof:
ß-oxybuttersaure Natrium erwies sich der Hefeatmung gegenüber als
vollständig wirkungslos.
In der Tabelle XIII A ist eine Auswahl der Messungen mit Bäcker-
hefe und Preßheie M wiedergegeben (Wiederholungen ergaben überein-
stimmende Resultate). Im Anschluß daran sind in Tabelle XIII B
die atmungswirksamen Stoffe nach der Größe der Atmungssteigerung
geordnet. Die hier nicht aufgeführten Stoffe sind ohne Einfluß. In
Tabelle XIV sind mehrere Vertreter der wirksamen Stoffe an Torula
und Kahmhefe untersucht worden, wo ihr Verhalten mit dem an der
Preßhefe nahezu übereinstimmt, nur daß die Steigerungen etwas ge-
ringer sind. Andererseits steigert Dioxyaceton hier stärker, obgleich
es auch von der Torula nicht stärker vergoren wird. Schließlich sind
in Tabelle XV einige Stoffe an Bier- und Weinhefe geprüft. Ganz
ähnlich wie in Gegenwart von Zucker steigt die Atmung hier im Laufe
einiger Zeit allmählich an, besonders stark bei der Bieroberhefe (vgl.
hierzu die Abb. 1 und 3, wo neben der Wirkung des Zuckers die von
Äthylalkohol und Milchsäure verzeichnet ist). Die verschiedenen Bier-
hefen verhalten sich gegenüber Zucker nicht genau gleich. Doch besteht
ein durchgängiger Parallelismus zwischen der jeweiligen Wirkung des
Zuckers und dieser atmungswirksamen Substanzen. Nur ist die Atmungs-
steigerung im allgemeinen durch Zucker größer. Andererseits ist
bei obergäriger Bierhefe in der ersten halben Stunde oft eine starke
Hemmung der Atmung in Zuckerlösungen zu beobachten, die dann
rasch einer Steigerung Platz macht.
Die Erklärung für diese eigenartige zuckergleiche Wirkung der
genannten Stoffe ist nun mit hoher Wahrscheinlichkeit die, daB sie
bei der Atmung in Zucker zurückverwandelt werden. Für Milchsäure
und Brenztraubensäure ergibt sich das zunächst aus der Analogie
mit dem Muskel, dann aus den angeführten Ergebnissen Fiirths und
seiner Schüler. Für den Alkohol und Acetaldehyd kann man es, und
zwar quantitativ, aus dem respiratorischen Quotienten entnehmen
(s. die Tabelle XVI). Denn der respiratorische Quotient für die direkte
Oxydation des Alkohols wäre 0,66; wird andererseits der Alkohol zu
Zucker oxydiert, so ist der respiratorische Quotient 0. Tatsächlich
findet sich der respiratorische Quotient im Durchschnitt zu 0,35. Man
kann daraus berechnen (s. unten), daß 3 bis 3,5 Mol. Alkohol zu Kohle-
hydrat assimiliert werden, während 1 Mol. verbrennt. Ähnliches gilt
für den Acetaldehyd. Der respiratorische Quotient bei totaler Ver-
brennung wäre 0,80; gemessen werden, übrigens mit Schwankungen,
0,69. Hieraus berechnet sich, daß für die Oxydation von 1 Mol. Acet-
aldehyd etwa 1 Mol. assimiliert wird. Die Assimilation des Äthyl-
alkohols ist auch durch die Kohlenstoffbilanzen von Fürtk und Mit-
arbeitern nachgewiesen, die andererseits den Acetaldehyd wirkungslos
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung d. Hefe. 71
Tabelle XIIIA.
Atmungssteigerung durch Intermediäre- und Endprodukte der Gärung.
e | e
S 653 | 3 |88| 38 8.13.
Zusatz Kb SET | S GE E ©: | d:
Së IE | E |M] ON | ST O%
© > SST
we > mg cmm | cmm | |
| |
1 | B | Brenztraubensaures Na | 0,1 66 1h |64 380 9,7 55
2 || B | Brenztraubensaures Na || 0,1 6,4 | 45'|42 293 8,8 | 61,5
| Milchsaures Na 0,2 6,4 222 | 46,5
| Äthylalkohol 0,2 6,4 272 | 57
3 | B | „ Alanin 0,2 66 | 30 137,6 31 11,8 | 9,4
4 | B| Äthylalkohol 0,2 64 | 30 |31 |214 | 97/67
| Äthylalkohol 1,0 64 | 30 207 | 65
| Methylalkohol | 0,4 64 | 30 | 33 ‚10,8
5 | B |Brenztraubensaures Na 0, 3,2 | lh |36 |229 | 112 |72
\ || Dasselbe +Äthylalkohol 0.1 +0,4 32 | 1 279 87
| | Traubenzucker 0,1 3,2 | 1 243 76
| || Traubenz. + Äthylalk. (01+04/ 3,2 | 1 | 248 78
eh Propylalkohol 0,4 32 | 1 | 39,5 ‚12,3
6| M. Milchsaures Na 0,08 26 | 1 |28,5|198 |110 |76
7M | Milchsaures Na 0,08 2,5 |1b20'| 32,5 | 187 9,8 156
I | Äthylalkohol 10,2 25 |1 20| 251 75
8 | M | Essigsaures Na | 0,07 25 | 1b | 4 |132 9,7 153
| | Acetaldehyd 10,007 | 25 | 1 | 184 74
I | Äthylalkohol 10,2 2,5 | 217 87
| ' Propionsaures Na 0,07 2,5 | | 15 6,0
po į Aceton 0,18 | 25 | 14 5,6
| Formaldehyd 0,01 2,5 0 0
| | Glycerin 10,02 | 2,5 26 10,1
9|M| Propionaldehyd 002 | 29 | 1 |30 35 |103|121
| | Formaldehyd 0,001 2,9 32,5 | 11,2
| Glycerin 10,07 | 2,9 32 | 11,0
| | Glycerinphosphors. Na 0,07 2,9 24 8,3
| || “Glycerinaldehyd 002 29 41.5 | 143
| | Dioxyaceton 0,02 2,9 52 18,0
10 |M | Butyrin (mono) 1005 28 | 40 — | 155 8,3
ll Methylglyoxal 0,02 2,8 | 123 66
| Äthylenglykol 1002 28 | 15,5 8,3
| Asparagin 10,07 2,8 | 13 7,0
11 | M | Methylglyoxal 0,01 29 | 1h — |165 57
| Ölsaures Na i< 0,05 2,9 | 21,5 7,5
12 || M | Buttersaures Na OI 29 | 1 27 7 94| 22
Weinsaures Na | 0,1 2,9 28 9,7
| Bernsteinsaures Na 0,1 2,9 27 9,4
| | Glykokoll 0,2 2,9 30 10,3
13 |M Acetoin (omg 29 | 1 32 | 42 |110|145
| Acetoin 0014 29 31 107
Acetoin 0,004 29 36 12,4
| Acetaldehyd '0,008 29 191 66
14 |X Acetaldol 0025 26 ag 110| 115| 68166
„Acetaldol 0,005 26 14,5 82
15 M Äthylalkohol ‚0,3 AN VE 9,0 158
16 | M Acetaldehyd 10,007 3,0 |1h20' 36 |256 | 86 |61
|
72 O. Meyerhof:
Tabelle XIIIB.
Wirksame Stoffe nach der Atmungssteigerung geordnet.
V | Vielfaches
“| Stoffe | vemor H egen Do, | Durchschn,
(Durch- | | 85
'fschnitt 85) d
2 | Athylalkohol . .. . 2 57 6,5 |
| i 65 ei
7 ep 77 1,2
8 87 90
| 15 85 6,4
3 | Acetaldehyd . . . . . 8 74 6,7
13 66 6.0 6,6
| 16 61 71
4 | Brenztraubens. Na. . 1 55 5,7
| 2 61,5 7,0 | 6,4
5 72 6,4
5 | Methylglyoxal . . . . | 10 66 64
con 18 5,5 | 60
6 | Milchsäure . . . . . | 2 46,5 5,8
| 6 76 69 | 6,0
| 7 56 57
7 || Essigsäure... e, | 8 58 5,5 5,5
8 || Maltose : | Tab. I 9 40 42 42
9 || Galactose ...... 515 18,3 1,8 | en
10 15,8 1,5
10 | Dioxyaceton. . . . . | 18,0 15 | 1%
Tabelle XIV.
Atmungssteigerung bei wilden Heferassen.
= | p
l, R | GER. 5 S N 2n | Y e | A
ge 23 o N KE | 8% & f) g x on
Nr. | Hefeart Zusatz | 23 SE 3 S | e | $ £ ng E 2
pE Eag] ¿[ON ON, SS | ON Se
; © ! = ' O Q E
| ES | mg | > | emm | cmm ¡>
== i— a me ng SS? A e ia Fr pen eg E a p ES A eg AR
] ¡Mycoderma | Milchsaures Na ' 0,07 , 3,0 |30| oa 32 ' 221107 49
2 N Alanin. . . . [0,1 | 853 |14 122 29 25 —
OS Äthylelkohol . 02 ' 10,8 | 45 | 30,5 145 3,15 17,9 ' 48
4 | Torula | Milchsaures Na | 0,07 | 55 '20”'445]/|133 |24 |72 (än
Äthylalkohol . | 0,2 5,5 ' 20 | 169 91 | 3,8
5 Acetaldehyd . 0,007| 2,5 |40 ; 31 |157 |18,6 | 94 | 5,0
I 0,02 | 25 a | 27,5 | 104 |27,5 | 62,5 | 3,3
6 | EE | | 003 | 165/40; "| 72 | ° I72o| 26
7 = . Hexosepbosphors. |j 0,07 25 40:31 , 47 |18,6 | 28 1,5
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 73
Tabelle XV.
Atmungssteigerung bei Bier- und Weinhefen.
GEN too Të la Be =
| I, | S SET, S en Zn 2 e 8
i i a E e sl BS Axr E 3 ny
Nr., Hefeart Zusatz i ER 3 J 3 3 AS ME 8 £ 2
, LE Eg ajo N | óS SS ES
| | "e | > O K
E EE
{Unte ärige EE | 0,2 94 | lb | 59 45,5 | 6,3 4.9 —
Ä A d ig Na á | i
o i
2 |Untergärigel| Brenztraubons. Na | 0,1 | 60 [1 |34 6,0 | 11,6 | 1,9
, „ sbuibrauer, Athylalkohol |) 0,2 6,0 |1 9,9 | 1,6
d u Obergärige | Atbylalkohol 0,1 32 |1 | 33,5 Js o 15,5 | 17,0 |1,1
VIE, || Propylalkokol || 0,1 | 3,2 | 30,0 14,0 | —
| brauerei l |
4 | e Brenztraubens. Na || 0,1 114 ¡2 en 216 94 | 95| —
bi — | Acetaldehyd || 0,007 | 1,45 | 1 11 | 90| 76| —
6 | „ Athylalkohol 0,2 1 22 5 | 28,5 6, 4 | 81113
7 | vn | Milchs. Na 0,07 3,45 | 30' 30 |37 117 5 21,5 |1,2
By | Milchs. Na [007 | 33 |ım |22 |35 | 6,7106 1,6
| Winningen | Xehylalkohol || 0,2 33 |1 | 38,5 11,7 | 1,75
fanden. Dies liegt jedoch zweifellos nur an der von den Autoren be-
nutzten zu hohen Konzentration von etwa m/3. Bei dieser wird, zuma)
in längerer Zeit, die Atmung allmählich stark gehemmt. Die von mir
benutzte Konzentration ist m/100 bis m/200. Die Umbildung in Zucker
läßt sich bei Stoffen, deren respiratorischer Quotient 1 ist d. h. für Essig-
säure, Methylglyoxal, nicht auf diesem Wege erweisen, ergibt sich aber
aus Analogien. Die genannten Stoffe sind von Fürth nicht geprüft worden,
wohl aber die Acetessigsäure, die ich meinerseits nicht untersuchte, weil
sich Verunreinigungen mit Essigsäure nicht ausschließen lassen. Nach
dem vorhergehenden scheint es naheliegend, daß die Assimilation der
Acetessigsäure zu Kohlehydrat sich ähnlich erklärt wie die oben er-
wähnten scheinbar positiven Resultate mit ß-Oxybuttersäure, nämlich
durch Verunreinigungen oder Spaltprodukte. Vielleicht entsteht auch
Essigsäure erst in Gegenwart der Hefe aus Acetessigsäure. Über den
respiratorischen Quotienten gibt die Tabelle XV Auskunft.
Der respiratorische Quotient wurde teils, wie in früheren Versuchen,
durch Kombination dreier Messungen bestimmt: eine Kontrolle, in die zu
Versuchsbeginn 0,5 ccm n HCl aus dem sackförmigen Anhang des Respira-
tionsgefäßes eingekippt wird, um die präformierte Kohlensäure auszutreiben,
ein zweites ebenso beschicktes Versuchsgefäß, in das zum Schluß des Ver-
suchs 0,5 ccm n HCl eingekippt wird, um die präformierte und gebildete
Kohlensäure auszutreiben, soweit sie nicht in den Gasraum entwichen ist,
und ein drittes Atmungsgefäß, im Einsatz NaOH, um den gleichzeitigen
Sauerstoffverbrauch festzustellen. Da jedoch als Versuchslösung reines
KH,PO, diente, das ebenso wie die Mehrzahl der für die Oxydation be-
nutzten Stoffe keine Kohlensäure retiniert, so findet sich praktisch keine
74 O. Meyerhof:
durch Salzsäure auszutreibende Kohlensäure in der Lösung, und es genügten
daher zur Bestimmung des respiratorischen Quotienten zwei Gefäße, eins
mit NaOH im Einsatz und ein zweites ohne NaOH. Obendrein zeigt sich
beim Einkippen von Salzsäure in die mit Alkohol oder Acetaldehyd ver-
setzte sauerstoffgeschüttelte Hefesuspension noch eine eigentümjiche
Komplikation: Es wird beim Ansäuern rasch eine gewisse Menge Sauerstoff
verbraucht, die auf die Oxydation eines labilen Zwischenprodukts zurück-
zuführen ist, das aus Alkohol und Acetaldehyd in Gegenwart sauerstoff-
geschüttelter Hefe entsteht. Es wurde daher in der Regel der respiratorische
Quotient nach der letztgenannten Methode bestimmt. Die Schwankungen
der Werte bei Alkohol und Acetaldehyd, die die Versuchsfehlergrenze
übertreffen, sind wohl auf verschieden starke Assimilation zurückzuführen.
Tabelle XVI.
Respiratorischer Quotient in Gegenwart assimilierbarer Substanzen.
| | è | Bu
| | Sg | R.Q.
Nr. Heferasse Zusatz en ‚ Zeit | Hefe | O? CO, | RQ. Durch, i QO.
ar | schnitt
= | mg cmm Si cmm | f A
Bid. ea — |3 ? 250 215 (086 aa;
2 , Brauerei» . — i 2b 11,4 | 213 |174 ¡0,82 j 084 9.4
Oberhete ` o | ! els rl ls e
3 | M.Hefe | Milchs. N Tom: 0,08: (man y: 25 | 2,5 1 187 [171 091 156
4 MeHefe | ea 10,2 [1520'| 25 | 251 | 97 |0,885 75
5 , 8 0,2 | 1h | 25 |217| 99 '0,455' logi 87
6 T $ 025 | 1 | 30 |173| 435'025 | 58
A x 03 |1h30': 20 | 208 | 58,0/0,29 |) |6 | 69.5
8 | M-Hefe | Acetaldehyd || 0,008 1h | 25 | 184 |110,5'060 |y |7. | | 74
9 e Ch E 0,005 | 1 165 | 1255/076 | 0.69.
u y | 2 0,007 | 1120’ 3,0 | 256 193 1075 if, 61
De S 0007! 50' | 30 ' 188 '126,5 0,67 75
Jo Ae -3»Oxybutt SE A lara aa laos. nam: | En:
12 | M.Hefe | P-Oxybutier 1 0,07 | lh | 2,88) 143 |124 [0,87 | | 50
*) Unreines Kahlbaumsches Präparat.
Ist nun der respiratorische Quotient mit Alkohol durchschnittlich
0,35, so kann man zur Berechnung des zu Zucker oxydierten Bruchteils
die folgende Überlegung anstellen: Bei ausschließlicher Oxydation
von Alkohol zu Kohlensäure und Wasser erhielten wir 0,66. Da aber
daneben wohl noch die ursprüngliche Atmung mit dem respiratorischen
Quotienten von 0,84 weitergeht, würde sich im Durchschnitt 0,68
ergeben. Die unbeeinflußte Atmung, die etwa ein Achtel des Gesamt-
umsatzes beträgt, ist auch bei dem respiratorischen Quotienten von
0,35 zu berücksichtigen. Auf die Alkoholoxydation selbst entfiele
demnach nur ein Quotient von 0,28 bis 0,29. Für die Oxydation von
3 Mol. Alkohol zu Zucker gilt die Gleichung:
3C,H,0H +30, = C,H,0, + 3 H,0.
Für die totale Oxydation von 1 Mol. Alkohol gilt die ee:
1 CHOH + 3 0, = 2 CO, + 2 H,O.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 75
Im Falle, daß sich beide Reaktionen in der angegebenen Pro-
portion gleichzeitig abspielten, würde der respiratorische Quotient
gerade 0,33 sein. Der von uns hier berechnete Quotient ist noch
etwas kleiner. Es würden also mehr als 3 Mol. Alkohol zu Zucker
oxydiert, während 1 Mol. total verbrennt. Ob diese Verbrennung
direkt oder auf dem Wege über Zucker erfolgt, kann nicht entschieden
werden. In ähnlicher Weise kann man berechnen, daß bei dem ge-
fundenen respiratorischen Quotienten von 0,69 für die Oxydation
des Acetaldehyds an Stella des theoretischen von 0,8, pro 1 Mol. total
oxydierten Aldehyds etwa 1 Mol. auf der Zuckerstufe assimiliert wird.
Diese Zahlen geben aber nur die untere Grenze der Assimilation an,
da ja auch die totale Oxydation über die Stufe des Zuckers geschehen
kann. Auch kommt diesen Werten nicht dieselbe Bedeutung wie dem
in den vorigen Abschnitten betrachteten Oxydationsquotienten zu,
denn die Assimilation des Alkohols und Acetaldehyds zu Zucker isı
als Oxydation ein freiwilliger Vorgang, der keiner weiteren Energie-
lieferung bedarf.
Die Wirkung des Sauerstoffs auf die Gärung beruht demnach
ohne Zweifel auf einem ähnlichen Kreislauf des Kohlehydrats wie im
Muskel. Weitere Überlegungen machen es wahrscheinlich, daß dieser
Kreislauf sogar in beiden Fällen identisch ist und ebenfalls wie dort
über die Milchsäure oder Brenztraubensäure führt.
I. Spaltung, freiwillig 1. + O,, Spaltung
Zucker 2 Milchsáure oder Zucker 2 Brenztraubensáure
II. Synthese, unfreiwillig II. — O,, Synthese.
Man könnte zunächst daran denken, daß der Kreislauf über das
Endprodukt des Gärungsstoffwechsels, den Alkohol, führe, der ja in
der Atmung in Zucker verwandelt werden kann. Das wäre natürlich
nicht so zu verstehen, daß Alkohol + Kohlensäure zu Zucker resynthe-
tisiert werden würden, sondern daß der Alkohol allein zu Zucker oxydiert
wird. Die Bilanz würde dann lauten:
+60,
Dieser Kreislauf müßte so verlaufen, daß von 3 Mol. Hexose,
die zu Alkohol und Kohlensäure vergären, durch die Oxydation des
gesamten entstandenen Alkohols zu Zucker 2 Mol. wieder resynthetisiert
würden. Wäre dies der zugrunde liegende Vorgang, so würde unsere
76 O. Meyerhof:
bisher durchgeführte Berechnung abzuándern sein. Es wäre dann
nicht die Atmungskohlensäure von der aeroben Gesamtkohlensäure
abzuziehen gewesen, da ja der respiratorische Quotient der Atmung 0
sein würde. Das, was bei der Sauerstoffatmung ‚verschwunden‘
wäre, wäre nicht Gärungskohlensäure, sondern Atmungskohlensäure.
Diese Annahme kann jedoch für die sich abspielende Hauptreaktion
nicht zutreffen. Denn es könnte pro Molekül Sauerstoff in diesem Falle
nur 1 Mol. Kohlensäure verschwinden. Dagegen verschwinden ja in den
am genauesten zu untersuchenden Fällen bei der Preßhefe pro 1 Mol.
Sauerstoff gut 2 Mol. Kohlensäure (Oxydationsquotient =6). Auch
könnte 1 Mol. Sauerstoff nur 1Mol. Alkohol zu Zucker oxydieren, während
unter den gleichen Umständen 2 Mol. Alkohol verschwunden sind. Da
gleichzeitig Alkohol und Gärungskohlensäure im gleichen Betrage ver-
schwinden, muß die Resynthese an einer Stelle einsetzen, wo diese
Kohlensäure noch nicht abgespalten ist, also an einer Dreikohlenstoff-
verbindung. Dies ist aber Methylglyoxal, Milchsäure oder Brenz-
traubensäure. Da in der Hefezelle sicherlich diese drei leicht ineinander
übergehen können, ist die Wahl an sich beliebig. Vielleicht kann man
der Brenztraubensäure, die im Gärungsablauf vorkommt, hier vor der
Milchsäure den Vorzug geben, zumal die Steigerung der Atmung durch
Brenztraubensäure höher als durch Milchsäure ist. Doch möchte ich
diese Frage offen lassen. Zu den zahlreichen Übereinstimmungen,
die sich schon früher zwischen Kohlehydratumsatz bei der alkoholischen
Gärung und bei der Atmung in tierischen Organen, speziell im Muskel,
ergeben hatten!), kommt nunmehr eine neue: der Kreislauf des Kohle-
hydrats, der durch die Oxydation, und zwar eine Oxydation, die
mindestens vorwiegend selbst das Kohlehydrat betrifft, unterhalten wird.
Schließlich sei noch auf einen Punkt hingewiesen: Da die zucker-
ähnlich auf die Atmung wirkenden Substanzen alle bei der Vergärung
des Zuckers im Hefestoffwechsel entstehen, ist nicht von vornherein
sicher, ob eigentlich der Zucker selbst oder irgend ein anderer dieser
Stoffe der Träger dieser spezifischen Atmungswirksamkeit ist. Für
den Zucker spricht jedoch erstens, daß die Atmungssteigerung mit
ihm stärker als mit irgend einem der anderen Stoffe ist, was sich dadurch
erklären würde, daß die jeweilig durch die Resynthese erzeugte Zucker-
konzentration wegen der sofort anschließenden Oxydation ganz niedrig
bleibt?). Hinzu kommt, daß das identische Verhalten von Alkohol,
Essigsäure, Acetaldehyd einerseits, von Methylglyoxal, Milchsäure,
Brenztraubensäure andererseits nur durch die Resynthese zu Zucker
1) Siehe z. B. O. Meyerhof, Zeitschr. f. physiol. Chem. 101, 165, 1918;
102, 1. 1918.
2) Tatsächlich ist bei Veratmung von Milchsäure oder Alkohol durch
Hefe in der Lösung analytisch kein Zucker nachweisbar.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 77
verständlich wird, da ja aus den ersteren Stoffen nur eine Vier-
kohlenstoffverbindung aber nicht eine Dreikohlenstoffverbindung
entstehen kann. Neben dem Hauptkreislauf über die Brenz-
traubensäurestufe spielt sich wohl auch die Resynthese des Alkohols
zu Zucker bei der Atmung dauernd ab. Dieser Prozeß könnte
mit für die Schwankungen des Oxydationsquotienten verantwortlich
sein, denn der partielle Kreislauf über Alkohol würde denselben von
dem Werte 6 teilweise auf den von 3 herabdrücken.
Der angenommene Kreislauf des Kohlehydrats darf nicht so auf-
gefaßt werden, als ob der resynthetisierte Zucker nun quantitativ
von der Hefe assimiliert wäre, wie es im Muskel geschieht, und dadurch
aus der Lösung verschwindet. Der Vergleich des Zuckerschwunds
mit der Gárungs- und Atmungsgröße ergibt vielmehr, daß die Ver.
hältnisse zwischen denen im Muskel und denjenigen liegen, die von
O. Meyerhof und P. Finkle!) bei Milchsäurebakterien gefunden worden
sind. Bei diesen nämlich fand sich die in Sauerstoff ‚verschwundene
Milchsáure** quantitativ als nicht gespaltener Zucker in der Lösung
vor. Bei der Hefe wird nun ebenfalls weniger Zucker in Sauerstoff
als in Stickstoff zersetzt. Bestimmt man aber gleichzeitig Kohlen-
säurebildung, Sauerstoffverbrauch und Zuckerschwund, so ergibt sich
in Sauerstoff eine größere Differenz zwischen dem titrierbaren Zucker-
schwund und dem durch Oxydation und Vergärung berechneten Ver-
brauch als in Stickstoff. Bei Versuchen mit Preßhefe (Rasse M) in
kurzen Zeiträumen (etwa 1 Stunde) und verdünnter Zuckerlösung
(0,25 Proz.) werden in Stickstoff etwa 20 bis 30 Proz., bezogen auf den
Umsatz des Zuckers, mehr verbraucht, als sich aus der Gárungskohlen-
säure berechnet, was zum größten Teil auf Kohlehydratassimilation,
zum geringeren auf Nebenprozesse zu beziehen ist. In Sauerstoff da-
gegen beträgt diese Differenz 50 bis 120 Proz. Dieses Plus muß auf
die in Sauerstoff gesteigerte Assimilation der Hefe bezogen werden.
In absoluten Zahlen ergibt sich etwa das folgende Bild (s. Tabelle XVI):
8 mg Preßhefe mit 75 Proz. Wassergehalt = 2 mg Trockengewicht
setzen von 5mg Zucker in 2ccm Phosphatlösung in einer Stunde bei
28° in Stickstoff etwa 3 mg, in Sauerstoff etwa 2,2 mg um. Anderer-
seits berechnet sich aus der Kohlensäurebildung in Stickstoff eine
Vergárung von etwa 2,2 mg, in Sauerstoff eine Veratmung und Ver-
gärung von etwa l mg. Im ersten Falle sind also ungefähr 0,8, im
zweiten 1,2 mg auf anderem Wege verschwunden. Die Differenz beider
Zahlen = 0,3 bis 0,4mg muß auf die durch den Sauerstoff bewirkte
Assimilation bezogen werden. Die relative Größe der Assimilation erklärt
sich vielleicht dadurch, daß die dünne Hefesuspension in der minera-
lischen Lösung noch organisches Material zum Wachstum vorfindet.
1) Chemie der Zelle und Gewebe 12, 157, 1925.
78 O. Meyerhof:
Tabelle XVII.
Vergleich von Zuckerverbrauch, Kohlensäurebildung und Sauerstoffatmung
bei der Preßhefe (Rasse M).
A. Dee ungen.
|
|
T ajo af.) I. | e
SS CEA EA SS. wi E= SE
Ne. [E BR Eo E ZO go ll
= BS Ga" SIS. > 32:35
AN Ad es Ä = ME ¡9 | ae
ln |
98 , (194)*) 80 | (1,2); (3,6)
85 | 24
E 223 84 | 165 50
915| 237 | 77 175. 53
1185 226 | 45 153| 46
1055| 200 | 30 | 160| 48
98 | 148 | 22 ' 131! 39
*) Aller Zucker vergoren.
B. Titrierter Zuckerschwund.
en 1 bis 4 Bertrand- nn Versuch 5 bis 7 Hagedorn d ensen
D e E a A GER k a| Essl
DE ag ap mit ads lion (Gë:
nl 8 | 88 s5 35E Zaig Fnr] Egt EC
eem | y mg mg ` mg mg m | _ Proz.
(him 13'| 1,5 |Vorher! 3,50 |
N, [00 | 3,50 293 0,57 20
| O, |103| 247 119 168 0,79 47
2 |1 13 | 20 | Vorher! 5,00 |
N, |200| 300 244 0566 : 2
O, (3001 1,91 0,73 096 ; 095 | 100
3¡1 7 | 2,0 ¡Vorher| 5,00 | | |
| N, |203| 297 204 093 45
| O, 12,73| 2,27 077 103 124 120
4 |1 20 | 20 ¡Vorher| 5,03 ' |
N, |160, 343 2,68 08538
O, 1277, 226 | 0,8 118 | 18 9
51 3| 20 ¡Vorher| 5,28: Ä |
N, ‚285 243 | 1,89 0,54 28
| Oz 4,98; 132 | 0,38 0,71 0,61 86
6 |1 33 | 2,0 | Vorher 4,81 |
N, 223 2,58 ` 2,09 0,49 23
3,59; 1,22 0315 | 066 ' 0,56 85
7111 3! 20 u 4,81 | | |
| N, |237| 2,44 | 1,78 | 06 37
O, |331| 150, 0,266 0,65 0,85 ` 130
Die Zuckerbestimmungen wurden teils nach Bertrand ausgeführt, in der
von Michaelis angegebenen Halbmikromodifikation!), teils rach Hagedorn-
Jensen?). In unserer Ausführung erhielten wir mit abgemessenen Zucker-
1) Diese Zeitschr. 59, 166, 1914.
2) Fbendaselbst 185, 546. 1923.
- Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 79
lösungen zwischen 0,6 und 1,3 mg, wie sie den Versuchen entsprachen, und Ti-
tration mitn/100 Permanganat durchschnittlich um 8,1 Proz. höhere Zucker-
werte,als in der Tabelle von Michaelis verzeichnet sind. Andererseits zeigten
die Resultate in 20 Kontrollbestimmungen eine mittlere Abweichung # vom
Drrehechritt + 2,1 Proz. (mittlerer Fehler = 0.47 Proz.). was für unsere
Zwecke ausreichend .genau war. Die Methode von Hagedorn-Jensen wurde
mit n'100 Lösungen in unserem Laboratorium in häufig erprobter Weise
durchgeführt. Es wurde in den Versuchen der Anfangszuckergehalt nach
Vermischen mit der Hefesuspension und Abzentrifugieren festgestellt und
ebenso am Schluß der etwa einstündigen Gärungsversuche. Stets wurden
Doppelbestimmungen mit je 0,5 oder 0,75 ccm der Lösung vorgenommen.
Die Resultate der Gasmessungen wurden dann von der Versuchszeit auf
die Gesamtzeit umgerechnet und mit dem Ergebnis der Zuckertitration
verglichen (siehe die Tabelle XVI). Anfangskonzentration 0,25 Proz.
Zucker. Im Versuch 6 und 7 wurde die Hefe erst im Beginn der Gärungs-
messung mit der Zuckerlösung vermischt, so daß Gesamtzeit und Respira-
tionszeit fast genau übereinstimmten.
IV. Besteht der Einfluß des Sauerstoffs auch bei der Gärung getöteter Hefe?
Die Frage, ob der im vorigen beschriebene Einfluß des Sauerstoffs
vom Leben und der Struktur der Zelle unabhängig ist, ist für das Ver-
ständnis des Vorgangs von großer Wichtigkeit. Beim Muskel besteht,
wie früher gezeigt wurde, der Kreislauf des Kohlehydrats zwar auch
in der zerschnittenen Muskulatur, die in Phosphatlösung suspendiert
wird, fort, jedoch nur eine gewisse Zeitlang; späterhin bringt der Sauer-
stoff nur noch wenig oder gar keinen Spaltungsumsatz mehr zum
Verschwinden!). Die zerschnittene Muskulatur besitzt obendrein
noch Struktur, nur das funktionsfähige Organ ist zerstört. Anderer-
seits spricht die wechselnde, von der Beschaffenheit des Muskels ab-
hängige Größe des Oxydationsquotienten dafür, daß hier nicht einfach
eine in Lösung ablaufende gekoppelte Reaktion vorliegt, sondern eine
Energieübertragung in einem mehrphasigen System, deren Ausbeute
von der Intaktheit der Struktur und Milieubedingungen abhängt.
Obgleich die Untersuchung des Sauerstoffeinflusses auf die Gärung
abgetöteter Hefe (Acetonhefe) und Hefeextrakt (Mazerationssaft
von Lebedew) durch eine Reihe von Komplikationen erschwert ist,
glaube ich in diesen Versuchen eine Bestätigung der obigen Ansicht
sehen zu dürfen: Derjenige spezifische Einfluß des Sauerstoffs, den
wir auf den Kreislauf des Kohlehydrats in der Atmung bezogen haben,
ist verschwunden. Allerdings ist der Sauerstoff auch hier gegenüber
der Gärung keineswegs indifferent. Doch muß man dafür zu einer
anderen Erklärung greifen. Bekanntlich setzt sich der Gärverlauf
bei Hefemazerationssaft und in ähnlicher Weise bei Aceton-
hefe aus mehreren Abschnitten zusammen, deren Geschwindigkeit
1) Pflügers Arch. 188, 114, 1921.
80 O. Meyerhof:
durch verschiedene kontrollierende Faktoren bestimmt ist!): Induktions-
periode, — Gäranstieg, Gärungsmaximum und Gärungsabfall —
diese drei entsprechen der Periode der Phosphatveresterung — und
dann die Phase annähernd konstanter Geschwindigkeit, die durch die
Spaltungsgeschwindigkeit der Hexosephosphorsäure bestimmt wird.
Die Gärungsgröße in jeder Periode hängt nun weiter von der Kon-
zentration und Art des Zuckers, dem vorhandenen Phosphatgehalt,
der Konzentration des Koferments und anderen regulierenden Faktoren,
wie Hexosephosphat, Acetaldehyd usw., ganz allgemein von den
Milieubedingungen ab, vor allem aber von dem Zymasegehalt der
Präparate.
Was den Sauerstoffverbrauch getöteter Hefe betrifft, der bereits
früher genauer untersucht wurde?), so unterscheidet er sich stack von
der Atmung der lebenden Hefe. Er wird erhöht durch gewisse Milieu-
bedingungen und Substanzen, die auf die lebende Hefe gar nicht ein-
wirken, z. B. steigt die Atmung der getöteten Hefe von py 5 bis py 7
auf das Doppelte, durch Zusatz von 0,05 Proz. Methylenblau auf das
Drei- bis Vierfache und anderes mehr. Andererseits ist, wie die gegen-
wärtigen Versuche zeigen, der spezifische EinfluB des Zuckers und
der zuckerähnlich wirkenden Stoffe auf die Oxydationsgröße der PreB-
hefe bei den aus ihr hergestellten Präparaten in Wegfall gekommen,
und zwar auch dann, wenn der Zucker von ihnen vergoren wird. Aller-
dings ist der Sauerstoffverbrauch der aus PreBhefe hergestellten Aceton-
hefe von vornherein erheblich größer als der aus Bierhefe, was mit
den Eigenschaften der lebenden Hefe zusammenhängen kann. Doch
besteht dieser Unterschied hier schon in zuckerfreier Lösung.
Die Gärkraft der aus den verschiedenen Heferassen hergestellten
Präparate weist, wie bekannt, große Unterschiede auf. Der Mazerations-
saft aus Preßhefe ist im allgemeinen nur schwach wirksam; Hayduck
und Haehn?) fanden, daß durch die Extraktion der Trockenhefe mit
Phosphat (py 7,4) statt Wasser und ferner durch Zusatz von koferment-
haltigem Kochsaft die Wirksamkeit erhöht werden kann. Daß die
schwache Gärkraft großenteils auf einem Mangel an Koferment beruht,
wurde von Neuberg‘) gezeigt, da der Kochsaft aus Unterhefe die Zymase
der Oberhefe stark aktiviert. Diese Beobachtungen habe ich mir zu-
nutze gemacht und verhältnismäßig gärkräftige Acetonhefe und
Mazerationssäfte aus Preßhefe M erhalten durch Zusatz von Kochsaft
aus Acetonunterhefe. Jedenfalls war für die kurze Zeit meiner Ver-
1) Harden, Alcoholic Fermentation, 2. Aufl., London 1914; 0. Mecyerhot,
Zeitschr. f. physiol. Chem. 102, 185, 1918.
2) Pflügers Arch. 170, 367, 1918.
3) Diese Zeitschr. 128, 587, 1922.
t) Gottschalk und Neuberg, diese Zeitschr. 154, 492 (1924).
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. N]
suche die Gärungsgröße dieser Gemische fast so groß wie der Präparate
aus Brauereihefe. Außerdem wurde zur Beseitigung der Induktions-
periode eine geringe Menge Hexosephosphat zum Gärgemisch gefügt
und die leichter gärende Fructose benutzt.
Obwohl die aus Preß- oder Bierhefe hergestellten Präparate und
andererseits auch Acetonhefe und Mazerationssaft große quantitative
Unterschiede zeigen, läßt sich in zwei Anordnungen regelmäßig eine
oftenbare Hemmung der Kohlensäureproduktion im Verlauf der
Gärung durch den Sauerstoff feststellen. Während ich den Vor-
sang der Angärung hierfür nicht untersucht habe, verläuft der
Gäranstieg in Sauerstoff und Stickstoff etwa gleich, wird jedenfalls
(durch Sauerstoff nicht verzögert. Dagegen ergibt sich konstant mit
Sauerstoff ein niedrigeres Gärungsmaximum und meist ein bedeutend
stärkerer Abfall der Gärungsgröße am Schluß der Phosphatperiode.
Daß es sich hier aber nicht um den bisher untersuchten Atmungs-
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Abb. 4. Acetonhefe. (Obergárige Bierhefe).
Garungsgeschwindigkeit in Phosphatperiode.
einfluß handelt, geht daraus hervor, daß die Differenz der Geschwindig-
keiten in Sauerstoff und Stickstoff von der Atmungsgröße ganz unab-
hängig ist und meist das Mehrfache des bisher studierten Atmungs-
einflusses beträgt, ferner bei schlechter gärenden Präparaten größer
und deutlich progressiv ist. Es handelt sich augenscheinlich um eine
Schädigung des Gärvermögens durch den Sauerstoff, die wohl durch
die Wegoxydation einer geschwindigkeitsregulierenden Komponente
dieses labilen Systems bedingt ist. In der Tat fällt die Gärungs-
größe in Sauerstoff bei Überschuß von Zucker schließlich auf viel
niedrigere Werte, als sie sich beim gleichen Präparat aus der Spaltungs-
geschwindigkeit der Hexosephosphorsäure ergeben.
Als Beispiel mögen die Abb.4 und 5 dienen, in denen die Ordi-
naten die Geschwindigkeiten, die Abszissen die Zeiten bezeichnen. Beide
Abbildungen entsprechen einem Teile der Phosphatperiode der Gärung
der Acetonhefe (aus Brauereioberhefe). Im ersten Falle (Abb. 4) beträgt
die Konzentration des KH,PO, etwa m/10, die Fructosekonzentration
Biochemische Zeitschrift Band 162. 6
82 O. Meyerhof:
4 Proz., die der Acetonhefe 40 mg in l ccm Gesamtlósung. Der Gär-
anstieg in Sauerstoff erfolgt etwas steiler, dagegen liegt das gedehnte
Maximum viel niedriger. In Versuch Abb.5 ist dasselbe Präparat
6 Wochen später benutzt, aber je 100 mg in 1,2ccm, die Fructose-
konzentration beträgt 2 Proz., die Phosphatkonzentration etwa m/30.
Die Phosphatperiode ist daher steiler und kürzer. Die Geschwindigkeit
ist in Stickstoff am größten, in reinem Sauerstoff am kleinsten und
liegt in Luft zwischen beiden. Diese Tatsache ist mit der Annahme,
daß auch hier ein Oxydationsvorgang verantwortlich ist, vereinbar,
denn im Gegensatz zur lebenden Hefe wird die Oxydationsgeschwindig-
keit der Acetonhefe in reinem Sauerstoff
gegenüber Luft gesteigert!). Daß aber
nicht der gleiche Faktor verantwortlich
ist wie in der lebenden Hefe, geht aus
dem Mißverhältnis zwischen Sauerstoff-
verbrauch und Gärungseinfluß desselben
hervor. In Versuch Abb. 4 betrug in
2 Stunden die Gárung in N, 617 cmm CO,,
in Sauerstoff 450 cmm CO,. Dieser
Differenz von 167 cmm CO, steht ein
Sauerstoffverbrauch von weniger als
20 cmm O, gegenüber, der bei der gleich-
zeitigen Gärung kaum zu messen war. In
Versuch Abb. 5 betrug in 1 Stunde
40 Minuten die Gárung in N, 1295 cmm
CO, in Luft 1077 cmm, in Sauerstoff
816 cmm. Der Differenz von 480 cmm
CO, steht ein Sauerstoffverbrauch von
Abb: 5. : Acetonhefe, höchstens 60 cmm gegenüber. Anderer-
Obergärige Bierhefe seits ist in der gleichen Anordnung die
Girungsgeschwindigkeit in der h Ñ
Phosphatperiode. Differenz zwischen aerober und anaerober
Gärungsgröße mit der Acetonhefe von
Rasse M viel geringer, obgleich der Sauerstoffverbrauch hier höher
ist. In einzelnen Fällen war in 1 Stunde überhaupt kein Unter-
schied zwischen Gärung in Sauerstoff und Stickstoff bei etwa 200 cmm
Gärungskohlensäure und 60 cmm Sauerstoffverbrauch. In einem
weiteren Falle betrug die Gärungsgröße in Stickstoff 210 cmm, in
Sauerstoff 164cmm bei 99cmm O,-Verbrauch. Diese Ergebnisse
werden obendrein durch Nebenumstände stark beeinflußt.
Schließlich gibt es noch eine zweite Anordnung, in der ein schein-
barer Einfluß des Sauerstoffs regelmäßig festzustellen ist: Dies ist
1) Pflügers Arch. 170, 377, 1918.
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 83
der Fall, wenn man ausschließlich Hexosephosphat als Gärungszucker
benutzt. Falls das Hefepräparat keine Selbstgärung besitzt, ist hier
die Geschwindigkeit von vornherein konstant und wird durch die
Spaltungsgeschwindigkeit des Esters bestimmt!). Hier ergibt sich
eine Differenz zwischen Gärung in Sauerstoff und in Stickstoff von
der Größenordnung der früher gefundenen, wobei jedoch fast stets
weniger als 1 Mol. CO, durch 1 Mol. O, zum Verschwinden gebracht
wird. Die naheliegende Erklärung ist hier die, daß bei der Oxydation
keine oder wenig Kohlensäure gebildet wird, wie es in Abwesenheit
des Zuckers direkt durch Bestimmung des respiratorischen Quotienten
festgestellt werden kann. Es ist also dann keine Gärungskohlensäure
verschwunden, sondern dies wird nur durch das Fehlen der Atmungs-
kohlensáure vorgetäuscht. Hierfür seien einige Beispiele in der
Tabelle XVII gegeben, in der unter Zugrundelegung dieser Annahme
in Sauerstoff die gesamte Kohlensäure (also ohne Abrechnung der
Atmungskohlensäure) angegeben ist.
Tabelle XVIII.
a des ı in O, und N,.
| IS ges) .„ Jesse. (Messer Gi G ts | Maximaler
Nr. Hefepräparat Zeit Es = coa | E CO, SECH d
d Ee zentration cmm = in Gi in Oz
ae =
1 |l Brauereioberhefe, Aceton ` 9
2 || MsHefe: Mazerationssaft 2 76.5 106
3 è 40 23
4 x 1 48 30
5 |!Brauereioberhefe, Aceton*) || 1b 20’ 52,5 36
6 ) M+Hefe: Acetonhefe ||2 30 235 116
+) 0,015 Proz. Methylenblau.
Auch diese Anordnung spricht daher nicht fiir das Fortbestehen
eines Kohlehydratkreislaufs in getóteter Hefe?).
Ich danke Herrn Walter Schulz für seine Mithilfe bei den Versuchen.
Zusammenfassung.
1. Bei gleichzeitiger Messung des Sauerstoffverbrauchs, der
Gärungskohlensäure (und des Alkohols) in Sauerstoff und Stickstoff
ergibt sich an in Traubenzucker-Phosphatlösung gufgeschwemmter
Hefe: 1 Molekül veratmeten Sauerstoffs bringt einen Gärumsatz ent-
sprechend 11% bis 2 Kohlensäuremolekülen zum Verschwinden, d. h. die
1) Zeitschr. f. physiol. Chem. 102, 209, 1918.
2) In einem Versuch von Fürth und Lieben (diese Zeitschr. 128, 158,
1922) war die Acetonhefe nicht mehr zur oxydativen Entfernung der Milch-
säure befähigt.
6*
84 O. Meyerhof:
Oxydation von 1 Molekül Zucker schützt 4 bis 6 Zuckermoleküle vor
der Vergärung. Dies entspricht zahlenmäßig genau dem bei der Milch-
säurespaltung des Zuckers gefundenen Oxydationsquotienten der
Milchsáure, da auch hier die Oxydation eines Zuckermoleküls die
Spaltung von 3 bis 6 Zuckermolekülen verhindert oder rückgängig
macht. Diese Gesetzmäßigkeit ist unabhäugig von dem Verhältnis
der Gärungsgröße zur Atmungsgröße, die sich bei den verschiedenen
Heferassen um mehr als den 30fachen Betrag unterscheidet.
2. Bei der Preßhefe (Brennerei- und Bäckerhefe) ist die Atmung
in Phosphatlósung klein; Qo, (gleich Kubikmillimeter O, pro Milligramm
Trockengewicht und Stunde) = 10, steigt aber in Traubenzucker auf den
acht- bis zehnfachen Wert. Die Gärungsgröße in Stickstoff (Qco,) ist
gleich 250 bis 300. Da bei der Preßhefe 1 Molekül Sauerstoff fast genau
2 Moleküle Gärungskohlensäure zum Verschwinden bringt, sinkt die
Gárungskohlensáure in Sauerstoff im allgemeinen auf Qco, 60 bis 100,
also auf ein Drittel bis ein Viertel. Die Beziehung zwischen Zuckerver-
atmung und verschwindender Zuckerspaltung gilt ebenso, wenn die
Atmung statt durch Stickstoff durch Blausäure verhindert wird. Die
Gärung in Sauerstoff steigt daher durch Blausäurevergiftung auf das
Drei- bis Vierfache, während die Gárung in Stickstoff ein wenig ge-
hemmt wird. Die Bildung des Alkohols wird in gleichem Maße wie die
der Gärungskohlensäure durch die Sauerstoffatmung gehemmt, die
Gärungsgleichung bleibt gewahrt.
3. Bei den Brauereihefen (Ober- und Unterhefen) und Weinhefen
entspricht die Atmungsgröße in Phosphatlösung ebenfalls einem
Qo,-Wert von 10, wird aber in Zuckerlösung, bei den verschiedenen
Rassen ungleichmäßig, wenig oder gar nicht gesteigert, höchstens
auf das Doppelte. Die Gärungsgröße in Stickstoff ist dagegen im
allgemeinen hoch: Qco, = 200. Die verhältnismäßig kleine Atmung
bringt entsprechend nur einen ganz geringen Bruchteil des Gärungs-
umsatzes zum Verschwinden, ein Umstand, der die Autoren fälschlich
zu der Ansicht brachte, daß der Sauerstoff die Größe der Gärung
nicht beeinflußt.
4. Ganz entgegengesetzt wie die Brauereihefen verhalten sich
die wilden Hefen: Bei ihnen ist die Atmung in Zuckerlösung im Ver-
hältnis zur Gärung so groß, daß bei einem normalen ‚„Oxydations-
quotienten‘‘ der Spaltung die alkoholische Gärung in Sauerstoff fast
restlos verschwindet. Der klarste Fall liegt bei der Torulahefe vor.
Der Qco,-Wert in Stickstoff gleicht dem der Preßhefe (250 bis 300),
die Atmung in Phosphatlösung hat aber bereits einen do Wert von 25,
was bei achtfacher Steigerung in Zuckerlösung einen Qco,-Wert von
etwa 200 ergibt. Durch diese große Atmung wird in Sauerstoff die
Gärung nahezu völlig aufgehoben. Die Gärung der Kulturhefe in
Einfluß des Sauerstoffs auf die alkoholische Gärung der Hefe. 85
Luft bei gleichzeitiger Atmung resultiert daher ausschließlich aus
dem Sinken des Sauerstoffverbrauchs, wobei einmal schon die Atmungs-
geschwindigkeit in reiner Salzlösung herabging, und zweitens die
Fähigkeit schwand, durch Zuckerlösung auf den acht- bis zehnfachen
Wert anzusteigen.
5. Es gelingt, den Stoffwechseltypus der Kulturhefen, speziell
der Brauereihefe, bis zu einem gewissen Grade umzustimmen, so daß
das Verhalten der Brauereihefe dem der Preßhefe nahezu gleich wird.
Bei etwa 15 Stunden langer Gärung in mineralischer Zuckerlösung
steigt das Oxydationsvermögen allmählich mehr und mehr an, während
die Gärungsgröße etwas herabgeht. Das Verhältnis der Atmung zur
Gärung in Sauerstoff verschiebt sich daher zugunsten der ersteren.
Während von der Brauereihefe aerob zunächst etwa 50 Zuckermoleküle
vergoren werden auf eins, das verbrennt, werden von der um-
gestimmten Hefe etwa vier Zuckermoleküle vergoren, während eins
oxydiert wird. Bei der Preßhefe ist diese Zahl 2 bis 4, bei den
wilden Hefen 0,3.
6. Der Einfluß der Sauerstoffatmung auf die Gärung beruht
zweifellos wie im Muskel auf einem durch die Atmung unterhaltenen
Kreislauf des Kohlehydrats. Eine ganze Reihe der im Gärverlauf
gebildeten Substanzen wirkt auf die Hefeatmung ein wie Zucker,
indem sie die OxydationsgróBe der Preßhefe und der wilden Hefen
um das Fünf- bis Achtfache steigern, dagen die der Wein- und Bier-
hefen am Anfang gar nicht und dann langsam zunehmend ein wenig
erhöhen. Und zwar sind dies Äthylalkohol, Acetaldehyd, Essigsäure,
Brenztraubensäure, Milchsäure, Methylglyoxal. Alle dazu homologen
und nächstverwandten Stoffe sind völlig unwirksam. Ferner sind
auch ß-Oxybuttersäure, Acetoin und Acetaldol (durch Vereinigung
zweier Aldehyde entstanden) ohne Einfluß. Daß die zuckergleiche
Wirkung auf der Rückverwandlung in Kohlehydrat beruht, geht
für Äthylalkohol und Acetaldehyd aus dem respiratorischen Quotienten
hervor, der z. B. bei Äthylalkohol nur 0,35 ist, während er bei
totaler Oxydation 0,66 sein würde. Es läßt sich daraus berechnen,
daß auf ein total oxydiertes Molekül etwa drei zu Zucker oxydiert sind.
Für Milchsäure, Brenztraubensäure und ebenso Äthylalkohol folgt
dies auch aus den Befunden von Fürth und Mitarbeitern.
Schließlich ergibt sich auch bei Vergleich des Zuckerschwunds
mit der Gärungskohlensäure aerob eine größere Differenz als anaerob.
Dieser Unterschied beruht auf der Assimilation des Kohlehydrats
während der Atmung. Jedoch wird nur ein Teil des in Sauerstoff
an der Spaltung gehinderten Zuckers wirklich von der Hefe assimiliert.
Weitere Überlegungen ergeben, daß der Hauptkreislauf des Kohle-
hydrats nicht über die Endprodukte, sondern wohl über die Brenz-
86 O. Meyerhof: Einfluß d. Sauerstofís a. d. alkoholische Gärung usw.
traubensäure bzw. Milchsäure führt und daher mit dem im Muskel
gefundenen identisch ist.
7. Die Gärung der Acetonhefe und des Hefemazerationssaftes wird
zwar auch in gewissen Phasen durch den Sauerstoff herabgesetzt,
und zwar besonders im Maximum und der zweiten Hälfte der ,, Phosphat-
periode‘‘ der Gärung. Scheinbar ist auch die Vergárung der Hexose-
phosphorsäure verringert. Doch muß dies auf anderen Faktoren be-
ruhen, zum Teil auf Wegoxydation eines gärungsbeeinflussenden
Faktors, und ist andererseits teilweise durch den Wegfall der Atmungs-
kohlensäure vorgetäuscht. Es besteht hier keine bestimmte Proportion
mehr zwischen Atmungsgröße und verschwundenem Gärumsatz, wie
bei der lebenden Hefe, und offenbar findet eine Rückverwandlung der
intermediären Produkte des Zuckerzerfalls nicht mehr statt.
Untersuchung über Autolyse. V.
Von
P. Rona, E. Mislowitzer und $. Seidenberg.
(Aus der chemischen Abteilung des pathologischen Instituts der Universitát,
Charité, Berlin.)
(Eingegangen am 4. Juli 1925.)
Mit 28 Abbildungen im Text.
I.
In der vorherigen Untersuchung!) erhobene Befunde sprechen gegen
eine irgendwie nennenswerte Beteiligung der ‚„Gesamtfette‘‘ an der
zunehmenden Säuerung?) im Verlauf der Autolyse. Eher geeignet
eine stärkere Aciditätsverschiebung hervorzurufen, sind die beiden
dem Kohlehydratstoffwechsel nahestehenden Säuren, die Milchsäure
und die Phosphorsäure. Um nähere Aufklärung über die Bedingungen
der Glykogenspaltung und der Zuckerbildung während der Autolyse
zu erhalten und einen Einblick in die Zusammenhänge zwischen der
Aciditätszunahme und dem Kohlenhydratabbau zu gewinnen, wurden die
folgenden Versuche angestellt. Es war zu erwarten, daß der autolytische
Glykogenabbau von der H-Ionenkonzentration des Mediums stark
abhängt®). Die erste Versuchsreihe bringt hierfür Belege. Es gelingt,
den Glykogenabbau in weitem Umfang durch Variierung der Wasser-
stoffzahl zu regulieren. Die Bestimmung der gleichzeitig entstandenen
Traubenzuckermenge ließ gewisse Beziehungen zwischen den beiden
Größen erkennen.
Bei den Versuchen wurden die Kaninchen durch Kopfschlag betäubt
und durch Halsschnitt getötet, die herausgensmmene Leber sofort in ein
in Eis vorgekühltes Gefäß gebracht, schnell durch den Latapie gedreht
und der Leberbrei in einem 300 ccm eisgekühltes Wasser enthaltenden
Gefäß aufgefangen, auf Eis gehalten. In Kolben A wurden 25 ccm dieser
Lebersuspension gebracht, mit 25ccm Wasser versetzt und sofort ver-
1) Vgl. vierte Mitteilung, diese Zeitschr. 154, 290, 1924.
2) Vgl. dritte Mitteilung, ebendaselbst 146, 26, 1924.
3) Vgl. hierzu vor allem E.J. Lesser, ebendaselbst 119, 108, 1921;
E. J. Lesser und K.Zipf, ebendaselbst 140, 439, 1923.
SS P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
arbeitet. Zu Kolben 1, 2, 3 kommen 100 eem der Lebersuspension mit
100 cem Puffergemisch (meist zu n/10 Endkonzentration). Diese Kolben
kamen in den Brutschrank (37°) und wurden zu den in den Versuchen
angegebenen Zeiten verarbeitet.
Zur Bestimmung des Glykogens wurden BO ccm Lebersuspension
mit 50 ccm 60proz. KOH 2 Stunden im Wasserbad gekocht, nachher mit
100 cem Wasser verdünnt und mit 200 ccm Alkohol das Glykogen gefällt.
Zur Beschleunigung des Absetzens wurden wenige Tropfen konzentrierter
H, S O, zugegeben, wobei das ausgeschiedene K,SO, das Absetzen begünstigt.
Nach 24 Stunden wurde filtriert, das Gefäß zur vollständigen Lösung mit
etwas Wasser versetzt, nochmals mit viel Alkohol gefällt, durch dasselbe
Filter filtriert. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, durch gewöhnliches
Filter in einen 250 ccm fassenden Meßkolben filtriert, bis zur Marke auf-
gefüllt. Dann 10 ccm mit HCl (etwa 2,0 bis 2,2 Proz.) versetzt und im
Wasserbad 2 Stunden hydrolysiert. Nach der Hydrolyse mit NaOH genau
neutralisiert, in einen 100-ccm-Meßkolben filtriert, bis zur Marke auf-
gefüllt. Davon wurden in zweimal 5ccm nach Bertrand- Michaelis der
Zucker bestimmt.
Zur Zuckerbestimmung wurden 50 ccm der neutralisierten Suspension
aufgekocht, mit kolloidalem Eisen enteiweißt, auf 200 eem aufgefüllt,
filtriert, vom Filtrat zweimal 10 ccm mit 2ccm einer kaltgesättigten
Quecksilberacetatlösung versetzt, dann so viel H,SO, zugegeben, bis
eine schwachgelbe Fällung entstand. H,S eingeleitet, filtriert, das Filtrat
bis etwa auf l5ccm eingedampft. Die ganze Menge wurde dann nach
Bertrand- Michaelis weiter verarbeitet. Von einer Säurehydrolyse des
enteiweißten Filtrats wurde zunächst abgesehen und vorerst nur die fermen-
Tabelle I. a) Glykogenwerte (Abb. 1).
|
|
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| a A N an
igg] £ | Te Sey 855
c RGS ú 5 Mittel» — EES V 32 ‚2°
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o ) cem mg ` mg mg mg oo
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EE | A 16L 076 Lon |770 | 1078.0 | 999,3, 100
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l. Abnahme 1 | 3,60 . 1,54 1 See T ` |
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1!/, Stunden | 2 ! 0,65 04, DÉI f i Se
l2 | = ugi [04% | 224 | 3136| 290,7 | 291
'3 | 3,60 i 1,54 sn Ge | |
E o 362 155 ] 1,54, | 17.2, | 1081,5 | 1002,6 ` 100,3
2. Abnahme | 1} 0,40 : 0,36 :) i E: |
en | 083 joga (00091 395 553,0 512,6 | 51,3
3 Stunde | 2 | 0,52 | 0,40 \ BE |
sr oar 1, 0408 20,2, 283,5 | 2628 | 26,3
13| 216 | 0,599 | nor | |
E BC? I} 09 | 48,5 | 6790 | 6294 | 62,9
EN
nach |
96 Stunden
; In allen 3 Kolben 0,3 cem Lie Permanganat verbraucht,
einer Restreduktion von 9 Proz. entsprechend.
Autolyse. V. 89
tativ entstandene, reduzierende Zuckermenge bestimmt und auf Trauben-
zucker bezogen.
Versuch 1 (Tabelle la und b): 54g Leberbrei + 300 cem H,O. Kol-
ben A: 25 ccm Suspension + 25 com H,O. Kolben 1: 100 ccm Suspension
15 3 Stunden —> $
Abb. 1 (Versuch 1).
Tabelle I. > Traubenzuckerwerte (Abb. 2).
d a CN |
i GE 2 8 8 |
(alse Sa ggg gil |
¡24801 48 ¿ol ys , Proz. |
EE INTE
au ur ee a O en nn
=- A a o a a a =:
EES A i DAR De | 18.0 252,0 | nam der ar Sus an
kx | li aufgefüllt, a an zur
— ll — ke | — Bestimmung
l. Abnahme | 1058| 0,41 |
| 080 | 0% } 21,0 294,0 | 116,6 |
1, Stunden | 2 Ä 25 | 112 | 280| 392,0| 155,5 |
i 3 | 0,82 | 0,49 1444 |
i 11.098 | 0,54
hi , ,
Eee a O 2
2. Abnahme! 1 | Lë |
dach S | 1,6 Jos 38,0 | 532,0 | 211,1 Aus jedem Kolben je 20 ccm
Suspension entnommen, ent»
3 Stunden | 2 | Sen | 145 | d 73,0 | 1022,0 | 405,5 | eiweißt, auf 100ccm auf»
3 | 2 26 | 103 | gefüllt, von 1 und 2 je 5 ccm,
o na |) |} 52,01 7280| 288,8 von3 10 cem zur Bestimmung
3. Abschnitt ij 1 || 1,85 | 0,86 | |
nach ` 190 | 088 ] Sal 1218,0 | 483,3 |
96 Stunden | 2 || 245 ' 1,10 |
n | 248, 114 1120, 1568,0 6222 |
3 | 2,12 0,98 | |
‚1290 ro } 100,0. 1400,0 | 555,5 |
90 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
+ 100cem Pufferlösung (Acetat 1: 8) pe 5,79. Kolben 2: 100 ccm
Suspension + 100 ccm Pufferlósung (Phosphat n/10 4,5: 5,5) pg 6,78.
Kolben 3: 100 ccm Suspension + 100 ccm Pufferlösung (Phosphat 0,5 : 9,5)
pp 7,51. Anfangswert: Fällung des Glykogens in 25 ccm; Glykogenlósung
auf 250 ccm aufgefüllt, davon zweimal 25 cem hydrolysiert, auf 100 ccm
aufgefüllt, 10 ccm zur Reduktion. Abnahmen: von jedem Kolben 50 cem
entnommen, Fállung des Glykogens, Lösung auf 250 ccm aufgefüllt, 25 ccm
hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt, 20 ccm zur Reduktion.
9,
70
090
600 | Br
550H— a
o Pr 610,7 .
500 — E =
450 — >= > e
Sg dëi
15 3 Stunden —> $
Abb. 2 (Versuch 1).
Wie man sieht, wird das Tempo der Glykogenspaltung (nicht die
Umsatzgröße) von der Wasserstoffzahl des Mediums wesentlich beeinflußt.
In den ersten 1% Stunden wurden bei pg 7,51 nichts, bei 5,79 fast nichts,
bei 6,78 70 Proz. vom Glykogen gespalten. Die nachweisbare Zunahme
an Traubenzucker erfolgte in Kolben 1 und 2 langsamer als die Glykogen-
spaltung. So war im Kolben 1 (pg 5,79) die Glykogenabnahme zwischen
1% und 3 Stunden groß, als Zucker erscheint nur die Hälfte der ver-
schwundenen Glykogenmenge; mit der Zeit tritt ein Ausgleich ein. Noch
deutlicher ist dies im Kolben 2 (pg 6,78), wo nach 1% Stunden 764,4 mg
Glykogen (als Traubenzucker) verschwanden, dafür aber nur 140 mg
reduzierender Zucker (als Traubenzucker) in Erscheinung traten. Nach
3 Stunden ist jedoch der Glykogenwert eingeholt.
Versuch 2 (Tabelle IIa und b): 78g Leberbrei + 300 ccm Wasser.
Kolben 1: 100 eem Suspension + 100 cem Pufferlósung (n/5 Milchsäure-
puffer 4: 1) pg 3,38. Kolben 2: 100 ccm Suspension + 100 cem Puffer-
lösung (n/5 Milchsäurepuffer 1: 1) pg 3,90. Kolben 3: 100ccm Suspen-
sion + 100 eem Pufferlósung (n/5 Milchsáurepuffer 1: 8) pg 4,60. Gly-
kogengehalt der ganzen Leber zu Beginn 3600 mg. Bei der Abnahme
werden je zweimal 25ccm entnommen, mit KOH behandelt, das Gly-
kogen gefällt, dieses gelöst, auf 200 ccm aufgefüllt, davon die angegebenen
Kubikzentimeter zur Reduktion genommen.
Der Versuch zeigt, daß bei den vorliegenden Wasserstofízahlen sowohl
eine starke Verlangsamung des Glykogenabbaues als auch eine Verringerung
Autolyse. V. 91
Tabelle II.
a) Glykogenwerte (Abb. 3).
| Jas g ag
| | 38 £ SS, ke
|s | E38] ja jig | gi
| 2 , PaE 4 9 GE A 3 Proz.
KS | VE a Wi o E
| Sé > As N £ | Do
` OE o A A mg u SC HEBEN
AS E Zu
1. Abnahme | 1 . 14 0,69*)
Wes | | 14 | 069 10350 | 9594,4 | 100
11/. Stunden | 2 1,32 | 0,66*)
[a en | | 142 | 070 10200 | 9453,4 | 98,5
ı3 | 35 | 151
2135 | rB 9060 | 8398,6 | 87,5
—_— , e d
2. Abnahme ¡ 1 || 3,5 1,51
| 338 | 146 8910 | 8259,6 | 86,1
2 | 1,70 | 0,80**
3 Stunden | Ve Iren ) 9960 | 92229 | 96,1
3 | 317 | 137
131 | 17 7920 | 73418 | 76,5
3. Abnahme ¡ 1 | 2,25 ı 2 5850 | 5423 56.5
nach U ’ >
72 Stund 2 ¡ 185 | 0,86
unden '00 | 0093 5340 | 4950,2 51,6
3 | 170 | 0,80
| 173 | 081 4830 | 44774 46,6
Si In 2ccm. — **) In 1 ccm.
Abb. 3 (Versuch 2).
der Umsatzgröße zu beobachten ist. Bei pg 3,3 und 3,9 wurden nach
11, Stunden nichts, nach 72 Stunden nur 43 Proz. gespalten, bei pp 4,6
bzw. 13 und 47 Proz. Die nachweisbare Zuckerbildung ist weit geringer
als die Glykogenspaltung. Die Glykogenspaltung ist in.dem vorliegenden
Bereich der pg ungefähr gleich; hingegen ist die Abhängigkeit der Zucker-
bildung vom py deutlich. Bei pp 4,60 ist die nachweisbare Traubenzucker-
menge fast zweimal so groß als bei pg 3,38.
92 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
| zë
| 153 S>
e| #53
I | ES
v> |
| | ccm
Anfangswert | | 1,63
1,78
Abnahme | 1 | 2.70 |
nach | | 2,75 |
72 Stunden || 2 | 2,80
| 2,80 |
3 | 2,15
2.20
Versuch 3 (Tabelle IIIa und b):
Tabelle II. b) Zuckerwerte.
Zucker in
Zucker
50 cem
Suspension
Zucker
in derganzen
Leber
3
| gà
Proz.
10 ccm Suspension wurden
| 100 enteiweißt, auf 150 ccm aufs
gefüllt, 7,5ccm verarbeitet
375
| 20 ccm enteiweißt, auf
100 ccm aufgefüllt, davon
384,2 2ccm (im Kolben 1 nur
l ccm) verarbeitet
625,0
52,0g Leberbrei + 300 ccm H,O
Kolben 1:100 ccm Suspension + 100 ccm Pufferlösung (n/5 Acetat-
pufferl: 10), pg 5,54. Kolben 2:
lösung (n/5 Phosphatpuffer 4,5: 5,5),
100 ccm Suspension + 100 ccm Puffer-
Pu 6,78. Kolben 3: 100 eem
Suspension + 100 ccm Pufferlösung (n/5 Phosphatpuffer 0,5: 9,5), pg 7,50.
Tabelle III. a) Glykogenwerte (Abb. 4).
ATREA
n/100
Kolben
Permanganat
e
S
| g Zucker in
| 10 ccm
Anfangswert | 3,
3
1. Abnahme | KE?
nach
Ui, Stunden
3 Stunden |2**) | 0,28
13 1,90 |
1'84
3. Abnahme, pee) | 0,20
0,21
2**) |! 0,22
| | 0,19
| 3**) 0, 20 `
| 0.21 |
*) In 5 cem. — **) In 20 ccm.
| es Jag
E 5 | D S D E > bu
| 332 SE | 4. | Proz.
e >
EN. A
| 264,0 | | ar | 1713,1 100
"am
131 o 1834,0 ' 1700, D
62,8
33.0 1162,0 | 1077,2
86,4
` 114,0. 1596 D 1479,5
1582,0 o 1466,5 85.6
En | mba etwa 12.5
(Restreduktion)
87,0 | 1218,0 1129,0 65,9
(Rest.
Autolyse. V. 93
Anfangswert: zweimal 10 ccm der ursprünglichen Suspension mit KOH
behandelt, das Glykogen gefällt, die Lösung auf 200 aufgefüllt, 50 ccm
hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt, davon 10 ccm reduziert. Abnahmen:
Y 3 Stunden —> 12
Abb. 4 (Versuch 3).
Tabelle III. b) Zuckerwerte (Abb. 5).
agil. ep, |
EENE | "858 | gie '
F E ck E 5 eg E >G | ES Proz. |
£ PEC] Zh ll wet | 585 1 N 37 |
2 "Zë 187 1 CIN] e,
a | mp i eg mi LE
SE EE BET EE
ad E e 0,67 ` 33,5 | 469 100 ||10ccmdSuspensionent,
a a : gefüllt, davon 5ccm
ze ek ma ` | f i verarbeitet ` `
1. Abnahme '] | 1,38 ` ` r | |
WEEN | 158 \ 0,68, 0.68 | 34,0, 476 | 101,5. 20 ccm der Suspen
IIe S den : O
wre a | 1,80 ` 0,84 | 0,84 1050 | 11470 | 313,4! 100 com aufgefüllt,
hg Er 0,85 | Sé | i l davon 5 ccm
; | D
i | 230 ] 1,04 | 1,04 EI 7128 | ibog, mem
See? Ee Eh ee
een E 235 e. 1,06 | 53,0 | 742 | 188,2
3 Stunden | a
E EJE 0%!) nos ma 18875 391,7 |
| | | |
, *
Y ) | an | 081 (1013, 1417,5 302,2 |
3. Abnabme | T 3.25 E re use SES
pad i ES un be 1,4 BS | 1960,0] 417,9 |
72 Stunden |
Ge 0,51
| 0:0 db 048 an! 125,0 | 1750,0] 373,1 |
e) 2 ccm verarbeitet. — **) 1,5 ccm verarbeitet. — +) 1 ccm verarbeiten:
94 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
je 20 ccm zur Glykogenfállung, die Lösung auf 200 ccm aufgefüllt, davon
50 ccm hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt, davon 10 ccm reduziert.
In diesem Versuch ist die Abhängigkeit der Glykogenspaltung von
der H-Ionenkonzentration besonders ausgesprochen. Der Abbau geht
bei ze 6,78 viel schneller vor sich als bei pg 5,54 und 7,50. Der Zucker-
zuwachs bleibt im allgemeinen mäßig hinter der Glykogenabnahme zurück.
—> 72
Stunden
Abb. 5 (Versuch 3).
Versuch 4 (Tabelle IVa und b): 60,5g Leberbrei + 300 ccm H,O.
Kolben 1: 100 ccm Suspension + 100ccm Pufferlösung (n/5 Lactat-
Tabelle IV. a) Glykogenwerte (Abb. 6).
S
la
=
Ze
Anfangswert
l. Abnahme |
BK: g Së
AH E a E N N
S Ba Tes | 358 | 855
5 SE | Zucker || Mittel | 335 a H | %9 | Proz
A E ES © Q N Q sel 1 ` ef ` rel
= y 5 wert 3% e Ka | Zb
Lé PE NG KE | Le
ccm my mg |
nach
11/, Stunden |
nach
3 Stunden
3. Abnahme | 1*)
nach ,
24 Stunden ` 2*)
H
2.60
13*) | 221
220
o ;
bad ROTO
NÓ
DB
. . KI KI . so
Le a
e | o e | o nn nn
|
| I
i
l `
,
a:
Qr i
Ei i
|
D |
-J ,
TN
©
-l
im
3 |
a]
bas
¡ si
in 4
ps
=
280,0
4320,0
4032,0
4032,0
3960,0
3542,4
4004,6 | 91,6
3737,7 | 85,4
3737,7 | 85,4
3671,0 | 83,9
3283,8 | 75,1
2749,9
ñ
Autolyse. V. 95
puffer 4: 1), ru 3,40. Kolben 2: 100 ccm Suspension + 100 ccm Puffer-
lösung (n/5 Lactatpuffer 1: 1), pa 3,93. Kolben 3: 100ccm Suspen-
sion + 100 cem Pufferlösung (n/5 Lacetatpuffer 1: 8), 7m 4,84. Anfangswert:
Zweimal 10 ccm Suspension, daraus Glykogen gefällt, die Lösung auf
Aë 3 Stunden —> 24
Abb. 6 (Versuch 4).
200 ccm aufgefüllt, davon 50 ccm hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt,
davon 2ccm reduziert. Abnahmen: In je 20 ccm Glykogen gefällt, die
Lösung auf 200 ccm aufgefüllt, davon 50 cem hydrolysiert, auf 100 ccm
aufgefüllt, davon 5 ccm (*) oder 2 ccm (**) reduziert.
Der Glykogenabbau betrug in diesem Versuch bei pp 3,3 20 Proz.,
bei pg 3,9 27 Proz., bei pg 4,8 39 Proz. Die Spaltung war also sehr gering,
Tabelle IV. b) Zuckerwerte (Abb. 7).
I su | | g
| Ge | e BG Kat N
| 2 Rz = | m Gh
lg |288 led ittol, || $ E 455 |
| BE: Es | F 5 ei | ht? EF Proz.
| 2 |38 |s" IN dëi s
CS H | ccm | mg | A mg mg sim
Anf rt lis | EA ER E Dë eno: Sespenál ts
eent | 181 | 084 || oga || ano | 6041 100 Lëg, ees, ca
| | ) ) gefüllt, davon 5 ccm
Me. ft) WS ës Ga Bei We BE i reduziert
1. Abnahme | ] 2,2 1,01 D me |
e | 217 | 100 ] 1,01 50,5 727,2| 120,2
11/2 Stunden | o 9 |
| 17 | 1,0 en
217 | 10 | 1,0 | 50,0 | 720,0| 119,0 |
3 245 | 11 | Sack! |
255 | 11, 1 1,12 | 56,0 | 8064 133,3
2. Abnahme| 1 | 244 | 1,1 ) | cal
| ma |} 1,08 | 54,0 | 777,6| 128,5
en | 2,36 | 1,06 | | Je 20 ccm enteiweißt,
ZEIEN AA 2,30 | 1,04 | | ” | 196 auf 100 ccm auf-
| 2,38 1.07 i 1,08 || 53,0 | 768,2] 126,1 |{ gefüllt, davon 5ccm
3*)| 121 | 0,62 | verarbeitet
124 | 063 | 0,63 78,75| 1134,0| 187,5
S A Ze LE KS Kë
3. Abnabme || 1*) [| 1,20 | 0,62 i e |
2” 112 | 0/59 |} 0,61 | 76,25| 1098,0| 181,5 |
24 Stunden || 2#)|| 12 | 062 | los el
11 1068 0,6 || 75,0 |1080,0| 178,5
Zeil 2,12 | 0,98 | | |
220 | 101 | 1,0 [125,0 | 1800,0| 297,5 |
*) 2 com verarbeitet.
96 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
die Abhängigkeit von der H'-Konzentration deutlich. Die Zuckerzunahme
ist hier wieder weit geringer als die Glykogenabnahme, so z. B. bei pg 3,93
nach 3 Stunden betrug die Glykogenabnahme (in Traubenzucker) 1174 mg,
die Traubenzuckerzunahme nur 158 mg.
15 3 Stunden —> 24
Abb. 7 (Versuch 4).
Versuch 5 (Tabelle Va und b): 590g Leberbrei + 300ccm H,O.
Kolben 1: 100 eem Suspension + 100 cem Pufferlösung (m/5 Acetat-
puffer 1: 10), pa 5,58. Kolben 2: 100 ccm Suspension + 100 cem Puffer-
lösung (m/5 Phosphatlösung 4,5: 5,5), pa 6,81. Kolben 3: 100 ccm Suspen-
sion + 100ccm Pufferlösung (m/5 Phosphatlósung 0,5: 9,5), pg 7,57.
Anfangswert: Zweimal 10ccm Suspension, Glykogenfállung, Lösung
auf 200 ccm aufgefüllt, davon 50 ccm hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt,
davon 2 cem reduziert. Abnahmen: In je 20 ccm Suspension Glykogen
gefällt, die Lösung auf 200 ccm aufgefüllt, davon 50 ccm hydrolysiert,
auf 100 ccm aufgefüllt, davon die angegebenen Mengen reduziert.
Tabelle V. a) Glykogenwerte (Abb. 8).
4 ge
ZE 'E £ -a
3 98 | RK 835
S$ G= |Zucker| Mittel 938 Seo
Kolben SES | 0a È A 8 . Proz
55 wert | 3R 2 ER
iss | , PH 0S |
BE ¡EM A J mg ll
|
|
|
100
m et Se H > = = = Se wa A r E A A =
Anfangswert l | 1,58 | 0,75 i
0,75 d A 5285,0 4899,2
1,60 0,76 76 5:
1. Abnahme 'l,red. 2 com | 13 0,65 to
SE Ya 0069 || %67 (aan 4690,0 | 4348,8 887
1!/, Stund 2 | 0,95 0,53 ei
» Stunden 2 » 095 058 0,53 (as 1855,0 | 1719,6| 35,1
13, „4 „| 236! 1,06 |
ma | 224 | 103 J 1.04, Gë 2a | 3657,5 3390,3 | 692
2. Abnahme l, „4 „ | 29 |127 Kal 312,5 4375,0 4055,6 | 82,7
nach ı 2,8 1,23 |
3 Stunden "2, „20 „ | 0,3 |0,33 | 0,33 Am 4375 40,6| 0,82
3, ,10 , || 32 | 139
8 | 30, | P33 | L36 1136,0 1904 |1765 | 36.0
3. Abnahme | In allen 3 Kolben Permanganatwert etwa 0,3ccm, einer
nach I Glykogenspaltung bis auf 0,82 Proz. entsprechend, d. h.
48 Stunden | praktisch vollständiger Abbau.
Autolyse. V. 97
Dieser Versuch bestätigt die Ergebrisse der vorherigen Versuche.
Nach 1% Stunden war die Spaltung bei pp 5,58 11 Proz., bei pp 6,81
65 Proz., bei pg 7,57 31 Proz., nach 3 Stunden bzw. 17, 100 und 64 Proz.
Auch hier beobachtet man ein starkes Zurückbleiben der Zuckerzunahme
Yo
100
90
80
70
60
50
YO
30
20
10
fa 6,81 i
On ie LAMA nr a rn E R
+ $ | Stunden —= 4
Abb. 8 (Versuch 5).
Tabelle V. b) Zuckerwerte (Abb. 9).
A Po mr KS Te sat)
| 2 E = E he N |
| (ie „| E 33/388] |
| Kolben [Sel 2 E SET 353 Proz.
NO e = opi 3 3 ye]
>ù | N z IN al 8
ccm | mg || mg mg mg
— = — e Eo m — ee meng mmm — — — e — es a
Anfangswert | 244 | 1,10! | | S | |10 ccm der Suspension
| 9.35 1.06 11,08 54,0 756,0 100 ` enteiweißt, auf 100 ccm
d Jee) | ‚aufgefüllt, davon 5 ccm
| | | | reduziert
— | - - ——— | e gët >
1. Abnahme | 1. red Beem 2,74 | 1,21 || KM s |
eh | SCH 124 |) 123 61,5 | 861,0113,9|
|
11/2 Stunden || 9 1 2.00 | 0.93 | p
[2 2 > E 0/91 |092 230,0 | 3220,0/425,9.
la, „ 2 „|| 1,84 | 0,86 à |
RW ros ben 10,89 111,25 EE
Cara Ca EES |
2 Abnahme l, „ 2, [1,24 0,63 (10 63 | 78,751 1102,51145,8 || Je 20 ccm der Sus.
H H 3 U |
nach | 1,20 | 0.62 |
3 Stunden 12, S 1 || 2,60 1,15 ||
pension enteiweißt,
11,15 | 287,5 | 4025,0 532,4 auf 100 ccm aufs
2,58 | 1,14! gefüllt, davon die an»
a „ 1,1149 | 0,72 A ¡| gegebenen Mengen
(ses | 190 | 059 110,71 [177,5 | 2485,01828,7 || TT verarbeite
3. Abnahme| 1, 1. [12721 12011, 0 Lane: | me
Bose 1, , 258 | 114 11,17 292,5 | 4095,0/541,6
48 Stunden |
lg , 1, äm) 131,0 |.
mr |292| 128 [13 13250 | 4550,0/601,8
||
[9 » l n || 2,88 (E 1,26 315,0 | 4410,0/583,3'
2,88 |
Biochemische Zeitschrift Band 162. 7
98 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
hinter der Glykogenabnahme. Bei pg 6,81 ist nach 2 Stunden die Glykogen-
spaltung beendet, die Zunahme des Traubenzuckers geht aber weiter.
Abb. 9 (Versuch 5).
Versuch 6 (Tabelle VIa und b): 43g Leberbrei + 300ccm H,O.
Kolben 1: 100 ccm Suspension + 100 cem Pufferlösung (n/5 Phosphatpuffer,
Tabelle VI. a) Glykogenwerte (Abb. 10).
= | E
| S 8 a ns
33 | žag) SS
Kolben = 7 SQ $3 1 S 3 | Proz.
E © >
3
BC
|
155,0 | 4216,0
346,2 | 4708,3 | 4364,6 | 99,6
Ui Stunden | 340,0 | 4624,0 | 4286,4 | 97,8
101,2 | 2752,6 | 2551,7| 65,2
|
2. Abnahme 322,5 | 4386,0 | 4065,9 | 92,8
nach
3 Stunden en | 1,33 | 322,5 | 4522,0 41920| 95,7
Zee eu A WEEN me
| | A E VA A
3. Abnahme = i) 1,21 | 302,5 41140 3813,7| 87,1
ER 2 dÉ 119 |
li yl , | | 7
96 Stunden | 28 | Vë | 1,21 | 302,5 | 4114,0 | 3813,7| 87,1
¡13 red.in20ccm 0,65 | 0,43 |
| oo } 0,44» 55,0 | 1496,0 | 1386,8| 35,4
Autolyse. V. 99
2tert.: 10 sekund. Phosphat), pm 8,83. Kolben 2: 100 ccm Suspension
+ 100 ccm Pufferlösung (n/5 Phosphatpuffer, 2 tert.: 8sekund. Phosphat),
pH 8,88. Kolben 3: 100 ccm Suspension + 100 ccm Suspension (n/5
Phosphatpuffer, 2 tert. : 8 sekund. Phosphat). Dieser |Kolben wurde
3 Stunden im Eisschrank stehengelassen, dann die Reaktion mit n H,SO,
auf ppm 5,96 gebracht, sofort eine Abnahme gemacht,Ydann in den
Brutschrank gestellt, nach 1%, 3 und 72 Stunden je 20 ccm zur Unter-
Abb. 10 (Versuch 6).
Tabelle VI. b) Zuckerwerte (Abb. 11).
E Pp | E E E SE / |
BES r P 8 |g E KEE | |
Kolben D Ge - O | 2 | ER e N 5. | Proz. ||
se |8 | Z |N”A| 3 |
— || [cm] me | me | me | me | 8
Le as P | en |
f | | > H
Anfengawert | Für 1und# | 1,66 | SN 110,70 39,5 | 537,2 |100 In, aut 100 com
| A | E | oe | | | davon 5ccm reduziert
m‘ Im | 0,60 10,62 31,0 | 843,2 |100
1. Abnahme | ¡ call | |
Wie) 1 e e 10,87 | 43,5. 591,6 (110,2 |
11/27 Stunden | o 182 | 085 a a |
| |192 | 0'89 10,87 | 43,5 ged ag
p > deu az | 35,5 | 965,6 114,5
AAA | —- | E — — —
2. Seen 1 | er 10,99 0,99 | 49,5 | 673,2 |125,3 Je 20 ccm Suspension
` POL wi gi DA eg A
| [2,04 | 0,94 10, EH CH davon 5ecm reduziert
| fr NOS 0,95 | 47,5 1202 [153,2
3. Abnahme|| 1 ||1,98 | 0,92 RN A
ar | | T89 | 0'87 10,90 45,0 | 612,0 114,0
96 Stunden | | | |
WW ` € 10,80 | 44,5 | 605,2 112,7
3 las Loi Lag) kenge Ai
15 111,46 || 73,0 |1985,6 (235,4
| ELSE "Ted Kies aad ii
7%
100 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
suchung entnommen. Anfangsweri: Zweimal 10 ccm der Suspension zur
Glykogenfállung, die Glykogenlösung auf 200 ccm aufgefüllt, davon 20 cem
hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt, davon 10 cem reduziert. Abnahmen:
In je 20 ccm Glykogenfállung die Lösung auf 200 ccm aufgefüllt, davon
20 ccm hydrolysiert, auf 100 cem aufgefüllt, davon 10 ccm reduziert.
15 3 Stunden ——> 96
Abb. 11 (Versuch 6).
Der Versuch zeigt die minimale Glykogenspaltung bei der stark alka-
lischen Reaktion von pg etwa 9. Diese rührt nicht von einer Zerstörung
des Ferments her, da nach einem halbstündigen Aufbewahren im Eisschrank
bei pa 9 und nachheriger Herstellung von py 5,96 nach 96 Stunden noch
eine Spaltung bis 70 Proz. zu erzielen war. Die nachweisbare Zucker-
zunahme blieb aber weit hinter dem Glykogenabbau zurück, was bei der
stark alkalischen Reaktion zum Teil auf eine beträchtliche Zuckerzerstörung
zurückgeführt werden kann.
Versuch 7 (Tabelle VIla und b): 32,0g Leberbrei + 200 ccm H,O.
Kolben 1: 100 eem Suspension + 100cem Pufferlösung (m/5 Lactat-
puffer 4: 1) pm 3,55. Kolben 2: 100ccm Suspension + 100 ccm
Pufferlösung (n/5 Lactatpuffer 4: 1). Dieser Kolben wurde für 3 Stunden
Tabelle VII. a) Glykopenwerte (Abb. 12).
| zi | Yes HIER
1 5 e E \ A ee >
f (253 | y E "Mittel. 58 EE PER |
i Kolben BE E 2 | Ser EFF dë | En Proz
bs zé |N u mar E LES A
= ] ccm S mg | | më mg | mg |
u SEEN i A L TA Me, yon u ` e eg? o E IS x er“ Ge eg = er CT ees
. |
zungen zur] Br A Se Jun 690,0: mme 100
K
e 2 | o6 $ 0,42 | be
8 i ` | 0.6 | 042 Jos | Pa
1. Abnahme „, 1 | 14 | 0,69 0,69 ES 3105,0 | 28783 | 100
nach | y 14 0,69
11/, Stunden 2. EE 195 oni | Yoga i 188,0 | 3384,0 kel 89,5
2. Abnahme, 1 Lë et | a
| 63, | 317,5, 2857,5 | 2648,9; 92
EC 13 002 110.635! 31 5 |26489; 9 0:
3 Stunden | 2 red. 5 cem ' i N jos 180,0 | 3240,0 3003,5. 85,7
Be E Na aha elo ann ee ’
3. Abnahme | l | 1,25 0,62 | i |
| 1 730 | 068 Jona ama 317,5 | 2857,5 SE 92,0
48 Stunden |2;red.lOcem, 0,45 | 0,37 |
under. | 050 | 039 | E) | 38,0| 6840| 6340. 18,1
Autolyse. V. 101
(bei pp 3,55) im Eisschrank aufbewahrt, dann mit n/l10 NaOH auf
pe 5,1 gebracht, sofort in ein Wasserbad von 37° gestellt, der Anfangs-
wert bestimmt und nach 1%, 3 und 48 Stunden Abnahmen gemacht.
Anfangswert: 10 ccm der Suspension für die Glykogenbestimmung, auf
NS
ës
EE
SW
Fafe
SE
Se
BS
EN
DE
N
un
La
Stunden =a
Abb. 12 (Versuch 7).
200 ccm aufgefüllt, davon 50 cem hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt,
2 ccm reduziert. Abnahmen: 20 ccm für Glykogenbestimmung, auf 200 ccm
aufgefüllt, davon 50 eem hydrolysiert, auf 100 eem aufgefüllt, davon
2 ccm reduziert.
Tabelle VII. b) Zuckerwerte (Abb. 13).
| | SN
| (EK: 5 | |
EE z z (19 8] ¿0
| |358| Tgl § 58% | #83 |
| Kolben € ES E 3 | b 132 4 333 Proz.
|| A IN z IN o | 3
zs — | SE | ccm mg m | mg | mg | z |
A ——— a E e
Anfangswert | Für 1 | 234 | 1,06. | | | |
| | 230 | 1.04 [jro ı 52,5 | 472,5 |100 10 SE
| | | 100 cc jefúllt,
Be 8 [11,20 0:05 Jungs) 32,5 | 585,0 |100 |] davon 5 cem
— HH > Bar SA — | | x A AI =
1. Abnah | |
ope zi Jr: Vë |1,07 53,5 | 481,5 [102,0
11/2 Stunden 2 | 170 0.80 | | |
ml? | 15 0/82 IS Bel Get | N
+ HA Er 468,0 Ah, A
nach | 2,30 | 1,04 | Ad ` ) ? | auf 100 ccm aufs
3 Stunden o | | | füllt, d 5
rt, | 05 10,86 | 43,0 774,0 1323| rn
3. Abnahme || 1 red2ccml 0,70 10,45 lla 4a | mel xi xl
ea le i 0:70 | 045 Dos | 57,5 | 517,5 [109,6
48 Stunden | 2 1264 1117 | |
| |274 | 122 WË | 150,0 [270,0 461,5
102 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
Der Versuch zeigt das Ausbleiben des Glykogenabbaues bei pg 3,55.
Die dreistündige Einwirkung dieses Säuregrades macht das Fermert nicht
dauernd unwirksam; wird der Brei nachher auf ein günstigeres pg gebracht
Abb. 13 (Versuch 7).
(5,1), so läßt sich noch eine Spaltung von über 70 Proz. erzielen. Die
schwache Glykogenabnahme bei pg 3,55 wurde von keiner nennenswerten
Zuckerzunahme begleitet.
Versuch 8 (Tabelle Villa und b): 41,0g Leberbrei + 200 ccm H,O.
Kolben 1: 100ccm Suspension + 100 ccm Pufferlösung (n/5 Lactat-
puffer 4: 1), pu 3,6. Kolben 2: wie Kolben 1 zusammengesetzt, 2 Stunden
im Eisschrank, dann mit n/10 NaOH auf py 6,4 gebracht. Anfangswerte:
Tabelle VIII. a) Glykogenwerte.
| ad S SS
ag g 25 y
5 SS -g g 6% $
Kolben FE y ee 428 EE | Proz.
5 Zu | wer || 52% di
Zë Ié INTA St?
EE DEEN Sr ¡Ml | mg mg
Anfangswert| Für 1 | 0,82 | 0,48
| 0,80 | 0,48
„ 2,red.4ccm | 0,80 | 0,48 |
0,81 | 0,48 `
1. Abnahme: 1 2 080 | 048 |
Sen ın®n | 080 | 048 | | 240,0 | 2208,0 2047,8 | 100
LL Stunden! 2, „5 „ || 0,83 | 0,49 ae
Ui eg a » d 092 | 052 l 102,0 1876,8 1739,8 | 85,0
2. Abnahme; 1,,4 17 08 | |
Sea ntn re | oze! 195,0 | 1794,0 | 1663,0 | 81,2
3 Stunden , %»0, 107 10,45 | 0,45 | 90,0] 1656,0 | 1535,1 | 75,0
3. Abnahme! 1,,5, 14 | 069 E T le
de | ein + | 0,68 | 138,0 | 1269,6 | 1176,9| 57,5
er 3036| 2814| 13,7
48 Stunden | 2, n 5 no i 0,3 Jos
| |. i
qe
`
|
Autolyse. V.
103
Tabelle VIII. b) Zuckerwerte.
| FF | JI: A E IR
| E38 el 2 138% 38:
| Kolben | £ Ge = O | E ké. ER | Proz
| Gë [3 [32 S73] 8 |
On» | com | mg || mg mg | mg |
Rz, e P TEE E me e F EF
£ |
Anfangswert Für 1 1,60 | 0,76 (Na ma | y 10 S s
j| | 1.58 0,75 WW 16: 38, 0 349,6 ‚100 | sion, enteiweißt
|| Für 2, 20 ccm | 0,81 | 0,48 | Gr füllt da eg
| enteiweißt 10,84 | 0,49 | Jan) 49 | 24,5 | 450,8 [100 foom reduziert
= mi ee Buell Br baia E ad: s
1. Abnahme || l i| 1,50 | 0,72 a mo || |
SERA 1'48 | 0°71 jo 72| 36,0 | 331,2) 944
11/3 Stunden 2 1 16 0 60 | 3
| 122 | 063 | j0, 62 1 31,0 | 570,4
| | | Ih wer 20 ccm Suspens
À nn l dl ja ocio lo, OR 35,5 | 326,6 93,4 | sion, enteiweißt,
3 Sa A 42 0, #9 UN | > auf 100 ccm auf»
e N Joso 34,5 | 6348 140,8 || gefüllt, davon
Re li sg 1,35 0,67 N 5ccm reduziert
3. Abnahme l | 1,74 | 0,82 | | |
mes? 166 | 078 jo, 80 | 40,0 | 368,0 105,2:
45 Stunden 9 red.2ccm!| 1,10 0,58 |
0.98 0.54 [0,66 70,0 1288,0 285
10 ccm Suspension zur Glykogenfällung, die Glykogenlösung auf 200 ccm
aufgefüllt, davon 50 ccm hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt, davon 2 ccm
reduziert. Abnahmen: 20 ccm Suspension zur Glykogenfällung, die Lösung
auf 200 ccm aufgefüllt, davon 50 cem hydrolysiert, auf 100 ccm aufgefüllt,
davon 2ccm reduziert.
Dieser Versuch ergibt dasselbe Resultat wie das vorherige. Kein
nennenswerter Glykogenabbau bei pp 3,6; die Hemmung ist reversibel.
Auch hier keine dem Glykogenabbau entsprechende Zuckerbildung.
In weiteren, hier nicht näher geschilderten Versuchen mit ,,alkalischer**
bzw. „saurer‘‘ Vorbehandlung in der Wärme erwies sich die Überführung
in ein günstigeres py vielfach unwirksam, wohl infolge irreversibler
Schädigung (Ausflockung ?) des Ferments. Stets findet sich im sauren
Gebiet eine starke Differenz zwischen Glykogenabnahme und Zucker-
zunahme.
Alle die angeführten Versuche zeigen die starke Abhängigkeit
der Glykogenspaltung bei der Leberautolyse von der Reaktion des
Mediums. Der stärkste Abbau wurde bei pu 6,7 gefunden; sowohl
nach der alkalischen wie nach der sauren Seite hiervon ist er geringer;
bei pa 3,5 und 8,8 ist er eben nur nachweisbar. Die Menge des durch
Reduktion nachweisbaren Zuckers geht nur selten mit dem Glykogen-
abbau gleichen Schritt; namentlich bei den sauren Reaktionen um
etwa pa 3 bis 4 bleibt die Zunahme des Traubenzuckers weit hinter
der Abnahme des Glykogens zurück, was ungezwungen auf eine starke
Verlangsamung der fermentativen Spaltung auf der Stufe nicht-
104 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
reduzierender Zwischenkohlenhydrate zurückgeführt werdenkann. Eine
Glykolyse ist bei den in Frage kommenden Reaktionen im sauren
Gebiet wohl auszuschließen. Zur Klärung dieses Punktes werden noch
weitere Versuche angestellt werden. Das Optimum der Glykogen-
spaltung stimmt befriedigend mit dem Optimum der Diastase (Amylase),
wie es von Holmbergh!) für die Amylase der Schweinsleber (bei 0,29 n
Phosphatpuffer und 0,024 n NaCl) gefunden wurde (py 6,9), überein.
Doch ist es naheliegend, für den vollständigen Abbau des Glykogens
— außer der stets vorhandenen Maltase — das Zusammenwirken
mehrerer Fermente, die sich gegen die Aciditäten des Mediums nicht
gleichmäßig verhalten, anzunehmen?).
IL
Eine zweite Reihe von Untersuchungen beschäftigte sich mit der
Zunahme des anorganischen Phosphors während der Autolyse in ihrer
Abhängigkeit von der Re-
aktion des Mediums. Die Be-
stimmung des anorganischen
Phosphors erfolgte nach der
Methode von H. Lieb.
Versuch 9 (Tabelle IX):
8,0g Leberbrei (Meerschweir:-
chen) + 100ccm H,O. Kolben 1:
40 com Suspension + 40 ccm
Pufferlösung (n/5 Lactatpuffer
4:1), pg 3,33. Kolben 2: 40 ccm
Suspension + 40 cem Puffer-
Abb. 14 (Versuch 9). lösung (n/5 Acetatpuffer 1:10).
Pg 5,3. Anfangswert: 5cem Sus-
Tabelle IX (Abh. 14).
| S P | in der
h dei | P ¡in 5
E Ä ewogen | Suspensión NEE Proz. |
SS BU j m | [m jo EE
Anfangswert : 0,0069 | o, 10 |
BER 0.0076 OU ¡po 0,3497, 7,344 100. | o
l ¡10 bei a e
` Zär 7 MI. oasi ) 0386 | 3086 Ir ue Dë A
3 Stunden $ 9. i 0,0132 | 0,192 0475 | 9,975 | 135,9 I en
o DN 0.0130 | 0,189 NK Bar | o
2. Abnahme ' l i 0,0213 | o 309 „ (eem, wie bei der 1. Ab.
nach | | 0,0218 | 0,316 ] 0,7812 8,203 | 111,7: nahme behandelt
28 Stunden |. 2. 0,0334 | 0,485 |
1) Zeitschr. f. physiol. Chem. 134, 68, 1924.
2) Vgl. hierzu „Die Fermente“, von O. Oppenheimer, I, S. 677 (1925).
Autolyse. V. 105
pension kurz aufgekocht, mit HgCl, und HCl enteiweißt, mit H,S ent-
quecksilbert, eingedampft, auf 50 com aufgefüllt. In 15ccm P bestimmt.
Versuch 10 (Tabelle X): 34,0 g Leberbrei (Kaninchen) + 200 cem H,O.
Kolben 1: 50,0 ccm Suspension + 50,0 cem Pufferlösung (n/10 Weinsäure-
puffer 1:1), pa 3,1. Kolben 2: 50,0ccem Suspension + 50,0 ccm Puffer-
lösung (n/10 Weinsäurepuffer 1: 32), pg 3,6. Kolben 3: 50,0 ccm Suspen-
sion + 50,0 ccm Pufferlósung (m/10 Acetatpuffer 1: 1), pg 4,75. Kolben 4:
50,0ccm Suspension + 50,0ccm Pufferlösung (n/10 Acetatpuffer 1:32), pg 6,2.
AE AAA
3 Stunden —> 28
Abb. 15 (Versuch 10).
Tabelle X (Abb. 15).
P P | dl
$ | Oo p li. 10ccm! in der |
A ogen | Suss | ganzen | Proz.
E Pension ` Leber |
. ONNENN AE N. .
Anfangswert | | 0,0069 ] 0.0995 | 0.995 | 22 38.! 100 ¡A eg pp AE
| | 0,0068 i ; | Aki || füllt, 10cem zur Bestimmung
2 D - SE | a S
1. Abnahme | 1 | 0,0068 ]
Le 0,102 1,02 | 22,95 | 102,5
nach | | 0,0072 | | |
3 Stunden | 2 | 0,0079 | 0.112 | 1.12 | 252 |1125 Je 20 ccm Suspension,
| || 0,0075 |} 3 Ae | 3 , | enteiweißt, auf 100 ccm
"83 0,0103 | | | aufgefüllt, 10 ccm zur
1" | 0.0108 | 0,1503 | 1,503 | 33,82 | 151,1 rs
| | | | |
| 4 || 0.0189 |) S
& 0,0200 j 0,289 | 2,89 leas 290,4 . 8
2. Abnahme || 1 || 0,0088 |) 7 194 | 126 | 28.35 [126.6 |
nach Í 0,0085 | i |
28 Stunden | 2 || 0,0094 | |
i 0.0091 0,134 | 1,34 | 30,15 | 134,6
| 3 | 0,0130 | e | e
kg } 0,195 1,95 43,88 | 195,9
| 4 | 0,0200 }
0,295 | 2,95 | 66,38 | 296,4
|
106 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
Versuch 11 (Tabelle XI): 30,0 g Leberbrei + 200 ccm H,O. Kolben 1:
100 ccm Suspension + 100 cem Pufferlösung (m/10 Weinsäurepuffer 1: 1),
Tabelle XI (Abb. 16).
|
| 20 ccm Suspension, ent:
| eiweißt, auf 100 ccm auf»
gefüllt, 5ccm zur
Bestimmung
1. Abnahme
nach 0,0082 S i 29,92 DAB ee an ee
3 Stunden 0 gefüllt, 5ccm zur
Bestimmung
3,22 | 35,42 | 136,4
2. Abnahme
nach 0,0174 , | 27,94 | 107,6 | 10 ccm zur Bestimmung
48 Stunden | 2 0,0304 |
3 Stunden ER E
Abb. 16 (Versuch 11).
Tabelle XIa. Hydrolysewerte.
EEN
|
f P
| Gewogen P in 20ccm |ind.ganzen
| mg
=
"I
0,311 | 3,112 | 3423 | 131,8 | HCI 4Proz
P
Suspension Leber
mg mg
I
H
|
Le
|
33,66 | 1296 | HCI10 .
352 |1356 | Ha 2.
)
Kolben 1 || 0,0215 | 0,312 3,12 34,32 | 1322 | HCW .
Autolyse. V.
107
Pa 3,17. Kolben 2: 100 ccm Suspension + 100 ccm Pufferlösung (m/10
Acetatpuffer
1: 32), pu 6,1.
Ferner wurden 20 ccm Suspension enteiweißt, auf 100 ccm aufgetüllt,
je 25ccm 2 Stunden im siedenden Wasserbad am Rückflußkühler mit
HCl von angegebener Konzentration hydrolysiert, nach der Hydrolyse
aui 50 com aufgefüllt, davon 20 ccm zur P-Bestimmung.
Versuch 12 (Tabelle XII): 28,0 g Leberbrei + 200 cem H,O. Kolben 1:
50 ccm Suspension + 50 eem Pufferlósung (m/10 Weinsáurepuffer 1: 1),
pu 3,17.
Acetatpuffer
1:1), pg 4,78.
Pufferlösung (m/10 Acetatpuffer 1: 32), pg 6,39.
Tabelle XII (Abb. 17a und b).
Kolben 2: 50 ccm Suspension + 50 ccm Pufferlösung (m/10
Kolben 3: 50ccm Suspension + 50 ccm
E
| & ¡Gewogen P
o
ii
GE | 8 mg
Anfangswert|| || 0,0204
| 0,0200 | 0,303
| 0,0118
0.0111 \ 0,166
A A
l. Abnahme | la || 0,0214 |
nach | 0,0214 0,309
3 Stunden 1b 0,0122 dm
¡0,0116 |j >
|
2a | 0,0212 |
| 0,0213 | 0,309
2b | 0,0141 |
0.0134 | 0,199
3a | 0,0293
| 0,0336 l 0,426
3b | 0,0151 |
| 10.0141 | 0212
2. Abnahme | la | 0,0216 || ¿317
nach | || 0,0220
72 Stunden |1b| 0,0114 | 0,166
2a | 0,0306
0,0300 SN
\2b | 0,0168 |
| 0,0154 | 0,234
'3a || 0,0426
| | 0.0419 ] 0,613
\3b | 0,0220 |)
K P P |
i. 20 eem in der
Sus» graon | Proz.
pension ber |
L mg mg /
| 10 S ion,
1,515 | 33,33 | 100 || "seg suf 100 ccm,
| 20 ccm zur Bestimmung
| 10 ccm Suspension, ent»
1,66 | 36,52 109,6 | eiweißt, auf 100 ccm, 25 ccm
mit 4proz. HCI hydros
| lysiert a? 50 com; 20 ccm
| AA. A zur Bestimmung
| 20 ccm Suspension, ents
| 1,545 | 33,99 | 101,9 ad Te hen ccm,
| avon 20 ccm
| | 10ccm Suspension, ent»
‚1,728 | 38,016| 114,0 | eiweißt, auf 100 ccm, 25 ccm
hydrolysiert (4 Proz. H Cl)
| auf er 20 ccm zur
estimmung
| 1,545 | 33,99 | 101,9 || Wie la
| 1,997 | 44,93,| 1348 || „ 1b
|
2,130 | 46,86 | 140,6 || . 1a
212 |46,64 | 139,9|| . 1b
1,585 | 34,87 | 104,6
| |
1,660 | 36,52 | 109,5
22 [484 | 145,2
| 234 |5148 | 1544 |> Wie Abnabme 1
3,065 |67,43 | 202,3
13,22 |70,84 | 212,5
P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
108
"SSÁJOIPÁJT yu — — — — “98AJOAPAH dUYO - “08 A¡03PApy yu — — — *98A[03pAp] ouyo
(er y9nes2 4) 481 "og “(El ansao A) 981 '4QVY
ES äu 9h — vIPUNIS
00L 9E“DE
7
DH
A
7
"ssAjolpAy osu — — — “95A[OIPAH auygo ——
(zi yansıaA) 321 'qqy
28AIOIpAH osu — — — ʻ‘ƏSÁJoIPAH əuyo
(ZI ANSIA) 921 gg
vapurys
Autolyse. V. 109
Versuch 13 (Tabelle XIII): 50 ccm Leberbrei + 200 cem H,O. Kolben 1:
bü eem Suspension + 500 ccm Pufferlósung (m/10 Acetat 1: 1), pp 4,88.
Kolben 2: Wie oben (m/5 Acetat 1: 32), pg 6,45. Kolben 3: Wie oben
(m/10 Boratpuffer 1,5: 8,5), pg 6,87. Kolben 4: Wie oben (m/10 Borat-
puffer 4,5: 5,5), pu 7,6.
Tabelle XTIT (Abb. 18a und b).
| davon 20 ccm
ccm Suspension. ents
| 20 Susp
| eiweißt, auf 100 ccm,
'davon 25 ccm SE siert
(4 Proz. HCI), auf 50 ccm.
davon 20 ccm
Ze A F nn a ee 2 Ti A A Sp ee e Ges
Anfangswert || a | 0,0178 0,235 | 1,265| 30,36 | 10 | o See =
49,92 | 164,4 |
i Abnahme. 20 ccm Suspension, ents
E: eiweißt, auf [00 cem, davon
nach 20 ccm zur Bestimmung
3 Stunden Ä Ib 20 ccm Suspension, ent»
eiweißt, auf 100 ccm, davon
25ccm SE 4Proz.
HCl) auf 50 ccm, davon
| 20 ccm zur Bestimmung
| Wie la
BEN
22980) oan
¡3a || 0,0275
| | 0,0273 0,398 „la
3b || 0,0167
0.0166 0,242 „1b
4a | 0,0272 |
| 0,0273 0,396 |. 1a
4b | 0,0158
E 00188 || 0,235 . 1b
2. | m 0,0363
| | 0,0355 ) 0,521
48 Stu i del
| ¡ 00193 |j 0,28
2 0,0524
, | 0,0528 0,764 |
2b | 0,0258
Wa } 0,38
nl | 0,0510 Wie Abnahme 1
| 0.0504 | 0,736 |
at) 0,0268
| | 0,0270 0,39
4a 0,0476
0,0480 0,694
wei 00280) ane j
| 0,0251 |j 93
110 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
Versuch 14 (Tabelle XIV): 84,0 g Leberbrei + 200 cem H,O. Kolben 1:
50 ccm Suspension + 50 ccm Pufferlósunz (m/5 Acetatpuffer 1: 32), pg 6,09.
Kolben 2: Wie oben (m/20 Borax 2, m/5 Borsäure 8), pg 6,90. Kolben 3:
Wie oben (m/20 Borax 6, m/5 Borsáure 4), pp 7,92. Kolben 4: Wie oben
(m/20 Borax 8, m/10 Borsäure 2), py 8,44.
Stunden —> 21
Abb. 19a (Versuch 14). -———— ohne Hydrolyse, — — — mit Hydrolyse.
d Stunden —»> Y ’
Abb. 19b (Versuch 14). -— —-- ohne Hydrolyse, — — — mit Hydrolyse.
Autolyse. V. 111
Tabelle XIV
(Abb. 19a und b)..
(ei P P
2 i. 10 ccm! in der
| = P Suss anzen Proz.
Sé pension ber
en A m | mg GR, _ £
| l se | a
inci CH | 0,266 | 133 | 37,24 100 | te aut 100 com
| davon 20 ccm
Kë | 0,178 | 1,78 | 49,84 1338 | na O
| 25 ccm mit 4Proz. H Cl
| \hydrolysiert, auf 50,0 ccm,
JE davon 20,0 ccm
|
| | i à
l. Abnahme (ie 0,311 | 1,55, | 43,54] 116,9 | fe E,
nach I || 20,0 ccm zur Bestimmung
3 Stunden
Ve 18 |18 |504 |135,3 | Wie oben b
Ze 0479 | 239, | 5748| 1543.
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nach |
4 Stunden pa! 404 | 404 [113,112 | 303,8
pp \ 0,914 | 4,57 127,96 | 343,6 |
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3 0.0613 | | Wie Abnahme 1
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| | 0.0609 |} 0,886 | 4,43 [124,04 | 334,0
li 00923 || 0,469 | 4,69 |131,32 | 352,6 |
I “yvos | | |
Versuch 15: 44,5g Leberbrei + 200 ccm H,O. Kolben 1: 50 ccm
Suspension + 50 cem Pufferlösung (m/5 Acetatpuffer 1:32), py 6,44.
Kolben 2: Wie oben (m/20 Borax 2, m/5 Borsäure 8), pg 7,23. Kolben 3:
Wie oben (Borax 6, Borsäure 4), Pa 7,94. Kolben 4: Wie oben
(Borax 8, n/10 NaOH 2), re 8,63. Den Verlauf des Versuchs schildert
Abb. 20a und b.
112 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
3 Stunden — 24
Abb. 20a (Versuch 15).
J Stunden — A
Abb. 20b (Versuch 15).
Versuch 16: 43,8g Leberbrei + 200 ccm H,O. Kolben 1: 50 cem
Suspension + 50 com Pufferlósung (m/5 Acetatpuffer 1:32), pg 5,72.
Kolben 2: Wie oben (m/20 Borax 2, m/5 Borsáure 8), pg 7,34. Kolben 3:
Wie oben (m/20 Borax 6, m/5 Borsäure 4), pg 8,14. Kolben 4: Wie oben
(m/20 Borax 8, n/10 NaOH 2), pa 8,95. Den Verlauf des Versuchs schildern
Abb. 2la und, b.
3 Stunden —> Y
Abb 2la (Versuch 16).
ohne Hydrolyse, — — — mit Hydrolyse.
113
Abb. 22b (Versuch 17).
ohne Hydrolyse, — — — mit Hydrolyse.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 8
114 P. Rona, E. Mislowitzer u. S. Seidenberg:
Versuch 17: 64,0 g Leberbrei + 200 cem H,O. In allen Kolben 50 ccm
Suspension + 50 ccm Pufferlösung wie im vorigen Versuch. Kolben 1:
pa 6,7; Kolben 2: pp 7,1; Kolben 3: pp 7,75; Kolben 4: pg 8,75. Den
Verlauf des Versuchs schildern Abb. 22a und b.
Die Gesamtheit der Versuche zeigt, daß die Menge der Phosphate
im Verlauf der Autolyse stark zunimmt und daß diese Zunahme vom
pa des Mediums stark abhängt. Die größte Zunahme des anorganischen P
findet man ungefähr im Neutralgebiet, etwa bei pu 7 bis 8, während
bei stark alkalischer (pa etwa 9) und sauren (pa 6 bis 3) Reaktionen
die Zunahme äußerst gering ist. Das Optimum der Spaltung der
Phosphatide, Nucleine bei der Autolyse fällt also nicht mit dem Optimum
der autolytischen Eiweißspaltung (pa 3,7 bis 3,8) und dem der Kohle-
- hydratspaltung (pa 6,7) zusammen. Die im Leben in der Leber wirk-
samen Fermente entfalten also auch während der Autolyse ihre
Wirkungen gemäß den speziellen Bedingungen.
Die bei der Autolyse direkt bestimmbare Menge der anorganischen
Phosphate wird durch Säurehydrolyse des eiweißfreien Filtrates
nicht wesentlich erhöht. Im Laufe der Autolyse werden höhere
phosphorhaltige Komplexe gespalten, die zu Beginn der Autolyse
entweder noch nicht wasserlöslich oder durch schwache Säuren
noch nicht spaltbar sind. Eine Überschlagsrechnung ergibt, daß etwa
zwei Drittel des entstehenden gesamten anorganischen Phosphors auf
die Nucleine und Phosphatide der Leber bezogen werden muß. In
vielen Fällen ist zu Beginn die Menge der säurehydrolysierbaren
Phosphorverbindungen etwas größer als die direkt gefundene Phosphat-
menge, während der Autolyse wird aber nicht bei dieser durch Säure
hydrolysierbaren Phosphorverbindung haltgemacht, sondern bis
zur direkt bestimmbaren anorganischen Form gespalten. Möglicher-
weise handelt es sich auch hier um mehrere ineinandergreifende Ferment-
prozesse. Ein sicherer Anhaltspunkt für Entstehung von Hexose-
phosphorsäureverbindungen während der Autolyse kann aus diesen
Versuchen noch nicht gewonnen werden.
IH.
Zum Schluß wurde in größeren Versuchsreihen die während
der Autolyse entwickelte Milchsäuremenge bestimmt und ihre Ab-
hängigkeit vom pm des Mediums untersucht. Benutzt wurde hierzu
die Methode von Fürth und Charnass unter Berücksichtigung der von
Embden, Parnas, Meyerhof angegebenen Modifikationen. Nach den
bisherigen Untersuchungen, von deren Wiedergabe abgesehen wird,
hängt die bei der Autolyse entstandene Milchsäuremenge weder mit
der Glykogenspaltung noch mit dem Zuckerangebot zusammen. Gesetz-
mäßige Zusammenhänge zwischen pa und Milchsäuremenge konnten
nicht aufgefunden werden. Für die Säuerung der Leber während der
Autolyse. V. 115
Autolyse kommt die Milchsäure neben der Phosphorsäure nur in ge-
ringem Maße in Betracht. Während in den Versuchen die Milchsäure
pro 100g Leber durchschnittlich 0,8 bis 1,6 Säure-Milliäquivalente
lieferte, kamen auf Rechnung der Phosphorsäure 15 bis 25 Milli-
áquivalente. Wir müssen die autolytische Säuerung der Leber im
wesentlichen auf Entstehung von Phosphorsäure während der Autolyse
beziehen.
Zusammenfassung.
l. Der Glykogenabbau während der Leberautolyse hängt stark
von der Reaktion des Mediums ab. Am günstigsten verläuft er bei
pu 6,7, sowohl bei alkalischer als auch bei saurer Reaktion ist er ge-
ringer. Bei pm 3,5 und 8,8 ist er eben nur nachweisbar. Die durch
Reduktion nachweisbare gleichzeitig entstandene Zuckermenge bleibt
gewöhnlich hinter der entsprechenden Glykogenabnahme zurück.
Namentlich bei den sauren Reaktionen (um pa 3) ist die fermentative
Spaltung der nichtreduzierenden Kohlehydrate stark verlangsamt.
2. Während der Autolyse nimmt die Menge des ‚anorganischen
Phosphors“ stark zu; auch diese Zunahme hängt stark vom pa des
Gemisches ab. Am größten ist sie im neutralen bzw. schwach sauren
Gebiet, während sie in stark alkalischen (pa 9) oder siärker sauren
Reaktionen (etwa von pu 6) nur äußerst gering ist. Im wesentlichen
ist die Entstehung des anorganischen Phosphors auf fermentative
Spaltung der Nucleine und Phosphatide zu beziehen, die unabhängig
von der Eiweiß- und Glykogenspaltung und unter anderen optimalen
Bedingungen vor sich geht. Für die Annahme der Entstehung von
Hexosephosphorsäureverbindungen während der Autolyse bieten die
Versuche vorläufig keinen Anhaltspunkt.
3. Für die Zunahme der Acidität in der Leber während der Autolyse
kommt die Milchsäure neben der Phosphorsäure nur in untergeordnetem
Maße in Betracht.
ge
Über die Botelhosche Reaktion.
(Aus der II. intern. Klinik der Universität Budapest.)
Von
Franz Faludi.
(Eingegangen am 6. Juli 1925.)
Der intermediäre Stoffwechsel ist ein Spiegel der physikalischen
und chemischen Vorgänge des menschlichen Organismus. Die Ent-
wicklung einer bösartigen Geschwulst irgendwo im Organismus wird
zwischen den gesunden und geschwülstigen Zellen das Angehen solcher
Vorgänge veranlassen, welche die Änderung des ganzen Stoffwechsels
verursachen. Seien auch diese aus der Zelle selbst erzeugte spezifische
Fermente oder Zerfallsprodukte, oder gar als Reaktion der Gewebe
entstehende Immunkörper, der veränderte Chemismus wird am emp-
.findlichsten das Stattfinden der Schädigung anzeigen. Es ist gleich-
gültig, ob wir die toxische Wirkung der Geschwulstzellen oder die auf
sekundäre Weise auftretenden reaktiven Erscheinungen bei Fest-
stellung der Diagnose benutzen. In beiden Richtungen wurden Ver-
suche unternommen, doch konnte bisher noch keine, nur auf maligne
Geschwülste charakteristische Blutveränderung mit voller Sicherheit
nachgewiesen werden. Auch die chemische Untersuchung der Sera
von Geschwulstkranken konnte bisher keinen wesentlichen Erfolg auf-
weisen. Seitens der organischen Bestandteile könnte noch ehestens
die Konzentrationsverminderung der Eiweißkörper als am meisten
charakteristisch erwähnt werden. Im Serum der Krebskranken finden
wir statt der normalen 7 bis 8 Proz. häufig Werte unter 6 Proz. Diese
Erscheinung kann aber — wenn auch bedeutend seltener — bei
anderen, hauptsächlich solchen chronischen Krankheiten beobachtet
werden, welche Inanition, Kachexie, mit einem Worte, das Abschwinden
des Organismus zur Folge haben. Nach den Forschungen von Kahn
wird hauptsächlich die Abnahme des hydrophilsten Teiles der ge-
samten Eiweiße, also das Albumin A, als besonders charakteristisch
bezeichnet. Die Nachweisung dieses Umstandes wäre nach seiner
Meinung auch diagnostisch verwendbar.
F. Faludi: Botelhosche Reaktion. 117
Der im Serum befindliche Zucker-, Salz- und Lipoidgehalt ist in
solchem Maße schwankend, daß er bei Erkennung von Geschwülsten
kaum zu verwerten ist. Nach Bernhard wäre der Phosphorquotient
(Zerner) und Zunahme der Blutzuckerwerte als Anzeichen einer fort-
geschrittenen Kachexie zu betrachten.
Unter den serologischen Krebsproben ist die Botelhosche Reaktion
wegen ihrer Einfachheit eine der hervorragendsten. Ihre Ausführung
ist ziemlich rasch, beansprucht keine besondere Handfertigkeit. Ihr
großer Vorteil ist, daß die dazu verwendeten Reagenzien haltbar sind.
Die Ausführung ist folgende: Durch Punktion der Armvene wird
Blut entnommen. Nach Gerinnung werden 0,25 ccm des sich zellenfrei
absondernden Serums mit 0,25 ccm einer 0,75proz. Kochsalzlösung gemischt.
Zu 0,5ccm der Mischung werden 2 ccm Citronensäure-Formalinlösung bei-
gemengt (Zusammensetzung dieser: Leem des im Handel käuflichen
Formalins und 5g Citronensäure werden in 100 ccm physiologischer Koch-
salzlösung aufgelöst). Nach dem Zusammenschütteln sind 0,7 ccm folgender
Lösung beizufügen: lg Jod, 2g Jodkalium in 210 ccm Wasser. Nach
dieser Beifügung werden wir an der Berührungsfläche der beiden Flüssig-
keiten eine grobe Ausflockung beobachten, die nach Schütteln des Probier-
röhrchens entweder verschwindet oder weiter verbleibt. Wenn sich die
Mischung aufklärt, geben wir weitere 0,2 ccm der Jodlösung dazu. Erfolgt
nach dem Schütteln keine bleibende Ausflockung, so ist das Resultat
der Probe negativ. Die nach 0,7 ccm entstehende Ausflockung ist als
positiv, die nach 0,9 ccm erfolgende als zweifelhaft (+) anzunehmen.
Gesundes Serum wird nur nach Zugabe von mehr als 1ccm Reagens eine
dauernde Ausflockung ergeben.
Mit auf diese Weise zusammengesetzten Lösungen werden wir aber
häufig unverläßliche Folgerungen ziehen, da auch bei anderen Erkrankungen
gar ott eine Ausflockung erfolgt. Deshalb beantragte Botelho, zur Hebung
der Spezifität der Probe die Citronensäure-Formalinlösung durch 1proz.
Salpetersäure zu ersetzen. Cabanis und Foulquier haben — da selbst das
Formalin in gewissen Fällen eine Opaleszenz, sogar auch Ausflockung
verursacht — das Reagens mit 5proz. Milchsäure ersetzt. Diese Modi-
fikationen haben sich aber in der Praxis nicht sehr bewährt.
Allein die Wilbouchewitchsche Modifikation ist von gewissem Wert,
weil hier die Zitronensäure und das Formalin nicht in physiologischer
Kochsalzlösung, sondern in destilliertem Wasser aufgelöst wird. Nach
Guerin ist die Reaktion nach dieser Weise zwar nur in 80 Proz. der
Sera von Krebsleidenden positiv, hingegen ist aber die Zahl der ver-
fehlten Diagnosen unvergleichbar geringer. Diese Momente erwägend,
haben wir unsere Versuche nach der Wilbouchewitchschen Modifikation
unternommen.
Es sei uns noch erlaubt, kurz auf das Wesen der Botelhoschen
Reaktion hinzuweisen. Palmieri beobachtete als erster, daß im Falle,
wenn das gesunde Serum stärker wie vorgeschrieben (also statt 1:1,
im Verhältnis 1:2) verdünnt wird, also dadurch die Konzentration
der gesamten Eiweißkörper vermindert wird, reichliche Ausflockung
118 F. Faludi:
schon bei 0,7 ccm des Reagenz zu erzielen ist. Wenn wir nicht das
Serum verdünnen, sondern die Jodlösungsmenge vermehren, z.B.
wenn wir gesundes Serum mit 1 bis 1,5 ccm Reagenz behandeln, wird
die Ausflockung ebenfalls erscheinen. Durch Zugabe kleiner Serum-
mengen kann die Ausflockung geklärt werden. Hieraus schließt Palmieri,
daß die Ursache der Positivität in der Verminderung der Eiweißkörper
zu suchen sei, d.h. die im gesunden Serum noch keine Ausflockung
verursachende Jodlösungsmenge sich gegenüber dem verminderten
Eiweißgehalt des Krebskrankenserums als überflüssig erweist. Kahn
hebt im Gegensatz mit Palmieri die Wichtigkeit der Verminderung
des Albumins hervor und versucht, die ganze Erscheinung von diesem
Standpunkt aus zu beleuchten.
Mit Rücksicht jedoch darauf, daß bei den Versuchen von Palmieri
mit dem Serum auch der Albumingehalt verdünnt wurde — und dies
nach Kahn der entscheidende Faktor wäre —, können seine Forschungen
in dieser Richtung keine Aufklärung geben. Eben deshalb hatten wir
uns mit dieser Frage eingehender beschäftigt.
In 30 Fällen haben wir mit dem Serum eine refraktometrische Eiweiß-
analyse nach Rohrer unternommen. Die Tabelle I zeigt unsere Ergebnisse
zusammenfassend.
Tabelle I.
| | Albumin | Globulin |Hesemt 7,
Diagnose | eiweiß Roteiho
u ee: | Proz. | Proz. Proz
Carcinoma oesophagi, schwere Inanition . | 2,0 3,80 . 5,80 +
Stenosis pylori nach Ulcus, schwere Inanition || 2,62 3,31 | 598 +
Carcinoma ventriculi, Inoperabel. .... | 3,46 2,68 6,14 —
Vorgeschrittene Tbc. pulmon. mit Fieber,
Koh ars u wre are 2,22 470 | 6,92 —
Bronchitis acuto, hohes Fieber. . . . . a.. - 3,20 3,74 6,94 E
Ulcus ventriculi, Haematimesis. . ..... | 4,10 3,10 720 į.
Tbc. pulmon., rechts Caverna, Koch +, | Ä
hohes Fieber . . 2.2... 2.0.0.0. - 224 4,98 | 7,22 a
Neurosis ventriculi. . . 2 2 2 2 2 220.0. | 4,13 3,52 | 765 Æ
Neurasthenie . ........ . . . o... | 5,10 2,60 1,10 | 8
Tbe pulmono mis eege ‚an | 527 | 18: m
Exsudat. pleuriticum rechts, Fieber 3,38 4,64 802 u
Insuff. bicusp. decompensiert . ..... | 4.02 4,79 ; 8,81 4
Arteriosclerosis inciprieus. Emphysema . . ` 3,20 6,64 8,84 Y
Neurosis cordis . . 2 2 2 2 e e o o e o o 4,19 4,65 8,94 H
Sclerosis multiplex. . . . 2 2 es... o, 4,22 515 ' 937 . A
Gesundes. oe ee 1 515 , 426 , 941 | 0
Die Refraktion des Serums wurde mit dem Pulffrichschen Refrakto-
meter gemessen. Zur Feststellung der Viskosität diente das Hesssche
Viskosimeter. Die Einzelheiten betreffend s. Abderhaldens Handbuch der
biologischen Arbeitsmethoden, Abt. IV, Teil 3.
Botelhosche Reaktion. 119
Nach der Summation unserer Daten stellt es sich heraus, daß die
Positivität der Botelhoschen Reaktion in keinem Zusammenhang mit
der Menge des Albumins und Globulins steht; das Erscheinen der Aus-
flockung ist mit dem Abnehmen der gesamten Eiweißkonzentration
parallel. Fällt der Eiweißwert unter 6 Proz., so ist die Reaktion eine
ausgesprochen positive.
Ähnliche Ergebnisse erhielten wir auch bei Prüfung von
tsolierten Albumin- und Globulinlösungen.
Die Herstellungsmethode der Globulinlósung war folgende: Den
aus dem menschlichen Serum durch Aussalzung mit MgSO, erhaltenen
Niederschlag haben wir nach wiederholter Ausflockung in einer verdünnten
Kochsalzlösung aufgelöst. Die so erhaltene Flüssigkeit haben wir in für
Eiweiß impermeablen Pergamentsäckchen so lange dialysiert, bis in der
äußeren Flüssigkeit das SO,-Ion nachweisbar war. Dies beanspruchte
etwa 36 Stunden. Das ausgeflockte Globulin wurde in stark verdünnter
Kochsalzlösung aufgelöst, bei einem niederen Wärmegrad nebst ständiger
Luftströmung konzentriert und nach Feststellung des Salzgehaltes so viel
Kochsalz beigegeben, daß der NaCl-Wert 0,85 Proz. erreichte.
Aus der von den Globulinen abfiltrierten Flüssigkeit haben wir die
Albumine auf ähnliche Weise durch Versäuerung auf 1 Proz. mit Essigsäure
hergestellt. Der Niederschlag wurde nach Auflösung in einer schwachen
Natronlauge dialysiert, die salzfreie Lösung wurde konzentriert und ebenfalls
auf physiologischen Salzwert gebracht.
Nachdem wir den Eiweißgehalt beider Lösungen mittels Kjeldahl-
Verfahrens feststellten, verdünnten wir mit 0,85proz. Kochsalzlósung
beide auf gleiche Konzentration. Die Konzentration der auf diese Weise
erhaltenen Albumin- und Globulinlösungen war 7 bis 7 Proz., der Salz-
gehalt 0,85 Proz.
Mit den Lósungen hatten wir folgende Versuche unternommen:
a) Bei 7 Proz. Gesamteiweißkonzentration veränderten wir das
Albumin-Globulinverhältnis (Tabelle II).
b) Bei 5 Proz. Gesamteiweißkonzentration veränderten wir ebenfalls
das Albumin-Globulinverhältnis (Tabelle III).
Tabelle II.
Albumin Ä Globulin un á Botelho | Albumin Globulin an Botelho
Teile _.__Teile__| Proz. Teile__| __ Teile | Pre |
7 |o | 7 o 3 4 7 9
6 ı | 7 | Ø 2 5 7 O
5 2 7 | fa] 1 6 7 H
4 3 | 7106 0 7 7 0
Die verbrauchte Albumin- und Globulinlósung war 7 bis 7 Proz,
120 F. Faludi:
Tabelle III.
Gesamt» , in | Gesamt.
Albumin | Globulin eiweiß Botelho | Albumin Globulin eiweiß | Botelho
=
|
Teile Teile Proz. __Teile , Teile Proz,
5 0 5 + 2 305 +
4 1 5 + 1 4 D> 2 f
3 2 5 + 0 5 5 o. +
Die verbrauchte Albumin- und Globulinlösung war 5 bis 5 Proz.
Bei Vergleich der Tabellen ersehen wir, daß zwischen dem Ver-
halten der Albumine und Globuline kein wesentlicher Unterschied besteht.
Wenn auch der prozentuale Gehalt der Albumine und Globuline, also
deren Verhältnis, verschieden ist, hängt das Erscheinen der Ausflockung
trotzdem und allein von der Gesamteiweißkonzentration ab. Bei 7 Proz.
war die Reaktion stets negativ, bei 5 Proz. immer positiv. Die An-
schauung Kahns, nach welcher die Ursache der Ausflockung die
Albuminverminderung sei, kann daher nicht weiter bestehen.
Einen gleichen Erfolg erzielten wir auch, als wir das gesunde Serum
mit physiologischer Kochsalzlösung verdiinnten. Bei diesen Versuchen
bestrebten wir uns festzustellen, bei welcher Konzentrationsgrenze die
Reaktion positiv wird. Als Ausgangspunkt benutzten wir ein 8,75 Proz.
Eiweiß enthaltendes gesundes Serum, welches wir in unten ersichtlicher
Weise verdünnten (Tabelle IV).
Tabelle IV.
Gesamteiweiß | Botelho 0,7 ccm Botelho 0,7 + 0,2 ccm
TEDE EDEL o A A == ees
8,75 Klar Klar
8,31 » »
7,88 x 2
7,43 $ A
7,00 D ”
6,56 » | Schwache Opaleszenz
6,13 Schwache Opaleszenz | Starke Opaleszenz
5,69 Starke Opaleszenz Ausflockung
5,25 | Ausflockung $
Zur Verdünnung nahmen wir eine 0,85proz. Kochsalzlósung.
Aus diesen Versuchen ergab sich in ausgeprágter Weise — was
auch im allgemeinen bei Ausflockungsreaktionen der Fall ist —, daß
bei Erscheinen der Flocken keine scharfe Grenze gezogen werden kann.
Bei einem Eiweißgehalt über 7 Proz. bleibt die Mischung kristallklar;
sie weist bei 6,5 Proz. eine schwache, bei 6 Proz. eine starke Opaleszenz
auf, unter 6 Proz. ist die Trübung entschieden flockig. Unsere Ergebnisse
stehen also mit den Daten der vorherigen Versuche im vollen Einklang.
Botelhosche Reaktion. 121
Das Erscheinen eines Niederschlages hängt im allgemeinen von der
Konzentration der dispersen Phase ab. In einem konzentrierteren Sol
werden wirksame Ionen in größerer Menge adsorbiert, da auch die Anzahl
der Teilchen eine größere ist. Die Konzentration der wirksamen Ionen
ist also nach der Ausflockung geringer, als wenn wir dem Koagulator von
gleicher Konzentration eine dünnere Eiweißlösung beimengen.
Wenn wir die Ionenkonzentration unmittelbar nach der Mischung und
vor Stattfinden der Adsorption mit y die Konzentration nach der Aus-
flockung in dem verdünnten Sol mit c, in doppelt konzentriertem Sol
mit c, die absorbierte Menge mit a, und a, bezeichnen, ergibt sich in
dünnem Sol y = c, + a, in doppelt so stark konzentriertem Sol g = cz + az.
Da nach der Gestalt der Kurve der Adsorptionsisotherme a, sich nur
sehr wenig von a, unterscheidet, müßte c, bedeutend weniger sein als c,,
d. h. in der doppelt konzentrierten Eiweißlösung ist nach der Ausflockung
die Konzentration der wirksamen Ionen bedeutend kleiner. Statt dieses
Y-Wertes muß daher ein größeres y genommen werden, also die Kon-
zentration des Koagulators muß erhöht werden: oder was damit gleich-
bedeutend ist, wir müssen bei größerer Eiweißkonzentration zur Erreichung
der Koagulation mehr Jodlösung nehmen.
Über das Wesen der eigentlichen Ausflockung ist bisher nur wenig
bekannt. Eins steht fest: die Aussalzbarkeit hängt von der Wasserlóslichkeit
des Eiweißes ab. Die Ionen, selbst hydratisiert, werden mit einer gewissen
Zahl Weassermoleküle umgebener Eiweißteilchen die Wasserhülle ab-
ziehen. Infolgedessen erscheint der Niederschlag. Am stärksten wird
das SO,-, am schwächsten das NO,-, J-, SCN-Ion hydratisiert.
Bei saurer Reaktion — im Gegensatz zur alkalischen — sondert sich
ein wasserreicher Niederschlag ab. Je weniger das Ion Wasser abzieht,
um so eher besteht die Möglichkeit der Ausflockung, es werden also jene
Ionen, die sich weniger hydratisieren, z. B. J, SCN, wirksamer sein.
Das Wesen der Botelhoschen Probe wäre demnach folgendermaßen
zu erklären: Bei saurer Reaktion verursachen den Niederschlag die
aus dem Kaliumtrijodid dissoziierenden Anionen, welche sich selbst nur
sehr wenig hydratisieren. Welche Rolle beim Entstehen des Nieder-
schlags die adsorbierenden J, spielen, ist fraglich, da sie auf in feinen
Flocken sich absondernde Niederschläge große Adsorptionsfähigkeit
besitzen. Sie erleichtern wahrscheinlich wegen ihres kolloidalen Zu-
standes das Ausscheiden des Niederschlags. Das in den Reagenzien be-
findliche Formalin ist von unwesentlicher Bedeutung, um so mehr, als,
wie wir früher ersahen, formalinfreie Reagenzienmischungen beinahe
dieselben Resultate erzielen. Auf alle Fälle fördert es die Aussalzung.
Höber und Gordon beobachteten, daß, im Falle einer dünnen Eiweiß-
lösung der Koagulator beigemengt wird, eine viel bedeutendere Menge
des Niederschlags erscheint, als wenn das Mischen langsam und
sukzessive geschieht. Diese Erscheinung ist auch bei der Botelhoschen
Reaktion ersichtlich. In solchem gesunden Serum, wo die 0,1 cem-
weise unter ständigem Schütteln beigefügte Jodlösung bei einer Menge
122 F. Faludi:
von 1,4 ccm Ausflockung verursachte, war nach plötzlichem Beimengen
von 1,1ccm eine ausgeprägte Trübung zu beobachten. Wie vorher
erwähnt wurde, zeigt sich an der Berührungsfläche der Jodlösung und
Serummischung im Moment der Zugabe eine grobe flaumige Aus-
flockung, die im gesunden Serum nach wenig Schütteln verschwindet.
Wir können uns auch leicht davon überzeugen, daß die Klärung der
Mischung auch von der Stärke des Schüttelns und deren Dauer ab-
hängt. Es ist unnötig, weiter zu betonen, daß behufs Erreichung für
Vergleich geeigneter Ergebnisse die Botelhosche Reaktion stets mit
gleicher Methode durchzuführen ist,
Aus oberen Voraussetzungen bietet sich selbstredend die Erklärung
der Wilbouchewitchschen Modifikation. Wir sahen nämlich, daß diese
bei Carcinom gegenüber der Botelhoschen Reaktion weniger empfindlich
ist, hingegen steht fest, daß bei anderen Erkrankungen das Resultat
nur selten positiv ist. Die Ursache des Unterschieds liegt in der Zu-
sammensetzung des Citronensäurereagens. Botelho benutzte zur Her-
stellung des Reagens eine physiologische Kochsalzlösung, während
Wilbouchew:tch die Citronensáure und das Formalin in destilliertem Wasser
aufgelöst verwendete. Wenn wir die Botelhosche Lösung benutzen,
werden die bei der Aussalzung mitwirkenden Salze eine größere Gesamt-
konzentration in der Serummischung aufweisen, es kann also auch eine
geringere Jodlösung ausgeprägte Ausflockung herbeiführen, d.h. die
etwas mehr als 6 Proz. Eiweißgehalt besitzenden Sera pflegen positiv
zu reagieren. Solches gesundes Serum, welches nach der Wilboucheuxtch-
schen Modifikation eingestellt noch bei 1,3 ccm klar blieb, gab bei der
originalen Reaktion mit derselben Jodmenge eine ausgesprochene
Trübung.
Unsere Versuche stellen demnach auf verschiedenem Wege die
entscheidende Wichtigkeit des gesamten Eiweißgehalts in den Vorder-
grund. Nach unserer Auffassung soll die Botelhosche Reaktion wesent-
lich für eine einfache quantitative Eiweißprobe betrachtet werden und
kann zur Feststellung dessen, ob der Eiweißgehalt des Serums mehr
oder weniger als 6 Proz. ist, gebraucht werden. Diesem Zwecke ent-
spricht aber unseres Erachtens jedwelches quantitative Eiweiß-
analyseverfahren.
Einen besonderen Vorteil besitzt: wegen ihrer Einfachh»it die
refraktometrisch® Bestimmung. Zum Messen der Refraktior haben
wir den Pul/frichschen Refraktometer benutzt.
Positivität der Botelhoschen Probe und Brechungsindex verhielten
sich stets parallel (Tabelle V).
Botelhosche Reaktion. 123
Tabelle V.
re | mem Skata Teile der Skala EEE Refraktion u E Botelho 0,7 ccm + 0,2 ccm
6,77 | 30 1,347 61 Kar
6,55 | 52,0 | 1,347 24 Schwache Opaleszenz
6,34 | 51,0 1,346 87 , Starke Opaleszenz
6,12 | 50,0 1,346 50 Sehr starke Opaleszenz
6,01 | 49,5 1,346 31 Ausflockung
5,90 | 49,0 | 1,346 12 =
5,68 | 48,0 | 134575 | ý
Wir erwähnten, daß das Erscheinen des Niederschlags gerade um
die Grenzwerte wesentlich von der Mischungsdauer, Stärke des
Schüttelns, endlich, da wir verhältnismäßig sehr wenig Serum be-
nutzen, auch von pünktlicher Abmessung aller Faktoren abhängt.
Alle diese Nachteile bleiben bei Refraktionsfeststellung des Serums
weg, da wir als erhaltenes Ergebnis nicht nur den Annäherungswert,
sondern nach Umrechnung auch den Eiweißprozent erhalten. Die
Feststellung des Brechungsindex wird die Botelhosche Reaktion voll-
ständig entbehrlich machen. Wenn der Brechungsindex sich unter 1,3461
verhält, wird das Ergebnis der Reaktion positiv, zwischen 1,3461 bis 1,3465
zweifelhaft sein, über 1,3476 bleibt die Mischung ganz klar.
Wir haben die Botelhosche Probe mit der Wübouchewitchschen
Modifikation in 180 Fällen eingestellt. Nachstehend versuchen wir, den
klinischen Wert der Reaktion zu schildern, teilweise auf Grund von
anderen Autoren publizierter Daten, teilweise nach unseren eigenen
Erfahrungen,
Wir fanden von 38 Fällen im Serum der an malignen Geschwülsten
leidenden Kranken in 30 Fällen eine Ausflockung. Wenn wir die ein-
zelnen Fälle mit Inbetrachtnahme des Erscheinungsorts der Geschwulst
gruppieren, ergibt sich — die Daten mit denen von Palmieri vereint —
folgendes Resultat (Tabelle VI).
Tabelle VI.
Ort und Stelle der Geschwulst | Zahl der Fälle —_m
|
ZungencarcinoM . . +... 2 2 22200. | 9 5 4
Uteruscarcinom `... o e 11 8 3
Leber- und Gallenblasecarcinom ...... 12 8 4
Magencareinom. . . ss 2 s v2 2200. l 22 21 1
Pankreaseareinom . .. esoo aen eao | 2 l 1
OesophaguscarcinoM . . ssa e +... .. | 4 4 =
Mammacarcinom `... eee | 10 6 4
Carcinosis peritonei . . . . . 2 .... .. .. , 2 1 1
124 F. Faludi:
Es ist auffallend, wie oft bei den malignen Geschwülsten des Ver-
dauungstraktes ein Niederschlag zu sehen ist. Diese Erscheinung steht
wahrscheinlich im Zusammenhang mit jenem Umstand, daß wegen der
gehinderten Verdauung, verhältnismäßig rasch der Inanitionszustand
eintrifft. Wie weiter unten ersichtlich, kann selbst die mangelhafte
Nahrung eine positive Reaktion verursachen, also auch in solchen
Fällen, wo es sich überhaupt um keine geschwülstige Erkrankung
handelt (z. B. Ulcusstenose höheren Grades).
Das Serum der an malignen Tumoren leidenden Kranken gab
prozentual ausgedrückt in 75 bis 80 Proz.!) Niederschlag.
Es werden auch andere Erkrankungen ein positives Ergebnis auf-
weisen, dementsprechend, daß der verminderte Eiweißgehalt nicht
nur im carcinomatösen Serum vorzufinden ist. Hier müssen wir in
erster Reihe jener Erkrankungen gedenken, die wegen ihrer toxischen
Einwirkung den starken Niederbruch des Organismus herbeiführen
(Tabelle VII).
Tabelle VIT.
l Botelho
Diagnose : Zahl der Fälle —————————
|. BR
Inanitionszustánde: Ulcus und o .
thenoses aca do aid er 3 | 3 —
Hydrámie: Herzfehler, "Nephritis, Nephrosis .| 16 1 4 12
Chronische infektiöse Erkrankungen: | 15
Lungentuberkulose mit Fieber, Koch +.. 30 | 15 3
Malaria ohne Kachexie . . ..... . EC 4 1 |
Malaria mit Kachexis. . +... > 2 2 2.0. | 3 3 `
Peritonitis tbe. Ascites . . 2 2 > s 2 1... | 2 l l
Akute infektiöse Erkrankungen: |
Typhus abdominalis . . . 2» 2 222000. 3 | 1. 2
Schwere Bronchitis und Bronchiolitis , . . i 3 — , 3
Lobare und lobulare Pneumonie ...... | 2 l
Lebererkrankungen: | | l
Cyrrhosis hepatis „Laennec“ . .......! 8 7 l
Cyrrhosis biliaris „Hannot“ . . . ..... 2 = 22 —
Lues: Wassermann +++ und ++++... 23 1 22
Nervenkrankheiten: Multiple Sclerose . . . . 4 ge 4
Benigne Hautgeschwülste: Epithelioma . . . | 15 2 13
Neurosen: Neurosis ventriculi und cordis . 27 = |: Se
Schwangerschaft 4 bis 8 Monat. ....... | 6 2 4
Gesund. .. ENEE idas Y 34 — 1 34
Die Tabelle VII enthält außer unseren 142 Fällen auch die Daten
Palmieris.
Am häufigsten sahen wir bei sehr schwerer Lungentuberkulose
mit hohem Fieber eine positive Reaktion (etwa 50 Proz.). Es ist auf-
1) Es sei bemerkt, daß der aus verhältrismäßig geringer Anzahl von
Fällen ausgerechnete Prozentsatz nur als Orientierungswert zum Vergleich
der Fälle dieren soll.
Botelhosche Reaktion. 125
fallend, daß luetische Kranke verhältnismäßig selten positiv reagieren
(etwa 4 Proz.). Häufig sahen wir Positivitát bei Fällen von Nephritis
(etwa 25 Proz.), benignen Geschwülsten (etwa 13 Proz.), Herzfehlern
(etwa 5 Proz.). Niederschlag ergaben in der Regel: Lebercyrrhose
(etwa 90 Proz.), schwere Inanition (etwa 100 Proz.), weiter Malaria
mit schwerer Kachexie (etwa 100 Proz.). Es ist bemerkenswert, daß
die Schwangerschaft, die in serologischer Hinsicht den geschwülstigen
Erkrankungen ähnlich ist, in einem Teile der Fälle ebenfalls eine positive
Reaktion verursachen kann (etwa 30 Proz.). Im Serum von gesunden
Individuen sahen wir niemals Ausflockung.
Wir erwähnen, daß Cabanis die Ursache des Erscheinens des Nieder-
schlages bei chronischen Nephritiden in Vermehrung des Ureums sieht.
Die Bedeutung dessen wird aber durch jenen Umstand sehr fraglich, da
das Urcum kein Elektrolyt ist, daher in den Eiweißproben keine wesentliche
Rolle spielen kann.
Es bedarf keiner besonderen Erläuterung, weshalb wir die Botelho-
sche Reaktion für maligne Geschwülste als unspezifisch betrachten.
Eine operative Indikation — da heute noch dies sozusagen die einzige
Erfolg versprechende Behandlungsmethode ist — kann allein auf Grund
der Positivität der Botelhoschen Probe noch nicht aufgestellt werden, da
bei einer Reihe von Erkrankungen ebenfalls Ausflockung erfolgen kann.
Wenn wir aber in Betracht nehmen, daß diese Erkrankungen nur
bei starker Kachexie positiv reagieren, also nur dann, wenn die
Symptome schon so ausgeprägt sind, daß das Krankheitsbild mit
Leichtigkeit erkennbar ist, können wir die Positivität der Botelhoschen
Reaktion, oder was gleichbedeutend ist, die Verminderung des Re-
fraktionseiweißwertes bis oder unter 6 Proz., bei Feststellung unserer
Diagnose als wertvollen Behelf betrachten. Wenn die Gesamteiweiß-
menge auf 6 Proz. oder noch tiefer sinkt, ist die Entwicklung einer bös-
artigen Geschwulst höchst wahrscheinlich.
Diese Verfahren können besonders gut bei Diagnostik der Er-
krankungen der Bauchorgane verwendet werden; sie weisen mit
genügender Sicherheit auf die Malignität der Geschwülste, sondern
das Myom, ulceröse Verwachsungen, Drüsen und Adnextumoren von
den malignen Geschwülsten entsprechender Organe ab. Ein Eiweiß-
wert unter 6 Proz. bedeutet stets eine recht ernste Prognose.
Sehen wir aber auch die Kehrseite der Frage an. Sind diese Ver-
fahren für eine rechtzeitige Erkennung der bösartigen Geschwülste geeignet ?
Aus den Ergebnissen Palmieris mit unseren Daten vereint sehen wir,
daß die maligen Tumoren anfangs in 30 bis 35 Proz. nachweisbar sind.
Bei den schon mehr fortgeschrittenen, aber am meisten operativen
Fällen werden wir 50 bis 60 Proz. Positivität erhalten.
126 F. Faludi:
Bemerkenswert sind die Versuche Bernhards und Zerners, da diese
nach unserer Meinung den Grund obiger Erscheinungen liefern. Bernhard
hat parallel mit der Kahnschen Trübungsflockungsreaktion Blutzucker-
bestimmungen unternommen. Er kam zu der bemerkenswerten Wahr-
nehmung, daß die Probe um so stärker positiv ist, als der Zuckergehalt
des Blutes sich vermehrte. So lange sie keine Kachexie verursachten,
haben die bösartigen Neubildungen negativ reagiert. In solchen Fällen
war auch der Blutzuckergehalt nichts mehr als normal. Die Positivität
der Probe steht außerdem noch mit der Erhöhung des Zernerschen Phosphor-
quotienten im Zusammenhang. Bernhard schließt hieraus, daß die Er-
scheinungen nicht auf bösartige Neoplasmen, sondern auf die Kachexie
charakteristisch sind, die Kahnsche Reaktion sei eigentlich eine frühzeitige
Kachexieprobe. Eben deshalb sehen wir bei Krebskranken nur im Falle
eines gewissen Herabkommers eine Positivität, gewiß ist, daß dieses rasch
genug erfolgt und besonders dann, wenn die Geschwulst sich in den Ver-
dauungsorganen bildet. |
Ähnliche Verhältnisse finden wir auch bei der Botelhoschen Reaktior.
In der Tabelle VIII sehen wir ziemlich regelmäßig erhöhte Zuckerwerte
bei ausgesprochener Verminderung des Eiweißgehaltes.
Tabelle VIII.
Diagnose _ Blutzucker Botelho re
ee een o a Ps AL A . —Proz.
Neurosis ventriculi . . ........... 0,08 0 : 9,02
Nephritis chronica . . . +... +... ... 0,08 H" 876
Polyarthritis chronica. . . . ... .... ..“ 010 H — 842
Schwere Tuberkulose, Koch +, hohes Fieber 0,12 0 7,12
e ar E S 0,13 E 6,12
Cyrrhosis hepatis, „Laennec“, Ascites . . . . 0,16 +, 60
Malariakachexie . ... . .... .. OT + 6,00
Ulceróse Pylorusstenose. . . .. . . +... + 0,22 + i 590
Magencarcinom, schwere Inanition .. ... 0,23 + | 5,76
Die Bestimmung des Blutzuckerwertes geschah mit dem an unserer
Klinik seit Jahren mit gutem Erfolg benutzten Hagedorn-Falzekasschen
Verfahren. Betreffs der Technik s. Fazekas, A vércukor meghatározási
módszerekrol (Blutzuckerbestimmungsmethoden). Wird nächstens mit-
geteilt werden.
Die Anschauung von Bernhard bezieht sich in gesteigertem Maße
auch auf die Botelhosche Reaktion, um so mehr, da die Verminderung
der Albumin-A-Fraktion für die malignen Geschwülste charakteristischer
ist als die des Gesamteiweißwertes. Es sei bemerkt, daß unsere negativen
Fälle auch bei normalem Blutzuckerwert keine Spuren einer angehenden
Kachexie zeigten. Dies offenbarte sich auch auffallend in dem verhältnis-
mäßig hohen Hämoglobinwert (60 bis 80 Proz.). Darum halten auch wir
die Positivitát der Botelhoschen Reaktion bzw. das Fallen des Eiweiß-
gehaltes unter 6 Proz. für eine Erscheinung früher Kachezie.
Zusammenfassung.
1. Die Botelhosche Reaktion ist wesentlich eine einfache Eiweiß-
ausflockungsprobe.
Botelhosche Reaktion. 127
2. Das Erscheinen des Niederschlags ist von dem Verhältnis des
Albumins zum Globulin unabhängig und hängt nur von der verhältnis-
mäßigen Konzentration der ausflockenden Reagenzien und des Gesamt-
eiweißes ab. Wenn der Gesamteiweißgehalt unter 6 Proz. sinkt, wird
die Reaktion eine ausgesprochen positive.
3. Erforderlich für die Probe sind: pünktliches Messen, gleiche
Schüttelungs- und Mischungsdauer.
4. Die Wilbouchewitchsche Modifikation gibt mehr brauchbare
Werte als die originale Vorschrift, da sie für mindere Eiweißprozente
eingestellt ist.
5. Die Reaktion ist nicht spezifisch. Bei angehenden operativen
malignen Geschwülsten wird sie in etwa 30 Proz., im fortgeschrittenen
Stadium ungefähr in 80 Proz. ein positives Ergebnis liefern. Regel-
mäßig geben Positivität: schwere Inanition, ausgebildete Leber-
insuffizienz, seltener Hydrämie chronisch-renalischen oder cardialischen
Ursprungs, schwere Tuberkulose mit Fieber und die Gravidität.
6. Die Reaktion kann in geeigneten Fällen als wertvoller dia-
gnostischer Behelf gebraucht werden. Ihr Vorteil ist einfache Durch-
führung, sie beansprucht keine besondere Fertigkeit.
7. An solchen Orten, wo ein Refraktometer vorhanden ist, ist es
zweckmäßiger, statt der Botelhoschen Reaktion die Refraktion des
Serums und aus den erhaltenen Werten unmittelbar den Eiweiß-
prozentsatz festzustellen. Einen diagnostischen Wert hat nur weniger
als 6 Proz. Gesamteiweiß.
Literatur.
Bernhard, Klin. Wochenschr. 1924, S. 1402. — Cabanis et Foulquier,
C. r. des séances de la soc. de biol. 88, 17, 1248, 1923. — P. et M. Guérin,
ebendaselbst 88, 13, 1011, 1923. — Kahn, Klin. Wochenschr. 1924, S. 920. —
Derselbe, ebendaselbst 1925, S. 178. — Palmieri, Rassegna internazionale
di clica e terapia 5, 6, 330. — Sabrazes et Muratet, Archive des Maladies
du Coeur des vaisseaux et du sang. 12, 841, 1923. — Wilbouchewitch, C. r.
des séances de la soc. de biol. 87, 39, 1339, 1922. — Zerner, Zeitschr. f.
Krebsforschung 21, 157.
Tierische Kalorimetrie.
VI. Mitteilung:
Milzexstirpation und Energieumsatz.
Von
Zoltán Aszodi.
(Aus dem physiologisch-chemischen Institut der k. ungar. Universität
Budapest.)
(Eingegangen am 7. Juli 1925.)
Mit 13 Abbildungen im Text.
Die fundamentale Bedeutung der Entdeckung, daß zwischen ge-
wissen Organen sogenannte chemische Korrelationen bestehen, bzw.
daß von gewissen Organen Stoffe geliefert werden, durch die Stoff-
wechsel- und Energieumsatz des ganzen Körpers unter physiologischen
oder pathologischen Umständen qualitativ oder quantitativ ent-
scheidend beeinflußt werden kann, macht es begreiflich, daß stets nach
neuen ähnlichen Zusammenhängen gefahndet wird; allerdings zu-
weilen mit sehr zweifelhaftem Erfolg, entweder, weil die angewandte
Methodik eine anfechtbare war, oder weil aus den Versuchsergebnissen
ungerechtfertigte Schlüsse gezogen wurden.
Alles bisher noch nicht definitiv erforschte physiologische Geschehen
auf Grund eines Panhormonismus auf- bzw. umzubauen, dürfte ein ge-
wagtes Unterfangen sein, denn die Sachlage ist durchaus nicht immer so
verhältnismäßig klar, wie sich nach dezennienlanger Arbeit bezüglich
einiger bereits feststehender chemischer Korrelationen herausgestellt
hat. So können z. B. die Ausfallserscheinungen nach der Exstirpation
der Schilddrüse schlechterdings nicht anders erklärt werden, als durch
das Fehlen des betreffenden Hormons; sintemal durch den Überfluß
am selben genau die entgegengesetzten Erscheinungen erzeugt
werden und an einer rein chemischen Korrelation in diesem Falle um
so weniger gezweifelt werden kann, als eine andere Erklärung zurzeit
nicht denkbar ist. Das gilt jedoch nicht von vornherein bezüglich
anderer Organe. Auch wenn durch die Entfernung eines Organs Stoff-
wechsel- und Energieumsatz entweder im Sinne einer Hemmung oder
im Sinne einer Förderung sichtlich beeinflußt werden, wird man nicht
ohne weiteres folgern dürfen, daß im betreffenden Organ ein förderndes
Z. Aszódi: Tierische Kalorimetrie. VI. 129
oder hemmendes Prinzip (Hormon) bereitet wird, denn nur allzu leicht
ist es möglich, daß die nach der Entfernung des Organs einsetzenden
biochemischen Änderungen bloß sekundäre Vorgänge sind, also Folge-
zustände einer durch die Organexstirpation primär entstandenen
Änderung anderer Natur.
Durch nachstehenden Bericht über die bisher erschienenen Mit-
teilungen sowie über die Ergebnisse eigener ausgedehnter Versuche soll
im Sinne obiger Ausführungen die Frage geklärt werden, ob der Milz
des Warmblüters eine Einwirkung auf den Energieumsatz auf primär-
brochemischer Grundlage zukommt oder nicht ?
Aus dem Verhalten der Harnbestandteile bzw. des Harnstickstoffs,
das von Paton!) am splenektomierten Hunde bzw. von Lafayette und
Gibson?) am splenektomierten Menschen geprüft wurde, desgleichen
aus den Untersuchungen von Goldschmidt und Pearce?) ergaben sich keinerlei
Anhaltspunkte für die Beeinflussung des Stoffwechsels durch die Milz;
und erst durch die Untersuchungen von Grossenbacher*) und von Zimmer-
mann°®) aus der Asherschen Schule wurde die Bedeutung der Milz für den
Eisenstoffwechsel festgestellt. Abgesehen von Richet®), der aus dem um
ein Drittel gesteigerten Nahrungsbedürfnis des milzlosen Hundes auf
einen erhöhten Stoffwechsel schließt, bestreiten spätere Autoren, wie
Korentscheweki?), Verzär®), Goldschmidt und Pearce?) auf Grund der von
ihnen ausgeführten Gaswechselversuche jedweden Einfluß der Milz auf
den Stoffwechsel.
Da wurde auf einmal durch neuere Mitteilungen aus dem Asherschen
Institut die Sachlage von Grund auf geändert, und schien es vorerst, als
würde die Frage einer endgültigen Klärung entgegengeführt. Im Anschluß
an die Duboisschen Befunde !°), wonach die Milz bezüglich der Blutbildung
in antagonistischem Verhältnis zur Schilddrüse stünde, gab nämlich
Streuli!!) an, gefunden zu haben, daß die Widerstandsfähigkeit milzloser
Ratten dem Sauerstoffmangel gegenüber eine geringere ist als die der
normalen, und weit geringer als die der schilddrüsenlosen Tiere. Hieraus
wurde gefolgert, daß die Milz, solange sie sich im Tierkörper befindet,
hemmend auf den Stoffwechsel einwirken müsse. Obzwar den Streulischen
1) D. N. Paton, Journ. of physiol. 25, 443—461.
2) B. M. Lafayette and R. P Gibson, Amer. Journ. of physiol. 18,
201—212.
3) S. Goldschmidt und R. M. Pearce, Arch. of intern. Med. 22, 319—332,
1915.
4) H. Grossenbacher, diese Zeitschr. 17, 78, 1909.
D R. Zimmermann, ebendaselbst 17, 297, 1909.
6) Ch. Richet, Journ. de Physiol. et de Path. generale 14, 689—703,
1912.
2) G. Korentschewski, Russki Wratsch 1910, S. 1441 — 1443.
8) Fr. Verzár, diese Zeitschr. 58, 69, 1913.
9) S. Goldschmidt and R. M. Pearce, Journ. of exper. Med. 22 (3),
319, 1917.
10) M. Dubois, diese Zeitschr. 82, 141, 1917.
11) H. Streuli, ebendaselbst 87, 359, 1918.
Biocbemische Zeitschrift Band 162. 9
130 Z. Aszódi:
Befunden von Klinger!) alsbald widersprochen wurde, spanr Danoff*)
denselben Gedanken weiter und kam in seinen an Ratten ausgeführten
Versuchen zu folgendem Ergebnis: „Nach Entfernung der Milz war der
Grundumsatz der Ratten erheblich gesteigert; von Tag zu Tag nach der
Operation wuchsen die Mengen gebildeter Kohlensäure und verbrauchten
Sauerstoffs.** Aus diesen Ergebnissen zog Danoff folgende Schlüsse: „Es
ist der definitive unmittelbare Beweis geliefert worden, daß das Vor-
handensein der Milz den respiratorischen Stoffwechsel hemmt, ihre Weg-
nahme ihn fördert. Hiermit tritt die Milz in antagonistische Beziehung
zur Schilddrüse, von der das Umgekehrte gilt. Auch mit Rücksicht auf
den Flüssigkeitswechsel gelten die gleichen Beziehungen.“ Ganz ähnlich
wie Ratten verhalten sich nach Hauri?) splenektomierte Kaninchen:
„Splenektomierte Tiere zeigen ... gesteigerte Wasser- und CO,-Abgabe.
Durch die ... mitgeteilten Resultate meiner Arbeit erhält der bisher nur
für Ratten streng gültige Satz von der antagonistischen Wirkung von
Schilddrüse und Milz auf den Stoffwechsel eine weitere Stütze durch den
Nachweis seiner Gültigkeit auch für das Kaninchen.“ Doch bereits nach
2 Jahren kommt Chu Kodat) zu einem wesentlich anderen Ergebnis
am milzlosen Hunde: ‚Als wesentliches Ergebnis der nachstehenden
Arbeit ist der Nachweis zu bezeichnen, daß beim Hunde, der auf gewöhnliche
Weise ernährt wird, die Milzexstirpation keinen erkennbaren Einfluß auf
die Größe des Gaswechsels hat, daß demnach die Verhältnisse anders
liegen als bei der Ratte und dem Kaninchen‘, welches Ergebnis auch
von Doubler*) bestätigt wird: „Die Weglassung von Eisen und die Ent-
milzung haben keinen bedeutenden Einfluß auf den respiratorischen Gas-
wechsel des Hundes“.
Wenn es schon von vornherein unwahrscheinlich ist, daß der Milz
bei der Ratte und beim Kaninchen eine so bedeutende, am Hunde jedoch
gar keine Wirkung auf den Stoffwechsel zukäme, wird die Sache erst recht
kompliziert, ja direkt bedenklich, wenn weitere 2 Jahre später von Taka-
hashi $) folgendes mitgeteilt wird: „Erneute Untersuchungen des respira-
torischen Grundumsatzes der Ratte zeigen, daß Entmilzung in der Mehrzahl
der Fälle eine Verminderung des Grundumsatzes zur Folge hat; nur einmal
konnte der Danoffsche Befund der Erhöhung des Grundumsatzes wieder
gefunden werden.“
Von einem Antagonismus zwischen Milz und Schilddrüse in ihrer
Einwirkung auf den Gaswechsel ist also eigentlich nichts mehr übrig-
geblieben, es sei denn, daß die von Streuli gefundene aber von Klinger
in Abrede gestellte größere Empfindlichkeit der milzlosen Tiere gegen-
über dem Sauerstoffmangel von Takahashi wiedergefunden wurde.
Eigene Versuche.
Auf die Ursache des diametralen Gegensatzes zwischen Danoffs
und Takahashis Ergebnissen werde ich weiter unten noch zurück-
1) R. Klinger, diese Zeitschr. 92, 376, 1918.
2) N. Danoff, ebendaselbst 98, 44, 1919.
3) O. Hauri, ebendaselbst 98, 1, 1919.
t) Chu Koda, ebendaselbst 122, 154, 1921.
5) H. Doubler, ebendaselbst 122, 161, 1921.
6) I. Takahashi, ebendaselbst 145, 130, 1923/24.
A a E a a.
Tierische Kalorimetrie. VI. 131
zukommen haben. Nachstehend soll zunächst über meine eigenen
Versuche berichtet werden. Aus den bei Häri!) angeführten Gründen
wurde der Einfluß der Splenektomie auf den Grundumsatz im Tanglschen
Respirationskalorimeter sowohl durch direkte Kalorimetrie bestimmt,
als auch aus dem Sauerstoffverbrauch und dem respiratorischen
Quotienten berechnet. Die meistens hinlänglich gute Übereinstimmung
zwischen den nach beiden Methoden erhaltenen Werten ist eine Gewähr
für ihre Verläßlichkeit wie auch für die Richtigkeit der aus ihnen ge-
zogenen Schlüsse.
Als Versuchstiere wurden erwachsene weiße Ratten verwendet,
die sich auch nach den Erfahrungen unseres Instituts vermöge ihres
überaus ruhigen Verhaltens zu ähnlichen Versuchen vorzüglich eignen.
Die Tiere wurden bei gemischter Nahrung (Küchenabfällen) gehalten
und 21 bis 24 Stunden vor jedem Versuch hungern gelassen. An jedem
Tiere wurde der Grundumsatz in zwei bi: drei Versuchen festgestellt,
sodann die Milz entfernt; 3 bis 6 Tage nachher wurden die Versuche
wieder aufgenommen und später in größeren Zeitintervallen fort-
gesetzt. Alle Versuche wurden bei oder in der Nähe der kritischen
Umgebungstemperatur, etwa bei 27°C, ausgeführt; und betrug die
Dauer jedes Versuchs 7 bis 8 Stunden.
Die Exstirpation der Milz wurde an den mit Äther narkotisierten
Tieren A, B, C und D unter aseptischen Kautelen ausgeführt. Es gelang
ohne weiteres, die Milz bei einer 1 bis 11, cm langen in der Linea alba
gesetzten Schnittwunde herauszuluxieren, worauf die gut sichtbaren
größeren Gefäße zwischen zwei Ligaturen durchschnitten wurden.
Nach stumpfer Trennung ligamentöser Verbindungen konnte die Milz
leicht entfernt werden, worauf Nähte in drei Etagen angelegt wurden:
Peritoneum, Muskulatur und Haut. Zuletzt wurde die Haut an der
Operatiunsstelle mit Pix liquida bestrichen. Die bereits nach einigen
Minuten aus der Narkose erwachenden Tiere nahmen noch an demselben
Tage von der ihnen gereichten Milch; am nächsten Tage hatten sie sich
bereits vollkommen erholt und fraßen wie vorher von den Küchen-
abfällen. Die in der Haut verbliebenen Nähte wurden am 8. oder 9. Tage
entfernt. In allen Fällen verlief die Operation nahezu ohne jeglichen
Blutverlust und erfolgte die Heilung per primam. Im Harn konnte
einige Tage lang ein wenig Zucker nachgewiesen werden. Die Lebens-
dauer meiner Tiere wurde, wie aus nachstehender Zusammenstellung
ersichtlich ist, durch die Operation nicht verkürzt, und hatte der Monate
später eintretende Tod nichts mit der Milzexstirpation zu tun. An
keinem der verendeten und obduzierten Tiere konnte eine akzessorische
Milz nachgewiesen werden. (Die Obduktion wurde von Herrn Josef Balo
1) P. Hári, diese Zeitschr. 152, 445, 1924.
132 Z. Aszódi:
ausgeführt, wofür ihm auch an dieser Stelle bester Dank ausgesprochen
sei.) Alle diese Daten seien aus dem Grunde nachdrücklich hervor-
gehoben, weil, wie weiter unten gezeigt werden soll, Danoff ganz andere
Erfahrungen an seinen operierten Tieren gemacht hat. Beiläufig sei
auch erwähnt, daß das Gewicht der Milz an Ratte B 0,19 Proz., an
Ratte C 0,37 Proz. und an Ratte D 0,23 Proz. des ganzen Körper-
gewichts ausgemacht hat. Die betreffenden Werte betragen bei
Lepehne!) 0,5 bis 1,0 Proz., bei Nishikawa, Joshikata und Toshio
Takagi?) 0,5 bis 0,66 Proz.
Tier Lebensdauer nach i l Todesursache Akzessorische |
der Milzexstirpation: bzw. Obduktionsbefund | Milz
A. junges erwach- || 6*/, Monate Eiterige Broncho- keine
senes Männchen | pneumonie
B. 11/, Jahre altes! 31/, „ Cachexie infolge
Männchen | massenhafter Exemplare
\ der Taenienart
Hymenolepsis diminuta
C. 1*/, Jahre altes! 8 Nicht identifizierte 4
Weibchen Leberparasiten
D. 1*/, Jahre altes , 9 > a | a
Weibchen | | |
Ergebnisse der Versuche.
Alle Daten und Ergebnisse meiner Versuche sind in den Tabellen I
bis V zusammengestellt, und zwar enthält Tabelle I die allgemeinen
Versuchsdaten, sowie auch diejenigen, die sich auf den Sauerstoff-
verbrauch beziehen. Dieser wurde nämlich einerseits aus der Gewichts-
abnahme des Tieres und seinen gasförmigen Ausgaben (und flüssigen
und festen Dejekten) berechnet, andererseits direkt bestimmt. Der
größte Unterschied zwischen den nach beiden Methoden erhaltenen
Werten betrug 4,4 Proz. (im Versuch 46), im Durchschnitt von ins-
gesamt 45 Versuchen gar nur 1 Proz. Die von uns nach Möglichkeit
stets geübte gleichzeitige Ermittlung des Sauerstoffverbrauchs durch
Berechnung sowohl wie auch durch direkte Bestimmung ist von erheb-
lichem Werte. Sie setzt uns nämlich bei guter Übereinstimmung des
berechneten und direkt bestimmten Sauerstoffverbrauchs in den
Stand, den Energieumsatz auch in dem Falle berechnen zu können,
wenn die direkte Kalorimetrie mißlungen ist.
In Tabelle II sind die Daten der direkten Kalorimetrie zusammen-
gestellt, in Tabelle III die Berechnung der Wärmeproduktion aus dem
1) G. Lepehne, Beitr. z. path. Anat. u. z. allgem. Path. 64, 55, 1917.
2) Nishikawa, Joshikata und Toshio Takayi, Deutsch. med. Wochenschr.
48, Nr. 32, S. 1067 — 1068, 1922.
Tierische Kalorimetrie. VI. 133
Sauerstoffverbrauch und dem respiratorischen Quotienten durch-
geführt. In letzterer Tabelle ist sowohl die berechnete wie auch die
direkt ermittelte 24stündige Wärmeproduktion auf 1 kg Körpergewicht
und auf 1 qm Körperoberfläche umgerechnet, und sind die nach beiden
Methoden erhaltenen Werte miteinander verglichen. Aus diesem
Vergleich ergibt sich, daß der maximale Unterschied 7,7 Proz. (in
Versuch 25), im Durchschnitt von 42 Versuchen aber nicht mehr als
1,4 Proz. beträgt.
In Tabelle IV endlich sind die Daten angeführt, aus denen sich
auf das Verhalten des Energieumsatzes nach erfolgter Splenektomie
folgern läßt. Bei jeder Ratte habe ich obenan die pro 24 Stunden
und l] qm Körperoberfläche berechnete Wärmeproduktion des normalen
Tieres im Mittelwert der Versuche, die vor der Operation ausgeführt
wurden, mit Fettdruck angegeben; darunter folgen die nach der
Splenektomie erhaltenen Werte. In den letzten fünf Stäben dieser
Tabelle ist die Berechnung der eingetretenen Änderung durchgeführt,
und zwar gesondert aus den Daten der indirekten und der direkten
Kalorimetrie. Da die beiden Zahlenreihen qualitativ dasselbe aus-
sagen und bloß in quantitativer Hinsicht (infolge der unvermeidlichen
Versuchsfehler) eine gewisse Verschiebung aufweisen, war es gerecht-
fertigt, sie im letzten Stabe dieser Tabelle zu einem Mittelwert zu
vereinigen.
Aus diesen Mittelwerten geht sofort hervor, daß die Änderung, die
nach erfolgter Splenektomie an verschiedenen Tieren eintritt, keine ein-
heitliche ist. An Ratte B ist eine im großen und ganzen konstante
Zunahme, an Ratte D nach einer kurz andauernden Steigerung eine
ungefähr konstante Abnahme, an Ratte C nach einer kurz andauernden
Steigerung eine tiefe Depression mit nachfolgender Steigerung zu
konstatieren, an Ratte A blieben die Werte überwiegend unter den vor
der Splenektomie ermittelten.
Was zunächst die kurz andauernde Steigerung des Energieumsatzes
anbelangt, wird es wohl niemand einfallen, sie dem Fehlen der Milz
zuzuschreiben. Denn so, wie bei Abwesenheit der Schilddrüse bzw. des
von ihr erzeugten Hormons, wenn kein künstlicher Ersatz geboten
wird, der Energieumsatz dauernd herabgesetzt bleibt, müßte die Ab-
wesenheit der Milz, welch letztere nach den früher genannten Autoren
im Organismus eine hemmende Wirkung auf Stoff- und Energie-
umsatz ausüben soll, deren dauernde Erhöhung bewirken. Wieso es
zu dieser vorübergehenden Steigerung auch in technisch nicht anfecht-
baren Versuchen kommt, läßt sich allerdings nicht präzisieren;
möglicherweise sind da gewisse, mit der operativen Ausschaltung der
Milz zusammenhängende Zirkulationsstörungen im Spiele, die nach
einiger Zeit kompensatorisch ausgeglichen werden.
Z. Aszódi:
Tabelle I. Allgemeine Versuchsdater
Versuchstier
' Nr. d. Versuchs
|
|
|
C
> |
sl O GUA WN ri
| S | Gewicht d. "Terbekäig
| ı Mittlere O + Tier inkl. Dejekte
Datum des | Dauer des Kalorimeter-' | am Beginn | am En
Versuchs Versuchs temperatur es a Teis id V Versuchs d. Ve i
oC oC Ei oC | g 8
. 1922 16, V. 8h 08' 27,6 36,5 363 | 47849 , 475,50
22. V. 7 58 | 279 36,5 | 362 | 48707 | 48330
29, V. 8 17 28,3 36,2 36,8 || 49293 | 48913
6. VI. 7 58 27,7 35,9 36,4 | 4804 477,8
| 19. VI. 7 22 28,0 36,0 36,4 | 49441 | 491,80
Ä 28, VI. 7 75 27,9 35,5 36,6 502,21 | 49,52
28. VIII. | 7 66 27,0 36,1 36,4 499,62 | 491,06
194 2X. 8 50 27,1 35,6 35,9 494,95 | 491,46
9.X. 7 78 27,1 35,3 36,1 489,60 | 486.73
16.X. 8 08 27,1 34,7 35,7 48646 48287
23,X. 7 75 27,2 35,1 35,7 49772 4943
30, X. 8 18 27,2 35,3 36,1 49575 492,70
6, XI. 7 2 27,0 35,3 35,5 500,60 497,4
13. XI. 7 50 27,2 35,7 36,0 500,30 497,0
| 20. XI. 8 00 27,1 35,5 36,0 497.96 49,32
| 27, XI. 7 42 26,9 35,8 36,2 51330 510%
4. XII. | 7 17 7,3 35,8 36,5 508,17 505,9
: 1925 17.1. 7 25 273 |" 36,3 36,0 490,88 437,8
1924 19. VIII. | 8 93 26,9 36,5 36,8 470,60 ` 4615
! 26. VIII. | 7 53 26,6 || 36,7 36,9 462,60 ' 460,52
| 2, IX. 7 92 263 | 36,6 37,3 | 450,92 ` 44870
| 9. IX. 7 58 26,6 37,5 372 44950 ` 4470
16. IX. 7 75 26,5 36,2 36,7 | 451,55 | 449.29
23. IX. 7 50 26,8 35,4 36,1 43705 | 4355
30. IX. 7 83 26,5 35,6 36,4 432,42 | 430.92
| 7.X. 7 33 266 | 360 | 361 45490 45316
! 14.X. 7 66 27,0 | 36,6 36,6 466,12 463,64
| 21.X. 8 16 | 269 | 376 | 369 46514 46210
l 28. X. 7 75 27,2 | 36,4 36,6 456,35 4530
j 11. XI. 8 42 26,8 | 36,7 36,8 458,21 ' 456.05
e 2,XIL | 7 58 270 | 36,5 36,5 479,48 47740
| 1925 15. I. 7 42 269 | 367 36,2 450,88 ` 4488
¡ 5. III. 8 17 269 | 369 36,3 461,50 459%
| 27. III. 8 00 27,0 37,4 36,2 466,90 464,52
| 1924 23. VIII. | 7 33 266 | 354 36,2 501,35 498,76
| 30. VIIL | 7 75 266 | 366 36,9 49550 492,38
6. TX. 7 75 26,7 | 35,6 36,0 491,17 488,5
13. IX. 8 00 268 | 36,2 36,7 478,38 474,8
20. IX. 7 83 27,2 | 362 36,5 477,30 474
27. IX. 7 92 273 | 356 36,1 479,63 : 477,08!
4.X. 7 92 272. 359 362 ' 49395 , 4915
11. X. 7 88 26,9 355 360 | 48540 48301
18, X. 8 13 27,1 35,7 35,8 | 48290 479%
25. X. 8 00 27,0 35,4 36,3 | 487,35 ¡ 485.01
8. XI. 7 87 26,8 35,5 36,0 489,33 ` 481.2
29. XI. 7 25 27,2 36,3 36,5 501,98 — 499.9%
1925 13. I. 7 66 27, 36,2 35,7 478,88 477,0
3. III. 7 25 27, 35,6 35,6 481,05 478.87
24. III. 7 58 27,0 36,2 35,3 || 480,52 47840
Tierische Kalorimetrie. VI. 135
sowie Daten für den O,-Verbrauch.
|
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183,74 ` 5 — 0,729 ee
179/69 | 2079 | —11 | 0,756
193,78 2298 | —30 | 0,736
194,77 | 2,746 +13 || 0,722
184,01 | 2370 | —14 ¡| 0,734
190,78 | 2618 | —29 | 0,738 || Splenektomie am
201,03 | 2666 | —0,4 0,730 ee
199,86 | 2649 | —0,1 | 0737
204,68 | 2,547 + 0,1 | 0,737
204,46 | 2,695 | —1,1 0,734
201,75 | pa E | 0,723 |
209,40 | 2586 | —0,7 0,736
203,34 | 2545 | — 25 | 0,735
192,1 — — | 0,729
168.79 2463 | —14 0,715
164.69 2035 | —17 | 0,732
155,89 | 2,047 | —13 0,742
154,53 | 2,076 + 0,6 | 0,738 || Splenektomie am
156,58 | 2,057 | —01 | 0,728 A das
14442 | 1,595 +08 | 0,736
138,95 | 1,659 | — 22 0,753
14949 ` 1752 | +11 0,729 |
160,75 2205 | —20 | 0,736
169,53 ` 2,481 —28 | 0,733
160,65 ' 2,177 + 0,1 0,743
16288: 2,268 | —30 | 0,732
176,13 2183 | — 22 0,729 |
152,83 1927 | +08 | 0,736 |
160,01 2196 | — 24 0,747
164,11 2,247 — 11 0,732
203,55 ` 2,347 +10 | 0,735
200,05 - 2673 | —0,7 0,728
195,17 ` 2,490 +05 || 0,730
182,60 2,727 — 11 0,737 || Splenektomie am
184,01 ' 2452 | +06 | 0,729 is
186,50 | 2,332 | —19 | 0,729 |
188,20 ' 2,395 | —05 | 0,730 |
180,14 . 2270 | —18 || 0,730
187,35 => — 0,748 |
191,01 `. 2,383 | —05 | 0,734
194,05 ` 2,356 | — 2,7 0,736
198,66 | 2200 | —44 | 0735 |
180,77 | 1,861 2,064 2,045 2,084 | —19 | 0,727 |
179,57 . 2,153 2,031 2,004 2032 | —14 | 0,732
17786 | 2,127 2,121 2,128 2,145 | —08 | 0,722 '
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136
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Tierische Kalorimetrie. VI.
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46 | 21, „ 373 "pp 80— 53 — 96 — 65|— 8,0
(AA a = 728 ¡730 '—105— 89127109 —11'8
48016, S 756 776 ¡— 11— 43 — 94 — 52i — 7,3
49,61, „ = mg ml 55— 80,— 6,6 — 9,7°— 8,1
1) Mittelwert von 3 Versuchstagen.
2) Mittelwert von 2 Versuchstagen.
Tierische Kalorimetrie. VI. 141
Aber auch das Verhalten des Energieumsatzes nach dem Abklingen
der ersten kurz andauernden Steigerung ist nicht danach, daß man der
Milzexstirpation irgend einen Einfluß von bestimmter Richtung auf
den Energieumsatz zuschreiben könnte. Denn auch, wenn die Änderung
im Energieumsatz an allen Tieren von derselben Richtung gewesen
wäre, hätte man nur in dem Falle das Recht, sie direkt dem Fehlen
der Milz zuzuschreiben, wenn andere dazwischenliegende Ursachen
sicher auszuschließen sind. Erst mit Recht muß man sich aber auf
einen ablehnenden Standpunkt stellen, wenn, wie in unseren Ver-
suchen, die Änderung im Energieumsatz an verschiedenen Tieren so
verschieden ausfällt. Dieser Umstand weist dringend darauf hin, daß
hier andere Momente im Spiele sind, und es ist durchaus nicht schwer,
solche zu finden.
Eines dieser Momente ist in dem Verhalten. des Körpergewichts
der Tiere gelegen. Während der langen Beobachtungsdauer, während
welcher ich die kalorimetrischen Versuche anfangs in kürzeren, später
in längeren Intervallen ausgeführt habe, war es nicht möglich, die mit
Küchenabfällen gefütterten Tiere bei gleichem Körpergewicht zu er-
halten; so ergaben sich z. B. an Ratte C vom kleineren Werte berechnet
bis zu 25 Proz. betragende Schwankungen. Nun ergibt sich aber sofort
die Frage, wie sich die auf irgend eine Einheit reduzierten Werte des
Energieumsatzes verhalten, wenn das Körpergewicht ab- oder zunimmt ?
Der Einfachheit halber wollen wir zunächst nur den Fall einer
Abnahme des Körpergewichts im Auge behalten. Wird diese Abnahme
durch einen gleichmäßigen Verlust an den massigsten Körperbestand-
teilen, wie Wasser, Fett und Eiweiß, verursacht, so müssen unter sonst
gleichen Versuchsbedingungen die reduzierten Werte des Energie-
umsatzes unverändert bleiben. Ist es das Fettgewebe allein mit seinem
trägen Stoffwechsel, auf dessen Kosten die Körpergewichtsabnahme
erfolgt oder gar das Gewebswasser allein (was allerdings unter physiolo-
gischen Umständen kaum vorkommen dürfte), so hat dies eine relative
Anreicherung des Körpers an eigentlich lebender Substanz und eine
konsekutive Steigerung des reduzierten Energieumsatzes zur Folge.
Ist endlich das Eiweiß der Hauptverlustträger, so muß der reduzierte
Energieumsatz eine Abnahme aufweisen, wie dies bereits von E. Voit!)
und später von Zuntz?) gezeigt wurde.
Am Menschen ist es bei mangelhafter Ernährung (nicht bei
konsumierenden Krankheiten) erfahrungsgemäß das Fettgewebe, das
die stärksten Verluste erleidet; bezüglich unserer am häufigsten
verwendeten Versuchstiere läßt sich aber nicht von vorherein sagen,
1) E. Voit, Zeitschr. f. Biol. 41, 147, 1901.
2 N. Zuntz, diese Zeitschr. 55, 341, 1913.
142 2. Aszödi:
ob im Falle einer erheblicheren Abnahme des Körpergewichts das
Körperfett oder das Körpereiweiß der Hauptverlusttráger ist? Die
bekannte Tatsache, daß manche Tiere leicht Fett, andere wieder leicht
Fleisch (Eiweiß) verlieren bzw. ansetzen, müßte eigentlich zum Gegen-
stand genauerer Studien gemacht werden, als es bisher geschah, und
wenn auch solche Studien im Rahmen dieser Arbeit nicht gemacht
werden konnten, drängt sich die Sachlage, wie sie sich aus meinen
Versuchen bezüglich der
Ratte als möglich oder
gar wahrscheinlich her-
ausgestellt hat, direkt
zur Besprechung auf,
um so eher, da sie mit
eine Handhabe zur Er-
klärung des oben be-
schriebenen Verhaltens
des Energieumsatzes
E 180 nach erfolgter Splenek-
vers 2 34567 Vers.Nr 8 I 10.11 12 131975 1677 78 tomie liefert.
we Ban In nachstehender
Abb. 1 habe ich das
Verhalten des Körper-
gewichts und des auf
l qm reduzierten Ener-
gieumsatzes von drei
unter meinen vier
Ratten, wie es von Ver-
such zu Versuch fest-
gestellt wurde, graphisch
dargestellt; dabei je-
Vers. Nr AI 00 21 28 23 292526 27 DCI IO FI 32.3534 doch der Raumersparnis
Abb. 1 era Versuche no ner. Ge: Zeinzehien
— Versuche so aneinander
gereiht, wie wenn das Zeitintervall zwischen je zwei Versuchen stets
dasselbe gewesen wäre. Aus den Kurven ergibt sich, daß an Ratte A
zwischen Körpergewicht und reduziertem Energieumsalz ein ganz auf-
fallender Parallelismus besteht; er ist längs größerer Kurvenabschnitte
(die ich ganz ausgezogen habe) gut zu erkennen an Ratte B und C,
nicht nachweisbar an Ratte D, daher ich den Verlauf hier überhaupt
nicht abgebildet habe.
Die Änderungen im Energieumsatz hängen also teilweise gut
erkennbar mit den Änderungen des Körpergewichts zusammen, was
sich nach obigen Erörterungen vielleicht so erklären läßt, daß Ratten
Tierische Kalorimetrie. VI. 143
leichter als andere Tiere größere Mengen von Eiweiß schnell zu ver-
lieren (oder anzusetzen) vermögen. Hiermit steht es nicht im Wider-
spruch, daß der Parallelismus an Ratte D fehlt bzw. auch an Ratte B
und C nicht während der ganzen Dauer der betreffenden Versuchsreihe
vorhanden war. Denn es gibt, wie gleich gezeigt werden soll, mehrere
konkurrierende Momente, die mit im Spiele sind, und anders als die
geänderte Körperzusammensetzung auf den Energieumsatz einwirken
können. So sei z.B. an die Mitteilung von Graham Lusk!) erinnert,
wonach der Energieumsatz seiner Versuchstiere auch bei gleich-
bleibendem Körpergewicht nach längerem Aufenthalt in den Instituts-
räumen eine erhebliche Abnahme erfuhr, jedoch alsbald wieder die
früheren Werte erlangte, als die Tiere nach einem längeren Aufenthalt
am Lande, wo sie sich frei bewegen konnten, wieder nach dem
Institut zurückgebracht und kalorimetrisch untersucht wurden. In
diesem Falle war es also nicht das Körpergewicht, sondern die all-
gemeine Verfassung der Tiere, oder waren es vielleicht gewisse Lust-
oder Unlustgefühle, durch die der Grundumsatz beeinflußt wurde.
Ein weiteres Moment, das auf den Energieumsatz unserer splenekto-
mierten Ratten von Einfluß gewesen sein mag, ist die geänderte Zu-
sammensetzung des Blutes, indem es ja bekannt ist, daß die Exstirpation
der Milz von einer Abnahme der roten Blutkörperchen gefolgt wird.
Ich habe an Ratte B, C und D während der ganzen kalorimetrischen
Versuchsreihe auch das Blutbild genau verfolgt. Über die Ergebnisse
dieser Untersuchungen wird an anderer Stelle (s. folgende Mitteilung)
berichtet; hier seien bloß die Befunde erwähnt, die sich auf die Zahl
der roten Blutkörperchen beziehen. Zwischen dieser und dem Energie-
umsatz war an Ratte B und C ein recht auffallender Parallelismus zu
konstatieren, der an Ratte D allerdings fehlte, daher ich in nachstehender
Abb. 2, die diese Verhältnisse graphisch darstellen soll, Ratte D über-
haupt nicht aufgenommen habe.
Wir haben also gleich zwei Momente kennengelernt, die von Einfluß
auf den Energieumsatz sein können. Eines dieser Momente, die ge-
änderte Körperzusammensetzung, ist von der Milzexstirpation ganz
unabhängig; das andere, die geänderte Blutkörperchenzahl, ist eine
Folge der Milzexstirpation. Daneben dürfte es aber noch eine Anzahl
nicht so leicht nachzuweisender Momente geben, deren Einfluß auf
den Energieumsatz in qualitativer und quantitativer Hinsicht ver-
schieden sein kann, so daß sie einander teils parallel, teils entgegen
wirken und es bloß einem Zufall zuzuschreiben ist, wenn die Änderung
des Körpergewichts, der Blutkörperchenzahl und der Wärmeproduktion
so überraschend gleich verläuft wie z. B. an meiner Ratte C. Darin
1) Graham Lusk, Journ. of biol. Chem. 20, 565, 1915.
144 2. Aszödi:
| =
N TI T
|
ade atte
re Ar 8 I 071 12 13 1415 6 178 19 20 2122 2384 25 26 27 28 29 30.31 ILII IIS
Ratte B. Ratte C.
Abb. 2. Eigene Versuche.
Kaninchen D. 270C. Kaninchen D 330 C.
Abb. 3. Versuche von Hauri.
Tierische Kalorimetrie. VI. 145
stimmen aber alle meine Versuche überein, daß keinerlei Anlaß vorliegt,
die Veränderungen, die nach der Milzexstirpation im Energieumsatz
eingetreten waren, mit dem Fehlen eines sonst von der Milz produzierten
Stoffes in Zusammenhang zu bringen.
Zur weiteren Erhärtung dieser meiner Auffassung wollen wir nun
einmal sehen, ob der Einfluß der von mir erwähnten Momente auch in
den Versuchen anderer Autoren aufzufinden ist bzw. ob sich der eingangs
erwähnte Widerspruch zwischen den Befunden von Hauri, der an
splenektomierten Kaninchen eine Zunahme der CO,-Produktion
konstatierte, und den Befunden von Takahashi, der an der Mehrzahl
seiner splenektomierten Tiere eine Herabsetzung des Gaswechsels
konstatierte, sich durch jene Momente erklären lasse. Da in den ge-
nannten Versuchen das Blutbild nicht geprüft wurde, kann es sich
nur um einen etwaigen Parallelismus zwischen den Änderungen des
Gaswechsels und des Körpergewichts handeln.
In nachstehender Abb. 3 habe ich den Gang des Körpergewichts
und der reduzierten CO,-Produktion der Kaninchen B und D von
Hauri graphisch dargestellt und konnte dieselben Zusammenhänge
wie an meinen Ratten konstatieren. An Kaninchen B ist bei 27 und 33° C
der Parallelismus ein ganz auffallender; teilweise gut zu erkennen an
Kaninchen D bei 27 und 33° C, weniger deutlich in den an Kaninchen B
und D bei 20° C ausgeführten Versuchen, daher letztere in die graphische
Darstellung überhaupt nicht aufgenommen sind.
Nach demselben Prinzip habe ich in Abb. 4 die Ergebnisse von
Takahashis Versuchen dargestellt!) und ist aus dieser Abbildung er-
sichtlich, daß in den beiden an Meerschweinchen ausgeführten Ver-
suchen seiner Tabelle VI und VII zwischen Sauerstoffverbrauch und
Körpergewicht wieder ein auffallender Parallelismus besteht; er ist
streckenweise gut zu erkennen an den Ratten der Tabellen II und V,
kaum oder gar nicht an den Ratten der Tabellen I, III und V, daher
ich letztere Versuche in Abb. 4 nicht aufgenommen habe.
1) In den Takahashischen Tabellen finden sich zwischen den Daten
des reduzierten Sauerstoffverbrauchs einige, die aus den vorliegenden
Daten (Körpergewicht, Versuchsdauer und Sauerstoffverbrauch während
der Versuchsdauer) berechnet, anders lauten. Dies ist der Fall in Tabelle I
bezüglich der Versuche vom 9. Februar, 13. und 15. März, in Tabelle II
bezüglich des Versuchs vom 17. März, in Tabelle III bezüglich des Versuchs
vom 16. Februar und in Tabelle IV bezüglich des Versuchs vom 19. Mai.
Leider bin ich nicht in der Lage, diese Unstimmigkeiten richtigzustellen,
da es nicht ausgemacht ist, ob es sich um Rechenfehler in der Reduktion
der betreffenden Werte handelt oder aber um Druckfehler in den be-
treffenden Versuchsdaten. Auf alle Fälle habe ich den zweifelhaften Wert
in der von mir graphisch dargestellten Tabelle II unberücksichtigt gelassen
und die Kurve über die betreffende Stelle hinweggezogen.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 10
146 Z. Aszódi:
Meerschweinchen der Tabelle VI. Meerschweinchen der Tabelle VIL
Abb. 4. Versuche von Takahashi.
Tierische Kalorimetrie. VI. 147
Der Umstand, daß in manchen Versuchen von Haurs und von
Takahashi der Parallelismus lange nicht so gut zu erkennen ist wie in
meinen Versuchen, spricht nicht gegen meine Annahme eines kausalen
Zusammenhangs zwischen den Änderungen im Körpergewicht und im
Gaswechsel, wenn man bedenkt, daß die Versuchsdauer bei den beiden
genannten Autoren eine weit geringere war als in meinen Versuchen:
bei Hauri, soweit es den Versuchsprotokollen zu entnehmen ist, an-
scheinend bloß Y, Stunde, bei Takahashi von 41, bis herunter zu
21, Stunden. Bei einer so kurzen Versuchsdauer ist es aber begreiflich,
daß Schwankungen unterlaufen können, die zwar sonst nicht schwer
ins Gewicht fallen, jedoch geeignet sind, den von mir gesuchten
Parallelismus teilweise zu verdecken. Auf Grund dieser Überlegungen
wird man also aussagen können, daß die Zunahme des Gaswechsels
bei Hauri und dessen Abnahme bei Takahashi sehr gut erklärlich sind,
wenn man die Änderung im reduzierten Gaswechsel der Änderung des
Körpergewichts bzw. der Körperzusammensetzung und nicht dem
Fehlen der Milz zuschreibt.
Zum Schluß bliebe noch zu erklären, wieso es in Danoffs Ver-
suchen zu der auffallenden Steigerung des Gaswechsels nach der Milz-
exstirpation gekommen war, die später von Takahashi und nun auch
von mir kaum oder gar nicht wieder gefunden wurde. Da ist vor allem
zu erwähnen, daß, wie Danoff angibt, nach Entfernung der Milz ,,ein
unerwartetes Verhalten der Tiere eintrat. Gewöhnlich am 4. Tage
begannen die im übrigen ganz gesunden Tiere an ihrer eigenen Wunde
zu nagen, vermutlich wegen Juckgefühl. Hierbei zernagten sie erstlich
Verbandgaze, dann die Haut und die Muskulatur...‘ Um dies zu
verhüten, hat Danoff ein Verfahren angewendet, darin bestehend, daß
er „...auf die Verbandgaze einen Drahtnetzverband aus Aluminium
legte und denselben mit dünnem Drahte über den ganzen Leib der
Ratte fixierte.‘‘ Manchen Tieren mußte sogar ein Maulkorb angelegt
werden.
Nun ist es aber klar, daß an den so versorgten Tieren wohl das
Benagen der Wunde, jedoch sicherlich nicht die durch das Juckgefühl
verursachte Unruhe des Tieres verhütet wurde, und es ist durchaus
begreiflich, daß es aus diesem Grunde allein schon zu einer Steigerung
des Gaswechsels kommen mußte.
Diese Steigerung kann aber auch eine andere Ursache gehabt
haben. Nach Danoffs Angaben hatte nämlich keines seiner Tiere die
Operation länger als um 10 Tage überlebt und wurden die Versuche
während dieser kurzen Spanne Zeit, also teilweise nur wenige Tage vor
dem Tode der Tiere ausgeführt. Warum Danoffs Tiere so bald nach
der Operation zugrunde gingen, läßt sich hinterher natürlich ebenso-
wenig feststellen, wie in den Versuchen von Lepehne, auf die sich Danoff
10 *
148 Z. Aszódi:
beruft und in denen die Tiere ebenfalls auffallend rasch eingingen.
Doch seien diesen Tieren diejenigen von Dastre!) gegenübergestellt,
die, am 25. Lebenstage operiert, noch am Leben waren, als andere Tiere
aus demselben Wurfe bereits Junge geboren hatten; ferner die am
40. Lebenstage splenektomierten Ratten von Smith und Ascham?),
die 43 Wochen, die von Nishikawa, Joshikata und Toshio Takagi, die
noch 15 Wochen später am Leben waren; dann meine Tiere, die die
Milzexstirpation um viele Monate überlebt haben, endlich die von
späteren Autoren aus dem Asherschen Institut, die auch eine etwas
längere Lebensdauer aufwiesen als die Dunvffschen Tiere.
Ich habe also allen Grund anzunehmen, daß Danoffs Tiere tagelang
vor ihrem Tode, also während der Zeit, in der an ihnen die ent-
scheidenden Respirationsversuche ausgeführt wurden, krank waren,
um so eher, da für ihre Körpertemperatur keine Angaben vorliegen
und es durchaus möglich ist, daß dieselbe dauernd erhöht war.
Aber auch hiervon gänzlich abgesehen, war die Verfassung der
Tiere nach der Milzexstirpation eine durchaus abnorme, wie aus folgenden
Angaben von Danoff hervorgeht: ‚Bei der Herausnahme der normalen
Ratten aus der Respirationskammer war das Tier trocken, und die
Wände zeigten nur einen geringen Flüssigkeitebeschlag. Ganz anders
verhielten sich die Dinge nach Herausnahme der milzlosen Ratten.
Die Tiere waren immer mit Schweiß bedeckt, die Haare oft am Leibe
verklebt, die Wandungen des Kastens voll Wassertropfen ...'* Daß
eine mäßige, allerdings vorübergehende Steigerung der Wasserver-
dampfung in der Tat der Milzexstirpation zuzuschreiben ist, wird
weiter unten gezeigt werden. Die Bildung so großer Mengen von
Kondenswasser muß aber andere Gründe haben und ist in den Normal-
versuchen der viel zu geringen Ventilation zuzuschreiben, die nach
Danoffs Angabe nicht mehr als 15, nicht weniger als 3 (!) Liter pro
Stunde betrug. Die noch weitaus größeren Mengen Kondenswasser,
die Danoff an seinen operierten Tieren beobachtete, dürften aber außer-
dem noch teilweise davon herrühren, daß die Tiere, deren Wärme-
abgabe durch Gaze- und Drahtnetzverband behindert war, vikariierend
Wasser in erhöhten Mengen verdampfen mußten; teilweise aber auch
davon, daß es sich wie erwähnt, offenbar um kranke, vielleicht fiebernde
Tiere gehandelt hatte, deren Stoffwechsel und Wasserproduktion aus
diesem Grunde allein schon abnorm erhöht war.
Die angeführten Umstände machen es begreiflich, daß der Energie-
umsalz bzw. der Gaswechsel der operierten Tiere eine Zunahme aufgewiesen
1) A. Dastre, C.r. soc. 1893, S. 584.
2) A. H. Smith and L. Ascham, Proc. of the soc. f. exper. biol. and
med. 19, 127 —128, 1921.
Tierische Kalorimetrie. VI. 149
hat, ohne jedoch, daß diese Zunahme der Abwesenheit der Milz zu-
geschrieben werden dürfte. Endlich muß noch zur Angabe von Danoff
Stellung genommen werden, wonach nicht nur der Energieumsatz,
sondern auch die Wasserausscheidung durch das Fehlen der Milz erhöht
würde. Eine Zunahme der Wasserverdampfung nach der Entmilzung
ist auch in einzelnen Versuchsreihen von Takahashi, so in Versuchs-
reihen IV, V und VI nachzuweisen und tritt klar zutage, wenn man, wie
es in nachstehender Zusammenstellung geschah, innerhalb jeder Ver-
suchsreihe die auf 1 Stunde und 1 kg Körpergewicht reduzierten Werte
vor und nach der Operation miteinander vergleicht.
Nach der
| Vor der
Tabelle | Splenektomie Splenektomie
N A MS A
I | 252 1,45
II | 154 1,51
III | 114 1,09
IV | 1% 174
vo 09 121
VI ' 108 141
VII || 1,03 1,05
Deutlich tritt diese Erscheinung auch an dreien meiner vier
Ratten zutage, wie dies aus nachstehender Tabelle V zu ersehen ist.
Im 4. Stab dieser Tabelle habe ich berechnet, wieviel Kg-Cal
von der gesamten Wärmeabgabe aut Wasserverdampfung vor und
nach der Entmilzung entfällt und es ist sofort zu ersehen, daß diese
Zahlen nach der Splenektomie eine deutliche, wenn auch bald wieder
abklingende Erhöhung zeigen. Diese Steigerung ist aber nicht etwa
bloß als eine Teilerscheinung der an diesen Tagen erhöhten Wärme-
produktion aufzufassen; denn, wie aus dem 5. und 6. Stabe dieser
Tabelle hervorgeht, ist auch die prozentuale Beteiligung der Wasser-
verdampfung an der gesamten Wärmeabgabe etwas erhöht. Es ist
möglich, daß diese vorübergehende (auch relative) Steigerung der
Wasserverdampfung auf dieselben postoperativen Momente (z. B. Zir-
kulationsströmungen) zurückzuführen ist, wie die oben erwähnte, nicht
lange andauernde Steigerung des Energieumsatzes. Allerdings fehlt
. hierfür jedweder Beweis; doch läßt sich so viel sicher sagen, daß auch
diese Steigerung nicht durch die Abwesenheit der Milz bedingt ist, denn
wenn dieses der Fall wäre, könnte die Erscheinung verhältnismäßig
nicht so rasch wieder verschwinden.
Aus allen diesen angeführten Gründen kann man dem Ausspruche
Takahashis, wonach ‚das Resultat von Danoff auch für die Ratte
keine allgemeine Gültigkeit besitzt‘, in dieser Form keinesfalls bei-
pflichten, denn man würde damit zugeben, daß es eine teilweise oder
150 Z. Aszödi:
Tabelle V.
3 | 5 2o Von der 24 stündigen Wärmeabgabe entfallen auf j
5 Si ES 3 | Leitung u. | Wasser- Leitung u. Wasser | Bemerkungen
gs sue Strahlung | verdampfung | Strahlung |verdampfung.
> |Z > | kgCal | kgCal | Proz kg:Cal kg-Cal Proz. Proz.
A 8 "` Direkte Kalorimetri Direkte Kalorimetrie fehlt.
B 8 1901 ' 580 , 77 23 S
9 - 18,62 530 | 79 21 | Vor der Splenektomie
| 10 19,14 6,08 76 | 24 | 3Tage | nach der
11 19,49 6,02 76 | 24 110, Splenek-
12 | 1926 5,14 79 au (nm? tomie
13 20,87 6,00 77 23 usw.
' 14 21,06 6,07 78 22
| 15 21,66 5,88 78 22 |
| 16 20,97 5,69 78 22 |
| 17 21,50 5,88 78 22
| 18 21,56 6,54 76 24 |
C| 19 16,72 474 78 22
20 | 17,79 3,80 84 16 | Vor der Splenektomie
| 21 16,24 3,82 81 19 |
22 | 16,85 4,48 79 21 ' 5Tage ) nach der
23 15,97 | 4,07 80 20 12 „ | Splenek-
| 24 | 13,57 2,86 82 18 19 > tomie
25 12,73 2,54 83 17 usw.
126 15,13 3,33 82 18
ı 27 17,71 4,43 80 20
28 18,05 5,11 78 22 |
29 | 17,25 4,69 79 21 |
30 17,65 3,50 84 16
31 19,05 3,78 83 17
| 32 Ä 17,42 3,55 83 17
' 33 | 18,58 3,79 83 17
34 17,17 4,10 81 19 |
Di 35 20,16 4,92 81 19 |
| 36 20,81 5,70 79 21 | Vor der Splenektomie
| 37 19,57 5,25 80 20 i
A8 18,55 677 74 26 | 4Tage | nach der
39 18,68 617° 78 22 II, | Splenek-
| 40 18,23 4,44 80 20 18 „ tomie
41 | 18,91 4,29 81 19 usw.,
42 17,79 4,18 8l 19
43 | 17,99 5,03 79 21
44 | 18,45 4,03 82 18
45 19,40 355 ' 83 17
46 19,94 381 ` 84 16
47 | 17,97 | 3,39 84 16 |
48 - 18,38 | 44 81 ' 9 |
49 | 1752 ¡ 392 | 82 | 18
spezielle Gültigkeit habe. Was sich sagen läßt, ist einzig und allein,
daß diese Resultate überhaupt nicht berücksichtigt werden können. Die
Ergebnisse meiner Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen :
Tierische Kalorimetrie. VI. 151
1. Ein primärer Einfluß von bestimmter Richtung, den die Exstirpa-
tion der Milz bzw. das Fehlen eines von der Milz produzierten Hormons
auf den Energieumsatz ausüben würde, ist nicht nachzuweisen.
2. Die nach der Milzexstirpation in verschiedenen Versuchsreihen
nachgewiesene Änderung des Energieumsatzes rührt entweder von Um-
ständen her, die von der Milzexstirpation unabhängig sind (Änderung
des Körpergewichts bzw. der Kórperzusammenselzung), oder aber wird
sekundär durch Umstände bedingt, die in primärer Weise durch die Milz-
exstirpation verursacht wurden (Änderung der Zahl der roten Blut-
körperchen).
3. Die Wasserverdampfung bzw. ihre Beteiligung an der gesamten
Wärmeabgabe wird durch die Milzexstirpation nur vorübergehend beein-
flußt.
Das Blutbild der splenektomierten weißen Ratte.
Von
Zoltän Aszödi.
(Aus dem physiologisch-chemischen Institut der k. ungar. Universität
Budapest.)
(Eingegangen am 7. Juli 1925.)
Die Gelegenheit, die sich mir anläßlich der vorangehend mit-
geteilten Untersuchungen über den Energieumsatz splenektomierter
Ratten bot, habe ich zum Studium des Blutbildes dieser Tiere um so
eher ergriffen, da einerseits solche Beobachtungen an Ratten nur in
sehr spärlicher Anzahl vorliegen, andererseits, weil auch die an anderen
splenektomierten Säugetieren ausgeführten Beobachtungen zu vielfach
widersprechenden Ergebnissen geführt haben.
Die Beobachtungen der Autoren beziehen sich auf die Zahl der roten
Blutkörperchen, auf das Auftreten von kernhaltigen Formen und auf
Zahl und Form der weißen Blutkörperchen.
Rote Blutkörperchen. Pugliese und Luzzati!), ferner auch Nikolas
und Dumoulin?) fanden eine Abnahme, die nach den beiden letztgenannten
Autoren innerhalb 17 Tage wieder ausgeglichen war. An den Kaninchen
von Sollberger?) trat nach der Milzexstirpation eine mächtige Zunahme
auf, die alsbald von einer Abnahme gefolgt war, wobei aber das Niveau
sich noch immer über dem ursprünglichen erhielt. Nach Vogel*) dauert
die Abnahme nur so lange an, als die Tiere cisenarme Nahrung zu sich
nehmen; ja, Dubois®) konnte an splenektomierten Kaninchen, die eisenreich
ernährt wurden, direkt eine vorübergehende Zunahme konstatieren. In
den von Freytag®) an Hunden ausgeführten Versuchen war bereits innerhalb
1) Pugliese und Luzzati, Arch. per la scienza med. 24.
2) Nikolas und Dumoulin, C.r. 57, 105— 107, 1904.
8) Sollberger, diese Zeitschr. Y, 55, 1913.
t) H. Vogel, ebendaselbst 48, 386, 1912.
5) M. Dubois, ebendaselbst 82, 141, 1917.
6) Freytag, Pflügers Arch. 120, 517, 1907.
Z. Aszödi: Blutbild der splenektomierten weißen Ratte. 153
des ersten der Splenektomie folgenden Tages eine deutliche Zunahme
vorharden, die jedoch bloß einige Stunden lang angedauert hatte und
bereits am dritten Tage einer Abnahme Platz machte, die ihrerseits wieder
binnen 10 bis 12 Tagen ausgeglichen war. Auch an den Hunden
von Eppinger ') ließ sich die Abnahme nur wenige Tage hindurch konstatieren.
Das Vorkommen von Erythroblasten, Normoblasten und namentlich
von Jollikórperchen im Blute von splenektomierten Tieren ist durch
zahlreiche übereinstimmende Angaben sichergestellt. Für uns ist namentlich
der Befund von Weinert?) von besonderem Interesse, wonach an der
splenektomierten Ratte durch die zahlreichen Kernreste geradezu das
Bild des Vogelblutes vorgetäuscht werden kann.
Weiße Blutkörperchen. Wie bezüglich der roten Blutkörperchen,
lauten die Angaben verschiedener Autoren auch hier zum Teil recht diver-
gierend. Nach Vogel ist ihre Zahl nach erfolgter Splenektomie kaum ver-
ändert, nach Dubois unverändert, nach Kurloff?) am Meerschweinchen
verdoppelt. Kurloff fand außerdem eine Zunahme der Lymphocyten im
ersten, eine Zunahme der eosinophilen Zellen im zweiten Jahre nach er-
folgter Splenektomie, welch letzterer Befund von Noguchi $) auch bezüglich
des Menschen bestätigt wurde. Eine relative bzw. absolute Lymphocytose
wurde auch von anderen Autoren, wie Messerli®), Carpenter®), Hanke’),
Weinert usw. gefunden.
Eigene Versuche.
Bluteninahme. Da es im Plane meiner Arbeit gelegen war, die
Untersuchung an splenektomierten Tieren längere Zeit hindurch (so-
lange die kalorimetrischen Versuche dauerten) fortzusetzen, konnte
ich mich keines Verfahrens bedienen, das mit einem irgend erheblichen
Blutverlust verbunden ist, also weder der von Wolf®) ausgeführten
Herzpunktion, noch aber des von Klieneberger und Carl?) geübten
„Kupieren des Schwanzes und Auspressen von Blut durch Quetschung**
bzw. des Aufschneidens der Gefäße am Oberschenkel.
Es gelang mir auf nachfolgende Weise, den Tieren hinreichende
Mengen von Blut zu entnehmen, ohne daß die in gewissen Zeitinter-
vallen oft wiederholten Eingriffe von irgendwelchen Störungen be-
gleitet gewesen wären. Das Tier wird auf den Tisch gestellt und von
1) A. Eppinger, Die hepato-linealen Erkrankungen, 8. 97. 1920.
2) Weinert, Zentralbl. f. Chirurgie 48, 474—477, 1921.
3) Kurloff, zitiert bei Eppinger, Die hepatolienalen Erkrankungen,
S. 98. 1920.
$) Noguchi, ebendaselbst S. 99. 1920.
5) Messerli, diese Zeitschr. 97, 40, 1919.
8) Carpenter, Arch. of pediatr. 87, 425—426, 1920.
1) H. Hanke, Centralbl. f. Chirurgie 48, 1156, 1921.
8) W. Wolf, Zeitschr. f. physiol. Chem. 26, 442, 1898/99.
9) C. Klieneberger und W. Carl, Die Blutmorphologie der Labora-
toriumstiere. 1912.
154 Z. Aszódi:
der fest aufgelegten rechten Hand des Assistierenden von oben her so
umfangen, daB Daumen bzw. Zeigefinger an die linke bzw. rechte Backe
des Tieres zu liegen kommen, durch den dritten bis fiinften Finger aber
die ganze rechte Seitenwand des Rumpfes fixiert wird; mit der linken
Hand hált der Assistent das Tier am Schwanze fest. Der Experimentator
wäscht die äußere Fläche eines Ohres mit Äther rein, hält es mit einer
Pinzette fest, worauf die Haut an einer Stelle, wo die Blutgefäße deutlich
durchschimmern, angeschnitten wird. Es tritt bei der so gesetzten
Wunde kaum mehr Blut hervor als zum Füllen der beiden Saugpipetten
(für rote und weiße Blutkörperchen) und zum Ausstreichen einiger
Präparate (auf Objektträgern) nötig ist. Nach Aufdrücken eines kleinen
Wattebausches hört jeglicher weiterer Blutaustritt sofort auf, und
dauert die ganze Blutentnahme nicht mehr als 1 bis 2 Minuten. Sie
muß auch während dieser Zeit beendet sein, da das Rattenblut sehr
rasch gerinnt.
Auszählung und Färbung. Zur Zählung der roten Blutkörperchen
wurde das Blut mit Hayemscher Lösung im Verhältnis 1:200; für
Zählung der weißen Blutkörperchen mit Türkscher Lösung im Verhältnis
von 1:20, 1 : 33, selten 1:50 verdünnt. Die Ausstrichpräparate wurden
mit Methylalkohol fixiert und nach Romanowsky-Giemsa gefärbt. Die
einzelnen Versuchsergebnisse sind in der Generaltabelle am Ende des
Textes zusammengestellt; die Schlüsse, die aus ihnen gezogen werden
können, sind durch Tabellen im Texte illustriert.
Das normale Blutbild der Ratte.
Um die Veränderungen, die durch die Splenektomie etwa ver-
ursacht werden, genau einschätzen zu können, mußte zunächst über
das normale Blutbild der Ratte Klarheit geschaffen werden. Trotzdem
es zu erwarten war, daß das Blutbild der splenektomierten Tiere durch
den auf obige Weise öfter gesetzten minimalen Blutverlust keinerlei
Veränderungen erleiden wird, habe ich vorsichtshalber die Bestimmungen
auch an einigen normalen Kontrolltieren ausgeführt, was unter anderem
auch aus dem Grunde nötig war, da, wie aus der Generaltabelle zu
ersehen ist, das Blut meiner Versuchstiere B, C und D vor
der Splenektomie bloß je zweimal untersucht wurde. An den
eigens zu diesen Zwecken eingestellten Kontrolltieren I, II und II
habe ich das Blut in Intervallen von je 1 Woche doppelt so
oft als an den Versuchstieren B, C und D untersucht und habe,
wie gleich gezeigt werden soll, keinen Unterschied im Blutbild der
Kontroll- und Versuchstiere (vor der Splenektomie) gefunden. Daher
es erwiesen ist, daß wiederholte Blutentnahme von keinerlei Folgen
begleitet war.
Blutbild der splenektomierten weißen Ratte. 155
Rote Blutkörperchen. Ihre Zahl betrug laut nachfolgender Tabelle I,
in der die an je einem Tiere erhaltenen Werte zu einem Mittelwert
vereinigt sind, durchschnittlich 7,65 Millionen. Diese Zahl entspricht
genau dem Mittelwert der Wolfschen Angaben, die zwischen 6,4 und
8,9 Millionen schwanken, bleibt aber recht weit hinter den von Kliene-
berger und Carl angegebenen 9,3 Millionen zurück. Dabei muß bemerkt
werden, daß das Kontrolltier III bis zum Tage der ersten Blut-
untersuchung im kühleren und weniger gut beleuchteten Kellerraum
gehalten wurde; dieser Umstand (Anämie?) erklärt den etwas niederen
Wert am ersten Untersuchungstage, dem aber alsbald höhere Werte
folgten, als das Tier in die oberen wärmeren und helleren Instituts-
räume zu den übrigen Tieren gebracht wurde.
Weiße Blutkörperchen. Ihre Gesamtzahl betrug, wie aus Tabelle I
ersichtlich, im Durchschnitt aller Versuche 8970, also weit weniger
als von Klieneberger und Carl angegeben wird, die durchschnittlich
15200 fanden. Ihre prozentuale Verteilung auf verschiedene Formen
ist ebenfalls in Tabelle I berechnet und ist aus ihr einerseits zu ersehen,
daß das Rattenblut einen ausgesprochenen lymphocytáren Charakter
Tabelle I.
| : | Später „|| Eleng
| Ee | splenektomierte Tiere | samt. | berger
HT mittel || und
Il [Mittel: B | C | D |Mittel Carl
Rote Blutkörp., Mill. . | 8,04 147 7:44 7,68 17,10 7,53] 8,19| 7,61 | al 9,30
Weiße Blutkörp., | | | |
Tausend ..... 9,23| 9,25 8,53. 9,00:7,75| 9,35 9,7 | 8,93| 8,97|| 15,20
Eosin. Leucocyten, | |
y AA % h Haj ajl ROCHER Da" Dal 3%,
Basoph. Leucocyten, | | | |
On o |o 0 o lo jo |o jo jo ¡0
Neutroph.Leucocyten, | |
e l93 10 Is us 27 (131,32 ¡24 an | 16
Große Lymphocyten, | | |
SE 5), 5 |3 jale |8 |81, 7, 6 | 24%,
Kleine Lymphocyten, | | | | | | |
Gene op 1821,80 "ei, 16131, 731), 5311,63 691, | 531,
Mononucleäre, Proz. . | 3 ¡1 [11,2 [3 21 2 | 23i 21, 1,
Übergangsformen, | | | l | | | |
Proz... Aw EN A ı 2 [1 | Pa Ph Gel | 11,13 | 2 | 12.1: 2
hat, außerdem aber auch, daß meine diesbezüglichen Befunde mit den
Klieneberger und Carlschen recht gut übereinstimmen. Denn unter
anderem darf auch nicht vergessen werden, daß die Unterscheidung
zwischen kleinen und großen Lymphocyten vielfach von subjektiver
Beurteilung abhängt. Auffallend ist der vollständige Mangel an baso-
philen Formen.
156 Z. Aszódi:
Das Blutbild der splenektomierten Ratte.
Wie eingangs bereits erwähnt, wurde das Blut der Tiere lange
Zeit — Wochen und Monate hindurch — nach erfolgter Splenektomie
in kürzeren und längeren Zeitintervallen untersucht; dabei wurden
folgende Veränderungen gefunden.
Rote Blutkörperchen. Ihre Zahl erleidet, wie aus Tabelle II zu ent-
nehmen ist, eine sicher nachweisbare Änderung und stimmt deren
Richtung und Ausmaß an den drei Versuchstieren gut überein; es
kommt an allen Tieren zunächst zu einer recht ansehnlichen Abnahme,
deren Dauer allerdings verschieden ist; sie wird am Tiere B bereits
Tabelle II.
| | Änderung der roten
Tier Zeitpunkt der Untersuchung | EE eeh
ll _ on BE dE Proz.
B ` 2 eg “13
9 =
16 — 6
| . Wochen nach der | + 7
| Splenektomie HET:
1 + 6
3 Monate +12
C | 1 Tag — 17
/ 4 Tage |
12 — 4
3 Wochen u
| to, —19
? 2 nach der 4 S
7 £ Splenektomie +1
8 S +3
10 H +0
il, Monate | +4 5
6 R dës)
71 „ + 11
D 1 Tag | —%
4 Tage — 14
ll , | —15
18 —99
4 Wochen Er,
5 > =-
6 S nach der ds A
7 S Splenektomie Ä — 1l
8 =b
4 Monate des dl
6 e | + 5
DI, n | + 13
T n + 7
| ef? n + 5
Blutbild der splenektomierten weißen Ratte. 157
in der vierten, am Tiere C in der sechsten und am Tiere D noch später
durch eine Zunahme ausgeglichen, ja alsbald überkompensiert.
In den ersten Wochen nach erfolgter Splenektomie nahm die Zahl
der Normoblasten, die vorher in spärlicher Zahl (1 auf 400 bis 500 aus-
gezählter weißer Blutkörperchen) anzutreffen waren, zu (4 bis 5 auf
500 ausgezählte weiße Blutkörperchen). Später fiel ihre Zahl wieder
sichtlich ab. Desgleichen waren auch Jollykörperchen in den beiden
ersten der Splenektomie folgenden Monaten in jedem Gesichtsfeld zu
sehen, späterhin nahm ihre Zahl ab, jedoch ohne daß sie oder die
Chromatinstäubchen, die beide als Zeichen mangelhafter Entkernung
der roten Blutkörperchen angesehen werden, ganz verschwunden wären,
Recht auffallend ist die stark erhöhte Polychromasie nach erfolgter
Splenektomie, die besonders starke Grade zu der Zeit erreicht, wo die
Zahl der roten Blutkörperchen herabgesetzt ist. Die Polychromasie
kehrt zu den früheren Werten zurück, ja sie sinkt an Ratte C und D
unter diese Werte, sobald die normale Zahl erreicht ist, bzw. die oben
erwähnte Polyglobulie sich eingestellt hat.
Weiße Blutkörperchen. An Ratte C und D weisen sie, wie aus der
Gencraltabelle zu ersehen ist, am Tage nach erfolgter Splenektomie
eine recht erhebliche Zunahme auf, die an Ratte C 12 Tage später, an
Ratte D aber bereits 4 Tage später nicht mehr vorhanden war. Die
Zunahme zeigt sich aber noch einmal, und zwar an Ratte C 3, an Ratte D
4 Wochen später, sogar auch an Ratte B in der 3. und 4. Woche nach
der Splenektomie. Im weiteren Verlauf war wieder eine ziemlich un-
regelmäßige Abnahme zu konstatieren, derzufolge die Zahl an Ratte B
3 Monate, an Ratte C aber 7 Monate nach erfolgter Milzexstirpation
erheblich unter den Normalwerten stehend gefunden wurde (siehe
Tabelle III). An Ratte D war die Abnahme nach 81, Monaten nicht be-
deutend. Die prozentuale Verteilung der verschiedenen Formen der
Tabelle III.
nn = Rte pe, D
Zeitpunkt Nach der | Vor der | Nach der | Vor der | Nach der
de Splenek» ` Splenek» | Splenek» | Spleneke | Splenek»
Untersuchung | tomie | tomie tomie |; tomie tomie
Weiße Blutkörperchen 9170 3)
Eosinophile Leucocyten Ma
Basophile Leucocyten . 0
Neutrophile Leucocyten 20
Große Lymphocyten.. . fa. a! la 81), 51,
Kleine Lymphocyten 70
Mononucleáre ..... 2
Übergangsformen | 2
1) Nach 3 Monaten. ?) Nach "la Monaten. 3) Nach 8!/, Monaten.
158
General- Tabelle.
Ta
der
Blut»
entnahme
Ratte
1924
D (129, VIII.
6, IX.
9, IX.
110. IX.
13, IX.
I
27. LS,
d 780 |
1
| Rote Blutkörperchen
1 eet
E Millionen
um +++
7,60 +
| Mittel 7,10 |
Splenektomie
| 6,20 ++
ol
6,70
7,58 de
8,26 +
7,50 ==
-r
A
BR
7,94
6,93
8,13
Mittel 7,58
Splenektomie `
6,24 | ++
7,05 |
7,25 |
6,44
6,10
| 7,32
8,20
7,60
7,80
7,50
7,95
7,60
8,37
8,18
8,20
Mittel 8, 19
Sal
fr
ch
dÉ ++
TEH HE +
Poly» A
chros |
masie || Tausend `
++
++
EA
+
SE
$
1 laah
basophil
© ©
- KR Mi Wi SW eg
SO9O990009090
ooo © nech CH CH CH CH CH
au), 0
3 a.
4 vu
"le 3
12 3
3 1
7113 212
3 11,
4 2
3 3
21), 2
11 3
6 3
51] 1
5 1
51) 2
3 1
9 TA
8 4
6%, 3
6 3
5 Dia.
Blutbild der splenektomierten weißen Ratte. 159
General-Tabelle (Fortsetzung).
Rote Blutkörperchen || Weiße Blutkörperchen
| | Von 100 abgezählten sind
mie) Sach, Tt
os laos Keep | ge | Kees | S ch S EE HF 5 e E
Millionen masie | Tausend £ 9 E FIT 25 az
8 |3| 3 [97 728/83
1925 |
112.1. 8,56 0 79 10 [0/14 |5 |7% |3 |2
2. III. 8,64 1960 10 10119 |€ gë [8 |2
(23. III. 9,28 ES 990 |o [0/26 |4 |66 |2 |2
7, IV. 8.75 + 92 lo joj21 |3 172 |2 12
26. V. 8,60 + 917 |O |0/22 3 in 2 |2
1924 | ¡NN |
IN 4.1x. | 815 | | 10,00 | 1,1 0/31 |51 |56 |4 |3
‚11. TX. gg | 70 |1 joa 14 18818 |1
18. IX. 8,20 | 110,50 | 1,1 0/16 | 6%, [75 |1 |1
| 1924 | | |
II || 1. X. 7,40 | 9210 |olm |3 |s |ı lı
| 8. X. 7,32 7,60 | 1/,| 0| 121| 6 |80 Ma | Ma
115, X. 7,80 1040 |O |0| 7 |4 |85 |11,|2,
|21. X. 7,75 980 |1 |0|101,1|6 |81 |11/,|0
| 1924 N|
II || 3.x. 6,70 | zeo |1 |o|j14,|3 [80 Jı |,
|10. X. 7,36 ( 9,60 | 1/0/10 |3 ‚82 | 2 21),
117, X. 7,90 | | 10,50 |2 | 0 181, | 3 [731612 |1
123, X. 7,80 6,44 | 1, 0| 8 |4 |831/,| ı,[21,
weißen Blutkörperchen an ihrer Gesamtzahl war, wie aus Tabelle III
hervorgeht, am milzlosen Tiere nicht anders als am normalen; nur
bezüglich der eosinophilen ist zu erwähnen, daß am Blute milzloser
Tiere ausnahmsweise 3 bzw. 31, Proz. gezählt wurden, was am normalen
Tiere nicht vorgekommen ist.
Die Ergebnisse meiner Arbeit lassen sich wie folgt zusammen-
fassen:
1. Das Blutbild der weißen Ratte kann an den minimalen
Mengen Blutes studiert werden, die man einer kleinen, an der äußeren.
Fläche des Ohres gesetzten Wunde entnimmt. Die Blutentnahme
kann oft wiederholt werden, ohne daß den Tieren hieraus ein Schaden
erwächst.
2. Die Zahl der roten Blutkörperchen bleibt nach der Entfernung der
Milz 4 bis 5 Wochen lang unter dem ursprünglichen Niveau, um dann
später in eine Polyglobulie überzugehen.
3. Jollykörperchen werden nach Entfernung der Milz einige Wochen
hindurch in großer Anzahl angetroffen, späterhin nimmt ihre Zahl ob,
ohne jedoch, daß sie ganz verschwänden.
160 Z. Aszödi: Blutbild der splenektomierten weißen Ratte.
d Die auch im normalen Rattenblut bestehende Polychromasie
nimmt zur Zeit der Abnahme der roten Blutkörperchenzahl erheblich zu,
wird dann geringer und sinkt zur Zeit des Eintritts der Polyglobulie auch
unter die ursprünglichen Werte.
5. Die Zahl der weißen Blutkörperchen sinkt nach einer kurzen, der
Splenektomie folgenden Steigerung, die sich noch einmal wiederholen
kann, schließlich unter den Normalwert.
6. Eine Verschiebung im prozentualen Vorkommen der verschiedenen
Formen der weißen Blutkörperchen findet nach erfolgter Splenektomie
nicht stait.
Beitrag zur Sauerstoffabsorption durch Pyrogallol.
Von
Etelka von Kovács-Zorkoczy.
(Aus dem physiologisch-chemischen Institut der k. ungar. Universitiit
Budapest.)
(Eingegangen am 7. Juli 1925.)
Die Absorption des Sauerstoffs durch Pyrogallol in Gegenwart
von Alkalien ist eine Reaktion, die in biochemischen Arbeiten vielfach
angewendet wird, ohne jedoch, daß zurzeit alle Einzelheiten der Reaktion
genau bekannt wären, sei es bezüglich der Endprodukte, die bei der
Reaktion entstehen, sei es bezüglich des Zusammenhangs zwischen
der Menge des Pyrogallols und des von ihm absorbierten Sauerstoffs.
In nachstehend geschilderten Versuchen habe ich es mir zunächst
zur Aufgabe gemacht, festzustellen, in welchen molekularen Mengen
sich Pyrogallol und Sauerstoff an der Reaktion beteiligen und will
kurz vorausschicken, was hierüber aus der mir zugänglichen Literatur
bekannt ist.
Berthelot*), der an etwa 311, proz. Pyrogallollösungen experimentierte,
fand, daß durch 1g-Mol. des Pyrogallols 3 Atome Sauerstoff gebunden
werden, wobei jedoch mindestens 1 g-Mol. Kalilauge vorhanden sein muß.
Verwendet man die Lauge in größerer Konzentration, so wird nicht mehr
Sauerstoff gebunden; wird ihre Menge unter 1 g-Mol. verringert, so nimmt
auch die Menge des absorbierten Sauerstoffsab. Hatte Berthelot?) statt Kali-
lauge Natronlauge verwendet, so erhielt er das nämliche Resultat; hingegen
fand er, als er Barytlauge verwendete, daß von 1g-Mol. Pyrogallol in
einem Versuch bloß 1 Atom, in zwei anderen Versuchen 2 Atome Sauerstoff
gebunden werden. Hat Berthelot endlich zu seinen Versuchen Ammoniak
verwendet, so betrug die Zahl der von 1g-Mol. Pyrogallol gebundenen
Sauerstoffatome 4. Die Verbindung, die bei der Sauerstoffabsorption
aus dem Pyrogallol entsteht, ist nach Berthelots Ansicht ein Hydrat des
Purpurogallins.
Führt man nach Harries ?) die Versuche unter Verwendung von Baryt —
statt Kali — oder Natronlauge, urd von Luft statt Sauerstoff aus, so erhält
1) M. Berthelot. C. r. des séances hebd. de l’acad. des sciences 126,
1066, 1898.
2) Derselbe, ebendaselbst 126, 1459, 1898.
3) C. Harries. Ber. d. deutsch. chem. Ges. 85 (3), 2954, 1902.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 11
162 E. v. Koväcz-Zerköczy:
man Hexaoxydiphenyl, (OH). C¿H,—C¿H,(OH). Diese Verbindung
kann man sich nach Harries unter anderem auch so entstanden der:ken,
daß 2 Mol. Pyrogallol, 1 Mol. Bariumhydroxyd und 2 Atome Sauerstoff
außer 2 Mol. Wasser und 1 Mol. Bariumsuperoxyd 1 Mol. Hexaoxydipheny]
liefern; weitere 2Mol. des Pyrogallols aber mit dem Bariumsuperoxyd
außer Bariumhydroxyd ein weiteres Molekül des Hexaoxydiphenvls liefern.
Es werden also durch 4 Mol. des Pyrogallols 2 Atome Sauerstoff, d. h.
durch 1 Mol. des Pyrogallols 1, Atom Sauerstoff gebunden.
Eigene Versuche.
Methodik.
Zur Bestimmung der Menge des durch Pyrogallol absorbierten
Sauerstoffs habe ich mich des Differentialapparats bedient, der von
Barcroft!) zur Verbesserung des ursprünglichen einfachen Apparats
von Haldane angegeben wurde. Er wird in der Regel verwendet, um
die Menge eines Gases (Sauerstoff oder Kohlendioxyd) zu bestimmen, das
aus einer Flüssigkeit (Blut oder Hämoglobinlösung) durch chemische
Reagenzien in Freiheit gesetzt werden kann; doch finden sich bei
Barcroft?) Angaben dafür, daß der Apparat auch zur Bestimmung
einer Gasmenge dienen kann, die von einer Flüssigkeit aus dem über
ihr befindlichen Gasraum absorbiert wird.
Nach der von Barcroft?) abgeleiteten Formel ist an diesem Apparat.
das Volumen des aus der Flüssigkeit entbundenen Gases, in Kubik-
millimeter ausgedrückt, gleich
h ( + 4) y
p
wo
h = Niveaudifferenz in Millimeter zwischen den beiden Nelkenöl-
säulen, die zu Beginn des Versuchs gleich hoch gestanden haben,
deren eine aber, und zwar auf der Seite der Gasentbindung, im
Versuch tiefer sinkt, während die andere höher rückt;
V = in Kubikmillimeter ausgedrückter Fassungsraum der Birne, des
über ihr befindlichen cylindrischen Ansatzstückes und der an-
schließenden Glaskapillare, abzüglich des Volumens der zur Unter-
suchung in die Birne eingegossenen Flüssigkeit und des im axialen
Röhrchen befindlichen Reagens;
p = herrschender Luftdruck in Millimeter Nelkenöl ausgedrückt;
A == Querschnitt der Kapillare in Quadratmillimeter.
1) Joseph Barcroft, Journ. of Physiol. 37, 12, 1908.
2) Derselbe, The respiratory function of the blood, S. 296. Cambridge
1914.
3) Derselbe, Journ. of Physiol. 37, 12, 1908.
wn,
Sauerstoffabsorption durch Pyrogallol. 163
Genau dieselben Verhältnisse walten auch in dem Falle ob, wenn
durch die Flüssigkeit in der Birne Gas aus dem über ihr befindlichen
abgeschlossenen Gasraum absorbiert wird, daher zur Berechnung seiner
Menge obige Formel in derselben Weise anzuwenden ist, mit dem
alleinigen Unterschied, daß am Ende des Versuchs die Nelkenölsäule
auf der Seite der untersuchten Flüssigkeit höher, auf der anderen Seite
tiefer steht.
Die erste und wichtigste Bedingung, um mit diesem Apparat gute
Resultate zu erhalten, ist die genaue Feststellung der konstanten V
und A. Die Apparate waren zum Teil noch dieselben, die in unserem
Institut seinerzeit von Wertheimer?) kalibriert und zu seinen Versuchen
benutzt wurden, und ist die Richtigkeit meiner Kalibrierungen auch
dadurch gewährleistet, daß die neuen Werte mit den alten recht gut
übereinstimmten. So hatte z.B. V den Wert
Nach Nach meinen
FR | Birne Wertheimer | Bestimmungen
= _ EE nn, Yen E
1 links | 28,92 28,98
l rechts 30,40 30,54
3 links 28 98 28.98
3 | rechts | ` 25,02 25,11
Während der Ausführung der zahlreichen Analysen ist später bald
die eine, bald die andere Birne zerbrochen, so daß nicht bis zum Abschluß
aller meiner Versuche mit den oben mitgeteilten Werten gerechnet
werden konnte.
Es wurde stets dem von Barcroft aufgestellten Postulat Genüge
getan, wonach der Fassungsraum der Birne usw. rechts und links genau
der gleiche sein muß, da die oben angegebene Formel nur für diesen
Fall gilt. Auf der Seite, wo sich der Fassungsraum als größer erwies,
wurden zum Ausgleich der Differenz Ebonitstückchen von berechnetem
Volumen in die Birne eingelegt.
Die Bestimmungen habe ich genau nach der bekannten Vorschrift
ausgeführt. In die eine Birne wurden 1, bis 11, ccm der Pyrogallol-
lösung aus einer genau kalibrierten Pipette eingefüllt und das axiale
Röhrchen mit 0,3 bis 0,4 ccm Lauge beschickt. Ich habe stets Sorge
getragen, daß die beiden cylindrischen Ansatzstücke, über deren unteren
Schliff die Birnen geschoben werden, bis zu dem zu oberst befindlichen
kleinen Glasstopfen vom Wasserbad bedeckt seien, das bereits Stunden
vorher die Temperatur des Zimmers angenommen hatte; denn nach
den Erfahrungen unseres Instituts ist es dieser Punkt, an dem, wenn
er nicht beachtet wird, die Analysen am häufigsten scheitern.
1) R. Wertheimer, diese Zeitschr. 106, 1, 1920.
11 *
164 E. v. Kovácz-Zerkóczy :
Ein weiteres Moment, das zu ganz erheblichen Versuchsfehlern
fúhren kann, jedoch nirgend genug betont wird, ist folgendes. Der
Schliff des Ansatzstückes, über den die Birne von unten her geschoben
wird, ist ein recht hoher, und bleibt die Birne, wenn der Schliff ein-
gefettet ist, in mehreren Stellungen, mehr oder minder hoch hinauf-
geschoben, fest stehen. Dementsprechend wird aber auch der Fassungs-
raum V geringer oder größer; und da die Niveaudifferenz zwischen
den beiden Nelkenölsäulen auch, wenn stets genau dieselbe Menge
des Gases in Freiheit gesetzt oder absorbiert wird, wesentlich vom
genannten Fassungsraum abhängt, wird jene Niveaudifferenz eine
verschiedene sein, je nachdem wieweit man die Birne über den Schliff
hinaufgeschoben hat. Es muß also die Birne jedesmal bei den Kali-
brierungen sowohl, wie auch in den eigentlichen Versuchen, so hoch
als nur möglich hinaufgeschoben werden.
Es braucht wohl nicht besonders hervorgehoben zu werden, daß ich
auf genaue Einfettung aller Glasschliffe peinlichst bedacht war;
sowie auch, daß ich den Versuch nicht eher begann, als völliger
Temperaturausgleich zwischen Wasserbad und der Luft in der Birne
eingetreten war.
Der Versuch selbst war höchst einfach und bestand darin, daß,
nachdem auf der einen Seite die Birne mit der Pyrogallollösung und
das Röhrchen mit der Lauge, auf der anderen Seite die Birne mit
destilliertem Wasser und das Röhrchen mit Lauge beschickt war und
Temperaturausgleich stattgefunden hatte, nach Herumdrehen der
Birne um den Schliff die Lauge hinunterfloß, und zwar auf der einen
Seite zur Pyrogallollösung, auf der anderen Seite zum destillierten
Wasser. Nach wiederholtem Schütteln war die Nelkenölsäule auf der
Seite des Pyrogallols bei einem erhöhten, auf der anderen Seite bei
einem tieferen Stande geblieben und würde nun die Niveaudifferenz
abgeben.
Auch die Berechnung des Ergebnisses war eine sehr einfache; sie be-
stand darin, daß ich in der voranstehenden Formel die zwischen beiden
Nelkenölsäulen abgelesene Niveaudifferenz in Millimeter ausgedrückt
für h, den in Nelkenól ausgedrückten Luftdruck für p und auch die
entsprechenden Werte der Konstanten V und A einsetzte. Auf diese
Weise erhielt ich die Menge des absorbierten Sauerstoffs in Kubik-
millimeter beim herrschenden Luftdruck und bei der herrschenden
Temperatur. Dieses Volumen wurde in Normalvolumen umgerechnet,
wobei im Sinne der Ausführungen von Wertheimer!) die Wasserdampf-
tension vom Luftdruck nicht abgezogen wurde. Endlich habe ich die
Normalvolumina in Grammen umgerechnet.
Sauerstoffabsorption durch Pyrogallol. 165
Um womöglich alle’ Zweifel an der Richtigkeit meiner Befunde
auszuschließen, habe ich es zum Prinzip erhoben, die Parallel-
bestimmungen nach Möglichkeit nicht an demselben, sondern an mehreren
Apparaten auszuführen. Des Beispiels halber seien nachstehend einige
an derselben Lösung ausgeführte Parallelbestimmungen angeführt.
|
KREE
Ga \ Ñ ! ua u | ne | 0,436 norm. ccm en
1. | SS | 5,145 0446 , , 9
3. | dE | 4,889 0444 o o, ,
Vorversuche.
Daß die Menge des absorbierten Sauerstoffs mit der Menge des in
der Lösung enthaltenen Pyrogallols in einer gewissen Proportion steht,
war allerdings sicher zu erwarten und ging auch aus den folgenden
Versuchsreihen hervor, in denen die Sauerstoffabsorption an ver-
schiedenen Mengen dreier verschieden konzentrierter Lösungen bestimmt
wurde, und zwar an demselben Apparat, bei nahezu demselben Luft-
druck und derselben Temperatur. In diesen Versuchen betrug die
Niveaudifferenz h in Millimeter bei Verwendung von
—— nn nn nn E A A AA AAA A As - 3 E pS ai
| 0,5 ccm 1,0 ccm 1,5 ccm
50 | 102 154
| 52 | 107 150
2 52 102 —
An Lösung 1 - + - - 50 101 En
48 100 —
A — E 101 e en.
Mittelwerte: + 20,4 102 152
i 46 80 | 120
| 44 82 119
An Lösung 2. .... , 40 . 83 | SE)
| 41 | 82 ==
tee A A En; en
Mittelwerte: | 42,4 i 52 119,5
| 55 102 157
56 103 156
53 106 —
An Lösung 3 +. +. +. + - —- 105 —
106 —
— 110 —
ER ef — 106 | en,
Mittelwerte: | 55 | 105,4 156,5
166 E. v. Koväcz-Zerköczy:
Werden die an 1 ccm erhaltenen Daten gleich 100 gesetzt, so ergeben
sich die Verhältniszahlen :
1. . 49 100 149
2. . 52 100 146
Bo... . 52 100 148
im Mittel: 51 100 145
Es besteht also eine recht genaue Proportionalität.
tionalitätsfaktor konnte aber
a) bei stärker abweichenden Pyrogallolkonzentrationen ein ver-
schiedener sein; außerdem konnte er aber auch
b) von der Konzentration der verwendeten Lauge,
c) von der Art der verwendeten Lauge und von
d) dem Partialdruck des Sauerstoffs im Gasraum oberhalb der
Flüssigkeit abhängen.
a) Bereits die Ergebnisse der an Lösungen 1, 2 und 3 ausgeführten,
sowie auch die nachstehenden orientierenden Versuche lassen über-
zeugend erkennen, daß die Proportionalität innerhalb der von mir
gewählten Grenzen von der Konzentration der Pyrogallollösung un-
abhängig ist. [q E
Der Propor-
1 ccm Pyros h h auf 0,1 proz.
gallollösung Pyrogallollösung
Proz. _ mm Ge bezogen Í
0,085 | 42 491,
0,1120 Io 51
0,225 , 112 491),
b) Innerhalb sehr weiter Grenzen ist die Beziehung zwischen Pyrogallol
und absolutem Sauerstoff auch von der Konzentration der verwendeten Lauge
unabhángig: z
Leem Pyros 0,4 ccm | h | h auf 0,1 proz.
gallollósung Natronlauge | | Pyrogallollósung
._— Proz. ol Proz. 2 mm _ | bezogen
0,175 | 16 86 | 49
0,064 16 311, 49
0,110 4 Däi, 501,
0,059 4 | 30 51
0,190 04 | 97 51
0,220 04 | 108 49
Wurde jedoch die Konzentration der Lauge noch weiter herabgesetzt,
so nahm auch an derselben Pyrogallollösung die Menge des absorbierten
Sauerstoffs rasch ab:
men EE en Cen
lccm Pyros |
0,4 ccm s ß
gallollösung ı Natronlauge i a | Nola `
Pro ` Proz. mm | Proz.. Si _Proz — mm __
0,190 0,4 97 0,110 l 4 55613
0,190 0,2 72 0,110 | 0,4 ö4
0,190 0,1 50 0,110 02 551,
0,190 005 23 0,110 0,1 7
0,190 0.02 | 11 0110 | 0/05 34
| | 0,110 | 0,025 21
Sauerstoffabsorption durch Pyrogallol. 167
Es steht also fest, daß die Laugenkonzentration nicht unter einen
gewissen Minimalwert, der allerdings auch von der Menge des an-
wesenden Pyrogallols abzuhängen scheint, verringert werden darf,
sofern dieselbe Reaktion zustande kommen soll. Größere Konzentra-
tionen haben keinen Einfluß.
ec) Versuche, die ich an Stelle von Natronlauge mit Kalilauge und
mit Barytwasser ausgeführt habe, führten zu denselben zahlenmäßigen
Ergebnissen (in der weiter unten folgenden Zusammenstellung sind
sie mit K, bzw. mit Ba bezeichnet), allerdings mit dem Unterschied,
daß es bei Verwendung von Barytwasser weit länger dauerte, bis sich
die Nelkenölsäulen auf einen konstanten Stand eingestellt haben.
d) Bei der Prüfung des Einflusses des Sauerstoffpartialdrucks
wählte ich als extreme Fälle einerseits Zimmerluft, andererseits reinen
Sauerstoff. Zu letzterem Behuf führte ich in die Birne mit der Pyrogallol-
lösung von der oberen Öffnung des Ansatzstückes aus möglichst tief
eine dünn ausgezogene Halbkapillare ein, verband diese mit einem
Sauerstoffbehälter, ließ Sauerstoff in kräftigem Strome einströmen
und zog dann die Kapillare langsam heraus. Auf diese Weise konnte
der Hohlraum der Birne mit nahezu reinem Sauerstoff gefüllt werden,
wovon ich mich in einigen vorausgeschickten Versuchen mittels eines
glimmenden Holzspans auf die bekannte Weise überzeugt habe.
Es wurden absorbiert von:
Leem einer 0,164proz. Pyrogallollösung aus atmosphärischer Luft
0,357 com Sauerstoff, aus O,-Atmosphäre 0,393 ccm Sauerstoff;
l ccm einer 0,0984proz. Pyrogallollösung aus atmosphärischer Luft
0,229 ccm Sauerstoff, aus O,-Atmosphäre 0,229 ccm Sauerstoff;
Leem einer 0,0859proz. Pyrogallollösung aus atmosphärischer Luft
0,190 ccm Sauerstoff, aus O,-Atmosphäre 0,190 ccm Sauerstoff.
Eigentliche Versuche.
Nachdem es sich auf diese Weise erwiesen hat, daß innerhalb der
von mir gewählten Grenzen die Menge des absorbierten Sauerstoffs dem
vorhandenen Pyrogallol proportional ist und diese Proportionalität
von der Konzentration der Pyrogallollösung, von der Art und Konzentra-
tion der verwendeten Lauge und von dem Partialdruck des Sauerstoffs
unabhängig ist, konnte ich daran gehen, das Verhältnis definitiv fest-
zustellen, in dem der Sauerstoff vom Pyrogallol gebunden wird.
Von den nachfolgend zusammengestellten Versuchen wurde das
Minimum an Pyrogallol, das eben noch verwendet werden durfte,
durch die kleinste Differenz zwischen den beiden Nelkenölsäulen be-
stimmt, die noch ohne wesentlich ins Gewicht fallende Fehler ab-
gelesen werden konnte; das Maximum aber durch die Höhe der
Kapillaren, die etwa 200 mm beträgt. In der großen Mehrzahl dieser
168 E. v. Koväez-Zerköczy: Sauerstoffabsorption durch Pyrogallo!.
Versuche wurde 16proz. Natronlauge, nur in einzelnen Versuchen solche
von geringerer Konzentration, außerdem, wie bereits erwähnt, manch-
mal auch Kalilauge und Barytwasser verwendet.
In der nachstehenden Zusammenstellung habe ich von Versuch
zu Versuch berechnet, wie viel Gramm Sauerstoff von 1 g-Molekül
Pyrogallol absorbiert werden; dabei die Versuche nach ansteigender
Konzentration der Pyrogallollösung, von der jedesmal 1 ccm verwendet
wurden, geordnet.
Nummer | Pyrogallol. Aur Mle Nummer Pyrogallol» | el mol.
we | lösung eer es lösung oe Beten
ersuchs _ Versuchs
f Proz. IP A PS BO A
1
1 0,055 42,9 16 0,158(K) 40,0
2 0,059 41,1 17 0,164 | 411
3 | 0,063 41,1 18 , 0,164(Ba) 40,0
4 : 004 407 19 i 40,6
5 || 0085 40.0 20 0,186 40.3
6 0,098 41,8 21 : 0,19 41.1
7 0,104 42,8 22 0,198 40,4
8&8 0105 ` 408 23 ' 0,203 43,7
9 | 0,110 | 39,5 24 | 0,207 48,0 (2)
10 | 0,113(K)! 394 25 , 0,210 | 39,6
11 | 01% 42,0 26 ` 0215(K) 38,1
12 | 01465 398 27 | 0223 39,9
13 | 0153 © 400 28 | 0,223 41.0
14 | 0156 ` 410 29 0,225 40,1
15 "on , 416 30 | 0228 390
Mittelwert 41.
Aus dieser Zusammenstellung ist ersichtlich, daß im Mittelwert.
von 30 Versuchen, deren jeder in mindestens zwei Parallelen ausgeführt
wurde, von 1 g-Molekül Pyrogallol annähernd genau 21, Atome, daher
von 2 g-Molekülen des Pyrogallols 5 Atome Sauerstoff absorbiert werden.
Diese Arbeit wurde auf Anregung und unter Leitung des Herrn
Prof. Paul Häri ausgeführt.
Bemerkungen zur Mitteilung von E. Salkowski über die
Herstellung eiweißfreier Antitoxinlösungen!).
Von
H. Dold und E. Freudenberg (Marburg).
(Eingegangen am 9. Juli 1925.)
Da das Bestreben der modernen Diphtherieserumtherapie dahin
geht, in möglichst kleinem Serumvolumen eine möglichst große Menge
Antitoxin anzureichern, so ist zweifellos die Herstellung hochwertiger,
gänzlich eiweißfreier Antitoxinlösungen das erstrebenswerte Ziel. Dieses
ist bis jetzt noch nirgends erreicht worden, es ist auch nicht sicher, ob
es überhaupt erreichbar ist. Wäre die Mitteilung von E. Salkowski
richtig, daß es ihm schon im Jahre 1896 gelang, „völlig eiweißfreies
oder in anderen Fällen fast völlig eiweißfreies Antitoxin aus Diphtherie-
heilserum darzustellen‘, so wäre ein großer Schritt vorwärts auf das
oben bezeichnete Ziel hin getan. Da wir uns in gleicher Richtung
bemüht hatten, prüften wir die diesbezüglichen Angaben von E. Sal-
kowski nach.
Dieser Autor bewirkt durch Kochsalzsättigung und Trichloressig-
säurezusatz eine Ausfällung der Serumeiweißkörper, wäscht den Nieder-
schlag mit gesättigter Kochsalzlösung, preßt ihn in Filtrierpapier aus
und zerreibt ihn dann mit Wasser. Nach halbstündigem Stehen wird
diese Aufschwemmung filtriert. Das Filtrat soll eiweißfrei sein und das
Antitoxin zu 20 Proz. der Ausgangsmenge enthalten. Was die Angabe
der Eiweißfreiheit anlangt, so vermißt Salkowski in seinen vor vielen
Jahren angefertigten Protokollen Notizen darüber, wie er sie nach-
gewiesen hatte. Wir selbst kontrollierten nach Salkowski hergestellte
Lösungen sowohl mittels der Fällungsreaktionen (Sulfosalicylsäure,
Natriumsulfatsáttigung, Sublimatsılzsäure, Bleiacetat, Ferrocyan-
kalium, Kochprobe, Hellersche Probe) wie auch mittels der Farben-
reaktionen (Xanthoprotein, Schwefelblei, Molisch) mit durchweg
positivem Erfolg auf Eiweiß. Diese Lösungen sind zwar eiweißarm,
1) Diese Zeitschr. 132, 84, 1922.
170 H. Dold u. E. Freudenberg: Herstellung einweißfreier usw.
aber nicht eiweißfrei. Der prinzipielle Einwand bleibt bestehen, daß
ein eventuell ermittelter Antitoxingehalt auf diese kleinen Eiweiß-
mengen zu bezichen ist.
Was den Nachweis des Antitoxins anlangt, so ist Salkowski damals
einem Irrtum unterlegen, der im Jahre 1896, in dem die Versuche
angestellt wurden, vollkommen entschuldbar war. Damals war die
Wirkung der H-Ionen, die bezüglich des Diphtherietoxins durch
v. Gröer-Kassowitz-Schick später untersucht worden ist, nicht bekannt.
Nach Salkowski hergestellte Lösungen reagieren stark sauer. Der
Autor schlägt eingangs seiner Arbeit zwar vor, die Filtrate mit Soda
zu neutralisieren, aus den Protokollen selbst aber ist ersichtlich, daß
die Filtrate direkt mit der Toxinlösung vermischt wurden. Leider ist
nicht angegeben, wie lange Toxinlösung und Filtrat in Kontakt waren,
ehe sie eingespritzt wurden. Nach unseren Erfahrungen muß aber die
toxinzerstörende Wirkung so hoher Wasserstoffionenkonzentrationen,
wie sie in Salkowskıs Filtraten vorhanden gewesen sein müssen
(pg etwa 3), schon in wenigen Minuten zur Geltung gekommen sein.
Noch bei Sáuregraden von pa 5 und ?*/,,-molarer Salzkonzentration
erhielten wir bei Lactat und Acetat als Puffer in 1 Stunde bei 37°
totale Toxinzerstórung. Die angegebene Zahl deckt sich mit den Er-
mittlungen der oben angeführten Wiener Autoren. Die Grenze ist
recht scharf. Bei pe 5,3 erfolgt die Zerstörung in 1 Stunde bei 370
nur mehr teilweise.
Der Angabe von Salkowsk+, daß es ihm gelungen sei, eiweißfreie
Antitoxinlösungen herzustellen, muß also widersprochen werden.
Der Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien.
VI. Mitteilung:
Über den Einfluß der Wasserstoffionenkonzentration auf das Wachstum der
säurefesten Bakterien in einfachen künstlichen Nährböden.
Von
Seigo Kondo (Kanazawa).
(Aus der bakteriologisch-hygienischen Abteilung des Städtischen
Hygienischen Universitätsinstituts zu Frankfurt a. M.)
(Eingegangen am 9. Juli 1925.)
Die Bedeutung der Wasserstoffionen-Konzentration für das
Wachstum der Tuberkelbazillen in der Glycerinbouillon ist von einer
Reihe von Autoren gewürdigt worden, in letzter Zeit vor allem in den
Arbeiten von Dernby und Näslund!), E. R. Long?) und seinen Mit-
arbeitern und von K.Ishimori?). Der letztere Autor hat auch einige
andere säurefeste Bakterien in dieser Richtung untersucht und gelangt
zu dem Schluß, daß die Reaktionsbreite, innerhalb welcher ein Wachs-
tum säurefester Bazillen in Glycerinbouillon stattfindet, bei den ver-
schiedenen saprophytischen und tierpathogenen Vertretern der säure-
festen Bakterien erhebliche Unterschiede zeigt. Während die rein
saprophytischen Stämme, z.B. der Timotheebazillus und Butter-
bazillus, sowohl bei stark alkalischer als auch bei stark saurer Reaktion
des Nährbodens gut gedeihen, sind die Wachstumsgrenzen der echten
Warmblütertuberkelbazillen nach seinen Erfahrungen wesentlich enger.
Die Kaltblütertuberkelbazillen nehmen nach Ishimori eine Mittelstellung
ein. Er fand z.B. in der Glycerinbouillon für den Timotheebazillus
optimales Wachstum bei pg 7,5 bis 9,1, beim Friedmannschen Schild-
krótentuberkelbazillus bei pg 7,5 bis 7,7, beim Tuberkelbazillus (Typus
humanus) bei py 7,4 bis 8,0, beim Tuberkelbazillus des Typus bovinus
bei py 5,8 bis 6,9. Ishimori hebt auf Grund seiner und anderer Autoren
1) Dernby und Näslund, diese Zeitschr. 182.
2) E. R. Long, Americ. review of tubercul. 8, 1919; 5, 1921.
3) K. Ishimori, Zeitschr. f. Hyg. u. Infektionskrankh. 102, 1924.
172 S. Kondo:
Erfahrungen hervor, daß das Optimum der Wasserstoffionen-
Konzentration für die verschiedenen Stämme der gleichen Art von
säurefesten Saprophyten, von Kaltblütertuberkelbazillen und von
Warmblütertuberkelbazillen ein variables ist.
Bei unseren bisherigen Untersuchungen über den Verwendungs-
stoffwechsel der säurefesten Bakterien, über die in dieser Zeitschrift
(Bd. 145, 146, 155) berichtet worden ist, wurde die neutrale oder schwach
alkalische Reaktion der Nährlösungen gewählt. Es war nun von
Interesse, zu untersuchen, welche Rolle die Wasserstoffionen-Konzen-
tration für das Wachstum dieser Bakterien in den primitiven Nähr-
böden, wie sie beim Studium des Verwendungsstoffwechsels benutzt
werden, spielt.
Von H. Braun und C. E. Cahn-Bronner!) wurde an Paratyphus-
bakterien gezeigt, daß die Empfindlichkeit dieser Mikroorganismen
gegenüber schädigenden Einflüssen chemischer und physikalischer
Natur in den synthetischen Nährlösungen eine viel größere ist als in
den gebräuchlichen bouillonhaltigen Laboratoriumsnährböden: Das
Wachstum der Paratyphusbakterien bleibt unter der Einwirkung
schädigender Einflüsse im Milchsäure-Ammoniaknährboden aus,
während es unter denselben Bedingungen in der Bouillon noch gut
vor sich gehen kann.
Speyer?) hat in einer aus hiesigem Laboratorium hervorgegangenen
Arbeit an Colibazillen gezeigt, daß diese Mikroorganismen in einer
stärker alkalischen Milchsäure-Ammoniaknährlösung nicht gedeihen
können, während sie sich bei derselben Wasserstoffionen-Konzentration
in der Bouillon vermehren. |
Auf Grund dieser Erfahrungen lag die Vermutung nahe, daß für
das Wachstum der säurefesten Mikroorganismen in den künstlichen
Nährböden die Wasserstoffionen-Konzentration noch von weit größerer
Bedeutung sein wird als in der Glycerinbouillon, in der von den meisten
Autoren die Untersuchungen durchgeführt worden sind.
Zu den Versuchen wurden folgende Stämme benutzt:
. der Timotheebazillus,
. Butterbazillus Petri,
Blindschleichentuberkelbazillus,
. Schildkrötentuberkelbazillus (Friedmann),
. Hühnertuberkelbazillus,
. Geflügeltuberkelbazillus,
SO A DD m
1) H. Braun und C. E. Cahn-Bronner, Zeitschr. f. Immunitátsforsch.
33; Centralbl. f. Bakt. 93; „Krankheitsforschung‘‘ 1, H. 3.
2) Speyer, Centralbl. f. Bakt. 98, 1924.
Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien. VI. 173
7. und 8. zwei Stämme des menschlichen Tuberkelbazillus,
(Humanus 1 und Humanus 2).
9. und 10. zwei Stámme des Rindertuberkelbazillus,
(Bovinus 1 und Bovinus 2).
Es sind das dieselben Stämme, die in unseren früheren Veröffent-
lichungen benutzt worden sind, und über die wir in vorherigen Veröffent-
lichungen berichteten!). Es kann hier deshalb auf die Schilderung der
Eigenschaften dieser Stämme verzichtet werden. Wir haben diese
Bakterien bei verschiedenen Wasserstoffionen-Konzentrationen parallel
in drei Nährböden geprüft, und zwar:
a) in 3proz. Glycerinbouillon,
b) im Acetat-Glycerin-Ammoniaknährboden und
c) im Acetat-Ammoniaknährboden.
Die Nährlösungen hatten folgende Zusammensetzung: Acetat-
Ammoniak-Nährlösung: 0,5g NaCl, 0,5g Ammoniumsulfat, 0,005 g
Magnesiumsulfat, 0,2g Kaliumphosphat (1 Teil primäres und 3 Teile
sekundäres Kaliumphosphat), 0,5 g Natriumacetat in 100 ccm doppelt
destillierten Wassers.
Die Acetat-Glycerin-Ammoniak-Nährlösung wurde so bereitet,
daB zum vorhergehenden Nährboden noch 0,5g Glycerin zugesetzt
wurde.
Die verschiedenen Wasserstoffionen-Konzentrationen wurden in
der Weise hergestellt, daß zu den oben genannten Nährlösungen
n/Salzsäure oder n/Natronlauge in verschiedenen Quantitäten zugesetzt
wurde. Py haben wir sofort nach der Herstellung der Lösungen und
nach verschiedenen Zeiten beim Stehen der unbeimpften Nährlösungen
bei Brut- oder Zimmertemperatur bestimmt. Diese Kontrolle, ob eine
Veränderung der Wasserstoffionen-Konzentrationen beim Stehen der
unbeimpfien Nährlösung eintritt, ist wichtig, da stärker alkalische
Nährlösungen ihre Wasserstoffionen-Konzentration allmählich ändern,
wie folgende Tabellen zeigen. Aus diesen geht auch hervor, wie wir die
Nährlösungen verschiedener Wasserstoffionen-Konzentrationen her-
gestellt haben. Die Wasserstoffionen-Konzentration haben wir nach
der Indikatorenmethode von Michaelis bestimmt. (Tabelle I, II und III.)
Wir wollen nun mit der Beschreibung der Versuche beginnen und
zunächst über das Verhalten der säurefesten Saprophyten berichten.
Der T'imotheebazillus wuchs in Glycerinbouillon bei pg 5,0 nicht,
ließ sich dagegen in dieser Nährflüssigkeit bei py 6,0; 6,5; 7,1; 7,4; 7,8
und 8,4 züchten. Er zeigte in der Schnelligkeit und Üppigkeit des
Wachstums bei pg 6,0 bis 7,8 keinerlei Unterschiede. In der Nähr-
lösung von De 8,4 war das Wachstum etwas geringer.
1) Diese Zeitschr. 145, 146, 155.
174 S. Kondo:
Tabelle 1.
| Glycerin» un PH
Nr. Bouillon n, HCI Aqua | nach Her» | nach nach nach nach
PH 7,1 ‚stellung der | 6 Tagen | 20 Tagen | 35 Tagen 50 Tagen
x ET cen | ccm ` en u bei Zimmertemperatur on
ı | 100 22 | 78 © 50 en | o | 50 51
2! 100 ' 15 ` 85 5,5 5,6 56 Së 5,7
Ä o m4 HCL, | |
3 l 100 | ‚l 49 ` 60 | 6,0 60 | 61 6,0
4 100 | 24 | 78 6,3 | 65 | 65 | 66 Ge
51 10 1 — | > 71 7,1 7,1 7,1 7,1
| | n/4 NaOH ` i
6. 10 , 18 : 82 TA COTA Il 73 73 73
7 100 ' 39 6,1 7,8 7,7 7,6 7,6 7,6
i n/NaOH
8 | 100 T 83 , 84 | 81 80 . 79 7,9
Tabelle II
` Glycerin | E
Ne Pr
| Ammoniak» | nHCI | Aqua ` | b h | nech | nach
N nährlösung A 6 Tagen | 20 Tagen |35 Tagen Is Tagen
ee a SR Stellung bei Zimmertemperatur
Ii 100 2.0 8,0 5,0 5,1 5,1 5
n/4 HCI
2 100 42 5,8 55 | 57 5,7 5 5,7
3 100 2,5 7,5 60 62 6,2 6 6,1
4 100 1,0 9, 65 > 65 6,5 6 6,5
5: 10 ; = , — GG 6,9 6 69
n/4 NaOH ı i
6 | 100 15 | 85 q4 as. | Ti 7 7.1
7 100 35 | 65 78 `° 76 7,3 7 7,1
n/NaOH l
8. 100 1,5 ' 85 | 84 | 7,8 7,4 73 ¡| 72
Tabelle 111.
| Acetat- | Pu
| ee n;HCl Aqua ' nach nach nach nach
dis eg PaT | en 6 Tagen | 20 Tagen 35 Tagen | 50 Tagen
| Sos an SER stellung bei Zimmertemperatur
ge zen E el zn, m A = ee Zu er re u "ech Den
1 100 2,0 | 8.0 50 , 50 5,1 50 —
| n’4 HCI | | |
2 10 Aë (58 A 57 | 58 | 59 | a
3. 100 25 | 75 60 | 62 6,2 6,3 6,1
4 100 10 į 90 65 ¡ 65 6,6 67:65
d 100 = 5 A 71 | 69 | 69 ' 68
4 NaOH |
6: 100 EK? 85 | 74 7,3 7,1 7,1 7,0
7 100 3,5 65 "8 7,6 7,4 7,1 7,1
n NaOH
8, 100 1,5 8,5 8,4 79 | 75 7,2 7,1
Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien. VI. 175
In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknáhrlósung von pg 5,0 wuchs
der Timotheebazillus nicht. Bei py 6,0 trat Wachstum nach längerer
Bebrütung ein, crreichte aber erst nach etwa 1 Monat sein Maximum.
Auch bei py 6,5 wuchs der Timotheebazillus langsam an und erreichte
erst nach mehrwöchiger Bebrütung sein Wachstumsmaximum. Da-
gegen war in dieser Nährlösung bei py 7,1; 7,4; 7,8und 8,4 das Wachstum
schon nach einigen Tagen ein sehr üppiges.
In der Acetat-Ammoniaknährlösung von py 5,0 wuchs der Timothee-
bazillus nicht. Bei py 6,0 gedieh er kümmerlich, und erst nach mehr-
wöchiger Bebrütung erreichte sein Wachstum das Maximum. Auch
bei pg 6,5 und 7,1 war eine Verzögerung des Wachstums feststellbar.
Bei pg 7,4 und 7,8 trat bereits nach einigen Tagen gutes Wachstum
ein. Bei py 8,4 ließ sich wiederum eine Verzögerung im Auftreten des
Wachstums und auch in seiner Üppigkeit feststellen.
Überblicken wir diese Ergebnisse, so zeigt sich, daß das Wachstum
des Timotheebazillus in der Glycerinbouillon durch verschiedene Wasser-
stoffionen- Konzentrationen weniger beeinflußt wird als in der Glycerin-
Acetat-Ammoniaknährlösung, und daß sich der schädigende Einfluß von
Säure und Alkali besonders in dem einfachsten Nährboden, nämlich in
der Acetat-Ammoniaknährlösung, bemerkbar macht.
Was das Verhalten des Butterbazillus Petri betrifft, so war es
folgendes: Iv Glycerinbouillon wuchs dieser Mikroorganismus bei
Pu 5,0; 5,5 und 6,0 mit einer Verzögerung, erreichte nach etwa 1 Woche
das Maximum seines Wachstums. Bei py 6,5; 7,1; 7,4; 7,8; 8,4 gedieh
er sehr üppig und das Wachstum trat ohne Verzögerung ein. In der
Glycerin-Acetat-Ammoniaknährlösung wuchs dieser Mikroorganismus
bei Py 5,0 nicht. Bei py 5,5 trat erst nach langer Bebrütung (24 Tage)
Wachstum ein. Bei pg 6,0 wuchs er mit einer Verzögerung, zeigte aber
nach etwa 1 Woche gutes Wachstum. Am besten gedieh er bei pg 6,5;
7,1; 7,4; 7,8 und 8,4. In der Acetat-Ammoniaknährlösung gedieh der
Butterbazillus bei py 5,0 nicht. Bei pg 5,5 trat erst nach einmonatiger
Bebrütung Wachstum ein. Auch bei pg 6,0 war eine Verzögerung
feststellbar. Erst nach 9 Tagen war gutes Wachstum wahrnehmbar,
während bei py 6,5; 7,1; 7,4; 7,8 und 8,4 schon nach 3 Tagen gutes
Wachstum festgestellt werden konnte.
Die Versuche zeigen, daß auch das Wachstum des Butterbazillus
durch verschiedene Wasserstoffionen-Konzentrationen in der Glycerin-
bouillon weniger als in den einfachen künstlichen Nährflüssigkeiten be-
einflußt wird.
Wir wollen jetzt zum Verhalten der Kaltblütertuberkelbazillen über-
gehen, und zwar zunächst das des Friedmannschen Schildkrötentuberkel-
bazillus beschreiben.
176 S. Kondo:
Der Friedmann-Bazillus wuchs bei 22° in der Glycerinbouillon bei
Pg 5,0 und 5,5 nicht. Bei pg 6,0 trat Wachstum nach einer Verzögerung
ein. In der Glycerinbnuillon von pg 6,5: 7,1; 7,4; 7,8 trat das Wachstum
bereits nach einigen Tagen ein und erreichte in etwa 1 Woche sein
Maximum. Bei py 8,4 wurde eine Verzögerung des Wachstums fest-
gestellt. Das gebildete Háutchen war auch viel zarter als das bei pg 6.5
bis 7,8. In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknährlösung und in der
Acetat-Ammoniaknährlösung wuchs der Friedmann-Bazillus bei pg 5.0:
5,5 und 6,0 nicht. Bei pg 6,5 konnte nach einer Verzögerung von
mehreren Tagen Wachstum festgestellt werden. Bei pg 7,1; 7.4 und 7,8
wuchs er in beiden Nährlösungen gut. Bei pg 8,4 trat zwar Wachstum
ein, das gebildete Häutchen war aber sehr zart.
Der Blindschleichentuberkelbazillus verhielt sich folgendermaßen:
In der Glycerinbouillon trat bei pg 5,0 und 5,5 nach etwa fünf-
wöchiger Bebrütung bei 22° Wachstum ein, das bei weiterer Bebrütung
an Ausdehnung zunahm. Bei pe 6,0 trat das Wachstum zögernd ein,
war aber nach etwa l4tágiger Bebrütung ein recht gutes. Bei pa 6.5;
7,1; 7,4; 7,8; 8,4 wuchs der Blindschleichentuberkelbazillus in der
Glycerinbouillon gut, und Unterschiede in der Wachstumsintensität
waren nicht feststellbar.
In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknährlösung und in der Acetat-
Ammoniaknährlösung wuchs der Blindschleichentuberkelbazillus bei
De 5,0 und 5,5 nicht. Bei py 6,0 trat erst nach fünfwöchiger Be-
brütung Wachstum ein, das im Laufe der Zeit weitere Fortschritte
gemacht hatte. Auch bei pg 6,5 war noch eine Verzögerung im Wachs-
tum feststellbar. Dagegen wuchs der Blindschleichentuberkelbazillus
in der Nährlösung bei pe 7.1; 7,4; 7,8 gut; bei py 8,4 war eine geringe
Verzögerung gegenüber den vorhergehenden Wasserstoffionen-Konzen-
trationen nachweisbar.
Überblicken wir diese Ergebnisse der Versuche mit Kaltblüter-
tuberkelbazillen, so zeigen sie uns, daß, wie bei dem Timotheebazillus,
in der Glycerinbouillon höhere Säuregrade vertragen werden als in den
einfachen künstlichen Nährböden.
Wir gehen nun zur Beschreibung des Verhaltens der Warmblüter-
tuberkelbazillen über und beginnen zunächst mit dem Typus gallinaceus.
Es wurden zwei Stämme untersucht, die wir als , Hihnertuberkel-
bazillus*'* und ,,Gefligeltuberkelbazillus'* bezeichnen.
Der Hühnertuberkelbazillus wuchs in Glycerinbouillon bei pg 5,0;
5,5 nicht. Bei py 6,0 und 6,5 gedieh er nach einer geringen Verzögerung.
Es dauerte 6 Wochen, bevor er zu wachsen anfing. Bei pg 6,5 und 7,1
war nach fünfwöchiger Bebrütung deutliches Wachstum feststellbar,
das in den nächsten Wochen an Intensität zunahm. Bei py 7,4 begann
der Hühnertuberkelbazillus nach vierwöchiger Bebrütung zu wachsen.
Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien. VI. 177
Am günstigsten erwies sich bei diesem Stamme eine Glycerinbouillon von
Pu 7,8. In solcher Nährflüssigkeit begann das Wachstum bereits nach
17 Tagen und erreichte nach etwa dreiwöchiger Bebrütung das Maximum.
In Glycerinbouillon von pp 8,4 gedieh der Hühnertuberkelbazillus
gut; es machte sich aber bereits eine geringe Verzögerung im Beginn
des Wachstums bemerkbar.
In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknährlösung wuchs der Hühner-
tuberkelbazillus bei pg 5,0 und 5,5 nicht. In derselben Nährlösung von
Py 6,0; 6,5; 7,1; 7,4; 7,8 und 8,4 begann das Wachstum erst nach vier-
bis fünfwöchiger Bebrütung. Ein deutlicher Unterschied in der Wachs-
tumsschnelligkeit wurde in den verschiedenen Nährlösungen nicht
festgestellt. In der Acetat-Ammoniaknährlösung zeigte der Hühner-
tuberkelbazillus das gleiche Verhalten wie in der vorerwähnten Nähr-
flüssigkeit.
Der Gefliigeltuberkelbazillus verhielt sich folgendermaßen: In
der Glycerinbouillon von py 5,0 wuchs er nicht. Bei pg 5,5 trat nach
sechswöchiger Bebrütung Wachstum ein und erreichte nach etwa zwei-
monatiger Dauer sein Maximum. Bei pg 6,0 trat Wachstum nach etwa
4 Wochen ein. Bei py 6,5 und 7,1 ließ sich Wachstum bereits nach
dreiwöchiger Bebrütung feststellen. Am günstigsten erwiesen sich
die Wasserstoffionen-Konzentrationen py 7,4; 7,8 und 8,4. Hier war
bereits nach etwa l4tágiger Bebrütung maximales Wachstum nach-
weisbar.
In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknáhrlósung war bei pe 5,0
und 5,5 kein Wachstum eingetreten. Bei py 6,0; 6,5; 7,1; 7,4 und 7,8
trat Wachstum nach etwa l4tägiger Bebrütung ein und erreichte
nach etwa 6 Wochen sein Maximum. Bei py 8,4 war nach fünfwöchiger
Bebrütung Wachstum eingetreten, das in den nächsten Wochen an
Intensität zunahm.
In der Acetat-Ammoniaknährlösung wuchs der Geflügeltuberkel-
bazillus bei pg 5,0 und 5,5 nicht. Bei py 6,0; 6,5; 7,1; 7,4: 7,8 und 8,4
war nach etwa vierwóchiger Bebrütung Wachstum eingetreten, das im
weiteren Verlauf des Versuchs an Intensität zugenommen hatte.
Überblicken wir die Ergebnisse bei diesen beiden Stämmen vom
Typus gallinaceus, so zeigt sich, daß sie sich nicht ganz gleich verhalten.
In den Versuchen mit dem Geflügeltuberkelbazillenstamm zeigte sich,
daß derselbe bei saurer Reaktion in Glycerinbouillon besser zu gedeihen
vermag als in den künstlichen Nährböden. Der Stamm ‚Hühner-
tuberkelbazillus‘‘ läßt diese Differenz vermissen. Weiterhin zeigte sich,
daß beide Stämme in den künstlichen Nährböden bei py 6,5 bis 8,4
zu gedeihen vermögen.
Was die menschlichen Tuberkelbazillen betrifft, so wurden zwei
Stämme untersucht. Der Stamm Humanus 1 verhielt sich folgender-
Biochemische Zeitschrift Band 162. 12
178 S. Kondo:
maßen: In der Glycerinbouillon von pg 5,0; 5,5 und 6,0 wuchs er nicht.
Bei Py 6.5 trat nicht in allen beimpften Kölbehen Wachstum ein; wenn
es eintrat, so erst nach etwa dreiwöchiger Bebrütung. Bei pg 7,1; 7,4
und 7,8 waren Unterschiede im Wachstum nicht feststellbar, jedenfalls
nicht in der Größe der gewachsenen Häutchen. Nach etwa l4tägiger
Bebrütung konnte bereits Wachstum festgestellt werden, das im Laufe
der nächsten 14 Tage sein Maximum erreichte. Bei pg 8,4 trat nicht
in allen beimpften Kölbehen Wachstum ein; wenn es eintrat, so mit
einer Verzögerung.
In der Glycerin-Acctat-Ammoniaknährlösung wuchs dieser Stamm
bei Pg 5,0 und 6,0 nicht. Bei pe 6,5; 7,0; 7,4 und 7,8 trat nach drei-
wöchiger Bebrütung Wachstum ein, das etwa nach 1 Monat sein
Maximum erreichte. Bei pg 8,4 wuchs er nicht,
In der Acetat-Amimoniaknährlösung verhielt sich der Stamm
genau so wie in der vorerwähnten Lösung.
Der zweite Stamm des Typus humanus zeigte folgendes Verhalten:
In Glycerinbouillon wuchs er bei pg 5,0 nicht. Bei pg 5,5 trat nach
einer etwa dreiwóchigen Bebrútung Wachstum ein, das im Laufe des
Versuchs an Intensität zugenommen hatte. Bei pg 6,0 wuchs er mit
einer geringen Verzögerung, doch im Laufe des Versuchs sehr gut. Bei
Pg 6,5; 7,1; 7,4 und 7,8 war das Wachstum ein sehr gutes und Unter-
schiede zwischen diesen einzelnen Wasserstoffionen-Konzentrationen
waren nicht feststellbar. Auch bei pg 8,4 war das Wachstum ein sehr
gutes, es trat nur mit einer geringen Verzögerung gegenüber den vorher-
gehenden ein.
In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknäbhrlösung von pg 5,0 und 5,5
wuchs dieser Stamm nicht. Bei py 6,0 trat Wachstum, wenn auch
nicht in allen beimpften Kólbchen, nach etwa 1 Monat ein. Bei pg 6.5:
7,1; 7,4 war das Wachstum ein gutes und begann bereits nach etwa
10tägiger Bebrütung. Bei py 7,8 und 8.4 trat bereits eine geringe Ver-
zögerung im Wachstum ein, und das Maximum wurde etwas später
erreicht.
In der Acetat-Ammoniaknährlösung verhielt sich dieser Stamm
ebenso wie in der vorhergehenden Lösung.
Von Rindertuberkelbazillen haben wir zwei Stämme untersucht,
die als Bovinus 1 und als Bovinus 2 bezeichnet sind. Stamm Bovinus 1
wuchs in der Glycerinbouillon bei pg 5,0 und 5,5 nicht, bei pg 6.0 trat
Wachstum mit einer geringen Verzögerung ein. Bei pe 6,5 und 7,1
trat bereits nach 17tägiger Bebrütung Wachstum ein und erreichte
nach vierwöchiger Bebrütung sein Maximum. Besonders gut gedieh
der Stamm in Glycerinbouillon bei py 7,4 und 7,8. Bei pg 8.4 machte
sich eine geringe Verzögerung im Wachstum bemerkbar. In der Glycerin-
Acetat-Ammoniaknährlösung wuchs dieser Stamm bei py 5,0; 5,5; 6,0
Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien. VI. 179
nicht. Bei pa 6,5; 7,1; 7,4 und 7,8 trat nach fünfwöchiger Bebrütung
Wachstum ein und erreichte etwa nach 8 Wochen sein Maximum. Bei
Py 8,4 trat kein Wachstum ein. In der Acetat-Ammoniaknährlösung
verhielt sich dieser Stamm genau so wie in der Glycerin-Acetat-
Ammoniaknáhrlósung. `
Der zweite Stamm von Rindertuberkelbazillen (Bovinus 2) wuchs
in der Glycerinbouillon bei pg 5,0; 5,5 und 6,0 nicht. Bei pg 6,5; 7,1;
7,4; 7,8 und 8,4 trat nach dreiwóchiger Bebrütung Wachstum ein und
nahm im Laufe der Zeit an Intensitát zu.
In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknährlösung und in der Acetat-
Ammoniaknáhrlósung verhielt sich dieser Stamm wie in der Glycerin-
bouillon. Bei py 5,0; 5,5 und 6,0 trat Wachstum nicht ein, bei pg 6,5;
7,1; 7,4 und 7,8 vermehrte sich dieser Bazillus gut. Auch bei py 8,4
war Wachstum feststellbar, aber in beiden Náhrlósungen nach einer
Verzógerung.
Zum Schluß wollen wir kurz die Erfahrungen, die wir bei Züchtung von
Colibazillen und Paratyphus-B-Bazillen bei verschiedenen Wasserstoff-
ionen-Konzentrationen in den hier untersuchten Nährlösungen ge-
sammelt haben, mitteilen. In Glycerinbouillon wuchs der Colibazillus
bei pg 5,0 bis 8,4 gut. In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknáhrlósung
wuchs er bei py 5,0 nicht, bei pe 6,0 und 6,5 war das Wachstum ein
weniger üppiges als bei pg 7,1; 7,4; 7,8 und 8,4. In der Acetat-
Ammoniaknährlösung wuchs dieser Colibazillus bei pg 5,0 nicht.
Bei pg 6,0; 6,5 und 7,1 trat mäßiges, bei pg 7,4; 7,8 und 8,4 gutes
Wachstum ein.
Der Paratyphus-B-Bazillus wuchs in Glycerinbouillon bei pg 5,0
bis 8,4 sehr üppig. In der Glycerin-Acetat-Ammoniaknährlösung
gedieh er bei pe 5,0; 5,5; und 6,0 nicht, ließ sich aber bei py 6,5 bis 8,4
sehr gut züchten. In der Acetat-Ammoniaknährlösung war bei py 5,0;
5,5 und 6,0 kein Wachstum feststellbar. Bei pg 6,5 trat Wachstum
nach einer Verzögerung ein. Bei pa 7,1; 7,4; 7,8 und 8,4 wuchs der
Paratyphus-B-Bazillus in dieser Nährlösung gut.
Es ergibt sich also, daß der Colibazillus und der Paratyphus-B-
Bazillus saure Reaktion in der Glycerinbouillon leichter überwinden
als in den synthetischen künstlichen Nährböden.
Uberblicken wir die Ergebnisse der angestellten Versuche mit
säurefesten Bakterien, so ergibt sich folgendes:
Die saprophytischen säurefesten Bakterien, die Kaltblüter- und
Warmblütertuberkelbazillen zeigen in bezug aüf das zum Wachstum
nötige Optimum der Wasserstoffionen-Konzentration in synthetischen
Nährböden kein für die einzelnen Arten charakteristisches Verhalten.
Die neutrale oder um den Neutralpunkt nach der sauren oder alkalischen
180 S. Kondo: Verwendungsstoffwechsel säurefester Bakterien. VI.
Seite liegende Wasserstoffionen-Konzentration ist für das Wachstum
der säurefesten Mikroorganismen meist günstig.
Je besser die Ernährungsbedingungen sind, desto leichter wird
eine ungünstige Wasserstoffionen-Konzentration überwunden. In
stärker saurer Glycerinbouillon wachsen im allgemeinen die säure-
festen Bakterien besser als in den synthetischen Nährböden derselben
Reaktion. Doch gibt es von dieser Regel insofern Ausnahmen, als
bei einzelnen Stämmen zwischen Glycerinbouillon und künstlichen
Nährböden kein wesentlicher Unterschied feststellbar ist.
men
MCAL LGCä:cn
Biochemische Zeitschrift: 2 196.
Unter Mitwirkung ven dan Francisco, 2.
M. Ascoll-Catanis, L. Asher-Bern, A. Bach-Moskau, M. Bergmana-Dreeden, @. Bortrand-
Paris, A. Bickel- Berlin, F. Blumonthal-Berlín, Fr. Boas- Weihenstephan, A. Bonanni-Rom,
Y. Bottazzi- Neapel, €. Brediy- Karlsruhe i. B., WI. Butkewitsch - Moskau, M. Cremer-
Berlin, B. Doorr-Basel, A. Durig- Wien, F. Ehrlich- Breslau, H.v. Euler-Stockholm, 8. Flexner-
New York, J. Forssman-Lund, $, Fränkel-Wien, E. Freund-Wien, H. Freundlich- Berlin,
E. Friedberger - Greifswald, E. Friedmann - Berlin, E. Fromm - Wien, 0. Fürth - Wien,
F. Haber - Berlin, M. Habn- Berlin, P. Härl- Budapest, F. Hayduek - Berlin, E. Hägg-
tand- Abo, V. Henri- Paris, V. Henriques- Kopenhagen, R. 0. Herzog - Berlin, K., Hess-
Berlin, W. Heubner - Göttingen, BR. Hóber- Kiel, M. Jacoby - Berlin, P. Karrer- Zürich,
N. Kochmann - Halle a. S., R. Krimberg- Biga, F. Landolf - Buenos Aires, L. Langstola-
Berlin, E. Laqueur - Amsterdam, 0. Lemmermann - Berlin, E. J. Lesser- Mannheim,
P. A. Lovene-Now York, L. v. Liebermann - Budapest, 8. Loewe - Dorpat, A. Loewy - Davos,
H. Lüers - München, Th. Madsen - Kopenhagen, A. Magnus - Levy-Berlin, J. A. Mandel-
New York, E. Mangold - Berlin, L. Marchlewski- Krakau, P. Mayer - Karlebad, J. Meisen-
heimer-Tübingen, 0. Meyerhof- Berlin, L. Michaclis- Nagoya, H. Molisch - Wien, H. Murseh-
hauser - Düsseldorf, W. Nernst - Berlin, C. v. Noorden - Frankfurt a. M., W. Omelianski-
Leningrad, W. Ostwald - Leipzig, A. Palladin - Charkow, J. K. Parnas - Lemberg, Th. Paul-
München, W. Pauli-Wien, R. Pfeiffer- Breslau, E. P. Piek-Wien, L. Pincussen - Berlin,
d. Pohl-Breslau, Ch. Poreher-Lyon, D. N. Prianisehnikow-Moskau, H. Pringsheim-Berlin,
P. Rona-Berlin, H. Sachs-Heidelberg, S. Salaskin-Leningrad, T.Sasaki-Tokio, B. Sbarsky-
Moskau, A. Scheunert - Leipzig, A. Schlossmann - Düsseldorf, E. Schmitz - Breslau,
8.P. L. Sórensen - Kopenhagen, K. Spiro - Basel, E. H. Starling - London, J. Stoklasa - Prag,
W. Straub - München, K. Suto-Kanasawa, U. Suzuki- Tokio, H.v. Tappeiner - München,
K. Thomas - Leipzig,” H. Thoms- Berlin, C. Tigerstedt - Holsingfors, P. Trendelenburg -
Freiburg L Br, 0. Warburg-Berlin, G. v. Wendt- Helsingiors, E. Widmark - Lund,
W. Wichowski - Prag, A. Wohl - Danzig, J. Wohigemuth - Berlin, N. Zelinsky - Moskau.
herausgegeben von
C. Neuberg-Berlin
i
Ai
Hundertzweiundsechzigster Band
Drittes bis sechstes Heft
Abgeschlossen am 2. Oktober 1925
Berlin
Verlag von Julius Springer
1925
Biochemische Zeitschrift. Bd. 162, Heit 3/6,
EE um = E ee © = E Ñ et Keng e Zë, EE
Biochemische Zeitschrift
erscheint in zwanglosen Heften, die in kurzer Folge zur Aus:
gabe gelangen; je sechs Hefte bilden einen Band. Der Preis
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Richtigstellung enthalten und höchstens zwei Druckseiten einnehmen.
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benötigten Exemplare zu bestellen. Über die Freiexemplare hinaus bestellte
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Verlagsbuchhandlung Julius Springer
Berlin W 9, Linkstraße 23/24.
162. Band. Inhaltsverzeichnis. Heft 3/6.
Bloch, Br. und F. Schaaf. Pigmentstudien. i :
Jendrassik, L. und E. Annau. Beiträge zu einer Pharmakologie der
Konzentrationsänderungen. III. Mitteilung: Weitere Versuche
über Kationenwirkungen . . TERR
Syniewski, Viktor. Untersuchungen über Diastase. II. Mitteilung:
Wirkt a-Diastase auch f-diastatisch, und umgekehrt #-Diastase
auch a-diastatisch ? .
— — Untersuchungen über Diastase. Ta. Mitteilung: Uber die Ge-
schwindigkeit der unter at von a-Diastase verlaufenden
Stárkehydrolyse . . . e
Fujita, Akiji. Untersuchungen über "elektrische Erscheinungen und
Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. Mitteilung: Die Eigen-
schaften der Membranen von amphoterem Charakter S
Michaelis, L. und Sh. Dokan. Untersuchungen über elektrische Er-
scheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. VI. Mit-
teilung: Membranen aus Paraffin, Wachs, Mastix, Kautschuk
Smorodinzew, J. A. und €. S. Lemberg. Über den Einfluß verschiedener
Präparate der Chiningruppe auf die fermentativen Funktionen des
Organismus. IV. eech bard den Einfluß der Chininsalze auf
das Magenpepsin . .
3/6
Seite
. 181
. . 207.
258
. 266
Fortsetzung des Inhaltsverzelchnisses siehe 3. PEN
~
Pigmentstudien.
Von
Br. Bloch und F. Schaaf.
(Aus der dermatologischen Klinik der Universität Zürich.)
(Eingegangen am 3. Juli 1925.)
Mit 2 Abbildungen im Text.
Einleitung.
Die folgenden Untersuchungen beschäftigen sich mit dem als
Melanin bezeichneten braunen bis braunschwarzen organischen Farb-
stoff, der im Stoffwechsel der meisten Tiere in bestimmten in dieser
Richtung differenzierten Zellen gebildet wird und durch gewisse
morphologische (granuläre, stäbchen-, kristallähnliche), physiologische
und chemische (Bleichung durch H,O,, Reduktion von Silbernitrat usw.)
Eigenschaften charakterisiert ist. Dieser Farbstoff wird von sehr ver-
schiedenen Organen gebildet, vor allem von der Haut und dem Auge.
Bildungsstätte da Pigments ist das Protoplasma der pigmentbildenden
Zelle. Wir bezeichnen solche Zellen als Melanoblasten im Gegensatz zu den
Melanophoren, d. h. den Pigmentzellen, welche das in ihnen enthaltene
Pigment nicht selber produzieren, sondern durch Phagocytose auf-
nehmen. Die Melanoblasten sind entweder ektodermaler oder meso-
dermaler Abkunft. Ektodermale Melanoblusten sind die Basalzellen der
Deckepidermis und die von ihnen sich ableitenden Haarmatrixzellen,
sowie die Pigmentzellen des retinalen Blattes. Mesodermale Melano-
blasten sind die Pigmentzellen der Chorioidea und der Iris, des Mongolen-
flecks, des blauen Naevus, sowie die tiefen kutanen Pigmentzellsysteme
mancher Tierarten (graue Maus, Affen, Seidenhuhn, Kaltblüter). Die
im Chorion des Menschen schon normalerweise, besonders aber bei
Pigmentalterationen häufig sich vorfindenden Pigmentzellen (,,Chro-
matophoren” bzw. Melanophoren), sind keine Melanoblasten, sondern
pigmentphagocytierende Bindegewebszellen (vgl. Miescher).
Wie durch die Untersuchungen von Bloch und seinen Schülern
gezeigt worden ist, besitzen alle erwähnten Melanoblasten die Fähigkeit,
3, 4-Dioxyphenylalanin innerhalb ihres Protoplasmas in einen dunklen,
Biochemische Zeitschrift Band 162. 13
182 Br. Bloch u. F. Schaaf:
unlöslichen Farbstoff (Dopamelanin) umzuwandeln und dadurch inner-
halb des sonst farblosen Schnittes als dunkle, oft mit den feinsten
Ausläufern versehene (,, Dendritenzellen**) Zellkomplexe hervorzutreten
(Dopareaktion). Auch in Extrakten pigmentierter Haut (neugeborene
Kaninchen) läßt sich diese Dopareaktion (D.-R.) nachweisen.
Die DR ist streng substrat-spezifssch, sie fällt negativ aus (d. h. die
von Bloch beschriebenen Bilder in Gefrierschnitten werden nicht mehr
erhalten), wenn das Molekül des Dioxyphenylalanins im geringsten
verändert wird. So ist sie negativ mit Adrenalin, Tyrosin, p-Oxypheny]l-
brenztraubensäure, Homogentisinsäure, Paraoxyphenyläthylamin,
Brenzkatechin, Pyrogallol usw. Sie ist ferner negativ mit folgenden
vier von uns zum ersten Male hergestellten Substanzen!) :
1. das 2, 5-Dioxyphenylalanin:
" Op
ud
CH,.CH(NH,).COOH
2. das 2, 3, 4-Trioxyphenylalanin:
CH,.CH(NH,).COOH
3. das 3, 4, 5-Trioxyphenylalanin:
OH
O EZ H
NY
CH,.CH(NH,). COOH
4. das Glycyl-1-3, 4-Dioxyphenylalanin :
OH
“NOH
NH.CO.CH,.NH,
E, Än Coop
Die D.-R. wird verursacht durch ein intrazelluläres oxydierendes
Ferment, die Dopaoxydase. Das Ferment wird durch Erhitzen (von
Schnitten oder des Extrakts) zerstört und ist auch gegen zahlreiche
1) Darstellung von 1. nach C. Funk, Journ. Chem. Soc. London 99,
554, 1911; 2. und 3. nach Fr. Schaaf und A. Labouchére, Helv. chim. acta
7, 357, 1924; 4. analog der Glyeyltyrosinsynthese von E. Fischer, B. 87,
2486, 1904.
Pigmentstudien.. 183
andere Eingriffe (Austrocknen, Einbetten der Schnitte, Zusatz von
H,S und anderen Fermentgiften usw.) sehr empfindlich; dagegen wird
es (im Gegensatz zu früheren Angaben von Bloch) durch Zusatz von
Y/. Mol KCN höchstens abgeschwächt, aber nicht zerstört, insofern
bei der Reaktion (was in den ersten Untersuchungen unterlassen wurde)
die richtige [H ] innegehalten wird. Die optimale H-Ionenkonzentration
bei Ausführung der D.-R. beträgt nach unseren Untersuchungen
Pa = 7,3 bis 7,4.
Zwischen dem zeitlichen und örtlichen Auftreten sowie der Intensität
der natürlichen Psgmentbildung einerseits und der positiven D.-R. anderer-
seits besteht, wie in zahlreichen Einzeluntersuchungen (Bloch, Miescher,
Barahwy, Steiner, Sato, Walthard usw.) gezeigt worden ist, ein strenger
Parallelismus, und zwar sowohl unter physiologischen als unter patho-
logischen Verhältnissen. So ist die D.-R. positiv in den pigment-
bildenden Schichten des Auges während der ersten Embryonalperiode
(während der hier allein Pigment neu erzeugt wird), in den kutanen
Melanoblasten des Mongolenflecks (Bahrawy), der Affen, der grauen
Maus (hier in wellenfórmigem rhytmischem Verlauf, analog der wellen-
förmigen natürlichen Pigmentbildung), in den Pigmentzellen der
Epidermis und der Haarmatrix, des Pigmentnaevus, der melanotischen
Tumoren usw. Bei allen Hyperpigmentationen (Entzündungen, Licht,
Röntgenstrahlen, Radium usw.) ist die Reaktion gesteigert, oft exzessiv,
und da, wo die Pigmentbildung von Haus aus fehlt (Albinismus, weiße
Haare gescheckter Tiere) oder sekundär degeneriert (Canities, Vitiligo,
depigmentierte Narben) ist die Reaktion stets negativ. Daraus geht
hervor, daß zwischen der positiven D.-R. und dem Vermögen, Pigment
zu bilden, ein innerer Zusammenhang bestehen muß, der sich in dem
Satze ausdrücken läßt: Die spezifische D.-R. bildet enen sicheren
Indikator für das Vermögen der Pigmentbildung. Sie beruht auf der An-
wesenheit und Wirkung des natürlichen pigmentbildenden Ferments, der
Dopaozxydase.
Über die Herkunft und Beschaffenheit des natürlichen Melanins
sowie seiner Vorstufen (Melanogen) gibt uns die positive D.-R. streng
genommen keinen Aufschluß; sie läßt bloß (unter anderem wegen der
Spezifität) bis zu einem gewissen Grade die Annahme, daß Brenz-
katechinderivate an dem Aufbau der natürlichen Melanine beteiligt
sind — als Arbeitshypothese —, als plausibel erscheinen; eine Hypo-
these, die auch durch anderweitige Befunde von Brahn (Nachweis von
o-Dioxygruppen im Melanin) und T'hannhauser (Nachweis der Homo-
protocatechusäure im melanotischen Urin) bis zu einem gewissen Grade
gestützt wird.
Alle Theorien über Konstitution und Zusammensetzung der natúr-
lichen Melanine und seiner Vorstufen sind heute noch als bloße Spekula-
13*
184 Br. Bloch u. F. Schaaf:
tionen zu betrachten. So beweist z. B. die Tatsache, daß Melanin die
Pyrrolreaktion gibt (Angeli, Galleran:, Succardi, Rondone, Quatirini u.a.)
nicht, daß das Melanin aus einem Pyrrol als Melanogen hervorgeht;
denn nach unseren Versuchen gibt dieselbe Reaktion z.B. auch das
aus Dioxyphenylalanin dargestellte künstliche Melanin. Die Reaktion
zeigt also nur an, daß in dem Melanin der Pyrrolring enthalten ist,
nicht aber, daß das Melanogen (wie z. B. hier das Dioxyphenylalanin)
bereits ein Pyrrolderivat ist. Ja, genau genommen ist nicht einmal
dieser Schluß vollkommen berechtigt; denn der Pyrrolring braucht in
der zu prüfenden Substanz gar nicht primär vorhanden zu sein, sondern
er kann erst während der Probe infolge der Erhitzung entstehen. So
gibt z.B. nach unseren Versuchen das 2, 5-Dioxyphenylalanin eine
positive Pyrrol-Fichtenspanreaktion, ebenso das 2, 3, 4-Trioxyphenyl-
alanin, während die Probe mit dem 3, 4, 5-Trioxyphenylalanin negativ
. ausfällt. Es scheint also, daß unter gewissen Konstitutionsbedingungen
(OH-Gruppe in Orthostellung zur NH,-haltigen Seitenkette) der Ring-
schluß während des Erhitzens zustande kommt. Die positive Reaktion
mit dem Melanin beweist daher nicht einmal mit Sicherheit, daß in
demselben der Pyrrolring schon fertig vorhanden ist, und natürlich
noch weniger, daß schon das Melanogen ein Pyrrolderivat ist. Sie
zeigt streng genommen nur an, daß im Melanin gewisse Gruppen so
gelagert sind, daß sie leicht unter Bildung eines Pyrrolringes zusammen-
treten können, wenn das Melanin erhitzt wird. Welche Gruppierung
im Melaninring hierfür in Betracht kommen könnte, soll später dargelegt
werden.
Die Lichtabsorption des Pigments im Ultravioletten.
Die wichtigste biologische Funktion der natürlichen Pigmente ist
ihre Lichtabsorption, es liegt nahe, diese Eigenschaft auch mit künst-
lichen Pigmenten zu untersuchen, und solche Untersuchungen sind in
der Tat unter Anwendung des sichtbaren Teiles des Spektrums auch
schon gemacht worden. Am ausführlichsten hat sich Gallerans mit
spektrophotometrischen Untersuchungen natürlicher und künstlicher
Melanine befaßt. Seine Untersuchungen beziehen sich aber nur auf
den sichtbaren Teil des Spektrums und sind daher mit den unserigen
nicht vergleichbar. Unsere eigenen Untersuchungen gingen ursprünglich
von einer etwas anderen Fragestellung aus. Wir hofften nämlich, in
fertigem Pigment bei der Absorption im ultravioletten Licht die charakte-
ristischen Absorptionsbanden des Melanogens, aus dem das Pigment
hergestellt wird, oder wenigstens an und für sich typische Banden zu
finden und dadurch vielleicht das Pigment in bezug auf sein Ausgangs-
material charakterisieren zu können. Wenn das möglich wäre, so
müßte die Methode, angewandt auf das natürliche Pigment, gestatten,
in einfacher Weise zu bestimmen, aus welchen Muttersubstanzen
— en — as hihi oooO
Pigmentstudien. 185
(Tyrosin, Brenzkatechinderivat, Tryptophan usw.) dieses Pigment
aufgebaut wird. Es sei gleich vorausgeschickt, daß sich diese
Hoffnung nicht erfüllte.
Die Untersuchungen wurden ausgeführt im Physikalisch-Chemischen
Institut der Universität von Herrn Prof. V. Henri, dem wir auch an
dieser Stelle hierfür danken.
Die Versuche waren folgendermaßen angeordnet: Die zu unter-
suchenden Lösungen (für Dopa betrug die günstigste Konzentration
0,001 Mol in 1000 ccm, für Pigment 0,1 Prom., beide in n/10 Na HC O,
gelóst) befanden sich in einem beiderseitig durch Quarzplatten verschlossenen
Glasrohr.
Als Lichtquelle diente der Kupferbogen. Das Abeorptionsspektrum
ein und derselben Lösung wurde bei verschiedenen Schichtdicken und
unter Anwendung verschiedener Expositionszeiten photographiert. Der
Extinktionskoeffizient e läßt sich dann nach folgender Formel berechnen:
old
de" d
worin Y und Jẹ die Lichtintensitáten, c die Konzentration una d die Schicht-
dicke bedeuten. Trägt man dann in einem Koordinatensystem als Ordinate
den Absorptionskoeffizienten e, als Abszisse die Wellenlängen, welche
durch Auswertung der photographischen Platte erhalten wurden, auf,
dann erhält man eine Kurve, welche die Stärke der Absorption in jedem
Punkte des Spektrums darstellt.
Wir geben aus den Untersuchungen von Prof. Henri drei Kurven
wieder, welche auf die genannte Art erhalten worden sind (Abb. 1).
15000
10000
5000
5000 4000 32000 A A
186 Br. Bloch u. F. Schaaf:
A. Absorptionsspektrum einer frisch bereiteten Lösung von 3, 4-
Dioxyphenylalanin (Kurve 1). Diese Aufnahme zeigt, daß eine Dopa-
lösung im sichtbaren Teile des Spektrums nicht absorbiert. Erst im
Ultravioletten, bei einer Wellenlänge von etwa A = 3100 A.-E. findet
man schwache Absorption (e = 682,4), welche aber von diesem Punkte
an stark ansteigt, um bei A. = 2807 A.R. ein scharf ausgeprägtes
Maximum von e = 18180 zu erreichen. Hierauf nimmt die Absorption
wieder ebenso stark ab, geht bei 4 = 2550 A.-E. mit e = 2369 durch
ein Minimum und zeigt dann von hier aus fiir alle Wellenlángen, welche
kleiner sind als 2550 A. E. eine stark zunehmende Absorption.
B. Absorptionsspektrum einer unvollständig oxydierten Dopalösung
(Kurve 2). Nachdem die zuerst verwendete Lösung 72 Stunden ge-
standen und sich unter dem Einfluß des Luftsauerstoffs teilweise
oxydiert hatte, wurde ihre Absorption von neuem bestimmt. Maximum
und Minimum liegen noch an der gleichen Stelle, hingegen ist die
Differenz zwischen den beiden Extremwerten geringer geworden.
EMax. = 13650 und £Min. = 8880. Das bedeutet eine Verflachung der
zuerst beschriebenen Kurve, welche auch dadurch deutlich wird,
daß die Absorption schon bei viel größeren Wellenlängen beginnt; denn
ihr Anfang liegt bei etwa A = 4000 A.-E., also schon an der Grenze
des sichtbaren Teiles des Spektrums, und der Absorptionskoeffizient
besitzt schon den Wert 3553. Das bedingt natürlich einen wesentlich
flacheren Anstieg zum Maximum. Die Verbreiterung des Absorptions-
gebiets ist.dem entstandenen Pigment zuzuschreiben, während Maximum
und Minimum der Kurve auf das noch vorhandene unveränderte
Dopa zurückzuführen sind.
C. Absorptionsspektrum von Dopamelanin (Kurve 3). Nach voll-
ständiger Pigmentierung erhält man ein Absorptionsspektrum ohne
irgend eine charakteristische Beziehung zum Spektrum des Dopas.
Die Kurve weist weder Maximum noch Minimum auf, sondern zeigt
stetigen Verlauf in dem Sinne, daß mit abnehmender Wellenlänge der
Absorptionskoeffizient wächst. Der Beginn der Absorption ist noch
weiter in den sichtbaren Teil des Spektrums gerückt, denn schon im
Gebiet der grünen Linien beträgt e = 1750. Irgend einen Hinweis
auf die Muttersubstanz des Melanins gibt diese Kurve also nicht, be-
sonders da auch das Pigment, welches aus Tyrosin dargestellt wurde,
die nämliche Absorptionskurve liefert; hingegen zeigt sie deutlich eine
Funktion des Pigments, nämlich seine Absorptionsfähigkeit für alle
Strahlen, deren Wellenlänge kleiner als 5000 Ä.-E. ist, beginnend im
Grün des sichtbaren Teiles des Spektrums und mit ständig wachsendem
Absorptionskoeffizienten fortschreitend bis ins äußerste Ultraviolett.
Pigmentstudien. 187
Wie aus diesen Untersuchungen hervorgeht, ‘kann also aus der
Absorption im sichtbaren und unsichtbaren Teile der Spektren fertiger
Pigmente keinRückschluß auf die Natur der Melanogene gezogen werden.
Ob es gelingen wird, in den Reduktionsprodukten der Pigmente
wieder solche charakteristische Banden zu finden, welche eventuell in
Beziehung stehen zu denjenigen des ursprünglichen Melanogens, ist
noch fraglich und muß in weiteren Untersuchungen geprüft werden.
Die Melaninbildung aus 8, 4-Dioxyphenylalanin und die Eigenschaften
des Pigments.
Es ist oben schon dargelegt worden, daß unsere Kenntnisse über
die Bildung und Zusammensetzung des natürlichen Pigments und seiner
Vorstufen trotz der zahlreichen darauf gerichteten Untersuchungen
noch wenig befriedigende sind. Angesichts der großen Schwierigkeit,
natürliches Pigment in analysenreiner Form zu gewinnen, oder die
mutmaßlichen Pigmentvorstufen (Melanogene), seien sie nun intra-
zellular oder im Kreislauf vorhanden, zu isolieren und zu erkennen, ist
es nicht eben wahrscheinlich, daß sich diese Sachlage bald erheblich
ändern wird.
Fs ist daher begreiflich, daß gesucht wird, dem Pigmentproblem auf
anderen Wegen näner zu kommen. Das Nächstliegende ist, zunächst den
Prozeß der künstlichen Pigmentbildung an einem einfachen, in seiner
Konstitution bekannten Melanogen zu verfolgen. Eine solche künstliche
Pigmentbildung kann gewissermaßen als Modell für die Erforschung des
natürlichen Pigments dienen, und das ist der Grund, weshalb zu derartigen
Untersuchungen in der Regel Substanzen ausgewählt werden, die nicht
nur an sich Melanogene sind, sondern vermutlich in der biologischen Melano-
genese eine Rolle spielen, wie z. B. Tyrosin (Fürth, Chodat u.a.) oder —
wie hier — Dopa. Es ist das Verdienst v. Fürths, diese Überlegung zuerst
erkannt und schon vor langer Zeit in seinen wichtigen Studien über die
Bildung des Pigments aus Tyrosin durch Tyrosinase in die Tat umgesetzt
zu haben.
Aber auch ganz abgesehen von der Nutzanwendung auf die natürliche
Melanogenese ist die Kenntnis der Bildung von dunklen Pigmenien aus
farblosen organischen Vorstufen ein sehr interessantes physikalisch-
chemisches Problem, das bis heute eigentlich nicht die Beachtung von
seiten der reinen Chemie gefunden hat, die es verdient. Außer der älteren,
unter W+illstátter gemachten Arbeit über Anilinschwarz, die man füglich
diesem Gebiet zurechnen darf, liegen hauptsächlich Untersuchungen vor
von Adler, Spiegler, Brahn, Heinlein, Stolzenberg, Gortner, Onslow u.a.,
ferner die interessanten Angaben von C. Neuberg und Kikkoji über Melanin-
bildung aus sehr zahlreichen organischen Substanzen durch Eisensalze
+ H,0..
Die hier mitgeteilten Untersuchungen wurden an Dioxyphenyl-
alanin gemacht, das ja sicher vermöge seines Baues einer der pigmen-
togensten Körper ist, die wir kennen, und außerdem vielleicht am Aufbau
188 Br. Bloch u. F. Schaaf:
des natürlichen Melanins beteiligt ist. Bei diesen Untersuchungen
kam es uns darauf an, unter möglichst einfachen und übersichtlichen
Verhältnissen, ohne irgendwelche fremde Beimengungen zu arbeiten.
Daher wurde die Darstellung des Pigments in der Regel (Ausnahmen
sind vermerkt) ohne Zusatz eines anorganischen oder organischen
Katalysators — wie Fe oder Tyrosinase — vorgenommen, und zwar
einfach so, daß durch eine Lösung von bekanntem Dopagehalt Luft
bzw. O, bis zur vollständigen Umwandlung des Dopa in Pigment durch-
geleitet wurde. Hierbei kam uns eben die außerordentlich große
Pigmentfähigkeit des Dopa sehr zu statten.
Darstellung und Eigenschaften des Dopamelanins.
Man leitet durch eine kaltgesättigte Lösung von 3, 4-Dioxyphenyl-
alanin in n/lONaHCO, so lange Luft, bis die Eisenchlorid-Brenz-
katechinreaktion verschwunden ist. Auf diese Weise erhält man eine
braunschwarze, undurchsichtige kolloidale Lösung. Durch Eintrocknen
oder durch Zusatz von Elektrolyten läßt sich daraus das Pigment
gewinnen, da es in der Siedehitze nicht koaguliert. Die Oxydations-
geschwindigkeit kann beschleunigt werden, wenn die Lösung mit
Sauerstoff in der Druckflasche geschüttelt wird (py = 8,1), oder wenn
man Tyrosinase zusetzt. Die Menge des auf diese Weise gewonnenen
Pigments entspricht etwa der Hälfte des ursprünglich angewandten
Dopas. Führt man die Oxydation von Dopa in stark alkalischer Lösung
(normale Natronlauge) durch, dann erhält man ein Pigment anderer
Zusammensetzung. Dasselbe ist, im Gegensatz zu dem nach der ersten
Methode erhaltenen Melanin nicht schwarzbraun, sondern reinbraun,
und die Lösung selbst zeigt während der Oxydation goldbraune Färbung
(anderer Dispersionsgrad). Ein deutlicher Unterschied hingegen tritt
auf beim Ausfällen des Melanins aus der stark alkalischen Lösung
durch Ansäuern mit Salzsäure. Es findet kräftige Gasentwicklung
(Abspaltung von CO,) statt. Alle Darstellungsmethoden des Pigments
haben hingegen die Eigenschaft gemeinsam, daß nach Maßgabe des
Fortschritts der Oxydation eine Abspaltung von Ammoniak statt-
findet.
Reaktionen des trockenen ausgefállten Pigments.
Das Pigment, das durch Oxydation in schwach alkalischer Lösung
erhalten wurde, löst sich in ganz geringer Menge in Wasser. Eine solche
Lösung wird auf Zusatz von Nitroprussidnatrium intensiv grün, nach
dem Alkalisieren rotbraun, mit Eisessig in der Kälte angesäuert, bildet
sich die grüne Farbe zurück. Der Niederschlag von Bleiacetat in
ammoniakalischer Lösung reißt das Pigment mit. Die Reaktionen
auf Brenzkatechinderivate und auf Dioxyphenylalanin verlaufen
Pigmentstudien. 189
negativ, ebenso der Nachweis von Pyrrol (mit Ausnahme der Fichten-
spanr.) und Tryptophan. In der Lösung des Pigments, die nach dem
Ausfällen desselben übrigbleibt, konnte bis jetzt außer NH,OH nichts
nachgewiesen werden, weder unverändertes Dopa (vollständige Oxydation
vorausgesetzt), noch Spaltstücke desselben (Desamidierte Säuren).
Was die Thormáhlensche Reaktion zum Nachweis von ‚„Melanogen“
betrifft, wurde gefunden, daß weder das nicht oxydierte Dopa, noch
eine nur teilweise oxydierte Dopalösung (in welcher also noch nicht
angegriffenes Dopa, eventuelle Zwischenstufen der Oxydation und
fertiges Pigment nebeneinander vorhanden sein könnten), noch eine
alkalische Pigmentlösung, welche mit Zinkstaub gekocht wurde, um
eine Reduktion einzuleiten, einen positiven Ausfall der Reaktion
zeitigten. Dabei ist über die Thormáhlensche Reaktion selbst zu sagen,
daß sie kaum geeignet ist, sichere Schlüsse auf die Anwesenheit von
„Melanogen‘ zu ziehen, da ihre Technik Möglichkeiten zu Trugschlüssen
birgt. Sobald nämlich beim Ansäuern der stark alkalischen Lösung
mit Eisessig durch gute Abkühlung eine Temperatursteigerung der
Lösung infolge der Neutralisationswärme nicht verhindert wird, kann
es leicht vorkommen, daß Farbumschläge beobachtet werden, welche
zur Annahme einer positiven Melaninprobe verleiten können.
Während so mit Dopa unter genauer Einhaltung der Vorschrift die
Thormählensche Reaktion negativ ausfällt, erhält man beim absicht-
lichen Erwärmen der gleichen Lösung ein blaugrünes Endstadium und
schließliche Bildung eines blauen Niederschlag. Die Melanogenprobe
ist übrigens in diesen Versuchen belanglos, denn wenn man auch eine
Melaninvorstufe annimmt, mit ,Melanogencharakter*“, d.h. eine Vor-
stufe, die unter geeigneten Bedingungen leicht Melanin bildet, dann
ist sie in diesem Falle nicht zwischen Dopa und Melanin zu suchen, da
die Reaktion, einmal eingeleitet, sicher auf keiner Stufe mehr fest-
gehalten werden kann, sondern das Dopa ist bei dieser Pigmentbildung
selbst das Melanogen. Auch die oft zur Charakterisierung von Melanin
herangezogene Fichtenspanreaktion auf Pyrrol ist, wie schon oben
angeführt, nicht eindeutig.
Fällungsversuche des Melaninsols.
Aus der Lösung, welche man nach der vollständigen Oxydation
des Dopas erhält und in welcher das Pigment als Kolloid gelöst vor-
handen ist, kann es durch Eintrocknen oder durch Elektrolytzusätze
ausgeflockt werden. Das Melanin fällt nach Zusatz von NaCl, aber
es ist dazu mindestens eine Normallösung erforderlich. Verwendet man
Salzsäure, dann genügt etwa ein Achtel des Volumens an 1proz. Säure.
Es wird nicht ausgeflockt mit Talk, Tierkohle oder Na H (N H,) P O,-
Lösung, wohl aber mit Aluminiumsulfatlösungen bzw. kolloidalem
190 Br. Bloch u. F. Schaaf:
Eisenhydroxyd. Über das Fällungsoptimum bei Anwendung der
beiden zuletzt genannten Mittel orientiert die Zusammenstellung:
| Volumenverhältnis
Melaninlösung ` ` ` `
n/10 Alaunlösung
O E ee +/+|+|+|+|+
| | | a En u e EE
Fr | Sg
| H
Fällurg mit kolloidalem Fe(OH.
nn i 8 ` Volumenverhältnis AS
4 | 2 2 1
en A | = o 15 1...
Flockung . . . .| SCENE | ele +
CB + +
| EL?
+
braun, Fast farblos gelblich
undurchsichtig , (schw. gelblich)
Farbe der Lösung |
Das Melaninsol ist also ein negatives Kolloid. Am vollstándigsten
verláuft die Alaun- bzw. Eisenhydroxydfállung. Hingegen ist derselben
die Fállung mit Salzsáure vorzuziehen, wenn es sich darum handelt,
zu quantitativen Versuchen ein móglichst reines Pigment zu erhalten.
Das ausgefällte trockene Pigment ist schwer löslich in kaltem
Wasser, etwas leichter in heißem (irreversibles Kolloid), wenig löslich
in Alkohol, gut in Pyridin, Laugen oder Säuren, unlöslich in Äther
und Chloroform.
Stickstoffgehalt des Melanins.
Die hier mitgeteilten Daten beanspruchen noch keinen definitiven
Wert, da es sich gezeigt hat, daß das, was man gewöhnlich unter dem
Begriff „Melanin“ versteht, kein eindeutig bestimmter Körper ist,
sondern daß er als Sammelbegriff aufgefaßt werden muß für alle durch
Oxydation von Melanogenen (in unserem Falle Dopa) entstandenen
dunklen Produkte, welche je nach den Versuchsbedingungen einen
anderen Stickstoffgehalt aufweisen. Dieser schwankt ungefähr zwischen
5 bis 8 Proz. Ob es gelingt, ein Verfahren zu finden, nach welchem in
jedem Falle ein und derselbe Körper erhalten wird, scheint noch
sehr fraglich, da die Pigmentierung nicht nur auf einer Oxydation des
Dopas, sondern auch auf einer Kondensation und einer eventuellen
Pigmentstudien. 191
Polymerisation beruht. (Analogie mit der Anilinschwarzbildung.)
Immerhin seien im folgenden einige Stickstoffwerte zusammengestellt,
wie sie bei Pigmenten gefunden wurden, die auf verschiedene Weise
dargestellt wurden.
A. Dopa in n/10 NaHCO, gelöst, Luft durchgeleitet bis zum Ver-
schwinden der Eisenchloridreaktion, das Pigment mit Salzsäure ausgefällt.
0,2141g Substanz verbrauchen nach Kjeldahl 8,16ccm n/10 HC!
= 5,84 Proz. N (Dopamelanin IV s. Tabelle).
B. Auf die gleiche Weise wie A dargestellt, jedoch noch mit Zusatz
eines Tyrosinase-Glycerinextraktes.
0,3674g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 17,23 cem n/10 HC]
= 6,57 Proz. N (Dopamelanin III s. Tabelle).
C. Dopa in n/10 NaHCO, gelöst, mit Phosphatpuffergemisch auf
Pp = 8,1 eingestellt und in der Druckflasche mit Sauerstoff auf der Schüttel-
maschine oxydiert. Pigment mit Salzsäure ausgefällt.
0,3149g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 17,6ccm n/10 HCl
= 1,8 Proz. N.
D. Genau die gleiche Darstellung wie C.
0,1674g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 9,95 ccm n/10 HC!
= 8,8 Proz. N.
E. Darstellung wie C und D, hingegen wird das Pigment mit n/10
KAI(SO,),-Lösung ausgefällt.
0,8270 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 12,75 ccm n/10 HCI
= 2,16 Proz. N.
Dieser letzte Wert ist so niedrig, weil das Pigment noch Aluminium-
hydroxyd mitgerissen hat, welches beim Ausfällen der alkalischen
Pigmentlösung entstanden ist. Dadurch entstehen für quantitative
Untersuchungen natürlich ganz unbrauchbare Produkte. Es ist möglich,
daß das sonst sehr brauchbare Fällungsverfahren (da es am quan-
titativsten arbeitet) noch dadurch verbessert werden kann, daß die
Pigmentlösung vor dem Zusatz des KAl(SO,), neutralisiert, eventuell
schwach angesäuert wird, um die Bildung des Aluminiumhydroxyds
zurückzuhalten.
Die sehr verschiedenen N-Werte, die hier in den Pigmenten, die
aus demselben und reinen Ausgangsmaterial je nach der Art der Dar-
stellung erhalten wurden, lassen die divergierenden Angaben der Autoren
über den N der natürlichen, wohl immer durch Beimengungen ver-
unreinigten Pigmente ohne weiteres verständlich erscheinen.
Verhalten des Pigments gegen Oxydations- und Reduktionsmittel.
Reduktionen und Oxydationen von künstlichen und natürlichen
Pigmenten sind schon vielfach durchgeführt worden. Der Zweck
192 Br. Bloch u. F. Schaaf:
solcher Untersuchungen ist, aus den Bausteinen Anhaltspunkte für
die Konstitution des Ausgangsprodukts zu gewinnen.
Das wäre der Fall, wenn es gelänge, z. B. durch Reduktion aus
Dopamelanin, die Brenzkatechinreaktion gebende Dioxyphenyl-
verbindungen, aus Tyrosinmelanin ein Monoxyphenylderivat zu ge-
winnen und das Verfahren auf natürliches Pigment übertragen würde.
Das Ziel ist aber bis jetzt nicht einmal mit den künstlichen, geschweige
denn mit den natürlichen Melaninen erreicht worden. Das Gefüge
des Melaninmoleküls ist offenbar ein so festes und kompliziertes, daß
nur eine weitgehende Zersprengung zu uncharakteristischen Teil-
stücken erhalten wird. Auch die folgenden Untersuchungen führten
nicht zum Ziele. Doch müssen sie zum Teil — wir denken dabei speziell
an die elektrolytische Reduktion — fortgesetzt werden.
Durch die Einwirkung von H,O,, Chromsäure und Salpetersäure
auf alkalische Melaninlösung ist es uns nicht gelungen, Spaltprodukte
zu fassen, welche zu einer näheren Charakterisierung des Melanin-
moleküls dienen konnten. Unter dem Einfluß von Kaliumpermanganat
(5 Proz.) findet weitgehende Oxydation und Aufspaltung statt unter
Entwicklung von viel CO,.
Im Gegensatz zu den Oxydationsmitteln scheint es vielleicht durch
Reduktion eher möglich zu sein, Abbauprodukte des Melanins zu er-
halten, welche auf dessen Konstitution zurückschließen lassen. Die
hier mitgeteilten Versuche haben noch nicht abschließenden Charakter,
sondern müssen noch weiter ausgebaut werden. Immerhin hat sich
schon jetzt gezeigt, daß eine Reduktion in saurer Lösung (Zink- und
Salzsäure) nicht zum Ziele führt, daß hingegen Reduktion in alkalischem
Medium (Zink und Natronlauge, Natriumamalgam — aktiviertes
Aluminium ist unwirksam — elektrolytisch) oder endlich katalytische
Hydrierung eher in gewünschter Richtung weiterführen könnten.
Beim Behandeln von Melanin in Natronlauge mit Zinkstaub läßt sich
eine Farbaufhellung beobachten.
Bei der sehr energischen katalytischen Hydrierung durch Erhitzen
der Substanz mit Platinmohr im Rohre unter Wasserstoff (wobei das
Produkt schmilzt), kann in der Vorlage eine ölige Flüssigkeit und ein
weißes, unangenehm und stechend riechendes Sublimat aufgefangen
werden, dessen Untersuchung aber, infolge der geringen Menge nicht
durchgeführt werden kann. Daneben tritt reichliche Ammoniak-
entwicklung auf. Das Öl gibt mit Eisenchlorid eine grüne Färbung,
die auch in alkalischer Lösung bestehen bleibt. Aus dem Rohrinhalt
läßt sich mit Alkohol ein Körper herauslösen, der leicht aus diesem
Mittel kristallisiert. Diese Methode ist aber wahrscheinlich zu wenig
schonend, indem sie weitgehend veränderte Spaltprodukte liefert.
Günstiger kann eventuell partiell hydriert werden, wenn man das
Pigmentstudien.. 193
Melanin in wasserfreiem Pyridin löst und in Gegenwart von Palladium-
katalysator reduziert.
Bei der elektrolytischen Reduktion wurde als Anolyt n-Na,CO,, als
Katholyt eine sodaalkalische Dopamelaninlösung verwendet. Beide
waren durch ein Tondiaphragma getrennt. Die Kathode bestand aus
einem mit Pb-Schlamm überzogenen Bleiblech von etwa 2,8 qdm Ober-
fläche. Es wurde bei einer Temperatur von 50° mit 16 Volt Spannung
4 Stunden elektrolysiert. Nach den Ansáuern und Ausäthern des
Elektrolyten findet sich im Äther in geringer Menge ein stechend
riechendes Öl, das zum Teil kristallinisch erstarrt, schwach sauer
reagiert und, auf die Haut gebracht, reizt. Daneben findet wieder eine
Ammoniakabspaltung statt, hingegen zeigt der Katholyt nach dem
Ausfällen des Pigments weder positive Eisenchlorid- noch Thormählen-
reaktion, was natürlich nicht gegen eine eingetretene Reduktion spricht.
Auf jeden Fall müssen diese Versuchsmethoden weiter durchgearbeitet
werden, da sie nach allen bisherigen Resultaten noch die einzige Möglich- `
keit zu bieten scheinen, charakteristische a des Melanins
fassen zu kónnen, -
Reaktionskinetische Untersuchungen.
Obwohl die Reaktion durch die vorangehenden Versuche chemisch
noch nicht so weit abgeklárt ist, fórdern doch die Untersuchungen des
Oxydationsverlaufs die Kenntnisse über den Pigmentierungsvorgang,
so daß solche kinetische Messungen auch jetzt schon gerechtfertigt
sind. Vor allem geben diese Untersuchungen Anhaltspunkte über die
Stufen, über welche die Oxydation von Dopa bis zum fertigen Pigment
verläuft.
Der Oxydationsverlauf wurde in jedem Falle durch die Abnahme
der Konzentration des Aminostickstoffs gemessen, und zwar in zwei
prinzipiell voneinander verschiedenen Anordnungen, in dem das eine
Mal das System Dopa—Luft ruhend war, die Oxydation also nur an
der Grenzfläche beider Phasen stattfand und demzufolge sehr langsam
verlief, während in einer anderen Anordnung das Oxydationsmittel
in großem Überschuß und in praktisch konstanter Menge im Verhältnis
zum Dopa vorhanden war, indem die Dopalösung mit Sauerstoff ständig
geschüttelt wurde. Die übrigen Versuchsbedingungen hingegen waren
in beiden Fällen gleich gewählt worden, d.h. Lösungsmittel war n/10
Natriumbicarbonatlösung mit Phosphatpuffer auf pe 8,1 eingestellt
und der Gehalt an Dopa betrug in Anfangskonzentration */,¿Mol im
Liter.
Die Temperatur wurde bei 17% gehalten. Die Verhältnisse der
beiden Reaktionen sind im Diagramm wiedergegeben, wo die prozentuale
194 Br. Bloch u. F. Schaaf:
Aminostickstoffabnahme als Ordinate, die Zeit als Abszisse aufgetragen
wurde (Abb. 2). Ihre Charakteristik ist kurz folgende:
Abnahme der NH, Shckstofkonzentratiorn
0 100 c00
Zeit ia Stunden
Abb. 2.
4. Reaktion in ruhendem System.
Die Abnahme des Aminostickstoffs wächst mit der Reaktionsdauer,
Aminostickstoff
d.h. de otient — ______ —.
r Qu Zeiteinheit
einem Aminostickstoffverlust von 80 Proz. hat die Reaktion ihr Ende
erreicht.
nimmt steigende Werte an. Bei
B. Reaktion in bewegtem System mit Sauerstoffüberschuß.
Zu Beginn rapide Abnahme des Aminostickstoffs. Im weiteren
Verlauf aber so, daß der Quotient SC fallende Werte
Zeiteinheit
annimmt. Schluß der Reaktion nach einer Aminostickstoffabnahme
von 80 Proz.
Diese auf den ersten Blick sich widersprechenden Befunde lassen
sich sehr gut in Einklang bringen, wenn man annimmt, daß die Reaktion
Dopa — Pigment mindestens in zwei Stufen verläuft, einer Oxydation des
Dopas an den Hydroxylgruppen (Körper 1) und einer nachfolgenden
Pigmentstudien. 195
Kondensation unter Veränderung der Aminogruppe (Körper 2), wobei
die Geschwindigkeit der ersten Reaktion größer ist, als diejenige der
zweiten. Der Messung zugänglich ist aber nur die zweite Phase.
Unter dieser Voraussetzung lassen sich die beiden Reaktions-
diagramme folgendermaßen interpretieren: Bei der Oxydation in
ruhendem System sind die Bedingungen zur Bildung von Körper 1
schlecht, denn die Oxydation kann nur an der Oberfläche der Lösung
stattfinden.
Weil nun weiter das Gemisch auch nicht gerührt wird, kann ein
Austausch zwischen Körper 1 und unverändertem Dopa nur durch
Diffusion stattfinden. Dieser Körper 1 ist befähigt, eine Kondensation
unter Veränderung der Aminogruppe einzugehen. Da nun seine Anfangs-
konzentration unter den schlechten Bedingungen gering ist, wird sich
auch der Umsatz zu Körper 2 nur in sehr geringer Menge vollziehen.
Ist nun aber die Geschwindigkeit der Bildung von 1 größer als die-
jenige von 2, dann kann sich Körper 1 trotz seiner schlechten Bildungs-
bedingungen dennoch in der Lösung anreichern, seine Konzentration
wächst also, und da die Bildung von 2 sicher nicht monomolekular ist,
muß die Konzentration von 1 auf die Reaktionsgeschwindigkeit von
Einfluß sein, d.h. mit steigender Konzentration von 1 muß die ge-
messene Bildung von 2 zunehmen. Diesen Verhältnissen entspricht
die Kurve mit ihrer zunehmenden Steigung. Je länger die Reaktion
dauert, desto größer ist die Konzentration von l und desto mehr
wird davon zu 2 umgesetzt, desto größer wird also der Quotient
Stickstoffabnahme
Zeiteinheit
In der zweiten Versuchsanordnung sind nun die Bedingungen
so gewählt (Oxydation mit Sauerstoff, ständiges Schütteln), daß die
Bildung von 1 sehr begünstigt ist. Aus dem Diagramm geht hervor,
daß diese erste Stufe fast momentan erreicht ist. Die Konzentration
von 1 erfährt im weiteren Verlauf keine Zunahme mehr, die Kurve
gibt also gerade ein Bild des Umsatzes von Körper 1 zu 2, und zwar
liegen die Verhältnisse hier ganz normal, indem die Reaktion um so
langsamer verläuft, je weiter der Umsatz vorgeschritten ist, d.h. der
Quotient none O muß kleiner werden.
Zeiteinheit
Zu Beginn des Versuchs ist aller Stickstoff in Form der Amino-
gruppe vorhanden, und die Bestimmung des Aminostickstoffs ist zugleich
eine Bestimmung des Gesamtstickstoffs. Am Schlusse des Versuchs
— vollständige Umwandlung in Melanin und totales Verschwinden
des ursprünglichen Dioxyphenylalanins — finden sich noch 60 Proz. des
ursprünglichen Stickstoffes, 20 Proz. = LG als Aminostickstoff, 40 Proz.
= ®/, Stickstoff in anderer Form gebunden. Die fehlenden 40 Proz.
196 Br. Bloch u. F. Schaaf:
sind als NH, abgespalten und von uns in der Flüssigkeit quantitativ
bestimmt worden. Dieses Verhältnis trifft nicht nur für das Endstadium
zu, sondern bleibt während des ganzen Verlaufs der Reaktionerhalten;
d.h. in jedem Zeitpunkt der Oxydation findet sich nach unseren
periodischen Messungen die Hälfte des verschwundenen Aminostick-
stoffs als freies NH, abgespalten, die andere Hälfte noch gebunden,
aber nicht mehr in Form der primären, nach Slyke bestimmbaren
Aminogruppe. |
Wir geben folgende Versuchsdaten:
O ns E | salis | 23 | 3 | 48 | 78,5 | 925 | 112,5
Abnahme des Aminostickstoffs | 27 | 38 80 *)
Gebildeter Ammoniakstickstoff | 21 40
Aminostickstoff
A mmoniakstickstoff 0 0.0.4. 0-2 ` 1,80 2,04 2,25 2,13 2,18 2,02 2
Mittel: 2,08.
D Ursprüngliche Konzentration = 100.
An dieser Feststellung erscheint uns einmal die Tatsache interessant,
daß bei dieser Melaninbildung durch O, eine so energische NH,-Ab-
spaltung stattfindet. Bekanntlich hat man ja vielfach bei der fermen-
tativen, mit NH,-Abspaltung einhergehenden Melaninbildung die
Mitwirkung besonderer Desamidasen angenommen. Unsere Versuche
zeigen nun, daß, wenigstens am Dopamolekúl, eine energische Des-
amidierung auch ohne das Dazwischentreten eines besonderen Ferments
stattfinden kann. Diese Melaninbildung aus Dopa unter Desamidierung
findet auch bei Zusatz von KCN (in äquivalenter Menge bezogen auf
Dopa) statt, so daß eine katalytische Wirkung von zufällig vorhandenem
Fe ausgeschlossen ist.
Unser Befund bildet eine Parallele zu dem von Wieland jüngst
erbrachten Nachweis der Überführung einer anderen aromatischen
a-Aminosäure, des Phenylalanins, in den nächst niedrigeren Aldehyd
unter Desamidierung durch Oxydation mit Hilfe von Sauerstoff unter
Zusatz von Kohle.
Die von uns festgestellte Tatsache, daß unter den erwähnten
Bedingungen bei der Dopamelaninbildung nicht nur ?/, des Gesamt-N
abgespalten, sondern von den restierenden 3/, zwei Drittel in eine
nach Slyke nicht mehr nachweisbare Form übergeführt wird, führt
nun zunächst zu zwei weiteren Fragestellungen, nämlich:
1. Ist das von uns konstatierte Verhältnis des Gesamt-N des
fertigen Melanins zu Aminostickstoff ein konstantes? (= 2:1), mit
anderen Worten: Enthält das Melaninmolekil aliphatischen Amino-N
als integrierenden Bestandteil, oder handelt es sich hier nur um einen
Pigmentstudien. 197
Gleichgewichtszustand zwischen fertigem Melanin ohne (nach Slyke)
nachweisbaren Amino-N und intermediären, solchen Amino-N noch
enthaltenden Produkten.
2. Wie verhält es sich in dieser Hinsicht mit der Bindung des
N in den natürlichen Melaninen ?
Zu 1. Die erste Frage läßt sich durch die Untersuchung des Ver-
hältnisses beider Arten von N-Bindungen in den unter verschiedenen
Bedingungen erhaltenen künstlichen Melaninen feststellen und ganz
besonders dadurch, daß man darnach trachtet, ein Melanin herzustellen,
das Slyke-N nicht mehr oder nur in ganz geringen Mengen enthält.
Wir führen hier einige solcher Untersuchungen an, unter Hinweis
auf die bereits oben (S. 191) mitgeteilten Daten über den nach der
Herstellungsmethode variierenden N-Gehalt der künstlichen Melanine.
a) Dopamelunine. Läßt man Sauerstoff in mäßigem Strom durch
eine beinahe neutrale Dopalösung (pe = 7,2) perlen und hält man die
Temperatur konstant auf 55 bis 60%, dann findet man ganz andere
Verhältnisse. Es gelingt unter diesen Bedingungen nicht, die Reaktion 1,
d.h. die Umwandlung zum Chinonkörper (s. später S. 202) vollständig
zu Ende zu führen, sondern es läßt sich unverändertes Dopa nach
Ausfällung des Pigments im Filtrat nachweisen (etwa 25 Proz. der
ursprünglich angewandten Menge), und in Reaktion 2 (Kondensation,
vgl. S. 202) wird das Gleichgewicht zwischen Kondensationsprodukt
und Chinonkórper im Sinne einer vollständigeren Kondensation
verschoben, denn auf das Pigment entfallen nur noch etwa 2 Proz.
Aminostickstoff, so daß also das unter diesen Bedingungen dargestellte
Melanin fast nur noch aus Körper 2 besteht. Änderung der
Wasserstoffionenkonzentration im Sinne einer stärkeren Alkalinität bei
gleicher Temperatur (55 bis 60%) und gleichem Sauerstoffstrom be-
günstigt hingegen wieder den vollständigeren Verlauf von Reaktion 1;
allerdings wird auch unter diesen Bedingungen Dopa noch nicht restlos
aufgebraucht, hingegen sind 90 Proz. aus der Lösung verschwunden.
Bei der Oxydation in Gegenwart von Tyrosinase ist das Verhältnis
zwischen Kondensationsprodukt und Chinonkörper im ausgefällten
Pigment wieder ein anderes, denn dieses Melanin enthält weniger
Aminostickstoff als das auf S. 195 ausführlich beschriebene Beispiel,
denn wáhrend jenes Pigment noch 33 Proz. seines N in Form der
Aminogruppe gebunden enthált, finden sich in diesem nur noch etwa
13 Proz. des N als aliphatische primáre Aminogruppe.
Die hier mitgeteilten Befunde sprechen dafür, daß sich sowohl in
Reaktion 1 wie in Reaktion 2 ein Gleichgewichtszustand einstellt, der
aber durch Wahl von besonders günstigen Bedingungen so verschoben
werden kann, daß die beiden Reaktionen praktisch vollständig ver-
Biochemische Zeitschrift Band 162. 14 |
108 Br. Bloch u. F. Schaaf:
laufen. Diese Tatsache ist nicht merkwürdig, sondern läßt sich bei
der Mehrzahl der Reaktionen zwischen organischen Körpern stets
nachweisen.
In einem weiteren Versuch wird Dopa in ö5proz. Lösung,
deren po 8,1 beträgt, mit Sauerstoff zuerst bei gewöhnlicher Tem-
peratur, dann auf dem Wasserbad oxydiert, bis die FeCl,-Brenz-
katechinreaktion verschwunden ist. Oxydation mit Luft bei Zimmer-
temperatur und pg = 7,2 führt niemals zum vollständigen Verbrauch
des Dopas.
Ausgefállt wird mit 1l proz. Salzsäure in der Kälte.
Dopamelanin 1.
1. 0,0688 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 20,45 ccm 0,02 n HCI.
2. 0,0379 g ap » ze » 11,40 ,, 0,02n HCI.
Gesamtstickstoff. . . . . . . 8,82 Proz. 8,48 Proz.
NH,-Stickstoff . . . . . . . 0,48 y
Gesamt-N : NH,-N = 17,4 :1.
Dieses Produkt zeigt im Vergleich zu friiher gefundenen Werten
(6,57 Proz., 5,34 Proz.) einen extrem hohen Stickstoffgehalt. Wird
das auf dieselbe Weise oxydierte Dopamelanin nach dem Zusatz der
zum Ausfällen nötigen Menge 1proz. HCl noch 2 Stunden auf dem
Wasserbad und 2 Stunden über freier Flamme erhitzt und dann erst
durch Dekantation bis zur vollständigen Entfernung der Elektrolyten
gewaschen und mit Alkohol und Äther getrocknet, dann erhält man
ein Produkt mit viel niedrigerem Stickstoffgehalt.
Dopamelanin II.
1. 0,0475 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 9,2 ccm 0,02n HCI.
e 5,7 „ 0,02n HCl.
2, 0,0302 g ap „ IT
Gesamtstickstoff. . . . . . . 5,18 Proz. 5,28 Proz.
Aminostickstoff . . . . . . . 0,84 „
Gesamt-N : NH,-N = 15,5 : 1.
Durch diese Behandlung wurde der Gesamtstickstoff stark her-
untergedrückt, während das Verhältnis von NH,-N zu Gesamt-
stickstoff größer wurde. Die großen Unterschiede zwischen diesen
zwei Produkten lassen sich nur so erklären, daß man annimmt, das
nicht mit HCl gekochte Pigment enthalte noch Ammoniak bzw.
N H,Cl, dessen Vorhandensein durch die Darstellungsmethode gegeben
ist, adsorbiert, das sich nicht durch das gewöhnliche Auswaschen,
sondern erst durch die Behandlung mit verdünnter Säure in der Wärme
entfernen lasse.
Diese Behandlung kann eventuell auch bei der weiteren Reinigung
eines nicht mehr zu rohen natürlichen Pigments eingeschaltet werden,
um auch darin zufällige anorganische stickstoffhaltige Verbindungen zu
Pigmentstudien. 199
entfernen. Die Entfernung des die NH,-Gruppen enthaltenden Bestand-
teils gelang hingegen auf diese Weise nicht, d. h. nicht befriedigend, denn
die absolute Menge des N H,-Stickstoffs wurde nur unwesentlich vermindert.
Um diesen restlos zu entfernen, ist wahrscheinlich eine höhere Säure-
konzentration notwendig.
Es gelingt also, durch die Variation der Bedingungen das
Verhältnis Gesamt-N zu NH,-N in dem Sinne zu ändern, daß der
en im Melanin bis auf */,¿ hinuntergedrückt wird.
Daraus geht eindeutig hervor, daß das fertige Melanin, wenigstens
was zunächst das künstliche Dopamelanin angeht, das Produkt eines
Gleichgewichtszustands ist und keinen nach Slyke nachweisbaren
Aminostickstoff als iniegrierenden Bestandteil des Moleküls enthält.
Es müßte demnach im Prinzip gelingen, durch weitere Modifikationen
der Darstellung ein Melanin zu gewinnen, das überhaupt keinen Amino-
stickstoff enthält. In der praktischen Ausführung liegen die Schwierig-
keiten wohl bei dem kolloiden Charakter des Produkts und der dadurch
bedingten starken Adsorption.
Was hier für das künstliche Dopamelanin gezeigt wurde, gilt im
Prinzip auch für andere künstliche Melanine, wenigstens spricht dafür
folgende Analyse eines Tyrosinmelanins:
Quotient
b) Tyrosinmelanin: Tyrosin wird in Y,proz. Lösung, deren Py
durch Phosphatpuffer auf 6,2 eingestellt wurde, durch Luft in Gegen-
wart eines Mazerationssaftes von Trockentyrosinase (dargestellt 1923
aus Lactarius vellereus) oxydiert. Die rasch tiefrot werdende Lösung
wird bald grauschwarz und das Melanin setzt sich in groben Flocken
ab. Das trockene elektrolytfreie Pigment ist schwer löslich in verdünnter
Lauge, unlöslich in Alkohol.
1. 0,0594 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 17,55 cem 0,02 n HCl.
2. 0,0375 g ep 5 ij ge 11,15 „ 0,02n HCI.
Gesamtstickstoff. . . . . . . 8,27 Proz. 8,38 Proz.
Aminostickstoff . . . . . . . 111 y
Zu 2. Unsere Versuchsergebnisse führen unmittelbar zur Frage
nach der Bindung des N in den natürlichen Melanınen. Trotz der außer-
ordentlich großen Zahl von vorliegenden Analysen haben wir in der
Literatur darüber keine Daten finden können. Es wird jeweilen nur
der Gesamt-N gegeben, die Frage seiner Bindung aber nicht besprochen).
1) Aus einer einfachen Bestimmung des Gesamt-N lassen sich bei
den natürlichen Pigmenten überhaupt keine Schlüsse ziehen, da dieser
Wert von zu vielen unbekannten Faktoren (Adsorption aller möglichen
Eiweißspaltprodukte an das Kolloidale Melanin, Bildung von huminartigen
. Stoffen bei der Hydrolyse usw.) abhängt. Sie kann höchstens einen Finger-
zeig über den Grad der Reinigung geben.
14 *
200 Br. Bloch u. F. Schaaf:
Um diese Lücke auszufüllen, haben wir ein Pigment aus Roßhaar,
eines aus Schafwolle, eines aus einer melanotischen Leber untersucht.
a) Pigment aus Roßhaar: Die mit Seifenlösung und 0,2n NaOH
gewaschenen Haare werden mit 25proz. H,SO, 15 Stunden (bis zur voll-
ständigen Hydrolyse) gekocht. Man filtriert das Pigment ab, löst das
gewaschene Produkt im verdünnten NaOH, fällt wieder durch Zusatz
von Säure, wäscht das Pigment bis zur vollständigen Elektrolytfreiheit,
spült mit Alkohol und Äther und trocknet schließlich dieses Rohpigment
bei 110°.
Analyse:
1. 1,8846 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 14,5 ccm n HCl.
2. 0,7780 g Substanz verbrauchten nach Slyke 26,1ccm N, (22%, 719mm).
Gesamtstickstoff. . . . . 10,78 Proz.
Aminostickstoff . . . . . 1,14 y
Durch zehnstündige Extraktion dieses Produktes mit der 20fachen
Menge absoluten Alkohols lassen sich Verunreinigungen entfernen, die
im Alkohol ziemlich, im Benzol zum Teil sehr leicht lóslich sind, die N
nur in geringer Menge, S aber reichlich enthalten und die selbst nicht
gefärbt sind. Nach dem Lösen in n/10 NaOH und Wiederausfällen mit
lproz. HCl ergeben sich folgende Analysendaten:
Analyse:
1. 0,0277 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 11,7 cem 0,02 n HCI.
2. 0,0597 g Se i 4 ës 24,95 ,, 0,02n HCl.
Gesamtstickstoff. . . . . 11,85 Proz. 11,71 Proz.
NH,-Stickstoff . . . . . 0,5561 y
Durch die Alkoholbehandlung wurde der N H,-N um mehr als ?/,
reduziert, während der Gesamtstickstoffgehalt etwas höher geworden ist.
b) Pigment aus Schafwolle: Das Rohpigment wurde analog wie
das Roßhaarpigment dargestellt:
Analyse:
0,8800 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 3,9 cem n HCl.
Gesamtstickstoff. . . . . 6,2 Proz.
Aminostickstoff . . . . . 0,86 ,,
Stark schwefelhaltig.
Dieses Produkt wird 20 Stunden im Soxhlet mit Pyridin extrahiert.
Die Pyridinlösung im Vakuum stark eingeengt, darauf mit H,O verdünnt
und mit HCl angesäuert. Dekantiert, noch zweimal mit HCl durchge-
arbeitet, dann bis zur Cl”-Freiheit gewaschen.
Analyse:
1. 0,0543 g Substanz verbrauchten nach Kjeldahl 11,85 cem 0,02 n HCl.
2. 0,0392 g 2 z S > 86 „ 0,02 n HCI.
Gesamtstickstoff. . . . . 6,11 Proz. 6,15 Proz.
Aminostickstoff . . . . . 0,25 „
Die Pyridinbehandlung des Pigments führt, aus dem Gesamt-
stickstoffgehalt zu schließen, zu keinem wesentlich reineren Produkt,
Pigmentstudien. 201
allerdings wird der Gehalt an NH,-Stickstoff und an S etwas geringer,
aber gerade das erste kann auch auf die Säurebehandlung zurück-
zuführen sein.
c) Pigment aus einer melanotischen Leber (Metastasen eines von
der Haut ausgegangenen Naevocarcinoms). Eine melanotische Leber wird
fein zerhackt, der Brei mit dem gleichen Volumen 15proz. NaOH 3 Wochen
in der Kälte stehengelassen, dann vom Ungelösten abgetrennt und das
Filtrat mit HCl deutlich angesäuert. Der entstehende Niederschlag wird
nach dem Absitzen gut gewaschen, abgesaugt, wieder in 2n NaOH gelöst,
vom Ungelösten abfiltriert und das Filtrat gefällt. Dieser neue Niederschlag
wird bis zur vollständigen Entfernung von Cl’ gewaschen und mit Alkohol
und Äther getrocknet. Hierauf 15 Stunden im Soxhlet mit Petroläther
extrahiert. Es bleibt nach dieser Behandlung ein braunschwarzes körniges
Pulver zurück. Dieses Rohpigment ist noch stark S-haltig.
' Analyse:
0,0358 g Substanz verbrauchten nach Kjeldah 13,0 cem 0,02n HCl.
Gesamtstickstoff. . . . 12,18 Proz.
Aminosticketoff . . . . 12 ,,
Die Resultate unserer Analysen sind in der folgenden Tabelle zu-
sammengestellt :
Gesamt!
Melanin | Darstellung | N Nach S
A u en eure D Proz ¡ Proz.
re | ==. ASS
T yrosinmelanın | Tyrosinase, Luft pg = 6,2 1 8,27 | 1,1 —
| y 8,33
Dopamelanin I | Sauerstoff, mit HCl gefällt, | 8,32
Dopamelanin II | Mit HCl gekocht | 5,18
| 5,28 | 0,34
Dopamelanin III | Tyrosinase, Luft pg = 8,1 | 6,75 0,90
| 0,86
Dopamelanin IV | Luft, pg = 8,1 mit HCl in der
|
| Hitze gefällt 5,34 | nicht bestimmt
Roßhaarpigment | Sáurehydrolyse, in Lauge gelöst u.
' mit HCl gefällt, 100% getrocknet ' 10,78 | 1,71 | ++
dasselbe y Mit absol. Alkohol extrahiert l 11,85
, ` WW 11,71 | 0,51 +
Schafwollepigment Säurehydrolyse, umgefállt, bei |
| 110° getrocknet 62 | 0,56 +++
dasselbe | In Pyridin löslicher Teil, |
|
umgefällt
II
Tumorpigment 1 Mit Lauge gelöst, umgefällt und
(Lebermetastasen) | mit Petroläther extrahiert
i n 0,25 ++
| 12,13 | 12 +++
Aus den angeführten Analysenzahlen läßt sich unseres Erachtens
der Schluß ziehen, daß sowohl in den künstlichen als in den natürlichen
Melaninen weitaus die Hauptmenge des N in einer nach Slyke nicht
nachweisbaren Form, also nicht als aliphatischer Amino-N vorhanden ist.
202 Br. Bloch u. F. Schaaf:
Das Verhältnis von Gesamt-N zu Slyke-N ist aber außerdem so wechselnd
und so sehr von den Versuchsbedingungen abhängig, daß man überhaupt
zu dem Schluß kommen muß, daß das endgültige Melaninmolekül keinen
integrierenden Slyke-N mehr enthält, sondern daß der im Melanın noch
nachweisbare Aminostickstoff von adsorbierten Ausgangs- und Zwischen-
produkten sowie von sonstigen Beimengungen herrührt.
Wenn wir nun dazu übergehen wollen, die bisherigen Resultate
einer Deutung oder Erklärung zu unterwerfen, so muß es uns klar sein,
daß wir damit den Boden der Tatsachen verlassen und uns auf den
einer provisorischen Arbeitshypothese begeben.
Die Bildung des Dopamelanins — denn auf dieses wollen wir uns
beschränken — geht offenbar über mindestens drei Stufen.
Als erste Stufe ist die Bildung des Chinonkörpers anzunehmen.
on o
HS RE
| > |
( T
CH,.CH.COOH H,.CH.COOH
NH, NH,
Als zweite und dritte Stufe nehmen wir an: Kondensation von
2 bzw. 3 Molekülen des Chinonkörpers unter Desamidierung der noch
unveránderten Seitenkette.
E
NZ
O O CH
o oA UI
NEN ER NH SS,
2 bzw. 3 | | =. e | \
(
CH.CH.COOH CH, +C0,+NH,
H, CHO
COOH CH,
K O NEN
Ki e / re
O NN NH No
| m |
dE
| CH H ` d
CH,COOH ` Jee
Pigmentstudien. 203
Eine solche Annahme würde uns folgende Momente erklären:
1. Die beobachtete Abspaltung von NH, und CO, bei der Melanin-
bildung.
2. Die Tatsache, daß sowohl die künstlichen als die natürlichen
Melanine Amino-N in aliphatischer Form in sehr wechselnder aber
stets im Vergleich zum Gesamt-N in sehr geringer Menge enthalten
[wobei wir die Restwerte von Amino-N durch noch adsorbierte Reste
des Chinonkörpers (I), bei den natürlichen Melaninen auch eventuell
durch andere mitgerissene Beimengungen erklären].
3. Die Annahme einer Aldehydgruppe würde uns auch eventuell
eine Erklärung dafür geben, daß sämtliche — natürliche und künst-
liche — Melanine, die wir daraufhin untersucht haben, sowohl Tollens-
sche Lösung als Nesslers Reagenz zu reduzieren vermögen. Vielleicht
ist sie auch die Ursache der starken Polymerisationstendenz der Melanine.
4. Sie würde auch die Pyrrolreaktion des Pigments plausibel
machen, denn die obige Formulierung des Kondensationsprodukts
enthält präformiert bereits den Pyrrolring, wie aus folgender Formel
hervorgeht:
CH,
ER
O SR
o | HOOC—CH
SN N
| | Hm A, Ao
E |
L, 07 O
H,.CHO
Es wäre anzunehmen, daß dieser Ringschluß unter den Bedingungen
der Fichtenspanreaktion (trockene Erhitzung) effektiv zustande kommt,
begünstigt vielleicht durch die Aldehydgruppe. Es sei hierbei auf die
Ausführungen über die Bedingungen der Pyrrolreaktion (S. 184) ver-
wiesen.
5. Schließlich ist auf die Übereinstimmung zwischen dem Gesamt-
stickstoffwert unseres reinsten, d.h. des Amino-N-ärmsten Dopamela-
nins und des nach der Formel III berechneten hinzuweisen.
Er beträgt im ersten Falle 5,23 Proz. N (Mittelwert aus 5,18 und
5,28 Proz., vgl. Tabelle), im zweiten Falle 5,2 Proz. N.
Die höheren N-Werte der meisten natürlichen Melanine (eine
Ausnahme bildet unser Schafwollepigment mit 6,2 Proz. N) erklären
sich zwanglos aus adsorbierten Beimengungen. Das gleiche trifft wohl
auch für diejenigen künstlichen Melanine zu, bei deren Darstellung
Tyrosinase Verwendung findet (z.B. Dopamelanin mit Tyrosinase
= 6,57 Proz. N).
204 Br. Bloch u. F. Schaaf:
Trotz dieser auffallenden Übereinstimmungen braucht aber wohl
das Hypothetische dieser ganzen Auffassung nicht nochmals betont zu
werden. Erst dann, wenn wir die Bausteine des Melanins durch Abbau
kennengelernt haben, wird es möglich sein, hier Tatsachen an die Stelle
von Hypothesen zu setzen.
Zusammenfassung.
1. Das Pigment (Melanin) wird, sowohl in der Haut als im Auge,
im Protoplasma der pigmentbildenden Zellen (ektodermale und meso-
dermale Melanoblasten) aus einer farblosen Vorstufe durch ein intra-
zelluläres Oxydationsferment, die Dopaoxydase, gebildet. Die Oxydase
läßt sich an Gefrierschnitten und Extrakten durch die ‚Dopareaktion“
(Umwandlung des ` 3, 4-Dioxyphenylalanins zu Dopamelanin) nach-
weisen. Sie ist gegen Erhitzen, Austrocknen, H,S usw. empfindlich,
wenig aber gegen HCN. Die D.-R. (Oxydase) ist streng substrat-
spezifisch und entfaltet ihre optimale Wirkung bei pg = 7,3 bis 7,4.
Natürliche Pigmentbildung und D.-R. verlaufen zeitlich, örtlich und
der Intensität nach parallel. Die D.-R. ist daher beim Menschen und
den höheren Wirbeltieren als Indikator des spontanen Pigmentbildungs-
vermögens, die Dopaoxydase als das natürliche pigmenthildende Ferment
aufzufassen.
2. Das Absorptionsspektrum des Dopameanıns besitzt keine
charakteristischen Banden. Die Absorption beginnt im sichtbaren
Teile des Spektrums, und der Extinktionskoeffizient wächst stetig
mit abnehmender Wellenlänge.
3. Dopamelanin ist ein negatives Kolloid, es wird am besten durch
Säure, Aluminiumsulfatlösung oder kolloidales Eisenhydroxyd aus-
gefällt.
Seine Löslichkeit hängt ab von der Art der Darstellung und
Trocknung. Als Lösungsmittel kommen außer Alkalien in Betracht:
Wasser, Alkohol und Pyridin.
Gegen Oxydations- und Reduktionsmittel ist Dopamelanin sehr
widerstandsfähig; nur bei energischem Eingriff findet Aufspaltung zu
uncharakteristischen Spaltstücken statt.
4. Dopamelanin wird dargestellt durch Oxydation von 3, 4-Dioxy-
phenylalanin mit Sauerstoff in alkalischer Lösung. Dabei findet Kohlen-
säureabspaltung statt. Der ursprünglich nur als primäre aliphatische
Aminogruppe vorhandene Stickstoff wird zum Teil in eine andere
(nach Slyke nicht mehr nachweisbare) Bindung übergeführt, zum Teil
als Ammoniak abgespalten.
Menge des als Ammoniak refundenen Stickstoffs o l
Aminostickstoftabnahme 2
Pigmentstudien. 205
Besonders interessant erscheint die Tatsache dieser Desamidierung
unter dem Einfluß von Sauerstoff allein; sie zeigt, daß eine energische
NH,-Abspaltung auch ohne das Dazwischentreten eines besonderen
Ferments (,Desamidase') und unter Ausschluß von Eisen als Kata-
lysator (denn auch in Gegenwart von KCN nimmt die Reaktion einen
gleichen Verlauf) stattfinden kann.
5. Der Stickstoffgehalt der unter verschiedenen Bedingungen er-
haltenen Dopamelanine schwankt zwischen 5 und 8 Proz. (das reinste
Produkt enthält 5,23 Proz. N). Noch stärker sind die Schwankungen
in den natürlichen Melaninen (Adsorption von Beimengungen).
Der in den fertig gebildeten (natürlichen und künstlichen) Melaninen
enthaltene Stickstoff ist zum weitaus größten Teile nicht mehr als
Aminostickstoff nachweisbar. Das Verhältnis zwischen Gesamtstickstoff
und Amino-(Slyke-) Stickstoff ist je nach Herkunft und Darstellung
der Melanine großen Schwankungen unterworfen. Der Quotient
Aminostickstoff
Gesamtstickstoff
einem künstlichen Dopamelanin betrug er etwa 1/15,5. Daraus läßt
sich der Schluß ziehen, daß sowohl in den natürlichen wie in den künst-
lichen Melaninen der Aminostickstoff kein integrierender Bestandteil
des Melaninmoleküls, sondern auf Verunreinigung durch adsorbierte
Zwischenprodukte der Oxydation zurückzuführen ist.
wird um so kleiner, je reiner das Melanin ist. Bei
Literatur.
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Beiträge zu einer Pharmakologie der Konzentrationsänderungen.
III. Mitteilung:
Weitere Versuche über Kationenwirkungen.
Von
L. Jendrassik und E. Annau.
(Aus dem physiologischen Institut der Universität Budapest.)
Ausgeführt mit Unterstützung der Hilfsaktion des ungarischen Hochschul-
vereins.
(Eingegangen am 6. Juli 1925.)
Mit 9 Abbildungen im Text.
Verändern wir die Konzentration der Kationen in der Tyrode-
lösung, so zeigen sich an der Bewegung des umspülten Darmes auf-
fallende, vorübergehende Änderungen. Diese Erscheinungen wurden
in der ersten Mitteilung beschrieben, und es wurde auch zu beweisen
versucht, daß diese mit den vorübergehenden Alkaloidwirkungen auf
gemeinsamer Grundlage erklärt werden müssen!). Ionen wirken nach-
dem auch dadurch, daß die Veränderung ihrer Konzentration als Reiz
fungiert. Den durch die Steigerung der Konzentration hervorgerufenen
Effekt nannten wir Augmentations- oder A-Wirkung, den durch Ab-
nahme der Konzentration hervorgerufenen Diminutions- oder D-Wirkung.
Beide haben wir den bleibenden oder manenten Wirkungen entgegen-
gestellt, die durch die Gegenwart einer Substanz aufrecht erhalten
werden.
Diese Erscheinungen können auch physiologische und allgemein-
pharmakologische Beziehungen haben. Darum schien es empfehlens-
wert, zu untersuchen, ob auch auf andere Tiere, andere Organe und
mit anderen Ionen derartige Wirkungen hervorzurufen sind. Einerseits
1) L. Jendrassik, diese Zeitschr. 148, 116, 1924; vgl. auch L. Jendrassik
und E. Moser, ebendaselbst 152, 94, 1924.
208 L. Jendrassik u. E. Annau:
ergänzten wir die Daten des ersten Aufsatzes; bei neuen Stoffen suchten
wir in erster Reihe immer die vorübergehenden Wirkungen.
Die Versuchsanordnung war wie in der ersten Mitteilung angezeben.
Die untersuchten Gaben beziehen sich überall auf 70 bis 75 eem Lösung.
Das Reservedarmstück hielten wir nicht auf 37° (mit Sauerstoffversorgung),
sondern in 5 bis 10° kalter Lösung (ohne Sauerstoff).
Einfachheitshalber werden wir im folgenden die Augmentations-
und Diminutionswirkungen mit einem gemeinsamen Namen (anlehnend
an die Terminologie von Straub) Potentialwirkungen nennen.
Da die Ionen der Tyrodelösung verschieden wirken, je nachdem
ihre Ausgangskonzentrationen kleiner oder größer sind, scheint es uns
praktisch, die Wirkungen unterhalb der normalen Konzentration (des
betreffenden Ions in der angewandten Lösung) als „subnormale‘“ zu
bezeichnen. Die oberhalb dieser ‚normalen‘ Tyrodekonzentration
verursachten sind dementsprechend die „supernormalen ` Wirkungen
(Kontrakturen, Hemmungen usw.).
Untenstehend beschriebene Versuche wurden im Sommer und
Herbst 1924 ausgeführt.
Versuchsergebnisse.
Darm.
Kalium. Am Kaninchendarm wurden die schon beschriebenen Ver-
suche wiederholt und so an einer größeren Zahl von Tieren bestätigt. Um
diese damaligen Daten zu ergänzen, erwähnen wir, daß die Kontraktion,
welche durch eine kaliumfreie Lösung erzeugt wird, manchmal auch längere
Zeit, 10 bis 20 Minuten, andauert. Ist diese verschwunden, so sind die
Bewegungen meistens schon sehr abgeschwächt, manchmal sind sie fast
gar nicht vorhanden. Ein großer Unterschied zeigt sich hier, je nachdem
wir verschieden reines Kochsalz gebrauchen. Bei einem „Analyse‘-Präparat
tritt diese Wirkung viel früher ein, zum Zeichen, daß Verunreinigungen
des Kochsalzes, wahrscheinlich der Kaligehalt, den Eintritt der Wirkung
hemmen. Hierüber vgl. die Untersuchungen von E. Jannink!).
Die „kritische Konzentretion‘‘, bei welcher die Richtung der Kalium-
wirkung eine Veränderung zeigt, liegt manchmal stark oberhalb 0,02 Proz.
KCl. In einem Falle rief auch die Steigerung der KCI-Konzentration auf
das Zehnfache eine reine Hemmung hervor.
An manchen Därmen sehen wir in der Umgebung der kritischen Kon-
zentration eine neutrale Zone: auch eine beträchtliche Veränderung der
Konzentration hat keine Wirkung. Andere Präparate sind gegen Änderungen
um die kritische Konzentration sehr empfindlich. Geben wir nach kalium-
freier Lösung normale Tyrode und erzeugen so die vorübergehende Lähmung,
und geben während derselben von neuem kaliumfreie, so bleibt die Diminu-
tionskontraktur aus. Die Erregung kann hier scheinbar die hemmende
Wirkung nicht überwinden.
Am Kaninchendarm kann die Diminutionskontraktur des Kaliums
mit Hilfe des Atropins nicht hintangehalten werden. Die Tonussenkung,
1) E. Jannink, Dissertation Utrecht 1921.
Kationenwirkungen. III. 209
die das nachträglich gegebene Atropin erzeugt, ist immer nur Cholin-
hemmung. Vorher gegebenes (0,001 bis 0,1 mg) Atropin bleibt fast
ohne Wirkung. (Nur in einzelnen Fällen leidet etwas die Kontraktur-
höhe.) Die Kalium-D-Wirkung ist beim Kaninchendünndarnı daher
der Pilocarpinwirkung nicht ähnlich.
Steigert man die Konzentration des Kaliums über eine gewisse
Grenze, so erzeugt dies eine Kontraktur. Bei höheren Konzentrationen
ist die Kontraktur manent; kleinere Kontrakturen sind gewöhnlich
von veränderlicher Natur. Auch die manenten Kontrakturen scheinen
mit einer Augmentationswirkung zu beginnen. Anfänglich ist die
Kontraktur sehr stark, später läßt sie nach, um endlich in der halben
Höhe zu verbleiben. In anderen Versuchen hat die Kontraktur eine
immer zunehmende Tendenz.
Es kommen gelegentlich auch
Fälle vor, wo starke Kali-
kontrakturen allmählich nach-
lassen. Dabei kann ein
Größerwerden der Bewegungs-
amplitude manenten Charak-
ter haben. Beim Wechsel auf
normale Tyrode zeigt sich
hierbei eine vorübergehende
Lähmung (s. Abb. 1).
Den Dünndarm der Katze
haben wir, gewöhnlich dem
Kaninchendarm in allem ähn-
lich, in nicht aufgeschnittenem
Zustande untersucht. Das Stei-
Abb. 1. Kaninchendarm. (6. Dezember 1924.) Vors
ga der Kaliumkonzentration übergehende Wirkung auf Zufügung von K Cl. Wieder,
ruft hier zuerst große uterusähn- kehr zur norm. Tyrodelösung (Ty) bewirkt nachher
liche Bewegungen hervor (un- eine vorübergehende Lähmung. (Zeitmarkierung 6 Sek.
gefähr bis auf 0,1 bis 0,2 Proz.); Vergrößerung der Darmbewegung an allen Abbildungen
oberhalb dieser entsteht erst die a
manente Kontraktur. Die Rück-
verminderung der Kaliumkonzentration zur normalen ergibt keine Wirkung.
Es zeigen sich aber nun oft Bewegungen, wenn auch diese vorher gänzlich
fehlten. Bei Verminderung unter die normale Konzentration ist die halbe
Konzentration (= 0,01 Proz. KCl) oft unwirksam. Kaliumfreie Lösung löst
auch hier eine Kontraktur aus, welche (entgegen dem Kaninchendarm) hier
von manentem Charäkter ist. Sie ist oft nach 20 bis 30 Minuten noch an-
wesend. Hierbei sind auch die Bewegungsamplituden größer als in normaler
Lösung. Ihr Verschwinden erfolgt erst nach längerer Zeit. Bei Rückkehr zur
normalen Lösung kommt die paradoxe Lähmung auch hier regelmäßig zu-
stande, jedoch dauert sie viel kürzere Zeit als am Kaninchendarm (selten
länger als 5 Minuten; oft nicht über Y Minute), geben wir noch
während bestehender Lähmung von neuem kalifreie Tyrodelösung, so
210 L. Jendrassik u. E. Annau:
kommt die Kontraktur — im Gegensatz zu den Kaninchen — auch in
diesem Falle zustande.
Es zeigt sich aber auch ein größerer Unterschied im Verhalten der
Katze und des Kaninchens. Bei der Katze kann man nämlich die
D-Kontraktur des Kaliums mit Atropin hemmen (schon mit 0,001 mg
Sulfat). Ebensoviel Atropin im voraus gegeben, verhindert ganz das
Auftreten dieser Kontraktur. (Bei diesem Versuch soll auch die kalifreie
Lösung Atropin enthalten).
Von den arderen abweichend, verhielt sich der Darm eines großen
Katers. Dieser reagierte auch auf große Gaben von KC! (bis auf die zehn-
fache Konzentration) mit Lähmung. Erst bei l5facher Konzentration
entstand Kontraktur. Bei diesem Tiere ergab die kalifreie Lösung keine
oder nur eine kleine Kontraktur. Ihre vorübergehende Wirkung bestand
vielmehr in einer Frequenzsteigerung und Höherwerden der Amplituden.
Am mucosafreien Präparat war die hvponormale D-Wirkung eine schwache
Kontraktur. Am folgenden Tage untersucht, erwies sich diese beträchtlich
stärker. Vorher gegebenes Atropin konnte aber das Zustandekommen
der Kontraktur nicht verhindern.
Auch am Meerschweinchendarm erzeugt die kalifreie Lösung Kontraktur,
und rachher eire rormale Lösurg die paradoxe Lähmung.
Wir haben die Ionenwirkungen auch an der zirkularen Muskulatur
des Darmes (am Kaninchen) untersucht, einfacherweise so, daß wir ein
ungefähr 3 cm langes Darmstück der Breite nach am Hebel aufgehängt
haben. Gelingt dies nicht ganz genau in querer Richtung, so ist der
hierdurch verursachte Fehler dennoch unbedeutend.
An der Ringmuskulatur des Kaninchendarms wirkt die Verringerung
der K-Konzentration ganz ähnlich wie auf die Lángsfaser. Nur die
Größe der Kontrakturen ist geringer, entsprechend dem Umstand,
daß die Faser kürzer als die verwendete Längsfaser ist.
Gegenüber der Diminutionswirkung des Calciums zeigt der
Kaninchendarm eine recht verschiedene Empfindlichkeit. Manchmal
verursacht eine Verminderung der Calciumkonzentration mit 1/,¿-Teil
schon eine deutliche Wirkung. (Verringern des Ca-Gehalts von
15/ auf Hiel Andererseits ergaben sich auch Fälle, bei denen
die Entnahme des ?/¿-Teiles des Ca (Tausch auf */¿ CaCl,) ohne
Wirkung blieb.
Es scheint, daß im allgemeinen die frisch herausgenommenen Prä-
parate gegenüber plötzlichen Veränderungen des Ionengehaltes der Nähr-
lösung weniger empfindlich sird. An einigen Präparaten vermißten wir
in der ersten halben Stunde die D-Wirkung des Ca oft ganz. Bei der zweiten
und dritten Wiederholung des Versuchs kam diese jedoch zum Vorschein.
(Oft ist aber die Wirkung von Anfang an ausgeprägt vorhanden.) Beim
Kalium und Natrium liegen diese Verhältnisse ähnlich.
Eine analoge Steigerung der Empfindlichkeit findet man an über-
leberden Organen auch geger über Alkaloiden. So beim Darme gegenüber
Pilocarpin, wo die zweite urd dritte Gabe am (jedesmal frisch ausge-
Kationenwirkungen. III. 211
waschenen) Darme stärkere und stärkere Wirkung verursacht!). Man ver-
suchte, diese Erscheinung dadurch zu erklären, daß das Pilocarpin sich
am Darme nicht nur am Vagusendapparat, sondern auch an Stellen an-
sammelt, wo es Keine spezifische Wirkung hat; dadurch bleibt ein Teil
immer unwirksam. Werden diese unspezifischen Rezeptoren beim Aus-
waschen nicht vollständig entgiftet, so ist der Verlust bei den späteren
Gaben immer kleiner und kleiner, und es gelangt immer mehr Pilocarpin
an den Ort, wo es seine spezifische Wirkung entfaltet!). Es ist aber zu
erwägen, ob die Erscheinung so für Alkaloide wie für Ionen auf gemein-
samer Grundlage beruhen könnte. In diesem Falle muß aber die Erklärung
selbstverständlich anders lauten (bei Diminutionswirkung kann von einer
Ansammlung keine Rede sein). Es muß vielleicht etwas aus dem Darme `
herausdiffundieren, daß seine Empfindlichkeit gegen kontrakturerzeugende
Eingriffe erhöht werde. Da die Anwesenheit des Magnesiums die D-Wirkung
von Ca hindert*), muß such mit der Möglichkeit gerechnet werden, daß,
wenigstens in unseren Versuchen, diese Substanzen Mg-Salze sind.
Vermindern wir die [Ca] stufenweise (z. B. */,g- weise der normalen
Konzentration) von 1 bis auf 1, herab, so könren wir oft die niedrigere Kon-
zentration erreichen, ohne daß am Darme sich eine Kontraktur erwiesen
hätte. Dies beweist auch, daß der Prozeß der Konzentrationsänderung
für die Wirkung verantwortlich ist.
Auch die Dauer der Diminutionskontrakturen des Calciums ist recht
verschieden. Manchmal schwinden auch starke Kontrakturen in kurzer
Zeit. In anderen Fällen dauerte es auch 15 bis 20 Minuten, bis der Tonus
auf sein ursprüngliches Niveau herabsinkt.
Die D-Kontraktur des Ca verschwindet plötzlich, wenn man dem
Darnı Salze anderer zweiwertiger Metalle, z. B. Chloride von Mg, Zn,
Col, Mn! verabreicht. Aluminiumchlorid bzw. -sulfat wirkt nur
manchmal, oft ist es ohne Einfluß. SrCl, ist wirkungslos. BaCl,, wie
zu erwarten, verstärkt sogar die Kontraktur. Dies alles weist darauf
hin, daß das Verbleiben der spezifischen Calciumwirkung die D-Kon-
traktur verursacht und nicht einfach das Fehlen des zwei- (bzw. mehr-)
wertigen Metalles. Besonders das Verhalten des Strontiums spricht für
diese Auffassung, welches allein den Darm nur in größeren Gaben
reizt, und kann das Ca doch nicht ersetzen. Die Wirkung von Mg,
besonders Zn, Co und Mn könnte ihre Erklärung einfach darin finden,
daß sie auch allein eine hemmende und tonussenkende Wirkung haben
(s. weiter unten).
Atropin (vorher bzw. nachträglich gegeben) beeinflußt die Ca-D-
Wirkung gewöhnlich nicht. Es ist daher anzunehmen, daß in Fällen,
wo die Kontraktur durch Atropin scheinbar vermindert ist, der Ausfall
der Cholinwirkung die Erscheinung vortäuscht.
Am Katzendarm ist die Empfindlichkeit gegenüber einer D-Wirkurg
des Calciums viel kleiner. 1 Ca reizt oft nicht. Calciumfreie Lösung gibt
1) W. Storm van Leeuwen und van d. Broeke, Arch. f. exper. Path.
u. Pharm. 88, 1920.
2) L. Jendrassik, l.c.; s. auch weiter unten.
212 L. Jendrassik u. E. Annau:
aber (nach normaler Tyrodelösung) schöne, in 4 bis 6 Minuten ablaufende
Kontrakturen, während auch die Darmbewegungen sich verstärken (siehe
Abb. 2). Auch das Calciumparadoxon ist ausgeprägt vorhanden.
Abb. 2. Katzendarm. (23. Juni 1924.) Vorübergehende Kontraktur
in calciumfreier Tyrodelósung (OCa).
Der Darm des oben erwähnten Katers, welcher sich gegenüber Kaliam
abnorm verhielt, ergab nur schwache und kurzdauernde Calcium-D-Kon-
trakturen.
Der Darm eines etwa 10 kg schweren männlichen Hundes (in nicht
aufgeschnittenem Zustande) zeigte beim Wechseln mit einer Ca-armen
bzw. Ca-freien Tyrodelösung verstärkte und mehr geordnete Bewegungen.
Wurde normale Lösung nach Ca-freier gegeben, so entstand eine kleine
vorübergehende Kontraktur. Steigern des [Ca] lähmte; eine D-Wirkung
oberhalb der normalen Konzentration bestand nicht. Es ist recht gut
möglich, daß die Unterschiede zwischen den größeren und kleineren Tieren
durch die Dicke der Darmmuskulatur bedingt sind. Hundedarm ist übrigens
wegen Unregelmäßigkeit seiner Bewegungen für eine genaue Beobachtung
dieser Verhältnisse nicht sehr geeignet.
Am Katzendarm ist auch die D-Wirkung des Calciums mit Atropin
hemmbar. Nach vorher gegebenem Atropin kommt diese Wirkung
nicht zustande (Atropingaben, wie oben angegeben).
Auch an der Ringmuskulatur des Kaninchen- und Katzendarms
ist die D-Kontraktur, ebenso die hemmende Wirkung bei Rückkehr
zur normalen Lösung stets nachzuweisen. Ebenso wie Katze- und
Kaninchendarm verhält sich gegenüber Konzentrationsänderungen
des Ca der Meerschweinchendünndarm.
Natrium. Will man die Wirkungen des Na-Ions untersuchen, so
stößt man, wie bekannt, auf zweierlei Schwierigkeiten. Die eine ist,
daß die Veränderung der NaCl-Konzentration eine beträchtliche sein
muß, um dadurch wahrnehmbare Wirkungen zu erhalten; man ver-
ändert aber dann auch nicht unbeträchtlich den osmotischen Druck
der Lösung. Zweitens, man kann nicht wissen, ob die beobachtete
Reaktion vom Natrium selber herrührt oder von dem mit ihm ver-
Kationenwirkungen. III. 213
bundenen Säureanion. Diese Frage können nur besondere Kontroll-
versuche entscheiden.
Vermindert man die NaCl-Konzentration der Tyrodelósung, so
erscheint am Kaninchendünndarm eine vorübergehende Kontraktur.
Beim Wechseln der normalen Lösung mit einer, die nur die Hälfte des
Normalen (also 0,4 Proz.) enthält, kann diese Kontraktur von sehr
verschiedener Stärke sein. Manchmal ist sie kaum zu bemerken, in
anderen Fällen ist sie sehr hoch. Schon während oder nach Ablauf der
Kontraktur werden die Bewegungen des Darmes schwächer, gewöhnlich
verschwinden sie auch ganz. Eine ähnliche Wirkung erhält man, wenn
man ganz NaCl-freie Tyrodelösung dem Darm verabreicht. Das Ver-
schwinden der Spontanbewegungen tritt so aber in noch kürzerer Zeit
6"
han?
YNa(hypot) 7951:
| Y Nalr
|
Abb. 3. Kaninchendarm. (20. April 1924.) 1|,Na+Ur. = 0,4 Proz. NaCl enthaltende
Tyrodelösung, durch Ureum isotonisch gemacht. !/ Na hypot. = dieselbe ohne Ureum.
ein. Gibt man nach den natriumarmen Lösungen normale Tyrode, so
kommt eine kurzdauernde Tonussenkung zustande; ist diese vorbei,
so kehren auch die Bewegungen allmählich zurück.
Die Wirkungen sind nicht durch Veränderung des osmotischen
Druckes verursacht. Machen wir nämlich die natriumarme Lösung
durch Zufügung einer entsprechenden Menge Carbamid isotonisch
(z. B. bei 0,4 Proz. NaCl mit 0,772 Proz. Carbamid), so kommen die
erwähnten Kontrakturen dennoch zustande (Abb. 3). Nur die Höhe
der Kontraktur scheint etwas kleiner zu sein. Dem Beginn der Kon-
traktur geht so bei hypotonischer wie carbamidhaltiger Lösung eine
flüchtige Hemmung voraus. Die kleinere Kontraktur der carbamid-
haltigen Lösung könnte ihre Erklärung darin finden, daß in der ver-
Biochemische Zeitschrift Band 162. 15
214 L. Jendrassik u. E. Annau:
wendeten Konzentration das Carbamid kein indifferenter Stoff ist und
den Darmtonus in bestimmtem Grade zu senken fähig ist. Fügen wir
zu einer in normaler Tyrode befindlichen Darmschlinge 2 bis 3ccm
einer proz. Lösung (0,35 Proz.), so kommt schon cine deutliche
hemmende Wirkung zustande. (Beim Auswaschen des Carbamids mit
normaler Tyrodelösung erscheint eine vorübergehende Kontraktur.) Da
diese Wirkungen des Carbamids den beobachteten entgegengesetzt.
sind, ist es sicher, daß auch in den mit Garbamid isotonisch gemachten
Lösungen das NaCl die Wirkungen verursacht.
Vertauschen wir eine 1,NaCl-haltige hypotonische Lösung mit
‘arbamidhaltiger isotonischer, so hat dies auf den Darm keinen Einfluß.
Der Wechsel in entgegengesetzter Richtung ist (außer einer flüchtigen
Hemmung) auch indifferent.
Machen wir die NaCl-freie Lösung mit Lactose isotonisch (indem
wir anstatt 0,8 Proz. NaCl 8.76 Proz. Lactose nehmen), so erhalten
wir ganz ähnliche Wirkungen wie beim Gebrauch von Carbamid.
Schwerer ist zu entscheiden, ob das Na- oder das Cl-Ion das wirk-
same ist. Da die meisten Anionen, so auch jene, die dem Cl am
nächsten stehen (F, Br, J). alle in entgegengesetzter Richtung wirken),
ist es im bestimmten Grade wahrscheinlich, daß diese Wirkungen
nicht vom Cl-Ion herrühren. Dies wird auch von dem Umstand gestützt,
daß auch am Froschherzen das Na und nicht das Cl das wirkende
Agens ist?).
Man könnte auch gegen die vorübergehende Natur der beschriebenen
Kontrakturen einen Einwand erheben. Es wäre nämlich zu denken, daß
die niedrige Na-Konzentration selbst manent wirkt, daß aber unter Einfluß
des Carbamids bzw. der Hypotonie der Tonus sich erniedrigt. Gegen
diese Auffassung spricht aber jener Umstand, daß die hemmende Wirkung
des Carbamids in viel kürzerer Zeit abklingt als die Kontraktur. Anderer-
seits sind in hypotonischen Lösungen manente Kontrakturen wohl möglich
(z. B. durch BaCl,).
Die Verminderung der [Na] wirkt an der Ringmuskulatur ganz
ähnlich wie an der Längsmuskulatur. (Wir untersuchten NaCl-freie
und 13, NaCl enthaltende Lösungen, die mit Carbamid isotonisch
gemacht waren. Die Kontrakturen sind auch hier vorrübergehender
Natur.)
Bein: Steiyern der NaCl-Konzentration über den normalen Wert
(auf 75ccm Ty + 2 bis 4ccm l0proz. NaCl) kommt (oft nach einer
kurzdauernden Tonussenkung) eine schnell vorübergehende, manchmal
starke, manchmal schwache Kontraktur zustande. Dies wird durch
eine Verkleinerung der Bewegungsamplituden gefolgert. [Auch hierin
1) Vgl. L. Jendrassik urd L. Antal, diese Zeitschr. (erscheint náchstevs).
23 8.0. Zondek, eberdaselbst 121, 87, 1921.
Kationenwirkungen. Ill. 215
besteht eine Analogie mit dem Froschherzen!).] Bei Rückkehr zur
normalen Tyrodelösung erscheint eine vorübergehende Hemmung
(s. Abb. 4). Es scheint daher auch für das NaC] eine ‚‚kritische Konzen-
tration** zu bestehen, bei welcher die Richtung der Wirkungen ins ent-
gegengesetzte umschlägt. Diese Verhältnisse sind daher dem Kalium
(-Chlorid) ähnlich. Die kritische Konzentration könnte etwas ober-
halb der normalen Konzentration liegen.
dl H
IN | | N
+4.10%Na CE N
(in TOcc Tyrode)
Abb. 4. Kaninchendarm. (17. Dezember 1924.) Wirkung der Steigerung
und Verminderung der [NaCl] oberhalb des normalen Wertes.
(Ty = Tyrodelósung )
Nichts zeigt darauf, daß hier die Hypertonie von Wirkung wäre.
Hiergegen spricht schon, daß die Hypotonie unwirksam ist. Erhöhen
wir den osmotischen Druck der Lösung durch Zufügen von anderen,
möglichst unwirksamen Substanzen in ähnlichem Maße, so gelingt die
Entscheidung dieser Frage doch nicht. Carbamid, Glucose, Saccharose
sind nämlich in so hohen Konzentrationen schon nicht indifferent für
den Darm (wirken hemmend).
Zusammenfassend kann man daher über die Wirkungen des NaCl
folgendes sagen: Bei der Veränderung seiner Konzentration in jeder
Richtung zeigen sich am Darm vorübergehende Änderungen. Unterhalb
der normalen Konzentration ist das Na-Ion wirksam. Die Hypotonie
ist wirkungslos, der Einfluß des Chlorions nicht wahrscheinlich. Ober-
halb der normalen Konzentration kann die Möglichkeit eines Einflusses
des osmotischen Druckes, ebenso des Cl-Ions nicht direkt ausgeschlossen
werden. Höchst wahrscheinlich ist aber, daß das Na-Ion auch hier
das wirksame ist.
Die Wirkung einer Veränderung der [NaCl] wurde am Warmbliter-
darm unserem Wissen nach noch nicht untersucht. An ausgeschnittenen
Ringen des Froschmagens gelangte Fruböse?) zu Ergebnissen, die mit den
1) S. G. Zondek, Le
2) A. Fruböse, Zeitschr. f. Biol. 70, 461, 1920.
JL
+
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e $
d
EI
E)
+
-~
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3
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-e
=
ben.
_
-+
ben
Ki
e
L. Jendrassik u. E. Annau:
g, in welcher das KCI mit einer äquivalenten Menge RbCl
Tvrodelösun
TyRb
Tyrodelösung, die nur die !/ bzw.
(31. Oktober 1924.)
ilə K, !, K
Wirkung von Rb und Cs am Kaninchendarm.
Abb. 5.
1, Konzentration von KCI enthält.
Jl
Abs
ds. mit Cs C
TyCs
ersetzt ist.
unseren in verschiedener Hinsicht
analog sind. Am Frosch- bzw. Sáuge-
tierherzen beschäftigten sich bereits
mehrere Autoren mit diesem Gegen-
stand 1). Die Wirkung schreiben sie
dem Na-lon zu. Sie befassen sich
aber nicht mit der Frage, warum
diese Wirkungen von vorübergehen-
dem Charakter sind.
Die Wirkungen des Rubidiums
und Caesiums haben wir nur am Ka-
ninchendarm untersucht. Vertauscht
man die normale Tyrodelösung mit
einer, in welcher KCl durch RbCl
substituiert ist, erscheint eine vor-
übergehende Kontraktur, als ob man
den Kaliumgehalt erniedrigt hätte.
Dies entspricht der bekannten Tat-
sache, daß an Nerven und Muskel
Rb schwächer wirkt als K. Ver-
gleicht man die Rb-haltige Lösung mit
einer von niedrigerem Kaliumgehalt,
so erweist sich diese mit %R ent-
haltender als gleichwirkend (siehe
Abb. 5). Dementsprechend erscheint
beim Wechseln der Rb-Tyrode mit
Rb-(und K-)freier Lösung auch eine
vorübergehende Kontraktur, auf Rb-
Tyrodelösung zurückkehrend, eine
dem K-Paradoxon ähnliche Lähmung.
In der Wirkung des Caestums
zeigt sich ein Unterschied gegenüber
dem Rb. Nach normaler Lösung
erzeugt nämlich Cs-Tyrode (dem Kb
ähnlich) die kurzdauernde Kontrak-
tur, diese geht aber noch vor seinem
Verschwinden in eine manente Kon-
traktur über. Dieselbe manente Kon-
traktur entwickelt sich auch dann,
wenn wir CsCl zur normalen Tyrode-
fliissigkeit des Darms zufügen. Beim
Entfernen dieser Cs-haltigen Lösung
sinkt der Tonus nur sehr allmählich
auf sein ursprüngliches Niveau zurück.
1) R. Böhm, Arch. f. exper. Path.
u. Pharm. 75, 230, 1914; T. Sakai,
Zeitschr. f. Biol. 62, 295—357; 64,
505 — 548; F. B. Hoffmann, eben-
daselbst. 66. 293, 1916; S. @. Zondek,
l.c.: bez. Skelettmuskel vgl. R. Benda,
Zeitsehr. f. Biol. 63, 11, 1914.
NS)
—
=]
Kationenwirkungen. III. 2
[Die Schwellenkonzentra-
tion, die zur Erzeugung einer
Wirkung nötig ist, ist mit
der von KCI ungefähr áqui-
molekular!)]. Es scheint, als
ob das Cs, trotzdem es eine
starke kontrakturerzeugende
Wirkung hat, das K nicht
vollwertig ersetzt. Dies weist
darauf hin, daß das Äquili-
brierungsvermögen und die
Wirkung auf den Tonus nicht
dieselbe sind. P
Cs erzeugt daher manente
Kontrakturen. Rb hat aus-
geprägte Potentialwirkungen,
die dem Kalium ähnlich sind.
Die Wirkung des Li-
thiums auf den Darm ist aus
mehreren Gesichtspunkten
interessant. Am Kaninchen-
dünndarm erzeugt das LiC!]
. schon in kleinen Konzentra-
tionen augenfällige Wir-
kungen. Darum kann Li
kein Vertreter des Natriums
sein. Fügen wir zur nor-
malen Tyrodelósung 1 ccm
einer 5proz. LiCl-Lösung,
so ruft dies eine schnell ab-
laufende Hemmung hervor,
nach welcher die Spontar -
hbewegungen (ebenso vor-
übergehend) stärker wer-
den. Bei Wiederkehr zur
Tvrodelösung kommt eine
ebensolche zweiphasische
Wirkung zustande: eire
flüchtige, intensive Kor-
traktur, wonach die Be-
wegungen vorübergehend
kleirer werden. Ähnlich ist der Erfolg, wenn wir einen Teil (z. B. !/,) des
NaCl mit äquimolekularer Menge LiCl ersetzen (s. Abb. 6). So verfahrend,
folgt der verursachten anfänglichen Hemmung eine ebenso vorübergehende
Kontraktur. Auch die Diminutionskontraktur ist bei dieser Konzentration
LiCl höher (ganz so verläuft der Versuch, wenn wir trotz des zugefügten
LiCl den NaCl-Gehalt nicht verringern). Ist die Hälfte des [NaCl] mit
LiCl ersetzt, so ist die nach der Hemmung auftretende Kontraktur sehr
hoch, nahezu maximal (s. Abb. 6), jedoch ist die Diminutionskontraktur
LGL zb
normale Tyrodelösung.
Ty =
N
des NaCl durch LiCl ersetzt ist.
j | \
\ Nana
|
Wirkung von Li am Kaninchendarm. (31. Oktober 1924.) 12 Li, 1/5 Li = Tyrodelosung, in welcher 1/2 bzw. !/, Teil
|
|
|
:
|
|
=
=
de
Abb. 6.
1) Vgl. Hanke urd Koessler, Journ. f. biol. Chem. 43, 579, 1920; A.-J
Clark, Journ. of Pharm. 18, 423, 1922 (Uterus, Darm).
218 L. Jendrassik u. E. Annau:
nicht größer. Ausgeprägt ist nachher die Verminderung der Bewegungs-
amplituden. Wird das ganze NaCl mit LiC! ersetzt, so verschwinden die
Bewegungen. Die Schwankungen des Tonus haben aber einen ganz analogen
Verlauf wie bei Anwesenheit von Natrium. Die Diminutionswirkungen
sind ganz wie erwähnt. In % NaCl und Na-freien Lösungen sind die Wir-
kungen natürlich nicht allein durch das Li, sondern auch durch die Ab-
nahme des [Na] verursacht. Daß aber die Wirkungen des Na von unter-
geordneter Bedeutung sind, geht schon daraus hervor, daß z. B. eine Ver-
minderung des [Na] mit !/, Teil des Gesamtwertes allein keine Wirkung
hat. Bei Rückkehr auf normale Tyrodelösung erhält man nach
Le NaCl oder 0 NaCl Hemmungen; wird die Lösung mit Lit)
isotonisch gemacht, so kommen, wie gesagt, Kontrakturen zustande An
der Ringmuskulatur sind die Wirkungen genau den Abbildungen der
Längsmuskulatur.
Diese Wirkungen des Lithiums sind schon darum interessant,
weil sie beweisen, daß für den Darm das Li einerseits nicht in-
different ist, andererseits daß es das Na nicht ersetzen kann. Dies
ist auffallend, weil das Li in seinen bekannten Wirkungen dem Na
sehr nahe steht.
Nach Zondek!) soll es am Froschherzen ebenso unwirksam sein
wieGlucose. Nach anderen Autoren soll das Natrium durch Li ersetzbar
sein1), Pugliese?), der die Ionen auf Grund ihrer physiologischen
Wirkungen einteilt, reiht das Li mit dem Na zusammen zwischen
die unwirksamen Ionen. Daß am Kaninchendarm das Li starke
Wirkungen zu entfalten imstande ist, folgt aus dem Gesagten in
unzweldeutizer Weise.
Andererseits sind die Wirkungen des Lithiums interessant, weil
in ihnen verschieden gerichtete Phasen zu unterscheiden sind. Die
Augmentationswirkung besteht — wie gesagt — aus einer Lähmung
und der darauffolgenden Erregung (hierin besteht mit der Na-D-Wirkung
eine Ähnlichkeit, nur die Lähmung ist mehr ausgesprochen) ; die Diminu-
tionswirkung ist zuerst eine Kontraktur, welche nachher von einem
Kleinerwerden der Amplituden gefolgt wird. Diese Erscheinungen
könnten erklärt werden mit der Annahme, daß die Veränderung
der [Li] die antagonistischen Funktionen in entgegengesetzter
Richtung beeinflußt, aber nicht gleichzeitig, so daß zuerst die eine
und nachher die folgende das Übergewicht erreicht.
Betreffs der Wirkungen des Magnesiums weisen wir auf das in der
ersten Mitteilung Gesagte. Interessant ist, daß zwar in der Ca-haltigen
Lösung die Wirkungen der Zufügung von Ca und Mg eine völlige Parallelitát
aulweisen, trotzdem das Ca durch Mg nicht ersetzbar ist. In Ca-freier
Lösung, wo die Darmbewegurgen reversibel sistieren, erscheinen diese auf
Zufügung von Mg Cl, nicht wieder. Steigert man den MgCl,- Gehalt oberhalb
0,03 Proz., so verschwinden sie endgültiz, und auch in normaler Tyrode-
lösung kehren sie nieht wieder.
1) S. G. Zondek, l. œ.
2) 4. Pugliese, Arch. ital. Biol. 46, 371, (1906).
Kationenwirkungen. III. 219
Das Barium (als Chlorid verabreicht) verursacht am Kaninchendarm
(wie an glatten Muskeln allgemein) schon von 0,002 Proz. (wasserfreien)
BaCl, an Kontrakturen. Diese werden als typische Muskelwirkungen
aufgefaßt. Niedere Kontrakturen sind von vorübergehender Natur und
sind anscheinend Augmentationswirkungen. Die Spontanbewegungen
werden gar richt oder nur auf dem Gipfeı der Kontraktur vorübergehend
geschädigt. Beim Tausch auf normaler Lösung erhält man keinen Effekt:
Diminutionswirkung hat das Barium nicht. Oberhalb 9,01 bis 0,02 Proz.
sind die Kontrakturen schon hoch und bleibend, mit einem Schwund der
Spontanbewegungen einhergehend.
Das Strontium(-chlorid) steht seinen chemischen Eigenschartea ent-
sprechend auch in seirer Darmwirkung zwischen Calcium und Barium!).
Während Ca lähmt und Ba reizt, beeinflußt das Sr gewöhnlich auch in
großen Gaben (bis zu 0,1 bis 0,2 Proz. SrC1,) den Tonus nicht. Eine manente
Wirkung zeigt sich indessen darin, daß die Darmbewegungen unregel-
mäßig werden. Manchmal erhält man ein Bild, als ob Ca- und Ba-Wirkungen
sich periodisch abwechseln würden. (Dies wäre möglich, wenn Ca und Ba
auf ein anderes Strukturelement des Nervmuskelapparates angreifen würden
und das Sr die Eigenschaften des Ca und Ba in sich vereinigt enthalten
würde.) Bei höheren Sr-Konzentrationen (nur ausnahmsweise unterhalb
0,1 Proz. SrCl,) erscheint eine allmählich einsetzende manente Kontraktur.
Geben wir nach SrCl, von neuem die norm Je Tyrodelósang, so tritt (zwar
nicht immer) eine vorübergehende Kontraktur auf (hierin erinnert es an
Calcium). In dieser Diminationswirkung besteht die einzelne Potential-
wirkung des Strontiums.
Es wurden auch andere mehrwertige Kationen auf ihre Darmwirkungen
untersucht. Es ist bereits bekannt, daß schwere Metalle in kleinen Dosen
an glatten Muskeln im allgemeinen tonussenkend wirken?). In unseren
Versuchen erwies sich als eine manente Wirkung des untersuchten Zn,
Co und Mn, daß die Darmbewegungen nach einer längeren Berührung mit
ihnen ihre Regelmäßigkeit allmählich einbüßen, endlich auch vollständig
verschwinden. Andererseits verkleinern sie in genügenden Dosen (z. B.
10 mg ZnCl, CoCl, oder MnCl,) auch die Amplituden dauernd. Beim
Auswaschen erscheint beim Zn und Mn keine oder nur eine unbedeutende
Diminutionswirkung. Beim Co ist diese jedoch deutlich vorhanden. Ähn-
liches beobachtete bereits Fienga an der Ösophagusmuskulatur des Huhnes?).
Die Wirkungen des dreiwertigen Aluminiums unterscheiden sich nicht
sehr von denen des zweiwertigen. Oberhalb 10 bis 20 mg hemmt Al-Sulfat
oder -chlorid die Darmbewegungen. (Hierdurch ist es fähig, die Diminutions-
kontraktur des Calciums zu lösen.)
Es tritt aber bei denselben Gaben AJ-Sulfat oft eine vorübergehende
Erregung auf. Dementsprechend wird die Hemmung einer größeren Gabe
durch eine flüchtige Kontraktur eingeleitet. Beim Auswaschen mit frischer
1) Auch gegenüber den peripherischen Nerven verhalten sie sich ähnlich:
Boruttau und Grassheim, Zeitschr. f. exper. Med. 27, 1922; vgl. auch Grützner,
Pflügers Arch. 53, 83, 1893; am Hühnerösophagus: G. Tienga, Zeitschr.
f. Biol. 54, 230.
2) A. Pugliese, l. c.; G. Fienga, l. c.; W. Salant und C.W. Mitchell,
Proc. Soc. Exper. Biol. New York 13, 15, 1915; Siccardi, Arch. sc. Med. 3%,
58, 1914; W. B. Bell, Lancet 206, 267, 1924.
3) Fienga, 1l. c.
220 L. Jendrassik u. E. Annau:
Tyrodelösung ist eine Diminutionskontraktur manchmal ausgeprägt vor-
handen; oft erscheint aber keine Wirkung (s. Abb. 7).
Die beschriebenen Potentialwirkungen sind von An- oder Ab-
wesenheit fremder Kationen nicht unabhängig. Die Untersuchung des
Zusammenhangs der Wir-
IH Dat? kungen der Kationen ist
6” auch betreffs Erklärung
der _Potentialwirkungen
Matt von Interesse. Nämlich
(10%) 92cc Al.sulf. | schon das Bestehen eines
Zusammenhangs weist dar-
auf hin, daß bei diesem
nicht nur dasjenige Kation
eine unmittelbare Rolle
spielt, dessen Konzentra-
tion wir verändern.
Abb.7. Wirkung von Aluminiumsulfat am Kaninchen» Bereits in der ersten
e ESA Mitteilung wurde erwähnt,
daß die ,, supernormale D-Kontraktur‘‘ des Calciums in kalifreier Lösung
schwächer ist oder auch ganz ausbleibt. Nun untersuchten wir den
Einfluß des Kaliummangels auf die subnormale D-Wirkung. Auch hier
stehen wir mit keiner unbedingten Regelmäßigkeit gegenüber. Jedoch
ist die Kontrakturhöhe fast immer kleiner als bei Anwesenheit von K,
manchmal bleibt die Kontraktur ganz aus. Regelmäßig ist aber die
Beeinflussung der subnormalen Augmentationswirkung. Nämlich bei
xückkehr auf normale Tyrode ist die Hemmung bei Kalimangel nur
schwach ausgeprägt, fast gar nicht vorhanden, auch dann, wenn die
D-Kontraktur unbeeinflußt zustandegekommen ist.
Auf dieser Grundlage könnte man denken, daß die D-Wirkung bei
Anwesenheit von mehr Kalium stärker wird als bei normalem Kalium-
gehalt. Dies ist aber nicht der Fall. Bei einem dreifachen K Cl-Gehalt
(0,06 Proz.), wo der Tonus derselbe oder nur unbedeutend höher ist als
in normaler Lösung, ist die Calcium-D-Wirkung nie stärker, gewöhnlich
schwächer. Das Calciumparadoxon (A-Wirkung) fehlt dabei vollständig.
Verringert man die Konzentration des Kaliums in caleiumarmer
Lösung (14 Ca, 15 Ca), so kommt die Diminutionskontraktur dennoch
zustande. Nur das Paradoxon (Augmentationswirkung) ist von etwas
kürzerer Dauer. Es scheint, daß bei diesen Versuchen das Verschwinden
der Mobilität oft irreversibel ist. Wahrscheinlich dies verursacht es,
daß diese Versuche nicht ganz eindeutig verlaufen, und der Einfluß
des Ca-Mangels aus ihnen nicht ganz klar zu entnehmen ist.
Bei gleichzeitiger Verringerung der K- und Ca-Konzentration ist
es auffallend, daß die Diminutionskontrakturen sich nicht summieren.
Kationenwirkungen. III. 221
Geben wir nach normaler Tyrodelösung eine kalifreie Lösung, die
gleichzeitig auch weniger Ca (1 oder 1; Ca) enthält, so ist die Kontraktur
nicht höher, als wenn wir kaliumfreie Lösung mit normalem Ca-Gehalt
gegeben hätten. Interessant ist es außerdem, daß in der 1, Ca ent-
haltenden kalifreien Lösung die Bewegungen in kurzer Zeit (2 bis 4 Mi-
nuten aufhören, während bei Anwesenheit des ‚‚antagonistischen‘
Kaliums bei dieser [Ca] die Darmmotilitát in so kurzer Zeit kaum
leidet. Zur normaler Tyrodelösung zurückkehrend, summieren sich die
Hemmungen ebenso nicht; die Lähmung verschwindet in kurzer Zeit.
Der Calciummangel beeinflußt auch die Diminutionswirkung des
Natriums nicht. Die 1, Na enthaltende und mit Carbamid isotonisch
gemachte Lösung verursacht bei 1⁄4 Ca-Gehalt ebensolche Kontrakturen
wie bei normaler Ca-Konzentration.
Vom Einfluß des Magnesium auf die D-Kontraktur des
Calciums haben wir bereits in der ersten Mitteilung Erwähnung getan.
Enthält die Tyrodelösung die vorgeschriebene Konzentration MgCl,
(wasserfrei 0,01 Proz.), so ist diese gewöhnlich minder hoch, manchmal
bleibt sie sogar vollständig aus (s. Abb. 8). Noch mehr leidet auch hier
ung‘
dE e?
Abb. $8. Kaninchendarm. (24. Oktober 1924) Hemmende Wirkung des Magnesiums auf die
PsKontraktur des Calciums. Ty, Ty — Mg = Mgsfreie Tyrodelösung, !/4 Ca = !/, der norm.
[Ca Cl] enthaltende Mg+freie Ty;Lösung; '/, Ca + Mg = ds., jedoch 0,01 Proz. Mg Cl, (wasserfrei)
enthaltend.
die subnormale Augmentationshemmung. Bei dreifachem Mg Cl,-Gehalt
(0,03 Proz. MgCl,) wird die D-Kontraktur des Ca regelmäßig vermißt.
Die Wirkungen des Kaliums werden durch das Magnesium nicht
verändert. Die Diminutionskontraktur ist bei 0,01 wie 0,03 Proz.
MgCl, immer ungefähr ebenso hoch als in Mg-freier Lösung; zum
Zeichen, daß das Mg nicht im allgemeinen die Kontrakturen hindert,
sondern speziell die Wirkungen des Calciums.
222 L. Jendrassik u. E. Annau:
Versuche am Uterus.
Die Augmentations- und Diminutionswirkungen von Kalium und
Calcium haben wir auch am Uturus einiger Tiere untersucht. Die
Versuchsanordnung war den Darmversuchen gleich. Die verwendete
Tyrodelösung war manchmal Mg-haltig, manchmal Mg-frei. Die Uteri
waren noch vor Beginn der eigentlichen Versuche in üblicher Weise
10 bis 20 Minuten gedehnt. Nachher war die Belastung der Präparate
ihrer Größe gemäß 1 bis 4g.
Die tonussteigernde Wirkung des Kaliums (und Rubidiums,
Caesiums) ist bekannt!). Aus diesem Grunde empfiehlt Spuelh das
KCl zur Standardisierung von Hypophysis- und Seealepräparaten?).
Auch für die Praxis wurde es als Uterustonicum empfohlen’).
Das Steigern des Kaliumgehaltes auf das Vier- bis Sechsfache (also
0,08 bis 0,12 Proz. KCl) bringt eine Erhöhung des Tonus oder Stärker-
werden der Bewegungen zustande, welches bei kleinen Gaben vorüber-
gehend, bei größeren ganz oder zum Teil dauernd ist. Oft beginut die
Reaktion mit einer Kontraktur und löst sich in Form verstärkter Bewegungen
auf. Am Katzenuterus zeigen sich bei hohem K-Gehalt besonders starke
Spontanbewegungen, und hoher und niederer Tonus wechseln sich dabei
periodisch ab. Kehren wir zum normalen K-Gehalt zurück, so erhalten
wir keine wahrnehmbare Diminutionswirkung. Die verstärkten Bewegungen
bleiben aber gewöhnlich auch weiterhin bestehen.
Die Kontrakturen, die beim Verringern des Kaliumgehaltes auftreten,
sind schon durch A. J. Clark?) beschrieben, ohne daß er sich aber mit
der Erklärung ihrer vorübergehenden Natur befaßt hätte. Gibt man nach
normaler Tyrodelösung eine kaliumfreie, so erhält man an der Kaninchen-
oder Katzengebärmutter bedeutende, manchmal maximale Kontrakturen.
Beim Wechsel auf % K bleibt diese Wirkung gewöhnlich aus. Der Uterus
eines (nicht trächtigen) Kaninchens war aber sehr empfindlich, und das
Sinken der Kalikonzentration auf !/, rief an diesem schon eine merkliche
(vorübergehende) Erregung hervor. Atropin hemmt diese D-Kontrakturen
(an der Katze) nicht.
Zum normalen K-Gehalt zurückkehrend, zeigt sich die paradoxe
Lähmung immer nur kurzdauernd. In 1 bis 10 Minuten hat sich die frühere
Motilität wieder hergestellt. Manchmal verschwinden die Bewegungen
gar nicht und die Wirkung besteht nur in einer vorübergehenden Senkung
des Tonus. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Angaben
von de Raad5), der die lange Dauer des Kaliumparadoxons am Uterus
hervorhebt. (In einem Falle dauerte nach ihm die Lähmung 2 Stunden.)
1) Mathison, Journ. of Phvsiol. 42, 471, 1911; Hanke und Koessler,
l.c. S. 12; Wasicrky, 1919; zitiert nach Rosenmann, Zeitschr. f. d. ges.
exper. Med. 29, 334, 1922.
2) R. A. Spaeth, zitiert nach Smith und Clorky, Publ. Health. Rep.
1923, S. 493; Tate und Clark, Arch. pharm. 26, 1921.
3) T. Franz, Wien. klin. Wochenschr. 32, 278, 1919.
1) A. J. Clark, l.c. S. 12.
5) H. de Raad, Dissertation Utrecht 1922.
Kationenwirkungen. IlI. 223
Die Wirkungen des Calciumions können bekanntlich je nach
Tierart und Zustand des Uterus sehr verschieden sein. Genügend
bekannt sind die Wirkungen, die beim Steigen des Ca-Gehalts auf-
treten!). Dem Einfluß einer Verringerung der [Ca] wurde bisher keine
Aufmerksamkeit gewidmet. Ebenso unbekannt sind die Wirkungen der
[Ca] unterhalb des normalen Wertes. Bekannt ist nur die manente
Wirkung der niederen Calciumkonzentration: die Bewegungen werden
dabei schwächer [darum pflegt man bei pharmakologischen Standar-
disierungen Lösungen mit 1, Ca zu verwenden?)].
Nach Potentialwirkungen suchend, untersuchten wir die Wirkungen
ebenso unterhalb wie oberhalb der normalen Konzentration. Die
Resultate fassen wir in der untenstehenden Tabelle zusammen. Ein-
fachheitshalber sind die subnormalen A- und D-Wirkungen mit n/A
und n/D bezeichnet, die supernormalen Wirkungen mit A/n bzw. D/n.
Diese Bezeichnungen glauben wir berechtigt, weil die sich ergebenden
Wirkungen wahrscheinlich wahre Augmentations- und Diminutions-
wirkungen sind. Das + -Zeichen bedeutet Tonusvermehrung oder
Stärkerwerden der Bewegungen; das —-Zeichen bedeutet das Gegenteil:
Hemmung. 0 = keine Wirkung. In der letzten Rubrik sind die-
jenigen kleinsten Ca-Dosen eingetragen (in Milligramm wasserfreien
Wirkung des Calciums auf den überlebenden Uterus.
| Das
| l Mgs l l y , o
| , en ` Wirkung | zugefügte
Nr. | Tier Se Uteruspräparat Ge d
' , rodes i ; i j m au
d | lösung Ä ` D WA En Ä SEH TU ccm)
ae “e ei eer e SST ees Ze SC Ke ze ss T T SC ar Feel + = =; EC 5 id Ch a = Fe
1 ` Katze ' + L Körper + Horn i 0 | 0 0 + ' 100
2,5 kg, gravid ` 2, Horn 0,0 0 | + ' 100
AN Meerschweinchen. — lL , a Sg SE DE 25
‚220g, nicht gr. a y d E + 25
3 , Kaninchen | — 1 a +. | + Paz 50
‚1,5 kg, nicht gr. 2. 5 + El + — 50
4 Meerschweinchen + 'l, Nicht gr. Hom + — , + — 715
340 g, gravid | 2, Ein Teil | = | | 5
Ä y y des gr. Hornes ` T Ba SS wa 19
D Meerschweinchen + | l. Körper + Horn ` */. | Ef + l=5v 150
260 g, gravid f 2. Horn ger E eg +1: 150
6 Meerschweinchen. + '1. Körper + Hom +: + Y —o 37
\ 210g, nicht gr. 2. Horn © + | Se a = — 12
7 , Kaninchen — hL , 0 | — 10° + 85
1,8 kg, nicht gr. KES. 3 o+: —' + 0 100
8 Kaninchen — ` Körper + Horn + | De + 0% 15
2 kg, nicht gr. | k
I) Vgl. Tate und Clark, Arch. intern. pharmacodyn. 26, 103, 1921;
S. G. Zondek, diese Zeitschr. 132, 362, 1922.
2) Vgl. Trendelenburg und Borgmann, diese Zeitschr. 106, 239, 1920.
224 L. Jendrassik u.
ES
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Kaninchendarm.
BLL pE E E ATREA H HHH bs
Abb. 9.
Calcium eine Tonussteigerung hervorruft
(27. August 1924.) Wirkungen der Steigerung und Verminderung der Calciumkonzentration oberhalb
und unterhalb der normalen 0,02 Proz. Cal,
-
). Annau:
CaCl,), nach welchen in
den betreffenden Versuchen
die supernormalen D-Wir-
kungen untersucht sind.
Es ergibt sich mit vol!-
ständiger Regelmäßigkeit
aus voriger Tabelle, daß die
Richtung der Diminutions-
wirkungen immer die gleiche
ist. In dieser Hinsicht be-
steht eine Ähnlichkeit im
Verhalten von Utsrus und
Darm. Ein quantitativer
Unterschied zeigt sich aber
darin, daß, während beim
Darm die supernormale
D-Kontraktur nie sehr
auffallend ist (und kommt
auch nicht immer zu-
stande), sie am Uterus
sehr ausgeprägt, manchmal
von maximaler Stärke ist
(s. Abb. 9). Umgekehrt
sind die subnormalen Kor-
trakturen am Darm stark
und am Uterus schwach.
Eine solche Kontraktur ist
in Abb. 9 ausgeprägt zu
sehen. Auffallend ist außer-
dem, daß die Ca-Diminu-
tionswirkung nie Hem-
mung seinkann. Auch in
dieser Hinsicht sind Uterus
und Darm gleich.
In den Fällen, wo das
zur Tyrodelósung gefügte
‚scheinen A- und M-Wirkungen
gleichzeitig im Spiele zu sein. Die Tonusstejgerung ist, wenigstens zum
Teil, Augmentationswirkung, weil sie vorübergehend ist, und nach ihr
bleiben nur die verstärkten Spontanbewegungen zurück. In den Fällen, wo
das Steigern des [Ca] eine Lähmung hervorruft, ist die Lähmung auch
vorübergehend, also wahrscheinlich auch A-Wirkung, Potentialwirkung.
In unseren Versuchen zeigt sich aber kein Parallelismus in der Trächtig-
Kationenwirkungen. HI. 225
keit oder Nichtträchtigkeit des Tieres und Wirkungsrichtung der
[Ca]-Steigerung.
Unter der normalen Konzentration ruft die Steigerung des Ca-
Gehalts eine Lähmung hervor. Wie zu entnehmen, ist auch diese
vorübergehend, und ist mitdem Calciumparadoxon des Darmes identisch.
Bei einem Meerschweinchen (6) (bei welchem die supernormale Kon-
zentrationssteigerung eine Lähmung hervorrief), zeigten sich bei der
subnormalen Konzentrationssteigerung flüchtige Kontrakturen. Diese
sind wahrscheinlich auch Potentialwirkungen, weil zwischenliegende
Konzentrationen keinen manent höheren Tonus verursachten.
Es zeigt sich aber ein Zusammenhang zwischen den Augmentations-
und den Diminutionswirkungen. Fehlt die D-Wirkung, so erzeugt die
Steigerung der Konzentration immer eine Erregung. Dies zeigte sich
als eine allgemeine Regelmäßigkeit. Am besten ist es jedoch beim
7. Tier der Tabelle (Kaninchen) sichtbar, bei welchem diz Steigerung
des [Ca] nur das eine Präparat reizte, das andere nicht. An ersterem
war keine D-Kontraktur hervorzurufen, während am anderen diese
sehr ausgeprägt vorhanden war. Auch umgekehrt besteht diese Regel-
mäßigkeit (bei positiver supernormaler Wirkung ist keine Diminutions-
erregung vorhanden). Von diesem Satze bildet aber das Meer-
schweinchen (2) eine Ausnahme, bei welchem die Veränderung des [Ca]
in beiden Richtungen Kontrakturen erzeugte.
Das Calcium hat daher auch an der Gebärmutter auffallende
Potentialwirkungen. Augmentations- und Diminutionswirkungen sind
fast immer von entgegengesetzter Richtung.
Bemerkungen, Folgerungen.
Die beschriebenen Versuche sprechen dafür, daß die Potential-
wirkungen sehr verbreitete Erscheinungen sind. Es sind bisher keine
Salze gefunden, die keine Potentialwirkungen hätten.
In ihrer Darmwirkung dem Kalium gleichen das Na, Rb und Cs,
dem Ca das Mg, schwere Metalle und Al. Li ebenso Ba nehmen eine
Sonderstellung ein. Das Sr scheint die Wirkungen von Ca und Ba in
sich zu vereinen.
Auffallend ist, daß am Darm die Kationen der Tyrodelösung unter
der normalen Konzentration viel stärkere Wirkungen entfalten können
als oberhalb dieser. Am Uterus liegen diese Verhältnisse etwa um-
gekehrt ; im subnormalen Konzentrationsbereich erhält man schwächere
Wirkungen.
Die Kenntnis der Potentialwirkungen wirft auch ein neues Licht
auf die Frage der lonenáquilibrierungen. Der Zusammenhang zwischen
den Wirkungen des Kaliums und Calciums läßt sich nicht ohne weiteres
in das gebräuchliche Schema ihres ‚„Antagonismus“ einfügen. Die
226 L. Jendrassik u. E. Annau:
Wirkungen dieser zwei Jonen sind manchmal entgegengesetzt, manch-
mal parallel. Sie verstärken sich aber nicht nötigerweise wo sie parallel
wirken, und hindern nicht wo sie entgegengesetzt sind.
E. Wollheim?) berichtete vor kurzem über interessante Ergebnisse,
die nach ihm die Theorie von S.G. Zondek über den Wirkungsmechanismus
der vegetativen Nerven zu stützen geeignet sind. Am Hund, Kaninchen
und Katze findet er nämlich nach Vagusreizung eine Zunahme des
Calciumgehalts im Pfortaderblut: nach Reizung des N. splanchnicus
dagegen eine Kaliumanreicherung. Hieraus folgert er, daß im Darm-
gewebe hierdurch die Wirkung des antagonistischen Ions in Übergewicht
geraten muß. Zondek?) sprach nun die Ansicht aus, daß die Wirkung des
Parasvmpathicus durch eine lokale Anreicherung an Kalium, die
Wirkung des Sympathicus durch eine lokale Anreicherung an Calciunı
zustande kommt. Die Versuche sprechen für diese Hypothese, da nach
ihnen bei der Vagusreizung ein relatives Übergewicht des Kaliums, bei
der Splanchnicusreizung cin solches des Calciums bestehen würde. Diese
Resultate selbst sind sicher von großem Belang. Auf Grund unserer
Ergebnisse können wir aber in ihnen keinen Beweis der Zondekschen
Theorie erblicken. Eine absolute Steigerung der Konzentration eines
Ions hat nicht immer dieselbe Wirkung wie die relative Steigerung
(durch Sinken der Konzentration des Antagonisten). Für den Darm
ist nicht nur der K/Ca- Quotient wichtig, sondern vielmehr die absolute
Konzentration der einzelnen Ionen. Verkleinern wir den Kaliumgehalt
der Lösung und rufen dadurch ein relatives Übergewicht des Ca hervor,
so ist die Richtung der Wirkung die gleiche, als wenn wir den K-Gehalt
vermehrt hätten. Die Wirkung des Verlustes von Kalium wirkt daher
eben im Sinne des Vagus, die Splanchnicusreizung kann daher un-
möglich auf diesen Mechanismus zurückgeführt werden.
Zusammenfassung.
Kalium, Calcium und Magnesium verursachen auch am Katzen-
und Meerschweinchendünndarm ,,Potentialwirkungen*, die den Wir-
kungen am Kaninchendarm ähnlich sind. Am Katzendarm verhindert
gewöhnlich Atropin die Diminutionskontraktur von K und Ca, am
Kaninchendarnı aber nicht. Die D-Kontraktur des Ca wird durch
Ausfall der spezifischen Calciumwirkung hervorgerufen und nicht
durch Mangel des zweiwertigen Metalls.
D-Kontrakturen von K und Ca summieren sich nicht. Beim
höheren K-Gehalt ist die Ca-D-Wirkung nicht stärker. Wechsel-
1) E. Wollheim, diese Zeitschr. 151, 416, 1924.
2) S. G. Zondek, ebendaselbst 132, 362, 1922.
Kationenwirkungen. TII. 227
wirkungen von K und Ca lassen sich nicht einfach auf Grund ihres
Antagonismus beschreiben.
Magnesium hindert die Potentialwirkungen des Calciums, nicht
aber die des Kaliums.
Die Abnahme der NaCl-Konzentration verursacht eine vorüber-
gehende Kontraktur. Das Steigern des [Na CI] bis zum normalen Wert
ergibt vorübergehende Lähmung, darüber hinaus: flüchtige Kontraktur.
Eine manente Wirkung der hohen [Na Cl] bestehtin einem Kleinerwerden
der Bewegungsamplituden. Abnahme der Konzentration bis zur
Normalen verursacht eine kurzdauernde Hemmung. Unter dem nor-
malen Wert ist die Abnahme des osmotischen Druckes ohne Einfluß
und dominiert wahrscheinlich die Wirkung des Na-lons.
Caesium, noch mehr das Rubidium, verhalten sich dem Kalium
ähnlich. Das Lithium hat am Kaninchendarm zusammengesetzte
Wirkungen. Bei Steigern seiner Konzentration entsteht flüchtige
Lähmung, nachher vorübergehende Kontraktur, welche später von
einer Verkleinerung der Bewegungsamplituden gefolgt wird. Das Na
kann es nicht vertreten.
Alle diese Wirkungen können analogerweise an der Ringmuskulatur
des Kaninchendarms ausgelöst werden.
An der isolierten Gebärmutter des Kaninchens, der Katze und des
Meerschweinchens sind auch ausgeprägte Potentialwirkungen zu finden.
Die Wirkungen des Kaliums sind mit denen am Darm ähnlich. Die
Diminutionswirkung des Calciums ist von verschiedener Richtung,
je nachdem die Steigerung der Konzentration (über den normalen Wert)
erregend oder lähmend wirkt. Die Richtungen der Augmentations- und
Diminutionswirkungen sind nie identisch. Oberhalb der normalen
Konzentration ist die D-Kontraktur des Ca auffallend stark.
Oft findet man Wirkungen, die nur teils vorübergehend sind. Diese
kommen vielleicht durch ein gleichzeitiges Vorhandensein manenter
und Potentialwirkungen zustande.
Untersuchungen über Diastase?!).
II. Mitteilung:
Wirkt a-Diastase auch j-diastatischh und umgekehrt p-Diastase auch
a-diastatisch?
Vor
Viktor Syniewski.
(Aus dem gärungschemischen und mykologischen Irstitut der Technischen
Hochschule in Lemberg.)
(Eingegangen am H. Juli 1925.)
Wenn man eine sich mit Jod rein blau färbeude Amylodextrin-
lösung mit einem a-diastatischen Gerstenauszug vollkommen ver-
zuckert und die abgespaltene Maltose aus dem Verzuckerungsgemisch
entfernt, so bleibt das rohe, nichtreduzierende Grenzdextrin 1 zurück.
das sich jedoch mit Jod gewöhnlich nicht rein blau, sondern etwas violett-
stichig färbt. Wenn man dann durch fraktionierte Fällungen mittels
Alkohol aus der wásserigen Lösung dieses Rohdextrins das sich mit Jod
blau färbende reine herausarbeitet, so bleiben geringe Mengen eines sich
mit genanntem Reagens bereits rot färbenden und Fehlingsche Lösung
etwas reduzierenden Dextrins zurück?). Da nun hydrolytische Zer-
setzungsprodukte der Stärke ein geändertes Färbungsvermögen mit Jod
dann zeigen, wenn in der Molekel bereits irgendwelche -Bindungen der
Dextrinringe aufgespalten worden sind3), so zeigt das Vorhandensein
des sich rot färbenden Dextrins in der verzuckerten Lösung neben dem
reinen nichtreduzierenden Grenzdextrin I an, daß hier der Maltose-
abspaltungs- also a-diastatische Prozeß nicht rein verlaufen ist. sondern
daß hierbei ebenfalls eine, wenn auch sehr schwache, ß-diastatische
Hydrolyse als Nebenprozeß stattgefunden hat.
Diese Tatsache könnte sehr einfach dadurch erklärt werden, daß
man in der Gerste das Vorhandensein einer gewissen Menge von ß-Dia-
1) Vorgel. d. poln. Akademie der Wiss. in Krakau.
2) Liebigs Ann. 441, 288, 1925.
3) Ebendaselbst, N. 291.
V. Syniewski: Diastase. 1I. 229
stase annimmt, die als Überbleibsel aus einer früheren Lebensperiode
der Pflanze im reifen Korn herstammt, oder sich vielleicht während
Regentagen im Korn bereits neu gebildet hat.
Diese einfache Annahme muß aber bewiesen werden, denn man
könnte sonst auch eine andere Erklärung der eingangs angeführten
Tatsache geben. Wenn man nämlich bedenkt, daß a-Diastase ein
gewisse, in der Stärkemolekel vorhandene Bindungen hydrolysierendes
Enzym ist, so erscheint es nicht unmöglich, daß es gegebenenfalls
auch andere Bindungen in dieser Molekel hydrolysiert, wenn auch mit
einer vielmals geringeren Geschwindigkeit. a-Diastase wäre dann ein
Enzym, das zwei verschiedene, in derselben Stärkemolekel an ver-
schiedenen Raumstellen tätige, nämlich die a- und die B-Bindungen,
jedoch mit verschiedener Intensität, angreifen würde.
Wenn nun diese zweite Möglichkeit theoretisch ebenfalls in Betracht
gezogen werden muß, so ist es ganz selbstverständlich, daß man sich
auch die analoge Frage stellen kann, ob nicht die ß-Diastase, da sie
wohl aus a-Diastase entstanden ist, ein wenn auch geringes a-dia-
statisches Vermögen neben dem ihm zukommenden B-diastatischen
aufweist. Zur Entscheidung der hier aufgeworfenen Fragen wurden
nachfolgende Versuche angestellt:
Versuche.
I. a-Diastase.
Bei Anstellung dieses Versuchs ging ich von nachfolgender Be-
trachtung aus: a-Diastase wird durch 20 Minuten langes Erhitzen des
betreffenden Auszugs auf 60 bis 61° vernichtet, während ß-Diastase
diese Behandlung zu etwa vier Fünftel überdauert. Wenn nun zwei
Portionen des nämlichen Gerstenauszugs, von denen eine durch Erhitzen
auf 60 bis 61% von a-Diastase befreit, die andere aber durch z. B. ent-
sprechendes Verdünnen mit totem Gerstenauszug schwächer oda.
statisch gemacht wurde, miteinander verglichen würden in ihrer
Wirkung auf nichtreduzierendes Grenzdextrin I, so müßten sie sich
hierbei nachfolgend verhalten:
a) Wenn a-Diastase auch etwas B-diastatisch wirkt: Die mit dem
auf 60 bis 61° erhitzt gewesenen, also von a-Diastase befreitem Auszug
versetzte Lösung des nichtreduzierenden Grenzdextrins I würde auch
nach längster Dauer des Prozesses sich mit Jod noch immer färben,
da eben die auch etwas ß-diastatisch wirkende a-Diastase nicht mehr
vorhanden wäre. Die mit dem bloß verdünnten, somit noch immer
a-diastatisch, also auch etwas ß-diastatisch wirkenden Auszug ver-
setzte Lösung müßte dann nach entsprechend langer Zeit eine Änderung
des Jodfärbungsvermögens aufweisen.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 16
230 V. Syniewski:
b) Wenn die bemerkte fB-diastatische Wirkung des Gerstenauszugs
nicht der a-Diastase, sondern einem gewissen Gehalt von B-Diastase zukäme:
Da die im auf 60 bis 61° erhitzt gewesenen Gerstenauszuge dann vor-
handene Menge ß-Diastase noch immer etwa vier Fünftel der ursprünglich
vorhandenen Menge ausmachen würde, so müßte sie auf das nicht-
reduzierende Grenzdextrin I so einwirken, daß sich mit der Zeit sein
Jodfärbungsvernögen ändern würde. Weil aber die Menge der ß-Dia-
stase im zweiten stark verdünnten Auszug auch entsprechend kleiner
wäre, müßte sich bei der Hydrolyse des nichtreduzierenden Grenz-
dextrins I mit diesem verdünnten Auszug das Jodfärbungsvermögen
entsprechend langsamer ändern.
Es wurde nun aus 1 Teil Gerstenmehl und 5 Teilen Wasser durch
9stündige Extraktion unter fortwáhrendem Quirlen ein Auszug hergestellt.
Sein nach Lintner ermitteltes, aber nach meiner Skala angegebenes Ver-
zuckerungsvermögen war De = 300.
a) Ein Teil dieses Auszuges wurde auf 60 bis 61° durch 20 Minuten
erhitzt.
b) Ein Teil des Auszuges wurde aufgekocht, und ein Teil noch frisch
belassen. 10 cem des frischen Auszuges wurden nun mit 40 ccm des toten
zusammengemischt.
Es wurde dann eine 0,2proz. Lösung des nicht reduzierenden Grenz-
dextrins I hergestellt; sie färbte sich mit Jod blau.
A. Zu fünf Proben von je 25 cem der Dextrinlösung wurden ansteigende
Mengen des Auszuges a) und absteigende von destilliertem Wasser hinzu-
getan, so daß das Gesamtvolumen immer 50 ccm betrug:
1. 2,5ccm des Auszuges + 22,5 com Wasser
2. 5,0 $9? 99 ?9 + 20,0 LK) E
3. 7,5 E 38 29 + 17,5 LE) 99
4. 10,0 sn 9 D T 15,0 sn za
5. 125 „n = E + 12,5 ,, ie
B. Zu ebensolchen fünf Proben von je 25 com der Lösung des Dextrins
wurden auf oben beschriebene Weise analoge Mengen der Auszugsmischung b)
und von destilliertem Wasser hinzugegeben.
Sämtliche zehn Proben wurden in Büretten eingefüllt und aus letzteren
dann von Zeit zu Zeit je 2ccm der hydrolysierten Lösung zu 1l ccm einer
5000 n Jodlösung abgelassen, worauf schließlich die Färbung beobachtet
und notiert wurde. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle I zusammen-
gestellt.
Aus der Tabelle I ist nun ersichtlich, daß die mit verdünntem frischen
Gerstenauszug behandelte Dextrinlösung in allen Proben bedeutend
(etwa fünfmal) langsamer ihr Färbungsvermögen mit Jod änderte als
die mit dem auf 60 bis 61° erhitzt gewesenen behandelte. Aus diesem Re-
sultate ist somit: bindend zu schließen, daß im Auszuge nicht die a-Diastase
das das Färbungsvermögen verändernde, also ß-diastatisch wirkende Enzym
ist, sondern f-Diastase, die im Gerstenauszuge in geringen Mengen
vorkommt.
Diastase. II. 231
Tabelle I.
d A. Hydrolysiert mit dem auf 60—610 C erhitzt gewesenen Auszug
Die Hydro» ||
lyse dauerte | Färbungsvermögen mit J der Probe:
Minuten 1 | 3 4 | 5
AAA E de Fr Sur aae "m z a SE
20 ' blau blau blau | blau blau
60 S ` violett violett violettrot |karmoisinrot
180 ‚Karmoisinrot rot rot braunrot braunrot
330 |; braunrot braun braun braun braun
450 raun von immer schwächerer Nuance
570 n 9 n ” H
1200 | braun braungelb | bräunlichgelb | gelb gelb
1365 | A gelb von immer schwácherer in Spuren iria
s mit reinem
i BL Nuance Wasser
1545 gelb von immer schwächerer Nuance ebenso
li
1845 ' sch h gelb Spuren einer | reine Jodfarbe
N ee | dunkler. Färb.
B. Hydrolysiert mit dem bloß verdünnten Auszug
Die Hydro- =
lyse dauerte |! Fárbungsvermógen mit J der Probe:
| ==
Minuten 8 1 | 2 | 3 | 4 | 5
EE oo. AA T E TS E EE r REST ae re AS E SR E e d Ee
20 blau blau blau | blau blau
60 i > violetter stärkere Sparen | ausdrückliche violett
| ` Schimmer von Violett ‚Spuren v. Violett Ñ
180 1, violett violett violett | violett rotviolett
330 ıı rotviolett , rotviolett | rotviolett 'karmoisinrot|karmoisinrot
E e |
450 karmoisinrot rot rot i rot rot
570 |
| n n n n
1200 , rot , A rotbraun braun
1365 | A rotbraun e 5
1545 | S rotbraun | braun von immer schwächerer Nuance
1845 | braun von immer schwächerer Nuance
II. f-Diastase.
Hier ging ich von nachfolgenden Betrachtungen aus:
Ein Malzauszug enthält sowohl a- als auch bereits ß-Diastase.
Beim Erhitzen dieses Auszugs durch 20 Minuten auf 60 bis 61° wird
die a-Diastase so vernichtet, daß sie mittels der Lintnerschen Methode
nicht mehr bestimmt werden kann; ihre Menge sinkt dann auf Null
oder jedenfalls auf weniger als 2,5 Lintnersche Grade nach meiner
Skala!). 8-Diastase ist weit beständiger und bleibt in ziemlicher Menge
noch intakt in der Lösung. Beim weiteren Erhitzen auf 68° wird sowohl
a-Diastase, wenn sie noch vorhanden sein sollte, als auch 8-Diastase
weiter vernichtet, und zwar a-Diastase offenbar bedeutend stärker als
ß-Diastase.
1) Diese Zeitschr. 158, 97. 1925.
16 *
232 V. Syniewski:
Wir können nun 2 Teile desselben Malzauszugs, von denen der
eine durch 20 Minuten nur auf 60 bis 61°, der andere aber ebensolange
auf 67 bis 68° erhitzt worden war, durch entsprechende Zumischung
von aufgekochtem, also totem Malzauszug gleich diastatisch Lininer-
scher Stärke gegenüber machen; sie werden wohl hauptsächlich $-dia-
statisch sein. Wenn sie nun auch etwas a-Diastase enthalten sollten,
so wird der bloß auf 60 bis 61° erhitzt gewesene an dieser Diastase
gewiß bedeutend mehr enthalten als der auf 67 bis 68° erhitzt gewesene.
Wenn wir nun zu den weiteren Versuchen nachfolgende Auszüge
nehmen:
A. den auf 60 bis 61° erhitzt gewesenen, aber in bezug auf dia-
statische Kraft bereits rektifizierten Auszug und
B. eine Mischung von 1 Teil des Auszugs A und 4 Teilen des auf
67 bis 68° erhitzt gewesenen, mit dem ersteren, gleichdiastatischen,
so werden selbstverständlich sowohl A als auch B die nämliche
diastatische Kraft aufweisen.
Mit Hilfe dieser Auszüge läßt sich nun entscheiden, ob in dem
bloß auf 60 bis 61° erhitzt gewesenen, also hauptsächlich B-diastatischen
Auszug, wenn er noch etwas a-diastatisch wirken sollte, diese letztere
Wirkung einem Überbleibsel nicht vernichteter a-Diastase oder aber der
ß-Diastase allein zu verdanken ist.
Als Einwirkungssubstrat wählte ich mein Grenzdextrin II, welches
bloß a-Karbonylbindungen enthält!).
a) Wenn ß-Diastase auch etwas a-diastalisch wirken sollte, dann
müßten zwei Proben einer Lösung des Grenzdextrins II durch gleiche
Mengen der Auszüge A und B gleich stark, also gleich rasch ver-
zuckert werden.
b) Wenn eine festgestellte a-diastatische Wirkung nicht von B-Dia-
stase herrühren würde, sondern einem Uberbleibsel von a-Diastase im
Auszug zukäme: In diesem Falle müßte der Auszug A, weil er aus bloß
auf 60 bis 61° erhitzt gewesenem Malzauszug bestünde, auf das Grenz-
dextrin II bedeutend (etwa fünfmal) rascher einwirken als der Auszug B,
weil der letztere an ersterem bloß !/, und @/, des auf 67 bis 68° erhitzt
gewesenen Malzauszugs enthielte.
nn — e —
Es wurde nun aus gutem Brennereimalz ein ,,dreifacher'* Auszug auf
die Weise hergestellt, daß am ersten Tage ein Teil des geschroteten Malzes
mit fünf Teilen Wasser unter Zusatz von Toluol durch 9 Stunden unter
fortwährendem Quirlen ausgezogen wurde, am zweiten Tage ein Teil Malz-
schrot mit fünf Teilen des am ersten erhaltenen Auszuges, ebenfalls unter
Zusatz von Toluol, auf die nämliche Weise, und analog am dritten Tage
nochmals eire Portion des Malzes mit dem Auszug des zweiten ausgelaugt
1) Liebigs Ann. 824, 222 und 264, 1902.
Diastase. II. 233
wurde. Dieses ‚‚dreifache‘' Ausziehen wurde deshalb ausgeführt, um schließ-
lich einen stark diastatischen Auszug zu erhalten, auf daß er auch nach dem
Erhitzen noch stark wirken sollte.
Der Auszug wies (nach meiner Skala) ein diastatisches Vermögen von
Día + D = 3750 Einheiten auf.
Er wurde in drei Teile geteilt: Den ersten Teil erhitzte ich durch
20 Minuten auf 60 bis 61°. Nach dem Abkühlen wies er ein Dg = 875 Ein-
heiten auf. Den zweiten Teil erhitzte ich ebenfalls durch 20 Minuten, aber
auf 67 bis 68°. Abgekühlt, hatte er ein diastatisches Vermögen von
Dg = 550 Einheiten. Der dritte Teil wurde zur Vernichtung jeglicher
diastatischen Kraft aufgekocht. Alle Auszüge wurden, selbstverständlich,
vorher blank filtriert.
Der auf 60 bis 61° erhitzt gewesene Teil des Auszuges wurde nun mit
so viel (durch Berechnung ermittelt) des toten versetzt, daß das diastatische
Vermögen von 875 auf 550 fiel. Es hatten jetzt sowohl der auf 60 bis 61°,
als auch der auf 67 bis 68° erhitzt gewesene Auszug dasselbe diastatische
Vermögen der Lintnerschen Stärke gegenüber, nämlich Dg = 550 Einheiten.
Es wurde nun einerseits
A. der nicht mehr veränderte, auf 60 bis 61° erhitzt gewesene Auszug
von Dg = 550, andererseits
B. eine Mischung von einem Teil des Auszuges A mit vier Teilen des
auf 67 bis 68° erhitzt gewesenen von ebenfalls Dg = 550 zu weiteren Ver-
suchen angewandt.
Das diastatische Vermögen der Auszüge A und B wurde zur Kontrolle
nochmals bestimmt ; es war bei beiden: De, wie berechnet, = 550 Einheiten.
14g (Trockensubstanz) eines Präparats von Grenzdextrin II wurde
zu 1000 ccm in Wasser gelöst. Vorher bestimmte man die Reduktionskraft
der Malzauszüge und die der Grenzdextrinlösung, und berechnete daraus,
wieviel Kubikzentimeter Fehlingscher Lösung angewendet werden muß,
um diese Reduktionskraft zu sättigen. Bei den Versuchen wurde dann ein
bestimmter Überschuß an Fehlingscher Lösung genommen und beobachtet,
wann die Hydrolyse jenes Stadium erreicht hat, in welchem die angewandte
Menge des Reagens vollständig reduziert wurde.
Fünf Portionen von je 97,5 ccm der Dextrinlösung wurden mit nach-
folgenden Mengen des Auszuges A und des toten zu 100 ccm ergänzt:
1. 0,5 ccm des Auszuges A + 2,0 ccm des toten Auszuges
Leo LO: u: 5; Se A +15, » >» va
3. 15 „ » ze A-LO oe — » za
4. 2,0 an 9 >> A + 0,5 IÉ „ „> d
5. 2,5 99 „ 29 A + 0,0 ER) 99 an „
Ebenso wurden fünf ebensolche Portionen derselben Dextrinlösung
auf dieselbe Weise'wie oben mit dem Auszuge B und dem ergänzenden
toten versetzt.
Der Inhalt der Kölbchen, in denen die Zusammenmischung erfolgte,
kam nun in zehn Büretten, aus welchen dann von Zeit zu Zeit je 5 ccm der
verzuckernden Lösung in je 8 cem Fehlingscher Lösung abgelassen wurden,
um die Mischung dann durch 5 Minuten im kochenden Wasserbade zu
erhitzen. Die Proberöhrchen mit der Mischung wurden beiseite gestellt,
um den Inhalt der Röhrchen sämtlicher Proben nach Beendigung des
Versuchs in bezug auf den Grad der Reduktion nach der Farbe zu vergleicher.
Das Resultat ist in Tabelle II zusammengestellt.
234 V. Syniewski:
Tabelle 1 1.
Die Ver | A. Verzuckert mit dem bloß auf 60—610 C erhitzt gewesenen
zuckerung | Auszug von Da = 55
dauerte
Minuten | 1 | 2 3 4 | 5
30 | nicht vollständig duren blau von immer schw ächerer
| Nuance
60 | nicht vollständig reduziert; blau von immer fast
| schwächerer Nuance reduziert
90 blau blau fast reduziert | vollkommen reduziert
120 A vollkommen reduziert
150 e fast reduziert | e
180 > vollkommen reduziert
270 fast reduziert a j
330 eben reduziert 5 E
Die Vers B. Verzuckert mit der Mischung von 1 Teil des Auszugs A mit 4 Teilen der
zuckerung auf 67—680C erhitzt gewesenen Auszüge von Dg = 550
dauerte
Minuten | 1 EA 2 | 3 | t | 5
|
a ' nicht vollständig reduziert; blau ohne sichtliche Abstufung
9 | "nicht vollständig reduziert; blau mit einer Spur von
| Abschwächung gegen 5 zu
120 | nicht vollständig reduziert; blau mit einer leichten
Abschwächung gegen 5 zu
150° nicht vollständig reduziert; blau mit gut sichtlicher
| Abschwächung gegen 5 zu
180 | nicht vollständig reduziert; blau mit starker Abschwächung
gegen 5 zu
270 nicht vollstándig reduziert; blau fast reduziert | vollkommen
reduziert
330 nicht vollständig reduziert; blau | fast reduziert vollkommen reduziert
Nach 12 Stunden wurden die Proben in bezug auf die Färbung nochmals miteinander ver»
glichen, und es wurde festgestellt, daß die Proben A, 1 bis 5 nach oi Minuten vollkommen
gleich nuanciert waren, wie die Proben B, 1 bis 5 nach 330 Minuten.
Aus dieser Tabelle ist nun nachfolgendes ersichtlich:
l. Beide angewandten Auszüge wirkten a-diastatisch.
2. Beide wirkten aber, wiewohl sie der Lininerschen Stärke gegen-
über gleiche diastatische Kraft aufwiesen (550 Einheiten), auf das bloß
a-Bindungen enthaltende Grenzdextrin II verschieden stark. Die mit
dem Auszug A versetzten Proben wurden, wenn wir die Zeit als Ver-
gleichsmaß nehmen, 3,66mal rascher verzuckert als die mit dem Aus-
zug B versetzten.
Aus obigem ist also zu schließen, daß in beiden Auszügen nicht
ß-Diastase auch schwach a-diastatisch wirkte, denn es hätten dann
beide Auszüge gleich schnell wirken müssen, sondern ein Überrest von
a-Diastase. Im Auszug A war eine größere Menge dieses nicht ver-
nichteten Restes von a-Diastase vorhanden, weil er auf bloß 60 bis 61°
erhitzt worden war, der Auszug B enthielt dieses Überrestes an a-Dia-
Diastase. II. 235
stase bloß !/, der im A. enthaltenen Menge und auch noch sehr geringe
Mengen aus dem auf 67 bis 68° erhitzt gewesenen Auszuge. Daß auch
dieser letztere Auszug von a-Diastase noch nicht vollkommen frei
war, ersieht man daraus, daß die mit ihm versetzten Proben nicht
etwa fünfmal, sondern bloß 3,66mal langsamer verzuckert wurden.
Ergebnis.
l. a-Diastase wirkt auch nicht etwas ß-diastatisch. Die fest-
gestellte geringe B-diastatische Wirkung des Gerstenauszugs ist dem Vor-
handensein einer geringen Menge von ß-Diastase zuzuschreiben.
2. f-Diastase wirkt auch nicht etwas a-diastatisch. Die a-dia-
statische Wirkung eines auf 60 bis 61° erhitzt gewesenen, also haupt-
sächlich B-diastatischen Malzauszuges ist einem geringen, durch das
Erhitzen noch nicht vollkommen vernichteten Überreste von a-Dia-
stase zuzuschreiben.
Untersuchungen über Diastase!).
IIa. Mitteilung:
Über die Geschwindigkeit der unter Vermittlung von a-Diastase verlaufenden
Stärkehydrolyse.
(Vorläufige Mitteilung.)
Von
Viktor Syniewski.
(Aus dem gärungschemischen und mykologischen Institut der Technischen
Hochschule in Lemberg.)
(Eingegangen am 9. Juli 1925.)
Wie bekannt, führte der zuerst von L. Wilhelmy?) studierte Verlauf
der Rohrzuckerhydrolyse unter Vermittlung von Säure zur Aufstellung
a
a— x
des Verlaufs sogenannter monomolekularer Reaktionen.
C.O. Sullivan und Tompson?) und später auch J.O. Sullivan)
zeigten, daß eine Rohrzuckerhydrolyse, die nicht durch Säure, sondern
durch Saccharase katalysiert wird, nach demselben Gesetz verläuft.
Dieser Befund der beiden Sullivan wurde zwar bald durch V. Henry5)
und ein Jahr später auch durch Adrian J. Brown?) in starken Zweifel
gestellt, genaue Arbeiten Hudsons?) jedoch haben die Angaben der
Sullivan vollkommen bestätigt und in der nicht berücksichtigten
Mutarotation der Glucose die Irrtumsquelle der Henrischen Angaben
erkannt. Es steht somit fest, daß die enzymatische Hydrolyse des Rohr-
zuckers nach demselben Gesetz verläuft wie die durch Säure katalysierte.
Die obengenannte Sullivansche Entdeckung konnte nun vermuten
lassen, daß auch die unter Vermittlung von Enzymen stattfindende
l
der Gleichung k = EN log für den Geschwindigkeitskoeffizienten
1) Vorgel. der Poln. Akad. der Wiss. in Krakau.
2) Poggend. Ann. 81, 413 und 499, 1850.
3) Trans. of the chem. Soc. 57, 834, 1890.
4) Ebendaselbst 61, 926, 1892.
5) C.r. 183, 891, 1901.
6) Trans. of the chem. Soc. 81, 373, 1902.
?) Journ. Amer. Chem. Soc. 30, 1160 und 1564, 1908.
V. Syniewski: Diastase. II. 237
Hydrolyse der Stärke sich nach demselben Gesetz abspielen wird;
diesbezügliche Untersuchungen verschiedener Autoren haben aber
gezeigt, daß die enzymatische Hydrolyse der Stärke wohl einem kom-
plizierteren Gesetz folgt; freilich sind diese Autoren bei weitem nicht
einig darüber, nach welchem es geschieht. Horace T. Brown zeigt
in Gemeinschaft mit T. A.@lendinning!), daß die Hydrolysegeschwindig-
keit der Stärke unter Vermittlung von Diastase im allgemeinen mit
dem Verlauf des Prozesses wächst. Wenn man sich jedoch den Verlauf
der Hydrolyse in zwei Stadien geteilt denkt, und zwar in ein Anfangs-
stadium bis zur Zersetzung von etwa 43,5 Proz. der überhaupt hydro-
lysablen Menge und in ein Nachfolgestadium, und den Geschwindig-
keitsverlauf während beider Stadien ermittelt, so ergibt sich, daß das
erste linear verläuft, die Geschwindigkeit also wächst, das zweite aber
annähernd nach der logarithmischen Formel, die Geschwindigkeit
also immer gleichbleibt. Demgegenüber behauptet V. Henry?), daß
die Geschwindigkeit der Stärkehydrolyse, gleichgültig, ob sie durch
Malz- oder Pankreasdiastase vermittelt wird, doch, der logarithmischen
Formel entsprechend, während des ganzen Reaktionsverlaufs gleich-
bleibt, während kurz darauf Ch. Philoche?) wieder in einer längeren
Arbeit nachweist, daß die Geschwindigkeit im Anfangsstadium der
Hydrolyse (bis zum Umsatz von etwa 25 bis 30 Proz. Stärke) immer
kleiner wird, um dann im späteren Stadium (bis zur Zersetzung von
90 bis 94 Proz. der Stärkemenge) einen gleichbleibenden Endwert
anzunehmen.
Die Angaben in dieser Materie der einzelnen Autoren stehen also
in einem vollkommenen Widerspruch zueinander; es dürfte schon
aus diesem Grunde schwer werden, irgend einer der auf Grund der
Ergebnisse dieser Arbeiten aufgestellten Theorien über die Rolle,
welche der Diastase bei der Stärkehydrolyse zukommt, den Vorzug
zu geben; man wird aber ganz vor ihrer Annahme zurückscheuen,
wenn man erfährt, daß die Diastasepräparate, welche von den bis-
herigen Autoren angewandt wurden, nicht ein einheitliches diastatisches
Enzym, sondern gewiß ihrer zwei enthalten haben®), daß somit die
Stärkehydrolyse dieser Forscher aus mindestens zwei nebeneinander
laufenden, verschiedenen, sich dabei auch beeinflussenden hydro-
lytischen Prozessen bestand. Mit der Erkenntnis, daß die sogenannte
Malzdiastase aus der maltoseabspaltenden a- und der dextrinring-
zersetzenden ß-Diastase zusammengesetzt ist, ergab sich die Notwendig-
1) Trans. of the chem. Soc. 81, 388, 1902.
2) C.r. 185, 916, 1902.
3) Journ. de chim. physique 6, 404, 1908.
4) Diese Zeitschr. 158, 87, 1925.
238 V. Syniewski:
keit der Wiederaufnahme der Untersuchungen über die Stärkehydrolyse,
und zwar über a- und $-Hydrolyse abgesondert.
Ich nahm vor allem das Studium der a-Hydrolyse auf, da man
hierbei neben dem nicht reduzierenden Grenzdextrin I ausschließlich
Maltose bekommt!), so daß die Geschwindigkeit der Maltoseentstehung,
die demnach auch die Geschwindigkeit der a-Hydrolyse vorstellt,
durch keine Nebenprozesse, wie Entstehung anderer reduzierender
Zwischenprodukte, verdunkelt wird.
Versuche.
Herstellung des a-diastatischen Auszuges. Wie ich in einer besonderen
Arbeit zeige?), ist das Gerstenkorn nicht vollkommen frei von ß-Diastase.
Die darin vorhandenen, wiewohl nicht großen Mengen dieses Enzyms,
könnten doch einen Nebenprozeß hervorrufen und so gewisse Maltose-
mengen vortäuschen, also den Verlauf der a-Hydrolyse verdunkeln; ich
mußte somit darauf bedacht sein, diese ß-Diastase zu eliminieren. 225g
fein gemahlener Gerste wurden mit 1125ccm Wasser und 5ccem Toluol
versetzt, unter stetem Umrühren durch 9 Stunden gelaugt. Über Nacht
filtriert, zeigte der unverdünnte Auszug die diastatische Kraft Da = 500 Ein-
heiten (meiner Skala)?).
Um mir auch einen Begriff von der Größe der ß-diastatischen Kraft
des Auszuges zu verschaffen, verfuhr ich nachfolgend: 25 ccm einer 0,2proz.
Lösung von nicht reduzierendem Grenzdextrin I wurden mit 25ccm des
Auszuges versetzt und in eine Bürette gebracht (Temperatur = 17,5°).
Von Zeit zu Zeit wurde je l cem der verzuckernden Lösung zu l ccm einer
5000 D Jodlösung abgelassen, worauf die Färbung beobachtet und notiert
wurde. Bei Anwendung der Daten, der von Jod nicht mehr gefärbten
Probe erfuhr man durch eine einfache Rechnung) die SECHER Stärke
der vorhandenen ß-diastetischen Kraft.
Das auf dem Filter zurückgebliebene ausgelaugte Mehl wurde ab-
gespritzt, mit frischem Wasser (+ öccm Toluol) auf das frühere Volumen
gebracht und von neuem durch 9 Stunden auf dieselbe Weise wie früher
gelaugt; so wurde viermal verfahren. Das D¿ des vierten Auszuges war
jetzt unter 10 Einheiten gesunken.
Auch das f-diastatische Vermögen wurde beurteilt, und zwar auf die
oben beschriebene Weise. Da es mir noch immer zu groß schien, so wurde
weiter gelaugt, jedoch mit Zusatz von 10 ccm einer 2proz. Formaldehyd-
lösung, und zwar deshalb, weil ich aus früherer Erfahrung wußte, daß
Malzauszüge mittels Toluol nicht über 5 bis 6 Tage aseptisch zu halten waren.
So wurde der Filterrückstand noch dreimal ausgelaugt. Die ß-diastatische
Kraft war jetzt so gering, daß sie wohl als nicht mehr schädlich angesehen
werden konnte.
Nachstehende Tabelle gibt einen Begriff vom Fallen der ß-diastatischen
Kraft nach den einzelnen Auslaugungen:
1) Liebigs Ann. 441, 285, 1925.
2) Siehe die vorhergehende Abhandlung.
3) Diese Zeitschr. 158, 87, 1925.
1) Ebendaselbst, S. 105.
Diastase: IH: 239
Jodfärbungsvermögen der verzuckernden Lösung
| verzuckert mit dem
| 1. Auszug | 4. Auszug | 6. Auszug 7. Auszug
30 | karmoisinrot
|
45 rot | — — —
60 ý — blau blau
120 braun — = —
150 — — violett —
180 — | — — Stich ins Violette
240 | schwach braun i — | — —
300 | — — | — violett
540 | — — | — karmoisinrot
570 || jodfarben — | — —
660 | — | — ; rotbraun —
690 | == ' schwach braun — rot
1320 | — | weiter geschwächt | == —
1440 | — | — | a braun
2160 ` — etwas dunkler als | — —
| . jodfarben
Bei Durchführung der Rechnung erfährt man, daß die ß-diastatische
Kraft des 1. Auszuges 0,0534 Einheiten betragen hat; im 7. Auszuge ist
sie nun auf etwa den zehnten Teil des obigen Betrages gefallen.
Der nach der siebenten Auslaugung auf dem Filter zurückgebliebene
Rückstand wurde jetzt mit 800 ccmWasser, in welchem vorher 10 g Papayotin
(Merck 1: 200) gelöst worden waren, versetzt, und durch 9 Stunden unter
stetem Rühren ausgelaugt, worauf klar filtriert wurde.
Da dieses Filtrats betrug 150 Einheiten.
Ds aber, auf dieselbe Weise wie oben bestimmt und berechnet, betrug
0,0195 Einheiten, das ist 0,013 Proz. der vorhandenen a-diastatischen
Kraft. Es konnte somit erwartet werden, daß eine so geringe Beimengung
von ß-Diastase die Geschwindigkeit der a-Hydrolyse werde nicht so weit
beeinflussen können, daß sich dies bei den zu Gebote stehenden analytischen
Methoden irgenwie fühlbar erweisen könnte.
Substrat der Hydrolyse. Ich wollte die Anfangsstadien des Prozesses
besonders gut erfassen, daher mußte ich, um in kurzer Zeit große Unter-
schiede im Reduktionsvermögen des Verzuckerungssubstrats zu erhalten,
auf möglichst hohe Konzentration der zu verzuckernden Lösung sehen.
Lintnersche Stärke, die von anderen Autoren bisher fast immer angewandt
wurde, läßt sich aber in höheren Konzentrationen als zu 2 Proz. nicht gut
anwenden; ich stellte deshalb etwa 5proz. Lösungen von Amylodextrin im
Autoklaven her, die sich tagelang halten lassen, ohne merkbar große Mengen
störender Reversionsprodukte auszuscheiden. 160 g lufttrockener Kartoffel-
stärke wurden, mit 0,3 g CaCO, versetzt, in 2 Litern Wasser verkleistert
und hierauf durch 12 Stunden im Autoklaven bei genau 135% im Wasser-
dampf gehalten. Nach dem Erkalten wurde filtriert; man erhielt 1675 ccm
einer klaren Amylodextrinlösung, die durch Hinzugabe von Wasser auf
etwa 5,5° Bllg. gebracht wurde. Diese Lösung färbte sich mit Jodlösung
rein blau. Eine Trockensubstanzbestimmung ergab 1,3767 g in 25cem und
darin 0,34 Proz. Asche.
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V . Syniewsk
241)
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Diastase. III. 241
Als Trockensubstanz hatte sie bereits Wasser verloren!); auf Amylo-
dextrin mußte sie im Verhältnis von 5886: 5940 umgerechnet werden. Bei
Berücksichtigung auch der Asche erfährt man dann, daß 100 ccm des zu
hydrolysierenden Substrats 5,5384 e Amylodextrin enthielten.
Hydrolysenverlauf. 1800 ccm der Amylodextrinlösung wurden mit
100 ccm des a-diastatischen Auszuges versetzt, rasch durchgemischt und
in einem Kolben im Wasserthermostaten bei 18% verzuckern gelassen.
100 ccm dieser verzuckernden Lösung enthielten also 5,24693g der ur-
sprünglichen Amylodextrinsubstanz. Von Zeit zu Zeit wurden gewisse
Mengen der Mischung entnommen und in einem Erlenmeyerkolben zu
0,2 ccm alkalischer Seignettesalzlösung fließen gelassen. Mit entsprechenden
Wassermengen wurde die Mischung immer zu 100 ccm aufgefüllt und bis
zur Bestimmung des Reduktionsvermögens aufbewahrt. Die erhaltenen
Resultate sind in Tabelle I zusammengestellt.
Aus den Prozentzahlen der letzten Kolumne erhält man ein Bild des
Verzuckerungsverlaufes in Gestalt einer Kurve, und wenn man nun die
offenbaren Fehler in der Stetigkeit dieser Kurve graphisch ausbessert
und zu den so erhaltenen richtigeren Prozenten die betreffenden Maltose-
mengen berechnet, so erhält man nachfolgende Tabelle der in den einzelnen
Zeitpunkten entstandenen Maltosemengen:
Neda ji Maltoßeptäzente Berichtigte N | Maltoseprozente l Berichtigte
ee experim. graphisch Maltosemenge Versuchs! | experim. graphisch. | altosemenge
i erhalten | ermittelt g le erhalten | ee g
d A
1 ES 401 | 401 | 02104 15 | 4514 | 455 2,3873
2 | 6,08 | 6,08 0,3190 16 | 496 | 26025
3 | 812 | 812 0,4260 17 53,25 | 540 | 2,8333
4 [| 10,83 | 10,3 0,5404 18 | 57,54 | 57,7 | 3,0275
5 | 1247 | 125 0,6559 19 | 6044 | 614 3,2216
6 | 14,71 | 147 | 0,7713 20 [| 62,93 | 639 i| 3,3528
7 | 1804 | 180 ! 09444 21 | 6533 | 652 || 34210
8 | 21,35 | 21,0 | 1,1019 22 | 64.69 | 658 3,4525
9 | 2442 | 244 | 1/2808 2 | 6590 | 659 | 34577
10 2736 | 271 | 114219 24 | 6564 | 66,0 3,4630
11 || 30,27 | 303 ¡ 15900 25 | 6594 | 66,1 3,4682
12- | 3340 | 332 | 1,7420 26 | 66,22 | 66,2 | 3,4735
13 36,95 | 31,1 || 1,9466 27 || 6679 | 668 | 3,5049
14 || 4087 | 409 | 21460 28 | 669 | —= ¡ —
Mit Hilfe dieser korrigierten Zahlen wurden nun unter der Voraus-
setzung, daß die Reaktion eine monomolekulare ist, die Geschwindigkeits-
koeffizienten in den einzelnen Zeitpunkten berechnet: 100 ccm der
verzuckernden Lösung enthielten 5,24693 g der ursprünglichen Amylo-
dextrinsubstanz ; diese Zahl stellt somit das a der bekannten logarith-
mischen Formel vor. Die Amylodextrinmolekel besteht aus dem
Dextrinringekomplex und 12 mit ihm verbundenen Maltoseresten;
ihr entspricht die Formel C,,¿ H ze 0,96 und das Molekulargewicht 5940.
Das Amylodextrin könnte also theoretisch, wenn der Prozeß restlos
1) Liebigs Ann. 809, 288, 1899.
242 V. Syniewski:
zu Ende laufen würde, im Maximum 69,09 Proz. Maltose liefern.
Zur Ermittlung des Reaktionsgeschwindigkeitskoeffizienten wandte ich
1 69,09 a
% 69,09a — 100 7
an, wobei hier x die in den einzelnen RE entstandenen
Maltosemengen bedeutet. Es wurden hierbei nachfolgende Werte
für k errechnet:
Nr. des
Versuchs | in n Minuten |
|
|
deshalb die für die Rechnung bequeme Formel k = E
1 15 0,001 731
2 25 1 600
3 35 1551
4 45 1 557
5 i 55 1 575
6 65 1 598
7 80 1 638
8 95 1 656
9 ' ug 1 720
0 | 1% 1 730
1 | 140 1 785
2 | 155 1 835
3 | 1% 1 910 ¡
14 195 1 996 |
Es ergibt sich also, daB die Reaktionsgeschwindigkeit nach obiger
Berechnung mit der Zeit wächst, um bei Entstehung von etwa 63,5
bis 65 Proz. Maltose ihr Maximum zu erreichen.
Wenn wir nun bedenken, daß die Amylodextrinmolekel, wie oben
gesagt, mit dem Dextrinringekomplex 12 Maltosereste verbunden
enthält, und daß es möglich ist anzunehmen, daß während der Hydro-
lyse in den einzelnen Molekeln nacheinander nicht alle Maltosereste
auf einmal abgespalten werden, sondern daß in ihnen anfangs je ein
Maltoserest abgespalten wird, wobei eine Substanz übrigbleibt, deren
Molekel aus dem Dextrinringekomplex und 11 Maltoseresten besteht,
diese Substanz dann weiter so hydrolysiert wird, daß ein weiterer
Maltoserest von der Molekel abgesprengt wird, und die restierende
Substanz dann aus Molekeln besteht, in denen mit dem Dextrinringe-
komplex bloß zehn Maltosereste verbunden zurückbleiben usw., da
die Hydrolyse also in 12 Etappen vor sich geht, wobei in jeder je ?/,,
der ganzen abspaltbaren Maltosemenge losgerissen wird, so haben wir
es in diesem Falle mit 12 insofern verschiedenen hydrolytischen Pro-
zessen zu tun, als in jedem prinzipiell eine andere Substanz und in
immer kleinerer Menge der Hydrolyse unterzogen wird. Wir wollen
nun berechnen, wie die Geschwindigkeit in den einzelnen Etappen
der Hydrolyse wächst.
Diastase. III. 243
Den Verlauf des ganzen Prozesses, das ist bis zur Erscheinung von
69,09 Proz. = 3,6251 g Maltose, teilen wir in 12 Etappen ein, wobei
also die erste nach dem Erscheinen von 5,76 Proz., die zweite nach
dem Entstehen von 11,52 Proz. usw. Maltose zu Ende ist. Wir er-
mitteln dann, welche Mengen von Maltose und in welchen Zeiten
in den einzelnen Etappen entstehen, und berechnen aus diesen Zahlen,
en 0,30209
(für 100 ccm), die Geschwindigkeitskoeffizienten. Die Resultate der
einzelnen Rechnungen sind in Tabelle II zusammengestellt.
bei Berücksichtigung dessen, daß a jetzt gleich ist
Tabelle II.
(| | Aus der | | Entstandene |
e || korrigiert. Kurve | Zu Ende der Etappe: | Maltose in der |
3 | g 5 | berechn. Maltose | betreff. Etappe |
OSPERN le; laun pa Ly
ola (Da | ESSLE | gS INS | “2% | g | oft?
ZlPäieoëlëaätl ww [335 1,8 | 228 [mech | vi || (a = 0,302 09)
a pA (39395 | Ne [+8 | 52 532 [Min | 62
Z || leal 35 > | NA az |
[Min |” $ g | | Proz. | £>” g |
I 7 1 R aen Rees
1 | 15 | 4,01) 0,2104 | 15 ‚0,2104 | 0,03426
i 25 || 5,7 | 0,2991 | | 25 0,2991 8018
| | | I.| 5,76 | 25,5 | 0,3021 | |
3 || 35 | 8,12| 0,4260 | | | 9,5 0,1249 2437
4 | 45 10,3 | 0,5404 | | | 19,5 | 0,2383 | 8591
| | | I. 11,52 | 51,0 | 0,6042 | |
5 55 125 | 0,6559 | | 4 |0,0517 | 2038
6 || 65 14,7 | 0,7713 | | 14 0,1671 2498
| | III. | 17,27 | 78,0 | 0,9063 | |
7. 80 18,0 | 0,9444 | | | 2 [0,0381 | 2878
8 | 95 121,4 | 1,1228 | | | | 17 02165 | 3222
| | IV. | 23,03 1105 |1,2084 | |
9 || 110 ¡244 | 1,2803 | | 5 0,0719 2361
10 || 125 |27,3 | 1,4324 | | | 20 0,2240 2938
| | v.| 28,79 (133 |1,5105 |
11 | 140 30,3 | 1,5900 7 0,0795 1895
12 || 155 [334 | 1,7525 ' | 22 | 0,2420 3186
| | VI. | 34,55 164 | 1,8125 ||
13 || 175 '37,1 | 1,9466 | 11 |0,1341| 2316
| | VII. 40,30 192 ¡2,1146
14 | 195 409 | 2,1460 3 00314 1589
15 || 220 |45,5 | 2,3873 | | 28 0,2727 3614
| VIII. | 46,06 (222.5 | 2,4167
16 | 245 49,5 | 2,6025 | 22,5 0,1858 1842
| | | IX. | 51,82 259,5 | 2,7188
17 || 275 |54,0 | 2,8333 | | 15,5 0,1145 1337
| X. 57,58 303,5 | 3,0209
18 | 305 |57,7 | 3.0275 | | 1,5 0,0066 640
19 || 345 61,4 | 3,2216 | 41,5 0,2007 1142
| | | | XI. | 63,35 (381,5 | 3,3230
20 | 395 63,9 | 3,3528 | 13,5 0,0298 334
21 | 445 65,2 | 3,4210 63,5 0,0980 269
22 || 505 (65,8 | 3,4525 | 123,5 0,1295 197
244 V. Syniewski: Diastase. lII.
Aus dieser Tabelle ist nun ersichtlich, daß die Geschwindigkeit
in den einzelnen Etappen (I. bis XI.) selbstverständlich ebenfalls
ansteigt, daß jedoch die Intensität des Anstieges in den einzelnen
Etappen immer geringer wird, um in der XI. fast auf Null zu sinken!),
die Verzuckerung in dieser Etappe also beinahe der logarithmischen
Formel entsprechend verläuft. In der XII. Etappe wird die Geschwin-
digkeit mit der Zeit kleiner.
Diese einleitende Untersuchung hat somit erwiesen, daß die
Hoffnung, die mit einem reinen diastatischen Enzym verlaufende
Hydrolyse der Stärke, analog der Rohrzuckerhydrolyse unter Ver-
mittlung der Saccharase, als monomolekular verlaufenden einfachen
Prozeß deuten zu können, trügerisch war. Er scheint viel komplizierter
zu sein, so daß es einer ganzen Reihe vielfach abgeänderter Versuche
bedürfen wird, um der richtigen von den vielen theoretisch denkbaren
Ursachen dieser Kompliziertheit auf die Spur zu kommen. Dieser
Aufgabe wird die weitere Arbeit gewidmet sein.
1) Aus der Konstruktion der Teilkurven der Geschwindigkeit ist dies
leicht zu ersehen.
Untersuchungen über elektrische Erscheinungen
und Ionendurchlässigkeit von Membranen.
V. Mitteilung:
Die Eigenschaften der Membranen von amphoterem Charakter.
Von
Akiji Fujita.
(Aus dem biochemischen Institut der Aichi-Medizinischen Universität
zu Nagoya, Japan.)
~ (Eingegangen am 19. Mai 1925.)
Das Gemeinsame derjenigen Membranen, welche in den früheren
Mitteilungen!) untersucht wurden, besteht darin, daß sie gegen wässerige
Lösungen stets negativ elektrisch geladen sind. Die gemeinsame Deutung
aller mitgeteilten Befunde konnte darin gefunden werden, daß die
mittlere Wanderungsgeschwindigkeit der Anionen im Vergleich zu der
der Kationen durch die Membran verringert wird. Es lag nahe, die
Elektronegativität der Membran mit ihrer verzögernden Wirkung aut
die Anionen in einen ursächlichen Zusammenhang zu bringen. Daraus
entsteht die Frage, ob bei elektropositiven Membranen nicht eine
Umkehrung der Wirkung eintritt. Membranen, welche stets elektro-
positiv geladen sind, sind kaum zu finden?). Dagegen gibt es zahlreiche
Membranen, welche je nach der Konzentration und Art der sie berühren-
den Elektrolytlösung bald positiv, bald negativ sind. Das sind Mem-
branen von chemisch amphoterem Charakter, also besonders Membranen
aus eiweißartigen Körpern. In dieser Beziehung liegen nun schon einige
Untersuchungen aus dem Laboratorium von Höber?) vor, insbesondere
1) Diese Zeitschr. (im Druck). |
2) L. Michaelis, Kolloid-Zeitschr. 81, 246, 1922, und zwar H 249.
3) Höber, Zeitschr. f. physik. Chem. 110, 142, 1924. `
Biochemische Zeitschrift Band 162. 17
246 A. Fujita:
untersuchte Mond!) die Eigenschaften von Gelatine und Filtern,
welche hergestellt waren durch Zusammenpressen von festem Casein
und Euglobulin. In diesen Arbeiten wird besonders für die Gelatine
beschrieben, daß die Wirkung solcher Membran auf die Potential-
differenz zweier durch sie getrennter Elektrolytlösungen umgekehrt ist,
je nachdem man eine saure oder eine alkalische Gelatinegallerte nimmt.
In der Deutung dieser Erscheinung, welche insbesondere von Höber?)
erörtert wird, sind die Autoren noch vorsichtig. Höber spricht nur
von allgemeiner Wirkung der Kapillarität und hebt hervor, daß keines-
falls die Verteilungspotentiale zwischen zwei Phasen nach Nernst
und Huber geeignet sind, die Erscheinung zu erklären, während Mond
eine Deutung der Erscheinungen auf Grund der Phasengrenzkräfte
für denkbar hält. Die Tatsachen sind physiologisch offenbar von
größter Bedeutung, weil wir hier Membranen vor uns haben, deren
Permeabilität und elektrische Erscheinungen durch Änderung der
äußeren Bedingungen von Grund auf geändert werden können. Wir
dürfen vermuten, daß die Aufklärung dieser Verhältnisse für die Physio-
logie von Nutzen sein wird, weil nach dem heutigen Stande unserer
Kenntnisse®) die Variabilität der Permeabilität einer Membran unter
dem Einfluß der äußeren Bedingungen von ausschlaggebender Be-
deutung für die Zellphysiologie ist.
In unseren früheren Mitteilungen, welche sich mit den elektro-
negativen Membranen beschäftigten, wurde folgende Erklärung für
die Wirkung dieser Membranen versucht. Die Negativität der Membran
ist der Ausdruck dafür, daß sie negative Ionen adsorbiert. Wenn
nun in den Kanälchen einer negativen Membran sich eine Elektrolyt-
lösung befindet, so müssen also die Anionen derselben zum Teil von
der Wand der Kanälchen fixiert werden. Deshalb wird die durch-
schnittliche Beweglichkeit der Anionen innerhalb der Kanälchen relativ
zu der der Kationen herabgesetzt. Auf Grund dieser Annahme
konnten alle von uns beobachteten Tatsachen betreffs der elektro-
motorischen Effekte und der Diffusion von Elektrolyten erklärt werden.
In genauerer Weise wurde diese Theorie an anderer Stelle von
Michaelis*) entwickelt.
Wenn diese Vorstellungen zu Recht bestehen, dann müßte man
bei amphoteren Membranen erwarten, daß diese im isoelektrischen
Punkte überhaupt keine Wirkung ausüben, d. h. daß zwei Elektrolyt-
1) Mond. Pflügers Arch. 203, 247, 1924.
2) Höber, Zeitschr. f. pnysik. Chem. 110, 142, 1924.
3) Hamburger, Ergebn. d. Physiol. 28. 77, 1924.
3) Michaelis, Journ. of general Physiol., Memorial Vol. for Jacques
J.oeb, 1925.
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 247
lösungen, welche durch eine isoelektrische Membran getrennt sind,
denselben Potentialunterschied zeigen wie bei freier Berührung; daß
die Membran, wenn sie negativ geladen ist, sich prinzipiell ebenso
verhalten wird, wie wir es für Pergamentpapier oder Kollodium be-
schrieben haben, d. h. daß die Beweglichkeit der Anionen relativ ver-
mindert ist, und daß, wenn sie positiv geladen ist, die relative mittlere
Beweglichkeit der Kationen vermindert ist. Dies soll in der folgenden
Mitteilung geprüft werden.
Die Membranen wurden in folgender Weise hergestellt. Extraktions-
hülsen von Schleicher und Schüll wurden mit 30proz. Gelatine gut
durchtränkt und an der Luft getrocknet. Diese Membranen wurden
teils ohne weitere Vorbereitung benutzt, teils vor der weiteren Be-
nutzung mit verschiedenen Mitteln gehärtet, um ihre Quellung im
Wasser herabzusetzen!). Sie wurden zum Teil über Nacht in zehnfach
verdünntes Formalin oder in 2proz. Kaliumbichromat oder 1proz.
Gefbsáure eingelegt, dann mindestens ebensolange gründlich gewássert
(bei Gerbsäure wurden vorher die entstandenen Niederschläge gründlich
beseitigt) und dann für die Versuche benutzt. Andere Membranen
wurden in derselben Weise aus Eiereiweiß hergestellt. Die Filtrier-
papierhülsen wurden mit frischem Eierklar durchtränkt und im Dampf-
kochtopf langsam zur Koagulation gebracht. Die meisten Versuche
mit diesen Hülsen beziehen sich auf die Messung der EMK zweier
Lösungen eines Elektrolyten in verschiedenen Konzentrationen, welche
durch diese Membranen getrennt wurden. Die Technik war dieselbe
wie die bei der Pergamentmembran beschriebene?). Die Einstellung
dieser Potentiale ist bei Eiereiweiß sehr schnell, meistens innerhalb
einer halben Stunde, ausgenommen die Fälle mit HCl und NaOH,
wo es 11 bis 2 Stunden dauerte. Bei Gelatineketten stellte sie sich
im allgemeinen langsamer ein, in den meisten Fällen aber innerhalb
1 Stunde, bei manchen Fällen, wie z. B. bei HCl, NaOH, AlCl, und
Puffergemischen dauerte es 11% Stunde oder mehr. Solche Fälle sind
in den Protokollen (Tabelle II) mit dem Zeichen * bezeichnet. Bei
chromierter Gelatine stellte sich das Potential im allgemeinen schnell
ein. Einige Beispiele für die Art der Einstellung des Potentials sind
in Tabelle I gezeigt. In den folgenden Protokollen bezieht sich das
Vorzeichen immer auf die verdünntere Lösung. Tabelle II gibt die
endgültigen Werte für verschiedene Membranen und Konzentrations-
ketten.
1) Von den drei gehärteten Gelatinearten ist die formolisierte am be-
quemsten. Die tannierte quillt fast ebenso wie die gewöhnliche unbehandelte
Gelatine.
2) Fujita, diese Zeitschr., dritte Mitteilung 159, 370, 1925.
17 *
248 A. Fu jita
Tabelle I.
Zeitliche Schwankung des Potentials der Konzentrationsketten
(0.1: 0,01 äquivalent-normal).
Formolisierte Gelatine
Ka | Age
Minuten li EiereiweiB
nach ` :
Ansetzung KC | MgCh | HCI
0 ¡ 30 |130 — 125| 365 | 135 |— 13,6 — 18,5 | — 15,0
5 38 '—I40|—200| 300 | 15,0 !— 10,6 | — 26,5 |; — 12,5
10 | 42 |—150|—210| 270 ' 16,0 |—120'—305' —100
15 | 42 |—158|—190| 240 | 16,8 1 —13,6 ;— 33,0 | SA
20 | 41 |—160|—1I60| 215 | 168 |—140, — 34,3 0
30 | 40 '—163|— 90| 180 | 168 |—156 — 34,5 7,0
40 | 40 |'—163|— 30| 120 Ï} — |—I170:—345 140
60 40 —163 70| 401 — ¡—190|—345¡ 25,0
80 EE E 10| 02| — ¡203 — 32,5
100 m 120| 0 '| — |—208 | së 34,5
150 = -e Pot a A es E e 34,5
Minuten Tannierte Gelatine | Chromierte Gelatine
nac DEE REENEN r A
Ansetzung | KCI | LiCl — HCI | NaOH ; KCI | CaCl | HCI | NaOH
a E A A E a EM
0 | 72 | 80 SC 33 | 70 ,—28,7|— 63| —1,0
Bo. 72 80 |—567 | 346 70 '—287¡— 72 60
10 | 7,2 TT [—463| 340 | 70 —287|— 80| 120
15 7,2 TO |—410| 333 | 7,0 |—287|— 85| 165
20 — ' 60 |—380| 340 SE — |—142| 193
30 72 | 50 |—36,7| 340 | — — |—160' 225
40 — | 40 |—37,2| 340 , 7,0 — |—165| 265
80 a Logo et: e, A Ze — '—I178| 265
80 = 1 18 132 e WW = — |—I80| —
100 | — 1,3 Sa e E ee u eg
150 | — | = | | - i=!
Überblicken wir die Resultate (Tabellen II und III), so finden
wir fast durchweg, daß das Potential der verdünnteren Lösung deutlich
positiver ist als bei freier Berührung ohne Membran. Z. B. ist dieses
Potential bei formolisierter Gelatine und KO (n/10:n/100) +13 bis
+ 17 Millivolt, bei tannierter Gelatine +7 bis + 8 Millivolt, bei chro-
mierter Gelatine + 7 Millivolt, bei Eiereiweiß +4 bis + 7 Millivolt,
während es bei freier Berührung = 0 ist. Bei NaCl ist es z. B. bei
formolisierter Gelatine +11 bis +16 Millivolt, während es bei freier
Berührung — 12 Millivolt ist, usw. Da in neutraler Lösung Gelatine
und Eiweiß negativ geladen sind, so deckt sich der Befund mit der
Erwartung auf Grund der Versuche der ebenfalls negativ geladenen
Pergamentmembran. Auch bei Elektrolyten mit mehrwertigen An-
ionen ist die diinnere Lósung in Gegenwart der Membran immer stárker
positiv als im Wasser, und diese Erscheinung ist sogar noch etwas
stárker ausgesprochen als bei den ein-einwertigen Salzen. Da die mehr-
wertigen Anionen die Negativität der Membran stark erhöhen, ist
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 249
¡983 — | ge
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GC kend gar —! 9 j 9r — 0 E
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250 A. Fujita.
Tabelle III.
Aus den Mittelwerten von Tabelle II berechneter positivierender Effekt
der Membran auf die verdünntere Lösung.
Membraneffekt gegenüber freier Diffusion, d. b. die Zunahme des
Art der ES Late freier || Potentials der verdünnteren Lösung bei Gegenwart der Membran
ffusion
EE (berechnen) Eiereiweiß Formol. Gelatine | Tann. Gelatine | Chrom. Gelatine
= ~- Ea 2 ai e EE d = SN A a a
KCI | — 04 | 4,7 | 14,4 | 8,1 7,4
KBr ' — 106 ` 5,16 16,86 8,36 9,36
KJ — 0584 | 2,34 18,04 7,34 9,34
K,SO, 13,4 | 5,0 22,2 10,8 14,6
K,FeCy,| 22% | — 02 16,2 8,6 15
NaOH | —346 | 321 "07 666 | 583
HCI | 38 | — 23,4 = 72] — 61,7 — 55
NaCl | —116 ' 5,1 22,5 10,9 12,2
Lici — 18,8 9,1 24,1 15,5 10,2
MgCl, | —225 ` 56 145 6,1 40
CaCl, | —199 3,3 11,4 3.8 | 1,3
AlCl, | — 387 | 5,9 6,6 0,1 — 21
») Dieser Wert ist durch direkte Messung erhalten, da die Beweglichkeit de Ferricyanidionen
uns nicht bekannt war. Siehe Fujita, diese Zeitschr., dritte Mitteilung.
diese Erscheinung im Sinne unserer Theorie verständlich. So wird
beispielsweise bei K,SO, das Potential der dünneren Lösung von
+ 13 Millivolt bei freier Diffusion auf + 36 Millivolt bei Gegenwart
der Membran verändert, bei Kaliumferricyanid von +22 auf +35 bis
+43 Millivolt. Aber auch bei zweiwertigen Kationen ist der Sinn der
Membranwirkung noch der gleiche. So wird bei CaCl, das Potential
der dünneren Lösung von — 20 Millivolt durch die Membran auf — 8
bis — 9 Millivolt bei formolisierter Gelatine geändert. Dagegen bei
H-Ionen wird der Sinn der Erscheinung vollkommen umgekehrt.
Hier wird das Potential der dünneren Lösung stark nach der negativen
Seite verschoben. So wird z.B. bei HCl das Potential von + 38 Millivolt
bei freier Diffusion für formolisierte Gelatine auf — 34 Millivolt ver-
schoben, und ähnlich, wenn auch in geringerem Maße bei den Membranen
aus anderen Gelatinearten und Eiweiß. Die Wirkung der dreiwertigen
Kationen ist nicht so klar überblickbar. Bei AlCl, ist der Effekt im
allgemeinen klein. Bei tannierter und chromierter Gelatine fällt er
vielleicht in die Fehlergrenzen und besteht, wenn überhaupt, jedenfalls
nicht in einer Positivierung der verdünnteren Lösung, sondern in einer
schwach negativierenden Wirkung. Eine deutliche Umkehrung des .
Effekts ist also nur bei HCl zu beobachten, und die H-Ionen sind es
ja auch gerade, welche am sichersten die Umladung der amphoteren
Membran bewirken.
Diese Versuche können nach mancher Richtung nur als qualitativ
betrachtet werden. Eine in gewisser Beziehung quantitative Frage
soll durch die folgende Versuchsanordnung beantwortet werden. Wir
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 251
haben gesehen, daß besonders die H-Ionen eine Umkehrung der Wirkung
hervorrufen. Es soll nun die Frage beantwortet werden, bei welchem
Pp diese Umkehrung eintritt (Tabelle IV). Zu diesem Zwecke wurde
ein Versuch mit Natriumacetatlösung gemacht, auf der einen Seite
der Membran n/10, auf der anderen n/100, und hierzu wurde beider-
seits eine bestimmte Menge Essigsäure hinzugegeben derartig, daß
das py beiderseits praktisch gleich wurde, und diese Essigsäuremenge
wurde in verschiedenen Versuchen variiert. Bei freier Berührung
zweier Lösungen von Natriumacetat wird das Diffusionspotential durch
den Zusatz von etwas Essigsäure nur sehr wenig geändert, denn die
Konzentration der H-Ionen ist auf alle Fälle verschwindend klein
gegenüber der der Na-Ionen, und das Diffusionspotential bleibt daher
praktisch dasselbe wie zwischen zwei reinen Natriumacetatlösungen,
welches bei einem Konzentrationsverháltnis n/10: n/100 + 6 Millivolt
für die verdünntere Lösung beträgt. Bei Gegenwart der amphoteren
Membranen zeigte sich im Gegensatz hierzu, daß das Potential von
der Menge der zugesetzten Essigsäure und daher vom De sehr stark
abhängt. Bei einem py von 4,7 ist das Potential für alle gehärteten
Gelatinearten innerhalb der Fehlergrenzen dasselbe wie für die freie
Diffusion (Tabelle V). Bei Natriumacetat ohne Essigsäure, also bei
annähernd neutraler Reaktion, ist das Potential der dünneren Lösung
für Gelatine in allen Fällen stark positiviert, ebenso wie bei der negativen
Pergamentmembran. Bei py 4,0 ist dagegen das Potential der ver-
dünnteren Lösung überall schon deutlich negativiert gegenüber der
freien Diffusion. Bei gewöhnlicher, nicht gehärteter Gelatine finden
wir (Tabelle VI) bei py 4,7 ein Potential praktisch gleich 0, die dünnere
Lösung ist daher um 7 Millivolt negativer als bei freier Diffusion.
Bei peäp ist das Potential + 16,5 Millivolt, also schon 9 Millivolt
positiver als bei freier Diffusion, und bei py 4,0 ist es — 8,7 Millivolt,
also schon 15 Millivolt negativer als bei freier Diffusion. Der Umkehr-
punkt scheint also zwischen py 5,6 und 4,7 zu liegen, also nur ungefähr,
aber nicht genau, im isoelektrischen Punkte der Gelatine, wie er ge-
wöhnlich angenommen wird, sondern ein wenig alkalischer. Nun hat
Gerngross und Bach!) beschrieben, daß es Gelatinesorten gibt, deren
isoelektrischer Punkt etwas alkalischer als 4,7, nämlich bei 5,05 liegt.
Wir werden sogleich sehen, daß die von mir benutzte Gelatinesorte
eben dieses Verhalten zeigt, und die Übereinstimmung des isoelektrischen
Punktes mit dem Umkehrpunkt der Membranwirkung wird dann
noch besser.
Nun muß man aber berücksichtigen, daß bei ungehärteter Gelatine
die Beschaffenheit der Poren der Gallerte durch die Quellung stark
1) Gerngross und Bach, diese Zeitschr. 143, 533, 1923.
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Flektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 253
beeinflußt wird und daß diese Quellung selbst vom py abhängt. Hier-
durch werden die Verhältnisse etwas kompliziert. Aus diesem Grunde
war die Untersuchung mit den gehärteten, kaum quellungsfähigen
Gelatinearten erwünscht. Auch hier stimmt der Umkehrpunkt mit
dem isoelektrischen Punkte überein, wenn wir annehmen, daß der
isoelektrische Punkt der gehärteten Gelatine annähernd derselbe ist
wie für gewöhnliche Gelatine. Über den isoelektrischen Punkt der
gehärteten Gelatinearten ist mir aber nur eine Angabe von Gerngross
und Bach!) bekannt. Diese fanden, daß der isoelektrische Punkt von
Gelatine in Gegenwart von Formol ein wenig nach der sauren Seite
verschoben wird. Aber erstens handelt es sich nur um einige Stellen
der ersten Dezimale des pg, welche für unsere sehr rohe Abstufung
im pyp sich kaum bemerkbar machen würde, zweitens hatten Gerngross
und Bach die Kataphoreseversuche mit einer Gelatinelösung bei Gegen-
wart eines Überschusses von Formaldehyd gemacht, während ich mit
einer formolisierten Gelatine arbeitete, welche gründlich ausgewässert
war. Da der Einfluß des Formaldehyds auf den isoelektrischen Punkt
wahrscheinlich wesentlich auf einer Bindung der Aminogruppen beruht,
diese aber ein reversibler Vorgang ist und beim Auswässern zum größten
Teil wieder rückgängig gemacht werden dürfte, so ist es möglich, daß
der isoelektrische Punkt einer formolisierten und wieder gewässerten
Gelatine dem der natürlichen Gelatine noch ähnlicher ist als in den
Versuchen von Gerngross und Bach. Für die auf andere Weise gehärteten
Gelatinearten sind uns Angaben über den isoelektrischen Punkt nicht
bekannt. Ich stellte deshalb einige orientierende Versuche an, welche
nur den Zweck haben sollen zu zeigen, daß die Änderung des isoelek-
trischen Punktes der Gelatine durch die verschiedenen Gerbungs-
verfahren jedenfalls sehr klein ist. Als Methode wählte ich die Be-
stimmung des 2g-Optimums für die Alkoholfällung, welche von Wo. Pauli
beschrieben ist. Zu diesem Zwecke mußte zunächst eine homogene
Lösung der verschiedenen Gelatinearten hergestellt werden. Bei der
tannierten Gelatine gelingt es verhältnismäßig leicht, eine homogene
Lösung in heißem Wasser zu erhalten. Bei der chromierten gelingt es
etwas schwerer, aber beim Kochen geht sie schließlich doch in Lösung.
Bei der formolisierten Gelatine gelang es überhaupt nicht, eine Ver-
quellung und Lösung herbeizuführen. Ich beschränkte daher die Ver-
suche auf die chromierte und tannierte Gelatine und stellte als Ver-
gleichsversuch einen ebensolchen mit unvorbehandelter Gelatine her. Die
Versuche wurden genau nach der Vorschrift des Praktikums der physika-
lischen Chemie von Michaelis?) gemacht und ergaben folgendes Resultat.
1) Gerngross und Bach, diese Zeitschr. 148, 533. 1923.
2) Michaelis, Prakt. f. physik. Chem., 2. Aufl., S. 66. Berlin 1922.
254 A.Fujita:
Tabelle VII.
Bestimmung des 7g-Optimums der Gelatine für Alkoholfállung.
Se Pr Messungen beziehen sich auf die Lósungen vor Zusatz des Alkohols.)
Ir Hülse 1 1 Hülse 2 | Hülse 3 Hülse 4 | Hülse 5 | Hülse 6, Hülse 7 d Hülse: s
n/10Na- Acetat. cem 2 j2 E 2 2 2 |2
n/10 Essigsäure, ccm o, 12 | 0,25 | 0,5 1 | 2 4 ==: —
n/l Essigsäure, cem — e e E — 08 |16
Dest. Wasser, ccm || 3,88 | 375 | 35:3 | 2 | 0 | 32 | 24
1. 1proz. gewöhnl. | | | |
Gelatine, ccm . | 2 ; 2 2 2 | 2 | 2 | 2 2
py (elektrometr.) | 5,82 5,52 | 526 | 494 466 | 444 | 4,15 | 3,87
abs. Alkohol, cem | 8 18 |8 18 j8 8 (el
Trübung nach | | | |
30 Minuten . . | — — [++ ++ ++; |]
2. lproz. tannierte | | | |
Gelatine, ccm. | 2 ¡2 |2 E E TO E
Py (elektrometr.) | 5,82 5,51 5,25 : 491 , 4,66 4,36 | 4,06 | 3,75
abs. Alkohol, eem | 8 |8 18 18 |8 ¡8 i8 8
Trübung nach 30 | | |
Minuten ...| — + ¡+++ EPT ETT £ => SZ
3. 1proz.chromierte | | | ¡
Gelatine, cem . || 2 2 | 2 12 2 2
(elektrometr.) | — . — | 5,23 | Se: EH a) ee
abs. Alkohol, com a 108 8 lsg 8 i8 8
Trübung nach 30 | | | | |
Minuten ... | T + tt Sr: EM F e
Die pg-Messungen in den Tabellen wurden elektrometrisch aus-
geführt und beziehen sich auf die fertig zusammengesetzten Gemische
vor dem Zusatz des Alkohols. Als Fällungsoptimum für Alkohol zeigte
sich sowohl bei gewöhnlicher Gelatine, wie bei tannierter und chromierter
Gelatine als Optimum ein py von etwa 4,9, also ziemlich übereinstimmend
mit dem von @Gerngross und Bach gefundenen isoelektrischen Punkte
gewisser Gelatinesorten des Handels, während der isoelektrische Punkt
einer guten Gelatine in der Regel bei 4,7 liegt, wie Chiari!) an Quellungs-
versuchen, Michaelis und Grineff?) durch die Kataphorese fanden und
von vielen Autoren, wie Jacques Loeb u.a., bestätigt worden ist. Es
ist nicht die Absicht dieser Arbeit, eine genaue Bestimmung des iso-
elektrischen Punktes anzustreben. Dies dürfte für die gegerbten Ge-
latinearten mit großen Schwierigkeiten verbunden sein. Aber selbst
diese Versuche zeigen deutlich, daß der Einfluß der Gerbung nur sehr
klein ist. *Der isoelektrische Punkt liegt auf jeden Fall in der Gegend
von Py 4,8 oder 4,9, und diese Feststellung genügt für die Zwecke
dieser Arbeit. '
I) Chiari, diese Zeitschr. 23, 167, 1911.
2) Michaelis und Grineff, ebendaselbst 41, 374, 1912.
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 255
Wenn wir nun zu den Membranversuchen zurückkehren, so können
wir sagen, daß im großen und ganzen der isoelektrische Punkt der
Membran den Umkehrpunkt für die Membranwirkung darstellt. Die
Natriumacetatkonzentrationskette hat bei Gegenwart der Membran
im isoelektrischen Punkte dieselbe Potentialdifferenz wie ohne Membran.
Wird die Reaktion saurer, so wird das Potential negativer für die
verdünntere Lösung, wird es alkalischer, sò wird es positiver als bei
freier Berührung der Lösungen.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Membranen unterscheiden sich
von denen in den früheren Mitteilungen untersuchten durch ihre
gallertige Beschaffenheit. Man könnte daher den Einwand machen,
daß die Abweichung der Resultate von denen mit Kollodium usw.
auf diese Beschaffenheit der Membran zurückzuführen ist und nicht
auf die amphotere Natur derselben. Diesen Einwand kann man leicht
prüfen, indem man eine ebenfalls gallertige, aber nicht amphotere
Membran untersucht. Diese beiden Eigenschaften finden sich ver-
einigt in einer Membran aus Agar. Dieses kann im allgemeinen als
ein elektronegatives Kolloid aufgefaßt werden. @yemant!) fand durch
Kataphoreseversuche, daß Agar gegenüber wässerigen Lösungen
elektronegativ ist. Die Ladung wurde durch mehrwertige Kationen
vermindert, aber nicht umgedreht. In n/1000 Salzsäure fand sich immer
noch eine deutliche negative Ladung; höhere HCl-Konzentrationen
wurden von ihm nicht untersucht. Es ist wohl anzunehmen, daß in
höheren Konzentrationen HCl noch stärker entladend wirkt, jedoch
liegen keine Anhaltspunkte dafür vor, daß eine Umkehrung der Ladung
eintritt. Kruyt und Jong?) beschrieben einige Kataphoreseversuche
mit Agar, aus denen hervorgeht, daß Agar selbst bei Anwesenheit
des dreiwertigen Luteokobaltchlorid negativ bleibt, wenn auch mit
steigender Konzentration des Salzes immer weniger. Im übrigen haben
Kruyt und Jong in ihrer Arbeit über die Viskosität des Agars wahr-
scheinlich gemacht, daß Agar immer negativ ist und durch Elektrolyte
im besten Falle entladen wird. Auf jeden Fall ist der Unterschied
des elektrischen Verhaltens zwischen Agar und Gelatine leicht erkennbar.
Bei Gelatine kann mit Leichtigkeit ein isoelektrischer Punkt mit den
verschiedensten Methoden nachgewiesen werden, für Agar ist bisher
noch keine Bedingung gefunden worden, unter welcher diese Substanz
elektropositiv auftritt. Wenn aber Agar immer elektronegativ ist.
so wäre auf Grund der entwickelten Vorstellungen zu erwarten, daB
der Effekt einer Agarmembran auf ein Diffusionspotential immer
nur in einer Positivierung der verdünnteren Lösung im Vergleich zu
1
) A. Gyemant, Kolloid-Zeitschr. 28, 103, 1921.
2) Kruyt und Jong, Zeitschr. f. physik. Chem. 100, 250, 1922.
242 V. Syniewski:
zu Ende laufen würde, im Maximum 69,09 Proz. Maltose liefern.
Zur Ermittlung des Reaktionsgeschwindigkeitskoeffizienten wandte ich
1 69,09 a
deshalb die für die Rechnung bequeme Formel k = - Jo og ` 69,094 _ 100z
an, wobei hier x die in den einzelnen ee entstandenen
Maltosemengen bedeutet. Es wurden hierbei nachfolgende Werte
für E errechnet:
Nr. des | wi # Nr. des el“
Versuchs | |! oin Minuten Versuchs in Miei EN
] 15 | 0,001 731 15 l 220 0,002 121
2 25 1 600 16 245 2243
3 ji 35 | 1551 Dm mp ` 2 402
4 | 45 1557 18 | 305 | 2 567
5 55 1575 19 | 345 2 764
6 ` 65 | 1 598 20 | 395 2 846
7 80 1 638 2... 445 2 808
8 | 95 | 1 656 22. 505 2 618
9. 110 | 1720 23. 565 2 363
10 125 1 730 au 625 | 2159
11 140 1 785 25 | 805 1 694
12 i 155 1 835 ge ` 985 1 399
13 175 | 1910 27 ¡ 1230 1 203
14 195 | 1 996 |
Es ergibt sich also, daß die Reaktionsgeschwindigkeit nach obiger
Berechnung mit der Zeit wächst, um bei Entstehung von etwa 63,5
bis 65 Proz. Maltose ihr Maximum zu erreichen.
Wenn wir nun bedenken, daß die Amylodextrinmolekel, wie oben
gesagt, mit dem Dextrinringekomplex 12 Maltosereste verbunden
enthält, und daß es möglich ist anzunehmen, daß während der Hydro-
lyse in den einzelnen Molekeln nacheinander nicht alle Maltosereste
auf einmal abgespalten werden, sondern daß in ihnen anfangs je ein
Maltoserest abgespalten wird, wobei eine Substanz übrigbleibt, deren
Molekel aus dem Dextrinringekomplex und 11 Maltoseresten besteht,
diese Substanz dann weiter so hydrolysiert wird, daß ein weiterer
Maltoserest von der Molekel abgesprengt wird, und die restierende
Substanz dann aus Molekeln besteht, in denen mit dem Dextrinringe-
komplex bloß zehn Maltosereste verbunden zurückbleiben usw., da
die Hydrolyse also in 12 Etappen vor sich geht, wobei in jeder je 1/13
der ganzen abspaltbaren Maltosemenge losgerissen wird, so haben wir
es in diesem Falle mit 12 insofern verschiedenen hydrolytischen Pro-
zessen zu tun, als in jedem prinzipiell eine andere Substanz und in
immer kleinerer Menge der Hydrolyse unterzogen wird. Wir wollen
nun berechnen, wie die Geschwindigkeit in den einzelnen Etappen
der Hydrolyse wächst.
Diastase. III. 243
Den Verlauf des ganzen Prozesses, das ist bis zur Erscheinung von
69,09 Proz. = 3,6251 g Maltose, teilen wir in 12 Etappen ein, wobei
also die erste nach dem Erscheinen von 5,76 Proz., die zweite nach
dem Entstehen von 11,52 Proz. usw. Maltose zu Ende ist. Wir er-
mitteln dann, welche Mengen von Maltose und in welchen Zeiten
in den einzelnen Etappen entstehen, und berechnen aus diesen Zahlen,
bei Berücksichtigung dessen, daß a jetzt gleich ist Zn = 0,30209
(für 100 ccm), die Geschwindigkeitskoeffizienten. Die Resultate der
einzelnen Rechnungen sind in Tabelle II zusammengestellt.
1235 ‚0,1295 197
Tabelle II.
i | Aus der ¡| Entstandene |
2 |l r korrigiert. Kurve Zu Ende der Etappe: | Maltose in der |
5 il i berechn. Maltose ı| betreff. Etappe
= 1 ga bt,
Su CS E SCH GE a
> SEIERE PEERKE FE f ven a
Y | NE oëleate a SS E | g£ nech fi (as 0,302 09)
K | eA asi | Nr. R br] eg 5 | Min. eo:
aE ana ee [87 (225 |
zZ: el es | a > S | PIN d ii
| ve £ | Proz. | Es i g , i ,
1 | | | 15 ¡0,2104 | 0,03426
2 | . 25 0,2991 8018
| 5,76 | 25,5 | 0,3021 ; |
3 | | | 9,5 0,1249) 2437
4 | | . 19,5 0,2383. 8591
h . 11,52 510; ‚0,6042 ' | |
NM | | | 4 '0,0517: 2038
6 | | i 14 0,1671 | 2498
| . | 17,27 : 78,0 ' 0,9063 ` 1
Sr Ä | | 2 100381: 2878
8. | | 1 17 10/2165. 3222
| . | 23,03 1105 | 1,2084 |
9: | ' ,0/0719 2361
10° | ' 20 0220 2938
\ V.j 28,79 133 |1,5105'
11. | | Be 0.0795. 1895
ER | | 22 102420 \ 3186
i I. 34,55 1164 |1,8125' |
ER | | ‚11 4841) 2316
\ .; 40,30 192 |2,1146.
14 Ä | 3 0,0314! 1589
15 | | | 28 Ko 2014
i .| 46,06 222,5 ‚2,4167 '
16. | | 225 0,1858 1842
| | 51,82 259,5 | 2,7188,
I7 '155 9145. 1337
i a ‚58 ECH 3,0209 :
18 | ` Lë 0,0066 640
19 | | 41,5 0,2007 1142
63,35 381,5. 3,3230 |
20 | 1 EE 0.0298 334
21 ` | | | 63.5 0,0980 269
| |
244 V. Syniewski: Diastase. 11I.
Aus dieser Tabelle ist nun ersichtlich, daß die Geschwindigkeit
in den einzelnen Etappen (I. bis XI.) selbstverständlich ebenfalls
ansteigt, daß jedoch die Intensität des Anstieges in den einzelnen
Etappen immer geringer wird, um in der XI. fast auf Null zu sinken),
die Verzuckerung in dieser Etappe also beinahe der logarithmischen
Formel entsprechend verläuft. In der XII. Etappe wird die Geschwin-
digkeit mit der Zeit kleiner.
Diese einleitende Untersuchung hat somit erwiesen, daß die
Hoffnung, die mit einem reinen diastatischen Enzym verlaufende
Hydrolyse der Stärke, analog der Rohrzuckerhydrolyse unter Ver-
mittlung der Saccharase, als monomolekular verlaufenden einfachen
Prozeß deuten zu können, trügerisch war. Er scheint viel komplizierter
zu sein, so daß es einer ganzen Reihe vielfach abgeänderter Versuche
bedürfen wird, um der richtigen von den vielen theoretisch denkbaren
Ursachen dieser Kompliziertheit auf die Spur zu kommen. Dieser
Aufgabe wird die weitere Arbeit gewidmet sein.
1) Aus der Konstruktion der Teilkurven der Geschwindigkeit ist dies
leicht zu ersehen.
Untersuchungen über elektrische Erscheinungen
und Ionendurchlässigkeit von Membranen.
V. Mitteilung:
Die Eigenschaften der Membranen von amphoterem Charakter.
Von
Akiji Fujita.
(Aus dem biochemischen Institut der Aichi-Medizinischen Universität
zu Nagoya, Japan.)
- (Eingegangen am 19. Mai 1925.)
Das Gemeinsame derjenigen Membranen, welche in den früheren
Mitteilungen!) untersucht wurden, besteht darin, daß sie gegen wässerige
Lösungen stets negativ elektrisch geladen sind. Die gemeinsame Deutung
aller mitgeteilten Befunde konnte darin gefunden werden, daß die
mittlere Wanderungsgeschwindigkeit der Anionen im Vergleich zu der
der Kationen durch die Membran verringert wird. Es lag nahe, die
Elektronegativität der Membran mit ihrer verzögernden Wirkung aut
die Anionen in einen ursächlichen Zusammenhang zu bringen. Daraus
entsteht die Frage, ob bei elektropositiven Membranen nicht eine
Umkehrung der Wirkung eintritt. Membranen, welche stets elektro-
positiv geladen sind, sind kaum zu finden?). Dagegen gibt es zahlreiche
Membranen, welche je nach der Konzentration und Art der sie berühren-
den Elektrolytlösung bald positiv, bald negativ sind. Das sind Mem-
branen von chemisch amphoterem Charakter, also besonders Membranen
aus eiweißartigen Körpern. In dieser Beziehung liegen nun schon einige
Untersuchungen aus dem Laboratorium von Höber®) vor, insbesondere
1) Diese Zeitschr. (im Druck). '
2) L. Michaelis, Kolloid-Zeitschr. 81, 246, 1922, und zwar 5. 240,
3) Höber, Zeitschr. f. physik. Chem. 110, 142, 1924.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 17
246 A. Fujita:
untersuchte Mond!) die Eigenschaften von Gelatine und Filtern,
welche hergestellt waren durch Zusammenpressen von festem Casein
und Euglobulin. In diesen Arbeiten wird besonders für die Gelatine
beschrieben, daß die Wirkung solcher Membran auf die Potential-
differenz zweier durch sie getrennter Elektrolytlösungen umgekehrt ist,
je nachdem man eine saure oder eine alkalische Gelatinegallerte nimmt.
In der Deutung dieser Erscheinung, welche insbesondere von Höber?)
erörtert wird, sind die Autoren noch vorsichtig. Höber spricht nur
von allgemeiner Wirkung der Kapillarität und hebt hervor, daß keines-
falls die Verteilungspotentiale zwischen zwei Phasen nach Nernst
und Huber geeignet sind, die Erscheinung zu erklären, während Mond
eine Deutung der Erscheinungen auf Grund der Phasengrenzkräfte
für denkbar hält. Die Tatsachen sind physiologisch offenbar von
größter Bedeutung, weil wir hier Membranen vor uns haben, deren
Permeabilitát und elektrische Erscheinungen durch Änderung der
äußeren Bedingungen von Grund auf geändert werden können. Wir
dürfen vermuten, daß die Aufklärung dieser Verhältnisse für die Physio-
logie von Nutzen sein wird, weil nach dem heutigen Stande unserer
Kenntnisse?) die Variabilität der Permeabilitát einer Membran unter
dem Einfluß der äußeren Bedingungen von ausschlaggebender Be-
deutung für die Zellphysiologie ist.
In unseren früheren Mitteilungen, welche sich mit den elektro-
negativen Membranen beschäftigten, wurde folgende Erklärung für
die Wirkung dieser Membranen versucht. Die Negativität der Membran
ist der Ausdruck dafür, daß sie negative Ionen adsorbiert. Wenn
nun in den Kanälchen einer negativen Membran sich eine Elektrolyt-
lösung befindet, so müssen also die Anionen derselben zum Teil von
der Wand der Kanälchen fixiert werden. Deshalb wird die durch-
schnittliche Beweglichkeit der Anionen innerhalb der Kanälchen relativ
zu der der Kationen herabgesetzt. Auf Grund dieser Annahme
konnten alle von uns beobachteten Tatsachen betreffs der elektro-
motorischen Effekte und der Diffusion von Elektrolyten erklärt werden.
In genauerer Weise wurde diese Theorie an anderer Stelle von
Michaelis?) entwickelt.
Wenn diese Vorstellungen zu Recht bestehen, dann müßte man
bei amphoteren Membranen erwarten, daß diese im isoelektrischen
Punkte überhaupt keine Wirkung ausüben, d. h. daß zwei Elektrolyt-
1) Mond, Pflügers Arch. 208, 247, 1924.
2) Höber, Zeitschr. f. physik. Chem. 110, 142, 1924.
3) Hamburger, Ergebn. d. Physiol. 28, 77, 1924.
1) Michaelis, Journ. of general Physiol., Memorial Vol. for Jacques
Loeb, 1925.
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 247
lösungen, welche durch eine isoelektrische Membran getrennt sind,
denselben Potentialunterschied zeigen wie bei freier Berührung; daß
die Membran, wenn sie negativ geladen ist, sich prinzipiell ebenso
verhalten wird, wie wir es für Pergamentpapier oder Kollodium be-
schrieben haben, d. h. daß die Beweglichkeit der Anionen relativ ver-
mindert ist, und daß, wenn sie positiv geladen ist, die relative mittlere
Beweglichkeit der Kationen vermindert ist. Dies soll in der folgenden
Mitteilung geprüft werden.
Die Membranen wurden in folgender Weise hergestellt. Extraktions-
hülsen von Schleicher und Schüll wurden mit 30proz. Gelatine gut
durchtränkt und an der Luft getrocknet. Diese Membranen wurden
teils ohne weitere Vorbereitung benutzt, teils vor der weiteren Be-
nutzung mit verschiedenen Mitteln gehärtet, um ihre Quellung im
Wasser herabzusetzen!). Sie wurden zum Teil über Nacht in zehnfach
verdünntes Formalin oder in 2proz. Kaliumbichromat oder lproz.
Getbsäure eingelegt, dann mindestens ebensolange gründlich gewássert
(bei Gerbsäure wurden vorher die entstandenen Niederschläge gründlich
beseitigt) und dann für die Versuche benutzt. Andere Membranen
wurden in derselben Weise aus Eiereiweiß hergestellt. Die Filtrier-
papierhülsen wurden mit frischem Eierklar durchtränkt und im Dampf-
kochtopf langsam zur Koagulation gebracht. Die meisten Versuche
mit diesen Hülsen beziehen sich auf die Messung der EMK zweier
Lösungen eines Elektrolyten in verschiedenen Konzentrationen, welche
durch diese Membranen getrennt wurden. Die Technik war dieselbe
wie die bei der Pergamentmembran beschriebene?). Die Einstellung
dieser Potentiale ist bei Eiereiweiß sehr schnell, meistens innerhalb
einer halben Stunde, ausgenommen die Fälle mit HCl und NaOH,
wo es 11, bis 2 Stunden dauerte. Bei Gelatineketten stellte sie sich
im allgemeinen langsamer ein, in den meisten Fällen aber innerhalb
l Stunde, bei manchen Fällen, wie z. B. bei HCl, NaOH, AlCl, und
Puffergemischen dauerte es 11 Stunde oder mehr. Solche Fälle sind
in den Protokollen (Tabelle II) mit dem Zeichen * bezeichnet. Bei
chromierter Gelatine stellte sich das Potential im allgemeinen schnell
ein. Einige Beispiele für die Art der Einstellung des Potentials sind
in Tabelle I gezeigt. In den folgenden Protokollen bezieht sich das
Vorzeichen immer auf die verdünntere Lösung. Tabelle II gibt die
endgültigen Werte für verschiedene Membranen und Konzentrations-
ketten.
1) Von den drei gehärteten Gelatinearten ist die formolisierte am be-
quemsten. Die tannierte quillt fast ebenso wie die gewöhnliche unbehandelte
Gelatine.
2) Fujita, diese Zeitschr., dritte Mitteilung 159, 370, 1925.
17 *
248 A. Fujita:
Tabelle 1.
Zeitliche Schwankung des Potentials der Konzentrationsketten
(0,1: 0,01 äquivalent-normal).
Minuten | Eiereiweiß Formolisierte Gelatine
nach — ul se ee a Se ee un Zi a een
Ansetzung KCI | Mei | HCI | NaOH |; kO | AC | HCI | NaOH
ta
4 `
| i |
0, 30 ¡—I30¡—125| 365, 135 ,—136,—18,5; — 15,0
5 | 3,8 '—140'—200| 300 ' 150 ` — 10,6 ,— 26,5 | — 125
10 | 42 |—150|—210| 270 | 160 —120 — 305 | — 10,0
15 vu 42 |—158 | —190| 240 | 168 !—136 —330 | — 55
20 41 |—16,0 | —16,0| 215 | 168 —140 —343, 0
30 4,0 Zı03 — 90| 180 168 —156 —345 7,0
40 40 !—163|— 30| 120 — '—-170 —345 14,0
60 | 40 ,—16,3 TO| 40 — |—190 —345 25,0
BO | — — 110| 02 — \—203, — ¡ 325
100 S E 120| 0 |; — 208 — | 345
150 — ¡y — 120| —07 : — — — | 35
Minuten | Tannierte Gelatine | Chromierte Gelatine
a EE EEN a a a Tg A
a KCI | LiCI HO | NaOH KO | CaCh | HCI NaOH
| | | ' |
0 7,2 80 ¡—74,7| 333 4 70 :—287,— 63' —10
5 7,2 80 |—567 | 346 , 70 —287 | — 712 60
10 7,2 77 |—463| 340 | 70 —287 — 80 120
15 | 72 oo |—410| 333 70 —287 BA 165
20 = 60 |—380| 340 | — — —142| 193
30 7,2 50 |—367| 340 — — —160 225
40 y — 40 |—372| 340 7,0 — ¡—165. 265
60 | — 30 |--37,7, — — — 1178| 265
80 — Kë E =. ve =- Jaio
100 . — 1,3 — == — .—13 —
|
Überblicken wir die Resultate (Tabellen II und III), so finden
wir fast durchweg, daß das Potential der verdünnteren Lösung deutlich
positiver ist als bei freier Berührung ohne Membran. Z. B. ist dieses
Potential bei formolisierter Gelatine und KCI (n/10:n/100) +13 bis
+17 Millivolt, bei tannierter Gelatine +7 bis + 8 Millivolt, bei chro-
mierter Gelatine +7 Millivolt, bei Eiereiweiß +4 bis + 7 Millivolt,
während es bei freier Berührung = 0 ist. Bei NaCl ist es z. B. bei
formolisierter Gelatine +11 bis + 16 Millivolt, während es bei freier
Berührung — 12 Millivolt ist, usw. Da in neutraler Lösung Gelatine
und Eiweiß negativ geladen sind, so deckt sich der Befund mit der
Erwartung auf Grund der Versuche der ebenfalls negativ geladenen
Pergamentmembran. Auch bei Elektrolyten mit mehrwertigen An-
ionen ist die dünnere Lösung in Gegenwart der Membran immer stärker
positiv als im Wasser, und diese Erscheinung ist sogar noch etwas
stärker ausgesprochen als bei den ein-einwertigen Salzen. Da die mehr-
wertigen Anionen die Negativität der Membran stark erhöhen, ist
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 249
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250 A. Fujita.
Tabelle III.
Aus den Mittelwerten von Tabelle 11 berechneter positivierender Effekt
der Membran auf die verdünntere Lösung.
Membraneffekt gegenüber freier Diffusion, d.b. die Zunshme des
EMK bei freier || Potentials der verdünnteren Lösung bei Gegenwart der Membran
Art der Diffusion
ad | (berechnet) Eiereiweiß Formol. Gelatine I Tann. Gelatine | Chrom. Gelatine
KCI +: — 04 470 144 | 8,1 | ZA
KBr — 1,06 5,16 16,86 8,36 9,36
KJ — 08 2,34 | 18/04 7,34 9,34
K,SO, | 13,4 5,0 22,2 10,8 14,6
K,Fecy, | 22*) — 02 16,2 8,6 15
NaOH | —346 32,1 70,7 66,6 58,3
HCI | 38 Si O EE — 61,7 — 55
NaCl — 11,6 51 | 225 10,9 12,2
LiCl — 18,8 9,1 24,1 15,5 10,2
MgCl, | — 22,5 5,6 14,5 6,1 4,0
Col, | —199 : 33 (4 3,8 1,3
AICL | —287 ` 59 | 6,6 01. — 21
*) Dieser Wert ist durch direkte Messung erhalten, da die Beweglichkeit der Ferricyanidionen
uns nicht bekannt war. Siche Fujita, diese Zeitschr., dritte Mitteilung.
diese Erscheinung im Sinne unserer Theorie verständlich. So wird
beispielsweise bei K,SO, das Potential der dünneren Lösung von
+ 13 Millivolt bei freier Diffusion auf + 36 Millivolt bei Gegenwart
der Membran verändert, bei Kaliumferricyanid von + 22 auf +35 bis
+43 Millivolt. Aber auch bei zweiwertigen Kationen ist der Sinn der
Membranwirkung noch der gleiche. So wird bei CaCl, das Potential
der dünneren Lösung von — 20 Millivolt durch die Membran auf — 8
bis — 9 Millivolt bei formolisierter Gelatine geändert. Dagegen bei
H-Ionen wird der Sinn der Erscheinung vollkommen umgekehrt.
Hier wird das Potential der dünneren Lösung stark nach der negativen
Seite verschoben. So wird z.B. bei HCl das Potential von + 38 Millivolt
bei freier Diffusion für formolisierte Gelatine auf — 34 Millivolt ver-
schoben, und ähnlich, wenn auch in geringerem Maße bei den Membranen
aus anderen Gelatinearten und Eiweiß. Die Wirkung der dreiwertigen
Kationen ist nicht so klar überblickbar. Bei AlCl, ist der Effekt im
allgemeinen klein. Bei tannierter und chromierter Gelatine fällt er
vielleicht in die Fehlergrenzen und besteht, wenn überhaupt, jedenfalls
nicht in einer Positivierung der verdünnteren Lösung, sondern in einer
schwach negativierenden Wirkung. Eine deutliche Umkehrung des .
Effekts ist also nur bei HCl zu beobachten, und die H-Ionen sind es
ja auch gerade, welche am sichersten die Umladung der amphoteren
Membran bewirken.
Diese Versuche können nach mancher Richtung nur als qualitativ
betrachtet werden. Eine in gewisser Beziehung quantitative Frage‘
soll durch die folgende Versuchsanordnung beantwortet werden. Wir
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 251
haben gesehen, daß besonders die H-Ionen eine Umkehrung der Wirkung
hervorrufen. Es soll nun die Frage beantwortet werden, bei welchem
Pu diese Umkehrung eintritt (Tabelle IV). Zu diesem Zwecke wurde
ein Versuch mit Natriumacetatlösung gemacht, auf der einen Seite
der Membran n/10, auf der anderen n/100, und hierzu wurde beider-
seits eine bestimmte Menge Essigsäure hinzugegeben derartig, daB
das py beiderseits praktisch gleich wurde, und diese Essigsäuremenge
wurde in verschiedenen Versuchen variiert. Bei freier Berührung
zweier Lösungen von Natriumacetat wird das Diffusionspotential durch
den Zusatz von etwas Essigsäure nur sehr wenig geändert, denn die
Konzentration der H-Ionen ist auf alle Fälle verschwindend klein
gegenüber der der Na-Ionen, und das Diffusionspotential bleibt daher
praktisch dasselbe wie zwischen zwei reinen Natriumacetatlösungen,
welches bei einem Konzentrationsverhältnis n/10: n/100 + 6 Millivolt
für die verdünntere Lösung beträgt. Bei Gegenwart der amphoteren
Membranen zeigte sich im Gegensatz hierzu, daß das Potential von
der Menge der zugesetzten Essigsäure und daher vom py sehr stark
abhängt. Bei einem py von 4,7 ist das Potential für alle gehärteten
Gelatinearten innerhalb der Fehlergrenzen dasselbe wie für die freie
Diffusion (Tabelle V). Bei Natriumacetat ohne Essigsäure, also bei
annähernd neutraler Reaktion, ist das Potential der dünneren Lösung
für Gelatine in allen Fällen stark positiviert, ebenso wie bei der negativen
Pergamentmembran. Bei py 4,0 ist dagegen das Potential der ver-
dünnteren Lösung überall schon deutlich negativiert gegenüber der
freien Diffusion. Bei gewöhnlicher, nicht gehärteter Gelatine finden
wir (Tabelle VI) bei pe 4,7 ein Potential praktisch gleich 0, die dünnere
Lösung ist daher um 7 Millivolt negativer als bei freier Diffusion.
Bei pg 5,6 ist das Potential + 16,5 Millivolt, also schon 9 Millivolt
positiver als bei freier Diffusion, und bei py 4,0 ist es — 8,7 Millivolt,
also schon 15 Millivolt negativer als bei freier Diffusion. Der Umkehr-
punkt scheint also zwischen py 5,6 und 4,7 zu liegen, also nur ungefähr,
aber nicht genau, im isoelektrischen Punkte der Gelatine, wie er ge-
wöhnlich angenommen wird, sondern ein wenig alkalischer. Nun hat
Gerngross und Bach!) beschrieben, daß es Gelatinesorten gibt, deren
isoelektrischer Punkt etwas alkalischer als 4.7, nämlich bei 5,05 liegt.
Wir werden sogleich sehen, daß die von mir benutzte Gelatinesorte
eben dieses Verhalten zeigt, und die Übereinstimmung des isoelektrischen
Punktes mit dem Umkehrpunkt der Membranwirkung wird dann
noch besser.
Nun muß man aber berücksichtigen, daß bei ungehärteter Gelatine
die Beschaffenheit der Poren der Gallerte durch die Quellung stark
1) Gerngross und Bach, diese Zeitschr. 148, 533, 1923.
A. Fujita
252
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Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 253
beeinflußt wird und daß diese Quellung selbst vom py abhängt. Hier-
durch werden die Verhältnisse etwas kompliziert. Aus diesem Grunde
war die Untersuchung mit den gehärteten, kaum quellungsfähigen
Gelatinearten erwünscht. Auch hier stimmt der Umkehrpunkt mit
dem isoelektrischen Punkte überein, wenn wir annehmen, daß der
isoelektrische Punkt der gehärteten Gelatine annähernd derselbe ist
wie für gewöhnliche Gelatine. Über den isoelektrischen Punkt "der
gehärteten Gelatinearten ist mir aber nur eine Angabe von Gerngross
und Bach!) bekannt. Diese fanden, daß der isoelektrische Punkt von
Gelatine in Gegenwart von Formol ein wenig nach der sauren Seite
verschoben wird. Aber erstens handelt es sich nur um einige Stellen
der ersten Dezimale des py, welche für unsere sehr rohe Abstufung
im Py sich kaum bemerkbar machen würde, zweitens hatten Gerngross
und Bach die Kataphoreseversuche mit einer Gelatinelösung bei Gegen-
wart eines Überschusses von Formaldehyd gemacht, während ich mit
einer formolisierten Gelatine arbeitete, welche gründlich ausgewässert
war. Da der Einfluß des Formaldehyds auf den isoelektrischen Punkt
wahrscheinlich wesentlich auf einer Bindung der Aminogruppen beruht,
diese aber ein reversibler Vorgang ist und beim Auswässern zum größten
Teil wieder rückgängig gemacht werden dürfte, so ist es möglich, daß
der isoelektrische Punkt einer formolisierten und wieder gewässerten
Gelatine dem der natürlichen Gelatine noch ähnlicher ist als in den
Versuchen von Gerngross und Bach. Für die auf andere Weise gehärteten
Gelatinearten sind uns Angaben über den isoelektrischen Punkt nicht
bekannt. Ich stellte deshalb einige orientierende Versuche an, welche
nur den Zweck haben sollen zu zeigen, daß die Änderung des isoelek-
trischen Punktes der Gelatine durch die verschiedenen Gerbungs-
verfahren jedenfalls sehr klein ist. Als Methode wählte ich die Be-
stimmung des pg-Optimums für die Alkoholfällung, welche von Wo. Pauli
beschrieben ist. Zu diesem Zwecke mußte zunächst eine homogene
Lösung der verschiedenen Gelatinearten hergestellt werden. Bei der
tannierten Gelatine gelingt es verhältnismäßig leicht, eine homogene
Lösung in heißem Wasser zu erhalten. Bei der chromierten gelingt es
etwas schwerer, aber beim Kochen geht sie schließlich doch in Lösung.
Bei der formolisierten Gelatine gelang es überhaupt nicht, eine Ver-
quellung und Lösung herbeizuführen. Ich beschränkte daher die Ver-
suche auf die chromierte und tannierte Gelatine und stellte als Ver-
gleichsversuch einen ebensolchen mit unvorbehandelter Gelatine her. Die
Versuche wurden genau nach der Vorschrift des Praktikums der physika-
lischen Chemie von Michaelis?) gemacht und ergaben folgendes Resultat.
1) Gerngross und Bach, diese Zeitschr. 148, 533. 1923,
2) Michaelis, Prakt. f. physik. Chem., 2. Aufl., S. 66. Berlin 1922.
254 A. Fujita:
Tabelle VII.
Bestimmung des £g-Optimums der Gelatine für Alkoholfällung.
(Die py-Messungen beziehen sich auf die Lösungen vor Zusatz des Alkohols.)
Hülse 3. Hülse 4| Hülse 5 | Hülse 6 Hülse 7 Hülse $
Trübung nach ! |
30 Minuten... — ' — | ++ +++ ++
2. 1proz. tannierte |
Gelatine, ccm . | | 2
py (elektrometr.) | 5,82 551 | 525 491 466 436 4,06 | 3,75
abs. Alkohol, cem | 8 8 8 8 18 8 8 8
Trübung nach 30 |
Minuten .. . | —
| Hülse 1 Hülse 2
n/10Na-Acetat, ccm | 2 | 2 2 e 2 2 T. | 2
n/10 Essigsáure,ccm || 0,12 | 025 | 05 1 2 4 ==: —
n/1 Essigsäure, ccm | — — | — — — — 0,8 1,6
Dest. Wasser, ccm | 3,88 | 375135 3 ,2 10 3,2 ZA
1. lproz. gewöhnl. | | | |
Gelatine, cem . || 2 | 2 2 2 ı 2 2 ' 2 2
py (elektrometr.) | 582 | 5,52 | 526 49 466 | 4,44 , 415 | 3,87
abs. Alkohol, cem ` 8 | 8 8 8 8 8 8 8
|
E EE DEE EE EE to
3. ]proz.chromierte Ä |
Gelatine, ccm . 2 2 ek: 2 2 2 2 2
py (elektrometr.) |. — — 5,23 | 493 | 4,64: — | — —
abs. Alkohol,cem | 8 ¿8 18 18 8 8 8 8
H ! |
Trübung nach 30 | | | |
Minuten ...i EI + +++ +++ +++ +. — | —
Die pn-Messungen in den Tabellen wurden elektrometrisch aus-
geführt und beziehen sich auf die fertig zusammengesetzten Gemische
vor dem Zusatz des Alkohols. Als Fällungsoptimum für Alkohol zeigte
sich sowohl bei gewöhnlicher Gelatine, wie bei tannierter und chromierter
Gelatine als Optimum ein py von etwa 4,9, also ziemlich übereinstimmend
mit dem von Gerngross und Bach gefundenen isoelektrischen Punkte
gewisser Gelatinesorten des Handels, während der isoelektrische Punkt
einer guten Gelatine in der Regel bei 4,7 liegt, wie Chiari!) an Quellungs-
versuchen, Michaelis und Grineff?) durch die Kataphorese fanden und
von vielen Autoren, wie Jacques Loeb u.a., bestätigt worden ist. Es
ist nicht die Absicht dieser Arbeit, eine genaue Bestimmung des iso-
elektrischen Punktes anzustreben. Dies dürfte für die gegerbten Ge-
latinearten mit großen Schwierigkeiten verbunden sein. Aber selbst
diese Versuche zeigen deutlich, daß der Einfluß der Gerbung nur sehr
klein ist. *Der isoelektrische Punkt liegt auf jeden Fall in der Gegend
von De 4,8 oder 4,9, und diese Feststellung genügt für die Zwecke
dieser Arbeit. `
1) Chiari, diese Zeitschr. 93, 167, 1911.
2) Michaelis und Grineff, ebendaselbst 41, 374, 1912.
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 255
Wenn wir nun zu den Membranversuchen zurückkehren, so können
wir sagen, daß im großen und ganzen der isoelektrische Punkt der
Membran den Umkehrpunkt für die Membranwirkung darstellt. Die
Natriumacetatkonzentrationskette hat bei Gegenwart der Membran
im isoelektrischen Punkte dieselbe Potentialdifferenz wie ohne Membran.
Wird die Reaktion saurer, so wird das Potential negativer für die
verdünntere Lösung, wird es alkalischer, só wird es positiver als bei
freier Berührung der Lösungen.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Membranen unterscheiden sich
von denen in den früheren Mitteilungen untersuchten durch ihre
gallertige Beschaffenheit. Man könnte daher den Einwand machen,
daß die Abweichung der Resultate von denen mit Kollodium usw.
auf diese Beschaffenheit der Membran zurückzuführen ist und nicht
auf die amphotere Natur derselben. Diesen Einwand kann man leicht
prüfen, indem man eine ebenfalls gallertige, aber nicht amphotere
Membran untersucht. Diese beiden Eigenschaften finden sich ver-
einigt in einer Membran aus Agar. Dieses kann im allgemeinen als
ein elektronegatives Kolloid aufgefaßt werden. Gyemant*) fand durch
Kataphoreseversuche, daß Agar gegenüber wässerigen Lösungen
elektronegativ ist. Die Ladung wurde durch mehrwertige Kationen
vermindert, aber nicht umgedreht. In n/1000 Salzsäure fand sich immer
noch eine deutliche negative Ladung; höhere HCl-Konzentrationen
wurden von ihm nicht untersucht. Es ist wohl anzunehmen, daß in
höheren Konzentrationen HCl noch stärker entladend wirkt, jedoch
liegen keine Anhaltspunkte dafür vor, daß eine Umkehrung der Ladung
eintritt. Kruyt und Jong?) beschrieben einige Kataphoreseversuche
mit Agar, aus denen hervorgeht, daß Agar selbst bei Anwesenheit
des dreiwertigen Luteokobaltchlorid negativ bleibt, wenn auch mit
steigender Konzentration des Salzes immer weniger. Im übrigen haben
Kruyt und Jong in ihrer Arbeit über die Viskosität des Agars wahr-
scheinlich gemacht, daß Agar immer negativ ist und durch Elektrolyte
im besten Falle entladen wird. Auf jeden Fall ist der Unterschied
des elektrischen Verhaltens zwischen Agar und Gelatine leicht erkennbar.
Bei Gelatine kann mit Leichtigkeit ein isoelektrischer Punkt mit den
verschiedensten Methoden nachgewiesen werden, für Agar ist bisher
noch keine Bedingung gefunden worden, unter welcher diese Substanz
elektropositiv auftritt. Wenn aber Agar immer elektronegativ ist,
so wäre auf Grund der entwickelten Vorstellungen zu erwarten, daß
der Effekt einer Agarmembran auf ein Diffusionspotential immer
nur in einer Positivierung der verdünnteren Lösung im Vergleich zu
1) A.Gyemant, Kolloid-Zeitschr. 28, 103, 1921.
2) Kruyt und Jong, Zeitschr. f. physik. Chem. 100, 250, 1922.
256 A. Fujita:
dem Potential bei freier Berúhrung der beiden Lósungen bestehen kann.
Der Versuch bestátigt diese Erwartung.
Die Húlsen wurden in derselben Weise wie die anderen hergestellt,
indem Extraktionshülsen mit einer heißen 3proz. Agarlösung durch-
tränkt und nach der Erstarrung für die Versuche benutzt worden.
Die Resultate sind in der Tabelle VIII zusammengestellt. Der Effekt
Tabelle VIII.
Konzentrationskette (0,1: 0,01 n) mit Agarhülse.
Art der | Membranpotential in Millivolt "— 3 Diffusionspoten« age:
Elektrolyte" Hülse 1 | Hülse 2 | Hülse 3 | Hülse 4 | Mittel wes, SES
| | |
Ka ` ah geg Se _ 1028! — 04 32
KBr | — 40, 28 28) 32) —1,06 4.26
KJ | 26| 33. — 34; 31 —084 3/9
K,SO, | 98 — Sei — 902 134 68
K,FeCy, 225| 248 | an 248| 240 22) 20
NaOH 298 18,3 — 23,6 | —225 —218 | —346 128
go mal 34,2 370 352 35,3) 38[362%)] -2,7 (-0,7)
Nacı |Z oi — 42| — — i= 54| —M6 . 62
LC —102 01-13 —105' —188 83
MgCl, —175 —165| — län —225 5,5
Call, — Ss — —147 —150| —199 49
ACL, | — |—186 — 18,5 | — 195 | — 18,8 || - 28,7 [- 25%], 9,9 (6,2)
1) Dieser Wert ist durch direkte Messung erhalten.
2) Der eingeklammerte Wert ist der bei unserer Versuchsanordnung zur Messung der freien
Diffusionspotentiale wirklich gefundene Wert (siehe die dritte Mitteilung). Dementsprechend ist
der eingeklammerte Ausdruck der letzten Spalte als der zutreffendere zu betrachten.
ist in den meisten Fällen nur klein und besteht in einer Positivierung
der verdünnteren Lösung gegenüber dem Effekt bei freier Berührung.
Die Größe dieser Positivierung ist in der letzten Spalte notiert und
beträgt bei den meisten Salzen nur etwa 4 bis 8 Millivolt, etwas größer,
aber nicht sehr gut reproduzierbar ist der Effekt mit der Kette mit
NaOH, wo die Negativität der Membran zweifellos erhöht wird. Die
Kette mit HCl scheint gar keinen Membraneffekt zu geben. Es ist
anzunehmen, daß das Ausbleiben eines Membraneffekts bei HCl auf
die entladende Wirkung auf die Membran zurückzuführen ist. Man
vergleiche den großen umkehrenden Effekt der HCl-Kette bei der
Gelatinemembran (Tabelle III), welcher je nach der Art der Gelatine
55 bis 75 Millivolt betrug, und bei der Eiweißmembran, bei der er
23 Millivolt betrug. Man sieht also deutlich, daß bei Agar die Membran-
wirkung durch HCl soeben aufgehoben wird, daß aber eine Umkehrung
Elektrische Erscheinungen und Ionendurchlässigkeit von Membranen. V. 257
nicht mit Sicherheit festzustellen ist. Dieser Befund stützt die An-
nahme, daß die vorher beschriebene Umkehrbarkeit der Membran-
wirkung bei Eiweiß und Gelatine der amphoteren Natur dieser Stoffe
zuzuschreiben ist.
Zusammenfassung.
Wenn man zwei verschieden konzentrierte Lösungen eines Elektro-
lyten durch eine Membran von Eiweiß oder Gelatine trennt, so ist
der Potentialunterschied der Lösungen der gleiche wie bei der freien
Berührung der Lösungen nur, wenn die Gelatine isoelektrisch ist.
Ist die Gelatine negativ geladen, so ist die dünnere Lösung positiver
als bei freier Berührung. Ist sie positiv geladen, so ist die dünnere
Lösung negativer als bei freier Berührung. Bei Agarmembranen ist
die dünnere Lösung immer ein wenig positiver als bei freier Berührung,
nur bei der HCI-Kette verschwindet der Einfluß der Membran überhaupt.
Untersuchungen über elektrische Erscheinungen und
Ionendurchlässigkeit von Membranen.
VI. Mitteilung:
Membranen aus Paraffin, Wachs, Mastix, Kautschuk.
Von
L. Michaelis und Sh. Dokan.
(Aus dem biochemischen Institut der Aichi-medizinischen Universität
zu Nagoya, Japan.)
(Eingegangen am 28. Mai 1925.)
Im Anschluß an die vorangegangenen Mitteilungen!) über die
Eigenschaften einiger Membranen sollen in dieser Mitteilung die Eigen-
schaften einiger neuer Membranen beschrieben werden, und zwar
handelt es sich um Membranen von chemisch möglichst indifferentem
Charakter, Paraffin, Wachs, Mastix, Kautschuk. Von den Möglich-
keiten, solche Membranen in einer unseren Zwecken entsprechenden
Weise herzustellen, beschreiben wir nur diejenige, die sich schließlich
am besten bewährt hat. Wir benutzen ein zylindrisches, beiderseits
offenes Glasgefäß. Der eine Rand ist etwas wulstig verbreitert und
eben abgeschliffen. Durch drei passend an der Außenwand an-
geschmolzene Glasfüße wird bewirkt, daß man den Zylinder auf eine
Unterlage stellen kann, ohne daß der untere abgeschliffene Rand
dieselbe berührt. Diese untere Öffnung wird durch die Membran ab-
geschlossen. Die Herstellung der Membran geschieht z. B. beim Paraffin
auf folgende Weise. Eine runde Scheibe Filtrierpapier wird erst in
absolutem Alkohol, dann in Äther gewaschen, getrocknet und in heißes
geschmolzenes Paraffin einige Zeit eingelegt, aus dem Paraffin heraus-
gehoben, auf den Rand des Zylinders aufgelegt, und der Rand nach-
träglich nochmals mit Paraffin gedichtet. Die Membranen aus Wachs
wurden genau ebenso hergestellt. Zur Herstellung von Membranen
aus Mastix wurde das Filtrierpapier mit Alkohol und Äther behandelt,
eine Stunde lang in eine ätherische Mastixlösung (20proz.) versenkt,
1) Diese Zeitschr. 158, 11; 158, 28; 159, 370; 161, 47: 162, 245, 1925.
L. Michaelis u. Sh. Dokan: Elektrische Erscheinungen usw. VI. 259
herausgehoben, auf die Öffnung des Glaszylinders aufgedeckt, der
Rand nochmals gedichtet und einen Tag lang an der Luft getrocknet.
Für Kautschuk wurde ganz entsprechend eine Lösung in Benzin benutzt.
Die so hergestellten Membranen schließen völlig wasserdicht, wenigstens
tropft aus ihnen in beliebig langer Zeit kein einziger Tropfen aus, wenn
man sie nur innen mit Wasser füllt. Wir werden jedoch sehen, daß sie
nicht absolut undurchlässig sind, wenn man sie nicht nur innen füllt,
sondern auch von außen mit einer wässerigen Lösung umgibt. In
diesem Falle tritt, wenn auch langsam, eine Diffusion gelöster Stoffe
durch die Membran ein. Die meisten unserer Versuche beziehen sich
auf die Potentialdifferenz zweier Elektrolytlösungen, welche durch
diese Membran getrennt sind. Das Potential wurde mit Hilfe der in
der früheren Mitteilung!) beschriebenen Agarheber zu zwei Kalomel-
elektroden abgeleitet und mit dem Kompensationsverfahren gemessen,
mit dem Kapillarelektrometer als Nullinstrument.
Zunächst ist es auffällig, daß es überhaupt so leicht gelingt, mit
dieser bei hohen Widerstánden versagenden Methode Potential-
differenzen zu beiden Seiten einer Membran zu messen, deren Substanz
zu den besten Isolatoren gehört. Die Methode setzt eine nicht unbe-
'trächtliche Leitfähigkeit des Systems voraus, und diese ist z. B. durch
eine fast 1 mm dicke Paraffinschicht ganz undenkbar. Es ist offenbar,
daß nicht die Substanz der Membran, sondern feine Lücken in derselben
die Leitfähigkeit vermitteln. Man wird sich vorstellen müssen, daß
beim Erstarren der geschmolzenen oder beim Trocknen der gelösten
Substanzen eine Schrumpfung eintritt, welche feinste kapillare Poren
erzeugt. Diese schließen zwar infolge der Kapillarität wasserdicht,
wenn außen Luft ist, zumal diese Substanzen sich nicht gut mit Wasser
benetzen. Aber wenn beiderseits sich eine wässerige Lösung befindet,
tritt eine langsame Diffusion ein. Wir können bei dem Stoffaustausch
durch Membranen hindurch zwei Mechanismen unterscheiden. Ent-
weder vermittelt die Substanz der Membran selbst den Austausch,
indem sie als Lösungsmittel für den diffundierenden Stoff dient, oder
es sind die Lücken in der Membran, durch welche die Diffusion stattfindet.
Beide Mechanismen können gleichzeitig vorkommen, indem für die eine
Substanz die Membran als Lösungsmittel, für die andere als Kapillar-
sieb fungiert. Die Mosaiktheorie der Zellmembran von Nathanson rechnet
mit dieser doppelten Möglichkeit. Für das grundlegende Studium der
Membranwirkungen ist es erforderlich, diese beiden Effekte gesondert
zu untersuchen, und unsere Membranen zeichnen sich dadurch aus,
daß sie eine reine kapillare Siebwirkung gegenüber wässerigen Lösungen
haben, zumal bei den von uns angewendeten anorganischen Elektro-
1) Diese Zeitschr. 159, 370, 1925.
260 L. Michaelis u. Sh. Dokan:
lyten, welche ganz gewiß in Paraffin und dergleichen im strengsten
Sinne des Wortes unlöslich sind. Es ist für das Verständnis dieser
Membranwirkung wichtig, daß die weiter unten zu beschreibenden
elektromotorischen Effekte zwischen Elektrolytlösungen sich sogar
oft ungeschwächt bei solchen Membranen zeigten, welche als nicht
völlig gelungen erscheinen, weil sie sich nach längerer Prüfung als
nicht streng wasserdicht erwiesen. Aber selbst wirklich wasserdichte
Membranen gestatten, wie gesagt, den Durchtritt gelöster Substanzen,
wenn beide Seiten mit Flüssigkeit in Berührung sind. Wenn man
z. B. auf der einen Seite reines Wasser, auf der anderen eine n/10 Lösung
von Traubenzucker, Harnstoff, ROL HCl hat, so kann man meist
in weniger als einer Stunde den Durchtritt einer Spur der gelösten
Substanz schon nachweisen (Tabelle I). Man beachte den Unterschied
Tabelle I.
Membranen aus verschiedenen Substanzen werden einerseits mit reinem
Wasser, andererseits mit einer m/10 Lösung der in der linken Spalte ge-
nannten Stoffe in Berührung gebracht und Proben des destillierten Wassers
in Abständen von anfänglich 5, später 10 Minuten qualitativ auf den
Durchtritt der gelösten Substanz geprüft. Die in den Tabellen angegebenen
Zehlen geben die Zeit in Minuten an, nach welcher die qualitative Prüfung
zum erstenmal positiv ausfiel. A und B sind Parallelversuche mit ver-
schiedenen Exemplaren der Membranen. Probe auf HCl: Methylorange;
KO: AgNO,; Harnstoff: Bromlauge; Traubenzucker: mit Lauge verdiinnte
Fehlingsche Lösung.
| Paraffin | Wachs d Mastix | Kautschuk
PA I Sr Ni ya ne Er u en
A i B Aa | BO ABA, B
HA EE 0 656 10: 156; 16 5| 5/ 10! 5
Ko su. 60 | 90 un, 130 : 40 i 50 | 130 : 160
Harnstoff . .... | 40 i 40 A0 40
, A |
Traubenzucker . . | 50 ; 80 i 140 | 140 | 30 | 50 | 50
gegen die früher von L. Michaelis und A. Fujita beschriebene Membran
aus getrocknetem Kollodium!). Dieses läßt gegen reines Wasser mit
Ausnahme von KOH keinerlei Elektrolyte diffundieren. Sie läßt
aber Kationen diffundieren, wenn zu beiden Seiten der Membran sich
Elektrolyte mit verschiedenen Kationen befinden. Sie läßt aber niemals
irgendwelche Anionen diffundieren. Die Undurchlässigkeit für Elektro-
lyte beruht nur auf der Unducchlässigkeit für Anionen. Sobald die
Bedingungen so eingerichtet sind, daß Kationen diffundieren können,
ohne daß sich gleichzeitig Anionen zu bewegen brauchen, wird ihre
Durchlässigkeit für Kationen offenbar. Dementsprechend hat eine
Konzentrationskette mit der Kollodiummembran dieselbe elektro-
1) Dieso Zeitschr. 161, 47, 1925.
Elektrische Erscheinungen u. Ionendurchlässigkeit von Membranen. VI. 261
motorische Kraft wie eine Konzentrationskette mit metallischen Elek-
troden, welche für die betreffende Kationenart reversibel funktioniert
und kein Diffusionspotential hat. Bei den jetzigen Membranen aus
Paraffin usw. ist eine Durchlässigkeit für Kationen und Anionen gleich-
zeitig vorhanden, und daher sind auch bei Konzentrationsketten so
hohe elektromotorische Kräfte nicht zu erwarten. Dagegen bleibt
noch die Möglichkeit bestehen, daß die Durchlässigkeit für verschiedene
Stoffe relativ quantitativ geändert ist, und daß z. B. die relative Be-
weglichkeit eines Anions im Vergleich zu der des zugehörigen Kations
innerhalb der kapillaren Spalten verschieden ist von der bei freier
Diffusion. Dies müßte sich darin äußern, daß das Diffusionspotential
nach Einschaltung der Membran verschieden von dem bei freier Be-
rührung ist. Die einfachste Methode, um die Wirkung der Kapillaritát
zu erkennen, ist daher die Messung des Diffusionspotentials von zwei
Lösungen des gleichen Elektrolyten in verschiedener Konzentration,
einmal mit und einmal ohne Membran.
Die Potentiale solcher Konzentrationsketten mit unseren Mem-
branen sind etwa innerhalb 2 Millivolt reproduzierbar. Die Einstellung
des Potentials erfordert verschieden lange Zeit, aber kaum jemals
mehr als eine Stunde, wenn die Membran nicht allzu dick ist. Bei
Paraffin und Wachs sind kaum irgendwelche individuellen Unter-
schiede bei verschiedenen Exemplaren vorhanden. Bei Mastix und
Gummi sind die individuellen, nur quantitativen Unterschiede etwas
größer, aber für jedes Exemplar bleiben die Eigenschaften konstant.
Der Wert für eine gewisse Elektrolytanordnung ist innerhalb etwa
2 Millivolt immer wieder reproduzierbar, auch wenn man die Membran
inzwischen für verschiedene andere Elektrolyte benutzt hat, wenn man
nur die Membran wenigstens ebensolange Zeit vorher mit dostilliertem
Wasser auswäscht, wie es im vorangehenden Versuch zur Einstellung
des Potentials erforderlich war. Für Paraffin gilt dies unter allen
Umständen. Für die drei anderen Stoffe muß man allerdings die Be-
nutzung von KOH ausschließen, welches aus leicht begreiflichen
Gründen diese Membranen allmählich verändern. Bei den folgenden
Versuchen wurde überall der Potentialunterschied zwischen einer
0,1 und 0,01 áquivalcntnormalen Lösung des genannten Elektrolyten
gemessen. Zur Vermeidung individueller Einflüsse der Membranen
wurde die in den Protokollen (Tabelle II) notierte Messung für die
Chloride verschiedener Kationen sämtlich mit einer einzigen Membran
und die für die K-Salze verschiedener Anionen mit einer einzigen
zweiten Membran ausgeführt. Der Versuch mit KC] ist in beiden
Reihen gemeinschaftlich. An ihm sieht man übrigens, daß für diese
beiden Membranen der individuelle Wert nicht nur bei Paraffin, sondern
auch bei den anderen Substanzen praktisch derselbe ist, wenn die
Biochemische Zeitschrift Band 162. 18
L. Michaelis u. Sh. Dokan
262
09° — SS + gr + Per + 1+ LO + 0 | 0 | ` Visit oioid
(FT +) || (8'9 +) | (ata +) | (691 +) (eu +) | (gag +) | (lez +) | (zez +) |
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(oe HI Hiert" (181 +) (Got +) | (rog +) | (zoz +) | (813 +) |
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Elektrische Erscheinungen u. Ionendurchlässigkeit von Membranen. VI. 263
beiden Membranen unter fast gleichen Bedingungen hergestellt sind.
Die Zahlen geben das Potential in Millivolt an, das Vorzeichen bezogen
auf die verdünntere Lösung. Die eingeklammerten Zahlen geben den
Unterschied gegen das Diffusionspotential bei freier Berührung ohne
Membran. Dieses freie Diffusionspotential ist das in der früheren
Mitteilung!) direkt gemessene. Es stimmt befriedigend überein mit
dem auf übliche Weise berechneten, wie an früherer Stelle gezeigt
wurde. Betrachten wir nun zunächst die Salze aus zwei einwertigen
Ionen, so ist bei ihnen der Membraneffekt unter sich recht gleichartig.
Den kleinsten Effekt gibt immer Paraffin. Das Potential der ver-
dünnteren Lösung ist stets positiver als bei freier Diffusion, und zwar
um folgenden Wert in Millivolt bei:
Tabelle III.
Paraffin | Wachs | Mastix | Kautschuk
Für Salze mit nur einwertigen Ionen:
11 | 20 | 25 | 21—29
mit zweiwertigen Kationen u. einwertigen Anionen:
6 | 8 | 12 | 9
mit dreiwertigem Kation:
5—1 | 0 | 0 | 0
mit vierwertigem Kation:
0 | 0 | —16() | —6
Der positivierende Effekt der Membran nimmt also deutlich mit
zunehmender Wertigkeit des Kations ab. Bei den dreiwertigen Kationen
ist der Effekt bei allen Membranen praktisch = 0, bei dem vierwertigen
Tho.ium gilt für Paraffin und Wachs innerhalb der Fehlergrenzen
wohl dasselbe, während er bei anderen Membranen, besonders bei
Mastix, in einen stark negativierenden Effekt umschlägt. Variieren
wir die Anionen in Form ihrer K-Salze, so ist zwischen den verschiedenen
einwertigen Anionen kein großer Unterschied. Die beiden untersuchten
zweiwertigen Anionenarten SO, und C,O, scheinen sich etwas ver-
schieden voneinander zu verhalten, groß ist der Unterschied gegen die
einwertigen Anionen jedenfalls nicht. Das dreiwertige Ferricyanid
hat in allen Fällen einen etwas kleineren positivierenden Effekt. KOH
verhält sich bei Paraffin nicht anders als andere ein-einwertige Elektro-
lyte. Auf die Messungen mit KOH bei den anderen Membranen können
wir aus den oben erwähnten Gründen kein großes Gewicht legen.
Eine besondere Besprechung erfordert HCl, welches wir in der letzten
Übersichtstabelle III nicht aufgenommen haben. Hier sind die Membran-
1) A. Fujita, diese Zeitschr. 159, 370, 1925 (III. Mitteilung dieser Serie).
18 *
264 L. Michaelis u. Sh. Dokan:
effekte nämlich durchweg am kleinsten, meist ist gar kein sicherer
Effekt der Membran zu bemerken. Nur bei Mastix besteht noch ein
wenig positivierender Effekt von etwa 6 Millivolt, welcher zwischen
dem der zweiwertigen und der dreiwertigen Kationen liegt.
Bei den Ketten mit amphoteren Membranen aus Gelatine oder
Eiweiß war es gelungen, den Membraneffekt der Natriumacetatkette
umzukehren, wenn man durch Zusatz von Essigsäure das py variierte?).
Zur Bestätigung der Annahme, daß diese Erscheinung einen inneren
Zusammenhang habe mit der amphoteren Natur der Membran, war
es von Bedeutung sich zu überzeugen, daß diese Umkehrung bei den
Membranen dieser Mitteilung nicht stattfindet. Zu diesem Zwecke
wurde mit der Mastixmembran eine Konzentrationskette mit n/10
und n/100 Na-Acetat angesetzt, indem zu beiden Lósungen eine be-
stimmte Menge Essigsäure hinzugefügt wurde, welche in beiden Lösungen
das gleiche pg erzeugte. In der ersten Spalte der nächsten Tabelle IV
Tabelle IV.
Mastixmembren, Natriumacetat n/10:n/100.
Potential
Esssigsäure x
Bechet | Pr | de dinneren
0
I etwa 8 + 22,5
1
I 4,7 + 21,8
4
I 4,1 + 21,7
> 3,05 | + 23,7
ist das molare Verhältnis von Essigsäure zu Natriumacetat angegeben,
in der zweiten das danach angenähert berechnete py, und in der dritten
Spalte das Potential der verdünnteren Lösung bei Anwesenheit der
Mastixmembran. Wie man sieht, wird dieses Potential in dem experi-
mentell zugänglichen pp- Bereich von 8 bis 3 nicht geändert, der Membran-
effekt ist also wenigstens in diesem Bereich unabhängig vom pg. Daß
das freie Diffusionspotential des Natriumacetats (+ 6 Millivolt) durch
Zusatz dieser Essigsäuremengen nicht meßbar beeinflußt wird, ist
in der vorigen Mitteilung schon bewiesen worden. Der Unterschied
dieser Resultate gegen die früher beschriebenen bei Gelatine und Eiweiß
ist ganz auffällig. Da wir den Effekt der Membran mit ihrer negativen
Ladung in Zusammenhang bringen, und da nachweislich die Negativität
1) Fujita, diese Zeitschr. 162, 245, 1925.
Elektrische Erscheinungen u. Ionendurchlässigkeit von Membranen. VI. 265
des Mastix zwischen pg 8 und 3 sehr bedeutend verringert wird!),
so hätte man sogar erwarten dürfen, daß der Membraneffekt des Mastix
durch Erhöhung der Acidität wenigstens geschwächt würde. Der
Versuch zeigt aber nichts davon.
Das Gesamtresultat ist, daß Membranen aus Paraffin, Wachs,
Mastix und Kautschuk im allgemeinen einen positivierenden Einfluß
auf die verdünntere Lösung einer Diffusionskette haben. Sind mehr-
wertige Ionen zugegen, so ist dieser positivierende Effekt im allgemeinen
kleiner als bei nur einwertigen Ionen, besonders wenn die Kationen
mehrwertig sind. Ist das Kation das H-Ion oder ein drei- oder vier-
wertiges Kation, so wird der Effekt der Membran meist bis auf 0 herab-
gedrückt. Eine Umkehrung des Effekts, d. h. eine Negativierung
der verdünnteren Lösung im Vergleich zur freien Diffusion, wurde
mit Sicherheit nur bei der Mastixkette mit Thorium beobachtet.
1) L. Michaelis und A. Domboviceanu, Kolloid-Zeitschr. 84, 322, 1924.
Über den Einfluß verschiedener Präparate der ¡Chiningruppe
auf die fermentativen Funktionen des Organismus.
IV. Mitteilung!):
Über den Einfluß der Chininsalze auf das Magenpepsin?).
Von
J. A. Smorodinzew und C. $. Lemberg.
(Aus der chemotherapeutischen Abteilung des Tropeninstituts des Volks-
kommissariats für Gesundheitswesen in Moskau.)
(Eingegangen am 9. Juli 1925.)
In der Fachliteratur finden sich widersprechende Angaben über
den Einfluß des Chinins auf das Pepsin.
Nach Chittenden und Allen®), Fujitani*) und Ascher®) verlangsamen
sowohl salzsaures (lproz.), besonders aber schwefelsaures Chinin (0,01- bis
lproz.) die Verdauung von Fibrin, Bien und Hühnereiweiß. Wolberg*)
beobachtete, im Gegensatze hierzu, eine geringe beschleunigende Wirkung
kleiner Dosen von schwefelsaurem Chinin (0,006- bis 0,031proz.) bei der
Verdauung des Fibrins. Er behauptet, daß die Beschleunigung des Pro-
zesses umgekehrt proportional der angewandten Chininmenge sei. Auf
Grund dessen könnte man annehmen, daß das Salz in großen Dosen eine
hemmende Wirkung ausübt. Nach seiner Meinung findet dies auch statt
bei Kranken, die mit Chinin behandelt werden. Nach Laqueur?) ist eine
Beschleunigung deutlich bemerkbar in den Grenzen von 0,001- bis 0,6proz.
1) III. Mitteilung, Smorodinzew und Danilow, diese Zeitschr. 161, 178,
1925.
2) Refcriert auf der Konfererz des Tropeninstituts.
8) R. H. Chittenden urd S. E. Allen, Trans. of the Connecticut Academy
of arts and scierces 7, I, S. 106, 1886; Malys Jahrb. 15, 277, 1886.
t) J. v. Fujitant, Arch. intern. pharmacodyn. 14, 22, 1905.
8) M. Ascher, Arch. f. Verdauungskrankh. 14, 629, 1908.
6) L. Wolberg, Pflügers Arch. 22, 291, 1880.
2) E. Laqueur. Arch. f. exper. Pathol. 55, 240, 1906.
J. A. Smorodinzew u. C. S. Lemberg: Einfluß der Chininsalze usw. IV. 267
Chinin im Gemisch, und sogar 1,5proz. Chinin verhindert die Verdauung
nicht.
Eine gleiche Wirkung des Chinins beobachtete Laqueur bei der Ver-
dauung von Hühnereiweiß wie auch bei Fibrin. Er glaubt die hemmende
Wirkung bei den Versuchen anderer Forscher dem Schwefelsäureion zu-
. schreiben zu müssen, obgleich bei einer großen Zahl (30 Proz.) seiner eigenen
Versuche salzsaures Chinin gleichfalls die Verdauung verzögerte oder aber
ganz wirkungslos war. Nach den Beobachtungen von Boeck!) und Petit?)
übt das Chinin keinerlei Einfluß auf das Pepsin aus (Boeck arbeitete mit
Hühnereiweiß, Petit mit Fibrin).
Indem wir annahmen, daß obige Widersprüche am einfachsten
durch die Verschiedenheit der Substrate der verschiedenen Forscher
zu erklären seien, wählten wir zu unseren eigenen Versuchen zu Anfang
die Caseinmethode®) von Grosst), auch prüften wir verschiedene Salze
des Chinins, um den Einfluß der mit dem Alkaloid verbundenen Säure
beobachten zu können.
Beim Studium der Einwirkung irgend einer Substanz auf Fermente
ist es notwendig, den Einfluß der Wasserstoffionenkonzentration auf
den Prozeß auszuschließen. Weil Chinin die Elektroden vergiftet®)
und mit Indikatoren falsche Resultate gibt®), ferner weil die pg-Skala
der Methode ohne Puffer oberhalb des Wirkungsgebiets des Pepsins
bei der Methode von Gross anfängt, so bietet die Bestimmung des pg
in diesem Falle große Schwierigkeiten. Wir bestimmten elektro-
metrisch die Wasserstoffionenkonzentration in der Caseinlösung, in dem
verdünnten Magensaft und in ihrer Mischung vor und nach der Ver-
dauung, ohne Zugabe von Chinin. Ferner überzeugten wir uns, daß
Methylviolett dieselben Anzeichen gibt vor und nach der Verdauung,
mit und ohne Chininzusatz (Tabelle I).
Diese Beobachtungen erlauben die Annahme, daß das pg bei der
Caseinverdauung nach Gross sich nicht merklich ändert und das py
daher im gegebenen Falle keine Rolle spielt. Chinin kann in schwach
saurer Lösung keine Wirkung ausüben wegen des Überschusses an
Säure, da die hemmende Wirkung des Chinins auf fermentative Pro-
1) H. Boeck, Zeitschr. f. Biolog. 7, 418, 1871.
2) A. Petit, Etudes sur les ferments digestifs; Maly Jahresber. f. Tierch.
10, 308, 1881.
3) Leider müssen wir bemerken, daß die Caseinpráparate der Firma
Kahlbaum, die wir nach dem Kriege erhalten haben, für unsere Versuche
untauglich waren. Wir benutzten das Casein, das L. K. Smorodinzew vor-
bereitet hatte, wofür wir ihr hier unseren Dank aussprechen.
t) O. Gross, Berl. klin. Wochenschr. 45, 643, 1908; J. A. Smorodinzew,
Die Fermente des Pflanzen- und Tierreichs 8, 102, 1922 (russisch).
5) L. Michaelis, diese Zeitschr. 106, 83,; 109, 165, 1920.
6) Derselbe, Practicum physik. Chem. 39. Berlin 1922.
268 J. A. Smorodinzew u. C. S. Lemberg:
Tabelle I.
LAA | Dtm
l prom. Caseinlösung . losa l 1,10,
Natürlicher Magensaft 1:32 0,4416 2,74,
Künstlicher Magensaft 1:8. || 0,4403 2,71,
10 ccm Casein + Leem ver-
dünnten Magensafts + 1 ccm
H,O ec 0,3457 l
Dasselbe nach der Verdauung 0,3435 1,04,
lOccm Casein + Leem ver-
dünnten Magensafts + 1 ccm
n/20 salzsauren Chinins . —
Dasselbe nach der Verdauung | —
n/20 salzsaures Chinin —
*) Nach Metbylrot, Neutralrot und UE
de Géi RÉI bei
an
00 -J
zessel) von der freien Base abhängt, sie verstärkt sich mit dem An-
steigen des pg nach der alkalischen Seite hin vom Neutralpunkt aus.
Die Versuche wurden vielfach wiederholt mit künstlichem Magen-
saft (2proz. Pepsinlösung in HCl, Azidität 30), mit durch Auspumpen
gewonnenem Magensaft des Menschen, mit dem natürlichen Magensaft
des Hundes nach Pawlow, und immer erhielten wir dasselbe Resultat:
alle geprüften Salze des Chinins in Konzentrationen von 0,000009 bis
0,2 Proz. im Gemisch wirken weder beschleunigend noch hemmend
auf die Verdauung des Caseins durch Pepsin.
Laqueur hat bei Kontrollversuchen zum Vergleich nicht Wasser,
sondern Kochsalzlösung genommen. In einem Teile unserer Versuche
ersetzten wir das Wasser gleichfalls durch Kochsalzlösung von ent-
sprechender Konzentration, erhielten jedoch, wie zu erwarten war,
dieselben Resultate wie bei Wasser, da nach Beobachtungen des einen
von uns Kochsalzlösung von dieser Konzentration nicht auf Pepsin
einwirkt?).
Die Ergebnisse vieler gleichartiger Versuche sind in Tabellen II
und III zusammengestellt.
Es ergeben sich folgende interessante Verhältnisse: Arsenpräparate
vergrößern die Absonderung von Magensaft?), den Verdauungs-
prozeB von Eiweiß aber verlangsamen siet), und Chininpräparate
unterdrücken die Sekretion des Magensafts, ohne irgend einen Einfluß
auf die Zerfallsgeschwindigkeit des Caseins auszuüben.
1) J. A. Smorodinzew und A. N. Adowa, diese Zeitschr. 185, 128, 1923.
2) J. A. Smorodinzew, Russ. physiol. Journ. 4, 103, 1921.
8) L. Klocman, Zeitschr. f. physiol. Chem. 80, 17, 1912.
4) J. A. Smorodinzew und N. P. Riabouschinsky, diese Zeitschr. 144,
26, 1924.
269
Einfluß der Chininsalze auf das Magenpepsin. IV.
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270 J.A. Smorodinzew u. C. S. Lemberg: Einfluß der Chininsalze usw. IV.
Gegenwärtig prüfen wir den Einfluß von Chininpräparaten auf
die Verdauung anderer Eiweißstoffe durch Pepsin.
Schlußfolgerungen.
1. Salzsaures Chinin, Chinin-Hydrobromid, saures Chinin-Hydro-
bromid, schwefelsaures und freies Chinin in Konzentrationen von
0,000009 bis 0,2 Proz. üben weder eine beschleunigende, noch eine
hemmende Einwirkung auf die Caseinverdauung durch Pepsin aus.
2. Bei der Verdauung von Casein durch Pepsin in Gegenwart von
Chinin ándert sich die Wasserstoffionenkonzentration des Gemisches
nicht.
Über die Einwirkung von Adrenalin und verwandter Substanzen
auf die Selbstgärung der Hefe.
Von
Hans Popper.
(Aus der chemischen Abteilung des Wiener physiologischen Universitäts-
Instituts.)
(Eingegangen am 10. Juli 1925.)
In den letzten Jahren beschäftigte man sich von vielen Gesichts-
punkten aus mit dem Einfluß des Adrenalins auf den Kohlehydrat-
stoffwechsel und konnte bekanntlich feststellen, daß die Reservekohle-
hydrate hauptsächlich aus Muskel und Leber unter dem Einfluß von
Adrenalin in Form von Glucose ins Blut übergehen.
Es war von Interesse festzustellen, ob das Adrenalin etwa im-
stande sei, einen direkten Zellreiz auf einzellige Organismen, insbesondere
auf Hefe, im Sinne einer vermehrten Mobilisierung der Reservekohle-
hydrate auszuüben.
Als Methodik wurde die Schüttlung mit gleichzeitiger Luftdurch-
leitung verwendet, wie sie zuerst von Fürth und Lieben!) und dann
von Lundin?) angewendet worden ist, wobei die Kohlensäureabgabe
titrimetrisch gemessen wurde. Es wurden immer gleichzeitig zwei
gleiche Hefesuspensionen verwendet, von denen die eine als Haupt-
probe die zu untersuchende Substanz enthielt, während die andere als
Kontrollprobe ohne Zusatz diente.
Über die Einwirkung von Adrenalin auf einzelne Zellen bzw. auf
isolierte Organe finden sich vereinzelte Angaben in der Literatur.
Neuschloss®) fand unter Einwirkung des Adrenalins eine erhöhte Reduktions-
fähigkeit von normalen Zellen in bezug auf m-Dinitrobenzol. Nach Grijfüh*)
dagegen beeinflußt das Adrenalin den Stoffwechsel von überlebenden
1) Fürth und Lieben, diese Zeitschr. 128, 144; 132. 165.
2) Lundin, ebendaselbst 141, 310, 1923.
3) Neuschloss, Klin. Wochenschr. 8, 57.
4) Griffith, Amer. Journ. Physiol. 65. 15.
272 H. Popper:
Muskeln nicht und ebensowenig nach Ellinger!) die Atmung von Vogel-
blutkórperchen. O. Schwarz?) fand durch Versuche mit dem Gärungs-
kólbchen, daß Adrenalin in einer Konzentration von 1: 1000 die Eigen-
gärung der Hefe sehr stark erhöht und ebenso bei der Traubenzuckergärung
eine vermehrte Kohlensäureentwicklung hervorruft. Außerdem sei in
Gegenwart von Adrenalin die Hefe imstande, Substanzen zu vergären,
die sie sonst nicht vergärt, wie z. B. Stärke, Glykogen, Casein und Alanin.
I. Versuch im Gärungskölbchen.
Es wurden zunächst die Versuche von O. Schwarz, der mit dem
Einhornschen Gärungskölbchen bei einer Konzentration von 1: 1000
gearbeitet hatte, wiederholt; es wurden jedoch Konzentrationen von
1: 10000, 1: 20000 und 1: 30000 gewählt, weil mir eine Konzentration
von 1 : 1000 zu hoch erschien, um mit den physiologischen Bedingungen,
wie sie in einem Tierkörper herrschen, verglichen zu werden.
In allen Versuchen wurde käufliche Preßhefe verwendet.
Es wurde je ein Teil einer dünnen Hefesuspension mit Adrenalin
hydrochloricum (lprom.) in den oben angegebenen Konzentrationen ver-
setzt, wobei die entwickelte Kohlensäure abgelesen wurde. Ein Teil der-
selben Suspension ohne Zusatz diente als Kontrollprobe. Die Kölbchen
wurden für mehrere Stunden in den Brutschrank bei 37% gestellt. Bei
mehrmals wiederholten Versuchen zeigte sich nur einmal, bei der Kon-
zentration 1: 10000, im Verlaufe von 2 Stunden eine gesteigerte Kohlen-
säureentwicklung, während in allen übrigen Fällen auch nach 24 Stunden
die Selbstgärung, die normal im Gärungskölbchen sehr gering ist, nicht
vermehrt war. Gleiche Versuche wurden mit Hefesuspensionen ausgeführt,
zu denen Traubenzucker und lösliche Stärke zugesetzt worden waren.
Auch hier zeigte sich keine Vermehrung der Kohlensäure gegenüber der
Kontrollprobe.
Es ergibt sich also, daß die von Schwarz angegebenen Wir-
kungen bei schwächeren Konzentrationen nicht eintreten.
II. Adrenalin im Liiftungsversuch ohne Zuckerzusatz.
Es war nun naheliegend, das Verhalten von Hefe gegenüber
Adrenalin im Luftschüttlungsversuch zu untersuchen, wie er im hiesigen
Laboratorium für viele Fragen der Hefechemie Anwendung gefunden hat.
Methodik: Ich verwendete die Fürth-Liebensche Methodik mit einer
kleinen Modifikation. Es wurde ein Luftstrom mittels einer Wasserstrahl-
pumpe durch fünf miteinander kommunizierende Gefäße nach Art von
Waschflaschen gesaugt. Im ersten Gefäß befand sich 30proz. Natronlauge,
um die Luft von C O, zu befreien. Als zweites Gefäß, das die Hefesuspension
enthielt, diente ein hoher Zylinder mit dreifach gebohrtem Stopfen. Durch
zwei Bohrungen wurde mit Hilfe eines Gabelrohres die Luft zugeleitet. Die
1) Ellinger, Arch. f. exper. Pathol. u. Pharm. 119, 11.
2) O. Schwarz, Wien. klin. Wochenschr. 24, 267, 1911.
Einwirkung von Adrenalin usw. auf die Selbstgärung. 273
dritte Bohrung diente zur Ableitung der Luft aus den Barytvorlagen.
Der lebhafte Luftstrom machte eine Schüttlung überflüssig. Es folgten
drei Vorlagen, in denen sich n/5 Ätzbaryt befand, um die C O, abzufangen.
Das verschwundene Ätzbaryt, das titrimetrisch mit n/5 HCl und Phenol-
phthalein als Indikator bestimmt wurde, ergab die entwickelte C O,-Menge.
Es wurde immer gleichzeitig durch zwei Systeme Luft durchgeleitet, durch
eine Hauptprobe und eine Kontrollprobe. Da es sich bei diesen Versuchen
um Ausschläge handelt, die durch sehr kleine C O,-Mengen hervorgerufen
werden, wurden bei jedem Versuch alle Gefäße mit Kollodium sorgfältigst
abgedichtet.
Die Hefe wurde bei allen Versuchen in der zehnfachen Menge
Leitungswasser suspendiert.
Tabelle I gibt die Werte der entwickelten Kohlensäure bei Ver-
suchen mit und ohne Adrenalin zu Hefesuspensionen. Es wurden
drei Barytvorlagen verwendet, die 200, 200 und 100 ccm Baryt ent-
hielten. Es wurden sowohl die Hefemengen als auch die Adrenalin-
konzentrationen sowie die Dauer der Versuche variiert.
Tabelle I.
| | e CO3» Entwicklung
Adrenalin» auer
mete | Adrenalin Konzentration | aen chs Hauptprobe Kontrollprobe
g j mg | H g g
10 | 2 1 : 50 000 3 0,183 0,181
10 | 5 1: 20 000 3 | 021 0,172
0 | on 1: 10 000 3 | 0.231 0.176
10 29 1: 4600 3d | 0,26 0,170
20 | 2 1: 8000 3 0,451 0,347
2 | 30 1: 6700 4 0,504 0,363
380 (| I 1 : 20 000 4 0,650 0,452
% 1 16 1:20 000 5 0,734 0,492
Aus diesen Zahlen ergibt sich, daß Adrenalin in einer Konzentration
von 1: 20000 imstande ist, die CO,-Entwicklung um ungefähr 30 Proz.
zu steigern, höhere Konzentrationen haben im wesentlichen keine
größere Wirkung. Eine geringere Konzentration, nämlich 1: 50000,
war unwirksam. Auch zeigt sich schon nach relativ kurzer Zeit dieser
Einfluß; längere Versuchsdauer vermehrt ihn nicht. Die Möglichkeit,
die vermehrte CO,-Entwicklung durch eine Verbrennung des zuge-
setzten Adrenalins selbst zu erklären, besteht nicht, da die Vermehrung
der CO,-Menge viel größer ist als die gesamte CO,-Menge, die ent-
stehen würde, wenn alle Kohlenstoffatome des zugesetzten Adrenalins
zu CO, verbrannten. Es war aber doch von Interesse festzustellen,
ob und wieviel vom Adrenalin verschwunden war; diesbezüglich siehe
unter VI.
274 H. Popper:
Es besteht nun die Frage, ob diese Wirkung des Adrenalins der
zuckermobilisierenden dieses Hormons im tierischen Organismus analog
ist? Man könnte sich nämlich vorstellen, daß durch das Adrenalin
Reservekohlenhydrate der Hefe zu Glucose abgebaut werden, diese dann
vergoren wird und so die CO,-Entwicklung vermehrt.
III. Adrenalinversuche in Gegenwart von Dextrose.
Es wurden je 20g Hefe und 2g Dextrose in 200 ccm HO gelöst.
Der Hauptprobe wurde Adrenalin zugesetzt, der Versuch 2 Stunden
laufen gelassen.
Tabelle II.
Zuges GE A j
A rre | Konzentatian `? CO, + Entwicklung
mg ER o H" g
10 | 1:20000 | 0,941 0,968
20 | 1:10000 0,883 0,871
Es zeigt sich daß Adrenalin keinen Einfluß auf die Trauben-
zuckergärung der Hefe hat, soweit man dies nach der CO,-Entwicklung
beurteilen kann. In beiden Experimenten war nach Abschluß des
Versuchs in Hauptprobe und Kontrollprobe aller Zucker verschwunden
und die Fehlingsche Reaktion negativ.
Es war nun notwendig festzustellen, ob der Einfluß von Adrenalin
ein spezifischer, einer Hormonwirkung beim Tiere zu vergleichbarer
sei, oder ob es sich um eine unspezifische Wirkung, vielleicht um eine
einfache Reduktionswirkung handelt ?
IV. Versuche mit einfachen Phenolen.
Um dies aufzuklären, wurde die Wirkung anderer Reduktions-
mittel, die mit dem Adrenalin verwandt sind, in derselben Anordnung
untersucht, und zwar zwei- und dreiwertige Phenole.
Bei diesen Versuchen wurden größere Durchleitungsgefäße und
Barytvorlagen, die 400, 300 und 300 cem n/5 Baryt enthielten, benutzt.
Tabelle TIT.
| ` COz»Entwicklung
|
Hefe Zugesetzte Menve Ä Dauer EEGENEN
| Substanz AFTER | = Hauptprobe | Kontrollprobe
SE eme R Mn nn
20 | Brenzeatechin | 50 4 0,380 0,216
30 ` R 30 4 0,545 0,445
50 | í 100 4 0,704 0,484
50 Resorcin | 100 | 51, 1,286 1,012
50 — Hydrochinon 100 | 4 0,440 0,396
bü ' A 2 100 | 5 1,122 1,100
50 y Pyrogallol 1% 3%, 1,408 0,964
KO Ñ 100 31 1.232 0.902
Einwirkung von Adrenalin usw. auf die Selbstgärung. 275
Es zeigt sich also, daß Brenzcatechin und Resorcin dieselbe Steigerung,
um ungefähr 30 Proz., bewirken wie das Adrenalin; ebenso das Pyrogallol,
während Hydrochinon, das ein stärkeres Reduktionsmittel ist, un-
wirksam bleibt. Vielleicht spielt dabei die Parastellung der Hydroxyl-
gruppen eine Rolle.
Es war nun auch notwendig festzustellen, wie diese Körper die
Traubenzuckergärung der Hefe beeinflussen; es wurde daher Brenz-
catechin in Gegenwart von Dextrose zugesetzt.
Tabelle IV.
| | I CO, Entwicklung
Z : ,
Are Su re | Monge |! Dauer | Hauptprobe Ä Kontrollprobe
rue dl, PR | a 2 e nn
50 Brenzcatechin || 100'mg | 2 1,760 1,804
Dextrose 5g |
50 Brenzcatechin 100 mg 2 2,288 2,266
Dextrose 5g |
Doch war dieses, wie sich aus Tabelle IV ergibt, ebenso wie das
Adrenalin gänzlich wirkungslos.
Die hier beobachtete Wirkung des Adrenalins erscheint also als
unspezifisch.
V. Versuche mit anderen Reduktionsmitteln.
Es wurde nun noch versucht, die Wirkung von anderen die Zelltätigkeit
nicht direkt schädigenden Reduktionsmitteln zu prüfen, die mit dem
Adrenalin keine chemische Verwandtschaft zeigen. Es wurde hierzu einer-
seits Ferrosulfat, andererseits Ferrotartrat gewählt (das sogenannte Stokes-
sche Reagens, das durch Auflösen von gleichen Mengen Ferrosulfat und
Weinsäure in H,O und Neutralisieren mit NH, bereitet wird).
Tabelle V. |
(Versuche mit 50g Hefe angesetzt.)
| | | | | Kohlensäureentwicklung
Substanz l; Menge i Dauer
l mg j
A A ee N A We A Free er a = ` Kg Ez
Ferrosulfat. . ..... | 190 | 4
Ferrosulfat. ...... | 500 3
Ferrotartrat ...... | 100 HB
Weinsäure. ...... 100 |
Ammoniak. ......
276 H. Popper:
Es zeigt sich also, daß FeSO, auch in starker Konzentration eine
geringe Wirkung hat, Ferrotartrat gar keine; doch ist der Versuch kaum
beweisend, weil der durchstreichende Luftstrom die Ferrosalze wohl sehr
rasch oxydiert und ihrer Reduktionswirkung beraubt.
VI. Kolorimetrische Bestimmung von Adrenalin und Brenzcatechin.
Um nun festzustellen, ob und wieviel von den zugesetzten Sub-
stanzen während der Versuche verschwunden war, wurde eine kolori-
metrische Bestimmung in den Hefefiltraten nach der Schüttlung
ausgeführt. Bei den Adrenalinversuchen waren Farbenreaktionen, wie
die von Fränkel und Allers mit Bijodat und Phosphorsäure, und die
Eisenchloridreaktionen positiv. Zur quantitativen Bestimmung wurde
eine Methode, die Fürth!) seinerzeit angegeben hatte, gewählt, die
auf der Rotfärbung von Brenzcatechin und Adrenalin mit FeCl, in
ammoniakalischer Lösung beruht. Sie bewährte sich, wie durch einige
Probebestimmungen festgestellt wurde, in Hefefiltraten sehr gut. Das
Hefefiltrat einer Kontrollprobe gab gar keine Färbung.
Es wurden 5 cem Hefefiltrat mit 10 ccm H,O und 1 ccm Seignettesalz
versetzt und 0,lccm FeCl, zugefügt. Es entsteht eine karminrote Farbe,
die längere Zeit bestehen bleibt. Als Standard wurde eine 0,1proz. Brenz-
catechinlösung verwendet, die in entsprechender Verdünnung ebenso be-
handelt wurde. Die Lösungen wurden im Dubosgkolorimeter verglichen.
Bei einer Reihe von Hefefiltraten aus den oben angeführten Ver-
suchen wurde die Rotfärbung mit der einer Standardlösung, die der
gleichen Konzentration entsprach, verglichen; es zeigte sich, daß,
soweit es sich aus dieser Reaktion beurteilen läßt, von dem zugesetzten
Adrenalin und Brenzcatechin nichts oder nur sehr wenig während der
Hefeeinwirkung verschwunden war.
Zusammenfassung.
l. Adrenalin steigert in einer Konzentration von 1: 20000, soweit
sich aus der CO,-Entwicklung im’ Luftschüttlungsversuch nach Fürth
und Lieben schließen läßt, die Selbstgärung der Hefe um ungefähr
30 Proz.; doch ist diese Wirkung keine spezifische, einer Hormon-
wirkung vergleichbare, da auch andere mehrwertige Phenole wie Brenz-
catechin, Resorcin und Pyrogallol dasselbe bewirken. Die Paraver-
bindung Hydrochinon jedoch ist unwirksam. Die Wirkung ist in ge-
wissen Grenzen von der zugesetzten Menge der Stoffe sowie von der
Versuchsdauer unabhängig.
1) Fürth, Hoppe-Seylers Zeitschr. f. phys. Chem. 29, 115, 1900.
Einwirkung von Adrenalin usw. auf die Selbstgärung. 277
2. Diese steigernde Wirkung tritt bei Traubenzuckerzusatz zu
gärender Hefe nicht ein.
3. Ob es sich dabei um eine einfache Reduktionswirkung handelt,
läßt sich in dieser Versuchsanordnung mit anorganischen und organischen
Reduktionsmitteln nicht eindeutig beweisen, da diese durch den durch-
geleiteten Luftstrom zu rasch oxydiert werden.
4. Soviel sich aus der kolorimetrischen quantitativen Bestimmung
von Adrenalin und Brenzcatechin im Hefefiltrat mit Hilfe der Rot-
färbung mit Eisenchlorid in ammoniakalischer Lösung nach Fürth
schließen läßt, verschwindet nur wenig oder gar nichts von den zu-
gesetzten Substanzen bei der Hefeeinwirkung.
Biochemische Zeitschrift Band 162, 19
Über den Einfluß einiger Ionen auf die Zuckerassimilation
durch sauerstoffgeschüttelte Hefe.
Von
Fritz Lieben und Daniel Laszlo.
(Aus der chemischen Abteilung des Physiologischen Universitäts-Instituts
in Wien.)
(Eingegangen am 10. Juli 1925.)
Fürth und Lieben!) haben seinerzeit den Vorgang der Milchsäure-
zerstörung durch Hefezellen bei Schüttelung im Sauerstoffstrom studiert
und haben an der Zunahme der Hefetrockensubstanz erkannt, daß
ein Teil des Milchsäurekohlenstoffs von der Hefe zum Aufbau ihrer
Leibessubstanz verwendet wird; dieselbe Versuchsauordnung hat
Lundin?) auf Zucker angewendet und besonders konstatiert, daß die
Zunahme der Hefeleibessubstanz auf Kosten des aus dem Zucker ent-
stehenden Alkohols erfolgt; der als Alkohol aufgefundene C plus dem
(als Ce Dal berechnet) C der Trockensubstanzzunahme ergänzt sich
auf die Menge C, die der dem zugesetzten Zucker entsprechende
Gárungsalkohol nach der Gay-Lussacschen Formel enthalten sollte,
wenn der Versuch in dem Moment abgebrochen wird, wo der Zucker
gerade verschwunden ist.
Es erschien nun interessant, den Einfluß verschiedener Anıonen
und Kationen in einer für die Gärung an und für sich unschädlichen
Konzentration auf diesen Vorgang der Assimilation von zugesetztem
Zucker durch Hefe zu beobachten. Man konnte daran denken, daß
z. B. die Anionen, je nach ihrem Vermögen, auf Proteine quellend oder
entquellend zu wirken, die Assimilation des Zuckers bzw. Alkohols
zur Hefesubstanz fördern oder behindern würden, die Zunahme der
Hefetrockensubstanz also, gegenüber einem Versuch mit Zucker ohne
Salzzusatz erhöht oder vermindert sein würde.
1) O. Fürth und F. Lieben, diese Zeitschr. 128, 144; 182, 165.
2) H. Lundin, ebendaselbst 141, 310 u. 342; s. speziell S. 365.
F. Lieben u. D. Läszlo: Einfluß einiger Ionen usw. 279
Da, wie aus den zitierten Arbeiten hervorgeht, schon die Be-
stimmung der Trockensubstanzzunahme selbst mit nicht geringer
Unsicherheit behaftet ist, so mußte dies von den durch die Ionen be-
wirkten Differenzen um so mehr gelten. Obwohl zu allen Versuchen
dieselbe Preßhefe von Stadlau verwendet wurde, mußten sich selbst-
verständlich doch Verschiedenheiten in der Beschaffenheit der Hefe-
proben geltend machen, abgesehen von den unvermeidlichen kleinen
Differenzen im Feuchtigkeitsgehalt; es spielten ferner Ungleichmäßig-
keiten im zugeleiteten Sauerstoffstrom eine kaum kontrollierbare Rolle,
schließlich war die Außentemperatur, wie an einigen Versuchen speziell
festgestellt werden konnte, von ausschlaggebendem Einfluß. Es mußte
daher für die geringe Sicherheit des einzelnen Versuchs die größere
Zahl der angestellten Versuche eintreten, wodurch es möglich wurde,
von einzelnen widersprechenden Befunden abzusehen und die unten
angeführten Resultate als gualitaliv gesichert zu betrachten. Dagegen
erschien es als unmöglich, die Wirkung der einzelnen Ionen etwa
quantitativ abzustufen.
Es ergab sich nun regelmäßig bei normaler Zimmertemperatur,
daß bei gewissen Ionen eine Erhöhung der Trockensubstanzzunahme
durch den Traubenzucker über den entsprechenden Wert beim Kontroll-
versuch ohne Salz eintritt, bei einigen anderen Ionen diese Erhöhung
ausbleibt, während in einem einzigen Falle (NaF) eine Erniedrigung
erfolgt, die aber der schädigenden Wirkung der F’ zuzuschreiben ist.
Wir verwendeten die Apparatur von Fürth und Lieben (l.c.),
jedoch wurden drei Literkolben gleichzeitig geschüttelt. In jedem
Kolben befanden sich 50 g Preßhefe (von Stadlau) in Y, Liter Leitungs-
wasser, der Sauerstoff!) wurde aus zwei Bomben durch eine Wasch-
flasche mit Alkali zugeleitet, als Vorlage dienten pro Kolben je drei
Gefäße à 400 ccm n/5 Ba(OH), zur Aufnahme der entwickelten CO,,
deren Menge nach jedem Versuch durch Titration mit n/5 HCI (und
Phenolphtholein) festgestellt wurde. Zugesetzt wurden meist je 5g
Glucose und das Salz in einer Menge, daß seine Lösung im Kolben n/10
wurde. Die Dauer der Versuche betrug gewöhnlich 4 Stunden.
Zunächst wurde konstatiert, daß n/10 Lösungen der betreffenden
Salze die Selbstgárung der Hefe nicht schädigen bzw. daß dieselbe
CO,-Menge entwickelt wird, wie in einer Probe ohne Salzzusatz. Die
Beobachtung der CO,-Entwicklung diente auch bei allen folgenden
Versuchen dazu, zu kontrollieren, ob eine solche schädigende Wirkung
1) Es wurden auch einige Versuche mit Luftschüttelung (s. Tabellen)
gemacht, sie ergaben jedoch meistens unregelmäßige, nicht verwertbare
Daten.
19*
280 F. Lieben u. D. Läszlo:
1 In WG 1 JP mol v |
| | FR CO,-Entwicklung in n/5 Lösung
Nr Glucose Salz in
| | | Stunden | A S E
g ccm ccm ccm
1 5 NaC] 4 480 545 150 |
2 | 5 NaCl BA, 498 468 168 ž '
3 | 5 | Naci 41, 432 | 432 Se d
4**) 5 | NaCl 2 | 380 346 =;
5 5 | NaNO, 4 | 372 | 426 168
6 5 NaN O, 4 ı 426 | 498 168 |
7 5 NaNO, | 4 | 450 | 438 162 |
8 5 NaNO, | 4 | - 328 | 285 —
o 5 NaSO, 6 660 ` 492 | 430%%
10***) 5 Na,SO, 6 5 1 540 | 438%*s;
11 | 5 Na,SO, 43, 624 |! 6% | ER
12 | 5 Na,SO, 431, 576 | 576 198
ID, 8 Na,SO, 8 | 792 7144 | 26
14 ll 8 | Na,SO, 4 720 606 | 186
15 1 05 | NaSO, | 2 202 341 SC
16 | 5 | Na,SO, 2 315 ' 328 | =
17 | 5 | Na, SO, 4 592 | 488}) =
18 | 5 Ka, BO, 4 | 373 | 3831) ís
| |
19 | 5 | NaCNS 4 oe ' 44 162
20 | 5 ' NaCNS 6 | 408 | 516 210
21 | 5 —NaCNS 4 AM 398 | 145
22; 5 —NaCNS 4 480 396 132
3 5 . NaCNS 4 8537 392 =
24 | 5 | NaCNS | 4 | 445 j alg =
25tt) | 5 —NaCNS | 2 225 | 380 =
2614) 5 NaCNS ' 2 |O a lo = a
a 5 = NaJ | 4 545 | 460 18 `
mm | 5 © Na ; 4 470 | 405 14 o!
29 | BOI NaJ | 4 mm Im —
am ` 5 NaF 41, 408 | mm ' 234 `
31 | 5 NaF 4 318 320 204
2 | 5 "ab | 4 390 402 168 ,
3 P NaF 4 392 392 An, — |
*) CsWert auffallend niedrig. — **) Luftschüttelung. — ***) Luftschüttelung, CO, der Luft in dit
In allen Fällen, wo sämtliche Kolonnen ausgefüllt sind, war die Versuch
Kolonne C, daher auch A—C usw. nicht ausgefüllt erscheinen, wurde noch ei
ist C verloren gegangen).
auf die Zuckergärung oder Selbstgärung eingetreten war; es war aber
außer beim NaF bei normaler Zimmertemperatur keine außerhalb der
Versuchsfehler liegende Beeinflussung der CO,-Entwicklung durch die
Ionen wahrzunehmen. Erst bei sommerlicher Hitze traten gleichzeitig
mit der erhöhten Salzempfindlichkeit der Hefe auch bei der CO,-
Entwicklung größere Diskrepanzen auf.
A
Einfluß einiger Ionen usw. 281
NI
_ Trockenrückstand
| X
i 23
3
; 0
35
25
20,17 | 19,67 | 16,57 3,60 3,10 | + 0,50 16
` 20,49 | 19,44 | 16,35 4,14 3,09 | +10 34 `
19,40 | 18,61 — = — +0,79 —
21,25 | 1942 | 17,33 3,92 2,09 + 1,88 88
19,02 | 18,93 | 16,57 2,45 2,36 | + 0,09 4
18,98 | 18,60 | 16,22 2,76 2,38 | + 0,88 16
19,75 | 19,10 == — — | + 0,65 =
20,24 | 19,20 — — | +1,04 —
20,11 | 19581)| — an — +0,58 —
19,50 19,007) we? SC ep LoF 0,50 Gë
19,19 | 18,63 | 17,11 2,08 1,52 | + 0,56 37
19,10 | 19,39 | 1731 1,79 2,08 || — 0,29 — 14
19,84 | 18,89 | 17,29 2,55 1,60 | +08 59
19,73 | 18,88 | 17,07 2,66 1,81 + 0,85 47
19,95 | 18,85 > — = + 1,10 —
19,90 | 19,63 — = = + 0,27 —
20,40 | 19,35 => — = ı +1,06 —
19,67 | 19,70 = = SS — 0,08 =
19,81 | 19,16 | 18,27 1,54 0,89 | + 0,65 73
20,08 | 19,51 | 17,98 2,10 1,53 | + 0,57 37
1928 | 1820 | > = = + 1.08 =
18,44 | 19,00 | 17,20 1,24 1,80 | — 0,56 — 3]
18,87 | 19,43 | 17,43 1,44 2,00 — 0,56 — 28
18,87 | 19,28 | 17,08 | 1,79 2,20 — 0,41 — 19
18,48 | 18,85 = Y = = — 0,87
ES eingedrungen. — +) Gegen NaCl + Zucker als Kontrolle gemessen. — tt) NaCNS in n/15 Lösung,
Tanordnung dieselbe, wie in obigem Beispiel, in den anderen Fällen, wo die
zweites Salz oder NaOH (siehe unten) zum Vergleich herangezogen (in Nr. 11
Ein Beispiel möge unsere Versuchsanordnung erläutern:
Im Kolben A befinden sich in % Liter Wasser 50 g Hefe, 5g Glucose,
NaCl in n/10 Lösung.
Im Kolben B befinden sich in Y, Liter Wasser 50 g Hefe, 5 g Glucose.
Im Kolben C befinden sich in % Liter Wasser 50g Hefe, NaCl in
n/10 Lösung.
282 F. Lieben u. D. Läszlo:
Sauerstoffschüttelung durch 4 Stunden; CO, (in Kubikzentimetern
n/5 Lösung) wurde entwickelt aus A 480, B 545, C 150; die drei Hefe-
proben wurden über den gleichen Mengen Kieselgur auf gehärtetem Filter
abgesaugt, wenig nachgewaschen und der auf der Nutsche verbleibende
Rückstand in einer gewogenen Schale zur Gewichtskonstanz getrocknet
und gewogen. Der Trockenrückstand von A wog 18,37, von B 18,05, von
C 16,68 g. Die Trockensubstanzzunahme betrug also in A (mit NaCl) 1,69 g;
in B (ohne NaCl) 1,37 g; die Differenz ist 0,32g. Die Kohlenstoffbilanzen
für A und B, ohne Berücksichtigung des Alkohols, wären:
A. zugesetzt 5g Glucose . . . . . 2 gc
1,458 CO}... . . 040g C
1,69 g Rückstand (als C Hat) ber. j . . 0,75g C
1,158 C
es fehlen. 2% esse ee 085. C
B. zugesetzt 5g Glucose . . . . . ....2 gC
1,748 CO,. . e ër e DARRO
1,37 g Rückstand (als CH, 0, ber.) . . 0,612 C
1,08 y C
es febleno s s a a 000%... 2.0928 C
Nach der Gárungsgleichung liefern 5g Glucose 2,55 g Alkohol mit
1,33 g C, hiervon wäre (nach Lundin) der C des Trockenrückstandes abzu-
ziehen, es könnten also in A 1,33 — 0,75 = 0,58g C, in B 1,33 — 0,61
= 0,72g C als Alkohol in die Bilanz einzusetzen sein; die dann noch ver-
bleibenden Mankos wären für A 0,85 — 0,58 = 0,27 g C, für B 0,92 — 0,72
= 0,20 g C; diese Mankos sind hiernach auf C O,-Verluste zu beziehen; im
allgemeinen schwankten sie zwischen 10 und 20 Proz.?).
In Tabelle I geben wir unsere Versuchsresultate bei n/10 Na-Salz-
lösungen mit verschiedenen Anionen, je 50g Hefe und Sauerstoff-
schüttelung wieder.
Wir entnehmen der Tabelle I, daß die CO,-Entwicklung durch den
Salzzusatz keine wesentliche, eindeutige Beeinflussung erfährt (s. oben);
Die CO,-Werte in A und B (Kolonne V) zeigen zumeist keine bedeutende
Abweichung, so daß vereinzelte größere Differenzen (Nr. 9, 19, 23, 30)
wohl auf Versuchsverluste zurückzuführen sind; beim 2-Stunden-
Versuch erscheinen besonders leicht Diskrepanzen (z. B. Nr. 15 und 25).
Wir sehen zweitens aus den Kolonnen IX (A — B) und eventuell X,
daß wir bei NaCl eine Erhöhung der Assimilation nicht wahrnehmen
können; auch beim NaNO, ist (selbst, wenn wir von dem stark ab-
weichenden Fall Nr. 6 absehen) eine erhöhende Wirkung der NO; nicht
deutlich abzuleiten. Hingegen geben sowohl No: SU, wie NaCNS
und NaJ, wie die Kolonne IX einwandfrei zeigt, eine deutliche Erhöhung
der Trockensubstanzzunahme, deren Betrag zwar stark schwankt,
deren Vorhandensein beim Na,SO, übrigens auch gegenüber einer
1) Diese Berechnung gilt allerdings streng nur für den Moment, wo der
Zucker gerade vollkommen verschwunden ist (vgl. Lundin, Lei
Einfluß einiger Ionen usw. 283
Na Cl-Zucker-Hefesuspension festgestellt werden konnte (Nr. 17 und 18).
Ebenso deutlich zeigt sich die Verminderung der Zuckerassimilation
bei Zusatz von NaF. Gelegentliche Anwendung einer größeren Zucker-
menge (Nr.13 und 14) ergibt eine verminderte Wirkung des Salzes.
Auch eine verlängerte Schüttelungszeit bietet undeutlichere Resultate
(vgl. Nr.9 und 13); es wird dann der assimilierte Trockenrückstand
allmählich wieder veratmet, wobei offenbar durch das Salz bewirkte
Unterschiede ausgeglichen werden (s. unten).
Bei Versuchen mit n/5 Na-Salzlösungen, auf deren detaillierte
Wiedergabe wir verzichten, zeigen sich analoge Effekte der einzelnen
Anionen, jedoch sind die Ausschläge gegen n/10 Lösungen nicht erhöht,
mitunter undeutlicher; beim NaF ist durch die giftige Wirkung nicht
nur die Zunahme des Trockenrückstandes, sondern auch die CO,-Ent-
wicklung stark herabgesetzt!).
Es drängte sich die Frage auf, wie die Salze Na, SO, NaCNS
und NaJ die Erhöhung der Trockensubstanzzunahme bewirken. Da
war vor allem dem Einwand zu begegnen, daß die angeführten Salze
selbst in höherem Maße als NaCl oder NaNO, von der Hefe durch
Adsorption zurückgehalten werden und eine Einwirkung auf die Zucker-
assimilation gar nicht besteht.
Der Widerlegung dieses Einwandes galt die folgende Versuchsreihe;
es wurden in Kolben A 50g Hefe in n/10 Salzlösung in Leitungswasser,
in B 50g Hefe in Leitungswasser ohne Salz suspendiert und im O,-Strom
geschüttelt.
Tabelle II.
Dauer ' CO,»Entwicklung | | Trockenrückstand |
Nr | Salz In a ; Bemerkung
| Stdn. A | B i B | A-B |
==- H — an E E
1*) N2,80, | 6 | 246 | 360 17,08 | — 0,13 | *) Luftschüttelg.
2 | Na,SO, | 4 117 | 166 17,62 | — 0,59 |
3 || Na,80, | 4 190 | 170 1742 | — 0,52 |
4 | NaCNS | 4 90 90 16,70 | + 0,08!
5 | NaNO, | 4 102 90 1670 | — |
6 | NaJ | 4 99 | 166 17.62 | — 0,46
7 | Sai 44, | 103 16.75 | +045 '
8 | NaF | 4%) 17 103 1685| — ;
Wir sehen ziemlich gute Übereinstimmung zwischen A und B
neben nicht sehr großen Schwankungen um den Nullwert, und zwar
eher nach der negativen Seite, so daß von einer Erhöhung des Trocken-
rückstands in A durch Salzretention allein gewiß nicht die Rede sein
kann, es ist aber immerhin damit zu rechnen, daß dieser Faktor in
1) Vgl. die Hemmungsreihe von Hägglund bei Euler- Lindner, Chemie der
Hefe 1915, S. 298.
F. Lieben u. D. Läszlo
op | aunt | ogi | Gs | grst oe | on ve | oos | #5 | + | 3N | el
e | eut | ort "es lau | sest | oe | 06 | oz | lp | s TOBIN | zi
= | 0 | 19% I9Z | 9691 | LP6I | LEGI | SOI 299 OP9 Ir “103 II
er 920 + EL GL | GOLI | 8L'8I | gogo 001 +09 LL? p 1931 | OI
68 Lut | osi LOZ | 0U8St | oer 2103 SL "| 08 GES $ *1,)8,) 6
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t
|
Einfluß einiger Ionen usw. 285
gewissem Maße die Resultate einmal im positiven, einmal im negativen
Sinne mit beeinflußt.
Bevor wir die Frage nach dem Ursprung der lonenwirkung auf die
Zuckerassimilation weiter besprechen, möchten wir einige, analog wie
oben ausgeführte Kationenversuche mit verschiedenen Chloriden an-
führen (O,-Schüttelung, je 5g Glucose, Bedeutung der Kolonnen wie
in Tabelle 1).
Wir sehen die zum Teil beträchtlich erhöhende Wirkung der K',
Ca und My -Salze, während die NH, -Salze eine Wirkung vermissen
lassen, vielmehr eher eine herabsetzende Tendenz zeigen; betreffs der
CO,-Werte können wir auf das zu Tabelle I Bemerkte verweisen
(größere Diskrepanzen zwischen A und B finden wir in den 2-Stunden-
Versuchen Nr.6 und 7, ferner in Nr. 12 und 13, in letzteren sind
mechanische Verluste eingetreten).
Auch die Wirkung von K,SO, und KCNS bei O,-Schüttelung
wurde untersucht; es ergab sich keinesfalls eine Summation der er-
höhenden Wirkung von K’ und SO, bzw. CNS’, vielmehr zeigen die
Salze K,SO, und KCNS eine ausgesprochen hemmende Wirkung auf
die Zuckerassimilation.
Es war naheliegend, bei Untersuchung der Wirkung dieser ver-
schiedenen Anionen und Kationen auch das unter ihrer Mitwirkung
(eventuell infolge hydrolytischer Spaltung) entstandene py des Hefe-
filtrats in Betracht zu ziehen; eine, wenn auch sehr geringfügige
Änderung des pp konnte nämlich den komplizierten Vorgang der
Trockensubstanzvermehrung der Hefe durch Zucker in Gegenwart
von Salzen modifizieren*). Es wurde daher nach dem Schütteln im
verdünnten Filtrat vom Heferückstand das pg nach der Indikatoren-
methode mit dem Indikator a-Dinitrophenol bestimmt. Die Filtrat-
proben waren kaum getrübt und ließen sich im Komparator mit aus-
reichender Genauigkeit mit den Standards vergleichen. Trotzdem
ergaben sich bei verschiedenen Versuchen mit demselben Salz Schwan-
kungen im py von 0,2 bis 0,3, ebenso stark differierten aber auch Filter-
proben aus Hefe-Zuckersuspensionen ohne Salz. Wir móchten den
absoluten Werten keine große Bedeutung beimessen und nur die
Pa-Werte der Filtrate vom A-Kolben (Hefe-Zucker-Salz) mit denen
vom B-Kolben (Hefe-Zucker) vergleichen.
Die Zahl der Bestimmungen ist für sichere Schlüsse natürlich nicht
ausreichend, wir möchten nur darauf aufmerksam machen, daß es
1) Bekanntlich bewirkt eine stärkere Änderung des py eine Umkehrung
der Hofmeisterschen Reihen.
286 F. Lieben u. D. Läszlo:
Tabelle IV.
a | Differenz |
Nr. Salz | Dp yon A ` Py von BB A—B | Bemerkungen
2 a re | < | EN A
. | Ä | Mittelwert
1 Nacl | 32 ` 33 — 0,06 | von 3 Bestimmungen
2 , NaNO, | 36 : 35 | +01 |,2 ,
3 j Na: SO, | 3,74 | 3,54 | T 0,2 1 5 n
4 ' NaCNS | Ia ` ` Za EA ELE
SL NaJ | 37 33 | +04
6! NaF | 38 0033 | +05
Ti KO | 3,6s 3,8; = „2 n
8 NHC | er 3,5 negativer Wert! „ 2 a
9 CaCl | | 3,6, +02 | ,2 z
10 \ MgCl, | 3,7, 3,6 | RE 0,1, | ” 3 n
wohl kein Zufall ist, wenn in Nr. 1, 2 und 8 (beim NaCl, NaNO, und
N H,Cl) die Differenz zwischen dem py in A und B um Null schwankt
bzw. beim N H,Cl deutlich negativ ist, also gerade in jenen Fällen, wo
durch die Anwesenheit der Salze keine Erhöhung der Zuckerassimilation
eingetreten ist (s. Tabelle I und III). Die Salze, die eine solche Assi-
milationserhöhung bewirken, zeigen — mit Ausnahme allerdings des
KCI — auch eine deutliche Erhöhung des pg von A gegenüber der
Probe aus B; letzteres ist allerdings auch bei dem die Zuckerassimilation
erniedrigenden NaF der Fall, eine Tatsache, die die spezifische Gift-
wirkung des F’-Ions gegenüber den anderen Ionen unterstreicht.
Es wäre nun verlockend, anzunehmen, daß die Wirkung des S0},
CNS’, J’, Ca” und Mg” auf die Vermehrung der Zuckerassimilation
des Heferückstandes eben nur auf der Erhöhung des pe gegenüber dem
der Zucker-Hefesuspension beruht. Bei gleichbleibendem oder herab-
gesetztem py gebe es auch keine oder eine herabsetzende Assimilations-
wirkung (wobei KCl eine Ausnahme bilden würde, während NaF eine
spezifische Giftwirkung ausübt). Um über diesen Punkt mehr Klarheit
zu gewinnen, wurden folgende Versuche angestellt:
Kolben A 50g Hefe, 5g Glucose, ccm n/10 NaOH in LG Liter
Leitungswasser.
Kolben B 50g Hefe, be Glucose, zcem n/10 NaOH in 4 Liter
Leitungswasser.
l | | ` | Bi: A a mn | Differenz
wa nn IS DEA A re MAA
II A n 42 383 | 19,08 ) —
Ei "e zez | ap | 405 | 1934 Sek
(A $ | A 482 19,25 Lo
u d B "Ia 35 414 | 1963 j m Oss
Ia ` 40 | 490 19,32
MI |! Bp i} 2 i 33 387 . 1920 ) + 0,12
Einfluß einiger Ionen usw. 287
Obwohl durch den Laugenzusatz das py in A durchwegs erhöht
wurde, andererseits eine wesentliche Schädigung der Gärung, an der
CO,-Entwicklung gemessen, noch nicht eingetreten sein konnte, zeigte
der Trockenrückstand keinerlei Vermehrung im Kolben A (eher eine
geringfügige Verminderung), so daß die analoge (etwas kleinere)
Änderung des py in den früher mitgeteilten Versuchen keinesfalls allein
die Trockenrückstandsvermehrung bewirkt haben konnte. Dies schließt
aber natürlich nicht aus, daß die H- bzw. OH’-Ionen in die Wirkung
der übrigen Ionen modifizierend eingreifen.
Auch diese Möglichkeit wurde dadurch experimentell zu prüfen ver-
sucht, daß das an sich unwirksame NaCl mit etwa 40 ccm n/10 NaOH
zusammen zu einer Zucker-Hefesuspension zugesetzt wurde und die C Oy
bzw. Trockenrückstandswerte mit den aus den Suspensionen Hefe-Zucker-
NaCl und Hefe-Zucker-NaOH verglichen wurden. Wir konnten aber nicht
zu deutbaren Ergebnissen gelangen.
Die hohe Sommertemperatur der letzten Wochen machte übrigens
zahlreiche Versuche dadurch wertlos, daß die viel rascher verlaufende
Gärung die durch in höherem oder geringerem Maße assimilierten
Zucker entstandenen Differenzen auszugleichen bestrebt ist, so daß
die bisher konstatierten Regelmäßigkeiten sich unserer Wahrnehmung
zu entziehen drohten. Wir begegneten dieser Schwierigkeit durch
Herabsetzung der Versuchsdauer von 4 auf 2 Stunden. Beim Na,SO,
trat die erhöhende Wirkung in der Tat sogleich wieder in obigem Aus-
maß (vgl. Tabelle I) auf, beim NaCNS hingegen war dies erst dann
zumeist der Fall, als außer der Versuchsdauer auch die Konzentration
des Salzes von n/10 auf n/15 herabgesetzt wurde (auch dann gab es
negative Versuche, z. B. Tabelle 1, Nr. 26). Man muß dementsprechend -
weiter schließen, daß bei hoher Außentemperatur die Hefe auch leichter
als sonst durch Saize in ihrem Zuckerassimilationsvermögen geschädigt
werden kann, was die sonst eventuell erhöhenden Wirkung derselben
kompensiert (dies scheint wohl auch beim N H,Cl der Fall zu sein; vgl.
Tabelle III, Nr. 6 und 7). Es empfiehlt sich daher, Versuche, wie die
oben angeführten, in der kühlen Jahreszeit anzustellen, um die oben
geschilderten Komplikationen zu vermeiden.
Wir sind uns dessen bewußt, daß unser Versuchsmaterial,
namentlich in Anbetracht der eingangs erwähnten methodischen
Schwierigkeiten, zu klein ist, um definitive, quantitative Schlüsse
über den Einfluß von Ionen auf die Zuckerassimilation der Hefe zu
ziehen, glauben aber auf Grund der mitgeteilten Versuche folgende
Sätze vertreten zu können.
Zusammenfassung.
l. Bei der Fürth-Liebenschen Versuchsanordnung (1. c.) (O,-Durch-
leitung durch eine geschüttelte Hefesuspension) beeinflussen die An-
288 F. Lieben u. D. Läszlo: Einfluß einiger Ionen usw.
ionen Cl’, NO, und das Kation NH, das Ausmaß der Zuckerassimilation
durch Hefe nicht, die Anionen SO,, CNS’, J’, ferner die Kationen EK,
Ca” und Mg bewirken eine Erhöhung, das Anion F’ eine Verminderung
derselben. Die Anionen wurden hierbei als Natriumsalze, die Kationen
als Chloride in n/10 Lösung zugesetzt. K,SO, und KCNS verursachen
eine deutliche Herabsetzung der Zuckerassimilation.
2. Die Wirkung läßt sich für die einzelnen Ionen nicht quantitativ
abstufen; es scheint aber (man beachte die analoge Wirkung von SO,
und CNS”), das Quellungsvermögen der lonen dabei keine Rolle zu spielen,
überhaupt scheinen Beziehungen zu den bekannten Hofmeisterschen
Reihen nicht zu bestehen.
3. An der erhöhenden Wirkung der oben genannten Ionen hat
eine etwaige adsorptive Salzretention durch Hefe keinen oder nur
einen ganz untergeordneten Anteil, hingegen könnte wohl das durch
den Salzzusatz beeinflußte py der Hefe-Zuckersuspension auch die
Wirkung auf die Zuckerassimilation mitbestimmen, obwohl diese
Pp-Änderung keinesfalls die einzige Ursache dieser Wirkung ist, viel-
mehr den einzelnen Ionen selbst ein ausschlaggebender Einfluß zu-
kommt.
4. Bei hoher Außentemperatur verwischen sich die in 1. erwähnten
Unterschiede in der Salzwirkung wegen schnelleren Ablaufs der Gärung
und erhöhter Salzempfindlichkeit der Hefe; man muß dann die Ver-
suchsdauer, eventuell die Salzkonzentration herabsetzen, um die Unter-
schiede wieder zu erhalten.
Die Dissoziationskonstante, das Löslichkeitsprodukt
und die Titrierbarkeit von Alkaloiden.
Von
J. M. Kolthoff.
(Aus dem pharmazeutischen Institut der Universität Utrecht.)
(Eingegangen am 7. Juli 1925.)
L Vom physikalisch-chemischen Verhalten von Alkaloidlösungen
und deren Salzen ist nur wenig bekannt. Besonders in der älteren
pharmazeutischen Literatur findet man viele Angaben, welche rein
empirisch gefunden sind, über die acidimetrische Titrierbarkeit von
Alkaloiden und deren Salzen!). Jedoch weiß man sehr wenig von der
Genauigkeit dieser Titration und ist in der Auswahl der Indikatoren
ziemlich willkürlich, was uns nicht zu verwundern braucht, weil man
die Werte der Dissoziationskonstanten der Alkaloide nicht kannte.
Nach den modernen Anschauungen ist es unbedingt notwendig, die-
selben zu kennen, wenn man in einer zweckmäßigen und systematischen
Weise die geeignetsten Indikatoren auffinden will. Im Zusammenhang
hiermit steht die Frage über den Hydrolysegrad von Alkaloidsalz-
lösungen, welche unter anderen bei der Reinheit dieser Salzlösungen
1) Über die ältere Literatur vgl. Kippenberger, Zeitschr. f. analyt.
Chem. 89, 201, 1900. Dieser Autor hat eingehende, auf exakter Basis be-
ruhende Untersuchungen ausgeführt und die nach ihm am besten sich
eignenden Indikatoren angegeben. Rupp und Segers, Apoth.-Ztg. 22, 748,
1907, schlagen vor, dort, wo es sich um farblose oder annähernd farblose
Lösungen handelt, Dinitrophenolphthalein oder praktischer und einfacher
p-Nitrophenole als Indikator bei der Bestimmung von Chinabasen zu ver-
wenden, was in Übereinstimmung steht mit den Resultaten von H. Bagges-
gaard-Rasmussen und S. A. Schou, Zeitschr f. Elektrochem. 81, 189, 1925
(vgl. S.6). Über die Titration in alkoholischer Lösung hat Messner,
Zeitschr. f. angew. Chem. 16, 444, 1903 geschrieben. Vgl. übrigens A. R.
-von Korczynski, Die Methoden der exakten quantitativen Bestimmung der
Alkaloide, S. 1, Berlin, Verlag von Gebr. Borntraeger, 1913. H. Bauer,
Analytische Chemie der ia S. 46. Berlin, Verlag von Gebr. Born-
traeger, 1921.
290 J. M. Kolthoff:
von Interesse ist. Auf die Literaturangaben komme ich unten aus-
führlicher zurück. Die Kenntnis der Dissoziationskonstante von
Alkaloiden kann auch von Wichtigkeit sein bei Trennungen dieser
Substanzen voneinander. Um dies zu erleichtern, nehmen wir an, daß
wir ein Salzgemisch von zwei Alkaloiden haben, welche denselben
Ausschüttelungskoeffizienten für ein organisches Lösungsmittel haben,
von denen aber das eine Alkaloid eine hundertmal kleinere Dissoziations-
konstante besitzt als das zweite.
Wenn wir nun zum Salzgemisch einen Überschuß einer Puffer-
mischung fügen, welche eine derartige Wasserstoffionenkonzentration
besitzt, daß ein Teil der Alkaloide in Freiheit gesetzt wird, dann wird
von der Base mit der kleinsten Dissoziationskonstante hundertmal
mehr im freien Zustande vorhanden sein als von der zweiten. Daher
wird bei dem bestimmten pa vom ersten 'Alkaloid auch hundertmal
mehr ausgeschüttelt als vom zweiten*). Vom organisch-chemischen
Standpunkte ist es im Zusammenhang mit der Konstitutionsfrage
natúrlich auch von Interesse, die Dissoziationskonstanten zu kennen.
Ich habe daher auch die Konstante von einigen einfachen Basen, von
denen die Alkaloide abgeleitet sind, bestimmt. Bekanntlich sind die
sekundären aliphatischen Amine stärkere Basen als die primären,
während die tertiären Amine schwächer als die letzteren sind. Führt
man in ein aliphatisches Amin eine aromatische Gruppe ein?), so nimmt
die Dissoziationskonstante ab, z.B.
KcH,NH, —5.10-%, während Kc, Hs CH NH3 — 0,24 . 10-4,
KCH N(CH) = 7,4. 1075, „ Kc ,H,CcH¿N(CHa). = 1,05 . 1075,
Die aromatischen Amine sind alle schwácher als die entsprechenden
aliphatischen. Interessant ist eine Vergleichung von den Konstanten
von Piperidin und Pyridin.
CH, CH
H NCH, e Kë
H,C\ CH, HO CH
ÑH Ñ
Piperidin: K = 1,6, 1073 Pyridin: K = 3.10-*
Nach Kauffmann?) soll hier beim Pyridin eine tiefgreifende
funktionelle Umänderung des Aminostickstoffs stattgefunden haben.
Jedenfalls scheint der gesättigte aromatische Ring den basischen
1) Über eine Anwendung davon vgl. N. Evers, Yearbook of Phar-
macy 1922; vgl. im Pharm. Weekbl. 59, 1390, 1923.
2) Bredig, Zeitschr. f. physik. Chem. 18, 288, 1894.
3) H. Kauffmann, Ber. 86, 1062, 1903.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 291
Charakter von der sekundären Base stark zu erhöhen, während der
ungesättigte Ring die Konstante stark erniedrigt.
Wie wir sehen werden, ist auch vom Löslichkeitsprodukt der
meisten Alkaloide wenig bekannt. Wenn man die Dissoziations-
konstante K und die Löslichkeit weiß, so ist das Löslichkeitsprodukt L
einfach zu berechnen. Ist doch:
[Alk ][{OH')
K= kon dl
und L = [AIk'][0H'] = K.[AlkOH].... (2)
Wenn die Löslichkeit bekannt ist, so kann man den entsprechenden
(oder für die Dissoziation korrigierten) Wert in die Gleichung für
[Alk . OH] einfüllen und Z berechnen. Leider ist es sehr schwer, die
Löslichkeit von Alkaloiden im Wasser genau zu bestimmen. Die Löslich-
keit ist nämlich im allgemeinen sehr gering, so daß Verunreinigungen,
besonders Kohlensäure, einen erheblichen Einfluß ausüben und die
Löslichkeit vergrößern. Den in der Literatur erwähnten Daten kann
man daher im allgemeinen nicht zuviel Gewicht beilegen. Ich habe
daher in anderer Weise versucht, das Löslichkeitsprodukt von Alkaloiden
zu ermitteln, und konnte aus den Werten die wahre Löslichkeit von
Alkaloiden im Wasser berechnen. In der analytischen Chemie kann
die Kenntnis von der Dissoziationskonstante und das Löslichkeits-
produkt von Interesse sein bei der Identifikation eines Alkaloides.
Wichtiger ist die Rolle des Löslichkeitsprodukts bei der Trennung
von zwei oder mehr Alkaloiden mit Hilfe der fraktionierten Fällung.
Nehmen wir an, zwei Alkaloide zu haben, mit verschiedenem Löslich-
keitsprodukt:
[A,][OHJ = and [4,][0H] = L, (3)
Wenn wir nun zu einem Salzgemisch dieser beiden Alkaloide so viel
Lauge hinzufügen, daß nicht alle gebundenen Alkaloide in Freiheit
gesetzt werden, so haben wir eine bestimmte Hydroxylionenkonzentra-
tion [OH] in der Lösung, welche kleiner ist als die der gesättigten
Alkaloidlösungen. Wenn unter diesen Verhältnissen [A] [OH] kleiner
ist als L, und [A,][OH’] größer als L}, so wird das zweite Alkaloid
niedergeschlagen werden, und zwar kann man ableiten, daß dies fort-
geht, bis
fe ZE
[4,] < z, Al (4)
Praktisch wird es wahrscheinlich besser sein, zum Alkaloidsalz-
gemisch eine Puffermischung statt Natronlauge hinzuzufügen. Dann
bleibt die Hydroxylionenkonzentration während. der Präzipitation des
einen Alkaloids ungefähr ungeändert und man kann die Verhältnisse
292 J. M. Kolthoff:
für eine quantitative Fällung sehr einfach berechnen. Natürlich kann
die fraktionierte Fällung auch verbunden werden mit der fraktionierten
Ausschüttelung der Alkaloide, was wir oben schon besprochen haben.
Eine Anwendung der fraktionierten Fällung hat Mauz!) schon gemacht.
Leider sind die Resultate seiner eingehenden Untersuchungen
nur in seiner Habilitationsschrift niedergelegt und weiter in der Literatur
unberücksichtigt geblieben. Ich erwähne daher einige von seinen
Resultaten:
Zugesetzt Zugesctz
Genommene Mischung ai HCI | UNA OH | Menge BE pu Ae gefüllten
0,3033 g Morphin . .' | 0,1370 g1,.:
0,2943 g Cinchonin . | EE d EE | | 0,1350 Al EES
0,3393 g Papaverin . Ä 0,1625 g Er
0,3343 g Strychnin . | | 20, 2 | 0,1627 Si Papaverin
0,3393 g Papaverin . ¡| o
0,3943 g Brucin . . . | H: 5, 0,1680 g .
20 „ 10, 0,3127 g y
i (ber. 0,3127 g)
0.3033 g Morphin . . | 20 ;
; | I 5 0,1300 g Strvchnin
0,3343 g Strychnin . : » | (ber. 0.146 g)
Eine Bedingung für das Gelingen der fraktionierten Fällung ist
natürlich diese, daß eine große Verschiedenheit zwischen den Löslich-
keitsprodukten der bezüglichen Alkaloide besteht. Auch gibt Mauz
Beispiele von Fällen, in denen beide Alkaloide aus der Mischung gefällt
werden.
Aus der gegebenen Einleitung darf wohl der Schluß gezogen werden,
daß die analytische Chemie der Alkaloide, vom physikalisch-chemischen
Standpunkt studiert, schöne Perspektiven öffnet. Bei der Unter-
suchung von unbekanntem Material, wie es z. B. bei phytochemischen
Arbeiten oft der Fall ist, werden die obengenannten Prinzipien oft mit
Vorteil verwendet werden können.
2. Die Dissoziationskonstante einer Säure oder Base kann nach
verschiedenen Methoden bestimmt werden. Gewöhnlich kommt eine
der folgenden in Betracht:
a) Die Bestimmung des Dissoziationsgrades einer Lösung der
Base oder Säure. Weil wir in unserem Falle im allgemeinen mit sehr
schwachen und dazu noch schwer löslichen Basen zu tun haben, kann
diese Methode hier im allgemeinen nicht empfohlen werden. Spuren
von Verunreinigungen, besonders Kohlensäure, würden einen zu er
heblichen Einfluß auf den Gleichgewichtszustand der Lösung ausüben.
1) P. Mauz, Physik.-chem. Untersuchungen über Alkaloide. Dissert.
Stuttgart 1904. E
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 293
b) Die Bestimmung des Hydrolysengrades eines Salzes der Säure
oder Base. Weil die Alkaloidsalze alle eine saure Reaktion haben, haben
Spuren Kohlensäure nur einen geringen Einfluß auf das Gleichgewicht
der Lösung. Bei der Anwendung der Methode b) muß man ganz sicher
sein, daß das bezügliche Salz keinen Überschuß an freier Säure oder
etwa freiem Alkaloid enthält. Bei sehr kostspieligen Zubereitungen,
welche man nicht ad libitum reinigen kann wegen Verlust an Material,
ist die Anwendung der Methode b) ohnehin also ziemlich gefährlich.
Wie wir im experimentellen Teile noch sehen werden, sind die
Angaben in der Literatur von der Wasserstoffionenkonzentration in
Lösungen von den gewöhnlichen Alkaloidsalzen sogar oft falsch an-
gegeben.
c) Die Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration während
der Neutralisation des Alkaloids, also der Neutralisationskurve. Diese
Methode wird die besten Resultate geben, weil geringe Verunreinigungen
von freier Säure oder Base im ursprünglichen Salze fast keinen Einfluß
haben auf die Größe der Wasserstoffionenkonzentration während der
Neutralisation. Besonders gilt dies beim Punkte, wo die Hälfte des
Alkaloids in Freiheit gesetzt ist, weil hier die Pufferkapazität der
Lösung am größten ist.
Wegen der Vorteile der Methode c) habe ich sie im allgemeinen
bei der Bestimmung der Dissoziationskonstante der Alkaloide ver-
wendet. Die Wasserstoffionenkonzentration wurde dabei kolorimetrisch
mit Hilfe von Farbindikatoren bestimmt. Die Anwendung der Wasser-
stoffelektrode verdient keine Empfehlung, weil verschiedene Alkaloide
unter der katalytischen Wirkung von platiniertem Platin reduziert
werden und keine exakten Resultate erhalten werden. Dies gilt nach
Pinkhof!) besonders für Strychnin und Chinin. Daher verwendete
Pinkhof bei seinen potentiometrischen Titrationen der Alkaloidsalze
die Quecksilber- Quecksilberoxydelektrode, welche für meinen Zweck
unbrauchbar ist, weil sie nur in alkalischer Lösung reproduzierbare
Werte gibt. Zwar ist auch die Wasserstoffelektrode für die Titration
von Alkaloiden angewendet worden?), dazu ist jedoch zu bemerken,
daß man keine exakten Einstellungen zu erzielen braucht, weil nur
der Potentialsprung beim Äquivalenzpunkt maßgebend ist. Neuerdings
hat Fr. Müller?) die Dissoziationskonstante einiger Alkaloide mit Hilfe
1) Pinkhof, Dissert. Amsterdam 1919.
2) N. Evers, Pharm. Journ. and Pharmacist 1921, S. 470; W.J. Me Gull
and P. E. Faulkner, Journ. Amer. Pharm. Assoc. 11, 1003, 1922: vgl. auch
Masucci und Moffat, ebendaselbst 12, 609, 1923; J. M. Mc Gill, Journ.
Amer. Chem. Soc. 44, 2156, 1922.
3) Fr. Müller, Dissert. Dresden 1924: Zeitschr. f. Elektrochem. 30,
587, 1924.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 90
294 J. M. Kolthoft :
der Wasserstoffelektrode abgeleitet. Jedoch bemerkt er selbst: ‚Den
kolorimetrisch ermittelten Werten der Dissoziationskonstante der
Alkaloide von Kolthoff (‚Der Gebrauch von Farbindikatoren‘) ist aus
den angeführten Gründen mehr Gewicht beizulegen“. Die Resultate
Müllers werde ich im experimentellen Teile erwähnen. Neuerdings
verwendete J. C. Krantz!) die Wasserstoffelektrode für die Bestimmung
von einigen Alkaloiden. Nach der Veröffentlichung von Eimar
Biilmann?) über die Anwendung der Chinhydronelektrode haben wir
eine geeignete Elektrode zur Bestimmung der Wasserstoffionenkonzen-
tration in Lösungen. Ich bezweckte daher, meine Versuche mit dieser
Elektrode zu wiederholen. Weil man jedoch von anderer Seite
auch damit beschäftigt war und H. Baggesgaard- Rasmussen?) seine
Resultate inzwischen veröffentlicht hat, habe ich davon abgesehen
(vgl. jedoch bei Chinin). Über die Anwendung der Chinhydronelektrode
ist zu bemerken, daß es nicht ganz sicher ist, daß sie in Alkaloidsalz-
lösungen ganz zuverlässige Resultate gibt. Das Chinhydron besteht
aus äquimolekularen Mengen Hydrochinon und Chinin; beide sehr
reaktionsfähige Substanzen, welche sich möglicherweise mit dem
Alkaloid oder dessen Salz verbinden können. Ich habe versucht, aus
den Resultaten Rasmussens die Konstanten der von ihm verwendeten
Alkaloide zu berechnen. Ich kam dabei jedoch auf Schwierigkeiten,
welche meine Annahme bestätigten. So gibt Rasmussen*) z.B. an,
daß eine Mischung von 20 ccm 0,02 mol. Strychnin in 0,0395 n Salz-
säure mit 100 ccm Wasser das pa gleich 2,40 hat. Wenn wir nun an-
nehmen, daß das Strychnin sich wie eine einsäurige Base verhält (was
in der Tat nicht richtig ist, wie wir sehen werden), so würde die genannte
Mischung 0,00325n an freier Salzsäure sein, was einem pa von 2,40
entsprechen würde. Das von Rasmussen gefundene pa entspricht einer
Salzsäurekonzentration von 0,004n, also einem zu hohen Werte.
Übrigens bezweckten Baggesgaard- Rasmussen und Schou nur praktische
Resultate zu haben. Sie verglichen das Resultat von der potentio-
metrischen Titration mit dem, welches mit Farbindikatoren erhalten
wurde. Sie konnten in dieser Weise ableiten, daß Strychnin, Brucin,
Morphin, Codein und Atropin scharf auf Methylrot titriert werden
können, Cinchonin auf denselben Indikator, wenn man bis zum
Pr = 5,8 titriert. Für Chinin verwendet man nach ihnen am besten
das p-Nitrophenol, und zwar bis zum py = 6,2 bis 6,4. Narcotin ist
1) J. C. Krantz, Journ. Amer. Pharm. Assoc. 14, 294, 1925.
2) E. Biilmann, Ann. de Chim. 15, 109, 1921; 16, 321, 1922.
3) H. Baggesgaard - Rasmussen, Farmaceutisk Tidensk 48, 689,
705, 721, 745, 1924; S. A. Schou, auch Zeitschr. f. Elektrochem. 31,
189, 1925.
1) Ebendaselbst. S. 191.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 295
nach ihnen auf Methylorange titrierbar, und zwar bis zum pp etwa
von 4,5.
Hydrastin läßt sich schwer genau titrieren, wenn man Methylrot
verwendet und ein py von 4,8 als Titrierexponent annimmt, kann man
einigermaßen gute Resultate erzielen. L. R. Wagener und W.J. Mce Gil!)
verwendeten neuerdings auch die Chinhydronelektrode zur Bestimmung
von Alkaloiden.
Ein Nachteil der von mir verwendeten kolorimetrischen Methode
ist natürlich dieser, daß wir den Salzfehler der Alkaloidionen auf die Indi-
katoren nicht kennen. Um diesen Fehler möglichst viel herabzusetzen,
habe ich gewöhnlich mit sehr verdünnten Lösungen gearbeitet und
die Messungen auch beim gleichen Verhältnis Alkaloid zu Alkaloidsalz,
aber bei verschiedenen totalen Konzentrationen wiederholt. Zudem
habe ich, wo möglich, bei der Messung derselben Lösung zwei ver-
schiedene Indikatoren verwendet, von denen der eine einen sauren und
der andere einen alkalischen Charakter hatte. Der Salzfehler einer
Indikatorsäure liegt nämlich in der entgegengesetzten Richtung von
der einer Indikatorbase, so daß wir in dieser Weise die Größe des Salz-
fehlers einigermaßen beurteilen konnten.
Die Berechnung der Dissoziationskonstante geschah in üblicher
Weise wie öfters beschrieben wurde. Wenn die Hydrolyse beträchtlich
war, wurde dafür eine Korrektur angebracht. Die Messungen sind alle
bei Zimmertemperatur, welche um 16° schwankte, ausgeführt. Daher
wurde bei der Berechnung für das lonenprodukt von Wasser ein Wert
von 6,4 . 101° in Rechnung gebracht, entsprechend einem Du o von 14,2.
Aus den Versuchsdaten und den Resultaten der Messungen konnte
leicht abgeleitet werden, welche Indikatoren bei Titrationen von
Alkaloiden am geeignetsten sind. Experimentell wurde dies natürlich
nachgeprüft, wobei auch die Wasserstoffionenkonzentration von reinen
Alkaloidsalzlösungen bestimmt und berechnet wurden. Bei der Be-
urteilung der Reinheit von Alkaloidsalzen ist die Kenntnis dieser Daten
natürlich nötig. Weil man bei vielen Bestimmungen von Alkaloiden
in Drogen die abgeschiedene Base in Weingeist löst und sodann titriert,
so habe ich auch den Einfluß von Alkohol untersucht. Jedoch sind
die Dissoziationskonstanten in Alkohol-Wassermischungen nicht be-
rechnet, weil der Alkohol zwei Einflüsse ausübt, nämlich einen auf
die Konstante des Indikators?) und einen auf die Konstante des
1) L. R. Wagener und W.J. Mc Gill, Journ. Amer. Pharm, Assoc. 14,
288 (1925).
2) Vgl. Kolthoff, Rec. Trav. Chim. 42, 251, 1923; siehe auch
L. Michaelis und M. Mizutani, diese Zeitschr. 147, 7, 1924.
20%
296 J. M. Kolthoff:
Alkaloids. Weil die Alkoholfehler der Indikatoren noch nicht ganz
genau bekannt sind, habe ich von einer approximativen Berechnung
abgesehen. Jedoch geht aus den Untersuchungen so viel hervor, daß
Alkohol die Dissoziationskonstante der Alkaloide stark erniedrigt.
Weil sie alle Stickstoffbasen sind, war dies auch zu erwarten. Bekannt-
lich ist doch die Dissoziation von Ammoniak und alipbatischen Aminen
in Alkohol so gering, daß diese Lösungen Phenolphthalein nicht mehr
röten.
Die Löslichkeitsprodukte wurden in einer besonderen Weise be-
stimmt. Wie schon im Anfang gesagt ist, ist die Löslichkeit der meisten
Alkaloide in Wasser so gering, daß sie nur äußerst schwierig in direkter
Weise genau bestimmt werden kann. Ich bin daher in folgender Weise
vorgegangen: In einer Alkaloidsalzlösung wurden steigende und genau
bekannte Mengen Lauge hinzugefügt, so daß in der Lösung Überschuß an
Alkaloidsalz neben freiem Alkaloid anwesend waren. Diese Mischungen
wurden verschlossen stehengelassen. Nach einem oder mehreren Tagen
wurde beurteilt, in welchen Röhren das Alkaloid sich abgesetzt hatte.
Die Lösung, in der eben keine Fällung mehr aufgetreten war, wurde
dann mit einem Kriställchen aus einer anderen Lösung geimpft und
wieder stehengelassen. Auf diese Weise konnte ich genau ablesen, bei
welcher Zusammensetzung eben noch eine Fällung eintrat. Dann
wurde in der Lösung py bestimmt und aus diesem Wert die ent-
sprechende Hydroxylionenkonzentration berechnet. Weil auch die
Zusammensetzung der Lösung bekannt war, konnte das Löslichkeits-
produkt
L = [A][OH]
sofort berechnet werden.
Jetzt können wir auch die Löslichkeit des Alkaloids in Wasser
berechnen. Ist doch nach Gleichung (2)
L = K[AIkOH] (2)
odei [Alk OH] — Es
[AlIkOH] stellt die Konzentration des ungespaltenen Teiles der
Base in der gesättigten Lösung vor. Wenn man die Dissoziation einer
reinen Alkaloidlösung vernachlässigt, so kann man [AlkOH] gleich der
totalen Konzentration setzen, oder wenn die Vernachlässigung nicht
erlaubt ist, kann man den dissoziierten Teil berechnen und zu [AIkOH]
addieren, und zwar ist ganz allgemein die totale Löslichkeit gleich
[AlkOH] + Y L. Wir sehen also, daß wir die Löslichkeit der schwer
löslichen Alkaloide berechnen können, ohne eine direkte Bestimmung
derselben auszuführen.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 297
Experimenteller Teil.
A. Künstliche Alkaloide.
Pyridin:
a
3. Eine Handelszubereitung wurde fraktioniert und der zwischen 115
und 115,5° übergegangene Teil verwendet. Vom in dieser Weise gereinigten
Präparate wurde eine 0,1 mol. Lösung in Wasser hergestellt. Mischungen
mit 0,1 n Salzsäure von der in der Tabelle angegebenen Zusammensetzung
wurden hergestellt und das py Kolorimetrisch bestimmt. Bei der Berechnung
der Dissoziationskonstante habe ich angenommen, daß der Dissoziationsgrad
a einer 0,05 n Pyridinchloridlösung gleich 0,8 ist, einer 0,025 n Lösung 0,85,
einer 0,02 n Lösung 0,88 und einer 0,01 n Lösung 0,94.
Die Resultate sind in folgender Tabelle zusammengestellt:
zen ee | CI [OH
Zussmmensetzung | Pa Indikator Pop; om x = e om 1
A ae eg eg NR: A ar en _ u A Taaa ee e 2 - as Ce SES
e | D Methylrot 1! | |
2 ¿[+ 1ccm0,1n Hc1'6,2 E 8,0 ¡1,0.10-8 ¡ 1,05. 10-°
-5 | t Bromthymolblau ) | !
Zäit? „ „ „159 | Methylrot 183 An. In" VS. 10-
Scan, n 5,35 1885|14. 10-9 | 1,20 . 10-°
2 148,» n p 49 9,33 50.1010; 160,10-%
Im Mittel 1,25 , 10°
Im Mittel finden wir fiir die Dissoziationskonstante von Pyridin bei
15° einen Wert von 1,25. 10—9, entsprechend einem pr = 8,90. V.H.
Veley!) fand in guter Übereinstimmung hiermit bei derselben Temperatur
eine Konstante von 1,06. 10-°. Andere in der Literatur angegebene Werte
sind bei 18%: 1,6. 10-° [Lunden?)]; bei 25% 2,4. 10-9 [Goldschmidt und
Salcher?)] und 3.0 . 10-9 [Constam und White *)].
CH,
Hu" "CH.
Piperidin: |
H,C Ey “H,
N
Im Anschluß an das Pyridin sei erwähnt, daß Brediq?) die Konstante
des Piperidins aus Leitfáhigkeitsmessungen abgeleitet hat. Er fand bei 25°
einen Wert für K = 1,6. 10-3, entsprechend pp = 2,80. Piperidin, das
ein sekundäres Amin ist, verhält sich der Erwartung nach wie eine ziemlich
starke Base. Weil in diesem Falle die von Bredig verwendete Methode
genauer ist als die kolorimetrische, übernehme ich den von ıhm an-
gegebenen Wert.
1) V. H. Veley, Journ. Chem. Soc. 93, 652, 1908.
2) Lunden, Journ. Chim. Phys. 5, 574, 1907.
3) Goldschmidt und Salcher, Zeitschr. f. physik. Chem. 29, 89, 1899.
1) Constam und White, Amer. Chem. Journ. 29, 36, 1903.
$) Bredig, Zeitschr. f. physik. Cherm. 13, 191, 1894.
to
©
Y
J. M. Kolthoff:
Pyrrol: | |.
SS
N
NH
Ich stellte eine etwa 0,02 mol. Lösung in Wasser her von einer Zu-
bereitung von Kahlbaum. Diese Lösung band keine Spur Salzsäure, was
man aus dem Verhalten von sehr wenig säureempfindlichen Indikatoren
wie Tropäolin 00 und Thymolblau ableiten konnte!). Dieses Verhalten
ist wohl sehr eigenartig und unerwartet, weil das Pyrrol seiner Formel
nach wie ein sekundáres Amin zu betrachten ist. Zwar löst das Pyrrol
sich in Säuren, aber nur sehr langsam, bildet dabei jedoch polymere Pro-
dukte, welche mit Ammoniak abgeschieden werden kónnen?). Auch aus
dem kristallinischen Salz mit Ferrocyanwasserstoffsäure wird mit Alkalı
nicht das Pyrrol zurückgewonnen?).
Offenbar sind also die von Pyrrol abgeleiteten Alkaloide, wie Hygrin,
Nicotin, Atropin, Cocain, nicht von demselben, sondern von einem Polymer
des Pyrrols aufgebaut. Nach R. Wolffenstein?) hat die NH-Gruppe des
Pyrrols schwach sauren Charakter, das Wasserstoffatom läßt sich nach
ihm durch die Alkalien ersetzen unter Bildung von kristallinischen Salzen.
Jedoch ist es mir nicht gelungen, auch bei Verwendung von den sehr wenig
alkaliempfindlichen Indikatoren Tropäolin 0 und Nitramin, eine saure
Funktion des Pyrrols nachzuweisen. Offenbar sind die von Wolffenstein
genannten Salze also auch von einem Polymer abgeleitet.
ASS
Chinolin: ,
wg E
N
Ein frisch bereitetes Laboratoriumspräparat wurde fraktioniert, und
der bei 237° übergehende Teil verwendet. Weil das Chinolin schwer
löslich ist, so habe ich die Versuche mit einer 0,01 mol. Lösung in Leit-
fähigkeitswasser ausgeführt. Bei der Berechnung ist eine vollständige
Dissoziation des Salzes, das in sehr großer Verdünnung vorlag, angenommen.
Dissoziationskonstante von Chinolin bei 15°.
: tae der Lösung Ip Indikator Bi POH | [OH] K i 1019
(+ jeet 001n HC] 565| Methylrot | 8,55 | 2,8.10-° 3.1
eaf g , ECH i 885 | 14.10 | 35
| Fo a n n l 4,8 p 9,4 4,0. 10710 4,0
2148 „ A » 1,39 | Methylorange | 10,3 "BD. III 2,0
Im Mittel K = 32. 10-10
Im Mittel finden wir also einen Wert bei 15° von 3,2. 10-10, ent-
sprechend einem px von 9,50. Mit einer anderen Zubereitung wurde für
K ein Wert von 3,1. 10-10 gefunden.
1) Vgl. auch N. Schoorl, Organische Analyse I, 2. Aufl., S. 83, 1920.
2) V. Meyer und P. Jacobson, Lehrb. d. organ. Chem., III. Teil,
S. 156, 1920.
3) R. Woljjenstein. Pflanzenalkaloide, 3. Aufl., S. 105, 1922.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 299
Eigenartig genug stimmt meine Angabe gar nicht mit denen in der
Literatur angegebenen überein. So fand Veley!) bei 15° einen Wert von
1,63. 10-9, während Bredig®) bei 25° K = 1,0. 10-9 fand und Walker
und Aston?) bei 60% 7,4. 10-9. Der von mir gefundene Wert stimmt besser
überein mit dem von Veley für das Isochinolin gefundenen, nämlich von
3,62 . 10-10 bei 15°. Ich habe daher auch die Dissoziationskonstante von
Isochinolin bestimmt.
Isochinolin. Eine Zubereitung war mir freundlichst von Herrn Prof.
Boeseken aus der Sammlung vom organisch-chemischen Laboratorium der
Technischen Hochschule Delft zur Verfügung gestellt. Die gelblich ge-
färbte Flüssigkeit wurde bei einigen Millimetern Druck bei 120° fraktioniert;
das Destillat war farblos. Vom so erhaltenen Präparate wurde eine 0,01 mol.
Lösung hergestellt. Die Messungen sind bei 20° ausgeführt. Für op.
ist ein Wert von 14,1 angenommen.
Dissoziationskonstante von Isochinolin.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | Don | [OH’]
|
|
+ lcem 0,01n HCl ‚6,0 Methylrot 81 8.
+2 „ a ” (BN 84 4
| 5, 7 |Bromkresolblau ] i i
+5, ` H 52 8,95 | 1,15.
‚5,15 Methy Irot 8,9 |1,26.
+8, > e Los E 955 |28 .
ethylorange >
see as 9,85 14 .
| 4,18 'Bromkresolblau, 9, 92 11,2 .
l
Im Mittel K = 1,1. 107?
pk = 8,9
Aus diesen Resultaten sehen wir, daß der von mir gefundene Wert
für die Dissoziationskonstante von Isochinolin übereinstimmt mit denen,
welche im Schrifttum für dieselbe von Chinolin angegeben sind (Veley
1,6. 10-9; Bredig 1,0 . 10—9). Ich nehme daher an, daß diese Autoren mit
Isochinolin statt mit Chinolin gearbeitet haben.
10 ccm 0,01 mol.
H, H,
: TE SÉ NN
Piperazin: HN f JN H.
C—C
H, H,
Das Ausgangsmaterial war eine Zubereitung von Schering, welche aus
schönen, farblosen Kristallen bestand. Im Schrifttum steht angegeben,
daß dieselben wasserfrei sind; in Widerspruch damit fand ich, daß sie
6 Mole Kristallwasser enthielten. Man kann das Wasser nicht in direkter
Weise bestimmen, weil sich beim Trocknen, auch bei Zimmertemperatur über
Schwefelsäure das Piperazin verflüchtigt. Ich berechnete daher den Wasser-
gehalt aus den Titrationswerten mit Salzsäure auf Dimethylgelb (Titrier-
exponent 3,8, vgl. unten), wo beide Stickstoffgruppen neutralisiert sind.
1) Veley, Journ. Chem. Soc. 98, 652, 1908.
2) Bredig, Zeitschr. f. phys. Chem. 18, 191, 1894.
3) Walker und Aston, Journ. Chem. Soc. 6%, 576, 1895.
300 J. M. Kolthofi:
Ich habe versucht, mit dem ursprünglichen Präparat die beiden Disso-
ziationskonstanten zu bestimmen. Obgleich vier Reihen Messungen aus-
geführt sind, wurden keine konstante Werte gefunden. Im Mittel war
K, = 10-*und K, = 4. 10-9. Zur Erhaltung von zuverlässigen Resultaten
habe ich das Salz mit 1 und 2 Molekülen Salzsäure bereitet und beide
durch Rekristallisation aus Alkohol-Wassermischungen zu reinigen versucht.
Es ergab sich, daß das Monosalz, das mit einer Alkohol-Äthermischung
ausgewaschen wurde, immer freie Base enthielt und daher zu stark alkalisch
reagierte, das Bisalz dahingegen konnte rein erhalten werden und hatte
die Formel C,¿H,,N,2 HCl. Ich bereitete eine Lösung, die 0,09 mol. war,
in bezug auf Chlorid also 0,18n. Bei den Berechnungen habe ich an-
genommen, daß das Bi- und Monosalz beide denselben Dissoziationsgrad
haben.
Zweite Dissoziationskonstante von Piperazin.
ee der SE ' Pa| | Indikator | POH li ée _ q Ko ‚108 |
2 (+9 com00lnyx 505 Methylrot ` E 71.100 64
253 +18 „ , EE? e 8,85 | 1,4. 10° 5.6
=22l+45 „ Oln Je 5,9 | = | 8,3 ¡ 5,0. 107° 5,0
Im A Mittel 5 Jo»
Wenn wir annehmen, daß das Verhältnis zwischen dem Dissoziations-
grad des Bi- und Monosalzes gleich 0,8 ist, so finden wir im Mittel einen Wert
für K, = 4,6. 10-9, entsprechend einem px, = 8,34.
In folgender Tabelle sind die Werte für die erste Dissoziationskonstante
des Piperazins zusammengestellt.
Erste Dissoziationskonstante des Piperazins.
> Zusammensetzung der Lösung el PH Pal Indikator | POH | [OH] | K l 105
= => | a a eu nn = et
BEL) | | ' Phenolpbthalein | er ms
SEE [+ cc OIM] E (ai È, wt In "rier T2
225\+108 „ 2 | 9,6 | Phenolphthalein | 4,6 | 2,5.10-° ¡ 10
e lyiss 7 2 JZ 1025 | Thymolphthalein. sch 11.104 | 1
Im Mittel K, = o 10->
Im Mittel finden wir bei 15° für X, einen Wert von 9 . 10-5, entsprechend
einem ?x, von 4,05. Dieser Wert ist in befriedigender Übereinstimmung
mit dem von Bredig*) nach der Leitfähigkeitsmethode abgeleiteten. Er
fand bei 25° K, = 6,4. 10-5; K, wurde nicht von ihm bestimmt.
Wie zu erwarten war, ist die zweite Konstante von Piperazin viel
geringer als die erste, weil das Ion, das sich nach Neutralisation der stärksten
Gruppe bildet, die Dissoziation der zweiten Gruppe verhindert. Das
Piperazin ist in dieser Hinsicht mit dem Hydrazin vergleichbar. Die erste
Konstante des Hydrazins ist 3. 10-6, während die zweite nach meinen
Berechnungen etwa 3.10-13 ist. Weil im Hydrazin die zwei basischen
Gruppen nebeneinander stehen, ist der Einfluß der ersten ionisierten
Form natürlich viel größer auf die Dissoziation der zweiten als im Piperazin,
wo sie paraständıg stehen.
1) Bredig, Zeitschr. f. physik. Chem. 13, 191, 1894.
Dissoziationskonstante, Lóslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 301
Analytisch sind die gefundenen Konstanten auch von Bedeutung, weil
wir jetzt imstande sind, zu berechnen, zu welchem Titrierexponent wir
gehen müssen bei der Bestimmung des Piperazins. Wenn wir es wie eine
einsäurige Base bestimmen wollen, so ist pg nach Neutralisation der ersten
basischen Gruppe!)
Pk, © Pr 4,05 + 834 _
dd
In der Tat bestimmte ich das pp, nachdem die Hälfte der Base neutrali-
siert war, auf 7,9; also eine gute Übereinstimmung. Für eine genaue Ti-
tration des Piperazins als einsäurige Base ist Phenolrot, Kresolrot oder
a-Naphtholblau als Indikator zu verwenden, und hat man zu pr = 7,9 — 8,0
zu titrieren [über die Genauigkeit bzw. Titrierfehler vgl. Kolthoff*)).
Wenn man Piperazin wie eine zweisäurige Base bestimmen will, so ist
der Umschlag in verdünnter Lösung auf keinen Indikator scharf. Die besten
Resultate erhielt man bei Verwendung von Dimethylgelb oder einem anderen
Indikator mit demselben Umwandlungsintervall, wobei man die richtige
Vergleichslösung benutzt [pr ist einfach aus K, und der Konzentration
zu berechnen?*)]. Wenn man eine 0,5 bis In Lösung der Base benutzt, so
ist der Umschlag scharf auf Tropäolin 00 oder Phenolblau wahrzunehmen ?).
Bevor wir zu den eigentlichen Alkaloiden übergehen, seien noch zwei
Substanzen genannt, welche viele Reaktionen mit den Alkaloiden gemeinsam
haben, nämlich p-Aminobenzoesäureäthylester (Anästhesin) und p-Amino-
benzoesäurediäthylaminoäthylester (Novocain ist das Salzsáuresalz).
NH,
Anästhesin: C¿H,
.NC00C,H,
Dieser Stoff ist in Wasser schwer löslich; daher habe ich eine 0,025 mol.
Lösung in 0,025 n Salzsäure durch Erwärmen hergestellt. Nach dem Ab-
kühlen und Anfüllen wurde schnell gearbeitet, weil das Anästhesin bei
längerem Stehenlassen wieder für einen Teil auskristallisiert. Die Lösung
des Chlorids ist stark hydrolytisch gespalten, bei der Berechnung der
Dissoziationskonstante aus der Hydroxylionenkonzentration von Mischungen
des Chlorids mit Lauge haben wir auch eine Korrektur für die Hydrolyse
angebracht.
Dissoziationskonstante des Anästhesins.
_ Zusammensetzung der Lösung D Pu d Indikator E Don sch om u K 1012
e SS [+ 95 cem 01n) z = 2,15 Tropa 00 | 1205! 9.107 63
FEST „ p YO 235 e 11.85, Lé Su
as8l425 > ”? f2 31 ! I1 8.109 78
Im Mittel K = = -6. 10-12
Beim Zusatz von Lauge zu der Chloridlösung wurde das Anásthesin
ausgefállt. Die Mischung wurde daher aufgewármt, bis die Kristalle gelöst
waren, abgekühlt und schnell gemessen. Die Resultate sind nicht so genau
wie bei den anderen Bestimmungen. lm Mittel finden wir eine Konstante
1) J. M. Kolthoff, Der Gebrauch von Farbenindikatoren, 2. Aufl., 1923.
2) Derselbe, Zeitschr. f. anorg. allgem. Chem. 115, 175, 1921.
32 J. M. Kolthoff:
von 6. 10-12, entsprechend pp = 11,22. Die Konstante ist etwa 50mal
kleiner als die des Anilins, die paraständige COOC,H,-Gruppe wirkt daher
der Dissoziation der N H,-Gruppe entgegen.
Wegen der geringen Dissoziationskonstante und der schlechten Löslich-
keit ist Anästhesin als Base nicht mehr genau titrierbar.
NH,
Novocain: C¿H, e
"COOCH,—CH;3N (C,H,), HCl.
Diese Substanz ist cin tertiáres Amin und zudem ein aromatisches
Amin, daher ist zu erwarten, daß sie zwei Dissoziationskonstanten hat.
Von einem reinen Präparat wurde eine 0,05 mol. Lösung hergestellt.
20 ccm dieser Lösung nahmen auf Phenolphthalein nur etwa 2ccm 0,1 n
Lauge (vager Umschlag). Nach Zusatz von Chloroform!) und bei starkem
Umschütteln wurden im ganzen 20,0ccm 0,1nLauge gebunden. Ich
titrierte bis zur erst wahrnehmbaren Rosafärbung. Die erste Konstante
der Base wurde berechnet aus der Hydroxylionenkonzentration in
Mischungen von Novocain mit Lauge, die zweite aus der in Mischungen
mit Salzsäure.
Erste Dissoziationskonstante von Novocain.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | Don Zë 10H] E A K, . 106
18,1 Phenolrot 5 e
„23 [+ 0,5 ccm 0,01 n e en Kresolrot 6L | 8.107 72
Ek ©: EN 9,05! Phenolphthalcin ae, A Š
"SS +25 „ A E 9005 Thymolblau 5,15 | 7,1.10 | 1,1
+4 „ = 9,65: Phenolphthalein 4,55 | 2,8. 1075 | 7.0
Im Mittel K, = = 7,1 . 1076
Im Mittel finden wir einen Wert für K, = 7,1. 10-6, entsprechend
pr, = 5,15. Ohne Zweifel ist dies die Konstante der tertiáren Amingruppe,
deren Basenstärke hier um etwa zweimal kleiner ist als die von Ammoniak.
Zweite Dissoziationskonstante von Novocain.
Zusammensetzung der Lösung PH Indikator | Don ` [OHM] Ka .101°
e (+0,5cem "34 Methylorarge | 10,8 16.10 | 1,8
E: 3 | +25 | Oln 246 Thymolblau | 11,74 | 18.102 | 19
SEA Së | HCI 252 Tropäolin 00 | 11,68 2,1. 10-12 |
TSZ t4 po 22 Thymolblau | 12,0 1.107132 1.8
Im Mittel K, = 1,8. 10-13
Bei der Berechnung ist im letzten Falle die Hydrolyse auch in Betracht
genommen, sonst würde ein viel zu hoher Wert gefunden sein. Im Mittel
finden wir einen Wert für X, = 1,8. 10-12, entsprechend einem pp, = 11,75.
Aus px, und px, läßt sich für eine Novocainlósung ein Wasserstoff-
exponent von 5,75 bis 15% berechnen. In einer Zubereitung von Meister,
Lucius u. Brüning fand ich in einer 0,05 mol. Lösung ein py von 5,95.
1) Niederländische Pharmacopoea Ed. 4, 252.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 303
Aus dem obenstehenden läßt sich ableiten, daß die freie Base des
Novocains sich auf Methylrot bis pr = 5,75 titrieren läßt. Nur die tertiäre
Amingruppe wird neutralisiert: die zweite basische Gruppe ist so schwach,
daß sie acidimetrisch nicht bestimmt werden kann.
B. Die natürlichen Alkaloide.
CH,
HA NCH
Coniin: | — «a-Propylpiperidin.
H d go H—CH,—CBH,CH,
NH
Als Ausgangsmaterial diente Coniinhydrobromid von Merck, von
dem ich nur so wenig hatte, daß es nicht einer besonderen Reinigung untere
worfen werden konnte. Die 0,05 mol. Lösung änderte die Reaktion des
Lösungswassers nicht; eine Hydrolyse des Salzes konnte also nicht wahr-
genommen werden. Das ist in Übereinstimmung mit dem Verhalten des
Coniins wie eine ziemlich starke Base. Die Dissoziationskonstante wurde
berechnet aus der Hydroxylionenkonzentration in Mischungen von Hydro-
bromid mit Lauge. Der Wasserstoffexponent wurde in denselben kolori-
metrisch nach zwei Methoden bestimmt, und zwar in der gewöhnlichen
Weise mit Puffermischungen, und in stärker alkalischen Lösungen mit
Salicylgelb G als Indikator nach der Methode von L. Michaelis und
A.Gyemant!).
Dissoziationskonstante des Coniins.
_ Zusammensetzung der an | Pa | 8 Indikator Ton y om | x.
2. (+1 cem 9,9 | Thymolphthalein | 43 | 5.1075 | 12
SESEJ+25 „ 0,01n 110,2 | e | 4,0 1.104 | 9
¿232145 „ [NaOH 10, 45i S | 3,75 | 18.1074 | 7,2
Soal 10 Ir | 3,2 164.104 | 96
Im Mittel K = 9,5. 10-4
Mit Salicylgelb G.
ne Zusammensetzung der Lösung | PH a e | RE
+ 25ccm 0,01n NaOH 9,0
5 ccm 0,05 mol. J+ 5 $ r 2 19
Coniinbromid \+15 „ a R | 11,10 3 10 | 80.10 | 53
+20 , $ 5 ‚11,60 2,60 25. 10-3 | 6,2
Im Mittel X = 1,5. 10-4
Im ganzen können wir ein Mittel annehmen von K = 8 (+ 1). 10-4,
entsprechend py = 3,1. In der Literatur habe ich keine Angaben über die
Konstante des Coniins gefunden. Wie zu erwarten war, verhält das Coniin
sich wie eine ziemlich starke Base und ist in dieser Hinsicht vergleichbar
mit seiner Stammbase, dem Piperidin, das eine Konstante von 1,6. 10-3
hat. Im Gegensatz zu den meisten anderen Alkaloiden ist Coniin auf alle
gebräuchlichen Indikatoren titrierbar, sogar auf Phenolphthalein erhält
man eben noch richtige Resultate. 'Thymolphthalein dart dahingegen nicht
mehr verwendet werden.
1) L. Michaelis und A. Gyemant, diese Zeitschr. 109, 165, 1920.
304 J. M. Kolthoff:
' ; | DAN N
Piperin: HA: |
ER CH=CH-—C H=CH-(0
Das Piperin ist ein Ester von Piperidin und Piperinsáure, es ist also
keine Base mehr. Bei meinen Versuchen verwendete ich eine Zubereitung
von Kahlbaum, welche zweimal aus Alkohol umkristallisiert wurde. der
Schmelzpunkt war 128,5°. Die Löslichkeit der Substanz in Wasser ist
sehr gering, die Reaktion des Wassers wird dabei nicht geändert. Mit Farb-
indikatoren konnte auch in Mischungen von Piperidin mit Salzsäure keine
basische Funktion nachgewiesen werden. Mittels Löslichkeitsversuchen
konnte jedoch gezeigt werden, daß die Substanz eine schwach basische
Funktion hat. Während die Löslichkeit des Piperins in Wasser nach meinen
Versuchen bei 18° einer Konzentration von 1,4. 10-# mol. entspricht
(40 mg im Liter), ist sie in 0,1 n Salzsäure 1,4 . 10-3 mol. (400 mg im Liter).
Hieraus läßt sich berechnen, daß die Dissoziationskonstante des Piperins
als Base etwa 6. 10-13, entsprechend pp = 12,22 ist.
Das Piperin hat praktisch also keine basische Funktion. Ich bemerke
noch, daß F. Arnall*) nach ganz anderer Methode bei 55° einen Wert fand von
3,2 . 10-13,
CH
HEC Scc ooCH,
Arecolin: | |
H, C".
N
Fr. Müller (l. c.) hat neulich die Konstante dieser Base berechnet
aus seinen Messungen mit der Wasserstoffelektrode. Bei 17,5° fand er
Ks = 1,5. 10-7, entsprechend px = 6,84. Ich hatte die Base nicht zur
Verfügung, so daß ich Müllers Wert übernehme. Bei der Titration von
Arecolin muß man einen alkaliempfindlichen Indikator verwenden;
Methvlrot ist noch zu säureempfindlich. Indikatoren, wie Methylorange,
Dimethylgelb, Bromphenylblau müssen jedoch gute Werte liefern.
CH,
H.C E H,
Y
Hu CH,
Nicotin: | NCH ;
d NL. 3
g N
Ich bin ausgegangen von einer Zubereitung von Merck, von der eıne
0,05 mol. Lösung in Wasser hergestellt wurde. 25 ccm dieser Lösung nahmen
auf Methylrot bis pr = 5,75 (vgl. unten): 12,40 bzw. 12,42 cem 0,1 n Salz-
säure. Ganz rein war die Lösung also nicht: dies ergab sich auch aus der
Hvdroxvlionenkonzentration derselben. Nach Messungen auf Thymol-
phthalein als Indikator fand ich ein pg von 10,2, entsprechend einer
1) F. Arnall, Journ. Chem. Soc. 117, 835, 1920.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 305
Hydroxylionenkonzentration von 10-%. Hieraus berechnen wir eine
Dissoziationskonstante von 2.10-7, während wir nach untenstehender
Tabelle im Mittel einen Wert von 7 . 10-7 fanden. Wie wir schon besprochen
haben, hat eine geringe Verunreinigung nur einen unbedeutenden Einfluß
auf das Resultat unserer Messungen.
Erste Dissoziationskonstante von Nicotin bei 15°.
E usammensetzung der der Lösung e | PE De | Indikator | PoH IOR HI | Kw
ap + 125ccm 8,95, Phenolphthalein 5,25 | 5,7. 107 Se d 6,5
3 25) EN 6, 2: 22 0,1n || 8,1 | Kresolrot 6,1 8 . 1077 | 8
Kë HCl ||(7,05 Phenolrot u
E +1115 „ (Tos Bromthymolblau ) 7,15 | 7,1.10 6,4
Im Mittel K, = 7.10-7
Im Mittel finden wir eine erste Dissoziationskonstante bei 15° von
7.10—7 entsprechend einem px, = 6,16. Weil das Pyridin eine sehr
schwache Base ist, so können wir annehmen, daß diese Konstante der
Pyrrolidingruppe gehört.
Zweite Dissoziationskonstante von Nicotin.
Zusammensetzung < der r Lösung Y Pu | Indikator d PoH | | (OH | K.1011
Pé Methylorange 99 |1 E 10-19,
4,25 Bromphenolbl. 9.95 1,13. 10-10 )
et zen Oln
M
+ 18,6 e [HE 3,25, Methylorange 10,85 14 jul 14
+236 > | 240, Tropáolin00 | 11,80 |1,6 ml 14
Im Mittel K, — 1,4. 10-11
1,35
25 com
0,05 mol.
Nicotin
Bei der Berechnung haben wir angenommen, daß das Bi- und Monosalz
beide denselben Dissoziationsgrad haben. Dies ist nicht ganz richtig,
wahrscheinlich ist das Verhältnis der Aktivitäten ungefähr 0,8. Mit dieser
Annahme finden wir K, = 1,1. 10-10, entsprechend px, = 10,96. Aus
dem Werte der beiden Konstanten können wir ableiten, daß Nicotin nur
als monosäurige Base genau titrierbar sein wird, und zwar läßt sich be-
rechnen, daß das py einer Lösung des Monosalzes gleich 5,75 sein wird.
In dieser Weise ist Nicotin also auf Methylrot bis zum angegebenen py
titrierbar. |
H H,
Eugen A CH,OH
| H |
Atropin H.C CO OC—CH
Ä
Heel. ci GH.
H H,
Das Atropin ist ein Tropanderivat, das mit der Tropasäure verestert
ist. Es ist eine tertiäre Base, so daß zu erwarten ist, daß es eine ziemlich
stark basische Funktion haben wird. Weil das Atropin ziemlich gut in
Wasser löslich ist, habe ich zuerst Versuche gemacht mit der freien Base,
von der ich in verschiedenen Konzentrationen die Leitfähigkeit und das pp
bestimmt habe. Es ergab sich jedoch, daß die wässerige Lösung sehr un-
306 J.M. Kolthoff:
beständig ist; die Leitfähigkeit und die Hydroxylionenkonzentrationen
nahmen beim Stehen stark ab. Es findet also eine Verseifung statt zu
Tropin und Tropasäure, und es wird tropinsaures Tropin gebildet!). Das
pg einer 0,0015 mol. Atropinlósung war nach einer Woche von 10,0 in 8,0
geändert. (vgl. auch Fr. Müller, 1. c.). In Übereinstimmung mit dem Oben-
stehenden fand ich, daß die Löslichkeit des Atropins beim längeren Schütteln
mit dem Bodenkörper fortwährend zunimmt. Nach ein- bis zweistündigem
Schütteln bei 18° fand ich konstante Werte. Die Flüssigkeit wurde filtriert
und 25 ccm mit 0,01 n Salzsäure auf Methylrot bis pr = 5,2 titriert. In
dieser Weise fand ich eine Löslichkeit von 5,5 .. 10-3 mol., entsprechend
einer Konzentration von 1,59 g im Liter oder 1: 625. Nach Angabe von
Schmidt!) beträgt sie im kalten Wasser 1: 600. Zur Ermittlung der Disso-
ziationskonstante habe ich die Wasserstoffionenkonzentration bestimmt: in
frisch hergestellten Mischungen von Atropinchlorid mit Natron. Dabei
wurde ausgegangen von Atropinchlorid von Merck von der Zusammen-
setzung C,,H,NO,HCI. 10ccm einer 0,05 mol. Lösung nahmen nach
Volhard titriert 4,97 ccm 0,1 n Silbernitrat; auf Phenolphthalein mit Lauge
titriert bei Anwesenheit von Chloroform 4,9 ccm 0,1n NaOH.
In Mischungen von 0,01 mol. Atropinchlorid mit 0,01n NaOH wurde
py in üblicher Weise bestimmt. Natürlich wurde sofort nach dem Zusatz
von Lauge gemessen.
Dissoziationskonstante von Atropin.
Zusammensetzung der Lösung | PH: Indikator | ron | | om ME E. 105
_ a Egg BEN EE A — _ u ne
{8 H Thymolblau | Ta
ZA -6 z
EEE [+ 0,5 ccm | 0,01n | 8, o Phenolphthalein 5,3 5 „10 1
E EAE i
S st 23: y ¡Se OH, | 9. 9, Thymolphthalein 4,3 | 5 .10- | | 5
SEA ` 104 y 3,8 ' Lë jg: 4
Im Mittel K — 4,5. 10-5
Im Mittel finden wir also einen Wert für die Dissoziationskonstante
von 4,5. 10-5, entsprechend einem py von 4,35.
Fr. Müller (l. c.) fand einen Wert von 10. 10-35; ich bin jedoch nicht
überzeugt, ob seine Messungen mit der Wasserstoffelektrode ganz zuverlässig
sind. Die von Weise und Levy?) bestimmte Konstante von 1,7. 10-12
muß ganz fehlerhaft sein. Ich unterstelle, daß sie mit einer alten Atropin-
lösung gearbeitet haben, in der alles Atropin zersetzt war. Aus der bekannten
Dissoziationskonstante und Löslichkeit läßt sich berechnen, daß das
Löslichkeitsprodukt von Atropin etwa 2,5. 10-7 bei 18° ist. Viel praktische
Bedeutung hat dieser Wert nicht, weil das Atropin sich nur langsam aus
übersättigter Lösung abscheidet, so daß ein großer Teil zersetzt werden
kann. Impfen wird wahrscheinlich nötig sein. Aus der Dissoziations-
konstante kann man ableiten, daß die Hydrolyse von Atropinsalzen nur
gering ist. Nach Berechnung ist das py einer 0,05 mol. Atropinchloridlösung
bei 16% 5,68, während ich einen Wert von 5,8 auf Methylrot bestimmte.
Im Schrifttum findet man über die Reaktion von Atropinsalzen falsche
1) E. Schmidt, Lehrb. d. pharm. Chem.
2) Weise und Levy, Journ. Chim. et de Phys. 14, 261, 1916.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 307
Angaben. So berichtet J. M. Mc GT, daß das py in einer 0,1 bis 0,002 n
Atropinsalzlósung schwankt zwischen 3,8 und 3,84! Masucci und Moffat ?)
bestimmten das pg von Handelszubereitungen und fanden in: Atropinsulfat
1:20 eine Schwankung zwischen pg = 4,39 bis 6,67. Hieraus ergibt sich,
daß sie zu saure und zu alkalische Präparate gehabt haben. Weingeist
hat wenig Einfluß auf die Farbe des Indikators, die Hydrolyse nimmt zu.
Eine Mischung von cem 0,05 mol. Atropinchlorid und 5ccm 96proz.
Alkohol hatte eine Farbe auf Methylrot, welche einem py von 5,2 in Wasser
entsprach. Durch Zusatz von 0,25ccm 0,01nNaOH ist die Reaktion
ganz alkalisch auf den Indikator, während in wässeriger Lösung 0,1 ccm
0,01n NaOH schon genügt. Auf Bromphenylblau ist die Reaktion sowohl
in wässeriger wie in 50proz. alkoholischer Lösung alkalisch. In letzterer
Lösung ist der Umschlag auf den letztgenannten Indikator scharf. Eine
Mischung von 5ccm 0,05 mol. Atropinchlorid und 5 ccm Weingeist wird
von Bromphenolblau blau gefärbt; nach Zusatz von 0,l cem 0,01 n Salz-
säure ist die Farbe grün, von 0,02ccm Säure gelb. Für die Titration in
wässeriger Lösung ist Methylrot der geeignetste Indikator, für alkoholische
Lösungen von Atropin ist Bromphenolblau vorzuziehen.
H, H H,
esse isn
Tropacocain: | H,CEN< »CHO—C0-—C,H,
Ge A 015
H, H,
Benzoylpseudotropin.
Dieses Alkaloid gehört seinem Vorkommen nach zu den Cocabasen,
seiner chemischen Konstitution nach ist es aber ein typisches Tropaalkaloid.
Bei meinen Versuchen verwendete ich Tropacocainchlorid, eine
Zubereitung von der ,,Nederlandsche Cocainefabriek‘‘ von der Formel
CG,H„NOCH,OHCI. 20 ccm einer 0,1 mol. Lösung nahmen bei Anwesen-
heit von Chloroform 20,0ccm 0,l n Natron auf Phenolphthalein. In
Mischungen von 0,01 mol. Tropacocainchlorid und 0,01l n Natron wurde
Pa wieder kolorimetrisch bestimmt. Die erhaltenen Werte mit Phenol-
phthalein als Indikator sind nicht zuverlässig und sind daher zwischen
Klammern gesetzt; nach Zusatz dieses Indikators trat nämlich eine
Fällung ein.
Dissoziationskonstante von Tropacocain.
Zusammensetzung der Lösung ` Du I Indikator | Pon | [OH’)] K .105
[i ' |
. N 8.6 | Kresolrot | 5,6 | | |
S + 0,5 cem | 8,55: Thymolblau : 5,65 ] 2,3.10°° | 2,1
Es (8,3 | Phenolphthalein) ` | |
es E +1 0,01n || 8,85 Thymolblau | 9,35 | 45,10-8 | 1,8
= ck ” (NaOH! (8,6 | Phenolphthalein) | |
S SSI+25 , | 9,5| Thymolblau | 4,7 | 20.10-5| 20
GC SS 10,0 he i 4,2 | DA 1079 | 1,6
e n || (farbl. auf Tymolphthalein!)' | |
Im Mittel K = 1,9 . 10-5
1) J. M. Mc Gill, Journ. Amer. Chem. Soc. 44, 2156, 1922.
2) Masucci und Moffat, Journ. Amer. Pharm.Assoc. 12, 609, 1923.
308 J. M. Kolthoff:
Im Mittel finden wir einen Wert von K = 1,9. 10-35, entsprechend
pr = 4,32. Die Konstante ist also von derselben Größenordnung wie von
Atropin. |
Auch habe ich das Löslichkeitsprodukt des Tropacocains bestimmt
(vgl. bei Cocain). Eine Mischung von 5 ccm 0,1 mol. Tropacocainchlorid mit
2ccm 0,055 mol. Natron gab nach einem Tage Stehen noch eben einen
Niederschlag von Tropacocain; mit weniger Lauge trat keine Fällung mehr
ein. Das py der obenstehenden Lösung war nach einem Tage 8,4, ent-
sprechend einem pop = 5,8 und einer [OH’] = 1,6. 10-6. Aus der Zu-
sammensetzung der Lösung und der Hydroxylionenkonzentration berechnete
ich ein Löslichkeitsprodukt von 8. 10-3. Hieraus und aus der Dissoziations-
konstante finden wir, daß eine gesättigte wässerige Tropacocainlösung bei
15° eine Konzentration hat von 4,3. 10-3 mol. (vgl. bei Cocain).
Ein Salz des Tropacocains reagiert wegen der Hydrolyse schwach sauer.
Für eine 0,1 mol. Chloridlösung berechnen wir ein pg von 6,0, während ich
auf Methylrot einen Wert von 5,8 fand. Über die Titrierbarkeit der freien
Base auf Methylrot und Bromphenolblau gilt dasselbe wie bei Atropin.
H. H H,
Us. len
Pseudotropin: | H,UN<S ¿CHOH.
C. ll!
H, H H,
Das Pseudotropin ist stereoisomer mit dem Tropin. Ich erhielt die
freie Base von der „Nederlandsche Cocainefabriek“. Eine 0,05 mol. Lösung
reagiert auf Nitramin sogar schwach alkalisch, sie hatte ein py von 11,5,
entsprechend einer Hydroxylionenkonzentration von 0,002 n.
Auch bei der Titration ergab sich, daß die Substanz eine ziemlich
starke Base ist, weil das Trajekt zwischen Phenolphthalein und Methylrot
nur gering war. 20 ccm meiner Stammlösung nahmen 9,50 cem 0,1 n Salz-
säure auf Phenolphthalein und 9,75 ccm auf Methylrot.
Dissoziationskonstante des Pseudotropins.
Zusammensetzung der Lösung j PH Indikator | POH | [O0H'] | K . 104
tee EE Ee ==> SR mr
SE 4,9 cem 0,01n H(1'11,25, Salievlgelb | 2,95 | 1,13. 107? | 1,25
35334243 Din „ 110,40 ñ | 3,80 | 1,6 .10-%. Lë
ES 443, , , 196] Thymolblau | 46 |25 Jon 20
Im Mittel K = Lë. IO
Im Mittel finden wir also eine Konstante von 1,6. 10—4, entsprechend
einem ?x = 3,80. Die Werte waren ziemlich schwankend, was wahrschein-
lich einer Verunreinigung des Pseudotropins zugeschrieben werden muß.
In Übereinstimmung hiermit berechnete ich einen zu niedrigen Wert der
Konstante aus der Hydroxvlionenkonzentration bzw. Leitfähigkeit der
wässerigen Lösung der Base. Ich fand nämlich K = 8. 10-5 bzw. 7. 10-35.
Veley!) leitete aus zwei Messungen einen Wert ab zwischen 0,84 bis
1,9. 10-9, also viel zu niedrig. Beim Vergleichen der Konstanten von
. Atropin, Tropacocain und Pseudotropin finden wir, daß letztere Base die
1) Veley, Journ. Chem. Soc. 95, 1. 1909.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 309
größte Konstante hat. Die Esterbildung bei Atropin oder Tropacocain
schwächt also die basische Funktion ab.
H
H, H ‚„COOCH;
C A
|
Cocain: HCN \CHOCOC,H,
|
C———-C —
H, H H,
Benzoylecgoninmethylester.
Ausgegangen wurde von einem Präparat Cocainchlorid, das die
„Nederlandsche Cocainefabriek Amsterdam“: mir mit einigen anderen
Cocaalkaloiden freundlichst zur Verfügung gestellt hatte. Das Chlorid
entsprach den Forderungen des Arzneibuches. : Weil die Konstante des
Alkaloids kleiner ist, als von Atropin, ist die Hydrolyse des Salzes größer
als die des Atropinchlorids. 5ccm 0,05 mol. Lösung des Cocainchlorids
nahmen bei Anwesenheit von 3 bis 5 ccm Chloroform 25,1 bzw. 25,2 ccm
0,01n Natron auf Phenolphthalein.
Die Dissoziationskonstante mußte in verdünnten Mischungen von
Cocainchlorid mit Lauge bestimmt werden, weil sonst das Alkaloid aus-
kristallisierte.
Dissoziationskonstante von Cocain.
Indikator kator | Poy | 10 om D mm
_ Zusammensetzung der Lö der Lösung ung || pe PH |
Da
öccm 0,01 mol. Cocainchlorid | 7,7 EL i Phenolrot |
+0 5 cem 0,01n NaOH 7,8 Neutralrot | 6,5 | 3,2. 107? 2,9
7,6
Dasselbe 10mal verdiinnt | ot Pieno |
5 ccm 0,01mol. Cocainchlorid | | 8,6 | Phenolpbthalein |
+ 2,5ccm 001n NaOH | a Thymolblau 5,55. 2,8.10-0 28
S ‚65 R '
Dasselbe 10mal verdünnt | 8,6 | Phenolphthalein | |
5 ccm 0,01 mol. Cocainchlorid |, 9,15 » | |
+4ccm 0,0ln NaOH | 9,20 Thymolblau | 502 ' 96.10-° | 24
9,15 S ’ I: ’
Dasselbe 10mal verdünnt i 9,15 | Phenolphthalein J |
5 ccm 0,01 mol. a sor dl, 9,5 Thymolblau 47 12 105 2]
+ 45 com 0,01n NaOH 9,5 | Phenolphthalein ` E l
Im Mittel K — 2,6. 10-"
Wir finden also einen recht konstanten Wert für K = 2,6. 10-6,
entsprechend einem pp = 5,59 (15°). In guter Übereinstimmung hiermit
fand Fr. Müller bei 24° K = 2,5 .10—6, während Veley!) den ungenauen
Wert von 2,5.10-7 gibt.
Auch habe ich das Löslichkeitsprodukt des Cocains bestimmt. 2 ccm
0,05 mol. Cocainchlorid wurde in Rohren von Resistenzglas mit ver.
schiedenen Mengen 0,01n NaOH versetzt, umgeschüttelt und nach 1 Tag
verschlossen Stehenlassen beurteilt. Die Resultate findet man in folgender
Tabelle.
1) Veley, Journ. Chem. Soc. 95, 1, 1909.
Biocbemische Zeitschrift Band 162. 91
310 J. M. Kolthoft:
f] n N |
Zusammensetzung der Lösung | Nach 24stünd. Steben
===, deeg
+ lcem 0,01n NaOH! Keine Änderung
+15, e e | Keine Änderung. pg = 7,8
2 ccm 0,05 mol. J+ 2 ¡Nach 4 Stunden schon wenig, schón
Cocainchlorid gebildete Kristalle abgesetzt.
| PH a 4,7.
+25, SC, E | Kristallisation tritt bald ein.
Aus diesen Daten können wir das Löslichkeitsprodukt des Cocains
einfach berechnen, und zwar ist es bei 15%: 1. 10-3. Hieraus und aus der
bekannten Dissoziationskonstante des Cocains können wir die Konzentration
des ungespaltenen Alkaloids in der gesättigten Lösung ableiten, und zwar
ist sie:
o L 10—8
IOC. OH o, K = 2,6. 10—6
= 4.10-3 mol.
Die Konzentration des gespaltenen Teiles ist 10—4mol., so daß (lie
totale Löslichkeit des Cocains in Wasser 4,1. 10-3 mol. ist.
Ich habe auch noch untersucht, ob das Cocain imstande ist, als Säure
aufzutreten. Jedoch wurde auf keinen Indikator eine nachweisbare Menge
Lauge gebunden. Wenn das Cocain kurze Zeit mit Lauge gekocht wird,
wird es quantitativ verseift, was ich durch verschiedene Versuche nachweisen
konnte.
Weil das Cocain eine schwächere Base ist als das Atropin, so ist die
Reaktion des Chlorids saurer als die des entsprechenden Atropinsalzes.
Ich fand in einer 0,05 mol. Cocainchloridlösung ein pg von 4,7 (auf Methylrot
und auf Methylorange), in einer 0,01 mol. Lösung py von 5,2. Nach Berech-
nung sollten diese Werte 5,05 bzw. 5,4 sein. Der Umschlag des Methylrots
in wässeriger Lösung ist sehr scharf; 5 ccm 0,05 mol. Cocainchloridlösung
war nach Zusatz von 0,05ccm 0,01n NaOH vollkommen alkalisch auf
diesen Indikator. In 50proz. alkoholischem Mittel ist der Indikator jedoch
nicht zu empfehlen; der Umschlag ist unscharf. So nahm eine Mischung
von 5 ccm 0,05 mol. Cocainchlorid und 5 cem 96proz. Alkohol 1 ccm 0,01 n
Natron, bevordieFarbedes Indikators von orangevölligin gelb verwandelt war.
In verdünnt alkoholischer Lösung ist Bromphenolblau wieder als
Indikator zu empfehlen; der Umschlag auf diesen Indikator ist im letzten
Falle viel schärfer als in wässeriger Lösung. So war eine Mischung von
5 ccm 0,05 mol. Cocainchlorid und 5 ccm 96proz. Alkohol mit Bromphenol-
blau ganz blau gefärbt; nach Zusatz von 0,04 ccm 0,1 n Salzsäure war die
Farbe gelb.
Zuletzt bemerke ich noch, daß man die gebundene Salzsäure an Cocain
ganz scharf auf Phenolphthalein titrieren kann, wenn die Lösung am Ende
der Titration wenigstens 50proz. Alkohol enthält.
H, H H COOH
(ee Sei
Ecgonin: | H¿CN< SCHONH.
AE E |
H, H,
Das Ecgonin bildet das Verseifungsprodukt aller Cocaine. Die Tat-
sache, daß die Ecgoninlósungen gegen Lackmus neutral reagieren, ver-
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 311
anlaßte Einhorn!) zu der Annahme, daß im freien Ecgonin die basischen
und sauren Atomgruppen sich gegenseitig absättigen, wodurch eine betain-
artige Bindung entsteht.
HO—-C,„H3;=NH
CO— O
Nach den neueren Anschauungen von N. Bjerrum?) können wir es
jedoch wie ein Zwitterion betrachten.
H Cum H,;;=N H+
'00-
Diese Annahme steht in bestem Einklang mit der Tatsache, daß der
gefundene Wert für die Konstante der sauren und basischen Gruppe sehr
klein ist. In der Tat bestimmen wir nach folgender Methode die scheinbaren
Konstanten k, und k,; die wahren Dissoziationskonstanten sind viel
größer?).
Ich ging aus von einer Zubereitung der „Nederlandsche Cocainefabriek“.
Die 0,05 mol. Lösung hatte dieselbe Reaktion wie das Lösungswasser.
In den folgenden Tabellen sind die Werte für die scheinbaren Dissoziations-
konstanten angegeben.
Scheinbare Dissoziationskonstante k, des Ecgonins.
Zus usammensetzung der Lösung | PH 1 | Indikat Indikator |o | von | [0 H’] ko ICH
s@s(+ Beem 0,01n z |3 3,9 | Methylorange | 10,3 | 5.1011 5,5
3E BN 10 „ E 3,55 i 10,65 | 2,2. 10-11 5,5
2 2l425 7 ois JH 305 . ¡11,16 | 71.103 | 7ı
Im Mittel Er = 6. 10-12
Scheinbare Dissoziationskonstante k, des Ecgonins.
Zusammensetzung der Lösung er Lösung | Pg "pe | Maik Indikator | CN tor | H] |k , 1012
ES £(+ 5 ccm OOln NaOH 10,2 | Thymolphthalein | 6,4. 10711 7
38 Bi +10 , P 10, ‚5; Salicylgelb 3,6.10-11 9
==33l+ 25 „ On i 11,15 a 7,1. 10-12 7.1
Im Mittel ka = 8.1071?
Die scheinbare saure- und basische Dissoziationskonstante sind also
von derselben Größenordnung. k, = 8.10-12, entsprechend pr, = 11,11;
kı = 6. 10-12, entsprechend Pr, = 11,22. Wenn wir das Ecgonin als
Zwitterion betrachten, so finden wir für die wahren Konstanten Ks und Kpg
uo 10— 14,2
er En, e Eeer, JE 2,98
K, = = an = 10,
K 0-142
Ga H,O _ l _
Aur — mua = 10.
8
1) Einhorn, Ber. 21, 3029.
2) N. Bjerrum, Zeitschr. f. physik. Chem. 104, 127, 1923; vgl. auch
J. M. Kolthoff, Rec. Trav. Chim. 44, 68, 1925.
312 J. M. Kolthoff :
In dieser Weise ist das Verhalten der sauren und basischen Gruppe
besser gedeutet. de
Aus dem Obenstehenden ergibt sich, daß das Ecgonin auf keinen
Indikator scharf titrierbar ist; weder als Sáure noch als Base.
H,
C— ——€C — —C—COOH
Anhydroecgonin: H. Che SCH
net
H, H,
Das Anhydroecgonin ist vollkommen vergleichbar mit dem Ecgonin.
Die folgenden Versuche sind wieder mit einer Zubereitung von der ,,Neder-
landsche Cocainefabriek“ ausgeführt.
Scheinbare Dissoziationskonstante k, von Anhydroecgonin.
Zusammensetzung der ‚Lösung | Pu | in Indikator POH IOH'] | kp. 1011
Fe 3 (+ Beem olr: | 43 | Methylorange 1,25.10-10° 14
E Ge
Zn a a |: | 5 10,25 | 5,7 . 10-11 1,4
oc y
SE Lean, 01n) 13,35 | H 10,85 | 1,4 4 ou] a
Im Mittel kọ = 1,4. 10-11
Dt 10,85
Scheinbare Dissoziationskonstante k, von Anhydroecgonin.
u _ Zusammensetzung der Lösu der der Lösung. I PH |Pu| na Indikator mi ` | ke te -1011 l
me + 5 ccm 0,01 n m [+ 5 com 001n NaOH a _ Thymolbl au 8. 10-0 9
cem -10 - 10
0,05 mol. +10 p 4.10
+25, 01n Ss T Thymolphthalein 8. 10 Se 8 l
Im Mittel %, = 9. 10-11
Dr, = 10,1
Die wahren Dissoziationskonstanten betragen also:
10—14,2
K, Denen eg 10-3.35,
— 14,2
Re: eg
10—10,11
Zu erwähnen ist noch, daß nach Veley (l. c.) ky von Anhydroecgonin
gleich 3,7 . 10-11 ist.
CC — —CCO00H
Benzoylecgonin: | HEN >CHOOCC3,H,.
C- — — fl
H, H H,
Die Versuche wurden wieder mit einer Zubereitung der ,,Nederlandsche
Cocainefabriek‘“ gemacht.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 313
Scheinbare Dissoziationskonstante kp von Benzoylecgonin.
Zusammensetzung der Besetzung der Lösung ! Pa el Indikator Indikator | Poy | om ` | do. CH
A Sieg Ee, ` ee E a e "See
un 10,8 | 16. A
Aen, [+ Sec 00I n a 5ccm 0,01 n HCI | 3,4
Lösung Jett e, % | 3,0 11,2 | 6,4. 10712
Im Mittel tel ku = SS - 17. 10-12
Pky = 11,77
Scheinbare Dissoziationskonstante k, von Benzoylecgonin.
Zusammensetzung der Lösung Na Pa TI Indikator. Im (411) | ka ke, wo
10 ccm (+ 5 cem 0,0ln NaOH. 10,80| Thymolphthalein 18.101 10-11 18 o
0.05mol. + 10 „ e (11,1 Nitramin 8 .10712 2
Lösung ly 25° ofin ? 1118 ý 16.103 | 16
Im Mittel ką = 1,8. 10712
Pk, = 11,75
Im Mittel finden wir also denselben Wert für k, und k,. Aus den
gefundenen Werten leiten wir ab, daß die wahren Konstanten
10-142
Bei der Vergleichung von Ecgonin, Benzoylecgonin und Anhydro-
ecgonin sehen wir, daß die beiden wahren Dissoziationskonstanten am größten
sind beim Benzoylecgonin, dann beim Ecgonin und schließlich beim Anhydro-
ecgonin.
H
( CH
Pa H ee `
H,( O CH, SC H—C H,—H( CH, CH,
Spartein: Ä | | 5
CR. CH.
ge. CH, HO 2 CH.
HO "cn Cl | CH;
N N
Die Konstitution des Sparteins als solche steht noch nicht fest, wahr-
scheinlich hat es nach Moureu und Valeur!) obengenannte Konstitution.
Bei meinen Versuchen ging ich aus von einer Zubereitung, welche Prof.
von Romburgh mir freundlichst zur Verfügung gestellt hatte. Das Alkaloid
bestand aus einer schwach gelb gefärbten, zähen Flüssigkeit, welche sich
nur schwer in Wasser löste. Ich stellte eine 0,01 mol. Lösung her, welche
nach Messungen auf Nitramin und Salicylgelb G eine Hyvdroxylionen-
konzentration von 5. 10-3 zu besitzen zeigte. Aus Titrationen auf Phenol-
phthalein und Phenolrot ergab sich, daß die totale Konzentration der
freien Base gleich 0,0094 mol. war. Aus (diesen Werten berechnen wir eine
erste Dissoziationskonstante K, = 5,7.10-3, entsprechend einem
DK = 2,24 2).
1) Nach R. Woljfenstein, Die Pflanzenalkaloide, 3. Aufl., S. 195.
2) Nach Veley, Journ. Chem. Soc. 95, 1, 1909, hat Spartein eine Kon-
stante von etwa 10-3.
314 J. M. Kolthoff :
Ich habe den Wert der zweiten Dissoziationskonstante berechnet
aus den Werten der Wasserstoffionenkonzentration in Mischungen von
Mono- und Bichlorid des Sparteins.
Zweite Dissoziationskonstante des Sparteins.
SZ osanmensetzung der Lösung | pa | Indikator | PoH [0H'] | Ka. 1010
m A A A EE a See EE A K
= „(+ 10,34 com 5,7 | Methylrot | 85 | 32.10 3,5
s85/+ 113 , lo0ln:535 | 885 | 14.10-9 | 35
Es 4141, (BO 48 ó 940 | 4 1009| 4
"SAL 16,9 , !4,3 | Methylorarge | 9,9 8 „10-10 3,2
Im Mittel K = 3,5. 10-10
Im Mittel finden wir einen Wert für X, von 3,5 . 10-10, entsprechend
Pr, = 9,46. Bei der Berechnung ist angenommen, daß das Bi- und Monosalz
denselben Dissoziationsgrad haben. Nehmen wir ein Verhältnis von 0,8 an,
so wird K, = 2,8. 10-10,
Weil ich von der Reinheit des obengenannten Präparates Spartein
weiter nichts wußte und zu wenig vorlag für eine Reinigung, so habe ich
auch mit einer Handelszubereitung Sparteinsulfat, das durch zweimalige
Rekristallisation aus Alkohol-Äther gereinigt wurde. Versuche gemacht.
Das gereinigte Präparat hatte die Zusammensetzung C„H„N,H,SO,-
Die 0,05 mol. Lösung hatte auf Methylorange als Indikator ein pg
von 3,3, während dieser Wert nach Berechnung aus K, 3,1 betragen sollte.
Zweite Dissoziationskonstante des Sparteins.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | POH | [OH] | Ka, 1010
4.10-1 | 5,7
A
|
| 40 | Methyvlorar ge
¿3 (+05ccm | 102 |6,
ESI+41 o lez (44 5 98 | 1,6. 10-10 6,4
SEI +25 „ asf [48 | Methylrot | 94 |4 .100| 40
ee | +4 n (53 (535 b 85 |1,4.10 | 35
2 & T 4,5 „ ) 5,7 | n | 8,5 3,2 . 10-9 | 3,5
Im Mittel K, — 46.100
Auch hier haben wir eine gleiche Dissoziation für das Mono- und Bisalz
angenommen. Die Übereinstimmung zwischen dem hier gefundenen Wert
von 4,6 . 10-10, entsprechend px, = 9,34 und dem beim Spartein gefundenen
von 2,8. 10-10 ist befriedigend. Aus der ersten und zweiten Dissoziations-
konstante können wir berechnen, daß eine Lösung des Monosalzes des Sparteins
ein py von 8,3 haben wird. Wenn wir also Spartein wie eine einsáurige
Base titrieren wollen, so muß die Bestimmung auf Phenolphthalein, Phenol-
blau, Kresolrot oder Phenolrot als Indikator ausgeführt werden. Tatsách-
lich erhielt ich mit den beiden letzten Indikatoren die schärfsten Resultate.
Mit Methylrot erhält man keine guten Resultate, so daß die Behauptung
von P. H Jenel!), Spartein sei auf Methylrot oder Phenolphthalein titrier-
bar, nicht richtig ist. 20 ccm 0,05 mol. Sparteinsulfat nahm 10,06 ccm
0,l n NaOH auf Phenolphthalein oder Thymolblau; 10 ccm auf Phenolrot
und Kresolrot. Besonders im letzten Falle war der Umschlag sehr scharf.
Der Erwartung nach wurde auf Methylrot zu wenig Lauge gebunden,
1) P.W.Jenel, Journ. Amer. Pharm. Assoc. 12, 107, 1923,
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 315
und zwar etwa 9,3ccm 0,l n; der Fehler betrug also etwa 7 Proz. Der
Umschlag war sehr vag. Fügt man so viel Alkohol hinzu, daß die End-
konzentration etwa 40 Proz. ist, so ist die Titration auf Methylrot auch
scharf und genau ausführbar. Ich habe alle obenstehenden Versuche mit
0,01 mol. Lösungen wiederholt und habe auch hier bestätigen können,
daß die Titrationen auf Phenolrot oder Kresolrot die besten Resultate
liefern. Man titriert dann, bis die Farbe der Lösung ganz rot geworden ist,
und bestimmt das Spartein als monosäurige Base.
CH,
H,C CH,
Pelletierin: | ;
H, o de H—CH,—CH,—COH
NH
Das Pelletierin ist eine luftempfindliche, leicht verharzende Substanz,
welches Verhalten aus der Anwesenheit der Aldehydgruppe erklärt wird.
Zuerst habe ich Versuche gemacht mit dem freien Alkaloid. Dazu wurden
Zubereitungen von Merck verwendet, welche dunkel aussahen und sich
mit dunkelbrauner Farbe in Wasser lösten. Der Berechnung nach müßte
die Konzentration der von mir verwendeten Lösung etwa 0,05 mol. sein;
in Wirklichkeit war sie nach den Resultaten von konduktometrischen
Titrationen um 0,0113 mol. Die Lösung rötete Phenolphthalein nicht;
auch aus vielen anderen Versuchen konnte ich die Folgerung schließen,
daß die Präparate zum größten Teil verharzt waren. Die Werte, welche
ich bei der Feststellung der Neutralisationskurve erhielt, waren also nicht
zuverlässig. Daher bin ich für die Bestimmung der Dissoziationskonstante
des Pelletierins vom salzsauren Salz ausgegangen, das von Merck bezogen
wurde (purissimum). Das Hydrochlorid ist stark wasseranziehend und
war dann auch in den kleinen Flaschen in eine Flüssigkeit übergegangen.
Ich stellte eine etwa 0,1 mol. Lösung her, welche nach der Volhardtitration
0,094 n war. In Übereinstimmung damit nahmen 10 ccm bei Anwesenheit
von Chloroform und Weingeist (Chloroform allein genügt nicht) 9,45 ccm
0,1n NaOH auf Phenolphthalein. Zur Bestimmung der Dissoziations-
konstante habe ich in Mischungen von 0,01 mol. Pelletierinchlorid mit
0,01 n Natron das py bestimmt.
Dissoziationskonstante von Pelletierin.
Zusammensetzung der ‚Lösung | Py | Indikator | PoH | [OH'] | A .105
10 ccm + l cem | sz Phenolphthalein 5,8 1,6 . 10-6 1,4
Belle | + 2 | n 53 |5 .10-| 2
chlorid +5 , » (35 e | 4,7 2 .10-° 2
Im Mittel K=1,8.10-*
Wir finden einen Wert für die Dissoziationskonstante von 1,8. 10-5,
entsprechend or = 4,75. Die Konstante ist also ebenso groß wie die des
Ammoniaks. Weil das Pelletierin eine sekundäre Stickstoffbase ist, würde
man eine größere Konstante erwartet haben; wahrscheinlich wird die
basische Funktion durch das Vorhandensein der Aldehydgruppe etwas
abgeschwächt. Der Berechnung nach müßte eine 0,1 mol. Pelletierinchlorid-
lösung ein pg von 5,12 haben. Die oben verwendete Lösung hatte ein py
von 4,75. In wässeriger Lösung kann das Pelletierin ebenso wie Ammoniak
316 J. M. Kolthoff :
am schärfsten auf Methylrot titriert werden, jedoch sind auch Methylorange,
Bromphenolblau und Dimethylgelb zu verwenden. Bei der Bestimmung
von Pelletierin in Drogen wird bei Anwesenheit von Áther titriert. Dadurch
wird der Umschlag unschárfer. Hierüber werde ich an anderer Stelle aus-
führlicher berichten.
Alkaloide der Chinarinden.
H
Han —-CH-CH-CH,
CH, |
r
OH CH,
——< BCN He
co. H
BACK NN
Chinin: | |
x 7 Ea
N
Weil N. Schoorl*) schon eine ausführliche Mitteilung über die Titrierbar-
keit der Chinaalkaloide veröffentlicht hat, werde ich nur einen Teil meiner
Resultate mitteilen. Für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten
bin ich ausgegangen von zwei ganz reinen Zubereitungen Chininhydrochlorid.
Die eine war von Prof. Schoorl gereinigt worden und ist in seiner Mitteilung
beschrieben. Bei der Feststellung der ersten Dissoziationskonstante habe
ich mit Mischungen von 0,00333 mol. Chininhydrochlorid und 0.01 n
Natron gearbeitet. Die Verdünnung mußte so groß genommen werden,
weil sonst das Alkaloid gefällt wurde, bevor die Messungen ausgetührt
werden konnten (vgl. unten beim Löslichkeitsprodukt). Phenolphthalein
konnte bei den Bestimmungen nicht als Indikator verwendet werden,
weil es vom freien Chinin gefällt wird. Auch Thymolblau gibt eine schwache
Fällung, jedoch scheint der verursachte Fehler hier nicht groß zu seın.
Erste Dissoziationskonstante von Chinin.
1
Zusammensetzung der Lösung | Py | Indikator | POH | [OH’] | Ka. 10°
Da Sn SE GR A en ÓN
+ 0,5 cem 7.15: Phenolrot 6,95 | 1,13. 107° 1,0
SS? | +05 „ | „= "UA Neutralrot 68 |16 .10-7, 144)
Sasat] » (32 76 | Phenolrot 66 |25 .10-7 | 10
236 | +25 , | ez 83, Kresolrot | 5,9 "Län 1076 | 125
+25 ? -83 | Thymolblau | 59 |125.10-° SZ
Im Mittel K, == 1,08. 10%
Im Mittel finden wir einen Wert für X, = 1,08. 10-6, entsprechend
pr, = 5.97. Wahrscheinlich ist der Wert etwas zu klein gefunden, wegen
des nicht korrigierten Salzfehlers der Indikatoren. Der von Veley?) ge-
fundene Wert von 2,16. 10-° ist bestimmt zu klein, denn aus der Leit-
fähigkeit einer gesáttigten Chininlösung berechnete ich eine Konstante
von 3. 10-0 bei 18% Besser steht der von mir gefundene Wert in Einklang
1) N. Schoorl, Rec. Trav. Chim. 41, 228, 1922.
2) Veley, Journ. Chem. Soc. 95, 758, 1909.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 317
mit dem von Barrat!), der 2,6. 10-6, und dem von P. Mauz?), der bei 18°
K = 1,7.10-6 fand. Bei der Bestimmung der zweiten Dissoziations-
konstante habe ich pg bestimmt in Mischungen von 0,01 mol. Chinin-
monochlorid und 0,01 n Salzsäure. Ich habe die totale Konzentration
klein gehalten, weil in größeren Konzentrationen der Salzfehler der großen
zweiwertigen Chininionen wahrscheinlich eine große Rolle spielt. Trotzdem
die Versuche oft wiederholt sind, habe ich keinen konstanten Wert für die
zweite Dissoziationskonstante gefunden, sondern einen regelmäßigen
Gang wahrgenommen. Als Indikatoren habe ich Methylorange oder Methyl-
rot verwendet. Bromphenolblau konnte leider nicht benutzt werden,
weil die Farbe in den Alkaloidsalzmischungen anders war als in den Puffer-
mischungen. In den Chininsalzlösungen war die alkalische Farbe des
Indikators rein blau, er verwandelte die Farbe nach gelb, ohne den be-
kannten Dichromatismus zu zeigen. Bei den Berechnungen ist die Hydrolyse
in Betracht genommen; weiter haben wir angenommen, daß das Mono-
und Bisalz des Chinins denselben Dissoziationsgrad haben.
Zweite Dissoziationskonstante des Chinins.
LT mm ns messer auaa hm nm m nn
Zusammenstellung der Lámuog | Pu Indikator | Day | mm | wm
DR NN a T en
ESSE + 0,5 cem) ls, 1 Methylrot | 9,1 8 .10-10 ug
BERESI 425 „ (W1nj435. Methylorange | 9,85 | 1,4. 10-10 1,4
Zelte 5 N 1305 Ñ 1025 | 5,7. 10-12 | 23
Im Mittel K, = 1,5 . 10-10
Weil die Konstante regelmäßig größer wird je saurer die Lösung wird,
so habe ich auch die Neutralisationskurve des Chininmonochlorids mit
Salzsäure mit Hilfe der Chinhydronelektrode bestimmt. Ich bin dabei
ausgegangen von 250 ccm 0,01 mol. Chininmonochlorid, welche mit 0,1 n
Salzsäure titriert wurde. Die Resultate sind in untenstehender Tabelle
mitgeteilt.
Zweite Dissoziationskonstante des Chinins (Chinhydronelektrode).
250 ccm 0,01 mol. Chininmonochlorid, titriert mit 0,1n Salzsäure.
_Zugefügt com äi Salzsäure ` | Pa | Pon POH Sr | pm _
|
0 6,23 | 7,97 ER 1.08. 10-8 | om
1,05 5.66 8.54 29 Ion, 1,2
2,5 5,35 885 ` I4 jn: 1,55
5,0 5,02 9,18 | 6,6 „10-10 1,65
12,5 4,54 966 | 2,2 „10-10 | 22
20,0 4,05 10,15 71.100 2,8
22,5 © 381] 10,39 4,1 100 | 3,6
24,0 3,66 10,54 2,9 „10-11 | SS
25,0 3,61 1059 ; 26 107" | =
26,0 351 | 1069 | 204.10 —
27,5 340 ' 1080 Lë .10-1 —
30,0 3,25 ` 10,95 `: 1,13. 10-11 |
Im Mittel X, = 2,2. 10-10
1) Barrat, Zeitschr. f. Elektrochem. 16, 130, 1910.
2) P. Mauz, Physik.-chem. Unters. über Alkaloide. Dissertation
Stuttgart 1904.
318 J. M. Kolthoff:
In allen Fällen fanden wir mit der Chinhydronelektrode Werte für die
Wasserstoffionenkonzentration, welche etwas kleiner waren, als die, welche
kolorimetrisch gefunden sind. Der Unterschied ist nicht groß. Übrigens
finden wir auch hier wieder den Gang in den Wert der Konstante, welche
zunimmt, je saurer die Lösung wird. Wahrscheinlich ist die Aktivität
der zweiwertigen Chininionen viel geringer als die der einwertigen. Wir
haben gerechnet, daß beide dieselbe Aktivität haben, wodurch ein zunehmen-
der Wert für die Konstante in saurer werdenden Lösungen gefunden werden
muß.
Die Übereinstimmung zwischen den Mittelwerten der nach kolorimetri-
schem und elektrometrischem Weg gefundenen Konstante ist sehr be-
friedigend. Wir können annehmen, daß sie bei 15° 2 . 10-10 beträgt, ent-
sprechend einem py, von 9,7. Dieser Wert liegt zwischen dem von Veley
(l.c.) und Barrat gefundenen: nämlich von 3,3 .. 10-10 bzw. 1,3. 10-19,
J. Arnall!) leitete aus Messungen bei 55° einen Wert ab von 2,35 . 10-9,
Jedoch nahm er einen Wert für das lonenprodukt von Wasser an von
1,2. 10-14, also viel zu niedrig. Wahrscheinlich ist das Produkt etwa
sechsmal größer, so daß wir dann berechnen, daß K, gleich 4. 10-10 bei
55° ist. Das Löslichkeitsprodukt des Chinins wurde in derselben Weise
bestimmt, wie das bei Cocain beschrieben ist. Zu 5ccm 0,05 mol. Chinin-
chlorid fügte ich verschiedene Mengen 0,01 n Natron und beurteilte die
Mischungen am nächsten Tage.
Löslichkeitsprodukt von Chinin in 0,05 mol. Chininchlorid.
Am nächsten Tag
Zusammensetzung der GH
Ausschen ' Pu PoH | [O H']
3com (+ 1,4cem\ | klar ni | sio 2 =
Cham | E DG n f Nach „Spur opalezent | 73 | 89 | 126.10°°
chlorid |+ 1,8 „ | Chinin in zusammenhängenden | 7,3 | 6,9 1,26 . 10°
j Massen abgesetzt
Hieraus läßt sich ableiten, daß das Löslichkeitsprodukt überschritten
wird, wenn die Konzentration an Monochlorid größer als 3,5. 10-2 und
zu gleicher Zeit [O H'] größer als 1,26. 10-7. Das Löslichkeitsprodukt von
Chinin ist dann:
LChin = [Chin 0H'][0H'] = 3,5. 10-2. 1,26. 10-7 = 4,4. 10-9,
Hieraus und aus der bekannten ersten Dissoziationskonstante berechnen
wir eine Löslichkeit von Chinin in Wasser von 4,05.10-3. Bei der Aus-
führung der Versuche mit Mischungen von 0,01 mol. Chininchlorid und
Natron fand ich ein Löslichkeitsprodukt von 2. 10-9, entsprechend einer
Löslichkeit in Wasser 1.9 . 10-3 mol. Auch diese letzte Zahl ist jedoch noch
zu groß, denn nach den Versuchen von Mauz (l. c.) ist die Konzentration
einer gesättigten Chininlösung = 6. 10—4 mol. bei 18%, und nach eigenen
Bestimmungen mit Chinin mit 3 Molen Kristallwasser 6,55. 10-4 mol.
Hieraus und aus der ersten Dissoziationskonstante ergibt sich, daß das
wahre Löslichkeitsprodukt von Chinin etwa 7.10-10 ist. Im Chinin-
1) J. Arnall, Journ. Chem. Soc. 117, 835, 1920.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 319
monochlorid finden wir einen größeren Wert, der mit steigender Konzentration
des Salzes zunimmt. Ob wir hier mit einer zunehmenden Löslichkeit des
Chinins zu tun haben oder mit einer Mischkristallbildung, habe ich nicht
weiter untersucht.
Das py einer 0,1 bis 0,01 n Chininmonochloridlösung ist nach W. J. M.
Mc Gill!) 5,98; nach Masucci und Moffat?) schwankte das pg von Handels-
zubereitung in 5proz. Lösungen (?) zwischen 5,60 und 5,92. N. Schoorl
(l. ei fand in seinen reinen Präparaten in 0,1 n Lösungen ein pg von 6,1,
während ich in Übereinstimmung damit in 0,1 und 0,01 mol. Lösungen
ein py zwischen 6,1 und 6,0 fand (Methylrot). Mit der Chinhydronelektrode
bestimmt, fand ich in 0,01 mol. -Lósung ein pg von 6,23, wáhrend der Wert
nach der Berechnung aus den beiden Dissoziationskonstanten 6,28 betragen
müßte.
In Chinindichloridlösungen aus dem Handel (1:20) fanden Masucci
und Moffat pg zwischen 2,45 und 2,79. Dies würde auf eine grobe Ver-
unreinigung an freier Säure hinweisen. Schoorl fand das py einer 0,1 mol.
Chininbichloridlösung auf 3,5 mit Methylorange als Indikator, während
ich in einer 0,01 mol. Lösung ein pg von 3,61 fand (mit der Chinhydron-
elektrode bestimmt). Ich weise darauf hin, daß das pg einer Chininbichlorid-
lösung sich durch Zusatz von wenig Säure oder Monosalz nur wenig ändert.
Daher ist die Titration von Chinin als zweisäurige Base auf keinen Indikator
genau durchzuführen.
Über die Titration von Chinin als monosäurige Base hat Schoorl aus-
führlich geschrieben. Wenn man von der sauren Seite kommt, empfiehlt
er die Verwendung von Methylrot und Neutralrot hintereinander. Ich ziehe
die Verwendung von Bromthymolblau vor und titriere, wenn man von
der sauren Seite kommt, so weit, bis die Farbe sich in grün ändert.
Bei Anwesenheit von nicht zu viel Weingeist ist Bromkresolpurpur
als Indikator zu empfehlen. Eine Mischung von ccm 0,05 mol. Chinin-
monochlorid und 3 ccm starkem Weingeist ist eben noch ganz sauer auf
den Indikator. Fügt man 0,1 cem 0,01 n Lauge hinzu (d.i. 0,4 áq. Proz.),
so wird die Farbe grüngelb, nach Zusatz von 0,2 ccm 0,01 n Lauge ist die
Farbe grünblau. Wenn man dafür Sorge trägt, daß der Weingeistgehalt
beim Endpunkte zwischen 35 und 40 Proz. schwankt, so erhält man mit
Bromkresolpurpur ganz genaue Resultate, was ich durch verschiedene
Titrationen mit wechselnden Konzentrationen an Chinin bestätigen
konnte. So nahm eine Mischung von 10 ccm 0,1 mol. Chininmonochlorid
mit Beem 0,1 n Salzsäure und 12ccm starkem Weingeist 4,95 cem 0,1 n
Lauge, bevor die Farbe anfing, etwas von rein gelb abzuweichen; nach Zusatz
von 5,00 ccm Lauge war sie gelbgrün und von 5,08 cem Lauge blaugrün.
Bei Anwesenheit von 16ccm Weingeist wurden dieselben Resultate ge-
funden.
Chinidin ist stereoisomer mit Chinin.
Bei meinen Versuchen ging ich aus von einer reinen Zubereitung
Chinidinsulfat der „Amsterdamsche Kininefabriek‘ aus. Ich stellte eine ge-
sättigte Lösung bei 18° her, welche eine Konzentration von 0,026 mol.
hatte und ein py von 5,9. Für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten
wurde die Lösung viermal bzw. zweimal verdünnt.
1) W.J. M. Mc Gall, Journ. Amer. Chem. Soc. 44, 2156, 1922.
2) Masucci und Moffat, Journ. Amer. Pharm. Assoc. 12, 609, 1923.
320 J. M. Kolthoff :
Erste Dissoziationskonstante von Chinidin.
a Zusammensetzung der Lösung d Dep | Indikator | [OH'] | Ki. 108 l
20com (+ 1,13 ccm Phenolrot | 36.1077 | 3,2
molt + 225, 4 Kresolrot | 9.107 | 38
sulfat +65 E R dE 10-9 `, 40
Im Mittel K,=3,7.1070
Phenolphthalein und Thymolblau wurden vom freien Chinidin gefállt
und waren als Indikator nicht zu verwenden. Fúr K, finden wir also einen
Wert von 3,7. 10—6, entsprechend px, = 5,43. Veley (Lei fand den
falschen Wert von 2,4. 10-7.
Zweite Dissoziationskonstante des Chinidins.
| Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | PoH | Op i K» 1010
Se peaa Se === = q A A A Deren Sg SS SE = Z —— Ze
¿cc + 1,13ccm a | 5,1) Methylrot ` D | 8 .10719 | 0,9
/ r ; |i - —10 |
Chinidin, SE 2,26 ” J HCI | 4,7 n | 9,5 | 3,2 e 10-10 | 0.8
sulfat (165 „ ¡43 ı Methylorange 99 .126.10-10| 1,26
Im Mittel K, = 1,0 . 10-10
Wir haben ebenso wie beim Chinin angenommen, daß das Mono- und
Bisalz dieselbe Aktivität besitzen. Unser Wert für K, = 1,0.10-1,
entsprechend px, = 10,0, ist kleiner als der von Veley angegebene, nämlich
von 3,3.10—10. Der von Arnall bei 55° bestimmte Wert ist 2,5.10—10
(korrigiert von mir). Das Löslichkeitsprodukt von Chinidin wurde bestimmt
in Mischungen von 4ccm 0,013 mol. Chinidinsulfat mit: 0,01 n Natron.
Erst nach Zusatz von 0,8 cem 0,01 n Natron erhielt ich am nächsten Tage
eine Fällung; das pg der obenstehenden Lösung war 7,6, also po = 6.6
oder [OH'] = 2,5. 10—7. Hieraus berechnen wir ein Löslichkeitsprodukt
von Chinidin:
LChinidin = [Chinid. OH] [OH’] = 2,5 . 10 7,
Aus diesem Werte und der ersten Dissoziationskonstante berechnen
wir eine Löslichkeit von Chinidin in Wasser von 6,7 .10-4 + 0,5.10-4
= 7,2.10-4 mol.
Cinchonin (Konstitution: Chinin ohne Methoxylgruppe). Bei den
Versuchen ging ich aus von Cinchoninsulfat einer reinen Zubereitung der
„Amsterdamsche Kininfabriek“. 25 ccm der bei 18% gesáttigten wásserigen
Lösung nahmen bei Titration auf Phenolphthalein bei Anwesenheit von
Chloroform und Weingeist 9,73 bzw. 9,76cem 0,l n Natron. Dies ent-
spricht einer Löslichkeit von 0,039 n oder 1,41 g (Cis H: N20): H; SO, 2H,O
im Liter oder 1:71. Nach Angaben in Schmidt (l. c.) ist sie bei 13° 1: 65,5.
Die gesättigte Lösung hatte ein py von 5,8.
Bei der Bestimmung der ersten Dissoziationskonstante mußte in stark
verdünnter Lösung und bei niedriger Alkalitát gearbeitet werden wegen
der selır geringen Löslichkeit des Cinchonins.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 321
Erste Dissoziationskonstante von Cinchonin.
Zusammensetzung der Lösung | Pg | Indikator | Poy | ont | Em
Een mann, Te A A A EE RE [ teg x I == =
g CH + 0,975 ccm | ex || 7 Phenolrot 6,9 | 1,25.10-7 | 1,12
3e 3 ? 0 ’ | ’ |
a222 419, | Sa |78 | . 6,4 | 4 Jo? | 1,6
zo | | |
Im Mittel K, = 1,4. 10-6
Veley (l. c.) fand einen Wert von 1,63 . 10-7, also zu niedrig. In guter
Übereinstimmung mit meiner Bestimmung fand Mauz (l. c.) aus der Leit-
fähigkeit einer gesättigten Cinchoninlösung bei 25% ein K, = 1,2. 10—6,
während der von mir bei 15° gefundene Wert 1,4. 10-6 ist, entsprechend
p K, 5,85 ist.
Bei der Berechnung der zweiten Dissoziationskonstante nahmen wir
wieder einen analogen Gang wahr, wie bei Chinin beschrieben ist.
Zweite Dissoziationskonstante von Cinchonin.
Zusammensetzung der Lösung | Pu | Indikator"
28. (+0,97 com) _ [5,1 Methylrot | 91 ¡8 .10-10| 09
$035 +L n 125/1475 B 9,45 13,8 .10-10| 09
egga +4,84 , S [143 | Methylorange 9,9 |1,75.10-10 1,26
ES 14874 , 35 | $ 107 12 .10-1| 18
Im Mittel K} = 1,2. 10-10
Pg, = 9,92
CR
Veley (l.c.) fand K, = 3,2.10-10, während Biddle und Watson!)
bei 25° einen Wert von 2,05.10-10 fanden. Aus den Resultaten von Arnall
berechne ich bei 25% K, = 3,3. 10-10, Das Löslichkeitsprodukt wurde
bestimmt in Mischungen von 0,00975 mol. Cinchoninsulfat mit 0,01n
Natron. Es ergab sich, daß eine Mischung von 5ccm Sulfat mit 0,2 ccm
Natron nach langem Stehen eine Fällung gab, bei Anwesenheit von 0,3
bzw. 0,4ccm Natron trat sofort eine Fällung ein. Alle Lösungen hatten
nachher ein py von 6,0 oder ein pou von 8,2, entsprechend [O H'] = 6,4. 10°.
Hieraus ergibt sich das Löslichkeitsprodukt
LCincbonin = [Cinch. OH'] [OH’] = 6. 10-1,
Hieraus und aus der ersten Dissoziationskonstante berechnen wir
eine Löslichkeit des Chinchonins von 4,8.10-6, entsprechend 14,4 mg
im Liter. Mauz fand bei seinen genauen direkten Bestimmungen eine
Löslichkeit von 21 mg im Liter oder 1:47652. Wahrscheinlich ist diese
Löslichkeit noch etwas zu hoch. Eine genaue direkte Bestimmung ist fast
nicht mehr möglich.
Über die Titrierbarkeit des Cinchonins gilt dasselbe, was bei Chinin
gesagt ist.
Cinchonidin ist stereoisomer mit Cinchonin.
Bei den Versuchen ging ich aus von Cinchonidinsulfat, einer reinen
Zubereitung der ‚„Amsterdamsche Kininfabriek“, 25 ccm einer bei 18°
gesättigten wässerigen Lösung, nahmen auf Phenolphthalein bei Anwesen-
1) Biddle und Watson, Journ. Amer. Chem. Soc. 89, 968, 1917.
322 J. M. Kolthoff:
heit von gleichen Volumen starkem Weingeist 8,60 bzw. 8,60 ccm 0,1 n
Natron. Dies entspricht einer Konzentration von 0,0324n oder 1,286 g
(C,,H,2N30),H,80, 6 H,O im Liter. Nach Schmidt ist die Löslichkeit
bei 12° 1: 97,5, während ich bei 18° 1:78 finde. Die gesättigte Lösung
hatte ein py von 6,2.
Erste Dissoziationskonstante von Cinchonidin.
Zuskmmensetzung der Losi Lösung Pa | h Indikator u d Pon mom | A, 105
cca + l cem \ re 74 Phenolrot | 6,8 | 1,6. Ir? | 1.4
Bea en j Kresolrot ` ` 6,4 4 .10-7 1.6
Säin, oz |845 | 575 | 1,7.10-8 | 17
Im Mittel K,=16. 10-6
Pr, = 5,80
Veley (l. ei fand den zu niedrigen Wert von 3,7 . 10-7,
Zweite Dissoziationskonstante von Cinchonidin.
Zusammensetzung der Lösung len h PH | Indikator Mi Pon sg dE | 5210 ka, win `
- => = Segen E A E O SÉNG A E | E Be
A GE Gi l ccm | A 5,1 | Methylrot E 9,1 | 8 „10-10 | 0,9
E Ces e
>=: +25 "ez [455 Methylorange | 9,65 | 2,2. 10-10 0,9
ssöslyıs „Jr las | ? 10,0 | 10.10- | 10
Im Mittel Ka 0,93. 10-10
Pr, = =10 ,03
Veley fand einen Wert von 3,3. 10—10,
Bei der Bestimmung des Löslichkeitsproduktes wurde folgendes
wahrgenommen.
Zusammensetzung der Lösung | Beurteilung a am n nächsten Tag
5cem 0,0086n Cinchonidinsulfat |
+ licem 001nNaOH .„... . | klar geblieben
5ccm 0,0086n Cinchonidinrulfat
+ 1,2com 0,01nNaOH.... . | wenig Kristalle abgesetzt pg = 7,6
5ccm 0,0086n Cinchonidinsulfat
+1,öccm 0,01nNa0OH..... ' wenig Kristalle abgesetzt py = 7,65
In der zweiten Lösung haben wir also ein pop von 6,6 oder eine Hydr-
oxylionenkonzentration von 2,5. 10--7%, Hieraus und aus der Zusammen-
setzung der Lösung berechnen wir ein
LCinchonidin = 1,38. 10-9.
Aus K und L finden wir dann eine Löslichkeit des Cinchonidins in
Wasser von 9. 10—4 mol.; oder 265 mg im Liter.
Über die Titration von Cinchonidin vergleiche bei Chinin.
Zusammenfassend finden wir für die wichtigsten Chinaalkaloide die
folgenden Konstanten:
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 323
Alkaloid | Kı | Löslichkeitsprodukt:
Chinin
Cuprein hat dieselbe Konstitution wie Chinin, enthält statt der
Methoxylgruppe eine OH-Gruppe.
Bei den Versuchen ging ich aus von Cupreinsulfat, das zweimal aus
Wasser umkristallisiert wurde. Die bei 18° gesättigte Lösung wurde ein-
gedampft und bei 100° getrocknet. Der Rückstand entsprach einer Löslich-
keit von 1,855 . 10-3n oder 0,666 g anhydrischem Cupreinsulfat im Liter.
Die gesättigte Lösung hatte eine Äquivalentleitfähigkeit bei 18° von 81,8.
Wenn wir annehmen, daß die Äquivalentleitfähigkeit bei unendlicher Ver-
dünnung 90 ist, so ist der Dissoziationsgrad der gesättigten Lösung gleich 0,91.
Die gesättigte Lösung hatte ein py von 5,8.
Vom Cuprein wurde nun die erste Dissoziationskonstante bestimmt.
Erste Dissoziationskonstante von Cuprein.
Zusammensetzung der Lösung d Pu | Indikator er | Poul POH om | Kı. 10°
pearl A ren ES ÁS EIER GEN ege — ———
E. $3 f + 0,185 ccm Së 6,7 Phenolrot | 7,5 3 Ip | H
e S E51) + 0,37 » SI 17,0 o ı 72 6,4 .1073 | 2,6
Ze | +092 „ Z 17,65 Ñ 6,55 | 2,8.10-7 | 28 `
Im Mittel K, = 2,7 . 10-7
Pe, =8, 57
Eigenartig genug finden wir, daß die erste Dissoziationskonstante
von Cuprein vier- bis fünfmal kleiner ist als die der anderen Chinaalkaloide.
Wahrscheinlich schwächt die freie Hydroxylgruppe die basische Funktion
etwas ab.
Hydrochinin (Zubereitung „Amsterdamsche Kininfabriek**).
Von der mir zur Verfügung stehenden Zubereitung wurde eine 0,1 mol.
Lösung in Überschuß Säure hergestellt. Der Überschuß wurde auf Methylrot
bis py 5,9 zurücktitriert. 10 ccm der 0,1 mol. Lösung hatte 10 ccm 0,1 n
Säure gebunden. Das Zurücktitrieren mit Lauge muß sorgfältig geschehen,
weil das durch örtlichen Überschuß frei gestellte Alkaloid ausgefällt wird,
und sich dann nur ziemlich langsam wieder löst.
Aus der Standardlösung wurde genau eine 0,005 mol. Lösung des
Monochlorids hergestellt. Das py war 5,85.
Erste Dissoziationskonstante von Hydrochinin.
Zusammensetzung der Lösung hb PH | Indikator | PoH | [OH’] | K . 106
SE AR 5 Eos — ——
|
10 cem 0,005 mol. Chlorid (17,85| Phenolrot 6,35 4 9.1071 4 5
+ 0,05 cem 0,1n Na OH i 7,9 Neutralrot 6, 3 E 5 .10° ?
10 cem 0,005 mol. Chlorid
+ 0,1l cem 0,1n NaOH
+ 10 cem Wasser. . . 8,3 Kresolrot |, 59 |1,25,10-6 5
Im Mittel K, = 4,7 . 10-6
Pg, = 5,33
324 | J. M. Kolthoff:
Stärker alkalische Mischungen konnten nicht gemessen werden, weil
das freie Alkaloid mit allen Indikatoren (Phenolphthalein, Thymolblau,
a-Naphtholphthalein, «-Naphtholblau einen Niederschlag bildete.
Aus der obigen Tabelle ergibt sich, daß die erste Dissoziationskonstante
des Hydrochinins größer ist als die der anderen Chinaalkaloide.
Das Löslichkeitsprodukt wurde bestimmt in Mischungen von 0,005 mol.
Hydrochininmonochlorid und 0,1 n Natron.
Löslichkeitsprodukt von ROPA:
Zusammenstellung der Lósung Am nächsten Tage
10 cem 0,005 mol. Hydrochlorid |
+ 0,08 cem 01n NaOH .... . klare Lösung
10 ccm 0,005 mol. Hydrochlorid
+ 0,1 com 0,1l n NaOH u . . Spur Kristalle py = 8,3 poH = 5,9
10 ccm 0,005 mol. Hy drochlorid
+0.12cem 01nNaO0H ..... “ deutlich Kristalle pg = 8,3
Aus diesen Versuchen ergibt sich, daß das Löslichkeitsprodukt von
Hydrochinin:
LHydrochinin = 4 . 10-3 e 1,25 . 10-6 = 5 . 10-9.
Aus K, und £ finden wir dann eine Löslichkeit in Wasser gleich
5.10-9
= rund 10-3 mol. (290 mg im Liter).
4.7. 10-6
CHCH
Ya /N/NcH
Strychnin: | | | CHCH
2
FEN, Ze pn
N | HC | 2
ol NL CH,
C H CHOH
H,
Strychnin hat zwei Stickstofferuppen, ist also eine zweisäurige Base.
Bei meinen Versuchen bin ich ausgegangen von einem reinen Präparat
Strychninnitrat, das nochmals aus Wasser umkristallisiert wurde. Eine
0,025 mol. Lösung (0,05 mol. löst sich nicht mehr) hatte ein pg von 5,5
(Methylrot). eine 0,01 mol. Lösung von 5,45. Bei der Bestimmung der
ersten Dissoziationskonstante mußte wieder in stark verdünnter Lösung
gearbeitet werden, weil «las Strychnin so schwer löslich ist.
Erste Dissoziationskonstante von Strychnin.
Zusammensetzung d der Lösung | Pai o _ Indikator | PoH | [O ni d Ki. 107
5ccm 0,01n Nitrat | | |
+0,5ccm 0,01nNa0OH 7,20 | Phenolrot 7,00 [1,0 .1077 9
5com 0,01 n Nitrat
+ lecm 001n NaOH 7,65 . 6,55 |28 .10-7' 112
10 cem 0,005n Nitrat | Ä
+25cem 0, 01nNaOH 8.25
20 com 0,0025 n Nitrat | |
+ 4cem 0,0In NaOH Sp Thymolblau | 5,45 |36 Jr 9
Im Mittel K, = 10. 10-*
De, = 6,0
Kresolrot | 5,95 1,13. 1078 11,3
t
Dissoziationskonstante, Lóslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 32:
v
Der von Veley gefundene Wert beträgt nur 1,0 . 10—7, ist also zu niedrig.
Besser im Einklang ist der von mir gefundene Wert mit dem von Mauz
aus Leitfähigkeitsbestimmungen abgeleiteten. Er fand K, = 8,6. 10-7.
Bei der Bestimmung der zweiten Dissoziationskonstante wurde wieder
ein regelmäßiger Gang wahrgenommen. Wenn die Messungen bei einem
py kleiner als 3 mit Tropaeolin 00 statt mit Thymolblau ausgeführt wurden,
fand ich niedrigere Werte für die Wasserstoffionenkonzentration.
Zweite Dissoziationskonstante von Strychnin.
Zusammensetzung der Lösung Py | Indikator | PoH | [OH] | Ka. 1017
E er
|
EEE. + 25cm) _ _ | 3,3 | Methylorange | 10,9 (1,25. 1071 1,25
EPEE E 125 , | Sr | 2,5 | Thymolblau | 11,7 la ? Ee 1,8
nes + 20,0 „ 2,25; A 11,95 | 1,13, 10-12, 36
Im Mittel X, = 2,2. 10-12
Pk, — 11,70
Ganz richtig ist diese Zahl nicht, weil die Schwankungen ziemlich
groß sind. Die zweite Konstante beträgt 2(+ 1). 10-12, während Veley
die viel größere Konstante von 6. 10-11 fand. Bei der Bestimmung des
Löslichkeitsproduktes wurde folgendes wahrgenommen.
Zusammensetzung der Lösung || Beurteilung nach einem Tage
ito o AS RRE == ee green
a + 0,5 ccm i klar geblieben
EEEs ) + 0,75, sx " kristallinische Abscbeidg. Ph 6,5
apa] tl ECHO n» ` Dn GA
sa + 15 n í n n Pu = 6,5
Das ausgefällte Strychnin ist also im Gleichgewicht mit einer 0,02 n
Strychninnitratlösung, welche ein py von 6,5, also ein po von 7,7 oder
eine Hydroxylionenkonzentration von 2.10-® besitzt. Hieraus ergibt
sich, daß
LStrychnin = 4 - 10-10,
Aus K, und Jistrychnin berechnen wir dann, daß die Konzentration
einer gesáttigten wässerigen Strychninlösung gleich 4,2.10-# ist. Aus
direkten Bestimmungen leitete Mauz eine Löslichkeit von 2,7 . 10-4 mol. ab.
Aus den beiden Dissoziationskonstanten des Strychnins leiten wir ab,
daß das py einer Strychninnitratlösung ist:
py = 14,2 — Y, (6,00 + 11,70) = 5,35.
In einem schön aussehenden Handelssalz fand ich in einer 0,025 mol.
Lösung ein py von 4,95, und in 0,01 mol. Lösung von 5,1. Nach der Um-
kristallisation waren die Werte 5,5 bzw. 5,45. Das Handelssalz enthielt also
einen Überschuß an freier Säure. W.J.M.Mc@ill (l.c.) fand in einer
0,02 mol. Strychninnitratlösung ein Du von 5,42; in 0,01 mol. Lösung von
5,44 und 0,002 mol. Lösung von 5,45.
Die Titration des Strychnins im wässerigen Mittel geschieht am besten
mit Methylrot als Indikator bis zu einer von gelb abweichenden Farbe.
10 cem 0,025 mol. Strychninnitrat nahmen 0,2ccm 0,01 n Natron, bi:
die Farhe des Methylrots ganz gelb war. Bei Anwesenheit von Weingeist
ist Methylrot nicht zu empfehlen, der Umschlag ist sehr unscharf. Eine
Mischung von 10ccm 0.025 mol. Strychninnitrat und 10ccm starkem
Weingeist nahm 1,5 bis 2 ccm 0,01n Natron, bevor die Farbe rein gelb
war. In alkoholischem Mittel ist Bromphenolblau wieder zu empfehlen.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 22
326 J. M. Kolthoff:
Die oben verwendete alkoholische Mischung wurde vom Bromphenolblau
blauviolett gefárbt, war also vóllig alkalisch auf den Indikator. Nach Zusatz
von 0,15 ccm 0,01 n Salzsäure (d.i. 0,6 Äqu.-Proz) war die Farbe grün:
von 0,3ccm gelbgrün. Der Umschlag ist sehr scharf wahrnehmbar. In
wässeriger Lösung ist Bromphenolblau aber nicht zu empfehlen wegen
des vagen Umschlags. Wir finden also, daß für die Titration von wásserigen
Lösungen Methylrot zu verwenden ist; in einem Mittel, das etwa 50 Proz.
Alkohol enthält, ist hingegen Bromphenylblau zu empfehlen.
Brucin hat dieselbe Konstitution wie Strychnin, enthält jedoch noch
zwei Methoxylgruppen.
Bei meinen Versuchen ging ich aus von einem Präparat Brucin, «las
der Angabe nach 4 Mol. Kristallwasser enthalten sollte. Bei der titri-
metrischen Gehaltsbestimmung zeigte es sich, daß es nur etwa 2 Mol.
Wasser enthielt. Dasselbe Resultat gab eine Bestimmung des Rückstandes
nach dem Trocknen bei 100°. Nach den genauen Untersuchungen von
Mauz ist Brucin nach dem Trocknen bei 84° schon wasserfrei. Das von mir ver-
wendete Präparat war zum Teil verwittert, zeigte sich jedoch bei fortgesetzter
Untersuchung genügend rein, um damit die Konstanten zu bestimmen.
Ich stellte eine 0,05 mol. Brucinhydrochloridlösung her, welche für die
Bestimmung der ersten Dissoziationskonstante fünfmal verdünnt wurde.
Erste Dissoziationskonstante von Brucin.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | PoH | [0H] | Kı. 10:
Ee == nn ph = en 77
vn + 0,5 ccm | SE 7,1 Pher olrot | 71 ¡8 .10°* 1.2
ESER)+1 „ (ES , 77 r 65 '3 jr, 12
SERA) +25, (23 | 8.25 Kresolrot 5,95 | 1,13. 10-6 11,3
"I+4 „ | i 87 . Thymolblau , 55 |3 .10-6 1,3
Im Mittel X, = 9,2. Ir:
Dk, = 6,04
Aus den Resultaten ergibt sich, daß Brucin etwa dieselbe Dissoziations-
konstante hat wie Strychnin. Der von Veley!) angegebene Wert von
7,2. 10-% ist viel zu hoch
Die von Mauz aus Leitfähigkeitsmessungen berechnete Konstante
von 9,7.10-° ist hingegen in schöner Übereinstimmung mit meinem
Werte.
Die zweite Dissoziationskonstante «des Brucins ist ebenso wie die des
Strychnins sehr gering.
Zweite Dissoziationskonstante von Brucin.
Zubammensetzäng der Free Py | Indikator PoH u [0H”] l K 102
sala (+ 1,25 cem | = 3.95| Methylorange | 10,25 |5,6 .10-1| 26
Se BEJ p 25 , Les 33 109 |1,25.10-1' 1,35
ss | +125 „ JS: 24 | Thymolblau |118 |16 .10-12/ 1,8
Im Mittel K, = 2.10":
PE, = 11,7
Auch die zweite Konstante des Brucins ist also von derselben Größe
wie die des Strychnins.
Die Löslichkeit des Brucins ist nach der Bestimmung von Mauz
ziemlich groß, die des vierten Hydrats beträgt 1,33 . 10-3 mol. Aus diesem
1) Veley, J. Chem. Soc. 95, 758 (1909).
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 327
Werte und der ersten Dissoziationskonstante des Brucins habe ich das
Löslichkeitsprodukt berechnet:
Lprucin = 9,2 . 107. 1,33 . 10-3 = 1,22. 10-9.
Im Gegensatz zu Strychnin bleibt Brucin längere Zeit in über-
sättigter Lösung. Wahrscheinlich ist dieses Verhalten der verschiedenen
und starken Hydratisierbarkeit des Brucins zuzuschreiben.
er die Reaktion des Monosalzes und die Titrierbarkeit von Brucin
gilt dasselbe, wie bei Strychnin bemerkt ist.
CH,
H,c/ Ch,
Cytisin: |
N HOH
Nach Wolffensteim (l.c., S. 257) ist es am wahrscheinlichsten, daß
Cytisin einen reduzierten. Pyrazolring enthält und gibt er obengenannte
Formel von Eosin als wahrscheinlich an. A. Rauwerda!) hat nach ver-
schiedenen Methoden versucht, die Dissoziationskonstante des Cytisins
zu bestimmen. In untenstehender Tabelle gebe ich einige von meinen
Resultaten. Das Cytisinchlorid war nach wiederholter Umkristallisation
völlig rein erhalten. Es wurden Mischungen hergestellt von 0,05 mol. Cytisin-
chlorid mit 0,05 mol. Cytisin und in denselben pg kolorimetrisch bestimmt.
Erste Dissoziationskonstante des Cytisins.
Züsammensetzung der Losung ' Pu | Indikator | ndikator | Poy | on ` E K. mm
ezésg (+ Leem | 3 e || 6,8 Phenolrot 7,4 4 A 10 8
E25 | 42, m3 || 7,2 a 7,0 1.107 10
22238 l 42 , 82/81 | Kresolrot | 61 | 8.107 go
Im Mittel K, = 9.10-7
PK, = 6,05
Dieser Wert ist in gutem Einklang mit dem, welchen ich zusammen mit
Rauwerda aus der Leitfähigkeit von Cytisinlösungen ableiten konnte. In
untenstehender Tabelle findet man die Äquivalentfähigkeit von drei- und
viermal umkristallisierten Präparaten Sa Das verwendete Wasser hatte
bei 18° eine Leitfähigkeit von 1. 10-6.
_Aquivalentleitfähigkeit 4 von YURI: bei 18°.
| g — gr 5
4 A
; 7
4 mal umkrist.| im Mittel Lo | Ny .10
0,3053 0,3067 E 0,3060 | 00015 , 48
Verwendete Lósung | 3 mal S GE
0,2 mol. Cytisin
Ol „ , | 0,4702 0,4679 0,4690 | 000225 | 5,06
0,05 , » || 0,7860 0,7860 0,7860 0,003 85 | 7,4
00257 ` | 1,100 1,092 1,096 0.005 37 72
0,01 „ ” | 2108 | 2,194 2,151 0,010 5 11,1
0.005 „ j | 3,004 | 3,004 3,004 0,0147 10,8
Im Mittel K, = 7,7 . 1077
pr, = 6,11
1) A. Rauwerda, Physisch-chemische eigenschappen van Cytisine en
de zouten. Diss., Utrecht 1920.
22%
328 J. M. Kolthoff :
Zu bemerken ist, daß man die Leitfähigkeit der frisch bereiteten
Lösungen messen muß, weil sie beim Stehen allmählich zunimmt.
Obgleich das Cytisin eine sekundäre Stickstoffgruppe enthält, ist es
nur eine relativ schwache Base.
Die zweite Konstante ist außerordentlich klein.
Für die Bestimmung der zweiten Dissoziationskonstante des Cytisins
fügte ich zu 10 cem 0,1 mol. Lösung des Monochlorids zunehmende Mengen
0,1l n Salzsäure und bestimmte das py. auf Tropaeolin 00 als Indikator.
Verglichen wurde mit frischbereiteten Salzsäureverdünnungen. Die Tem-
peratur war 18% Die Dissoziationskonstante wurde in der gewöhnlichen
Weise berechnet nach der Gleichung:
(PT. J.Euo
[BOH'](H]
[B"] wurde der Konzentration des entstandenen Bisalzes gleich-
gesetzt. Die Konzentration des letzteren ist gleich der Differenz zwischen
der zugefügten Menge Salzsäure und der Wasserstoffionenkonzentration
der Mischung.
[BOH'] wurde der übriggebliebenen Menge des Monosalzes gleich-
gesetzt.
KR, =
Zweite Dissoziationskonstante des Cytisins.
Zusammensetzung der Mischung | IH’ Ka. 1013
10 « cem 0,1 mol. Cytisinchlorid + 0,52 ccm 0,1 1.
A e
|
Salzsäure ee RR 2 „10-3 1,07
10 ccm 0,1 mol. Cytisinchlorid + 0,7 eem 0,1 n |
BALZSRULG: ¿a a ee a , ZY. Ir? 1,10
10 ccm 0,1 mol. Cytisinchlorid + 0,78 ccm Oln `
SAIZSHUTE: u. ad a A a ran Sr 3 Lü? 1,10
10 eem 0,1 mol. Cytisinchlorid + 1 cem 0,1 n
Salzsaure. . A e ee A 4 Ir? 1,05
10 ccm 0,1 mol. Cytisinchlorid + 1,22 ccm 0,1 n |
Salzsaure . oa een | 5 Ich 1,02
10 ccm 0,1 mol. ('vtisinchlorid + 1,43 eem 0,1 n |
Salzsäure 0 ee da 6 .1073 1.01
Im Mittel X, = 1,05. 10713
PK, = 12,98
Wenn man das Verhältnis zwischen den Aktivitäten des Bi- und Mono-
ions gleich 0,8 setzt, so findet man für K, einen Wert von 8,4.10-1% oder
PRK, = 13, 08.
Weil das Cvtisin sich wie eine zweisáurige Base verhält, kann man aus
dem Hydr olysierungsgrad eines Monosalzes nicht einfach die erste Konstante
berechnen. In Ubereinstimmung damit nimmt das py einer Cytisinchlorid-
lösung beim Verdiinnen regelmäßig zu.
pm von Cytisinchloridlósungen.
Konzentration | PH
01 ESCH | 4.25
0.05 „ 4.35
001 ` | 48
005, 5,0
Aus dem Obenstehenden ergibt sich schon, daß man Cytisin nicht mehr
genau auf Methylrot titrieren kann. Der Umschlag tritt zu frúh auf und
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 329
ist sehr unscharf. Besser geeignet ist Dimethylgelb, Methylorange oder
Bromphenolblau. Besonders wenn man neben einer Vergleichslösung von
Cytisinchlorid titriert, ist die Bestimmung sehr genau. So nahmen 50 cem
einer 0,02 mol. Cytisinlösung 9,9% ccm 0,1l n Salzsäure auf Dimethylgelb.
Opiumalkaloide.
PY
Papaverin:
) H,
pa
ee
N
OCH;
Bei den Untersuchungen mit Papaverin und dessen Salzen bin ich vielen
Schwierigkeiten begegnet. Wie sich aus dem Untenstehenden ergeben wird,
scheint der Salzfehler des Papaverinions auf Indikatoren sehr groß zu sein.
Wie sich zeigte, reagierte das Papaverinion mit vielen Anionen, wie Nitrat,
Chromat usw. unter Bildung von schwer lóslichen Salzen. Ich unterstelle
nun, daß das Alkaloidion auch imstande ist, mit Indikatoranionen zu
reagieren unter Bildung von schwer lóslichen Salzen. Mit Bromkresolpurpur
konnte ich dies leicht nachweisen. 10ccm 0,05 mol. Papaverinchlorid gab
nach Zusatz von 10 Tropfen 0,1proz. Indikatorlósung eine Fállung. Ich
werde nun zuerst das Verhalten von Papaverinchloridlösungen mit ver-
schiedenen Indikatoren beschreiben. Ich bin dabei von zwei Präparaten
ausgegangen: das erste war „kryptopinfreies Papaverinhydrochlorid Merck“,
das zweite war aus dem ersteren erhalten durch Umkristallisation aus
0,01 n Salzsäure. Beide Zubereitungen verhielten sich vollkommen gleich.
Eine 0,05 mol. Lösung beider Zubereitungen zeigte auf Methylorange
ein py von 4,3. Beim Verdünnen ändert sich diese Farbe nach der alkalischen
Seite hin. Auf Dimethylgelb war das pp derselben Lösung 3,8. Wie wir
sehen werden, ist letzterer Wert am zuverlässigsten, weil er dem berechneten
aus der Dissoziationskonstante am meisten entspricht (py ber. 3,72).
Dennoch scheint das Papaverinion auch mit dem Dimethylgelb zu reagieren,
denn wenn man so viel Lauge hinzusetzt, daß der Indikator ganz in die
alkalische Form übergeführt ist, so ist die Farbe nicht rein citronengelb,
sondern sie hat einen Stich ins Orange. Auf a-Dinitrophenol als Indikator
hatte die 0,05 mol. Papaverinchloridlösung ein py von 4,0.
Auf Bromphenolblau war das py gar nicht zu messen. Während der
Indikator in den gewöhnlichen Puffermischungen einen Dichromatismus
zeigt (in dünneren Schichten blau, in tieferen Schichten rot), war die Farbe
in der Papaverinlösung rein blau. Ich unterstelle, daß die Alkaloidsalz-
lösung ziemlich stark den roten Teil des Spektrums adsorbiert. Sogar in
sehr verdünnter Papaverinchloridlösung (0,0001 mol.) ist die Farbe blauer
als in einer alkalischen wässerigen Lösung ohne Alkaloid.
20 ccm der 0,05 mol. Papaverinchloridlösung nahmen nach der Volhard-
titration 9,85 ccm 0,1 n Silbernitrat. Nach dem Zusatz von Salpetersäure
wurde ein ölartiger Niederschlag von Papaverinnitrat gebildet. Die Mohr-
titration lieferte keine guten Resultate, weil das Papaverinchromat gefällt wird.
330 J.M. Kolthoff:
Bei der Bestimmung der Dissoziationskonstante des Papaverins taten
sich auch wieder verschiedene Schwierigkeiten vor. Zuerst mußte in stark
verdünnter Lösung gearbeitet werden, wegen der Schwerlöslichkeit des
Papaverins. Aber auch dann schien der Salzfehler noch ziemlich grol}
zu sein. Nach Zusatz von noch mehr Wasser änderte das py sich oft sehr
merkbar, während man dieses Verhalten in den puffernden Mischungen
von Papaverinsalz und freiem Papaverin nicht erwarten würde. Bei sehr
großen Verdünnungen scheinen wir einen konstanten Wert zu erreichen.
Die wahrgenommenen Erscheinungen sind in folgender Tabelle zusammen-
gestellt.
Dissoziationskonstante des Papaverins.
Menge |, | |
rei At | pu Indikator | Pon OH" i 10°
peppra e eO o pae ee ` cem.. See E A = SE GE EE,
bcem 0,01 mol. | 10 |49 ` Methylrot Er a .10-0
Papaverinchlorid 30 5,1 | 91 8 ,10-10 |
+ 0,5ccm 0,01 n 50 DI. 9,1 8 „1010! 7,2
NaOH 80 on | | 9,1 |8 Ion
10 5,6 y Dintpheno 86 |25. 0
5 cem 0,01 mol. 50 A4 | 88 |16 al
Papaverinchlorid 80 154. | 88 | 16.107 f 9
+ lccm 0,0l n 10 | 5,3 Methv rot 8,9 1,25. 10-?.. (6)
NaOH 30 5,5 g | 87 |20 .10-°| (8)
50 |56 i 86 |25 .10->' 10
ET. z -9
5 cem 0,01 mol. 10 cn ” 3,9 3,2. In |
) | 50 ¡61 81 18 ua
Papaverinchlorid ý a
Ju 30 Les | 80819 cz
+ 2,5öccm 0,01 n 60 1615 S 805 |9 10-9 ' 9
NaOH la S i ]
50 : 6,2 | Bromkresolpurpur | 80 ¡10 .10-°1 10
Im Mittel X = 8,5. 107?
pg = 8,07
Das Wasser, das bei der Verdünnung verwendet wurde. war kohlen-
säurefreies Leitfähigkeitswasser mit einer Leitfähigkeit von 1,4. In Im
Mittel finden wir eine Konstante von 8,5.10—9, entsprechend px = 8,07.
Mauz fand einen viel größeren Wert, den er aus der Leitfähigkeit einer
gesättigten Papaverinlösung ableitete; er fand K = 2,8.10—"7. Ich bin
jedoch nicht überzeugt, daß sein Präparat cryptopinfrei war. Helen (l. c.)
gibt nur einen angenäherten Wert von 9.1073; weil jedoch die meisten
seiner Bestimmungen falsch sind, ist diesem Wert nicht zuviel Bedeutung
beizulegen. Sicher festgestellt ist die Konstante des Papaverins also noch
nicht; eine potentiometrische Untersuchung wäre erwünscht.
Mit dem von mir gefundenen Wert für die Dissoziationskonstante
berechne ich ein py für eine 0,05 mol. Lösung von Papaverinchlorid
von 3,72, während ich auf Dimethylgelb einen Wert von 3,8 feststellte.
Mit der von Mauz bestimmten Dissoziationskonstante berechne ich ein
Dep von 4,50; also zu niedrig.
Bei der Titration von Papaverin ist Methylrot nicht als Indikator zu
verwenden, weil die Base dafür zu schwach ist. Geeignete Indikatoren sind
Dimethylgelb, Methylorange und Bromphenolblau. Bei Verwendung von
Dimethylgelb muß man in 0,05 n Lösung bis zum pr = 3,8 titrieren. Fügt
man zu cem 0,05 mol. Papaverinchlorid 0.2cem 0,01 n Salzsäure
(d.i. 0.8 Äqu.-Proz.). so ändert sich die Farbe deutlich nach der sauren
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 331
Seite. Mit Methylorange hat man bis zum pr = 4,3 zu titrieren in 0,05 n
Lösungen. Der Umschlag ist dann ebenso scharf wie bei Verwendung von
Dimethylgelb. Die Methylorange-Indigomischung ist dahingegen nicht zu
verwenden. Mit Bromphenolblau kann man ohne Vergleichslösung arbeiten,
weil «ler Indikator in Papaverinchloridlösungen seine alkalische (blaue) Farbe
hat. Fügt man zu cem 0,05 n Papaverinchlorid 0,2 ccm 0,01 n Salzsäure,
so ändert sich die Farbe des Indikators deutlich nach grün. Demnach gibt
der Indikator bei der Titration des Papaverins nicht so scharfe Resultate
wie die Azoindikatoren. Bei Anwesenheit von Weingeist ist es mir nicht
gelungen, einen Indikator zu finden, der einen guten Umschlag gab.
Unten gebe ich einige Resultate von Titrationen mit Papaverin, das
in einem Überschuß Säure gelöst und mit Lauge zurücktitriert wurde.
Das Molekulargewicht des Papaverins ist 339.
938 mg Papaverin gelöst in 30 ccm 0,1n HCl; Methylorange als
Indikator: bis py = 4,0; gebunden 27,5 ccm 0,1 n Säure entspricht 932 mg
Papaverin: bis pr = 4,8 (alkalische Farbe), gebunden 27,0 cem 0,1 n Säure
entspricht 915 mg Papaverin.
ee j | neoe SE) | Indikator - |c Gebunden ccm | Gefunden mg
ig | cn | Br 0,1 n Ken Papaverin
678 | 2 | Dimethylgelb 8 37 ae 200 | 678
329 105 | | 37 10,0 339
678 | 25 Methyloran ge | 4,0 20, A | 678
339 | 105 Ñ 4.0 10,0 339
339 | 10,5 , Bromphenolblau — 10, 05 | 341
Im letzten Falle wurde titriert, bis die Farbe noch eben grún war.
Auch habe ich direkte Titrationen ausgeführt, indem ich das Papaverin
in Weingeist löste und mit Salzsäure titrierte. Bei Verwendung von Brom-
phenolblau kann man dann wohl gute Resultate erhalten, wenn man am
Ende stark mit Wasser verdünnte. Empfehlen kann ich die Methode jedoch
nicht.
Die Titration von 0,01 n wásserigen Papaverinlösungen ist natürlich
weniger scharf als die der 0,1l n Lösungen. Unter den richtigen Verhält-
nissen beträgt die Genauigkeit etwa 2 bis 3 Proz.
Narcotin: HA |
OL
|
E
d JOC H,
OC H,
Weil ich kein Salz des Narcotins zur Verfügung hatte, habe ich das
Chlorid aus dem Alkaloid hergestellt. Es ergab sich, daß das Chlorid in
332 J. M. Kolthoff:
Wasser und. Weingeist zu gut löslich war, um es aus diesen Flüssigkeiten
umzukristallisieren. Ich habe das Chlorid daher einige Male mit einer
Alkohol-Äthermischung gefällt, abgesaugt, mit Alkohol-Äthermischung
ausgewaschen und schließlich mit verdünntem Weingeist. Das luft-
trockene Präparat wurde bei den Versuchen verwendet. Nach Angaben
in Beilstein hat das Chlorid die Zusammensetzung C„H„NO,HCIH,O.
Das von mir bereitete Chlorid verlor nach dem Trocknen bei 90° 10,8 Proz.
Wasser. Dies entspricht einem Hydrochlorid mit 3 Molen Kristallwasser.
Die Chlorbestimmung wies auch auf einen Kristallwassergehalt von 3 Molen
hin. Annehmend, daß die richtige Formel C„H„NO,HC13 H,O war,
stellte ich eine 0,05 mol. Lösung her. 20 ccm nahmen nach der Volhard-
titration 9,85 ccm 0,1 n Silbernitrat, während dasselbe Volumen Narcotin-
chlorid bei Anwesenheit von 30 cem Weingeist 9,95 ccm 0,1l n Lauge auf
Phenolphthalein nahm. Bei letzterer Titration wurde das Alkaloid trotz
der Anwesenheit des Weingeistes gefällt. Bei der Bestimmung der Disso-
ziationskonstante begegnete ich wieder denselben Schwierigkeiten wie bei
Papaverin beschrieben sind. Das Narcotin ist außerordentlich schwer
löslich (vgl. unten beim Löslichkeitsprodukt); in allen Fällen, auch bei
sehr großer Verdünnung, mußte nach der Herstellung der Mischung von
Narcotinchlorid und Lauge schnell gemessen werden, weil sonst das Alkaloid
ausgefällt wurde.
Dissoziationskonstante des Narcotins.
Menge | |
Z t 2 S E
We Ee | Ree EA Indikator | PoH [OH’] KE . 108
5ccm 0,01 n Narcotin» ee y 20 | 52 | | Methy lrot | 90 | .10-°
chlorid + 0,5ccm : 40 | 5,4 | » l 8, 1,6 . 10-°
001n NOH |) 80 "au i 88 | Lë In
5ccm 0,01n Narcotins 40 5.8 | 8,4 2,5 .10-9
EE EE 80 6,4 | Brömkresolpurpur | 7,8 1,6 . IR
one 280 | 6,4 | Bromthymolblau | 7,8 Lë. 10-8 | L
Im Mittel X = 1,5. 10-7“
pK = 7,83
Im Mittel finden wir also eine Konstante von 1,5. 10-38, entsprechend
px = 7,83. Mauz leitete aus seinen Leitfähigkeitsbestimmungen in ge-
sättigten Narcotinlösungen einen Wert von 8. 10-3 ab. Weil das Alkaloid
so schwer löslich ist, ist diese Konstante wahrscheinlich etwas zu hoch.
Veley fand K = 7,9.10-3. Aus Messungen mit der Wasserstoffelektrode
leitete Fr. Müller einen Wert ab von 0,73. 10-8 (24%). Jedoch waren seine
Messungen, wie er selber bemerkt, nicht ganz einwandfrei, weil ein Teil
der Base während der Bestimmung gefällt wurde.
Bei der Bestimmung des Löslichkeitsproduktes habe ich eine große
Reihe von Versuchen ausgeführt. Sogar aus sehr verdünnten Narcotin-
lösungen wird das Alkaloid durch eine Spur Lauge ausgefállt. Narcotin-
chloridlösungen selbst sind schon so stark hydrolysiert, daß sie übersättigt
an Narcotin sind.
5 ccm 0,002 n Narcotinchlorid + 0,05 ccm 0,01 n NaOH : Fallung
5. 0,001 n ô +0.05 „ 901n ZC Te Pg= 50 (Methylrot)
10 „ 0001 n $ + 0035 „ 001 n e >: © Pg” 50 ( e )
10 „ 0,001 n E +005 „ 00n 2» o. P=50 ( ` y
Dissozrationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 333
Aus diesen und mehreren anderen Versuchen konnte gefolgert werden,
daß das Narcotin im Gleichgewicht war mit einer Narcotinchloridlösung,
welche 0,00092 n war und ein pg von 5,0, d.i. ein pon von 9,2 oder [O H']
von 6,4. 10-10 hatte. Daraus ergibt sich das Löslichkeitsprodukt des
Narcotins:
LNarcotin = 9,2, 10—4. 6,4. 10-10 = 6. 10-13,
Aus LNarcotin und K, berechnen wir eine Löslichkeit in Wasser von
4 . 10— 3 mol., entsprechend 20 mg Narcotin im Liter. Mauz fand nach
der direkten Bestimmung 17,4 mg im Liter.
Von dem sehr geringen Löslichkeitsprodukt des Narcotins kann man
in der Analyse Vorteil haben bei der Trennung von anderen Alkaloiden.
Nehmen wir z.B. an, daß wir zu einer Mischung von Alkaloidsalzen eine
Puffermischung fügen, so daß pu = 6,2, dann ist [OH'] = 10-8.
Nach dem Löslichkeitsprodukt entspricht diese [OH’] einer Narcotin-
ionenkonzentration von 6. 10-5n. Es wird also so lange freies Narcotin
gefällt, bis die Narcotinionenkonzentration gleich 6. 10-3 ist.
Eine 0,05 mol. Lösung des Narcotins hatte auf Dimethylgelb ein pa
von 3,75; auf Methylorange von 4,4. Auf Bromphenolblau war die Farbe
rein blau.
Für die Titration des Narcotins sind Methylorange und Dimethylgelb,
ebenso wie beim Papaverin, die geeigneten Indikatoren.
Narcein: HC
Das Narcein enthält außer der Stickstoffgruppe auch noch eine
Carboxylgruppe. Es verhält sich also als Säure und als Base; ich habe
daher versucht, ks und Er, zu bestimmen. Dabei bin ich ausgegangen von
einer Handelszubereitung Narceinchlorid, das nach Schmidt die Formel
C„H;;NO,HC13H,O hat (M = 535,5). Eine Chlorbestimmung nach
Volhard konnte nicht ausgeführt werden, weil das Chlorid sich in Säure
nicht löste, und das Alkaloid beim Erwärmen in salpertersaurem Mittel
durch Oxydation gelb gefärbt wurde. Ich habe daher 535,5 mg Narcein-
chlorid mit Wasser gekocht und noch warm auf Phenolphthalein titriert.
Der Umschlag war scharf; gebunden waren 9,9 ccm 0,1 n Natron. In der-
selben Flüssigkeit wurde nach der Titration der Chlorgehalt nach Mohr
bestimmt; gebunden 9.8ccm 0,1n Silbernitrat. Das Narceinchlorid ist
so stark hydrolysiert, daß es sich nicht mehr in Wasser löst. Sogar eine
durch Erwärmen bereitete 0,005 mol. Lösung ist so stark hydrolysiert,
daß nach Übernachtstehen wieder Kristalle von Narcein ausgeschieden
werden. Eine in der Wärme bereitete 0,01 mol. Lösung scheidet beim Ab-
kühlen sofort wieder Kristalle aus. Bei der Bestimmung der Dissoziations-
konstante mußte also in sehr verdünnter Lösung gearbeitet werden.
334 J. M. Kolthoff:
Bestimmung der basischen Konstante k, des Narceins.
| Zugesetzt [freies [Narceins
; e [ron mm | a | Mt a 11
O E n | PH | Indikator POH [OH’] Alkaloid] ion] ‚10
1.25 com , 3,55, Methylorange lorange 10,65 2,24 . 10-11] 1,53 . 10-310,97 65/2,24 . 10-11] 1,53 . 10-3) 097.1 10-3! 1,45
|
dasselbe, zweis
n 10,55 2,8 . 10-11
mal verdünnt 3,65 1,47. 10-3 11,03. 10-3 des
2cem 14,05 S 10,15/7,1 10-1121 .10-3514,1 .10- -4| 14
2.25 com | 4, 6 | Methylrot | 96 [25 .10-10227.10-3,23 .10-4| 25
2,5 com (Aqui. | | |
valenzpunkt) 17 ,2 | Phenolrot | 7,0 | — | — d "e
Im Mittel k» =
pr, = 10,7
Veley konnte die Konstante nicht bestimmen: ebensowenig gelang
dies Fr. Müller, der an der Wasserstoffelektrode Reduktionserscheinungen
wahrnahm.
Wegen der starken Hydrolyse war die Rechnung ziemlich verwickelt.
Ich habe daher in der Tabelle die zugehörigen berechneten Konzentrationen
an freiem Alkaloid und Alkaloiden auch angegeben. Im Mittel finden wir
die sehr niedrige Konstante von 2. 10-11,
Bestimmung der sauren Konstante k; des Narceins.
Lü eem 0,0025 mol. Narceinchlorid mit 0,0l n NaOH.
ec cem 0,01 n NaOH | Pu | Indikator ator 3 | Im ` In: ] Ka . 1010
u = Zeg, ee m en IR A nl
3 ccm TI, 8,75 | Phenolphthalein | 18. 10-* 4,5
3,75 „ | 922 | , | 60. 10-19 | 60
4,25 „ ! 9 65 | 23. 10-10 | 5,3
45 „ l 9,95 ` Thymolphthalein | 11. 10-10 | 4.4
Im Mittel k=5. 10-10
Pr, = 9,3
Das Narcein ist also eine stärkere Säure als Base. Daher wird der
isoelektrische Punkt bei saurer Reaktion liegen. Wir können die Reaktion
beim isoelektrischen Punkte berechnen nach der Gleichung:
k La 93
. 8
[H lz. P = Ve y kuo ==, Vo 10- + 10— 14.2 = 10-64,
Der isoelektrische Punkt liegt beim py = 6,4. Hier muß das Narcein
also eine minimale Lóslichkeit haben. Zur Bestátigung habe ich die Lóslich-
keit des Narceins in einigen Puffermischungen und auch in Wasser bestimmt.
Die Konzentration des Narceins wurde oxydometrisch festgestellt.
Für die Bestimmung sehr kleiner Mengen Alkaloide ist diese Methode
besonders zu empfehlen. Man fügt in ganz reine Erlenmeyerkolben mit
eingeschliffenem Stöpsel einen bekannten und großen Überschuß 0.1n
Permanganat, 5 bis 10 cem reine stickstofffreie 4 n Schwefelsäure und die
Alkaloidlösung. Auf 10 cem 0,001 mol. Alkaloidlösung soll man im all-
gemeinen wenigstens 20 ccm 0,1m Permanganat verwenden. Man läßt
24 Stunden stehen, fügt Kaliumjodid hinzu und titriert mit Thiosulfat.
Bei den Versuchen setzt man auch eine blinde Probe ein von Permanganat
und Schwefelsäure allein, und bestimmt ın anderen Proben, wieviel Per-
manganat von 10 oder 20 cem 0.001 mol. Alkaloidsalzlösung verbraucht wird.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 335
So reduzierten 10 ccm 0,001 mol. Narceinlösung nach 24 Stunden
Stehen 6,22ccm 0,l n Permanganat, nach 48 Stunden 6,6ccm. In der
beschriebenen Weise ist die Löslichkeit des Narceins in untenstehenden
Flüssigkeiten bestimmt.
Zusammensetzung der Flüssigkeit
Löslichkeit
1,34 . 10-3
Leitfähigkeitswasser . (der ges. Lösung)
Phosphatpuffer 1,31. 10-3
> 1,60, 10-3
= el 1,70. 10-3
Die minimale Löslichkeit liegt also beim py von etwa 6,2, während
es nach der Berechnung bei pg 6,4 liegen müßte. Rechnen wir, daß die
minimale Löslichkeit des Narceins 1,3. 10-3 ist, so finden wir für das
Löslichkeitsprodukt
als Base = LNarcein OH = ]Narc‘] [OH’] 2,6. 10-14,
„ Säure = £Lnacinh = [Narc'][H"] = 6,5. 10-13,
Bei der Analyse neben anderen Alkaloiden kann man von dem oben-
stehenden natürlich wieder Vorteil haben, zur Abscheidung des Narceins
bei pm 6.2. Übrigens unterscheidet sich Narcein auch von den meisten
anderen Alkaloiden, daß es glatt löslich ist in Basen.
Weil die basischen und sauren Konstanten so gering sind, kann man
Narcein auf Farbenindikatoren weder als Base noch als Säure bestimmen.
Die Salze des Narceins sind sehr stark hydrolytisch gespalten. So hatte
eine 0,001 mol. Narceinchloridlösung ein py von 3,3!
HAL —NCH;
Theba in:
Hat Lë
ME
Bei meinen Versuchen verwendete ich ,Thebainhydrochlorid Merck“.
20 ccm der 0,05 mol. Lösung nahmen bei Anwesenheit des gleichen Volumens
starken Weingeist 9.9 cem 0,1n Natron auf Phenolphthalein.
Die Konstante wurde bestimmt durch Messung von pg in Mischungen
von 0,01 n Thebainchlorid mit 0,01 n Natron und Wasser.
Dissoziationskonstante des Thebains.
Zusammensetzung der Lösung | PH $ Indikator | PoH | [O H'] |K . 107
E ET + ce mj SG + 0.45 eimi) SE 7,1 Phenolrot | 8 .10-* 8
322, -10 , 12+2 a „ Ss 815| Kresolrot | 6,05 | 9.1077 9
ng E +10 , 2+4# , |5Z 88 |Thymolblau| 54 | 4.107"
Im Mittel K =
pk = 6,05
336 J. M. Kolthoff:
Bei der Bestimmung des Löslichkeitsproduktes wurden folgende
Resultate erhalten:
5ccm 0,01n Thebainchlorid
+ 0,8 „ 0,01n NaOH: keine Fällung,
+ 0,9 ,, yY0ln NaOH: nacn 4 Stunden schwache Kristallabsetzung
PH = 7,6,
+1 ,, 0,01nNaOH: nach 4 Stunden schwache Kristallabsetzung
PH = 7,6,
+ 1,5 „ 0,01 n NaOH: stärkere Fällung.
Aus diesen Versuchen ergibt sich, daß das Lóslichkeitsprodukt über-
schritten ist in einer Lósung mit einer Thebainionenkonzentration von
8.10-3 und py = 7,6 oder poH = 6.6 oder [O H”] von 2,5. 10-7. Also ist
Erhebain = 8-10-3.2,5. 10-7 = 2. 10-9.
Hieraus und aus der Dissoziationskonstante des Thebains finden wir
eine Löslichkeit des Thebains in Wasser entsprechend einer Konzentration
von 2,2. 10-3 oder 685 mg im Liter.
In wässeriger Lösung ist Thebain scharf auf Methylrot titrierbar.
Eine 0,05 mol. Thebainchloridlösung hat auf Methylrot ein pg von 4,95.
Beem der Lösung mit einem Tropfen 0,01 n Natron geteilt, ist schon voll-
kommen alkalisch auf den Indikator. Bei Anwesenheit von Weingeist ist
der Umschlag auf Methylrot vag; in diesem Falle ist Bromphenolblau
wieder zu empfehlen.
Hate NC Ha
CH;
HOHC/ SCH!
Morphin: HU
A T SC
HE O9 -H
|
HON H;
Das Verhalten von dieser wichtigen Substanz, welche auch vom
physiko-chemischen Standpunkt so interessant ist, habe ich eingehend
untersucht. Das Morphin enthält eine Stickstoffgruppe und ist zudem
ein Phenol; es hat also basische und saure Eigenschaften.
Bei meinen Versuchen bin ich ausgegangen von Morphin, das zweimal
aus Weingeist umkristallisiert wurde. Es enthält dann noch 1 mol. Kristall-
wasser, das es beim Trocknen nur schwer abgibt. Nach Dott!) verliert es
bei 90° alles Wasser. Nach Mauz kann es bis 84° erhitzt werden, ohne daß
es sein Wasser abgibt, erst bei 95° fängt das Gewicht an, langsam abzu-
nehmen. Um es wasserfrei zu erhalten, muß bei 120° getrocknet werden.
W. Göhlich?) fand, daß Morphin beim Trocknen bei 100° nur Spuren Wasser
verlor, bei 120° gibt es alles Wasser ab. Heiduschka ?) und M. Faul trockneten
4 Stunden bei 95 bis 100%; das Präparat hatte sein Kristallwasser nicht
verloren. N. Evers*) erhielt sein Präparat wasserfrei nach dem Trocknen
bei 115% Das von mir bereitete Präparat verlor sein Kristallwasser nicht
nach dem Trocknen bei 90°. Ich bereitete daraus mit der berechneten
1) Dott, Pharm. Journ. Transact., 3. Serie, 1884, S. 701; Ref. in Arch.
Pharm. 226, 325, 1898.
2) W.(@öhlich, Arch. Pharm. 238, 631, 1895.
3) A. Heiduschka und M. Faul, ebendaselbst 255, 441, 1917.
t) N. Evers, Journ. Amer. Pharm. Assoc. 10, 666, 1921.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 337
Menge Salzsäure eine Morphinchloridlösung, mit welcher die Bestimmungen
für die Berechnung der Dissoziationskonstante ausgeführt sind. Später
habe ich sie mit denselben Resultaten wiederholt mit einer Morphinchlorid-
lösung, welche aus einer reinen Zubereitung hergestellt war. In unten-
stehender Tabelle sind die pg-Werte angegeben in Mischungen von 0,01 n
Morphinchlorid mit 0,01n Natron. Das Morphin bleibt in übersättigter
Lösung. Das Resultat der letzten Messung können wir nicht ohne weiteres
umrechnen, weil wir ganz in der Nähe vom isoelektrischen Punkte sind.
Ich habe daher die Werte zwischen Klammern gesetzt.
Bei der Berechnung ist: angenommen, daß das Morphinchlorid völlig
in die Ionen gespalten ist.
Dissoziationskonstante des Morphins als Base: kp».
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | Don | [O H'] | wK. 107
7,1 Phenolrot 7,1 ¡8 .10-° Ä 7,2
553 + LcomO01n NaOH | 715| Neutralrot | 705 9 jos 81
ssl+2, s, M 71,45 Phenolrot 6,755 18.10 7,2
ES +5 j 8,1 E 61 |8 .1071 g
SE nn n A 8,1 Kresolrot 61 18 .107 f
So gd 8 5
"118,5 Pherolphthal.
+
00
3
3
3
Ia 2,0. 10-6 | 5
Im Mittel kè = 7,5. 10°
Pky = 6, 13
Wenn wir annehmen, daß das Morphinchlorid für 90 Proz. in die
lonen gespalten ist. so finden wir eine basische Dissoziationskonstante von
6,8 . 10— 7, entsprechend px, = 6,17. Mauz leitete aus seinen Leitfáhigkeits-
bestimmungen eine Konstante von 1,2.10-6 ab. Er nahm bei seiner
Berechnung jedoch keine Rücksicht darauf, daß Morphin sich auch wie
eine Säure verhält. Der von ihm gefundene Wert ist daher zu niedrig.
Bei der Bestimmung der Dissoziationskonstante als Säure bin ich auch
wieder ausgegangen von einer 0,01 n Morphinchloridlösung. Wenn man
zu Deem dieser Lösung 5ccm 0,01n Natron hinzufügt, so erhält man
eine übersättigte Morphinlösung, die nicht auskristallisiert. Fügt man
mehr Lauge hinzu, so wird der größte Teil derselben zu Morphinat ge-
bunden. Weil die Hydroxylionenkonzentration in bezug auf die gebildete
Menge Morphinat so gering ist, können wir ohne einen Fehler zu machen
annehmen, daß alle Lauge vom Morphin zu Morphinat gebunden wird.
Die Berechnung gestaltet sich dann sehr einfach. Nehmen wir z.B. an,
daß zu 5ccm 0,01 n Morphinchloridlösung 6 ccm 0,01 n Lauge hinzugesetzt
ist. Dann ist das Verhältnis zwischen Morphinat und Morphin gleich 1:4.
Multipliziert mit der Wasserstoffionenkonzentration erhält man dann die
Dissoziationskonstante als Säure.
Dissoziationskonstante des Morphins als Säure: ks.
ar der Lösung d PH | Indikator | Li | ie 1010
„(+5 cem 0,0In NaOH| 8,8 | Phenolphthalein |1,6 .1079
esa +55 = 8.9 , 1.25.10-° | 14
SEENEN | 9,3 S 50 .10-0| 125
z (+75 = = ı 98 Thymolphthalein |1,6 .10-10! 1,6
Im Mittel k, = 1,4. 10-10
— 985
Pr,
338 J. M. Kolthoff:
Der isoelektrische Punkt, d.i. die Wasserstoffionenkonzentration, bei
der die maximale Menge des Morphins im undissoziierten Zustand vorliegt,
bei der also die Löslichkeit minimal ist, muß bei alkalischer Reaktion liegen,
weil k, viel kleiner ist als Er. Aus diesen beiden Konstanten können wir
berechnen, daß die Wasserstoffionenkonzentration beim isoelektrischen
Punkte [H']7. p:
H a Droe 10-142 = 10-396
[H]; p = Eto = piore A SS
Beim isoelektrischen Punkte von Morphin ist py also 8,96. Heiduschka
und Faul (l.c.) haben aus indirekten Bestimmungen die Löslichkeit von
Morphin in Ammoniak-Ammoniumchloridmischungen berechnet. Aus
ihren Versuchsdaten leite ich ab, daß die minimale Löslichkeit liegt zwischen
einem Verhältnis von Ammoniumchlorid und Ammoniak, von 1 auf 0,75 Mol.
und 1 auf 0.50 Mol. Nehmen wir mit Noyes, Kato und Sosmar!) an, daß die
Dissoziationskonstante von Ammoniak bei 18% gleich 1,72. 10-3 ist, so
liegt die minimale Löslichkeit zwischen py 9,05 und 9,23, also angenähert
bei pr 9,15. Weil die Bestimmungen der Löslichkeit nach Mitteilung von
Heiduschka und Faul nicht ganz genau sind, und der berechnete Wert
von pg beim isoelektrischen Punkte die Fehler in den Dissoziationskon-
= stanten in sich hat, so ist die Übereinstimmung zwischen dem berechneten
(8,96) und dem von Heiduschka und Faul gefundenen Werte (9,15) be-
friedigend.
Bei der Bestimmung von Morphin neben anderen Alkaloiden ist es
natürlich von großem Interesse zu wissen. bei welchem pg das Alkaloid
am vollständigsten abgeschieden wird. Ich habe daher die Löslichkeit des
Morphins in Puffermischungen von Natriuncarbonat und Natrium-
bicarbonat bestimmt. F. Auerbach und H. Pick?) haben von einer großen
Reihe solcher Mischungen das py kolorimetrisch gemessen. Ich habe bei
den Versuchen die 0,2 mol. Mischungen verwendet, weil diese eine gute
Pufferwirkung haben. In trockenen Kólbchen wurden 20 ccm Pulfer-
mischung pipettiert, hierzu wurde genau Beem 0,1 mol. Morphinhydro-
chloridlösung gefügt. Sodann ließen wir die Kólbchen 3 Tage verschlossen
stehen, so daß kein Morphin mehr in übersättigter Lösung vorhanden sein
konnte. Dann wurde filtriert und im Filtrat das pg kolorimetrisch be-
stimmt durch Vergleichung mit den ursprünglichen Puffermischungen. In
weiteren 20 cem des Filtrats habe ich das Morphin nach der Permanganat-
methode mit 0,1n Reagens (vgl. bei Narcein) bestimmt. Die Resultate
sind in untenstehender Tabelle mitgeteilt.
Löslichkeit von Morphin in Mischungen von 0,2 mol. Natriumcarbonat (a)
und 0,2 mol. Natriumbicarbonat (b).
) | N Su e S
"eg der "SEO | mm im ptn | Dëse
10 burdO a 8,35 | 8,3 ı 20,5 .10-tmol.
95b „ 05a 8.90 8,4 143 IO,
90b „ 10a ' 9,15 8.65 8,62.10-* ,
80b „ 20a | 9.45 9,1 5,66 It „
0b , 30a | 9,65 | 9,4 | 6,35. 10-74 ,
1) Noyes, Kato und Sosman, Zeitschr. f. physik. Chem. 71, 1, 1916.
2) F. Auerbach und H. Pick, Arb. d. Kais. Ges. Amt. 3S. 243, 1911.
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 339
Wir finden also bei einem py im Filtrat von 9,1 eine minimale Löslichkeit
des Morphins. Dabei ist zu bedenken, daß Auerbach und Pick bei ihren
Bestimmungen keine Korrektur für den Salzfehler angebracht haben. Weil
dieser in diesen ziemlich konzentrierten Salzlösungen etwa — 0,2 pp beträgt,
so finden wir, daß der korrigierte Wert für ze bei der minimalen Löslichkeit
bei py von etwa 8,95 liegt.
Weiter finden wir, daß die minimale Löslichkeit des Morphins gleich
5,6 . 10—4 mol. ist, oder 165 mg im Liter, d.i. 1: 6000. Dies ist in guter
Übereinstimmung mit dem Werte, den Mauz für eine gesättigte wässerige
Morphinlösung bei 18° fand, nämlich von 4,7 . 10-4. oder 143 mg im Liter,
.d. 1.1: 7000. Heiduschka und Faul fanden in Wasser mit einer Leitfähigkeit
von 2. 10-6 sec/Ohms bei 18% eine Löslichkeit von 1: 5516, oder 181 mg
im Liter, d. i. 6,1. 10—4 mol. Dieser Wert ist wahrscheinlich etwas zu hoch
wegen des Kohlensäuregehalts des Wassers. Auch die anderen im Schrift-
tum angegebenen Werte sind zu hoch. Im Mittel können wir wohl annehmen,
daß die Löslichkeit des Morphins bei 18° gleich 5. 10-4 ist, entsprechend
147 mg im Liter.
Aus den Werten für die Dissoziationskonstanten des Morphins, das
Ionenprodukt des Wassers, und die totale Löslichkeit im Wasser, können
wir die Zusammensetzung einer gesättigten Morphinlösung berechnen.
Die Berechnungsweise ist ziemlich verwickelt, so daß ich sie an anderer
Stelle mitteilen werde. Das Resultat ist, daß py der gesättigten Lösung
gleich 8,92 ist, oder [H] = 1,2. 10-9. Die Konzentration des uv-
gespaltenen Teiles des Morphins ist 4,1. 10-4, die der Anionen 4,7 . 1075,
die der Kationen 5,1. 10-5 mol.
Bei der Berechnung der Ionenprodukte als Säure und als Base müssen
wir also annehmen, daß die molare Konzentration des ungespaltenen
Morphins in einer gesättigten Lösung gleich 4,1.10-% ist. Wir finden
dann für das Löslichkeitsprodukt
als Base:
L Morph OH = [Morph’][OH’] = 3,1. 10—10,
als Säure:
L Morph H = [Morph'] [H'] = 57.10-14.
Aus den Löslichkeitsbestimmungen von Heiduschka und Faul des
Morphins in Ammoniak von verschredenen Konzentrationen, konnte
ich nun auch das Löslichkeitsprodukt des Morphins als Säure berechnen.
Das Morphin reagiert in folgender Weise mit Ammoniak:
MorphH + NH,OH —> Morph’ + NH; + H,O.
Die total gelöste Menge Morphin ist also die Summe der Menge, welche
der Löslichkeit des Morphins im Wasser entspricht (4,1. 10—%) und der
Konzentration der Morphinationen. Ziehen wir also von der von Heiduschka
und Faul gefundenen Totalkonzentration 4,1. 10-*% ab, so finden wir die
Konzentration der Morphinationen. Diese Konzentration ist gleich der
der Ammoniumionen, welche bei der Salzbildung aus Ammoniak gebildet
werden. Die totale Ammoniumionenkonzentration ist größer, weil ein Teil
auch entsteht bei der Dissoziation des Ammoniaks. Nennen wir die Konzen-
tration dieses Teiles z, so ist [OH’J] = x und
[NH,] = [Morph’]) + x
340 J. M. Kolthoff:
Aus der Dissoziationskonstante des Ammoniaks finden wir dann, daß
([Morph’] + x)x
[NH,OH]
Wenn wir x berechnet haben, finden wir für (H`):
= Kun, = 1,72, 10-3.
In dieser Weise sind alle Werte der folgenden Tabelle berechnet.
o al des e als Säure.
` i l
„Ammonisk- | [Morph.] | SH ` mm | op H10
0,1 2,38 . 10-3 | 5,8 „10-4 |
0,2 3,54 ,10-3 | 7,7 .10-4
0,588 7,7 ,1073 | 1,14.10-?
1 9,7 .10-3 | 1,53. 10-3 m
2,94 1,37.10-2 | 3,00.10-3 |
15,88 2,71.10-2 | 3,45. 10-3
Im Mittel ee Gë = 2,8. 10-14
Die Übereinstimmung mit dem von mir berechneten Werte von
5.7.10-14, ist also sehr befriedigend. Aus dem Löslichkeitsprodukt von
2,8 . 10—14 und einer Löslichkeit von 4,1. 10— 4 berechne ich eine Dissozia-
tionskonstante als Säure von 0,68.10-10. In ganz anderer Weise hatte
ich 1,4. 10-10 gefunden.
Über die Reaktion von Morphinchloridlösungen findet man im Schrift-
tum verschiedene Angaben. Ich werde darüber an anderer Stelle aus-
führlicher berichten und hier nur kurz meine eigenen Resultate mitteilen.
Aus der Dissoziationskonstante als Base können wir das pp von
Morphinchloridlösungen berechnen. Ich habe dabei angenommen, dau
der Dissoziationsgrad einer 0,1 mol. Morphinchloridlösung 0,8 ist. der
einer 0 95 mol. Lösung 0,85, der einer 0,01 mol. Lösung 0,9.
EN }
a uo. _ 1710-182
[m] D = EE
i 1 hlorids $ p | a h l )
Morphiumehlori | [H | b ber. PH ber. PH gef F Gill | sg
0,1 275.10: 456 | — | 398 |
0.05 2.105 47 4,8 3,99 < 3,65
0.01 9,1 .10- 5.05 5,15 3,99
0.005 | 66 `10-6 518 Aë | au |
Die von McGill (ei und Evers (l. c.) gefundenen Werte sind ganz
fehlerhaft. Zu meinen eigenen Resultaten ist folgendes zu bemerken.
Eine 0,05 mol. Lösung von einem Handelssalz Morphinchlorid in
reinem Wasser hatte auf Methylrot ein py von 5,4. Nach der Umkri-
stallisation aus Wasser ein Du von 6.0! Offenbar enthält das Salz also
eine Spur freies Morphin und nimmt diese Menge beim Umkristallisieren
zu. Ich habe daher ein Handelssalz zweimal aus Alkohol umkristallisiert
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 341
bei Anwesenheit von sehr wenig Salzsäure, gut ausgewaschen usw. Dann
erhielt ich Werte, welche in der Tabelle mitgeteilt sind und in guter
Übereinstimmung mit den berechneten sind.
Über die Titrierbarkeit des Morphins werde ich an anderer Stelle auch
ausführlicher berichten. Das Resultat der Untersuchung war, daß Morphin
in wässerigem Mittel ganz scharf auf Methylrot titrierbar ist. Sogar eine
0,01 n Lösung läßt sich auf 0,4 Proz. genau auf diesen Indikator titrieren.
Mc Gill empfiehlt Bromphenolblau, das jedoch in verdünnter, wásseriger
Lösung nicht so gut brauchbar ist wie Methylrot. Bei Anwesenheit von
50 Proz. Weingeist fand ich jedoch, daß Methylrot einen unscharfen Um-
schlag gibt, Bromphenolblau dahingegen zu empfehlen ist, wenn man
zu einer grünen Farbe titriert. Sogar in 0,01 n Lösungen ist der Umschlag
dann auf einen Tropfen scharf wahrzunehmen.
Codein, Monomethylester des Morphins. Bei der Bestimmung der
Dissoziationskonstante bin ich ausgegangen von einer Handelszubereitung,
die aus Weingeist bei Anwesenheit von einer Spur Salzsäure umkristallisiert
wurde. Aus der Chloridbestimmung und der Titration auf Phenolphthalein
mit Natron ergab sich, daß die Konzentration der Lösung der abgewogenen
Menge Salz entsprach.
Dissoziationskonstante von Codein.
Zusammensetzung der Lösung PH Indikator | POH | [OH | K .107
«21 + 0,5ccm 0,01n NaOH 7,18) Phenolrot
ser Hl å e E 6,60 10
2,+25 , = a Kresolrot 6,05 9
Balte „ , i Phenolrot | 5,45 9
nS +45 „ ” n = 5,15 8
| Im Mittel k = 9.107
pr = 6,05
Weise und Levy!) fanden eine Konstante von 1. 10-7,
Bei der Vergleichung der Konstante des Codeins mit der des Morphins
sehen wir, daß die Einführung der Methoxylgruppe fast gar keinen Einfluß
auf die Größe der Konstante der basischen Gruppe hat.
Das Verhalten von Codeinsalzen ist dasselbe wie das von Morphin-
salzen. Eine 0,05 mol. Codeinchloridlösung aus einer Handelszubereitung
hergestellt, hatte ein pg von 5,6; nach der Umkristallisation aus saurem
Weingeist 5,3 (ber. 4,75). Es scheint also, daß auch dieses gereinigte Salz
noch eine Spur freie Base enthält. In Übereinstimmung damit fand ich,
daß das pg beider Lösungen sich beim Verdünnen nicht änderte.
Ebenso wie Morphin ist Codein in wässeriger Lösung scharf titrierbar
auf Methylrot. ` Beem 0,05 mol. Codeinchloridlósung sind nach Zusatz
von 0,12 eem 0,01n Natron (d.i. 0,5 Äqu.-Proz.) vollkommen alkalisch
auf Methylrot und vollkommen sauer auf diesen Indikator nach Zusatz
von 0,04 ccm 0,01 n Salzsäure (0,16 Äqu.-Proz.).
Bei Anwesenheit von Weingeist ist der Umschlag dahingegen wieder
unscharf. Eine Mischung von Beem 0,05 mol. Codeinchlorid und 5 ccm
starkem Weingeist nahm 1,8ccm 0,0l n Natron, bevor die Farbe rein
gelb war und 0,1 ccm 0,01n Salzsäure, bevor die Farbe ganz rot war. Bei
1) Weise und Levy, Journ. Chim. Phys. 14, 261, 1916.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 23
342 J. M. Kolthoff :
Anwesenheit im Weingeist ist Bromphenolblau wieder zu empfehlen. Eine
Mischung von 5ccm und 5ccm starkem Weingeist ist noch blau gefärbt
auf diesem Indikator. Nach Zusatz von 0,1ccm 0,01 n Salzsäure ist die
Farbe schon grünblau, von 0,2ccm 0,01 n Säure grúngelb.
Durch verschiedene Titrationen konnte ich dann bestätigen, daß in
wässeriger Lösung mit Methylrot, in 50 Proz. alkoholischer Lösung, mit
Bromphenolblau ganz genaue Resultate erhalten werden.
Dionin, Äthylmorphinchlorid. Bei den Versuchen ging ich aus von
einer Zubereitung von Fr. Bayer. Die 0,05 mol. Lösung hatte ein pg von 4,8
(ber. 4,75), die 0,01 mol. Lösung 5,0 (ber. 5,1). Die Dissoziationskonstante
wurde wieder aus py berechnet in Mischungen von 0,01 mol. Dionin mit
0,01n Natron.
Dissoziationskonstante des Dionins.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | PoH | [OH’] | A .107
S 7,15 Bromthymolbl. 7,05 | ia A
SE DEE 1715 Phenolrot | 708 1 9-10 SI
38)41 „| 00ln ı 7,55 R 6,65 | 22.10” ¡ 90
Z2) +25 „ [NaOH |815, Kresolrot ; 605 ' 9.10-7 ' 90
32144, 18,6 | Thymolblau | 56 25.10-4 | 62
e (+45 „ li 8,951 e ı 5,25 . 57.106 | 63
Im Mittel K = 7,6. 10-7
px = 6,12
Praktisch können wir also sagen, daß Morphin, Codein und Äthyl-
morphin dieselben Dissoziationskonstanten als Base haben. Das Athyl-
morphin hat ebensowenig wie das Codein saure Eigenschaften.
Von den Eigenschaften einer Dioninlösung und die Titrierbarkeit des
Äthylmorphins gilt genau. dasselbe, was bei Codein gesagt ist.
Apomorphin: |
dee
Hof"
EIN
Das Apomorphin verhält sich ebenso wie das Morphin wie eine schwache
Base und eine sehr schwache Säure.
Bei meinen Versuchen ging ich aus von „Apomorphinhydrochlorid
Merck‘, das fast ganz farblos war, die 0,05 mol. Lösung war nur schwach
gefärbt. 10ccm dieser Lösung nahmen bei Anwesenheit von Chloroform und
unter starkem Schútteln 4,9 ccm 0,1n Natron auf Phenolphthalein. Ohne
Chloroform findet man etwa 20 Proz. zuviel Lauge gebunden, während
dieser Fehler bei Anwesenheit von Weingeist noch größer wird.
Beem 0,01 mol. Apomorphinchlorid nahmen 6 ccm 0,01 n NaOH auf
Phenolphthalein, mit 5ccm Weingeist etwa 6,7 com 0,01 NaOH.
Das py der 0,05 mol. Lósung war 4,2 (Methylorange), der 0,01 mol.
Lósung 4,5 (Methylorange); nach Berechnung aus der Dissoziationskonstante
" Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 343
sollten diese Werte 4,25 bzw. 4,6 sein. Bei der Bestimmung der basischen
und sauren Dissoziationskonstante hatten wir große Schwierigkeiten wegen
der geringen Löslichkeit des Apomorphins, daher mußten die Mischungen
stark mit Wasser verdünnt werden.
Dissoziationskonstante als Base Er des Apomorphins.
Zusamnensolsung der aus PH Indikator PoH | O a BL ko -10° ‚107
— un a A ae A e ere
+ 20 cem} + 0,5ccm o 6,2) Bromkresolpurpur | 8,0 10- 8 ag
+40 , +r » lol Gë S 76 | 25.108 | 1,0
SEJ+80 , +25 „ 15| 7,2. Phenolrot 7,0 1.107 | 10
As X af 7,3 Kresolrot 6,9 | 125.10” | 1,25
ch E "KN +4 „Is las Neutralrot 66 | 25.107 | 2,5)
ei Sl 7,8| Kresolrot 6,4 4.107 | 10
Im Mittel & = 1.10-
Pky = 7,0
Bei den meist alkalischen Lösungen mußte schnell gemessen werden,
weil die Flüssigkeit schnell anfing sich grün zu färben. Eigenartig war das
Verhalten von Bromthymolblau. Die beiden ersten Mischungen, welche
in der Tabelle genannt sind, hatten eine rein gelbe Farbe auf diesen Indikator.
Daraus würde man schließen, daß das py kleiner als 6,0 war! Das Apo-
morphin scheint also stark auf den Indikator einzuwirken und einen großen
Fehler zu verursachen.
Bei der Bestimmung der Dissoziationskonstante als Säure habe ich:
auch wieder Mischungen von Apomorphinchlorid und Lauge hergestellt,
welche möglichst schnell gemessen wurden. Die Pufferlösungen, welche
zur Vergleichung dienten, wurden mit Indikator versehen fertiggestellt.
Über die Berechnungsweise vergleiche bei Morphin.
Dissoziationskonstante als Säure k, des EE
Zusammensetzung der Li r Lösung | Pa Pa| hal Indikator | er |k ID | kg 1
get (+ 90 ccm S +6 cem} ar 8,4 | Phenolphthalein 4 Ir 1 0
s3£j +9% , 3 +75 „ ¡32 |90 y 1.109 10
"elt a EPE y
S S SŽ |94 | » 4.100] Lë
Im Mittel ke — 1 ‚2. 10-9
Pk, = 8, 92
Aus den Werten von k, und k, können wir wieder berechnen, daß
der isoelektrische Punkt liegt bei einer Wasserstoffionenkonzentration
o
Py beim isoelektrischen Punkte ist 8,06.
Das Löslichkeitsprodukt wurde wieder bestimmt in der Weise, wie
früher abgeleitet war. Die Versuche konnten nicht so genau gemacht
werden wie bei den anderen Alkaloiden. Mit einer Apomorphinionen-
konzentration von 1,5.10-3 und einer Hydroxylionenkonzentration von
2,5.10-3 in der Lösung, war das gefällte Alkaloid im Gleichgewicht.
Daraus berechnen wir ein Ionenprodukt als Base:
LApomorphin OH = etwa 4. 10-11.
Hieraus und aus der Dissoziationskonstante leiten wir eine Löslichkeit
des Apomorphins im Wasser ab von 4. 10-* molar.
23 *
344 | J. M. Kolthoff:
Von der Titrierbarkeit des Apomorphins gilt wieder dasselbe, was
bei den vorigen Alkaloiden gesagt ist. Im wässerigen Mittel ist Methylrot
geeignet, bei Anwesenheit von Weingeist ist Bromphenolblau zu empfehlen.
H ydrastis-Alkaloide.
CH,
o N H,
Hydrastin: HCC |
OL, NCH,
NS
5H
|
CH-O
|
Eë
q
Das Hydrastin hat also ungefáhr dieselbe Konstitution wie Narcotin.
In Übereinstimmung damit werden wir sehen, daß wir auch dieselbe Disso-
ziationskonstante für Hydrastin finden, wie beim Narcotin bestimmt ist.
Bei meinen Versuchen bin ich ausgegangen von „Hydrastin Merck“, von
dem ich 393 mg (M = 393) in 10 ccm 0,1 n Salzsäure löste. Diese Lösung
wurde in einem Maßkolben bis zu 100 ccm verdünnt und zeigte dann ein py
von 4,1 auf Methylorange. Bromphenolblau zeigte in der Lösung eine
andere Farbe wie in der Pufferlösung und war daher zur Messung von Py
nicht zu verwenden.
Bei der Bestimmung der Dissoziationskonstante mußten die meist
alkalischen Lösungen wieder stark verdünnt werden, weil sonst das Alkaloid
gefällt wurde.
Dissoziationskonstante von Hydrastin.
2(+0,5ccm 0,01 n NaOH ` 55| Methylrot |87| 2.10-9| 1,8
et +d » D » 8,3 5.10 | 2,0
23) Dasselbe + 30 ccm Wasser 58 Ñ 84 | 4.10-°| Lë
53) + 20ccm) 5 + 2,6ccm] 001 n || 6,4 |Bromkresolpurp. 7,8 | 1,6 . 10-8 | Lë
33 +20 d +4 E | ,9 | Phenolrot |7, |5,0.10-8| 1,25
E ” j3 n 7,1 | Neutralrot | 7,1 | 8.10-8| 2,0
Im Mittel K = 1,7. 1078
pk = 1,17
Für ein Narcotin fanden wir ein pk von 7,84.
Veley gibt an, daß die Dissoziationskonstante des Hydrastins etwa
gleich 1. 10-7 ist.
Bei der Bestimmung des Löslichkeitsproduktes wurde folgendes
wahrgenommen:
Bestimmung des Löslichkeitsproduktes des Hydrastins.
= Zeg ` Se Séier
| Am nächsten Tage
Zusammensetzung der Lösung AA“ AO
| Aussehen | Pa | POH
5cem 0,01 n Chlorid + 0,7 cem 0,01 nun ' klar |
5, n nm +09 , n O | ”
D > a +10 , e e ` Spuren Kristalle abgesetzt | 5,7 8,5
5, 5 > +12, | Schöne Kristalle abgesetzt | 5,5 8,7
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 345
Die dritte Lösung, welche Spuren Kristalle abgesetzt hatte, war nach
ltäg. Stehen noch nicht im Gleichgewicht. Aus den obenstehenden und
anderen Versuchen konnte ich ableiten, daß das feste Hydrastin im Gleich-
gewicht war mit einer Lösung, welche 7.10—3n an Hydrastinsalz war
und eine Hydroxylionenkonzentration von 2.10—9 hatte. Daher finden
wir für das Lóslichkeitsprodukt
l LHydrastin = 1,4 . 10-11.
Aus L und K berechnen wir dann eine Löslichkeit des Hydrastins
in Wasser, welche einer Konzentration von 8,2. 10-* mol. entspricht.
Für die Titration des Hydrastins ist Methylorange oder Dimethylgelb
am geeignetsten. Wenn die Endkonzentration etwa 0,0l n ist, so nimmt
man eine Vergleichslósung mit pg von 4,2; ist sie 0,1 n, so titriert man bis
zum Py 3,9. Bromphenolblau ist in wässeriger Lösung nicht so geeignet
wie die beiden Azoindikatoren.
Eine Mischung von 10 ccm 0,01 n Hydrastinchlorid und 10 ccm starkem
Weingeist ist ganz sauer auf Bromphenolblau. Sie nimmt etwa 0,25 ccm
0,01 n Lauge, bevor die Farbe anfängt sich nach grün zu ändern. Es ist
also zu empfehlen, Hydrastin in wässerigem Mittel zu titrieren.
or NCH,
Hydrastinin: H,CÍ
NO
Wenn man am Kohlenstoffatom & eine OCH,-Gruppe einführt,
erhált man Cotarnin (vgl. bei Narcotin). Beide Substanzen sind quaternáre
Stickstoffbasen; es ist also zu erwarten, daß sie sich wie starke Basen ver-
halten werden. In der Tat konnte dies bestätigt werden. Bei den Ver-
suchen bin ich ausgegangen von ,,Hydrastininhydrochlorid Merck‘. Die
Lösung hatte eine gelbe Farbe und eine starke Fluoreszenz. Daher sind
alle kolorimetrischen Messungen im Komparator ausgeführt. Das Hydro-
chlorid änderte die Reaktion des Wassers nicht.
Dissoziationskonstante des Hydrastinins.
Zusainmensetzungcder Lösung | PH | Indikator | POH | oni |x 103
+1 cem) ¿ty [10,2 |Salicylgelb G
5 com +25 „ lo
0,05n Chlorid | + 10 a
+ 15 Zi
pai
©
| 11,60 S
Im Mittel X 24. 1078
pk = 2,62
Die Konstante ist also ziemlich groß, daher ist die Unsicherheit in
dem von uns gefundenen Werte auch etwas größer als bei den anderen
Alkaloiden. Wenn man die in der Tabelle genannten Mischungen einige
Tage gut verschlossen stehen läßt, so nimmt die Hydroxylionenkonzen-
tration ab. Wahrscheinlich findet eine Tautomerisation statt.
346 J. M. Kolthoff:
Berberin: HC | | or
Hier haben wir also auch eine quaternäre Stickstoffgruppe. Ich habe
eine Handelszubereitung Berberin zweimal aus Alkohol umkristallisiert.
Dann wurde bei 18° eine gesättigte Lösung in Wasser hergestellt, das
Wasser abgegossen und dies so oft wiederholt, bis die Leitfähigkeit konstant
blieb. Das verwendete Wasser hatte bei 18° eine Leitfähigkeit von
1,1.10—6sec/Ohm und die gesättigte Lösung bei 18% von 1,98. 10—4sec/Ohm.
Wenn wir annehmen, daß die Äquivalentleitfähigkeit des Berberins bei
unendlicher Verdünnung gleich 22 + 174 = 196 ist, so finden wir, daß
eine Leitfähigkeit von 1,98. 10-* einer Hydroxyl- und Berberinionen-
konzentration entspricht von 1,01. 10-3n.
Die totale Konzentration des Berberins in der Lösung wurde kolori-
metrisch bestimmt durch Vergleichung der Farbe mit der von Berberin-
lösungen von bekanntem Gehalt. Die Messungen sind am schärfsten in
alkalischem Mittel von Soda auszuführen, die Farbe ist dann orangebraun ;
in saurer Lösung ist sie gelb. In dieser Weise fand ich, daß die totale Konzen-
tration des Berberins gleich 1,3 . 10-3 n ist. Der ungespaltene Teil ist daher
(1,3 — 1,01) 10-3 = 0,29. 10-3 mol. und die Dissoziationskonstante
. 10— 3)2
D = 2,47.
Wahrscheinlich ist dieser Wert noch etwas zu klein. Jedenfalls sehen
wir, daß das Berberin sich ebenso wie das Hydrastinin wie eine ziemlich
starke Base verhált.
Aus den Bestimmungen können wir weiter ableiten, daß
L Berberin = l D 10-6.
CH,
H HH |
H¿C¿4—C - - -C —C—N
Pilocarpin: N i ycH
— 0—C C—N
| H, H
Pilocarpin enthält den Glyoxalinring (Imidazol) und ist eine zwei-
säurige Base. Bei den Versuchen ging ich aus von Pilocarpinchlorid, von
dem eine 0,05 mol. Lösung hergestellt wurde. 20 ccm dieser Lösung nahmen
9,4ccm 0,1n Natron auf Phenolphthalein; wurden dann 20 ccm starken
Weingeists zugefügt, so wurden 10,0 cem Lauge verbraucht. Statt Weingeist.
Dissoziationskonstante, Lóslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 347
kann man auch Chloroform hinzufügen; es wird dann die berechnete Menge
Lauge gebunden.
Für die Berechnung der ersten Dissoziationskonstante habe ich pg
gemessen in Mischungen von 0,01 mol. Pilocarpinchlorid und 0,01 n Natron.
Erste Dissoziationskonstante des Pilocarpins.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | PoH | [OH'] | K, . 108
AAA _ ea ae See Se Ee E
6,1 Methylrot 9 10-9 81
e H
ESE d Sie nn 0.01n [6,1 | Bromthymolblau E
Kä: 4 NaOH || 6,95 Phenolrot 7,28 | 5,7. 1078 5,7
SOLE E 117,65 p 6,55 | 28.107 | 7
i Im Mittel K, = 7 . 10-8
' pk, = 7,16
Nach Helen beträgt die erste Dissoziationskonstante etwa 1. 10-7,
nach den Messungen von Fr. Miller mit der Wasserstoffelektrode 1,07.10-7
(18%). Die Übereinstimmung mit meinem Werte ist also befriedigend.
Die zweite Dissoziationskonstante ist sehr klein. Bei den Berechnungen
habe ich angenommen, daß das Mono- und Bisalz denselben Dissoziations-
grad haben. Hierdurch wird die Konstante etwas zu hoch berechnet; der
Fehler ist in bezug auf die Genauigkeit der Messungen vernachlässigbar.
Zweite Dissoziationskonstante des Pilocarpins.
mm
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator | PoH | [O H7 | K3.1013
ger be 1,12 cem | „ _ [3,3 | Methylorange | 10,9 | 1,25. 10-11 4
El Er aro (ue 1,1 .10-12| Lë
57
Im Mittel K, = 2,77. 10-33
Pk; — 12,
Veley gibt den viel größeren Wert von 4,2. 10-11 an.
Eine 0,05 mol. Pilocarpinchloridlösung hatte ein py von 4,7; die des
Nitrats von 4,9. Die 0,01 mol. Chloridlösung ein py von 4,85. Für die
Titration des Pilocarpins sind Methylorange, Dimethylgelb oder Brom-
phenolblau am geeignetsten. Der Umschlag auf Methylrot ist vag und tritt
zu früh auf. Beem 0,05 mol. Pilocarpinchloridlösung nahmen etwa 1 ccm
0,01 n Natron, bevor die Farbe des Methylrots rein gelb war. Bei Anwesenheit
von gleichem Volumen Weingeist ist der Umschlag noch unschärfer und wird
fast alle gebundene Salzsäure titriert, bevor der Indikator seine alkalische
Farbe angenommen hat. Eine 0,05 mol. Pilocarpinchloridlösung hat auf
Bromphenolblau eine blauviolette Farbe; 5 ccm verbrauchten 0,2 cem 0,01 n
Salzsäure, bevor die Farbe gelbgrün war. Bei Anwesenheit von gleichem
Volumen starken Weingeists ist Bromphenolblau der einzige brauchbare
Indikator. Eine Mischung von 5 ccm 0,05 mol. Pilocarpinchlorid und
5ccm starkem Weingeist hatte eine hellgrüne Farbe nach Zusatz des
Indikators. Nach Zusatz von 0,3ccm 0,01n Natron war die Flüssigkeit
rein blau und von 0,1 ccm 0,01n Salzsäure gelb.
lIsopilocarpin. Nach Fr. Müller ist die erste Dissoziationskonstante
bei 18% 6,8. 10-3; pz = 7,17.
348 J. M. Kolthoff:
Aconitin. Cay H,NO,, Die Konzentration dieses Alkaloids ist noch
nicht erkannt. Zuerst verwendete ich bei meinen Versuchen Aconitinnitrat.
Es zeigte sich jedoch, daß die Löslichkeit dieses Salzes zu gering war für
meine Zwecke, die gesättigte Lösung entsprach einer Konzentration von
2,6. 10— 4 mol.
Daher habe ich aus ,,Aconitin Merck'* Aconitinchlorid hergestellt.
322 mg des Alkaloids nahmen 5,0 ccm 0,1n Salzsäure auf Methylrot.
Dissoziationskonstante des Aconitins.
Zusammensetzung der Lösung | PH | Indikator " POH | [0H] | E. 106
a E rar er een A a
S (+0,5cem 17,1 Phenolrot 7,1 [9 .10-8| 0,72
si | H Se S 0,01 n En Kresolrot ls en
56 | +25 ` |Ne0H 34 | Thymolblau 28 1,6
e UFE „ 19,15 a 55 | 9 10-6| 22
Im Mittel K — Lä 10-6
Pk — 5,88
Im Gegensatz hiermit fand Veley einen Wert von nur 3.108.
Bei der Bestimmung der Löslichkeitsprodukte zeigte es sich, daß die
Löslichkeit des Aconitins sehr gering ist. Sogar eine Mischung von 5 ccm
0,01 mol. Aconitinchlorid mit 0,1 ccm 0,01n Natron, welche geimpft war,
gab nach 24 stündig m Stehen noch eine sehr geringe Fëllung. Ich konnte
ableiten, daß das Aconitin im Gleichgewicht war mit einer Lösung, welche
8.10-3 n an Aconitinchlorid war und eine Hydroxylionenkonzentration
6,4. 10-8 hatte. Daraus finden wir:
Laconiin = 8- 10-3.6,4.10-8 = 5. 10-10,
Aus L und K berechnen wir dann eine Löslichkeit von Aconitin im
Wasser, welche einer Konzentration von 4. 10-* mol. entspricht, oder
260 mg im Liter.
Aus der Größe der Dissoziationskonstante können wir schon ableiten,
daß Aconitin auf Methylrot scharf titrierbar ist.
In der Tat konnte ich dies bestätigen. Bei Anwesenheit von gleichem
Volumen Weingeist ist der Umschlag wieder unscharf, aber in diesem Falle
ist Bromphenolblau wieder zu empfehlen. Eine Mischung von 5 ccm 0,01 mol.
Aconitinchlorid mit 5 ccm starkem Weingeist wurde vom Indikator blau
gefärbt, nach Zusatz von 0,l cem 0,0l n Salzsäure war sie grünblau, von
0,2 cem 0,0l n Säure grüngelb.
Colchicin. CG Has NOs. Das von mir verwendete Präparat von Merck
löste sich sehr gut in Wasser. Eine 0,05 mol. Lösung änderte die Wasser-
stoffionenkonzentration des Wassers nicht. Hieraus können wir schon
ableiten, daß das Colchicin sich nur wie eine äußerst schwache Base ver-
halten kann. In Wirklichkeit fand ich dann auch, daß die Basenstārke
des Colchicins von der Ordnung de: Harnstoffe; ist. Nach Windaus
enthält das Colchicin die —-N H—C O C, H;-Gruppe, in welcher die Stickstoff-
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 349
gruppe also nur äußerst schwache Basenfunktion haben kann (vgl. mit
Eiweißsubstanzen).. Die Dissoziationskonstante habe ich berechnet aus
Messungen von pg in Mischungen von 0,05 mol. Colchicinlösungen mit
0,01n Salzsäure. Die Berechnungsweise ist nicht sehr einfach und wird
hier fortgelassen.
Dissoziationskonstante des Colchicins.
Zusammensetzung der Lösung | PH Pu | Indikator | POH on || (OH) K ms
Sii j + 0,5 cem ) a 3,6 | Methylorange | 10,6 | 2,5. 10-11 3,3
E 5134 g 108 | 16.101 | 49
3 0 11,2 6,4 10-12 5
0,05 mol. 1
Colchiein \ D 2,5 E SI S
Im Mittel K = 45.10-13
pk —12,35
N
Das Colchicin ist also auf keinen Indikator titrierbar.
Zudem können wir bemerken, daß Colchicin aus schwach saurem
Mittel fast ebensogut ausschüttelbar ist in organische Lösungsmittel wie
in alkalischem Mittel. Nur in stark saurer Lösung kann die Salzbildung
merkbar werden.
. Emetin. ` Ce Ba MN: UA, Das Emetin ist eine zweisäurige Base.
Eigenartig genug geben uns Veley und Fr. Müller beide nur eine
Konstante an, und zwar, wie sich zeigen wird, die zweite Dissoziations-
konstante.
Bei meinen Versuchen hatte ich zwei Zubereitungen von Emetin-
chlorid von verschiedener Herkunft zur Verfügung. Beide verhielten sich
vollkommen analog und hatten die Zusammensetzung C„H4N;,0, 2 HO
4 H,O. Man kann alle gebundene Säure titrieren auf Phenolphthalein als
Indikator bei Anwesenheit von Chloroform. 10 ccm 0,033 n Lösung nahmen
SS SE } 00,1n Natron, während nach der Volhardtitration 33,0 ccm
0,01n Silbernitrat verbraucht wurden. Mit stärkeren Lösungen wurden
analoge Resultate erhalten. Bei der Bestimmung der ersten Dissoziations-
konstante mußte wegen der Schwerlöslichkeit des Emetins bei großer Ver-
dünnung gearbeitet werden.
Zweite Dissoziationskonstante des Emetins.
Zusammensetzung der der der Lösung sung | Pg H Indikator | POH 8 om Je K3. w
có + 0,475 cem y ¿HH | 6,6 | Bromthýmolbiai 7,6 |
Sms J +0,95 „ 1-0 705 Phenolrot 7,15 |
e36) +237 „ Se T75 | S 6,7 |
S +4,28 e WER | Kresolrot 61 |
Im Mi
; Bei einer Versuchsreihe mit der anderen Zubereitung des Emetin-
chlorids in 0,086 mol. Lösung fand ich im Mittel einen Wert von 1,5. 10—6,
Nach Veley ist der Wert 2.10-5, also viel zu groß; nach Fr. Müller
8,1. 10-7. Letzterer Wert ist in besserem Einklang mit meinen Resultaten.
350 J. M. Kolthoff:
Erste Dissoziationskonstante des Emetins.
Zusammensetzung der Lösung g der Lösung | De IM Indikator H — Ion Ki, 108
Po
10 ccm |4 1, E a SC S Thymolblou 5,7 „10-6 E
0,00475 mol, f +7 6 5, 3 . 1076
se GE 93 4,9 13° 1,3. 10-5 | 12 ` 12
Im Mittel K, = 1,7. Ir?
Dr, = 5,17
Das Lóslichkeitsprodukt des Emetins berechnet als einsáurige Base:
Hieraus und aus K, berechnen wir eine Lóslichkeit des Emetins in
Wasser, welche einer Konzentration von 2. 10—3 mol. entspricht.
Die erste Dissoziationskonstante ist nur etwa l13mal größer als die
zweite. Daher ist es unmöglich, Emetin wie eine einsäurige Base zu titrieren.
Die Flüssigkeit puffert sehr stark in der Nähe von Monosalz. Dahingegen
ist die zweite Konstante noch groß genug, um Emetin als zweisäurige Base
auf Methylrot titrieren zu können. Der Umschlag ist sehr scharf. Eine
0,025 mol. Emetinchloridlösung hatte auf Methylrot ein pg von 5,2.
Bei Anwesenheit von Weingeist ist Methylrot wieder nicht gut zu
verwenden. Dann ist: Bromphenolblau wieder zu empfehlen.
Solanin. Cs H2NOj; M = 919. 500 mg des von mir verwendeten
Práparats verbrauchten 5,4 cem 0,1 n Salzsäure auf Methylrot. Dimethyl-
gelb und Methylorange sind auch zu verwenden. Man löst in Überschuß
Säure und titriert zurück. Die oben gefundene Titerzahl entspricht einem
Äquivalentgewicht von 925. Das ist also eine gute Übereinstimmung mit
der angegebenen Zusammensetzung nach Zwenger. Das Solanin ist außer-
ordentlich schwer löslich; daher mußte bei der Bestimmung der Dissozia-
tionskonstante stark mit kohlensäurefreiem Wasser verdünnt werden und
nach Herstellung der Mischungen schnell gemessen werden.
Dissoziationskonstante des Solanins.
ER UNE de der Lösung | Pa Pa Indikator | POH | [0H] ` |x. 10°
e ES j + 50ccm) 5 ee ps a Bromtbymolblau| 7,7 2 .1078 1,8
SES + 50, ie 1,1 73 | 5 .10-8 | 20
-=5l+4100 > J3 ES 76 Phenolrot | 6,6 | 25.107 | 25
Im Mittel X = 2,2. 10-*
Pk — 6,66
Bei der Bestimmung der Löslichkeitsprodukte ergab sich, daß in einer
Mischung von Beem 0,0108 n Solaninchlorid, 50 ccm Wasser und 0,5 ccm
0,01n Natron beim Stehen schon eine Fällung des Alkaloids eintrat. Das
De der obenstehenden Lösungen war dann 6,0, also [OH’] = 6,4 . 10-9.
Hieraus berechnen wir ein Löslichkeitsprodukt
Lsotanin = 6,4. 10-12,
Aus L und K finden wir dann eine Löslichkeit von Solanin in Wasser
entsprechend einer Konzentration von 3.10-3 mol. oder etwa 25 mg
im Liter.
Dissoziationskonstante, Lóslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw. 351
Wie schon gesagt, und aus der Konstante abzuleiten ist, ist Solanin
auf Methylrot, Methylorange und Dimethylgelb titrierbar.
Physostigmin (Eserin): Cis Ha, N; Oz-
‚NHCH
co \
unse / CHN CH.
NINZ
NCH,
Die Konstitution ist noch nicht ganz aufgeklärt.
Zu erwarten ist, daß die Gruppe —CO—NH-—-CH, nur sehr schwach
basische Eigenschaften haben wird, so daß das Pilocarpin wie eine zwei-
säurige Base zu betrachten ist. Wie wir sehen werden, ist auch die zweite
Dissoziationskonstante sehr klein, so daß das Alkaloid sich praktisch wie
eine einsäurige Base verhält. -
Bei den Versuchen ging ich aus vom Physostigminsulfat Merck
(Ge Daa N-O: H, BO, Die 0,025 mol. Lösung hatte ein pg von 4,7. Eine
Mischung von 10 ccm dieser Lösung und 50 ccm starkem Weingeist nahmen
5,0 ccm 0,l n Natron auf Phenolphthalein.
Erste Dissoziationskonstante von Physostigmin.
CA Lösung | Pp Indikator Don | [OH’) | Ka. 1013
Do a ee Pe A A
„ (+ 0,5 com Fri | 7,1 Phenolrot 7,1 | 8 1078 | 7,2
gos | T nm E O 1,5 nm 6,7 2 .107 . 80
esa]+ 25 ,, © g | 8,1 Kresolrot 61 | 8 Jr? 8,0
+4 Jeton Thymolblau | 52 | 6,4. Lü? 7,1
Im Mittel K, = 76. 107
Pk, = = 6,12
Die Größe der zweiten Dissoziationskonstante wurde angenähert
bestimmt durch Messungen von py in Mischungen von 5ccm 0,05 n
Physostigminsulfat mit Salzsäure.
Zweite Dissoziationskonstante des ak en
Br El Indikator [Pon Ion [Bisalz] [Monosalz] Ky.1013
1 cem 001n 3,45 Meihylorange (10,75 1,8. 1074 | 13, 1073 .4,2.10° 55
25 „ OOln[31. e 111 8 . 10-12 25. 10-3 3,3. 10-2 6
Im Mittel K, = 5,7. 10-13
Pk, = 12,24
Aus K, und K, berechnen wir einen Wert für das py einer Physostigmin-
salzlösung von 5,0. Die oben verwendete Sulfatlösung hatte in 0,05 mol.
Lösung ein py von 4,7. Physostigmin ist als einsäurige Base gut titrierbar
auf Methylrot als Indikator. Man titriert bis zum pg = 5,0.
Cevadin (kristallisiertes Veratrin. ` CG Dan Oe: M = 591. Ich ver-
wendete eine Zubereitung von Merck, welche den Anforderungen der nieder-
ländischen Pharmocopaea entsprach. 591 mg wurden in 11 ccm 0,1 n Salz-
säure gelöst und auf Methylrot zurücktitriert. Gebunden waren 9,9 ccm
352 J. M. Kolthoff :
0,1 n Säure. Der Umschlag ist sehr scharf; man muß jedoch sehr vorsichtig
zurücktitrieren, weil das Cevadin beim Einfallen der Lauge niedergeschlagen
wird.
Dissoziationskonstante von Cevadin:
EEE A O Ee
10 ccm 0,01n Cevadin- |
chlorid + 0,5ccm 0,01n |
NaOH ....... | 8,1 | Thymolblau 61 | 8 .10-7| 72
10 ccm 0,01n Cevadin- |
chlorid + l cem 0,01n |
NaOH ..... , (as | , 57 | 2 ..10-°| 80
10 ccm 0,01n Cevadin- | |
chlorid + 2,5 ccm 0,01n | | |
NaOH (+10ccm Wasser) || 9,0 | a 5,2 | 6,4 . 10-6 6,4
Im Mittel K = 7,2. 10-6
Pg = 5,15
Das Cevadin ist also eine ziemlich starke Base. Bei der Bestimmung
des Löslichkeitsprodukts ergab sich, daß eine Mischung von cem 0,05 n
Cevadinchlorid und 0,8 cem 0,01n Lauge nach 1 tāg. Stehen noch eben
keine Fällung gab, mit 0,9 ccm 0,01 n war eine kristallinische Abscheidung
gebildet. Das py der Lösung war 8,5, also [OH”] 2. 10—6, die Cevadinsalz-
konzentration 3. 10-2n.
Hieraus finden wir für das Löslichkeitsprodukt:
LCevadin = 6. 1078.
Aus L und K finden wir für die Löslichkeit 8. 10-3 mol.
In wässerigem Mittel ist Cevadin scharf auf Methylrot titrierbar. Bei
Anwesenheit von gleichem Volumen starken Weingeists ist Bromphenolblau
wieder zu empfehlen.
Kurze Zusammenfassung.
1. Alkaloide, welche einsäurige Basen sind und eine Dissoziations-
konstante haben größer als etwa 5 x 10-7, sind scharf auf Methylrot
titrierbar. Wenn die Konstante kleiner ist, muß man Dimethylgelb,
Methylorange oder Bromphenolblau anwenden und titrieren bis zu
der richtigen Wasserstoffionenkonzentration, also mit einer Vergleichs-
lösung. Aus der Dissoziationskonstante ist zu berechnen, bis zu welchem
De man zu titrieren hat. :
2. Bei Anwesenheit von 50 Proz. Weingeist ist der Umschlag auf
Methylrot nie scharf. In diesem Falle ist Bromphenolblau als Indikator
zu empfehlen.
3. In der folgenden Tabelle sind die wichtigsten Versuchsergebnisse
zusammengestellt. Die Werte beziehen sich auf eine Temperatur
von 15° (+ 10).
Dissoziationskonstante, Löslichkeitsprodukt und Titrierbarkeit usw.
Physico-chemische Eigenschaften von Alkaloiden bei 15°.
353
| Dissosiationskonstanten
Alkaloid |
|
l Pk | Pr, Pr |
Pyridin . .......¡ 8,90 |
Piperidin ....... 2,80
Pyrrol......... EAE
Chinolin. ....... | 9,50
Bonn ER EE . | 8,96
A ME al
Novoeain . o... | 5,15 | 11,75
A 0 rr a 3,1
Piperin EENEG | 12,22 |
colin... 2.2... |
Nieotin . 2.0... .. | 6,16 | 10,96 |
Atropin ........ 436 |
Tropacocain...... - | 4,32
Pseudotropin e...) 3,80
Cocan ........ 5,59
Ecgonin .....>°. 11,22 | — nm
Anhydroecgonin . . . . 10,85 | — |10,
Benzoyleegonin .. .. 11,77 | — |11,75
Sparten... s.. a.. ‚A | 9,40
Pelletierin ....... | 4,75
Chinin. essea. 6597| 9,7
Chinidin EEE | 5,43 | 10,0
inchonn ...... + 5,85 | 9,92
Cinchonidin ...... | 580 | 10/03
Cuprein ........ 6,57 | —
een EENE E EE
rychnin ....... g d
Brucin ... sss 6,04 | 11,70
Cytisin. . .. aa. ée e H 6,08 | 13,0
Papaverin ....... | 8,07
Narootin. 222.2... | ze
Narcein ........ | 10,7 — 9,3
Thebain. ....... | 6806| —
Morphin. ....... | 6,13 9,85
Codein H 6,05
Dionin. o e 6,12
Apomorphin. ..... | 7,00 8,92
Hydrastin ....... | 7,77
Hydrastinin ...... 2,62
Berberin. ....... 2,47
Pilocarpin . ...... 7,15 | 12,57
Isopilocarpin. . . . 7,17
Aoonitin. ....... 5,88
Colchicin > P 12,35
un Wuer ren ie 5,77 | 6,64
Ds aora a 6,66
Physostigmin . . .-.. 6,12 | 12,24
Cevadin 2.2.2... 5,15 |
Lóslichkeits»
produkt
. 1077
. 10-8
. 10-8
. 10-9
. 1079
. 10711
10%
.10-?
. 10-10
. 1079
. 10-13
, 10-92
. 10-10
10-11
. 10-11
„10-10
10?
, 10-13
„10-8
Löslichkeit
1,4 .1074
5,5 . 1073 mol.
43 103 ,
4 6,103 ,
6 .10%)
7,2 . 1074
48 Ir?
9 Ir
10-3
2,7 .10-*
1,33 . 10-3
4 rh
LA rz?
22 10-3
5 Ir
A 107 4
8,2 .10-*
4 .10-711
2 .10-3
3 .105
8 .10-3
Allgemeines Prinzip zur Bestimmung
verschiedener Substanzen in den Körperflüssigkeiten.
Von `
L. Lorber.
(Aus dem Zentrallaboratorium der Krankenhäuser der jüdischen Gemeinde
in Budapest.)
(Eingegangen am 13. Juli 1925.)
Die quantitativen Bestimmungen in den Körpersäften können
nicht einfach nach den allgemeinen Regeln der quantitativen Chemie
ausgeführt werden. Die Regeln der allgemeinen quantitativen Analyse
beziehen sich auf Lösungen in destilliertem Wasser, die verschiedenen
in den Körpersäften vorkommenden Nebenstoffe beeinflussen die
Reaktionen, so daß die auf destilliert-wässerige Lösungen eingestellten
Titrationsflüssigkeiten zur Bestimmung der verschiedenen Stoffe der
Körpersäfte nicht zu brauchen waren, oder aber man konnte die Be-
stimmungen mit diesen Titrationsflüssigkeiten nur mit geringeren
oder größeren Fehlern ausführen.
Die in den Körpersäften vor sich gehenden quantitativ- chemischen
Reaktionen werden durch Salze, organische Stoffe, hauptsächlich durch
Kolloide gestört. Zur Vermeidung dieser störenden Einflüsse benutzte
man bisher verschiedene Wege.
1. Man entfernte die Kolloide und sonstigen störenden Stoffe und
bestimmte die in der Lösung zurückgebliebenen Bestandteile. Die
Entfernung geschah entweder mittels Fällung oder durch Zerstörung.
Die Fällungsmethode ist oft ungenau wegen der durch die Oberflächen -
adsorption erfolgenden Verluste. Die Zerstörung aber macht das Ver-
fahren sehr umständlich. |
2. Die zu bestimmenden Stoffe wurden in Form ihres in Wasser
unlöslichen Salzes abgeschieden. Dieses Verfahren ist sehr langwierig
und auch sonst nicht genau, da die verschiedenen, im destillierten
Wasser unlöslichen Verbindungen sich in den Körpersäften in meß-
baren Quantitäten lösen; daher arbeiten wir bei diesem Verfahren
manchmal mit beträchtlichen Verlusten.
L. Lorber: Allgem. Prinzip zur Bestimmung versch. Substanzen usw. 355
Mit dem obigen Verfahren streben wir also die Überführung der
verschiedenen Stoffe aus den Körpersäften in solches Milieu an, daß
die auf destilliert-wässerige Lösungen ausgearbeiteten Meßmethoden
bei ihnen anwendbar werden. Durch dieses Verfahren wurden zwar
die Stoffe nicht in dasselbe Milieu übergeführt, in welchem der Titer
der Titrationsflüssigkeiten bestimmt wurde, aber dasselbe wurde
wenigstens angenähert.
Das unten zu behandelnde allgemeine Prinzip gibt uns die
Möglichkeit, die meisten Stoffe ohne eine Isolierung aus den Körper-
säften zu bestimmen, ferner den Titer der Meßflüssigkeiten in dem-
selben Milieu zu bostimmen, in welchem die Messung geschieht. Dadurch
werden die Bestimmungen rascher, einfacher und zugleich genauer, ferner
wird es durch Berücksichtigung der unten auseinanderzulegenden
Gesichtspunkte überflüssig, den Titer schnell zersetzlicher Titrations-
flüssigkeiten zu kennen.
Das Prinzip gründet sich darauf, daß die Stoffe aus den Körper-
säften nicht entfernt werden, sondern die den Titer genau bestimmende
Lösung wird in das neue Milieu übertragen und der zu bestimmende Stoff
durch den so festgesetzten Titer — mit Hilfe der unten erklärten Gleichung —
gemessen.
Die Bestimmung.
Wir messen zwei gleiche Teile vom Körpersaft genau ab, zu dem
einen Teil fügen wir eine genau bekannte Menge des zu bestimmenden
Stoffes, und nun führen wir mit beiden Teilen die Bestimmung nach
den allgemeinen Regeln mit spezifischen Reagenzien aus. Aus der
hinzugegebenen Menge a, aus den Meßzahlen beider Portionen y und z
können wir die ursprünglich in der Lösung anwesend gewesene Stoff-
menge durch folgende Überlegung berechnen:
In der ersten Portion war anwesend x, dessen Meßzahl war y, in
der zweiten Portion aber x + a, deren Maß z war. So daß
x:(x + a) = y:z,
hieraus kann z berechnet werden, und zwar
2.02 = Y (x + a) = yx + ya;
z HE = ya;
e O SER. RR
z— y z— Y
Aus dieser Formel ist aber y und z durch Bestimmung bekannt,
das a ist bekannt, somit wird durch die drei Werte x bestimmt.
Durch dieses einfache Verfahren kann also jede Bestimmung in
den Körpersäften mit spezifischen Reagenzien ausgeführt werden.
356 L. Lorber: `
Sind unsere Reagenzien nicht spezifisch, so müssen wir die dieselbe
Reaktion gebenden Stoffe trennen, siehe weiter unten.
Im. folgenden teile ich einige praktische Ausführungen obigen
Prinzips mit.
Bei der Titrimetrie.
Eine sehr wichtige Folge des obigen Prinzips ist, daß der genaue
Titer der Titrationsflüssigkeiten nunmehr überflüssig sein wird. Den
größten Nutzen hiervon werden wir bei den zersetzlichen, ihren Titer
leicht verändernden Lösungen sehen. Aber auch bei ihren Titer nicht
verändernden Lösungen können wir obiges Prinzip vorteilhaft ver-
wenden. Die Bestimmungen werden genauer, weil wir die Messung
— wie das oben bereits auseinandergesetzt wurde — mit auf dasselbe
Milieu eingestellten Lösungen ausführen und den zu bestimmenden
Stoff mit sich selbst unmittelbar messen, nicht aber, wie bisher, mit
mittelbaren Verfahren, also Chlor eben mit Chlor und nicht mit auf
Chlor eingestelltem Argentum bzw. Rhodan.
Die Titration geschieht also wie folgt: Wir messen gleiche Mengen
der zu bestimmenden Lösung ab, zu der einen geben wir eine genau
bekannte Menge der zu bestimmenden Substanz, beide titrieren wir
mit der ungefähr bekannten Titrierlösung und berechnen dann die
Stoffmenge durch die obige Gleichung.
Wir bemerken, daß diese Methode sehr gut anwendbar ist dort,
wo wir nicht scharf genug die Beendigung der Titration registrieren
können, z. B. bei der acidimetrischen Messung von Körpersäften. In
diesen Fällen titrieren wir obige beiden Lösungen bis zu gleicher Farben-
veränderung; die Farbe mag welche immer sein, nur muß auch die
zweite Titration bis zu der gleichen Farbenintensität geführt werden.
Kolorimetrische Bestimmungen.
Die Vergleichsflüssigkeiten sind allgemein destilliert-wässerige Lö-
sungen, die Körperflüssigkeiten enthalten aber verschiedene Begleit-
stoffe, welche die bei der Kolorimetrie entstandenen Farben verändern.
Durch Anwendung des obigen Prinzips schalten wir das die Farben-
nuancen beeinflussende Milieu aus, wodurch die Ablesungen schärfer
werden, die Vergleichslösungen werden dieselben. Zu der Bestimmung
werden auch hier gleiche Mengen abgemessen, der eine Teil mit einer
genau bekannten Stoffmenge vermehrt und in beiden die Farben-
reaktionen mit den spezifischen Reagenzien hervorgerufen. Sonach
wird das Verhältnis der Farbenintensitäten von den verschiedenen
Kolorimetersystemen abhängig bestimmt. Beim Kolorimeter nach
Autenrieth kommt z.B. x im Trog (x + a) im Keil. Die Berechnung
Allgemeines Prinzip zur Bestimmung verschiedener Substanzen usw. 357
geschieht nach der aus der allgemeinen Gleichung abgeleiteten
Gleichung:
z = a 100 — Sk
Sk ’
wo Sk = Skalenteil ist.
Nephelometrie.
Die quantitative Bestimmung der Trübungen war bisher deshalb
so schwer, weil die in destilliert-wässerigen Lösungen zustande ge-
kommenen Trübungen nicht vergleichbar waren mit denen in den
Körpersäften gebildeten; denn sie zeigten trotz gleicher Quantitäten
verschiedene Trübungen. Die Ursache hiervon aber war, daß die Korn-
größe der gleichen Quantitäten in den beiden Milieus eine verschiedene
war; die Dispersität der in den Kolloiden (Körpersäften) hervor-
gebrachten Niederschläge war größer, daher auch ihre Trübung. Dem
versuchte man so abzuhelfen, daß man die Kolloide zerstörte und die
in dieser kolloidfreien Lösung entstandene Trübung verglich mit der
in destilliertem Wasser entstandenen Trübung (Kleinmann, PO,).
Diese Bestimmung ist umständlich. Durch die Anwendung obigen
Prinzips bringen wir die Trübung im Körpersaft selbst hervor, die
Vergleichslösung ist ebenfalls im selben Milieu, somit wird ihre Di-
spersität identisch. Ein Vorteil der Methode ist noch, daß die Trübung
in den Kolloiden ständiger ist, während die Dispersität in destilliertem
Wasser in kürzerer oder längerer Zeit sinkt. wodurch sie zum Vergleich
miteinander untauglich werden.
Näheres siehe bei der SO,-Bestimmung!).
Fermentative Bestimmungen.
Bei empfindlichen Fermenten sehen wir schr klar die Bedeutung
obigen Prinzips, weil wir durch dessen Anwendung sehr einfach die die
Messung störenden Einflüsse (Paralysatoren, Aktivatoren, Tempe-
raturschwankungen usw.) des Milieus ausschalten können.
Siehe Diastasebestimmung?).
Eudiometrie.
Unnötig ist die Kalibrierung von Eudiometern, ferner die um-
ständlichen Berechnungen und Tabellen (Temperatur + Barometrie).
Wir bestimmen im Eudiometer das Volumen des Stoffes von un»
1) Einfache und schnelle nephelometrische Bestimmung der ver-
schiedenen Substarzen, zugleich einfache Sulfatbestimmung im Harn.
. L. Lorber, Diese Zeitschrift, 1925.
2) Einfache MikrocCiastasebestimmung. L. Lorber, ebendaselbst 1925.
Biocbemische Zeitschrift Band 162. 24
358 L. Lorber: Allgem. Prinzip zur Bestimmung versch. Substanzen usw.
bekannter Quantität, in einer zweiten Portion vermehrt mit einer
bekannten Menge desselben Stoffes und bestimmen mit einfacher
Berechnung dessen Quantität, y und z bedeuten hier die Volumina
der Stoffe. Wenn ‚a‘ in Milligramm bekannt ist, so sind auch die
Stoffmengen in Milligrammen berechnet.
Außer den obigen unmittelbaren Messungen können wir noch
einen großen Nutzen des obigen Verfahrens bei der Vorbereitung des
Stoffes sehen. Sowohl wenn es der Enteiweißung als auch der Um-
destillierung oder Ausfällung zur Bestimmung bedarf (weil wir keine
spezifischen Reagenzien besitzen): wir führen obige Manipulationen
mit der einen Portion einfach, mit der anderen nach Vermehrung aus,
wobei Adsorption, Verdampfung, Lösung die zu messende wie die
messende Substanz in gleicher Weise betreffen; dadurch aber werden
unsere Bestimmungen genauer.
Ich bemerke, daß das obige Prinzip natürlich auch bei allgemeinen
quantitativ-chemischen Analysen — also nicht nur in Körpersäften —
nutzbringend anwendbar ist.
Über die
nephelometrische Bestimmung von Calcium und Magnesium. II.
Von
Leonia Kriss.
[Aus dem medizinisch-chemischen Institut der Universität Lwöw (Lemberg)].
(Eingegangen am 13. Juli 1925.)
I.
Die Methoden zur quantitativen Bestimmung des Calciums neben
Magnesium beruhen bekanntlich auf der Fällbarkeit des Calciums als
Oxalat oder Carbonat in einer ammonsalzhaltigen Lösung, in welcher
das Magnesiumion mit diesen Anionen keine Fällung gibt. Dieses
Prinzip bildet die Grundlage zahlreicher Methoden, die für Zwecke
der anorganischen Analyse, der Wasseranalyse und in vielen Modifi-
kationen der physiologisch-chemischen Analyse dienen. In diesen
Methoden wird nach erfolgter Trennung der beiden Erdalkaliionen
das Calcium gravimetrisch, maBanalytisch oder kolorimetrisch bestimmt,
das Mg meistens gravimetrisch, in einigen Methoden auch kolorimetrisch
[Briggs*)]. Eine Methode, die eine schnelle maßanalytische oder kolori-
metrische Bestimmung von Ca und Mg nebeneinander ermöglicht, gibt
es bis jetzt nicht.
Rona und Kleinmann?) haben nach vorhergehenden Versuchen anderer
Forscher [Lymann?)] ein Verfahren zur nephelometrischen Bestimmung
kleinster Ca-Mengen angegeben; durch Natriumsulforicinat wird eine
Trübung erzeugt, welche Ca”- und Mg”-Ionen als Summe nephelometrisch
bestimmen läßt. Die Methode von Rona und Kleinmann war für biochemische
Zwecke bestimmt und erlaubte bei Anwendung des Kleinmannschen
Nephelometers die Messung von Ca-Mengen von der Größenordnung 0,01 mg,
also die Durchführung von Ca-Bestimmungen in 0,25 ccm Blut ‚in kürzester
Zeit und einfachster Form“.
Bei einer Nachprüfung der Methode von Rona und Kleinmann,
die ich auf Veranlassung von Prof. Parnas unternommen habe, hat es
1) Journ. of biol. Chem. 59, 255, 1924.
2) Diese Zeitschr. 187, 157, 1923.
3) Journ. of biol. Chem. 21, 551, 1915; 29, 169, 1917.
24 *
360 L. Kriss:
sich ergeben), daß unter den Bedingungen, unter welchen diese Forscher
Trübungen in Blutaschelösungen erzeugten, die mit Chloranımonium
versetzt waren, Mg -Ionen in die Trübungen nicht eingingen. Die Werte,
welche von Rona und Kleinmann angegeben worden sind, stellen also
den Ca Gehalt, dar, und nicht die Summe der Erdalkaliionen. Es war uns
unmöglich, in Abwesenheit von Ammoniumsalzen in Lösungen von
reinen Mg-Salzen oder in Lösungen, die Ca und Mg enthielten, solche
Trübungen durch Sulforicinat zu erzeugen, die an einer Ca-Standard-
lösung nephelometrisch gemessen werden könnten. Die Mg-Trübungen
fielen stets flockig aus, waren unbeständig und eigneten sich nicht für
eine nephelometrische Bestimmung. Soweit also stellte die Nephelo-
metrie in ammonsalzhaltiger Lösung eine genaue und äußerst bequeme
Schnellmethode für die Bestimmung von Ca” neben Mg, jedoch ohne
die Möglichkeit, in ebenso einfacher Form auch das Mg zu bestimmen.
Indem wir nach einer nephelometrischen Methode zur Bestimmung
der Summe von Ca und Mg” suchten, wurden wir auf eine Publikation
von F. Feigl und F. Pavelka?) aufmerksam. Diese Autoren haben
die Fällbarkeit des Ca” und Me als Ferrocyanid (nach dem Vor-
gang von Wyrubow, Betie, Behrens-Kley) untersucht und die große
Empfindlichkeit dieser Reaktion, die sie in 50proz. alkoholischer
Lösung und mittels des Ammoniumsalzes hervorrufen, zum qualitativen
Nachweis und zur quantitativen Bestimmung ausgearbeitet. Die
Empfindlichkeit, die für Calcium 1: 109 beträgt, ist erheblich größer
als die Empfindlichkeit der Oxalatfällung für Ca”- und der Tripel-
phosphatfällung für Mg.
Die quantitative Bestimmung von Ca und Mg wurde von Feigl
und Pavelka in der Weise versucht, daß sie die erzeugten Trübungen
im Autenrieshschen Kolorimeter zur Messung brachten. Sie bezeichnen
diese Methode als eine nephelometrische; diese Bezeichnung ist jedoch
nicht richtig, da man als Nephelometrie allgemein die Messung des
Tyndalleffektes bezeichnet®). Feigl und Pavelka haben durch solche
Triibungsmessungen in Bestimmungen von Ca” und Mg”, sowie der
1) Diese Zeitschr. 158, 203, 1925.
2) Der Nachweis und die Bestimmung kleinster Mengen von Ca und Mg
mit Hilfe von (NH,),Fe (CN), sowie ein neues nephelometrisches Verfahren
zur Bestimmung der Härte des Wassers. Mikrochemie 2, 85, 1924.
3) Es erschien uns auch undenkbar, wie man mit Hilfe des Autenrieth-
schen Kolorimeters eine nephelometrische Ablesung machen könnte.
Dr. Feigl hat auf Anfrage von Prof. Parnas freundlichst mitgeteilt, daß
er und Pavelka in Wirklichkeit mit Hilfe des Autenriethschen Instrumentes
nur die Trübung kolorimetrisch verglichen haben, ähnlich wie dies früher
für die Messung der Trübung durch Chlorsilberfällungen angegeben worden
ist (vgl. z.B. Krúss, „Kolorimetrie‘‘, 2. Aufl.).
Nephelometrische Bestimmung von Ca und Mg. II. 361
Härte des Wassers zufriedenstellende Resultate erzielt. Wir müssen
jedoch bemerken, daß wir in Versuchen, mittels des Autenriethschen
Instruments die Methode von Feigl und Pavelka nachzuprüfen, keinen
Erfolg hatten.
Dagegen erwies sich die Ferrocyanidfällung, nach der Vorschrift
von Feigl und Pavelka ausgeführt, für die nephelometrische Bestimmung
mit dem Kleinmannschen Instrument hervorragend geeignet. Sowohl
Mg und Ca” allein als auch beide Ionen nebeneinander ließen sich im
Kleinmannschen Nephelometer mit einer Ca -Standardlósung ver-
gleichen und genau bestimmen. Damit war nun die Möglichkeit ge-
geben, Ca und Mg nephelometrisch nebeneinander zu bestimmen.
Hatte man beide Ionen in Lösung, so wurde in einem aliquoten Teile
die Summe von Ca und Mg bestimmt, in einer zweiten Portion nach
Zusatz von Chlorammonium das Ca allein mittels Natriumsulforicinat.
Wir haben diese Methode bis jetzt auf die Analyse von Gebrauchs-
wasser, von Mineralwässern, sowie auf die Bestimmung von Ca und Mg
in Blut und Geweben angewandt. Ihr hauptsächlicher Vorzug liegt
in der Schnelligkeit und in ihrem minimetrischen Charakter. Eine
Bestimmung von Ca und Mg nebeneinander ist im Wasser bequem
in 15 Minuten auszuführen, diese Zeit verkürzt sich natürlich noch in
Serienbestimmungen. Sie ist, bei Gebrauch gewöhnlicher guter Pipetten
von 5 und 10ccm Inhalt bequem in 5ccm Wasser auszuführen, von `
harten Wässern braucht man entsprechend weniger. Ein Kubikzenti-
meter Blut genügt auch ohne Anwendung der ‚„Mikroeinrichtung‘ des
Nephelometers für zwei Analysen.
Wir glauben, daß die neue Methode der Bestimmung von Ca
und Mg nebeneinander für viele Zwecke sowohl der physiologisch-
chemischen als auch der anorganischen Analyse geeignet sein wird.
Ihrer Verbreitung steht einstweilen der Umstand im Wege, daß das
Nephelometer von Kleinmann noch wenig verbreitet ist. Nephelo-
metrische Bestimmungen sensu strictiori lassen sich indessen auch
mit jedem guten Kolorimeter des Dubosqschen Typus ausführen,
wenn auch weniger genau als mit dem Kleinmannschen Nephelometer.
Es ist zu erwarten, daß mit zunehmender Anwendbarkeit der nephelo-
metrischen Methoden die Verbreitung der Nephelometer steigen wird;
andererseits ist es zu wünschen, daß neben dem Kleinmannschen
Nephelometer und dem nach Rusznyak!) zu einem Nephelometer um-
gewandelten Chromophotometer auch eine einfachere, wohlfeilere Form
von Nephelometer auf den Markt kommen möge. Ein Holzkästchen
mit der optischen Einrichtung des Kleiınmannschen Instruments,
einem einfach gebauten Doppelspalt mit Nonius, ohne die Mikro-
1) Diese Zeitschr. 188, 365, 1922.
362 L. Kriss:
einrichtungen und mit einfacherer Einrichtung zur Ablesung der Spalt-
breite, würde wahrscheinlich den meisten Anforderungen entsprechen,
und es würde seiner Verbreitung der hohe Preis nicht im Wege stehen.
IL
Ich habe bei der Ausfiihrung der Methode nach Rona und Klein-
mann folgende Reagenzien benutzt: |
l. Natrium sulforicinicum nach Berlioz-Heryng (Merck). Es
werden 10ccm geschmolzenes Natriumsulfori:inat mit einer Pipette
abgemessen und in einem Becherglas mit 112ccm optisch reiner
n Natronlauge gut vermischt. Hierauf wird mit destilliertem Wasser
auf 125 ccm aufgefüllt. Das Reagens wird in einer Flasche mit ge-
schliffenem Stöpsel aufbewahrt.
2. n Chlorammonium.
3. Eine Standardlösung, welche 3,5695g CaCO, in 100 ccm
n Salzsäure enthält und mit destilliertem Wasser auf 2 Liter auf-
gefüllt ist. Leem dieser Lösung enthält 1 mg Calciumoxyd.
Zu den nach Feigl und Pavelka ausgeführten Bestimmungen habe
ich Ammoniumferrocyanid von Kahlbaum benutzt; es ist ein grünliches
Pulver, das auch in dieser Form zu den nephelometrischen Be-
stimmungen benutzt wird und hellgrünlich gefärbte Trübungen gibt.
. Die grüne Farbe stört nicht bei dem Vergleich im Nephelometer.
Ich habe zur Bestimmung des Ca und Mg im Wasser 5 ccm Wasser
bei Wässern bis zu 10 deutschen Härtegraden, 2 bis 3 ccm bei Wässern
von 10 bis 30 Härtegraden, 0,5 cem bei Wässern von über 30 Härte-
graden verwendet. Das zur Analyse bestimmte Wasser wurde stets
entsprechend mit destilliertem Wasser verdünnt, so daß IO ccm der
Lösung 0,5 bis 5 cem Wasser enthielten. Es muß deshalb immer ein
Vorversuch ausgeführt werden, um daraus auf die ungefähre Härte des
Wassers schließen zu können und das Wasser entsprechend zu ver-
dünnen. Das Abmessen kleinerer Volumina ist nicht ratsam, da es
leicht zu Fehlern führt. Bei Wässern mit hohem Alkalicarbonatgehalt
ist es notwendig, die Alkalicarbonate mittels verdünnter Salzsäure in
Chloride zu überführen, durchzuschütteln und die überschüssige Salz-
säure mit Ammoniak zu neutralisieren.
In ein Becherglas werden mit einer genauen Pipette 10 ccm des
verdünnten Wassers, in ein zweites Becherglas 10 ccm einer Standard-
lösung, die aus der obengenannten durch Verdünnung erhalten ist,
abgemessen. Das Verhältnis des Ca in der Standardlösung zum Ca
im Wasser darf nicht größer als 1:2 sein.
Nun werden, wie es Feigl und Pavelka vorschreiben, zu beiden
Prob n je 10ccm 95proz. Alkohols zugegeben, mittels Schüttelns ver-
mischt (das Erwármen auf 50°C erwies sich als entbehrlich) und in
Nephelometrische Bestimmung von Ca und Mg. II. 363 `
die beiden Bechergläser ein kleiner Überschuß des festen Ammonium-
ferrocyanids geschüttet. Nachdem sich dieses gelöst hat, sind die
Lösungen zum nephelometrischen Vergleich fertig. Die Ablesung und
die Berechnung erfolgt in der von Kleinmann!) angegebenen Weise.
Gleichzeitig wird in zwei anderen Bechergläsern der Ca-Gehalt
des Wassers bestimmt. Zu den beiden Lösungen (Standard und Wasser)
wird eine entsprechende Menge Chlorammonium?) und 0,4ccm des
Sulforicinatreagens nach Rona und Kleinmann?) zugegeben und auf
15 ccm mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Die nephelometrische
Bestimmung kann sofort ausgeführt werden.
Bestimmung des Ca und Mg im Blute.
l cem Blut wird in einer Platinschale getrocknet und dann im
elektrischen Ofen verascht. Die Asche mit einigen Tropfen verdünnter
Salzsäure aufgenommen, mit destillierttem Wasser etwas verdünnt,
erwärmt und mit n Ammoniak schwach alkalisch gemacht. Das vor-
handene Eisen scheidet sich als Eisenhydroxyd aus. Die Flüssigkeit
wird durch ein quantitatives Filter (Schleicher und Schüll) in ein 25 ccm-
Meßkölbchen überführt und auf 25ccm aufgefüllt. Es werden nun
je 10 ccm in Bechergláser abgemessen und das Ca + Mg, sowie das Ca
allein, wie oben bestimmt. Der so erhaltene Gehalt von Ca und Mg
entspricht 0,4ccm Blut.
Die Bestimmung des Ca und Mg in Geweben gestaltet sich in
derselben Weise wie im Blut, nur müssen die Lösungen, wenn sie mehr
Ca und Mg enthalten, entsprechend verdünnt werden. Gewebe, welche
viel Ca-Phosphat enthalten, dürfen nicht mit Ammoniak alkalisch
gemacht werden, da sonst Calciumphosphat gefällt wird. Ich habe in
diesen Fällen Ammoniumacetat verwendet.
Alle Versuche werden in Bechergläsern aus Jenaer Glas von 50
bis 100 eem Inhalt ausgeführt, die Flüssigkeiten stets mit geeichten
Pipetten von 5 oder 10 ccm Inhalt abgemessen und aus einer Bürette
auf das gewünschte Volumen mit destilliertem Wasser aufgefüllt.
Ich habe die Ergebnisse aller Analysen mittels gravimetrischer
Bestinimungen des Calciums als Calciumoxyd und des Magnesiums
als Magnesiumpyrophosphat geprúft und gute Resultate erhalten.
Die von Briggs*) ausgearbeitete kolorimetrische Methode zur Be-
stimmung des Ca neben Mg gab beim Vergleich auch gute Ergebnisse.
Ich habe sie dahin abgeändert, daß ich zuerst die Summe von Ca und Mg
1) Diese Zeitschr. 99, 115, 1919.
-2) Ebendaselbst 158, 203, 1925.
8) Ebendaselbst 187, 157, 1923.
t) Journ. of biol. Chem. 59, 255, 1924.
364 L. Kriss:
bestimmte, dann das Ca allein. Die Lösungen wurden mit einem
Phosphorstandard verglichen. Der Ca-Gehalt, in Milligramm Phosphor
ausgedrückt, wurde von dem in Phosphor berechneten Gehalt von
Ca + Mg subtrahiert und so der Gehalt von Mg ermittelt. Die Be-
stimmung des Mg in der von Briggs angegebenen Weise gibt oft zu
niedrige Werte. Ich habe diese Bestimmungen in geteilten Zentrifugen-
gläschen ausgeführt, wodurch das lästige Ausspülen und Auffüllen
auf ein bestimmtes Volumen in ungenau geteilten Cylindern ver-
mieden wurde.
Nachstehend die Ergebnisse einiger Analysen.
Standardlösungen (nephelometrisch).
Verglichen mit einer 0,28 mg CaO in 10 ccm enthaltenden Lösung.
Gewogen | Gefunden
Een u ee en ee ae ke En ea
CaO + MgO CaO | MgO "Ca0+MgO ` Con | MgO
ml mmm nm, g
SE e cl E
0,28 | 0252 mg | 0279 | 0251 0,028
|
0,28 | 0,168 0,112 0,28 0,1688 | 0112
0,28 0,112 0,168 | 0,279 | 0,110 0,169
0,14 == 0,14 || 0,138 — | 0,138
0,25 0,25 — | 0,246 | 0,246 =
Die für MgO angegebenen Werte sind als mg Ca O berechnet.
Gebrauchswässer.
Gesamthärte (gravim.) |
(Deutsche Grade) . .
Gesamthärte (nephelom.)
(Deutsche Grade). .
Gesamthärte (kolorim.) |
(Deutsche Grade) . d
50,08136,31'27,04 |22,32/14,14/39,08 (25,44 18,11 153.18
‚06 EE 22,31114,1 39,08 |26,92|18,042|62,7
‚1836,44127,17 |22,36|14,33|39,304|25,65 18,084l63
1.
mgCaO im Liter.
CaO (gravimetrisch) . . . s 22.2.0200.
CaO (nephelometrisch)
CaO (kolorimetrisch) . . . s s s 2.2 0020.
MgO (gravimetrisch) . ........
MgO (kolorimetrisch) . . . . 2: 2 2 22.0. 1,85
Gesamthärte (kolorimetrisch) (Deutsche Grade) || 8,359 | 18,06
|
Nephelometrische Bestimmung von Ca und Mg. II. 365
Mineralwässer.
EN EN
CaO (gravim.) .
CaO (nephelom. ) E
CaO (kolorim.) .
MgO (gravim.) .
MgO (nephelom.) .
MgO (kolorim.)
Gewebsanalysen.
Knochen (nephelometrisch).
0,51 g Knochen.
CaO + MgO . perp 0,2625 g
CO e E Ne A 0,197 18,
MgO .......... 0,0653 ,
Froschhaut (nephelometrisch).
Nasses Gewicht CaO + MgO CaO
8 mg mg
4,225 60 44,2
2,003 26 16,1
2,5597 32,3 23,3
2,664 36 24
2,8978 36,1 25,4
3,833 43 35
3,7468 42 32
Froschdarm (nephelometrisch)
Nasses Gewicht . ..... 3,40 g
CaO0+Mg0........ 4,88 mg
CaO E ea a a 1,58 „
MRO 0 e a a 3,30 „
Blut (nephelometrisch).
mg in 100 com.
Genen | ao | mo
11,93 10,5 1,021.
11.726 10.2 1,089
11.43 9,8 1.164
Zur Chemie und Physiologie der Pflanzenphosphatide.
II. Mitteilung:
Die wasserlöslichen Phosphatide aus Aspergillus oryzae.
Von
V. Grafe und H. Magistris.
(Aus dem chemischen Laboratorium der Neuen Wiener Handelsakademie.)
(Eingegangen am 14. Juli 1925.)
Mit 1 Abbildung im Text.
Um festzustellen, ob und welche Verschiedenheiten zwischen den
Zellphosphatiden höherer Pflanzen und Pilze beobachtet werden können,
wurden, nachdem von Grafe und Horvat!) die wasserlóslichen Phos-
phatide aus der Zuckerrübe beschrieben worden waren, nunmehr die
Phosphatide aus Aspergillus oryzae mittels derselben Methode wie
dort isoliert und der Analyse zugeführt.
Bisher wurden Pilzphosphatide im Mutterkorn?), in Boletus edulis 3)
und in Cantharellus cibarius?) gefunden und als „Glucophosphatide‘‘ be-
schrieben, in einer Reihe höherer Pilze wurden Phospholipoide festgestellt 5).
auch in Penicillium, Mucor und Aspergillus wurden solche nachgewiesen,
ohne aber daß bis auf die Bestimmung der P: N-Relation auf die chemische
Zusammensetzung eingegangen worden wäre. Alle früheren Darstellungs-
methoden basieren auf der Behandlung des getöteten und getrockneten
Materials mit siedenden organischen Lösungsmitteln, wodurch zweifellos
schon tiefergreifende Veränderungen der fraglichen Verbindungen eintreten
können. Schon Erlandsen*) betont, daß bei der Darstellung die Lebens-
temperaturen des Körpers nicht wesentlich überschritten werden dürfen
und daß alle Eingriffe vermieden werden müssen, die erfahrungsgemäß
störend auf leicht veränderliche Atomkomplexe einwirken können. Auch
Winterstein?) bemerkt, daß diese so überaus labilen Stoffe schon durch
Alkohol oder Äther gespalten oder mindestens denaturiert und bezüglich
1) V. Grafe und V. Horvat. diese Zeitschr. 159, 449, 1925.
2) L. Brieger, Zeitschr. f. physiol. Chem. 11, 184, 1887.
3) R. Fritsch, Arch. f. Pharm. 1889, $. 193.
t) I. Zellner, Sitzungsber. d. Wiener Akad. d. Wiss. 1910, 1915, 1917,
1918.
8) Sieber, Journ. f. prakt. Chem. 28, 412, 1881.
€) Erlandsen, Zeitschr. f. physiol. Chem. 51, 71, 1907.
2) E. Winterstein, ebendaselbst 58, 500, 1909.
V. Grafe u. H. Magistris: Pflanzenphosphatide. II. 367
ihrer Löslichkeitsverhältnisse verändert werden können. Trier!) erhielt
je nach Art der Extraktion Phosphatide von verschiedener Zusammen-
setzung, verschiedener Farbe und wechselndem N- und P-Gehalt. Wenn
man durch Dialyse bei einer 15° nicht übersteigenden Temperatur aus
Pilzdecken die Phosphatide mit Wasser extrahiert, so erhält man ein völlig
klares Filtrat, das ein oder mehrere Phosphatide gelöst enthält. Ein Teil
davon wurde im Vakuum bei höchstens 30° zur Trockene eingedampft;
der gelbe, aus Phosphatiden und anorganischen Salzen bestehende Rück-
stand war in Wasser vollkommen löslich. Ein anderer Teil wurde im Schüttel-
trichter mit frisch destilliertem, über geschmolzenem Na,SO, getrocknetem
Äther behandelt, die ätherische Schicht mit den darin befindlichen Phos-
phatiden abgetrennt und der Äther bei Zimmertemperatur entfernt. Das
gelbe, P- und N-haltige Residuum hatte dasselbe Aussehen wie das vorher
gewonnene, war aber jetzt in Wasser vollkommen unlöslich.
Bei der im folgenden geschilderten Darstellung der Phosphatide
aus Aspergillus oryzae wurde nicht nur die Verwendung organischer
Lösungsmittel, sondern auch eine Erhöhung der Temperatur über 30°
und auch der störende Einfluß von Licht und Luft ausgeschaltet.
Experimenteller Teil.
Für die Züchtung der notwendigen Pilzkulturen wurden die Sporen
von Reinzuchten verwendet, die in unserem Laboratorium zur Ver-
fügung standen?). Dieselben wurden in der üblichen Weise auf einen
in Proberöhren befindlichen Agar-Agarnährboden übertragen und im
Thermostaten bei 30° zur Entwicklung gebracht. Von dieser Stamm-
kultur wurden Kulturen in großem Maßstab auf folgender Nährlösung
hergestellt: 100g Melasse wurden in 1 Liter Wasser gelöst und mit
einer Lösung von 2g KH,PO, in 20 ccm Wasser versetzt, gut durch-
gerührt und die Flüssigkeit mit einigen Tropfen HCl genau neutralisiert.
Nach dem Sterilisieren im Autoklaven und Erkalten wurde dieselbe
in große flache Entwicklerschalen aus Porzellan gegossen, welche
vorher durch Abbrennen steril gemacht worden waren. Die Rein-
kultur wurde nun in Wasser gerührt und mit Hilfe einer Spritzflasche
gleichmäßig in der Nährlösung verteilt. Die Küvetten wurden dann
mit Glasplatten locker überdeckt zur Entwicklung in den Thermo-
staten gesetzt, nach etwa 8 Tagen hatte die Pilzdecke Fingerdicke
erreicht und wurde nach jedesmaliger Prüfung auf ihre Reinheit zur
Verarbeitung herangezogen. Von der Nährlösung sorgfältig abgehoben,
wurde sie mit dem Skalpell in Ziegel geschnitten und diese mit der
Spritzflasche gründlich von der anhaftenden Melasselösung befreit.
Dann in große flache Porzellanschalen verteilt und so lange mit fließen-
dem Leitungswasser gewaschen, bis dieses nicht mehr gefärbt abfloß,
1) G. Trier, Zeitschr. f. physiol. Chem. 86, 153, 1913.
2) Für die Überlassung der Reinzuchtsporen sird wir Herrn Dr. J. Szücs
zu bestem Danke verpflichtet.
368 V. Grafe u. H. Magistris:
weiterhin noch 1, Stunde mit destilliertem Wasser, bis dieses ganz
klar verblieb. Jetzt wurde die Pilzmasse so verteilt, daß sie in jeder
Schale nur eine einzige dichte Schicht bildete. Diese Schichten wurden
sofort mit so viel destilliertem Wasser übergossen, daß sie eben bedeckt
waren, die Schalen mit Glasplatten locker bedeckt und im Dunkelraum
des Laboratoriums bei 12 bis 17% stehengelassen. Nach 24 Stunden
wurde der Versuch abgebrochen und das gelblich gefärbte Dialysat,
das eine minimale Trübung zeigte, die durch mehrfache Lagen Papier
durchging, durch ein Pukall gezogen, die nunmehr vollkommen klare
Lösung durch Aufschlämmen mit Tierkohle in der Kälte und Filtrieren
entfärbt und das Filtrat im Vakuum bei höchstens 30° stark konzentriert.
Die klare, fast farblose Lösung reagierte völlig neutral gegen Lackmus,
schäumte stark und roch hefeartig. Biuret-, Millon- Adamkiewicz-
und Molischreaktion auf Proteine fiel negativ aus, ebenso ergab, wie
später zu beschreiben, die ausgeführte Formoltitration keine Anhalts-
punkte für das Vorhandensein von Eiweißspaltprodukten. Mit Blei-
acetat, Cadmiumchlorid, Quecksilberchlorid, Platinchlorid, Uranyl-
acetat, Silbernitrat und Phosphorwolframsáure traten starke Fállungen
ein, nicht aber mit Aluminiumchlorid und Calciumacetat. Das Dialysat
wurde am Wasserbad bei 30% tropfenweise mit 2 bis 3 ccm n/2 wásseriger
neutraler Bleiacetatlösung!) versetzt, wobei zuerst eine starke Trúbung
und alsbald eine weiße grobflockige Fällung entstand, deren Absetzen
durch Umrühren so gefördert wurde, daß die überstehende Lösung
schnell ganz klar wurde. Die Fällung gelingt nur im frischen, stark
konzentrierten neutralen Dialysat gut, ist die Phosphatidlösung zu
sehr verdünnt oder die Menge des Fällungsmittels zu gering, erhält
man kolloide Niederschläge, die auch beim Kochen nicht gerinnen.
Ist das Dialysat sauer, was in einigen Versuchsreihen der Fall war?),
erhält man überhaupt keine Fällung. Die für das Gelingen der Fällungen
günstigste Temperatur ergab sich durch Vorversuche als bei 20 bis 30°
liegend, bei höheren Temperaturen wird der Niederschlag drahtige
Fäden bildend, setzt sich aber rasch ab, während bei niedrigeren Tem-
peraturen die Fällung wohl grobflockig wird, sich aber weniger schnell
absetzt. Nach 12stiindigem Stehen im Dunkelraum wurde der Nieder-
schlag nach Abdekantieren der überstehenden Lösung abfiltriert und
so lange mit 30grädigem Wasser gewaschen, bis die Bleireaktion ver-
schwunden war. Der Niederschlag hat die Tendenz, sich zu Klümpchen
1) Die Auflösung des Merckschen Präparates ergab fast immer eine
trübe, alkalisch reagierende Lösung infolge CO,-Gehaltes des Wassers,
sie wurde daher mit einigen Tropfen Essigsäure genau neutralisiert.
2) Das war mitunter der Fall, wenn die alkalisch reagierende Melasse
der Pilznährlösung, mit Säure neutralisiert, eine Spur Säureüberschuß
erhalten hatte.
Pflanzenphosphatide. II. 369
und Háuten zu aggregieren und bildet bei langsamem Eintrocknen
stark kohärente, papierähnliche Massen, die, am Objekttráger ein-
gedunstet, einem ausgebildeten Parenchymgewebe mit zellähnlichen
Wabenräumen gleichen. Trotz Lichtausschlusses, und obzwar über
der Nutsche beim Filtrieren ein anschließender Trichter angebracht
war, durch dessen nach oben gerichtetes Rohr ein starker Strom trockener
CO, während des Filtrierens geleitet wurde, nahm doch der anfangs
völlig weiße Niederschlag schon auf der Nutsche gelbbraune Farbe
an, was wohl mit der Oxydation ungesättigter Fettsäureradikale zu-
sammenhängen dürfte. Die frische Fällung ist in Wasser teilweise
löslich, weshalb ein allzulanges Auswaschen des Niederschlages ver-
mieden wurde. Die von überschüssigem Fällungsmittel sorgfältig
befreite, stark klebrige Masse wurde im Vakuumexsikkator über H,SO,
getrocknet und ließ sich dann zu einem hellbraunen Pulver verreiben.
In Berührung mit Wasser zeigte es die für die sogenannten „Myelin-
formen“ charakteristischen Quellungserscheinungen, beim Erwármen
der gequollenen Substanz mit Wasser treten unter Bräunung Zer-
setzungserscheinungen ein. Indessen tritt die Quellung erst nach
mehrtägigem Stehen auf, direkt mit Wasser gekocht, erweist es sich
dagegen resistent. Zur völligen Befreiung der Fällung von etwa ad-
sorbierten Stoffen, besonders von Zucker, wurde das Auswaschen
mit 30grädigem Wasser immerhin so lange fortgesetzt, bis das Wasch-
wasser weder direkt noch nach der Hydrolyse weder Reduktion der
Fehlingschen Lösung zeigte, noch Fällung mit Phosphorwolframsäure
mehr eintrat. Die Bleifällung ist in Wasser, Aceton, Chloroform, Tetra-
chlorkoblenstoff, Benzol, Ligroin und Methylacetat nach dem Trocknen
völlig unlöslich (auch in der Wärme), während sie sich in der Kälte
schon in mineralalkalischen Lösungsmitteln auflöst (unter Zersetzung).
Teilweise löst sie sich in etwa 25 Teilen warmen Alkohols oder Äthers.
Aus dem klaren, ganz schwach sauren Filtrat nach der Bleifällung,
das mit neutralem Bleiacetat keine Fällung mehr ergibt, gelingt es,
durch Aciditätsänderung des Mediums noch ein weiteres, durch Blei
fällbares Phosphatid zu gewinnen. Versetzt man die saure Lösung mit
einigen Tropfen Ammoniak, so fällt auf Zusatz von Bleiacetat (war
ein Überschuß davon vorhanden gewesen, genügt der Ammoniakzusatz)
ein grobflockiger, grauweißer Niederschlag aus, der sich schnell absetzt
und schon in der Farbe von dem ersterhaltenen verschieden ist. Dieses
Phosphatid, dessen Verschiedenheit von dem ersten durch die spätere
Analyse sichergestellt wurde, fällt erst nach Ausfällung des erst be-
schriebenen Phosphatids aus, fällt man aber gleich mit ammoniaka-
lischem Bleiacetat, so enthält die Fällung beide Phosphatide gemein-
schaftlich. Im Filtrat ist dann beim Neutralisieren keine Fällung mehr
erhältlich. Die zweite Fällung stellt nach Abdekantieren der oben-
370 V. Grafe u. H. Magistris:
stehenden klaren Lösung und Auswaschen bis zum Verschwinden der
Bleireaktion eine leicht filtrierbare, nicht klebrige, an der Luft wenig
veränderliche Masse von blätterig-körnigem Gefüge dar, die nach
Trocknen im Vakuum sich als gelbgraues, in den vorerwähnten Rea-
genzien völlig unlösliches Pulver erweist.
In dem hellgelben Filtrat nach der zweiten Bleifällung wurde
nach Einengen auf das halbe Volumen durch tropfenweisen Zusatz
von 2proz. H,SO, das überschüssige Blei entfernt (H,S eignet sich
zum Entbleien nicht, nach Eindampfen eines so erhaltenen Präparats
resultierte eine schmierige dunkelbraune Masse von lauchartigem
Geruch; es konnte auch anderweitig festgestellt werden, daß beim
Behandeln mit H,S der S in das Molekül des Phosphatids eingetreten
war). Das klare bleifreie Filtrat vom PbSO, wurde etwa mit dem
vierfachen Volumen 96proz. Alkohols versetzt, wobei sich eine grob-
flockige, schneeweiße Fällung bildete, die sich bei Zimmertemperatur
rasch und vollkommen als voluminöser Bodensatz absetzte. Zum
richtigen Gelingen der Fällung muß die Alkoholmenge die genannte,
die Flüssigkeit möglichst konzentriert und nicht zu schwefelsauer
sein. Die mit Alkohol gewaschene Fällung wurde in warmem Wasser
gelöst; im Exsikkator schieden sich nach einiger Zeit weiße glänzende
Kristalle aus, die außer in 20 Teilen kalten oder 3 Teilen warmen
Wassers in keinem gebräuchlichen organischen Lösungsmittel löslich
sind und beim Veraschen einen größeren anorganischen Rest hinter-
lassen, der Na, K, Ca und Mg enthält.
Statt Blei wurde in einigen Versuchsreihen auch Cd CL, als Fállungs-
mittel verwendet und auch hier in neutraler und ammoniakalischer
Lösung verschiedene Fällungen erzielt. Das gelbe schwefelsaure Filtrat
nach der Alkoholfällung hinterläßt nach Abdestillieren des Alkohols im
Vakuum eine rotbraune P- und N-haltige klare Lösung, die Fettsäuren
enthält. Von der Annahme ausgehend, daß die Fällbarkeit der Phos-
phatide durch Schwermetallsalze eine Funktion der enthaltenen Base
ist, wurde, nachdem Adenin als Base sichergestellt war, AgNO, als
Fällungsmittel in Anwendung gebracht, indessen eine so wenig licht-
beständige Fällung erhalten, die überdies so große Differenzen in
ihrem N-Gehalt zeigte, daß von ihrer Analyse Abstand genommen
und neben der Isolierung der zugehörigen Base nur die P: N-Relation
festgestellt wurde. Ein Fällungsmittel für das in dieser Restfraktion
enthaltene Phosphatid wurde bisher nicht gefunden. Im Filtrat von
der Bleifällung — und das ist einer der größten Nachteile bei der Ver-
wendung von Bleiacetat als Fällungsmittel — hinterbleibt nach dem
Entbleien die frei gewordene Essigsäure, die auf das Phosphatid nicht
ohne Einwirkung ist, während die durch ihre Neutralisierung ent-
standenen Salze die Isolierung der in Frage kommenden organischen
Pflanzenphosphatide. II. 371
Komplexe verhindern. Verwendet man aber etwa frisch gefälltes
Pb(OH), statt des Acetats als Fällungsmittel, so enthalten die
Fällungen im Gegensatz zur Konstanz des Bleigehaltes nach der
Acetatfällung so wechselnde Bleimengen, daß von der Verwendung
des Hydroxyds Abstand genommen wurde.
Der Untersuchung lagen also folgende Fraktionen vor:
. Die Fällung mit Bleiacetat in neutraler Lösung.
. Die Fällung mit Bleiacetat in ammoniakalischer Lösung.
Die Fällung mit Cadmiumchlorid in neutraler Lösung.
. Die Fällung mit Alkohol.
. Das Filtrat nach den Fällungen mit Bleiacetat und Alkohol.
Or a Fo DD ra
1. Fällung mit Blelacetat in neutraler Lösung.
Für die P-Bestimmung eignet sich nach Erlandsen am besten die
alkalimetrische Methode von Neumann!). Die Substanz wurde durch
Säuregemischveraschung zerstört und aus der Aschenlösung die
Phosphorsäure in bekannter Weise als Molybdat gefällt; der ausge-
waschene Niederschlag in überschüssiger n/10 NaOH gelöst und nach
Wegkochen des NH, und völligem Erkalten mit n/10 H,SO, zurück-
titriert. Jedem verbrauchten Kubikzentimeter n/10 NaOH ent-
sprechen (auf n/2 NaOH berechnet) 1,268 mg P,O, (auf ein P,O,
entfallen zur Neutralisation bei Verwendung von Phenolphthalein
56 NaOH). 0,3743 g Substanz verbrauchten (Mittel aus drei Analysen)
16,67 ccm n/10 NaOH, entsprechend 2,47 Proz P. Ferner: 0,4324 g
Substanz ergaben 0,0325 g Me DO entsprechend 2,09 Proz. P.
N wurde nach Kjeldahl unter Parallelführung je eines blinden
Versuchs bestimmt.
0,709 g Substanz enthielten (Mittel aus vier Versuchen) 9,2 mg N,
entsprechend 1,297 Proz. N.
Die Elementaranalyse wurde nach der von Erlandsen?) für P-haltige
Substanzen verbesserten Methode nach Dennstedt durchgeführt, bei
welcher vor und hinter der Pt- Quarzschicht je eine oxydierte Cu-Draht-
rolle in starker Glut erhalten wird, um das Hinterbleiben einer phosphor-
säurehaltigen Kohle im Schiffchen zu vermeiden.
0,5930 g Substanz (Mittel aus drei Analysen) ergaben 0,3035 g
CO, und 0,1240 g H,O, entsprechend 41,87 Proz. C und 7,01 Proz. H.
Das Pb wurde in der mit Soda-Salpeter erhaltenen Asche als
Sulfat bestimmt.
0,8039 g Substanz (Mittel aus zwei Analysen) gaben 0,1757 g
PbSO, = 29,86 Proz. Pb.
1) Neumann, Zeitschr. f. physiol. Chem. .87, 115, 1907; 48, 32, 1907.
2) Erlandsen, ebendaselbst 51, 71, 1907.
372 V. Grafe u. H. Magistris:
Zum Nachweis der gebundenen Kohlehydratgruppe (das intakte
Phosphatid reduziert Fehlingsche Lösung nicht) wurden 0,9106 g
Substanz durch 7 Stunden mit 5proz. H,SO, unter Rückfluß gekocht.
Das Filtrat von den ausgewaschenen Fettsäuren und dem PbSO,
wurde auf 100 ccm aufgefüllt und der Zucker nach Bertrand bestimmt.
Je 20 ccm verbrauchten (Mittel aus drei Titrationen) 4,85 ccm KMn O;
Lösung (l ccm KMnO, entsprach 9,91 mg Cu), die resultierenden
48,06 mg Cu entsprechen 23,63 mg = 12,97 Proz. Glucose.
Das Verhältnis P: N beträgt 1:1,21. Mit Berücksichtigung des
Fehlers, der durch Verbleiben eines Teiles des N im Fettsäurerest nach
der Spaltung!) sich ergibt, kann das Präparat wohl als Monoamino-
monophosphatid angesprochen werden.
Die elementaranalytischen Daten lauten also:
Gefunden:
O (ber.) 17,50, C 41,87, H 7,01, P 2,37, N 1,297, Pb 29,86 Proz.
ber. f. Cis Hos N P O, . 2Pb als empirische Formel:
O , 17,50, C 42,02, H 6,98, P 2,26, N 1,02, Tb 30,22 ,
Abbau des Phosphatids.
Es wurde die Spaltung sowohl mit H,SO, als auch mit Lauge
durchgeführt. Malengreau und Prigent?) fanden bei der Säurespaltung
des Eiphosphatids, daß die Abspaltung der verschiedenen Radikale
im Molekül gleichzeitig beginnt, immerhin erfolgt die Abspaltung der
Fettsäureradikale schneller als die Verseifung des Glycerinphosphor-
sáureesters. Auch mit Hilfe von CH,OH + HCl?) kann das Phos-
phatid gespalten werden. Es zeigte sich, daß der Abbau mit Alkalien
[alkoholischer KOH und wässeriger Ba(OH),] viel rascher und voll-
ständiger erfolgt als mit Säuren, vor allem aber haftet bei der Säure-
hydrolyse ein Teil des N zähe an der Fettsäurefraktion, was für die
alkalische Hydrolyse nicht zutrifft. Die Aufarbeitung der einzelnen
Fraktionen wurde im allgemeinen nach der von Schulze und seinen
Mitarbeitern beschriebenen Methode vorgenommen).
Spaltung mit proz. H,SO,®): 65,51 g Trockensubstanz wurden
mit der zehnfachen Menge H,SO, zuerst am Wasserbad und nach
1) G. Trier, Zeitschr. f. physiol. Chem. 86, 143, 1913; Mac Lean, eben-
daselbst 59, 223, 1909.
2) F. Malengreau und G. Prigent, ebendaselbst 78, 68, 1911; 77, 687,
1912.
3) Fourneau und Piettre, Bull. Soc. Chim. de France 11, 805, 1912.
4) E. Schulze, Zeitschr. f. physiol. Chem. 52, 54, 1907; 55, 338, 1908;
60, 155, 1909; 71, 174, 1911; G. Trier, ebendaselbst 86, 1, 1913; E. Winter-
stein, ebendaselbst 58, 506, 1909.
5) Bei der Säurehydrolyse werden die Kohlehydratgruppen unverändert
abgespalten und kónnen daher leicht identifiziert werden, wáhrend bei der
Alkalispaltung eine Zersetzung derselben eintritt.
Pflanzenphosphatide. II. 313
Aufhóren des Schäumens 8 Stunden über freier Flamme unter Rückfluß
erhitzt. Der abgeschiedene, von Fettsäuren braun gefärbte PbSO,-
Niederschlag wurde von der überstehenden rotbraunen Flüssigkeit
abfiltriert, zuerst mit heißem Wasser und dann mit heißem Alkohol
so lange behandelt, als dieser noch gefärbt abfloß. Der gelbliche Rück-
stand bestand aus 98,68proz. PbSO,. N konnte in ihm nicht nach-
gewiesen werden. Das schwefelsaure Filtrat wurde im Schütteltrichter
so lange mit Äther ausgezogen, als dieser sich noch anfärbte, die äthe-
rische Lösung bis zum Verschwinden der sauren Reaktion gewaschen
und die zwischen wässeriger und ätherischer Schicht sich bildenden
Emulsionen durch Zusatz von viel Äther entfernt. Die Emulsion redu-
zierte Fehlingsche Lösung nicht, löste sich vollkommen in Alkalien
und bestand wahrscheinlich aus hochmolekularen Kohlehydraten
(Pektinstoffen). Die von der ätherischen abgetrennte wässerige Schicht
wurde am Wasserbad völlig von Äther befreit: und mit konzentrierter
Phosphorwolframsäurelösung versetzt. Der entstehende weiße Nieder-
schlag wurde nach 24stündigem Stehen abfiltriert und gut mit 5proz.
H,SO, gewaschen.
Phosphorwolframsäurefällung: Aus 65.51 g trockenem Phosphatid
wurden 34,48 g dieser Fällung erhalten. Bei der Kjeldahlbestimmung
ergaben (Mittel aus zwei Versuchen) 1,804 g Substanz 27,58 mg N,
berechnet aus 34,48g des Ausgangsmaterials: 527,6mg N. Vom
Gesamt-N des Phosphatids per 1,297 Proz. enthält also der Basen-
anteil 62,10 Proz. Da in einem Vorversuch die Abwesenheit von Alloxur-
basen, wie Arginin und Histidin festgestellt worden war, wurde die
Fällung durch Verreiben mit Wasser und Ba(OH), zerlegt und das
NH, in der Kälte ausgetrieben. Die breiige Masse wurde in eine flache
Glasschale gebracht und unter Darüberleiten eines Luftstromes an der
Wasserstrahlpumpe kräftig gerührt. Das phosphorwolframsaure
Barium wurde durch Filtration entfernt, das Filtrat durch CO, von
überschüssigem Baryt befreit, mit HCl übersättigt und die so erhaltene
Lösung der Basenchloride eingedunstet. Mehrmals mußte von aus-
geschiedenen dunklen Zersetzungsprodukten abgeschieden und mit
Tierkohle entfärbt werden. Nach dem Trocknen des Verdampfungs-
rückstandes wurde dieser mit 95proz. Alkohol erhitzt, wobei etwas
Ba Cl, ungelöst blieb. Die durch Fällen mit alkoholischer Hg Cl,- Lösung
erhaltenen Hg-Doppelsalze wurden aus heißem Wasser umkristallisiert,
mit H,S zerlegt und die abfiltrierte Lösung im Vakuum langsam ein-
dunsten gelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle waren in absolutem
Alkohol fast ganz unlöslich, woraus schon die Abwesenheit von Cholin
wahrscheinlich wurde. Beim Erhitzen gab das Salz weder Pyrrol-
reaktion noch Pyridingeruch, war gegen saure KMnO,-Lösung be-
ständig. Bei raschem Erhitzen lieferte es den für Betainhvdrochlorid
Biochemische Zeitschrift Band 162. 25
374 V. Grafe u. H. Magistris:
charakteristischen Schmelzpunkt 243% unter Zersetzung. Bei der
Fällung mit AuCl, resultierten große glänzende Blättchen, die beim
schnellen Erhitzen unter Zersetzung bei 233 bis 234% schmolzen.
Das umkristallisierte Chloraurat lieferte bei der Flementaranalvse
folgende Werte:
Ber. für Betainchloraurat
Cs Hui NO».HCI. AuCl
0,2633 g Subst. gaben 0,1235 g C O,, entspr. 12,79 Proz. C 13,13 Proz.
0,2633g „ vn 0,0633 g H,O si 269 „ H 2,64 „,
0,191g „ „ 0,0818 g Au we 43,03 „ Au 4314 „,
0,3954g , „ 0,4952 g AgCl ,„ 30,98 ,, Cl 31,03
Filtrat von der Phosphorwolframsäurefällung: Das Filtrat, zu dem
die Waschwässer gefügt wurden, wurde auf 600 ccm aufgefüllt. In
100 ccm davon waren (Mittel aus zwei Bestimmungen) 21,66 mg N
enthalten, entsprechend 15,29 Proz. des Gesamt-N. Das Filtrat wurde
mit Ba(OH), von den anorganischen Säuren befreit, der überschüssige
Baryt durch CO, entfernt, nach dem Filtrieren mit Tierkohle entfärbt
und eingedampft. Die über H,SO, getrocknete Masse wurde wiederholt
mit 95proz. Alkohol bei 60% ausgezogen, der verbleibende Rückstand
enthielt die Glycerinphosphorsäure. Die alkoholische Lösung wurde
eingedampft, mit Wasser aufgenommen, H,SO, zugefügt, bis 5 Proz.
davon vorhanden waren, und wieder mit Phosphorwolframsäure gefällt.
Die aus der Fällung regenerierten Basen wurden als Goldsalz bestimmt.
0,2841 g Substanz ergaben nach Ausfällen des Au mit H,S und
Glühen des Sulfids 123 mg Au, entsprechend 43,29 Proz. Au, und
0,1672g Substanz gaben bei direkter Verbrennung 72,5mg Au
== 43,36 Proz. Au (theoretisch 43,14 Proz... Im ganzen wurden in
dieser Fraktion ungefähr ] g Betain gewonnen, das der ersten Fällung
mit Phosphorwolframsäure entgangen war. Die Mutterlauge, aus der
sich bei längerem Stehen noch Kristalle ausschieden, gab nach Ent-
fernung des überschüssigen Goldes mit H,S und Entfernung auch
dieses minimale Reduktion der Fehlingschen Lösung, ein Teil des
Zuckers war also jedenfalls beim Extrahieren mit Alkohol in Lösung
gegangen.
Der vorerwähnte Rückstand, in dem sich neben der Glycerin-
phosphorsäure die Kohlenhydrate befinden mußten, wurde in Wasser
gelöst, mit Ticrkohle entfárbt, auf 500 ccm gebracht und in einem
aliquoten Teil der N bestimmt. Es ergaben sich, auf obiges Volumen
berechnet, 61,26 mg N, entsprechend 7,21 Proz. des Gesamt-N. Die
Lösung wurde langsam eingedunstet, mehrmals von dunklen Zer-
setzungsprodukten abfiltriert, dann der Rückstand mit 50 proz. Alkohol
bei Siedehitze extrahiert. In der durch den Heißwassertrichter filtrierten
alkoholischen Lösung schied sich beim Erkalten der Zucker aus, der
Pfilanzenphosphatide. U. 375
nach vollständigem Vertreiben des Alkohols in Wasser gelöst wurde,
worauf das Filtrat von etwas Ungelöstem in mehrere Teile geteilt
wurde. Ein Teil wurde im Vakuum eingedunstet und davon 0,2638g
in 5ccm Wasser gelöst, die im 1-dm-Rohr bei 20% eine Drehung von
+ 2,720 zeigten (Mittel aus mehreren Äblesungen). [a]5 = + 51,550
(theoretisch für Glucose + 52,50%). In einem anderen Teil wurde in
bekannter Weise die Oxydation mit HNO, vorgenommen und das
Monokalisalz der Zuckersäure isoliert, umkristallisiert und aus diesem
mit AgNO, das Ag-Salz hergestellt. Dasselbe ergab, im Dunkeln
getrocknet (Mittel aus zwei Analysen): 0,11035 g Substanz ergaben
beim Glühen 0,05635 g Ag = 51,06 Proz. Ag (für zuckersaures Ag
berechnet 50,9 Proz. Ag). |
In einem dritten Teil endlich wurde das Diphenylhydrazon nach
E. Fischer!) hergestellt, das in Aussehen und Schmelzpunkt 162° voll-
kommen einem aus Kahlbaums reinster Glucose hergestellten analogen
Präparat glich und auch im Gemisch mit diesem keine Schmelzpunkts-
depression zeigte. Der im Phosphatid enthaltene Zucker war also
Glucose. |
Der bei Extraktion mit Alkohol verbliebene Rückstand wurde
in Wasser gelöst, filtriert und mit 98proz. Alkohol ausgefällt. Er wurde
dann noch zweimal in Wasser gelöst und wieder mit Alkohol ausgefällt.
Die rein weiße Fällung war in heißem Wasser sehr schwer löslich, etwas
leichter in kaltenı. Der Darstellung nach mußte sie glycerinphosphor-
saures Ba sein. Von der im Vakuum getrockneten, zu einem feinen
Pulver zerriebenen Substanz wurde nach Hydrolyse mit verdünntem
H,SO, keine Reduktion der Fehlingschen Lösung gezeigt. 0,4487 g
davon, in 5 ccm Wasser gelöst, zeigten bei 18% eine Drehung von + 0,14°.
Lol? = +1,56%. 0,2245 g Substanz getrocknet, mit Soda-Salpeter
verbrannt, dann mit Molybdat und Mg-Mixtur gefällt, lieferten 77,7 mg
Mg,P,0, = 9,64 Proz. P (Kontrollanalyse 10,24 Proz. P), 0,1996 g
Substanz gaben 0,1433g BaSO, = 42,25 Proz. Ba (die bei 130% ge-
trocknete Substanz 44,74 Proz. Ba).
ber. für Ba-Glycerophosphat C,H, PO,Ba + H,O:
Ba = 42,20, P= 9,53 Proz.,
wasserfreies Ba-Glycerophosphat:
Ba = 44,68, P = 10,09 Proz.
Feitsäurefraktion: Die rotbraune alkoholische Lösung, die bei der
Extraktion des bei der Phosphatidhydrolyse ausgeschiedenen PbSO,
erhalten worden war, gab bei langsamem Eindunsten einen festen
Rückstand, der in Äther gelöst und mit der beim Ausäthern der schwefel-
sauren Lösung erhaltenen Fettsäurelösung vereinigt wurde. Die Äther-
anszúge wurden mehrmals mit Wasser gewaschen, die ätherische Schicht
1) E. Fischer, Ber. d. deutsch. chem. Ges. 23, 805, 1890.
25*
376 V. Grafe u. H. Magistris:
mit geglühtem Na,SO, getrocknet und der Äther verdunstet. Das
im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknete Fettsäuregemisch
wog 23,89 g, entsprechend 36,47 Proz. Diese Menge enthielt, in ali-
quoten Teilen der Kjeldahlbestimmung unterzogen, 107,9 mg N (Mittel
aus zwei Analysen). Durch den positiven Ausfall der Elaidinreaktion
war das Vorhandensein von Ölsäure wahrscheinlich geworden. Die
Trennung der gesättigten von den ungesättigten Fettsäuren geschah
auf Grund der verschiedenen Löslichkeit ihrer Pb-Salze*). 10g Fett-
säuregemisch wurden mit 60 ccm alkoholischer NaOH am Wasserbad
im Erlenmeyerkolben erwärmt, verdünnt und mit Essigsäure genau
neutralisiert, nach Verjagen des Alkohols in 100 ccm heißen Wassers
gelöst und mit einer neutralen Lösung von 10 g Bleiacetat in 100 ccm
50proz. Alkohols gefällt, die überstehende Flüssigkeit nach dem Er-
kalten abgegossen und die Bleiseife im Leuchtgasstrom getrocknet.
Nun wurde der Kolbeninhalt mit 100 ccm Äther behandelt, die Flüssig-
keit mit den Bleisalzen der flüssigen Fettsäuren in einen Scheide-
trichter filtriert und zur Zersetzung der Bleisalze mit verdünntem
HCl geschüttelt. Die wässerige Schicht wurde abgezogen und die
ätherische mit 5proz. NaOH gut durchgeschüttelt. Durch Zusatz
von etwas Alkohol wurde eine vollständige Trennung der beiden
Schichten erzielt. Die ungesättigten Fettsäuren gehen in die alkalische
Lösung über, während das Unverseifbare in der ätherischen Lösung
zurückbleibt. Die erstere wurde nun stark verdünnt, mit HCl ange-
säuert, die Fettsäuren mit Petroläther ausgezogen, säurefrei gewaschen,
das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert, worauf ein gelblich ge-
färbtes Öl zurückblieb, das nach der Trocknung folgende Analysen-
werte gab:
0,3581 g Substanz verbrauchten 0,32225 g J, entsprechend 89,98 Jod-
zahl (Mittel aus zwei Bestimmungen) (berechnet für Ölsäure 90,07).
Außerdem wurde ein Teil der Fettsäuren in ammoniakalischem
Alkohol gelöst, das Ba-Salz mit BaCl, gefällt, abgezogen, gewaschen,
aus Alkohol umkristallisiert und getrocknet.
0,3446 g Substanz gaben 0,115 g BaSO, mit 19,64 Proz. Ba (Mittel
aus 2 Versuchen) (berechnet für Ba-Oleat 19,62 Proz. Ba).
Die feste Fettsäure wurde durch Zerlegen der in Äther unlöslichen
Bleiseife gewonnen. Der ätherunlösliche Rückstand wurde in 50 proz.
Alkohol suspendiert und unter Erhitzen K,CO.,, bis zur deutlich alka-
lischen Reaktion zugesetzt. Nach Abfiltrieren des Carbonats wurde
verdünnt und die Seife unter Anwendung von Methylorange mit HCl
zerlegt. Beim Einengen der Lösung und raschem Abkühlen fiel die
1) Varrentrapp-Fahrion, Abderhalders Handb. d. biol. Arbeitsmethoden
2, 223; vgl. auch Benedict-Ulzer, Analyse der Fette und Wachsarten und
Kremel, Pharm. Centralhalle 5, 337.
Pflanzenphosphatide. II. 377
Fettsäure in großen Schuppen aus, die abgesaugt und mehrmals aus
Alkohol umkristallisiert wurden.
Schmelzpunkt 61,8° (Mittel aus mehreren Bestimmungen) (Schmelzp.
der reinen Palmitinsäure 62,6°).
0,4365 g Substanz verbrauchten 17,07 cem n/10 KOH, entsprechend
Säurezahl 219,25 (berechnet für Palmitinsäure 218,9).
Acetylzahl war 0.
Aus einem Teil des Fettes wurde in alkoholisch-ammoniakalischer
Lösung das Ag-Salz in stark glänzenden Blättchen gewonnen.
0,1972 g Substanz lieferten 58,5 mg Ag = 29,66 Proz. Ag (berechnet
für das Ag-Salz des Palmitins 29,70 Proz. Ag).
Die kleine Menge an Unverseifbarem, die nach Abdestillieren des
Äthers erhalten wurde, hatte den Schmelzpunkt 139 bis 140%, gab
Moleschottsche und Liebermannsche Reaktion und bestand wahr-
scheinlich aus einem Phytosterin.
Als Spaltungsprodukte des durch Bleiacetat in neutraler Lösung
fällbaren Phosphatids waren also gefunden worden: Betain, Glycerin-
phosphorsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Glucose, wobei die Frage offen
bleibt, ob der Zucker im Phosphatidmolekül gebunden oder adsorbiert
ist. Nach Njegovan sind die Kohlenhydrate ‚nicht molekulare Bestand-
teile der Phosphatide**, doch können hier die Verhältnisse anders liegen,
da unsere Phosphatide am ehesten den Anspruch haben, „nativ“
genannt zu werden. Betain ist im Vergleich zu den vielen Angaben
über Vorhandensein von Cholin selten in Phosphatiden gefunden
worden!). Zur Auffindung eventueller Eiweißspaltungsprodukte wurde
in den einzelnen Fraktionen Formoltitration?) vorgenommen, indessen
mit durchaus negativem Erfolg.
Die zur Spaltung verwendeten 65,51 g Phosphatid enthielten
1,297 Proz. (0,8496 g) N. Von diesen konnten 97,3 Proz. in den einzelnen
Fraktionen gefunden werden. Die N-Verteilung in den verschiedenen
Fraktionen der Säurespaltung des mit Bleiacetat in neutraler Lösung
gefällten Phosphatids stellte sich folgendermaßen dar:
l | N ' Phosphatid ae Gesamt
Priktion | $ | Proz. Proz.
Fällung mit Phosphorwolframsäure . | 0,5276 | 0,805 62,10
Filtrat dieser Fällung ....... O, 1299 0, 198 15, 29
Glucose und Glycerinphosphorsáure . 0,0613 O, 093 7 21
Fettsäuren. . .........-. 0,1079 O, 164 12, 70
Zusammen. o... | 0,8267 l 260 97 30
Im EES gefunden. ..... ¡0,8496 l 297 | 100
1) Stanek, Zeitschr. f. physiol. Chem. 48, 343, 1906; O. Lippmann,
Ber. d. deutsch. chem. Ges. 20, 3201, 1887; E. Schulze und V. Pfenniger,
Zeitschr. f. physiol. Chem. 71, 478, 1911.
2) E. Abderhalden und Fr. Kramen, ebendaselbst 77, 428, 1912.
378 V. Grafe u. H. Magistris:
`
Bei der Spaltung mit 10proz. HSO, wurden keine anderen
Spaltungsprodukte gefunden als die eben beschriebenen.
Spaltung mit 20 proz. H,SO,: 25g der Bleifällung wurden
41, Stunden mit der H}, SO, erwärmt. Das abfiltrierte PbSO, er-
schöpfend mit Alkohol extrahiert, die Lösung eingedunstet, der Rück-
stand mit Äther aufgenommen. Das dunkelgefärbte Filtrat vom
Pb SO, wurde zur vollständigen Gewinnung der Fettsäuren andauernd
mit Äther geschüttelt, dann mit Wasser gewaschen und der Äther ab-
destilliert. In der öligen Fettsäureschicht schied sich eine kleine Menge
eines kristallisierten Körpers aus, der durch seine Löslichkeit in Wasser
von der Fettsäure getrennt werden konnte. Nach mehrmaligem Um-
kristallisieren zeigten die sehr geringen Kristalle den Schmelzpunkt 32
bis 330, charakteristisch für Lävulinsäure, die als Spaltungsprodukt der
Hexose aufgetreten sein dürfte. Ein größerer Teil der schwefelsauren
Lösung wurde mit Kupferacetatlösung versetzt und dabei ein in blauen
Nadeln kristallisierter Körper erhalten, der in Wasser und Alkalien
löslich war und in dem qualitativ N nachgewiesen wurde. Bei der
Analyse lieferte der getrocknete Körper:
0,4487 g Substanz gaben 0,1546 g CuO = 0,1235g Cu = 27,52 Proz. Cu;
für das Cu-Salz der Aminoessigsäure berechnet 27,68 Proz. Cu.
0,1529 g Substanz gaben 0,1531g CO, = 21,03 Proz. C; für das Cu-Salz
der Aminoessigsäure berechnet 20,91 Proz. C.
0,1529 g Substanz gaben 0,0765g H,O = 4,31 Proz. H; für das Cu-Salz
der Aminoessigsäure berechnet 4,38 Proz. H.
0,1529g Substanz gaben 0,0185g N = 12,14 Proz. N; für das Cu-Salz
der Aminoessigsäure berechnet 12,20 Proz. N.
0,1535g Substanz verbrauchten bei der Formoltitration 6,68 ccm
n/5 NaOH, entsprechend 18,7 mg N = 12,18 Proz. Amino-N, so daß der
Gesamt-N als formoltitrierbarer N vorhanden war.
Beim Zerlegen der wässerigen kalten Lösung mit H,S wurde eine
braune Flüssigkeit erhalten, die sich beim Erwärmen olivgrün färbte.
. Die Lösung enthält nach Lottermoser*) das Hydrosol des CuS; das
mehrmals aus Wasser umkristallisiertte Glykokoll bildete farblose
Prismen, die sich beim raschen Erhitzen bei 225% bräunten und bei
233 bis 234° mit Purpurfarbe schmolzen. Dieses hier gefundene Glykokoll
zeigte sich bei weiteren Versuchen als Abbauprodukt des Beiains.
Die übrigen Spaltungsprodukte: Ölsäure, Palmitinsäure, Glycero-
phosphorsäure und Betain konnten unverändert, wenn auch nicht in
gleichem Reinheitsgrad wie nach Spaltung mit 5proz. H,SO, erhalten
werden. Daß Glykokoll tatsächlich aus dem Betain entstanden war
und daß bei tiefer eingreifender Spaltung Lävulinsäure auftritt, zeigten
folgende Ergebnisse:
1) A. Lottermoser, Journ. f. prakt. Chem. (2) 75, 293, 1907; T. Curtius,
Ber. d. deutsch. chem. Ges. 23. 3041, 1890.
Pflanzenphosphatide. II. 319
13,483 g Phosphatid wurden mit 150 eem 5proz. H,SO, unter
Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wurde vom PbSO, abfiltriert,
dieses wiederholt mit heißem Wasser gewaschen, die Waschwässer
mit der von allen Fettsäuren befreiten Hauptmenge des Filtrats ver-
einigt und eingeengt. Dann bis zur alkalischen Reaktion mit reinem
Baryt versetzt. Nach 12 Stunden die ausgefallenen Ba-Salze abfiltriert
und gewaschen. Das Filtrat zur Trockne gebracht, mit Alkohol auf-
genommen, mit HCl eingedunstet, die überschüssige Säure entfernt
und die getrockneten Salze mit 98proz. Alkohol extrahiert, wieder
eingedunstet, mit Alkohol aufgenommen und mit warmer alkoholischer
HgCl,-Lösung versetzt. Das abgesaugte gewaschene, umkristallisierte
Hg-Doppelsalz wurde mit H,S zerlegt, das Filtrat zur Trockene ein-
gedampft, mit Alkohol aufgenommen und durch Fällen mit AuCl,
das Chloraurat hergestellt. Es wurden erhalten 4,2893 g C,H,,NO,
. HCl. AuCl,, entsprechend 1,0988 g C,H,,NO, oder 8,15 Proz. Betaın
des Gesamtphosphatids. l
Nun wurden 32,847 g Phosphatid 9 Stunden mit l5proz. HO
hydrolysiert, der Niederschlag nach dem Erkalten abgesaugt und ge-
waschen. Im Filtrat wurde das Pb als Carbonat entfernt und das
Filtrat in zwei Teile geteilt. Der eine wurde viermal mit dem gleichen
Volumen Äther ausgeschüttelt!), der Rückstand vom Ätherextrakt,
der auch noch einen Teil der Fettsäuren enthielt, wurde im Dampf-
trockenschrank eine halbe Stunde erwärmt, und da eine Probe Jodo-
formreaktion gab, wurde derselbe mit Wasser ausgezogen, wobei nur
die Fettsäuren ungelöst blieben. Die wässerige Lösung wurde mit
ZnO digeriert und das nach Entfärben mit Kohle und Abdampfen
erhaltene kristallinische Zinklävulat durch Fällen seiner konzentrierten
Lösung mit AgNO, in das Ag-Salz der Lävulinsäure übergeführt.
Das umkristallisierte Produkt zeigte: 0,1857 g des Salzes lieferten
84,9 mg Ag = 48,40 Proz. Ag (Mittel aus zwei Analysen), für C¿H,0,Ag
berechnet 48,39 Proz. Ag.
Der zweite Teil wurde von den Fettsäuren befreit und im Vakuum
eingedampft, der getrockneie Rückstand mit der dreifachen Menge
absoluten Alkohols versetzt und so lange trockenes HCI-Gas ein-
geleitet, bis die Lösung gesättigt war. Dann abfiltriert und im Vakuum
eingeengt. Nach längerem Stehen in der Kälte schieden sich Kristalle
aus, die sich bei der Analyse als salzsaurer Ester des Glykokolls erwiesen.
Ber. f. salzs. Glykokoll
0,1936 g Subst. gaben 0,2455 g CO,, entspr. 34,58 Proz.C 34,41 Proz. C
0.1936g ,, » 91241gH,0 „ TITO, H, 722, H
0,2127g „ „ 0.002158N, „ Mil „N 1004 „N
„ CE 292. Cl
0,2563 „ „ 0.2398 g AgCl, „ 23,06
1) Ann.d.Chem. 248, 314, 1888.
380 V. Grafe u. H. Magistris:
Schmelzpunkt 143° (theoretisch 145°). Aus der Mutterlauge konnte
noch Substanz gewonnen werden. Der in absolutem Alkohol unlösliche
Rückstand wurde mit 95proz. Alkohol in der Wärme extrahiert und
aus der Lösung zuerst das Hg-Doppelsalz und dann das Chloraurat
des Betains dargestellt. Es wurden 3,8508 g des Goldsalzes gewonnen.
Aus der ersten Hälfte des Filtrats resultierten 3,7909 g Betainchloraurat,
zusammen also 7,6417 g, entsprechend 1,9577 g Betain = 5,96 Proz.
Es waren also bei der tiefergreifenden Spaltung 2,599 g Betain weniger
erhalten worden. Diese Differenz führen wir auf das Glykokoll zurück,
das sonst bei der Hydrolyse niemals erscheint. Es war also bei der
tiefergreifenden Hydrolyse das Kohlenhydrat weiter zu Lävulinsäure
abgebaut und das Betain zu Glykokoll entmethyliert worden.
Spaltung mit 5proz. KOH: Die Abbauprodukte waren die gleichen
wie die mit 5 und 10 proz. Säure erhaltenen. Indessen war im Gegensatz
zur Säurehydrolyse das Fettsáuregemisch hier stickstofffrei. Das Filtrat
nach der Fällung mit Phosphorwolframsáure enthielt nur noch 4 mg N,
das sind für die zur Spaltung verwendeten 10,40 g Phosphatid mit
135 mg N nur 2,97 Proz. des Gesamt-N. Es hat den Anschein, als ob
bei der alkalischen Spaltung die Abtrennung der N-haltigen Kom-
ponente des Phosphatids gründlicher erfolge als bei der Säurespaltung.
2. Fällung mit Bleiacetat in ammoniakalischer Lösung.
Diese unterscheidet sich schon im Aussehen (Farbe, blätterig-
körniges Gefüge) von der vorigen. Die Analysenwerte (Mittel aus je
zwei Analysen) sind:
0,3271g Substanz gaben 0,2576g CO, und 0,1079 g H,O, entsprechend
21,47 Proz. C und 3,69 Proz. H.
0,3981 g Substanz gaben 0,00645 g N, entsprechend 1,72 Proz. N.
0,5428 g 5 » 0,5013g PbSO,, entsprechend 63,07 Proz. Pb.
0,4621 g = verbrauchten 15,81 cem n/10 NaOH, entsprechend
1,89 Proz. P.
Aus der Differenz berechnet 8,16 Proz. O.
Das Verhältnis P:N ist 1: 2,01.
Mit H,SO, hydrolysiert, lieferte die Substanz keine Reduktion
der Fehlingschen Lösung, Kohlenhydrate waren also nicht vorhanden.
Das Phosphatid erweist sich also als Diamino- Monophos phatid
mit der empirischen Formel: C'a Heo Na PO; . 5 Pb.
Spaltung mit 5 proz. H,SO,: 52,13 g Substanz wurden mit 500 ccm
5proz. H,SO, 6 Stunden unter Rückfluß erhitzt. PbSO, abfiltriert,
gewaschen, mit heißem Alkohol ausgezogen, eingedunstet, der braune
Rückstand mit Äther aufgenommen. Die gelbgefärbte trübe, schwefel-
saure Lösung ausgeäthert, der Extrakt mit Wasser gewaschen, über
Pflanzenphosphatide. II. 381
Na,SO, getrocknet, der Äther abdestilliert. Es hinterblieb eine
schuppige gelbe Masse, die nach dem Trocknen 8,18g wog. Sie ent-
hielt N und etwa 16 Proz. Fettsäuren des Phosphatids, und zwar
nur gesättigte. Die in kaltem Alkohol und Äther lösliche Masse wurde
mit alkoholischer KOH behandelt, aus der Seife die Fettsäuren mit
HCl in Freiheit gesetzt, mit Petroläther ausgezogen und dieser nach
Waschen und Trocknen abdestilliert. Beim Eindunsten des in Alkohol
gelösten Rückstandes im Vakuum schieden sich große Kristallschuppen
aus, die nach der Reinigung den Schmelzpunkt 61,5 bis 62,3% zeigten
(für Palmitinsäure 62,6°).
0,2335 g Substanz verbrauchten 9,13 ccm n/10 KOH, entsprechend
der Säurezahl 219,2 (für Palmitinsäure 218,9).
0,3005 g Substanz gaben bei der Ag-Bestimmung des Ag-Salzes
0,0893 g Ag = 29,72 Proz. Ag (für Palmitinsäure berechnet 29,7 Proz. Ag).
Die schwefelsaure Lösung nach dem Ausäthern der Fettsäuren
wurde nach Einengen mit Phosphorwolframsäure gefällt. Der volu-
minöse Niederschlag nach Stehen, Waschen mit wässeriger Baryt-
lösung unter Rühren zerlegt, die Barytsalze nach Vertreiben des NH,
entfernt, der Baryt mit CO, beseitigt und das Filtrat mit HCl an-
gesäuert und eingedunstet. Die von dunklen Zersetzungsprodukten
und der überschüssigen HCl befreiten getrockneten Salze wurden mit
absolutem Alkohol extrahiert und nach Wiederholung dieses Verfahrens
mit alkoholischer HgCl,-Lösung gefällt. Der umkristallisierte Nieder-
schlag mit H,S zerlegt, die Lösung zur Trockne gebracht, mit absolutem
Alkohol in der Kälte behandelt, wieder das Hg-Salz der Base aus-
gefällt, zerlegt und die Lösung eingedunstet. Ebenso wurde noch
ein drittes Mal verfahren. Die Lösung der salzsauren ‘Salze wurde
mit AuCl, gefällt und das erhaltene Au-Doppelsalz aus heißem Wasser
umkristallisiert.
0,1746 g Substanz gaben 77,8mg Au = 44,52 Proz. Au (für
Cholinchloraurat berechnet 44,50 Proz. Au).
Das in absolutem Alkohol Ungelöste wurde mit 98proz. Alkohol
warm extrahiert, darauf wieder wie vorher über das Hg-Doppelsalz
die Au-Verbindung gewonnen.
0,1632 g Substanz (Mittel aus zwei Analysen) gaben 78,1mg Au
= 43,21 Proz. Au (für Betainchloraurat berechnet 43,14 Proz. Au).
Das Filtrat von der Fällung mit Phosphorwolframsäure wurde
mit Ba(OH),, dann mit CO, behandelt, mit Kohle entfárbt, zur Trockne
gebracht, mit 98proz. Alkohol digeriert, um noch vorhandene Base
in Lösung zu bringen, abfiltriert. Die getrocknete Masse wurde dann
in Wasser gelöst, entfárbt und mit Alkohol gefällt, diese Operation
wiederholt. Das bei 130% getrocknete Ba-Salz der Glycerinphosphor-
säure gab:
382 V. Grafe u. H. Magistris:
0,2201 g Substanz 'ieferten 0,1673 g BaSO, = 44,73 Proz. Ba (Mittel aus
zwei Analysen); berechnet für C,H,PO,Ba 44,68 Proz. Ba.
0,1667 g Substanz lieferten 0,0611 g Mg,P,0, = 10,21 Proz. P; (Mittel aus
zwei Analysen); berechnet für C,H,PO,Ba 10,09 Proz. P.
0,4049 g des Ba-Salzes, in 6 ccm Wasser gelöst, zeigten im 1-Dezimeterrohr
bei 21° eine Drehung von + 0,12, [a4 = + 1,67°.
Bemerkenswert ist auch, daß dieses Ba-Glycerophosphat auch in
kaltem Wasser außerordentlich schwer löslich war. Die Formoltitration
zur Feststellung von Aminosäuren lieferte kein positives Ergebnis.
Spaltung mit 5 proz. alkoholischer KO H: 15,54 g der Pb-Verbindung
des Phosphatids wurden mit 600 ccm der Lauge 34, Stunden im kochen-
den Wasserbad unter Rückfluß behandelt. Die dabei erhaltene gelbliche,
vollkommen klare, stark schäumende Lösung wurde mit HCl über-
sättigt und die dabei stark trüb gewordene Flüssigkeit von dem volu-
minösen braunen Niederschlag und von PbCl, abfiltriert, mit Äther
im Scheidetrichter geschüttelt. Die klare gelbe Ätherschicht bis zum
Verschwinden der sauren Reaktion mit Wasser gewaschen, getrocknet,
der Äther abdestilliert, das Residuum im Vakuum getrocknet. Es
enthielt keinen N und wog 2,35 g, entsprechend 15,12 Proz. Fettsäuren
(in Übereinstimmung mit den bei der Säurespaltung erhaltenen
15,69 Proz. Fettsäuren). Es wurde das Pb-Salz in der üblichen Weise
hergestellt. 0,5196 g Substanz gaben 0,2202 g PbSO, = 28,95 Proz. Pb
(berechnet für Palmitinsäure 28,86 Proz. Pb). Der abgetrennte braune
flockige Niederschlag wurde mit warmem H£XCl-haltigen Wasser ge-
waschen und stellte sich getrocknet als dunkelbraune amorphe, in
neutralem oder alkalischem Wasser leicht lösliche, dagegen in Äther,
Alkohol völlig unlösliche Substanz dar, die weder Fehling reduzierte
noch die Pentosereaktionen gab, auch keinen N enthielt. Wahrscheinlich
bestand sie aus einem Pektinstoff.
Die wässerige salzsaure Lösung wurde dann von Äther befreit,
das Pb als Sulfat entfernt, auf 500 cem gebracht und in zwei Teile
geteilt.
In der einen Hälfte wurde der N bestimmt. es ergaben sich auf
die ganze Flüssigkeitsmenge gerechnet 0,2658 g N = 1,70 Proz. N.
Hier befand sich tatsächlich die gesamte N-Menge in der Basenfraktion.
Die erste Hälfte wurde nun mit Phosphorwolframsáure ausgefällt,
die aus dem Niederschlag regenerierten Basen erwiesen sich wie früher
als Cholin und Betain, wobei die Ausbeute an ersterem größer war.
Es wurden nur 60,5 Proz. Cholinchlorhydrat und 39,5 Proz. Betain-
chlorhydrat erhalten. Die Trennung wurde durch die verschiedene
Löslichkeit in absolutem Alkohol bewirkt. Das Filtrat nach der Fällung
mit Phosphorwolframsäure enthielt keinen N mehr.
Pflanzenphosphatide. II. 383
Die andere Hälfte wurde vorsichtig zur Trockne eingedunstet,
der Rückstand zur Abscheidung der Basen mit Alkohol extrahiert.
Der nach der Extraktion verbliebene Rückstand wurde in Wasser
gelöst, mit Tierkohle entfärbt und mit Bleiacetat versetzt. Der feine
nadelige Niederschlag wurde abgesaugt, gewaschen, getrocknet. Er
wog 1,796 g. 0,4467 g davon gaben 0,3611 g PbSO, = 55,13 Proz. Pb
(berechnet für glycerinphosphorsaures Pb 54,92 Proz. Pb). Er gab
deutliche P-Reaktion, gab beim Erhitzen mit KHSO, Akroleingeruch
und bestand also aus glycerinphosphorsaurem Pb.
Die Spaltungsprodukte waren also dieselben wie bei der Säure-
spaltung.
Untersuchung des in Alkohol löslichen Anteiles der Fällung mit Bleiacetat
in neutraler Lösung.
32,046 g Trockensubstanz der Verbindung wurden in einem Erlen-
meyerkolben am Wasserbad so lange mit 98proz. Alkohol bei 60°
behandelt, als sich dieser noch anfärbte, was nach etwa 6 Stunden
beendet war. Bei der Behandlung des Materials mit siedendem Alkohol,
wie es durch andere Autoren in der Regel vorgenommen wurde, geht,
wie der Versuch lehrte, eine Destruktion des Phosphatids vor sich,
mindestens spalten sich die Fettsäureanteile ganz oder teilweise ab.
Deshalb wurde in unseren Versuchen die Verwendung von siedendem
Alkohol sorgfältig vermieden. Die unten folgenden Daten zeigen aber
deutlich, daß durch Alkohol schon bei 60° eine wenigstens teilweise
Abtrennung der Kohlehydratgruppe erfolgt, so daß das Produkt der
Alkoholyse in seiner Zusammensetzung vom ursprünglichen Phosphatid
nicht unbeträchtlich abweicht. Daraus geht wohl deutlich hervor,
daß selbst solche organische Solventien, welche normalerweise nicht
tief in den molekularen Bau eingreifen, hier zerstörend wirken können.
Nach dem Trocknen wog die Bleifállung noch 18,548 g. Es sind
somit 13,498 g = 42,12 Proz. der ursprünglichen Fällung in den Alkohol
übergegangen.
Der gelbe alkoholische Extrakt wurde im Vakuum eingedunstet,
das fettartige Residuum mit Äther aufgenommen, worin es bis auf
einen ganz geringen anorganischen Rest vollkommen löslich war. Die
ätherische Lösung wurde getrocknet, der Äther abdestilliert und nun
in Portionen Benzol zugesetzt. Die anfänglich ölige Abscheidung
wurde durch weiteren Benzolzusatz in eine feste, gelblichweiße knetbare
Masse verwandelt. Die getrocknete Fällung wog 9,942 g, das sind
73,65 Proz. des in Alkohol gelösten Anteils. Die Fällung war in Wasser
und Benzol unlöslich, in Alkohol, Äther, Aceton, Cloroform löslich.
384 V. Grafe u. H. Magistris:
Nach wiederholter Reinigung und nach dem Trocknen lieferten (Mittel
aus zwei Analysen):
0,5337 g Substanz 69,5 mg Mg,P,O, = 3,62 Proz. P
0,3931 g si 6,78 „ N = 1723 „ N
0,1467 g » 3385 „ CO, = 62,93 „ C
und 133,7 mg H,O = 10,19 Proz. H.
0,874 g Substanz wurden mit 80 eem 5proz. HSO, 6 Stunden
unter Rückfluß gekocht, die Fettsäuren mit Petroláther aufgenommen,
das wässerige Hydrolysat auf 100 ccm gebracht. Je 20ccm davon
wurden nach Bertrand auf Zucker untersucht. Es wurden verbraucht
(Mittel aus 3 Analysen): 1,683 eem KMnO, (l cem = 9,91 mg Cu),
entsprechend 8,2 mg Glucose = 4,69 Proz. Glucose. Das Verhältnis
P:N=1:1,05. Das vorliegende Präparat ist also ein Monoamino-
monophosphatid.
Bei der Extraktion der Bleifällung mit Alkohol war also das
Phosphatid herausgelöst worden, der Zucker aber nicht in die alko-
holische Lösung übergegangen. So konnte eine immer weitergehende
Reinigung des Phosphatids vom Zucker vorgenommen werden. Was
für Zucker, gilt wohl auch für andere Stoffe, wie die weiteren Er-
mittlungen zeigen; die Phosphatide scheinen jedenfalls hervorragend
geeignet, andere Zellstoffe in mehr oder weniger fester Bindung zu
halten, was ihre Rolle als Transportmittel für die verschiedensten Stoff-
wechselprodukte im Zellhaushalt zu dienen, zusammen mit der Tatsache,
daß es wasserlösliche und wasserunlösliche, aber hydrophile Phosphatide
gibt, die überdies ineinander übergehen können, in ein ganz neues Licht
rückt. Die Forschungen über die Permeabilitätsverhältnisse der Zelle
werden in Zunkunft den Phosphatiden ein besonderes Augenmerk: zu
schenken haben.
Wenn andere Forscher, die über pflanzliche Phosphatide gearbeitet
haben, aber ihr Material mit siedendem Alkohol auszogen, nur etwa 2 bis
3 Proz. reduzierender Substanz fanden, so ist das auf die Alkoholyse
zurückzuführen.
Das Phosphatid wurde nun in warmem Äther gelöst, die Lösung
im Vakuum eingedunstet, mit warmem Alkohol aufgenommen und
diese Operation mehrmals wiederholt. Schließlich wurde wie früher
mit Benzol gefällt, die wachsartige Fällung gründlich mit Benzol durch-
geknetet und getrocknet. 0,2968 g Substanz wurden mit 5proz. H,SO,
hydrolysiert, das Filtrat auf 80 ccm gebracht, wovon je 20 ccm (Mittel
aus 2 Bestimmungen) 0,375 cem KMnO, verbrauchten. Nach der
früheren Relation entspricht das 3,71 mg Cu = 1,82 mg = 2,45 Proz.
Glucose. Der Zuckergehalt war also durch die eingehende Behandlung
mit Alkohol gegen früher auf die Hälfte herabgegangen, der ver-
bleibende Rest konnte aber durch diese Methode auf keine Weise
Pflanzenphosphatide. II. 385
entfernt werden. 0,1616 g Substanz wurden mit H,SO, hydrolysiert,
das Filtrat auf 50 ccm gebracht. Je 25ccm verbrauchten 0,41 ccm
KMnO, = 4,06 mg Cu = 1,99 mg @lucose = 2,47 Proz. Dieses Phos-
phatid wurde zur Analyse gebracht. Mittel aus zwei Analysen:
0,1743 g Subst. gaben 24,1 mg Mg,P.O,, entspr. 3,86 Proz. P
0,1976g „ „3,46 „ N, „ 1745 „N
0,1734g „ „ 4195 „ CO, » 641 „ C
0,1734g ,„ „ 165,3 „ H,O, „ 1036 „ H
aus der Differenz berechnet 19,92 O
LE
Das Phosphatid entspricht danach der empirischen Formel
Cas Hga N PO, mit dem Molekulargewicht 804.
Spaltung des Phosphatids mit verdinntem H,SO,: Der Rest der
Benzolfällung, etwa 6g, wurden mit 100ccm 5proz. H,SO, unter
Rückfluß 5 Stunden erhitzt, die Fettsäuren ausgeäthert, die wässerige
Lösung davon mit Phosphorwolframsäure gefällt, die Fällung mit
Baryt zerlegt, CO, eingeleitet und das Filtrat eingedunstet.
Mehrmals mußte von dunklen Zersetzungsprodukten abfiltriert
werden, dann wurde mit HCl übersättigt und im Exsikkator langsam
auskristallisieren gelassen. Die aus der bräunlichen Masse sich aus-
scheidenden Kristalle wurden am Tonteller mit absoluten Alkohol
gewaschen, dann in Wasser gelöst und mit Kohle entfärbt. Schließlich
wurde zur Trockne eingedunstet, mit warmem Alkohol aufgenommen
und von dem ganz geringen Rückstand (BaCl,) abfiltriert. Nach Ein-
dampfen im Vakuum hinterblieben etwa 0,6g eines Salzes, das sich
als Betainchlorhydrat erwies. Schmelzpunkt war 242 bis 243°, unlöslich
in absolutem Alkohol, reagiert stark sauer, gibt beim Erhitzen weder
Pyrrolreaktion noch Pyridingeruch. Es wurde das in rechtwinklig
begrenzten Blättchen kristallisierte Cloraurat hergestellt, von dem
0,2023 g 87,1mg Au gaben, entsprechend 43,05 Proz. Au (berechnet
für Betainchloraurat 43,13 Proz. Au).
Durch Versetzen der wässerigen Lösung des salzsauren Salzes mit
Natriumpikrat wurde das in glänzenden Nadeln kristallisierende, bei
182% schmelzende Pikrat gewonnen. Die bräunliche Masse wurde
nach Entfernung der Basenkristalle in Wasser gelöst, mit Kohle ent-
färbt, die Lösung eingeengt und mit Alkohol gefällt. Nach wiederholter
Reinigung wurde das bei 105° getrocknete Ba-Salz der Glycerinphosphor-
säure analysiert.
0,1205g Substanz gaben 87,1mg BaSO,, entsprechend 42,53 Proz. Ba;
berechnet für CH, PO, Do + H,O 42,20 Proz. Ba.
0,2163g Substanz gaben 75,1mg Mg,P,O;,. entsprechend 9,67 Proz. P;
berechnet für C,H,PO, + H,O 9,53 Proz. P..
Obwohl der Ba-Gehalt anscheinend annähernd stimmt, muß das
Präparat doch als unrein bezeichnet werden, da es N enthielt. Eine
386 V. Grafe u. H. Magistris:
weitere Reinigung aber verbot sich bei der geringen Ausbeute. Auch
die Menge der nach Abdestillieren des Äthers erhaltenen Fettsäuren
war für die quantitative Bestimmung unzulänglich. Indessen konnte
durch die Reaktion von Maneal), die auch bei Vorhandensein von
Verunreinigungen eintritt, Ölsäure nachgewiesen werden. Etwas reine
Baumwolle wird in konzentriertem H,SO, gelöst, dann mit einigen
Tropfen der zu prüfenden Flüssigkeit versetzt und unter Schütteln
Wasser zutropfen gelassen. Es trat die charakteristische Rot- und
später Violettfärbung ein.
8. Fällung mit CdCl, in neutraler Lösung.
Um festzustellen, ob die verschiedenen Schwermetallsalze im-
stande sind, Phosphatide verschiedener Zusammensetzung zu fällen,
wurden verschiedene derselben in Anwendung gebracht, von denen
sich dazu besonders CdCl, und Uranylacetat eigneten. In dem wie
immer hergestellten konzentrierten Dialysat wurde mit CdCl ein
grobflockiger hellbrauner Niederschlag erhalten, der wie die ent-
sprechende Pb-Verbindung behandelt wurde. Die Analyse des getrock-
neten Phosphatids ergab folgende Werte:
Mittel aus drei Analysen:
0,3214 g Subst. gaben 26,8 mg Mg,P,O,, entspr. 2,35 Proz. P
0,6333g ., e 6.81 „ N, 2 1,05 , N
gäe „ „ 3365 „ CO, „44 „ C
0,2lllg ,, » 130,2 „ H,O, 2 689 H
0,3916g „ 5, 595 „(Cdo, „ 1614 , Cd
0,1761g ,, „71,65 „ AgCI, „1007 „ Cl
Die empirische Formel berechnet sich daraus mit Us Da A PO,,
.2 CdCl. P:N = 1:0,98. Es handelt sich also um ein Monoamino-
monophosphatid.
0,8466 g Substanz wurden 6 Stunden mit 5proz. H,SO, hydro-
lysiert. Das Filtrat von den Fettsäuren wurde auf 100 ccm gebracht.
Je 50ccm verbrauchten 11,78ccem KMnO, = 119,46 mg Cu, ent-
sprechend 57,39 mg = 13,56 Proz. Glucose.
Spaltung mit öproz. H,SO,: 40 g der Cd-Verbindung wurden mit
500 cem 5proz. H,SO, 6 Stunden unter Rückfluß gekocht, von den
ausgeschiedenen Fettsäuren abfiltriert und diese mit Wasser gewaschen.
Beim Ausäthern der schwefelsauren Lösung konnte noch ein Teil
der Fettsäuren erhalten werden. Die in der üblichen Weise isolierten
Säuren erwiesen sich als Ölsäure und eine feste Fettsäure, deren Identi-
fizierung leider nicht gelang. Schmelzpunkt derselben 59 bis 60°. Wahr-
scheinlich handelte es sich um Palmitinsäure wie in der entsprechenden
Pb-Fällung. Aus der schwefelsauren Lösung wurde nun durch vor-
1) Manea, Chem. Centralbl. 1908, II. 1702.
Pflanzenphosphatide. L. 387
sichtigen Zusatz von (NH,),CO, das Cd ausgefállt, das Filtrat davon
mit H,SO, angesäuert und die Base durch Phosphorwolframsäure
ausgefállt. Die aus dem Niederschlag regenerierte Base war Betain.
(Nachweis durch dem Schmelzpunkt des dargestellten Au-Salzes 234°
und den richtigen Au-Gehalt, 43,19 gegen 43,14 Proz. der Theorie.)
Cholin war nicht vorhanden. Das mit Ba(OH), und CO, gereinigte
Filtrat nach der Fällung mit Phosphorwolframsäure gab nach dem
Eindunsten am Wasserbade einen bräunlichen Rückstand, der in
85proz. Alkohol zum Teil, in kaltem Wasser aber klar löslich war.
Aus der mit Kohle entfärbten Lösung wurde das Ba-Salz der Glycerin-
phosphorsäure mit Alkohol ausgefällt; die Fällung und Auflösung
wurde wiederholt. Trotzdem mußte es als unrein bezeichnet werden,
da 0,18 g der Substanz Fehling beträchtlich reduzierten. Eine weitere
Reinigung erwies sich als untunlich. Das getrocknete Ba-Salz gab
nur 8,42 Proz. P und 40,98 Proz. Ba gegen 9,53 Proz. P und 42,20 Proz.
Ba der Theorie. Der enthaltene Zucker war Glucose, nach dem Schmelz-
punkt des dargestellten Phenylhydrazons 158,80 (Mittel aus drei Be-
stimmungen) gegen 160° der Theorie. Die Spaltungsprodukte waren
also die gleichen wie die der Bleiacetatfällung in neutraler Lösung.
Die beiden Fällungen sind wohl trotz der etwas abweichenden empi-
rischen Formel identisch, was später noch näher ausgeführt werden wird.
4. Die Fällung mit Alkohol.
Diese enthielt, in Wasser vollkommen löslich, wie schon erwähnt,
reichliche Mengen anorganischer Stoffe. Durch Lösen und Wieder-
ausfällen mit den verschiedensten Reagenzien wurde versucht, das
Phosphatid rem" zu erhalten, doch sind diese anorganischen ,,Ver-
unreinigungen‘“ entweder chemisch gebunden, was bei den konstanten
Analysenwerten, die bei verschiedenen Präparaten gefunden wurden,
uns nicht ausgeschlossen erscheint, oder doch so stark adsorbiert,
daß eine Befreiung davon auf physikalischem Wege nicht möglich ist.
Aus unserem Versuchsprotokoll sei die folgende Tabelle angeführt:
ki . Nach der
Ursprüngl. Wässerige Auf» Zan reilen zweiten
lösung der : Mit Methyl» Aceton»
Alkohol» Ge Male mit A fáll P
fállung Fállung mit Aceton gefällt acetat gefällt Ko KA D
S o
Aceton gefällt gefällt
_Proz. | _Proz. | Proz. Proz,
Peg ses 1,03 0,98
narra 0,45 0,43
S eto 1,58 1,39
Mg... ... 0,72 0,94
Na. l...a. 0,58 0,44
EEE 1,60 1,45
Teen VC || 19,57 19,39
388 V. Grafe u. H. Magistris:
Die in Anbetracht der schwierigen Analysenverhältnisse immerhin
halbwegs befriedigende Übereinstimmung der Resultate bei den ein-
zelnen Fällungen läßt den Schluß zu, daß durch die wiederholten
Fällungen eine wesentliche Veränderung (Reinigung) des Phosphatids
nicht eingetreten ist. Bei der Analyse gab die Alkoholfällung folgende
Werte (Mittel aus zwei Analysen):
0,2823g Substanz verbrauchten 5,28cem n/10 NaOH, entsprechend
1,03 Proz. P.
0,3963 g Substanz lieferten 1.75mg N, entsprechend 0,45 Proz. N.
1,3425g Substanz gaben nach Säuregemischveraschung und doppelter
Ausfällung 30,35 mg CaO, entsprechend 1.58 Proz. Ca.
1,3425g Substanz gaben nach Säuregemischveraschung und doppelter
Ausfällung 43,65 mg Mp,P.O,, entsprechend 0,72 Proz. Mg.
1,1421g Substanz gaben nach Säuregemischveraschung und doppelter
Ausfällung 64,5 mg Na,SO,, entsprechend 0,58 Proz. Na.
0,52235g Substanz gaben (nach Finkener) 21,25 mg Pt, entsprechend
1,60 Proz. K.
0,22675g Substanz gaben (bei der Elementaranalvse mit Bleicarbonat
durchgeführt) 307 mg CO, und 223,5 mg H,O, entsprechend 35.35 Proz.
C und 10,56 Proz. H.
Das Verhältnis von P:N = 1:0,96, es handelt sich demnach
um ein Monoaminomonophosphatid.
1,5448 g Substanz wurden mit 5proz. HSO, 5 Stunden unter
Rückfluß gekocht, das Filtrat von den ausgeschiedenen gewaschenen
Substanzen wurde auf 100 ccm gebracht und in je 25ccm davon die
Zuckerbestimmung vorgenommen (Mittel aus drei Analysen). 25 ccm
verbrauchten 15,5leem KMnO, = 153,7mg Cu = 75,57 mg =19.57 Proz.
Glucose.
Spaltung mit 5proz. H,SO,: 17 g der Alkoholfällung wurden mit
200 ccm der Säure über freier Flamme unter RückflußB 7 Stunden
gekocht, nach dem Erkalten die gelbe Lösung vom mineralischen
Rückstand abfiltriert, die Fettsäuren durch Ausäthern gewonnen.
Beim Abdestillieren hinterblieb eine ganz geringe Menge eines mikro-
kristallisierten Rückstandes, der für eine genaue Definition der Fett-
säure unzureichend erschien. Immerhin wurde festgestellt, daB es
sich um eine gesättigte Fettsäure mit dem Schmelzpunkt 57 bis 58°
handelte. Die von den Fettsäuren befreite schwefelsaure Flüssigkeit
wurde nach Verjagen des Äthers mit konzentrierter Phosphorwolfram-
säurelösung versetzt, der weiße Niederschlag nach 12 Stunden Stehen
abfiltriert, mit 5proz. H,SO, gut ausgewaschen und mit Baryt und
Wasser zerlegt. Nach Ausfällen des Baryts im Filtrat mit CO, wurde
mit starker HCl eingedunstet. Es war zuerst ermittelt worden, daß
die Basenlösung weder mit AgNO,, noch mit diesem und Baryt N-
Pflanzenphosphatide. II. 389
haltige Niederschläge gab. Der getrocknete kristallinische Rückstand
wurde mit absolutem Alkohol in der Kälte aufgenommen, mit Kohle
entfärbt und mit PtCl,-Lósung versetzt. Im Vakuumexsikkator
schieden sich orangerote Tafeln aus, die folgendes Analysenresultat
ergaben (Mittel aus zwei Bestimmungen):
0,26965 g trockene Substanz ergaben beim Glühen 85,4 mg Pt
= 31,67 Proz. Pt (berechnet für Cholinchloroplatinat 31,67 Proz. Pt).
Beim Auskristallisieren zeigte sich der für dasselbe charakteristische
Dimorphismus. Betain war in der Alkoholfällung nicht zugegen.
Das Filtrat wurde nach der Basenfällung in der üblichen Weise
von den anorganischen Säuren und dann von Baryt befreit, mit Kohle
entfärbt, am Wasserbad eingedampft, die ausgeschiedene Kristallmasse
von der Mutterlauge abfiltriert, mit Alkohol gewaschen und mehrmals
aus Wasser umkristallisiert. Sie sublimierten unzersetzt, enthielten
weder P noch N, dagegen Ca und gaben Pyrrolreaktion.
0,21835 g Substanz lieferten 213,7 mg CO, und 73,6 mg H,O, entsprechend
31,06 Proz. C und 4,39 Proz. H.
0,2491g Substanz lieferten 45,6 mg CaO, entsprechend 13,08 Proz. Ca
(für Ca-Succinat berechnet 30,96 Proz. C, 4,54 Proz. H, 12,92 Proz.
Ca).
Mit der Alkoholfällung wurde ferner eine Spaltung mit Ba(OH),
vorgenommen, um festzustellen, ob auch hier die Resultate der Spaltung
von denen der Säurespaltung verschieden seien, wie das bei dem blei-
fällbaren Phosphatid der Fall war. Es ergaben sich jedoch hier dieselben
Spaltungsprodukte wie bei der Säurespaltung, mit Ausnahme der
Bernsteinsäure, welche hier nicht als Spaltungsprodukt auftrat.
5. Das Filtrat nach der Fällung mit Bleiacetat und Alkohol.
Das im Vakuum von allem Alkohol befreite Filtrat hatte weinrote
Farbe und war vollkommen klar. Trotz der verschiedensten Versuche
ist es bisher nicht geglückt, in dieser Restfraktion ein Phosphatid durch
Salzfällung oder ein organisches Fällungsmittel zu fixieren und so der
quantitativen Ermittlung zuzuführen. Es wurden die Fettsäuren, die
Basen und die P: N-Relation bestimmt. Dabei war die Frage nicht
zu beantworten, ob es sich überhaupt um ein reguläres Phosphatid
handelt oder um ein durch P-, N- und fettsäurehaltige Spaltungs-
produkte anderer bereits isolierter Phosphatide verunreinigtes neues
Phosphatid oder vielleicht gar nur um solche Spaltungsprodukte.
Gegen die letztere Annahme spricht allerdings das Vorhandensein
einer Base (Adenin), die in den anderen Phosphatiden nicht gefunden
wurde, und das Vorkommen von Fettsäuren aus der Linolsäure-
reihe, die sonst gleichfalls nirgends auftraten. Dagegen wurde Cholin
auch hier festgestellt, so daß wenigstens die Wahrscheinlichkeit
Biochemische Zeitschrift Band 162. 26
390 V. Grafe u. H. Magistris:
der Verunreinigung eines in der Restfraktion vorhandenen neuen
Phosphatids durch Spaltungsprodukte früherer vorliegt. Nach Winter-
stein!) erfolgt ja eine teilweise Spaltung von Phosphatiden schon bei
der Fällung mit Metallsalzen. Auch anorganische Stoffe finden sich
in dieser Restfraktion in nicht unbeträchtlichen Mengen.
50 ccm lieferten 244,5 mg Mg,P,O, = 68,15 mg P
50 ,, Fe A 154,08 , N
P:N = 1:5,01
Spaltung mit proz. H,SO,: Diese wurde in der beschriebenen
Weise durch sechsstündiges Kochen ausgeführt, die trübe Lösung von
einem dunklen Niederschlag abfiltriert und dieser so lange mit Wasser
und dann mit warmem Alkohol behandelt, als noch etwas in Lösung
ging. Der unlösliche Rest (Huminsubstanzen ?) wurde nicht weiter
untersucht. Die schwefelsaure Lösung wurde ausgeäthert und der
Extrakt mit der Lösung vereinigt, die durch Äther aus dem Rückstand
gewonnen worden war, nachdem man das Lösungsmittel (Alkohol)
abgetrieben hatte. Die ätherische Lösung wurde nun gewaschen, ge-
trocknet und die enthaltenen Fettsäuren wie früher aufgearbeitet.
Die feste Fettsäure erwies sich als Palmitinsäure. Die flüssige Fett-
säure zeigte Elaidinreaktion, besaß aber eine sehr hohe Jodzahl. Sie
wurde in Ligroinlösung mit Br unter Kühlung behandelt. Das Bro-
mierungsprodukt wurde nach mehrstündigem Stehen abfiltriert, die
gereinigten Kristalle schmolzen bei 113,30. Sie wurden mit Zn und
Methylalkohol unter Rückfluß gekocht, dann tropfenweise mit methyl-
alkoholischer HCl versetzt und wieder gekocht. Beim Abkühlen schied
sich ein gelbes Öl aus, das mit Petroläther ausgeschüttelt wurde. Die
Petrolätherschicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet, das
Lösungsmittel abdestilliert und der zurückgebliebene Methylester der
Fettsäure mit alkoholischer NaOH stehengelassen. Nach 24 Stunden
hatte sich eine gallertartige Masse abgeschieden, die in Wasser gelöst
wurde. Nach dem Ansäuern mit H,SO, wurde die Fettsáure mit
Petroläther ausgezogen und die Petrolätherschicht wie oben behandelt.
Von dem enthaltenen Öl wurde die Jodzahl bestimmt.
0,51715g Substanz verbrauchten 936,95 mg J, entsprechend
186,2 Jodzahl (für Linolsäure ist die Jodzahl 181,4, der Schmelzpunkt
des Linolsäuretetrabromids 114 bis 115°).
Ferner konnte Ölsäure nachgewiesen werden.
Die schwefelsaure Lösung nach Entfernung der Fettsäuren wurde
mit Phosphorwolframsäure gefällt, der Niederschlag gewaschen und
durch Verreiben mit Ba(OH), zersetzt. Nach Abtreiben des NH,
wurde die durch Filtrieren von den unlöslichen Ba-Verbindungen
1) E. Winterstein, Zeitschr. f. physiol. Chem. 58, 500, 1909.
Pilanzenphosphatide. II 391
getrennte Basenlösung mit HNO, neutralisiert und am Wasserbad
eingeengt. Mit AgNO, wurden dann nach bekanntem Verfahren
die Alloxurbasen ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde unter
HClI-Zusatz mit H,S zerlegt, worauf beim Eindampfen des Filtrats
Kristalle von salzsauren Salzen der Alloxurbasen auskristallisierten,
die nach dem Reinigen die Kosselsche Probe auf Adenin gaben. Bei
halbstündigem Erwärmen am Wasserbad mit Zn und HCl trat vor-
übergehende Purpurrotfärbung auf, bei Verdünnen mit Wasser und
Übersättigen mit NaOH die charakteristische, in Braunrot übergehende
Rotfärbung. Ein Teil wurde in das Au-Salz übergeführt, das die für
Adenin charakteristische Prismenform und nach dem Umkristallisieren
den Schmelzp. 215 bis 216° besaß,
0,17995 g Substanz gaben 67 mg Au = 37,24 Proz. Au (berechnet
für C,H,N,.2HCl.AuCl, + H,O 37,23 Proz. Au) (Mittel aus zwei
Analysen).
Ein anderer Teil wurde in das Pikrat übergeführt, gelbe Nadeln,
die nach dem Umkristallisieren bei raschem Erhitzen unter Gasent-
wicklung bei 278% schmolzen (theoretisch 279 bis 2810),
Das Filtrat gab nach der Fällung mit AgNO, keine Basenfällung.
Es wurde mit HCl von überschüssigem Ag befreit, mit H,SO, an-
gesäuert, stark eingeengt und zum zweitenmal mit Phosphorwolfram-
säure versetzt, der Niederschlag nach dem Auswaschen mit 5proz.
H,SO, wieder mit Baryt zerlegt. Nach Entfernung desselben wurde
die Basenlösung unter HCl-Zusatz eingedunstet. Die entstehenden
Kristalle wurden nach Auflösen in absolutem Alkohol in das Chloro-
platinat übergeführt. Die orangeroten Tafeln gaben bei der Analyse
folgende Werte: 0,2495 g getrockneter Substanz lieferten beim Glühen
78,9 mg Pt = 31,62 Proz. Pt (berechnet für Cholinchloroplatinat
31,67 Proz. Pt).
Das Filtrat wurde nach der ersten Basenfällung mit Phosphor-
wolframsäure mit Baryt von den Säuren, mit CO, von Baryt befreit,
das Filtrat mit Kohle entfärbt. Am Wasserbad schied sich eine Kristall-
haut ab, die durch Zusatz von Wasser wieder in Lösung gebracht
wurde, dann wurde mit 98proz. Alkohol das Ba-Salz der Glycerin-
phosphorsäure gefällt, der wiederholt gelöste und wieder gefällte Nieder-
schlag abgesaugt und getrocknet (Mittel aus zwei Analysen).
0,5665 g Substanz gaben 407,85 mg BaSO, = 42,37]Proz. Ba
0,4671g ,, „ 1897 „ Mg,P,0,= 964 P
(berechnet für CH: PO, Da + H,O 42,20 Proz. Ba, 9.53'Proz.IP)
Nach Hydrolyse mit verdünnter Säure trat keine Spur einer Re-
duktiorf von Fehlingscher Lösung ein.
26 *
392 V. Grafe u. H. Magistris:
0,3412 g Substanz, in 5 cem Wasser gelöst, drehten im 1-dm-Rohr
bei 20% +0,15°, daher [a]$ = + 2,190. Aus dem Filtrat der Alkohol-
fällung konnte ein Zucker gewonnen werden, der sich als Glucose erwies.
Versuche zur Isolierung der Phosphatide.
Die Verbindung mit Metallen verleiht den Phosphatiden eine
gewisse Stabilität, die es ermöglicht, sie zu isolieren. Ob es sich dabei
um eine Verbindung oder um eine Niederschlagsreaktion handelt,
kann noch nicht beantwortet werden!). Da die Metallniederschläge
der Phosphatide ausnahmslos in Wasser unlöslich waren (nur die
frischen Fällungen zeigen eine minimale Löslichkeit), und da eine Ent-
fernung des Metalls nur unter Zerstörung des Phosphatids möglich
war, ist vielleicht der Schluß gerechtfertigt, daß es sich bei unseren
nativen Phosphatiden um chemische Verbindungen derselben mit
den Metallen handelt. Eine Reindarstellung wurde aus der mit Blei-
acetat in neutraler Lösung gewonnenen Fällung versucht.
20 g des getrockneten pulverisierten Bleiniederschlages wurden
in 400 ccm kalten Alkohols suspendiert und, während durch ein Rühr-
werk für feinste Verteilung gesorgt wurde, H,S eingeleitet und das
abfiltrierte PbS mit warmem Alkohol ausgewaschen. Da dasselbe
bei der Entstehung verschiedene Stoffe mitzureißen vermag, wurde
es der Reihe nach mit kochendem Wasser, kochendem Alkohol und
Ammoniak behandelt, ohne daß beim Abdampfen der Waschflüssigkeit
Rückstände erhalten worden wären. Zuletzt wurde es mit H,O, oxydiert
und das gebildete PbSO, mit Wasser und Alkohol ausgekocht, wobei
es sich als von organischen Substanzen völlig frei erwies. Durch Ein-
leiten von CO, wurde der H,S verdrängt, da eine Probe beim Abdampfen
Abscheidung von S ergeben hatte. Nach Abdestillieren des Alkohols
im Vakuum hinterblieb ein rotbraunes, widerlich riechendes Öl, das
im Exsikkator allmählich zu einer knetbaren Masse eintrocknete. Es
wurde zweimal in Alkohol gelöst und durch die Lösung CO, geleitet,
dann der Alkohol wieder abdestilliert und die Substanz getrocknet.
In CS, war die Masse leicht löslich. Sie stellte schließlich eine dunkel-
rotbraune, merkaptanartig riechende Masse dar, die entsprechend der
qualitativen Untersuchung Schwefel enthielt. Eine quantitative
Untersuchung hatte kein Ergebnis gegeben, da wahrscheinlich durch das
Einleiten von H,S Fettsäuren abgespalten worden waren und die
erhaltenen Resultate daher keine einheitlichen Ergebnisse lieferten.
So ergab die Elementaranalyse einmal 63,93 Proz. C und 10,51 Proz. H,
das andere Mal 66,44 Proz. C und 11,98 Proz. H. Die Zahlen für S
1) W. Koch, Zeitschr. f. physiol. Chem. 87, 181, 1902;03: O. Porges urd
E. Neubauer, diese Zeitschr. 7, 152, 1908.
Pflanzenphosphatide. LI. 393
variierten zwischen 1,08 und 2,60 Proz. Beim Abbau des Produktes
mit 5proz. H,SO, wurde ein S- und N-haltiges Glycerophosphat er-
halten. Die Fettsäuren und Basen waren S-frei, die ersteren aber stark
N-haltig. Die Trennung der einzelnen Fraktionen erwies sich viel
schwieriger als sonst, es hatte überhaupt den Anschein, als wäre das
ganze Phosphatidmolekül verändert. Das Ba-Glycerophosphat war
eine schmutziggraue sandige Masse, die sich sehr schwer in Wasser
löste und Fehlingsche Lösung nach der Hydrolyse mit verdünnter
Säure reduzierte. Die Befreiung des Präparats von der reduzierenden
Substanz mißlang. Im übrigen gab das Glycerophosphat starke P-Reak-
tion sowohl mit Ammonmolybdat wie mit Magnesiamixtur in der Asche,
roch, mit KHSO, erhitzt, stark nach Akrolein, enthielt also Glycerin
und Phosphorsäure. Seine wässerige Lösung gab mit H,SO, einen
Niederschlag von BaSO,. Eine quantitative Bestimmung des S wurde
darin nicht vorgenommen. Es ist immerhin bemerkenswert, daß ein
Phosphatid, wie hier zum erstenmal gezeigt wurde, bei der bloßen
Behandlung mit H,S Schwefel aufzunehmen vermag.
Weiterhin wurde versucht, aus der Fállung mit Cd Cl, in neutraler
Lösung das Phosphatid zu isolieren.
Etwa 10g der betreffenden Fällung wurden in 30gräd. Alkohol
angerührt und (NH,),CO, eingetragen, bis eine Probe der Flüssigkeit
deutlich alkalische Reaktion gab. Das abfiltrierte CACO, wurde mit
Alkohol gewaschen. Nach langsamem Abdunsten des Alkohols bei
Zimmertemperatur blieben gelbliche Nadeln zurück, die in Wasser
vollständig, in Alkohol bis auf einen kleinen Rest löslich waren und
umkristallisiert wurden.
0,18535 g Substanz (Mittel aus zwei Analysen) gaben 23,4 mg Mg,P,O;
= 3,52 Proz. P und
0,38535 g Substanz (Mittel aus zwei Analysen) gaben 12,27 mg N
= 3,17 Proz. N (P:N = 1:2 gegen 1: 0,98 bei der Cd-Verbindung)
Es ist auffallend, daß das Präparat N-reicher geworden ist gegen-
über dem Ausgangsmaterial; anfangs wurde dieser Umstand auf
Analysenfehler zurückgeführt, aber es ergaben sich selbst bei mehr-
facher Wiederholung dieselben Werte. Eine ähnliche Erscheinung
ist übrigens aus der Literatur bekannt!) und wird dort auf den Umstand
zurückgeführt, daß sich aus dem Ammoncarbonat Ammoniak an die
Fettsäuren anlagern kann, woraus der große N-Gehalt erklärbar wäre.
Vielleicht hängt das irgendwie mit der besonderen Natur unseres
Phosphatids zusammen, da eine Vergrößerung des N-Gehaltes durchaus
nicht bei allen, ungesättigte Fettsäuren enthaltenden Phosphatiden
eintritt (s. auch Malengreau und Prigent, ferner Mac Lean, 1.c.).
1) W. Lüdecke, Dissertation, München, zitiert nach Trier, Zeitschr. f.
physiol. Chem. 86, 141, 1913.
394 V. Grafe u. H. Magistris:
1,5479g Substanz wurden 5 Stunden mit 5proz. H,SO, unter
Rückfluß gekocht. Das Filtrat von den gut ausgewaschenen Fett-
säuren wurde auf 100 ccm gebracht und je 25 ccm davon mit Fehlingscher
Lösung gekocht, darauf der Zucker bestimmt. Verbraucht wurden
(Mittel aus drei Versuchen) 15,026ccm KMnO,. Nach der früheren
Relation entspricht das 148,9 mg Cu in der Gesamtmenge = 73,21 mg
— 18,92 Proz. Glucose.
Zur Frage der ‚„wasserunlöslichen‘‘ Phosphatide.
Hansteen Cranner!) meint, „daß die plasmatischen Grenzschichten
der Zellkörper — die Plasma- und die Vakuolenhaut — ein kolloidales
System darstellen, dessen halbfestes, hydrophiles Dispersionsmittel
aus in Wasser unlöslichen, aber kolloidal quellbaren, dessen flüssige,
disperse Phase aber aus in Wasser ganz löslichen Phosphatiden‘ be-
stehe. Auch sollen die beiden Phosphatide — lösliche und unlösliche —
ineinander überführbar und dieser Vorgang ein reversibler sein?).
Wir haben nun das Austreten von Phosphatiden aus verschiedenen
Pflanzen, Pisum arvense, Beta vulgaris, Aspergillus oryzae, eingehend
studiert und gefunden, daß bei Dialyse bei 30% die ‚„unlöslichen‘‘ Phos-
phatide immer erst nach der achten bis zehnten Stunde auftreten,
die „löslichen“ dagegen schon nach der dritten bis vierten Stunde.
Wir können in der ‚wasserunlöslichen‘‘ Fraktion nun keine ‚nativen‘
Phosphatide mehr sehen, sondern meinen, daß durch die längere Ein-
wirkung der Wärme und der 24stündigen Dialysenzeit ein Teil der
wasserlöslichen Phosphatide denaturiert und dadurch wasserunlöslich
wird. Oberhalb 30° treten wohl auch deshalb nur wasserunlósliche
neben wenig lóslichen, bei Temperaturen unter 20% nur wasserlósliche
Phosphatide aus.
Im folgenden erscheint das Austreten der Phosphatide aus Asper-
gillus oryzae quantitativ verfolgt, indem zu jedem Versuch tunlichst
genau das gleiche Gewicht der Pilzdecke (250 g) in sechs flache Porzellan-
schalen verteilt und mit je 500 ccm Wasser versetzt und im Thermo-
staten bei 30° dialysieren gelassen wurde. Von 4 zu 4 Stunden wurden
1) Hansteen Cranner, Zur Biochemie und Physiologie der Grenzschichten
lebender Pflanzenzellen. Meldinger fra Norges Lardbrukshóiskole 2, H. 1:2,
1922.
2) In seinen weiteren, nachgelassenen Arbeiten, zu deren Bearbeitung
und Herausgabe der eine von uns (Grafe) von dem verstorbenen Autor
letztwillig verpflichtet worden ist, spricht Hansteen Cranner gleichfalls
schon die Anschauung aus, es möchte sich bei den Beziehungen zwischen
löslichen und unlöslichen Phosphatiden um Zustandsänderungen derselben
Stoffe handeln, deren Abhängigkeit von äußeren Momenten aber nicht
untersucht worden ist. Die erwähnten Arbeiten stehen unmittelbar vor der
Drucklegung.
Pflanzenphosphatide. II. 395
nun in den einzelnen Schalen die Phosphatide mit n/2 alkoholischer
Bleiacetatlösung, die mit einigen Tropfen Ammoniak versetzt wart),
gefällt und das Trockengewicht ermittelt. Nach der 12. Stunde wurde
die unlösliche Suspension durch ein Ultrafilter von den löslichen An-
teilen getrennt, in Wasser verrührt und wie oben gefällt und gewogen.
Folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die erhaltenen Werte:
| caia Trockensubstanz der Pb-Fällung
Nr. See? Gi lösliche Fraktion unlösliche Fraktion
| mg mm
(ru | 543 | —
2 Ss 914,3 =
3 | 12 | 15890 ` 401,2
A 16 | 23746 1025,1
5 20 2490,2 | 1417,6
6 24 2501,4 1954,3
S
SL,
Za"
D
SPOS
76 Zi 24
72
Stunden
Kurve vorstehender Tabelle über das Austreten wasserlöslicher
und „wasserunlöslicher“ Phosphatide aus Aspergillus oryzae.
wasserlösliche Phophatide, ----- wasserunlösliche Phospbatide.
Es gelingt auch, zu zeigen, daß eine bei 15° gewonnene, vollkommen
lösliche Fraktion durch nachträgliche Einwirkung von unerheblich
erhöhter Temperatur, von Licht, ja selbst beim Stehen im Dunkeln
und bei O-Ausschluß, und zwar immer parallel und proportional der
Dauer der verändernd wirkenden Einflüsse, wasserunlöslich wird.
Ein bei 15% gewonnenes, vollkommen klares, in der üblichen Weise
gereinigtes und konzentriertes Dialysat wurde auf 3000 ccm gebracht
und je 500 ccm gesondert behandelt. Als Fällungsmittel wurde wie
früher alkoholische, ammoniakalische Bleiacetatlösung verwendet.
Die unlösliche Fraktion wurde durch ein Berkefeldfilter mit einer
Wasserstrahlpumpe von der löslichen getrennt, nach mehrmaligem
Auswaschen in Wasser suspendiert und gleichfalls mit Bleiacetat
behandelt.
1) Hier wurde zum erstenmal alkoholische ammoniakalische Blei-
acetatlösung verwendet. Die Fällung ward dadurch viel grobflockiger
und setzte sich rascher ab.
396 V. Grafe u. H. Magistris:
| Trockensubstanz |
Gefällt am Behandlung der Lösung | lösliche Fraktion unlösl. Fraktion E
= En E: en E a Ne E
== SE
Sofort nach der Dialyse | 3126,8 — ' 3188
Stehen im Dunkelraum | | |
bei 30°. ...... 2760,5 | 1549 | 2915,4
Bei 15° im Licht . . . 2954,1 80,6 | 3043,7
Bei 15° im Dunkelraum | 30011 | 1043 | 31054
Bei 15° im Licht . . . 19264 | 9734 | 2899,8
Bei 10° im Dunkel, |
Kolben m. CO, gefüllt 2699,0 | 233,7 | 29327
Die einmal unlóslich gewordenen Phosphatide gehen in keinem
Falle mehr in die lósliche Form über, die Umwandlung der löslichen
in die unlösliche Form ist also irreversibel.
Zusammenfassung.
Bei der Behandlung von Reinkulturen von Aspergillus oryzae
mit Wasser bei einer 17° nicht übersteigenden Temperatur (Dialyse)
wurde eine fast klare Lösung erhalten, die nach dem Durchziehen
durch ein Pukallfilter auf ihren Gehalt an Phosphatiden untersucht
wurde.
Es wurden erhalten:
1. Fällbar mü Bleracetat in neutraler Lösung: Die Fällung gelbbraun,
oxydabel, in feuchtem Zustand klebrig und kittartig. Unlöslich in
Wasser, Benzol, Ligroin, Aceton, Chloroform, Methylacetat, Tetra-
chlorkohlenstoff, teilweise löslich in Alkohol und Äther. Die empirische
Formel lautet C„H,,NPO,,.2Pb; das Verhältnis P: N =1:1,21 es
ist also ein Monoamino-monophosphatid.
Als Spaltungsprodukte wurden gefunden:
Ölsäure, Palmitinsäure, Betain, Glycerin, Phosphorsäure, Glucose.
Erwärmt man diese Fällung mit Alkohol auf 60°, so erhält man
eine Lösung, in der durch Benzol eine in Alkohol und Äther lösliche,
gelbe wachsartige Masse von der Zusammensetzung C,Hs»NPO,o
gefällt wird. Spaltungsprodukte sind: Betain, Palmitinsäure (?),
Ölsäure, Phosphorsäure, Glycerin, Glucose. Verhältnis P:N = 1:1.
Frühere Autoren, welche ihre Phosphatide aus frischen oder getrock-
neten Pflanzenteilen durch Extraktion mit siedendem Alkohol gewannen,
hatten also immer nur ein dem obigen entsprechendes, gegen das native
1) Zur Vermeidung von Infektionen wurden die Lösungen in sterilisierte
_Erlenmeyerko]ben mit sterilisierten Wattepfropfen gebracht. Bei E und F,
die besonders lange aufbewahrt wurden, setzten wir überdies je 2 com frisch
destillierten Äther zu. In einem Vorversuch war festgestellt worden, daß
diese Menge Äther das Phosphatid selbst in keiner Weise verändert.
Pflanzenphosphatide. II. 397
Produkt veránderies Abbauprodukt einer Alkoholyse in Händen, in
welchem namentlich die Kohlenhydratgruppe Veränderungen erlitten hat.
2. Fällung mit Bleiacetat in ammoniakalischer Lösung: Macht man
das Dialysat nach Entfernung der ersten Bleifällung schwach ammo-
niakalisch, so erhält man ein weiteres, durch Blei fällbares Phosphatid.
Die Fällung ist gelbgrau, von blätterig-körnigem Gefüge, wenig oxy-
dabel in allen organischen Solventien, ebenso in Wasser, unlöslich,
löslich unter Zersetzung in alkalischem Wasser. Empirischo Zusammen-
setzung Cay He: BU. 5 Pb, das Verhältnis P:N = 1:2,01, es ist
also ein Diamino-monophosphatid.
Spaltungsprodukte sind: Cholin, Betain, Palmitinsäure, Phosphor-
säure, Glycerin.
3. Bei der Suche nach anderen Fällungsmitteln wurde Cadmium-
chlorid und Uranylacetat als geeignet gefunden, das Fällungsprodukt
mit ersterem Salz analysiert.
Die Fállung mit CdCl, in neutraler Lösung stimmt im Aussehen
und den übrigen Eigenschaften mit der entsprechenden Bleifällung
überein.
Empirische Zusammensetzung Ce Ha NPO,, :2CdCl,, das Ver-
hältnis P:N = 1:0,98 (Monoamino-monophosphatid).
Spaltungsprodukte: Betain, en Palmitinsäure, Phosphor-
edure, Glycerin, Glucose.
Man darf wohl annehmen, daß die Cd-Fállung von der Pb-Fällung
trotz der vorhandenen Differenz um 20 und 4H sich elementar-
analytisch nicht unterscheidet. Die Gründe für diese Annahme liegen
in dem Umstand, daß der O-Gehalt nur aus der Differenz errechnet
wurde, so daß sich hier die gesamten Analysenfehler ausdrücken müssen,
und daß ferner statt des Elementes Pb in der Pb-Fällung hier das
gesamte CdCl, eintritt, was wohl auch die Differenz im H-Gehalt zu
erklären imstande ist.
4. Im Filtrat der Bleifällung wurde durch Alkohol eine Phos-
phatidfällung erhalten, die durch den Gehalt an Mineralstoffen aus-
gezeichnet ist, aber auch nach mehrmaligem Lösen und Wiederausfällen
keine wesentlich verschiedenen Analysenzahlen lieferte. Die Fällung
war schneeweiß, nicht oxydabel, unlöslich in organischen Solventien,
löslich in Wasser. |
Spaltungsprodukte: Cholin, eine feste Feltsäure, Bernsteinsäure,
Phosphorsäure, Glucose.
Die Asche besteht aus Ca, Mg, Na, K, deren quantitative Ver-
hältnisse festgestellt wurden. P:N = 1:0,96, also ein Monoamino-
monophosphatid. Die elementare Zusammensetzung kann nicht mit
Sicherheit angegeben werden. Auf ihre Berechnung wurde verzichtet.
398 V. Grafe u. H. Magistris: Pflanzenphosphatide. II.
5. Filtrat nach der Fällung mit Alkohol (Restfraktion): Es ist
unsicher, ob es sich hier um ein reines Phosphatid handelt oder um
ein durch Spaltungsprodukte anderer verunreinigtes oder nur um
solche Spaltungsprodukte. Daß ein besonderes Phosphatid in dieser
Fraktion vorhanden ist, wird durch die Auffindung einer anderen
Base (Adenin) und das Vorkommen andersartiger Fettsäuren (aus
der Linolsäurereihe) wahrscheinlich. Die Restfraktion ist eine rot-
braune klare Lösung. Ein Fällungsmittel konnte nicht gefunden werden.
P:N=1:5.
Spaltungsprodukte: Cholin, Adenin, Ölsäure, Linoleäure, Palmitin-
sáure, Phosphorsäure, Glycerin, Glucose. Asche besteht aus Ca, Mg, K.
6. Bei den Versuchen einer Isolierung der Phosphatide aus ihren
Metallverbindungen [durch H,S aus der Pb-Verbindung und durch
(NH CO, aus der Cd-Verbindung] wurden keine unzersetzten
(nativen) Präparate erhalten. Im Falle der Zerlegung durch H,S
wurde ein Derivat erhalten, in dessen Molekül der S eingetreten war.
bei der Zerlegung der Cd-Verbindung ergab sich eine bedeutende
Bindung von N (Anreicherung an N) in der freien Substanz gegenüber
der Cd-Verbindung, wahrscheinlich durch Anlagerung von NH,-
Radikalen an ungesättigte Fettsäureradikale,
7. Es konnte nachgewiesen werden, daß es sich bei den aus Pflanzen-
zellen bei Dialyse gegen Wasser austretenden Phosphatiden verschie-
dener Löslichkeit dem Wasser gegenüber wahrscheinlich nicht um
chemisch verschiedene Substanzen, sondern um irreversible Zustands-
änderungen derselben oder einander sehr nahestehender Phosphatid-
komplexe handelt. Der Übergang dieser Formen ineinander konnte
als Funktion der Zeitdauer des Versuchs, des Einflusses von Licht
und Dunkel quantitativ verfolgt werden; es zeigte sich, daß diese Er-
scheinung des kolloiden Alterns sogar noch im Dunkeln und unter
Ausschluß von Sauerstoff stattfindet.
Zellatmung.
IV. Mitteilung:
Über den Oxydationsmechanismus der Kartoffeln.
Von
A. v. Szent-Györgyi.
(Aus dem physiologischen Laboratorium der Reichsuniversität zu Groningen.)
(Eingegangen am 15. Juli 1925.)
In den vorhergehenden Mitteilungen!) wurde die Theorie ent-
wickelt, daß im höheren tierischen Organismus der aktivierte Wasser-
stoff durch den aktivierten Sauerstoff verbrannt wird, daß aber hierbei
der Sauerstoff nicht in diffuser Weise zu einem gewissen erhöhten
Oxydationspotential erhoben wird, durch das nun der aktive Wasser-
stoff unmittelbar wegoxydiert wird, sondern daß die Sauerstoffakti-
vierung die Funktion eines Ferments sei, deren Wirksanıkeit in relativ
scharfer Weise gegen bestimmte Substanzen gerichtet ist, die durch
das Ferment nur ganz oberflächlich unter Verlust von Wasserstoff-
atomen oxydiert und die dann durch den aktiven Wasserstoff
wieder zur Ausgangssubstanz reduziert werden. Es wurde gezeigt, daß
eine dieser Substanzen, die im Wesen also Wasserstofftransporteure
darstellen, ein aromatischer Körper sein muß?).
Die definitive Stütze dieser Theorie scheint mir in der Isolierung
und Identifizierung dieser intermediären Wasserstofftransporteure zu
liegen, die dann auch die Möglichkeit eröffnet, die chemischen Ver-
1) Mitteilung 1 diese Zeitschr. 150, 195, 1924; Mitteilung II ebendaselbst
157, 50, 1925; Mitteilung III ebendaselbst 157, 67, 1925.
2) Auf Grund mancher Erfahrungen scheint es auch nicht unwahr-
scheinlich, daß das Succinoxydon von Battelli und Stern, d.h. das Ferment,
das Bernsteinsäure zu Fumarsäure oxydiert, ebenfalls die Oxydase
eines derartigen Oxydationssystems darstellt, in der ein bernsteinsäure-
ähnlicher Körper als Wasserstofftransporteur fungiert, der unter Abgabe
und Aufnahme von zwei Wasserstoffatomen abwechselnd in seine unge-
sáttigte (Fumarsäure) bzw. gesättigte Form übergeht.
400 A. v. Szent-Györgyi:
anderungen festzustellen, die das Molekúl des Transporteurs unter
Einwirkung der Oxydations- bzw. Reduktionsfermente erleidet. Meine
mit Eifer durch längere Zeit vorgenommenen diesbezüglichen Versuche
scheiterten aber an der großen technischen Schwierigkeit, die das
tierische Material in diesem Gebiet dem Forscher bietet. Die hier
bestehenden starken Reduktionswirkungen sind namentlich in hohem
Maße geeignet, die Wirkung der relativ so empfindlichen Oxydasen zu
verdecken, die nicht in befriedigender Weise frei von Wasserstoff-
aktivierungsfermenten, Brennstoffen und sonstigen störenden Bei-
mengungen präpariert werden konnte.
Ergab aber die Arbeit an diesem Material auch nicht die erwünschten
Resultate, so führte sie doch zu manchen für die weitere Arbeit wert-
vollen Einzelbeobachtungen. Einen sehr tiefen Eindruck hierbei machte
dann auch die weitgehende Analogie zwischen den Oxydationsprozessen
der Pflanze und Tiere, die uns an so vielen Punkten in so markanter
Weise entgegentrat, und dann auch den Gedanken einflößte, vor dem
weiteren Angriff des so verwickelten tierischen Materials zunächst
einige Erfahrungen am pflanzlichen Material zu sammeln, das bei der
Analyse dem tierischen Material gegenüber sehr weitgehende technische
Vorteile bietet. Im folgenden seien einige dieser Erfahrungen wieder-
gegeben.
1. Die Guajakreaktion.
Wird eine frische Schnittfläche einer Kartoffel mit Guajaktinktur
benetzt, so sieht man als Zeichen der Oxydation des Harzes die be-
kannte prachtvolle grüne Farbe auftreten. Diese Reaktion bildet seit
mehr als 100 Jahren den Gegenstand zahlreicher Untersuchungen, die
zum Ziele haben, eine tiefere Einsicht in den Oxydationsmechanismus
der Pflanzen zu gewinnen!).
Durch die Arbeiten von J. Wolff?), Wolff und N. Rouchelmann?),
M.W.Onslow*) und M. E. Robinson bi ist in den letzten Jahren in die
Auffassung dieser Reaktion ein wesentlicher Umschwung gekommer.
Durch die Arbeiten ist es namentlich deutlich geworden, daß bei dem
Zustandekommen dieser Reaktion neben den Oxydationsfermenten Brenz-
catechinderivate eine wesentliche Rolle spielen. Die Arbeiten von Wolff
und seiner Mitarbeiterin beziehen sich eigentlich nicht auf die Guajak-
reaktion, sondern beschäftigen sich mit der analogen Jod-Stärkereaktion.
1) Über die Geschichte dieser Reaktion lese man die so lesenswerte
schöne Monographie von J. H. Kastle: The Oxidases. Treas. Dep. Pub.
Health and Mar.-Hosp. Service U. 8. Hygien. Lab. Bull. 59.
2) J. Wolff, Ann. Inst. Past. 81, 92, 1917.
3) J. Wolff und N. Rouchelmann, ebendaselbst 81, 96, 1917.
4) M. W. Onslow, Biochem. Journ. 18, 1, 1919; 14, 535, 1920; 14, 541,
1920: 15, 107, 1921; 15, 113, 1921.
$) M. E. Robinson, ebendaselbst 18, 543, 1924.
Zellatmung. IV. 401
Sie erbringen den Beweis, daß die pflanzlichen Gewebe den Jodwasserstoff
nurin Gegenwart von Brenzcatechinderivaten zu Jod zu oxydieren vermögen,
und zeigen zugleich, daß bei dieser Reaktion die natürlichen Brenzcatechin-
derivate durch künstlich zugesetztes Brenzcatechin ersetzt werden können.
Die ausgedehnten schönen Arbeiten Onslows erbringen denselben Beweis
dann auch für die Guajakreaktion.
Die experimentelle Grundlage obiger Arbeiten gibt aber keine weitere
Aufklärung über den Mechanismus der Reaktion, die dann auch von Wolff
und Onslow in verschiedener Weise gedeutet wird. Wolff nimmt an, daß
durch das Oxydationsferment das Brenzcatechin zum Chinon oxydiert
wird, das dann unmittelbar den Jodwasserstoff oxydiert. Onslow hingegen
sieht durch ihre Versuche den folgenden Reaktionsmechanismus bewiesen:
bei der Reaktion sind zwei verschiedene Fermente im Spiele. Das erste
bewirkt die Oxydation des Brenzcatechins zu einem Peroxyd (Oxygenase),
das dann, mit einem zweiten Ferment, einer Peroxydase, in Reaktion tretend,
das Guajak oxydiert. Mit dieser Auffassung wird eigentlich nur der älteren
Bach-Chodatschen Theorie eine neue Form gegeben. Nach diesen Theorien
ist es also eine Peroxydase, die die eigentliche Oxydation ausübt und der
der wesentliche Anteil bei den Verbrennungen zukommt. Die Oxygenase
hat. eben nur für dieses Ferment das Peroxyd vorzubereiten.
Um dieser prinzipiell so bedeutenden Frage näher zu treten, habe
ich zunächst mit dem Kartoffelmaterial die Wolffschen und Onslowschen
Versuche wiederholt und kann beide vollauf bestätigen. Werden die
Fermente von Brenzcatechinen frei präpariert, so vermögen sie nicht
das Gaujakharz anzugreifen. Wird hingegen Brenzcatechin zugesetzt,
so sieht man bald die blaue Farbe erscheinen, die dann allmählich
zu einer tiefblauen Farbe anwáchst. Zweifelsohne ist der primäre
Vorgang in diesem Prozeß die Oxydation des Brenzcatechins durch
das Ferment. Was mir aber durch die Onslowschen Versuche noch
ganz unbewiesen erschien, war, daß dieses Oxyd des Catechins tat-
sächlich ein Peroxyd sei, das unter Mitwirkung von besonderen Fer-
menten, der Peroxydasen ihre Oxydationskraft entfaltet. Um diese
Frage zu entscheiden, wurde folgendermaßen vorgegangen: Das Brenz-
catechin wurde mit dem Ferment 10 Minuten lang ohne Guajak be-
brütet, dann wurde das Ferment präzipitiert, wobei das Oxyd des
Catechins in Lösung blieb. Nun wurde dieses fermentfreie Oxyd mit
Guajak versetzt. Sogleich zeigte sich eine blaue Farbe, die sehr rasch
dunkelte und die im Laufe 1 Minute dieselbe Farbentiefe erreichte als
die Kontrollproben, in denen Guajak mit Ferment und Brenzcatechin
10 Minuten lang bebrütet wurde.
Dieser Versuch besagt in unzweideutiger Weise, daß an der Bläuung
des Guajaks keine Fermente beteiligt sind. Die gesamte Reaktion
besteht also aus zwei Phasen, aus der Oxydation des Brenzcatechins
durch eine Oxydase und dann der unmittelbaren Oxydation des Guajaks
durch dieses Oxyd des Brenzcatechins. Eine Peroxydase ist also nicht
im Spiele; das einzige Ferment, das sich an der Reaktion beteiligt, ist
402 A.v. Szent-Györgyi:
die Oxydase, die das Brenzcatechin unter Einwirkung des Luftsauer-
stoffs zu seinem Oxyd oxydiert.
Was die Form dieses Oxydes anbelangt, so müssen wir auf Grund der
Arbeit von Wallstátter und Müller!) in erster Linie an ein Chinon denken,
und zwar an die Diketoform des Chinons, da die Peroxydform wegen ihrer
Labilität kaum in Betracht kommen kann?). Es fragte sich nun, ob die
Oxydationskraft dieses Chinons in der Tat genügend stark sei, um diese
starke oxydative Wirkung zu erklären. Der Versuch ergab, das die Oxy-
dationskraft des nach Willstätter und Müller präparierten Chinons Guajak
gegenüber tatsächlich mit der Oxydationskraft des durch Kartoffeloxydase
gewonnenen Chinons übereinstimmt.
Die Guajakreaktion läßt sich also folgendermaßen formulieren :
die Phenoloxydase oxydiert das Brenzcatechin zum Diketo-Chinon,
das ohne Mitwirken eines Fermentes das Guajak unmittelbar oxydiert.
Peroxydasen haben keinen Anteil an der Reaktion?).
—
1) Willstätter und Müller, Ber. d. deutsch. chem. Ges. 41, 2580, 1908.
\ = >
Diketo-Chinon Peroxyd-Chinon
3) Ich kann hier die Bemerkung nicht unterdrücken, daß, trotz der
ausgebreiteten Peroxydaseliteratur mir das Bestehen von Peroxydasen
ganz unbewiesen, ja sogar in hohem Maße zweifelhaft erscheint. Alle
Oxydasen, die verschiedene Substanzen durch den Sauerstoff der Luft
oxydieren, müssen in ihrem Molekül Atomgruppierungen haben, die zum
Binden und Übertragen des molekularen Sauerstoffes geeignet sind. Daß
derartige Atomgruppen, so wie z.B. im Hämoglobin, auch denihnen von Per-
oxyden künstlich aufgezwungenen aktiveren Sauerstoff ebenfalls übertragen
können, kann kein Wunder nehmen und ist kein Beweis für eine biologische
Peroxydasefunktion, ebensowenig, wie man vom Hämoglobin sagen wird,
daß es eine Peroxydase sei, weil es auch den Sauerstoff von künstlich
zugesetzten Peroxyden zu übertragen vermag. Eine weitere flüchtige
Analogisierung der Oxydasen mit dem Hämoglobin ist meiner Ansicht
nach ausreichend, um das weitere Tatsachenmaterial, das das Bestehen der
Peroxyde stützt, zu erklären. Nimmt man an, daß bei der Oxydase, ebenso
wie beim Hámoglobin durch verschiedene schädliche Faktoren zuerst die
Fähigkeit verloren geht, molekularen Sauerstoff zu übertragen, während
dessen die Fähigkeit, den Sauerstoff der Peroxyde zu übertragen, noch lange
erhalten bleiben kann. so wird man in einfacher Weise auch ohne Annahme
von Peroxydasen begreifen, daß es gelingt, nach langer Behandlung mit.
Alkohol (Bach und Chodat, Linossier, Aso) oder höherer Temperaturen
„oxXydasefreie Peroxydasen‘“ zu erhalten. Daß zahlreiche Pflanzen Guajak
oder Jodstärke nur nach Zugabe von Peroxyd, nicht aber ohne dieses
bläuen können (nach der alten Auffassung also nur Peroxydasen und keine
Oxydase enthalten) läßt sich nun auf Grund der Arbeiten von Wolff und
Onslow auch ohre Peroxydase ungezwungen erklären. Ob das Gewebe
die genannten Reagenzien färbt, ist wohl in erster Reihe nur von der Frage
abhängig, ob die Pflanze neben der Oxydase auch ein Brenzcatechin enthält.
Zellatmung. IV. 403
Das Fermentpráparal wurde für diese Versuche, anlehnend an
Onslow, folgendermaßen hergestellt:
Junge Kartoffeln wurden gewaschen, dann an einem mit einem Messer
montierten Schabebrett. das im Haushalt gebraucht wird, in dünne Scheiben
zerschnitten. Das Messer des Brettes wurde so gestellt, daß die Scheiben
sehr dünn waren. Nur die fermentreicheren peripheren Teile der Kartoffeln
wurden verarbeitet. Die zentrale Masse, die ungefähr die Hälfte bis zwei
Drittel des Gewichtes der Kartoffel ausmachte, wurde verworfen. Die
derart hergestellten Scheiben fielen vom Brette unmittelbar in einen großen
alkoholhaltigen Becher, der einen Liter 96 Proz. Alkohol enthielt. Nach.
dem so 330 g Kartoffeln im Becher gesammelt wurden, wurde etwa eine
halbe Stunde lang mit einem dicken, scharf abgeschnittenen Glasstabe
gerührt und gestampft. Dann wurde die Masse an einer großen Büchner-
kerze filtriert, der Rest tüchtig ausgepreßt, nochmals in einem Becher
mit 500 ccm Alkohol etwa ein halbe Stunde lang in obiger Weise
tehardelt, dann durch ein Tuch filtriert, ausgepreßt und der Rest
an der Buchnerpresse mit 300 Atm. Druck ausgepreßt. Der praktisch
trockene Rest wurde in einer Mühle zu einem feinen Pulver zermahlen.
Das derart gewonnene Pulver wird als Fermentpräparat gebraucht.
Das Präparat ist zum Arbeiten sehr angenehm, und es läßt sich längere
Zeit im Vakuumexsikkator mit unveränderter Wirksamkeit bewahren.
Es wurde von diesem Fermentpräparat zu einem jeden Versuch ein kleines
Spatelchen voll (+ 30 mg) genommen und in Wasser oder 0,2 mol. Phos-
phatlösung von der entsprechenden py suspendiert (KH,PO, und Na¿HP O,
bzw. Mischungen beider). Dieser Suspension wurde dann, wo nötig, stets
ein Tropfen einer 1proz. frischen Guajaktinktur zugesetzt, und zwar wurde
die Tinktur stets nach dem Ferment zugesetzt, da ohne Ferment das Guajak
zum größten Teile rasch ausflockt. Die Versuche wurden alle in kleinen,
6 cem fassenden Becherchen ausgeführt. |
Wird nun in dieser Weise das Ferment (30 mg) in 1 cem Wasser
suspendiert, dann 1 Tropfen Guajaktinktur zugesetzt und dann
Arbeitet die Pflanze an Stelle des Systems Oxydase — Brenzcatechin mit
Oxydase — Hydrochinon, so wird man ratürlich eine Bläuung des Guajaks
nur nach Zugabe von Peroxyd beobachten können. Nehmen wir zuletzt an,
daß die Oxydasen, ebenso wie das Hämoglobin, aus einem leicht spalt-
baren hochmolekularen, kolloidalen und einem niedrigmolekularen, diffu-
siblen, mehr lipoidlöslichen Teil bestehen (Globin und Hámatin). von welchen
letzterer den Sauerstoffakzeptor trägt, der aber an und für sich, so wie das
Hámatin nur noch Peroxyd-Sauerstoff, nicht aber mehr molekularen
Sauerstoff übertragen kann, so wird man auch die Trennbarkeit von Oxydase
und Peroxydase durch Alkohol (Aso), Ultrafiltration (Bach) und die
Diffusibilität der Peroxydasen (Bach und Chodat), sowie die Aktivierung
der Oxydasen durch ‚Peroxydase‘‘ (Bach und Chodat) ungezwungen erklären
können. Jch meine hiermit natürlich nicht, das Nichtbestehen von Per-
oxydasen beweisen zu können. Ich möchte nur darauf hinweisen, daß sich
das Tatsachenmaterial, das das Bestehen der Peroxydasen stützt, sich auch
ungezwungen ohne die Annahme besonderer Fermente in viel einfacherer
Weise erklären läßt und somit die ganze Frage aus diesem Standpunkte
einer Revision bedarf.
404 À A. v. Szent-Györgyi:
im Thermostaten bei 37% bebrütet, so zeigt sich nach 10 Minuten nur
eine sehr geringe blaue Verfärbung. Wird hingegen noch 1 Tropfen einer
verdünnten Brenzcatechinlösung zugesetzt, so zeigt sich bald eine
tiefe blaue Farbe. Es lag im allgemeinen Interesse, erst die optimalen
Bedingungen dieser Reaktion aufzusuchen.
Die Konzentration des Brenzcatechins sowie die Wasserstoffionen-
konzentration haben einen sehr starken Einfluß auf denGang der Reaktion.
Der Einfluß der Konzentration des Brenzcatechins sei durch folgenden
Versuch illustriert: Es wird eine Reihe von Becherchen mit je 1 ccm
einer wässerigen Brenzcatechinlösung versetzt. Im ersten Becher ist die
Konzentration des Phenols 5 Proz., im folgenden 2,5 Proz., im dritten
wieder halb so stark usw. Dann wird in jedes Becherchen ein
Spatelchen Ferment und dann ein Tropfen Guajaklösung getan und
die ganze Reihe 10 Minuten lang bei 37° bebrütet. Das Resultat ist
in folgender Reihe dargestellt, wobei die Kreuze die relative Intensität
der blauen Farbe angeben: 0, 0, 0, 0, 0, 4,4, +, +, ++, +++,
++, ++, +, +,+,+,0. Der Versuch ergibt also, daß die Reaktion
eine optimale Konzentration hat, die ungefähr bei 0,006 Proz. liegt.
Bei 0,0001 Proz., also in einer Konzentration von 1: 1000000, is! die
Reaktion noch positiv. Ebenso auffallend ist aber auch die starke
Reaktionshemmung bei höheren Konzentrationen. Diese kommt nicht
durch die Hemmung der Fermentfunktion zustande, da die tiefbraune
Farbe der Flüssigkeiten die weitgehende Oxydation des Catechins
beweist. Es sei vorausgreifend bereits hier festgestellt, daB die
Hemmung der Oxydation durch die Hemmung der zweiten Reaktion,
der Oxydation des Guajaks durch das Chinon zustande kommt,
da aller Wahrscheinlichkeit nach das entstandene Chinon mit dem
Überschuß des Catechins unter Bildung minder aktiver Verbindungen
reagiert.
Ebenso stark ist der Einfluß der Wasserstoffionenkonzentration.
In sekundärem Natriumphosphat komnit die Reaktion gar nicht zu-
stande. In einer Phosphatmischung von 74 7,4 kommt sie relativ
rasch zustande, hat aber eine starke Neigung, bald zu verblassen.
Minder rasch kommt und verblaßt die Reaktion bei pg 7. In primärem
Phosphat kommt sie relativ langsam zustande, ist aber dann auch
relativ stabil, so daß die Reaktion nach 10 Minuten langer Bebrütung
in der Regel in primärem Phosphat deutlich stärker ist als bei pp 7
(oder in ungepuffertem Wasser). Wahrscheinlich kommt die Reaktion
zwischen Chinon und dem unveränderten Brenzcatechin mit steigendem
Py Stets leichter zustande. Bei 10 Minuten langer Bebrütung scheint
das Reaktionsoptimum für die Guajakreaktion etwa bei De 6,4 zu
liegen, die Reaktion, die dem wiederholt gemessenen normalen py der
Kartoffelzellsäfte entspricht.
Zellatmung. IV. 405
Es wurde nun folgende Versuchsreihe wiederholt ausgeführt:
a) l ccm primäres Phosphat wird mit 1 Tropfen 0,]proz. Brenz-
catechiulösung, 30 mg Ferment und 1 Tropfen 1proz. Guajaktinktur
versetzt und 10 Minuten lang bebrütet. Blaue Farbe ++.
b) l ccm primäres Phosphat wird mit derselben Menge Ferment
und Brenzcatechin aber ohne Guajak 10 Minuten lang bebrütet. Dann
werden 4ccm Methylalkohol zugesetzt (das Ferment präzipitiert), an
einer kleinen Büchnerkerze mit gehärtetem Filterpapier filtriert, das
Filtrat beim Vakuum der Wasserstrahlpumpe in dem a.a. O. be-
schriebenen!) Kölbchen unter sehr gelindem Erwärmen auf Leem
eingedampft. Trotz der Erwärmung bleibt hierbei die Flüssigkeit unter
Zimmertemperatur. Die alkohol- und fermentfreie Flüssigkeit wird
nun in ein Becherchen gegossen und mit 1 Tropfen Guajak versetzt.
Sogleich zeigt sich eine Blaufärbung, die in einer Minute ihr Maximum
erreicht, das der Farbentiefe des obigen: Versuchs a) entspricht.
c) Derselbe Versuch wird wiederholt mit dem Unterschied, daß
der Tropfen Brenzcatechin erst nach der Bebrütung, nach der Zugabe
von Alkohol zugesetzt wurde. Weiter wird vorgegangen wie oben.
Die Flüssigkeit zeigt weder direkt, noch nach 10 Minuten langer Be-
brütung eine blaue Farbe. Dieser Kontrollversuch zeigt, daB das
Ferment tatsächlich quantitativ präzipitiertt wurde, und daß das
oxydierende Produkt aus dem Catechin nur unter Einwirkung des
Ferments entsteht.
Anschließend an diese Versuche wurde festgestellt, daß die
alkoholische Chinonlösung beim Stehen bald inaktiv wird. Auch beim
Erwärmen der wässerigen Lösung wird das Chinon bald inaktiv.
10 Minuten langes Bebrüten bei 37% wird vom Chinon noch gut er-
tragen. Wird aber vor der Bebrütung überschüssiges Brenzcatechin
der wässerigen Chinonlösung zugesetzt, so verliert sie bald ihre Wirk-
samkeit.
Es fragte sich nun, ob sich in diesen Versuchen tatsächlich ein Di-
ketochinon für die Oxydation des Guajaks verantwortlich machen ließ,
da doch in allen diesen Versuchen nicht mehr als 0,005 Proz. Brenz-
catechin verwendet wurden. Um zu entscheiden, ob mit einer so geringen
Menge des Chinons eine so tiefe Färbung des Guajaks bewirkt werden
konnte, wurde nach Willstätter und Müller?) das Diketochinon her-
gestellt, in primärem Phosphat gelöst und in verschiedenen Konzentra-
tionen mit Guajak versetzt. Es zeigte sich hierbei, daß bei einer
Konzentration von 0,005 Proz. sich noch ungefähr dieselbe tiefe Färbung
1) A. v. Szent-Qyörgyi und Ty. Tominaga, diese Zeitschr. 146, 232, 1924.
2) l.c.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 97
406 A. v. Szent-Györgyi:
des Guajaks erreichen ließ wie im Kartoffeloxydaseversuch bei der-
selben Brenzcatechinkonzentration. Ähnlich wie das durch Oxydase-
wirkung erhaltene Chinon zeigte auch das nach Willstätter und Müller
präparierte Chinon eine ziemlich große Labilität, und wurde in seiner
Wirksamkeit durch überschüssiges Brenzcatechin stark gehemmt.
Es lag nun an der Hand, neben dem Brenzcatechin auch noch
andere Phenole auf ihr Aktivierungsvermögen zu prüfen. Auch Onslow
berichtet über derartige Versuche, in denen er feststellt, daß im Gegen-
satz zum Brenzcatechin Adrenalin und Tyrosin unwirksam waren.
Ein positives Resultat konnten sie hingegen mit dem p-Kresol erhalten.
Unsere Resultate, die mit diesen Onslowschen Angaben gut überein-
stimmen, sind in folgender Tabelle zusammengestellt. Es sei bemerkt,
daß zu diesen Versuchen ein Fermentpräparat zur Verwendung kam,
das mit Alkohol nicht vollständig extrahiert war, daher noch geringe
Reste des natürlichen Brenzcatechins enthielt und imstande war, auch
ohne besondere Zugabe das Guajak in deutlicher Weise zu bläuen.
KzHPO,
0,2 mol. KH¿PO, | 0.2 mol. — Na, HPO,
0,06 | 0,015 |0,004 [0,001 | O || 0,25 | 0,06 |0.0150,004|0,001| O
1:2
++ E
09000990 ett
+
+++
HHHH HHH
phenylalanin) . .
Hydrochinon E
Pyrogallol . ....
p-Amidophenol
p-Phenylendiamin .
m-Phenylendiamin ,
o-Phenylendiamin .
eeeeeee oo+H++
eeeeeee ooHH++
ooooooo ett 1
eeeeeee FH ett
+
E
ES
T
t
0
0
0
0
0
0
F
E
E
ES
3
SS
z
E
3
|
Q
g
g
E
E
E,
$
B
3
3
2
©:
E
P
&
B
CA
d
8
E
A
1 Tropfen 1 proz. Guajakas,
Wir wir aus der Tabelle ersehen, wurde mit Phenol und p-Kresol
eine Aktivierung erhalten, die aber an Intensitát noch weit hinter
dem Brenzcatechin zurúckbleibt. Viel minder, aber noch deutlich
war die Reaktivierung beim m-Kresol, die dann beim o-Kresol ganz
ausblieb; in Übereinstimmung mit der Tatsache, daß die Oxydierbarkeit
der drei Kresole durch das Ferment in derselben Reihenfolge abnimmt.
Außer dem Brenzcatechin enthält die Tabelle noch zwei Brenz-
catechinderivate, die ebenso wie das unsubstituierte Catechin zwei
freie OH-Gruppen in Orthostellung enthalten, also theoretisch ebenfalls
zur Aktivierung geeignet sein müssen (Dopa und Adrenalin). Wie wir
Zellatmung. IV. 407
sehen, ist dies aber nicht der Fall, so daß wir die Konklusion ziehen
können, daß außer den OH-Gruppen auch die Substituenten einen ent-
scheidenden Einfluß auf das Reaktivierungsvermögen einer Verbindung
ausüben. Einen weiteren analogen Fall sehen wir auch im Phenol
bzw. p-Kresol und Tyrosin (Onslow).
Wie wir sehen, ist dem o-Dioxybenzol gegenüber das p-Dioxy-
benzol ganz inaktiv, trotzdem auch diese Verbindung, ebenso wie das
Brenzcatechin, durch das Ferment wahrscheinlich zum Diketochinon
oxydiert wird. Um den Grund dieses negativen Resultats festzustellen,
wurde das Verhalten des p-Chinons (das von Kahlbaum bezogen wurde)
dem Guajak gegenüber untersucht. Es zeigte sich, daß dieses Chinon,
im Gegensatz zum o-Chinon, in stärkerer Verdünnung das Guajak
nicht zu bläuen vermag. Das Oxydationspotential dieses Chinons
scheint hierzu nicht auszureichen. Auf Grund dieser wie weiter oben
besprochenen Beobachtungen können wir also feststellen, daß eine
Verbindung reaktivierend wirkt, wenn 1. sie von der Oxydase überhaupt
angegriffen wird, 2. wenn ihr Oxyd bei dem betreffenden py eine ge-
nügend starke Oxydationskraft besitzt, um das Guajak zu oxydieren,
3. wenn der Überschuß der Verbindung bei dem betreffenden pg mit
dem primären Oxyd keine inaktiven Verbindungen eingeht, und 4.
wenn natürlich zwischen Guajak und Oxyd keine besonderen Reaktions-
hemmungen bestehen. Unter diesen Gesichtspunkten läßt sich dann
auch die aus der Tabelle hervorgehende interessante Beobachtung
ohne weiteres erklären, daß die meisten Verbindungen, die selbst keine
Aktivierung des Ferments gaben, die natürliche Bläuung des Guajaks
durch das Ferment stark hemmten. Dementsprechend wurde auch
gefunden, daß z. B. schon sehr geringe Mengen Pyrogallol die Oxydations-
kraft des o-Chinons (ebenso des synthetischen, wie des durch das Ferment
dargestellten) dem Guajak gegenüber augenblicklich aufheben.
Anschließend an die obige Tabelle sei noch erwähnt, daß, außer
beim o- und m-Kresol, bei allen Versuchen die starke Verfärbung der
Flüssigkeiten die Oxydation des betreffenden Phenols durch das
Ferment andeutete. Auffallend stark und rapid war die Verfärbung
beim Dopa. |
II. Das Oxydationssystem der Kartoffeln. Das Tyrin.
Verschiedene Beobachtungen leiteten auf die Vermutung, daß
neben dem Brenzcatechin noch eine andere, wahrscheinlich aromatische
Substanz im Oxydationssystem der Kartoffeln eine bedeutende Rolle
spielen muß. Um diese Substanz näher zu untersuchen, wurde versucht,
sie in soweit wie möglich reinem Zustande von den anderen Extrakt-
stoffen abzuscheiden. Zu diesem Ende wurde der alkoholische Extrakt
von Kartoffeln mit Barium gefällt, wobei eine große Menge schleimiger
27*
408 A. v. Szent-Györgyi:
Substanzen abgetrennt wurde. Dann wurde das natürliche Brenz-
catechin, das bei der Guajakreaktion die so bedeutende Rolle spielt,
als Bleiverbindung abgetrennt. Der Rest der gelöst gebliebenen Stoffe,
die weder eine unlösliche Barium- noch Bleiverbindung gaben, wurde
in eine acetonlösliche und einer acetonunlösliche aber methylalkohol-
lösliche Fraktion zersetzt. Letztere acetonunlösliche, aber in Methyl-
alkohol glatt lösliche Fraktion enthält den gesuchten Körper. Im
einzelnen war der Vorgang beim Präparieren der folgende:
330 g fein zerschnittener neuer Kartoffeln werden in der eingangs
beschriebenen Weise in 1000 ccm Alkohol gebracht. Der Alkohol wird
mit 3 Tropfen Eisessigsäure angesäuert und dann unter stetem Rühren
aufgekocht. Dann wird der Becher in kaltes Wasser gestellt. Nach genügen-
der Abkühlung wird an einer Büchnerkerze filtriert, der Rest tüchtig aus-
gepreßt. Nun wird die für die Neutralisation von 3 Tropfen Essigsäure
nötige Menge Ammoniak zugesetzt. Dann wird unter stetem Rühren in
kleinen Portionen eine gesättigte Bariumacetatlösung zugesetzt, bis kein
weiterer Niederschlag entsteht. Überschuß wird vermieden. Der voluminöse
flockige Niederschlag wird abzentrifugiert. Die klare Flüssigkeit wird nun
mit Plumbum aceticum Bas. Sol. (der Pharmakopae) versetzt, bis kein
Niederschlag mehr entsteht (kein Überschuß!). Die Reaktion der Flüssigkeit
in diesem Stadium ist gegen Lackmus neutral oder schwach sauer. Das
Präzipitat, das das natürliche Brenzcatechin der Kartoffeln enthält, wird
scharf abzentrifugiert.
Fraktion 1 (unlösliche Bleiverbindungen). Die Flüssigkeit wird vom
Präzipitat möglichst vollständig abgegossen und für die weitere Verarbeitung
bewahrt. Das Präzipitat wird in etwa 300 ccm Wasser suspendiert, das mit
Ameisensäure angesäuert wurde. Das Präzipitat wird möglichst vollständig
suspendiert. Es wird nun noch weiter Ameisensäure zugesetzt, bis die Flüssig-
keit Kongorot bleibend bläut. Nach starkem Rühren und Durcharbeiten der
Suspension mit einem mit Gummi montierten Glasstabe wird an einer
Büchnerkerze filtriert. Das Filtrat wird nun mit etwas basischem Bleiacetat
versetzt und mit Ammoniak neutralisiert. Das entstehende Präzipitat
wird an der Büchnerkerze abgetrennt, mit Wasser gewaschen, in etwa
100 ccm, mit 1 Tropfen Essigsäure angesäuertem Wasser suspendiert, mit
Schwefelwasserstoff zersetzt, filtriert, das Filtrat im Vakuum unter Durch-
leitung von Luft aus einer sehr dünnen Kapillare bei niedriger Temperatur
tüchtig ausgekocht, bis der Schwefelwasserstoff ganz entfernt ist. Die derart
gewonnene klare Flüssigkeit, die das natürliche Brenzcatechin der Kartoffeln
enthält, gibt mit Ferrichlorid eine tiefgrüne Farbe, gibt mit Ferrosulfat, durch
Natriumacetat schwach alkalisiert, die für Brenzcatechine charakteristische
tiefviolette Farbe, die bei stärkerer Alkalität ins Bordeauxrot umschlägt.
Die Flüssigkeit gibt eine positive Millonsche Reaktion. Die Flüssigkeit
vermag das Fermentdem Guajak gegenüber stark zu aktivieren. In neutraler
oder alkalischer Lösung verliert die Flüssigkeit bald diese Aktivität.
Fraktion 2 (acetonlöslich). Die klare alkoholische Flüssigkeit, die nach
der ersten Präzipitierung mit Bleiacetat gewonnen wurde (s. weiter oben),
wird tropfenweise mit Schwefelsäure versetzt, bis eine kleine entnommene
Probe mit Schwefelsäure nunmehr nur ein geringes Präzipitat gibt.
Das Präzipitat, das alles Barium und das meiste Blei enthält, wird abge-
sondert, die Flüssigkeit in vacuo bei ungefährer Zimmertemperatur bis
Zellatmung. IV. 409
auf etwa 300 ccm abdestilliert. Der Rest (300 ccm) wird filtriert, dann mit
Schwefelwasserstoff behandelt, filtriert, der Schwefelwasserstoff in obiger
Weise entfernt. der Rest bei niedriger Temperatur in vacuo auf etwa 10 ccm
eingeengt. '
Dann werden unter starkem Schütteln in kleinen Portionen etwa 100 cem
Aceton eingegossen, nochmals tüchtig durchgeschüttelt, dann etwa eine
halbe Stunde stehengelassen. Hierbei scheidet sich eine dicke, ölige Flüssig-
keit ab. Das stets noch trübe Aceton wird so vollständig wie möglich in
ein Zentrifugenrohr abgegossen, abgedreht, das Aceton vom Zentrifugat
abgegossen. Der Rest im Destillierkolben wird nochmals mit etwa 50 ccm
Aceton tüchtig durchgeschüttelt, das Aceton in das erst gebrauchte Zentri-
fugenrohr gegossen, hier mit dem obigen Zentrifugat gut durchgeschüttelt
und abgedreht. Das Aceton wird abgegossen. Die vereinigten aceton-
haltigen Flüssigkeiten bilden die Fraktion 2.
Diese Fraktion 2, die nicht weiter unser Interesse beschäftigen wird,
scheint neben Essigsäure und anderen Substanzen einen phenolartigen
Körper in größerer Menge zu enthalten. Sie reduziert das zugegebene
Ferrichlorid, gibt positive Millonsche Reaktion und zeigt, mit Lauge
erwärmt, eine braune Farbe.
Fraktion 3 (acetonunlöslich). Das Zentrifugenrohr und der Destillier-
kolben enthalten nun eine dicke, halbfeste Substanz. Der Kolben wird
nun mit etwa 20 ccm Methylalkohol ausgespült, in dem sich der Rest
vollkommen löst. Der Methylalkohol wird in das Zentrifugenrohr gegossen,
in dem sich die Substanz ebenfalls löst. Nun wird der Kolben nochmals mit
Methylalkohol ausgespült, der Alkohol in das Zentrifugenrohr gegossen
und hier die Flüssigkeit mit Methylalkohol noch auf etwa 100 ccm auf-
gefüllt. Der hierbei etwa entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert
und die klare methylalkoholische Lösung in vacuo bei niedriger Temperatur
abdestilliert. Es bleibt hierbei eine dicke, ölige, klare und farblose Substanz
zurück, die nun zum Zwecke der weiteren Versuche in 30 ccm Wasser
gelöst wird.
Wird diese Lösung (also die acetonunlösliche, methylalkohol-
lösliche Fraktion) nun mit Natriumacetat schwach alkalisiert und etwa
1/ Vol. gesättigte Chinonlösung zugegeben und in ein Wasserbad von 500
gesetzt, so erscheint sogleich eine tiefe, schöne, bordeauxrote Farbe,
die an Intensität während der ersten 2 Minuten stets deutlich zunimmt.
Ebenso schön erscheint die Farbe, wenn man die Flüssigkeit mit
sekundärem Natriumphosphat alkalisiert und dann mit etwas p-Chinon
stehen läßt. Die Flüssigkeit enthält also eine Substanz, die durch Chinon
behandelt eine prachtvolle tiefe Farbe gibt. die dann aber beim längeren
Stehen in eine schmutzig-braune übergeht, und die wir, wegen mancher
Ähnlichkeit mit dem Tyrosin, im folgenden Tyrin nennen werden. Die
tiefe Farbe deutet auf einen aromatischen Charakter, währenddessen
die analoge Reaktion von Adrenalin und Tyrosin darauf hindeutet,
daß der Farbwechsel auf einer Oxydation der betreffenden Substanz
durch das Chinon beruht. Diese Annahme wird durch die Beobachtung
gestützt, daß die Flüssigkeit, wenn man ihr ohne Chinonzusatz etwas
Ferrichlorid und Kaliumferricyanid zusetzt, sich nicht blau färbt, als
410 A. v. Szent-Györgyi:
Zeichen dessen, daß das Tyrin die zugesetzten Eisensalze nicht
zu reduzieren vermag. Ebensowenig reduziert das Chinon. Wird jedoch
das Tyrin in obiger Weise mit Chinon behandelt und dann mit den
Eisensalzen versetzt, so erhält man sogleich einen dicken Niederschlag
von Berlinerblau, da das Chinon bei seiner oxydativen Funktion selbst
in Hydrochinon übergeht, das die Eisensalze glatt reduziert.
Für diese Auffassung der Reaktion spricht auch der Umstand,
daß die rote Farbe durch Natriumhydrosulfid in reversibler Weise
augenblicklich zum Verschwinden gebracht, die Verbindung also in
ihre Leukoform zurückgeführt werden kann.
Das Tyrin, das mit dem Chinon in seiner oxydierten Form die
prachtvolle purpurne Reaktion gibt, läßt sich weder durch alkalische,
noch saure Fällungsmittel niederschlagen (basisches Bleiacetat, Baryt,
Cu(OH),, Sublimat, Phosphorwolframsáure, Wolframsáure, Pikrin-
säure), ist in Wasser und Methylalkohol extrem löslich, löst sich etwas
minder gut in Äthylalkohol, reduziert, wie gesagt, kein Eisensalz und
gibt eine negative Millonsche Reaktion, was zugleich ausschließt, daß
wir es hier mit Tyrosin zu tun haben. Beim Eindampfen hinterläßt (auch
mit HCI angesäuert) die Lösung eine farblose, harzartige Substanz.
Meine Versuche, sie zu kristallisieren, sind bis jetzt fehlgeschlagen.
Zum Auftreten der Farbenreaktion ist neben dem Chinon eine
Reihe anderer anorganischer Oxydationsmittel versucht worden
(Wasserstoffperoxyd, Kaliumchlorat, Ferrichlorid, Kaliumferricyanid,
Kalibichromat, Kaliumhypochlorit), es wurde aber mit keinem ein
positives Resultat erhalten. Nach meiner Erfahrung spricht dies auch
einigermaßen für einen aromatischen Charakter. Tyrosin zeigt in dieser
Beziehung mit unserer Substanz eine Ähnlichkeit.
Das Tyrin scheint in der Pflanzen- und Tierwelt weitgehend ver-
breitet zu sein. Eine Substanz mit den gleichen Eigenschaften kann
auch aus den Säugetiergeweben in relativ großer Menge präpariert
werden. Sie wurde in prinzipiell analoger Weise bis jetzt aus Pferde-
fleisch, Rinder- und Schweineherz und Schweineleber präpariert. Das
aus Rinderherz gewonnene Präparat zeigte im Kataphoreseversuch
bis Pg 4 eine anodische, über py 3 eine kathodische Wanderung!).
1) Nachdem Hefe eine stark positive Chinonreaktion gab, ebenso
auch das Eigelb, nicht aber das Eiweiß, weiterhin geschälter Reis eine nur
kaum positiv zu nennende Reaktion gab, währenddessen das Mehl der
Reisschalen stark positiv reagierte, und auch andere Gründe vorlagen,
das Tyrin mit dem Vitamin B zu identifizieren, wurden Tauben-
versuche vorgenommen. Die Versuche zeigten aber, daß die Gewebe (auch
das Gehirngewebe) der avitaminotischen Tauben im prämortalen Stadium
die Reaktion in normaler Intensität gaben, so daß die Vermutung der
Identität beider Substanzen unwahrscheinlich wurde,
Zellatmung. IV. 411
Wird das Tyrin nun mit der Oxydase zusammengebracht, so zeigt
sich keinerlei Veránderung. Die Lósungen bleiben ungefárbt als Zeichen
dessen, daß das Tyrin durch die Oxydase nicht angegriffen wird.
Versuch. Eine Reihe von Bechergláschen wird mit je 1 ccm der folgenden
Phosphatlösungen versetzt: Na,HPO, Mischungen von KH,PO, und
Na,HPO, von py 7,4, 7,0, 6,4, und endlich reines KH,PO,. Dann wird
einem jeden Becherchen 1 cem Wasser und 2 Tropfen der mit starker
NaOH neutralisierten Lösung des Tyrins (Fraktion 3) zugesetzt. Nach
der Zugabe von je einem Spatel Ferment wird 10, dann weitere 20 Minuten
lang bebrütet. Alle Proben bleiben während dieser Zeit vollkommen farblos.
Das Ferment ist also nicht imstande, das Tyrin aus seiner Leukoform zur
roten Pigmentform zu oxydieren.
Nun wird derselbe Versuch wiederholt, aber an Stelle des Wassers 1 cem
der neutralisierten Brenzcatechinlösung (Fraktion 1) zugesetzt. In einer
dritten Reihe wird zum Vergleich dieselbe Brenzcatechinlösung zugesetzt,
aber das Tyrin (Fraktion 3) weggelassen. In dieser letzten Reihe zeigt
sich als Zeichen der Oxydation des Brenzcatechins nach 10 Minuten eine
schwache, gelb bis braungelbe Farbe, die in den weiteren 20 Minuten noch
etwas deutlicher wird. Hingegen zeigen die Becher mit der zugleich zu-
gesetzten Fraktion 3 (Tyrin) eine sehr deutliche rote bis rotbraune Farbe.
Ebenso wie bei der Guajakreaktion, so bleibt auch hier die Färbung in reinem
sekundären Phosphat aus. Am stärksten und reinsten ist die Farbe beim
natürlichen pg 6,4 der Kartoffeln. In reinem primären Phosphat ist sie
bedeutend schwächer. Beim weiteren längeren Stehen geht die rote Farbe
auch hier ins Dunkelbraune über.
Das Tyrin verhält sich also in unserem Versuch ganz analog der
Guajaktinktur. Es wird offenbar nicht direkt durch das Oxydations-
ferment angegriffen, wird aber durch das aus dem Catechin unter Ein-
wirkung des Ferments entstandene Chinon aus seiner Leucoform zum
Pigment oxydiert. Die drei Substanzen bilden also ein einheitliches
System, in dem also letzten Endes unter katalytischer Mitwirkung des
Ferments und des Catechins das Tyrin durch den Sauerstoff oxydiert wird.
Wird dieses rote oxydierte Pigment unter anaeroben Bedingungen
mit Kartoffelgewebe in Kontakt gebracht, so kann man bald wieder
ihre Entfárbung beobachten, die augenscheinlich ihre Reduktion zur
Ausgangssubstanz andeutet.
Das Tyrin scheint also als Glied einer Kette von Reaktionen die
Oxydation des aktivierten Wasserstoffs zu vermitteln. Offenbar haben
wir es hier mit einem Gliede der von W. Palladın aufgestellten Gruppe
der Respirationspigmente zu tun. Im folgenden werden wir der Kürze
halber die reduzierte Leucoform des Tyrins als Leucotyrin, die oxy-
dierte Pigmentform als Oxytyrin bezeichnen. Der Gang der Oxydationen
in der Kartoffel scheint also der folgende zu sein:
Molekularer Sauerstoff + Oxydase + Brenzkatechin > o-Diketochinon,
o-Chinon + Leucotyrin > Brenzkatechin + Oxytyrin,
Oxytyrin + aktiver Wasserstoff > Leucotyrin.
412 A. v. Szent-Györgyi: Zellatmung. IV.
Hiermit sei natürlich nicht weggenommen, daß bereits zwischen
aktivem Wasserstoff und Chinon direkte Beziehungen bestehen können
und dieser durch den aktiven Wasserstoff reduziert werden kann, noch
bevor es zur Oxydation des Tyrins käme. Es scheint mir sogar recht
wahrscheinlich, daß das Zusammentreffen des Chinons mit dem
Glutathion zur Reduktion des ersteren und Oxydation des letzteren
führen muß!). Möglicherweise ist dies auch die gesuchte Verbindung
des Glutathions und des zugehörigen Reduktionssystems von Hopkins
und Dixon mit dem molekularen Sauerstoff. Natürlich läßt sich über
die funktionellen Verhältnisse des beschriebenen Oxydase-Brenz-
catechin-Tyrinsystems noch nicht mehr mit Sicherheit sagen, als daß
sie einer eingehenden experimentellen Erforschung bedürfen.
Zusammenfassung.
1. Es wird gezeigt, daß in den Kartoffeln der Mechanismus der
Guajakreaktion der folgende ist: Durch die Oxydase wird ein Brenz-
catechin zum o-Diketochinon oxydiert. Dieses Chinon oxydiert ohne
Mitwirken weiterer Fermente unmittelbar das Guajakreagens. Per-
oxyde oder Peroxydasen sind nicht an der Reaktion beteiligt. Die
Versuche von J. Wolff und M. W. Onslow werden bestätigt.
2. Es wird gezeigt, daß in den Kartoffeln außer dem Brenzcatechin
am System der Oxydation noch ein anderer, wahrscheinlich ebenfalls
aromatischer Körper beteiligt ist, der der W. Palladinschen Gruppe
der Respirationspigmente zugehört, der, so wie das Guajak, nicht un-
mittelbar vom Oxydationsferment, sondern erst durch das, unter Ein-
wirkung der Oxydase vom Brenzkatechin entstandene Chinon von
seiner Leucoform zum Pigment oxydiert wird. Die Substanz, die auch
im Warmblütergewebe in relativ großer Menge nachgewiesen wurde,
wurde mit dem Namen Tyrin belegt. Es werden einige chemische
Eigenschaften dieses Körpers erörtert.
1) So z.B. fand ich vor einigen Jahren, daß die Thioglykolsáure
bzw. ihre Sulfhydrylgruppe durch die Meerrettigwurzeloxydase nicht
angegriffen wird. Hingegen kann das Enzym durch die Zugabe von
Adrenalin der SH-Gruppe gegenüber aktiviert werden. Aller Wahrscheinlich-
keit nach wird nun das Adrenalin zum Chinon oxydiert, das wieder die
Thioglykolsäure zum Disulfid oxydiert, wobei das Chinon wieder zum
Adrenalin reduziert wird, das somit als Katalysator der Reaktion zwischen
Sauerstoff bzw. Oxydase und SH-Gruppe fungiert.
Über einen durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker
der Hefe entstehenden schwefelhaltigen Zucker.
Von
U. Suzuki und T. Mori.
(Aus dem agrikulturchemischen Institut der Universität Tokio.)
(Eingegangen am 16. Juli 1925.)
Mit 5 Abbildungen im Text.
Einleitung.
Vor kurzem haben die Verfasser eine schwefelhaltige Substanz
aus dem alkoholischen Extrakt der Hefe isoliert, welche durch Ein-
wirkung von verdünnter Säure in Adenin und einen schwefelhaltigen
Zucker gespalten wird. Das Phenylosazon des letztgenannten Zuckers
kristallisiert in schönen gelben Prismen vom Schmelzpunkt 159 bis 160°.
Auf Grund verschiedener Beobachtungen wurde für den Thiozucker
die folgende Formel vorgeschlagen !).
/ CH-OH
CHOS = 0, |
, CH-OH
CH—O H
CH
CH, —S—CH,
Die Verfasser haben die Untersuchung dieses Thiozuckers weiter
fortgesetzt und folgendes gefunden.
1. Der freie Thiozucker ist ein hellbrauner Sirup und schmeckt
schwach süßlich mit etwas brennenden, bitterem Nachgeschmack; er
gibt außer den allgemeinen Zuckerreaktionen noch die Pentosereaktion,
nicht aber die Methylpentosereaktion; so gibt er z. B. beim Kochen
mit starker Salzsäure die Furfurolreaktion, gibt auch die Bialsche sowie
die Phloroglucin-Salzsäurereaktion, aber keine Blaufärbung mit
rauchender Salzsäure und Vanillin. Er liefert ferner mit Aceton und
rauchender Salzsäure eine Rotfärbung, welche aber sehr rasch ver-
schwindet).
1) U. Suzuki, S.Odake und T. Mori, diese Zeitschr. 154, 278, 1924,
2) L. Rosenthaler, Der Nuchweis organischer Verbindungen, 2. Aufl.,
S. 194.
414 U. Suzuki u. T. Mori:
Diese Erscheinungen lassen sich dadurch erklären, daß die
—S-CH,-Gruppe zuerst durch Salzsäure abgespalten wird und der
resultierende Zucker die eigentlichen Pentosenrcaktionen gibt.
2. Der Thiozucker absorbiert Brom, gibt weiße Fällung mit Queck-
silberchlorid, Quecksilbernitrat und Goldchlorid.
3. Das Acetylderivat des Thiozuckers kristallisiert nicht, obgleich
die Acetylzahl des möglichst gereinigten Präparats beinahe mit der
des Triacetylderivats übereinstimmt.
4. Das Dibenzoylderivat des Thiozuckers bildet farblose Nadeln
von der Formel C¿H,/¿0,S(C¿H¿C0O), mit dem Schmelzpunkt 185°.
5. Mit Natriumamalganı reduziert, entsteht ein Thiozuckeralkohol
von der Formel C,H, ,SO,. Er bildete farblose büschelförmige Nadeln
vom Schmelzpunkt 115 bis 117% Das Dibenzalderivat desselben be-
steht gleichfalls aus farblosen Nadeln vom Schmelzpunkt 135 bis 136°.
CH,-O.
| CH CH,
CH—O
l HO. Dibenzalderivat des Thiozuckeralkohols.
| CH Ge:
(HO
CH,-S—CH,
6. Wird der Thiozucker mit konzentrierter Salpetersäure unter
Zusatz von Spuren Vanadinsalz vorsichtig eingedampft, so bilden sich
etwa 32 Proz. Oxalsáure. Nimmt man aber die Oxydation mit ver-
dünnter Salpetersäure (D = 1,15) ohne Zusatz von Vanadin vor, so
entsteht: eine Monocarbonsáure von der Formel C,H,,0,S mit dem
Schmelzpunkt 183 bis 184°. Sie ist keine Lactonsäure und absorbiert
kein Brom. Mit Zink und Salzsäure erhitzt, entsteht ein mercaptan-
ähnlicher Geruch. Höchst wahrscheinlich wird die —S—-CH,-Gruppe
durch Salpetersäure zur —SO—CH,-Gruppe oxydiert und die letztere
wieder durch Zink- und Salzsäure zum —S— CH, reduziert und weiter
abgespalten. Deshalb nehmen die Verfasser für diese Monocarbonsäure
die folgende Formel an:
CHOH
¿Hon
C¿H5 0,5 = CHOH
|
CHOH
|
CH,—S-CH,
|
7. Wird die wässerige Lösung des Thiozuckers in der Kälte tropfen-
weise mit Brom versetzt, bis die gelbbraune Farbe nicht mehr ver-
Durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker der Hefe entstehender Zucker. 415
schwindet, dann vorsichtig mit Alkali neutralisiert und mit Phenyl-
hydrazin erwärmt, so entstehen schöne hellgelbe Prismen von der
Formel C,¿H,¿03N, mit dem Zersetzungspunkt 223 bis 2240; diese
Verbindung ist als Phenylosazon des sulfoxydierten Zuckers zu be-
trachten. Der Reaktionsverlauf ist wahrscheinlich folgender!):
CHO CHO
|
CHOH Liai
| |
CHOH 2H,O CHOH
—>
CHOH CHOH
|
( H,—S—UCH, C H,—S—C H,
HE \
Br Br HO OH
CHO CH=N—N H.C H;
| |
CHOH C=N-NHC¿H,
|
CHOH CHOH
| |
C— S O—C Hs CH,—SO—C H,
Daß die Aldehydgruppe durch diese Behandlung nicht angegriffen
wurde, ist durch Kontrollversuche mit Xylose nachgewiesen. Das
Brom wurde nämlich in der Kälte von Xylose nicht absorbiert, so daß
keine Oxydation stattgefunden haben kann. |
8. Die Bestimmung der —S-CH,-Gruppe im Thiozucker bzw.
im Adenylthiozuckermolekül wurde nach Kirpal?) und nach Bühn und
Kirpal 3) ausgeführt. Das Resultat war positiv, obgleich die Reaktion
nicht quantitativ verlief. |
9. Auf Grund oben erwähnter Beobachtungen kann man mit ziem-
licher Sicherheit darauf schließen, daß dic Strukturformel des Thiozuckers
CH—OH
A
/ CH-OH
o |
x CH—OH
‘CH
|
C H,—S—U H,
ist. Das optische Verhalten soll später studiert werden.
1) Hantzsch und Hibbert, Ber. 40, 1514, 1897.
2) Hans Meyer, Lehrbuch der organischen Methodik, 4. Aufl. 1.
902 bis 904 und 1098.
3) Houben-Weyl, Die Methoden der organischen Chemie, 2. Aufl..
8, 148 bis 149.
416 U. Suzuki u. T. Mori:
10. Es seinoch bemerkt, daß Schneider und Wrede!) durch Spaltung
des Sinigrins mit Kaliummethylat eine Thioglucose erhielten. Diese
Thioglucose ist mit unserem Thiozucker nicht identisch, weil bei der
Behandlung der ersteren mit Phenylhydrazin in der Hitze unter
Glucosazonbildung leicht der Schwefel abgespalten wird.
HC—SH
| HC—O H
O HO-CH Thioglucose Schneiders.
CH
CHOH
CH,OH
Experimenteller Teil.
1. Darstellung und Eigenschaften des Thiozuckers.
10 g Adenylthiomethylpentose wurden in einem Rundkolben mit
200 ccm 5proz. Schwefelsäure, unter Rückflußkühlung 1 Stunde auf
dem Wasserbade gekocht, nach dem Erkalten saugte man von aus-
geschiedenem Adeninsulfat ab. Das Filtrat wurde, nach dem Entfernen
der Schwefelsäure durch Baryt, im Vakuum bis auf 50 ccm eingedampft
und in üblicher Weise mit Phosphorwolframsäure versetzt, um Adenin
zu entfernen. Nach dem Entfärben mit Tierkohle wurde bis zum Sirup
eingedampft. Ausbeute 4 g.
Der so erhaltene Thiozucker bildete einen hellbraunen Sirup,
schmeckte schwach süßlich mit brennendem, bitterem Nachgeschmack
und hatte folgende Eigenschaften.
2. Eigenschaften des Thiozuckers.
l. Die wässerige Lösung des Thiozuckers mit 5proz. Natronlauge
erhitzt, gibt gelbliche und dann braune Färbung und riecht schwach
nach Karamel.
2. Der Thiozucker gibt die Molischsche Reaktion, reduziert die
Fehlingsche, die Barfoedsche, die Nylandersche sowie «die ammoniaka-
lische Silberlósung.
3. Mit wenig Natriumcarbonat und Pikrinsäure erwärmt, ent-
steht eine rötlichbraune Färbung von Pikraminsäure.
4. Mit Diazobenzolsulfosäure und Alkali gibt er rote Färbung.
5. Die Seliwanoffsche Reaktion ist negativ.
6. Durch Bier- oder Sakéhefe wird der Thiozucker nicht vergoren.
1) Ber. 47, 2225, 1914; 52, 1756, 1919; Zeitschr. f. physiol. Chem. 119,
46, 1922; 126, 211, 1923.
Durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker der Hefe entstehender Zucker. 417
7. Mit Salzsäure erhitzt, entwickelt sich Furfurol, welches Anilin-
acetatpapier rötet. Methylfurfurol gibt in diesem Falle nur eine gelbe
Farbe.
8. Er gibt die Orcin- sowie die Phloroglucin-Salzsäurereaktion.
Methylfurfurol gibt diese beiden Reaktionen nicht.
9. Mit Aceton und rauchender Salzsäure erwärmt, entsteht Rot-
färbung, die sehr rasch wieder verschwindet. Bei der Methylpentose
soll diese Farbe wenigstens 10 Minuten bestehen bleiben.
10. Der Thiozucker selbst gibt keine Nitroprussidreaktion.
11. Die wässerige oder Eisessiglösung des Thiozuckers absorbiert
Brom.
12. Die wässerige Lösung gibt weiße Fällung mit Sublimat,
Mercurinitrat und Goldcehlorid; sie gibt aber keine Fállung mit Silber-
nitrat und Platinchlorid.
13. Die Thiozuckerlösung mit dem doppelten Volumen Salzsäure
(D = 1,19) und wenig Vanillin vorsichtig auf dem Wasserbad erwärmt,
gibt keine blaue Färbung; Methylpentose gibt dagegen diese Reaktion.
3. Acetylderivat.
l g Thiozucker wurde in gewöhnlicher Weise mit 4 g Essigsäure-
anhydrid und 0,5g wasserfreiem Natriumacetat in einem kleinen
Rundkolben unter Rückflußkühler 30 Minuten auf dem Wasserbad
erhitzt. Nach dem Erkalten wurde viel Wasser hinzugefügt und das
dabei ölig ausgeschiedene Acetylprodukt abgehoben, in Äther gelöst
und die ätherische Lösung im Scheidetrichter so lange mit Wasser
gewaschen, bis das Waschwasser keine saure Reaktion mehr gab. Nach
dem Trocknen der ätherischen Lösung mittels Chlorcalcium wurde
sie eingedampft, das zurückbleibende Öl aber kristallisierte nicht. Zur
Bestimmung der Acetylzahl wurde es mit n/2 alkoholischem Kali
verseift.
(l cem n/2 HCl entspricht 0,029 g CO.CH,.)
Substanz | n¡2 HCl,Lösung verbraucht | Acectylzahl
Ä ccm | Proz.
0,2399 | 3,3 39,89
Berechnet für C¿H,0,S .(0C CHA, 42,16
e a CeHio0 S. (OC.CH;h a. >. 32,56
Obgleich das Acetylderivat nicht vollkommen rein war, so stimmt
die Acetylzahl mit der des Triacetats des Thiozuckers beinahe überein.
418 U. Suzuki u. T. Mori:
4. Benzoylderivat.
5g Thiozucker wurden in wenig Wasser gelöst, mit 40 g Benzoyl-
chlorid und 270 ccm lOproz. Natronlauge portionsweise und ab-
wechselnd unter Schütteln versetzt,
mit Wasser auf 1 Liter gebracht
und unter Kühlen kräftig geschüt-
¡Ss ¿A telt. Nach einiger Zeit schied sich
N CIMA das Benzoylprodukt als weiße,
AS , $ weiche Masse aus. Nach 12 Stunden
S5 wurde es gesammelt, im Mörser
mit verdünntem Alkali und Wasser
gut verrieben, vom Wasser möglichst
befreit und mit Äther behandelt,
ging ein Teil in Lösung. Beim
Abdampfen des Äthers verblieb ein
dicker Sirup, aber er kristallisierte
Abb. 1. Dirbenzoylthiozucker (1:330) Nicht. Der in Äther unlösliche Teil
wurde in heißem Benzol gelöst.
Nach dem Erkalten schieden sich nadelförmige Kristalle ab (siehe
Abb. 1). Schmelzpunkt 185% (unkorr.), Ausbeute l g. Das Produkt
wurde im Vakuum bei 75° getrocknet und analysiert.
a h
QUES
u.
"
Di
-
Substanz | CO» | H,O | © | H
g = | g | Proz. | Proz.
0,1520 0.3457 0,0714 62,03 5,22
0,1201 | 0,2737 0,0581 62,08 5,38
Berechnet für Co Hals BIO" Colas, >. | 61,88 5,15
Es liegt also das Dibenzoylderivat des Thiozuckers vor. Diese
Substanz ist in Wasser und Äther unlöslich, dagegen wenig löslich bei
gewöhnlicher Temperatur in Alkohol, Benzol, Chloroform und Eis-
essig; beim Erwärmen aber ist sie darin leichter löslich.
A. Thiozuckeralkohol.
5g Thiozucker wurden in 50 ccm Wasser gelöst, unter Wasser-
kühlung mit 21⁄4 proz. Natriumamalgam portionsweise versetzt und
kräftig geschüttelt. Die dabei entstehende alkalische Reaktion wurde
vorsichtig mit verdünnter Schwefelsäure beseitigt. Diese Operation
wurde so lange fortgesetzt, bis fast alles reduziert war. Das dauerte
etwa 5 Stunden. Hierauf wurde die genau neutralisierte Lösung
im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit
Durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker der Hefe entstehender Zucker. 419
absolutem Methylalkohol drei-
mal extrahiert. Der Rückstand
der eingedampften methylalko-
holischen Lösung verwandelte
sich beim Stehenlassen im Va-
kuumexsikkator in eine Kristall-
masse, welche aus einem Benzol-
Eisessiggemisch umkristallisiert,
büschelförmige Nadeln vom
Schmelzpunkt 115 bis 117% (un-
korr.) lieferte (siehe Abb. 2).
Ausbeute = 2 g. Diese Sub-
stanz wurde im Vakuum bei
75° getrocknet und analysiert. Abb. 2. Thio»zuckeralkohol (1 : 330).
re a i u B so, : E e
Nr. | Substanz CO, HO lach Carius) C H S
g g g | q Proz. Proz. | Proz.
l 0,1525 | 0,2225 0,1039 | — | 3979 7,70 | —
2 0,1315 | 0,1916 | 0,0879 — | 3987 7,43 =
3 0,1519 = ec |-019076 | — — | 17,86
4 FUI ll A | Cham JL es = | 1718
Berechret für CHULOS as | 39,54 7,75 17,57
l Í
Die Analysendaten stimmen auf den Thiozuckeralkohol von der
Formel:
CH,OH
CH.OH
¿ H.OH
(CH OH
Cr, S—0H,
Diese Substanz schmeckt süßlich, reduziert aber nicht. Sie ist
ziemlich leicht löslich in Alkohol, Wasser, Methylalkohol, Aceton und
Eisessig, unlöslich in Äther, Benzol und Chloroform; sie gibt keine
Nitroprussidreaktion, absorbiert aber Brom.
6. Acetyl- und Benzoylderivat des Thiozuckeralkohols.
Die beiden Derivate wurden genau so dargestellt wie beim
Thiozucker. Sie bilden Öle und halbfeste Masse, kristallisieren
jedoch nicht.
420 U. Suzuki u. T. Mori:
Acetylzahlbestimmung des Acetylthiozuckeralkoho!s.
a com r/2 HCl REDEN 0 NISSE COCH,.)
at | n/2HCI
Acetylzahl
g ccm
0,1628 3,1 | 45,70
Berechnet für C¿H,0,4S(CO.C Hg). . | 49,19
e ew De 9, S(CO.CH,) | 41,88
So scheint das Produkt ein Gemisch von Tri- und Tetraacetat
zu sein.
7. Benzalderivat des Thiozuckeralkohols.
l g Thiozuckeralkohol wurde in Deem Salzsäure (D = 1,19)
unter Eiskühlung gelöst und mit 2g eisgekühltem Benzaldehyd unter
Schütteln versetzt. Die Flüssigkeit trübte sich, und allmählich
bildeten sich farblose, haarartige
Kristalle. Dieselben wurden
im Vakuumexsikkator über kon-
zentrierter Schwefelsäure und
Natronkalk 3 Tage getrocknet.
Dann wurden sie mit mög-
lichst wenig Wasser und Äther
gewaschen, um noch etwa
anhaftende Salzsäure und Benz-
aldehyd zuentfernen,und schließ-
lich aus Alkohol umkristallisiert.
Nadeln vom Schmelzpunkt 135
bis 136° (unkorr.) (s. Abb. 3).
Ausbeute 1,5 g. Zur Analyse
wurde die Substanz im Vakuum
bei 75° getrocknet.
5 | Substanz ; CO; H,O | c | H
N E TA ee
l 0,1308 0,3227 0,0708 ` 6721 om
2 01013 02498 | 00580 6725 6.36
Berechr.et für Ci H Or S (CH: C,H, en e 67,04 | 6,15
Die Analyse stimmt auf
CH,-O.
| "CH Gel,
CH—0O
|
Ce H100, BIO He Hale = CH—O,
| GH GH
CH—0O°
|
CH.=S-CH,
Durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker der Hefe entstehender Zucker. 421
Die Substanz ist geschmacklos, löst sich in Aceton, Benzol und
Chloroform, ziemlich leicht in Äther, Wee, in Alkohol und ist fast
unlöslich in Wasser.
8. Oxydationsprodukt des Thiozuckers.
Wird Thiozucker mit fünffachem Volumen konzentrierter Salpeter-
säure unter Zusatz von Spuren Vanadinoxyd vorsichtig erwärmt und
auf dem Wasserbad allmählich eingedampft, so bildet sich reichlich
Oxalsáure. Zu ihrer Bestimmung wurde der eingedampfte Sirup mit
Wasser verdünnt, mit Ammoniak neutralisiert und die Oxalsäure als
Calciumoxalat gefällt.
Substanz Calciumoxalat Oxalapure
Proz.
0,1541 | 0,0721 32,9
|
Wird die Oxydation noch vorsichtiger und milder vorgenommen,
so bildet sich keine Oxalsáure, sondern eine Kohlenhydratsáure von
der Formel C¿H;,20,58, vielleicht von folgender Strukturformel :
COOH
CHOH
¿ HOH
i HOH
CH, —S0- CH,
Neben der Aldehydgruppe
wurde daher auch die —CH,
—S—CH,-Gruppe gleichzeitig
oxydiert.
Zu diesem Zwecke wurde
lg Thiozucker mit 8ccm Sal- $.
petersäure (D SZ 1,15) übergossen, Abb. 4. Thioszuckersäure (1 : 600).
zuerst bei niedriger Temperatur,
später aber bei 95° unter stetem Rühren vorsichtig zum Sirup ver-
dampft. Der Rückstand wurde in wenig Wasser gelöst und aber-
mals vorsichtig eingedampft. Der zurückgebliebene Sirup lieferte
nach 10tägigem Stehen im Eisschrank farblose Kristalle, die ab-
gesaugt, mit wenig Alkohol gewaschen, aus möglichst wenig heißem
Eisessig umkristallisiert, farblose Tafeln (s. Abb. 4) vom Schmelz-
punkt 183 bis 184% (unkorr.) in einer Ausbeute von 0,19 g lieferten.
Sie wurden im Vakuum bei 75° getrocknet und nach Pregl analysiert.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 28
422 U. Suzuki u. T. Mori:
N. Substanz Cie HO, | Bän C H s
r. | | i
mg mg | mg | mg | Proz. Proz. | Proz.
1 5,189 6283 2404 | — 33/02 | 518 —
2 5,158 6,938 2,489 | — 34,69 5,10 —
3 7,580 — | — | 833 — — 15,10
4 4370 ` — — |; 499 ` — ` — 1509
Berechnet für Ce HOS +... > 2 2 20. 33,93 |; 5,66 15.11
| | |
Substanz | Verbraucht n/10 KOH Carboxyl+H
g ccm Proz.
0,0537 | 2.6 0.48
Berechret für C,H,,0,S'OOH... ` 0,48
Die Substanz ist daher eine Monocarbonsáure. Zur Feststeliung.
ob diese Substanz ein Lacton ist, wurde dieselbe mit einem Überschuß
von Alkali auf dem Wasserbade 1 Stunde lang gekocht und dabei das
unverbrauchte Alkali zurücktitriert.
Zugesetzte | - Zurücktitrierte | Verbrauchte | <>
Substanz n¡/lOKOH | nil0H,SO, nj10 KOH Carboxyl-H
g cum | ccm ccm Proz.
= >= a 22 eu u 9 = a = R $ EAN i 2
0,0364 40 | 2,2 | 1,8 Ä 0,49
Berechnet für C¿H,0,S.COOH.....¿....... | 0,48
Hieraus wird ersichtlich, daß es sich nicht um ein Lacton handelt.
Die Substanz ist in warmem Wasser und Eisessig löslich, weniger
in heißem Alkohol und kaltem Eisessig; unlöslich in kaltem Alkohol,
Äther, Aceton und Benzol. Sie reduziert die Fehlingsche Lösung nicht.
Die wässerige- oder Eisessiglösung absorbiert kein Brom. Mit Zink
und Salzsäure erhitzt, entwickelt sich ein schwacher, aber deutlich
mercaptanähnlicher Geruch.
9. Phenylosazon des durch Brom oxydierten Thiozuckers.
Das aus Adenylthiomethylpentose oder aus freiem Thiozucker
dargestellte Phenylosazon des Thiozuckers bildet feine gelbe Prismen
vom Schmelzpunkt 158 bis 159%). Wenn man aber Adenylthiomethyl-
pentose erst mit 5proz. Schwefelsäure spaltet und den dadurch ent-
standenen freien Thiozucker unmittelbar mit Brom oxydiert und mit
Phenylhydrazin in gewöhnlicher Weise das Phenylosazon bereitet, so
erhält man ein höher schmelzendes und beständigeres Phenylosazon.
1) Diese Zeitschr. 194, 278, 1924.
Durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker der Hefe entstehender Zucker.
423
Zu diesem Zwecke wurden 3 g Adenylthiomethylpentose mit 60 cem
5proz. Schwefelsäure im Wasserbade gekocht.
Nach dem Erkalten,
Neutralisieren und Entfärben wurde die Flüssigkeit mit Eiswasser
abgekühlt und dann so lange
tropfenweise Brom zugesetzt,
bis die Bromfarbe nicht mehr
verschwand. Sodann wurde die
Flüssigkeit neutralisiert und in
üblicher Weise das Phenylosazon
dargestellt. Man erhielt so neben
ziemlich viel gallertartiger Sub-
stanz das Phenylosazon in hell-
gelben Nadeln. Diese Kristalle
wurden gesammelt und mit Eis-
essig gewaschen, dann in Pyridin
gelöst und durch Zusatz von
Wasser umgefällt oder aus
heißem Alkohol umkristallisiert.
Durch wiederholtes Umlösen er-
Abh. 5. Phenylosazon des sulfoxydierten Zuckers.
hält man hellgelbe, nadelförmige Kristalle (s. Abb. 5) vom Schmelz-
punkt 223 bis 224° (unkorr.) in einer Ausbeute von 0,5g. Zur Analyse
wurde die Substanz im Vakuum bei
pa ~
15% getrocknet.
| Substanz
Atmosph. Druck | Temperatur
N
SS g ccm mm oC Proz
1.0.0805 7,8 748 I an | 1444
2 0.0710 9,3 756,8 | 22 14,70
Substanz | CO», H,O C H
Nr. |
| g g g Proz. i Proz.
3 0,1332 0,2807 0,0730 57,47 6,09
4 0,1240 0,2624 0,0697 57,71 6,24
Zusammenstellung der beiden obigen Analysenresultate.
N G H N
S Proz. Proz. Proz.
1 | — -— 14 44
2 | Ge e 14,70
3 "57,47 6,09 ec
4 57,71 6,24 bes
Berechret für Cis Ha O¿N¿S. . 57,75 5,88 14,97
28 *
424 U. Suzuki u. T. Mori: Durch Hydrolyse von Adenyl-thiozucker usw.
Die Substanz stimmt also mit dem Phenylosazon des an der S-Stelie
oxydierten Zuckers überein.
CH 5 N—NH-4C,H,
|
C:N—NH—",H,
|
CHOH
|
CHOH
|
CH,--SO—CH,
Dieses Osazon löst sich in Pyridin sehr leicht, ziemlich gut in
heißem Alkohol, weniger gut in Äther, Eisessig und kaltenı Alkohol:
es ist nicht löslich in Wasser, Aceton, Chloroform und Benzol. Mit
Zink- und Salzsäure erhitzt, entwickelt sich ein schwacher, aber deut-
licher Mercaptangeruch.
Nach obigen Eigenschaften scheint die Substanz das Phenylosazon
des oxydierten Thiozuckers, und zwar der sulfoxydierten Verbindung,
zu sein.
10. Nachweis der Thioäthergruppe (—S—UH;) im Thiozucker.
Adenylthiomethylpentose wird mit 5Ufacher Menge Jodwasser-
stoffsáiure (D = 1,7) allmählich zum Kochen erhitzt und der ent-
wickelte Dampf in roten Phosphor und 20proz. Cadmiumsulfatlösung
(zwecks Entfernung freien Jods) eingeleitet und nach der zweiten
Methode von Kirpal und Bühn!) in Pyridin absorbiert. Nach ein-
stündigem Kochen wurde das Pyridin langsam verdampft und der
trockene Rückstand in wässeriger Lösung mit n/10-AgN O,-Lösung
titriert, wobei man Kaliumchromatlösung als Indikator gebrauchte.
(l ecm n/10 AgNO, entspricht 0,004512g —S-—CH,.)
Substanz | n/10 Ag NO3 | Thiomethylzahl — 5 CH,
g | ccm Proz.
GE ET ee FE = bes 24 SR Le, A SR e = Sam SE sé ==
0,3101 | 4,4 6,42
Berechret für C,H}0; N,;SCH, ......... | 15,86
So sieht man, daß die Reaktion nicht quantitativ verlief. Trotz-
dem ist das Vorhandensein der —S—CH,-Gruppe dadurch positiv
nachgewiesen.
1) Houben-Weyl, Die Methoden der organischen Chemie, 2. Aufl.,
3, 149.
Über den Ursprung
des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs.
Von
Nicolaus N. Iwanoff.
[Aus dem pflanzenphysiologischen Institut der Universität zu Petersburg
(Leningrad).]
(Eingegangen am 16. Juli 1925.)
Das Vorkommen von Harnstoff in Pilzen, die unter künstlichen
Ernährungsverhältnissen kultiviert werden, führte mich zu dem Schlusse,
daß hier eine allgemeine Eigenschaft der Pilze vorliegt „und daß die
Anwesenheit von Harnstoff im Pilze nicht den Pilz selbst charakterisiert,
sondern dessen Nahrungsbedingungen‘“!).. Nach meinen Versuchen
vollzieht sich die Bildung des Harnstoffs bei einem Überschuß von
Eiweißstoffen und bei Abwesenheit von Kohlenhydraten im Nähr-
substrat, auf dem sich die Pilze entwickeln; zugleich verschwindet
für gewöhnlich die in den Pilzen anwesende Urease. Das Kultivieren
von Pilzen, die in das Nährmedium Harnstoff ausscheiden, der für sie
als Abfallsprodukt auftritt, gab mir die Möglichkeit, die Entstehung
dieses Harnstoffs unter geeigneten Laboratoriumsbedingungen zu
verfolgen.
In der vorigen Arbeit hatte ich steril aufgewachsene Pilze untersucht
wie Aspergillus niger, Penicillium glaucum, Rhizopus nigricans, Tie-
ghemella orchidis und außerdem Champignon. In einzelnen Kulturen
fand eine Anhäufung von Harnstoff bis 48,6 mg auf 100 ccm Nähr-
flüssigkeit statt, die 3g Pepton enthielt. Die erwähnten Pilze gehören
verschiedenen Klassen an, zu den Zygomyceten, Ascomyceten und
Basidiomyceten; dies gab schon die Gewähr dafür, daß der Harnstoff,
wenn seine Bildung in zufällig ausgewählten, weit voneinander ent-
fernten Vertretern von Pilzen erfolgte, unter passenden Bedingungen
1) N. N. [wanoff, Über die Ausscheidung des Harnstoffs bei Pilzen,
diese Zeitschr. 157, 229, 1925.
426 N. N. Iwanoff:
bei allen Pilzen konstatiert werden kónnte. Ich erhielt von Prof.
A. A.Jaczewsky, dem ich an dieser Stelle meinen wärmsten Dank
aussprechen möchte, Reinkulturen einiger Pilze. Ich säte dieselben
auf sterilisierte Gelatine — unter Beifügung von Malzextrakt — aus
und bestimmte dann, nachdem das Pilzmycel sich entwickelt hatte,
den Harnstoff im Nährsubstrat. Bei allen untersuchten Pilzen habe
ich in der verdünnten Gelatine Harnstoff festgestellt. Nur zwei Fälle
waren zweifelhaft; es ist möglich, daß beim Umsäen eine Infektion
durch Bakterien eingetreten war; zum Unterschied von den anderen
Proben wies die verdünnte Gelatine in diesen beiden Versuchen einen
starken Geruch nach Ammoniak auf, das durch Zersetzung des Harn-
stoffs entstanden war. Im ersten Versuch sind die Untersuchungs-
ergebnisse von sieben verschiedenen Pilzarten aufgeführt.
Versuch 1.
In Petri-Schalen wurden je 10 cem 10 proz. Gelatine mit einer geringen
Menge Malzextrakt versetzt, mit Sporen von Pilzen besät und auf einige Tage
bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wurde die verdünnte Gelatine
abfiltriert, das Mycel mit Wasser gewaschen, das Trockengewicht bestimmt.
und im Filtrat mit den Waschwässern der Harnstoff nach Fosse mit Xant-
hvdrol gefällt.
au wi
Benennung der Pilze der Kultur Ree ee | Harnstollmenje
Tage | mg mg
Phycomycetes nitans . ` 9 71,4 3,14
Acremonium. s... | 9 464,0 8,64
Diplocladium ..... 12 | 70,0 3,63
Penicillium multicolor . 12 54,0 3,67
Botrytis cinerea . . . . 12 52,0 2,16
Amblyosporium `... 12 | 110,0 | 2.27
Trichothecium . ... . | 20 | 60,0 | 2,50
In allen genannten Fällen wurde Harnstoff konstatiert, wenn auch
in wechselnden Mengen. Alle Pilze wurden ohne jegliche Auswahl
genommen, und da sie zu den verschiedensten Klassen gehören, kann
man schon mit Sicherheit behaupten, daß die Harnstoffanhäufung
eine allgemeine Eigenschaft der Pilze ist, wenn sich diese auf einem
eiweißstoffreichen Nährboden entwickeln.
Im weiteren war es nötig, den Mechanismus der Harnstoffbildung
aufzuklären und die Quelle seiner Entstehung aufzufinden. Die Tat-
sache, daß sich der Harnstoff nur in Pilzen angehäuft hat, die auf
eiweißstoffreichem Nährsubstrat aufgewachsen waren, findet eine
analoge Erscheinung im tierischen Organismus, in welchem der Harn-
stoff aus den Endprodukten des Eiweißstoffzerfalls — Ammoniak und
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstofís. 427
Kohlensäure — synthetisiert wird. Mir ist es früher gelungen darzutun?),
daß eine derartige sekundäre Bildung des Harnstoffs bei höheren Pilz-
arten, wie den Bovisten, stattfindet, die den Harnstoffgehalt ver-
mehren, wenn man ihnen von außen Ammoniak zusetzt.
Als es mir gelang, die Biläung von Harnstoff nur in Abwesenheit von
Kohlenhydraten hervorzurufen, kam mir daher der Gedanke, daß wir es
hier mit der gleichen Erscheinung zu tun haben. Es ist längst bekannt,
daß Aspergillus niger auf einer Peptonkultur oxalsaures Ammonium als
Abfallsprodukt bildet. In meinen früher beschriebenen (l. ce.) Versuchen
wurden neben einer Harnstoffanhäufung in der Nährlösung große Mengen
von Ammoniumsalzen aufgefunden, so daß ich nicht endgültig entscheiden
konnte, ob hier nur ein partieller Übergang von Ammoniumsalz in Harnstoff
stattfindet, oder ob der Harnstoff aus irgend einer anderen Quelle entsteht.
Im letzteren Falle würde er nicht in analoger Weise wie der Harnstoff der
Tiere und Boviste entstehen. Alle weiteren Versuche wurden mit Aspergillus
niger angestellt. Dir angewandte Nährflüssigkeit bestand aus Salzen: 0,1 g
KH,PO,, 0,1g MgSO, FeSO; (Spuren) und Img ZnSO, in 100 ccm
Wasser; zu dieser Lösung wurden entweder Pepton, oder ein (Gemisch von
Aminosäuren oder Argininsalz hinzugefügt. Das Mycel des Pilzes wurde
nach dem Versuche abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Im Filtrat wurde
der Harnstoff nach Fosse bestimmt, durch Destillation mit Magnesia wurde
die Menge des Ammoniakstickstoffs ermittelt.
Es wurde angenommen, die Harnstoffanhäufung erfolge wegen
des Fehlens der zur Neutralisation des Ammoniaks erforderlichen
organischen Säuren; dieses kann nicht an Kohlensäure gebunden
werden, da eine derartige Verbindung durch das Auftreten alkalischer
Reaktion eine schädliche Wirkung hervorruft. Der Pilz muß infolge-
dessen zur Synthese von Harnstoff schreiten. Die Richtigkeit dieser
Hypothese kann man prüfen, indem man dem Pilz außer der gewöhn-
lichen Nahrung noch Oxalsäure zufügt, oder umgekehrt die Säure durch
zur Kultur zugefügte Kreide bindet. Im ersten Falle konnte. beim `
Ansteigen der Acidität die Harnstoffbildung gehemmt werden, im
zweiten war eine fördernde Wirkung zu erwarten.
Versuch 2.
Kultur von Aspergillus niger. 100 cem Lösung von Náhrsalzen mit 3g
Pepton; zu einigen wurde noch lg Oxalsäure zugefügt. Temperatur 30
bis 33° C.
A. Nach 7 Tagen.
|! Trockengewicht Ammonialr+N | N im Mycel
| |
| des Mycels Hamstot - in der Flüssigkeit
l mg | mg | mg mg
Kontrolle . . .. 589 40.4 167,7 51,1
Mit 1g Oxalsiture 696 0 279,0 60,2
1) N. AN. Jwanoff, diese Zeitschr. 136, 9, 1923.
428 N. N. Iwanoff:
B. Eine Flasche enthielt vom Anfang an während des Versuchs 5 g CaCO,;
nach 23 Tagen erwies sich:
Trockengewicht
N—NH Een
des Mycels preto in der Flüssigkeit N im Mycel
350 | 16,95 60,8 9,36
Die Zugabe von Oxalsäure zur Kultur wirkte auf die Entwicklung
des Mycels günstig ein, es erfolgte eine Zunahme des Trockengewichts
sowie auch des Stickstoffgehalts, Harnstoffbildung trat jedoch bei
Zugabe von lg Oxalsáure nicht ein. Ein weit höherer Gehalt an
ammoniakalischem Stickstoff würde im vorliegenden Falle dafür
sprechen, daß bei überschüssiger Acidität kein Harnstoff gebildet
wird. Die Zugabe von CaCO, in der Serie B, wodurch die Säure ent-
fernt wurde, führte nicht zum Verschwinden des Abfallstickstoffs in
Form von Ammoniak; die Menge des letzteren erwies sich ziemlich
bedeutend — 60,8mg — im Vergleich zu 16,95 mg Harnstoff.
Versuch 3.
100 cem Flüssigkeit, Mineralsalze, 3g Pepton; Aussaat der Sporen von Asper-
gillus niger. Temperatur 30 bis 32°C. Zu der einen Kultur wurden 2g Ammo-
niumoxalat hinzugefügt, zu einer anderen außerdem noch 2 g Oxalsáure.
Nach 7 Tagen.
| Trockengewicht Harnstoffmenge
Portion des Mycels
omg | mg
l. Kontrolle a la ie as | 633,9 46,3
2. 2g (NH, OO, ... 2.2... | 687,5 | 48,6
3. 2g (NH,COO)+ 1g (COOH),.| 517,8 | 17,4
Es wurde durch einen besonderen Versuch gezeigt, daß die Harn-
stoffbildung infolge der Zufügung von Oxalsáure mit einer bestimmten
H-Ionenkonzentration in Beziehung steht, da diese Säure in Form
ihres Salzes keinen Einfluß ausübt. In Versuch 2 war während 7 Tagen
in Gegenwart von l g Oxalsäure überhaupt kein Harnstoff entstanden,
in Versuch 3 im ganzen nur 17,4 mg, in der Kontrolle dagegen 46,3 mg.
Weitere Versuche haben aber gezeigt, daß bei langdauernden Kulturen
selbst bei ursprünglichem Zusatz von Oxalsáure Harnstoff entsteht.
Im Versuch 4, in welchem von Anfang an nur 0,5 g Oxalsäure zugesetzt
wurden, hat sich der Harnstoff in normaler Weise gebildet. Somit hängt alles
von einer anfänglichen hohen H-Tonenkonzentration ab, welche die Bildung
von Harnstoff hemmt; hernach ergeben sich in dem Maße als die Oxalsäure
dureh das sich bildende Ammoniak neutralisiert wird, passende Bedingungen
zur Anhäufung des Harnstoffs.
Aus dem weiter unten beschriebenen Versuch ist zu ersehen, daß eine
Zugabe selbst geringer Mengen Oxalsáure eine Erhöhung des ammoniakalı-
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs. 429
schen Stickstoffs in der Kulturflüssigkeit nach sich zieht, ebenso ein An-
steigen des Trockengewichtes des Mycels.
Versuch 4.
Kultur von Aspergillus niger. 100 ccm Flüssigkeit, Mineralsalze,
3 g Pepton; zu einigen wurden je 0,5 g Oxalsáure zugefügt. Temperatur
30 bis 320 C. Die Mycelien wurden in Form von dicken Háutchen und voll-
stándig weiB erhalten; Sporen wurden nicht gebildet. Nach bestimmten
Zeitráumen wurde in einzelnen Flaschen das Trockengewicht des Mycels,
der Stickstoffgehalt desselben, die Harnstoffmenge und die des ammoni-
akalischen Stickstoffs in der Kulturflüssigkeit bestimmt.
Dauer
des Versuchs
Trockengewicht Ammoniakal. N in
des Mycels | Harnstoffmenge N des Mycels | Kulturflüssigkeit
_ po omg l o oog mg Im
NL
A. Ohne Zugabe von Oxalsáure.
8 | 401,8 31,7 33,1 128,0
10 553,0 37,2 47,6 ` 221,9
13 393,0 39,9 22,3 259,5
B. Mit Zugabe von 0,5g Oxalsáure.
10 732,0 36,9 . 64,2 235,9
13 634,0 40,3 43,0 282,7
Aus den Versuchen geht hervor, daß die zu Anfang des Versuchs
zugefügte Oxalsáure in einer Menge von 1 g eine Hemmung hervorrief;
0,5g waren schon ohne Einfluß, da sie bald von dem sich bildenden
Ammoniak neutralisiert wurden. In der vorigen Arbeit (l.c.) war es
mir gelungen zu zeigen, daß eine Zugabe von Glucose zur Kultur des
Pilzes, der auf Pepton aufgewachsen war und Harnstoff enthielt, eine
schnelle Entwicklung des Mycels, Bildung von Urease und Verschwinden
des Harnstoffs bewirkte. Wenn die Glucose in einem derartigen Falle
nur als Kohlenstoffquelle erscheint, so könnte man sie vielleicht durch
andere Verbindungen ersetzen, wie z.B. auch durch Oxalsäure; von
Interesse wäre es, das Schicksal des Harnstoffs unter diesen Umständen
zu verfolgen.
Versuch 5.
Kultur von Aspergillus niger in 100 ccm Lösung von Nährsalzen mit
3g Pepton. Temperatur 30 bis 33°C. Nach 7 Tagen wurde eine Kultur
zur Analyse entnommen, zur anderen unter sterilen Bedingungen 1 g Oxal-
säure in Lösung zugefügt, dann noch auf 3 Tage im Thermostaten stehen-
gelassen und analysiert.
Portion en e im Mycel Harstoffmenge near
an PA ROA A p E eb S
7 Be Kontrolle . . . 589 | 511 40,4 167,7
Zugabe von 1g Oxal- Ä
eäure nach Verlauf von
7 Tagen und nach drei-
tägigem Stehen .. . 955 78,2 39,8 323,3
430 N.N. Iwanoff:
Die Zugabe von Oxalsäure zur Kultur wurde nicht von einer Zer-
setzung und einer Assimilation des Harnstoffs begleitet, aber sie förderte
die Assimilation des Peptons durch den Pilz; dieses zeigte sich in der
Vermehrung des Trockengewichts des Mycels und im Ansteigen des
Stickstoffgehalts.
Hieraus folgt, daß die Oxalsáure nicht dieselbe Rolle wie ein Kohlen-
hydrat, z.B. Glucose und Saccharose, spielen kann. Ich führe noch
einen Versuch an, um zu zeigen, wie die Umwandlung stickstoffhaltiger
Substanzen bei Zufügen von Saccharose zur Kultur des Pilzes von-
statten geht.
Versuch 6.
Kultur von Aspergillus niger in 100 ccm Lösung von Nährsalzen und
3g Pepton. Temperatur 30 bis 33°C. Nach 10 Tagen wurde eine Kultur
analysiert, die zweite noch auf 3 Tage unverändert gelassen, zur dritten
wurden urter sterilen Bedingungen 10 g Saccharose in Lösung zugefügt
und noch 3 Tage stehengelassen.
mg
Zehntägige ge Kontrolle .. e
Zehntägige Kultur noch
3 Tage stehengelassen
Nach 10 Tagen Zufúgung
von 10g Saccharose,
noch 3 Tage stehen-
gelassen . . ... . .
Das völlige Verschwinden des Harnstoffs wurde bei Zugabe von
Saccharose beobachtet; hier wurde auch Urease vorgefunden. Das
Trockengewicht des Mycels und die Stickstoffmenge hatte sich zehnfach
vergrößert, der Gehalt an ammoniakalischem Stickstoff in der Nähr-
lösung auf 100 mg vermindert.
Im folgenden Versuch wurden so günstige Kohlenstoffquellen
wie Glycerin und Mannit erprobt. Es erwies sich, daß sie ebenso wie die
anderen Zuckerarten die Assimilation des Harnstoffs und die Bildung
der Urease in der Kultur fördern.
Versuch 7.
Kultur von Aspergillus niger. 100ccm Flüssigkeit, Mineralsalze,
3 g Pepton und je 0,1 g Saccharose. Nach Verlauf von 8 Tagen wurden die
Kulturen bei 37°
l. noch 2 Tage unverändert stehengelassen,
2. 5g Glycerin unter sterilen Bedingungen in Lösung hinzugefügt
und noch 2 Tage stehengelassen.
3. 5 g Mannit steril in Lösung beigefügt und auch 2 Tage stehengelassen.
Nach 2 Tagen — d. h. im ganzen hatte sich jede Kultur 10 Tage lang
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs. 431
entwickelt —, wurden die Ernten des Pilzes der Analyse unterworfen;
es wurde erstens das Trockengewicht des Mycels und dessen Stickstoff-
gehalt, zweitens der Harnstoffgehalt und der des ammoniakalischen Stick-
stoffs im Filtrat bestimmt.
Portion
| Trockengewicht Harnstoff» | Ammoniakal. N
i des Mycels | des Ge ES in nr
mg
Zehntägige Kontrolle
290,0
Achttägig + 2 Tage mit
5g Glycerin. ... . 236,6
Achttägig + 2 an mit
5g Mannt ... 201,2 `
Im ersten Falle verlief die Prüfung auf Urease negativ, im zweiten
und dritten Falle mit Glycerin und Mannit positiv.
| Somit gleichen Glycerin und Mannit den Zuckerarten vollkommen
hinsichtlich der Harnstoffassimilation, sowie auch in bezug auf die
Ureasebildung. Die Oxalsäure erweist sich als ein Stoff, der nicht als
Material zur Eiweißstoffsynthese dienen kann, wenigstens nicht bei
Aspergillus niger. Darum finden wir auch einen Unterschied im Ver-
halten der Oxalsäure einerseits und der Glucose, des Glycerins, des
Mannits andererseits; die letzten drei Verbindungen zeigen sich als
gute Kohlenstoffquellen für den Pilz. Es bleibt nun noch zu untersuchen,
ob der Pilz darauf reagieren wird, wenn man ihm Säuren, wie Milch-
und Weinsäure, verabreicht, auf denen sich der Aspergillus niger gut
entwickelt. Es ist möglich, daß man, je nachdem, ob der Harnstoff
aus der Kultur nach Zugabe der betreffenden Kohlenstoffquelle ver-
schwindet oder nicht, den Grad der Tauglichkeit derselben für die
Entwicklung des geprüften Pilzes bemessen kann.
Indem ich eine große Anzahl Analysen von Pilzkulturen ausführte,
die auf einer bestimmten Menge Pepton (3 g) gewachsen waren, konnte
ich beständig konstatieren, daß eine Menge von bzw. 30, 40, 48,6 mg
Harnstoff gebildet wird und nicht mehr, wie sehr auch die Zeit der
Entwicklung für Aspergillus niger verlängert wurde und wie sehr auch
die Bedingungen der Kultur verbessert wurden.
Ich stellte Versuche mit anderen Pilzen an, und nach langdauerndem
Kultivieren auf gewöhnlicher Salzlösung mit 3g Pepton kam ich zu
dem gleichen Resultat:
40tägige Kultur Penicillium multiflorum gab 36,8 mg Harnstoff
20 ,, » Thieghemella orchidis ve, DL es
35 y S ep ba „ 57,9 „ a
Indessen belief sich die Menge des ammoniakalischen Stickstoffs
in der Portion im letzten Versuch bis auf 397,6 mg. Somit betrug die
Menge des gebildeten Harnstoffs auf 3g Pepton, d.h. auf 480 mg
Gesamtstickstoff, nicht über 57,9 mg.
432 N.N. Iwanoff:
In anderen Proben, in denen nicht 3g, sondern 5g und mehr
Pepton genommen worden waren, vermehrte sich dementsprechend
die Menge des Harnstoffs.
Alle diese Tatsachen führten zu dem Schlusse, daß hier der Harn-
stoff nicht aus Ammoniak und Kohlensäure synthetisiert wird, wie bei
Tieren und höheren Pilzen (Bovisten), sondern er entsteht durch Um-
wandlung von Zerfallsprodukten des Eiweißstoffs, vielleicht des
Arginins.
Die fermentative Umwandlung des Arginins wird gegenwärtig außer
Zweifel gestellt. Zum ersten Male war dieselbe von F. Kutscher!) bei der
Autolyse der Thymusdrüse konstatiert worden und darauf endgültig von
Kossel und Dakin?) bewiesen. Die Arginase — das Ferment, welches das
Arginin in Harnstoff und Ornithin spaltet - hatte K. Shiga?) im Hefesaft
aufgefunden, aber der Charakter der Spaltung wurde in seinen Versuchen noch
nicht aufgeklärt. Seit 1907 hatte A. R. Kiesel‘) (Moskau) umfassende
Untersuchungen über die Pflanzenarginase ausgeführt; nach seinen Ver-
suchen erwies sich, daß bei vielen Pflanzen, wie bei Lupinen, Weizen-
keimlingen, Trüffeln (Tuber mesentericum), Champignons, eine sehr
energische Arginase vorhanden ist. Nach den Angaben der Autoren, die
mit Arginase arbeiteten, traten aber als Zerfallsprodukt des Arginins außer
Omithin auch noch Ammoniak auf, da sich zur Arginasearbeit auch die
Ureasetätigkeit beigesellt.
Bei Aspergillus niger war der fermentative Zerfall des Arginins von
Jaloustre5) im Jahre 1908 festgestellt worden, aber die Zerfallsprodukte
waren nicht untersucht worden.
Da aber K. Shibata bei diesem Pilze schon im Jahre 1904 die Urease
aufgefunden hatte, die dann von Kiesel (el untersucht wurde, so
schien es zweifellos, daß bei der fermentativen Umwandlung des
Arginins bei Aspergillus niger Ammoniak aus Harnstoff erhalten werden
muß. In der vorigen Arbeit (l. c.) habe ich gezeigt, daß Pilze auf Pepton
und Gelatine ganz ohne Urease zu kultivieren sind, daher stieg mir der
Gedanke auf, die Harnstoffanhäufung im Lebensprozeß des Aspergillus
niger sei durch die Entstehung desselben aus Arginin zu erklären,
welch letzteres sich wegen der Abwesenheit von Urease nicht weiter
zersetzen konnte. Um den Beweis dafür zu erbringen, züchtete ich
den Pilz nicht auf Gelatine oder Pepton, die beide Arginin enthalten,
sondern auf einzelnen Aminosäuren. Indem ich Aspergillus niger
einzeln auf Alanin oder Asparagin wachsen ließ, konnte ich keine
Harnstoffbildung konstatieren. Das Pilzháutchen war jedoch sehr
1) F. Kuischer, Zeitschr. f. physiol. Chem. 84, 114, 1901.
2) Ebendaselbst 41, 321; 42, 181, 1904.
3) K. Shiga, ebendaselhst 42, 505, 1904.
4) A. R. Kiesel, Arginin und dessen Verwandlung in Pflanzen. Moskau
1916. Fbendaselbst 118, 247, 1922.
5) Jaloustre, Memoire presenté á la Faculté des sciences de Paris 1908.
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs. 433
schwach, deshalb wandte ich.mich zur Kultur auf einem Gemisch von
reinen Aminosäuren, das sehr gut entwickelte Mycelien lieferte. Die
zahlreichen Versuche zeigten ganz deutlich, daß Aspergillus niger in
einer Kultur auf Aminosäuren keinen Harnstoff hervorbrachte, nur
bei langdauernder Kultur zeigten sich geringe Mengen, die aber bei
der Autolyse des Pilzeiweißstoffs aus Arginin entstanden sein können,
wie aus dem Versuch 8 zu ersehen ist.
Versuch 8.
Nährsalzlösung, 0,1 g Saccharose urd ein Gemisch von Aminosäuren
(1g Alanin, 0,5g Leucin, 0,5g Asparaginsáure, (lg Tyrosin); 6- und
13tágige Kulturen von Aspergillus niger.
6 Tage | 13 Tage
Trockengewicht des Mycels in mg ....... 440 | 280
N des Mycels in mg... .......... o. 25,7 16,2
In der Kulturflüssigkeit:
Ammoniakal. Ninmg. ... 2.2 22220. 119,3 189,5
Harnstoff in mg... 2: 2 2 2 2 nee ne. 0 2,3
Bei wiederholtem Verruche:
Trokengewicht des Mycels in mg ...... 420 220
Gesamt-N des Mycels inmg..... ie 29,8 11,2
In Kulturflüssigkeit ammoniakal. N i in mg . er 157,1 ;
In Kulturflüssigkeit Harnstoff in mg ..... 0 2,0
Nach 6 Tagen wurde, trotz der guten Entwicklung des Pilz-
häutchens, keine Spur von Harnstoff!) in der Kulturflüssigkeit vor-
gefunden. Als aber die Kultur auf 13 Tage stehengelassen wurde, trat
im Mycel Autolyse ein, die Menge der Trockensubstanz sank von 440
auf 280 mg und die Stickstoffmenge im Mycel von 25,7 auf 16,2 mg.
In dieser Zeit begann der Zerfall des Eiweißstoffs, und aus dem Arginin
desselben konnte der Harnstoff in einer Menge von 2,0 bis 2,3 mg
entstehen, wie das in den vorigen Versuchen beobachtet wurde.
Im folgenden wird das noch verständlicher. Wenn aus 3g Pepton
bei einer Pilzkultur 57,9 mg Harnstoff erzielt wurden, so würde man, wenn
sich der Harnstoff nur aus Arginin bildete, bei der Berechnung finden, daß
diese Menge Harnstoff aus 168,0 mg Arginin entstehen konnte
(57,9 , =) Wenn aber 3g Pepton beim Zerfall 168,0 mg Arginin
lieferten, so enthält demnach das Wute-Pepton 5,6 Proz. Arginin. Nach
den Angaben von Levene und var Slyke?) sind aber in demselben nur
1,48 Proz. Arginin enthalten. Hieraus folgt, daß wir bei Anwendung von
Pulzkulturen durch die Bildung von Harnstoff als Abjallsprodukt imstande
1) Indessen wurden im Versuch 7 bei Entwicklung des Pilzes auf
Pepton, wo fast ein eben solches Trockengewicht des Mycels erhalten
worden war, 35,0 mg Harnstoff konstatiert.
2) Levene und van Slyke, diese Zeitschr. 18, 440, 1908.
434 N.N. Iwanoff:
sind, das Arginin im Eiweißstoff auf biologischem Wege genauer zu bestimmen,
als mit Hilfe chemischer Methoden.
Zum Beweise dieses Satzes stellte ich noch Versuche über die Ent-
wicklung des Pilzes auf Eiweißstoff an, welcher reich an Arginin ist,
nämlich auf Edestin aus Hanfsamen, das nach verschiedenen Angaben
von 11,2 bis 14,17 Proz. Arginin!) enthält. Anfangs fügte ich zur
Nährsalzlösung 3 g Edestin in Pulverform zu, nach stattgefundener
Sterilisation besáte ich mit Sporen von Aspergillus niger. Nach
11 Tagen erhielt ich:
Trockengewicht' Im Nährmedium
des Mycels || Harnstoff | Ammoniakal. N
mg en mg O A mg
1643 oun | 2050
Ein Teil des Edestins war aber unverändert im Niederschlag
geblieben, so daß es nicht gelungen war, die Menge des gesamten
Arginins im zugefügten Edestin zu bestimmen. Daher beschloß ich,
dem Pilze als Kohlenstoff- und Stickstoffnahrung die Produkte der
vollständigen Hydrolyse des Edestins darzureichen. Hierbei erhielt
ich eine größere Ausbeute an Harnstoff.
Versuch 9.
15 g Edestin wurden während 25 Stunden mit 300 ccm 30 proz. Schwefel-
säure gekocht; die Huminsubstanzen wurden abfiltriert, das Filtrat mit
Baryt neutralisiert, das entstandene Bariumsulfat abfiltriert, die Produkte
der Hydrolyse des Edestins auf dem Wasserbade eingedampft. Portionen
von Hydrolyseprodukten zu 20 ccm, welche 198,0 mg N enthielten, wurden
als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zur Entwicklung der Kultur von
Aspergillus niger in 100 ccm gewöhnlicher Nährsalzlösung bei 35° angewandt.
Nach 5-, 7- und 11tágiger Entwicklung wurden die Kulturprodukte unter-
sucht; in einem Falle wurden zur tägigen Kultur noch 20 ccm
Hydrolyseprodukte des Edestins (198,0 mg N) hinzugefügt und noch
4 Tage lang stehengelassen.
|| Trockengewicht N Ammoniakal N
Kultur | des Ey Be des Mycels Harnstoff im Filtrat
ER | mg l mg mg `
Fúnftágigo .'..... 383,9 25,4 124 4
Siebentägige. . . . . - 285,7 14,8 132,7
Elftágigo . ...... 283,5 12,4 134,1
Siebentägige Zugabe v..
198,0 mg N-Edestin- |
hydrolysats und noch
viertägiges Steher.-
lassen . . 2 ..... 670,0 37,1 273,9
1) Kossel und Patten, Zeitschr. f. physiol. Chem. 88, 39, 1903.
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs. 435
Bei der Wahl eines Eiweißstoffes, der viel reicher an Edestin ist
als das Witie-Pepton, wurde entsprechend mehr Harnstoff erhalten:
auf 198,0mg N... .. . 59,6 mg Harnstoff
auf 396,0 , N...... 116,6 ,, D
nach Berechnung auf 480,0 „ Edestin-N . . 141,0 „ š
im Wute-Popton auf 480,0 „p N...... 57,9 „ Ge
Somit hängt die Menge des Harnstoffs in der Kultur davon ab,
wieviel Arginin im Eiweißstoff enthalten ist, der dem Pilze zur Nahrung
verabreicht wird. Im folgenden Ansatz wurde der Versuch gemacht,
einen Vergleich zwischen der zu erwartenden und der erhaltenen Harn-
stoffmenge bei Entwicklung des Pilzes auf Edestinhydrolyseprodukten
anzustellen.
Versuch 10.
15 g Edestin wurden einer Hydrolyse während 24 Stunden mit 200 ccm
Salzsäure unterworfen; der Niederschlag von Huminsubstanzen wurde
abfiltriert, das Filtrat verdampft und der größte Teil des Chlorwasserstoffs
im Vakuumexsikkator über Natronkalk entfernt; der Rest wurde in Wasser
gelöst und einzelne Portionen desselben zur Entwicklung des Pilzes ver-
wendet. Nährsalzlösung; zu den Kulturen wurden 10 ccm Edestinhydrolyse-
produkte (mit 188,0 mg N) hinzugefügt, zu anderen 30 ccm (mit 564,0 mg N).
Kultur von Aspergillus niger bei 35°.
Nach 10 Tagen.
Nach Bes
Kultur
Zehntágige mit IO eem
Edestinhydrolysat . . 270,0 10,2 143,5 48,1 49,1
Zehntägige mit 30ccm
Edestinhydrolysat . . || 1050,0 60,4 325,9 145,0 147,3
Fünftägige mit 30ccm
Edestinhydrolysat,
dann noch 20 ccm des-
selben Hydrolysats
(376,0 mg N) steril zu-
gefügt und noch 5 Tage
stehengelassen . . . . || 1080,0 57,7 716,7 242,0 245,4
Im dritten Ansatz wurden bei der Pilzkultur 242,0 mg Harnstoff
erhalten; der Vergleich der beiden letzten vertikalen Kolonnen zeigt,
daß die Menge des erhaltenen Harnstoffs mit derjenigen des aus Edestin-
arginin berechneten fast übereinstimmt!). Diese Zahlen weisen be-
stimmt auf die Entstehung des Harnstoffs aus Arginin hin.
1) Es wurde berechnet unter der Annahme, daß Edestin 14,17 Proz.
Arginin enthält. Die Berechnung kann keine große Genauigkeit beanspruchen,
da aus den Hydrolyseprodukten, die zur Nahrung verwendet waren, die
Huminsubstanzen entfernt sind.
436 N. N. Iwanoff:
Im weiteren führte ich in die Kultur des Aspergillus niger Arginin
in Form von Salz ein. Ich erhielt 5 g Argininnitrat von Prof. C. Neuberg
und etwas Argininpikrat von Prof. A. R. Kiesel (Moskau); den ge-
nannten Professoren spreche ich meinen tiefsten Dank aus.
Einige Male setzte ich das Argininsalz zu Beginn des Versuchs
hinzu, so daß der Pilz einen Teil des Arginins für den Aufbau seines
Eiweißstoffs benutzen konnte; in anderen Fällen reichte ich das Arginin
steril dar, zu einer Zeit, als sich das Pilzmycel bereits gebildet hatte.
Hierbei ging das Arginin quantitativ in Harnstoff über. In Versuch 11
benutzte ich Arginin, das aus dem Pikrat abgeschieden und in Sulfat
übergeführt worden war; hier bestimmte ich in einer einzelnen Probe
den Stickstoff des Arginins und berechnete, wieviel Harnstoff aus dem-
selben entstehen könnte.
Versuch 11.
Nährlösungsalze, 0,1 g Saccharose und ein Gemisch von Aminosäuren
(1,0 g Alanin, 0,5g Glykokoll, 0,2 g Leucin, 0,1g Tyrosin). 1. bis 2. die
entsprechende Lösung. 3. Die entsprechende Lösung + 10 ccm Arginin-
lösung (mit 37,10 mg N). Kultur von Aspergillus niger.
Nach 5 Tagen bei 35° hat sich erwiesen:
en hb Ohne > Arginin| 2. Mit Arginin
———— M nn MMM “mu
Trockengewicht des Mycels in mg ..... | 320 370
Harnstoff in der Kulturflüssigkeit in mg . . || 0 33,55
Aus zugefügtem Arginin wurden erhalten 33,55mg Harnstoff, nach
Berechnung waren zu erhalten 39,73 mg Harnstoff.
Nach fünftägigem Kultivieren auf Aminosäurelösung ohne Arginin
(zweite Portion), wurden steril hinzugefügt 10 ccm Argininlósung (mit
74,2 mg N). Nach 3 Tagen erwies sich in der Kultur: Trockengewicht
des Mycels 340 mg; in der Kulturflüssigkeit: Ammoniakalischer N
238,6 mg, Harnstoff 78,42 mg.
Aus dem zugefügten Argininstickstoff müßten 79,46 mg Harnstoff
entstehen, es wurden 78,42 mg erhalten. Die nahe Übereinstimmung
der zu erwartenden Menge Harnstoff aus Arginin mit der tatsächlich
erhaltenen spricht für die Möglichkeit, auf diesem Wege die Menge
des Arginins im Nährsubstrat zu bestimmen. Der auf Eiweißstoffen
oder auf Aminosäuren kultivierte Aspergillus niger enthält reichlich
Arginase und ist völlig der Urease beraubt, welche sich als ein Abfalls-
produkt anhäuft und als Maß der Argininzersetzung dienen kann.
In dieser Hinsicht scheinen sich die Pilze von einigen Bakterien zu
unterscheiden. So hat T. Takahata!) gefunden, daß ein Zusatz von Leucin
1) T. Takahata, diese Zeitschr. 140, 166, 1923.
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs. 437
zur Kultur von Bakterien die Bildung der Urease bei den Proteusbakterien
bedeutend verstärkt, aber offenbar spielen hier die Aminosäuren die Rolle
eines Puffers zur Bildung geeigneterer Verhältnisse bei der Ureasebildung.
Da ich die Umwandlung des Arginins bei der Entwicklung des
Aspergillus niger beobachten wollte, stellte ich einen Versuch an, bei
dem dieser Pilz als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle nur Arginin in
Form von Nitrat erhielt.
Versuch 12.
Nährsalzlösung 50 ccm und als C- und N-Quelle je 10 ccm Arginin-
nitratlösung zugefügt, welche 0,1881 g Argininbase enthielt. Kulturen von
Aspergillus niger, 10 und 14 Tage.
Menge Menge
Trockengewicht| N im | Ammoniak. Summe des N—N Ha:
eg des Mycels N im Filtrat| Harnstoff amo a d
| mg mg mg mg
10 | 619 2.02 | 2947 | 5836 | 272 58,73
l4 | 406 156 | 2991 | 5904 | 2756 59,03
Es war zu erhalten Harnstoff-N 30,26 mg.
Es wurde erhalten Harnstoff-N 27,56 mg.
Von Interesse ist, daß die Gesamtmenge des Argininstickstoffs 60, 52
fast übereinstimmt mit der Summe des Stickstoffs 59,03, die durch‘
Addition des Ammoniak-Mycel- undedes Harnstoffstickstoffs erhalten wird.
Bei der Wiederholung des Versuchs, bei dem 0,3123 g Argininbase
zugefügt worden waren, wurden erhalten:
10 || 692 | 203 | 4806 | 99,96 | 46,66 | 96,78
Aus 0,3123 g Arginin konnte erhalten werden: Harnstoffstickstoff
50,25 mg, gefundener Harnstoffstickstoff 46,66 mg.
Man erhält das Bild einer fast vollständigen Umwandlung des
Argininstickstoffs in zwei gleiche Teile: in Ammoniak- und in Harnstoff-
stickstoff, und nur ein geringer Teil der Gesamtsumme, 2,03 mg, ging
in den Bestand des Mycels über.
In den folgenden Versuchen entwickelte sich Aspergillus niger auf
Aminosäuren, darauf wurde Arginin zur Kultur hinzugefügt.
Versuch 13.
Nährsalzlösung 50 ccm und Gemisch von Aminosäuren (lg Alanin,
0,1 g Tyrosin, 0,1 g Leucin, 0,1 g Glykokoll). Kultur von Aspergillus niger
bei 35°. Nach fünftägiger Entwicklung wurden zur ersten (Kontroll-)
Portion 10 ccm Wasser hinzugefügt, zur zweiten 10 ccm Argininnitratlösung
mit einem Gehalt von 0,1881 g Argininbase, zur dritten 10 ccm einer Lösung,
welche zweimal soviel Arginin, d. h. 0,3762 g enthielt. Nach dieser Zugabe
standen die Portionen noch 5 Tage.
Im Resultat ergab sich zehntägige Kultur:
Biochemische Zeitschrift Band 162. 29
438 N.N. Iwanoff:
| Trockengewicht| N Ammoniakal. N a
Portion des Mi cele des Mycels im Filtrat Harnstoff
ee mg me mg mg
1. Kontrolle . ..... ı ug 6,41 119,3 0,85
2. 0,1881 g Arginin. . . 148 9,53 155,8 59,90
3. 0,3762 g Arginin. . . 152 11,04 201,6 121,96
Resultate:
| Es wurde erhalten Es war zu erwarten nach
| Harnstoff Berechnung aus Arginin
2, 0,1881 g Arginin Far | 28,0 30,26
3. 0,3762g Arginin . . .| 56,96 60,52
In einem anderen Versuch wurden bei sonst gleichen Bedingungen
10 cem Argininnitratlösung zugefügt, welche 0,2125g Argininbase
enthielt.
EE
Trockengewicht N Ammoniakal. N |
des Mycels | des Mycels | im Filtrat Harnstoff
Portion
Kontrolle ....... | 136 8,11 107,6 Spuren
Arginin ........ 8,52 141,3 67,98
Nach Berechnung war zu erwarten, Harnstoff-N 34,24 mg, es
wurde erhalten 31,73 mg.
In den Versuchen 12 und 13 wurde das Arginin unter Ausscheidung
von fast der theoretischen Menge Harnstoff gespalten.
Besondere Aufmerksamkeit verdient die Tatsache, daß die an
Arginin gebundene Salpetersäure unverändert bleibt und unter den
obwaltenden Versuchsbedingungen nicht zu Ammoniak reduziert wird.
Unlängst hat S. Hino*) verschiedene Bakterien auf Arginin mit
Mineralsalzen kultiviert und gefunden, daß einige derselben, wie z. B. Bac.
pyocyaneus und Bac. fluorescens, sich bei Gegenwart von Arginase und
Urease entwickelten, andere aber, wie Bac. coli, wahrscheinlich keine
Urease hervorbrachten, da in der Kulturflüssigkeit kein Ammoniak ge-
bildet wurde. Es erwies sich, daß man nach Abtötung der Bakterien die
Tätigkeit der Urease und Arginase weiter verfolgen kann. Also liegen bei
den Bakterien kompliziertere Verhältnisse als bei den Pilzen vor. Die
Versuche von Hino müssen, was die quantitative Bestimmung anbelangt,
wiederholt werden; vielleicht gelingt es auch, mit einigen Bakterien dieselben
Beziehungen hervorzurufen. Das Kultivieren der Pilze ohne Urease gibt
die Möglichkeit, sie zur Bestimmung der Argininmenge im Eiweißstoff
oder in den Zerfallsprodukten des letzteren zu benutzen.
1) Saburo Hino, Zeitschr. f. physiol. Chem. 188, 100, 1924.
Ursprung des von Schimmelpilzen ausgeschiedenen Harnstoffs. 439
A. Kossel und R. Eberhard Gross!) haben soeben ein Verfahren der
quantitativen Bestimmung des Arginins in Eiweißstoffen veröffentlicht:
das Arginin wird an Flaviansäure gebunden und in Form einer unlöslichen
Verbindung ausgeschieden. Diese Methode erwies sich genauer als die früher
von Kossel vorgeschlagene Fällung des Arginins als Silbersalz in Gegenwart
von Ätzbaryt.
Ich glaube, daß man in Fällen, wo das Arginin in sehr kleinen
Mengen (0,5 bis Loi Eiweißstoff oder in dessen Zerfallsprodukten
zu bestimmen ist, zu dem von mir eben beschriebenen Verfahren greifen
kann. In der nächsten Abhandlung beschreibe ich die quantitative
Bestimmung des Arginins in 0,4g Eiweißstoff, der aus dem Proto-
plasma des Myxomyceten Aethalium septicum erhalten wurde.
Aus 400 mg Eiweißstoff wurde erhalten Harnstoff 16,88 mg,
was nach Berechnung aus 48,98 mg Arginin ausgeschieden werden
konnte, d.h. der Eiweißstoff des Myxomyceten enthält 12,24 Proz.
Arginin auf Trockengewicht.
Weiter will ich die Argininmenge in anderen Eiweißstoffen unter
Benutzung von Kulturen ureasefreier Pilze bestimmen.
Natürlich könnte man statt lebender Pilze auch die Spaltung des
Arginins durch gepulvertes Mycel vornehmen, aber die Tätigkeit der
Fermente in getöteten Pilzen erscheint bedeutend geschwächter als
in lebenden, und deswegen kann man nicht darauf rechnen, daß die
Reaktion des Argininzerfalls so glatt verlaufen wird, wie mit dem
lebenden Pilze.
Die angeführten Daten zeigen, daß die Pilze in künstlicher Kultur
Harnstoff aus dem zum Náhrmedium zugefügten Arginin bilden.
In dieser Hinsicht müssen sie den höheren Pilzen, Bovisten und Cham-
pignons, gegenübergestellt werden, bei denen der Harnstoff synthetisch
aus den Zerfallsprodukten gebildet wird und bei denen die Menge des
Harnstoffstickstoffs nach meinen Ergebnissen die Hälfte des Gesamt-
stickstoffs des Pilzes erreicht. Der Harnstoff bei Aspergillus niger
erscheint als Abfallsprodukt, da der Pilz unter den vorliegenden Ver-
suchsbedingungen völlig frei von Urease ist. Das Einführen so wert-
voller Kohlenstoffquellen wie Zuckerarten, Mannit und Glycerin in die
Kultur, ruft die Bildung der Urease hervor, unter deren Einwirkung
der Harnstoff zersetzt und vom Pilze utilisiert wird. Obgleich der
Ursprung des Harnstoffs bei höheren Pilzen, bei Aspergillus niger und
einigen anderen Vertretern, verschieden ist, so entsteht derselbe doch
unter gleichen Bedingungen des Pilzwachstums, nämlich, wenn die
Urease verschwindet und die Quelle der Kohlenstoffnahrung in Form
von Zucker, Mannit und dergleichen versiegt.
1) A. Kossel und R. Eberhard Gross, Zeitschr. f. physiol. Chem. 185,
167, 1925. |
29 *
440 N. N. Iwanoff: Ursprung d. v. Schimmelpilzen ausgeschied. Harnstoffs.
Das Verschwinden der Urease in Pilzen deutet auf die Möglichkeit
der Harnstoffbildung in Pilzen hin, worauf schon längst A. R. Kiesel
(l.c.) hingewiesen hat. Weiterhin muß man die Bedeutung der Urease-
bildung in grünen Pflanzen, besonders in solchen, welche große Vor-
räte von Eiweißstoff besitzen, wie Lupinen, aufklären. Läßt man die-
selben im Dunkeln aufwachsen, so kann man das Verschwinden der
Kohlenhydrate erzielen; unter solchen Bedingungen kann man in den-
selben eine Harnstoffanhäufung untersuchen. Einige vergleichende
Versuche A. R. Kiesels (mit Sonnenblumen) zeigen, daß ätiolierte
Keimlinge bedeutend kleinere Mengen Urease enthalten als die grünen.
Weitere Untersuchungen sind nötig, welche die Rolle der Urease
und des in einigen Fällen durch Fosse bei grünen Pflanzen entdeckten
Harnstoffs erklären würden.
Schlußfoigerungen.
1. Pilze, die in reiner Kultur gezüchtet werden und nicht auf
einem Substrat, das Eiweißstoffe oder deren Zerfallsprodukte enthält,
bilden Harnstoff, dessen Menge in einzelnen Versuchen bis zu 242,0 mg
beträgt.
2. Der Harnstoff entsteht unter den angewandten Bedingungen
aus dem Arginin, das sich unter den Zerfallsprodukten von Eiweiß-
stoffen befindet. Auf reinen Monoaminosäuren bildet der Pilz keinen
Harnstoff.
3. Bei der Entwicklung des Aspergillus niger auf Arginin als
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle geht die eine Hälfte des Stickstoffs
in Harnstoff, die andere in Ammoniak über.
4. Eine derartige ureasefreie Kultur des Pilzes kann zur Be-
stimmung des Arginins im Eiweißstoff oder in dessen Zerfallsprodukte
benutzt werden, da der aus dem Arginin vollkommen abgespaltene
Harnstoff quantitativ nach Fosse bestimmt werden kann.
Über den Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten.
Von
Nicolaus N. Iwanoff.
[Aus dem pflanzenphysiologischen Institut der Universität zu Petersburg-
(Leningrad).
(Eingegangen am 16. Juli 1925.)
Vor 45 Jahren hat J. Reinke!) in seinen klassischen Unter-
suchungen den kühnen Versuch unternommen, eines der interessantesten
Probleme der Biochemie zu lösen, nämlich die chemische Zusammen-
setzung des Protoplasmas zu ermitteln. Da es fast unmöglich ist, aus
den Zellen höherer Pflanzen genügende Mengen von Protoplasma aus-
zuscheiden, weil dieses durch die Zellwände dauerhaft geschützt ist, so
wandte sich Reinke der chemischen Untersuchung der Schleimpilze,
der Myxomyceten zu, die man damals wegen des Fehlens der Zell-
wände als aus reinem Protoplasma bestehend ansah. Zurzeit wissen
wir, daß sich in den Plasmodien der Myxomyceten Zellkerne mit einem
eigenartigen Protoplasma befinden; diese Tatsache darf man bei der
Wertung der Reinkeschen Resultate nicht überseben. Die Analysen
der nackten Zellen von elementaren Organismen sind von äußerster
Wichtigkeit, weil der größte Teil ihres Körpers aus Protoplasma besteht.
In dieser Beziehung stellen sie für Untersuchungen ein geeigneteres
Material dar als z. B. Tiere, die hochdifferenzierte Zellen und Gewebe
besitzen. Selbstverständlich mußte man bei der Erforschung von
Myxomyceten danach trachten, bestimmte chemische Verbindungen
zu isolieren und nicht den gesamten Organismus einer summarischen
Analyse zu unterwerfen. Über diese Frage äußert sich Reinke folgender-
maßen (l.c., S. 15): , Eine Elementaranalyse des Protoplasmas von
Aethalium septicum kann an und für sich keinen größeren Wert be-
anspruchen, als wenn man den ganzen Körper eines höheren Tieres,
z. B. einer Maus oder eines Frosches, trocknen, pulverisieren und durch
Verbrennung analysieren wollte.“ Die Arbeitsweise Reinkes zielte
1) J. Reinke, Studium über das Protoplasma I bis III. Unters. aus d.
bot. Lab. der Universität Göttingen 1881. Einleitung in die theoretische
Biologie. Berlin 1901.
442 N.N. Iwanoff:
darauf ab, aus den Myxomyceten spezifische Substanzen zu gewinnen.
Die meisten der von Reinke erhaltenen Stoffe sind in jeder Pflanzenzelle
aufzufinden, daher erscheinen diese nicht als eigentlich charakteristisch
für das Protoplasma als solches; dagegen zeigt sich der Grundstoff
der Myxomyceten — das Plastin — allem Anschein nach als Kern-
substanz des Protoplasmas. Plastin nannte Reinke den Grundstoff
der Myxomyceten nach Behandlung desselben mit Wasser, Alkohol,
10 proz. NaCl, 0,2 proz. KOH und 0,2 proz. HCl. Nach Ansicht
dieses Forschers, schließt sich das Plastin den Nucleinen an, oder es
besteht aus Eiweißstoffen, die mit organischen Phosphorverbindungen
verbunden sind.
O. Loew!) wiederholte Reinkes Untersuchungen über das Plastin und
stellte dabei fest, daß seine Angaben noch nicht ausreichten, um diese
Substanz „als einheitlichen Körper zu charakterisieren'“. Reinke fand im
Plastin 12 Proz. Stickstoff, 53,49 Proz. C, 7,22 Proz. H und 2,15 Proz. P.
Die Stickstoffmenge beträgt 3,5 bis 4 Proz. weniger als bei anderen Eiweiß-
stoffarten, und dieser Umstand führte Loew zu der Annahme, das Plastin
von Reinke stelle einen stark verunreinigten Eiweißstoff dar. Loew fand
in Myxomyceten ein in Wasser unlösliches, aber in Salzsäure lösliches
Kohlenhydrat auf, das von Reinke nicht festgestellt worden war; auf Grund
der Anwesenheit dieses Kohlenhydrates erklärt Loew die geringe Menge
Stickstoff, die im Plastin enthalten ist.
Die Bezeichnung ,,Plastin*“ ist allgemein angewandt worden; viele
Autoren, unter diesen auch Zacharias?), bedienen sich dieses Ausdruckes,
aber die chemische Natur des Stoffes ist bisher unaufgeklärt geblieben.
Die wichtigste Frage, ob das Protoplasma etliche Eiweißstoffe enthält,
blieb bisher ohne eine bestimmte Antwort. Natürlich besitzt das Proto-
plasma unter normalen Ernährungsbedingungen Vorratseiweißstoffe, aber
im Hungerzustand verbraucht die Zelle den gesamten Vorrat und in ihr
verbleibt nur das Skelett des Plastins, das keine Reaktionen auf Eiweiß-
stoff aufweist. Reinke (l.c., S. 10) hat ein derartiges eiweißstoffloses
Stadium des Protoplasmas an Algen beobachtet. Eine dem Bache
entnommene Vaucheria wurde zerteilt, abgepreßt und eine Prüfung auf
Eiweißstoff angestellt; das Ergebnis war, daß es durch keine Reaktionen
gelungen war, das Vorhandensein von Eiweißstoff nachzuweisen. Ebenso
extrahierten die gebräuchlichen Lösungsmittel keine Spur von Eiweiß-
stoffen aus dem abgepreßten Reste. Loew?) konnte in den Algen Spirogyra
keine Biuretreaktion wahrnehmen; diese Reaktion trat erst nach Verweilen
des genannten Objektes in verdünnter Lauge auf. Der verborgene Eiweiß-
stoffcharakter des Protoplasmas ist wiederholt auch an tierischen Objekten
bemerkt worden; so hat Sosnowsky*) bei Paramaecium überhaupt keine
echten Eiweißstoffe aufgefunden. Vor verhältnismäßig kurzer Zeit ist
H. Walter?) an die Aufklärung der chemischen Natur des Plastins heran-
1) O. Loew, Bot.-Ztg. 1884, S. 113.
2) Zacharias, ebendaselbst 1887, S. 281; Prog. rei. bot. 3, 67, 1910,
3) Loew, Bot.-Ztg. 1884, S. 273.
4) Sosnowsky, Centralbl. f. Physiol. 13, 1899.
$) Heinrich Walter, diese Zeitschr. 122, 86, 1921.
Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten. 443
getreten, indem er die Methode der Verdauung desselben durch Trypsin
und Pepsin benutzte. Der Autor beobachtete die Auflösung des ge-
waschenen Plastins durch Trypsin in Gegenwart von 0,5 Proz. Na,CO,
und nimmt daher an, daß in seinen Versuchen eine vollständige Trypsin-
verdauung stattfand, und daß dieser Umstand auf die Eiweißstoffnatur
desselben hinweist. Auf Grund der Beobachtungen der Plasmaauflösung
durch Trypsin bei höheren Pflanzen vertritt der Autor die Ansicht —
nach meiner Meinung ohne genügende Begründung —, daß deren Plasma
„eine ähnliche chemische Konstitution‘ besitze wie das Plastin.
In letzter Zeit hat W. W.Lepeschkin!) Untersuchungen über die
chemische Zusammensetzung des Protoplasmas der Plasmodien ausgeführt,
aber die von ihm erzielten Ergebnisse unterscheiden sich nur wenig von den
Resultaten Reinkes. Die von ihm angewandten Methoden können vom
Standpunkte der gegenwärtigen Biochemie angefochten werden, außerdem
aber findet man in der Arbeit fast gar keine Angaben über Konstanten der
von ihm ausgeschiedenen Substanzen vor. Das Plastin von Reinke rechnet
er zu den Nucleoproteiden. |
Die Daten der klassischen Arbeiten von Reinke bedürfen in einigen
Fällen einer Ergänzung und Durchsicht; insbesondere betrifft das die
Eiweißstoffe, die der Autor Myosin und Vitelin nennt und für die er
keine Analysen anführt, so daß ihre Natur undefiniert bleibt. In einigen
Fällen (l. c.) bestimmt Reinke die ‚„peptonoide Substanz“ nur auf
Grund dessen, daß ‚‚dieselbe in Geruch und Geschmack teils an Fleisch-
extrakt, teils an frische Brotrinde erinnert“.
Obwohl die Untersuchung des Protoplasmas der Myxomyceten
verlockend schien, ist diese Frage wenig beachtet worden in Anbetracht
der verhältnismäßigen Schwierigkeit, große Mengen Versuchsmaterial
darzustellen. Schon längst habe ich mich für die Untersuchung der
Natur der Pilzeiweißstoffe?) interessiert. Gegenwärtig im Besitz von
800 g trockenen Materials von einigen Vertretern der Myxomyceten
stellte ich mir die Aufgabe, aus den Myxomyceten Eiweißstoffe dar-
zustellen und die Bestimmung ihrer Natur vorzunehmen.
Das Untersuchungsmaterial.
1. Den Myxomycetes Reticularia Lycoperdon habe ich auf einem
Birkenholzlager in reifem Zustande in einer Menge von 400 g Trockengewicht
gesammelt. Aus den Fruchtkörpern, die eine Größe von 5 bis 7cm im
Durchschnitt erreichen, wurden die braun gefärbten Sporen ausgeschüttelt
und zur Analyse verwendet.
2. Brefeldia maxima, im Stadium des Plasmodiums, wurde von der
Rinde abgenommen und in Alkohol gebracht. Das Material war mir von
Prof. A. A. Jaczewsky verschafft worden. .
3. Die Plasmodien von Aethalium septicum wurden im Stadium der
Schmandkonsistenz in einer Menge von 2024,0 g von einem Baumstumpf
1) W. W. Lepeschkin, Ber. d. deutsch. bot. Ges. 41, 179, 1923.
2) N. N. Iwanoff, Bull. de . Acad. des Sciences de Russie 1918, S. 397;
diese Zeitschrift 187, 331, 1923.
444 N. N. Iwanoff :
abgenommen und mit 24 Liter Äthylalkohol behandelt; darauf wurde der
Alkohol abfiltriert, das Material getrocknet und im Mörser zerrieben. Das
Gewicht betrug 407,0g. Das Plasmodium war von Prof. A. A. Richter in
Perm gesammelt worden. Den genannten Professoren spreche ich für die
Überlassung dieses sehr wertvollen Materials meinen wärmsten Dank aus.
Die vorbereitende Behandlung des Materials.
Das an der Luft getrocknete Material von Reticularia Lycoperdon
und ebenso die nach dem Aufbewahren in Alkohol getrockneten
Brefeldia maxima und Aethalium septicum wurden zuerst mit Äther
im Soxhletschen Apparat, darauf mit Alkohol, heißem Wasser, 0,5 bis
1 Proz. Salzsäure!) extrahiert, sodann wieder mit Wasser, Alkohol und
Äther und bei 105 bis 110% C getrocknet. Dieser ausgewaschene Rück-
stand der Myxomyceten entsprach gewissermaßen dem Plastin von
Reinke; bei den verschiedenen Myxomyceten variierte jedoch die
Menge des Stickstoffs.
So waren in den gewaschenen Sporen von Reticularia Lycoperdon
8,58 Proz. N (0,4513 g Trockensubstanz gaben 38,71mg N) enthalten,
in den Plasmodien von Aethalium septicum 10,0 Proz. N (0,2375 g gaben
23,72 mg N), in den Plasmodien von Brefeldia maxima 1. 10,72 Proz. N
(0,2604 g gaben 27,89 mg N), 2. 12,74 Proz. N (anderer Stamm) (0,1034 g
gaben 13,17 mg N).
Somit wies der Stickstoffgehalt des Materials starke Schwan-
kungen auf und unterschied sich von Reinkes Plastin, das gegen
12,0 Proz. N enthielt.
Die Menge Phosphor stimmte auch nicht mit der von Reinke auf-
gefundenen überein.
Das Material, das 10,72 Proz. N (Brefeldia maxima) enthielt, wies
1,34 Proz. P (0,5518g gaben 7,38 mg P) auf, und dasjenige mit 10,0 Proz. N
(Aethalium septicum) wies 0,357 Proz. P (0,50 g gaben 1,70 mg P) auf,
in anderen Fällen war der Phosphorgehalt geringer. Vielleicht sind die
für N und P von Reinke angegebenen Zahlen nur für eine Untersuchung
des Autors gültig; in anderen Fällen kann der Phosphor- und Stickstoff-
gehalt im Plastin, wie aus meinen Daten zu ersehen ist, stark variieren.
Darstellung und Reinigung des Eiweißstoffes.
Mit den gebräuchlichen Lösungsmitteln war es nicht gelungen,
die Eiweißstoffe aus dem Plastin zu extrahieren, daher wurde versucht,
sie mit Hilfe von Säuren zu erhalten, eine Methode, die ich bei der
Darstellung der Eiweißstoffe aus Pilzen angewandt habe. In einigen
1) In einem Falle, wie es z.B. bei Aethalium septicum stattfand,
wurde das Waschen mit Salzsäure vor der Auflösung des gesamten CaCO,
ausgeführt.
Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten. 445
Fällen wurde die Extraktion des Eiweißstoffes nach Winterstein!) aus-
geführt; das Material wurde auf dem Wasserbad während 10 bis
15 Minuten mit 24 proz. Salzsäure behandelt, der Extrakt filtriert,
mit Wasser verdünnt und mit Phosphorwolframsäure gefällt, woraus
der Eiweißstoff sodann durch Zersetzung des Niederschlags mit Ätz-
baryt erhalten wurde. In anderen Versuchen bediente ich mich der
Extraktion mit l0proz. Schwefelsäure während 2 Stunden auf dem
Wasserbade, und endlich behandelte ich einige Male das Plastin mit
der zehnfachen Menge 70proz. Schwefelsäure bei einer Temperatur
von 30°C im Verlauf von 2 x 24 Stunden; der Eiweißstoff wurde hier
nach dem Verdünnen mit Wasser ebenfalls mit Phosphorwolfram-
säure gefällt.
In geringen Mengen wurde der Eiweißstoff aus den Sporen der
Myxomyceten erhalten; das Material wurde auf dem Wasserbade mit
24proz. Salzsäure 10 bis 15 Minuten lang erwärmt.
Aus 17,8g Sporen Reticularia Lycoperdon 1,35g Eiweißstoff
= 7,59 Proz.
Aus 115g Sporen Reticularia Lycoperdon 8,02g Eiweißstoff
7,0 Proz.
Aus 6g Sporen Aethalium septicum 0,49 g Eiweißstoff = 8,2 Proz.
Aus dem Plastin der Plasmodien wurde mehr Eiweißstoff erhalten:
5,6 g Plastin Reticularia Lycoperdon 0,91 g Eiweißstoff = 16,25 Proz.
5,5 g m Brefeldia maxima 0,81 g = = 14,79 „
Aus dem Plastin der Plasmodien von Aethalium septicum:
a) nach 10 bis 15 Minuten langem Erwármen mit 24proz. Salzsäure:
l. aus 4g Plastin 0,44 g Eiweißstoff, d.i. 11,0 Proz.
2. „ 1g „ Lilög e d.i. 115 ,,
3. „ 20g ve 2,10 g ge d.i. 10,5 ,
b) nach zweistündigem Erwärmen auf dem Wasserbade mit 10proz.
Schwefelsäure:
l. aus 10g Plastin 1,1g Eiweißstoff, d.i. 11,0 Proz.
2. „ 20g „ 2lg e d.i.10,5 „
c) nach teilweiser Hydrolyse mit 70proz. Schwefelsäure im Verlaufe
von 2 Tagen bei 30°C:
l. aus 10g Plastin 0,8g Eiweißstoff, d.i. 8 Proz.
2. „ 10g SN 0,98 2 d.1.9 „
Die Ausbeute an Eiweißstoff war verhältnismäßig gleich groß in
den ersten zwei Fällen, sie schwankte zwischen 10,5 bis 11,5 Proz.,
nur die partielle Hydrolyse mit 70proz. Schwefelsäure hat die Aus-
beute bis auf 8 bis 9 Proz. verringert.
Auf diesem Wege ist es gelungen, aus dem Plastin mittels Säure-
hydrolyse 8,0 bis 16,25 Proz. Eiweißstoff zu erzielen. Selbstverständlich
1) E. Winterstein, Zeitschr. f. physiol. Chem. 26, 438, 1898/1899.
E. Winterstein und Hofmann, Hofmeisters Beitr. 2, 404, 1902; Hofmann,
Über die chemischen Bestandteile einiger Pilze. Zürich 1901; Reuter, Zeitschr.
f. physiol. Chem. 78, 167, 1912; N. N. Iwanoff, Bull. de l’Acad. des Sciences
de Russie 1918, S. 397; diese Zeitschr. 187, 320, 1923.
446 N.N. Iwanoff:
erscheint das durch Säuren ausgeschiedene Produkt als veränderter
Eiweißstoff, und es wäre richtiger, denselben als Pepton zu bezeichnen.
Der ausgeschiedene Eiweißstoff wurde nach Entfernung des Bariums
wie auch der Schwefelsäure in einer geringen Menge Wasser gelöst
und in eine große Menge 95proz. Äthylalkohols eingegossen. Der un-
bedeutende Niederschlag wurde abfiltriert; in der alkoholischen Lösung
befand sich der gereinigte Eiweißstoff, der nach Entfernung des
Alkohols getrocknet und der Analyse unterworfen wurde.
Eigenschaften des aus dem Plastin dargestellten Eiweißstofles.
l. Leicht löslich in Wasser und in 80- bis 85proz. Äthylalkohol.
2. Gereinigt enthält derselbe 16,47 bis 16,77 Proz. N,
a) aus Reticularia Lycoperdon, 84,8 mg Substanz gaben
13,97 mg N, d.h. 16,47 Proz. N;
b) aus Aethalium septicum, 73,6 mg Substanz gaben 12,34 mg N,
d.h. 16,77 Proz. N.
3. Zeigt farbige Eiweißstoffreaktionen.
4. Wird durch Kupferoxydhydrat, Phosphorwolframsäure und
Bleiessig gefällt.
5. Nach völliger Säurehydrolyse (s. weiter unten) geht etwa die Hälfte
des Gesamtstickstoffes in den Phosphorsäureniederschlag über,
aus dem Arginin, Histidin und Lysin isoliert worden sind.
6. Ohne vorhergegangene Hydrolyse spaltet der Eiweißstoff nach
van Slyke 8,02 Proz. N ab; 0,2087 g enthielten im ganzen
24,37 mg N, gaben nach van Slyke N H,-N — 1,95 mg, d. h. auf
den Aminostickstoff kommen 8,02 Proz. des gesamten N.
Hydrolyse von 10 g Eiweißstoff aus Myxomycetes.
10 g Eiweißstoff wurden mit 300 ccm einer 25proz. Schwefelsäure
im Verlauf von 12 Stunden gekocht, mit Wasser verdünnt und ab-
filtriert; es wurden keine Huminsubstanzen erhalten.
In 10 ccm Lösung wurde mit Phosphorwolframsäure gefällt und
der Stickstoff bestimmt: N im Phosphorwolframsäureniederschlag
23,43 mg = 49,22 Proz., N im Phosphorwolframsäurefiltrat 24,38 mg
— 50,75 Proz., d.h. fast die Hälfte des Gesamtstickstoffes ist durch
Phosphorwolframsäure gefällt.
Eine einzelne Probe, die 14,12 mg Gesamt-N enthielt, gab nach
van Slyke 6,15 mg, d.h. 43,55 Proz. des Gesamt-N.
Die ganze Portion des Filtrats wurde mit Phosphorwolframsäure
gefällt; aus dem Niederschlage wurden die Basen ausgeschieden und nach
Kossel getrennt; es wurden erhalten:
Total-N Substanz
Evan. u wei u . +. . 181,44 mg oder 0,9465 g
AIDU e a a er 85,90 „ vn 0,2619 g
Histadin: ~s «ec cal % 45,25 » „ 0,1743g
Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten. 447
Diese Bestimmung kann nicht als quantitativ angesehen werden,
da das Ausgangsmaterial nur in geringer Menge vorhanden war.
Über die Kohlenhydratgruppe des Plastins.
Loew fand (ei in den Plasmodien von Aethalium ein in Wasser
unlósliches Kohlenhydrat, das nach seiner Meinung die Ursache des
niedrigen Stickstoffgehaltes im Plastin war. Bei der Darstellung von
Plastin aus verschiedenen Plasmodien konnte ich die Anwesenheit eines
Kohlenhydrats bestätigen, das nach dem Erwärmen mit schwacher Salz-
säure Fehlingsche Mischung gut reduziert. Die Menge dieses Kohlenhydrats
schwankt in den Plastinarten verschiedenen Ursprungs; manchmal war
es gar nicht vorhanden. So z.B. wies das Plastin aus Brefeldia maxima,
das 12,74 Proz. N enthielt, gar keine Mengen eines derartigen Kohlen-
hydrats auf. |
Bei der Untersuchung eines bestimmten Materials, in den
Plasmodien von Aethalium, konnte ich die Menge dieses Kohlenhydrats
auf verschiedene Weise genau bestimmen.
1. 20g Plastin wurden auf dem Wasserbade im Verlauf von
2 Stunden mit 300 ccm einer 10proz. Schwefelsäure erhitzt; im Filtrat
wurden nach Fehling 2,632 g Glukose, d.h. 13,16 Proz. auf Trocken-
gewicht gefunden.
2. Ebenso auf 10g; 1,228 g Glucose, d.h. 12,28 Proz.
3. 10g mit 100 ccm 70proz. H,SO, während 2 Tage bei 35°C;
nach Verdünnung mit Wasser wurde im Filtrat gefunden in einem
Falle 1,355 g, d. h. 13,55 Proz., im anderen Falle 1,375 g, d. h. 13,75 Proz.
4. 7g Plastin + 0,1g Takadiastase + 100 com Wasser + Toluol
wurden 2 Tage lang bei 35% C stehengelassen.
Im Filtrat wurden 790 mg Glucose, d.h. 11,9 Proz. gefunden.
Das Plastin war unverändert geblieben, aus 7g wurden nach Ein-
wirkung der Takadiastase 6,2g davon ausgeschieden: es waren im
Plastin N 10,0 Proz. (0,1678 g gaben 16,72 mg N) vorhanden, es waren
nachher im Plastin N 10,8 Proz. (0,1473 g gaben 15,84 mg N).
Folglich hat die Takadiastase die Kohlenhydratgruppe vollkommen
abgespalten, indem sie das Plastin fast unverändert ließ.
Zur Bestimmung der Natur des Zuckers wurde dieser aus 30 g
Plastin durch Säure abgespalten. In der Portion, die nach Berechnung
0,9 g Glucose enthielt, wurde eine Fällung mit Phenylhydrazin vor-
genommen: es resultierte 1 g Osazon, das nach dem Umkristallisieren
den Schmelzpunkt 205°C zeigte, der dem Osazon der Glucose ent-
spricht. Da aber das Glucosamin das gleiche Osazon liefert, so wurde
das Drehungsvermögen des erhaltenen Kohlenhydrats im Polarimeter
untersucht.
5g Plastin mit 40 ccm Wasser und 0,1l g Takadiastase wurden mit
Toluol auf 3 Tage bei 37° C stehengelassen, abfiltriert und im Polarimeter
sowie nach Bertrand untersucht: auf Glucose berechnet, wurden gefunden im
Polarimeter 547,6 mg, nach Bertrand 536,7 mg.
448 N. N. Iwanoff:
Wäre hier keine Glucose, sondern Glucosamin: zugegen gewesen,
so würde die polarimetrische Untersuchung nicht so genau mit der
Bestimmung nach Bertrand übereinstimmen.
Von Interresse ist, daß das nach Abspaltung des Kohlenhydrats
entstandene Plastin schon nicht mehr 10 Proz. N, sondern 10,99 Proz. N
enthielt, d.h. 0,2024 g ergaben 22,26 mg N.
Der Versuch, aus dem Plastin die Kohlenhydratgruppe mit Hilfe
des Magensafts vom Hunde oder durch Papayotin abzuspalten, führte
zu keinen positiven Resultaten.
Hieraus folgt, daß das Polysaccharid aus dem Plastin durch
Takadiastase leicht gespalten wird und Glucose bildet; außerdem bleibt
bei der Abtrennung dieses Kohlenhydrats der Grundstoff des Plastins
unverändert.
Über den Phosphorgehalt im Plastin.
Die von Reinke angegebene Zahl für den Phosphorgehalt im
Plastin, 1,88 Proz., ist nicht konstant. Manchmal muß das Material
andauernd mit Salzsäure gewaschen werden und am Ende sinkt die
Phosphormenge stark.
So enthielt das Material:
1. 10,72 Proz. N und 1,34 Proz. P (auf 0,5518g 7,38 mg P)
2. 10,00 „ N „ 0357 „ P(„ 0,50 g 1,786 „ P)
3. 1274 „ N „ 0,324 „ P (,, 0,4438g 1,437 „ P)
Nachdem das Präparat im Versuch 3 der Einwirkung der Taka-
diastase unterworfen worden war, hat sich die Phosphormenge in ihm nicht
verändert: es erwiesen sich auf 0,2730g Präparat 1,03 mg Phosphor,
d.h. 0,376 Proz.
Hieraus folgt, daß die Phosphormenge im Plastin starken Schwan-
kungen unterliegt. Nach Behandlung mit Säure oder Takadiastase
bleibt nur ein geringer Rest Phosphorsäure zurück (0,32 bis 0,37 Proz.).
Identifizierung des Protoplasmaeiweißstoffes der Myxomyceten mit den
Eiweißstoffen des edlen Steinpilzes und der Stáublinge.
Bei der Untersuchung des Eiweifstoffes aus dem Protoplasma
der Myxomyceten wird die Aufmerksamkeit unwillkürlich auf die
Ähnlichkeit desselben mit dem Eiweißstoffe anderer Pilze gelenkt.
Zunächst ist schon die Darstellung an und für sich ganz ungewöhnlich —
man muß die Einwirkung starker Säuren zu Hilfe nehmen —, den
Eiweißstoff von einer gewissen Verbindung, mit der er fest verbunden
ist, abzuspalten. Ich hatte den Eiweißstoff aus Lycoperdon piriforme?)
früher untersucht. Der dargestellte peptonartige Stoff ist in allen
seinen Eigenschaften völlig identisch mit dem Eiweißstoff aus Myxo-
myceten.
1) N. N. Iwanoff, diese Zeitschr. 187, 331, 1923.
Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten. 449
ii Eiweißstoff
. aus Myxomyceten aus Bovisten
Proz çć Pros çć
Gesamtstickstoffgehalt . . . . 2... . | 16, en ‚7 0471677 | 162-167 16, e 75
Stickstoff nach van Slyke (vord. Hydrolyse) 8,0
Stickstoff im Phosphorwolframnieder- |
schlage (nach der Hydrolyse) .... 50 51—58
Farbige Eiweißstoffreaktionen . . ... . | positiv positiv
Fällung durch Kupferoxydhydrat, Blei- |
essig, Phosphorwolframsäure . . . . . völlige völlige
Löslichkeit in Wasser und in 80— 85 proz.
Alkohol: u was se a e e leichte leichte
Außerdem wird aus dem Eiweißstoff der Myxomyceten sowie
auch der Boviste viel Arginin, Histidin und Lysin ausgeschieden. Aus
Myxomyceten dargestellten Eiweißstoff besaß ich wenig: im ganzen
hatte ich während der Arbeit nur 30 g hergestellt. Diese Substanz-
menge war ungenügend, um quantitative Trennungen von Amino- und
Diaminosäuren im gegebenen Eiweißstoff vorzunehmen und einen
Vergleich desselben mit anderen Eiweißstoffarten durchzuführen.
Aus diesem Grunde wandte ich mich zum Vergleich der Pilz-
eiweißstoffe zu einer genauen Bestimmung des Arginins in demselben
nach einer Methode, die ich in der vorhergehenden Abhandlung be-
schrieben habe. Diese Methode beruht darauf, daß der auf Amino-
säuren, d.h. auf einem kohlenhydratfreien Substrat aufgewachsene
Schimmelpilz Aspergillus niger vollständig frei von Urease ist, aber die
‚stark wirkende Arginase enthält. Wenn man dem ausgewachsenen Pilz-
häutchen eine Lösung von Pilzeiweißstoff unter sterilen Bedingungen
-darreicht, so zerlegt dieser den Eiweißstoff in Amino- und Diaminosäuren ;
-das dabei gebildete Arginin spaltet infolge der Tätigkeit der Arginase
quantitativ Harnstoff ab, der nach der Methode von Fosse leicht zu
bestimmen ist. Um aber den Eiweißstoff aus dem Protoplasma der
Myxomyceten mit den Eiweißstoffen anderer Pilze zu vergleichen,
stellte ich den Eiweißstoff aus dem edlen Steinpilz (Boletus edulis)
.dar, den Winterstein und seine Mitarbeiter (s. oben) zum ersten Male
erhalten hatten.
400 g des gepulverten Steinpilzes wurden einer aufeinanderfolgenden
Extraktion mit Äther, Alkohol, Wasser, schwacher Salzsäure und dann
wieder mit Wasser unterworfen. Aus 400 g wurden 250g lufttrockenes
Material erhalten, aus dem der Eiweißstoff durch partielle Hydrolyse
abgeschieden wurde. Zu 250 g Präparat wurden 1000 cem 70proz. Schwefel-
säure hinzugefügt und auf 2 Tage bei 35% C stehengelassen; darauf wurde
die ganze Masse in kaltes Wasser eingegossen, mit Phosphorwolframsäure
gefällt und daraus in gewöhnlicher Weise 34,8 g Eiweißstoff abgeschieden.
Der Eiweißstoff wurde durch Auflösen in 80- bis 85proz. Alkohol gereinigt;
. es erwiesen sich darin 15,48 Proz. Gesamtstickstoff (0,1074g gaben
450 N.N. Iwanoff:
16,62 mg N). Die Bestimmung des Stickstoffs im Eiweißstoff nach van Slyke
(vor der Hydrolyse) ergab 8,23 Proz. des Gesamtstickstoffs (0,5 g Eiweiß-
stoff, die 83,1 mg N enthielten, gaben 7,04 mg N). Der Eiweißstoff wurde
nochmals durch erneute Fällung mit Phosphorwolframsäure gereinigt und
zur Untersuchung des Arginins verwendet. Nach allen Angaben zu urteilen,
besitzt der aus dem edlen Steinpilz dargestellte Eiweißstoff dieselben
Eigenschaften wie auch der Eiweißstoff der Myxomyceten und des Stäublings.
Es wurde eine Kulturflüssigkeit hergestellt, welche Nährsalze
mit 1 mg Zinksulfat und ein Gemisch von Aminosäuren (l g Alanin,
0,1 g Tyrosin, 0,l g Leucin und 0,1 g Glykokoll) enthielt; nach der
Sterilisation wurde dieselbe mit Sporen von Aspergillus niger besát
und im Thermostaten bei 35%C stehengelassen. Nach Verlauf von
5 Tagen, als sich das Pilzhäutchen gebildet hatte, wurde mit einzelnen
Kulturen folgendermaßen verfahren:
1. Kontrolle unverändert gelassen.
2. Zur Lösung unter sterilen Bedingungen 0,4 g Eiweißstoff aus Myxo-
myceten hinzugefügt.
3. Dieselbe, zugefügt 0,5 g Myxomyceteneiweißstoff.
4. = j 0,4 g Bovisteneiweißstoff.
5. d S 0,4 g Steinpilz (Boletus edulis)-Eiweißstoff.
Die Kulturen wurden noch auf 5 Tage im Thermostaten stehen-
gelassen; dann wurden die Mycelien abfiltriert, mit Wasser gewaschen
und im Filtrat der Harnstoff bestimmt und daraus das Arginin be-
rechnet.
| i Arginin berecbnet
Erzielter |
Harnstoff m Wee ele auf
Wa S
ne | E gefügten Eiweißstoffes
Gees? Ze = e x =- E" e ue See A EE EE
l. Kontrolle .....+...... | Spuren | — | —
2. Mit 0,4 g Myxomyceteneiweißstoff | 16,88 48,98 12,24
3. , 058 ó 21,03 61,03 12,21
4. , 0,4g Bovisteneiweißstoff . .| 16,61 48,20 12,05
5. „ 0,4g Steinpilzeiweißstoff . „|| 17,85 51,80 12,95 *)
D Diese Menge Arginin im Eiweißstoff wurde erhalten, nachdem es mehreremal durch
Auflösen in Alkohol und nochmalige Fällung mit Phosphorwolframsäure gereinigt worden war.
Der so dargestellte Eiweißstoff aus dem Steinpilze enthielt ursprünglich nur 10,2 Proz. Arginin.
Diese übereinstimmenden Mengen Arginin sind ein wichtiger
Beweis für die Identität dieser drei Eiweißstoffe.
Überhaupt ist die Menge des Arginins sehr kennzeichnend für einzelne
Gruppen von Eiweißstoffen. Es genügt, daran zu erinnern, daß z. B. Gliadine
verschiedener Herkunft diese Substanz nur in geringen Mengen enthalten!),
so z.B.
Gliadin des Weizens enthält 3,2 Proz. Arginin
s „ Roggens m 22 5 SS
SS » Gerste 22 Ge Së usw.
1) R. Plimmer, The Chemical Constitution of the Proteins 1, 51, 1902.
Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten. 451
Andererseits besitzen die Pflanzenglobuline einen großen Gehalt an
Arginin!), so z.B.
Edestin aus Hanf . . . ..... 11,7 Proz.
Legumin aus Erbse . ...... 11,7 „
Legumin aus Wicke . ...... 11,7 „ usw.
Der hohe Arginingehalt in den Protoplasmaeiweißstoffen der
Myxomyceten, des edlen Steinpilzes und der Stäublinge nähert diese
den Histonen tierischer Herkunft, die 14,4 Proz. Arginin (Thymus-
Histone) enthalten. Hofmann fand im Laboratorium von Winterstein
in dem von ihm ausgeschiedenen Eiweißstoff des weißen Pilzes 10,7 Proz.
Arginin.
Folglich ist der Eiweißstoff des Plastins vollständig identisch mit
den Eiweißstoffen anderer Pilze.
Über das Plastin des Protoplasmas.
Die von Reinke aufgeworfene Frage, ob das Plastin ein Eiweißstoff
sei oder nicht, muß in dem Sinne gelöst werden, daß zu den Bestand-
teilen des Plastinkomplexes auch der Eiweißstoff gehört. In meinen
Versuchen gelang es mir, bis 16,25 Proz. Eiweißstoff aus dem aus-
gewählten Plastin auszuscheiden. Aber in Wirklichkeit muß mehr
Eiweißstoff darin enthalten sein, da aus meinen Versuchen der Aus-
scheidung von Pilzeiweißstoffen hervorgeht, daß bei der Darstellung
des Eiweißstoffes aus dem Phosphorwolframsáureniederschlag ein
gewisser Teil desselben (bis 50 Proz.) durch Baryt verloren geht wegen
der Absorption durch den Niederschlag von phosphorwolframsaurem
Barium. Es kam vor, daß aus 10 g Eiweißstoff bei wiederholter Fällung
mit Phosphorwolframsäure nur 3 bis 4g gereinigtes Produkt aus-
geschieden wurden. Da ich die Menge des Eiweißstoffes im Plastin
genauer bestimmen wollte, entschloß ich mich, eine indirekte Methode
anzuwenden. Vorher habe ich beschrieben, wie man mit Hilfe des Pilzes
Aspergillus niger in der Nährflüssigkeit aus Arginin quantitativ Harn-
stoff abspalten und nach der Menge des letzteren berechnen kann,
wieviel Arginin in der Flüssigkeit enthalten war. Da mir aber der
Prozentgehalt des Arginins im Eiweißstoff aus Plastin bekannt war,
so ermittelte ich nach der Menge des Harnstoffs das vorhandene
Arginin und aus diesem den Eiweißstoffgehalt des Plastins. Zur Lösung
dieser Frage habe ich folgenden Versuch angestellt.
Es wurde eine wässerige Kultur von Nährsalzen hergestellt, als
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle wurde 1g Plastin aus Myxomyceten '
hinzugefügt, das 11,05 Proz. Stickstoff enthielt. Nach der üblichen
Sterilisation wurden Sporen von Aspergillus niger ausgesät. Das Plastin
verblieb in Form von Pulver am Boden der Flasche und das Pilzhäutchen
1) R. Plimmer, The Chemical Constitution of the Proteins 1, 57, 1902.
452 N.N. Iwanoff:
erwies sich nach 13 Tagen sehr klein. Nach Entfernung desselben wurde
das Plastin mit Wasser gewaschen und auf Stickstoff analysiert: es
fanden sich darin 11,25 Proz. Stickstoff (0,2180g gaben 24,53mg N),
d. h. das Plastin hatte fast gar keine Veränderungen erlitten; es erwies sich
als ein derart stabiler Stoff, daß selbst die Fermente des Schimmelpilzes
denselben nicht zu spalten vermochten. In diesem Versuche enthielt die
Kulturflüssigkeit keinen Harnstoff.
Nachdem unterwarf ich das Plastin einer Hydrolyse mit Säure
und verwandte die Spaltprodukte zur Bestimmung des Arginins.
0,95g Plastin wurden mit 50ccm Salzsäure während 12 Stunden
gekocht; darauf wurde die Säure durch Abdampfen auf dem Wasser-
bade entfernt und der Rückstand in den Vakuumexsikkator über
Natronkalk gebracht. Die Spaltungsprodukte des Plastins wurden
unter sterilen Bedingungen zu einer achttägigen Kultur von Aspergillus
niger hinzugefügt, der auf einer Salzlösung mit einem Gemisch von
‚Aminosäuren (auf 50 ccm Flüssigkeit 1 g Alanin, 0,1 g Tyrosin, 0,1 g
Leucin und 0,1 g Glykokoll) aufgewachsen war. Nach der Zugabe der
Hydrolyseprodukte des Plastins zur Pilzkultur, wurde dieselbe noch
5 Tage lang bei 35°C gehalten, alsdann wurde in der Flüssigkeit der
Harnstoff bestimmt.
1. In der Kultur, zu der die Hydrolyseprodukte des Plastins
hinzugefügt waren . . 2. 2 2 sees ees oc eeen 17,19
2. In der Kontrolle unter denselben Bedingungen, wie die
Versuchskultur gehalten, aber ohne Zugabe von Spaltungs-
Produkten a e s 4 5 te e ne ana | 1,77
*) Wie aus meiner vorigen Arbeit zu ersehen ist, bringt der Pilz Aspergillus niger einige
Mengen Harnstoff hervor, selbst bei einer Kultur auf Aminosauren. Dies beruht auf dem Zerfall
der Eiweißstoffe des Pilzes selbst bei langdauernder Kultur.
Der Unterschied zwischen beiden Zahlen, 15,42 mg Harnstoff,
stammt vom Arginin, das sich unter den Zerfallsprodukten des Plastins
befand.
Waren im Plastin vorhanden: 15,42 mg Harnstoff, so ist dieser
nach Berechnung aus 44,74 mg Arginin entstanden.
Wenn bekannt ist, daß im Eiweißstoff 12,24 Proz. Arginin ent-
halten sind, so ergibt sich das Vorhandensein von 365,5 mg Eiweißstoff
in der angewandten Menge Plastin.
Wenn 0,95g Plastin 365,5 mg enthalten, so entspricht das
38,48 Proz. Eiweißstoff.
| Auf diese Weise ergab die indirekte Bestimmung der Eiweißstoff-
menge im Plastin die Zahl 38,48 Proz., es gelang aber nur, 16,25 Proz.
auszuscheiden; das ist vollkommen verständlich, wenn man die
komplizierten Manipulationen, die bei der Gewinnung des Eiweiß-
stoffes erforderlich sind, in Betracht zieht.
Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten. 453
Die Daten, die in dieser Arbeit angeführt sind, können die Frage
nach der Natur des Plastins nicht lösen. Eins ist zweifellos, daß man
dasselbe nicht zu einer bestimmten Gruppe von Eiweißstoffen, wie
z. B. zu den Nucleoproteiden, rechnen kann. Wir sehen, daß sich der
iatente Charakter des Eiweißstoffes im Plastin durch seine stabile
Bindung mit anderen Komponenten erklären läßt: im Plastin sind
nach unseren Daten nur 38,48 Proz. Eiweißstoff enthalten. Der Versuch,
unter den Zerfallsprodukten des Plastins Glucosamin aufzufinden,
hatte keinen Erfolg. Bei der Hydrolyse des Plastins scheidet sich aus
dem in Wasser unlöslichen Kohlenhydrat Glucose aus, welche die Aus-
führung der Glucosaminbestimmung sehr erschwert. Aber dieses in
Wasser unlösliche Kohlenhydrat wird vom Plastin unter der Einwirkung
von Säuren genau so leicht und vollkommen durch Takadiastase ge-
spalten. Es muß daher nicht zu den Bestandteilen des Plastins selbst,
sondern eher zu Reservekohlenhydraten gerechnet werden. Gelänge
es, durch weitere Untersuchungen zu beweisen, daß zum Bestande des
Plastins auch Glucosamin gehört, so könnte man annehmen, daß es
im Grunde aus einem phosphorhaltigen Glucoproteid besteht, wie ich
das für den Eiweißstoff der Stäublinge (Lycoperdon) dartun konnte.
Die Phosphormenge im Plastin ist aber eine veränderliche, schwankende
Größe von 0,32 bis 1,34 Proz. Sollte der Grundstoff des Plastins aus
einem Glucoproteid bestehen, so ist es zweifellos, daß letzteres wie
mit Phosphor, so auch mit Lecithin und anderen Stoffen verknüpft ist.
Das Molekül des Protoplasmas erscheint im höchsten Grade
kompliziert, wobei einzelne seiner Bestandteile sehr fest miteinander
verbunden sind, was aus dem Umstand zu ersehen ist, wie schwer
diese durch Fermente und Säuren abzuspalten sind. Mit dieser kom-
plizierten Struktur verbinden wir unwillkürlich auch jene verwickelten
und vielfältigen Funktionen, die wir dem Protoplasma zuschreiben.
Die Abscheidung des EiweiBstoffes aus dem Protoplasma der
Myxomyceten, der identisch mit den Eiweißstoffen höherer Pilze ist,
wirft die Frage nach der Einheit oder wenigstens nach der großen
Ähnlichkeit unter diesen chlorophyllosen Pflanzen auf.
Eine dem Plastin der Myxomyceten analoge Substanz wurde
auch bei Bakterien aufgefunden. Galeotti!) stellte aus Bacillus ranicidus
einen Eiweißstoff dar, den er zu den Nucleoproteiden zählte, der aber
12,00 Proz. N und 0,94 bis 1,83 Proz. P enthielt. Wheeler?) erhielt aus
Typhoidbakterien eine Substanz mit 10,92 Proz. N und 0,403 Proz. P
und nahm an, daß sie der Gruppe der Glucoproteide nahesteht (Ate
composition mare closely resembles that of the group of Glucoproteins‘“‘).
1) G. Galeotti, Zeitschr. f. physiol. Chem. 25, 48, 1898.
2) G. M. Wheeler, Journ. of biol. Chem. 6, 509, 1909.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 30
454 N. N. Iwanoff: Eiweißstoff des Protoplasmas der Myxomyceten.
In letzterem Falle stimmt der Gehalt des Stickstoffs und des Phoxphors
mit dem überein, den ich beim Plastin der Myxomyceten erhalten habe.
Der Grundstoff des Protoplasmas, das Plastin, das in den Myxo-
myceten enthalten ist, muß eine weite Verbreitung unter den Pilzen
und unter den Bakterien besitzen. Es sind weitere Untersuchungen
nötig, die beweisen müßten, daß nicht nur bei den chlorophyllosen,
sondern auch bei den grünen Pflanzen eine dem Plastin analoge Substanz
zum Bestande des Protoplasmas gehört.
Sehlüsse.
1. Es ist gelungen, aus dem Protoplasma der Myxomyceten durch
partielle Hydrolyse bis 16,25 Proz. eines Eiweißstoffes auszuscheiden,
der in Wasser und in 80 bis 85proz. Äthylalkohol löslich ist und 16,47
` bis 16,77 Proz. Stickstoff enthält. `
2. Der Eiweißstoff enthält nach vollständiger Hydrolyse durch
Säuren etwa die Hälfte des mit Phosphorwolframsäure fällbaren Stick-
stoffs und weist 12,24 Proz. Arginin auf.
3. Nach allen seinen Eigenschaften ist der Eiweißstoff des Proto-
plasmas der Myxomyceten dem ausgeschiedenen und gereinigten
Eiweißstoff aus höheren Pilzen (Stáublinge und Edelsteinpilz) ähnlich.
4. Das Plastin aus Myxomyceten verschiedener Herkunft weist
hinsichtlich des Gesamtstickstoffgehalts (von 10,0 bis 12,74 Proz.),
sowie auch in bezug auf den Phosphorgehalt (von 0,324 bis 1,34 Proz.)
Schwankungen auf. Das Plastin enthält manchmal ein in Wasser un-
lösliches Kohlenhydrat, das durch Einwirkung von Säure sowie von
Takadiastase in Glucose gespalten wird. Der Eiweißstoffgehalt des
Plastins, auf indirektem Wege bestimmt, übersteigt nicht 38,48 Proz.
Über die Trehalose und Trehalase bei Myxomyceten.
Von
Nicolaus N. Iwanoff.
[Aus dem pflanzenphysiologischen Institut der Universität zu Petersburg-
(Leningrad).]
(Eingegangen am 16. Juli 1925.)
Der im Jahre 1832 von Wiggers!) im Mutterkorn entdeckte Zucker
Trehalose erwies sich auf Grund der zahlreichen Arbeiten von Bour-
quelot?) als weit verbreitet unter den Pilzen. Gegenwärtig nimmt man
sogar an, daß die Trehalose bei den Pilzen dieselbe biochemische Rolle
spielt wie die Saccharose bei den grünen Pflanzen®?). Bourquelot unter-
suchte in einer Arbeit 212 Pilzarten und konnte in 142 Fällen die Gegen-
wart von Trehalose konstatieren. Da er aber beobachtet hatte, daß
die Trehalose in einigen Fällen während des Reifens und Trocknens
der Pilze manchmal verschwindet, so war Bourquelot geneigt anzu-
nehmen, daß überhaupt alle Pilze in einem bestimmten Stadium ihrer
Entwicklung Trehalose enthalten.
Die Myxomyceten wurden nicht einmal der chemischen Analyse
unterworfen. In seinen klassischen Untersuchungen fand Reinke*) beim
Myxomycetes Aethalium septicum irgend einen Zucker, den er ,,Aethalium-
zucker“ nannte. Der Autor hat nach dem Abdampfen des alkoholischen
Extraktes des Myxomycetes einen nicht kristallinischen Zucker isoliert,
der Fehlingsche Lösung erst nach dem Kochen mit Säure reduzierte.
Reinke nimmt an, daß diesem Zucker die Formel C,,„H,,0,, zukommen
müsse. Ogleich der Autor keine anderen Bestimmungen zur Ermittlung
der Natur des Zuckers unternommen und denselben auch nicht in kristallini-
schem Zustande isoliert hatte, so hatte er doch wahrscheinlich auch mit
Trehalose zu tun gehabt, denn positive Andeutungen über diese Substanz
finden wir bei Müntz (1874) und Gerard (1892)5).
1) Wiggers, Ann. d. Chem. u. Pharm. 1, 173, 1832.
2) Bourquelot, Bull. de la Soc. mycol. de France 7, 5, 1891; 9, 185,
1895; 21, 50, 1905.
3) J. Zelner, Chemie der höheren Pilze, S. 99 und 110. Leipzig 1907.
1) J. Reinke, Studien über das Protoplasma I bis III, Unters. aus dem
bot. Labor. d. Univ. Göttingen 1881, S. 34, 54, 170.
5) Zitiert nach Zener, Le, S. 110; Múntz, C. r. 1874, S. 1184; J. Reinke
nimmt an, daß die von Müntz ausgeschiedenen Kristalle Asparagin sind,
da sie Stickstoff enthielten und kein Drehungsvermögen der Polarisations-
ebene zeigten. |
30 *
- 456 N.N. Iwanoff:
Als ich verschiedene Myxomyceten chemisch untersuchte, erzielte
ich beständig beim Extrahieren des trockenen Materials mit heißem
Alkohol ein Ausfallen von großen Kristallen, die nach ihrem Verhalten
zu Fehlingscher Mischung, sowie auch nach ihrem Schmelzpunkt, voll-
ständig mit Trehalose übereinstimmten. Besonders viel Trehalose
wurde aus den Myxomyceten Reticularia Lycoperdon gewonnen.
Es wurde von Birkenholz, das zu faulen begann, über 400 g luft-
trockenes Material von Reticularia Lycoperdon gesammelt. Die Myxo-
myceten befanden sich im Stadium der Reife. Nach dem Trocknen
wurden die Sporen aus den Fruchtkörpern ausgeschüttelt und bei
100% C getrocknet. Im vorliegenden Falle wurden 115g getrockneter
Sporen ausgewählt; nach der üblichen Extraktion mit Äther und nach
der Entfernung desselben aus dem Pilzmaterial wurde eine zweimalige
Extraktion der Sporen mit siedendem Äthylalkohol vorgenommen.
Der heiß filtrierte klare alkoholische Extrakt wurde bei Zimmer-
temperatur stehengelassen; beim Stehen fielen nach einiger Zeit große
(5 bis 6 mm) rhombische Kristalle aus, die abgesaugt und aus 80 proz.
Alkohol umkristallisiert wurden. Es resultierte eine schneeweiBe
kristallinische Substanz mit einem Schmelzpunkt von 98 bis 99% C;
der Zucker reduzierte Fehlingsche Lösung erst nach dem Kochen mit
Säure.
Für die Formel der Trehalose C,,H,20,1 . 2H,O wurden nach Ent-
fernung des Kristallwassers 90,48 Proz. wasserfreier Substanz berechnet,
gefunden wurden 90,91 Proz.
1,0260 g Substanz gaben nach dem Erhitzen bei 140° C 0,9327 g Trocken-
substanz.
1,0260 g Trehalose wurden in 23 ccm Wasser gelöst; die Ablesung im
Polarimeter (l = 20 ccm) ergab a = + 15,946°; das spezifische Drehungs-
vermögen betrug also [a]p = + 178,79 statt + 178,30,
Aus 115g Sporen wurden 2,52g umkristallisierter Trehalose,
d.h. 2,19 Proz. auf Trockengewicht erhalten.
Aus diesen Befunden geht unzweifelhaft hervor, daß die Myxo-
myceten nicht nur Trehalose enthalten, sondern diesen Zucker auch,
wie wir das bei Reticularia Lycoperdon festgestellt haben, bis zu 2,19 Proz.
auf Trockengewicht anhäufen können.
Die Trehalose, die aus zwei mit den beiden reduzierenden Gruppen
miteinander verbundenen Glucosemolekülen besteht, tritt als ein
Zucker auf, der nur mit großer Mühe in seine Bestandteile zerlegt
werden kann. Zur vollständigen Hydrolyse desselben ist ein Sieden
mit 5proz. Schwefelsäure während 6 Stunden erforderlich. In den
Geweben der Pilze wird die Spaltung durch das Ferment Trehalase
bewirkt, das Bourquelot (1. c.) bei Aspergillus niger, Penicillium glaucum
und anderen Pilzen entdeckt hat. Die Trehalase erwies sich als ein
Trehalose und Trehalase bei Myxomyceten. 457
spezifisches Ferment; von der Maltase unterschied sie sich z. B. durch
ihre Inaktivierungstemperatur. Bei der Untersuchung einer großen
Anzahl von Pilzen, die Trehalase enthielten, fand Bourquelot, daß
in denselben bald eine starke Trehalase zugegen war, bald völlig fehlte.
In verschiedenen Stadien des Pilzwachstums variierte die Menge der
Trehalase; aber auch in verschiedenen Teilen des Fruchtkörpers, so
im Stiele, im Hute, in der Hymenschicht, änderte sich der Gehalt der-
selben.
Es steht außer Zweifel, daß die Trehalose, die bei der Entwicklung
der Pilze verbraucht wird, vorher in Glucose zerlegt sein muß, aber
nicht immer ist das Ferment und die Substanz, auf die es einwirkt,
in der Pflanzenzelle vorhanden. Öfters, wie z. B. beim Harnstoff und
der Urease, bestehen umgekehrte Beziehungen, d.h. bei reichlicher
Anhäufung von Harnstoff fehlt die Urease und umgekehrt.
Ich suchte in einigen Fällen eine Spaltung der Trehalose zu er-
reichen, indem ich die Anwesenheit des Ferments im Trockenmaterial
verschiedener Myxomyceten annahm, aber ich erhielt negative Resultate.
Daraufhin verwandte ich zum Versuch unreife Fruchtkörper des Myxo-
mycetes Lycogola, die das Aussehen von Korallen besitzen, die Größe
etwa eines Pfefferkorns haben und auf faulenden Baumstümpfen
wachsen. Hier war das Ferment Trehalase zugegen.
Zu 10ccm Wasser, die 44,27 mg Trehalose enthielten, wurden zwei
unreife Fruchtkörper von Lycogola (von der Größe eines Pfefferkornes)
zugesetzt, welche zu einem Brei zerrieben wurden. Das Gemisch wurde
unter Beigabe von Toluol während 10 Tagen bei 18 bis 20° C stehengelassen ;
nach Verlauf dieses Zeitraumes wurde in der Portion der reduzierende
Zucker nach Bertrand bestimmt: Glucose gefunden 19,5 mg, theoretisch
mögliche Menge 42,17 mg. Somit waren unter Einwirkung der Trehalose
der unreifen Lycogola 46,2 Proz. gespalten worden.
In einem anderen Versuch wurden ebenso je 10 ccm Wasser mit
48,97 mg Trehalose (C,,H,,0,, + 2 H,O) genommen.
Es wurden folgende Ansätze aufgestellt:
1. Trehalose + zerriebene Masse von vier unreifen Lycogola.
2, ge + ji be an » reifen 2
3. a + 20 mg an der Luft getrockneter Fruchtkórper von
Fuligo varians.
4. Kontrolle: ohne Trehalose, vier zerriebene unreife Lycogola.
Überall wurden 3 Tropfen Toluol hinzugefügt. Es wurde auf 4 Tage
bei 40°C stehengelassen; danach wurde in den Portionen die Menge des
reduzierenden Zuckers, der Glucose, bestimmt.
l. Portion . . . . . . . . . 41,67 mg Glucose
Ze ga g ve EI dg eg e Apure
3. $9 A A ër e
4. eS Sg
Da sich aus der zugesetzten Menge Trehalose 46,66 mg Glucose bilden
konnten und in der ersten Portion nur 41,67 mg erhalten wurden, so be-
deutet dies, daß die Trehalose unter der Einwirkung der Trehalase der
458 N. N. Iwanoff: Trehalose und Trehalase bei Myxomyceten.
unreifen Fruchtkörper von Lycogola zu 90 Proz. zerlegt worden war. Von
Interesse ist, daß in den reifen Fruchtkörpern keine Trehalase vorhanden
war, so wie auch nicht im Mycel von Aethalium septicum.
Wir wissen, daß die Fermente in der Pflanzenzelle je nach deren
Bedarf bald zum Vorschein kommen, bald wieder verschwinden. Un-
längst ist es mir gelungen zu zeigen!), daß die Gegenwart oder Ab-
wesenheit der Urease bei Schimmelpilzen von der Beschaffenheit des
Nährsubstrats abhängt. Es steht außer Zweifel, daß auch bei anderen
Fermenten die gleichen Beziehungen bestehen. Diesbezügliche Tat-
sachen sind in der Literatur vielfach beschrieben worden. Wir müssen
bei der Untersuchung der Tätigkeit der Fermente stets den physio-
logischen Zustand des betreffenden Organismus im Auge behalten.
Das Fehlen eines Ferments bedeutet noch nicht, daß der Organismus
es nicht hervorbringen kann; oft wird dadurch nur bewiesen, daß
der Zeitpunkt für die Lösung der gestellten Aufgabe nicht passend
gewählt war.
1) N. N. Iwanoff, diese Zeitschr. 157, 229, 1925.
Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Raum.
I. Mitteilung:
Gaswechsel und Eiweißstolfwechsel.
Von
W. Laubender.
(Aus dem Institut für Hochgebirgsphysiologie und Tuberkuloseforschung
in Davos.)
(Eingegangen am 17. Juli 1925.)
Mit 3 Abbildungen im Text,
Wenngleich über den Einfluß des Höhenklimas auf die Stoff-
wechselvorgánge des menschlichen Organismus zahlreiche Unter-
suchungen!) vorliegen, bestehen doch hinsichtlich der ursächlichen
Bedeutung der einzelnen , Hochgebirgsfaktoren* am Zustandekommen
dieser Erscheinungen noch große Meinungsverschiedenheiten. Während
der eine Teil der Autoren (Kestner, Dannmeyer, Peemöller usw.) auf
die Kälte- und Strahlungswirkung das Hauptgewicht legen zu müssen
glaubt, stellt der andere Teil der Autoren (Loewy und Mitarbeiter)
den Sauerstoffmangel der Gewebe in den Vordergrund der Betrachtung.
Bei dieser Lage der Dinge schien es von Bedeutung, die Frage, ob
die Luftverdünnung und damit der relative Sauerstoffmangel auf den
Ablauf der Stoffwechselvorgänge in charakteristischer Weise ein-
zuwirken imstande sei, tierexperimentell zu prüfen.
Theoretisch lassen sich zwei Hauptrichtungen denken, in denen
der Sauerstoffmangel die Stoffwechselvorgänge beeinflussen könnte.
Die eine Möglichkeit besteht darin, daß das verminderte Sauerstoff-
angebot schließlich zu unvollkommenen Oxydationsstufen — organischen
Säuren verschiedenster Art — im intermediären Zellstoffwechse) führt.
Eine derartige Gewebsacidose würde, nach dem, was vielfach an-
genommen wird, im weiteren Verlauf zu einer Herabsetzung der
1) Handbuch der Balneologie, Klimatologie usw. 8 (Leipzig 1924);
A. Loewy, Pflügers Arch. 207, Heft 5%.
460 W. Laubender:
oxydativen Stoffwechselvorgänge und zu einer Steigerung des Eiweiß-
zerfalls führen. Die andere Möglichkeit bestände darin, daß durch
irgendwelche Regulationsvorgänge der drohende Gewebssauerstoff-
mangel kompensiert, ja vielleicht sogar überkompensiert würde, wie
es zahlreiche Autoren aus den Befunden ihrer physikalisch-chemischen
Blut- und Harnuntersuchungen nach Versuchen in der pneumatischen
Kammer folgern zu müssen glauben (Haldane und Kennaway, Grand
und Goldmann usw.). In diesem Falle müßte die Veränderung der
Stoffwechselvorgänge in entgegengesetzter Richtung liegen.
Wir durften also hoffen, aus der Untersuchung des Gaswechsels,
gemessen an der CO,-Ausscheidung und dem O,-Verbrauch, sowie
des Eiweißstoffwechsels, gemessen an der N-Ausscheidung und dem
Ammoniakkoeffizient, im Tierexperiment bei einer Luftverdünnung,
die hinsichtlich Größe und Dauer der Einwirkung auf den Menschen
bei größeren Höhentouren entsprach, Aufschluß über unsere Frage-
stellung zu gewinnen.
Methodik.
Wir bedienten uns zu unseren Untersuchungen eines Ventilations-
systems, dessen Anorduung durch die beifolgende Skizze verdeutlicht
werden möge.
F
Zur Lufipumpe So
Abb. 1.
Am Anfang des Systems befindet sich ein Kasten A aus starkem
Eisenblech, dessen Deckel fünf Öffnungen trägt, in die der Reihe nach
folgende Bestandteile luftdicht eingeschraubt sind: a stellt ein Feder-
ventil dar, das von einer bestimmten Luftverdünnung an der Außen-
luft den Eintritt in den Kasten und damit in das ganze System gestattet.
Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Raum. 461
Die Spannung der Feder ist durch die Schraube a regulierbar, so daß
man dadurch das System auf die gewünschte Luftverdünnung ein-
stellen kann. Hahn b dient dazu, um am Ende des Versuchs die Luft-
verdúnnung durch langsam zuströmende Nebenluft auszugleichen.
c ist ein Metallmanometer, an dem der jeweilige Grad der Luftver-
dünnung abgelesen werden kann. Hahn d ermöglicht die Verbindung
des Eisenkastens mit dem übrigen System. (Das Ventil e ist ein Über-
druckventil, dessen wir für unsere Versuche nicht bedürfen. Wir haben
es eingebaut, um den Kasten auch für Überdruckversuche verwendbar
zu machen. Ebenso ist das Manometer derart eingerichtet, daß es
einerseits vollkommenes Vakuum, andererseits bis 1 Atm. Überdruck
anzeigt.)
An den Kasten A schließt sich an die Waschflasche B, die mit
Kalilauge beschickt ist, um die in den Tierkäfig C eintretende Luft
CO, frei zu waschen.
Der Tierkäfig C besteht aus einem starkwandigen, durch Glas-
platte luftdicht verschließbaren Exsikkator, in dem das Tier auf einem
durch Metallfüße erhöhten Metallrost sitzt. Diese Einrichtung schien
uns ein gutes AbflieBen des Harnes in den Harnauffangraum, der stets
reichlich mit Thymol beschickt war, zu gewährleisten. Der Metallrost
wurde übrigens am Ende jedes Versuchs bzw. jedes Versuchstages
sorgfältig mit destillierttem Wasser abgespúlt.
Die aus dem Tierkäfig C austretende Luft läuft zur quantitativen
CO,-Bestimmung durch die Gaswaschflasche D.
Zwischen dem Tierkäfig C und der Flasche D befindet sich ein
Glas-T-Stück, an das die Gaspipette E angeschlossen werden kann,
um Proben der Exspirationsluft zur gasanalytischen Untersuchung
ihrer Zusammensetzung zu entnehmen. Die Abnahme der Gasproben
geschah wegen der herrschenden Druckunterschiede mit Hilfe von
Quecksilber.
Am Ende des ganzen Systems arbeitet eine kräftige Wasserstrahl-
pumpe nach Bunsen.
Die CO,- Bestimmung geschah in einstündigen Perioden durch Vorlage
von n/lOBa(OH), und Rücktitrierung der überschüssigen Lauge mit
n/10 HCl (Indikator: Phenolphthalein). In den Zeitperioden, in denen die
CO, nicht bestimmt wurde, wurde die Gaswaschflasche D durch das Glas-
rohr F ersetzt. Vor dem Auswechseln wurde bei f das rückwärtige System
durch eine Schraubklemme abgeklemmt, so daß das Versuchstier dabei
keinen größeren Luftdruckschwankungen ausgesetzt war.
Die Bestimmung des O,-Verbrauchs geschah in folgender Weise: die
mit Hilfe der Gaspipette abgenommene Probe der Exspirationsluft wurde
nach den Regeln der Gasanalyse — Absorptionsmethode — auf ihren
prozentualen CO,- und O,-Gehalt untersucht.
462 W. Laubender:
Da die prozentuale Zusammensetzung der Inspirationsluft bekannt
war (für die CO, betrug bei unserer Versuchsanordnung der Wert
0,00 Proz.), konnten wir die Zunahme an CO, und die Abnahme an O,
in unserer Probe jener gegenüber direkt auf die Gaswechselvorgänge
des Versuchstieres beziehen, d.h. wir hatten ein Maß für den respira-
torischen Quotienten desselben. Aus diesem sowie aus der anderweitig
bestimmten Gesamtkohlensäuremenge pro Stunde ließ sich der O,-
Verbrauch pro Stunde in Kubikzentimetern berechnen nach der
CO, l ` e l
Formel: O, = k(R.-Q. = respiratorischer Quotient, k = 0.001977
für den Fall, daß co, in Gramm gegeben ist). Für eine solche Be-
stimmung wurden mindestens zwei an analysiert und daraus
der Mittelwert genommen,
Der Gesamt-N im 24-Stundenharn wurde nach dem Mikrokjeldahlver-
fahren bestimmt, wobei sich uns die Anordnung von Pincussen?) sehr gut
bewährt hat. Auch hier wurden stets Doppelbestimmungen ausgeführt.
Der Ammoniak-N im 24-Stundenharn wurde ebenfalls nach der von
Pincussen!) beschriebenen Methode untersucht. Doch ist nach unseren
Erfahrungen eine Luftdurchsaugung von 15 Minuten bei der verhältnis-
mäßig niederen Temperatur von 45°C, die nicht überschritten werden soll,
ungenügend. Nach sorgfältigen Kontrollversuchen glauben wir mit einer
Luftdurchsaugung von 45 Minuten das Ammoniak quantitativ übergetrieben
zu haben.
Der Ammoniakkoeffizient (A.-K.) wurde errechnet als der prozentuale
Anteil des Ammoniakstickstoffs am Gesamtstickstoff.
Als Tiermaterial verwandten wir Meerschweinchen, die wir teils 24,
teils 48, teils 72 Stunden einem Minusdruck von 200 bis 250 mm Hg
aussetzten. (Da Davos einen mittleren Barometerstand von 630 mm Hg
aufweist, betrug der absolute Druck, unter dem die Tiere standen,
430 bis 380 mm Hg; das entspricht einer Berghöhe von 4500 bis 5500 m.)
Jedes der Versuchstiere wurde vorher gleich lange und unter denselben
Bedingungen bei gewöhnlichem Luftdruck (Davoser) in bezug auf
seine Stoffwechselgiößen beobachtet.
Hinsichtlich der Fütterung ließen wir uns von folgenden Gesichts-
punkten leiten: Da jede kohlenhydratreiche Fütterung — und um eine
solche handelt es sich bei Pflanzenfressern schließlich immer —- einen
durch andere Ursache bedingten Eiweißzerfall herabmindert und
somit verschleiert, wäre an sich das Hungern der Tiere erstrebenswert
gewesen. Abgesehen nun davon, daß bei Pflanzenfressern nie ein
Hungern im Sinne des Hungerns bei Fleischfressern erreichbar ist, war
auch ein vollkommener Nahrungsentzug bei unseren kleinen Versuchs-
tieren in Betracht der verhältnismäßig langen Versuchszeit unmöglich.
1) Pincussen, Mikromethodik. Leipzig, Thieme, 1923.
Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Raum. 463
Wir haben deshalb die Tiere im Normal- wie im Luftverdünnungs-
versuch in genau gleicher Weise unterfüttert (etwa 50 Proz. ihres
Bedarfs). Um von denselben Ausgangsbedingungen auszugehen, wurde
wenigstens bei den 48- und 72-Stundenversuchen eine Auffütterungs-
periode eingeschaltet, so daß beide Versuchsreihen mit ähnlichen
Ausgangsgewichten begannen.
Bezüglich der Ammoniakausscheidung haben wir die Beobachtung
gemacht, daß die Höhe des Ammoniakkoeffizienten bei Meerschweinchen
weitgehend von Unreinlichkeiten des Futters beeinflußt werden kann.
In erster Linie ist hier wohl an Erdreste, die natürlich Ammoniaksalze
in ungeahnter Menge enthalten können, zu denken. Um dieses —
wenn wir es so nennen dürfen — exogene Ammoniak nach Möglichkeit
auszuschalten, wurde den Tieren das als Futter dienende Karotten-
material stets sauber gebürstet und gereinigt verabreicht. Außerdem
wurde sowohl im Normal- wie im Luftverdünnungsversuch ein Vor-
versuchstag mit dem gleichen Futtermaterial eingeschaltet, um ein
Hereinspielen dieser Ammoniakart in den Versuch zu verhindern.
Wir geben nun im folgenden unsere Versuchsergebnisse in den
Tabellen I bis VI und den Kurven der Abb. 2 und 3 wieder.
normal verdünnt normal verdünnt
Bez A GE Eegen
We,
NS .
`.
w, $
agı A 3 lo l g lag 1.
Abb.2. Meerschweinchen Nr. 7 Abb. 3. Meerschweinchen Nr, 8
KEE Gewichtskurve e Gewichtskurve
— +.+— O5, »Verbrauch — «+ — Oz7+Verbrauch
N» Ausscheidung -= - —-- NoAusscheidung
EE CO» Ausscheidung sees: COzsAusscheidung
— — — Ammoniak s Koeffizient — — — Ammoniak » Koeffizient
464 W. Laubender:
Tabelle I. 24-Stundenversuch.
REI | CO,.Aus» Oz Vere! Geo Ammo«!
| Futter | Gewicht scheidung | Si RO. BEN) en A.K
| | pro Stunde Stunde 24Std. | 24 Std. |
_ I. e IN) en Ire
1 rn Sam SEN A AAA TA A Gm
Meerschweinchen ` E 2; 0,209 129 0, 823! |
Nr. 9, normal 50,00 g 3500 ¡2 oa | i
aroen — 30,08 Ge 115 0,839 0,294 | 7,51 , 2,6
UE — -
Meerschweinchen 2| 0,237 | 133 0,900
Nr. 9, Luftver» | 50,00 340,0
Ee 0,8 0,243 | 137 0,900 0,336 | 4,03 | 1,2
250 mm Hy | 23|0.157| 95 0839 |
°) Stundenzahl nach Versuchsbeginn.
Tabelle II. 24-Stundenversuch.
l! | | CO»: Aug, Ke Ver Ge un
Futter Gewicht | scheidung | os R.Q. Semth niskeN | AK,
| ' pro Stunde ' Stunde | ads Std. As Std.
_ AI A
M hweinch | |
Sa | 40,008 | 310,0 > 0'171 | 100 0,865| 0,241 | 1,19 og
allen) 2093 u. 116 10,764
Meerschweinchen || 210,171 | 104 0,833]
See, Luftver. Pa Be o 8| 0157! 92 (0,868, 0,298 | 1,12 | 0,4
250 mm Hg | n 23| 0,145 į 94 10,780, |
*) Stundenzahl nach Versuchsbeginn.
Tabelle III. 48-Stundenversuch.
I i C Oa- Auge Ge» Ammos |
: samt:N Se AK.
ii Futter Gewicht scheidung
| pro Stunde 24 Sta. (A 24 Std.
RER ae: E A g , 8 | mp
Meerschweinchen Nr.3, normal N 80,00 ccm 570,0 |23 | 0,308
Tyrodelösung 00 47 | 0,312 | 9296 | 4,93
E
a as TEE subkutan ,
eerschweinchen Nr. 3, Luft, | 120, 00 g 550,0 23 0,297 0, 239 | 13 ‚03 P
verdünnung 1% bis 210mm Hg Karotten — 510,047 0,288
*) Stundenzahl nach Versuchsßegnt:
Tabelle IV. 48-Stundenversuch.
| | COz-Aus- | Ges Ammos.
| Futter | Gewickt scheidung Rn niak.N | Ask.
l pro Stunde ` 24 Std. ds Std..
| os m. u mo
Meerschweinchen Nr.6, normal | 90,00 g 350,0 23 0,209
| Karotten |— 300,0 47 | 0,207
Meerschweinchen Nr. 6, Luft» | 72008 | 300,0 |23| 0,134
verdunnung 1% bis 210 mm Hg l Karotten | ER 300 A 47 | 0,158
*) Stundenzahl nach Versuchsbeginn.
0,201 | 1,30 | 0,7
0,319 | 4,77 | 15
10
Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Raum.
*UUIBIQSUYINSIZA Yosu ¡YSZUIPUNIS Le
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PO Sg 300 [gigo| eer cogeo Je goes | 3006 | “€ |
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T , , 89.0 98T 2820 |ZE| 0079 — | ueyouey |
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Z 28% Lipo | 0180 161 2080 |8 | 0'089— | uepolsy ` 81q 003 BUNUUNPASAIOT
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466 W. Laubender:
Die Gewichtskurve unserer Tiere ließ in den ersten 24 Stunden
der Luftverdünnung keinen deutlichen Unterschied gegen die Norm
erkennen; in einem Teile der Fälle allerdings nahmen die Tiere im Luft-
verdünnungsversuch stärker an Gewicht ab als am entsprechenden
Normalversuchstag. Nach den ersten 24 Stunden aber zeigte sich bei
allen Versuchstieren eine deutliche Abflachung der Gewichtskurve
während der Luftverdünnung.
Die CO,-Ausscheidungskurve ließ folgenden Verlauf erkennen: In
den ersten 2 bis 6 Stunden zeigte die CO,-Ausscheidung eine Zacke
von 20 bis 40 Proz. gegen den Mittelwert der Norm, um dann nach
etwa 12 bis 24 Stunden um 5 bis 30 Proz. gegen den Mittelwert der Norm
für dauernd abzusinken. Nur bei Meerschweinchen Nr.7 hielt sich
die CO,-Ausscheidung nach der Zacke im Bereich der Norm. Doch
mag bemerkt werden, daß dieses Versuchstier sich im Luftverdünnungs-
versuch während der Messungen unruhig verhielt. Bei Meerschweinchen
Nr. 11 fehlt die Zacke in den ersten Stunden. Dieses Tier hatte am
Versuchstage infolge Karottenmangel gehungert, so daß wir das Fehlen
der Anfangszacke wohl auf diesen Umstand zurückführen müssen.
Es taucht nun die Frage auf, ob die Steigerung der CO,-Aus-
scheidung in den ersten Stunden der Luftverdünnung eine echte Stoff-
wechselsteigerung darstellt und weiterhin, ob die spätere Senkung
der CO,-Ausscheidung als Stoffwechselhemmung gedeutet werden
darf. Das mußte aus der Größe des O,-Verbrauchs während dieser Zeit
erhellen. Es muß nun zugegeben werden, daß bei unserer Methodik
die Messung des O,-Verbrauchs zweifellos größere Fehlerquellen in
sich trägt als diejenige der CO,-Bestimmung. Trotzdem glauben wir
an den gefundenen Zahlenwerten sichere Anhaltspunkte für die
Beantwortung unserer Fragestellung zu haben. In keinem der unter-
suchten Fälle macht, die Sauerstoffverbrauchskurve die CO,-Zacke
mit. Sie hält sich im wesentlichen um den Höchstwert der Norm. Der
respiratorische Quotient liegt dementsprechend ziemlich hoch. Als
Erklärung für diese Erscheinung bleiben unseres Erachtens nur zwei
Möglichkeiten: Entweder handelt es sich um eine durch die Luft-
verdünnung erzwungene gesteigerte Kohlenhydratverbrennung, oder
die CO,-Zacke beruht nicht auf Steigerung der Verbrennungsprozesse,
sondern auf einer Ausschwemmung der Kohlensäure infolge inter-
mediárer Säurebildung. Daß eine solche wirklich zustande kommt
und am Blute deutlich nachweisbar ist, wird durch Versuche be-
wiesen, über die Herr Dr. Fritz demnächst berichten wird.
Das Absinken der CO,-Ausscheidung nach den ersten 12 bis
24 Stunden muß wohl im Sinne einer Stoffwechselhemmung aufgefaßt
werden. Denn auch der O,-Verbrauch, der ein eindeutigeres Maß für
den Stoffwechsel abgibt als die CO,-Ausscheidung, zeigt denselben
Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Raum. 467
Gang, nämlich gleichfalls eine Einschränkung, und zwar eine noch
etwas stärkere als die der GO,-Ausscheidung. Letzteres führt zu Unter-
schieden im respiratorischen Quotienten zwischen den Normalperioden
und den Luftverdünnungsperioden. Denn während die respiratorischen
Quotienten im Normalversuch nach dem ersten Tage langsam und
stetig heruntergehen, eine Erscheinung, die bei unseren unterfütterten
Tieren wohl verständlich ist, steigen sie im Luftverdünnungsversuch
gegen den zweiten Tag hin noch einmal an. Das deutet auf Unter-
schiede im Stoffzerfall hin, auf deren Natur hier nicht näher ein-
gegangen werden soll.
Den Gesamt-N im Harn haben wir in fast sämtlichen Fällen um
14 bis 59 Proz. im Luftverdünnungsversuch erhöht gefunden. Nur
Meerschweinchen Nr. 3 macht scheinbar eine Ausnahme. Dieses Tier
stammte aus einer Reihe, in der wir versuchten, die Tiere ohne Fütterung
zu halten, und statt des Futters Tyrodelösung subkutan zu infundieren,
um die Zurückhaltung von N-haltigen Abbauprodukten zu verhindern.
Offenbar hat diese Maßnahme zu einem übergroßen Effekt im Normal-
versuch geführt und die relativ reichliche Karottenfütterung im späteren
Luftverdünnungsversuch den Eiweißstoffwechsel in besonderer Weise
geschont. Bei Meerschweinchen Nr. 8 war am ersten Normalversuchs-
tag ein auffallend hoher N-Wert vorhanden, der durch irgend einen
Versuchsfehler bedingt sein muß. Er bleibt deshalb am besten sanıt
dem ersten Tage der Luftverdünnung für die Prozentberechnung fort.
Nach den beiden 72-Stundenversuchen zu schließen, fällt der Gipfel
der N-Ausscheidung im Luftverdünnungsversuch auf den zweiten Tag.
Die Ammoniakausscheulung bzw. der Ammoniakkoeffizient lagen
in den beiden 24-Stundenversuchen bei der Luftverdünnung (Tabelle I
und II) niederer wie am entsprechenden Normaltag. Es scheint, daß
trotz der oben erwähnten Vorsichtsmaßregeln die vorausgehende
Fütterung am ersten Tage unserer Versuche den A.-K. noch dominierend
beeinflußt hat. In den 48- und 72-Stundenversuchen aber liegt der
A.-K. im Luftverdünnungsversuch deutlich höher als im Normal-
versuch; der bestimmende Unterschied gegen die Norm fällt auf den
zweiten Tag, während am dritten Tage bereits wieder die Norm erreicht
wird. Wir müssen aus diesen Befunden schließen, daß bei unseren
Versuchstieren dieser Mechanismus der intermediären Säureneutrali-
sation verhältnismäßig spät einsetzt und quantitativ schlecht aus-
gebildet ist. Es sei an dieser Stelle an die alten Untersuchungen von
Salkowski*) über das besondere Verhalten der Pflanzenfresser bei der
Säurevergiftung erinnert, demzufolge diese Tiere zur Neutralisation
der eingeführten Säuremengen nicht NH,, wie die Fleischfresser und
1) E. Salkowski, Virchows Arch. 88, 1, 1873.
468 W. Laubender: Über den Stoffwechsel im luftverdünnten Raum.
Omnivoren!), sondern im wesentlichen Alkalimetalle (Na, K) mobili-
sieren.
Wenn wir nun zum Schlusse unsere Versuchsergebnisse: Hemmung
der oxydativen Abbauvorgänge, Steigerung des Eiweißzerfalls und
vorübergehende Heranziehung der Eiweißabbauprodukte zur inter-
mediären Säureneutralisation, von einem einheitlichen Standpunkt
aus deuten wollen, scheint uns die Annahme einer Gewebsacidose mit
all ihren Folgen für die Stoffwechselvorgänge die beste Erklärungs-
möglichkeit zu bieten. Dabei müssen wir kurz der Parallele gedenken,
die unsere Befunde mit denen der experimentellen Säurevergiftung
aufweisen. Hatten schon die früheren Untersuchungen von Chvostek ?)
eine Herabsetzung des respiratorischen Gaswechsels bei HCl-Ver-
giftung ergeben, so konnten Loewy und Münzer?) diesen Befund in
neueren Untersuchungen durchaus bestätigen. Die beiden letzteren
Autoren haben aus ihren Versuchsergebnissen gefolgert, daß trotz
der durch die Acidose eintretenden Veränderungen in den Blutgas-
bindungsverhältnissen die Störung des Zellstoffwechsels das aus-
schlaggebende Moment für das Zustandekommen der Säurevergiftung
darstellt.
Ob und inwieweit nun auch bei den Versuchen im luftverdünnten
Raume Gewebsveränderungen nachweisbar werden, diese Frage soll
in einer nächsten Mitteilung behandelt werden.
Zusammenfassung.
Unsere an Meerschweinchen bei einem Druck von 430 bis 380 mm
Hg ausgeführten Untersuchungen haben ergeben:
l. Geringere Gewichtsabnahme als im Normalversuch.
2. Steigerung der CO,-Ausscheidung in den ersten 2 bis 6 Stunden
um 20 bis 40 Proz., an der der O,-Verbrauch nicht teilnimmt.
3. Herabsetzung des Gaswechsels nach den ersten 12 bis 24 Stunden
um 5 bis 30 Proz.
4. Steigerung der Gesamt-N-Ausscheidung im Harne um 14 bis
59 Proz.
5. Erhöhung des Ammoniakkoeffizienten am zweiten Versuchstage.
1) Fr. Walter, Arch. e. P. P. 7, 148, 1877.
2) F. Chvostek, Zentralbl. f. inn. Med. 14, 329, 1893.
8) A. Loewy und E. Münzer, diese Zeitschr. 184, Heft 5/6, 1923.
Über Glucose-phosphorsäure.
Von
S. Sabetay und L. Rosenfeld.
(Aus dem Kaiser-Wilhelm-Institut für Biochemie in Berlin-Dahlem.)
(Eingegangen am 20. Juni 1925.)
Als Naturstoffe wie als Produkte der Synthese kennt man eine
Reihe von Kohlenhydrat-phosphorsäure-Verbindungen, die in physiolo-
gischer Hinsicht ein erhebliches Interesse erlangt haben; im Hinblick
auf die Rolle der in diesen Substanzen in besonderer Verknüpfung
vorhandenen Bestandteile ist es wichtig, die Konfiguration der Kohlen-
hydrat-phosphorsäuren aufzuklären. Man wird zweckmäßig so vorgehen,
daß man aus den teilweise komplizierten Gebilden den Grundkörper
herausschält, der in allen Fällen eine Monosaccharid-phosphorsäure
ist. So kann man das Zymophosphat zu einer Hexose-monophosphor-
säure abbauen, so kann man aus den Nucleinsäuren Pentose-phosphor-
säure abspalten und so kann man schließlich von der Saccharose-
phosphorsáure ebenfalls zum Phosphorsäure-ester eines Monosaccharids
gelangen. Schon die Entdecker der Rohrzucker-phosphorsáure
haben gefunden!) und I. Hatano hat jüngst genauer festgestellt?),
daß infolge ungleicher Bindungsart der beiden zum Rohrzucker zu-
sammengefügten Monosaccharide einerseits und des in den Gesamt-
komplex eingeführten Phosphorsäure-radikals andererseits es unschwer
gelingt, auf rein chemischem Wege eine Hydrolyse des Rohrzucker-
anteils herbeizuführen, während die Kuppelung zwischen der einen
Hexose und der Phosphorsäure bestehen bleibt.
Diese partielle Zerlegung der Rohrzucker-phosphorsäure führt man
am besten durch gemäßigte Spaltung mit verdünnter Oxalsáure?)
aus und verwendet als Ausgangsmaterial das sehr bestándige und leicht
zugängliche Calcium-saccharosephosphat. Neuberg und Pollak!) sowie
Hatano?) haben dargetan, daß bei der geschilderten Behandlung schnell
1) C. Neuberg und H. Pollak, diese Zeitschr. 28, 515; 26, 521, 1910.
2) I. Hatano, ebendaselbst 159, 175, 1925.
3) C. Neuberg, ebendaselbst 88, 432, 1918.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 3]
470 S. Sabetay u. L. Rosenfeld:
Reduktionsvermögen in der vorher nicht reduzierenden Flüssigkeit
auftritt. Nach Absättigung mit Kalk oder Baryt kann man durch Be-
handlung mit Alkohol die Reaktionsprodukte trennen, wobei der in
Weingeist lösliche Teil sich auf Grund des Drehungsvermögens, der
Vergärbarkeit und des charakteristischen Methyl-phenyl-osazons als
d-Fructose erweist. In Alkohol unlöslich sind dagegen Erdalkalisalze
der abgespalteten Hexose-mono-phosphorsäure.
Auf Vorschlag von C. Neuberg haben wir diese Verbindung einer
weiteren Untersuchung unterzogen und können folgendes über ihre
Eigenschaften, Zusammensetzung sowie zur Frage nach ihrer Konstitu-
tion mitteilen.
Zunächst haben wir die günstigen Bedingungen ermittelt, unter
denen die glykosidische Spaltung der Rohrzucker-phosphorsäure erfolgt
und die Glucose-mono-phosphorsäure mit bester Ausbeute erhalten wird.
Als am vorteilhaftesten erwies es sich, mit einer etwa 1proz. Oxalsáure
zu erhitzen und nach kurzenı Erwärmen von ausgefallenem Calcium-
oxalat abzufiltrieren. Sobald bei weiterem Erwärmen organisch ge-
bunden gewesene Phosphorsáure abgespalten und als Magnesium-
ammonium-phosphat nachweisbar wird, unterbricht man die Behand-
lung. Durch Neutralisation zuerst mit Bariumcarbonat und schließlich
mit Barytwasser schaltet man die weitere Säurewirkung aus. Durch
sofortiges Einleiten von Kohlensäuregas muß man eine sich bildende un-
lösliche basische Verbindung zerlegen. Aus dem klaren Filtrat kann man
alsdann mit Alkohol in einer Ausbeute von 60 Proz. der Theorie glucose-
mono-phosphorsaures Barium in Form eines schweren sandigen Pulvers
niederschlagen und durch Umfällen aus wässeriger Lösung mittels
Alkohol reinigen. Diese Substanz weist bei richtiger Bereitung keine
positive Seliwanoffsche Probe mehr auf. Aus dem Reduktionsver-
mögen gegenüber Fehlingscher Mischung crgibt sich, daß die im Rohr-
zucker maskierte Aldehydgruppe des Traubenzucker-restes freigelegt
ist. Das Vergärungsvermögen zeigt an, daß die Zuckerkomponente nicht
in Mitleidenschaft gezogen ist.
Es handelte sich zunächst darum, die Einheitlichkeit dieser Ver-
bindung zu prüfen. C. Neuberg und O. Dalmer!) haben gezeigt, daß die
verschiedenen Zucker-phosphorsäuren schön kristallisierende Alkaloid-
salze liefern. Ein gleiches Verhalten konnten wir für unsere Glucose-
phosphorsäure konstatieren. Wir gewannen leicht in gut ausgebildeten
Kristallen das Cinchonidin- sowie Brucin-salz, und zwar durch Um-
setzung des Bariumsalzes der Glucose-phosphorsäure mit Lösungen
der entsprechenden Alkaloidsulfate; durch Zugabe von Äthylalkohol
beugt man einer hydrolytischen Dissoziation vor. Die Alkaloidsalze
1) C. Neuberg und O. Dalmer, diese Zeitschr. 131, 188, 1922.
Über Glucose-phosphorsäure. 471
entsprechen den Formeln (C,¿Hz20N»), - H,PO,.C,H,,0O, und
(C23 Hə Nal H¿P O, - C¿H,10;5 Das Cinchonidinsalz, mit dem wir
hauptsächlich gearbeitet haben, wurde bis zur Konstanz von Drehung
und Schmelzpunkt umkristallisiert. Hierzu möchten wir bemerken,
daß schon das rohe Alkaloidsalz nahezu rein erhalten wird, ein Umstand,
der uns von Wichtigkeit erscheint im Hinblick auf die Frage nach der
Einheitlichkeit der von uns untersuchten Glucose-phosphorsäure und
damit ihrer Muttersubstanz, des Saccharo-phosphates selber.
Durch Zerlegung mit Barytwasser und Entfernung des frei
gewordenen Alkaloids gewinnt man aus dem Cinchonidinsalz das
Bariumsalz der Glucose-phosphorsäure zurück. Dasselbe zeigt kaum
eine geänderte Drehung gegenüber dem Produkt, das noch nicht über
das Cinchonidinsalz gereinigt worden ist. Auch dieser Umstand bezeugt
die Einheitlichkeit der Zucker-phosphorsäure.
Sodann haben wir die hydrolytische Spaltung der Glucose-phosphor-
säure untersucht und folgendes beobachtet: Nach vierstündigem
Kochen einer 5proz. Lösung der Substanz in n Salzsäure erhält man
eine Flüssigkeit mit maximaler Rechtsdrehung; auch hierin liegt ein
Beweis dafür, daß Glucose-phosphorsäure und nicht die Fruchtzucker-
verbindung zugegen ist.
Um Anhaltspunkte über die Stellung des Phosphorsäure-restes zu
gewinnen, haben wir unsere Substanz mit Phenylhydrazin unter ver-
schiedenen Bedingungen behandelt. Durch die Arbeiten von 4. Harden
und W.J. Young!) weiß man, daß der in vicinaler Stellung zur Carbonyl-
gruppe?) vorhandene Phosphorsäure-rest bei der Osazonreaktion ab-
geworfen wird. Aus den Untersuchungen von C. Neuberg und E. Rein-
furth®) geht hervor, daß eine nicht in Nachbarstellung befindliche
Phosphorsäure-gruppe bei der Osazonbildung erhalten bleibt. Es ergab
sich nun, daß bei der Osazonprobe sowohl unsere freie Glucose-
phosphorsäure als ihr Kaliumsalz ein phosphorfreies Osazon liefert.
Nach Zusammensetzung und Eigenschaften ist dasselbe d-Glucosazon.
Kann man hieraus nun den Schluß ziehen, daß unsere Verbindung
Glucose-2-phosphorsäure ist € Diese Folgerung erschiene nicht schlüssig,
da wir über die Haftfestigkeit der Phosphorsäure an den übrigen Stellen
im Molekül vorläufig nicht orientiert sind. Während der Niederschrift
dieser Arbeit erhielten wir Kenntnis von einer Untersuchung, die
S. Komatsu und R. Nodsu*) ausgeführt haben. Die beiden japanischen
1) A. Harden und W.J. Young, diese Zeitschr. 82, 173 und 177, 1911.
2) Die Formulierung von A. I. Virtanen (H. 148, 78, 1925) mit 3, 4-
Stellung der Phosphorsäure-reste erscheint als reine Spekulation.
3) C. Neuberg und E. Reinfurth, diese Zeitschr. 146, 589, 1924.
4) S. Komatsu und R. Nodsu, Memoirs of the college of Science,
Kyoto, Series A, 7, 377, 1925.
31*
472 S. Sabetay u. L. Rosenfeld:
Forscher haben mehrere Phosphorsáure-ester des Traubenzuckers
synthetisch bereitet, und zwar die Glucose-1-phosphorsáure aus Tetra-
acetyl-glucose und Phosphoroxychlorid, die Glucose-3-phosphorsäure
aus 1,2,5,6-Diaceton-glucose und Phosphoroxychlorid, sowie die
Glucose-6-phosphorsäure aus Glucose + Phosphoroxychlorid in Gegen-
wart von Pyridin oder kohlensaurem Calcium. Nach den gegebenen
Beschreibungen wäre unsere Glucose-mono-phosphorsäure mit keiner
jener Estersäuren identisch. Unter der Voraussetzung, daß die
Annahmen der genannten Autoren über die Konstitution ihrer
Zuckerphosphorsäuren stichhaltig und ihre nicht kristallisierten Körper
einheitlich gewesen sind, müßten wir unsere Substanz als Glucose-2-
phosphorsáure oder als Glucose-4-phosphorsäure oder Glucose-5-
phosphorsäure betrachten. Allein eine solche Schlußfolgerung schiene
uns sehr gewagt.
In der 4-Stellung (und ebenso der 1-Stellung) des Glucose-restes
ist im Rohrzuckermolekül nach der üblichen Auffassung keine freie
Hydroxylgruppe vorhanden, so daß eine im Traubenzucker-anteil
phosphorylierte Saccharose das Phosphorsäure-radikal nicht in Stellung
Glucose-4 (oder Glucose-1) tragen kann. Allenfalls müßte man eine
Acyl-wanderung im Augenblicke der Disaccharid-hydrolyse annehmen.
Angesichts der sehr ungleichen Resistenz der Äther- und Ester-bindungen
scheint ein solcher Vorgang a priori nicht sehr wahrscheinlich, wenn
er auch vorläufig nicht ausgeschlossen werden kann.
Von dem Glucose-mono-phosphorsäure-ester unbekannter Struktur,
der nach R. Robison!) neben Hexose-di-phosphat beim Phosphory-
lierungsakt der Hefe auftritt, ist übrigens unser synthetisches Produkt
gleichfalls verschieden.
Für die Konstitutionsermittlung muß man also nach neuen Wegen
suchen. |
Glucose-phosphorsaures Barium, C, H,, 0, . 0 . P 0O, Ba.
Als Ausgangsmaterial diente das Hesperonal-calcium (Calcium-
naccharo-phosphoricum). 50 g Hesperonal-calcium wurden in 1000 cem
Wasser gelöst. Zu der Flüssigkeit wurde eine Lösung von 15 g Oxal-
säure in 750 ccm Wasser gesetzt. Nach kurzem Erhitzen auf dem
Wasserbade wurde filtriert. Das Filtrat wurde auf dem Wasserbade
so lange belassen, bis eine abgekühlte Probe sich mit ammoniakalischer
Magnesiamischung trübte, was nach längstens 1 Stunde der Fall war.
Das Hydrolysat wurde noch warm mit Bariumcarbonat und zuletzt in
der Kälte mit Barytwasser neutralisiert. Das überschüssige Barium-
hydroxyd wurde sogleich durch Einleiten von Kohlendioxyd unschädlich
1) R. Robinson, Biochem. Journ. 16, 809, 1922.
Über Glucose-phosphorsäure. 473
gemacht; dann wurde abgenutscht, mit Wasser gründlich gewaschen, das
Filtrat im Vakuum auf 300 ccm eingeengt und von entstandenem Carbonat
(aus gelóstem Bicarbonat) abfiltriert. Das Filtrat wurde auf 120 ccm
konzentriert und unter Umrühren in die doppelte Menge absoluten
Alkohols gegossen. Das Bariumsalz der Glucose-phosphorsäure scheidet
sich dabei als weißer, körniger Niederschlag aus. Derselbe wurde ab-
genutscht, mit Alkohol gewaschen und darauf in 100ccm warmen
Wassers gelöst. Nach Einleiten von Kohlensäure in der Wärme wurde
filtriert und das klare Filtrat wieder in die doppelte Menge Alkohol
eingetropft. Die abgeschiedene Masse muß weiß aussehen und ist dann
praktisch rein. Ausbeute an exsikkatortrockener Substanz 26 g oder
rund 60 Proz. der Theorie.
Zur Analyse wurde die Substanz nochmals in Wasser gelöst, in
der Wärme mit Kohlensäure behandelt, filtriert und mit Alkohol um-
gefällt. Nach dem Waschen mit Weingeist und zuletzt mit Äther wurde
im Hochvakuum bei 1mm Druck mit Aceton als Heizflüssigkeit ge-
trocknet.
1,7410 g lufttrockener Substanz verloren nach 16stündigem Trocknen
0,1816 g an Gewicht; das entspricht 24, Mol. Kristallwasser.
C¿H,05.0.PO,.Ba + 2% H,O Ber.: H,O = 10,23 Proz.
(440,5). gef.: 10,43 Proz.
Ursprünglich war die Substanz rein weiß, durch das Trocknen
erhielt sie einen Stich ins gelbliche.
Die folgenden Analysen sind mit der wasserfreien Substanz aus-
geführt worden.
0,1665 g Substanz: 0,1126g CO, und 0,0472g H,O.
Zur Aschenbestimmung wurde vorsichtig erhitzt und der Rückstand
mit Ammonnitrat geglüht, bis er rein weiß wurde.
0,2188 g Substanz hinterließen 0,1238 g Asche.
Die Bestimmung des Phosphors nahmen wir durch Soda-Salpeter-
Schmelze über das Molybdat vor.
0,2116 g Substanz: 0,0560 e Mg,P,0O..
Die Bariumbestimmung wurde wie üblich ausgeführt. 0,2509 g Sub-
stanz: 0,1502 g BaSO,.
C,H,ı0,PBa (395,5).
Ber.: C = 18,21, H = 28, P =7,84, Ba = 34.73, Ba,P.O,
= 56,74 Proz;
18,45, H = 3,17: P
56,78 Proz.
gef.: C 7,38, Ba = 35,22, Ba,P,O,
Zur optischen Bestimmung wurde die wasserfreie Substanz benutzt
(Lösungsmittel Wasser).
[a]? = + 7,440 (l =1, c = 9,408, a= + 0,700).
Ein viermal mit Alkohol umgefälltes Produkt zeigte
[a]? = + 8,53%, (l=1, c = 5,856, a= + 0,500).
474 S. Sabetay u. L. Rosenfeld:
Um Anhaltspunkte über die Einheitlichkeit des Ausgangsmaterials
zu gewinnen, haben wir ein direkt dargestelltes Präparat von saccharose-
phosphorsaurem Calcium mit einem aus dem Strychninsalz regenerierten
verglichen. Zu dem Zwecke wurde das Hesperonal-calcium in Wasser
gelöst, erhitzt, mit Kohlensäure gesättigt, durch ein Tierkohlefilter
filtriert und in die dreifache Menge Alkohol gegossen. Diese Operationen
wurden zweimal wiederholt. Das rein weiße Pulver wurde im Hochvakuum
bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und in wässeriger Lösung polarisiert.
[a = + 49,55% (l = 1. c = 7,568, a = + 3,75°).
Das Strychninsalz der Saccharose-phosphorsäure wurde in der von
Neuberg und Dalmer!) angegebenen Weise dargestellt. Nach dem Um-
kristallisieren aus 70proz. Aceton schmolz das Salz gegen 186° unter
Bräunung und Gasentwicklung. Die wässerige Lösung des Strychnin-
salzes wurde in der Kälte mit einem Überschuß von Ca(OH), versetzt und
das überschüssige Hydroxyd mit Kohlensäure unschädlich gemacht. Nach
dem Abnutschen wurde das nunmehr schwach sauer reagierende Filtrat
zum Sieden gebracht und wiederum filtriert. Nach der Abtreibung des
Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand zwecks Entfernen des
zurückgebliebenen Alkaloids mehrmals mit siedendem Alkohol extrahiert.
Der Rückstand wurde im Wasser aufgenommen und, wie oben angegeben,
mit Alkohol umgefällt. Das schneeweiße Pulver erwies sich als frei von
Stickstoff. Die optische Bestimmung wurde mit der wässerigen Lösung
ausgeführt.
[a]} = + 51,90% (l = 1, c = 2,196, a = + 1,14°).
Das glucose-phosphorsaure Barium ist im Wasser lóslich, leichter
in warmem als in kaltem. Auch in verdúnnten Mineralsáuren ist es
löslich, dagegen unlóslich in organischen Lösungsmitteln. Die wässerige
Lösung reduziert in der Wärme die Fehlingsche Mischung. Mit konzen-
trierter Salzsäure erhitzt, liefert es eine Fichtenspan-reaktion?).
Uranylacetat bewirkt in essigsaurer Lösung keine Fällung. Die wässerige
Lösung gibt mit Bleiessig einen dicken Niederschlag (löslich im Über-
schuß), nicht aber mit Bleiacetat. Beim Erhitzen mit neutralem Silber-
nitrat entsteht eine schwarze Fällung von Silber. Bemerkenswert ist
das Verhalten der wässerigen Lösung. Sie ist gegen Lackmus schwach
basisch. Eine konzentrierte wässerige Lösung reagiert auf Phenol-
phthalein kaum; verdünnt man aber die Lösung, so wird sie kräftig
rot. Alkalien rufen in der wässerigen Lösung Niederschläge hervor.
Hydrolyse des hexose-phosphorsauren Bariums.
Um nochmals festzustellen, ob Fructose oder Glucose der Grund-
zucker des hexose-phosphorsauren Salzes ist, wurde mit normaler
Salzsäure in der Wärme hydrolysiert und die Spaltung an Hand der
Drehungsänderung verfolgt. Zu diesem Zwecke wurden 2,694 g Barium-
salz in 50 ccm n HCl gelöst und auf freier Flamme am Rückflußkühler
a Re
2) H. Steudel und E. Peiser, H 139, 209, 1924.
Über Glucose-phosphorsäure. 475
erhitzt. Stündlich wurde eine Probe herausgenommen, mit wenig
Tierkohle geschüttelt und im Prozente Traubenzucker anzeigenden
Apparat polarimetrisch geprüft.
Gleich nach der Auflösung z
in kalter Salzsäure . . Ablenkung entsprechend + 0,50 Proz.
Nach 1 stúndigem Kochen | a 5 + 0,90 z
D n | n n T 1,20 n
” 4 n n j n D T 1,50 n
Für die totale Hydrolyse werden etwa 2,4 Proz. Glucose berechnet.
Somit sitzt in der Saccharose-phosphorsäure das Phosphorsäure-
radikal am Glucoserest.
Überführung in Glucosazon.
Für diesen Zweck wurde die freie Glucose-phosphorsäure benutzt.
2,78g Bariumsalz in 30 ccm Wasser gelöst, wurde mit der äquivalenten
Menge nH,SO, versetzt; vom Bariumsulfat wurde abzentrifugiert.
Das Filtrat wurde mit 3 ccm Pbenylhydrazin + der äquivalenten Menge
50 proz. Essigsäure vermischt und 1 Stunde auf dem Wasserbade
erhitzt. Der schön gelbe kristallinische Niederschlag wurde abgenutscht,
mit Wasser, verdünntem Alkohol und Äther gewaschen. Ausbeute an
exsikkatortrockener Substanz 1g. Das Osazon hat die Neigung, ölig
auszufallen, so daß es nicht immer gelingt, der Kristalle habhaft zu
werden. Die Tendenz zur Abscheidung in Ölform legt übrigens den
Gedanken nahe, daß primär ein phosphorhaltiges Osazon auftritt, das
alsdann Phosphorsáure abspaltet!).
Zur Analyse wurde mehrmals aus verdünntem Alkohol um-
kristallisiert und im Hochvakuum (mit Aceton als Heizflússigkeit)
getrocknet. Schmelzpunkt bei langsamem Erhitzen gegen 204 bis 205°
(unkorr.). Das Osazon erwies sich beim Schmelzen mit Soda-Salpeter
als phosphorfrei und durch Löslichkeitsverhältnisse, Schmelzpunkt,
Mischschmelzpunkt sowie Drehung in Pyridin-Alkohol [nach Neuberg ?)]
als Phenyl-d-glucosazon. Somit ist bei der Darstellung des Osazons
der Phosphorsäure-rest abgelöst worden.
0,1770 g Substanz: 23,8 ccm N (18% und 768 mm, 33 proz. KOH).
Cis Haz DNA, Ber.: N Kee 15,64 Proz.; gef.: 15,72 Proz.
In derselben Weise wurde aus dem Kaliumsalz der Glucose-
phosphorsáure das Osazon bereitet. Um die Ausfällung eines
kristallinischen Niederschlags zu erleichtern, wurde von vornherein mit
1) Vgl. hierzu die Erfahrungen von E. Fischer und H. Noth, Ber. 51,
329, 1918.
2) C. Neuberg, Ber. 32, 3386, 1899.
476 S. Sabetay u. L. Rosenfeld:
einem Kriställchen von Phenyl-d-glucosazon geimpft. Nach dem
Umkristallisieren aus 60proz. Alkohol erwies sich das ÖOsazon als
phosphorfrei und gemäß Schmelzpunkt (205°, unkorr.), Drehung sowie
Zusammensetzung als identisch mit Phenyl-d-glucosazon.
0,1023 g Substanz: 13,6ccm N (19% und 756mm, 50proz. KOH).
Ce Hs NAU, Ber.: N = 15,64 Proz; gef.: 15,46 Proz.
0,10g Osazon wurden in 5,0ccm eines Gemisches von Alkohol und
Pyridin gelöst; a = — 1,25% sofort und — 0,64%!) nach 24stündiger
Aufbewahrung.
Darstellung des Cinchonidinsalzes, (Ce H. ON,),H,P 0, . C¿H,, Os-
l g glucose-phosphorsaures Barium wurde in 50 eem H,O gelöst
und mit einer äquivalenten Menge wässeriger Cinchonidinsulfatlösung
versetzt. Gleichzeitig wurden 50 com Alkohol hinzugetan. Das Ganze
wurde auf dem Wasserbade 1, Stunde erhitzt, von BaSO, abzentri-
fugiert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der kristallisierte
Rückstand wurde mit warmem Alkohol unter Zugabe von wenig Wasser
extrahiert, eingeengt und im Eisschrank stehengelassen. Es schieden
sich schöne Drusen ab, die abgenutscht und gewaschen wurden. Für
die Analyse wurde zweimal aus Alkohol umkristallisiert und dann im
Hochvakuum (mit Aceton als Heizflüssigkeit) bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Die wasserfreie Substanz schmolz bei langsamem Erhitzen
gegen 164° unter Bräunung und Gasentwicklung.
0,1504 g Substanz gaben 0,0192 g Mg,P,O,.
0,1141 g Substanz gaben 7,0ccm N (20°, 747 mm, 33proz. KOH).
Cu Hs 01, NP. Ber:. P = 3,66, N = 6,61 Proz.
(848,7) Gef.: P = 3,56, N=69 ,,
Für die optische Untersuchung wurde Methylalkohol als Lösungs-
mittel angewendet.
1,58 . 3,985
Sa E 0
ta], 1. 0,0724 . 0,8001 19S
(a = — 1,58%, l = 1, d = 0,8001; 0,0724 g Substanz, Gesamtgewicht
der Lösung 3,9850 g.)
Nach 2 Stunden war die Drehung unverändert. Das Cinchonidin-
salz der Glucose-phosphorsäure ist in warmem Alkohol, Wasser, Methyl-
alkohol und Eisessig löslich, dagegen in Aceton, Essigester und Äther
unlöslich.
In derselben Weise wurde das Brucinsalz dargestellt. Es kann
entweder aus absolutem Alkohol oder aus Wasser unter Zusatz von
Aceton umkristallisiert werden. Platten. Für die Analyse wurde zwei-
mal umkristallisiert und im Hochvakuum (mit Acston als Heiz-
1) Vergl. P. A. Levene und F. B. La Forge, Journ. of biol. Chem. 20,
429, 1915.
Über Glucose-phosphorsäure. 477
flüssigkeit) getrocknet. Die untenstehenden Analysen (P und N) sind
mit der wasserfreien Substanz ausgeführt worden‘.
0,2806 g lufttrockene Substanz verloren nach 24stündigem Erhitzen
im Hochvakuum bei 56° 0,0380 g an Gewicht, entsprechend 9 Mol. H,O-
Kristallwasser.
H,O. Ber.: 13,40 Proz. Gef.: 13,54 Proz.
0,1340 g Substanz: 0,0158 g Mg,P,0,.
0,1704 g Substanz: 8,0 ccm N (20° und 760 mm).
C52 Hes O17: NaP Ber.: P = 2,96, N = 5,35 Proz.
. (1049). Gef.: P = 3,28, N = 5,39 „
Für die optische Untersuchung wurde 50proz. Äthylalkohol als
Lösungsmittel benutzt.
[a]$ = — 16,81% (l = 1, c = 2,26, a = — 0,389),
Das Brucinsalz der Glucose-phosphorsáure ist lóslich in kaltem
Wasser, Methylalkohol, Eisessig und warmem Methylalkohol, dagegen
unlö:lich in Aceton, Essigester und Äther.
Fermentative Spaltung des Phosphorsáure-esters durch Takadiastase und Hefe.
2,5414 g Bariumsalz wurden durch eine äquivalente Menge Kalium-
sulfat in das Kaliumsalz verwandelt. Gesamtvolumen der Lösung
100 cem. Aliquote Teile davon (je 30 ccm) wurden mit Takadiastase
(2 g) oder untergäriger Hefe (4 g) versetzt. Nach Zugabe von 1 Proz.
Toluol wurde unter häufigem Umschütteln bei 37° digeriert. Gleichzeitig
wurden drei Kontrollproben angesetzt: Kaliumsalz, Hefe, Takadiastase
in Toluolwasser. Zur Bestimmung der abgespalteten Phosphorsáure
wurden 10,0 ccm herauspipettiert, mit 5,0 ccm Wasser verdünnt und
filtriert; in 10,0 ccm Filtrat wurde mit ammoniakalischer Magnesia-
mischung in üblicher Weise das abgespaltene Phosphat ermittelt.
Mgz P2 07
nach 24 Stunden | nach 48 Stunden
g g
Nr.
1. | Blindversuch mit Takadiastase . . | 0,0290 0,0302
2. | Blindversuch mit Kaliumsalz . . | 0,0054 0,0054
3. , Kaliumsalz + Takadiastase. . . + | 0,0609 0,0639
4. | Blindversuch mit Hefe ..... l 0,0092 0,0124
5. | Kaliumsalz + Hefe. ....... | 0,0238 0,0280
Gärung des glucose-phosphorsauren Kaliums.
3,0342 g Bariumsalz wurden in 20 ccm Leitungswasser gelöst, dazu
wurde eine äquivalente Menge wässeriges K, SO, hinzugetan. Im
ganzen waren 40,0 cem H,O vorhanden. 10,0 ccm der klar zentrifugier-
ten Flüssigkeit wurden mit 2g frischer Unterhefe ( Patzenhofer) im Eudio-
478 S. Sabetay u. L. Rosenfeld: Über Glucose-phosphorsäure.
meter über Quecksilber bei 35° 2 Tage stehengelassen. Gleichzeitig
wurde ein Kontrollversuch mit Hefe allein angesetzt. Nach 2 Tagen
waren 13,4ccm (Ablesungstemperatur 21% durch KOH absorbier-
baren Gases entstanden.
Es ist wahrscheinlich, daß die Gárung erst nach Loslósung der
Glucose eintritt, denn bei Zusatz von Takadiastase und unter Beriick-
sichtigung der Blindversuche mit Takadiastase + Hefe konnte eine
erhebliche Beschleunigung der Zuckerspaltung festgestellt werden.
In einer anderen Reihe von Versuchen wurde Trockenhefe anstatt
frischer Hefe benutzt; auch damit war Gärung zu konstatieren.
Die enzymatische Spaltung der Saccharose-phosphorsäure
in Fruchtzucker und Glucose-phosphorsáure.
Von
Carl Neuberg und Sebastian Sabetay.
(Aus dem Kaiser Wilhelm - Institut für Biochemie in Berlin - Dahlem.)
K. Djenab und C. Neuberg!) haben beobachtet, daß die Salze der
Saccharose-phosphorsäure durch ein in Ober- und Unterhefen vor-
handenes Ferment dephosphoryliert werden und daß gleichzeitig mit
dieser Phosphatase die Saccharase in Tätigkeit tritt. Denn bei Unter-
bindung der Gärung (Hefe in Gegenwart von Toluol) häufen sich
Phosphat und Invertzucker an. Diese Versuche sagen nichts darüber
aus, ob das Molekül der Rohrzucker-phosphorsäure zuerst von der
Phosphatase oder von der Invertase angegriffen wird. Im Besitz von
Enzympräparaten, die nur eines der beiden Fermente Phosphatase-
Invertase enthalten, konnte man hoffen, die reine Inversion und die
reine Dephosphorylierung der Saccharo-phosphate herbeizuführen.
Eine solche spezifische Leistung der Fermente mußte um so eher
nachweisbar sein, als nach den Erfahrungen von C. Neuberg und
E. Kretschmer?), I. Hatano?) sowie S. Sabetay und L. Rosenfeldt) die
Ätherbindung zwischen den beiden Hexosen und deren estermäßige
Verknüpfung zum Saccharo-phosphat bereits chemischen Agentien
gegenüber eine ungleiche Resistenz besitzen.
Zunächst sei über die invertatische Hydrolyse der Saccharo-phosphor-
säure berichtet. Wir haben in Invertaselösungen, die nach R. Will-
staetter und F. Racke®) bereitet sind, ein Material gefunden, das keine
Phosphatase-wirkung zeigte und die enzymatische Zerlegung des
Saccharo-phosphats in Fruchtzucker und Glucose-phosphorsäure
ermöglichte.
1) K. Djenab und C. Neuberg, diese Zeitschr. 82, 391, 1917.
2) C. Neuberg und E. Kretschmer, ebendaselbst 86, 5, 1911.
3) I. Hatano, ebendaselbst 159, 175, 1925.
4) S. Sabetay und L. Rosenfeld, diese Zeitschr. 162, 469, 1925.
5) R. Willstaetter und F. Racke, Ann. 425, 53, 1921.
480 C. Neuberg u. S. Sabetay :
Dieses Ergebnis bietet auch nach anderer Richtung hin ein Interesse.
Nach der von R. Willstaetter und R. Kuhn!) begründeten An-
schauung gehört die Saccharase der Hefe zu den Fructosidasen. In
unserem Ausgangsmaterial, dem Saccharo-phosphat, haftet erwiesener-
maßen die Phosphorsáure am Glucose-rest. Die Beschwerung des
letzteren mit der Phosphorsäuregruppe hindert also den Zugriff der
Invertase nicht. Dieses Verhalten erinnert an die Zerlegbarkeit der
Raffinose durch Invertase?); hierbei entstehen Fructose und ein mit
Galaktose kombinierter Glucose-rest, die Melibiose.
Die Invertinlösung wurde nach dem Verfahren der raschen Autolyse
von Willstaetter und Racke (l. c.) dargestellt.
l kg gewaschene und gepreßte Patzenhofer Bierhefe wurde unter Zusatz
von Toluol und Essigester in 1 Liter Wasser suspendiert und unter häufigem
Umschütteln einige Tage stehengelassen. Die auftretende Säure wurde von
Zeit zu Zeit mit verdünntem Ammoniak neutralisiert. Nach dem Filtrieren
durch eine Reihe von Faltenfiltern wurde das Filtrat mittels Bleiacetat
enteiweißt. In das neue Filtrat wurde Schwefelwasserstoff eingeleitet
und das kolloidal ausgefallene Bleisulfid durch mit Fullererde gedichtete
Filter abgenutscht. Die klare Flüssigkeit wurde der Dialyse unterworfen.
Die so gewonnene Invertinlósung hatte ein py von 6,3; sie reduzierte
Fehlingsche Mischung nicht und war, wie qualitative Versuche an
Saccharose und saccharose-phosphorsaurem Calcium dartaten, sowohl
in neutraler als in saurer Lösung aktiv. In allen Blindproben mit
passivem Ferment (erhalten durch Kochen der Lösung) waren negative
Resultate zu verzeichnen. Die meisten Versuche wurden ohne Zugabe
von Mononatrium-phosphat ausgeführt, um die Isolierung der Glucose-
phosphorsäure nicht zu erschweren. Die benutzte Invertinlösung war
praktisch phosphatasefrei, wie einwandfrei aus einem quantitativen
Versuch folgt.
Versuch 1. 10g saccharose-phosphorsaures Calcium wurden in
120 ccm der Invertinlósung gelöst; dazu kamen 1,5 ccm Toluol. Durch
passenden Zusatz von Mononatrium-phosphat wurde der Neutralpunkt
erreicht (py = 7). Die schon in kurzem Fehlingsche Mischung redu-
zierende Flüssigkeit wurde 2 Tage bei Zimmertemperatur aufbewahrt.
Endwert von pg = 7,0. Nach Zufügung von lg Calciumcarbonat
wurde im Vakuum bei 40% konzentriert. Die eingeengte Lósung wurde
tropfenweise unter Rühren in das vierfache Volumen absoluten Alkohols
gegossen. Der abgenutschte Niederschlag wurde gründlich mit 80 proz.
Weingeist gewaschen. Die vereinigten Alkoholauszüge, in denen sich
die Fructose befand, wurden im Vakuum abgedampft und der Rück-
stand wurde in Wasser aufgenommen. Nach dem Filtrieren wurde in
1) R. Willstaetter und R. Kuhn, H.129, 57, 1923.
2) Dieselben, H. 115. 180, 1921; R. Kuhn, H.125, 71, 1923.
Enzymatische Spaltung der Saccharose-phosphorsäure usw. 481
einem Stöpselzylinder auf 25,0 ccm verdünnt. Die Flüssigkeit redu-
zierte stark alkalische Kupferlösung und zeigte im 1-dcm-Rohr Links-
drehung, entsprechend — 2,76 Proz. Traubenzucker. Dieser Wert aber
ist 0,77 Fructose äquivalent und besagt, daß rund 20 Proz. der theo-
retisch zu erwartenden Menge Fructose entstanden waren. Zur Dar-
stellung des Methylphenylosazons wurde die wässerige Fruchtzucker-
lösung eingeengt und nach der Vorschrift von C. Neuberg!) mit
Methyl-phenylhydrazin behandelt. Es resultierten 1,25 g exsikkator-
trockenes Methyl-phenylosazon. Nach dem Umkristallisieren aus
l0proz. Alkohol schmolz das Osazon bei schnellem Erhitzen bei 1580
und drehte im Pyridin-Alkoholgemisch = + 1,4% in Übereinstimmung
mit den in der Literatur verzeichneten Daten.
Versuch 2. Derselbe Versuch wurde mit einer durch kurzes Kochen
inaktivierten Invertinlösung ausgeführt. Die übrigen Verhältnisse, Zeit-
dauer und Arbeitsweise, wie bei Versuch 1. Die vereinigten alkoholischen
Auszüge besaßen nach dem Abdampfen und Aufnehmen in Wasser
kein Reduktionsvermógen gegenüber Fehlingscher Mischung und
zeigten im 2-dem-Rohr eine minimale Rechtsdrehung.
Versuch 3. 10g saccharose-phosphorsaures Calcium wurden in
140 ccm Invertinlösung gelöst und mit 1,5 ccm Toluol versetzt. Durch
Zugabe von Essigsäure wurde ein pg von 4,7 hergestellt. Die Mischung
wurde 9 Tage bei 24% aufbewahrt; dabei blieb das pg unverändert. Die
Mischung wurde unter Beifügung von 5g Calciumcarbonat eingeengt
und wie in Versuch 1 weiterverarbeitet. Es ergab sich, daß 33 Proz.
der theoretisch möglichen Menge Fructose frei geworden waren.
Zum Nachweis des anderen bei der Inversion entstandenen Bruch-
stückes, des glucose-phosphorsauren Caleiums, wurde folgendermaßen ver-
fahren. Der durch Alkohol erzeugte Niederschlag wurde nach flüchtigem
Trocknen in heißem Wasser aufgenommen. Das Filtrat ergab mit Blei-
acetat nu eine schwache Trübung. Mit Bleiessig (ein Überschuß ist hier
jedoch zu vermeiden) bildete sich ein dicker Niederschlag von glucose-
phosphorsaurem Blei [Saccharose-phosphorsäure gibt mit Bleiessig keine
Fállung?)]. Der Niederschlag wurde abgenutscht und gründlich mitWasser
gewaschen. Da der voluminöse Bleiessigniederschlag etwas Saccharose-
phosphat mit niederreißt, wurde die Reinigung durch Bleiessigfällung
(nach vorheriger Behandlung mit H,S) noch zweimal wiederholt.
Nach Aufschwemmung in Wasser wurde mit Schwefelwasserstoff
zerlegt, filtriert, der Überschuß an H,S durch einen Luftstrom ver-
trieben und mit Barytwasser genau neutralisiert. Diese wässerige
Lösung des glucose-phosphorsauren Bariums wurde eingeengt, erwärmt,
1) C. Neuberg, Ber. 85, 961, 1902.
23 C. Neuberg und H. Pollak, diese Zeitschr. 23, 516, 1910.
482 C. Neuberg u. S. Sabetay:
mit Kohlensäure gesättigt und nach dem Erkalten in die doppelte
Menge Alkohol eingegossen. Der amorphe Niederschlag wurde ab-
gesaugt und zweimal aus Wasser mit Alkohol umgefállt. Nach dem
Trocknen im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz wurde die Ver-
bindung analysiert. Die erhaltenen Zahlen sowie das Verhalten lassen
keinen Zweifel daran, daß fast völlig reines glucose-phosphorsaures
Barium vorlag. Das Präparat reduzierte kräftig Fehlingsche Lösung
beim Kochen und zeigte auch alle übrigen Eigenschaften des durch
Säurehydrolyse aus der Saccharose-phosphorsäure gewonnenen Barium-
glucose-phosphats. (Siehe die voranstehende Abhandlung.)
0,1638 g Substanz gaben nach dem Glühen mit Ammon-nitrat 0,0924 g
Asche (Ba,P,O,).
0,1734 g Substanz: 0,1006 g BaSO..
0,1556 g de 0,0454 g Mg,P,0,.
0,1799 g u 0,1140g CO, und 0,0537 g H,O.
C,H,ı0,PBa (395,5).
Ber.: Ba, P,O, = 56,74, Ba = 34,73, P = 7,84, C = 18,21,
H = 2,80 Proz.
Gef.: Ba, P,O, = 56,41, Ba = 34,15, P = 8,12, C = 17,30,
H = 3,31 Proz.
Versuch 4. Bedingungen wie in Versuch 3. Die Invertinlösung
war durch kurzes Kochen inaktiviert. Die vereinigten alkoholischen
Auszüge hinterließen einen geringen Rückstand, der beim Aufnehmen
im Wasser keine Reduktion von Fehlingscher Mischung bewirkte. Im
2-dcm-Rohr war die Drehung 0.
Versuch A 10g saccharose-phosphorsaures Calcium in 140 cem
Invertinlósung + 1,5 ccm Toluol; durch Zusatz von Essigsäure wurde
ein py von 4,8 hergestellt. Die Mischung wurde unter háufigem Schütteln
1 Woche im Brutschrank bei 37% belassen. Die H-Ionenkonzentration
blieb unverändert. Nach dem Einengen über CaCO, wurde filtriert
und in Alkohol gegossen. Die alkoholischen Auszüge wurden, wie oben
angegeben, auf Fructose untersucht. Gefunden haben wir 1,16 g Frucht-
zucker oder etwa 30 Proz. der zu erwartenden Menge.
Versuch 6. Anordnung wie in Versuch 5, aber mit inaktiviertem
Ferment. Die alkoholischen Auszüge enthielten zum Schluß keine
Spur von Fructose.
Versuch 7. Zur Prüfung der Frage, ob unsere Invertinlösung
unter den obwaltenden Bedingungen Phosphatasewirkung zeigte,
wurde folgender Versuch vorgenommen: 3,5g saccharose-phosphor-
saures Calcium in 50,0 ccm der Invertinlösung wurden mit 1 ccm
Toluol versetzt. Vermittelst Essigsäure wurde ein pg von 4,8
hergestellt. Die Mischung wurde im Brutschrank bei 37% aufbewahrt
und von Zeit zu Zeit auf anorganische Phosphorsäure analysiert. Zu
diesem Zwecke wurden 4,0 ccm der schwach getrübten Lösung heraus-
Enzymatische Spaltung der Saccharose-phosphorsäure usw. 483
pipettiert, ammoniakalisch gemacht und mit 20 ccm ammoniakalischer
Magnesiamischung versetzt. Nach l6stündigem Stehen wurden die
Niederschläge auf übliche Weise in Magnesium-pyrophosphat über-
geführt.
Zeit ` MgzP20;
ae ee une PU een
Gleich nach dem Auflósen des |
saccharo-phosphorsauren Cal- |
ciums in der Fermentlósung 0,0040
nach 1 Tage ......... | 0,0038
sw 4Tagen .......» | 0,0036
ae ee EE | 0,0036
e ENEE EH | 0,0034
Über das physiologische Verhalten des Acetoins.
II. Mitteilung:
Über das Verhalten des Acetoins im Tierkörper.
Von
C. Neuberg und A. Gottschalk.
(Aus dem Kaiser Wilhelm-Institut für Biochemie in Berlin-Dahlem.)
Durch die Untersuchungen von C. Neuberg und E. Reinfurtk!)
war festgestellt, daß im Stoffwechsel der Hefe die Bildung von großen
Mengen Acetoin (Acetyl-methyl-carbinol) erzwungen werden kann.
Damit war zum ersten Male gezeigt worden, daß das wichtige inter-
mediáre Umsetzungsprodukt Acetaldehyd die ‚„Acyloin-kondensation“
zu einer Substanz erleiden kann, die normalerweise nicht als Aus-
scheidungsprodukt des betreffenden Organismus nachzuweisen ist.
Bis dahin war noch niemals Acetoin bei irgend einer Betätigung der
Hefe zutage getreten. Wohl aber ist dieser Körper seit langem als ein
gar nicht seltenes Erzeugnis verschiedener Bakterien beobachtet,
wie des Bacillus lactis aerogenes, des Bacterium cloacae, des Bac? ` m
subtilis und verwandter Arten.
Somit war immerhin mit der Möglichkeit zu rechnen, daf “er
Acetaldehyd auch im Tierkörper zur Entstehung des Acetoins A’
geben könnte. Denn gerade durch unsere Untersuchungen?) ist kı
geworden, daß für die animalische Zelle gleichfalls Acetaldehyd im
Mittelpunkt der Abbaureaktionen steht. Da aber der Acetaldehy.
normalerweise und bei pathologischen Zuständen nicht oder nur in
Spuren zur Ausscheidung gelangt3), so muß intermediär gebildeter
Acetaldehyd anderweitig verbraucht werden, sei es daß er in letzter
Linie zur Synthese von Kohlenhydraten, Fetten und Acetonkörpern
dient, sei es daß er über die Essigsäurestufe auf nicht bekannten Wegen
der endgültigen Oxydation anheimfällt.
So wenig wie für die Hefezellen ist für den tierischen Organismus
normaliter eine Ausscheidung von Acetoin oder seinem Reduktions-
produkt, dem $, y-Butylenglykol, bekannt. Um über das Schicksal
fertigen Acetoins und Butylenglykols etwas zu erfahren, haben wir
1) C. Neuberg und E. Reinfurth, diese Zeitschr. 143, 553, 1923.
2) C. Neuberg und A. Gottschalk, ebendaselbst 146, 164, 1924; 151, 169,
1924; 158, 253, 1925.
3) W. Stepp und I. Rothman-Manheim, ebendaselbst 146, 349, 1924;
dortselbst ausführliche Literaturangaben.
C. Neuberg u. A. Gottschalk: Physi s Verhalten des Acetoins. II. 485
Kaninchen beide Körper subkuta® .verleibt und besonders auf zwei
Produkte gefahndet, die durch Umwandlung aus den beiden Stoffen
hätten hervorgehen können, nämlich auf Milchsáure und 8-Oxy-butter-
säure (bzw. Acetessigsäure oder Aceton). Die Suche nach diesen Sub-
stanzen ist in allen Fällen erfolglos geblieben; auch Zucker war in den
Ausscheidungen nicht zugegen. Dagegen ergab sich, daß im Falle des
Acetoins ein kleiner Teil des dargereichten Ausgangsmaterials un-
verändert in den Harn übertrat, aus dem es in Form des charakte-
ristischen p-Nitro-phenyl-osazens isoliert werden konnte. Gleichzeitig
war der Gehalt des Urins an gepaarter Glucuronsäure unzweideutig
vermehrt. Ob es sich dabei um die Glucuronsäure-verbindung des
Acetyl-methyl-carbinols selber gehandelt hat oder um das Derivat des
zugehörigen $, y-Butylenglykols, ist nicht entschieden.
Das 2,3-Butandiol gibt zu einer sehr reichlichen Bildung gepaarter
Glucuronsäure Anlaß. Daneben tritt kein Acetoin auf, so daß eine
Oxydation des $, y-Butylenglykols zu Acetyl-methyl-carbinol im Tier-
körper jedenfalls nicht in dem Maße erfolgt, daß eine Eliminierung des
freien Keton-alkohols stattfindet. Hinsichtlich der Fähigkeit zur
Paarung mit Glucuronsäure schließen sich diese beiden aliphatischen
Körper einigen anderen Alkoholen dieser Reihe an, so insbesondere dem
Pinakon!) und dem Propylenglykol?).
Zu den Versuchen hat in beiden Fällen razemisches Material
ge o das durch halbseitige oder ganzseitige Reduktion des Diacetyls
gewonnen worden war. Bemerkenswert ist, daß trotz der verabfolgten
r- iv hohen Dosen sich keine Vergiftungserscheinungen, auch keine
‚‚denreizungen (Fehlen von Eiweiß im Urin) bemerkbar gemacht
haben. Das steht in Übereinstimmung mit der erstaunlichen Un-
;‚ftigkeit der beiden genannten Körper auch für die Hefezelle, die aus
Acetaldehyd und Zucker Acetoin bilden und letzteres zu D, y-Butylen-
glykol phytochemisch reduzieren kann). Sowohl Acetoin als Butylen-
glykol wurden von den Versuchstieren reaktionslos vertragen, und man
wird wohl zum mindesten für das Acetoin im Hinblick auf die geringe
Menge des unverändert ausgeschiedenen Materials und die nicht sehr
beträchtliche Paarung mit Glucuronsäure mit einiger Wahrscheinlichkeit
annehmen dürfen, daß es im tierischen Organismus Umsetzungen unter-
liegt oder weitgehend verbrannt wird.
A.
Kaninchen, männlich, 2,275 kg schwer, erhält 3 Tage lang eine gleich-
mäßige Kost, bestehend aus Runkelrüben. Der bei dieser Nahrung ge-
1) H. Tierfelder und 1.v. Mehring, H.9, 513, 1885, sowie J. Pohl,
Arch. f. exper. Pathol. u. Pharm. 1908, Suppl., 427.
2) S. Miura, diese Zeitschr. 36, 25, 1911.
3) C. Neuberg und M. Kobel, diese Zeitschr. 160, 250, 1925.
Biochemische Zeitschrift Band 162. 39
486 C. Neuberg u. A. Gottschalk:
lassene Urin ist frei von Eiweiß, reduziert Fehlingsche Lösung in der Wärme
nicht und gibt nur eine ganz schwache Glucuronsäure-reaktion mit Naphtho-
resorcin.
1. Versuchstag. 10 Uhr vormittags: Das Tier bekam 1 ccm d, l-Acetoin,
in 10 ccm aqua dest. steril gelöst, subkutan injiziert.
11 Uhr 30 Minuten vormittags: Injektion von weiteren 2ccm Acetoin
in 1l5ccm H,O.
2 Uhr nachmittags: Es waren 95ccm Urin entleert. Dieser Urin
reduzierte Fehlingsche Mischung in der Wärme mittelstark und enthielt
keine optisch aktiven Substanzen. Aceton- und Acetessigsäureproben
negativ. Eiweiß nicht vorhanden.
20 ccm des entleerten Harnes werden mit 0,5 g p-Nitrophenylhydrazin,
die in 2,5ccm absolutem Alkohol und 2,5ccm Essigsäure gelöst waren,
21, Stunden im kochenden Wasserbade erhitzt. Es fällt ein in Alkohol
und Essigsäure unlösliches, in Pyridin lösliches Osazon aus. Schmelzpunkt
nach dem Umkristallisieren aus Pyridin-Eisessig 312°. .
2. Versuchstag. 9 Uhr vormittags: 245 ccm Urin. Derselbe reduziert
Fehlingsche Lösung in der Hitze. Die reduzierende Substanz wird von
frischer Hefe nicht vergoren. Polarisation 0. Aceton, Acetessigsäure sowie
Eiweiß abwesend.
9 Uhr 30 Minuten vormittags: Das Tier erhält abermals subkutan
2 ccm Acetoin, in 15 ccm keimfreien Wassers.
3. Versuchstag. 9Uhr 15 Minuten vormittags: 410 ccm Urin, der
die gleichen Eigenschaften wie der Harn des Vortages aufweist.
9 Uhr 30 Minuten: Subkutane Injektion von 2ccm Acetoin in 15 ccm
Wasser.
4. Versuchstag. 9 Uhr vormittags: 455 ccm Urin. Der Harn reduziert
Fehlingsche Lösung in der Wärme. Polarisation 0. Acetonkörper und
Eiweiß nicht nachweisbar.
100 ccm dieses Urins werden mit 1g p-Nitrophenylhydrazin, gelöst
in 5ccm Essigsäure und 5 ccm Alkohol, 21, Stunden im siedenden Wasser-
bade erhitzt. Das ausgefallene Osazon wird abgesaugt, ausgewaschen,
getrocknet, dann 2 Stunden mit Alkohol ausgekocht, abgenutscht und
getrocknet. Aus 100 ccm Harn wurden 0,0914 g rohes Acetoin-p-nitro-
phenyl-osazon vom Schmelzpunkt 270° erhalten. Nach dem Umkristalli-
sieren aus Pyridin-Eisessig lag der Schmelzpunkt bei 309°.
Weitere Untersuchung der vereinigten Harne der vier Versuchstage.
500 ccm Urin (alkalische Reaktion) werden auf dem Wasserbade auf
100 ccm eingeengt. Alsdann Zusatz von 25 ccm 25proz. Schwefelsäure,
wodurch die Flüssigkeit stark kongosauer wird, und Sättigung mit festem
Ammoniumsulfat. Die klar filtrierte Flüssigkeit wird nunmehr 35 Stunden
lang im Perkolator mit Äther ausgezogen. Darauf wird der Äther des
Extraktes an der Luft verdunstet. Die Thiophen-probe auf Milchsäure
ist im Rückstande negativ. Der restierende Teil des Extraktes wird in
15 com Wasser aufgenommen, einige Zeit mit Zinkcarbonat gekocht und
filtriert. Das Filtrat wird auf dem Wasserbade eingeengt und in den Ex-
sikkator gestellt; es kristallisierte nichts aus.
20 ccm Urin + 2cem 50proz. Schwefelsäurelösung 21% Stunden am
Rückflußkühler auf dem Baboblech gekocht, durch Tierkohle entfärbt
und filtriert. Drehung nicht deutlich; Fehlingsche Lösung wird in der
Wärme schwach reduziert. Naphthoresorcin-probe positiv, stärker als im
Urin der Vorperiode.
m
en
Physiologisches Verhalten des Acetoins. II. 487
B.
Männliches Kaninchen im Gewicht von 2,63 kg wird 3 Tage hindurch
wie das andere Versuchstier ernährt. Der bei dieser Kost gelassene Urin
ist frei von Eiweiß, reduziert heiße Fehlingsche Lösung nicht und gibt
nur eine ganz schwache Naphthoresorcin-reaktion.
1. Versuchstag. 10 Uhr vormittags: Das Tier erhält eine subkutane
Injektion von 6ccm reinem d, !-Acetoin, gelöst in 30ccm sterilem Wasser.
Die Einspritzung wird sehr gut vertragen.
2. Versuchstag. 10 Uhr vormittags: 145 ccm Urin. Naphthoresorcin-
probe deutlich positiv. Fehlingsche Lösung wird in der Hitze schwach
reduziert. Polarisation entsprechend 0,8 Proz. Glucose nach links. Aceton
und Acetessigsäure fehlen.
Nach Spaltung des Urins mit Mineralsäure Rechtsdrehung entsprechend
0,5 Proz. Traubenzucker. Deutliche Naphthoresorcin-reaktion. Fehlingsche
Lösung wird in der Wärme kräftig reduziert.
3. Versuchstag. 10 Uhr vormittags: 205ccm Urin; reduziert Fehling-
sche Mischung in der Wärme schwach. Polarisation entsprechend 0,5Proz.
Glucose nach links. Aceton und Acetessigsäure abwesend. Nach Spaltung
des Urins mit Mineralsäure Drehung = 0,35 Proz. nach rechts. Naphtho-
resorcin-reaktion deutlich positiv, Fehlingsche Lösung wird stark reduziert.
Aufarbeitung des vereinten Urins der drei Versuchstage.
200 ccm Urin werden in der oben angegebenen Weise auf Milchsäure
untersucht. Sie konnte weder durch die Thiophen-probe noch als Zinksalz
nachgewiesen werden. Aus dem mangelnden Drehungsvermögen des
verdunsteten Ätherrückstandes ist auch auf die Abwesenheit von ß-Oxy-
buttersäure zu schließen.
C.
Kaninchen, männlich, 1,85 kg schwer, erhält 3 Tage lang eine gleich-
mäßige Kost, bestehend aus Runkelrüben. Der bei dieser Nahrung ge-
lassene Urin ist frei von Eiweiß, reduziert Fehlingsche Lösung in der Wärme
nicht und zeigt nur eine schwache Naphthoresorcin-probe.
Dem Tier werden im Abstande von 5 Stunden zweimal je 5,0 cem reines
PB, y-Bulylenglykol (insgesamt 10,0 cem) in je 40cem sterilem Wasser
subkutan beigebracht. Urinmenge von 48 Stunden: 360 ccm. Eiweiß,
Aceton und Acetessigsäure nicht zugegen. Naphthoresocin-reaktion sehr
stark positiv. Reduziert Fehlingsche Lösung in der Wärme nicht.
10,0ccm Urin werden mit 2g festem Quecksilberacetat!) verrieben,
filtriert, durch H,S entquecksilbert und filtriert. Das Filtrat reduziert
Fehlingsche Lösung nicht. Polarisation entsprechend 0,8 Proz. Glucose
nach links. Nach Spaltung mit Mineralsäure reduziert das dextrogyre
Filtrat Fehlingsche Mischung äußerst kräftig.
300 ccm des nativen Harns werden nach Einengen auf dem Wasser-
bade, Ansäuerung mittels Schwefelsäure und Sättigung mit Ammonium-
sulfat 36 Stunden lang im Extraktionsapparat mit Äther ausgezogen.
Im Extrakt konnte Milchsäure nicht nachgewiesen werden.
1) Siehe C. Neuberg, Der Harn. S. 328.
32 *
Notiz über das Aldehydacetal des Methylglyoxals.
Von
C. Neuberg und 0. Dalmer.
(Aus dem Kaiser Wilhelm-Institut für Biochemie in Berlin-Dahlem.)
Für die ersten Untersuchungen über die enzymatische Dismutation
des Methylglyoxals zu Milchsäure!) hat uns das reine Methylglyoxal
gedient, das durch die grundlegende Untersuchung von J. Meisen-
heimer?) in der für diese Zwecke erforderlichen Qualität zugänglich
geworden war. Das Methylglyoxal wird nach diesem Verfahren aus
seinem Aldehyd-acetal gewonnen, dessen Bereitung von der Dichlor-
essigsáure aus dank der originellen Synthese von A. Wohl und
W. Lange?) möglich ist. Der Weg ist folgender: Dichloressigsäure,
CHCI, .COOH => Diäthoxy-essigester, CH(OC,H;), .COOC,H; > Di-
äthoxy-essigsäure-piperidid, OH (OC, H;) -CO . NCG;Hio — Aldehyd-
acetal des Methylglyoxals, CH(OC,H,),.CO.CH,, — Methylglyoxal,
CHO .CO.CH}.
= Meisenheimer empfiehlt (l. c.), unbedingt nur von reiner Dichlor-
essigsäure aus Chloral auszugehen. Wir haben nun gefunden, daß
man auch die technische Dichloressigsäure?) trotz ihres Gehalts an
mono- und dichlorierter Essigsäure ganz gut verwenden kann. Mono-
und Dichloressigsäure sind wegen ihrer nahezu identischen Siedepunkte
(Kp. 188,5 und 189°) nicht durch Destillation zu trennen. Dagegen
kann man durch zweimalige Fraktionierung am mehrkugeligen Bi-
rektifikator die Hauptmenge der Trichloressigsäure (Kp. 195°) zurück-
halten. Benutzt man die Fraktion vom Siedepunkt 188 bis 189° und
behandelt sie nach der Vorschrift von Wohl und Lange mit so viel
Natriumäthylat, als ob reines dichloriertes Material vorläge, so erhält
man nach anschließender Veresterung nunmehr ein Produkt, aus dem
1) C. Neuberg, diese Zeitschr. 49, 502, 1913; 51, 484, 1913.
2) J, Meisenheimer, Ber. 45, 2635, 1912.
3) A. Wohl und W. Lange, Ber. 41, 3615, 1908.
t) Den Höchster Farbwerken, die uns vor mehreren Jahren ein größeres
Quantum von Riickstánden der Monochloressigsáure-fabrikation über-
lassen haben, sind wir sehr zu Dank verpflichtet.
weree mg A
C. Neuberg u. O. Dalmer: Aldehydacetal des Methyl-glyoxals. 489
unschwer das diäthoxy-essigsaure Äthyl herausdestilliert werden kann;
denn sein Siedepunkt!) (Kp. 1990) ist z. B. von dem des Äthoxy-essig-
esters?) (Kp. 152%) recht verschieden. Mehrfache, sorgfältige Bi-
rektifikation liefert reinen Diäthoxy-essigester. Bei der Wohlfeilheit
der technischen Dichloressigsäure und dem hohen Preise der reinen
Dichloressigsäure (aus Chloral) ist die beschriebene Gewinnungsweise
nicht ohne Wert.
Die Umwandlung des diäthoxy-essigsauren Äthyls in das Aldehyd-
acelal des Methylglyoxals und schließlich in den freien Ketonaldehyd
selbst haben wir mit bestem Erfolge auch nach den Angaben von
H. D. Dakin und H. W. Dudley?) über den y-Diäthoxy-acetessigsäure-
äthylester, CH (OC: H;) CO. CH, . COOC, H;, ausgeführt 4).
Durch das neue Verfahren von H.O. L. Fischer und C. Taube’)
zur Darstellung von freiem Methylglyoxal ist der Weg über das Aldehyd-
acetal entbehrlich geworden. Aber für synthetische Zwecke, beispiels-
weise auch zur Gewinnung des interessanten a-Oxypropion-aldehyds,
ist das Aldehyd-acetal des Methylglyoxals von Bedeutung geblieben,
um so mehr, als eine Acetalisierung des Methyiglyoxals5) dessen T:tra-
äthylacetal ergibt und diese Verbindung keine reaktionsfähige Carbonyl-
gruppe mehr besitzt. Wir haben es deshalb für nicht überflüssig ge-
halten, die erwähnten Erfahrungen mitzuteilen.
1) W. Traube, Ber. 40, 4949, 1907.
2) A. Fölsing, Ber. 17, 486, 1884.
3) H. D. Dakin und H. W. Dudley, Journ. Chem. Soc. London 105,
2453, 1914.
4) Bei der Kondensation mit Essigester empfiehlt sich die Verwendung
von Natrium in Drahtform, was bei Benutzung eines Natriumaufsatzes
keine Schwierigkeiten bereitet.
5) H.O. L. Fischer und C. Taube, B. 57, 1502, 1924.
Über den Mechanismus der Milchsäurebildung bei Bakterien.
Von
C. Neuberg und G. Gorr.
(Aus dem Kaiser Wilhelm-Institut für Biochemie in Berlin-Dahlem.)
Vor 12 Jahren haben C. Neuberg!) einerseits und H. D. Dakin
und H. W. Dudley?) andererseits an tierischen Zellen das regelmäßige
Vorkommen eines Ferments dargetan, das leicht und schnell Milchsäure
aus Methylglyoxal erzeugt. Nach Art der Umwandlung und nach
dem Charakter des Ferments handelt es sich dabei um die Verwirk-
lichung einer inneren Cannizzaroschen Reaktion, um eine Dismutation.
Genau wie die Tätigkeit der Carboxylase rricht spezifisch eingestellt
ist allein auf die Brenztraubensäure, die zum Methylglyoxal gehörige
Säure, sondern sich auch auf deren Homologe und Substitutions-
produkte erstreckt, so greift nach den Feststellungen der beiden
amerikanischen Autoren die Ketonaldehydmutase (von ihnen Gly-
oxalase genannt) die Abkömmlinge des Methylglyoxals ebenfalls an.
Die physiologisch größte Bedeutung besitzt die Entstehung von Milch-
säure aus Methylglyoxal. Die Fähigkeit zur Bildung von Milchsäure
ist nämlich eine der sinnfälligsten Äußerungen der tierischen Zelle.
Neuberg sowie Dakin und Dudley haben bereits den fermentativen
Charakter der Methylglyoxal-umwandlung bewiesen, indem sie zeigten,
daß sie auch durch zellfreie Auszüge von Organen herbeigeführt wird.
Wenn man von der Anschauung ausgeht, daß ein so weit verbreitetes
und kräftiges Ferment wie die Ketonaldehydmutase eine Funktion zu
erfüllen hat, so wird man die Bildung von Milchsäure aus Methyl-
1) C. Neuberg, diese Zeitschr. 49, 502, 1913; 51, 484, 1913.
2) H. D. Dakin und H. W. Dudley, Journ. of biol. Chem. 14, 155,
423, 1913; 16, 505, 1914.
C. Neuberg u. G. Gorr: Mechanismus der Milchsäurebildung usw. 491
glyoxal nicht als eine zufällige Leistung der tierischen Zelle betrachten,
sondern als einen in der Norm sich vollziehenden Vorgang. Die Berechti-
gung für eine solche Schlußfolgerung erscheint um so größer, als auch
für den allgemeinen Mechanismus des Kohlenhydratabbaues ein inter-
mediäres Auftreten von Methylglyoxal mit guten Gründen angenommen
werden darf; daß zudem diese Umwandlung des Methylglyoxals durch
animalisches Ferment in physikalisch-chemischer Hinsicht den Charakter
der typischen Stoffwechselreaktionen trägt, hat jüngst O. Meyerhof!)
dargelegt.
Nun ist aber die Bildung von Milchsäure keineswegs ein Merkmal
der tierischen Zelle, sondern in der ganzen belebten Natur nachweisbar ;
besonders deutlich tritt sie bei den Mikroorganismen zutage. Ist doch
‘die Milchsäure — als ein Erzeugnis der bakteriellen Kohlenhydrat-
spaltung — gerade im Stoffwechsel der Kleinlebewesen entdeckt worden.
Es erhob sich nun die Frage, ob sich auch für Bakterien der
Reaktionsablauf nachweisen läßt, der vom Methylglyoxal zur Milch-
säure führt. Es liegt über diesen Gegenstand bisher nur eine vereinzelt
gebliebene positive Angabe von C. Neuberg vor. Er konnte beobachten,
daß unter bestimmten Verhältnissen?) Hefensaft zugefügtes Methyl-
glyoxal in Milchsäure umwandelt. Nun ist jedoch erwiesenermaßen
bei der Hefe die Kraft, Milchsäure hervorzubringen, sehr schwach aus-
gebildet. Normal lebende Hefe erzeugt überhaupt kein Lactat, und es
ist auch nicht immer mit genügender Sicherheit ausgeschlossen worden,
daß Hefezubereitungen, die Milchsäure ergaben, frei waren von ubi-
quitären Milchsäurebildnern aus dem Reiche der Bakterien. Wir haben
es deshalb für wichtig gehalten, die Frage mit garantierten Rein-
kulturen eines Milchsäure produzierenden Bacillus zu prüfen. Wir
berichten zunächst über das Verhalten des Bacterium coli, mit dem
man bekanntlich aus Zucker sehr reichlich Milchsäure erhält.
Wir haben gefunden, daß Milchsäurebakterien das Methylglyoxal
rasch und quantitativ in Milchsäure umwandeln. Dabei entstand.
ausschließlich die racemische Säure, wie sie auch bei der Milchsäure-
gärung von Zucker zumeist?) auftritt.
Wenn wir hinzufügen, daß nach Erfahrungen des hiesigen Institute,
über die später berichtet werden soll, andere pflanzliche Zellen eben-
falla Methylglyoxal angreifen, so kann an der Verbreitung dieses
Mechanismus der Milchsäure-entstehung auch bei vegetabilischen
Zellen kein Zweifel obwalten.
1) O. Meyerhof, diese Zeitschr. 159, 432, 1925.
2) C. Neuberg, ebendaselbst 51, 506, 1913.
3) Vgl. hierzu .4. Mc Kenzie, Chem. Centralbl. 1905, II, 1527.
492 C. Neuberg u. G. Gorr:
Das labile Methylglyoxal wird durch die Colibazillen zu Milch-
säure stabilisiert, die offenbar gegen die Erreger widerstandsfähig ist.
Dieser Umstand vermag auci zu erklären, warum W.C. de Graaff und
A.J.LeFevre!) im Verlauf ihrer bemerkenswerten Untersuchungen
über bakterielle Gärungen aus Methylglyoxal (bei Anwendung des
Abfangverfahrens) keinen Abbau zu Acetaldehyd konstatiert haben.
Läßt man das Bacterium coli auf Methylglyoxal einwirken, so
erfolgt, wie gesagt, die Umwandlung in Milchsäure quantitativ. Damit
wird zugleich der Anschluß an die von A. Harden?) aufgestellte Ideal-
gleichung der Coli-gärung erreicht. Der genannte Forscher hat gezeigt,
daß unter günstigen Verhältnissen die Umsetzung praktisch gemäß
der Gleichung:
20,H,,0, + H,0 = 20H,.CHOH.COOH + C,H,OH
+CH,.000H +2C0,+2H,
verläuft.
Diese Formulierung kann, wie früher dargelegt worden ist3), nach
dem heutigen Stande des Wissens in folgender Weise aufgelöst werden:
a) 20,H,,0, = 2CH,.CHOH.COOH + 2CH,.C0.COOH + 2H,,
ß)2CH,.CO.COOH = 2CH,.COH + 2C0,,
y)2CH,.COH + H,O = C,H, OH + CH, .COOH.
Diese Deutung besagt, daß die Vergärung der Hexose durch das
Bacterium coli im Grunde ähnlich vor sich geht wie durch Hefe. Von
dem intermediär entstehenden Methylglyoxal werden zwei Moleküle
zu Milchsäure stabilisiert; mit zwei weiteren Molekülen bzw. ihrem
Zuckeräquivalent erfolgt eine Umwandlung analog den Erscheinungen
bei der dritten Vergärungsform, nur mit dem Unterschiede, daß der
„Gärungswasserstoff‘, der bei der Erhebung des Methylglyoxals auf
die Brenztraubensäure-stufe disponibel wird, hier auf keinen Akzeptor
übertritt, sondern in molekularem Zustande frei entweicht. Inzwischen
hat F. Windisch in unserem Laboratorium mit Colibakterien auch die
Dismutation des Acetaldehyds zu äquimolekularen Mengen Essigsäure
upd Äthylalkohol durchgeführt; dabei kann das Ausgangsmaterial auch
Brenztraubensäure sein, die sich somit auf neue Weise als die Vorstufe
des Äthylalkohols und der physiologisch vielleicht noch wichtigeren
Essigsäure erweist. Die Angreifbarkeit der Brenztraubensäure durch
dieselben Erreger?) ist außer Zweifel gestellt. Somit kann das
1) W.C.de Graaff und A.J. Le Fèvre, diese Zeitschr. 155, 313, 1925.
2) 4. Harden, Journ. of Chem. Soc. 79, 610, 1901.
3) C. Neuberg und F.F. Nord, diese Zeitschr. 96, 139, 1919.
4) Vgl. G. Wagner, Centralbl. f. Bakt. 71, [I], 33, 1913.
Mechanismus der Milchsäurebildung bei Bakterien. 493
modifizierte Schema für die Vorgänge bei der Coligärung in weit-
gehendem Maße als bewiesen gelten.
Die Überführung des Methylglyoxals in Milchsäure durch die
Colibazillen geschah in folgender Weise:
Die auf Bierwürze-Agar gewachsenen Bakterien wurden mit einer
flüssigen Bierwürze abgeschwemmt, in der dieselben Erreger gezüchtet
worden waren. Die so gewonnenen Kulturen von 90 Platten wurden in
großen, 500 ccm fassenden Nickelbechern zentrifugiert und dreimal mit
physiologischer Kochsalzlösung nach dem Aufrühren in denselben
Metallgefäßen gewaschen. Die unter allen Kautelen durchgeführten
Manipulationen lieferten eine hell-bräunliche Bakterienmasse.
a) Zur Verwendung gelangte — nach Ermittlung an einer kleinen
Probe — eine Bakterienmenge entsprechend 5,4g Trockensubstanz.
Diese wurde in 980 ccm keimfreier physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert und nach Zugabe von 10g Calciumcarbonat (bei 1300
entkeimt) mit 20,0 ccm einer 4,85proz. Methylglyoxallösung versetzt.
Das Gemenge blieb in einem sterilen Gefäß mit WatteverschluB im
Brutschrank bei 37° stehen.
b) Zur Kontrolle wurden 5,0 ccm derselben Methylglyoxallósung
mit 245 ccm physiologischer Kochsalzlósung und 2,5 g Calciumcarbonat
zusammengebracht und bei 37% aufbewahrt. Beide Flüssigkeiten be-
saßen also denselben Gehalt an Methylglyoxal = 0,97 Proz. Der
Gehalt an Methylglyoxal war nach der recht genauen Nitrophenyl-
osazonmethode!) ermittelt. |
Während im bakterienfreien Ansatz b) nach 18 Stunden das
Methylglyoxal noch in größten Mengen nachweisbar war, ist es im
Versuch mit den Colibakterien vollständig verschwunden gewesen.
(Prüfung mittels p-Nitrophenylhydrazin in einem kleinen abgeschleu-
derten Quantum.)
Wir haben deshalb zu diesem Zeitpunkt zu beiden Ansätzen noch
jeweils die gleiche Menge Methylglyoxallösung, wie ursprünglich, hinzu-
gefügt. Diese wurde von den Bakterien in weiteren 24 Stunden sben-
falls restlos verarbeitet, während im Blindversuch auch nach dieser
Zeit bedeutende Mengen Methylglyoxal vorhanden waren.
Um die freiwillige Umwandlung von Methylglyoxal zu Milchsäure
zu kontrollieren, haben wir nach dem Nitrophenylosazon-Verfahren in
der Blindprobe b) die restierende Quantität Methylglyoxal ermittelt.
1) C. Neuberg, E. Färber, A. Levite und E. Schwenk, diese Zeitschr.
88, 263, 1917.
494 C. Neuberg u. G. Gorr:
Wir fanden genau 70 Proz. wieder, wobei zu bemerken ist, daß durch
die Bestimmungsmethode in verdünnten Lösungen eher zu wenig als
zu viel Methylglyoxal angezeigt wird.
Für die Kennzeichnung der Milchsäure schien es uns in diesem
grundsätzlich wichtigen Falle angebracht, nicht eines der indirekten
Verfahren oder eine der analytischen Methoden anzuwenden, die auf
der Umwandlung der anwesenden Substanz in Acetaldehyd beruhen.
Wir haben vielmehr die Milchsäure als kristallisiertes Zinklactat isoliert.
Zu diesem Zwecke wurde die, wie erwähnt, vollkommen methyl-
glyoxalfrei gewordene Flüssigkeit des Ansatzes a) aufgekocht und
filtriert. 950 ccm klares Filtrat wurden im Faust-Heimschen Ver-
dunstungskasten auf 300 ccm eingeengt und mit 10 ccm konzentrierter
Salzsäure sowie mit 2g Sublimat versetzt. Es trat nur ein geringer
Niederschlag auf, der nach 24stündigem Stehen im Eisschrank be-
seitigt und ausgewaschen wurde. Das klare Filtrat wurde mit Schwefel-
wasserstoff entquecksilbert. Das Quecksilbersulfid setzte sich gut ab
und wurde ausgewaschen. Das durch einen Luftstrom vom H,S befreite
Filtrat wurde mit Natronlauge genau neutralisiert, mit verdünnter
Salzsäure ganz schwach angesäuert und im Vakuum auf 100 ccm ein-
geengt. Alsdann wurde mit 15 ccm 60 Proz. P,O; enthaltender Phosphor-
säure angesäuert und mit festem Ammoniumsulfat gesättigt. Dabei
schied sich Gips ab, der am nächsten Tage abfiltriert und mit gesättigter
Ammoniumsulfatlösung ausgewaschen wurde. Die klare Flüssigkeit
wurde dann im Perkolator 36 Stunden mit Äther extrahiert und der
Rückstand in der schon von E. Salkowski!) empfohlenen Weise ge-
reinigt, d.h. auf dem Wasserbade zur Vertreibung flüchtiger Säuren
mit H,O erwärmt und dann mit alkalifreiem Bleicarbonat nach Zugabe
von 200 ccm destillierten Wassers 1 Stunde lang gekocht. Nach Ab-
kühlung in Eis wurde von den festen Bleisalzen abfiltriert. Dieselben
wurden mit Eiswasser ausgewaschen; die wasserklare Flüssigkeit wurde
mit Schwefelwasserstoff entbleit. Nach Austreibung von H,S durch
einen Luftstrom wurde mit reinem Zinkcarbonat 11, Stunden im
siedenden Wasserbade erhitzt, dann wurde eingedunstet und die
konzentrierte Flüssigkeit in ein gewogenes Glasschälchen übergepült.
Beim weiteren Einengen kristallisierte der Inhalt nahezu vollständig.
Er wog 1,98g und bestand aus den charakteristischen Krusten von
milchsaurem Zink. Diese wurden mit wenig Wasser verrührt, ab-
genutscht und dann aus heißem Wasser umkristallisiert, aus dem sich
sofort reines Zinklactat abschied. Dasselbe wurde nach 24stündigem
Stehen abgesaugt, mit Eiswasser gewaschen und an der Luft zur
1) E.Salkowski und W. Leube, Die Lehre vom Harn, Berlin 1882, S. 126;
E. Salkowski, H. 68, 240, 1909.
Mechanismus der Milchsäurebildung bei Bakterien. 495
Gewichtskonstanz getrocknet. Gemäß den Analysen lag racemisches
Zinklactat vor.
0,1621 g Substanz gaben bei 105% 0,0290g H,O ab.
0,1173 g entwässerte Substanz lieferten 0,0394 g ZnO!).
0,1015g Substanz ergaben 0,0340 g ZnO.
(C,H,O,),Zn + 3H,0O. Ber.: H,O = 18,18; gef.: 17,89 Proz.
(C¿H,0,)¿Zn. Ber.: ZnO = 33,47 Proz.; gef.: 30,50 und 30,49 Proz.
Ein Körnchen der Substanz lieferte auf das intensivste die Milch-
sáurereaktion mit Thiophenlösung nach Fletcher und Hopkins.
Die polarimetrische Prüfung mit einer Auflösung von 0,1202 g
wasserfreien Zinksalzes in 10,0 ccm Wasser ergab keinerlei Ablenkung;
auch die Mutterlauge, in der das leichter lösliche Zinksalz einer aktiven
Modifikation sich hätte befinden können, zeigte kein Drehungsver-
mögen.
1) Bestimint nach R. Willstaetter und A. Pfannenstiel, Ann. 358, 250,
1907/08.
Über eine Reaktion der Fructose mit Alanin.
Von .
C. Neuberg und M. Kobel.
(Aus dem Kaiser Wilhelm-Institut für Biochemie in Berlin-Dahlem.)
Seit langem weiß man, daß Aminosäuren mit Kohlenhydraten
reagieren können. Dies macht sich namentlich bei der hydrolytischen
Spaltung von Proteinen bemerkbar, die Kohlenhydrate als Bestandteile
oder Beimengungen enthalten. Schon in der älteren Literatur finden
sich zahlreiche Angaben über die gemeinsame Beteiligung von Zucker-
arten und Eiweißbausteinen an der Entstehung von Melaninen und
` Huminstoffen!). Bei einigen synthetischen Aminosäuren der aroma-
tischen Reihe sind gut kristallisierte Umsetzungsprodukte mit Aldosen
beobachtet. So vereinigt sich nach den wenig bekannt gewordenen
Versuchen von B. Schilling?) die 1, 2, 3-Diaminobenzoesäure (y-Diamino-
benzoesäure) mit Glucose, Maltose und Lactose zu Verbindungen. denen
der stickstoffhaltige Ring des Benzimidazols zugrunde liegt, indem
beispielsweise dem Derivat des Traubenzuckers die Konstitution
HOOC H
deg
i H ¿EACH OH),—CH,OH
Se
zuzuerteilen ist. Eine Reaktion zwischen gewöhnlichen Amino-
sáuren und Zuckerarten hat L.C. Maillard?) zum Gegenstand em-
1) Vel. F. Samuely, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 2, 335, 1902.
2) B. Schilling, Ber. 34, 902, 1901; s. auch P. Griess und G. Harrox,
Ber. 20, 2210 und 3110, 1887.
3) L.C. Maillard, C.r. 154, 66, 1912.
C. Neuberg u. M. Kobel: Über eine Reaktion der Fructose mit Alanin. 497
gehender Untersuchungen gemacht und damit viel zur Klärung
jener Melanoidinbildung beigetragen, die schon früheren Forschern
aufgefallen war, wenn sie Eiweißspaltprodukte mit Kohlenhydraten
zusammentreffen sahen. Der Autor hat gezeigt, daß beim Kochen
hochkonzentrierter Lösungen von Zucker mit Aminosäuren unter
Entwickelung von Kohlensäure und Abspaltung von Wasser dunkel
gefärbte Kondensationsprodukte entstehen, wobei nach seinen An-
gaben 12 Mol. Wasser und 1 Mol. Kohlendioxyd austreten. Er nimmt
an, daß in dieser Weise 2 Mol. Zucker mit 1 Mol. Aminosäure reagieren.
Dieselbe Umsetzung erfolgt nach Angabe von Maillard innerhalb
mehrerer Tage auch bei 37% und — noch viel langsamer — selbst bei
niederer Temperatur, bemerkbar an der Huminbildung und Abgabe
von Kohlensäure. Zu analogen Ergebnissen gelangte C.J. Lintner!) in
Versuchen, die bei 100° angestellt waren. Bei hohen Temperaturen und
starken Konzentrationen haben auch S. Kostytschew und W. Brilliant?)
ähnliche Körper wie Maillard erhalten. Dagegen hat N. N. Iwanoff?)
mit verdünnten Lösungen der Komponenten nur dann Umsetzungen
erzielt, wenn Natronlauge zugegen war und Wochen und Monate hin-
durch auf mindestens 58° erhitzt wurde. Auf den Eintritt einer Reaktion
schließt dieser Forscher aus der Abnahme des nach van Slyke nachweis-
baren Amidstickstoffs. Übrigens hat Iwanoff die von Maillard an-
gegebene Kohlensäureentwicklung nicht wahr nehmen können.
Anscheinend gänzlich verschieden von dem Mechanismus der
erwähnten Reaktion ist die Umsetzung des Fruchtzuckers mit d, 1-
Alanin, die wir im folgenden beschreiben wollen.
Mischt man bei Zimmertemperatur eine Fruchtizuckerlösung mit
einer Lösung von d, l-Alanin, so findet man eine momentan eintretende
Erhöhung der Linksdrehung. Da racemisches Alanin verwendet wurde,
das synthetisch bereitet war und sein mangelndes Drehungsvermögen
in allen Kontrollversuchen zu erkennen gab, so handelt es sich offenbar
um eine Reaktion zwischen den beiden Körpern. Als Kontrollen dienten
die Vergleiche mit der Drehung, welche dieselbe Fruchtzuckerlösung
auf Zugabe einer der Alaninlösung gleichen Wassermenge aufwies.
Selbstverständlich ist jeder Blind versuch stets in demselben Polarisations-
rohr ausgeführt worden, wie der Hauptversuch, und zum Abmessen
wurden immer die gleichen geeichten Pipetten benutzt. Die Frucht-
zuckerlösung, ursprünglich warm bereitet, war 24 Stunden alt und von
endgültigem Drehungswert.
1) C.J. Lintner, Chem. Centralbl. 1913, I, 969.
2) S. Kostytschew und W. Brilliant, zitiert nach N. N. Iwanoff, diese
Zeitschr. 120, 7 und 15, 1921.
3) N. N. Iwanoff, diese Zeitschr. 120, 1, 1921.
498
Die Erscheinung tritt mit Fructose und Alanin so gleichmäßig
und sicher ein, daß irgendwelche Versuchsfehler nicht in Betracht
kommen. Ein besonderes Argument hierfür liegt auch darin, daß eine
Lösung von Traubenzucker unter sonst gleichen N dieses
. C. Neuberg u. M. Kobel:
Phänomen nicht zeigt.
Die Einzelheiten ergeben sich aus folgenden Tabellen:
Tabelle 1.
m, 2m, 3m Fructoselösung + m Alaninlösung.
3
5 ccm 2 m Fructoselösg
2 (Vergleich)
5 ccm m Fructoselösung 5 ccm m Fructoselösung
+ 5ccm m Alaninlósung + 5 com H20
— 7,940 — 7,800
— 7,95 | 7.78
— 7,94 7238
— 7,96 — 7,79
— 7,97 — 7,79
— 7,95 — 7,79
— 7,95
— 7,95
< — 0,160,
4 (Vergleich)
5ccm 2m Fructoselösg
5 com 2m Fructoselösg
leich)
5 = e Me ar TA
+ 5ccm m Alaninlösg + Beem H,O t 3 ccm m Alaninlósg + 5ccm H,O
— 16,360 — 16,06° ' — 16,490 — 16,16°
— 16,36 — 16,05 — 16,48 — 16,16
— 16,35 — 16,03 — 16,47 — 16,15
— 16,34 — 16,04 I — 16,49 — 16,15
— 16,35 — 16,03 ` — 16,48 — 16,14
— 16,34 — 16,03 | . —1650 — 16,16
— 16,34 — 16,03 — 16,50 — 16,16
— 16,34 e — 16,03 — 16,50 — 16,16
4 = 0,31° I — 0,340,
7 8 (Vergleich): | 9 10 (Vergleich)
5ccm 3m Fructoselösg 5ccm 3m Fructoselösg || 5ccm 3 m Fructoselösg | 5ccm 3 m Fructoselösg
Go 5 ccm m Alaninlösg 5 ccm H,O |+ 5 ccm m en | + 5com H20
— 25,120 — 24,770 i — 25,540 | — 25,16°
— 25,10 — 2478 , — 2554 | — 25,17
— 25,10 — 24,78 | — 25,55 — 25,17
— 25,11 — 24 76 — 25,56 | — 25,18
— 25,11 — 24,75 — 25,55 | — 25,18
— 25,10 — 24.75 1 — 2556 | —2518
— 25,11 — 24,75 ` — 25,56 | —25,18
— 25,11 i | — 25,56 |
J — 0,360 J — 0,380
Über eine Reaktion der Fructose mit Alanin. 499
Tabelle II.
m, 2m, 3m Fructoselösung + 2m Alaninlösung.
1 2 (Vergleich)
5 ccm m Fructoselösg 5ccm m Fructoselösg
+5ccm 2m Alaninlösg + 5ccm H2O
— 7,980 — 7,730
— 7,98 7
— 7,99 713
— 7,99 —7,74
— 7,98 173
— 7,9 = 773
— 7,98
— 7,98
92 a 0,250,
| 4 (Vergleich) ` 6 (Vergleich)
5ccm 2m Fructoselösg | 5ccm 2m Fructoselösg Beem 2 m Fructoselösg 5ccm 2 m Fructoselösg
+5ccm 2m Alaninlosg | +5ccm H20 + 5ccm 2m Alaninlosg . + 5cum H,O
— 15,680 — 15,230 | — 16,800 — 15,830
— 15,69 — 15,25 — 16,30 — 15,84
— 15,70 — 15,24 — 16,31 — 15,84
— 15,67 — 15,23 + — 16,32 — 15,83
— 15,67 — 15,24 © — 16,30 — 15,84
— 15,68 | — 15,24 d — 16,30 — 15,83
— 15,67 | — 15,23 S — 16,30 — 15,84
— 15,77 | —1524 | | — 15,84
— 15,24 . | — 15,84
I — 0,430. i J -— 0,460,
8 (Vergleich) | 9 10 (Vergleich)
5cem 3 m Fructoselósg | 5ccm 3 m Fructoselösg |5 ccm 3m Fructoselösg | 5cum 3 m Fructoselósg
+ 5ccm 2 m Alaninlösg + 5ccm H,O "+ 5 ccm 2m Alaninlósg +5ccem H,O
— 24,850 00 24,210 j — 25,820 | — 25,150
— 24 88 0024,23 — 25,82 — 25,16
— 44,86 — 24,23 0025,85 2516
— 24,87 000 24,22 | — 25,84 | — 25,17
— 24,86 o 194.93 © — 25,83 | — 25,15
— 24,87 — 24,22 | — 25,83 | — 25,15
— 4,87 |- 224.98 | — 25,82 | — 25,15
— 4,87 — 24,23 — 25,82 — 25,16
— 24 22 — 25,82 — 25,15
— 24,22 — 25,15
A - ap `
500 C. Neuberg u. M. Kobel:
Tabelle III.
m, 2m, 3m Glucoselósung + 2m Alaninlósung.
2 (Vergleich)
5 ccm m Glucoselösg 5 ccm Ge Glucoselósg
+ 3 eem 2m Alaninlösg +5ccm H,O
4,40° | 4,380
4,40 4,38
4,41 4,39
4,40 4,39
4,40 4,38
4,39 4,39
4,40 4,39
4,40 4,38
4,39
4,39
4 = 0,010
4 (Vergleich) 6 (Vergleich)
5 ccm 2 m E H 5ccm 2m a 5ccm 3m sold 5 ctm 3m Clucoselósg
= Scem 2 2m Alaninlösg + S ccm H + 5 ccm 2m Alaninlósg 5ccm H20
9,020 | 9,040 | 13,820 13,820
9,02 9,05 | 13,83 13,82
9,01 | 9,05 | 13,83 Ä 13,82
9,03 | 9,04 13,82 13,83
9,02 | 9,04 13,83 | 13,83
9,02 9,03 13,82 13,82
9,02 | 9,04 4 13,82
| 9,04 | |
ys ia 0,020, | J = 0,000.
Die mitgeteilten Versuche stellen zugleich einen neuen Beweis fiir
die verschiedene Reaktionsfähigkeit!) von Glucose und Fructose dar,
die sich in manchen chemischen und biologischen Beziehungen zu er-
kennen gibt, unseres Wissens aber gegenüber Aminosäuren sich bisher
nicht offenbart hat.
In diesem Zusammenhange wollen wir erwähnen, daß durch das Tier-
experiment K. Spiro?) folgendes gefunden hat: Nach gleichzeitiger intra-
venöser Applikation von Fructose und Glykokoll tritt bei Kaninchen zwar
nicht regelmäßig, sondern in Abhängigkeit von individuellen Verhältnissen
2, 5-Pyrazin-dicarbonsáure im Harn auf, deren Bildung auf Oxydation
von intermediär erzeugtem Fructosazin bezogen wird. Das Fructosazin
entsteht aus Fructose plus Ammoniak (ebenso wie aus freiem Glucosamin )
1) Vergl. H +. Euler u. R. Nilsson, H. 145, 193, 1925.
2) K. Spiro, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 10, 285, 1907.
Über eine Reaktion der Fructose mit Alanin. 501
durch Kondensation und Oxydation; es ist nach K. Stolte!) als 2, 5-Di-
tetraoxybutyl-pyrazin aufzufassen.
Unsere Versuche über die schnell verlaufende Reaktion zwischen
Fructose und Aminosäuren sollen nach mehreren Richtungen und unter
verschiedenen Verhältnissen fortgesetzt werden; insbesondere wollen
wir andere Zucker sowie optisch-aktive Aminosäuren prüfen. Wir
wollen noch bemerken, daß bei den von uns gewählten Bedingungen,
Zimmertemperatur, auch in Wochen weder Melaninbildung noch Kohlen-
säureentwicklung festzustellen gewesen ist.
1) K. Stolte, Beitr. z. chem. Physiol. u. Pathol. 11, 19, 1908.
Nachtrag zu den Autolysestudien. V.
Von
P. Rona, E. Mislowitzer und S. Seidenberg.
(Diese Zeitschr. 162, 87, 1925.)
Während der Drucklegung erschien die Arbeit von D @yörgy:
„Über den autolytischen Abbau organischer Phosphorverbindungen
in den Geweben‘, diese Zeitschr. 161, 157, 1925. Wie ersichtlich,
sind unsere experimentellen ee mit denen von György in
guter Übereinstimmung.
Leider ist die Anführung der Arbeit von Sevringhaus: ,,Post-
mortem acidity Iu. II“, Journ. of biol. Chemistry 57, 181 bis 197, 1923,
durch ein Versehen unterblieben, was jetzt nachgeholt werden soll.
Biochemische Zeitschrift Band 162 33
Autorenverzeichnis.
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Aszodi, Zoltan.
splenektomierten weißen Ratte.
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— Tierische Kalorimetrie. VI. Mit-
teilung: Milzexstirpation und
Energieumsatz. S. 128.
Bing, H. I. und H. Heckscher. Unter-
suchungen über Fett-Cholesterin-
Das Blutbild der |
` lwanoff, Nicolaus N. Über den
Eiweißstoff des Protoplasmas der
Myxomyceten. S. 441.
— Über den Ursprung des von
Schimmelpilzen ausgeschiedenen
Harnstoffs. S. 425.
|
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|
|
mengen im Blute bei Adipositas `
und Myxödem. S. 32.
Bloch, Br. und F. Schaaf. Pigment- |
studien. $. 181.
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Dold, H. und E. Freudenberg. Be-
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bei Myxomyceten. S. 455.
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Kationenwirkungen. S. 207.
| Karczag, L. und G. v. Farkas. Kata-
phoreseversuche an pathologischen
Organen. I. S. 28. |
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Beeinflussung der Zellpermea-
bilität durch den Sympathicus.
S. 18.
Karczag, L. und L. Nemeth. Über
Elektropie. VIII. Mitteilung: Vital-
chemoskopie unter verschiedenen
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Über
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Gárung der Hefe. S. 43.
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Verhalten des Acetoins im .Tier-
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gemeng
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Schaaf, F. a Br. Bloch.
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Smorodinzew, J. A. und C. S. Lemberg.
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den Einfluß der Chininsalze auf
das Magenpepsin. S. 266.
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durch Hydrolyse von Adenyl-thio-
zucker der Hefe entstehenden
schwefelhaltigen Zucker. S. 413.
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über Diastase. II. Mitteilung:
Wirkt a-Diastase auch f-diasta-
tisch, und umgekehrt ß-Diastase
auch a-diastatisch ?_ S. 228.
Untersuchungen über Diastase.
Illa. Mitteilung: Über die Ge-
schwindigkeit der unter Ver-
mittlung von a-Diastase ver-
laufenden Stärkehydrolyse. S.236.
Szent-Györgyi, A. v. Zellatmung.
IV. Mitteilung: Über den Oxy-
dationsmechanismus der Kar-
toffeln. S. 399.
Zilahy, N. a L. Karczag.
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