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中 华农 业 科 教 基金 会 简介

中华 农业 科教 基金 会 经 中 国人 民 银 行 批 准 , 民 政 部 注
册 登 记 , 于 1995 年 12 月 20 日 成 立 。 基金 会 得 到 国家 科 委 、
中 国人 民 银 行 . 民 政 部 .农业 部 等 部 委 的 大 力 支持 ;得 到 国
内 外 企业 界 、. 知 名 人 士 的 积极 响应 。 基 金 会 归口 农业 部 管
理 ,接受 中 国人 民 银 行 和 民政 部 监督 。

中 华农 业 科 教 基 金 会 的 宗旨 是 :通过 广泛 吸收 国内 外
和 社会 各 方面 的 资金 ,用 以 支持 中 国 农业 科教 事业 ,补充 国
家 主 渠 道 对 农业 科技 的 投入 ,以 加 快 实施 “科教 兴 农 ?战略 。

中 华农 业 科 教 基 金 会 的 任务 是 :发 展 农业 科教 事业 , 推
动 农业 科技 进步 ,提高 农业 劳动 者 素质 ,促进 中 国 农业 发 展
和 农村 经 济 繁荣 。 基 金 会 资助 农业 基础 研究 应 用 研究 、 坛
验 击 范 、 成 果 推广 和 农业 科教 前 沿 重大 课题 的 研究 ;资助 有
突出 贡献 和 有 发 展 潜力 的 中 青年 农业 科技 人 才 ; 资 助 优秀
农业 科技 著作 的 出 版 ;奖励 在 中 国 农业 科教 事业 中 做 出 重
要 贡献 的 个 人 。

中 华农 业 科 教 基 金 会 将 根据 政府 制订 的 农村 经 济 发 展
规划 ,定期 公布 资助 方向 .资助 项 目的 遵 选 实行 “公开 申请 ，
专家 评审 ,民主 公正 ,择优 资助 ”原则 .基金 会 建立 严格 的 筹
资 .管理 和 使 用 制度 ,公正 、 合 理 、 规 范 . 科 学 有效 地 使 用 农
业 科 教 基金 ,向 捐 内 者 公开 收 支 帐 目 , 接 受 监督 。

中 华农 业 科 教 基金 会 热忱 欢迎 国内 外 企业 、 社 团 、 各 界
人 士 向 本 基金 会 捐 风 资金 ,本 基金 会 可 根据 捐 内 者 的 意愿 ，
设立 名 人 基金 .专项 基金 等 。

分 子 生 物 学
(第 二 版 )

间 隆 飞 ” 张 玉麟 ”主编

中 国 农业 大 学 出 版 社

图 书馆

II

图 书 在 版 编目 (CIP) 数 据

分 子 生物 学 / 净 隆 飞 , 张 玉 麟 主编. 一 2 版 . 一 北京 ;中国
农业 大 学 出 版 社 ,1997. 8
IJSBNs7-81002-843-X

I 人 分” 工 .包间 …@ 张 … 开 . 分 子 生物 学 N.Q7

中 国 版 本 图 书馆 CIP 数据 核 字 (97) 第 00994 号

主 编 : 韶 隆 飞 ” 张 玉麟

编 者: 李 明 启 ” 齐 顺 章 ， 曹 淡 君 ， 陈 祖 洁
杨 礼 锐 “于 嘉 林 王 荣 臣 “” 效 小 松
净 隆 飞 ” 张 玉麟

责任 编辑 : 赵 玉 生
封面 设计 : 郑 川

加 中 国 农业 大 学 出 版 社

销 ， 新 华 书店 2
刷 村 北京 丰 华 印 刷 厂 印刷 所
“1997 年 8 月 第 2 版

1997 年 8 月 第 1 次 印刷

16 ”印张 32.25 千 字 798 .二
787X1092

1 一 5000

42. 00 元

讲 吕 洪 注 加 机 加 疏 涉 正
字 泣 吉 计 并 兴

邮政 编码 :100094 电话 :(010)62892620
社 址 :北京 市 海淀 区 圆明园 西 路 2 号

再 版 前 言

随 着 现代 科学 技术 突飞猛进 地 发 展 , 生 物 科 学 也 正经 历 着 激烈 的 变化 。 在 这 一 转变 中 ,最
突出 的 是 分 子 生 物 学 渗 人 到 各 个 学 科 之 中 ,如 细胞 生物 学 、 发 育 生物 学 .遗传 学 .神经 学 .生物
学 、 免 疫 学 .病毒 学 、 微 生物 学 ,生理 学 等 都 几乎 无 一 例外 .因此 ,在 高 等 院 校 各 专业 的 研究 生 教
学 中 开设 分 子 生 物 学 课程 ,作为 有 关 专 业 的 必修 课 或 选修 课 , 对 提高 研究 生 的 业务 水 平 , 是 至
关 重 要 的 。

本 书 是 为 了 适应 当前 研究 生 教学 的 需要 而 编写 的 。 它 既是 一 本 教材 ,又 是 一 本 专著 。 第 一
版 已 人 选 为 "当代 科 技 重 要 著作 “农业 领域 "丛书 我们 根据 第 一 版 在 使 用 时 发 现 一 些 问题 , 修
订 时 在 章节 安排 上 做 了 适当 地 调整 ,对 真 核 生 物 基 因 组 结构 及 其 表达 调控 的 内 容 予以 加 强 。 在
其 余 各 章节 也 适当 地 补充 了 新 内 容 , 使 读者 能 了 解 分 子 生物 学 的 新 进展 。

由 于 分 子 生 物 学 的 发 展 极其 迅速 ,文献 资料 浩如烟海 ,编者 虽 尽力 吸收 各 方面 的 研究 材
料 , 但 挂 一 漏 万 之 处 在 所 难免 , 尚 希 读者 不 音 惠 予 指正 。

编 者
1997 年 5 月

际 主 二 亲 让

“说 证 呈 人 St
“ 娩 上 光

第 一 节 ” 分 子 生物 学 的 含义 …
第 二 节 “分 子 生物 学 发 展 简 史 …

第 三 节
第 四 节

第 五 节

分 子 生物 学 在 生命 科学 中 的 人 位置 oo so。o。
分 子 生 物 学 的 现状 和 展望 9
第 二 章 生命 的 物质 基础 …………………………… ooosooooooossosoooosoooooooooooooooorooooooooooooooooooseooooo。
生命 是 物质 进化 的 产物 站 pp 。
生命 的 分 子 逻 辑 osoooeovoooooooooosooosooooooooooooooooo
生物 分 子 aossosoosssoeooooeooooosoooooooooooooooooooooooooooooooiooooooooooeooseooyoooooooooos
生物 分 子 的 强 键 和 弱 键 aoooesoosoooeoooooooooooooosooooooooooooosooooooiooooooooossooooosoo
生命 系统 和 热力 学 woweoeoooososoooosooosooooooooooooooooooooooooooooooooooooseooeooboooooos

生物 大 分 子 的 构象 及 其 组 装 ，

原核 细胞 、
大 肠 杆菌 “
真 核 细 胞 “

第 四 章 “DNA 的 结构 …

第 一 节

DNA CT

多 核 苷 酸 链 …
DNA hs,-

Z-DNA …
DNA 的 变性 和 复 性 …

DNA 的 形状 、 大 小 和 库 列 组 织 0

DNA 的 精细 结构 …
超 螺旋 DNA

”拓扑 异 构 酶 …

第 十 一 节 绿色 质 的 结构

第 十 一 节 一 些 DNA 户 二 站 汪 和 本
第 十 三 和 DNA 2 ssewesessweoswwowovwwoosyoessooooseeovossesssosss

第 五 章 DNA 和
第 一 节 DNA 复制 概 狐

第 二 节 DNA 的 复制 酶 和 相关 和 蛋白 osieee ee eee seeeee oseieesossi5eoedagi。 iso 二, 二 总 。 圾 号 二

蛋白 质 与 共 woweoesoooooooooooooooooosoooeooooososooooooooooooooosoo。

原核 细胞 1

A-DNA 和 B-DNA 结构 的 多 态 性 Re

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第 三 节
第 四 他
第 五 节

第 一 节
第 二 节
第 三 节
第 四 节

引言
同 源 重组 pe
位 点 专 一 性 重组 站 pe

转 座 重组 ee
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第 七 章 RNA 的 合成 ，

第 一 节
第 二 节
第 达 节
第 四 节
第 五 节
第 六 节
第 七 节
第 八 节
第 九 节

引言

RNA 酶 促 合 成 的 特点

RNA 聚合 酶
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RNA 的 酶 促 合 成 pp
RNA 转录 后 的 加 工 pooeeeeoee
本
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真 核 生物 RNA 的 合成 …

第 八 章 ”遗传 密码 …

第 一 节

第 二 节

第 三 节
第 四 节
第 五 节
第 六 节
第 七 节

第 一 节
第 二 节
第 三 节
第 四 节
第 五 节
第 六 节
第 七 节
第 八 节

遗传 密码 的 破译 …

重 本 基因 5
引言

忌 六 体 及 核 术 体 核 请 核酸 结构 --
氨基 酸 的 激活 与 氨 酰 -tRNA 的 合成 ，

真 核 生 物 的 蛋白 质 的 生物 合成 …

蛋白 质 折 午 与 村 和 和合 丰 中 多 细作 oaoooosoooooiosoosooooossssooe

蛋白 质 的 易 位 与 分 滋 …

第 十 章 We
第 一 节 “引言

第 是 节 细菌 对 营养 的 通 认 pe
第 三 节 组 成 蛋白 与 调节 蛋白 ……… 和 0 ooo ooeooesoosoooisooooooooosooooooooooosooooosoh

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原核 生物 RNA 人

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操纵 基因 的 结构 9999 99 和 5959
乳糖 操纵 子 ……: oovoosoosoooeosoooooooooooooooooooooosooooeooooooooooooooosooooososoosooieos

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氨基 酸 合成 的 操纵 子 …
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引言

发 育 的 基因 调节 …
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放射 性 同位 素 技术 …
核酸 的 提取 和 纯化 …

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核酸 的 序列 分 析 …

病毒 粒子 的 结构 和 pe
病毒 的 基因 组 ，eee
病毒 的 和 复制，
病毒 基因 的 表 丰 ee
真 核 染 色 体 和 基因 组 的 结构 和 pp
真 核 基 因 组 的 结构 pe
细胞 器 中 的 基因 组 站 pp
真 核 基 因 表 达 的 调控 pp
真 核 基 因 表 达 的 调 相 pp

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基因 的 表达 和 改造 PP ES

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第 一 章 “ 络 ' 9 论

第 一 节 “分子 生 物 学 的 含义

生物 学 经 历 了 一 个 漫长 的 研究 历程 。 最 早 人 们 从 研究 动物 和 植物 的 形态 .解剖 和 分 类 开
始 , 以 后 进一步 研究 细胞 学 .遗传 学 、 微 生物 学 .生理 学 、 生 物化 学 ,进入 细胞 水 平 的 研究 。 到 20
世纪 中 叶 以 来 ,生物 学 以 生物 大 分 子 为 研究 目标 ,分 子 生 物 学 (molecular biology) 开始 形 成 了
独立 的 学 科 , 这 是 对 生物 界 的 认识 不 断 深 入 的 过 程 。

自从 1838 年 Schleiden 和 Schwan 证 明 动 物 和 植物 都 是 由 细胞 组 成 ,Virchow(1858) 提 出
细胞 学 说 (the cell theory) 之 后 ,细胞 学 的 研究 得 到 迅速 发 展 , 随 之 遗传 学 原理 也 得 到 揭示 。 同
时 生理 学 和 生物 化 学 也 随 之 兴起 ,以 细胞 为 主要 材料 ,进行 深入 地 研究 ,使 生物 学 的 探索 进入
了 细胞 水 平 。

随 着 物理 学 和 化 学 渗 人 生物 学 的 研究 领域 ,人 们 对 细胞 的 化 学 组 成 的 了 解 日 益 深 化 ,我 们
对 构成 细胞 的 生物 大 分 子 , 主要 是 蛋白 质 及 核酸 在 生命 科学 中 所 起 的 作用 有 了 深刻 的 认识 。
Sanger 利用 纸 层 析 和 纸 电 泳 技 术 于 1953 年 第 一 次 揭示 出 胰岛 素 的 一 级 结构 ,开创 了 以 后 数
手 种 蛋白 质 序列 分 析 的 先 声 .不久 Perutz 及 Kendrew(1953) 利 用 X 射线 衍射 技术 解析 了 肌 红
蛋白 (myoglobin) 和 血红 蛋白 (hemoglobin) 的 三 维 结构 ,使 人 们 第 一 次 能 够 洞察 生物 大 分 子 的
室 间 结构 ,从 而 了 解 这 些 蛋 白质 在 运送 分 子 氧 中 的 特殊 作用 .这些 研 究 结果 使 人 们 第 一 次 能 从
分 子 水 平 了 解 生 命 物质 的 结构 与 功能 。 生 物 大 分 子 结构 与 功能 的 研究 乃 成 为 生命 科学 中 最 重
要 的 课题 。

在 核酸 方面 随 着 核酸 化 学 研究 的 进展 ,人 们 揭示 出 核酸 化 学 的 许多 规律 之 后 , Watson 和
Crick (1953) 共 同 提出 了 脱氧 核糖 核酸 CDNA) 的 双 螺 旋 模 型 (double helix model) 。 这 个 模型
为 揭 开 遗传 信息 的 复制 和 转录 的 秘密 铺 平 了 道路 。 随后 Crick 又 提出 了 中 心 法 则 (central dog-
ma) ,明确 了 遗传 信息 传递 的 规律 。 从 此 以 后 ,核酸 的 分 子 生 物 学 得 到 了 异乎 寻常 的 迅速 发 展 ，
使 分 子 生 物 学 成 为 生命 科学 中 活力 最 强 的 学 科 。

从 广义 来 讲 , 蛋 白质 及 核酸 等 生物 大 分 子 结构 和 功能 的 研究 都 属于 分 子 生 物 学 的 范畴 ,也
就 是 从 分 子 水 平 阐明 生命 现象 和 生物 学 规律 .例如 ,蛋白 质 的 结构 .运动 和 功能 , 酶 的 作用 机 理
和 动力 学 , 膜 蛋白 结构 功能 和 跨 膜 运输 等 都 属于 分 子 生 物 学 的 研究 内 容 。

不 过 目前 人 们 踪 常 采用 狭义 的 概念 ,将 分 子 生物 学 的 范畴 偏重 于 核酸 (或 基因 ) 的 分 子 生
物 学 ,主要 研究 基因 或 DNA 的 复制 转录、 表达 和 调节 控制 等 过 程 , 当然 其 中 也 涉及 与 这 些 过
程 有 关 的 蛋白 质 和 酶 的 结构 与 功能 的 研究 。 本 书 也 采用 狭义 的 概念 对 基因 分 子 生物 学 的 基本

原理 进行 讲述 。 至 于 专门 问题 如 发 育 分 子 生 物 学 、 分 子 免疫 学 等 , 则 请 读者 阅读 有 关 专 著 。

第 二 节 分子 生物 学 发 展 简 史

随 着 化 学 及 物理 学 的 渗透 ,构成 生物 细胞 的 生物 大 分 子 的 结构 与 功能 的 研究 日 益 获 得 突
破 性 的 进展 。 早 在 1871 年 Miescher 从 死 的 白细胞 核 中 分 离 出 脱氧 核糖 核酸 (CDNA) ,迄今 已
有 120 年 的 历史 。 到 了 1928 年 Griffith 发 现 肺炎 链球 菌 CPnexxzococczs) 的 无 毒 菌株 与 其 被 杀
死 的 有 毒 菌株 混合 , 即 变 成 致 病菌 株 。1944 年 Avery 等 人 发 现 从 致 病 力 强 的 光滑 型 (S 型 ) 肺
炎 链 球菌 提取 的 DNA 能 使 致 病 力 弱 的 粗糙 型 (R 型 ) 转 化 成 S 型 。 如 果 加 少量 DNA 酶 ,这 种
转化 立即 消失 ,但 加 入 各 种 蛋白 水 解 酶 则 不 能 改变 这 种 转化 他 们 的 实验 充分 证 明 引 起 细菌 遗
传 改 变 的 物质 为 DNA。

由 于 核酸 化 学 的 研究 进展 ,Chargaft(1949) 从 不 同 来 源 DNA 测定 出 4 种 核酸 碱 基 , 即 胸
腺 喀 喧 (thymidine , 工 )、 胞 旷 啶 (cytocine,C)、 腺 叶 叭 (adenine,A) 和 乌 味 叭 (guanine,G) 。 腺 嘲

叭 与 胸腺 喀 啶 的 量 和 乌 味 叭 与 胞 喀 啶 的 量 并 不 相等 , 即 (A 十 IT)/G 十 C) 的 比值 随 不 同 来 源 的
DNA 而 有 所 不 同 。 他 发 现 鸟 味 叭 的 量 与 胞 喀 啶 的 量 总 是 相等 , 腺 味 叭 与 胸腺 喀 啶 的 量 相等 , 即 ，

G 一 CC ，A 一 工 , 这 个 规律 称 为 Chargaff 规律 。 与 此 同时 Wilkins 及 Franklin(1950 一 1952)
用 X 射线 衍射 技术 测定 了 DNA 纤维 的 结构 , 它 的 衍射 图 像 表明 DNA 具有 典型 的 螺旋 结构 ，
并 且 由 2 条 以 上 的 多 核 苷 酸 链 组 成 。 当时 ,Pauling(1953) 曾 经 提出 DNA 分 子 具 有 三 股 螺旋 的
设想 ( 见 Nature 1953,171 : 346 一 348) 。 几 乎 与 其 同时 年 青 的 Watson 和 Crick 于 1953 年 也 在
Nature 杂志 (171:737 一 738) 上 提出 了 DNA 双 股 螺旋 模型 。DNA 以 磷酸 糖 链 形成 了 双 股 螺
旋 , 脱氧 核糖 上 的 碱 基 按 Chargaff 规律 构成 双 股 磷酸 糖 链 之 间 的 碱 基 对 。 这 个 模型 表明 DNA
具有 自身 互补 的 结构 ,根据 碱 基 对 原则 ,DNA 中 贮存 的 遗传 信息 可 以 精确 地 进行 复制 .他 们 的
理论 奠定 了 分 子 生物 学 的 基础 。

DNA 双 螺旋 模型 已 经 预示 出 DNA 复制 的 规则 。 玫 ornberg 于 1956 年 在 大 肠 杆菌 ( 歼 .
co22) 的 无 细胞 提取 液 中 实现 了 DNA 的 合成 。 他 从 五 . coi 中 分 离 出 DNA 聚合 酶 IIDNA poly-
merase JTJ) ,能 使 4 种 dNTP( 即 dATP,dGTP,dCTP 和 dTTP) 连 接 成 DNA.。DNA 的 复制 需要
以 一 个 DNA 作为 模板 。 以 后 证 明 DNA 的 复制 是 一 个 非常 复杂 的 过 程 ,包含 着 许多 种 酶 的 参
与 。

DNA 复制 在 分 子 生物 学 中 是 一 个 异常 重要 的 问题 。 Meselson 与 Stah1(1958) 用 精彩 的 实

验证 明 ,DNA 复制 时 DNA 分 子 的 两 条 链 先行 分 开 。 他 们 用 "5N 重 同位 素 及 密度 梯度 超速 离心
证 明 DNA 复制 是 一 种 半 保 留 复制 。
Crick 于 1954 年 提出 了 遗传 信息 传递 的 规律 , DNA 是 合成 RNA 的 模板 (template 马
RNA 又 是 合成 蛋白 质 的 模板 , 称 之 为 中 心 法 则 |
转录

让 、 2 RNA 下 蛋白 质
SS

这 个 中 心 法 则 对 以 后 分 子 生 物 学 的 发 展 起 了 极其 重要 的 指导 作用 。

由 于 多 年 的 研究 编码 组 成 蛋白 质 的 氨基 酸 的 遗传 密码 得 到 解决 ,对 分 子 生 物 学 的 发 展 有
重要 推动 作用 。 和 蛋白 质 由 20 种 氨基 酸 组 成 ,而 DNA 仅 由 4 种 核 苷 酸 构成 ,按照 中 心 法 则 , 氢
基 酸 与 核 苷 酸 的 关系 如 何 ? Yanofsky 和 Brener(1961) 提 出 了 三 联 体 (triplet) 的 设想 , 即 3 个

2

碱 基 编 码 一 种 氨基 酸 。 这 个 问题 经 过 Nirenberg 和 Matthai(1963) 的 努力 研究 ,编码 氨基 酸 的
遗传 密码 终于 得 到 了 破译 .他 们 在 无 细胞 系统 中 加 入 一 定 序列 的 人 工 合成 的 多 核 苷 酸 , 即 合成
了 一 定 序列 的 多 肽 链 , 充分 证 明 编 码 20 种 氨基 酸 的 遗传 密码 。

Khorana(1966) 用 实验 证 实 了 Nirenberg 提出 的 遗传 密码 .Khorana 用 有 机 化 学 方法 合成
了 多 聚 脱氧 核糖 核 苷 酸 ,并 以 它 为 模板 用 DNA 育 合 酶 工 合成 DNA 链 ,然后 他 以 DNA 为 模板
用 RNA 聚合 酶 合成 了 RNA 链 ,二 者 具有 互补 的 关系 。

蛋白 质 合成 是 分 子 生物 学 的 重要 课题 , 它 的 研究 经 历 了 很 长 的 过 程 。 早 在 1953 年 Zamec-
mik 及 其 同事 就 开始 在 无 细胞 系统 中 利用 放射 性 同位 素 标记 的 氨基 酸 研 究 蛋 白质 合成 过 程 ，
发 现 蛋 白质 合成 的 场所 为 核糖 体 Cribosome) .。 他 们 还 证 明和 蛋白 质 合 成 需要 ATP 作为 肽 链 形成
的 能 源 。 氨基 酸 挨 人 蛋 由 质 之 前 首先 要 与 转移 RNA tRNA) 结合 , 它 是 由 氨基 酰 合成 酶
(aminoacyl synthetase) 催 化 的 。 在 细胞 总 RNA 中 tRNA 约 占 10% ,RNA 的 85%% 存 在 于 核糖
体 (CrRNA) 中 ,1960 年 以 后 利用 T4 喉 菌 体感 染 Escpnerzchza coi 作为 系统 , 鸣 菌 体 侵 染 细菌
后 ,寄主 的 RNA 合成 被 中 止 ,只 有 T4 DNA 被 转录 成 T4 RNA.。 令 人 惊奇 的 是 T4 RNA 的 碱
基 组 成 与 T4 DNA 非常 相似 ,但 它 并 不 与 rRNA 结合 形成 核糖 体 。 后 来 这 种 RNA 携带 DNA
的 信息 转移 到 核糖 体 上 合成 蛋白 质 , 故 称 为 信使 RNA(Cmessenger RNA ,mRNA)。mRNA 约
占 总 RNA 的 4%。 继 mRNA 被 发 现 之 后 ,Hurwitz,Stevans 及 Weiss 等 人 发 现 了 RNA 聚合
酶 ,这 种 酶 以 DNA 为 模板 利用 ATP,GTP,CTP,UTP 等 合成 RNA ,这 就 是 转录 (transcrip-
tion ) 过 程 。

在 细胞 中 蛋白 质 合成 是 受到 控制 的 。 例 如 ,. cox 中 的 8- 半 乳糖 苷 酶 (8-galactosidase) 的
含量 就 随 着 对 它 的 需要 而 变化 。 当 乳糖 存在 时 它 的 含量 就 高 ,将 乳糖 分 解 成 葡萄 糖 和 半 乳 糖 ，
而 在 乳糖 不 存在 时 ,细菌 合成 的 8- 半 乳糖 苷 酶 则 极 少 。Monod 和 Jacob 于 50 年 代 示 对 此 问题
做 了 详细 研究 ,提出 了 操纵 子 学 说 (operon theory) ,指出 在 操纵 子 中 存在 调节 基因 (regulatory
gene), 它 可 以 产生 阻 遏 蛋白 (repressor) ,在 乳糖 不 存在 时 阻 遇 蛋白 就 关闭 结构 基因 ,使 之 不 能
合成 半 乳 糖苷 酶 。

DNA 是 一 个 长 链 的 生物 高 分 子 ,在 研究 DNA 重组 、 表 达 质 粒 的 构造 及 它 的 碱 基 序列 分

, 析 之 前 往往 需要 将 DNA 分 子 切 割 成 为 较 短 的 片段 ,这 就 需要 一 种 酶 来 完成 .Smith 于 1970 年
从 天 . coli 中 分 离 出 第 一 个 能 切割 DNA 的 酶 .由 于 它 能 在 DNA 核 苷 酸 序列 的 专 一 性 位 点 上 切
割 DNA 分 子 , 他 将 这 种 酶 称 为 限制 性 酶 (restriction enzyme) 。 亿 后 很 多 种 限制 性 酶 陆续 被 分
离 出 来 , 目前 已 有 数 百 种 限制 性 内 切 酶 作为 商品 出 售 , 给 分 子 生 物 学 研究 带 来 极 大 的 方便 。

玫 按 照 中 心 法 则 信息 传递 的 方向 是 从 DNA 到 RNA ,再 从 RNA 到 蛋白 质 .但 是 RNA 在 反
转录 病毒 Cretrovirus ) 中 并 非 如 此 ,它们 能 以 RNA 为 模板 合成 单 链 的 DNA ,然后 再 以 这 条
sSDNA(single-strand DNA) 为 模板 合成 互补 DNA(complementary DNA ,cDNA)。 以 RNA 为
模板 催化 DNA 合成 的 酶 称 为 反 转 录 酶 (reverse transcriptase), 它 是 由 Temin 和 Baltimore
《1970) 首 次 分 别 发 现 的 。 现在 ,我 们 可 以 利用 反 转 录 酶 以 分 离 得 到 的 mRNA 为 模板 合成
seDNA, 从 而 进行 基因 结构 及 其 表达 的 研究 。

限制 性 内 切 酶 的 分 离 成 功 使 得 重组 DNA 成 为 可 能 。 在 此 以 前 已 经 发 现 细菌 中 存在 DNA
连接 酶 CDNA ligase) 。 它 能 将 被 限制 性 酶 切割 的 DNA 片段 连接 在 一 起 ,1972 年 Berg 首次 将
不 同 的 DNA 片段 连接 起 来 ,并 且 将 这 个 重组 的 DNA 分 子 有 效 地 插入 到 细菌 细胞 之 中 ,重组
的 DNA 进行 繁殖 ,于 是 产生 了 重组 DNA 的 克隆 (clone) 。Berg 是 重组 DNA 或 基因 工程 技术

的 创始 人 ,于 1980 年 获得 了 Nobel 奖 。

在 研究 分 子 生物 学 中 了 解 DNA 的 核 苷 酸 的 排列 顺序 无 疑 是 非常 重要 的 。Sanger(1977)
及 Gilbert (1977) 分 别 用 与 测定 蛋白 质 序列 截然 不 同 的 方法 解决 了 DNA 分 子 中 碱 基 序列
(DDNA sequence) 的 复杂 问题 。Sanger 采用 的 是 酶 法 ,而 Glibert 采用 化 学 法 。 他 们 都 将 DNA
分 子 中 碱 基 的 序列 准确 地 测定 出 来 ,使 我 们 对 基因 甚至 基因 组 的 结构 得 到 了 解 。

自 Summer(1936) 证 明 酶 是 蛋白 质 以 来 ,已 有 50 多 年 的 历史 ,人 们 一 直 认为 酶 是 蛋白 质 。
但 是 近年 有 一 个 惊人 的 发 现 , 即 一 些 RNA 也 具有 催化 功能 。Cech 于 1986 年 发 现 四 膜 虫 CTe-
trajyxmzeza) 的 核糖 体 RNA 能 够 自我 前 切 。mRNA 中 的 内 含 子 能 被 RNA 本 身 的 催化 作用 准
确 无 误 地 切除 。 这 种 内 含 子 衍 生出 来 的 RNA 在 特定 位 点 切 和 连接 ,而 其
身 并 不 被 消耗 ,完全 符合 酶 的 性 质 。 这 种 催化 剂 被 定名 为 核 酶 (ribozyme)。 这 一 发 现 使 人 推测
在 生物 进化 的 早期 可 能 先 形成 RNA ,然后 区 RNR 碎 模 板 形 成 DNA。DNA 后 来 代替 RNA 作
为 遗传 物质 , 它 的 双 螺 旋 结 构 比 RNA 单 链 更 稳定 ,适宜 于 遗传 物质 的 存 贮 ,而 RNA 在 核糖 体

中 仍 保留 着 催化 性 质 。

由 于 分 子 生 物 学 的 研究 对 生命 科学 的 发 展 起 着 巨大 的 推动 作用 ,受到 国际 科学 界 的 高 度
重视 ,许多 位 分 子 生 物 学 家 获得 了 诺 贝 尔 化 学 奖 或 生理 学 奖 。 现 在 将 历年 来 分 子 生 物 学 家 获得

诺 贝尔 奖 的 情况 简单 介绍 于 表 1 中 。
分 子 生物 学 从 开始 到 如 今 只 有 50 多

表 1 分 子 生物 学 家 获得 诺 贝 尔 奖 一 览 表

年 的 发 展 历史 ,在 人 类 文明 史 中 只 是 短暂 -人
的 一 段 , 却 使 生物 学 发 生 了 巨大 变化 ,其 进 watson,J.D. 1962 ”“DNA 双 螺 旋 结 构
展 可 谓 极其 迅猛 。 由 于 无 数 分 子 生物 学 家 。 Crick'F. 蕊 C
的 刻苦 研究 ,使 我 们 现在 不 但 能 从 分 子 水 Ne， 1
平 上 了 解 DNA 的 结构 、 复 制 . 转 录 和 表达 Jacob
的 详尽 过 程 ,而 且 对 某 些 重要 生物 如 果 电 。 Nirenberg,M. 1968 。 址 传 密码 的 解析
(Drosopjzla) 或 拟 南 芥 (4rapzdozpszs) 复杂 3 1060 二 汪 二 生生
的 发 育 过程 有 了 深入 地 了 解 ,使 生物 科学 Teni 皇 5 去 术 二 利生
进入 了 一 个 新 阶段 ,这 在 过 去 是 办 不 到 的 。 Baltimore,D.
上 面 介绍 的 只 是 分 子 生 物 学 的 少数 重要 成 。 Eee ， 人
就 ,我 们 不 可 能 作 全 面 详细 介绍 .关于 分 子 。 Sn
生物 学 今后 的 展望 ,我 们 将 在 第 四 节 加 以 ”Cech,T. 1989 _。 核 酶 (ribozyme) 的 发 现
讨论 。

三 节 ”分 子 生 物 学 在 生命 科学 中 的 位 置

分 子 生 物 学 是 从 生物 化 学 发 展 出 来 的 一 门 学 科 。 由 于 蛋白 质 及 核酸 生物 化 学 的 研究 逐渐
深入 到 这 些 生物 大 分 子 结构 和 功能 的 研究 中 ,物理 学 家 利用 X 射线 衍射 技术 使 蛋白 质 及 核酸
大 分 子 的 结构 得 到 了 解析 , 揭露 出 它们 的 三 维 结构 ,从 而 提出 了 脱氧 核糖 核酸 (CDNA)7 双 螺旋

模型 。 此 后 核酸 的 分 子 生 物 学 得 到 了 迅速 发 展 ,形成 分 子 生 物 学 一 门 独 立 的 新 学 科 。 但 是 ,分

子 生 物 学 并 不 能 与 生物 化 学 相 分 离 ,而 是 关系 日 益 密 切 。 例 如 ,国际 生物 化 学 协会 (The Inter- |
national Unipn of Biochemistry ) 现 已 改名 为 国际 生物 化 学 与 分 子 生 物 学 协会 (The Interna-

4

tional Union of Biochemistry and Molecular Biology) ,足以 表明 二 者 的 关系 十 分 密切 。 此 外 ，
近年 来 蛋白 质 与 DNA 结合 的 研究 日 益 受 到 重视 ,成 为 晶体 学 (crystallography) 的 重要 内 容 ，
这 个 问题 深入 探讨 将 使 分 子 生物 学 的 重要 机 理 , 如 复制 转录、 翻译 .调控 的 本 质 得 以 充分 阐
明 ,也 就 是 蛋白 质 和 酶 究竟 是 如 何 使 复杂 的 复制 .转录 及 翻译 过 程 进行 的 。DNA 虽然 可 以 复
制 ,但 是 DNA 本 身 却 不 能 复制 .RNA 可 以 转录 ,但 RNA 本 身 却 不 能 转录 。 复 制 和 转录 都 是 由
蛋白 质 和 酶 实现 的 .翻译 过 程 也 是 由 核酸 和 蛋白 质 完成 的 .。 由 此 可 见 , 核 酸 和 和 蛋白质 的 关系 是
相辅相成 的 。

目前 分 子 生物 学 的 研究 虽然 仍 以 DNA 重组 技术 为 主要 手段 ,但 是 愈 来 愈 多 的 事实 表明 ，
蛋白 质 和 酶 的 研究 在 分 子 生 物 学 研究 中 的 重要 地 位 ,例如 ,研究 基因 的 表达 问题 , 必然 涉及 到
基因 表达 的 产物 ,也 就 是 蛋白 质 和 酶 。 而 要 想 深刻 前 明 所 表达 的 蛋白 质 和 酶 ,就 必须 彻底 了 解
其 结构 和 功能 .因此 ,在 分 子 生物 学 的 研究 中 , 蛋白质 的 纯化 、 一 级 结构 .晶体 的 三 维 结构 ,溶液
构象 .光谱 性 质 、 酶 的 动力 学 等 就 成 为 必须 研究 的 内 容 , 这 样 才能 对 基因 表达 的 产物 做 出 确切
的 解释 。

分 子 生物 学 与 微生物 学 的 关系 是 密 不 可 分 的 .早期 分 子 生 物 学 的 研究 对 象 都 是 原核 生物 ，
特别 是 大 肠 杆菌 ( 正 . coi ) 。 大 肠 杆菌 的 DNA 和 RNA 及 其 复制 、 转 录 、 翻 译 和 调控 过 程 我 们 已
经 了 解 得 非常 清楚 .。 甚至 我 们 现在 用 于 分 子 生物 学 研究 的 各 种 质粒 (plasmid) 和 限制 性 内 切 酶
(restriction endonuclease) 大 都 是 五 . co 中 分 离 出 来 的 。 现 在 研究 基因 表达 也 往往 是 先 用 玖 .
coli 作为 受 体 菌 。 难怪 有 人 认为 ,目前 的 分 子 生 物 学 主要 是 “到 .coli 的 分 子 生 物 学 ”。 当然 ,目前
分 子 生物 学 的 研究 对 象 早 已 不 限于 微生物 ,动物 和 植物 的 分 子 生 物 学 也 已 取得 很 大 进展 .由 于
微生物 学 与 分 子 生 物 学 的 结合 ,许多 重要 的 微生物 学 课题 已 经 达到 了 分 子 水 平 ,如 生物 固氮
(biological nitrogen fixation) 和 植物 微生物 相互 关系 (plant-microbe interaction ) 的 机 理 已 日
渐 明 朗 。

遗传 学 无 疑 是 与 分 子 生 物 学 关系 异常 密切 的 学 科 。 分 子 生 物 学 的 发 展 极 大 地 丰富 了 遗传
学 的 内 容 , 产 生 了 分 子 遗传 学 (molecular genetics ) 。 分 子 遗 传 学 与 细胞 遗传 学 .生化 遗传 学 、 数
量 遗 传 学 、 群 体 遗 传 学 等 ,构成 遗传 学 的 重要 内 容 , 并 且 成 为 遗传 学 的 重要 部 分 分子 生 物 学 极
大 地 丰富 了 基因 学 说 (gene theory) ,不 但 大 量 基 因 的 序列 分 析 已 测定 清楚 ,而 且 人 类 基因 组
Chuman genome) 的 结构 也 作为 重大 课题 开展 了 研究 。

细胞 生物 学 与 分 子 生 物 学 也 有 密切 的 关系 。 现 在 ,细胞 生物 学 已 经 不 限于 从 细胞 水 平 研究
细胞 的 形态 .结构 与 功能 , 而 进一步 从 分 子 水 平 探讨 构成 细胞 各 种 组 分 的 基因 及 其 表达 ,于 是
产生 了 分 子 细胞 生物 学 (molecular cell biology) 的 新 学 科 。 这 个 学 科 正 在 冲 勃 发 展 , 将 会 改变
细胞 生物 学 的 面 狐 。

发 育 生 物 学 研究 动 植物 的 生长 发 育 , 是 生命 科学 的 重要 内 容 . 过 去 的 组 织 学 和 胚胎 学 偏重
于 动 植物 结构 和 发 育 的 形态 描述 .实验 胚 胎 学 虽然 对 生物 的 发 育 进行 了 细胞 水 平 的 研究 ,但 对
发 育 的 实质 难以 揭示 。 近 年 来 分 子 生物 学 渗 人 到 发 育 生物 学 以 后 , 发 育 生物 学 的 面貌 大 为 改
观 。 现在 我 们 已 经 认识 到 不 论 低 等 真 核 生 物 或 高 等 生物 ,它们 的 发 育 都 是 受 基因 组 中 DNA 控
制 的 ,并 且 按 照 特 定 的 时 间 和 空间 顺序 (temperal and spacial sequence) 依 次 表达 出 来 ,从 而 认
识 生物 发 育 过 程 的 实质 。 |

目前 生理 学 的 研究 也 与 分 子 生 物 学 密切 结合 起 来 ,不 论 动物 生理 学 或 植物 生理 学 都 是 如
此 。 例如 ,神经 系统 分 子 生物 学 的 研究 造成 神经 生物 学 的 革命 性 变化 .乙酰胆碱 受 体 的 分 离 纯
有

|

化 和 基因 克隆 已 经 完成 。 神 经 通道 也 已 得 到 纯化 和 基因 克隆 。 分 子 生 物 学 渗入 神经 科学 已 产
生 了 分 子 神经 生物 学 。 在 植物 生理 学 方面 光合 作用 的 研究 已 进入 分 子 水 平 。 一 些 植物 的 叶 绿
体 DNA 的 全 序列 测定 已 经 完成 。 光 合作 用 有 关 的 基因 如 光 系 统 I，I ,电子 传递 链 , 二 磷酸 核
酮 糖 羧 化 酶 /加 氧 酶 (Rubisco) 等 基因 的 表达 调控 大 量 的 研究 都 已 完成 了 ,使 光合 作用 进入 了
一 个 新 阶段 。

不 仅 上 述 学 科 与 分 子 生 物 学 有 密切 关系 ,生物 科学 的 许多 学 科 也 都 进入 分 子 生 物 学 的 研
究 领 域 ,如 分 子 免疫 学 分子 药 理学 分子 病理 学 分子 分 类 学 等 等 ,都 从 分 子 水 平 进行 探索 ,使
这 些 学 科 进 入 更 高 的 阶段 。

第 四 节 “分子 生物 学 的 现状 和 展望

分 子 生物 学 的 现状 和 发 展 前 景 是 非常 令 人 鼓舞 的 。90 年 代 以 来 分 子 生 物 学 在 理论 和 技术
方面 都 取得 了 重要 进展 ,在 DNA 的 复制 、 修 复 ` 转 录 、 翻 译 和 调控 的 分 子 机 理 等 方面 都 得 到 了

进一步 的 阐明 ,如 拓扑 异 构 酶 ICtopoisomerase IT) 的 唱 体 结构 、 核 糖 体 (ribosome) 结 构 的 研究

使 得 我 们 对 DNA 的 复制 .翻译 等 的 认识 比 过 去 更 深入 了 。

分 子 生物 学 正在 渗 和 人 到 生物 科学 的 有 关 学 科 之 中 ,使 得 这 些 学 科 的 面目 大 为 改观 。 首先，
在 发 育 生物 学 方面 ,生活 周期 短 的 一 些 动 植物 如 线虫 (Caezorhnapaztis elesgazs)、 果 蝇
(Drosopjizla maelazogaster)、 拟 南 芥 (47rapzcdozpsis 态 aliaza) 已 成 为 发 育 生 物 学 的 重点 研究 对
象 , 它 们 的 发 育 过 程 很 多 已 从 分 子 水 平 得 到 了 解 。 例 如 , 果 蝇 从 卵 发 育成 成 虫 的 遗传 信息 是 编
写 在 基因 组 中 的 。 一 切 性 状 都 是 由 相关 的 基因 所 决定 。 在 发 育 中 基因 的 表达 在 时 间 和 空间 顺
序 上 受到 控制 ,如 果 蝇 不 能 在 幼虫 时 表达 腿 部 的 基因 ,只 能 在 晴 期 才能 长 出 腿 ,也 不 能 在 晴 期
产生 卵 ,只 能 在 峻 性 的 成 虫 产生 卵细胞 。 植 物 也 是 如 此 , 它 的 生长 发 育 过 程 也 是 在 时 间 和 空间
上 依靠 各 种 基因 依次 表达 的 。 这 样 , 生 物体 的 各 种 代谢 过 程 才 得 以 有 条 不 紊 地 进行 。 例 如 , 植
物 开花 的 基因 十 分 复杂 , 花 的 各 种 器 官 由 许多 基因 控制 着 , 花 状 的 颜色 由 多 种 次 生物 质 代 谢 产
物 ( 如 黄酮 类 色素 flavanoid pigments) 所 决定 , 它 要 在 开花 期 才 表达 形成 ,而 不 会 在 幼苗 期 表
达 。 现 在 黄酮 类 色素 生物 合成 的 途径 及 有 关 基 因 已 基本 研究 清楚 。

分 子 生物 学 与 细胞 生物 学 关系 密切 ,已 形成 一 门 新 的 分 子 细胞 生物 学 (molecular cell bi-
ology) 。 许 多 细胞 生物 学 问题 如 细胞 分 裂 、 细 胞 骨架 (cytoskeleton)、 细 胞 因子 (cytokine) 的 研
究 都 进入 了 分 子 水 平 。

免疫 学 与 分 子 生 物 学 结合 ,产生 了 分 子 免疫 学 (molecular immunology)。 病 理学 与 分 子 生
物 学 结合 ,产生 了 分 子 病理 学 (molecular pathology) ,其 中 病毒 学 与 分 子 生 物 学 结合 ,就 是 分
子 病毒 学 (molecular virology) 。 目 前 ,分 子 生 物 学 几乎 已 渗 和 人 到 所 有 生物 科学 的 各 个 领域 ,其
至 最 古老 的 动物 和 植物 的 分 类 学 也 开始 采用 分 子 生物 学 研究 物种 的 亲缘 关系 ,于 是 有 分 子 系
统 学 (molecular systematics ) 的 出 现 。

自 1990 年 以 来 在 生物 科学 中 兴起 了 一 门 新 的 结构 生物 学 (structural biology) 它 专门 研

究 生物 大 分 子 的 空间 结构 和 功能 。 由 于 结构 生物 学 在 发 展 生物 科学 的 重要 性 ,著名 的 Nature

杂志 从 1994 年 专门 出 版 了 Nature Structural Biology 月 刊 ,充分 登载 结构 生物 学 的 研究 成 果 。

Current Biology 公司 则 出 版 了 Current Opinion of Structural Biology,Structure 及 Macro-

molecules 等 刊物 ,分 别 发 表 有 关 和 蛋白 质 及 核酸 的 三 维 结构 . 目前 ,生物 大 分 子 三 维 结构 的 研究
6

芭

进展 极 快 , 在 全 世界 范围 业已 达到 平均 每 天 能 解析 出 三 种 蛋白 质 晶体 结构 的 速度 ,而 30 年 前 ，
10 年 间 只 解析 出 一 种 蛋白 质 结构 ,结构 生物 学 这 样 的 高 速度 发 展 对 生物 科学 做 出 了 重大 贡
献 。 高 分 辨 的 蛋白 质 晶 体 结构 使 我 们 清晰 地 看 到 蛋白 质 分 子 中 多 肽 链 如 何 折 生 成“ 螺旋 、p 折
春 片 .7 转角 以 及 整个 分 子 的 折 于 情况 ,甚至 蛋白 质 ( 酶 ) 与 配 基 (ligend) 的 结合 情况 。 在 结构 生
物 学 中 DNA 与 蛋白 质 的 相互 作用 是 一 个 重要 领域 , 它 对 分 子 生物 学 的 理论 研究 至 关 重 要 。 例
如 ,在 核酸 结构 中 除去 双 股 DNACDNA duplix) 外 ,还 发 现 了 三 股 DNACGDNA triplex) 和 四 股
DNA(CDNA tetraplex) ,三 股 DNA 在 抑制 真 核 基 因 表达 中 有 重要 作用 ,而 四 股 DNA 存在 于 染
色 体 的 端 粒 (telomere) 中 ,有 稳定 染色 体 结构 的 作用 。 目 前 ,晶体 学 家 已 经 解析 出 大 量 与 DNA
相互 作用 的 蛋白 质 ,如 各 种 限制 性 内 切 酶 CEcoRI, BaxzHI) ,各 种 阻 巡 蛋白 (repressors ,CAP，
trp ,Cro,434,Arc,MetJ) 、DNA 修复 蛋白 (CDNA repair protein)、TATA box 和 蛋白、 组 蛋白 (hi-
stone) 、 转 座 酶 (transponase) 等 。 拓 扑 异 构 酶 ICtopoisomerase IT) 的 三 维 结构 也 已 解析 出 来 , 它
是 一 个 很 特殊 的 酶 ,具有 环 状 结构 , 它 能 在 瞬间 打 断 一 股 DNA ,将 另 一 股 DNA 穿 过 断裂 处 ，
然后 又 封闭 裂口 ,使 两 股 DNA 重新 组 合 。 拓 扑 异 构 酶 I 在 DNA 复制 .转录 及 重组 中 起 重要 作
用 。 此 外 ,分 子 生 物 学 对 结构 生物 学 的 发 展 也 有 很 大 帮助 。 从 动 植物 、 微 生物 细胞 中 分 离 纯化
蛋白 质 是 一 项 十 分 艰苦 的 工作 ,由 于 大 多 数 蛋 白质 在 细胞 中 的 含量 都 很 低 , 要 想 分 离 纯 化 出 某
种 蛋白 质 , 进行 晶体 培养 ,是 相当 困难 的 .现在 ,我 们 可 以 将 编码 某 种 蛋白 质 的 基因 用 分 子 生 物
学 技术 进行 克隆 ,用 聚合 酶 链 式 反应 (PCR) 扩 增 , 然 后 与 融合 蛋白 质粒 (fusion protein
plasmid) 构 建成 表达 质粒 ,用 它 转化 大 肠 杆菌 (. co2 ) 。 然 后 进行 发 酵 培 养 , 即 可 得 到 大 量 含 有
该 种 蛋白 质 的 菌 体 .从 这 些 菌 体 中 即 可 分 离 纯化 出 足够 数量 的 该 种 蛋白 质 ,从 而 培养 晶体 就 容
易 得 多 了 。
蛋白 质 工 程 (protein engineer) 技 术 与 分 子 生 物 学 结合 是 促进 分 子 生 物 学 发 展 的 一 条 途
径 ,采用 定点 突变 (site-directed mutagenesis ) 方 法 使 基因 结构 发 生 改 变 , 从 而 可 以 改变 基因 表
达 产 物 中 的 氨基 酸 残 基 , 就 有 可 能 使 我 们 了 解 蛋 白质 中 每 个 氨基 酸 甚 至 每 个 化 学 基 团 所 起 的
作用 。
目前 , 动 植物 基因 组 Cgenome) 的 研究 已 成 为 分 子 生 物 学 的 重大 课题 。 最 近 线 虫
《Caenzorpapaitis elegazs) 基 因 组 即将 测定 完成 , 它 由 1 000 万 个 核 苷 酸 组 成 。 我 国 科 学 家 正在
进行 水 稻 (Oryza satza) 基 因 组 的 DNA 序列 测定 ,这 项 工作 的 完成 必 将 对 植物 分 子 生 物 学 及
农业 科学 做 出 重大 贡献 。 目 前 ,人 类 基因 组 (Human genome) 的 研究 是 国际 上 的 重大 科学 课
题 , 世界 上 许多 国家 投入 大 批 人 力 、 物 力 研究 人 类 染色 体 DNA 的 全 序列 。 这 项 宏伟 工程 的 完
成 将 会 对 分 子 生 物 学 做 出 巨大 贡献 ,并 将 对 医学 特别 是 遗传 病 的 诊断 治疗 做 出 贡献 。
今后 ,分 子 生 物 学 在 实际 方面 的 发 展 也 是 令 人 乐观 的 。 在 医学 方面 ,基因 治疗 (gene thera-
py) 目 前 已 在 研究 之 中 。 在 动 植物 方面 转基因 动 植物 的 培育 ,也 已 进入 重点 研究 之 列 , 成 为 生
物 技 术 (biotechnology) 的 主要 内 容 。 将 苏 云 金 杆 菌 毒 蛋白 (Bt) 基 因 转 人 棉花 已 获得 抗 棉铃 虫
的 抗 虫 物 ,并 已 取得 经 济 效益 。 利 用 反 义 RNAantisense RNA) 技 术 延 长 果实 、 蔬 菜 的 保鲜 其
和 改变 花卉 的 花色 也 已 取得 成 果 , 这 些 都 是 分 子 生物 学 在 实际 方面 的 贡献 。 随 着 分 子 生物 学 和
生物 技术 的 发 展 , 它 们 在 医学 和 农业 方面 必 将 对 人 类 的 健康 和 生活 做 出 更 大 的 贡献 。

〈 净 隆 飞 )

对 生命 现象 本 质 的 认识 ,历来 存在 两 种 截然 不 同 的 看 法 :生命 是 一 种 超自然 现象 和 生命 是
物质 的 一 种 属性 。 随 着 物理 学 和 化 学 对 生物 学 的 渗透 和 融合 ,作为 生物 学 语言 的 生物 化 学 出 现
了 。 而 蛋白 质 和 核酸 等 生物 大 分 子 结构 和 功能 关系 的 阑 明 进 一 步 使 人 们 得 以 从 分 子 水 平 上 来
认识 生命 现象 的 总 体 。 事 实 表 明 , 生 物 机 体 中 物质 的 转化 以 及 伴随 的 能 量变 化 ,各 种 化 学 组 分
在 时 空 上 的 相互 关系 ,以 及 驾驭 这 一 切 的 遗传 信息 的 传递 无 一 不 遵循 物理 学 和 化 学 的 基本 法
则 。 这 些 都 证 明生 命 不 是 超越 自然 的 , 它 的 本 质 即 是 物质 运动 的 一 种 状态 。

第 一 节 ”生命 是 物质 进化 的 产物

洪荒 时 代 的 地 球 是 一 个 无 生命 的 世界 , 它 笼罩 在 一 种 还 原 性 大 气 中 ,当时 大 气 的 成 分 主要
是 H,,CH,NH:,N:,CO,CO,,HS 等 。 以 后 随 着 水 分 由 地 球 内 部 外 溢 , 海 洋 形成 了 。 从 此 ,地
球 上 的 化 学 反应 活跃 了 起 来 ,地 球 上 的 物质 开始 了 化 学 进化 。 无 机 化 合 物 藉 地 热 . 放 电 、 紫 外
线 、 宇 宙 射 线 等 的 能 量 合成 了 简单 的 有 机 化 合 物 ,随后 氨基 酸 、 糖 ,脂肪酸 、 核 苷 酸 .路 啉 化 合 物
等 相继 形成 。 地 球 上 出 现 了 非 生物 合成 的 有 机 化 合 物 。 随 着 有 机 化 合 物 的 著 积 ,原始 生命 终于
在 某 种 特定 环境 中 出 现 了 ,这 大 约 发 生 在 30 亿 年 前 , 即 前 寒 武 纪 年 代 ,物质 进化 从 此 步 和 生物 进
化 (图 2-1)。 最 原始 的 生物 是 一 些 异 养 厌 氧 生物 ,它们 以 环境 中 的 非 生物 合成 有 机 成 分 为 养料 ，

5 区 让 了 SSXiED ZX 1 X:0" 年 骨 生 现在
地 球 诞生 最 古 的 化 石
SR
和 于

图 2-1 地球 上 的 物质 演化 进程

通过 酵 解 方式 获取 生物 可 以 利用 的 能 量 形式 一 -ATP。 但 环境 中 的 有 机 成 分 有 限 , 这 就 限制 了
原始 生物 的 发 展 。 随 着 时 间 的 推移 , 一 种 光合 自 养生 物 出 现 了 , 它 使 还 原 性 大 气 中 出 现 了 氧 。 氧 昌 时
不 是 生命 所 必需 的 , 却 是 高 水 平 的 能 量 代谢 所 不 可 少 的 。 氧 对 生物 进化 孕育 着 巨大 的 潜力 。 有 氧
生活 虽 更 能 满足 高 等 生物 所 需 的 能 量 , 不 过 氧 对 原始 厌 氧 生物 却 具 有 毒性 . 大 气 中 氧 的 出 现 推动
了 生物 进化 ,原始 厌 氧 生物 终于 获得 了 对 氧 毒 性 的 防护 机 制 。 糖 的 酵 解 发 展 为 有 氧 分 解 , 原核 生
物 发 展 为 真 核 生 物 .# 这 些 变化 为 生物 进化 在 遗传 上 和 代谢 上 准备 了 条 件 , 生 物 进 化 加 速 了 。
生命 ,不 管 是 其 低级 或 高 级 形态 都 显示 出 与 无 生命 物体 明显 不 同 的 特点 。 生 命 的 出 现 是 物
质 进化 的 一 个 转折 点 。
生命 所 具有 的 特征 是 :
8

。 ” 母 相 比 ,前 者 含 1 个 染色 体 , 其 DNA 人、^

1. 生物 体 是 由 许多 称 为 生物 分 子 (biomolecule) 的 有 机 化 合 物 组 成 的 。 活 机 体 中 ,生物 分
子 是 有 组 织 的 ,它们 按 一 定 的 层次 形成 一 高 度 有 序 的 系统 。 活 机 体能 维持 这 一 有 序 性 直至 死
亡 。 无 生命 物质 则 相反 ,它们 总 是 自发 地 向 无 序 方向 发 展 。

2. 活 机 体 不 断 地 与 环境 发 生物 质 和 能 量 的 交换 。 活 机 体 中 存在 着 一 个 具 一 定 顺 序 . 相 互 协
调 、 可 自我 调节 的 代谢 网 络 , 其 中 各 个 代谢 反应 都 由 相应 的 酶 催化 。 细 胞 和 机 体 与 环境 保持 在
一 个 远离 平衡 态 的 稳 态 (steady state) 中 。 与 此 相反 ,无 生命 物质 总 是 趋向 于 与 环境 达成 平衡 。

3. 生物 体能 够 精确 地 自我 复制 , 即 机 体 的 形状 、 结 构 和 功能 等 能 够 代 代 相传 ,能 够 生长 、 繁
殖 。 与 此 相反 ,无 生命 物质 则 不 能 自我 生长 和 繁殖 。

什么 是 生命 是 一 个 难以 简单 界定 的 问题 , 它 的 答案 还 得 从 活 机 体 的 自身 去 寻找 。

第 二 节 ”生命 的 分 子 逻 和 辑

活 细 胞 或 机 体 是 由 许多 无 生命 的 有 机 化 合 物 组 成 的 。 但 细胞 不 是 一 般 意 义 上 的 口袋 ,会 包
容 所 有 相遇 的 物质 ,而 是 有 选择 的 摄取 。 在 物质 进化 过 程 中 ,只 是 特定 生物 分 子 的 集聚 才 导 致
生命 的 出 现 。 在 物质 化 学 进化 的 末期 , 核 苷 酸 、 氨 基 酸 .脂肪 酸 . 中 啉 等 小 分 子 化 合 物 出 现 了 .。 根
据 现 有 资料 ,人 们 认为 这 时 可 能 出 现 了 关键 性 的 一 步 , 即 是 核 苷 酸 缩聚 成 了 RNA。 它 是 第 一 个
具 催 化 功能 的 基 团 , 它 能 催化 自我 复制 .RNA 自我 复制 中 产生 的 变异 体 引 起 了 和 氢 基 酸 的 缩聚 ，
蛋白 质 出 现 了 .。 以 后 ,DNA 蔡 代 RNA 成 为 遗传 信息 的 载体 , 脂 类 物质 形成 的 半 通 透 性 膜 使 前
述 的 分 子 聚 集体 形成 为 细胞 。

上 述 生命 发 生 过 程 虽 在 一 定 程度 上 仍 是 一 种 假设 , 狂 待 进一步 验证 。 不 过 ,这 一 假设 已 指
明 , 在 细胞 和 机 体 中 ,生物 分 子 是 高 度 组 织 化 的 ,形成 了 严密 的 系统 ,生命 现象 是 它 的 总 体 表现 。

一 ` 机 体 化 学 组 成 上 的 统一 性 和 多 样 性

活 机 体 ,不 论 是 原核 或 是 真 核 生物 都 是 由 核酸 蛋白质, 脂 质 和 糖 类 等 生物 大 分 子 和 一 些
小 分 子 化 合 物 及 无 机 盐 组 成 的 。 表 2-1 列 出 的 是 原核 生物 大 肠 杆菌 的 分 子 组 成 。 事 实 上 ,所 有

生物 的 化 学 组 成 都 可 以 分 为 这 几 类 ， 有 天 大 二 科 二 计量 吕 于 站
这 就 是 其 统一 性 之 所 在 。 不 同 生物 在

-一 一 一 占 疙
化 学 组 成 上 的 差异 不 在 于 分 子 的 类 总 重 的 百分数 分 子 的 种 数

水
别 ,而 在 于 每 一 类 分 子 的 质 与 量 . 如 以 蛋白 质 下 3 有

大 肠 杆菌 与 最 简单 的 真 核 生物 酿酒 酵 核酸
]

含 4.7X10*bp(base pair,bp) ,而 后 江 5

者 含 16 个 染色 体 , 其 DNA 含 1.4X 脂 质 2

107 pp。 不 仅 如 此 *DNA 的 核 苷 酸 序 ee 贡

列 也 不 同 .DNA 质 和 量 上 的 不 同 决定 无 机 离子 1 20

了 细胞 所 含 的 RNA 的 不 同 ,主要 是

mRNA 的 不 同 ,从 而 也 使 所 含 的 包括 酶 在 内 的 蛋白 质 的 质 和 量 不 同 , 转 而 影响 机 体 的 代谢 和

其 它 的 化 学 组 成 。 机 体 这 种 代谢 上 的 差异 就 反映 为 生物 性 状 上 的 多 样 性 。 生 物 的 多 样 性 是 以

其 统一 性 为 基础 的 。

8

二 、 生 物 大 分 子 的 高 聚 物 特性

核酸 CDNA 和 RNA)、 蛋 白质, 多 糖 和 脂 质 是 组 成 生物 体 的 4 类 生物 大 分 子 .DNA 是 生物
体 中 遗传 信息 的 原初 载体 。DNA 通过 复制 使 遗传 信息 由 亲 代 流向 子 代 ,通过 转录 使 特定 基因
的 遗传 信息 转换 成 相应 的 指令 一 mRNA, 后 者 指导 氢 基 酸 按 一 定 的 顺序 连接 成 特定 的 多
肽 ,然后 折 秋 成 相应 的 蛋白 质 。 和 蛋白质 是 遗传 信息 的 体现 者 。 核酸 和 有 蛋 白质 合成 代表 生命 活动
中 遗传 信息 流动 的 主线 , 它 驾 驭 着 生命 活动 的 进行 .核酸 和 有 蛋白质 的 高 聚 物 特性 正 是 实现 这 种
信息 流动 的 基础 ,核酸 分 子 的 骨架 是 由 核 苷 酸 通过 3 ,5 -磷酸 二 酯 键 连接 成 的 多 核 苷 酸 链 , 核
苷 酸 是 其 单 体 . 构成 DNA 和 RNA 的 分 别 是 4 种 脱氧 核糖 核 苷 酸 和 核糖 核 苷 酸 。 不 同 的 核糖
核 苷 酸 ( 和 脱氧 核糖 核 苷 酸 ) 的 区 别 在 于 其 碱 基 的 差异 .和 蛋白质 分 子 的 骨架 是 由 20 种 氨基 酸 通
过 肽 键 连接 成 的 多 肽 链 。20 种 氨基 酸 的 区 别 在 于 其 侧 链 (R 基 ) 的 差异 (图 2-2)。 这 就 极 大 地 简
化 了 遗传 信息 的 转化 ,使 其 成 为 4 种 核 苷 酸 和 20 种 "- 氢 基 酸 连接 顺序 间 的 转换 , 亦 即 核酸 语
言 转换 成 了 蛋白 质 语言 。 在 转录 中 ,DNA 的 碱 基 顺 序 决定 了 新 合成 的 mRNA 的 碱 基 顺 序 , 这
是 遗传 指令 的 发 送 。 在 翻译 中 ,mRNA 上 的 碱 基 顺 序 规定 了 新 合成 的 多 肽 链 的 氨基 酸 顺 序 , 而
氨基 酸 侧 链 的 结构 和 性 质 则 决定 了 多 肽 链 可 折 生 成 的 稳定 构象 和 形成 相应 的 功能 。 这 是 指令
转换 为 功能 的 过 程 。

季

N 个
这 和
AR ca 局
委 二 Ho | 尺
0
NE 过 所 7 COOH

图 2-2 ” 核 苷 酸 和 -氨基酸

除了 核酸 和 蛋白 质 外 ,多 糖 和 脂 质 是 组 成 细胞 的 另 两 类 重要 的 物质 。 多 糖 的 单 体 是 单 糖 。
根据 单 糖 的 种 类 ,多 可 分 为 同 多 糖 (homopolysaccharide) 和 杂 多 糖 (heteropolysaccharide) 。 同
多 糖 由 一 种 单 糖 组 成 , 杂 多 糖 由 一 种 以 上 的 单 糖 组 成 。 淀 粉 . 糖 原 和 纤维 素 属 同 多 糖 , 都 由 万 -
葡萄 糖 组 成 ,但 它们 的 分 子 内 糖苷 键 的 类 型 有 所 不 同 。 糖 蛋白 和 糖 脂 的 糖 链 属 杂 多 糖 , 它们 不
仅 组 成 单 糖 的 种 类 多 ,并 且 单 糖 残 基 间 糖苷 键 的 类 型 也 多 样 化 .这些 寡 糖 链 是 机 体 中 分 子 的 识
别 标 志 。 守 糖 链 的 组 成 和 结构 也 是 受 遗 传 信息 控制 的 ,它们 是 在 特定 酶 的 催化 下 形成 的 。

脂 质 是 一 个 松散 的 概念 。 它 包括 许多 化 学 上 不 同 的 物质 ,如 油脂 、 磷 脂 . 类 固 醇 类 胡 葛 下
素 和 脂 溶性 维生素 等 。 它们 的 共同 特点 是 难 溶 于 水 。 脂 质 从 结构 上 考虑 不 属于 高 聚 物 , 但 脂 质 中
的 磷脂 等 是 两 亲 分 子 (amphipathic molecule) , 即 分 子 的 一 部 分 亲 水 另 一 部 分 亲 脂 , 在 水 中 能 藉
朴 水 交互 作用 聚集 成 双 分 子 层 ,是 膜 的 基本 组 成 物质 之 一 。 磷脂 分 子 中 脂肪 酸 链 的 不 同 会 影响 它
们 在 膜 中 排列 的 规整 性 , 从 而 影响 膜 的 一 些 特性 , 如 流动 性 等 。 这 类 似 于 单 体 对 高 聚 物 的 影响 。

从 以 上 的 讨论 ,我们 不 难看 出 表 2-1 所 列 的 6 000 一 7 000 种 分 子 是 由 4 种 核糖 核 苷 酸 ,4
种 脱氧 核糖 核 苷 酸 ,20 种 - 氨 基 酸 以 及 少数 几 种 单 糖 和 脂肪 酸 等 组 成 的 ,这 些 生物 大 分 子 又
进而 形成 超 分 子 复合 物 和 细胞 (图 2-3)。

10

细胞

超 分 子 复 合 物 染色体, 核糖 体 , 膜 , 微 管 等
生物 大 分 子 DNA,RNA, 蛋 白质 ,多 糖 等

单 体 核 苷 酸 ,氨基 酸 , 单 糖 ,脂肪 酸 等

图 2-3 细胞 的 结构 层次

三 、 生 物 大 分 子 单 体 在 代谢 中 的 地 位
各 种 单 体 不 仅 是 生物 大 分 子 的 结构 单位 ,又 是 合成 机 体 的 许多 重要 组 分 的 前 体 ( 图 2-4) 。
果糖 -蔗糖 ATP 活性 驮
甘露 糖 本 神经 递 质
葡萄 腺 苷 氨基 生物 碱
葡 糖 胺 一 ~ 唾液 酸 机 iv 攻 需 吉
核糖 一 ~ 核 苷 酸 神经 递 质 中 听

图 2-4 生物 大 分 子 单 体 是 一 些 重要 生物 分 子 的 前 体

生物 大 分 子 的 单 体 ,尤其 是 单 糖 , 脂 肪 酸 以 及 氨基 酸 也 是 机 体 中 间 代 谢 的 重要 环节 ,它们
循 不 同 而 又 相互 连接 的 途径 逐步 降解 并 汇集 到 少数 共同 产物 , 如 “- 酮 友 二 酸 (Cs), 草 酰 乙 酸
(C4) ,丙酮 酸 (C:) 和 乙酰 辅酶 A(C:) ,然后 进入 三 羧 酸 循环 并 通过 呼吸 链 生成 二 氧化 碳 (Ci) 和
水 (图 2-5)。 这 是 一 放 能 过 程 , 所 释放 出 的 能 转化 为 代谢 中 的 能 量 通货 一 -ATP。 分 解 代谢 和
合成 代谢 是 新 陈 代谢 的 两 个 基本 方面 。 从 总 体 说 ,分 解 代谢 是 放 能 过 程 , 合 成 代谢 是 需 能 过 程 。
分 解 代 谢 释放 出 的 自由 能 使 ADP 和 无 机 磷酸 (Pi) 形 成 ATP, 合 成 代谢 所 需 的 能 可 由 ATP 裂
解 为 ADP 和 Pi 来 提供 。ATP 是 这 两 大 过 程 间 能 量 转移 的 基本 环节 (图 2-6)。
脂 质 蛋白 质
多 业 】

氨基 酸

+ 直
第 一 阶段 单 糖 甘油 “脂肪酸 |
第 二 阶段 丙酮
乙酰 辅酶 A_ “- 酮 成 草 酰
二 酸 乙酸

第 三 阶段 CO， H;O
图 2-5 多 糖 、 蛋 白质 和 脂 质 的 降解 过 程

也

二 HC | | Pi
7 NS
全 二 全 TY O N 合成 代谢 分 解 代谢
O O
Si H 从 TI 瑟
OH 也

图 2-6 合成 代谢 和 分 解 代谢 间 的 能 量 转移

\ 活 机 体 是 一 远离 平衡 态 的 开放 系统

分 解 代谢 和 合成 代谢 间 的 能 量 转移 并 不 说 明 两 者 间 存 在 平衡 ,而 只 是 说 机 体 中 ATP 处
在 稳 态 中 。 在 活 机 体 中 ,ATP 转化 为 ADP 和 Pi 的 速率 导致 ADP 和 Pi 重新 合成 ATP, 故
ATP 的 总 浓度 趋向 于 不 变 ,但 细胞 和 机 体 是 远离 平衡 态 的 。

细胞 的 各 部 分 是 不 均匀 的 ,各 类 生
物 分 子 的 分 布 存在 着 差异 ,各 部 分 间 也 稚 二
存在 着 分 子 和 离子 的 浓度 梯度 以 及 电 MA
位 差 等 , 正 是 这 种 差别 使 细胞 各 部 分 间 。 阳光 -一 /小 分 子 局 国电
存在 物质 和 能 量 的 流动 。 同 样 ,细胞 机 。 则 Neo，
体 与 环境 间 也 存在 着 差异 ,这 种 差异 较
细胞 内 各 部 分 间 的 差异 更 为 巨大 。 一 膜
之 隔 , 外 部 是 无 生命 的 , 死 气 沉沉 ;而 内 小 分 子
部 是 有 生命 的 ,生机 郑 然 。 内 外 一 旦 平
衡 ,死亡 立即 降临 。 图 2-7 细胞 为 一 开放 系统

已 如 上 述 , 活 机 体 是 一 高 度 有 序 的 系统 ,这 是 生命 的 基础 所 在 。 机 体 为 了 保持 自身 的 这 种
有 序 性 就 必须 从 环境 吸收 淀粉 .脂肪 和 和 蛋白质 等 有 机 养分 ,再 通过 分 解 代谢 取得 自由 能 ,也 可
从 阳光 摄取 辐射 能 。 在 此 同时 ,机 体 向 环境 排出 CO,,H;O 等 简单 分 子 以 及 在 等 温 、 等 压条 件
(这 是 机 体 的 工作 环境 ) 下 难于 利用 的 热 。 细 胞 为 一 开放 系统 (图 2.7)。

细胞 的 代谢 构成 了 一 个 复杂 的 网 络 ,各 个 代谢 反应 都 是 酶 促 反应 .代谢 反应 基本 上 都 是 可
着 的 ,但 在 活 细胞 中 ,由 于 反应 产生 的 产物 很 快 被 移 去 , 故 反应 难以 达成 平衡 .这 使 细胞 中 的 代
谢 物 保持 一 定 流向 。 远 离 平衡 态 是 活 机 体 的 一 个 基本 特征 ,细胞 是 一 个 远离 平衡 态 的 开放 系
统 ，

三 节 生物 分 子

生命 是 物质 进化 到 达 一 定 阶 段 后 的 产物 。 在 此 之 前 存在 于 地 球 上 的 矿物 质 并 不 能 导致 生
命 的 出 现 , 只 有 当 核 苷 酸 、 氮 基 酸 、 脂 肪 酸 、 单 糖 等 形成 后 ,生命 的 诞生 才 具 备 了 条 件 。

一 ` 生 命 的 化 学 元 素

生命 的 产生 具有 明显 的 化 学 背景 .在 多 于 90 种 的 天 然 存 在 元 素 中 ,只 有 约 30 种 是 机 体 必
需 的 ,其 中 碳 、 氢 ` 氧 ` 氮 占 多 数 细胞 质量 的 99%% 以 上 。 假 如 以 地 充 、 海 水 和 人 体 的 元 素 组 成 做
成 一 比较 ( 表 2-2) ,我 们 不 难 发 现 人 体 的 元 素 组 成 相对 更 接近 于 海水 。 这 和 构成 细胞 的 有 机 化
合 物 形成 于 陆地 ,而 生命 则 发 生 于 海水 的 假设 相 一 致 。

水 是 机 体 中 一 种 大 量 存在 的 化 合 物 , 它 占 机 体重 量 的 70 狼 或 更 多 。 许多 证 据 表 明 , 生 命 发
生 于 水 中 。 水 影响 着 细胞 中 生物 分 子 间 相 互 作用 ,水 的 电离 特性 也 影响 着 生物 分 子 的 功能 ,水
也 使 细胞 质 呈 现 出 一 定 的 结构 性 。 水 对 生命 现象 具有 很 大 的 重要 性 。 除 了 和 氢 、 氧 外 , 碳 构成 了
生物 分 子 的 骨架 , 碳 具 有 一 个 非常 独特 的 性 质 , 即 碳 原 子 能 连接 成 各 种 稳定 的 链 或 环 , 所 以 , 生
物 机 体 不 选择 与 碳 同族 的 ,在 地 壳 中 含量 丰富 的 硅 。 生 物 分子 除 碳 以 外 还 含 氢 ` 氧 ` 氮 、 磁 、 硫 ，

有

这 6 种 元 素 有 一 个 共同 的 特点 , 即 都 是 轻 元 素 ,都 能 形成 稳定 共 价 键 , 除 氢 外 还 都 能 形成 重 键
〈 双 键 和 三 键 )。 它 们 形成 了 有 具 不 同 结构 和 性 能 、 适 合 表现 出 生命 现象 的 化 合 物 。

表 2-2 ” 地壳、 海水 和 人 体 组 成 元 素 的 丰 度

海水 ( 色 ) 人 体 ( 色 ) 地 壳 ( 儿 )
也 66 五 63 O 47
O 33 O 25. 5 Si 28
Cl 0. 33 C 9.5 Al 7
Na 0. 28 N 1.4 Fe 4.5
Mg 0. 033 Ca 0. 31 Ca 3. 5
S 0. 017 P 0. 22 Na 2. 5
Ca 0. 0062 Cl 0. 08 开 2. 5
K 0. 0060 K 0. 06 Mg 2.2
C 0. 0014 S 0. 05 HH 0. 22
Na 0. 05 C 0. 19
其 它 0 亲 其 它 一 0.01 其 它 二 0 可

除了 上 述 6 种 元 素 外 ,细胞 还 含有 许多 微量 元 素 : 铁 、 铜 、 锰 、 锌 、 钼 、 钼 、 硒 、 钒 、 镍 、 碘 、 镁
等 。

这 些 元 素 的 含量 虽 甚 微 ,但 它们 对 生命 活动 却 具 有 十 分 重要 的 功能 .其 中 许多 是 酶 的 不 可
缺少 的 组 分 ,有 的 是 氧化 还 原 中 的 电子 载体 ,有 的 参与 代谢 的 调节 ,有 的 是 呼吸 作用 和 光合 作
用 所 不 可 缺少 的 ,等 等 。

二 、 生 物 分子 是 碳 的 化 合 物

生物 分 子 是 碳 的 化 合 物 , 碳 构成 了 它们 的 骨架 ,在 生物 分 子 中 , 碳 原子 可 通过 单 键 相连 接 ，
也 可 以 通过 双 键 (生物 分 子 很 少 含 三 键 ) 相 连接 ; 碳 原子 可 以 连接 成 链 ,也 可 以 连接 成 环 。 分 子
中 ,饱和 碳 原子 的 4 个 价 键 分 布 于 空间 , 故 呈 立体 型 ;以 双 键 连接 的 碳 原子 上 的 4 个 价 键 分 布
于 同一 平面 中 , 故 呈 平面 型 (图 2-8) 。 这 是 生物 分 子 的 结构 呈现 出 多 样 性 的 基础 。

本 H
证
AS

H H

4 1
、 2
和 “、 视 域

图 2-8 有 机 化 合 物 的 分 子 模型

碳 氢 化 合 物 是 有 机 化 合 物 的 母体 ,化 学 上 稳定 ,但 当 它 们 的 分 子 中 引入 一 定 的 官能 团 后 ,化
学 活动 性 就 相应 增加 了 。 生 物 分子 中 常见 的 官能 团 有 产 基 、 痰 基 、 羧 基 、 毛 基 、 琉 基 等 (图 229) 。
13

R: 一 CH 一 C= 一 CH

R: 一 CH 一 0 一 H RI 一 CH 一 0 一 CH 一 Rz
>
R: 一 CH H H 9
ao
RI 一 CH 一 N 到
H
R: 一 CH 一 C 一 CH; 一 R2
RE GE
环 -2C 本 CN CPP 党 油
R 一 CH 一 9 一 OH R 一 CH 一 S 一 S 一 CH, 一 R2
0
7 的- OH
R: 一 CH 一 N 一 C 一 N 如
0 YY R cH 0O_b_og
0 >H
2-9 一些 常见 的 官能 团

生物 分 子 除 碳 环 外 还 常 含 杂 环 (由 碳 及 非 碳 原 子 构 成 的 环 状 结构 ), 它们 在 生命 活动 中 起 ，
着 重要 作用 , 如 核酸 的 喀 啶 和 味 叭 碱 基 , 氨基 酸 侧 链 中 的 咪唑 和 昭 吕 基 以 及 血红 素 和 叶绿素 中
的 中 啉 等 。 杂 环 化 合 物 常 含 共 扼 双 键 , 故 呈 扁 平 型 。
生物 分 子 的 各 种 骨架 以 及 它们 具有 的 不 同 官能 团 使 它们 在 结构 和 功能 上 显示 出 高 度 的 多
样 性 ,从 而 满足 生命 活动 的 需要 。

三 、 生 物 分子 的 构象 和 构 型

关于 一 个 化 合 物 的 分 子 结构 ,我们 不 仅 要 知道 其 构成 原子 的 种 类 和 数目 ,相互 间 的 连接 方
式 和 连接 顺序 ,还 要 确定 原子 在 空间 的 排 布 。 分 子 中 组 成 原子 的 空间 排 布 对 生物 分 子 , 尤 其 是
生物 大 分 子 十 分 重要 ,因为 三 维 的 细胞 是 由 三 维 的 生物 大 分 子 组 成 的 ,而 生物 分 子 间 高 度 专 一
的 相互 作用 也 是 通过 空间 关系 实现 的 .构象 和 构 型 就 是 指 分 子 中 组 成 原子 在 空间 的 相互 关系 。
1. 构象 ” 乙 烷 分 子 含 2 个 碳 和 6 个 氧 原 子 , 这 6 个 氢 原 子 在 空间 的 关系 不 是 固定 的 ,这 是
由 于 两 个 碳 原子 可 以 单 键 为 轴 心 而 相对 转动 .不 过 两 个 碳 原 子 的 相对 转动 不 是 完全 自由 的 ,这
是 由 于 当 碳 原子 作 相 对 转动 时 , 非 键 合 的 氧 原子 间 会 发 生 不 同 程度 的 干扰 , 从 而 使 分 子 的 热能
发 生 改 变 ( 图 .2-10) 。 图 中 表示 的 只 是 乙 烷 分 子 中 氧 原子 空间 排 布 的 两 种 极端 方式 ,一 种 称 为
重生 式 ; 另 一 种 称 为 交叉 式 。 重 又 式 的 势能 最 高 ,交叉 式 最 低 , 其 它 方式 则 介 于 两 者 之 间 。 如 乙
烷 那 样 ,由 于 有 关 原 子 相对 转动 所 造成 的 相应 原子 或 基 团 在 空间 的 不 同 排 布 称 为 构象 (con-
formation ) 。
乙 烷 分 子 只 含 两 个 碳 原 子 , 它 的 构象 变化 较为 简单 .但 当 乙 烷 分 子 的 两 个 碳 原子 各 有 一 个
氨 为 甲 基 取代 时 ( 即 形成 丁 烧 ), 情 况 就 复杂 得 多 。 如 仅 取 第 二 和 第 三 两 个 碳 原子 , 它 就 可 以 形
成 如 图 2-11 的 几 种 主要 构象 , 如 再 考虑 第 一 和 第 二 及 第 三 和 第 四 碳 原子 的 相对 转动 , 则 不 仅
构象 变化 更 为 复杂 ,并 且 各 个 极端 构象 间 的 势能 差 也 将 扩大 .不 同 构象 能 量 上 的 差异 来 自 有 关
原子 或 基 团 的 大 小 和 人 性质, 不同 大 小 的 原子 或 基 团 会 产生 不 同 的 空间 障碍 ,而 基 团 的 性 质 如 是
否 具 有 极 性 会 产生 排斥 或 吸引 。 表 2-3 列 出 了 一 些 原子 的 大 小 ,其 中 共 价 半径 代表 成 键 时 该 原
子 的 半径 ,而 范 德 华 半径 则 代表 从 一 个 原子 的 中 心 到 它 所 接触 的 非 键 合 原子 的 距 离 。 共 价 半径
之 和 即 为 该 两 原子 间 的 键 长 ,而 范 德 华 尔 半 径 则 决定 分 子 可 达到 的 紧密 程度 。
14

0 60” 120” 180” 240"
转动 角度
图 2-10 乙 烷 构象 体 的 能 量变 化
上 图 : 乙 烷 构象 的 Newman 投影 式 ; 下 图 : 乙 烷 的 构象 及 其 能 量变 化 。

除了 上 述 的 含 单 键 的 分 子 可 以 形成 各 种 构 表 2-3 ”一 些 元 素 的 范 德 华
象 外 ,一 些 具 环 形 结构 的 分 子 也 可 采取 不 同 的 半径 和 共 价 半径 单 键
构象 , 如 环 成 烷 、 环 已 烷 等 。 已 糖 常 以 环形 结构 素 范 德 华 半径 Com) 。 共 价 半径 Cnm)
的 椅 型 存在 。8-D- 葡 萄 糖 还 会 由 于 羟 甲 基 这 一

引 |

H 0.10 0.030

较 大 基 团 在 空间 可 采取 的 取向 而 形成 两 种 构 O 0.14 0.074
象 , 它 们 可 以 相互 转化 ,但 更 多 的 是 以 势能 较 低 号 人 庆
的 一 种 存在 (图 2-12) 。 C 0.17 0
2. 构 型 ” 当 一 个 碳 原子 上 连接 4 个 不 同 的 S 0.18 0. 103
原子 或 基 团 时 ,这 4 个 原子 或 基 团 在 空间 可 能 多 站 二

有 两 种 排 布 顺序 , 即 一 种 按 右手 性 方向 排列 ; 另
一 种 按 左手 性 方向 排列 。 含 有 这 一 结构 特点 的
两 种 分 子 互 为 镜像 ,或 如 左右 手 关 系 一 样 , 不 管
在 空间 如 何 转动 它们 都 不 能 重 碍 , 故 它们 称 为 不 对 称 分 子 或 手 性 分 子 (图 2-13)。 连 有 4 个 不
同 基 团 的 原子 称 为 不 对 称 中 心 或 手 性 中 心 。 由 于 手 性 的 存在 而 造成 的 基 团 不 同 空间 排 布 称 为
构 型 (configuration) 。“- 氨 基 酸 (甘氨酸 除外 ) 可 以 分 为 工 型 和 万 型 就 是 一 例 。 例如 , 乙 - 丙 氨 酸 和
D- 丙 氨 酸 的 分 子 式 、 分子 量 相同 .所 含 的 基 团 也 相同 .故而 化 学 性 质 相 同 : 但 <- 碳 上 4 个 基 团

G

避
忆

0. 20 0. 114
0. 22 0. 133

1

图 2-11 丁 烷 的 几 种 主要 构象

2 G@ 日 CH2OH
OH 考生 H 0 H
HONOH H ~H HO HO 间 HO 于 H
H oOH

羟 甲 基 ,羟基 位 于 平 伏 键 上 羟 甲 基 , 羟 基 位 于 直立 键 上
图 2-12 CA-D- 葡 萄 糖 的 两 种 异 构 体

图 2 天 拓 性 专 韭 泡 诗 分 二
(a) 为 手 性 分 子 ; (b ) 为 非 手 性 分 子 。

的 空间 排 布 不 同 , 结果 造成 它们 旋光 性 的 不 同 。 除 -所 基 酸 外 ,乳酸 ,甘油 醛 、 糖 等 都 是 不 对 称 的 。

除了 不 对 称 原 子 外 ,分 子 中 的 双 键 也 可 造成 有 关 基 团 在 空间 的 不 同 排 布 。 丁 烯 二 酸 的
C-2,C-3 上 连接 着 氢 和 羧基 , 由 于 C-2 和 (C-3 以 双 键 相连 从 而 不 能 作 相 对 转动 ,故而 氢 和 羧基
在 空间 可 以 有 二 种 排 布 方式 , 即 两 种 构 型 ,结果 形成 马 来 酸 和 延 衣 索 酸 。

H H HOOC H
区 SN
Ge C 一 人 C
2 2 全 二 和
HOOC COOH H COOH
马 来 酸 延 胡 索 酸

构象 和 构 型 虽然 都 涉及 基 团 的 空间 排 布 方式 ,但 不 同 构象 可 通过 绕 单 键 旋转 而 相互 转换 ，
而 构 型 则 不 能 转换 除非 发 生 相 应 共 价 键 的 断裂 。
构象 和 构 型 对 理解 生物 分 子 的 结构 和 功能 具有 重要 意义 。

第 四 节 ”生物 分 子 的 强 键 和 弱 键

一 、 强 键 和 能 键

生物 分 子 是 共 价 化 合 物 , 共 价 键 是 通过 成 键 原子 间 电 子 对 的 共享 形成 的 ,这 是 一 放 能 过

程 ， 如;
已 本 十 -全 人 E 交

相反 ,为 使 氢 分 子 裂解 为 氢 原 子 就 需 加 入 同样 数量 的 能 。 这 一 数量 的 能 一 般 称 为 键 能 ,可 用 作
16

表 2-4 生物 分 子 中 常见 共 价 键 的 强度

十 40 十 40 -
键 的 类 型 键 能 (kJ/mol) 键 的 类 型 键 能 (kJ/mol)

O 一 H 461 C 一 N 293
这 H 一 H 435 C 一 S 260
& PP 一品 419 N 一 0 二 7201
E C 一 H 414 S 一 S 214
由 0 SS N 一 H 389 ,| 97]2
断裂 的 分 数 C 一 O 352 = 一 N 615
锤 C 一 C 348 C 一 C 611
各 S 一 H 339 P 一 0 502
键 强 弱 的 量度 .但 对 含 一 个 以 上 相同 键 的 分 子 而 言 , 情 况
人 就 有 不 同 。 如 甲烷 分 子 含 4 个 C 一 H 键 , 这 4 个 C 一 H 键

图 2-14 键 能 与 键 的 稳定 性 如 逐次 裂解 ,每 一 C 一 H 键 裂 解 所 需 的 能 量 并 不 完全 相

同 , 它 们 称 为 裂解 能 。 这 时 键 的 强度 要 用 有 裂解 能 来 表示 。 不 过 在 多 数 情况 下 ,我 们 用 它们 的 平
均值 来 衡量 键 的 强度 。

共 价 键 的 键 能 一 般 都 在 200kJ/mol 以 上 ( 表 2-4) ,强度 都 较 大 。 尤 其 是 组 成 生物 分 子 的 都
是 轻 元 素 ,形成 的 键 都 很 稳定 。 但 生物 分 子 中 ( 间 ) 常 存在 其 它 的 作用 力 , 如 氢 键 ` 盐 键 、 范 德 华
力 和 玻 水 交互 作用 ,它们 的 强度 常 小 于 20 kJ/mol , 故 称 为 弱 键 。

从 原则 上 言 , 强 键 也 不 是 无 限 稳定 的 ,在 某 一 瞬间 总 还 会 有 一 定数 量 的 键 会 断裂 , 如 断裂
后 的 原子 并 未 脱离 原来 的 位 置 , 键 随后 又 可 重新 形成 , 键 的 形成 和 断裂 处 于 动态 平衡 中 。 平 衡
时 ,已 断裂 键 所 占 的 分 数 随 键 能 的 大 小 而 有 不 同 ( 图 2-14) 。 如 某 一 键 的 键 能 为 6 kJ/mol, 室温
时 ,已 断裂 键 的 分 数 约 为 0. 1; 如 键 能 达到 200 kJ/mol, 这 一 分 数值 仅 约 为 10 “, 即 原子 实际
上 都 以 键 合 状态 存在 。 弱 键 的 一 个 特点 是 :在 各 个 瞬间 总 有 一 定数 量 的 键 发 生 断 裂 。 弱 键 对 生
物 分 子 的 结构 和 功能 具有 重要 意义 ,下面 就 分 别 加 以 讨论 。

二 氨 键

当 一 个 共 价 结合 于 强 电 负 性 原子 上 的 氨 与 另 一 电 负 性 原子 接近 时 ,两 电 负 性 原子 就 可 能
共享 一 个 质子 而 形成 氢 键 (hydrogen bond) 。 水 分 子 间 的 氢 键 就 是 一 例 。 生 物体 中 最 重要 的 氢
键 存 在 于 氧 氨 、 氧 氧 和 氢 氮 之 间 ( 图 2-15) 。

H
汪 SR Et

< 一 O
or
CH
CTNN
| H
2 人
全 二 一-
AS RN 果

图 2-15 ”一些 重要 的 氢 刍
17

在 氢 键 中 ,质子 位 于 两 个 电 负 性 原子 间 从 而 屏蔽 了 负
电荷 的 交互 作用 。 如 构成 氢 键 的 三 个 原子 不 处 在 同一 直线
上 ,屏蔽 作用 就 会 减弱 ,甚或 氢 键 就 不 能 形成 。

氢 键 的 键 能 较 小 , 约 为 20 kJ/mol。 个 别 的 氢 键 虽 较
弱 , 但 生物 大 分 子 内 和 氢 键 的 数量 往往 很 多 , 故 总 体言 ,其 强
度 仍 是 可 观 的 。

细胞 为 一 含水 系统 。 水 对 细胞 的 结构 和 发 挥 功 能 具有
重要 意义 。 水 是 一 个 高 度 缔 合 化 合 物 , 即 分 子 间 存在 着 氢
键 。 氢 键 使 水 ,即使 在 液态 时 也 具有 一 定 的 结构 性 (图 2-
6)。 氧 键 使 水 具有 强 内 聚 力 ,高 气 化 热 和 熔化 热 。 它 为 细 图 2-16 水 分 子 间 的 氢 键
胞 提供 了 一 个 稳定 的 内 环境 .水 分 子 不 仅 相互 间 形 成 氢 键 ，

也 与 许多 生物 分 子 形成 氢 键 ,从 而 影响 生物 分 子 的 结构 和 功能 。 水 的 强 极 性 使 它 成 为 一 种 对 极
性 化 合 物 和 离子 型 化 合 物 的 良好 溶剂 ,而 非 极 性 化 合 物 都 难 溶 于 其 中 。 这 是 形成 膜 结构 的 基

础 。 水 也 是 一 种 电离 性 溶剂 , 它 影响 着 溶质 分 子 的 离 解 ,水 在 细胞 中 不 仅 是 一 种 介质 ,也 是 一 种 ，

反应 物 和 产物 , 它 参 与 了 许多 代谢 反应 。
二

离子 键 代表 着 正 负离子 间 的 引力 。 在 真空 或 空气 中 ,它们 属 强 键 ,但 在 水 溶液 中 , 它们 的 强

度 大 为 减弱 而 属于 弱 键 .这 是 由 于 水 分 子 为 一 偶 极 ，

水 分 子 会 与 正 负离子 形成 水 合 离子 ,并 在 正 负离子

号 间 按 电场 方向 作 定向 排列 ,这 就 大 大 减弱 了 离子 间

55 的 引力 (图 2-17)。 离 子 间 的 作用 力 可 用 顾 一 2 表

ce ce 示 ,9: 和 9: 代表 离子 电荷 量 ,> 代表 相互 间 的 距离 ，

D 为 介 电 常 数 。 真 空 的 介 电 常 数 为 1, 水 的 介 电 常数

为 80(20C )。 这 表明 离子 键 在 水 中 的 强度 约 为 真空

中 的 1/80。 在 细胞 这 样 的 含水 环境 中 ,离子 键 的 强
度 相当 于 氧 键 , 约 为 20 kJ/mol。 上 式 显 示 离 子 键 的 强度 会 随 介质 的 介 电 常数 的 不 同 而 异 。

四 , 短 程 力

短程 力 (short-range force) 是 一 种 当 原子 或 基 团 接近 到 很 短 距 离 时 才 明显 出 现 的 作用 力 。
短程 力 的 强度 约 为 5 kJ/mol 左右 ,并 随 脱离 ~ 的 增加 按 1/ 盖 一 1/” 而 迅速 衰减 。

短程 力 可 存在 于 离子 和 分 子 间 及 分 子 和 分 子 间 ( 图 2-18)。

当 离 子 与 分 子 接近 时 ,相互 间 即 逐渐 产生 静电 作用 。 离 子 可 以 与 极 性 分 子 交 互 作用 ,如 离
子 的 水 合 即 是 。 离 子 也 可 与 非 极 性 分 子 交 互 作用 , 即 当 它 们 相互 接近 时 ,离子 的 存在 就 使 非 极
性 分 子 产生 诱导 偶 极 , 从 而 产生 微弱 的 静电 引力 。

分 子 和 分 子 间 也 可 发 生 交互 作用 ,这 种 交互 作用 可 以 发 生 在 偶 极 和 偶 极 间 , 偶 极 与 诱导 偶
极 间 及 诱导 偶 极 间 ,这些 作用 力 统称 为 范 德 华 (van der Waals ) 力 。

2-17 水 合 离子 间 的 作用

18

这 种 交互 作用 的 强度 虽然 很 弱 , 但 由 于 生物 分 子 主要 都 是 些 大 分 子 , 它 们 的 组 成 原子 很
多 ,因此 , 当 它们 接近 时 ,这 种 交互 作用 在 总 体 上 就 会 变 得 不 可 忽视 。

g 要 汐 :
Ca) 高 子 - 偶 极 、 Y

由
(b) 偶 疏 - 偶 和 极

(c) 偶 极 - 诱 导 侦 极

(e) 诱 导 偶 极 -诱导 偶 极
2-18 短程 力

五 、 疏 水 交互 作用

当 油 与 水 混合 时 ,它们 由 于 不 能 互 溶 而 分 层 。 一 种 物质 是 否 深 于 水 与 其 分 子 的 极 性 有 关 ，
现 以 脂肪 酸 为 例 来 讨论 这 一 问题 .在 醋酸 离子 中 , 甲 基 虽 是 非 极 性 的 ,但 它 很 小 , 强 极 性 的 羧基
使 整个 分 子 成 为 水 溶性 。 但 在 硬 脂 酸 钠 中 , 由 于 其 烃基 远 较 甲 基 为 大 , 故 同 样 强 极 性 的 羧基 在
分 子 中 所 占 的 比重 大 为 降低 ,结果 就 使 硬 脂 酸 钠 成 为 两 亲 化 合 物 , 既 亲 脂 又 亲 水 。 两 亲 化 合 物
的 分 子 在 水 中 趋向 于 在 水 面 形成 单 分 子 层 ,或 是 在 水 中 形成 胶 粒 (图 2-19)。 这 种 使 两 亲 分 子
的 非 极 性 基 ( 玻 水 基 ) 避 开水 而 相互 簇 聚 的 作用 称 为 疏水 交互 作用 (hydrophobic interaction ) 。
梳 水 交 豆 作 用 有 时 也 称 为 琉 水 键 ， 但 后 一
条 并 不 人 而 容易 导 ， 四 为 两 末 分 了 区 世 UUUUUINNNLDUDDL
基 团 的 复 聚 并 不 是 相互 间 存 在 某 种 键 而 导致
的 。 胶 粒 中 ， 两 亲 分 子 的 疏水 基 间 可 以 存在 范

胶 夺
德 华 力 ， 但 它 不 是 杖 水 基 焦 聚 的 起 因而 是 其 结 计
果 。 2 因

当 两 亲 分 子 与 水 接触 时 , 它 的 朴 水 基 难 于
与 极 性 的 水 分 子 交 互 作 用 ,人 迫使 周围 的 水 分 子
间 的 氢 键 有 所 增加 。 永 即 增加 了 琉 水 面 上 水 分 su 二 hr
子 的 有 序 排 列 。 液 态 水 的 分 子 是 通过 氢 键 在 一
定 程 序 上 缔 合 的 ,但 氢 键 会 在 水 分 子 间 转移 ,水 “ 图 2-19 两 亲 分 子 形成 的 单 分 子 层 和 胶 粒
分 子 并 未 形成 晶 格 , 仍 可 或 多 或 少 地 自由 运动 。
水 分 子 间 氧 键 的 增加 意味 着 分 子 运 动 自由 度 的 降低 , 即 水 分 子 进一步 走向 有 序 。 在 这 一 过 程 中
所 消耗 的 能 量 超过 形成 更 多 氧 键 所 释放 的 能 量 , 故 这 一 状态 在 能 量 上 是 不 利 的 . 当 两 亲 分 子 的

9

芷 水 基 相 互 艇 聚 时 ,上 述 能 量 上 的 不 利 状态 就 得 到 解除 , 故 朴 水 交互 作用 是 一 个 主要 由 水 分 子
混乱 度 改 变 所 驱动 的 过 程 ( 这 将 在 第 五 节 中 作 进一步 的 讨论 ) 。
许多 生物 分 子 是 两 亲 的 , 玻 水 交互 作用 对 细胞 的 结构 和 功能 都 很 重要 。

六 . 配 价 键

一 些 金属 离子 能 与 含 氨 、 氧 的 基 团 间 形 成 一 种 特殊 类 型 的 共 价 结合 。Cu(OH): 是 一 种 淡
绿色 的 不 溶 于 水 的 物质 ,加 入 浦 氨水 后 即 形成 一 种 深蓝 色 的 溶液 , 这 是 由 于 形成 了 铜 氨 络 离
二

GE CEIONEOa

氨 分 子 中 的 氮 各 以 一 个 单 键 与 氢 结 合 外 还 具有 一 孤 对 电子 ,后 者 可 与 铜 离子 形成 配 价 键 。

配 价 键 的 本 质 也 是 电子 对 的 共享 ,与 一 般 共 价 键 不 同 的 是 共享 电子 对 全 由 键 合 原子 的 一 方 提

供 。 由 Cu#+ 与 NHs 形成 的 离子 称 为 络 离子 ,其 中 的 铜 称 为 中 心 离子 , 氨 称 为 配 位 体 , 含 这 种 结

构 的 化 合 物 称 为 络 合 物 。 许多 过 渡 金 属 离子 都 能 形成 络 合 物 。 此 外 ,上 节 提 到 的 金属 离子 的 水

合 物 中 ,水 的 氧 原子 与 金属 离子 间 虽 存在 着 离子 及 偶 极 间 的 作用 力 , 但 也 存在 配 价 键 的 成 分 。

配 价 键 的 强度 约 与 其 它 共 价 键 相 当 , 常 在 250kJ/mol 上 下 ;在 细胞 的 含水 介质 中 , 由 于 水 具有
形成 配 价 键 的 能 力 , 因 此 , 它 实 际 上 的 强度 较 上 述 数字 为 低 。

络 合 物 中 , 同一 分 子 具 有 2 个 或 更 多 的 配 位 基 的 化 合 物 称 为 鳌 合 物 (chelate) ,它们 广泛 存

在 于 细胞 中 .中 啉 是 许多 蛋白 质 的 辅 基 , 它 也

| 是 一 种 鳌 合 剂 (chelating agent) ,能 与 金属 离

CH H
ed 子 鳌 合 ,血红 素 就 是 一 个 例子 (图 2-20)。 血
:一 -1 红 素 为 一 扁平 的 分 子 , 其 中 由 18 个 原子 构成
we- 站。 e 一 sw 。 。 的 共 频 体系 处 于 同一 平面 中 ,Fet+ 与 4 个 所
ooe_on_en 凡 一 A 和 。_-。 络 合 .在 血红 蛋白 中 ,血红 素 在 平面 的 一 便 与
0 组 氨 酸 侧 链 的 咪唑 基 氮 络 合 ,在 另 一 侧 与 所
1 一 络 合 。 血 红 蛋 白 在 呼吸 过 程 中 起 着 运输 氧 的
9H，。 ch 功能 .除了 血红 素 外 ,细胞 色素 .过 氧化 氢 酶 、
T 维生素 Biz 等 也 都 含 中 啉 辅 基 , 只 是 所 整合 的

金属 离子 不 尽 相 同 。

图 2-20 血红 素 的 结构 络 合 物 在 生物 系统 中 具有 很 高 的 重要 性 。

第 五 节 ”生命 系统 和 热力 学

生物 是 物质 进化 的 产物 ,细胞 是 由 各 种 生物 分 子 组 成 的 ,但 无 生命 物质 和 有 生命 物质 具有
不 同 的 特征 ,前 者 自发 地 由 复杂 向 简单 .由 存在 差异 向 均匀 方向 发 展 , 后 者 则 由 简单 向 复杂 、 由
低级 向 高 级 发 展 。 两 者 形成 了 鲜明 的 对 比 。 既 然 生命 是 遵循 物理 和 化 学 的 基本 规律 的 ,那么 我
们 怎样 来 理解 有 生命 和 无 生命 物质 的 这 一 区 别 呢 ?
20

写
一 ee
7

一 ` 三 种 热力 学 系统
ae 下 二 0

胞 和 机 体 就 是 一 个 系统 ， 它 也 遵循 热力 学 的 规律

系统 可 以 分 为 三 种 :孤立 系统 \ 封 闭 系统 和 开放 系统 。 扳 立 系统 与 其 环境 间 没 有 物质 和 能
量 的 转移 ,整个 宇宙 可 以 看 做 是 一 孤立 系统 .封闭 系统 与 环境 间 虽 无 物质 的 转移 ,但 可 发 生 热 、
功 和 辐射 等 的 转移 。 处 于 一 封闭 容器 中 的 物质 构成 了 一 个 封闭 系统 。 开 放 系统 是 一 种 能 与 环
境 发 生物 质 和 能 量 转移 的 系统 。 细 胞 即 是 一 开放 系统 。

二 、 能 的 转化 和 守恒

能 量 概念 最 早 是 在 机 械 现象 研究 中 建立 起 来 的 。 例 如 ,斜坡 上 物体 的 下 滑 会 做 功 ,后 者 是
物体 的 势能 转化 来 的 .以 后 ,热机 发 明了 ,人 们 在 改进 热机 效率 的 努力 中 ,进一步 认识 到 了 能 的
一 些 特性 ,热力 学 随 之 形成 。 热 力学 专门 讨论 热 和 能 的 其 它 形态 间 的 关系 ,并 用 以 描述 和 预测
宏观 物体 的 物理 和 化 学 过 程 。 热 力学 所 讨论 的 物质 性 质 包括 压强 (P) ,体积 (V) ,温度 (7) , 热
(a)， 功 (zw) 和 内 能 (五 ) 。

系统 和 环境 间 的 能 量 交换 可 以 采取 多 种 形式 ,例如 , 热 . 光 ,机 械 功 \ 电 功 等 现在 先 讨论 封
闭 系统 与 环境 间 热 (xz) 和 功 (w) 交 换 的 定量 关系 。 当 系统 从 环境 吸收 热 时 定 为 正 , 放 热 时 4
为 负 ; 向 环境 做 功 时 ,uw 为 正 ,反之 为 负 。 在 这 一 过 程 中 ,能 的 形态 虽然 改变 了 但 量 是 守恒 的 ;

A 兢 一 丈 多 一 玖 始 一 9 一 也

这 就 是 热力 学 第 一 定律 , 式 中 的 忆 8 表示 过 程 开 始 时 的 能 量 , 丈 & 表示 过 程 终止 时 的 能 量 ,AF
表示 两 者 之 差 . 忆 代表 系统 的 内 能 ,包括 分 子 的 平 动能 、 转 动能 、 振 动能 和 电子 能 .但 必须 指出 ，
这 些 能 量 的 变化 是 量子 化 的 , 即 分 为 独立 的 、 不 连续 的 能 级 。 例 如 , 氧 原子 的 核 外 电子 ,一 般 情
况 下 处 于 最 低能 级 ( 即 基 态 ) 中 , 当 它 吸 收 到 1. 6X10” J 能 量 时 即 跃 人 第 二 能 级 中 ,如 吸收 1. 9
“X10 J 和 2.1X10 JJ 能 量 时 就 分 别 跃 人 第 三 \ 第 四 能 级 中 。 能 级 只 采取 特定 的 值 。

在 分 子 中 还 存在 其 它 形式 的 运动 ,一 个 双 原 子 分 子 中 的 两 个 原子 可 以 振动 , 即 相互 接近 或
远离 。 振 动能 也 是 量子 化 的 ,数量 级 为 10 “一 10“J, 数 值 与 分 子 的 结构 有 关 。 这 上 比 电子 能 级
的 间隔 小 。 分 子 还 能 转动 ,能 级 间 差 别 的 数量 级 为 10 “J。 最 后 ,分 子 还 能 在 空间 平移 , 它 的 能
。 级 间隔 更 小 ,为 10“J。 在 这 几 种 能 量 中 ,电子 能 对 内 能 的 贡献 最 大 ,然后 依次 为 振动 能 转动

能 和 平 动 能 。

系统 的 内 能 为 一 一 状态 函数 , 即 它 依赖 于 其 状态 ,而 与 到 达 该 状态 的 途径 无 关 , 故 过 程 的 内

能 差 可 表达 为 :

A 刁 一 歼 玫 一 玖 始

烩 CH,enthalpy) 是 热力 学 的 另 一 个 状态 函数 。 一 个 化 合 物 , 一 种 理想 气体 的 烩 变 为 系统 的

内 能 加 上 压强 和 体积 变化 的 乘积 , 即 始 分 子 自身 的 能 和 分 子 的 相互 作用 ,因为 分 子 间 存 在 着 并

不 涉及 化 学 反应 的 相互 作用 。 在 一 个 过 程 中 , 灼 变化 用 4A 玉 表示 ， 与 内 能 的 关系 可 用 下 式
21

表示 :
4 万 =AF 十 APT
当 烩 的 变化 很 微小 时 ，
d 石 三 d( 正 十 PV) 王 d 丈 十 PdY 十 VdP=da 一 dz 十 PdV 十 YdP
对 一 个 只 作 PdV 功 的 系统 ,dww 王 PdV , 故
d 万 二 da 十 VdP
由 于 系统 相应 的 内 能 变化 为 4 严 于 de 一 PdV , 故 当 系统 体积 不 变 时 ，
d 歼 一 da 或 4AF=qv
如 过 程 发 生 于 恒 压 下 ，
d 万 =da 或 4 人 万 =apP
上 式 中 的 g, 和 9e 分 别 表 示 恒 容 和 恒 压 下 的 热量 。 这 表明 , 当 系 统 体积 恒定 时 ,过 程 的 内 能 变
化 等 于 它 所 吸收 的 热 , 而 过 程 的 烩 可 由 恒 压 下 系统 所 吸收 的 热 测 得 ,由 于 大 多 数 的 生物 过 程 的
压强 和 体积 变化 都 很 小 , 故 A 豆 和 4 的 差异 实质 上 微不足道 。 这 对 研究 生命 活动 有 很 大 方
便 。 例 如 ,测定 生物 组 织 中 葡萄 糖 完全 氧化 时 烩 的 变化 是 一 个 很 困难 的 问题 ,这 是 因为 它 要 经
历 许多 代谢 反应 ,逐步 测定 无 疑难 于 做 到 ,何况 组 织 中 同时 还 有 许多 与 葡萄 糖 所 化 无 关 的 反应
在 进行 着 。 既 然 生化 反应 常 在 恒 压 下 进行 , 又 是 一 个 状态 函数 ,只 与 产物 和 反应 物 的 能 量 差
有 关 , 并 不 涉及 反应 的 机 理 与 速度 , 故 葡萄 糖 氧 化 成 二 氧化 碳 和 水 时 的 烩 变 就 可 通过 采用 等 压
量 热 器 的 方法 来 测 得 ,因为 在 这 一 方法 中 葡萄 糖 完全 转化 为 二 氧化 碳 和 水 。

三 过 程 的 自发 性

在 生命 活动 的 研究 中 ,我们 常 希望 了 解 一 个 过 程 的 自发 性 (spontaneity) 。 但 热力 学 第 一 定
律 并 没有 为 我 们 提供 判别 能 否 自 发 进行 的 标准 。

人 们 一 般 常 会 认为 , 放 热 过 程 总 是 自发 的 ,因为 它 代表 系统 由 高 能 量 向 低能 量 水 平 转变 ，
ATP 的 水 解 确 是 如 此 ,但 情况 并 不 都 尽 然 。 如 水 溶性 蛋白 溶液 与 Cu:+ 作 用 会 自发 生成 沉淀 ，
可 是 这 一 过 程 是 吸 热 的 。 已 如 前 述 , 机 体 的 生化 过 程 的 内 能 变化 一 般 等 于 其 热能 变化 ,但 热能
变化 并 不 能 成 为 判别 过 程 是 否 自发 的 标准 .因为 一 个 过 程 发 生前 后 的 能 量变 化 由 两 部 分 组 成 ;
一 部 分 是 分 子 的 键 能 和 构象 变化 等 所 涉及 的 能 , 它 在 常温 、 常 压 下 可 以 做 功 , 称 为 自由 能 (free
energy,F) ; 另 一 部 分 束缚 于 系统 的 混乱 度 ( 即 系统 组 分 的 自由 度 ) ,并 与 温度 有 关 , 称 为 箭 (Cen-
tropy,S) 。 它 在 常温 、 常 压 下 不 能 被 利用 。 只 有 自由 能 才 是 判别 一 个 过 程 能 否 自发 进行 的 标准 。

自由 能 也 称 为 Gibbs 函数 (C) 。 一 个 过 程 的 自由 能 变化 (4AGC) 可 以 表示 为 ;

A4AC 王 4 万 一 TA9
现在 我 们 来 逐步 讨论 这 一 问题 。 在 下 一 反应 中
a4 十 0B 一 二 CC 十 dDD
反应 开始 时 ,4 和 避 逐步 转变 为 C 和 厂 , 直 至 建立 平衡 为 止 ,这 一 过 程 的 自由 能 变化 为 :

一 Aee [CjLD]
4G 一 4AG" 十 RTln(F 让 ET)

上 式 中 的 AG" 为 标准 自由 能 变化 , 即 是 25 C ,1 大 气压 和 反应 物 、 产 物 都 是 单位 活 度 时 的 自由
22

能 变化 , 当 反 应 建立 平衡 时 ,AC 一 0, 故 :

AG"= 一 RT1n《 1 Re

通过 这 一 式 子 ,我 们 可 以 由 AC 计算 表 2-5 25 也 时 Kg 与 AG" 间 的 关系
出 反应 的 平衡 常数 ,或 由 平衡 常数 计 、 KW 4
和
间 的 数值 关系 。 由 表 2-5 可 以 看 出 ， 放 8
25C 时 Ka 每 变化 10 倍 ,4G" 变 化 pt
5.7kJ/mol.ACG* 的 这 一 变化 还 小 于 氢 io 0.0
键 键 能 的 一 半 。 2 局
从 表 2-5 看 出 ,过 程 的 自由 能 变 吕 5
化 由 系统 的 烩 变 和 入 变 共同 决定 的 这 10- _a4.3
一 关系 ,对 分 子 生 物 学 有 着 重要 意义 。
我 们 先 从 几 个 具体 例子 讨论 起 。

我 们 知道 ,葡萄 糖 酸 常 以 环 型 内 酯 形式 存在 , 它 是 一 种 稳定 的 形式 ,但 羧 酸 和 醇 分 子 间 生
成 的 酯 并 不 很 稳定 ,现在 我 们 就 来 分 析 这 两 种 情况 的 差别 。 羧 酸 和 醇 分 子 间 酯 化 反应 的 天 接
近 1。
1 1i
CHCHCHC-OH +CHCHOH= 芋 CHCH;CHC--O 一 CHCH， 十 H:O
而 醇 酸 的 分 子 内 酯 化 的 天 :之 1。
天 1 福 ]

CHCHCOOH 一 一 CHCH 一 C 一 0

+H:O
HGHSOH CHzCH: 一 OO

表 2-5 指出 ,4AG* 与 及 7 竺 间 存 在 着 紧密 的 依赖 关系 。 上 述 两 反应 间 平 衡 常数 的 不 同 显然 是
&AG" 的 差异 造成 的 。 现 在 我 们 再 来 考察 两 反应 的 烩 变 和 变 。 两 个 反应 中 都 有 酯 键 形 成 , 故 迷
变 应 该 相同 且 都 为 负 值 . 但 两 个 反应 的 焙 变 不 同 。 在 第 一 个 反应 中 , 羧 酸 和 醇 分 别 为 两 个 分 子 ，
反应 后 羧基 和 羟基 转 入 同一 分 子 中 ,分 子 运动 受到 的 影响 较 大 .。 羟 酸 的 羧基 和 羟基 本 在 同一 分
子 中 , 故 反 应 后 分 子 运动 受到 的 影响 小 ,这 使 第 一 个 反应 中 灼 改变 大 于 第 二 个 反应 。

分 子 内 反应 ACi=A4 万 一 TAS，
分 子 间 反 应 4AGC:=A4 万 一 TAS，
结果 第 二 个 反应 AG: 更 负 , 反 应 更 趋 完成 , 环 型 内 酯 更 为 稳定 。

再 讨论 一 个 例子 。 前 面 提 到 过 的 Cu2+ 与 水 溶性 蛋白 形成 沉淀 的 过 程 是 自发 进行 的 。 但 测
定 的 A 瓦 为 12 kJ/mol ,这 不 利于 过 程 的 自发 进行 。 但 我 们 还 需 考虑 反应 物 和 产物 分 子 运动 自
由 度 的 变化 。 蛋白 质 和 Cu2+ 的 结合 虽然 使 运动 自由 度 降低 ,但 两 者 在 结合 前 都 是 水 合 的 ,一 旦
结合 , 原来 被 束缚 于 水 合 物 中 的 水 分 子 被 释放 , 即 业 增 加 了 ,这 有 利于 过 程 的 自发 进行 .由 于
增 天 于 迷 增 , 故 AG 为 负 值 ,反应 能 自发 进行 。 这 时 我 们 是 把 溶液 作为 一 个 系统 来 考虑 的 。

下 水 交互 作用 是 细胞 结构 中 的 一 种 重要 作用 力 。 现 在 我 们 再 从 热力 学 的 角度 作 进一步 的

23

分 析 .。 一 个 玻 水 基 团 插入 水 分 子 间 产 生 了 两 方面 的 效应 : 它 一 方面 迫使 周围 水 分 子 间 形成 更 多
的 氧 键 ,A 玉 有 利于 过 程 的 进行 ; 另 一 方面 周围 水 分 子 运 动 的 自由 度 降 低 了 ,As 不 利于 过 程 的
进行 ,并 且 超 过 了 4A 互 的 效应 ,使 AG 不 利于 过 程 的 自发 进行 ( 见 表 2-5)。 但 当下 水 基 团 簇 聚 在
一 起 时 ,上 述 情况 就 逆转 , 故 疏 水 交互 作用 的 出 现 是 一 种 和 驱 动 的 过 程 。 |
一 个 过 程 的 自发 性 是 由 过 程 的 烩 变 和 箭 变 共同 决定 的 ,现在 我 们 把 这 三 者 之 间 的 关系 概
括 如 下 : 当 AcC 为 负 , 过 程 能 自发 进行 ;AC 为 正 , 过 程 不 能 自发 进行 ;AC=0, 过 程 建 立 平 衡 .AC |
与 人 五 和 As 间 的 关系 则 可 归纳 为 表 2-6。
表 2-6 过 程 的 自发 性 与 A 妃 ,AS 的 关系
4 万 AS 4C 王 4 万 一 TAS
一 5 烩 变 和 焙 变 都 有 利于 过 程 的 自发 进行 ,温度 对 自发 性 无 影响
际 烩 变 有 利 , 业 变 不 利于 过 程 的 进行 ,过 程 只 有 当 温 度 低 于 7 一 知 时 才 自发 进行

注 站 烩 变 不 利 , 和 变 有 利于 过 程 的 进行 ,过 程 只 有 当 温 度 高 于 T 一 知 时 才 自发 进行
守 烩 变 和 和 变 都 不 利于 过 程 的 进行 ,过 程 在 任何 温度 下 都 不 能 自发 进行

四 、 类 和 热力 学 第 二 定律

过 程 的 方向 和 限度 是 我 们 讨论 一 个 系统 时 的 基本 问题 ,它们 是 由 系统 的 娩 科 共同 决定
的 。 答 的 意义 已 讨论 得 比较 充分 , 炉 则 还 有 进一步 讨论 的 需要 。

为 了 便于 解释 丧 的 意义 ,我 们 先 从 一 个
简单 模型 讨论 起 。 假 设 有 一 个 可 以 平均 分 陋 。 天 7 《一 ee
为 三 的 箱子 ,其 中 放置 子 人 个 完全 相同 的 球 、 从 CO 人 二

“讨论 时 ,为 方便 起 见 暂 把 它们 分 别 标 为 A， 0 4 0
B,C,D) .在 过 程 开 始 时 ,A,B,C,D 都 位 于 左
方 CL), 以 后 它们 随机 移动 ,其 中 一 些 球 就 移 KK ，
向 右 方 CR) , 表 2-7 列 出 的 就 是 4 个 球 随机 移 LI R L 1 3
动 的 可 能 结果 。 R LI 工 工 3 1

在 这 二 南 4 个 球 组 成 的 系统 中 ,每 个， ， RAR” 了 了 有
球 可 能 的 排 布 方式 为 2( 即 或 左 或 右 ),4 个 球 工 R LR ? 2
共 16 种 方式 , 任 一 球 采取 某 一 特定 排 布 方式 ”LI R R L ? 3
的 概率 为 1/16。 但 4 个 球 实际 上 没有 差别 ， R ， KK
实际 情况 是 :3 个 球 出 现在 左 ( 右 ) 方 ,1 个 球 RTLTLRK

在 一 方 的 概率 为 6/16,4 个 球 全 出 现在 一 方 和 和 下 工
的 概率 为 1/16。 由 此 可 知 ,出现 频率 最 高 的 电光 | 康 司 册 1 3
排 布 为 2 个 球 在 一 方 , 另 2 个 球 在 另 一 方 (图 LILRRR 1 3

关 关 关 其

2-24)
当 箱 中 鬼 球 效 缘 加 时 ，, 球 完 全 集中 在 一
方 的 概率 就 越 来 越 小 , 如 球 数 增加 至 20 时 , 这 一 数字 仅 为 (%) .图 2-22 表示 的 是 箱 中 的 球 数
24

R -了 R “了 RE 0 4

CN) 分 别 为 4,20, 和 100 时 的 概率 分 布 曲线 通过 比
较 ,我 们 可 以 看 出 , 当 N 增加 时 ,曲线 就 越 来 越 窗 ， 5/
这 表明 它 与 球 在 一 方 的 平均 数 的 偏差 越 小 。 由 此 可 5/16
以 引出 结论 ,系统 中 所 有 粒子 集中 于 一 侧 的 情况 ,从 4/
能 力学 言 是 可 能 的 ,从 统计 学 言 实际 是 不 存在 的 。
现在 我 们 再 回 到 前 述 的 模型 ,并 假设 它 是 一 个
孤立 系统 ,而 箱子 由 一 假设 的 可 开启 的 隔 板 分 隔 为
二 。 开始 时 箱 的 左 方 充满 1 mol 理想 气体 , 当 隔 板 开 1/16
启 的 瞬间 ,分 子 开始 采取 许多 方式 排 布 (即位 于 左 方 0
或 右 方 ), 随 着 时 间 的 消逝 ,分 子 在 箱 的 左右 方 的 数 是
_ 目 趋 于 均匀 , 即 建 立 起 了 平衡 ,这 时 宏观 上 不 再 表现 图 ?21 4 个 球 在 箱子 两 半 的 概率 分 布
出 变化 .或 者 说 ,在 这 一 过 程 中 最 可 能 出 现 的 状态 即
是 分 布 概率 最 高 的 ,或 是 最 混乱 的 状态 。 业 即 是 系统 混乱 度 的 量度 。
一 个 孤立 系统 总 是 自发 地 朝 炳 增加 的 方向 发 展 (4S 之 0) ,直至 建立 平衡 , 即 4S 一 0。 这 就
是 热力 学 第 二 定律 。

概率

| 3

49S0
由 于 宇宙 不 再 有 环境 , 故 宇 宙 是 一 孤立 系统 ,宇宙 的 业 趋 向 于 一 最 大 值 。
和 内 能 、 妈 一 样 是 系统 的 状态 函数 ,系统 的 箭 变 仅 决定 于 其 状态 。

和 Xz 球 出 现在 左 方 的 概率

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
nm/N

图 2-22 ”粒子 概率 分 布 函 数
在 前 面 的 讨论 中 。 为 了 使 情况 简化 从 而 便于 说 明 问 题 ,我 们 忽略 了 粒子 排 布 中 的 位 置 差
异 ,现在 如 以 友 代表 特定 状态 下 系统 组 分 的 所 有 可 能 的 排 布 数 , 则 焙 与 三 的 关系 就 可 表示

名 -

一 尺 In

R 为 气体 常数 。
25

现在 我 们 再 从 分 子 运动 角度 来 讨论 凡 。 系 统 的 内 能 包括 分 子 的 平 动能 、 转 动能、 振动 能 以
及 电子 能 。 在 这 些 能 量 中 , 平 动能 的 能 级 最 密 , 能 级 的 间 隅 最 小 ,其 次 为 转动 能 、 振 动能 和 电子
能 .分 子 的 这 些 运动 中 , 平 动 对 灼 贡献 最 大 ,转动 次 之 ,振动 最 小 ;对 电子 言 ,它们 常 处 于 最 低
能 级 中 , 对 灶 的 贡献 常 为 0, 这 和 内 能 相反 。

此 外 ,分 子 的 一 些 结构 因素 对 灶 也 是 重要 的 。 例 如 ,分 子 刚性 的 增加 会 减少 转动 和 振动 能
对 焙 的 贡献 ,这 些 因 素 包 括 双 键 、 三 键 和 环 等 等 。

五 , 与 生命

活 机 体 是 一 高 度 有 序 的 系统 ,这 种 有 序 性 表现 在 它 是 由 一 组 特定 的 生物 分 子 , 按 照 一 定 的
层次 和 一 定 的 规律 构成 的 。 机 体 各 个 部 分 中 各 类 分 子 的 分 布 是 不 均匀 的 ,因而 功能 也 不 同 , 但
相互 间 分 工 精致 而 又 协调 ,体内 的 代谢 按照 一 定 的 程序 .一 定 的 方向 进行 ,生物 机 体 是 一 远离
平衡 态 的 开放 系统 。 活 机 体 和 无 生命 物体 表现 出 很 大 的 不 同 。 无 生命 物体 总 趋向 于 无 序 和 均
匀 , 趋 向 于 平衡 。 生 物 则 不 仅 能 维持 其 高 度 的 有 序 性 ,并 且 不 论 在 个 体 发 育 或 是 生物 进化 中 都
向 更 高 一 层 的 有 序 性 , 即 向 减少 灼 方向 发 展 , 活 机 体 之 所 以 能 如 此 ,因为 它 是 一 个 开放 系统 ，
能 与 环境 发 生物 质 和 能 量 的 交换 ,机 体 的 高 度 有 序 性 是 以 增加 环境 的 混乱 度 ( 焙 ) 为 代价 的 。

As 系统 十 AS 环境 一 A3 字 宙 僵 0

已 如 前 述
9 一 &lnT

其 中 的 矿 是 系统 组 分 的 各 种 可 能 的 排 布 数 , 它 反映 了 系统 的 无 序 性 ,因此 ,1/ 太 可 用 作 表 示
系统 有 序 性 的 量度 。

一 S 王 旭 n 四

一 $ 可 称 为 负 业 。

Schrodinger, 王 . 在 他 的 著名 论文 ”What is life” 中 指出 ,一 个 生命 有 机 体 不 断 地 在 增加 习 ，
并 趋向 于 一 最 大 值 , 最 后 达成 平衡 ,这 就 是 死亡 的 来 临 。 机 体 要 生存 就 必须 从 环境 不 断 汲 取 负
箭 .有 机 体 是 依赖 负 业 生 存 的 .Schrodinger 也 曾 预 言 生物 机 体 中 存在 遗传 物质 ,生命 的 特征 之
一 就 是 能 自我 复制 ,他 指出 机 体内 的 遗传 物质 具有 晶体 的 一 些 特性 。 以 后 发 现 的 DNA 证 实 了
细胞 中 存在 遗传 物质 的 预言 。Schrodinger 的 论点 对 我 们 认识 生命 现象 无 疑 具有 重要 意义 ,但
如 何 全 面具 体 地 掌握 生命 的 本 质 看 来 还 有 漫长 的 道路 。

第 六 节 “生物 大 分 子 的 构象 及 其 组 装

一 、 核 酸 ` 蛋 白质 和 遗传 信息

核酸 (CDNA 和 RNA) 和 蛋白质 是 机 体 的 两 类 最 基本 的 生物 大 分 子 .它们 都 属 信 息 分 子 , 但
DNA 是 遗传 信息 的 原初 载体 ,蛋白 质 是 遗传 信息 的 体现 者 .或 者 说 ,BNA 在 机 体 中 代表 信息 ，
蛋白 质 代 表 功 能 ,但 两 者 是 相互 依存 的 。 蛋 白质 的 功能 是 遗传 信息 规定 的 ,而 遗传 信息 的 表达
又 依赖 蛋白 质 的 参与 。

26

verreerrrrrrrerrrrrrs

在 DNA 和 mRNA 间 , 遗 传 信息 的 传递 是 通过 碱 基 互 补 实现 的 ;在 mRNA 和 多 肽 链 间 ，
它 是 由 tRNA 作为 中 介 实 现 的 ,使 mRNA 的 核 苷 酸 顺 序 转变 为 氨基 酸 顺 序 。

DNA 是 由 4 种 核 苷 酸 组 成 的 , 核 苷 酸 的 排列 顺序 代表 了 核酸 的 语言 。 蛋 白质 是 由 20 种“-
氨基 酸 组 成 的 ,氨基 酸 的 排列 顺序 代表 了 蛋白 质 的 语言 ,两 者 存在 着 对 应 关系 (图 2-23)。 多 肽
链 的 氨基 酸 顺 序 并 不 能 直接 表现 出 功能 ,功能 只 是 多 肽 链 折 县 成 特定 的 三 维 结构 后 才 出 现 的 ，
但 多 肽 链 的 氨基 酸 顺 序 包含 了 它 折 友 全 部 信息 。Anfinsen 的 著名 实验 证 明了 这 一 点 。 变 性 使
蛋白 质 丧 失 其 活力 ,这 是 它 的 三 维 结构 受到 破坏 的 结果 。Anfinsen 先 用 尿素 和 琉 基 乙醇
HOCH2:CH2:SH) 处 理 牛 胰 核 糖 核酸 酶 ,结果 酶 发 生变 性 , 原 有 的 4 个 二 硫 键 还 原 成 8 个 琉 基 。
然后 用 透析 法 除去 尿素 和 和 琉 基 乙醇 , 酶 的 活力 由 于 复 性 而 恢复 。 酶 分 子 中 的 8 个 劳 基 可 组 合成
105 种 二 硫 键 , 酶 活力 的 全 部 恢复 表明 重新 形成 的 二 硫 键 位 于 原来 的 位 置 上 , 即 天 然 三 维 结构
得 到 重新 建立 , 它 是 多 肽 链 自 发 折叠 的 结果 (图 2-24) 。

吕
s

难
于
沾

Da Sha
忆
史
mm

忌
关
=aSeeceaeoaoeeeeoaenoeGae=

图 2-23 ” 核 苷 酸 和 氨基 酸 顺 序 间 的 对 应 关系 图 2-24 牛 胰 核糖 核酸 酶 的 变性 和 复 性
多 肽 链 是 怎样 折 丢 成 三 维 结构 的 ?
二 .多肽 链 的 共 价 结构

、__ 蛋 白质 的 结构 可 分 为 多 个 层次 , 即 一 级 结构 (primary structure), 二 级 结构 (secondary
structure) ,三 级 结构 (tsEtiary-etructure) 和 四 级 结构 Cquaternary structure) (图 2-25) 。

多 肽 链 是 蛋白 质 结 构 的 基础 , 它 是 由 “氨基 酸 按 一 定 的 顺序 通过 肽 键 连接 成 的 。 有 多肽 侠
的 氨基 酸 顺 序 称 为 蛋白 质 的 一 级 结构 。

基

27

肽 键 是 一 个 氨基 酸 的 "- 羧 基 与 另 一 氨基 酸 的 - 氨 基 间 失 水 缩合 成 的 。

O
as
肽 键

多 大 和 二 司 生 四 级 结构

请 5 2 三 级 结构

De 结构 域

不 同 折 营 形式 的 组 合
多 肽 链 的 折 琶
1
人 人 和 一 级 结构
(3)
图 2- 25 妈 次

SS SS |
由 于 共生 效 应 ， C 一 0 和 NH 间 的 单 负 带 9
有 双 键 性 质 ,在 一 般 情况 下 不 能 转动 。 肽 键 是 一
个 具 一 定 刚性 的 接近 平面 的 结构 (图 2-26), 因 H 豚 过
此 ,多 肽 链 的 主 链 可 以 看 做 是 由 “- 磋 和 及 键 交 本 基 酸 | _ 记 -， | AN
蔡 连 接 成 的 ,不 同 多 肽 链 的 主 链 完全 相同 ,不 同 “的 * 磺 志 CV 和 GeNN
的 是 主 链 上 R 基 的 种 类 和 排 布 , 它 是 由 遗传 信 是 4 3 汉 ，

8 人 信 氨 基 酸 2
息 规定 的 。 2 | 2 本 的 w- 碳
蛋白 质 氨基 酸 共有 20 种 ,它们 的 差别 在 于 芯 汐 2 中

x- 碳 上 连接 的 基 团 ( 表 2-8) .这 些 基 团 决定 了 多
肽 链 可 采取 的 构象 和 所 表现 出 的 功能 。

三 、 多 肽 链 的 构象

在 多 肽 链 的 主 链 中 , 由 于 肽 链 为 一 整体 , 故 能 转动 的 只 能 是 “ 碳 上 的 两 个 单 键 C. 一 N 和
C,-C。 由 于 多 肽 链 含 数 以 百 计 的 氨基 酸 残 基 , 在 理论 上 由 绕 单 键 旋 转产 生 的 构象 应 是 一 天 文
数字 。 但 实际 上 ,多 肽 链 可 采取 的 构象 是 有 限 的 , 因为 多 肽 链 主 链 的 组 成 原子 间 、 主 链 原 子 和 便
链 间 都 可 发 生 干扰 ,这 些 干 扰 来 自 原子 或 基 团 的 大 小 和 形状 ,它们 的 极 性 和 所 带 的 电荷 等 。 这
些 限 制 因 素 的 存在 使 有 些 构象 是 不 允许 的 ,有 些 构象 虽然 可 能 但 是 不 稳定 的 ,只 有 一 定 的 构 过
是 化 学 上 允许 和 能 力学 上 有 利 的 。 这 些 限制 因素 使 C. 一 N 和 C. 一 C 只 能 在 一 定 的 角度 内 转
动 ， Er 一 N 和 C, 一 C 转动 的 角度 虽 和 小 来 表述 。 氨 基 酸 R 基

决定 蛋白 质 结构 和 功能 的 实质 所 存 。 我 们 如 以 瑟 对 由 做 图

就 得 到 多肽 链 的 构 和 图 或 入 Ramachandran 图 (图 2-27) ,其 中 实 线 框 标 出 的 是 更 和 由 的 刘

许 组 合 ,网 点 区 表示 的 是 虽 有 空间 障碍 ,但 实际 仍 可 存在 的 构象 。 这 些 人 允许 的 惠 直 组合 规 定 了
28

图 2-26 。 肽 键 结构

TI99599095959059ppgepememgprermppwrrerrepaorerrrrrrarrrrrrr ee

表 2-8 蛋白 氨基 酸 的 侧 链 和 符号

R 的 结构 R 的 性 质 名 称 符号 R 的 结构 R 的 性 质 “名称 符号
HO
加 位 阻 最 小 甘氨酸 Gly,G 极 性 苏 氨 酸 Thr, 工
CH: 一 CH 一
二 一 非 极 性 ” 丙 氨 酸 ”Ala,A |‖ HooccH: 一 酸性 天 冬 氨 酸 Asp,D
隐
人 非 极 性 缚 氢 酸 Val ,V HOOC(CH2) :一 酸性 谷 氢 酸 Glu, 下
CHs
区 非 极 性 亮 氨 酸 Leu, 工 下 极 性 天 冬 酰 胺 Asn,N
H3sC O
这 H2N、
| 非 极 性 异 亮 氨 酸 lle,1 cC 一 (CH 家 性 谷 所 酰胺 Gln,Q
CHsCH2CH 一 本
CC 下: 一
Hic/ 非 极 性 且 氨 酸 Pro ,了 P HS 一 CH 一 弱酸 性 半 胱 氨 酸 Cys,C
NS 形成 二 硫 键
CH.: 一
人 _》 CH: 一 非 极 性 。 辩 丙 氨 酸 Phe,F | CH:SCCH2) 一 甲 基 供 体 。 甲 硫 氨 酸 Met,M

百 .- 一
HO-< > CH; 习 酸性 酷 乞 酸 TyrO | an 极 性 组 氨 酸 His,H

H: 一
名 NU 非 极 性 ” 色 氢 酸 Trp,W HzN 一 (CH2)4 一 碱 性 赖 氨 酸 Lys, 开

H

HzN+
HO 一 CH: 一 极 性 丝氨酸 Ser,S | 碱 性 精 氨 酸 Arg,R
Hz:N 一 C 一 NHCCH2): 一

注 :氨基 酸 的 符号 有 两 种 .一 种 由 3 个 字母 组 成 ; 另 一 种 仅 含 1 个 字母 。

第 i 氨基 酸
重复 距离 残 基

(0. 72nm)

图 2-27 ”多肽 链 的 构象 图
29

蛋白 质 的 二 级 结构 。 蛋 白质 的 二 级 结构 有 -螺旋 、p- 折 和 玖 和 及 转角 (图 2-28)。“- 螺 旋 相 当 于
一 一 60",% 一 一 45 一 50"。 它 的 主 链 呈 螺旋 走向 ,螺旋 的 半径 为 0. 23 nm 每 下 螺旋 含 3. 6 氨基 酸
残 基 , 每 一 残 基 的 轴 向 距离 为 0. 15 nm, 故 每 0. 54 nm 重复 一 次 。“- 螺 旋 中 ,上 下 两 臣 主 链 的

|
本 和 区 间 都 形成 了 氢 键 ;在 螺旋 内 部 存在 范 德 华 尔 力 ,R 则 突出 于 螺旋 的 外 侧 。c-

螺旋 是 一 种 能 力学 上 稳定 的 构象 。8- 折 释 中 ,多 肽 链 为 伸展 的 稍 呈 扭曲 的 锯齿 状 , 相 邻 氨基 酸
残 基 的 R 基 交 蔡 指 辐 g 顷 构 的 上 下 方 。p- 折 友 的 更 小 于 土 180", 并 未 完全 伸展 。8- 折 丢 中
NS ES
相 邻 多 肽 链 的 了 和 人 间 也 存在 着 氧 键 。8- 折 礁 有 平行 和 反 乎 行 的 两 种 ( 指 多 肽 链
的 走向 ), 图 中 表示 的 是 反 平 行 的 。 这 两 种 8- 折 麦 以 反 亚 行 的 较为 稳定 。 订 转角 是 一 种 位 于 多
LS

<
链 转 折 处 的 结构 2- 转角 含 4 个 氨基 酸 残 基 , 它 为 第 一 个 氨基 酸 残 基 的 与 第 四 残 基 |

SN
的 他 间 的 氢 键 所 稳定 。 有 8 转角 有 工 型 和 工 型 两 种 ,它们 的 主要 区 别 在 于 第 二 个 肽 键 的 空
间 取 向 。 甘 氨 酸 和 膊 氨 酸 是 8 转角 中 经 常 出 现 的 两 种 氨基 酸 。 这 是 由 于 甘氨酸 的 “- 碳 上 为 两 |
个 氨 , 故 在 减轻 空间 障碍 中 表现 出 很 大 的 灵活 性 ; 肛 氨 酸 则 相反 , 它 的 “- 碳 参加 了 环 状 结构 ,下
故而 降低 了 理 的 自由 度 , 有 利于 对 构象 的 制约 。

图 2-28 有 蛋白质 的 二 级 结构
左 为 - 螺 旋 , 中 为 8- 折 释 , 右 为 5- 转角 。

在 许多 球状 蛋白 质 中 ,我 们 常 可 观察 到 一 些 二 级 结构 的 组 合 形式 ,它们 称 为 超 二 级 结构 ，
超 二 级 结构 的 经 常 出 现 ,表明 它们 在 多 肽 链 折 又 过 程 的 动力 学 和 能 力学 上 都 是 有 利 的 。 最 常见
的 超 二 级 结构 有 :aa,pap8 和 888 三 种 图 式 (图 2-29)。

形成 二 级 结构 后 ,多 肽 链 还 可 进一步 折叠 盘 曲 成 三 维 球状 结构 ,它们 具有 独立 的 结构 和 功
能 , 称 胡 三 级 娃 柯 -蛋白 质 的 这 种 折 查 盘 曙 是 由 分 布 于 二 级 绩 柯 表面 的 基 团 所 绞 动 和 准时
的 , 亦 即 是 受 一 级 结构 指导 的 .这 种 折 丢 使 多 肽 链 形成 特定 的 形状 和 使 一 些 基 团 进 入 合适 的 位
置 ,从 而 导致 相应 功能 的 出 现 。 二 . 业
”在 多 肽 链 折 笃 形 成 相应 的 稳定 构象 的 讨论 中 ,我 们 不 能 下 提 到 二 硫 键 的 作用 ;对 一 些 低 分
子 量 的 蛋白 质 言 尤其 如 此 .核糖 核酸 酶 的 变性 和 复 性 就 是 一 例 , 胰 岛 素 为 我 们 提供 了 另 一 类 型 |
的 例子 。 胰 岛 素 含 51 氨基 酸 残 基 , 刚 合成 时 为 一 较 大 的 前 体 , 以 后 切 去 一 小 肽 段 成 六 胰岛 要

30

原 ,后 者 再 切 去 C 链 后 才 成 为 含 A 链 和 了 链 的 胰岛 素 (图 2-30) 。 且 岛 素 共 含 3 个 二 硫 键 ,两 个
存在 于 链 间 ,一 个 存在 于 A 链 的 两 部 分 间 。 和 核糖 核酸 酶 一 样 , 胰 岛 素 的 二 硫 键 一 经 破坏 , 它
亦 立 即 失 活 。

(c)

(ay)

图 2-29 有 蛋白质 的 超 二 级 结构
(a)aal Cb)p8ap， (c)8p8p8。

58 54 和 CC 48
S6 Clcn Gly 47 46 15

二 57 全 人 2 Se 44
井 43

39
人 38
(Pa 37
-COOH an 36
Gm55
21 后 3
连接 肽 33

1Che 和 : 四 全

1
和

30
友 5
6 Se CEB 26
区 2
化学 二 和 (本 于) 一 ee

知

-二 二 二 四 ,蛋白 质 的 三 级 结构
则 _ 肌 红 蛋 白 三 级 结构 的 测 昨 是 蛋白 质 结构 研究 中 的 一 个 突破 。 肌 红 蛋 白 是 肌肉 中 氧 的 载体 ，

31

它 是 一 个 含 153 氨基 酸 残 基 的 单 体 蛋 白 , 分
子 量 为 16.7kD。 图 2-31 是 肌 红 蛋白 三 级 结
构 模 型 , 肌 红 蛋白 的 三 级 结构 含 8 个 螺旋 ，
在 图 中 分 别 用 A,BrC,D.....: H 表示 ( 表
2-9) 。 分 子 中 R 基 的 位 置 也 已 确定 ,大 部 分
朴 水 基 都 位 于 分 子 的 内 部 ,而 亲 水 基 团 则 位
于 分 子 表面 ,这 一 情况 说 明 朴 水 交互 作用 在
多 肽 链 的 折 蚕 中 ,是 折 和 至 的 驱
动力 . 肌 红 蛋 白 的 分 子 极为 紧密 ,其 内 部 仅 能
容纳 4 个 水 分 子 。 二 个 紧密 的 疏水 核心 是 球
状 蛋白 的 典型 特征 。 肌 红 蛋 白 的 这 种 紧密 结
构 使 短程 力 得 以 充分 发 挥 作 用 。 肌 红 蛋 白 含
有 4 个 且 氨 酸 残 基 , 它 的 刚性 侧 链 使 其 难 溶
手 - 螺 旋 内 部 而 都 位 于 转折 中 。 肌 红 蛋 白 的

2-31 肌 红 蛋白 结构 模型

人

辅 基 为 血红 素 , 它 位 于 蛋白 质 部 分 的 隙 颖 中 。 血 红 素 为 中 啉 化 合 物 , 其 中 心 的 铁 一 方面 与 分 子 |
平面 一 侧 组 氨 酸 咪唑 基 中 的 N-3 络 合 ,在 另 一 侧 则 可 与 氧 络 合 ,从 而 起 着 贮 所 和 输 氧 功能 。 这 上
一 结构 上 的 安排 对 肌 红 蛋 白 是 重要 的 。 由 于 辽 颖 位 于 分 子 表

工 一 企 氧 发 挥 功能 的 下 水 环境 ,因为 在 水 中 Fe ”会 迅速 氧化 成 Fe“ 而 难以 与 氧 可 逆 结 合 。

近 , 但 隙 缝 亦 提供 “

肌 红 蛋白 是 以 *- 螺 旋 为 主 的 蛋白 质 ,有 些 蛋 白质 兼 含 两 者 ,也 有 些 蛋白 质 以 太 -结构 为 主 和

( 表 2-10) 。
表 2-9 肌 红 蛋白 分 子 中 的 o- 螺 旋
螺旋 长 度 非 螺旋 长 度
人 A 16 NA 到
了 16 AB |
和 8
D 7 CD 8
PE 10
匡 > 10
上 10 了 F 8
G 19 FG- 4
了 26 GH 5
HC 4
总 长 度 121 32

些 较 大 和 蛋白质 的 多 肽 链 会 折 梧 成 相
多 结构 域 是 多 肽 链 上

表 2-10 一些 单 链 蛋 白 中 c- 螺 旋 和 户 折 又 的 含量

蛋白 质
〈 残 基数 )

肌 红 蛋白
(153)

细胞 色素
(104)

溶菌 酶
(129)

核糖 核酸 酶
(124)

凝 乳 蛋白 酶
(24)

羧 肽 酶
〈307)

一 个 部 分 ,但 已 具有 完整 球状 蛋白 质 的 特征 ，

残 基 的 百分数

“螺旋
78

有 - 折 和 三

17

的 你 为 结构 域 (structural domain ) 的 三 玲 点

从 这 二 意义 来 说 它 是 自主

的 一 记 们 可 以 通过 有 限 的 蛋白 酶 解 从 多 肽 链 上 切割 下 来 而 不 改变 其 性 质 。 有 些 蛋 白质 的 结构

域 相 似 , 有 些 则 具 明 显 差异 。 现在 已 证 明 , 秆 构 域 常 对 应 于 基因 自

域 的 组 合 就 形成 了 蛋白 质 的 完整 三 级 结构 。

中 各 身 的 外 显 子 (sxoi)7 线 构

本
磷酸 甘油 醛 脱 氢 酶 为 一 较 淡 的 蛋白 质 , 含 334 氨 基 酸 残 基 , 形 成 了 两 个 分 别称 为 NAE#+- 堆 |
ee

3

(A) (B)

图 2-32 ”磷酸 甘油 醛 脱 氢 酶 的 两 个 结构 域
(A) 为 NAD+- 结 合 结构 域 ;(B) 为 催化 结合 结构 域 。

后 全 过 的 天 信人 2-32) 。 在 这 两 个 结构 域 中 ,6@- 折 又 都 占 优势 :NAD+- 结 合 结构
所 含 的 几乎 全 是 平行 的 8- 结 构 ( 由 箭头 表示 ) ,而 催化 结构 域 则 含 平行 和 反 平 行 两 种 &- 结
梅 。 两 种 结构 域 还 都 含 - 螺 旋 , 它们 位 于 中 心 片 层 结构 的 两 侧 。

许多 蛋白 质 ,尤其 是 分 子 量 较 大 的 蛋白 质 是 由 几 个 结构 域 组 成 的 。

五 、 多 肽 链 的 折 和 三 过 程

天 然 蛋 白质 是 多 肽 链 合成 后 经 折 登 而 形成 的 热力 学 上 稳定 的 构象 。 多 肽 链 的 折 春 是 一 自
发 过 程 。 在 这 一 过 程 中 ,多 肽 链 的 共 价 结构 基本 上 没有 变化 ,起 作用 的 是 弱 交互 作用 。 多 肽 链
的 折 乔 代表 着 信息 转变 为 功能 的 过 程 ,是 生命 现象 的 一 个 重要 过 程 , 正 受到 人 们 的 重视 。 这 一
过 程 现在 并 不 完全 清楚 ,但 根据 现 有 的 实验 证 据 人 们 已 提出 了 一 些 模型 。
假设 一 个 多 肽 , 它 由 100 个 氨基 酸 残 基 组 成 ,如 根据 多 肽 链 中 到 和 少 可 采取 的 值 计算 , 它
形成 天 然 蛋白 质 至 少 需 105 年 .这 对 一 个 天 然 过 程 是 不 可 想象 的 。 胰岛素 的 复 性 也 说 明了 这 一
状况 。 人
的 可 能 组 合 方式 难于 计算 , 亦 即 很 难得 到 状态 。 可 是 中 国 的 科学 家 在 使 牛 胰岛 素 的 A
链 和 了 链 分 开 , 然后 重建 的 实验 中 ,产物 的 活力 竟 恢 复 到 50% 。 这 一 结果 发 表 于 1966 年 ,随后
合成 了 胰岛 素 的 A 链 和 了 链 以 及 获得 了 天 然 胰岛 素 晶体 。 这 是 世界 上 第 一 个 人 工 合成 的 蛋白
质 . 人 种 形式 ,但 多 肽 链
旧 折 间 于 下 是 一 个 下 类 这 过 各 ， ,而 是 一 个 有 导 5 人
些 多 肽 链 的 折 午 模型 ,大 致 可 以 分 为 二 类 。 一 种 模 妈 状 链 的 折 芭 是 ; 2
一 种 稳定 的 三 级 结构 作为 核心 * 然 后 三 级 半生 所 其 一步 发 牛 奖 也 作用 -扩大 成 天 然
三 维 结构 ; 另 一 种 模型 提 仙 7 多肽 锌 可 能 十 疙 鞭 伏 沙 仙 链 的 真水 交 于 作用 而 突然 自发 和
,最 后 调整 成 天 然 结 构 。 这 两 种 模型 看 来 不 是 排斥 的 ， 有 些 多 肘
能 以 其 中 之 一 为 主 ,有 些 多 肽 链 的 折 释 兼 而 有 之 。 在 这 两 种 情况 下 , 超 三 级 结构 的
33

FF

折

形成 都 可 能 起 着 导 引 作用 ,而 弱 键 则 做 最 后 的 热力 学 上 的 调整 。

活体 中 ,多 肽 链 发 生 折 县 的 环境 似乎 更 为 复杂 , 而 折 丢 的 效率 更 高 , 现 已 证 明 , 活 体内 至 少
有 两 类 蛋白质 因子 参与 了 多 肽 链 的 折 释 ,一 类 蛋白 质 称 为 多 肽 链 结合 蛋白 (polypeptide chain
binding protein ) 或 分 子 伴 侣 (molecular chaperone) 。 这 些 蛋 白质 中 ,有 些 能 结合 于 多 肽 链 以 防
止 侧 链 间 的 非 专 一 性 缔 合 ,它们 导 引 一 些 多肽 链 的 折 蚕 和 使 多 个 多 肽 链 聚 集成 更 大 的 结构 ; 另
一 类 蛋白 质 是 酶 ,它们 能 通过 解除 限制 折 友 的 因素 来 促进 多 肽 链 的 折 码 ,例如 * 二 硫 键 异 构 酶 、

且 氨 酰 顺 - 反 异 构 酶 等 。 在 多 肽 链 的 合成 过 程 中 肽 键 可 能 成 C
为 顺 式 , 但 顺 式 较 不 稳定 ,与 反 式 比 相差 8 kJ/mol ,及 氨 栈 Ci 请
顺 - 反 异 构 酶 能 催化 其 转变 为 反 式 。 在 多 肽 链 的 折 驮 过 程 RN
中 ,二 硫 键 可 能 形成 于 不 适 的 位 置 间 , 二 硫 键 异 构 酶 催化 二 i

硫 键 的 可 逆 形 成 , 以便 二 硫 键 形成 于 正确 的 位 置 上 。
六 ` 蛋 和 白质 的 四 级 结构

有 些 蛋 白质 仅 含 一 条 多 肽 链 , 为 单 体 蛋 白 , 有 许多 蛋白 质 含 二 个 或 二 个 以 上 的 亚 基 ,为 寡
聚 蛋白 (oligomeric protein) ,如 血红 4 个 亚 基 组 成 ,天 冬 氨 酸 转 氨 甲 酰 酶 由 12 个 亚 基

组 成 等 .在 这 些 蛋 白质 中 , 亚 基 的 空间 关系 和 缔 合 称 为 四 级 结构 。 寡 聚 蛋白 普遍 存在 于 机 体 中 。 上

地 结合
Mb 十 O， NID 本 辐 ，
Hb 十 O 〇 ， 下 晶 (9

但 肌 红 蛋白 为 单 体 蛋白 , 血红 和 蛋白 为
- 朝 聚 蛋白 ,它们 对 氧 的 亲和力 有 所 不
同 。 血 红 蛋 白 流 经 肺 部 时 约 有 96 % 为
氧 饱 和 ，, 但 在 静脉 中 仅 有 64 儿 饱和，
在 这 一 过 程 中 约 有 携带 的 氧 的 1/3 释
放出 去 。 可 是 肌 红 和 蛋白 在 同样 的 氧 分
压 变化 中 仅 释 放出 1%% 一 2 弛 结合 的
氧 。 在 功能 上 的 这 一 差别 即 在 于 一 个
为 单 体 ; 另 一 个 为 守 聚 蛋白 。 血 红 和 蛋白
的 亚 基 结构 为 ap:,a 亚 基 含 141 氮
基 酸 残 基 ,8 亚 基 含 146 氨基 酸 残 基 。
虽然 肌 红 蛋 白 与 血红 蛋白 亚 基 的 三 级 氧 合 时 酷 氨 酸 答
结 椅 十 分 类 似 , 但 血红 蛋白 的 多 亚 基 侧 链 的 移动
绩 构 使 得 各 个 主 基 的 所 合作 用 得 芒 调 Da 图 2-33 一 血红 蛋白 的 结构 和 作用 一
荐 瑟 忌 的 毕 容 会 使 其 余 亚 基 的 氧 合 更 趋 容易 ,这 称 为 协同 效
应 ,血红 蛋白 的 协同 效应 应 是 二 过 其 三 本 下 网 士 的 变化 实现 的 (图 2-33)。 肌 红 蛋 让 具有 一 全 亚 |
基 , 故 而 没有 协同 效应 。 蛋白 质 的 耳 级 结 隐 的 出 现 是 为 了 完 复杂 的 生理 定 花 了 过程”
血红 蛋白 的 4 个 亚 基 分 别 位 于 四 面体 的 顶点 上 ,血红 蛋白 个 2 或 2 个 了 亚 扫 都 是 相

34

脱氧 血红 蛋白 中 的 2,3-
1

肌 红 蛋白 (myoglobin ,Mb) 和 血红 蛋白 (hemoglobin ,Hb ) 都 是 氧 的 携带 者 ,都 能 与 氧 可 逆 下

同 的 ,但 为 了 讨论 方便 起 见 , 故 暂 标 为 aya 和 pp。 在 血红 蛋白 中 ,yp 和 yp: 间 广 泛 存
在 着 交互 作用 ,这 就 使 oa/p 和 wy/p: 的 结合 较 %/8 和 xz/VB: 更 为 紧密 。 这 种 亚 基 间 交互 作用
上 的 差别 就 使 w/B ,oz/p8: 作为 整体 发 生 转动 ,从 而 引起 亚 基 构象 的 变化 ,这 就 是 氧 合作 用 协
同 效应 的 结构 基础 。

七 、 蛋 白质 结构 的 组 合 性

o- 螺 旋 ,p8- 折 大 和 8- 转 折 是 多 肽 链 所 形成 的 二 级 结构 ,它们 是 热力 学 上 稳定 的 构象 。 二 级
结构 又 可 组 合成 不 同 的 超 二 级 结构 ,很 多 蛋白 质 都 可 看 作 是 一 定 的 超 二 级 结构 组 合成 的 。 在 许
多 和 蛋白质 结 构 中 ,我 们 都 可 看 到 868,8ap8 等 这 样 的 结构 单位 。

现 已 发 现 ,许多 超 二 级 结构 常 具有 专 一 的 功能 上 的 意义 。 例 如 ,螺旋 -转折 -螺旋 这 样 的 超
三 级 结构 最 初 发 现存 在 于 CAP 和 Cro 阻 遏 物 中 , 两 个 螺旋 几乎 成 直角 ,其 中 之 一 舱 入 DNA
的 大 沟 中 ,与 DNA 的 专 一 性 序列 结合 。 这 一 结构 单位 存在 于 许多 调节 蛋白 中 。

超 二 级 结构 和 结构 域 都 常 与 蛋白 质 特定 活力 相对 应 。 例 如 ,在 以 NAD- 为 辅酶 的 磷酸 甘
油 醛 脱 气 酶 .乳酸 脱 氢 酶 等 分 子 中 都 存在 一 种 称 为 二 核 苷 酸 折 破 (dinucleotide fold) 的 结构 单
位 。 与 此 同时 ,以 ATP 为 底 物 的 激酶 中 也 有 类 似 的 结构 域 。 这 两 种 结构 域 , 一 个 与 NAD+ 结
合 ,一 个 与 ATP 结合 ,但 它们 在 结构 上 具有 共同 点 , 即 其 中 心 为 平行 的 8- 折 丢 , 两 侧 为 王 螺 旋
(参见 图 2-32) ,NAD+ 或 ATP 的 结合 部 位 则 位 于 6- 结构 的 羧基 端 。 两 者 的 差异 主要 在 于 - 螺
旋 的 数目 和 排 布 。 这 种 状况 表明 ,它们 可 能 是 由 共同 的 前 体 演 化 来 的 。

许多 蛋白 质 在 功能 上 的 差异 似乎 也 是 来 自 结构 域 的 组 合 上 。 例 如 , 脱 氢 酶 都 有 两 种 结构
域 ,二 个 与 NAD+ 结 合 ; 另 一 个 与 底 物 结合 ,后 者 的 结构 在 不 同 的 脱氧 酶 中 是 不 同 的 。

调节 基因 表达 的 阻 过 物 (repressor) 和 活化 蛋白 (activator protein ) 为 蛋白 质 结 构 的 组 合
性 提供 了 另 一 类 例子 。 大 肠 杆 菌 的 /ac 阻 巡 物 和 分 解 代谢 基因 活化 蛋白 (CAP) 都 含 多 个 结构
域 。CAP 含 两 个 结构 域 , 较 大 的 与 <AMP 结合 , 较 小 的 识别 和 结合 于 DNA 的 特定 序列 (图 2-
34)。CAP 的 <cAMP- 结 合 结构 域 和 依赖 于 cAMP 的 蛋白 激酶 的 调节 亚 基 的 氨基 酸 序列 具有 明
显 的 同 源 性 ,这 提示 它们 可 能 是 由 共同 的 前 体 演 变 来 的 。 在 CAP 中 ,cAMP- 结 合 结构 域 与
DNA- 结 合 结构 域 相 连接 ,<cAMP 水 平 的 变化 直接 控制 转录 水 平 。 依 赖 于 cAMP 的 蛋白 激酶 为
变 构 酶 , 它 的 cAMP- 结 合 结构 域 所 调节 的 是 糖 原 降解 级 联系 统 (cascadeJ 中 的 第 一 个 酶 .CAP

V

图 2-34 CAP 与 DNA 的 结合

35

的 DNA- 结 合 结构 域 与 其 它 许多 的 基因 调节 和 蛋白 所 显示 出 的 结构 和 氮 基 酸 序 列 上 的 类 似 性 ，
同样 表明 它们 的 DNA- 结 合 结构 域 可 能 具有 共同 的 祖先 。

/ac 阻 遇 物 也 具有 类 似 的 组 合 结构 。 它 的 小 结构 域 的 氨基 酸 序 列 与 CAP 的 结合 于 DNA
的 那 一 部 分 相关 , 而 它 的 大 结构 域 则 与 半 乳 糖 结合 蛋白 的 氨基 酸 序列 类 似 。 这 再 一 次 显示 , 具
不 同 功能 的 结构 域 (结合 半 乳 糖 和 结合 特定 DNA 序列 的 结构 域 ) 能 组 合成 另 一 种 蛋白 质 。

第 七 节 ”和 量 质 与 其 它 生物 分 子 的 交互 作用

蛋白 质 除了 通过 多 肽 链 的 折 且 ,不同 结构 单位 的 组 合 形成 不 同 的 三 维 结构 .产生 不 同 功能
外 ,还 能 和 其 它 大 分 子 发 生 交互 作用 ,从 而 拓展 它 的 结构 和 功能 上 的 多 样 性 。 和 和 蛋 自 质 发 生 交
互 作 用 的 生物 分 子 有 :多 糖 、, 脂 质 、 核 酸 和 和 蛋白质 自 身 。 蛋 白质 与 其 它 分 子 之 间 的 交互 作用 ,有
的 通过 共 价 结合 实现 ,有 的 通过 非 共 价 力 实 现 。

一 ` 蛋 白质 与 其 它 生物 分 子 的 共 价 结合

糖 蛋白 (glycoprotein) 是 蛋白 质 和 寡 糖 链 通过 苷 键 连接 成 的 , 寡 糖 链 含 有 多 种 单 糖 ,而 每

一 单 糖 除 半 缩 醛 羟基 外 还 含 1 个 以 上 的 醇 性 羟基 ，, 故 单 糖 间 可 通过 不 同 的 苷 键 连接 .加 上 基 团

空间 取向 的 不 同 , 同 一 人 和 六 两 型 。 春 糖 链 通过 其 组 成 单 糖 的 种 类 , 以 及 结

折 玫 同 链 是 机 体 申 分 子 的 识别 标志 。 组 成 寡 糖 链 的 单 糖 有 :

区 萄 要 半 有 乳糖、 甘露 糖 、 鼠 李 糖 、 阿拉 信 糖 、 胞 壁 酸 和 唾液 酸 等 (图 2-35) 。 单 糖 相 互 间 的 苷 键

有 1-~2,13,1-~4,1>6,23,2 一 6 等 , 半 缩 醛 的 构 型 可 以 是 “或 28 型。 这 种 结构 上 的 变化 也

代表 着 一 种 信息 。 糖 蛋白 的 寡 糖 链 是 通过 与 重 白质 部 分 中 丝氨酸 ,、 苏 氨 酸 残 基 侧 链 中 的 凑 基 形
成 苷 键 而 连接 的 。

CH:OH CH2OH Te 和
0 SS <
NO 是 2 EN 7 二 人 划

H 谓 Nia， 直 / ;j 这 0 放生 也 NE

p-D- 葡 萄 糖 0-D- 葡 萄 糖 胺 p-D- 半 乳糖 -7D- 甘 露 糖
Glc GlcN Gal Man

O
也 OH |
区 oO= 忆 工 间 CE
芭 . 了 也 O
HO | HN AR
人
HNNL_UYAot
Eee
OH 旧 一
x- 民 - 岩 藻 糖 cx- 六 也 李 糖 N- 乙 酰 胞 壁 酸 唾液 酸 |
FE Rha Mur Sia
Uc Wan 0

图 2-35 宴 糖 链 中 常见 的 单 糖
36

顺便 一 提 , 机 体 中 还 有 一 些 蛋 白质 与 脂 质 共 价 结合 成 的 蛋白 脂 Cproteolipid)。 有 蛋白 脂 中 的
脂 质 , 有 些 通过 酯 键 与 多 肽 链 中 的 丝氨酸 和 苏 氨 酸 连接 ,有 些 通过 硫 酯 键 与 半 胱 氨 酸 连接 。
不 论 是 寡 糖 链 还 是 共 价 连接 于 蛋白 质 的 脂 质 ,都 会 对 后 者 的 结构 和 性 能 产生 一 定 的 影响 。

二 、 蛋 白质 形成 的 超 分 子 复 合 物

蛋白 质 自身 及 蛋白 质 和 其 它 生物 大 分 子 都 可 能 自发 聚集 成 超 分 子 复合 物 (supramolecular
complex) 。 血 红 蛋 白 在 尿素 的 存在 下 会 裂解 为 两 个 由 “和 亚 基 组 成 的 半分 子 , 当 尿素 去 除
后 ,两 个 半分 子 又 重新 缔 合 成 功能 性 的 血红 蛋白 .血红 蛋白 裂解 为 两 个 半分 子 是 原来 存在 的 弱
键 被 破坏 的 结果 。 而 半分 子 的 重新 缔 合 是 弱 键 重新 形成 的 结果 。 生 物 分 子 之 间 的 自发 缔 合 称
为 自 组装 (self-assembly) 。 生 物 分 子 的 自 组 装 涉及 到 两 方面 的 问题 :一 是 AG 有 利于 复合 物 的
形成 ;一 是 形成 夏 合 物 的 分 子 具 有 相应 的 专 一 性 表面 结构 。 例 如 ,细胞 膜 和 细胞 壁 都 是 由 许多
分 子 组 成 的 镶嵌 结构 ,现在 虽然 对 膜 中 不 同 分 子 的 确切 排 布 还 不 很 清楚 ,但 这 些 分 子 是 充分 接
触 和 存在 着 交互 作用 的 .血红蛋白 的 形成 是 生物 分 子 自 组 装 的 一 个 具体 例子 ,下 面 对 此 稍 加 普
遍 化 。

例如 , 某 一 蛋白 质 分 子 如 具有 一 个 能 与 自身 表面 某 一 区 域 互补 的 位 点 ,这 样 的 两 个 分 子 就
可 能 自发 组 装 成 二 聚 体 .假如 蛋白 质 分 子 的 结合 位 点 互补 于 结合 位 点 以 外 的 区 域 ,结果 它们 就
可 能 形成 链 状 结构 ; 如 每 一 亚 基 采 取 一 定 的 取向 ,它们 就 可 能 形成 环 状 和 螺旋 状 结构 (图 2-
36)。 肌 动 看 和 (serin) 是 一 个 普 记 存在 于 真 核 细胞 内 的 球状 蛋 和 ， 肌 动 蛋白 微 丝 就 是 肌 动 蛋白
单 体 聚 集成 的 。 胶原 则 是 一 白 复合 物 。 蛋白 质 亚 基 形 成 螺旋 、 环 、 管 或 球状 结构 后 ，
由 于 亚 基 间 弱 键 的 作用 ， ,其 稳定 性 得 到 进 一 秒 的 加 强 ,许多 细胞 结构 都 是 生物 分 子 通 过 自我 组
装 形成 的 。

图 2-36 蛋白 质 单 体 的 聚集 sx
微 管 (microtubule) 是 真 核 细 胞 的 另 一 种 重要 和 蛋白质。 它 的 半径 为 25 nm 的 中 空 管状 结
。 构 ,一 般 由 13 股 铭 丝 组 成 组 成 微 管 的 有 c< 和 8 两 种 微 管 蛋白 (tubulin)。w 和 及 微 管 蛋 白 先
结合 成 二 聚 体 ,然后 再 组 装 成 微 管 ( 图 2-37)。 微 管 和 微 管 蛋白 处 于 动态 平衡 中 ,因而 会 因 代 谢
37

条 件 的 改变 而 趋向 于 聚集 或 解体 。

@ OOo
OO cpo 8 mw
外
有 8 亚 基 a 亚 基
微 管 蛋白 亚 基 xp8- 微 管 蛋白 二 聚 体

图 2-37 微 管 的 组 装

蛋白 质 还 能 与 核酸 形成 复合 物 。 病 毒 粒 子 就 是 由 RNA 或 DNA 与 蛋白 质 形成 的 。 例 如 , 烟
草花 叶 病 毒 (tobacco mosaic virus ,TMV ) 是 由 1 个 RNA 分 子 与 2130 个 相同 的 蛋白 质 亚 基
构成 的 。 病毒 粒 子 的 形成 仍然 离 不 开 组 分 的 前 述 两 种 因素 .对 TMYV 言 , 各 个 组 分 间 的 作用 力 ，
主要 的 是 疏水 交互 作用 。 据 测定 ,TMV 组 装 过 程 的 A 互 为 120kJ/mol,AS 为 415J]mol, 开 *
AG=4H 二 TAS, 故 TMYV 的 组 装 过 程 显著 受 温度 的 影响 (图 2-38) 。 低 于 10C ,AG 为 正 ,病毒
粒子 解体 ; 约 16C,AC=0, 两 者 建立 平衡 ;37C 时 ,AcC 为 负 , 过 程 明 显 趋向 自 组 装 。 这 是 由 于
温度 不 同 ,过 程 的 烩 变 箭 变 在 AC 中 所 占 的 比重 发 生变 化 的 结果 。

忆
区 0
0 和- 于 /

图 2-38 TMYV 的 自 组 装

AG 王 4 万 一 TAS 、
有 CC AG 王 120 000 一 (310) (415) 三 一 8. 6 kJ/mol
416 让 AG 王 120 000 一 (289) (415)s0kJ/mol
10OC MAG= 三 120 000 一 (283 尖 415) 全 十 2.5 上 J/mol

除了 病毒 外 ,生物 机 体内 蛋白 质 与 核酸 的 交互 作用 对 生命 活动 具有 十 分 重要 的 意义 .遗传 ，
信息 的 传递 和 调控 都 离 不 开 蛋白 质 与 核酸 的 交互 作用 。 蛋 白质 和 核酸 的 交互 作用 可 以 分 为 两 ，
个 方面 ;一 是 核酸 与 蛋白 质 形 成 特定 的 超 分 子 复合 物 ,如 核糖 体 (ribosome) , 核 内 小 核糖 核 蛋
38 了

白 (small nuclear ribonucleoprotein, snRNP), 信号 识别 颗粒 (signal recognition particle，
SRP) ,延长 因子 ,tRNA 与 核糖 体形 成 的 三 元 复合 物 等 。 它 们 为 生命 过 程 提 供 所 需 的 机 构 。 另
一 种 蛋白 质 与 核酸 间 的 交互 作用 是 动态 性 的 , 它 与 基因 表达 及 其 调控 有 关 。 关 于 前 者 的 原理 已
有 介绍 ,现在 专 就 后 者 作 一 梗概 性 的 讨论 。

DNA 的 复制 是 藉 DNA 聚合 酶 .RNA 聚合 酶 及 相应 的 蛋白 质 因 子 与 DNA 的 结合 实现
的 。 作 用 时 , 这 些 蛋 白质 必须 与 DNA 的 特定 序列 结合 ,这 里 就 有 一 个 蛋白 质 因 子 是 如 何 寻 找
和 识别 DNA 特定 序列 的 问题 。 现 在 认为 ,在 这 一 过 程 中 常 是 蛋白 质 的 “螺旋 嵌入 DNA 的 大
沟 中 ,先是 其 结合 部 位 附近 的 具 正 电 性 区 域 ( 由 具 正 电 性 的 氨基 酸 侧 链 构 成 ) 与 DNA 主 链 棍
酸 基 的 负电 荷 产 生 非 专 一 性 的 静电 交互 作用 * 由 于 两 者 间 的 距离 较 远 ,作用 力 因而 较 弱 , 故 蛋
白质 能 藉 热 运动 而 在 DNA 上 滑行 。 当 蛋白质 移 动 到 靶 位 点 时 ,由 于 蛋白 质 分 子 特定 位 点 上 的
氢 供 体 和 受 体 在 空间 的 取向 正好 与 DNA 驾 位 点 互补 ,结果 氧 键 得 以 形成 ,相互 的 距离 缩短 约
1.0 一 1.5 nm, 作 用 力 的 强度 增强 10 一 10' 倍 , 专 一 性 的 复合 物 形 成 了 , 酶 和 蛋白 质 的 功能 开
始 发 挥 。 蛋 白质 对 DNA 特定 序列 的 这 种 寻找 方式 要 比 在 DNA 上 跳动 能 更 迅速 地 找到 靶 位
点 。

Cro 阻 遇 物 与 DNA 的 结合 是 这 种 交互 作用 的 一 个 具体 例子 。X 射线 分 析 等 都 说 明 ,Cro
阻 遏 物 是 以 二 聚 体形 式 与 DNA 结合 , 阻 遏 物 的 螺旋 -转折 -螺旋 结构 突出 于 其 表面 ,螺旋 之 一
插 人 大 沟 中 ,DNA 稍 呈 弯曲 (图 2-39)。 除 Cro 阻 巡 物 外 ,/ 阻 遇 物 和 CAP 等 与 DNA 的 结合
涉及 螺旋 -转折 -螺旋 这 一 共同 的 结构 单位 。 但 在 DNA- 结 合 蛋白 中 , 螺旋 -转折 -螺旋 并 不 是 唯
一 的 结构 模式 。

图 2-39 Cro 阻 晕 物 与 DNA 的 交互 作用

39

参考 文 献

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Gene， The Benjamin/VCummings Publishing Company,California :1987.

Cn

〈 张 玉麟 )

40

徒
SS
J 尼

细胞 (cell) 的 研究 目前 正 处 于 现代 生物 学 研究 的 中 心地 位 ,这 是 由 于 细胞 是 生命 的 基本 单
位 ,细胞 在 生物 的 结构 上 处 于 承前启后 的 位 置 。 生 物体 内 由 小 分 子 ( 毛 基 酸 、 核 苷 酸 等 ) 组 成 蛋
白质 及 核酸 等 生物 大 分 子 , 再 由 生物 大 分 子 组 成 超 分 子 结构 ,如 各 种 细胞 器 ,最 终 由 各 种 细胞 .
器 构成 细胞 . 在 多 细胞 生物 中 又 由 各 种 细胞 组 成 组 织 (tissue) 和 器 官 (organ), 最 后 形成 动物 或
植物 的 机 体 。
生物 界 是 形形色色 的 ,但 一 切 生 物 都 是 由 细胞 组 成 的 ,小 的 生物 机 体 由 单个 细胞 组 成 ,如
单 细 胞 藻类 (algae)、 细 菌 及 原生 动物 (protist), 它 们 只 能 靠 细胞 的 生长 和 分 裂 进行 发 育 和 繁
殖 。 自 从 1665 年 虎 克 (Robert Hooke) 用 复式 显微镜 观察 到 植物 木质 组 织 中 存在 “细胞 ”之 后 ，
施 药 登 (Matthius Schleiden ) 于 1838 年 证 明 植 物 结 构 由 细胞 组 成 ,次 年 施 旺 (Theodor
Schwann) 又 证 实 动物 结构 也 由 细胞 组 成 ,从 而 产生 了 细胞 概念 cell concept)。 德 国 病理 学 家
维尔 荷 CRudoff Virchow) 于 1858 年 进一步 提出 了 细胞 学 说 (the cell theory) ,他 认为 “细胞 是
生命 的 单位 (Cvital unit)”, 他 说 : 每 个 动物 是 许多 生命 单位 的 总 和 ,每 个 生命 单位 本 身 带 有 生
命 的 全 部 特性 ” ,现代 生 物 学 已 经 证 明了 他 的 观点 ,细胞 的 基因 组 拥有 该 种 生物 的 全 部 遗传 信
息 。 -
在 形态 上 细胞 大 体 上 由 细胞 核 ` 细 胞 质 及 细胞 膜 三 部 分 组 成 。 根 据 细 胞 核 的 区 别 , 生 物 可
以 分 为 原核 生物 (prokaryote) 及 真 核 生 物 (eukaryote) 两 大 类 。 原 核 生 物 在 生物 进化 上 是 很 原
始 的 ,多 为 单 细 胞 生物 ,而 真 核 生物 由 原核 生物 进化 而 来 ,在 结构 和 功能 上 都 日 益 复杂 。 真 核 生
物 除去 核 物 质 外 面 有 一 层 核 模 包围 以 外 ,其 细胞 质 的 结构 也 比较 复杂 ,其 中 含有 许多 细胞 器 ，
如 线粒体 (mitochondria) 高 尔 基体 (Golgi body) 内 质 网 (endoplasmic reticulum) 、 溶 酶 体
(ysosome)、 细胞 骨架 (cytoskeleton ) 等 ,在 植物 时 细胞 中 还 含有 叶绿体 (chloroplast) 以 及 液 泡

(vacuoles ) 。

第 二 节 ”原核 细胞 与 真 核 细 胞 的 比较

细胞 分 为 原核 细胞 (prokaryotic cell) 和 真 核 细 胞 Ceukaryotic cell) 。 原 核 生 物 是 简单 的 单
细胞 有 机 体 ,它们 的 核 物 质 没有 被 一 层 核 膜 nuclear membrane) 所 包围 , 核 物 质 散布 在 细胞 质
中 ,未 形成 明显 的 细胞 核 ,因此 称 为 原核 。 细菌 (如 大 肠 杆菌 天. cox)、\ 蓝 绿 藻 (如 鱼 腥 藻 4zapae-
ja)、 立 克 氏 体 (rickettsia) .支原体 (mycoplasma) 都 属于 原核 生物 。 真 核 生 物 的 核 物 质 是 被 核
膜 Cnuclear envelope) 包 围 的 ,形成 一 个 结构 非常 分 明 的 细胞 核 nucleus) ,其 中 还 有 一 个 或 多
个 核 仁 Cnucleolus) 。 真 核 细 胞 的 细胞 质 外 面 有 一 层 质 膜 (plasma membrane), 成 为 细胞 的 外

41

层 。 细 胞 质 中 含有 许多 细胞 器 , 这些 细 胞 器 也 都 由 膜 包 围 着 。 在 细胞 分 裂 时 核 膜 消失 , 核 物质
形成 浓缩 的 染色 体 (chromosome ) 。
下 面 我 们 将 原核 细胞 与 真 核 细 胞 做 一 比较 , 列 于 表 3-1。

表 3-1 原核 细胞 与 真 核 细 胞 的 比较

特 性 原核 细胞 真 核 细胞
尺度 通常 很 小 (1 一 10 pm) 通常 较 大 (10 一 100 pm)
基因 组 DNA 与 非 组 蛋白 结合 ,基因 组 存 “DNA 与 组 蛋白 及 非 组 蛋白 结合 ,存在 于 染色 体 中 ,染色
在 于 类 核 体 中 ,无 膜 包围 体 存在 于 具 核 膜 的 细胞 核 中
细胞 分 列 二 分 裂 (binary fission)， 有 丝 分 裂 ,含有 纺 钴 体 .中 心 体
或 出 芽 (budding) ,无 有 丝 分 列
膜 包围 的 细胞 器 无 线粒体 叶绿体 (植物 中 )、 内 质 网 ,高 尔 基体 ` 溶 酶 体 等
营养 吸收 ,有 些 进行 光合 作用 (光合 细 ”吸收 或 进行 光合 作用 (绿色 植物 )
菌 )
能 量 代谢 无 线粒体 ,氧化 酶 类 与 质 膜 结合 ， “氧化 酶 类 包装 在 线粒体 中 ,氧化 代谢 途径 较 单一
多 条 代谢 途径
细胞 骨 架 无 复杂 ,有 微 丝 ( 肌 动 蛋白 丝 )、 微 管 及 中 间 纤维 系统
细胞 内 运动 无 / 胞 质 流动 ,内 香 作 用 、 胞 饮 作用 ,有丝分裂 , 突 触 运输 等

随 着 早期 原核 细胞 的 进化 ,产生 出 各 种 单 细 胞 的 真 核 生物 ,如 原生 动物 (protist) ,其 中 有
些 能 进行 光合 作用 ,如 衣 营 (Chaxzyaomzozas) 以 后 出 现 了 非 光 合 的 原生 动物 , 如 草 履 虫
CParaxzecizz7az ) 及 网 柄 菌 (CDictyostelzzzz) 。 单 细胞 真 核 生 物 在 地 球 上 是 大 量 存 在 的 ,而 多 细胞 的
动物 、 植 物 和 菌 类 都 属于 真 核 生 物 。 原 核 生 物 只 有 数 千 种 , 而 真 核 生 物 则 有 数 百 万 种 之 多 。

大 约 15 亿 年 前 ,从 原核 细胞 进化 出 真 核 细 胞 。 从 原核 细胞 到 真 核 细 胞 的 进化 主要 有 下 列
三 方面 的 进化 。 首 先是 细胞 获得 更 多 的 DNA , 见 表 3-2。

表 3-2 DNA 含量 及 基因 组 的 复杂 性

基因 组 大 小 基因 组 相对 大 小 DNA 长 度
Cnt 对 ) (五 . coi 一 1) 人
病 毒
SV40 5 又 103 0. 00125 0. 0017
到 4X104 0.01 0. 014
下 2 2Xk05 0. 05 0. 68
原核 细胞
JWycoplaszza 3X105 0. 075 0. 10
BaciLlzs 3X108 G575 1. 06
Ecoi 10s 1.00 1.36
真菌
酵母 2X107 5 68
动物
果 蝇 2X108 50 6.8
鸡 2X109 500 680
人 类 5 又 108 1 250 1700
植物

静 豆 1X108 2 250 3 100
小 麦 1X101 30 000 34 000

号
DNA 与 一 些 特殊 的 蛋白 质 ( 组 蛋白 等 ) 结 合 , 折 赤 并 由 膜 包装 成 染色 体 , 在 有 丝 分 裂 时 可 |
42

人

以 平均 分 配 到 两 个 子 细胞 之 中 。

其 次 ,由 于 细胞 变 大 ,在 细胞 内 产生 一 些 腊 系统。 在 染色 质 外 面 生 出 一 个 核 膜 , 将 染色 质 包
装 起 来 成 为 细胞 核 ,在 核 外 面 为 细胞 质 , 它 是 蛋白 质 合 成 的 场所 ,以 RNA 为 模板 在 核糖 体 (ri-
bosome) 上 合成 蛋白 质 。

最 后 , 原始 的 真 核 细 胞 是 不 能 进行 有 氧 代谢 或 光合 作用 的 .它们 与 好 氧 细菌 或 光合 细菌 形
成 共生 关系 (symbiotic association) ,有些 好 氧 细 菌 变 成 现代 的 真 核 生物 中 的 线粒体 ,进行 有
氧 代谢 ; 另 一 些 光 合 细菌 与 真 核 细 胞 共生 ,形成 它们 的 叶绿体 ,进行 光合 作用 ,利用 日 光 能 将
CO, 固定 ,并 释放 氧气 ,供需 氧 生物 所 利用 。

第 三 节 原核 细胞

原核 细胞 的 特征 是 : 它 的 遗传 系统 比较 简单 ,没有 形成 由 核 膜 包围 的 细胞 核 , 只 有 一 个 环
状 的 脱氧 核糖 核酸 分 子 (circular DNA) ,不 含 组 蛋白 ,没有 核 仁 , 称 为 类 核 体 (nucleoid), 它 不
进行 有 丝 分 裂 (mitosis), 只 进行 二 分 裂 (binary fission) ,是 一 种 无 性 生殖 过 程 。

原核 细胞 的 细胞 质 也 比较 简单 ,其 中 不 存在 线粒体 .叶绿体 .内 质 网 ,高 尔 基体 、 液 泡 等 。 但
是 ,在 原核 细胞 细胞 质 中 分 布 有 大 量 核糖 体 (ribosome) ,而 在 真 核 细胞 中 核糖 体 则 排列 在 内 质
网 上 。 此 外 , 原核 细胞 的 核糖 体 体积 较 小 ,其 沉降 系数 为 70 S ,而 真 核 生物 为 80 S ,都 是 由 大 亚
基 (large subunit) 和 小 亚 基 (Csmall subunit) 组 成 的 。 原 核 细 胞 核糖 体 的 大 亚 基 为 50 S, 小 亚 基
为 30 S, 而 真 核 细胞 核糖 体 的 大 亚 基 为 60 S, 小 亚 基 为 40 S。

在 细胞 质 的 性 质 方面 ,原核 细胞 与 真 核 细 胞 也 有 所 不 同 , 如 头 核 细胞 中 有 细胞 质 流 动 (cy-

toplasmic streaming) 及 胞 饮 作 用 (phagocytosis) , 而 在 原核 细胞 中 则 不 存在 。

原核 细胞 中 呼吸 作用 的 电子 传递 链 (electron transport chain ) 及 光合 细菌 的 光 系 统 都 存
在 于 质 膜 之 上 , 而 在 真 核 细胞 中 呼吸 作用 的 电子 传递 链 存 在 于 线粒体 膜 上 ,光合 作用 的 光 系 统
存在 于 叶绿体 的 类 赛 体 (thylakoid) 膜 上 。

原核 细胞 的 细胞 壁 是 由 肽 葡 聚 糖 (peptidoglycan) 构成 的 ， 而 真 核 细 胞 (植物 及 菌 类 ) 的 细
胞 壁 则 由 纤维 素 和 半 纤 维 素 等 组 成 ,在 动物 细胞 中 不 存在 细胞 壁 。

”原核 细胞 (如 细菌 ) 运 动 的 细胞 器 是 简单 的 纤 丝 ,而 真 核 细 胞 的 鞭毛 或 纤毛 是 具有 “9 十 2?
结构 的 微 管 (microtubule) 所 组 成 。

在 代谢 方面 原核 细胞 与 真 核 生 物 也 有 显然 不 同 的 区 别 。 原 核 细 胞 的 代谢 途径 具有 多 样 性 ，
特别 是 在 无 氧 产 能 反应 方面 ,有 多 条 代谢 途径 , 而 在 真 核 细 胞 中 则 以 糖 酵 解 、 三 羧 酸 循环
(CILICA cycle) 及 呼吸 链 为 主要 的 产能 途径 。

从 上 面 简略 介绍 的 情况 可 以 看 出 ,原核 生物 的 特征 非常 适合 分 子 生物 学 的 研究 .原核 生物
在 进化 上 是 原始 的 生物 , 它 的 遗传 物质 比较 简单 ,基因 组 很 小 ,便于 操作 , 因此 是 一 种 极 方便 的
研究 模型 。 原 核 生 物 特别 是 细菌 生长 繁殖 极其 迅速 ,便于 培养 , 作为 研究 材料 是 真 核 生物 无 法
比拟 的 。 细 菌 中 的 核酸 、 蛋 白质 及 酶 类 都 比较 容易 分 离 纯 化 ,用 它 研究 基因 的 分 子 生物 学 十 分 方
便 。 近 年 来 ,分 子 生 物 学 的 迅速 发 展 也 是 与 原核 细胞 作为 研究 材料 分 不 开 的 .为 此 ,我 们 在 本 节 中
较 详 细 地 讨论 细菌 特别 是 大 肠 杆菌 的 一 些 生物 学 特征 ,以便 更 好 地 学 习 以 后 各 章 的 内 容 。

一) 细菌 的 形态 与 结构
细菌 是 极 小 的 微生物 ,大 多 数 细 菌 的 直径 为 0.1 一 5. 0 am, 长 2 一 8 pm。 由 于 它们 的 细胞
43

极 小 ,其 表面 积 /体积 之 比 (surface/volume) 则 特别 大 , 这 是 与 真 核 细胞 有 显著 区 别 的 特点 。 个
体 小 有 许多 生理 上 的 优点 ,营养 物 及 废弃 物 进出 细胞 的 速率 与 细胞 大 小 成 反比 ,从 而 物质 运转
速率 影响 其 代谢 速率 及 生长 速率 , 因此 ,细胞 越 小 ,其 潜在 生长 速率 越 快 。 . |

细菌 由 于 为 一 层 坚硬 的 细胞 壁 所 包围 , 妃 赋予 它 们 以 特有 的 形状 。 有 些 细菌 旦 球形 或 卵
形 , 称 为 球菌 (Cocczxs coccz); 有 些 细 菌 呈 杆 状 , 称 为 杆菌 (Buczzlxs pacil); 还 有 一 些 细 菌 呈 螺
旋 状 , 称 为 螺 菌 (CSzzrzluzz spzzzla)， 见 图 3-1。 如 果 用 浴 菌 酶 (lysozyme) 处 理 细 菌 , 胞 壁 组 分 被
去 掉 , 胞 壁 的 刚性 即 失 去 ,这 时 一 切 细胞 都 会 变 成 圆 球形 ,最 后 即 破裂 。

3-1 细菌 的 形态
Ca) 球菌 ;(b) 杆 菌 ;(c) 螺 菌 。

(二 ) 细 菌 的 结构

细菌 主要 由 细胞 壁 .细胞 膜 .核糖 体 ,类 核 体 等 组 成 。 但 是 ,通常 在 细胞 壁 以 外 还 含有 胞 辟
外 的 结构 ,包括 细胞 糖 葛 、 凌 毛 、 菌 毛 等 。 现 在 ,我 们 依次 予以 介绍 。

1. 细胞 糖 莹 ”细胞 糖 莹 (glycocalyx) 是 包围 细菌 细胞 物质 的 总 称 。 细 胞 糖 苯 为 胶 质 高 分
子 , 由 多 糖 .多 肽 或 二 者 混合 组 成 .不 同 种 细菌 的 细 胸 稿 零 酌 花 学 组 成 变异 很 大 ,细胞 糖 苯 的 粘
性 很 大 , 它 在 细胞 的 内 部 形成 ,而 分 泌 到 细胞 表面 。 附 着 有 粘性 的 细胞 糖 莹 的 细菌 能 使 细菌 固
着 在 宿主 组 织 上 , 这 种 粘性 物质 有 时 也 称 为 荧 膜 (capsule)。 有 些 细菌 的 莹 膜 对 细菌 致 病 性
(virulence) 很 重要 。 鞭 膜 可 以 保护 这 区 致 病菌 侈 受 宿主 细胞 的 吞噬 作用 (phacocytosis ) , 吞 鸣
作用 是 白细胞 吞食 并 破坏 细菌 的 一 种 过 程 。 粘 的 细胞 糖 苯 的 另 一 站 功能 是 将 细菌 附着 在 各 种
表面 上 ,以 便 在 自然 环境 中 存在 .通过 附着 细菌 可 以 在 物体 的 表面 上 生长 ,如 流水 中 的 岩石 . 植
物 根部 、 动 物 或 人 的 组 织 等 。

ve

图 3-2 玖 ,coii 细胞 结构

2. 鞭毛 ”细菌 的 鞭毛 (flagellum) 为 毛 状 ,是 从 细胞 伸 出 的 螺旋 状 附属 物 , 它 担负 细胞 运动
的 功能 ,细菌 的 鞭毛 比 真 核 生 物 的 鞭毛 或 纤毛 (cillum) 纤 细 得 多 ,直径 只 有 0.01 一 0.02pm, 其 |
44 |

结构 也 较为 简单 (如 图 3-2), 细 菌 的 鞭毛 在 光学 显微镜 下 一 般 看 不 到 ,只 有 在 负 染 后 在 电子 显
微 镜 下 才 可 以 观察 到 。

鞭毛 的 位 置 随 细 胞 种 类 而 变化 ,有 的 为 极 生 (polar) ,在 细菌 的 一 端 或 两 端 生 有 鞭毛 ;有 的
为 侧 生 (lateral) ,鞭毛 生 于 两 侧 。 蒜 毛 由 三 部 分 组 成 :中 基部 (basal body), 它 与 细胞 膜 及 细胞
壁 相 结合 ;@ 一 个 短 的 钧 状 物 (hook) ;@@ 一 螺旋 状 的 丝 (filament)。 凌 毛 的 长 度 通常 为 细胞 的
数 倍 ,基部 的 化 学 成 分 尚 不 很 清楚 ,而 钩 状 物 及 丝 是 由 蛋白 质 亚 基 组 装 成 的 ,排列 成 螺旋 状 , 组
成 鞭毛 丝 的 蛋白 质 , 称 为 鞭毛 蛋 日 (flagellin) 。

带 有 鞭毛 的 细菌 能 够 运动 ,鞭毛 的 运动 是 靠 鞭 毛 在 其 基部 旋转 (rotation), 从 而 推动 细菌
的 运动 ,鞭毛 旋转 的 方向 为 顺 时 针 方 向 或 反 时 针 方向 (图 3-3)。

与 真 核 生物 的 鞭毛 或 纤毛 不 同 , 细 菌 的 鞭毛 蛋白 分 子 没 有 ATP 酶 活性 。 因 此 ,在 细菌 半
毛 做 旋转 运动 时 ,ATP 并 非 其 直接 的 能 源 ,鞭毛 运动 的 动力 (或 马达 motor) 是 由 质子 动 势
(proton motive force) 驱 动 的 , 即 靠 跨 过 质 膜 的 质子 梯度 所 获得 的 动力 驱动 的 。

细胞 厨 细胞 膜
旋转 马达
H+ 窗
TIE 二 2
图 3-3 细菌 的 鞭毛

3. 菌 毛 ” 菌 毛 (pili) 是 比 鞠 毛 更 细 更 短 而 数目 多 的 附属 物 , 在 电子 显微镜 下 可 以 观察 到 。
菌 毛 是 非 螺 旋 状 的 丝 状 物 , 没 有 运动 的 功能 ,因为 不 论 在 能 运动 和 不 能 运动 的 菌 种 , 菌 毛 都 存
在 。 有 一 种 性 菌 毛 (F-pili) 在 细菌 交配 时 起 作用 ,能 使 遗传 物质 \ 质 粒 ) 通 过 菌 毛 传送 到 另 一 细
胞 中 .还 有 些 菌 毛 则 在 人 体感 当时 起 作用 ,它们 使 致 病菌 能 接触 在 呼吸 道 、 肠 道 或 生殖 道上 ,这
种 接触 能 使 细菌 不 致 被 体液 冲洗 掉 , 从 而 完成 感染 过 程 。

4. 细 胞 壁 ”在 细菌 外 结构 如 莱 膜 鞭毛 、 菌 毛 之 下 及 细胞 膜 之 外 是 一 层 细胞 壁 (cell
wall), 它 是 一 种 很 坚硬 的 结构 ,使 细胞 保持 一 定 的 形状 。 它 的 主要 功能 是 防止 细胞 吸水 膨胀 ，
以 臻 最终 破裂 。 因 为 大 多 数 细菌 生活 在 低 渗 环 境 中 ,由 于 吸水 可 能 胀 破 。

在 真 细 菌 (eubacteria) 细 胞 壁 里 ,决定 形状 的 物质 主要 为 肽 葡 聚 糖 (peptidoglycan), 它 是
一 种 不 溶 于 水 的 多 和 孔 的 交 联 高 分 子 ,有 很 大 的 刚性 。 肽 葡 聚 糖 只 在 原核 生物 中 存在 . 肽 葡 聚 粮
的 结构 和 组 分 在 种 间 虽 有 不 同 , 但 是 它们 的 基本 结构 相似 ,都 含有 N- 乙 酰 葡 萄 糖 胺 .N- 乙 栈 胞
壁 酸 \ 志 -两 氨 酸 、D- 丙 氨 酸 、D- 谷 氨 酸 及 二 氨基 酸 ( 如 二 氨基 庚 二 酸 diaminopimelic acid) 。

通常 细菌 分 为 两 大 类 , 即 革 兰 氏 阳 性 (Gram-positive) 及 革 兰 氏 阴性 (Gram-negative) ， 这
是 根据 一 种 特殊 染色 法 ,将 细菌 涂 片 固定 后 加 革 兰 氏 染 料 染 色 ( 染 料 含 有 亚 甲 蓝 ,结晶 紫 crys-
tal violet 及 番 红 safranin) , 革 兰 氏 阳 性 细菌 呈 紫 色 , 革 兰 氏 阴性 细菌 呈 红 色 。 细菌 胞 壁 的 结构
与 革 兰 氏 染 色 反应 有 密切 关系 。 在 革 兰 氏 染 色 反应 中 ,在 细胞 内 部 形成 一 种 不 溶解 的 结晶 紫 -
碘 复 合 物 , 这 种 复合 物 可 以 用 乙醇 从 革 兰 氏 阴 性 菌 提取 出 来 ,但 是 不 能 从 革 兰 氏 阳 性 菌 提取 出
来 。 革 兰 氏 阳 性 细菌 的 胞 壁 很 厚 , 由 多 层 肽 葡 聚 糖 组 成 , 乙醇 使 之 脱水 ,这 使 得 胞 壁 上 的 孔 关

闭 ,阻止 不 溶解 的 结晶 紫 - 碘 复合 物 从 细胞 出 来 ,因此 染 成 紫色 。 而 在 革 兰 氏 阴 性 细菌 中 , 溶剂
45

readioneerraiis

很 容易 溶解 出 来 , 透 过 外 层 , 薄 的 肽 葡 聚 糖 层 也 不 阻止 溶剂 的 透 过 ,经 过 番 红 复 染 后 , 革 兰 氏 阴性 |
细菌 乃 染 成 红色 。 因 此 , 革 兰 氏 染 色 反应 不 是 由 于 细胞 壁 的 化 学 组 成 而 是 由 于 其 物理 结构 所 致 。 |

5. 细胞 膜 ” 紧 连 在 细胞 壁 下 面 的 是 一 层 细胞 质 膜 (cytoplasmic membrane), 这 个 结构 大 |
约 厚 7. 5 nm, 主要 是 由 磷脂 ( 占 20% 一 30%) 及 蛋白 质 ( 占 60% 一 70%) 组 成 的 ,磷脂 形成 一 个 |
脂 双 层 ,而 大 部 分 蛋白 质 则 灸 虞 于 其 中 。 这 些 蛋 白质 称 为 整体 蛋白 (integral protein) ,与 脂 双
层 结合 在 一 起 ,只 有 用 去 污 剂 处 理 后 将 磷脂 去 掉 时 才能 提取 得 到 ,其 余 蛋 白质 属于 外 围 蛋白 |
(peripheral proteins), 用 温和 处 理 ,如 渗透 冲击 (osmotic shock) 即 可 除 掉 。 膜 的 脂 质 部 分 有 流 |
动 性 ,能 使 其 组 分 侧 向 移动 。 流 动 性 对 膜 的 功能 很 重要 , 它 随 温度 及 磷脂 中 不 侈 和 脂肪 酸 对 人
和 脂肪 酸 的 比值 而 改变 。

细菌 细胞 膜 的 主要 功能 有 二 :GDATP 的 合成 。 细菌 细胞 中 没有 线粒体 和 叶绿体 ,根据 化 学 |
渗透 学 说 (Mitchell,1961) ,在 细菌 中 质子 通过 细菌 的 细胞 膜 , 通 过 载体 分 子 的 电子 流 ,可 以 驱 |
动 带 正 电荷 的 H+ 。 质 子 运动 的 结果 ,使 介质 的 酸度 增加 ,产生 pH 梯度 ,也 离子 运动 导致 电位 |
差 的 形成 。 电位 差 是 靠 跨 过 膜 么 出 H+ 离 子 而 产生 的 (图 3-4);@@ 物 质 的 跨 膜 运输 。 通 过 细胞 膜 |
的 物质 都 不 是 被 动 的 运输 ,而 是 主动 运输 。 细胞 膜 的 透 性 是 选择 性 的 。 细 胞 膜 含 有 专 一 的 载体 |
蛋白 (carrier protein) ,它们 参与 运输 过 程 。 大 多 数 膜 的 运输 蛋白 是 跨 膜 蛋 白 (transmem_ ，
brane proteins) , 跨 膜 蛋白 一 部 分 暴露 在 细胞 质 外 , 一 部 分 在 细胞 质 内 。 由 于 运转 蛋白 的 构象 |
变化 ,使 与 细胞 外 表面 结合 的 溶质 进入 细胞 。 大 多 数 运转 过 程 要 消耗 ATP, 以便 克服 浓度 梯 |
度 。 葡 萄 糖 .果糖 .甘露 糖 ,p- 葡 萄 糖苷 等 的 运转 是 靠 基 团 移 位 (group translocation) , 当 运转 时 |
这 些 精 先 被 克 酸 转移 芋 系 统 (phosphotransferase system ) 使 之 磅 酸化 ,然后 克 酸 化 的 精 关 运 |
入 细胞 ,在 那里 它 可 以 被 正常 的 降解 途径 所 代谢 .

2 2

细菌 细胞 腊

电子 传递

ADP 十 Pi 2H+ ”ATP

++++ 十 十

高 质子 浓度
图 3-4 细菌 细胞 膜 电位 差 的 产生 和 ATP 的 生成

6. 间 体 “细菌 的 质 膜 常常 含有 一 个 或 多 个 ij 的 折 和 至 , 称 为 间 体 (mesosome)。 通
常 间 体位 于 或 靠近 细胞 分 裂 的 部 位 , 间 体 在 真 核 细胞 中 是 环 存在 的 。

间 体 主要 在 细菌 繁殖 中 起 作用 。 当 细菌 细胞 分 裂 时 (二 分 裂 ,binary fission), 靠 间 体形 成 |
二 个 横 隔 (transverse septum) ,将 亲 代 细胞 的 遗传 物质 分 配 到 两 个 相同 的 子 细胞 之 中 ;, 间 体 可 |
能 是 形成 横 隔 的 开始 ,并 使 细菌 DNA 与 质 膜 接触 , 间 体 帮助 把 DNA 分 配 到 两 个 子 细胞 中 。
7. 细胞 质 “在 细菌 中 细胞 质 (cytoplasm 被 细胞 质 膜 包围 起 来 。 它 可 以 分 为 三 部 分 :@ 细
46

胞 质 区 , 外 表 为 颗粒 状 , 富 含 大 分 子 的 RNA 蛋白 质 体 称 为 核糖 体 Cribosome) ,它们 是 合成 蛋
白质 的 重要 场所 .原核 细胞 核糖 体 的 沉降 系数 为 70 S, 由 两 个 亚 基 组 成 ,大 亚 基 为 50 S, 小 亚 基
为 30 S;@@ 染 色 质 区 ,其 中 富 含 DNA。 细 菌 与 真 核 细胞 不 同 , 它 没有 明显 的 由 核 膜 所 包围 的 细
胞 核 , 也 没有 有 丝 分 裂 器 (mitosis apparatus) , 而 是 在 细胞 核 的 中 央 集 中 着 DNA 分 子 。 因 为 它
不 是 一 个 完整 的 细胞 核 , 故 称 类 核 Cnucleoid) 或 染色 质 体 (chromatin body) 或 细菌 染色 体 (bac-
terial chromosome) , 它 是 由 一 条 环 状 DNA 分 子 组 成 的 ,所 有 的 基因 在 其 上 连 成 一 串 。 原 核 细
。 胞 的 染色 质 体 与 真 核 细胞 不 同 , 它 不 含有 组 蛋白 (histone) ;@@ 液 体 部 分 ,在 细胞 质 的 液体 部 分
中 含有 溶解 的 物质 , 如 糖 类 、 氨 基 酸 等 。 与 动物 或 植物 细胞 不 同 , 细 菌 细胞 没有 核糖 体 结合 在 上
面 的 内 质 网 。 有 些 核 糖 体 游 离 在 细胞 质 中 ,有 些 则 与 细胞 质 膜 的 内 表面 结合 , 它们 参与 蛋白 质
的 合成 ,并 将 这 些 蛋白 质 运 送 到 细胞 外 面 。 细 菌 的 细胞 质 中 含有 成 千 上 万 的 核糖 体 , 它们 使 细
胞 质 具 有 颗粒 状 的 外 观 。
此 外 ,细胞 质 的 液体 部 分 中 , 还 含有 多 糖 颗粒 、 脂 质 . 异 染 粒 (carboxsome)、 硫 颗粒 等 ,这 些
统称 为 内 含 物 (inclusions ) 。

第 四 节 大 肠 杆 瑚

一 大 肠 杆菌 的 重要 性

在 原核 生物 中 我 们 了 解 得 最 清楚 的 是 大 肠 杆 菌 ,我 们 对 于 歼 . co 的 生物 学 的 了 解 比 任何
生物 都 多 ,甚至 包括 人 类 (五 omo sazpzezs) 自己 。 玫 .coli 的 结构 与 功能 常常 被 当 作 是 所 有 生物 的
原型 (archetype) , 玫 . coi 之 所 以 如 此 出 名 , 主要 是 因为 它 在 实验 室 中 容易 操作 ,甚至 那些 对 灭
菌 技术 及 其 微生物 学 操作 不 熟练 的 人 通常 也 能 用 天. co 工作 而 不 感到 困难 。 玖 . coi 生长 迅
速 ,只 要 求 简单 的 营养 物质 ,并 且 能 进行 很 多 生理 生化 过 程 ,还 有 一 点 使 它 在 现代 生物 学 中 有
用 , 那 就 是 性 别 (sex)。 天 .col 是 发 现存 在 有 性 生殖 的 第 一 种 细菌 ,1946 年 Lederberg 及
Tatumi 首次 发 现 。 由 于 有 性 生殖 使 得 遗传 学 的 研究 成 为 可 能 ,遗传 杂交 得 以 进行 ,并 且 遗 状 性
状 可 以 分 析 。 五. co 另 一 有 价值 的 性 质 是 它 能 够 供应 细菌 病毒 的 生长 ,这 就 使 病毒 的 本 性 及
病毒 扩 增 的 深入 研究 成 为 可 能 .因此 ,由 于 其 适 于 实验 室 操作 ,有 利于 研究 病毒 学 及 有 性 生殖 ，
分 子 生 物 学 家 及 生物 化 学 家 万能 深入 探讨 生命 的 本 质 , 他 们 的 研究 工作 最 终 导 致 今日 的 分 子
生物 学 。

正 .coi 是 1885 年 由 德国 细菌 学 家 Theodor Escherich 首次 发 现 的 , 它 是 肠 道 中 普通 的 栖
息 者 。 Escherich 将 这 种 细菌 命名 为 大 肠 杆菌 (Bacterzzza co ) ,表明 细菌 为 杆 状 , 并 且 在 大 肠
中 栖息 。 以 后 将 其 属 名 Bacterzzm 改变 成 Eschericjhia ,以 纪念 发 现 者 。 虽 然 大 多 数 五 . coii 菌株
是 不 致 病 的 ， zol 则 致 病 ,引起 腹泻 及 尿道 感染 , 致 病 的 达 . co 菌株 与 不 致 病菌 株
有 明显 差异 。

5 的 一 些 五. coli 的 特点 。

二 ,大肠 杆菌 的 菌株

歼 . co 为 杆 状 菌 , 其 大 小 为 0. 5X 2 km, 属于 肠 细菌 科 (Enterobacteriaceae) ,下 scperzicjia 属 。
它 是 兼 性 厌 气 菌 , 革 兰 氏 阴 性 ,用 番 红 染色 显 红 色 。
47

丈 . coii 有 许多 菌株 (strain) ,其 野生 型 为 C-1A。 五 . col 很 容易 培养 , 它 的 培养 基 成 分 比较
简单 , 表 3-3 为 瑟 . col 培养 基 的 组 成 。

K2HPO，
KH2?PO:
(CNH4)2SO:
MgSO4
CaCl，

表 3-3 瑟 .cofl 培养 基 的 成 分

7.0g 葡萄 糖 10 g
2.0g 微量 元 素 每 种 2 一 10 pg
1.0g ( 含 Fe,Co,Mn,Zn,Cu,Ni,Mo)
0515 蒸馏 水 1 000 ml
0. 02 g
三 \ 大 肠 杆 菌 的 遗传 物质

大 肠 杆菌 的 遗传 物质 主要 是 染色 体 DNA , 另外 , 还 有 一 些 质粒 DNA，, 下 面 我 们 分 别 加 以 介绍 。
1. 天 .coi 基因 图 F.coli 的 DNA 为 双 股 环 状 DNA, 含 有 1 400 个 以 上 的 基因 ,这些 基因
都 已 经 定位 ,图 3-5 就 是 歼 . col 的 基因 图 (图 中 仅 列 出 少数 基因 ) 。

图 3-5 瑟 .col 染色 体 的 基因 图 ”

在 基因 图 中 有 些 基因 是 集中 成 入 的 , 如 操纵 子 基因 ( 见 第 十 章 ), 但 在 某 些 相关 的 基因 中 ，
如 组 氨 酸 生物 合成 所 包括 的 基因 紧 紧 连 在 一 起 ,但 味 叭 生物 合成 所 包含 的 基因 则 沿 染 色 体 分

散 Czpxr 基因 ) 。

匹 .coli 的 基因 组 (genome) 的 总 长 度 为 4.6X10'sbp;DNA 的 总 长 度 为 1100 一 1400 pm。
2. 质粒 ”质粒 (plasmid) 是 细菌 中 的 另 一 类 遗传 物质 。 质 粒 是 环 状 DNA ,能 自我 复制 , 它

48

们 存在 于 染色 体 之 外 。 质 粒 能 靠 结 合 过 程 (conjugation process) 从 细胞 代 代 相传 , 某 些 质 粒 还
能 与 染色 体 整 合 (integration) ,在 这 种 情况 下 其 复制 则 受 染 色 体 的 控制 。
质粒 也 携带 有 许多 基因 ,例如 ,控制 产生 毒素 的 基因 , 对 抗菌 素 、 重 金属 及 其 它 抑 制 物 有 抗
“性 的 基因 。 有 些 质粒 携带 着 降解 稀有 底 物 如 芳香 化 合 物 及 杀 虫 剂 的 基因 。 图 3-6 为 PBR322 的
基因 图 。

pPBR322 是 达 .co 中 的 质粒 ,长 4 367 核 苷 酸 ,是 分 子 生 物 学 研究 中 最 常用 的 一 种 质粒 ,其
上 有 各 种 内 切 酶 如 BaxzHI，Psi I， Sa I，EcoR L 玖 zzdE 等 的 酶 切 位 点 。 此 外 , 玫 .coiz 的 质粒 的
种 类 很 多 ,如 :

P 太 下 了 53 (36 下 b 六 EEC 58 kby5
PMK 16 (46 khb ). PGRELAGNSSKb)5

图 3-6 质粒 PBR322 的 基因 图
箭头 表示 DNA 从 原点 复制 的 方向 。

四 ,大 肠 杆菌 的 酶 类

正 . coli 细胞 中 含有 多 种 酶 类 ,除去 进行 合成 代谢 及 降解 代谢 所 需要 的 酶 类 之 外 ,天 . col 还
含有 核酸 代谢 所 需要 的 酶 类 ,包括 DNA 聚合 酶 (CDNA polymerase)、.RNA 聚合 酶 (RNA poly-
Imerase) 以 及 多 种 限制 性 内 切 酶 (restriction endonuclease) 。 限 制 性 酶 只 在 具有 特异 顺序 碱 基
的 位 点 上 与 DNA 结合 。 限制 性 酶 有 一 个 特点 , 它 能 在 双 链 上 沿 一 固定 位 点 按 对 称 顺 序 打 断
DNA。 例 如 , 正 . col 的 一 种 限制 性 内 切 酶 EcoR I ,具有 下 列 识别 顺序 :

+ /
本
六 全 C- 宁 一 T 直 A 一 ATG……3
裂解 的 部 位 以 箭头 表示 , 对称 轴 以 虚线 ( …… ) 代 表 。
限制 性 酶 对 DNA 的 研究 极其 重要 , 因为 它们 可 使 大 的 DNA 分 子 切割 成 小 的 片段 ,由 限
制 性 酶 所 生成 的 片段 可 以 测定 其 序列 ,从 而 可 以 完成 DNA 分 子 的 全 序列 测定 ( 详 见 第 四 章 )。

现在 ,许多 种 限制 性 酶 已 有 商品 出 售 ,其 中 不 少 是 从 无. co 细胞 分 离 纯化 得 到 的 ,成 为 研究 分
49

子 生物 学 必 不 可 缺少 的 工具 酶 。
从 天 . coli 细胞 分 离 得 到 的 限制 性 内 切 酶 常用 的 还 有 下 列 各 种 : EcoR D BazmH TD 碳 ind 了
Pstl Sall Smal 等 等 。 上 述 各 种 聚合 酶 及 限制 性 内 切 酶 将 在 以 后 各 章 中 经 常 遇 到 。

第 五 节 真 核 细胞

地 球 上 的 生物 大 多 数 属于 真 核 生 物 , 包 括 原 生动 物 (protist) 真菌 (fungiD)、 动 物 和 植物 。
从 单 细 胞 的 酵母 (Saccharomzyces) 到 人 类 都 是 真 核 生物 。 我 们 在 本 章 的 第 二 .三节 中 已 经 谈 到
过 真 核 生 物 区 别 于 原核 生物 的 一 些 特征 。 真 核 细胞 中 存在 着 明显 的 细胞 核 , 外 面 有 一 层 核 膜 ，
其 中 的 脱氧 核糖 核酸 CDNA) 与 组 蛋白 结合 形成 核 小 体 (nucleosome)。 这 些 遗 传 物质 在 有 丝 分
裂 或 减 数 分 裂 时 浓缩 成 特定 数目 的 染色 体 . 在 真 核 细 胞 的 细胞 质 中 还 存在 着 许多 种 细胞 器 , 如
线粒体 .叶绿体 .内 质 网 ,高 尔 基体、 溶 酶 体 等 ,承担 着 呼吸 作用 、 光 合作 用 、 蛋 白质 合成 等 重要
功能 。 真 核 细胞 中 还 有 一 个 由 微 丝 , 微 管 及 中 间 纤 维 组 成 的 细胞 骨架 系统 ， 在 细胞 质 中 构成 一
个 复杂 的 网 络 ,维持 不 同 细胞 所 特有 的 形状 ,并 执行 细胞 运动 和 物质 运输 等 功能 。

酵母 是 单 细胞 的 真 核 生物 .。 酵母 细胞 虽然 很 小 ,但 是 它 具 有 真 核 细 胞 的 结构 和 功能 。 酵母
的 遗传 物质 DNA 分 布 在 16 条 染色 体 上 , 共 含 有 11X10' bp, 它 能 进行 有 丝 分 裂 和 减 数 分 裂 。 上
酵母 的 细胞 质 中 含有 各 种 细胞 器 ,包括 线粒体 .粗糙 内 质 网 ,高 尔 基体、 溶 酶 体 和 细胞 骨架 ( 微
丝 和 微 管 ) 。

酵母 细胞 中 除 存在 DNA 外 ,还 含有 各 种 RNA( 包 括 rRNA,tRNA 和 mRNA) 及 DNA 聚
合 酶 .RNA 聚合 酶 等 , 它 能 进行 DNA 的 复制 .转录 及 蛋白 质 合 成 。 因 此 ,酵母 也 是 研究 分 子 生
物 学 的 一 个 很 重要 的 材料 ,并 且 它 有 易于 培养 、 容 易 操作 、 便 于 大 量 繁殖 等 优点 ,通常 用 作 基 因
表达 的 载体 ,其 表达 产物 (和 蛋白质 ) 可 以 分 刻 到 细胞 之 外 ,便于 分 离 纯化 。

酵母 中 富 含 线粒体 ,因此 , 酶 母 曾经 是 研究 糖 酵 解 (glycolysis ) 等 生物 氧化 作用 的 重要 材
料 , 对 生物 化 学 研究 做 出 了 重大 贡献 。

衣 藻 (Chlamzydomozas) 也 是 一 种 单 细 胞 的 真 核 生 物 , 它 属于 眼 虫 目 (Euglenoid) 。 衣 落 细
胞 上 有 两 条 鞭毛 ,能 在 水 中 游泳 .其 DNA 为 环 状 。 它 的 细胞 质 中 除 含有 线粒体 外 ,还 含有 叶 绿
体 , 能 进行 光合 作用 。 它 的 叶绿体 中 含有 光合 作用 所 需 的 各 种 成 分 ,如 叶绿素 、 质 体 蓝 素 、 光 系 ，
统 工 ` 光 系统 工 P700 等 。 衣 藻 在 实验 室 中 很 容易 培养 ,因此 , 衣 藻 成 为 研究 分 子 生 物 学 常用 的
良好 材料 。

在 真菌 的 粘 菌 科 (Myxomycete) 中 有 两 种 粘 菌 (slime mold) 最 为 常见 ,一 种 是 单 细胞 烙 菌
(cellular slime mold), 即 盘 基 网 柄 菌 CDictyostelixma discozdexmz) , 它 的 细胞 呈 变 形 虫 状 , 当 细
胞 发 育 到 一 定时 期 , 由 于 环 式 AMP 的 作用 ,细胞 集合 起 来 ， 形成 一 个 能 运动 的 聚合 体 , 以 后 产
生子 实体 ,生出 孢子 ,孢子 萌发 即 是 变形 虫 状 的 细胞 ; 另 一 种 是 多 头 绒 泡 菌 C(Physaraza poly-
cetbjhalz7z), 它 的 细胞 集合 成 一 个 多 核 的 原 质 团 (plasmodium ) 。 当 生 存 条 件 不 良 ( 如 干燥 ) 时 ，
它 会 产生 孢子 。 这 两 种 粘 菌 是 研究 发 育 的 分 子 生 物 学 的 良好 材料 。

在 多 细胞 真 核 生 物 中 许多 种 动物 和 植物 现在 都 成 为 分 子 生 物 学 的 研究 材料 ,在 重组 DNA
技术 方面 已 不 成 为 问题 。 不 过 ， 在 遗传 学 和 发 育 生物 学 方面 果 蝇 (Drosopjaza Nielazz0gaster) 的 |
研究 是 特别 深入 的 。 在 果 蝇 的 变态 过 程 中 ,从 受精 卯 到 幼虫 . 师 , 以 至 于 邬 化 成 成 虫 , 受 着 很 多 |

种 基因 在 时 间 、 空 间 和 序列 的 调控 ,是 一 个 非常 复杂 而 奥妙 的 问题 ,现在 已 经 有 不 少 过 程 研究
50 |

清楚 了 。
在 植物 方面 , 拟 南 并 (4rabidopsis thaliana) 是 一 个 研究 分 子 生物 学 的 理想 材料 。 拟 南 闪 属
于 十 字 花 科 (Crucifer) , 它 的 染色 体 2 一 10。 由 于 很 多 科学 家 的 努力 , 拟 南 闪 的 基因 组 序列 已
经 测定 出 150 000 bp 以 上 ,并 存 和 人 基因 银行 中 ,可 供 查阅 。
下 面 我 们 较 详细 地 介绍 真 核 细胞 的 细胞 核 .细胞 质 、 质 膜 等 的 结构 。

一 ` 细 胞 核

真 核 细 胞 的 细胞 核 nucleus ) 比 原核 细胞 的 类 核 体 (nucleoid) 在 结构 上 和 功能 上 都 复杂 得
多 . 细胞 核 含 有 大 部 分 的 DNA ,只 有 一 小 部 分 DNA 存在 于 线粒体 或 叶绿体 中 。 细胞 核 被 核 腊
《nuclear envelope) 所 包围 。 核 膜 由 两 层 膜 组 成 ,其 外 层 与 内 质 网 (endoplasmic reticulum) 相 连
接 。
在 细胞 核 内 存在 着 1 个 或 多 个 核 仁 (nucleolus ) 。 核 仁 是 DNA 转录 成 核糖 体 RNA 的 场
所 。RNA 合成 后 通过 核 孔 运送 到 细胞 质 中 ,再 组 装 成 核糖 体 。 除 核 仁 部 分 外 细胞 核 的 其 余部
分 为 染色 质 , 它们 由 DNA 及 与 之 紧密 结合 的 蛋白 质 组 成 ,在 有 丝 分 裂 (mitosis ) 的 前 期 ,它们
浓缩 成 染色 体 (chromosome) (图 3-7) 。 各 种 动 植物 染色 体 的 数目 和 大 小 不 同 , 随 物 种 而 异 , 如
人 类 的 染色 体 数 为 46, 四 膜 虫 (Tetrapymzeza) 为 4, 玉 米 (Zea zays) 为 20, 拟 南 芥 为 10。 与
DNA 结合 的 蛋白 质 主要 是 组 蛋白 (histone), 它 是 一 种 碱 性 蛋白 质 ,能 与 呈 酸 性 的 DNA 大 分
子 相 结合 . 此 外 , 细胞核 中 有 时 还 存在 酸性 的 非 组 蛋白 (nonhistone) 。 组 蛋白 与 DNA 结合 成 一
种 复合 体 称 为 核 小 体 。

Tc 汪 cher 过

核 孔

核 仁

内 腊 一 一
核 膜 十 染色 质
3-7 细胞核 的 结构 示意 图

在 原核 细胞 和 真 核 细胞 DNA 大 分 子 中 含有 大 量 基因 , 原核 生物 如 支原体 (Mycoplaszza
&enitalizm) 的 DNA 为 一 环 状 分 子 , 所 有 基因 都 排列 在 上 面 , 构 成 它 的 基因 组 (genome)。 在 真
核 细 胞 中 基因 组 很 大 ,于 是 形成 许多 个 染色 体 , 每 个 染色 体 为 一 个 DNA 分 子 , 共 同 构成 整个
基因 组 。 基 因 组 含有 编码 各 种 蛋白 质 、 酶 .RNA 的 基因 (DNA) ,这 些 基 因 控 制 着 整个 细胞 的 结
构成 分 与 功能 , 如 碳水 化 合 物 、 脂 肪 , 氮 素 代谢 及 能 量 代谢 的 途径 ,DNA 的 复制 .转录 、 翻 译 、 调
控 , 以 及 细胞 的 其 它 功能 。

基因 组 是 当前 生物 学 研究 的 重大 课题 ,特别 是 ”人 类 基因 组 计划 ”(Human Genome Pro-

51

ject) 受 到 国际 上 普遍 重视 ,世界 上 许多 国家 都 投入 了 大 量 人 力 、 物 力 、 财 力 ,正在 采用 最 先进 技
术 紧 张 地 进行 研究 。 由 于 人 类 基因 组 大 约 含 有 10; 个 基因 ,3X10" 个 bp, 全 部 基因 组 的 测定 需
要 很 长 的 时 间 。 基 因 组 控制 着 人 类 的 全 部 遗传 信息 和 各 种 生命 活动 ,一 旦 基因 组 的 基因 定位 ` 寿
核 苷 酸 序列 及 氨基 酸 序列 都 测定 完成 ,我 们 对 这 些 基 因 的 功能 将 会 更 好 地 理解 ,并 且 在 医学 上
对 遗传 病 治 疗 . 基 因 治 疗 等 将 做 出 极其 重大 的 贡献 。

目前 ,许多 科学 家 已 经 完成 一 些微 生物 动物、 植物 或 细胞 器 基因 组 的 核 苷 酸 全 序列 ,我 们
将 这 些 结 果 列 于 表 3-4。

表 3-4 一 些微 生物 动物 和 植物 基因 组 的 研究 结果
生 物 碱 基 对 数 (bp) 作者

嗜 菌 体 @X174 (Bacteriobpjhage X174) 5 386 Sanger 〈19777
嗜 菌 体 (Bacteriobpjhage 入 ) 48 502 Sanger (1982)
CMV (Cytomzegalo virzs) 229 000
Mycoplasmaa gerzitaLizz7z 580 070 Venter 等 (1995)
瑟 emopjhiilzs 加 7xuergae 18 301 376
线虫 Caenorhapditis elegans 100 000 000 Hodgkin 等 〈1995)
拟 南 芥 4rabidozpsis 太 aliana 染色 体 4 15 000 000
烟草 叶绿体 Nicotiarna tapaczmrz 155 844 杉 浦 昌 弘 等 〈1986)

在 Sanger 测定 了 嗜 菌 体 BEX174,4 的 基因 组 之 后 ,近年 来 Venter 等 (1995) 完 成 了 支原体
CMycoplaszza gerztaliuz2) 基 因 组 的 全 序列 分 析 。WMycoplasa 的 基因 组 为 一 环 状 DNA , 据 认 为
是 细菌 中 最 小 的 基因 组 ,共有 580 070 bp ,其 中 G+C 占 32%,A+T 占 68%, 此 项 研究 工作 量
很 大 ,由 30 人 完成 ,将 基因 组 切 成 8 472 个 片段 分 析 后 再 组 装 得 到 。 他 们 认为 所 编码 的 蛋白 质
”′ 和 酶 都 已 鉴定 出 来 。

在 动物 方面 线虫 的 研究 最 为 深入 。 线虫 是 研究 发 育 生物 学 的 模式 动物 。 它 的 个 体 很 小 , 纺
lmm 长 ,身体 透明 ,生活 史 短 ,3 天 一 个 世代 ,可 在 琼脂 培养 基 上 生长 。 它 的 遗传 物质 DNA 约
为 1 亿 bp, 为 人 类 基因 组 的 1/30.。 它 的 物理 图 谱 较 易 构建 ,截至 1995 年 为 止 ,线虫 DNA 全 序
列 的 1/5 已 经 测定 完成 。

在 植物 方面 拟 南 芥 基因 组 的 研究 是 当前 的 重点 。 拟 南 芥 共有 10 条 染色 体 。 现 在 ,重点 研
究 第 4 条 染色 体 DNA 的 序列 。 在 我 国 水 稻 基 因 组 的 研究 已 列 为 重点 , 现 正 进行 研究 。 当 水 稻
基因 组 的 全 部 基因 及 DNA 序列 测 出 后 ， 我 们 对 水 稻 的 遗传 性 及 基因 工程 的 研究 将 会 有 更 大
的 改进 。

二 . 细 胞 质
记

在 一 个 细胞 的 质 膜 之 内 ,除去 细胞 核 以 外 ,都 属于 细胞 质 (cytoplasm) 的 范畴 . 细胞 质证 含
有 多 种 细胞 器 (organelle) ,最 显著 的 是 线粒体 , 它 是 供应 细胞 能 源 的 中 心 。 细 胞 的 各 种 认命 活
动 如 生物 合 威 * 运 动 \ 物 质 运 输 所 需要 的 能 量 都 是 靠 线粒体 将 碳水 化 合 物 等 通过 精 酵 解 、 三 羧
酸 循环 及 电子 传递 链 以 及 氧化 磷 酸化 等 步骤 形成 腺 苷 三 磷酸 (ATP 或 GTP)。 ATP 是 _ 切 生 |
急 可 利用 的 能 的 形式 . 在 绿色 植物 中 还 存在 一 种 叶绿体 , 它 是 植物 进行 光合 作用 的 场所 . 植物
叶片 依靠 叶绿体 中 的 1, 5- 二 磷酸 核 酮 糖 羧 化 酶 (Rubis CO) 将 CO, 固定 , 并 通过 卡尔 广
Calvin) 循环 生成 糖 类 , 同时 放出 氧气 ,这 是 植物 所 需 氧 气 的 重要 来 源 .

细胞 质 中 还 存在 进行 蛋白 质 合 成 的 内 质 网 Cendoplasmic reticulum )、 进行 蛋白 质 加 工 的 |
52 |

|
]

高 尔 基 体 (Golgi body) \ 溶 酶 体 (lysosome)、 过 氧化 物体 (peroxisome) ,在 植物 细胞 中 还 有 液 泡
(vacuole) 。 在 细胞 质 中 还 有 一 个 细胞 骨架 系统 , 它 由 微 丝 , 微 管 和 中 间 纤 维 组 成 一 个 网 络 系
统 , 对 维持 细胞 形状 .进行 运动 有 重要 功能 。 除 去 这 些 结 构 以 外 就 是 一 些 溶液 , 称 为 胞 液 (cy-
tosol) ,其 中 含有 各 种 有 机 物质 和 无 机 离子 。 下 面 我 们 扼要 地 讨论 主要 的 细胞 器 。

一 ) 线 粒 体

在 所 有 真 核 生物 的 细胞 中 都 含有 线粒体 (mitochondria), 其 形状 为 线 状 或 粒状 。 典 型 的 线
粒 体 的 大 小 约 为 1 &m*, 与 细菌 细胞 相似 ,大 多 数 动 植物 细胞 含有 数 百 个 到 1 000 个 线粒体 。 线
粒 体 通过 其 中 的 生物 氧化 作用 将 糖 类 分 子 中 的 化 学 能 转变 成 ATP , 供 细胞 维持 生理 功能 之
用 ,因此 ,线粒体 是 细胞 的 发 电厂 。

每 个 线粒体 有 两 层 膜 ,外 层 包 围 整 个 线
粒 体 ,内 层 向 内 折 释 成 内 旺 (crista) ,赋予 它 内 腊 折 三 友
以 大 的 表面 积 ,线粒体 的 螨 与 旺 之 间 为 间 质
matrix) ,其 间 充 满 很 浓 的 酶 类 ,如 三 羧 酸 循
环 的 酶 类 及 中 间 代 谢 物 。 进 行 电 子 传递 的 蛋
白质 及 氧化 磷酸 化 的 腺 苷 三 磷酸 酶 (ATP

外 膜

|

内 膜 上 进行 生物

酶 ) 分 子 则 镶 骨 在 内 膜 之 中 。ATP 酶 分 子 的 把 鞭 示 央 记 家 间 质 (含有 各 种 酶 )
本 图 3.8 “作答 体 的 结构 示意 图

线粒体 有 其 自己 的 基因 组 , 它 编 码 构成 线粒体 的 蛋白 质 、 酶 类 和 RNA, 但 是 也 有 些 线粒体
蛋白 质 由 核 基因 编码 。

由 于 线粒体 有 其 自己 的 基因 组 ,这 也 有 助 于 证 明 线 粒 体 是 由 远古 的 好 氧 细菌 与 真 核 生 物
共生 的 理论 。

(二 ) 叶 绿 体

在 绿色 植物 细胞 中 含有 许多 质 体 (plastids) ,其 中 最 显著 的 是 叶绿体 (chloroplast) 。 与 线
粒 体 相似 ,叶绿体 是 绿色 细胞 的 发 电厂 , 它 将 叶绿素 吸收 的 日 光 能 转化 成 ATP 分 子叶 绿 体
的 叶绿素 吸收 日 光 能 通过 光 系 统 反 应 中 心 激
人 发 出 电子 ,经 过 电子 传递 链 ,使 ADP 磷酸 化
成 为 ATP.。 叶绿体 中 含有 大 量 1,5- 二 磷酸 核
酮 糖 羧 化 酶 /加 氧 酶 ,将 CO, 固定 为 已 糖 , 再
通过 卡尔 文 循环 生成 葡萄 糖 , 以 后 葡萄 糖 可
以 转化 成 蔗糖 和 淀粉 。 光 合 细菌 的 反应 中 心
的 晶体 结构 已 于 1989 年 由 德国 的 Deisen-
hofer, Michel 和 Huber 解析 出 来 ， 获得 了
Nobel 奖 。 图 3-9 为 叶绿体 的 示意 图 。

日 本 的 杉 浦 昌 弘 等 人 于 1986 年 将 烟草
(CNVicotzanza abacaom) 叶 绿 体 基因 组 DNA 的 全 序列 测定 成 功 , 它 由 155 844bp 组 成 。 这 些 核 苷
酸 序列 组 成 了 编码 叶绿体 中 所 有 和 蛋白质 (如 psaA,B,psbA,B,C,D) 的 基因 及 tRNA 和 rRNA
的 模板 。 这 项 研究 结果 对 我 们 认识 光合 作用 的 分 子 基 础 是 至 关 重 要 的 。

上 一 一 5um

3-9 叶绿体 的 结构 示意 图

53

(三 ) 内 质 网

内 质 网 是 细胞 中 合成 蛋白 质 的 重要 场
所 。 内 质 网 上 有 很 多 合成 蛋白 质 的 核糖 体
Cribosome) 。 内 质 网 是 贯穿 整个 细胞 质 的 由
膜 组 成 的 网 络 , 与 胞 质 分 开 , 其 表面 有 许多 核
糖 体 , 显得 很 粗糙 ,因此 , 常 称 为 粗糙 内 质 网
(rough endoplasmic reticulum) 。 它 有 许多 扇

平 状 的 分 枝 , 彼 此 联系 并 与 核 膜 结合 (图 3- 大 芝 国 攻
10)。 在 特 化 成 专门 分 泌 蛋 白质 的 细胞 (如 腰 WANSS

脏 分 沁 胰 岛 素 的 细胞 ) 中 , 内 质 网 特别 丰富 。 sw 以) 广
合成 脂 质 的 内 质 网 表面 是 光滑 的 , 称 为 平滑 汉

内 质 网 (smooth endoplasmic reticulum ) 。 在 图 3-10 内 质 网 的 结构 示意 图

骨骼 肌 中 内 质 网 特 化 成 贮藏 及 释放 Ca 的 (Ge) 粗 精 内 质 网 ( 含 核糖 体 );b) 光滑 内 质问 。

结构 ,Ca2+ 离 子 释放 是 肌肉 收缩 以 及 许多 生理 功能 的 扳机 (trigger)。 合 成 向 外 输出 的 蛋白 质 的

内 质 网 定位 于 内 质 网 的 外 表面 (朝向 胞 质 ) ,而 在 那些 存留 在 胞 液 (cytosol) 中 的 蛋白 质 则 是 在
与 内 质 网 不 结合 的 核糖 体 上 合成 的 。 有 关 核 糖 体 的 结构 与 功能 还 将 在 第 九 章 中 详细 讨论 。
(四 ) 高 尔 基体

真 核 生 物 细 胞 有 一 个 由 膜 吉 泡 组 成 的 结

一 个 高 尔 基体 通常 可 看 作 是 一 个 扁平 的 膜 玫
泡 ( 内 螨 )。 靠 近 这些 内 旺 的 末端 有 无 数 更 小
的 球状 训 泡 ,它们 是 运输 赛 泡 ( 图 3-11)。

对 称 的 ,其 顺 向 (cis) 一 侧面 向 粗糙 内 质 网 ，
关 池 (出丑 介 ) < 回 9 而 反 向 (trans) 便 则 面向 质 膜 ,二 者 之 间 为 中

@ 到 于 间 介 质 Cmedial element ) 。 当 有 蛋白质 在 核糖 体

有 址 2 上 合成 时 ,蛋白 质 嵌 入 到 内 峰 的 内 部 。 含 有 新

ED ED1A 高 尔 基体 的 示意 图 合成 的 蛋白 质 小 膜 囊 泡 从 内 质 网 上 以 出 芽 方

式 运动 到 高 尔 基体 上 ,与 顺 向 侧 融 合 。 当 蛋白 质 通过 高 尔 基体 到 达 顺 向 侧 时 ,高 尔 基 体 中 的 酶
类 即将 蛋白 质 分 子 加 以 修饰 ,如 将 硫酸 基 团 、 碳 水 化 合 物 或 脂 质 加 到 某 些 氨基 酸 侧 链 上 。 这 些
新 合成 蛋白 质 修饰 的 功能 之 一 就 是 将 蛋白 质 定位 于 正确 的 位 置 上 , 当 它 在 运输 囊 泡 中 离开 高

尔 基体 即 从 反 向 (trans) 侧 生出 荐 。 有 些 谭 泡 包容 在 分 泌 训 泡 中 ,最 终 以 外 吐 (exocytosis) 方 式 ，

从 细胞 中 排出 去 。 另 一 些 则 镶嵌 在 细胞 内 的 细胞 器 上 ,如 深 酶 体 ,或 者 在 细胞 生长 时 挫 信 到 质
膜 之 中 。

(五 ) 溶 酶 体

溶 酶 体 (ysosome) 存 在 于 动物 缅 胞 中 , 呈 球 状 , 岂 意 层 异 组 成 ,直径 通常 为 1 pm。 溶 酶 体
中 含有 能 够 溶解 的 蛋白 质 ` 多 糖 ,核酸 及 脂 质 的 水 解 酶 类 (图 3-12) 。 这 些 生物 大 分 子 被 酶 类 降
解 成 简单 的 成 分 ,如 氨基 酸 . 单 糖 ,脂肪 酸 等 , 排 人 泡 液 之 中 ,重新 循环 利用 。

54

构 称 为 高 尔 基体 (Golgi body or complex)。

高 尔 基 复 合体 在 结构 上 和 功能 上 都 是 不

过 氧化 物体 :在 某 些 细胞 中 存在 着 一 种 过 氧化 物体 (peroxisome) ,其 中 含有 较 大 量 的 过 氧

化 氢 酶 catalase), 它 可 催化 下 列 反应 ，
2H2:O， 2 OO) 十 O，

在 氨基 酸 及 脂肪 降解 所 进行 的 氧化 反应 有 时 产生 自由 基 (free radical) 及 过 氧化 氢 , 它 是 很 活
牙 的 化 学 试剂 ,可 以 破坏 细胞 的 结构 。 为 了 免 于 被 这 些 副 产物 所 破坏 ,细胞 将 这 些 反 应 集中 到
小 的 由 膜 包围 的 过 氧化 物体 之 中 。

| 2 一 0. 5pm | 2 一 0. 5pm

图 3-12 溶 酶 体 及 过 氧化 物体

(六 ) 乙 醛 酸 体

在 油料 植物 细胞 中 存在 一 种 特 化 的 细胞 器 , 它们 含有 很 高 浓度 的 乙 醛 酸 循环 (glyoxylate
cycle) 的 酶 类 (主要 是 异 柠檬 酸 裂 解 酶 及 苹果 酸 合成 酶 ) 。 乙 醛 酸 循环 是 油料 植物 所 特有 的 一
条 代谢 途径 , 当 种 子 萌发 时 可 将 贮存 的 脂肪 转化 成 碳水 化 合 物 。

过 氧化 物体 、 溶 酶 体 和 乙 醛 酸 体 有 时 总 称 之 为 微粒 体 (microbodiss ) 。
(七 ) 浅 ;

植物 细胞 不 含 溶 酶 体 , 它 们 的 液 泡 (vacuole) 能 执行 类
似 的 降解 反应 。 幼 嫩 植 物 细胞 含有 许多 小 液 泡 , 由 单 层 膜
形成 ,成 熟 细 胞 中 央 由 小 液 泡 融合 成 一 个 大 液 泡 。 液 泡 膜
(tonoplast) 能 调节 离子 和 代谢 物 进 入 液 泡 ( 图 3-13)。 在 有
些 植物 中 液 泡 内 含有 高 浓度 的 色素 ,如 花 青 素 (an-
thothyanin ) 黄酮 类 (carotinold ) 使 玫瑰 、 葡 萄 等 花 果 具有
红 、 紫 \ 蓝 、 黄 等 各 种 颜色 。

图 3-13 液 泡 结构 的 示意 图

三 细胞 骨 如

细胞 质 并 不 像 过 去 所 了 解 的 那样 是 一 小 红 溶 液 ( 胞 液 ), 而 具有 非常 复杂 的 结构 。 由 于 细胞
生物 学 和 生物 化 学 研究 方法 的 日 至 完善 , 现 已 证 明 , 细 胞 质 中 除 含 有 线粒体 ,高 尔 基体 .内 质 网
等 细胞 器 之 外 ,还 有 一 个 组 成 细胞 质 的 重要 结构 , 即 细胞 骨架 (cytoskeleton ) 。 研 究 表明 , 一切
真 核 细 胞 中 都 存在 细胞 骨架 ， 绎 胞 肯 积 可 以 使 细胞 形状 稳定 ， 使 细胞 质 组 织 化 ,并 且 能 产生 运
动 (motility ) 。
细胞 骨架 由 三 三 部 分 成 分 组 成 : 即 微 丝 (microfilament) 系 统 、 微 管 (microtubule 中 间
工 微 管 2 纤维 (intermediate filament) 系 统 ( 图 3-14) 。 我们 分
直径 别 讨 论 如 下 :

2. 肌 动 蛋白 丝 (一 ) 微 丝 系统
nm 微 丝 由 肌 动 蛋白 (actin)、 肌 球 和 蛋白 (myosin) 和
和 -本 直 & 二- 肌 动 蛋 自 结合 蛋白 Cactin-bindiag protein , 简称
人 10 nm ABP) 组 成 . 肌 动 蛋白 于 1942 年 由 Straub 在 肌肉 细
胞 中 发 现 。 它 的 单 体 是 一 个 构 哆 分 子 , 称 为 G-actin，，

人

59

图 3-14 细胞 骨架 的 示意 图

分 子 量 为 42kD, 由 375 个 氨基 酸 组 成 。1990 年 Kabsch 等 用 入 光 街 射 技术 测 出 了 它 的 晶体 结
构 。 它 的 分 子 由 2 个 结构 域 (structural domain) 组 成 ,每 个 结构 域 又 可 分 成 2 个 亚 结构 域 ,中 间
有 一 个 裂隙 ,其 中 可 以 结合 ATP。 许 多 G- 肌 动 蛋白 分 子 在 KC1 存在 时 可 以 聚合 成 纤维 状 的 也
肌 动 蛋白 ,或 称 为 肌 动 蛋白 丝 Cactin filament), 亦 即 微 丝 。 微 丝 赋予 细胞 以 比较 坚韧 的 结构 , 常
称 之 为 应 力 丝 (stress fiber ) ， 从 而 可 以 使 细胞 具有 稳定 的 结构 。
让 肌 动 蛋白 的 基因 称 为 act 基因 ,目前 已 经 有 100 多 种 act
风 b 基因 的 核 苷 酸 序列 测定 完成 ,包括 养 椎 动物 ` 昆 虫 原 生动 物 、
( 镶 。。 植 物 、 漠 类 和 真菌 的 act 基因 。 这 些 基因 是 四 营 枉 军 的 ,研究
《和 表明 每 1 亿 年 1 个 氨基 酸 才能 产生 1 次 突变 。 根 据 这 100 多
儿 SSNJAJS 种 动 植物 act 基因 核 苷 酸 序列 或 肌 动 蛋白 氨基 酸 序列 ,可 以
朴 S 吕 起 给 出 生物 的 进化 树 \ 图 3-15)。
肌 球 蛋白 (myosin) 是 肌 动 蛋白 丝 的 马达 蛋白 (motor
protein) ,马达 蛋白 具有 ATP 酶 活性 ,可 使 ATP 分 子 的 化 学
忆 。 1 员 动 各 白 的 二 维 结构 ”能 直接 转化 成 机 械 能 做 功 , 推 动 肌 动 蛋白 丝 运动 * 肌 球 蛋 白 的
分 子 量 为 460kD, 由 2 条 重 链 和 4 条 轻 链 组 成 ,具有 ATP 酶
活性 。 电 子 显微镜 显示 肌 球 蛋 白 分 子 有 两 个 圆 形 的 头 部 和 一 个 长 的 尾部 < 男 3-T6)。 肌 球 蛋 白
的 晶体 结构 已 于 1993 年 由 Rayment 等 测定 函 来 ” 评 多 古物 的 航 球 蛋白 基因 (pgo gene) 如 本

母 、. 盘 基 网 柄 菌 等 的 肌 球 蛋白 基因 的 核 苷 酸 序列 也 已 经 测定 出 来 (图 3-17) 。

1

图 3-16” 肌 球 蛋 白头 部 的 三 维 结构

soltu
a act Oxyfa
act2 pe&l act1 Soybn act Oxyno
act1 dauca act1 Soltu doo)
act2 dauca act1 orysa (Go0) act eupcr
act3 Soybn act1 arath act2 trybb
归 王 ， acta human act7 soltu act2 soltu Ge act1 trybb
act1 maize actz
N act2 orySa act7 orySa actt
human actSAA 讶 act3 orysa 了
acte xenl acth hu act volca act
man 二
act2 xentr actm halro G7.8) act achbi
act1 xenla (oo0) actm stycl act1 phyin
actc human act1 naefo act2 0
act2 caeel T actm stypl
act4 caeel
aa act enthi
act1 oncvo 他 力
act2 oncvo 40 ai
7 冯 taeso 一 一 997) 99.5) 1 phypo
ab jgtb xenbo~actcyPca 8 一 7 act1 acaca
actb human 3 和 有
actb ansai n act schpo 而 和 守 人
actg human ct 上 /| 人 act2 absgl dicdi
act3 bommo 8 dicdi
act2 .drome act4 artsx actm pisoc
act4 drome
act3 st 86.
要 act thela
二 加 ydal acanal ac emen
act2 artsx 了 strpu
act1 artsx act1 bommo
act5 drome act yeast actkiula
act3 drome act2 strfn act1 strfn

图 3-17 动物、 植物、 真菌 中 的 肌 动 蛋白 基因 的 进化 树

动物 中 的 肌 动 蛋白 结合 蛋白 (ABP) 已 发 现 了 多 种 ,如 原 肌 球 蛋 白 (tropomyosin)、. 肌 钙 蛋
白 (troponin), 肌 动 蛋白 丝 . 肌 球 蛋白 及 各 种 ABP 在 细胞 中 构成 一 个 复杂 的 网 络 系统 ( 肌 动 蛋
自 骨 架 actin cytoskeleton) ,维持 细胞 所 特有 的 结构 ,并 且 可 以 进行 运动 ,如 变形 虫 运 动 . 粘 菌
的 穿梭 运动 、 植 物 细胞 的 胞 质 流动 等 ,都 是 由 于 肌 动 蛋白 丝 与 肌 球 蛋白 的 相互 作用 引起 的 。

我 们 于 1963 年 在 南瓜 、 烟 草 中 发 现 肌 动 球 蛋 白 (actomyosin) 的 存在 ,并 且 具 有 ATP 酶 活
性 。 以 后 ,研究 证 明 植 物 细胞 中 普遍 存在 肌 动 蛋白 和 肌 球 蛋白 ,与 动物 完全 相同 。

《二 ) 微 管 系统

微 管 系统 由 微 管 (microtubule) 及 微 管 结合 蛋 自 (microtubule associated protein, 简称
MAP ) 组 成 。 微 管 是 1964 年 由 Porter 等 用 电子 显微镜 发 现 的 。 微 管 的 直径 为 25 nm, 它 是 微 管
蛋白 (tuebulin)a 亚 基 与 8 亚 基 的 聚合 体 ， 中 空 管状， 每 圈 由 13 个 亚 基 组 成 。 微 管 蛋白 分 子 量 为

5 绽 D， 在 体外 紫杉醇 (taxol) 可 促进 征管 蛋白 的 孙 合 .在 MAP 中 现 已 发 现 3 种 马达 蛋白 , 即 力
醒 本 Ciein) : 动 重 自 (inesin) 和 动力 看 向 ttymarrin) . 前 二 种 具有 ATP 酶 活性 ,后 一 种 具有
GTP 酶 活性 。 力 蛋白 是 Gibbons(1965 年 ) 从 海胆 精子 、 衣 藻 鞭 毛 中 发 现 的 , 它 是 构成 鞭毛 或 纤
扎 的 主要 成 分 。 官 的 分 子 量 极 大 , 约 为 500kD.。 近年 在 真 核 细胞 的 细胞 质 中 发 现 了 胞 质 力 蛋白
(cytoplasmic dymiein)。 动 蛋白 是 Vale(1989 年 ) 从 动物 脑 细胞 中 发 现 的 ,分 手 量 也 很 大 , 约 为
400KD。 最 近 , 它 的 晶体 结构 也 已 测定 出 来 ,很 像 肌 球 蛋白 ,也 具有 画 个 头 部 和 一 个 尾部 。 动力
蛋白 是 Vallee(1989) 发 现 的 ,与 力 蛋 白 和 动 蛋 白 不 同 , 它 具 有 GTP 酶 活性 , 分子量 为 100kD。
这 三 种 马达 蛋白 都 可 以 推动 细 蛋白 颗粒 沿 着 微 管 进行 正 向 或 反 向 的 运动 ,在 神经 细胞
二 5 全

的 长 距离 物质 运输 中 起 着 非常 重要 的 作用 。 上 面 介 绍 的 微 管 蛋白 及 其 马达 蛋白 的 基因 都 已 经
克隆 ,并 测定 了 核 苷 酸 序列 。

(三 ) 中 间 纤 维系 统

中 间 纤 维 (IF) 是 一 种 直径 介 于 微 丝 与 微 管 之 间 的 细 丝 状 网 络 系统 , 它 的 直径 为 10 nm。 组
成 IF 的 单 体 有 许多 种 ,其 中 一 种 称 为 波状 蛋白 (vimentin) ,分 子 量 约 为 57 kD。 波 状 蛋 和 白 丝 常
位 于 细胞 核 的 周围 ,其 功能 是 将 细胞 核 固定 在 细胞 质 的 中 央 ; 另 一 种 正 的 单 体 为 角 和 蛋白 (ki-
ratin ) ,分 子 量 为 55 kD。 它 们 的 功能 可 能 是 将 横 纹 肌 的 忆 线 (2 disc) 固 定 在 该 处 。 在 植物 细胞
中 杨 澄 等 (1992) 发 现 也 存在 角 和 蛋白 组 成 的 中 间 纤 维 。 动 物 神经 元 (neuron) 中 存在 三 种 正 的 蛋
白质 亚 基 , 其 分 子 量 分 别 为 70kD,150kD 和 210kD, 它 们 赋予 伸 长 的 神经 元 细胞 以 刚性 。

四 .细胞 质 膜

在 细胞 质 的 外 面 被 一 层 生 物 膜 包围 ,这 层 生 物 膜 称 为 质 膜 (plasma membrane)。 质 膜 也 是
细胞 与 其 它 细胞 相 接触 的 外 表面 。 它 由 脂 双 层 (lipid bilayer) 组 成 。 在 质 膜 上 含有 各 种 内 在 和 蛋
白 和 跨 膜 蛋白 (transmembrane proteins ) 。 在 电子 传递 链 中 合成 ATP 的 ATP 酶 (ATPase) ,就
是 定位 在 质 膜 上 的 跨 膜 蛋白 , 它 在 ATP 的 合成 并 供应 细胞 以 能 量 上 是 非常 重要 的 膜 蛋 白 。 在
质 膜 上 有 许多 运输 蛋白 (transporter) ,它们 能 把 营养 物 运输 到 细胞 内 部 ,并 将 产生 的 废物 运送
到 细胞 之 外 ,对 维持 细胞 的 代谢 起 着 重要 的 作用 。

质 膜 上 有 许多 离子 通道 (ion channel) ,能 使 无 机 离子 通过 生物 膜 。 离子 通道 的 专 一 性 很 强
(图 3-18) 。

胞 外 空间 双 蛋 白

细胞 质

3-18 ” 质 膜 结构 的 示意 图

在 质 膜 上 还 存在 许多 信和 号 受 体 (signal receptor) , 它 能 接受 外 界 的 信号 分 子 (signal), 如
光 、 热 .触觉 ,味觉 嗅觉 ,神经 递 质 等 。 当 外 界 的 刺激 传导 到 受 体 上 , 受 体 即 将 该 信号 (或 配 体
ligand) 转 导 到 细胞 内 的 通道 ,使 通道 开放 , 允许 大 量 离子 通过 。 在 信号 转 导 中 最 重要 的 是 神经
的 信号 转 导 (signal transduction) 。 乙 酰 胆 碱 (acetylcholine , 简称 ACh) 是 一 种 重要 的 神经 递 质
(neurotransmitter)， 它 可 以 将 信和 号 传递 给 乙酰 胆 碱 受 体 (ACh receptor) 。 当 动 物 受 到 外 界 的 刺
激 如 电 刺 激 时 ,刺激 的 信号 即 通过 神经 细胞 (神经 元 neuron) 中 的 ACh 传递 到 ACh 受 体 虞 引
起 az 的 释放 ,于 是 肌肉 即 发 生 收 缩 。 在 动物 细胞 的 免疫 系统 中 , 当 外 来 的 组 菌 .病毒 或 蛋白
质 作为 抗原 进入 细胞 后 , 即 被 细胞 的 特殊 受 体 识别 出 来 ,开动 扳机 产生 抗体 (antibodyj、 信和 号
转 导 在 生命 过 程 中 起 着 极其 重要 的 作用 。 有 ， ”现代 生物 学 中 信号 转 时 的 研究 硕 坟 二 各
热点 课题 。

近年 来 发 现在 细胞 的 质 膜 下 面 还 存在 一 个 膜 骨架 (membrane skeleton) 结 构 。 动物 的 红 细
胞 如 果 在 低 渗 溶 液 中 胀 破 , 血红 蛋白 全 部 流出 之 后 ， 即 剩 下 一 个 血 影 细 胞 (ghost) , 即 血 红细胞
空 帝 。 在 血 影 细 胞 的 质 膜 下 面 发 现 了 一 些 特殊 蛋白 质 , 它 们 是 ; 血 洒 生 让 (spectsin)、 带 3 蛋白

58 = 一 一

(band 3 protein)、 肌 动 蛋白 (actin )、 锚 蛋 白 (ankyrin) 和 全 1 蛋 1 蛋白 .用 电子 显微镜 及 胶体 金 技术
证 明 ,在 红细胞 的 其 膜 下 面 存在 一 膜 表 架 网 络 。 这 个 膜 骨架 结构 与 细胞 骨架 有 紧密 的 联系 ,在
生命 活动 中 起 重要 作用 。 现 在 业已 证 明 , 除 红细胞 以 外 ,其 它 细胞 ,如 果 蝇 以 及 植物 ( 短 豆 表皮
细胞 ) 中 也 存在 有 膜 骨架 蛋白 和 膜 骨架 结构 。 膜 骨架 是 真 核 细胞 的 一 个 重要 结构 。

五 、 细 胞 的 基本 功能

细胞 是 动 植物 和 微生物 的 基本 单位 , 它 执 行 这 些 生物 的 基本 功能 .我 们 不 但 要 了 解 细胞 的
结构 ,而 且 要 了 解 它 们 的 功能 , 才 真 正 了 解 细胞 的 全 貌 。 下 面 我 们 扼要 地 讨论 细胞 的 一 些 主要
的 功能 。

(一 ) 细 胞 的 分 裂 Ccell division )

细胞 分 裂 包括 细胞 核 分 裂 和 细胞 质 分 裂 两 部 分 。 在 真 核 细 胞 中 细胞 核 分裂 称 为 有 丝 分 裂
(mitosis) 。 有 丝 分 裂 分 为 4 个 时 期 , 即 前 期 (prophase)、 中 期 (metaphase)、 后 期 (anaphase) 和
末期 (telophase)。 在 前 期 细胞 核 中 分 散 的 染色 质 首先 浓 缩 成 染色 体 , 每 个 染色 体 又 等 分 为 两
个 染色 体 。 中 期 时 在 细胞 质 中 形成 纺锤 体 , 染色体 排列 在 中 间 的 赤道 板 上 。 后 期 时 两 套 染色 体
分 别 向 两 极 的 中 心 体 移动 。 末 期 时 到 达 两 极 的 染色 体 分 别 形 成 两 个 子 细胞 的 核 , 重新 产生 核
膜 , 将 染色 质 包装 起 来 。 纺 锤 丝 是 由 微 管 组 成 的 。 染色 体 向 两 极 的 运动 靠 微 管 及 其 马达 和 蛋白
< 动 蛋 自 ) 的 相互 作用 进行 。 由 此 可 见 ， 细胞 骨架 在 有 丝 分 裂 及 减 数 分 要 中 起 著 重要 作用 。 近来
还 有 证 据 表明 ， 肌 动 蛋白 丝 和 肌 球 蛋白 在 有 丝 分 裂 过程 中 也 起 着 较 重 要 的 作用 。

(二 ) 胞 质 分 裂 (cytokinesis )

动物 细胞 在 有 丝 分 烈 后 在 细胞 的 中 央 形成 一 个 收缩 环 (contractile ring) ,将 一 个 细胞 分 列

成 两 个 子 细胞 (daughter cells) ,这 个 过 程 称 为 胞 质 分 烈 。 现 已 证 明 : 胞 质 分 裂 是 由 于 细胞 中 央
出 现 的 须 动 腹 白 丝 ( 微 丝 ) 进行 收缩 ,将 母 细胞 平均 分 制 成 两 个 子 细胞 。

植物 细胞 与 动物 不 同 , 它 是 在 有 丝 分 裂 后 于 细胞 质 的 中 央 形成 一 个 成 膜 体 (phragmoplast)，
将 两 个 子 细胞 分 开 。

(三 ) 细 胞 运动 (cell motility)

动物 的 精子 . 衣 藻 (CHlaxzydoxozas) 细 胞 都 具有 鞭毛 (flagellum) 、 草 履 虫 (Pauzyrazazeczzzzz )
“这 面 具有 许多 纤毛 (cillium) ,它们 依靠 这 些 鞭 毛 或 纤毛 的 摆动 ,使 这 些 原 生动 物 可 以 在 水 中 自
由 泳 动 。 凌 毛 和 纤毛 的 运动 都 是 靠 这 些 细胞 器 中 的 微 管 系统 进行 的 。 用 电子 显微镜 可 以 观察
到 纤毛 或 鞭毛 的 横断 面 上 排列 着 一 圈 微 管 , 外面 是 9 个 成 双 的 微 管 , 中 间 是 2 个 单个 的 中 心 微
管 ,共同 形成 “9 十 2? 。 微 管 与 其 马达 即 力 蛋白 相互 作用 而 使 纤毛 或 鞠 毛 运动 。 编 色
动 植物 微 管 蛋白 和 力 蛋 白 的 基因 的 核 苷 酸 序列 已 经 测定 出 来 。

:动物 的 肌肉 收缩 (muscle contraction ) 是 一 种 特 化 的 细胞 运动 。 热 行 肌肉 收缩 的 肌 小 节
Gsarcomere) 细 胞 中 含有 规则 排列 的 肌 动 蛋白 丝 ( 细 丝 ) 和 肌 球 蛋白 丝 ( 粗 丝 ): Huxley(j1969) 根
据 他 对 横 纹 肌 结 构 电 子 显 微 镜 的 大 量 研究 ,提出 了 一 个 著名 的 肌 丝 滑动 模型 (sliding Hiamnent
model)。 他 认为 肌 球 蛋白 头 部 与 肌 动 蛋白 丝 上 的 肌 动 蛋白 分 子 接触 后 ,利用 头 部 的 移动 ,推动
肌 动 蛋白 丝 产 生 运动 后 来 ,大 量 研究 发 现 除 肌肉 外 ,动物 小 肠 壁 的 刷 状 缘 (bruch border)、 白
细胞 血小板 (platelet)、 成 纤维 细胞 .精子 等 多 种 非 肌 细 胞 ,都 有 类 似 肌 肉 收缩 的 运动 和 类 似
肌 丝 滑动 模型 的 分 子 运动 机 理 。 例 如 , 小肠 的 刷 状 缘 细胞 中 排列 有 整齐 的 肌 动 蛋白 丝 ,依靠 这
些微 丝 刷 状 缘 可 以 不 停 地 运动 ,促进 小 肠 吸 收 营养 物 。 动 物 精子 头 部 的 顶 体 (acrosome) 中 含有

59

大 量 肌 动 蛋白 单 体 , 当 授 精 时 这 些 单 体 迅 速 聚合 成 肌 动 蛋 日 丝 ， 从 而 将 精 予 的 细 用 区 证 。 拓 人
胞 中 ,因此 , 顶 体 中 的 肌 动 蛋白 在 授精 作用 中 起 着 极其 重要 的 作用 。 /

植物 细胞 的 运动 很 多 也 类 似 肌 肉 收缩 , 靠 细胞 中 的 肌 动 蛋白 丝 及 肌 球 蛋白 的 相互 作用 ,如
丽 藻 C(Nitella) 节 间 细 胞 中 的 细胞 质 流 动 (cytoplasmic streaming) ,各 种 植物 花粉 管 中 的 细胞 质
流动 ,都 是 由 于 细胞 中 的 肌 动 蛋白 丝 与 肌 球 蛋白 相互 作用 的 结果 。

最 近 的 研究 结果 表明 ,有 些 细胞 运动 ,如 伸 出 (protrusion) 只 依靠 肌 动 蛋白 单 体 聚合 成 肌
动 蛋白 丝 , 就 可 以 推动 细胞 向 前 运动 。

最 近 两 年 关于 细胞 运动 的 研究 有 了 很 大 的 突破 。Spudich(1994) 和 柳 田 敏 雄 (Yanagida，
1994) 分 别 采 用 光 钳 Coptic trap) 技 术 研究 单个 肌 球 蛋白 头 部 所 产生 的 运动 ,取得 成 功 。 他 们 将
肌肉 的 单个 肌 动 蛋白 丝 的 两 端 用 光 钳 固定 在 塑料 小 球 上 ,将 肌 球 蛋白 一 个 头 部 与 肌 动 蛋白 单
体 接 人 触 ,在 生理 条 件 下 ,用 非常 灵敏 的 光电 二 极 管 (photodiode) 装 置 ,测量 肌 球 蛋白 推动 肌 动
蛋白 丝 所 产生 的 力 和 所 移动 的 位 移 。 他 们 两 个 研究 组 所 得 的 结果 基本 相同 。 单 个 肌 球 蛋白 头
部 可 以 产生 3 一 4pN 的 力 (1 个 牛顿 N 等 于 10"pN) ,并 使 肌 动 蛋白 丝 移 动 11 nm 的 距离 。 这 项
研究 使 我 们 能 从 分 子 水 平 了 解 动 植物 的 细胞 运 动 ， 同时 在 物理 学 上 细胞 运动 的 研究 水 平 使 生
物力 学 (biomechanics) 取 得 了 很 大 突破 。

(四 ) 物 质 的 运输

细胞 还 有 运输 物质 如 蛋白 质 或 其 它 分 子 ) 的 功能 ,特别 是 距离 较 远 的 时 候 , 靠 简单 的 扩散
作用 不 能 达到 所 需要 的 速度 。 例 如 ,动物 神 绎 双 元 Cneuron) 细 胞 结构 很 复杂 ,在 它 的 细胞 体 (cell
body) 上 有 一 企 突 触 (axon) , 它 是 一 个 很 长 的 神经 纤维 ,可 以 传递 神 动 (impulse), 它 的 长 度 从
lmm 到 1 m 不 等 ， 蛋 自 质 只 能 在 细胞 体 中 合 减 ， ,神经 末梢 所 需要 的 蛋白 质 必 须 沿 着 突 触 运输
四 transport)。 蛋 白质 浓 灾 和 运 辆 的 适度 是 郝 较 快 的 ;大 绝
相当 于 每 天 30 cm ,或 者 说 每 秒 3 wpm。 重 曰 质 分子 ( 主 要 是 乙酰 胆 碱 酯 酶 、 膜 蛋白 和 神经 纤维
Cneurofilament 亚 基 ) 可 以 从 神经 元 的 细胞 体 运 送 到 突 触 的 末端 ,并 且 可 以 反 向 运输 。 突 触 运
输 是 依靠 突 触 中 的 微 管 进行 的 ,蛋白 质 由 马达 蛋白 (如 动 蛋 白 ) 帮 助 沿 着 微 管 的 表面 运行 . 突 触
运输 受 Ca 离子 的 调节 。 突 触 运 输 是 目前 神 纤 ai

和 (五 ) 信 和 号 转 导
信号 转 导 CSiEnal transduction) 是 生物 的 一 种 重要 功能 。 生物 生存 的 环境 中 有 许多 种 信
号 , 如 光 、 气 味 (Codorant) 口味 (taste)、 神 经 递 质 (neurotransmitter) 激素 (hormane) 等 ,细胞
二 -对 这 些 信号 非常 敏感 ,能 做 出 迅速 的 反应 .例如 ,细菌 和 单 细 胞 藻类 遇 到 营养 物质 ,能 朝向 营养
物 而 运动 , 称 为 趋 化 性 (chemotaxis)。 动 物 的 视觉 细胞 能 感受 光 的 信和 号 而 做 出 各 种 反应 , 这些
过 程 都 属于 信和 号 转 导 。

蛋白 的 < 下 甘 又 与 细胞 内 的 效应 物 (effector) 相 互 作 用 ,效应 物 是 各 种 靶 Ctarget) 如 和 离子
通道 (ion channel), 效 应 物 蛋 白 能 动员 第 二 信使 (如 Ca…)， 引起 细胞 内 特殊 的 作用 。 信和 号 转 导
过 程 可 以 简单 地 表示 如 图 3-19。

在 信号 转 导 的 研究 中 以 哺乳 动物 眼球 的 视网膜 的 杆 状 细胞 (rod cell) 的 研究 最 为 深入 。 杯
状 细 胞 是 细 而 长 的 细胞 ,直径 1 sm, 长 40 pm。 杆 状 细胞 上 存在 光 受 体 , 即 视 紫 红 和 蛋白 |
trhodopsin) , 它 是 一 种 跨 膜 蛋 白 , 分 子 量 为 40kD , 由 7 股 c- 螺 旋 组 成 ,其 发 色 团 (chromophore) |

60

外 界 信和 号
( 光 , 气味、 口味 等 )
jcr

有 体
(7 股 螺旋 组 成 的 跨 膜 蛋白 )

G- 和 蛋白 (T.-GITP)
效应 物
(细胞 内 的 靶 : 酶 、 离 子 通道 )

3-19 ”信号 转 导 过 程

为 11-cis- 视 黄 醛 (retinal) 。 杆 状 细胞 的 转 导 和 蛋白 (transducin )
就 是 G- 和 蛋白 , 它 是 GTP 结合 蛋白 。 当 光 激 发 视 紫 红 有 蛋白 后 ，
即使 G- 蛋 白 发 生 构 象 变化 ,导致 G- 蛋 白 的 解体 ,%- 亚 基 从 P，
儿 亚 基 上 解 离 下 来 ,随后 活化 的 - 亚 基 (T.-GCTP) 结 合 到 磷酸
二 酯 酶 (phosphodiesterase,PDE) 上 ;可 以 下 式 表示 :
R 芋 R' 一 -T.-GTP 一 -PDE"| ER
5 -GMP-~ 关 闭 的 通道
在 视觉 刺激 的 信号 转 导 过 程 中 ,信息 流 是 从 光 激 发 的 视
紫红 蛋白 CR” ) 传 到 转 导 蛋白 ( 即 G- 和 蛋白 ,T-GCTP) ,然后 再
传 到 磷酸 二 酯 酶 (PDE*),PDE* 水 解 环 式 GMP (cyclic
GMP) 为 5 -GMP , 光 诱 导 引 起 cGMP 浓度 下 降 , 就 使 阳离子
通道 关闭 。 阳 离子 通道 在 张 开 时 可 使 10 万 以 上 Na- 离子 通

过 , 当 吸 收 1 个 光子 (photon) 后 ,Na 离子 流 即 被 阻 断 。 这 个 极其 显著 的 放大 机 制 是 什么 呢 ? 在
黑暗 中 质 膜 上 的 阳离子 通道 靠 cGMP 使 之 张 开 . 光 激发 的 视 紫 红 恒 白 扳 动 一 个 开关 (switch)，
这 个 开关 就 是 磷酸 二 酯 酶 (PDE) ,结果 就 使 cGMP 水 解 5 -GMP ,阳离子 通道 力 关 闭 . 实质 上 ，
质 膜 是 一 个 环 式 CMP 的 电极 ,可 以 开 闭 。

开关 机 制 。

在 嗅觉 的 信号 转 导 中 有 一 个 非常 类 似 的 离子 通道 起 作用 ,但 是 它 靠 环 式 AMP(McAMP) 起

颜色 的 识别 是 通过 视网膜 圆锥 (cone) 完 成 的 ,圆锥 受 体 有 吸收 蓝光 、 绿 光 及 红 光 三 种 颜色

的 受 体 。 圆锥 细胞 的 光 受 体 也 是 7 股 跨 膜 蛋白 ,含有 11-cis- 视 黄 醛 作为 发 色 团 。 位置 靠近 视 黄
醛 分 子 的 受 体 , 蛋白 质 氨基 酸 中 的 非 极 性 残 基 被 极 性 残 基 取代 时 ,其 最 大 吸收 峰 即 从 蓝光 向 红
光 移 动 ( 约 10 nm)。

人

参考 文 南

“ 汪 梦 仁 , 薛 绍 白 , 柳 惠 图 . 细胞 生物 学 . 北京 :北京 师范 大 学 出 版 社 ,1990.

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〈 净 隆 飞 )

61

第 四 章 DNA 的 结构

第 一 节 ，DNA 结构 的 多 样 性 和 动 态 性

< 种 豆 得 豆 , 种 瓜 得 瓜 是 古 时 人 们 对 遗传 现象 的 概括 。 经 过 长 时 期 的 探索 ,人 们 歼 于 获知
生物 的 遗传 特性 是 由 一 种 称 为 基因 的 遗传 因子 决定 的 ,而 基因 则 线 性 地 分 布 于 染色 体 上 ， 以 后
又 进而 证 明光 色 体 是 由 核酸 (主要 为 DNA) 和 蛋白 质 组 成 的 。 但 遗传 物质 是 DNR 还 是 改 白 质
的 争论 仍 在 继续 . 1944 年 ,Avery 等 的 肺炎 球菌 的 转化 实验 指出 遗传 物质 应 是 DNA 司 952 年 ，
Hershey 和 Chase 的 工 2 喉 菌 体 对 大 肠 杆菌 的 感染 试验 进一步 证 实 了 这 一 点 ,1953 年 , Watson
和 Crick 提出 了 DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 , 它 使 许多 遗传 现象 从 分 子 水 平 上 得 到 了 充分 和 合理 的
解释 ,成 为 分 子 生 物 学 发 展 中 的 一 个 里 程 碑 。 可 是 事物 总 是 发 展 的 ,人 们 在 以 后 的 研究 中 ,除了
证 实 双 螺 旋 模 型 的 正确 性 以 外 ,也 发 现 DNA 并 不 是 过 去 所 认为 的 那样 是 上 下 一 统 的 棒状 分
子 。DNA 双 螺 旋 结 构 并 不 是 完全 规整 的 , 它 的 构象 参数 是 随 核 苷 酸 序 列 的 不 同 而 在 一 定 范围
内 变化 的 。 以 后 随 之 又 发 现 了 Z-DNA 及 其 它 的 稀有 结构 等 。 各 种 实验 证 据说 明 DNA 结构 具
有 多 样 性 ,并 且 这 些 多 样 性 的 结构 还 会 相互 转变 ,它们 处 在 动态 中 ,这些 结 果 把 DNA 结构 研
究 推 向 新 的 高 度 。 在 此 同时 ,基因 表达 调控 的 研究 显示 ,DNA 序列 不 仅 与 编码 各 种 蛋白 质 有
关 , 也 与 其 调控 有 关 。 首 先 发 现 的 是 原核 生物 一 些 基 因 的 调控 是 通过 相应 蛋白 质 因 子 与 特定 的
DNA 序列 结合 实现 的 ,以 后 又 发 现 真 核 生物 的 基因 表达 虽然 更 为 复杂 ,但 也 是 通过 类 似 方 式
实现 的 ,复杂 的 生命 现象 需要 DNA 结构 具备 相应 的 多 样 性 ,很 难以 一 个 统一 结构 概念 来 说 明
DNA 的 各 种 功能 。

正 像 蛋白 质 结 构 那 样 ,人 们 也 常 把 DNA 结构 分 为 不 同 的 层次 一 一 一 级 结构 、` 二 级 结构 和
三 级 结构 。 一 级 结构 是 指 DNA 的 共 价 结构 和 核 苷 酸 顺 序 , 二 级 结构 是 指 一 定 或 全 部 核 苷 酸 序
列 所 形成 的 规律 性 结构 ,三 级 结构 是 指 染 色 体 DNA 所 具有 的 复杂 折 笃 状态 。 当 然 ,蛋白 质 和
DNA 的 结构 层次 间 并 不 是 完全 可 以 类 比 的 。

第 二 节 “多核 苷 酸 链
多 核 苷 酸 链 (polynucleotide chain) 是 核酸 CDNA 和 RNA)7 结 构 的 基础 。 它 是 由 核 苷 酸 通
过 3 ,5 -磷酸 二 酯 键 连接 成 的 线 型 大 分 子 。 核 苷 酸 是 多 核 苷 酸 链 的 结构 单位 。 由

核 苷 酸 由 三 部 分 组 成 ;成 糖 ,磷酸 和 碱 基 。 在 核 苷 酸 分 子 中 , 戊 糖 的 6- 半 缩 醛 羟基 与 碱 基 、
中 的 氧 ( 喀 啶 环 1 位 , 嘲 叭 环 9 位 上 的 氢 ) 失 水 缩合 成 N- 苷 键 而 形成 核 苷 , 核 苷 的 5 位 与 磷酸
通过 酯 键 形 成 5 - 核 昔 酸 (图 4-1) ,不 同 的 核 苷 酸 用 碱 基 第 一 个 字 来 命名 ( 表 4-1)。 核 苷 酸 分 子
的 碱 基 类 似 于 蛋白 质 氨基 酸 的 侧 链 ,它们 影响 着 所 形成 的 核酸 的 结构 和 功能 。

9 0 本 区 sa
了 N 2
0-P-0 守 NZ- 、CERAN HI 9 ce
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OH OH OH 也
磷酸 成 糖 碱 基
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OH OH OH OH
核 苷 5 - 核 苷 酸 胸腺 喀 啶 胞 喀 啶 ”” 尿 喀 啶 (RNA)

图 4-1 核 苷 和 核 苷 酸

暗 喧 和 厌 叭 都 是 含 氨 杂 环 化 合 物 , 具 弱 碱 性 , 分 子 所 含 的 闭合 共 罗 体 系 使 其 呈现 为 扁平
状 。 碱 基 难 深 于 中 性 水 溶液 中 ,它们 的 这 一 证 水 特性 附 DNA 的 结构 具有 重要 意义 , 碱 基 的 另
二 重要 特性 是 其 环 氨 及 所 含 的 官能 团 能 成 为 氢 键 的 供 体 或 受 体 。 在 DNA 分 子 中 ,一 定 的 碱 基
通过 这 些 氢 键 相 缔 合 ,这 对 DNA 作为 遗传 物质 具有 首要 意义 ，

表 4-1 核 苷 酸 的 组 成 和 名 称

核酸 核 苷 酸 (缩写 ) 核 苷 碱 ” 基
RNA 腺 苷 酸 (A,AMP) 腺 苷 腺 味 叭
鸟 苷 酸 (GC,GMP) 鸟 苷 鸟 味 叭

胞 苷 酸 (C,CMP) 胞 苷 胞 喀 啶

” 尿 苷 酸 (U,UMP) 尿 霸 尿 喀 喧

DNA 脱氧 腺 苷 酸 (A,dA,dAMP) 脱氧 腺 苷 腺 味 叭
脱氧 鸟 苷 酸 (G,dG,dGMP) 脱氧 鸟 苷 鸟 味 叭
脱氧 胞 昔 酸 (C,dC,dCMP) 脱氧 胞 苷 胞 喀 喧

脱氧 胸 苷 酸 (T,dT,dTMP) 脱氧 胸 苷 胸腺 喀 喧

注 : 核 苷 酸 现 已 成 为 包括 核糖 核 苷 酸 和 脱氧 核糖 核 苷 酸 在 内 的 类 名 。 在 核酸 分 子 中 ,它们 都 以 A,G,T,C 表示 # 在 游离
状态 号 脱氧 核糖 核 苷 酸 则 分 别 以 dA,dG,dT 和 dc 表示 。

多 核 华 酸 链 是 由 核 苷 酸 通过 3' ,5' -磷酸 二 酯 键 连接 成 的 很 长 的 线 型 分 子 (图 4-2) 。 在 多 核
苷 酸 链 中 ,交替 的 磷酸 和 2- 脱 氧 核糖 构成 了 分 子 的 骨架 , 碱 基 为 侧 链 。 不 同 多 核 苷 酸 链 的 骨架
是 相同 的 ,不 同 的 是 碱 基 的 种 类 和 排列 顺序 。 多 核 昔 酸 的 碱 基 可 简化 表示 如 图 4-2 的 右 方 ,也
可 缩写 为 pDGpCpTPA 和 pGCTA。 按 规定 ,多 核 苷 酸 链 以 连接 于 5 -羟基 的 磷酸 开始 ,以 脱氧 核
糖 的 3' -羟基 终止。
063

图 4-2 ”多核 苷 酸 链 片段
和 多 受 四 而 你 本 RN 而 项 和 是 外，

的 ,但 项链 ( 央 基 ) 是 下 水 的 ， 这 些 特点 规定 了 志 核 才 改 作 可 治 员 和
CgiaaaiguaueeiaLreeceiirIIOIIR 直人 全

第 三 节 DNA 的 双 螺 旋 结 构

50 年 代 初 ,关于 DNA 的 结构 可 说 已 积累 了 不 少 资料 ,Chargaff 对 DNA 碱 基 组 成 的 分 析
得 到 了 高 度 规律 性 的 结果 :虽然 不 同 来 源 DNA 的 碱 基 组 成 变化 很 大 ,但 腺 味 叭 核 苷 酸 的 数目
却 总 与 胸腺 喀 啶 核 苷 酸 相 等 , 鸟 味 叭 核 苷 酸 与 胞 喀 啶 核 苷 酸 相 等 , 即 A/T=G/C=1。DNA 纤
维 的 X 光 衍 射 图 指出 其 中 的 原子 排 布 沿 长 轴 存 在 0. 34 和 3.4nm 两 种 周期 性 ,这 提示 分 子 可
能 具有 螺旋 构象 .综合 这 些 , Watson 和 Crick 终于 在 1953 年 提出 DNA 的 双 螺 旋 结 构 模 型 .他
们 指出 ,DNA 是 由 两 条 反 平 行 的 多 核 背 酸 链 组 成 的 ,分 链 位 于 螺旋 的 外 缘 , 碱 基 则 堆积
于 螺旋 的 内 部 ,两 条 多 核 苷 酸 链 通过 碱 基 间 的 氢 键 相 结 合 ( 图 4-3)。

Watson 和 Crick 所 提出 的 DNA 双 螺 旋 结 构 的 特征 是 :

构成 DNA 的 两 条 多 核 苷 酸 链 的 磷酸 - 戊 糖 骨 架 盘 旋 成 直径 为 2 nm 的 双 螺 旋 , 由 于 脱氧
核糖 中 连接 碱 基 的 C1' 并 不 正好 处 在 螺旋 的 相对 位 置 上 ( 见 图 4-3) , 故 两 股 链 在 螺旋 轴 上 的 间
臣 并 不 相等 ,从 而 在 分 子 表面 形成 宽 罕 不 等 的 大 沟 (major groove) 和 小 沟 (minor groove) 。 双
股 多 核 昔 酸 链 上 的 碱 基 则 位 于 螺旋 的 内 部 ,大 沟 垂直 于 螺旋 轴 , 相 邻 碱 基 的 间隔 为 0. 34 nm
每 一 下 螺旋 含 10 bp( 以 后 从 溶液 中 测 得 的 数字 为 10. 5) ,其 轴 向 距离 为 3. 4 nm 每 一 下 螺旋 转
动 360" , 故 相 邻 碱 基 对 间 转 动 36"。

” 双 螺 旋 中 , 碱 基 的 配对 关系 是 严格 的 , 即 腺 嘎 叭 和 胸腺 喀 喧 配对 , 鸟 味 叭 和 胞 喀 喧 配对 , 碱
基 的 这 种 严格 配对 关系 基于 两 方面 的 因素 :一 是 形成 氢 键 的 基 团 在 空间 的 取向 ;二 是 碱 基 对 的
大 小 能 容纳 于 双 螺 旋 中 。 由 于 双 股 链 是 反 平 行 的 ,其 立体 化 学 取向 正好 相反 ,这 就 使 双 螺 旋 的

外 形 , 无 论 从 何 端 观察 都 相同 ,呈现 出 二 重 对 称 性 。 碱 基 的 上 述 配对 关系 称 为 Watson-Crick
对 (图 4-4)

64

一

小 沟

图 4-3 DNA 的 双 螺旋 结构
左 图 : 示 大 沟 小 沟 ;
下 图 : 示 碱 基 对 。

作为 遗传 物质 ,DNA 的 结构 是 稳定 的 。
链 的 许 水 交互 作用 是 形成 双 螺旋 结
构 的 一 个 重要 因素 ,能 力学 上 它 有 利于 螺旋
结构 的 稳定 。 在 双 螺 旋 结 构 中 , 碱 基 对 上 下 间
隔 0. 34 nm, 这 相当 于 葵 的 厚度 ,并 表明 碱 基
的 堆积 是 紧密 的 , 碱 基 间 存 在 着 包括 van der
Waals 力 在 内 的 堆积 力 。 碱 基 在 横向 则 由 氢
键 相 结 合 . 此 外 ,多 核 苷 酸 链 骨架 上 的 氧 原子
还 能 与 水 形成 氢 键 。 这 些 因 素 都 使 DNA 结
构 趋 向 稳定 化 。 双 螺旋 骨架 中 磷酸 基 的 氧 原
子 带 负电 荷 , 其 相 斥 作用 会 降低 螺旋 结构 的
稳定 性 .在 细胞 中 ,DNA 与 碱 性 的 组 蛋白 , 亚
精 胺 以 及 Mg 六 等 结合 ,这 抵 销 了 负电 荷 间 排 斥 作用 。
DNA 是 址 传 信息 的 载体 , 它 的 核 苷 酸 序列 不 仅 编码 各 种 蛋白 质 , 并 且 也 与 基因 表达 的 调
控 有 关 , 即 它们 能 为 一 些 蛋 白质 因子 所 识别 和 结合 。 员 在 认为 这 过程
的 ,因为 大 沟 比 小 沟 携 带 更 多 的 形成 氢 键 的 信息 (图 4-5) .图 中 的 圆圈 代表 螺旋 的 截面 ,大 于
65

4-5 碱 基 的 可 能 形成 氢 键 的 基 团 在 大 沟 小 沟 中 的 分 布

180 的 一 侧 表示 大 沟 , 另 一 侧 为 小 沟 。 在 大 沟 中 裸露 的 是 碱 基 对 顶部 的 基 团 ,不 同 的 碱 基 对 这
些 基 团 排列 的 次 序 不 同 ,从 而 也 就 制约 了 与 之 结合 的 蛋白 质 因子 的 结构 。 这 些 基 团 在 4 种 碱 基
对 中 的 顺序 为 ，

大 沟 ， A-T ，” 环 氮 ,氨基 , 酮 基 小 沟 : A-T ，” 环 氮 ， 酮 基
T-A ， 酮 基 , 氢 基 , 环 氮 IT-A ， 酮 基 ， 环 氮
G-C ，” 环 氮 , 酮 基 , 氨 基 c-L ， 环 氮 ,氨基 , 酮 基
C-G ”氨基 , 酮 基 , 环 氮 C-G ， 酮 基 , 氢 基 , 环 氮

从 上 不 难看 出 小 沟 中 显示 出 的 信息 要 少 些 。 蛋 白质 因子 沿 DNA 大 沟 形成 氢 键 的 可 能 性 较 沿 :|

小 沟 更 多 地 依赖 于 碱 基 序列 , 即 专 一 性 更 强 。 但 小 沟 对 DNA 的 功能 也 不 是 不 重要 的 ( 见 第 11
节 ) 。

DNA 双 螺 旋 结 构 的 建立 对 分 子 生物 学 的 发 展 无 疑 意义 重大 ,但 也 不 是 从 未 受到 挑战 ，
66

DNA 具有 双 螺 旋 结 构 的 最 初 证 据 来 自 DNA 纤维 的 和 射线 衍 射 实验 ,但 这 一 方法 在 当时
的 条 件 下 还 难于 确立 DNA 结构 的 细节 ; 以后, 分子 模型 的 建造 回答 了 多 核 苷 酸 链 根据 其 化 学
特征 可 以 折 生 成 怎样 的 三 维 结构 ,并 当 腺 味 叭 和 胸腺 喀 淀 及 乌 味 叭 与 胞 喀 啶 的 配对 关系 一
建立 时 ,一 种 与 立体 化 学 相符 的 规整 双 螺 旋 分 子 就 出 现 了 。 这 一 模型 不 仅 可 以 解释 DNA 的 碱
基 组 成 ,并 且 也 通过 多 核 苷 酸 链 上 碱 基 间 的 互补 关系 为 DNA 的 复制 提出 了 一 种 清晰 的 机 制 。
有 理由 可 以 认为 双 螺 旋 结 构 模 型 是 正确 的 。

不 过 ,多 年 积累 起 来 的 有 关 DNA 结构 的 实验 资料 只 可 能 认为 与 通过 分 子 模型 建立 起 来
的 双 螺 旋 结 构 相 一 致 。 因 为 DNA 的 序列 的 高 度 异 质 性 使 所 得 到 的 DNA 纤维 的 取向 难以 达到
能 提供 各 个 原子 定位 所 需 的 精确 度 , 这 使 人 们 不 能 像 蛋白 质 (例如 血红 和 蛋白) 那样 类 X 射线 衍
射 法 来 建立 确定 的 分 子 结构 .因此 ,长 时 间 来 虽 没 有 分 子 生 物 学 家 对 碱 基 配 对 的 双 螺 旋 模 型 提
出 重大 的 怀疑 ,但 亦 无 法 确证 DNA 是 右手 性 的 和 它 的 碱 基 配 对 确 是 通过 氧 键 结合 的 。 后 来 ，
有 机 化 学 家 终于 合成 出 了 具 确 定 核 苷 酸 序 列 的 寡 核 苷 酸 晶体 ,例如 ，

GGTATACC
CCATATGG

X 射线 衍射 分 析 证 明 , 它 确 是 长 期 来 所 认为 的 通过 碱 基 间 形成 氢 键 而 配对 的 双 螺 旋 结 构 。

DNA 的 结构 最 近 由 于 应 用 扫描 隧道 显微镜 (scanning tunnel microscope，STM) 而 得 到
了 进一步 的 证 实 。 扫 描 隧道 显微镜 是 近 几 年 发 展 起 来 的 一 种 用 于 研究 物质 表面 的 新 设备 。 它
利用 量子 隧道 效应 原理 ,将 原子 线 度 的 极 细 针 尖 在 接近 样品 处 (二 1 nmy) 扫 描 , 通 过 监测 样品
与 针尖 间 隧 道 电流 随 距 离 的 变化 从 而 获知 样品 表面 的 面 角 。 现 在 ,人 们 通过 STM 已 直接 观察
到 天 然 DNA 的 双 螺 旋 结 构 ,SITM 正在 成 为 研究 核酸 、 蛋 白质 结构 的 新 的 有 力 工 具 。

第 四 节 A-DNA 和 B-DNA 结构 的 多 态 性

在 溶液 中 ,DNA 一 般 为 B 型 ,但 当 水 合 的 B-DNA 脱水 ,或 由 于 加 入 乙醇 或 盐 而 使 水 的 活
度 降低 时 就 转变 为 A 型 。B-DNA 中 ,2- 脱 氧 核糖 的 构象 出 现 了 变化 从 而 使 同 股 多 核 苷 酸 链 中
相 邻 磷酸 基 间 的 距离 缩短 % 1 nm。 这 一 变化 使 每 臣 螺 旋 的 碱 基 对 数 由 B-DNA 的 10( 溶 液 中
为 10.5) 转 变 为 A-DNA 的 11。A-DNA 的 另 一 重要 差别 在 于 碱 基 对 在 螺旋 中 的 位 置 ,在 B-
DNA 中 , 碱 基 对 集中 于 螺旋 轴 ; 在 A-DNA 中 , 碱 基 对 向 大 沟 方 向 移动 了 约 0. 5 nm, 这 一 变化
的 结果 改变 了 B-DNA 的 外 形 和 沟 的 尺寸 (图 4-6)。

在 实验 室 中 ,从 互补 的 寡 核 苷 酸 获 得 的 DNA 晶体 由 于 制备 过 程 中 化 学 试剂 的 作用 而 呈
现 为 A-DNA.。 不 过 ,现在 还 不 清楚 ,细胞 中 是 否 存在 纯 的 A-DNA 片段 。 在 转录 过 程 中 , 在 .
DNA 单 股 上 合成 RNA 时 ,DNA 与 所 合成 的 RNA 形成 杂交 双 螺 旋 , 这 种 片段 可 能 是 A 型 ，
这 是 由 于 RNA 中 核糖 的 C2 羟基 强烈 趋向 于 采取 C3'- 内 式 构象 。 现 已 考查 过 的 RNA 双 螺 旋
也 采取 A 型 构象 。

除了 A-DNA,B-DNA 外 ，
DNA 。 这 一 现象 称 为 DNA 结构 上
是 其 中 之 一 。

DNA 结构 产生 多 态 性 的 原因 在 于 多 核 苷 酸 链 的 骨架 含 许多 可 转动 的 单 键 ,从 而 使 糖 环 可
采取 不 同 的 折 码 形式 和 昔 键 采取 不 同 构象 。 本

门 也 还 观察 到 了 其 它 的 、` 结 构 参 数 有 一 定 关 异 的 双 螺 旋
多 态 性 (polymorphism ) 。 即将 在 下 一 节 中 讨论 的 2Z-

67

图 4-6 B-DNA 和 A-DNA
右 侧 为 B-DNA, 左 侧 为 A-DNA。

多 核 音 酸 链 骨 架 含 有 许多 可 转动 的 键 (图 4-7), 但 实际 上 主要 的 转动 发 生 在 磁 酸 二 酯 刍
的 两 个 O 一 P 键 上 。 多 核 苷 酸 链 的 N- 苷 键 也 可 转动 ,从 而 使 糖 环 和 碱 基 处 在 不 同 的 空间 关系
中 ,两 个 极端 的 情况 是 反 式 和 顺 式 的 构象 (图 4-8) 。 在 反 式 构象 中 , 喀 院 碱 基 的 CO 基 ( 或 呆 叭
碱 基 的 喀 喧 部分) 远离 糖 环 ; 在 顺 式 构象 中 ,上 述 基 团 位 于 糖 环 上 方 。 在 DNA 中 , 反 式 较 顺 式

构象 远 为 多 见 。

) C4 ( 味 叭 )
Cz2( 喀 啶 )

核 苷 酸 单位

4-7 多核 苷 酸 链 中 的 可 转动 键

68

图 4-8 苷 键 的 反 式 和 顺 式 构象

DNA 中 的 脱氧 核糖 为 叶 喃 型 , 它 的 环 状 结构 由 《4 个 碳 和 1 个 氧 原子 构成 ,这 5 个 原子 不

是 共 平面 的 ,而 形成 不 同 的 折叠 形 式 。 图 4-9 列 出 的 是 常见 的 几 种 ,其 中 e 为 中 间 类 型 ,易于 转

变 成 其 它 三 种 。 在 a,b 和 d 中 , 氧 和 3 个 碳 原子 处 于 同一 平面 中 ,C2' 或 C3' 位 于 平面 的 上 方 或
下 方 。5C2 或 C3 位 于 5C5 同 侧 的 构象 称 为 内 式 , 位 于 相反 一 侧 的 称 为 外 式 。

C(5) C(5)

4

ES De 三 订 式 了 ce CC2 汪 = 有 二 63 性 5 外 式 GE 再 式
图 4-9 ”脱氧 核糖 的 一 些 构象
由 于 上 述 因素 的 差异 , 具 同 样 序列 的 DNA 即 呈 现 出 构象 上 的 多 态 性 ( 表 4-2) 。
A-DNA,B-DNA 和 Z-DNA 的 一 些 构象 参数 有 所 不 同 ( 表 4-2) ,其 外 形 也 呈现 出 差异 (图
4-12) 。

表 4-2 A-DNA,B-DNA 和 Z-DNA 的 一 些 结构 特性

A-DNA B-DNA Z-DNA
螺旋 方向 右手 性 右手 性 左手 性
每 圈 螺 旋 的 碱 基数 | 则 | 10 12
每 一 碱 基 对 的 上 升 距 离 0. 255 nm 0 3 057 是 十
螺 下 f 2. 8 nm 3.4 nm 3 4. 5 nm
碱 基 对 的 倾斜 度 20。 6。 7。
每 一 碱 基 对 在 螺旋 中 旋转 的 角度 38s = 二 60"( 每 二 不 二 聚 体 )
糖苷 键 的 构象 sa
脱氧 胞 喀 喧 核 苷 反 反 反 -一 一 一 一
脱氧 鸟 味 叭 核 苷 、 反 反 顺
糖 的 折 和 三
脱氧 胞 喀 啶 核 苷 C'-3- 内 式 C'-2- 内 式 C'-2- 珊 去
脱氧 鸟 嘎 叭 核 苷 Cs 内 式 C'-2- 内 式 C-3- 内 式
总 尺寸 短 而 宽 较 长 而 细 长 而 细
沟 的 尺寸
大 沟 细 而 深 宽 和 中 等 深 平 伏 于 螺旋 表面

小 沟 宽 而 浅 窄 和 中 等 深 很 秦 和 很 深

69

第 五 节 Z-DNA

在 DNA 双 螺 旋 构 象 中 ,最 使 人 感到 震惊 的 是 Z-DNA.ZDNA 是 Rich 及 王 惠 君 等 对 守 聚
核 苷 酸 d(CpGpCpGpCpG ) 进 行 X 射线 衍射 分 析 后 发 现 的 。Z-DNA 不 同 于 B-DNA, 它 是 左手
双 螺 旋 。 它 的 基本 重复 单位 为 叮 叭 - 喀 啶 一 核 音 酸 ， ,其 中 喀 啶 核 背 酸 中 的 苷 键 为 反 式 取向 ,而 味
聆 核 苷 酸 的 童 键 为) 顺 式 取向 。 在 右手 双 螺 旋 中 , 苷 键 的 构象 都 是 反 式 。 这 表明 味 叭 核 苷 酸 苷 键

构 型 的 不 同 产生 了 左手 双 螺 旋 。
与 B-DNA 相 比 ,Z-DNA 更 为 细 长 ,Z-DNA 中 ,每 一 碱 基 对 在 螺旋 轴 上 的 上 升 距离 为

0. 37 nm , 螺 距 为 4. 5 nm ,每 一 螺旋 圈 含 12 bp。 与 B-DNA 比较 ,Z-DNA 中 的 碱 基 对 平面 相对
于 螺旋 轴 转 动 了 180( 图 4-10)。 碱 基 对 平面 的 翻转 对 交 蔡 dCCC) 序 列 中 两 种 残 基 的 构象 产生

不 同 的 影响 。 在 这 一 过 程 中 , 胞 旷 啶 核 苷 残 基 整 个 转 劲 了 180-， 岛 呆

叭 核 苷 残 基 中 的 碱 基 则 绕 苷 键 转动 了 180", 其 结果 就 使 多 脱氧 核 苷 酸 主 链 的 走向 呈现 为 锯 肯

形 ( 图 4-11)。 产 生 这 一 差异 的 原因 已 由 分 子 模 型 得 到 说 明 : 核 苷 受到 的 空间 描

压 虽 然 较 轻 ,但 dG 和 dC 比较 ,后 者 难于 采取 顺 式 构象 。
一

图 上 10 B-DNA 向 Z-DNA 转变 中 碱 基 对 平面 的 翻转 图 4-11 Z-DNA 中 d(GC) 残 基 的 构象

2DNA 中 ,G-C 碱 基 对 并 非 对 称 地 位 于 螺旋 轴 附 近 , 它们 向 边缘 伸展 ,从 而 使 大 海外 凸 ，
小 沟 则 变 得 罕 而 深 ( 图 4-12) 。
CDNA 的 入 史 耻 主 链 的 伸展 程度 不 如 人 或 B-DNA。 汪汪 中 汪 窗子 (如 Na

由 于 GC 二 光 对 为 稳定 ,因此 , 含 交替 d(GC) 的 双 螺旋 短片 段 比 相应 的 dCAT) 玉
段 更 易 形 成 晶体 。 最 早 的 左手 性 DNA 晶体 就 是 由 交替 d(GC) 守 核 苷 酸 获得 的 ;随后 ,由 重 为
复杂 的 序列 如

CGCATGCG

GCGTACGC
也 得 到 了 完美 的 Z-DNA 晶体 。 现 在 认为 ， 在 适当 的 离子 条 件 下 ,任何 含 不 少 于 6 bp 的 交替 嘎
怜 - 喀 院 序列 都 能 形成 Z 型 片段 。 以 后 ,1985 年 ,X 射线 衍射 法 进一步 证 明 如 下 的 序列 ，

70

ATC G
G"5C TA G"C (m 指甲 基 化 )
也 能 形成 Z-DNA 晶体 。 这 说 明 ,如 胞 旷 啶 残 基

的 5 位 一 经 甲 基 化 (由 专 一 性 的 甲 基 化 酶 催
化 ) ,交替 味 叭 - 喀 喧 序列 就 不 再 构成 产生 Z-
DNA 的 必要 条 件 .我 们 现在 还 不 可 能 仅 靠 对 核
昔 酸 序列 的 孝 察 就 正确 地 指出 可 能 形成 Z-
DNA 的 区 段 。

现在 已 有 证 据说 明 Z-DNA 存在 于 天 然
DNA 中 。 应 用 针对 Z-DNA 的 抗体 已 可 鉴别 出
天 然 DNA 中 的 Z-DNA 区 段 。 但 细胞 中 所 存在
的 Z-DNA 的 量 至 今 仍 不 清楚 。 对 此 的 一 个 最
可 能 的 估计 是 ,细胞 中 的 DNA 只 有 微小 的 区
段 成 为 Z 型 。Z-DNA 在 天 然 DNA 中 的 存在 表
明 它 应 有 自己 的 独特 功能 。 已 有 一 些 证 据 表 明
Z-DNA 的 存在 与 基因 表达 的 调控 有 关 。

现在 已 发 现 大 多 数 染 色 体 DNA 站 的 少 部

4-13 《dG-dG)5 和 (CdC-dG)， 的 结构

左 方 为 未 甲 基 化 的 Z-DNA , 右 方 为 甲 基
化 的 2DNA。 图 中 的 黑 线 表示 主 链 ,黑色 图 形
表示 甲 基 中 的 碳 原 子 , 箭 头 标 出 的 是 Z-DNA
中 的 止 陷 部 。

图 4-12 B-DNA 和 2Z-DNA

分 胞 喀 喧 残 基 的 C5 是 甲 基 化 的 ,这 是 在 胞 喀
了 喧 残 基 挫 人 DNA 后 由 专 一 性 的 DNA 甲 基 化
酶 催化 的 。 同 样 ,DNA 中 的 腺 味 叭 也 可 通过 另
一 种 专 一 性 甲 基 化 酶 的 作用 转变 成 6- 甲 基 腺
味 叭 ; 在 原核 细胞 中 , 甲 基 化 腺 味 叭 较 甲 基 化 胞
都 是 胞 喀 啶 残 基 。

在 真 核 细 胞 中 ,DNA 甲 基 化 酶 优先 修饰 其
3' 侧 为 鸟 味 叭 的 胞 喀 啶 (5"CG3' ) 。 但 并 不 是 所
有 的 5 CG3' 中 的 C 都 是 甲 基 化 的 ,在 多 细胞 生
物 的 不 同类 型 细胞 中 , 特定 基因 的 甲 基 化 程度
也 相差 很 大 .有 迹象 表明 , 胞 喀 啶 残 基 的 甲 基 化
可 能 与 基因 表达 的 调控 有 关 。

关键 性 胞 喀 啶 残 基 的 甲 基 化 可 能 通过 全
B_DNA 转变 为 Z-DNA 而 影响 基因 功能 晰 欢
挥 。 在 大 多 数 细胞 的 阳离子 条 件 下 ,交替 的 CG
区 段 很 可 能 以 B 型 存在 ,但 在 胞 喀 啶 被 甲 基 化
后 ,平衡 就 转向 有 利于 Z 型 。 产 生 这 一 转变 的
理由 是 ,在 B-DNA 中 甲 基 突 出 于 大 沟 的 含水

环境 中 , 这 是 一 种 不 稳定 状态 ;在 ZDNA 中 ,相同 的 甲 基 转 而 形成 了 较 稳 定 的 疏水 区 (图 二

后 )

71

第 六 节 DNA 的 变性 和 复 性

|
到了 如 的 互补 是 DNA 在 结构 和 功能 上 的 一 个 基本 特性 ,也 是 DNA 研究 中 一 些 实验 技术
的 基础 。
一 .DNA 的 变性

DNA 的 生物 学 功能 依赖 于 其 结构 。 当 双 螺 旋 DNA 加 热 至 生理 温度 以 上 (接近 100C ) 时 ，
百 1

这 一 过 程 叫做 DNA 的 : 性 (denaturation )
或 融 解 LDNA 的 变性 发 生 在 一 个 狭窄 的 温度
和 范 围 丙 ,并 伴随 着 许多 物理 性 质 的 变化 这些
物理 性 质 的 变化 中 ,特别 有 用 的 是 增色 效应
(hyperchromatic effect) 。 在 DNA 的 变性 过
程 中 , 它 在 260 nm 的 吸收 值 先 是 缓慢 上 升 ，
到 达 某 一 温度 后 即 骤然 上 升 ( 图 4-14), 故 称
为 增色 效应 。 天 然 DNA 和 变性 DNA 的 吸收
值 相 差 可 达 34% 。 吸 收 值 的 骤然 上 升 表 明
DNA 的 变性 是 一 协同 性 过 程 . 吸 收 值 增 加 的 4-14 _DNA 的 融 解 曲线
ss 中 点 称 为 融 解 温度 (melting temperature，
江 和 咱 7Tw)。 在 接近 生理 条 件 下 ,DNA 的 To。 一 般
6 在 85 一 95C 间 。DNA 的 开 , 为 多 种 因素 所
影响 。 Tv 决定 于 DNA 的 G 十 C 含量 ;G 十
C 含量 高 ,T, 也 高 (图 4-15)。 深 液 的 离子
强度 也 会 影响 T, 因为 离子 强度 会 影响
DNA 的 稳定 性 ,每 升 0. 18 mol Na -是 常
用 的 标准 条 件 。T, 还 会 因 甲 酰胺 .尿素 等
的 存在 而 降低 。 这 是 由 于 甲 酰胺 等 会 增加
碱 基 在 水 中 的 溶解 度 , 从 而 减弱 碱 基 的 朴
水 交互 作用 。 当 洲 液 的 pH 接近 12 时 ，
2 DNA 碱 基 的 酮 基 会 转变 成 烯 醇 基 ; 当 pH
et 接近 2 一 3 时 , 碱 基 上 的 氨基 即 质子 化 。 pH
的 这 些 变化 都 会 影响 碱 基 间 的 氢 键 的 稳定
性 从 而 改变 Tu。 故 当 这 些 条 件 发 生变 化
时 ,DNA 的 T。 也 就 改变 。 例 如 ,在 甲 酰胺
w 的 存在 下 ,Tw。 可 降低 至 40C。 又 如 在 中 等
温度 或 中 等 量 的 碱 . 甲 酰胺 等 去 稳定 剂 存 在 下 ,DNX 父 部 分 变性 。 在 这 种 部 分 变性 的 分 子 中 ，
富 于 AT 的 区 域 融 解 ,而 富 于 GC 的 区 域 仍 保持 其 双 螺 旋 特 性 。

G 二 CCmol%)

图 4-15 ”两 种 不 同 溶液 (pH7) 中 ,DNA
T" 对 GT+C 含量 的 依赖 性

2

二 、DNA 的 复 性

热 变性 的 DNA 如 组 组

naturation) 。 复 性 的 速度 与 DNA 的 波 度 有 关 ， 因为 两 补 序列 间 的 配对 决定 于 它们 的 碰 挤 上
率 。 对 高 分 子 量 DNA 言 ,这 一 过 程 更 为 复杂 , 因为 分 子 会 由 于 部 分 互补 而 形成 不 完全 的 双 螺
旋 , 这 时 在 260 nm 的 吸收 值 虽 会 有 所 恢复 ,但 不 会 恢复 至 天 然 DNA 溶液 的 数值 。 如 使 DNA
在 剪 切 力作 用 下 分 割 成 较 短 的 片段 ,它们 就 可 完全 复 性 。DNA 复 性 的 速率 还 可 用 为 量度 其 序
列 复杂 性 (complexity ) 的 方法 。 两 种 含 相同 缓冲 剂 的 变性 DNA 溶液 ,如 它们 的 浓度 相等 ( 即 单
位 容积 中 含 相同 的 核 苷 酸 数 ) 而 来 源 不 同 ( 例 如 一 种 来 自 小 病毒 ; 另 一 种 来 自 关 椎 动物 ), 则 小
病毒 的 复 性 就 要 快 得 多 。

DNA 的 变性 和 复 性 是 可 逆 的 . 如 DNA 仅 部 分 变性 , 它 的 复 性 就 表现 在 快速 的 一 级 反应 ，
如 DNA 已 完全 变性 , 它 就 表现 为 缓慢 的 二 级 反应 。 不 完全 变性 DNA 的 复 性 只 是 已 分 开 部 分
的 双 股 链 间 碱 基 的 重新 配对 , 它 犹如 拉链 的 扣 合 。 完 全 变性 DNA 的 复 性 就 不 同 , 两 条 完全 分
开 的 互补 链 只 有 在 正确 位 点 上 形成 氢 键 才能 导致 全 面 复 性 。 既 然 多 核 苷 酸 链 是 由 许多 核 苷 酸
组 成 的 ,因而 两 者 在 正确 位 点 上 的 缔 合 就 是 一 个 不 断 尝试 的 过 程 ,两 股 链 的 浓度 越 高 ,成 功 的
频率 也 高 , 故 它 的 复 性 就 表现 为 二 级 反应 。 现 如 以 C。 代表 完全 变性 DNA 生成 的 单 股 链 的 起
始 浓度 , 则 在 时 间 上 时 的 浓度 变化 就 是 :

积分 后 得

CR 1
上 式 中 的 & 为 复 性 的 速度 常数 。 以 CVC。 对 Cu 作 图 即 得 Cx 曲线 (图 4-16) 。 当 CVC.。=0. 5 时
的 CE 值 称 为 Cixi 。Cux 与 & 的 关系 为 :
直 由

2 “ 主 配 纺

开 对 DNA 具有 特征 性 , 它 与 DNA 的 碱 基 对 数目 CN) 成 反 相 关 , 因此 ,C. 曲线 提供 了 一 种 测定
DNA 分 子 量 的 方法 。Cu 曲线 也 揭示 单一 来 源 的 DNA 所 具有 的 不 同 复杂 性 部 分 。 图 4-16(a)
中 的 中 和 包 分 别 为 MS2 鸣 菌 体 和 T4 叭 菌 体 DNA 的 Cu 曲线 ;(b) 中国 为 小 鼠 DNA 的 Cu 曲

基因 组 的 复杂 性 是 用 DNA 中 单一 序列 的 长 度 加 上 各 个 重复 序列 的 长 度 来 表示 。 如 某 一
基因 组 含 序列 ,2， <，d 而 无 重复 , 则 其 复杂 性 即 为 < 十 十 < 二 4。 这 时 复杂 性 即 与 分子量 相
同 。 高 等 生物 的 DNA , 除 单一 序列 外 还 常 含 重复 序列 。 例如 , 某 一 生物 的 DNA 由 105 拷贝 的
a,，103 拷贝 的 5，10 拷贝 的 <c 和 1 拷贝 的 de 和 /了 组 成 ,其 复杂 性 为 & 十 "十 c 十 & 十 e 十 思 这 时
DNA 的 复杂 性 就 大 大 小 于 其 分 子 量 。 复 杂 性 的 单位 为 核 苷 酸 对 的 数目 。 在 图 4-16 中 ,@ 的 复 “
杂 人 性 低 于 @ , 岛 的 复杂 性 最 高 ， 它 由 3 个 动力 党 成 分 组 成 w 扣 性 动 竹 导 renaturation kinetic ) 是
研究 DNA 复杂 性 的 一 种 有 用 方法 。

应 该 指出 的 是 ,图 中 的 单一 动力 学 成 分 是 一 平均 值 , 它 可 以 是 由 几 种 序列 组 成 的 ,它们 之

所 以 会 形成 一 个 独立 成 分 是 在 于 它们 在 总 DNA 中 占有 明显 的 比例 。

3

OSIOSIO TO
1

4 人 (Cot)
《Copy (Cotb) 汪

[GO so io 0 OO NO 各
Cnt
图 4-16 3 种 不 同 来 源 DJNA 的 Cu 曲线
图 上 方 的 标尺 为 标准 条 件 下 的 序列 复杂 性 , 横 坐 标 表示 的 是 Cut。

三 .分 于 区 过

由 DNA 复 性 研究 发 展 成 的 一 种 实验 技术 是 分 子 杂交 。 杂 交 可 以 发 生 在 DNA 和 DNA 或
RNA 间 。DNA : DNA 杂交 可 用 以 估 测 DNA 间 的 同 源 序列 ,不 同 生 物 在 进化 过 程 中 的 相关
性 ,以 及 DNA 限制 片段 的 作 图 等 .DNA : RNA 杂交 可 通过 RNA 转录 本 检测 DNA 中 特定 基
因 的 存在 等 。
DNA : RNA 杂交 中 的 一 个 应 予 充分 考虑 的 问题 是 DNA : RNA 与 DNA : DNA 杂交 间
的 竞争 ， RU 这 一 困难 是 可 以 克服 的 ,因为 DNA : RNA 杂交 分 子 更 为
稳定 , 故 采 用 一 个 稍 低 于 其 Tv 的 温度 可 使 其 优先 形成 , 此 外 ,这 一 困难 也 可 通过 不 同 RNA 泊
TAA 度 并 使 其 双 倒数 图 外 插 到 无 限 浓度 时 的 杂交 量 来 得 到 进一步 解决 (图 4-17 ayb)。 这 一 操作 吕
采用 放射 性 RNA, 未 杂交 的 RNA 用 RNA 酶 A 除去 ,杂交 分 子 可 先 沉淀 然后 计数 ,或 是 用 确
酸 纤维 薄膜 分 离 。
有 些 工作 也 可 不 测定 所 形成 的 杂交 分 子 , 而 是 测定 在 一 种 核酸 大 量 过 剩 条 件 下 杂交 分 子
的 形成 速率 (图 4-17c,d) 。 这 一 方法 类 似 于 Cx 法 , 当 过 剩 的 为 RNA 时 称 Ru 法 , 当 过 剩 的 为
DNA 时 称 Dz 法 。 在 Ru 法 中 ,杂交 分 子 的 形成 速率 为 Ruz(CR。 为 RNA 的 总 浓度 ) 的 函数 ;在
Du 法 中 ,杂交 分 子 的 总 浓度 ) 的 函数 。 杂 交 分 子 的 形成 速率 在
R. 法 中 ,以 DNA 的 数 射 性 不 再 为 核酸 酶 S1 所 改变 来 要 宗 ' 在 Duz 法 中 ,以 RNA 的 放射 性 不
再 为 RNA 酶 A 所 改变 来 表示 ,图 4-17 的 (c) 指 出 样品 中 存在 两 类 RNA. 转 录 本 ,其 中 四 所 含 -

的 拷贝 数 较 @) 为 多 ;(d) 指 出 DNA 存在 三 类 同 源 序 列 , 其 中 @@ 含 的 拷贝 数 最 多 。
74

(b)

RNA 浓度 一 w

[ea oo 本 1o5 [35IOaOE OSIO
Re Doe

图 4-17 RNA : DNA 分 子 杂交 曲线
R 表示 已 杂交 的 RNA 量 。

第 七 节 DNA 的 形状 .大 小 和 序列 组 织

一 .DNA 的 形状 和 大 小

DNA 一 般 为 长 而 无 分 支 的 双 股 (ds ) 线 型 分 子 , 但 有 些 为 环 型 ,也 有 少数 为 单 股 (ss ) 环 型 。
不 同 的 DNA ,大 小 相差 悬殊 。SV40 含 5. 1 kb , 而 南美 肺 鱼 的 基因 组 含 102 000 000 kb 。 虽 然 一
般 言 ,复杂 的 机 体 需 要 更 多 的 DNA, 但 不 存在 严格 的 对 应 关系 ( 表 4-3) 。

二 .DNA 的 碱 基 组 成 和 序列 组 织

在 所 有 生物 种 的 双 股 DNA 中 ,A 和 T 的 量 相等 /'G 和 CC 的 量 相等 。 故 根据 A,T,G,C 中
任 一 种 的 含量 就 可 确定 双 股 DNA 的 其 它 3 种 碱 基 的 含量 。DNA 的 碱 基 组 成 一 般 可 用 其 GC
含量 来 表示 。

同一 物种 所 有 细胞 DNA 的 GC 含量 都 相同 , 而 种 间 的 差异 则 很 显著 ,尤其 在 细菌 间 , 可 :
从 0. 3 一 0.7。 高 等 生物 的 GC 含量 一 般 小 于 0. 5。

DNA 中 ,除了 A,T,G,C 外 还 含有 修饰 碱 基 ,常见 的 为 甲 基 化 碱 基 , 它 们 是 在 DNA 合成
后 形成 的 。 在 大 多 数 动物 和 植物 中 , 胞 喀 啶 ,尤其 是 CpG 中 上 的 5 位 党 具有 甲 基 ,它们 与 发 育
过 程 中 基因 的 钝 化 有 关 。 在 细菌 中 也 已 发 现 碱 基 的 修饰 作用 , 它 可 保护 自身 DNA 免 被 细胞 内
的 限制 酶 所 降解 。 在 大 肠 杆 菌 和 相关 的 细菌 中 , 转 座 酶 的 启动 子 含 cATC 序列 ,其 中 A 能 为
甲 基 化 酶 所 甲 基 化 。 当 双 股 链 中 GATC 序 烈 中 的 "Ar 都 被 甲 禁 化 时 ?启动 子 相对 钝 化 ,复制 后
形成 的 半 甲 基 化 DNA 中 ,启动 子 是 较为 活跃 的 。 这 是 细胞 在 复制 过 程 中 控制 转 座 的 方式 之

75

表 4-3 DNA 分 子 的 形状 和 大 小
基因 组 大 小

人 碱 基 对 数 CED) 总 长 度 CPm) 类 型
病毒
SV40 5.1 7 环 型
GX174 5.4 9 二 民 基
M13(fd',fl) 6. 4 交往
P4 LS 3.
7 39.9 13
P22 权 吻 1 这
A 48.6 16 线 型
TIT2,T4,IT6 166 55
牛 交 190 63
禽 辣 280 93
细菌
类 菌 质 体 760 260
大 肠 杆 菌 4700 1 360 | 环 型
真 核 生 物
酵母 13 500 4600 16
果 蝇 165 000 56 000 二
1 2 900 000 9g0 000 二 jeema
南美 肺 鱼 102 000 000 34 700 000 19

原核 生物 DNA 的 碱 基 组 成 是 均匀 的 , 即使
DNA 被 破碎 为 较 小 的 ,例如 ,10 kb 片段 后 ,氧化 饮
密度 梯度 仍 只 能 使 其 形成 单一 的 峰 。 可 是 真 核 生物
DNA 的 碱 基 组 成 与 此 相反 , 显示 出 很 大 的 不 均匀 性 。
这 反映 为 DNA 复 性 曲线 的 复杂 性 和 其 剪 切 片段 在
浮力 密度 梯度 中 的 不 对 称 分 布 ( 图 4-18)。 这 两 方面
的 实验 证 据 都 表明 DNA 中 存在 着 一 些 独特 的 序列 。

真 核 生 物 DNA 碱 基 组 成 上 的 异 质 性 主要 由 于 存
在 着 3 类 DNA 序列 :高 度 重 复 序列 ;@ 中 度 重复 序
列 和 G@@) 单 一 序列 。 这 3 类 序列 各 具 特 点 和 意义 。

(一 ) 高 度 重复 序列 本

高 度 重复 序列 (highly repetitive sequence ) 的 < 一 氧化 饮 中 的 浮力 密度
长 度 为 2 一 10 bp ,在 基因 组 中 可 串联 重复 至 10 一
10 次 , 约 占 基因 组 的 1%% 一 50%% ,平均 为 15% 。 一 些
等 的 重复 序列 为 交替 A,T,G 和 C, 仅 占 3%% 并 散布 其 间 。 大 鼠 和 果 蝇 的 重复 序列 分 别 由 6 个
和 7 个 碱 基 组 成 。 这 些 重 复 序列 常 称 为 卫星 DNA Csatellite DNA) 。

DNA 主 带 卫星 DNA
1.700
1.692(ACAAACT)，

1. 688 (AIAAACT)，
1. 671 (ACAAATT)，

光 密 度

4-18 果 蝇 的 卫星 DNA

角 代 三 一 咎
大 刀 ，_ GaEc 一 AEC 王 人 二 CEG 三 CE 人 三 CA 二 C
采 蝇 ”人 C 一 A 一 A 一 A 一 T 工 一 A 人 一 CA 一 A 二 工 二 工

同一 物种 的 不 同 卫星 序列 谱 带 常 是 相关 的 ,例如 ,在 果 蝇 的 一 个 种 中 发 现 的 重复 107 次 的
3 种 卫星 序列 为 ，
76

5 2ACAAATT=3'

SENAGCANAGTES

5 -ATAAACT-3'/
有 些 卫星 DNA 的 序列 很 长 ,例如 , 猿 猴 DNA 的 重复 序列 长 达 172 bp ,一 种 果 蝇 重复 序列 长 达
359 bp ,而 牛 的 卫星 DNA 含 1 400 bp 重复 单位 。

高 度 重复 序列 的 功能 和 确切 位 置 都 不 完全 清楚 , 它们 一 般 不 转录 。 现 在 已 知 ,有 些 卫 星
DNA 位 于 染色 体 的 中 心 粒 ,它们 可 能 在 减 数 分 裂 中 承担 一 定 的 功能 。 也 有 一 些 重复 序列 位 于
染色 体 的 端 粒 ,它们 是 由 一 些 富 仿 G9 的 序列 组 成 ,重复 20 一 100 次 。 端 粒 的 功能 在 于 保持 染
色 体 的 稳定 ( 端 粒 的 结构 将 在 第 十 二 节 中 进一步 讨论 ) 。

高 度 重复 序列 也 散布 于 整个 基因 组 ,它们 可 分 为 长 (6 一 7 kb) 和 短 (79 一 300 bp) 散 布 重复
序列 两 类 ,它们 是 由 细胞 中 的 RNA 通过 逆转 录 形 成 并 插入 染色 体 个 别 部 位 的 。 研究 得 最 透彻
的 短 散 布 序列 是 灵 长 严 DNA 中 的 Ahu AIu family)。 它 制 性 内 切 核 酸 酶
AluI 的 识别 位 点 而 命名 的 。 Alu 家 族 含 一 种 281 bp 序列 的 各 种 变 体 , 人 类 基因 组 含有 500 000
拷贝 ,构成 总 DNA 的 5% 一 6%。Alu 家 族 原来 是 由 7 SL RNA( 一 种 信号 识别 颗粒 SRP 的 组
成 RNA) 逆 转录 而 来 。 在 其 它 生 物体 中 也 已 发 现 相关 的 序列 ,如 小 鼠 的 Bl 家 族 , 它 的 序列 与
Alu 家 族 相似 而 长 度 仅 为 其 一 半 。 中 国 仓鼠 也 含 类 似 的 序列 ,大 多 数 的 短 散 布 重复 序列 不 是 由
7SLRNA 而 是 由 转移 RNA 遂 的 。

这 些 散 布 重复 序列 大 致 是 较 近 阶段 中 形成 的 。

(二 ) 中 度 重复 序列

中 度 重 复 序 列 (moderately repetitive sequence) 包 括 rRNA 和 组 蛋白 基因 ,每 一 基因 组 约
含 1 000 拷贝 。 核 糖 体 DNA 序列 不 仅 在 真 核 基因 组 中 重复 许多 次 ,即便 原核 DNA 也 含 多 重
拷贝 。 基 因 的 这 种 重复 的 目的 在 于 满足 蛋白 质 合成 对 核糖 体 的 需求 。 南 非 爪 蟾 的 rRNA 基因
存在 于 卫星 带 中 ,18 S 和 28 S RNA 基因 成 串联 重复 ,并 为 高 GC 含量 的 间隔 区 所 分 开 。 其 它
的 中 度 重复 序列 不 是 串联 而 是 分 布 在 整个 基因 组 中 的 。

河

想

坚

省

，

届

惑

牙

吉

一 -=
加 区 病 图 陋

0 ono-on>y>oO

图 4_19 人 甩 疝 重 夏 序列 .发 夹 结构 和 十 字形 结构

(三 对 一 序列
单一 序列 (unique sequence) 包 括 酶 在 内 的 各 种 蛋白 质 基因 ,数目 在 一 个 到 几 个 ,单一 序列
77

构成 人 基因 组 的 65% 和 约 接近 细菌 、 病 毒 以 及 质粒 基因 组 的 全 部 。

〈 四 ) 反 向 重复 序列
反 向 重复 序列 (inverted repetitive sequence) 是 DNA 中 的 一 种 常见 的 序列 形式 (图 4-

19)， 各 括 一 种 能 与 同 股 或 另 一 股 链 中 相应 互补 的 序列 。 这 种 序列 单 股 时 形成 发 夹 结构 Chair-
本 在 果 蝇 、 爪 蟾 和 人
DNA 中 发 现 的 这 种 序列 长 度 达 1 200 bp。 四 膜 虫 大 核 (macronucleus) 的 核糖 体 DNA 位 于 20
kb 的 反 向 重复 序列 中 。 发 夹 序列 约 占 人 基因 组 的 6%% ,在 单 们 染色体 中 的 数目 约 为 2X105。 这

一 状况 从 未 在 原核 生物 中 发 现 。
三 、 真 核 和 原核 生物 基因 组 的 进一步 比较

真 核 和 原核 生物 基因 组 的 序列 组 织 (sequence organization) 已 在 上 节 做 了 比较 ,但 两 者 的 “
差别 不 仅 表现 在 重复 序列 上 , 真 核 生 物 DNA 的 单一 序列 也 具 不 少 特 后 ;
(G) 大 多 数 的 蛋白 质 基因 (包括 部 分 RNA 基因 ) 是 割 ( 断 ) 裂 基因 (split gene); 它 们 含有 一
些 称 为 内 含 子 (introny 的 "转录 后 被 切除 的 序列 ,内 含 子 常 使 基因 扩大 20 伪 。 不 同 内 含 子 的 长
度 和 序列 是 有 差 看 的 "它们 可 以 存在 于 基因 的 各 个 部 位 。 至 今 ,内 含 子 是 否 具有 何 种 功能 仍 是
一 个 正在 探索 中 的 问题 。
(2) 真 核 生物 DNA 的 基因 间 存 在 着 转录 或 不 转录 的 间隔 区 ,即使 是 转录 的 间隔 区 亦 不 翻
译 成 蛋白 质 。 ESOPTSEL
一 [3 高 等 真 核 生物 DNA 所 含 的 特定 基因 (如 rRNA, 组 看 自 基因 等 ) ,在 二 定 条 件 下 会 发
(4) 假 基因 (pseudogene) 是 真 核 生物 DNA 的 另 一 个 特点 。 这 些 序列 与 真 基因 具 高 度 的 同
源 性 ,但 由 于 突 赤 而 示 能 委 天 . 有 人 佑 计 ,4 不 DNA 序列 中 有 一 个 是 假 基因 。 假 基 因 的 存在 扩
充 了 真 核 基因 组 的 大 小 。
以 上 讨论 说 明 , 真 核 生物 的 基因 组 ,无 论 是 其 大 小 所 刘 的 重 和 序 列 和 音 序列 都 显示 出
与 原核 生物 有 很 大 不 同 。 同 时 ,高 等 直 核 生物 基因 组 ]
估计 下 郁 过 6 一 7%。 高 等 直 核 生物 基因 组 的 这 一 条 点 引起 不 少 人 的 浊 | 曾 把 它 称 为 自
私 的 DNA(selfish DNA) ,. 即 疆 一 各
不 清 而 与 表 DNA 目 放 首 祛 种 为 庆 示 NS 站 国 序列 是 否
是 毫 无 功能 的 呢 ? 这 一 问题 ,现在 似乎 正在 逐步 氢 卉 面 约 。

第 八 节 _DNA 的 精细 结构

一 、\ 依 赖 于 序列 的 B-DNA 构象 变化

Watson-Crick 的 DNA 双 螺 旋 结 构 模型 是 根据 DNA 纤维 的 X 射线 本 射 分 桥 建 立 起 来

的 ,这 样 得 到 的 是 双 螺旋 结构 的 平均 信息 , 从 而 归结 出 DNA 结构 的 规整 性 。 到 了 70 年 代 未 ,化

学 合成 技术 的 改进 使 人 们 能 够 合成 具 确定 序列 的 DNA 片段 ,并 使 之 形成 单 晶 。 这 种 合成 DNA

晶体 的 X 射线 衍射 揭示 ,DNA 双 螺旋 实际 上 不 是 完全 均匀 的 , 即 双 螺旋 的 许多 结构 参数 是 随 大

基 序 列 的 不 同 而 在 一 定 范围 内 变化 的 ,这 称 为 DNA 的 局 部 构象 .在 DNA 中 , 随 碱 基 序列 不 同 而
78

变化 的 参数 有 许多 , 其 中 重要 的 有 螺旋 扭转 角 (helix twist angle), 螺旋 桨 扭 角 (propeller twist
ingle) , 碱 基 对 转动 角 Croll angle of base pair) 等 ,此 外 碱 基 对 间 还 会 发 生 滑动 (图 4-20) 。

螺旋 桨 扭转

图 4-20、DNA 的 一 些 局 部 构象 变化
具 CGCGAATTCGCG 的 DNA 片段 的 X 射线 衍
射 分 析 指 出 , 它 的 螺旋 扭转 角 是 在 28 一 42" 间 变动 的 4 上
《图 4-21) ,而 不 是 36", 其 它 的 参数 也 会 随 序列 的 不 同 这
而 变动 ,只 是 数值 不 同 。 但 DNA 的 局 部 构象 为 什么 会 世 3
显示 出 依赖 于 序列 的 变化 呢 ? 让 32
”前面 已 讨论 过 ,DNA 的 双 螺 旋 结 构 是 通过 碱 基 对 站 30
的 堆积 和 形成 氢 键 而 稳定 的 。 但 碱 基 的 堆积 会 因 序列 26
的 不 同 而 有 变化 。 这 是 由 于 碱 基 对 中 , 味 叭 是 双环 结
构 , 它 大 于 单 环 的 喀 啶 ,故而 在 碱 基 对 中 会 伸 过 中 点 突 20
出 到 对 方 一 侧 .这 一 情况 不 仅 增加 了 碱 基 的 堆积 程度 ，
也 使 碱 基 官 能 团 间 发 生 挤 压 ,而 这 种 挤 压 是 随 序列 而 人
变 楷 的。 对 嘲 叭 -(3' ,5')- 喀 啶 序列 言 ,来 自 乌 叮 叭 Os/
腺 味 岭 Ne 间 的 挤 压 发 生 于 大 沟 中 ; 对 喀 啶 -(3' ,5' )- 嘎 办 光 萎 的 螺旋 扭转 月
险 序列 言 , 来 自 乌 味 叭 Na,N;/ 腺 味 叭 Ns 间 的 挤 压 发 生 于 小 沟 中 (图 4-22).。 位 于 小 沟 的 挤 压 更

哮 啶 - 味 叭

图 4-22 ” 碱 基 官能 团 间 的 挤 压
79

为 严重 。 现 已 观察 到 ,这 种 挤 压 发 生 于 混合 味 叭 / 喀 啶 序列 中 。
为 了 缓解 这 种 效应 , 双 螺 旋 结 构 就 做 出 局 部 调整 ， 以 增强 方 利 的 项 玫

压 , 如 改变 螺旋 扭转 角 、 碱 基 转 动 角 、 碱 基 对 的 螺旋 桨 扭 角 和 相 邻 碱 基 对 间 发 生 滑动 等 双 螺 旋

中 也 可 能 除了 标准 碱 基 配 对 外 ,形成 交叉 氢 键 。
以 上 这 些 变化 使 DNA 形成 了 精细 结构 (fine structure) 。 而 精细 结构 正 是 DNA 发 挥 功能

时 ,相应 蛋白 质 因子 与 靶 位 点 作 专 一 性 识别 和 结合 的 标志 。
二 .连续 AT 序列 的 构象

现 已 观察 到 ,DNA 与 一 些 蛋 白质 因子 的 结合 部 位 是 弯曲 的 。 这 种 弯曲 (bend) 是 连续 A 残
基 产 生 的 。 产 生 弯 曲 需要 至 少 有 3 个 连续 的 A(A;), 最 大 的 曲率 是 由 连续 的 As 造成 的 。 产 生
弯曲 的 另 一 个 要 求 是 连续 的 A 为 其 它 的 核 苷 酸 所 隔 开 。 现 观察 到 的 最 佳 状况 为 5 bp 其 它 核
苷 酸 所 隔 开 的 是 连续 As。

也 有 这 样 的 情况 ,有 些 DNA 序列 本 身 并 不 弯曲 ,但 在 有 关 和 蛋白 质 的 诱导 下 会 发 生 弯曲 。
这 一 情况 首先 在 核 小 体 中 观察 到 。 为 了 实现 组 蛋白 八 聚 体 与 DNA 的 结合 ,面向 蛋白 质 的
DNA 沟 变 罕 , 而 另 一 面 则 扩大 。DNA 沟 的 这 种 变化 是 和 其 所 含 的 一 些 短 序列 有 关 。 在 DNA
的 小 沟 朝 内 的 部 位 常 含 2 一 3 个 连续 的 AT 碱 基 对 ,在 大 沟 朝 内 处 则 常 有 2 一 3 个 连续 的 GC
碱 基 对 。 核 小 体 常 位 于 这 种 变形 区 内 。 这 说 明 , 组 蛋白 不 是 随意 结合 于 DNA 的 。

三 、 含 错 配 碱 基 对 的 B-DNA

含 GT,AC 和 GA 破 基 对 的 寡 聚 核 苷 酸 的 晶体 分 析 说 明 , 这 些 错 配 的 碱 基 对 都 能 包容 在
B-DNA 双 螺 旋 中 ,它们 的 构象 参数 一 般 处 于 人 允许 范围 内 。 每 一 错 配 碱 基 ( 除 了 一 种 GA 配对
外 ) 都 形成 两 个 氢 键 ,并 且 它 们 的 宽度 也 都 在 Watson-Crick 碱 基 配对 宽度 的 0. 05 nm 范围 内 上
(图 4-23) 。
GA 可 采取 两 种 配对 方式 ,两 种 方式 中 G 都 为 反 式 ,而 A 则 一 个 采取 反 式 ; 另 一 个 采取 顺 -
式 ;前 者 的 宽度 为 1. 25 nm, 后 者 为 1. 07 nm。 已 知
5 CGCGAATTAGCG
3'GCGCTTAAGCGC
两 个 GA 碱 基 对 中 人 A 的 昔 键 都 采取 顺 式 构象 ,而 G 则 仍 保持 反 式 构象 这样 ,形成 的 GA 碱 基 ，
对 仅 宽 1. 07 nm, 与 GC 对 的 尺寸 十 分 接近 , 亦 未 引起 螺旋 方向 的 改变 ,所 以 ,这 一 错 配 于
DNA 的 结构 并 不 产生 明显 的 影响 。 在 DNA 的 GA 碱 基 对 处 , 腺 味 叭 官能 团 的 位 置 与 螺旋 的
其 余部 分 明显 不 同 ,这 一 特点 可 能 为 修复 酶 提供 了 识别 标志 。GA 碱 基 对 容纳 进 螺旋 的 方式 可
通过 下 例 说 明 。 在
5ICCAAGATTGG
3GGTTAGAACC
例 中 ,两 个 错 配 碱 基 对 中 的 G 和 和 A 都 采取 反 式 构象 ,它们 通过 拓宽 小 沟 而 容纳 进 螺旋 .G 和 A ，
间 , 除 了 形成 两 个 氢 键 外 ,扩大 的 螺旋 桨 式 扭 角 也 使 G 的 Ns 和 相 邻 AT 中 工 的 0, 间 形 成 氢
键 , 从 而 使 螺旋 结构 稳定 化 。
错 配 碱 基 对 包容 于 双 螺 旋 , 以 及 它们 所 产生 的 构象 变化 ,明显 地 依赖 于 各 自 的 序列 环境 ，

《sequence envVIronment ) ， 这 方面 的 知识 对 复制 过 程 的 校对 、 复制 后 的 修复 和 重组 的 酶 学 都 是
80

需要 的 。

畴 、 N

出

G=A G( 反 式 )-A( 顺 式 )

H、
N 一 昌 虽 cs
SR
We GAN-N
/ O.…H-N EC O 天 入
EN
H-N

本 一 1.03nm 一 一 2 十 - 1.03nm 一 一 一
已 一 从 IT=G

4-23 错 配 碱 基 对 间 的 氢 键 和 量度
e

\ 再 论 ZDNA

Z-DNA 的 形成 依赖 于 一 定 的 序列 。Z-DNA 与 B-DNA 的 差别 不 仅 在 于 螺旋 的 方向 , 亦 涉
及 昔 键 的 取向 。 在 A-DNA 和 了 B-DNA 中 , 苷 键 的 构象 都 属 反 式 , 糖 环 属 C2'- 内 式 。 在 Z-DNA
中 , 喀 喧 碱 基 的 苷 键 仍 为 反 式 和 糖 环 为 C2'- 内 式 , 而 叮 叭 核 苷 酸 的 相应 构象 则 转换 为 顺 式 和
C3'- 内 式 。 由 于 相 邻 碱 基 对 间 的 螺旋 转角 变化 很 大 , 因而 形成 一 种 二 核 苷 酸 重复 单位 ,出 现 了
螺旋 转角 的 交替 变化 。 在 CpG 中 ,C 和 G 间 的 螺旋 转角 为 15"; 在 GPC 中 ,G 和 C 间 的 转角 为
45"。 交替 的 味 叭 - 喀 啶 序列 虽然 倾向 于 形成 Z-DNA ,但 也 可 由 于 邻近 的 B-DNA 区 域 而 被 迫 采
取 B 型 .此 外 ,序列 以 外 的 因素 ,如 甲 基 化 ,特定 的 DNA- 结 合 蛋白 的 存在 和 超 螺旋 程度 的 改变

等 都 能 影响 DNA 所 采取 的 构象 。

五 .DNA 的 局 部 构象 与 DNA- 结 合 蛋白

DNA 的 局 部 构象 是 有 其 功能 上 的 意义 的 ,它们 常 是 DNA- 结 合 蛋白 (DNA-binding Pro-
tein) 结 合 的 标志 。DNA- 结 合 蛋白 泛 指 一 类 能 结合 于 DNA 的 蛋白 质 , 它 包 括 各 种 酶 (如 DNA
聚合 酶 .RNA 聚合 酶 等 ) 和 调节 蛋白 (如 CAP,Cro 阻 遇 物 等 )。 这 些 蛋 日 质 与 DNA 的 结合
及 到 生物 学 中 的 一 些 基 本 问题 ,如 遗传 和 个 体 发 育 等 ,因此 ,核酸 -和 蛋白质 交 互 作用 (Cnucleic
acid-protein interaction) 已 成 为 分 子 生 物 学 中 的 一 个 研究 热点 。DNA 和 重 白 质 的 结合 实质 上
是 一 个 双向 过 程 ,DNA 的 局 部 构象 既 提 供 了 识别 标志 和 发 生 交 互 作用 的 结构 条 件 , 而 蛋白 质
的 结合 又 促使 该 处 DNA 的 构象 发 生 进一步 的 变化 和 使 交互 作用 深化 。 如 大 肠 杆 菌 的 调节 蛋
白 CAP(catabolite gsne activator protein ) 对 乳糖 操纵 子 (lac operon ) 的 启动 子 (promoter) 的
结合 即 导 致 该 DNA 区 段 产 生 更 多 的 折 有 释 。 核 小 体 中 DNA 与 组 蛋白 和 限制 性 内 切 酶 EcoRI 与

81

DNA 上 识别 位 点 所 形成 的 复合 物 (complex) 的 入 射线 结晶 学 分 析 就 为 这 种 相互 关系 提供 了

更 为 直接 的 证 据 。
限制 性 内 切 酶 EcoRI 是 含 两 个 相同 亚 基 的 二 聚 体 , 它 结合 于 DNA 的 识别 位 点 (recogni-

tion site) 上 。
了 GCCAATTICIGEC
的

如 有 Mg:+ 存 在 , 酶 就 在 特定 位 点 切割 DNA, 故 EcoRIDNA 复合 物 是 在 无 Mg “条 件 下
分 离 得 到 的 。 衔 射 分 析 结 果 表 明 , EcoRI 的 两 个 亚 基 紧 紧 包 详 着 DNA 双 螺 旋 , 它 与 大 沟 中 的
碱 基 契 合 而 与 小 沟 无 接触 。 在 复合 物 中 ,DNA 的 构象 不 同 于 经 典 的 A 型 和 B 型 ;变形 集中 于
三 个 突然 出 现 的 扭 结 中 ,后 者 又 把 各 含 3 bp 的 4 组 核 苷 酸 分 隔 开 。 由 于 DNA 序列 的 对 称 性 ，
第 一 和 第 三 扭 结 完全 相同 但 不 同 于 中 间 的 扭 结 。DNA 的 两 个 相同 的 末端 片段 具有 类 似 于 和 A
型 的 构象 ,而 中 间 的 区 域 类 似 于 B-DNA 。 两 个 末端 扭 结 的 构象 反映 为 A 型 和 B 型 的 过 渡 状
态 。 结 合 时 ,位 于 B-DNA 的 中 心 结 的 双 螺旋 骤然 松 开 25" 和 形成 12" 的 弯曲 ,结果 使 大 沟 扩 大
以 使 EcoRI 得 以 接近 (图 4-24)。 这 一 结构 明显 地 不 同 于 与 限制 酶 复合 前 的 情况 。 中 心 结 的 构
象 尤 为 奇特 , 它 在 未 与 EcoRI 结合 前 可 能 仅 十 分 短暂 地 存在 。B-DNA-EcoRI 复合 物 的 结构 说
明了 和 蛋白质 与 DNA 的 交互 作用 决定 于 多 方面 的 因素 ,其 中 包括 DNA 的 特定 序列 和 蛋白 质 的
结构 。 结 晶 学 分 析 则 为 DNA 的 扭 结 提供 了 更 为 直接 的 证 据 。

8B-DNA-EcoRl 复合 物 : B-DNA

图 4-24 `B-DNA-EcoRI 复 合 物 中 两 者 的 交互 作用

DNA 是 遗传 信息 的 载体 ,而 遗传 信息 则 是 通过 核 苷 酸 的 排列 顺序 体现 出 来 的 ,DNA 所 携
带 的 遗传 信息 ,根据 已 有 证 据 大 致 可 以 分 为 两 类 :一 种 是 编码 蛋白 质 ,它们 通过 核 苷 酸 三 联 体
与 各 个 氨基 酸 间 的 对 应 关系 使 遗传 信息 由 DNA 流向 蛋白 质 , 但 遗传 信息 的 这 种 流动 不 是 通
过 基因 自身 的 功能 ,而 是 通过 独立 于 该 基因 之 外 的 蛋白 质 合成 机 构 实现 的 。 同 时 ,蛋白 质 基因
的 表达 并 不 总 是 构成 型 的 , 它 是 受 调控 的 。DNA 所 携带 的 第 二 类 信息 即 是 有 关 基 因 表 达 调 控
的 信息 ,它们 贮存 在 DNA 的 精细 结构 中 ,直接 表现 为 特定 的 空间 结构 , 即 密码 结构 域 (code
domain), 然 后 为 相应 的 蛋白 质 因 子 所 识别 和 结合 ,从 而 控制 蛋白 质 基因 的 表达 ,这 一 方面 的
研究 近来 已 取得 不 少 进展 ,并 已 触及 “废弃 DNA” 是 否 具 有 一 定 的 功能 。 无 疑 ,这 将 成 为 分 子 生
物 学 中 的 一 个 重要 领域 。

82

第 九 节 ” 超 螺旋 DNA

一 、` 超 螺旋 DNA 的 发 现

超 螺 旋 DNA (supercoiled DNA) 最 早 是 在 SV40 和 多 瘤 病毒 中 发 现 的 。 人 们 使 用 电子 显
微 镜 可 直接 观察 到 超 螺旋 DNA 的 形象 。

当 SV40 DNA 从 被 感染 细胞 分 离 出 来 时 , 它 与 组 蛋白 结合 形成 为 核 小 体 , 每 一 分 子 约 形
成 24 个 核 小 体 。 如 使 DNA 与 组 蛋白 分 离 ,DNA 就 成 为 超 螺旋 (图 4-25)。 起初 ,人 们 认为 超 螺
旋 是 一 些小 环形 DNA 的 特点 。 以 后 发 现 它 是 几乎 一 切 DNA ,无 论 是 环 型 或 线 型 DNA 的 共有
的 重要 特征 。

超 螺旋 DNA

图 4-25 SV40 DNA 形态 转变

KANZRRRRTRARRRRRRVR
AAARZIAXZAXRZAXRZ AN 世

松弛 态 双 螺旋 DNA
超 螺 旋 DNA

7

和
LA/

图 4-26 ” 双 螺 旋 和 超 螺旋 DNA

83

DNA 的 分 子 是 一 种 双 股 螺旋 ,但 当 它 自身 进一步 盘 绕 时 就 形成 超 螺旋 ,DNA 双 螺 旋 和 超

螺旋 见 图 4-26 。

二 、.DNA 超 螺旋 的 形成

B-DNA 的 多 核 苷 酸 链 的 空间 结
构 是 以 一 组 构象 参数 为 表征 的 , 它 规
定 B-DNA 的 每 熙 螺 旋 含 10 bp ( 晶
中 ) ,这 是 一 种 松弛 状态 。 它 的 轴 成 一
直线 。 对 松弛 状态 的 环 型 DNA 言 , 轴
处 在 同一 平面 中 , 故 可 以 平 放 在 平面
上 ,但 如 B-DNA 每 熙 的 螺旋 数 通过
一 定 的 途径 改变 , 它 就 可 以 形成 超 螺
旋 ( 图 4-27)。 例 如 ,一 环 型 双 股 DNA
共 含 420 bp , 它 应 形成 42 压 螺 旋 。 现
在 ,如 切割 其 骨架 中 的 任 一 磷酸 二 酯
键 , 它 就 转变 为 含 同 数 碱 基 对 的 线 型
B-DNA。 如 使 所 形成 的 线 型 DNA 的
一 端 固定 另 一 端 向 左 放 松 6 圈 , 然 后
再 使 两 端 重新 闭合 ,由 于 B-DNA 是
一 种 在 能 力学 上 稳定 的 结构 ,螺旋 数
的 减少 就 使 其 转变 为 一 种 受 力 状态 。
分 子 所 经 受 的 张力 可 以 按 两 种 方式 分
布 :一 种 方式 是 分 子 保留 一 单 链 区 ,其
余部 分 仍 保持 B-DNA 状态 ; 另 一 种
方式 是 形成 超 螺 旋 , 超 螺旋 的 形成 使

10 15 20 25 30 35 (

超 螺旋

图 4-27 DNA 超 螺旋 的 形成

图 4-28 超 螺旋 DNA 的 两 种 拓扑 形式

84

* x 右手 双 螺 旋 放 松 6 圈 人 Z 王 一 6。

已 放松 的 双 螺旋 分 子 的 碱 基 对 接近 于
B-DNA 中 的 状态 (图 4-27) 。

超 螺 旋 DNA 可 采取 两 种 拓扑 学
上 相当 的 形式 :一 种 相当 于 双 螺 旋 绕
圆柱 体 旋 转 ;, 另 一 种 相当 于 双 螺旋 相
互 盘 绕 。 超 螺旋 的 这 两 种 形式 可 以 相
互 转变 (图 4-28)。

DNA 结构 的 上 述 变化 可 以 用 数
学 式 来 表述 。

万 一 了 上 大

卫 称 为 DNA 的 连接 数 (linking num-
ber), 它 是 DNA 的 一 股 链 绕 另 一 股
链 盘 绕 的 次 数 , 它 代 表 环 型 双 螺 旋
DNA 分 子 的 拓扑 特性 。 在 不 发 生 链 的

断裂 时 , 它 是 一 常数 。 例 如 ,图 4-27 中 DNA 原来 的 世 为 42, 放 松 后 为 36。 在 右手 双 螺 旋 中 , 世
规定 为 正 ,T 称 为 盘 绕 数 (twisting number) , 它 代 表 DNA 的 一 股 链 绕 双 螺 旋 轴 所 做 的 完整 的
旋转 数 . 对 B-DNA 言 , 它 等 于 DNA 的 碱 基 数 除 以 10( 唱 体 中 ) 。 太 为 超 盘 绕 数 (writhing num-
ber) ,代表 双 螺 旋 轴 在 空间 的 转动 数 ,7 和 了 殉 是 可 变 的 。

现在 ,我 们 回 到 图 4-27, 其 中 原来 的 环 型 DNA 的 工 =42, 了 三 42, 故 你 王 0, 即 不 存在 超 螺
旋 。 它 螺旋 轴 处 在 同一 平面 中 ,分 子 处 在 松弛 状态 。 在 保留 一 单 链 区 的 DNA 分 子 中 ,志和 7 了 都
为 36 ,分 子 未 形成 超 螺旋 。 在 超 螺旋 DNA 中 , 世 仍 为 36, 如 使 了 保持 未 松 开 前 的 42, 凡 就 成
一 6, 即 成 为 超 盘 绕 6 次 的 负 超 螺旋 。

超 螺旋 是 DNA 三 级 结构 的 一 种 普遍 形式 。 双 螺旋 DNA 的 松 开 导致 形成 负 超 螺旋 , 而
DNA 的 拧紧 则 导致 形成 正 超 螺旋 。
”天然 的 DNA 都 呈 负 超 螺旋 ,但 在 体外 可 得 正 超 螺旋 。 溴 乙 锭 、. 放 线 菌 素 了 D 等 的 分 子 都 是
扁平 的 ,它们 可 以 人 散 入 DNA 的 碱 基 对 之 间 。 省 乙 锭 分 子 的 艇 和 能 使 相 邻 碱 基 对 的 间隔 增 至
0.7nm, 即 使 螺旋 发 生 了 解 旋 。 对 一 个 呈 负 超 螺 旋 的 环形 DNA 分 子 来 说 , 溴 乙 锭 的 敌人 并 没
有 改变 连接 数 ,但 盘 绕 数 减 少 ,结果 超 螺旋 数 向 相反 方向 改变 . 随 着 溴 乙 狂 量 的 增加 , 负 超 螺旋
DNA 就 转变 为 松弛 态 ; 省 乙 锭 的 进一步 增加 ,DNA 就 转变 为 正 超 螺旋 (图 4-29) 。

沉降 速度

溴 乙 锭 (mol/L)
图 4-29 通过 省 乙 锭 的 戏 入 ,环形 DNA 超 螺旋 状态 的 改变

环形 DNA 分 子 会 由 超 螺 旋 化 而 变 得 更 为 致
密 , 它 们 在 超 离心 中 的 沉降 速度 和 在 凝 胶 电泳 中 的
迁移 速度 都 增加 , 故 超 螺旋 DNA 可 以 通过 这 两 种
方法 来 检测 和 分 离 。 现 在 ,琼脂 糖 凝 胶 电泳 已 成 为
检测 DNA 超 螺旋 程度 的 一 种 最 直接 的 方法 (图 4-
30) 。 它 能 够 分 离 仅 差 一 圈 的 超 螺旋 DNA。

对 一 特定 的 DNA 言 忆 是 一 定 值 ,但 细胞 内
存在 着 一 些 可 使 DNA 分 子 断裂 和 重新 连接 的
酶 , 故 工 会 在 一 定 范围 内 变化 ,DNA 的 超 螺 旋 结
图 4-30 ”松弛 的 和 超 螺 旋 DNA 的 凝 胶 电泳 构 常 处 于 动态 变化 中 (图 4-31) ,在 这 一 过 程 中 ，

85

我 们 实际 上 关心 的 是 连接 数 的 改变 及 其 对 和 了 现 的 影响 , 即
AZ 一 AT 十 A 丈

不 过 , 超 螺旋 对 DNA 的 影响 随 其 分 子 的 长 度 而 异 。 为 了 表达 一 定 的 超 螺旋 \ 友 ) 对 不 同 DNA
分 子 的 影响 ,人 们 就 引入 超 螺旋 密度 (superhelix density) 概念 ，

AZ 一 了 一， 厂 为 松弛 态 DNA 的 连接 数

ie 2 dg 区
人

二 冤

图 4-31 DNA 的 电镜 图 (大 肠 杆菌 的 质粒 二 聚 体 )

_ 当 两 个 不 同 长 度 的 DNA 做 比较 时 , 代表 螺旋 和 超 螺旋 的 总 数 , 它 与 分 子 的 长 度 和 其 拓
扑 状态 两 者 都 有 关系 , 故 情况 比较 复杂 。 如 采用 ,由 于 它 仅 与 分 子 的 拓扑 张力 有 关 , 故 而 可 直
接 加 以 比较 。 现 在 ,已 测 得 从 细胞 和 病毒 粒子 分 离 到 的 DNA 的 超 螺旋 密度 介 乎 0. 05 一 0. 07
间 ,一 般 为 0. 05。

虽然 超 螺 旋 最 早 是 在 环 型 DNA 中 发 现 的 ,但 其 后 的 工作 证 明 线 型 DNA 也 是 超 螺旋 化

的 。 对 用 温和 方法 分 离 得 到 的 真 核 染 色 体 的 考察 指出 ,它们 的 DNA 沿 着 由 DNA- 结 合 蛋 白 组
成 的 支架 (scaffold) 形 成 许多 连续 的 环 状 区 域 。 每 一 个 环 中 的 DNA 独立 形成 超 螺 旋 和 具有 不
同 的 张力 ,支架 的 存在 可 以 防止 一 个 环 中 的 张力 传递 到 另 一 个 环 中 去 .从 果 蝇 的 巨大 唾液 染色
体 和 蝶 晨 的 环 状 灯 刷 染 色 体 所 获得 的 许多 证 据说 明 ,每 一 个 环 代 表 染 色 质 的 一 个 功能 单位 , 常

转录 出 一 个 或 更 多 的 长 RNA 分 子 。 现 已 查 明 ,染色 质 DNA 中 与 蛋白 质 结合 的 区 域 ( 称 为 支架

附着 DNA ,或 SAR DNA, 即 scaffold attached region DNA) 是 弯曲 的 ,这 表明 DNA 是 在 特定
的 区 域 与 蛋白 质 结 合 的 。

三 、 超 螺旋 的 意义

对 DNA 言 , 超 螺旋 是 普遍 存在 的 ,这 也 就 表明 了 它 的 重要 性 。
在 活体 中 ,DNA 的 结构 不 是 一 成 不 变 的 。DNA 的 各 种 构象 是 互 变 的 ,是 动态 的 DN 厦 的
这 种 结构 变化 对 它 的 功能 具有 重要 意义 .而 DNA 超 螺 旋 程 度 的 改变 介 导 了 这 种 结构 变化 。B-
DNA 是 一 种 能 力学 上 稳定 的 结构 , 超 螺旋 的 引入 就 提高 了 它 的 能 量 水 平 。 负 超 螺 旋 的 存在 会
影响 DNA 结构 变化 的 平衡 , 具 超 螺旋 的 DNA 能 实现 松弛 态 DNA 所 不 能 实现 的 结构 转化 。
已 如 前 述 , 大 多 数 DNA 的 超 螺旋 密度 约 为 一 0. 05, 这 相当 于 每 200 bp 存在 1 负 超 螺旋 ，
其 结果 就 赋予 DNA 分 子 以 约 37 681 JJ/mol 能 量 。DNA 的 超 螺旋 水 平 在 活体 中 是 重要 的 ,但

已 并 不 是 在 整个 DNA 分 子 中 都 是 均匀 的 。DNA 特定 区 域 中 超 螺旋 的 增加 有 助 于 DNA 的 结
86

构 转 化 .DNA 结构 变化 之 一 就 是 使 DNA 双 股 链 分 开 , 或 局 部 熔 解 。 超 螺旋 所 具有 的 多 余 的 能
量 被 用 于 碱 基 间 和 氢 键 的 断裂 。DNA 中 ,10 bp 的 分 离 大 约 需 50 241. 6 一 209 340 J/mol, 因此，
DNA 所 具有 超 螺旋 水 平 仅 是 分 离 很 少 几 个 碱 基 对 ,但 DNA 的 这 种 结构 上 的 变化 对 复制 、 转
录 等 的 启动 仍 很 重要 。

DNA 结构 变化 中 的 一 个 极端 例子 是 B-DNA 向 Z-DNA 的 转变 , 负 超 螺旋 有 利于 形成 乙
DNA。B-DNA 转化 成 Z-DNA 仅 发 生 于 特定 的 序列 处 ,在 连接 处 这 种 转化 涉及 到 右手 性 双 螺
旋转 变 为 左手 性 双 螺 旋 , 即 了 值 改 变 2。 所 需 的 自由 能 较 高 , 约 32 238.4J/mol, 以 后 每 延伸
1bp 对 仅 需 1884. 1 JJmol。

超 螺旋 不 仅 使 DNA 形成 高 度 致 密 的 状态 从 而 得 以 容纳 于 有 限 的 空间 中 ,在 功能 上 也 是
重要 的 , 它 推 动 着 结构 的 转化 以 满足 功能 上 的 需要 。

第 十 节 ”拓扑 异 构 酶

一 、 拓 扑 异 构 酶 的 分 类

细胞 内 存在 着 一 类 能 催化 DNA 拓扑 异 构 体 (topoisomer) 相 互 转化 的 酶 ,它们 称 为 拓扑 异
构 酶 (topoisomerase) 。 它 们 能 与 DNA 形成 共 价 结合 的 蛋白 质 -DNA 中 间 体 ,从 而 在 其 骨架 的
磷酸 二 酯 键 处 造成 特 时 性 的 裂口 ,使 DNA 的 多 核 苷 酸 链 得 以 穿越 ,结果 改变 了 分 子 的 拓扑 状
态 。 在 这 一 过 程 中 ,DNA 的 连接 数 虽 然 改变 了 ,但 其 核 苷 酸 序列 并 无 任何 变化 。 拓扑 异 构 酶 还
能 使 DNA 发 生 连 环 化 (catenate) 或 脱 连环 化 (decatenate) , 打 结 (knot) 或 解 结 (Cunknot ) 。

拓扑 异 构 酶 可 以 分 为 工 型 和 工 型 两 类 ( 表 4-4)。I 型 和 I 型 拓扑 异 构 酶 的 作用 不 同 。I 型
酶 在 DNA 的 一 股 链 产生 一 切口 ,从 而 使 另 一 股 链 得 以 穿越 ,而 工 型 酶 则 在 两 股 链 上 都 产生 一
切 日 ; 黄 结 果 是 ，I 型 酶 使 DNA 的 连接 数 每 作用 一 次 改变 1, 工 型 酶 则 使 连接 数 每 次 改变 2。
在 细胞 中 , 这 两 类 酶 的 活力 是 严格 调节 的 ,拓扑 导 构 酶 工 使 DNA 超 螺 旋 化 的 作用 为 拓扑 异 构
酶 工 使 DNA 松弛 化 的 作用 所 抗衡 ,从 而 使 DNA 的 超 螺 旋 程 度 保 持 在 适当 的 水 平 上 。 由 于
DNA 的 超 螺旋 程度 深刻 地 影响 着 机 体 的 活动 , 故 能 改变 拓扑 异 构 酶 活力 的 突变 常 是 致命 的 。

表 4-4 拓扑 异 构 酶 的 类 别 和 特性

性 质 上

原核 生物 : 真 核 生 物 ? 原核 生物 真 核 生物
被 切割 的 DNA 链 1 1 2 2
亚 基 分 子 量 (kD) 100 95 97,90 150
亚 基 数 单 体 单 体 AszBs 均 二 聚 体
对 ATP 的 需求 否 否 是 是
对 Mg 入 的 需求 是 否 是 是
依赖 于 DNA 的 ATP 酶 否 否 是 是
产生 负 超 螺旋 否 否 是 否
松弛 负 超 螺旋 是 是 否 ? 是
松弛 正 超 螺旋 否 是 是 : 是
连环 , 打 结 是 是 是 是

1. 大 肠 杆菌 topo I 和 topo I ;2. 酵母 topo 3 很 可 能 编码 特性 更 近似 大 肠 杆菌 的 [型 酶 ;3. 无 ATP 时 能 松弛 负 超 螺旋 ;
4. 借助 于 引入 负 超 螺旋 ,5. 要 求 双 股 链 之 一 具有 一 切口 。
87

二 .原核 拓扑 异 构 物

最 先 发 现 的 拓扑 异 构 酶 是 大 肠 杆 菌 的 ” 蛋 日 ， 它 能 使 超 螺 旋 DNA 松弛 。 以 后 在 其 它 细菌
和 真 核 细 胞 中 都 发 现 了 能 使 DNA 松弛 的 酶 ' 故 “ 蛋白 就 重新 命名 为 大 肠 杆 菌 拓扑 异 构 酶 1
(topo I) ,由 于 大 肠 杆 菌 中 能 使 DNA 超 螺旋 化 的 旋转 酶 (gyrase) 有 时 称 为 大 肠 杆菌 拓扑 异
构 酶 工 , 故 而 另 一 个 1 型 酶 就 称 为 大 肠 杆菌 拓扑 异 构 酶 下 。

拓扑 异 构 酶 的 作用 是 催化 DNA 骨架 中 磷酸 二 酯 键 的 断裂 和 重新 连接 。 与 其 它 的 酶 不 同 ，
它们 的 作用 并 不 导致 新 类 型 共 价 键 的 形成 ,而 是 在 多 核 背 酸 键 中 产生 一 入 时 性 的 断口 。 在 这 一
“过程 中 ,多 核 苷 酸 链 不 产生 游离 末端 ， 而 是 酶 本 身 共 价 结合 于 两 末端 之 一 (究竟 连接 于 3 或 5
端 则 依赖 于 特定 的 酶 ) .这 时 拓扑 异 构 酶 的 一 个 酷 氨 酸 残 基 即 连接 于 切割 产生 的 多 核 苷 酸 链 林
端的 磷酸 基 上 ,使 原来 贮存 于 磷酸 二 酯 键 中 的 目 由 能 得 以 保存 ,并 转 而 用 于 断口 的 重新 连接 。

(一 ) 大 肠 杆 菌 拓扑 异 构 酶
拓扑 异 构 酶 ! 是 分 子 量 约 100 kD 的 单一 多 肽 链 ， 含 3 一 4 个 为 其 活力 所 需 的 冬 原 了 。

拓扑 异 构 酶 I 的 松弛 活力 具有 如 下 特点 : 它 消除 DNA 的 负 超 螺旋 而 不 引起 DNA 发 生 其

它 改变 ;DNA 的 松弛 是 逐步 进行 的 ,磷酸 二 酯 键 的 自由 能 通过 形成 共 价 的 蛋白 -DNA 中 间 体
而 保存 并 转 而 用 于 链 的 重新 连接 , 它 不 需要 ATP 或 NAD 这 样 的 辅助 因子 。，
拓扑 异 构 酶 I 的 松弛 作用 机 制 大致 如 图 全 32。

连接 数 一 " 连接 数 一 n 十 1

一 一 >
穿越 断口 和
使 两 端 连接

图 4-32 I 型 拓扑 异 构 酶 作用 机 理 示 意图

拓扑 异 构 酶 I 首先 结合 于 DNA ,使 该 处 的 DNA 熔 解 ,随后 与 单 链 区 形成 酶 -DNA 复合
物 ; 切 割 DNA 双 股 中 的 一 股 ,切割 点 的 5'-P 形成 磷 栈 酯 氨 酸 键 ;DNA 的 一 股 链 穿越 切割 点 ;
断裂 的 链 重 新 连接 , 酶 被 释放 。

拓扑 异 构 酶 下 是 大 肠 杆菌 中 另 一 个 I 型 酶 , 单 体质 量 为 74kD, 但 它 似乎 并 不 是 必要 的 。

《二 ) 大 肠 杆 菌 的 旋转 酶

旋转 酶 有 时 也 称 为 大 肠 杆 菌 拓 扑 异 构 酶 工 , 它 使 松弛 的 双 股 环 型 DNA 转化 为 负 超 螺旋
DNA , 故 是 工 型 酶 。 它 的 亚 基 结 构 为 A;B,, 质 量 分 别 为 97 和 90kD。 亚 基 A 的 基因 &” 4 控
制 对 蔡 啶 酮 酸 Cnalidixic acid) 的 抗 性 , 故 过 去 曾 用 nal4 表示 ; 亚 基 B 的 基因 8yrB 由 于 与 在 豆

RR&

caperameea

霉 素 (coumermycin ) 的 关系 而 曾 表 示
为 cou。

旋转 酶 与 拓扑 异 构 酶 工 不 同 ,拓扑
异 构 酶 工 使 DNA 的 连接 数 每 次 改变
1 ,而 旋转 酶 则 每 次 改变 2( 图 4-33) 。

旋转 酶 使 DNA 超 螺 旋 化 的 步骤
为 : (1 ) 旋 转 酶 结合 于 DNA ,并 使 长 约
105 一 140bp 的 片段 按 正 方向 包 庄 目
身 ; (2) 在 包 庄 片段 的 中 心 附 近 切 割 ，
每 一 -断口 的 5 端 与 亚 基 A 的 Tyr 122
共 价 结合 ; 3) 接近 或 位 于 包 庄 片段 内
的 DNA 区 域 ,通过 亚 基 B 与 ATP 的
结合 而 穿越 断口 ; (4) 被 切 开 的 DNA
链 利用 蛋白 -DNA 复合 物 所 贮存 的 能
量 重新 闭合 ; (5)DNA 的 超 螺旋 化 依
赖 于 ATP 的 水 解 。 旋转 酶 的 亚 基 B 具
ATP 酶 活力 。 在 无 ATP 存在 时 ,旋转
酶 能 使 负 超 螺旋 DNA 松弛 。

4-33 ”由 旋转 酶 催化 的 DNA 超 螺 旋 化 示意 图
为 了 清晰 起 见 , 起 始 DNA 用 1 个 正 超 螺旋 代表 。

三 、 真 核 生物 拓 扑 异 构 酶
酵母 、 两 栖 动物 .昆虫 .哺乳 动物 和 植物 的 I 型 拓扑 异 构 酶 的 特性 相似 ,但 它 与 原核 生物 的

酶 有 明显 差异 。

真 核 生 物 拓扑 异 构 酶 I 是 质量 约 为 95 kD 的 单 体 蛋 白 。 虽 然 它 所 催化 的 反应 一 般 与 原核
生物 的 酶 相似 ,但 它 同样 能 使 正 ` 负 超 螺旋 DNA 松弛 。 松 弛 作用 不 依赖 于 ATP, 能 发 生 于 有
EDTA 存 在 的 条 件 下 ,Mg “能 提高 酶 的 活力 。 酶 通过 其 特定 Tyr 与 断口 的 3 了 连接 而 形成 中

间 体 , 这 与 原核 生物 酶 形成 于 5 P 端 不 同 。

I 型 真 核 生物 拓 扑 异 构 酶 为 150 一 180 kD 的 均 二 聚 体 ,能 以 同样 的 速率 松弛 正和 负 超 螺
旋 DNA ;但 与 原核 生物 酶 不 同 , 不 能 产生 负 超 螺旋 。 作 用 时 , 它 需要 ATP 和 Mg”。
原核 和 真 核 生物 拓扑 异 构 酶 都 参与 DNA 复制 、 转 录 和 重组 等 。

第 十 一 节 “染色 质 的 结构

染色 体 原来 是 指 真 核 细胞 染色 后 存在 于 核 内 的 着 色 物 体 。 它 只 存在 于 分 裂 中 的 真 核 细胞
内 。 在 非 分 裂 细胞 内 , 它 是 无 定形 的 ,并 弥散 于 核 内 ,只 是 在 有 丝 分 裂 前 才 形成 确定 的 形状 。 现
在 ,染色 体 已 被 普遍 用 于 指 存在 于 病毒 .细菌 、 真 核 细胞 及 其 细胞 器 内 所 含 的 核酸 分 子 。

DNA 属 生 物 大 分 子 。 例 如 叭 菌 体 的 DNA 含 48 502 bp, 同 时 DNA 与 病毒 粒子 的 长 度
相差 悬殊 ,为 17. 5 : 0. 19(pm) 。 对 原核 生物 的 大 肠 杆 菌 来 说 ,DNA 的 上 述 特点 更 为 明显 ,大

89

肠 杆菌 的 基因 组 为 双 股 环 型 DNA， 它 约 含 4. 7 六 10sbp, 周 长 约 1.7 mm 但 大 肠 杆 菌 的 长 度

约 2 pmy 即 前 者 约 为 后 者 的 850 倍 , 远 比 病毒 大 。 真 核 细胞 的 DNA 含量 又 比 原核 高 。 就 最 简 |

单 的 真 核 生 物 之 一 的 酵母 言 , 它 的 DNA 含量 为 大 肠 杆菌 的 4 倍 , 果 蝇 和 人 的 每 一 细胞 的
DNA 含量 约 为 大 肠 杆菌 的 25 和 600 倍 。 许多 植物 和 两 栖 动物 的 DNA 含量 更 高 ,还 有 一 点 应
指出 的 是 ,它们 都 是 线 型 分 子 , 即 长 度 更 大 。 但 真 核 细 胞 的 半径 一 般 在 10 一 30 pm 间 。 以 上 数
字 充 分 说 明 , 不 论 是 原核 还 是 真 核 生 物 的 DNA 都 不 是 直接 以 环 型 或 线 型 分 子 的 形态 存在 于
细胞 中 的 。DNA 必须 经 高 度 压 缩 ， 即 形成 一 定 的 高 级 结构 后 才能 装 人 类 核 和 核 内 。 过 去 讨论 过
的 DNA 超 螺旋 所 提供 的 压缩 倍数 显然 还 远 远 不 够 , 超 螺旋 DNA 还 进一步 形成 更 高 级 的 结构 。

二 、 核 小 体 是 DNA 在 细胞 内 存在 的 形态

虽然 游离 的 DNA 在 能 力学 上 趋向 于 形成 松弛 态 ,但 不 能 仅 因此 而 认为 天 然 的 DNA 是 松
池 的 。 事 实 上 ,所 有 原核 和 真 核 细胞 DNA 都 是 以 负 超 螺旋 形态 存在 的 。 第 九 节 已 指出 ,DNA

超 螺旋 可 以 两 种 拓扑 形式 存在 ,在 溶液 中 ,DNA 主要 以 相互 盘 绕 的 形态 存在 ,这 种 形态 较为 稳 “

定 ;在 细胞 中 ,DNA 主要 以 螺旋 管 形态 存在 ,DNA 通过 与 蛋白 质 结合 而 稳定 化 ,在 这 两 种 形态
中 ,螺旋 管 形式 对 DNA 的 压缩 所 起 的 作用 更 大 。

在 染色 质 中 ,与 DNA 相 结合 的 蛋白 质 为 组 蛋白 。 组 蛋白 是 二 类 较 小 的 、 荷 正 电 的 、 富 含 精
氨 酸 和 赖 氨 酸 的 蛋白 质 。 组 蛋白 是 已 知 的 最 为 保守 的 蛋白 质 中 的 一 种 。 组 蛋白 可 以 分 为 5 种
基本 类 型 ,分 别称 为 H1,H2A,H2B,H3 和 H4( 表 4-5)。

表 4-5 组 蛋 息

碱 性 氨基 酸 含量 (%)
Lys Arg
呈 I” 21. 13 223 29.5 1 汉
H2A* 13..96 129 10. 9 9.3
H2B* 13.774 125 16.0 6.4
3 155273 135 9.6 13:3
H4 11. 236 102 10. 8 3

“* ” 标 出 的 组 蛋白 的 大 小 ,在 种 间 稍 有 差异 , 表 中 给 出 的 是 牛 的 组 蛋白 。

染色 质 在 电子 显微镜 下 观察 时 呈现 为 由 10 nm 的 球状 颗粒 和 DNA 纤维 组 成 的 念珠 状 外
观 。 这 些 球状 颗粒 称 为 核 小 体 (nucleosome) , 核 小 体 间 的 DNA 称 为 接头 DNA(linker DNA)。
核 小 体 所 缔 合 的 DNA 约 为 200 bp( 对 不 同 的 机 体 和 组 织 言 ,DNA 的 量 约 在 150 一 250bp 间 变
动 ) .由 于 接头 DNA 易于 为 核酸 酶 所 作用 ,因此 , 当 染 色 质 以 微 球菌 核酸 酶 (micrococcal nucle-
ase) 等 轻微 处 理 后 ,染色 质 就 产生 一 系列 依次 相差 200 bp 的 长 度 不 等 的 DNA 片段 。 核 酸 酶 的
更 广泛 处 理 就 产生 高 度 被 保护 的 长 146bp 的 DNA 片段 。 这 一 DNA 片段 及 其 所 结合 的 组 蛋
白 称 为 核 小 体 核 心 颗粒 Cnucleosome core Particle) ,每 一 核 小 体 分 别 含 2 个 H2A，H2B，H3
和 H4, 称 为 组 蛋白 八 聚 体 (histone octamer) 和 一 个 当 接 头 DNA 降解 后 即 失 去 的 H1( 图 4-
3 到
X 射线 衍射 分 析 证 明 ,DNA 的 含 146 bp 片段 以 左手 性 螺旋 管 的 形态 包 庄 于 组 蛋白 八 聚
体 的 外 面 ( 图 4-34) 。 对 这 一 结构 的 仔细 观察 可 以 解释 ,虽然 真 核 细胞 不 含 能 产生 负 超 螺旋 的

酶 ,但 它 仍然 以 负 超 螺旋 的 形态 存在 .这 是 由 于 ，, 当 双 螺 旋 DNA 包 庄 于 组 蛋白 八 聚 体外 时 ，
90

类 别 分 子 量 (kD) 氨基 酸 残 基数

，

组 蛋白 八 聚 体

(146bpDNA 8 组 蛋白 》

< 和 迁移 距离

图 4-34 由 DNA 和 核 小 体 组 成 的 念珠 状 结构
〈1) 核 酸 酶 的 轻微 处 理 ;(2)? 凝 胶 电泳 ;!(3) 切 口 间距 离 。

DNA 必须 去 除 , 臣 螺旋 才能 完成 。 在 体外 ,组 蛋
和 白 核 心 与 松弛 态 DNA 的 结合 会 造成 一 负 超 螺
旋 , 但 这 一 过 程 显 然 不 需要 切割 DNA 链 , 而 是
以 另 一 处 正 超 螺旋 的 形成 为 补偿 的 (图 4-35) 。
与 原核 DNA 旋转 酶 不 同 , 真 核 生 物 酶 并 不 能
使 DNA 负 超 螺旋 化 ,但 能 使 正 超 螺旋 松弛 , 见
表 4-4。 现 已 在 实验 室 中 证 明 , 环 型 DNA 与 组
蛋白 结合 成 染色 质 时 ,拓扑 异 构 酶 是 必要 的 。 拓
扑 异 构 酶 使 核 小 体形 成 时 所 产生 的 正 超 螺旋 松
弛 ,使 整个 分 子 的 连接 数 降低 , 即 形成 负 超 螺
旋 。

DNA 与 组 蛋白 结合 成 核 小 体 的 另 一 个 重
要 因素 是 涉及 DNA 的 一 定 序 列 。 组 蛋白 核心
并 不 是 随机 地 结合 于 DNA 的 各 部 分 ,而 是 专
一 地 结合 于 特定 位 点 .DNA 上 核 小 体形 成 部 位
现在 还 不 完全 清楚 ,但 有 证 据 表 明 核 小 体形 成
于 DNA 中 富 含 AT 碱 基 对 处 ,在 该 处 DNA 的

小 沟 与 组 蛋白 核心 相 接触 (图 4-36) 。DNA 紧 紧 包 庄 组 蛋白 核心 就 使 该 处 的 小 沟 受 到 压缩, 显

然 AI 碱 基 对 有 利于 这 种 压缩 的 出 现 。

组 蛋 5

AL 三 0
结合 的
负 超 螺旋 (b)
非 结 合 的 SS

正 超 螺旋

拓扑 异 构 酶

AL 三 一 1

(c)
产生 一 负 超 螺旋

图 4-35 环 型 DNA 与 组 蛋白 结合 成 核 小 体

9

4-36 DNA 上 形成 核 小 体 的 位 置

在 很 长 一 段 时 间 内 ,人 们 一 直 认
为 细菌 DNA 与 真 核 DNA 不 同 , 它 是
裸露 的 ,并 不 束 紧 成 染色 质 样 的 结构 。
近年 来 ,由 于 采用 了 更 为 温和 的 方法 ，
人 们 已 在 大 肠 杆 菌 中 观察 到 了 形成 珠
状 小 束 的 凝集 状 染 色 体 , 并 由 此 提取
到 了 组 蛋白 样 的 碱 性 蛋白 .细菌 DNA
与 组 蛋白 样 蛋白 质 的 复合 无 可 置疑 地
说 明 ,DNA 为 了 发 挥 功能 就 要 规整 地
束 紧 。 从 这 些 蛋白 质 中 已 分 离 得 到 一
种 称 为 DNA- 结 合 蛋白 工 ( 也 称 为
HU 蛋白 ) 的 晶体 。 它 是 一 种 二 聚 体 ，
每 一 亚 基 的 分 子 量 为 9.5kD, 它 们 各
有 一 条 延伸 出 的 含 精 氨 酸 的 臂 。 精 氨
酸 在 生理 条 件 下 带 正 电荷 ,DNA 主 链
的 磷酸 基带 负电 荷 , 因 此 ,DNA- 结 合
蛋白 工 就 通过 静电 交互 作用 与 DNA
双 螺 旋 相 缔 合 。 关 于 DNA- 结 合 蛋 自
IL 和 DNA 在 复合 物 中 的 取向 ,现在

认为 大 致 旦 ,蛋白 质 二 聚 体 毗 连 地 分 布 于 DNA 的 一 侧 ,蛋白 质 的 另 一 端 则 通过 静电 作用 而 相

互 于 拢 ,结果 就 使 DNA 双 螺旋 发 生 弯曲 而 超 螺旋 化 。 这样 的 结合 就 使 蛋白 质 位 于 复合 体 的 内 |
部 (图 4-37)。 有 趣 的 是 ,所 有 天 然 存在 的 超 螺旋 DNA ,不论 其 来 源 ,它们 的 平均 超 螺旋 度 ( 即 |
每 10 bp 所 形成 的 超 螺旋 圈 数 ) 都 约 为 0. 05。 这 可 能 是 由 于 原核 和 真 核 细胞 中 染色 体 的 结构 是 |

十 分 相似 的 缘故 。

92

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DNA- 结 合 AAA 人 雇 天 Am 信 三 人
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4-37 大 肠 杆菌 的 DNA 与 DNA- 结 合 蛋白 亚 昌 谷 物

还 应 该 一 提 的 是 ,病毒 染色 体 不 论 在 细胞 中 增殖 或
包装 进 病毒 粒子 时 , 也 是 和 蛋白 质 复合 的 。SV40 的 病毒
染色 体 任 何 时 候 都 束 紧 在 24 个 含 组 蛋白 的 核 小 体 中 (图
4-38) ,它们 的 结构 与 宿主 细胞 中 的 一 样 。 当 与 蛋白 质 分
“ 开 时 ,SV40 DNA 就 呈现 为 超 螺旋 。 相 反 , 存 在 于 腺 病毒
粒子 中 的 DNA 并 未 与 组 蛋白 复合 。 这 些 兰 椎 动物 病毒
DNA ,通过 所 编码 的 一 种 独特 的 DNA- 结 合 蛋白 而 包装
进 莱 膜 中 。 可 是 , 当 腺 病毒 DNA 在 细胞 中 发 挥 作 用 时 ，
它 就 释放 出 自身 的 DNA- 结 合 蛋白 ,并 与 各 个 细胞 都 相
同 的 组 蛋白 结合 。 无 核 小 体 区

形成 核 小 体 是 染色 体 结构 的 一 个 层次 , 它 还 形成 更 图 上 38 SV40 的 含 组 蛋白 的 核 小 体
高 级 的 结构 ( 见 第 十 三 章 )。 染 色 体 的 这 种 高 级 结构 不 仅 ”图 中 的 无 核 小 体 区 位 于 复制 原点 附近 。
有 利于 DNA 装 人 核 中 ,并 且 还 有 着 功能 上 的 意义 。

第 十 二 节 ”一 些 DNA 序列 的 不 寻 第 结构

一 `DNA 二 级 结构 的 多 样 性

DNA 的 二 级 结构 一 度 认为 是 均匀 和 单调 的 ,可 是 现在 已 清楚 ,情况 并 非 如 此 ,DNA 的 二
级 结构 常 是 各 具 个 性 的 。 关 于 DNA 的 局 部 结构 ,第 八 节 已 有 论述 ,本 节 着 重 讨论 DNA 的 一 些
不 寻常 结构 (unusual structure ) 。

现在 已 证 明 ,DNA 的 有 些 序 列 会 形成 特定 的 结构 , 这 些 不 寻常 结构 不 是 完全 独立 于 B-
DNA 之 外 的 ,有 些 以 B-DNA 为 基础 ,有 些 由 B-DNA 转变 而 来 。 现 已 发 现 的 DNA 不 寻常 结
梅 ,如 前 已 讨论 过 的 Z-DNA ,十 字形 结构 , 单 链 遥 泡 (single stranded bubble) 弯曲 外 ,还 有 三 链
DNA 四 链 DNA 等 。

DNA 的 不 寻常 结构 是 以 一 定 的 DNA 序列 为 基础 的 。 例 如 ,交替 的 术 啶 、 味 叭 重复 序列 倾
疝 形 成 ZLDNA , 反 向 重复 序列 倾向 形成 十 字形 结构 ,构成 镜像 重复 的 同型 旷 啶 -同型 味 叭 序列
可 能 形成 三 链 结构 ,而 富 含 G 的 序列 可 能 形成 四 链 结构 等 .这些 结 构 的 存在 对 DNA 发 挥 其 功
能 有 着 重要 意义 。 也 有 些 不 寻常 结构 是 在 生命 过 程 中 形成 于 分 子 间 的 。 例如, 当 二 条 具 互 补 序
列 的 RNA 与 双 链 DNA 的 一 股 链 配对 ; 另 一 股 链 就 被 游离 成 单 链 环 , 从 而 形成 人 - 环 。 转 录 过
程 中 会 出 现 R- 环 。D- 环 是 由 双 链 DNA 与 另 一 DNA 链 形成 的 。D- 环 形成 于 哺乳 类 线粒体
DNA 的 复制 中 ,也 是 遗传 重组 中 由 大 肠 杆菌 的 RecA 蛋白 等 所 催化 形成 的 。Holliday 结构 是
遗传 重组 中 的 重要 中 间 体 , 它 由 4 条 DNA 链 组 成 (图 4 39)。 两 个 DNA 双 螺 旋 的 碱 基 可 以 通
过 连接 部 而 配对 并 堆积 。 以 上 的 分 子 间 的 不 寻常 结构 是 夭 DNA 间 的 同 源 序列 形成 的 。

DNA 的 不 寻常 结构 的 能 量 水 平常 高 于 B-DNA, 它 的 形成 常 夭 DNA 的 负 超 螺旋 来 推动 。
如 DNA 的 单 链 肛 泡 就 是 负 超 螺旋 DNA 张力 的 一 种 分 布 形式 。DNA 分 子 中 最 先 发 生 变性 的
常 是 含 较 多 AT 的 区 域 , 如 这 些 片 段 含 反 向 重复 序列 , 则 这 些 区 段 的 变性 就 可 能 形成 十 字形 结
构 ( 图 4-40) 。 十 字形 结构 的 碱 基 , 除 环 中 的 少数 几 个 外 都 是 完全 配对 的 。 因 此 ,十 字形 结构 的
形成 过 程 中 , 氢 键 的 减少 并 不 多 , 超 螺旋 度 稍 有 减少 即 足以 提供 其 所 需 的 能 量 。 但 这 不 足以 说

98

明 十 字形 结构 在 细胞 中 一 定 存在 ,这 是 一 个 还 有 争论 的 问题 ,因为 这 一 转变 可 能 在 能 力学 上 是
可 行 的 ,在 动力 学 上 却 是 禁忌 (kinetically forbidden) 的 。

图 4-39 Holliday 结构
图 的 左 方 表示 为 平面 构象 , 右 方 用 两 个 平行 螺旋 表示 ,图 中 的 箭头 表示 分 支 迁移 。

图 4-40 DNA 分 子 中 十 字形 结构 的 形成

Z-DNA 的 形成 也 常 利用 超 螺旋 的 高 能 态 。Z-DNA 是 含 12 bp 重复 的 左手 性 双 螺旋 结构 。

过 去 认为 ,重复 的 CG 或 TA 对 形成 ZDNA 是 必要 的 。 现在 发 现 这 一 条 件 并 不 是 严格 的 ,高 达

8 个 的 TA 如 以 CG 重复 为 两 愤 时 ,也 能 形成 左手 性 螺旋 ,只 是 比 纯 CG 序列 需要 更 多 的 能 量 。

适当 的 序列 在 超 螺旋 DNA 张力 的 诱导 下 也 能 形成 Z-DNA.Z-DNA 是 左手 性 螺旋 ,而 B-DNA

是 右手 性 螺旋 ,B~>2Z 的 转变 降低 了 分 子 的 螺旋 臣 数 人 (T)。 如 1. 2 熙 的 右手 性 螺旋 (12 bp) 转 变

为 1 臣 左 手 螺 旋 ,7 值 约 改变 2。 由 于 工 保持 不 变 , 故 酌 就 升 高 2, 即 负 超 螺旋 减少 2。B->2Z 的

转变 是 协同 性 过 程 ,B-DNA 和 2Z-DNA 间 的 连接 部 构成 了 这 一 过 程 的 能 障 Cenergy barrier ) 。

Z-DNA 片段 的 稳定 性 是 随 其 长 度 的 增加 而 提高 的 。B-DNA 向 Z-DNA 的 转变 需要 有 足够 的
能 量 来 克服 连接 部 构成 的 壁 驹 。

许多 不 寻常 结构 的 形成 与 DNA 超 螺旋 值 之 间 存 在 着 类 似 的 关系 , 这 种 关系 可 能 与 基因

表达 的 调控 有 关 。 蕊
二 、 三 链 DNA
早 在 1957 年 ,人 们 就 发 现 一 股 含 味 叭 ; 另 一 股 含 喀 啶 的 双 股 多 核 苷 酸 ,在 体外 能 够 形成 三
链 DNA。 可 是 由 于 当时 未 能 获得 它 可 能 存在 于 体内 的 证 据 , 故 这 一 发 现 沉 家 了 30 年 。1987

年 ,Mirkin 发 现 ,一 种 质粒 DNA 在 酸性 溶液 中 能 形成 三 螺旋 DNA .从 此 以 后 ,这 一 领域 的
94

镜像 重复

了 EECEAFCUGRGICTTIADA

研究 才 逐 渐 受 到 人 们 的 重视 。 人 们 不 仅 发 现在 接
近 生 理 条 件 下 能 形成 三 链 DNA ,并 且 也 发 现在 真
核 生物 DNA 中 存在 能 形成 三 链 DNA 所 需 的 同
型 味 叭 -同型 喀 喧 序列 ,其 含量 可 高 达 1%% 。 此 外 ，
也 发 现 了 其 它 的 证 据 。 三 链 DNA 中 的 第 三 股 链
可 来 自分 子 内 ,也 可 来 自分 子 外 。

含 CTC),， 和 (AG), 这 样 的 同型 喀 啶 和 同型 嘲
叭 ,并 形成 镜像 重复 (mirror repeat ) 的 序列 (图 4-
41)。 在 低 pH 条 件 下 能 形成 分 子 内 的 三 链 DNA，

AaATCGTGCOACGAT

反 向 重复
TTAGCACCACGATT

和
ArATC2GoRiGoGaT GCT A7A

图 4-41 镜像 重复 和 反 向 重复

CHa3

三 链

4-42 三 链 DNA 的 形成 和 Hoogsteen 碱 基 配 对

官 是 由 双 链 PNA 拆 开 后 产生 的 多 涌 喀 喧 链 回 折 。 5 和 人 T 人 人 TECN
并 网 入 剩 下 的 双 链 DNA 的 大 沟 中 形成 的 (图 4- 3-C-TA-6-6-A-A-6-6-6-A-6-A-A-G-6-6-6-6、 |
42)。 在 三 链 DNA 中 ,原来 两 股 链 的 走向 是 反 平 全 区 和 的
行 的 ,其 碱 基 通 过 Watson-Crick 方式 配对 , 位 于 ee
大 沟 中 的 多 聚 喀 喧 链 则 与 双 链 DNA 中 的 多 聚 呆 机
聆 链 成 平行 走向 , 碱 基 则 按 Hoogsteen 方式 配对 1

并 形成 TAT,CGC 三 联 体 。 在 后 一 配对 方式 中 ，
多 聚 喀 啶 链 中 的 胞 喀 啶 残 基 必 须 先 与 H+ 结 合

T
《质子 化 ) 才 能 与 鸟 叮 叭 配对 。 这 也 就 是 HDNA At
A 1

命名 的 由 来 。 在 形成 三 链 DNA 过 程 中 游离 出 来
的 多 聚 厌 叭 链 则 保持 单 链 状 态 。 故 三 链 DNA 对
Sil 核酸 酶 的 作用 敏感 。 由 于 三 链 DNA 含有 镜像
重复 , 故 可 以 形成 两 种 异 构 体 :一 是 多 聚 味 聆 链 的
5 部 分 成 单 链 ; 另 一 是 3' 部 分 成 单 链 (图 4-43)。
三 链 DNA 的 形成 也 可 由 负 超 螺旋 的 改变 驱

A
6
“6-6-6-6-A-A-6-A-6-6-6”

A”

AAA

!
(
下

T
1 1
TeA
1 1
Ce6
1 1
区 5

图 4-43 H-DNA 的 两 种 异 构 体

95

动 , 随 着 负 超 螺旋 的 增加 ,即使 在 中 性 条 件 下 DNA 中 31 核酸 酶 的 超 敏 位 点 也 能 形成 。
现在 ， 已 经 在 基因 的 调节 区 和 染色 体重 组 热点 分 离 到 能 在 离 体 条 件 下 形成 三 链 DNA 的 ，
序列 。 这 提示 它们 在 基因 表达 中 的 可 能 作用 , 当然 ,这 还 待 进一步 的 直接 证 据 予 以 证 实 。

三 、 端 粒 DNA 的 结构 一 一 四 链 DNA

端 粒 (telomere) 是 真 核 染色 体 的 末端
序列 . 端 粒 的 生物 学 功能 是 保持 染色 体 的 稳
定 , 它 决定 着 细胞 的 寿命 。 线 型 DNA 复制
长 期 来 存在 的 一 个 问题 就 是 它 的 末端 是 如

(Ge 二 这 二
一人》
及 丁丁 硕 而 高 起

《CA 2

何 复制 的 .DNA 的 复制 需要 RNA 引物 ,而
引物 随后 被 降解 ,其 结果 就 使 子 代 DNA 的 全
5' 端 逐步 缩短 , 端 粒 DNA 的 结构 及 其 复制 染色 体 DNA / 庆 2
的 痔 明 为 解决 这 一 问题 葛 定 了 基础 。 殉

与 生物 的 多 样 性 不 同 , 端 粒 DNA 厅 7
列 和 结构 却 是 类 似 的 。 端 粒 DNA 主要 是
由 一 段 十 分 简单 和 串联 重复 的 序列 组 成 。 “一 从 所 名
例如 ,人 和 其 它 关 椎 动物 等 的 端 粒 重复 单位
为 AGGGTT ,纤毛 原 生动 物 四 膜 虫 的 重复 图 4-44 真 核 染 色 体 的 端 粒
单位 为 GGGGTT 和 GGGGTTTT ,面包 图 下 部 表示 染色 体 未 端的 端 粒 蛋白 (用 空白

YL_ 和 和 斜 线 标 出 员 ) 站 圆圈 ) 。
酵母 等 的 重复 单位 为 GT 和 Gi_sA。 它 未 出 的 机 圆 形 ) 和 核 小 体 (空白 圆圈

们 的 共同 特点 是 富 含 G, 它们 的 长 度 可 达 几 百 到 几 千 碱 基 对 。

端 粒 DNA 的 序列 具有 一 定 的 取向 特征 。 在 每 一 染色 体 末端 , 富 含 G 的 一 股 链 由 5 向 3--
未 端 延伸 ,并 突出 于 互补 的 富 含 C 一 股 链 12 一 16 核 苷 酸 (图 4-44)。 染 色 体 的 末端 与 特定 的 蛋
白质 形成 复合 物 。

现 已 证 明 , 端 粒 或 类 似 端 粒 的 寡 聚 核 苷 酸 在 实验 室 条 件 下 能 形成 多 种 G 一 G 碱 基 配对 形
式 。 例如 , 短 的 如 端 粒 DNA3'- 未 端 那样 的 12 一 16 bp 突出 序列 能 够 形成 回 折 结 构 ( 图 4-45 b)，
它们 可 能 是 通过 碱 基 间 的 非 标 准 配对 形成 的 。 较 长 的 富 含 G 的 序列 可 能 形成 G 的 四 链 DNA
(图 4-45 c, d) 。 在 这 样 的 结构 中 ,G 形成 一 种 四 联 体 ,相互 间 通 过 Hoogsteen 方式 结合 ,并 为

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R 下 有

图 4-45 富 含 G 的 端 粒 序 列 形成 的 不 寻常 结构
a 为 单 链 形式 ;b 为 回 折 形 成 的 结构 ic,d 为 所 形成 的 四 链 结构 je,G- 四 联 体 。
96

K+ 或 Na+ 所 稳定 (图 4-46) ,四 联 体 再 上 下 堆积 。
端 粒 DNA 究竟 具有 何 种 结构 有 待 更 深入 地 研究 才能 确定 .关于 端 粒 DNA 的 复制 则 将 在
第 五 章 中 讨论 。

四 .DNA 序列 与 遗传 信息

DNA 是 遗传 信息 的 载体 。 但 它 载 有 哪些 遗传 信息 和 又 怎样 荷载 这 些 遗 传 信息 呢 ? 这 确 是
一 个 值得 而 又 必须 提出 的 问题 。

长 时 期 来 ,人 们 认为 DNA 所 携带 的 遗传 信息 主要 是 通过 编码 蛋白 质 体 现 的 。 但 编码 蛋白
质 的 序列 仅 占 真 核 DNA 的 很 小 一 部 分 。 这 是 否 表明 DNA 的 其 它 序 列 都 是 无 用 的 呢 ? 两 方面
的 证 据 终于 使 这 一 问题 的 答案 露出 了 端倪 。 一 是 原核 生物 基因 表达 调控 中 阻 遏 物 是 和 DNA
中 的 特定 序列 (操纵 基因 ) 结 合 的 ,这 种 结合 具有 特异 性 ;二 是 DNA 具有 依赖 于 序列 的 精细 结
构 ( 见 第 八 节 )。 这 说 明 DNA 的 一 些 序列 可 能 与 基因 表达 的 调控 有 关 。 事实 真是 这 样 。 对 真 核
生物 尤其 是 这 样 , 因为 真 核 生 物 是 多 细胞 的 , 它 的 机 体 是 按照 一 定 的 时 空 程序 生长 .发 育 的 ，
DNA 的 许多 序列 都 与 此 有 关 。 按 照 一 定时 空 程 序 的 生长 发 育 无 疑 属 遗 传 信息 ,因此 ,DNA 所
携带 的 遗传 信息 至 少 包括 两 方面 :一 是 规定 体现 生物 机 体 功 能 的 各 种 蛋白 质 结构 的 信息 (有 蛋白
质 基 因 ), 另 一 是 规定 基因 选择 性 表达 的 信息 。 这 两 类 信息 的 性 质 不 同 ,方式 也 不 同 。

对 和 蛋白 质 基 因 来 说 ,DNA 的 核 苷 酸 序列 通过 mRNA 规定 蛋白 质 的 氨基 酸 序 列 , 两 者 为 线
性 关系 ,同时 信息 的 转换 要 通过 蛋白 质 基 因 以 外 的 因子 ,如 tRNA、 核 糖 体 等 来 完成 。 而 有 关 基
因 表达 调控 的 信息 则 与 此 不 同 , 它 是 通过 DNA 有 关 序 列 所 形成 的 特异 性 结构 与 有 关 蛋 白质
因子 的 结合 来 体现 的 。

这 一 领域 正在 成 为 分 子 生 物 学 发 展 的 一 个 重要 前 沿 。

第 十 三 节 DNA 的 限制 图 谱 和 序列 分 析

DNA 的 核 苷 酸 序列 是 其 结构 和 功能 的 基础 ,因此 ,序列 分 析 就 成 了 分 子 生物 学 的 一 项 重
要 的 基础 工作 。 不 过 ,这 一 工作 只 是 在 发 现 限制 性 内 切 酶 和 DNA 重组 技术 及 电泳 技术 得 到 长
足 进 步 后 才 获得 现实 意义 。

一 、 限 制 性 内 切 醇

限制 性 内 切 酶 restriction endonuclease) 的 发 现 是 分 子 生物 学 发 展 中 一 个 重大 事件 , 它 对
核酸 研究 做 出 了 重大 贡献 。

在 很 长 时 间 内 ， 人 们 认为 所 有 的 核酸 内 切 酶 相对 而 言 都 是 非 专 一 一 性 的 。 然 而 不 久 前 在 原核
细胞 内 发 现 了 一 类 新 的 核酸 内 切 酶 ， 它们 仅 切 断 特 定 序列 中 的 磷酸 二 酯 键 , 这 些 酶 称 为 限制 性
内 切 酶 。

当 一 种 外 来 DNA 进入 细菌 的 细胞 ， 它们 就 会 被 其 中 的 核酸 酶 破坏 ， 但 细菌 自身 的 核酸 却

会 受到 这 些 酶 的 作用 。 这 是 细菌 对 和 人 侵 DNA 可 能 干扰 其 遗传 信息 的 一 种 防卫 . 这 一 过 程 涉
二 自身 DNA 的 识别 和 外 来 DNA 的 降解 ,这 称 做 限制 -修饰 系统 (restriction-modifica-
tion system ) 。 限制- 修饰 系统 最 早 是 由 鸣 菌 体 的 感染 效应 发 现 的 :由 一 种 细菌 释放 的 喉 菌 体能 够
感染 同 种 的 细菌 ,但 不 能 感染 其 它 种 的 细菌 , 因为 它们 在 进入 后 者 细胞 后 即 被 破坏 (限制 ) 了 。

97

限制 性 内 切 酶 大 致 可 分 为 两 大 类 .这 两 类 限 表 4.6 ”两 类 限制 性 内 切 栈
制 性 内 切 酶 的 主要 区 别 在 于 :类 型 工 的 限制 修一， ya 类 和 1

饰 系统 由 两 种 酶 组 成 ,限制 酶 仅 使 DNA 降解 ， -要 解 ， 随机 位 点 专 二 性
而 DNA 的 修饰 由 另 一 种 甲 基 化 酶 承担 ;类 型 I 产 约 异 质 的 专 一 片段
的 这 两 种 活力 存在 于 同一 酶 分 子 上 。 不 仅 如 此 ， ee 人
两 类 酶 的 产物 ,辅助 因子 等 也 都 不 同 ( 表 4-6)。 。 对 SAM 的 需求 是 得
类 型 工 限 制 -修饰 系统 中 的 甲 基 化 酶 能 使 《对 ATP 酶 的 依赖 是 否

细菌 自身 DNA 的 专 一 性 腺 味 叭 或 胞 喀 啶 残 基
甲 基 化 。 这 些 高 度 专 一 的 甲 基 化 酶 与 原核 细胞 中 生成 mcC 和 m'A 的 较为 通用 的 甲 基 化 酶 不
同 ,它们 仅 识 别 和 使 特定 序列 中 的 有 关 碱 基 甲 基 化 。 这 样 经 过 甲 基 化 的 DNA 就 能 被 细胞 中 的
限制 酶 所 识别 而 免 遭 降解 。DNA 的 甲 基 化 和 切割 都 发 生 在 其 分 子 的 识别 序列 中 , 亦 即 限制 酶
表 4-7 不 同 限制 性 内 切 酶 的 识别 序列
酶 识别 位 点 酶 识别 位 点

对 称 轴 对 称 轴

箭头 表示 切割 位 点 :Pu 一 嘎 叭 ,Py 一 喀 啶 。 所 有 序列 上 方 一 股 的 5 端 在 左 侧 。
98

和 甲 基 化 酶 都 结合 于 同一 序列 上 。 不 同 限制 酶 的 识别 序列 不 同 。 因 此 ,一 种 特定 的 细菌 仅 能 获
得 针对 其 自身 限制 酶 的 保护 ,而 不 能 免 受 具 不 同 识别 序列 的 限制 酶 的 切割 .类 型 工 限制 酶 对 核
酸 研究 特别 有 用 。

类 型 工 限 制 酶 的 识别 序列 常 是 一 组 含 4 一 6 核 背 酸 的 回 文 序列 ( 表 4-7) ,少数 可 达 8 核 昔
酸 。 这 种 序列 显示 出 二 重 对 称 性 ,如 ;

TTCGAA 巡 呈
这 种 序列 ,如 绕 其 中 心 转动 180*, 它 的 碱 基 顺 “ASASCSCSNCNCMORCSCSCSASOS

序 完 全 相同 .由 于 这 种 对 称 性 ,两 股 链 上 的 碱 基 都 可 ANONONONONONONONONONONOSN
被 甲 基 化 ; 同样 限制 酶 亦 引起 DNA 双 股 的 断裂 ,并
且 几 乎 是 同时 发 生 的 。 识 别 序列 并 不 总 是 连续 的 , 它 Rose 六 志
们 可 以 为 一 个 或 更 多 的 非 专 一 性 碱 基 隔 开 。 细 胞 中 ， 。 2
DNA 靶 位 点 可 以 是 全 甲 基 化 、. 半 甲 基 化 和 非 甲 基 化 ASOSCNCNCNCSONCNCNCRNONON
的 。 对 于 这 些 靶 位 点 , 甲 基 化 酶 和 限制 酶 的 作用 不 ANA SOSOSeS
同 。 故 其 命运 也 不 同 (图 4-46)。 甲 基 化 酶 和 限制 酶 NINYNYS 和 2Zsv
对 全 甲 天 化 的 识别 序列 都 不 作用 ;限制 酶 对 半 甲 天。 AAANNANANAA 人 AAA
化 序列 虽 不 作用 ,而 甲 基 化 酶 则 可 使 其 进一步 甲 基
化 生成 全 甲 基 化 序列 ,这 样 就 保证 了 复制 成 的 半 甲
基 化 序列 不 被 降解 。

限制 酶 对 DNA 的 切割 点 一 般 都 位 于 识别 序列 内 。 多 数 情况 下 ,DNA 两 股 链 的 切割 位 点
偏离 识别 序列 的 中 心 , 故 酶 作用 的 结果 会 产生 单 股 尾巴 ,这 些 单 股 尾巴 如 并 列 放置 ,相应 的 碱
基 间 就 通过 氢 键 而 缔 合 , 故 它们 称 为 粘性 未 端 (cohesive end) 。 有 些 酶 沿 同一 位 点 切割 双 股 链 ，
结果 就 产生 平整 未 端 (blunt end) (图 4-47)。 也 有 一 种 情况 是 :两 种 不 同 的 酶 虽 结合 于 相同 的
识别 序列 ,但 在 不 同 的 核 苷 酸 间 进行 切割 ( 即 切 点 不 同 ) 。 迄 今 发 现 的 识别 序列 中 ,G 和 C 常 占
优势 。 这 一 情况 的 存在 是 否 由 于 鸟 味 吟 和 胞 喀 啶 残 基 间 具 有 较 强 的 配对 能 力 则 尚 不 清楚 。 近
来 ,发 现 了 一 种 其 识别 序列 全 由 AT 残 基 (TTTAAA) 组 成 的 酶 (4ha IE )。

|
SETCECXIIAAGCTTCEcEA ,Ed .52TGCGATA AGCTTCCCA . .
.. .ACGCTATTCGAAGGGT . ，. .….ACGCTATTCGA AGGGT .
二 |

|
IIRTRECEC GecTA…… 万 DO0I.'……cTTCCCGTT AACGGTA
:…GAAGGG GECAT .…， “GAAGGGCAA FTEGEEAT :ie

(6)3wi |

-图 上 上 46 DNA 中 甲 基 化 和 非 申 基 化 序列
* 表示 甲 基 化 位 点 。，

图 4-47 DNA 片段 的 两 种 酶 切 末端
由 4 种 碱 基 所 形成 的 某 一 组 合 要 每 几 百 碱 基 对 才 可 能 遇 到 一 次 ,而 6 种 碱 基 对 的 特定 组
合 则 需 几 千 碱 基 对 才能 出 现 一 次 。 因 此 ,限制 性 内 切 酶 切割 所 产生 的 DNA 片段 都 具 特 定 的 长
度 。 例 如 ,EcoR I 的 含 6 bp 的 识别 序列 在 SV40 DNA(5 243 bp) 中 仅 出 现 一 次 ,而 五 zzdE 则 可
在 5 处 切割 SV40 DNA。 此 外 ,存在 于 一 种 DNA 中 的 序列 在 另 一 种 DNA 中 常常 缺 如 。 例 如 ，
T7 喉 菌 体 DNA(39 936 bp) 甚 至 完全 不 含 EcoR I 的 识别 序列 。

99

由 限制 性 内 切 酶 产生 的 是 DNA 的 特异 性 片
段 。 这 些 片段 对 建立 DNA 的 限制 图 谱 和 重组 体
等 都 十 分 有 用 。

经 限制 性 内 切 酶 作用 所 产生 的 酶 切片 段 可 以
方便 地 通过 琼脂 糖 凝 胶 电泳 分 离 。 在 琼脂 糖 凝 胶
中 ,DNA 片段 的 迁移 速率 依赖 于 它们 的 长 度 , 迁
移 的 距离 随 片段 长 度 的 增加 而 减少 。 电 泳 后 ，
DNA 的 位 置 可 藉 溴 乙 锭 处 理 而 显现 为 可 见 的 条
带 。DNA 片段 的 大 小 则 可 通过 已 知 分 子 量 DNA
的 对 照 而 确定 (图 4-48)。 分 离 后 的 DNA 片段 可
以 活性 形态 回收 。

人 DNA

Zind 开 消化 产物
碱 基 对

-二 一 23130

-419
557

人 4371

3322
-人 2028

图 448 DNA 酶 切片 段 的 琼脂 糖
凝 胶 电 泳 分 离

二 .DNA 的 限制 图 谱

DNA 限制 酶 切片 段 沿 染色 体 或 染色 体 片段 的 依次 排列 称 做 限制 图 谱 (restriction map) 。
酶 切片 段 可 用 选 定 的 限制 酶 处 理 待 测 DNA 获得 ,然后 通过 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 , 并 根据 泳 动
距离 推算 各 自 的 分 子 量 ( 泳 动 距 离 与 分 子 量 的 对 数 成 反比 ) .第 一 张 这 样 的 限制 图 谱 就 是 Eizd
I ,已 zzd 开 以 及 EcoRI 这样 的 限制 酶 处 理 SV40 DNA 获得 的 (图 449)。FcoR 1 在 SV40
DNA 上 只 有 一 个 切 点 , 故 它 使 DNA 由 环 型 转变 为 线 型 ,图 中 标 出 的 零点 即 是 酶 的 切 点 。 所 得
的 线 型 病毒 DNA 再 依次 由 EEzzdI ,ErizdE 处 理 而 降解 成 11 个 片段 。DNA 片段 的 依次 排列
是 通过 DNA 的 不 完全 彻底 酶 解 所 得 各 个 片段 来 实现 的 ,不 完全 酶 解 所 得 的 片段 数 少 于 完全
酶 解 的 ,而 多 数 片段 的 分 子 量 则 大 于 后 者 ,由 于 酶 在 DNA 上 的 切 点 是 固定 的 ,因此 , 酶 切片 段
间 必 然 会 出 现 固定 的 重 春 区 。 根 据 这 些 重 蚕 区 ,完全 酶 解 的 片段 就 可 沿 染色 体 片段 依次 排列 。
由 不 同 限制 酶 得 到 的 图 谱 是 不 同 的 ,最 初 使 用 的 常 是 那些 对 待 测 DNA 的 切 点 较 稀 少 的 限制

酶 ,因为 这 样 可 产生 较 少 的 便于 分 离 的 片段 。

EcoRI

Hipndll 二 咒

B
Hpnd1l ”一 | 一 -一
Hindl “一 -一
Hpa 1 全 全 人 秆 生生 人 仆 |

Hpa 1 一
A B 人 A
有 ha 一
B C DAN A E KFiaMFib H F。GJ B
ae 证
A F 下 HKL CN EGG DUOLE J> A
Eco RI

[一
图 谱 单 位 ”0 各 10700037 00 0 900E790.8 029-1.0

碱 基 对 0

530 1060 1590 2120.， 2650 3180 3710 4240 4770 5300

图 4-49 SV40 基因 组 的 限制 图
ZeoRI 对 SV40 DNA 只 有 一 个 切 点 , 它 使 SV40 DNA 转变 为 一 线 型 分 子 。 为 了 便于 与 其 它 限制 酶 切片 段 做 比
较 , 故 把 酶 切片 段 从 EcoR ! 的 切 点 (作为 0 点 ) 开 始 展现 为 开 环 型 。 每 一 直线 各 代表 不 同 酶 的 切 点 和 形成 的 片段 。

1]100

酶 的 识别 位 点 在 DNA 中 的 多 寡 决 定 所 产生 的
酶 切片 段 的 数量 。 对 长 DNA 言 , 人 们 和 希望 找到 在 该
DNA 中 识别 序列 较 少 的 酶 ,以 免 酶 切片 段 过 多 。 现
在 已 可 通过 巧妙 利用 两 种 高 度 专 一 性 的 甲 基 化 酶 为
限制 酶 Don I 构建 包括 8 和 10bp 的 人 为 延长 的 识
别 序 列 。 这 种 人 为 延长 的 识别 序列 大 大 方便 了 工作
的 开展 ,因为 即便 是 8bp 的 识别 序列 在 DNA- 中 至
少 也 要 每 65 000(4 )bp 才 有 机 会 遇 到 一 次 , 故 延 长
的 识别 序列 就 可 能 使 一 个 很 大 的 DNA 分 子 仅 断 裂
成 较 少 的 片段 。 构 建 这 种 人 为 延长 的 识别 序列 之 所
以 成 为 可 能 是 由 于 利用 了 限制 酶 Pen I 的 一 种 独特
性 质 , 即 它 仅 切割 含 甲 基 化 腺 味 叭 的 限制 位 点 。

G= ARTC
AAA

因此 , Dpon I 一 般 不 能 切割 大 多 数 生物 的 DNA( 例
如 , 肴 椎 动物 DNA)。 但 这 种 DNA 如 以 一 种 其 识别
序列 与 Doz I 的 识别 序列 相 重 合 的 甲 基 化 酶 处 理 ，
DNA 分 子 中 适当 的 腺 味 叭 残 基 就 被 甲 基 化 ,这 样 的
序列 也 就 随即 可 为 Don I 所 作用 .例如 ,M.Tac 工 能
使 识别 序列 中 顺 向 重复 的 TICGA 发 生 甲 基 化 ,从 而
产生 一 个 含 8 bp 的 Dpm I 识别 序列 (图 4-50) 。M.

5 -TCGATCGA
AGCGCTAGCT-5/
| 甲 基 化 本
ENET APCtm 人
AOLC 工 -5
| 眼 制 性 内 切 本
5 下 CC 全 SAESO RS 人 人 m 人
mAGC ESNENSOCASC 工 -5/
5EATECGCATCGAT-3:
SEAGTLRAGCTA25/
| 甲 基 化 本
EROGCEAS RNGGATE3/
二 5
| 限制 性 内 切 本
5'-TCGmAT-3'
ANAGGC 下 AE5:

(a)

5 -A TCGPA-3-
下 AGC 5

(by)

图 4-50 人 为 延长 的 限制 酶 识别 序列
(\a) 含 8 bp 的 延长 识别 序列 ;
\b) 含 10 bp 的 延长 识别 序列 。

CiaI 可 以 识别 两 个 部 分 重 本 的 AITCGA 序列 ,并 使 其 甲 基 化 , 故 从 而 构建 出 含 10 bp 的 Dpn 1

识别 序列 (图 4-50) 。

这 种 实际 上 很 稀少 的 识别 序列 对 构建 含 多 于 10 bp 的 DNA 的 限制 图 谱 是 十 分 有 用 的 。
虽然 直至 不 久 前 ,人 们 还 无 法 分 离 这 些 构建 的 识别 位 点 所 产生 的 很 大 DNA 片段 。 但 现在 ,由
于 采用 琼脂 糖 凝 胶 脉 冲 电泳 ,高 至 10"` bp 的 DNA 也 可 进行 常规 处 理 了 .现在 大 肠 杆 菌 染 色 体 (4 久
10 bp) 已 经 被 裂解 为 20 个 片段 , 它 的 限制 图 谱 可 望 即将 完成 。

三 .DNA 的 序列 分 析

随 着 限制 性 内 切 酶 的 发 现 和 DNA 重组 技术 的 建立 , 紧 接着 就 出 现 了 两 种 确定 DNA 片段
中 4 种 碱 基 顺 序 的 有 效 方法 ， 即 Maxam 和 Gilbert 法 及 Sanger 法 。Maxam 和 Gilbert 法 亦 称
化 学 法 ,Sanger 法 亦 称 酶 法 ,以 后 又 在 这 两 个 方法 的 基础 上 提出 了 不 少 改进 法 。

Maxam 和 Gilb 重 t 法 的 基本 原理 是 使 待 测 DNA 的 单 股 链 ,通过 选 定 条 件 下 专 一 性 试剂
(如 硫酸 二 甲 酯 ) 的 作用 ,裂解 成 较 小 的 片段 ,由 于 专 一 性 试剂 只 作用 于 特定 碱 基 ,因此 ,有 裂解 产
生 的 是 具 一 定 长 度 的 片段 。 图 4-51 中 的 DNA 单 股 链 ,如 使 试剂 仅 专 一 性 地 破坏 C, 不 完全 的
裂解 反应 可 产生 图 中 所 表示 的 几 种 产物 。 由 于 单 股 链 仅 在 5 端 标 记 , 故 放射 自 显影 能 检测 的
仅 是 保留 原来 ?5 端的 片段 。 如 裂解 反应 进行 到 底 , 具 放射 性 的 裂解 产物 就 只 有 一 种 ,结果 就 不
能 检测 出 其 它 胞 喀 啶 残 基 所 在 的 位 置 。 故 在 测序 中 ,使 反应 不 进行 到 底 是 重要 的 。Maxam 和

Gilbert 测序 法 的 要 点 是 :

101

(1) 取 待 测 DNA 的 一 股 链 ,使 其 一 端 ( 一 般 为 5 端 ) 用 了 标记 。

(2) 样 品 分 为 4 份 ,分 别 在 选 定 条 件 下 与 专 一 性 试剂 作用 。 每 一 份 样品 各 生成 一 套 长 短 不
等 的 放射 性 片段 。

(3) 应 用 凝 胶 电泳 分 离 每 一 反应 的 产生 ,放射 自 显影 后 ,根据 按 长 短 排列 ` 具 特定 末端 碱 基
的 DNA 片段 就 可 读 出 待 测 DNA 的 碱 基 序 列 (图 4-51) .现在 应 用 凝 胶 电 泳 可 以 分 离 仅 相差 一
个 核 苷 酸 的 DNA 片段 ,在 同一 凝 胶 板 上 可 解析 出 300 以 上 的 条 带 。 这 一 方法 最 初 被 用 于 测定
细菌 DNA 中 1lac 操纵 子 调节 区 的 序列 。 其 后 不 久 就 实现 了 以 一 个 科学 家 的 力量 在 一 年 时 间 内
就 完成 了 质粒 PBR322(4 362 bp ) 的 序列 分 析 。

ET

ap ACTTCGACAA 未知 序列 的
FEAANGETCTT 双 股 DNA

32P

链 的 分 离
重 一 rrrrr DNA 的 单 股 链

32P
人 ear
一 或 二 种 特定 核 苷 酸

破坏 的
核 苷 酸
凝 胶 电泳
放射 活性 条 带 的 检测
(放射 自 显 影 )
破坏 的 核 首 酸 。。 G G+AT+C 2
较 大 片 自 本 人
EN 该 出 《
2 碱 基 序 列 人
”一 >
一 1
0 T
较 小 片段 3

图 4-51 DNA 的 Maxam 和 Gilbert 测序 法

第 二 种 广泛 使 用 的 DNA 测序 法 是 Sanger 法 。 这 两 种 方法 的 基本 区 别 在 于 :第 一 种 方法
是 利用 专 一 性 试剂 使 待 测 DNA 在 特定 的 碱 基 处 裂解 为 长 短 不 等 的 DNA 片段 ;第 二 种 方法 是
在 特定 2 ,3'- 二 脱氧 核 苷 酸 (2 ,3'-dideoxy nucleotide) 的 存在 下 用 合成 方法 生成 长 短 不 一 WE
特定 末端 的 DNA 片段 。 由 于 二 脱氧 核 苷 酸 不 再 能 延伸 生成 3 ,5'- 磷 酸 二 酯 键 ， 合成 反应 也 就
在 该 处 停止 , 故 这 一 一 方法 也 称 为 双 脱 氧 法 。Sanger 法 的 要 点 (图 4-52) 是 ，

41) 选 取 待 测 DNA 的 一 股 链 为 模板 ,使 5 端 标记 的 短 链 引物 互补 于 模板 的 3' 端 。
102

《2) 以 样品 分 成 4 份 , 分 别 以 4 种 脱氧 核 苷 酸 和 相应 于 其 中 一 种 的 二 脱氧 核 苷 酸 为 底 物 ，
加 入 DNA 聚合 酶 I 引发 DNA 合成 。 二 脱氧 核 苷 酸 与 正常 核 苷 酸 发 生 竞争 , 故 合成 反应 在 二
脱氧 核 苷 酸 挫 人 处 停止 ,结果 生成 一 套 长 短 不 等 的 片段 。

《3) 应 用 凝 胶 电泳 分 离 每 一 合成 反应 的 产物 。 根 据 所 得 条 带 的 位 置 , 读 出 待 测 DNA 的 碱
基 序 列 。

这 一 方法 一 经 问世 就 受到 人 们 的 关注 ,很 快 就 测 出 了 工 4 喉 菌 体 DNA(5 577 bp) 的 完整
序列 ,其 后 又 建立 了 鸣 菌 体 ADNA(48 513 bp) 的 完整 序列 。 这 一 方法 正 得 到 越 来 越 多 的 应 用 。
5 3 未 知 序列 的

ET
CTGACTTCGACAA 。 单 股 DNA
TGUI

LLLL@ 放射 性 标记 的 引物
pvA 条 合 柄 ， | (DBDHG) -cppo、 了
dATP H H

dGTP
dCTP H H
H H

二 脱氧 核 苷 酸 (ddNTP)

ddGT

凝 胶 电 泳
放射 性 条 带 的

ddATP
ddCTP
ddTTP
| ddGTP

本 |

AL C
T

G

该 出 A

3 碱 基 序列

0 一 一 > 1

CR 9

一 G

0 A

ee 和

ii A

较 小 并 段 本

4-52 DNA 的 Sanger 测序 法

DNA 的 测序 法 现在 已 日 益 走向 成 熟 。 在 上 述 两 种 方法 的 基础 上 已 发 展 出 不 少 改进 的 方

法 。 同 时 ,应 用 计算 机 来 贮存 DNA 的 碱 基 序列 亦 成 为 一 种 常规 方法 。 当 碱 基 序列 由 凝 胶 读 出

时 即 可 直接 输入 计算 机 中 ,这 就 避免 了 手工 抄录 很 长 序列 时 常 易 发 生 的 差错 。 一 旦 输入 计算

机 ,限制 酶 的 识别 位 点 ,RNA 合成 的 起 始 和 终止 信号 , 反 向 回 文 结构 ,可 能 形成 ZDNA 的 优
103

势 片 段 (交替 明 叭 - 喀 啶 区) 和 其 它 已 知 DNA 的 同 源 序列 等 就 都 可 由 扫描 获得 。DNA 的 碱 基
序列 也 可 转 读 成 蛋白 质 的 氨基 酸 序列 。 实 现 这 些 工作 的 高 效 软件 程序 已 可 由 多 种 来 源 获 得 ,不
过 现 有 的 巨大 数量 的 DNA 序列 方面 的 信息 则 需要 采用 更 为 强大 的 计算 机 。

DNA 序列 测定 本 身 可 以 藉 采 用 强大 的 计算 机 而 加 速 ,但 建立 长 序列 的 限制 图 谱 所 需 的 时
间 则 远 比 测序 为 多 。 因 此 ,人 们 希望 测定 许多 可 能 重 到 的 DNA 片段 ,然后 利用 计算 机 寻找 能
据 以 使 DNA 片段 沿 各 自 染 色 体 依次 排列 的 重 至 序列 。 不 过 这 一 方法 只 是 在 二 脱氧 测序 法 的
MI13 改进 法 (参阅 第 十 三 章 ) 出 现 后 才 变 得 具有 实际 意义 。M13 法 使 序列 测定 变 得 十 分 简便 。
可 使 工作 以 在 几 年 前 还 难以 想象 的 速度 (每 周 约 2 000 bp 进行。 不 久 ,一 些 很 大 染色 体 片段 的
碱 基 序 列 都 可 能 最 终 被 测定 。

参考 文 献

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〈 张 玉 鹿 )

104

第 五 章 DNA 的 复制 和 修复

DNA 是 遗传 信息 的 载体 ,细胞 传代 时 ,DNA 必须 忠实 地 复制 才能 使 子 细胞 含有 相同 的 遗
传 信息 ,从 而 保持 物种 的 稳定 。 这 就 是 为 何 DNA 的 双 螺 旋 结 构 提出 时 ,遗传 学 家 所 以 如 此 感
兴趣 的 原因 ,因为 DNA 双 股 链 间 的 互补 关系 为 复制 提供 了 使 人 信服 的 基础 。

DNA 通过 其 双 股 链 间 的 互补 关系 所 实现 的 复制 , 初 看 起 来 似 是 一 个 直截了当 的 过 程 ,但
如 再 加 审视 ,DNA 复制 的 复杂 性 也 是 显而易见 的 。 例 如 ,DNA 的 复制 是 在 单 链 上 进行 的 ,而
DNA 在 细胞 中 是 以 高 级 结构 存在 的 ,那么 DNA 的 结构 在 复制 前 后 究竟 发 生 怎样 的 变化 呢 ?
在 细胞 周期 中 ,DNA 复制 只 发 生 在 S 期 ,那么 DNA 复制 的 起 始 与 终止 是 怎样 调控 的 呢 ?DNA
是 一 些 巨大 的 分 子 , 那 么 它 的 复制 是 从 分 子 的 固定 位 点 开始 还 是 随机 的 呢 ? 为 了 物种 的 稳定 ，
DNA 的 复制 必须 准确 无 误 , 那 么 复制 所 要 求 的 这 种 高 度 保 真性 是 怎样 达到 的 呢 ? 如 此 等 等 ,不
一 而 足 。 实 际 也 证 明 ,DNA 复制 是 一 个 先 及 多 方面 问题 的 复杂 过 程 ,是 一 个 由 多 种 酶 催化 和 有
多 种 蛋白 质 参 与 的 受到 精密 调控 的 过 程 。

DNA 复制 要 求 能 保持 遗传 信息 的 完整 ,但 复制 的 精确 性 毕竟 不 是 绝对 的 。 同 时 ,DNA 还
会 受到 各 种 因素 的 损伤 ,这 些 作 用 虽然 十 分 缓慢 ,但 由 于 生物 对 此 的 耐 受 力 十 分 低 , 故 仍 可 引
起 严重 后 果 .。 为 了 保持 物种 的 延续 ,细胞 通过 多 种 修复 系统 使 损伤 减少 到 最 低 限 度 .DNA 是 细
胞 中 唯一 具 修复 系统 的 生物 大 分 子 。

第 一 他 DNA 复制 概 狐

无 论 是 染色 体 的 数目 或 是 染色 体 DNA 的 大 小 ,原核 细胞 都 要 比 真 核 细胞 为 小 。 同 时 , 原
核 细 胞 生活 周期 短 ,容易 在 人 工 条 件 下 培养 ,原核 细胞 容易 获得 各 种 突变 体 , 而 原核 细胞 中 的
大 肠 杆 菌 又 是 在 各 方面 研究 得 最 为 透彻 的 一 种 生物 。 这 些 就 使 原核 细胞 成 为 研究 DNA 复制
CDNA replication) 的 一 种 良好 的 实验 系统 。 此 外 ,基因 组 比 原核 细胞 更 小 的 叹 菌 体 对 前 者 的
感染 又 为 这 方面 的 工作 提供 了 很 好 的 研究 途径 。 因 此 ,我 们 目前 所 掌握 的 有 关 DNA 复制 的 知
识 主 要 来 自 原核 细胞 DNA 。

一 .DNA 复制 的 半 保 留 性

DNA 如 何以 其 所 携带 的 遗传 信息 通过 复制 传递 给 后 代 可 能 有 三 种 方式 :全 保留 (conser
vative) 、 半 保留 (semiconservative) 和 分 散 (dispersive) 复 制 ( 图 5-1)。

实验 证 明 ,DNA 是 按 半 保留 方式 复制 的 ,这 一 著名 实验 是 Meselson 和 Stahl 在 1958 年
完成 的 。 他 们 先 以 大 肠 杆菌 在 含 SNCNH4C1 形态 ) 的 培养 基 中 党 殖 多 代 , 使 喀 啶 和 味 叭 碱 基 中
的 YN 全 被 置换 为 SN 。 收集 大 肠 杆 菌 , 分 离 其 中 的 DNA ,然后 再 进行 CsCl 平衡 密度 梯度 离心 ，
这 时 DNA 形成 一 单独 的 ,浮力 密度 为 1.724 g/ml 的 条 带 。 和 对 照 ( 浮 力 密 度 为 1. 710 g/ml)
相 比 ,DNA 浮力 密度 (buoyant density) 的 这 种 增加 是 由 于 ”N 置换 了 "”N 。 现 在 再 以 在 3N 氮 源

105

中 培养 的 大 肠 杆 菌 转移 到 含 N 的 培
养 基 中 传代 ,每 隔 一 定时 间 取 样 , 分 离
其 DNA 并 进行 密度 梯度 离心 。 这 时 ，

由 浮力 密度 不 同 所 产生 的 DNA 条 带

显示 了 规律 性 变化 (图 5-2)。 这 种 规
律 性 变化 只 能 由 DNA 的 半 保 留 复 制
得 到 解释 。 在 零 代 细胞 中 ,DNA 双 股
链 中 氮 的 分 布 为 "NA 人 N ,其 浮力 密度
为 1. 724 g/ml; 在 第 一 代 细 胞 中 ，

-DNA 双 股 链 中 氮 的 分 布 由 "NAN 转

变 为 SN/AN , 其 浮力 密度 也 由 1. 724
转变 为 1. 717 g/ml; 在 第 一 代 以 后 的

细胞 中 ,DNA 双 股 链 中 氮 的 分 布 有 两 种 , 即 "N

亲 代 DNA

NS
SA
SN
We
四 天 \NN 国 国 YNNN

|

全 保留 方式

长
误

融

可
半
站
十
迪

图 5-1 DNA 复制 的 可 能 方式
口 代表 原来 的 DNA; 四 代表 新 合成 的 DNA。

AN 和 NAN, 条 带 扫描 曲线 的 峰 也 分 裂 为

二 ,分 别 相 应 于 浮力 密度 1. 717 和 1. 710 g/ml. 随 着 细胞 传代 的 进行 , 双 链 均 含 'N 的 DNA 的
比重 也 越 来 越 高 。 这 一 实验 证 明 , 复 制 后 的 DNA 是 由 一 条 亲 代 链 和 一 条 子 代 链 组 成 的 , 即 复

制 是 按 半 保留 方式 进行 的 。

光 密 度 扫 描 ， 代数

0,1.0,1.9 和 3.0 代 的 DNA 组 成

106

rer

上 NDNA LN DNA
15N VIA]A4N DNA

二 0 S 15N AN DNA

Am

四 SS
S 1 Sn
和 二

图 5-2 DNA 的 半 保留 复制

在 这 一 实验 中 所 使 用 的 技术 称 为 密度 标记 DNA(density labeled DNA) , 它 在 DNA 的 复
制 、 修 复 和 重组 研究 中 都 有 广泛 的 应 用 , 当然 标记 的 方法 也 可 不 同 , 如 以 5- 溴 脱氧 尿 苷 来 代替
胸腺 喀 啶 核 苷 就 可 获得 DNA 的 更 大 密度 增 量 。

二 ,复制 过 程 的 顺序 性
复制 的 半 保 留 性 仅 说 明 , 子 代 DNA 分 子 中 的 一 股 链 来 自 亲 代 ; 另 一 股 链 是 新 合成 的 ,但
它 并 未 指出 复制 的 进行 过 程 , 即 双 螺旋 DNA 是 先 全 部 解 开 成 两 股 单 链 , 然后 分 别 作为 模板 合

成 新 链 , 还 是 边 解 开 边 合成 的 。
许多 实验 证 明 ,DNA 的 复制 是 按 一 定 的 程序 进行 的 。SV40 DNA 复制 早期 的 电镜 照片 指

出 ,分 子 中 除了 已 复制 的 部 分 外 , 还 存在 着 呈 超 螺旋 的 未 复制 部 分 (图 5-3)。 复 制 从 分 子 的 称

图 5-3 SV40 DNA 复制 图
右 图 :处 在 复制 的 SV40 DNA 分 子 ; 左 图 :复制 又 。

为 原点 Corigin) 的 特定 位 点 开始 ,然后 向 未 复制 部 分 逐步 扩大 。.DNA 分 子 中 正在 进行 复制 的 分
叉 部 位 称 为 复制 又 (replication fork), 它 由 两 股 亲 代 链 及 在 其 上 新 合成 的 子 链 构 成 。DNA 的
正在 复制 的 部 分 在 电镜 下 观察 起 来 犹如 一 只 眼睛 , 称 为 复制 眼 (replication eye) 。 对 环形 DNA
言 , 复 制 眼 的 存在 就 使 其 成 为 图 5-4 所 示 的 2 结构 (O structure)。 复 制 眼 本 身 并 不 能 说 明 它 是
由 一 个 或 是 二 个 复制 又 形成 的 , 亦 即 复制 是 单 向 还 是 双向 的 (图 5-5)。 事 实说 明 , 单 向 或 是 双
向 复制 都 是 存在 的 ,但 多 数 DNA 的 复制 是 双向 的 ,SV40DNA 的 复制 就 是 一 例 .SV40 的 基

四 正二 可 癌症 省

单 向 复制 静止 的 原点 移动 的
权 复制 又
2 rn 和 一 二

|
|
|
1
1
1
1
1

双向 复制

图 5-4 环形 DNA 复制 所 形成 的 2 结构 图 5-5 DNA 可 能 的 单 向 或 双向 复制
107

因 组 是 一 个 含 5 224 bp 的 环形 DNA, 它 仅 含 限制 性 内 切 酶 EcoR I 的 一 个 切 点 ，
5 一 GAATTC 一 3
3' 一 CTTAAG 一 5
人
故 当 复制 中 SV40 DNA 群体 用 EcoR I 处 理 时 ,它们 就 转变 为 具 不 同 大 小 复制 眼 的 线 型 分 子 。
在 这 样 所 得 的 不 同 线 型 分 子 中 ,复制 眼 两 侧 的 DNA 链 的 长 度 随 复制 眼 的 扩大 而 相应 缩短 ,这
一 情况 有 力 地 说 明 SV 40 DNA 的 复制 是 由 原点 开始 然后 双向 进行 的 。

三 .DNA 的 半 不 连续 复制

双 螺 旋 DNA 的 两 股 链 的 极 性 是 相反 的 ,因此 ,在 复制 又 两 股 亲 代 链 上 合成 的 子 链 的 极 性
也 应 相反 。 据 此 就 产生 了 一 个 问题 , 即 一 股子 链 的 DNA 合成 如 沿 5 一 3 方向 延伸 , 则 另 一 股
链 上 DNA 的 合成 似 就 应 按 3' ~5' 方向 进行 .事实 是 ,至 今 没 有 能 找到 DNA 合成 能 按 3 一 5
方向 进行 的 证 据 。 但 如 双 股 链 上 DNA 的 合成 都 按 5 -3 方向 进行 ,由 于 双 螺 旋 DNA 是 逐步
解 旋 的 , 则 一 股 链 上 的 DNA 合成 可 以 是 连续 的 ; 另 一 股 链 上 的 合成 只 能 是 不 连续 的 。Okazaki
( 冈 崎 ) 证 明 情 况 确 是 如 此 , 它 用 CH] 胸 腺 喀 喧 脱氧 核 苷 脉冲 标记 大 肠 杆菌 培养 物 , 这 时 优先
标记 的 是 新 合成 的 DNA。 沉 降 分 析 证 明 新 合成 的 大 多 是 一 些 约 含 1 000 核 苷 酸 的 短片 段 。 如
以 培养 物 再 在 非 放射 性 培养 基 中 保温 ,标记 就 进入 高 分 子 量 DNA 中 , 这 些 实验 就 证 明 DNA
的 复制 是 半 不 连续 的 (semidiscontinuous) , 即 一 股 模板 上 的 DNA 合成 是 连续 的 ; 另 一 模板 上
的 合成 是 不 连续 的 。 同 时 ,复制 又 一 股 链 上
的 DNA 合成 总 是 比 另 一 股 超前 一 步 , 称 -出山 玫 4 7
为 先导 链 (leading strand), 另 一 股 的 复制 M

要 滞后 一 步 , 称 为 后 随 链 (lagging 。 内 屿 片段 RNA 引物

strand)。 在 不 连续 合成 中 形成 的 短 DNA IT 机

片段 称 为 冈 崎 片段 COkazaki fragment )，

它们 随后 连接 成 大 片段 (图 5-6)。 图 5-6 DNA 的 半 不 连续 复制

四 ,复制 单位
各 种 生物 基因 组 的 大 小 不 同 , 尤 其 是 原核 和 真 核 生物 差异 更 大 .大 肠 杆菌 的 基因 组 是 单个

环 型 双 股 DNA， 含 3 一 9 义 10 bp , 它 仅 含 一 个 原点 ,复制 一 次 约 需 40 min。 真 核 生物 基因 组 要

比 原核 的 大 许多 ，* 它 复制 时 每 秒 所 合成 的 核 苷 酸 数 比 原 核 少 \ 表 5-1) .如 真 核 生 物 的 每 一
表 5$-1 不 同 细胞 的 复制 参数

克 大 肠 杆菌 和信“
DNA 含量 ,每 一 细胞 的 核 苷 酸 数 3. 9 勾 106 . 药 108
复制 叉 的 移动 速率 (my/miny) 30 3
DNA 复制 速率 , 核 苷 酸 数 /s/ 复 制 叉 850 60 一 90
每 一 细胞 的 复制 原点 数 1 103 一 104
整个 基因 组 复制 所 需 的 时 间 (hy) 0. 67 8
细胞 分 裂 所 需 的 时 间 (hy 0. 33 24

* 人 DNA 的 复制 参数 来 自 Hela 细胞 。
108

DNA 分 子 也 仅 含 一 个 原点 ,细胞 所 有 DNA 复制 一
次 就 需 几 个 星期 。 实 际 情况 是 , 真 核 生 物 DNA 含 许
多 复制 原点 ,使 整个 DNA 分 子 可 分 为 多 个 可 同时
复制 的 单位 ,从 而 使 DNA 复制 可 以 在 细胞 周期 的 S
期 中 完成 .DNA 的 这 种 能 独立 复制 的 单位 称 为 复制
子 (Creplicon ) 。

复制 子 概 念 可 以 通过 大 肠 杆菌 的 染色 体 和 附加
体 的 关系 来 说 明 。 大 肠 杆 菌 含 有 一 些 称 为 质粒
(plasmid) 的 染色 体外 遗传 因子 (Cextrachromosomal
genetic element) 。 质 粒 是 一 些小 的 环形 DNA ,在 大
肠 杆菌 细 胞 中 ,染色 体 DNA 和 质粒 DNA 分 别 独 自
复制 。 质 粒 中 ,有 些 称 为 附加 体 (episome) 的 DNA
能 整合 (integration ) 进 染色 体 DNA ,这 时 它 的 复制
就 和 后 者 同步 进行 。 大 肠 杆 菌 有 一 称 为 温度 敏感 型
(temperature sensitive typeyts ) 的 突变 体 , 它 改变
了 DNA 复制 的 引发 。 这 种 突变 体 在 30C 能 正常 复
制 , 但 在 42C 却 不 能 引发 DNA 复制 。 在 未 整合 前 ，
染色 体 DNA 的 复制 是 双向 的 ,附加 体 的 复制 是 单
向 的 ;整合 后 ,附加 体 的 复制 就 受 染色 体 DNA 复制 ”图 5 只 加 体 和 染色 体 DNA 复制 的 关东
的 控制 . 当 温 度 提 高 至 42C 时 ,由 染色 体 DNA 原点
开始 的 双向 复制 停止 , 代 之 的 是 由 附加 体 原 点 开始 的 单 向 复制 (图 5-7)。 从 这 一 现象 可 以 看

”出 'DNA 复制 的 起 始 是 由 一 组 基因 控制 的 ,这 些 基因 包括 复制 原点 和 其 它 的 结构 基因 ,复制 即

是 在 结构 基因 的 表达 产物 作用 于 原点 而 引发 的 。 上 述 的 这 些 基 因 以 及 在 其 控制 下 的 DNA 区
段 统称 为 复制 子 。 原 核 DNA 构成 一 个 复制 子 , 而 真 核 DNA 则 构成 多 个 复制 子 。

从 表 5-1 还 可 以 观察 到 一 个 表面 上 蜡 常 的 现象 , 即 细菌 的 细胞 数 每 20 min 增加 一 倍 ,但 其 染
色 体 DNA 的 一 轮 复制 却 需 40 min。 实 际 情况 是 , 在 快速 生长 的 细胞 中 ,DNA 在 完成 一 轮 复制 前 即
开始 了 新 一 轮 的 复制 。 这 些 实验 有 力 地 表明 ,DNA 复制 的 控制 主要 是 在 起 始 水 平 上 实现 的 。

第 二 节 DNA 的 复制 酶 和 相关 和 蛋白

DNA 复制 是 一 个 涉及 许多 酶 和 蛋白 的 系统 。 尤 其 是 真 核 生 物 DNA 复制 更 为 复杂 ,难以
用 较 短 的 篇 幅 阑 述 清楚 。 鉴 于 原核 生物 DNA 复制 的 相关 酶 和 蛋白 研究 得 较为 深入 ,以 及 原核
和 真 核 生 物 DNA 复制 的 一 些 基 本 原理 相同 ,所 以 ,本 章 就 着 重 讨论 原核 生物 DNA 复制 ,而 真
核 生 物 方面 的 情况 就 留待 在 适当 的 章节 逐步 深入 。

DNA 复制 是 一 个 复杂 过 程 , 它 包括 双 螺 旋 和 超 螺旋 的 解 旋 和 重新 形成 ,复制 的 起 始 和 调
控 , 模 板 上 新 DNA 链 的 合成 ,复制 的 终止 等 等 。 复 制 是 在 许多 相关 酶 和 蛋白 的 协同 作用 下 运
行 的 。 如 按照 在 复制 过 程 中 出 现 的 先后 ,它们 包括 :DDNA 旋转 酶 ; 包 使 DNA 双 股 链 在 复制
叉 分 离 的 蛋白 质 ;@@ 在 复制 前 防止 DNA 链 退火 的 蛋白 质 ; 引 合成 RNA 引物 的 酶 ;:G@ODNA 聚
合 酶 ;@ 除 去 RNA 引物 的 酶 ; 〇 使 冈 崎 片段 共 价 连接 的 酶 等 等 。

109

一 、 核 苷 酸 的 聚合 和 DNA 聚合 酶

1957 年 ,Kornberg 报道 在 大 肠 杆 菌 抽 提 液 中 发 现 了 能 催化 DNA 合成 的 酶 。
(CdNMP), 二 dNTP 一 (dNMP),+: 十 PP

DNA 片段 延伸 的 DNA
片段
上 式 中 的 dNMP 代表 脱氧 核 苷 -磷酸 ,dNTP aa

代表 脱氧 核 苷 三 磷酸 。 这 一 反应 需要 加 入 短 的 人

DNA 片段 ,否则 不 能 进行 ;如 加 入 的 为 完整 的 线 人 一 之

型 DNA 或 是 环 型 DNA, 反 应 同样 不 会 进行 。 实 ER 次 ~

际 情况 是 ,反应 是 在 加 入 的 DNA 一 股 链 的 3' -未 。 咏 上 | 必 2

端 延伸 ; 另 一 股 链 决定 摊 人 核 苷 酸 的 顺序 (图 5- 7
8)。 加 入 的 DNA 片段 既 提 供 了 反应 的 引物 2 .2

(primer), 又 提供 了 合成 反应 的 模板 (template ) 。 全 一 人 上

核 苷 酸 的 聚合 是 一 亲 核 反应 ,引物 3' -未 端的 关 YY

基 向 进入 的 dNTP 的 “ 磷酸 基 进行 亲 核 进攻 ,而

形成 磷酸 二 酯 键 。 这 是 一 个 可 逆反 应 , 它 还 需 焦 磷
酸 酶 (pyrophosphatase) 的 作用 使 焦 磷 酸 转 变 为

图 5-8 核 苷 酸 的 聚合 反应

正 磷酸 从 而 驱使 反应 趋向 完成 。 这 表明 DNA 中 每 挨 和 人 一 个 核 苷 酸 需 消 耗 两 个 高 能 磷酸 键 。 这
一 催化 核 苷 酸 聚 合 的 酶 根据 发 现 者 称 为 Kornberg 酶 。 以 后 ,另外 两 种 原核 生物 DNA 育 台 酶
相继 发 现 , 故 Kornberg 酶 就 称 为 DNA 聚合 酶 I (Pol I ) ,而 另 两 种 分 别称 为 DNA 育 合 酶 I
和 ICPolr 和 PolI)。 三 种 DNA 聚合 酶 中 ,聚合 酶 下 虽然 是 真正 的 复制 酶 (replicase), 但 聚合 。
酶 ! 发 现 的 历史 最 长 和 在 应 用 上 的 重要 性 , 故 是 研究 得 最 为 深入 的 一 种 。 同 时 ,对 它 的 讨论 也
有 助 于 对 其 它 聚 合 酶 的 认识 ,因此 ,对 DNA 聚合 酶 的 讨论 就 从 DNA 聚合 酶 I 开始 。

5-9 Polil 的 3' ->8 核 酸 外 场 酶 活力

DNA 到 合 酶 I 是 一 单 体 蛋 白 ,分 子 量
为 109kD , 共 含 928 个 氨基 酸 残 基 。DNA
聚合 酶 I 具有 一 些 与 一 般 酶 不 同 的 特性 。
DNA 聚合 酶 I 催化 脱氧 核 背 酸 的 聚合
但 脱氧 核 苷 酸 是 按照 一 定 顺序 挫 入 的 。 这
种 专 一 性 来 自 进 入 的 脱氧 核 苷 酸 与 模板 间
的 碱 基 配 对 ,而 不 是 酶 对 碱 基 的 直接 识别 。 ，
当 某 一 脱氧 核 苷 酸 挫 入 DNA 后 , 酶 阳 并
不 立即 与 模板 脱离 ,而 是 继续 作用 ,这 称 为
持续 性 (processitivity)。Pol TI 每 一 次 与 模

板结 合 可 使 10 或 更 多 的 脱氧 核 苷 酸 摊 人 DNA ,这 加 快 了 反应 的 速率 。Pol I 除了 聚合 酶 活力
外 ,还 具有 3' 一 5 核酸 外 切 酶 活力 和 5 一 3' 核 酸 外 切 酶 活力 。Pol I 3'-5/' 核 酸 外 切 酶 活力 ,是
由 具 游 离 一 OH 的 未 配对 3' -末端 核 音 酸 所 激活 。 若 一 个 不 能 形成 碱 基 配 对 的 错 配 脱氧 核 昔 酸
挨 和 人 延长 中 的 DNA 链 未 端 ,聚合 酶 活力 就 被 抑制 ,而 3'-~5/' 核酸 外 切 酶 活力 被 激活 ,结果 错

110

配对 的 核 苷 酸 就 被 切除 (图 5-9)。 聚 合 酶
活力 随即 使 复制 重新 开始 。 所 以 ,Pol I 对
DNA 合成 具 校对 作用 。Pol I 的 5 一 3 核
酸 外 切 酶 活力 则 作用 于 具 切 口 的 双 螺 旋
DNA ,并 在 切口 以 外 的 配对 区 切割 ,使 具
5 -端的 DNA 链 降解 为 单 核 苷 酸 或 寡 聚 核
昔 酸 (图 5-10) 。Pol I 的 聚合 酶 和 3' 一 5' 及
5 一 3' 核 酸 外 切 酶 三 种 活力 存在 于 同一 多 图 5-10 PolI 的 5 一 3!' 核 酸 外 切 酶 活力
肽 链 中 (图 5-11) 。 当 以 枯草 杆菌 蛋白 酶
或 胰 和 蛋白酶 处 理 时 ,Pol I 就 裂解 为 大 小
不 同 的 两 个 活性 片段 。 较 大 的 C 端 片段
( 残 基 324 一 928) 具有 聚合 酶 和 3' 一 5/
核酸 外 切 酶 活力 ,也 称 为 人 lenow 片段 ;
较 小 的 N 端 片 段 ( 残 基 1 一 323) 具 有 5
~3' 核酸 外 切 酶 活力 (图 5-11)。 结 构 分
析 指 出 ,Klenow 片段 又 含 一 大 ( 残 基

图 5-11 Poli 的 结构 域 521 一 928) 一 小 ( 残 基 324 一 517) 两 个 结
构 域 。Klenow 片段 较 大 结构 域 ( 图 5-12) 的 螺旋 IO 间 为 一 裂 除 ,DNA 即 结合 于 此 ,螺旋 工 和
百 间 的 这 部 分 结构 则 形成 一 可 活动 的 盖 , 使 所 结合 的 DNA 不 易 脱 开 。 这 一 结构 特点 可 用 以 解
释 Pol I 作用 的 持续 性 。

图 5-12 Pol I Klenow 片段 的 结构

Pol I 是 1957 年 发 现 的 ,人 们 曾 一 度 认 为 它 即 是 寻找 的 复制 酶 。 可 是 ,随后 的 许多 事实 表
明 情 况 并 不 如 此 。 例 如 , 它 每 分 钟 只 能 使 600 核 苷 酸 挫 人 DNA ,实际 测定 数字 要 比 这 约 大 20
|

倍 . 遗 传 分 析 也 表明 ,大 肠 杆菌 的 复制 还 与 其 它 基因 产物 有 关 .。 以 后 ,Cairns 等 在 1969 年 发 现 ，
大 肠 杆 菌 一 种 突变 体 的 抽 提 液 ,虽然 仅 显 示 出 一 1 欠 的 Pol I 活力 ,但 该 突变 体 却 能 以 正常 的
速率 繁殖 。 与 此 同时 ,该 突变 体 对 紫外 辐射 和 化 学 诱 变 却 表现 出 高 度 人 敏感。 这 表明 复制 可 能 主星
要 由 其 它 的 聚合 酶 负责 ,而 Pol I 的 主要 功能 可 能 与 DNA 的 修复 有 关 。 事 实证 明正 是 如 此 。

DNA 聚合 酶 I 的 生理 功能 主
要 是 DNA 的 修复 。DNA 在 机 体 中 5 IT 3
会 受到 紫外 辐射 .化 学 诱 变 等 许多 切口 。dNTP 呈 DNA 聚合 酶 1
物理 和 化 学 因素 的 作用 而 发 生 改 变 PPi
或 损伤 。 如 不 加 修复 ,机 体 就 难于 适 。 ,， 5
应 ,或 产生 遗传 上 的 突变, 甚或 死 :II UL ，
亡 。 细 胞 中 存在 多 种 DNA 修复 系 单 核 首 酸 /1
统 , 它们 的 核酸 内 切 酶 活力 会 在
DNA 受 损 伤 部 位 的 5' 端 进行 切割 产
生 单 链 切 口 ,后 者 就 激活 Pol I 的 5 -3!' 核 酸 外 切 酶 活力 ,从 而 切除 DNA 的 受 损伤 部 分 ,Pol I 的
育 合 酶 活力 随即 开始 工作 ,使 DNA 链 向 3' 端 延伸 ,这 称 为 切口 位 移 (nick translation)( 图 5-13)。
在 体外 ,人 们 可 利用 切口 位 移 制备 高 放射 活性 的 DNA 序列 。DNA 上 的 切口 可 用 少量 胰 核 糖 核酸 上
酶 处 理 来 产生 , 在 放射 性 标记 dNTP 的 存在 下 ,切口 位 移 即 生成 原来 切口 3 端的 DNA 序列 。

Pol I 的 5->3!' 核 酸 外 切 酶 活力 ,在 生理 条 件 下 ,也 会 切除 新 合成 DNA 8 端的 RNA 引物
和 填补 所 形成 的 缺口 。 这 说 明 Pol I 在 大 肠 杆 菌 的 复制 中 也 是 有 作用 的 。

大 肠 杆菌 的 3 种 DNA 聚合 酶 虽然 都 能 催化 dNTP 的 聚合 ,但 其 特性 并 禾 相 同 ( 表 5-2)，
这 反映 它们 在 复制 中 所 承担 的 作用 不 同 。

表 5$-2 大肠 杆菌 DNA 事 合 酶 I,I, 苞

图 5-13 切口 位 移

Pol I PolI Pol 亚 〈 核 心 )
结构 基因 oL4 zolB olCs
分 子 量 (kD) 103 90 130,27.5,10b
亚 基数 ] 之 4 之 10
分 子 数 /细胞 ,估计 值 400 10 一 20
聚合 酶 活力 中 理 十 *
3' 一 5 核酸 外 切 酶 活力 下 十
5 一 3' 核酸 外 切 酶 活力 s 记 三
模板 -引物
完整 双 股 DNA 惠 一
具 引 物 长 单 股 链 二 李 六
具 缺 口 的 双 股 DNA 或 5 端
突出 的 单 链
单 链 长 度 一 100 核 音 酸 于 机
单 链 长 度 二 100 核 苷 酸 < 下 地
转换 数 C, 估 计 值 600 30

9 000
a.&% 亚 基 的 基因 ;b.w,e 和 2 亚 基 的 大 小 ;c. 聚合 时 (37C ) 的 核 苷 酸 数 /min/ 酶 分 子 。
Pol 是 大 肠 杆菌 的 复制 酶 , 它 在 细胞 中 是 以 多 亚 基 复 合 物 的 形态 存在 和 发 挥 功 能 ,这 种
复合 物 称 为 DNA 聚合 酶 开 全 酶 CDNA polymerase 贡 holoenzyme) 。DNA 聚合 酶 开 全 酶 可 以
分 为 几 个 层次 ( 表 5-3) 。PolE 全 酶 中 ,PolI 核心 酶 (core enzyme) 与 聚合 作用 直接 有 关 ,PolE

的 亚 基 组 成 为 eg, 其 中 “ 为 基因 polC 的 产物 ,具有 聚合 酶 活力 。e 为 基因 dzaQ 的 产物 ,为 3/
112

-~ 中 核酸 外 切 酶 .c 和 e 亚 基 的 混合 后 会 产生 1 : 1 复合 物 ,这 时 聚合 酶 活力 就 增加 2 倍 ,3'-5/
核酸 外 切 酶 活力 增加 50 一 100 倍 , 接 近 核 心 酶 的 水 平 。9 亚 基 的 功能 还 不 清楚 ,可 能 与 亚 基 间
的 结合 有 关 。 除 了 不 能 使 具 引物 的 单 链 DNA 和 具 切 口 的 DNA 复制 外 ,Pol IE 的 催化 活力 与
Pol I 相似 。Pol IE 全 酶 中 ,核心 酶 以 外 亚 基 的 功能 现 虽 还 不 很 清楚 ,但 它们 的 参与 提高 了 反应
的 速率 和 持续 性 ( 表 5-4) 。 这 可 能 与 有 些 亚 基 使 核心 酶 与 模板 紧密 结合 有 关 , 从 而 加 强 了 作用
的 持续 性 . 其 中 ,8 亚 基 是 最 重要 的 持续 性 因子 (processivity factor) ,两 个 8 亚 基 围 爷 DNA 形
成 钳 状 结构 ,DNA 能 滑动 而 难于 脱落 。

表 5-3 Pol 亚 全 酶 的 主要 亚 基 及 其 组 装 层次
亚 基 分 子 量 (kD) 基 因 组 装 层次

“和 = 亚 基 由 同一 基因 所 编码 ,而 y 亚 基 由 亚 基 的 N- 端 部 分 构成 。
表 5-4 不 同 层次 Pol 亚 的 持续 性

层 次 持续 性 刺激 因子
了 Pol 下 10 无
Pol 区/ 60 亚 精 胺
Pol 200 SSB
全 酶 过 105 SSB

Pol 全 酶 的 结构 是 一 种 非 对称 的 二 聚 体
(Casymmetric dimer ) 在 图 5-14 中 Pol 开 包括
we 和 0,PolE 包含 两 个 核心 酶 加 上 r 亚 基 ，
Pol E” 比 全 酶 少 8 亚 基 。 括号 中 的 数字 代表 分
子 量 。 这 种 结构 特点 支持 了 DNA 在 先导 链 和
后 随 链 上 同时 合成 的 看 法 ( 见 本 章 第 三 节 ) 。 图 5-14 Pol 全 酶 的 非 对 称 二 聚 体 的 可 能 结构

二 .引物 的 合成 和 引物 酶

已 经 证 明 ,DNA 的 复制 是 半 不 连续 的 。 既 然 聚 合 酶 只 能 使 DNA 从 引物 的 3 端 延 伸 , 而 不
能 引发 DNA 的 重新 合成 ,这 就 产生 了 另 一 问题 , 即 DNA 复制 是 如 何 开 始 的 。 喉 菌 体 Ml3 为
此 提供 了 一 个 线索 , 即 它 的 DNA 复制 显示 出 对 转录 抑制 剂 的 敏感 性 ,从 而 表明 RNA 可 能 提
供 了 DNA 复制 的 3 端 。

Reiji 等 利用 含 甲 葵 的 缓冲 液 处 理 大 肠 杆 菌 以 提高 对 外 源 核 苷 酸 的 通 透 性 ,然后 再 以 大 肠
村 菌 与 c-[?P] 脱 氧 核 苷 三 磷酸 和 未 标记 的 核糖 核 苷 三 磷酸 的 混合 物 保温 ,最 后 从 大 肠 杆菌 分

113

离 DNA 和 用 稀 碱 处理 。 碱 性 水 解 发 生 在 3 ,5 -磷酸 二 酯 键 A x Y
的 磷酸 基 与 C-5' 间 ,这 样 就 使 dNTP 的 放射 性 磷 转 移 到 核 on 上 册
糖 核 苷 酸 上 去 (图 5-15)。 结 果 发 现 ,每 一 冈 崎 片段 都 产生 JE 了
一 个 RNA-DNA 接头 ,说 明 DNA 的 复制 是 以 RNA 为 引
物 。 催化 RNA 引物 合成 的 酶 叫 引物 酶 (primerase), 它 是 由 。A 碱 性 市 和
大 肠 杆菌 的 drzaC 基因 所 编码 的 。DNA 复制 是 随 模板 特
表 5-5 DNA 半 不 连续 复制 的 引物
基因 组 引物 长 度 “ 主要 产物

DN

图 5-15 RNA 引物 存在 的 证 明
定 序列 上 RNA 引物 ( 表 5-5) 的 合

成 开始 的 。
ApCpC/A(CPN)I~，

T7 只 次 休 15 ON 多 为 A 和 加) 机 体 之 所 以 选择 RNA 作为 引
人 省 直 0 物 的 原因 可 能 在 于 减少 致死 突变
SX174 噬菌体 1 一 5 (ethal mutation)。DNA 复制 中 ,在
海胆 lz>8 (p)pPPAV/CCPN)7 .时
和 0 模板 上 放置 的 最 初 几 个 核 昔 酸 的 正
(分 离 核 ) 人 确 性 必然 远 比 其 后 的 为 低 。 如 引物 为
动物 细胞 了 RNA, 这 一 部 分 所 发 生 的 差错 就 会 避

“在 模板 上 合成 的 引物 序列 为 3"-pCpTpGpGV/Tp-;G/T。
四 rc/ 免 或 减少 , 因为 引物 随后 即 被 降解 。

三 .DDNA 双 股 链 的 分 离 和 解 螺 旋 酶

复制 过 程 中 ,复制 叉 在 不 断 前 进 , 复 制 又 前 方 的 亲 代 DNA 就 需 不 断 解 链 , 为 使 复制 能 够
顺利 进行 ,也 就 必须 防止 DNA 单 链 的 复 性 。 以 上 过 程 是 由 解 螺旋 酶 (helicase) 和

单 链 结合 蛋白 (single-strand binding pro- ssB
tein，SSB) 所 承担 (图 5-16)。 解 螺旋 酶 。 /

解 螺 旋 酶 利用 ATP 水 解 的 能 量 使
DNA 双 股 链 分 离 , 并 在 DNA 上 沿 一 定 的
方向 移动 .生物 机 体 含 有 多 种 解 螺旋 酶 ,有
些 解 螺旋 酶 参与 DNA 复制 ,有 些 解 螺旋
酶 参与 DNA 修复 ,重组 等 非 复 制 过 程 。 大 蛋白
肠 杆 菌 的 复制 解 螺旋 酶 有 DnaB,PriA 和 图 5-16 DNA 双 螺旋 的 解 旋
- Rep 蛋白 ,它们 的 特性 有 些 不 同 , 移动 的 极 性 也 有 差异 ,DnaB 蛋白 沿 5 ->3/ 方 向 移动 ,PHA 和
Rep 蛋白 沿 3 一 5 方向 移动 。

随 着 双 螺 旋 PNA 的 逐步 解 旋 ,SSB 随 之 结合 于 单 股 链 上 。SSB 与 单 股 DNA 的 结合 是 重量
要 的 ,它们 使 后 者 保持 一 种 伸展 的 构象 ,从 而 便于 以 之 作为 DNA 合成 的 模板 ，SSB 对 单 链
DNA 的 结合 具有 高 度 的 协同 性 (cooperativity ), 即 SSB 的 初步 结合 能 使 其 随后 的 结 仿生 为 容
易 。 不 同 生物 中 ,SSB 对 单 链 DNA 的 结合 机 制 似 不 相同 。SSB 可 以 重复 使 用 。SSB 还 参与
DNA 的 修复 和 重组 。

\ 超 螺旋 的 松弛 和 旋转 酶

天 然 DNA 的 负 超 螺旋 虽然 有 利于 DNA 的 解 旋 ,但 随 着 复制 的 进行 ,复制 又 前 方 的 亲 代

DNA 中 仍然 会 积累 巨大 的 张力 。 如 大 肠 杆菌 以 一 1 000 核 苷 酸 As 的 速率 复制 ,这 意味 着 DNA
114

将 以 一 100 rpmy/s 的 速率 旋转 ,更 何况 大 肠 杆 菌 DNA 是 环 型 的 ,这 种 旋转 实际 上 不 可 能 ,结果
必然 使 复制 停止 。 实际 情况 是 工 型 拓扑 异 构 酶 (旋转 酶 ) 参 与 了 大 肠 杆 菌 的 DNA 复制 , 它 不 断
解除 DNA 由 此 产生 的 拓扑 学 障碍 。
拓扑 异 构 酶 在 DNA 复制 中 的 关键 性 作用 已 通过 抑制 剂 的 应 用 得 到 证 明 。 扑 拓 蜡 构 酶 工 是 由
亚 基 A 和 亚 基 B 所 组 成 的 四 聚 体 , 即 A:B:. 蔡 啶 酮 酸 (nalidixic acid) 是 一 种 复制 抑制 剂 ,但 它 的 结
合 位 点 是 拓扑 异 构 酶 的 亚 基 和 A.。 新 生 霉 素 (novobiocin ) 是 另 一 个 复制 抑制 剂 , 它 结合 于 亚 基 B 从 而
抑制 与 该 亚 基 相 联系 的 ATP 酶 活力 。 这 些 都 证 明 拓 扑 异 构 酶 的 参与 是 DNA 复制 所 必 不 可 少 的 。

五 .DNA 连接 酶

DNA 后 随 链 上 的 复制 是 不 连续 的 。 当 冈 崎 片段 形成 后 ,其 5 端的 RNA 引物 通过 DNA 聚
合 酶 I 催化 的 切口 移 位 而 降解 ,并 为 脱氧 核 苷 酸 片段 所 置换 ,新 形成 的 切口 即 由 DNA 连接 酶
(CDNA ligase) 了 予以 封闭 (图 5-17) 。

E-(Lys)NH3- O 0
局 和
(]) | RE 二 ER H 0 NMN
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E-(Lys) NH? G= O- ENS Nt 二 0 三 RAT 二 二
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图 5-17 DNA 连接 酶 的 作用

DNA 连接 酶 在 使 双 股 DNA 中 的 单 链 切口 连接 时 ,要 求 切口 必须 含 3 - 羟 基 和 5'- 磷 酰基 ，
并 正确 排列 。 连接 酶 利用 NAD-* 或 ATP 中 磷酸 本 键 的 基 团 转移 势 以 形成 磷酸 二 酯 键 。 反应 过 程
中 ,先是 NAD 或 ATP 的 腺 苷 酰基 转移 给 酶 活性 中 心 的 赖 氨 酸 使 之 活化 ,继而 生成 的 中 间 体 又
以 腺 苷 酰基 转移 给 切口 5 端的 磷 酰 基 。 切 口 3' 端 羟基 对 磷 酰 基 的 亲 核 攻击 就 生成 磷酸 二 酯 键 真
核 生 物 和 工 4 噬菌体 利用 以 ATP 作为 腺 苷 酰 体 的 供 体 , 而 原核 生物 则 以 NAD 为 辅 因 子 。

第 三 节 ”原核 生物 DNA 的 复制

DNA 复制 ,即使 在 原核 生物 中 也 是 一 个 复杂 的 顺序 性 过 程 . 除了 DNA 聚合 酶 外 , 它 还 需要
许多 辅助 蛋白 。 这 些 酶 和 蛋白 目前 可 能 虽 还 不 齐全 , 它们 的 功能 也 了 解 得 不 彻底 ;但 各 方面 的 证
] 隔

据 表明 , 这些 酶 和 蛋白 是 协同 作用 的 ,是 通过 形成 - 种 组 织 化 的 复合 体 以 适应 这 一 顺序 性 过 程 的 。
DNA 复制 的 知识 ,不 少 是 通过 大 肠 杆菌 的 突变 体 获 得 的 ,也 有 不 少 是 通过 噬菌体 获得 的 。
所 以 ,我 们 在 进行 原核 生物 DNA 复制 的 讨论 前 ,简单 介绍 这 两 方面 的 情况 。

一 大 肠 杆 菌 与 复制 有 关 的 基因 及 突变 体

DNA 复制 涉及 到 许多 酶 和 有 关 和 蛋白。 这
些 知 识 很 多 来 自 大 肠 杆菌 的 相应 突变 体 , 它 们
在 确定 有 关 酶 和 蛋白 如 何 开 展 工作 的 研究 中
起 过 重要 作用 。 例 如 ,人 们 发 现 有 些 基因 如
drna4 控制 新 复制 叉 的 形成 ,但 对 已 存在 复制
又 的 移动 无 影响 ; 另 一 些 基 因 , 则 由 于 编码 聚
合 反 应 组 分 (如 ana 五 编码 PolE 的 cv 亚 基 ) 或
引物 体 组 分 (如 编码 引物 酶 的 draC ) 参 与 已
存在 复制 叉 的 移动 。 又 如 编码 Pol I 的 zo4
基因 和 DNA 连接 酶 的 2g 基因 的 突变 体 亦 已
发 现 。 这 些 位 点 的 突变 不 会 使 DNA 合成 停
止 ,但 引起 冈 崎 片段 的 异常 积累 。 这 些 情 况 说
明了 各 个 蛋白 在 DNA 复制 中 所 承担 的 角色

和 所 起 的 作用 。 现在 ,许多 涉及 DNA 合成 的 基
因 已 经 克隆 (clone) ,已 获得 便于 研究 的 数量 ， 图 5-18 与 DNA 复制 部 分 有 关 的 大
这 些 进 展 对 DNA 复制 的 研究 无 疑 是 重要 的 。 肠 杆 菌 K 12 的 遗传 图
表 5$-6 大 肠 杆菌 复制 基因
基 因 图 中 的 定位 (min) ”突变 体 的 表 型 蛋白 质 及 其 体外 功能
dma4 82 慢 停 ,缺陷 性 原点 起 始 未 知
dmaB 91 快 停 DnaB 蛋白 ,引物 预 合成
anaC 99 慢 或 快 停 ( 与 突变 有 关 ) DnaC 和 DnaB 蛋白 复合
dza 匹 (po1C) 4 快 停 聚合 酶 工 全 酶 亚 基
aaG 66 快 停 ,缺陷 性 片段 起 始 引物 酶
al720T 39 慢 停 未 知
dzadJ 0. 5 慢 停 未 知
cma 玉 0.5 慢 停 未 知
ca 了 28 快 停 未 知
Ca7t 书 84 苯 乙 醇 抗 性 , 慢 停 未 知
dzaT 95 一 99 调节 终止 未 知
anaZ 10 快 停 聚合 酶 开 全 酶 的 了 亚 基 , 链 的 生长
cot 82 香 豆 霉 素 ( 和 新 生 霉 素 ) 抗 性 拓扑 异 构 酶 工 的 亚 基 也 ,切割 /封闭
0ig 51 复制 片段 的 积累 DNA 连接 酶
malLA4 48 蔡 啶 酮 酸 ( 和 奥 啉 酸 ) 抗 性 拓扑 异 构 酶 工 的 亚 基 A,ATP 酶 活力
zo1A 85 DNA 修复 能 力 受 损 DNA 聚合 酶 1
2 83 复制 又 缓 慢 移动 解 螺旋 酶

5SD 91 快 售 SSB

-一

116

大 肠 杆 菌 的 许多 有 关 DNA 复制 的 基因 现在 已 定位 (图 5-18) ,它们 的 产物 功能 也 已 清楚
( 表 5-6)。 此 外 ,枯草 杆菌 和 酵母 一 些 有 关 基 因 的 定位 也 已 完成 。

二 、 鸣 菌 体 oY174 的 复制

鸣 菌 体 是 DNA 复制 研究 中 的 一 个 重要 实验 系统 ,这 是 由 于 它们 的 基因 组 都 较 小 ,它们 的
复制 是 在 进入 寄主 细胞 后 主要 利用 寄主 的 基因 产物 进行 的 。 鸣 菌 体 DNA 有 的 是 线 型 ,有 的 是
环 型 ,有 的 是 单 链 ,有 的 是 双 链 。 这 些 特 点 都 对 复制 研究 提供 了 方便 ,下面 就 先 讨 论 SX174 的
复制 。

大 肠 杆菌 噬菌体 X174 的 基因 组 是 一 个 含 5 386 核 苷 酸 的 单 链 环 型 DNA ,复制 中 首先
合成 的 不 是 其 自身 而 是 其 互补 链 。 为 了 进行 繁殖 ,@X174 采取 的 策略 是 : 先 合成 原来 DNA( 称
为 正 链 ) 的 互补 链 ( 称 为 负 链 ) ,然后 (十 ) 链 和 (一 ) 链 形成 双 链 环 型 DNA , 这 种 双 链 环 型 DNA
称 为 复制 型 (replicative form,RF) ,然后 以 REF 中 的 (一 ) 链 为 模板 合成 (十 ) 链 , 即 原来 的
DNA。 或 是 说 ,@X174 的 复制 循环 可 以 分 为 3 个 阶段 :(1) 病 毒 ( 一 ) 链 的 合成 和 RE 的 形成 (SS
一 REF);(2)RF 的 繁殖 (RF->RF); (3) 新 病毒 (十 ) 链 的 产生 (RF->SS) 。 这 一 过 程 中 的 (一 ) 链
合成 已 成 为 研究 大 肠 杆菌 中 后 随 链 复制 的 模型 , 而 由 复制 型 生成 (十 ) 链 则 成 了 先导 链 上 DNA
合成 的 模型 。

瑟 X174 的 以 (十 ) 链 为 模板 的 (一 ) 链 合成 (SS

_>RF) 完 全 依靠 寄主 的 酶 和 有 关 和 蛋白, 这 一 过 程 as

需要 引物 体 的 参与 。 引 物体 (primosome) 由 7 种 蛋白 亚 基 结 构 亚 基质 量 (ctD)
蛋白 组 成 ( 表 5-7)。@X174 的 DNA 在 接近 2 300 SP
位 处 有 一 个 由 44 核 背 酸 组 成 的 发 夹 结 构 , 它 与 引 ”pricoanm 基体
物体 的 形成 有 关 。 整 个 过 程 可 分 为 6 步 ( 图 5- 。 DnaB 六 聚 体 50

19) 。 DnaC 单 体 29

引物 酶 (DnaG) 单 体 60

《1) 当 更 X174 的 (十 ) 链 进入 寄主 细胞 后 , 除
nyn' ,na' 为 各 该 蛋白 原来 的 表示 法 。

了 分 子 中 的 发 夹 结 构 外 ,其 它 部 分 都 为 SSB 所 履

盖 。 引 物体 的 组 装 是 以 PriA 蛋白 对 引物 体 组 装 位 点 (Primosome assembly site,pas) 的 识别 开
始 的 ,@X174 的 pas 位 于 基因 下 和 C 间 的 70 核 苷 酸 片 段 上 ,pas 能 形成 包括 发 夹 结构 在 内 的
多 种 二 级 结构 而 且 能 被 识别 。 随 后 ,PriB 和 PriC 参与 复合 物 的 形成 。

《2) 由 PriA ,PriB 和 PricC 组 成 的 复合 物 进 一 步 与 DnaT ,DnaB 和 DnaC 组 装 成 预 引物 体
Cpreprimosome) 。 其 中 DnaB 和 DnacC 形成 由 ATP 稳定 化 的 B,-C。 复合 物 。 预 引物 体 与 引物
酶 的 结合 形成 了 引物 体 。

C3)PriA 利用 ATP 水 解 的 能 量 使 引物 体 在 (十 ) 链 上 沿 3 一 5 方向 移动 。

《4) 引 物体 在 随机 选 定 的 位 置 逆 转移 动 方向 ,并 在 多 个 位 置 合成 RNA 引物 。DnaB 是 一 种
依赖 于 DNA 的 ATP 酶 , 它 驱 动 引 物体 在 ssDNA 上 的 移动 ,但 方向 与 PriA 相反 。

《5)Pol 全 酶 从 引物 延伸 合成 DNA 片段 。

(6)Pol I 切除 RNA 引物 ,填补 缺口 ,连接 DNA 片段 。 在 这 一 过 程 中 所 形成 的 带 切口 的 双
链 DNA 称 为 RFI ,切口 封闭 和 超 螺 旋 化 后 的 复制 型 称 为 RF I 。

引物 体 继续 与 DNA 相 结合 以 备 参与 (十 ) 链 的 合成 。

117

机 人

pol 1 引物 体
加 有 + 4rNTPs
2 人 ea
(9 ) NAD ss，

四
填补 缺口 连接
图 5-19 g@X174 的 以 (十 ) 链 为 模板 的 RE 合成

@X174 的 由 REF 合成 (十 ) 链 的 过 程 (RF->SS) 是 研究 先导 链 复制 的 模型 。 图 5-20 表示 出
两 种 过 程 :一 是 不 连续 的 (一 ) 链 合成 ;二 是 连续 的 (十 ) 链 合成 。( 十 ) 链 合成 涉及 到 两 种 未 参与
SS~~RF 的 蛋白 ,其 中 之 一 是 噬菌体 编码 的 基因 4 蛋白 (gpA); 另 一 是 大 肠 杆菌 的 Rep 蛋 自 。

原点 (4305 一 4306)
字 | 5

RFI 一 一 一 、

gp 8B,D,F,G,H

图 5-20 @X 174 的 (十 ) 链 合成

|

gpA 是 一 60kD、 对 SX174( 十 ) 链 原点 具有 专 一 性 的 核酸 内 切 酶 活力 的 蛋白 , 它 是 这 一 过
程 中 到 X174 所 编码 的 唯一 复制 蛋白 。gpA 的 功能 是 引发 复制 起 始 , 整 个 (十 ) 链 合成 过 程 可 以 |
分 为 4 步 :
118

(1) (十 ) 链 合成 是 从 REF I 开始 的 。gpA 借助 于 引物 体 结合 于 识别 位 点 , 专 一 性 地 作用 于
4305 和 4 306 间 的 磷酸 二 酯 键 产生 一 切口 。 切 口 的 3 -OH 端 为 4 305 位 的 G 残 基 , 蛋白 则 通过
其 酷 氨 酸 残 基 结合 于 4 306 位 5 -P 的 A 残 基 ,从 而 保存 键 能 。

(2)Rep 蛋白 结合 于 gpA 处 的 (一 ) 链 。Rep 蛋白 从 (十 ) 链 使 gpA 复合 物 从 (十 ) 链 的 5 端
开始 使 双 股 链 不 断 解 开 , 从 双 股 链 中 分 离 出 来 的 (十 ) 链 即 为 SSB 覆盖 , 以 免 重 新 与 (一 ) 链 退
火 。

(3)Pol IE 全 酶 从 原来 (十 ) 链 的 3 端 使 DNA 链 不 断 延 伸 , 结果 就 形成 一 个 环 化 的 滚 环 结
构 (looped rolling circle structure) 。 其 中 原来 的 (十 ) 链 在 复制 叉 移 动 时 仍然 与 gpPA 相连 接 , 这
犹如 原来 的 (十 ) 链 逐步 被 剥离 RF。

(4) 复 制 绕 (一 ) 链 超过 完整 一 周 后 即 产 生 一 双 股 复制 原点 ,gpPA 在 此 再 做 专 一 性 切割 ,并
与 新 形成 的 5 端 共 价 结合 .gpA 的 第 二 次 切割 生成 一 单位 长 度 的 @X174DNA，, 它 的 3 -OH 向
gpPA 5'-P 做 亲 核 攻击 从 而 形成 环 状 分 子 。 每 一 分 子 的 gpPA 含 两 个 活性 酷 氨 酸 , 故 可 完成 相继
的 切割 ,并 与 5 端 连接 。

在 SBX174 感染 的 中 期 ,每 一 新 合成 的 (十 ) 链 指导 (一 ) 链 合成 从 而 形成 REFE。 在 感染 的 后
期 ,新 合成 的 (十 ) 链 通过 叭 菌 体 编码 的 病毒 成 熟 蛋 白 和 衣 壳 蛋白 (gpB,D,F,G 和 互 ) 形 成 新 的
病毒 粒子 。

由 上 述 过 程 可 见 ,@X 174 的 (一 ) 链 合成 是 不 连续 的 ,相当 于 大 肠 杆 菌 DNA 后 随 链 的 复
制 ;( 十 ) 链 的 合成 是 连续 的 ,相当 于 大 肠 杆菌 先导 链 的 复制 。

三 \ 大 肠 杆菌 的 DNA 复制

大 肠 杆 菌 的 基因 组 是 一 双 股 环 型 DNA.。 它 的 复制 是 由 单一 原点 出 发 按 双 向 的 2 方式 进行
的 。 先 是 原点 处 双 股 DNA 解 链 ,然后 是 先导 链 上 DNA 的 连续 合成 和 后 随 链 上 DNA 的 不 连
续 合 成 ,最 后 复制 完成 。

(一 ) 复 制 的 起 始

原核 生物 DNA 由 于 较 小 ,每 一 分 子 只 有 一 个 复制 原点 ,而 真 核 生物 DNA 则 有 多 个 原点 。
DNA 复制 原点 不 同 于 后 随 链 上 冈 崎 片段 的 起 始点 大肠 杆 菌 基因 组 的 复制 原点 位 于 天 冬 酰胺
合成 酶 和 ATP 合成 酶 操纵 子 间 ， 共 有 245 bp， 称 为 orxC。 现 在 已 分 离 到 许多 噬菌体 、 细 菌 、
质粒 和 细胞 器 的 复制 原点 ， 并 测定 了 它们 的 核 苷 酸 序列 ， 它 们 一 般 都 含 两 个 系列 的 重复 单位
(图 5-21) :3 个 13 bp 重复 序列 和 4 个 9bp 重复 序列 .大肠 杆菌 编码 的 Dna 蛋白 即 作用 于 orzC
而 引发 复制 的 起 始 ，Kornberg A. 认为 大 肠 杆菌 的 起 始 经 历 了 下 述 步骤 〈 图 5-22): 首先 是
DnaA 蛋白 识别 和 结合 于 ozC 的 9bp 重复 单位 形成 复合 物 ， 其 中 20 一 40 个 DnaA 蛋白 形成
核心 , 负 超 螺旋 的 ozC 包 庄 于 外 .HU 蛋白 (参阅 第 四 章 ) 参与 并 促进 这 一 过 程 。 随后, DnaA
蛋白 使 13 bp 重复 单位 熔 解 而 形成 开放 复合 物 。P1 核酸 酶 〈 作 用 于 单 链 ) 的 作用 证 明 约 有 45
bp 成 为 单 链 。 开 放 复 合 物 的 形成 需要 DnaA 蛋白 和 ATP。 这 一 过 程 发 生 于 22C 以 上 (至少 在
离 体 条 件 下 如 此 ) 。 于 是 DnaA 蛋白 使 DnaB 和 DnaC 蛋白 进入 DNA 的 熔 解 区 形成 前 引物 化
复合 物 (prepriming complex) 。DnaB 为 解 螺旋 酶 ， 它 使 DNA 双向 熔 解 形成 两 个 复制 又 ， 并
使 引物 酶 和 RNA 聚合 酶 得 以 进入 ， 这 两 种 酶 参与 了 先导 链 上 引物 的 合成 。 在 这 一 过 程 中 ，
RNA 聚合 物 的 参与 称 为 转录 活化 transcriptional activation)， 此 外 , SSB 和 旋转 酶 也 都 参与
了 这 一 过 程 ，

119

识别 位 点 一 一 一 一 | 言 含 AT 的 重复 序列
A A 入 忆 5

|

下
CC 全 全 生生

图 5-21 细菌 的 复制 原点
A 为 构成 DnaA 蛋白 识别 位 点 的 9 bp 重复 单位 ;箭头 表示 富 含 AT 的 重复 单位 ?n 代表 任何 核 苷 酸 。

图 5-22 ”大肠 杆 菌 DNA 复制 的 起 始

大 肠 杆菌 中 ,DNA 复制 是 受 细胞 分 裂 所 控制 的 ,每 一 细胞 分 裂 周期 仅 复制 一 次 ,37C 时 是
大 肠 杆 菌 的 加 倍 时 间 随 生长 条 件 而 在 二 20 min~10h 之 间 恋 化 。 不 过 ,复制 又 的 移动 速率 是 固
定 的 ,每 秒 约 850 核 苷 酸 , 这 就 使 复制 时 间 固定 在 40 mm', 加 上 分 裂 过 程 中 细胞 组 分 的 分 离 和
隔膜 的 形成 约 需 20 min ,两 者 相 加 约 共 需 60 min。 因 此 ,加 倍 时 间 少 于 60 min 的 细胞 ,在 前 一
轮 细胞 周期 结束 前 必 已 开始 新 一 轮 的 复制 ,这 已 为 实验 所 证 实 。 从 而 表明 ,细胞 中 可 能 存在
种 触发 每 一 轮 DNA 复制 的 信号 。 这 种 调控 机 制 目前 还 不 清楚 ,但 各 方面 的 研究 已 指出 可 能
机 制 之 一 是 :PaaA 蛋白 由 与 其 紧密 结合 的 ATP 的 缓慢 水 解 ( 约 1 hb) 而 形成 钝 化 的 Dna 年
ADB 复合 物 。 这 一 复合 物 的 活化 是 通过 以 ATP 置换 ADP 实现 的 ,而 细菌 质 膜 中 的 酸性 磷脂 旺
能 优 进 这 一 过 程 。 复 合 物 由 活化 向 钝 化 状态 的 转化 ,以 及 一 种 称 为 染色 体 起 始 抑制 剂 呈 -
hibitor of chromosomal initiation ，Ici A) 的 蛋白 结合 于 ozC 的 13 bp 重复 单位 ,就 阻止 了 不 适
当时 候 复制 的 起 始 。 这 一 过 程 的 细节 现在 还 不 清楚 。

二 ) 复 制 的 延伸

随 痢 复制 起 始 中 2 结构 的 形成 ,许多 酶 和 蛋白 相继 进入 复制 又 (图 5-23) 。 来 自 噬菌体 . 动 |
物 病 毒 和 orzC 研究 的 知识 说 明 , 这 些 酶 和 相关 蛋白 在 复制 又 形成 了 称 为 复制 体 (replisome) 的

超 分 子 复合 物 。 不 同系 统 中 ,复制 体 的 组 分 虽 有 差异 ,但 其 功能 十 分 相似 解 螺旋 酶 使 DNA 双
120

[7 了
7 Dnar \,- 一 引物 酶

9， 引
前 导 链

引物 体
总 /3 党-DnaB-DnaC 复合 物

引物

图 5-23 DNA 复制 又

股 链 分 离 和 复制 又 前 进 ; 旋转 酶 解除 由 此 产生
的 正 超 螺旋 张力 ;DNA 单 股 随即 为 SSB 履 盖 ，
形成 作为 模板 所 需 的 伸展 构象 ;前 导 链 上 开始
DNA 的 连续 合成 ,后 随 链 上 的 不 连续 合成 ;内
崎 片段 上 引物 的 切除 ` 缺 口 的 填补 和 切口 的 封
闭 。 根据 计算 ,每 一 复制 又 仅 含 1 个 DNA 聚合
酶 工 全 酶 ,这 说 明 前 导 链 和 后 随 链 上 的 DNA 合
成 是 由 同一 复制 体 负责 的 。 但 DNA 两 股 链 上 的
DNA 合成 不 是 同步 进行 的 ,并 且 方 向 相反 。 那
么 ,复制 体 是 怎样 工作 的 呢 ? 对 此 , 现在 已 提出 了
一 个 模型 。 这 一 模型 认为 , 当前 导 链 上 开始 DNA
合成 和 复制 又 向 前 移动 时 , 后 随 链 随 即 向 后 回 折
成 环 , 并 与 聚合 酶 的 鸡 一 个 活性 中 心 按 前 导 链 的
取向 缔 合 (图 5-24)。 在 这 样 的 结构 中 ,PriA 和
Dnag 蛋白 是 两 个 关键 的 组 分 ,PriA 蛋白 具 依赖

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复制 又 处 前 导 链 和 后 随 链
同时 复制 的 工作 模型

图 5-24

于 DNA 的 ATP 酶 活力 , 它 提供 引物 体 移动 的 动力 , 清除 过 程 中 遇 到 的 SSB, 使 DaaB 蛋白 和 引
物 酶 发 挥 功 能 。DnaB 蛋白 的 解 螺旋 活力 在 大 肠 杆菌 的 复制 中 占 重 要 地 位 , 它 使 复制 又 处 的

DNA 不 断 解 旋 。 但 这 两 种 蛋白 的 移动 极 性 不 同 ，

DaaB 蛋白 为 55->3',PriA 为 3' 去 5' 。 这 二 模

型 可 以 合理 地 解释 在 DNA 的 双 股 链 上 是 如 何 同时 合成 DNA 的 ,使 引物 酶 和 复制 又 的 相反 移 位
方向 得 到 统一 解释 。 复 制 时 ,DNA 不 断 地 在 复制 体 中 抽动 ,不 断 使 PNA 延伸 。

三) 复制 的 终止

复制 的 终止 (termination) 是 一 个 尚 不 清楚 的 问题 ,大 肠 杆 菌 的 基因 组 是 一 环 型 DNA, 它
的 复制 终止 位 点 约 相对 于 原点 ( 见 图 5-18) 。 我 们 知道 大 肠 杆 菌 DNA 复制 进行 到 一 特定 区 域

1 鸡

(和 重复 序列 >

互补 末端 间 的
，， > / 碱 基 配 对

3 5
缺口 由 DNA 聚合 酶
I 及 连接 酶 填补

位 点 专 一 性
广 酸 酶 切割
ES 中 |
人 a

3 出 取 全 3

(b) 站

5-25 T7 DNA 的 复制 人 5)

(a) 线 型 DNA 3 端的 不 完全 复制 ;

(b) 多 联 体 的 形成 和 复制 的 完成 。 -mm
后 ,复制 叉 的 移动 会 由 于 这 一 区 域 两 侧 的 核 昔
酸 序列 而 放 慢 移动 速度 ,从 而 协调 两 复制 又 到
达 的 时 间 .。 在 复制 的 最 后 阶段 ,大 肠 杆 菌 的 环形 一 --IImmrrn )。
DNA 会 产生 两 个 相互 套 接 在 一 起 的 环 。 那 么 ，
大 肠 杆菌 DNA 的 复制 究竟 最 后 怎样 完成 并 生 图 5-26 ”总 病 病毒 的 DNA 复制
成 两 个 独立 的 DNA 分 子 的 呢 ? 拓扑 异 构 酶 在 图 中 由 (3) 到 (5) 仅 表示 出 半分 子 。
这 里 显然 发 挥 了 重要 作用 。 当 复制 接近 完成 时 ,两 个 复制 又 相互 接近 所 产生 的 空间 障碍 会 干扰 |
拓扑 异 构 酶 对 复制 又 前 方 DNA 的 解 旋 作 用 。 这 时 , 一 个 可 能 的 情况 是 ,DNA 先 通过 拓扑 异 构 |
酶 的 作用 先 去 连环 化 ,然后 DNA 再 完成 复制 。

虽然 很 多 细胞 ,病毒 和 质粒 的 DNA 是 环 型 的 ,但 也 有 一 些 基因 组 是 线 型 的 。 这 些 线 型
DNA 的 复制 ,由 于 RNA 引物 在 复制 后 的 切除 ,故而 在 5 端 会 留 下 一 缺口 。 这 些 线 型 DNA 是
1 2

一

怎样 完成 其 末端 的 复制 的 呢 ? T7 DNA 的 复制 (图 5-25) 提 供 了 一 种 途径 。

T7DNA 的 复制 原点 位 于 分 子 左 端 约 17% 处 ,复制 双向 进行 ,不 久 左 端的 复制 完成 ,形成
一 立 结构 并 不 断 扩大 。 由 于 T7 DNA 的 两 个 末端 是 重复 的 ,其 左 端 完全 是 其 右 端的 重复 。 故
T7DNA 复制 生成 的 不 是 单位 长 度 的 子 代 DNA ,而 是 由 单位 长 度 DNA 通过 其 末端 重复 序列
连接 成 的 多 联 体 (concatemer)。 多 联 体 为 单位 长 度 DNA 间 提 供 了 DNA 延伸 所 需 的 3' 端 , 然
后 Pol I 填补 缺口 ,连接 酶 封闭 切口 ,多 联 体 再 经 专 一 性 核酸 酶 切割 成 单位 长 度 分 子 。

痘 病 病毒 (poxvirus ) 为 线 型 DNA 末端 复制 提供 了 另 一 途径 (图 5-26) 。 癌 病 病毒 的 两 端 由
发 赤 结 构 连 接 。 复 制 从 其 内 部 的 起 始 位 点 开始 (1) ,复制 使 发 夹 结构 转变 成 双 链 (2) ,分 子 内 部
发 生 交错 切割 (3) ,分 子 重 排 (4) ,未 端 回 折 再 经 DNA 连接 酶 作用 生成 原来 的 分 子 (5)。

原核 生物 线 型 DNA 复制 的 终止 现 仍 不 完全 清楚 。

(四 ) 复 制 的 忠实 性

DNA 复制 是 一 个 高 度 精 确 的 过 程 。 据 计算 ,每 复制 10 一 10bp 中 仅 有 一 个 错 配 。 复制 的

这 种 近乎 完全 的 高 度 精确 性 是 必要 的 ,因为 只 有 这 样 才能 保证 遗传 信息 在 传代 中 保持 完整 。

复制 的 忠实 性 是 通过 多 种 因素 实现 的 。 聚 合 酶 I 和 开 的 3 一 5 核酸 外 切 酶 活力 对 此 做 出
了 贡献 。 现在 , 育 合 酶 ! 的 结构 已 经 确定 ,其 Klenow 片段 具有 两 个 结构 域 . 大 结构 域 含 一 个 荷
正 电 的 ,直径 约 2 nm 的 裂缝 ,DNA 即 结合 于 此 。DNA 一 旦 结合 ,裂缝 即 被 关闭 ;这 时 ,DNA
只 能 在 裂缝 中 前 后 滑动 。 而 小 结构 域 含 核 苷 酸 结合 位 点 。 两 结构 域 在 空间 相距 3 nm。 当 新 合
成 的 DNA 中 含 错 误 配 对 的 核 苷 酸 时 , 双 螺 旋 发 生变 形 , 因而 不 再 能 在 裂缝 中 向 前 滑动 ,只 能
后 移 , 这 时 3 一 5 核酸 外 切 酶 活力 就 切除 错 配 的 核 苷 酸 。 错 配 核 苷 酸 切 除 后 ,聚合 反应 继续 进
行 (图 5-27)。 聚 合 酶 中 聚合 和 校对 两 种 活力 的 相对 强 弱 影响 着 突变 的 频率 。 如 聚合 酶 对 3'-5/
核酸 外 切 酶 相对 活力 高 ,突变 就 上 升 , 反 之 就 下 降 。

图 5-27 ”3'- 外 切 核 酸 酶 对 复制 的 校对 作用

DNA 聚合 酶 只 能 从 引物 的 3' 端 延伸 DNA 链 ,也 增加 了 复制 的 精确 性 。 这 可 以 从 两 方面
理解 : 碱 基 配 对 具有 协同 性 ,开始 几 个 碱 基 错 配 的 概率 高 ;同样 ,开始 阶段 所 形成 的 短 核 苷 酸 序
列 中 的 错 配 也 不 易 被 校正 。 由 于 RNA 引物 最 终 被 降解 ,其 中 可 能 存在 的 错误 也 就 为 随后 由 聚
合 酶 工 合成 的 正确 短 DNA 片段 所 代替 。

后 随 链 上 的 DNA 合成 是 不 连续 的 ,但 生物 机 体 为 何 未 演化 出 一 种 能 使 核 苷 酸 按 3 一 5
方向 聚合 的 酶 ,从 而 使 后 随 链 上 的 DNA 合成 也 是 连续 的 呢 ? 实际 上 这 一 系统 有 利于 提高 复制
的 忠实 性 。 如 核 苷 酸 按照 3 一 5 方向 聚合 ,延长 中 的 DNA 链 5 端 必须 保留 三 磷酸 基 以 驱动 下
一 步 反 应 (图 5-28) 。 如 聚合 反应 出 现 差错 , 错 配 碱 基 切 除 后 留 下 的 只 能 是 5 -OH 或 55-P。 这 些

123

末端 基 团 都 难于 为 进一步 的 聚合 提供 所 需 的 能 量 。 为 使 聚合 反应 得 以 继续 ,5 端 必 须 重 新 活 [

化 。 因 此 ,不 连续 合成 虽然 复杂 ,但 它 有 利于 错 配 核 苷 酸 的 校正 。

5 5 PPi 站
一 全- P | 了
PPP 人 | PPP | 工
3 3 HO
记 近 -o8
PPP | P | P | 了 PPP 了 十 放 和 于

图 5-28 ”假想 的 脱氧 核 苷 酸 的 3 一 5 聚合 反应
复制 虽然 具有 校正 功能 ,但 总 还 可 能 有 漏 校 。 此 外 ,环境 中 的 化 学 或 物理 因素 还 不 断 地 使

A

DNA 受到 损伤 ,它们 可 以 通过 细胞 的 各 种 修复 机 制 不 断 加 以 纠正 ,这 就 把 DNA 中 的 差错 降 星

低 到 最 小 程度 。

第 四 节 ， 真 核 生 物 DNA 的 复制

许多 证 据说 明 , 真 核 和 原核 生物 DNA 复制 的 基本 特征 是 相同 的 。 但 由 于 真 核 生 物 DNA
远大 于 原核 的 ,大 多 数 真 核 生物 是 由 不 同 的 细胞 组 成 的 多 细胞 系统 ,故而 两 者 间 志 其 在 复制 天
调节 上 显示 出 许多 明显 的 不 同 。

一 ` 真 核 生 物 DNA 复制 的 一 些 特点

真 核 生 物 的 一 生 要 经 历 许多 次 细胞 分 裂 ,而 每 一 次 细胞 分 裂 都 要 经 历 4 个 不 同 的 时 期 , 称
为 细胞 周期 (cell cycle)。 细 胞 周期 可 分 为 :由 有丝分裂 期 (M) ;@@ 第 一 间隔 期 (G1) , 次 定 细胞 ，
进入 DNA 复制 或 是 停留 在 静止 期 (G0)，
如 细胞 一 旦 通过 限制 点 (restriction
point)， 它 就 进入 S 期 ;@ 合 成 期 (S), 它 是
细胞 周期 中 唯一 发 生 DNA 合成 的 时 期 ;
由 第 二 间隔 期 (G2), 细 胞 随后 进入 有 丝 分
裂 ( 图 5-29) 。

培养 细胞 的 细胞 周期 通常 可 经 历 16 四 区
一 24h。 在 多 细胞 生物 中 ,不 同类 型 细胞 的 “\ 闪 全
周期 可 相差 很 大 ,从 8 h 直至 100 天 以 上 ， 及
这 种 差异 多 发 生 在 G1 期 。 有 些 细胞 ,如 神
经 元 等 则 已 不 再 分 裂 。

在 细胞 周期 中 ,细胞 能 否 通过 限制 点
决定 它 进 入 细胞 分 裂 或 是 滞留 在 静止 期 ， 5-29 真 核 生 物 的 细胞 周期

124

这 种 信和 号 来 自 细胞 外 .对 多 细胞 生物 而 言 , 它 是 通过 一 些 专 一 性 的 生长 因子 结合 于 细胞 表面 的
受 体 发 挥 作用 的 ,不 同类 型 细胞 具有 对 应 于 不 同 生长 因子 的 受 体 。 例 如 ,上 皮 细 胞 的 繁殖 是 由
来 自 血 小 板 的 生长 因子 (PDGF)7 引 起 的 , 工 细胞 是 由 白细胞 介 素 2 激发 的 。 生 长 因子 与 受 体 的
结合 就 触发 有 关 的 级 联系 统 (cascade system ) 。

真 核 和 原核 生物 的 另 一 个 显著 不 同 点 是 ,前 者 的 DNA 具有 多 重复 制 原点 ,而 原核 生物 只
有 一 个 。 在 真 核 生物 中 ,复制 叉 的 移动 速率 为 约 50 核 苷 酸 /s, 如 从 一 个 原点 出 发 进行 双向 复
制 , 一 个 平均 大 小 的 真 核 基 因 组 的 复制 就 需要 1 个 月 时 间 。 这 与 事实 不 符 , 细 胞 周期 中 的 S 期
一 般 只 经 历 几 个 小 时 。 电镜 观察 证 明 , 真 核 生物 染色 体 具 有 多 重 原 点 , 约 3 一 300 kb 一 个 原点 。
真 核 生 物 DNA 上 的 原点 数 决 定 于 物种 和 组 织 两 者 。

真 核 生物 DNA 原点 的 特征 ,由 于 其 基因 组 的 巨大 和 检测 技术 上 的 困难 ,现在 还 不 清楚 。
但 有 证 据 表 明 , 酵 母 DNA 中 存在 专 一 性 的 复制 原点 ,它们 称 为 自主 性 复制 序列 (autonomous
replication sequence,ARS) 。 酵 母 约 含 400 ARS ,每 一 复制 子 约 为 36 kb 。

ARS 是 由 两 个 功能 域 组 成 的 : (1) 功 能 域 A 含 11 bp, 其 共有 序列 为 (A/TIITTTAT(CA/
G)TTTCA/T)。 这 是 ARS 的 核心 ,可 能 是 起 始 和 蛋白 的 结合 位 点 ,不 过 这 有 待 确 证 ;2) 功 能 域
B 富 含 AT, 延 伸 到 核心 序列 3 - 端 50 一 100 bp 处 ,这 可 能 是 DNA 熔 解 的 区 域 . ARS 显然 是 可
能 的 复制 原点 ,但 仍 有 许多 问题 不 清楚 。

实验 证 据 表 明 , 真 核 生 物 DNA 的 各 个 区 域 不 是 全 都 同时 复制 的 ,而 是 20 一 80 相 邻 复制
子 一 次 被 活化 。s 期 中 不 断 有 新 复制 子 被 活化 ,直至 整个 染色 体 完 全 复制 。 真 核 生物 病 毒 的
DNA 合成 研究 说 明 ,复制 子 的 复制 是 由 引物 转录 触发 ,由 与 原点 相 联系 的 增强 子 与 转录 因子
的 结合 所 调控 的 .组 织 特异 和 细胞 周期 特异 的 转录 因子 能 够 使 特定 的 复制 子 进 入 复制 ,从 而 控
制 每 一 细胞 周期 仅 复 制 一 次 。 /

DNA 复制 是 细胞 分 裂 的 中 心 问题 ,DNA 在 何 时 和 以 何 种 频率 进行 复制 是 受 多 种 信和 号 控
制 的 。

二 ` 真 核 生物 DNA 聚合 酶

人 们 对 真 核 生 物 DNA 聚合 酶 比 原核 生物 的 酶 了 解 得 更 少 ,这
-CH2OH 主要 由 于 它们 分 离 纯 化 不 易 , 不 同 组织 和 不 同时 期 细胞 中 的 酶 有 差
区 HE 异 ,难于 得 到 相应 的 突变 体 等 。 迄 今 在 真 核 细胞 的 核 中 已 发 现 4 种
DNA 聚合 酶 :xc,6,9 和 e; 另 一 种 7 存在 于 线粒体 内 ( 表 5-8)。
DNA 育 合 酶 < 在 体内 参与 染色 体 DNA 的 复制 。 它 的 这 一 功能
本 -二 和 是 通过 抑制 剂 阿 菲 柯 林 (aphicolin) 确 定 的 。 阿 非 柯 林 是 一 种 真菌 产
HOH2C 。 物 , 它 在 抑制 聚合 酶 活力 的 同时 抑制 了 DNA 复制 ,这 证 明 它 参与
阿 菲 柯 林 了 复制 。 不 同 真 核 细胞 Pol zx 的 结构 和 性 质 都 相似 ,其 核心 亚 基 具 聚
合 酶 活力 ,50 KED 和 60kD 的 亚 基 具 引物 酶 活力 ,但 未 检测 到 3 一 5 核酸 外 切 酶 活力 。
Pol 8 与 c 一 样 ,都 参与 DNA 的 复制 ,不 同 的 是 ,Pol 6 缺乏 引物 酶 活力 ,但 显示 3' 一 忆 核
酸 外 切 酶 活力 .它们 的 另 一 个 不 同 是 ,Pol 8 具 高 持续 性 ,而 Pol " 的 持续 性 仅 为 中 等 , 约 100 核
苷 酸 。 这 些 特点 表明 :聚合 酶 $ 可 能 是 前 导 链 的 复制 酶 , 仅 偶尔 需要 引物 ,但 要 求 高 的 持续 性 ;
聚合 酶 则 是 后 随 链 的 复制 酶 , 它 的 100~200 核 苷 酸 的 持续 性 已 可 满足 冈 崎 片段 的 合成 ,但
需 经 常 形成 引物 。 聚 合 酶 c 和 9 可 能 是 整个 复制 体 的 两 个 组 分 。

]25

表 5-8 真 核 生 物 DNA 聚合 酶
Q 和 E 8 4

细胞 内 的 部 位 核
分 子 量 (kD)
天 然 状 态
核心 酶 165 一 180
其 它 亚 基 70,50,60

7 250 170 256 36 一 38 160 一 300
125 215 36 一 38 125

持续 性

3 一 5 核酸 外 切 酶

引物 酶

修复
a.PCNA 代表 增殖 细胞 核 抗 原 ;b. PCNA 存在 时 ;c. 果 蝇 中 为 隐 人 性 。

聚合 酶 $ 具有 多 种 形式 。 由 牛 胸腺 得 到 的 聚合 酶 $ 由 125kD 和 48KkD 两 种 亚 基 组 成 ; 酵 ，
母 的 聚合 酶 4 由 125kD 和 55kD 亚 基 组 成 ;由 人 胎盘 分 离 到 的 相应 酶 含 1 个 170kD 多 肽 和
一 些 较 小 的 亚 基 。Pol6 的 一 个 重要 特征 是 对 增殖 细胞 核 抗 原 (proliferating cell nuclear anti-
gen,PCNA) 的 依赖 性 .PCNA 大量 存在 于 增殖 细胞 的 核 中 .。 由 牛 胸 腺 分 离 得 到 的 PCNA 为 一
36kD 的 蛋白 质 。PCNA 使 Pol5 的 持续 性 增加 40 倍 , 它 的 作用 类 似 Pol 工 全 酶 中 的 8 亚 基 。，

聚合 酶 6 和 *e 的 功能 尚 不 完全 清楚 ,可 能 与 DNA 修复 有 关 。

真 核 生物 DNA 复制 还 涉及 两 种 称 为 复制 因子 (replication factor ,REF) 的 蛋白 ， 即 RFA 和
REFC。 它们 存在 于 从 酵母 到 哺乳 动物 中 . RFA 为 真 核 生物 单 链 DNA- 结 合 蛋白 ,相当 于 原 荒 生
物 的 SSB。REFC 促进 活性 复制 复合 物 的 组 装 。

三 、 真 核 生 物 Pol y 和 线粒体 DNA 复制

线粒体 是 碍 核 生 物 的 重要 细胞 器 , 它 有 自身 的 DNA。 线粒体 DNA 一 般 为 环 型 双 股 分 子 ，
动物 的 线粒体 DNA 的 大 小 约 16 kb ,植物 的 线粒体 DNA 更 为 复杂 。 线粒体 DNA 的 双 股 链 由
于 浮力 密度 的 不 同 而 区 分 为 轻 链 和 重 链 。 线 粒 体 DNA 的 复制 (图 5-30) 称 为 D_ 环 复制 , 它 含
有 两 个 单 向 复制 又 ,负责 这 一 复制 的 是 真 核 生物 DNA 聚合 酶 y。 复 制 从 重 链 ( 理 链 ) 的 原点 开 .
始 , 这 时 新 合成 的 互 链 即 置 换 原 来 的 链 ,这 样 所 形成 的 结构 称 为 取代 环 (displacemneni 攻 ,让
D 环 。 当世 链 的 合成 进行 到 约 2/3 时 , 轻 链 (L 链 ) 合 成 的 原点 即 被 暴露 ,从 而 引发 了 工 链 的 个
成 ,后 者 延伸 的 方向 与 瑟 链 相 反 。 整 个 过 程 约 需 1 h, 这 和 真 核 生 物 DNA 的 复制 远 慢 于 原核 生 各

敲

籽

摩
1 十 1 十 到 京 |

新 H 链 的 起 始 位 点
8 开 链 的 突起
一 -一
人 人 >
时
超 螺旋 新 L 链

图 5-30 线粒体 DNA 的 复制 半
126 |

物 DNA 相 一 致 . 这 一 复制 方式 大 致 亦 需 RNA 引物 。 人 们 亦 在 线粒体 中 发 现 了 拓扑 异 构 酶 , 它
们 可 能 参与 亲 链 的 解 旋 和 子 链 的 分 离 。

四 ,逆转 录 酶

道 转录 酶 的 存在 是 在 70 年 代 证 实 的 。 一 些 含 RNA 的 肿瘤 病毒 如 乌 类 成 血细胞 白血病 病
毒 (avian myeloblastosis' virus) 和 劳 氏 肉瘤 病毒 (Rous sarcoma virus ) 含 有 一 种 独特 的 RNA
指导 的 DNA 聚合 酶 (RNA-directed DNA polymerase), 它 以 RNA 为 模板 指导 DNA 合成 。 感
染 时 ,病毒 的 单 链 RNA 连同 逆转 录 酶 一 起 进入 寄主 细胞 ,逆转 录 酶 即 以 病毒 RNA 为 模板 合
成 与 其 互补 的 DNA 链 ,同一 酶 使 RNA-DNA 杂交 分 子 中 的 DNA 为 模板 合成 互补 DNA 从 而
形成 双 股 DNA.。 这 样 合 成 的 双 股 DNA 被 整合 进 一 寄 主 基因 组 。 在 一 定 条 件 下 ,整合 的 休眠 病
毒 基 因 组 被 活化 ,随即 转录 生成 病毒 RNA 和 形成 新 的 病毒 粒子 。 这 一 过 程 可 以 表述 为 :

RNA(CT) 、DNA( 一 )
DNAC-) ” DNA( 十 )

RNA CD 记 RNAI

逆转 录 酶 除 具 有 RNA 指导 的 DNA 聚 合 酶 活力 外 ,还 具有 :核糖 核酸 外 切 酶 (核糖 核酸 酶 匡 )
活力 , 它 专 门 降 解 RNA-DNA 杂交 分 子 中 的 RNA 和 DNA 指导 的 DNA 育 合 酶 活力 。

含 逆 转录 酶 的 RNA 病毒 也 称 为 着 转录 病毒 (retrovirus ) 。 逆 转录 病毒 基因 组 含 3 种 基因
(图 5-31) :gag,zol 和 ezzosgasg(Cgroup associated antigen) 基 因 编 码 一 种 多 蛋白 (polyprotein ) ，
它 通 过 自身 的 蛋白 水 解 酶 活力 裂解 为 3 一 4 种 病毒 核心 蛋白 。zo 编码 逆转 录 酶 。 疼 转录 酶 有
ae 和 有 两 个 亚 基 ;zol 编码 的 为 8 亚 基 ( 分 子 量 90 kD) ,而 “ 亚 基 ( 分 子 量 65 kD) 是 8 亚 基 的 水
解 产 物 。zol 产物 还 能 使 蛋白 水 解 生 成 使 病毒 DNA 整合 进 寄主 基因 组 所 需 整 合 酶
(Gintegrase) 。ezv 编码 另 一 多 蛋白, 它 产 生 构 成 被 膜 的 蛋白 。 在 病毒 RNA 的 两 端 为 长 未 端 重复
(long terminal repeat,LIR)， 它 长 几 百 个 核 苷 酸 , 与 病毒 基因 的 调节 有 关 。

LTR
寄主 LTR

编码 包括
道 转 录 酶 和
整合 酶 的 多 和 蛋白

蛋白 的 多
蛋白

图 5-31 整合 后 的 逆转 录 病 毒 基 因 组
* 乡 是 还 原 病毒 RNA 包装 进 成 熟 病 毒 粒 子 所 需 的 序列 。

逆转 录 酶 与 其 它 DNA 和 RNA 聚合 酶 一 样 含 Zn2?+ 。 疼 转录 酶 作用 时 也 需 引物 , 它 是 包含
于 病毒 粒子 内 的 一 种 tRNA , 它 与 病毒 RNA 5' 端 的 互补 序列 相配 对 从 而 提供 DNA 延伸 所 需
的 3' 端 ,DNA 合成 同样 按 5 ->3' 方 向 进行 。 逆 转录 酶 与 RNA 聚合 酶 一 样 不 具 3' 一 电 核 酸 外 切
酶 活力 ,聚合 的 差错 率 达 1/20 000 核 苷 酸 ,其 后 果 是 容易 突变 。
逆转 录 酶 在 理论 和 应 用 上 都 有 重要 意义 。 逆 转录 病毒 引起 癌症 和 艾滋 病 。 逆 转录 酶 也 与
真 核 生物 基 因 组 中 一 些 重复 序列 的 来 源 有 关 。 真 核 的 许多 转 座 子 具 有 与 逆转 录 病 毒 基 因 组 十
127

分 相似 的 结构 ,在 其 两 翼 为 LTR ,编码 区 包含 有 还 原 病 毒 逆转 录 酶 同 源 的 序列 ,它们 有 时 亦 称
为 道 转录 转 座 子 (retrotransposon) 。 它 在 基因 组 中 可 能 通过 RNA 中 间 体 的 逆转 录 实 现 转 座 。 ]
逆转 录 酶 在 遗传 工程 中 也 很 有 用 , 它 可 以 使 mRNA,tRNA 等 转录 成 其 互补 DNA (comple-

mentary DNA,cDNA) 并 进行 基因 克隆 。 |

五 .DNA 端 粒 的 复制

真 核 生 物 线 型 DNA 的 未 端 为 具 特 定 结构 的 端 粒 (telomere)( 见 第 四 章 ) 。 它 们 一 般 含 许多
串联 的 短 赛 聚 核 苷 酸 序列 ,其 一 股 链 如 为 T.G,, 其 互补 链 就 为 C,A-z 和 > 在 1 一 4 范围 内 。

端 粒 结构 具有 特定 的 生物 学 意义 。DNA 复
制 需要 引物 ,但 在 线 型 DNA 分 子 末 端 不 可 能 通
过 正常 的 机 制 在 引物 被 降解 后 合成 相应 的 DNA
片段 (参阅 原核 生物 线 型 DNA 分 子 未 端的 复
制 ) .如 无 特殊 的 机 制 合成 末端 序列 ,染色 体 就 会
在 细胞 传代 中 变 得 越 来 越 短 。 这 一 难题 是 通过 端
粒 酶 (telomerase) 的 发 现 才 得 到 了 澄清 。 端 粒 酶 |
能 使 端 粒 延伸 , 它 是 一 种 含 RNA 的 蛋白 复合
体 。 端 粒 酶 所 含 的 RNA 约 长 150 核 音 酸 ,并 约
含 1 一 5 拷贝 的 C,A- 重复 序列 , 它 是 合成 端 粒 旱
T.G, 股 的 模板 。 端 粒 酶 实际 上 是 二 种 闻 转 录 酶 , 嘲
它 催化 互补 于 RNA 模板 的 DNA 片段 的 合成 。

TITTTITGGOGGTTITGGGG)TTTTGGGGTTI]

本 |

5 一 一 一 TTTTGGGGmTTTGGGG)TTTTGGGGTT
3 一 一 一 一 (3)HO 一 GGGGTT

DNA 聚合 酶

5 人 TT
3' 一 一 一 一 AAAACCCCIAAAACCCC 人 AAAGGGGTT
下

二 和 人 | 天 2 1

图 5-32 ” 端 粒 合成 的 一 种 模型

端 粒 酶 的 作用 ,在 已 讨论 过 的 酶 中 是 找 不
到 先例 的 , 它 的 机 制 也 不 很 清楚 ,但 已 提出 了 一 些 模型 ,如 图 5-32。 图 中 表示 的 是 四 膜 虫 的 端
粒 合成 。 酶 的 内 部 模板 先是 通过 碱 基 配对 与 端 粒 的 3 端的 TG 股 结合 ,然后 根据 模板 的 序列 延
伸 工 G 股 。 在 合成 一 拷贝 的 重复 序列 后 , 端 粒 酶 必须 调整 位 置 以 便 进 一 步 延 伸 端 粒 。 这 是 通过
新 合成 的 TG 股 回 折 并 藉 非 标准 碱 基 配 对 形成 发 夹 结构 实现 的 ,这 称 做 尺 贬 模型 . 当 TG 股 进

一 步 延 伸 至 一 定 长 度 时 ,又 回 折 形 成 发 顽 结 构 , 从 而 使 其 末端 成 为 合成 互补 CA 股 所 需 的 引物
《图 5-33) 。

图 5-33 ” 端 粒 合成 的 完成

1]28

四 膜 虫 中 , 端 粒 酶 活力 的 消失 使 端 粒 长 度 逐 步 缩短 ,最 后 导致 细胞 死亡 。 类 似 情 况 亦 存在
人 体 中 ,生殖 细胞 的 端 粒 长 度 维持 不 变 , 而 体 细胞 的 端 粒 长 度 则 随 个 体 的 老化 而 逐步 缩短 。 对
此 的 一 个 推论 是 ,生殖 细胞 具 端 粒 酶 活力 , 体 细胞 则 否 。 这 一 问题 的 解决 无 疑 会 有 助 于 对 生命
衰老 的 认识 。

第 五 节 DNA 的 修复

DNA 复制 虽然 是 一 个 高 保 真 的 过 程 ,但 复制 形成 的 子 代 DNA 总 不 免 还 会 存在 少量 未 被
校正 的 差错 。. 除 此 之 外 ,DNA 还 会 受到 各 种 物理 和 化 学 因素 的 损害 .这些 差 错 和 损伤 如 不 予以
改正 ,结果 就 会 引起 突变 ,甚至 机 体 的 死亡 。

一 .DNA 损伤 的 来 源

环境 中 的 许多 因素 都 可 引起 DNA 结构 上 发 生 某 些 变化 。DNA 的 损伤 归纳 起 来 主要 有 :

(一 ) 碱 基 的 脱落

酸 和 热 都 能 影响 糖苷 键 而 使 碱 基 脱 落 。 在 生理 温度 和 pH 下 ,哺乳 动物 的 基因 组 据 估计 每 天
约 失去 10 000 味 叭 和 几 百 喀 啶 碱 基 。 许 多 由 其 它 因素 所 产生 的 已 改变 的 碱 基 也 会 为 专 一 性 的
DNA 糖 基 化 酶 所 除去 , 从 而 形成 无 嘎 叭 或 无 旷 啶 位 点 或 AP 位 点 (apurinic or apyrimidinic site ) 。

(二 ) 碱 基 ( 或 核 背 ) 的 改变

电离 辐射 和 亲 电 试剂 (如 烷 化 剂 ) 等 都 能 改变 碱 基 和 糖 基 。 硫 酸 二 甲 酯 .甲烷 磺 酸 甲 酯
(MMS) 等 都 是 常见 的 烷 化 剂 ,它们 能 生成 相应 的 正 碳 离子 与 碱 基 中 的 亲 核 基 团 作用 生成 烷 基

GO :0 O
NS |
S GEEESOGE
AN |
Op 9 O MMS

化 碱 基 。 碱 基 类 似 物 ( 如 5- 溴 尿 喀 啶 为 胸腺 喀 啶 的 类 似 物 ) 的 摊 人 DNA 也 使 原来 的 碱 基 转 换
成 另 一 碱 基 。 黄 曲霉 毒素 B1,2- 乙 酰 -氨基 东 , 共 并 花 等 都 是 强力 的 致癌 物 , 能 在 DNA 中 导 人
大 体积 的 加 合 物 ,从 而 在 复制 过 程 中 改变 遗传 信息 。
由 于 自身 的 化 学 不 稳定 性 或 亚 硝酸 的 作用 , 胞 喀 啶 、 腺 味 吟 和 鸟 味 叭 能 自发 形成 尿 喀 达 、
次 黄 叮 叭 和 黄 味 叭 ,其 结果 是 尿 喀 啶 与 腺 味 叭 配对 , 黄 嗓 叭 与 胞 喀 啶 配对 。
(三 ) 错 误 碱 基
其 复制 中 错误 碱 基 的 挫 和 会 导致 形成 错 配 碱 基 对 。 增 变 基因 (mutator gene) 编 码 具 缺陷
的 聚合 酶 、 核 酸 酶 或 高 保 真 复制 所 需 的 其 它 蛋白 , 故 也 提高 了 突变 频率 。 碱 基 的 互 变异 构 也 能
导致 复制 中 错误 碱 基 的 挫 人 。
(四 ) 碱 基 的 缺失 或 插入
嘱 啶 类 (acridine) 由 于 其 分 子 呈 扁平 ,易于 艇 人
Use SNA ce Na。 DNA 碱 基 平面 间 ( 图 5-34), 从 而 导致 在 复制 或 重组 过
二 氨基 nY 院 程 中 缺失 或 插 人 二 个 碱 基 。 此 外 ,DNA 聚合 酶 在 复制 过
程 中 发 生 滑 移 ,尤其 在 连续 存在 几 个 相同 碱 基 的 区 段 产 生 1 个 或 几 个 碱 基 的 缺失 或 插入 ,聚合
酶 在 模板 链 上 的 滑 移 易于 造成 缺失 ,在 生长 链 上 的 滑 移 易于 造成 插入 (图 5-35)。

N

129

图 5-34 叫 啶 插 和 人 于 碱 基 间
(a) 是 平面 图 :(b ) 为 立体 图 .

2 AGATGCCTORTP | 生长 链

送 昌 是 本 泛 本 7
TCTACGCAAAAAGTCAGCCAT 模板 链

…AGATGCGTTTT 全 AT 环 状 伸 出
山上 宙 二 提 放 |
..TCTACGCAAAAGTCAGCCAT.. ..TCTACGCAAAAAGTCAGCCAT
NV
A 模板 链 向 外 呈 环 状 伸 出
、 一 个 碱 基
造成 一 个 碱 基 缺 失 着 全
..AGATGCGTTTTCAGTCGGTA:. Te TTT TCAGTCGGTA .…
和 ITTTENNTTTTI 人 1 TITTTTITTDODENOTER
..TCTACGCAAAAGTCAGCCAT .. …TCTACGCAAAAAGTCAGCCAT
NANX

A

图 5-35 复制 中 DNA 聚合 酶 滑 移 造 成 的 缺失 和 插入

(五 ) 喀 啶 碱 基 的 二 聚 化

紫外 线 照射 (254 nm) 能 使 相 邻 喀 啶 、 尤 其 是 胸腺 喀 啶 形成 环 丁 基 二 聚 体 。 胞 喀 啶 (或 胸腺
喀 啶 ) 的 Ce 也 可 与 相 邻 胞 喀 院 的 C, 连结 形成 另 一 重要 的 光化学 产物 (图 5-36)。 这 些 二 聚 体 的
存在 就 使 正常 的 碱 基 配 对 难于 发 生 。

(六 ) 链 的 断裂

电离 辐射 或 博 菜 霉 素 (bleomycin) 等 化 学 试剂 能 作用 于 DNA 链 ， vi
二 酯 键 发 生 断 裂 。

(七 )3'- 脱 氧 核糖 片段

许多 能 产生 游离 基 的 试剂 ( 博 菜 孝 素 和 电离 辆 射 ) 都 能 使 脱氧 核糖 裂解 ,结果 就 在 链 的 3
端 产生 磷酸 乙醇 酸 这样 的 裂解 产物 。

WANDNA 链 的 交 联

二 价 烃 化 剂 ， 此 裂 委 素 (mitomyciny 和 交 活 化 的 补 骨 脂 (psorslen) 等 能 够 使 DNA 双 股 链 |
间 形 成 交 联 ,其 结果 使 双 股 链 不 再 能 分 开 。

在 引起 DNA 损伤 的 各 种 原因 中 ,氧化 是 普遍 、 严 重 而 又 了 解 得 很 少 的 一 种 。 在 原核 和 真

人 核 细胞 中 ,7 射线 和 紫外 线 照 射 ,臭氧 `. 过 氧化 物 都 能 通过 各 种 形式 产生 不 同 的 效果 .。 在 这 一 过
130

Fr

夏 刍 ae

se AM

OIC

相 邻 的 胸腺 嗜 喧 胸腺 嘲 啶 二 下 站

(3)

图 5-36 ”紫外 线 照 射 产 生 的 喀 嘎
(1) 每 个 喀 啶 环 的 第 5 和 第 6 个 碳 跨 环 连接 ;(275 喀 啶 的 6 位 碳 与 3 喀 啶 的 4 位 碳

相连 ;(3) 胸 腺 喀 啶 - 胞 喀 啶 6 一 4 产物 ;(4) 相 邻 的 胸腺 喀 啶 ( 左 ) 和 胞 喀 啶 ( 右 ) 。 合 为 NH:。

1 |
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1 II TH IV v
图 5-37 氧 自 由 基 生 成 的 DNA 损伤 产物

1 济

程 中 , 氧 逐 步 被 还 原 为 水 :0: 一 "07 一 ~H20, 一 ~HO 一 ~H2O

氧 自由 基 对 DNA 的 损伤 是 由 金属 离子 ,尤其 是 铁 离子 所 介 导 的 (图 5-37)。 因 此 , 莹 合剂 、 自 由 ，

基 清 除 剂 和 过 氧化 物 歧化 酶 .过 氧化 物 酶 和 过 氧化 氢 酶 活力 的 增强 都 能 降低 氧 的 毒性 。
Fe2+ 十 H,O, 十 H+ 一 >Fes+ 十 HO 十 H:O

二 、.DNA 修复 与 突变

虽然 DNA 聚合 酶 的 校对 功能 和 DNA 的 修复 机 制 十 分 有 效 , 但 复制 产生 的 一 些 差 错 仍 可
能 会 漏 校 ,以 及 DNA 的 一 些 损伤 仍 可 能 未 被 修复 ,结果 它们 就 会 遗传 下 去 。DNA 的 这 种 永久
性 的 改变 叫做 突变 。

突变 可 由 单一 碱 基 的 改变 产生 , 称 为 点 突变 。 这 种
一 个 碱 基 的 改变 可 以 是 一 个 碱 基 的 缺失 (deletion)、 插 a
人 (insertion) ,或 是 由 一 个 碱 基 由 一 种 喀 啶 ( 味 叭 ) 转
变 为 另 一 种 旷 啶 ( 叶 叭 ) 的 转换 (transition ) ,或 是 由 喀
啶 〈 叮 叭 ) 转 换 为 叮 叭 ( 喀 啶 ) 的 颠 换 (transversion ) 。 突
变 也 可 由 多 个 碱 基 的 改变 产生 。

DNA 复制 中 的 错 配 以 及 随后 产生 的 差错 都 可 能
形成 突变 。 现 在 我 们 举例 讨论 这 一 过 程 。

前 述 的 碱 基 的 烷 基 化 、 自 发 脱 氨基 或 是 由 于 亚 硝 酸
的 作用 或 是 由 于 碱 基 类 似 物 的 挫 人 都 可 以 在 一 定 程 度 上
改变 核 苷 酸 序列 , 即 改变 遗传 信息 。5- 溴 尿 喀 啶 是 胸腺 喀
啶 的 类 似 物 , 当 它 的 酮 型 存在 时 能 与 腺 味 叭 配对 (A- 一
BU) (图 5-38 a), 当 它 以 烯 醇 型 存在 时 能 与 鸟 味 叭 配对
〈G 一 BU) (图 5-38 b)。 这 是 基 团 键 合 性 质 改变 的 结果 ， ”图 5-38 ”5- 溴 尿 喀 啶 的 两 种 配对 方式
当 5-BU 挫 人 到 DNA 中 时 , 它 就 可 能 使 A 一 T 转换 为 G 一 C( 图 5-39) 。 但 在 某 一 情况 下 5-BU 再
次 摊 人 DNA 并 与 G 配对 ( 呈 烯 醇 型 ) ,G 一 C 又 可 能 转换 为 A 一 开 ， 这 称 为 回复 (reversion ) 。

图 5 39 5-BU 摊 人 所 引起 的 转换

1]32

颠 换 的 机 制 还 不 清楚 。 现 已 发 现 , 烷 化 剂 能 够 导致 脱 叶 叭 作用 , 味 叭 一 旦 除去 ,4 种 碱 基 可
能 进入 该 位 置 ,从 而 可 能 导致 站 换 。

”点 突变 仅 改变 基因 的 一 个 密码 子 。 由 于 遗传 密码 具有 简 并 性 , 故 这 一 改变 可 能 或 并 未 引起
一 种 氨基 酸 为 另 一 种 氨基 酸 所 替代 ,如 密码 子 GGT 改变 为 GGA ,两 者 都 编码 且 氨 酸 , 故 不 会
引起 产物 组 成 和 结构 上 的 改变 。 即 使 产物 中 个 别 氨基 酸 确 发 生 了 变换 ,但 如 两 种 氨基 酸 的 性 质
和 结构 相近 ,产物 的 生物 学 特性 仍 可 无 明显 改变 。 这 种 突变 常 称 为 沉默 突变 (silent mutation ) 。
不 过 ,有 些 改变 如 影响 到 关键 性 氨基 酸 ,其 结果 就 会 导致 产物 生物 功能 的 丧失 。 假 如 这 一 酶 又
位 于 中 心 代 谢 途 径 中 ,这 种 突变 就 会 致死 , 称 为 致死 突变 (lethal mutation) 。

还 有 一 种 可 能 的 情况 是 , 某 一 氨基 酸 改 变 的 结果 是 基因
产物 的 功能 基本 上 未 有 重大 变化 ,改变 的 只 是 及。 和 最 大 速 5 3
度 等 ,这 种 突变 称 为 渗 漏 突变 (leaky mutation)。 有 时 ,基因 窗 1 CUC AGC GUU ACC AU
变 产 物 的 功能 可 能 更 适合 机 体 所 处 的 特定 条 件 , 从 而 更 有 利 ”Te _sw_ wii TH 一
于 其 存活 ,这 种 突变 就 可 能 导致 新 物种 的 出 现 。 CUCA GcG UUA CCAT

当 基 因 突 变 是 由 于 碱 基 的 缺失 或 插入 引起 时 , 其 结果 是
DNA 的 密码 子 与 所 生成 的 多 肽 链 中 的 氨基 酸 残 基 间 的 共 线 性
Ccolinearity) 就 会 被 中 断 。 这 种 中 断 从 缺失 和 插入 部 位 开始 , 随
后 发 生 读 码 框 (reading frame) 的 移动 。 在 mRNA 中 ,每 一 个 核 ” 一 cn 一 Arg 一 ITyr 一 His 一
昔 酸 三 联 体 编码 一 种 氨基 酸 , 称 为 密码 子 。 在 原则 上 ,mRNA 上 委 上 日 拓 合 成 让 的
的 三 联 体 序列 可 按 3 种 可 能 方式 翻译 (图 5-40) 。 实 际 上 只 有 其 本
中 之 一 产生 功能 性 蛋白 ,这 种 密码 子 序列 称 为 读 码 框 , 碱 基 的 缺失 或 插入 常 引起 读 码 框 的 移
动 , 故 称 为 移 码 突 变 (frameshift mutation) (图 5-41) 。 大 多 数 移 码 突变 常 产 生 无 活性 产物 ,有
些 移 码 突变 会 在 基因 内 部 形成 终止 密码 子 , 从 而 使 所 生成 的 多 肽 链 长 度 变 短 。

移 码 突变 有 时 可 由 同一 基因 内 的 另 一 碱 基 的 缺失 或 插入 所 抵消 ,但 要 求 第 二 个 移 码 突变
发 生 在 前 一 突变 位 点 的 下 游 。 这 样 的 第 二 个 移 码 突变 称 为 校正 突变 (suppressor mutation ) 。

野生 型

于 -1 |2 人 3) 二 < 下
EU CAGCGUNUUAC CAU
2

C 及 届 二 人 首 CC AAA 转 C 及 C 凡 于 C 凡 T C A 吕 心 三 克 T
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图 5-41 移 码 突变 和 校正 突变

信息 饮 复

133

三 .DNA 修复 的 多 样 性

DNA 是 细胞 中 唯一 的 一 种 在 受 损伤 或 改变 后 能 修复 的 分 子 ,因为 没有 其 它 任何 分 子 完整
生 的 受 损 会 像 DNA 那样 影响 细胞 的 存活 。 机 体 的 各 种 基因 必须 保证 高 度 的 稳定 ;DNA 之 所
以 能 表现 出 这 种 稳定 性 的 原因 之 一 即 在 细胞 具有 多 种 修复 机 制 。

DNA 的 修复 机 制 是 多 样 (图 5
4h2) 而 有 效 的 。 大 肠 杆菌 基因 组 约 有 品 汪 复
100 个 位 点 涉及 DNA 的 修复 和 有 关
功能 .DNA 的 互补 双 链 保证 它 一 股 链 所
上 的 损伤 被 切除 后 能 从 另 一 股 获 得 所 D
需 的 遗传 信息 .同时 , 核 苷 酸 的 缺失 和 | |
插入 , 链 间 的 交 联 也 可 通过 重组 予以 易 错 修复
置换 。 一 个 在 复制 过 程 中 被 漏 校 的 不
适当 碱 基 也 可 通过 错 配 修复 (mis-

:二 股 问 交 联 :
match repair) 予 以 改正 。 甚 至 损伤 严 革
重 的 双 股 链 的 断裂 也 可 通过 连接 酶 封 Se 号
闭 和 通过 重组 予以 修复 。

图 5-42 DNA 的 多 种 修复 机 制
DNA 的 修复 机 制 可 以 分 为 : 山 使

损伤 着 转 , 如 光 活 化 、 脱 烷 基 化 等 ;@ 切 除 受 损 部 分 ,然后 通过 复制 或 重组 予以 置换 ;@@ 错 配 修
复 。 当 修复 无 效 时 ,基因 组 的 连续 性 (continuity) 可 以 通过 修复 得 到 保持 , 即 复制 可 以 通过 损 侮
的 旁 路 进行 。

四 .直接 修复

DNA 中 的 喀 啶 二 聚 体 可 通过
可 见 光 (300 一 600nm) 的 光 解 作用 0
而 恢复 为 单 体 ( 图 5-43) 。 催 化 这 一
过 程 的 酶 为 光敏 有 裂 合 酶 (pho-
tolyase)。 反 应 的 第 一 步 是 酶 结合 于 ， 酶 -DNA 复合 物
DNA 中 喀 啶 二 聚 体 部 位 。 酶 含 两 个
发 色 团 ,一 是 FADH,; 另 一 在 大 肠
杆菌 和 酵母 中 为 蝶 叭 ,在 其 它 生物
中 为 脱 氮 黄 素 (deazaflavin) 。 当 变
形 的 DNA 吸收 与 发 色 团 特 征 性 波
长 相当 的 光波 后 , 酶 -DNA 复合 物
就 利用 这 能 量 使 二 聚 体 裂解 为 单 图 5-43 ” 喀 了 啶 二 聚 体 的 酶 促 光 解
体 , 酶 随即 脱离 DNA。

烷 基 化 碱 基 也 可 通过 类 似 的 途径 道 转 。 例 如 ,o- 甲 基 乌 味 叭 的 甲 基 在 。- 甲 基 鸟 味 叭 -

DNA 转 甲 基 酶 的 作用 下 转移 给 酶 分 子 的 一 个 半 胱 氨 酸 残 基 。 与 一 般 的 酶 不 同 ,该 酶 的 这 一 过
程 是 不 可 逆 的
134

五 .切除 修复
DNA 中 的 喀 啶 二 聚 体 也 可 通 让
过 切除 而 修复 .在 大 肠 杆 菌 中 ,担当 本 未
切除 功能 的 酶 为 多 亚 基 的 UvrABC 切口 核酸 内 切 酶 DNA- 糖 苷 化 物
核酸 内 切 酶 ,它们 是 wor4 ,xzrB 和 -一
zwrC 基因 的 产物 。 该 酶 作用 时 需要

ATP , 它 切 割 于 二 聚 体 55 和 3' 端 的 和光 人
第 八 和 第 四 磷酸 二 酯 键 ,形成 的 缺 上 无 厢 叭 /无 罚 辽
口 为 PolI 和 DNA 连接 酶 填补 和

核酸 内 切 酶
封闭 的 。 3
切除 修复 中 的 核酸 内 切 酶 可 切 oo

除 喀 啶 二 聚 体 , 也 可 切除 其 它 受 损 切除 核酸 内 切 酶
伤 部 位 (图 5-44), 如:@ 申 受 损伤 的

碱 基 , 形 成 AP 位 点 ;包含 AP 位 点 8 8
的 片段 ;@@ 受 损伤 的 核 苷 酸 及 邻近

部 位 ;四 双 链 的 交 联 部 位 .切除 所 造 直 聚合 酶 ,连接 栈

成 的 单 链 缺 口 为 聚合 酶 (大 肠 杆 菌 ee

中 为 PolI)、DNA 连接 酶 填补 和

封闭 的 。
DNA 受伤 部 分 的 切除 涉及 许 5 4 切除 修复 的 两 种 途径

多 核酸 酶 ,如 切口 核酸 内 切 酶 ,AP 位 点 核酸 内 切 酶 ,切除 核酸 外 切 酶 ,UvrABC 和 NN- 糖 基 化 酶
等 。 真 核 生物 的 DNA 切除 修复 现在 还 不 清楚 。

六 ` 错 配 修 复

复制 是 一 个 高 保 真 过 程 , 但 其 正确 性 毕竟 不 是 绝对 的 ,复制 产物 中 仍 会 存在 少数 未 被 校 出
的 错 配 碱 基 。 错 配 碱 基 的 修复 会 使 复制 的 保 真 性 提高 10 一 10` 倍 。 现 已 在 大 肠 杆 菌 、 酵 母 和 哺
乳 动 物 中 都 发 现 了 这 一 系统 。

错 配 修复 是 按 模板 的 遗传 信息 来 修复 错 配 碱 基 的 ,因此 ,修复 时 首先 要 区 别 模板 链 和 新 合
成 的 DNA 链 。 这 是 通过 碱 基 的 甲 基 化 实现 的 。

大 肠 杆 菌 DNA 的 5 -GATC 序列 中 A 的 N* 都 是 甲 基 化 的 。 这 是 Dam 甲 基 化 酶 (专门 使
脱氧 腺 苷 甲 基 化 ) 负 责 的 。 复制 后 的 一 个 短暂 ( 约 几 分 钟 ) 的 时 间 内 ,新 合成 链 的 GATC 中 的 人
未 被 甲 基 化 , 故 子 代 DNA 暂时 是 半 甲 基 化 的 (图 5-45), 几 分 钟 后 新 合成 链 进一步 甲 基 化 ,从
而 成 为 全 甲 基 化 DNA。 半 甲 基 化 DNA 成 为 识别 模板 链 和 新 合成 链 的 基础 。 错 配 修复 发 生 在
GANWG 的 邻近 处 , 故 这 种 修复 也 称 为 甲 基 指导 的 错 配 修复 (methyl-directed mlismatch repair) 。

大 肠 杆菌 的 错 配 修复 机 制 还 不 完全 清楚 ,但 所 需 的 Dam 甲 基 化 酶 ,MutH,MnutL,MutS
蛋白 ,DNA 解 螺旋 酶 I ,SSB,DNA 聚合 酶 工 ,核酸 外 切 酶 和 DNA 连接 酶 都 已 得 到 纯化 , 并 重
建 了 它们 的 工作 模型 (图 5-46) 。 在 修复 过 程 中 ,MutS,MutH 和 MautL 是 关键 性 的 ,MnutS 结 谷
于 错 配 碱 基 ,MutH 结合 于 GATC ,MnutL 使 MutS 和 MutH 连结 成 复合 物 .如 错 配 碱 基 位 于 距

135

5-45 “新 合成 的 半 甲 基 化 DNA

GAnmTC 1 000 核 苷 酸 以 内 ,MutH 的 位 点 专
一 核酸 内 切 酶 活力 ,就 在 未 甲 基 化 链 中
GATC 序列 中 G 的 5 侧切 割 ,作为 待 修复 链
的 标志 。 如 错 配 位 于 切割 点 的 5 侧 , 未 甲 基
化 链 即 “ 解 链 者 ” 按 3' 一 5 方向 降解 直至 错 配
碱 基 在 内 ,所 缺少 的 部 分 由 新 链 填 补 . 这 一 过
程 需要 DNA 解 螺旋 酶 工 ,SSB ,核酸 外 切 酶
I ( 按 3'~>5/ 方 向 降解 单 链 DNA),DNA 聚
合 酶 科 和 DNA 连接 酶 的 联合 作用 。 如 鲁 配
位 于 切割 点 的 3' 侧 ,除了 以 核酸 外 切 酶 册
( 按 一 3' 或 3 一 5 方向 降解 单 链 ) 或 RecJ
蛋白 (一 种 按 5 一 3/ 方 向 降解 单 链 的 核酸 外
切 酶 ) 代 替 核酸 外 切 酶 I 外 ,修复 过 程 都 相
同 。

所 有 错 配 都 可 由 这 一 系统 修复 ,但 其 中

新 合成 DNA 链 中

DNA 解 螺旋 酶 工
核酸 外 切 酶 |-aae
SSB

GATC

5 下 个

CT EC
CHs
攻

3 二- 二 -一 -一 一 -一 一 -一 二

DNA 育 合 酶 下 | 一 4NTE
DNA 连接 酶
G AT 记
和
CHs
G

C

图 5-46 ” 甲 基 指导 的 错 配 修复

以 G 一 下 错 配 修复 更 为 有 效 ,C 一 C 错 配 的 修复 为 弱 。
由 于 要 降解 和 置换 1 000 或 更 多 碱 基 对 ,这 种 修复 代价 显然 是 高 的 ,但 这 也 说 明 修复 的 重

要 ,细胞 为 此 不 惜 代价 。

七 ` 易 错 修 复

前 述 的 各 种 修复 都 以 受 损伤 链 的 互补 链 为 模板 进行 的 ,因此 是 无 差错 的 (error free) 但
当 DNA 所 受 的 损伤 是 严重 和 广泛 时 ,修复 常 易 招致 差错 Cerror prone) 。

正常 情况 下 ,DNA 的 损伤 多 数 在 复制 前 即 已 修复 ,但 也 还 可 能 有 少数 未 被 修复 。 遇 到 这 种
情况 ,机 体 可 能 产生 两 种 措施 。 一 种 措施 是 复制 越过 损伤 部 位 ,在 其 下 游 约 1 000 核 苷 酸 处 重
新 开始 (图 5-47) 。 新 合成 链 的 缺少 部 分 则 通过 重组 修复 (recombinational repair ) 予 以 补充 , 即
以 受 损伤 链 的 互补 链 的 相应 片段 转移 至 缺口 处 ,这 时 DNA 链 上 仍然 存在 的 损伤 随后 再 为 直

136

复制 后 的 重组 修复

< 二

亲 代 DNA

图 5-47 重组 修复 和 易 错 复制

接 修复 或 切除 修复 系统 予以 修复 。 机 体 对 DNA 的 严重 创伤 可 采取 的 另 一 种 措施 是 产生 一 系
列 的 蛋白 来 应 急 , 故 称 为 应 急 措施 (SOS response) 。 这 些 应 急 蛋 白 的 功能 ( 表 5-9) 有 些 已 知 ,有
些 未 知 。 其 中 一 些 蛋 白 负责 超 越 DNA 创伤 复制 (translesion replication) 。 这 是 一 种 无 模板 指
导 的 复制 (non-template directed replication) ,因此 , 常 易 错 配 和 致 突变 。 负 责 超 越 创 伤 复 制 的
育 合 酶 是 聚合 酶 II 。 DNA 聚合 酶 工 与 聚合 酶 下 不 同 , 它 能 够 使 复制 通过 AP 位 点 这 样 的 DNA
损伤 . 它 的 有 些 亚 基 与 聚合 酶 臣 相同, 有 些 亚 基 是 在 应 急 措施 中 大 量 生成 的 .除了 聚合 酶 工 外 ，
易 错 修复 还 需要 其 它 的 蛋白 。

表 5-9 应 急 蛋 和 白 的 功能 和 相应 基因

基因 在 DNA 修复 中 的 作用

己 知 功能 的 基因
zolLB(din4) 编码 易 错 修复 所 需 的 DNA 桶 合 酶 I 工 的 聚合 亚 基
zU7 4
| 编码 UvrABC 核酸 内 切 酶
MO7C
27722C

| 编码 易 错 修复 所 需 的 蛋白

2772DD
sulA 编码 抑制 细胞 分 裂 的 蛋白 ,以 争取 时 间 使 修复 得 以 进行
rec4 编码 易 错 修复 和 重组 修复 所 需 的 RecA 蛋白

与 DNA 代谢 有 关 ， 但 在 修复 中 的 作用 未 知 的 基因
SSB 编码 SSB
zz 站 编码 DNA 解 螺旋 酶 1I
不 “ 编码 位 点 专 一 重组 ,复制 和 转 座 所 涉及 的 整合 寄主 因子 亚 基
recN 参与 重组 修复

未 知 功能 基因
ein
dzi7

az

137

DNA 修复 的 目的 在 于 保持 遗传 信息 的 完整 ,从 而 得 以 存活 ,但 超越 创伤 复制 却 易 招 致 差
错 和 常 引 起 突变 ,这 似乎 相 矛 盾 。 实 际 不 然 ,这 样 产生 的 突变 虽 最 终 导致 许多 细胞 的 死亡 ,但 少 ，
数 细胞 的 DNA 可 能 得 到 修复 ,有 些 突变 细胞 也 还 能 存活 。 许 多 细胞 的 死亡 只 是 为 一 些 细胞 的
存活 所 付 的 代价 。

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〈 张 玉麟 )

138

第 六 章 DNA 重 组

人

:所 有 的 DNA 都 是 重组 体 (recombinant)。DNA 重组 (recombination ) 不 仅 在 减 数 分 裂
(meiosis) 中 发 现 , 而 且 也 在 高 等 生物 的 体 细胞 中 , 衣 菠 (CCPaxzydomzozas rezzjparazz) 的 叶绿体
基因 间 和 了 酿酒 酵母 (Sacchnaromyces cerevisiae) 的 线粒体 基因 间 发 生 . 在 温和 噬菌体 的 整合 过 程
中 和 转 座 子 (transposon) 的 转 座 (transposition) 过 程 中 也 发 生 重组 。 所 以 ,可 以 说 只 要 有
DNA ,就 会 发 生 重组 .因为 生物 要 生存 就 得 适应 ,要 适应 就 得 有 变异 (variation) ,而 变异 的 来 源
就 是 突变 (mutation) 和 重组 。 但 就 每 个 个 体 而 言 ,发 生 突变 的 概率 毕竟 是 很 低 的 ,涉及 到 的 基
因数 目 也 非常 有 限 。 所 以 ,如 果 只 有 突变 而 没有 不 同 个 体 间 的 基因 交换 (gene exchange), 则 生
物体 难以 迅速 地 组 装 以 产生 最 能 适应 环境 的 基因 组 合 。 而 且 , 通 过 不 同 个 体 间 的 基因 交换 ,可
以 保证 遗传 的 多 样 性 ,从 而 为 选择 黄 定 物质 基础 。

根据 对 DNA 序列 和 所 需 蛋 白质 因子 的 要 求 可 以 把 重组 分 为 4 种 类 型 , 即 同 源 重组 (ho-
mologous recombination ) , 位 点 专 一 性 重组 (site-specific recombination ) , 转 座 重 组 (transposi-
tion recombination ) 和 异常 重组 (illegitimate recombination ) 。 同 源 重 组 发 生 在 DNA 的 同 源 序
列 之 间 , 真 核 生 物 非 姊妹 染色 单 体 的 交换 ,姊妹 染色 单 体 的 交换 ,细菌 及 某 些 低 等 真 核 生 物 的
“转化 ,细菌 的 转 导 、 接 合 、 唉 菌 体 的 重组 等 都 属于 这 一 类 型 。 同 源 重 组 要 求 较 大 的 DNA 片段 进
行 交换 ,只 要 它们 的 序列 相同 或 接近 相同 ,就 可 以 在 序列 中 的 任何 一 点 发 生 重组 , 当然 也 存在
重组 热点 , 即 某 类 序列 发 生 重组 的 概率 高 于 其 它 序 列 。 大 肠 杆 菌 的 同 源 重 组 需要 RecA 蛋白
质 。 类 似 的 蛋白 质 也 存在 于 其 它 细菌 中 。 因 此 ,细菌 中 的 同 源 重 组 又 称 为 依赖 RecA 重组 。 转
座 子 是 可 移动 的 DNA 片段 , 转 座 过 程 中 转 座 单元 从 染色 体 的 一 个 区 段 转移 到 另 一 个 区 段 , 即
发 生 转 座 重 组 ,改变 了 染色 体 的 结构 , 它 既 不 依靠 转 座 单元 和 插 和 人 区 段 序 列 的 同 源 性 ,也 不 需
要 重组 酶 。 转 座 作 用 除了 单纯 地 移动 基因 外 ,还 打 乱 了 DNA 序列 而 造成 缺失 、 倒 位 和 重 排 . 这
种 改变 显然 是 染色 体 进化 的 关键 特征 ,特别 在 真 核 细 胞 中 更 是 如 此 。 位 点 专 一 性 重组 是 直接 在
专 一 序列 之 间 配 对 而 发 生 的 重组 , 即 鸣 菌 体 基 因 组 整合 到 细菌 染色 体 基因 组 中 去 ,因此 ,重组
只 需要 有 限 的 同 源 序列 ,但 必须 有 位 点 专 一 性 的 蛋白 质 因 子 参与 催化 。 异 常 重组 不 需要 DNA
序列 的 同 源 性 ,也 不 需要 重组 酶 参与 。 目 前 对 这 类 重组 的 机 制 尚 不 清楚 。

可 见 重组 不 是 偶然 的 ,而 是 细胞 为 了 编码 和 调节 的 必要 酶 促 过程 重 组 酶 类 除了 提供 遗传
变异 外 , 当 DNA 被 辐射 或 化 学 故障 损伤 时 ,通过 重组 可 以 将 同 源 染 色 体 未 损伤 DNA 链 置换
损伤 部 分 , 使 细胞 损伤 的 序列 恢复 过 来 。 而 且 重组 的 一 些 特定 类 型 还 调节 基因 表达 。 通 过 染色
体 上 特定 片段 的 互 换 ,细胞 能 将 暂停 活动 的 基因 放 到 能 表达 的 位 点 上 , 甚至 产生 新 的 蛋白 质 编
码 区 。

在 体外 进行 DNA 片段 的 连接 和 修饰 只 是 模拟 重组 和 突变 的 自然 过 程 ,遗传 学 上 的 重组
操作 往往 是 融合 和 重 排 染 色 体 。 研 究 重组 的 分 子 机 制 可 为 基因 的 熟练 操作 提供 新 方法 ,例如 ，

139

利用 基因 的 转 座 原理 ,可 为 细胞 的 分 化 和 发 育 提供 依据 。 转 座 子 在 染色 体 上 的 移动 ,控制 了 结

构 基 因 的 开启 ,造成 了 不 同 细胞 中 基因 启动 上 的 差异 ,还 可 启发 对 瘤 细胞 发 生 原 因 的 研究 。 转 、

座 子 最 重要 的 应 用 是 作为 基因 定位 的 标记 和 通过 转 座 子 在 不 同 染 色 体 上 的 插 和 人 和 舱 合 ` 转 移
和 克隆 基因 。 通过 转 座 子 上 的 标记 基因 ,就 可 检测 突变 基因 的 位 置 和 分 离 突 变 基因 。 又 如 同 源 重
组 技术 是 目前 能 精确 地 修饰 基因 组 的 最 有 效 的 方法 ,使 外 源 DNA 与 受 体 细胞 染色 体 上 的 同 源
序列 发 生 重组 ,并 整合 到 预定 的 位 点 上 ,就 能 改变 细胞 遗传 特性 。 它 能 根据 实验 设计 对 哺乳 动物
细胞 基因 组 结构 进行 定量 定点 地 改变 ,因而 能 定向 改变 细胞 或 整体 本 身 的 遗传 结构 和 特征 ,这
对 目前 分 子 生 物 学 及 基因 工程 领域 中 的 主要 研究 内 容 : 基 因 结构 和 功能 ,基因 表达 和 调控 及 人 类
遗传 病 的 基因 治疗 的 研究 极为 重要 。 重 组 技术 的 发 展 又 为 重组 机 制 的 研究 开辟 了 广阔 的 前 景 。

第 二 节 同 源 重组

同 源 重组 也 称 交 换 (crossing over), 是 指 减 数 分 裂 \meiosis) 过 程 中 染色 体 间 遗传 物质 的 ，
交换 , 即 在 两 个 双 螺 旋 DNA 分 子 间 的 相互 作用 ,其 特征 是 重组 酶 能 以 两 个 DNA 分 子 中 任何 ，
一 对 同 源 序列 作 底 物 进行 交换 。 从 整个 基因 组 看 ,重组 频率 并 不 是 恒定 的 , 它 受 综合 效应 和 局 性

部 效应 的 影响 。 如 在 精子 细胞 中 同 源 重 组 的 频率 比 卵 母 细胞 高 出 一 倍 以 上 , 同时 重组 频率 还 受

染色 体 结构 的 影响 ,例如 ,在 异 染色 质 附 近 , 同 源 重 组 就 要 受到 抑制 。 细 菌 没 有 减 数 分 裂 , 同 源 上

重组 发 生 在 接合 过 程 中 , 交配 的 染色 体 DNA 在 两 个 紧密 连接 的 细胞 中 转移 , 单 细胞 内 在 复制
中 和 复制 后 的 两 条 同 源 染色 体 也 可 发 生 交换 。 同 源 重 组 至 少 具 有 3 种 明显 的 功能 :一 是 维持 种
群 的 遗传 多 样 性 ;二 是 在 真 核 生 物 中 它 使 染色 单 体 (chromatid) 产 生 了 瞬间 的 物理 连接 ,这 对 第
一 次 减 数 分 裂 中 染色 体 正 确 分 离 到 子 代 细胞 至 关 重要 ; 三 是 它 有 助 于 DNA 损伤 几 种 类 型 的
修复 。 关 于 前 两 种 功能 早已 引起 研究 工作 者 的 极 大 兴趣 ,认为 同 源 重 组 是 遗传 多 样 性 的 来 源 。 而
细胞 中 DNA 的 修复 功能 也 早 就 引起 重视 , 因为 遗传 信息 贮存 于 未 损伤 的 互补 链 中 , 单 链 DNA
的 损伤 能 准确 地 得 到 修复 。DNA 的 损伤 有 几 种 类 型 如 双 链 断裂 、 双 链 交 联 (cross-linking) ,或 在

复制 中 单 链 的 损伤 ,甚至 互补 链 本 身 也 可 能 受 损 等 等 ， 当 这 种 情况 出 现时 ,准确 修复 DNA 的 上

信息 必须 来 源 于 不 相连 的 同 源 染 色 体 , 因 此 涉及 同 源 重组 。 图 6-1 比较 了 减 数 分 裂 期 可 观察 到
的 染色 体 的 变化 和 发 生物 质 交 换 双 链 DNA 分 子 的 相互 作用 。 减 数 分 裂 开 始 于 较 复 杂 的 前 期
I (prophase), 前 期 可 分 为 5 个 阶段 , 减 数 分 裂 开 始 的 重要 标志 是 染色 体 变 得 清晰 可 见 ,每 条
染色 体 各 自 复 制 组 成 两 条 姊妹 染色 单 体 ,每 一 姊妹 桨 色 单 体 都 包括 一 个 双 链 DNA 分 子 , 同 源
”染色 体 相 互 靠近 并 在 一 个 或 多 个 区 域 开始 配对 ,形成 二 价 染 色 体 Cbivalant), 配 对 区 段 的 长 度

取决 于 同 源 片段 的 长 短 。 这 一 过 程 称 为 联 会 (synapsis ) 或 称 染 色 体 配 对 .。 联 会 结束 时 染色 体 相

|

互 连 接 形成 联合 丝 复合 体 (synaptonemal complex) 。 它 们 在 物种 之 间 存 在 很 大 的 差异 ,每 种 生
物 都 各 具 其 特有 的 结构 。 最 近 从 分 离 酵母 突变 体 中 发 现 其 重组 步骤 与 减 数 分 裂 很 相似 。

一 、 同 源 重 组 的 机 制
一 ) 断 有 裂 - 复 合
同 源 重组 是 指 DNA 分 子 内 断裂 -复合 (breakage and reunion ) 的 基因 交换 。 对 于 其 作用 机

制 有 两 种 假设 :第 一 种 假设 认为 交换 是 完整 DNA 分 子 的 断裂 重 接 (breakage and rejoining ) 。

这 是 从 细胞 学 观察 得 来 的 经 验 图 式 , 即 当 卷 曲 的 染色 体 减 数 分 裂 和 配对 时 ,有 时 在 染色 单 体 的
140

|

减 数 分 裂 过 程 分 子 相互 作用

细 线 期
滥 聚 染色 体 恋 得 清晰 OASOSOSNONOSONORSOS， 每 条 染色 体 已 复制 ,由 两 条 姊妹
ANONOANANOSOANANON 六 色 体 组 成
SCNANCNANNANCN
SCNNONANANCNAN
心
ASONONCSCSOSCANCS 起 始
染色 体 开始 在 有 限 区 AS ANORARCRORORS 在 一 个 基因 组 上 发 生 断 列
或 某 些 区 域 配对
NONNANNANNCN
ANONCANCANANNANCAN
粗 线 期
联 会 丝 复合 体 沿 整个 配对 ANCNCSARCROSOSCS。 链 交换
染色 体 伸展 ASOSROSNOROSORORAOS-， 单 链 与 另 一 基因 组 发 生 链 交 换
小
ANCNCNCSCSCNOSCSN
双 线 其

AOLNONONONOANCRAON 同化

人 LORCRARANOANCANI 链 交换 区 域 的 延伸
ANCSCNCNANRSAScv
ANONNANNININON

染色 体 分 离 ,但 在 交叉 点 连接 上

2 ANONONONONOANONON 拆 分
染色 体 凝 聚 . 从 被 膜 分 离 ; ANONONONONCANONOANL， 通过 切割 释放 基因 组
保留 交叉 ,四 条 染色 单 体 人 SCONSNANNINNAY
ANONNONONONONON

全 部 变 清晰

6-1 第 一 次 减 数 分 裂 前 期 的 重组

水 平 上 发 生物 理 的 断裂 。 这 是 染色 体 收 缩 所 产生 的 张力 造成 的 。 断 裂 端 可 通过 交叉 重 接 而 解
除 张力 ,从 而 产生 两 个 相互 重组 的 染色 单 体 (图 6-2 a) ,按照 这 个 模式 ,重组 发 生 在 染色 体 复制
完成 之 后 , 那 就 是 在 每 对 联 会 染色 体 (synapsed chromosomes) 中 有 4 条 染色 单 体 时 发 生 * 另 一
种 假设 称 为 拷贝 选择 (copy choice ) ， 即 配对 的 染色 体 复制 时 ， 沿 着 父 本 (paternal) 染色 体形 成
的 新 DNR 链 转 而 以 母 本 (maternal) 染色体 为 模板 。 假 如 母 本 链 的 互补 链 当 达到 相同 点 时 也 转
换 模板 ,结果 就 形成 两 个 相对 应 的 重组 体 ( 图 6-2 b)。 这 两 种 假设 的 基本 区 别 在 于 对 重组 染色
体 物 理 起 点 的 推测 ,前 者 为 两 个 亲本 染色 体 在 断裂 和 重 接 之 后 ,产生 重组 染色 体 的 物理 遗传 物
质 ,后 者 则 为 DNA 在 复制 时 由 于 选择 不 同 的 模板 产生 重组 。 ，

141

一 > memmmm ? 二 在 > 一 一 一 mr
Edaseageoe 一 DROPEEE- PERDCTTIZDC
2. 两 条 染色 单 体 3. 断裂 染色 单 体 4. 交换 产物
的 断裂 的 交叉 复合

(b) 拷 贝 选择

> 一 -一 一 二
ER
2. 合成 转换 以 拷贝 3. 相互 重组 拷贝 4. 拷贝 选择 产物

另 一 染色 单 体

6-2 染色体 间 发 生 交换 的 两 种 假设

交换 是 DNA 分 子 的 断裂 和 嫩 接 , 它 是 通过 很 多 实验 得 到 证 明 的 ,如 图 6-1 所 述 染色 体 复
制 在 间 期 中 已 经 完成 ,而 交换 出 现在 减 数 分 裂 的 早期 ,在 细菌 和 高 等 生物 中 也 可 看 到 同 料 的 现
象 ,例如 ,在 组 织 培养 细胞 中 常用 染色 法 分 辨 染色 单 体 ,可 看 到 哺乳 动物 染色 单 体 之 间 发 生 明
显 的 DNA 物理 交换 。 另 外 ,用 标记 噬菌体 进行 实验 ,发现 重组 与 DNA 复制 无 关 ,重组 体 可 以
在 非 复制 DNA 分 子 之 间 产 生 ,, 进 一 步 证 实 了 完整 双 螺旋 的 断裂 -复合 是 交换 的 主要 机 制 。

二) 异 源 双 链

两 个 DNA 分 子 的 连接 是 重组 过 程 的 核心 ,重组 从 两 个 配对 DNA 双 螺旋 同 源 片 段 的 相应
位 点 上 的 断裂 开始 ,断裂 使 由 切口 产生 的 自由 末端 移动 ， 每 个 单 链 离开 它 本 身 的 配偶 链 到 另 一
个 双 螺 旋 上 的 互补 链 交叉 配对 。 这 种 相互 交换 在 两 个 双 链 DNA 分 子 之 间 形 成 连接 体 。 一 对 相
连 的 双 链 DNA 称 为 连接 分 子 (joint molecule) 。 一 个 DNA 分 子 上 的 一 股 单 链 与 另 一 个 双 螺 旋
的 交叉 位 点 称 为 重组 体 连 接点 (recombinant joint) 。 在 重组 位 点 上 ,每 个 双 链 都 有 二 个 由 两 个
亲本 DNA 分 子 中 的 一 股 单 链 共 同 组 成 的 双 链 区 域 ,这 段 区 域 称 为 杂种 DNA(hybrid DNA) 或
异 源 双 链 DNA (heteroduplex DNA)。 所 以 ,在 两 条 染色 体 相连 时 ， 中 间 就 有 一 段 异 源 双 链 区 ，
遗传 分 析 证 明 所 有 病毒 都 有 异 源 双 链 区 .每 个 T 4 分 子 上 异 源 双 链 区 往往 长 达 几 千 不 核 昔 酸 。

^ 噬菌体 中 的 异 源 双 链 区 的 特点 也 是 其 长 度 远 比 最 初 配 ”

8 3，

人 5

一 对 阶段 可 达到 的 长 度 长 。 所 增加 的 长 度 大 致 都 是 分 支 迁 。
重组 接合 点 中 的 交叉 链 三 ) 分 支 迁 移

两 个 双 螺 旋 形成 的 交叉 连接 是 两 个 原来 的 分 子 等 量 |
茂 基 交 换 的 所 在 ,交叉 连接 很 容易 以 拉链 式 效 应 扩散 ;也 ，

8 -一 杂种 一 一 -| 3
3 5

E

本
3'

在 两 个 双 链 中 产生 延伸 的 杂种 ,分 支
向 右 扩散 (分支 迁 移 )

图 6-3 重组 连接 点 的 扩散

142

耽 是 链 交 换 可 沿 着 双 链 滑动 ,这 个 过 程 称 为 分 支 渤 移 是
(branch migration) (图 6-3) 。 特定 链 的 延伸 区 段 可 以 通
过 这 种 方式 从 一 个 螺旋 移 至 另 一 个 螺旋 而 产生 异 源 双 链
区 的 杂种 DNA 长 片段 。 分 支点 可 以 向 任何 方向 移动 分
支 迁 移 具有 理论 和 实践 上 的 重要 性 .在 理论 上 , 它 是 重组
结构 的 一 个 重要 动力 学 特征 ,在 实践 中 , 它 的 存在 说 明了

|

体外 分 子 检测 不 能 产生 分 支点 ,因为 分 子 解 离 时 分 支 可 发
生 迁 移 。 分 支 迁移 的 速度 不 易 确 定 , 体 外 观察 的 结果 可 能 不
适应 于 维持 自然 条 件 下 大 范围 异 源 双 链 DNA 的 形成 ,在
体内 进行 大 范围 的 分 支 迁 移 必 须 有 重组 酶 的 催化 。

(四 )Holliday 结构

重组 中 连接 两 个 DNA 双 链 的 交换 中 间 物 含有 4 股

DNA 链 , 在 其 连接 处 为 了 转换 配对 所 形成 交叉 链 的 连接 点

(crossed-strand junction ) 称 为 Holliday 结构 (图 6-4) 。 重

6-4 Holliday 结构

组 分 子 在 Holliday 连接 点 (junction) 上 主 链 能 自由 转动 ,使 一 条 链 从 一 个 双 螺 旋 移 至 另 一 个
双 螺 旋 而 不 失去 碱 基 对 或 等 价 地 消除 拓扑 束缚 力 。

双 链 DNA 配对

切 开 同 源 链

双 螺旋 间断 裂 链 发 生 交换

通过 分 支 迁移 移动 交换 点

4 7

在 相同 链 上 第 二 次 切割 下 在 另外 链 上 形成 第 二 次 切口

2

/ 双 螺旋 间 进 行
第 二 次 链 交换 ，
封 住 切口

基因 组 不 是 重组 体 ，
但 含有 异 源 双 链

产生 相互 重组 基因 组

图 6-5 ”两 个 配对 双 链 DNA 之 间 的 重组 ,从 互补 交换 开始 ,分 支 迁移 延伸 ,然后 通过 切割 而 拆 分
143

(五 ) 连 接 分 子 的 拆 分
链 交 换 形成 的 连接 分 子 必 须 拆 分 (resolution) ,彼此 分 离 为 双 链 DNA 分 子 。 拆 分 要 求 两 个

切口 进一步 配对 ,反应 结果 则 取决 于 配对 链 上 切口 的 位 置 。 由 于 交 联 在 一 起 的 两 条 双 链 DNA
分 子 实际 上 处 在 不 断 地 异 构 化 中 ,切口 可 能 在 两 对 同 源 链 中 任意 一 对 上 发 生 ( 如 图 6-5 右 )。 如
果 切 口 发 生 在 形成 连接 分 子 过 程 中 原先 没有 切割 过 的 配对 链 上 ,至 此 所 有 4 条 单 链 实际 上 都
已 发 生 过 断裂 ,由 此 将 释放 出 两 条 重组 DNA 分 子 , 一 条 亲本 双 螺 旋 分 子 与 另 一 条 亲本 双 螺 旋
分 子 共 价 相连 ,中 间 有 一 段 异 源 双 链 区 域 , 这 种 重组 称 为 交互 重组 (reci-procal recombination )
(图 6-5, 右 )。 如 果 切 口 发 生 在 重组 过 程 中 曾 被 切 开 过 的 一 对 同 源 单 链 上 ,那么 原来 二 直 保 持
完整 的 另 一 对 同 源 链 将 继续 保持 完整 。 这 种 切割 释放 出 两 条 原来 的 亲本 DNA 分 子 , 并 没有 发
生 交 互 重 组 ,但 每 个 双 链 DNA 都 保留 一 段 较 长 的 异 源 双 链 DNA( 图 6-5, 左 )。 由 此 可 见 ,连接
分 子 可 以 以 两 种 交替 方式 进行 拆 分 ,两 侧 基 因 或 是 发 生 交 互 重组 ,或 是 无 重组 发 生 。 但 不 论 哪
种 拆 分 方式 都 说 明 一 个 原则 , 即 链 交换 后 总 会 在 两 条 DNA 分 子 上 留 下 一 段 异 源 双 链 区 ,但 侧

机 序列 的 重组 未 必 与 之 同时 发 生 。 图 6-6 表示 Holliday 连接 点 的 拆 分 ,连接 点 上 主 链 自由 转动 ，

时 ,根据 所 形成 的 一 对 切口 的 位 置 不 同 , 拆 分 后 产生 亲本 双 螺 旋 或 重组 双 螺 旋 。

TI

站 转动 表示 Holliday 连接 点 的 结构

|

切口 控制 结果
切口 在 另 一 链 上 释放 重组 体 切口 在 同一 链 上 释放 亲本 双 螺 旋

SS SS
※

图 6-6 Holliday 连接 点 的 拆 分

RE

ae

SARmeqEee=

通过 将 携带 较 短 的 同 源 序 列 的 质粒 或 噬菌体 导 和 人 细菌 受 体 中 ,就 可 以 观察 到 重组 双 链 间
建立 连接 体 所 需 最 短 序 列 的 长 度 。 实验 证 明 , 震 同 源 序 列 小 于 75 bp 时 , 则 重组 率 会 明显 下 降 。

二 、 双 链 断 裂 启 动 重组

6-1 的 重组 一 般 模 式 表明 , 双 螺 旋 DNA 分 子 先 形成 双 链 切口 ,从 此 位 点 上 解 链 形成 的
单 链 可 参与 并 完成 基因 交换 。 重 组 的 热点 就 是 双 链 断裂 开始 的 位 点 。 图 6-7 是 目前 提出 的 重组
模式 。 图 中 把 引发 重组 \ 双 链 断 裂 ) 的 DNA 分 子 称 为 受 体 , 把 受 体 链 侵入 的 同 源 双 螺 旋 称 为 供
体 。 当 核酸 内 切 酶 在 受 体 DNA 双 链 分 子 上 切 开 一 个 切口 时 ,重组 就 从 此 开始 。 通 过 核酸 内 切

FT

MI UL 在 受 体 上 形成 双 链 断裂

TFT FF
ER Leuici 断裂 在 3- 端 一 边 扩大 成 缺口

ai LI LLLLLLLLL

Pr-TerTTTTTA FT 和
轴 请 加 古 古 古语 蕊 weeuasas 3' -未 端 迁移 至 另 一 双 螺 旋

TV ， TFT 从 3- 示 端 合 成 以 置换
业
) 和

Er PTTT7TT 置换 链 迁 移 至 另 一 双 链
种 纪 st 本 本 本 可 |

SR 未 端 发 生
\ 通 过 供 体 序列 恢复 钒 口 _

相互 迁移 产生 双 链 交换
中- -

图 6-7“ 双 链 断 裂 启动 重组 ,随后 形成 单 链 3 -末端 ,其 中 一 条 链 迁 移 至 同 源 双 链 上

145

酶 的 进一步 切割 ,扩大 成 缺口 。 然 后 核酸 外 切 酶 在 断裂 的 另 一 端的 一 条 链 上 切割 ,产生 了 3' 单
链 未 端 。 这 样 , 一 个 游离 的 3' 端 侵入 供 体 双 链 的 同 源 区 。 异 源 双 链 的 形成 产生 了 D- 环 结构 ,其 |
中 供 体 的 一 条 链 被 取代 。D- 环 利用 3' 端 作为 引物 ,通过 修复 合成 而 延伸 ,最 后 ,D- 环 逐渐 延长 ，
足以 达到 交换 染色 单 体 上 缺口 的 全 长 。 当 突出 的 单 链 到 达 缺 口 的 远 侧 (尽头 ), 互 补 单 链 序列 就
退火 ,这 样 在 缺口 的 任何 一 侧 都 有 异 源 双 链 ,而 缺口 本 身 则 代表 了 D- 环 单 链 。 用 缺口 左 侧 的 “
3'- 末 端 为 引物 ,通过 修复 合成 将 缺口 区 修复 成 完整 的 双 链 。 总 之 ,缺口 是 由 两 股 独立 的 单 链
DNA 的 合成 途径 得 到 修复 的 。 分 支 迁移 把 这 个 结构 转化 成 具有 两 个 重组 连接 点 的 分 子 , 连 接
点 必须 通过 切割 而 拆 分 。 如 果 两 个 连接 点 以 同样 的 方式 拆 分 , 则 释放 出 原来 的 两 个 未 交换 的 分 ”
子 , 它 们 各 自 含 有 一 个 改变 了 遗传 信息 的 区 段 , 该 区 段 是 足迹 试验 交换 的 结果 。

如 果 两 个 连接 点 以 相反 的 方式 拆 分 , 则 是 基因 交换 的 结果 .。 拆 分 前 具有 两 个 连接 点 的 分 子
结构 说 明了 双 链 断裂 模式 和 只 是 产生 单 链 交换 的 模式 之 间 是 截然 不 同 的 。 一 是 随 着 双 链 的 断 ”
裂 ,区 段 各 端 包括 交换 区 都 形成 了 异 源 双 链 DNA ,两 个 异 源 双 链 片段 的 序列 相当 于 缺口 区 段 。
此 时 ,在 两 个 DNA 分 子 中 缺口 区 被 供 体 DNA 序列 所 取代 (图 6-7)。 因 此 , 异 源 双 链 的 序列 是 二
不 对 称 的 。 并 且 一 个 DNA 分 子 的 部 分 序列 可 以 转换 成 另 一 个 DNA 分 子 的 对 应 序列 。 这 就 是 ，
行使 引发 作用 的 染色 单 体 称 作 受 体 的 原因 ;二 是 随 着 互补 单 链 交 换 的 进行 ,每 个 DNA 双 链 从
交换 起 始点 到 分 支 迁移 点 之 间 的 区 段 都 有 异 源 双 链 成 分 (图 6-5) 。 单 链 交换 模式 不 同 之 处 在
于 一 些 DNA 能 降解 或 重新 合成 (而 起 始 染色 单 体 是 基因 信息 的 供 体 )。 双 链 断 裂 模式 并 未 降
低 异 源 双 链 DNA 形成 的 重要 性 。 它 仍 是 双 链 分 子 相互 作用 唯一 合理 的 方式 。 双 链 断裂 乍 看 起 星
来 令 人 惊异 ,因为 一 旦 断裂 贯穿 整个 DNA 分 子 就 无 法 回 到 原状 。 比 较 图 5.5 和 图 6-7, 在 单 链
交换 模式 中 ,没有 任何 信息 丢失 ,但 在 双 链 断裂 模式 中 ,在 切割 开始 就 有 信息 丢失 ,在 纠正 信息
时 任何 错误 都 是 致命 的 。 另 一 方面 ,借助 于 另 一 双 链 进行 再 合成 以 恢复 失去 的 信息 ,可 给 细胞 ，
提供 一 个 主要 的 安全 措施 。

三 、 双 链 断 裂 引 发 联 会

多 年 来 一 直 认 为 联 会 丝 复合 体 代 表 了 重组 的 某 个 阶段 ,也 可 能 是 DNA 交换 必 不 可 少 的
开端 。 近 来 则 认为 联 会 丝 复合 体 是 重组 的 结果 而 不 是 原因 , 联 会 开始 于 每 条 染色 体 ( 姊 妹 染色
单 体 对 ) 环 绕 一 种 称 为 轴 心 体 4axial element ) 的 结构 发 生 凝 聚 。 轴 心 体 是 二 种 蛋白 质 , 各 染色 用
体 的 轴 心 体 排列 在 同一 直线 上 。 联 会 丝 复合 体形 成 三 分 体 结构 ,此 时 联 会 丝 复合 体 的 轴 心 体 称
为 侧 体 (lateral element ) 。 每 条 染色 体 在 此 期 间 呈 一 团 染 色 质 与 连 着 一 个 侧 体 的 状态 ( 侧 体 有
条 纹 结构 ) , 两 个 侧 体 被 一 个 精细 而 致密 的 中 体 (central element) 分 开 , 这 些 平 行 而 致密 的 链
沿 轴 盘 旋 扭 结 处 在 一 个 平面 上 。 从 分 子 水 平 来 看 , 同 源 染 色 体 之 间 的 恕 离 较 大 ,超过 200an
CDNA 分 子 直径 为 2 nm)。 所 以 ,尽管 同 源 染色 体 排列 在 同一 直线 上 ,但 是 ,它们 的 间 臣 天 大 ，
以 致 不 能 实现 同 源 DNA 分 子 间 的 接触 。

但 是 ,在 真菌 或 昆虫 的 球形 体 或 圆柱 体 结构 中 ,能 看 到 联 会 丝 复合 体 两 侧 形成 的 交叉 连
接 , 称 为 节 Cnode) 或 重组 节 (recombination noduce)。 它 们 出 现 的 频率 及 分 布 与 染色 体 交 又 相
同 , 因 此 ,可 证 明 是 重组 的 位 点 关于 重组 与 联 会 丝 复合 体形 成 之 间 的 关系 已 经 确定 ,在 果 蝇 或 |
酵母 中 ,取消 染色 体 配对 的 突变 可 阻止 重组 的 发 生 . 目 前 没有 二 个 体系 将 重组 的 分 子 机 制 与 细
胞 活动 做 出 比较 。 最 近 ,在 对 酿酒 酵母 的 减 数 分 裂 的 分 析 中 取得 了 一 些 进展 ,二 者 的 时 间 关 系 |

概括 于 图 6-8。 有 充分 的 证 据 表 明 在 酵母 体内 无 论 是 同 源 重组 还 是 位 点 专 一 性 重组 都 是 双 链
146

分 子 活动

时 间 (min)
网 胞 活动 DNA 复制 终了 轴 心 体形 成 联 会 丝 复合 体形 成
减 数 分 裂 期 2 三

6-8 轴 心 体形 成 出 现 双 链 断裂 ,而 当 联 会 丝 复合 体 延 伸 时 就 消失 ,DNA
重组 体 可 在 粗 线 期 末 检 出 ,测定 时 间 从 减 数 分 裂 前 的 复制 终了 时 计算

断裂 启动 重组 。 双 链 断 裂 最 初 在 交配 型 染色 体 转换 过 程 中 发 现 ,在 转换 过 程 中 一 段 序列 被 另 一
段 序列 所 置换 。 双 链 断 裂 发 生 在 减 数 分 裂 早 期 的 特定 位 点 上 , 这 就 为 重组 提供 了 热点 。 重 组 在
某 一 位 点 附近 的 频率 是 高 的 ,在 此 位 点 的 一 侧 或 两 侧 ,重组 频率 呈 梯 度 下 降 , 双 链 断裂 所 造成
的 平 端 两 侧 同 时 转变 成 长 的 3'- 单 链 未 端 (图 6-7) 。 酵母 突变 体 (rad 50) 是 重组 缺陷 型 的 , 它 阻
断 了 平 端 转变 为 单 链 突出 的 粘性 未 端 , 这 表明 双 链 断裂 是 重组 过 程 必 不 可 少 的 。 双 链 断裂 出 现
在 轴 心 体形 成 时 期 ,消失 在 配对 的 染色 体 转变 成 联 会 丝 复合 体 时 .这 种 精巧 的 时 间 上 的 对 应 表
明 : 联 会 丝 复 合体 的 形成 是 重组 引发 的 结果 ,而 重组 的 引发 又 借助 于 断裂 双 链 的 出 现 和 随后 的
重组 中 间 体 的 形成 。 这 一 观点 由 rad 50 突变 体 使 轴 心 体 无 法 转变 成 联 会 丝 复合 体 的 结果 得 到
验证 ,这 与 传统 的 减 数 分 裂 的 观点 形成 鲜明 的 对 照 , 即 联 会 丝 复合 体 是 染色 体 配 对 以 产生 重组
分 子 的 需要 。 联 会 丝 复合 体 的 产生 与 预计 的 交换 时 间 是 一 致 的 。 至 于 重组 是 否 发 生 在 联 会 期 ，
一 直 难 以 提供 直接 的 证 据 。 因 为 用 重组 体 的 出 现 来 确定 的 重组 是 在 减 数 分 裂 结束 之 后 。 但 是
在 酵母 中 ,直接 根据 是 用 含有 限制 性 位 点 的 DNA 分 子 的 产生 来 确定 重组 体 的 出 现 , 它 证 明 重
组 是 发 生 在 粗 线 期 的 未 期 。 显 然 , 这 将 重组 置 于 联 会 丝 复合 体形 成 之 后 。 在 重组 过 程 中 , 联 会
丝 复合 体 可 能 占据 中 介 的 位 置 ,在 同 源 染 色 体 相互 识别 以 后 , 双 链 断裂 产生 单 链 未 端 , 并 参与
寻求 互补 序列 ,寻求 的 结果 使 同 源 片 段 之 间 连 接 , 这 种 连接 使 它们 紧密 接近 并 引发 三 又 联 会 丝
复合 体 的 形成 。 在 双 线 期 染色 体 脱 去 了 联 会 丝 复合 体 , 于 是 交叉 就 成 为 染色 体 上 可 见 的 连接
所 "和 雪 示 基因 交换 的 发 生 。 但 是 高 又 分 子 的 性 质 尚 不 甚 清楚 , 它 可 能 代表 交换 完成 的 残余 物 , 或
代表 同 源 染 色 体 之 间 的 连接 点 ,而 基因 交换 尚未 拆 分 。 在 减 数 分 裂 末 期 ,交叉 移 向 染色 体 的 两
端 , 这 种 变化 说 明 它 代 表 重 组 过 程 的 某 种 残迹 ,并 非 真 正 的 重组 中 间 体 。

四 、 细 菌 DNA 的 重组 和 单 链 同化

要 研究 DNA 分 子 间 序 列 交换 的 本 质 ,必须 藉 助 于 细菌 体系 。 虽 然 识 别 反应 只 是 重组 机 制

的 一 小 部 分 ,而 且 是 局 部 的 ,只 涉及 到 DNA 分 子 有 限 的 区 域 , 并 非 整 个 染色 体 ,但 是 分 子 相互

作用 的 一 般 顺序 都 是 相似 的 :从 分 子 断裂 产生 的 单 链 与 其 亲本 双 螺 旋 作 用 ;配对 区 域 不 断 扩

大 ;核酸 内 切 酶 拆 分 亲本 双 螺旋 ;很 多 酶 参与 重组 的 各 个 阶段 (尽管 这 些 酶 只 代表 部 分 重组
147

酶 ) 。 细 菌 重组 酶 是 通过 在 其 基因 中 存在 的 rec- 突变 而 发 现 的 ,rec- 突变 体 表 现 型 丧失 了 重组
能 力 而 不 能 进行 一 般 的 重组 .细菌 不 进行 双 链 大 量 交换 ,在 原核 生物 体内 有 几 种 不 同 的 途径 引
发 重组 。 在 某 些 情况 下 DNA 可 有 效 利用 单 链 的 自由 3'- 未 端 参加 反应 (为 接合 作用 ) 。 单 链 的
缺口 可 以 受 外 部 影响 而 产生 , 当 DNA 受到 紫外 线 辐射 .X 射线 辐射 及 化 学 药剂 等 作用 时 双 链
断裂 或 产生 缺口 (或 双 链 的 单 链 区 ) ,这 些 处 理 都 会 使 重组 增加 。 而 对 细菌 本 身 而 言 , 当 其 DNA
连接 酶 和 DNA 聚合 酶 I 的 基因 发 生 突变 ,复制 和 修复 中 的 DNA 就 不 能 正常 封闭 ,从 而 产生
断裂 和 缺口 。 单 链 的 尾部 则 由 正在 进行 滚动 复制 的 唆 菌 体 基因 组 产生 。 如 果 有 两 个 双 链 DNA
分 子 参与 交换 , 则 必然 要 产生 单 链 区 和 自由 的 3'- 未 端 。

(一 ) 细 菌 重组 酶
在 重组 反应 中 其 活性 最 为 明显 的 是 由 大 肠 杆菌 染色 eeeeeeeeee- 区
体 上 rec 基因 和 rz 基因 编码 的 一 些 酶 。RecA 蛋白 具有 |

联 会 同 源 DNA 分 子 的 能 力 ,并 启动 一 个 分 子 的 单 链 侵

入 到 另 一 分 子 的 双 螺 旋 上 。 通 过 取代 双 螺 旋 上 的 原始 链
而 形成 异 源 双 链 ,RecBCD 核酸 酶 结合 在 DNA 分 子 chi
序列 的 一 端 , 沿 着 该 链 移动 时 解 开 DNA 双 链 ,并 在 cj

位 点 上 切割 而 产生 单 链 未 端 。RuvA 和 RuvB 指导 异 源 |

双 链 DNA 的 形成 ,而 RuvC 则 具有 切 开 Holliday 结构

的 功能 ， 区 。
1. RecA 蛋白 ”对 重组 机 制 了 解 得 最 为 详细 的 是 天 关

肠 杆菌 rec4 基因 产物 的 研究 。 靶 染色 体 的 单 链 DNA 与 |

其 互补 序列 的 匹配 需要 RecA 蛋白 的 催化 ,RecA 蛋白 是 从
催化 重组 基本 反应 的 酶 ,能 通过 碱 基 配 对 使 两 个 DNA YYYMSCwwwwsasasas
连接 成 杂交 分 子 。 RecA 蛋白 引发 单 链 DNA 与 其 互补 双 。 图 6.。 用 体外 DNA 开朗 的 楼 区
链 之 间 的 配对 ,能 用 单 链 去 置换 双 链 中 的 同 源 链 (图 6- 反应 才 示 RecA 恒 外 的 活性

9) ,RecA 和 蛋白 能 在 体外 催化 Holliday 结构 的 形成 ,图 6- A. RecA 蛋白 首先 结合 在 单 股

11 说 明 RecA 蛋白 如 何在 体外 从 两 个 相同 的 双 螺 旋 ( 其 。 DNA 上 ;B. 双 链 DNA 的 不 同 区 段 被 结

中 之 一 在 末端 有 缺口 ) 形 成 完整 的 重组 体 。 当 RecA 蛋白 合 到 单 链 片段 上 的 RecA 蛋白 解 链 iC。
驱使 退火 到 缺口 边缘 时 (图 6-10 c) 缺 口上 部 螺旋 就 解 了 号
旋 ; 这 样 连接 点 扩散 到 整个 双 螺旋 区 ,同时 交换 点 的 右边 。 交 , 形 成 D 下. 下

形成 第 三 个 杂交 双 螺 旋 ( 图 6-10 d) .RecA 蛋白 在 这 一 阶 | |
段 还 表现 出 第 二 种 作用 , 即 它 指 导 形成 四 股 螺旋 . 四 股 螺 旋 由 交换 点 左边 区 域 的 两 个 DNA 双 疆
链 组 成 ,从 而 加 速 了 链 交 换 , 使 连接 通过 整个 双 螺 旋 而 移动 .图 6-11 A 的 结构 与 图 6-10 也 的 完 避
全 双 链 部 分 相同 ,但 有 两 点 不 同 :一 是 两 个 同 源 双 链 到 交换 点 的 左边 画 成 四 股 螺 旋 , 二 是 RecA
蛋白 存在 于 四 股 螺旋 区 。 图 6-11 B 表示 RecA 全 白 从 四 股 螺旋 中 间 体 引发 互补 的 链 交 换 。

2. RecBCD 酶 ， 亦 称 核酸 外 切 酶 v , 它 通过 cj 序列 识别 靶 位 点 ,这 种 酶 的 各 个 亚 基 是 由
recB,recC 和 recD 基因 编码 的 产物 。 它 是 一 种 有 效 的 降解 DNA 的 核酸 酶 ,具有 多 种 活性 ,可 上
以 在 单 链 结合 蛋白 的 存在 下 松 开 DNA 双 链 ,同时 还 具有 ATP 酶 活性 。 它 在 重组 中 的 作用 是
提供 具有 3 -未 端的 单 链 区 域 。 遗 传 学 实验 证 明 ,核酸 外 切 酶 v 以 相当 高 的 频率 促进 含有 中

148

C
| 分 支 迁 移
一
ee 细
上 必 5
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ANNA Naz

用 交换 位 点
人 STR
汉 AAS TS

本 ， 5 [XA 代 人 供

NI

和 于 二 :这 二
已 配对 的 双
和
A

分 支 迁移 的 方向

(3)
6-11 和 A. 重组 中 的 DNA 四 股 螺旋 ;B. (1) 双 螺旋 结合 在 RecA 蛋白 上 ; (2) 链 转换 以
形成 两 个 异 源 双 链 ;(3) 两 条 DNA 双 链 间 形 成 四 股 螺旋 假设 的 配对 位 点

149

GCTGGTEG 于 了
位 点 的 DNA 重组 ,chi 位 点 具有 恒定 的 8 bp 不 对 称 序列 3yCCACCACC5/ 在 自然 情况 下 这 自

序列 在 忆 . co 中 每 隔 5 一 10 bp 出 现 一 次 。c 乱 序列 可 以 在 大 范围 内 激发 重组 ,有 的 甚至 远 在
10 kb 处 起 作用 。 当 核酸 外 切 酶 V 结合 于 DNA 的 cj 位 点 右 侧 时 , 便 可 沿 着 正在 解 链 的 DNA
移动 。 当 它 移 动 到 cj 位 点 右 侧 4 一 6 kb 时 ,在 上 边 的 链 上 将 单 链 切 断 。 核 酸 外 切 酶 Y 的 作用
见 图 6-12。 这 个 模型 是 体外 反应 所 得 数据 建立 起 来 的 。 它 参 与 解 旋 、 切 制 和 产生 引发 形成 异 源
双 链 连接 点 的 末端 。 本

3. 在 重组 后 期 发 挥 功 能 的 一 组 酶 “在 大 肠 和 co
杆菌 中 存 有 由 3 个 基因 ”xzv4 ,rxvB 和 rzxmC 组 和
成 的 一 组 酶 ,其 中 rxv4 和 zxvB 两 个 基因 产物
会 促进 异 源 双 链 结构 的 形成 。 这 种 结构 是 在
RecA 蛋白 催化 一 个 双 螺 旋 和 一 个 单 链 反应 所
形成 的 .RuvA 识 别 Holliday 结构 连接 点 ,RuvB
是 一 种 ATP 酶 ,为 分 支 迁 移 提 供 动 力 , 分 支 迁
移 是 以 10 一 20 bpy/s 速度 进行 。 第 三 个 基因 是
ruoC ,是 编码 专 一 识别 Holliday 结构 连接 点 的
核酸 内 切 酶 , 它 在 体外 切断 连接 点 以 拆 分 重组
中 间 体 。

(二 ) 单 链 摄 入 和 链 交 换

RecA 蛋白 作用 于 DNA 分 子 , 用 单 链 去 置

换 双 链 分 子 的 同 源 区 段 , 这 个 反应 称 为 单 链 摄 ”图 6-12 RecBCD 核酸 酶 从 右 侧 到 达 < 乱 序列 ，

入 (single-strand uptake) 或 单 链 同化 (single- 并 在 c 庆 侧切 断

strand assimilation) 。 置 换 反应 可 以 在 几 种 不 同 构 型 的 DNA 分 子 之 间 发 生 , 但 必须 具备 下 列 3
个 条 件 :四 其 中 一 个 DNA 分 子 必 须 具 有 单 链 区 域 ;@ 其 中 一 个 DNA 分 子 必 须 具 有 自由 3 -未
端 ;@@ 单 链 和 3'- 未 端 必须 位 于 DNA 分 子 间 的 互补 区 域内 。 反 应 以 两 种 形式 进行 , 当 二 线 型 单
链 侵 入 环 型 双 链 时 ,在 互补 区 内 它 取代 了 原先 的 一 条 链 并 形成 D 环 。 当 一 环 状 单 链 去 作用 于
线 型 双 链 时 , 链 交换 产生 了 开 环 分 子 。 图 6-13 中 ,反应 的 DNA 分 子 是 一 个 环 状 单 链 和 部 分 与
环 状 单 链 同 源 的 线 状 双 链 片段 , 双 链 片段 的 一 条 链 被 环 状 单 链 的 同 源 片段 所 置换 。 单 链 同化 与
重组 的 引发 有 关 , 各 种 重组 模式 都 要 求 有 中 间 体 形成 ,在 中 间 体 上 ,一 条 或 两 条 单 链 从 一 条 双
链 上 交换 到 另 一 条 双 链 上 (图 6-5 和 图 6-7)RecA 蛋 白 催化 中 间 体 的 形成 .RecA 蛋白 能 将 单 链
和 双 链 DNA 素 集 为 长 的 细 丝 ,表明 它 具 有 促进 分 支 迁移 的 能 力 ,在 每 个 细 丝 的 转达 处 结合 6
个 RecA 蛋白 单 体 , 每 个 单 体 结合 三 个 核 苷 酸 , 细 丝 具有 螺旋 结构 。

DNA 分 子 的 相互 作用 就 发 生 在 这 些 细 丝 中 , 当 一 条 单 链 被 双 螺 旋 同 化 时 ,首先 由 RecA
蛋白 将 单 链 结合 进入 细 丝 ,然后 双 螺旋 也 被 结合 进来 形成 三 链 结构 。 在 这 个 体系 中 , 联 会 先 于
DNA 的 物理 交换 , 因为 配对 反应 可 以 在 缺少 自由 末端 的 情况 下 发 生 , 而 此 时 的 链 交 换 却 是 不
可 能 的 。 链 交换 需要 自由 的 3 -末端 ,反应 在 细 丝 中 进行 ,RecA 蛋白 始终 结合 在 最 先 形 成 的 单
链 上 ,因此 ,在 反应 结束 时 ,RecA 蛋白 就 结合 到 双 链 分 子 上 。 在 反应 进行 过 程 中 ,大 量 的 ATP
会 被 水 解 .ATP 的 作用 是 让 RecA 蛋白 对 DNA 更 具有 很 大 的 亲和力 ,这 是 结合 和 配对 反应 的
需要 。 ATP 水 解 后 就 会 使 结合 部 位 的 亲和力 下 降 , 有 利于 异 源 双 链 DNA 的 释放 。 可 将 RecA

150

蛋白 催化 单 链 和 双 链 DNA 的 反应 划分 为 3 个 阶段 :四 缓慢 的 联 会 前 阶段 ,此 时 RecA 蛋白 结
合 在 单 链 上 ;@ 单 链 与 双 螺旋 的 互补 链 迅 速配 对 ,形成 异 源 双 链 连接 分 子 ;@ 从 双 螺 旋 结构 中
缓慢 置换 一 条 链 产生 一 段 长 的 异 源 双 链 DNA。

7
新 形成 的 双 链 和

尚未 反应 的 双 链
DNA

图 6-13 RecA 蛋白 众 化 体外 链 交 换 的 电镜 图 (a) 及 示意 图 (b)
《1) 尚 未 反应 的 双 链 DNA( 同 电镜 图 ); (2) 单 股 环 状 DNA 与 RecA 蛋白 复合 ;
《3) 从 双 链 置换 下 来 的 RecA 蛋白 结合 DNA 链 ( 因 为 有 过 剩 的 RecA 蛋白 可 利用 ) 。
一 一 一 人 ONANRNORNORONOAY
ANONCARCAACONONONAROCNONNANONNORAIN

小 自由 链 启动 交换

Acesesessasesv 一 一
ASCNOSCNeNoScSoNCSONCNCNONONCS

小 释放 的 链 与 互补 链 配对 Et ，
r |

| 一
CARCNCNCNMRCKN PNSCNNSCRSCRCS-

AN A

小 完成 链 交 换

_APSCSOSONONANOCET-

MSONRANANOANRNCNCNNNINCANNCNAN
图 6-14 在 部 分 双 链 或 全 部 双 链 之 间 RecA 介 导 的 链 交 换 , 产 生 重组 中 间 体 连接 分 子

151

单 链 侵 入 还 需要 单 链 结合 蛋白 (SSB)， ee

以 保证 底 物 不 形成 二 级 结构 ,从 而 促进 反应 人 的 和 社区

的 进行 。SSB 与 RecA 蛋白 都 结合 在 伸展 的 人
DNA 上 ,表明 它们 在 单 链 同化 中 的 作用 是 结 小

合 DNA 以 便 形 成 一 个 与 细 丝 相连 的 结构 。

当 单 链 分 子 与 双 螺旋 作用 时 , 双 螺 旋 分 子 在 RecA Tryry

epsmamripeapmpjeaataaa
重组 连接 区 段 开 始 解 旋 , 异 源 双 链 开始 的 区 。。 链 交换 er

域 不 是 以 传统 的 双 螺 旋 形 式 存在 ,而 是 两 条
链 并 排 地 连 到 一 起 ,这 种 类 型 的 区 段 称 为 平 小
行 汇 接 (paranemic joint) , 平行 汇 接 是 不 稳
定 的 , 随 着 反应 的 进一步 深入 , 它 就 转变 成 双 第 二 次 链 交换 nn
螺旋 形式 。 这 种 反应 是 以 等 摩尔 消除 负 超 螺 Ar
旋 方式 进行 的 。 这 就 需要 一 种 酶 通过 瞬间 断 ]

下

裂 让 一 条 链 环绕 另 一 条 链 转动 来 完成 松 旋 和
紧 旋 .以 上 讨论 的 即 单 链 侵入 到 双 螺 旋 中 ,只

人
是 重组 反应 的 一 部 分 。 DNA 合成 填 满 ”人
在 链 交换 过 程 中 (图 6-14), 一 部 分 双 螺 缺 9 ee

旋 分 子 和 一 个 完整 的 双 螺旋 分 子 作 用 , 单 链
同化 开始 于 分 子 的 末端 ,人 侵 的 单 链 以 常规
的 方式 取代 了 双 螺 旋 上 的 同 源 片 段 。 当 反应

TY
进行 到 两 分 子 都 是 双 螺 旋 时 ,人 侵 的 单 链 从 分 文 证 和 rpmr
其 互补 链 上 分 离 下 来 ,互补 链 再 与 其 它 被 置 |
换 的 单 链 配对 。 在 这 个 阶段 中 DNA 分 子 形 小 要
成 重组 连接 体 ,在 体外 RecA 蛋白 催化 Helli-

day 结构 的 形成 ,表明 它 介 导 了 互补 链 的 苇 Ruvc ”mrrrrrrrrrerer

换 .但 是 ,要 完成 链 交 换 还 需要 另外 3 且 汪 轴 关 。 罗 和 do。 TREE
产物 参加 ,RuvA 识别 Holliday 结构 的 连接 aa
SRUYB 克 三 种 ATP 酶 ,可 以 为 分 支 迁 移 图 6-15 “修复 途 和

旨 机 天 加 束 分 支 迁移 内 前 推进 .RE com 二 三 二

别 Holliday 结构 的 核酸 内 切 酶 ) 切 割 Holl-
day 结构 的 连接 点 , 拆 分 重组 中 间 体 完成 链 的 交换 。 根 据 各 种 蛋白 质 的 催化 作用 ,可 以 说 明 大 上
肠 杆 菌 重组 过 程 的 各 个 阶段 (图 6-15) :利用 重组 从 另 一 条 双 链 取得 DNA 修复 双 链 的 缺口。 细
菌 中 的 反应 大 多 发 生 于 DNA 片段 与 整 条 染色 体 相 互 作用 中 ,并 且 DNA 损伤 促使 了 修复 反应
的 发 生 , 它 们 完全 不 同 于 减 数 分 裂 期 间 基因 组 之 间 的 重组 ,但 在 控制 DNA 方面 则 具有 相同 的
分 子 活性 。 RecA 的 同系 物 在 原核 生物 中 普遍 存在 ,在 真 核 生物 中 也 发 现 了 相关 和 蛋白质。 例如 ，|
酿酒 酵母 中 DMC 1 和 RAD 51 两 个 基因 编码 了 与 RecA 相 类 似 的 蛋白 质 .。 这 些 基 因 突 变 会 引 |
起 一 种 类 似 的 表现 型 , 即 双 链 片段 不 断 积累 , 即 无 法 形成 正常 的 联 会 丝 复合 体 。 说 明 DNA 双 上
螺旋 之 间 的 链 交换 与 联 会 丝 复合 体 的 形成 有 关 , 并且 增 加 了 染色 体 联 会 与 细菌 单 链 同 化 反应 |
有 关 的 可 能 性 。 但是, 真 核 生物 中 RecA 同系 物 并 不 形成 细 丝 , 因 此 其 反应 可 能 有 所 不 同 。

153

五 .基因 转换 导致 等 位 基因 间 重 组

异 源 双 链 DNA 参与 重组 是 等 位 基因 间 发 生 重 组 的 特征 ,等 位 基因 重组 也 推动 了 异 源 双
链 模型 的 发 展 。 几 乎 有 1/4 的 单 基 因 形 成 异 源 双 链 ,其 本 身 就 是 异 源 双 链 的 原因 ,发生 在 基因
座 内 的 个 别 断 裂 和 复合 产生 了 相互 配对 的 重组 染色 体 。 因 为 在 子宫 菌 (4scomzycetes) 中 ,每 一 次
减 数 分 裂 的 产物 包含 在 一 个 大 的 子 吉 里 ,所 以 ,用 子宫 菌 做 材料 来 研究 重组 的 机 制 较为 方便 。
用 减 数 分 有 裂 产生 的 四 倍 体 细胞 核 呈 线性 排列 , 减 数 分 裂 发 生 于 这 4 个 细胞 核 产 生 之 后 ,并 形成
8 个 线性 排列 的 单 倍 体 细胞 核 。 图 6-17 中 这 8 个 单 倍 体 细胞 核 分 别 代表 减 数 分 裂 产生 的 4 个
染色 体 上 8 条 链 的 遗传 特征 。 杂 合子 经 减 数 分 裂 后 每 个 等 位 基因 产生 4 个 拷贝 。 在 大 多 数 苞
子 中 都 可 见 到 这 种 情况 。 但 也 有 一 定 比例 的 异常 孢子 ,在 等 位 基因 不 同 区 域 , 异 源 双 链 的 形成
和 校正 是 孢子 比例 异常 的 原因 。 图 6-16 说 明 重 组 过 程 中 ,4 条 经 减 数 分 裂 的 染色 体 中 的 一 条
存 有 一 段 长 的 杂种 DNA ,可 能 是 由 于 双 链 断裂 而 引发 了 重组 。 假 设 两 个 等 位 基因 由 于 单 点 突
变 而 产生 差别 , 当 发 生 链 交换 产生 异 源 双 链 时 , 腊 源 双 链 的 两 条 链 会 在 突变 位 点 上 产生 错 配 。
实际 上 ,DNA 的 每 条 链 都 带 有 不 同 的 遗传 信息 , 如果 序列 上 未 发 生变 化 ,那么 ,两 条 链 就 会 在
保 真 复制 中 发 生 分 离 。 每 条 链 产 生 了 信息 不 变 的 双 链 ,这 种 现象 称 为 减 数 分 裂 后 分 离 (post-
meiotic segregation) ,因为 它 反映 了 减 数 分 裂 后 的 链 分 离 。 它 的 重要 性 在 于 直接 证 实 了 等 位 基
因 重 组 过 程 中 异 源 双 链 的 存在 .在 等 位 基因 重组 时 也 发 生 了 另 一 种 情况 :等 位 基因 的 比例 不 同
于 原来 的 4: 4 的 比例 ,这 种 现象 称 为 基因 转换 (gene conversion)。 它 说 明 一 条 染色 单 体 与 另
一 条 染色 单 体 信息 间 的 非 相 互 重 组 。DNA 分 子 的 链 交 换 导 致 了 基因 转换 ,而 序列 的 改变 又 在
分 子 水 平 上 提供 了 基因 转换 的 原因 之 一 。 其 过 程 为 : 山 图 6-7 所 示 的 双 链 断裂 模型 ,一 个 DNA

非 重 组 作用 。”EEEEE》 4 二 比

= 三 > rear 全 三 3 : 5 减 数 分 裂 后

TD 分 离
保留 一 个 杂种

杂种 转换
为 浅 色

= 三 二 | 本

图 6-16 “ 子 襄 菌 孢 子 形成 中 在 减 数 分 裂 期 确定 每 条 链 的 基因 组 成

1

分 子 作为 遗传 信息 的 供 体 通过 链 交换 反应 和 缺口 填补 反应 取代 了 互补 双 链 上 的 对 应 序列 ; 包 )
异 源 双 链 DNA 作为 交换 过 程 的 一 部 分 ,在 一 个 双 螺 旋 上 的 单 链 与 其 另 一 螺旋 互补 区 域 配 对
时 产生 的 。 当 修复 系统 识别 异 源 双 链 上 错 配 的 碱 基 对 时 ,切除 和 置换 其 中 一 条 链 使 其 恢复 互补
性 。 这 种 过 程 使 代表 一 个 等 位 基因 的 DNA 链 变 成 了 代表 另 一 个 等 位 基因 的 序列 。

基因 转换 并 不 取决 于 交换 ,但 与 交换 有 关 .。 大 部 分 异常 的 子 赛 在 等 位 基因 转换 位 点 两 侧 的
标记 之 间 出 现 遗 传 重组 。 因 为 如 果 异 常 比例 是 由 于 重组 引起 的 结果 (图 6-5 和 图 6-72， 那 么 无
论 重组 与 否 , 结 构 的 拆 分 频率 大 致 相等 (图 6-6) ,意味 着 真菌 染色 体 所 引发 的 交换 频率 大 约 相
当 于 远 葡 离 基因 重组 频率 的 两 倍 。 目 前 有 各 种 不 同 观点 企图 从 分 子 水 平 来 解释 重组 。 一 种 观
点 认为 基因 转换 的 两 个 方向 或 者 效应 相同 ,或 者 等 位 基因 向 一 个 方向 的 转换 优先 于 另 一 方向
的 专 一 性 效应 ; 另 一 种 观点 则 认为 重组 频率 梯度 从 热点 ( 双 链 断裂 开始 的 位 点 ) 两 侧 递 降 。 重 组
频率 梯度 形成 与 热点 处 缺口 的 扩大 并 转化 为 较 长 的 单 链 末端 有 直接 关系 。 基 因 转 换 的 某 些 信
息 , 得 自 许多 基因 敌 成 员 的 序列 研究 ,重组 产物 往往 会 发 生 分 离 从 而 不 适用 于 DNA 序列 水 平 ，
上 的 分 析 , 但 是 ,如 果 某 基因 簇 两 个 成 员 之 间 发 生 不 等 量 交换 ,这 两 个 非 等 位 基因 之 间 就 可 形 ，
成 异 源 双 链 。 基 因 转 换 有 效 地 将 其 中 一 个 非 等 位 基因 转换 成 另 一 个 基因 序列 。 在 同一 条 染色 一
体 上 如 果 存 在 一 个 以 上 的 基因 拷贝 , 便 可 用 足迹 法 (foot printing) 以 追踪 其 活动 。 如 蜡 源 双 链
的 形成 和 基因 转换 超过 一 个 基因 还 多 一 部 分 ,那么 这 部 分 序列 可 以 与 另 一 基因 完全 相同 或 紧
密 相关 。 而 剩余 部 分 则 呈现 较 大 的 趋 异 性 .。 有 效 的 序列 在 基因 转换 过 程 中 延伸 很 远 , 甚 至 达到 旺
数 千 个 碱 基 对 。

Re

六 ,重组 修复

(一 ) 交 换 中 产生 的 插入 和 缺失 差错

大 多 数 的 交换 过 程 是 非常 精确 的 , 它 依赖 于 重新 形成 氢 键 时 互补 单 链 区 的 正确 匹配 。 这 种
正确 排列 为 大 多 数 多 核 苷 酸 序列 的 独特 性 所 保证 ,因为 一 条 多 核 苷 酸 的 随机 链 若 多 于 10 一 12
个 核 苷 酸 时 , 它 几 乎 不 会 与 相似 长 度 的 其 它 片段 具有 相同 的 序列 .因此 ,只 要 单 链 片段 比较 长 ，
一 个 基因 的 片段 与 其 本 身 错误 部 分 或 与 不 同 基 因 的 错误 连接 是 极 不 可 能 的 。 但 是 在 极 少 数 的
情况 下 , 当 两 条 不 同 染 色 体 的 区 段 具 有 很 大 同 源 性 时 , 发 生 偶然 的 错 连 也 是 可 能 的 。 结 果 导 臻
一 大 段 核 苷 酸 的 插入 或 缺失 (insertion or deletion)( 图 6-17) .这 种 偶然 的 重 排 往往 由 RecA . 蛋
白 所 催化 ,可 能 还 有 其 它 未 知 的 酶 在 起 作用 。

二) 重组 修复 损伤 的 DNA 分 子

我 们 常 认 为 交换 是 产生 遗传 多 样 性 的 机 制 ,但 它 主要 的 功能 还 在 于 修复 (repair)DNA 的
损伤 。 这 是 在 研究 recA 细菌 和 酵母 重组 缺陷 型 突变 体 (recombination _ defective mutant) 中 新
发 现 的 屿 因为 它们 对 射线 和 一 些 化 学 药剂 非常 敏感 致使 DNA 受 损 .DNA 受 损 后 所 产生 的 缺
口 通过 重组 修复 形成 重组 中 间 体 , 单 链 缺 口 被 同 源 重组 的 DNA 填 满 后 就 完成 修复 。 但 修复 不
仅 是 否 切 去 中 间 体 以 交换 两 个 螺旋 的 侧 臂 , 重要 的 是 以 正确 的 序列 填补 缺口 “虽然 简单 缺口 可
由 DNA 聚合 酶 来 填 满 ,但 如 缺口 含有 胸腺 喀 啶 二 聚 体 , 它 不 能 进行 碱 基 配对 ,复制 时 必须 在
受伤 位 点 前 停止 ,在 后 面 再 重新 开始 。 伤 痕 上 的 遗传 信息 已 从 两 条 DNA 链 上 于 失 , 只 有 通过
同 源 双 链 重组 才能 得 到 恢复 .尽管 一 个 细菌 细胞 往往 有 其 染色 体 的 其 它 拷 由 ,但 新 复制 的 姊妹
DNA 分 子 是 正确 序列 最 容易 得 到 的 来 源 。

154

人
假 同 源 的 范围

图 6-18 RecA 蛋白 修复
断裂 双 链 DNA 的 模型
A. DNA 中 丢失 了 一 个 片段 , 造
成 双 链 断 裂 ;B. 解 链 之 后 ,被 核酸 酶
降解 ,在 各 断裂 端 暴露 出 单 链 DNA，
RecA 蛋白 与 之 结合 ,并 启动 与 同 源
DNA 链 交换 ;C. 形成 一 个 双重 组 连
接点 ;D. DNA 聚合 酶 填补 产生 的 缺
图 6-17 相同 基因 内 近似 同 源 序列 的 配对 导致 多 核 苷 酸 的 插 人 口 ;E', 两 个 重组 连接 点 均 已 拆 分 , 产
(1) 相 同 的 基因 在 不 同 部 分 中 的 近似 同 源 区 段 间 的 配对 形成 了 生 两 条 完整 双 链 。
异 源 双 链 ; (2) 两 个 后 代 分 子 各 含有 不 同 的 一 大 段 插入 的 核 苷 酸 。

上 述 机 制 的 引伸 可 以 说 明 RecA 蛋白 如 何 修复 最 基本 的 损伤 , 如 由 于 X 射线 照射 引起 的
双 链 断裂 。 核 酸 酶 使 每 个 断裂 形成 单 链 末端 , 单 链 末端 能 分 别人 侵 一 同 源 序列 以 形成 两 个 邻近
的 重组 连接 点 (图 6-18), 此 外 ,RecBC 酶 进入 每 一 个 自由 末端 以 提供 起 始 位 点 。 当 两 个 结合 点
切 开 时 ,分 离 了 亲 代 螺旋 ,所 产生 的 缺口 由 DNA 聚合 酶 填补 ,并 由 DNA 连接 酶 封闭 。

第 三 节 ”位 氮 专 一 性 重组

位 点 专 一 性 重组 需要 在 特定 位 点 上 发 生 断 裂 和 重 接 , 从 而 产生 精确 的 PNA 重 排 。 与 同 源
重组 不 同 ,位 点 专 一 性 重组 不 是 由 DNA 序列 的 同 源 性 (虽然 也 涉及 短 的 同 源 序列 ) 所 导 引 ,而
是 在 结合 序列 部 位 由 专 一 的 酶 来 催化 断裂 重 接 。 位 点 专 一 性 的 重组 是 由 能 使 相应 酶 出 现 的 调
节 过 程 所 引发 ,而 同 源 重组 则 是 由 能 与 RecA 蛋白 结合 的 DNA 序列 随机 断裂 引发 的 。

位 点 专 一 性 重组 最 早 是 在 》 叹 菌 体 的 遗传 学 研究 中 发 现 的 。ADNA 通过 重组 整合 到 大 肠
杆菌 染色 体 的 专 一 性 位 点 上 ,转变 成 为 原 喉 菌 体 DNA 的 非 活性 状态 。 一 般 位 点 专 一 性 重组 都
具有 人 整合 作用 的 两 个 基本 特征 :中 交换 是 相互 的 和 保存 原先 的 DNA ,是 典型 的 保守 性 重组
(conservative recombination) ;@) 它 发 生 在 吻 菌 体 和 细菌 DNA 短 同 源 序列 中 的 专 一 性 核 昔 酸

Js

下 ,在 高 等 生物 细胞 中 ,最 重要 的 例子 是 通过 一 组 前 体 序列 的 位 点 专 一 性 重 排 构建 多 种 多 样 的
专 一 抗体 基因 。
.位 点 专 一 性 重组 的 机 制

MDNA 在 不 同 生 活 型 之 间 的 转换 包括 两 种 状态 。 在 浴 菌 状态 时 ,ADNA 在 宿主 细菌 中 以 环
状 分 子 独立 存在 ,而 在 溶 源 状态 时 , 哈 菌 体 DNA 则 是 细菌 染色 体 的 整合 部 分 , 称 原 轻 菌 体 。 这
丙种 状态 的 转换 都 与 位 点 专 一 性 重组 有 关 。 要 进入 浴 源 状态 ,游离 的 IDNA 必须 整合 Ginte-
erate) 到 宿主 DNA 中 去 ,为 了 从 溶 源 状态 过 湾 到 溶菌 状态 , 原 噬菌体 DNA 必须 从 细菌 染色
体 上 切除 (excise) 下 来 。 整合 和 切除 过 程 是 在 细菌 DNA 和 鸣 菌 体 DNA 专 一 的 附着 位 点 (at-
tachment site 或 ad) 上 进行 的 。 细 菌 的 附着 位 点 称 atzB ,由 序列 BOB' 组 成 ,噬菌体 的 附着 位 点
称 atP, 由 序列 POP' 组 成 .图 6-19 说 明 在 这 些 位 点 处 发 生 的 重组 反应 * 其 中 9 序列 是 <#zB 和
attP 所 共有 的 ,所 以 , 称 为 核心 序列 (core se-
quence) 。 重组 就 发 生 在 这 段 序列 上 。 侧 要 区
B,B' 以 及 P,P' 称 为 臂 (arm) ,其 序列 则 各 不
相同 。 由 于 鸣 菌 体 DNA 是 环 状 的 ,在 重组 过
程 中 , 它 以 线性 形式 插入 细菌 染色 体 中 , 此 时
原 鸣 菌 体 被 重组 产生 的 两 个 新 zt 位 点 所 固 ”细菌 DNA 808:
定 。 所 以 ,形成 这 两 个 新 的 附着 位 点 at

att8
(BOP') 和 axR(POB') 是 很 重要 的 ,这 样 可 | 几 和 IF 1 人
以 使 整合 和 切除 反应 不 在 一 对 相同 的 反应 序 YV，
列 之 间 发 生 。 整 合 过 程 要 求 在 atB 和 at 红

之 间 进 行 识别 ,而 切除 过 程 则 在 atzZ 和 at 下
之 间 识 别 .因此 ,位 点 专 一 性 重组 反应 的 定向
特征 取决 于 重组 位 点 的 识别 。 尽 管 重 组 反应

是 可 逆 的 ,但 反应 导向 则 由 不 同 条 件 决 定 , 这

是 鸣 菌 体 生活 过 程 的 重要 特征 ,因为 它 保 证 人
了 整合 反应 不 会 立即 被 切除 反应 所 逆转 。 反 Y'
之 亦 然 当 二

一) 整合 酶 attL 原 噬菌体 attR
ft 3 本 整合 栈 。 中 6-19 ,通过 在 wiiP 和 atB 间 的 相互 重组 ，
0 插入 人 汶 。。 环 状 的 噬菌体 DNA 转换 为 整合 的 原 哈 菌 体 ，
杆菌 染色 体 中 , 通过 两 条 DNA 的 专 二 位 点 国生 向 条 通过 ur 和 uiR 间 相 己 二 汪汪 生
上 的 重组 合并 成 一 个 环 状 分 子 (图 6-20)。 在
吻 菌 体 侵 染 早 期 产生 较 多 的 整合 酶 ,所 以 ,整合 作用 几乎 发 生 在 每 个 被 侵 染 的 细胞 中 。 整 合 反 ，
应 还 需要 由 大 肠 杆菌 编码 的 整合 宿主 因子 IHF integration host factor) 的 共同 作用 ,IHF 是 由
两 个 不 同 亚 基 组 成 的 蛋白 质 , 分 子 量 为 20kD ,分 别 由 /zz4 和 AirzD 基因 编码 。jmz 基因 的 突
变 会 阻止 \ 位 点 专 一 性 重组 的 发 生 ,同时 hznz 基因 突变 也 会 抑制 忆 m 基因 突变 的 发 生 ,这 表明
IHF 和 Int 的 相互 作用 。

156

细菌 附着 位 点

6-20 通过 位 点 专 一 性 重组 ,， 噬菌体 DNA 整合 到 大 肠 杆菌 染色 体 中

(二 ) 整 合 反应

离 体 研 究 链 交换 的 进程 可 利用 自杀 底 物 (suicide substrate) 的 方法 去 中 止 中 间 体 的 形成 。
此 时 在 核心 序列 上 造成 切口 ,干扰 了 重组 的 进行 ,有 利于 识别 重组 反应 已 经 开始 但 未 结束 的
DNA 分 子 。 中 间 体 结构 表明 了 链 交 换 发 生 的 顺序 。Int 蛋白 能 切断 DNA ,并 使 它 重 新 连接 , 进
而 使 Holliday 结构 拆 分 .图 6-21 模型 说 明 atP 和 atB 部 位 进行 的 交叉 断裂 ,互补 单 链 末端 进
行 交 叉 杂 交 。ADNA 交换 点 之 间 的 距离 为 7 bp, 反 应 产生 出 3 -磷酸 末 端 和 5' -羟基 末端 ,反应
说 明了 所 产生 的 重 释 单 链 末端 进行 了 退火 。 每 个 螺旋 的 相应 链 在 同一 位 置 上 切割 ,游离 的 3'-
末端 在 双 螺 旋 之 间 进 行 交 换 ,7 bp 的 序列 沿 同 源 区 分 支 迁 移 ,然后 在 对 应 的 双 链 上 切割 并 拆
分 。 离 体 反应 需要 在 attP 上 有 超 螺旋 ,而 azB 则 不 需要 ,Int 蛋白 具有 松弛 负 超 螺旋 的 能 力 。

.体外 重组 反应 需要 大 量 的 Int 和 IHF 蛋白 ,它们 共同 结合 在 atzP 上 ,由 于 超 螺旋 加 强 了 它们

对 结合 部 位 的 亲和力 ,这 种 高 剂量 的 蛋白 并 不 引起 酶 促 作 用 ,而 是 为 了 维持 单 链 重组 所 要 求 的
结构 。

噬菌体 和 细菌 DNA, 组 合

噬菌体 DNA

机 NA

“CGAAAAAATATGATT

交错 切割 导致 交叉 配对

EECTTL 人 人文 训 和
CGGAANAANAATATEATTY 二

细菌 DNA

封闭 重组 体 连 接点 ,产生 整合 的 原 噬菌体 DNA

E ecTTTTTTATACTAA P-GCTTT TTTATACTA 太 pb
人 央 三 入 AT 页 T GIAT CGAAAAAATATGATT

图 6-21 在 atP 和 atB 共同 的 核心 序列 上 交错 切割 ,通过 交叉 复合 产生 相互 复 组 体 连接 点
1

(三 )att 位 点 的 结构 分 析
整合 酶 的 结合 位 点 ,是 通过 测定 其 真实 二
交换 位 点 需要 多 少 个 毗连 的 DNA 碱 基 , 才 -RCRRANRNRNCRCNNRANANRANAAAA
能 满足 整合 酶 的 结合 来 确定 的 。 定 界 试验 说 ”ee 必
明 attP 远 远 大 于 atiB,atP 需要 240bp 才 二
能 行使 其 功能 ,而 atB 只 需要 从 一 11 一 十 11
的 23bp 的 片段 。 其 中 在 核心 区 两 侧 只 有
4bp,atP 和 atB 的 bp 数 不 同 ,暗示 两 者 在
重组 中 起 的 作用 不 同 。 与 位 点 专 一 性 重组 有
关 的 蛋白 质 结合 在 翌 部 位 的 特定 位 点 上 ， 人
Int 蛋白 有 两 种 不 同 的 结合 模式 ,一 种 是 结合 人
在 核心 序列 的 反 向 位 点 上 ,这 些 位 点 具有 共
有 序列 (consensus sequence), 以便 在 每 条 链 6-22 Int 和 1IHF 结 从 看 电 十 床 辣 生 二 站
的 适当 位 置 上 进行 切割 (图 6-22); 另 一 种 是 mnt 在 核心 区 的 识别 序列 包括 切割 位 点
结合 在 et 臂 上 , 这 些 位 点 没有 共有 序列 . Int
蛋白 的 不 同 结构 域 识别 不 同类 型 的 序列 , 含 N- 末 端的 结构 域 识 别 att 臂 , 含 C- 末 端的 结构 域
则 识别 attP 和 atB 核心 序列 。 这 两 个 结构 可 能 同时 结合 于 DNA ,促使 臂 位 点 靠近 核心 区 。
(四 ) 整 合体 及 其 作用
当 Int 和 JIHF 蛋白 结合 到 attP 位 点 时 形成 的 复合 物 称 为 整合 体 (intasome) 。 在 整合 体 中
所 有 结合 部 位 可 以 共同 引 向 一 守 聚 蛋白 的 表面 ,形成 类 似 核 小 体 的 结构 ,所 以 整合 体 的 形成 需 。
要 attP 位 点 的 超 螺旋 。atB 的 结合 部 位 是 核心 区 的 两 个 Int 位 点 ,但 Int 并 不 是 在 游离 的
DNA 形成 时 直接 结合 在 attB 上 ,整合 体 就 是 捕获 atiB 的 中 间 体 。Int 蛋白 分 子 可 能 作为 整合
体 的 一 部 分 结合 到 attB 的 核心 位 点 上 ,说 明 axtP 和 axB 的 最 初 识别 不 是 直接 取决 于 DNA
的 同 源 性 ,而 是 由 Int 蛋白 识别 两 个 at 序列 的 能 力 来 决定 的 ,然后 两 个 wtz 位 点 被 结合 到 整合
体 结构 预定 的 定向 部 位 上 , 当 需 要 链 交 换 反 应 时 , 同 源 序列 在 此 阶段 才 显得 重要 。
(五 ) 切 除 反应
当 诱 发 原 噬 菌 体 生长 时 ,整合 作用 (integration) 发 生 逆 转 , 这 个 过 程 称 为 切除 。Xis 蛋白 在
控制 反应 方向 上 起 重要 作用 .。 切除 需要 Xis 蛋白 。 它 抑制 整合 作用 ,Xis 蛋白 结合 在 otzP 区 相互
。 靠近 的 位 点 上 ,其 保护 区 延伸 到 30 一 40 bp ,Int,Xis 和 IHEF 连 在 一 起 覆盖 了 全 部 azP,Xis 蛋白 ，
的 连接 改变 了 DNA 的 组 织 结构 , 从 而 成 为 整合 反应 的 惰性 底 物 。 整 合 和 切除 的 不 对 称 性 ,可 通
过 加 大 Xis 之 后 Iat 与 atR 形成 类 似 复合 物 来 说 明 ,这 个 复合 物 与 Int 在 attz 形成 凝聚 复合 物
相 匹 配 。 可 见 反 向 重组 反应 必须 有 Int 和 Xis 复合 体 紧 密 与 att 位 点 紧密 结合 才能 实现 。
位 点 专 一 性 重组 的 高 度 复杂 性 可 能 是 由 于 调节 反应 的 需求 引起 的 ,所 以 , 当 鸣 菌 体 进 入 洲 量
源 状态 时 优先 发 生 整合 反应 。 而 当 原 史 菌 体 进入 裂解 周期 时 则 切除 反应 占 优 势 , 通 过 控制 fnt
和 Xis 的 存量 发 生 适 当 的 反应 。

二 、 位 点 专 一 性 重组 调节 基因 表达

在 一 个 DNA 分 子 上 两 个 位 点 之 间 的 重组 会 得 到 两 种 结果 ,这 取决 于 作用 位 点 的 取向 。 重

组 可 以 除去 插 和 人 片段 或 使 片段 倒转 (图 6-23)。 细 胞 有 时 利用 重组 的 倒转 以 在 两 个 交替 排列 的
158

DNA 之 间 做 出 选择 ,从 而 使 两 种 或 两 组 不 同 的 和 蛋

白质 得 到 表达 。 这 种 机 制 常 常 调节 生物 外 表 的 恒 取向 相反 的 重组 位 点
白质 。 例 如 , 喉 菌 体 Mx( 增 变 基因 ) 的 尾部 蛋白 是

直 倒 转 的 gz 片段 调节 的 ,还 有 沙门 氏 杆 菌
(Salzzozelia ) 的 鞭毛 抗原 亦 与 此 类 似 。

取向 相同 的 位 点

| |
1. 锥 虫 (trypanosome) 表面 蛋白 的 改变 则 是 通
迁 DNA 连续 重 排 达到 的 ”重组 或 许 用 来 控制 表 而 ws ，
蛋白 , 因为 可 以 使 转换 完全 以 使 有 机 体 只 制造 出 一

种 表面 抗原 , 这 样 就 避免 了 抗原 对 抗体 的 轻微 反应 :

2. 沙门 氏 杆 菌 的 相 变 (phase variation ) 导致 一 -

两 种 鞭毛 蛋白 媚 1 和 妃 2 的 交替 表达 ”在 特定 时

间 内 细胞 只 表 大 其 中 的 一 种 ,两 种 蛋白 质 不 能 同 本 oo

时 表达 。 妃 2 基因 的 启动 子 位 于 相 邻 的 ,长 970 bp
可 倒转 的 DNA 片段 上 ,片段 的 边界 为 两 个 方向

相反 的 重复 序列 ,它们 的 长 度 各 为 14 bp( 图 6- 图 6-23 在 一 个 DNA 分 子 上 两 个 位 点 之 间

24)。 短 同 源 序列 可 以 像 整合 时 那样 作为 同 源 序

的 重组 ,使 插入 序列 倒转 或 缺失

列 的 核心 指导 重组 。 因 为 同 源 重 复 序列 的 指向 相反 ,因此 ,片段 在 每 次 交换 中 就 倒转 。 在 一 种
情况 中 ,局 动 子 位 于 五 2 的 一 边 , 妃 2 就 和 相 邻 的 、 编 码 鞠 毛 蛋 白 H1 阻 遏 物 的 基因 同时 转录 ，
结果 瓦 2 得 到 转录 而 已 1 被 阻 遏 。 如 果 片 段 倒转 , 瑟 2 因 没 有 启动 子 而 不 再 形成 ,同时 五 1 的 阻
遏 物 也 不 能 形成 ,从 而 产生 H1 蛋白 。 倒 转 序列 本 身 编 码 催化 倒转 反应 的 Hin 酶 , 当 细 胞 生长

受到 妨碍 时 ,Hin 酶 的 活性 或 表达 或 增加 , 因而 就 形成 另 一 种 新 的 表面 蛋白 。

IRL( 左 反 向 重复 ) IRR( 右 反 向 重复 )
Ca) H2 接 上 , 孔 ! 断 开
mRNA mRNA
一 一 一 一 一 一 一 一 一 全
ps 胃 过 物 不 能 形成
可 倒转 片 股
(b) 互 1 接 上 , 互 2 断 开 -

图 6-24 倒转 的 DNA 片段 控制 沙门 氏 菌 鞠 毛 基 因 丈 1 和 已 2 的 交 蔡 表达

第 四 节 转 座 重组

基因 组 可 通过 获得 新 序列 而 进化 ,也 可 通过 现存 序列 的 重 排 实 现 这 二 目的 .新 序列 可 通过
一 定 的 载体 导入 基因 组 .细菌 的 质粒 通过 接合 作用 转移 遗传 信息 ,而 噬菌体 是 靠 侵 染 来 传递 信
息 ;质粒 和 哈 菌 体 都 可 偶然 地 随 着 它们 自身 的 复制 子 而 转移 进 寄 主 的 基因 组 ;DNA 的 直接 转

159

移 可 以 借助 转化 作用 在 细菌 间 发 生 .在 真 核 生 物 中 ,一 些 病毒 (逆转 录 病 毒 ) 可 以 在 一 个 侵 染 循
环 中 转移 遗传 信息 。 另 外 , 重 排 也 可 以 产生 新 的 序列 ,如 果 通 过 转 座 作用 把 现存 序列 放 到 新 调
节 位 置 而 改变 现存 序列 的 功能 。

无 论 原 核 生 物 还 是 真 核 生 物 , 转 座 子 或 转 座 元 件 (transposon or transposable element ) 的
移动 提供 了 基因 组 变化 的 潜在 可 能 。 转 座 子 就 是 基因 组 上 不 必 借 助 于 同 源 序列 就 可 移动 的
DNA 片段 ,它们 可 以 直接 从 基因 组 内 的 一 个 位 点 移 到 另 一 个 位 点 。 和 大 部 分 其 它 的 途径 不 同 ，
转 座 作 用 与 供 体 和 受 体 部 位 之 间 的 序列 没有 任何 关系 。 转 座 子 有 的 是 编码 蛋白 质 的 序列 ,这 些
蛋白 质 能 直接 操纵 DNA; 有 的 转 座 子 则 是 和 逆转 录 病 毒 有 关 , 逆转 录 病 毒 的 移动 是 靠 它们 的 “
RNA 转录 产物 产生 的 DNA 拷贝 ,然后 ,DNA 拷贝 整合 到 基因 组 的 新 位 点 上 。

在 原核 生物 和 真 核 生物 中 都 发 现 经 由 DNA 移动 的 转 座 子 。 每 个 细菌 转 座 子 携带 有 编码
其 自身 转 座 作用 所 需 的 酶 的 基因 ,可 能 还 需要 细菌 细胞 的 一 些 辅助 因子 (如 DNA 聚合 酶 和 族
转 酶 ) 的 协助 。 真 核 生 物 中 也 存在 类 似 的 系统 ,目前 对 参与 转 座 作用 的 酶 的 功能 还 不 甚 清楚 。

一 、` 转 座 子 的 类 型 和 结构 特征

在 原核 生物 中 已 发 现 两 种 类 型 的 转 座 子 ,简单 转 座 子 (simple transposon) 和 复合 转 座 子 ，
(composite transposon ) ,前 者 称 为 插 和 人 序列 (insertion sequence,IS) 。 所 有 转 座 子 都 有 两 个 结
构 特 征 :@ 四 两 端 有 20 一 40 bp 的 反 向 重复 序列 (inverted repetitive sequence,IR) ;GO 具有 编码
转 座 酶 (transposase) 的 基因 ,这 种 酶 催化 转 座 子 插入 新 的 位 置 .复合 转 座 子 除了 转 座 过 程 必需 上
的 基因 外 还 含有 一 到 几 个 基因 ,它们 常 有 可 鉴定 的 遗传 标记 如 抗菌 素 抗 性 或 毒素 生成 等 。

(一 ) 揪 入 序列

这 类 转 座 子 最 初 是 在 细菌 操纵 子 中 以 自发 插 和 人 形式 鉴定 出 来 的 。 插入 序列 可 以 在 不 同 的
复制 子 间 转 移 位 置 .以 非 正常 重组 的 方式 从 一 个 位 点 插入 到 另 一 个 位 点 ,从 而 对 该 位 点 的 到 因
的 结构 与 表达 产生 多 种 遗传 效应 ,也 常 对 捅 人 位 点 后 面 的 基因 功能 表达 产生 极 性 效应 。 插 人 序

列 是 最 简单 的 转 座 子 ,每 一 类 型 都 以 字 头 JS 加 鉴定 类 型 的 编号 来 表示 ,IS 元 件 是 细菌 染色 体 是 硬

和 质粒 的 正常 组 分 ,是 一 个 自主 的 单位 ,每 种 IS 元 件 均 编码 自身 转 座 所 需 的 蛋白 质 。 每 种 IS
元 件 具有 不 同 的 序列 ,但 有 共同 的 组 织 形 式 。 大 部 分 转 座 子 插入 到 宿主 DNA 的 不 同位 点 ,但
一 些 转 座 子 不 同 程度 地 优先 地 插 和 人 到 特殊 的 热点 上 。 常 见 的 IS 元 件 的 参数 见 表 6-1。

表 6-1 某 些 插入 序列 的 参数

元 件 长 度 (bp) 末端 反 向 重复 (bp) ” 葛 位 点 反 向 重复 (bp) 靶 位 点 选择
IS1 768 23 9 随意

IS2 1327 41 5 热点

IS4 1] 428 18 11 或 12 AAAN2zoTTT
IS5 1 195 16 4 热点 “

IS10R 1 329 22 9 NGCTNAGCN
IS50R 1531 9 9 热点

IS903 1 057 18 9 未 知

图 6-25 是 插入 序列 IS 1 的 结构 ,IS 1 含有 转 座 酶 基因 ,负责 IS 1 的 移动 ,该 基因 的 两 端 为
24 bp 的 反 向 重复 序列 。
一) 复合 转 座 子
13 1 本 身 没有 任何 表 型 效应 .而 复合 转 座 子 除了 与 它 的 转 座 作 用 (transposition) 有 关 的 基

160

因 外 ,还 含有 其 它 基因 ,如 带 有 抗 药 基因 ,这 就 赋予 窒 加
主 细菌 以 一 定 的 表 型 ,使 宿主 细菌 对 某 些 药物 呈现 抗

性 。 在 抗 药性 质粒 上 最 早 发 现 带 有 抗 药性 基因 的 转 座 ，，
全 天 汪汪
是 由 两 个 重复 序列 赤 着 携带 抗 药物 标记 的 中 央 区 段 。 图 6-25 插入 序列 1S 1 的 结构

( 含 一 个 或 多 个 结构 基因 ) 组 成 的 ,通常 以 Tn 和 后 面 加 数码 来 命名 。 有 的 转 座 子 的 重复 顺序 就
是 1S。 复 合 转 座 子 也 和 1S 一 样 ,能 从 一 个 位 点 转 座 到 另 一 个 位 点 ,或 从 一 个 复制 子 转 座 到 另 一

个 复制 子 。 复 合 转 座 子 的 特性 总 结 于 表 6-2 中 。

表 6-2 ” 几 种 复合 转 座 子 的 特征

元 件 长 度 C(bp) 遗传 标记 末端 组 件 组 件 取向 组 件 间 关 系 组 件 功 能
Tn903 3 100 kanR IS903 反 疝 完全 相同 两 者 都 有 功能
Tn9 2 500 canR IS1 正 向 可 能 相同 可 能 有 功能
Tnl0 9 300 tetR IS10RV/IS101 反 疝 2.5% 差 异 有 功能 /无 功能
Tn5 5 700 kanR IS50RVIS501 反 疝 1 bp 变化 有 功能 /无 功能

Tn1681 在 某 些 情况 下 ,复合 转 座 子 的 序列 组
，” 件 Cmodule) 是 完全 相同 的 ,例如 ,Tn903
(JIS903 的 反 向 序列 ) 和 Tn9(IS1 的 正 向 序
列 )。 在 另 一 些 情 况 下 ,复合 转 座 子 的 组 件
6-26 ” 复 人 台 转 座 子 结构 示意 图 是 密切 相关 的 ,但 不 完全 相同 ,如 Tnl0 和

In5.。 一 个 功能 性 的 IS 组 件 可 以 自身 转 座 , 也 可 使 整个 复合 转 座 子 进行 转 座 。 当 一 个 复合 转 座

子 的 组 件 完 全 相同 时 , 如 可 在 Tn903 或 Tn9 中 ,任何 一 个 组 件 都 可 以 引起 转 座 子 的 移动 。 当 组
件 不 同时 ,如 在 Tnl10 或 Tn5 中 , 转 座 必须 严格 地 完全 依赖 于 其 中 一 个 组 件 。

复合 转 座 子 都 比 IS 大 , 约 4500bp 一 20 000bp。 通 过 将 带 有 Tn 的 DNA 先行 变性 ,再 进
行 链 内 复 性 ,在 电镜 下 就 可 以 看 到 一 个 有 双 链 的 茎 和 单 链 的 环 的 DNA 分 子 。 研 究 证 明 单 环 是
Ta 的 结构 基因 部 分 , 双 链 荃 是 两 端的 一 对 重复 序列 。 这 些 重复 序列 多 数 是 反 向 重复 ,因此 ,在
复 性 时 形成 双 链 的 茎 .用 这 个 方法 已 测 知 一 些 转 座 子 中 的 结构 基因 及 其 两 端 重复 序列 的 长 度 。
复合 转 座 子 的 结构 如 图 6-26 所 示 。 图 中 两 个 IS1 元 件 构成 的 转 座 子 Tnl 681 ,两 个 IS1 组 件 之

_ 间 是 另 一 个 基因 (大 肠 杆 菌 热 稳定 毒素 7 了 基因 ) 。

二 、 转 座 子 的 转 座机 制

转 座 子 都 具有 编码 与 转 座 作用 有 关 的 酶 一 一 转 座 酶 的 基因 ,而 末端 大 多 数 都 是 反 向 重复
序列 。 转 座 酶 既 识 别 转 座 子 的 两 未 端 ,也 能 与 靶 位 点 序列 结合 。 转 座 作用 的 机 制 是 转 座 子 插 到
新 的 位 点 上 (图 6-27) 产 生 交错 切口 ,所 形成 的 突出 单 链 末端 与 转 座 子 两 端的 反 向 重复 序列 相
连 ,然后 由 DNA 聚合 酶 填补 缺口 ,DNA 连接 酶 封闭 切口 ,交错 末端 的 产生 与 填补 说 明了 竟
DNA 在 插入 位 点 存在 正 向 重复 ,两 条 链 上 切口 之 间 的 交错 取决 于 正 向 重复 的 长 度 , 国 此 ,每 个
转 座 子 所 特有 的 靶 重 复 序 列 ,反映 了 切割 靶 DNA 的 酶 的 几何 形状 。

在 常见 各 种 转 座 方 式 中 ,尽管 交错 未 端的 利用 是 共同 的 ,但 转 座 作 用 的 机 制 仍 可 分 为 3 种
不 同类 型 , 即 复制 型 、 非 复制 型 和 保守 型 。

在 靶 位 点 上

形成 交错 切口
|
硕 TTTTTT 转 座 子 连接 到

单 链 末 端 上

7
靶 DNA 的 正 向 重复

图 6-27” 转 座 子 插 人 到 新 位 点 的 反应 过 程

一) 复制 型 转 座
” 在 复制 型 转 座 (replicative transposition ) 中 , 发 生 转 座 的 实体 是 原先 元 件 的 拷贝 , 即 转 座 子

作为 可 移动 的 元 件 被 复制 ,一 个 拷贝 保留 在 供 体 的 原来 部 位 不 变 ; 另 一 个 拷贝 则 插 人 到 受 体 的 位
点 上 ， 供 体 和 受 体 都 有 一 个 转 座 子 的 拷贝 ,所 以 , 转 座 过 程 中 扩 增 了 转 座 子 的 拷贝 数 。 复 制 型 转 座
需要 两 种 酶 : 转 座 酶 作用 于 原来 转 座 子 的 两 个 未 端 , 解 离 酶 (resolvase) 作 用 于 复制 后 的 拷贝 上 。

二) 非 复制 型 转 座 1 量

在 非 复制 型 转 座 Cnonreplicative transposition ) 中 , 转 座 子 作为 一 个 物理 实体 直接 从 供 体 ，
”的 一 个 位 点 移动 到 受 体 的 新 位 点 处 ,这 就 会 在 供 体位 点 上 留 下 一 个 裂口 ,其 结果 是 使 供 体 基 因 是
组 受到 轻微 的 损伤 (在 具有 多 拷贝 的 细菌 中 可 以 忍受 ) 或 致死 ,还 有 一 种 可 能 ,就 是 宿主 修复 系
统 能 识别 双 链 断裂 处 ,并 加 以 修复 。 非 复制 型 转 座 只 需要 转 座 酶 。

(三 ) 保 守 型 转 座

保守 型 转 座 \conservative transposition) 是 另 一 种 非 复制 型 转 座 。 转 座 过 程 中 ， 转 座 子 从
供 体 位 点 上 切除 ,通过 一 系列 反应 插 大 到 部 位 点 上 ,其 中 每 个 核 苷 酸 键 都 保留 下 来 。 这 种 保守
型 转 座 反应 过 程 正 好 与 4 整合 机 制 相 似 , 而 且 这 种 转 座 子 的 转 座 酶 与 4 整合 酶 家 族 有 关 . 利用
这 种 机 制 不 但 可 以 介 导 转 座 子 自身 的 转移 ,而 且 也 可 以 介 导 供 体 DNA 从 一 个 细菌 转移 到 另
一 个 细菌 中 。 所 以 ,把 保守 型 转 座 的 元 件 称 作 附加 体 (episome) 更 为 合适 。

实际 上 ,有 些 转 座 子 仅 使 用 一 条 途径 进行 转 座 ; 而 有 的 则 可 能 使 用 两 种 途径 。IS1 元 件 和
162

IS903 元 件 就 是 使 用 非 复制 型 和 复制 型 途径 . Mu 叹 菌 体 借 助 子 两 种 并 通过 一 个 普遍 存在 的 中
间 体 进行 转 座 。

三 、 转 座 子 的 转 座 模式

一) 复制 型 转 座 模式

复制 型 转 座 经 由 两 个 阶段 。 首 先 ,含有 转 座 子 的 复制 子 与 没有 转 座 子 的 复制 子 , 通 过 复制
子 融 合 产生 一 种 称 为 共 合体 (cointegrate) 的 结构 。 共 合体 含有 转 座 子 的 两 个 拷贝 ,每 个 转 座 子
都 位 于 原来 两 个 复制 子 之 间 的 连接 处 ,并 且 取 向 相同 。 然 后 , 转 座 子 两 个 拷贝 之 间 的 同 源 重 组
可 以 产生 原先 供 体 复制 子 , 并 释放 出 靶 复 制 子 . 靶 复制 子 获 得 的 转 座 子 两 侧 带 有 宿主 靶 序列 的
短 重复 序列 .这 一 反应 称 为 拆 分 ,由 解 离 酶 介 导 的 拆 分 反应 释放 出 两 个 各 自 带 有 一 个 转 座 子 拷

一
0D ID 2

单 链 切割 产生 交错

转 座 子 上 切口 末端
连接 到 攻 位 点 切口
末端

从 游离 3 中

单个 共 合 体 分 子
具有 两 个 拷贝 的
转 座 子

图 6-28 复制 型 转 座 形成 的 共 合 体

163

贝 的 独立 复制 子 。 图 6-28 说 明 Mnu 转 座 作用 中 共 合 体 结构 的 形成 。 这 一 过 程 是 由 和 条 单 链 断

裂 开 始 的 。 供 体 分 子 的 转 座 子 被 转 座 酶 切 开 ,该 酶 具有 识别 末端 位 点 的 专 一 性 ,并 在 针 DNA

分 子 上 产生 5 bp 的 交错 切口 。 供 体 链 在 切 口 处 与 靶 链 连接 , 即 转 座 子 序列 的 每 一 未 端 都 与 在

靶 位 点 产生 的 一 条 突出 单 链 相连 ,在 连接 点 上 形成 一 个 交叉 形 结 构 交 又 形 结 榴 的 形成 是 由 转

座 酶 完成 的 。 这 种 结构 决定 了 转 座 方式 。 所 以 ,复制 型 转 座 是 通过 在 供 体位 点 和 部 位 点 土产 生

转 座 子 的 拷贝 ,其 产物 是 共 合
(二 ) 非 复制 型 转 座 模 式 立 天
交叉 结构 也 可 用 于 非 复制 型 转 座 , 这 种

机 制 的 基本 原理 是 通过 断裂 和 复合 反应 来 重

新 构建 靶 位 点 ,而 供 体 仍 保持 断裂 ,因而 不 能

形成 共 合 体 。 图 6-29 说 明 Mu 噬菌体 发 生 的

非 复制 型 转 座 的 切割 反应 。 非 复制 型 转 座 是 外 拆 分

通过 切割 释放 出 一 个 交叉 结构 时 产生 的 。 由

交错 切割 所 产生 的 单 链 区 通过 修复 系统 填
补 .该 反应 形成 的 产物 是 靶 复制 子 , 转 座 子 已 攻
站 插入 到 原先 单 链 切割 处 所 产生 的 重复 序列

>
See -SeenG Lars

之 间 。 供 体 复 制 子 上 产生 双 链 断裂 ,断裂 处 就 供 体 复制 了

是 转 座 子 最 初 的 位 置 . 总 之 ,只 要 在 靶 DNA

上 形成 切口 ,在 转 座 子 任何 一 端 发 生 双 链 断 6-29 ” 非 复制 型 转 座 模式

烈 , 由 于 双 链 断 裂 阻止 复制 的 完成 ,就 亿 使 反应 以 非 复制 型 转 座 的 形式 进行 下 去 。
(三 )TnA 及 其 转 座 模 式

TnA 转 座 子 家 族 是 复合 转 座 子 ,含有 较 长 的 核 苷 酸 片 段 ( 约 5 000 bp) ,是 复制 型 转 座 。 它
们 携带 负责 自身 转 座 的 转 座 酶 基因 和 诸如 抗 药性 基因 等 其 它 基因 。TnA 家 族 转 座 子 的 两 端 没
有 1S 或 类 IS 的 组 件 , 而 具有 长 度 为 38 bp 的 反 向 重复 末端 特征 ;在 靶 位 点 处 产生 一 个 5bp 的 间 |
正 向 重复 序列 。TnA 介 导 的 转 座 作 用 的 两 个 阶段 分 别 是 在 由 zzz4 基因 编码 的 转 座 酶 和 由
izpR 基因 编码 的 解 离 酶 的 作用 下 完成 的 , 解 离 酶 需要 一 个 特异 的 内 部 位 点 ,这 是 TaA 家 族 独
有 的 特征 。 转 座 酶 识别 位 于 转 座 元 件 未 端 38 bp 反 回 重复 中 的 25 bp 序列 ,并 在 靶 DNA 5 bp
上 进行 交错 切割 产生 切口 ,这 样 以 便 转 座 子 的 插入 。 |
解 离 酶 具有 双重 功能 :这 种 蛋白 既 能 作为 基因 表达 的 阻 巡 物 , 又 提供 解 离 功能 。zzzpR 基因 ”
突变 增加 了 转 座 频率 。 原 因 在 于 TnpR 蛋白 阻 遇 了 top4 及 其 自身 基因 (tzzpR) 的 转录 。 因 此 ，
TnpR 的 失 活 就 增加 了 TnpA 蛋白 的 合成 ,从 而 导致 了 转 座 频 率 的 增加 ,这 说 明 转 座 酶 的 含量 ，
是 转 座 作 用 的 限制 因子 。 二
mp 甩 和 tnpR 基因 的 表达 是 一 个 富 含 A 一 下 的 顺 反 子 间 (intercistronic 控制 区 段 向 外 散发 时
的 ,这 可 以 从 图 6-30 的 Tn3 图 谱 中 看 出 。 其 两 端 具有 反 向 末端 重复 ,一 个 内 部 res 位 点 及 3 个 已
知 基因 。 转 座 过 程 必须 经 过 共 合 体 这 一 中 间 体 ; 在 复制 型 转 座 过 程 中 , 共 合体 原则 上 能 被 转 座 子 1
两 个 拷贝 中 的 任何 一 个 相应 的 配对 点 之 间 的 同 源 重 组 而 拆 分 ,这 种 共 合体 结构 中 的 正 向 重复 序 量 :
列 间 ( 即 转 座 子 ) 的 重组 需要 解 离 酶 TapR 的 参与 .Tn3 的 拆 分 反应 仅 发 生 在 特定 位 点 上 。 这 个 拆
分 位 点 被 称 为 res (iesolvation site) ,位 于 夸 24 和 2 芭 R 的 中 间 。 如 果 zes 缺失 ， 会 引起 共 合 体 的 积

累 ; 在 无 res 情况 下 , 拆 分 反应 可 以 为 RecA 蛋白 介 导 的 一 般 重 组 作用 代替 ,但 效率 很 低 。
164

了 - 元

ER

TnpR 解 离 酶 结合 的 部 位 已 由 DNA
蛋白 复合 物 足 迹 法 确定 ,其 位 置 见 图 6-30
下 部 .结合 发 生 在 3 个 独立 的 部 位 ,每 个 部
位 长 30 一 40 bp。 3 个 结合 部 位 具有 序列 的
同 源 性 , 这 种 同 源 性 说 明了 它们 都 有 一 个
双重 对 称 的 共有 序列 。 部 位 I 包括 遗传 上
定义 为 res 位 点 的 区 段 。 它 的 缺失 ,将 使 拆
分 反应 无 法 进行 ;此 外 , 拆 分 反应 也 包括 结
合 部 位 I 和 开 , 因 为 部 位 和 开 这 些 位 点
的 任何 一 个 缺失 , 拆 分 反应 都 变 得 很 弱 .。 部
位 工 与 tmp4 转录 起 始 位 点 相 重 到 , 部 位
I 与 tazpR 转录 起 始 位 点 相 重 到 。 解 离 酶 需
要 在 3 个 部 位 上 结合 ,才能 保持 DNA 合
适 的 拓扑 学 结构 , 这 样 才能 在 不 引起 任何 图 6-30 TIn3 转 座 子 的 结构
DNA 变化 的 情况 下 抑制 tzzp4 和 zzzpR 的 转录 。

解 离 酶 催化 拆 分 反应 是 在 一 个 较 大 的 核糖 核 蛋 白 结 构 中 发 生 , 解 离 酶 以 4 个 亚 基 结 合 到
重组 ”es 位 点 上 行使 功能 。 每 个 亚 基 产 生 一 个 单 链 断裂 ;然后 彼此 相关 的 亚 基 又 重新 组 织 排
列 , 移 动 DNA 链 , 使 它们 处 于 一 种 重组 的 构象 中 ,接着 封闭 切口 。 在 此 过 程 中 , 键 的 断裂 和 连
接 不 需要 输入 能 量 , 解 离 酶 共 价 附 着 在 ”es 位 点 形成 的 双 链 切口 的 5 -末端 上 .断裂 对 称 地 出 现
在 回 文 对称 区 段 ,产生 两 个 碱 基 的 单 链 延伸 。 部 位 I 交换 区 域 的 切割 反应 为 :

束 开 由 下 A 其 3K 下 9 忆 直 不及 二 重合 古 Ay
ATAIF 下 EL 30AA= 息 自 二 .RATT5/

该 反应 与 》 噬菌体 在 at 位 点 的 反应 很 相似 。
四 、 转 座 子 转 座 频率 的 调控

细胞 中 转 座 频率 的 控制 是 很 重要 的 ,为 了 存活 , 转 座 子 必须 以 某 一 最 低 的 频率 移动 ;频率
太 高 ,也 会 对 细胞 造成 损害 ,细胞 内 的 转 座 酶 在 一 般 情 况 下 浓度 很 低 , 极 少 引起 转 座 , 每 个 细胞
每 个 世代 产生 的 转 座 酶 分 子 还 不 到 一 个 (如 Tnl0 转 座 酶 是 以 每 个 世代 每 个 细胞 中 合成 0. 15
个 分 于 的 低 水 平 进 行 的 ), 引 起 自发 转 座 频率 只 有 10 次。 如 果 由 含有 Tn10 转 座 酶 基因 的 工
程 质粒 ,就 能 提供 更 多 的 转 座 酶 ,Tnl0 的 转 座 频率 可 以 提高 1 000 倍 以 上 ,每 个 转 座 子 似乎 都
有 控制 其 自身 转 座 频 率 的 机 制 , 目 前 对 Tnl0 的 各 种 调控 机 理 已 研究 得 很 清楚 。

Ta10 是 “个 复合 转 座 子 ,其 中 只 有 末端 的 几 个 碱 基 是 转 座 反 应 必需 的 。 In10 是 优先 先
择 特定 葛 序 列 (热点 ) 的 几 个 转 座 元 件 中 的 一 个 。 由 转 座 产生 的 DNA 两 侧 的 9 bp 的 正 向 重复 .
中 ,有 三 个 6bp 的 共有 序列 对 称 地 排列 在 靶 位 点 上 ,因此 ,Tnl0 两 侧重 复 序列 经 常 采用

5 NGCTAGCN3' ，， | 本

转 座 酶 识别 靶 序 列 及 转 座 子 末端 所 要 求 的 。
IS10R 是 Tnl0 的 活性 组 件 ,IS10L 组 件 是 功能 缺陷 型 的 , 它 仅 能 提供 IS10R 转 座 酶 活性
的 1% 一 10% ,尽管 IS10L 是 缺陷 型 的 ,但 它 的 末端 能 被 转 座 酶 所 识别 (ISIOR 和 IS]10DL 分 别
165

转录 作用

是 构成 复合 转 座 子 Tn10 两 端的 两 个 组 件 ,又 称 右 臂 和 左 臂 )。 图 6-31 概括 了 IS1OR 的 结构 ，j
靠近 IS10R 边界 外 缘 有 两 个 方向 相反 的 启动 子 : 弱 启动 子 Pw 负 责 IS10R 的 转录 ,转录 方向 是
向 左 进行 ,其 转录 产物 是 一 个 具有 编码 区 段 的 RNA, 其 长 度 一 直 延 伸 到 整个 IS10R ,并 产生
47kD 的 蛋白 质 ( 即 转 座 酶 ) ; 强 启动 子 Pour 转 录 向 右 进行 ,转录 产物 称 为 OUTRNA， 转 录 可 到
达 邻 近 宿主 DNA 一 侧 ,通常 终止 于 转 座 子 内 部 ,偶尔 也 能 转录 到 宿主 DNA 内 。 甚 至 这 种 连续
转录 会 激活 毗邻 的 细菌 基因 ,两 种 转录 产物 IN RNA 和 OUT RNA 存在 40 bp 的 重要 。 从 多
拷贝 抑制 现象 说 明 :IS 10 R 转 座 酶 基因 表达 受 IS 10 R 元 件 的 调控 。 在 多 拷贝 质粒 中 导入 额 ，
外 的 IS 10 R 拷贝 时 ,细菌 染色 体 上 Tn 10 元 件 的 转 座 作 用 便 会 下 降 。 这 种 抑制 效应 需要 Pour ，
启动 子 参加 ,而 且 是 在 翻译 水 平 上 起 作用 ; 由 于 从 Px 和 Pour 两 个 启动 子 产 生 的 转录 物 , 其 5-
末端 都 处 于 40 bp 重 亚 区 域内 ,OUT RNA 是 含有 69 bp 的 转录 物 .Pour 启 动 子 要 比 PwN 启 动 子
强 得 多 ,而 用 OUT RNA 比 IN RNA 更 为 稳定 ,所 以 ,OUT RNA 的 水 平 比 INRNA 高 100 多
倍 。 实 际 上 RNAour 行 使 反 义 RNA 的 功能 。 因 为 这 两 种 RNA 的 5' 端的 重 琶 而 能 配对 ,过 剩
的 OUT RNA 促使 它 在 IN RNA 与 核糖 体 连接 之 前 早已 迅速 地 与 IN RNA 结合 ,配对 后 的
IN RNA 不 能 作为 合成 蛋白 质 的 模板 ,因此 ,不 能 被 翻译 , 即 IS10R 转 座 酶 基因 不 表达 。

除了 OUTVIN RNA 的 配对 抑制 转 座 酶 合成 外 ,单个 转 座 子 的 转 座 作 用 会 因 复制 后 发 生
的 甲 基 化 作用 而 受到 限制 。

[要 汪 Tnl0_ 区 一， SIR 过 >

宿主 DNA

|
36 个 碱 基 重 麦
地

QQQQA

转 座 酶
6=31 TITnol0 中 IS10R 部 分 的 组 织 结构 8

Tal0 和 另 一 些 转 座 子 的 转录 酶 启动 子 含 有 GATC 序列 ,在 大 肠 杆菌 中 这 二 序列 的 信 被 ，
Dam 甲 基 化 酶 催化 二 基 化 了 ;因为 GATC 的 互补 链 也 是 GATC (都 从 5 ->3' 阅 读 ) 此 处 DNA
的 两 条 链 都 被 甲 基 化 。 在 这 种 情况 下 ,启动 子 便 相对 地 钝 化 . 但 在 DNA 复制 时 ,新 从 成 的 。
GATC 中 的 A 不 立即 被 甲 基 化 (可 能 有 5min 或 更 长 ), 这 样 , 在 新 复制 的 两 个 拷贝 中 ;中 有 一 下
条 链 上 甲 基 化 ,而 另 一 条 链 上 没有 甲 基 化 的 启动 隆 , 比 上 述 两 条 链 都 被 甲 基 化 的 启动 子 的 活性
高 得 多 ,于 是 在 DNA 刚 复制 后 出 现 少数 的 转 座 酶 。 与 此 类 似 ,在 转 座 酶 的 作用 位 点 上 ,也 就 是
在 1S10R 的 末端 反 向 重复 序列 内 部 也 含有 GATC ,新 复制 的 DNA 是 转 座 酶 的 最 好 的 底 物 . 因
此 ' Inl10 在 DNA 刚 复 制 后 易 发 生 转 移 。 总 之 , 甲 基 化 作用 阻止 转 座 酶 的 合成 ,并 且 阻 止 转 座

了 酶 结合 到 DNA 上 ,从 而 限制 转 座 , 使 转 座 频 率 降 低 。
166

Emma

综 上 所 述 ,控制 转 座 子 转 座 频 率 的 核心 因素 就 是 转 座 酶 的 水 平 , 转 座 酶 的 数量 通常 是 相当
关键 的 。

五 、 转 座 子 的 某 些 遗传 学 效应

尽管 原则 上 转 座 子 在 基因 组 内 移动 的 概率 相当 小 ,但 转 座 子 作为 位 于 基因 组 内 的 一 个 独
立 实 体 , 它 的 不 连续 的 活动 似乎 提供 了 某 种 自然 选择 。

转 座 子 与 基因 组 的 关系 就 像 寄生 物 与 宿主 的 关系 一 样 .如 果 转 座 会 使 必需 的 基因 失 活 ,或 者
转 座 子 的 数量 过 多 , 它 就 会 成 为 细胞 系统 的 负担 ,结果 可 能 通过 不 利于 转 座 发 生 的 过 程 来 平衡 ;
但 任何 提供 有 利于 选择 的 转 座 作 用 , 如 遗传 重 排 , 都 将 导致 携带 活性 转 座 子 的 基因 组 优先 存活 。

转 座 因 子 的 共同 现象 以 及 它们 带 来 的 遗传 学 效应 有 以 下 几 个 方面 :

一 ) 引 起 插入 突变

以 10 一 10 “频率 进行 的 转 座 会 引起 插入 突变 。 各 种 IS,Tn 和 Mnu 唉 菌 体 都 可 以 引起 插
入 突变 ,如 果 揪 入 的 位 置 是 一 个 操纵 子 的 前 端的 基因 ,那么 所 造成 的 便 可 能 是 一 个 极 性 突变 ，
极 性 突变 是 指 减 低 蛋 白质 合成 速度 的 基因 突变 。 一 般 碱 基 置 换 突变 没有 极 性 效应 ,只 有 终止 密
码 子 突变 和 移 码 突变 才 有 极 性 效应 ;由 IS1 和 IS2 的 碱 基 序列 分 析 中 发 现 , 它 们 确实 存在 无 义
密码 子 , 当 信息 转移 到 mRNA 中 相应 的 无 义 密码 子 处 , 肽 链 的 延长 就 终止 ,产生 的 是 无 酶 活性
的 多 肽 片段 ,并 且 影 响 同一 操纵 子 中 其 后 基因 产物 的 合成 。IS2 以 任何 方向 插 和 人 都 有 极 性 效
应 ;IS3 只 有 以 一 个 方向 插 人 时 才 有 极 性 效应 。 然 而 也 有 关于 因 IS2 的 插入 而 出 现 新 的 启动 子
信和 号 的 报道 。

(二 ) 插 入 位 置 上 出 现 新 的 基因

如 果 转 座 子 上 带 有 抗 药性 基因 ,那么 它 一 方面 造成 一 个 基因 插入 突变 ; 另 一 方面 在 这 一 位
置 上 出 现 一 个 新 的 抗 药性 基因 。

《三 ) 造 成 插入 位 置 上 出 现 靶 DNA 的 少数 核 苷 酸 对 的 重复

不 同 的 转 座 子 播 入 后 造成 的 受 体 靶 位 点 处 DNA 的 重复 的 碱 基 对 数 多 少 不 等 。 如 IS1，
nl0 等 造成 9bp 的 重复 ,IS3 造成 3 或 4bp 的 重复 ,IS4 造成 11 bp 重复 。

(四 ) 转 座 后 原来 位 置 上 保持 原 有 的 转 座 子

插 大 序列 和 转 座 子 从 一 个 位 点 上 转移 到 另 一 个 位 点 上 , 原来 位 点 上 的 这 些 结构 依然 存在 ，
转 座 子 实际 上 是 以 它 的 一 个 复制 品 转移 到 靶 位 点 处 的 。

(五 ) 引 起 染色 体 的 畸变

尽管 转 座 作用 与 细胞 重组 系统 有 差异 ,然而 转 座 子 作为 细胞 重组 系统 的 底 物 ,执行 着 携带
同 源 区 段 的 作用 。 在 不 同位 点 (甚至 不 同 染色 体 上 ) 的 同一 个 转 座 子 的 两 个 拷贝 可 以 提供 相互
重组 的 位 点 ,这 种 交换 导致 缺失 、 倒 位 、 插 人 或 转 座 。

宿主 DNA 的 重 排 可 能 由 转 座 子 的 一 个 拷贝 插入 到 邻近 位 置 的 第 二 个 位 点 引起 。 宿 主 系
统 可 以 在 两 个 拷贝 的 转 座 子 之 间 产 生 重组 作用 ,其 结果 取决 于 重复 序列 的 取向 。 下 条 全 二 风
两 个 拷贝 到 向 相同 , 则 重组 后 产生 缺失 ;如 果 取 向 相反 , 则 发 生 倒 位 。

4(x) 切 除

转 座 子 可 以 从 原来 位 置 上 消失 ,这 一 过 程 称 为 切除 。 切 除 的 方式 有 两 种 * 谁 确 的 切除 和 不
准确 的 切除 .准确 切除 的 结果 使 插入 突变 的 基因 发 生 回复 突变 ;如果 这 个 转 座 子 是 一 个 带 有 抗
药性 基因 的 转 座 子 ,那么 抗 药性 同时 消失 。 不 准确 切割 的 结果 留 下 转 座 子 的 残迹 ,而 发 生 了 揪

167

和 突变 基因 的 不 回复 突变 ,但 转 座 子 本 身 所 带 的 遗传 标志 消失 ,这 是 由 不 准确 切除 引起 的 染色
体 畸 变 造 成 的 。 这 些 现象 均 已 在 Tn10 插入 juzsG 的 突变 株 的 回复 突变 株 中 得 到 了 证 据 。

在 鼠 伤寒 沙门 氏 菌 中 有 一 个 由 Tnl0 插入 而 造成 的 组 氨 酸 基因 /zsc 的 插 和 人 突变 。Tn10
带 有 四 环 素 抗 性 基因 ,所 以 ,jisG :: Tnl10( 这 表示 Tn10 插入 到 wzsC) 插 入 突变 型 既是 组 氨 酸
缺陷 型 又 是 四 环 素 抗 性 突变 型 Tc 。

自发 的 四 环 素 敏 感 回复 子 以 10-* 一 10- 的 频率 发 生 。 在 Tc 回复 子 中 一 部 分 是 原 养 型 的 ，
它们 是 Tnl0 准确 切除 的 结果 ;一 部 分 Tcs 菌株 仍然 是 组 氨 酸 缺陷 型 ,它们 可 发 生 倒 位 或 缺
失 , 这 是 不 准确 切除 的 结果 。

总 之 ,由 转 座 子 介 导 的 基因 重 排 在 进化 中 非常 重要 。 例 如 ， 转 座 子 可 将 一 些 原来 在 染色 体
上 相距 甚 远 的 基因 组 合 到 一 起 而 形成 一 些 操纵 子 ;也 有 可 能 把 两 段 分 离 着 的 碱 基 序列 转 变 成
连 在 一 起 的 DNA .这 样 在 进化 过 程 中 就 产生 一 些 新 的 蛋白 质 。 在 细胞 繁殖 的 一 个 世代 中 , 基因
重 排 可 能 也 是 非常 重要 的 。 例 如 , 转 座 子 可 以 看 作 是 一 个 开关 ， 在 一 个 特殊 的 位 点 发 生 插入 作
， 用 或 倒转 一 个 含有 启动 子 的 序列 ,就 可 以 使 基因 打开 或 关闭 。 ，

六 ` 真 核 生物 的 转 座 子

转 座 子 首先 在 玉米 中 发 现 ,其 它 真 核 生 物 中 的 转 座 子 则 直到 60 年 代 后 期 ,在 大 肠 杆菌 的
半 乳 糖 操 纵 子 的 研究 中 第 一 次 发 现 插 和 人 序列 后 才 陆 续 发 现 的 。 真 核 生 物 中 转 座 子 的 转 座机 制
有 的 与 细菌 转 座 子 相似 ,其 遗传 信息 的 流动 从 DNA 到 DNA ,如 玉米 的 Ac-Ds 元 件 , 果 蝇 P 元
件 和 FEB 元 件 等 。 有 的 则 与 逆转 录 病 毒 相 似 , 其 遗传 信息 从 RNA 到 DNA 再 到 RNA, 如 逆转
录 病 毒 . 果 蝇 的 copia 元 件 和 酵母 的 Ty 元 件 等 。

(一 ) 玉米 的 控制 元 件

早 在 本 世纪 初 ,玉米 遗传 学 家 已 经 鉴别 了 在 玉米 中 影响 籽粒 色素 的 不 稳定 突变 ,第 三 个 发
现 转 座 子 的 就 是 玉米 中 的 控制 元 件 Ccontrolling element) .Barbara MecClintock 从 1942 年 到 冷
泉 港 实验 室 后 就 开始 了 玉米 控制 元 件 的 研究 。1951 年 发 表 了 关于 玉米 控制 元 件 的 论文 。 她 的
开创 性 工作 ,打破 了 孟 德尔 关于 基因 在 各 个 独立 的 染色 体 上 固定 排列 的 概念 .控制 元 件 没有 固
定 的 染色 体 定位 ,它们 能 抑制 与 其 毗邻 的 其 它 玉 米 基因 的 表达 , 即 控制 元 件 在 二 个 部 位 上 的 插
入 可 影响 邻接 基因 活性 ,使 基因 有 较 高 的 突变 频率 ; 并 且 控 制 元 件 出 现 的 部 位 可 以 引起 缺失 、j
复制 、 倒 位 和 易 位 。

在 玉米 基因 组 中 含有 好 几 组 控制 元 件 的 家 族 。 在 每 种 玉米 的 品系 中 ; 它 的 数目 、 类 型 和 插 ，
人 部 位 都 有 其 特征 。 同 一 家 族 的 成 员 又 可 以 分 为 两 类 : 即 自主 元 件 和 非 自主 元 件 。 自 主 元 件 ，
Cautonomous element), 具 有 切割 和 转 座 能 力 。 因 为 它 的 持续 活性 ， 在 任何 位 点 正 的 揪 人 会 产 量
生 一 个 砂 稳 的 或 易 变 的 等 位 基因 .自主 元 件 本 身 的 缺失 或 其 转 座 能 力 的 缺失 ,可 把 易 突 变 的 等 星
位 基因 变 成 稳定 的 等 位 基因 。 非 自主 元 件 Cnonautonomous element) ,它们 不 能 转 座 或 自发 地
经 受 其 它 变 化 .只 有 当 同 一 家 族 的 自主 元 件 在 基因 组 的 某 处 存在 时 , 非 自主 元 件 才 变 成 不 稳定
的 。 而 当 非 自主 元 件 与 自主 元 件 反 式 互补 时 , 才 会 显示 出 与 自主 元 件 相 联系 的 普遍 活性 ,包括 |
转 座 到 新 位 点 的 能 力 。 自 主 元 件 转 座 作用 所 需要 的 反 式 功能 缺失 时 就 产生 自主 元 件 。

玉米 控制 元 件 中 的 每 一 个 家 族 是 由 一 个 简单 类 型 的 自主 元 件 和 多 种 类 型 的 非 自 主 元 件 组
成 。 非 自主 元 件 之 所 以 列 和 此 家 族 是 因为 它 可 以 被 自主 元 件 反 式 激 活 。

玉米 中 转 座 子 具有 共同 的 结构 特征 。 其 末端 具有 反 向 重复 及 邻接 的 靶 DNA 的 短 的 正 向
168

重复 ,但 在 大 小 和 密码 的 容纳 能 力 方面 有 所 不 同 。 对 自主 元 件 和 非 自主 元 件 的 Ac-Ds 家 族 的
研究 已 最 为 清楚 。 在 玉米 转 座 子 研究 中 最 初 所 用 的 品系 的 第 九 染 色 体 上 有 一 个 解 离子 (disso-
6iate,Ds) ,在 另 一 染色 体 上 有 活化 子 (activator,Ac) ,构成 Ac-Ds 系统 。Ac 元 件 是 一 个 完整 的
转 座 子 ,其 组 织 结构 与 细菌 转 座 子 非常 相似 ,长 度 为 4 563bp ,转录 后 的 单 链 RNA 经 剪接 后 形
成 3500bp 的 mRNA, 其 中 有 编码 801 个 密码 子 的 序列 ,与 它 含 有 5 个 外 显 子 的 单 基因 表达 相
三 致 ,此 序列 占 Ac 的 长 度 的 绝 大 部 分 。 在 编码 序列 的 两 侧 带 有 11bp 的 短 反 向 重复 ;在 插入 位

呈正 复制 了 8 bp 的 划 序 列 . 因 为 Ac 具有 活性 的 转 座 酶 基因 ,所 以 ,使 Ac 可 自主 地 移动 .Ae 元
件 能 引起 较 高 回复 频率 的 突变 。 基 因 中 的 Ae 突变 可 以 合成 玉米 粒 色 素 花色 素 苷 ,因此 ,在 发

生 回复 突变 时 ,会 在 正常 籽粒 颜色 的 背景 上 产生 带 有 杂 色 的 斑点 。

Ds 元 件 的 长 度 和 序列 是 可 变 的 ,但 都 与 Ac 有 关 。 实际 上 ,Ds 元 件 是 在 转 座 酶 基因 上 有 缺
失 的 Ac 元 件 , 其 缺失 的 长 度 变化 不 定 ,在 Ds 9 中 仅 缺 失 194 bp ,Ds 6 缺失 长 达 2kb。Ds 元 件
比 Ac 元 件 短 ,但 它 同 样 有 11 bp 的 反 向 重复 末端 。Ds 本 身 不 能 移动 ,Ds 元 件 必 须 有 Ac 元 件
(Ac element) 的 存在 才 起 作用 。Ds 元 件 能 引起 稳定 的 突变 ,这 些 突变 产生 无 色 的 玉米 粒 ( 除 非
这 些 植 物 与 Ac 品系 杂交 ) 。 当 Ace 存在 并 且 具 有 转 座 酶 的 活性 时 ,Ds 就 能 像 复合 转 座 子 那样
跳 牙 并 活化 花色 素 苷 基因 .。 虽然 Ds 和 Ac 不 在 同一 条 染色 体 上 ,但 Ac 元 件 通过 所 产生 的 某 些
可 扩散 的 物质 作用 于 Ds 元 件 而 影响 Ds 元 件 (Ds element) ,Ds 元 件 作 用 于 染色 体 , 使 之 发 生
断裂 。Ac 元 件 越 少 , 则 由 Ds 引起 的 染色 体 断 裂 得 越 早 ,颜色 斑点 越 大 。

Ac 激活 Ds 而 引起 染色 体 断 裂 的 结果 以 一 个 杂 合 子 为 例 ,Ds 位 于 一 条 同 源 染色 体 的 着 丝
点 和 一 系列 显 性 标记 之 间 ; 另 一 条 同 源 染色 体 无 Ds 而 带 有 隐 性 标记 Cc,pz,zoz 的 无 着 丝 点 片
段 。Ds 处 断裂 产生 一 个 带 有 显 性 标记 的 无 着 丝 点 片段 ,因为 该 片段 没有 着 丝 点 ,所 以 ,在 有 丝
分 裂 中 丢失 ,导致 表现 型 的 改变 。 所 以 ,其 后 代 细 胞 只 表现 由 完整 染色 体 携带 的 隐 性 标记 所 决
定 的 表现 型 。 玉 米 体 细胞 发 育 时 出 现 的 表 型 改变 称 斑 驭 现象 (variegation ) ,表现 为 一 块 新 表 型
的 扇 状 体 散 合 在 原 表 型 组 织 内 。.

(二 ) 果 蝇 中 的 P 元 件

墨 腹 果 蝇 的 某 些 品系 杂交 时 ,其 后 代 显 示 了 不 育 特 征 。 一 系列 的 突变 .畸变 破坏 了 减 数 分
裂 ,结果 导致 不 孕 , 这 些 缺 陷 现象 称 为 杂种 不 育 (hybrid dysgenesis ) 。

当 果 凯 的 P 型 (paternal contributing) 和 M 型 (maternal contributing ) 的 两 个 品系 杂交
时 ,形成 不 对 称 系统 , 即 当 P 雄 蝇 与 M 型 雌 蝇 杂 交 时 产生 的 杂种 后 代 是 不 育 的 ,而 反 交 则 正
常 。 不 育 原 则 上 是 一 种 种 系 生殖 细胞 现象 ,在 P-M 杂交 系统 中 ,F, 杂种 果 蝇 有 正常 体 组 织 ,但
它们 的 性 腺 不 发 育 ,配子 中 发 育 形 态 缺陷 始 于 种 系 生殖 细胞 快速 分 裂 阶段 。

在 与 M 型 雌 蝇 杂 交 时 ,P 雄性 的 任何 一 个 染色 体 都 能 诱发 不 育 。 重 组 染色 体 显 示 在 每 个
已 品系 染色 体 中 有 若干 区 段 能 引起 不 育 。 这 表明 P 雄性 有 大 量 的 了 因子 (F factor) ,其 序列 分
布 在 许多 不 同 的 部 位 上 ,不 同 的 P 品系 中 P 因子 的 位 置 不 同 ,M 品系 采 蝇 染色 体 上 没有 了 因
子 . 由 花 种 不 育 的 突变 型 DNA 作 图 得 知 ;所 有 突变 是 DNA 序列 的 插 和 人 造成 的 ,该 插 大 序列 称
为 也 元 件 .P 元 件 的 插入 形成 了 一 个 典型 的 转 座 系 统 . 可 见 杂 种 不 育 的 原因 可 能 是 果 蝇 的 P 转
认 元 件 转 座 引 起 的 结果 。 单个 P 元 件 的 长 度 是 变化 的 ,但 在 序列 上 是 同 源 的 : 携带 P 元 件 的 果
蝇 品 系 通常 只 携带 几 个 全 长 转 座 子 ,最 长 的 P 元 件 长 约 2.5 kb, 有 4 个 转 座 作 用 都 需要 的 可
阅读 框架 (open reading frame,ORE) ,推测 它们 所 编码 的 转 座 酶 和 阻 遇 物 可 能 与 细菌 转 座 子
移动 所 需要 的 一 样 . 大 多 数 P 序列 像 Ds 一 样 , 是 由 全 长 的 完整 P 元 件 向 内 部 缺失 产生 的 衍生

169

物 . 这 些 元 件 至 少 责 失 了 产生 转 座 酶 的 能 力 ,因此 ,它们 要 依赖 全 长 元 件 编码 转 座 酶 才能 移动 。
缺失 的 P 元 件 衔 生物 的 大 小 为 0. 5 一 1.4 kb ,两 侧 边界 都 有 31 bp 的 末端 反 向 重复 ,了 元 件 择 |
下 站 DNA 插入 位 点 处 产生 8 bp 的 正 向 重复 DNA 序列 . 二
品系 带 有 了 元 件 的 拷贝 数 是 30 一 50 个 ,其 中 1/3 是 全 长 的 ,但 M 品系 中 无 下 元 件 。 在 百

P 元 件 就 像 染 色 体 上 的 惰性 组 分 ,只 有 当 了 雄 蝇 与 M 雌 蝇 杂交 时 ,它们 才 被 激活 。 即
由 于 进入 的 雄性 DNA 编码 的 转 座 酶 迅速 产生 ,引起 P 元 件 移动 ,而 且 通过 新 的 王 元 件 的 插入
引起 频繁 的 突变 ,这 种 劣 生 杂 交 的 子 代表 现 出 较 低 的 生育 能 力 和 染色 体 的 畸变 .P 元 件 的 最 初
转录 产物 长 为 2. 5 一 3. 0 kb ,长 度 的 差异 可 能 只 反映 了 终止 位 点 的 渗 漏 ,转录 产物 合成 两 种 蛋 量
白 .P 元 件 的 活性 具有 组 织 专 一 性 , 它 只 存在 于 种 系 中 ,但 在 种 系 和 体 细胞 组 织 中 都 能 转录 ,组
织 专 一 性 是 通过 改变 剪接 方式 实现 的 。 在 体 细胞 组 织 中 , 仅 前 两 个 内 含 子 被 剪 切 ; 即 外 显 子 2,
外 显 子 3 不 发 生 剪接 ,产生 的 mRNA 组 成 是 ORFu-ORF,-ORF,, 其 翻译 产物 是 66kD 的 蛋白
质 ,该 蛋白 质 是 转 座 子 活性 的 抑制 物 ,起 阻 遏 作用 ,而 不 是 启动 转 座 作用 的 发 生 。 这 种 调节 形式
就 限制 了 P 元 件 转 座 到 生殖 细胞 中 。

在 种 系 组 织 中 , 另 一 种 剪接 反应 去 除了 第 3 个 内 含 子 ,这 样 就 全 部 4 个 外 显 子 剪 接 到 一
起 ,得 到 的 mRNA 翻译 产物 是 87 kD 的 蛋白 质 , 即 转 座 酶 .可 见 P 元 件 转 座 通过 可 变 剪 接 机 制
只 限于 在 果 蝇 的 种 系 生殖 细胞 中 ,活性 转 座 酶 由 4 个 外 显 子 编码 ,而 最 后 的 剪接 则 只 发 生 在 生 时
殖 细胞 中 ,负责 这 种 组 织 特异 性 剪接 的 体 细胞 中 含有 一 种 蛋白 质 , 它 可 以 结合 到 外 显 子 下 的 序
列 上 ,从 而 阻止 了 最 后 一 个 内 含 子 的 剪接 。 在 种 系 生殖 细胞 中 , 由 于 这 种 蛋白 质 的 缺失 可 以 产
生 编 码 转 座 酶 的 mRNA 。 如 果 用 基因 工程 手段 把 一 个 P 元 件 的 最 后 一 个 内 含 子 准确 切除 , 则
第 三 四 外 显 子 就 能 像 剪接 一 样 连 在 一 起 。 这 样 经 人 工 改造 的 P 元 件 在 果 蝇 的 体 细胞 中 很 和
易 地 进行 转 座 。

P 元 件 的 转 座 需要 150 bp 长 的 末端 DNA , 转 座 酶 结合 于 10 bp 上 ,后 者 与 31 bp 的 反 疝 重
复 邻接 。 转 座 发 生 的 机 理 类 似 于 Tn10, 通 过 非 复制 型 的 切割 和 粘连 进行 转 座 。 已 转 座 的 元 件 插 ”
入 到 新 位 点 可 以 引起 突变 ; 留 在 供 体 部 位 的 断裂 具有 有 害 的 影响 ,结果 导致 产生 杂种 不 育 的 后 代 。

M 品系 的 雄性 与 P 品系 的 雌性 杂交 或 PxP 杂交 都 不 会 少 生 ,因为 当 完 整 的 忆 元 件 存 在

于 雄性 基因 组 时 抑制 了 许多 短 P 元 件 的 转 座 作 用 , 卵 的 细胞 质 可 能 早已 充满 了 阻 遏 物 型 分
子 。 杂 种 不 育 对 杂交 时 性 别 定向 的 相依 性 表明 了 细胞 质 和 了 因子 本 身 同样 重要 ,因此 ,把 细胞
质 的 作用 称 为 细胞 质 型 (cytotype) 。 含 P 元 件 的 果 蝇 品系 中 有 了 P 细胞 质 型 ,而 无 P 元 件 的 果 蝇
品系 有 M 细胞 质 型 。 3

细胞 质 型 的 效应 可 做 分 子 水 平 的 解释 。 它 藉 助 于 66 kD 蛋白 来 抑制 转 座 。 该 六 本 在 怀 瑟 全 玫
为 母系 因子 。 在 一 个 了 家 族 中 ,必须 有 足够 的 阻 过 蛋白 才能 阻 过 转 座 的 发 生 , 即 使 P 元 件 存在 ，
也 是 如 此 ,在 任何 有 了 元 件 峻 性 杂交 中 ,该 66 KD 蛋白 存在 时 或 阻止 转 座 酶 的 合成 或 抑制 转 座
酶 的 活性 * 但 当 肉 性 亲本 是 M 型 时 ,在 卵 中 不 存在 阻 过 物 , 从 雄性 亲本 导入 P 元 件 时 生殖 品系 目
上 则 产生 了 转 座 酶 活性 ,P 细胞 质 型 至 少 在 一 个 世代 后 才能 发 挥 作用 ,因为 它 必须 经 过 下 一 世 ，
代 的 成 虫 卵 中 有 充足 和 稳定 的 阻 过 蛋白 。

P 元 件 转 座 引起 的 杂种 不 育 和 其 它 转 座 体系 相 类 似 ,在 物种 形成 过 程 中 起 重要 作用 . 因为 和
杂种 不 育 降低 了 近 交 能 力 ,所 以 , 它 是 物种 进化 中 的 一 个 阶段 。 假 如 某 一 地 区 通过 转 座 子 产生
一 种 不 育 系统 ,而 在 另 一 地 区 由 证 其 它 原因 产生 不 同 的 不 育 系统 ,这 两 个 地 区 的 果 蝇 将 是 两 个
系统 间 杂 种 不 育 。 如 果 这 使 得 它们 之 间 杂 交 不 孕 , 那 么 两 个 群体 就 成 为 遗传 性 隔离 。 因而 多 重

]70

不 育 系 统 的 进一步 出 现 将 最 终 导致 不 能 交配 , 即 物 种 形成 。 此 外 ,最 近 P 单元 已 成 为 将 基因 导
人 果 蝇 基因 组 新 位 点 上 的 有 效 载 体 。
(三 ) 逆 转录 转 座 子
逆转 录 病 毒 能 将 其 RNA 基因 组 的 DNA 拷贝 ( 原 病 毒 ) 插 人 宿主 细胞 的 染色 体 上 而 发 生
转 座 作用 ,因而 称 之 为 着 转录 转 座 子 (retrotransposon), 亦 称 逆转 录 子 (retroposon)。 目 前 已
知 , 在 所 有 高 等 生物 的 基因 组 构成 中 ,也 存在 着 与 关 转 录 病 毒 基因 组 非常 相似 的 逆转 录 转 座
子 , 如 酵母 的 Ty 转 座 子 和 果 蝇 的 copia 转 座 子 , 它 们 位 于 较 长 的 正 向 重复 或 长 末端 重复 (long
frminal repeat ,LTR) 区 域内 ,在 转录 、 逆 转录 及 整合 过 程 中 发 生 移动 。
逆转 录 转 座 子 具有 着 一 些 与 简单 转 座 子 相似 的 特性 :
《1i) 可 能 与 高 频率 的 自发 突变 有 关 。
(2) 刺 激 寄主 细胞 基因 组 发 生 多 种 形式 的 遗传 重 排 , 如 相 邻 细胞 DNA 的 缺失 、 倒 位 .加 倍
和 易 位 。
(3) 择 入 单元 两 端的 DNA 序列 在 插 人 过程 中 可 能 稍 有 增加 (3 一 13 bp ) 。
《4) 转 座 单元 的 末端 含有 长 度 为 2 一 50 bp 的 反 向 重复 。
《5) 转 座 过 程 经 常 与 转 座 单元 的 复制 同时 进行 。 这 一 点 对 逆转 录 转 座 子 来 说 是 必需 的 ,在
原核 生物 的 转 座 中 则 时 有 发 生 。
《6) 转 座 子 通过 编码 蛋白 质 , 以 顺 式 或 反 式 方式 作用 于 转 座 单元 ,来 对 自身 的 转 座 功能 进
就 逆转 录 转 座 子 而 言 , 逆 转录 病毒 与 真 核 生 物 的 酵母 Ty 转 座 子 . 果 蝇 copia 转 座 子 之 间
的 差别 在 于 道 转 录 病 毒 中 存在 另外 一 个 基因 ,也 就 是 编码 逆转 录 病 毒 外 层 类 脂 包 膜 糖 蛋白 的
ezy 基因 。 逆 转录 病毒 是 一 种 真正 的 二 倍 体 病 毒 。 其 粒子 中 除了 含有 两 个 基因 组 RNA 拷贝 以
外 ,还 含有 一 种 在 基因 组 逆转 录 合 成 DNA 过 程 中 作为 引物 的 细胞 tRNA。
1. 逆转 录 病 毒 基因 组 ”逆转 录 病 毒 基 因 组 编码 逆转 录 酶 和 整合 酶 , 道 转录 酶 在 侵 染 细胞
的 细胞 质 中 把 RNA 转换 成 线 型 双 链 DNA , 线 型 DNA 进入 细胞 核 , 由 整合 酶 催化 整合 作用 ，
整 台 后 的 原 病毒 DNA 通过 宿主 系统 产生 病毒 RNA ,所 以 ,它们 以 mRNA 作为 基因 组 包装 进
病毒 颗粒 中 ,整合 至 感染 细胞 的 逆转 录 病 毒 序列 作为 内 源 病 毒 留 在 细胞 基因 组 中 。
(1) 基 因 组 结构 “典型 的 逆转 录 病 毒 基因 组 含有 3 个 或 4 个 基因 。 具 有 3 个 基因 gag-zol-
ez 序列 的 结构 。 它 们 表达 成 熟 产 物 的 功能 如 下 :sgag 基因 :产生 病毒 颗粒 核 蛋 白 核心 的 蛋白 质
部 分 , 即 DNA 结合 蛋白 。zo/ 基因 : 编码 与 核酸 合成 和 重组 有 关 的 多 肽 复合 物 , 它 具 有 3 种 功能 不
同 的 活性 , 即 逆转 录 酶 .整合 酶 和 RNA 酶 机 的 活性 。ezv 基因 :编码 病毒 颗粒 被 膜 的 组 分 。
逆转 录 病 毒 基 因 组 两 端 还 有 很 长 的 非 编码 序列 ,在 5' 端 有 凯 子 结构 ,在 3 端 有 聚 腺 苷 酸
尾 * 除 了 这 两 个 转录 后 加 工 的 产物 外 ,基因 组 本 身 在 两 端 有 完全 相同 的 10 一 80 碱 基 正 向 重复
序列 R。 其 长 度 因 病 毒 株 系 而 有 所 变化 。 这 两 个 R 片段 的 内 侧 ,5 端 部 分 为 80 一 100 个 碱 基 长
的 U5,3 端 部 分 为 170~…1 350 个 碱 基 长 的 U3。 在 'U5 的 内 侧 为 引物 结合 位 点 (primer binding
site,PB) 该 引物 是 RNA 基因 组 复制 时 从 宿主 细胞 中 得 来 的 tRNA。 在 不 同 的 逆转 录 病 毒 中
tRNA 的 种 类 也 不 同 。 这 些 tRINA 都 是 通过 3' 端 部 分 与 PB 位 点 互补 ， 人
DNA 的 合成 。
逆转 录 病 毒 RNA 、 线 型 DNA 和 原 病 毒 DNA 的 结构 :中 病 毒 RNA 的 两 端 是 正 向 重复 R;
@) 病 毒 线 型 DNA 两 端 为 LTR;G 原 病毒 DNA 两 端 是 缩减 2bp 的 LTRL
17 了

(2) 弟 转 录 病 毒 RNA 转换 为 原 病毒 DNA ”从 病毒 RNA 逆转 录 为 病毒 线 型 DNA, 并 非
RNA 基因 组 的 精确 拷贝 , 而 是 在 5 端 增加 了 U3 ,在 3' 端 增加 了 U5 ,产生 了 两 个 完全 相同 的 正 向
重复 序列 U3RU5 , 称 为 长 未 端 重复 LTR 。 在 长 未 端 重复 中 存在 转录 起 始 信号 和 3!- 端 切割 并 加 聚 ”
腺 苷 酸 尾 的 信和 号。 在 逆转 录 过 程 中 ,逆转 录 酶 以 tRNA 为 引物 , 以 U5R 为 模板 ,产生 大 约 100 一
200 核 音 酸 的 cDNA , 当 逆 转录 酶 到 达 基因 组 5 端 时 ,该 酶 的 RNA 酶 世 活力 切除 刚才 拷贝 过 的 模
板 ,于 是 新 生 的 DNA 序列 U' 5R' 通 过 R' 与 R 的 互补 关系 与 3' 端 的 R 序列 相 结合 (第 一 次 跳跃 ) ,里
因此 产生 了 新 的 模板 一 一 引物 配对 。 利 用 新 的 模板 ,逆转 录 酶 能 产生 全 部 RNA 的 互补 链 。 为 了 转
变 成 双 链 DNA ,在 RNA 模板 U3 序列 的 左边 有 一 个 切割 位 点 ,从 这 里 切断 RNA ,并 以 其 3 -OH 为 量
引物 ,开始 了 正 链 DNA 的 合成 ,产生 了 正 链 DNA 的 U3RU5PB ,然后 出 现 了 第 二 次 跳 九 , 即 tR- 四
NA 被 RNA 酶 理 活性 所 分 解 ,而 使 正 链 上 的 PB 与 负 链 上 的 PB' 互补 ,RNA 酶 孔 又 降解 了 整个 基于
因 组 RNA ,最 后 将 两 条 DNA 链 的 合成 进行 到 底 , 产生 两 端 具有 U3RU5 的 线 状 DNA。

整合 的 原 病毒 DNA 其 结构 与 线 型 DNA 相似 ,LTR 两 端 是 反 向 重复 ,在 其 两 侧 则 是 靶
DNA 的 正 向 重复 。 现 已 证 明 逆 转录 病毒 是 以 线 型 DNA 的 形式 进行 整合 的 。 在 整合 过 程 中 , 病 时
毒 DNA 的 未 端 至 关 重 要 。 在 紧 靠 每 个 LTR 反 向 重复 的 末端 存在 两 个 保守 的 碱 基 CA ,整合 酶 量
覆盖 型 状 DNA 的 两 个 未 端 , 切 除 保守 的 CA 之 外 的 碱 基 , 把 平 齐 末 端 变 成 凹陷 未 端 。 同 时 整
合 酶 随机 选取 宿主 DNA 部 位 点 进行 交错 切割 ,两 个 切口 由 4 或 6bp 分 隔 。 整 合 酶 催化 由 靶 位 轩
点 断裂 所 产生 的 中 端 ,与 病毒 DNA3' -凹陷 端 共 价 相连 ,而 病毒 DNA 凸 出 的 忆 端 则 由 宿主 细
胞 的 酶 修复 。 所 以 ,整合 后 的 原 病毒 DNA 在 LTR 中 和 技 失 2 bp ,相当 于 端 U3 左边 2bp 和 3 呈
端 U5 右边 的 2bp。

所 有 原 病毒 DNA 上 与 细胞 基因 组 DNA 相连 接 的 两 端 序列 都 是 5-TG……CA-34, 而 且
酵母 Ty 元 件 , 果 蝇 的 copia 元 件 以 及 Mu 吹 菌 体 的 两 端 也 都 是 同样 的 序列 ,可 见 它们 在 进化
过 程 中 有 着 密切 的 关系 。

2. copia 元 件 copia 元 件 (copia element ) 是 果 蝇 中 另 一 种 转 座 元 件 ， 它 大 放生
11 个 ) ,每 个 家 族 的 成 员 都 相当 保守 。 在 果 蝇 基因 组 中 ,copia 元 件 的 拷贝 数 为 20~60 个 ,取决
于 果 蝇 的 品系 ,这 些 DNA 序列 重复 移动 ,并 能 在 基因 组 内 随机 分 布 。copia 元 件 的 插 人 能 引起
若干 基因 的 稳定 突变 .copia 的 长 度 约 为 5 000 bp ,两 端 具有 相同 的 276 bp 的 正 向 长 未 端 重复 ，
其 长 度 和 序列 在 家 族 之 间 有 所 变化 ,每 个 未 端 各 有 13 bp 的 不 完整 的 反 向 重复 。 与 其 它 转 座 子
一 样 , 它 插入 到 一 个 新 位 点 ,在 靶 DNA 上 产生 5 bp 的 正 向 重复 的 复制 ，

最 近 发 现 copia 元 件 本 身 可 以 游离 环 型 DNA 分 子 的 形式 单独 存在 ,copia 环 状 分 子 有 两
种 ,一 种 是 5 000 bp; 另 一 种 缺少 276 bp 的 末端 重复 , 约 为 4 700 bp。 就 像 着 转录 病毒 的 DNA
环 一 样 ,copia 元 件 的 一 个 特有 的 性 质 是 它们 以 高 度 转录 其 全 长 并 产生 聚 腺 音 化 的 RNA, 这 样
的 转录 仅 限于 细胞 核 。copia 序列 只 含有 一 个 较 长 的 阅读 框架 , 它 与 着 转录 病毒 的 ga 和 .2o1
序列 间 存在 同 源 性 ,因此 , 亦 同 源 于 逆转 录 酶 .整合 酶 和 核 内 酸性 结合 蛋白 ,但 与 包装 病毒 所 需 旺
的 逆转 录 病 毒 的 exz 序列 就 没有 同 源 性 ,这 说 明 copia 不 可 能 产生 病毒 样 粒子 . 。 |

3. 酵母 中 的 Ty 单元 “Ty 是 酵母 转 座 子 (transposon yeast) 的 缩写 。Ty 单元 插入 到 编码
序列 或 调节 序列 时 ,除了 有 灭 活 基因 的 功能 外 ,有 时 Ty 的 插入 还 能 使 沉默 的 基因 激活 。 这 种

行为 已 由 克隆 和 序列 分 析 得 到 证 实 。

酵母 基因 组 中 存在 的 Ty 元 件 有 两 种 重要 的 类 型 ,Tyl 和 Ty17, 它 们 的 结构 大 致 相同 , Ty

1 元 件 长 6. 3 kb ,两 端 各 有 334bp 的 正 向 重复 , 称 为 8 序列 ,它们 也 被 称 为 LTRs . 重复 序列 含
人 人

有 RNA 育 合 酶 工 的 强 启动 子 , 导 致 完整 元 件 从 左边 8 序列 转录 成 5.6 kb 的 mRNA, 从 右边 9

序列 转录 宿主 的 DNA ,这 就 是 Tyl 元 件 能 激活 沉默 基因 的 原因 。Ty 元 件 携带 两 个 开放 读 框 ，

它们 同方 向 表达 但 不 同步 阅读 ,并 重 和 于 13 个 氨基 酸 .TyA 序列 编码 DNA 结合 蛋白 ,7TyB 基因
编码 一 个 长 的 多 聚 蛋白 ,加 工 后 成 为 几 个 不 同 的 酶 ,依次 为 蛋白 酶 .整合 酶 .逆转 录 酶 和 RNA
酶 再 ,以 Ty mRNA 逆转 录 为 DNA ,并 且 把 它 整合 到 宿主 基因 组 。 这 个 基因 在 动物 中 与 逆转 录
病毒 的 zol 基因 有 关 。

Ty 转 座 子 与 前 述 的 果 蝇 copia 元 件 相 类 似 , 它 也 与 在 兰 椎 动物 细胞 中 增殖 的 反 转 录 病 毒 基
因 组 有 很 多 相似 的 性 质 。 当 它 插 入 逆转 录 病 毒 基 因 组 能 激活 邻近 基因 的 表达 ,从 而 产生 肿瘤 。

Ty 元 件 和 copia 元 件 的 结构 不 同 于 细菌 转 座 子 ,它们 的 转 座机 制 也 不 同 于 细菌 转 座 子
(通过 信息 从 DNA 传递 到 DNA) 。Ty 元 件 通过 RNA 中 间 体 转 座 , 这 是 利用 重组 DNA 技术 ，
在 人 工 构建 的 Ty 基因 组 的 一 系列 实验 中 被 发 现 的 。 人 工 构建 的 Tyl 衍生 物 是 可 被 半 乳 糖 诱
导 的 酵母 C471 基因 的 启动 子 蔡 代 左 侧 $ 中 的 启动 子 , 且 插入 的 GAL1 片段 是 第 一 个 内 含 子
的 酵母 基因 。 工程 构建 的 Ty 转 和 人 酵母 细胞 后 可 在 葡萄 糖 或 半 乳 糖 上 生长 。 当 细胞 生长 在 半 乳
糖 上 ,人 工 Ty 元 件 以 高 水 平 转录 , 这 就 提高 了 它们 的 转 座 频率 ;而 且 这 个 带 有 内 含 子 的 人 工
Ty 转 座 后 的 单元 中 精确 地 缺少 了 内 含 子 序列 。 因 为 去 除 内 含 子 的 方法 只 有 一 种 , 即 RNA 前
接 , 所 以 ,新 的 转 座 子 元 件 一 定 是 由 供 体 元 件 转录 的 剪接 RNA 分 子 的 逆转 录 产 物 一 -DNA
拷贝 。 因此 ,酵母 的 Tyl 转 座 子 也 被 称 为 道 转录 转 座 子 .虽然 芭 y 质粒 并 不 产生 感染 粒子 ,但 在
诱导 产生 转 座 的 细胞 内 部 却 积累 病毒 样 颗粒 ,其 中 含有 RNA 的 全 部 长 度 , 双 螺旋 DNA ,具有
逆转 录 酶 和 整合 酶 活力 的 TyB 的 产物 。TyA 产物 就 如 gag 前 体 一 样 断 裂 后 产生 “VLP?” 的 成
熟 的 核心 蛋白 , 这 使 Ty 转 座 子 与 逆转 录 病 毒 之 间 的 相似 性 更 进 了 一 步 , 因 此 ,Ty 的 转 座 子 就
像 丢 失 了 ezv 基因 而 不 能 包装 其 基因 组 的 逆转 录 病 毒 。

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822.

CA

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~]

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〈 曹 淡 君 )

人

第 七 章 “RNA 的 合成

第 5 莆 ii 请

细胞 中 的 遗传 信息 是 从 脱氧 核糖 核酸 CDNA) 到 核糖 核酸 (ribonucleic acid, 简称 RNA)，
再 由 RNA 到 和 蛋白质 。 第 五 章 已 讲 过 DNA 的 合成 (复制 ), 我 们 在 本 章 讨论 RNA 的 合成 ,RNA
的 合成 是 以 DNA 为 模板 ,合成 核糖 核酸 链 , 这 个 过 程 称 为 转录 (transcription)。 虽 然 RNA 的
合成 和 DNA 的 合成 ,从 核 苷 酸 的 水 平 上 看 来 ,是 很 相似 的 ,但 此 二 过 程 的 生物 学 意义 却 十 分 ，
不 同 .DNA 的 合成 仅 是 基因 组 的 精确 复制 ,并 且 固定 不 变 。 但 基因 组 转录 成 RNA , 却 涉及 许多
遗传 和 表达 的 复杂 性 .例如 ,基因 通常 在 转录 时 要 进行 调节 ,RNA 在 合成 的 不 同时 期 会 受到 改 ，
变 :一 条 RNA 链 在 DNA 模板 上 的 转录 ,从 何 处 起 始 , 何 处 停止 , 何 时 起 始 , 何 时 停止 ;如 何 使
二 者 达到 协调 一 致 等 ,都 是 很 重要 的 问题 。 有 关 基 因 表 达 的 分 子 生 物 学 最 新 进展 ,都 是 来 自 对 ”
DNA 序列 和 控制 转录 的 蛋白 质 因子 的 研究 ,特别 是 对 RNA 聚合 酶 的 研究 。 第 一 次 积累 的 基
本 资料 是 从 细菌 (主要 是 大 肠 杆菌 )RNA 聚合 酶 得 来 的 ,这 些 研究 结果 所 建立 起 来 的 原则 在 原
核 生物 中 具有 普遍 意义 ,但 在 真 核 生 物 中 就 要 复杂 得 多 。 本 章 将 从 RNA 的 基本 伯 过 涯 天 原核
生物 的 RNA ,并 进一步 谈 到 真 核 生物 的 RNA。

一 般 说 来 ,DNA 分 子 所 贮存 的 蛋白 质 遗 传 信息 , 必须 转变 成 信使 RNA 分 子 (mRNA)， 才
能 到 达 蛋 白质 合成 的 工厂 即 核糖 体 , 然后 ,蛋白 质 合 成 酶 系 才 能 把 mRNA 所 带 来 的 信息 翻译 ，
成 蛋白 质 。 在 合成 蛋白 质 过 程 中 , 还 需要 有 能 携带 氨基 酸 的 tRNA 和 构成 核糖 体 的 zRNA. 这 ”
3 类 RNA 都 必须 以 DNA 为 模板 ,在 依赖 于 DNA 的 RNA 聚合 酶 催化 之 下 合成 ,和 旬 括 RNA
链 的 起 始 ` 延 伸 和 终止 等 环节 ,上 述 一 系列 过 程 就 叫做 转录 或 RNA 的 合成 。 转 录 是 基因 表达 昌
的 第 一 步 , 也 是 关键 的 一 步 , 其 所 以 是 关键 ， oa 这 种 决定
的 调控 机 制 也 是 极其 重要 的 。

转录 过 程 有 两 个 重要 方面 :一 是 RNA 合成 的 酶 学 过 程 ; 二 是 RNA 合成 的 起 始 和 终 正 及
其 调控 。 早 在 50 年 代 , 人 们 就 对 RNA 的 合成 酶 进行 了 研究 ,了 解 比较 清楚 ;而 对 DNA 分 于 上 生 国
的 特定 序列 ,其 研究 的 开展 还 是 近 10 多 年 来 的 事 , 在 DNA 重组 技术 和 序列 分 析 发 展 的 情况
下 ,DNA 分 子 上 的 特定 序列 研究 ,也 获得 了 成 果 。 本 章 中 对 DNA 的 两 条 链 采 取 了 与 60 年 代 ，
相反 的 新 命名 法 , 即 把 不 做 模板 的 DNA 链 称 为 有 义 链 (sense strand ) ， 2 人
strand); 把 做 模板 的 链 称 为 反 义 链 (antisense strand) 或 模板 链 (template strand) ,这 是 新 的
示 方 法 ,因为 非 模 板 链 的 核 苷 酸 序列 与 转录 出 来 的 RNA 序列 一 致 ,只 是 工 与 有 所 区 别 ， 对
于 mRNA ,也 易于 将 DNA 序列 直接 与 氨基 酸 密码 子 联系 起 来 ,按照 新 的 表示 方法 ,大
3X 174; 其 DNA 进入 宿主 细胞 后 必须 复制 出 一 条 互补 链 而 成 为 双 链 超 螺旋 的 形式 ,才能 从 有 这
条 互补 链 上 转录 出 它 所 需要 的 RNA。 这 样 ,这 条 互补 链 就 称 为 反 义 链 ,又 称 为 负 链 ,而 能 够 进

人 噬菌体 颗粒 的 DNA 链 则 称 为 有 义 链 , 又 称 正 链 。 对 于 单 链 RNA 病毒 , 若 其 基因 组 RNA 能
174

人 够 作为 mRNA , 则 该 RNA 病毒 就 称 为 正 链 RNA 病毒 ; 若 基 因 组 RNA 进入 宿主 细胞 后 必须
通过 RNA 复制 ,产生 出 互补 链 作为 mRNA, 则 这 种 病毒 就 称 为 负 链 RNA 病毒 。

第 二 节 ”原核 生物 RNA 的 结构 及 种 类

一 RNA 的 结构

(一 )RNA 的 化 学 结构

RNA 合成 的 前 体 是 ATP,GTP,CTP 和 UTP 等 4 种 5'- 核 苷 三 磷酸 (rNTP)。 每 个 NTP 的
核糖 部 分 有 两 个 羟基 ,各 位 于 2 和 3'- 碳 原子 上 (图 7-1) 。 0

在 聚合 反应 中 ,一 个 核 苷 酸 的 3' -OH 基 团 与 第 二 个 9 09 一)
核 苷 酸 的 5' -磷酸 基 团 发 生 反 应 ,释放 出 焦 磷酸 ,形成 磷 “” 2” “

5
一 0 一 CH,_ 9 碱 基
4

酸 二 酯 键 ( 图 7-2) 。 这 与 DNA 合成 中 发 生 的 反应 相同 。 过 和 村 全
如 图 7-2 所 示 ,DNA 模板 链 上 的 C,T,G,A 分 别 与 图 7-1 5'- 核 苷 三 磷酸
RNA 分 子 中 的 G,A,C,U- 配 对 ,被 转录 的 DNA 分 子 虽 2'-OH 基 团 用 黑体 字 表示 ，
系 双 链 ,但 只 有 一 条 链 做 模板 。RNA 链 按 5 一 3 “方向 延 在 脱氧 核糖 中 被 H 所 取代 。
伸 , 与 模板 DNA 链 呈 反 平 行 。
部 三 磁 酸 本 5- 三 磷酸 了

它 达 本
马达 可 一

OO= oO 一

起
工

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5 志 z>

I> - 考

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o 一 P 一 0 一 忆
记 ls 本 o、 了 硕 基 .… 碱 基
PP EL Oo、 硕 基 … 碱 基 K
H
HA Wn HO- 一 TO
HO HO 革
5 5

图 7-2 RNA 聚合 酶 催化 链 伸 长 的 反应 机 制
焦 磷酸 基 团 (PPi) 和 框 中 的 氢 原 子 不 出 现在 RNA 链 中 。DNA 模板 链 和
RNA 链 是 反 平 行 的 ,和 双 链 DNA 中 的 情况 一 样 。 粗 箭头 连接 反应 基 团 。

(二 )RNA 形成 大 分 子 后 的 结构
与 DNA 不 同 ,RNA 几乎 常常 是 单 链 , 它 以 各 种 方式 在 DNA 模板 上 合成 。 有 的 RNA 分
子 像 蛋 白质 那样 ,具有 确定 的 结构 ,有 的 RNA 的 结构 则 是 不 太 确 定 也 不 十 分 稳定 。 几 乎 每 个
RNA 分 子 都 有 许多 短 的 双 螺 旋 区 域 , 双 螺 旋 区 域 的 形成 是 因为 在 一 条 RNA 链 的 发 严 结 构 之
内 碱 基 对 以 反 平行 方向 靠 氢 键 结合 之 故 ( 见 图 7-3) 。 除 了 正规 的 AU 和 GC 碱 基 对 之 外 ,结合
得 较 弱 的 GU 碱 基 对 在 形成 RNA 结构 中 也 起 作用 。 还 有 些 RNA, 如 tRNA 还 含有 较 多 的 互
175

补 序列 ,互补 序列 使 整个 RNA 分 子 形成 特殊 形状 ,如 三 叶 草 结构 。 二 级 结构 也 在 单 链 RNA 中
存在 ,如 形成 一 条 长 的 双 螺 旋 结 构 等 ( 见 图 7-3)。

UGGCGUUCGUACUUAAAUAUGGAAUU A

GCCUCAAGCAUCGCUUUUAACCUUAU ”人
图 7-3 RNA 的 某 些 结构

每 个 细胞 中 均 含 有 许多 不 同 的 RNA 分 子 , 其 长 度 从 小 于 50 个 核 昔 酸 大 到 万 个 以 上 的 核 | |
苷 酸 ,几乎 都 是 一 些 线 状 的 单 链 ,也 有 一 些 为 环 状 的 RNA 分 子 。

二 .RNA 分 子 的 种 类

RNA 分 子 有 3 大 类 , 即 信使 RNA(Cmessenger RNA 简写 mRNA) 、 核 糖 体 RNA(Criboso= ，
mal RNA 简写 rRNA) 和 转移 RNA(transfer RNA 简写 tRNA) .所 有 这 些 RNA 都 按 DNA 碱

基 序 列 合 成 .这 3 类 RNA 的 结构 与 功能 均 不 一 样 ,原核 与 真 核 的 RNA 也 不 一 样 , 此 处 先 谈 原
核 的 RNA。

(一 )mRNA

把 DNA 模板 链 上 的 碱 基 序列 ,转录 为 RNA 分 子 上 的 碱 基 序列 (mRNA) ,再 从 mRNA 上 用 三
的 碱 基 序列 通过 合成 蛋白 质 的 机 构 , 获 得 氨基 酸 的 序列 , 即 为 mRNA 的 功能 。mRNA 的 碱 基
序列 从 起 始 密码 到 终止 密码 以 3 个 碱 基 为 一 组 而 读 码 ,3 个 一 组 的 碱 基 称 为 密码 子 (codon )，
每 个 密码 子 对 应 一 个 氨基 酸 或 二 个 终止 信和 号。 对 应 于 一 条 多 肽 链 的 DNA 片段 加 上 起 始 信号、
终止 信号 称 为 顺 反 子 (cistron), 只 编码 一 条 多 肽 链 的 mRNA 称 为 单 顺 反 子 mRNA(mono-
cistronic mRNA) 。 由 一 条 mRNA 分 子 编码 几 条 不 同 的 多 肽 链 也 是 常 有 的 ,这 种 mRNA 称 为 中
多 顺 反 子 mRNA(polycistronic mRNA) 。 多 顺 反 子 mRNA 往往 对 应 于 一 个 代谢 途径 中 的 各 种 |
蛋白 质 .例如 ,在 大 肠 杆菌 中 半 乳 糖 代谢 需要 3 种 蛋白 质 , 它们 都 是 从 一 条 mRNA 分 子 介 成 的 ; 上
组 氨 酸 合成 所 需 的 10 种 酶 是 由 另 二 条 mRNA 分 子 编码 的 .细胞 利用 多 顺 反 子 比较 经 济 ; 因 各 上
种 蛋白 质 的 合成 便于 统一 调控 。mRNA 分 子 的 大 小 不 同 ,最 小 的 有 150 个 核 背 酸 长 ,一般 为 “是
900~~1 800 个 碱 基 , 大 的 如 组 氨 酸 mRNA, 编 码 10 个 蛋白 质 , 含 有 12 000 个 核 苷 酸 。 除 了 顺 反
子 、 转 录 所 需 的 起 始 序 列 和 终止 序列 外 ,mRNA 中 还 有 位 于 编码 区 前 的 前 导 区 (leader) ,此 区
位 于 mRNA 的 5 -P 端 和 起 始 位 点 ( 肽 链 合成 ) 之 间 , 有 些 前 导 区 中 含有 一 个 调节 区 称 为 弱化
子 (attenuator) , 它 调节 蛋白 质 合成 的 速度 。 在 5-P 和 3-OH 两 个 未 端 都 发 现 过 非 翻 译 区 ,多

顺 反 子 mRNA 分 子 还 含有 顺 反 子 间 序列 , 称 隔离 序列 (spacer) ,长 达 几 百 个 碱 基 。mRNA 的 奉
176

。 命 较 短 ,典型 的 mRNA 分 子 半衰期 是 几 分 钟 。

(二 ) 核 糖 体 RNA
核糖 体 是 合成 蛋白 质 的 场所 ,由 核糖 体 RNA .和 具有 各 种 功能 的 大 量 恒 白 质 组 成 。 核 糖 体

RNA 共 分 3 种 , 原核 生物 的 由 5S rRNA,16'S rRNA 和 23S rRNA 所 组 成 , 分别 含 有 120，
， 工 541 和 2 904 个 核 音 酸 。rRNA 是 稳定 的 分 子 , 其 前 体 比 成 熟 的 TRNA 分 子 大 。

(三 ) 转 移 RNA
tRNA 是 传递 氨基 酸 的 RNA ,此 类 RNA 的 分 子 也 比 原始 转录 物 小 得 多 ,并 且 富 含 稀 有 碱

| 基 , 稀 有 了 碱 基 都 是 转录 后 加 工 形成 的 ,成 熟 的 tRNA 常常 形成 三 叶 草 结构 。

第 三 节 RNA 酶 促 合 成 的 特点

一 `RNA 在 DNA 模板 上 酶 促 合成

前 已 述 及 ,RNA 实际 上 像 DNA 一 样 , 是 长 的 \ 不 分 枝 的 链 , 由 4 种 不 同 的 核 苷 酸 直接 将
DNA 链 上 的 遗传 信息 转移 到 互补 的 RNA 核 苷 酸 序列 上 , 腺 味 叭 与 RNA 的 尿 喀 啶 ; 鸟 味 叭 与
RNA 的 胞 喀 喧 配对。 这 说 明 , 某 些 控制 机 制 必须 使 DNA 链 分 离 , 并 为 互补 的 RNA 链 充当 模板 。

上 述 推测 为 RNA 聚合 酶 (RNA polymerase) 的 发 现 所 证 实 。RNA 聚合 酶 存在 于 一 切 细
胞 中 ,一 个 大 肠 杆 苗 细胞 大 约 有 3 000 个 分 子 的 RNA 聚合 酶 ,此 酶 将 核糖 核 苷 酸 聚 合 在 一 起 ，
催化 形成 核 苷 酸 之 间 的 3 一 5 磷酸 二 酯 键 ,形成 分 子 的 骨架 (^ 见 图 7-4) 。 酶 以 这 种 方式 作用 时 ，
必须 有 DNA 的 存在 ,DNA 必须 将 正确 的 核 苷 酸 排 成 一 列 , 以 便于 RNA 聚合 酶 起 催化 反应 。

[ 原 厌 哈 ] - 核糖 -~(B)-( 四 | DpNA 模板 |[ 腺 大 叭 ] - 核糖 ~
[ 芭 藉 叭 ] - 核糖 -D-~(D-(D| RNA 聚合 酶 | [本 项 叭 ] - we

[网 哮 啶 | - 核糖 -(D- 人 ~@) ae
[ 屎 哮 吁 ] - 核糖 ee -oa

二

7-4 在 RNA 合成 中 催化 形成 的 3 一 5 磁 酸 二 梧 键
“虽然 ,RNA 聚合 酶 在 合成 RNA 时 通常 用 的 是 双 链 DNA ,实际 上 酶 用 的 模板 都 是 单 链
DNA.。 当 酶 通过 时 , 双 螺 旋 DNA 一 小 段 解 链 , 酶 用 单 链 DNA 做 模板 合成 RNA.。 此 现象 在 @X
174 病毒 的 实验 中 观察 得 很 清楚 。 此 病毒 属于 单 链 DNA 病毒 , 当 其 作为 RNA 的 模板 时 ,只 有
一 条 DNA 链 存在 ,而 它 的 产物 则 是 一 条 与 DNA 链 互补 的 RNA 链 ( 见 表 7-1)。 这 时 可 以 分 离
出 来 DNA-RNA 的 杂交 双 链 。 当 模板 是 双 链 时 ,RNA 合成 后 便 迅速 脱 离 DNA 模板 ,两 个 分 开 ，

]

的 DNA 链 又 重新 结合 在 一 起 ,不 能 分 离 出 DNA-RNA 杂交 链 。
表 7-1 用 单 链 OX 174 病毒 DNA 做 模板 酶 促 合 成 RNA 的 碱 基 组 成

GX 174 DNA RNA 产物 的 观察 值 预期 的 RNA 组 成
腺 叶 叭 0. 25 0. 32 0. 33
尿 喀 喧 0. 33( 胸 腺 喀 啶 ) 0. 25 0. 25
鸟 味 叭 0. 24 0. 20 1 卫 下
胞 喀 啶 0. 18 0. 23 0. 24

总 计 1.00 1. 00 1. 00

由 此 ,我 们 看 到 RNA 的 合成 与 DNA 的 合成 原理 基本 上 是 一 致 的 。 这 两 种 合成 的 直接 前
体 都 是 核 苷 三 磷酸 ,从 它 的 一 个 焦 磷 酸 键 获得 能 量 促使 反应 走向 合成 ; 另 一 种 相似 的 情况 是 时
两 种 合成 都 是 一 个 酶 为 4 种 核 苷 酸 工作 ,为 了 碱 基 的 配对 ,必须 做 出 正确 的 选择 。
RNA 合成 过 程 也 很 精确 , 但 不 像 DNA 有 校对 机 制 , 因此 ,精确 程度 不 及 复制 ,DNA 的 复制
系统 相当 完美 ,拷贝 得 很 精确 , 而 细胞 中 的 RNA 不 是 自我 复制 的 ,所 以 ,能 产生 非 遗传 上 的 差错 。

二 ` 只 有 一 条 DNA 链 作为 一 个 基因 的 RNA 模板

假如 一 个 已 知 基因 两 条 DNA 链 的 每 一 条 都 可 作为 RNA 的 模板 , 则 每 个 基因 将 会 产生 两
个 RNA 产物 ,而 此 两 个 RNA 产物 是 互补 的 。 但 是 ,遗传 学 的 证 据说 明 ,每 个 基因 只 有 一 种 蛋 上
白质 。 这 就 有 两 种 可 能 ,一 种 是 两 条 DNA 互补 链 只 产生 出 一 条 RNA; 另 一 种 是 合成 了 两 知
RNA, 但 只 有 一 条 RNA 有 功能 。 看 来 前 一 种 可 能 性 是 对 的 ,在 生物 体内 只 发 现 一 条 RNA ,这 上
在 检测 病毒 SP8 合成 RNA 的 过 程 中 就 可 以 获得 证 据 。SP8 病毒 是 在 枯草 杆菌 (Bacizzus sxi
42i5) 中 繁殖 的 ,而 且 碱 基 序 列 很 独特 ,很 容易 与 别 的 RNA 或 DNA 的 序列 区 分 开 , 这 样 就 易于
鉴别 其 DNA 是 产生 了 一 条 RNA 或 两 条 RNA.。

DNA) DNA，

一 OA

| 热处理 使 所 键 断 裂 |

“5 只 有 一 条 DNA 链 与 RNA 互补 试验
178

此 项 试验 的 过 程 是 ,加 热 双 链 DNA ,使 分 开 成 单 链 ,再 与 此 DNA 产生 的 RNA 混合 ,使 形

”成 人 工 的 DNA_RNA 杂交 分 子 , 即 可 检测 出 结果 .具体 的 做 法 是 ,加 热 DNA 分 子 , 温 度 要 恰好
， 低 于 100'C ,使 互补 氢 键 断 裂 ,DNA 变性 ,两 条 链 很 快 分 开 。 如 温度 逐渐 降低 , 则 DNA 复 性 ,两

条 链 的 氢 键 又 重新 形成 。 假 如 有 该 DNA 合成 的 RNA 分 子 存在 时 ,缓慢 冷却 就 会 出 现 DNA-
RNA 杂交 分 子 , 就 像 DNA 双 螺 旋 复 性 那样 。 此 一 试验 图 示 于 8-5, 从 试验 中 我 们 可 以 看 到 ,只
有 一 条 SP 8 的 DNA 链 与 RNA 互补 。

图 7-5 用 DNA-RNA 杂交 链 的 检 出 试验 说 明 , 一 个 做 模板 的 双 链 DNA, 与 其 合成 的

| RNA 之 间 , 只 有 一 条 DNA 链 可 与 RNA 链 形成 DNA-RNA 杂交 分 子 。 图 的 左边 说 明 ,DNA

解 链 后 混 人 其 拷贝 的 RNA ,可 形成 DNA-RNA 杂交 物 。 右边 的 图 说 明 , 将 RNA 混 人 其 非 模板
链 的 DNA 中 ,无 DNA-RNA 杂交 分 子 形成 。

以 上 结果 还 解释 了 为 什么 双 链 DNA 的 碱 基数 目 A 等 于 工 , 而 G 则 等 于 C, 但 产生 了 RNA
后 ,这 种 比例 就 没有 了 。 不 过 , 单 链 DNA 分 子 产 生 了 RNA 链 时 ,A 与 U,G 与 C 则 接近 相等 。

三 .RNA 链 按照 一 个 固定 的 方向 合成

OH on 3 3 OH
o-o-@ | | 一 一 > -oO-@|l
RNA 聚合 生
VAN 由 |
5 5 5 5 全
(a) 链 生 长 的 方向 5->3' 5
上 焦 厂 酸 本
2@
G@ @
焦 磷 酸 栈 9 9
@ 〇 -9 四 3 oh Ag
[Eeelalal < 一 一 o-oe@| ooels
2 RNA 聚合
| 站 风 |
(b) 链 生长 的 方向 3' 一 5'
9 四 Q@ O Oo Q

5 (d)
3' -脱氧 腺 苷 三 雁 酸
〈c)3' -脱氧 腺 苷 三 磷酸 摊 入

图 7-6 RNA 合成 的 方向 图
(d) 无 3' -羟基 团 与 下 一 个 核 苷 三 磷酸 反应 , 链 生长 终止 。

T 构

像 每 一 条 DNA 链 那 样 , 每 条 RNA 链 均 有 被 糖 磷酸 骨架 所 规定 的 走向 。 链 的 末端 被 5 碳
原子 结尾 , 称 5 -未 端 ;而 含有 3' 碳 原子 的 一 端 则 称 为 3' -末端 .就 像 DNA 合成 那样 ,RNA 链 的
汪 长 顺序 只 从 两 端 中 的 一 端 开始 是 比较 合理 的 ,不 是 从 5 -3' ,就 是 从 3-5 。 假如 RNA 生长 是
从 5 一 3 ， 则 我 们 将 预料 核 昔 酸 开始 于 一 个 ~ ~@( 三 磷酸 ) 基 团 ; 假如 链 的 生长 是 从 3' 一
5 , 则 生长 未 端的 核 苷 酸 应 含有 Br~B~ 吕 基 团 。 可靠 的 证 据 表 明 , 生 长 的 方向 为 5 一 3 ， 新 摊
入 的 核 苷 酸 都 在 3' -未 端 发 现 ,而 @ 一 @ 一 叫 基 团 则 在 链 开始 生长 的 核 背 酸 上 发 现 。

用 代谢 抑制 剂 ,3' -脱氧 腺 苷 可 以 证 明 RNA 的 合成 方向 是 5 ~3。3 -脱氧 腺 苷 与 腺 昔 相
似 ,但 在 3' 处 缺 氧 原子。 当 将 3' -脱氧 腺 苷 加 入 细胞 中 后 , 它 首先 被 磷酸 化 成 3 -脱氧 腺 苷 - 叱 - 沁
@ 一 人 ,然后 连接 到 3' 的 生长 端 上 去 ,因为 它 不 含 3 -OH 基 团 ,其 它 核 苷 三 磷酸 就 不 再 能 与 其
结合 ,RNA 合成 就 终止 。 这 就 说 明 合成 方向 是 5 一 3， 如 为 3 一 5 ,抑制 剂 是 不 能 挫 人 的 。

图 7-6(a) 与 (b) 中 说 明 ,RNA 合成 的 方向 总 是 从 5 一 3 的 。(c) 说 明 ,3 = 脱氧 腺 苷 三 磷酸
的 结构 及 其 挫 入 一 条 从 5' -3' 生 长 中 的 RNA 链 的 3 -未 端 , 及 其 使 RNA 合成 停止 的 情况 。 ，

第 四 节 RNA 聚合 酶

一 RNA 聚合 酶 的 结构
号 :

像 DNA 聚合 酶 下 那样 ,细菌 RNA 聚合 酶 也 有 一 个 很 复杂 的 亚 基 结 构 。 在 有 活性 的 状态
时 ,全 酶 的 沉降 系数 约 为 15S, 含 有 5 种 不 同 的 肽 链 ,8 ,8,c,e 和 ,它们 的 分 子 量 顺 次 为 量
155,151,70,36.5 和 约 为 11 kD( 以 上 均 为 大 肠 杆 菌 的 ) 。 各 链 之 间 没 有 共 价 键 相连 , 仅 靠 次 级
键 聚 合 。 在 有 活性 的 分 子 中 ,其 它 亚 基 仅 出 现 一 次 ,但 例外 ,为 两 次 。 全 酶 为 太 Basw5, 分 子 量
约 为 450 kD( 见 图 7-7, 表 7-2)。 假 如 此 酶 为 球状 ,RNA 聚合 酶 的 直径 大 约 为 10 nm, 有 30bP
的 双 螺 族 DNA 链 那样 长 . 然而 ,实际 上 它 与 DNA 结合 时 , 巴 盖 60 个 核 首 酸 ,这 表明 它 具有
伸 的 形状 。
人 们 企图 使 细菌 RNA 聚合 酶 的 复杂 性 与 RNA 合
成 的 起 始 、 延 伸 和 终止 等 各 个 酶 促 步骤 联系 起 来 .但 鸣 菌
体 工 7 编码 的 RNA 聚合 酶 虽 只 含 一 条 分 子 量 为 98 kD
的 链 , 却 具 有 所 有 这 些 功能 。 细 菌 酶 的 结构 为 何如 此 复
杂 , 想 必 是 细菌 的 转录 较为 精确 和 进行 调控 所 需要 的 。 可
惜 至 今 尚 不 能 深入 了 解 细菌 RNA 聚合 酶 的 三 维 结构 ，
原因 是 此 酶 太 大 ,难于 进行 X 射线 结晶 学 研究 ,也 还 没 项 而
有 制 出 此 种 酶 的 晶体 。 Se y
5 与 其 它 亚 基 的 结合 不 是 特别 牢固 的 ,所 以 , 它 与 8 Baaw 团聚 在 一 起 的 亚 基 很 易 分 离 . 忆 Bac
形成 的 聚集 体 称 为 核心 酶 (core enzyme) , 因为 不 管 是 否 有 存在 它 同样 有 效 地 催化 形成 核 苷 酸
间 的 磷酸 二 酯 键 。 催 化 中 心 看 来 在 核心 酶 的 8 亚 基 上 ,有 亚 基 也 是 抗菌 素 利 福 平 (rifampicin) 一 类
药剂 的 结合 部 位 。 利 福 平 是 此 酶 的 有 效 抑制 剂 , 它 阻 止 RNA 链 的 起 始 ,但 不 影响 以 后 的 延伸 。 抗 ，
利 福 平 的 突变 菌株 ,其 突变 位 点 即 在 编码 8 的 基因 7poB 位 点 上 。p 亚 基 基 因 的 突变 ,是 一 种 非 致
命 的 突变 ,对 RNA 聚合 酶 功能 的 影响 很 微妙 。 利 链 菌 素 Cstreptolydigin ) 也 是 一 种 抗菌 素 , 它 抑

制 RNA 链 的 延伸 ,突变 细菌 对 此 抗菌 素 产生 抗 性 , 也 是 在 编码 8 的 基因 上 产生 突变 。
180

表 7-2 大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 的 亚 基 和 转录 因子
人

基因 名 (min )
RNA 聚合 酶 亚 基
尼 rpoC 89.5 155 1 与 DNA 结合 ?
8 7- 力 0 及 89.5 ji 1 RNA 聚合 酶 作用 的 催化 部 位
ca rpoD 66.5 70 1 识别 启动 子 , 并 启动
7oo4 72 证 语 5 2 ?
包 一 一 有 | 吕
转录 因子
D zho 84.5 46 6 终止
12234 7234 65 69 1 延伸 ,终止
* 基因 图 指 大 肠 杆菌 的 常规 环形 基因 图 。

二 .RNA 聚合 酶 的 基因

大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 亚 基 的 基因 ,除了 w 的 基因 未 知之 外 ,都 在 3 个 操纵 子 中 找到 ,其
中 也 含有 其 它 一 些 基 因 ( 见 图 7-8) 。
5 操纵 子

化 子
有 操纵 子

和 P P

一 侈 请
=IHZTE
c 操 纵 子

P

RE
salsuil se He HL7

图 7-8 3 个 含有 RNA 聚合 酶 亚 基 基因 的 操纵 子 图
国 削 示 DNA 事 合 酶 .

7-8 列 出 3 个 含有 RNA 聚合 酶 亚 基 ,8,8 和 wx 的 基因 的 操纵 子 。 主 要 的 启动 子 (P) 在
左 侧 ,RNA 向 右 合成 。 次 要 的 启动 子 (P) 可 以 在 这 些 操纵 子 中 找到 ,它们 只 能 启动 和 转录 它们
右 侧 的 基因 ,其 中 一 个 Cs) 含 在 c 操纵 子 中 , 它 在 热 激 条 件 下 有 活性 。p8 操纵 子 头 两 个 基因
列 1 和 ZL1 有 时 可 以 看 成 一 个 单独 的 操纵 子 , 因为 在 基因 工 10 前 有 一 个 启动 子 。

这 些 基因 与 一 些 其 它 蛋 白质 基因 组 合 在 一 起 ,很 明显 是 共同 调节 的 需要 ,这 种 需要 与 细胞
的 生长 速度 密切 相关 ,但 是 这 些 操纵 子 是 如 何 调节 的 尚 不 得 而 知 。 虽然 知道 " 操纵 子 有 两 个 串
连 的 启动 子 , 就 像 核糖 体 RNA 的 操纵 子 一 样 ,想必 也 是 按 生 长 速度 受 PPGpPp 分 子 控制 的 ，
ppGpp 是 鸟 呆 叭 在 其 忆 端 和 3' 碳 原子 上 各 连 有 两 个 磷酸 ,过 去 也 写成 四 ~ 中-G 一 @~@. 这
此 基因 在 这 些 操 纵 子 中 ,都 不 是 平均 表达 的 。

三 .RNA 聚合 酶 的 识别 功能 与 启动 子

0 亚 基本 身 并 无 催化 功能 ,其 作用 为 识别 DNA 分 子 上 的 起 始 信和 号。 体外 试验 证 明 ,缺乏
5 的 核心 酶 只 会 偶然 性 地 启动 RNA 的 合成 ,但 这 是 错误 启动 的 结果 。 当 RNA 链 只 被 核心 酶
181

-35 区
TTGACA

ET

5' -CCCCAGGCTTTACACT TTATGCTTCCGGCTCGTAT
3' .GGGGTCCGAAATGTGAAATACGAAGGCCGAGCATA | 如

Ga) (2)

T 一

cG 丰
G

撒

207 亡 CT 碍

县 SC
了

A 路

1 乱 。 不

ET 三

一 30 ap 和 全

2 虽
人

一 35 区 T 寻
T
T
C
二 二 每
G
2 人
一 40 eaB 人
C
am 全 人
C

em 国 国 人 m
C

(b) mp G mn
2 G

182

〈1) (2)

图 7-9 启动 子 的 共有 序列 和
RNA 聚合 酶 的 结合 部 位

-10 区

TATATT

共有 序列
的

习 39 人 休 AATGTGTGGAAT 上
De TGTGCAGCC2 3
(PDDAA-

ACACTCG- 5

RNA 链 的 起 始

J >TTACNAEXACCTA

由
下
(3)

合成 时 , 则 会 随机 地 在 一 个 基因 的 两 条 链 上 启动 . 光 ，
有 = 时 ,就 会 选择 正确 的 位 点 ,全 酶 能 够 专 一 地 与 一
个 “启动 序列 ”结合 ,这 个 序列 就 是 启动 子 。
DNA 结构 的 何 种 特征 引导 细菌 RNA 聚合
仅 结 合 于 启动 子 上 呢 ? 显然 , 某 些 核 苷 酸 序列
DNA 产生 能 与 RNA 聚合 酶 契合 的 局 部 构象 ,正如

酶 与 自己 的 底 物 相 结合 一 样 。 对 100 多 个 启动 子 做
过 的 比较 说 明 , 大 约 在 RNA 合成 起 点 之 前 的 10bpl
和 35 bp 处 ,有 两 个 由 6 个 组 成 的 共有 序列 ，

这 些 茂 基 被 合 名 为 二 35 和 一 10 序列 , 这 利和 将 编码
上 少数 启动 子 正好 具有 一 10 区 和 一 35 区 的 共有 序列
《consensus sequence) ,大 多 数 共 有 序列 仅 有 少数 几
个 核 苷 酸 不 同 ( 图 7-9)。
7-9 表示 启动 子 的 共有 序列 和 RNA 聚合 酶
的 接触 位 点 。(a) 在 一 35 区 和 一 10 区 共有 序列 的 下
面 是 一 个 称 为 乳糖 UV5 的 启动 子 。RNA 聚 合 酶 与
启动 子 中 ,尤其 一 35 和 一 10 附近 的 碱 基 L 上 画 有 标
记 符 号 和 分 子 骨 架 中 的 磷酸 基 ( 符 号 标 在 碱 基 中
间 ) 相 接触 。(1) 被 RNA 聚合 酶 保护 , 免 于 受 化 学
或 光化学 作用 的 碱 基 ; (2) 在 开放 复合 物 中 ,与 RNA
聚合 酶 结合 的 磷酸 ; (3) 开 放 复 合 物 中 ,被 RNA 聚
合 酶 解 链 的 区 域 。 本 次 试验 表明 至 少 有 12 bp 的 片
段 解 链 , 有 的 试验 指出 解 链 片段 为 17 个 碱 基 。(b) 乳
糖 UV5 启动 子 的 “足迹 分 析 ”(footprint analysis )
(1) 在 用 限制 性 脱氧 核糖 核酸 酶 处 理 前 启动 子 先
RNA 聚合 酶 结合 ;(2) 在 没有 RNA 聚合 酶 的 条 件 下 『
用 脱氧 核糖 核酸 酶 处 理 。 受 RNA 聚合 酶 保护 的 ，
DNA 序列 能 免 受 DNA 酶 的 限制 性 核酸 酶 消化 。 这
个 实验 说 明 ,RNA 聚合 酶 覆盖 了 50 一 60 个 DNA 碱
基 , 覆 盖 部 位 使 核酸 酶 不 能 靠近 和 消化 磷酸 二 酯 键 。

-保护 试验， 化 学 修饰 "试验 等 , 强 有 力 地 证 明 ,这 些 序列 是 启动 子 的 关键 部 分 。 第 一 ，
| RNA 聚合 酶 是 在 一 35 区 和 一 10 区 序列 中 与 磷酸 与 碱 基 接触 ;第 二 , 较 弱 的 启动 子 与 共有 序列

区 别 较 大 , 较 强 启动 子 与 共有 序列 更 为 接近 ;第 三 ,此 点 最 明显 , 即 75% 的 能 摧 筑 启动 子 功能
的 突变 都 发 生 在 共有 序列 中 ,其 余 25%% 的 变化 也 在 共有 序列 附近 发 生 ( 见

-35 |
共有 序列 TTGACA TATAAT

图 7-10) 。

/ RNA 起 始 位 点
色 氨 酸 操 纵 子 AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTA

酷 氨 酸 tRNA AACGTAACACTTTACAGCGGCGCG-TCATTTGATATGATGCGCGCCCCGCTTECCECCGATA
T

CRYE 5
乳糖 操纵 子 TI CCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTC

和 噬菌体 启动 子 PTCTGGCGGTGT TGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCAGCAGGACG
，

T

AT
入 两 个 碱 基 发 生变 化
一 个 碱 基 缺失

部 分 缺陷

攻
一 一 一 一 一

GC

具 抗 性 的 P22 AGTTAGTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATATTCTCAATAGGTCCACGG
六 生
ER

噬菌体 启动 子 本 人
上
|
沁
图 7-10 5 个 启动 子 的 突变 体

本 1
和
图 9-10 是 5 个 启动 子 的 突变 体 。 突 变 的 减少 ,用 向 下 的 箭头 表示 ; 突变 的 增加 ,用 向 上 的
箭头 表示 。

两 个 结合 区 距离 大 约 20 bp ,或 者 是 双 螺 放 两 个 整 图 。 由 于 两 个 结合 区 均 在 DNA 分 子 的
同 侧 酶 必须 与 曙 旋 的 同一 侧面 结合 , 栈 还 必须 识别 每 一 结合 区 的 专 一 结构, 这 些 专 一 的 结构
都 是 在 四 模 的 底部 由 碱 基 对 构成 的 ( 见 图 7-11)。

T AS
|
A

很 大 缺陷

封闭 复合 物

起 始 核 苷 酸
图 7-11 RNA 聚合 酶 与 DNA 结合 形成 封闭 和 天 放 的 启动 子 复合 物

图 7-11 说 明 ,RNA 聚合 酶 与 启动 子 刚 开始 结合 时 是 封闭 复合 物 ; 当 DNA 链 分 开 ,RNA
链 开始 延伸 就 形成 了 开放 复合 物 。RNA 链 的 起 始 三 磷酸 核 苷 也 在 图 中 给 出。

四 .RNA 聚合 酶 与 DNA 结合 并 使 之 解 链

大 肠 杆菌 RNA 聚合 酶 与 一 个 启动 子 结合 有 两 个 明显 的 步骤 ( 见 图 7-11)。 首 先 , 酶 ` 发现”
启动 子 的 序列 并 与 之 结合 成 较 松 弛 的 “封闭 型 复合 体 。 此 一 步骤 大 都 发 生 在 一 35 区 ,改变 了
一 35 区 碱 基 序列 的 突变 体 , 就 降低 了 这 种 结合 功能 ;第 二 ,封闭 型 复合 体 转变 成 开放 型 “复合
体 , 此 时 RNA 聚合 酶 与 DNA 结合 得 更 紧密 。 开 放 型 复合 体 在 一 10 区 解 链 ， 解 链 范围 约 为
17 bp , 解 链 有 使 模板 暴露 的 作用 ， 在 暴露 的 模板 上 聚集 了 等 待 合成 RNA 的 核 苷 酸 。 通 过 研究
发 现 ,一 10 区 内 含有 丰富 的 AT 碱 基 对 ,由 于 AT 融 解 比 GC 容易 , 故 对 解 链 有 利 ; 进 一 步 研 究
证 明 ,一 10 区 内 的 碱 基 序列 常 有 改变 ,但 AT 含量 保持 不 变 。 一 10 区 内 碱 基 序 列 突变 , 则 开放
型 复合 物 不 能 形成 。 开 放 型 复合 物 一 旦 形成 ,DNA 就 继续 解 链 ,将 解 链 区 向 启动 子 一 10 区 以 |
外 远离 启动 子 的 方向 移动 。

五 不同 的 c 因子 使 RNA 聚合 酶 识别 不 同 的 启动 子 序列

RNA 聚合 酶 的 核心 酶 能 够 催化 RNA 的 合成 ,但 要 识别 启动 子 序列 , 却 一 定 要 有 = 因子 。
这 一 结论 的 证 据 来 自 于 不 同 c 因子 的 发 现 。 这 些 不 同 的 起 主要 作用 的 c 因子 可 以 指导 RNAI
聚合 酶 作用 于 不 同 的 启动 子 上 ,这 些 非常 c 因子 识别 的 启动 子 序列 和 主要 的 启 动 子 序列 有 很
大 的 区 别 。 j
这 类 特殊 的 e 因子 在 细胞 中 执行 一 些 特殊 功能 ,使 某 一 些 或 某 一 套 基因 能 够 表达 。 首先 被
发 现 的 是 枯草 芽 胞 杆菌 中 负责 生成 芽 胞 的 c 因子 。 在 大 肠 杆 菌 中 ,有 一 种 “ 因子 (o2) ,能 够 识
别 热 激 蛋 白 基因 的 启动 子 , 它 启动 热 激 基因 的 表达 , 当 细胞 周围 的 温度 急剧 上 升 , 热 激 基因 表
达 后 就 产生 热 激 蛋白 质 。 还 有 一 些 噬菌体 产生 的 “ 因子 ， 在 只 菌 体 发 育 时 ， 为 噬菌体 转录 产生
必需 的 蛋白 质 。 和

最 近 的 研究 说 明 , 叭 菌 体内 编码 合成 的 x 因子 ， 在 指导 合成 大 大 杆 菌 碰 菌 体 下 4 晚期 基因
时 ,ca 因子 只 与 一 10 区 结合 T4 晚期 启动 子 的 一 35 区 序列 可 以 用 基因 工程 的 方法 改变 而 不 会
损害 启动 子 的 功能 。 这 说 明 对 一 35 区 的 结合 可 能 是 不 需要 的 ,需要 结合 的 是 一 10 区 。

第 五 节 己 动 子

一 \ 启 动 子 的 不 同 效率

从 上 述 资料 可 以 看 出 ,各 启动 子 的 效率 是 不 一 样 的 ,在 一 些 序列 上 转录 得 好 一 些 ; 另 二 些
较 差 。 转录 得 好 的 启动 子 可 以 使 RNA 合成 从 开始 到 终止 重复 得 更 快 一 些 ( 即 轮换 速度 快 ) 。 生
化 试验 说 明 ,启动 子 开始 与 酶 结合 和 开放 型 复合 物 的 形成 这 两 个 步 又, 在 启动 子 之 间 效 率 是 不
相同 的 。 因 此 ,细胞 中 的 启动 子 在 启动 速度 上 可 以 划分 成 不 同 的 等 级 ,有 的 是 10 nn 或 00 二
分 钟 启动 一 次 ,有 的 仅 1 一 2 s 内 启动 一 次 。 这 是 一 个 基本 的 限 速 步骤 ,在 这 一 步骤 的 基础 上 于，
基因 表达 的 速度 就 确定 了 。

二 、 调 节 蛋 白 对 启动 子 的 影响

一 个 特定 基因 的 转录 速度 不 是 固定 不 变 的 , 它 需要 在 不 同 的 生长 环境 中 根据 情况 来 改变
184

|

转录 的 节奏 ,这 就 是 基因 的 调节 。 在 大 肠 杆菌 中 ,转录 的 调节 经 常 有 蛋白 质 介 和 ,这 种 蛋白 质 在
启动 子 附近 ,或 在 启动 子 内 部 ,它们 起 增加 或 降低 RNA 聚合 酶 启动 RNA 合成 速度 的 作用 。

这 些 蛋白 质 包 括 阻 过 物 , 它 阻 碍 RNA 聚合 酶 的 结合 ,从 而 抑制 转录 ;还 包括 激活 剂 , 它 与
RNA 育 合 酶 结合 并 刺激 其 活性 。 需 要 激活 剂 的 启动 子 常 与 一 35 区 的 共有 序列 结合 较 弱 ,看 来
激活 剂 是 补足 结合 位 点 的 这 一 功能 。 还 有 一 种 情况 是 ,一 个 蛋白 质 是 一 个 启动 子 的 阻 歇 物 ,也
可 能 是 另 一 个 启动 子 的 激活 剂 , 也 有 反 过 来 的 情况 。 根 据 调 节 和 蛋白 首次 发 现 的 位 置 和 功能 , 往
往 以 该 情况 下 的 条 件 命名 。 某 些 重要 的 调节 蛋白 载 于 表 7-3 中 。

表 7-3 ”影响 启动 子 功能 的 调节 蛋白

蛋白 质 ea 在 细胞 中 的 功能
屯 糖 划 过 物 画 上 顷 胞 缺 糖 时 ,阻止 合成 代谢 乳糖 的 蓝
半 屯 糖 阻 过 物 阻止 细胞 缺 糖 时 ,阻止 合成 代谢 半 乳 糖 的 酶
LexA 阻 过 物 阻止 细胞 DNA 无 损伤 时 ,阻止 合成 DNA 修复 酶
1 阻 遇 物 阻止 阻止 合成 为 溶菌 生长 所 需 的 蛋白 质

(Pt 与 PR 启动 子 )
) 阻 过 物 激活 用 刺激 本 身 启动 子 的 办 法 来 增加 自身 的 合成

(PRM 启 动 子 )
CAP 蛋白 阻止 葡萄 糖 缺 乏 时 ,调节 自身 的 基因 ,并 且 阻 止 其 它 不 需要 蛋白 质 的 合成
CAP 蛋白 激活 葡萄 糖 不 能 利用 时 ,增加 代谢 其 它 糖 的 酶 的 合成
Arac 蛋白 阻止 细胞 无 糖 时 ,阻止 代谢 阿拉 伯 糖 的 酶 的 合成
AraC 蛋白 激活 有 阿拉 伯 糖 可 利用 时 ,增加 利用 阿拉 伯 糖 所 需 的 蛋白 质 的 合成
Me 工 蛋 白 激活 刺激 建立 溶 源 性 所 需要 的 噬菌体 蛋 白质 的 合成

三 上游 DNA 序列 可 增强 启动 子 的 活性

虽然 启动 子 的 一 10 区 和 一 35 区 中 的 6 个 碱 基 序列 是 RNA 聚合 酶 结合 和 启动 的 必需 序
列 , 但 它们 附近 的 其 它 DNA 序列 也 能 影响 启动 子 的 功能 。 例 如 ,在 启动 子 位 点 上 游 50 一 150
核 背 酸 之 间 的 自然 序列 在 合成 核糖 体 RNA 时 能 增强 启动 子 的 活性 。 假如 这 些 序列 缺失 ,或 以
外 源 DNA 代替 (如 一 个 质粒 DNA 进入 此 一 序列 中 ), 则 此 核糖 体 RNA 基因 在 进行 克隆 和 表

达 时 ,启动 的 速度 将 降低 10 倍 。

另外 ,上 游 序列 在 某 些 时 候 可 以 作为 一 些 激活 剂 的 结合 部 位 ,直接 激活 RNA 聚合 酶 。 有
时 启动 子 上 游 序 列 还 可 以 和 一 个 拓扑 异 构 酶 结合 ,此 酶 可 以 诱导 DNA 形成 有 利 的 超 螺旋 状
态 , 以 利 RNA 的 合成 。 上 游 序列 还 可 帮助 DNA ,使 RNA 聚合 酶 能 更 好 地 接近 DNA 的 启动
区 层 , 或 者 使 DNA 与 蛋白 质 结 合 固定 在 细胞 结构 上 。 最 后 存在 着 这 样 的 可 能 ,一 些 专 一 性 序

。 列 所 引起 的 DNA 结构 上 的 微妙 差别 会 沿 螺旋 传递 很 长 距离 ,所 以 , 某 一 特定 的 上 游 序 列 可 以

影响 一 10 和 一 35 区 的 DNA 结构 。
四 、 模 板 的 超 螺旋 张力 对 启动 子 效率 的 影响

由 于 RNA 聚合 酶 在 开始 合成 RNA 之 前 ,必须 在 启动 子 处 解 开 DNA 链 , 有 助 于 或 妨碍
解 链 的 条 件 必然 增加 或 降低 RNA 合成 的 起 始 速度 。 在 细胞 中 DNA 筑 板 超 螺旋 的 张力 是 影响
起 始 的 重要 条 件 之 一 .DNA 旋转 酶 (gyrase) 使 DNA 产生 负 超 螺旋 作用 ，
但 负 超 螺旋 作用 又 受 拓 扑 异 构 酶 I(topoisomerase IT) 的 抗衡 , 它 使 过 度 的 负 超 螺旋 松弛 。 上 述
两 种 酶 的 调节 ,可 使 DNA 达到 解 链 的 最 适 状 态 。 突变 或 抑制 剂 引起 的 上 述 酶 活性 的 改变 都 能

185

使 启动 子 的 功能 向 所 希望 的 方 回 肥 展 。 如 旋转 酶 抑制 剂 蔡 啶 柄 Cnalidixic acid) 可 抑制 许多
六 的 委 达 .使 编码 拓扑 异 构 酶 I 的 基因 突变 , 可 产生 相反 的 效果 ,增加 了 茶 些 基 因 的 表达 。 当

细胞 中 的 DNA 的 负 超 螺旋 充分 时 ,DNA 旋转 酶 的 合成 就 降低 了 ,这 是 细胞 的 自我 调节 。

第 六 节 RNA 的 酶 促 合成

一 .RNA 合成 的 起 始

(一 )RNA 链 的 合成 从 pppA 或 pppG 开始

RNA 合成 的 开始 ,实际 上 发 生 在 解 链 区 段 的 一 端 ,此 端 大 肠 杆 菌 RNA 聚合 酶 与 之 结合

结合 位 置 在 解 链 区 段 之 内 (图 7-9 与 图 7-11) ,大 约 在 自 一 10 区 起 第 12 或 13 个 碱 基 处 。 区
办 pppA 或 pppG, 有 时 是 pppC,pppU 很 少见 。 有 时 酶 一 开始 偶然 落 在 附近 几 个
核 苷 酸 上 ,这 时 酶 就 扫描 解 链 区 ,寻找 一 个 呆 叭 做 起 点 ,如 无 叮 叭 ,第 二 位 则 选择 旷 啶 做 起 点 。

从 细胞 中 分 离 出 来 的 RNA 分 子 , 其 5- 末端 的 核 苷 酸 不 是 开始 转录 时 的 核 背 酸 , 因 为 在
RNA 合成 之 后 ,要 被 核酸 内 切 酶 切 去 一 小 段 , 剩 下 的 链 端 很 多 是 从 喀 喧 开始 的 。 例 如 ,tRNA
链 从 U 开始 ,它们 的 末端 也 无 三 磷酸 基 团 , 这 是 长 链 在 体内 切 开 形成 的 。 实 际 上 ,所 有 细胞 都
含有 各 种 核酸 酶 ,有 关 起 始 核 苷 酸 序列 的 资料 大 都 来 自体 外 试验 。

(二 ) 在 第 一 个 核 苷 酸 参 加 合成 之 后 5 就 解 离

RNA 链 开始 延长 后 ,o 从 核心 酶 -DNA- 新 生 RNA 链 构成 的 复合 物 上 解 离 下 来 ,随时 能 附
着 在 另外 的 核心 酶 分 子 上 ( 见 图 7-12)。

RNA 聚合 酶 _- 一 一
人 p 因子 全 :
c 因子
S NusA 蛋白
图 例
与 聚合 酶 结合 区 NusA 蛋白 释放

和
主 人 A.
PPP 嫩
| 一 一 一 一 一
SN 0 B
三 y
旺 。 因子 释放 并 循环 ，|NsA 蛋白 结合 多

TCD

转录 开始 三 磷酸 核 苷 RNA 链 增长

三 磷酸 核 背

图 7-12 RNA 的 合成 示意 图
A.2 因子 ,RNA 和 RNA 聚合 酶 均 释 放 ;B. o 因子 与 RNA 和 RNA 聚合 酶 结合 ;C. 帮助 识别 转录 的 起 始点 。
186

在 图 7-12 的 情况 下 , 链 的 终止 需要 2 因子 ,在 另外 的 情况 下 ,RNA 聚合 酶 自己 能 阅读 终
止 信号 。

可 以 想象 ,a 的 释放 可 能 是 它 的 功能 不 再 需要 了 ,或 者 是 a 的 继续 存在 可 能 会 因 与 启动 子
序列 紧密 结合 从 而 使 酶 (核心 酶 ) 以 后 难于 沿 着 模板 滑动 。

全 酶 与 无 启动 子 序列 的 DNA 结合 时 ,sc 因子 抑制 了 RNA 聚合 酶 与 DNA 的 非 专 一 性 结
合 , 它 使 酶 轻 轻 沿 着 DNA 滑动 ,直至 找到 一 个 启动 子 序列 ,o 因子 就 使 全 酶 与 启动 子 紧密 地 结

合 . 释放 后 ,核心 酶 与 启动 子 的 结合 就 减弱 。

由 于 正在 转录 的 RNA 聚合 酶 分 子 缺 乏 c 和 可 能 只 有 一 半 的 酶 分 子 在 细胞 中 是 活 路 的，
因此 ,sc 因子 与 酶 分 子 的 数量 不 需要 相等 ,不 过 它们 也 不 会 相差 太 悬 殊 , 也 可 能 游离 的 o 保持
为 一 个 库 , 所 以 , 当 核 心 酶 在 终端 位 置 上 释放 出 来 后 ,又 很 快 重新 形成 了 全 酶 。

二 RNA 合成 链 的 延伸

〈 一 ) 当 酶 前 进 时 DNA 被 RNA 聚合 酶 解 链 然后 又 复 链

当 酶 使 RNA 链 延 伸 时 ,RNA 聚合 酶 继续 解 开 DNA 链 , 使 模板 暴露 出 来 .RNA 链 开始 的
部 分 是 一 个 RNA-DNA 杂交 区 ,其 长 度 约 为 12 个 碱 基 , 当 RNA 链 离 开 模 板 链 后 ,两 条 DNA
又 重新 复 链 成 为 双 螺旋 ( 见 图 7-13)。

聚合 酶 的 移动
7-13 RNA 延伸 的 图 解

， DNA 的 解 链 部 分 要 比 RNA-DNA 杂交 物 的 长 度 长 , 约 为 17 个 碱 基 , 与 开放 复合 物 在 启
动 子 处 形成 时 的 长 度 相 同 。DNA 被 RNA 聚合 酶 解 链 的 长 度 测 量 起 来 很 方便 ,方法 是 用 一 个
拓扑 异 构 酶 去 松弛 正在 被 转录 的 共 价 闭环 DNA ,然后 加 入 去 污 剂 去 掉 RNA 聚合 酶 和 RNA，
最 后 测量 DNA 中 超 螺旋 的 数目 即 可 ( 见 图 7-14) 。 拓 扑 异 构 酶 作用 时 ,每 解 开 10. 4 个 碱 基 就
会 出 现 一 个 新 的 负 超 螺旋 。 于 是 ,根据 活性 酶 的 数目 我 们 就 能 计算 出 每 一 次 解 链 的 碱 基 对 数
目 。 :

在 图 7- 了 4 中 ,(a) 说 明 , 当 DNA 转录 时 ,用 拓扑 异 构 酶 去 松弛 共 价 闭环 DNA, 人 们 就 能 捕

获 活 性 RNA 聚合 酶 分 子 所 诱导 的 解 链 程度 .使 RNA 聚合 酶 变性 ,转录 复合 物 瓦 解 ,部 分 解 链
DNA 变 成 负 超 螺旋 , 变 得 更 紧密 , 在 琼脂 糖 凝 胶 中 负 超 螺旋 的 迁移 比 松弛 的 DNA 快 ;(b) 将
诱导 出 来 的 超 螺旋 数目 与 活性 的 RNA 聚合 酶 的 分 子 数目 做 图 ,可 以 看 出 每 个 酶 解 链 的 数量
是 :每 个 酶 为 1.6 个 超 螺旋 ,或 每 个 酶 解 链 17 bp(DNA 1.6X10.5bp)。

虽然 延伸 复合 物 一 般 使 DNA 解 开 17 bp ,但 当 RNA 聚合 酶 遇 到 特殊 的 DNA 序列 时 ,这
187

(b)

让 2.0

蓉
台
罗
开
-
人 鉴 1.0
台 二 se 撒
刺 ERREEcaa|
抠
二
] RNA 聚合 酶 数量 增加 0.5 1.0 1.5
无 RNA 聚合 酶 每 个 DNA 分 子 中 的 活性 RNA 聚合 酶 分 子

图 7-14 被 RNA 聚合 酶 诱导 解 链 的 DNA

个 数目 变化 就 很 大 。 例 如 ,在 终止 处 时 , 酶 和 RNA 链 从 复合 物 上 释放 下 来 ,DNA 就 复 链 。 相 反
的 情况 发 生 在 转录 CoEI 质粒 复制 所 需 的 RNA 引物 中 ,DNA 链 的 重新 盘 绕 在 专 一 位 点 受到
阻碍 ,转录 本 就 保持 为 RNA-DNA 杂交 分 子 , 它 可 长 达 几 百 个 核 苷 酸 , 此 种 现象 是 如 何 发 生 的
尚 不 得 而 知 。

(二 ) 在 RNA 合成 的 延伸 和 终止 时 NusA 因子 可 以 代替 o 因子

_ 个 RNA 聚合 酶 附属 因子 , 称 为 NusA 蛋白 ,经 很 多 年 它 才 被 认识 。 因 为 此 因子 对 酶 的 上

基本 活力 无 影响 ,纯化 RNA 聚合 酶 时 又 未 发 现 酶 与 NusA 蛋白 在 一 起 ,因此 一 直 对 它 忽视 。
但 此 因子 对 RNA 的 合成 很 重要 , 它 是 在 NusA 蛋白 紧 紧 地 结合 在 4 基因 和 蛋白 上 时 发 现 的 ,后

者 是 1 生长 中 防止 转录 终止 的 调节 因子 。 像 c 一 样 ,NusA 与 RNA 聚合 酶 的 核心 酶 结合 ,但 不 时

那么 牢固 ,所 以 在 纯化 时 ,5 就 取代 了 NusA。 这 些 特性 说 明 , 在 细胞 中 当 释放 出 来 后 ,NusA 星
就 马上 与 这 个 RNA 聚合 酶 分 子 结合 , 并 制造 出 一 条 RNA 链 。 但 是 ,在 转录 时 ,NusA 并 非 总 量 晤
是 固定 在 一 个 RNA 聚合 酶 上 ,帮助 延伸 一 条 RNA 链 ,在 转录 中 它 可 以 和 几 个 RNA 聚合 酶
分 子 起 作用 .因此 ,细胞 中 的 NusA 分 子 并 不 比 纯化 时 所 获得 的 多 多 少 ,每 个 细胞 才 几 百 个 ,但

却 能 与 所 有 执行 转录 功能 的 RNA 聚合 酶 分 子 起 作用 .可 以 预料 ,RNA 聚合 酶 从 DNA 上 释放 星

出 来 后 ,a 因子 由 于 与 核心 酶 的 亲和力 比 NusA 大 ,所 以 “ 又 取代 了 NusA 与 核心 酶 结合 在 一
起 (图 7-12) 。

NusA 蛋白 在 转录 中 的 全 部 作用 目前 很 难说 清楚 , 虽然 遗传 试验 说 明 它 是 一 一 种 重要 的 蛋
白质 ,但 具体 的 功能 尚 属 未 知 。 在 体外 ,NusA 对 RNA 聚合 酶 在 转录 的 速度 和 终止 方面 都 显示

出 肯定 的 作用 , 这 些 肯 定 的 量 用 大 Re 和 二 就 像 在 ^ 鸣 菌 体 YX 基
因 恒 白 上 的 作用 那样 。

三 .RNA 合成 的 终止
在 细菌 DNA 中 ,有 一 个 信号 称 为 终止 子 (terminators) ,其 功能 为 在 DNA 模板 上 的 一 个

符 定点 停止 RNA 的 合成 。 在 终止 点 上 ,RNA 聚合 酶 停止 使 核 苷 酸 聚 合成 RNA, 释 放 RNA
188

链 ,使 DNA 在 另外 的 启动 子 上 重新 开始 转录 。 在 某 些 位 点 上 ,终止 需要 一 个 附属 蛋白 , 即 o 因
子 , 在 另外 一 些 位 点 上 ,核心 酶 本 身 即 能 实现 RNA 合成 的 终止 。

对 于 细菌 及 病毒 DNA 的 终止 子 序列 做 过 很 多 分 析 和 研究 ， 特别 是 对 于 没有 2 因子 的 序
列 着 重 进行 了 研究 。 在 不 依靠 2 因子 的 终止 方式 上 发 现 了 两 个 明显 的 特点 : 即 在 DNA 上 有 一
个 二 重 对 称 性 (dyad symmetry), 此 对 称 性 集中 在 15 一 20 个 核 苷 酸 上 ,位 于 RNA 尾部 之 前 ，
另 一 特点 为 在 DNA 模板 链 上 有 一 串 大 约 为 6 个 A 的 碱 基 , 它 们 转录 为 RNA 末端 的 一 连 虽
的 U( 见 图 7-15)。

一- 一 二 重 对 称 体 一 一 一 一
5-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA-3-

模板 DNA
3-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTTGTTTT-5'

转录 本 (RNA) 5-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU -oOH3-
上

人 A
A U
U

转录 本 折 琶 形成 终止 发 夹 _- c
1
二
5%E 它 世 起 交合
SG 缺失 :
7-15 不 依赖 e 因子 的 终止 序列 和 终止 RNA 的 结构
图 中 箭头 处 为 突变 碱 基 ,缺失 碱 基 已 标明 。

虽然 图 中 的 二 重 对 称 性 往往 是 DNA 与 寡 聚 蛋白 结合 的 标志 ,但 转录 本 形成 的 发 夹 结构
对 终止 来 说 ,可 能 更 为 重要 ( 见 图 7-16) 。

体外 试验 说 明 , 终 止 可 由 挫 人 不 能 按 正常 方式 配对 的 改变 碱 基 而 防止 ,这 就 证 明 发 夹 结构
的 形成 对 终止 是 重要 的 。 此 外 ,大 多 数 丧 失 终止 功能 的 突变 体 涉及 单一 核 苷 酸 的 改变 ,从 而 破
坏 发 夹 结构 中 双 螺旋 葵 的 形成 (图 7-15) 。 终 止 子 突变 体 的 分 析 也 指出 了 模板 链 多 聚 dA 的 重
要 性 ,这 一 序列 中 某 一 碱 基 的 改变 或 缺失 部 分 碱 基 都 会 使 终止 子 失 活 。

图 7-16 表示 ,RNA 的 一 段 短 的 双 螺 旋 和 富 含 U 的 序列 如 何 导致 终止 作用 和 RNA 链 的
释放 的 。(a) 是 延伸 复合 物 恰好 完成 富 含 U 的 RNA 链 ; (b)RNA-RNA 杂交 物 ( 发 夹 ) 的 形成
破坏 了 一 部 分 RNA-DNA 杂交 链 , 仅 留 下 多 到 U 与 多 聚 A 的 一 段 杂 交 链 ; (c) 多 依 U 与 多 娶
A 杂交 物 解 离 ,转录 本 即 被 释放 。

图 ?7-16 的 模型 说 明 , 发 夹 结构 的 形成 ,对 于 终止 子 的 作用 ,其 重要 性 是 很 清楚 的 。

依赖 e 因子 的 终止 子 , 没 有 不 依赖 p 因子 终止 子 那样 的 多 聚 人 序列 特征 ,而 且 也 不 一 定
形成 稳定 的 发 夹 。 至 今 尚 不 知道 依赖 。 因子 的 终止 子 是 如 何以 p 因子 来 代替 这 些 发 夹 结构 序
列 的 作用 的 .但 存在 下 面 一 些 可 供 参 考 的 线索 :第 一 ,2 在 RNA 存在 下 对 ATIE 的 水 解 提示 , 它
可 能 结 人 台 在 新 生 的 RNA 链 上 并 利用 ATP 的 能 量 ,使 2 产生 将 RNA 链 从 酶 和 模板 链 中 释放
出 来 的 活性 。 第 二 ,o 可 能 是 RNA 聚合 酶 在 起 作用 时 与 该 酶 结合 , 因为 某 些 因 jpo 基因 突变 而
发 生 改 变 的 o 蛋白 ,仅仅 在 编码 RNA 聚合 酶 6 亚 基 基因 发 生 专 一 性 突变 从 而 受到 修饰 后 才
具有 终止 活性 。 第 三 ,我 们 知道 ,RNA 聚合 酶 本 身 能 识别 依赖 o 的 DNA 终止 序列 ,这 以 后 p
就 释放 出 RNA。 证 据 是 RNA 聚合 酶 本 身 在 需要 po 的 终止 处 停顿 ,如 反应 中 无 o 存在 则 RNA

189

聚合 酶 会 一 直 移 动 下 去 直到 2 一 种 阐明 2 功能 的 模式 是 ,即便 是 一 个 弱 发 夹 结 构 也 会
使 RNA 聚合 酶 的 移动 停顿 .使 p 得 以 结合 和 使 RNA 与 聚合 酶 实现 酶 促 分 离 。
…-CCCASGCCC
0

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六 二 让 En

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5-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTITTTTTTGAACAAAA-3'

图 7-16 ”RNA 合成 时 形成 的 发 夹 终止 结构
第 七 节 RNA 转录 后 的 加 工

RNA 在 转录 完成 后 ， 继续 形成 具有 功能 的 活性 RNA 分 子 。 在 原核
分 为 以 下 3 种 类 型 。 核 细胞 中 ， 加 工 方式 可 以

一 .tRNA 及 rRNA 分 子 由 某 些 新 生 RNA 于 解 及 化 学 修 全 于 于 本

大 肠 杆 菌 的 3 种 rRNA 及 一 种 tRNA 分 子 是 由 3
含有 间隔 区 的 初级 RNA 转录 本 前 切 形成 ( 见 图 AN
下 7

| [RN
| 本

另外 , 一 些 转录 本 含有 几 种 tRNA 的 序列 ,或 同一 上 上 EEE

tRNA 的 几 个 拷贝 。 裂 解 及 前 切 这 些 rRNA 及 tRNA 前 图 ?-17 rRNA 的 初级 转录 本

体 的 核酸 酶 是 高 度 精 确 的 . 例如 ,大 肠 杆菌 的 核糖 核酸 初级 转录 本 的 裂解 产生 5 S,16 S 及 23S

枉 了 能 正确 地 制 成 其 全 部 IRNA 分 子 的 5 -未 端 。 核 酸 :RNA 分 了 及 一个 tRNA 分 子 ， 空 折 杠 为 间隔 区 。
190

酶 正 通过 裂解 初级 转录 本 发 夹 区 的 专 一 位 点 而 切 下 5 S,16 S 及 23 S rRNA 前 体 。 相反 的 是 , 原
核 细 胞 的 mRNA 分 子 不 经 过 或 很 少 被 修饰 。 事实 上 是 这 些 mRNA 在 转录 时 ,有 的 就 同时 被 翻
译 。 但 是 ,有 些 病毒 的 mRNA( 如 T7 鸣 菌 体 mRNA) ,在 翻译 前 也 要 被 核酸 酶 下 裂解 。

二 ,在 有 些 RNA 链 末 端 加 上 核 背 酸

很 多 情况 是 将 CCA 加 到 原来 没有 此 序列 的 tRNA 分 子 的 3 -末端 上 。 在 真 核 细 胞 中 则 是
将 长 段 的 多 聚 A 加 在 大 多 数 mRNA 分 子 的 3 -末端 上 ,将 甲 基 化 的 乌 核 苷 酸 加 在 5 -末端 上
〈 称 为 帽子 ,以 后 将 要 氢 述 ) 。

三 、 碱 基 和 核糖 的 修饰

在 真 核 细 胞 的 rRNA 中 ,100 个 核糖 单位 大 约 有 一 个 核糖 的 2 -OH 由 S- 腺 苷 甲 硫 氨 酸 经
酶 促 被 甲 基 化 。 在 细菌 中 则 是 rRNA 的 碱 基 而 非 核糖 被 甲 基 化 。 还 有 一 个 普遍 现象 是 所 有 的
tRNA 分 子 中 均 含 有 稀有 碱 基 , 它们 是 由 tRNA 前 体 中 的 常见 核 苷 酸 经 酶 促 修 饰 而 成 。 例 如 ，
假 尿 苷 酸 及 胸腺 喀 喧 核 苷 是 尿 喀 了 啶 核 苷 酸 残 基 在 转录 后 修饰 而 成 。

在 真 核 细胞 中 ,所 有 RNA 转录 本 皆 需 普遍 加 工 。 rRNA 和 tRNA 的 有 裂解 与 修饰 类 似 原 核
细胞 。 与 原核 细胞 最 不 同 的 是 , 真 核 细 胞 的 mRNA 来 自 一 个 很 大 的 转录 本 ,经 裂解 与 拼接 而
成 。 真 核 细胞 的 转录 与 翻译 在 细胞 中 的 不 同 区 域 进行 。 似 乎 RNA 的 加 工 对 调节 mRNA，
rRNA 和 tRNA 从 胞 核 到 胞 浆 的 转运 上 起 了 关键 作用 。

第 八 节 ” 真 核 生物 RNA 的 合成

一 ` 真 核 生物 的 RNA 聚合 酶

真 核 细 胞 中 有 3 种 RNA 聚合 酶 , 即 RNA 聚合 酶 I ,RNA 聚合 酶 工 ,RNA 聚合 酶 下。 这
些 名 称 最 早 是 依据 它们 从 DEAE- 纤 维 素 柱 上 洗 脱 的 先后 顺序 而 定 出 来 的 。 后 来 发 现 不 同 的 生
物 3 种 RNA 育 合 酶 的 洗 脱 顺 序 不 一 样 ,后 来 就 改 为 以 3 种 酶 对 - 忽 襄 曹 碱 (c-amanitine ) 的
敏感 性 不 同 来 区 别 。

RNA 聚合 酶 I :基本 不 受 "- 鹅 膏 草 碱 的 抑制 ,在 大 于 10-?mol/L 时 才 表现 出 轻微 的 抑制
作用 。 此 酶 存在 于 核 仁 中 , 其 功能 是 合成 5.8 SrRNA,18SrRNA 和 28 SrRNA。

RNA 聚合 酶 工 :对 - 玫 膏 草 碱 最 为 敏感 ,在 10-" 一 10-smol/L 浓度 下 就 会 被 抑制 。 此 酶
在 在 于 核 质 中 , 其 功能 是 合成 mRNA 和 snRNA。

RNA 聚合 酶 工 ;: 对 - 狼 襄 草 碱 的 敏感 性 介 于 酶 及 酶 工 之 间 , 在 10 一 10 “mol/L 时 表
现 出 抑制 作用 三 此 酶 也 存在 于 核 质 中 ,其 功能 是 合成 tRNA 和 5S rRNA 及 转录 Alu 序列 。 在
细胞 质 中 也 能 发 现 一 些 RNA 聚合 酶 于 , 是 从 细胞 核 中 渗 漏 出 来 的 。

以 上 3 种 RNA 聚合 酶 的 分 子 量 都 在 500 kD 左右 (14 一 15 S) ,每 种 酶 分 子 含有 两 个 大 亚
基 和 4 一 8 个 小 亚 基 ,每 个 小 亚 基 的 分 子 量 为 10 一 90kD, 各 个 亚 基 的 功能 还 没有 很 好 地 了 解 。
真 核 生 物 也 像 原 核 生物 一 样 ,不 同 种 类 的 基因 ,需要 不 同 的 蛋白 辅助 因子 协助 RNA 聚合 酶 进
行 工作 。 在 真 核 生 物 的 线粒体 和 叶绿体 中 , 均 已 发 现 少数 RNA 聚合 酶 ,它们 分 子 量 小 , 活性 也
较 低 。 这 些 RNA 聚合 酶 都 是 核 基因 编码 ,并 在 细胞 质 中 合成 后 运送 到 细胞 器 中 去 的 。

191

二 、 真 核 生物 的 启动 子

真 核 生 物 有 3 种 RNA 聚合 酶 ,每 种 酶 都 有 自己 的 启动 子 。
(一 )RNA 聚合 酶 工 的 启动 子 届
RNA 聚合 酶 I 是 转录 rRNA 的 ,其 启动 子 可 分 两 部 分 :一 40 一 十 5 称 近 启 动 子 ,其 功能 为
决定 转录 起 始 的 精确 位 置 。 一 165 一 一 40 称 为 远 启动 子 , 其 功能 为 影响 转录 的 频率 。 每 种 生物
都 有 特定 的 转录 因子 与 RNA 聚合 酶 I 结合 ,从 而 促进 酶 与 启动 子 结合 形成 转录 起 始 复合 物 ，
因此 ,RNA 聚合 酶 I! 具有 明显 的 种 族 特异 性 。 启 动 子 均 位 于 不 转录 的 间隔 区 (nontranscribed
spacer,NTS) 。 应 该 指出 ,不 转录 间隔 区 目前 发 现 大 部 分 是 转录 的 , 故 系 误 称 ,但 已 沿用 。
(二 )RNA 桶 合 酶 工 的 启动 子
真 核 生 物 RNA 聚合 酶 工 的 启动 子 是 多 部 位 结构 , 主要 有 四 个 部 位 ,其 中 前 三 个 部 位 是 大
多 数 启动 子 都 具备 的 。
第 一 个 部 位 为 帽子 位 点 , 即 转录 起 始 位 点 。 其 碱 基 大 多 为 A( 指 非 模板 链 )， 隔 的 每 行 计 届 |
个 喀 了 啶 核 苷 酸 。
第 二 个 部 位 为 下 ATA 框 CHogness box)。 其 共有 序列 为 :T82A97T93A85433A835 和 ,基本
上 由 AT 碱 基 对 所 组 成 ,只 有 很 少 启动 子 中 有 GC 碱 基 对 的 存在 。
第 三 个 部 位 为 CAAT 框 。 其 共有 序列 为 GGYCAATCT ,一 般 位 于 一 75 附近 。 虽 然 此 序列
名 为 CAAT 框 , 但 其 中 头 两 个 G 的 重要 性 并 不 亚 于 CAAT 部 分 。 浊
第 四 个 部 位 是 增强 子 C(enhancer) ,又 称 远 上 游 序 列 (far upstream sequence)。 一 般 都 在
一 100 以 上 。 增 强 子 的 作用 主要 是 ,对 依赖 于 工 ATA 框 的 转录 和 不 依赖 ATA 框 的 转录 都 有
增强 效应 ,但 对 前 者 增强 效应 高 ;距离 效应 , 离 72 bp 的 重复 序列 近 的 容易 起 始 转录 ; 极 性 效
应 ,转录 方向 离开 72 bp 重复 序列 的 起 始 序列 优先 转录 , 而 朝向 72 bp 重复 序列 的 则 效率 差 ; 细
胞 类 型 的 选择 ,不 同 细胞 类 型 增强 作用 不 一 样 。
(三 )RNA 聚合 酶 焉 的 下 游 启动 子
RNA 聚合 酶 下 的 启动 子 在 转录 起 始 位 点 的 下 游 ,是 在 研究 非洲 爪 蟾 5S RNA 基因 时 发
现 的 , 故 又 称 内 部 启动 子 。 非洲 爪 蟾 5SRNA 基因 的 启动 子 在 转录 起 始点 50bp 之 后 。 在 研究
中 发 现 ,缺失 十 50 以 前 的 序列 和 缺失 十 83 以 后 的 序列 都 能 正常 转录 ,而 唯 独 十 50 一 十 83 这 段 ，
序列 不 可 缺少 。 把 这 段 序列 插入 任何 DNA 中 ,RNA 育 合 酶 工 都 能 识别 并 起 始 转录 ， 转录 起 始
点 在 其 上 游 方向 50 bp 左右 一 个 味 叭 碱 基 。 这 段 序列 就 是 5 S RNA 的 启动 子 。
除了 5S RNA 基因 外 ,RNA 聚合 酶 开 也 能 转录 疏 NA 基因 ,部 分 snRNA 基因 和 腺 病毒 的 】
VY4 基因 。 这 些 基 因 也 是 内 部 启动 子 ,但 这 些 基因 与 5S RNA 启动 子 不同 , 是 由 两 个 不 连续 的 区
域 所 组 成 ,靠近 5 方向 的 称 为 A 区 ,靠近 3 方向 的 称 为 B 区 。 这 些 启动 子 的 结构 见 图 13-66 。
RNA 聚合 酶 下 识别 不 同类 别 的 启动 子 , 在 于 有 共同 的 转录 因子 TF IC 和 TFIHB, 对 于
tRNA 基因 和 YA4RNA 基因 来 说 ,只 需要 前 述 两 种 转录 因子 ,而 对 于 5S RNA 基因 的 启动 子 ”
除了 这 两 种 转录 因子 外 , 还 需要 一 种 37kD 专 一 的 转录 因子 TF IA ,这 因子 与 RNA 育 合 酶 下 和
和 局 动 子 相互 作用 。

三 ` 真 核 生物 转录 的 起 始 和 延伸

关于 真 核 生 物 转录 的 起 始 机 制 ,现在 还 不 清楚 ,其 原因 在 于 转录 机 制 十 分 复杂 ,以 RNA
192

聚合 酶 工 的 转录 起 始 尤 甚 。 从 启动 子 结构 方面 来 说 , 它 包含 了 许多 启动 子 成 分 ,每 种 成 分 均 有

相应 的 蛋白 因子 与 之 结合 ,这 些 蛋 白 因子 总 称 为 转录 因子 ,目前 均 在 分 门 别 类 的 研究 之 中 。
RNA 合成 的 速度 大 约 为 每 秒 30 一 50 个 核 苷 酸 ,但 链 的 延长 并 非 以 便 定 速度 进行 ,有 时 会

降低 速度 或 延迟 ,这 是 延长 阶段 的 重要 特点 ,其 原因 尚 不 明 。 人 们 发 现在 通过 一 个 语 含 G' C

。 对 的 模板 以 后 约 8 一 10 个 碱 基 , 则 会 出 现 一 次 延迟 。 如 果 在 突变 体 中 G'C-~A .T 工 则 减少 延

人 一 二 二

迟 。 如 果 在 连续 的 G'，C 对 之 间 只 有 一 个 AT 对 ,把 这 个 AT 变 为 G'C 则 会 出 现 强烈 的
延迟 作用 。 这 种 延迟 作用 可 能 对 RNA 链 的 终止 和 释放 有 关 。

\ 真 核 生物 转录 的 终止
对 于 真 核 生 物 转录 的 终止 信号 和 机 制 了 解 很 少 , 其 主要 困难 在 于 很 难 确定 原初 转录 本 的 3'- 末

端 ,因为 大 多 数 在 转录 后 很 快 进行 加 工 , 无 论 是 mRNA,tRNA 还 是 rRNA 都 如 此 。 病 毒 SV40 的

终止 点 经 过 研究 ,很 像 大 肠 杆 菌 不 依赖 o 因子 的 终止 子 , 有 一 个 发 夹 结构 ,未 端 有 一 长 序列 U。

对 于 RNA 聚合 酶 下 ,体外 与 体内 转录 本 相同 ,表明 体内 转录 确 是 在 RNA 末端 处 终止 的 。

不 蟾 5SRNA 的 3- 末 端 为 4 个 口 ,而 这 4 个 吉 的 前 后 均 为 富 含 G…C 的 序列 ,在 G'…C 序列

中 分 布 着 寡 聚 工 (4 个 以 上 ) 是 所 有 真 核 生 物 RNA 聚合 酶 开 转 录 的 终止 信号 。 这 种 序列 特征 高
度 保守 ,从 酵母 到 人 都 很 相似 。

五 、 真 核 生 物 转录 后 的 加 工

(一 )mRNA 的 转录 后 加 工
mRNA 转录 后 的 加 工 主要 是 帽子 及 多 到 工
(A) 尾 。N7- 甲 基 鸟 味 叭 核 背 酸 部 分 称 为 帽子 0， 1
符号 为 mGpppX, 单 细胞 真 核 生物 如 酵母 ,只 具 区
有 帽子 O。 如 果 在 原来 转录 本 的 第 一 个 核 苷 酸 的 0
2-0 位 上 产生 甲 基 化 , 则 构成 帽子 1(1 个 甲 基 1 本
化 ,包括 帽子 0 部 分 ), 其 符号 为 mGpppXm ,这 0 六/
是 除了 单 细胞 真 核 生物 外 的 其 余 真 核 生物 的 主要
帽子 形式 .在 有 些 真 核 生 物 中 ,在 第 二 个 核 苷 酸 的
2.-0 位 上 还 可 以 再 产生 甲 基 化 ,构成 帽子 2( 包 括 于 沾

帽子 1 部 分 ), 其 符号 为 m'GpppXmpYm ,帽子 2

(2 不 甲 基 化 ) 一 般 只 占有 帽子 的 mRNA 的 10% 一 要 直人
15%% 以 下 。3 种 帽子 的 结构 见 图 7-18, 所 有 帽子 结 H
构 皆 含 7 甲 鸟 音 酸 ( 框 示 ), 通 过 焦 斐 酸 链 连 于 5 和
端 。 帽 子 的 功能 还 不 完全 清楚 ,但 已 知 对 mRNA 下
的 识别 ;结合 和 稳定 有 利 。 8 和 六
多 聚 (A) 尾 巴 。 有 多 聚 (A) 尾 巴 的 mRNA 写 H H
作 poly(A)+ ,反之 为 poly(A)-， poly(A) 是 在 转 = 帽子 2 中 的 甲 基 化
录 后 由 RNA 未 端 腺 昔 酸 转移 酶 催化 一 个 一 个 地 加 六
加 上 去 的 。RNA 末端 腺 苷 酸 转 移 酶 (RNA termi- 7-18 真 核 mRNA 5' 端 的 帽子 结构

nal riboadenylate transferase) 的 催化 反应 如 下 : 帽子 O 核糖 无 甲 基 化 。
193

多 聚 核糖 核 苷 酸 十 2zATP 一 一 十 上 = _Mg ”多 聚 核糖 核 苷 酸 (A)， 十 zPPi
poly(A) 的 功能 尚 不 清楚 ,但 知 poly(A) 与 蛋白 质 结 合 , 构 成 mRNP ,可 能 增加 mRNA 的 量

稳定 性 。
(二 )rRNA 转录 后 的 加 工 吕
真 核 生物 有 4 种 rRNA, 即 5.8S rRNA,18SrRNA,28SrRNA 和 5SrRNA.。 前 三 者 的

基因 组 成 一 个 转录 元 ,产生 45 S 的 前 体 RNA。 由 于 真 核 生物 TRNA 的 加 工 过 程 比较 缓慢 ,其
中 间 产 物 可 以 分 离 出 来 ,因此 , 真 核 生物 rRNA 的 加 工 过 程 比较 清楚 。 哺 乳 动 物 45 SRNA 的，
加 工 有 几 种 不 同方 式 。 例 如 ,人 类 45 S RNA 与 小 鼠 的 45 S RNA 加 工 方式 就 不 相同 ,其 具体

方式 见 图 7-19。

|

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1 8S GE 全 “5

小 鼠 45 5 [ 旗 -一
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]

ii 8S
7-19 哺乳 动物 45 S rRNA 前 体 的 转录 后 处 理 《

近年 来 发 现 , 哺 乳 动 物 的 原始 转录 本 并 不 是 45 S, 而 是 47 S。 由 于 3' 端 部 分 很 快 进行 转录
处 理 ,5' 端 也 除 掉 一 小 部 分 故 变 为 45 S。

关于 5SrRNA, 与 NA 一 起 由 RNA 聚合 酶 工 转 录 。5 S rRNA 的 基因 含 120bp， 处 在
另 一 个 转录 单位 中 , 这 个 单位 含有 120 bp 的 转录 区 和 600 bp 的 非 转录 片段 ( 见 图 7-20)。

5S 四 芭 本
(720 bDP )
图 7-20 和 爪 蟾 5SrRNA 的 基因 结构
只 有 黑色 区 域 被 转录 ,长 达 120 个 单位 。 每 个 黑色 区 域 和 虚线 之 间 有 一 个 片段 ,其 碱 基 顺 序 与 5S
rRNA 很 相近 , 可 奇怪 的 是 它 并 不 被 转录 。

三 )tRNA 的 转录 后 加 工

其 转录 后 的 加 工 内 容 大 致 为 :第 一 ,切除 tRNA 前 体 两 端 多 余 序 列 。tRNA 前 体 引 端 较 成
194

|

熟 谎 NA 通常 多 几 个 到 10 个 核 苷 酸 ,去 除 这 些 核 苷 酸 是 由 高 度 专 一 的 RNase P( 即 tRNA 5/
端 成 熟 酶 ) 催 化 的 .tRNA 3' 端 的 切除 由 两 个 酶 催化 , 即 tRNA3' 端 成 熟 核酸 内 切 酶 和 核酸 外 切
酶 。 第 二 是 未 端的 添加 , 即 在 3' 添 加 CCA 序列 ,此 一 步骤 由 tRNA 核 苷 酰 转移 酶 (tRNA nu-
cleotidyl transferase) 催 化 。 第 三 ,修饰 。tRNA 修饰 碱 基 很 多 , 主要 为 甲 基 化 修饰 占 被 修饰 碱
基 的 一 半 以 上 。 其 它 如 少 碱 基 (U 异化 产生 ),Y 碱 基 (tRNA 特定 位 置 上 的 G37 转变 而 来 ) ,I
和 人 Q 主要 系 置换 产生 (前 者 是 次 黄 味 叭 置换 了 前 体 tRNA 上 34 位 的 腺 味 叭 ,后 者 是 Q 碱 基 置
换 了 前 体 tRNA34 位 上 的 鸟 味 叭 获得 )。tRNA 转录 后 的 加 工 参 见 图 7-21。

他

No

加 工

成 熟 tRNA

早 转录 本
图 7-21 酵母 酷 氨 酸 tRNA 前 体 的 加 工
一 个 14 核 苷 酸 的 间隔 顺序 (标本 ?被 去 除 ,若干 个 碱 基 被 修饰 .通过 断裂 5 -末端 的 领先 段 及 在 3'- 末 端 加 上
CCA 顺序 ,由 一 个 含 108 核 苷 酸 的 初级 转录 本 形成 了 含 92 核 苷 酸 的 产物 。

(四 ) 居 间 序 列 的 切除
居间 序列 (intervening sequence,IVS) 或 内 含 子 (intron) ,在 RNA 的 转录 后 加 工 中 要 除
去 ,切除 后 要 进行 剪接 ,这 是 所 有 的 RNA 在 转录 后 加 工 中 必须 进行 的 一 个 重要 步骤 。
RNA 剪接 机 制 的 研究 ,是 80 年 代 的 热点 之 一 , 它 不 仅 解决 不 连续 基因 转录 产物 的 剪接 问
题 , 而 且 对 于 了 解 不 连续 基因 的 起 源 甚至 整个 生命 的 起 源 与 进化 都 是 有 力 的 推动 .核酸 分 子 的
催化 功能 的 发 现 使 人 们 有 了 对 核 酶 的 认识 , 近 几 年 人 们 对 于 RNA 剪接 机 制 研 究 的 进展 主要
内 容 如 下 。
不 连续 基因 的 居间 序列 又 称 内 含 子 , 被 内 含 子 隔 开 的 基因 序列 称 外 显 子 (exon”。 一 人 基
因 的 外 显 子 和 内 含 子 都 转录 在 一 条 原初 转录 本 RNA 分 子 中 ,然后 把 内 合子 切除 ,把 外 显 子 连
接 起 来 ,才能 产生 成 熟 的 RNA 分 子 。 这 个 过 程 就 叫 RNA 的 剪接 。 内 含 子 上 游 方向 的 一 个 拼
接点 称 为 中 拼 接点 或 左 拼 接点 ,内 含 子 下 游 方向 的 一 个 拼接 点 称 为 3 拼接 点 或 右 拼 接点 。
通过 研究 说 明 , 内 含 子 有 各 种 类 型 。 第 一 类 内 含 子 有 二 级 结构 ,构成 此 二 级 结构 的 是 4 个
10 一 12 碱 基 的 保守 序列 ,线粒体 与 核 基因 属于 此 种 类 型 。 第 二 类 内 含 子 是 不 具备 上 述 二 级 结
构 和 保守 序列 的 ,如 酵母 线粒体 细胞 色素 < 氧化 酶 亚 基 a 和 亚 基 上 基因 的 内 含 子 al 1,aI 2，
al5 和 bI1 等 。 另 一 类 内 含 子 ( 也 可 能 称 为 第 三 类 ) 是 核 基因 mRNA 前 体 中 的 内 含 子 .。 还 有 一
类 是 tRNA 基因 的 内 含 子 .tRNA 前 体 的 剪接 不 同 于 前 3 类 内 含 子 的 剪接 ,前 3 类 内 含 子 的 前
195

接 有 共同 特点 。 关 于 剪接 的 情况 将 在 第 十 三 章 中 详 述 。

在 剪接 RNA 时 ,有 两 个 磷酸 二 酯 键 破坏 , 同时 形成 一 个 新 的 磷酸 二 酯 键 。 核 酸 内 切 酶 与
连接 酶 活性 可 能 处 于 同一 复合 体 上 ,剪接 时 协调 进行 。 各 类 RNA 内 含 子 的 切除 及 拼接 皆 有 不 ，
同 的 特点 ,将 在 第 十 二 章 讨论 。

第 九 节 RNA 的 自我 剪 切 与 催化

一 、 核 酶 的 发 现

真 核 生 物 中 的 核糖 RNA 分 子 与 原核 生物 相似 ,也 是 靠 初级 转录 本 的 裂解 而 形成 的 。Cech
用 四 膜 虫 (Tetrajymena, 一 种 原生 动物 ) 做 的 一 个 RNA 剪 切 试验 得 到 了 意 想不到 的 结果 。 人 内，
四 膜 虫 的 一 个 6. 4 kb 前 体 去 掉 一 个 414 核 苷 酸 内 含 子 ,从 而 得 到 一 个 26 S rRNA 分 子 。 原 来
他 们 是 想 将 细胞 提取 液 加 到 RNA 前 体 中 以 测定 剪 切 所 需 的 蛋白 质 。 很 奇怪 ,他 们 发 现在 只 含
有 RNA 前 体 及 三 磷酸 核 昔 的 对 照 中 并 无 蛋白 质 , 却 也 发 生 了 RNA 的 前 切 (splicing) ,为 了 避
免 RNA 前 体 含 有 某 种 蛋白 质 ,他 们 采用 重组 DNA 法 制备 RNA 前 体 , 用 纯化 的 编码 这 种 前 j
体 的 DNA 在 体外 转录 成 RNA 前 体 ,以 便 进行 剪 切 反应 ,结果 也 和 上 面 所 讲 的 一 样 ,在 核 苷 酸
存在 下 ,RNA 自己 将 自己 剪 切 。 这 个 惊人 的 试验 证 明 : 一 种 RNA 分 子 具 有 高 度 专 一 的 催化 活
性 ,并 且 在 无 蛋白 质 情况 下 能 进行 自我 剪 切 (self-splicing) 。 原 来 在 此 反应 中 要 含有 核 苷 酸 , 因
为 据 认 为 需要 ATP 或 GTP 作为 能 源 。 后 来 证 明 所 需要 的 辅助 因子 为 一 鸟 音 Cguanosine) 单 ，
元 ,可 以 是 鸟 苷 ,GMP,GDP 或 GTP。G 并 非 作 为 能 源 而 是 作为 一 攻击 基 团 (attackin 硬
group) 。G 结合 到 RNA 中 ,然后 攻击 5 前 切 部 位 , 与 内 含 子 的 5 -未 端 形 成 一 磷酸 二 酯 键 。 这
种 转 酯 化 作用 (transesterification) 反 应 在 上 游 外 显 子 未 端 生成 二 3 -OH。 然 后 ,3' 前 切 部 位 被
此 新 生成 的 3.-OH 基 团 攻击 。 这 第 二 次 转 酯 化 反应 将 两 个 外 显 子 连接 起 来 并 导致 L4nt 内 会
子 的 释放 。 这 个 试验 可 以 用 图 (图 7-22) 说 明 。 在 此 反应 中 进行 两 种 自我 剪 切 , 肉 含 子 的 3.O
攻击 中 端的 磷酸 二 酯 键 ,形成 一 环 状 结构 。 在 第 一 步 中 含有 G 的 一 个 15- 核 埋 酸 片段 挫 人
去 。 所 形成 的 399 核 苷 酸 环 打开 ,形成 一 个 线 型 分 子 ,然后 失去 4- 核 苷 酸 片段 ,形成 一 个 环 状 量

5

切 去 的 外 显 子
上 游 外 显 子 5

号

所

下 游 外 显 子 3 3

Co
届

“-22 四 膜 虫 的 核糖 体 RNA 前 体 的 自我 剪 切
196

结构 ,最 后 此 环 状 物 打开 成 一 线 型 RNA , 称 为 L 19 RNA( 因 为 此 RNA 失去 19 个 居间 序列 ) 。

RNA 自我 剪 切 要 依靠 rRNA 前 体 结构 的 完整 。 内 含 子 的 大 部 分 对 自我 剪 切 都 是 必要 的 ，
rRNA 含有 由 许多 双 股 螺旋 蔡 部 及 套 圈 (loop ) 形 成 的 折 压 结构 。 折 二 的 RNA 含有 较 弱 的 CU
碱 基 对 和 较 强 的 AU 和 GC 碱 基 对 ,它们 三 者 的 亲和力 之 比 为 1 : 100 : 1 000。RNA 前 体 含 有
一 个 专 一 的 与 G 结合 的 口袋 ,在 两 个 外 显 子 之 间 形 成 一 个 磷酸 二 酯 键 , 而 内 含 子 则 以 线 型 分
子 被 释放 出 去 。 在 此 rRNA 前 体 中 键 的 形成 与 断裂 的 自我 催化 也 是 具有 高 度 立体 化 学 专 一 性
的 ,与 蛋白 质 酶 类 的 催化 作用 相似 。

二 、.L19 RNA 具有 核酸 酶 及 聚合 酶 性 质

Cech 曾 设想 L19 RNA 可 能 作用 于 外 部 底 物 上 ,实验 证 明确 实 如 此 。L19 RNA 能 催化 五
胞 喀 啶 苷 酸 (pentacytidylate ,Cs) 成 为 更 长 或 更 短 的 寡 聚 体 , 见 图 7-23。

Gon
CCCC pC

GGGAGG、
ts

G pC
ECGaeEon
GGGAGG、

D
图 7-23 L19 RNA 的 催化 机 理
A. 酶 本 身 ;B. Cs 与 酶 以 氢 键 连接 ; pC 未 端 以 共 价 键 连 于 酶 的 G 上 ;
C. GpC 水 解 ,使 酶 复原 ;D. 第 二 个 Cs 分 子 攻击 pC 生成 Ce 分 子 。

由 图 7-23 可 见 L19 RNA 确实 是 一 个 真 酶 , 它 既 是 一 个 核酸 酶 Cnuclease) 也 是 一 个 聚合
酶 (polymerase) 。 这 个 酶 (ribozyme, 暂 译 为 核 酶 ) 水 解 Cs 的 速率 是 未 催化 反应 速率 的 102 倍 ，
这 表明 RNA 分 子 具 有 很 大 的 催化 力 。 这 个 发 现 意 味 着 RNA 在 生物 进化 的 初期 可 以 在 没有 蛋
白质 参与 的 情况 下 进行 自我 复制 。

核 酶 究竟 是 如 何 将 其 底 物 切割 呢 ? 根据 用 一 13- 聚 体 RNA 做 底 物 的 研究 结果 提出 下 列 切
割 方式 :

Co
N
5-GGCCCUCUBAAAAA-3' 13- 聚 体 底 物

人
本
正门

3'-GGGAGG-5/
三 、 只 含 A3 核 苷 酸 的 锤 头 RNA 具有 催化 活性
具有 催化 活性 的 RNA 分 子 至 少 有 多 大 呢 ? 植物 病源 的 RNA 的 研究 表明 核 酶 比 L19
RNA 要 小 得 多 。 侵 染 植物 的 类 病毒 (viroid ) 为 单 股 的 环 状 RNA 分 子 , 约 300 nt 长 , 菲 律 椰

子 的 一 种 病毒 就 是 这 种 小 RNA 病毒 。 植 物 不 含 任何 酶 能 裂解 类 病毒 RNA ,类 病毒 也 不 编码
工 97

任何 蛋白 质 ,类 病毒 本 身 进行 自我 裂解 (self-cleavage) 。

比较 核 酶 切割 部 位 邻近 的 核 苷 酸 序列 ,我 们 可 以 看 到 一 个 锤 头 (hammerhead) 二 级 结构 。
它 由 一 个 不 配对 的 中 心 辐射 出 3 个 螺旋 组 成 ( 见 图 7-24) 。 根 据 这 个 模型 ,用 化 学 方法 可 以 合 。
成 一 个 19 nt RNA 及 一 个 24nt RNA ,形成 锤 头 RNA。 合 成 的 锤 头 19 nt RNA 是 酶 ( 核 酶 ) 而
24 nt RNA 则 为 底 物 。 已 经 用 许多 种 24 nt RNA 加 到 19 nt RNA 中 证 明 核 酶 的 作用 。 现在 已 和
经 有 可 能 设计 合成 核 酶 ,使 之 在 特定 的 部 位 切割 靶 RNA (target RNA) ,以 便 阻止 病原 物 的 性
RNA 病毒 的 基因 或 基因 组 的 表达 ,达到 治疗 RNA 病毒 病 的 目的 。Cech 的 出 色 研 究 成 果 获 得 ，
了 1989 年 诺 贝尔 化 学 奖 。

产

套图
ACE 三 交 二 二
茎 工 2 家 SR 荟 攻 汪 <
/ 民 / N\
1 史 19 交 了 1
一 G~、 / / C ; L
凡 cus GCCU 35CiGICGiG AGCUCG 一 G 一 ppp 5
GGAC ACCGGA / ' ppp 一 6GCGCC UCGAGC 3/
BAR< 攻 : N 5' ppp 一 人 二 从 5
fs 量 6 SA
AU A，。
C。G 裂解 部 位 G。G 裂解 部 位
Ai AU
葵 下 GeC 全 全
G。C NS 六
人 CE 5
5
B

图 7-24 锤 头 RNA 的 结构 及 其 切割
A: 烟 草 环 斑 病 毒 卫 星 RNA 的 自我 切割 序列 ;
B: 人 工 合成 的 锤 头 催化 RNA,1 一 19 序列 为 核 酶 ,1 一 24 序列 为 底 物 。

参考 文 献

1 Watson,J. D.，Hopkins,N. H.，Roberts,J. W. ,Steitz,J. A. and Weiner,A. M. Moleeular Biology of the
Gene.Vol I (4th ed. ). Benjamin/Cummings ,Menlo Park :1987，

2.， Lewin ,I. V. ,Genes V. Oxford University Press ,London :1995，

3. Stryer, 工 . Biochemistry 〈4th ed. ). W. H. Freeman and Company ,New York :1995，

村 Freifelder,D, Molecular Biology 〈2nd ed, ). Johns and Bartlett Publisher,Boston :1987.

〈 陈 祖 洁 )

198

第 八 章 遗传 密码

在 1954 年 ,Gamovw 首先 提出 遗传 密码 (genetic code) 的 问题 。 遗 传 密码 是 指 DNA( 或 其
转录 本 mRNA) 中 碱 基 序列 和 和 蛋白质 中 氨基 酸 序列 之 间 的 相互 关系 。 这 便 存 在 由 几 个 核 苷 酸
决定 一 个 氨基 酸 的 问题 。 由 于 蛋白 质 含 有 20 种 氨基 酸 , 而 核 苷 酸 只 有 4 种, 所以, 至少 要 由 3
个 核 昔 酸 组 成 一 个 密码 , 这 样 便 可 以 有 4X4X4=64 种 密码 ,以 满足 要 求 . Brenner 和 Crick 在
1961 年 的 实验 证 明 , 加 入 或 减少 1 或 2 个 核 苷 酸 便 导 致 形成 不 正常 的 蛋白 质 ,但 加 入 或 减少 3
个 核 苷 酸 则 生成 的 蛋白 质 常 常 具有 完全 的 活性 .因此 ,他 们 认为 遗传 密码 是 由 3 个 核 苷 酸 组 成
的 ,这 也 为 以 后 的 试验 所 证 明 。

但 至 1960 年 ,虽然 RNA 如 何 参与 蛋白 质 合 成 的 总 轮廓 已 经 清楚 , 却 仍 未 了 解 遗传 密码
的 细节 。 破 译 遗 传 密码 的 最 直接 而 又 令 人 信服 的 途径 是 测定 一 个 基因 的 核 苷 酸 顺 序 及 与 其 对
应 的 多 肽 的 氨基 酸 顺 序 , 然 后 进行 比较 。 但 那 时 只 有 测定 氨基 酸 顺 序 的 有 效 方 法 ,而 没有 测定
核 苷 酸 顺 序 的 成 熟 方法 。1961 年 Nirenberg 等 在 大 肠 杆菌 提取 液 中 , 借助 于 添加 合成 的 多 聚
尿 喀 啶 核 苷 酸 而 合成 出 只 含 1 种 氨基 酸 ( 茶 丙 氨 酸 ) 的 多 肽 ,这 说 明 polyU 中 含有 葵 丙 氢 酸 的
密码 ,从 而 部 分 地 破译 了 遗传 密码 。 随 后 经 过 科学 家 们 的 多 年 努力 ,终于 对 遗传 密码 有 了 较 全
面 地 了 解 。

本 章 讨论 遗传 密码 的 破译 及 其 特性 ,基因 突变 及 基 抑 制 或 校正 ,以 及 重 友 基 因 等 内 容 。

第 一 节 ”遗传 密码 的 破译

一 ` 蛋 白质 的 体外 合成

对 密码 子 的 破译 起 很 大 作用 的 是 蛋白 质 体 外 合成 的 试验 。 用 活 牙 地 进行 蛋白 质 合成 的 大
肠 杆菌 制备 无 细胞 提取 液 , 并 用 放射 性 同位 素 标记 (CH,"*C,*sS) 的 氨基 酸 以 研究 氨基 酸 斤 人 到
重 自 质 中 的 情况 (图 8-1)。(a) 在 冷冻 (0C ) 中 离心 收集 迅速 生长 的 大 肠 杆 菌 细胞 ,破碎 , 获得
细胞 液 , 加 六 脱氧 核糖 核酸 酶 以 破坏 DNA;(b) 细 胞 液 离心 (0C ) 除 去 细胞 壁 和 细胞 膜 碎 片 。 收
集 沉 降 较 慢 的 组 分 (多 核糖 体 . 游 离 核糖 体 、 游 离 mRNA 和 tRNA、 酶 ) 于 试管 中 ;每 管 加 人
ATP,GTP 和 放射 性 氨基 酸 ,将 试管 放 在 37C 下 保温 不 同时 间 ;(c) 加 入 酸 锅 淀 恒 白质 ;游离
氨基 酸 仍 在 溶液 中 。 洗 桨 沉淀 ,收集 , 放 入 计数 器 计数 ,从 沉淀 的 放射 活性 测量 出 氨基 酸 挫 人
(蛋白质 合 成 ) 量 。 用 这 种 方法 证 明和 蛋白 质 的 合成 需要 3 种 RNA， 即 tRNA,rRNA 和 mRNA
的 参与 。 但 是 ,这 个 体外 合成 只 进行 几 分 钟 便 逐 渐 减 慢 以 至 停止 这 是 由 于 在 提取 液 中 存在 降
解 mRNA 的 酶 ,使 mRNA 分 解 ,如 果 加 入 新 的 mRNA 于 已 停止 合成 蛋白 质 的 提取 液 ,又 可 以
重新 开始 合成 。 这 不 但 证 明 蛋 白质 的 合成 需要 mRNA 作为 模板 ,而 且 用 已 停止 合成 蛋 自 质 的
提取 液 ,加 入 不 同 的 mRNA , 便 可 以 研究 出 mRNA 是 如 何 编码 蛋白 质 的 合成 了 。

但 是 ,在 体外 合成 的 蛋白 质 ,是 否 和 在 体内 合成 的 天 然 蛋 白质 一 样 呢 ? 在 1962 年 ,用 大 肠

199

杆菌 提取 液 进行 体外 合成 试验 ,加 入 细菌
病毒 t2 的 RNA ,结果 合成 了 一 个 与 天 然
的 妈 外 壳 蛋 白 完全 相同 的 蛋白 质 , 其 氨基
酸 顺序 完全 一 样 . 这 便 证 明 在 体外 条 件 下 ，
可 以 准确 地 按照 mRNA 的 遗传 信息 合成
相应 的 蛋白 质 。

在 随后 的 10 年 中 ,已 成 功 地 用 无 细胞
系统 合成 多 种 其 它 的 病毒 和 细菌 蛋白 。 例
如 ,T4 溶菌 酶 , 它 是 一 个 分 子 量 为 20kD 的
分 解 细菌 细胞 壁 的 酶 。 用 无 细胞 系统 合成
的 T4 溶菌 酶 具有 酶 促 活性 , 这 便 进一步
证 明 在 体外 正确 翻译 的 可 能 性 。 以 后 又 合
成 了 有 了 酶 活性 的 8- 半 乳糖 背 酶 (一 种 合
1 300 个 氨基 酸 的 蛋白 质 ) 。 随 后 ,又 在 斌
管内 合成 了 多 种 重要 的 哺乳 动物 蛋白 (如
血红 蛋白 、 轻 链 和 重 链 免疫 于 蛋白、 肌 动 蛋
自 < 胶 原 重 直 有 球 蛋 自 姓 证 明 高 等 生物 纲 四 8 1 休 外 重 白 质 评 民 长 三
胞 蛋白 也 能 在 体外 合成 。

二 .用 人 工 合成 的 mRNA 进行 蛋白 质 合成

用 人 工 合成 的 已 知 其 碱 基 顺 序 的 mRNA 进行 体外 蛋白 质 合成 ,观察 氨基 酸 挫 人 情况 ' 便
可 以 了 解 编码 各 种 不 同 氨基 酸 的 密码 子 。

在 1955 年 Grunberg-Manago 和 Ochoa 从 细菌 中 分 离 出 多 核 苷 酸 磷酸 化 酶 (polynucleotide
phosphorylase) ,催化 下 列 反 应 :

RNA 十 四 一 一 核糖 核 苷 一 ~@

在 核 背 二 磷酸 开始 浓度 很 高 时 , 此 酶 可 以 催化 核 苷 酸 间 形成 3 -5' 磷酸 二 酯 键 ,生成 RNA 分 子 ;
5 …ApApAon3 十 ppA 一 二 …ApApApAun 十 人
多 聚 A， 多 聚 A，，

用 多 核 昔 酸 磷酸 化 酶 合成 RNA 并 不 需要 模板 DNA 或 RNA; 人 工 合成 产物 的 碱 基 成 分 完全
随 加 大 反应 混合 物 中 的 不 同 核糖 核 音 二 磷酸 的 比例 而 异 .例如 , 当 只 加 入 腺 考 二 磷酸 时 ,生成
的 RNA 只 含 腺 音 酸 , 称 为 多 腺 音 酸 或 多 聚 A。 同 样 也 可 合成 多 聚 U .多 聚 C.、 多 聚 GL 加 入 两
个 或 多 个 不 同 的 核 苷 二 磷酸 , 则 生成 混合 共 育 物 ,如 多 聚 AU .多 聚 AC .多 聚 CU 多 聚 AGCU
等 。 这 些 混合 共聚 物 的 碱 基 硕 序 近 似 于 随机 排列 ,而 且 决定 于 反应 物 的 相对 浓度 .例如 ,用

A:U=2:1 混合 物 , 则 生成 的 多 AU 的 碱 基 顺 序 可 能 为 UAAUAUAAAUAAUAAAAUAU

人

Ti

在 1961 年 ,Nirenberg 和 Matthaei 用 上 述 合成 了 多 聚 尿 苷 酸 (多 聚 U)。 他 们 发 现 ,在 由 大
肠 杆 菌 制备 的 无 细胞 蛋白 质 合 成 系统 中 加 入 多 聚 吕 和 各 种 氨基 酸 , 结 果 生 成 只 含有 葵 丙 氨 酸

ss 根据 三 联 体 密码 的 模型 , 便 可 知 茶 丙 氨 酸 的 密码 子 应 是 UUU。 随后 其 他 研究 者 亦

用 同样 技术 证 明 赖 氨 酸 的 密码 子 是 AAA, 且 氨 酸 的 密码 子 是 CCC。 但 用 这 方法 未 能 破译
GGG 所 编码 的 氨基 酸 , 因 为 多 聚 G 中 的 鸟 苷 酸 残 基 以 氢 键 牢固 地 彼此 连结 成 三 股 螺旋 (triple
helix) ,因而 防 碍 其 与 核糖 体 结合 。

但 是 用 这 方法 却 不 能 破译 含 两 种 以 上 的 碱 基 的 密码 子 . 例如 ,多 聚 AC 分 子 可 以 含有 8 种
不 同 的 密码 子 :CCC,CCA ,CAC,ACC,CAA,ACA,AAC,AAA.。 除 已 知 CCC 和 AAA 分 别 编
码 且 氨 酸 和 赖 氨 酸 外 ,其 它 密码 子 则 无 从 破译 。

当 用 多 聚 AC 进行 蛋白 质 合成 时 ,除了 且 氨 酸 和 赖 氨 酸 外 ,还 能 使 天 冬 酰胺 . 谷 氨 酰 胺 、 组
氨 酸 、 苏 氨 酸 挫 人 到 蛋白 质 中 去 。 这 些 氨基 酸 的 挫 人 比例 , 随 A/C 比率 而 异 。 如 果 在 多 聚 AC
中 A 的 量 大 大 超过 C, 则 天 冬 酰 胺 的 挫 人 大 大 多 于 组 氨 酸 。 这 样 便 可 推断 ,天 冬 酰 胺 是 由 2A
和 1C 编码 的 ,而 组 氨 酸 是 由 2C 和 1A 编码 的 。 用 其 它 共 育 物 进行 类 似 试验 , 亦 可 推断 出 其 它
的 密码 子 的 碱 基 组 成 .但 这 些 试验 仍 未 能 确定 一 个 密码 子 内 的 碱 基 顺 序 , 如 组 氨 酸 的 密码 子 可
能 是 CCA ,也 可 能 是 CAC 或 ACC 。

三 ,用 tRNA 结合 法 破译 密码 子

在 1964 年 , Nirenberg 发 现 ,即使 没有 蛋白 质 合 成 所 需 的 全 部 因子 存在 ,特异 的 氨 酰
-tKNA 分 子 也 可 以 与 核糖 体 -mRNA 复合 物 结合 .例如 ,多 聚 吕 与 核糖 体形 成 的 复合 物 只 与 茶
丙 氨 酰 -tRNA 结合 。 而 多 聚 C 与 核糖 体 的 复合 物 则 只 与 有 睛 氨 酰 -tRNA 结合 。 而 且 , 这 个 特异
结合 并 不 需要 长 的 mRNA 分 子 , 只 要 一 个 短 的 三 核 苷 酸 就 足够 了 。 例 如 ,加 入 三 核 苷 酸 UUU
可 与 茶 两 氨 酰 -tRNA 结合 ,而 AAA 则 可 与 赖 氨 酰 -tRNA 特异 地 结合 于 核糖 体 。 用 已 知 碱 基
顺序 的 三 核 苷 酸 进行 试验 , 便 可 以 测 知 各 种 不 同 氨基 酸 的 密码 子 了 。 表 8-1 列 出 一 些 三 核 苷
酸 -核糖 体 复合 物 所 结合 的 氢 酰 -tRNA.。 但 是 ,用 这 个 方法 还 未 能 确定 全 部 氨基酸 的 密码 子 , 因
为 有 些 三 核 苷 酸 的 结合 率 十 分 低 , 以 致 无 法 确定 哪 一 个 密码 子 对 应 于 哪个 氨基 酸 。 而 且 , 用 这
方法 也 把 一 些 密码 定 错 了 ,如 表 8-1 中 的 UCU 实际 上 是 丝氨酸 而 不 是 顷 氢 酸 的 密码 子 。

表 8-1 和 氨 酰 tRNA 结合 于 三 核 昔 酸 -核糖 体 复合 物

三 核 苷 酸

5 2UUU=35UUC
UUA,UUG,CUU,CUC,CUA ,CUG
AUU,AUC,AUA

AUG
GUU,GUC,GUA,GUG,UCU*
EUCC,UCAYUCG
CuCCCCCA5TCCG
AAA,AAG

UGU,UGC

GAA,GAG

3

结合 的 AA-tRNA

葵 丙 氨 酸
亮 氨 酸
异 亮 氨 酸
甲 硫 氢 酸
缚 氢 酸
丝氨酸
且 氨 酸
其 氨 酸
半 胱 氮 酸
谷 氨 酸

ER 一

“注意 用 这 方法 把 这 密码 子 定 错 了 。

四 、 用 重复 共聚 物 确定 密码 子

在 应 用 三 核 苷 酸 技术 的 同时 ,Khorana 用 有 机 化 学 与 酶 学 技术 相 结合 的 方法 合成 了 已 知
顺序 的 含 2,3,《 种 碱 基 的 共聚 物 。 这 方法 如 图 8-2 所 示 。 首 先 , 用 有 机 化 学 方法 合成 了 含 9 个

201

碱 基 的 两 条 互补 的 脱氧 寡 核 苷 酸 链 d(TAC)。 和 d(GTA),, 以 此 为 模板 ,用 DNA 聚合 酶 I 合 】
成 长 链 的 DNA。 又 以 此 为 模板 ,在 RNA 聚合 酶 作用 下 ,如 果 加 入 GTP,UTP 和 ATP， 便 合成 上
多 聚 (GUA) 的 RNA 链 (图 8-2 左 ); 如 果 加 入 的 是 CTP,UTP,ATP, 便 合成 多 聚 CUAC) 链 (图 上
8-2 右 ) 。 这 样 , 便 可 以 合成 各 种 不 同 的 重复 共聚 物 , 并 用 以 研究 密码 子 , 例如 ,用 重复 顺序
CUCUCUCU…… 做 模板 ,结果 生成 亮 氨 酸 与 丝氨酸 交替 排列 的 多 肽 , 由 此 推 知 亮 所 酸 的 密码 上
子 是 CUC ,而 丝氨酸 的 密码 子 是 UCU 。 同 样 ,用 重复 顺序 UGUGUGUG…… 做 模板 , 便 得 出 |

半 胱 氨 酸 与 顷 氨 酸 交替 排列 的 多 肽 ,并 推 知 半 胱 氨 酸 的 密码 子 是 UCU , 顷 氨 酸 的 密码 子 是
GUG 。

DNA 模板
5 一 一 一 TACTACTACTAC 一 一 3/
时 te
3 一 人 ATGATGATGATG 一 一 5
RNA 聚合 酶
二 GTP +CTP
+UTP +UTP
十 ATP +ATP
5 一 GUAGUAGUAGUA 呈 3/ 5'eme UACUACUACUAC 一 3/

8-2 ”用 重复 顺序 双 链 DNA 为 模板 合成 具有 不 同 重复 顺序 的 RNA 链

用 同样 的 方法 ,也 可 以 测 知 含 3 种 碱 基 重 复 顺 序 所 编码 的 多 肽 。 例 如 ,用 多 聚 AAG(AAG-
AACAAG……) 得 出 3 种 多 肽 :多 聚 赖 氨 酸 (密码 子 是 AAG) 多 聚 精 氨 酸 (密码 子 是 AGA) 和
多 聚 谷 氨 酸 (密码 子 是 GAA)。 同 样 ,多 聚 AUC 则 是 多 聚 异 亮 氨 酸 (密码 子 AUC 入 多 聚 丝 氨
酸 (密码 子 UCA) 、 多 聚 组 氨 酸 (密码 子 CAU ) 的 模板 ( 表 8-2)。 甚 至 用 4 个 碱 基 重复 顺序 , 亦 可
以 测 知 不 同 氨基 酸 的 密码 子 。 例 如 ,用 多 聚 C(UAUC) , 则 合成 的 多 肽 为 栈 氨 酸 - 亮 氨 酸 -丝氨酸
异 亮 氨 酸 重复 顺序 的 多 肽 :

GAUOCUIAUC:UAUICUATUCOUSATE
栈 亮 丝 异 亮 栈 亮 丝 异 亮
表 8-2 用 2 个 或 3 个 核 背 酸 构建 的 重复 共聚 物 确定 的 密码 子

共聚 物 识别 的 密码 子 氨基 酸 挫 人 或 生成 的 多 肽 确定 的 密码 子
(CU COUCSUGCURGUC 亮 氨 酸 5'2CUC-3/
丝氨酸 UCU
(CUG )， UGU : GUG ; UGU… 半 胱 氨 酸 UGU
央 氮 酸 GUG
CAC 和 5 ACA :; CAC ; ACA… 苏 氨 酸 互 GXIRS
组 氨 酸 CAC
(AG)7) AGA : GAG ; AGA.… 精 氨 酸 AGA
谷 氢 酰 胺 GAG
(AUC)， AUC :AUC :AUC… 多 聚 异 亮 氨 酸 5 -AUC-3/
UCA : UCA : UCA… 多 聚 丝氨酸 UCA
CAU : CAU ; CAU，… 多 聚 组 氨 酸

一 ca
这 伴 , 用 Nirenberg 的 三 核 童 酸 结合 技术 ,和 Kbhorana 的 重复 顺序 技术 ,终于 在 1966 年 ,将 遗

传 密码 完全 破译 了 . 表 8-3 列 出 遗传 密码 ,其 中 61 个 是 编码 各 种 氨基 酸 的 , 另 3 个 是 终 上 密码
子 ( 详 见 下 文 ) 4
202

表 8-3 遗传 密码

UGU
OUEEG jc
UGA 终止
UCGE LT

( 菲 沁 ) 疗 (| 小
(区 空 ) 序 | 吊 波

U
C
A
G
U
CE
A
G
U
C
人
G
U
C
A
G

“ 亦 作 为 甲 酰 甲 硫 氨 酰 -tRNA 的 起 始 密码 子 。GUG 同时 编码 顷 氨 酸 和 甲 硫 氨 酸 ,是 双关 密码 子 (ambiguous codon) 。

由 于 Nirenberg 和 Khorana 2 人 在 破译 遗传 密码 研究 工作 中 的 重大 贡献 ,他 们 2 人 共同
获得 1968 年 的 诺 贝 尔 奖 。

审 察 表 8-3 的 遗传 密码 ,可 以 看 出 下 列 特点 :

《1) 除 色 氨 酸 和 甲 硫 氨 酸 只 有 1 个 密码 子 外 ,其 它 18 种 氨基 酸 均 有 1 个 以 上 的 密码 子 , 如
葵 丙 氨 酸 、 酷 氨 酸 、 组 氨 酸 、 谷 氨 酰 胺 、 谷 所 酸 、 天 冬 酰胺 、 天 冬 氢 酸 、 赖 氨 酸 、 半 胱 氨 酸 各 有 2 个
密码 子 ; 异 亮 氢 酸 有 3 个 密码 子 ; 统 氨 酸 、 且 氨 酸 、 苏 氨 酸 \ 丙 氨 酸 .甘氨酸 各 有 4 个 密码 子 ; 亮
氨 酸 、 精 氨 酸 、 丝 氢 酸 各 有 6 个 密码 子 。
(2) 许 多 氨基 酸 的 密码 子 均 在 同一 方 框 内 , 即 第 一 和 第 二 个 碱 基 相同 ,只 有 第 三 个 碱 基 不
同 , 这 称 为 非 混合 型 密码 子 族 (unmixed codon family)”, 如 上 文 列 出 的 有 4 个 密码 子 的 氨基
酸 。 有 些 方 框 内 有 两 种 氨基 酸 的 密码 子 , 这 些 称 为 混合 型 密码 子 族 Cmixed codon family) 。 它们
的 第 一 、 二 个 碱 基 均 相 同 , 第 三 个 味 叭 或 喀 喧 分别 编码 不 同 氨基 酸 。 有 6 个 密码 子 的 氨基 酸 的
密码 子 分 布 在 不 同方 框 内 ,它们 的 第 一 或 第 一 和 第 二 个 碱 基 不 同 , 如 亮 氨 酸 的 密码 子 第 一 个 碱
基 为 U 或 C, 精 所 酸 的 第 一 个 碱 基 为 C 或 A, 丝氨酸 密码 子 的 第 一 个 碱 基 为 U 或 A, 第 二 个 碱
基 为 C 或 G。

《3) 甲 硫 氨 酸 的 密码 子 AUG 同时 也 作为 起 始 密码 子 ( 见 下 文 )。
《4) 性 质 相 近 的 氨基 酸 的 密码 子 分 布 在 相近 位 置 , 如 表 中 第 一 一 纵 行 (第 二 碱 基 为 品 ) 的 苯 两

_ 氨 酸 、 亮 氢 酸 、 异 亮 氨 酸 、 甲 硫 氨 酸 、 统 氨 酸 ,以 及 第 二 纵 行 (第 二 碱 基 为 C) 的 且 氨 酸 和 丙 氨 酸
均 为 下 水 氨基 酸 ; 第 三 和 第 四 纵 行 的 组 氨 酸 、 赖 氨 酸 .天 冬 氨 酸 、 谷 氨 酸 和 精 氨 酸 均 为 带电 荷 的
氨基 酸 ; 第 二 、 三 .四 纵 行 的 丝氨酸 、 苏 氨 酸 、 天 冬 酰胺 、 谷 所 酰胺 . 半 胱 氨 酸 .甘氨酸 则 为 不 带电
荷 的 氨基 酸 。 遗 传 密码 的 这 种 特性 ,可 使 发 生 突变 时 ,对 蛋白 质 的 性 质 不 会 产生 太 大 影响 ( 见 下
焉 类

(5) 在 mRNA 模板 上 的 密码 子 是 连续 的 ,在 前 一 个 密码 子 与 后 一 个 密码 子 之 间 没 有 间隔 ，
即 没 有 一 个 间断 的 讯号 。 因此 ,在 进行 翻译 时 ,解读 的 框架 (frame) 决 定 于 起 始 的 碱 基 。 如 果 在

203

解读 开始 时 移动 了 1 个 或 2 个 大 基 , 或 者 核糖 体 在 mRNA 链 上 移动 时 偶然 越过 工 个 核 音
酸 , 便 会 生成 不 完全 的 蛋白 质 ( 见 本 章 第 五 节 及 第 九 章 )。

第 二 节 ”密码 的 简 并 性 与 变 偶 假 说
许多 氨基 酸 都 是 由 多 个 密码 子 编码 的 ,这 称 为 简 并 性 (degeneracy)。 例 如 ,UUU 和 UUC

编码 葵 丙 氨 酸 ,UCU,UCC,UCA,UCG,AGU 和 AGcC 编码 丝氨酸 。 事 实 上 ,在 头 两 个 核 苷 酸
相同 时 ,第 三 个 核 苷 酸 则 可 以 是 胞 喀 啶 或 尿 喀 啶 ,也 可 以 是 腺 味 叭 或 鸟 味 哈 ， 而 仍 是 编码 同一 “

204

攻
/
训
瘟
下

UROLOGY 六

COOrrPaoOnan

ES
EGG E 六 GOL 王
歹
之

GAO O

图 8-3 大 肠 杆 菌 的 两 种 不 同 的 携带
亮 氨 酸 的 tRNA 分 子
* 表示 人 性质 未 明 的 修饰 。

种 tRNA 与 61 个 密码 子 配 对 。 但 人 们 发 现 有 些

个 氨基 酸 。 但 并 不 是 所 有 的 简 并 性 都 是 头 两 个 核 苷
酸 相 同 。 例 如 , 亮 氨 酸 可 由 QUUA 和 UUG 编码 ,也
可 由 CUU,CUC,CUA,CUG 编码 ,它们 分 别 由 两 和 |
种 tRNA 与 之 结合 (图 8-3) 。 密 码 子 的 简 并 性 ,特别 玫
是 第 三 位 的 胞 喀 啶 和 尿 喀 啶 或 鸟 味 叭 和 腺 味 叭 的 简
并 性 常常 等 同 , 这 说 明 为 什么 在 不 同 生 物 的 DNA
中 的 AT/GC 比率 会 有 很 大 的 变异 ,而 其 蛋白 质 的
氨基 酸 相 对 比例 却 没有 很 大 的 变化 。

cs

由 于 携带 氨基 酸 的 tRNA 是 以 其 反 密 码 子 与
mRNA 上 的 密码 子 碱 基 配 对 的 ,那么 看 来 必须 有 61

外 NA 如 丙 所 酰 -tRNA) 可 以 和 几 种 密码 子 配对 。
而 且 还 发 现 有 些 tRNA 的 反 密 码 子 含有 稀有 碱 基
次 黄 味 叭 4 I ), 它 是 由 腺 嘎 叭 的 6 位 C 上 脱 氨 生成
6-= 酮 基 而 形成 的 :

次 黄 味 叭 可 以 与 A,U 或 C 配对 。 在 1966 年 ,Crick
提出 “ 变 偶 假 说 ”(wobble hypothesis) ,用 以 解释 上
述 现象 。 这 个 假说 包括 下 述 内 容 :

《CDmRNA 上 的 密码 子 的 第 一 、 第 三 个 碱 基 与
tRNA 上 的 反 密 码 子 相应 的 碱 基 形成 强 的 配对 ; 密
码 的 专 一 性 , 主要 是 由 于 这 两 个 碱 基 对 的 作用 。

(2) 反 密码 子 的 第 一 个 碱 基 ( 以 5 一 3' 方 向 ,与
密码 子 的 第 三 个 碱 基 配对 ) 决 定 一 个 tRNA 所 能 解
读 的 密码 子 数目 。 当 反 密 码 子 的 第 一 个 碱 基 是 C 或
A 时 , 则 只 能 和 一 个 密码 子 结合 。 但 当 反 密码 子 上
的 第 一 个 碱 基 是 U 或 G 时 , 则 可 以 和 两 个 密码 子 结

合 , 即 U 可 以 和 A 或 G 配对,G 可 以 和 C 或 U 配对 。 而 当 反 密码 子 的 第 一 个 碱 基 是 工 时 , 便

可 以 和 3 个 密码 子 结合 , 即 工 可 以 和 A,U 或 C 配对。 如 表 8-4 所 示 :

《3) 当 一 种 氨基 酸 是 由 几 个 不 表 8-4 ”根据 变 偶 假 说 的 碱 基 配 对
友子 的 反 密 码 子 的 第 一 个 碱 基 密码 子 的 第 三 个 碱 基
头 2 个 碱 基 的 任 一 个 是 不 同 的 , 便 弄
必须 有 不 同 的 tRNA。 和 二

(4) 这样 , 便 要 求 至 少 要 有 32 世
种 tRNA, 来 与 61 个 密码 子 相 结 U 和 A 或 6
合 。 I A,U 或 C

密码 子 与 反 密 码 子 相互 作 用 的

复杂 情况 ,表明 密码 子 的 头 2 个 碱 基 在 决定 其 专 一 性 中 是 起 主要 作用 的 。 第 三 个 碱 基 ( 变 偶 碱
基 ) 对 专 一 性 也 起 一 定 作 用 ,但 因 其 与 反 密 码 子 中 的 相应 碱 基 结 合 较 弱 ,在 蛋白 质 合成 时 这 种
tRNA 便 能 以 较 快速 度 与 密码 子 解 离 , 这 便 有 利于 加 快 蛋白 质 的 合成 。

O HH
“| 人 H 地 2 让 于
cs 太 N\ 关 区 访 生生
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核糖 下 Sa 核 精 =， 大
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次 黄 苷 - 胞 喀 喧 鸟 苷 - 尿 喀 喧
反 密码 子 密码 子 密码 子 或 反 密码 子 密码 子 或 反 密 码 子
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O 基 H 站 hH
四 庆 一 MX 二 区 人
PN=CL N H 玫 ` 核 精 ON ) 一 Ht- 一 必 让 一 AN
核糖 NM= 和 核糖 N=< 和 核糖
H H H
反 密 码 子 ′ 密码 子 反 密 码 子 密码 子
tRNA 的 反 密码 子 辟 tRNA 的 反 密码 子 劈
SA 35 3 3 SS
[一 三 : 二: 二 王 ;
RS ; 。 SN 2
WE。。 反 宙 码 子 。 人 全 SET 到 密码 子 。 入 人
下 有 2 中 II 和 Ti 于 几 ，
5 一 ^G^ 一 3 mRNA 链 ”5 一 ^GG 一 3 5 一 GCU 一 3 mRNA 链 ， 5 一 GGC 一 3 0
过 一 这 和
密码 子 密 码 子 过 时 密码 子 密码 子
f 图 8-4 变 偶 配对

下 图 : 变 偶 作 用 能 使 反 密 码 子 的 碱 基 与 非 标准 配对 的 碱 基 形成 氢 键 。 下 图 左 : 反 密码 子 第 一 位 的 U 可 与 A
或 G 配 对 * 下 图 右 : 反 密码 子 第 一 位 的 I 可 与 U,C 或 A 配 对 。

这 些 可 以 发 生 配对 的 碱 基 的 核糖 -核糖 之 间 的 距离 ,与 标准 AU 或 GC 配对 的 距离 相近
似 。 而 味 叭 与 味 叭 或 喀 啶 与 喀 啶 之 间 的 配对 , 均 使 核糖 -核糖 之 间 的 距离 过 长 或 过 短 , 因 而 不 能
发 生 配对 。 图 8-4 列 出 根据 变 偶 假 说 可 发 生 配对 的 例子 。 从 图 8-4 看 出 , 变 偶 配对 的 核糖 -核糖
距离 与 标准 的 AU 或 GC 配对 相 接近 。
205

自 1966 年 以 后 ,差不多 所 有 的 试验 结果 均 支 持 变 偶 假说 。 例 如 ,根据 变 偶 假 说 ,有 6 个 密
码 子 的 丝氨酸 便 至 少 有 3 种 好 NA, 事 实 也 证 明 如 此 。 精 氨 酸 和 亮 氨 酸 也 有 6 个 密码 子 , 它 们 和
的 第 一 个 碱 基 不 完全 相同 ,这 些 氨基 酸 也 有 不 同 的 tRNA, 用 以 与 第 一 或 第 二 个 碱 基 不 同 的 密
码 子 结合 。

根据 近年 确定 的 tRNA 三 维 结构 , 反 密 码 子 的 3 个 碱 基 以 及 其 3 端 以 后 的 2 个 碱 基 均 是 量
指向 差不多 同一 的 方向 的 ,其 构象 主要 决定 于 碱 基 的 平面 之 间 的 堆 友 相 互 作用 。 这 样 , 反 密码 一
子 的 5 端 碱 基 便 位 于 堆 释 下 方 ,因而 在 与 密码 子 3 端的 碱 基 配对 时 便 不 那么 受 限 制 而 可 以 发
生 播 摆 ( “wobble” 原 意 为 “ 播 摆 ”, 变 偶 假 说 也 有 人 译作 ” 播 摆 假 说 “.) 而 反 密 码 子 的 3 端 碱 基 重
则 位 于 堆叠 的 中 央 , 而 且 邻 近 的 碱 基 又 是 体积 较 大 的 修饰 味 叭 碱 ,因而 限制 了 它 的 摆动 。 :

然而 ,也 发 现 一 些 现象 不 符合 变 偶 假说 。 例 如 , 顷 氨 酸 的 tRNA 中 的 任何 一 种 均 可 以 和 幼 二
氨 酸 的 4 个 密码 子 结合 。 而 按照 变 偶 假 说 , 顷 氢 酸 的 3 种 tRNA 中 的 2 种 反 密 码 子 CAC 和
UAC 最 多 只 能 和 2 种 密码 子 结合 ,第 三 种 tRNA 的 反 密码 子 IAC 也 只 能 和 3 种 密码 子 结合
这 便 不 能 说 明 上 述 现象 。 】

在 原核 生物 和 在 真 核 生 物 的 细胞 质 内 , 反 密 码 子 的 5 位 U 通常 是 经 过 修饰 的 ,这 可 以 影 时
响 其 与 密码 子 可 能 配对 的 范围 。 在 线粒体 内 发 现 约 有 一 半 的 tRNA 反 密 码 子 的 5 位 U 是 未 经 四
修饰 的 。 这 些 tRNA 可 用 以 解读 非 混合 密码 子 族 ( 即 密码 子 XYU ,XYC,XYG,XYA 编码 同一
种 氨基 酸 ) 的 全 部 4 个 密码 子 。 但 在 混合 密码 子 族 中 , 密码 子 XYA 和 XYG 则 由 同一 种 在 反 密
码 子 的 5 位 具有 修饰 U 的 tRNA 解读 。 这 样 看 来 ,U 的 修饰 显然 是 将 其 解读 的 专 一 性 限于 味 。
叭 碱 。 在 混合 密码 子 族 的 另 2 种 末端 为 喀 啶 的 密码 子 (XYU ,XYC) 则 由 在 反 密 码 子 世 位 为 G
的 tRNA 与 之 按 变 偶 假 说 配对 。

三 节 ”密码 子 的 使 用 频率

密码 子 具 有 简 并 性 , 即 同一 种 氨基 酸 具 有 多 个 密码 子 , 那 么 是 否 各 个 密码 子 均 以 相同 或 近
似 的 几率 被 使 用 ,或 是 其 中 有 些 优先 被 使 用 呢 ? 例如 ,在 具有 富 含 AT 的 DNA 的 生物 中 ,是 否
大 多 数 密 码 子 的 第 三 位 都 会 有 U 或 A 呢 ? 研究 发 现 ,在 喉 菌 体 @X174 的 单 链 DNA 基因 组 中
含 A24%%,C22%% ,G23%, 工 31% 。 其 密码 子 中 的 第 三 位 是 优先 使 用 亲 的 。

即使 在 有 些 生物 中 的 碱 基 组 成 是 比较 均匀 的 ,其 密码 子 的 使 用 也 不 是 随机 的 。 在 大 肠 杆 菌
中 即 发 现 ,有 些 密码 子 被 反复 使 用 ,而 有 些 则 几乎 不 被 使 用 .例如 ,在 大 肠 杆菌 核糖 体 蛋 白质 基
因 的 1 209 个 密码 子 中 ,编码 苏 氨 酸 的 4 个 密码 子 中 的 ACU 被 使 用 36 次 ,ACC 26 次 ,而
ACA 只 有 3 次 ,ACG 则 完全 没有 使 用 。 动物 密码 子 也 有 类 似 情况 . 据 统计 ,在 2 244 个 密码 子
中 ,编码 丙 氨 酸 的 GCU 密码 子 有 28 个 ,GCC 38 个 ,GCA 14 个 ,GCG 6 个 .其它 氨 基 酸 密码 子
的 使 用 也 有 类 似 情况 。 上 述 例子 说 明 , 编 码 同一 个 氨基 酸 的 各 个 密码 子 的 使 用 不 是 平均 的 . 量

在 第 十 章 将 谈 到 ,一 种 氨基 酸 有 1 个 以 上 的 tRNA。 有 时 这 些 tRNA 的 碱 基 顺 序 昌 然 不
同 ,其 反 密码 子 却 是 相同 的 。 这 些 携带 同一 氨基 酸 的 不 同 tRNA 的 量 常 有 很 大 差异 (可 达 下
倍 ) 。 例 如 ,在 大 肠 杆 菌 中 有 一 种 主要 的 和 一 种 次 要 的 酷 氨 酰 -tRNA ,它们 的 反 密码 子 均 勇
3 -AUG-5' 。 这 次 要 tRNA 的 功能 还 不 清楚 。

据 研究 ,大 肠 杆菌 mRNA 中 的 密码 子 出 现 频率 与 相应 的 tRNA 含量 有 高 度 相关 性 . 图 8-
5 表示 大 肠 杆菌 几 个 基因 的 tRNA 使 用 频率 与 其 含量 的 相关 性 。 图 的 横 坐 标 为 26 种 tRNA 的

206

| 相对 量 , 以 tRNAI' 为 1. 0。 根 据 这 些 tRNA 的 已 知 反 密 码 子 的 碱 基 顺 序 , 算 出 4 种 基因 中 相
| 应 的 密码 子 出 现 频率 。 从 图 8-5 中 看 出 ,高 度 表达 的 rec4 基因 和 核糖 体 蛋白 基因 ,tRNA 量 与

使 用 频率 呈 高 度 相关 ,而 A- 内 酰胺 酶 (8-lactamase) 基 因 和 噬菌体 @X174 基因 则 各 点 很 分 散 。
在 高 等 生物 内 也 是 如 此 ,被 主要 的 tRNA 同 工 受 体 解读 的 ,也 就 是 那些 使 用 频率 最 高 的 密码
子 。 例 如 ,酵母 的 醇 脱 氢 酶 同 工 酶 ! 和 磷 酶 甘油 醛 脱 氢 酶 ,它们 的 氨基 酸 的 96 儿 只 由 25 种 密

其 相应 的 tRNA 因此 ， 高 度 表 达 ,密码 子 的 选择 受 控 于

是 使 其 翻译 效率 达到 最 佳 状 态 , 而 稀有 tRNA

tRNA 使 用 频率 (%%)

tRNA 量 (相对 于 IRNAY)

8-5 大 肠 杆菌 中 的 tRNA 量 与 4 个 基因 中 RNA 使 用 频率 的 相关 关系
tRNA 以 相对 量 表示 ,以 tRNAI' 的 量 为 1. 0。

这 样 ,即使 多 个 密码 子 可 由 变 偶 作 用 与 一 种 tRNA 配对 ,但 通常 是 其 中 一 个 密码 子 被 优
先 结合 。 密 码 子 的 优先 结合 有 下 列 几 种 情况 ，

GD) 反 密 码 子 的 5 位 ( 变 偶 位 )U 被 修饰 可 使 之 优先 与 密码 子 第 三 位 的 A 配对 胜 过 与 G 配
对 。

《2) 反 密码 子 的 5 位 的 I 与 密码 子 的 U 和 C 配对 优先 于 与 A 配对 。

(3) 当 一 个 密码 子 的 头 2 个 碱 基 与 反 密码 子 形成 AU 配对 时 ' 则 第 三 个 碱 基 优先 用 C( 生

成 GC 配对 ) 而 不 用 U( 生 成 AU 对 ), 因 前 者 较 后 者 稳定 。
根据 上 述 几 个 规律 ,同时 也 根据 细胞 内 各 种 tRNA 的 相对 量 , 我 们 可 以 推测 在 一 个 细胞

内 的 mRNA 中 的 密码 子 使 用 情况 。

207

第 四 节 ， 起 始 密码 子 与 终止 密码 子

一 ` 起 始 密码 子

密码 子 AUG 是 与 N- 甲 酰 甲 硫 氨 酰 -tRNA 结合 的 密码 子 , 在 原核 生物 中 启动 蛋白 质 的 合
成 ,所 以 叫做 起 始 密码 子 (initiation codon) 起 先 人 们 发 现 有 一 种 专门 携带 N- 甲 酰 甲 硫 氨 酸 的
tRNA(CtRNAe) ,因此 推 想 , 它 会 识别 与 甲 硫 氨 酸 的 密码 子 AUG 不 同 的 另 一 种 密码 子 。 但 是 ，
将 tRNANe: 进行 顺序 分 析 , 却 发 现 它 的 反 密码 子 与 运载 甲 硫 所 酸 的 让 NA 一 样 , 即 3 本
UAC-5' 。 即 是 说 ,tRNA 和 tRNAN 都 是 与 AUG 配对 的 。 那 么 ,如 何 区 别 这 两 种 尽 NA 的
配对 呢 ? 这 是 由 蛋白 质 合成 的 因子 决定 的 ,因为 只 有 fMet-tRNAj#* 才能 和 起 始 因子 正 2 结合
以 生成 30 S 起 始 复合 物 ;也 只 有 Met-tRNAXe 才能 与 延长 因子 EF-Tu 结合 。 这 样 , 虽然 它们
共用 一 个 密码 子 AUG ,但 甲 酰 甲 硫 氨 酸 只 能 在 多 肽 链 合成 起 始 时 挫 人 ,而 甲 硫 氨 酸 则 只 能 在
多 肽 链 延 长 时 挫 人 到 肽 链 内 部 。

随后 又 发 现 ,fMet-tRNAie: 还 可 以 与 GUG 密码 子 结合 。 在 大 肠 杆 菌 内 ,GUG 作为 起 焕
密码 子 的 频率 只 有 AUG 的 1/30。GUG 原 是 顷 氨 酸 的 密码 子 。GUG 与 tRNANe 的 反 密码 子
3'-UAC-5' 配 对 , 便 意 味 着 有 一 种 新 的 变 偶 。 因 为 在 这 里 ,不 是 密码 子 的 第 三 个 (3' 端 ) 碱 基 而 是 |
第 一 个 (5 端 ) 与 反 密 码 子 发 生变 偶 。 对 这 种 异常 的 变 偶 的 一 个 可 能 的 解释 是 ,根据 让 NA 的
顺序 分 析 , 邻近 反 密码 子 3' 端 的 碱 基 是 未 经 修饰 的 腺 味 叭 ,而 不 是 在 差不多 所 有 其 它 tRNA
中 都 存在 的 体积 巨大 的 烷 基 化 衍生 物 。 不 仅 如 此 ,甚至 UUG 和 CUG 有 时 也 具有 起 始 密码 也
的 作用 ,但 其 频率 则 比 GUG 更 低 . 四

codon) 。 但 这 个 名 称 并 不 恰当 , 因为 它们 虽然 不 编码 任何 氨基 酸 , 却 起 着 终止 肽 链 合成 的 作用 ，
因此 , 称 为 终止 密码 子 (termination codon)。UAA 也 称 为 赭石 型 (ochre),UAG 称 为 下 珀
(amber),UGA 称 为 乳白 型 (opal) 密 码 子 。 所 有 这 3 个 密码 子 均 是 作为 肽 链 终 止 的 密码 子 , 它
， 们 在 蛋白 质 合成 中 起 着 终止 肽 链 延 长 的 作用 . 在 第 九 章 将 谈 到 ,有 两 个 释放 因子 RF1 和 REF2，
它们 分 别 识别 2 个 终止 密码 子 :RF1 识别 UAA 和 UAG,RF2 识别 UAA 和 UGA。RFEI1 和 国 呈
REF2 均 是 蛋白 质 , 这 便 表明 ,多 核 苷 酸 不 仅 可 以 和 另 一 种 多 核 苷 酸 相互 作用 ,也 可 以 和 蛋白 质量
起 相互 作用 ;也 即 是 说 ,不 仅 碱 基 与 碱 基 之 间 可 以 生成 氢 键 而 互相 识别 ,也 可 以 和 蛋白质 中 的
氨基 酸 生成 氢 键 而 被 识别 。 】
尚 不 清楚 为 什么 需要 3 个 终止 密码 子 。 据 对 大 肠 杆菌 的 一 些 基因 所 做 的 碱 基质 序 界 本， 多
数 基因 是 用 UAA 作为 终止 密码 子 。 有 些 基 因 有 2 个 甚至 3 个 连续 的 终止 密码 子 ( 图 8-6)。 例
如 ,噬菌体 Qp 的 外 壳 蛋 白 基 因 只 有 一 个 终止 密码 子 , 而 喉 菌 体 R17 和 MS2 的 外 壳 蛋 白 基 因
则 有 2 个 终止 密码 子 . 从 图 8-6 可 以 看 出 ,在 有 些 mRNA 中 ,2 个 或 3 个 终止 密码 子 是 连续 的 ，
但 有 的 则 分 隔 开 。 多 个 终止 密码 子 的 存在 ,对 保证 蛋白 质 合 成 的 适时 终止 是 很 重要 的 。

208

MS2A 蛋 白 5 一 一 AGA uaG NGC 二
MS2 外 壳 蛋 白 一 一 UAC [os [uac ACG

有 - 半 乳 糖苷 梅 一 及 人 [os | [use| [uas|

IIVG 和 蛋白 一 一 GUU [ac | EAI
本 休 要 和 513 一 -AAA|wAA|vceccdvcee|
核糖 体 蛋 白 S7 一 一 AAU ucA| AcG

图 8-6 在 大 肠 杆 菌 内 几 种 mRNA 编码 区 3 端的 核 苷 酸 顺 序
终止 密码 子 以 方 框 表 示 。

第 五 节 ”遗传 密码 的 突变

当 基 因 组 的 DNA 的 顺序 发 生变 化 时 , 便 产 生 突变 (mutation)。 本 节 从 遗传 密码 的 角度 ，

讨论 突变 发 生 的 情况 及 其 抑制 或 校正 。

一 、 无 义 与 错 义 突变

突变 有 两 种 情况 : 当 一 个 密码 子 发 生 改 变 , 使 这 个 密码 子 编码 出 另 一 个 "错误 ”的 氨基 酸 ，
这 便 称 为 错 义 突变 (missense mutation) 。 如 果 肽 链 终止 无 义 密 码 子 改变 为 有 义 密 码 子 ,或 有 义
密码 子 改变 为 无 义 密 码 子 , 便 称 为 无 义 突 变 (nonsense mutation ) 。

由 于 终止 密码 子 只 有 3 个 , 而 编码 氨基 酸 的 密码 子 有 61 个 ,所 以 ,如 果 只 改变 1 个 碱 基
( 称 为 点 突变 ,point mnutation) ,那么 通常 是 发 生 错 义 突变 ,而 无 义 突变 出 现 的 几率 较 少 。 由 错
义 窦 变 产 生 的 蛋白 质 只 改变 1 个 氨基 酸 , 仍 具有 原来 的 一 些 生 物 学 活性 。 上 文 已 指出 ,在 遗传
密码 表 上 , 性质 相 同 的 氨基 酸 的 密码 子 是 排 在 附近 的 ,因此 ,发生 错 义 突 变 对 生成 的 蛋白 质 的
性 质 往往 无 大 影响 。 它 们 和 常 能 保持 原来 的 蛋白 质 的 某 些 活性 。 在 高 温 下 , 错 义 蛋白 质 会 失去 其
原来 的 功能 ,这 是 因为 在 高 温 下 ,多 肽 链 不 能 折 丢 成 正常 的 构象 , 因而 失去 活性 .这 称 为 温度 敏
感 突变 型 (temperature-sensitive mutation) 。 显 现 突变 型 性 状 的 温度 称 为 限制 性 温度 (restric-
tive temperature) ,而 保持 原来 正常 性 状 的 温度 则 称 为 许可 温度 (permissive temperature), 许
多 异常 血红 蛋白 (abnormal hemoglobin ) 就 是 由 错 义 突变 产生 的 ; 另 一 方面 ， 冷 敏 感 (cold-sen-
sitive) 型 突变 则 在 较 高 温度 下 产生 正常 的 蛋白 ， 而 在 低温 下 则 会 产生 失 活 的 蛋 日 。

当 发 生 无 义 突变 时 ,使 会 改变 生成 的 多 肽 长 度 , 视 无 义 突变 发 生 的 位 置 而 异 。 如 果 在 靠近
起 始 不 远 处 的 有 义 密码 子 突变 为 无 义 密码 子 , 则 生成 很 短 的 片段 ;反之 ,如 果 是 在 靠近 末端 处 ，
则 生成 的 多 肽 链 长 度 与 正常 的 无 大 差异 .如 果 无 义 密码 子 突变 为 有 义 密 码 子 , 则 生成 的 多 肽 链
比 正常 的 长 。

二 、 抑 制 基因 突 变

由 突变 产生 的 有 害 效果 常 可 由 第 二 次 突变 而 使 之 恢复 原来 的 性 状 , 这 也 称 为 抑制 或 校正
209

(Csuppression) 。 这 第 二 次 突变 可 以 是 简单 地 把 第 一 次 突变 所 改变 了 的 核 苷 酸 顺 序 变 回 原来 状
态 . 但 有 些 情 况 则 较为 复杂 , 它 是 在 染色 体 的 另 一 位 点 或 另 一 个 基因 发 生 突变 而 消除 了 或 抑制
了 第 一 次 突变 的 效果 ,这 称 为 抑制 基因 突变 (suppressor mutation)。 抑 制 基 因 突 变 可 分 为 基因
内 抑制 (intragenic suppression) 和 基因 间 抑 制 (intergenic suppression) 二 类 型 。 两 种 类 型 的 抑
制 均 是 使 由 于 第 一 次 突变 所 产生 的 失 活 蛋白 质 回 复 至 原来 的 具 活 性 (或 部 分 活性 ) 的 蛋白 页
但 两 者 的 机 理 则 回 然 不 同 。
(一 ) 基 因 内 抑制
基因 内 抑制 是 在 同一 基因 内 发 生 第 一 次 突变 ,从 而 抑制 或 校正 第 一 次 突变 所 生 的 伤 交
这 种 可 被 基因 内 抑制 所 回复 的 第 一 次 突变 , 常 是 由 插入 或 缺失 单个 核 苷 酸 引 起 的 。 这 便 使 在 本
|

变 位 点 以 后 的 密码 子 的 解读 发 生 移 码 (frameshift) ,生成 一 段 所 基 酸 顺序 不 同 的 多 肽 。 而 且 记
样 的 移 码 常会 产生 新 的 无 义 密码 子 , 结 果 使 翻译 至 此 中 断 而 生成 较 短 的 不 成 熟 的 多 肽 链 。 如 村
在 第 一 次 突变 位 点 附近 发 生 第 二 次 突变 (插入 或 缺失 核 苷 酸 ), 便 有 可 能 使 第 一 次 突变 位 点 |
后 的 密码 子 回复 至 正常 ,从 而 抑制 了 第 一 次 突变 (图 8-7)。 从 图 8-7 看 出 ,由 于 第 一 次 突变 人 @
变型 DNA,) 缺 失 了 一 个 核 苷 酸 ,使 突变 部 位 以 后 发 生 移 码 (密码 子 向 后 移 1 个 碱 基 位 )， 因而 时
产生 错 义 密码 子 和 错误 的 氨基 酸 ,也 可 能 出 现 无 义 密码 子 而 使 多 肽 链 过 早 终止 ,于 是 产生 一 达
不 完全 的 和 无 活性 的 多 肽 链 。 如 果 在 缺失 核 音 酸 附近 发 生 第 二 次 突变 (抑制 突变 ) ,增加 一 个 村
苷 酸 , 便 会 使 以 后 的 密码 子 恢复 正常 。 虽 然 在 两 次 突变 点 之 间 可 能 出 现 一 些 夏 正常 的 密码 予
但 由 于 密码 子 的 简 并 性 ,很 可 能 它们 仍 是 编码 同一 氨基 酸 , 如 果 是 这 样 , 便 会 产生 具 正常 功能
的 多 肽 链 。

(a) (b)

DN 一 一 突变 体 DNA， 上 广 -一

基因 复 提 时 上 基因 复制 时 增加
3 一 个 核 苷 酸
| 突变 体 DNA， 上 一
。 终止 信号 、 J
突变 体 ERNA CTTTTRTTTmTTTW 突变 体 mRNA, Cr
有 意义 密码 子 | 错 义 无 义
二 刘 玛 子 机 到 了
不 完全 的 无 活 CHOHOHOODEHTHDH DOODOOoHYTODOODOOD

过 早 终 上 完全 的 多 肽 链
仙 氨基 酸 氨基 酸 链 末 端
图 8-7， 核 华 酸 缺失 或 插入 突变 的 基因 内 抑制 用
Ga) 单 个 核 苷 酸 缺 失 突变 的 结果 ;by 第 三 次 突变 增加 一 个 核 苷 酸 抑制 了 第 一 次 突变 的 伤害 其 中 两 下 要 基
酸 被 置换 ,如 果 不 是 发 生 在 要 害 部 位 , 则 多 肽 链 将 保持 部 分 或 完全 的 活性 . 二
如 果 第 一 次 突变 是 错 义 突变 ,那么 也 可 由 第 二 次 错 义 突变 而 使 之 回复 .这 是 因为 第 一 沉 赤
变 改变 了 密码 子 , 使 生成 的 多 肽 链 中 含 一 个 错误 的 氨基 酸 ,这 便 可 能 改变 蛋白 质 的 二 维 上 构
从 而 使 之 失 活 。 如 果 在 同一 基因 内 发 生 第 二 次 突变 , 便 可 能 使 该 蛋白 的 功能 部 位 恢复 原来 榈
象 , 从 而 恢复 其 活性 。 例 如 ,大 肠 杆 菌 的 色 氨 酸 合成 酶 由 A,B 两 条 链 组 成 ,这 两 条 链 单独 存 家

便 失 去 活性 。A 链 含 267 个 氨基 酸 。 当 用 诱 变 剂 使 它 的 第 211 个 氨基 酸 即 甘氨酸 变 为 精 氨 酸
210

(密码 子 GGA 变 为 AGA) 时 , 便 失 去 活性 。 如

DODDGGADD
于 胆 发 生 突变 使 靖 氨 酸 变 为 丝氨酸 (密码 子 基站 人 让
AGA 变 为 AGU ) , 便 完 全 恢复 活性 ;如 果 精 氨 甘氨酸
酸 变 为 苏 氨 酸 (密码 子 AGA 变 为 ACA) ,也 可 | 主人
部 分 恢复 活性 (图 8-8)
(二 ) 基 因 间 抑制 人
基因 间 抑 制 比 基 因 内 抑制 的 情况 更 复杂 ， 人
它 是 由 于 在 另 一 基因 发 生 突变 而 产生 抑制 的 。 。 第 元 次 突 赤
这 另 一 基因 称 为 抑制 基因 (suppressor gene)。 > 委 2
抑制 基因 的 作用 并 不 是 改变 第 一 次 突变 基因 上 辐 酉
的 碱 基 硕 序 , 而 是 由 其 它 方式 产生 抑制 的 ,有 下 证 [三
列 的 不 同类 型 ， 丝 所 本
1. 终 止 密码 子 的 错 读 (misreading) 这 是 。 具 部 分 匠人 具 完 全 活性

由 于 抑制 基因 改变 了 mRNA 模板 的 解读 方式

而 抑制 突变 的 。3 个 终止 密码 子 都 有 抑制 基因 ，

这 些 抑制 基因 的 作用 是 把 终止 密码 子 解读 成 某 种 氨基 酸 。 已 知 UAG 密码 子 有 3 个 抑制 基因 ;
一 个 把 UAG 密码 子 解 读 为 丝氨酸 ; 另 一 个 解读 为 谷 氨 酰 胺 ;第 三 个 解读 为 酷 氨 酸 。 这 是 因为
抑制 基因 编码 生成 不 正常 的 tRNA, 使 携带 这 些 氨基 酸 的 tRNA 的 反 密 码 子 发 生 了 变化 。 如
tRNA 基因 发 生 突变 ,将 反 密 码 子 由 3 -AUG-5 变 为 3 -AUC-5 ,这 便 使 它 可 以 识别 UAG
终止 密码 子 , 把 它 解 读 为 酪 氨 酸 (图 8-9)。 同 样 , 其 它 2 个 抑制 基因 也 使 tRNA 的 反 密 码 子 的
一 个 碱 基 改变 ,使 它们 能 将 终止 密码 子 UAG 解读 为 丝氨酸 或 谷 氢 酰 胺 。

终止 密码 子 UAA 也 可 以 通过 tRNA 的 突变 而 被 抑制 ,例如 , 酷 氨 酸 和 赖 氨 酸 的 密码 子 和
UAA 只 差 一 个 碱 基 , 通 过 tRNA 的 突变 ,可 以 将 UAA 解读 成 酷 氨 酸 或 赖 氨 酸 。

终止 密码 子 UGA 也 是 通过 突变 tRNA 分 子 被 抑制 的 ,这 就 是 tRNATmP, 它 使 UGA 解读
成 色 氢 酸 。 但 这 与 上 述 的 不 同 ,不 是 改变 了 反 密 码 子 的 碱 基 , 而 是 把 tRNA 分 子 中 第 24 位 的 G
改变 为 A。 但 这 样 的 改变 如 何 能 影响 其 与 密码 子 的 配对 还 不 清楚 。 从 tRNAz 的 三 维 结构 看 ，
2 中 位 是 在 工 形 结构 的 折 角 处 , 它 能 影响 距离 1. 5 nm 处 的 密码 子 - 反 密 码 子 相 互 作 用 ,说 明 核
糖 体 上 的 mRNA 的 正确 解读 ,要 求 tRNA 分 子 有 微小 的 构象 变化 。 此 外 ,即使 正常 的 tRNA
也 能 解读 UGA 终止 密码 子 , 但 其 频率 很 低 。 因 此 ,终止 密码 子 UGA 叫做 “ 渗 漏 ”leaky) 密码
避

既然 具有 无 义 抑制 基因 的 细胞 含有 发 生 了 突变 的 tRNA ,那么 ,与 这 些 RNA 对 应 的 密码
子 如 何 能 正常 地 被 解读 呢 ? 目前 ,对 栈 氨 酸 UAG 抑制 基因 已 有 所 了 解 , 发现 编 码 tRNA “的
基因 有 3 个 ,其 中 一 个 编码 主要 的 tRNAzr ,其 它 两 个 是 重复 基因 (duplicate gene), 只 编码 生
成 少量 的 诊 NAz .在 大 肠 杆菌 的 染色 体 中 ,这 两 个 重复 基因 距离 200 bp。 抑制 突变 就 是 发 生
在 两 个 重复 基因 的 一 个 上 面 。UGA 的 抑制 则 与 此 不 同 , 因为 起 抑制 作用 的 tRNA ? 仍 能 解读
色 氨 酸 密码 子 UGG 。

无 义 抑 制 的 作用 ,可 视 为 抑制 基因 tRNA 与 蛋白 质 合 成 的 释放 因子 之 间 的 竞争 作用 号 当
终止 信号 进入 核糖 体 的 A 位 点 后 , 它 可 能 与 抑制 基因 tRNA 结合 而 解读 成 氨基 酸 , 这 时 肽 链
便 继 续 延 长 ; 它 也 可 能 与 释放 因子 结合 而 终止 肽 链 的 延长 。 这 便 发 生 竞争 , 视 何 者 先 到 达 而 结

211

8-8 基因 内 抑制 恢复 色 氮 酸 合成 酶 活性

RN 十 -一 一 CT 一 一 个 5
转录 一 才 (此 股 转录 )
2
mRNA5'” 5 UAG 3 本
(3) AUG
(4)
(5)
5 十 一 一 TAG 一 一 才 十 一 一 CTA 人 一 3
BA 地 站 十 -一 一 GAT 一 下 5
转录 | (此 股 转录 )
3
E

mRNA 5” 5 weermree LAO 〇 rm 一 一 了

图 8-9 酷 氨 酰 tRNA 的 无 义 抑制
(1) 基 因 突 变 使 酷 氨 酸 密码 子 变 为 无 义 密码 子 ; (2) 编 码 酷 氨 酰 tRNA 的 基因 ;(3) 突 变 mRNA 含 无 义 密 码
子 ; (4) 酷 氨 酰 tRNA; 5) 编码 反 密 码 子 区 发 生 突变 ;(6) 突 变 产 生 的 酪 氨 酰 tRNA;(7) 无 义 密码 子 被 抑制 ,解读

昌
为 酷 氨 酸 。
果 不 同 。UAG 和 UGA 密码 子 的 抑制 效率 是 相当 高 的 ,在 有 抑制 基因 tRNA 存在 时 , 约 有
50% 的 UAG 和 TUGA 被 解读 为 氨基 酸 。 但 UAA 的 抑制 通常 只 有 1%% 一 5 中 。 起 先 人 们 以 为
由 于 UAG 和 UGA 的 抑制 效率 很 高 ,它们 很 少 起 终止 密码 子 的 作用 .因为 如 果 它 们 常 被 使 用 呈
则 抑制 基因 的 存在 将 使 肽 链 超常 延长 ,细胞 生长 也 就 停止 。 后 来 人 们 发 现 ,在 许多 基因 的 末端
常常 出 现 UAG 和 UGA 密码 子 , 虽 然 有 它们 的 抑制 基因 存在 , 却 不 生成 太 多 不 正常 的 过 长 的
多 肽 链 。 其 原因 尚 不 清楚 。
另 一 个 还 没有 在 分 子 水 平 上 解释 清楚 的 问题 是 ,终止 密码 子 周围 的 核 苷 酸 顺 序 如 何 影响
其 抑制 效率 。 视 无 义 密码 子 在 mRNA 上 的 位 置 的 不 同 ,其 相应 的 抑制 基因 tRNA 抑制 的 程度
相差 达 10 倍 之 多 。 而 且 ,这 种 对 终止 密码 子 解读 的 “上 下 文 效 应 "(context effect) 并 不 限于 舍 |
抑制 基因 的 细胞 .已 知道 一 些 正常 的 终止 密码 子 也 能 被 解读 成 氨基 酸 而 使 肽 链 延长 ,虽然 其 程 ，
度 很 低 ,但 亦 有 生物 学 上 的 重要 性 。 一 个 已 充分 证 明 的 例子 是 叭 菌 体 Qp 的 RNA 基因 组 翻译 ，
这 种 噬菌体 有 两 种 外 壳 蛋 白 ,一 种 主要 的 (分 子 量 约 14kD) 和 一 种 次 要 的 (分 子 量 约 38KD)，
它们 的 N- 末 端 氨基 酸 顺序 均 相同 。 这 种 次 要 的 外 壳 蛋 白 是 由 主要 外 壳 蛋 白 的 UGA 终止 密码

子 偶然 被 解读 为 色 氨 酸 , 遂 使 肽 链 延 长 成 为 次 要 外 壳 蛋 白 ( 图 8-10) 。 这 种 次 要 蛋白 是 病毒 侵
212

染 所 必需 的 。 图 8-10 表明 , 约 有 5% 的 UGA 被 解读 为 色 氨 酸 ,使 肽 链 延 长 ,生成 含 327 个 氨基
酸 的 次 要 外 壳 蛋 白 (A 蛋白 ) 。

成 熟 复制 酶

AwVVVYYY 131 氨基 酸
-95% 主要 外 壳 蛋 白

327 氨基 酸
一 53 A, 蛋白
8-10 图 示 叭 菌 体 Qp 基因 组 中 主要 外 壳 蛋 白 的 终止 密码
子 UGA 被 抑制 生成 次 要 外 壳 蛋 白

正常 的 终止 密码 子 本 身 也 可 能 发 生 突变 而 使 之 成 为 可 被 解读 成 某 种 氨基 酸 的 密码 子 。 由
于 mRNA 的 3' 端 常 含有 不 翻译 的 区 段 ,这 样 的 突变 便 使 多 肽 链 不 能 正常 终止 ,而 生成 一 条 特
别 长 的 多 肽 链 。 例 如 ,人 类 的 血红 蛋白 的 “ 链 含 141 个 氨基 酸 , 其 基因 的 终止 密码 子 是 UAA。
但 当 U 变 为 C 时 , 它 便 变 为 编码 谷 氨 酰 胺 的 密码 子 CAA, 肽 链 的 第 142 位 便 成 为 谷 氨 酰 胺 ，
并 继续 延长 至 172 个 氨基 酸 。
表 8-5 大肠 杆菌 的 甘氨酸 -tRNA
被 识别 的 产生 的 错 义 tRNA 产物 的 。 被 识别 的

也 酸 千 友子 ，，， 抑制 基因 反 密码 子 。 。 精 氢 酸 密码 子
ELyUJ tRNA 3'-CCC-5/ GGG ELy USz CC2S5/ AGG
5O0T tRNAgr 3'-CCU-5' GGA 2 3-UCU-5: AGA

GGG- AGG
2 tRNAgr 3'-CCA-5' GGU

GGC

2. 错 义 突变 的 抑制 ” 错 义 突变 亦 可 由 tRNA 突变 而 被
抑制 。 例如, 色 氢 酸 合成 酶 A 链 的 甘氨酸 改变 为 精 氨 酸 ,此 酶
便 失 去 活性 .可 由 抑制 基因 突变 而 使 之 变 回 甘氨酸 ,并 恢复 酶
活性 。 这 也 是 由 tRNA 突变 产生 的 。 在 大 肠 杆菌 内 有 3 种 tR-
NA ,其 反 密 码 子 均 不 同 , 分 别 识 别 不 同 的 密码 子 ( 表 8-5) 。
众 表 8-5 看 出 ,tRNAY 识别 密码 子 GGG ,但 GGG 也 可 被 ua- ，A ACE CS
tRNA 识别 .所 以 ,对 蛋白 质 合 成 来 说 ,tRNASP 并 不 是 必需 ”< 二 区 和 ，

sonooong8
南 巩 | 直道 请 |
noOanmononcCmnmnr

的 。 当 它 的 反 密 码 子 3'-CCC-5' 改 变 为 3'-UCC-5' 时 , 便 可 以 cc
解读 精 氨 酸 的 密码 子 AGG , 而 不 会 影响 对 甘氨酸 密码 子 2
GGG 的 解读 。 入 人

另 一 些 例子 是 由 于 tRNA 的 突变 ,使 它 携带 错误 的 氨基
酸 而 产生 抑制 。 在 tRNA 分 子 的 不 同 部 位 均 可 发 生 改变 ,使 图 8-11 移 码 抑制 基因

它 被 错误 的 氨 酰 -tRNA 合成 酶 识别 ,从 而 运载 了 错误 的 氨基 tRNASip 的 三 叶 草 形
酸 。 结构 和 核 苷 酸 顺 序

213

3. 移 码 抑制 “mRNA 上 的 密码 子 是 以 3 个 核 昔 酸 为 一 组 ,组 成 一 个 三 联 体 , 称 为 码 组 或
框架 (frame) 。 如 果 发 生 突变 , 核 苷 酸 增加 了 1 个 或 2 个 ,那么 便 会 使 以 后 的 密码 手 码 组 发 生 牙
变 , 称 为 移 码 (frameshift) 。 例如 ,正常 mRNA 为 CAU ; CAU ; CAU : ……， 如 果 在 吉之 后 择
入 一 个 ,三 联 体 便 变 为 CAU ; UCA ; UCA ; UXX……，, 即 密码 子 向 后 移 了 一 个 位 置 。 缺失
核 苷 酸 也 同样 会 发 生 移 码 。 但 如 果 插 入 或 缺失 的 核 苷 酸 是 3 个 或 其 倍数 , 则 不 会 发 生 移 码 。

由 插入 核 苷 酸 而 产生 的 移 码 突变 ,也 可 由 抑制 基因 使 之 消除 。 在 这 里 ,也 是 由 tRNA 的 罕
变 起 作用 。 例 如 , 移 码 甘 氨 酰 -tRNA( 称 为 tRNASio 或 tRNA&gcc) 。 它 的 反 密码 子 多 了 一 个 碱
基 , 由 原来 的 CCC 变 为 CCCC( 图 8-11) 。 它 是 由 基因 syC( 见 表 8-5) 发 生 插 和 人 突变 产生 的 。 直
于 tRNAS8se 的 反 密码 子 有 4 个 碱 基 , 它 便 可 以 和 mRNA 上 发 生 插 人 突变 的 4 个 碱 基 配 对 ,下
核糖 体 上 由 A 位 点 移 至 P 位 点 时 ,一 次 移动 4 个 碱 基 。 这 样 , 以 后 的 密码 子 便 恢 复 正 常 。 且 氮
酰 -tRNA 也 有 类 似 情况 。

4. 由 核糖 体 错 读 产 生 的 抑制 ”核糖 体 的 结构 与 遗传 密码 的 正确 解读 有 密切 关系 。 如 果 由
于 突变 引起 核糖 体 30 S 亚 基 的 蛋白 质 的 氨基 酸 顺 序 发 生变 化 , 便 会 影响 它 的 正常 结构 ,从 而
导致 与 错误 的 氨 酰 -tRNA 分 子 相 结合 。 一 个 明显 的 例证 是 抗菌 素 链 霉 素 的 作用 。 将 链 霉 素 策
和 到 活 细胞 或 体外 系统 中 , 便 会 使 遗传 密码 的 翻译 发 生 错 误 , 产生 无 活性 的 蛋 和 白质, 导致 细 豚
死亡 。 链 者 素 与 核糖 体 的 30 S 亚 基 结 合 ,干扰 了 其 正常 的 mRNA-tRNA- 核 糖 体 相互 作用 , 观
而 导致 错 读 。

(1) (2) 《3)
已

错 义 突变 站
( 异 亮 氨 酸 一 顷 氨 酸 )| (丝氨酸 一 亮 氨 酸 名
RiggSDDcncg

(e) (f)

图 8-12 ”编码 核糖 体 蛋 白 的 基因 发 生 错 义 突变 而 引致 抑制
41) 突 变 体 基因 4 编码 一 种 核糖 体 蛋白 的 氨基 酸 ;(2) 基 因 R 编码 具 活性 的 R 酶 的 氨基 酸 ;(3) 穴 弯 体 基因
区 编码 无 活性 的 X 酶 的 氨基 酸 。
Ga) 突变 体 核 糖 体 蛋 白 ,(b) 突 变 体 核 糖 体 可 偶尔 错 读 遗 传 密码 ,将 亮 氨 酸 解读 为 丝氨酸 ;(c) 由 于 亮 氨 酸 ~

丝氨酸 产生 的 少量 无 活性 的 酶 ;(d) 大 量 的 正常 具 活性 的 酶 《e) 大 量 的 无 活性 的 酶 ;(f) 由 于 亮 氨 酸 二 丝氨酸 产
生 少 量 的 具 活性 的 酶 。

图 8-12 表示 出 , 由 于 编码 核糖 体 蛋 白 的 基因 4 发 生 错 义 突变 ,使 异 亮 氨 酸 改变 蚊 须 恒
酸 ,产生 核糖 体 蛋白 突变 体 。 这 个 核 独 体 突变 体 偶然 被 引起 错 读 ,使 原来 应 解读 为 训 氢 酸 前 区
码 子 解读 成 丝氨酸 (图 8-12 左 ) .这 便 会 使 小 部 分 具 活性 的 R 酶 由 于 核糖 体 错 读 发 生 亮 氨 配 旦
丝 氢 酸 的 改变 而 失去 活性 ,但 大 部 分 酶 仍 是 正常 的 (图 8-12 中 ) 。 如 果 另 一 编码 X 酶 的 基因 区
发 生 错 义 突变 ,使 丝氨酸 改变 为 亮 氢 酸 ,因而 产生 无 活性 的 酶 ,由 于 核糖 休 突 变 体 也 可 将 竞 所
酸 变 为 丝氨酸 ,从 而 恢复 酶 活性 。 但 这 个 抑制 很 少 发 生 , 所 以 ,只 生成 很 少量 的 具 活性 的 栈 。

214

5. 抑制 基因 引起 正常 基因 的 错 读 “抑制 基因 的 产
筷 并 不 选择 性 地 对 突变 体 基因 的 mRNA 模板 起 作用 ，
它们 也 能 对 野生 型 mRNA 模板 的 解读 起 作用 ,因而 二
抗 正 常 蛋白 质 的 合成 .一 般 来 说 ,这 样 的 变化 对 正 生长
着 的 细胞 为 害 不 大 ,因为 通常 生成 正常 蛋白 质 的 量 大
大 多 于 不 正常 的 量 .但 是 ,即使 是 生成 小 量 不 正常 蛋白
质 ,对 细胞 也 是 没有 什么 好 处 的 。
关于 抑制 基因 的 功能 可 归纳 如 下 :一 个 基因 由 突
变 而 成 为 抑制 基因 .在 这 种 突变 发 生 之 前 ,这 个 基因 是
正常 的 和 具 活性 的 。 它 可 以 编码 一 种 特异 的 tRNA ,或
一 种 核糖 体 蛋 白 , 或 一 种 氨 栈 -tRNA 合成 酶 ,也 可 能
包括 修饰 tRNA 的 酶 。 现 在 已 证 明 ,在 反 密码 子 中 的
或 其 附近 的 碱 基 被 修饰 , 均 可 影响 抑制 (图 8-13)。 图
8-13 为 果 蝇 (Drosopjzza) 的 tRNA , 当 它 的 反 密 码 子 _ G A 隐 冯
的 第 一 位 为 G 时 , 它 偶然 可 以 解读 终止 密码 子 UAG， ee di is

卫

已 志 傈 全

人
三
扣
记
G
C
人 A
人
G
C
U

maG 7

从 而 产生 抑制 ; 当 用 QQuxexosine) 代 替 G 时 , 便 失 去 Sen 3
摘 制 活性 .生物 在 进化 过 程 中 形成 所 有 这 些 基因 ,使 得 c 一

其 产物 具有 最 佳 的 构 型 ,保证 遗传 密码 能 正确 解读 .如 Au

条 爱 生 一 次 突变 ,产生 改变 了 的 产物 ,使 错 读 增多 ,这 2

时 这 些 基因 便 转 变 为 抑制 基因 ,使 由 于 第 一 次 突变 产 和

生 的 伤害 得 以 校正 。 图 8-13 果 蝇 tRNA 的 结构

第 六 节 ”遗传 密码 的 改变

上 文 在 谈 到 遗传 密码 的 破译 时 指出 ,在 用 体外 合成 蛋白 质 系 统 研究 密码 子 时 ,不 管 所 用 的
无 细胞 提取 液 是 来 源 于 细菌 或 高 等 生物 ,加 入 多 聚 U 总 是 得 出 多 聚 葵 丙 氨 酸 肽 链 ,加 入 多 聚
已 则 总 是 得 出 多 育 且 氨 酸 , 加 入 多 聚 A 得 出 多 聚 赖 氨 酸 。 这 似乎 意味 着 遗传 密码 在 目前 存在
的 从 低 等 到 高 等 的 各 种 生物 中 都 是 通用 的 。
但 是 ,Barrell 等 在 1979 年 发 现在 人 的 线粒体 中 ,通用 的 密码 子 AUA 却 是 编码 甲 硫 氨 酸
而 不 是 异 亮 氨 酸 ,\UGA 不 是 作为 终止 密码 子 而 是 编码 色 氨 酸 。 以 后 ,许多 的 研究 发 现在 多 种
生物 中 有 些 密码 子 与 表 8-3 列 出 的 通用 密码 不 同 ,这 些 非 通用 的 密码 子 在 多 种 生物 体 中 均 有
发 现 ,而 且 主 要 是 在 线粒体 的 遗传 密码 中 发 现 的 。 这 些 遗 传 密码 的 自然 变化 可 分 为 2 个 类 型 ，
一 个 类 型 是 终止 密码 子 UGA ,UAA 和 UAG 改变 为 编码 氨基 酸 的 密码 子 。 这 在 多 种 生物 的 线
粒 体 遗传 系统 一些 原 生动 物 的 核 质 系统 .以 及 一 些 原核 生物 的 遗传 系统 中 均 有 发 现 ; 另 一 类
| 型 是 改变 有 义 密码 子 的 编码 意义 , 即 编码 的 氨基 酸 与 表 8-3 列 出 的 不 同 , 它 存在 于 线粒体 的 遗
传 系统 中 ，

一 、 线 粒 体 的 遗传 系统

线粒体 DNA 中 改变 的 密码 子 如 表 8-6 所 示 。 从 表 中 看 出 ,许多 种 生物 的 终止 密码 子
215

UGA 改变 为 编码 Trp ,而 在 牛 、 鼠 等 动物 中 的 AGA 和 AGG 则 改变 为 终止 密码 子 .AUA 在 总
些 动物 和 酵母 中 作为 Met 的 密码 子 ,AUA,AUU 和 AUC 也 作为 鼠 线粒体 基因 的 起 始 密 太
子 。 在 高 等 植物 线粒体 内 , 则 用 另 一 密码 子 变 异体 来 编码 Trp ,例如 ,玉米 的 线粒体 中 的 细胞 多 攻
素 氧 化 酶 亚 基 工 的 基因 中 即 含有 3 个 CGG 密码 子 用 以 编码 Trp 。 一 些 对 莱 因 衣 莹 线粒体 基因 项
的 研究 未 发 现 非 通用 的 密码 子 , 亦 未 发 现 UGA 和 CGG 密码 子 ( 表 8-6 中 的 “?” 号 ), 很 可 能 它 基
的 终止 密码 子 也 发 生变 异 。 < 少
表 8-6 线粒体 中 的 密码 子 变异 体

密码 子
生物 体 UGA AUA 二 全 CUN CGG
AGG ”二
通用 密码 动物 终止 Jle Arg Leu Arg 1 1
脊 椎 动物 Trp Met 终止 二
果 蝇 Trp Met Ser 在 一
酵母
accAha7zozayCceEs ce7remistae Trp Met : Thr 十
Torxlozpsis 8Laprata Trp Met 二 Thr ?
Schizosaccharomayces zoomzpe Trp 了 十 二 十
丝 状 真菌 Trp 二 = 让 十
锥 虫 Trp 十 手 中 :
高 等 植物 二 = 了 并 Trp
莱 因 衣 荡 ? 二 ?

按照 变 偶 假 说 ,至 少 要 有 32

种 tRNA 才能 与 64 个 密码 子 配 ES 5
对 。 但 在 兰 椎 动物 线粒体 中 只 发 - 忆 ES IRNASe" ec IRNAr
现 有 22 种 tRNA, 因此, 便 有 一 下
套 不 同 的 变 偶 规 律 ,使 22 种 谎 - A 一 1 T 二 A 娄 和
NA 与 64 个 密码 子 配对 在 非 清 e II 人 4 RE
将 还 害 码 子 族 (密码 于 宝宝
基 相 同 ,第 三 个 不 同 ) 中 ,只 用 一 ， 57 Ac 和
个 tRNA 与 之 配对 ,其 反 密 码 子 2 ER
的 第 一 个 ( 变 偶 ) 碱 基 为 U, 这 WU ， ， ^-1 A
可 能 与 4 个 密码 子 第 三 个 碱 基 配 5 ^ 5
”对 ,也 可 能 根本 不 配对 。 另 一 些 和 TT1
tRNA 识别 第 三 个 碱 基 为 A 或 G 3 一 USA 一 5 mRNA 3 二 一 5
的 密码 子 ,或 为 U 或 C 的 密码 | 本
子 。 这 样 ,所 有 tRNA 可 以 识别 2 图 8-14 人 类 线粒体 的 2 种 tRNA 的 基因 核 苷 酸 顺 序 中
或 4 个 密码 子 。 由 于 线粒体 的 以 三 叶 草 形 表示 (转录 后 在 3' 端 加 F CCA)。 到 |
章 , 相 人 0GA 便 改 变 为 编码 Trp,lle 的 密码 |

线粒体 tRNA 的 结构 也 与 非 线粒体 的 不 同 。 例 如 , 常 缺 少 GT 科 CRA 顺序 。D 环 和 工 C

和 中 的 一 些 核酸 介 发 生变 化 在 非 线粒体 tRNA 的 三 叶 章 形 结构 中 ,TC 环 总 是 含 7 个 核

一 二 Er 一 一 =

REED

本

埋 酸 ,但 线粒体 tRNA 可 含 3~9 个 。 还 有 线粒体 的 一 种 丝氨酸 tRNA 完全 缺少 D 臂 ( 图 8-

14) 。 这 表明 线粒体 tRNA 结构 及 其 与 核糖 体 的 相互 作用 方式 , 均 与 非 线粒体 的 不 同 。
二 、 非 线粒体 的 遗传 系统

除 线粒体 外 ,在 非 线粒体 的 遗传 系统 中 也 发 现 有 密码 的 改变 。 例如 ,原核 生物 Mycozplaszza
cazzicolzzz 的 UGA 密码 子 变 为 编码 Trp。 在 纤毛 原生 动物 嗜 热 四 膜 虫 (Tetrapyxzzenza 态 e 六
mopjila) 中 ,UAA 和 UAG 不 作为 终止 密码 子 而 改变 为 编码 Gln。

三 ` 编 码 的 位 点 专 一 性 变异 COO

在 一 些 遗 传 系统 中 观察 到 在 特定 位 点 的 密码 变异 ,包括 用 无 义 密码 时
子 来 编码 氨基 酸 ,以 及 非 三 联 体 的 翻译 。 例 如 ,在 大 肠 杆菌 中 的 甲酸 脱 氢 让
酶 是 一 种 硒 蛋 白 , 含 有 硒 代 半 胱 氨 酸 (selenocysteine Se-Cys)。 它 是 由 基 下
因 万 1 编码 的 ,其 结构 基因 含 715 密码 子 。 试验 证 明 其 肽 链 的 第 140 个 H

氨基 酸 是 由 UGA 编码 的 Se-Cys。 在 哺乳 动物 中 也 发 现 UGA 编码 Se- 三代 半 胱 氨 酸
Cys . 另 一 例子 是 大 肠 杆 菌 的 释放 因子 2(RF-2, 见 第 九 章 ) 的 基因 , 它 的 第 26 个 密码 子 是 UGA
( 原 是 终止 密码 子 ) ,但 在 这 个 密码 子 发 生 移 码 ,解读 为 4 个 碱 基 的 UGAC ,编码 为 Asp(Asp 的
通用 密码 子 是 GAC) 。 以 后 即 按 这 个 新 的 (十 1) 框 架 进行 翻译 。

一 般 来 说 ,在 绝 大 多 数 情况 下 各 种 生物 仍 是 用 通用 的 标准 密码 ,只 在 少数 情况 下 出 现 密码
子 的 变异 。 这 说 明 地 球 上 的 生物 在 遗传 上 是 同 源 的 。

第 七 节 ” 重 到 基 因 与 重重 密码

由 于 DNA 的 密码 子 是 连续 的 ,在 密码 子 之 间 没 有 间断 ,这 样 ,一 条 DNA 链 便 可 以 有 3 个
解读 框架 ,编码 出 3 条 不 同 的 多 肽 链 。 但 大 多 数 的 DNA 只 用 其 中 一 个 框架 ,编码 出 一 条 多 肽
链 。 而 且 , 一 般 说 来 各 个 基因 也 是 不 重 到 的 。 但 是
这 个 一 般 规律 有 时 也 有 例外 。 在 一 些 病 毒 中 发 现
同一 DNA 碱 基 顺 序 可 以 编码 出 两 条 不 同 的 多 肽
链 。 这 是 由 于 有 些 基因 可 以 完全 埋藏 在 另 一 个 基
因 之 内 。 这 表明 一 段 DNA 顺序 有 多 个 功能 。 例
如 ,1976 年 Barrell 等 发 现 ,在 喉 菌 体 E@X174 环
型 的 单 链 DNA 中 ,五 基因 的 237 个 核 苷 酸 完全
包含 在 含有 456 个 核 背 酸 的 刀 基因 之 内 ,但 它们
的 解读 框架 不 同 。1977 年 Sanger 又 发 现 B 基因
的 260 念 核 苷 酸 完全 位 于 合 1 546 个 核 苷 酸 的 4
基因 之 肉 。 此 外 又 发 现 另 一 个 天 基因 则 跨越 在 4
基因 和 忆 基因 之 间 ( 图 8-15)。 基 因 大 与 基因 万 图 8-15 ” 喉 菌 体 @X174 的 环 型 DNA
共用 =- 段 相同 的 碱 基 顺 序 ,但 解读 框架 不 同 图 ， 划 员 订 放 秦 全 才 站 不 由 鸭 Us
8-16 表示 这 2 个 基因 的 部 分 碱 基 顺 序 中 的 密码 大 基因 路 越 在 用 和 上 基因 显 间 、

子 及 其 编码 的 氨基 酸 。 从 图 中 可 以 看 出 , 下 基因

的 解读 框架 向 3' 端 移动 了 一 个 碱 基 。 以 后 在 多 种 病毒 DNA 中 也 发 现 有 类 似 情况 ,如 鸣 菌 体 入 量
猿 猴 病毒 40(SV40) 、 以 及 RNA 噬菌体 Q8 和 Ql17、 噬 菌 体 GA 等 。 有 人 认为 上 述 这 种 一 个 基
因 内 包含 另 一 个 基因 的 情况 只 在 病毒 内 存在 ,因为 在 病毒 外 壳 蛋 白 所 包围 的 内 部 空间 很 小 , 几
须 充 分 利用 其 所 包含 的 有 限 DNA 以 编码 必需 的 多 种 蛋白 。 但 是 ,在 编码 多 于 一 种 蛋白 质 的 细
菌 mRNA 中 ,也 常 发 现在 一 小 区 段 内 有 几 个 核 苷 酸 的 重 友 , 在 其 中 一 个 编码 区 终止 ,而 另 一 个
起 始 , 如 图 8-17 所 示 。

一 cys 一 竺 三 局 公测 一 Leu 一 Asp 一 Phe =---
万 基因 的 --- Val 一 Giu 一 Aa 一 Cys Val Tyr Gly Thr
解读 框架 5-TEoGAgGcoDcocrorAoDccuAcocrocGAcvogEG---:3

巨 基因 的 ---GUUcaAcaccugcccuUuUuETocrACcomcoAcUvg---
解读 框架 Met 一 Val 一 Arg 一 Trp 一 Thr 一 Leu =--

图 8-16 BX 174 DNA 的 基因 和 基因 天 的 mRNA 转录 本 部 分 核 苷 酸 顺 序 的 解读 框架

重 秋 基因 是 怎样 翻译 的 呢 ? 是 否 在 同一 条 mRNA 链 上 由 核糖 体 按 2 个 不 同 框架 解读 同一
个 基因 ,还 是 在 不 同 mRNA 上 分 别 解 读 不 同 基因 ? 对 鸣 菌 体 MS2 的 重 春 基因 的 研究 表明 , 重 |
释 基 因 开始 进行 翻译 之 前 ，“ 母 "多肽 的 合成 必须 由 错 读 导致 终止 。 叭 菌 体 MS2 的 RNA 含 3

有

T | |
厅 7 力 - 杂 力 万 `CAGGAGACTTTC T GATGGCT
和 及

t7 力 刀 - 太 记 4 CGAGGGGAAATCTGATGGAA

图 8-17 ”大肠 杆菌 色 氨 酸 操纵 子 中 几 个 顺 反 子 间 连 接 处 的 基因 重奏
起 始 及 终止 密码 子 分 别 以 | ] 及 [| 号 表示 。

|
个 主要 基因 ,被 顺 反 子 间 的 间隔 区 隔 开 (图 8-18)。 另 _ 重 矢 基 因 ,是 在 第 二 个 基因 (外 壳 鼻 白 和
基因 ) 的 未 端 开 始 , 跨 过 隔离 区 ,插入 第 三 个 基因 (复制 酶 基因 ) 内 .这 重 矢 基 因 是 编码 一 种 引起
寄主 细胞 深 胞 的 蛋白 质 的 。 这 溶 胞 蛋白 基因 相对 于 外 壳 蛋 白 基 因 和 复制 酶 基因 是 十 1 码 组 ( 即
向 前 移 一 个 核 苷 酸 )。 溶 胞 蛋白 基因 的 表达 ,必须 与 外 壳 蛋 白 的 产生 偶 联 。 当 翻译 外 壳 蛋 白 的
核糖 体 进行 至 距 溶 胞 蛋白 基因 不 远 处 时 , 便 发 生 移 位 错 读 ( 移 码 ) ,结果 遇 上 一 个 无 义 密码 子 ，

多 肽 链 的 合成 便 终 止 并 释放 出 来 ,然后 在 AUG 密码 子 指导 下 开始 溶 胞 蛋白 的 合成 但 目前 还
不 知道 是 否 所 有 的 重 琶 基 因 的 解读 均 要 发 生 移 码 错误 ,也 有 可 能 核 精 休 在 重 登 基因 起 始 处 重 】
新 结合 。

1 30 1308 1335 ”1724 1761 3395
2 SN 六 二

1678 41 9o2
2 图 8-18 RNA 噬菌体 MS 2 的 遗传 图

一 些小 基因 组 的 解读 有 时 亦 利用 核糖 体 移 码 , 使 得 由 同一 DNA 顺序 可 以 编码 两 条 不 同
的 多 肽 链 ,这 便 增加 其 编码 的 效能 。 例 如 ,噬菌体 工 7 有 一 条 含 约 30 个 基因 的 线 状 双 链 DNA

基因 组 ,由 同一 基因 可 产生 一 种 主要 的 和 一 种 次 要 的 外 壳 蛋 白 . 这 两 种 蛋白 的 N 端 氨基 酸 顺
218

序 相同 ,但 C 端的 顺序 和 长 度 均 不 同 。 次 要 的 外 壳 蛋 白 较 长 ,这 是 由 于 在 编码 主要 外 壳 蛋 白 区

段 的 近 末端 处 有 约 10% 的 核糖 体 移 人 一 1 码 组 (向 后 移 一 个 核 苷 酸 ) ,使 肽 链 超越 终止 密码 子

而 继续 延长 约 20 个 氨基 酸 ,至 遇 到 另 一 个 终止 密码 子 才 停 止 .所 以 ,次 要 外 壳 蛋 白 比 主要 和 蛋白
长 约 20 个 氨基 酸 。

参考 文 献

. 徐 铃 , 彭 朝 晖 编 . 基因 的 分 子 生 物 学 . 第 四 章 . 北京 :中 国 科学 技术 出 版 社 ,1992.
.Fox ,T.D. Natural Variation in the Genetic Code. Ann. Rev. Genet. 1987. 21 :67 一 91.

3

.Lehninger,A.L.et al， Principles of Biochemistry. (2nd. ed. ). Chapters26. Worth Publishers ,New York :
1993，

。Watson ,J.et al，Recombinant DNA. (2nd.ed. ). Chapters3. 1992.

。、 Watson , J. A. et al.， Molecular Biology of the Gene.〈4th ed. ). Chapters15. The Benjamin/Cummings
Pub. ,Co. Inc.California :1987.

CD

cn 心

〈 李 明 启 )

219

第 九 章 RNA 的 翻译 一 一 蛋白 质 的 生物 合成

人

了 尼

蛋白 质 是 生命 活动 的 重要 物质 基础 ,要 不 断 地 进行 代谢 和 更 新 ,因此 ,细胞 内 利用 20 种 氮
基 酸 进行 蛋白 质 合 成 便 成 了 生命 现象 的 主要 内 容 。 细 胞 内 每 个 蛋白 质 分 子 的 生物 合成 都 受 细
胞 内 DNA 的 指导 ,但 是 贮存 遗传 信息 的 DNA 并 非 蛋白 质 合 成 的 直接 模板 。 它 是 经 转录 作用
把 遗传 信息 传递 到 信使 核糖 核酸 的 结构 中 ,然后 再 经 翻译 作用 将 遗传 信息 从 信使 核糖 核酸 传
递 到 蛋白 质 结构 中 去 ,使 合成 的 产物 具有 一 定 的 正确 无 误 的 结构 。 在 遗传 信息 传递 的 过 程 中 录 芋
包括 了 如 何 将 DNA 分 子 中 的 碱 基 顺 序 转变 为 多 肽 链 中 的 氨基 酸 顺 序 的 信息 传递 问题 ,还 全
含 了 蛋白 质 生物 合成 的 实际 过 程 : 即 合成 的 起 始 ;将 氨基 酸 按 一 定 的 顺序 连接 ; 肽 链 的 终止 ; 完
整 的 肽 链 从 合成 装置 上 的 释放 ; 肽 链 的 折 琶 以 及 新 合成 肽 链 的 修饰 等 等 的 被 称 之 为 翻译 的 问 ，
题 。 在 整套 遗传 信息 传递 过 程 中 ,遗传 信息 传递 问题 已 由 前 文 讨论 过 了 。 本 章 则 讨论 核糖 核酸 上
的 翻译 问题 , 即 蛋白 质 的 生物 合成 。 - 渤

本 世纪 50 年 代 初期 ,Caspersson 等 人 就 发 现 处 于 生长 状态 的 组 织 和 分 泌 蛋 白质 的 细胞 量
蛋白 质 合 成 的 速度 极 高 ,同时 发 现 RNA 的 含量 也 特别 丰富 。 这 些 现象 使 学 者 们 得 知 ,蛋白
的 生物 合成 与 核酸 有 着 密切 的 关系 .经 过 近 40 年 的 努力 ,对 于 这 个 问题 的 认识 已 比较 清楚 . 现
在 知道 蛋 折 质 生 物 合成 过 程 要 比 “ 复 制 " 与 “转录 ”复杂 得 多 ,需要 大 约 200 多 种 生物 大 分 子 , 其
中 包括 有 核糖 体 ( 由 RNA 和 蛋白质 组 成 ) 信使 RNA(Cmessenger ribonucleic acid ,mRNA) 、 转 |
移 RNA(transfer ribonucleic acid,tRNA) 、 氨 酰 -tRNA 合成 酶 (aminoacyl-tRNA-synthetase)
以 及 一 些 辅助 因子 , 即 可 溶性 蛋白 质 分 子 (起 始 因子 ) (initiation factor,IF)、 延 伸 因 子 (elongaz
tion factor,EF)、 释 放 因 子 ( 终 止 因子 )(release factor,REF) 等 参加 的 协同 作用 。

蛋白 质 合成 的 场所 是 在 核糖 体 ,蛋白 质 合成 的 原料 是 细胞 中 的 20 种 氨基 酸 ,反应 所 需 的
能 量 由 ATP 与 GIP 提供 。

蛋白 质 生 物 合成 的 早期 研究 工作 都 是 用 大 肠 杆 菌 的 无 细胞 体系 《cell-free-system ) 进行 的 ，
所 以 ,对 大 肠 杆 著 的 蛋白 质 合成 机 理 了 解 最 多 , 真 核 生物 的 蛋白 质 合成 的 机 理 与 大 肠 杆菌 有 许多 和
。 相似 之 处 ,但 也 有 不 少 差异 ,下 面 即 详细 讨论 原核 生物 与 真 核 生物 的 蛋白 质 的 生物 合成

二 节 ”核糖 体 及 核糖 体 核糖 核酸 结构

一 .核糖 体 与 多 核糖 体

核糖 体 是 由 几 十 种 蛋白 质 和 几 种 RNA 组 成 的 一 种 亚 细 胞 颗粒 。 它 是 蛋白 质 生 物 合成 的

饭 所 。 基 本 上 不 含 脂肪 。 研 究 得 最 详细 的 是 大 肠 杆菌 的 核糖 体 。 一 个 迅速 生长 的 大 肠 杆菌 细
220

rsTRE 二 PT xc

胞 内 有 约 15 000 个 核糖 体 , 每 个 核糖 体 的 分 子 量 略 小 于 3X10: kD , 故 核糖 体 大 约 共 占 细菌 细
胞 总 质量 的 1/4。 所 以 ,在 总 的 细胞 合成 物质 中 有 相当 大 部 分 是 用 于 制造 核糖 体 。 在 单个 核糖
体 上 每 次 只 能 合成 一 条 多 肽 链 。 在 最 适 条 件 下 ,合成 一 条 含 400 个 氨基 酸 的 多 肽 链 ( 分 子 量 约 为
40KkD) 约 需 10s。 合 成 好 了 的 多 肽 链 便 被 释放 , 游离 的 核糖 体 立 即 用 于 另 一 轮 蛋 白质 的 合成 。
利用 超速 离心 与 其 它 分 离 技术 对 核糖 体 组 分 的 化 学 结构 已 经 基本 弄 清 , 从 形状 看 真 核 生
物 细 胞 质 的 核糖 体 与 原核 生物 的 核糖 体 一 样 都 是 由 大 小 2 个 亚 基 组 成 。 大 亚 基 的 大 小 约 为 小
亚 基 的 2 倍 (图 9-1)。2 个 亚 基 均 含有 RNA 和 有 重 白质 。 在 大 肠 杆菌 内 ,RNA 和 和 蛋白质 的 比例

20 nm

505 303S

多 165S 核糖 体 RNA

235 核糖 体 | RNA
ooQooooo 人 SS 二
oo oo9 0 oo ooeoa Ooo
oooo-oooo9 oocoio
9ooo9o09 9 0u0 9
34 核糖 体 蛋白 质 21 核 糙 体 蛋白 质

9-1 天 .coui( 大 肠 杆 菌 ) 核 糖 体 结构

由 于 核糖 体 在 离心 时 是 以 70 S 沉降 , 故 称 其 为 70 S 核糖 体 。S 代表 Sendberg , 它 是 沉降 速度 的 标准 。 同样 '30S 与 50 S
代表 核糖 体 小 亚 基 与 大 亚 基 的 沉降 系数 。5 S,16 S 和 23 S, 是 小 亚 基 与 大 亚 基 中 RNA 分 子 的 沉降 系数 。5 S$'16 S$,23 S 核
糖 体 RNA 分 子 量 分 别 为 40,500,1 000 kD;70 S,50 S,30 S 的 分 子 量 分 别 为 2700,1 600,900 kD。 所 有 细菌 核糖 体 的 大 小 与
屯 . coli 相似 ,具有 30 S 和 50 S 亚 基 。 在 高 等 生物 中 ,核糖 体 稍 大 些 (80 S), 具 有 :40 S 与 60 S 亚 基 。
约 为 2 : 开 , 在 其 它 许多 生物 体 中 则 为 1 : 1( 表 9-1)。 大 小 亚 基 均 含有 许多 不 同 的 蛋白 质 。 小 亚
基 (30S) 由 1 种 RNA(16S,1 542 个 核 苷 酸 ) 和 21 种 蛋白 质 组 成 ,大 亚 基 (50S) 由 2 种 RNA
(23.S,2 904 个 核 苷 酸 和 5S,120 个 核 苷 酸 ) 和 34 种 蛋白 质 组 成 。 由 于 核糖 体 中 3 种 RNA 的
序列 已 经 测 出 ,核糖 体 及 其 亚 基 的 分 子 量 分 别 是 :小 亚 基 蛋 白质 共 350X10 kD,16SrRNA 为
500 又 103kD ,两 者 之 和 为 850X 103kD; 大 亚 基 蛋白 质 为 400X10 kD,23S rRNA 与 5S
rRNA 为 990X103 kD, 共 为 1450X103kD, 故 核糖 体 总 分 子 量 是 2 300X103kD。 大 肠 杆 菌 小

221

表 9-1 核糖 体 的 性 质 与 核糖 体 亚 基

}

RNA/ rRNA 1
种 类 Szo,W 大 小 Cnmy) 分 子 量 蛋白 质 轴 向 比 一 一 二 -2
(最 大 的 ) (MD) C(W/W) 分 子 量 (MD) Sazo,w
核糖 体
原核 生物 大 肠 杆菌 70 22.5 土 2.5 ”2.6 一 2.9 2
真 核 生物
细胞 质 380 28. 0 士 2.8 3.4 一 4.5 ls
叶绿体 70 22.5 士 2.5 2.5 一 3.3 总 汶
线粒体 55 一 77 一 3. 2 一 4.5 ji 攻 <
核糖 体 小 亚 基
原核 生物 大 肠 杆 菌 30 22. 0 士 2. 2 0.95 7 喇 | 2 0.6 16'S
真 核 生物
细胞 质 36 一 4 25. 0 士 2.5 1.4 及 渍 | 项 0 到 18 S
叶绿体 25 壹 35 22.0 土 2-2 本 访 面 | 2 可 0.6 16 S
线粒体 28 一 40 一 1.1 一 1.7 RE 一 0.3~0.7 12~14S
核糖 体 大 亚 基
原核 生物 大 肠 杆 菌 50 22. 5 士 2. 2 1.75 23 这 1 站 下 25S- 硬
真 核 生物 02 国 S，
细胞 质 60 28.0 土 2.8 ”2.1~3.1 攻 语 | T 汉 加 1.2~1.75 _ 25 一 28 S
0. 05 58S 是
0.4 5 S
叶绿体 4 2255 圭 295 2 254 Tv 条 地 三 1 23 S
0. 04 5 S
0. 03 4.5 Ss
线粒体 39 一 60 一 1.65 一 2.5 县 这 一 0.5~1.5 16 一 25 S

0. 045 时

a4. 5 S rRNA 相当 于 在 真 细菌 内 的 23 S rRNA 的 3'- 末 端的 100 个 核酸 ,在 高 等 植物 的 叶绿体 中 作为 一 个 分 别 的 种 类 存在 。
"这 种 品种 仅 出 现在 植物 线粒体 中 ,在 其 它 线粒体 核糖 体 是 不 存在 的 。
一 表示 无 资料 可 引用 ; * MD 为 百 万 道 尔 顿 。

亚 基 上 的 21 种 蛋白 质 分 别 以 S1~S 21 表示 ,大 亚 基 上 的 34 种 蛋白 质 分别 以 站 1 一 L 34 讲

示 。 在 字母 S 与 L 后 面 的 数码 则 表示 蛋白质 在 双向 电泳 系统 中 的 迁移 率 。 这 样 ，
的 移动 最 慢 的 蛋白 质 就 是 S 1 了 (图 9-2) 。

人 AAA - Sr em

图 9-2 五.co 核糖 体 小 亚 基 ( 磊 )21 种 蛋白 质 与 大 亚 基 ( 右 )34 到 机 质 的 双 疝 本 设 二 二 时
S 20 与 L 26 实际 上 为 同一 蛋白 质 ,L8 是 L7/L 12 和 L 10 的 复合 物 . 三 般 来 说 ， RN 二 汪
这 样 ,在 30 S 亚 基 上 S 1 是 最 大 的 蛋白 质 ( 分 子 量 约 为 60 kD),S 21 是 最 小 的 蛋白 质 ( 分 子 量 约 为 8kD) ,而 在 50 S 亚 基 上 开
1 是 最 大 的 蛋白 质 (分 子 量 约 为 25 kD),L 34 是 最 小 蛋白 质 (分 子 量 约 为 5kD)

222

在 核糖 体 的 大 亚 基 中 世 7 与 L 12 的 氨基 酸 数目 与 序列 完全 相同 ,只 是 L7 的 N 端 为 乙酰
丝氨酸 而 工 12 的 N 端 是 丝氨酸 。 蛋 白质 L8 是 L7/L 12 和 L 10 分 子 组 成 的 复合 物 , 这 个 复合
物 可 能 由 于 与 核糖 体内 部 的 功能 性 结合 有 关 , 当 分 离 核 糖 体 时 , 这 个 复合 物 有 时 也 不 分 开 。 此
外 ,蛋白 质 L 26( 每 5 个 50S 颗粒 才 有 1 个 L 26 分 子 ) 实 际 上 是 小 亚 基 30 S 颗粒 上 的 蛋白 质
S 20, 当 70S 颗粒 解 离 时 ,S 20 偶然 离开 30S 颗粒 并 且 与 50 S 颗粒 相 结合 。 所 以 ,在 核糖 体
中 ,S 20=LL 26。 这样, 大 肠 杆菌 的 核糖 体 的 蛋白 质 共 有 54 种 。 至 于 核糖 体 中 蛋白 质 的 数目 , 除
了 7]LDI2 具有 4 个 拷贝 外 ,每 一 种 蛋白 质 只 有 1 个 拷贝 。 目 前 ,54 种 核糖 体 蛋 白质 全 序列 均 已
测 出 ;得 知 小 亚 基 大 多 数 蛋白 质 是 球状 蛋白 , 带 有 28%% 的 x 螺旋 与 20%% 的 8 折 和 大 。 小 亚 基 中 ，
除 S1,S2 与 S6 是 酸性 蛋白 质 外 其 它 均 为 碱 性 蛋白 质 。 而 在 大 亚 基 中 ,只 有 L 7 与 L 12 是 酸
性 蛋白 质 , 其 它 均 为 碱 性 蛋白 质 。 现 认为 , 荷 负电 荷 的 RNA 与 碱 性 蛋白 质 之 间 的 相互 作用 有
利于 核糖 体 的 稳定 。

在 大 亚 基 上 , 现 知 L 7/L 12 具有 特殊 结构 与 功能 , 它 是 很 多 可 溶性 蛋白 质 因子 出 和 人 大、 小
亚 基 间 空 腔 的 门户 ,包括 起 始 因子 .延伸 因子 和 终止 因子 等 都 首先 与 L 7/L 12 相 结合 而 发 挥
作用 ,并 且 在 蛋白 质 合 成 的 能 量 利 用 上 起 关键 作用 *L 16 被 认为 是 与 肽 键 形成 有 关 。 在 小 亚 基
上 ,S1 能 使 16S rRNA3' 端 “发 严 状 2 的 二 级 结构 散 开 , 从 而 使 核糖 体 核 糖 核酸 (ribosomal
RNA,TRNA) 分 子 与 mRNA5 端的 碱 基 配对 处 相 结合 。S5 对 30S 亚 基 的 结构 与 功能 也 很 重
要 ,缺少 S5 时 ,只 能 形成 30 S 亚 基 的 前 体 28 S 亚 基 , 其 活性 仅 为 原来 的 30% 一 50%% ,使 蛋白
质 合 成 的 起 始 受阻 或 减弱 。S5 与 S2 及 S4 的 结合 能 提高 蛋白 质 合成 时 延伸 因子 的 GTP 酶
活性 。S 4 与 S 5 则 与 错 读 发 生 有 关 。S 12 可 以 降低 蛋白 质 合成 中 的 错 读 , 因 此 ,这 3 种 蛋白 质
的 相互 作用 ,控制 着 蛋白 质 合 成 的 精确 性 。

用 氯 化 饮 密 度 梯 度 离 心 , 可 以 将 核糖 体 蛋 白质 分 为 两 部 分 ,一 种 是 核心 蛋白 (core pro-
tein,CP); 另 一 种 是 脱落 蛋白 (split protein ,SP) 。 将 核心 蛋白 及 脱落 蛋白 与 RNA 放 在 一 起 保
温 , 两 者 很 快 自行 组 装 成 为 有 功能 的 30 S 与 50S 亚 基 。 脱 落 蛋 白 再 用 层 析 法 又 可 将 其 分 为 酸
性 部 分 与 碱 性 部 分 。 这 两 种 性 质 不 同 的 部 分 在 功能 上 是 不 同 的 。 实 验 表明 在 小 亚 基 中 的 酸性
蛋 自 在 蛋白 质 合 成 中 仅 起 一 种 激活 作用 ,而 碱 性 蛋白 在 合成 中 则 是 重要 的 。 与 此 相反 ,在 大 亚
基于 则 酸性 蛋白 是 蛋白 质 合成 的 重要 组 分 , 而 碱 性 蛋白 只 起 激活 作用 。

与 原核 生物 不 同 , 真 核 生物 中 细胞 质 与 细胞 器 (主要 是 叶绿体 和 线粒体 ) 的 核糖 体 是 不 凤
的 5 这 种 不 同 反 映 在 核糖 体 的 总 体 大 小 与 RNA 与 蛋白 质 的 组 成 上 。 高 等 真 核 生物 细胞 质 的 核
” 糖 体 比 细菌 的 大 ;蛋白 质 和 xzrRNA 的 总 含量 比较 高 ,大 的 rRNA 的 分 子 也 比较 长 ;蛋白 质 的 种
” 类 数 也 比较 多 。 表 9-1 列 出 了 真 核 生 物 细胞 质 核糖 体 组 分 与 大 小 的 数据 。 核糖 体 小 亚 基
GOS) 有 1 个 各 SrRNA 与 大 约 33 个 蛋白 质 ;大 亚 基 (60S) 则 由 1 个 28SrRNA 和 1 个 5.8S
ITRNA 与 1 个 5SrRNA， 以 及 大 约 49 个 蛋白 质 组 成 。 从 表 9-1 可 以 看 出 ,原核 生物 核糖 体 颗
粒 分 子 量 的 大 部 分 是 由 rKENA 提供 的 ,在 真 核 生物 中 ,rRNA 也 是 核 独 体 颗粒 分 子 量 中 的 主要
成 分 。

真 核 生 物 细胞 器 的 核糖 体 则 与 细胞 质 的 核糖 体 有 所 不 同 。 比 如 叶绿体 的 核糖 体 与 细菌 核
糖 体 大 小 相近 ,但 它们 的 RNA 比例 要 比 细菌 的 大 一 些 , 而 植物 线粒体 中 的 核糖 体 则 比 它 周 转
的 细胞 质 的 核糖 体 略 小 ( 表 9-1) 。 低 等 真 核 生物 ( 如 真菌 ) 核 糖 体 总 的 大 小 还 是 比 细 菌 的 大 ,但
是 ,哺乳 动物 的 线粒体 或 两 栖 类 动物 的 线粒体 显得 更 小 ,总 共 只 有 60 S, 其 中 RNA 的 分 子 量
比 也 较 小 。

223

在 查核 生物 的 细胞 质 中 j# 核 糖 体 常 常 与 细胞 骨架 一 一 一 种 纤维 状 的 基质 结合 在 过 起 "在 有
些 真 核 细胞 让 ,核糖 体 与 肉质 网 膜 结合 在 二 起, 尺 管 核糖 体 在 细胞 内 的 存在 方式 可 尼 下 同 , 但
其 共同 特 志 是 ?承担 着 蛋白 质 合成 任务 的 核糖 体 在 细胞 中 不 是 自由 存在 的 ， 有
地 垢 细胞 结构 结合 在 二 起 ，
匹 论 是 原核 生物 还 是 袜 核 和 本物 ?从 细胞 中 柯 分 离 出 3 种 类 型 的 核糖 体 ; 核糖 体 ， 机 人
基 和 效 村 糖 体 (Eotysome 沾 了 细胞 内 蛋白 质 的 生物 合成 正 是 通过 这 些 核糖 体循环 进行 的 8 在 细
胞 质 申 5 大 多 数 核糖 体 处 证 非 活性 的 稳定 状态 单独 存在 。 只 有 少数 与 mRNA 一 起 形成 多 核糖 】
体 !. 得 多 核糖 栖 中 其 大 水 变 人 后 全 般 视 RNA 链 的 长 短 及 核糖 体 的 组 装 紧 密 程度 而 蜡 曙 者 显
然 与 核糖 体 在 一 全 特定 的 基因 的 开端 起 始 的 频 度 有 关 ， as
二 般 二 条 三 RNIA 的 最 类 利用 率 是 每 '80 个 核 苷 酸 有 .1 个 核糖 体 ( 图 9:3 况
，- 游离 的 核糖 体 亚 基 0 si
人 将 要 与 mRNA 纺 合 SU 0

从 十 少 下 已 对 训 史 二 忆 王公 (有 Jr, AY
Rd 后 洽 员 ,由 82 沁 类 ,到 |
贞 二 全 上 SDH 亲信 mRNA De
5 区 ;会 下 中 的 多 肘 人 晤 -aaA 陨 z3 忆 2 科 训 和
图 9-3 蛋白 质 合成 时 多 核 独 体 的 图 示 萎 二 车 , 肝 汗 总 采 量 |
上 本 汉 光 少 相 mRNA 分 汉 直 右 向 左 移动 。 由 则 小 理 季 |

亚 沉 本 | 区) 昌 ，

_ 利 用 两 种 不 同 的 电 记 显微镜 对 想 凡 体 进行 了 观察 一 种 是 对 含有 分 出 了 70S 核 六 体 ，，
504 1 亚 基 和 ;30IS: 亚 基 的 视野 做 直接 的 观察 (图 9-4); 另 一 种 是 用 数学 重组 法 (mathematical;rer |
sppstfhction methods) 拟 解释 天 然 丰 在 的 核糖 体 微 晶体 产生 的 图 像 。 现 在 认为 50.Si 亚 基 像 六 个 灶
球形 , 从 其 平面 伸 出 3 个 窗 起 ;39 总 比较 扁 革 :可 分 为 上 173 和 下 2/3, 在 其 结构 的 玉 部 二 侧 伸 出 二
沦 平 台 轴 图 94 和 图 45 表示 推导 出 的 两 个 亚 基 的 形状 以 及 它们 如 何 装配 成 7 S 核 糖 体 ;

} 费 立 衣 面 利用 重组 技术 ; 屁 党 变 联 各 化 学 修饰 技术 .荧光 标记 技术 、 重 氢 标 记 由 也 衍射 技
术 8 费 疫 电 镜 以 到 亲 和 层 析 等 方法 % 确 定 了 核糖 体 蛋白 质 彼 此 相 邻 情况 。 最 近 ， Stark 等 人 用 成
角 重 组 人 amgular reconstitution) 与 低温 曲 镜 4eryoelectron microscopy) 结 合 方法 ， 对 大 肠 杆 菌
核糖 体 进行 研究 "得 出 一 个 0:3inm 汐 高 分 辩 率 的 实体 图 像 ( 图 9-6). 当 个 图 显示 出 核糖 体 量 |
直径 约 :240 nm 的 分 枝 状 结构 在 泪 0S 亚 基 内 六 证 存在 网 状 通道 ， 它们 是 新 生 炭 的 出 吕 人 |
Stark 称 立 为 出 口 通道 复合 物 (exit channeliepmplex, 了 CC) (图 9-6)。 有 两 个 可 能 是 进 大 EGG ，

的 位 点 ,一 个 是 在 L 1 突起 与 中 央 突 起 (CP) 之 间 的 裂隙 ; 另 一 个 则 与 第 一 个 相 邻 ,刚好 在 ;GE

的 种 方 * 在 10S 颗粒 的 外 表面 ,EECi 基 有 车 币 个 开 甩 (图 9-6b 中 较 大 的 开 虽 是 四 一 人 50
S 颗粒 左 侧 较 低 位 置 的 1 号 开 岂 所 用 免疫 电镜 观察 到 的 新 生 肽 链 伸 出 处 ， 无 村 天

对 币 16SrRNA 在 核糖 体 30:S 亚 基 的 装配 如 图 /9 泾 所 示 .| 图 中 显示 出 30 S 亚 基 的 43 2
部 忆 颈 主 B4 丢 二 ?这 足 ” 部 玉 嘴 忆 “ 趾 " 以 及 和 连接 黎 各 部 分 < zxRNA 的 各 螺旋 用 ! 0

后 面 的 数字 为 螺旋 的 编号 ,从 图 9-7 中 可 看 出 各 螺旋 在 30 S 亚 基 上 的 位 置 。
224

Se
一 和

国外 电 小 亚 基 全 大 亚 基 旭 7o 核 猫 体

中 心 突起 部

9:4 ”用 电子 显微镜 得 到 的 核糖 体形 状 的 直接 显影
慎 菌 芒 柱 体 的 视野 ， 它 包 括 了 在 模型 b 中 A 或 是 B 的 取向 ,一 些 核糖 体 亚 基 也 在 视野
S 代表 小 亚 基 ， [代表 大 亚 基 , 视 野 是 用 电镜 负 妆 得 到 的 ,每 一 个 核糖 体 是 由 一 种 重

图 9-5- 五 ,coli 核糖 体 2 个 亚 基 的 形状
通过 结合 的 方法 将 其 功能 位 点 定位 ,70 S 核糖 体 图 示 表 示 出 :NA 如 何在 |A 位 点 定位 ,A 位
点 定位 于 30 S 与 50 S 亚 基 之 间 。

225

(a) 70S 核糖 体

(b?50S 亚 基 的 通道 系统

亚 基 间 连 接

通道 系统

9-6 ”大肠 杆菌 70 S 核糖 体 的 三 维 重 组 图 9-7 ”30S 亚 基 半 透明 图 ，
(a) 从 50 S 亚 基 L 1 突起 一 侧 去 看 70 S 核糖 体 ;(b) 除 去 30 S 亚 基 显示 16S rRNA 的 装配 位 置
闫 部 分 可 看 出 亚 基 间 的 连接 与 2 个 通道 系统 的 人 口 ( 黑 箭头 ) 。 RNA 各 螺旋 的 编号 用 “h” 表 示 。

图 9-8 示 2 个 tRNA 分 子 在 核糖 体 上 的 装配 。 在 核糖 体 的 30S 和 50 S 亚 基 之 间 有 - 桥 - 作
为 主要 的 连接 ,在 这 个 桥 的 上 方 有 亚 基 间 空 腔 , 这 个 空 腔 刚好 可 以 容纳 在 A 位 点 和 了 位 点 的 2
个 直 形 的 tRNA 分 子 。 这 2 个 tRNA 分 子 呈 -S 形 构 型 排 布 , 即 A 位 点 的 tRNA 的 D- 环 面向

图 9-8 2 个 tRNA 装配 六 核糖 体 ,2 个 分 子 呈 “” 构 型 排 布
(4a)70 S 核糖 体 ( 半 透明 )tRNA 的 反 密 码 子 环 (anticodon loop) 在 左 侧 ,而 CCA 末端 则 在 右 侧 ,P 位 点 的 tRNA 的 一 部 分

在 界面 的 桥 后 面 ;(b)70 S 核糖 体 ( 不 透明 的 ) 的 俯视 图 , 反 密 码 子 环 ( 埋 在 30 S 亚 基 内 ) 是 在 左 侧 , 而 CCA 末端 ( 埋 在 50 S 亚
基 内 ) 则 是 在 右 侧 。

226

P 位 点 tRNA 的 工 环 ,这 便 使 得 它们 可 以 合适 地 装配 人 桥 的 转折 处 。 这 样 的 排 布 使 RNA 的 反

密码 子 环 与 在 30 S 亚 基 的 头 部 与 躯干 之 间 的 mRNA 接触 ;而 tRNA 的 CCA 末端 则 在 出 口 通
道 的 入 口 处 附近 。

70 S 核糖 体 大 约 是 一 个 半径 为 11 nm 的 球体 ,由 此 算出 其 体积 应 约 为 5 600 nms。 而 根据
核糖 体 的 分 子 量 计算 ,其 体积 则 约 为 2 600 ms, 占 结构 的 45%% ,其 余 的 结构 55% 是 由 溶剂 所 组
成 ,那些 与 溶剂 有 关 的 部 分 则 包括 : 亚 基 间 的 间 辽 ,以 及 全 部 洞穴 与 通道 。 这 样 ,核糖 体 实际 上
是 一 个 具有 思 陷 .空洞 裂隙 和 坑道 的 结构 。

二 、 核 糖 体 核糖 核酸 (rRNA)

核糖 体 核糖 核酸 (rRNA) 是 核糖 体 的 组 成 成 分 。 它 们 对 于 核糖 体 的 自身 组 装 和 活力 表现
起 着 重要 作用 。 综 合 运用 现代 生物 学 、 化 学 和 物理 学 技术 测定 ,得 知 每 一 个 细菌 核糖 体 中 均 有
2 个 大 的 rRNA(16 S,23 S) 和 一 个 小 的 (5 S)rRNA 分 子 。 它 们 是 整合 的 组 分 ,除去 了 它们 便 会
使 核糖 体 结构 完全 瓦解 .由 此 可 知 *rRNA 的 功能 是 和 核糖 体 蛋 白质 相互 作用 以 维持 核糖 体 的
三 维 结构 .另外 ,rRNA 还 直接 参加 mRNA 与 核糖 体 小 亚 基 的 结合 以 及 亚 基 间 的 联合 .体外 重
组 实验 表明 ,核糖 体 蛋 白质 本 身 无 蛋白 质 合 成 活性 ,缺少 部 分 核糖 体 蛋 白质 也 不 会 导致 核糖 体
的 失 活 ,rRNA 在 蛋白 质 合 成 中 起 着 决定 性 的 作用 ,这 一 点 已 被 越 来 越 多 地 研究 所 证 实 。

在 核糖 体 中 , 小 亚 基 中 的 16 S rRNA 链 长 为 1 542 个 核 苷 酸 ; 作 为 大 亚 基 的 一 个 组 分 的
23 S 则 含有 2 904 个 核 苷 酸 。 此 外 ,每 一 个 大 亚 基 还 有 一 个 很 短 的 5 S rRNA, 含 有 120 个 核 苷
酸 。 所 有 3 种 rRNA 均 为 单 链 ,其 乌 味 叭 和 胸腺 喀 啶 以 及 腺 味 叭 和 屎 喀 啶 均 不 相等 。 虽 然 如
此 ,还 是 有 足够 等 价 的 碱 基 对 ,使 得 在 同一 条 链 上 许多 碱 基 对 形成 氢 键 ,生成 像 在 tRNA 中 的
发 夹 结 构 。rRNA ,特别 是 大 的 rRNA 分 子 中 ,有 多 个 螺旋 区 和 环 区 组 成 的 区 域 ,每 个 区 域 大 概
是 在 结构 上 和 功能 上 相对 独立 的 单位 。

(一 )16 S rRNA

1987 年 第 一 次 将 大 肠 杆 菌 的 16 S rRNA 的 1 542 个 核 苷 酸 序列 确定 之 后 ,根据 序列 的 互
补 性 以 及 RNA 序列 的 某 些 部 分 对 核糖 核酸 酶 和 化 学 试剂 的 敏感 性 , 提出 了 一 个 折 释 的 形式 ，
并 且 得 知 不 同 来 源 的 16 S rRNA 都 具有 相似 的 二 级 结构 。 后 来 发 现 真菌 细胞 18 S rRNA 和 线
粒 体 12 S rRNA 也 有 类 似 的 二 级 结构 (secondary structure) 模 式 。

大 肠 杆菌 16 S rRNA 的 二 级 结构 见 图 9-9。1 542 个 核 苷 酸 中 已 知 有 10 个 核 苷 酸 被 甲 基
化 ,例如 ,m"Goss Am Cotzym CnlioymsCioymsAl ss m2Als 等 。 其 中 入 ,二 甲 基 A 及 其 相
邻 序列 参与 mRNA 与 tRNA 的 相互 识别 。 由 非 甲 基 化 的 16 S rRNA 构建 的 核糖 体 ,在 体外 只
各 下 下 捕 二 用 禁用 取 的 合成 另 一 方面 ,缺少 mgAl ss 与 m8A， se 修饰 碱 基 时 ,核糖 体 对 春日 霉
素 表 现 出 抗 性 。

16 S TRNA 机 与 终 沙 起 闭 这 憾 作用 , 它 的 反 Shine-Dalgarno
序列 通过 与 mRNA 上 的 Shine-Dalgarno 序列 碱 基 配 对 而 与 mRNA 结合 。 这 Shine-Dalgarno
序列 位 于 mRNA 的 起 始 密码 子 AUG 上 游 附 近 。 这 种 相互 作用 对 维持 mRNA 的 正确 阅读 框
架 无 疑 是 重要 的 。

解码 位 点 , 即 密码 子 与 反 密码 子 发 生 相互 作用 的 位 点 ， 位 于 16SrRNA 的 1400 位 置 的 C
残 基 的 1 或 2nm 之 内 。 当 tRNA 位 于 核糖 体 P 位 点 时 ,利用 紫外 光 可 以 使 tRNA 反 密 码 子 的

2

Ac
机

WEGCAVI
用 = 人 本 上 w 才 有 站 下 用 和 1

与 tRNA 的

e-
E
光 有 本
2 -让 -1540 no
3500 | 40 Dalgarno 序列
ES 二 了 汉 : 亚 基 结 合
EN 2 :
< 蕊 人 | <
,3 Go 和
0 :
本 5
AT Eee
大 这 E
Fo

休 收 儿 定员 站 = 解码 位 点 :
岂 岂 于,' 笑 ) 图 9.9 大 肠 杆菌 16S 5RNA 的 功能 区

WeS 7 则 的 李 双 可 与 RNA- ,tRNA 共 辣 开 让 基站 堆 下 大 天 古国 提高 盔 译
的 准确 性 。 16S rRNA 的 Com 可 通过 形成 5,6- 环 丁 二 喀 喧 与 tRNA 结合 。 一 级 结构 中 不 配
区 域 之 问 可 能 包括 非 RE 的 相互 作用 。 在 16 S rRNA 分 子 的 一 些 从 区 中 还 出 2
碱 基 突 起 ， 如 Ga “太吉 on 441》 中 2 SG3， A746) 被 认为 与 核 问 体 虱 白 的 识别 有 关 。

为 16 S rRNA 的 功能 区 域 可 能 人 法 生 休 的 9
现 知 TRNA 与 核 狂 体 | 小 亚 基 结合 有 关 ， 16 S rRNA 让 一 二 矶 |

16SERNA 中 790 环 是 与 50 亚 基 的 结合 部 位 ， 而 果 Gu 闪 变 为 A, 即 会 减 绚 50SE RS 让
基 的 结合 ， 另 一 企 与 亚 基 结 含 有 关 的 部 信息 16 S tRNA 的 1 409~…1 491 序 齐 ， 这 个 灶 结 构 的
缺失 或 G, | ,其 换 为 :出 亚 基 立 间 的 结合 就 和 能 实现 ;而 A，， 和 和 A。 的 大 电 帮 全 上
合 减弱 。 出

在 训 GA 终止 区 ,C 岂 和 Cl . 灾 出 会 庆 人 玉 友子 UGA 的 终止 效率 .“ :3 册

(二 )23STRNA: 与 SS TRNA 由 9 泊 改 治

23 S rRNA 是 由 2 904 作 核 苷 酸 残 基 组 成 : 记得 成分 双 昌 结构 其 特征 在 进化 民 是
保守 的 。23 S rRNA 的 二 级 结构 的 重要 功能 区 域 见 图 9-10， 天 时

228

ER
区

9-10 23S rRNA 功能 区 域 的 二 级 结构 图 解 ,一 般 地 代表 夫 亚 基 zRNA
(a) 起 始 ;Cb) 延 伸 5(c 终 止 5d) 应 激 反 应 。
扩大 (或 不 变 ) 片 段 从 5'- 未 端 起 编号 。

元 革 关 区 是 到 过 划 中
己 同 现 发 现 所 有 23ISERNA 中 ,803 一 811 序列 是 高 度 保 守 的 ,并 可 能 具有 5'UAGCUGGUU3
序列 2B3ISSRNA. 的 三 级 折 释 表明, 肽 酰 转 移 酶 的 位 点 由 2 个 区 域 组 成 ,其 中 心 围绕 在 803 一
811 与 2030 一 2 615 位 置 ,而 它 的 AiayCzisz 则 是 肽 酰 -tRNA 与 己 位 点 的 结合 位 点
时 于 延伸 因子 刁 F-Tu 与 EE2G 彼此 竞争 在 核糖 体 上 的 结合 位 点 ;: EF-G 交 联 于 23S TRNA 的
芭 67 位 转 殴 域 凡 化 学 保护 作用 研究 表明 ,EF3G :也 与 2 660 位 置 附近 的 高 度 保守 的 核 蔡 酸 摩 列
相互 作 用 ;这 个 位 置 是 细胞 毒素 -sarcin 与 草 麻 蛋白 作用 位 点 :
1 自 5S RN 由 闻 208 核 音 酸 残 基 组 藏 站 总 = 沫 端 附近 的 序列 与 3 末端 附近 的 序列 互补 , 形
成 “Y" 形 二 级 结构 (图 9%11) 。 由 于 并 不 进一步 折叠 ， 由 此 可 知 缺 少 三 级 的 相互 作用 :
尽管 5 四 上 RNK 对 芒 糖 神 活 性 是 必需 的 ,可 是 它 的 作用 仍 不 十 分 清楚 。 很 可 能 当 核糖 体 执
行 功能 蛙 , 它 与 16 SERNA 超 相 所 作用 ?与 已 知 的 真 核 生 物 的 5 STRNA 与 18 SrRNA 相互 作
用 相 类 似 ， 沁 提 引 关
已 试验 指出 ;iaRNAI 中 许多 不 配对 的 碱 基 与 其 它 RNA 押 子 结合 平 核糖 体 止 有 关 避 胡 靠 近
药 SzRNNA 3' 端 的 多 个 不 配对 碱 基 , 与 mnRNK 分 也 起 始 位 点 5 侧 有 全 段 不 转录 的 前 导 序 列 豆
补 ,这 无 疑 对 蛋白 质 合 成 起 始 的 正确 与 否 极为 重要 ;再 有 ,在 5SIRNA 中 负 31 垃 345 和 HP 己
225

PT) 人 全 本 的

51 构成 的 螺旋 叫 共同 臂 螺旋 ,在 所 有 5 S rRNA 中 都 含有 4 bp (酵母 例外 ,只 有 3 bp)。 紧 靠 此 时
螺旋 的 环 ,在 绝 大 多 数 原核 细胞 中 都 含有 CGAAC 序列 (图 9-11), 它 是 5S rRNA 与 tRNA 分 时
子 TC 环 上 不 变 的 GT 下 CG 相互 作用 的 部 位 。 所 有 这 些 在 进行 翻译 时 所 形成 的 RNA-RNA
键 , 将 有 助 于 将 核糖 体 的 2 个 亚 基 结 合 在 一 起 ,其 它 rRNA 残 基 也 可 与 小 的 RNA- 蛋 白质 复合
物 形成 碱 基 对 ,这 些 复合 物 与 将 新 合成 的 蛋白 质 导向 细胞 膜 以 外 的 区 域 有 关 。

9-11 大 肠 杆菌 5 S rRNA 二 级 结构 模型
配对 的 碱 基 用 线 表示 ， 用”" "表示 G 一 U 碱 基 对 ;图 示 螺 旋 片 段 (A~E) 与 单 链 环 (M,D ,TH ,H,)。-

三 ) 核 糖 体 小 亚 基 模 型

小 亚 基 的 模型 见 图 9-12。 平台 可 能 是 密码 子 与 反 密 码 子 相 互 作 用 的 位 点 ,通过 区 域 咎 括
有 16S rRNA 的 3- 末端 ,N*- 二 甲 基 腺 味 叭 核 苷 酸 1 518 与 1 519, 以 及 由 Shine_Dalgarng 序 `
列 为 前 导 的 mRNA 起 始 密码 子 序列 。 蛋 白质 S6,S11,S15,S18 也 发 现在 平台 止 , 它 们 与
mRNA 结合 有 关 。 蛋 白质 S 3,S 10,S14 与 S 19 则 和 依赖 于 聚 (U ) 的 tRNAR 的 结合 有 关 ;，

四) 核糖 体 大 亚 基 模 型

大 亚 基 具有 一 个 明确 的 轮廓 。 具 有 3 个 特征 :L 1 兰 .中 央 突 起 .L7/L 1? 茸 。 中 央 突 起 是
由 蛋白 质 上 27,L 18 与 5SrRNA 组 成 。 茎 由 2 个 L7/L12 二 聚 体 与 位 于 它 的 底部 的 五 10 组
成 (图 9-13(a) 与 (b)) 。 肽 酰 转 移 酶 活性 位 点 定位 于 中 央 突 起 与 背 之 间 。 茎 与 移 位 有 关 。 新 生
肽 链 的 出 口 位 点 位 于 了 位 点 对 面 , 膜 结 合 位 点 定位 在 蛋白 质 L 19 的 区 域 (图 9-13c)。 秦 白质
在 亚 基 内 的 排 布 见 图 9-13(d) 与 (e)。

利用 闪 射线 本 射 对 5 S rRNA 的 研究 证 实 让 5,L 18,L 25 是 与 5S rRNA 的 结合 蛋白 (图
9-11)。5SrRNA 与 站 18 结合 位 点 分 别 是 23，24,51)54,56,64,67 位 的 G。L 18 的 18 一 25 氨
基 酸 的 序列 (Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Ala-Thr-Arg-) 是 识别 5 SzRNA 的 结构 域 。5 S rRNA 的
Aie,Ge 与 18 的 Gln 19 间 通 过 形成 氢 键 使 5S rRNA 与 站 18 相互 作用 。 核糖 体 组 分 的 异 源

重组 实验 发 现 原核 生物 的 工 5,L 18,L 28 不 能 与 酵母 5 S TRNA 结合 ,但 它们 的 L 18,E25 能
与 酵母 5. 8 S rRNA 结合 .

230

(d)

(b)
图 9-12 大 肠 杆菌 核糖 体 小 亚 基 模型
《a) 与 (b) 是 小 亚 基 在 常规 电镜 显示 出 的 头 ` 有 裂口 ` 平 台 主 要 特征 的 模型 ;\c) 与 (4) 显 示 出 起 始 因子 IF1,IF2,IF3 以 及 延
伸 因 子 EF-G 和 EF-Tu 的 结合 位 点 ;(e) 是 16 S TRNA- 3- 末 端 与 5= 末 端 及 一 些小 亚 基 蛋 白质 定位 。

中 央 突 起 大 亚 基

图 9-13 ”大肠 杆菌 核糖 体 大 亚 基 模 型
(a),(b), 用 常规 电镜 观察 到 的 形状 ,显示 出 中 央 突 起 ,L 1 背 和 L 7/La2 营 ;!(c): 几 种 大 亚 基 蛋白 .5 S rRNA,23S

rRNA 的 功能 区 域 的 定位 ,P,M,E 分 别 代表 肽 酰 转移 酶 位 点 、 膜 结合
在 大 亚 基 内 的 排 布 。

位 点 和 新 生 肽 链 出 口 位 点 ;(d),(e) :表示 大 亚 基 和 蛋 白质

3

现 将 有 关 核 糖 体 主要 结构 功能 域 的 特征 列 于 表 9-2。
表 9-2 核糖 体 主要 结构 功能 域 的 特征

功能 域 rRNA 核糖 体 蛋白 质 核糖 体 中 的 位 置
mRNA 合 .16S3 端 SD 上 询 Si 1 30S 坏 基 大 叶 与 基底 的 接合 部
R 位 点 16 S/m7zG-526 S3S10,S145S19 小 亚 基 外 表面
A 位 点 16.S/G 530WA92,A1493，\_ SI,S11,S19,S18 大 小 亚 基 交 办 处
人 TEL408,G1494
P 位 点 23S/803 二 811?， S13,S 19 大 小 亚 基 交 界 处
16 SF393~ 工 401
解码 区 16 S/C 1 400~A 1 500 S 1 二 5,S 9,S 12,S 18,S 2 小 亚 基 裂 隙 处
起 始 因子 结合 位 点 ”16 S/J392 一 1 408 S 12,Si3,S 19~ 1 近 裂 辽 与 平台 处
GTP.。 中 心 呈 S/1 030~1 130 7 困 2 到 0 记 匡 50 S 亚 基 Z 7/L 12 分 子 柄
肽 酰基 转移 酶 中 心 23 S/I ,575 一 745 L2 民 项,L23 中 央 突 起 与 L 1 突起 之 间
V ,2 030 一 2 615
E 位 点 23 S 50 S 亚 基
亚 基 重 组 区 16 S/787 一 795,811 一 820 S 12 等 大 小 亚 基 的 裂隙 与 凹 模

23 S/2 306 一 2 ,313*2)750 一 2 .757

三 ,核糖 体 的 自我 组 装 CR

核糖 体 含 3 种 TRNA 和 53 种 蛋白 质 , 这 些 成 分 如 何 组 装 成 具有 活性 的 核糖 体 ,是 一 个 值

得 深入 研究 的 问题 .在 1968 年 第 一 次 完成 大 肠 杆 菌 核 糖 体 小 亚 基 由 其 zRNA 和 蛋白 质 组 分

“在 体外 的 重新 组 装 $ 这 个 重组 装 的 颗粒 具有 与 30 S 亚 基 功能 完全 相同 的 履 白 质 合成 活性 . 这

个 重组 装 只 需 16 SEERNA 和 3 种 蛋白 质 ,而 不 需要 加 入 其 它 组 分 (如 酶 或 特殊 因子 ), 表 明 是

一 个 “自我 组 装 "(selEassembly) 的 对 程 。 所 谓 自我 组 装 ,是 指 2 让
都 在 亚 基 结 构 里 ,其 蛋 自 质 和 3fRNA 都 带 有 规定 组 装 过 程 的 信息 。 自 我 组 装 的 驱动 力 包括 朴 。

水 性 相互 作用 、 2 以 及 碱 基 堆 春之 间 的 相互 作用 等 。 |]

进一步 的 研究 发 现 , 这 个 组 上装 过 程 有 一 定 顺序 , 即 某 蛋 白质 的 加 入 要 先 于 其 它 蛋 白质 的 加

加 而 且 有 组 分 介 A 即 一 种 组 分 的 加 入 加强 了 下 一 一 种 组 分 的 厢 和 图 到 1

1 4 上) 中 ， 术 共生 白质 结合 (实际 上 ， .这些 蛋 白质 的 结合 也 有 和
16 STRN 上 G
= \ 三 忆 齐 ->21 颗粒 -- 26S 颗粒 30 S 核糖 体 亚 基
21S 蛋白 质 呈 ”含有 15S 绰 白 大 合 有 全 部 21S 蛋白 质 和
23 S rRNA 7
本 33S 颗粒 |- 0 条， 一 一 -48S 颗粒 50C
4mmol/I 从 王 人 10 所 “50S 核 六
下 这 M25 -含有 约 20L 蛋白 质 人 体 亚 基

图 9-14 五 .coi: 核糖 体 30 S， 508 呈 关 本 思 丰

图 示 需 要 输入 能 量 (构象 改变 ) 的 步骤 ,在 30 S 组 装 中 ,依赖 rRNA 制备 方法 ,证 实 有 7 一 13 种 S 蛋白 质 可 直接 结
合 于 16 S rRNA; 大 约 17 种 工 蛋白 质 是 直接 结合 于 23 S rRNA,3 种 工 蛋白 质 结合 到 5 S rRNA 。

232

”后 诛 形 成 昼 及 新 粒 5 然后 再 加 出 其 余 6 种 蛋白 质 ( 相 当 于 上 文 的 脱落 蛋白 六 最 后 组 装 成 30S

亚 基 这 个 组 装 过 程 ,可 能 在 16 SirRNA 转 录 开 始 之 后 即行 发 生 , 因为 在 rRNA: 链 上 结合 最 强
韩 蓉 信 | 都 集中 在 最 先 转录 的 5 端 。

1 夫 肠 杆菌 核糖 体 50S 亚 基 的 组 装 比较 复杂 , 它 包 括 两 种 (23 S 和 5S)rRNA， 而 且 蛋 白质
数目 也 较 和 多 ， 图 :9214 再 举 部 分 概括 地 表示 出 这 个 组 装 过 程 。 先 由 .23 S rRNA),5ISTRNA 与 约
20 种 瑟 蛋 家 结合 ,生成 33iS: 颗 粒 ; -然后 再 加 下 其 余 蛋 白质 ,组 装 成 4 S 颗粒 。 最 后 在 :Mg 入
GTC ) 和 50C 于 转变 为 50S 亚 基 。

第 三 节 氨基 酸 的 激活 与 扰 酰 -tRNA 的 合成

愉 册 氨 栈 -tRNA 是 氨基 酸 挫 大 到 多 肽 链 中 的 一 企 关 键 性 的 中 间 物 质 ; 并 县 它 们 的 合成 执行 着
双重 机 能 <。 首先 #RNA, 的 氨 酰 化 作用 需要 全 TPR; 它 为 肽 键 的 合成 提供 能 量 。 其 次 , 它 准 许 在 核
糖 体 上 肽 键 形 成 时 ,mRNA 密码 子 的 3 个 碱 基 要 和 tRNA 上 与 之 互补 的 反 密 码 子 之 闻 通 过 反
向 平行 的 碱 基 配 对 ,执行 遗传 信息 的 解读 过 程 。

现 知 原核 生物 与 真 核 生 物 细胞 质 含 有 -49 多 种 不 同 的 tRNA, 线粒体 与 叶绿体 含有 的
tRNA 数量 则 少 于 此 ,并 且 结构 上 也 与 细胞 项 的 有 所 不 同 。 在 动物 与 酵母 线粒体 中 各 自 仅 含有
22 与 24 种 尽 NA, 可 知 , 线 粒 体 的 DNA 中 , 民 NA 的 基因 也 会 相应 地 减少 。

一 \tIRNA 的 结构

现在 已 从 各 种 不 同 生 物 中 测定 350 多 种 疏 NA 的 核 苷 酸 顺 序 。 所 有 tRNA 都 是 单 链 分
子 , 长 度 大 约 是 80 个 核 苷 酸 残 基 。tRNA 的 三 级 结构 呈 三 叶 草 形 , 由 4 个 臂 和 4 个 环 组 成 ,其
中 可 变 环 是 含有 5 一 21 个 核 苷 酸 残 基 ( 图 :9-15a,9-15 b)。 用 X 射线 结晶 学 阐明 tRNA 的 三 级
结构 是 一 个 紧密 的 工 - 形 分 子 ,远离 的 残 基 闻 由 和 氢 键 和 琉 水 堆 至 之 忆 相 互 作 用 维持 了 稳定 (图
9-16) 。
接受 臂 是 由 外 NA 5 -= 未 端 与 3 -末端 的 碱 基 配 对 形成 所 有 tRNA 3': 未 端的 一 CCA 是 不
成 碱 基 配 对 的 , 它 在 原核 生物 tRNA 生物 合成 中 有 两 种 情况 ,一 类 其 自身 有 CCA 三 核 苷 酸 ，
它们 位 于 成 熟 下 NA 序列 与 3 端 附加 序列 之 间 , 当 加 工 切 除 附 加 序列 后 便 显 露出 来 ; 另 一 类
则 是 其 自身 并 无 CCA 序列 , 它 是 在 切除 3' 端 附加 序列 后 ,由 tRNA 核 苷 酰 转移 酶 Cnucleotidyl
transferase) 催 化 进行 ,并 由 CTP 与 ATP 供给 胞 苷 酰基 与 腺 苷 酰基 。 对 于 真 核 生 物 , 其 CCA
序列 的 形成 , 则 与 原核 生物 后 者 的 形成 相同 tRNA 3'- 未 端的 A 残 基 是 氨 酰 -tRNA 合成 酶 反
应 时 接受 氨基 酸 的 部 位 ,这 样 ,在 三 级 结构 上 握 基 酸 的 接受 位 点 就 远离 反 密 码 子 。 这 使 得 氨 栈
基 人 靠近 肽 酰 转 移 酶 ,而 反 密码 子 (anticodon) 册 与 水 亚 基 上 的 mRNA 密码 子 配对 。 一 CCA 序
列 对 原核 生物 延伸 因 予 EF-Tu 和 GTP 识别 荷载 的 ERNA, 以 及 随后 将 氨 酰 -tRNA 运 人 核糖
体 的 人 A 位 点 起 重要 作用 ,一 CCA 序列 的 修饰 ,例如 ' 插 人 C 残 基 , 或 是 用 避 代替 倒数 第 二 个
Cv 都 会 减弱 与 EF-Tu 的 相互 作用 。 由 此 想到 ,延伸 因子 对 mmSCCA 末端 的 空间 结构 :以 及 .3:- 未
端的 A 与 氨 酰 基 团 的 一 NHzt 具有 识别 作用 ， 六
所 有 生物 的 tRNA 所 特有 的 结构 特征 是 许多 各 异 的 修饰 核 苷 ， 包括 单纯 的 碱 基 或 核糖 残
基 的 甲 基 化 ,以 及 非常 复杂 的 取代 (图 9-15 b, 表 9-3)。 所 有 修饰 是 发 生 在 tRNA 基因 转录 之
一 般 都 是 碱 基 的 改变 , 而 不 是 碱 基 的 置换 。 然 而 偶然 会 发 生 碱 基 的 交换 ,例如 , 插 人 次 黄 苷
233

或 是 不 常见 的 碱 基 queuosine ,取代 了 在 多 核 苷 酸 前 体 中 的 腺 味 叭 或 鸟 味 叭 。 修 饰 核 音 可 能 有
下 列 功用 :三 级 结构 的 稳定 ,有 助 于 密码 子 - 反 密 码 子 的 相互 作用 ,防止 被 不 适当 的 氨基 酸 所 错 ，
载 ,增加 翻译 效率 和 信 实 程度 以 及 维持 解读 的 框架 (图 9-16)。 对 缺少 tRNA 修饰 酶 的 突变 种 “
研究 发 现 ,在 邻近 反 密码 子 3' 侧 (位 置 37) 的 修饰 核 苷 酸 的 改变 ,或 是 反 密码 子 本 身 变 偶 位 置 ，
(位 置 34) 核 苷 的 改变 ;都 显示 出 特殊 的 重要 性 。 王 德 宝 的 研究 证 实 ,tRNA4 中 ,以 且 或 G 代 ，
蔡 的 类 似 物 , 能 接受 丙 氨 酸 ,但 所 携带 的 丙 氨 酸 挫 人 蛋白 质 中 去 的 程度 分 别 是 原 活力 的 173
或 90%% 以 上 ,而 如 果 以 A,G 或 C 代替 tRNArw mlT 的 类 似 物 时 ,也 能 接受 丙 氨 酸 ,但 挫 人 蛋
白质 中 去 的 活力 却 只 有 20% 一 30%。 其 它 部 位 的 修饰 核 苷 ,例如 , 真 细菌 的 tRNA 中 位 置 38,， 必
39 和 40 的 假 尿 苷 的 改变 , 则 会 影响 延伸 的 速度 以 及 翻译 的 错误 程度 。

线粒体 与 叶绿体 含有 对 其 蛋白 质 合成 所 需要 的 全 部 tRNA。 线粒体 tRNA 含有 59 一 75 个
核 苷 酸 残 基 , 比 细胞 质 tRNA 较 小 一 些 。 哺 乳 动物 线粒体 仅 含有 单个 基因 编码 起 始 王 延 伸 的
线粒体 tRNA ,显然 ,最 初 的 转录 本 是 由 不 同 的 途径 来 修饰 ,得 出 两 种 线粒体 tRNAMe 而 开
般 它 们 是 由 不 同 的 基因 来 转录 的 。

(a)

” 可 变 环

3 了 《5 一 21 核 苷 酸 )

35
反 密 码 子

图 9-15a 转移 RNA 的 共同 的 二 级 结构

显示 出 除了 起 始 +RNAs 之 外 的 所 有 tRNA 序列 中 可 变 与 半 可 变 碱 基 的 位 置 ,用 村 母 IRNArv 的 编号 ,并 对 附 吉 电 训

用 下 列 字母 表示 :Y 一 喀 啶 ,R= 呆 叭 ,了 = 超 修饰 嘎 吟 ,R+ 和 Y+ 常 是 互补 的 ,位置 9 与 26 通常
饰 的 G, 可 变 环 的 大 小 是 5 一 21 核 苷 酸 ,D 环 的 大 小 上 也 有 一 定 的 可 变性 ，

234

是 嘎 叭 .位置 10 常 是 G 或 修

9-15b 真 核 生 物 转移 RNA 的 二 级 结构
_ 显示 了 在 不 同 tRNA 中 修饰 核 苷 的 变化 和 其 分 布 , 最 常见 的 修饰 核 苷 是 假 尿 苷 ( 习 )，
其 它 常 见 的 修饰 包括 碱 基 或 核糖 2 -位 置 的 甲 基 化 ,缩写 符号 见 表 9-3。

Twc 臂

图 9-16， 转 移 RNA 的 三 级 结构
酵母 tRNAPhe 的 2 个 侧 视 图 显示 出 核糖 磷酸 骨架 ,数字 代表 了 序列 中 的 核 苷 酸 残 基 编 号 。
碱 基 之 间 的 氢 键 用 横 档 表示 ,不 成 氢 键 的 碱 基 用 短 杆 附着 在 多 核 苷 酸 骨 架 上 。

235

表 9-3 ” 真 核 生 物 tRNA 修饰 核 背

修饰 核 苷 名 称 缩 | 己 在 tRNA 的 位 置
假 尿 苷 刘 1,13,20B,25,26,28,30,31,32735736)38
40,45,46,47A,50,54,55,65,67,68,72
2'-o- 甲 基 核 苷 Um,Cm,Gm' 亚 m 4,13,18,32,34,39,44,64
N2- 甲 基 鸟 苷 m2G 6,7,10,26
N4- 乙 栈 胞 苷 ac4C 12
NL- 甲 基 腺 苷 mn1I 及 14,58
5,6- 二 氧 尿 苷 D 16,17,20,20A ,20B,47
3-(3- 氮 基 -3- 羧 基 ' 两 基 ) 尿 苷 acp3U 20A
N2,N2- 二 甲 基 鸟 苷 mgG 26
3- 甲 基 胞 苷 msC 32,47C
5- 氨 甲 酰 基 甲 基 尿 苷 cm 3 和 <CATNN
5- 甲 氧 基 狂 基 甲 基 尿 华 mcrisU 34 Te
5- 甲 氢 基 迷 基 甲 基 -2- 硫 尿 昔 cmss2 于 2
5- 甲 基 胞 昔 4 ms5C -3478060772- 飞 0 又
queuosine Q 34 3 | 站
p-D-manosylqueuosine roianQ 34 Ucaog
pB-D-galactosylqueuosine dalQ 34
次 黄 苷 I 34
Wybutosine( 以 前 为 Y) yW 37
Wybutoxosine( 过 氧 wybotosine) oO2yYW 37
N5- 异 成 烯 腺 苷 i5A 37
N5- 苏 氨 酸 痰 酸 腺 苷 t6A 37
N6- 甲 基 t5A mt6A 37
N1- 甲 基 鸟 苷 mlG 37
N1- 甲 基 次 黄 背 mlI 37
2'-o- 甲 基 假 尿 苷 亚 m 38
N7?- 甲 基 鸟 苷 m7G 46 :
5- 甲 基 尿 苷 ( 核 胸 苷 ) 本 项 5 在 /下 : 54

2'-o- 甲 基 -5- 甲 基 尿 苷 。。 ，( 必 ) 背 罚 司 时 半 芭 jmsUJm 54

下 区 出 发 现在 不 同 丰 核 生物 的 t RNA 的 人 人 坊间 的 名称 与 以 及 它 PR 贝 党 半 其

Q 机 ye 衍生 物 (前 作 Y 入 生物 )
衡 生物 本 工 羡 7e 邮 村 要
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5
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rw 中
核糖
了 = 一 EF 这 -C 在 ， -eica_coocf
Na
Q 或 Quo : R= 百 丛 党 OOCHi
Ci 交 于 ero7 zybutosine (前作 :YE 立 w 或 过 氧 Y，
manQ ,R 二 8.D 甘露 糖 基 R= 一 CH 本
galQ : R=p8-D 半 乳 糖 基 1 OH COOCH，
h
236

二 氨基酸 的 激活

。， 现 已 知 氨基 酸 是 不 能 直接 与 模板 相 结合 的 ,氨基 酸 在 被 转运 到 模板 之 前 必须 与 接合 体 相
连接 , 这 个 接合 体 就 是 上 文 所 述 的 tRNA。 和 氨基 酸 与 tRNA 连接 形成 氨 酰 -tRNA 即 是 氨基 酸 ，

前 激 浑 纶 是 在 细胞 质 内 进行 的 .每 一 种 氨基 酸 以 共 价 键 连接 于 一 种 专 一 的 让 NA, 这 个 过 程

需要 消耗 ATP ,形成 的 氨 酰 键 是 一 个 高 能 键 , 使 生成 的 复合 物 被 激活 。 这 个 高 能 氨 酰 -tRNA

的 键 能 ( 氨 酰 键 ) 可 用 于 较 低能 量 的 肽 键 的 形成 。

将 氨基 酸 接合 于 tRNA 以 形成 氨 酰 -tRNA 的 激活 反应 是 在 氨 酰 -tRNA 合成 酶 的 催化 作

用 下 进行 的 ,下 文 将 对 此 酶 的 性 质 加 以 阐述 。

三 、 氨 酰 -tRNA 合成 酶

1 研 毛 酰 GRNNA: 谷 参 酶 的 作用 是 将 氨基 酸 接合 于 tRNA ,因此 , 它 必须 同时 能 够 专 一 地 与 氨
基 酸 的 柚 通 基 夯 以 及 与 让 NAI 相 结合 。 原核 生物 含有 20 种 氨 酰 -tRNA 合成 酶 ,每 一 种 合成 酶
对 一 种 氨基 酸 专 一 ,但 可 以 和 该 氨基 酸 的 多 个 同 亚 受 体外 NA 结合。 但 也 有 例外 ,如 在 大 肠 杆
菌 中 只 有 一 种 tRNA ,但 却 有 2 种 赖 氨 酸 的 氨 酰 -tRNA 合成 酶 .在 真 核 生物 内 ,细胞 质 ` 叶 绿
条 和 线粒体 内 的 氨 栈 :让 NA 合成 酶 是 不 同 的 ; ' 现 已 对 多 种 不 同 来 源 的 合成 酶 进行 提纯 ,并 对

22 种 酶 进行 了 氨基 酸 测序 。

各 种 氨 酰 -tRNA 合成 酶 的 四 级 结构 有 很 大 差异 ,可 以 是 单 体 ( 六 二 聚 体 (dimer)Co) 和 同
型 或 中 型 四 对 林 (co, 或 风 B. 冯 其 多 肽 链 长 度 为 300 汪 900 个 氨基 酸 残 基 , 其 中 一 些 较 长 的 肽 链

是 雷 蒋 短 的 驮 链 在 氨基 端 延 长 而 成 的 ;其 延长 部 分 似
乎 与 其 催化 功能 苑 关 。 高 等 真 核 生 物 的 氨 酰 :tRNA 合
式 酶 药 一 外 特点 是 形成 特殊 的 聚集 物 (aggregate) 可
以 形 获 芬 子 量 高 达 了 000 KD 的 由 11 条 多 肤 链 组 成 的
本 有 些 则 游离 于 细胞
潜质 中

“ 玖 者 拉 估 RON 合成 酶 按 其 初

级 和 三 级 结构 以 及 反应 机 制 的 差异 可 分 为 二 类 ,每 类 ，

有 3 了 0 种 酶 ( 表 臣 鸭 , 这 个 分 类 也 适用 于 其 它 经 研究 过
的 生物 忆 它 们 都 舍 有 8 外 区域 , 即 催化 域 (ATP 和 氨基
酸 结合 入 点 为 tRNN 受 体 螺旋 结合 域 和 tRNA 反 密 码
子 结 从 域 . 此 四 ;多 蔷 态 的 合成 酶 还 有 一 个 守 聚 形成 区
域 。 催 化 域 是 一 个 大 的 区 域 ,在 其 中 插入 tRNA 受 体

表 9-4

两 类 氮 酰 -tRNA 合成 酶

第 二 类 第 三 类

Arg
Cys

螺旋 结合 域 ! 第 二 类 和 佑 成 酶 具有 一 个 NE 末端 催化 域 ， 它 是 一 个 称 为 核 背 酸 结合 折 春 Cnu-
dleotide- 贡 和 ii 各 划 ) 酌 基 序 (GDtit):, 由 平行 的 不 折 友 和 “螺旋 交替 排列 组 成 。 在 催化 域 中 有
两 介 短 前 气 基 酸 序列 , 称 为 喀 名 序列 %sigmature sequnce) ,形成 ATP- 结 合 位 点 的 一 部 分 ;
让 NiA 受 体 螺旋 结 侣 域 以 及 酶 的 C- 未 端的 其 它 两 个 区 域 均 视 不 同 的 酶 而 有 很 大 差异 , 第 忆 类
知 成 酶 的 机 花 域 有 8 个 相同 的 序列 ,其 活性 位 点 含 二 个 由 多 个 六 螺旋 包围 着 的 天 的 反 平 行 有
折 春 .插入 催化 域 的 受 体 螺旋 结合 域 的 结构 也 视 不 同 的 酶 而 异 。 反 密码 子 结合 域 在 'N: 末

端 。

2ZSA

氨 酰 -tRNA 合成 酶 催化 的 反应 分 两 步 进行 。 氨 基 酸 先 被 氨 酰 -tRNA 合成 酶 活化 ,生成 氢
酰 腺 苷 酸 (AA-AMP) ,其 中 氨基 酸 的 羧基 是 以 高 能 键 连接 于 腺 苷 酸 上 ,同时 放出 焦 磷酸 :

可 心 ，
人 人 于 和 AT 气 卫 NA 全 及 降 、 人 和 人 -AMP 十 BEi (1)

在 正常 情况 下 ,AA-AMP 中 间 物 仍然 紧密 地 结合 在 酶 上 。 直 到 与 该 氨基 酸 专 一 的 tRNA
分 子 碰撞 时 为 止 。 随 后 同一 酶 将 氨基 酸 转移 至 tRNA 的 末端 腺 苷 酸 残 基 上 。

AA_AMP 二 tRNA - 儿 卫 NA 全 上 AA_tIRNA 十 AME (2
反应 (1) 与 反应 (2) 加 成 后 的 总 反应 为 :
生 心
AA 二 tRNA 十 ATPIE 各 隆 下 NA 合成 四 。AA-tRNA 十 AMP 十 PEi (3 六

总 反应 (3) 的 平衡 常数 接近 于 1 ,自由 能 降低 极 少 。 这 说 明 tRNA 与 氨基 酸 之 间 的 键 是 高
能 酯 键 ,高 能 键 的 能 量 来 自 ATP 的 水 解 这 个 键 水 解 时 的 标准 自由 能 变化 为 一 30.51jkJs 由 于
反应 中 形成 的 PPi 水 解 成 正 磷酸 ,对 每 个 氨基 酸 的 活化 来 说 , 净 消 耗 的 是 2 个 高 能 磷酸 键 。 因
此 ,此 反应 是 不 可 逆 的 。 站
上 述 二 步 反 应 的 机 制 如 图 9-17 所 示 .。 可 以 看 出 ,反应 的 第 二 步 因 两 类 酶 而 不 同 ,第 一 类 酶
先 将 氨 酰 基 转移 至 tRNA3' 端 腺 苷 酸 的 2-OH 上 ,然后 通过 转 酯 作用 转移 至 34OH 上 ; 筝 二 类 量
酶 则 直接 将 氨 酰 基 转 移 至 3 -OH 上 ，
蛋白 质 合成 的 一 个 关键 问题 是 如 何 保证 20 种 不 同 的 氨基 酸 按 mRNA 上 遗传 密码 的 顺序 性
正确 地 挫 人 到 多 肽 链 上 去 ,以 形成 正常 的 具有 生理 活性 的 蛋白 质 。 为 此 , 氨 酰 -tRNA 合成 酶 必 上 四
须 能 正确 识别 其 底 物 氨基 酸 和 tRNA, 如 发 生 错误 , 则 必须 具有 进行 校正 的 机 制 。
不 同 氨 酰 -tRNA 合成 酶 对 氨基 酸 的 专 一 性 是 不 同 的 ,有 些 是 高 度 专 一 的 ,只 与 一 种 氨基
酸 结合 ,有 些 则 同时 能 与 正确 氨基 酸 结构 相近 的 氨基 酸 结合 .但 虽然 有 时 能 结合 上 这 些 类 似 的
却 是 不 正确 的 氨基 酸 ,最 终 却 不 能 生成 稳定 的 氨 酰 -tRNA ,这 是 因为 存在 进行 校正 (proofread-
ing) 的 机 制 。 校 正 包括 两 个 阶段 ,这 两 个 阶段 均 需要 相关 tRNA (cognate tRNA) 参 与 。 第 一 阶
段 的 校正 是 当 相关 tRNA 结合 上 时 ,即将 已 生成 的 不 正确 的 氨 酰 -AMP 水 解 掉 ;如 甲 硫 氨 酸 、
异 亮 氨 酸 、 顷 氨 酸 的 氨 酰 -tRNA 合成 酶 即 是 如 此 。 第 二 阶段 的 校正 是 当 不 正确 的 氨基 酸 转移 量
至 tRNA 上 时 ,由 于 tRNA 在 其 结合 位 点 识别 其 结构 错误 而 将 之 水 解 掉 。 这 两 个 校正 阶段 如 量 量
9-18 所 示 。 上 述 两 个 阶段 的 校正 均 要 求 相关 tRNA 的 参与 。 甚 至 在 形成 氨 栈 -AMP 之前, 痢
tRNA 也 起 着 引发 校正 的 作用 。 例 如 ,大 肠 杆菌 的 lle-tRNA 合成 酶 同时 可 以 催化 纺 氨 酸 与
AMP 结合 ,但 当 加 入 tRNA 时 ,Val-AMP 便 发 生 水 解 。 这 说 明 相 关 tRNA 在 校正 氨基 酸 结 重
合 中 的 重要 性 。 潮
氨 酰 -tRNA 合成 酶 也 必须 识别 正确 的 tRNA。 现 已 知 合成 酶 蛋白 是 在 L 形 tRNA 的 侧面
与 之 结合 的 ,而 且 两 类 合成 酶 结合 的 侧面 不 同 , 它 们 是 分 别 在 相对 的 侧面 结合 的 (图 9-19)。 具
体 地 说 ,第 一 类 酶 (如 Cln-tRNA 合 成 酶 ) 是 在 tRNA 的 D- 环 侧 结合 ,识别 其 受 体 臂 的 小 海
《minor groore), 反 密码 子 环 在 另 一 端 ， 而 第 二 类 酶 (如 AsprtRNA 合成 酶 ) 则 在 另 一 侧 与
tRNA 接触 ,识别 其 可 变 环 和 受 体 臂 的 大 沟 (major groove)。 由 于 tRNA 的 受 体 臂 和 反 密码 子
臂 (anticodon arm) 是 和 合成 酶 紧密 接触 的 ,因此 ,对 tRNA 的 识别 也 是 在 这 两 部 位 .利用 穴 变

的 方法 ,改变 tRNA 的 个 别 碱 基 , 然后 测定 合成 酶 对 它 的 识别 能 力 ,可 以 了 解 哪些 核 苷 酸 是 与
238

本 计

五 |
0
NEO OF

5 - 氮 酰 腺 苷 酸
OH OH 〈《 氮 酰 -AMP )

了

第 一 类 酶 第 二 类 酶 氨 酰 -tRNA

图 9-17 氨 酰 -tRNA 合成 酶 的 tRNA 氨 酰 化 作用

239

校正 : 氨 酰 -tRNA 水 解

_ tRNA 荷载 小
六

正确 氨基 酸 小

及
RCH
多
CO
AMP 机

氨 酰 -tRNA

9-18 氢 酰 -tRNA 合成 酶 结合 错误 氨基 酸 的 校正

识别 有 关 的 。 表 9-5 示 已 知 的 一 些 tRNA 的 识别 位 置 . 据 现 在 所 知 ,这 些 识别 位 置 为 数 不 多 ，
般 只 有 1 一 5 个: 如 ARNA 合成 本 的 识别 位 置 只 是 在 受 休 避 上 的 G3 , U70 bp 上 。 而 且 ,每
一 种 合成 酶 对 tRNA 的 识别 位 置 均 不 相同 ,没有 一 般 的 规律

由 于 氨 酰 -tRNA 合成 酶 对 tRNA 的 识别 在 蛋白 质 的 正确 合成 中 的 重要 性 , 因此， 有 人 陈 -
之 为 “第 二 遗传 密码 ”。 但 是 ,这 ” 第 二 遗传 密码 ”Csecondary code) 的 具体 内 容 如 何 ， 现 仍 未 清
楚 。 显 然 , 它 是 比 经 典 的 遗传 密码 ( 见 第 八 章 ) 复 杂 得 多 的 。

二 se

第 二 类

图 9-19 第 一 类 和 第 二 类 氢 酰 -tRNA 合成 酶 的 结晶 结构
示 tRNA( 深 色 ) 分 别 结合 于 酶 蛋白 ( 浅 色 ? 的 相对 侧面 。

表 9-5 ”一些 tRNA 中 对 识别 合成 酶 起 决定 作用 的 核 苷 酸

tRNA 起 作用 的 核 苷 酸

大 肠 杆菌 两 所 酸 G3U70

大 肠 杆菌 精 氢 酸 A20 和 其 它

大 肠 杆菌 谷 氨 栈 U35

大 肠 杆菌 异 亮 氨 酸 L34

大 肠 杆菌 甲 硫 氨 酸 反 密 码 子

大 肠 杆菌 丝氨酸 GCC725C25C7T 人 SU70 稚 开 G24
大 肠 杆 菌 绩 氢 酸 反 密 码 子

酵母 茱 丙 氨 酸 元 G20,G34,A35,A36,A73

第 四 闻 原核 生物 的 生 白 质 的 生物 合成

一 ` 核 糖 体 的 作用

在 细胞 质 中 ,大 多 数 mRNA 是 与 一 个 或 数 个 核糖 体 结合 于 称 为 多 核糖 体 的 复合 物 中 (图
9%-3) 。 核 糖 体 在 多 ( 聚 ) 核 糖 体 上 的 数目 受 mRNA 密码 子 序列 的 长 短 ` 以 及 在 核糖 体循环 中 起
始 、 延 伸 、\ 侨 止 的 相对 速度 所 控制 。 例 如 ,合成 珠 蛋白 链 的 mRNA 密码 子 序列 含有 约 450 个 核
苷 酸 ,其 多 核糖 体 最 大 是 五 聚 体 。 这 表明 两 个 连续 的 核糖 体 中 心 之 间 的 平均 距离 是 80 一 90 个
核 苷 酸 。 如 果 蛋 白质 合 成 的 起 始 相 对 慢 于 延伸 和 终止 ,核糖 体 沿 着 mRNA 将 会 有 更 宽阔 的 空
间 ,结果 是 核糖 体 少 . 相反 ,起 始 比 延 伸 或 终止 快 ,mRNA 上 组 装 的 核糖 体 紧 密 ,导致 多 量 的 核

糖 体 。 一 般 来 说 ,特定 的 mRNA 的 翻译 效率 人
是 受 起 始 速度 所 决定 。 在 蛋白 质 合成 的 调控 CSS2CE
中 ,起 始 作 用 的 控制 是 一 个 重要 因素 . 当 起 始 多
作用 被 抑制 ,例如 ,被 金 红 三 羧 酸 (aurintril-
carboxylic acid) 或 密 旋 霉 素 (pactamycin ) 抑 @
制 之 后 ,已 经 启动 蛋白 质 合 成 的 核糖 体 是 仍
能 完成 肽 链 的 延伸 、 终 止 ,并 从 mRNA 上 解
离 。

核糖 体 由 容易 解 离 的 亚 基 组 成 ,表明 其
在 蛋白 质 合成 的 某 个 阶段 大 亚 基 与 小 亚 基 有
周期 性 的 分 离 . 将 细胞 放 在 重 同 位 素 中 生长 ，
然后 转 人 轻 介 质 中 ,不 久 即 开始 出 现 杂 交 的
核糖 体 ( 重 50 S/ 轻 30S 和 轻 50S/ 重 30S)，
它们 出 现 的 速率 表明 ,多 肽 合成 的 每 周转 一
次 就 有 一 次 亚 基 交换 。 体 外 蛋白 质 合 成 研究
也 证 实 这 个 推断 :在 有 大 量 过 剩 的 轻 核糖 体
存在 时 , 约 1 min 左右 (这 是 合成 一 条 多 肽 链 ,0 ，
所 需 的 时 间 ) ,差不多 全 部 重 核糖 体 都 消失 ， ve |
同时 出 现 杂交 的 核糖 体 ( 图 9-20) ,用 抗菌 素 入 含有 蛋白 质 合成 所 需 全 部 组 分 的 试管 中 ;@@ 做 类 似 的 二 国医
稀 琉 霉 素 (sparsomycin ) 做 体外 试验 证 实 了 实验 但 此 时 加 入 稀 朴 霉 素 。 这 个 化 学 试剂 阻碍 蛋白 质 的
亚 基 交 换 对 蛋白 质 合成 的 专 一 性 依赖 关系 。 合成 ;:@) 短 时 间 温 育 后 ,将 核糖 体 分 离 ;*@ 蛋 白质 合成 时 ，
这 种 化 合 物 抑制 了 多 肤 链 的 延长 ,也 防止 了 。 30S/ 重 50S) 发 全 直 基 六 投 ,@@ 瘟 站 质 全 成 有
亚 基 的 交换 。 阻 时 ,没有 亚 基 交 换 ,分 离 不 出 杂种 的 核 狂 体 。

二 .mRNA 的 结构 与 功能

所 有 的 mRNA 都 是 单 链 的 多 聚 核 苷 酸 ,含有 一 个 决定 氨基 酸 序列 的 编码 区 ;还 有 与 起 妈
密码 子 和 终止 密码 子 紧邻 的 侧 可 序列 。 真 核 生物 与 原核 生物 的 mRNA 的 区 别 在 于 前 者 在 豆
端 有 一 个 帽子 结构 和 在 3' 端 有 一 个 多 聚 (A) 的 尾部 ,帽子 结构 由 7- 甲 基 鸟 音 和 三 磷酸 号
mRNA 的 5 端 连接 (图 9-21) 。 寻 于

在 mRNA 的 编码 区 ,三 级 结构 对 翻译 速度 影响 较 小 。 在 多 顺 反 子 mRNA 中 ,二 级 结构 甬

调节 个 别 解读 顺 反 子 的 频率 。 三 级 结构 的 5 -和 3! -不 翻译 序列 对 特定 蛋白 质 的 合成 ， 例如 ,组

蛋白 , 铁 蛋白 、 微 管 蛋白 和 生长 因子 等 的 翻译 调控 可 能 会 有 特殊 的 重要 性 ， 十

原核 生物 多 顺 反 子 mRNA 常常 有 一 个 5- 前 导 序 列 , 以 pppA 或 pppG 开始 ,还 有 不 翻 主 旺
的 顺 反 子 间 序列 ,以 及 在 最 后 的 顺 反 子 终止 密码 之 后 有 一个 3 -不 翻译 区 域 ， 前 导 序列 的 长 度
依 mRNA 而 定 , 一般 都 是 短 的 ( 约 20 一 200 个 核 苷 酸 )。 也 有 些 例外 ,其 起 始 密码 子 位 于
mRNA 5' -末端 或 虐 5" 端 仅 有 几 个 核 苷 酸 。 原 核 生物 转录 终止 之 前 ,新 生 的 mRNA 即 开 嫩 番
译 , 并 且 在 前 导 序 列 上 的 核糖 体能 够 改变 新 生 mRNA 的 二 级 结构 ， 从 而 调节 操纵 子 剩余 部 分
的 转录 。 在 某 些 情况 下 ,前导 序列 也 可 以 翻译 成 短 的 无 功能 的 多 肽 。

顺 反 子 间 序列 通常 是 短 的 ,但 也 可 以 长 达 400 个 核 苷 酸 。 也 有 重 亚 顺 反 子 的 例子 , 它 的
242

|

TUGA 终止 密码 子 的 最 后 一 个 核 苷 酸 就 作为 邻近 起 始 密码 子 AUG 的 第 一 个 碱 基 。

AUG AUG AUG

(b)

AUG
7MeG.ppp.

帽子 结构 前 导 序 列 ”编码 序列

图 9-21 典型 的 信使 RNA 结构
(a) 原核 生物 多 顺 反 子 mRNA; (b) 真 核 生物 mRNA 。

在 蛋 自 质 合成 中 ,mRNA 3'- 不 翻译 区 域 的 功能 还 不 清楚 。 它 的 主要 作用 可 能 是 终止 RNA

3' -不 翻译 序列 ”多 聚 (A) 尾 部

54ppp A 3/
“前 导 序列 顺 反 子 1 顺 反 子 2 1 顺 反 子 3 3'- 不 翻译 序列
顺 反 子 间 序列

(不 编码 )

聚合 酶 的 转录 作用 ,但 也 可 能 起 mRNA 稳定 与 翻译 调控 (translation regulation) 的 作用 。

三 起 始 复合 物 的 形成
(一 )N- 甲 酰 甲 硫 氨 酸

在 核糖 体 上 进行 的 蛋白 质 的 合成 是 从 氮 基 末端 开始 ,逐步 加 上 一 个 个 氨基 酸 ,在 羧基 端 终
蛤 "这 可 以 用 放射 性 标记 的 氨基 酸 加 入 合成 血红 昌 白 的 网 织 红 细胞 ,然后 立即 分 离 新 合成 血红
蛋白 链 得 以 证 明 。 如 果 标 记 时 间 比 完成 一 条 链 所 需要 的 时 间 短 的 话 , 放 射 性 很 少 会 出 现在 氨基
末端 的 氨基 酸 中 ,而 大 多 是 出 现在 羧基 末端 的 氨基 酸 中 ,并 且 沿 着 从 氨基 端 至 羧基 端 可 以 观察

到 一 个 清楚 的 放射 性 增加 的 梯度 。

所 有 细菌 蛋白 质 合 成 的 氨基 端的 第 一 个 氨基 酸 都 是 N- 甲 酰
甲 硫 氨 酸 (fMet), 这 是 一 个 修饰 了 的 甲 硫 氨 酸 ,在 其 氨基 末端 连
接 上 一 个 甲 酰 基 ( 图 9-22) 。 一 个 像 这 样 封 闭 的 氨基 酸 只 能 用 于 蛋
自 质 合成 的 起 始 阶段 。 由 于 不 存在 游离 的 氨基 ,这 便 防 止 它 在 肽 链
延伸 时 插入 内 部 。 这 个 甲 酰基 是 在 甲 硫 氨 酸 连接 于 tRNAf' 接 合
体 上 以 后 , 由 酶 促 加 上 去 的 。 甲 酰基 的 供 体 是 N"- 甲 酰 四 氧 叶酸 ，
催化 该 反应 的 酶 叫做 转 甲 酰 酶 。

Met-tRNAje

并 非 所 有 甲 硫 氨 酰 -tRNA 分 子 都 可 以 甲 酰 化 。 大肠 杆菌 细胞
内 有 两 种 类 型 tRNAje ,一 类 是 tRNAje*, 一 类 是 tRNAn 。 只 有
tRNA 深 上 的 甲 硫 氨 酸 可 以 甲 酰 化 ,对 tRNAN 和 tRNAn (内 部
甲 硫 氨 酸 ) 做 顺序 分 析 显 示 出 ,两 者 具有 相同 的 反 密码 子 顺 序 , 但
它们 编码 的 氨基 酸 不 同 。 大 肠 杆菌 的 tRNA'” 和 tRNAnw” 的 结构
主要 有 3 点 不 同 :@ 氨 基 酸 臂 3' 端 第 5 个 碱 基 在 tRNA ”是 A, 它
与 tRNA 5' 端 C 不 配对 ;在 tRNAw”" 相对 应 的 位 置 是 C, 它 可 以

一 fMet-tRNANE:

Ch

甲 硫 氨 酸 (Mei)
图 9-22 N- 甲 酰 甲 硫 氨 酸 与
甲 硫 氨 酸 结构 的 比较

243

与 弛 端的 G 形成 配对 ;@TYC 环 上 ,tRNAJ 是 TYCA, 在 tRNA 相对 应 位 置 是 G;G 反 密 汪
码 环 上 ,tRNA 反 密 码 子 3' 端 邻 位 碱 基 是 A ,在 tRNAw” 相对 应 位 置 是 烷 基 化 的 全 。 实 验 发
现 ,只 有 甲 酰 甲 硫 氨 酰 -tRNA; 起 的 凤 及 30 S 核糖 体 亚 基 结 合 .形成 起 复
合 物 , 而 甲 硫 氨 酰 -tRNA。 只 能 与 延伸 因子 结合 ,将 甲 硫 氨 酸 挫 人 肽 链 的 中 间 。

(二 ) 起 始 密码 子 的 正确 选读 量

细菌 内 蛋白 质 合成 的 起 始 是 从 核糖 体 小 亚 基 30 S 与 {Met-tRNAN 和 一 个 mRNA 分 隆
形成 复合 物 开 始 的 。 然 后 50 S 亚 基 参 加 进去 ,形成 有 功能 的 70 S 核糖 体 。 每 一 个 mRNA 上 有 省
一 个 与 核糖 体 结合 位 点 ,以 合成 一 条 独立 的 多 肽 链 。 每 一 位 点 内 的 核 苷 酸 的 顺序 是 使 RN 人
分 子 在 蛋白 质 合成 开始 之 前 在 核糖 体 上 先行 正确 定位 。

核糖 体 是 如 何 辨 别 在 一 个 基因 开始 的 AUG 密码 子 和 编码 内 部 甲 硫 氨 酸 的 密码 子 呢 ? 实
验 发 现 : 将 30 个 核 苷 酸 长 度 的 大 肠 杆菌 噬菌体 R17 合成 A 蛋白 的 起 始 区 mRNA 片段 ,使 其
与 大 肠 杆菌 多 核糖 体形 成 起 始 复合 物 。 然 后 用 大 肠 杆 菌 素 E3 (colicin E3)( 它 可 以 从 16S
RNA 的 3'- 未 端 切 下 59 个 核 苷 酸 ) 加 到 复合 物 中 。 用 表面 活性 剂 处 理 混合 物 , 解 离 核 糖 体 释放 站
出 RNA.。 释放 出 的 RNA 是 mRNA-rRNA 杂交 分 子 。 在 这 杂交 分 子 内 ,mRNA 和 rRNA 片 E
通过 氢 键 结合 在 一 起 。

早 在 1975 年 ,Shine 等 就 注意 到 上 述 现象 由 此 提出 一 种 很 吸引 人 的 假设 来 解释 起 始 密
码 子 的 识别 。 他们 见 到 几 种 细菌 16 S rRNA 3 -末端 顺序 为 :5 -PyACCUCCUA-3 。 其 中 Py 可
以 是 任何 喀 啶 核 苷 酸 。 它 可 以 和 mRNA 中 离 AUG 顺序 5 侧 约 10 个 碱 基 不 有 二 有 段 富 含 顺 喉 汪
的 间隔 顺序 AGGA 或 GAGG( 后 来 称 此 区 域 为 Shine-Dalgarno 顺序 ) 互 补 。 现 认为 正 是 由 带
样 的 配对 将 AUG( 或 GUG,UUG ) 密 码 子 带 到 核糖 体 的 起 始 位 置 上 (图 9-237

Qp 叭 菌 体 蛋 白 A EUGC AGCU ”AUA AGA GGA CAU” AUCTCCONS AN 守 半生
Qp 叭 菌 体外 壳 GUVU UGG 'GUC AAU UUG AUC AUG GCAUNNANRUNA
Q8 叭 菌 体 复制 酶 UUA CUA_AGG AUG AAA UGC AUG TUCUURARAGSAER

1 噬菌体 Cro AUGRAUAC ， UAA GGA GGU_、UGU _AUG “ 忆 信 并 站

人 噬菌体 外 壳 TUONAAU CCcA AAC UUC cUc AUG” 从 AD 交 各 站 人 全 和 站
GX 鸣 菌 体 174A AAU CUU ” GGA GGC UUU UUU AUG GUUUCCUNROED

丐 X 噬菌体 174A UUGUCUCINGAG .GCC UCcC ACU AUG -AIAA

G6X 噬菌体 174B ACECURUCUO LAGG Acc UAA AcGA AUG CGAA 让 站
GSX 噬菌体 174E GCCIUUCCIRAGG cUU GCc UUU AUG “GD 由 全 相生 人 和 的 和
脂 蛋 白 AUGCIRUAGIAGG GUA UUA AUA AUG ANAGSCEI NGON 的 汉
RecA GGCUIAUCIRACA ccGA GUA AAA AUG GCUISRAGCC SS
TD 《全 ECGCUAEAUCCAG ccA AUU AUG - AGALE 和 宝宝
GalT EECAUNEUXARICcA Acc AcC AUc AGCT ERART 守 全 和 和 的 和
Lacl IOUWUC GeaascUcG GUG AAU GUG _AAAIUCOCXARNTA

LacZ 3 二 GASGAGRGAA ACA GcCU AUG Acc AUGUNAUGE
核糖 体 L10 CAUNCAARRSCCGAURGCA AAG CUA AUG GcU UU 斑 - 王 AAO 各
核糖 体 L7/L12 UAU UCA_ CCAULACA AUU UAA AUG Ucu AUc AGO >
RNA 聚合 酶 8 亚 基 AGG CACICUcERCNAAGE CC AUc cuu UAc” TU 证

16S tRNA 3/- 未 端 bg ADUGCU CCACUAG 5'
图 9-23 已 知 部 分 蛋白 质 的 mRNA 在 大 肠 杆菌 核糖 体 上 的 结合 位 点
《蛋白质 合 成 起 始 区 域 )
mRNA 上 互补 于 16 S 训 NA 3'- 未 端的 核 苷 酸 用 横 线 表示 ,应 注意 能 与 16 S tRNA 3' -未 端 碱 基 配 对 的 长 度 与 位 置 是 可
变 的 ,与 16 S tRNA 3' -未 端 相互 作用 的 正确 配对 也 是 可 恋 的 。
244

进一步 支持 Shine-Dalgarno 假设 的 证 据 来 自用 其 它 细 菌 核糖 体 进 行 R17A 蛋白 合成 效率
| 的 研究 。 测 定 了 6 种 细菌 16 S rRNA 分 子 3' 末 端 顺序 ,发现 碱 基 配 对 区 的 长 度 和 强度 (G.C
对 和 和 AU 对 的 比值 ) 是 不 同 的 * 尿 同 核糖 体 合成 A 蛋白 的 量 与 碱 基 对 区 的 稳定 性 有 关 。 表明
， 起 始 频 率 的 主要 因素 取决 于 mRNA-16 S rRNA 碱 基 配 对 的 强度 。

| 虽然 Shine-Dalgarno 顺序 是 识别 AUG (或 GUG， UUG) 起 始 密码 子 的 基本 条 件 ,但 并 非
。 充分 条 件 。 现 知 Shine-Dalgarno 顺序 会 靠近 不 做 密码 子 使 用 的 AUG 三 联 体 。 显 然 ,为 起 始 作
用 还 必须 有 另 一 些 mRNA 的 碱 基 顺 序 在 起 作用 。 在 前 导 序 列 的 上 游 序列 ,在 mRNA 与 核糖 体
之 间 可 能 提供 了 识别 信号 ,以 保证 这 个 Shine-Dalgarno 序列 在 合适 的 构象 内 ,或 在 整个 核糖
体 的 结 谷 域 内。 整个 mRNA 分 子 的 折 释 以 及 30 S 核糖 体 蛋白 质 ( 如 S 1,S 4,S 18,S 21) 对 核
。 糖 体 与 mRNA 的 结合 也 起 到 某 些 作用 。

-多肽 链 的 延伸 一 旦 开始 ,16 S rRNA-mRNA 的 碱 基 配 对 便 要 在 一 定 程度 上 解 离 ,使 松 开

的 mRNA 可 以 在 核糖 体 表 面 上 自由 移动 。 当 核糖 体 沿 着 mRNA 移动 时 , 它 必须 暂时 地 破坏 双

曙 旋 发 赤 区 域 (这 些 区 域 是 许多 游离 mRNA 区 段 的 特征 ) ,这样 便 创 造 出 可 以 正确 选择 氨 酰 -

tRNA 前 体 的 反 密 码 子 的 单 链 区 域 。

(三 )mRNA 翻译 的 方向

当 mRNA 分 子 的 起 始 区 域 正 确 地 结合 上 一 个 核糖 体 后 ,在 蛋白 质 合成 中 , 它 总 是 以 固定
的 方向 移动 , 即 由 其 5 端 向 3' 端 的 方向 。 开 始 解读 的 一 端 , 即 5 端 ,是 最 先 合成 的 一 端 。 这 样 ，
DRNA 在 DNA 模板 上 合成 过 程 中 ,核糖 体 可 以 连接 在 一 条 未 完成 的 mRNA 上 。 如 果 与 此 相
反 多肽 合成 是 朝 3' 一 5 方向 进行 的 话 , 那 么 ,相应 于 一 条 完整 的 多 肽 链 的 mRNA 则 必须 先 完
成 ,然后 核糖 体 才 能 连接 上 去 。 蛋 白质 合 成 朝 5 一 3 方向 ,意味 着 在 迅速 生长 的 细菌 细胞 中 ,不
与 核糖 体 连 接 的 长 段 mRNA 通常 是 不 存在 的 。

四) 起 始 因子
”蛋白 质 合 成 的 启动 必须 有 起 始 因子 的 参加 。 起 始 因子 是 一 类 参与 蛋白 质 生 物 合成 起 始 的

可 溶性 蛋白 因子 。 蛋 白质 合成 的 起 始 要 生成 核糖 体 . mRNA tRNA 三 元 复合 物 ,也 叫 起 始 复
合 物 。 复合 物 必须 在 起 始 因子 帮助 下 才能 完成 。 目 前 已 知 原核 生物 起 始 因子 有 3 种 。 即 :IF1，
IF2 和 了 IF3。 首先 ,这 3 种 起 始 因子 连接 于 30 S 亚 基 上 ,GTP 使 这 个 结合 稳定 。GTP 可 能 直接
被 正 2 结合 。IF1 是 一 个 小 的 碱 性 蛋白 , 它 能 增加 其 它 2 个 起 始 因子 的 活性 。 有 些 原 核 生 物 不
具 相 当 于 IF1 的 起 始 因 子 , 在 这 些 生 物 中 ,蛋白质 合成 的 起 始 可 以 只 在 IF2 和 IF3 参与 下 进
行 * 现 知 下 1 二 16 STRNA- 的 结合 位 点 分 别 是 Gsze yssoyA: 访 0 林 Ai iss。 足迹 分 析 表 明 贡 1 与
氨 酰 -tRNA 在 16S rRNA 上 的 识别 位 点 相同 ,这 瞳 示 IF1 在 翻译 起 始 时 可 代替 氢 栈 -tRNA
暂时 封闭 核糖 体 的 氨 酰 -tRNA 接受 位 (A 位 ) ,起 到 协调 30 S 亚 基 功能 的 作用 。 另外 ,IF1 是 一
个 G 蛋 自 ,在 核糖 体 亚 基 聚 合 时 ,具有 活化 GTP 酶 的 作用 。 IF2 有 两 种 分 子 形式 , 正 2a 与 IF2b
是 同一 个 mRNA 的 翻译 产物 .IF2b 的 起 始 密码 位 于 正 2a 的 十 471 核 苷 酸 处 .区 基 是 IFE2 活性
所 必需 的 , 正 2 磷酸 化 以 后 活性 不 变 。IF2 的 功能 是 通过 生成 正 2， GTP ' fMet-tRNA 和 ”三 元
复合 物 , 在 IF3 存在 下 ,使 起 始 tRNA 与 核糖 体 小 亚 基 结合 :下 2 与 {fMet-tRNAwet 间作 用 的 专
一 性 非常 严格 ,用 于 延伸 的 氨 酰 -tRNA 甚至 非 甲 酰 化 的 Met-tRNAIM 均 不 能 与 IF2 结 从 或 结
合 得 很 不 稳定 。IF2 具有 很 强 的 GTP 酶 活性 ,在 肽 链 合成 起 始 时 催化 GIP 水 解 。IF3 绠 具 双
功能 的 蛋白 质 , 它 至 少 有 两 种 分 子 形式 ,IF3c 和 IF38, 后 者 比 前 者 只 少 N 端 6 个 氨基 酸 残 基 。

245

IF3 对 mRNA 与 核糖 体 的 结合 很 严格 , 它
与 16 S rRNA 相互 作用 位 点 在 700 与 790
环 ,840 茎 与 1 500 连接 区 (图 9-9) ,其 中
700 与 790 环 与 肽 酰 -tRNA 接受 位 点 (P

CD ~ 六 各 33

二 2

RE no 了

ES at 和
2

位 点 ) 邻 近 。 IF3 能 通过 促使 未 翻译 的 前 导 安 2
序列 与 16 S rRNA 的 3 - 端 碱 基 配 对 , 让 无 活性 70S 核糖 体
核糖 体 识别 天 然 mRNA 上 的 特异 的 启动 F3 秤 :ri

信和 号, 又 能 刺激 fMet-tRNA: 与 核糖 体 结

合 在 AUG 上 .。 另外 ,IF3 能 使 30 S 亚 基 形 IF3

状 发 生 细 微 的 变化 ,以 阻止 其 与 50S 缔
合 。 表 9-6 列 出 了 3 种 起 始 因子 以 及 蛋白

质 合成 的 延伸 因子 和 终止 因子 的 分 子 量 和
功能 。 5(LLLPILIIAUGLL3'+ :学
IF 2。fMet - tRNAKe:

fMet -tRNA et

Shine-Dalgarno
序列

表 9-6 ”大肠 杆菌 的 起 始 因子 .延伸

因子 和 终止 因子 的 特性 和 功能
分 子 量
因子 “py ”特性 和 功能
超 始 因子
FF1 9 ”促进 核糖 体 的 解 离 和 IF2 活性
IFy 100 由 一 个 要 求 GTP 的 反应 使 Mer

tRNA 结合 于 核糖 体 的 P 位 点

将 mRNA 结合 于 核糖 体 的 小 亚 基 ，
IF3 22 ”可 能 是 促进 非 翻 译 的 前 导 序列 与
16 S rRNA 3' 端 的 碱 基 配 对

ceeweneeqim ac

延伸 因子 Re
三 人
铺 辣 3 ， 指 气 了 RNA 结合 于 核 生体 人 人 这
EF-Ts 30 ”重新 生成 EF-Tu-GTP
ERG ，， 肽 基 tRNA 和 mRNA 密码 子 和 人
位 点 移 至 P 位 点 ,此 过 程 依 末 GTP
终止 (释放 ?因子
tRNA， UAA
Rel 36 水 和 区 基 RNA, 要 求 DAA 或 ee
RF2 38 水 解 肽 基 +tRNA, 要求 UAA- 或 RE
UGA 密码 子 70S 起 始 复合 物
RF3 46 ”促进 RF1,RF2 活性

图 9-24 ”大肠 杆 菌 蛋 白质 合成 的 起 始 过 程
第 二 步 ,ftMet-tRNAK 和 mRNA 连接 于 IF .30S. GTP 聚集 体 上 。 在 结合 时 ,fs 二
tRNA 党 与 IF2-GTP 复合 物 紧密 接触 。30 S 起 始 复合 物 一 旦 完全 形成 后 ,IF3 即 释放 出 来 ,以
后 50S 参加 进来 ,并 引起 GTP 水 解 和 释放 其 它 两 个 起 始 因子 (图 9-24) ,最 后 的 复合 物 称 芳
70S 起 始 复合 物 。
(五 ) 核 糖 体 上 tRNA 的 结合 位 点
前 文 述 及 每 一 个 核糖 体 含有 2 个 tRNA 结合 位 点 的 空 腔 , 它们 是 P( 肽 酰基 ) 位 点 ,A( 氢

酰基 ) 位 点 。 表 9-2 已 指出 P 位 点 和 A 位 点 是 由 部 分 30S 亚 基 与 部 分 50 S 亚 基 形 成 的 。 由 一
246

| 不 特殊 的 mRNA 密码 子 而 使 位 点 的 形状 对 一 给 定 的 氨 酰 -tRNA 专 一 ,就 是 说 在 该 位 点 上 的
mRNA 的 表面 使 核 灶 体 的 空 腔 对 任 一 给 定 的 氨 栈 -tRNA 分 子 是 专 一 的 。

四 、 多 肽 链 的 延伸 、 移 位 循环

(一 ) 肽 链 的 延伸

从 起 始 阶段 形成 的 起 始 复合 物 可 以 接受 第 二 个 氨 酰 -tRNA, 以 形成 蛋白 质 第 一 个 肽 键 . 在
第 三 个 氢 酰 -tRNA 进入 A 位 点 之 后 , 便 形 成 一 个 肽 键 ,并 产生 出 一 个 连接 于 第 二 个 氨基 酸 的
谍 NA 上 的 二 肽 。 然 后 便 发 生 移 位 , 肽 酰 -tRNA 和 与 之 结合 的 mRNA 密码 子 协 同 转移 至 P 位
点 ; 这 个 氨基 酸 加 成 过 程 一 再 重复 ,每 次 加 上 一 个 氨基 酸 , 直 至 形成 一 条 完整 的 多 肽 链
〈 图 9-25)。

EF - Ts GTP

新 生 多 肽 EF - Tu。EF - Ts

EF -Tu。 GTP
cpP fMet 人

ERF - Ts
氨 酰 -tRNA EF -Tu。GDP
*，EF - Tu。 GTP

图 9-25 大 肠 杆菌 蛋白 质 合 成 的 延伸 过 程

肽 链 的 延伸 要 求 有 延伸 因子 EF-Tu 和 EF-Ts 参与 。EF-Iu 的 作用 是 帮助 氨 酰 -tRNA 进
入 A 位 点 。EF-Tu 先 与 GTP 结合 ,此 时 它 处 于 活性 状态 。 此 EF-IU“" GTIE 二 元 复合 物 (EF-
TU “GTP somplex) 与 氨 酰 -tRNA 形成 EF-Tu。 GTP“' 氨 酰 -tRNA 三 元 复合 物 。 此 三 元 复
合 物 进 人 核糖 体 的 A 位 点 ,而 了 位 点 则 为 fMet-tRNAi 或 肽 酰 -tRNA 占 据 。 以 后 GTP 即 被
水 解 ,生成 无 活性 的 EF-Tu . GDP 被 释放 出 。EF-Tu 是 大 肠 杆菌 内 最 丰富 的 蛋白 质 , 每 个 细
胞 约 含 100 000 个 分 子 , 与 tRNA 分 子 数 约 相等 。

EF-Tu 是 如 何 通 过 与 tRNA 受 体 未 端的 相互 作用 来 促进 反 密 码 子 在 分 子 的 另 一 端正 确
配对 并 不 清楚 ,不 过 ,在 这 个 过 程 中 GTP 的 水 解 却 起 了 主要 作用 。 如 果 三 元 复合 物 ( 即 GTP .

247

EF-Tu . 氨 酰 -tRNA) 中 的 tRNA 反 密 码 子 与 结合 在 A 位 点 的 密码 子 完 全 不 互补 的 话 , 该 复
合 物 将 不 会 与 核糖 体 相 互 作用 。 如 果 复 合 物 的 反 密 码 子 是 接近 于 匹配 ,但 不 是 十 分 正确 , 那 和 分
瞬间 结合 将 会 发 生 ,GTP 也 会 水 解 ,但 是 错 配 的 tRNA 将 从 核糖 体 上 剔除 。 只 有 密码 子 和 反 密
码 子 正确 配对 ,在 GTP 水 解 后 , 氨 酰 -tRNA 的 结合 才 会 保持 着 。 这 样 ,凭借 EF-Tu 催化 GTE
的 水 解 ,似乎 起 着 校正 与 阅读 的 机 制 , 从 而 增加 蛋白 质 合成 中 氨基 酸 排列 的 精确 性 ，
最 近 Powers 等 提出 ,核糖 体能 觉察 正确 tRNA 的 结合 ,并 能 通过 16 S rRNA 的 构象 变化
传递 信息 以 引起 GTP 水 解 与 EF-Tu 释放 。 这 种 信息 的 传递 步骤 中 有 核糖 体 小 亚 基 蛋 白质 S
4,S5 与 S$12, 特 别 是 围绕 16 S rRNA G530 环 和 912~-915 区 的 RNA 结构 域 的 参与 。
1981 年 Rheinberger 等 提出 当 有 聚 (U) 存 在 时 ,有 3 个 未 经 酰 化 的 tRNA 分 子 能 和 核糖 属
体 结合 。2 个 tRNA 分 子 和 A 位 与 P 位 结合 ,第 三 个 tRNA 分 子 则 和 下 位 (exit ,释放 部 位 ) 圣 大
合 。 现 在 ,已 有 许多 证 据 表 明 大 肠 杆菌 的 70 S 核糖 体 上 除了 A 和 了 位 外 ,还 存在 结合 tRN 有
的 第 三 个 位 点 , 即 王 位 点 。 并 证 实 移 位 前 后 的 核糖 体 是 处 于 两 种 不 同 构象 状态 。 据 此 提出 一 种
延伸 循环 变 构 3 位 点 模型 (图 9-26) 。 此 模型 认为 核糖 体 有 A,P,E 3 个 tRNA 结合 位 点 匡 使
点 与 P 位 点 相 邻 ,偏向 mRNA 的 5 端 , 脱 酰基 -tRNA 离开 P 位 点 后 转 至 了 位 点 。 这 一 结合 使
A 位 点 的 空间 结构 改变 ,利于 新 的 氨 酰 -tRNA 的 结合 。 当 新 的 氨 酰 -tRNA 与 A 位 结合 后 ,使 夺
E 位 点 结构 改变 , 脱 酰基 -tRNA 即 脱离 E 位 点 。 ]

翻译 域 出 口 域 膜

图 9-26 “核糖 体 的 3 个 位 点 及 人 性 中 心 示意 图 ,各 活性 中 心 的 确切 位 置 未 定 村 了 量
EF-Tu 的 再 利用 于 携带 男 一 个 氨 栈 -tRNA 至 核糖 体 A 位 点 , 则 要 求 另 一 个 因子 PF Ts
的 参与 。EF-Ts 将 GDP 从 EF-Tu 置换 下 来 , 它 本 身 则 与 EF-Tu 形成 一 个 复合 物 。 当 这 个 复合
物 遇 到 GTP 时 , 便 形成 一 个 GTP-EF-Tu 复合 物 , 并 放出 EF2Ts。EF-Tu-GTP 又 可 以 与 另 三 1
个 氨 酰 -tRNA 结合 而 重复 这 个 循环 (图 9-25) 。
移 位 前 后 ,核糖 体 上 的 2 个 tRNA 反 密码 子 与 mRNA 密码 子 相互 配对 形成 6 bpymRNA

到 “ 型 转角 ,导致 A 与 位 靠近 ,产生 变 构 效 应 。 最 近 (1996 年 ) ,Agrawal 等 用 低温 电子 ，
4

| 显微镜 (eryoelectron microscopy) 技 术 直 接 观 察 到 大 肠 杆 菌 的 70 S 核糖 体 上 有 3 个 tRNA 结
| 合 , 证 实 有 人 A,P,E 3 个 位 点 存在 。

另 有 实验 证 实 ,大 肠 杆菌 核糖 体 的 下 位 除 为 脱 酰基 tRNA 离开 核糖 体 提供 出 口外 , 尼 位
被 正确 的 脱 酰基 tRNA 占据 时 ,A 位 对 不 正确 氨 酰 tRNA 的 结合 可 降低 ,而 对 正确 氨 酰 RNA
的 结合 几乎 不 受 影响 。 相 反 , 当 下 位 存在 不 正确 的 脱 酰基 tRNA 时 , 则 可 增加 不 正确 的 氨 栈 -
康 NA 与 A 位 结合 。 这些 都 意味 着 下 位 及 下 位 上 的 密码 子 - 反 密 码 子 相互 作用 ,对 蛋白 质 的 生
物 合成 及 其 翻译 精确 性 也 起 着 重要 作用 。
1989 年 Moazed 和 Noller 对 23 SrRNA 上 的 tRNA 结合 位 点 进行 研究 ,提出 了 移 位 中 间
天 假说 ,认为 存在 着 杂 合 位 点 (hybrid site) 。 在 肽 链 形成 时 , 肽 酰 -tRNA 的 CCA 端 从 P 位 点 移
| 向 23 SrRNA 的 E 位 点 ,其 它 部 位 仍 位 于 16 S rRNA 的 P 位 点 上 ,形成 了 一 个 复合 位 点 P/E。
同样 , 氨 栈 -tRNA 的 CCA 端 由 A 位 点 移 向 23 S 的 P 位 点 ,其 它 部 分 也 留 在 16 S rRNA 的 和 A
位 点 上 , 即 处 于 A/P 位 点 。 这 样 , 移 位 是 分 两 步 进行 。 第 一 步 是 tRNA 相对 于 23 S rRNA 移
要 和 第 二 步 是 完成 移 位 后 回 到 非 杂 合 状态 。 这 样 ,3 种 ERNA 就 存在 着 6 个 结合

一

一

肽 键 形成 的 酶 促 催化 是 核糖 体 大 亚 基 的 任务 。 催化 肽 键 形成 的 酶 叫 肽 酰 转移 酶 (peptidyL-
transferase)。 大 约 6 个 工 蛋白 质 和 23 SrRNA 对 此 酶 的 活性 是 必需 的 。 另 外 ,6 个 蛋白 和 5 S
rRNA 也 起 很 大 作用 。 现 认为 它 是 把 2 个 氨 酰 -tRNA 定 于 调 准 的 位 置 , 使 之 形成 肽 键 。

肽 键 形 成 后 ,核糖 体 处 于 前 移 位 状态 .占领 P 位 是 去 酰 化 礁 NA,A 位 为 肽 酰 -tRNA 。 移 位
过 程 需要 延伸 因子 FF-G 和 GTP。 在 核糖 体 存在 下 ,EF-G 使 GTP 水 解 , 故 EF-G 是 一 个 依赖
于 核 精 体 的 GTP 酶 。 随 着 GTP 水 解 ,导致 EF-G 的 释放 。 因 此 ,除了 起 始 需要 1 个 GTP 外 ，
以 后 在 生长 中 的 多 肽 链 上 ,每 加 上 1 个 氨基 酸 就 需要 水 解 2 个 GTP 分 子 . 此 外 还 需要 K+ 离 子
和 Mg” 离子 参与 。

1992 年 Noller 等 发 现 催化 肽 键 形成 的 不 是 肽 酰 转移 酶 ,而 是 由 23 S rRNA 与 其 它 临界
生物 学 机 能 的 ripozyme 所 催化 .这 个 发 现 使 人 们 对 RNA 在 翻译 中 的 功能 做 出 新 的 评价 .1994
年 ,Purohit 与 Stern 实验 证 实 , 解 码 是 一 种 RNA 的 功能 ,是 rRNA 介 导 了 mRNA 与 tRNA
的 相互 作用 的 结果 。 他 们 认为 密码 子 / 反 密 子 复合 物 的 识别 可 能 是 RNA 进化 上 的 早期 功能 ，

“而 副 译 的 准确 性 可 以 看 做 是 进化 后 期 RNA/ 蛋 白质 的 功能 ，

五 多肽 链 合成 的 终止

蛋 自 质 合成 的 终止 需要 两 个 条 件 : 一 个 是 应 存在 能 特异 地 提出 多 肽 链 延 伸 应 子 停止 的 信
号 ; 另 一 个 是 有 能 解读 链 终止 信号 的 蛋白 质 释 放 因子 CRE)。 由 于 多 肽 链 延伸 至 其 足够 长 度 之
后 ,其 羟基 端 仍 结合 于 谎 NA 接合 体 上 .因此 ,终止 应 包括 切除 终端 的 tRNA.。 当 出 现 这 个 切除
之 后 ,新 生 的 链 便 迅 速 离 去 , 因为 它 主 要 是 通过 接合 体 tRNA 结合 在 核糖 体 上 的 。

开始 人 们 认为 可 能 有 肽 链 终 止 tRNA 分 子 的 存在 ,它们 能 专门 地 结合 于 终止 密码 子 上 ，

只 是 其 3' 端 处 没有 连接 氨基 酸 ,并 且 能 以 某 种 方式 促进 终端 tRNA 释放 出 NA 试验 的 结果
却 排除 有 这 种 tRNA 分 子 的 存在 。 终 止 密码 子 是 被 一 种 称 为 释放 因 了 于 (release factor,REF) 的
蛋白 质 解读 的 。 已 知 在 大 肠 杆菌 中 ,释放 因子 RF1 能 识别 终止 密码 子 UAG 和 UAA ,而 RF2

上 本 ) 肽 键 的 形成

249

则 识别 UGA 和 UAA.。 每 种 释放 因
子 先 与 GTP 形成 活性 复合 物 , 这 的 肥 各 如 人
个 复合 物 再 与 终止 密码 子 相 结合 ， S -上 -= 《7
形成 三 元 复合 物 ,并 且 改 变 肽 栈 转 NS | ，
移 特异 性 .有 释放 因子 存在 时 , 肽 栈 AAA 和
转移 酶 催化 肽 基部 分 与 水 结合 ,而 2 人
不 是 与 游离 氨基 酰 -tRNA 结合 。 这 ” 咯 生计
ca C

样 , 肽 酰 转 移 酶 便 将 P 位 上 的 肽 基 s，
转移 至 水 中 (图 9-27) 。 即 水 解 P 位 、
上 tRNA 与 肽 链 之 间 的 键 , 随 着 便 -一
是 新 生 肽 链 与 最 后 一 个 脱 酰基 呵 他
tRNA 离开 了 核糖 体 . 已 知 RF 具有
依赖 核糖 体 的 GTP 酶 活性 , 众 化 | 氨 酰 转移 酶
GTP 水 解 ,使 RF 与 核糖 体 解 离 . 2 入 Yr 交 5 局 辣
在 大 肠 杆菌 中 ,还 有 一 种 释放 因子 ，。 、， 多 过
即 RF3。 它 本 身 无 识别 终止 密码 子 人 人》 “全 人 代 了 >
的 功能 ,但 却 可 以 增加 RF1 和 RF2 人
的 活性 。 现 知 核糖 体 结合 与 释放 、
RF1 和 RF2 都 要 受到 RF3 的 刺激 Ho oh 区
作用 ,后 者 可 以 与 GTP 和 GDP 相
互 作用 。

肽 链 合成 终止 后 ,50 S 核糖 体
“” 亚 基 即 释放 。 此 时 有 一 个 被 称 为 核
糖 体 释放 因子 (ribosome releasing
factor,RR) 参 与 。 在 RR 的 作用 下 ，
核糖 体 与 mRNA 分 离 , 同 时 携带 最
后 一 个 脱 酰基 -tRNA 与 终止 因子

Z
】
总

克
全
二

到 类 全 妓生 -| 蝇

ZD
已
|

ns

亦 即 脱落 ,RR 起 上 述 作 用 时 , 还 必 图 9-27。 肽 酰 转移 酶 反应
须 有 GTP 和 肽 链 延 伸 因 子 EF-G 图 示 出 因 加 入 1 个 氨基 酸 而 使 多 肽 链 的 延伸 ,在 链 侈 正 隔
萝 存 在 .经 过 这 一 步 双 ,核糖 体 又 可 。 时 ,tRNA 的 8- 腺 寿 与 所 基 酸 之 问 的 酯 键 受到 了 取代 另 一 个
供 重新 合成 另 一 条 多 肽 链 之 用 。 氨基 酸 的 氨基 的 水 的 亲 核 攻击 。 有

六 、 原 核 生 物 蛋 自 质 合 成 中 的 某 些 抑制 因素

原核 生物 的 蛋白 质 生物 合成 为 多 种 抗生素 所 抑制 。 某 些 抗生素 可 影响 复制 与 转录 而 阻 断
蛋白 质 合成 ,但 也 有 不 少 抗生素 则 是 直接 妨碍 翻译 过 程 ，

(一 ) 嘎 吟 老 素

味 叭 霉 素 的 结构 很 类 似 氨 酰 -tRNA , 故 能 与 后 者 相 竞争 ,作为 转 肽 反应 中 氨 酰 异 党 复合
匠 , 从 而 阻 断 蛋白 质 的 生物 合成 . 当 生长 着 的 肽 链 ( 或 甲 酰 甲 硫 氨 酸 ) 被 转移 到 嘎 叭 霍 素 的 氨基

上 时 ,新 生 的 肽 酰 - 顺 叭 霉 素 会 从 核糖 体 上 脱落 下 来 ,从 而 终止 翻译 。 肽 链 合成 过 早 终 上 ,而且 |
250
5

|

?

ee

<

截 短 的 肽 链 的 羧基 端 连 有 1 分 子 的 味 叭 霉 素 。

(二 ) 链 雷 素

链 霉 素 能 与 30 S 亚 基 结 合 .此 30 S 链 霉 素 复合 物 是 一 种 效率 很 低 的 并 且 不 稳定 的 起 始 复
奉 物 ,很 容易 解 离 而 终止 翻译 。 链 霉 素 结合 在 30 S 亚 基 上 时 ,能 改变 氨 酰 -tRNA 在 A 位 点 上
与 其 对 应 的 密码 子 配对 的 精确 性 与 效率 。

(三 ) 四 环 素

四 环 素 能 阻 断 氨 酰 -tRNA 进入 A 位 点 ,从 而 抑制 肽 链 的 延伸 。

(四 ) 氯 雪 素

毛 霉 素 能 抑制 核糖 体 中 的 50 S 大 亚 基 的 肽 酰 转移 酶 的 活性 ,抑制 肽 链 的 延伸 。

(五 ) 红 老 素

红 霉 素 与 50 S 亚 基 结合 ,抑制 肽 酰 转移 酶 ,妨碍 移 位 ,因而 将 肽 酰 -tRNA 冻结 ?在 A 位
5》 训

直 于 细菌 核糖 体 与 哺乳 动物 线粒体 核糖 体 相 似 , 因 此 ,能 抑制 细菌 核糖 体 的 抗生素 也 能 抑

制 哺乳 动物 线粒体 的 核糖 体循环 ,但 它们 并 不 与 哺乳 类 通常 核糖 体 结合 ,因此 ,它们 对 哺乳 动
物 蛋 白质 侣 成 影响 不 大 。 四 环 素 类 ( 土 霉 素 、 金 霉 素 . 四 环 素 ) 虽 然 对 细菌 与 哺乳 动物 两 种 核糖
体 都 能 结合 ,但 因为 它 进 入 细菌 体 比 进入 哺乳 动物 的 细胞 器 要 容易 些 , 所 以 ,对 细菌 有 选择 作
用 。

第 五 节 GTP 在 重 白 质 合 成 中 的 作用

一 .GTP 在 核糖 体 反应 中 的 作用

GTP 和 ATP 一 样 是 高 能 分 子 。 一 般 来 说 , 当 这 样 的 分 子 水 解 时 ,水 解 的 自由 能 用 来 驱动
需 能 的 反应 进行 .但 在 蛋白 质 合 成 中 则 似乎 并 非 如 此 。 考 察 反 应 顺序 表明 ,GTEP 的 作用 是 使 各
种 翻译 因子 (GIF2,EF-Tu,EF-C) 与 tRNA 或 核糖 体 易于 以 非 共 价 键 结合 。 这 些 结 合 要求 GTP
的 存在 。 此 外 ,GTP 水 解 成 GDP 和 Pi 的 反应 则 是 释放 出 结合 因子 的 信和 号。 比较 了 游离 因子 和
因子 :GTIP 复合 物 的 结构 表明 , 当 GTP 结合 时 ,诱导 翻译 因子 发 生 形状 变化 ,而 这 正 是 它们 结
合 于 核糖 体 所 必需 的 . 因此 ,GTP 是 一 种 变 构 因 子 , 即 可 以 通过 结合 诱 使 大 分 子 形状 发 生变 化

上 的 小 分 子 , 当 GTP 与 之 结合 时 ,大 分 子 为 活性 构象 ; 当 GTP 水 解 或 除去 时 ,大 分 子 回复 其 无

活性 形式 ,结果 是 将 相应 的 因子 从 核糖 体 表面 排出 。

重组 试验 证 明 ,在 50 S 亚 基 上 的 4 个 L7/L12 蛋白 拷贝 是 与 GTP 水 解密 切 相 关 的 。 这 些
核糖 体 给 分 对 各 种 蛋白 质 合成 因子 的 结合 是 必需 的 , 当 它们 起 作用 时 , 则 利用 贮存 于 GTIP 中
的 能 量 。 但 是 ,在 没有 GTP 水 解 和 延伸 因子 存在 时 ,也 能 进行 蛋白 质 的 合成 ,但 速率 很 慢 。 这
样 , 核 糖 体 本 身 必 须 具备 本 来 就 具备 的 结合 氨 酰 -tRNA 和 移 位 的 能 力 ,各 种 因子 和 GTP 的 参
与 则 是 增加 这 个 速率 。

除 上 述 功能 之 外 ,GTP 的 另 一 个 极其 重要 的 功能 是 使 翻译 准确 。 不 少 证 据 证 明 , 在 氨 栈 -
tRNA 结合 后 有 一 个 校正 步骤 。 即 氢 栈 -tRNA 最 初 在 A 位 点 与 EF-ITu-GIP 结合 成 复合 物
时 ,起 始 的 mRNA-tRNA 碱 基 配对 相互 作用 并 没有 足够 的 特异 性 可 用 以 说 明和 蛋白 质 合 成 的 低
的 误差 率 ( 约 10-9 。 凭 借 氛 弃 不 正确 的 氨 酰 -tRNA 以 进行 校正 , 便 可 以 降低 其 误差 率 。 这 就 要

251

消耗 一 个 氨 酰 -tRNA-EF-Tu-GTP 复合 物 ( 包 括 AIP-~CDE 的 转变 ), 而 多 肽 链 并 不 延伸 。 这
样 , 校 正 步 又 便 要 求 有 添加 的 能 量 输入 。
二 、 鸟 苷 5 多 磷酸 3' 多 磷酸 化 合 物 (p)ppGpp 的 生成

如 果 偶然 地 一 个 无 载荷 的 tRNA 占据 A 位 点 时 ,不 仅 多 肽 生长 暂时 停止 ,并 且 在 受 影 叶
的 核糖 体 上 发 生 一 个 空 载 反应 (idling reaction), 这 个 反应 是 用 AIP 做 焦 磷 酸 的 供 体 ,将
pp5'-G-3'-OH(GDP) 转 变 为 稀有 的 鸟 味 叭 核 苷 酸 pp5 -G-3 pp。 现 知 只 有 当 无 载荷 的 下 NA
正确 地 与 暴露 于 A 位 点 的 mRNA 密码 子 配 对 时 , 才 会 促进 pp5'-G-3 pp 的 生成 。 PP5 -G-3 PP
简写 为 ppGpp。1969 年 Cashel 发 现 此 化 合 物 时 , 称 其 为 魔 点 I (magic spot 1L， MsS I ) ,将 星
pppGPppPp 称 为 魔 点 I (MS I )。 其 产生 的 反应 如 下 :

核糖 体 . mRNA tRNA
人

合成 CD)ppGpp 时 需要 核糖 体 的 2 个 亚 基 .mRNA 以 及 对 核糖 体 A 位 上 密码 专 一 的 游离 ( 即
不 带 氨 基 酸 ) 的 tRNA。 它 们 是 在 蛋白 质 合成 的 “ 空 步 * 上 生成 的 。 反 应 式 中 的 SF (stringent faca 量
tor ) 是 “严格 控制 因子 ” 它 是 rc/4 基因 产物 ,是 联系 在 核糖 体 上 的 一 种 蛋白 质 ,分 子 量 为 基
77kD。 现 认为 它 即 是 催化 pppGpp 和 ppGPpp 合成 的 酶 。
实验 得 知 ,细菌 正常 生长 时 只 生成 极 少 的 ppPGPp , 当 细 菌 缺 乏 必需 的 氨基 酸 时 ， 细菌 体内
发 生 一 系列 的 变化 来 应 付 不 利 的 环境 。 这 些 变化 主要 表现 为 对 体内 各 种 代谢 的 “严格 控制 ” 星
tRNA 和 rRNA 的 合成 被 抑制 , 延伸 因子 EF-Tu,EF-Ts,EF-G 以 及 其 它 二 些 核糖 体 蛋 医
白质 如 S3,S4,L1,L2,L3,L4,L7,L10,L11,L12 等 的 合成 也 被 抑制 ,细菌 的 不 少 代 谢 如 糖 原
水 解 . 糖 的 氧化 、 磷 脂 合成 脂肪 合成 细胞 壁 多 糖 的 形成 、 膜 的 转运 、 核 昔 酸 的 合成 多 胺 的 顺 畦
收 和 合成 等 都 被 抑制 ;有 少数 代谢 如 糖 原 合 成 和 氨基 酸 合 成 以 及 蛋白 质 的 水 解 却 被 促进 .许多 晨
实验 表明 ppGpp 和 pppGpp 是 细菌 “严格 控制 "反应 的 多 效应 的 信和 号 分 子 , 这 样 就 保证 细胞 飞 莉
会 制造 多 于 其 需要 的 核糖 体 而 造成 浪费 。 这 种 在 氨基 酸 缺 乏 条 件 下 对 rRNA 和 人 急 NA 合成 的 |
专 一 性 的 阻塞 称 为 严格 应 答 (stringent response) .可 是 它 的 存在 不 是 强制 性 的 。 因 为 有 些 松弛
型 突变 型 (relaxed mutant) 即 使 在 氨基 酸 缺 乏 时 ,也 继续 合成 rRNA 和 tRNA 链 ,这 是 因为 从 上
弛 型 突变 型 细胞 缺少 SF 因子 的 缘故 。 其 它 松弛 型 突变 型 则 是 50 S 核糖 体 蛋 白 L11 发 生 了 对 |
化 。 这 种 “严格 控制 ”系统 在 原核 生物 中 具有 普遍 性 , 真 核 生 物 中 有 无 该 控制 系统 , 目前 尚 无 定论 时

(CP)ppPGPP 十 PA

伟 报 、 第 六 敬 ” 真 核 生 物 的 蛋白 质 的 生物 合成
宇 司
真 核 生 物 蛋白 质 傣 成 下 不 楼 生物 商 者 相 比 ,密码 相同 ， 让 生生 RNA
及 各 种 重 自 质 因 拖 。 总 的 合成 途径 也 相似 ,有 起 始 、 延 人 及 必 止 阶段 ,但 也 有 不 同 之 处 ，
(G1) 真 核 生物 的 蛋白 质 合成 与 mRNA 的 转录 生成 不 偶 联 . mRNA 在 细胞 核 内 以 前 体形 起
合成 ,合成 后 需要 经 加 工 修饰 才 成 熟 为 mRNA, 从 细胞 核 内 输入 细胞 质 然 后 投入 蛋 外 质 容 成
过 程 。 |
(2) 真 核 生 物 蛋白 质 合 成 机 构 比 原核 生物 复杂 ， 起 始 步 曙 涉及 起 给 因子 众多 ,过 程 复 杂
(3) 真 核 生 物 蛋 白质 合成 的 调控 复杂 .

《4) 真 核 生 物 与 原核 生物 的 蛋白 质 合成 可 为 不 同 的 抑制 剂 所 抑制 。
252

|

一 ` 真 核 生物 蛋白 质 合 成 的 起 始

真 核 细 胞 的 mRNA 在 5 -末端 " 戴 2 有 一 个 三 磷酸 7- 甲 基 鸟 苷 (m?GpppN) 的 帽子 ,3'- 末 端
常见 有 一 个 由 50 一 200 个 残 基 构 成 的 多 聚 腺 苷 酸 (polyA) 的 尾 ( 图 9-21)。 在 细胞 核 内 的
mRNA 前 体 中 常 含有 插入 序列 , 它 相 当 于 基因 中 的 内 含 子 . 输入 细胞 质 前 ,mRNA 还 与 很 多 蛋
白质 结合 成 核 蛋 白 , 即 信使 核糖 核 蛋 白 。 现 知 戴 “ 帽 ”与 加 “ 尾 ? 在 细胞 核 内 与 细胞 质 中 都 可 以 进
行 。 帽 的 结构 在 蛋白 质 合 成 的 起 始 过 程 具 有 重要 作用 。 它 能 增强 翻译 。 没 有 甲 基 化 的 帽子
(GpppN 一 ) ,以 及 用 化 学 方法 或 酶 学 方法 脱 去 帽子 的 mRNA ,其 翻译 活力 显著 下 降 。 帽子 还 会
保护 mRNA 不 受 核酸 外 切 酶 的 侵袭 ,使 mRNA 相对 稳定 。 近 年 来 对 尾 的 研究 表明 ,poly(A)
尾 的 功能 不 仅 显示 在 mRNA 由 核 向 细胞 质 转 运 的 过 程 中 ,而 且 它 对 mRNA 的 稳定 性 以 及 翻
译 效率 均 有 调控 作用 。 现 知 poly(A) 尾 对 mRNA 分 子 的 稳定 作用 需要 有 poly(A) 结 合 蛋 白
(PABP) 的 参与 ,而 对 翻译 的 促进 还 与 poly(A) 尾 的 长 度 有 关 。

与 原核 生物 不 同 , 真 核 生 物 的 起 始 tRNA” 所 携带 的 是 甲 硫 氨 酸 。 虽 然 在 体外 可 被 由 大
肠 杆菌 所 提取 的 甲 硫 氨 酸 tRNA 转 甲 酰基 酶 催化 而 甲 酰 化 ,但 在 体内 携 有 甲 硫 氨 酸 的 tRNA
分 子 上 ,其 甲 硫 氨 酰 部 分 并 未 甲 酰 化 , 即 可 在 肽 链 合成 中 起 始 反 应 。

”参与 翻译 起 始 反应 的 起 始 因子 已 发 现 有 十 几 种 ,其 特性 与 功能 见 表 9-7.。 从 图 9-28 可 见 真
核 生 物 蛋 自 质 生物 合成 的 起 始 过 程 。 这 个 过 程 可 以 分 为 3 个 步骤 :

(一 )43 S 前 起 始 复合 物 的 形成

在 起 始 因子 eIF-3 的 作用 下 ,80 S 核糖 体 解 聚 为 40S 和 60S 亚 基 。eIF-3 并 有 防止 这 2 个
亚 基 再 结合 的 作用 。 另 一 因子 eIF-4C(CeIFE-1A7) 也 有 助 于 这 个 解 聚 。 起 始 因子 eIF-2 与 GTP 形
成 稳定 复合 物 , 后 者 与 Met-tRNAi- 形成 三 元 复合 物 , 再 与 40 S 亚 基 形成 43 S 前 起 始 复合 物
(图 9-28 a) 。

(二 )mRNA 的 结合

在 起 始 因子 esIF-4A,eIF-4B,eIF-4E 和 ATP 的 参与 下 ,43 S 与 mRNA 结合 .eIF-4A 有 使
mRNA 三 级 结构 解 旋 的 作用 .eIF-4B 则 有 结合 mRNA 并 识别 起 始 密码 子 AUG 的 作用 。 上 述
的 slF=3 也 参与 40S 三 元 复合 物 与 mRNA 结合 的 作用 。eIF-4E 或 称 " 帽 子 结合 蛋白 I ”(cap
binding proteinyCBP I ) ,起 与 mRNA 帽子 结合 的 作用 。 另 有 eIF-4F ,又 称 CBPEI ,实际 是 包
括 CBPI 和 elIF-4A 和 一 种 分 子 量 为 220kD 的 蛋白 (P220) 。 此 外 还 有 eIF-6 ,与 60 S 亚 基 结合
使 核糖 体 保持 在 解 聚 状态 。

。 直 各 SS 亚 基 `Wet-tRNAIM 和 一 些 起 始 因子 组 成 的 前 起 始 复合 物 在 mRNA 的 5 -帽子 处
或 其 附近 与 之 结合 ,然后 沿 着 mRNA 滑动 ,直至 遇 上 第 一 个 AUG 密码 子 (图 9-28 bl ) 。 这 个 过
程 由 CBP 促进 ,并 消耗 ATP, 使 mRNA 的 5' 端 二 级 结构 解 旋 , 使 它 呈 线 状 穿 过 40 S 亚 基 棋 部
的 通道 。CBP 是 在 mRNA 的 5' 端 识别 帽子 的 ,以 后 eIF-4A 和 eIF-4B 也 参与 沿 着 mRNA 的
解 旋 。43 S 前 起 始 复合 物 与 mRNA 的 结合 ,是 在 帽子 结构 下 游 50 一 100 个 核 苷 酸 范围 内 。 据
Kozak 等 的 研究 ,大 多 数 起 始 密码 子 的 合适 上下文" 为 CCACCAUGG 。 在 43 S 前 起 始 复合 物
沿 mRNA 向 3' 端 方向 移动 时 , 遇 到 合适 的 上下文:, 即 停止 移动 。 起 始 密码 子 AUG 的 识别 可
能 是 通过 与 RNA 上 的 反 密码 子 配对 的 作用 。eIF-2 也 参与 这 个 识别 的 作用 。 以 后 , 便 形 成 各
S 前 起 始 复合 物 ( 图 9-28 b,) 。

258

eIF-2B

eIF-3

eIF-3A
eIF-4A/eIF-48

elIF-4B
eIF-4E(eIF-4a)
eIFE-4F

eJIF-5

eIF-5A
eIF-6

注 :43 Sa 为 43 S 天 然 起 始 复合 物 ;CBP: 帽 子 结合 蛋白 ,GEF :GTP-GDP 交换 因子 。

15
18
130

272

550

表 9-7 ” 真 核 生物 蛋 白质 合成 的 起 始 因子

亚 基
CkD)

LE

15

836

7115
b170

7Y220

三 )80S 起 始 复合 物 的 形成

在 形成 48S 前 起 始 复合 物 之 后 ,再 与 核糖 体 的 60S 大 亚 基 结合 ,最
合 物 。 在 另 一 起 始 因子 IF-5 的 作用 下 与 elF-2 键 合 的 GTP 被 水 解 ,并 释放 出 IF_2-GDE
和 elIF-3。 其 它 起 始 因子 也 释放 出 来 ,最 后 形成 由 40S 亚 基 ， Met-tRNAMe ,mRNA 。60S 亚 基
组 成 的 起 始 复合 物 (图 9-28 c)。 释 放出 的 起 始 因子 可 以 再 用 于 下 一 轮 的 起 始 复合 物 的 形成 而

循环 利用 。 在 起 始 因子 中 ,Met- tRNA ”是 在 核糖 体 的 P 位 位 点 ,以 后 其 中 甲 硫 氮 酸 与 另 一 氨 栈
-tRNA 形成 二 肽 酰 -tRNA。

254

功能 旧名 称
促使 43S 和 48S 起 始 复合 物 的 形成
使 核糖 体 解 聚 eIF-4C

依赖 GTP 使 Met-tRNA; 结合 到 小 亚 基 上

eIF-2， GDP
转变 为 eIF-2。GTP

GEF ,anti-HRI

与 40 S 亚 基 结合 ,保持 解 聚 80 S 核糖 体 ，
结合 mRNA 于 43 S 起 始 复合 物 前 体

使 核糖 体 解 聚 并 与 60 S 亚 单位 结合

具有 RNA 依赖 的 ATP 酶 、 解 旋 酶 活性 ，

使 mRNA 结合 到 43 Sn 上

使 mRNA 结合 到 43 S 复合 物 上 ,识别 AUG

帽子 结合 蛋白 CBP-1
识别 帽子 结构 ,具有 RNA 依赖 的 ATP 酶 . 解 旋 酶

活性 ,使 mRNA 结合 到 43 S 前 起 始 复合 物 上 CBP-1

使 eIF-2 键 合 的 GTP 水 解释 放 eIF-2 和 eIF-3 以 使
释放 eIF-2 和 eIF-3 以 便 60 S 亚 基 连 接 上

使 甲 硫 氨 酰 基 味 吟 夫 素 形成 .elIF-4D
与 60 S 亚 基 结 合 ,保持 亚 基 解 聚

后 便 形成 sos 起 |

和 ER

Meit Met

wer tRNAL Met
人 sr-: "本
V GTP
elF-4A

43S

elF- 3 5220
FOR 4E m7zGNNNAUGNNNNNN
RE

menNNwuenwNNNN 5
ee P;
Met
elF -2 -GDP
N er s CO

mz7GNNNAUGNNNNNN m7GNNNAUGNNNNNN

48S

起 始 复合 物

“二 二 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一、

肖
蒜
油
中
本

= 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 = 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一

图 9-28 ”哺乳 动物 ( 真 核 生 物 ) 蛋 白质 合成 的 起 始 复合 物 形成

二 、 肽 链 的 延伸 与 终止

〈 一 ) 肽 链 的 延伸
真 核 生物 的 肽 链 延伸 与 原核 生物 相似 ,只 是 延伸 因子 EF-Tu 和 EF-Ts 被 eEF-1 取代 ,而
EF-G 则 被 seEF-2 取代 (图 9-25) 。 在 真菌 中 ,还 要 求 第 三 种 因子 , 即 eEF-3 的 参与 ,以 维持 其 翻
译 的 准确 性 。
延伸 因子 eEF-1 是 个 多 聚 体 蛋 白质 ,大 多 数 由 “,8,y,64 个 亚 基 组 成 .eEF-lea 的 分 子 量 是
50KkD, 作用 与 EF-Tu 相似 ,与 GTP 和 和 氮 酰 -tRNA 形成 复合 物 , 并 把 氨 酰 -tRNA 传递 给 核糖
体 。 在 每 一 轮 循 环 中 ,GTP 在 eEF-1la 从 核糖 体 上 释放 之 前 被 水 解 。eEF-18 具 鸟 苷 酸 交 换 活
性 ,作用 与 EF-Ts 相似 ,eEF-17 常 与 eEF-18 形成 复合 物 , 增 加 后 者 的 GDP-GTP 交换 功能 。
在 兰 椎 动物 中 还 有 eEF-10, 它 与 eEF-18 具 同 源 性 。 这 样 ,eEF-1lap7Y6 复合 物 就 包含 有 两 个 蛋
自 质 交 换 因 子 ,而 在 原核 生物 中 只 有 EF-Ts 一 个 交换 因子 。
延伸 因子 sEF-2 是 个 单 体 蛋白 。 分 子 量 约 100 kD。 相当 于 原核 生物 中 的 EF-G ,催化 CIE
水 解 ,使 氨 酰 -tRNA 从 A 位 转移 至 P 位 。Nilsson 报道 ,eEF-2 可 以 与 核糖 体形 成 高 亲和力 与
低 亲 和 力 两 种 形式 的 复合 物 , 前 者 相当 于 转 位 前 状态 ,后 者 相当 于 转 位 后 状态 ,并 且 在 后 者 中 ，
其 GTP 酶 活性 被 激活 。eEF-2 可 与 GDP 形成 稳定 的 二 元 复合 物 , 与 CDFE 的 结合 比 与 GTP 的
结合 高 10 倍 。eEF-2 近 氨 基 端 的 Thrse T 工 hrs 残 基 被 磷酸 化 后 ,会 使 延伸 速率 降低 ,从 而 达到
调控 目的 。
延 伟 因 子 eEF-3 是 在 真菌 中 发 现 的 。 是 一 条 120 一 125 kD 的 多 肽 链 ,可 结合 GTP , 亦 能 水
解 GTP 与 ATP,eEF-3 在 翻译 的 校正 阅读 方面 起 重要 作用 。Uritani 推断 ,在 酵母 核糖 体 上 存
在 一 个 引入 位 点 TI (introductory site) 。 由 eEF-3 介 导 ,使 eEF-1c'， GTP. 氢 酰 -tRNA 三 元 复
合 物 先 结合 到 该 位 点 上 ,然后 再 以 密码 依赖 的 方式 进入 A 位 点 。 这 样 使 正确 的 tRNA 进入 得
255

到 保证 。eEF-3 的 ATP 酶 活性 可 能 与 氨 酰 -TRNA 在 核糖 体 上 位 点 之 间 移 动 有 关 。
二) 肽 链 的 终止
真 核 生 物 的 肽 链 合成 的 终止 仅 涉及 一 个 释放 因子 seRF。eRF 分 子 量 约 115 kD。 它 可 识 风
3 种 密码 子 UAA,UAG,UGA .eREF 在 活化 了 肽 酰 转 移 酶 释放 新 生 的 肽 链 后 , 即 从 核糖 体 上 筷
离 。 解 离 要 求 GTP 的 水 解 。 故 终止 肽 链 合成 是 耗 能 的 。

三 、 真 核 生物 蛋白 质 生物 合成 的 特异 抑制 齐
真 核 生物 的 蛋白 质 合成 有 一 些 特异 的 抑制 剂 ,如 白喉 毒素 (diptheria toxin)、 志 贺 氏 毒 对
(Cshigella toxin) . 草 麻 蛋白 (ricin) 等 ,在 此 不 详 述 。

第 七 节 ”蛋白 质 折 私 与 蛋白 质 生物 合成 中 多 肽 链 的 修饰

上 文 讨 论 的 mRNA 翻译 得 到 的 多 肽 链 是 初级 产物 。 由 它们 转变 成 相应 的 天 然 蛋 白质 多
括 从 末端 或 内 部 位 置 去 除 某 些 氨基 酸 残 基 , 某 些 氨基 酸 侧 链 的 改变 ， 以
二 级 与 三 级 结构 。

一 、 蛋 白质 的 折 簿

蛋白 质 折 春 是 指 从 多 肽 氨基 酸 序 列 形成 具有 正确 三 维 空间 结构 的 蛋白 质 的 过 程 。 肽 链 的
折 和 到 从 核糖 体 出 现 新 生 的 多 肽 链 即 可 开始 。

(一 ) 体 外 蛋白 质 的 复 性 让

60 多 年 前 , 吴 宪 教 授 提出 了 和 蛋白 质变 性 (denaturation ) 学 说 ， 即 : 天 然 蛋白 质 之 分 子 , 因
环境 种 种 之 关系 ,从 有 秩序 而 坚 密 之 构造 , 变 为 无 秩序 散漫 之 构造 ,是 为 变性 作用 。 若 数 分 子 莉
撞 而 缠 结 , 则 为 凝固 作用 。 和 蛋白 质变 性 之 种 种 事实 , 均 可 以 此 说 解释 之 ”可 见 , 失 去 活性 的 一 量
白质 是 处 于 伸展 状态 。 如 果 一 旦 去 除 变性 因素 ,恢复 到 “有 秩序 而 坚 密 之 构造 ” 称 为 复 性 (证
naturation) 。60 年 代 初 ,Anfinsen 的 实验 表明 ,失去 活性 的 胰 脏 核糖 核酸 酶 A, 在 适当 条 件
能 够 再 折 乔 成 呈 活 性 的 酶 。 与 此 同时 (1961 年 ), 杜 雨 苍 等 根据 胰岛 素 A,B 链 拆 合 的 实验 就 攻
出 : 亚 基 间 S 一 S 的 形成 有 高 度 选择 性 ,不 是 随机 的 。 只 要 有 了 一 级 结构 ,就 能 形成 天 然 高 级 右
构 。 这 些 研 究 成 果 说 明 ,氨基 酸 序列 是 决定 蛋白 质 空间 构象 的 最 基本 因素 。 越 来 越 多 的 事 立 潭 二
明 , 一 维 多 肽 序列 向 三 维 蛋白 空间 结构 信息 传递 ,必然 存在 某 些 迄今 未 被 揭示 的 内 在 规律 。
人 亦 称 之 为 "第 二 密码 或" 折 乔 密 码 ”. 把 其 规律 揭示 出 来 正 是 当今 分 子 生物 学 研究 热点 之

(二 ) 体 外 蛋 自 质 折 套 的 机 制 本

变性 的 蛋白 质 能 复 性 的 现象 ,暗示 在 适合 的 条 件 下 , 一 级 结构 具有 We
构 的 能 力 。 近 年 来 的 研究 表明 ,伸展 肽 链 (U) 经 早期 的 变化 进入 中 间 态 (D ， 下 国术
到 最 终 的 天 然 态 \N) 。

【本 TEN

伸展 的 肽 链 从 什么 地 方 开始 折 春 ? 这 问题 目前 仍 未 有 统一 的 意见 。 有 人 认为 ， 伸展 的 肽 链
上 已 有 茶 些 扭曲 转角 或 链 的 不 同 部 位 之 间 的 相互 作用 的 区 域 . 这 些 亚 结构 可 能 是 不 稳定 的 ，

但 在 折 香 开始 阶段 它们 可 能 起 到 “种 子 ” 作 用 ,围绕 着 它们 形成 较 稳 定 紧密 的 区 域 , 然 后 形成 稳
256

定 的 二 级 结构 。 计算 机 模拟 认为 , 折 生 可 能 起 始 于 转角 。 转 角 属 于 稳定 的 二 级 结构 。 这 些 转角
在 折 秋 过程 中 一 直 存在 ,直到 最 后 被 编 和 三 维 结构 中 。

。 另 一 观点 认为 折 释 起 于 由 朴 水 作用 而 引起 的 南 塌 , 称 为 朴 水 妈 塌 (hydrophobic collapse) 。
结果 是 下 水 侧 链 集中 埋藏 于 分 子 的 内 部 ,而 极 性 侧 链 则 裸露 于 与 水 接触 的 分 子 表面 。

也 有 人 认为 , 折 丢 起 始 于 共 价 键 的 相互 作用 的 形成 。Oas 与 Kim 合成 了 牛 胰 胰 蛋白 酶 抑
制剂 的 两 个 片段 。 一 个 为 16 肽 ,相当 于 氮 基 酸 顺 序 的 43 一 58; 另 一 为 14 肽 ,相当 于 第 20 一 33
氨基 酸 。 它 们 分 别 在 第 30 与 51 位 各 有 一 个 Cys 残 基 。 在 还 原 条 件 下 ,两 个 肽 都 是 伸展 的 。 但
当 两 个 肽 的 Cys 30 和 Cys 51 以 二 硫 键 连接 起 来 时 ,各 自 表 现 出 天 然 分 子 的 构象 。 说 明 二 硫 键
形成 使 两 个 肽 段 都 获得 稳定 的 二 级 结构 。

Ptitsyn 研究 了 和 牛 或 人 v- 乳 清 蛋 白 在 酸性 , 热 变 性 .中 等 浓度 盐酸 肌 溶 液 条 件 下 的 各 种 物
理性 质 。 发 现在 这 些 条 件 下 ,形成 了 一 种 彼此 类 似 但 与 天 然 a- 乳 清 蛋 白 不 同 的 新 的 物理 性 状 ，
这 种 形式 被 称 为 “ 熔 球 态 ”(Cmelton-globule state) 。 熔 球 态 是 目前 比较 公认 的 折 破 过程 中 的 中
间 态 。 与 天 然 分子 相 比 , 熔 球 态 波动 性 增加 ,不 存在 特定 的 牢固 安排 的 侧 链 基 团 , 但 其 结构 紧
密 , 具 有 含量 很 高 的 类 似 天 然 分 子 的 二 级 结构 。

概括 起 来 ,体外 蛋白 质 的 折 释 可 能 是 始 于 朴 水 南 塌 , 或 始 于 转角 ,或 始 于 共 价 键 相互 作用
《如 三 硫 键 的 形成 )。 在 折 释 早期 ,可 能 这 三 种 方式 联合 起 作用 。 之 后 ,可 能 沿 着 有 限 的 多 途径
形成 中 间 态 ( 熔 球 态 )。 这 个 过 程 是 快速 的 ,一 般 在 毫秒 范围 内 完成 。 最 后 再 由 中 间 态 进入 天 然
态 , 此 过 程 比 较 慢 ,是 折叠 反 应 的 限 速 步骤 。

三 ) 体 内 蛋白 质 的 折 和 琶

体内 和 蛋白质 的 折 和 至 与 体外 的 很 不 相同 。 体 外 蛋白 质 折 笃 的 环境 单纯 , 折 释 从 完整 的 肽 链 开
始 ; 体 内 的 则 环境 复杂 ,有 很 多 其 它 因子 与 蛋白 质 参 与 。 从 效率 上 看 ,体内 的 效率 高 ,而 体外 的
效率 低 。-

与 较 早 期 的 认为 重 白质 的 折 和 三 是 发 生 在 完整 的 多 肽 链 合成 之 后 的 观念 相反 , 邹 承 鲁 提出
了 新 生 肽 折 生 的 假说 。 他 认为 体内 蛋白 质 的 折 琶 可 能 存在 着 与 肽 链 合成 同步 进行 的 过 程 (co-
translational) 。 随 着 肽 链 延 伸 , 其 空间 构象 不 断 调 整 ,合成 终结 后 再 进一步 形成 天 然 态 (post-
tramslation)。 实 验证 实 , 肽 链 合成 尚未 结束 的 8- 半 乳糖 苷 酶 已 具有 免疫 原 性 和 酶 的 活性 ,表明
酶 蛋 自 的 N 端 部 分 就 有 天 然 态 的 结构 与 功能 。 这 一 事实 有 力 地 支持 了 邹 氏 模型 。 体 内 蛋白质
的 折 礁 远 比 体外 环境 复杂 ,有 很 多 其 它 因 子 与 蛋白 质 存在 , 正 是 由 于 它们 的 参与 使 错误 的 折 丢
与 育 集 作用 大 大 降低 ,从 而 提高 了 效率 。 实 验证 实 ,体内 新 合成 的 野生 型 蛋白 质 肽 链 , 有 95%%
以 圭 能 转变 为 天 然 的 三 维 结构 。

近来 的 研究 表明 ,至 少 有 两 类 蛋白 质 参与 体内 的 折 和 至 过 程 , 称 为 助 折 和 登 焦 日 (folding
helper ) ;

1. 酶 如 蛋白 质 二 硫 键 异 构 酶 (protein disulfide isomerase,PDI) 与 肽 酰 且 氨 酰 顺 反 异 构 酶
《peptidy]l prolyl cis /trans isomerase ,PPI) 。 前 者 能 加 速 蛋 白质 正确 二 硫 键 的 形成 ,后 者 催化 肽 -
且 氨 酰 之 间 的 肽 键 的 旋转 反应 。 这 些 反应 与 新 生 肽 链 的 折 蚕 密切 相关 ,加 速 重 白质 折 帮 过 程 。

且 氨 酸 吡 咯 环 上 的 亚 氨 基 在 形成 肽 键 时 ,可 以 形成 顺 式 或 反 式 结构 ; 反 式 结构 是 较为 稳定
的 。 在 蛋白 质 中 ,也 有 一 部 分 有 睛 氨 酸 亚 氨基 的 肽 键 是 顺 式 的 。 蛋 白质 变性 后 , 便 全 部 异 构 化 为 反
式 。 在 复 性 时 , 必须 再 异 构 化 为 顺 式 , 才 能 恢复 蛋白 质 原来 的 空间 结构 。 在 体外 ,这 一 反应 是 一 个
较 慢 的 反应 。 在 体内 , 在 肽 酰 且 氨 酰 顺 反 异 构 酶 的 催化 下 ,使 这 一 顺 反 蜡 构 作 用 快速 进行 。

叱 58

二 硫 键 存在 于 大 多 数 分 沁 蛋 白 及 膜 蛋白 中 。 在 翻译 产物 形成 的 早期 ,都 是 以 还 原 的 莞 基 形 式
存在 ,然后 再 氧化 生成 二 硫 键 。 在 体外 ,蛋白质 中 的 一 基 为 空气 氧化 生成 二 硫 键 反应 很 慢 。 在 体
内 ,在 蛋白 质 二 硫 键 异 构 酶 的 催化 下 ,新 生 肽 键 的 琉 基 氧化 生成 二 硫 键 可 以 加 速 进行 。

2. 分 子 伴侣 ”分子 伴侣 最 早 是 由 Laskey 等 人 提出 来 的 .他们 发 现 组 蛋白 必须 先 与 核 内 的
核 质 素 Cnucleo-plasmin) 结 合 后 ,才能 与 DNA 组 成 核 小 体 。 他 们 将 这 个 核 质 素 称 为 分 子 伴 倡
(molecular chaperone) 。 后 来 Ellis 等 ,把 一 类 在 细胞 内 帮助 新 生 肽 链 正确 组 装 ,成 为 成 熟 蛋 和 白
质 ,而 本 身 却 不 是 最 终 功能 蛋白 质 分 子 的 组 成 成 分 的 分 子 , 都 称 为 分 子 伴 个 。 分 子 伴 但 促 进 三
个 反应 的 进行 ,而 本 身 却 不 出 现 于 最 终 产物 ,具有 类 似 于 酶 的 特征 ,但 它 又 与 酶 有 很 大 差异 . 它
对 靶 蛋 白质 专 一 性 不 高 。 同 一 个 分 子 伴侣 可 以 促进 多 种 氨基 酸 序 列 完 全 不 同 的 多 肽 链 折 码 成
为 空间 结构 、 性 质 和 功能 都 不 同 的 蛋白 质 .。 而 且 它 的 “催化 ?效率 很 低 。 分 子 伴 倡 的 作用 有 时 世
只 是 阻止 肽 链 的 错误 折 释 ,而 不 是 促进 其 正确 折 春 。

成 熟 的 功能 蛋白 质 的 空间 结构 是 疏水 性 基 团 在 分 子 内 部 , 亲 水 性 基 团 在 分 子 的 外 部 ,使 蛋 外
质 分 子 具 有 水 溶性 。 在 新 生 肽 链 合成 过 程 中 , 先 合成 的 部 分 通常 会 含有 下 水 性 的 侧 链 , 肽 链 开始
折 友 时, 可 能 在 合成 和 折 释 的 早期 已 经 形成 一 定 的 疏水 性 结构 。 在 整个 分 子 合 成 完毕 之 前 ,在 党
形成 的 疏水 性 结构 之 间 可 能 发 生 错 误 的 结合 ， 产生 肽 链 的 错误 折叠 和 部 分 疏水 性 结构 瞬间 暴露
在 分 子 外 部 而 引起 沉淀 。 分 子 伴侣 可 能 识别 多 肽 链 中 某 些 先 合成 的 并 部 分 折 丢 成 的 下 水 结构 并
与 之 结合 ,使 玻 水 表面 间 不 会 形成 错误 的 相互 作用 ,从 而 防止 多 肽 链 的 错误 折 玲 。 分 子 伴 个 的 作
用 在 促进 驾 蛋 白质 正确 折 答 或 阻止 其 错误 折 释 的 作用 后 , 便 从 靶 蛋 白质 上 脱离 。

目前 已 鉴定 很 多 分 子 伴侣 蛋白 质 , 其 中 被 研究 得 最 多 的 有 两 个 蛋白 质 家 族 ， 即 胁 过 -70
(stress-70) 家 族 与 分 子 伴 侣 (chaperonin) 家 族 , 这 些 蛋 白质 广泛 存在 于 原核 与 真 核 生物 细胞 中 。

(1) 胁 迫 -70 家 族 ”本 家 族 成 员 的 分 子 量 约 为 70 kD。 由 两 个 结构 域 组 成 .不 同 来 源 的 胁 通
-70 蛋白 的 N 端的 结构 域 高 度 保守 ,具有 ATP 酶 活性 .C 端的 结构 域 保守 性 较 差 ,是 与 多 肽 链 三
结合 部 位 .胁迫 -70 蛋白 在 细胞 内 含量 丰富 .研究 较 多 的 是 其 家 族 成 员 之 一 的 热 休 克 和 蛋白 (heaE
shock protein ,Hsp)70,Hsp70。 现 在 已 知 , 热 休 克 蛋 白 除 参与 蛋白 质 的 折 丢 外 ,在 蛋白 质 的
装 (assembly) 、 跨 膜 . 分 刻 与 降解 都 有 它们 的 参与 。

Flynn 等 用 一 套 随机 氨基 酸 顺 序 但

长 度 有 限 的 合成 的 多 肽 与 胁迫 -70 蛋白 L ee vB
之 一 的 重 链 结 合 蛋白 Bip 相互 作用 , 观 ATP 四

察 到 由 四 肽 至 七 肽 之 间 ,Bip 与 其 结合 | (d) ADP
的 能 力 是 随 着 肤 链 的 长 度 延伸 而 增加 ， AN 2 0
并 且 刺 激 ATP 水 解 的 能 力也 随 之 增 一 必 轿 天
加 ,但 肽 链 再 延长 则 上 述 能 力 不 见 增长 ， | 二 9 -本
说 明 结合 部 位 只 能 容纳 七 捧 。 同 时 还 发 本

ADP + GrpE

现 ,Bip 偏爱 与 脂肪 侧 链 的 多 肽 相 结合 ，
于 疆 人 而

预示 这 种 结合 可 能 是 下 水 相互 作用 。 现 图 9-29 DnaK,DnaJ 和 GrpE 在 蛋白 质 折 释 中 的 反应 循环

知 新 生 肽 链 合成 过 程 中 , 首先 合成 的 部

分 通常 也 会 有 朴 水 侧 链 。 肽 链 开 始 折 丢 时 外 可 能 在 合成 过 程 中 已 经 形成 一 定 的 疏水 结构 .这 样 和

一 个 新 生 的 伸展 的 肽 链 就 可 能 通过 朴 水 作用 与 若干 个 胁迫-70 蛋白 相 结合

在 六 肠 杆菌 中 的 Hsp70 称 为 DaaK , 它 的 功能 受 两 个 协同 因子 热 休 克 蛋 白 DnaJ( 一 种 温
258

口 Dnaj RS Dnak

度 敏 感性 蛋白 ) 与 GrpE( 一 种 富 甘 氨 酸 和 蛋白) 的 调节 。 伸 展 的 肽 链 在 DanJ 的 介 导 下 与 DnaK 结
和 谷 ,从 而 形成 多 肽 ` DnaK“.DnajJ 三 联 体 复合 物 ( 图 9-29 a) 。DnajJ 能 使 DnaK 上 的 ATP 水 解
【图 9-29b), 另 一 方面 ,DnaJ 又 能 使 DnaK-ADP 稳定 ,而 稳定 的 DnaK-ADP 对 伸展 的 肽 链 具
.有 很 高 的 亲 和 性 .此 时 被 结合 其 上 的 多 肽 链 不 会 进一步 折 和 ,也 不 会 错误 折 释 或 聚集 成 不 溶 形
式 。 之 后 ,在 GrpE 作用 下 ,ADP 从 DnaK 上 释放 (图 9-29 c) ,结合 其 上 的 多 肽 链 也 随 之 脱落 ，
DanaK 恢复 结合 ATP 的 能 力 。 释放 的 肽 链 或 被 折 友 成 天 然 态 ,或 随 着 ATP 的 水 解 再 次 形成 多
肽 <“DnaK“。DnajJ 三 联 体 复 合 物 或 被 转移 给 另外 的 监护 分 子 。
《2) 分 子 伴 个 家 族 ”监护 蛋白 有 两 种 氨基 酸 顺 序 相 关 的 类 型 。 大 的 叫 分 子 伴 侣 -60(cpn-

60) 是 一 个 窒 聚 体 , 由 14 个 相同 亚 基 形成 双 层 饼 状 , 亚 基 分 子 量 约 为 60 kD。 具 有 多 个 肽 链 的
绪 侣 位 点 。 在 大 肠 杆菌 中 称 为 GroEL 的 是 cpn-60 家 族 成 员 之 一 。 小 的 叫 分 子 伴 侣 -10(Ccpn-
1J0) ,也 是 以 守 聚 体形 式 存 在 。 由 ?7 个 相同 亚 基 组 成 单 层 环 状 。 亚 基 分 子 量 为 10kD.。 在 大 肠 杆
菌 中 称 为 GroES 的 是 其 cpn-10 家 族 成 员 之 一 。

用 在 生理 条 件 下 ,GroEL 与 GroES 形成 复合 物 , 形 如 空 圆 简 状 。 非 天 然 底 物 蛋白 就 结合
GroEL 空 圆 简 上 的 开放 空 从 上 , 像 是 -帽子 ”一样 。 然 后 通过 一 系列 ATP 的 水 解 ,使 结合 的 蛋
“下 质 被 释放 到 中 空 的 简 中 ,并 使 之 折叠, 如 折 释 完成 就 被 释放 ,如 未 完成 折 释 就 被 再 次 结合 ，
行 第 二 次 循环 。
二 已 知 分 子 伴侣 所 识别 的 靶 和 蛋白 是 它们 的 部 分 折 友 的 非 天 然 态 ,但 是 分 子 伴 侣 怎样 去 识别
它们 , 还 不 清楚 ; 另外 ,GroEL 水 解 ATP, 可 以 加 速 结 合 的 底 物 蛋白 质 的 释放 ,并 且 , 即 使
GioES 缺乏 时 ,ATP 也 可 使 底 物 蛋白 质 成 功 地 折 礁 。 可 是 ,AITP 水 解 所 释放 的 能 量 怎样 与 折
到 相 偶 联 仍 知 之 甚 少 。

应 该 指出 ,就 蛋白 质 的 天 然 态 .伸展 态 与 中 间 态 而 言 , 它 们 之 间 存 在 能 量 上 的 差异 ,尽管 其
差异 较 小 。 已 知 一 个 体系 处 于 能 量 最 低 态 时 是 最 稳定 的 ,但 是 ,天 然 态 的 蛋白 质 并 非 是 能 量 的
最 低 状态 , 因为 蛋白 质 在 执行 生物 学 功能 时 ,就 要 求 其 构象 具有 一 定 的 柔性 (flexibility), 例
如 , 酶 的 活性 中 心 即 是 如 此 .因此 ,蛋白 质 的 折 友 是 与 其 体系 的 自由 能 和 折 释 的 途径 有 关 , 即 受
制 于 体系 的 热力 学 ,也 与 其 动力 学 有 关 。

二 、 蛋 和 白质 的 修饰

直 核 糖 体 合成 的 多 肽 链 除 需要 折 释 成 正确 的 空间 结构 外 , 还 必须 进行 修饰 ,才能 成 为 具有
生理 功能 的 蛋白 质 。 修 饰 可 以 在 肽 链 折 释 之 前 、 或 折 丢 期 间 、 或 折 友 之 后 进行 ,也 可 以 在 肽 链 延
伟 期 间或 在 终止 之 后 进行 。 有 些 修饰 对 多 肽 链 的 正确 折 释 是 重要 的 。 有 时 ,修饰 也 与 合成 的 蛋
白质 在 细胞 内 的 转移 或 分 泌 ( 见 下 节 ) 有 关 。

《一 ) 末 端 氨基 的 脱 甲 酰 化 和 N 端 甲 硫 氨 酸 的 切除

大 肠 杆菌 等 细菌 的 多 肽 链 合 成 的 起 始 氨基 酸 是 甲 酰 甲 硫 氨 酸 ,在 翻译 后 这 个 甲 酰基 被 肽
脱 甲 酰基 酶 (peptide deformylase) 除去 ， 甲 硫 氨 酸 通常 也 被 氨 肽 酶 切除 。

真 核 生 物 的 多 肽 链 合成 的 起 始 氨基 酸 是 甲 硫 氨 酸 。 这 个 甲 硫 氨 酸 也 只 暂时 存留 ,在 肽 链 延伸
一 定 长 度 后 便 被 切除 ,例如 , 珠 蛋 白 在 合成 了 约 30 个 氨基 酸 残 基 后 便 将 起 始 的 甲 硫 氨 酸 切 除 。

(二 ) 多 肽 链 的 水 解 断 列

” 新 生 多 肽 链 常 发 生 水 解 断裂 ,生成 较 短 的 肽 链 。 例 如 ,胰岛素 的 合成 ,先生 成 较 大 的 前 体 , 即
前 胰岛 素 原 (preproinsulin) , 然后 水 解 断 去 一 段 由 一 1 一 一 24 位 氨基 酸 的 N 端 信号 序列 ( 称 为 前
259

肽 pre-peptide) ,并 形成 二 硫 键 ,生成 胰岛 素 原 (proinsulin ) 。 胰 岛 素 原 再 由 一 肽 链 内 切 酶 在 两 妃
切 去 两 对 碱 性 氨基 酸 ,并 由 肽 链 外 切 酶 再 切 去 一 段 连接 的 肽 链 ,最 后 生成 胰岛 素 的 两 条 以 一 硫
连接 的 A,B 链 。 一 些 酶 也 是 先 形成 无 活性 的 酶 原 , 经 切 去 一 段 肽 链 后 才 变 为 有 活性 的 酶 。

三) 氨基酸 侧 链 的 修饰

1. 二 硫 键 形成 ”上 文 已 提 及 ,在 多 肽 链 中 的 Cys 残 基 , 可 在 蛋白 质 二 硫 键 (disulfide is
merase) 异 构 酶 的 作用 下 形成 二 硫 键 。 这 个 反应 可 在 翻译 过 程 中 或 在 翻译 后 进行 。

2. 羟 化 作用 “例如 胶原 蛋白 在 合成 后 ,其 中 的 某 些 且 氨 酸 和 赖 氨 酸 残 基 发 生产 化 。 在 买
Pro-Gly(X 代表 除 Gly 外 的 任何 氨基 酸 ) 序 列 中 的 有 睛 氨 酸 羟 化 为 全 产 睛 氨 酸 ;也 可 生成 3- 关
有 睛 氨 酸 ,但 较 少 。 且 氨 酸 的 产 化 有 助 于 胶原 蛋白 螺旋 的 稳定 有 一 些 赖 氨 酸 也 羟 化 为 5- 凑 赖 银 ，
酸 ,以 后 再 糖 基 化 ( 见 下 文 ) 。 其 它 蛋 白质 如 核心 专 一 凝集 素 (core-specific lectin) 也 含有 羟 县
酸 和 羟 赖 氨 酸 。

3. 氨基 酸 残 基 的 交 联 在 一 些 结构 蛋白 如 胶原 蛋白 和 弹性 蛋白 中 ,多 肽 链 常 发 生 交际
《cross-linking), 除 形成 二 硫 键 外 ,也 包括 其 它 氨 基 酸 的 交 联 。 例 如 ,胶原 蛋白 中 的 一 些 特殊 bj
赖 氨 酸 和 羟 赖 氨 酸 氧化 为 醛 衍 生物 =- 醛 基 赖 氨 酸 (allysine), 以 后 2 个 发 生 醛 醇 缩 合 形成 醛 醒
桥 (aldol bridge) ,或 与 另 一 赖 氨 酸 缩合 并 还 原 , 形 成 仲 胺 桥 (图 9-30); 另 一 例子 是 谷 所 酰胺 错
酰胺 基 与 赖 氨 酸 侧 链 中 的 氨基 缩合 。 这 个 反应 是 在 谷 氨 酰 胺 酶 (glutaminase) 催 化 下 进行 的
它 在 血液 凝固 时 血 纤 维 蛋白 单 体 的 交 联 中 起 重要 作用 。

Collaqen

CHa CH2> CH

1 1
CH。 赖 氨 酸 侧 链 CH 这
5 2 Ce CH>
| CH2.NH Ch， :“NHt
全 全 全 全 全 全 全 4 YA
CH2 CH:

-7

CH: Ch: 缩合 和 还 原
Cha chHa e- 醛 基 赖 氨 酸 侧 链
CHO 醛 醇 缩 合 ”CHo

/CHO
H2 “CH: 呈 CH 一 CH、 CH。: “CH CH 妈
大
HO 9
醛 醇 桥 仲 胺 桥

CH CH CH CH NH,CH2. CH CH CE 用

图 9-30 ”胶原 蛋 自 中 多 肽 链 间 的 共 价 交 联

4. 羧 化 作用 ”一些 蛋白 质 的 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 可 发 生 羧 化 作用 .例如 ,血液 凝固 蛋 自 凝血
酶 原 (prothrombin) 的 谷 氨 酸 在 翻译 后 羧 化 成 疙 羧基 谷 氨 酸 ,后 者 可 以 与 Cas+ 束 合 . 这 是 由 依
赖 于 维生素 的 羧 化 酶 催化 的 。

”再 基 化 ”在 一 些 蛋白 质 中 赖 氨 酸 被 甲 基 化 。 在 肌肉 蛋白 和 细胞 色素 e 中 含有 一 甲 基 和

一 中 基 赖 氨 酸 。 大 多 数 生 物 的 钙 调 蛋白 含有 三 甲 基 赖 氨 酸 。 有 些 蛋 白质 中 的 一 些 谷 氨 酸 的 侧
链 羧 基 也 甲 基 化 。

260

在 蛋白 质 合 成 中 多 种 氨基 酸 均 可 发 生 修 饰 , 表 9-8 列 出 各 种 氨基 酸 的 修饰 。
表 9-8 蛋白 质 生物 合成 中 氨基 酸 残 基 的 修饰

氨基 酸 残 基 修 侯

两 氨 酸 氨基 酸 末端 甲 基 化

精 氨 酸 ADP- 核 糖 基 化 ;氨基 末端 甲 基 化

天 冬 酰胺 ADP- 核 糖 基 化 ; 糖 基 化 ;氨基 末端 甲 基 化 ;6- 产 化 作用

天 冬 氨 酸 在 GPI- 错 锭 蛋白 中 以 酰胺 连接 于 乙醇 胶 ;8- 产 化 作用

半 觅 氨 酸 二 硫 键 形成 ;脂肪 酰 化 作用

谷 氨 酸 六 拳 基 化 作用 ; 甲 基 化 作用

谷 氢 栈 胺 交 联 赖 氨 酸 的 氨基 ;氨基 末端 甲 基 化 ; 内 部 环 化 成 氨基 末端 焦 谷 所 本

甘氨酸 转变 成 郑 基 末端 栈 胺 ;氨基 末端 的 肉 豆 寇 酰 化

组 氨 酸 形成 白喉 酰胺 (dipbthamide), 以 后 ADP- 核 糖 基 化 ;氨基 末端 甲 基 化

赖 氨 酸 羟 化 作用 后 5- 羟 加 氨 酸 糖 基 化 ; 交 联 形成 ;乙酰 化 作用

甲 硫 氨 酸 氨基 末端 甲 酰基 团 脱 甲 酰 化 作用 ;氨基 末端 甲 基 化

茜 两 氨 酸 氨基 末端 甲 基 化

睛 氢 酸 羟 化 作用 形成 3- 或 4- 产 及 氨 酸 ,氨基 末端 甲 基 化

丝氨酸 磷酸 化 作用 ; 糖 基 化 作用 ;脂肪 酰 化 作用 ;在 tRNA 水 平 上 硒 代 半 胱 氨 酸 的 形成

苏 氢 酸 磷酸 化 作用 ; 糖 基 化 作用 ;脂肪 酰 化 作用

酷 氢 酸 磷酸 化 作用 ;哺乳 动物 "- 微 管 蛋白 中 羧基 林 端 残 基 的 交换
《四 ) 糖 基 化

在 多 肽 链 合成 过 程 中 或 在 合成 之 后 常 以 共 价 键 与 单 糖 或 窒 糖 侧 链 连 接 , 生 成 糖 蛋白 .这 些
糖 可 连接 在 天 冬 酰 胺 的 酰胺 上 (N- 连 接 寡 糖 ) 或 连接 在 丝氨酸 、 苏 氨 酸 或 产 赖 氨 酸 的 羟基 上 (o-
连接 寡 糖 ) . 糖 基 化 是 多 种 多 样 的 ,可 以 在 同一 条 肽 链 上 的 同一 位 点 连接 上 不 同 的 寡 糖 ,也 可 以
在 不 同位 点 上 连接 上 诊 糖 . 糖 基 化 是 在 酶 催化 反应 下 进行 的 。 糖 蛋白 是 一 类 重要 的 和 量 日 :许多
膜 蛋 白 和 分 记 和 蛋白 均 是 糖 蛋白 。
《五 ) 脂 类 对 蛋白 质 的 共 价 修饰
在 生物 膜 中 , 蛋白 质 埋藏 在 脂 类 双 层 内 。 脂 类 可 以 非 共 价 键 与 蛋白 质 的 疏水 区 相互 作用 ，
也 可 以 共 价 键 将 脂肪 酸 连接 于 和 蛋白质。 蛋白- 脂 的 连接 有 3 个 主要 类 型 :
《1) 在 翻译 后 , 脂肪酸 与 半 胱 氨 酸 、 丝 氨 酸 或 苏 氨 酸 侧 链 酯 化 , 如 揽 磅 脂 的 蛋白 脂 质 、 病 毒
糖 蛋白 .人 类 铁 传递 蛋白 受 体 等 均 是 .参与 酯 化 的 脂肪 酸 有 肉 豆 节 酸 ,棕榈 酸 、 硬 脂 酸 、 油 酸 等 ，
以 脂 酰 -CoA 为 供 体 。
《2) 在 翻译 中 ,连接 肉 豆 节 酸 于 N- 端 甘氨酸 。 大 多 数 N- 肉 豆 薄 酰 化 蛋白 质 与 脂 结合 ,也 有
少量 在 细胞 溶质 。
(3) 在 翻译 后 ,通过 乙醇 胺 将 糖 基 - 磷 脂 酰基 肌 醇 (GPI) 连接 于 多 肽 前 体 的 接近 C 端的 氨
基 酸 残 基 上 ， 生成 与 刚 结合 的 GPI- 锚 定 和 蛋白 (GPLIanchored Protein ) 。
(六 )ADP- 核 糖 基 化
在 翻译 后 ,一 个 或 多 个 ADP_ 核 精 从 NAD+ 上 转移 至 受 体 蛋 白质 上 ,核糖 与 氨基 酸 残 基 以
N- 或 o- 糖 苷 键 结合 .例如 ,单个 ADP- 核 糖 与 精 氨 酸 、 天 冬 酰胺 或 白喉 酰胺 (diphthamide, 一 种
修饰 的 组 氨 酸 ) 残 基 的 N 以 N- 糖 苷 键 结合 . 多 ADP- 核 糖 基 化 主要 在 细胞 核 内 进行 , 先 将 一 个
ADP- 核 糖 与 谷 氨 酸 残 基 的 羧基 侧 链 或 与 C 端 赖 氨 酸 的 羧基 生成 o- 糖 苷 连接 ,以 后 再 连接 上
多 个 ADP- 核 糖 ,形成 多 聚 (ADP- 核 糖 ) 侧 链 。 细 胞 核 内 发 生 多 ADP- 核 糖 基 化 的 蛋白 质 主要 有
组 蛋白 ,以 及 RNA 聚合 酶 亚 基 和 拓 朴 异 构 酶 I 等 。
261

(七 ) 乙 酰 化

蛋白 质 的 乙酰 化 普遍 存在 于 原核 生物 和 真 核 生物 中 ,例如 ,烟草 花 叶 病 病毒 外 壳 蛋 白 ,在
细菌 、 真 菌 、 动 植物 中 均 存 在 。 乙 酰 化 有 二 类 型 :一 类 是 由 结合 于 核糖 体 的 乙酰 基 转 移 酶 催化 虽
将 乙酰 -CoA 的 乙酰 基 转 移 至 正在 合成 的 多 肽 链 上 , 当 将 N 端的 甲 硫 氨 酸 除去 后 , 便 发 生 NE
乙酰 化 ,例如 卵 清 蛋白 的 乙酰 化 便 是 如 此 ; 另 一 类 型 是 在 翻译 后 由 细胞 质 的 酶 催化 发 生 乙 酰
化 ,例如 肌 动 蛋白 和 猫 的 珠 蛋白 。 此 外 ,细胞 核 内 的 组 蛋白 的 内 部 赖 氨 酸 也 可 以 乙酰 化 。

( 八 ) 磷酸 化

酶 、 受 体 、 介 体 (mediator)、 调 节 因子 等 蛋白 质 的 可 逆 磷 酸化 是 普遍 存在 的 蛋白 质 修饰 ,在
细胞 生长 和 代谢 调节 中 有 重要 功能 。 磷 酸化 发 生 在 翻译 后 ,由 各 种 蛋白 质 激酶 催化 ,将 磷酸 基
团 连接 于 丝氨酸 、 苏 氨 酸 和 酷 氨 酸 的 羟基 上 。 在 磷酸 酯 酶 的 作用 则 发 生 脱 磷酸 作用 。

( 九 )C 端 酰胺 基 的 引入

一 些 蛋白 质 如 肽 激素 含有 C 端 酰胺 基 。 这 是 由 多 肽 链 的 C 端 甘氨酸 的 氧化 修饰 生成 的 。 在
肽 基 甘 氢 酸 羟 化 酶 作用 下 ,将 甘氨酸 的 -C 羟 化 ,以 后 甘氨酸 以 乙 醛 酸 态 除去 ,并 歧化 为 酰胺 。

(十 ) 蛋 白质 酷 氨 基 的 硫酸 化

真 核 生 物 的 蛋白 质 的 酷 氨 酸 普 遍 发 生 硫 酸化 。 由 酷 氨 酰 蛋白 质 转移 酶 从 3- 磷 酸 腺 苷 -5'-
磷 酰 硫酸 将 硫酸 基 转 移 至 特定 的 酷 氨 酸 残 基 上 。

第 八 节 蛋白质 的 易 位 与 分 泥

许多 蛋白 质 要 从 它们 合成 的 地 方 转运 至 其 它 位 置 .在 真 核 生 物 , 大 多 数 蛋 白质 是 由 细胞 质
核糖 体 合成 ,许多 酶 包括 在 代谢 中 的 特定 的 蛋白 质 , 如 血红 蛋白 与 肌肉 蛋白 是 保留 在 细胞 质 ，
而 其 它 蛋白 质 则 易 位 进入 细胞 器 与 膜 .或 是 分 泌 出 细胞 。 虽 然 ,线粒体 和 叶绿体 能 合成 少量 的
蛋白 质 , 仍 需要 从 细胞 质 转移 人 蛋白 质 。 原 核 生 物 缺 乏 细胞 器 , 它 合成 的 蛋白 质 有 些 特 定 留 在
细胞 质 内 ,而 另 一 些 则 要 插入 到 膜 ,或 是 分 泌 出 去 (图 9-31)，

和 ” 核 陛 细胞 核
“ 进

5
上 信号 序列
四
(Casaeamw 加
2. 线粒体 蛋白
se

OO
过 的 本 人 深 酶 体 人 ，， ，
LS 后

分 沁 和 蛋白
图 9-31 真 核 生 物 蛋 白质 易 位 的 主要 途径

262

了 WA Te
本 和 二

在 真 核 生物 中 ,蛋白 质 从 细胞 排出 以 及 易 位 到 细胞 器 与 在 多 肽 链 或 其 前 体 上 的 特定 信和 号
序列 (信和 号 肽 ) 有 关 。 这 些 信 号 肽 指导 多 肽 从 细胞 内 一 个 区 域 转运 至 另 一 区 域 ,或 使 之 停留 在 特
定 的 位 置 。 新 生 的 多 肽 链 可 以 含有 一 个 以 上 的 信和 号 肽 ,使 之 易 位 至 某 一 位 置 ,然后 使 之 停留 在
该 位 置 。

一 ` 蛋 白质 易 位 的 途径

蛋白 质 的 易 位 有 2 个 主要 途径 。
(一 ) 共 翻译 (co-translation ) 易 位
由 与 内 质 网 (粗糙 内 质 网 ) 结 合 的 核糖 体 合成 的 蛋白 质 前 体 , 在 其 N 端 含有 一 个 信和 号 序列

《信号 肽 ), 它 使 新 生 肽 链 在 合成 过 程 中 ( 即 共 翻 译 ) 插 人 到 内 质 网 膜 上 的 特殊 通道 ,然后 转移 人

其 内 腔 。 在 切 去 信号 肽 后 ,蛋白 质 可 以 停留 在 内 质 网 用 内 ,或 进一步 通过 高 尔 基 体 转移 至 浴 酶
体 ,或 分 刻 小 泡 ,然后 分 泌 出 去 。 蛋 白质 停留 在 某 一 给 定位 置 是 受 分 子 上 的 信号 肽 控制 的 , 它 防
止 蛋 白质 进一步 的 运送 。

二 ) 翻 译 后 易 位

是 直 洲 高 核糖 体 合成 的 蛋白 质 前 体 在 多 肘 链 合成 之 后 ， 将 蛋白 质 从 细胞 质 转移 到 线粒体
与 叶绿体 等 细胞 器 中 去 。

二 、 蛋 白质 的 共 翻 译 易 位

《一 ) 新 生 肽 进入 内 质 网
定位 在 膜 中 的 、 洲 酶 体 的 或 分 泌 的 蛋白 质 前 体 的 N 端 含有 信号 肽 。 现 已 有 上 百 种 信号 肽
被 测序 。 信 号 肽 含 约 13 一 36 个 氮 基 酸 残 基 , 在 或 靠近 其 N 端 有 一 至 多 个 带 正 电荷 的 氨基 酸 ，
在 信号 肽 的 中 部 为 由 10 一 15 个 氨基 酸 ( 大 部 或 全 部 是 玻 水 性 的 ) 组 成 的 玻 水 核 。 在 信号 肽 的 C
端 靠近 断裂 位 点 亦 有 一 短 段 序列 , 含 侧 链 较 短 的 和 较 具 极 性 的 氨基 酸 ( 如 丙 氨 酸 ) 儿 图 9-32)。

足 水 核 有 助 于 新 合成 的 肽 链 附着 于 内 质 网 的 膜 上 。 人 少数 蛋白 如 卵 清 蛋 白 含 有 和 信和 号 肽 功能 相

同 的 内 序列 ,但 在 易 位 后 不 被 切除 。

Emmas 汪

断裂
成 熟 蛋白 cr]

9-32 和牛 生长 激素 的 N 端 由 29 个 氨基 酸 组 成 的 信号 序列 , 含 中 心 赃 水 核 ,其 前 面 是 极 性 甩 基 酸
一 旦 新 生 肽 链 从 核糖 体 出 现 并 延伸 时 ,信号 肽 便 被 信号 识别 颗粒 (signal recognition pa
ticle,SRP) 所 识别 (图 9-33) 。SRP 与 携带 新 生 多 肽 链 的 核糖 体 相 互 作用 ,引起 翻译 暂时 的 终
止 .SRP 的 功能 就 是 将 暂停 翻译 的 新 生 肽 链 和 内 质 网 膜 靠 近 .。 随后 ,SRP- 核 糖 体 与 内 质 网 上 一
个 SRP 受 体 (又 称 停泊 蛋白 ,docking protein,DP) 结 合 ,通过 一 个 GTP 依赖 过 程 ,打开 一 个 通
263

道 。 另 一 个 内 质 网 膜 蛋白 即 信 号 序列 受 体 二 革 记
(signal sequence receptor,SSR ) 与 信号 肽 结 s ED 3 mRNA
合 ,并 促进 新 生 多 肽 链 进 入 易 位 通道 。 另 外 ，
在 内 质 网 膜 上 ,还 有 核糖 体 的 受 体 , 这 样 , 通 本 了
过 这 3 个 受 体 的 多 重 识别 ,信号 肽 可 以 无 误 QU
地 与 内 质 网 专 一 地 结合 。 同 时 ,SRP 释放 入 ” 本
细胞 质 , 多 肽 链 易 位 到 内 质 网 的 内 腔 . 被 释放
出 的 SRP 则 再 用 于 另 一 个 蛋白 质 的 转运 。 信
号 肽 在 多 肽 链 合成 完成 之 前 , 即 由 内 质 网 内 了
的 信号 肽 酶 切除 掉 。 在 易 位 时 会 发 生 多 肽 链 2
的 修饰 ,如 天 冬 酰胺 残 基 的 N- 糖 基 化 作用 ， 人
或 是 在 膜 蛋白 的 脂肪 酸 的 酰基 化 作用 。

SRP 是 由 1 种 含 300 个 核 苷 酸 的 TSL-
RNA 与 6 个 不 同 多 肽 链 组 成 。6 个 不 同 多 肽
链 的 分 子 量 分 别 是 9kD, 14kD, 19kD，
54kD,68kD,72kD.。 头 2 个 组 分 的 功能 是 抑
制 翻 译 。 含 有 一 个 GTP 结合 结构 域 的 54 kD
蛋白 的 功能 是 与 信号 肽 相互 作用 。68 kD/
72kD 是 杂 二 聚 体 ,由 它们 与 停泊 蛋白 结合 。
停泊 蛋白 含有 2 个 亚 基 ,70kD 的 “ 与 30kD
的 8 多肽 链 。x 亚 基 整 合 于 内 质 网 膜 内 , 它 的
一 级 结构 中 ,有 多 个 朴 水 区 ,中 间 是 一 个 高 度 多 9-33 上 削 白质 的 共 翻 译 转移 人 内 质 网 内 腔
正 志 着 欧 肤 民 恒 正 是 此 胰 民 与 SRP 的 7SL- 。 ,sst ,入 er 芝 人
RNA 作用 ,使 SRP 结合 于 “ 亚 基 上 。wx 亚 基 二
具有 GTIP/GDP 的 结合 能 力 , 这 一 结合 能 力 调节 了 停泊 有 蛋白 与 SRP 的 结合 。8 亚 基 的 功能 不
清楚 。SSR 为 一 个 六 聚 体 ,含有 各 为 34 kD 与 23 kD 的 糖 蛋白 。 它们 可 以 与 信号 肽 和 新 生 肤 链
的 其 它 部 分 相互 作用 .促进 新 生 肽 链 穿越 内 质 网 ,它们 还 可 以 在 新 生 肽 链 易 位 与 切除 信和 号 肽 过
程 中 起 作用 。

现 知 SRP 对 翻译 还 有 负 调 节 (negative regulation ) 作 用 .哺乳 动物 分 泌 蛋 白质 中 的 许多 种
都 是 降解 酶 类 (如 核酸 酶 .蛋白酶 等 ) ,它们 的 偶然 出 现 于 胞 浆 内 都 会 造成 细胞 内 的 灾难 。SRP 琶
暂时 终止 这 些 蛋 白质 的 翻译 ,确保 这 些 蛋 白质 未 到 达 内 质 网 腊 之 前 不 会 完成 翻译 。 这 样 , 在 信
号 肽 和 SRE 的 共同 作用 下 ,使 得 这 些 分 泌 蛋 白 能 及 时 进入 内 质 网 腔 内 ,完成 转运 和 分 雍 。

现 知 在 新 生 肽 链 的 C 端 也 存在 一 些 影响 肽 链 穿越 内 质 网 膜 的 肽 段 ,使 穿越 膜 的 过 程 终
止 。 这 部 分 称 为 终止 转移 序列 ,也 可 认为 是 一 种 信号 序列

一 般 地 说 ,新 生 肽 链 进 入 内 质 网 是 一 个 共 翻 译 过 程 ,但 也 有 例外 ,如 在 酵母 菌 内 ,和 蛋白质 是
在 翻译 后 进入 内 质 网 的 。

(二 ) 蛋 白质 在 内 质 网 内 的 滞留

运 和 白质 网 腔 的 蛋白 质 一 部 分 滞留 在 内 质 网 内 ,但 大 多 数 蛋 白质 则 在 内 质 网 腔 内 被 加 工 ，

“后 转 人 高 尔 基体 ,最 终 转送 到 细胞 其 它 位 置 或 是 由 胞 谈 作 用 被 排出 。 如 果 某 些 分 沁 和 蛋白 不
64

飞 新 生 多 肽

， 具有 正确 的 空间 构象 , 肽 链 是 不 能 通过 内 质 网 的 ,此 时 ,常常 会 被 重 链 结合 蛋白 ( 热 休 克 和 蛋白 的
一 种 )Bip 结合 , 先 被 滞留 然后 进一步 会 被 降解 。 现 在 知道 ,定位 在 细胞 内 的 蛋白 质 是 与 一 些 特

定 的 肽 链 序列 有 关 。 灌 留 在 内 质 网 的 蛋白 质 ,如 重 链 结合 蛋白 (Bip),2 个 葡萄 糖 调节 蛋白 (grp

78 与 grp 94) 以 及 二 硫 键 异 构 酶 ,在 它们 的 羧基 末端 找到 了 四 肽 KDEL( 即 Lys。，Asp。Glu，
Leu) 序 列 。 如 果 除 去 重 链 结合 蛋 白 C- 末 端的 KDEL, 它 就 被 分 泌 。 溶 菌 酶 的 C- 末 端 接 上 了 这
一 四 肽 ,溶菌 酶 就 被 保留 在 内 质 网 中 ,不 再 被 分 泌 。 在 酵母 中 也 有 类 似 的 情况 ,只 是 四 肽 的 序列
是 HDEL(H=His)。 在 内 质 网 内 的 蛋白 质 有 一 部 分 插入 到 膜 内 ,成 为 膜 的 整合 蛋白 (integral
membrane protein) 。 这 些 肽 链 有 一 段 锚 定 (Canehor ) 序 列 , 作 为 终止 转移 信和 号 (stop-transfer
signal) 。 它 由 一 些 疏 水 性 氨基 酸 组 成 。 它 的 作用 是 使 肽 链 插 在 膜 上 ,而 不 会 整 条 穿越 过 去 。 膜
上 的 蛋白 有 2 个 类 型 : I 型 是 N 端 在 内 侧 ,C 端 在 外 侧 ( 细 胞 溶质 一 侧 ); 工 型 则 相反 ,C 端 在 内
侧 而 N 端 在 外 侧 。 大 部 分 膜 蛋白 属于 I 型 ,只 有 少数 属于 工 型 。
”三 ) 蛋 和 白质 在 内 质 网 内 的 加 工

在 内 质 网 内 的 蛋白 质 发 生 两 种 重要 的 变化 : 折 和 至 和 糖 基 化 修饰 ;修饰 与 折 释 是 相 联系 的 ，
正确 的 折 友 必须 加 上 糖 基 。 同 时 ,在 蛋白 质 二 硫 键 异 构 酶 的 作用 下 ,发生 二 硫 键 的 重 排 。

重 链 结合 蛋 白 Bip 参与 了 折 秋 过程。 它 是 属于 Hsp70 家 族 的 一 种 分 子 伴侣 。 它 在 内 质 网
腔 内 促进 蛋白 质 寡 聚 化 和 /或 折 友 。 蛋 白质 的 寡 聚 化 对 以 后 的 转运 是 重要 的 。Bip 也 起 着 除去
错误 折 释 的 蛋白 质 的 作用 。

蛋白 质 的 糖 基 化 是 在 内 质 网 和 高 尔 基体 内 进行 的 。 糖 基 化 包括 下 列 步 又 ;

《1) 在 内 质 网 的 膜 上 有 一 种 高 度 疏 水 性 的 脂 质 长 莫 醇 (lipid dolichol), 它 以 焦 磷 酸 基 连 接
2 个 N- 乙 酰 葡萄 糖 胺 ,9 个 甘露 糖 和 3 个 葡萄 糖 残 基 。

CHs CHs CHs
5 ODS Ci
HH
长 昔 醇 (2 一 9 一 22)

《2) 在 内 质 网 膜 上 的 糖 基 转 移 酶 的 催化 下 ,将 上 述 糖 基 转 移 至 膜 上 的 多 肽 链 的 天 冬 酰 胺 残
基 上 ,形成 -糖苷 键 连接 的 糖 蛋白 , 其 糖 基 暴 露 于 内 质 网 腔 。
《3) 在 内 质 网 内 的 糖苷 酶 作用 下 ,依次 切除 3 个 葡萄 糖 残 基 和 1 一 4 个 甘露 糖 残 基 。
4G4) 以 后 将 生成 的 糖 蛋白 转移 至 高 尔 基体 ,并 在 其 中 由 甘露 糖苷 酶 再 切除 几 个 甘露 糖 残
基 , 连 接 上 N- 乙 酰 葡萄 糖 胺 、 半 乳糖 .唾液 酸 等 ,完成 糖 基 化 ,生成 复合 糖 重唱 :
和 届 Man 一 AcG 一 Gal 一 SiA
和 CH CN_AcGc_ AcG 一 Man AcG 一 Gal 一 SiA

生 和 天 ACE -< 澳

RS

冬
肽 链 ”天 冬 酰胺 内 核 端 区

AcG:N- 乙 酰 葡 萄 糖 胺 ;Man: 甘露 糖 ;Cal: 半 乳糖 ;SiA :唾液 酸 。
265

高 尔 基体 是 有 极 性 的 ,其 顺 式 侧 朝向 内 质 网 , 反 式 侧 朝向 质 膜 。 上 述 的 糖 基 化 步骤 是 严格
依次 在 高 尔 基体 内 各 个 襄 泡 (cisterna) 之 间 由 顺 式 侧 向 反 式 侧 方向 逐步 进行 的 。 当 到 达 反 式 侧
之 后 , 便 分 别 转移 到 不 同 的 终点 位 置 。

《四 ) 和 蛋白 质 的 定位 和 分 泌

恒 晶 质 进入 高 尔 基体 后 , 便 分 别 运送 至 不 同 的 目的 地 ,如 溶 酶 体质 膜 或 分 刻 出 细胞 外 。 蛋
扎 质 是 通过 膜 小 泡 (vesicle) 的 作用 ,在 其 中 运送 的 。 蛋 白质 一 旦 进入 内 质 网 的 膜 后 , 便 一 直 保
留 插 和 人 膜 内 ,直至 到 达 最 后 目的 地 。

， 组 成 分 这 胞 吐 作用 内 吞 作用
质 腊
记
了 和 六 形 成

小 泡 与 膜 融 合 外 信号 “ It
Q / 人 @ < 有 > 全

mm 小 泡 捏 断

图 9-34 和 蛋白质 在 小 泡 内 的 运送

小 泡 是 由 膜 形 成 的 , 膜 先 是 凸 起 “出 芽 ”，
以 后 捏 断 , 便 形 成 圆 形 小 泡 (图 9-34)。 小 泡 的
形成 要 求 小 分 子 的 GTP 结合 蛋白 和 消耗
AIP. 小 泡 外 面 含有 一 层 蛋 白 外 壳 (coat) ,其 内
是 一 层 称 为 接合 体 (adaptor) 的 蛋白 ,内 层 是 包
含有 待 运送 的 蛋白 质 膜 ( 图 9-35) 。 小 泡 由 膜 上
脱 下 后 , 包 上 外 壳 , 移 至 靶 膜 上 , 脱 去 外 壳 , 然 后
与 划 膜 融合 ,其 中 的 蛋白 质 即 运送 到 该 靶 膜 上
下

小 泡 视 其 外 壳 蛋 白 的 不 同 而 分 为 两 个 类
型 ,分 别 负责 两 个 不 同 途径 的 运送 。 一 个 类 型 的 “图 9%35 以 网 格 蛋 白 为 外 壳 的 小 泡 , 外 壳 处 层 ，
小 泡 由 一 种 未 知 的 蛋白 做 外 壳 , 负 责 由 内 质 网 为 网 格 蛋 白 , 内 层 为 接合 体 蛋 白
一 ”~ 高 尔 基体 一 ~ 质 膜 的 运送 , 称 为 组 成 分 泌 (Cconstitutive secretion ) 或 大 量 流动 (bulk flow 直
印 一 类 型 的 外 壳 蛋 白 是 网 格 蛋白 (clathrin) , 称 为 分 泌 小 兆 (sesretory vesicles)， 由 高 尔 基体 的
芭 式 侧 将 蛋白 质 通过 胞 吐 作用 (exocytosis ) 分 泌 出 去 ， 细胞 外 的 蛋白 质 也 可 以 由 这 种 小 泡 通过
内 香 作 用 (endocytosis) 运 入 细胞 内 (图 9-34) 。

溶 酶 体 是 由 膜 包 着 的 小 体 , 内 含 多 种 水 解 酶 ， 蛋白 质 可 以 由 高 尔 基体 反 式 侧 生成 的 小 泡 ，

266 六

， 再 经 过 内 体 (endosome 是 一 种 小 管 和 小 泡 组 成 的 外 包 以 膜 的 结构 ), 进 入 浴 酶 体 。 在 蛋白 质 糖
基 化 过 程 中 形成 的 甘露 糖 -6- 磷 酸 是 作为 蛋白 质 进入 溶 酶 体 的 识别 信号 。 细胞 外 的 蛋白 质 也 可
以 通过 内 吞 作 用 , 由 小 泡 运送 ,通过 内 体 而 进入 浴 酶 体 。

]

三 、 蛋 和 白质 的 翻译 后 易 位 (translocation for post-translation )

细胞 器 例如 线粒体 .叶绿体 ` 细 胞 核 `. 过 氧 物 酶 体 的 许多 组 成 蛋白 质 是 由 游离 的 核糖 体 合
成 的 ,并 作为 前 体 释放 到 细胞 质 中 去 ,随后 为 细胞 器 所 接受 ,最 终 成 为 结构 蛋白 质 .由 核糖 体 合
成 的 蛋白 质 前 体 按 其 所 携带 的 信号 不 同 而 分 别 转运 到 不 同 的 细胞 器 中 去 ( 表 9-9)。 可 看 出 , 导
向 不 同 细胞 器 的 信号 序列 的 位 置 . 性 质 和 长 短 都 不 同 , 如 过 氧 物 酶 体 蛋白 的 信号 只 有 3 个 氨基
酸 残 基 。 如 果 缺 乏 这 些 信 号 ,合成 的 蛋白 质 便 停 留 在 细胞 溶质 中 , 呈 似 溶解 (quasi-soluble) 态 。

表 9-9 将 游离 核糖 体 合成 的 蛋白 质 导 向 不 同 细 胞 器 的 信号

细胞 器 信号 位 置 类 型 信号 长 度 ( 残 基数 )
线粒体 N- 末 端 带电 荷 12 一 30
叶绿体 N- 未 端 带电 荷 一 25

细胞 核 内 部 碱 性 7 一 9

过 氧 物 酶 体 C- 末 端 区 3

x SKL :Ser-Lys-Leu

一) 蛋白 质 进入 线粒体
对 酵母 线粒体 的 研究 表明 蛋白 质 的 进入 有 多 条 途径 (图 9-36) ,其 中 的 途径 A 可 分 为 4 个
阶段 :
1) 前 体 蛋 白 结 合 于 特定 的 进口 位 点 , 它 是 由 42kD 的 蛋白 质 组 成 ,位 于 线粒体 的 外 膜 。 在
这 个 区 域 ,外 膜 与 内 膜 是 靠近 的 ;
《2) 蛋 白质 与 一 种 抗 折 笃 蛋白质 相 结合 ,使 之 解 折 肥 ;
《3) 易 位 穿 过 内 膜 , 这 个 过 程 需要 ATP 的 水 解 和 在 膜 外 侧 要 有 一 个 正 电 荷 的 电化 学 梯度 ;
《4) 受 溶解 于 衬 质 的 金属 蛋白 酶 的 作用 ,切除 N 端的 序列 ,并 折 肢 成 三 级 结构 , 分子 伴侣
和 ATIP 起 促进 作用 。
途径 B 包括 了 蛋白 质 进 入 线粒体 外 膜 , 是 在 细胞 质 中 完成 的 多 肽 链 合成 之 后 直接 插入。
定位 于 内 外 膜 之 间 的 蛋白 质 , 可 以 有 两 条 途径 由 细胞 质 进 入 。 一 条 途径 是 C ,蛋白质 插 人
到 外 膜 脂 双 层 ,在 内 外 膜 空间 进行 分 子 修饰 。 例 如 ,细胞 色素 < 作为 成 熟 的 脱 辅 基 鱼 白质 穿 过
外 膜 ,然后 ,在 看 在 于 外 膜 内 侧 的 细胞 色素 血红 素 裂 合 酶 的 催化 下 ,将 它 在 膜 间 的 空间 处 转变
为 与 血红 素 共 价 结合 .血红 素 蛋 白质 随后 插 和 人 到 内 膜 的 外 侧 . 另 一 条 途径 是 D, 例 如 ,细胞 色素
b2 开始 是 将 前 体 插入 衬 质 ( 途 径 A) ,然后 分 两 步 切除 前 序列 ,先是 在 衬 质 ,其 次 是 内 膜 。 成 熟
的 蛋白 质 就 释放 到 两 层 膜 中 间 去 。
蛋白 质 进 入 线粒体 内 不 同 部 位 (内 、 外 膜 . 内 外 膜 间隙 、 衬 质 ) 是 由 蛋白 质 前 体 的 N 端 前 序
列 ( 信 号 序列 ) 决 定 的 。 前 序列 的 前 一 半 使 蛋白 质 穿 过 两 层 膜 进入 衬 质 , 称 为 " 衬 质 靶 向 信和 号?
(matrix-targeting signal) 。 前 序列 的 第 二 部 分 称 为 " 膜 靶 向 信号 ”(membrane-targeting
signal) 。 在 蛋白 质 进 入 衬 质 后 ,由 在 其 中 的 Mg 一 依赖 蛋白 酶 切 去 衬 质 靶 向 信号 :如果 前 序列
中 没有 其 它 信号 ,蛋白 质 便 停 留 在 衬 质 中 ; 如 果 后 一 半 有 膜 靶 向 信号 ,在 切 去 前 一 半 后 , 膜 靶 向
267

信和 号 (此 时 为 N 端 ) 便 使 蛋白 质 转送 到 外 膜 . 内 外 膜 间 隙 .或 内 膜 。 最 后 再 切 去 此 信和 号 序列 。 此
外 ,也 可 以 由 一 个 “终止 转移 序列 ”(stop-transfer sequence) 使 蛋白 质 停 留 在 外 膜 或 内 膜 上 。

(与 抗 撕 副 融和 结合 ,保持 解 折 得 状态 )

多 肽 前 体
Se 乡 & 和 下 过 上

途径 B 途径 C 前 序列
ARP 途径 D

成 熟 蛋白
(由 监护 蛋白 和 ATP 助 其 折 梧 )

图 9-36 蛋白 质 易 位 入 线粒体 。 蛋白 质 从 细胞 质 通过 不 同 途 径 进 入 线粒体 的 不 同 区 域
AS 线粒体 内 膜 和 外 膜 的 附着 点 ;OM 外 膜 ;IMS 膜 内 空间 ;IM 内 膜 ;M 衬 质 。

蛋白 广 前 体 首先 在 线粒体 外 膜 上 与 受 体 蛋 白 结 合 。 已 知 在 酵母 线粒体 外 膜 上 有 3 种 受 体
蛋白 ,分 别称 为 Tomzp,Tomzsp,Tom?p。 以 后 蛋白 质 前 体 即 通过 跨 膜 的 通道 进入 线粒体 。 这
通道 是 由 膜 的 整合 蛋白 组 成 的 ,具有 亲 水 性 。 一 种 称 为 蛋白质 易 位 马达 ”(protein transloca-
tion motor) 由 水 解 核 苷 三 磷酸 驱动 蛋白 质 通 过 通道 , 跨 膜 电位 也 有 助 于 蛋白 质 通过 。

(二 ) 蛋 白质 进入 叶绿体

蛋白 质 进 入 叶绿体 的 过 程 和 进入 线粒体 相似 ,其 前 序列 由 约 50 个 氨基 酸 组 成 , 它 的 前 一
半 指 导 蛋 白质 进入 叶绿体 间 质 ,然后 在 第 20 一 25 个 氨基 酸 处 切断 ,余下 后 半 段 即 指导 蛋白质
进入 类 春 体 膜 或 腔 。 蛋 白质 前 体 结合 于 叶绿体 表面 受 GTP 控制 。 有 两 种 具有 结合 GTP 的 基
序 Cmotif) 的 蛋白 质 Oep34 和 Oep86 认为 可 能 是 蛋白 质 进 入 的 受 体 。

(三 ) 蛋 自 质 进 入 细胞 核

细胞 核 内 全 部 的 蛋白 质 都 是 由 细胞 质 输入 的 。 在 细胞 核 的 核 膜 上 有 核 孔 ,是 细胞 核 与 细胞
质 交换 大 分 子 的 通道 。 高 等 真 核 生物 的 核 孔 复合 物 由 约 100 种 不 同 多 肽 组 成 ,其 质量 达 125X
10?kD。 但 其 孔径 只 有 约 9 nm 分 子 较 小 的 蛋白 质 如 细胞 色素 可 以 自由 扩散 通过 , 较 大 分 子 一
的 牛 血清 清 蛋白 则 不 能 通过 ,所 以 ,大 分 子 的 蛋白 质 进入 细胞 核 是 一 个 主动 过 程 ,而 且 要 求 有

信和 号 指引 。 细 胞 核定 位 序列 Cnuclear localization sequence,NLS ) 由 一 全 多 个 碱 性 氨基 酸 禾 组

成 。 蛋 白质 进入 细胞 核 分 二 步 : 先 是 携带 NLS 信和 号 的 蛋白 质 与 在 细胞 质 中 的 “输入 蛋白 ”(im:
portin, 又 称 karyopherin 或 NLS 受 体 ) 结 合 。 输 入 蛋白 由 “,p2 个 亚 基 组 成 。 蛋 白质 先 与 < 亚
基 结合 ,然后 通过 输入 蛋 白 -有 结合 域 (importin-B binding domain，IBB) 与 8 亚 基 结合 。 由 有
亚 基 介 导 此 蛋白 复合 物 停泊 于 核 孔 复合 物 。 下 一 步 是 在 小 GTP 酶 Ran (small guanosine
tiphasphatase，Ran) 作 用 下 水 解 GTP, 并 使 蛋白 复合 物 通过 核 孔 进入 核 内 ,输入 蛋白 的 2 个
亚 基 则 释放 出 再 回 到 细胞 质 。 整 个 过 程 如 图 9-37 所 示 。

\ 四 ) 蛋 白质 进入 过 氧 物 酶 体

大 多 数 输入 过 氧 物 酶 体 的 蛋白 质 均 具有 C 端的 Ser-Lys-Lenu 序列 或 其 十 分 近似 的 序列 ，

268

统称 为 过 氧 物 酶 体 靶 向 信号 1(peroxisome-targeting signal 1,PTS1) , 另 一 些 少数 蛋白 则 具有
端的 信号 ,是 含 11 个 残 基 的 共有 基 序 (consensus motif) , 称 为 PTS2。 更 有 其 它 蛋 白质 含 未
鉴定 的 信号 。PTS1 信和 号 被 称 为 Pas8p 或 Pasl0p 的 蛋白 识别 , 视 酵 母 种 的 不 同 而 异 。PTS2 信
号 被 Pas7p 蛋白 识别 。 上述 的 Pas8p,Pasl0p 和 Pas7p 是 在 细胞 质 中 还 是 在 膜 上 仍 有 争论 。 关
于 蛋白 质 进 入 过 氧 物 酶 体 的 机 制 及 其 动力 仍 不 清楚 。

输入 蛋白 细胞 核 蛋白
〈 受 体 ) SP
Si
一 <
目 心
细胞 质

核 质
中 人 全、 EN、 多
下 、
定 一 公
图 9-37 和 蛋白质 输入 细胞 核 的 步骤
四 、 细 菌 的 蛋 和 白质 易 位

上 文 所 述 的 是 真 核 细胞 的 蛋白 质 易 位 ,在 原核 细胞 (细菌 ) 内 也 有 类 似 情况 ,蛋白 质 在 细胞

质 合成 后 要 转移 人 内 膜 和 进入 周 质 空间 ,有 时 还 通过 外 膜 。 在 大 肠 杆 菌 内 , 一 般 是 共 翻 译 易 位 ，
但 也 有 少数 蛋白 质 是 可 以 同时 共 翻 译 和 翻译 后 易 位 的 。
3 前 导 肽 本

田 ATP

so 耻 由

则
多 pp

-有 <
守
介 SB 结 公 新 生 重 百 质 > 用

图 9-38 细菌 内 蛋白 质 的 易 位
269

细菌 分 泌 的 蛋白 质 含 有 N 端的 前 导 序列 ,其 前 端 为 亲 水 性 ,连接 一 朴 水 核 。 蛋白 质 进 入 膜

后 的 正确 定位 也 要 求 次 级 信号 。 蛋 白质 的 正确 构象 是 关键 。 已 知 有 多 种 分 子 伴 倡 参与 蛋白 质

的 折 释 ,包括 SecB,SecA,SecE,SecY 等 .新生 肽 链 先 与 SecB 结合 ,使 之 不 会 发 生 错 误 折 码 , 并 ，

把 肽 链 导 向 膜 上 的 SecA。 SecA 是 一 个 大 的 膜 周 边 蛋 白 , 它 同时 具有 ATP 酶 活性 。SecA 与 蛋

白质 和 ATP 结合 ,并 水 解 ATP.。 以 后 肽 链 即 由 SecA 转移 给 SecE/Y( 均 是 膜 的 整合 蛋白 六 最
后 由 膜 上 的 前 导 肽 酶 (leader peptidase) 切 去 蛋白 质 的 前 导 序 列 。 上 述 过程 如 图 9-38 所 示 。

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〈 杨 礼 锐 ” 李 明 启 )

270

本 第 十 章 “” 原核 生物 基因 表达 的 调控

9

了 J 收

和 要 达 , 而 在 其 余 的 时 间或 空间 这 些 基因 则 被 关闭 。 例 如 ,昆虫 变态 过 程 的 各 种 基因 要 在 一 定 发
是 育 阶段 (如 幼虫 、 师 、 成 虫 ) 才 能 表达 ;与 植物 开花 有 关 的 基因 也 只 有 在 开花 前 才能 表达 ,而 在 营
养 体 ( 根 、 蔡 . 叶 ) 生 长 时 则 全 被 关闭 。
虽然 一 种 基因 编码 一 种 蛋白 质 ,但 是 不 同 蛋白 质 在 细胞 中 的 相对 数量 差别 很 大 , 随 着 它们
出 的 荔 能 而 不 同 ,例如 ,在 互 . coii 细胞 中 ,从 总 蛋白 的 不 足 0. 01% 一 2%% ,各 种 蛋白 质变 化 不 定 。
岂 细胞 要 使 其 蛋白 质 合成 达到 这 种 差异 ,可 以 有 两 条 途径 。 第 一 条 途径 是 细胞 控制 从 其
ULDNA 模板 上 转录 其 特异 的 mRNA 的 速度 ,这 是 一 种 最 经 济 的 办 法 ,可 以 免 去 浪费 从 mRNA
凑 成 蛋白 质 的 各 种 元 件 和 材料 。 这 大 概 是 生物 在 长 期 进化 过 程 中 自然 选择 的 结果 。 这 种 控制
通常 称 之 为 转录 水 平 (transcriptional level) 的 调控。 大 多 数 基 因 表 达 都 属于 转录 水 平 的 调控 。
第 三 条 途径 是 在 mRNA 合成 后 ,控制 从 mRNA 翻译 成 多 肽 链 的 速度 ,包含 一 些 分 子 装置 问
j 题 ,其 与 核糖 体 的 结合 速度 等 。 这 种 蛋白 质 合成 或 基因 表达 的 控制 称 为 翻译 水 平 (translational
LIEvel) 的 调控 。 这 种 调控 是 较 少 的 。
对 于 细胞 来 说 , 它 不 能 合成 超过 它 所 需要 的 mRNA ,对 它 才 不 浪费 原料 和 能 量 。 因 此 ,我
个 也 应 当 更 多 地 注意 转录 水 平 的 调控 问题 。 原 核 生物 特别 是 大 肠 杆菌 ( 尼 . cox 基因 表达 调控
的 原理 研究 得 比较 成 熟 和 深入 ,本 章 我 们 以 原核 生物 为 主 , 讨 论 有 关 它 们 的 基因 表达 的 调控 问
题 。 至 了 于 真 核 生 物 基因 表达 的 调控 则 要 在 第 十 三 章 中 详细 讨论 。

二 节 “细菌 对 营养 的 适应
除 光 合 自 养 细菌 外 ,一 般 细 菌 如 大 肠 杆 菌 所 需 的 碳 源 首 先是 葡萄 糖 ,利用 葡萄 糖 发 酵 获 得
能 量 ,维持 生存 . 在 缺乏 葡萄 糖 时 ,细菌 也 可 以 利用 其 它 糖 类 如 乳糖 作为 碳 源 ,维持 生活 。 从 大
肠 杆菌 染色 体 的 长 度 可 以 估计 它 大 约 可 以 编码 2 000 一 4 000 种 重 白质 。 一 般 估计 生长 在 以 葡
萄 糖 为 唯一 碳 源 的 细菌 中 的 酶 类 至 少 有 600~-800 种 .在 这 些 酶 中 特别 是 与 降解 葡萄 糖 第 一 步
有 关 的 酶 ( 即 所 谓 关键 酶 ), 及 与 制造 氨基 酸 与 核 苷 酸 有 关 的 酶 ,以 相当 大 的 数量 存在 着 ,产生
271

ATP 所 需 的 酶 类 也 大 量 存在 。 与 此 相反 ,其 它 制 造 少 量 辅酶 的 酶 类 则 只 以 微量 存在 。 用 于 构建
细胞 壁 细 胞 膜 及 核糖 体 的 各 种 结构 蛋白 也 必须 大 量 存在 。

了 解 在 大 肠 杆 菌 细胞 中 稀有 的 及 丰富 的 蛋白 质 有 多 少 个 拷贝 (copy) 是 很 有 必要 的 。 有 半
弛 糖 昔 酶 (B_galactosidase) 是 研究 得 最 透彻 的 酶 , 它 能 将 乳糖 分 解 成 葡萄 糖 及 半 乳 糖 。 有 - 半 乳 ，
糖 音 酶 的 分 子 量 为 460kD, 具 有 四 聚 体 结构 , 由 4 个 分 子 量 各 为 116 kD 相同 的 多 肽 链 组 成 。
这 是 一 个 极 重要 的 酶 ,因为 乳糖 不 能 用 做 碳 源 或 能 源 , 它 必须 先 被 分 解 成 简单 的 葡萄 糖 和 半 乳
糖 。 生长 在 以 乳糖 为 唯一 碳 源 的 大 肠 杆菌 中 通常 含有 3 000 个 记 半 乳 糖苷 酶 分 子 , 占 其 总 蛋白
质 的 1.5%%, 这 是 所 能 合成 的 最 大 数量 。

已 经 精确 计算 过 ,其 它 丰富 的 蛋白 质 包括 有 蛋白 质 合成 过 程 的 组 分 一 核糖 体 蛋白 (平均
分 子 量 20kD) 等 共计 53 种 ,它们 总 起 来 占 细胞 总 蛋白 的 20%% ,每 种 蛋白 质 约 有 2 000 个 拷 |
贝 , 大 肠 杆 菌 中 最 丰富 的 蛋白 质 是 蛋白 质 合成 的 延长 因子 EF-Tu( 见 第 九 章 ) 每 个 细胞 中 存
在 100 000 个 分 子 左右 。

与 这 些 永久 分 子 不同 , 调 节 蛋 白 及 酶 在 每 个 细胞 中 只 以 少数 100 一 200 个 拷贝 存在 ， 此
它们 很 难 检 测 和 纯化 ,目前 我 们 尚 缺乏 其 数量 的 确切 资料 。

当 细 胞 需要 一 种 蛋白 质 时 ,与 它 不 需要 的 时 候 比较 , 它 能 以 极 大 数量 存在 .例如 ,五 cox 生 潮
长 在 乳糖 中 , 则 8- 半 乳糖 昔 酶 分 子 几 乎 有 3 000 个 之 多 ,而 生长 在 其 它 碳 源 的 细胞 此 酶 只 有
171 000。 像 以 乳糖 为 底 物 那样 ,引入 培养 基 中 而 专 一 地 增加 某 种 酶 的 数量 ,这 个 底 物 即 称 为 诱 夸
导 物 (Cinducer) ,而 这 种 酶 则 称 为 诱导 酶 (inducible enzyme) 。 |

在 生物 合成 中 所 包含 的 酶 类 却 有 与 此 相反 的 反应 .例如 ,生长 在 不 含 任何 氨基 酸 的 培养 基
中 的 大 肠 杆菌 ,细胞 中 含有 合成 20 种 氨基 酸 所 需要 的 全 部 酶 类 。 而 当 培养 基 中 含有 某 种 氨基
酸 时 , 则 该 种 氨基 酸 生物 合成 的 酶 类 几乎 完全 缺失 。 生 物 合成 的 酶 类 受 其 终 产 物 (end proa
duct) 的 抑制 ,如 组 氨 酸 为 组 氨 酸 生物 合成 酶 类 的 终 产物 ,此 种 酶 称 为 阻 过 酶 (repressive en
zyme) 。 而 那些 导致 某 种 阻 巡 酶 数量 降低 的 终 产 物 则 称 为 辅 阻 遇 物 (corepressor) 。 诱 导 与 阻 遏
效应 对 细菌 来 说 是 同等 有 用 的 。 当 需要 某 种 酶 转化 一 种 特异 的 食物 分 子 或 者 合成 一 种 所 需 的
细胞 组 分 时 ,它们 即 存 在 ,而 不 需要 它们 时 ,它们 则 不 存在 ，

蛋白 质 含量 的 变化 反映 了 mRNA 分 子 数目 的 多 少 。 在 旺 感 分 裂 的 细菌 中 ,大 多 数 蛋白
分 子 一 旦 合成 后 即 十 分 稳定 。 因 此 , 蛋 自 质数 量 的 变化 通常 反映 蛋白 质 合成 的 速度 ,而 非
对 稳定 性 ,但 是 也 有 例外 情况 。 当 细胞 适应 了 新 的 生长 条 件 , 某 种 蛋白 质数 量 的 变化 常常 是 莉
mRNA 模板 数量 变化 的 结果 。 我 们 估计 当 广 半 乳 糖苷 酶 合成 最 多 时 ,每 个 细胞 中 存在 50 1
信 半 乳糖 首 栈 mRNA 分 也 ;而 相反 在 红糖 不 存在 时 ,细胞 中 则 只 全 有 不 到 1 个 全 半 屯 糖 从
的 mRNA 与 全 7

第 三 节 | 组 成 蛋 自 与 调节 各 折

一 、 组 成 蛋白

在 细胞 内 有 许多 种 蛋白 质 其 数量 几乎 不 受 外 界 环境 的 影响 这 些 和 蛋白 质 称 为 组 成 蛋白 质
(constitutive proteins)。 例 如 ,在 巨 . co: 中 控制 葡萄 糖 降解 的 酶 类 数量 并 无 剧烈 变化 ,不 论 是

放生 和 闪 二 中 于 从 下 卉 关于 到 才 | ,都 无 大 的 变化 。 3 卫 至 全 coi 在 自然 界 中
9

有

， 笃 常 得 到 萄 萄 糖 ,以 致 没有 必要 演化 出 一 个 阻 晕 产 生 这 些 酶 类 的 手段 。 而 且 对 细菌 来 说 ,控制
和 蛋白质 极 小 量 的 合成 也 很 不 经 济 ,如 将 乳糖 阻 遇 物 极 低 的 拷贝 数 做 成 组 成 蛋白 质 。 组 成 蛋白 质
奉 成 的 速度 是 遗传 上 规定 的 ,由 于 (1) 启 动 子 的 天 然 效 率 , 靠 它 可 以 制造 mRNA; (2) 核 糖 体 阅
读 信使 的 速度 ; (3) 其 信使 被 核酸 酶 降解 的 敏感 性 。

二 、 调 节 蛋 和 白

调节 蛋白 (regulatory protein) 是 一 些 特殊 和 蛋白质, 它们 决定 着 何 时 诱导 酶 或 阻 遇 酶 可 以
从 成 。 每 种 调节 蛋白 影响 一 种 或 多 种 特殊 基因 的 表达 。 它们 有 两 种 基本 类 型 : 即 正 调节 和 蛋白
(positive regulator) 及 负 调 节 蛋 白 (negative regulator) 。 这 两 种 调节 可 以 由 调节 它们 的 基因 之
相反 效应 加 以 区 别 。 负 调节 蛋白 或 称 阻 过 蛋 白 , 会 使 其 靶 蛋 白 的 合成 受到 抑制 , 即 不 表达 ,而 不
管 是 否 需要 -这 类 突变 种 称 为 组 成 突变 种 (constitutive mutant) 。 与 此 相反 , 正 调节 蛋白 是 激活
蛋 自 (activator) , 它 的 存在 对 合成 所 调节 的 酶 是 需要 的 ,因此 ,激活 蛋白 存在 时 被 控制 的 基因

“ 即 表达 。

第 四 节操 纵 子 学 说

和

细菌 基因 表达 调控 的 许多 原理 是 在 研究 五 . coi 乳糖 代谢 调节 时 被 发 现 的 。 法 国 巴 斯 德 研
穿 院 的 Francois Jacob 与 Jacques Monod 于 1960 年 在 法 国 科 学 院 院 报 (Proceeding of the
UErench Academy of Sciences) 上 发 表 了 一 篇 论文 ,提出 乳糖 代谢 中 的 两 个 基因 被 一 靠近 它们
的 遗传 因子 所 调节 。 这 二 个 基因 为 #- 半 乳糖 苷 酶 (8-galactosidase) 和 半 乳 糖苷 透 过 酶 (galac-
UEGside permease) 。 前 者 能 水 解 乳糖 成 为 半 乳 糖 和 葡萄 糖 ,后 者 将 乳糖 运输 到 细胞 之 中 。 在 此 文
市 他 们 首先 提出 了 操纵 子 (operon) 和 操纵 基因 (operator) 的 概念 ,他 们 的 操纵 子 学 说 (theory
iof operon) 使 我 们 得 以 从 分 子 水 平 认 识 基 因 表 达 的 调控 ,是 一 个 划时代 的 突破 ,因此 他 们 二 人
于 1965 年 过 获 诺 贝 尔 生理 学 奖 。

Jacob 与 Monod 所 提出 的 关于 基因 表达 调控 的 操纵 子 学 说 可 以 简 述 如 下 :有 一 个 专 一 的

| 阻 过 分 子 ( 蛋 白质) 结合 在 靠近 8- 半 乳糖 昔 酶 基因 上 面 , 这 段 DNA 他 们 称 之 为 操纵 基因 。 由 于
机 过 分 子 结合 在 DNA 的 操纵 基因 上 ,从 而 阻止 了 RNA 聚合 酶 合成 82- 半 乳糖 苷 酶 的 mRNA。
此 外 ,他 们 还 指 出 乳糖 为 诱导 物 , 当 乳 糖 结合 到 阻 遇 分子 上 时 , 即 阻止 阻 遏 分 子 与 操纵 基因 的
结合 ; 当 有 乳糖 时 , 阻 遇 分 子 即 失 活 ,mRNA 就 可 以 转录 出 来 如 果 去 掉 乳 糖 时 , 阻 歇 分 子 又 恢

复 其 活力 ,与 操纵 基因 DNA 结合 ,将 乳糖 基因 关闭 。 我 们 可 以 从 下 面 的 图 10;1 了 解 。 在 图 中

电 s2

上 边 为 乳糖 操纵 子 被 阻 道 的 状态 ,下边 为 被 诱导 的 状态 。
二 .乳糖 操纵 子

乳糖 操纵 子 (lac operon) 是 原核 生物 中 研究 得 最 清楚 的 一 种 操纵 子 , 它 的 调节 模式 如 图
10-1.。 在 乳糖 操纵 子 上 ,除去 8- 半 乳糖 苦 酶 (Z) 和 半 乳 糖苷 透 过 酶 (Y) 基 因 之 外 ,还 有 一 个 硫 半
乳糖 苷 转 乙 酰 酶 (thiogalactoside transacytylase) 基 因 (4)( 它 的 生理 功能 尚 不 清楚 ). 这 3 个 基

273

因 每 个 前 面 都 有 一 翻译 信号 ,引导 核糖 体 结 合 及 蛋白 质 合成 在 底 物 乳糖 不 存在 时 ,lac 操纵 子

基因 即 被 阻 台 ,8- 半 乳糖 苷 酶 只 以 很 少 的 拷贝 存在 (每 个 细胞 几 个 分 子 )。Jacob 与 Monod 发

现 ,操纵 基因 或 一 称 为 ;( 或 刀 的 基因 的 突变 会 引起 lac 操纵 子 基因 产物 的 合成 。 当 ;: 基因 失效 |
时 ,将 一 有 功能 的 ; 基因 引入 细胞 的 另 一 DNA 分 子 上 阻 巡 作用 可 能 恢复 这 表明 :基因 编码 一

个 可 扩散 的 分 子 , 引 起 基因 的 阻 遇 。 以 后 这 种 分 子 被 证 明 为 蛋白 质 ,现在 称 之 为 阻 遇 蛋白 (re-

pressor) 即 上 文 所 说 的 阻 遏 分 子 。 阻 遏 作用 并 不 是 绝对 的 ,即使 在 阻 遇 情况 下 ,每 个 细胞 也 有

少数 拷贝 的 太 半 乳糖 苷 酶 及 半 乳 糖苷 透 过 酶 。

乳糖 操纵 子 表达 状态
调节 基因 控制 部 位 结构 基因
ee

让 2
具 阻 遏 蛋白 与 操纵 基因 (O) 结 合 ， 全
下 阻止 Z, 了 7 及 4 转录
阻 遏 蛋白
乳糖 操纵 子 的 诱导 状态

诱导 物 诱导 物 - 阻 遏 蛋白
(乳糖 ) 复合 物

图 10-1 控制 乳糖 (lac) 操 纵 子 有 关 基 因 的 阻 电 蛋白 及 诱导 物
调节 基因 (编码 乳糖 阻 过 蛋白 。DNA 链 的 P 段 为 启动 子 。

当 供给 细胞 以 乳糖 时 ,lac 操纵 子 即 被 诱导 , 一 个 诱导 物 分 子 结合 在 阻 遏 蛋白 的 特异 部 各
上 ,引起 阻 过 蛋白 构象 的 改变 ,结果 使 阻 过 蛋白 从 操纵 基因 上 解 离 下 来 (图 10-1T) 。 在 此 系统 征
的 诱导 牺 并 非 乳 糖 本 身 , 而 是 乳糖 的 同 素 异 形体 , 称 为 异 乳糖 (allolactose)， 引 糖 进入 忆 co
细胞 ,被 转化 成 异 乳 糖 。 异 乳糖 与 阻 过 蛋白 结合 后 , 它们 即 从 操纵 基因 上 解 离 下 来 上 操纵 :
基因 即 开始 表达 ,及 半 乳糖 音 酶 的 浓度 可 以 增加 1 000 倍 之 多 .

有 些 结构 上 与 异 乳 糖 相似 的 及 半 屯 糖 音 也 是 8- 半 弛 糖 并 酶 的 诱导 物 ， 但 并 非

而 某 些 8- 半 乳糖 昔 为 底 物 ,， 却 非 诱导 物 。 汉 两 基 硫 代 半 乳 糖苷 〈isopropyl 省

称 IPTG) 是 一 种 特别 有 效 的 诱导 物 ,目前 在 基因 表达 的 研究 中 常常 使 用 , 在 基因 忌 达 的 东 妊
加 和 让 TG 之 后 ， 基因 的 表达 量 常 成 售 地 增加 。IPTG 不 是 乳糖 代谢 的 底 物 ， 必 于 非 代谢 请
扯

在 所 有 忆 . cox 的 启动 子 中 转录 起 始 部 位 之 前 的 第 35 及 第 10 核 苷 酸 ( 画 框 处 ) 都 是 高 度 便

这 两 个 区 域 的 突变 都 对 转录 有 明显 的 影响 ,突变 成 单 核 苷 酸 或 成 对 的 改变 ,也 可 能 是 缺 ，
(图 10-2) 。

274

人

<

启动 子 区

转录 起 始 部 位
由 二 二 全 人

Gin escacrnetArRDRRIICTCaAiL ee
GT A

SS 直下 AT 人 六
一 个 碱 基 缺 失 人 人 | am

二 个 碱 基 交 换
10-2 DNA 的 特殊 序列 对 巨 . coi RNA 聚合 酶 的 影响

第 五 节操 纵 基 因 的 结构

一 、 操 纵 基 因 的 鉴定
DNA 上 和 蛋白质 的 结合 部 位 ,如 一 种 操纵 基因 , 如何 能 够 鉴定 出 来 呢 ? 原来 操纵 基因 是 靠 阻
阻 过 蛋白 二
结合 处 无 切 点 现 现
盟 遍

到

0

mmmnnmnrFnmnn
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二

”nnano -ao -orrr--o-nzno->r-nzzr DNA 酶 切 侧 的 序列

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DNA 未 切片 段 一 一 一 一 和
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) 放射 自 显影

图 10-3 ”用 足迹 法 鉴定 蛋白 质 在 DNA 上 的 结合 部 位
\a) 示 足迹 法 如 何 揭示 蛋白 质 在 DNA 上 的 结合 部 位 ;(b) 乳 糖 阻 遏 蛋白 与 操纵 基因 结合 的 足迹 照片 。
〈1) 乳 糖 阻 遏 蛋白 与 操纵 基因 结合 ;(27DNA 分 子 被 DNA 酶 随机 切割 后 用 聚 两 精 栈 胺 凝 胶 电泳 分 离 ; (3)
DNA 分 子 处 理 如 左 方 , 但 是 用 阻 遏 蛋白 与 DNA 结合 ; (4) 核 酸 酶 未 分 解 处 表明 在 核 苷 酸 110 一 130 间 有 阻 遏 蛋
白 结合

下 品

台 95

遇 物 的 专 一 结合 以 免除 核酸 酶 (nuclease) 的 攻击 的 ,通过 DNA 片段 的 分 离 与 序列 测定 , 即 可
确定 其 结构 。 但 是 这 是 一 件 极 吃力 的 工作 . 由 于 我 们 利用 限制 性 内 急 酶 可 以 确 急 分 离 出 重 自
质 所 接触 的 部 位 的 片段 ,于 是 就 可 以 鉴定 操纵 基因 的 结构 ,与 测定 DNA 序列 的 化 学 法 相似
测定 操纵 基因 的 基本 原则 是 :如 果 一 条 DNA 片段 被 放射 性 原子 所 标记 ,这 条 链 中 任何 断裂 部
位 从 所 产生 的 标记 片段 的 大 小 即 可 推导 出 来 .DNA 片段 的 大 小 可 以 用 高 分 辩 的 聚 两 烽 酰 胺 将
胶 电泳 所 确定 .这 种 方法 称 为 足迹 图 法 (foot-printing method) ,这 是 仿照 用 纸 层 析 鉴定 蛋白 质
的 指纹 图 法 (finger printing method) 命 名 的 。 结 合 部 位 靠 结合 蛋白 使 核酸 酶 的 酶 切 作用 被 保
护 而 不 被 切割 (图 10-3) 。 靠 这 种 方法 我 们 可 以 了 解 蛋 白质 在 何 处 与 DNA 的 糖 磷酸 酯 骨架 上
的 碱 基 及 磷酸 进行 特殊 接触 。

二 .操纵 基因 的 结构

目前 已 有 许多 种 操纵 基因 用 足迹 法 定位 并 进行 了 DNA 序列 分 析 , 将 影响 阻 遏 物 结合 的 |
操纵 基因 突变 的 特性 加 以 描述 ,它们 最 重要 的 特征 是 反 向 重复 (inverted repeat) 或 毗邻 重复 |
Cnear repeat ) 。 例如 ,用 核酸 酶 消化 DNA 与 lac 阻 遏 物 的 复合 体 ,分离 得 到 一 个 乳糖 操纵 基因 j
片段 ,由 24 bp 组 成 ,其 中 约 有 16 个 是 与 二 重 对 称 轴 有 关 , 以 第 11 位 碱 基 为 中 心 , 其 结构 如 图
10-3 及 图 10-4。 操 纵 基 因 的 序列 测定 出 来 后 就 使 我 们 了 解 到 这 种 对 称 能 够 使 阻 遏 蛋白 多 聚 休 |
的 两 亚 基 可 以 同时 结合 在 操纵 基因 上 ,从 而 阻碍 了 转录 的 发 生 。 有

| 10 5 20

由 人

扣 人

和
四

10-4 lac 操纵 基因 的 序列
lac mRNA 转录 的 起 点 为 核 音 酸 1, 核 苷 酸 11 为 对 称 的 中 心 ,水 平 的 箭头 表示 操纵 基因 , 另 二 半 具 有 对 称 结
构 。 碱 基 对 改变 则 使 lac 操纵 基因 的 结合 减弱 ,序列 下 列 出 的 为 野生 型 。

三 ` 阻 歇 蛋 自 与 操纵 基因 的 结合

近年 来 以 X 射线 晶体 学 测定 几 种 结合 蛋白 与 DNA 的 三 维 结构 ,得 出 一 些 惊人 的 结果 便
们 表明 调节 蛋白 ( 阻 过 蛋白) 与 特异 的 DNA 部 位 是 如 何 结合 的 。 第 一 个 测定 的 结构 是 有 .< 大
CAP 蛋白 的 结构 ,随后 不 久 ,XGro 蛋白 、， 人 434 的 阻 过 蛋白 (4 的 近 这 先后 测 |
定 成 功 。 有 如 晶体 学 家 预测 的 那样 ,活性 结 人 们 为 两 个 相同 的 球状 多 肽 链 的 二 公 体 ,在 训 间
以 相反 的 取向 形成 一 个 二 重 对 称 轴 的 构象 ,与 DNA 的 结合 部 位 的 结构 相 吻 合 ( 图 10.5).
调节 蛋白 与 DNA 的 结合 是 由 两 股 较 短 而 邻近 的 螺旋 形成 。》 阻 过 蛋白 结构 是 在 第 2 股
第 3 个 - 螺 旋 上 ,Cro 和 CAP 也 有 类 似 结构 。 在 久 阻 遇 蛋 白 中 螺旋 3 从 蛋白 质 表面 突出 ,与 划
对 手 ( 即 ^ 阻 遏 蛋白 二 聚 体 第 二 个 亚 基 ) 恰 好 以 B-DNA(3.4nm) 的 螺旋 重复 距离 相隔 开 . 模 列
夫 明 螺旋 3 与 大 沟 恰 相 吻合 ,于 是 阻 歇 蛋 白 二 聚 体 通过 每 个 单 体 的 螺旋 3 与 操纵 基因 的 一 半
但 互 接触 而 与 DNA 的 一 侧 相 结合 。 大 部 分 接触 是 由 大 沟 的 碱 基 边 沿 与 螺旋 3 侧 链 的 氢 键 千

276

互补 完成 .下 列 事实 有 力 地 证 实 这 个 模型 , 即 影响 4 阻 歇 蛋白 与 操纵 基因 的 大 多 数 突变 种 都 是
改变 两 个 相 邻 -螺旋 的 氢 基 酸 。 最 近 这 个 模型 已 用 叭 菌 体 434 X 射线 分 析 直 接 证 实 。

和 阻 过 蛋白 二 聚 体

DNA- 结 合 结构 域
CNH;: 末端 )

操纵 基因 的 对 称 两 边

图 10-5 4》 阻 遏 蛋白 与 操纵 基因 结合 的 示意 图 , 示 N- 末 端 DNA 结合 的 结构 域 及 C- 末 端 结构 域

几 从 这 些 例 子 中 “螺旋 的 结构 以 及 氮 基 酸 序列 的 知识 使 我 们 可 以 靠 检 测 氨 基 酸 序列 就 能
够 预测 这 个 结构 是 否 可 以 形成 。 由 10 种 以 上 DNA 结合 蛋白 的 研究 结果 指出 :成 对 的 - 螺 旋
是 结合 专 一 性 DNA 调节 蛋白 部 位 的 一 般 特 征 。 与 DNA 相 结合 的 调节 和 蛋白 的 "- 螺 旋 - 转 折 -c-
螺旋 (helix-turn-helix) 的 超 二 级 结构 (motif) 的 发 现 是 阐明 遗传 调节 基础 的 一 个 重要 进展 。

螺旋 -转角 -螺旋 是 许多 原核 生物 调节 蛋白 中 蛋白 质 与 DNA 相互 作用 的 基础 。 螺 旋 - 转 角 -
螺旋 由 两 个 短 - 螺 旋 片 段 组 成 ， 各 约 7 一 9 个 氨基 酸 残 基 长 ， 中 间 由 一 条 8 转角 〈 约 20 个 氢
基 酸 长 ) 分 隔 开 。 通常 这 个 结构 本 身 并 不 稳定 , 但 它 代 表 蛋 白质 与 DNA 结合 的 反应 部 分 。 这
两 个 性 螺旋 中 有 一 个 称 为 识别 螺旋 (recognition helixz)， 因 为 它 含 有 许多 能 与 DNA 相互 作用

的 氨基 酸 。 这 个 螺旋 定位 于 DNA 的 大 沟 中 ， 吹 菌 体 434 的 Cro 阻 遇 蛋 白 就 是 一 个 典型 例子

《图 10-6) 。

除去 螺旋 -转角 -螺旋 之 外 ,近年 发 现 锌 指 (Zn finger) 和 亮 氨 酸 拉链 (leucine zipper) 也 是 调
节 绰 自 的 DNA 结合 结构 域 中 起 重要 作用 的 超 二 级 结构 。

锌 指 由 大 约 30 个 氨基 酸 残 基 组 成 ,其 中 的 4 个 残 基 或 者 是 半 胱 所 酸 (Cys) ,或 者 是 两 个 半
胱 氨 酸 (Cys) 和 两 个 组 氨 酸 (His) , 与 一 个 锌 (Zn:+ ) 原 子 配 位 。 这 种 超 二 级 结构 存在 于 许多 原
核 生物 的 DNA 结合 蛋白 中 .。 叹 菌 体 T4 有 一 种 基因 32 蛋白 (gene 32 protein) ,能 与 单 链 DNA
结合 ,就 具有 锌 指 的 结构 。

亮 氢 酸 拉链 是 一 种 特殊 的 c- 螺 旋 , 它 的 疏水 氨基 酸 集 中 排列 在 螺旋 的 一 侧 。 下 水 的 表面
是 2 个 蛋白 质 分 子 构成 二 聚 体 的 接触 点 .这 些 w- 螺 旋 的 显著 特点 是 亮 氨 酸 的 频繁 出 现 , 它们 在
每 7 个 氨基 酸 残 基 出 现 1 个 ,使 之 沿 着 -螺旋 的 疏水 侧 排列 成 直线 ,有 如 日 常 使 用 的 拉链 结
构 , 故 称 之 为 亮 氨 酸 拉链 。

277

图 10-6 上 图 :两 个 阻 过 蛋白 单 体 与 操纵 基因 结合 ,二 者 互相 适合 ;下 图 ;三 种 站
调节 蛋白 (从 Cro 从 阻 过 蛋白 Cap) 具 有 相似 结构 ,c- 螺 旋 由 - 转 折 连 接
圆柱 代表 “- 螺 旋 , 两 个 “- 阻 过 蛋白 单 体 在 操纵 基因 中 心 两 边 呈 对 称 状 结合 。

第 六 节 ， 乳 糖 操纵 子

二 局

起 初 我 们 认为 乳糖 操纵 子 仅仅 处 于 乳糖 阻 过 物 的 负 控制 之 下 ,但 是 现在 了 解 到 ,即使 有 :
导 物 存在 将 阻 歇 蛋白 中 和 ,操纵 子 的 正常 表达 还 必须 有 一个 蛋 白质 介 导 的 正 调 榨 信号 (图 0
1 作 避 在 研究 葡萄 糖 怎样 阻 断 许 多 种 操纵 子 (葡萄 糖 敏感 操纵 子 glucose-sensitive operons ) 的 功
能 时 , 发现 了 这 种 正 调控 蛋白 的 存在 ,每 一 种 正 调控 蛋白 控制 一 种 糖 (如 乳糖 、 半 乳糖 .阿拉 个
糖 及 麦芽 糖 ) 的 降解 。 例 如 ,已 . co 生长 在 既 有 葡萄 糖 又 有 乳糖 存在 的 介质 中 , 则 只 利用 葡萄

粮 , 而 乳糖 操纵 子 蛋白 质 处 于 低 水 平 。 同样 如 果 既 有 萄 葡 糖 又 有 半 乳 糖 存在 时 , 半 乳 糖 操纵 子
278

， 即 无 活性 。 葡 萄 糖 比 其 它 糖 类 被 优先 利用 的 原因 还 不 清楚 。 这 可 能 是 由 于 在 进化 过 程 中 细菌

各 常 处 于 谨 信 葡萄糖 的 环境 之 中 ,长 期 适应 的 结果 。
调节 基因 乳糖 操纵 子
2 To 0
阻 过 蛋白 6- 半 乳糖 背 酶 通 透 酶 乙酰 化 酶
二 色 体
| 1040 | 3510 780 825

启动 子 启动 子 “操纵 基因

图 10-7 ”乳糖 操纵 子 及 其 有 关 的 调节 基因
数字 表示 每 个 基因 的 碱 基 对 数 。
葡萄 糖 的 抑制 作用 并 非 由 于 不 同 糖 类 进入 细胞 的 速度 有 所 不 同 , 而 是 由 于 转录 作用 受到
影响 。 这 首先 是 由 于 发 现 了 使 乳糖 操纵 子 对 葡萄 糖 不 敏感 的 控制 区 发 生 了 突变 的 结果 。 用 这
种 突 变 体 乳糖 操纵 子 可 以 最 大 限度 地 诱导 ,即使 有 大 量 葡萄 糖 存在 之 时 也 是 如 此 。
(一 ) 阻 遏 物
RNA 育 合 酶 (与 启动 子 结合 ) 及 阻 遏 蛋白 (与 操纵 基因 结合 ) 与 DNA 结合 部 位 的 阐明 向
情 或 们 指出 阻 过 蛋白 是 如 何 工 作 的 。 它 们 以 物理 方式 阻止 在 启动 子 上 RNA 聚合 酶 的 结合 以 及
URNA 合成 的 起 始 . 乳糖 操纵 子 是 由 同样 的 21 个 DNA 碱 基 对 组 成 的 ,它们 是 乳糖 操纵 子 mR-
NA 最 初 21 个 核 苷 酸 的 模板 。 因此 ,lac 阻 遇 物 覆盖 着 模板 ,恰恰 是 RNA 聚合 酶 要 占据 的 催化
车 让 ,从 而 阻止 它 靠近 模板 ,其 它 操纵 基因 都 与 启动 子 的 不 同 部 位 重 友 ,但 它们 都 干扰 RNA
恒 束 合 酶 的 结合 。 恰 如 我 们 所 预计 , 阻 遏 蛋白 仅 阻 止 RNA 合成 的 起 始 , 一 旦 延长 开始 后 ,对
ULRNA 链 的 生长 就 没有 影响 。
” (二 ) 辅 阻 遏 物
U 。 阻 过 物 并 非 永远 能 阻止 mRNA 的 合成 .否则 ,它们 就 将 永远 抑制 其 特异 蛋白 质 的 合成 . 许
和 分子 能 以 性 的 及 无 活性 的 两 种 形式 存在 ,这 要 看 它们 与 其 适当 的 诱导 物 或 辅 阻 过
则 物 Ceorepressor) 是 否 结合 而 定 ,诱导 物 的 结合 可 使 阻 遏 物 失 活 。 例 如 , 当 与 一 8- 半 乳糖 苷 如 乳
糖 或 异 乳 糖 (allolactose ,乳糖 的 代谢 物 ,为 天 然 诱导 物 ) 结 合 时 ,lac 阻 遏 物 即 不 能 与 其 专 一 的
忆 却 纵 基因 结合 .因此 ,加 8- 半 乳糖 昔 于 生长 细胞 中 ,以 降低 lac 阻 歇 蛋白 的 分 子 浓度 ,可 使 太 半
糖苷 酶 得 以 合成 。 反 之 , 辅 阻 如 物 的 结合 则 将 无 活性 的 阻 遏 物 变 为 有 活性 的 形式 。 例 如 ,在
胸中 加 入 色 氨 酸 可 以 激活 阻 过 物 ,后 者 控制 色 氨 酸 生 物 合成 所 需 酶 的 合成 ,这 台 迅 速 切断 其
RNA 分 子 的 合成 (图 10-8) 。

(3

RE
5-TA SCAcScSCCAGGCTTTACATTTATGCTTCCGGECTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATG-3
一 1

一 35 0 二 全 用人 于 二 于 全

小， 了

(2 )
图 10-8 ”乳糖 操纵 子 的 启动 子 与 操纵 基因 部 位 的 重 和 到 DNA 链 与 mRNA 在 序列 上 一 致
CD)DNA 阻 过 蛋白 结合 区 ;(2) 启 动 子 同 源 识 别 系列 ;(37 对 称 的 操纵 基因 。
一 一 示 被 阻 过 蛋白 覆盖 的 启动 子 。
299

乳糖 操纵 子

的 转录

10-9 有 功能 阻 遇 蛋白 比 失 活 的 阻 遏 蛋白 占 优势 ,在 无 外 加 8- 半 乳糖 苷 时 ,8- 半 乳糖 苷 酶 分 子 不 产生

在 阻 遏 物 与 其 诱导 物 或 辅 阻 过 物 之 间 不 形成 共 价 键 。 每 个 阻 遏 物 分 子 的 一 部 分 在 形状 王

与 其 诱导 物 或 辅 阻 过 物 的 专 一 部 分 是 互补 的 。 二 者 以 次 级 键 ( 氢 键 ` 盐 桥 或 范 德 华 力 ) 相 连结

由 于 这 些 键 是 弱 键 ,它们 可 以 快速 形成 或 快速 破坏 ,使 阻 遇 物 (活性 的 或 非 活 性 的 ) 迅 速 调整

以 适应 生理 的 需要 。 例 如 ,8- 半 乳糖 苷 酶 mRNA 的 合成 在 去 掉 乳 糖 后 几乎 可 以 立即 停止 (图

10-9) 。 阻 遇 物 与 诱导 物 相 结合 构 型 上 的 可 逆 变 化 是 别 构 酶 转化 的 又 一 个 例证 (图 10-10)。
(al)

操纵 基因 突变
突变 桨 色 体 ， 调节 基因 5
一 王 <
山
6 868695658
人 3 和
(1) (2)
突变 染色 体 攻 翅 y

操纵 子 产 物 合成
一 一 -一作 一- 一 | 一 一 一 | 一

SS
559 6 - 半 屯 糖苷 酶 mRNA 不 合成

7

8
@
光
〇
ee
沁
ee
ee
ee
县

图 10-10 正常 及 突变 的 操纵 基因 对 专 一 的 mRNA 合成 的 调控
4a) 合 突变 操纵 基因 的 细胞 ; (b) 含 正常 操纵 基因 及 突变 操纵 基因 的 细胞 o* 比 O 占 优 势 。

《12 阻 过 蛋白 不 能 与 突变 操纵 基因 结合 ; (2) 在 缺少 诱导 物 时 及 半 乳糖 苷 酶 及 通 透 酶 之 合成 。
280

二 、 环 式 AMP

葡萄 糖 对 转录 的 作用 并 不 是 直接 的 ,其 降解 产物 (降解 物 catabolite) 是 靠 降 低 细 胞 内 的 环

式 AMP(cAMP) 的 含量 起 作用 。 此 关键 代谢 物 (CAMP) 对 葡萄 糖 降解 代谢 所 抑制 的 各 种 操纵

子 的 转录 都 是 需要 的 , 葡萄糖 降解 物 控制 细胞 内 cAMP 水 平 的 方式 还 不 清楚 。ATP 是 c<AMP

的 直接 代谢 前 体 ,担任 这 种 转化 的 酶 是 腺 苷 酸 环 化 酶 (adenylcyclase) ,此 酶 可 能 受 代谢 降解 物

的 直接 抑制 .另外 有 一 种 磷酸 二 酯 酶 (phosphodiesterase) ,能 将 cAMP 转变 成 AMP , 故 这 种 抑
制作 用 可 能 受 <AMP 分 解 的 速度 所 控制 (图 10-11) 。

NH :
N
第 本
N N

下 En

OH OH

?
蛛 并 酸 环 化 酶 ae |
Tai 二 二 二 三 :ESESESES 号 二
RNA 聚合 酶 十 环 式 《 T>
调 AMP 十 蛋白 因子 ie |
， 尖 技 关机 全 本

环 式 AMP 代谢 物

蛋白 质 因子 本

(p) 一 D OH 促进 ?
磁 酸 二 酯 酶 二
N~
2
NS

5 ANMP

RNA

(P)-O-cH， O

OH OH
图 10-11 环 式 .AMP 对 代谢 降解 物 敏感 的 转录 的 控制
环 式 AMP 并 不 直接 促进 lac mRNA 的 合成 ,而 靠 结 合 在 代谢 降解 物 基因 激活 蛋白
(catabaolite gene activator protein , 简称 CAP) 上 起 作用 。CAP 是 一 个 分 子 量 为 45 kD 的 二 聚
体 。 它 对 转录 没有 影响 ,只 有 cAMP 与 它 结合 才 起 作用 。 此 后 它 就 获得 与 DNA 专 一 部 位 结合
的 能 力 , 这 时 就 增加 邻近 操纵 子 的 转录 速度 。CAP 对 一 切 葡萄 糖 敏 感 的 操纵 子 都 是 正 调控 因
了 于" 故 突变 的 细胞 都 不 能 利用 大 多 数 的 糖 类 。

三 .CAP 对 RNA 聚合 酶 的 控制

CAP 能 控制 RNA 娟 合 酶 在 乳糖 启动 子 上 的 结合 。CAP 或 者 阻 遇 物 对 mRNA 生长 速度
都 没有 任何 影响 。 但 二 者 则 控制 RNA 聚合 酶 分 子 与 启动 子 结 合 的 速度 ,一 个 为 正 调控 , 另 一
为 负 调 控 。 实 际 上 阻 遇 物 阻 断 KNA 聚合 酶 的 结合 ,CAP 帮助 RNA 聚合 酶 有 效 地 与 乳糖 启动 ，
子 结合 ,使 更 多 的 RNA 的 合成 起 始 进行 。 有 如 操纵 基因 一 样 ,CAP 与 乳糖 操纵 子 DNA 结合
的 部 位 也 由 阻止 其 功能 的 突变 做 出 了 标记 , 即 在 <AMP 较 高 的 条 件 下 并 不 刺激 乳糖 酶 ,用 足

281

迹 法 鉴定 出 一 个 专 一 的 结合 序列 ,重要 的 结果 是 CAP 及 cAMP 的 复合 物 在 启动 子 上 与 RNA
聚合 酶 相 结合 ( 见 图 10-12 及 图 10-13) 。

和 本 人 入 的 开 妇

_ 因 旭 和 折 革 固 本 只 -天 烙 |
了 上 cvz{ 二 0 mRNA
5: adAAXMGcG5G2KGTGAGcacAAcGcAATTAATGTGKGTTAGCTESXACrcATTAGGCACCCCAGGCTFTACATTFTATGCTrCCGGCTCGTATGTTGTGTG GGAATIGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG ，
TCGAGTGAGTAATCCGTGGGGTCCGAAATGTAAATACGAAGGCC AGCATACAACAC ACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCGATA Ac ，
” 3:CCTTTCGCCCGTCACTCGCGTTGCGTTAATTACACTCAA 二 ET CTTTGTCGATACTGGT
四 止 CAP 与 DNX 结合 的 奖 变 存 位 启动 子 共有 序列
10-12 五.coli 乳糖 操纵 子 调 控 区 的 核 苷 酸 序 列 及 结构
CAP 部 位 启动 子 操纵 基因 条 件 结果
AR 5. 无 转录 , 因 阻 歇
9 1. 无 cAMP
蛋白 抑制 RNA 聚
无 诱导 物 村
CANMP 阻 过 和 蛋白 合 酶
3 6. 无 转录 , 因 阻 过
AN 2.cAMP 存在 1
es IPTG 蛋白 抑制 RNA 聚
|

无 诱导 物

合 酶
ES 3. 无 <cAMP 到 少量 转录 因 CAP

有 诱导 物 (IPTG) 不 结合

| 一 让 二 8. RNA 聚合 酶 结
一 一 一 1
人 和 < 一 一 > 合 , 启 动 乳 糖 操纵
SERIES 有 诱导 物 均 存 在 “ 子 mRNA 合 成
10-13 ”乳糖 操纵 子 转录 被 CAP、 阻 遇 蛋 白 .<AMP 及 诱导 物 ( 如 天 然 诱 导 物
异 乳 糖 或 合成 的 诱导 物 , 异 丙 基 硫 半 乳糖 苷 IPTG ) 的 调控

第 七 节 “阿拉伯 糖 操纵 子

细菌 中 有 一 个 阿拉 伯 糖 操纵 子 (arabinose operon) ,在 葡萄 糖 会 乏 时 , 它 能 利用 阿拉 伯 糖 作 轩
为 能 源 。 阿 拉 伯 糖 C 基因 编码 一 种 C 蛋白 , 它 能 激活 阿拉 伯 糖 BAD 操纵 子 的 转录 ,此 操纵 子 由 旺
araB,ara4 及 araD 基因 组 成 (图 10-14) 。

C 蛋白 必须 与 阿拉 伯 糖 形成 复合 物 , 才 能 完成 调控 ,因此 只 有 当 底 物 存在 时 , 酶 才能 生成 。
与 乳糖 操纵 子 相似 ,阿拉 伯 糖 操纵 子 对 葡萄 糖 很 敏感 ,因此 除 阿 拉 伯 糖 及 C 和 蛋白 外 , 它 也 被
AMP 及 CAP 控制 。 两 种 激活 剂 ,C 蛋白 及 CAP 如 何 调节 一 个 操纵 子 呢 ?

这 个 机 理 比较 复杂 ,但 是 可 以 理解 。C 蛋白 既是 激活 剂 又 是 阻 过 物 ,而且 它 以 两 种 不 同方
式 作为 阻 过 物 。C 蛋白 在 阿拉 伯 糖 操纵 子 中 的 3 个 不 同 部 位 上 结合 ,控制 aral,araO， 及 araO，
区 (图 10-15) 。

中 间 区 araO 与 C 基因 的 启动 子 重 概 , 当 细 胞 中 有 足够 的 C 蛋白 积累 时 ,只 起 阻 过 C 基
因 mRNA 合 成 的 作用 .因此 C 基 因 是 自我 调节 的 (autoregulated) 另外 两 个 C 蛋 白 结合 部

入 ,aral 及 ara0, 则 与 CAP 结合 部 位 共
|

同 起 着 调节 BAD 操纵 子 的 阻 歇 及 激活 PP 尖 由 考 四 基因
和 苦 用 , 据 认为 当 cAMP 浓度 低 ,CAP 结 creww 要 下
人

是 三 聚 体 或 四 聚 体 ), 即 与 aral 及 远离 “20 | 中 入 品 本 6

的 araO, 部 位 结合 ,于 是 将 DNA 拉 成 阿拉 全

一 个 环 ( 见 图 10-15)。 在 这 个 阻 过 模型 4_ | 全

中 ,不 论 阿 拉 伯 糖 是 否 与 之 结合 ,C 蛋白 0 异 构 酸 ||

都 不 能 在 BAD 启动 子 上 激活 RNA 聚 本 江门

合 酶 。 然 而 afal 后 面 CAP-cAMP 的 结 激 酸 |

洽 改 变 位 于 aral 的 C 蛋白 的 活性 ,可 能 “车 本 狂 5

千 直 接 与 之 接触 。 这 时 C 蛋白 放出 关 和 别 构 本 |
，ara0, 部 位 ,于 是 并 不 形成 环 , 而 它 也 能 、 |

激活 RNA 聚合 酶 ,以 使 邻近 的 BAD 启 图 10-14 大 肠 杆 菌 的 阿拉 伯 糖 操纵 子

动 子 开始 合成 ,对 C 蛋 白 激活 BAD 转 ( 正 调控 )

Ca) 阿 拉 伯 糖 操纵 子 的 调节 部 位
人
araO， araO) araT
二
C mRNA 二 BADmRNA
148 核 苷 酸

Cb) 阿拉 伯 糖 操纵 子 的 控制
条 件 结果

图 10-15

ara O， araO，

araO:

ara O)

BAD mRNA

大 肠 杆 菌 中 阿拉 伯 糖 操纵 子 的 调节

Ca) 阿拉 伯 糖 操纵 子 的 调节 部 位 ;(b) 阿 拉 伯 糖 操纵 子 的 控制 。1. 无 C 蛋白 ;2.C 蛋白 存在 ,阿拉 伯 糖 <AMP
低 ;3.C 蛋白 及 阿拉 伯 糖 。A. BAD 启动 子 不 活化 ,C 基因 转录 ;B. BAD 启动 子 阻 过 ,C 基因 启动 子 阻 遏 5;C.BAD N

启动 子 活化 ,C 基因 启动 子 阻 遏 。

283

本

录 来 说 , 它 必须 首先 结合 阿拉 伯 糖 ,所 以 ,两 个 小 分 子 ,cAMP 和 阿拉 伯 糖 ,对 BAD 有 效 的 表
达 是 必需 的 。

至 于 乳糖 操纵 子 , 细 胞 利用 操纵 子 上 的 专 一 的 调节 因子 (lac 阻 过 物 或 C 蛋白 ) 和 CAP 蛋白 和
去 检测 专 一 性 糖 的 存在 及 葡萄 糖 的 缺少 , 它 是 与 阿拉 伯 糖 操纵 子 不同 的 机 制 。 像 阿拉 伯 糖 C 蛋
白 那样 ,任何 DNA 结合 蛋白 可 能 既是 激活 剂 又 是 阻 过 物 , 这 要 看 它 是 否 阻 断 或 促进 RNA 聚合
酶 与 启动 子 结合 而 定 。 而 鸣 菌 体 和 阻 巡 物 则 二 者 兼 而 有 之 。 当 葡萄 糖 受 限 制 时 , 有 时 CAP 蛋白 也 四
充 作 阻 遏 物 ,阻止 不 需要 的 基因 的 表达 .。 忆 .co 的 乳糖 操纵 子 中 CAP 和 蛋白, 既 作为 激活 剂 又 作为 时
阻 过 物 的 这 种 复杂 控制 即 是 一 例 。 此 外 ,还 有 一 个 结合 两 个 操纵 基因 的 半 乳 糖 调节 的 阻 遏 物 ,这 四
样 可 以 将 DNA 拉 成 一 个 环 , 有 如 阿拉 伯 糖 操纵 子 那样 。 最 近 的 研究 表明 ,甚至 在 乳糖 操纵 子 上 ,
CAP 可 能 也 有 一 个 像 阻 遏 物 的 次 要 功能 。 除 去 乳糖 操纵 子 的 主要 启动 子 之 外 ,还 有 一 个 第 二 位 置
强 的 启动 子 上 游 区 ,在 该 处 RNA 聚合 酶 强烈 结合 ,但 是 并 不 有 效 地 起 始 RNA 的 合成 ,因为 这 两
个 启动 子 重 至 ,这 种 结合 可 以 阻 断 RNA 聚合 酶 与 主要 启动 子 的 相互 作用 .CAP 结合 部 位 与 第 二 量
个 启动 子 重奏 ,因此 CAP 蛋白 阻止 RNA 聚合 酶 结合 在 第 二 个 启动 子 上 , 同时 它 直接 激活 RNA 重
聚合 酶 结合 在 主要 启动 子 上 ,CAP 这 两 种 功能 对 lac 操纵 子 的 表达 都 是 必要 的 。

CAP 及 阿拉 伯 糖 C 蛋白 代表 两 类 细菌 中 存在 的 激活 剂 :一 般 激活 剂 如 CAP, 其 功能 是 在 时
一 定 条 件 下 所 需要 ,如 葡萄 糖 、 氨 或 碟 酸 盐 受 限 时 ; 另 一 类 是 特异 的 激活 剂 ,如 阿拉 伯 糖 C, 它 时
们 控制 少数 基因 ,其 产物 是 将 特殊 化 合 物 降解 (如 阿拉 伯 糖 .麦芽糖 或 丝氨酸 )。

第 八 节 “氨基 酸 合成 的 操纵 子

生物 细胞 中 的 氨基 酸 合成 也 是 由 操纵 子 调 节 的 ,细胞 需要 某 种 氨基 酸 时 其 基因 即 表 达 ,不 ，
需要 时 基因 即 关闭 ,达到 经 济 的 原则 。 目 前 有 多 种 氨基 酸 合成 的 操纵 子 的 结构 已 研究 清楚 ;如
色 氨 酸 、 苏 氨 酸 组 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 异 亮 氨 酸 等 十 余 种 ,现在 我 们 详细 讨论 色 氨 酸 操纵 ，
子 (trp) 的 基因 表达 的 调控 。

一 ` 色 氨 酸 操纵 子

色 氨 酸 操纵 子 控制 5 种 酶 的 合成 ,由 zzz 天 ,D,C,B,4 编码 (图 10-16)。 当 色 氨 酸 浓度 低 蜂
时 ,这 5 个 邻近 的 zrp 基因 才 开始 转录 成 mRNA。 色 氨 酸 不 是 一 个 诱导 物 ,而 是 帮 为 一 个 辅 阻
歇 物 (corepressor)。 辅 阻 过 物 活化 其 专 一 的 阻 过 物 , 因 此 它 能 与 zrp 操纵 基因 结合 并 阻止 其 相 闻
应 基因 的 转录 。 当 色 氨 酸 浓度 低 时 ,zrz 操纵 基因 不 被 占据 ,zrp mRNA 的 合成 在 邻近 的 启动 沪
处 开始 进行 .不 过 ,rp mRNA 天目 起 始 合成 ,并 不 自动 生长 到 全 长 度 ,而 大 多 数 ip mRNA 人
子 在 第 一 个 zzp 基因 (trz 书 ) 开 始 转录 之 前 即 停止 生长 (图 10-16) 。 接近 此 序列 的 二 器 及 zz 区
之 前 为 转录 的 终止 子 (terminator), 它 由 一 个 特征 的 RNA 发 严 环 组 成 (图 10_16 中 3 区 及 4 区
的 序列 构成 ), 随 后 为 8 个 屎 喀 啶 (U) 残 基 , 此 处 即 所谓 弱 化 子 Cattenuator) ,RNA 合成 通常 在
此 即行 停止 ,前 导 RNA 长 为 139 个 核 苷 酸 (图 10-17)， 前 导 序列 有 3 个 特征 可 使 RNA 聚合 酶
通过 弱化 子 。(1) 除 去 由 前 导 的 1 区 与 2 区 所 形成 的 终止 子 发 夹 外 还 有 第 二 个 发 赤 ;(2)2 区 与

3 区 互补 ,于 是 又 形成 一 由 2 区 及 3 区 组 成 的 另 一 发 夹 ,从 而 阻止 终止 子 发 夹 的 形成 ;(3) 引 导
RNA 编码 14 个 氨基 酸 组 成 的 短 前 导 肽 ,其 前 面 为 一 长 的 核糖 体 结合 位 点 .前 导 肽 有 一 特殊 的

序列 特征 : 即 2 个 色 氨 酸 密码 子 排 成 一 列 , 在 编码 制造 氨基 酸 的 酶 的 其 它 操 纵 子 的 相应 序列 中
284

尚未 发 现 ( 表 10-2) 。 而 亮 氨 酸 的 前 导 肽 有 4 个 相 邻 的 亮 氨 酸 密码 子 排 成 一 列 ,组 氨 酸 操纵 子
前 导 肽 有 7 个 组 氨 酸 密码 子 排 成 一 列 。

前 导 上 六 玖 t7p tr 六 C tmp 吓 trb4

下

岂 弱化 的 mRNA
|

〈2) (3) (4) 《5) (6)

10316 天 .coli 的 色 氨 酸 操纵 子 , 表 示 前 导 肽 与 编码 trp 酶 的 结构 基因 的 关系
《17 核糖 体 结合 部 位 ;(2) 氨 基 革 甲酸 合成 酶 ! (3) 磷 酸 核糖 氨基 葵 甲 酸 转移 酶 ; (4) 磷 酸 核糖 氨基 茶 甲 酸 异
构 酶 - 呵 | 唆 甘 油 磷 酸 合成 酶 ;5)8- 色 氨 酸 合成 酶 !(6)e- 色 氨 酸 合成 酶 。

表 10-2 ”弱化 子 控制 的 含有 和 氨基酸 生 物 合 成 的 操纵 子 的 前 导 肽

(1)

操纵 子 前 导 肽 的 氨基 酸 序列
色 氢 酸 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser
苏 氨 酸 Met Lys Arg lle Ser Thr Thr lle Thr Thr Thr JIle Thr lle Thr Thr Gly Asn Gly Ala Gly
组 氨 酸 Met Thr Arg Val Gln Phe Lys His His His His His His His Pro Asp
异 亮 氨 酸 - Met Thr Ala Leu leu Arg Val lle Ser Leu Val Val Jle Ser Val Val Val Ile…
线 氨 酸 GEDA …Jle JIle Pro Pro Cys Gly Ala Ala Leu Gly Arg Gly Lys Ala
亮 氨 酸 Met Ser His lle Val Arg Phe Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asn Ala Phe Jle Vel…
…Arg Gly Arg Pro Val Gly Gly Jle Gln His
苯 丙 氨 酸 Met Lys His Jle Pro Phe Phe Phe Ala Phe Phe Phe Thr Phe Pro
” 蜡 亮 氨 酸 - 线 氢 酸 B Met Thr Thr Ser Met Leu Asn Ala Lys Leu Leu Pro Thr Ala Pro Ser Ala …

… Ala Val Val Val Val Arg Val Val Val Val Val Gly Asn Ala Pro

PPpAAGUUCAC

SS
7
户
全
人
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<
< 前 导 肽
C
8 Ne 一 ty 一 Alo 一 一 ile- 一 phe- 一 yal- 一 Leu 一 ts 一 Gy 一 f 生 一 Tp 一 Arg- 一 Thr 一 3e 一 停
4CAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUUGGUGGCGCACuUUCCUGAA414
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AUGCGuACCACY 2
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Ne 一 Gin 一 Th

了 nm mn
4 AACAAAAUUAGAGAAUAACAAUGCAAACA.-
vcaAGcceGccuuuuuuuuc

如

前 导 末 端
(弱化 部 位 )

10-17 trp 操纵 子 的 前 导 肽 RNA 核 苷 酸 序列 特征
这 些 密 码 子 的 功能 是 使 企图 翻译 前 导 肽 的 核糖 体 停 止 前 进 . 而 当 色 所 酸 缺 乏 时 ,核糖 体 达
到 色 氨 酸 密码 子 时 必须 停止 ,围绕 色 氢 酸 密码 子 的 RNA 停 下 来 结合 在 核糖 体 上 ,不 能 成 为 发

夹 环 的 一 部 分 ,图 10-18 即 显示 这 个 结果 :在 色 氨 酸 密码 子 处 被 捕捉 的 核糖 体 被 放 在 可 使 2 区
285

与 3 区 自由 配对 的 位 置 上 ,于 是 终止 子 发 夹 (3,4) 不 能 形成 ,RNA 聚合 酶 跨 过 弱化 子 达到 操纵

子 , 使 trp 酶 表达 。 反 之 ,如 果 有 充分 的 色 氨 酸 , 使 核糖 体 得 以 通过 名 氨 酸 密码 子 前 进 , 则 核糖
体 阻止 序列 2, 使 3,4 区 形成 终止 子 发 夹 , 则 转录 在 前 导 RNA 末端 流产 。 第 三 种 可 能 性 是 在 色 电
氨 酸 密码 子 之 前 翻译 停止 (因为 某 些 其 它 氨基 酸 缺 乏 ) ,或 者 不 能 使 翻译 起 始 进行 ,那么 ,序列
1 与 序列 2 自由 配对 , 则 终止 子 结构 再 度 形成 ,以 停止 rp 操纵 子 的 表达 。 前 导 肽 被 认为 在 合成 量
时 对 核糖 体 的 就 位 是 重要 的 ,但 立即 就 被 细胞 的 蛋白 酶 破坏 近 。

1， 高 色 氨 酸

3， 无 蛋白 质 合 成
1 2
3 基 才

d.

图 10=18 tp 操纵 子 的 弱化 子 上 的 转录 终止 由 色 氨 酸 的 供应 控制
a. 序列 3 与 序列 4 配对 ,形成 转录 终止 发 夹 ,RNA 合成 停止 ,trp 酶 不 表达 ;b. 核糖 体 前 进 至 前 导 肽 终止 密
码 子 , 封 闭 序列 2;c. 核糖 体 在 邻近 的 trp 密码 子 停 在 让 序列 2 与 3 配对 ,阻止 3,4 终止 发 夹 形成 ,RNA 育 合 酶
进入 操纵 子 , 制 造 trp 酶 的 mRNA;d, 如 核糖 体 在 开始 前 导 肽 AUG 的 翻译 ,1,2 发 夹 形成 ,阻止 2,3 形成 。

阻 遏 作用 与 弱化 子 控制 之 间 可 能 同时 存在 ,使 得 细胞 内 色 氨 酸 微细 调节 到 一 个 水 平 ,使 得
两 步 反 应 更 紧急 地 达到 色 氢 酸 饥 狐 , 起 始 反应 是 停止 阻 巡 物 的 结合 ,更 大 的 饥 狐 则 导致 弱化 作
用 的 松弛 ,其 它 氨 基 酸 的 操纵 子 , 如 组 氨 酸 及 亮 氨 酸 操纵 子 没 有 阻 过 物 ,它们 完全 依靠 弱化 作
用 来 控制 。

下 面 再 讨论 一 下 弱化 子 的 重要 性 。 色 氮 酸 操纵 子 的 转录 必须 由 一 个 可 控制 的 终止 部 位 来
调节 ,这 个 部 位 就 是 弱化 子 。 它 位 于 操纵 子 与 这 个 氨基 酸 合成 途径 的 第 一 个 酶 的 基因 之 间 , 如
图 10-19

弱化 子 这 个 调节 部 位 与 某 些 操纵 子 末 端的 停止 信号 相似 ,含有 一 个 富 含 GC 的 序列 ,随后
为 一 个 富 含 AT 的 序列 。 这 两 个 区 域 都 以 弱化 子 为 中 心 , 表 现 出 对 称 的 结构 ,如 图 10-20。

哗 化 子 部 位 与 调节 trzp 基因 转录 的 操纵 子 部 位 是 互补 的 , 当 色 氨 酸 充裕 时 , 色 氮 酸 转 录 的

起 始 就 被 色 氨 酸 阻 过 物 复合 物 与 操纵 子 相 结合 而 阻拦 住 ;而 当 细胞 中 色 氨 酸 浓度 下 降 时 , 阻 遇
286

就 被 取消 ,转录 又 再 开始 运行

全 酶 类 的 基因
2

贡生 加 村 活 || 重 训 辣 生 了 2 下 区 本 可 部

此 a

和 人

站 10-19 trp 操纵 子 的 示意 图
略为 咎 动 了 ,0 操纵 子 ,。 能 化 子 ,L 为 前 导 肽 ,,D,C,B,4 为 色 所 本 合成 途径 中 的 本 类 基因 ,在 rp 操 欠 了
和 中 操纵 子 (O) 与 启动 子 (P) 是 重 权 的 。
和

富 含 GC 区 域

这 人 AGLCLCGC | CT AAT GA; GCGGGCT 下 ; TITTTG; IAAI ICAAAAI : 工 工

r-------=---------- rr- 一 ---------， To-------- 一 ---

1 1 1 4
二 | 全

人 TcGGGCG: GAi MEA CT cGCccGA: AAA IAAAAC: 开工 GTTTT| AAA

玫 二 二 世 忆 站 证 ea enel | Fammmmmwm 抽 wa 证 mmsegi | 首 虽 2 记忆 忆 再 aemo

前导 mRNA

图 10-20 trP 弱化 子 部 位 的 碱 基 序 列
富 含 GC 区 域 与 富 含 AI 区 域 中 的 碱 基部 都 具有 二 重 轴 对 称 的 结构 。

到 二 、 组 氨 酸 等 的 操纵 子

大 肠 杆菌 其 它 所 基 酸 合成 的 操纵 子 也 都 含有 弱化 子 。 每 个 操纵 子 的 前 导 肽 (leader
ptidey 链 中 含有 该 操纵 子 所 调控 的 氨基 酸 的 大 量 残 基 。 例 如 , 苏 氨 酸 操纵 子 含有 合成 苏 氨 酸
及 异 亮 氨 酸 的 酶 ,其 前 导 肽 在 16 个 残 基 序列 中 含有 8 个 苏 氨 酸 及 4 个 异 亮 氨 酸 ,如 图 10.21

A， Met- Lys- Arg- llez Ser- Thr- Thr- Jle- Thr- Thr- Thr- lle- Thr- Jle- Thr- Thr
( 式 氢 酸 纪 AUG AAA CGC AUU AGG ACC 'ACC AUU ACC ACC ACC AUC ACC AUU ACC AcCC 3' 操 纵 子 )
马 ， Met- Lys- His- Je- Pro- Phe- Phe- Phe- Ala- Phe- Phe- Phe- Thr- Phe- Pro- Stop
(其 两 氨 酸 SAUG AAA CAC AUA-CCG UUU UUC UUC GCA UUC UUU UUU ACC UUC CCC UGA3' 操 纵 子 )
(， Met- Thr- Arg- Val- GIEE Phe- Lys- His- His- His- His- His- His- His- Pro- Asp
《组 氨 酸 5 AUG ACA CGC GUU CAA UUU AAA CAC CAC CAU CAU CAC CAU-CAU CCU GAC3 操纵 子 )
图 10-21 mRNA 相应 部 分 的 前 导 肽 的 氨基 酸 序列 及 碱 基 序列
A. 苏 氨 酸 操纵 子 ;B. 基 丙 氨 酸 操纵 子 !C- 组 气概 生 了 ，，
在 茶 丙 氨 酸 操纵 子 的 前 导 肽 的 15 个 残 基 序列 中 存在 7 个 茶 丙 氨 酸 ,而 在 组 氨 酸 操纵 子 的
前 导 肽 所 含 的 7 不 组 氨 酸 残 基 则 列 成 一 排 。 很 明显 ,这 些 前 导 肽 的 mRNA 正 是 设计 成 能 够 察
觉 出 所 被 合成 的 蛋 自 质 的 氨基 酸 水 平 。 如 果 相 应 的 氨基 酰 tRNA 缺乏 时 ,前 导 肽 的 翻译 就 自
动 停止 下 来 。 例如 ,在 色 氨 酸 操 纵 子 中 被 阻止 的 核糖 体 促使 mRNA 的 构象 开放 ,使 RNA 聚合
酶 能 阅读 过 弱化 子 部 位 。 在 组 氨 酸 操纵 子 前 导 RNA 存在 7 个 编码 组 氨 酸 的 密码 子 就 强化 了

检查 系统 的 灵敏 性 。 这 个 组 氨 酸 操纵 子 可 以 单纯 靠 弱 化 子 的 结构 实现 它 的 控制 作用 。
287

第 九 节 ， 基 因 表 达 翻 译 水 平 的 调节

原核 生物 中 基因 的 表达 也 在 翻译 水 平 上 受到 控制 。 蛋 白质 翻译 的 起 始 主要 依靠 AUG 起
始 密码 子 上 游 富 含 味 叭 的 6 一 8 个 核 苷 酸 之 存在 与 否 。1974 年 Shine 与 Dalgarno 首先 指出 这
个 核糖 体 结合 位 点 (ribosome-binding site) 的 存在 ,这 段 DNA 序列 就 称 为 Shine-Dalgarno 序 ，
列 。 他 们 观察 到 在 细菌 核糖 体 中 的 16 S 小 亚 基 rRNA3' 端 在 序列 上 与 核糖 体 结合 位 点 序列 是 ，
互补 的 。 mRNA 与 核糖 体 结合 序列 一 般 集 中 在 起 始 密码 子 上 游 的 8 个 核 苷 酸 上 。 如 果 这 个 区
域 发 生 突变 ,就 会 大 大 降低 其 相应 的 mRNA 的 翻译 效率 ,不 论 这 个 突变 靠近 AUG 密码 子 , 或 |
远离 密码 子 都 是 一 样 。 这 样 的 序列 被 包 在 环 卡 结构 (loop structure) 之 中 ,因而 无 法 与 16 S
rRNA 相互 作用 ,进行 翻译 。
近来 有 证 据 表明 Shine-Dalgarno 序列 的 工作 效率 受 与 它们 结合 的 蛋白 质 控制 ,从 而 阻碍
其 作用 。 天 .col 的 核糖 体 蛋 白 Cribosomal protein, 即 记 -蛋白 ) 就 是 一 个 例证 。 当 六 蛋白 合成 的 速
度 超过 Y-RNA 合成 的 速度 时 ,游离 的 记 蛋 白 就 积累 起 来 ,有 一 些 “ 关 键 的 六 蛋 白 ” 就 与 Shine-
Dalgarno 序列 结合 。 这 样 的 话 , 核 糖 体 蛋白 就 不 能 比 它们 用 于 制造 核糖 体 时 合成 得 更 快 。
交 蛋 白 不 同 组 合 的 基因 包含 在 已 . cozz 基因 组 一 些 不 同 的 操纵 子 上 ,每 个 操纵 子 编码 其 自
己 的 关键 蛋白 质 , 它 抑 制 整个 操纵 子 的 表达 。 在 核糖 体 组 装 时 , 关键 的 六 蛋白 与 RNA 结合
得 早 些 。 与 这 些 蛋 白质 结合 的 Y-RNA 的 序列 及 与 关键 蛋白 质 相 互 作 用 的 六 蛋白 的 mRNA 的 量
序列 是 十 分 相似 的 。 因 此 ,翻译 水 平 的 调控 就 是 Y- RNA 与 记 -蛋白 mRNA 之 间 相 互 与 其 关键
蛋白 结合 的 竞争 。 当 Y- 蛋 白 mRNA 被 所 结合 的 关键 蛋白 使 它 不 能 结合 时 ,它们 就 比 平 时 更 快 时
地 降解 。 蛋 白质 翻译 一 旦 开始 后 ,其 速度 即 受 对 应 于 mRNA 分 子 中 所 利用 的 各 种 让 NA 的 供
应 情况 而 决定 。 在 细胞 中 不 同 tRNA 分 子 的 数量 是 不 同 的 。 大 量 存在 的 那些 名 NA 通常 是 对
应 最 常 使 用 的 密码 子 , 因 此 ,被 稀少 的 tRNA 分 子 所 识别 的 密码 子 大 都 翻译 得 较 慢 ,而 被 丰富
的 ItRNA 识 别 的 密码 子 则 翻译 得 要 快 些 。
担任 以 mRNA 为 模板 翻译 成 蛋白 质 的 核
糖 体 是 一 个 很 大 的 生物 天 分 子 ， 含有 50 多 种 核
糖 体 蛋 白 及 许多 种 核 粮 体 RNACrRNA)。 在 重 ， 呈 :
白质 合成 时 ,这 50 多 种 蛋白 质 如 何 协调 工作 是 sii 2
一 个 非常 复杂 的 问题。 它们 的 基因 分 别 定位 于 入 呈 是 迁 |
沁

mr ER

20 多 个 操纵 子 上 ,它们 的 合成 是 精确 而 平衡 轩 创 放
的 。 因此 ,严格 的 调控 是 非常 必要 的 。 核糖 体 成
分 构成 了 细菌 细胞 总 干 重 的 40 双 关 者 核糖 休
蛋白 合成 的 调控 主要 是 在 翻译 水 平 上 ,而 不 是
在 转录 水 平 上 完成 的 ,这 一 点 与 大 多 数 其 它 蛋 ， ” 3
白质 不 同 , 例 如 ,至 少 每 种 核糖 体 蛋白 的 操纵 子 ， 二
都 有 一 种 蛋 自 质 当 作 它 的 翻译 阻 过 蛋白 过 图 10-22 翻译 阻 遏 的 反馈 调控
ktranslational repressor) , 它 定 位 在 靠近 合成 ，) “二 个 核糖 体 蛋 白 (4 S) 阻 过 编码 核糖 体 大 (L)、
的 起 始 部 位 的 mRNA: 上 ,从 而 阻止 许多 种 蛋白 .小 CS) 亚 基 及 RNA 聚合 酶 < 亚 基 的 翻译 过 程 。
质 的 合成 (图 ,10-22) 。

288

呈 。 这 种 与 mRNA 结合 并 不 影响 核糖 体 的 聚合 ,这 是 因为 核糖 体 蛋白 与 核糖 体 RNA 的 结合
j 其 与 mRNA 的 结合 更 紧 。 只 有 当 核 糖 体 蛋 白 的 生产 超过 核糖 体 RNA 时 ,翻译 的 阻 巡 才 会
发 生 , 或 者 当 这 些 核糖 体 蛋 白 的 形成 不 是 以 等 摩尔 生成 时 翻译 的 阻 遇 也 会 发 生 。
核糖 体 RNA 及 转移 RNACRNA) 的 合成 与 非 核糖 体 蛋 白 的 合成 也 是 相互 协调 的 。 当 氢
| 车 酸 缺 乏 时 ,这 些 RNA 即 停止 合成 。 当 氨基 酸 缺 乏 时 从 ATP 和 GDP 合成 一 种 新 的 化 合 物 ，
1 称 为 5 -二 磷酸 - 鸟 苷 -3'- 二 磷酸 (5 -diphosphate-gunosine-3'-diphosphate,ppGpp), 从 ATP 分
子 上 转移 2 个 磷酸 分 子 到 GDP 的 3 -羟基 (一 OH) 上 ,ppGPpp 也 可 以 从 ATP 及 GTP 形成 的
UpppCpp 经 过 水 解 而 生成 ppPGpp。 当 核糖 体 的 A 部 位 上 存在 未 氨 酰 化 的 tRNA 时 ,ppGpp 的
验 成 即 发 生 . 因此 ,ppGpp 和 pppGpp 只 在 缺乏 氨基 酸 的 细胞 中 形成 。 这 是 由 于 在 不 饥 狐 的 细
j 胞 中 人 A 部 位 总 是 由 氨 酰 tRNA 占据 着 ,一 旦 PPGpp 形成 , 它 即 抑制 操纵 子 转录 的 起 始 ,并 使
许多 其 它 转录 本 (transcript) 的 延长 变 得 缓慢 下 来 。

参考 文 献

1. Stryer. 工 . Biochemistry 〈4th ed. ). W. H. Freeman and Company,New York :1995.

: Watson ,J. D. ,Hopkins ,N. HH. ,Roberts ,JW. ,Steitz,J. A. and Weiner,A. M. Molecular Biology of the
_Gene. Vol.I. (4th ed. ). EACHmii SS Park :1987.

3 Lewin ,TI. V. Genes V.Oxford University Press,London :1995.

下 Freifeldar ,D. Molecular Biology (2nd ed. ):Johns and Bartlett Publisher ,Boston :1987.

〈 净 隆 飞 )

289

由 于 病毒 的 寄生 涉及 各 种 不 同类 型 的 生物 ， 所 以 病毒 之 间 也 存在 着 极 大 的 差异 。 病 毒 在
生物 学 上 的 分 化 程度 ， 比 细菌 、 植 物 以 及 动物 各 类 群 的 总 和 还 要 高 。 对 于 这 种 多 样 性 的 理解
认识 过 程 , 构成 了 对 病毒 本 身 以 及 病毒 与 相应 寄主 相互 作用 关系 的 研究 历史 。 和 蛋白 与 蛋白 、 蛋
白 与 核酸 、 蛋 白 与 脂 类 间 的 相互 作用 决定 了 病毒 粒子 (virions ) 的 结构 、 病 毒 基因 组 的 合成 与 表
达 以 及 病毒 对 寄主 细胞 的 影响 。 这 便 是 在 分 子 水 平 上 的 病毒 学 。

一 、 病 毒 的 定义

简单 地 说 ， 病 毒 就 是 一 类 亚 显 微 专 性 细胞 内 寄生 物 。 虽 然 这 一 定义 可 以 将 病毒 区 别 于 其
它 各 类 高 等 的 或 “可 见 ” 的 生命 有 机 体 ,但 它 又 与 少数 具有 特殊 寄生 性 生活 史 的 原核 生物 相 混 是
淆 。 如 立 克 次 氏 体 和 衣原体 ,它们 均 是 专 性 细胞 内 寄生 细菌 , 仅 能 在 寄主 细胞 外 存活 很 短 一 段 ，
时 间或 保持 侵 当 性。 因此 ,以 下 内 容 以 对 病毒 的 定义 也 是 必要 的 : (1) 病毒 粒子 (virions) 由 看
白质 和 核酸 构成 ， 其 中 的 核酸 仅 为 DNA 或 RNA 中 的 一 种 ; (2) 病毒 粒子 是 由 预先 形成 的 组
分 装配 而 成 的 , 自身 不 进行 “生长 ”或 发 生 分 裂 .其 它 生命 形式 则 是 通过 其 各 种 组 分 综合 数量 的
增加 而 “生长 ”, 并 通过 分 裂 进行 繁殖 ; (3) 病毒 自身 不 具备 进行 能 量 代谢 和 产生 蛋白 质 合 成 所
需 核糖 体 的 遗传 信息 ， 在 能 量 代谢 上 绝对 依赖 于 寄主 细胞 。
”与 其 它 生 物 类 型 相 比 , 另 外 一 些 病原 体 具 有 与 病毒 更 加 相近 的 特性 。 如 : 类 病毒
Cviroids)、 拟 病毒 (virusoids， 目 前 多 称 作 与 类 病毒 相似 的 卫星 RNA-viroidlike satellite RNA)
和 侵 染 性 蛋白 (prions)。 类 病毒 是 非常 小 的 环 状 RNA 分 子 (200~400 nt* ) ,并 具有 棒状 三 级
结构 。 它 们 没有 外 壳 蛋 白 或 包 膜 ,但 与 某 些 植物 病害 相关 。 其 复制 策略 与 病毒 相似 ,也 是 细胞
内 专 性 寄生 物 。 拟 病毒 是 分 子 量 较 大 ( 约 1 000 nt)， YA
于 病毒 的 复制 而 增殖 ,并 被 包 被 于 病毒 的 衣 壳 蛋白 中 . 侵 染 性 蛋白 是 一 种 定义 比较 模糊 的 侵
物质 , 它 由 单一 种 类 的 蛋白 分 子 构成 ,而 不 含有 核酸 .这 些 蛋 白 多 与 * 慢性 病毒 病 " 相 关 如 入 类
C- 丁 病 . 羊 播 痒 病 及 牛 海绵 状 脑 炎 ( 疯 牛 病 ) 。

二 、 病 毒 学 的 起 源 及 发 展

1892 年 ， 俄国 植物 学 家 D，Iwan5wski 证 明 , 感 病 烟 草 的 汁液 用 当时 孔径 最 小 的 细菌 滤 |
器 过 滤 后 ， 仍 可 将 病害 传染 给 其 它 植物 。 稍 后 的 1898 年 , M. Beijerinick 充实 了 TIwanowsKki
的 结果 ,确认 了 烟草 花 叶 病 毒 的 存在 ,成 为 现代 病毒 学 的 创始 人 .他 将 病毒 称 为 “感染 性 活 |

* nt 表示 核 苷 酸 数目 。，
290

液 “(contagium vivum fluidum) 。 此 后 20 年 里 ,世界 各 国 的 科学 家 分 别 在 牛 的 口蹄疫 、 人 类 关
尺 灰 质 炎 以 及 细菌 中 发 现 了 不 同类 型 的 病毒 ， 其 中 侵 染 细菌 的 病毒 称 为 吻 菌 体 (bacterio-
Ehages)。 自 30 年 代 以 来 , 许多 人 对 病毒 学 的 不 同方 面 进行 了 研究 ， 其 中 包括 病毒 的 结构 、 遗
传 和 复制 等 。 同 时 ， 病 毒 学 的 历史 也 是 实验 设备 及 系统 的 发 展 过 程 。 如 : 动 植物 活体 寄主 体
系 、 细 胞 培养 方法 、 血 清 及 免疫 学 技术 、 超 微 结 构 研 究 以 及 大 量 的 现代 分 子 生 物 学 技术 。 利 用 这
病 技术 及 系统 , 不 仅 可 以 对 病毒 进行 测定 ,也 成 为 生物 学 的 一 个 新 的 领域 。 其 中 不 仅 包括 病
毒 本 身 的 生物 学 ,而 且 也 包括 了 病毒 赖 以 生存 的 寄主 细胞 生物 学 。
4 回顾 现代 分 子 生物 学 的 发 展 过 程 ， 我 们 随处 可 见 病毒 学 所 发 挥 的 重要 作用 , 许多 突破 性
的 进展 都 是 来 自 于 病毒 学 的 研究 结果 。 例 如 ,1935 年 ，Stanley 以 烟草 花 叶 病毒 CTMV ) 为 材
ji 料 ， 首 次 获得 蛋白 质 结晶 , 并 进行 了 X 光 衍 射 分 析 ; 1952 年 , Hershey 和 Chase 利用 T2 鸣 菌
条 对 大 肠 杆菌 的 感染 , 证 明 DNA 含有 遗传 信息 ; 1967 年 ，Sinheimer 根据 对 单 链 DNA 噬 菌
i 体 @X174 的 研究 结果 ,提出 了 基因 的 “ 滚 环 式 ” 复 制 模 型 ; 1970 年 ，Baltimore 和 Temin 在 纯
化 的 罗斯 肉瘤 病毒 中 发 现 了 逆转 录 酶 ， 证 明 可 以 由 RNA 反 向 产生 DNA,， 使 中心 法 则 ?得 到
了 完善 和 补充 ; 1971 年 ,Schneider 在 烟草 环 斑 病毒 的 卫星 RNA 中 , 发 现 了 具有 了 酶 活性 的 核
片段 ， 核 酶 Cribozyme); 1977 年 ,Sanger 以 @X174 喉 菌 体 为 材料 ， 建 立 了 末端 终止 DNA
则 序列 分 析 方 法 。 这 些 成 就 不 仅 极 大 的 丰富 了 分 子 生物 学 的 内 容 ,也 体现 了 病毒 作为 一 种 生物
群 ， 在 遗传 构成 .基因 表达 方式 以 及 与 其 它 生 物 相 互 关系 上 的 特殊 性 。 病毒 基因 组 一 般 要 比
真 核 生 物 基 因 组 小 得 多 , 而且 便 于 大 量 纯 化 获得 ， 更 重要 的 是 因为 一 些 较 小 的 真 核 病 毒 基 本
上 正 是 依靠 寄主 所 具有 的 系统 进行 复制 .表达 和 调控 的 ， 因 此 , 对 于 病毒 基因 组 遗传 规律 的 研究
沾 果 ， 在 一 定 程 度 上 也 就 反映 寄主 基因 组 本 身 的 一 些 规律 , 成 为 我 们 认识 其 它 生物 类 群 的 一
个 窗口 。

随 着 对 于 病毒 本 质 和 遗传 规律 研究 的 深入 ， 以 及 相关 分 子 生 物 学 理论 、 技 术 的 发 展 ， 病
， 毒 学 研究 在 利用 病毒 开展 基因 工程 方面 也 有 了 迅速 的 发 展 。 例 如 ， 动 植物 病毒 和 鸣 菌 体 基因
组 及 其 启动 子 等 调控 元 件 ,， 已 经 被 广泛 用 于 构建 不 同类 型 的 基因 工程 载体 ,在 外 源 基 因 对 细
， 菌 和 真 核 细胞 的 转化 及 表达 调控 中 发 挥 着 重要 作用 ,如 4 噬菌体 `.SV40、 花 椰 菜花 叶 病 毒 等 。
另外 , 在 病毒 病 的 预防 、 治 疗 中 ,具有 广 谱 性 抗 病毒 活性 的 多 肽 一 一 干扰 素 ,， 在 国内 外 均 有 基
， 因 工程 产品 的 开发 应 用 ; 乙 型 肝炎 等 病毒 的 基因 工程 疫苗 也 在 病毒 性 疾病 的 预防 中 得 到 了 广
省 使 用 。 继 1986 年 R. Beachy 首次 利用 烟草 花 叶 病毒 外 壳 蛋 白 基 因 , 转化 获得 对 病毒 侵 染 具
和 我 国 的 科技 工作 者 在 利用 病毒 基因 构建 抗 病毒 转基因

物 方面 取得 了 许多 成 绩 。 已 经 用 不 同 病 毒 基因 或 结构 ， 转 化 获得 了 多 种 对 病毒 危害 具有 搞
性 的 作物 或 品种 ,在 抗 病毒 基因 工程 育种 的 应 用 方面 居于 世界 领先 水 平 。

第 二 节 ， 病毒 粒子 的 结构

一 、 病 毒 粒子 的 功能

最 简单 地 来 说 ,病毒 粒子 的 外 过 具有 保护 核酸 基因 组 免 受 物理 及 化 学 因素 和 各 种 酶 类 破
坏 的 功能 。 当 离开 寄主 细胞 时 ,病毒 便 处 于 一 种 不 利 其 生存 的 环境 中 , 无 保护 的 基因 组 可 能 迅
速 失 活 。 核 酸 对 物理 损伤 和 紫外 线 ( 如 日 光 ) 造 成 的 化 学 修饰 非常 敏感 。 由 于 自然 环境 中 大 量

-291]

存在 的 核酸 酶 ,可 以 造成 病毒 基因 组 单 链 核酸 中 的 磷酸 二 酯 键 断 裂 , 或 对 核 苷 酸 进行 化 学 个
饰 ， 这些 都 足以 使 基因 组 不 能 复制 ,从 而 对 病毒 粒子 产生 抑制 作用 。 病毒 衣 壳 (capsid) 中 的
白 亚 基 是 大 量 存在 的 ,也 就 是 每 个 粒子 中 都 含有 许多 拷贝 .对 一 个 或 多 个 亚 基 所 造成 的 损伤 可 有
能 使 特定 的 亚 基 天 失 功能 ,但 就 整个 粒子 来 说 却 仅 造成 对 侵 染 性 的 有 限 破 旦 。 因 此 可 以 说 衣 过 有
是 一 种 有 效 的 屏障 .

另外 ,病毒 的 外 部 表面 还 与 对 寄主 细胞 的 识别 以 及 侵 染 初期 的 相互 作用 有 关 。 虽 然 这 全
过 程 基本 上 是 通过 一 类 特异 性 的 病毒 附着 蛋白 与 细胞 受 体 的 结合 来 实现 的 ,但 在 侵 染 的 起 始
阶段 ， 衣 过 也 具有 通过 某 种 结构 形式 传递 病毒 基因 组 的 能 力 , 在 这 种 结构 中 的 基因 组 可 以 与
寄主 细胞 相互 作用 。 有 时 ,这 仅 是 一 个 将 病毒 基因 组 释放 到 细胞 原生 质 体 中 的 简单 过 程 ， 但 记
可 能 是 一 个 非常 复杂 的 过 程 。 例 如 ,在 着 转录 病毒 中 , 当 基因 组 仍然 位 于 病毒 粒子 内 部 时 便 会
进行 大 量 的 修饰 ,在 进入 寄主 细胞 核 之 前 由 两 条 单 链 RNA 分 子 转变 成 为 一 条 双 链 DNA 分
子 。 因 此 ,蛋白 衣 壳 在 病毒 侵 染 过 程 的 建立 中 发 挥 着 生物 学 功能 。 5

二 、 衣 过 的 对 称 性 和 病毒 的 结构 4
j

病毒 的 衣 壳 肯定 是 由 多 个 蛋白 分 子 , 也 就 是 亚 基 (Csubunit) 结 构 所 构成 的 。1955 年
Fraenkel-Conrat 和 Williams 证 明 , 当 用 纯化 的 烟草 花 叶 病毒 CTMVJIRNA 与 外 壳 蛋 白 混合 保 ，
温 时 ,可 以 形成 病毒 粒子 。 这 一 发 现 表 明 病 毒 粒 子 的 结构 是 处 于 最 低 的 能 级 状态 ,也 就 是 各 种
组 分 的 最 适 结构 形式 。 结构 上 的 稳定 性 是 病毒 粒子 的 一 个 重要 特征 。 有 些 病毒 非常 脆弱 ,不 能
在 寄主 细胞 外 存活 ,但 许多 病毒 却 能 存活 较 长 一 段 时 间 , 有 时 可 达 数 年 。

在 病毒 组 装 的 过 程 中 , 所 涉及 的 作用 力 包括 下 水 力 和 静电 作用 力 ,另外 还 有 少量 的 共 价
键 与 多 个 亚 基 间 的 结合 有 关 。 这 意味 着 蛋白 与 蛋白 、 蛋 白 与 核酸 以 及 蛋白 与 脂 类 间 的 相互 作
用 .目前 对 大 多 数 病毒 结构 中 的 这 类 相互 作用 的 细节 尚未 充分 认识 ,但 是 已 经 对 其 中 的 二 些 基
本 原则 和 结构 型 式 有 了 一 些 了 解 ， 它 们 作用 于 各 种 不 同类 型 的 病毒 结构 。 以 下 将 要 讨论 的 是
病毒 结构 的 两 种 主要 类 型 ; 即 螺旋 对 称 和 20 |
面体 对 称 。

(一 ) 螺 旋 体 衣 壳

烟草 花 叶 病毒 (CTMV) 是 螺旋 体 (helix)
对 称病 毒 结构 的 代表 。 它 以 旋转 对 称 方式 将
多 个 相同 的 蛋白 亚 基 有 序 地 组 合 到 一 起 , 也 。。 下 次 名 放 的 亚 基
就 是 将 不 规则 外 形 的 蛋白 质 沿 环形 圆周 排
列 ,形成 一 个 盘 状 结构 多 个 盘 状 结构 相互 堆
集 形成 一 个 柱状 体 , 而 病毒 基因 组 则 被 蛋白
外 壳 包 含 在 中 空 的 柱状 体内 部 。

X 光 衍 射 分 析 表 明 ,TMYV 粒子 的 衣 帝
实际 上 是 一 种 螺旋 体 结构 。 它 包括 了 直径 和
螺 距 两 个 较为 稳定 的 数学 参数 (图 11-1), 也
是 一 种 较为 简单 的 结构 .在 TMYV 的 粒子 中 ，

爸 成 螺旋 体 一 个 圆周 的 亚 基数 量 (/) 为 ， 图 1L1 由 单 -种 类 的 多 个 外 壳 蛋 白 稳定 排列 构成

16.3， 每 个 亚 基 轴 向 上 升 的 高 度 Cz) 为 。 的 TMYV 衣 壳 是 -- 种 螺 虐 为 2. 28 nm 的 螺旋 体
292

0.14nm， 而 螺旋 体 的 螺 距 (已 ) 则 等 于 16.3 X0.14 =2.28nm。 也 就 是 已 =Xp。TMV 的 粒
j 子 为 刚直 棒状 结构 ,有 些 螺旋 体 病毒 则 具有 一 定 的 柔韧 性 , 较 长 的 螺旋 体 病毒 粒子 一 般 都 表现
里” 为 弯曲 状 。
时 单一 种 类 的 蛋白 亚 基 通 过 螺旋 对 称 形成 病毒 粒子 , 已 经 在 许多 不 同 种 类 的 病毒 中 得 到 证
几 实 。 丝 状 噬菌体 科 中 的 一 些 噬菌体 便 具 有 最 简单 的 螺旋 状 衣 壳 , 如 M13 和 fd( 即 Ff) 唆 菌 体 。
四 这 些 噬菌体 长 度 约 900 nm， 直径 约 9 nm, 含有 5 种 蛋白 (图 11-2): 主要 外 壳 蛋 白 是 噬菌体
目 285， 在 每 个 粒子 中 , 这 种 蛋白 的 拷贝 数 为 2 700~3 000。 同时 ,在 线 状 粒子 的 两 端 还 存在 其 它
外 种 其 它 的 蛋白 (g3p,g6p,g7p 和 g9p), 它们 的 拷贝 数 各 约 为 5 个 。 成 熟 的 g8p 分 子 大 约 由 50
国 不 氨基 酸 残 基 构 成 ,几乎 完全 是 一 种 由 “螺旋 构成 的 短 棒状 结构 .在 短 棒状 结构 中 存在 3 个 不
， 同 的 区 域 :(1) 氨基 末端 的 负电 荷 区 ,这 一 区 域内 含有 酸性 氨基 酸 残 基 并 构成 了 病毒 粒子 外
必 部 的 亲 水 表面 ;(2) 羧基 末端 的 碱 性 正 电 荷 区 , 它 位 于 蛋白 柱状 体内 侧 并 与 带 有 正 电荷 的
ULDNA 基因 组 相 邻 (3) 在 以 上 两 个 区 域 之 间 还 存在 一 个 朴 水 区 , 它 与 g8p 亚 基 之 间 相 互 作
出 用 .形成 或 稳定 噬菌体 粒子 有 关 ( 图 11-2) 。 也 就 是 说 ，Ff 叭 菌 体 粒子 是 由 外 壳 蛋 白 亚 基 间 的
由 疲 永 作用 而 形成 的 。 螺 旋 体 中 连续 旋转 的 g8p 亚 基 与 下 部 的 亚 基 相互 连接 ,与 粒子 长 轴 旺 约
20" 倾角 并 呈 鱼 鳞 状 互相 重 玛 。 它 的 上 值 为 4.5, 刀 值 为 1.5 nm。
吕 。 由 于 鸣 菌 体 DNA 包装 在 螺旋 状 粒子
于 的 中 心 ,所 以 基因 组 的 长 度 决定 了 粒子 的
长度。 在 Ff 喉 菌 体制 备 物 中 都 存在 着 各 种
不 同 的 粒子 ， 如 : 含有 大 于 一 个 基因 组
， DNA 长 度 的 多 聚 噬菌体 (polyphage)、 含
有 约 0. 2 一 0. 5 个 基因 组 长 度 缺失 型 DNA
的 小 噬菌体 (miniphage) 以 及 含有 长 度 大
岂 于 一 个 基因 组 , 但 具有 遗传 献 损 DNA 的
特长 唆 菌 体 (maxiphage) 等 各 种 形式 .M13
。 线 状 粒子 的 这 种 特性 已 经 被 用 于 将 其 基因
组 改造 成 为 一 类 克隆 载体 。 外 源 DNA 插
， 类 基 因 组 所 产生 的 重组 噬菌体 粒子 ， 长度
大 于 野生 型 粒子 ,但 基因 组 能 够 被 粒子 包
。 装 的 长 度 限 制 不 明确 。 随 着 M13 基因 组 长
届 度 的 增加 ,其 复制 效率 随 之 下 降 . 当 重组 只
菌 体 基因 组 较 野 生 型 长 度 增加 1% 一 10%%
时 ,无 明显 的 不 利 表现 ; 当 长 度 较 野生 型 增
加 10 罗 一 50 闪 时 ,复制 明显 减 慢 ; 而 当 增
胡 长 度 超过 正常 基因 组 长 度 的 50%% 时 ,分 离 获得 重组 唆 菌 体 则 更 加 困难 。
衣 壳 结构 在 Ff 叭 菌 体 对 适当 宿主 细胞 进行 侵 染 的 过 程 中 也 具有 作用 。Ff 鸣 菌 体 为 雄性
宿主 专 一 性 噬菌体 , 在 侵 染 过 程 中 要 求 大 肠 杆菌 表面 的 F 菌 毛 . 侵 染 过 程 的 第 一 个 步骤 是 , 位
手 丝 状 粒子 未 端的 gap 蛋白 与 F 菌 毛 的 末端 发 生 相 互 作 用 ,从 而 导致 gg 蛋 自 的 形态 变 枇 ，
g8p 蛋白 的 结构 首先 由 100%% 的 e- 螺 旋 变 为 85%% 的 -螺旋 , 丝 状 粒子 变 短 , 附 着 于 F 茵 毛 上 的
粒子 未 端 张 开 , 喉 菌 体 DNA 外 露 。 然 后 ,g8p 蛋白 亚 基 发 生 第 二 次 形态 变化 ,螺旋 的 比例 直
293

图 11-2 M13 叭 菌 体 粒子 结构 示意 图

85% 下 降 为 50% ,导致 噬菌体 粒子 成 为 一 个 直径 约 40 nm 的 中 空 球体 , 叭 菌 体 DNA 排出 , 开 司
始 对 寄主 细胞 的 侵 染 。

许多 植物 病毒 属于 螺旋 体 对 称 , 如 烟草 脆 裂 病毒 组 \ 烟 草花 叶 病毒 组 、 菌 传 棒状 病毒 组 ,大 国
麦 病毒 组 、 马 铃 昔 X 病毒 组 、 香 石竹 病毒 组 . 马 铃 葛 Y 病毒 组 和 线 状 病毒 组 。 这 些 病毒 的 粒子 时
长 度 由 大 约 100 nm (烟草 脆 裂 病毒 组 ) 至 1 000 am ( 线 状 病毒 组 ) 不 等 。 植 物 病毒 组 所 具有 的 是
这 种 结构 可 能 与 寄主 植物 细胞 的 生物 学 有 关 , 或 是 与 在 寄主 之 间 的 传播 方式 有 关 。 人

相当 数量 的 动物 病毒 也 都 属于 螺旋 体 对 称 ,但 它们 的 外 层 另外 还 都 含有 一 个 脂 类 包 膜 时
(envelope)。 这 一 类 群 中 包括 许多 熟知 的 人 类 病原 物 。 如 :流感 病毒 ( 正 粘 病毒 科 )、 腮 腺 炎 病 毒 是
和 麻疹 病毒 ( 副 粘 病毒 科 )、 以 及 狂犬 病毒 ( 弹 状 病毒 科 )。 所 有 这 些 病毒 均 为 单 链 负 意 RNA 基
因 组 ,而 且 分 子 结构 相似 。 在 被 侵 染 细胞 内 ,病毒 核酸 与 一 种 碱 性 的 核酸 结合 成 蛋白 聚集 ,构成 是
螺旋 状 核 衣 壳 (nucleocapsid) 。 这 种 蛋白 质 与 RNA 形成 的 复合 体 , 除 具有 保护 病毒 基因 组 免 上
受 物理 及 化 学 因素 伤害 的 功能 外 ,有 时 还 在 病毒 复制 中 发 挥 作用 。

有 些 具 有 包 膜 的 螺旋 状 动物 病毒 结构 比较 简单 ，
如 :狂犬 病毒 及 非常 相近 的 水 泡 性 口 炎 病 毒 (VSV)
(图 11-3)。 它 们 为 弹 状 病毒 属 成 员 ,粒子 沿 着 长 约
11 000 个 核 苷 酸 的 负 意 RNA 基因 组 进行 组 装 。 病 毒
RNA 与 碱 性 核 衣 壳 CN) 蛋白 相互 作用 ,形成 一 种 螺 距
约 5 nm 的 螺旋 结构 。 这 种 结构 在 另外 两 种 非 结构 蛋

rrarAerer nr
Doxaa
四 ASACCAGQ

自 (L 和 NS) 的 参与 下 形成 病毒 粒子 的 链 心 , 链 心 核 蛋 。 让 RE

白 螺 旋 体 由 30 一 35 次 旋转 构成 ,长 约 180 nm, 直 径 约 中 核 衣 壳 (N) 和 蛋白
80 nm。 单 体 N 蛋白 体积 约 为 9X5 又 3 nm, 每 个 单 体 汪 和

约 可 覆盖 RNA 基因 组 中 的 9 个 核 背 酸 。 在 上 面谈 到 NTRR 河 人 项 oo 本

当面 R

的 丝 状 噬菌体 粒子 中 ,N 蛋白 的 作用 是 稳定 RNA 基
因 组 ,并 保护 其 不 受 化 学 、 物 理 及 酶 的 破坏 。 对 大 多 数
具有 包 膜 的 病毒 而 言 , 核 衣 壳 是 由 一 种 不 定形 的 层 体
所 包 被 ,这 一 层 体 即 可 以 与 介 心 作用 ,又 可 以 与 外 部 连
接 的 类 脂 膜 相 互 作 用 。 这 一 层 体 被 称 为 基质 (matrx ) ss
基质 (M) 和 蛋白 在 病毒 粒子 中 通常 为 数量 最 大 的 蛋白

质 。 例 如 :在 VSV 粒子 中 存在 约 1 800 个 基质 蛋白 拷 图 11-3 弹 状 病毒 粒子 结构 示意 图
贝 和 约 1 250 个 N 蛋白 拷贝 。

CC
翁
RN

:到
SR

杂 的 病毒 则 利用 这 种 结构 作为 病毒 粒子 的 项 ;并 以 蛋白 质 和 脂 类 表层 进 _ 上 四 下 : 娄
(二 )20 面体 (等 轴 体 ) 衣 壳

合 在 里 面 。 蛋 白 亚 基 在 立体 表面 的 组 装 是 一 个 比 构成 螺旋 体 更 为 复杂 的 过 程 . 20 面体 (icosa- 村

由 重复 亚 基 构建 衣 壳 ,病毒 必须 具有 如 何 排列 这 些 亚 基 的 规则 . 对 一 个 20 面体 来 说 ,这 种

加 则 便 是 立体 旋转 对 称 , 也 称 作 2-3-5 对 称 。 它 的 含义 为 ;四 轴线 穿 过 每 条 边线 中 点 可 产生 2
294

次 旋转 对 称 ;@ 轴 线 穿 过 每 个 表面 的 中 心 可 产生 3 次 旋转 对 称 ; 图 轴线 穿 过 每 个 顶点 可 产生 5
次 旋转 对 称 。

对 于 最 简单 的 20 面体 衣 壳 来 说 , 每 个 三 角形 表面 是 由 3 个 相同 的 亚 基 所 构成 的 。 也 就 是
说 ,构建 一 个 完整 的 衣 壳 至 少 需要 60 个 相同 的 亚 基 。 人 少数 几 种 简单 的 病毒 粒子 是 通过 这 种 方
式 构 建 的 ,如 微小 吹 菌 体 科 的 @X174 喉 菌 体 , 最 近 通 过 X 光 衍 射 对 它 的 完整 结构 进行 了 确
认 .。 但 是 , 由 于 蛋白 质 分 子 的 形状 并 不 规则 ,所 以 由 此 而 形成 的 并 不 是 真正 的 等 边 三 角形 或 严
格 几何 学 意义 上 的 20 面体 。

研究 结果 表明 , 在 大 多 数 情况 下 20
面体 病毒 衣 壳 含有 60 个 以 上 的 亚 基 .由 于
所 有 亚 基 都 是 等 价 相 连 的 ,也 就 是 它们 之
间 的 空间 距离 相等 ,并 处 于 最 小 自由 能 级
状态 ， 所 以 由 60 个 相同 亚 基 构成 的 规则
20 面体 是 一 种 非常 稳定 的 结构 .由 于 一 个
真正 的 规则 20 面体 只 能 由 20 个 亚 基 组
成 ,对 于 含有 60 个 以 上 亚 基 的 20 面体 来 “
说 ,这 些 亚 基 之 间 要 进行 真正 的 等 价 连接 ，
完全 对 称 地 排列 是 不 可 能 的 。 为 了 解释 这
一 问题 ,1962 年 Caspar 和 Klug 提出 了 准
等 价 (quasi-equivalence) 假 说 。 他 们 的 想法
简单 地 说 就 是 : 亚 基 在 近乎 相同 的 局 部 环
境 下 与 相 邻 亚 基 形 成 近乎 等 价 的 连接 ,从 而 使 20 面体 衣 壳 由 多 个 亚 基 进行 自我 装配 。 就 高 度
有 序 的 20 面体 来 说 ,病毒 粒子 的 对 称 性 可 以 用 20 面体 的 三 角 剖 分 数 (triangulation number)
来 定义 (图 11-4)。 三角 剖 分 数 ( 人 7) 的 定义 为 :7 三 产 XP。 其 中 ,了 是 三 角形 面 每 一 条 边 上 的 分
割 次 数 ,因此 疡 就 是 每 个 面 上 的 小 三 角形 数目 。 己 = 天 十 雁 十 居 , 其 中 心 和 下 为 任何 不 同 的 非
负 秆 整数 。 这 就 是 说 T 值 将 以 1,3,4,7,9,12,13,16,19,25,27,28……. 的 方式 违 增 志 当 关 等 于
1 或 3 时 ,可 以 形成 规则 的 20 面体 . 任何 其 它 的 己 值 都 将 导致 偏 斜 态 20 面体 , 即 构成 20 面体
的 水 三 角形 在 每 个 面 的 边线 上 不 是 对 称 排 列 。 目 前 已 经 测定 了 包括 了 =1( 微 小 噬菌体 科 , 如

EX174),T 王 3( 许 多 昆虫 ,植物 及 动物 病毒 )、 了 =4( 披 膜 病 毒 ) 以 及 7 一 7( 有 尾 噬 菌 体 的 头 部 ，
如 闪 叹 菌 体 ) 在 内 的 各 类 20 面体 病毒 粒子 的 精确 结构 .具有 更 大 三 角 剖 分 数 的 病毒 粒子 ,采用

-不 同 的 亚 基 装配 方式 形成 20 面体 的 面 和 顶点 ,并 含有 具 框 架 作用 的 内 部 骨架 重 日 。 这 些 因素
决定 了 病毒 粒子 的 装配 ,其 中 主要 是 通过 将 预先 形成 的 蛋白 结构 亚 基 进 行 再 次 组 合 来 完成 的 。

小 RNA 病毒 (Picornaviridae) 是 20 面体 病毒 粒子 结构 的 一 个 很 好 例子 。 近 年 来 ,对 许多
不 同 小 RNA 病毒 衣 壳 的 细微 结构 进行 了 测定 ,其 中 包括 1 型 .3 型 月 介 灰 质 炎 病毒 (PV1 和
PV3) ,口蹄疫 病毒 (EMDV) ,14 型 人 鼻 病 毒 CHRV-14) 等 许多 其 它 种 类 。 这 些 病毒 的 粒子 结
构 与 许多 其 它 无 关 的 病毒 非常 相似 ,如 属于 野田 病毒 科 的 昆虫 病毒 及 殉 豆 花 叶 病毒 组 的 植物
病毒 。 所 有 这 些 病毒 种 类 均 为 20 面体 衣 壳 ,直径 约 30 nm, 三角 训 分数 了 =3 (图 11-5)。 衣 壳
均 由 60 个 重复 的 结构 亚 基 梅 成 ,而 每 个 结构 亚 基 又 都 含有 VP1,VP2,VP3 3 个 主要 的 亚 基 。
也 就 是 说 在 整个 小 RNA 病毒 粒子 中 共有 60X3 王 180 个 表面 亚 基 单 体 . 3 种 蛋白 的 结 梅 相似 ，
都 是 由 150 一 200 个 氨基 酸 残 基 以 所 谓 的 “8 股 反 向 平行 8- 折 要 ”构成 。

11-4 20 面体 粒子 2-3-5 对 称 示意 图

295

实际 上 ,小 RNA 病毒 共 含 有 4 种 结构 蛋白 ，
除 上 述 VP1-3 3 种 主要 蛋白 之 外 ,还 存在 第 四 种
小 蛋白 VP4。VP4 主要 位 于 衣 壳 内 侧 ,而 不 暴露
于 粒子 表面 。 通 过 对 小 RNA 病毒 感染 细胞 的 生
物化 学 研究 ,很 久 以 来 , 便 已 经 知道 这 4 种 衣 壳 蛋
白 是 由 最 初 的 多 蛋白 (polyprotein) 所 产生 。，VYEI4
是 装配 开始 后 由 VPo 前 体 切 割 成 为 VP2 和 YEF4
的 ,并 在 其 氨基 末端 进行 豆 茸 酸 化 , 即 在 转录 后 与
豆 营 酸 (一 种 14 碳 不 饱和 脂肪 酸 ) 发 生 共 价 结合
而 被 修饰 。5 个 VP4 单 体 形成 一 个 玻 水 分 子 团 ，
从 而 构成 一 个 五 聚 体 的 结构 亚 基 。 生 物化 学 研究
结果 表明 ,形成 衣 壳 顶 点 的 这 些 五 聚 体 是 粒子 区
配 中 的 重要 前 体 : 因此 可 见 , 小 RNA 病毒 衣 充 组
成 蛋白 的 化 学 特性 、 结 构 特 性 以 及 对 称 性 决定 了
其 装配 过 程 。

图 11-5 三 角 齐 分数 了 =3 的 小
RNA 病毒 20 面体 粒子 结构

(三 ) 包 膜 病 毒
以 上 主要 讲述 了 “裸露 病毒 粒子 的 结构 ; 即 那些 量
衣 壳 蛋白 暴露 于 外 界 环境 中 的 病毒 。 这 些 病 毒 在 复制 遇
循环 未 期 产生 于 被 感染 细胞 ,此 时 的 细胞 会 发 生死 亡 、 生
崩溃 或 溶解 ,而 将 其 内 部 组 装 好 的 病毒 粒子 释放 出 来 昌
另外 许多 病毒 粒子 则 以 出 芽 方 式 (budding) 穿 过 细胞 ，
膜 ， 由 被 感染 细胞 内 释放 时 仍然 保持 寄主 细胞 膜 的 完 和
整 性 ,并 不 造成 细胞 的 完全 毁坏 。 也 就 是 病毒 粒子 在 穿 轴
过 细胞 膜 时 被 脂 类 膜 (envelope) 所 包 被 这 些 外 膜 产生 量
于 寄主 细胞 膜 , 成 分 与 细胞 膜 相 似 ( 图 工 芋 6 包
这 种 方式 对 病毒 来 说 具有 许多 优点 。 名 膜 下 层 的 是
结构 可 能 与 螺旋 体 或 20 面 对 称 体 结构 相连 $ 它 可 能 在 国
离开 细胞 之 前 或 在 病毒 释放 过 程 中 形成 。 多 数 包 膜 病 昌
毒 都 是 利用 细胞 膜 作 为 装配 的 场所 。 粒 子 在 细胞 内 的
形成 ,成 熟 及 释放 多 为 一 个 连续 的 过 程 。 装 配 场所 因 病 显
毒 种 类 而 不 同 , 除 部 分 病毒 以 细胞 外 膜 为 装配 场所 外 ，，
许多 病毒 还 利用 如 高 尔 基 体 这 样 的 细胞 质 膜 进 行 装配
另外 一些 在 细胞 核 内 复制 的 病毒 (如 疱疹 病毒 属 ) 则 可 上
能 在 核 膜 上 进行 装配 。 以 上 这 些 病毒 通常 被 某 种 形式 的
液 泡 所 包 被 ,转移 通过 细胞 表面 后 再 释放 。
病毒 粒子 的 类 脂 噶 不 仅 具 有 防止 水 分 均 失 或 酶 区
降解 的 功能 ,同时 还 具有 生物 活性 和 对 寄主 细胞 上 受
图 11-6 包 膜 病毒 在 通过 寄主 细胞 膜 “” 体 分 子 的 识别 功能 。 这 些 功 能 需要 病毒 合成 几 种 类 型
出 芽 时 形成 完整 粒子 的 蛋白 对 其 类 脂 膜 进 行 修饰 ,并 通过 图 11-7 所 列 的 3

296

脂 质 外 腊

(三 聚 体 刺 罕 )

霹 s 内 部 的 “ 尾 ” 与 基质
部 各 二 硫 键 NS 蛋白 互相 作用
跨 膜 蛋白
外 部 糖 蛋白
图 11-7 ”病毒 包 膜 上 结合 的 几 种 蛋白 质

和 种 方式 之 一 与 包 膜 相 连接 。 具 体 种 类 如 下
(1) 基 质 蛋 白 是 一 些 位 于 病毒 粒子 内 部 的 蛋白 质 , 它 的 功能 是 将 内 层 的 核 衣 壳 与 包 膜 有 效
U 的 连接 。 这 些 蛋白 通常 不 被 糖 基 化 ,并 经 常 是 大 量 存在 。 如 在 逆转 录 病 毒 中 ,基质 蛋白 可 约 占

到 病毒 粒子 总 重量 的 30% 。 某 些 基 质 蛋 白 含有 穿 膜 固着 区 , 另 一 些 基 质 蛋 白 则 以 其 表面 的 牙
未 区 域 ,或 通过 与 包 膜 糖 蛋白 之 间 的 相互 作用 与 膜 相 连 。

(2) 糖 蛋白 是 一 些 通过 朴 水 区 固着 在 膜 上 的 穿 膜 蛋白 。 根 据 其 功能 又 可 分 为 以 下 两 种 类
型 ,加 借 助 于 一 个 穿 膜 区 固着 在 包 膜 上 的 外 露 糖 蛋白 。 这 种 蛋白 的 大 多 数 结构 都 在 膜 的 外 侧 ，
千 权 有 三 个 较 短 的 尾部 插入 膜 中 .借助 于 电子 显 微 技 术 ,可 在 许多 包 膜 病 毒 的 表面 上 观察 到 由 一
。 帮 单 体 所 形成 的 * 刺 突 ”。 这 些 蛋 白 是 包 膜 病毒 的 重要 抗原 。 糖 基 化 作用 多 是 发 生 在 氮 原 子 或
U 氧 原子 上 的 ,多 数 这 种 蛋白 的 糖 基 化 程度 很 高 ,总 重量 75 闻 的 蛋白 可 能 都 含有 转录 后 附加 的
， 糖 基 。 这 些 蛋白 不 仅 是 包 膜 病毒 的 主要 抗原 ,而 且 在 病毒 与 外 部 环境 发 生 接触 中 也 具有 许多 重

要 的 动能 。 例 如 : 流感 病毒 的 血细胞 凝集 素 便 是 受 体 结合 膜 融合 以 及 血细胞 凝集 所 必需 的 ;

时 包 运 输 通道 蛋白 含有 多 个 朴 水 穿 膜 区 ,可 以 排列 构成 一 个 穿 过 包 膜 的 通道 ， 使 病毒 包 膜 的 通
几 透 性 (如 离子 通道 ) 发 生变 化 。 因 此 ,这 种 蛋白 对 病毒 粒子 的 内 部 环境 是 很 重要 的 , 它 保证 了 病
毒 粒子 在 成 熟 和 侵 染 过 程 ， 能 够 进行 各 种 必需 的 生物 化 学 变化 ,甚至 是 这 类 变化 的 决定 因素

(如 流感 病毒 的 M2 蛋白 ) ，
本 许 多 具有 得 膜 的 状 椎 动物 病毒 相 比 , 仅 有 极 少 的 植物 病毒 具有 包 膜 ,而 且 多 属于 弹 状 病

毒 科 . 除 了 植物 弹 状 病毒 以 外 , 仅 有 少数 侵 染 植物 的 布 尼 病毒 和 披 膜 病 毒 成 员 的 外 层 具 有 类 脂
包 膜 。 在 植物 病毒 中 的 这 种 情况 ,可 能 反映 了 寄主 细胞 的 生物 学 特性 ,尤其 是 病毒 由 被 侵 染 缅
胞 向 外 释放 的 有 关机 制 ， 如 植物 病毒 的 释放 要 求 在 坚硬 的 细胞 壁 上 必须 要 有 缺口 在 原核 生物 病毒
中 不 存在 这 种 障碍 , 因而 也 就 有 许多 科 的 病毒 具有 包 膜 (如 芽 生 叭 菌 体 科 及 圳 状 鸣 菌 体 科 等 )。
(四 ) 其 它 复杂 病毒
大 多 数 病毒 都 可 以 被 归 人 上 述 3 种 结构 类 型 之 一 , 即 螺 旋 对 称 `20 面体 对 称 或 包 膜 病毒 。
297

人

| 鸭

间 ]
| 也

但 还 有 许多 结构 更 为 复杂 的 病毒 .在 这 些 病毒 中 ,虽然 一 部 分 由 多 层 蛋 白 及 脂 类 构成 的 外 这 也
是 遵循 上 面 提 到 的 基本 对 称 规则 , 但 它们 体积 较 大 , 结构 更 为 复杂 ,无 法 像 比较 简单 的 螺旋 有
体 或 20 面体 病毒 那样 ， 直接 进行 数学 描述 。

总 病毒 科 便 是 这 类 病毒 的 一 个 例子 。 它 们 的 粒子 一 般 长 约 200 一 400 nm， 圣 椭圆 形 或 长
方形 ,外 层 表 面具 有 平行 排列 的 脊 状 物 , 有 时 也 呈 螺 旋 状 排列 。 这 些 粒子 是 非常 复杂 的 , 已 经
证 明 其 中 含有 100 种 以 上 不 同 的 蛋白 质 。 在 复制 过 程 中 具有 两 种 形式 的 粒子 ， 即 由 两 层 膜 包
被 的 胞 外 粒子 和 仅 由 一 层 内 膜 包 被 的 胞 内 粒子 (图 11-8)。 电 子 显 微 镜 下 的 超 薄 切片 观察 证

|

外 层 包 膜
表面 小 管 NS 本 1 核心 包 膜
和 六
at xd 机 几 Na 多
S II 全 . 光

图 11-8 阁 病 毒 的 粒子 结构 示意 图

明 ， 病 毒 粒 子 的 外 层 表面 含有 蛋白 及 脂 类 ,， 它 包 被 着 哑铃 形 的 人 心 及 两 个 功能 尚 不 清楚 的 侧
体 。 病 毒 的 复 心 是 由 紧密 压缩 的 核 蛋白 构成 ,周围 绰 绕 着 双 链 DNA 基因 组 。 就 抗原 性 而 言 ，
斗 病 毒 是 非常 复杂 的 , 它 可 以 同时 诱导 特异 性 抗体 和 交叉 反应 抗体 。 因此 ,可 以 利用 某 种 病毒
来 对 另外 一 种 疾病 进行 免疫 接种 ， 如 使 用 总 苗 病毒 来 对 天 花 病毒 进行 免疫 。 斗 病毒 和 许多 其
它 病 毒 的 复杂 性 还 表现 在 它们 的 粒子 中 至 少 含有 10 种 以 上 与 核酸 代谢 或 基因 组 复制 有 关 的
酶 。 除 了 交 病 毒 科 以 外 ， 另 外 还 有 一 些 粒 子 结构 研究 较为 深入 的 复杂 病毒 ， 如 感染 大 肠 杆菌
的 有 鞭毛 鸣 菌 体 和 感染 昆虫 的 杆 状 病毒 。

第 三 节 ”病毒 的 基因 组

一 、 病 毒 基因 组 的 结构 及 其 复杂 性

病毒 基因 组 的 构成 和 成 分 的 变异 程度 远 远大 于 目前 对 整个 细菌 、 植 物 或 动物 界 研究 的 已
知 结果 。 构 成 病毒 基因 组 的 核酸 可 能 是 单 链 或 双 链 ; 可 能 是 一 条 线 状 或 环 状 分 子 , 也 可 能 是 分
离 存在 的 几 个 分 子 。 单 链 病毒 基因 组 可 能 是 正 意 (与 mRNA 的 核酸 序列 相同 ) 或 者 负 意 的 , 也 了
可 能 是 双 意 的 (上 述 两 种 的 混合 体 )。 病 毒 基因 组 的 长 度 范围 由 约 3 500 个 核 音 酸 (如 轻 小 噬菌体
科 的 MS2 和 QAp 噬菌体 ) 至 大 约 280 kb( 如 疱疹 病毒 科 的 巨细 胞 病毒 ) 。 与 由 DNA 构成 的 所 有
细胞 生物 基因 组 不 同 的 是 ,病毒 基因 组 含有 的 遗传 信息 仅 由 DNA 或 RNA 中 的 一 种 所 编码 。

无 论 一 种 病毒 的 基因 组 构成 如 何 特殊 ,它们 都 将 符合 上 述 条 件 之 一 .由 于 病毒 是 细胞 内 专
性 寄生 并 只 能 在 适当 的 寄主 细胞 内 进行 复制 ,所 以 ,病毒 基因 组 所 含 的 遗传 信息 必须 以 一 种 能

够 被 所 寄生 的 特定 细胞 体系 识别 并 破译 的 形式 存在 .因此 ,病毒 所 使 用 的 遗传 密码 必须 与 寄主
298

岂 体系 相 匹 配 ,或 者 至 少 能 够 被 寄主 所 识别 ,而 控制 病毒 基因 组 表达 的 指令 信号 也 必须 与 寄主 相

适应 。
由 于 重组 DNA 技术 在 病毒 基因 组 方面 的 大 量 应 用 ,近年 来 对 病毒 基因 组 的 结构 及 核酸

U 序列 有 了 深入 的 了 解 。 在 70 年 代 , 第 一 个 被 测定 的 全 基因 组 序列 是 @X174 噬菌体 。 这 种 病毒
U 具有 许多 特点 :第 一 , 它 的 基因 组 为 已 知 的 最 小 基因 组 之 一 (5 386 个 核 苷 酸 ); 第 二 ,只 菌 体 在
天 肠 杆 菌 中 可 进行 大 量 增殖 ,并 易于 纯化 和 抽 提 基因 组 DNA; 第 三 ,这 种 噬菌体 的 基因 组 由 单

链 DNA 构成 ,可 直接 用 于 链 终止 法 序列 测定 。
另外 一 些 病 毒 , 如 疱疹 病毒 和 意 病 毒 , 它们 含有 较 大 的 双 链 DNA 基因 组 ,复杂 程度 到 目

前 为 止 也 无 法 对 其 所 有 功能 进行 分 析 。 许 多 真 核 生 物 DNA 病毒 在 基因 组 的 生物 学 方面 与 它
岂 们 的 霖 主 细胞 非常 相似 。 例 如 :有 些 DNA 病毒 基因 组 与 细胞 组 蛋白 结合 ,在 病毒 粒子 内 形成

二 种 类 似 于 染色 质 的 结构 .假如 这 些 基 因 组 存在 于 寄主 的 细胞 核 内 ,它们 的 作用 则 完全 类 似 于
外 型 的 卫星 染色 体 , 从 而 对 细胞 内 的 酶 类 和 细胞 周期 发 生 支 配 作 用 。 另 外 ,1970 年 ]，Kates
在 痘 苗 病毒 mRNA 的 3'- 未 端 发 现存 在 多 聚 腺 苷 酸 尾 序 ; 1977 年 Sharp 在 腺 病毒 中 首次 发 现
断裂 基因 存在 非 编码 内 含 子 、 蛋 白 编码 外 显 子 ,以 及 拼接 而 成 的 mRNA。

在 很 大 程度 上 , 所 有 的 病毒 都 受到 基因 组 体积 最 小 化 的 压力 。 例如 ,原核 寄主 病毒 的 复制
速度 必须 达到 能 够 与 其 寄主 细胞 的 分 裂 保持 同步 的 程度 。 许 多 噬菌体 紧凑 的 结构 特性 也 说 明
了 这 一 点 。 基 因 重 和 亚 是 一 种 普遍 的 现象 , 以 这 种 方式 ,病毒 得 以 在 最 小 化 的 基因 体积 中 包容
最 大 量 的 编码 信息 。 对 于 真 核 寄 主 的 病毒 来 说 ,也 存在 对 于 基因 组 体积 的 选择 压力 , 但 它 则
主要 是 针对 于 病毒 粒子 的 “包装 体积 ”>， 也 就 是 能 够 被 包容 在 粒子 内 部 的 核酸 数量 。 因 此 , 与
在 页 核 细胞 基因 组 中 ,由 于 分 布 密度 较 低 而 造成 的 遗传 信息 浪费 相 比 , 真 核 寄 主 病毒 也 通常
表现 出 对 于 遗传 信息 的 极 大 浓缩 。

在 一 些 例外 情况 中 ,， 某 些 噬菌体 (如 T4 只 菌 体 所 属 的 肌 尾 叹 菌 体 科 病 毒 ) 具 有 可 达
160 kb 的 基因 组 。 在 这 些 病毒 中 ,病毒 的 基因 组 含有 许多 与 其 自身 复制 有 关 的 基因 ,尤其 是 一
些 与 核酸 代谢 有 关 的 酶 。 由 此 推断 ,这 些 病 毒 具有 通过 编码 额外 元 件 来 避免 受到 寄主 细胞 生
楷 代 谢 制 约 的 能 力 。 具 备 这 种 能 力 的 不 利 一 面 是 ,它们 不 得 不 含有 编码 较 大 而 复杂 的 病毒 粒
子 所 必需 的 所 有 遗传 信息 ， 这 样 也 就 增加 了 对 于 基因 组 体积 的 选择 压力 。

二 、 分 子 遗 传 学 研究 进展

一 般 来 说 ， 对 于 病毒 基因 组 的 任何 研究 通常 都 包括 了 以 下 问题 。 即 病毒 基因 组 的 构成
CDNA 或 RNA、 单 链 或 双 链 、 线 状 或 环 状 )、 基 因 组 大 小 及 片段 的 数目 .未 端 结构 、 核 苷 酸 序列 、
编码 能 力 (阅读 框架 -ORF) 和 调控 信号 (转录 增强 子 、 启 动 子 和 终止 了 )。

对 于 病毒 基因 组 的 分 析 可 以 分 为 两 种 方式 : (1) 基本 以 体外 实验 为 主 的 ， 对 于 结构 和 核
苷 酸 序列 的 物理 分 析 ; (2) 对 于 完整 病毒 基因 组 和 单个 遗传 因子 在 结构 与 功能 关系 方面 的 生
物 学 研究 ， 通 常 涉及 病毒 在 活体 内 的 表现 。

对 于 病毒 基因 组 的 物理 学 分 析 , 通常 采用 不 同 纯度 的 病毒 提纯 物 ， 从 中 分 离 核酸 。70 年
代 , 使 用 逆转 录 酶 ,由 RNA 获得 cDNA 的 技术 被 广泛 采用 ,RNA 的 序列 分 析 得 到 了 迅速 发
展 。Berg 等 人 在 1972 年 将 和 叭 菌 体 DNA 的 酶 切片 段 首 次 克隆 进入 了 SV40 的 DNA 基因 组
中 。 因 此 ,病毒 基因 组 即 是 第 一 种 克隆 载体 ,又 是 第 一 种 采用 这 类 技术 进行 分 析 的 核酸 。 前 面
已 经 提 到 ,@X174 基因 组 是 第 一 个 被 完整 分 析 的 复制 子 (replicon) ,此 后 ,如 Ml3 等 许多 喉 菌

299

体 基 因 组 也 被 改造 用 于 DNA 分 析 的 载体 。

除了 分 子 克隆 以 外 ,其 它 分 子 水 平 上 的 分 析 技 术 也 已 经 被 大 量 用 于 病毒 学 研究 。 在 采用
已 知 标准 物 进 行 校正 的 情况 下 ,利用 电子 显微镜 技术 可 以 直接 对 核酸 分 子 的 大 小 进行 估计 。，
凝 胶 电泳 技术 是 另外 一 项 最 重要 的 技术 。 目 前 多 采用 琼脂 糖 凝 胶 来 分 离 较 大 的 核酸 分 子 ， 而
聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电泳 (PAGE ) 则 多 用 于 较 小 片段 的 分 离 。 凝 胶 电 泳 技术 不 仅 可 以 在 核酸 序列
分 析 中 将 大 小 差别 仅 为 一 个 核 苷 酸 的 分 子 相 互 分 离开 来 ， 而 且 它 在 完整 病毒 基因 组 的 分 析 中
也 具有 极 高 的 价值 , 尤其 是 对 于 含有 分 离 基因 组 的 病毒 来 说 ;

病毒 群体 的 生物 学 表现 ,长 期 以 来 一 直 被 作为 一 种 病毒 学 的 标准 技术 .对 于 变异 型 病毒 和
- 自然 界 存在 的 自发 突变 体 所 进行 的 研究 ,是 一 种 长 期 使 用 的 ,用 于 确定 病毒 基因 功能 的 方
法 。 分 子 生 物 学 使 得 这 类 研究 增加 了 一 项 非常 有 力 的 工具 , 它 能 够 通过 体外 缺失 和 重组 来 设
计 并 创造 特异 性 的 突变 .尽管 mRNA 在 体外 体系 中 的 转录 也 可 以 用 于 编码 能 力 和 某 些 蛋 白质
- 特性 的 研究 , 但 对 于 病毒 基因 组 的 全 部 功能 却 只 能 在 完整 病毒 上 进行 分 析 。 在 这 方面 ， 即 便
与 最 简单 的 细胞 生物 相 比 ,病毒 基因 组 的 结构 也 更 为 简单 ， 具有 可 以 由 续 化 或 这 的 标本 二 国
获得 侵 染 性 病毒 的 特点 。 由 核酸 所 引起 的 细胞 侵 染 称 作 转 染 (transfection) 。

当 采 用 不 含有 任何 蛋白 的 纯化 病毒 RNA 对 细胞 进行 接种 时 ,由 正 意 RNA 省
人 有 食 灯 性 。 这 是 因为 正 意 RNA 也 就 是 mRNA. 在 正常 情况 下 , 被 侵 染 细胞 内 首先 进

行 的 便 是 病毒 RNA 翻译 产生 基因 组 复制 所 需 的 病毒 蛋白 .在 这 种 情况 下 ,向 细胞 中 直接 导入
RNA 对 复制 循环 的 早期 步骤 不 会 产生 影响 。 由 双 链 DNA 所 构成 的 病毒 基因 组 一 般 也 能 够 具
有 侵 染 性 。 由 于 双 链 DNA 病毒 基因 组 必须 由 寄主 的 复制 酶 转录 产生 mRNA,， 所 以 涉及 的 机
制 就 更 为 复杂 一 些 。 这 种 过 程 在 感染 原核 生物 的 鸣 菌 体 基 因 组 中 较为 简单 ,但 对 于 像 疱 疹 病
毒 那 样 在 真 核 细胞 的 细胞 核 内 复制 的 病毒 来 说 , 其 DNA 必须 首先 进入 特定 的 细胞 器 官 。. 虽 然 ”
由 转 染 导入 细胞 的 DNA 中 的 绝 大 部 分 都 将 被 细胞 内 的 核酸 酶 降解 , 但 总 有 一 小 部 分 含有 革
种 序列 的 DNA ,在 进入 细胞 后 可 以 很 快 进入 细胞 核 ， 并 在 其 中 由 细胞 内 的 复制 酶 进行 转录 。
另外 ， 虽 然 效率 低 于 前 面 提 到 的 病毒 RNA， 有 些 正 意 RNA 病毒 (如 小 RNA 病毒 ) 的 基因 组
cDNA 克隆 也 可 以 具有 侵 染 性 .这 可 能 是 因为 细胞 内 的 酶 对 DNA 进行 转录 ， 而 产生 了 RNA。 利
用 这 些 技术 ， 可 以 由 克隆 的 病毒 基因 组 ， 包 括 那 些 在 体外 经 过 改造 的 基因 组 ， 重 新 获得 病毒 。

由 于 含有 负 意 基因 组 的 病毒 粒子 中 都 含有 一 种 病毒 特异 性 的 复制 酶 。 病 毒 基因 组 进入 细

胞 后 ， 负 意 基 因 组 首先 要 由 这 种 复制 酶 复制 ,产生 像 mRNA 那样 可 以 直接 翻译 的 正 意 转 录 ，
子 , 或 者 是 先 产生 所 谓 的 复制 中 间 体 (RI) 及 复制 型 RE) 双 链 分 子 , 并 以 此 为 模板 进一步 合成
mRNA。 由 于 纯化 的 负 意 基因 组 不 能 直接 翻译 ， 也 不 能 在 没有 病毒 复制 酶 的 情况 下 复制 ，
此 这 类 基因 组 自然 情况 下 不 具有 侵 染 性 。 最 近 建 立 了 一 种 由 纯化 或 克隆 的 核酸 中 获得 负 意 基
因 组 病毒 的 系统 。 它 的 原理 是 通过 向 纯化 病毒 或 病毒 感染 细胞 的 提取 物 中 加 入 mRNA， 或 者
用 mRNA 转 染 “辅助 细胞 2helper cell) ， 这 些 辅助 细胞 能 够 以 异 位 (in trans) 互补 方 式 提供 所
需 功能 。 这 一 系统 的 建立 ,使 对 负 链 病毒 的 遗传 研究 成 为 可 能 。

三 、 病 毒 的 遗传 学

对 于 病毒 的 遗传 学 研究 ， 传 统 上 主要 是 通过 对 于 突变 体 的 分 离 及 分 析 来 进行 的 。 随 着 分 |
子 遗 传 学 的 建立 , 大 量 新 的 遗传 学 技术 应 用 于 不 同类 型 的 病毒 。 例 如 : 使 用 代谢 抑制 剂 来 进 |
行 生物 化 学 分 析 并 构建 遗传 图 谱 , 使 用 高 分 辩 率 电泳 技术 对 病毒 蛋 自 或 核酸 的 遗传 多 态 性 进 “|

300

于 和 鉴 定 以 及 其 它 的 分 子 生 物 学 技术 。 通 过 这 些 分 析 可 以 建立 以 下 不 同类 型 的 遗传 图 谱 。
1. 基因 重组 (recombination) 图 谱 tc 根据 两 个 遗传 标记 之 间 的 重组 概率 , 按照 一 定 的 排列
由 硕 序 进行 突变 ， 重 组 概率 与 它们 之 间 的 距离 成 正比 。 这 是 一 种 经 典 的 遗传 学 技术 ,可 用 于 基
。 因 组 不 分 段 的 病毒 (CDNA 或 RNA)。
1 2. 基因 组 重 配 (reassortment) 图 谱 在 分 段 基因 组 病毒 中 , 对 于 特定 基因 组 片段 的 突变
可 以 用 来 确定 与 每 个 基因 片段 相对 应 的 遗传 连锁 重 配 组 合 。
3. 物 理 图 谱 ” 转 染 敏感 细胞 后 ,利用 小 片段 野生 基因 组 对 突变 体 基因 组 进行 修复 (如 在
j 痊 变 体 与 野生 型 DNA 之 间 形 成 杂种 双 链 分 子 )， 从 而 确定 突变 或 其 它 变化 在 病毒 基因 组 中 的
物理 位 置 。
。 夺 限制 性 酶 切 图 谱 ”使 用 限制 性 内 切 酶 对 DNA 的 特定 位 点 进行 切割 ， 可 以 用 于 确定 病
， 毒 基 因 组 的 结构 。 利 用 cDNA 克隆 , 也 可 对 RNA 基因 组 进行 分 析 。
5. 转录 图 谱 以 下 方法 可 以 对 编码 不 同 mRNA 的 区 域 进行 定位 。 @D 使 用 各 种 mRNA 对
特定 的 基因 组 片段 杂交 (如 限制 性 酶 切片 段 ) .mRNA 的 确切 起 始 或 终止 位 置 可 以 通过 放射 性
探 针 的 S1 酶 降解 来 确定 。 利 用 体外 翻译 确定 各 种 mRNA 的 编码 蛋白 ; @ 由 于 紫外 光 造 成 病
毒 RNA 的 部 分 降解 , 在 体外 翻译 体系 中 , 距离 翻译 起 始 位 点 越 远 的 部 分 被 表达 的 可 能 性 也
就 越 小 , 因此 可 对 RNA 病毒 基因 组 进行 紫外 辐射 ,来 确定 其 开放 阅读 框架 的 位 置 。
6. 翻 译 图 谱 使 用 翻译 起 始 抑制 剂 来 确定 病毒 的 蛋白 编码 区 域 。 脉 冲 标记 使 放射 性 仅仅
挫 信 到 那些 在 抑制 剂 加 入 以 前 起 始 合成 的 蛋白 中 ,靠近 基因 组 3' 端 编码 的 蛋白 标记 强度 最
高 ， 而 靠近 5' 端 的 编码 产物 则 最 低 。
(一 ) 病 毒 突 变 体
株 系 “ 型 ”变种 、 突 变 体 以 及 分 离 物 都 是 一 些 在 使 用 中 可 以 互 换 的 名 称 ， 目 的 是 将 它们
区 别 于 所 来 源 的 野生 型 病毒 。 引 起 病毒 间 遗 传 差异 的 基础 尚 不 清楚 , 但 这 些 名 称 的 准确 定义
如 下 ; 株 系 是 同一 病毒 的 不 同系 或 分 离 物 ; 型 是 同一 病毒 的 不 同 血清 型 (如 不 同 的 中 和 反应
表现 型 ); 变种 则 是 与 原始 野生 型 株 系 不 同 的 病毒 。
L. 病毒 突变 的 类 型
《D 自 发 突变 “在 有 些 病 毒 中 , 单个 核 苷 酸 的 突变 频率 可 高 达 10-* 一 10-4( 如 逆转 录 病 毒
中 的 HIV)， 而 另 一 些 病毒 的 突变 频率 则 较 低 ,与 细胞 DNA 的 突变 频率 相近 ,可 能 只 有 10…
过 10 (如 疱疹 病毒 ) 。 这 种 差别 是 由 基因 组 的 复制 机 制 所 引起 的 。 依赖 于 RNA 的 RNA 复制
， 酶 GRdaRpy 所 产生 的 错误 比率 一 般 高 于 依赖 于 DNA 的 DNA 复制 酶 (DdDp)。 虽 然 有 些 RNA
病毒 的 复制 酶 的 确 具 有 校对 功能 ,但 一 般 来 讲 , 大 多 数 RNA 病毒 的 突变 频率 明显 高 于 DNA
病毒 就 特定 病毒 而 言 ; 突变 也 是 一 个 复杂 的 过 程 。 病毒 具有 产生 抗原 性 变种 的 能 力 ， 以 避 开
免疫 反应 局 无 疑 是 有 它 的 优点 2 但 是 大 多 数 突变 又 是 有 害 的 ， 它 也 产生 了 许多 缺损 型 粒子 。 在
一 些 特 殊 的 情况 再 (如 HiVv), 单个 核 苷 酸 的 错误 比率 可 达 10 一 10 。HIVY 的 基因 组 长 度 约
为 9.7 kb 复制 产生 的 单个 基因 组 中 将 应 存在 0. 9 一 9. 7 次 突变 。 因 此， 所谓“ 野生 型 病毒 实
际 上 也 就 是 病毒 复制 过 程 中 ,一 种 在 不 同 病 毒 繁殖 体 的 动态 平衡 中 暂时 占 主导 地 位 的 基因 组
群体 这些 分 子 变异 体 混合 物 现在 被 称 作 “ 近 似 种 ”(quasispecies)，， 其 它 RNA 病毒 中 (如 小 ，
RNA 病毒 ) 也 有 这 种 情况 存在 ! 这 些 变异 体 中 的 大 多 数 将 不 具有 侵 染 人 或 严重 缺 隐 因而
被 很 快 地 从 复制 群体 中 淘汰 出 去 。
(2) 诱 导 突 变 ”大 多 数 病毒 的 遗传 学 分 析 都 是 用 诱 变 剂 处 理 后 ， 从 病毒 群体 中 分 离 得 到 突
301

恋 体 作为 材料 进行 的 。 诱 变 剂 可 分 为 体外 诱 变 剂 和 体内 诱 变 剂 两 类 。 体 外 诱 变 剂 的 活性 不 依
赖 于 核酸 的 复制 .如 : 亚 硝酸 可 对 碱 基 进行 脱胶， 导致 AT->GC 及 CG-~TA 的 同型 转换 ; 羟 胺
可 导致 CG 一 工 A 同型 转换 ;而 烷 化 剂 (如 亚 硝 基 股 ) 则 可 对 味 叭 核 昔 的 N-7 位 进行 烷 基 化 。
体内 诱 变 剂 的 活性 则 针对 代谢 性 核酸 ， 即 正在 进行 复制 的 核酸 。 如 碱 基 类 似 物 (2- 所 基 嗓
叭 .5- 省 脱氧 尿 及 5- 氮 胞 苷 )， 在 挫 和 核酸 的 过 程 中 ， 它们 可 导致 碱 基 错 配 而 发 生 同 型 转换
(transitions)， 即 叮 叭 变 为 叮 哈 和 喀 啶 变 为 喀 啶 (如 AT 一 GC 和 CG 一 TA); 或 异型 转换
(transversions) ， 即 叮 叭 变 为 喀 喧 和 喀 喧 变 为 嘎 叭 (如 AT 一 ~I 工 A 和 GC-~CG) 。 on
5- 茨 光 尿 喀 啶 , 是 一 种 常用 的 RNA 基因 组 诱 变化 合 物 。
另外 ,， 嵌 和 试剂 (如 丫 啶 类 染料 ) 在 碱 基 间 的 交 联 可 造成 插 和 人 或 缺失 ; 紫外 照射 可 导致 喀
院 形 成 二 聚 体 ， 并 被 修复 功能 从 DNA 中 去 除 。 但 这 种 修复 功能 的 错误 比率 比 DNA 复制 过 程
中 的 多 数 酶 类 都 要 高 得 多 。 这 一 技术 也 适用 于 RNA 的 诱 变 。
诱导 突变 体 的 关键 是 每 个 基因 组 中 发 生变 异 的 次 数 。 所 使 用 的 诱 变 剂 剂量 必须 非常 谨 蛋 ，
每 个 基因 组 的 平均 变异 数目 不 能 超过 一 次 。 否 则 所 产生 的 病毒 将 含有 多 种 变异 ， 而 使 得 对 其
表现 型 的 解释 更 为 复杂 。
2. 突变 的 表现 型
(1) 叭 菌 斑 形 态 “ 与 野生 型 病毒 相 比 ， 由 于 复制 速度 的 加 快 或 降低 ， 突 变 体 即 可 能 形成
较 大 的 叹 菌 冀 , 也 可 能 形成 较 小 的 噬 菌 斑 。 鸣 菌 斑 的 大 小 常常 与 对 温度 的 敏感 性 (t. s. ) 有 关 。
(2) 寄 主 范围 “这 一 概念 在 这 里 不 仅 包 括 了 活体 寄主 ,也 包括 了 不 同类 型 的 体外 受 纳 细
胞 (permissive cell) 。 在 体外 系统 中 , 已 经 利用 终止 密码 抑制 子 细胞 分 离 获得 了 这 种 类 型 的 条
件 突 变 体 (conditional mutant) ， 如 许多 叭 菌 体 和 一 些 动物 病毒 。
(3) 温 度 敏 感性 (ts. ) 一 类 对 高 温 表 现 敏感 的 突变 体 ， 在 分 离 获得 条 件 致死 突变 体
(conditional-lethal mnutant) 中 非常 有 用 ， 也 是 测定 有 关 病 毒 基 因 的 有 效 方法 。 这 种 突变 经 常
是 由 蛋白 的 错 义 (missense) 所 导致 的 。 由 于 某 些 氨基 酸 的 代 换 ， 使 完整 蛋白 的 构象 产生 了 一
些微 小 的 变化 ， 而 只 能 在 较 低 的 温度 下 才 具 有 功能 ,但 突变 后 的 蛋白 质 在 免疫 学 上 一 般 不 发
生变 化 。 虽 然 在 非 适合 温度 下 ， 这些 突变 一 般 仍 可 部 分 保留 原 有 的 活性 , 但 即便 在 适合 温度
突变 蛋白 的 功能 也 会 降低 。 由 于 野生 型 病毒 的 复制 比 这些 突 变 体 更 快 ， 因 此 , 这 类 突变 经
常 存在 着 较 高 频率 的 突变 恢复 问题 。 在 一 些 病 毒 中 (如 孤 肠 呼 病毒 和 流感 病毒 )， 多 年 来 已 经
获得 了 针对 每 一 个 基因 的 许多 温度 敏感 型 突变 体 , 用 于 对 基因 组 的 完整 遗传 分 析 。 ，
(4) 低 温 敏 感性 (c. s. ) 这 种 突变 体 与 上 面谈 到 的 相反 . 由 于 寄主 细胞 可 以 在 较 低 的 温度
下 增殖 ， 因 此 , 低温 敏感 突变 体 对 叹 菌 体 和 植物 病毒 的 研究 非常 有 用 。 上
(5) 无 义 突 变 “ 也 称 为 终止 容 变 ， 即 在 编码 区 内 出 现 了 三 种 翻译 终止 密码 中 的 二 种
(UAG- 琥 珀 子 ; UAA- 赭 石子 ;UGA- 虱 自 子 )。 翻译 由 此 提前 终止 , 仅 产生 相应 蛋 自 的 氨基 林
端 片段 。 这 种 突变 体 的 表现 型 可 以 通过 将 病毒 在 含有 不 同 抑制 子 tRNA 的 细胞 (细菌 或 动物
细胞 ) 中 繁殖 而 得 到 恢复 。 无 义 突变 不 像 温 度 突变 那样 仍然 可 保留 部 分 活性 , 仅 能 通过 原来 位
点 的 恢复 重新 成 为 野生 型 病毒 ,但 恢复 频率 较 低 。
《6) 缺 失 突 变 “ 与 无 义 突变 近似 刀 但 可 能 涉及 一 个 或 多 个 病毒 基因 ，。 也 可 能 涉及 如 启动
子 等 非 编 码 调控 区 。 自 然 缺 失 突变 体 经 常 以 缺损 型 干扰 (DI) 颗粒 的 形式 在 病毒 群体 中 出 现 ，
有 人 认为 ， 对 于 某 些 病毒 的 侵 染 来 说 ， 这 些 没有 侵 染 性 ， 也 不 是 病毒 遗传 所 必需 的 基因 组 可

能 在 侵 染 过 程 的 建立 及 致 病 性 方面 具有 重要 作用 。 遗 传 缺 失 只 能 通过 重组 才能 恢复 为 野生 型
302

病毒 ， 发 生 频率 较 低 。 缺 失 突变 可 以 通过 物理 分 析 进行 定位 ， 所 以 对 了 解 病毒 基因 组 中 结构

。 与 功能 的 关系 非常 有 用 。

(7) 生 化 特征 突变 ”其 中 包括 了 药物 抗 性 突变 ; 导致 毒 力 变化 的 特异 性 突变 ; 使 蛋白 或

， 核酸 电泳 迁移 率 变化 的 多 态 性 ; 以 及 对 钝 化 剂 敏感 性 的 变化 。

《8) 回 复 突变 ” 反 向 突变 是 突变 体 自身 进行 的 一 种 变化 , 上述 大 多 数 类 型 的 病毒 都 可 以 发

村 。 突 变形 式 即 可 以 是 直接 地 回复 突变 (对 原 有 突变 的 修复 ), 也 可 以 是 其 它 位 置 上 的 补偿 突变 。

(全 ) 病 毒 之 间 的 遗传 互 作

寄主 通常 都 是 受到 一 个 以 上 的 病毒 侵 染 ， 活体 中 的 病毒 之 间 经 常会 在 遗传 学 上 发 生 相 互

作用。 通过 培养 细胞 的 混合 侵 染 (superinfection) 试 验 ， 遗传 互 作 可 分 为 以 下 两 种 类 型 : @D 突
变 体 按 功能 基 团 分 为 互补 群 ; @ 根据 重组 频率 分 析 , 将 突变 体 按 线性 遗传 图 谱 排列 。

， 功能 互补 就 是 侵 染 细胞 中 病毒 基因 产物 的 相互 作用 。 通 过 这 种 作用 ， 虽 然 相 关 的 一 种 或
者 两 种 突变 体 的 基因 型 并 未 发 生 任何 变化 , 但 它们 的 复制 得 到 了 增强 。 也 就 是 在 混合 侵 染 中 ，
一 种 病毒 提供 了 另 一 种 病毒 所 缺少 的 某 种 功能 性 基因 产物 (图 11-9)。 如 果 两 种 突变 体

生 同一 荔 能 上 发 生 缺 损 ， 便 不 能 在 复制 中 相互 促进 ， 这 样 的 两 个 突变 体 属 于 同一 个 互补 群 。
.理论 上 讲 , 互补 群 的 数量 应 该 与 病毒 基因 组 中 的 基因 数目 相等 。 但 由 于 某 些 突变 是 致死 性 的 ，

靖 放 基因 又 是 非 必需 的 ,无 法 进行 测定 ,所 以 ,在 实际 上 互补 群 的 数量 总 是 少 于 基因 数目 . 目

前 ,已 知 有 两 种 可 能 的 互补 方式 , 即 等 位 (allelic) 互 补 和 非 等 位 Cnon-allelic) 互 补 。 等 位 互补 是

岂 三 种 基因 内 的 互补 ， 也 就 是 不 同 突变 体 在 同一 蛋白 上 存在 互补 性 缺损 ， 如 不 同 的 功能 区 或 多

聚 体 蛋白 的 不 同 亚 基 之 间 。 非 等 位 互补 则 是 基因 间 的 互补 ， 突 变 体 在 不 同 基因 上 发 生 缺 损 ，
这 种 形式 更 为 常见 。

， 重组 是 混合 侵 染 中 病毒 基因 组 之 间 的 物理 作 A 群
用 , 它 使 子 代 病 毒 的 基因 组 含有 与 亲 代 病毒 不 同
的 遗传 信息 。 根 据 病 毒 基因 组 的 结构 ， 有 3 种 不
同 的 重组 方式 。

1. 通过 核酸 的 断裂 和 重新 连接 ,产生 分 子 内
重组 以 DNA 为 中 间 体 的 所 有 DNA 或 RNA
病毒 都 会 发 生 这 种 重组 , 并 可 能 是 在 细胞 中 的 酶 作
用 下 进行 的 。

2. 通过 复制 选择 进行 的 分 子 内 重组 ”发 生 在
RNA 病毒 中 , 可 能 是 由 于 在 基因 组 合成 中 ， 病
毒 育 合 酶 在 模板 链 上 发 生 易 位 所 引起 的 。 虽 然 其
中 可 能 有 某 些 细胞 中 的 酶 (如 剪 切 酶 ) 参 与 , 但 基
本 上 是 一 种 随机 的 过 程 .RNA 病毒 侵 染 过 程 中 的 “全 秆 ”基因 2? 基因 1
缺损 型 干扰 粒子 通常 是 由 这 种 方式 产生 的 。 11-9 流感 病毒 的 互补 群

3. 重 配 ”具有 分 离 基因 组 的 病毒 在 混合 侵 染
中 , 来 源 于 不 同 亲 本 病毒 的 基因 组 片段 可 能 会 重新 组 合 .如 流感 病毒 含有 8 个 基因 组 片段 , 所
以 在 混合 侵 染 中 便 可 能 产生 28， 即 256 种 子 代 病毒 。 在 这 类 病毒 中 , 粒子 包装 过 程 也 可 能 与
重组 子 的 产生 有 关 。 对 于 分 子 内 重组 来 说 ,两 个 标记 基因 之 间 发 生 上 述 重组 的 可 能 性 呈 与 它
们 之 间 的 距离 成 正比 。 所 以 , 一 对 标记 基因 之 间 的 重组 机 率 最 高 可 达 50 外 ,并 可 以 根据 图 臣

303

员 几 | 中 串 |

峰
于

单位 ( 即 重组 机 率 百分比 ) 的 距离 定位 在 一 个 线性 遗传 图 谱 上 。 对 于 重 配 来 说 ， 两 个 标记 基因

产生 重组 子 的 概率 可 能 很 高 ， 也 可 能 较 低 ， 分 别 代表 了 标记 基因 是 位 于 两 条 不 同 的 基因 组 片
段 上 还 是 在 同一 片段 上 。 重 配 作用 通常 会 掩盖 同时 发 生 的 分 子 内 重组 。

(三 ) 病 毒 间 的 非 遗传 性 互 作

病毒 之 间 发 生 的 许多 非 遗传 性 互 作 ， 也 可 以 影响 遗传 作用 的 结果 。 在 病毒 中 ， 除 了 逆转
录 病 毒 整个 基因 组 都 是 两 个 拷贝 的 二 倍 体 以 外 , 还 有 一 些 病 毒 ( 如 疱疹 病毒 ) 也 含有 重复 序
列 ,， 是 一 种 部 分 杂 合体 。 另外 , 少量 病毒 (多 为 包 膜 病 毒 ) 多 个 基因 组 的 异常 包装 ， 有 时 也 可 能
产生 杂 合 的 多 倍 体 粒子 。 如 在 新 城 疫病 毒 中 , 杂 合 粒子 可 达 10% 。 这 种 杂 合 现象 (heterozygoz=
sis) 导致 了 病毒 群体 遗传 的 复杂 性 。

干扰 作用 (interference) 是 不 同 病 毒 之 间 另 一 种 常见 的 非 遗传 性 互 作 。 这 是 在 受到 病毒 感 员
染 的 细胞 中 ,首先 侵 染 的 病毒 对 后 来 侵入 病毒 的 一 种 抵抗 作用 。 在 同 种 病毒 之 间 发 生 的 干扰 三

作用 多 是 由 缺损 型 干扰 粒子 引起 的 ， 它 们 可 以 对 必需 的 细胞 成 分 形成 竞争 并 阻 断 复制 过 程 。
在 其 它 类 型 的 突变 体 之 间 ( 如 显 性 温度 敏感 型 突变 ) 也 可 以 产生 干扰 作用 。

抑制 作用 (suppression ) 是 发 生 在 病毒 基因 组 或 寄主 细胞 基因 组 中 的 一 种 抑制 性 突变 ,对

男 一 种 突变 表现 型 的 抑制 。 这 种 作用 的 机 制 不 同 于 由 寄主 编码 的 抑制 型 恨 NA 引起 的 所 谓
“信息 抑制 ”， 它 使 遗传 突变 体 病 毒 具有 明显 的 野生 型 表现 ,也 就 是 一 种 假 性 回复 体 (pseu-
dorevertant) 。 这 种 现象 在 原核 生物 中 研究 最 为 深入 。 最 近 , 在 一 些 动物 病毒 中 也 发 现 这 样 一

些 例 子 ， 如 扳 肠 呼 病毒 .总 苗 病毒 和 流感 病毒 。 由 于 抑制 作用 使 病毒 能 够 克服 某 些 突变 引起 的 时

不 利 影响 ,. 因此 在 生物 学 上 也 是 非常 重要 的 。 突 变 体 病 毒 可 以 通过 以 下 3 种 方式 之 一 而 表现
为 回复 : 员 真 实 回复 ， 通 过 回复 突变 产生 野生 基因 型 和 表现 型 ;@ 基 因 内 抑制 ,原来 突变 的 基
因 经 过 校正 后 发 生 补偿 突变 ， 如 通过 另 一 次 移 码 突变 使 原来 的 读 码 框架 得 到 恢复 ;@@ 基 因 外
抑制 ,在 不 同 的 病毒 或 寄主 基因 上 发 生 抑制 突变 。

在 混合 侵 染 中 , 子 代 病 毒 含有 来 自

病毒 A 病毒 B
于 两 种 亲 代 病毒 结构 蛋白 的 现象 叫做 表 基因 组 A 基因 组 B
型 混合 (phenotypic mixing)。 其 中 ， 有 Ap 衣 壳 B

上 坚 病 毒 的 基因 组 可 能 完全 包 被 在 另外 一
种 病毒 的 衣 壳 或 包 膜 内 ， 而 另 一 些 子 代
病毒 的 外 壳 或 包 膜 则 可 能 是 由 两 种 病毒
蛋白 混合 构成 的 。 由 于 这 种 混合 作用 ，

虽然 未 使 子 代 病 毒 发 生 任何 遗传 性 改
变 , 但 却 具 有 了 一 些 依赖 于 粒子 组 成 蛋 、
白 的 表现 型 特征 ， 如 对 于 细胞 的 趋向
性 .这 种 作用 在 相近 的 无 包 膜 病 毒 ( 如 肠
道 病 毒 的 不 同 株 系 ) 或 不 相关 的 包 膜 病 0

毒 之 间 很 容易 发 生 。 例 如 , 在 有 包 膜 的 oj(@]f CC)

逆转 录 病 毒 中 ,可 以 通过 辅助 病毒 ， 使 ea az 毒 基因 组 来 决定
复制 缺损 型 病毒 得 到 回复 。 也 就 是 不 同 亲 间 4 必 间 8 交 尖 人 闪

有 包 膜 病毒 的 糖 蛋白 可 以 在 非特 异性 的 图 11-10 混合 侵 染 中 的 表 型 混合

装配 的 包 膜 中 , 形成 一 种 基因 组 与 包 膜 蛋白 来 源 不 同 ， 具有 混合 表 型 的 假 型 病毒 (pseudotype
304

侣 成 及 蛋白 质 加 工 ( 如 蛋白 质 激酶 ) 。 虽 然 这

Virus)， 在 弹 状 水 泡 性 口 膜 炎 病毒 与 逆转 录 病 毒 之 间 也 可 以 发 生 这 种 作用 (图 11-10)。 表 型 混
合 现象 对 于 研究 病毒 的 生物 学 特性 是 一 种 非常 有 用 的 工具 。

四 .DNA 病毒 基因 组

许多 类 型 的 病毒 具有 较 大 而 且 复 杂 的 基因 组 ,这些 病 毒 在 遗传 中 的 许多 方面 与 所 侵 染 的
寄主 细胞 相似 。 下 面 以 腺 病毒 科 和 疱疹 病毒 科 为 例 加 以 说 明 。

疱疹 病毒 科 是 一 个 较 大 的 科 ， 它 含有 100 多 种 病毒 ,到 目前 为 止 在 每 种 动物 上 至 少 发 现
一 种 .共有 7 种 感 当 人 的 疱疹 病毒 ， 它们 都 具有 基本 相同 的 基因 组 , 但 在 基因 组 结构 和 核 苷 酸
序列 上 存在 一 些 细微 的 差别 。 根 据 它 们 的 生物 学 特性 ， 又 分 为 3 个 亚 科 ， 即 ;

a 疱疹 病毒 亚 科 : 在 感觉 神经 节 表 现 为 潜伏 侵 染 ， 如 人 “ 疱疹 病毒 1 型 和 人 “ 疱疹 病毒 3
型 。 基 因 组 约 120 一 180 kb 。

有 疱疹 病毒 亚 科 :寄主 范围 较 窗 ,如 巨细 胞 病毒 和 人 A 疱疹 病毒 5 型 。 基 因 组 约 180 一 280

khb 。

x 疱疹 病毒 亚 科 :感染 淋巴 母 细 胞 ,如 人 7y 疱疹 病毒 4 型 。 基 因 组 约 105 一 170 kb。
疱疹 病毒 的 基因 组 体积 可 达 230 kb， 为 UL Us

双 链 线 状 DNA， 病 毒 粒 子 体 积 大 而 且 较 复

杂 , 其 中 的 蛋白 质 在 30 种 以 上 。 所 有 的 病毒
都 编码 一 些 不 同 的 酶 ， 参 与 核酸 代谢 DNA 。 了 100 152

个 科 中 的 不 同 成 员 在 基因 组 序列 及 蛋白 质 种 证 芝
类 上 差别 很 大 , 但 它们 在 基因 组 的 构成 及 结 、 FEB 一 人 一 二 三 有 -加

构 上 却 是 相似 的 (图 11-11 a) .有些 疱 疹 病 毒 -一 人 一 ED 一 人 [四

的 基因 组 含有 两 个 共 价 结合 的 部 分 ， 即 分 别 本 -本 KEED 帮 四
与 反 向 重复 连接 的 单一 长 区 (Ur) 和 单一 短 ， 睫
区 (Us)。 这 种 重复 使 单一 区 域 在 结构 上 可 以 - 4 二 坟 拓 二
发 生 重 排 ， 并 因此 使 基因 组 存在 4 种 功能 相 1 -11 〈a7 有 些 疱疹 病毒 的 基因 组 中 合 有
同 的 蛋 构 体 ( 图 11.11b) 。 疱 次 病毒 的 基因 组 两 个 共 价 结合 的 区 域 ;b 有 可 能 形成 4 种
韦 还 含有 一 些 多 次 重复 的 序列 ， 由 于 重复 次 个 同 的 基 办 组 异 构 形 式
数 的 不 同 ， 同 一 种 病毒 的 不 同 分 离 物 的 基因 组 差别 可 达 10 kb。

这 个 科 的 典型 成 员 是 人 的 疱疹 病毒 ， 基 因 组 由 长 约 152 kb 的 双 链 DNA 构成 ， 全 部 核 苷
酸 都 已 被 测定 。 其 中 至 少 含有 75 个 基因 ， 以 非常 密集 的 方式 排列 ， 并 有 读 码 框架 重 毒 ， 每 个
基因 都 是 由 自身 的 启动 子 表达 的 。

与 疱疹 病毒 相 比 ， 腺 病毒 的 基因 组 则 是 由 一 种 长 度 约 30 一 38 kb 的 双 链 DNA 构成 ， 确
切 长 度 在 不 同 种 类 之 间 有 所 差异 ,分 别 含有 30 一 40 个 基因 (图 11-12)。 每 条 DNA 的 未 端 序列
都 是 一 种 长 约 100~.140 bp 的 反 向 重复 ， 因 此 变性 后 的 单 链 DNA 可 以 形成 一 种 “ 锅 柄 ” 状 的
结构 。 这 种 结构 在 DNA 的 复制 中 是 重要 的 ， 一 种 55 kD 的 末端 蛋白 与 每 条 链 的 5 -未 端 共 价
结合 ,作为 引物 起 始 新 的 DNA 链 的 合成 。 虽 然 腺 病毒 的 基因 组 明显 小 于 疱疹 病毒 ， 但 是 遗传
信息 的 表达 却 更 为 复杂 。 不 同 基因 共同 使 用 少量 的 启动 子 进行 表达 。 对 产生 的 mRNA 进行 多
次 剪接 ,或 采用 不 同 的 剪接 方式 ， 使 每 个 启动 子 能 够 表达 不 同 的 蛋白 质 。

305

早期 基因

0 5 10 15 20 25 30 35 36 一 39

多 11-12 如 狼 虚 基 央 组 结构

人 腺 病毒 被 分 为 6 个 组 ( 亚 属 ) 。 根 据 分 子 杂交 和 限制 性 酶 切 图 谱 ， 病 毒 的 基因 组 结构 可 必
作为 将 这 些 病毒 进行 归 类 的 另 一 个 特征 。 在 同一 组 的 病毒 之 间 , 全 基因 组 的 核 音 酸 序列 同 源
性 约 70%% 一 95%%; 不 同 组 病毒 间 的 同 源 性 则 仅 为 5 外 一 20%。

侵 染 原 核 生 物 的 叭 菌 体 ,在 基因 组 结构 上 与 其 它 病毒 也 存在 许多 差异 ,其 中 有 些 基因 组 小 时
而 简单 ; 另 一 些 却 大 而 复杂 , 如 M13,T4 和 只 菌 体 。M13 叭 菌 体 的 粒子 结构 与 其 它 病毒 不
同 , 它 的 线 状 衣 壳 可 以 由 于 蛋白 亚 基 的 过 量 装配 而 膨胀 , 6. 4 kb 的 基因 组 体积 也 可 以 因 额 外
插入 的 序列 而 增加 。 由 于 这 些 序列 是 插入 在 基因 之 间 的 一 些 不 重要 的 区 域内 ， 所 以 不 会 影响
衣 壳 的 包装 。 而 在 其 它 一 些 噬 菌 体 中 , 对 于 包装 的 要 求 则 要 苛刻 得 多 。 如 在 1 噬菌体 中 , 只 有
当 DNA 为 正常 基因 组 (49 kb) 大 小 的 95 色 一 基因 组 多 联 体 的 内 切 酶 切 灾
110% 时 ( 约 46 一 54 kb) 才 能 被 包装 到 病毒 颗 1
， 粒 中 。 1 吗 菌 体 和 T4 唆 菌 体 分 别 含有 49 kb 和 ss
160 kb 的 双 链 DNA 基因 组 ,它们 代表 着 线 状
病毒 基因 组 的 另外 一 种 普遍 特征 ， 即 基因 组 的
未 端 序列 具有 重要 作用 。

对 于 ) 噬菌体 来 说 , 在 装配 过 程 中 被 包装
进入 噬菌体 头 部 的 是 一 种 长 的 DNA 多 联 体
(concatemers)， 它 是 在 营养 复制 的 后 期 阶段 产
生 的 。 这 种 DNA 明显 地 是 被 额外 装 进 叭 菌 体
头 部 的 ， 当 完整 基因 都 被 装 入 时 ， 它 又 被 一 类
噬菌体 编码 的 内 切 酶 在 特定 序列 上 切 开 ( 图
11-13)。 这 些 酶 在 每 条 切割 链 的 末端 造 成 一 个
叫做 cos 的 12 bp 5 突出 末端 。 通 过 这 些 粘 性 未
端 之 间 产 生 的 氢 键 可 以 形成 一 种 环 状 分 子 。cous
位 点 两 侧 的 缺口 可 以 在 侵 染 细胞 以 后 ， 经
DNA 连接 酶 的 作用 而 弥合 ,并 以 这 种 环 状
DNA 进行 营养 复制 或 整合 到 细菌 染色 体 中 去 。

T4 噬菌体 和 其 它 的 大 肠 杆 菌 噬菌体 还 具
有 某 些 线 状 病毒 基因 组 的 另外 一 种 分 子 特征 ，

寺
整 全
基因 组

即 末端 丰 余 (terminal redundancy) 。T4 喉 菌 体

的 基因 组 复制 也 能 产生 长 的 DNA 多 联 体 , 并

被 特定 的 内 切 酶 所 切割 ,但 与 4 鸣 菌 体 基 因 组
306

图 11-13 4 鸣 菌 体 基因 组 cos 位 点 的 粘着 末端
在 寄主 细胞 内 连接 形成 一 种 环 状 分 子 ， 通 过
对 基因 组 中 at 位 点 的 特异 性 识别 和 切割 ，
环 状 分 子 可 以 整合 到 大 肠 杆菌 染色 体 中

的 不 同 。 被 装配 进入 颗粒 的 T4 DNA，, 在 长 度 上 稍 大 于 完整 基因 组 (图 11-14) 。 也 就 是 说 基因
组 两 个 未 端的 某 些 基因 发 生 了 重复 ， 使 包装 在 病毒 粒子 内 的 DNA 含有 重复 的 信息 。

CE DISCYOTE TAO ARDHE
AiC 古 汪 汪 共 拓 间 本 下:

基因 组 DNA 多 联 体 的
内 切 酶 切割
ED 下 从- 日 CE
有 EEC DD E，A BDIET AiB
未 端 修复 产生 末端 丰 余
和 蕉 2C 外 BA 记 Eee
BC 一 民 坟 册 n BC iD E- A B 避
基因 给 DNA

图 11-14 工 4 噬菌体 基因 组 未 端 丰 余 导致 遗传 信息 的 重复

细小 病毒 和 多 瘤 病 毒 是 两 类 动物 病毒 ,它们 代表 了 具有 较 小 DNA 基因 组 的 病毒 .其 中 细
小 病毒 科 包 括 三 个 属 ， 即 细小 病毒 属 、 依赖 病 毒 属 和 浓 病 毒 属 。 细小 病毒 的 基因 组 为 长 约 5 kb
的 线形 、 不 分 段 单 链 DNA。 所 有 这 类 病毒 都 至 少 含 有 一 定 比 例 的 正 意 链 ， 除 在 依赖 病毒 中 正
意 链 与 负 意 链 的 部 分 相等 外 ,其 它 种 类 包 被 在 粒子 内 的 核酸 大 部 分 区 域 为 负 意 链 。 它 们 的 基
因 组 都 非常 小 ,即使 是 能 复制 的 (replication-competent) 细 小 病毒 也 只 含有 编码 产物 与 转录
“有 关 的 rep 和 编码 外 壳 蛋 白 的 ca 2 个 基因 。 然 而 ,这 些 基 因 的 表达 却 是 相当 复杂 的 , 每 个 基
因 都 有 着 类 似 于 腺 病毒 那样 的 多 种 剪接 方式 。 这 类 病毒 的 基因 组 末端 都 有 约 115 个 核 苷 酸 的
回 文 序列 ， 并 形成 “发 夹 ?结构 (图 11-15)。 这 种 结构 对 于 基因 组 的 复制 起 始 是 必需 的 ,， 它 也 体
现 了 基因 组 末端 序列 的 重要 性 。

G-C 40 二

一 一 一 和
100 120

oooooononp-ooononpoo
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和
靖

图 11-15 ”细小 病毒 基因 组 末端 的 回 文 序列 形成 与 复制 有 关 的 -发 夹 2 结构

在 细小 病毒 中 ， 目 前 是 根据 病毒 基因 组 的 功能 来 划分 病毒 属 的 。 依 赖 病毒 属 是 首先 发 现
307

的 一 个 属 , 它 包括 了 4 种 类 型 的 腺 病毒 伴随 病毒 (AAV 1 一 4) ,也 就 是 一 些 完 完全 依赖 于 腺 病毒
(或 疱疹 病毒 ) 的 辅助 作用 才能 够 进行 复制 的 病毒 。 虽 然 依赖 病毒 复制 所 必需 的 腺 病毒 基因 可 |
以 编码 早期 调控 蛋白 ， 而 不 编码 后 期 的 腺 病毒 结构 蛋白 ,但 最 近 的 研究 结果 表明 ， 使 用 紫外
线 、 放 线 菌 酮 或 某 些 致癌 剂 处 理 细胞 后 ,可 以 取代 依赖 病毒 对 于 辅助 病毒 的 需要 。 因 此 , 依赖 ，
病毒 所 需要 的 可 能 是 一 种 对 细胞 环境 的 修饰 ， 而 不 是 某 种 可 能 影响 缺损 型 病毒 基因 组 转录 的 上
特定 病毒 蛋白 。

多 瘤 病毒 的 基因 组 由 长 度 约 5 kb 的 双 链 环 状 DNA 分 子 构成 ， 属 内 所 有 病毒 的 全 基因 组 ，
序列 都 已 经 被 确定 ,并 在 分 子 水 平 上 对 它们 的 基因 数目 、 排 列 方式 以 及 调控 信号 和 调控 系统 的 硬
功能 等 进行 了 非常 深入 的 研究 。 在 颗粒 内 部 ,病毒 DNA 以 一 种 超 螺旋 的 形式 存在 ,并 与
H2A,H2B,H3 和 H4 4 种 组 蛋白 结合 。 由 于 同时 利用 了 基因 组 的 两 条 DNA 链 以 及 基因 重 委 滑
这 些 病毒 以 最 小 的 空间 (5 kb 包含 了 最 大 量 的 遗传 信息 (6 个 基因 )( 图 11-16)。 其 中 ,Yz1 是 本

N\

11-16 多 瘤 病毒 的 基因 组 结构

由 一 个 独立 的 阅读 框架 (ORF 编码 的 , 但 VP2 和 VP3 基因 则 是 重 到 的 , 即 VP3 包含 在 VP2
之 中 。 复 制 起 始点 的 两 侧 为 控制 转录 的 非 编 码 区 . 另外 , 多 瘤 病毒 还 编码 工 抗 原 蛋白 ， 这 些 蛋 ，
白 与 复制 起 始点 结合 ， 并 表现 出 一 些 与 DNA 复制 及 病毒 基因 转录 有 关 的 复合 活性 。

五 、 正 链 RNA 病毒

这 一 类 型 病毒 约 占 已 知 病毒 总 数 的 70% 以 上 ,包括 有 包 膜 和 无 包 膜 、 基因 组 分 段 或 不 分
段 的 各 种 病毒 。 由 于 RNA 比较 脆弱 , 较 长 的 核酸 链 更 易于 断裂 , 单 链 RNA 基因 组 的 大 小 范
围 因 此 受到 限制 。 另 外 ,由 于 复制 的 精确 性 较 差 , RNA 基因 组 的 突变 比例 高 于 DNA 基因 组 岂
这 可 能 是 RNA 病毒 基因 组 一 般 都 较 小 的 另 一 个 原因 。 单 链 RNA 基因 组 由 基因 组 长 度 约 旁
30 kb 的 冠状 病毒 ， 到 基因 组 仅 约 为 3. 5 kb 的 MS2 和 @Ap 鸣 菌 体 ,变异 幅度 较 大 。

虽然 这 些 病 毒 分 别 属 于 不 同 的 病毒 科 ， 但 它们 在 基因 组 的 生物 学 方面 都 具有 着 一 些 共同
的 特性 , 即 正 意 RNA 可 以 直接 翻译 产生 蛋白 质 , 经 提纯 的 裸露 RNA 对 敏感 寄主 细胞 具有 侵
染 性 ， 而 不 需要 其 它 任何 病毒 蛋白 的 参与 ( 侵 染 效率 较 病毒 粒子 低 100 万 倍 ) 。 在 基因 组 的 复

制 中 , .这 类 病毒 采用 了 与 DNA 半 保 留 复 制 完 全 不 同 的 不 对 称 复制 方式 , 也 就 是 在 由 RNA 纺
308

码 的 RNA 聚合 酶 (RdRp) 参 与 下 ， 通 过 双 链 复制 中 间 体 (replicative intermediate，RI) ， 产 生
子 代 基 因 组 。 由 于 RdRp 对 复制 过 程 中 的 负 意 RNA 3' -末端 有 着 较 高 亲 和 性 ,复制 结果 不 对
称 合成 过 量 的 正 意 基因 组 RNA。 通 过 对 以 下 4 种 糊 椎 动物 病毒 科 的 比较 ,可 以 看 出 : 虽然 它
们 在 基因 组 构成 的 细节 上 可 能 存在 差异 , 但 有 许多 相同 之 处 (图 11-17) 。

小 RNA 病毒
5 他 结构 蛋白 “” 非 结构 蛋白 2

引
CD SSSSSSSAIE 一 州 RV)

披 膜 病毒
5 UTR 非 结 构 蛋 白 结构 蛋白 3UTIR
5 | A][3，
-poly (A)
黄 病 毒
汪 Te 结构 蛋白 非 结构 蛋白
冠状 病毒

非 结构 蛋白
上
TINSNNSSSSSESNSSSSSSESSSNSSN 本 有 扩 合
结构 蛋白

11-17 正 链 RNA 病毒 基因 组 结构

(一 ) 小 RNA 病毒

小 RNA 病毒 的 基因 组 由 一 条 单 链 正 意 RNA 构成 ,长度 由 7. 2 kb 的 人 鼻 病 毒 CHRYV ) 到
8.5 kb 的 口蹄疫 病毒 (EMDYV ) 不 等 ,并 有 着 许多 共同 的 特性 。

(1)5'- 未 端 含有 一 个 长 的 非 翻 译 区 (CUTR ，600~1 200 个 核 苷 酸 )， 这 一 区 域 对 于 病毒 的
翻译 、 致 病 性 及 衣 壳 装配 都 具有 重要 作用 。 另 外 还 有 一 个 较 短 的 3 -末端 非 翻 译 区 450 一 100 个
核 苷 酸 )， 它 是 复制 过 程 中 的 负 意 链 合成 所 必需 的 。

2) 基因 组 的 其 余部 分 仅 编 码 一 个 氨基 酸 数目 在 2100 一 2400 之 间 的 多 和 蛋 扬
(polyprotein ) 。

43) 基因组 的 2 个 末端 都 会 受到 修饰 ,其 中 5 -末端 共 价 结合 着 一 个 由 23 个 氨基 酸 构成 的
VPg (viral genome associated protein ) 碱 性 蛋白 ; 3'- 示 端 则 含有 多 聚 腺 苷 酸 [Lpoly(A)Jj。 多 聚
腺 昔 酸 序列 并 不 是 自身 编码 的 ,而 是 在 3'- 未 端 上 游 有 一 个 多 聚 腺 苷 酸 信号 ,就 像 真 核 生 物 的
mRNA 那样 。

二 ) 披 膜 病 毒

技 膜 病毒 的 基因 组 由 长 度 约 为 11. 7 kb， 不 分 段 的 单 链 正 意 RNA 构成 ,它们 具有 以 下 特征

GD) 含有 与 细胞 mRNA 相似 的 5 - 甲 基 化 “帽子 ”结构 和 3 -poly(A7 尾 序 。
(2) 通 过 两 次 翻译 进行 表达 ,首先 由 基因 组 5 -区域 编 码 产 生 非 结构 蛋白 ， 然 后 再 由 复制
而 来 的 3' -区域 亚 基因 组 (subgenomic) mRNA ,， 编 码 结构 蛋白 。

(三 ) 黄 病毒

黄 病毒 基因 组 含有 一 条 单 链 正 意 RNA 分 子 , 长 约 11.5 kb。 它 们 具有 以 下 特征 :

(1)5'- 末 端 有 甲 基 化 的 “帽子 ?结构 ,但 RNA 3' -末端 没有 poly(A)。

309

人 基因 组 结构 与 披 膜 病毒 不 同 ,结构 蛋白 由 基因 组 5 -区 域 编码 ,而 非 结构 蛋 自 则 由 3
区 域 编码 。

3) 基因 表达 与 小 RNA 病毒 相似 ,也 是 产生 一 种 多 和 蛋白，

(四 ) 冠 状 病毒

冠状 病毒 基因 组 由 不 分 段 的 单 链 正 意 RNA 构成 ， 长 度 约 27 一 30 kb, 是 最 长 的 RNA 病
毒 。 它 们 具有 以 下 特征 :

@) 具 有 5/- 甲 基 化 “帽子 "和 3'-poly(A) 结 构 ,病毒 RNA 可 以 作为 mRNA 直接 表达 。

2 基因 组 端 约 20 kb 的 片段 首先 翻译 产生 一 种 病毒 的 聚合 酶 ， 再 由 这 种 聚合 酶 产生 |
人 长 的 负 意 链 ,利用 这 种 全 长 的 负 意 RNA 为 模板 , 转录 产生 一 系列 相互 重 本 的 RNA， 在 它
们 的 5 器 都 具有 一 个 由 72 个 核 音 酸 构成 的 相同 非 翻 译 前 导 序列 ,3' 端 也 都 有 一 个 Poly(A) 必 |

3) 每 种 mRNA 都 是 单 顺 反 子 ,位 于 基因 组 5 端的 基因 由 最 长 的 mRNA 进行 翻译 ， 并 |

修饰 ) 所 产生 的 ,而 是 由 特定 的 聚合 酶 通过 转录 而 来 。
六 、 负 链 RNA 病毒

与 上 面 讨论 的 正 链 病 毒 相 比 , 具有 负 意 RNA 基因 组 的 病毒 之 间 差异 更 大 一 些 。 可 能 是 由 和
于 表达 难度 的 原因 ,这 些 病 毒 一 般 都
有 着 较 大 的 基因 组 ， 以 编码 更 多 的 遗 。。 下 是 要

传 信息 。 同 时 ， 在 这 类 病毒 中 普 记 在 ”上 [一

在 着 分 段 基 因 组 (图 11-18)。 经 过 提 。 M sSSSNNTSSeNN ss
纯 的 这 类 病毒 基因 组 RNA 都 不 具有 GPC

侵 染 性 。 这 是 由 于 在 未 受 感染 的 细胞 4
中 , 不 含有 RNA 编码 的 RNA 阳 合 ”LE 下，。s ES
酶 (RdRp)， 负 意 基因 组 也 不 能 作为 [ CC

mRNA 进行 翻译 ， 所 以 这 些 基 因 组 。 。 正 粘 病毒

就 不 具有 生物 活性 。 下 面 要 讨论 的 二 基因 1 Ce |] 基因 2[ 一 Per ] 基因 CR
部 分 病毒 ， 并 非 严 格 意义 上 的 负 意 病 基因 4[SkRA 半 基因 5ENP 习 基因 NAN
毒 ， 而 是 一 种 双 意 (ambisense) 基 因 基因 ?7 基因 8 加 ]
组 ， 也 就 是 部 分 为 负 意 ， 部 分 为 正 Mi/Ma NSVNS。
和

(一 ) 布 尼 病 毒

布 尼 病 毒 科 成 员 的 基因 组 为 单 链
负 意 分 段 RNA， 它们 具有 以 下 特征 :
个 基因 组 由 长 (L，8. 5 kb)、 中 (M，
5.7 kb)、 短 (S，0. 9 kb)3 种 分 子 构
成 ;@ 所 有 的 3 种 RNA 均 为 线 状 。 在
病毒 颗粒 内 ， 由 于 碱 基 配 对 使 它们 的
未 端 相互 靠拢 而 呈 环 状 .3 种 RNA 组 图 11-18 负 链 RNA 病毒 的 基因 组

310

以 此 类 推 产生 多 种 蛋白 这些 病毒 所 特有 的 、\ 类 似 于 细胞 质 mRNA 的 结构 不 是 由 剪接 (转录 后

沙 粒 病毒

GPC

NS(Mi) NS(M?)

| 分 的 分 子 数目 在 病毒 提纯 物 中 不 等 量 存在 ;@ 像 所 有 的 负 意 RNA 一 样 ， 基因组 5 和 3'- 未 端
不 存在 “帽子 结构 或 poly(A) 尾 序 ;@ 白 蛤 热 病 毒 属 成 员 与 本 科 中 S 基因 组 分 长 度 较 短 的 其
启 4 个 属 ( 布 尼 病 毒 属 . 内 罗 病 毒 属 . 汉 坦 病毒 属 及 托 斯 波 病毒 属 ) 不 同 ， 它 的 各 个 基因 组 分 都
是 忆 端 为 负 意 .3' 端 为 正 意 的 双 意 分 子 。
(二 ) 沙 粒 病毒
沙 粒 病毒 为 线 状 单 链 RNA, 基因 组 双 意 ,与 布 尼 病 毒 科 的 白 蛤 热 病毒 属相 似 。 基 因 组 分
勇 两 段 ， 分 别 为 长 (L，5.7 kb) 和 短 (S，2. 8 kb) 组 分 。
于 《三 ) 正 粘 病毒 〈 见 分 段 基 因 组 )
” (四 ) 副 粘 病毒
， 副 粘 病毒 科 成 员 的 基因 组 为 长 度 约 17 一 20 kb 的 不 分 段 负 意 RNA。 所 含 的 6 个 基因 按 顺
序 排 列 ， 相 互 之 间 由 基因 末端 的 poly(A) 加 尾 信号 .基因 间 序 列 GAA 和 下 一 个 基因 的 翻译 起
欧 信 号 所 构成 的 重复 区 分 隔 开 来 。
” (五 ) 弹 状 病毒
二 弹 状 病毒 科 成 员 的 基因 组 为 长 度 约 11 kb 的 不 分 段 负 意 RNA。 病 毒 RNA 基因 组 的 3 和
王 未 端 分 别 有 一 个 由 约 50 个 核 苷 酸 构成 的 前 导 区 和 一 个 由 60 个 核 苷 酸 构成 的 非 翻译 区
WUTR)。 所 含 5 个 基因 的 排列 方式 基本 上 与 副 粘 病毒 相似 , 每 个 基因 的 末端 都 有 一 个 保守 的
ERGI7(A) 信 号 ,基因 之 间 也 都 有 一 个 短 的 间隔 区 。

第 七 、 分 段 和 多 组 分 病毒 基因 组

这 两 种 类 型 的 基因 组 结构 经 常 被 混淆 .分 段 (segmented) 病 毒 基因 组 是 基因 组 被 分 为 两 个
荔 两 个 以 上 不 同 的 核酸 分 子 , 但 被 包装 在 同一 个 病毒 粒子 内 ， 而 多 组 分 (multipartite) 基 因 组
划 然 也 是 分 段 的 , 但 它们 的 每 个 基因 组 片段 却 是 包装 在 不 同 的 病毒 颗粒 中 的 。 虽 然 多 组 分 病
毒 的 不 同 颗 粒 在 结构 上 是 相似 的 ， 并 可 能 由 相同 的 蛋白 质 构成 , 但 由 于 所 包含 的 病毒 基因 组
片段 的 长 度 不 同 ,经常 在 颗粒 的 大 小 上 存在 差异 。 采 用 分 段 基因 组 策略 的 病毒 很 多 ,在 人 \ 动
牺 和 植物 的 病原 物 中 都 有 存在 ,如 正 粘 病毒 、. 孤 肠 呼 病毒 和 布 尼 病 毒 . 而 多 组 分 基因 组 病毒 则
要 少 得 多 ,并 全 部 都 是 植物 病毒 。 其 中 包括 含有 两 个 基因 组 分 段 并 有 两 种 病毒 粒子 的 二 分 体
(ipatite) 病 毒 ， 如 单 链 DNA 的 双 联 病毒 组 、 双 链 DNA 的 隐 性 病毒 组 和 单 链 RNA 的 豆 豆 花
叶 病 毒 组 ,烟草 脆 裂 病毒 组 大麦 黄色 花 叶 病毒 组 及 真菌 传 杆 状 病毒 组 。 含 有 3 个 基因 组 片段
和 3 种 病毒 粒子 的 三 分 体 (tripartite) 病毒， 如 单 链 RNA 的 省 麦 花 叶 病毒 组 、 黄 瓜 花 叶 病毒
组 ` 烟 草 线条 病毒 组 和 大 麦 病毒 组 。 另 外 还 有 一 些 含有 更 多 组 分 的 植物 多 组 分 病毒 ， 如 含有 5
个 单 链 了 NA 基因 组 片段 的 甜菜 坏死 黄 脉 病毒 。
病毒 基因 组 的 分 离 存 在 既 有 优点 也 有 一 些 缺点 。 由 于 核酸 的 物理 特性 ,尤其 是 较 长 的 分
子 容易 被 剪 切 断裂 ,因而 不 分 段 病 毒 基因 组 的 大 小 受到 限制 ， 使 被 包装 到 衣 壳 中 的 核酸 不 能
过 长 。 因为 与 双 链 DNA 相 比 在 化 学 性 状 上 更 不 稳定 ,核酸 链 的 断裂 对 单 链 RNA 来 说 尤其 突
出 。 最 长 的 单 链 RNA 基因 组 是 长 约 30 kb 的 冠状 病毒 ,而 最 长 的 双 链 DNA 病毒 基因 组 则 要
长 得 多 ,如约 280 kb 的 巨细 胞 病毒 . 由 于 不 能 进行 完整 的 转录 ,翻译 及 复制 ,基因组 的 断裂 会
使 病毒 丧失 生物 学 活性 。 基 因 组 的 分 离 存在 使 病毒 避免 了 将 其 全 部 遗传 信息 过 分 集中 , 降低
了 由 于 剪 切 而 造成 断裂 的 可 能 性 ， 从 而 使 整个 基因 组 所 具有 的 编码 能 力 得 到 提高 。 这 种 策略
的 缺点 在 于 所 有 的 单个 基因 组 片段 必须 被 包装 到 同一 个 病毒 颗粒 中 ， 和 否则 便 会 由 于 遗传 信息
3 但

的 丢失 而 造成 病毒 缺损 。 对 这 种 包装 如 何 进行 调控 的 机 制 目前 尚 不 清楚 。

将 基因 组 分 段 分 别 包装 到 不 同 病 毒 颗粒 中 的 多 组 分 策略 ， 虽 然 不 需要 对 每 个 基因 组 片段
的 包装 进行 精确 地 控制 , 但 在 有 效 侵 染 的 建立 中 , 单个 寄主 细胞 必须 受到 所 有 不 同 的 病毒 粒
子 的 感染 。 由 于 在 植物 病毒 进行 感染 的 许多 途径 中 , 都 可 以 使 大 量 的 侵 染 性 病毒 颗粒 得 以 侵 ，
入 ， 从 而 使 最 初 的 细胞 有 机 会 受到 一 个 以 上 病毒 粒子 的 侵 染 ， 如 利用 获 毒 昆虫 或 对 组 织造 成
物理 损伤 进行 的 接种 。 这 可 能 也 是 为 什么 多 组 分 病毒 只 发 生 在 植物 上 的 原因 。

除了 基因 片段 的 重 配 以 外 ,分 段 基因 组 的 遗传 学 与 不 分 段 基因 组 基本 相同 。 无 论 各 种 基
因 片 段 是 包装 在 一 个 粒子 还 是 包装 在 多 个 粒子 中 , 都 可 能 发 生 重 配 。 重 配 作用 是 快速 实现 遗
传 分 化 的 有 效 途 径 ,， 也 可 能 是 进化 的 另 一 个 因素 。 同 时 基因 组 的 分 离 也 必然 涉及 到 遗传 信息 ，
的 分 割 及 其 表达 方式 。

要 了 解 这 类 基因 组 的 复杂 性 ， 就 必须 认识 分 段 病毒 基因 组 (如 正 粘 病毒 科 的 流感 病毒 ) 和
多 组 分 基因 组 (如 双 联 病毒 ) 的 结构 。 流 感 病毒 A,B 株 系 的 基因 组 由 8 个 单 链 负 意 RNA 片段
构成 (图 11-18)，C 株 系 则 由 7 个 片段 构成 。 所 有 8 个 片段 的 5 和 3'- 未 端 都 具有 基因 组 复制
所 必需 的 相同 核酸 序列 (图 11-19): 这 些 序列 之 间 是 互补 的 。 在 病毒 颗粒 内 ， 基 因 组 片段 的 末 ”
端 以 碱 基 配 对 结合 到 一 起 , 形成 一 种 被 认为 是 与 复制 有 关 的 “ 锅 柄 ” 状 结构 这 些 RNA 基因 组
片段 并 非 是 以 裸露 核酸 的 形式 被 包装 的 ， 而 是 与 第 五 个 片段 的 编码 产物 一 一 核 蛋 白 相 结合 ，
在 电子 显微镜 下 形成 一 种 螺旋 状 结构 。 就 生物 化 学 和 遗传 学 来 说 ,每 个 基因 组 片段 都 是 独立
起 作用 的 ,但 在 电子 显微镜 下 ， 经 非 离子 去 垢 剂 解 离 后 的 流感 病毒 颗粒 的 核 衣 壳 却 仅 是 一 种
长 的 螺旋 体 结构 。 这 说 明 在 这 些 基 因 组 片段 之 间 存 在 某 种 相互 作用 ， 它 使 流感 病毒 的 每 个 粒 j
子 能 够 以 非常 低 的 错误 比率 ， 对 基因 组 片段 进行 选择 和 包装 。 决 定 这 种 精确 过 程 的 基因 组 序
列 和 蛋白 质 相 互 作用 尚 不 清楚 。

vRNA

《8 个 基因 组 片段 )
UCGUUUUcGucc 一 /全 一 GGAACAAGAUGA

mRNA
( 比 vRNA 短 15 一 22nt)

人 全 入 -hahacSaAAGcAGG 一 一 一 /一 一 ooyA?

iv |
来 自 细 胞 mRNAs 的 帽子 序列

CRNA
(复制 中 间 体 )
pppAGCAAAAGCAGGE /人 ccuucuuucuncus |
11-19 流感 病毒 RNA 组 分 的 共有 未 端 序列
1

根据 寄主 植物 (单子 叶 或 双子 叶 ) 和 昆虫 介 体 ( 叶 蝉 或 飞 乔 ) 的 不 同 , 双 联 病毒 被 分 成 3 个
组 。 在 III 两 个 组 中 ,基因 组 由 长 约 2. 7 kb 的 单 链 DNA 构成 。 虽 然 在 感染 细胞 内 的 正 意 和
负 意 链 都 含有 蛋白 质 编码 序列 ， 但 一 般 还 是 认为 包含 在 病毒 粒子 内 的 是 正 意 DNA。III 组 双
联 病 毒 是 二 分 体 的 ， 含 有 两 个 单 链 环 状 DNA 分 子 ， 分 别 包 装 在 两 个 不 同 的 粒子 中 (图 1

20)。 构 成 基因 组 的 两 条 链 都 是 约 长 2. 7 kb, 除了 与 DNA 复制 有 关 的 一 段 长 约 200 个 核 苷 酸 】
312

的 区 域 以 外 , 相互 间 的 核酸 序列 完全 不 同 。 两 条 基因 组 DNA 包装 在 完全 分 离 的 衣 壳 中 。 由 于
有 效 侵 染 的 建立 同时 需要 基因 组 的 两 个 组 分 参与 ， 所 以 必须 至 少 要 有 两 个 分 别 含有 一 个 基因
组 片段 的 病毒 颗粒 才能 对 寄主 细胞 造成 侵 染 .虽然 双 联 病毒 并 不 在 它们 的 昆虫 介 体内 增殖 ( 非
增殖 型 传播 )， 但 摄 毒 量 却 相 当 大 ,在 注入 新 的 寄主 植物 时 ， 可 以 使 两 种 粒子 同时 造成 感染 。

图 11-20 二 分 体 双 联 病毒 基因 组 的 结构 和 可 能 的 蛋白 编码 区
顺 时 针 箭头 为 正 意 ORF， 逆 时 针 箭 头 为 负 意 ORF 。

八 ` 逆 转录 病毒

1970 年 ,Howard Temin 和 David Baltimore 同时 发 现 了 在 含有 RNA 基因 组 的 闭 转 录 病
毒 的 粒子 中 含有 一 种 依赖 于 RNA 的 DNA 聚合 酶 (RdDp)， 也 就 是 逆转 录 酶 。 通 过 对 逆转 录
病毒 基因 组 及 其 复制 过 程 的 研究 ,目前 已 经 获得 了 大 量 关于 逆转 录 转 座 子 (retrotransposon)
的 知识 。 在 高 等 生物 的 基因 组 中 , 也 存在 着 非常 相似 的 结构 。

在 逆转 录 病 毒 中 最 引 人 注 意 的 便 是 人 类 免疫 缺损 性 病毒 (HIV)， 俗 称 艾滋 病毒 (AIDS) 。
它 与 其 它 逆转 录 病 毒 不 同 ,除了 通常 的 gag ,zol 和 ex 基因 以 外 ,基因 组 中 还 存在 5 一 6 个 其
上 的 基因 (图 11-21) 。 这 些 基因 都 比较 小 , 分 别 通过 一 组 经 过 剪 切 的 mRNA 表达 ,从 而 使 HIV
对 被 感染 细胞 比 其 它 逆转 录 病 毒 具有 更 强 的 损伤 不 同 嫉 IV 基因 的 确切 功能 尚 不 清楚 , 但 关于
宛 们 在 转录 及 mRNA 剪 切 中 的 作用 ,已 经 获得 了 一 些 较为 深入 的 研究 结果 ( 见 本 章 第 五 节 ) 。

Vi rev
LTR gag | 2 8 LTR
(a) 站 pol 目 困 站 < 一 一 友 L_ 月 |
一 wor | 一 一 加

rev
vif vp 用 < 一 人、 人 国 mer

/ 有 目 < 一 一 Lal 一 -一 > 四 加 天 天下
(b) EC Po 二 一 惠

VPX env LTR
图 11-21 两 种 不 局 的 艾滋 病毒 L(a) 为 瑟 TV-1;Cb) 为 瑟 TV-2] 的 基因 组 结构

逆转 录 病 毒 是 一 种 真正 的 二 倍 体 病 毒 . 其 粒子 中 除了 含有 两 个 基因 组 RNA 拷贝 以 外 , 还
含有 一 种 在 基因 组 逆转 录 合 成 DNA 过 程 中 作为 引物 的 细胞 tRNA( 图 11-22) 。
313

tRNA
引物
vRNA 5 k

形成 强 终止 soNA 3
cDNA 5

入 入 核 到 栈 世 降解。
RNA:DN 本
杂 合 体 昌 的 模板
2

合成 跳 九 " 到 模板 链
的 另 一 端

|

第 一 条 链 的 延伸

第 二 条 链 合成 起 始

第 二 条 链 延 伸

核糖 核酸 酶 H 降解
tRNA 引物

第 二 条 链 在 “ 跳 九

注 :
[病毒 RNA
国 一 新 合成 的 cDNA

11-22 ”逆转 录 病 毒 RNA 基因 组 的 逆转 录 过 程

在 逆转 录 过 程 中 , 构成 病毒 基因 组 的 两 条 单 链 正 意 RNA 被 转换 成 为 二 条 双 链 DNA 分 子 .，
由 于 两 端正 向 重复 序列 (LTR) 的 延伸 ， 所 产生 的 DNA 分 子 比 原来 的 RNA 模板 稍 长 (图 1
23) 。 逆 转录 过 程 中 的 某 些 步骤 尚 不 清楚 ， 如 逆转 录 酶 由 模板 链 的 一 端 向 另 一 端的 长 距离 跳跃
由 于 逆转 录 病 毒 的 RNA 只 能 在 部 分 脱 壳 的 病毒 核心 颗粒 中 完全 转换 为 双 链 DNA， 而 在 体外 溶
液 中 却 不 能 复制 ,说 明 逆转 录 病 毒 核 衣 壳 内 的 两 条 RNA 的 构象 决定 了 逆转 录 过 程 。 由 于 在 核心
颗粒 内 部 病毒 核酸 链 的 末端 可 能 是 相 邻 的， 所 以 实际 上 可 能 也 就 不 存在 所 谓 的 “ 跳 妈 兄

逆转 录 对 于 逆转 录 病 毒 的 遗传 具有 重要 的 作用 。 首 先 ,由 于 逆转 录 酶 不 像 细胞 中 依赖 于
DNA 的 DNA 聚合 酶 (DdDp) 那 样 具有 校正 功能 , 所 以 它 是 一 种 高 度 的 易 错 过 程 .在 这 一 过 程
中 , 逆转 录 病 毒 的 基因 组 中 产生 许多 突变 ,并 导致 快速 的 遗传 分 化 。 另外 ,逆转 录 对 遗传 重组
也 有 促进 作用 .由 于 在 每 个 病毒 粒子 中 包装 的 两 条 RNA 都 被 用 作 逆转 录 模 板 ， 所 以 在 这 两 条
链 之 间 便 可 以 发 生 重组 . 由 于 突变 可 以 产生 两 条 不 同 的 RNA,， 重组 后 将 产生 一 种 在 遗传 学 上 |
不 同 于 任 一 亲 代 的 病毒 。

314

当 逆 转录 完成 以 后 , 双 链 DNA 进
入 细胞 核 中 , 并 仍 与 病毒 蛋白 相 结合 。
zol 基因 的 成 熟 产物 实际 上 是 一 种 多 肽
复合 体 , 它 包括 了 3 种 不 同 的 酶 活性 ，
即 与 着 转录 有 关 的 逆转 录 酶 和 核糖 核酸
酶 HICRNase H)， 以 及 与 催化 病毒
DNA 与 寄主 细胞 染色 质 整 合 的 整合 酶 。
整合 以 后 才能 产生 原 病 毒 (provirus )
(图 11-24) 。 逆转 录 之 后 , 在 感染 细胞 中
可 以 发 现 3 种 形式 的 双 链 DNA， 即 一
种 线 状 DNA 和 两 种 含有 一 个 或 两 个
ETR 结构 的 环 状 DNA。 根 据 原 病毒 的
末端 结构 ， 曾 经 认为 这 种 由 两 个 LIR
构成 的 环 是 用 于 整合 的 结构 。 近 年 来 ，

pol

未 整合 的 线 状 DNA

整合 的 原 病毒
转录

图 11-23 ”逆转 录 病 毒 末端 重复 序列 的 产生 过 程
在 U3 和 R 区 域内 分 别 含有 转录 启动 子 和 多 聚 腺 苷 酸 信号 。

细胞 DNA
整合 酶 使 线 状 DNA 的

形成 交错 切口

整合 的 原 病 毒 :
每 个 LTR 末端 各 丢失 2 个 碱 基 对
在 插 人 区 两 端 有 来 源 于 细胞 DNA
的 6 个 碱 基 的 正 向 重复

图 11-24 ”逆转 录 病 毒 基 因 组 与 寄主 细胞 染色 质 的 整合 机 制
利用 逆转 录 病 毒 DNA 体外 整合 体系 进行 的 研究 表明 , 发 生 整 合 的 实际 上 是 一 种 线 状 结构 。 即

315

两 个 LTR 的 末端 在 逆转 录 酶 -整合 酶 复合 体 的 作用 下 ,相互 非常 靠近 。 整 合作 用 使 每 个 LTR
未 端 缺失 1 一 2 个 碱 基 , 并 在 原 病毒 的 两 端 增加 了 来 源 于 细胞 DNA 的 4 一 6 个 碱 基 。 目 前, 沿
不 清楚 是 否 存在 对 于 细胞 基因 组 整合 位 点 的 特异 性 , 但 在 真 核 生物 基因 组 中 可 能 存在 一 些 比
其 它 部 分 更 利于 整合 的 区 域 或 位 点 。

在 整合 以 后 ， 原 病毒 基因 组 成 为 细胞 基因 的 一 部 分 ,并 随 细胞 的 表达 而 表达 。 由 于 细胞
基因 组 的 修饰 作用 ， 有 时 原 病毒 也 可 能 丢失 或 发 生变 化 , 关于 整合 后 的 原 病毒 被 细胞 基因 组 |
删除 的 机 制 尚 不 清楚 。 病 毒 由 细胞 基因 组 中 释放 的 唯一 途径 就 是 通过 转录 产生 二 种 全 长 的
mRNA( 在 LTR 中 不 含有 未 端 丰 余 序列 ) .这 种 RNA 便 是 病毒 RNA, 每 个 病毒 粒子 中 都 包装
有 两 个 这 样 的 拷贝 (图 11-23) 。

各 种 具有 逆转 录 过 程 的 病毒 ,采用 了 两 种 不 同 的 基因 组 策略 。 一 种 是 上 面 提 到 的 逆转 录 |
病毒 所 采用 的 策略 ,整个 过 程 以 RNA 作为 病毒 基因 组 被 包装 进 病毒 粒子 为 结束 ; 另 一 种 是
DNA 肝炎 病毒 和 花椰菜 花 叶 病毒 所 采用 的 策略 。 它 与 逆转 录 病 毒 复制 过 程 正好 相反 ， 首 先进 行
DNA 转录 ， 然 后 在 病毒 粒子 形成 过 程 中 再 进行 RNA 的 逆转 录 ， 最 终 产 生 DNA 病毒 基因 组

乙肝 病毒 (HBV) 是 DNA 肝炎 病毒 科 的 典型 代表 ， 具 有 含有 脂 类 的 球形 粒子 ,直径 为 42
一 47 nm。 基 因 组 为 有 缺口 的 (gapped) 双 链 DNA, 并 在 粒子 中 含有 一 种 逆转 录 酶 (图 11-254
A)。DNA 肝炎 病毒 的 基因 组 在 所 有 已 知 病毒 中 是 最 小 的 , 负 意 链 长 度 因 DNA 肝炎 病毒 的 种 |
类 不 同 约 为 3. 0 一 3. 3 kb , 正 意 链 长 度 则 因 病 毒 粒 子 的 不 同 约 为 1. 7 一 2. 8 kb。 在 对 细胞 的 侵 ，
染 中 , 可 以 产生 3 种 主要 的 基因 组 转录 物 , 分 别 为 3.4,2.4 和 2.1 kb 的 mRNA。 所 有 这 些
RNA 都 是 以 同一 方向 ,由 同一 条 核酸 链 转录 而 来 的 , 具有 共同 的 3 未 端 ,但 引 末 端 不 同 。 虽 然
这 些 转录 物 的 长 度 不 等 ,每 种 转录 物 编码 那些 蛋白 质 也 尚 不 清楚 , 但 已 知 在 病毒 中 有 以 下 四
个 基因 ， 即 编码 核心 蛋白 的 C 基因 ;编码 着 转录 酶 的 忆 基因 ; 编码 Pre-S1,Pre-S2 和 S 3 种 表
面 抗原 蛋白 的 $ 基因 ;以 及 编码 一 种 病毒 转录 所 需 反 式 激活 蛋白 的 X 基因 。 侵 染 后 不 久 便 可
在 寄主 细胞 核 内 发 现 闭合 环 状 DNA ,可 能 由 它 再 转录 产生 上 述 RNA。 这 种 DNA 是 按照 以 下
方式 ,通过 对 有 缺口 病毒 基因 组 的 修复 而 产生 的 : 〇 正 意 链 延 伸 合拢 ;加 由 负 意 链 和 正 意 链 中 腹
分 别 除去 蛋白 及 寡 核 音 酸 引物 ;@@ 切 除 负 意 链 未 端的 多 余 序列 ;四 两 条 链 的 未 端 进行 连接 。 在 量

35S RNA

19S RNA 亿

图 11-25 乙肝 病毒 和 花椰菜 花 叶 病毒 的 基因 组 结构 和 可 能 编码 的 蛋白 质 (A 为 HBV;B 为 CaMV)
316

病毒 的 核心 颗粒 中 含有 3. 4 kb 的 RNA、 核 心 抗原 和 聚合 酶 ， 当 这 些 颗粒 在 细胞 质 中 形成 时 ，
RNA 由 聚合 酶 转化 成 为 DNA。
花椰菜 花 叶 病毒 (CaMYV ) 是 花椰菜 花 叶 病毒 组 的 典型 成 员 , 与 DNA 肝炎 病毒 相 比 , 虽 然
存在 一 些 差异 ,但 它们 在 基因 组 结构 和 复制 中 都 存在 相似 之 处 .。 CaMV 的 基因 组 由 一 条 长 约 8
Kb， 具 有 缺口 的 双 链 DNA 分 子 构成 ， 其 中 包括 只 含有 一 个 缺口 的 “< 链 和 一 条 有 两 个 缺口 的
互补 链 ( 图 11-25 B) 。 在 它 的 基因 组 中 共有 8 个 基因 , 但 尚未 在 感染 细胞 内 检测 到 全 部 这 些 基
ji 国 的 产物 。CaMYVY 基因 组 的 复制 与 HBV 相似 , 带 有 缺口 的 病毒 DNA 也 是 要 首先 进入 感染 细
胞 的 核 内 ,再 修复 成 为 一 种 共 价 闭合 环 状 分 子 。 这 种 DNA 转录 产生 长 短 两 种 带 有 多 聚 腺 苷 酸
尾 序 的 RNA . 较 短 的 mRNA 在 细胞 质 中 翻译 产生 一 种 蛋白 质 ,这 种 蛋白 在 侵 染 细胞 的 细胞 质
中 形成 较 大 的 内 含 体 (inclusion body), 它 也 是 第 二 个 复制 阶段 的 进行 场所 。 在 这 些 复制 复合
体 中 , 较 长 的 mRNA 进行 翻译 和 逆转 录 , 并 被 包装 到 正在 形成 的 病毒 粒子 中 。

第 四 节 病毒 的 复制

病毒 的 复制 过 程 可 以 被 分 为 8 个 阶段 (图 11-26) 。 虽 然 这 些 “ 阶段 ?纯粹 是 人 为 的 划分 ,以
用 来 说 明 一 种 并 不 存在 的 典型 的 病毒 复制 过 程 ,但 所 有 的 病毒 ,无 论 它们 的 寄主 是 什么 , 在 完
有 成 其 复制 循环 的 过 程 中 ,都 一 定 以 茶 种 方式 经 历 了 这 些 阶 段 。 以 下 所 描述 的 各 个 阶段 ,并 非 在
出 每 一 种 病毒 中 都 是 可 以 被 分 别 检测 到 的 。 它 们 经 常 互相 交织 在 一 起 ,或 者 几乎 是 同时 发 生 。 其 中 某

图 11-26 ”病毒 复制 过 程 示意 图

型 7

二

些 阶 段 已 经 被 研究 得 非常 深入 , 并 获得 了 大 量 的 资料 , 而 另 一 些 阶 段 则 所 知 甚 少 或 一 无 所 知 。
一 ` 吸 . 蔡

具体 来 讲 ， 病 毒 的 吸附 是 病毒 附着 蛋白 (virus-attachment protein) 或 称 作 反 受 体 -an=
tireceptor) 与 细胞 受 体 (receptor) 分 子 的 特异 性 结合 过 程 。 现 在 已 经 发 现 了 许多 受 体 蛋 白 的 例
子 ( 表 11-1)。 细 胞 表面 的 受 体 分 子 可 以 是 蛋白 (多 为 糖 蛋白 ) ,也 可 以 是 糖 蛋 白 或 糖 脂 中 的 一
些 碳 水 化 合 物 残 基 。 糖 蛋白 多 为 特异 性 受 体 , 既 病 毒 以 一 种 特定 蛋白 为 受 体 。 由 于 许多 不 同 糖
基 化 的 膜 结 合 分 子 可 能 具有 相同 的 侧 链 构 型 ,碳水 化 合 物 基 团 的 特异 性 较 低 。 Rs
《如 冶 病 毒 和 疱疹 病毒 ) 可 能 采用 一 种 以 上 的 受 体 ,并 通过 不 同 的 途径 进入 细胞 。

表 11-1 目前 已 知 的 一 些 病毒 受 体 及 其 相应 的 病毒 附着 蛋白

病 毒 受 ， 体 病毒 附着 蛋白
RNA 病毒
小 RNA 病毒
兰 人 灰 质 炎 病毒 类 似 于 免疫 球 蛋 白 的 100 kD 蛋白 家 族 VP1
人 类 鼻 病 毒 胞 内 固着 分 子 1(ICAM-1) V1,2 和 3( 在 病毒 衣 壳 表面 形成 上 四 区 )
呼 肠 孤 病毒
呼 肠 孤 病毒 3 肾上腺 素 受 体 或 唾液 糖 蛋白 5-1 蛋白 C 末端 区 域 ( 血 细胞 凝集 素 )
披 膜 病 毒 ，
西门 利 启 森 林 甲 病毒 工 型 HLA 或 H-2 MHC(?) E2 包 膜 糖 蛋 白
正 粘 病毒
流感 病毒 液 酸 寡 糖 血细胞 凝集 素 C(HA) 和 蛋白
副 粘 病毒
仙台 病毒 唾液 酸 寡 糖 血细胞 凝集 素 - 神 经 胺 酸 酶 (CHN) 和 蛋白
弹 状 病毒
狂犬 病毒 乙酰 胆 碱 受 体 或 三 液 酸 神经 节 苷 脂 病毒 C 蛋白
逆转 录 病 毒
HIV-1 和 HIV-2 CD4 分 子 (及 辅助 蛋白 ) gp120 包 膜 糖 蛋白
维 斯 那 病 毒 I 型 MHC(?) 包 膜 糖 蛋白
DNA 病毒
腺 病毒
人 类 腺 病毒 I 型 HLA MHC 分 子 纤 丝 蛋白
疱疹 病毒
巨细 胞 病毒 I 型 HLA MHC 分 子 及 P- 小 球 蛋 白 H301 蛋白 的 区 (病毒 编码 的 类 工 型 MHC 分 子 )
EB 疱疹 病毒 C3d 受 体 "CR2:( 王 CD21) gp350
总 病 毒
总 苗 病毒 表皮 生长 因子 受 体 (EGF) VGF 蛋白
A 肝炎 病毒
乙肝 病毒 多 聚 血清 白 蛋 白 ,多 聚 IgA 包 膜 蛋白 的 原 S 区
或 唾液 糖 蛋 白 肝 细胞 受 体

小 RNA 病毒 种 和 流感 病毒 属 是 目前 对 于 病毒 与 受 体 相互 作用 研究 最 为 深入 的 两 类
毒 .小 RNA 病毒 与 受 体 的 相互 作用 已 经 从 两 个 方面 得 到 了 验证 ， 即 与 受 体 结合 有 关 的 痪 毒
构 特征 及 受 体 本 身 的 结构 特征 。 人 类 鼻 病 毒 受 体 分 子 ICAM -1 是 种 细胞 附着 分 子 ， 它 前 十
党 功能 是 将 细胞 与 附近 的 底 物 结合 到 -起 .ICAM1 在 结构 上 与 免疫 球 蛋 白 分 子 相似 ,也 广 汗 上
与 抗体 类 似 的 保守 区 (C) 和 易 变 区 (V)， 被 归属 于 免疫 球 蛋白 家 族 成 员 (图 11.27)。 痊 骨 灰 质
炎 病 毒 的 受 体 与 它 相 似 ,是 同属 这 二 家 族 的 一 种 膜 整合 蛋白 ,含有 一 个 易 变 区 和 两 个 保守
区 。 兰 血 灰 质 炎 病 毒 受 体 的 正常 功能 尚 不 清楚 。
318

ICAM-1: 人 类 鼻 病毒 5cD4: 艾滋 病毒 ?7 角 俏 灰质 炎 病 毒

、 NH，
; NH。

; : NH，

细胞 质

COoOH COOH COoH
”图 11-27 类 似 免 疫 球 蛋 白 的 病毒 受 体 结构 示意 图

岂 对 许多 小 RNA 病毒 衣 壳 结构 的 认识 可 以 达到 零点 几 个 纳
下 米 的 分 辩 率 , 因此 ,有 可 能 确定 病毒 中 与 受 体 结合 相关 的 特征 ，
、 春 鼻 病毒 中 ,20 面体 衣 壳 的 每 个 三 角形 表面 都 存在 一 种 被 称 为
5 困 谷 > 的 深 裂 , 它 是 由 VP1,VP2 和 VP3 3 种 亚 基 蛋 白 单 体 之
间 的 空隙 所 形成 的 (图 11-28 ,图 11-29) 。 利 用 可 以 阻 断 鼻 病 毒
二 细胞 吸附 的 抑制 剂 所 得 到 的 研究 结果 表明 ,ICAM-1 与 病毒
粒子 间 的 相互 作用 便 是 在 这 种 受到 趟 蔽 的 峡谷 底部 进行 的 。 与 病
毒 表面 的 其 它 部 分 不 同 的 是， 构成 峡谷 内 侧 表面 的 氨基 酸 残 基
不 易 发 生变 异 。 由 于 抗体 分 子 较 大 而 不 能 插入 这 种 狭 儿 ， 因 此 这
些 残 基 可 以 免 受 抗原 性 压力 .虽然 这 一 区 域 的 基 团 通过 变异 也 可
使 病毒 回避 免疫 应 答 ， 但 同时 也 将 阻 断 与 受 体 的 结合 ， 因 而 这
种 结构 特点 是 非常 重要 的 。 在 兰 癸 灰 质 炎 病 毒 中 , 取代 “ 狭 谷 "的
是 环绕 衣 壳 每 个 五 边 形 顶点 的 四 槽 . 与 抗体 发 生 结合 的 衣 壳 蛋白
高 度 变异 区 位 于 这 一 凹 槽 两 侧 的 峰 顶 ， 由 于 过 于 狭 窑 使 得 抗体
不 能 与 位 于 凹 槽 底部 的 残 基 结合 ， 而 这 些 残 基 则 是 衣 壳 与 受 体
分 子 相 互 作 用 所 需要 的 。

11-28 鼻 病 毒 粒子 表
面 的 深 裂 止 谷 ”

3 进 9

流感 病毒 的 血细胞 凝集 素 蛋
白 和 神经 氨 酸 酶 是 粒子 表面 两 种
可 见 的 糖 蛋白 " 刺 突 ”.。 每 个 血细胞
凝集 素 刺 突 由 3 个 分 子 的 聚合 体
构成 ,神经 氢 酸 酶 刺 突 则 是 由 四 到
体 构 成 (图 11-30) 。 血 细胞 凝集 素
刺 突 与 流感 病毒 和 受 体 结合 有 关 ，
它 的 受 体 为 唾液 酸 (N- 乙 酰 神经 所
酸 ), 是 许多 不 同 的 糖 基 化 分 子 中
经 常 存 在 的 一 种 糖 基 。 因 此 , 这 类
受 体 作 用 的 细胞 类 型 特异 性 很 低 ，
而 使 流感 病毒 除了 可 以 与 那些 可
进行 有 效 侵 染 细胞 结合 外 , 还 可 以
与 差异 很 大 的 不 同类 型 细胞 结合
(如 对 红血球 的 凝集 作用 ) 。 11-29 鼻 病 毒 的 受 体 结合

在 病毒 的 这 个 复制 阶段 中 , 流感 病毒 四

血细胞 凝集 素 (HA) 三 聚 体 ”神经 氨 酸 酶 (NA) 四 聚 体 ”及 副 粘 病毒 的 神经 氨 酸 酶 分 子 具 有 另 一 种 因
受 体 结合 位 点 特性 。 假 如 病毒 不 能 很 快 地 侵入 细胞 , 则
全 可 能 从 细胞 表面 上 脱离 下 来 , 因此 对 于 细 午
胞 受 体 的 吸附 通常 是 一 种 可 逆 的 过 程 。 有
些 病毒 具有 一 些 特殊 的 脱离 机 制 , 神经 氨
酸 酶 便 是 其 中 之 一 。 神 经 氨 酸 酶 是 一 种 脂 和
酶 , 它 可 以 将 唾液 酸 由 糖 基 侧 链 上 切割 下
来 。 这 对 于 流感 病毒 是 非常 重要 的 。 由 于
受 体 分 子 的 种 类 非常 繁多 , 病毒 可 能 与 各
种 类 型 的 细胞 ,甚至 是 细胞 碎片 发 生 一 些
错误 的 结合 。 与 受 体 结合 后 , 病毒 由 细胞 量

图 11-30 “流感 病毒 的 糖 蛋 自 " 刺 突 " 二 而 站 有 经 党 使 生 全 下

， ，， 毒 吸附 蛋白 的 丢失 或 结构 改变 ), 这 种

化 使 病毒 再 次 吸附 到 其 它 细胞 上 的 能 力 降低 或 完全 丧失 . 在 流感 病毒 中 ,被 神经 氨 酸 酶 切割 下 来 的
唾液 酸 残 基 与 血细胞 凝集 素 的 活性 位 点 结合 , 从 而 使 这 些 分 子 不 能 再 与 其 它 受 体 结合 。

许多 情况 下 ,， 受 体 在 细胞 表面 的 存在 与 否 , 在 很 大 程度 上 决定 了 一 种 病毒 的 趋向 性
(tropism) ， 即 病毒 能 够 在 其 中 进行 复制 的 细胞 种 类 。 个 别 例子 中 , 复制 后 期 阶段 细胞 内 的 一
些 障碍 也 可 影响 病毒 进行 有 效 侵 染 的 细胞 种 类 。 由 此 可 见 ， 复 制 过 程 的 早期 阶段 以 及 病毒 与
寄主 细胞 的 首次 相互 作用 ,对 于 病毒 的 致 病 性 和 侵 染 过 程 具 有 重要 的 影响 。

人 Y 疱疹 病毒 (EBV ) 的 复制 便 是 由 受 体 决 定 的 趋 性 具有 重要 作用 的 一 个 例子 。 EBV 仅 能
感染 人 类 细胞 , 在 体内 所 侵 染 的 细胞 又 分 为 两 类 : 可 发 生 有 效 侵 染 的 上 皮 细胞 和 不 能 有 效 侵
染 的 B 型 淋巴 细胞 。 对 于 B 型 淋巴 细胞 的 侵 染 是 通过 细胞 表面 的 CR2 分 子 进 行 的 。 虽 然 上 皮
细胞 在 体内 均 可 受到 病毒 以 某 种 未 知 方式 的 侵 染 , 但 因 大 多 数 上 皮 细 胞 系 不 含有 CR2， 在 体

320

外 也 就 不 受 感染 。 使 用 可 表达 CR2 的 重组 DNA 结构 转 染 上 皮 细 胞 可 以 克服 这 种 障碍 ， 也 就
是 使 得 这 类 细胞 可 以 受到 EBYV 的 感染 。

对 于 HIV 的 研究 也 得 到 了 相似 的 结果 。 HIV 的 初级 受 体 为 另 一 种 淋巴 细胞 表面 分 子 CD4。
使 用 重组 的 CD4 表达 结构 转 染 正常 情况 下 不 能 表达 CD4 的 人 类 细胞 ， 可 以 使 这 些 细胞 受到
HIV 的 侵 染 。 而 用 人 类 CD4 表达 载体 转 染 的 吗 齿 类 细胞 ,HIV 却 不 能 进行 有 效 侵 染 。 当 将 HIV
的 原 病 毒性 DNA 注入 这 些 吐 齿 类 细胞 时 ， 病 毒 便 可 以 繁殖 。 这 说 明 在 细胞 内 部 不 存在 对 于 侵 染
的 障碍 。 有 人 推测 除了 CD4 以 外 ,还 存在 一 种 或 多 种 对 于 HIV 受 体 功能 所 需要 的 (人 类 ) 和 蛋白 。
另外 ,还 有 证 据 表明 ， 至 少 在 茶 些 细胞 类 型 中 ，HIY 的 侵 染 不 会 因 可 溶性 CD4 的 竞争 而 被 阻
断 。 因 而 表明 ， 在 这 些 细胞 中 ， 有 不 同 的 受 体 分 子 在 起 作用 ， 或 者 至 少 是 病毒 侵入 的 途径 不 同 。

在 有 些 情 况 下 ， 病 毒 粒子 与 细胞 间 的 非特 异性 相互 作用 ,能够 阻 断 特 异性 受 体 的 结合 。 病
毒 粒子 虽然 可 能 偶然 地 通过 胞 饮 或 吞 鸣 作 用 进入 细胞 ， 但 在 缺少 能 够 使 病毒 粒子 与 细胞 表面 保

和 有 竺 紧密 联系 的 某 种 物理 作用 的 情况 下 ， 这 种 现象 的 发 生 频 率 是 非常 低 的 。 抗 体 包 被 的 病毒 粒子
上 于 单 核 细胞 或 其 它 血 细胞 表面 的 Fe 受 体 分 子 结合 ， 使 病毒 进入 细胞 的 过 程 ， 便 是 这 样 一 个 不 涉及
时 特异 性 病毒 受 体 的 相互 作用 .这 种 现象 在 很 多 情况 下 都 可 能 发 生 ， 其 中 抗体 对 于 病毒 侵入 的 促进 作

和 用 柯 以 导致 一 些 意 想不到 的 结果 。 例 如 ,病毒 抗体 的 存在 有 时 可 使 细胞 对 于 病毒 的 摄 和 增加， 并 所
和 高 其 致 病 性 ， 而 不 是 通常 想象 的 那样 对 病毒 发 生 中 和 作用 。 有 人 认为 ， 这 种 机 制 在 巨 噬 细 胞 和 单 术

民

过程， 即 : 在 此 过 程 中 细胞 必须 具有 代谢 活
性 。 包 括 以 下 三 种 主要 机 制 :

出 角 胞 对 于 HIV 的 摄 入 中 可 能 也 是 重要 的 ， 而 且 这 也 可 能 是 艾滋 病 致 病 过 程 中 的 一 个 因子 。

坦
1

区

， 面 的 相应 受 体 接合 后 的 很 短 时 间 内 发 生 的 。 与

二 \ 得 得 本 大
病毒 对 于 细胞 的 侵 和 人 ,通常 是 在 与 细胞 表 党

吸附 不 同 的 是 ， 对 于 细胞 的 侵入 多 是 一 种 耗 能

(1) 完 整 病毒 粒子 以 转 位 作用 (transloca-
tion ) 穿 过 细胞 质 膜 ( 图 11-31) 。 这 种 方式 在 病
毒 中 较为 少见 ， 研 究 较 少 。 肯 定 是 由 病毒 衣 壳
中 的 蛋白 及 特异 性 膜 受 体 所 介 导 的 。

《2) 病 毒 在 胞 饮 作 用 (endocytosis) 下 进入
细胞 内 的 液 泡 图 (ii-32) 。 这 可 能 是 病毒 进入 细
胞 的 最 常见 方式 。 除 了 那些 在 受 体 结合 中 所 需
要 的 病毒 蛋白 之 外 ,这 一 过 程 不 需要 其 它 特 异
性 病毒 蛋白 ， 仅 依赖 于 细胞 膜 上 形成 被 有 包 膜 | 病毒 粒子 释放 到 胞 质 中 ，
的 向 内 目 陷 。 由 受 体 控制 下 的 胞 饮 作用 对 于 报 二 作 和 细胞 再 次 利用
和 和 浓缩 细胞 外 的 大 分 子 物 质 更 是 一 种 有 效 的 “ 了 壮 和
过 程 。 包 膜 的 凹陷 使 得 与 质 膜 相连 的 液 泡 进入 申 晤
细胞 质 内 。 这 些 刚 形成 的 包 膜 液 泡 保 持 的 时 间 人
非常 短 ， 在 几 秒 钟 内 便 与 胞 内 体 (endosome ) 融 图 11-31 完整 病毒 粒子 借助 细胞 的 表面
合 ， 并 将 所 含 物质 释放 到 那些 更 大 的 液 泡 中 。 受 体 穿 越 胞 膜 进 行 转 位

| 病毒 粒子 借助 受 体
全

321

11-32 ”病毒 粒子 的 胞 饮 作 用 和 胞 吐 作用

此 时 ， 这 些 结构 中 所 包含 的 病毒 仍然 被 脂 类 膜
与 细胞 质 相 隔离 ， 并 未 真正 进入 细胞 .。 随 着 胞 内
体 与 游离 体 (episome) 或 者 是 溶 酶 体 (lysosome)
的 融合 ， 由 于 酸化 作用 造成 的 pH 值 降低 和 消
解 酶 的 浓度 升 高 ， 使 得 这 些 液 泡 内 的 环境 逐渐
恶化 。 因 此 病毒 必须 脱离 液 泡 ， 进 入 细胞 质 ， 以
免 受到 降解 。 这 一 过 程 的 机 制 有 多 种 ， 其 中 包括
质 膜 融合 及 穿 胞 作用 。 病毒 粒子 由 胞 内 体 的 释放
和 进入 细胞 质 的 过 程 与 脱 壳 过 程 密切 相关 。
(3) 直 接 在 细胞 表面 或 胞 饮 进 入 细胞 质 液 泡
后 ， 包 膜 病 毒 的 外 膜 与 细胞 膜 融合 (fusion ) 进 和
细胞 (图 11-33) 。 融 合作 用 需要 病毒 包 膜 中 的 特
异性 融合 蛋白 参与 ， 如 流感 病毒 的 细胞 凝集 素
或 道 转录 病毒 的 TM 糖 蛋白 。 这 些 蛋 白 对 细胞

11-33 ”病毒 诱导 的 膜 融 合
病毒 粒子 表面 的 特定 融合 蛋白 受到 激活
后 ,可 诱导 液 泡 膜 和 病毒 外 膜 发 生 融合 。

与 病毒 包 膜 的 结合 具有 促进 作用 ， 从 而 使 核 衣 壳 在 细胞 质 中 直接 脱落 。 病 毒 与 膜 的 融合 分 为 两

种 类 型 : 即 依赖 于 pH 的 融合 与 不 依赖 于 pH 的 融合 。

三 、 脱

脱 壳 一 般 是 指 在 侵 和 以后， 病毒 衣 壳 被 全 部 或 部 分 去 除 ， 使 以 核 蛋白 复合 体形 式 存在 的 病
毒 基因 组 得 以 外 露 。 脱 壳 过 程 是 病毒 复制 过 程 中 研究 较 少 的 一 个 环节 ， 认 识 了 解 也 较为 薄弱 。
就 某 种 意义 来 说 ,在 质 膜 融 合 中 病毒 包 膜 的 去 除 也 就 是 脱 壳 过 程 的 一 部 分 。 虽 然 病 毒 包
膜 与 胞 内 体质 膜 间 的 融合 是 由 病毒 融合 蛋白 控制 的 , 但 这 些 蛋 白 的 激活 则 多 是 由 于 液 泡 内 的

322

低 pH 值 引起 蛋白 构 型 变化 , 从 而 使 原来 隐 项 的 融合 区 暴露 出 来 。 脱 壳 的 起 始 可 能 是 在 胞 内
体内 进行 的 ， 胞 内 体 酸化 引起 的 pH 变化 激发 了 这 一 过 程 , 但 也 可 能 是 直接 在 细胞 质 中 进行
的 。 离 子 载体 葛 能 菌 素 或 尼日利亚 菌 素 与 氧 诗 或 氢化 铵 等 阳离子 一 起 使 用 ,可 以 用 于 阻 断 这
些 液 泡 的 酸化 作用 , 并 对 脱 壳 究 竟 是 发 生 于 胞 内 体 酸 化 之 后 (依赖 pH 值 的 膜 融合 )， 还 是 直
接 在 细胞 表面 或 细胞 质 中 发 生 的 (不 依赖 pH 值 的 膜 融合 ) 进 行 测定 。 在 小 RNA 病毒 中 , 病毒
“经 过 胞 内 体 对 于 细胞 质 的 侵入 与 脱 壳 过 程 密切 相关 。 胞 内 体 的 酸性 环境 导致 衣 壳 构 型 发 生变
枇 ， 使 正常 病毒 粒子 表面 并 不 表现 的 疏水 区 得 以 暴露 。 有 人 认为 ， 这 些 疏 水 区 域 与 胞 内 体 腊
的 相互 作用 可 以 产生 和 孔洞， 使 病毒 基因 组 得 以 进入 细胞 质 。

脱 壳 之 后 的 产物 因 病 毒 核 衣 壳 的 结构 不 同 而 异 。 有 些 病 毒 可 能 比较 简单 ， 如 小 RNA 病
毒 , 仅 有 一 个 约 23 个 氨基 酸 的 碱 性 蛋白 (VPg) 共 价 结合 于 病毒 RNA 基因 组 的 5 末端 。 但 在
另 一 些 情 况 下 则 非常 复杂 ， 如 逆转 录 病 毒 的 核心 区 即 为 高 度 有 序 排列 的 核 蛋 白 复合 体 。 其 中
除 含有 二 倍 体 RNA 外 , 还 含有 将 病毒 RNA 基因 组 转录 成 为 DNA 原 病毒 的 逆转 录 酶 。 核 衣
壳 的 结构 及 化 学 特性 决定 了 此 后 的 复制 步 又。 逆转 录 只 能 在 逆转 录 病 毒 有 序 的 核心 粒子 内 进
行 , 而 不 能 在 含有 同样 成 分 的 反应 液 中 进行 。 疱疹 病毒 . 腺 病毒 及 乳 多 空 病 毒 的 衣 壳 在 侵入 后
虽然 也 产生 了 结构 变化 ,但 仍然 基本 保持 了 其 完整 性 。 这 些 衣 壳 中 含有 一 些 与 细胞 骨架 的 吸
岂 附 有 关 的 序列 ， 经 过 相互 作用 使 完整 的 衣 壳 能 够 进入 细胞 核 。 脱 壳 及 核 衣 壳 进入 细胞 核 都 是
于 在 核 孔 中 进行 的 。 对 于 呼 肠 孤 病毒 和 痘 病 毒 而 言 ， 并 不 发 生 彻底 地 脱 壳 ,基因 组 的 许多 复制
过 程 都 是 由 病毒 编码 的 酶 所 催化 的 ， 这 些 酶 作为 成 熟 病 毒 粒 子 的 构成 成 分 存在 于 细胞 质 内 的
粒子 中 。
和

一 一

四 、 基 因 组 复制 及 基因 表达

每 一 种 病毒 的 复制 策略 都 取决 于 其 遗传 物质 的 特性 。 就 这 一 点 来 说 ， 病 毒 可 以 被 分 为 7

种 类 型 。 这 一 划分 方式 在 1971 年 由 David Baltimore 首次 提出 。 早期 仅 包括 6 种 类 型 ,但 现在
又 包括 了 DNA 肝炎 病毒 和 花 郁 菜花 叶 病 毒 组 的 基因 组 复制 方式 ,对 于 许多 病毒 ,尤其 是 含有
RNA 基因 组 的 病毒 来 说 ， 基 因 组 的 复制 与 遗传 信息 的 表达 是 紧密 联系 在 一 起 的 。 在 以 下 划分
的 各 种 类 型 中 ,同时 包括 了 复制 和 表达 两 部 分 内 容 , 图 11-34 表示 了 它们 的 复制 及 表达 策略 。

人 WE I
dsDNA +DNA
| 蛋白 质
VI I
+RNA dsDNA

IV 马 区
11-34 病毒 的 基因 组 类 型 及 复制 表达 途径

323

I : 双 链 DNA( 乳 多 空 病毒 科 、 腺 病毒 科 、 疱 疹 病 毒 科 、 癌 病毒 科 ) 。
这 类 病毒 可 再 被 分 为 两 个 类 型 :(1) 复 制 过 程 仅 限于 细胞 核 内 ( 乳 多 空 病毒 科 、 腺 病毒 科 、
疱疹 病毒 科 ) ， 对 于 细胞 因子 具有 较 高 的 依赖 性 ; (2) 在 细胞 质 内 进行 复制 ( 阁 病 毒 科 )， 具 备 ，
了 其 基因 组 转录 及 复制 所 有 必需 因子 ,因此 对 于 细胞 代谢 具有 较 高 的 独立 性 。
I : 单 链 正 意 DNA( 细 小 病毒 科 ) :在 细胞 核 内 进行 复制 ,通过 合成 一 条 负 意 链 作为 正 意
链 合成 的 模板 。

E : 双 链 RNA( 呼 肠 孤 病毒 科 ) :病毒 含有 分 段 基因 组 , 每 个 基因 片段 分 别 转录 , 产生 各 种
单 顺 反 子 mRNA 。

W : 单 链 正 意 RNA( 小 RNA 病毒 科 、 杯 状 病毒 科 、 披 膜 病毒 科 、 黄 热 病 毒 科 、 冠 状 病毒 科 、。
大 多 数 植物 病毒 ) 。

可 分 为 以 下 两 种 类 型 : (1) 病 毒 含有 多 顺 反 子 mRNA( 小 RNA 病毒 科 、 杯 状 病毒 科 、 黄 热
病毒 科 、 马 铃 薯 Y 病毒 组 .页 豆 花 叶 病 毒 组 .大麦 黄 色 花 叶 病 毒 组 ) 所 有 这 类 病毒 的 RNA 在 侵 ，
染 后 可 作为 mRNA 进行 翻译 ,产生 的 多 肽 蛋白 产物 再 通过 切割 ,形成 成 熟 蛋 白 ;(2) 病 毒 转录 ，
较为 复杂 ( 披 膜 病 毒 科 、 冠 状 病毒 科 、 多 数 植物 病毒 ) 基因组 RNA 的 产生 必须 至 少 通过 两 次 转
录 方 能 完成 。

V : 单 链 负 意 RNA( 正 粘 病毒 科 、 副 粘 病毒 科 、 弹 状 病 毒 科 、 纤 丝 病 毒 科 、 布 尼 病 毒 科 )。

这 类 病毒 的 基因 组 可 分 为 两 种 类 型 : (1) 分 段 基 因 组 ( 正 粘 病毒 科 ) ,复制 过 程 的 第 一 步 是
由 毒 粒 中 的 依赖 RNA 的 RNA 聚合 酶 对 负 链 RNA 进行 转录 ,产生 单 顺 反 子 mRNA; 这 种
mRNA 也 可 作为 下 一 步 基因 组 复制 的 模板 ; (2) 不 分 段 基因 组 复制 方式 与 上 相同 ， 病毒 转录
酶 由 全 长 病毒 基因 组 产生 每 个 基因 的 单 顺 反 子 mRNA 。

W :具有 DNA 中 间 体 的 单 链 正 意 RNA( 逆 转录 病毒 科 ) ,病毒 基因 组 昌 然 是 由 正 意 RNA
构成 ,但 在 两 个 方面 与 其 它 病毒 不 同 。 第 一 , RNA 基因 组 为 二 倍 体 ; 第 二 ， 虽 然 RNA 基因 组
并 不 能 作为 mRNA， 但 可 作为 模板 道 转录 产生 DNA。

:具有 RNA 中 间 体 的 双 链 DNACDNA 肝炎 病毒 科 、 花 椰 菜花 叶 病 毒 组 ) ;这 类 病毒 虽
然 也 存在 逆转 录 , 但 与 逆转 录 病 毒 不 同 的 是 , 它 的 发 生 是 在 成 熟 过 程 中 的 病毒 粒子 内 进行
的 。 侵 染 一 个 新 的 细胞 后 ,首先 要 对 带 有 缺口 的 基因 组 进行 修补 然后 才能 转录 ，

五 装 配

装配 过 程 就 是 构成 病毒 粒子 所 必需 的 所 有 组 分 ,在 细胞 内 特定 场所 的 集合 ,形成 病毒 粒子
的 基本 结构 。 装 配 场所 取决 于 病毒 在 细胞 内 的 复制 地 点 和 不 同 的 释放 机 制 . 例如 ,小 RNA
毒 、 癌 病 毒 及 呼 肠 孤 病毒 在 细胞 质 中 复制 ， 腺 病毒 . 乳 多 空 病毒 及 细小 病毒 在 细胞 核 中 复制 ，
而 逆转 录 病 毒 则 是 在 细胞 膜 的 内 侧 表 面 进行 复制 的 。

在 复制 的 早期 阶段 ， 有 时 无 法 将 装配 、 成 部 和 释放 过 程 作为 不 同 的 独立 阶段 进 生 厅 究 邓
在 任何 情况 下 ， 装配 场所 却 对 这 些 过程 具 有 重要 的 影响 。 在 绝 大 多 数 情况 下 ,细胞 膜 都 被 才
来 附着 病毒 蛋白 并 起 始 装配 过 程 。 目 前 一 般 认 为 ， 随 着 细胞 内 病毒 蛋白 和 基因 组 分 子 浓度 的
提高 ,在 达到 一 定 水 平时 便 可 启动 装配 过 程 。 许 多 由 病毒 合成 的 结构 成 分 , 在 细胞 内 的 局 部
区 域 可 以 达到 很 高 的 水 平 。 这 种 浓缩 形式 叫做 内 含 体 Ginclusion body)， 可 在 光学 显微镜 下 观
察 到 ,也 是 许多 病毒 导致 细胞 侵 染 后 期 阶段 的 一 种 特征 。 内 含 体 的 大 小 和 在 侵 染 细胞 内 的 位

置 ， 对 于 某 一 病毒 来 说 也 常 具有 特征 性 。 如 ,1903 年 由 Adelehi Negri 首次 发 现 的 , 狂 大 病毒

324

感染 所 产生 的 大 型 核 周 涅 格 里 氏 体 “。 另 外 ,病毒 结构 成 分 的 局 部 浓度 也 可 因 膜 相关 和 蛋白 的
相互 作用 而 提高 。 这 种 机 制 对 于 借助 出 芽 由 细胞 内 释放 的 包 膜 病毒 来 说 尤为 重要 。

仅仅 由 衣 壳 亚 基 间 的 相互 作用 所 决定 ， 并 遵循 对 称 性 规律 形成 病毒 粒子 ， 是 一 种 较为 简
单 的 过 程 。 在 另外 一 些 情 况 下 ， 病 毒 的 装配 则 是 一 个 非常 复杂 包括 了 许多 步骤 的 过 程 。 它 不

。 仅 涉及 病毒 结构 蛋白 ， 同 时 涉及 一 些 来 自 于 病毒 或 细胞 ,作为 模板 指导 毒 粒 装配 的 骨架 蛋白 。

病毒 基因 组 的 衣 壳 包装 可 以 是 在 粒子 装配 的 早期 阶段 (如 : 许多 螺旋 对 称病 毒 衣 壳 蛋 白 与 基
因 组 的 结合 )， 也 可 以 是 在 装配 的 后 期 阶段 。 在 后 一 种 情况 下 ,基因 组 是 被 装配 放 和 人 一 个 几乎

， 完整 的 蛋白 外 壳 中 的 。

六 成 “ 熟
经 过 这 个 阶段 ， 病 毒 方 能 具备 侵 染 性 。 成 熟 过 程 通常 涉及 病毒 粒子 的 结构 变化 ， 即 通过

量 允 衣 壳 蛋白 的 特异 性 切割 而 形成 成 熟 蛋白 产物 或 在 装配 中 使 蛋白 发 生 构 型 变化 。 这 种 变化
量 经 常 导 致 衣 壳 结构 的 本 质 性 改变 ， 通 过 对 未 成 熟 病毒

夺

本

PP

而 受到 调控 。 仅 在 由 于 衣 壳 构 型 、 局 部 疏水 环境 、\ 衣 这 内

和 及 成 病毒 粒子 的 抗原 性 差异 比较 可 以 确定 这 些 改变 ，
| 在 用 电 情 况 下 抗原 性 可 能 完全 不 同 (如 , 小 RNA 病
上 毒 )。 另 外 , 核 蛋白 与 病毒 基因 组 结合 所 引起 的 内 部 结

， 物 特 异性 较 低 ， 容 易 将 衣 壳 蛋白 彻底 降解 ， 它 的 作用 存

构 的 改变 也 经 常 导 致 上 述 变化 。
虽然 在 有 些 情 况 下 细胞 中 的 酶 或 病毒 与 胞 内 酶 的

混合 物 也 会 参与 成 熟 过 程 ， 但 由 于 细胞 内 蛋白 酶 的 底

在 很 多 弊端 。 因 此 ， 病 毒 编码 的 蛋白 酶 在 成 熟 中 发 挥 着
”主要 作用 ,它们 通常 具有 针对 特定 氨基 酸 序列 和 结构
的 高 度 特 异性 ， 多 数 情况 下 仅 对 一 个 大 的 复杂 病毒 衣
壳 中 的 某 个 特定 肽 链 进行 切割 。 另 一 方面 ， 这 些 病 毒 来

源 蛋 白 酶 的 功能 ， 由 于 在 装配 中 被 包装 进入 病毒 颗粒 | 本 一

部 pH 或 金属 离子 浓度 变化 时 ， 它 们 才能 与 目标 序列 紧 Sr
密 接触 ， 并 具有 活性 。 在 成 熟 过 程 中 受到 严格 调控 的 酶
类 中 ,， 逆 转录 病毒 的 蛋白 酶 便 是 一 个 很 好 的 例证 。 逆 转
录 病 毒 的 核心 粒子 由 gag 基因 编码 的 蛋白 所 构成 ， 其
蛋白 酶 在 出 芽 释 放 之 前 被 包 被 于 核心 粒子 之 中 。 在 出 芽
过 程 的 某 个 阶段 ( 因 不 同 逆 转录 病毒 而 异 ) , 蛋白 酶 对 机 二 有， 析 | [ee
gag 蛋白 前 体 进行 切割 , 产生 各 种 成 熟 蛋白 ， 即 成 熟 病 生意
毒 粒 子 的 衣 壳 蛋白 、 核 衣 壳 及 基质 蛋白 (图 11-35)。 4
在 成 熟 过 程 中 , 并 非 所 有 的 蛋白 酶 切割 都 是 受到 。 核 衣 这 蛋 白 ” 吹 病毒 基因 组
这 种 严格 调控 的 。 天 然 的 流感 病毒 血细胞 凝集 素 翻 译
后 需 进行 修饰 (在 高 尔 基体 上 糖 基 化 )， 并 在 此 阶段 表 图 1135 病毒 通过 出 芽 方式 区 放
现 出 受 体 结合 活性 。 然 而 ， 这 种 蛋白 必须 被 切割 成 为 两 个 片段 (HA, 和 HA ， 才 能 在 盆 染 中
使 膜 发 生 融 合 。 在 释放 到 细胞 表面 之 前 ,切割 作用 发 生 在 病毒 出 芽 进 入 的 分 沁 液 泡 中 细胞
325

基质 蛋白
细胞 质

内 的 类 胰 和 蛋白酶 与 此 过 程 有 关 。 人 金刚 胺 是 一 种 对 和 A 型 流感 病毒 具有 抑制 活性 的 药剂 。 虽 然 这

种 试剂 的 作用 机 理 是 较为 复杂 的 ,尚未 全 部 了 解 , 但 它 肯 定 可 以 阻 断 细胞 膜 的 离子 通道 。 这 种 ，

药剂 的 作用 靶 点 是 流感 病毒 的 基质 蛋白 (M:) ,但 对 于 药剂 的 抗 性 却 是 在 血细胞 效 集 素 基 因 上 。
某 些 流感 病毒 株 系 的 复制 可 以 在 细胞 侵入 阶段 受到 抑制 ， 而 另 一 些 则 发 生 在 成 熟 期 。 药 剂 的 这
种 不 同 作用 是 由 于 在 经 处 理 的 细胞 内 ,病毒 不 能 对 液 泡 内 的 低 PH 做 出 反应 (这 种 功能 多 由 Ms
基因 产物 所 控制 )， 因 此 也 就 不 能 在 成 熟 过 程 中 对 血细胞 凝集 素 进 行 切 割 。 与 此 类 似 ， 逆 转录 病
， 毒 包 膜 糖 蛋白 也 需要 切割 方 能 具有 表面 蛋白 (SU ) 和 穿 膜 蛋白 (TM) 的 活性 。 关 于 细胞 内 的 酶 类
参与 这 一 过 程 的 机 制 所 知 甚 少 。

如 上 所 述 ， 对 某 些 病毒 而 言 ， 装 配 和 成 熟 过 程 都 是 在 细胞 内 进行 的 ， 也 是 难以 区 分 的 ，
但 另 一 些 病毒 的 成 熟 则 仅 发 生 于 病毒 粒子 由 细胞 中 释放 以 后 。 在 任何 一 种 情况 下 ,成 熟 过 程
都 使 得 病毒 粒子 具备 了 对 于 细胞 的 侵 染 性 。

七 . 释 放

对 于 溶 源 性 病毒 (如 大 多 数 非 包 膜 病毒 ) 来 说 , 释放 过 程 是 比较 简单 的 ， 即 细胞 破碎 而 释 ，

放出 病毒 .有 包 膜 病毒 释放 之 前 则 需要 在 通过 细胞 膜 向 外 出 芽 或 进入 胞 内 液 泡 时 形成 脂 类 膜 。
病毒 的 包 膜 蛋白 是 在 粒子 释放 过 程 中 装配 到 外 膜 上 的 ， 这 个 过 程 称 为 出 芽 。 病 毒 粒 子 以 这 种
方式 释放 可 能 对 细胞 造成 严重 的 伤害 (如 弹 状 病毒 和 疱疹 病毒 )， 也 可 能 不 造成 伤害 (如 逆转

录 病 毒 )。 但 无 论 在 哪 种 情况 下 ,这 一 过 程 都 是 由 病毒 所 决定 的 ， 即 衣 壳 蛋白 对 于 细胞 膜 内 壁

的 物理 作用 使 病毒 粒子 得 以 穿 过 膜 结 构 ( 图 11-35) 。 对 于 以 出 芽 方 式 释放 的 病毒 来 说 ， 装 配 、

成 熟 及 释放 ,是 一 些 同 时 发 生 的 过 程 。 与 病毒 出 芽 有 关 的 膜 的 类 型 是 由 相应 病毒 决定 的 , 即

可 以 是 细胞 的 外 膜 ( 如 逆转 录 病 毒 和 披 膜 病毒 )， 也 可 以 是 细胞 质 膜 ( 如 正 粘 病毒 . 副 粘 病毒 、
布 尼 病毒 .冠状 病毒 . 弹 状 病毒 及 肝炎 DNA 病毒 ) 或 核 膜 (如 疱疹 病毒 )。

某 些 病毒 的 膜 蛋白 不 仅 作用 于 释放 过 程 ， 也 可 以 在 复制 的 初始 阶段 具有 功能 。 流 感 病毒
的 神经 氨 酸 酶 蛋白 便 是 这 种 表现 的 一 个 很 好 例子 。 神 经 氨 酸 酶 不 仅 能 够 通过 血细胞 凝集 素 使
病毒 粒子 与 细胞 的 结合 逆转 ， 它 还 被 认为 在 防止 流感 病毒 粒子 聚集 及 病毒 释放 中 具有 重要 作
用 。 除 了 特异 性 蛋白 以 外 ,具有 出 芽 功 能 的 病毒 还 通过 在 装配 -成熟 一 释放 过 程 中 精确 的 时

间 顺 序 来 解决 释放 中 的 问题 。 虽 然 不 太 可 能 通过 生物 化 学 分 析 将 这 些 阶 段 区 别 开 来 ,但 是 这 ”

些 过 程 在 空间 位 置 上 却 存在 着 一 些微 小 的 差别 。 另外 ,在 复制 过 程 后 期 的 阶段 ,伴随 闭 病毒 粒
子 和 包 膜 内 所 发 生 的 许多 构象 变化 ,有些 病毒 仍然 可 以 进行 复制 。
总 之 ,所 有 类 型 的 病毒 复制 包括 了 3 个 大 的 阶段 , 即 侵 染 的 起 始 . 基 因 组 的 复制 和 表达 ,以

及 最 后 成 熟 病 毒 粒 子 由 侵 染 细胞 中 的 释放 。 虽 然 不 同 病 毒 在 这 一 过 程 中 都 存在 着 一 些 表现 形

式 不 同 的 相似 阶段 ， 但 它们 在 复制 过 程 的 细节 上 又 存在 着 许多 差异 .这 是 由 于 不 同类 型 寄主
细胞 的 生物 学 及 病毒 基因 组 的 特性 所 决定 的 。

第 五 节 ， 病毒 基因 的 表达

4
入

一 .遗传 信息 的 表达

病毒 与 寄 主 细胞 间 最 主要 的 相互 作用 ， 就 是 病毒 要 在 细胞 器 官 中 进行 核酸 及 蛋白 质 的 合
326

成 。 因 此 ,病毒 的 复制 过 程 也 受到 寄主 基因 表达 的 严格 控制 。 就 真 核 细胞 和 原核 细胞 来 说 ,各 自
有 着 完全 不 同 的 表达 调控 机 制 ， 这 些 差异 不 可 避免 地 对 利用 它们 作为 寄主 的 病毒 产生 影响 。 另
外 ,与 最 简单 的 细胞 相 比 ， 更 为 精炼 的 病毒 基因 组 在 这 一 过 程 中 也 表现 出 很 强 的 调控 能 力 。 细 胞

可 以 利用 丰富 的 遗传 信息 ,通过 各 种 不 同 的 复杂 机 制 来 对 基因 的 表达 进行 调控 。 而 病毒 则 要 在

有限 的 遗传 资源 中 ,通过 严格 的 定量 和 时 间 、 空 间 上 高 度 特异 性 , 来 实现 对 表达 的 控制 。

病毒 需要 通过 一 系列 方式 来 弥补 遗传 资源 的 不 足 。 其 中 包括 ， 能 够 高 效 启动 或 阻 遇 基因

表达 的 正 、 负 调控 信号 ; 高度 精 炼 ， 并 经 常 含有 重 秋 阅读 框架 的 基因 组 ;常常 包含 在 其 它 基 因

遇 中 的 调控 信号 ; 以 及 由 一 条 mRNA 合成 多 种 蛋白 的 不 同 策略 。 基因 表达 包括 了 由 各 种 信号 参

上 5 的 调节 过 程 ， 这 些 信 号 中 有 些 以 顺 式 方式 作用 于 相 邻 的 基因 (czs), 有 的 则 可 能 通过 其 产物

对 相 邻 或 不 相 邻 的 调控 位 点 发 生 反 式 作用 (trans)。 例 如 ,转录 启动 子 便 是 顺 式 作用 序列 , 它 与

所 调控 的 基因 相 邻 。 而 细胞 内 与 核酸 特定 序列 结合 的 “转录 子 " 蛋 白 则 是 反 式 作 用 因子 。 较 小

基因 组 和 所 具有 的 精确 调控 机 制 构成 了 病毒 遗传 调控 的 基本 模式 。

二 噬菌体 的 表达 调控

对 1 鸣 菌 体 基 因 组 研究 较 其 它 病 毒 更 为 深入 ,目前 已 经 得 到 了 一 些 有 关机 制 的 结果 。 如 阻
遏 蛋白 在 溶 源 (lysogeny) 复 制 与 裂解 (lytic) 复 制 之 间 的 调控 作用 ,以 及 鸣 菌 体 编码 的 顺 式 调
挖 因子 在 抗 转录 终止 中 的 作用 。 主 要 以 前 噬菌体 (prophage) 形 式 存在 于 大 肠 杆 菌 中 的 4 叭 菌
i 体 即 可 以 进行 溶 源 性 生长 ,也 可 以 进行 裂解 生长 。 图 11-36 所 示 为 只 菌 体 的 简单 基因 图 谱 。
除 编码 病毒 外 壳 蛋 白 的 头 、 尾 部 分 的 结构 基因 外 ,在 4 只 菌 体 生活 史 中 , 以 下 元 件 在 基因 调控
中 的 功能 更 为 重要 。

在 新 感染 细胞 中 ,N 基因 和 cro 基因 分 别 由 PL 和 PR 转录 (图 11-37)。N 蛋白 使 RNA 聚
， 合 酶 对 多 个 喉 菌 体 基 因 进 行 转录 ,包括 那些 与 DNA 重组 .前 喉 菌 体 整合 有 关 的 基因 以 及 c 厅 7

汪 二

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玉
忆

| 下 ag |||||

OL Oh
nuf

: 图 11-36 简化 的 4 噬菌体 遗传 图 谱

Pi :包括 N 和 <c177 基因 在 内 的 ) 基因 组 左 侧 区 域 转录 启动 子 。OL: 基 因 组 中 的 一 小 段 非 编码 区 ( 约 50 bp), 位 于 cf 和 和
基因 之 间 , 与 Pu 相 邻 。 到 :包括 cro,cI7 和 编码 结构 蛋白 的 基因 在 内 的 》 基因 组 右 侧 区 域 转录 启动 子 。OR :基因 组 中 的 一 小 自
非 编码 区 ( 约 50 bp) ,位 于 cr 和 ro 基因 之 间 , 与 PR 相 邻 。c7: 以 其 自身 的 启动 子 转录 ,编码 一 种 236 个 氨基 酸 的 阻 遇 蛋白 .此
蛋白 与 OR 基因 结合 后 将 阻止 cro 的 转录 , 但 仍 允 许 cz 转录 :与 Or 基因 结合 后 则 阻碍 N 基因 及 位 于 基因 组 左 侧 的 其 官 基因 的
转录 。c77 和 cITT; 编 码 与 基因 组 结合 的 激活 蛋白 ,具有 增强 c7 基因 转录 的 作用 。cro: 编 码 一 种 66 个 氨基 酸 的 蛋白 ,此 蛋白 与
OR 基因 结合 后 可 以 防止 阻 过 物 与 它 的 结合 。N ;编码 -种 反 终 止 子 蛋白 ,通过 对 寄主 细胞 RNA 聚合 酶 的 活性 进行 修饰 , 保证
了 PL 和 PR 的 高 效率 转录 ,作用 与 六 因子 类 似 。Q: 是 与 N 基因 相似 的 反 终止 子 ,但 它 只 允许 从 PR 起 始 的 延 伟 转 录 。

327

基因 表达

延迟 早期
基因 表达

(cro)[cl o
溶 源 建 立 RN 裂解 侵 染

EN

Pu 和 Pa 启动 子 所 引 PL 和 Ph
导 的 转录 被 阻 断 启动 子 激活
图 11-37 4 鸣 菌 体 基 因 组 的 表达 调控

和 <1T7 基因 。N 蛋白 作为 转录 正 调控 子 起 作用 。 当 没有 N 蛋白 时 ,RNA 聚合 酶 全 酶 分 别 在 位
于 N 和 @Q 基因 未 端的 wut 和 gu 位 点 处 中 止 。RNA 聚合 酶 -N 蛋白 复合 物 是 由 P, 和 Pu 引导
下 的 转录 能 够 完成 ,而 RNA 聚合 酶 -Q 蛋白 复合 物 则 仅 保证 了 Ps 引导 下 的 转录 。 随 着 细胞 中
cf 和 lll 蛋白 水 平 的 增加 ,cr 阻 遏 子 基因 由 自己 的 启动 子 引导 开始 转录

通常 情况 下 ，clI 蛋白 会 不 断 地 受到 细胞 中 蛋白 酶 的 降解 , 当 ell 蛋白 水 平 保持 在 基 个 临
界 水 平 以 下 时 , 由 P 和 PR 引导 的 转录 将 持续 进行 , 哈 苗 体 进行 增殖 性 复制 ,最 终 使 细胞 裂解
并 释放 出 噬菌体 颗粒 。 但 在 极 少数 情况 下 ,clI 蛋白 的 浓度 会 积累 升 高 ,从 而 促进 了 "7 基因 的
转录 ,并 导致 细胞 内 ecI 阻 过 蛋白 水 平 的 上 升 .这 种 阻 过 蛋白 与 Ov 和 0 区域 结合 ,阻碍 了 除 自
身 以 外 的 所 有 噬菌体 基因 的 转录 . 但 是 过 高 浓度 的 cI 阻 过 蛋白 也 会 与 O, 区 域 的 大 端 结合 ,从
而 盟 止 c7 的 转录 (图 1-38)。 所 以 wel 机 的 水 平 受到 一 种 负 友 馈 机 的 自动 调节 ;本 被 感
细胞 保持 稳定 的 溶 源 状 态 。

这 些 溶 源 细胞 又 是 如 何 转换 进入 增殖 性 裂解 复制 循环 的 呢 ? 生理 压力 ,以 及 志 其 是 皮蛋
线 对 细胞 的 辐射 ,可 以 诱导 寄主 细胞 产生 一 种 称 作 RecA 的 蛋白 质 。 这 种 蛋白 可 以 降解 中 困
过 蛋白 ， 它 的 正常 功能 是 诱导 细胞 的 某 些 基因 表达 ,使 细胞 能 够 在 变化 的 环境 条 件 下 适应
存活 .虽然 RecA 蛋白 本 身 并 不 足以 阻止 细胞 重新 进入 溶 源 状态 ,但 当 cLI 阻 过 蛋白 不 能 与 O
结合 时 ,cro 基因 便 可 以 被 PR 引导 开始 转录 。 所 产生 的 ero 蛋白 也 可 以 与 0 区域 结 合 ， 但 与

328

主要 结合 于 OF 区 域 右 端的 cI 蛋白 不 同 的 是 ,cro 蛋白 优先 与 Og 区 域 的 左 端 结合 , 阻 断 了 c7
基因 的 转录 ， 并 通过 一 种 正 反 馈 机 制 促进 其 自身 的 转录 ,从 而 使 噬菌体 保持 裂解 复制 ,不 能 恢
复 到 溶 源 状 态 。

0EEE 0
在 高 波 度 条 件 下 1
电 c 启 动 子 。 生 | 抑制 其 本 身 人 入 点

二 有”
间 了 各 图 11-38 噬菌体 的 溶 源 调 控

三 、 病 毒 基因 组 的 编码 策略

在 上 一 节 中 , 根据 结构 将 病毒 基因 组 分 为 7 种 类 型 。 由 于 病毒 基因 组 的 复制 和 表达 是 密
不 可 分 的 (尤其 是 RNA 病毒 ) ,下 面 再 对 上 述 7 类 病毒 基因 组 的 表达 方式 逐一 进行 讨论 。

(一 ) 双 链 DNA 病毒 ( 腺 病毒 科 、 疱 疹 病 毒 科 、 辣 病毒 科 及 乳 多 空 病毒 科 )

如 上 节 所 述 ,这些 病毒 都 与 细胞 双 链 DNA 相似 的 基因 组 ,基本 上 是 采用 与 细胞 基因 相同
的 机 制 进行 转录 .。 就 这 一 点 来 说 ,可 以 说 它们 是 相似 的 , 但 是 每 一 类 病毒 对 寄主 细胞 器 官 的 依
赖 程度 却 存在 很 大 差异 。

1. 乳 多 空 病毒 ” 乳 多 空 病毒 的 复制 和 基因 表达 均 高 度 依赖 于 细胞 器 官 。 其 中 多 瘤 病 毒 和
乳头 瘤 病 毒 都 编码 一 些 反 式 作用 因子 (TI- 抗 原 )， 来 起 始 转录 及 基因 组 复制 。 尤 其 是 乳头 瘤 病
毒 的 夏 制 更 要 依赖 于 寄主 细胞 ， 虽 然 这 些 病毒 能 够 编码 几 种 反 式 调控 蛋白 , 但 仅 能 在 分 化 未
期 的 角质 化 细胞 申 复制 ;而 不 能 在 其 它 类 型 的 细胞 中 复制 。

2. 腺 病毒 “ 腺 病毒 的 转录 同样 高 度 依赖 于 细胞 器 官 。 但 是 它们 采用 不 同 的 机 制 来 对 病毒
基因 的 表达 进行 调控 。 在 这 些 机 制 中 , 包括 了 E1A 蛋白 等 反 式 作 用 转录 激活 子 ， 以 及 通过
mRNA 的 拼接 和 病毒 编码 的 V4 RNA 对 表达 进行 转录 后 调控 。 腺 病毒 对 于 细胞 的 感染 分 为
早 、 晚 两 个 阶段 ， 后 一 个 阶段 与 基因 组 复制 同时 开始 ,在 不 同 腺 病毒 之 间 差 异 较 小 。

3. 疱疹 病毒 ”这 类 病毒 比 上 述 各 种 病毒 对 细胞 中 酶 类 的 依赖 程度 较 低 。 它 们 编码 多 种 与

329

DNA 代谢 有 关 的 酶 (如 胸 苷 激酶 ) 和 一 些 反 式 作用 因子 ,后 者 对 病毒 基因 的 表达 时 间 进 行 调
控 ， 从 而 控制 侵 染 的 进程 .这 些 病 毒 的 基因 组 较 大 , 也 较 复杂 , 它 的 转录 是 以 串联 方式 按 顺 序

调控 的 。 在 寄主 细胞 RNA 聚合 酶 II 的 参与 下 , 基因 组 转录 后 至 少 可 产生 50 种 病毒 编码 的 蛋 ，

白 。 其 中 涉及 以 下 3 种 类 型 的 mRNAs :dc- 立 即 早期 (IE)mRNAs，, 编码 5 种 对 于 病毒 转录 的
反 式 作用 调节 子 ;@p-( 延 迟 的 ) 早 期 mRNAs， 编码 非 结构 调控 蛋白 和 某 些 较 次 要 的 结构 蛋
白 ;G@ 思 晚期 mRNAs， 编 码 主要 的 结构 蛋白 。

疱疹 病毒 的 基因 表达 是 受到 严格 而 协调 控制 的 . 即 : 册 如果 蛋白 翻译 在 感染 后 很 快 受到 阻
断 ( 如 用 放 线 菌 酮 处 理 细 胞 ) ,早期 mRNAs 立即 在 细胞 核 中 积累 ,但 不 进 二 步 转录 产生 病毒
mRNA:; 色 早期 基因 产物 的 合成 会 终止 立即 早期 产物 的 形成 并 起 始 基因 组 的 复制 ;@ 某 些 晚

期 结构 蛋白 的 产生 不 依赖 于 基因 组 复制 ,而 其 它 蛋 白 则 只 能 在 基因 组 复制 后 ， 由 新 复制 的 轩

DNA 转录 产生 。

基因 组 复制 的 起 始 同时 需要 立即 早期 蛋白 和 早期 蛋白 。 一 神 病 毒 编码 的 依赖 于 DNA 的
DNA 聚合 酶 (DdDp) 和 一 种 DNA 结合 蛋白 ， 以 及 多 种 影响 细胞 生化 代谢 的 酶 (如 胸 苷 激酶 》
共同 参与 基因 组 复制 。 所 有 这 些 蛋 白质 的 产生 都 是 受到 严格 调控 的 。

4. 痘 病毒” 在 首 病 毒 中 ,基因 组 的 复制 和 基因 表达 ， 除 需要 寄主 细胞 核糖 体外 ， 几 乎 独 ，

立 于 细胞 代谢 。 辣 病毒 基因 组 编码 许多 与 DNA 代谢 ,病毒 基因 转录 和 mRNA 转录 后 修饰 有
关 的 酶 ， 其 中 许多 种 类 都 包含 在 病毒 颗粒 中 。 这 使 得 在 细胞 质 中 进行 的 基因 组 转录 、 复 制 , 几
乎 全 部 都 在 病毒 自身 控制 之 下 ， 而 上 述 其 已 闫 型 的 病毒 则 需要 在 细胞 核 中 复制 。 基因 表达 是
由 与 病毒 粒子 核心 结合 的 酶 指导 的 ,可 分 为 两 个 差别 较 大 的 阶段 。 即 ;

41) 约 占 癌 病 毒 基因 组 50 为 的 早期 基因 ,可 以 在 部 分 脱 壳 的 核心 粒子 内 ， 于 基因 组 开始

复制 以 前 进行 表达 ,产生 具有 5- 帽 子 、.3'-polyA 结构 ,但 没有 剪接 的 mRNAs 。

(2) 晚 期 基因 于 基因 组 开始 复制 以 后 , 在 细胞 质 中 进行 表达 。 但 这 些 基因 的 表达 也 是 依赖
于 病毒 编码 的 转录 蛋白 ,而 不 是 位 于 细胞 核 内 的 细胞 转录 蛋白 。 如 同 疱疹 病毒 一 样 , 癌 病毒 晚
期 基因 启动 子 的 激活 也 依赖 于 DNA 的 早期 复制 。

(二 ) 单 链 正 意 DNA 病毒 (细小 病毒 科 和 双 联 病毒 组 )

由 于 细小 病毒 的 基因 组 非常 小 ,不 足以 编码 各 种 必需 的 生化 产物 ,所 以 不 管 是 自主 型 还 是
依赖 于 辅助 病毒 的 细小 病毒 ， 它 们 的 基因 表达 和 基因 组 复制 都 在 很 大 程度 上 依赖 于 来 源 于 外
部 的 帮助 。 它 们 表达 和 复制 都 是 利用 寄主 细胞 核 所 具有 的 正常 功能 来 进行 的 。 植 物 双 联 病 毒
的 基因 组 结构 也 属于 这 种 类 型 ， 虽 然 它们 的 基因 组 表达 与 细小 病毒 相差 较 大 ,但 是 也 是 高 度
依赖 于 寄主 细胞 的 功能 。

细小 病毒 科 的 复制 缺陷 型 依赖 病毒 属 (Depencdovirws 成员, 完全 依赖 于 腺 病毒 或 疱疹 病
毒 的 双重 感染 来 提供 复制 必需 的 辅助 功能 。 作 为 辅助 子 的 E1A 等 腺 病毒 基因 是 早期 转录 的 调

控 基 因 , 但 对 聊 期 结构 基因 没有 作用 。 最 近 的 研究 结果 表明 ， 用 此 外线、 放 线 菌 本 或 某 些 致 痕 。

物 处 理 细 胞 可 以 取代 辅助 病毒 的 作用 。 因 此 ,所 需要 的 辅助 作用 可 能 仅 是 对 细胞 环境 的 改变
而 不 是 一 种 可 能 影响 缺陷 型 细小 病毒 基因 组 转录 的 特定 病毒 蛋白 。

《三 ) 双 链 RNA 病毒 ( 呼 肠 孤 病毒 科 , 多 数 真菌 病毒 )

咱 肠 孤 病 毒 在 寄主 细胞 质 中 复制 ， 并 具有 多 分 体 基因 组 。 在 侵 染 过 程 中 , 在 病毒 颗粒 中
含有 的 一 种 病毒 特异 性 RNA 聚合 酶 作用 下 ,以 全 保留 方式 由 每 个 基因 组 片段 分 别 产生 独立

的 单 顺 反 子 mRNA( 图 了 -39) 。 即 仅 以 核心 粒子 内 的 双 链 基因 组 中 的 负 意 链 为 模板 ,合成 产生
330

|

mRNA, 释放 后 由 这 些 mRNA 翻译 产生 复制 所 需要 的 病毒 非 结构 蛋白 , 原 有 双 链 基因 组 仍然
保持 完整 。 在 侵 染 过 程 的 后 期 , 单 链 正 意 RNA 也 被 病毒 编码 的 复制 酶 复制 产生 负 意 RNA 链 ，
并 与 正 意 链 共同 形成 新 的 双 链 基因 组 片段 在 基因 组 复制 结束 之 后 ,由 新 形成 的 基因 组 片段 转

录 产 生 编码 结构 蛋白 的 晚期 mRNA, 并 从 病毒 核心 粒子 中 释放 翻译 ,进而 形成 成 熟 的 病毒 颗
区 粒 。 ，

由 装配 在 病毒 核心 中 的
转录 酶 对 双 链 RNA 基因 组
片段 进行 早期 转录

?二 了 一 一 一 poly(A)
全 攻 一 poyA) 释放 出 5" 端 具有 “帽子 ”，
全 纪 一 一 poyA) 3' 端 有 poly(A) 的
俐 人 -一 poly(A) 早期 mRNA

TO 由 核心 粒子 中 释放 出

EN 无 帽子 "结构 ,3' 端 有 .
一 -poly(A) poly(A) 的 晚期 mRNA
一 poly(A)

图 11-39 ， 呼 肠 孤 病毒 基因 组 的 表达

(四 ) 单 链 正 意 RNA 病毒
这 一 类 型 中 包括 了 多 种 动物 ( 杯 状 病毒 科 、 冠 状 病毒 科 、 黄 热 病 毒 科 . 小 RNA 病毒 科 和 披
膜 病 毒 科 ) 和 植物 病毒 (省 才 花 叶 病毒 组 、 香 石竹 斑驳 病毒 科 、 开 豆花 叶 病 毒 科 、 黄 瓜 花 叶 病毒
科 、 石 竹 病 毒 科 真菌 传 杆 状 病毒 科 . 大 麦 病 毒 科 、 烟 草 线 条 病毒 科 `. 大 麦 黄 矮 病 毒 科 ; 线 虫 传 多
角 体 病毒 科 、 马 铃 薯 X 病毒 科 、 马 铃 昔 Y 病毒 科 、 南 方 菜豆 花 叶 病毒 科 ` 烟 草花 叶 病毒 科 , 烟 草
脆 裂 病毒 科 、 番 茄 丛 矮 病 毒 科 和 芜 其 花 叶 病毒 科 ) 。 是 病毒 种 类 及 科 的 数目 最 多 的 一 类 病毒 基
因 组 。 这 些 病毒 基因 组 可 作为 mRNA， 在 感染 寄主 细胞 后 立即 进行 翻译 。 由 于 包括 的 病毒 种
类 繁多 ,这 一 类 基因 组 在 基因 表达 和 基因 组 复制 的 调控 策略 上 表现 出 极 大 的 差异 性 。 这 类 病
毒 在 广义 上 可 分 为 以 下 两 个 类 群 :
(1) 整 个 基因 组 首先 编码 一 种 多 蛋白 (polyprotein) ,然后 被 病毒 编码 的 特异 性 蛋白 酶 切割 4
成 为 前 体 蛋 白 和 各 种 成 熟 的 蛋白 。 由 于 不 同 的 切割 可 以 从 一 种 前 体 产生 性 质 各 不 相同 的 几 种
蛋白 ,所 以 这 些 切 割 对 遗传 信息 的 表达 是 一 种 非常 精细 的 调控 方式 ， 例 如 ,小 RNA 病毒 和 马
铃 昔 Y 病毒 (图 11-40 A) .。 某 些 含有 多 分 体 基 因 组 的 植物 病毒 也 采用 了 一 种 非常 相似 的 策略 ，
从 每 个 基因 组 片段 分 别 产生 多 蛋白 ,来 对 基因 的 表达 进行 调控 。 基 因 组 的 结构 与 小 RNA 病毒
- 放 |

非常 相似 的 珊 豆 花 叶 病毒 便 是 一 个 极 好 的 例子 (图 11-40 B)。

小 核糖 核酸 病毒 科
衣 碗 切割 和 RNA 合成

不 同 的 切割 方式

11-40 以 多 蛋白 为 初始 翻译 产物 的 正 链 RNA 病毒 基因 组
B 中 数字 后 的 单位 为 kD。

(2) 产 生 亚 基因 组 mRNA,， 基因 组 进行 两 次 或 更 多 次 数 的 翻译 循环 。 这 一 策略 使 复制 过
程 在 时 间 上 能 够 分 隔 开 来 ,实现 必要 的 “早期 ”和 “晚期 "阶段 。 在 早期 阶段 中 ,产生 包括 一 种 病
毒 复 制 酶 在 内 的 非 结 构 蛋白 ,而 在 以 后 的 晚期 阶段 中 则 产生 一 些 结构 蛋白 (图 11-41)。 在 以 上
每 个 复制 阶段 中 所 产生 的 蛋白 质 , 都 有 可 能 是 通过 对 多 蛋白 水 解 加 工 而 来 的 ,但 与 上 二 种 类
型 不 同 的 是 ,这 些 蛋 白 仅 占 全 部 基因 组 遗传 信息 的 一 部 分 ,而 不 是 全 部 。 蛋 白质 的 酶 解 又 可 以 、
对 在 每 个 复制 阶段 中 所 产生 的 不 同 蛋白 的 比例 进行 调控 (如 披 膜 病 毒 和 马 铃 董 X 病毒 ) .除了
对 蛋白 质 酶 解 以 外 , 某 些 病毒 还 采用 了 另外 的 策略 来 产生 不 同 的 蛋白 ， 如 产生 亚 基因 组 ”
mRNA、 对 翻译 终止 密码 的 通读 (read-through)( 烟 草花 叶 病毒 ) .在 特定 位 点 上 发 生 的 核糖 体
移 码 ( 红 三 叶 草 坏死 斑 驱 病毒 ) 或 使 用 相互 重 和 到 的 读 码 框架 (番茄 从 矮 病毒 ) 。

总 之 ,所 有 的 这 一 类 病毒 的 基因 表达 调控 都 通过 以 下 机 制 来 实现 的 ， 也 就 是 病毒 编码 用
同 蛋白 的 比例 以 及 产生 这 些 蛋白 的 复制 阶段 。 与 前 面谈 到 的 两 类 DNA 病毒 基因 组 相 比 ,这 些
机 制 在 很 大 程度 上 独立 于 它们 的 寄主 细胞 。

332

NsP3_NsP4
医 二 本 |

NsP1 NsP2 pi 50 人
[E

长
轰 妾
TI 基因 组
下 6
考 记
此
互补 RNA( 一 )
一 一 一 -- 基因 组
RNA( 十 )
FS 了 亚 基 因 组
ER Poy 和 mRNA
再 p13C
这 则 |
星 拓 p98 蛋白 酶 切 加 工
时 堪 p62 Ef1
亲 守 E 一 全
小 沁 ENE

11-41 通过 两 个 相互 独立 的 翻译 循环 进行 表达 的 正 链 RNA 病毒 基因 组 ( 披 膜 病 毒 )
在 侵 染 后 期 产生 亚 基因 组 mRNA。

(五 ) 单 链 负 意 RNA 病毒 ( 正 粘 病毒 科 、 副 粘 病毒 科 、 弹 状 病毒 科 、 纤 丝 病 毒 科 和 布 尼 病 毒
科 )

正 粘 病毒 分 段 基因 组 的 复制 ， 第 一 步 是 负 意 RNA 在 与 病毒 粒子 结合 的 RdRp 作用 下 ，
转录 产生 单 顺 反 子 mRNA,， 这 种 mRNA 也 是 下 一 步 基 因 组 复制 的 模板 (图 11-42)。 在 所 有 的
负 意 RNA 病毒 中 , 由 于 寄主 细胞 内 不 含有 任何 能 够 破译 和 复制 这 类 RNA 基因 组 的 酶 ， 所 以
病毒 特异 性 的 转录 酶 或 复制 酶 必须 包装 在 病毒 的 核 衣 壳 中 。

侵入 的 病毒 RNA
的 初级 转录

子 代 病毒 RNA 的
次 级 转录
呈 ' 3

(+RNA)

5
( 子 代 RNA)

病毒 粒子

图 11-42 负 链 RNA 病毒 基因 组 表达 示意 图

333

具有 不 分 段 基 因 组 的 其 它 病毒 科 , 同样 也 产生 单 顺 反 子 mRNA。 但 是 ， 对 于 不 分 段 基 因
组 来 说 , mRNA 必须 来 源 于 一 个 长 的 负 意 RNA 分 子 。 如 何 实现 这 一 点 的 确切 机 制 尚 不 清楚 。
可 能 是 由 一 个 全 长 基因 组 转录 子 ， 经 过 转录 后 切割 形成 不 同 的 mRNA。 更 有 可 能 的 是 ， 这 些
mRNA 是 通过 一 种 转录 的 终止 一 起 始 机 制 分 别 产生 的 ， 而 这 种 机 制 又 受到 存在 于 每 个 病毒
基因 之 间 的 保守 序列 的 调控 。 由 于 所 有 的 病毒 在 产生 每 个 病毒 颗粒 时 需要 的 结构 蛋白 (如 核 衣
壳 蛋 白 ) 要 比 非 结 构 蛋 白 ( 如 聚合 酶 ) 多 得 多 ,所 以 , 除了 上 述 基因 表达 模式 以 外 ,在 转录 过 程 。
中 和 转录 以 后 都 还 要 对 不 同 蛋白 的 比例 进行 调控 。 例 如 ,在 副 粘 病毒 的 转录 中 ,存在 一 种 对 于
病毒 基因 组 由 3' 端 到 5' 端 转录 的 明显 极 向 性 ,从 而 使 编码 结构 蛋白 的 基因 组 3 端 mRNA 合
成 远 远 多 于 位 于 5 端的 非 结 构 蛋 白 编码 区 域 ,3' 端 基因 翻译 产生 的 结构 蛋白 和 5 端 基 因 翻 译
产生 的 非 结 构 蛋 白 的 相对 量 可 以 相互 调节 (图 11-43)。 与 此 相似 ,在 产生 的 每 个 单 顺 反 子
mRNA 之 间 ,， 也 会 存在 翻译 效率 的 差异 。

前 导 序 列 NP PC M HN L

一

图 11-43 ” 副 粘 病毒 基因 组 的 转录 极 性 ”

(六 ) 以 DNA 为 中 间 体 的 单 链 正 意 RNA 病毒 (逆转 录 病 毒 科 )

六 转录 病毒 的 RNA 基因 组 不 具有 mRNA 的 功能 ,而 是 作为 逆转 录 模 板 的 产生 DNA。
DNA 原 病 毒 (provirus ) 一旦 整合 到 寄主 细胞 的 基因 组 中 , 其 所 有 的 功能 便 都 在 寄主 细胞 的 探
制 之 下 ,并 完全 像 其 它 细胞 基因 一 样 受到 转录 .但 也 有 一 些 逆转 录 病 毒 具有 若干 转录 及 转录 后
调节 机 制 , 来 对 它们 的 遗传 信息 的 表达 进行 调控 。

(七 ) 以 RNA 为 中 间 体 的 双 链 DNA 病毒 (CDNA 肝炎 病毒 科 、 花 椰 菜花 叶 病 毒 ) |

这 些 病 毒 基 因 组 的 表达 较为 复杂 ,所 知 甚 少 。DNA 肝炎 病毒 含有 若干 重奏 的 阅读 框架 ，，
是 二 种 高 度 精炼 .压缩 了 最 大 数量 编码 信息 的 基因 组 。X 基因 编码 一 种 反 式 转录 激活 子 ,但 它 。
在 感染 中 的 作用 尚 不 清楚 。 由 各 自 独 立 的 启动 子 至 少 产生 两 种 mRNA ,每 一 种 mRNA 都 编码
几 种 蛋白 ,其 中 较 大 的 一 种 又 是 在 病毒 颗粒 形成 中 的 逆转 录 模 板 . 花 宛 菜 花 叶 病 毒 基因 组 的 表
达 也 较 复 杂 。 两 种 主要 mRNA 的 产生 与 DNA 肝炎 病毒 相似 。 每 一 种 mRNA 都 编码 几 种 多 |

肽 , 较 大 的 一 种 在 病毒 基因 组 的 形成 中 也 作为 逆转 录 的 模板 。 |

四 、 表 达 的 转录 调控

. 猴 病 毒 40(SV40) 是 乳 多 空 病毒 科 成 员 ， 对 于 它 的 基因 组 及 其 相关 的 细胞 基因 组 研究 较
为 深入 。SV40 基因 组 编码 两 种 肿瘤 抗原 (I- 抗 原 )， 根 据 和 蛋白 的 分 子 量 分 别称 为 大 工 -抗原 和
小 工 -抗原 (图 11-44)。SV40 双 链 DNA 基因 组 在 寄主 细胞 核 中 复制 .基因 组 在 寄主 细胞 RNA
聚合 酶 工 的 作用 下 进行 转录 ,同时 大 工 - 抗 原 在 病毒 基因 组 的 转录 调控 中 发 挥 着 重要 作用 。 小

334

工 -抗原 对 于 病毒 的 复制 不 是 必需 的 , 它 使

病毒 DNA 在 细胞 核 中 积累 。 两 种 蛋白 都

含有 可 以 使 病毒 在 细胞 质 中 合成 后 ,向 细

胞 核 内 积累 的 核 导 向 信号 Cnuclear loca-

lization signals ) 。

在 对 细胞 侵 染 后 不 久 , 便 由 早期 启动

子 引 导 表 达 早 期 mRNA。 在 这 个 启动 子 中
包含 一 段 由 72 bp 构成 的 重复 序列 ,具有
很 强 的 转录 增强 子 作 用 ,激活 启动 子 在 新
| 感染 的 细胞 中 的 功能 (图 11-45)。 所 合成
的 早期 蛋白 便 是 上 述 两 种 工 -抗原 。 随 着 大
T- 抗 原 在 细胞 核 中 的 浓度 上 升 ,大 工 -抗原
蛋白 与 基因 组 起 始 区 的 结合 ,使 早期 基因
的 转录 受到 抑制 , 阻 断 了 由 早期 启动 子 引
导 的 转录 ,使 其 进入 侵 染 的 晚期 阶段 。 在 图 11-44” 猴 病毒 40 的 基因 组 结构

DNA 的 复制 开始 以 后 ,晚期 启动 子 便 引 导 放生 和 和

起 始 晚期 基因 的 转录 ,合成 结构 蛋白 VP1,VP2 和 VP3.。 因 此 ,SV40 T- 抗 原 在 基因 组 转录 调控

中 的 作用 就 像 一 个 开关 。

21 个 碱 基 的 重复 序列
CSP1 结合 位 点 )

晚期 基因 转录 早期 基因 转录
SP1( 】) jsP1
| 到 | 2 | 用 全 和 ai] 人
| 是
72 个 碱 基 的 重复 序列
400 300 200 100 0 100

图 11-45 ” 猴 病 毒 40 基因 组 的 转录 调控

清 在 病毒 转录 调控 研究 中 ， 另 一 类 较为 深入 的 工作 是 在 人 类 逆转 录 病 毒 中 开展 的 , 即 人 的
嗜 工 细胞 白血病 病毒 (HTLV) 及 艾滋 病毒 (HIV) 。 逆 转录 病毒 的 RNA 基因 组 经 过 逆转 录 形
成 整 侣 型 的 DNA 原 病 毒 (provirus ) 。 通 过 DNase I 足迹 蛋白 和 凝 胶 移 位 实验 分 析 表 明 ， 在 这
些 病毒 的 长 未 端 重复 序列 (LTR ) 中 , 存在 许多 细胞 转录 因子 的 结合 位 点 ( 图 11-46)。 在 LTR
的 U3 区 域 中 , 由 远 端 序列 (如 NKxkB 和 SP1 结合 位 点 ) 和 近 端 元 件 ( 如 TATA 盒 ) 一 起 构成
了 功能 性 转录 启动 子 。 但 这 些 启动 子 本 身 的 活性 较 弱 ,只 能 在 RNA 聚合 酶 工 的 作用 下 对 原 病
毒 基因 组 进行 有 限 地 转录 。

335

cREB/ AP2 SP1 NF1
ATF-TN

TATA

2 引 并 0 趟 从 二
人
病毒

21 个 碱 基 的 重复 序列
P-

UBP-1
COUP AP1 NF-AT USF NFkB SP1 TATA | 六 NF1

0 100 200 300 400 500 600 700 800

图 11-46 “与 逆转 录 病 毒 LTR 相互 作用 的 胞 内 转录 因子
HTLYV 编码 的 tax 蛋白 和 HIV 编 “人 嗜

码 的 tat 蛋白 都 是 转录 过 程 中 反 式 作用 工 细 胸 1
三 于 一 种 月 玫 2， ww

比 原来 启动 子 效率 高 50 一 100 倍 的 因 闪

有 二 世 二 站 可 内 二 驻 国 详 毒 LTR 引 ww ~ wxD ne
导 的 转录 。 目 前 ,这 些 蛋 白 的 作用 机 制 沿 一 一

不 清楚 。 与 T- 抗 原 及 SV40 的 早期 启动 人

子 不 同 , 结 构 不 同 的 tax 蛋白 和 tat 蛋白 艾 商 5LTR 3'LTR

都 不 能 直接 与 LTR 结合 . HIV 的 tat 蛋 病毒 PE

白 与 一 个 称 为 TAR ( 反 式 激活 效应 ) 的 人

区 域 结 合 ， 它 是 一 个 蔡 - 环 结构 ， 由 于 名 卓 wm 品 编码 产物
En
认为 ，tat 蛋白 与 TAR 区 域 之 间 ， 可 能 -
具有 类 似 于 》 鸣 菌 体 中 N 蛋白 与 wait 位 一 一 全 一 |
点 间 那 样 的 转录 反 终 止 子 功能 。 虽 然 这

种 观点 尚 不 能 肯定 ， 但 tat 蛋白 和 tax 0
蛋白 有 可 能 通过 某 种 方式 , 直接 或 间接 区

地 对 在 病毒 LTR 启动 子 上 形成 的 转录 图 11-47 人 嗜 T 细胞 白血病 病毒 和

起 始 复合 体 进行 修饰 。 艾滋 病毒 基因 组 的 表达

由 于 HTLV tax 蛋白 和 HIV tat 蛋白 的 合成 依赖 于 它们 自身 活化 的 启动 子 ， 所 以 ,这 凋
种 蛋白 是 由 病毒 控制 的 ， 作 用 于 原 病毒 LTR 初始 启动 子 的 正 调控 子 ,在 转录 水 平 上 激活 所
有 病毒 基因 的 表达 。 由 于 这 一 过 程 将 导致 不 能 控制 的 正 向 反馈 作用 ， 并 对 整合 到 宿主 细 胸 基
因 组 中 的 道 转录 病毒 产生 不 利 影响 ,所 以 这 一 过 程 是 不 能 单独 存在 的 。 因 此 ,HTLV 和 HIV
还 分 别 编码 了 另外 一 种 蛋白 , 即 rex 和 rev 蛋白 ,它们 在 转录 后 水 平 上 对 基因 的 表达 进行 调

控 ， 维持 粒 子 结构 蛋白 和 调节 蛋白 之 间 的 平衡 (图 11-48) 。
336

EC4 pp10 zol mRNA
e72W mRNA

本 结构 蛋白
|

ee

图 11-48 ”病毒 编码 蛋白 对 人 哮 工 细胞 白血病 病毒 和 艾滋 病毒 基因 表达 的 反 式 调节

五 .表达 的 转录 后 调控

许多 DNA 病毒 可 以 在 细胞 核 中 进行 复制 ,它们 编码 的 mRNA 在 被 翻译 之 前 必须 借助 于
寄主 细胞 的 修饰 机 制 进行 剪接 ,去 掉 中 间 的 部 分 序列 (内 含 子 )。 由 于 mRNA 在 被 转移 到 细胞
质 进 行 翻译 之 前 ， 需 要 借助 于 细胞 核 的 功能 进行 加 工 ， 所 以 这 种 修饰 仅 限于 一 些 在 细胞 核 内
复制 的 病毒 。 另 外 , 还 有 一 些 科 的 病毒 则 利用 寄主 细胞 的 这 种 能 力 ,将 更 多 的 遗传 信息 “ 压

缩 ? 到 它们 的 基因 组 中 。 细小 病毒 科 便 是 进行 这 种 剪接 (splicing) 的 最 好 例子 。 它 们 的 转录 可 在
， 侵 染 细胞 的 细胞 质 中 产生 多 种 经 过 剪接 . 带 有 多 腺 苷 尾 序 的 转录 物 , 使 它们 5 kb 的 基因 组 能
够 编码 多 种 蛋白 质 . 与 此 相似 的 还 有 乳 多 空 病 毒 科 中 的 猴 病 毒 40( 图 11-44)。 相 反 , 由 于 在 疱
疙 病毒 中 含有 较 大 的 遗传 容量 ,使 这 些 病 毒 有 可 能 产生 几乎 不 经 剪接 的 单 顺 反 子 mRNA ,也
就 是 每 二 种 mRNA 都 是 由 自身 启动 子 表 达 的 。 因 此 ,对 这 些 病 毒 来 说 ,也 就 没有 必要 通过 大
量 的 剪接 来 产生 全 部 所 需要 的 蛋白 。
腺 病毒 基因 组 的 表达 是 对 病毒 mRNA 剪接 研究 的 最 好 例子 之 一 (图 11-49)。 有 些 类 型 的
腺 病毒 基因 ,转录 后 首先 产生 核 内 不 均一 RNA(ChnaRNA) 前 体 ,然后 再 通过 各 种 剪接 来 进行
表达 。 对 于 在 侵 染 后 立即 表达 、 编 码 反 式 作用 调控 蛋白 的 早期 基因 来 说 尤其 是 这 样 . 首先 , 表
达 的 蛋白 质 是 EIA 和 E1B, 是 由 腺 病毒 基因 组 沁 - 链 靠 近 左 端的 一 个 转录 单位 编码 的 (图 1-
49)。 与 上 面谈 到 的 tax 和 tat 蛋白 相似 ,这 些 蛋 白 是 转录 作用 的 主要 反 式 调控 蛋白 , 同时 也 与
腺 病毒 感染 细胞 的 转型 有 关 。 转 录 后 可 以 产生 5 种 具有 多 腺 苷 酸 尾 序 , 并 经 过 剪接 的 mRNA
(13s,1?S,11S,10S 和 9S), 这 些 mRNA 又 可 编码 5 种 相关 的 E1A 蛋白 (分 别 为 289 ,243，
217,171 和 55 个 氨基 酸 )( 图 11-50)。 所 有 这 些 和 蛋白 都 是 由 同一 个 阅读 框架 翻译 而 来 的 ,并 有
337

三 芋 =
和 = E4
一- -一 一 一 一 -cg = 二 汉
-一
E2B
图 11-49 腺 病毒 基因 组 的 转录
箭头 示 病 毒 基因 组 中 外 显 子 的 位 置 , 通过 剪接 产生 不 同 病 毒 蛋白 。
在 腺 病毒 基因 组 中 的 位 置
mRNA 185 104
135 一 II

bp

11-50 腺 病毒 E1A 蛋白 的 表达
图 中 数字 为 每 个 外 显 子 所 编码 的 氨基 酸 数目 。

着 同样 的 氨基 和 羧基 末端 。 它 们 间 的 差异 是 对 E1A 转录 单位 的 不 同 剪接 ,从 而 导致 了 它们 功
能 上 的 明显 差异 .289 和 243 个 氨基 酸 的 多 肽 是 转录 激活 子 。 己 们 能 够 激活 所 有 腺 病毒 早期 启
动 子 的 转录 ， 并 可 能 还 同时 具有 其 它 功能 。 如 可 以 激活 许多 目前 已 知 的 , 能 够 对 RNA 聚合 酶
I 进行 应 答 的 启动 子 。 这 些 局 动 子 中 并 没有 明显 的 共有 序列 ,同时 也 没有 证 据 表明 EiA 和 蛋 自
可 以 直接 与 DNA 结合 。 现 在 认为 , E1A 蛋白 所 具有 的 功能 是 间接 的 。 它 通过 对 细胞 转录 因子
的 化 学 修饰 或 与 一 种 DNA 结合 中 间 蛋 白 的 相互 作用 结合 于 启动 子 上 。217,171 和 55 个 氨基
酸 的 蛋白 不 具有 转录 过 程 反 式 激活 子 的 作用 ,但 可 能 与 细胞 转型 或 表达 调控 有 关 。

E1A 的 合成 可 以 启动 E1B,E2,E3 和 了 4 等 其 它 腺 病毒 早期 基因 的 转录 ,从 而 起 始 一 系
列 转录 过 程 (图 11-49) 。 在 病毒 基因 组 完成 复制 以 后 ,这 一 过 程 最 终 导 致 编码 结构 蛋白 的 晚期

基因 进行 转录 。 DNA 病毒 的 立即 早期 基因 的 启动 子 上 游 都 含有 强 的 增强 子 单元 。 在 新 感染 的
338

缅 胞 中 , 这 种 增强 子 对 启动 病毒 基因 的 表达 是 必需 的 ,而 合成 产生 的 立即 早期 蛋白 则 是 起 始
其 它 病毒 基因 表达 的 转录 激活 子 , 如 E1A 蛋白 便 具 有 这 种 功能 .E1A 的 转录 是 一 个 平衡 的 自
我 调控 系统 ， 虽 然 E1A 蛋白 可 以 反 式 激活 自身 的 启动 子 , 但 是 由 于 它 同 时 可 以 抑制 上 游 增 强
子 的 作用 ,因此 在 高 浓度 下 对 自身 的 表达 也 能 进行 负 调 节 ( 图 11-51)。

mRNA 由 细胞 核 到 细胞 质 的 转移 过 程 是
进行 表达 调控 的 另 一 个 阶段 , 腺 病毒 中 的 一 些 早期 基因 表达 : 正 向 调控
种 类 仍然 是 其 中 研究 得 最 好 的 例子 。 在 RNA
聚合 酶 工 ( 它 的 正常 功能 是 转录 产生 如 5S
TRNA 和 tRNA 等 一 些小 RNA) 的 参与 下 ,74
基因 在 病毒 复制 的 后 期 阶段 , 由 基因 组 的 ”- 链
转录 编码 两 个 小 的 RNA( 图 11-49),V4 RNA
和 YY4 RNAI。 它 们 都 具有 高 度 的 二 级 结
鬼 ， 也 不 编码 任何 多 肽 分 子 ， 有 着 与 tRNA 相
似 的 特点 。 这 两 种 RNA 作用 方式 尚 不 完全 清
楚 , 但 它们 确实 对 于 提高 腺 病毒 晚期 蛋白 的 合
有 碱 具 有 影响 。 现 已 经 证 明 , YA RNA 与 核 内 小 。 gg 增强 子 元 件 。 4 启动 于 。 _。 RNA 转录 方向
核糖 体 蛋 白 (snRNP) 的 复合 物 有 关 ,snRNP 是
细胞 核 内 RNA 剪接 因子 的 一 部 分 ,但 也 有 证 11-51， 腺 病毒 基因 的 表达 调控
据 认 为 ,VY4 RNA I 以 其 它 方式 选择 性 起 始 腺
病毒 mRNA 的 翻译 。 病毒 侵 染 细胞 后 可 以 刺激 产生 干扰 素 ， 它 的 作用 之 一 是 活化 一 种 细胞 中
的 蛋白 激酶 ,如 已 知 的 DAI 或 p68。 这 种 激酶 对 细胞 和 病毒 两 者 的 翻译 起 始 都 具有 抑制 作用 。
Ya RNA I 与 这 种 激酶 结合 后 能 够 阻碍 它 的 活性 ,从 而 解除 它 对 翻译 的 抑制 。 也 就 是 V4
RNA I 可 能 在 细胞 mRNA 的 翻译 受到 抑制 的 情况 下 ,选择 性 起 始 腺 病毒 mRNA 的 翻译 。
前 面 提 到 的 HTLVrex 蛋白 和 HIVrev 蛋白 ,对 病毒 特定 mRNA 的 翻译 也 具有 选择 性 。
L 据 目前 所 知 ， 它 们 能 够 对 病毒 基因 组 的 不 同 表 达 进 行 调 节 , 但 却 不 影响 细胞 mRNA 的 表达 。

这 两 种 蛋白 在 氨基 酸 序 列 上 并 不 相关 , 但 是 它们 的 作用 方式 相似 , 其 中 HTLYV 的 rex 蛋白 在

动能 上 可 以 代替 HIV 的 rev 蛋白 。HIV 和 HTLV 基因 组 中 的 某 些 负 调 控 序列 可 能 会 使 病毒

mRNA 滞留 在 感染 细胞 的 核 中 。 这 些 序列 位 于 内 含 子 内 ， 经 过 剪接 之 后 ,它们 将 被 从 mRNA
“中 除去 ， 并 使 mRNA 具有 编码 tax,tat 和 rex,rev 蛋白 的 能 力 (图 11-47)。 通 过 这 些 步骤 ,上 述
蛋 自在 侵 染 之 后 可 以 立即 得 到 表达 ,tax 和 tat 蛋白 又 可 进一步 提高 由 病毒 LTR 引导 的 转录
强度 ( 狗 11-48)。 一 些 未 经 剪接 或 只 经 过 简单 剪接 的 mRNA ,虽然 具有 编码 gag ,pol 和 eny 等
蛋 自 的 能 力 , 但 只 能 在 细胞 中 存在 足够 的 rex 或 rev 蛋白 时 才能 表达 。 这 两 种 蛋白 都 是 与 一 种

由 mRNA 中 的 特殊 序列 形成 的 二 级 结构 结合 。 结 合 以 后 ， 它 们 的 作用 可 能 是 在 核 中 控制
mRNA 由 细胞 核 到 细胞 质 的 转移 ， 也 可 能 是 在 细胞 质 中 通过 促进 多 核糖 体 的 形成 或 提高 它们

的 活性 ,来 增强 mRNA 的 翻译 。

由 于 RNA 的 稳定 性 和 二 级 结构 等 因素 , 不 同 mRNA 的 翻译 效率 有 很 大 差异 。 其 中 的 一 个
主要 原因 可 能 是 翻译 起 始 密码 AUG 前 后 的 核 苷 酸 序列 不 同 , 它 们 是 核糖 体 识别 的 特殊 序列 。 翻
译 起 始 的 最 佳 序列 是 GCC(A/G)CCAUGGG，, 但 其 中 也 存在 着 很 大 幅度 的 变异 。 许多 病毒 利用
这 段 序列 中 的 差异 来 对 由 一 种 mRNA 合成 的 蛋白 量 进行 调控 。 如 在 HTLV 的 表达 中 , tax 和

339

rex 蛋白 是 由 两 个 重 春 的 阅读 框架 编码 的 ， 这 两 个 框架 位 于 同一 条 经 过 两 次 剪接 的 2. 1 kb 的
mRNA 上 (图 11-47) 。rex 蛋白 的 起 始 密码 子 AUG 位 于 tax 蛋白 起 始 密码 子 的 上 游 ,但 是 AUG
周围 的 序列 对 起 始 翻译 过 程 却 不 如 tax 蛋白 的 相应 区 域 合适 。 因 此 , 在 HTLYV 感染 的 细胞 中 ，
尽管 两 种 蛋白 由 同一 条 mRNA 编码 ,但 rex 蛋白 的 相对 含量 明显 少 于 tax 蛋白 。

小 RNA 病毒 基因 组 代表 了 另外 一 类 翻译 起 始 的 调控 机 制 。 这 些 基 因 组 的 5 喘 含 有 约 占
整个 基因 组 的 10%% 的 非 编码 区 (5'-NCR)， 并 与 病毒 基因 组 的 复制 及 包装 有 关 。 小 RNA 病毒
基因 组 的 翻译 方式 与 大 多 数 细胞 mRNA 不 同 。 在 其 RNA 的 5 端 没有 帽子 结构 ,也 不 能 像 其
它 mRNA 那样 被 核糖 体 识别 ,但 却 被 一 种 VPg 蛋白 所 修饰 。 另 外 ,在 多 蛋白 编码 区 起 始 位 点
上 游 ,5'-NCR 中 含有 多 个 不 能 被 核糖 体 识别 的 AUG 密码 子 。 实验 表明 ,这 类 病毒 在 翻译 起 始
调控 中 采用 了 不 同 的 机 制 。

通过 在 多 蛋白 编码 区 中 间 插 入 额外 5-NCR 信和 号 ,构建 含有 双 顺 反 子 的 人 工 突 变 小 RNA
基因 组 ,并 在 体外 对 其 mRNA 进行 翻译 .结果 表明 ,核糖 体 的 识别 对 小 RNA 病毒 55-NCR 内 部
的 某 些 序列 具有 特异 性 ， 这些 序列 引导 核糖 体 与 RNA 结合 并 起 始 翻译 ,而 不 是 像 细 胞 mRNA ，
那样 ， 由 引 端 开始 沿 着 RNA 按 顺 序 识别 。 尚 未 发 现在 其 它 病毒 中 是 否 也 存在 这 种 机 制 。

另外 还 有 一 种 称 作 核 糖 体 移 码 的 机 制 ， 被 一 些 病毒 用 来 实现 翻译 起 始 调控 。 其 中 研究 最 ，
为 深入 的 是 逆转 录 病 毒 基因 组 ,冠状 病毒 和 一 些 芜 其 黄花 叶 病 毒 组 的 植物 病毒 也 采用 了 相似
的 机 制 。( 这 种 移 码 现象 目前 在 某 些 细菌 基因 的 表达 中 也 已 发 现 ,但 是 除了 受到 病毒 感染 以 外 ，，
还 没有 在 真 核 细胞 中 发 生 的 报道 .) 逆 转录 病毒 基因 组 转录 后 至 少 产生 两 种 5 具有 帽子 结构 、
3' 具 有 多 腺 苷 酸 尾 序 的 mRNA。 经 过 剪接 的 mRNA 可 以 编码 包 膜 蛋白 ,在 HTLV 和 HIV 等
更 复杂 的 逆转 录 病 毒 中 ,还 可 以 编码 如 tax 或 tat 和 rex 或 rev 等 其 它 蛋 白 ( 图 11-47)。 一 种 长
的 未 经 剪接 的 转录 物 可 编码 gag ,zzro 和 zol 基因 ,同时 也 作为 包 被 在 病毒 粒子 中 的 基因 组
RNA。 在 不 同 的 逆转 录 病 毒 中 ,这 3 个 基因 的 排列 是 不 一 样 的 。 在 某 些 情况 下 (如 HTLV) , 它
们 位 于 3 个 不 同 读 码 框架 中 ; 而 在 其 它 的 病毒 中 (如 HIV)， 和 蛋白 酶 (ro) 基 因 是 由 zol 基因 的
5 端 延 伸 构 成 的 (图 11-52) 。 在 后 一 种 情况 下 ,蛋白 酶 和 聚合 酶 ( 即 反 转录 酶 ) 是 作为 一 种 多 蛋
白 来 表达 的 ,经 过 自身 切割 后 产生 成 熟 蛋白 ,过程 与 小 RNA 病毒 多 蛋白 的 切割 相似 。

在 这 3 个 基因 之 间 的 边界 上 ,存在 一 段 通常 由 重复 核 苷 酸 构成 的 特殊 序列 ,如 UUU-
AAAC( 图 11-53)， 大 多 数 核糖 体 都 可 以 顺利 地 对 它 进行 翻译 。 但 是 ,有 二 部 分 核糖 体 在 对 这
种 序列 进行 翻译 时 ， 却 需要 先 向 后 滑动 一 个 核 音 酸 ， 然 后 才能 以 不 同 的 阅读 框架 ( 即 一 1 位 )
继续 翻译 过 程 。 因此,UUUAAAC 序列 可 称 为 “滑动 序列 ”slippery sequence) , 移 码 的 结果 是

翻译 得 到 一 种 由 不 同 阅读 框架 而 来 的 多 蛋白 。 同 时 ， 这 种 机 制 也 使 病毒 能 够 对 所 产生 的 蛋白
比例 进行 调控 。 由 于 仅 有 部 分 核糖 体 在 滑动 序列 上 发 生 移 码 ,所 以 从 mRNA 阅读 框架 忆 端 到
3' 端 的 翻译 存在 着 一 种 梯度 。

然而 ,滑动 序列 本 身 仅 能 导致 较 低频 率 的 移 码 ， 这 对 于 产生 病毒 所 需 的 蛋白 酶 和 反 转 录 柄
的 量 来 说 是 不 够 的 。 因 此 ,有 另外 一 类 序列 在 这 一 系统 中 , 通过 增加 移 码 的 发 生 频 率 ， 发 挥 着
进一步 的 调控 作用 。 离 滑动 序列 不 远 的 下 游 ， 有 一 个 反 向 重复 区 , 它 使 mRNA 中 形成 一 个 划 -
环 (stem-loop) 结 构 ( 图 11-53) 。 在 稍 远 一 些 的 位 置 上 ， 还 存在 另外 一 段 与 环 状 结构 核 苷 酸 互
补 的 序列 ， 它 使 RNA 的 这 两 个 区 域 间 发 生 碱 基 配 对 。 所 形成 的 结构 也 就 是 通常 所 说 的 RNA
假 结 节 (pseudoknot)。mRNA 中 的 这 种 二 级 结构 ， 使 核糖 体 的 翻译 在 上 游 的 滑动 序列 中 放 慢

或 中 止 , 提 高 了 移 码 的 发 生 频 率 ， 也 就 增加 了 下 游 框 架 编 码 蛋 白 的 相对 量 。
340

人 嗜 工 细 胞 核
gag 白血病 病毒

鼠 白血病 病毒
人
[rr aa si 二 -Tc 下

终止 抑制

图 11-52 ”逆转 录 病 毒 中 的 核糖 体 移 码 和 终止 抑制

芭 环

“滑动 序列 ”

二 3' 假 结 节

11-53 RNA 假 结 节 的 形成 和 核糖 体 移 码 的 机 制

翻译 调控 的 最 后 一 种 途径 是
终止 抑制 。 这 种 机 制 在 许多 方面
与 移 码 相似 , 它 可 以 在 一 条
mRNA 上， 通过 不 同 的 阅读 框架
表达 产生 多 种 蛋白 。 如 逆转 录 病
毒 中 的 小 鼠 白血病 病毒 (MLV )，
它 的 zzo 基因 与 gsag 基因 之 间
不 存在 “滑动 序列 ”和 假 结 节 , 而
是 被 UAG 终止 密码 子 分 隔 开 来

.〈 图 11-52)。 在 大 多 数 情 况 下 ，，”

MLVY mRNA 的 翻译 将 在 此 序列
上 终止 ,产生 gag 蛋白 。 但 是 在 有
些 情 况 下 ,UAG 终止 密码 子 会
受到 抑制 ,继续 翻译 产生 一 个
gag-pro-pol 多 蛋白 ,然后 再 切割
产生 成 熟 蛋白 .gag ,pro 及 pol 蛋
捍 的 相互 比例 ， 受 核糖 体 对 于
UAG 终止 密码 子 的 通读 频率 调
控 。

341

参考 文献

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， 故 维 藩主 编 . 植物 病毒 学 . 北京 :科学 出 版 社 ,1985.

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。Darnell ，J. ,Lodish H. and Baltimore D. Molecular Cell Biology (2nd ed. )，Scientific American Books.
1990.

6. Dolia,V.V. and Carrington，]J.C.Evolution of Positive-strand RNA Viruses. Seminars in Virology. 1992.

SS315 326:

7，Fraenkel-Conrat, H.，Kimball,P. C,. et, al, Unenveloped Plus-strand RNA Viruses in Virology, Prentice
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8，Harrison,S, Principles of Virus Structureyin Virology. B. N,. Raven Press,1985.p, 27 一 44，

9. Matthews，R. 下 ,下 ,. Plant Virology (3rd. ed, ). Academic Press ,1991.

10. Waterson， A, P. and Wilkinson,L. An Introduction to the History of Virology. Cambridge University

Press,1978，

GI 和 二

(于 嘉 林 )

342

第 十 二 章 ” 真 核 染 色 体 和 基因 组 的 结构

真 核 染 色 体 比 原核 的 大 ,并 且 具 有 高 度 的 结构 性 组 织 。 酵 母 . 果 蝇 和 人 类 基因 组 所 含 的
ONA 分 别 约 为 大 肠 杆 菌 基 因 组 的 4,40 和 1 000 倍 。 这 样 大 的 基因 组 使 得 真 核 生物 具有 了 原
芒 生 物 所 没有 的 潜力 ,同时 也 使 真 核 基因 的 表达 遇 到 额外 的 挑战 ，
是 本 章 将 重点 讨论 以 下 几 个 问题 :@D 真 核 的 很 长 的 DNA( 人 类 总 DNA 的 线 型 长 度 接近 1 m) 是
用 样 压 积 在 细胞 核 中 的 ? 和 原核 的 裸露 的 DNA 不 同 , 真 核 DNA 是 与 一 类 叫做 组 蛋白 的 碱 性 蛋白
质 结合 在 一 起 的 ,完整 的 这 种 DNA- 和 蛋白 质 复合 体 叫做 染色 质 。 在 DNA 的 压 积 中 组 蛋白 起 着 关键
性 作用 。 DNA 缠绕 在 组 鼻 白 上 形成 核 小 体 ,许多 核 小 体 由 DNA 连 在 一 起 形 同 串 珠 。 它 再 经 折 得 压
丙 而 形成 染色 体 。 真 核 染色 体 的 这 种 结构 对 基因 的 表达 有 着 重要 的 影响 ; @ 在 真 核 染色 体 中 基因 是
怎样 安排 的 ? 高 等 真 核 生物 基因 组 的 一 个 突出 特点 是 它 含有 大 量 的 重复 序列 ,其 中 绝 大 多 数 是 不 编
码 蛋 白质 或 RNA 的 ， sh 中 绝 大 多 数 是 断裂 的 , 即 在 编码 片段 (外 显 子 ) 之 间
有 有 非 编码 的 片段 (内 含 子 ) 。 因 此 ,在 高 等 直 术 生物 的 基因 组 中 只 有 很 小 一 部 分 是 编码 蛋白 质 的 。
此 外 ， ae 这 些 细胞 器 中 的 基因 组 在 结构 上 有 着 与 核 基
因 组 不 同 的 特色 。 最 后 , 由 于 真 核 基因 是 断裂 的 , 而 且 在 转录 时 内 含 子 与 外 显 子 一 起 转录 ,因而 转录 、
天 生 的 RNA 必须 经 过 加 工 ,将 内 含 子 剪接 掉 , 才能 成 为 成 熟 的 mRNA , 作为 蛋白 质 合成 的 模板 。
有 们 将 讨论 这 种 剪接 的 机 制 ,以 及 由 于 对 剪接 机 制 的 研究 ,导致 了 核 酶 的 发 现 。

第 一 节 ” 真 核 染 色 体 的 结构

真 核 染 色 体 是 由 染色 质 (chromatin) 构 成 的 ,染色 质 是 由 DNA、RNA 和 蛋白质 形 成 的 复
目 人 合体。 染色 体 是 动态 的 物体 ,其 外 观 随 细胞 周期 的 不 同 阶 段 发 生 明 显 的 改变 。 仅 当 细 胞 分 裂
《细胞 周期 的 M 期 ) 时 ,每 个 染色 体 才 呈现 出 大 家 所 熟知 的 凝聚 型 (图 12-1) 。 在 分 裂 间 期 (细胞
| 染色 体 DNA 发 生 转 录 和 复制 ,此 时 大 多 数 细胞 的 染色 体 变 为 高 度 弥散 ,以
致 于 无 法 区 分 每 个 染色 体 。 长 期 以 来 细胞 学 家
即 已 辨认 出 这 种 弥散 的 染色 质 有 两 种 型 :一 种
密度 较 低 , 称 为 常 染 色 质 (euchromatin ); 另 一 >” ，
种 密度 较 高 , 称 为 异 染色 质 (heterochromatin ) 。
这 两 种 染色 质 的 区 别 是 : 常 染色 质 被 表达 , 异 染
色 质 不 被 表达 .事实 是 , 真 核 染 色 体 的 结构 对 其 . : 确 绿
基因 的 表达 有 着 明显 的 影响 ,而 原核 的 影响 则 “2
不 明显 .因此 ,在 研究 真 核 基因 的 表达 时 必须 要
研究 其 染色 体 的 结构 。
真 核 DNA 是 怎样 组 装 在 染色 体 中 的 ? 这
个 重要 问题 曾经 困惑 了 人 们 许多 年 。 经 过 多 年

图 12-1 人 类 NM 期 桨 色 体 的 电镜 图

343

的 研究 ,现在 已 知 一 个 真 核 染色 体 中 含有 一 个 完整 的 DNA 分 子 , 并 且 此 DNA 分 子 是 线 型 的
和 不 具 分 支 的 。 其 分 子 量 很 大 。 例如 , 果 蝇 最 大 染色 体 中 DNA 的 分 子 量 为 43 关 10 kD, 相 当 于
76X10s bp , 约 为 大 肠 杆菌 的 20 倍 ( 表 12-1) 。

在 人 类 细胞 的 6 个 染色 体 中 ， 表 12-1 “一 些 原核 和 真 核 基因 组 中 DNA 的 含量

每 个 染色 体 所 含 的 DNA 为 4800

碱 基 对 数 ”DNA 长
万 一 24 000 万 bp, 它们 极 可 能 是 完 。 生物 Ca 末 色 体 数
整 的 ,因而 其 线 型 长 度 在 1.6 一 8. 2 大 肠 杆 菌 4 汉 106 正 汉
cm 之 间 然而 9 在 细胞 分 裂 期 即 染 酵母 (9. cerevzisiae) 1.4X107 4.6 16
色 体 处 于 最 凝聚 状态 时 ,每 个 染色 果 蝇 (D. mazelazogaster) 工 .7 兴 册 08 56 4
站 天 3.9X108 990 23

体 的 长 度 却 仅 为 1.3 一 10pm 之

注 : 为 单 倍 体 基因 组 数值 。

间 。 可 见 , 染 色 体 DNA 的 堆积 比
(packing ratio) ( 指 其 线 型 长 度 与 其 容器 长 度 的 比值 ) 大 于 8 000。 染 色 质 中 的 DNA 是 怎样 达
到 如 此 高 度 凝 聚 的 ? 结构 研究 声 示 ,这 是 通过 3 个 水 平 的 折 和 县 做 到 的 ,下 面 逐 步 讨论 之 。

一 组 恒 白

和 原核 不 同 , 真 核 染 色 体 中 的 DNA 不 是 裸露 的 , 而 是 与 蛋白 质 紧 密 地 结合 在 一 起 。 与 真 核
DNA 相 结合 的 蛋白 质 主要 是 一 类 小 的 碱 性 蛋白 质 , 称 为 组 蛋白 (histone)。 组 蛋白 约 占 真 核 染 色 ，
体 总 量 的 一 半 , 其 余 一 半 为 DNA.。 此 核 重 白 的 染色 物质 称 为 染色 质 。 用 盐 或 稀 酸 处 理 染 色 质 ,可 ，
使 组 蛋白 与 DNA 解 离开 来 ,再 用 离子 交换 柱 层 析 分 级 分 离 组 蛋白 , 共 得 到 5 个 组 分 。 这 5 种 组
蛋白 分 别 命名 为 H1,H2A,H2B,H3 和 H4. 它 们 的 分 子 量 在 约 11 kD 一 21kD 之 间 ( 表 12-2) .组
蛋白 的 一 个 突出 特点 是 含有 很 多 带 正 电荷 的 氨基 酸 残 基 , 约 4 个 残 基 中 就 有 1 个 是 赖 氨 酸 或 精
氨 酸 。 因 此 ,组 蛋白 是 以 离子 键 与 DNA 中 带 负 电荷 的 磷酸 基 相 结合 的 ,所 以 用 0. 5mol/L 的
NaCl 深 液 即 可 把 组 蛋白 由 染色 质 中 抽 提 出 来 ,因为 这 样 浓度 的 盐 溶液 即 足 以 破坏 其 静电 作用 。

表 12-2 小 牛 胸腺 组 蛋白
分 子 量 (kD)

残 基数

HI1 219 省
H2A 129
H2B 125
了 H3 135
也 4 102

%% 精 %% 赖
23. 0 29
14.0 9 :人

13.8 6 16
15. 3 10
开 .3 14 11 和

组 蛋白 在 进化 中 是 保守 的 。 氨 基 酸 顺序 分 析 表 明 , 吏 豆 秧苗 的 H4 和 小 牛 胸腺 的 H4 的 氨基
酸 顺序 ,在 它们 的 102 个 残 基 中 仅 有 两 个 差异 。 而 且 这 两 个 位 点 的 改变 颇 小 , 即 一 个 位 点 是 由 蛋
亮 氨 酸 变 为 顷 氨 酸 ; 另 一 个 位 点 是 由 精 氨 酸 变 为 赖 氨 酸 。 可 见 , 自从 植物 和 动物 趋 异 后 的 1.2 广
10* 年 中 H4 的 氨基 酸 顺 序 几 乎 没有 改变 。 同 样 , 在 经 过 这 样 长 的 进化 期 间 H3 的 改变 也 很 小 ,总
豆 秧苗 H3 的 氨基 酸 顺 序 和 小 牛 胸腺 的 仅 有 4 处 不 同 。 将 在 进化 过 程 中 这 些 组 蛋白 的 改 恋 速度
与 其 它 蛋 白质 的 改变 速度 进行 比较 是 有 意义 的 。 一 个 有 用 的 指数 叫做 单位 进化 周期 (unit evola
tionary period) , 它 指 的 是 在 两 个 进化 系 (evolutionary lines ) 趋 异 后 顺序 改变 1%% 的 时 间 间 隔 。
对 于 H3 来 说 此 间隔 为 3 亿 年 ,H4 为 6 亿 年 , 比 迄今 已 研究 过 的 其 它 蛋白 质 长 很 多 。 例 如 ,细胞

色素 e 的 单位 进化 周期 为 2X107 年 ,血红 蛋白 为 6X10* 年 , 血 纤 肽 (fibrinopeptides ) 为 1 又 108
344

年 .H3 和 H4( 还 有 H2A 和 H2B) 结 构 的 高 度 保守 ,说 明 在 真 核 生物 进化 的 初期 即 已 确定 它们 的
大 用 至 关 重 要 , 而 它们 的 结构 也 已 完全 适合 它们 的 功能 ,但 不 能 忍受 改变 。 至 于 Hl 则 比 其 它 组
蛋白 更 可 改变 ,下面 我 们 将 要 谈 到 这 是 由 于 它 的 功能 与 其 它 组 蛋白 不 同 之 故 。.
组 蛋白 在 翻译 后 是 受到 修饰 的 ,其 中 包括 特异 精 、 组 、 赖 \, 丝 和 苏 氨 酸 残 基 的 甲 基 化 乙酰
， 基 化 和 磷酸 化 (图 12-2)。 这 些 修 饰 中 有 许多 是 可 逆 的 . 所 有 修饰 都 降低 组 蛋白 的 正 电荷 ,因而
显著 改变 组 蛋白 -DNA 之 间 的 相互 作用 。 虽然 组 蛋白 在 进化 中 是 高 度 保守 的 ,但 它们 修饰 的 程
几 度 却 随 品种 ` 组 织 以 及 细胞 周期 阶段 的 不 同 而 差别 很 大 。 一 个 特别 引 人 注 目的 修饰 是 10 儿 的
HzA 联结 上 了 泛 素 (ubiquitin), 即 它们 的 赖 (119) 的 e- 氨 基 与 泛 素 的 羧基 之 间 以 肽 键 联结 在
由 一 起 .虽然 已 知 这 种 泛 素 化 (ubiquitination ) 的 作用 是 给 胞 液 中 需要 降解 的 蛋白 质 打 上 标签 ,从
由 而 促使 这 些 蛋 白质 降解 ,然而 还 不 知道 H2A 的 泛 素 化 是 否 也 是 起 这 种 作用 。 最 令 人 感 兴趣 的
岂 问 题 是 ,这 种 泛 素 化 以 及 组 蛋白 的 其 它 方式 的 修饰 是 否 是 以 某 种 方式 调控 着 真 核 基因 的 表达 。
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图 12-2 小 牛 胸腺 组 蛋白 H4 的 氨基 酸 顺 序
在 此 102 个 残 基 的 蛋白 质 中 精 和 和 赖 残 基 占 了 25% 。 吏 豆 秧 苗 的 H4 与 小 牛 胸腺 的 H4 有 两 个 残 基 不同 : 绑 (60)
一 ~ 异 亮 和 赖 (77) 一 ~ 精 . 下 面 划 线 的 是 翻译 后 修饰 的 残 基 : 丝 (1) 总 是 N- 乙 酰基 化 的 , 它 也 可 发 生 o- 磷 酸化 , 赖 (5,8，
12 和 16) 可 N- 乙 酰基 化 , 赖 (20) 可 被 1 或 2N- 甲 基 化 。

许多 真 核 生 物 具 有 遗传 上 不 同 的 也 1,H2A,H2B 和 再 3 的 亚 类 ,它们 是 在 胚胎 发 生 和 某 些
类 型 细胞 发 育 的 特异 阶段 合成 或 不 合成 。 对 于 H2A,H2B 和 了 3 来 说 ,这 些 亚 类 的 序列 改变 仅
为 极 少数 氨基 酸 残 基 , 但 了 1 的 改变 则 比较 多 。 组 蛋白 合成 的 开关 似乎 与 细胞 分 化 有 关 , 但 这
种 关系 的 本 质 尚 不 清楚 。

二 、 核 小 体 : 染 色 质 结构 的 第 一 层次

组 蛋白 是 怎样 与 DNA 结合 起 来 以 形成 染色 质 纤维 的 ? 1974 年 ,Roger Kornberg 综合 多
方面 的 实验 证 据 指出 ,染色 质 是 由 重复 单位 构成 的 ,每 个 单位 由 约 200 bp 的 DNA 和 H2A，
H2B,H3,H4 各 2 分 子 所 组 成 。 现 在 ,把 这 些 重复 单位 叫做 核 小 体 \nucleosome) , 它 是 染色 质
结构 的 第 一 层次 。 在 核 小 体 中 ,大 部 分 DNA 缠绕 在 组 蛋白 构成 的 核心 (core) 的 外 面 。DNA 的
其 余部 分 将 相 邻 的 核 小 体 联结 起 来 ,此 部 分 DNA 称 为 联结 物 \linker) , 它 使 染色 质 纤 维 具有
和 柔性。 可 见 , 一 条 染色 质 纤维 是 条 由 联结 起 来 的 核 小 体 构成 的 易 弯 曲 的 链 , 很 像 一 条 串珠 。 染
色 质 的 这 一 结构 模型 具有 广泛 的 实验 证 据 , 主要 如 下 :

(1) 染 色 质 所 含 H2A,H2B,H3 和 H4 的 分 子 数 目 大 致 相等 ,了 1 的 分 子 数 不 超 过 它们 的 一 半 。

345

(2) 电 镜 观 察 (图 12-3) 染 色 质 , 发 现 它 由 直径 约 10 nm 的 颗粒 所 组 成 ,这 些 颗粒 由 裸露 的

DNA 细 线 联结 在 一 起 可见, 电镜 观 察 直接 提供 了 染色 质 结

的 一 串 大 致 为 球形 的 颗粒 。

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100nm

图 12-3 ”染色 质 的 电镜 图
串珠 样 颗 粒 的 直径 约 为 10 nm。 引 自 Ada Olins 和 Donald Olins.

构 的 概念 , 即 它 是 用 易 弯曲 区 隔 开

aas -er 一

|
|
}
|

(3)X 射线 衍射 研究 得 出 了 与 电镜 观察 相同 的 结论 。 中 子 衍 射 的 研究 表明 DNA 位 于 核 小 法

体 的 外 侧 。

(4) 核 酸 酶 消化 实验 .用 胰 脱 氧 核糖 核酸 酶 1(DNase
1) 或 小 球菌 核酸 酶 在 溶液 中 消化 游离 DNA 时 可 裂解 其
任意 的 磷酸 二 酯 键 。 与 之 相反 ,染色 质 中 的 DNA 被 保护
了 , 仅 在 少数 位 点 处 能 被 酶 裂解 . 酶 解 染 色 质 的 电泳 图 谱
的 突出 特征 是 它 的 简单 性 :其 图 谱 ( 图 12-4) 由 一 系列 不
同 大 小 的 带 所 构成 。 这 些 片段 中 的 DNA 含量 是 约 为 200
bp 的 基本 单位 的 倍数 。 电 镜 观 察 表 明 ,染色 质 一 个 片段
中 球形 颗粒 的 数目 与 其 DNA 为 200 bp 单位 的 倍数 相同
(图 12-5)。 例 如 ,含有 600bp DNA 的 片段 是 由 3 个 直径
为 10 nm 的 颗粒 组 成 的 。 可 见 , 在 电镜 下 观察 到 的 一 个
珠子 相当 于 用 核酸 酶 消化 确定 的 一 个 核 小 体 。

《5) 再 造 。 将 组 蛋白 加 到 腺 病毒 或 SV40 的 DNA 中
可 在 体外 形成 染色 质 样 纤维 。 在 这 些 再 造 体 系 中 , 与 一 个
核 小 体 相 结合 的 DNA 极 近 于 200 bp。 而 且 , 形 成 核 小 体
所 需 H2A,H2B,H3 和 HI4 的 分 子 数目 是 相等 的 。 在 再 造
混合 物 中 缺少 这 4 种 组 蛋白 中 的 任何 一 种 都 不 能 形成 这
种 特点 的 珠子 。 但 H1 是 不 需要 的 ,这 与 瑞 1 不 整合 在 核
小 体 中 的 发 现 相 一 致 。

下

+
Tm
反
四
和
-和
笋

图 12-4 用 小 球菌 核酸 酶 部 分 消化 染
色 质 后 ,消化 产物 的 凝 胶 电泳 图 谱
4. 为 未 经 分 级 分 离 的 消化 产物 芒
糖 梯度 离心 分 离 后 产生 ;了 B. 单 体 iC. 三
聚 体 ;D. 三 聚 体 ;E. 四 聚 体 。

(一 )DNA 盘 绕 在 一 个 组 蛋白 八 聚 体 上 形成 核 小 体 的 核心 颗粒

如 上 所 述 , 用 小 球菌 核酸 酶 降解 染色 质 开始 生成 的 是 单个 核 小 体 , 它 还 含有 组 蛋白 Hl . 进 一 腥
消化 时 其 DNA 被 剪 短 并 释 出 HI 。 此 产物 称 为 核 小 体 的 核心 颗粒 , 它 由 146 bp 的 DNA 和 一 个 红
蛋白 的 八 聚 体 (H2A ,H2B,H3 和 H4 各 2 分 子 ) 所 组 成 . 在 所 有 真 核 生 物 中 的 核 小 体 核心 几乎 都 是
相同 的 。 原 来 联结 在 核 小 体 上 并 被 进一步 剪 去 的 DNA 部 分 称 为 联结 物 , 它 的 长 度 昌 然 一 般 为

346

二 5p 左右 ,但 在 不 同 生 物 和 同一 生物 的 不 同 组 织 中 的 变
却 很 大 ,在 8 一 114 bp 之 间 , 从 而 使 不 同 生 物 和 同一 生物
的 不 同 细胞 类 型 的 核 小 体 DNA 含量 在 约 160 一 240 bp 的
范围 内 变动 ( 表 12-3)。

表 12-3， 核 小 体 的 DNA 含量

细胞 类 型 碱 基 对 数 (bp)
酵母 165
Hela 183
大 鼠 骨 通 192
大 鼠 肝 196
大 鼠 肾 196
鸡 输卵管 196
鸡 红 细胞 207
海胆 原 肠 胚 216

海胆 精子 241

Gerard Bunick 和 Edward Uberbacher 用 X 射线 分 析
也 核 小 体 核 心 颗粒 的 结构 (图 12-6) ,分 辩 率 在 0. 8 nm 左右 。
在 此 低 分 辩 率 的 情况 下 , 仅 能 辨别 出 来 诸如 螺旋 之 类 的 分
避 的 粗略 情况 。 核心 颗粒 是 个 双 折 堆 对 称 的 盘子 形 , 厚 7nm，
径 11 am。(H3)>(CH4)。 四 聚 体 构 成 组 蛋白 八 聚 体 的 核心 ，
入 子 的 顶部 和 底部 各 有 一 个 H2A“.H2B 二 聚 体 。 B-DNA 以
左手 超 螺 旋 形 式 缠绕 组 蛋白 八 聚 体 1. 8 圈 , 螺 距 为 2. 8 nm。
然而 ,DNA 并 不 遵循 平稳 的 超 螺旋 途径 ， 而 是 在 有 些 局 部 做
相当 急剧 的 弯曲 , 以致 其 大 沟 和 小 沟 的 宽度 发 生 大 的 改变 。 蛋
本 的 相互 作用 发 生 在 DNA 超 螺旋 的 内 侧 , 没有 蛋白
锅 DNA 的 现象 ,蛋白 质 也 不 由 DNA 超 螺旋 的 圈 与 圈 之 ”图 12-5 图 12-4 中 的 单 体 (A), 一

有 聚 体 (BE) , 三 聚 体 (C) 和 四 聚 体 (D)
| 的 电镜 观察
(二 ) 组 蛋白 H1 把 核 小 体 “ 封 锁 ” 起 来
在 用 小 球菌 核酸 酶 消化 核 小 体 的 约 200 bp DNA 时 首先 降解 为 166 bp。 然 后 经 过 暂时 停
后 ,Hl1 释 出 ,DNA 进一步 降解 为 146 bp。 核 心 颗粒 的 双 折 释 对 称 (twofold symmetry) 结
帮 提 示 ,原来 长 度 为 166bp- 的 DNA 是 由 其 两 端 各 移 去 约 10 bp 而 变 为 146 bp 的 .由 于 核心 颗
粒 的 146 bp DNA 形成 1.8 超 螺旋 圈 , 因 而 166 bp 中 产物 应 能 形成 完整 的 2 超 螺旋 圈 , 这 样 将
使 它 的 两 个 末端 尽 可 能 地 靠近 到 一 起 。 因 此 ,Klug 提出 ,Hl 是 在 核 小 体 DNA 的 中 部 段 与
DNA 进入 和 离开 核心 颗粒 的 片段 之 间 形 成 的 空洞 处 联结 在 核 小 体 DNA 上 的 (图 12-7)。 支 持
此 模型 的 实验 证 据 是 :染色 质 纤 维 含 有 H1,DNA 是 在 同一 侧 进入 和 离开 核 小 体 ,但 在 没有 Hl
的 染色 质 中 , 则 DNA 的 进 、 出 位 置 是 更 为 随机 分 布 的 ,并 且 趋 于 发 生 在 核 小 体 的 对 侧 .。 此 模型 -
还 提示 ,联结 物 DNA 的 长 度 是 由 联结 在 其 上 的 组 蛋白 Hl 的 亚 类 决定 的 。

三 .30nm 纤 丝 :染色 质 结构 的 第 二 层次

166 bp 核 小 体 DNA 的 堆积 比 约 为 10( 其 56 nm 线 型 长 度 弯曲 成 一 个 约 5. 6 nm 高 的 超 螺
347

图 12-7 设想 组 蛋白 H1 是 联结 在 166 bp 核 小
图 12-6- 核 小 体 核心 颗粒 模式 图 体 上 的 。DNA 的 两 个 完整 超 螺旋 圈 使 百 1
能 够 与 DNA 的 两 端 及 其 中 部 联结 起 来

旋 ) 。 显然 ,在 低 离 子 强度 下 形成 10 nm 核 小 体 纤 丝 (filament) 仅 代表 染色 体 DNA 堆积 的 第 一
层次 。 只 有 在 生理 的 离子 强度 下 ,染色 体 结构 的 下 一 层次 才 被 明显 看 出 来 。
随 着 盐 浓 度 的 提高 ,含有 也 1 的 核 小 体 纤 丝 开始 折 码 成 曲 曲折 折 的 构象 (电镜 下 可 观察 ，
到 )。 此 外 ,观察 提示 ，, 核 小 体 通过 它们 的 H1 分 子 间 的 接触 而 相互 作用 。 然 后 , 当 盐 浓度 接近
生理 范围 时 ,染色 质 形 成 一 条 30 nm 厚 的 纤 丝 (图 12-8)， 人 Klug 认
为 ,30nm 纤 丝 是 由 10 nm 核 小 体 纤 丝 卷 绕 成
为 圆 简 形 线圈 而 形成 的 ,此 线圈 的 每 一 圈 约 为
6 个 核 小 体 , 螺 距 为 11 nm'( 核 小 体 直径 ,图 12-
9)。 此 圆 简 形 线圈 是 由 Hl 分 子 稳定 的 。 每 个
HIl 分 子 由 两 部 分 组 成 :一 部 分 是 保守 的 球形 核

图 12-9 30 nm 染色 质 纤 丝 的 一 种 模型 表示
出 随 着 盐 浓 度 的 升 高 纤 丝 的 可 能 形成 过 程
之 字形 的 核 小 体 (1,2,3,4)? 靠 近 在 一 起 形
成 一 个 圆 简 形 线圈 ,每 圈 约 6 个 核 小 体 。 许 多
Hl 分 子 稳定 此 结构 ,设想 它们 是 沿 着 圆 简 形
线圈 的 中 心 形成 螺旋 形 多 聚 体 。

12-8 30 nm 染色 质 纤 丝 的 电镜 图
注意 纤 丝 为 2 一 3 核 小 体 宽 。 线 段 表 示 100 nm
长 。 引 自 Jerome B. Rattner.

348 |

证 , 它 是 联结 核 小 体 的 ; 另 一 部 分 是 比较 可 变 的 延伸 出 去 的 N 端 和 C 端 臂 ,设想 它们 是 与 相 邻
目的 核 小 体 相 接触 。 此 模型 与 30 nm 纤 丝 的 X 射线 衍射 图 谱 相 符合 ,其 堆积 比 约 为 40(6 个 核 小
生体, 每 个 约 200 bp DNA ,总 高 11 nm) .然而 ,需要 注意 的 是 ,对 于 30 nm 纤 丝 来 说 ,还 提出 了 几
是 种 其 它 的 模型 ,这 些 模型 看 来 似乎 也 是 合理 的 。

、 辐 射 的 环 Cradial loops) :染色 质 结 构 的 第 三 层次

组 蛋白 被 剥离 的 (细胞 分 裂 ) 中 期 的 染色 体 表
现 出 一 个 中 心 纤维 状 的 蛋白 质 脚手架 ”, 其 周转
环绕 着 广泛 的 DNA 学 圈 Chalo) (图 12-10 a) 。 在

(by)

图 12-11 (a) 人 类 中 期 染色 体 横 断面 电镜 图 ,注意
大 量 的 染色 质 纤 维 辐射 样 的 由 中 心 脚手架 射出 ;

图 12-10 组 蛋白 被 剥离 的 人 类 人 b) 解 释 (a) 图 的 模式 图
中 期 染色 质 电镜 图 指明 设想 的 0. 3 am 长 的 辐射 环 是 怎样 联结 在 0. 4 pm

(Ca) 中 心 蛋白 质 基质 (脚手架 ), 作为 周围 DNA “ 古 王 |
的 支撑 点 ; (b) 更 高 倍 的 放大 , 可 以 看 到 DNA 以 环 宽 的 脚手架 上 "以 形 成 直径 为 1 0 的 中 期 江 色 体 的 四 引
形 连 到 脚手架 上 。 引 自 Ulrich Laemmli. 自 Ulrich Laemmli.

349

电镜 下 可 以 看 到 DNA 的 股 线 是 成 环 的 , 它 几 乎 是 由 同一 位 点 进出 脚手架 (图 12-10b)。 这 些
环 的 大 多 数 的 长 度 在 15~30 wm( 相 当 于 45 一 90 kb) 范 围 内 ,因而 当 它 们 堆积 成 30 nm 年 丝
时 ,其 长 度 应 为 约 0. 6 wm。 电镜 观察 染色 体 的 横断 面 , 如 图 12-11a 所 示 , 有 力 地 提示 中 期 染色
体 的 染色 质 纤 维 是 辐射 状 安置 的 .如 果 看 到 的 环 相当 于 这 些 辐射 纤维 ,它们 的 每 一 个 将 使 染色
质 的 直径 加 大 0. 3 nm( 一 条 纤维 必须 回 到 其 原点 而 形成 环 )。 加 上 脚手架 的 宽度 为 0.4pm, 此
模型 指明 中 期 染色 体 的 直径 为 1. 0 sm, 这 与 观察 到 的 是 一 致 的 (图 12-11 b)。 一 条 典型 的 人 类 项
染色 体 含 有 约 14X107 bp, 因 而 它 应 有 2 000 个 左右 这 种 约 70 kb 的 辐射 环 。 这样 一 条 直径 为 响
0.4pm, 长 6.0pm 的 染色 体 脚手架 ,其 面积 足以 联结 2 000 个 左右 的 辐射 环 。 因 此 ,辐射 环 模 基
型 是 符合 观察 到 的 中 期 染色 体 的 堆积 比 的 。

关于 30 nm 纤 丝 是 怎样 组 织 起 来 以 形成 辐射 环 的 情况 几乎 什么 都 不 清楚 ,也 不 知道 中 期 固
染色 体 与 更 为 松散 的 细胞 分 裂 间 期 (inter-phase) 染 色 体 之 间 是 怎样 互 变 的 。 然 而 ,可 以 肯定 的 ，
是 , 几 百 甚至 是 几 千 种 不 同 的 非 组 蛋白 蛋白 质 ( 它 们 约 占 染 色 体 蛋白 质 总 量 的 10 为 ) 必 定 参与 |
这 些 过 程 。 而 且 , 有 证 据 表 明 辐 射 环 是 染色 体 的 转录 单位 。

第 二 节 ，” 真 核 基因 组 的 结构

真 核 生 物 的 特征 是 它 的 基因 组 的 主要 部 分 存在 于 核 中 ,并 用 核 膜 将 其 保护 起 来 而 不 暴露
在 胞 浆 中 。 另外 有 一 小 部 分 存在 于 细胞 器 中 . 在 我 们 探讨 真 核 生 物 的 基因 组 结构 时 ,首先 要 提
”出 的 二 个 问题 是 ,在 高 等 真 核 生 物 中 其 不 同 细胞 所 含 的 基因 组 是 否 相 同 ? 高 等 生物 具有 很 多 种
不 同 的 细胞 ,它们 不 仅 在 外 观 上 不 同 ,而 且 合 成 的 蛋白 质 也 不 相同 .例如 , 胰 脏 的 腺 细胞 合成 大
量 的 消化 酶 类 ,但 不 合成 胰岛 素 ,而 与 之 邻近 的 胰 8 细胞 却 产 生 大 量 的 胰岛 素 , 但 不 产生 消化
酶 类 。 很 显然 ,不 同类 型 的 细胞 所 表达 的 基因 是 不 同 的 。 然 而 一 个 多 细胞 生物 的 大 多 数 (不 是 ，
全 部 ) 体 细胞 所 含 的 遗传 信息 是 相同 的 ,因为 它们 都 是 从 一 个 受精 卵 传 下 来 的 ,此 现象 被 说 成
是 全 能 性 (totipotemeyj。 例 如 ,John Gurdon 曾经 证 明了 这 一 点 。 他 用 师 竖 肠 细胞 的 细胞 核 取
代 青蛙 受精 卵 的 细胞 核 , 并 用 这 种 受精 卵 培育 出 来 了 正常 的 成 年 青蛙 (关于 细胞 是 怎样 分 化 的
将 在 第 十 三 章 中 讨论 兰

然而 ,不 同 生物 核 中 的 DNA 总 量 是 差别 很 大 的 ,组 成 核 基因 组 的 序列 类 天 也 可 以 是 很 不
相同 的 ,不 同 生物 的 染色 体 数 目 差别 也 很 大 ,细胞 器 中 的 基因 大 小 也 不 一 致 .当然 ,不 同 真 核 生
物 的 基因 组 之 间 也 会 有 些 共同 的 特点 ,在 这 一 节 中 我 们 就 是 要 讨论 真 核 生 物 的 核 基 因 组 结构 ，
的 某 些 共 同 特点 (关于 细胞 器 基因 组 将 在 第 三 节 中 讨论 ) .但 是 , 必须 注意 到 真 核 生 物 界 是 非常 ，
之 大 的 ,而 我 们 现在 知道 的 只 是 少数 玫 种 生物 的 基因 组 结构 . 因此 ,我 们 在 下 面 讨论 真 核 DNA 、
的 特点 时 ,只 能 说 是 在 已 知 的 内 容 中 挑 沁 出 一 些 有 代表 性 的 特点 加 以 分 析 , 而 禾 能 确定 真 核 基 ，
因 组 的 所 有 结构 特点 。

一 `C- 值 悼 理

在 讨论 真 核 生物 基因 组 的 结构 时 ,我 们 首先 看 看 真 核 基 因 组 的 大 小 .人 们 早已 知道 真 核 细 胞
DNA 的 含量 比 原核 的 大 很 多 , 例如 ,哺乳 动物 细胞 的 DNA 含量 约 为 大 肠 杆 菌 的 800 倍 。 在 真 核
生物 中 ,每 种 生物 的 单 倍 体 基因 组 的 DNA 总 量 是 恒定 的 , 称 之 为 C- 值 (C-value) ,C- 值 是 每 种 生
物 的 一 个 特性 。 不 同 物种 的 C- 值 差别 很 大 ,图 12-12 列举 不 同门 (phyla) 生 物 C- 值 的 范围 。

350

5 又 105 5X105 5X107 5X108 5X109 bp

真菌
革 兰 氏 阳 性 细菌
革 兰 氏 阴性 细菌
2

WOY 十

12-12 不 同门 生物 的 C- 值 范围

人 们 有 理由 设想 ,一 个 生物 的 形态 学 复杂 性 应 该 与 其 C- 值 的 大 小 大 致 相关 ,因为 归根 结
次 ,一 个 生物 的 形态 学 复杂 性 必然 是 它 的 基因 复杂 性 的 反映 。 从 图 中 可 以 看 出 , 低 等 生物 的 情
国 咒 大 致 符合 这 种 设想 。 例 如 ,啤酒 酵母 (S. cereuisiae) 的 基因 组 约 为 1.3X107bp, 比 细菌 (大 肠
杆菌 为 4.2X105) 大 约 3 倍 , 它 是 单 细胞 真 核 生 物 。 而 粘 菌 (slime mold ,D. azscozdexzz 的 基因
组 为 5.4X107) 的 基因 组 比 酵 母 的 更 大 ,从 而 使 它 既 能 以 单 细 胞 形式 生长 又 能 以 多 细胞 形式
由 生长 。 而 首先 出 现 的 是 完全 多 细胞 生物 一 一 线虫 Cnematode wormC. eresgans 的 DNA 含量 为
8SX107) 的 基因 组 又 比 粘 菌 的 大 。 然 而 ,在 生物 进化 为 更 加 复杂 时 情况 就 并 非 如 此 了 。 例 如 ,有
星 亚 两 栖 类 的 基因 组 与 人 的 同样 大 ,难道 它们 的 基因 的 复杂 性 真 的 和 人 一 样 吗 ? 而 且 许 多 生物 的
G- 值 是 出 乎 预料 的 大 ,例如 , 肺 鱼 (lungfish) 的 比 哺乳 动物 的 大 10 一 15 倍 , 这 就 更 难以 理解 .再
者 ,从 图 12-12 中 可 以 看 出 ,有 些 门 ,如 鸟 类 、 疏 行 动物 和 哺乳 动物 的 C- 值 范围 是 比较 窗 的 ,最
是 天 的 约 为 最 小 的 两 倍 ;然而 在 另 些 门 ,如 昆虫 \ 两 栖 动 物 和 植物 ,其 C- 值 的 变动 范围 很 大 。 一 种
普通 家 蝇 的 基因 组 为 8.6X10s ,一 种 普通 果 蝇 的 基因 组 为 1.4X10", 家 蝇 比 果 蝇 的 约 大 6 售 。
从 们 怀疑 家 蝇 的 形态 学 是 否 真 比 果 蝇 复 杂 6 倍 。 这 种 形态 学 的 复杂 程度 与 C- 值 大 小 的 不 一 至
称 为 C- 值 悖 理 (C-value paradox) 。 它 使 人 们 怀 搬 , 在 比较 大 的 基因 组 中 的 “额外 `DNA 是 否 有
功能 ? 如 果 没 有 功能 ,为 什么 还 一 代 二 代 地 传 了 下 来 ?
引起 这 种 疑问 的 另 一 个 问题 是 对 基因 数目 的 估 测 。 据 认为 ,大 肠 杆 菌 的 4X10" bp DNA
约 编码 3 000 种 基因 产物 (其 中 一 半 左 右 已 被 鉴定 出 来 了 ) 。 人 类 单 倍 体 基因 组 为 29X108bp，
比 大 肠 杆 菌 的 大 700 多 倍 , 按 大 肠 杆菌 的 标准 估算 ,应 该 有 上 百 万 个 基因 。 然 而 事实 却 远 非 如
此 。 尽 管 到 目前 为 止 还 无 法 测 知人 类 (或 哺乳 动物 ) 基 因 组 中 确实 含有 多 少 个 编码 蛋白 质 的 基
因 , 但 可 以 肯定 比 上 述 估算 的 数字 要 少 很 多 .当前 ,有 多 种 估 测 基因 数目 的 方法 ,其 中 之 一 是 根
据 不 同 细 胞 中 mRNA 的 数目 来 估算 每 种 细胞 中 表达 产生 和 蛋白质 的 基因 数目 。 根 据 这 种 估算 ，
3 型

孔

间 的 延长 而 下 降 的 分 数 ( 妃 可 按 下 列 公 式 计算 :

哺乳 动物 的 每 种 表 型 的 细胞 表达 的 基因 约 为 1X10' 个 。 由 于 有 些 基 因 是 在 所 有 类 型 的 细胞 中
都 表达 的 , 即 这 些 基因 的 功能 为 所 有 细胞 所 必需 ,因而 常 把 它们 叫做 持家 基因 (housekeeping
gene) 或 组 成 型 (constitutive) 基 因 。 而 另 一 些 基因 则 是 仅 在 某 种 类 型 的 细胞 中 表达 的 ,有 时 把
它们 叫做 奢侈 基因 (luxury gene)。 这 样 , 整 个 哺乳 动物 的 基因 数 要 多 于 每 种 细胞 的 表达 数 , 估
计 应 该 有 1X10: 个 (不 同 作者 估算 的 数目 有 所 不 同 ), 即 约 为 大 肠 杆菌 的 30 倍 。 由 此 可 见 ,在
人 类 以 及 其 它 真 核 生 物 的 基因 组 中 存在 着 大 量 的 不 被 表达 的 DNA(〈\ 人 类 的 约 占 总 DNA 的
98%) ,它们 的 功能 是 什么 ? 诚然 , 真 核 基因 表达 的 调控 比 原核 的 要 复杂 得 多 ,难道 这 些 不 被 表
达 的 DNA 的 功能 就 是 调控 基因 的 表达 吗 ?

当前 对 于 上 述 这 些 问题 是 无 法 给 以 圆满 解答 的 。 然 而 ,从 后 面 的 讨论 中 将 会 看 到 ,我们 已
经 获得 了 大 量 关于 真 核 染 色 体 基因 结构 的 知识 ,并 将 继续 深入 研究 下 去 。 这 些 知 识 对 于 找到 上 里
述 问 题 的 答案 无 疑 是 有 重大 帮助 的 。

二 、 复 性 动力 学 指示 DNA 的 复杂 度

DNA 复 性 (renature) 的 速度 能 够 指明 该 DNA 的 单一 序列 (unique sequence) 的 长 度 。Roy
Britten 及 其 同事 在 研究 热 变 性 DNA 的 复 性 动力 学 时 发 现 ,与 原核 生物 的 DNA 不 同 , 真 核 生 嘲
物 DNA 中 含有 许多 重复 的 碱 基 序列 。 在 实验 中 ,他们 将 DNA 剪 切 成 小 的 片段 (300 一 医
10 000 bp) ,然后 将 含有 这 些小 片段 DNA 的 溶液 加 热 至 温度 高 于 DNA 的 解 链 温度 (melting ，
temperature,T,) ,使 DNA 变性 。 再 将 此 含有 单 链 DNA 的 溶液 温度 降 至 约 25C( 低 于 了 ) ,这
是 互补 的 单 链 DNA 重新 结合 起 来 成 为 双 螺 旋 DNA 的 最 适 温度 . 有 多 种 方法 测定 其 再 结合 的
动力 学 ,其 中 比较 好 的 一 种 是 利用 羟 磷 灰 石 (磷酸 钙 ) 柱 层 析 。 此 法 的 原理 是 ,由 于 羟 磷 灰 石 仅
与 双 链 DNA 相 结合 ,不 与 单 链 DNA 结合 ,因此 , 当 含 有 二 者 的 混合 溶液 流 经 产 磷 灰 石 柱 时 ，
双 链 DNA 结合 在 柱 上 , 单 链 DNA 则 流出 ,从 而 可 将 二 者 分 开 , 并 能 计算 出 在 给 定时 间 内 变性
的 DNA 中 有 多 少 复 性 了 。

用 大 肠 杆菌 或 工 叭 菌 体 DNA 所 做 的 实验 结果 表明 ,它们 的 复 性 动力 学 符 侣 双 分 子 反 应

ED

规律 ,这 是 事前 所 预期 的 ,因为 此 反应 是 由 互补 的 两 条 单 链 ( 式 中 以 S 和 S 代 表 ) 结 合成 二 条 下
双 链 ( 式 中 以 D 表示 )。 式 中 的 为 结合 反应 速度 常数 . 对 于 这 样 的 反应 来 说 ,其 单 链 分 子 随 时
六
7
式 中 C. 为 DNA 的 总 浓度 (以 每 升 中 核 昔 酸 的 摩尔 数 表 示 ),: 为 时 间 (s ) 。 在 给 定 的 DNA 和 实 和
验 条 件 ( 例 如 离子 强度 ` 温 度 .DNA 片段 的 大 小 ) 下 法 仅 随 CzCDNA 浓度 和 时 间 的 乘积 ) 的 改
变 而 改变 。 描 述 复 性 动力 学 的 方便 方法 是 以 了 对 Cz 的 对 数 做 图 ,这 种 C 曲线 为 S
(sigmoidal) 型 (图 12-13) 。
这 种 作 图 的 一 个 有 用 的 指数 是 C. 1/2, 它 表示 DNA 的 半数 再 结合 (7 一 1/2) 时 的 C 值 。
大 肠 杆菌 DNA 的 C.z 172 约 为 15 mol.s 人 L。 而 T4 鸣 菌 体 DNA 的 约 为 0.3 mol . s ,这 些
数值 说 明 大 肠 杆 菌 DNA 的 再 结合 ( 复 性 ) 比 T4 鸣 菌 体 DNA 慢 很 多 。 大 肠 杆菌 DNA 的 再 结
合 为 什么 比 工 4 只 菌 体 的 慢 ? 这 是 因为 大 肠 杆菌 的 DNA 兹 T4 噬菌体 的 大 ,而 且 已 知 它 们 的 |

352

1.0

f 刀 小 鼠 卫 星 \_MS-2 T4 无 .coii
三 条 小 牛 胸腺 DNA
的 非 重复 组 分
本
0
于 的 镍 广 0 0 10” 0z 0.1 于 10 102 103 104
Coi (mol。s/L)
S
图 12-13 - 这 些 Cu 曲线 描述 了 几 种 热 变 性 DNA 的 再 结合 动力 学
引 | 自 人 .J. Britten and D. 匡 . Kohne,Science. 1968. 161 : 530,

DNA 都 是 单一 序列 ( 即 没有 或 很 少 有 重复 序列 ) ,因而 在 用 等 量 (注意 :在 实验 中 所 用 DNA 的
量 是 每 升 溶液 中 含有 相同 摩尔 数 的 核 苷 酸 )DNA 切 成 片段 后 , 原来 越 长 的 DNA ,其 不 同类 型
的 片段 在 溶液 中 的 浓度 就 越 低 。 由 于 大 肠 杆 菌 的 DNA 比 工 4 鸣 菌 体 的 DNA 大 ,所 以 它 的 不
同类 型 的 DNA 片段 的 浓度 比较 低 , 因而 复 性 的 速度 就 比较 慢 了 。 我 们 把 每 个 单一 序列 所 含 的
碱 基 对 数 称 为 该 DNA 的 复杂 度 (complexity)。 例 如 ,一 个 重复 序列 (repeating sequence)
(AGCT),, 它 的 复杂 度 为 4, 而 一 个 大 肠 杆 菌 染 色 体 是 由 非 重复 的 4X10' bp 序列 组 成 的 , 它 的
复杂 度 即 为 4X10sbp。 由 此 可 见 , 一 个 DNA 的 Cu 1/2 值 越 大 ,表明 它 的 复杂 度 越 高 。

在 用 相同 方法 研究 小 鼠 DNA 时 得 到 了 出 人 意料 的 结果 。 由 于 哺乳 动物 的 基因 组 比 大 肠
路 菌 的 大 3 个 数量 级 左右 ,因而 其 Cu 1/2 值 似乎 应 该 为 104 mol。s/L。 一 个 10-4mol/L 的 具
和 这 种 C 1/2 值 的 DNA 溶液 ,将 需 10* s( 约 3 年 ) 才 能 有 一 半 再 结合 起 来 。 然 而 令 人 惊异 地
是 ,小 鼠 DNA 中 有 一 部 分 ( 约 占 10 为 ) 仅 在 几 秒 钟 内 就 有 一 半 再 结合 了 。 事 实 是 ,小 鼠 DNA
的 这 一 部 分 的 再 结合 速度 甚至 比 最 小 的 病毒 DNA 还 要 快 。 这 一 事实 说 明 ,在 小 鼠 DNA 中 有
用 比较 小 的 片段 ,它们 在 整个 DNA 中 有 很 多 拷贝 ( 即 重复 序列 ) ,在 切 成 片段 时 ,它们 的 浓度 很

高 ,因而 复 性 很 快 。

三 .重复 序列

。 复 性 动力 学 的 分 析 表 明 ,病毒 和 原核 DNA 中 没有 或 很 少 有 重复 序列 ,因为 它们 的 Ce 曲
纪 如 图 12-13 中 MS2,T4 和 大 肠 杆菌 的 ) 是 个 简单 的 S 型 。 与 之 相反 , 真 核 DNA 的 Cu 曲线
表现 为 多 曲折 型 , 即 有 多 个 Cu1/72 值 。 由 于 这 种 曲线 很 复杂 ,而 且 不 同 真 核 生物 的 曲线 也 不 相
同 , 为 了 说 明 问 题 , 图 12-14 所 列 是 个 模式 图 。 通过 对 这 种 图 的 分 析 , 可 以 佑 测 出 不 同 重复 序列
的 重复 频率 ,每 种 重复 序列 片段 的 长 度 范围 ,以 及 各 种 重复 序列 和 单一 序列 各 在 总 DNA 中 所
占 的 百分数 ( 见 图 中 下 面 的 表 ) 。

根据 对 真 核 生 物 的 Cuz 曲线 的 分 析 可 把 它们 的 DNA 相对 地 分 为 4 类 : 呈 单 一 序列
(unique sequence) ,每 个 单 倍 体 基 因 组 中 含 1 拷贝 (也 包括 含 几 拷 贝 的 2; 包 中 度 重复 序列 (mo-
derately repetitive sequence ) ,每 个 单 倍 体 基 因 组 中 含 二 10” 拷 忠 ;G@) 高 度 重 复 序列 (highly
repetitive sequence) ,每 个 单 倍 体 基 因 组 含 这 105 拷贝 ;由 反 向 重复 序列 。
(一 ) 反 向 重复 序列
这 是 真 核 DNA 中 再 结合 最 快 的 部 分 , 约 占 某 些 基因 组 的 10% 。 复 性 动力 学 的 研究 表明 ，
353

它 的 复 性 为 一 级 反应 ,说 明 这 种 DNA 含
有 靠 得 很 近 的 反 向 重复 (自我 互补 ) 序 列 ，
它们 能 够 自我 折 琶 起 来 形成 发 夹 结 构 ( 图
12-15)。 反 向 重复 序列 的 长 度 范围 为 100
一 1000bp。 这 样 大 的 序列 不 可 能 是 在 进
化 中 随机 出 现 的 .用 这 种 反 向 重复 序列 (分

离 出 来 的 ) 对 中 期 染色 体 进行 原 位 杂交 (in -

situ hybridization) 的 研究 表明 ,它们 是 分
布 在 染色 体 的 许多 点 处 。

在 人 类 基因 组 中 这 种 反 向 重复 序列 大
约 有 2X10" 个 ,它们 的 功能 尚 不 清楚 。 然
而 ,由 于 用 配对 的 折 回 结构 形成 的 十 字形
结构 (cruciform structure) 的 稳定 性 (
12-15 b) 仅 比 正常 的 双 螺 旋 DNA 稍微 差
一 些 , 因而 有 人 认为 ,染色 质 中 的 反 向 重复

复 性 分 数 (1 - C/C。)

重复 频率

图 12-14 真 核 生 物 DNA 复 性 动力 学 模式 图

序列 的 功能 可 能 是 作为 某 种 分 子 开关 (molecular switch ) 。

3

5

12-15 _DNA 中 的 折 回 结构
Ka) 含有 反 向 重复 序列 的 单 链 DNA ,在 复 性 条 件 下 ,形成 一 个 碱 基 配 对 的 环 ,叫做 折 回 结构 (fold_back structure
这 里 人 与 A' 互 补 ,B 与 B' 互 补 ,如 此 等 等 ;(b) 在 双 链 DNA 中 的 一 个 反 向 重复 序列 可 设想 它 形 成 _ 种 含有 两 个 折 回

结构 的 十 字形 构象 。 这 种 结构 的 稳定 性 比 双 螺旋 要 差 些 ,因为 它 有 未 配对 的 环 。

二) 高 度 重复 序列

此 种 序列 是 由 长 度 不 到 10 bp 的 DNA 片段 所 组 成 ,在 每 个 细胞 的 DNA 中 重复 次 数 以 百
万 计 , 在 大 鼠 中 这 种 序列 约 占 其 总 DNA 量 的 10%%。 许 多 高 度 重复 序列 可 用 密度 梯度 离心 法 分

354

离 出 来 (有 的 则 不 能 ) ,这 是 因为 这 些 序 列 中 富 含 A,T, 因 而 它们 的 浮力 密度 (buoyant density)
比 DNA 总 体 较 低 。 例 如 ,将 果 蝇 的 DNA 打 碎 后 ,在 CsCl 溶液 中 进行 梯度 离心 后 ,其 沉降 图 谱
如 图 12-16 所 示 。 从 图 中 可 以 看 出 ,除了 主 带 (1. 700) 外 还 有 3 条 额外 的 带 , 称 之 为 卫星 (satel-
lite) 带 (因而 将 它们 的 DNA 称 为 卫星 DNA) 。 分 析 这 些 卫 星 带 的 DNA 表明 它们 都 是 高 度 重
复 序 列 。
事实 上 , 果 蝇 的 这 3 种 卫星 DNA 是 分 别 由 3 种 不 同 的 (虽然 是 很 类 似 的 27 核 背 酸 序列 串
联 重复 形成 的 ,这 3 种 序列 是 :

5 -ACAAACT-3-

SETCTREC 和 -5
卫星 1 5 -ATAAACT-3/

3-TATTTGA-5/
卫星 I 5'-ACAAATT-3/

3'-TGTTTAA-5'
卫星 矶

卫星 DNA 也 叫做 简单 序列 DNA (simple se-
quence DNA) , 据 认 为 它们 是 不 编码 蛋白 质 或
RNA 的 ,许多 高 度 重 复 的 DNA 是 位 于 真 核 染 色
体 的 两 个 重要 结构 一 一 着 丝 点 (centromere) 和 端
- 粒 (telomere) 处 ,这 是 用 原 位 杂交 技术 证 明 的 。
每 个 真 核 染 色 体 都 有 一 个 着 丝 点 , 它 的 功能
是 作为 那些 (把 染色 体 联 结 到 有 丝 分 裂 的 纺锤 体
上 的 ) 蛋 白质 的 接合 点 。 在 细胞 分 裂 时 这 种 结合 对
于 将 染色 体 分 配给 子 细胞 是 必需 的 。 酵 母 染 色 体
上 的 着 丝 点 已 被 分 离 并 研究 过 (图 12-17)。 着 丝 点
功能 所 必需 的 序列 约 为 130 bp 长 , 它 非 常 富 含
A 一 T 对 。 高 等 真 核 生 物 的 着 丝 点 要 比 酵 母 的 长
很多。 在 高 等 真 核 生物 中 (不 是 在 酵母 中 ), 卫星 12-16， 果 蝇 DNA 在 中 性 CsCl 中 离心 至
DNA 普遍 存在 于 着 丝 点 区 ,并且 是 由 数 以 千 计 拷 平衡 时 的 沉降 图 谱
贝 的 一 种 或 几 种 短 序列 串 连 (一 个 挨 一 个 ,并 且 是 引 自 Gall,J. G. ,Cohen, 卫 . H. and Atherton,D.D，
相同 方向 ) 而 成 。 已 鉴定 的 卫星 序列 一 般 是 5 一 10 bp 长 。 卫 星 DNA 在 着 丝 点 功能 中 所 起 的 具
体 作 用 尚 不 清楚 。
端 粒 是 位 于 线 型 的 真 核 染 色 体 未 端的 序列 , 它 有 助 于 使 染色 体 稳定 .研究 得 最 清楚 的 是 简
单 真 核 生 物 的 端 粒 。 酵 母 端 粒 的 末端 有 约 100 bp 的 不 太 严格 的 重复 序列 ,其 形式 为 :
5' (TZzGy)，
3' (AzCy)，
式 中 zx 和 >y 通常 在 1 一 4 范围 内 。 产 生 这 种 重复 序列 的 原因 是 ,由 于 真 核 DNA 为 线 型 ,而
DNA 聚合 酶 只 能 由 5' 向 3 方向 复制 ,因而 在 复制 完毕 时 ,在 去 掉 其 头 上 的 RNA 引物 后 ,此 一
355

DNA 主 带 卫星 DNA
1.700

1.692(ACAAACT)x

1. 688(ATAAACT)，
1.671 (ACAAATT)，

光 密 度

< 一 氧化 饮 中 的 浮力 密度

段 是 无 法 补 齐 的 。 如 果 没 有 补救 机 制 , 则 会 使 DNA 每 复制 一 次
便 会 缩短 一 段 ,这 当然 是 不 可 以 的 。 补 救 的 机 制 是 由 端 粒 酶 区 闪
(telomerase) 完 成 的 。 此 酶 是 个 含有 RNA 的 反 转 录 酶 , 它 以 其
自身 的 RNA 为 模板 ,连续 不 断 地 向 DNA 未 端 加 上 6 个 碱 基 的
DNA 序列 ,从 而 形成 了 端 粒 未 端的 重复 序列 。 这 样 就 保证 了 在
复制 过 程 中 DNA 不 会 越 来 越 短 了 ( 详 见 第 五 章 ) 。
虽然 如 上 所 述 在 构成 果 蝇 的 卫星 序列 的 每 个 重复 片段 之 间
同 源 性 很 高 ,但 并 非 所 有 生物 的 卫星 序列 都 是 如 此 。 例 如 ,已 分
析 的 一 段 小 鼠 的 卫星 序列 中 ,其 重复 片段 之 间 在 序列 上 是 有 差
异 的 。 由 小 鼠 中 制 得 的 此 234 bp 的 片段 (一 个 很 长 的 卫星 序列
中 的 一 小 段 ) 是 由 两 个 117 bp 的 序列 串联 而 成 的 ,但 这 两 个 序 “着 丝 点 呈 “分 若 攻 要 网
列 之 间 有 19% 的 差异 ( 同 源 性 81 儿 )。 进 一 步 分 析 这 两 个 序列 发 2 人
现 ,它们 每 一 个 都 是 由 两 个 更 小 的 片段 串联 重复 组 成 ,这 4 个 片
段 之 间 的 差异 更 大 一 些 。 再 进一步 分 析 表 明 ,整个 序列 实际 上 是
由 一 个 9bp 的 单位 串联 重复 而 成 的 。 据 推测 ,产生 这 种 结果 的
原因 可 能 是 ,最 初 的 一 个 9bp 片段 经 过 扩 增 而 成 为 多 重复 单
位 ,这 些 单位 原本 是 一 样 的 ,但 经 过 突变 (包括 碱 基 蔡 换 、 插 入 和
缺失 ) ,它们 彼此 间 就 产生 了 差异 。 此 重复 序列 再 扩 增 而 构成 由
更 大 单位 形成 的 重复 序列 ,这 些 序列 又 发 生 突变 ,如 此 反复 而 形
成 了 现在 我 们 看 到 的 卫星 序列 卫星 序 列 之 所 以 易于 发 生 突变 ， 。 总站
是 由 于 它们 不 编码 蛋白 质 之 故 。 而 且 这 种 重复 序列 在 复制 过 程
中 ,由 于 基因 重组 的 结果 ,容易 发 生 重复 次 数 的 改变 。 图 12-17 “一 个 酵母 染
在 人 类 (和 其 它 动物 中 ) 普 遍 存在 着 与 卫星 序列 类 似 , 由 短 色 体 的 重要 结构 特征
的 单位 串联 重复 组 成 的 序列 ,但 它们 的 总 长 度 短 得 多 ,大 致 由 5~50 个 重复 单位 组 成 , 称 之 为
小 卫星 (minisatellite) 或 数目 可 变 的 串联 重复 (variable number tanc 症 repeat,VNTR) 序 列 。
由 于 它们 的 重复 次 数 变动 很 大 , 因而 在 一 个 群体 中 , 在 基因 组 的 相同 位 点 ,和 不同 个 体 的 小 卫星 和
序列 的 长 度 变动 很 大 ,表现 出 高 度 的 多 态 性 。 而 且 已 经 发 现 ,在 人 类 和 动物 中 存在 有 小 卫星 家
族 ,它们 有 共同 的 核心 序列 (core sequence)。 因 此 , 当 我 们 用 限制 性 内 切 酶 将 某 一 个 体 的 DNA
切断 ,经 电泳 将 不 同 长 度 的 DNA 片段 分 开 后 ,用 制 得 的 小 卫星 探 针 与 之 杂交 , 即 可 显示 出 许
多 条 长 短 不 等 的 带 , 这 些 带 代表 着 该 个 体 基因 组 申 许多 位 点 处 的 小 卫星 片段 长 度 . 这 种 图 型 补
称 为 DNA 指纹 图 CDNA finger printing) 。 之 所 以 叫 这 个 名 字 是 因为 它 和 人 的 指纹 类 似 ,能 够
用 以 区 分 每 个 个 体 。 这 是 易于 理解 的 ,因为 同一 位 点 的 每 个 个 体 的 小 卫星 长 度 已 经 是 高 度 变 愉
的 ,而 两 个 个 体 的 多 个 位 点 (通常 是 显示 出 20 一 30 个 们 点 ) 小 卫星 序列 的 长 度 完全 二 样 的 可 能
性 几乎 是 没有 的 。 因 此,DNA 指纹 图 已 在 法 医 上 得 到 了 广泛 地 应 用 。
(三 ) 中 度 重复 序列
中 度 重复 序列 是 由 100 到 几 千 个 bp 的 片段 重复 而 成 ,它们 分 散在 整个 高 等 生物 的 基因 组
中 ,居于 比 它们 更 长 的 单一 序列 包括 单 拷贝 和 仅 几 拷 贝 的 片段 , 约 占 基 因 组 DNA 总 量 的 40 人 5
一 70%% ,大 多 数 基因 在 这 类 序列 中 间 。 在 这 类 重复 序列 中 ,有 些 是 由 一 组 基因 串联 重复 所 组 成 ，

这 些 基 因 规 定 的 产物 是 细胞 大 量 需 要 的 ,例如 ,核糖 体 RNAs,tRNAs 和 组 蛋白 等 。 这 些 基 因 |
356

的 结构 将 在 下 面 讨论 。 在 这 种 DNA 中 鉴定 得 最 清楚 的 是 Alu 家 族 (Alu family) ,这 样 命名 是
。 因为 这 种 约 为 300 bp 长 的 片段 中 ,大 多 数 片段 含有 一 个 限制 性 内 切 酶 Alu I 的 酶 切 位 点 。Alu
家 族 是 人 类 基因 组 中 存在 最 广泛 的 中 度 重 复 DNA ,含有 30 万 一 50 万 个 Alu 序列 , 约 为 人 类
基因 组 DNA 总 量 的 1%% 一 3 外 。 它 们 显然 是 由 一 个 编码 7SL RNA 的 基因 衍生 出 来 的 。7 SL

RNA 是 一 种 叫做 信号 识别 颗粒 的 组 分 ( 见 第 八 章 ) ,此 信和 号 识别 颗粒 在 蛋白 质 合成 中 起 作用 。

然而 ,Alu 序列 缺乏 7 SL RNA 基因 中 的 一 些 部 分 ,因而 产生 不 出 有 功能 的 7 SL RNA .在 猴 和
， 帆 此 动物 中 也 有 Alu DNA ,而 在 亲缘 关系 很 远 的 生物 ,例如 棘皮 动物 、 两 栖 动物 和 禽类 中 则 含

是 有 Alu 样 (Alu-like) 序 列 。 虽 然 在 许多 生物 中 Alu 家 族 是 最 突出 的 中 度 重复 DNA ,但 它 并 不
是 唯一 的 。 序 列 分 析 已 经 证 明 , 在 脊 椎 动物 的 基因 组 中 通常 含有 几 种 不 同 的 中 度 重复 DNAs。
| ”除了 表达 产生 核糖 体 RNAs ,tRNAs 和 组 蛋白 的 序列 外 ,其 余 大 多 数 不 表 达 的 中 度 重复
ULDNA 的 功能 是 什么 ?从 它们 的 片段 长 度 和 拷贝 数 看 似乎 是 应 该 有 不 同 的 功能 ,然而 ,虽然 已 经
目 提 出 了 一 些 设想 ,但 都 没有 得 到 实验 的 证 实 。 在 这 些 设想 中 觉得 最 有 可 能 的 是 中 度 重复 DNA
的 功能 是 作为 调控 序列 ,它们 参与 其 附近 基因 的 活化 。 另 一 种 设想 是 中 度 重复 DNA 的 某 些 家
是 族 为 复制 起 点 。 第 三 种 设想 的 中 度 重复 DNA 的 功能 是 它们 提高 了 真 核 基因 组 进化 方式 的 多
， 样 性 ,这 是 通过 促进 染色 体 的 重 排 (rearrangement) ,或 者 是 它们 作为 库存 ,以 便 由 其 中 得 到 新
的 功能 性 序列 而 实现 的 。 诚然 ,有 些 中 度 重复 序列 在 结构 上 有 一 定 转 座 因子 (transposable ele-
jaent, 见 第 六 章 ) 的 性 质 。 然 而 由 于 所 有 这 些 设想 都 未 能 得 到 实验 的 证 实 ,因此 关于 这 些 中 度

重复 序列 的 功能 可 以 说 是 迄今 毫 无 所 知 。

由 于 对 于 这 些 中 度 重复 序列 的 种 种 设想 的 功能 都 得 不 到 证 实 ,因而 另 一 种 设想 , 即 它们 可

能 就 是 废弃 的 无 用 的 DNA ,是 在 进化 过 程 中 残留 下 来 的 设想 ,也 是 需要 认真 对 待 的 。 当 然 是 否

， 是 这 样 ,也 还 需要 用 实验 来 证 实 .

四 ,串联 重复 的 基因 艇

在 生物 的 单 倍 体 基因 组 中 ,大 多 数 基因 仅 出 现 一 次 ( 单 拷贝 )， 即使 是 那些 需要 量 很 大 的 蛋
， 自 质 的 基因 也 是 单 拷贝 。 然 而 rRNA,tRNA 和 组 蛋白 的 基因 是 多 拷贝 的 。
， (一 )rRNA 基因 组 织 成 一 套 并 重复
我 们 已 经 知道 ,在 大 肠 杆菌 的 基因 组 中 ,尽管 其 它 基 因 都 是 单一 序列 的 ,但 rRNA 和
tRNA 的 基因 却 是 多 拷贝 的 。 在 真 核 生 物
量 下 ,规定 18S,5.8S 和 28S 的 基因 总 是 按 rRNA 基因
gs,5.8S,28S 的 顺序 排列 ,在 这 些 基因 fssss .os
之 间 有 短 的 被 转录 的 间隔 区 (spacer) 将 它
们 分 开 , 形 成 一 个 约 7 500bp 的 转录 单位
(图 12-18)。 此 基因 艇 (gene cluster) 的 初 村 0 本 半生
始 转录 物 是 个 45S RNA, 由 此 RNA 经 转
录 后 加 工 形 成 成 熟 的 rRNA 这 个 转录 的 图 12-18 编码 18 $,5.8S$ 和 28 SIRNA 的 基因
基因 生 是 串联 重复 的 ,在 秘 与 入 之 间 用 不 组 成 一 个 转录 单位 ,此 转录 单位 串联 重复 ,在 两
转录 的 间隔 区 分 开 。 这 些 串联 重复 序列 典 和 生 下 人 全 辣 可 信任 下 的 浊 必 芝
型 的 长 约 12 000 bp ,尽管 不 同 品种 生物 的 不 转录 间隔 区 的 长 度 有 所 不 同 ,而 且 同 二 生物 的 基
因 与 基因 之 间 的 不 转录 间隔 区 的 长 度 也 有 比较 小 的 差异 。 用 放射 性 标记 rRNAs 进行 杂交 的
357

定量 测定 表明 ,这 些 rRNA 基因 (CDNA) 是 分 布 在 几 个 染色 体 中 ,其 在 单 倍 体 中 的 数目 因 品 种
的 不 同 而 不 同 , 在 少 于 50 一 10 000 个 以 上 的 范围 内 变动 。 人 的 rRNA 基因 簇 为 50 一 200 个 ,分
布 在 5 个 以 上 染色 体 上 。

在 典型 的 间 期 细胞 核 中 rDNA 浓缩 形成 一 个 核 仁 。 在 核 仁 中 这 些 基 因 迅 速 不 断 地 由 RNA
聚合 酶 I 转录 。 放 射 性 标记 实验 表明 , 核 仁 也 是 这 些 rRNAs 转录 后 加 工 的 场所 ,并 且 在 胞 浆 中
合成 的 核糖 体 蛋 白质 也 到 核 仁 处 与 这 些 rRNA 装配 形成 未 成 熟 的 核糖 体 亚 基 。 仅 当 这 些 未 成 熟
的 核糖 体 亚 基 被 运输 到 胞 浆 中 后 , 才 最 后 装配 成 成 熟 的 核糖 体 亚 基 , 这 大 概 是 为 了 避免 在 细胞 核
中 翻译 那些 部 分 加 工 了 的 mRNA 之 故 。

和 上 述 几 种 rRNA 的 基因 相似 ,编码 。 个 转录 的 假 基因
5 SizRNA 的 基因 也 是 安排 成 能 的 , 它 总 共 [ 罚 [| 上
含有 几 百 到 几 十 万 个 串联 重复 ,分 布 在 一 ss nn
个 或 更 多 个 染色 体 中 。 当 前 研究 得 最 清楚 基因
的 是 爪 蟾 CXenzopzxs /cevis) 的 5STrRNA 基
因 , 它 的 重复 单位 是 由 一 个 5S rRNA 基 图 12-19 爪 蟾 5 STRNA 基因 的 结构
因 ,一 个 邻近 的 假 基因 (pseudogene,5S rRNA 基因 的 一 个 101 bp 的 片段 , 它 是 不 被 转录 的 )
和 一 个 不 转录 的 间隔 区 所 组 成 (图 12-19)。 间 隔 区 的 长 度 不 相同 ,但 平均 约 为 400bp。5S
rRNA 基因 是 在 核 仁 之 外 由 RNA 聚合 酶 下 转录 的 ,所 以 5S rRNA 必须 被 转运 到 核 夺 中 以 便
挫 和 到 核糖 体 的 大 亚 基 中 。tRNA 基因 也 是 多 重复 的 和 成 簇 的 ,但 对 它们 的 结构 所 知 甚 少 。
tRNA 基因 是 由 RNA 聚合 酶 开 转 录 的 。

(二 ) 组 蛋白 基因 是 成 簇 的 并 串联 重复 许多 次

编码 蛋白 质 的 基因 是 怎样 安排 的 ?组 蛋白 基因 是 最 早 被 分 离 并 鉴定 的 ,这 是 因为 在 迅速 分
裂 的 海胆 胚 细 胞 中 组 蛋白 mRNA 的 含量 非常 丰富 之 故 这 些 海 生 的 无 脊 椎 动物 由 二 个 受精 卵
发 育成 1 个 1 000 个 细胞 的 赛 肥 Cblastula) 是 在 约 10h 完成 的 ,在 此 期 间 必 须 合 成 大量 的 组 蛋
白 , 以 便 形 成 新 的 染色 质 .诚然 ,在 早期 胚胎 发 生 时 期 所 合成 的 蛋白 质 中 有 14 以 上 是 组 蛋白 。
而 且 在 此 期 间 所 合成 的 mRNA 中 约 70%% 是 组 蛋白 mRNA ,因而 它们 是 易于 分 离 出 来 的 。

用 提取 的 组 蛋白 mRNAs 与 海胆 的 DNA 杂交
并 分 析 其 动力 学 ,从 而 测 得 其 组 蛋白 基因 的 拷

|
不 转录 的 间隔 区

表 12-4 组 蛋白 基因 的 重复 频率

贝 数 .结果 发 现 ,其 杂交 的 速度 比 单 拷贝 序列 的 基因 的 插 风 数
速度 快 几 百 倍 , 说 明 组 蛋 自 基因 是 高 度 重复 出 果 册 oooii ws
现 的 。 在 海胆 的 几 个 品种 中 ,组 蛋白 基因 的 拷贝 爪 丹 (Xenopus acsin 人

数 在 300 一 1 000 范围 内 ( 表 12-4) 。 在 其 它 生物 小刀 en

中 的 拷贝 数 低 一 些 。 例 如 ,酵母 中 每 种 组 蛋白 基 鸡 1

因 仅 为 2 拷贝 。 一 种 生物 的 组 蛋白 基因 拷贝 数 人

与 其 对 组 蛋白 mRNA 合成 速度 的 需求 是 相关 的 。

海胆 的 5 种 主要 组 蛋白 的 基因 是 在 一 个 7 kb 的 重复 单位 中 成 能 存在 的 (图 12-20)。 在 此
重复 单位 中 5 个 编码 区 与 5 个 不 转录 的 间隔 区 交 蔡 出 现 。 这 一 5 种 组 蛋白 基因 能 串联 重复 要
多 次 。 在 不 同 组 织 中 以 及 发 育 的 不 同时 期 表达 不 同 套 的 组 蛋白 基因 。 在 果 蝇 中 (图 12-20) 这 5
种 组 蛋 自 的 基因 也 是 成 能 在 一 起 并 串联 重复 , 据 认 为 ,这 种 安排 可 通过 一 套 组 蛋白 基因 的 同步

转录 而 灵敏 调控 组 蛋白 的 合成 。 然 而 在 某 些 脊 椎 动物 中 , 几 种 组 蛋白 的 基因 是 分 散 开 的 ,说 明 |
358

”为 了 协调 基因 的 表达 ,这 些 基 因 并 不 一 定 必 须 成 簇 。

jw ea vi 和

12-20 在 一 种 海胆 (Strozgyloceztzrotzs zzzzpxratxdy) 和 一 种
果 蝇 (Drosopjzlia zelazogaster) 中 组 蛋白 基因 敌 的 图 谱
箭头 表示 转录 的 方向 。

”组 蛋白 基因 的 表达 还 有 两 个 值得 注意 的 特点 :中 组 蛋白 基因 没有 内 含 子 。 在 兰 椎 动物 中 这
种 连续 的 基因 是 罕见 的 ; 包 组 蛋白 mRNA 没有 多 聚 A 尾巴 .没有 内 含 子 和 多 聚 人 尾巴 大 概 是
能 使 组 蛋白 mRNA 可 以 很 快 地 生成 ,并 且 很 快 地 转运 到 胞 液 中 。

五 .许多 主要 蛋白 质 是 由 单 拷贝 基因 编码 的

前 面 已 经 谈 到 核糖 体 RNA 和 组 蛋白 的 基因 是 重复 多 次 的 。 那 么 编码 大 量 产物 的 其 它 基
因 是 否 也 是 多 拷贝 的 ? Donald Brown 在 重组 DNA 技术 出 现 之 前 就 解答 了 此 问题 。 他 由 家 等
(Boxmozyz 到 omi) 中 分 离 出 丝 的 丝 心 蛋 白 (fibroin) mRNA 。 选 择 这 一 体系 进行 研究 是 因为 丝 心
蛋白 mRNA 分 子 具 有 结构 特点 而 易于 分 离 , 而 且 在 幼虫 发 育 的 特定 阶段 其 单一 类 型 的 巨细 胞
(giant cellD) 能 合成 非常 大 量 的 丝 心 蛋白 。 用 提纯 的 丝 心 蛋白 mRNA 与 基因 组 DNA 杂交 的 结
果 发 现 ,在 每 个 单 倍 体 基因 组 中 仅 有 一 个 丝 心 蛋白 的 基因 。

此 结果 对 真 核 生 物 基因 的 表达 具有 重要 意义 。 它 表明 即使 仅 有 一 拷贝 的 基因 即 可 合成 出
大 量 的 由 它 编 码 的 特定 蛋白 质 。 丝 心 蛋白 的 一 个 基因 是 合成 10: 个 mRNA 分 子 的 模板 ,这 些
mRNA 分 子 可 稳定 地 存在 几 天 。 每 个 mRNA 又 是 合成 10: 个 蛋白 质 的 模板 。 可 见 一 个 基因 即
足以 合成 出 10" 个 蛋白 质 分 子 。

人 外 是 许 许 多 多 编码 蛋白 质 的 基因 的 一 个 例子 ,即使 是 产量 很 大 的 蛋白 质 的 基因 也 是 一 个 。 例

1 核糖 体 RNA 和 组 蛋白 基因 的 多 拷贝 是 特殊 的 ,不 是 普遍 的 现象 . 丝 心 蛋白 的 基因 只 有 一

各 ,网 织 红细胞 中 含有 一 个 或 很 少 拷贝 的 血红 蛋白 亚 基 的 基因 . 同样 , 卵 清 蛋白 (ovalbumin) 是
卵 清 中 的 一 种 主要 蛋 自 质 , 它 的 含量 很 大 ,是 由 产 蛋 母 鸡 的 输卵管 合成 的 ,而 在 输卵管 中 每 个
单 倍 体 基因 组 中 仅 有 一 拷贝 卵 清 蛋白 基因 。

六 ,基因 扩 增

特定 的 一 套 基 因 的 选择 性 复制 过 程 称 为 基因 扩 增 (gene amplification) ,在 正常 情况 下 , 它
仅 发 生 在 某 些 生物 的 生命 过 程 中 的 特异 阶段 。
(一 ) 正 在 发 育 的 卵 母 细胞 中 rRNA 基因 扩 增 了
在 胚胎 发 生 的 早期 阶段 ,蛋白 质 合成 的 速度 非常 快 ,致使 某 些 生物 的 正常 基因 组 中 所 含
rRNA 基因 的 数量 不 能 满足 需要 。 在 这 些 生物 中 最 明显 的 有 某 些 屁 虫 . 鱼 类 和 两 栖 动物 ,在 它
359

们 的 正在 发 育 的 卵 母 细胞 (未 成 熟 的 卵细胞 ) 中 ,rRNA 基因 被 选择 性 地 复制 了 。 此 扩 增 过 程 的
一 个 最 令 人 惊异 的 例子 是 爪 蟾 的 卵 母 细胞 ,在 其 中 rRNA 的 基因 扩 增 至 约 为 爪 体 细胞 的
1 500 倍 , 即 产 生 了 约 2X10s 套 rRNA 基因 ,使 细胞 总 DNA 的 近 75% 为 TRNA 基因 。 扩 增 的
rRNA 基因 以 凸 出 在 染色 体 之 外 的 环 状 物 (extrachromosomal circle) 形 式 存在 ,每 个 环 状 物 含
有 一 或 两 个 转录 单位 ,它们 被 组 织 在 数 以 百 计 的 核 仁 之 中 。 因 此 ,在 成 熟 的 爪 蟾 卵 母 细胞 中 含
有 约 102 个 核糖 体 , 此 数 为 大 多 数 爪 蟾 细胞 中 的 200 000 倍 。

rRNA 基因 扩 增 的 机 制 是 怎样 的 ? 一 个 重要 的 线索 是 发 现 , 一 个 给 定 的 凸 出 在 染色 体外 的
核 仁 (Cextra-chromosomal nucleolus ) 中 的 所 有 不 转录 间隔 区 的 长 度 都 是 一 样 的 ,然而 我 们 已
经 谈 到 ,其 相应 染色 体 中 的 间隔 区 则 是 长 短 明 显 不 一 致 的 。 此 发 现 提 示 ,在 单个 核 仁 中 的 所 有
rRNA 基因 环 都 是 由 一 个 染色 体 基 因 传 下 来 的 .已 证 明基 因 的 扩 增 分 两 个 阶段 :第 一 阶段 是 低
水 平 的 扩 增 , 随后 是 第 二 阶段 的 大 量 扩 增 。 因 此 ,很 可 能 是 在 第 一 阶段 仅 有 很 少 几 个 染色 体 的
rRNA 基因 被 一 个 尚 不 清楚 的 机 制 复 制 了 ,并 且 新 生成 的 子 链 DNA 被 放出 来 形成 在 染色 体
之 外 的 环 。 然 后 在 第 二 阶段 这 些 环 被 大 量 地 复制 。

(二 ) 卵 壳 (Cechorion ) 基 因 的 扩 增

唯一 已 知 的 其 它 按 程序 扩 增 的 基因 是 果 蝇 卵巢 滤 泡 (follicle) 细 胞 中 编码 卵 壳 蛋白 类 的 基
因 。 在 卵 壳 生成 之 前 每 个 卵巢 滤 泡 细胞 的 整个 单 倍 体 基因 组 复制 16 倍 , 然 后 只 有 卵 壳 基 因 被
选择 性 复制 约 10 倍 。 有 意思 的 是 在 丝 蛾 (silk moth) 卵 母 细胞 中 的 卵 壳 基 因 不 发 生 扩 增 , 而 是
在 它 的 基因 组 中 有 多 拷贝 的 卵 壳 基 因 。

(三 ) 在 选择 压力 (selective ns

在 用 化 学 疗法 治疗 癌症 时 观察 到 一 个 普遍 的 现象 , 即 在 连续 投 给 对 细胞 有 杀伤 作用 的 药
物 时 ,开始 时 对 肿瘤 很 有 作用 ， win 抗 性 逐渐 增加 ,从 而 达到 使 药物 失去 治
疗 作 用 的 地 步 。 用 细胞 系 (cell line) 所 做 的 研究 表明 ,一 个 细胞 系 能 获得 这 种 药物 抗 性 的 机 制
之 一 是 它 过 量 地 产生 此 药物 的 靶 酶 (target enzyme)。 能 够 观察 到 这 种 过 程 的 一 个 例子 是 用 氢
甲 蝶 叭 (methotrexate) 处 理 培养 的 动物 细胞 。 氨 甲 蝶 叭 是 二 氧 叶 酸 的 类 似 物 , 因 而 它 是 三 氢 叶
酸 还 原 酶 (CDHFR ) 的 竞争 性 抑制 物 。 由 于 DHFR 是 脱氧 胸 苷 酸 合成 的 一 企 关键 酶 ;而 氨 甲 蝶
叭 能够 强烈 地 抑制 此 酶 的 活性 ,从 而 封 阻 了 脱氧 胸 苷 酸 的 合成 ,所 以 氨 甲 喉 叭 能 杀 死 快速 复制
的 细胞 (包括 瘤 细胞 ) ,是 一 种 治疗 许多 癌症 的 有 效 药 物 。 当 用 氨 甲 蝶 叭 处 理 培 养 的 动物 细胞 ，
而 氨 甲 唆 叭 的 剂量 缓慢 增高 时 , 可 得 到 存活 下 来 的 细胞 .在 最 后 存活 下 来 的 细胞 中 含有 高 达
1 000 找 贝 的 了 BFR 基因 ;从 而 能 够 产生 大 大 过 量 的 二 氢 叶 酸 还 原 酶 .

这 种 基因 扩 增 的 机 制 尚 不 清 楚 , 但 此 发 现 说 明了 基因 组 的 动态 本 质 .基因 的 扩 增 是 经 常 发

生 的 ,而 选择 压力 (用 氮 甲 喉 叭 处 理 ) 能 使 这 种 扩 增 保留 下 来 .由 于 对 二 气 叶 酸 还 原 酶 的 这 一 工
作 担 示 了 上 期 用 二 下 玖 全 全 和 于 信人 了 产 生 抗 药性 ， 因而 对 用 化 学 疗法 治疗
癌症 的 策略 也 是 有 用 的 。

这 种 基因 的 扩 增 是 遗传 不 稳定 的 。 当 细胞 在 没有 氨 甲 蝶 叭 的 条 件 下 进一步 生长 时 ,额外 的
DHFR 基因 便 会 逐渐 消失 掉 。

七 .割裂 基因 (Csplit gene)

在 真 核 生物 中 ,大 多 数 编码 蛋白 质 的 基因 是 不 连续 的 , 即 在 其 编码 氨基 酸 的 序列 之 间 揪 入
了 不 编码 的 序列 , 故 称 之 为 割裂 基因
360

(一 ) 割 裂 基因 的 发 现

在 细菌 中 ,多 肽 链 是 由 DNA 中 一 排 连续 的 密码 子 编码 的 。 在 许多 年 里 人 们 认为 高 等 生物
”的 基因 也 是 连续 的 。 这 个 概念 在 1977 年 被 出 卑 意料 地 打破 了 ,因为 有 几 个 实验 室 的 研究 者 发
”更 许 多 基因 是 不 连续 的 。 例 如 ,血红 蛋 共 这

白 8 链 基因 中 编码 氨基 酸 的 序列 之 人 拓 汪 各 衣 间 三

。 间 被 一 个 550 bp 长 的 非 编码 序列 和
本 区 菲 编 和 峰 蜀 办 隔 开 ER -|

240 120 500 550 250 bp

了 (图 12-21)。 这 样 ,8- 珠 蛋白 基因 被 总 省 到 汪

割裂 成 为 3 个 编码 序列 。 这 种 出

卑 意 料 的 结构 是 用 电镜 观察 mRNA 12-21 全 珠 生日 基因

DNA 与 含有 编码 它 的 基因 的 DNA 片段 的

对 bw _AF new 杂交 物 时 发 现 的 。 图 12-22 是 这 种 杂

| 交 的 模式 图 。 图 中 表明 DNA 的 双 链
被 取代 的 DNA 链 有 些 部 位 拆 开 了 ,使 得 其 中 的 一 条 与

mRNA 互补 的 链 和 mRNA 杂交 了 ;
间 插 序列 而 另 一 条 DNA 单 链 则 凸 出 成 环 。 如
果 基 因 是 连续 的 , 则 在 电镜 下 只 能 看
到 一 个 单 链 ( 较 细 ) 的 环 ( 图 12-22
A)。 如 果 基 因 中 含有 一 个 间 插 序列
〈 图 12-22 B) , 则 可 看 到 两 个 单 链 的 环

mRNA

被 取代 的 DNA 链

8 和 一 个 较 粗 的 双 链 DNA 的 环 ( 由 间
图 12-22 ”用 电镜 检测 间 插 序列 的 示意 图 揪 序 列 所 形成 )。 用 小 鼠 8- 珠 蛋白
mRNA 与 含有 8- 珠 蛋白 基因 的 DNA 片段 进行 杂交 ,在 电镜 下 观察 (图 从 略 ) 的 结果 ,清楚 地
表明 了 在 该 基因 中 有 两 个 间 插 序列 。
已 证 明 , 在 转录 时 这 些 不 编

和 码 的 间 揪 序列 是 和 编码 的 序列 一
”起 转录 的 ,从 而 产生 一 个 比 成 熟

mRNA 大 得 多 的 mRNA 前 体 (或
、 称 初始 转录 物 ), 然 后 经 过 一 个 剪
接 (splicing) 过 程 ,将 不 编码 的 序
列 去 掉 , 把 编码 的 序列 连 在 一 起 ，
成 为 成 熟 的 mRNA, 它 才 是 合成
蛋白 质 的 模板 .因此 ,把 割裂 基因

中 编码 的 序列 称 为 外 显 子 (exon， |
因为 它们 是 被 表达 的 区 段 ) ,而 把 图 12-23 ”一 个 割裂 基因 的 结构
非 翻 译 的 间 插 序列 叫做 内 含 子 将 含有 卵 清 蛋白 基因 的 DNA 与 卵 清 蛋白 mRNA 进行 杂交 。 基

(intron)。 或 者 说 内 含 子 是 在 形 。 因 的 8 个 外 显 子 CL 和 1 一 7) 与 mRNA 中 的 互补 区 段 杂交 在 一 起
成 成 熟 mRNA 分 子 时 被 剪接 掉 个 内 含 子 (A 一 G) 则 打 成 环 。
的 序列 。

361

现在 看 来 ,在 几乎 所 有 兰 椎 动物 的 基因 中 都 有 内 含 子 .在 真 核 微 生物 (如 酵母 7 的 基因 中 也
有 内 含 子 , 不 过 其 存在 的 频率 要 比 高 等 生物 低 得 多 .不 同 基 因 所 含 内 含 子 的 数目 以 及 内 含 子 的
大 小 是 很 不 相同 的 。 编 码 胶 原 蛋 白 (collagen) 长 多 肽 链 的 基因 含有 近 40 个 内 含 子 .而且 一 个 基
因 的 内 含 子 的 核 苷 酸 数 常常 比 编码 的 外 显 子 的 核 苷 酸 数 多 很 多 (图 12-23) ,这 个 事实 至 少 部
分 地 解释 了 为 什么 初始 转录 产生 的 RNA 很 大 .初始 产生 的 许多 RNA 很 大 的 现象 是 早 就 知道
的 ,但 长 期 以 来 不 明白 它们 为 什么 这 样 大 。
并 非 所 有 的 高 等 生物 的 基因 都 含有 内 含 子 。 在 已 经 分 析 过 的 基因 中 ,已 知 ( 也 仅仅 是 ) 编 码
组 蛋白 和 干扰 素 (interferons) 的 基因 是 不 含 内 含 子 的 。 不 过 我 们 可 以 用 重组 DNA 技术 制备 出
编码 任何 蛋白 质 的 不 含 内 含 子 的 基因 。 例 如 ,可 以 通过 对 某 一 mRNA 进行 反 转 录 而 获得 与 该
mRNA 互补 的 DNA(complementary DNA ,简称 cDNA)。 通 常 把 与 某 一 蛋白 质 mRNA 互补
的 DNA 称 为 该 蛋白 质 的 cDNA 基因 , 而 把 存在 于 基因 组 中 的 含有 内 含 子 的 基因 称 为 该 蛋白
质 的 基因 组 基因 ,以 示 区 别 。 含 有 内 含 子 的 真 核 基因 组 基因 只 能 在 真 核 细胞 中 进行 表达 ,不 能
在 原核 细胞 (例如 大 肠 杆菌 ) 中 表达 , 因为 原核 细胞 没有 将 内 含 子 剪接 掉 的 能 力 *cDNA 基因 则 ，
既 可 在 真 核 细胞 中 表达 (虽然 由 于 尚 不 清楚 的 原因 ,其 表达 效率 常常 比 基 因 组 基因 差 一 些 ) ,也
可 在 原核 细胞 中 表达 出 正确 的 多 肽 链 来 。
二) 内 含 子 的 意义
已 分 析 的 DNA 序列 的 数目 的 迅速 增多 , 揭示 出 在 原核 生物 的 结构 基因 中 内 含 子 是 罕见
的 ,在 低 等 真 核 生 物 如 酵母 中 内 含 子 不 很 普遍 ,而 在 高 等 真 核 生 物 中 则 大 量 存在 (在 状 椎 动物
的 结构 基因 中 仅 知 编码 组 蛋白 和 干扰 素 的 基因 没有 内 含 子 ) .在 大 多 数 割 裂 基因 中 外 显 子 的 长
度 均 在 100 一 250 bp 范围 内 。 与 之 相反 ,内 含 子 的 长 度 则 在 50 一 20 000bp 以 上 范围 内 。 而 且 在
一 个 基因 中 内 含 子 的 数目 可 以 多 得 惊人 ,迄今 已 知 的 内 含 子 数目 最 多 的 是 编码 鸡 21) 胶原
蛋白 的 基因 ,在 此 38 kb 的 基因 中 有 51 个 内 含 子 。 因此 ,在 一 个 典型 的 肴 椎 动物 的 结构 基因 中
不 表达 的 序列 约 占 80 儿 。
内 含 子 的 功能 是 什么 ? 认为 所 有 内 含 子 都 是 无 用 的 DNA 的 观点 看 来 是 站 不 住 脚 的 。 因 为
如 果 只 是 无 用 的 DNA 序列 , 则 很 难 解释 为 什么 由 于 内 含 子 的 存在 还 发 展 出 来 了 剪接 的 机 构
( 见 第 四 节 ) ,而 在 进化 中 发 展 出 剪接 的 机 构 并 不 比 简单 除 掉 内 含 子 有 任何 明显 的 优越 性 。 然
而 ,在 大 多 数 基因 中 内 含 子 又 确实 没有 什么 明显 的 功能 (尽管 内 含 子 可 以 保护 基因 家 族 中 基因
的 完整 性 , 见 后 ;以 及 在 某 些 基 因 的 转录 中 作为 调控 成 分 )。 而 且 事实 上 ,编码 某 一 蛋白 质 的 基
因 中 所 含 内 但 子 的 数目 在 不 同 生物 中 可 以 是 不 同 的 ,甚至 在 同一 个 体 中 也 可 以 不 同 。 例 如 ,大
卢 有 两 个 功能 的 胰岛 素 基因 ,其 中 之 一 有 两 个 内 含 子 , 这 和 大 多 数 嘻 元 类 动物 的 胰岛 素 基 因 是
一 样 的 ,而 在 另 二 个 基因 中 则 只 有 一 个 内 含 子 , 另 一 个 内 含 子 缺 失掉 了 .因此 有 人 认为 ;在 遗传
进化 的 一 个 早期 阶段 内 含 子 具 有 重要 的 功能 ,后 来 就 不 再 重要 了 ,就 是 说 内 含 子 可 能 是 遗传 的
残留 物 。
Walter Gilbert 提出 了 一 个 关于 内 含 子 作用 的 假说 .他 认为 编码 蛋白 质 的 基因 是 由 外 显 子
的 集成 产生 的 ,这 种 集成 过 程 是 通过 内 含 子 序列 之 间 的 重组 而 将 外 显 子 聚集 在 一 起 的 。 因 此 ，
现在 看 到 的 内 含 子 是 促使 蛋白 质 进 化 过 程 的 残迹 。 有 许多 实验 证 据 支 持 此 假说 ,举例 如 下 ，
(1) 鸡 xc2(1) 胶 原 蛋 白 的 三 股 螺旋 (triple helix) 区 是 由 332 个 重复 的 三 联 体 Gly-x-y(Gly
代表 甘氨酸 ,x 和 y 代表 其 它 不 固定 的 氨基 酸 ) 组 成 的 , 它 由 胶原 蛋白 基因 52 个 外 显 子 中 的 42
个 外 显 子 所 编码 。 这 42 个 外 显 子 的 碱 基 对 数 都 是 9 的 倍数 (其 中 有 23 个 外 显 子 的 长 度 为
362

绰 bp, 其余 的 为 45,99,108 或 162 bp 长 ) ,每 个 外 显 子 都 以 甘氨酸 的 密码 子 开 始 , 以 y 的 密码
子 告终 .这 种 分 布 提 示 ,编码 胶原 蛋白 三 股 螺旋 区 的 基因 片段 是 由 用 内 含 子 夹 起 来 的 基因 元 件
(genetic element) 经 多 次 加 倍 进化 而 成 的 。
《2) 根 据 鸡 肌肉 中 丙酮 酸 激酶 基因 的 碱 基 序列 分 析 此 酶 的 结构 发 现 ,此 基因 共有 10 个 外
显 子 ,每 个 外 显 子 都 编码 蛋白 质 二 级 结构 的 一 个 独立 成 分 ,大 多 数 内 含 子 都 标志 出 多 肽 链 形成
一 个 回 折 (reverse turn) 的 位 置 。 可 见 , 丙 酮 酸 激酶 的 基因 显然 是 通过 一 系列 较 小 的 编码 蛋白
质 的 单位 连接 在 一 起 形成 的 ,并 且 利用 RNA 的 剪接 把 它们 表达 成 为 一 条 多 肽 链 。
《3) 对 于 Gilbert 的 假说 最 有 说 服 力 的 证 据 是 对 低 密度 脂 蛋 白 (low density lipoprotein，

U LDL) 受 体 基因 序列 的 分 析 。 LDL 受 体 由 839 个 氨基 酸 残 基 组 成 ,是 整合 在 质 膜 上 的 一 种 蛋白

质 , 它 的 功能 是 结合 LDL ,并 通过 胞 知 作 用 (endocytosis) 将 LDL 转运 到 细胞 内 。LDL 受 体 的
基因 长 45 kb, 含 有 18 个 外 显 子 。 大 多 数 外 显 子 都 是 分 别 编码 蛋白 质 的 一 个 功能 结构 域 (ftunc-
tional domain ) 。 而 最 令 人 感 兴趣 的 事实 是 ,在 它 的 外 显 子 中 有 13 个 外 显 子 编码 的 多 肽 片段 与
其 它 蛋白 质 中 的 片段 是 同 源 的 (homologous)。 例 如 , 它 的 某 些 外 显 子 编码 的 多 肽 片段 在 补体
C9kcomplement C9) 中 也 存在 等 。 很 明显 ,LDL 受 体 的 基因 是 由 外 显 子 按 标准 构成 的 ,而 这 些
， 外 显 子 也 编码 其 它 蛋 白质 的 一 部 分 ,许多 其 它 真 核 蛋 白质 的 组 成 也 与 此 类 似 。

然而 由 此 提出 的 一 个 问题 是 ,如 果 Gilbert 的 假说 是 对 的 , 即 内 含 子 是 原初 基因 重新 组 合
过 程 的 残迹 的 话 , 那 么 为 什么 在 低 等 生物 中 没有 或 几乎 没有 内 含 子 呢 ?而 高 等 生物 是 由 这 些 低
等 生物 进化 而 来 的 呀 ? 例如 ,酵母 丙酮 酸 激 酶 的 氨基 酸 顺 序 与 鸡 的 同 源 性 为 45% ,但 酵母 丙酮
酸 激酶 的 基因 中 却 没有 内 含 子 。 看 来 对 此 问题 的 最 为 合理 的 解释 似乎 是 : 低 等 生物 的 生命 类 型
是 助长 效率 的 , 它 的 内 含 子 已 选择 性 地 缺失 掉 了 。 与 之 相反 ,高 等 生物 已 经 适应 了 稳定 的 环境 ，
使 它们 缺失 掉 内 含 子 的 选择 压力 已 经 大 大 减少 了 (尽管 如 前 所 述 , 大 鼠 胰 岛 素 基因 提供 了 一 个
明显 的 将 内 含 子 缺 失掉 的 例子 ) ,因而 存留 了 那样 多 的 内 含 子 。

内 含 子 除了 使 新 蛋白 质 的 进化 易于 发 生 外 ,在 基因 家 族 中 的 内 含 子 可 能 还 有 保护 作用 , 即
岂 保护 基因 家 族 中 相 邻 近 的 外 显 子 不 被 不 等 交换 (unequal crossing-over) 所 消除 。 双 份 的 基因 特

上 别 易 于 进行 这 种 形式 的 降解 ,因为 它们 的 碱 基 序列 相似 促进 了 它们 的 错 配 (mispairing)。 然 而 ，

由 于 这 些 外 显 子 与 可 变性 大 得 多 的 并 因而 不 易 错 配 的 内 含 子 交替 存在 的 结果 ,抑制 了 此 过 程 。
原核 生物 和 人 酵母 的 基因 家 族 很 少 , 因而 它们 不 太 需 要 这 种 保护 作用 。

八 ` 成 能 的 基因 家 族 :血红 蛋白 基因 的 结构

在 一 个 生物 个 体内 ,只 有 少数 蛋白 质 确实 是 独特 的 。 然 而 许多 蛋白 质 , 例 如 ,消化 酶 类 ( 胰
蛋白 酶 、 胰 凝 乳 蛋白 酶 和 酯 酶 ) 或 者 各 种 不 同 的 胶原 蛋白 等 ,它们 分 别 构 成 在 结构 和 功能 上 相
关联 的 蛋白 质 家 族 ,每 种 蛋白 质 都 是 某 一 家 族 的 成 员 。 我 们 把 编码 一 个 蛋白 质 家 族 (也 包括 在
结构 和 功能 上 相关 联 的 rRNA 和 tRNA 等 ) 的 若干 个 基因 称 为 一 个 基因 家 族 (gene family) 。
一 个 基因 家 族 的 成 员 彼 此 在 结构 和 功能 上 是 相似 的 ,但 也 包括 在 结构 上 相似 而 没有 功能 的 基
因 , 没 有 功能 的 基因 称 为 假 基因 。 一 个 基因 家 族 的 基因 常常 是 成 复 地 存在 于 一 个 染色 体 上 ,得
也 有 分 散 的 ,甚至 位 于 不 同 染 色 体 上 。

根据 基因 家 族 的 情况 目前 可 分 为 三 种 类 型 , 即 : 中 简单 多 基因 家 族 ;@) 复 杂 多 基因 家 族 ;
图 由 发 育 阶 段 控制 的 多 基因 家 族 ( 图 12-24)。5 S rRNA 基因 家 族 属于 简单 的 多 基因 家 族 , 其
中 的 基因 结构 是 相同 的 ,基因 与 基因 之 间 由 中 度 重 复 序 列 隔 开 。 复 杂 多 基因 家 族 的 各 个 成 员 并

363

不 都 是 相同 的 。 例 如 ,海胆 和 果 蝇 的 5 个 组 蛋白 基因 构成 为 一 个 复杂 的 多 基因 家 族 , 这 5 个 组
蛋白 的 基因 作为 一 个 单位 可 重复 多 达 近 千 次 ,每 个 基因 单独 地 按 一 定 方向 转录 。 又 如 果 蝇 的 ，
tRNA 基因 是 由 多 种 不 同 氨基 酸 的 tRNA 基因 集中 在 一 起 而 构成 复杂 的 多 基因 家 族 的 。

(a) 简单 的 多 基因 家 族

SSTRNRZE TRY
(b) 复杂 的 多 基因 家 族
人 加 四 瑟 项 划 交 .ie 本 2 人
ec
重复 单位
| 2B HI
人 - 本 1
重复 单位
L A A Asn
一 < 一 生生 可 本 本 忆 拯 基 生 0 0 人

(c) 由 发 育 阶段 控制 的 多 基因 家 族
所

胚 腑 的

6- 珠 蛋白 "”

一 一 一 一 一 一 吃

12-24 基因 家 族 的 几 种 类 型

人 类 珠 蛋 白 基 因 家 族 是 典型 的 由 发 育 阶 段 控制 的 多 基因 家 族 。 关 于 rRNA,tRNA 和 组 蛋
白 基 因 的 结构 前 面 已 经 讨论 了 。 下 面 介绍 人 类 珠 蛋 白 基 因 的 结构 。

(一 ) 人 类 血红 蛋白 的 基因 是 按 发 育 的 次 序 安排 在 两 个 簇 中

血红 蛋白 的 研究 使 我 们 获得 了 许多 关于 蛋白 质 的 结构 和 功能 的 知识 。 同 样 ,研究 血红 蛋白
基因 及 其 表达 方式 ,曾经 是 洞察 一 般 真 核 基因 功能 的 来 源 。 例 如 ,研究 8- 珠 蛋白 mRNA 与 8-

珠 蛋 白 基因 的 杂交 导致 发 现 了 真 核 基 因 是 用 内 含 表 12-5 人 类 血红 蛋白 的 亚 基
子 断 开 的 .而 且 , 编 码 人 类 血红 蛋白 两 类 亚 基 的 基 胚胎 的 血红 蛋白

因 家 族 是 迄今 鉴定 得 最 清楚 的 两 个 成 能 的 基因 家 二 二
族 。 Hb Portland 5

成 年 人 的 血红 蛋白 主要 是 血红 蛋白 A 人

CHbA), 约 占 总 血红 蛋白 的 97%, 它 是 由 两 条 “ 成 年 的 血红 蛋 它
链 和 两 条 8 链 组 成 的 四 聚 体 (%zp:) 。 占 总 血红 蛋 二 人 人
白 2%% 的 是 血红 蛋白 AzGHbA:), 它 由 2 条“ 链 和 和 2
2 条 9 链 所 组 成 ,所 以 HbAs: 的 组 成 为 6:( 表 12-5)。 另 外 还 有 约 1 兴 的 HbF 。 然而 ,在 人 类 胚
胎 中 最 初生 成 的 血红 蛋白 是 个 gzez 四 聚 体 ( 称 为 Hb Gower 1) ,其 中 5 和 * 分 别 为 洲 样 和 尼 样
亚 基 。 在 怀孕 后 8 周 左右 ,胚胎 的 血红 蛋白 亚 基 (在 新 生成 的 红细胞 中 ) 被 v 亚 基 和 有 样 的 7 亚
基 所 取代 ,从 而 生成 胎儿 的 血红 蛋白 (HbF) ,ozy:( 在 此 转变 期 间 存 在 有 ce, 和 呈 7 型 血红 蛋
白 ,它们 被 分 别 命名 为 Hb Gower 2 和 Hb Portland)。 由 出 生 几 周 前 开始 ,7 亚 基 逐 渐 为 8 亚 基
所 取代 ,最 后 形成 成 年 的 血红 蛋白 。 血 红 和 蛋白 各 种 亚 基 在 胚胎 中 的 变化 见 图 12-25。 |

364

a27Y2

在 哺乳 动物 中 ,编码 血红 蛋白 的 - 样 和 P- 样 亚 基
的 基因 分 别 形成 两 个 不 同 的 基因 艇 ,并 存在 于 不 同 的
染色 体 上 。 这 种 分 布 主要 是 通过 血红 蛋白 基因 的 克隆
和 进行 序列 分 析 确定 的 。 这 些 基 因 是 用 Southern 印迹
法 (Southern blotting ) 由 基因 组 文库 中 筛选 出 来 的 。
在 筛选 过 程 中 所 用 的 探 针 是 由 血红 蛋白 mRNA 制 成
的 , 由 于 在 网 织 红细胞 中 的 mRNA 主要 是 血红 蛋白
mRNA, 因 而 易于 将 它 分 离 出 来 。 在 人 类 以 及 许多 其
它 哺乳 动物 中 ,这 两 个 科 的 基因 都 是 按 其 在 发 育 过 程
中 的 表达 次 序 由 5 ->3' 排 列 在 编码 链 上 (图 12-26), 即
在 “ 簇 中 ,胚胎 的 《 链 基因 在 两 个 < 链 (x2 和 el) 基因
的 前 面 ,2 和 al 分 别 是 胎儿 和 成 年 血红 蛋白 的 成 分 ;
在 8 簇 中 ,胚胎 的 e 链 的 基因 在 最 前 面 ,然后 是 胎儿 的
两 个 y 链 的 基因 ,最 后 是 成 年 的 9$ 和 链 基 因 。 由 此 可 12-25 “在 人 类 发 育 过 程 中 血红
见 , 人 类 珠 蛋白 基因 的 顺序 是 与 它们 在 发 育 过 程 中 的 蛋白 基因 的 表达
表达 次 序 相 吻 合 的 .这 种 次 序 在 哺乳 动物 中 是 普遍 的 ， 和
， 但 也 并 非 都 是 这 样 。 例 如 ,在 小 鼠 的 8 基因 簇 中 ,成 年 的 基因 在 胚胎 基因 的 前 面 。

总 珠 蛋 白 链 的 百分数

12-26 ”人 类 珠 蛋 白 基 因 在 它们 各 自 的 编码 链 上 的 安排

在 c 和 有 基因 徐 中 都 有 假 基 因 。 这 些 序列 与 其 吡 邻 的 基因 是 同 源 的 ,但 它们 不 编码 功能 的
产物 。 前 级 Y 指 明 是 一 个 假 基因 ,例如 yael, 则 表明 它 是 与 el 基因 相 类 似 的 假 基因 。 这 种 假 基
困 的 几 种 结构 特点 使 得 它们 不 活动 :(1) 缺 乏 剪接 的 5 共有 序列 ( 见 第 四 节 ); (2) 多 聚 A 化 信

号 由 AATAAA 突变 为 AATGAA; (3) 正 常 的 起 始 密码 子 ATG 为 GTG 所 取代 ;(4) 由 第 38

号 氨基 酸 的 密码 子 开始 缺失 了 20 个 核 苷 酸 ,从 而 产生 了 3 个 终止 密码 子 ,阻止 了 多 肽 链 的 完

整合 成 。 为 什么 会 有 假 基因 ? 它们 中 的 大 多 数 是 基因 的 残 遗物 ,是 在 基因 进行 重复 时 其 序列 有

所 漂移 而 产生 的 , 并且 变 成 了 不 活动 的 基因 。 由 此 我 们 可 以 看 到 , 真 核 基 因 组 既 有 其 强 有 力 的
一 面 , 也 有 被 摧毁 的 一 面 。

(二 ) 所 有 血红 蛋白 基因 都 有 相同 的 外 显 子 -内 含 子 结构

无 论 在 c 珠 蛋 白 基 因 灸 或 8 珠 蛋白 基因 往 中 ,编码 蛋白 质 的 序列 都 不 到 其 全 长 的 5% 。 造

”成 这 种 情况 的 原因 ,主要 是 由 于 在 每 个 复 中 都 存在 有 不 同 的 把 基因 分 开 的 间隔 区 的 结果 。 此

外 ,所 有 已 知 的 肴 椎 动物 (哺乳 类 、 疏 虫 类 、 禽 类 、 两 栖 类 和 多 骨 鱼 ) 的 珠 蛋 白 基 因 , 包 括 肌 红 蛋

白 的 基因 和 血红 蛋白 的 假 基因 ,都 有 3 个 位 置 相似 的 编码 序列 (外 显 子 ) ,它们 被 两 个 稍 有 不 同

的 不 表达 的 间 插 序列 (内 含 子 , 图 12-27) 分 隔 开 。 这 种 基因 结构 显然 是 在 冰 椎 动物 发 展 史 的 很

365

早期 即 已 形成 。 而 这 些 基因 的 DNA 序列 之 间 的 差异 提示 它们 是 由 一 个 祖先 的 血红 蛋白 的 基
因 经 过 重复 (duplication) 和 趋 异 (divergence) 而 产生 了 “ 和 珠 蛋 白 基 因 。 由 一 种 原始 的 脊椎 量
动物 的 单一 类 型 血红 蛋白 亚 基 变 为 和 8 两 种 类 型 的 亚 基 大致 发 生 在 5 亿 年 前 , 即 在 兰 椎 动
物 进 化 的 早期 。 由 于 肌 红 蛋白 与 血红 蛋白 的 c 和 亚 基 的 差异 比 血红 蛋白 的 < 和 有 亚 基 之 间
的 差别 还 大 ,所 以 肌 红 蛋白 与 血红 蛋白 的 趋 异 应 在 < 和 有 基因 分 开 之 前 .在 和 基因 分 开 之
后 ,它们 再 经 过 重复 和 多 样 化 ,从 而 产生 了 当前 人 类 所 具有 的 " 和 两 个 基因 系列 。

图 12-27 ”典型 血红 蛋白 基因 的 结构
指明 了 外 显 子 - 内 含 子 边界 处 的 保守 序列 (剪接 序列 ) 和 基因 3'- 末 端的 保守 序列 (多 聚 A 化 位 点 ) 。
给 出 了 每 个 外 显 子 的 长 度 ( 以 密码 子 数 表示 ) 和 每 个 内 含 子 的 长 度 (以 碱 基 对 数 表 示 交

九 、 根 据 DNA 的 多 态 性 可 建立 家 谱 (genealogies )
不 表达 的 序列 几乎 不 受 选 择 压力 ,因而 它们 的 演化 比 表 达 的 序列 快 很 多 ,以 至 于 在 一 个 品

种 内 能 够 积累 出 显著 数目 的 序列 多 态 性 Cpoly-
morphism ) (变异 )。 因 此 ,测定 一 系列 的 多 态 性
DNA 序列 在 一 个 品种 内 的 不 同 群体 中 分 布 的 情
况 , 可 以 确定 这 些 群 体 在 进化 中 的 亲缘 关系 。 例
如 ,通过 人 类 不 同 群体 的 8 珠 蛋 白 基 因 簇 的 5 个
片段 中 有 或 无 某 一 限制 性 酶 的 酶 切 位 点 , 即 限制
性 酶 切 位 点 长 度 多 态 性 (RFLPs, 见 第 十 四 章 ) 技
术 , 已 推断 出 一 些 不 同 的 人 类 群体 的 家 谱 。 通 过 此
研究 已 建立 起 一 个 “家 系 树 "(family tree, 图 12-
28) , 它 指 明 , 欧 亚 人 群体 彼此 之 间 的 亲缘 关系 比
他 们 与 非洲 人 之 间 的 关系 近 很 多 。 化 石 的 证 据 指
明 , 现 代 人 大 约 在 10 万 年 前 起 源 于 非洲 ,并 很 快
地 遍及 全 世界 。 因 此 , 这 个 家 系 树 提示 ,所 有 的 欧

共有 剪接 序列

C G
AAGGTAAGT

3 末端
裂解 信号

于
(C) NAGG AATAAA poly (A)

英国 人
意大利 人
塞浦路斯 人
印度 人

美 拉 尼 西 亚 人
波利尼西亚 人
泰国 人
非洲 人

图 12-28 8 个 人 类 群体 间 血 统 关系 的 家 族 树

这 是 由 他 们 的 P- 珠 蛋白 基因 簇 中 5 个 限制 性
位 点 多 态 性 的 分 布 测定 出 来 的 。 横 坐标 指示 相关
群体 间 的 遗传 距离 。

亚 人 群 都 是 由 一 个 惊人 之 小 的 人 群 (可 能 仅 有 几 百 人 ) 遗 传 下 来 的 ,这 个 小 的 人 群 大 约 在 5 万

年 前 离开 非洲 来 到 欧 亚 大 陆 。

366

十 .哺乳 动物 基因 组 只 有 一 小 部 分 编码 蛋白 质

于 从 前 面 的 讨论 我 们 可 以 把 真 核 DNA 分 为 几 类 ( 表 12-6), 而 编码 蛋白 质 的 仅 为 其 中 的 一
示 部 分 。 以 哺乳 动物 的 功能 的 珠 蛋白 基因 为 例 来 说 ,c 复 和

及 饮 彼 此 相距 很 远 。e 秘 长 35 kb ,8 簇 长 60 kb ,平均 起 来 每

不 基因 约 为 12 Kb. 然而 编码 一 个 约 150 氨基 酸 残 基 的 珠 蛋 |

自 需要 DNA 的 量 仅 为 0. 45 kb。 可 见 ,这 些 伐 中 编码 蛋白 协和 问

质 的 DNA 不 到 其 全 长 的 4%。 而 且 , 珠 蛋白 基因 和 离 它 最 编码 RNA 的 基因

近 的 编码 蛋白 质 的 DNA 也 相距 很 远 。 因 此 ,可 能 哺乳 动物 生 和 和

的 DNA 只 有 2%% 是 真正 编码 蛋白 质 的 。 可 见 哺乳 动物 。 重复 DNA

DNA 显然 与 细菌 DNA 不 同 : 细 菌 DNA 是 非常 紧凑 的 ,大 简单 序列 DNA

量 的 应 用 于 编码 蛋白 质 。 人 类 基因 组 约 为 大 肠 杆菌 基因 组 全 全 六 让 中 )

的 1000 倍 , 但 它 的 基因 数 看 来 只 有 大 肠 杆菌 的 50 倍 , 而 《包括 可 移动 的 遗传 成 分 )

不 是 1 000 倍 。 真 核 生 物 的 种 类 很 多 ,它们 的 基因 组 结构 彼 功能 不 清楚 的 间隔 DNA

此 差异 也 很 大 ,但 可 以 肯定 它们 的 基因 数 不 是 与 基因 组 的

天 示 成 比例 的 。 当 前 分 子 生 物 学 的 一 个 很 大 的 挑战 是 阐明 那些 大 量 的 不 编码 蛋白 质 和 RNA
的 DNA 的 功能 。

表 12-6 真 核 DNA 的 分 类

第 三 节 ”细胞 器 中 的 基因 组

一 ` 细 胞 器 基因 组 的 发 现

在 真 核 细 胞 中 ,并 非 所 有 的 遗传 信息 都 是 由 其 核 中 染色 质 DNA 编码 的 。 对 酵母 的 遗传 研
究 发 现 了 在 线粒体 中 有 与 核 基 因 组 不 同 的 基因 组 。1949 年 ,Boris Ephrussi 发 现 ,有 些 面包 酵
本 的 突变 体 是 不 能 进行 氧化 磷酸 化 的 ,这 些 呼吸 缺陷 型 突变 体能 够 依靠 酵 解 缓慢 生长 .由 于 它
们 形成 的 菌落 很 小 ,所 以 称 之 为 小 菌落 (petites)。 遗 传 分 析 惊 异地 发 现 , 使 小 菌落 突变 分 离
(segregate) 的 基因 独立 于 核 基因 ,提示 线粒体 有 其 自己 的 基因 组 。 几 年 后 ,发 现 了 线粒体 含有
DNA. 而 且 一 个 小 菌落 株 的 线粒体 DNA 的 浮力 密度 (buoyant density ) 与 野生 型 酵母 的 不 同 ，
班 此 突变 体 中 其 线粒体 基因 组 缺失 了 很 多 。 随 后 发 现 光合 真 核 生物 的 叶绿体 中 也 含有 DNA。
弘 粒 体 和 叶绿体 中 的 DNA 都 进行 复制 转录 和 翻译 。
事实 上 , 早 在 本 世纪 初 即 在 植物 中 已 经 观察 到 非 孟 德尔 遗传 (non-Mendelian inheritance)
现象 ,这 是 表明 核 外 有 基因 组 的 最 早 证 据 。 与 之 有 关 的 体 细胞 分 离 \somatic segregation ) 现 象 ，
同样 指明 有 核 外 基因 组 的 存在 .这 是 因为 在 非 孟 德尔 遗传 中 , 交配 的 后 代 不 表现 双亲 特性 的 孟
德尔 分 离 (Mendelian segregation) ,反映 出 其 分 离 特性 与 减 数 分 裂 之 间 没 有 联系 。 而 在 植物 中
发 现 的 体 细 胞 分 离 现 象 表现 为 一 个 植株 的 某 些 组 织 表现 出 双亲 之 一 的 表 型 ,而 另 些 组 织 则 表
现 出 男 一 个 亲本 的 表 型 ,说明 这 种 分 离 特性 与 有 丝 分 裂 无 关 。 因 此 ,如 果 没 有 核 外 基因 组 , 则 不
可 能 发 生 这 两 种 现象 。 而 在 发 现 线粒体 和 叶绿体 中 有 DNA 后 ,这 些 现象 就 易于 理解 了 。
非 孟 德尔 遗传 的 极端 情况 是 单亲 遗传 (uniparental inheritance), 此 时 只 有 双亲 之 三 的 基
因 型 被 遗传 ,而 另 一 个 亲本 的 基因 型 则 持久 地 丢失 了 。 非 极端 的 情况 是 一 个 亲本 的 基因 型 超过
367

了 另 一 个 亲本 的 基因 型 .通常 的 情况 是 母 本 的 基因 型 被 优先 (或 单独 ) 遗 传 ,这 种 现象 有 时 称 为 国
母体 遗传 (maternal inheritance) 。 重要 的 是 双亲 之 一 对 基因 型 的 贡献 占 优势 。 这 种 对 双亲 基因
型 的 偏 傈 (bias) 是 在 合子 形成 时 或 稍 后 建立 起 来 的 ,有 多 种 可 能 的 原因 。 一 种 可 能 是 双亲 的 信
息 贡 献 给 合子 细胞 器 的 不 相等 ,在 最 极端 的 情况 下 是 只 有 双亲 之 一 做 贡献 ; 另 一 种 可 能 是 双亲
的 贡献 是 相等 的 ,但 双亲 之 一 提供 的 信息 未 能 存活 下 去 ;再 一 种 可 能 是 上 述 两 种 情况 同时 都 存
在 。 总 之 ,不 论 是 何 种 原因 引起 的 ,这 种 双亲 信息 的 不 等 量 表现 度 (representation) 是 由 细胞 器
遗传 物质 引起 的 , 它 与 核 遗 传 信息 的 情况 相反 , 核 遗传 信息 是 由 双亲 等 量 获 得 的 。

能 够 说 明 此 问题 的 一 个 例子 是 在 高 等 动物 中 发 现 的 一 种 母性 遗传 。 在 受精 时 合子 的 线 粒
体 完全 是 由 卵子 提供 的 ,而 精子 则 一 点 也 不 提供 .这 样 ,线粒体 的 基因 完全 是 由 母亲 得 到 的 ,而
且 每 一 代 都 将 雄性 的 线粒体 基因 丢弃 了 。 另 一 个 引起 单亲 遗传 的 例子 是 在 水 藻 Chary-
domzoxzas 7eizjazaiz 中 发 现 的 。 它 的 大 小 相同 的 配子 (gamete) 融 合 形成 合子 , 这样 双 亲 的 叶 绿
体 DNA 都 提供 给 了 合子 。 但 在 合子 形成 之 后 不 久 , 双 亲 之 一 提供 的 叶绿体 DNA 降解 了 ,因而
在 叶绿体 中 只 剩 下 了 另 一 个 亲本 的 DNA。 由 于 这 种 选择 性 机 制 的 存在 ,因而 不 可 能 预料 双亲
之 一 的 基因 型 占 优势 的 原因 。 因 为 即使 在 双亲 提供 给 合子 的 细胞 浆 量 不 同 的 情况 下 ,此 时 可 能
一 个 亲本 提供 的 细胞 器 拷贝 数 比 另 一 亲本 的 多 ,但 选择 性 的 机 制 仍 可 改变 这 种 情况 。

在 双亲 的 细胞 器 基因 组 都 存活 的 植物 中 ,在 躯体 的 生长 过 程 中 其 野生 型 基因 型 和 突变 型
基因 型 发 生 分 离 ,其 结果 在 一 个 杂种 的 (heterozygous ) 植 株 中 , 一 些 组 织 有 双亲 之 二 的 表 型 ;
另 一 些 组 织 则 表现 为 另 一 亲本 的 表 型 ,此 即 为 体 细胞 分 离 . 这 是 与 孟 德 尔 遗传 学 确定 的 整个 核
的 基因 型 的 稳定 性 相反 的 。 体 细胞 分 离 发 生 的 原因 是 因为 合子 中 的 细胞 器 基因 是 多 拷贝 的 ,在
体 细胞 分 裂 时 它们 被 分 配 到 不 同 的 细胞 中 ,有 的 细胞 分 配 到 一 种 基因 型 ,而 另 些 细胞 分 配 到 另
一 种 基因 型 的 结果 。

二 、` 细 胞 器 基因 组 的 一 般 性 质

迄今 已 鉴定 的 细胞 器 基因 组 大 多 数 是 以 环 状 双 链 DNA 分 子 的 形式 存在 。 线 粒 体 DNA 以
mtDNA 表示 之 ,叶绿体 DNA 的 代号 为 cDNA .。 极 少数 线粒体 DNA 为 线 型 分 子 , 这 通常 是 在
低 等 真 核 生物 中 。 在 每 个 细胞 器 中 一 般 有 数 拷贝 的 基因 组 ,而 每 个 细胞 中 又 有 多 个 细胞 器 ,所 “
以 ,在 每 个 细胞 中 有 很 多 个 细胞 器 基因 组 .因此 ,虽然 细胞 器 基因 组 本 身 是 单一 序列 的 , 它 不 自
我 重复 ,但 以 一 个 细胞 为 单位 来 说 ,和 核 中 的 任何 非 重 复 序列 相 比 , 它 都 算是 由 重复 序列 组 成
的 。

叶绿体 基因 组 比较 大 。 高 等 植物 的 通常 为 140 kb 左右 , 低 等 真 核 生 物 的 小 于 200 kb . 此 大
小 相当 于 一 个 大 的 噬菌体 基因 组 ,例如 T4 的 约 为 165 kb 。 在 高 等 植物 中 ,每 个 叶绿体 中 通常
有 20 一 40 拷贝 的 基因 组 ,每 个 细胞 中 有 20 一 40 个 叶绿体 。 -

不 同 生物 线粒体 基因 组 的 大 小 差别 很 大 。 动 物 细胞 的 线粒体 基因 组 比较 小 ,人 、 小 鼠 和 奶
牛 的 由 于 很 小 ,已 经 做 了 全 序列 分 析 , 都 是 16. 5 kb 左右 。 每 个 细胞 中 有 几 百 个 线粒体 ,每 不 绕
粒 体 中 又 有 多 拷贝 的 DNA。 果 蜗 和 蛙 的 线粒体 稍 大 一 些 , 但 尚 不 清楚 它们 的 每 个 细胞 中 宫 有 有
多 少 个 线粒体 和 每 个 线粒体 中 含有 几 拷 贝 的 基因 组 。 动 物 线粒体 DNA 的 总 量 比 核 少 ,不 到 核
DNA 的 1%。

酵母 线粒体 的 基因 组 则 大 得 多 。 在 $. cerevisiae 中 ,不 同 株 系 的 大 小 差别 很 大 ,但 二 般 为
84 kb 左右 。 每 个 细胞 约 含 22 个 线粒体 ,每 个 线粒体 约 含 4 个 基因 组 。
368

不 同 植物 线粒体 DNA 的 大 小 差别 很 大 ,但 最 小 的 约 为 100 kb。 很 多 DNA 的 功能 尚未 确
定 , 但 看 来 大 部 分 是 非 编 码 的 。 由 于 其 基因 组 很 大 ,因而 难以 分 离 到 完整 的 DNA.。 但 对 一 些 植
物 进行 的 限制 性 酶 切 图 谱 分 析 提 示 , 它们 都 是 单一 序列 的 环 状 DNA。 在 此 环 状 DNA 中 有 些
短 的 同 源 序 列 ,在 这 些 成 分 之 间 进 行 重组 (recombination ) 的 结果 产生 一 些小 的 亚 基 因 组 的
Csubgenomic ) 环 状 分 子 , 它 们 与 完整 的 主 (master) 基 因 组 共同 存在 ,说 明了 植物 线粒体 DNA

的 复杂 性 。

细胞 器 DNA 就 在 该 细胞 器 中 进行 复制 转录 和 翻译 (与 核 中 不 同 , 核 DNA 是 在 核 中 转
录 , 但 到 胞 浆 中 进行 翻译 ), 所 以 细胞 器 中 有 自己 的 核糖 体 和 tRNA.。 细胞 器 基因 组 编码 其 所 需
要 的 全 部 rRNA 和 tRNA.。. 由 于 核酸 不 能 穿 过 细胞 器 膜 , 所 以 细胞 吉 内 的 各 种 RNA 都 是 自己
合成 的 。 然 而 转录 和 翻译 所 需要 的 大 部 或 全 部 蛋白 质 则 是 来 自 胞 浆 ,这 些 蛋 白质 是 由 核 基因 编

。 码 的 。 表 12-7 中 示 出 了 在 线粒体 中 基因 表达 所 需 各 种 成 分 的 来 源 。 由 表 中 可 见 , 线 粒 体 核糖 体

是 由 一 个 大 亚 基 和 一 个 小 亚 基 组 成 的 ,每 个 亚 基 含 有 一 个 rRNA, 它 们 是 由 线粒体 DNA 编码

”的 ,而 核糖 体 的 蛋白 质 成 分 则 是 由 胞 浆 输入 的 。 然 而 不 同 生 物 的 核糖 体 结构 差别 很 大 。 线粒体

OO

所 需 一 套 tRNA 的 数目 比 胞 浆 中 的 少 。 例 如 ,人 类 胞 浆 中 用 61 种 tRNA ,而 线粒体 中 仅 用 22
种 ,有 些 线粒体 tRNA 阅读 4 种 密码 子 .虽然 线粒体 的 蛋白 质 合 成 装置 的 所 有 和 蛋白 质 成 分 都 是
由 核 基因 编码 的 ,但 这 些 蛋 白质 成 分 是 线粒体 独 有 的 , 与 胞 浆 中 的 并 不 相同 。 因 而 细胞 器 中 的
蛋白 质 合 成 有 与 胞 浆 中 不 同 的 特征 。

表 12-7 ”线粒体 中 基因 表达 所 需 成 分 的 来 源

成 分 在 线粒体 中 合成 的 在 胞 浆 中 合成 的
模板 一 10mRNAs RNA 聚合 酶
核糖 体 2rRNAs 一 75 蛋白 质
衔接 子 22tRNAs 22AA-tRNA 合成 酶

线粒体 和 叶绿体 都 是 与 能 量 转 换 有 关 的 细胞 器 , 因而 它们 的 基因 组 除了 编码 rRNA 和
tRNA 外 , 主要 编码 它们 所 需要 的 与 能 量 转 换 有 关 的 蛋白 质 。 这 些 基因 只 在 细胞 器 中 转录 和 翻
译 ,并 且 细胞 器 只 表达 它 自 己 的 基因 .然而 ,细胞 器 只 产生 它 所 需要 的 蛋白 质 的 一 部 分 ; 另 一 部

” 分 则 来 自 胞 浆 , 是 由 核 基 因 编 码 的 。 细胞 器 用 这 两 部 分 蛋白 质 构建 成 能 量 转换 体系 。 以 酵母 线

粒 体 为 例 , 它 的 呼吸 链 成 分 的 来 源 列 于 表 12-8。 由 表 中 可 见 , 酵 母 呼吸 链 中 的 几 个 蛋 白 复合 体
的 成 分 只 有 一 小 部 分 是 线粒体 自己 合成 的 ,其 余 大 部 分 由 胞 浆 中 运 人 ,然后 共同 组 装 成 复合
体 。 例如 ,ATP 酶 由 两 个 单位 组 成 :一 个 是 由 3 个 亚 基 组 成 的 膜 因子 ,这 3 个 亚 基 是 由 线粒体
基因 组 编码 的 ; 另 一 个 是 FI1ATP 酶 , 它 的 5 个 亚 基 则 是 在 胞 浆 中 合成 的 .细胞 色素 < 氧化 酶 的
亚 基 也 是 来 自 两 个 方面 :而 细胞 色素 bcl 复合 体 只 有 一 个 亚 基 是 由 线粒体 合成 的 ,其 它 6 个 亚
基 都 是 来 自 胞 浆 。

表 12-8 ”酵母 线粒体 呼吸 链 中 蛋白 复合 体 的 成 分 来 源

蛋白 复合 体 分 子 量 (kD) 线粒体 中 合成 的 亚 基 胞 浆 中 合成 的 亚 基
喜 霸 素 敏 感 ATP 酶 340 ATP 酶 6,8,9(F0 膜 因 子 ) ATP 酶 1,2,3,4,7(F1ATP 酶 )
细胞 色素 c 氧化 酶 137 CO 1,253 CO 4,556 ,7

细胞 色素 bcl 复合 体 160 细胞 色素 b 脱 辅 蛋白 质 6 亚 基
369

细胞 器 中 的 条 件 与 核 中 的 不 同 ,因而 细胞 器 的 DNA 以 其 特有 的 速度 进化 。 如 果 遗 传 是 单
亲 的 , 则 没有 双亲 基因 组 间 的 重组 。 并 且 即 使 细胞 器 基因 组 是 由 双亲 遗传 下 来 的 ,通常 也 不 发
生 重 组 。 由 于 复制 细胞 器 DNA 的 DNA 聚合 酶 与 核 中 的 不 同 ,因而 在 复制 中 的 错误 率 也 就 不
同 。 再 者 ,细胞 器 的 DNA 修复 体系 以 及 其 它 影响 序列 忠实 性 (fiaelity) 的 机 制 也 与 核 中 的 不
同 。 由 于 这 些 原因 ,已 知 哺乳 动物 线粒体 DNA 聚 累 突变 的 速度 比 核 中 快 。 而 在 植物 中 其 线 粒
体 聚 累 突 变 的 速度 比 核 中 慢 ,叶绿体 的 速度 则 在 线粒体 与 核 的 速度 之 间 。

母性 遗传 的 后 果 之 一 是 线粒体 DNA 序列 对 育种 群 (breeding population ) 规 模 的 降低 比
核 DNA 更 敏感 。 这 意味 着 分 析 线粒体 DNA 序列 间 的 差异 比分 析 核 DNA 的 差异 更 易于 区 分
个 体 。 因 此 ,在 育种 中 为 了 用 遗传 标志 (例如 ,用 限制 性 片段 长 度 多 态 性 技术 ) 区 分 群体 时 , 当前
大 家 更 趋向 于 分 析 线粒体 DNA ,而 不 是 核 DNA。

由 于 不 同 生 物 的 细胞 器 基因 组 差别 很 大 ,目前 对 大 多 数 生物 的 细胞 器 基因 组 尚 不 清楚 ,下
面 仅 举 几 个 比较 清楚 的 例子 ,以 便 对 细胞 器 基因 组 有 些 具体 的 概念 。

三 酵母 线粒体 基因 组

面包 酵母 (S. cereisiae) 的 线粒体 基因 组 约 为 84 kb ,哺乳 动物 的 约 为 16 kb ,酵母 线粒体
基因 组 的 大 小 约 为 哺乳 动物 的 5 倍 .这 一 巨大 差异 本 身 提醒 我 们 ,虽然 酵母 线粒体 的 功能 与 哺
乳 动物 的 一 样 ,但 它们 的 基因 组 构 (gene organization) 必 定 有 大 的 差异 。 从 与 线粒体 功能 有 关
的 酶 来 说 ,在 酵母 线粒体 内 合成 的 数目 与 哺乳 动物 是 相似 的 ,那么 酵母 线粒体 中 额外 的 遗传 物
质 的 功能 究竟 是 什么 ?

213 rRNA

忆

细胞 色素 b box 84 000bp

下 NA por

AR 1
ATP ,人 | 和 |

本 外 8 子 ，

区 ] 内 合子 ATP 酶 8 卫 - 和 15S 末 NA

of ] 和 志和 全 生生 和 ATP 酶 习

ox 驮 总 细 由 台 末 < 所 化 了 (CO) COl
box ”编码 细胞 色素 b

功能 未 知
~vor “小 核糖 体 亚 基 蛋 白质

12-29 面包 酵母 的 线粒体 基因 组
tRNA 的 基因 未 列 出 ,箭头 指明 转录 的 方向 。

人

和 碱 基 对 都 属于 一 个 基因 。 只 有 D 环 (D

动物 的 已 做 了 全 序列 分 析 。 它 们 的 基

.16 569bp。 此 基因 组 编码 13 个 蛋白

12-29 是 酵母 线粒体 的 基因 图 谱 , 指 明了 其 主要 的 RNA 和 蛋白质 产物 。 但 没有 指出 其
约 22 个 tRNA 分 子 , 因 为 它们 还 没有 被 完全 定位 。 此 基因 组 的 一 个 罕见 的 特点 是 它 的 两 个
rRNA 基因 是 分 开 的 。 其 15 S rRNA 基因 是 不 割裂 的 ,并 且 与 21 S rRNA 基因 相距 约 24kb。
在 面包 酵母 的 某 些 株 系 中 21 S rRNA 基因 有 一 个 内 含 子 ( 如 图 中 所 示 ) ,但 在 另 一 些 株 系 中 则

是 不 割裂 的 。

两 个 最 突出 的 基因 座 是 woz( 编 码 细胞 色素 b) 和 ozi3( 编 码 细胞 色素 氧化 酶 的 亚 基 1) , 它
们 都 是 割裂 基因 。 这 两 个 基因 加 在 一 起 几乎 与 哺乳 动物 线粒体 的 整个 基因 组 一 般 长 ! 在 这 些
基因 中 的 许多 长 内 含 子 和 它们 前 面 的 外 显 子 合 在 一 起 有 开放 读 框 , 有 证 据 表明 ,至 少 在 有 些 情
况 下 内 含 子 是 被 翻译 的 .这 就 使 酵母 线粒体 增加 了 一 些 蛋 白质 ,推测 这 些 蛋白 质 的 合成 量 是 低
的 。

其 余 的 基因 看 来 都 是 非 割 裂 的 。 其 中 有 编码 细胞 色素 氧化 酶 的 另外 两 个 亚 基 的 ;编码
ATP 酶 亚 基 的 ,以 及 var 是 编码 线粒体 核糖 体 蛋 白质 的 等 。 酵 母线 粒 体 基因 组 有 24 妈 左右 是
由 短 的 富 含 A 一 IT 碱 基 对 的 序列 所 组 成 ,它们 大 概 没有 任何 编码 功能 .尽管 如 此 ,仍然 还 有 相
当 大 量 的 遗传 物质 的 功能 需要 鉴定 ,并 且 , 如 果 在 图 谱 的 空白 区 域 不 能 进一步 找到 一 些 基 因 ，
那 将 是 令 人 奇怪 的 事 。 然 而 ,即使 再 找到 一 些 基因 ,估计 酵母 线粒体 基因 的 总 数 也 不 会 超过 25
个 左右 。

\ 哺 乳 动物 的 线粒体 基因 组

动物 线粒体 DNA 的 一 个 突出 特点 是 它 非常 紧凑 。 虽 然 不 同门 (phyla) 的 动物 线粒体 基因
组 构 (gene organization) 的 细节 很 不 相同 ,但 基本 情况 是 相同 的 。 它 们 的 基因 组 都 比较 小 ,编码
的 数目 也 比较 少 。 知 道 得 最 清楚 的 是
哺乳 动物 的 线粒体 基因 组 ,其 中 有 些 H 链 一 、 3 中

因 组 构 非 常 紧凑 ,没有 内 含 子 ;有 些 基
因 实 际 上 是 重 玫 的 ;并且 几乎 每 一 个

loop) 是 例外 , 它 是 DNA 复制 的 起 始
区 . 在 人 类 线粒体 基因 组 的 16 569 bp
中 ,可 算 成 是 基因 之 间 的 区 域 的 不 超
过 87bp。

人 类 和 上 鼠 的 线粒体 基因 组 的 全 部
核 苷 酸 序列 表现 出 高 度 的 同 源 性 。 图
12-30 是 人 类 线粒体 基因 组 的 概要 。
它 是 个 环 状 DNA 双 螺 旋 , 含有

图 12-30 人 类 线粒体 基因 组 的 图 谱 ，

和 指明 了 由 两 条 链 (H 和 LL) 编 码 的 基因

DNR 的 蛋白 质 编码 容量 约 60%% 用 于 VD 基因 编码 NADH-Q 还 原 酶 (也 叫 NADH 脱 氢 酶 或 复 雁 体
编码 NADH-Q 还 原 酶 的 7 个 亚 基 ， 卫 的 亚 基 ;CO 是 细胞 色素 氧化 酶 的 基因 ;Cytp 是 细胞 色素 还 原 酶 5
此 酶 是 线粒体 内 膜 上 3 个 质子 泵 复合 ”成 分 的 基因 ;4s 是 AIF 合成 酶 的 基因 ; 国 为 tRNA 的 基因 。

3f

体 (proton-pumping complexe) 中 的 第 一 个 .此 DNA 分 子 还 编码 细胞 色素 还 原 酶 的 一 个 亚 基 ， 1

细胞 色素 氧化 酶 的 3 个 亚 基 ,和 ATP 合成 酶 的 2 个 亚 基 。 其 中 L 链 (L strand ,两 条 链 中 密度
较 小 者 ) 编 码 一 种 蛋白 质 和 14 种 tRNA, 其余 所 有 的 蛋白 质 和 RNA 都 由 联 链 CH strand ,两 条
链 中 密度 较 大 者 ) 编 码 。

在 许多 情况 下 是 基因 之 间 完 全 没有 间隔 。 一 个 基因 的 最 后 一 个 碱 基 与 下 一 个 基因 的 第 一
个 碱 基 相 邻 。 有 些 情 况 是 有 重 琶 的 ,最 常见 的 是 仅 重 玛 一 个 碱 基 , 即 一 个 基因 的 最 后 一 个 碱 基
是 下 一 个 基因 的 第 一 个 碱 基 。 有 5 个 读 框 缺乏 终止 密码 子 , 它 们 的 末尾 是 U 或 UA, 因 而 是 通
过 转录 物 的 加 多 聚 A 尾巴 (线粒体 mRNA 在 其 3' 未 端 加 一 个 短 的 多 聚 A 序列 ) 而 补充 产生 终 “
止 密码 子 UAA。 有 3 种 情况 是 其 终止 密码 子 为 AGA 或 AGG ,它们 通常 是 用 精 氨 酸 的 密码
子 。 相 当 于 所 有 蛋白 质 编码 区 的 mRNA 已 被 鉴定 。 每 个 mRNA 的 起 始 密码 子 都 离 转录 起 点
6 个 碱 基 以 内 。 所 用 起 始 密码 子 可 以 是 AUG ,AUA 或 AUU 。 人 类 线粒体 mRNA 实际 上 不 存
在 5 和 3' 的 非 翻 译 区 。 人 类 线粒体 有 4 个 密码 子 的 意义 是 不 标准 的 : 正常 编码 精 氨 酸 的 AGA，
AGG 为 终止 密码 子 ;AUA 编码 甲 硫 氨 酸 而 不 是 异 亮 氨 酸 ;UGA 编码 色 氨 酸 而 不 是 终止 信 生 。

除了 上 述 基 因 组 的 利用 非常 经 济 和 有 些 密码 子 与 核 中 有 所 不 同 外 ,人 类 线粒体 基因 组 在
基因 的 表达 方面 还 有 个 明显 的 特点 ,其 表现 为 :DOD 几 乎 所 有 基因 的 转录 方向 都 是 顺 时 针 的 ;四
除了 有 一 处 有 两 个 基因 (CATP 酶 6 和 CO3) 相 邻 外 ,所 有 其 它 基因 都 是 用 至 少 一 个 切 NA 基因
所 隔 开 ;四 用 tRNA 基因 将 rRNA 和 蛋白 质 编码 区 断 开 之 处 并 没有 像 真 核 的 核 中 或 细菌 中 那
样 的 启动 子 , 而 是 仅 在 D 环 区 有 一 个 顺 时 针 转 录 的 启动 子 。 这 些 特 点 提示 ,转录 只 是 从 12S
rRNA 基因 前 面 的 tRNA 基因 之 前 开始 , 一直 把 整个 环 转录 完 , 到 D 环 区 终止 。 因 此 ,由 于 链
产生 一 条 转录 物 , 链 产生 另 一 条 转录 物 。 这 些 初始 转录 物 在 tRNA 的 两 端 断 开 , 形 成 单 基因
的 mRNA, 只 有 ATP 酶 6 和 CO3 是 例外 . 因此 ,线粒体 DNA 与 细菌 的 一 个 操纵 子 很 相似 , 它
由 单一 的 启动 子 区 开始 转录 ,转录 出 一 条 初始 转录 物 , 然 后 经 过 加 工 每 个 tRNA,rRNA 和
mRNA 释放 出 来 ,可 见 在 其 基因 表达 中 加 工 是 非常 重要 的 。

L 链 编码 的 tRNA 基因 是 怎样 表达 的 ?其 机 制 大 概 与 上 述 类 似 。L 链 产生 一 个 大 的 转录 产
物 ,在 其 中 有 tRNA 序列 和 mRNA 序列 ,然后 经 过 降解 ,把 这 些 序列 保存 下 来 ,而 其 余 的 则 降
解 掉 。L 链 也 是 由 D 环 区 开始 转录 ( 闭 时 针 )。 可 以 提取 到 很 大 的 世 链 转录 产物 ,说 明 它 是 在 转
录 后 经 过 一 定时 间 才 加 工 的 。 而 蔚 链 的 大 的 转录 产物 则 未 能 获得 ,说 明 它 是 在 转录 出 每 个 t-
NA 时 (转录 尚未 终止 ) 便 立即 加 工 的 。

五 .叶绿体 基因 组

叶绿体 的 基因 列 于 表 12-9。 叶 绿 体 基 因 组 的 情况 与 线粒体 的 类 似 , 只 是 比 线粒体 的 基因
多 一 些 。 叶 绿 体 基因 组 编码 其 合成 蛋白 质 所 需要 的 所 有 rRNA 和 tRNA 。 在 它 的 核糖 体 中 除
了 两 个 主要 的 rRNA 外 ,还 含有 两 个 小 的 rRNA。 和 线粒体 类 似 , 叶 绿 体 tRNA 的 种 类 也 比 胞
浆 中 的 少 。 叶绿体 基因 组 编码 约 50 种 蛋白 质 , 其 中 包括 RNA 聚合 酶 和 一 些 核 糖 体 蛋白 质 。 叶
绿 体 的 基因 也 是 在 叶绿体 中 转录 和 翻译 的 。

不 同 高 等 植物 的 叶绿体 基因 组 长 度 不 同 , 但 都 有 个 特点 , 即 都 有 个 长 的 序列 ,其 长 度 因 不
同 植物 而 不 同 , 在 10 一 20 kb 范围 内 , 它 以 两 个 相同 的 拷贝 存在 ,并 成 为 反 向 重复 (图 12-31)。
在 此 反 向 重复 之 内 的 基因 是 每 个 基因 组 两 拷贝 ,并且 含有 rRNA 基因 ,两 个 重复 序列 之 间 的
重组 ， 可 使 它们 之 间 的 短 的 单 拷贝 序列 (short single copy sequence,SSC) 相对 于 长 的 单 拷贝

7 爷

序列 (long single copy sequence ,LSC ) 来 说 发 生 逆 转 。

已 经 测定 了 欧 龙 亚 草 (Zzverzuo ,一 种 苦 雁 )、 烟草 和
水 稻 叶 绿 体 DNA 的 全 序列 ,水 稻 叶 绿 体 基因 组 图 谱 见 图
12-32。 虽 然 它们 的 总 长 度 相 差 很 大 ( 欧 龙 亚 草 的 约 为
121 kb ,烟草 的 约 为 155 kb) ,但 基因 的 组 构 相 似 , 基 因 的 总
数 几 乎 相同 。 基 因 产 物 的 大 多 数 是 类 圳 体 (thylakoid) 膜 的
成 分 ,或 与 氧化 还 原 反应 有 关 的 成 分 ,如 表 12-9 中 所 示 。

12-31 叶绿体 基因 组 是 一 个 环 , 它 被 两 个 反 向 重复
序列 分 开 为 一 个 短 的 单 拷贝 区 和 一 个 长 的 单 拷贝 区

水 稻
(Oryza sativa)

叶绿体 DNA
134 525bp

图 12-32 水 称 叶 绿 体 基因 组 图 谱

杉 浦 昌 弘 等 1986 ,1988.

表 12-9 叶绿体 基因 组 编码
4 个 rRNAsS,30 个 tRNAs 和

50 种 左右 蛋 和 白质

基因

编码 RNA
16 S rRNA
23 S rRNA
4.5SITRNA
5STrRNA
tRNA

基因 表达 所 需 的
核糖 体 蛋白 质
RNA 聚合 酶
其 它

类 囊 体 膜 上 的

RuBP 羧 化 酶
未 查 明 的
总 计

373

表 12-9 欧 龙 亚 草 ,烟草 及 水 称 叶 绿 体 DNA 全 序列 及 其 组 构

欧 龙 亚 草 (bp) 烟草 (bp) 水 稻 (bp)
反 向 重复 序列 (IR) 10 058 25 339 20 798
短 单 拷贝 区 (SSC) 19 813 18 482 12 335
长 单 拷贝 区 (LSC) 81 095 86 684 80 592
总 基因 组 121 024 155 844 134 525

叶绿体 的 功能 是 进行 光合 作用 , 它 的 许多 基因 是 编码 类 襄 体 膜 的 复合 体 中 的 蛋白 质 。 表
12-10 中 列 出 了 烟草 叶绿体 基因 组 中 所 含 与 光合 作用 有 关 的 基因 。 光 合作 用 可 分 为 暗 反应 和
光 反应 两 部 分 。 在 暗 反 应 的 酶 系 中 只 有 核 酮 糖 二 磷酸 羧 化 酶 -加 氧 酶 (rubisco) 的 大 亚 基 是 由 叶
绿 体 DNA 编码 的 。 在 光 反 应 中 有 5 组 类 襄 体 膜 上 的 复合 体 , 即 ATP 酶 、. 光 系统 工 . 光 系统 工 、
细胞 色素 b/f 复合 体 和 集 光 叶绿体 蛋白 复合 体 。

从 表 中 可 以 看 出 ,虽然 有 些 复合 体 和 线粒体 的 情况 一 样 , 即 复合 体 的 一 些 亚 基 由 叶绿体 基
因 组 编码 ,而 另 些 亚 基 则 由 核 基因 组 编码 ,但 叶绿体 有 些 复合 体 的 成 分 是 由 一 种 基因 组 编码
的 。 例 如 , 光 系 统 工 . 光 系 统 工 的 亚 基 完 全 由 叶绿体 基因 组 编码 ,而 集 光 叶绿体 蛋白 复合 体 的 亚
基 则 完全 由 核 基因 组 编码 。

已 被 鉴定 出 来 的 叶绿体 基因 的 情况 如 下 :45 个 编码 RNA 的 基因 ;27 个 基因 编码 与 基因
表达 有 关 的 蛋白 质 ;18 个 基因 编码 类 襄 体 膜 的 蛋白 质 ; 另 外 有 10 个 基因 编码 与 电子 传递 功能
有 关 的 蛋白 质 。 还 有 约 30 个 开放 读 框 的 产物 尚 待 鉴定 。

表 12-10 烟草 叶绿体 DNA 所 含 编码 的 光合 作用 中 的 基因

与 光合 作用 有 关 的 成 分 宝 7 与 菠菜 同 源 性 (多 )
Rubisco 大 亚 基 rpc 也 477 53 92
H+-ATPase x 亚 基 atP 4 507 55 87*

8 亚 基 妃 498 54 96

< 亚 基 已 133 15 87

I 亚 基 F 184 19 78( 有 695 bp 内 含 子 )

工 亚 基 五 81 8.0 99

4 亚 基 了 247 27 82 平
光合 系统 1 P700 前 蛋白 psa 4 750 83 97#

A2 亚 基 妃 734 82 96#
光合 系统 1 P32 蛋白 zs0 4 353 39 100

P680 前 蛋白 已 508 56 96

44 kD 蛋白 质 G 473 52 98

D2 蛋白 质 卫 353 40 98

细胞 色素 b559 羽 83 9.4 99

10 kD 磷酸 化 蛋白 玉 73 7.8 旭 :

4kD 和 蛋白质 (ORF39?) 〈《C) 39 4. 5 97 和
电子 传递 系统 ”细胞 色素 f et 4 320 35 91 内

细胞 色素 b6 B 215 24 97( 有 759 bp 内 含 巴 )

亚 基 4 也 139 15 98

* 和 小 麦 比 较 ;# 和 玉米 比较 ,对 :和 吏 豆 比较 。

叶绿体 的 蛋白 质 合 成 装置 表现 出 与 细 调 的 装置 相似 。 许 多 核糖 体 蛋白 质 (r 蛋白 质 ) 与 大

肠 杆 菌 的 是 同 源 的 ,而 且 核 糖 体 蛋 白质 的 一 些 基 因 的 成 得 存在 也 与 大 肠 杆菌 中 的 相应 的 簇 类
374

似 ,RNA 育 合 酶 的 ,8 和 亚 基 的 基因 与 大 肠 杆菌 核心 酶 (core enzyme) 的 基因 同 源 。 然 而 其
尼 亚 基 的 基因 有 个 内 含 子 。 割裂 基因 的 存在 提示 叶绿体 来 源 于 丢失 其 内 含 子 之 前 的 原核 生物 。
叶绿体 的 内 含 子 有 两 类 :tRNA 基因 的 内 含 子 通常 (不 是 必定 ) 位 于 反 密 码 子 环 中 ,类 似 于 酵
母 核 中 的 tRNA 基因 ;@ 编 码 蛋 白质 的 基因 中 的 内 含 子 类 似 于 线粒体 基因 的 内 含 子 。

第 四 节 ”mRNA 前 体 的 甬 接

由 于 真 核 生 物 ,特别 是 高 等 生物 的 编码 蛋白 质 的 基因 绝 大 多 数 是 割裂 的 ,并 且 已 经 证 明 在
转录 时 其 内 含 子 与 外 显 子 一 起 转录 ,因而 最 初 的 转录 产物 是 含有 内 含 子 的 未 成 熟 的 mRNA，
称 为 mRNA 前 体 。 随后 必须 把 内 含 子 删除 掉 , 将 外 显 子 联结 在 一 起 ,才能 形成 成 熟 的 mRNA，
作为 合成 蛋白 质 的 模板 。 这 一 删除 内 含 子 的 过 程 称 为 RNA 的 剪接 (splicing) ,已 知 它 是 在 核 中
进行 的 。 此 外 ,已 知 有 些 rRNA 和 tRNA 的 初始 转录 物 也 有 内 含 子 ,它们 也 需要 经 过 剪接 才能
成 为 功能 的 rRNA 和 tRNA。 研 究 rRNA 前 体 的 剪接 导致 了 核 酶 (ribozyme) 的 发 现 。

一 .mRNA 前 体 的 剪接 位 点 是 由 内 含 子 末端 的 序列 规定 的

mRNA 前 体 中 的 内 含 子 必 须 精 确 地 剪接 掉 , 因为 在 剪接 位 点 处 多 剪接 掉 或 少 剪接 掉 一 个
核 苷 酸 , 就 使 得 剪接 处 3 一 侧 的 所 有 密码 子 都 改变 了 ,从 而 合成 出 一 个 完全 不 同 的 氨基 酸 序
列 。 那么 ,剪接 的 机 械 是 怎样 做 到 高 度 忠实 的 对 其 底 物 进行 加 工 的 ? 已 分 析 了 几 百 个 剪接 前 的
RNA 转录 物 中 内 含 子 -外 显 子 交 界 处 的 碱 基 序 列 \ 表 12-11), 从 而 解答 了 此 问题 。

表 12-11 含有 内 含 子 的 转录 物 中 剪接 区 的 碱 基 序列

国清 本 白肉 含 了 2 ， ， UAAG - GUGAGC-UUACAG -， - -GUUG
， 卵 清 蛋 白 内 含 子 3 UCAG GUACAG ~ 一 AUUCAG UNGRNG
， p- 珠 蛋白 内 含 子 1 GCAG GUUGGU 一 一 CCcCUUAG GERG

有 - 珠 蛋白 内 含 子 ? CAGG GUGAGU ~ 一 CCACAG UCUC
免疫 球 蛋白 % 内 含 子 1 EDAG GUCAGC ~ 一 UUccCAG GGGC

SV40 病毒 早期 T- 抗 原 UAAG GUOAAU 一 OUTUWNUAG AUU C
一

在 测定 这 些 序列 之 初 曾经 设想 ,在 内 含 子 两 端的 碱 基 序列 可 能 是 彼此 互补 的 。 由 这 些 互补
序列 通过 碱 基 配 对 而 形成 发 夹 结构 ,从 而 使 两 个 外 显 子 靠拢 在 一 起 ,这 样 在 酶 的 作用 下 , 便 易
手 将 内 含 子 剪除 ,把 外 显 子 联结 在 一 起 。 然 而 分 析 的 结果 和 设想 的 完全 不 同 , 没 有 发 现 有 互补
序列 .但 是 在 分 析 了 从 酵母 到 哺乳 动物 这 样 广泛 范围 内 的 真 核 生 物 的 这 些 序列 之 后 ,发 现 它 们
有 个 共同 的 结构 基 元 Cstructural motif) : 即 所 有 内 含 子 的 序列 都 是 以 CU 开始 ,以 AG 告终 。
背 椎 动物 内 含 子 5 -末端 的 共有 序列 (consensus sequence ) 为 AGGUAAGU (图 12-33) 。 在 内 含
子 3'- 未 端的 共有 序列 是 在 一 段 10 个 喀 啶 (U 或 C) 之 后 有 个 任意 碱 基 , 然 后 是 个 C, 最 后 是 不
变 的 AG 。 内 含 子 还 有 一 个 重要 的 内 部 位 点 , 它 位 于 3' 剪 接 位 点 上 游 20 和 50 个 核 苷 酸 之 间 ，

5' 前 接 位 点 分 支点 3 剪接 位 点

攻 有 汉 Ac GUAAGU A (Py)zNCAG Gwz 池 外 显 子 ;
=

内 售 村 一 二 下

12-33 ”剪接 信 号 ,指明 了 5 剪接 位 点 和 3 剪接 位 点 的 共有 序列
3175

叫做 分 支点 (branch site), 叫 做 分 支点 的 原因 在 随后 讨论 剪接 过 程 时 就 明白 了 。 在 酵母 中 分 支
点 的 序列 几乎 都 是 UACUAAC ,但 在 哺乳 动物 中 已 发 现 了 多 种 不 同 的 序列 。

在 内 含 子 中 ,除了 5 和 3 剪接 位 点 以 及 分 支点 的 序列 之 外 ,其 它 部 分 对 决定 在 何 处 发 生 ，
剪接 看 来 并 不 重要 。 内 含 子 的 长 度 范围 为 50 一 10 000 个 核 苷 酸 。 一 个 内 含 子 的 大 量 序列 被 缺
失掉 并 不 改变 其 剪接 位 点 或 效率 。 同 样 , 在 基因 的 内 含 子 中 插入 大 片段 的 DNA 也 不 影响 其 剪
接 。 而 且 , 用 重组 DNA 的 方法 将 一 个 内 含 子 的 5 端 一 段 序 列 和 另 一 个 十 分 不 同 的 内 含 子 的 3:
端 一 段 序列 联结 在 一 起 ,形成 一 个 嵌 合 的 内 含 子 , 只 要 其 剪接 位 点 和 分 支点 没有 改变 , 照样 发
生 正 确 的 剪接 .与 之 相反 ,在 这 3 个 关键 区 域 的 任 一 个 区 域 发 生 突变 时 , 则 可 引起 异常 的 剪接 。
在 离 剪接 位 点 的 远 处 发 生 突变 时 也 能 引起 不 正常 的 剪接 ,但 这 种 情况 只 有 当 突 变 后 在 新 的 位
置 产 生 了 一 个 5 或 3 的 剪接 共有 序列 时 才 会 发 生 。

地 中 海 贫血 症 (thalassemia) 是 一 类 遗传 性 贫血 症 , 其 特点 是 血红 蛋白 的 合成 有 缺陷 .在 这
类 贫血 症 中 有 一 些 是 由 于 异常 剪接 引起 的 。 其 中 有 一 个 病例 是 在 其 8 珠 蛋 白 基 因 的 第 一 个 内
含 子 中 发 生 了 突变 ,此 突变 发 生 在 正常 3 剪接 位 点 上 游离 位 点 20 个 核 苷 酸 处 ,正常 此 处 为 G，
.病人 的 突变 成 了 A( 图 12-34), 从 而 产生 了 一 个 新 的 3 剪接 位 点 。 由 于 用 此 新 的 剪接 位 点 剪接
的 结果 ,使 产生 的 mRNA 中 的 一 系列 密码 子 不 正常 了 。 在 新 的 剪接 位 点 剪接 后 的 第 7 个 密码 子 旱
是 蛋白 质 合成 的 终止 信号 ,因此 合成 出 来 的 是 个 不 正常 的 未 成 熟 蛋白 质 ,所 以 就 产生 了 贫血 病 。 蛋

内 含 子 的 正 党
/一 3 末端
正常 5 CCTATTGGTCTATTTTCCACCCETAGGCTGCcTG 3

8- 地 中 海 贫血 症 5 CCTAFTAGITCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG 3:

12-34 由 于 8 珠 蛋 白 基 因 的 一 个 内 合子 发 生 了 一 个 碱 基 突 变 (G 变 为 A) 引 起 的 地 中 海 贫血 病
此 突变 大 概 是 产生 了 一 个 与 正常 3 剪接 位 点 相 类 似 的 新 的 3 剪接 位 点 ,此 位 点 在 正常 位 点 的 上 游 。 引 自 R. A. Spritz 等 。

二 、 剪 接 体 催 化 的 剪接

首先 讨论 在 真 核 生物 中 最 常见 的 一 种 剪接 方式 , 即 前 接 体 (spliceosome ) 催 化 的 前 接 方式 。
(一 ) 在 mRNA 前 体 的 剪接 中 形成 套 索 形 中 产物
在 一 个 mRNA 的 前 体 中 , 一 个 外 显 子 的 末端 是 怎样 与 其 相 邻 的 另 一 个 外 显 子 的 前 端 联结
在 一 起 的 ? 剪接 的 第 一 步 是 上 游 外 显 子 (外 显 子 1) 与 内 含 子 5 未 端 之 间 磷 酸 二 酯 键 的 裂解 (图
12-35) 。 在 此 反应 中 攻击 的 基 团 是 分 支点 中 的 一 个 腺 苷 酸 残 基 的 2-OH。 通 过 此 反应 ,在 此 腺 苷
酸 残 基 与 内 含 子 的 5 -末端 磷酸 基 之 间 形 成 了 一 个 2 ,5' -磷酸 二 酯 键 。 注 意 , 此 腺 苷 酸 残 基 仍然
用 正常 的 3 ,5' -磷酸 二 酯 键 联 结 在 另外 2 个 核 苷 酸 上 (图 12-36)。 因 而 在 此 位 点 形成 了 1 个 式
支 ,并 形成 了 1 个 套 索 形 的 (lariat) 中 产物 。 然 后 ,外 显 子 1 的 3' -OH 未 端 攻击 内 含 子 和 外 显 也 有
之 间 的 磷酸 二 酯 键 ,其 结果 是 外 显 子 1 和 外 显 子 2 联结 在 一 起 , 并 将 内 含 子 以 套 索 形 释 放出 雪
值得 注意 的 是 , 剪接 是 由 2 个 转 酯 反应 (transesterification reaction ) 完 成 的 , 而 不 是 由 水 解 后 再
联结 完成 的 。 第 一 个 反应 在 外 显 子 1 的 末端 产生 一 个 3 -OH , 而 在 第 二 个 反应 中 此 3'-OH 与 外
显 子 2 的 5- 磷酸 基 联结 在 一 起 。 在 这 些 反应 步骤 中 , 磷酸 二 酯 键 的 总 数 始终 没有 改变 。 第 一 个 反
应 的 产物 一 直 由 剪接 体 抓 持 在 一 起 ,直到 两 个 外 显 子 联结 起 来 之 后 为 止 。 剪接 体 是 由 多 个 核 蛋白
聚集 而 成 的 , 它 能 识别 mRNA 前 体 的 5 剪接 位 点 .3 剪接 位 点 和 分 支点 ,下 面 讨论 之 。
376

如

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Y 沁 Y JU Y

外

前 体 中 产物 ，。 前 接 的 产物 套 索 形 内 含 子

图 12-35 “在 真 核 生 物 的 细胞 核 中 mRNA 剪接 的 机 制

Y 代表 一 个 味 叭 核 昔 酸 ,R 代表 一 个 喀 啶 核 苷 酸 ,N 代表 任何 核 苷 酸 。 5 剪接 位 点 受到 分 支点 腺 苷 2-OH 的 攻击 ，
然后 新 生成 的 上 游 外 显 子 的 3 -OH 攻击 3' 剪接 位 点 。 两 个 外 显 子 联结 在 一 起 了 ,内 含 子 以 套 索 的 形式 释放 出 去 。 引 自
P. A. Sharp ,Cell.， 1985.2: 3 980.

(二 ) 剪 接 体 中 的 核 内 小 RNA CsnRNA ) 催化
mRNA 前 体 的 剪接

在 细胞 核 和 胞 质 溶胶 中 都 含有 多 种 不 到 300 个

核 音 酸 的 小 RNA 分 子 , 它 们 被 称 为 核 内 小 RNA |
民 small nuclear RNA,snRNA) 和 胞 质 内 小 RNA

H， 5”′ oO、 ” 腺 味 叭
small cytoplasmic RNA,scRNA) .这 些 RNA 分 子 国生 人
和 特异 的 蛋白 质 结合 在 一 起 形成 复合 体 , 这 些 复合 他

下

体 分 别 叫做 核 内 小 核糖 核 蛋 白 颗 粒 (small nuclear 访 生 局 六 CE，
fibonucleoprotein partticles ,snRNPs) 和 胞 质 内 小 核 世 人 0 鸟 顺 叭
糖 核 蛋白 颗粒 Csmall cytosolic ribonucleoprotein 上

H HH
Earticles,scRNPs)。 研 究 者 们 也 常常 把 它们 叫做 局 懈
“snurps” 和 “scurps”。 剪 接 小 体 是 一 类 大 的 复合 体
660 s) ,它们 是 由 mRNA 前 体 和 snRNPs( 表 12-12)
动态 的 聚集 在 一 起 而 形成 的 。 由 于 发 现 特异 于 这 些
核糖 核 蛋 白 的 抗体 能 够 封 阻 剪接 作用 ,从 而 揭示 出 图 12-36 “在 剪接 过 程 中 形成 的
| 这些 snRNPs 在 剪接 中 起 着 关键 的 作用 。 这 些 特异 套 索 形 中 产物 中 分 支 处 的 结构
的 抗体 是 由 全 身 性 红斑 狼疮 (systemic' lgpus ery- 此 腺 苷 酸 残 基 以 磷酸 二 酯 键 与 3 个 核
thematosus) 病 人 中 获得 的 。 这 是 一 种 自身 免疫 (au- 2
toimmune) 的 疾病 ,其 特点 是 产生 抗 许多 细胞 核 成 2
分 的 抗体 。 这 些 抗 体 与 核 成 分 相 结合 ,引起 了 关节 炎 和 肾 损伤 。

37 昌

表 12-12 ”参与 mRNA 前 体 剪 接 的 snRNPs

snRNP 的 大 小
snRNP ( 核 音 酸 数 ) 作用
Ul 165 结合 在 5 剪接 位 点 上 ,然后 结合 在 3 剪接 位 点 上
2 185 结合 在 分 支点 上 ,并 形成 催化 中 心 的 一 部 分
U5 116 结合 在 5 剪接 位 点 上
U4 145 遮蔽 U6 的 催化 活性
U6 106 催化 剪接

在 哺乳 动物 细胞 中 ,剪接 是 以 U1 snRNP 识别 5 剪接 位 点 开始 的 (图 12-37) 。 事 实 是 ,在
U1 RNA 中 有 个 与 此 位 点 互补 的 序列 , 当 Ul snRNP 结合 在 一 个 mRNA 前 体 上 时 ,保护 了 5
剪接 位 点 处 一 个 15- 核 苷 酸 区 不 被 消化 。
5 剪接 位 点 mRNA 前 体
:LE
人
U1 snRNA

外 星子 1 内 含 子 > 外 显 子 2
|
前 体 mRNA
U1
全
U1 U2
一 一 一 :
U4-U5-U6
太 复合 体
SO 一 3
5 pGuc
人
沪 风

完整 剪接 体

12-37 ”剪接 体 装 配 的 途径
U1l 结合 在 5 剪接 位 点 上 ,U2 结合 在 分 支点 处 。 一 个 事先 形成 的 U4-U5-U6 复合 体
最 后 联结 在 其 上 形成 完整 的 剪接 体 。

然后 U2 snRNP 结合 在 内 含 子 的 分 支点 上 。 随后 由 于 U1 和 U2 结合 起 来 的 结果 ,把 内 容
子 的 5 端 和 3' 端 带 到 一 起 ,使 U1 也 能 与 3 剪接 位 点 配对 .此 Ul1,U2 和 mRNA 前 体形 成 的 复
合体 与 事先 组 装 好 的 U4-U5-U6 复合 体 联 结 在 一 起 ,形成 一 个 完整 的 剪接 体 。 理

已 有 的 证 据 提 示 剪 接 的 途径 如 下 :首先 ,U5 与 剪 接 位 点 处 的 外 显 子 序列 相互 作用 。 下
一 步 是 ATP 推动 的 Ul 与 5 剪接 位 点 之 间 的 碱 基 配 对 的 解 开 。U1l 离开 剪接 体 ,U5 扩展 其 与
mRNA 前 体 的 碱 基 配 对 至 包括 5' 剪 接 位 点 在 内 。 再 后 ,U4 和 U6 之 间 的 碱 基 配 对 折 开 ,从 而
释放 出 U6 的 催化 活性 ,开始 了 剪接 反应 。U4 是 个 抑制 剂 , 在 对 准 特 异 的 剪接 位 点 之 前 , 它 三
直 把 U6 遮蔽 起 来 。

378

U6 从 U4 释放 出 来 后 , 它 就 与 内 3

含 子 中 剪 接 位 点 的 保守 序列 进行 配
对 . 此 外 ,U6 还 与 U2 配对 ,而 U2 又 ee se 2
与 内 含 子 的 分 支点 配对 。U2 和 U6 AcasaGaAueAUGA-，

snRNAs 大 概 是 构成 了 剪接 体 的 催化 AS ua
中 心 ( 图 12-38) 。 然 后 分 支点 的 2 - 产 了

基 攻 击 5 剪接 位 点 , 释 出 外 显 子 1 ,新 和 光 全 厅 作 直 才 3
生成 的 外 显 子 1 的 3'- 羟 基 再 攻击 3 3 区 虹 2 GeA，， AW

剪接 位 点 ,从 而 把 两 个 外 显 子 联结 在 si，

一 起 。 联 结 在 剪 切 下 来 的 套 索 形 内 含 | 外 显 了 1

子 上 的 U2,U5 和 1U6 最 后 被 释放 出 前 体 mRNA

来 ,剪接 反应 就 完成 了 。 此 过 程 有 两 个 图 12-38 ”剪接 体 的 催化 中 心 是 由 U2 snRNA 和
特点 值得 注意 :GDRNA 分 子 在 对 准 前 U6 snRNA 形成 的 ,它们 之 间 形 成 了 碱 基 配 对

接 位 点 和 在 进行 催化 中 起 着 关键 的 作 引 自 H.D. Madhani 和 C. Guthrie. Cell. 1992. 71 : 803.

用 ;@ 在 ATP 的 推动 下 ,蛋白 质 使 RNA 的 双 链 中 产物 解 开 , 并 且 引 起 核糖 核 蛋 白 由 mRNA
前 体 及 其 产物 上 释放 出 来 。

三 、 自 我 剪接 的 RNA :催化 活性 的 RNA 的 发 现

和 原核 的 一 样 , 真 核 生 物 的 核糖 体 RNA 分 子 也 是 由 初始 转录 物 经 过 裂解 后 生成 的 。 在 四

膜 虫 (Tetrahymenra, 一 种 有 纤毛 的 原生 动物 ) 中 ,裂解 后 生成 的 一 个 6. 4 kb 的 前 体 中 要 除去 1
个 414 核 苷 酸 的 内 含 子 以 生成 成 熟 的 26 S rRNA 分 子 ( 图 12-39) 。Thomas Cech 及 其 同事 在
研究 此 剪接 反应 时 得 到 了 一 些 非常 意外 的 发 现 。 他 们 开始 研究 时 的 目的 是 想 鉴 定 出 剪接 作用
所 需要 的 蛋白 质 ,做 法 是 在 制 得 此 RNA 前 体 的 纯 品 后 ,向 其 中 加 入 细胞 抽 提 物 , 以 便 观察 细
胞 抽 提 物 中 的 那些 蛋白 质 能 促进 剪接 .然而 他 们 惊异 地 发 现 ,一 个 仅 含 有 纯化 的 前 体 和 核 苷 三
上 磷酸 ,而 显然 没有 和 蛋白质 的 对 照样 品 中 居然 发 生 了 剪接 作用 。 由 于 剪接 作用 是 个 有 共 价 键 的 裂
解 和 生成 反应 的 过 程 ,这 种 过 程 是 必须 有 酶 参与 催化 的 , 而 在 任何 酶 的 化 学 本 质 都 是 蛋白 质 已
到 成 为 固定 概念 的 当时 ,这 种 没有 蛋白质 的 参与 即 发 生 了 剪接 作用 的 现象 是 没有 人 能 够 相信
的 。 因 而 怀疑 ,是 不 是 在 制备 的 前 体 RNA 中 没有 将 蛋白 质 除 尽 ? 而 残留 的 一 点 点 蛋白 质 正 是
梭 楷 剪接 作用 所 必需 的 ?为 了 解答 这 个 问题 ,他 们 用 重组 DNA 的 方法 制备 与 此 6. 4 kb 相应 的
DNA 。 这 是 用 大 肠 杆菌 作为 寄主 细胞 制备 的 ,而 大 肠 杆 菌 细胞 中 原来 是 没有 此 RNA 分 子 的 。
在 获得 纯 的 编码 此 前 体 RNA 的 DNA 后 ,再 用 体外 转录 的 方法 制备 出 合成 的 此 RNA, 并 观察
其 剪接 反应 。 其 结果 与 上 述 相同 , 即 在 有 核 苷 酸 存在 的 条 件 下 ,此 RNA 自我 剪接 了 ,并 且 精 确
地 将 其 414 核 苷 酸 的 内 作 子 剪接 掉 了 。 这 一 卓越 的 实验 表明 ,一 个 RNA 分 子 能 够 具有 高 度 特
异 的 催化 活性 ,并 能 自我 剪接 。

前 已 述 及 ,在 自我 前 接 反 应 中 需要 有 核 苷 酸 的 参与 。 在 原来 寻找 起 催化 作用 的 蛋白 质 时 在
反应 混合 物 中 加 入 ATP 或 GTP ,是 因为 曾经 设想 剪接 反应 需要 由 ATP 或 GTP 提供 能 量 。 后
来 在 研究 自我 前 接 的 反应 时 发 现 , 它 不 需要 ATP 或 GTP 提供 能 量 , 但 此 反应 需要 GTP 作为
辅助 因子 。 而 且 不 一 定 非 GTP 不 可 , 鸟 苷 .GMP,GDP 或 GIP 中 任何 一 种 都 可 起 辅助 因子 的
作用 ,我 们 用 G 代表 这 些 化 合 物 中 的 任何 一 种 。G 的 作用 不 是 提供 能 量 , 而 是 作为 一 个 攻击 基

379

团 并 暂时 挫 合 到 RNA 中 (图 12-39) 。G 结合 在 RNA 上 之 后 , 它 攻击 5 -剪接 位 点 ,并 与 内 含 子
的 5 -末端 形成 磷酸 二 酯 键 。 此 转 酯 反应 使 上 游 外 显 子 产 生 一 个 3 -OH, 然 后 此 新 生成 的 上 游
外 显 子 的 3'-OH 攻击 3'- 剪 接 位 点 。 此 第 二 个 转 酯 反应 把 两 个 外 显 子 联结 在 一 起 ,并 将 414 核
苷 酸 的 内 含 子 释放 出 去 。

外 号 生 > 全 中
内 人 了
G

Se 3; : @@ 本 济 CO

L19
RNA

12-39 ”一 个 四 膜 虫 的 核糖 体 RNA 前 体 的 自我 剪接 作用
剪接 过 程 中 的 第 一 个 剪接 反应 是 将 一 个 414 核 苷 酸 的 内 含 子 释 出 ,在 此 反应 中 鸟 苷 或 者 一 个 鸟 苷 酸 (用 G 表示 )
是 个 辅助 因子 ,随后 此 内 含 子 又 自我 剪接 两 次 ,产生 一 个 线 型 RNA, 它 比 原来 的 内 含 子 少 了 19 个 核 苷 酸 。 此 L19
RNA 是 有 催化 活性 的 。

随后 还 发 生 两 轮 自 我 剪接 。 第 一 轮 剪 接 是 生成 的 内 含 子 的 3 -OH 攻击 其 靠近 5 -末端 的 一 目
个 磷酸 二 酯 键 , 结 果 内 含 子 形成 环 状 ,并 释 出 一 个 含有 G 的 15 核 苷 酸 片段 ,G 是 在 前 述 的 剪接
过 程 中 摊 合 进来 的 。 生 成 的 399 核 背 酸 环 打 开 成 为 线 型 分 子 , 并 进行 第 二 轮 剪接 ,其 结果 是 释 出
一 个 4 核 苷 酸 片段 并 形成 环 。 此 环 再 打开 形成 一 个 线 型 RNA ,此 RNA 叫做 L19 IVS(linear mi-
nus 19 intervening sequence， 线 型 的 缺失 19 个 核 苷 酸 的 间 插 序列 ) ,我 们 称 之 为 L19 RNA。
自我 剪接 依赖 于 此 rRNA 前 体 分 子 结构 的 完整 。 自 我 剪接 对 内 含 子 有 许多 要 求 。 与 许多
其 它 RNA 一 样 ,此 RNA 分 子 具 有 折 友 结 构 , 它 是 由 许多 双 螺 旋 的 葵 (stem) 和 环 (loop) 构 成
的 (图 12-40) 。 在 此 折 释 的 RNA 中 除了 含有 较 强 的 AU 和 GC 碱 基 对 外 ,还 含有 较 弱 的 GU )
碱 基 对 。 这 些 碱 基 对 中 两 个 碱 基 之 间 的 亲和力 大 致 为 :CU : AU : GC=1: 100 : 1 000。 在 加
入 变性 剂 , 如 二 甲 基 甲 酰胺 等 ,使 RNA 前 体 的 二 级 和 三 级 结构 遭 到 破坏 时 ,剪接 作用 便 被 封
胃 了 。 而且 ,G 的 结合 是 可 侈 和 的 (K。 值 为 32 km) ,并 且 能 被 交 争 性 地 抑制 。 这 些 发 现 强力
地 提示 ,在 此 前 体 中 含有 一 个 特异 结合 G 的 袋 (pocket) (图 12-41)
碱 基 序列 分 析 的 结果 提示 ,5 剪接 位 点 与 催化 位 点 是 以 碱 基 配 对 的 方式 相 结合 的 , 即 在 上
外 显 子 中 的 一 个 富 含 喀 喧 区 (CUCUCU ) 与 内 含 子 中 的 一 个 富 含 味 叭 的 指导 序列 4guide
quenceyGGGAGG ) 相 配对 (图 12-42) 。 内 含 子 将 辅助 因子 鸟 苷 和 5 剪接 位 点 聚拢 在 一 起 ,使 得
G 的 3'-OH 正好 能 亲 核 攻击 此 剪接 位 点 的 磷 原 子 。 然 后 内 含 子 的 另 一 部 分 将 下 游 外 显 子 抓 持 在
一 定位 置 , 使 新 生成 的 上 游 外 显 子 的 3 -OH 正好 攻击 它 。 其 结果 是 在 两 个 外 显 子 之 间 形 成 一 个 磷
酸 二 酯 键 , 同时 将 内 含 子 以 线 型 分 子 的 形式 释放 出 来 .在 此 rRNA 前 体 中 自我 催化 的 键 的 生成 和 肥
解 是 高 度 立 体 特 异性 的 (stereospecific), 这 和 化 学 本 质 为 蛋白 质 的 酶 所 催化 的 反应 是 一 样 的 。
380

12-40 四 膜 虫 的 一 个 核糖 体 RNA 前 体 的 二 级 结构 的 一 部 分
引 自 工 . Cech.RNA as an Enzyme. Copyright (O 1986 by Scientific American ,Inc.

外 显 子 -3
信和
U
N
CH;OH
OO
CH 2TTOH
RE
耳 色
3 OH
了 各 )
呈 和
产 :|
AR

12-41 设想 的 一 个 RNA 酶 中 含有 的 活性 中 心 处 结合 鸟 苷 的 模式 图
引 自 B. 世 . Bass and 工 .R, Cech. Nature， 1984. 308 ;820.

381

在 线 型 的 内 含 子 分 子 释 出 后 , 它 的 富 含 嘎 叭 的 指导 序列 再 与 内 含 子 中 的 另 一 个 富 含 喀 啶 ，
的 序列 相 结合 ,从 而 进行 再 一 次 剪接 , 释 出 一 个 15 核 苷 酸 的 片段 ,并 形成 环 状 。 此 环 状 RNA 罩
打开 , 另 一 个 富 含 喀 啶 的 序列 再 与 指导 序列 相 结合 ,此 最 后 一 轮 剪接 释 出 一 个 4 核 苷 酸 产 物 而 和
形成 一 个 缩短 了 的 新 环 状 RNA。 最 后 ,此 395- 核 苷 酸 内 含 子 打开 ,生成 L19 RNA。 此 II19
RNA 是 稳定 的 ,因为 它 不 再 含有 富 含 喀 啶 的 互补 序列 了 。

然而 ,在 L19 RNA 中 仍然 含有 一 个 G 结合 位 点 和
一 个 指导 序列 。 因而 Cech 认为 L19 RNA 有 可 能 作用 于
外 部 的 底 物 ,并 进行 了 大 量 研 究 。 结 果 表 明 ,L19 RNA 以
高 度 特 异 的 方式 催化 寡 聚 核糖 核 苷 酸 的 裂解 和 联结 反
应 。 五 胞 核 苷 酸 (Cs) 被 L19 RNA 转变 为 更 长 一 些 和 更
短 二 些 的 寡 聚 体 ( 图 12-43) 。 具 体 地 说 ,Cs 被 降解 为 C，
和 Cs。 与 此 同时 ,又 能 生成 Cs 和 更 长 一 些 的 聚合 物 。 可
见 ,L19 RNA 既是 一 个 核糖 核酸 酶 ,又 是 一 个 RNA 聚
合 酶 。

此 RNA 性 质 的 酶 对 Cs 的 催化 作用 比 对 U5 快 很
多 ， 而 对 As 和 Gs 则 完全 没有 作用 。 它 按照 Michaelis-
Menten 动力 学 行为 ,对 Cs 的 天 v 值 为 42 pmy,ACu 值 为
0. 033/s 。 其 底 物 必须 有 个 2 -OH, 这 是 由 于 发 现 脱氧 -Cs
是 Cs 的 竞争 性 抑制 剂 而 证 明 的 。 由 此 可 见 ,L19 RNA 表
现 出 经 典 酶 催化 作用 的 几 个 标志 :高 度 的 底 物 特异 性 ;
Michaelis-Menten 饱和 动力 学 行为 ;和 对 竞争 性 抑制 剂
的 敏感 性 。

此 395- 核 苷 酸 RNA 分 子 是 怎样 发 挥 核糖 核 酸 酶 和
RNA 聚合 酶 两 方面 的 作用 的 ? 它 的 三 维 结构 虽然 还 不 清
楚 , 但 可 对 其 催化 机 制 做 些 推断 (图 12-43)。 此 底 物 的 5
个 C 碱 基 中 若干 个 大 概 是 与 此 RNA 性 质 的 酶 中 富 含 G
的 序列 以 碱 基 配 对 的 方式 结合 起 来 .然后 ,结合 在 酶 上 的

Cs 的 第 4 和 第 5 号 C 之 间 的 磷酸 二 酯 键 受 到 此 酶 的 末 线 型 内 含 子

端 G 残 基 的 38-OH 的 攻击 。 结 果 在 酶 的 末端 G 与 底 物 7 |
的 未 端 C 之 间 形 成 一 个 磷酸 二 酯 键 ,从 而 产生 一 个 -GPC 前 接 的 RNA |
共 价 中 产物 ,与 此 转 酯 作用 发 生 的 同时 C, 被 释放 出 来 ( 伟 耻 人生 和 |

了 。 此 新 生成 的 高 度 不 稳定 的 磷酸 二 酯 键 可 被 水 分 子 攻 图 12 47 设想 的 四 膜 虫 内 信子

击 , 结 果 释 出 pC ,并 使 酶 恢复 原状 以 上 三 步 反应 就 起 到 自我 前 接 的 催化 机 抽

了 L19 RNA 的 核糖 核酸 酶 活性 的 作用 。 引 自 T. Cech. RNA as an Enzyme，COpy<

另 一 方面 ,此 GpC 酶 中 产物 可 结合 上 另 一 个 Cs 分 right (DO 1986 by Scientific American Inc
子 , 然 后 此 Cs 分 子 攻击 GpC ,结果 产生 Ce 并 使 酶 恢复 原状 。 此 步骤 起 到 了 L19 RNA 的 聚合
酶 作用 。 可 见 , 共 价 中 产物 -GpC 既 可 被 OH 攻击 , 亦 可 被 第 二 个 底 物 的 3 -OH 攻击 .高 PH 有
利于 进行 水 解 , 而 高 浓度 的 Cs 底 物 则 促进 转 酯 作用 以 生成 Ce. 连续 的 转 酯 作用 可 使 生成 的 (cs
延长 为 C， 以 至 更 长 些 的 寡 聚 体 。
382

此 RNA 性 质 的 酶 的 催化 功效 与 蛋白 质 性 质 的 酶 相 比 情况 如 何 ? 看 来 ,L19 RNA 的 催化
功效 没有 功效 最 高 的 蛋白 质 性 质 的 酶 那样 高 ,但 与 一 般 的 酶 相似 。 它 催化 Cs 水 解 的 速度 约 为
不 催化 时 速度 的 10" 倍 。 很 明显 ,RNA 分 子 和 和 蛋白质 一 样 , 是 能 够 作为 很 有 效 的 催化 剂 的 。 和
蛋白 质 一 样 ,RNA 分 子 是 能 够 形成 精确 的 三 维 结构 以 结合 特异 的 底 物 和 稳定 暂 态 分 子 的 。 然
而 ,RNA 与 蛋白 质 的 不 同 之 处 在 于 , 它 不 能 形成 大 的 非 极 性 吉 袋 。 而 且 由 于 RNA 是 由 仅 4 种
结构 元 件 (building block ) 构 成 的 ,蛋白 质 则 是 由 20 种 构成 的 ,所 以 RNA 的 多 面 手 性 能 远 不
如 有 蛋白质。 因此 ,大 多 数 的 酶 是 蛋白 质 。 但 必须 记 住 , 蛋 白质 并 非 唯一 的 催化 剂 。 现 在 把 RNA
性 质 的 酶 叫做 核 酶 (ribozyme) ,除了 L19 RNA 外 已 发 现 了 一 些 其 它 的 核 酶 。 看 来 核 酶 更 适合
于 识别 和 催化 单 链 的 核酸 分 子 , 因 为 核 酶 和 这 类 底 物 用 的 是 共同 的 碱 基 配 对 的 语言 。

Gon
了
CCCCPC
RRRRRR
5，

H20

图 12-43 设想 的 L19 RNA 的 催化 机 制
A. 单独 存在 的 酶 ;B. Cs 以 氢 键 与 酶 连接 起 来 ,并 且 其 末尾 的 pC 与 酶 的 末端 G 以 共 价 键 连 在 一 起 。 剩 余 的 C4
部 分 由 酶 上 解 离 出 来 ;C._GpC 水 解 使 酶 恢复 为 其 原来 状态 ; D. 另 一 条 途径 是 , 共 价 联结 着 的 pC 可 被 第 二 个 Cs 分
子 攻击 ,从 而 生成 Ce。 引 自 A.J. Zaug and 工 . R. Cech. Science. 1985. 231 :473.

核 酶 的 发 现 使 得 人 们 对 于 生命 的 起 源 有 了 新 的 认识 。 以 前 一 般 认 为 ,由 于 DNA 和 蛋白 质
是 生命 的 最 基础 物质 ,因而 生命 的 最 初 形 式 必定 是 DNA 或 者 蛋白 质 。 然 而 DNA 的 复制 需要
和 蛋白质 ( 酶 ) 的 催化 ,而 特定 蛋白 质 分 子 的 合成 又 必须 以 DNA 为 模板 , 因而 二 者 究竟 是 那 一 种
首先 出 现 ,实在 难以 推断 。 核 酶 的 发 现 使 得 人 们 普遍 认为 :生命 的 最 初 形式 大 概 是 RNA, 最 初
的 生命 界 可 能 是 个 RNA 王国 . 因为 RNA 既 可 作为 模板 而 复制 繁殖 ,同时 它 又 是 催化 剂 , 即 它
兼 有 DNA 和 有 蛋白质 二 者 的 功能 。 然 而 在 进化 过 程 中 , 由 于 作为 模板 而 遗传 的 功能 RNA 不 如
双 链 DNA 稳定 ;而 作为 催化 剂 的 功能 它 又 不 如 蛋白 质 那样 灵活 多 样 ,所 以 作为 遗传 信息 携带
者 的 功能 它 让 位 给 DNA ,作为 催化 剂 的 功能 则 大 部 分 由 蛋白 质 所 取代 ,RNA 则 仅 保留 了 它 作
为 信使 和 一 部 分 催化 作用 等 功能 ,这 就 是 目前 生命 界 的 实际 情况 这 种 推断 是 否 正确 还 有 待 实
验 的 证 明 。 在 应 用 方面 ,人 们 正在 设计 合成 特异 切割 病毒 RNA 或 其 它 RNA 的 核 酶 ,以 便 用 以
治疗 包括 艾滋 病 . 瘤 症 在 内 的 疾病 。 这 种 研究 虽然 目前 还 没有 应 用 于 临床 上 的 报道 ,但 是 是 有
前 途 的 。

四 、 和 剪 接 体 催化 的 剪接 可 能 是 由 自我 剪接 进化 产生 的

酵母 和 真菌 线粒体 中 的 mRNA 前 体 也 发 生 上 自我 剪接 , 单 细 胞 生物 ,如 单 细 胞 藻 (Chla-my-
383

donionas) 叶绿体 中 的 某 些 RNA 前 体 也 是 自我 剪接 。 自 我 剪接 反应 可 按 攻 击 上 游 剪 接 位 点 的

单元 的 本 质 进行 分 类 。I 类 自我 剪接 是 由 一 个 乌 苷 辅助 因子 激发 的 ,就 像 前 面 所 说 四 腊 虫 中 的 。

那 种 情况 。 工 类 自我 剪接 的 攻击 单元 是 内 含 子 中 一 个 特异 腺 苷 酸 的 2-OH( 图 12-44)。 转 移 量
RNA 前 体 中 的 内 含 子 是 用 一 种 完全 不 同 的 剪接 方式 剪接 掉 的 ,例如 ,酵母 中 酷 氨 酸 tRNA 前 上
体 中 的 一 个 14- 核 苷 酸 内 含 子 是 先 由 内 切 酶 切除 ,然后 由 连接 酶 将 上 游 和 下 游 两 个 片段 联结 是
在 一 起 而 剪接 掉 的 。
I 类 和 工 类 自我 剪接 在 两 方面 与 剪接 体 催 化 的 剪接 是 类 似 的 。 第 一 ,起 始 的 步骤 是 由 一 个
核糖 的 羟基 攻击 5 剪接 位 点 。 然 后 新 生成 的 上 游 外 显 子 的 3 -OH 末端 攻击 3 剪接 位 点 ,从 而
与 下 游 外 显 子 之 间 形 成 一 个 磷酸 二 酯 键 。 第 二 ,两 步 反 应 都 是 转 酯 作用 ,反应 中 在 每 个 剪接 位
点 处 的 磷酸 基 团 都 保留 在 产物 中 。 磷酸 二 酯 键 的 数目 维持 不 变 。I 类 剪接 还 有 两 点 与 mRNA
前 体 的 剪接 体 催 化 的 剪接 方式 相似 。 第 一 , 头 一 步 裂解 作用 是 由 内 含 子 本 身 的 一 部 分 (A 的 2-
OH) 引 发 的 ,而 不 是 由 一 个 外 部 辅助 因子 (G7) 引 发 的 . 第 二 ,内 含 子 是 以 套 索 的 形式 释放 出 来 。

自我 剪 接 的 内 含 子 核 内 mRNA 的 剪接 体

和 下

A
P
HO as Ho 人

图 12-44 自我 剪接 和 剪接 体 催 化 的 剪接 的 比较
在 I 和 工 类 剪接 中 催化 位 点 是 由 内 含 子 自身 形成 的 :与 之 相反 ,细胞 核 中 mRNA 前 体 的 前 接 是 由 剪接 体 中 的
snRNAs 催化 的 。 引 自 P.A. Sharp. Science， 1987. 235:769.

Phillip Sharp 提出 ,mRNA 前 体 的 剪接 体 催化 的 剪接 作用 是 由 RNA 催化 的 自我 前 接 作
用 进化 出 来 的 。 工 类 剪接 作用 恰好 是 I 类 剪接 作用 和 高 等 真 核 生 物 细胞 核 中 的 前 接 作用 之 间
的 一 种 中 间 形 式 。 由 工 类 剪接 作用 过 渡 到 剪接 体 催化 的 剪接 作用 的 一 个 主要 步骤 ,是 将 催化 力
由 内 含 子 自身 转 给 其 它 分 子 。 剪 接 体 的 形成 给 予 了 内 含 子 新 的 自由 ,因为 它 不 再 被 迫 必 须 提供
剪接 的 催化 中 心 了 。 用 外 部 催化 剂 进行 剪接 的 另 一 个 优点 是 更 易于 调控 前 接 作用 。 我 们 的 眼
界 已 经 开阔 到 认识 更 多 的 早期 RNA 王国 与 当代 生命 界 之 间 的 潜在 连续 性 ，
384

: 参考 文献
寻

1. Lehninger,A.L. ,Nelson,D. L. and Cox,M. M. Principles of Biochemistry 《2nd ed. ), Worth Publishers，
(Chapters 23. )1993. :

2. Stryer,L. Biochemistry (4th ed. ). W. H. Freeman and Company, (Chapters 33 and 37. )1995,

3. Lewin ,B. Genes V,Oxford University Press, (Chapters 22,23,24,25,26,27 and 28. )1994，

〈 齐 顺 章 )

|
|
]

385

第 十 三 章 ” 真 核 基因 表达 的 调控

真 核 基 因 表 达 的 调控 是 当前 分 子 生 物 学 中 最 活路 的 研究 领域 之 一 。 当 内 外 环境 发 生 改 变
时 ,生物 常用 调控 某 些 基 因 表 达 和 另 些 基因 不 表达 的 方式 以 及 表达 量 的 多 少 进行 适应 。 而 且 细
胞 的 生长 和 增殖 ,个 体 发 育 过 程 中 的 细胞 分 化 ,都 是 以 基因 表达 的 调控 为 基础 的 。 本 章 首先 介
绍 真 核 基因 表达 调控 的 一 般 原 理 , 然 后 在 此 基础 上 介绍 关于 调控 细胞 增殖 和 个 体 发 育 过 程 的
已 有 资料 。

第 一 节 ” 真 核 基因 表达 的 调控

自从 60 年 代 Monod 和 Jacob 用 经 典 和 遗传 学 的 方法 揭示 出 原核 基因 表达 的 操纵 子 调控 模
式 起 ,人 们 就 开始 企图 用 类 似 的 方法 研究 真 核 基因 表达 的 调控 机 制 。 然 而 直到 70 年 代 DNA
重组 技术 出 现 之 前 没有 任何 实质 性 的 进展 。 这 主要 是 由 于 在 原核 生物 中 行 之 有 效 的 遗传 分 析
方法 在 真 核 中 难以 使 用 ,加 上 难以 获得 真 核 生物 的 突变 体 , 因而 使 真 核 生 物 基因 表达 调控 机 制
的 阑 明 至 少 比 原核 生物 推迟 了 20 年 。

重组 DNA 技术 的 出 现 , 使 得 真正 的 研究 真 核 基因 的 结构 及 其 表达 调控 的 机 制 成 为 可 能 。 |
例如 ,可 以 将 一 个 特定 的 真 核 基因 (基因 组 基因 或 cDNA) 分 离 出 来 ,从 而 分 析 它 的 编码 区 和 上 慎
游 .下 游 侧 机 (flanking) 序 列 , 然 后 按 设计 的 方案 进行 各 种 改造 ,再 送 回 细胞 中 进行 表达 。 根 据
改造 后 表达 情况 的 变化 ,可 以 找 出 调控 此 基因 表达 的 序列 ,并 进一步 研究 其 调控 机 制 。 转 基因
动 \ 植 物 的 成 功 , 更 使 我 们 有 可 能 在 完整 生物 中 研究 其 基因 表达 的 调控 机 制 。 由 于 研究 真 核 基
因 表达 的 调控 无 论 在 理论 上 或 实践 中 都 有 十 分 巨大 的 意义 ， 因而 近年 来 这 方面 的 研究 非常 活
路 ,文章 浩如烟海 ,已 揭示 出 来 了 大 量 的 事实 , 下面 做 简要 介绍 。

一 .和 原核 相 比 真 核 基因 表达 调控 的 一 些 特点

真 核 基因 表达 调控 的 许多 基本 原理 和 原核 是 相同 的 。 例 如 ,和 原核 一 样 , 真 核 基 因 表 达 的
调控 也 有 转录 水 平 的 调控 和 转录 后 的 调控 ,并 且 也 以 转录 水 平 的 调控 为 最 重要 。 又 如 ,在 真 核 ，
结构 基因 的 上 游 和 下 游 ( 甚 至 内 部 ) 也 存在 着 许多 特异 的 调控 成 分 ,并 依靠 特异 蛋白 因子 与 这 量 。
些 调 控 成 分 的 结合 与 否 调 探 着 基因 是 否 转录 .然而 已 经 发 现 ， 在 真 核 基因 表达 的 调控 中 至 少 有
4 个 带 普 遍 性 的 与 原核 不 同 的 机 理 , 即 : 届 原 核 的 染色 质 是 裸露 的 DNA ,而 真 核 的 染色 质 则 题
由 DNA 与 组 蛋白 紧密 结合 形成 为 核 小 体 ( 见 第 十 二 章 )。 在 原核 中 染色 质 的 结构 对 基因 的 表
达 没 有 明显 的 调控 作用 ,而 在 真 核 中 这 种 作用 是 明显 的 。 包 在 原核 基因 转录 的 调控 中 , 既 有 用
激活 物 的 调控 (阳性 调控 或 正 调控 ), 也 有 用 阻 遏 物 的 调控 (阴性 调控 或 负 调 控 ) ,二 者 同等 重
要 。 在 真 核 中 虽然 也 有 正 调 控 成 分 和 负 调 控 成 分 ,但 迄今 已 知 的 主要 是 正 调控 。 而 且 一 个 真 核
基因 通常 都 有 多 个 调控 序列 , 必须 有 多 个 激活 物 同 时 特异 地 结合 上 去 才能 启动 基因 的 转录 。@)
原核 基因 的 转录 和 翻译 通常 是 在 同一 地 点 同时 进行 的 (图 13-1), 即 在 转录 尚未 完成 之 前 翻译

386

中 便 已 开始 。 而 真 核 基因 的 转录 是 在 细胞 核 中 进行 ,生成 的 初级 转录 物 需 在 核 中 加 工 为 成 熟 的
mRNA, 然 后 mRNA 进入 胞 质 ,在 胞 质 中 进行 翻译 。 所 以 真 核 基因 的 转录 和 翻译 是 在 不 同 地
点 不 同时 间 进 行 的 ,从 而 使 得 真 核 基因 的 表达 有 多 种 转录 后 的 调控 机 制 ,其 中 许多 机 制 是 原核
所 没有 的 。 包 真 核 生物 大 都 为 多 细胞 生物 ,在 个 体 发 育 过 程 中 发 生 细胞 分 化 后 ,不 同 细胞 的 功
能 不 同 , 基 因 表 达 的 情况 也 就 不 一 样 , 茶 些 基 因 仅 特 异地 在 某 种 细胞 中 表达 , 称 为 细胞 特异 性
或 组 织 特异 性 表达 ,因而 具有 调控 这 种 特异 性 表达 的 机 制 .以 上 是 现在 已 知 的 真 核 基 因 表 达 调
控 的 特点 ,是 否 还 有 其 它 特 点 , 尚 待 进一步 发 掘 。

13-1 在 原核 中 转录 和 翻译 是 紧密 偶 联 的 (A); 在 真 核 中 则 转录 和 翻译 是 在 空间 和 时 间 上 都 是 分 开 的 (B)

二 调控 蛋白 与 DNA 结合 的 方式

前 已 述 及 ,基因 表达 调控 的 基本 方式 是 靠 调控 蛋白 与 基因 调控 成 分 的 特异 结合 ,也 靠 调控
蛋白 与 调控 蛋白 之 间 的 特异 结合 ,这 在 真 核 和 原核 生物 中 都 是 一 样 的 。 因 此 ,在 讨论 真 核 基因
表达 调控 的 具体 机 制 之 前 , 先 介 绍 一 下 蛋 日 质 与 DNA 之 间 以 及 蛋白 质 披 此 之 间 的 结合 方式
是 必要 的 。
调控 蛋白 通常 是 结合 在 特异 的 DNA 序列 上 。 但 也 与 非特 异 DNA 序列 结合 ,不 过 与 特异
序列 结合 的 亲和力 要 比 非特 异 序列 一 般 高 10 一 10" 倍 。 这 种 区 别 的 分 子 原理 曾经 是 深入 研究
的 课题 。 一 个 带 普遍 性 的 结论 是 ,调控 蛋白 通常 有 独立 的 结合 DNA 的 结构 域 。 而 且 , 这 种 结构
城中 与 DNA 接触 的 亚 结构 的 结构 基 元 仅 有 少数 几 种 。
(一 ) 蛋 白质 对 特异 DNA 序列 的 识别
在 讨论 这 些 蛋 白质 的 结构 之 前 , 先 看 一 看 能 够 被 调控 蛋白 所 识别 的 DNA 表面 ,这 是 调控
蛋白 能 与 特异 DNA 序列 相 结合 的 分 子 基础 。 为 了 特异 地 结合 ,调控 蛋白 必须 能 够 将 它 特异 结
合 的 DNA 序列 与 其 它 序列 区 分 开 来 ,这 种 区 分 是 靠 暴 露 在 DNA 大 沟 ( 它 易于 被 蛋白 质 接触 )
表面 的 不 同 碱 基 的 基 团 有 所 不 同 , 并 且 主 要 是 靠 这 些 基 团 是 氢 键 的 给 体 或 受 体 的 情况 不 同 ( 图
13-2) 而 识别 出 来 。 因 此 ,在 大 多 数 蛋白 质 与 DNA 之 间 的 接触 中 ,其 特异 结合 是 靠 氢 键 的 形
成 。 一 个 明显 的 例外 是 在 喀 啶 C-5 附近 的 非 极 性 表面 ,在 该 处 由 于 胸腺 喀 啶 有 个 凸 出 的 甲 基 而
易于 将 它 与 胞 喀 喧 区 分 开 来 。 蛋 白质 和 DNA 也 能 在 DNA 的 小 沟 处 接触 ,但 这 里 可 以 形成 氢
键 的 花样 一 般 不 易于 将 不 同 的 碱 基 区 分 开 来 。

387

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图 13-2 在 DNA 的 大 沟 中 DNA 碱 基 对 暴露 的 功能 团
注意 不 同 碱 基 对 露出 的 功能 团 的 分 布 位 置 是 不 同 的 , 藉 此 蛋白 质 可 将 不 同 的 碱 基 对 识别 出 来 。

对 于 调控 蛋白 来 说 ,最 常见 的 其 侧 链 与 DNA 的 碱 基 形 成 氢 键 的 氨基 酸 残 基 有 天 冬 酰胺 、
谷 酰胺 、 谷 氨 酸 、 赖 氨 酸 和 精 氨 酸 。 有 没有 一 个 简单 的 “识别 密码 ”? 按 此 密码 某 个 氨基 酸 总 是
与 某 个 碱 基 配 对 ? 在 谷 酰胺 或 天 冬 酰 胺 与 腺 味 叭 的 N* 和 N-7 位 之 间 形成 两 个 氢 键 (图 13-3
A) ,它们 不 能 与 任何 其 它 碱 基 形成 这 种 样子 。 同 样 , 一 个 精 氨 酸 残 基 可 与 鸟 味 叭 的 N-7 和 0 形
成 两 个 氢 键 (图 13-3B) .然而 ,在 鉴定 了 许多 DNA 与 蛋白 质 相 结合 的 结构 证 明 ,一 个 蛋白 质

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谷 酰胺 或 H CH， 和
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13-3 在 DNA 和 调控 蛋白 相 结合 的 结构 中 观察 到 的 特异 氨基 酸 和 碱 基 对 相互 作用 的 两 个 例子

388

识别 碱 基 对 的 方式 是 多 种 多 样 的 ,不 存在 简单 的 密码 。 有 些 蛋 白质 是 用 谷 酰胺 - 腺 味 叭 的 相互
作用 识别 A 一 T 碱 基 对 ,而 另 些 蛋白 质 则 是 用 适合 于 胸腺 喀 啶 的 甲 基 的 范 德 华 袋 (van der
Waals pocket) 的 机 制 识 别 A 一 工 碱 基 对 .现在 还 不 可 能 用 测定 结合 DNA 的 蛋白 质 的 结构 来
推断 该 蛋白 质 所 结合 的 DNA 序列 。

调控 蛋白 结合 DNA 的 结构 域 看 来 是 比较 小 的 460 一 90 个 氨基 酸 残 基 )。 真 正 与 DNA 接
触 的 仅 是 这 些 结构 域 中 的 一 小 套 氨基 酸 , 并 且 在 这 些 氨基 酸 存 在 之 处 的 蛋白 质 结 构 不 是 随意
的 。 已 发 现在 很 多 调控 蛋白 中 有 两 种 结构 基 元 (structural motif ) 在 与 DNA 结合 中 起 着 主要 的
作用 : 即 锌 指 (zinc finger) 基 元 和 螺旋 -转角 -螺旋 (helix-turn-helix) 基 元 。 在 某 些 蛋白 质 中 还 存
在 有 其 它 的 与 DNA 结合 的 基 元 ,但 这 里 着 重 讨论 这 两 种 研究 得 比较 清楚 的 基 元 。

(二 ) 锌 指 (zinc finger)

13-4 示 出 了 锌 指 的 结构 ,在 其 中 一 小 组 保守 的 氨基 酸 与 一 个 锌 离子 结合 起 来 ,形成 蛋
白质 中 一 个 相对 独立 的 结构 域 。 有 两 类 与 DNA 结合 的 蛋白 质 具 有 这 种 结构 , 即 经 典 的 锌 指 蛋
白 (zinc finger protein ) 和 类 固 醇 受 体 (steroid receptor ) 。

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图 13-4 转录 因子 SP1 有 一 排 3 个 锌 指 ,每 个 都 有 个 特征 性 样式 ，
即 用 半 胱 氨 酸 和 组 氨 酸 残 基 构 成 结合 锌 的 位 点

13-4 中 所 示 为 经 典 的 锌 指 和 蛋白 ,通常 有 一 系列 锌 指 。 单 个 锌 指 的 共有 序列 为 ;

半 胱 -X~= 半 胱 -X:- 共 两-X:- 亮 -X2z- 组 -X3s- 组 ,把 这 种 基 元 叫做 锌 指 是 因为 有 个 氨基 酸 的
环 , 由 锌 结合 位 点 凸 出 如 手指 ,上述 锌 指 又 叫做 半 胱 2/ 组 2 锌 指 。 锌 被 抓 持 在 由 保守 的 半 胱 氨
， 酸 和 组 氨 酸 残 基 形成 的 四 面体 结构 中 。 锌 指 本 身 由 约 23 个 氨基 酸 组 成 , 锌 指 间 的 联结 物 (lin-
ker) 通 常 是 7 一 8 个 氨基 酸 。

解释 具有 公认 的 锌 指 时 必须 谨慎 ,特别 是 在 解释 一 个 仅 具有 一 个 锌 指 的 蛋白 质 时 更 是 如
此 。 因为 锌 指 可 以 是 与 RNA 的 结合 有 关 , 而 不 参与 和 DNA 的 结合 ,甚至 与 任何 核酸 的 结合
没有 关系 。 例 如 ,最 初 鉴 定 的 锌 指 蛋白 ,TF EACRNA 聚合 酶 下 转录 5 S rRNA 基因 时 所 需要
的 转录 因子 ) 既 与 5 S 基 因 结 合 , 也 与 转录 产物 5 S rRNA 结合 。 翻 译 起 始 因子 ,eIF26 有 一 个
锌 指 , 它 的 突变 影响 对 起 始 密码 子 的 识别 。

然而 , 锌 指 是 与 DNA 结合 的 蛋白 质 常见 的 基 元 。 锌 指 通常 组 织 成 为 一 个 串联 重复 的 样
子 , 但 也 有 多 于 一 组 的 锌 指 。 不 同 蛋白 质 的 锌 指数 目 不 同 .在 TF KEA 中 锌 指 的 数目 多 至 9 个 ，
它们 几乎 占 了 整个 蛋白 质 的 长 度 。 在 果 蝇 调节 物 ADR1 中 则 仅 有 2 个 锌 指 , 它 们 仅 为 蛋白 质
的 一 个 小 的 结构 域 。 在 转录 因子 SP1 的 结合 DNA 的 结构 域 中 有 3 个 锌 指 (图 13-4)。

389

图 13-5 为 TFIEA 分 子 中 9 个 锌 指 与 DNA 结合 的 模式
图 .。 锌 指 的 尖端 可 进入 DNA 的 大 沟 或 小 沟 , 以 识别 它 特 异 结
合 的 DNA 序列 并 与 之 结合 。 每 个 锌 指 结合 约 5 bp ,相当 于 双
螺旋 的 半 转 。9 个 锌 指 共 结 合约 45 bp, 与 5S rRNA 基因 的 内
部 启动 子 的 长 度 相近 .5 S rRNA 基因 的 启动 子 在 转录 起 始 位
点 的 下 游 , 即 在 基因 的 内 部 。TF IEA 特异 识别 此 启动 子 序列
并 与 之 结合 。 在 一 分 子 TF EA 与 此 序列 结合 而 形成 复合 体
后 ,TFIEC,TFEB 和 RNA 聚合 酶 开 依 次 结合 上 去 使 5 S
rRNA 基因 得 以 转录 。

在 转录 时 ,TFIEA 仍然 结合 在 基因 上 。 有 多 个 锌 指 的 优
点 之 一 是 , 当 RNA 聚合 酶 下 通过 时 ,TFIEA 的 一 些 锌 指 可
将 DNA 的 模板 链 释放 出 来 ,而 其 余 的 锌 指 则 仍 结合 在 双 螺
旋 上 ,或 结合 在 编码 链 上 。

由 于 已 知 在 RNA 聚合 酶 工 和 下 的 一 些 转录 因子 中 具有
锌 指 ,因而 当 一 个 蛋白 质 具 有 多 个 锌 指 时 ,可 以 认为 它 可 能 是
个 转录 因子 。 用 这 种 观点 鉴定 出 来 了 在 果 蝇 胚胎 发 育 过 程 中

图 13-5 TFEA 的 结构 域 结 构
9 个 锌 指 与 5 S rRNA 基因 的
内 部 调控 区 结合 促进 其 转录

, 蜀 已 珊 起 作用 的 一 些 转录 因子 。
8 己 国 另 一 类 锌 指 蛋 白 是 类 固 醇 受 体 ( 和 一 些
e 9 2 其 它 蛋 白质 ) .由 于 这 类 锌 指 是 由 两 对 半 胱 氨 四
个 有 9 酸 残 基 与 Zn2+ 形 成 的 ,所 以 也 叫做 半 胱 2/ 半 村
es 32。 光 co 胱 2 锌 指 ( 但 也 有 人 不 把 它 归 为 锌 指 一 类 )。
sie 9 已 知 的 这 种 锌 指 结合 的 DNA 区 比较 短 ,并

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合 。 两 种 受 体 中 相同 的 序列
有
图 13-6 类固醇 受 体 的 第 1 个 锌 指控 制 与 DNA 结合
的 特异 性 ,第 2 个 锌 指控 制 形成 二 聚 体 的 特异 性
390

且 是 回 文 结 构 。 糖 皮质 激素 和 肉 激 素 受 体 都
有 两 个 锌 指 ( 图 13-6)。 实 验 表 明 , 当 将 类 固
醇 受 体 的 后 两 个 半 胱 氨 酸 残 基 突 变 为 组 氨 酸
残 基 时 , 它 就 不 能 再 活化 其 靶 基 因 了 .。 可 见 半
胱 2/ 半 胱 2 锌 指 和 半 胱 2/ 组 2 锌 指 是 不 同
类 型 的 锌 指 , 不 能 交换 使 用 它们

类 固 醇 激素 受 体 是 以 二 聚 体形 式 发 挥 其
促进 转录 作用 的 ( 详 见 后 面 )。 它 们 的 两 个 锌
指 的 功能 不 同 。 第 1 个 锌 指 的 右 侧 是 控制 与
DNA 结合 的 ,第 2 个 锌 指 的 左 侧 则 是 控制 形
成 二 聚 体 的 能 力 的 .第 1 个 锌 指控 制 与 DNA
结合 的 直接 实验 证 据 是 , 当 将 峻 激素 受 体 的

此 锌 指 缺 失掉 , 并 用 糖 皮质 激素 受 体 的 此 和 锌

指 取 代 时 , 则 新 蛋白 质 识 别 糖 皮质 激素 受 体
的 靶 位 点 (GRE 序列 ) ,不 再 识别 肉 激素 受 体
的 靶 位 点 (ERE 序列 ) 了 。 可 见 , 此 区 域 规定
了 它 识 别 DNA 序列 的 特异 性 。

GRE 和 ERE 序列 是 很 相似 的 ,进一步 的 实验 证 明 , 区 分 这 两 个 序列 是 依靠 第 1 个 锌 指 中
的 两 个 氨基 酸 。 糖 皮质 激素 受 体 和 峻 激素 受 体 之 间 在 序列 上 的 差异 主要 是 在 锌 指 的 基部 。 将
按 图 13-6 中 指明 的 位 置 改变 氨基酸 时 , 则 糖 皮质 激素 受 体 不 再 结合 CRE ,而 是 结合 在 ERE
上 了 。 放 今 仅 在 真 核 生 物 中 发 现 有 锌 指 蛋 白 , 在 原核 中 尚未 发 现 。

(三 ) 螺 旋 - 转 角 - 螺 旋

这 种 与 DNA 结合 的 蛋白 质 基 元 首先 是 在 原核 中 发 现 ,并 且 是 首先 详细 研究 过 的 。 许 多 原
核 的 调控 蛋白 (例如 鸣 菌 体 的 Cro 蛋白 , 它 与 DNA 的 结合 样式 已 被 详细 研究 了 ) 都 是 以 这
种 方式 与 DNA 结合 的 。 螺 旋 -转角 -螺旋 基 元 的 基本 组 成 是 :两 个 “螺旋 被 一 个 8- 转 角 隔 开 。
此 结构 本 身 通 常 不 稳定 ,但 它 是 较 大 的 结合 DNA 的 结构 域 的 活性 部 分 。 两 个 必 螺 旋 之 一 是 起
识别 作用 的 螺旋 , 因为 它 通 常 含 有 多 个 与 DNA 相互 作用 的 氨基 酸 残 基 , 并 且 被 安置 在 大 沟
中 。 目前 发 现 许多 真 核 调控 蛋白 也 含有 与 之 非常 相似 的 与 DNA 结合 的 这 种 基 元 ,例如 同 源 异
型 域 就 是 如 此 。

同 源 异 型 域 Chomeodomain) 最 初 是 由 调控 果 蝇 早期 发 育 的 调控 蛋白 中 发 现 的 (其 名 称 来
源 朋 一 级 结构 等 详 见 第 三 节 )。 编码 此 结构 域 的 DNA 序列 称 为 同 源 异 型 框 (homeobox)。 在 果
蝇 中 调控 其 早期 发 育 的 一 大 类 基因 中 的 同 源 异 型 框 的 同 源 性 很 高 ,而 同 源 异 型 框 外 的 序列 则
很 少 同 源 性 。 后 来 发 现 , 同 源 异 型 域 广泛 存在 于 真 核 生 物 的 蛋白 质 中 , 并且 不 限于 调控 发 育 的
调控 蛋白 中 ,在 其 它 转录 因子 中 也 存在 同 源 异 型 域 , 但 它们 的 保守 性 不 像 上 述 果 蝇 中 的 一 大 类
的 保守 性 那样 高 。 同 源 异 型 域 担负 着 含有 它 的 蛋白 质 与 DNA 结合 的 作用 ,不 同 的 同 源 异 型 域
特异 的 识别 不 同 的 DNA 序列 。 同 源 异型 域 有 3 个 注 螺旋 。 图 13-7 是 果 蝇 engraziiea 基因 产物
的 同 源 异 型 域 与 DNA 结合 的 模式 图 . 从 图 中 可 以 看 出 ,螺旋 3 结合 在 DNA 的 大 沟 中 , 它 是 蛋
白质 和 DNA 的 主要 接触 部 位 。 螺 旋 3 的 一 些 部 位 与 磷酸 骨架 结合 ,这 是 没有 特异 性 的 。 但 中
间 部 分 则 与 碱 基 相 结合 ,这 种 结合 规定 着 特异 性 。 螺 旋 2 和 螺旋 3 形成 螺旋 -转角 -螺旋 式样 ，
螺旋 1 和 螺旋 2 为 反 平 行 样式 ,它们 与 螺旋 3 近 于 垂直 。 此 外 ,在 结构 域 N 端 有 个 伸展 的 臂 ，
它 伸 入 到 小 沟 中 ,成 为 蛋白 质 与 DNA 的 另 一 个 接触 位 点 。

| ”螺旋 1 和 ?处 于 DNA 之 上
站) N- 末 端 臂 位 于 小 沟 中 |

螺旋 3 位 于 大 沟 中

图 13-7 “” 果 蝇 engrailea 基因 的 产物 与 DNA 结合 的 模式 图
同 源 异 型 域 的 螺旋 3 结合 在 DNA 的 大 沟 中 ,螺旋 1 和 2 则 居于 双 螺 旋 的 外 侧 。
螺旋 3 与 磷酸 骨架 和 特异 碱 基 都 接触 。N- 末 端 辟 居于 小 沟 中 ,形成 额外 的 接触 。

381

三 \ 调 控 和 蛋白 与 蛋白 质 结 合 的 方式

调控 蛋白 除了 与 DNA 结合 的 结构 域外 ,通常 还 有 与 蛋白 质 结 合 的 结构 域 ,用 以 和 RNA
聚合 酶 其它 调 控 恒 白 相 互 作用 ,也 用 于 相同 调控 蛋白 分 子 之 间 的 作用 。 调 控 蛋 白 所 结合 的
DNA 区 常常 是 一 小 段 反 向 重复 的 DNA 序列 ( 回 文 结构 ), 因而 常常 是 2 个 或 4 个 同一 调控 蛋
白 分 子 结合 在 此 序列 上 .例如 ,在 原核 中 ,Cro 蛋白 是 以 二 聚 体 结合 在 DNA 的 一 段 特 异 回 文 序
列 上 ,lac 阻 遇 物 则 由 相同 亚 基 组 成 的 四 聚 体 结合 在 乳糖 操纵 子 的 操纵 基因 上 。

在 真 核 中 ,许多 转录 因子 以 二 聚 体 结 合 在 DNA 上 。 这 些 调控 蛋白 除了 与 DNA 结合 的 结
构 域外 ,还 有 与 蛋白 质 结 合 的 结构 域 。 这 些 结构 域 参与 二 聚 体 的 形成 。 这些 二 聚 体 有 的 是 由 相
同 亚 基 所 组 成 , 称 为 同 二 聚 体 (homodimer); 有 的 则 由 不 同 亚 基 所 形成 , 称 为 异 二 聚 体 (hete- ，
rodimer) 。 二 聚 体 的 形成 是 它 与 DNA 结合 的 必要 条 件 . 和 蛋白质 与 DNA 结合 的 基 元 一 样 , 媒
介 和 蛋白 质 -蛋白质 相互 作用 的 蛋白 质 结构 基 元 也 可 归属 于 几 种 类 型 .其 中 鉴定 得 比较 清楚 的 有
螺旋 - 环 -螺旋 和 亮 氨 酸 拉链 两 种 。

(一 ) 螺 旋 - 环 -螺旋 Chelix-loop-helix ,HLH)

含有 螺旋 - 环 - 螺 旋 的 蛋白 质 称 为 螺旋 - 环 - 螺 旋 蛋 白质 (HLH 蛋白 ), 它们 的 HLH 的 共同
结构 特点 是 :在 一 个 40 一 50 个 氨基 酸 残 基 的 片段 中 有 两 个 双亲 (amphipathic)w- 螺 旋 , 两 个 螺
旋 用 长 度 不 等 的 联结 区 ( 环 ) 分 开 。 此 类 和 蛋白质 用 两 个 螺旋 的 相应 面 上 的 朴 水 基 间 相互 作用 的
方式 形成 同 二 聚 体 和 蜡 二 聚 体 .螺旋 区 为 15 一 16 个 氨基 酸 长 ,每 个 螺旋 都 有 几 个 保守 残 基 。 图
13-8 比较 了 两 个 例子 。 形 成 二 聚 体 的 能 力 是 靠 双 亲 -螺旋 ,这 对 所 有 的 HLH 蛋白 都 是 如 此 。
环 的 作用 大 概 只 是 使 得 两 个 螺旋 区 能 够 互 不 依赖 的 自由 地 起 作用 。

MyoD Ala Asp Arg Arg Lys Ala Ala Thr Met Arg Gln Arg Arg Arg 碱 性 区

Id Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Gln Glu Glu Val Asn Val Leu Id 中 没有 6 个 保守 残 基
MyoD Leu Ser Lys Val Asn Gln Ala Phe Gln Thr Leu Lys Arg Cys Thr 螺旋 1

可 Leu Tyr Asp Met Asn Gly Cys ITyr Ser Arg Leu Lys Gln Leu Val “MyoD 和 1a 中 都 有 保守 残 基
MyoD Lys Val Gln Jle Leu Arg Asn Ala lle Arg Iyr lle Gln Gly Leu Glu 螺旋 2

Id Lys Val Gln Jle Leu Glu His Val lle Asp Iyr Jle Arg Asp Leu Glu

13-8 所 有 HLH 蛋白 都 有 螺旋 1 和 螺旋 2, 并 用 10 一 24 个 残 基 的 环 将 它们 分 开
碱 性 HLH 蛋白 在 紧邻 螺旋 1 处 有 个 具有 保守 正 电荷 的 区 域 。 下 面 划 线 者 为 保守 残 基 。

从 图 13-8 中 可 以 看 出 ,在 MyoD 的 HLH 基 元 附近 有 个 高 度 碱 性 的 区 段 ,此 区 段 是 结合
DNA 所 必需 的 ,大 多 数 HLH 蛋白 有 此 区 段 , 含 有 此 区 段 的 HLH 蛋白 称 为 碱 性 HLH 蛋白
(basic HLH protein,bHLH 蛋白 )。 图 中 还 示 出 ,在 bHLH 蛋白 中 ,其 14 个 氨基 酸 的 碱 性 区 段
内 有 约 6 个 残 基 是 保守 的 。 而 有 些 HLH 蛋白 (如 图 中 的 Id) 则 缺乏 此 碱 性 区 段 ,或 者 含有 破坏
此 碱 性 区 段 功能 的 且 氨 酸 残 基 。

已 知 的 bHLH 蛋白 有 :E12 和 47, 它 们 是 结合 在 一 个 免疫 球 蛋 白 基 因 的 增强 子 中 的 三 不
元 件 (Celement) 上 的 两 种 蛋白 质 ;MyoD 、 肌 细胞 生成 素 (myogenin) 和 Myf-5 都 是 参与 肌 细胞
生成 (myogenesis ) 的 转录 因子 ;zzyc 基因 类 [它们 是 致癌 基因 的 细胞 对 应 物 (counter-part)] 的

产物 ,它们 参与 生长 调节 ;和 果 蝇 中 一 类 规定 神经 系统 发 育 的 因子 。bHLH 蛋白 按 其 表达 情况
可 分 为 两 类 : 一 类 是 在 各 种 组 织 中 广泛 表达 的 蛋白 质 , 其 中 有 哺乳 动物 的 E12,E17 和 果 蝇 的
392

da 蛋白 ; 另 一 类 是 组 织 特异 性 表达 的 ,如 哺乳 动物 的 MyoD 和 果 蝇 的 AC-S。 组 织 特异 性 的
bHLH 蛋白 类 可 能 是 转录 调节 物 , 它 们 和 广泛 表达 类 的 蛋白 质 形成 异 二 聚 体 时 最 有 效 。
bHLH 蛋白 是 以 二 聚 体 与 DNA 结合 并 发 挥 作 用 的 。 一 个 同 二 聚 体 或 一 个 异 二 聚 体 的 两
个 亚 基 都 有 碱 性 区 时 才能 与 DNA 结合 。HLH 结构 域 的 作用 大 概 是 正确 安置 这 两 个 (由 每 个
亚 基 提供 一 个 ) 碱 性 区 的 位 置 .但 由 不 同 bHLH 蛋白 形成 的 二 聚 体 与 DNA 结合 的 能 力 有 所 不
同 .例如 ,E47 的 同 二 聚 体 ,E12-E47 的 异 二 聚 体 和 MyoD-E47 的 异 二 聚 体 都 能 有 效 地 形成 ,并
有 较 强 的 与 DNA 结合 的 能 力 ;E12 的 同 二 聚 体 也 能 有 效 地 形成 ,但 与 DNA 的 结合 很 差 ; 而
MyoD 的 同 二 聚 体 本 身 就 不 易 形 成 。 为 什么 会 有 这 种 差异 ,目前 还 不 清楚 , 即 我 们 还 不 能 根据
HLH 的 序列 来 推断 二 聚 体 是 否 易于 形成 以 及 它们 与 DNA 结合 的 强度 。
与 DNA 结合 的 能 力 不 同 是 因为 HLH 基 元 内 部 或 其 邻近 区 域 的 性 质 不 同 之 故 。 例 如 ,和
E47 不 同 ,El12 的 碱 性 区 附近 有 抑制 区 , 它 抑 制 了 12 的 同 聚 物 与 DNA 结合 。 有 些 HLH 蛋白，
例如 ,前面 提 到 的 Id ,没有 碱 性 区 和 /或 含有 破坏 其 功能 的 且 氨 酸 残 基 。 此 类 和 蛋白质 形成 二 聚
体 的 能 力 与 bHLH 蛋白 相同 ,然而 在 一 个 二 聚 体 中 含有 一 个 这 样 的 亚 基 , 它 就 不 再 能 够 与
DNA 特异 地 结合 了 。 这 有 力 地 证 明了 ,在 与 DNA 结合 的 蛋白 质 中 ,其 与 DNA 结合 的 基 元 加
倍 是 非常 重要 的 。 而且 已 知 ,在 不 同 条件 下 形成 不 同 的 二 聚 体 ( 能 够 和 不 能 与 DNA 结合 的 ) 是
调控 基因 表达 的 重要 方式 之 一 ,因为 调节 物 蛋 白 调控 基因 表达 的 先决 条 件 是 它 必 须 与 DNA
特异 结合 。
(二 ) 亮 氨 酸 拉链 (leucine zipper)
此 种 结构 基 元 的 特点 是 蛋白 质 的 “- 螺 旋 的 一 侧 集 中 了 许多 下 水 氨基 酸 ,两 分 子 蛋 白质 的
这 种 朴 水 侧面 相互 作用 使 之 形成 二 聚 体 。 这 些 %- 螺 旋 的 一 个 突出 特点 是 频繁 出 现 亮 氢 酸 ,并
且 趋 于 每 7 个 氨基 酸 残 基 出 现 一 个 亮 氨 酸 ,这 种 出 现 频率 使 得 在 形成 螺旋 时 , 亮 氨 酸 出 现在
x“- 螺 旋 的 朴 水 一 侧 , 并 且 直 线 排列 ,如 图 13-9 所 示 。 早 期 设想 的 这 些 必 螺 旋 之 间 的 蛋白 质 - 蛋
白质 相互 作用 的 模式 是 亮 氨 酸 残 基 的 交错 插 和 人 ,因而 把 它 叫 成 亮 氨 酸 拉链 。 现 在 已 知 ,在 两 个
蛋白 质 上 的 亮 氨 酸 残 基 是 肩 并 肩 地 排列 起 来 的 ,并 且 相 互 作 用 的 两 个 -螺旋 是 彼此 缠绕 在 一
起 ,成 为 螺旋 了 的 螺旋 (coiled coil) 。
亮 氨 酸 拉链 蛋白 在 序列 上 的 另 一 个 共同 特点 是 ，
在 拉链 区 的 氨基 端 有 个 约 30 个 残 基 的 碱 性 区 ( 富 含 赖
氨 酸 和 精 氨 酸 ) 。 此 区 的 作用 是 与 DNA 结合 , 它 也 形
成 -螺旋 。 亮 氨 酸 拉链 区 的 作用 是 将 一 对 与 DNA 结
合 的 区 域 拉 在 一 起 ,以 结合 两 个 相 邻 的 DNA 序列 。 两
个 亮 氨 酸 拉链 蛋白 形成 二 聚 体 时 构成 立 字形 ,螺旋 了
的 螺旋 是 Y 字 的 干 , 而 碱 性 区 则 为 其 臂 。 每 个 碱 性 区
的 - 螺 旋 看 来 是 发 生 弯曲 , 以 便 缠 绕 在 DNA 的 大 沟
中 。 亮 氨 酸 拉链 蛋白 在 真 核 中 广泛 存在 ,在 原核 中 也 已
有 所 发 现 。 图 13-9 表明 亮 氢 酸 拉链 蛋白 结合 在 二
酵母 中 的 GCN4 是 个 亮 氨 酸 拉链 蛋白 , 它 是 酵母 ”个 回 文 的 靶 DNA 序列 上 的 模式 图
细胞 在 对 氮 基 酸 饥 狐 发 生 应 答 时 合成 的 。GCN4 同步 引 诈 C.R.Viisoa. 及 避 5
活化 40 多 个 基因 的 转录 ,这 些 基 因 都 编码 氨基 酸 合成 L. Meknight. Scienee. 1989. 246;911. 加 代
的 酶 .GCN4 二 聚 体 激 活 物 结合 在 9 bp 的 一 个 回 文 序 。” 表 亮 氨 酸 。

393

列 上 ,此 序列 位 于 氮 基 酸 合成 的 基因 的 上 游 。GCN4 有 个 酸性 的 转录 活化 结构 域 ,此 结构 域 是 玫
与 碱 性 的 结合 DNA 区 以 及 亮 氨 酸 拉链 区 分 隔 开 的 (图 13-10).。 当 结合 在 DNA 上 时 ,此 活化 结
构 域 与 TATA 框 处 的 转录 因子 ID(CTF TD)7 相 互 作用 而 启动 转录 ( 详 见 后 )。
与 TATA 框 上 的 TFID
和 生生 识别 回 文 的 四 序列 “二 取 化

图 13-10 ”酵母 中 一 个 转录 激活 物 ,GCN4 的 结构 域 结构
GCN4 促进 编码 氨基 酸 合成 的 酶 类 的 基因 表达 。

在 高 等 真 核 生 物 中 , 亮 氨 酸 拉链 蛋白 媒介 环 状 AMP(cAMP) 对 转录 的 效应 。cAMP 调控
的 基因 含有 一 个 <AMP 应 答 元 件 (CRE) , 它 是 个 回 文 的 8 bp DNA 序列 ,其 共有 序列 为 :
ETCAGGTCA-3
BACxRGCAGTS/
一 个 叫做 cAMP 应 答 元 件 结合 蛋白 (CREB) 的 43 kD 蛋白 质 结合 在 DNA 的 此 靶 序 列 上 。 两 个
CREB 分 子 以 亮 氢 酸 拉链 的 方式 形成 二 聚 体 ,从 而 把 两 个 分 子 中 结合 DNA 的 碱 性 区 域 拉 在
一 起 ,并 将 它们 定位 成 与 回 文 的 CRE 结合 。cAMP 是 怎样 调控 CREB 的 转录 活性 的 ? cAMP
是 由 G 蛋白 级 联 产生 的 , 它 活 化 蛋白 激酶 ACPKA)。PKA 是 个 多 功能 激酶 , 它 催 化 CREB 磷
酸化 ,CREB 磷酸 化 后 增强 了 二 聚 化 作用 ,从 而 提高 了 它 作为 一 个 转录 激活 物 的 效应 。

亮 氢 酸 拉链 蛋白 可 形成 同 二 聚 体 或 异 二 聚 体 ,GCN4 和 CREB 都 是 同 二 聚 体 的 例子 .哺乳
动物 的 转录 因子 AP1( 激 活 物 蛋 白 1) 是 一 组 异 二 聚 体 .AP1 的 组 成 成 分 有 2: 其 一 是 基因 <c-jzz
的 表达 产物 Jun，c-7zzn 是 动物 细胞 中 与 病毒 的 癌 基 因 v-yzn 的 对 应 物 。 后 来 在 动物 细胞 中 还
发 现 有 基因 jzxzB,yjzxzD, 它 们 与 c-7zz 的 序列 同 源 性 很 高 。 所 以 现在 已 知 有 3 种 序列 相似 的
Jun 蛋白 ,它们 都 有 亮 氢 酸 拉链 ,能 形成 同 二 聚 体 , 也 能 形成 异 二 聚 体 .AP1 的 另 一 组 成 成 分 是
Fos , 它 是 c-js 基因 的 产物 ,c-jos 也 是 病毒 癌 基 因 "yjos 的 细胞 对 应 物 。 在 细胞 中 也 有 一 组 与
Fos 类 似 的 蛋白 质 , 除 Fos 外 ,其 它 蛋 白质 都 叫做 Fos 相关 抗原 (Fos-related antigens,FRA)，

它们 组 成 一 个 Fos 样 蛋白 家 族 。
Fos 也 有 亮 氨 酸 拉链 ,Fos 不 能 形成 同 二 聚 体 ,但 Fos 能 与 Jun 形成 异 二 聚 体 。 事 实 是 ，
Jun-Fos 异 二 聚 体 比 Jun-Jun 同 二 聚 体 更 稳定 。Jun-Fos 和 Jun-Jun 识别 的 是 相同 的 DNA 上
的 靶 位 点 , 即 API1 结合 位 点 。

看 来 ,多 种 亮 氨 酸 拉链 蛋白 可 用 各 种 不 同 的 组 合 形成 很 多 种 不 同 的 同 二 聚 体 或 异 二 聚 体 。
例如 ,ATF-CREB 家 族 有 13 个 成 员 ,它们 间 可 以 彼此 三 聚 化 形成 13 种 同 二 聚 体 和 78 种 异 二
聚 体 。 亮 氨 酸 拉链 家 族 生动 地 表明 ,用 组 合 的 结合 (combinational association ) 可 产生 不 同 的 调
控 蛋 白 , 它们 能 阅读 很 多 种 不 同 的 DNA 序列 。 螺 旋 - 环 -螺旋 蛋白 的 情况 也 是 如 此 。

四 、 活 泼 转 录 区 染色 质 的 结构 发 生 改 变

前 已 述 及 ,和 原核 不 同 , 真 核 染色 体 是 有 高 度 组 织 结构 的 。 这 种 结构 对 基因 的 表达 有 没有
调控 作用 ? 回答 是 肯定 的 。 因 为 现在 虽然 还 不 清楚 这 种 结构 调控 基因 表达 的 机 制 是 怎样 的 ,但
394

。 已 有 许多 实验 表明 活泼 转录 区 的 核 小 体 结构 与 非 转录 区 的 结构 有 所 不 同 。 而 且 用 体外 再 造 的
染色 质 所 做 的 实验 结果 表明 ,这 种 结构 对 基因 的 表达 有 着 明显 的 影响 。

说 明 染 色 质 中 转录 活泼 区 结构 发 生 改 变 的 一 个 明显 事实 是 ,这 些 区 对 核酸 酶 的 敏感 性 提
高 了 。 当 用 核酸 酶 ,例如 DNase I 消化 未 发 生 转录 的 染色 质 时 ,得 到 的 是 约 200 bp 长 的 片段 ，
这 是 由 于 核酸 酶 仅 能 作用 于 核 小 体 核心 部 分 以 外 的 DNA 特异 位 点 上 ,而 核心 部 分 由 于 受到
组 蛋白 的 保护 作用 而 不 被 消化 ,此 结果 反映 出 染色 质 的 重复 的 核 小 体 结构 .然而 在 活泼 转录 区
形成 的 片段 更 小 ,而 且 长 短 也 不 均一 ,说 明 这 些 区 有 对 核酸 酶 高 度 敏 感 的 序列 , 称 之 为 超 敏 感
位 点 。 仅 在 发 生 基因 表 达 的 细胞 中 才能 发 现 有 这 种 对 核酸 酶 超 敏 感 的 位 点 ,可 见 它 与 基因 的 转
录 有 关 。 已 发 现 ,这 些 位 点 通常 位 于 被 转录 基因 的 5 端 1 000 bp 的 侧 要 内 ,但 也 有 位 于 离 5 端
更 远 一 些 \3' 端 附近 和 甚至 基因 内 部 的 。 许 多 超人 敏感 位 点 相当 于 已 知 的 调控 蛋白 所 结合 的 位
点 。 现 在 看 来 ,这 些 位 点 之 所 以 对 核酸 酶 敏感 是 由 于 该 处 的 核 小 体 结构 已 不 完整 ,使 核酸 酶 易
于 起 作用 之 故 。 这 种 核 小 体 的 变 为 不 完整 可 能 是 使 调控 蛋白 易于 结合 ,或 者 是 由 于 调控 蛋白 的
结合 引起 了 核 小 体 结构 的 不 完整 。

正在 转录 的 染色 质 处 DNA 的 另 一 个 变化 是 其 甲 基 化 程度 降低 了 .已 知 在 真 核 DNA 中 的
CpG 序列 的 胞 喀 啶 是 普遍 甲 基 化 的 。 然 而 许多 基因 在 表达 它们 的 组 织 中 ,其 附近 的 CpG 序列
的 甲 基 化 程度 低 于 不 表达 它们 的 组 织 中 。

在 转录 时 观察 到 的 另 一 个 明显 变化 是 组 蛋白 和 有 关 蛋 白质 的 改变 。 活 泼 转 录 的 染色 质 趋
于 缺乏 组 蛋白 Hl ,而 且 其 它 的 核心 组 蛋白 则 被 乙酰 基 化 或 与 泛 素 (Cubiquitin ,一 种 蛋白 质 , 它
的 已 知 功能 是 它 与 某 种 蛋白 质 结合 后 ,使 该 蛋白 质 易于 降解 , 即 给 需要 降解 的 蛋白 质 打上 标
签 ) 相 结合 而 被 修饰 。 有 些 情况 下 ,在 非常 活泼 的 转录 区 ,例如 ,许多 真 核 细胞 的 rRNA 基因 处
是 没有 核 小 体 结构 的 .所 有 这 些 事实 提示 , 活 浚 转录 的 染色 质 是 通过 去 掉 潜 在 的 结构 障碍 而 为
转录 做 好 准备 的 ,但 发 生 这 些 变化 的 机 制 却 不 甚 明了 。

在 体外 将 组 蛋白 加 到 真 核 DNA 中 可 实现 染色 质 的 再 造 。 例 如 ,将 等 分 子 的 H2A,H2B，
H3 和 H4 加 到 DNA 中 可 形成 核 小 体 。 最 近 用 这 种 再 造 体系 进行 的 体外 转录 实验 的 结果 可 以
看 出 ,染色 质 结构 对 基因 的 表达 有 明显 的 影响 。 再 造 的 核 小 体 比 裸 露 DNA 转录 的 速度 慢 得
多 ,如 果 再 加 上 H1( 完 全 再 造 的 染色 质 ), 则 转录 的 速度 更 慢 。 然 而 当 将 转录 因子 加 到 完全 再 千
的 染色 质 中 时 ,可 使 转录 的 速度 提高 100~200 倍 ,达到 体内 的 水 平 ,但 对 裸露 DNA 的 转录 速
度 仅 能 提高 约 10 倍 。 这 些 结果 提示 ,组 蛋白 对 基因 的 转录 在 一 定 情况 下 起 阻 遏 作用 ;在 另 种 情
况 下 又 起 激活 作用 ,转录 因子 可 能 是 引起 基因 的 启动 子 区 核 小 体 结构 发 生 明显 改变 这 种 实验

的 另 一 个 有 意义 的 发 现 是 关于 增强 子 的 效应 。 在 体内 转录 时 增强 子 的 效应 不 受 它 与 被 转录 基
因 的 距离 的 影响 ,但 用 裸露 的 DNA 在 体外 转录 时 则 不 成 ,只 能 是 用 完全 再 造 的 染色 质 时 才能
实现 体内 观察 到 的 增强 子 的 效应 。

五 .大 多 数 真 核 启动 子 是 受 正 调控 的 原因

一 般 说 来 , 真 核 RNA 聚合 酶 对 其 启动 子 只 有 很 小 或 者 没有 特异 的 亲 和 性 ,转录 的 启动 几
乎 总 是 依靠 一 个 ,而 更 经 常 的 是 多 个 激活 物 蛋 白 的 作用 。 尽管 真 核 的 调控 蛋白 在 某 些 条 件 下 可
以 是 激活 物 或 阻 过 物 ,但 广泛 应 用 的 是 正 调控 , 负 调 控 成 分 看 来 不 普遍 。
真 核 基 因 的 表达 普遍 采用 正 调控 的 原因 可 能 有 二 :中 由 于 真 核 基 因 组 比 原核 的 大 很 多 , 因
而 调控 蛋白 在 DNA 上 的 非特 异性 结合 便 成 为 一 个 很 重要 的 问题 。 随 着 基因 组 的 加 大 ,一 个 特
395

异 结合 蛋白 质 的 DNA 序列 在 不 适当 位 置 随机 出 现 的 可 能 性 也 加 大 。 在 这 种 情况 下 ,能 够 保证
调控 基因 特异 表达 的 方法 之 一 就 是 使 用 多 个 调控 蛋白 ,因为 几 个 分 别 特异 结合 几 种 不 同调 控
蛋白 的 DNA 序列 ,能 够 以 适当 的 有 功能 的 方式 排列 在 一 起 的 随机 发 生 的 可 能 性 几乎 是 没有
的 。 然 而 用 多 种 蛋白 质 调控 一 个 基因 的 表达 必须 都 是 正 调控 才能 做 到 特异 的 调控 ,因为 如 果 是
用 几 种 阻 巡 物 进行 调控 , 则 只 要 结合 上 一 种 即 足 以 封 阻 RNA 聚合 酶 的 作用 。 但 是 由 于 是 用 几
种 正 调 挖 蛋白质, 则 这 些 蛋 白质 必须 同时 分 别 结 合 在 DNA 特异 序列 上 ,并 且 然 后 形成 复合 体
才能 启动 转录 ,这 样 就 保证 了 基因 的 特异 表达 。 现 在 看 来 ,一 个 多 细胞 生物 基因 的 调节 位 点 ( 即
调控 蛋白 特异 结合 的 序列 ) 平 均 至 少 是 5 个 ;中 真 核 基 因 普 遍 采 用 正 调控 的 第 二 个 可 能 的 原因
是 ,由 于 真 核 基因 所 含 基因 的 数目 很 多 ,但 在 分 化 了 的 不 同 细胞 中 ,每 种 细胞 只 需 表 达 一 小 套
基因 。 例 如 ,人 的 基因 组 中 大 约 含有 100 000 个 基因 ,但 在 不 同 的 每 种 细胞 中 却 只 分 别 表达 其
中 不 同 的 一 小 部 分 。 如 果 是 用 负 调 控 , 则 任何 细胞 都 需要 合成 100 000 种 不 同 的 阻 遏 物 蛋 白 ，
而 且 它们 的 浓度 都 必须 达到 足以 特异 地 结合 在 调控 位 点 上 ,以 封 阻 每 个 基因 的 表达 .而 采用 正
调控 , 则 由 于 每 种 细胞 的 大 部 分 基因 通常 是 不 表达 的 ( 即 RNA 聚合 酶 不 结合 在 其 启动 子 上 )，
表达 的 仅 为 一 小 部 分 ,因此 ,每 种 细胞 仅 合成 它 需要 的 一 小 套 激 活 物 蛋白 就 可 以 了 , 这 就 大 大
减轻 了 细胞 合成 蛋白 质 的 负担 . 除 上 述 两 种 可 能 的 原因 外 , 真 核 基 因 普 遍 采 用 正 调控 是 否 还 有
其 它 的 原因 , 尚 需 进 一 步 探讨 。

六 ` 真 核 细 胞 中 有 3 种 RNA 聚合 酶

在 原核 中 ,RNA 是 由 一 种 聚合 酶 合成 的 。 而 在 真 核 的 细胞 核 中 则 有 3 种 RNA 聚合 酶 , 它
们 的 模板 特异 性 、. 所 处 位 置 和 对 抑制 剂 的 敏感 性 是 彼此 不 同 的 ( 表 13-1) 。RNA 聚合 酶 [位 于
核 仁 中 , 它 在 核 仁 处 转录 前 后 排列 的 一 批 18 S,5.8 S 和 28 S 核糖 体 RNA 的 基因 。 另 一 个 核糖
体 RNA 分 子 (5 S rRNA)7 和 所 有 的 转移 RNA 分 子 是 由 RNA 聚合 酶 开 合 成 的 ,此 酶 位 于 核 浆
中 。 信 使 RNA 的 前 体 是 由 RNA 聚合 酶 工 合 成 的 ,此 酶 也 位 于 核 浆 中 。 一 些小 的 RNRA 分 子 ，
例如 ,剪接 装置 中 的 U1 snRNA 也 是 由 聚合 酶 工 合成 的 。

表 13-1 真 核 的 RNA 聚合 酶

类 型 位 置 转录 产物 “- 忽 襄 草 碱 的 效应
I 核 仁 18 S,5.8 和 和 28 S rRNA 不 敏感
I 核 浆 mRNA 前 体 和 snRNA 强烈 抑制
开 核 浆 tRNA 和 .5 S rRNA 高 浓度 抑制

和 原核 的 一 样 , 真 核 RNA 聚合 酶 在 催化 RNA 合成 时 也 是 以 核糖 核 苷 三 磷酸 为 底 物 , 按
DNA 模板 链 的 指令 ,由 5 -~3!' 方 向 一 个 核 音 酸 一 个 核 昔 酸 地 联结 上 去 。 真 核 RNA 聚合 酶 也
不 需要 引物 , 它 也 没有 核酸 酶 活性 ,这 意味 着 初始 RNA 中 的 错误 不 被 校正 。

三 种 真 核 RNA 聚合 酶 都 是 大 的 蛋白 质 , 分子量 为 500 kD 或 更 大 ,由 8 一 14 个 亚 基 组 成
提纯 的 酶 可 按 模板 转录 出 RNA, 但 不 能 选择 性 地 从 启动 子 处 开始 。 关 于 亚 基 的 鉴定 对 RNA
聚合 酶 工 做 的 比较 多 ,其 中 唯一 把 所 有 亚 基 都 确定 了 的 是 酵母 的 RNA 聚合 酶 工 。 真 核 RNA
聚合 酶 IE 有 3 个 特性 是 保守 的 :@ 它 们 含有 8 一 12 个 亚 基 ,酵母 的 由 11 个 亚 基 组 成 ;@ 它 们 含
有 两 个 大 的 亚 基 (分 别 约 为 220kD 和 140kD) ,命名 为 RPB1 和 RPB2, 它 们 相当 于 原核 核心

酶 中 起 催化 作用 的 8 亚 基 和 记 亚 基 。 其 最 大 (220kD) 亚 基 的 羧基 末端 结构 域 (carboxy1l-termi-
396

nal domain,CTD) 是 值得 注意 的 , 它 由 共有 序列 : 酷 - 丝 - 且 - 苏 - 丝 - 且 - 丝 的 多 个 重复 所 组 成 ,此
序列 是 RNA 聚合 酶 工 独 有 的 。 在 酵母 中 有 27 个 这 种 CTD 序列 ,在 哺乳 动物 中 有 50 多 个 。
CTD 序列 是 由 磷酸 化 作用 调节 的 ,它们 参与 识别 活化 信号 。 此 区 域 是 非常 重要 的 ,因为 发 现 含
有 突变 的 RNA 育 合 酶 工 的 酵母 中 , 当 此 酶 的 CITD 序列 少 于 10 个 时 是 不 能 存活 的 ;所 有 的
RNA 聚合 酶 工 都 含有 3 个 共同 的 亚 基 (CRPB5,6 和 8)。 而 且 这 些 亚 基 在 RNA 聚合 酶 I 和 下
中 也 存在 。 线 粒 体 和 叶绿体 的 RNA 聚合 酶 与 细菌 的 相似 , 而 不 与 任何 核 中 的 酶 相似 。

世界 上 每 年 都 有 上 百 的 人 死 于 食用 毒 蘑菇 ,尤其 是 4mranzta ppaliozdes。 此 种 毒 蘑 的 毒素
之 一 叫做 - 鹅 膏 曹 碱 (camanitin), 它 是 个 环 状 八 肽 ,对 RNA 聚合 酶 工 有 强烈 的 抑制 作用 ,从
而 封 阻 了 mRNA 前 体 的 合成 。 较 高 浓度 (1 wmol/L) 的 - 鹅 膏 草 碱 抑制 RNA 聚合 酶 工 , 但 聚
合 酶 I 对 此 毒素 不 敏感 。

七 、 真 核 启动 子 和 转录 因子

和 细菌 的 RNA 聚合 酶 一 样 , 在 启动 转录 时 真 核 RNA 聚合 酶 也 需要 辅助 因子 ,并 且 在 随
后 的 转录 过 程 中 就 不 需要 了 。 然 而 辅助 因子 的 作用 则 真 核 的 与 原核 的 有 所 不 同 。 在 细菌 中 是
RNA 聚合 酶 自己 识别 启动 子 成 分 ,但 在 真 核 中 主要 是 由 辅助 因子 识别 启动 子 的 组 成 序列 , 而
不 是 RNA 聚合 酶 本 身 。
真 核 的 3 种 RNA 聚合 酶 的 启动 子 是 不 同 的 ,但 它们 的 共同 特点 是 都 含有 特定 的 一 套 短
的 保守 序列 ,每 个 序列 都 由 特定 的 蛋白 因子 所 识别 并 与 之 结合 ,然后 这 些 蛋白 因子 与 RNA 聚
合 酶 相互 作用 以 形成 起 始 复合 体 , 由 此 复合 体 启 动 转 录 。RNA 聚合 酶 I 和 下 的 启动 子 的 这 种
保守 序列 的 数目 较 少 ,所 需要 的 辅助 因子 也 比较 少 .RNA 聚合 酶 工 的 启动 子 的 这 种 序列 很 多 ，
变化 也 很 大 ,所 需 的 辅助 因子 当然 也 就 很 多 。 由 此 可 见 , 真 核 启 动 子 的 定义 和 原核 启动 子 的 定
义 是 有 所 不 同 的 。 细 菌 的 启动 子 是 由 RNA 聚合 酶 本 身 所 识别 并 结合 的 ,所 以 可 定义 为 RNA
聚合 酶 结合 区 ,此 区 域 在 转录 起 始 位 点 附近 。 启 动 子 的 附近 虽然 也 有 对 启动 子 起 调控 作用 的 序
列 ( 如 操纵 基因 ) 人 动 子 的 一 部 分 .而 真 核 启 动 子 的 多 个 保守 序列 都 不
是 由 RNA 聚合 酶 本 身 所 识别 和 结 ,因而 不 能 定义 为 RNA 聚合 酶 结合 区 .从 实用 出 发 , 真
人 点 附近 的 序列 ,这 些 序列 都 是 启动 转录 所 必
需 的 。 而 把 识别 并 结合 在 这 些 序 列 上 的 蛋白 因子 都 称 为 转录 因子 。
需要 说 明 的 是 ,上 述 关 于 真 核 启动 子 的 定义 中 没有 把 增强 子 序列 包括 在 内 ,因为 增强 子 序
列 可 以 距离 转录 起 始 位 点 很 远 。 然 而 增强 子 是 参与 启动 转录 的 序列 ,因此 上 述 定义 并 非 严格 的
定义 ,我 们 也 不 一 定 要 把 启动 子 和 增强 子 绝 对 地 分 开 。 增 强 子 并 非 RNA 聚合 酶 工 所 独 有 ，
RNA 聚合 酶 I 的 启动 子 也 受 增 强 子 的 协同 作用 , 当然 它们 是 与 RNA 聚合 酶 ! 的 增强 子 不 同
的 增强 子 。 此 外 , 转录 因子 也 不 一 定 都 直接 结合 在 DNA 上 。 有 些 转录 因子 结合 在 其 它 转录 因
子 上 以 形成 转录 装置 。 因 此 ,一 ww 性 指标 是 看 它 的 功能 , 即 发 生 转 录 所 必需 的
蛋白 质 才 是 转录 因子 。
《一 )RNA 聚合 酶 I 的 启动 子
在 真 核 细胞 的 核 中 RNA 聚合 酶 I 的 启动 子 样 式 最 少 ,RNA 聚合 酶 I 仅 由 一 种 样子 的 启
动 子 转录 rRNA 的 基因 。 图 13-11 表示 出 此 启动 子 的 结构 以 及 与 启动 转录 有 关 的 过 程 。 对 人
类 细胞 中 的 RNA 聚合 酶 I 的 启动 子 研究 得 最 清楚 , 它 由 起 始 位 点 上 游 区 域 中 的 两 个 序列 组
成 。 核 心 启 动 子 (core promoter) 在 起 始 位 点 周围 (一 45 一 十 20), 它 足 以 启动 转录 ,然而 它 的 效
397

RNA 聚合 酶 I 的 启动 子 由 两 个 序列 所 组 成

CT <SSAGT 二

受 本 入 全 全 于 汪 人

-170 -160 -~150 一 140 -130 -120 -00 一 50 -40 -~30 -20 一 10 +10 ”+20

人 NANANANOANANOANA CNONNONONRSANSAN

起 始 复合 体 按 三 步 装配

_UBF1 结合 到 富 含 GrC 的 序列 上
aa

SL1 协同 地 结合 到 UBF1 上

了 3 男 汪
号 E 全
SCSNCRANCN

13-11 RNA 聚合 酶 I 的 启动 子 由 一 个 核心 启动 子 组 成 , 它 与 上 游 调控 元 件 用 70 bp 分 开 。
UBE1 与 两 个 区 都 结合 ,随后 SL1 能 够 结合 。 再 后 RNA 聚合 酶 ! 与 核心 启动 子 结合
率 被 上 游 调控 元 件 (upstream control element ,UCE) 大 大 地 提高 .UCE 位 于 一 180 一 一 107。 两 ，
个 区 都 各 有 一 个 富 含 GC 的 特异 序列 ,二 者 约 85% 相 同 。
RNA 聚合 酶 I 需要 两 个 辅助 因子 :UBF1 和 SL1。UBF1 能 结合 在 核心 启动 子 和 UcE
上 。SL1 自己 不 能 结合 在 启动 子 上 ,然而 一 旦 UBF1 结合 上 了 ,SL1 便 可 与 之 协同 地 结合 在 六
大 了 的 DNA 区 域 上 。 二 旦 两 个 因子 都 结合 了 ,RNA 聚合 酶 I 便 能 结合 到 核心 启动 子 上 以 启
动 转录 。 可 以 设想 结合 在 核心 启动 子 上 的 辅助 因子 是 与 RNA 聚合 酶 1 直接 相互 作用 的 ,但 还

不 清楚 结合 在 UCE 上 的 相同 因子 是 怎样 促进 转录 的 。 后 面 我 们 将 要 谈 到 关于 RNA 聚合 酶 工
启动 子 的 类 似 情况 。

UBF 1 是 个 单 链 多 肽 , 它 特异 地 结合 在 核心 启
398

动 子 和 UCE 的 富 含 GC 的 元 件 上 .UBF1 和

RNA 育 合 酶 I 能 对 异 源 的 模板 有 效 地 作用 ,例如 ,小 鼠 的 UBF1 因子 和 聚合 酶 工 能 识别 人 的
基因 。SL1 因子 具有 种 属 特异 性 ,小 鼠 SL1 不 能 在 人 的 模板 上 启动 转录 ,反之 亦 然 。

SL1 由 4 个 蛋白 质 组 成 。 其 中 之 一 叫做 TBP( 名 称 来 源 见 后 ), 它 也 是 RNA 聚合 酶 工 和 下
启动 转录 所 需 的 一 个 因子 .RNA 聚合 酶 I 所 需 的 TBP 在 品种 间 是 很 保守 的 , 它 不 负责 种 属 特
异性 ,也 不 与 富 含 GC 的 DNA 序列 特异 结合 。 可 见 种 属 特异 性 以 及 和 DNA 结合 都 是 SL1 其
它 组 分 的 任务 。 看 来 TBP 是 与 RNA 聚合 酶 相互 作用 的 。SL1 的 行为 类 似 于 细菌 的 c 因子 。 分
离 出 来 的 SL1 不 特异 地 结合 到 启动 子 上 ,但 与 其 它 蛋 白质 结合 时 特异 地 结合 于 启动 子 区 。 在
保证 将 RNA 育 合 酶 定位 于 适当 的 起 始 位 点 处 它 大 概 负 有 主要 的 责任 。 下 面 将 要 谈 到 ,由 TBP
和 其 它 蛋 白质 结合 而 成 的 因子 对 RNA 聚合 酶 工 和 开具 有 类 似 的 功能 .可见 所 有 3 种 RNA 聚
合 酶 在 启动 转录 中 的 一 个 共同 特点 是 依靠 一 个 定位 因子 (Positioning factor), 此 因子 是 由
TBP 与 其 它 蛋 白质 结合 而 成 的 ,而 其 它 蛋 白质 则 是 对 每 种 启动 子 特异 的 。

(二 )RNA 聚合 酶 下 的 启动 子

RNA 育 合 酶 下 的 启动 子 有 两 种 。5 S rRNA 和 tRNA 基因 的 启动 子 在 起 始 位 点 的 下 游 ，
即 在 基因 的 内 部 , 称 为 内 部 启动 子 (internal promoter)。 这 是 很 特殊 的 ,因为 其 它 RNA 聚合 酶
以 及 RNA 育 合 酶 开 的 另 一 种 启动 子 都 是 在 起 始 位 点 的 上 游 . RNA 聚合 酶 下 的 另 一 种 启动 子
是 snRNA( 核 内 小 RNA) 基 因 的 启动 子 。 图 13-12 示 出 了 RNA 聚合 酶 下 的 3 种 类 型 的 启动
子 , 其 中 上 面 两 个 (1 型 和 2 型 ) 属 于 内 部 启动 子 , 下 面 的 1 个 (3 型 ) 为 上 游 启 动 子 。 两 种 内 部 启
动 子 都 是 由 两 个 短 序列 元 件 (sequence element) 构 成 的 , 两 个 元 件 用 可 变 的 序列 分 隔 开 1 型
由 框 (box)A 和 框 C 所 组 成 ,2 型 由 框 A 和 框 了 所 组 成 。2 型 中 框 A 和 框 B 的 距离 可 变化 很
大 ,但 不 能 相距 很 近 , 否则 将 丧失 功能 。 上 游 启 动 子 的 结构 将 在 后 面 叙述 。

1 型

ASCNNCNCNCRSCNCRCNOARSCRNONCORIANLCSNOSCRSCRCRSORCRSCOv
框 C

框 A

2 型
框 A 框 B

3 型
人 AAACACCACCASCS SCRSCNANCCARCORCRCSv

PSE TATA

13-12 RNA 聚合 酶 下 的 启动 子 类 型

13-13 概括 了 内 部 启动 子 在 启动 转录 时 所 发 生 的 过 程 。 在 此 过 程 中 有 3 个 辅助 因子 参与 ，
即 TFEA,TFEB 和 TFIHC。 在 1 型 启动 子 首先 是 TFIEA 结合 在 包含 框 C 的 一 个 序列 上 , 这
样 可 使 TF EC 结合 在 其 下 游 。TF IC 的 结合 能 使 TF EEB 结合 在 起 始 位 点 的 周围 ,TF KEB 的 结
合 是 伴随 另 一 个 TF EC 的 结合 发 生 的 ,最 后 RNA 聚合 酶 下 结合 在 起 始 位 点 周围 以 启动 转
录 。 在 2 型 启动 子 则 是 TF EC 直接 结合 在 框 B 和 框 A 处 ,然后 TFEB 就 结合 上 去 了 。

由 于 体外 实验 表明 , 当 TFEA,TFEB 和 TFIC 结合 在 启动 子 上 后 ,将 TFIEA 和 TFIC
移 去 时 ,TF EB 仍 能 结合 在 起 始 位 点 附近 ,而 且 它 的 存在 就 足以 使 RNA 聚合 酶 下 结合 在 起 始
位 点 处 ,可 见 TFEB 是 RNA 聚合 酶 下 所 需要 的 唯一 真正 启动 因子 。 然 而 TFIEB 自己 不 能 结
合 在 正确 的 DNA 位 点 上 ,要 靠 TFEA 和 TFIEC 的 帮助 ,所 以 TFEA 和 TFIC 是 组 装 因子

399

(assembly factor) ,TFIEB 是 使 RNA 聚合 酶 正确 定位 的 定位 因子 。 像 RNA 聚合 酶 :I 在 启动
转录 时 所 需 的 SL1 一 样 ,TF EB 中 也 含有 有 蛋白质 TBP,TBP 是 直接 与 RNA 聚合 酶 起 作用 的
亚 基 。

RNA 聚合 酶 下 的 第 3 型 启动 子 是 在 起 始 位 点 的 上 游 ,在 图 13-13 中 所 举 的 例子 是 由 3 个
上 游 元 件 组 成 的 , 即 TATA,PSE 和 OCT. 有 些 snRNA 基因 是 由 RNA 聚合 酶 工 转录 的 , 另 一
些 则 由 RNA 聚合 酶 开 转 录 。RNA 聚合 酶 工 转 录 的 snRNA 基因 的 启动 子 元 件 也 有 RNA 聚
合 酶 开 的 这 些 元 件 .RNA 聚合 酶 开 的 上 游 启 动 子 仅 有 TATA 元 件 时 也 能 启动 转录 ,然而 PSE
和 OCT 元 件 的 存在 大 大 提高 转录 的 效率 ,结合 在 这 些 元 件 上 的 因子 是 协同 的 相互 作用 的 。

1 型 内 部 启动 子 2 型 内 部 启动 子

[转录 起 点

NANANANN SSv ANANAN

TFIIA

NSCNNCNPNONCNNONRECBSN CNSCRNC 作

TFIIIB FRR
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作 SRRRResesae CSOSCSOSCASL | 人 ARCScsA

13-13 RNA 聚合 酶 开 内 部 启动 子 的 启动 过 程 需要 装配 因子 TF KEA 和 TFIEC， 间
启动 因子 TFEB 和 RNA 聚合 酶 上
注意 指明 每 个 因子 所 结合 的 位 置 是 它们 保护 的 DNA 区 ,而 不 是 用 分 子 的 作用 确定 的 。
例如 ,图 中 所 指出 的 是 TF EC 的 保护 区 ,但 可 能 是 单个 或 多 个 蛋白 质 所 起 的 作用 。

TTPTITTTDIORPY
N NA o 忆
人

OKCSCSCSA-

结合 在 关键 的 TATA 元 件 上 的 是 个 含有 TBPLTBP 是 TATA-binding protein(TATA:-
结合 蛋白 ) 的 简称 ] 的 因子 ,此 因子 中 的 TBP 与 前 面 提 到 的 TF EB 和 SL1 因子 中 的 TBP 是 相
似 的 ,但 该 因子 中 的 其 它 蛋 白质 则 是 特有 的 。TF EB 和 SL1 都 不 是 自己 直接 结合 在 特异 的
400

DNA 位 点 上 ,而 是 由 其 它 因 子 协助 结合 上 去 的 。 但 在 有 TATA 元 件 的 启动 子 中 , 则 是 由 TBP
直接 识别 并 特异 地 结合 到 DNA 上 的 。 现 在 看 来 ,作用 于 RNA 聚合 酶 开 的 启动 子 的 因子 有 个
基本 一 致 的 功能 , 即 RNA 聚合 酶 下 自己 不 能 特异 地 结合 在 DNA 的 一 定位 点 上 ,而 是 先 由 这
些 因子 结合 在 特定 的 DNA 位 点 上 ,形成 一 个 前 起 始 复合 体 Cpreinitiation complex), 然后
RNA 聚合 酶 开 识 别 此 复合 体 并 结合 上 去 成 为 起 始 复合 体 , 在 其 中 TBP 是 与 RNA 聚合 酶 直
接 起 作用 的 蛋白 质 。

(三 )RNA 聚合 酶 工 的 启动 子 和 转录 因子

RNA 聚合 酶 工 所 使 用 的 启动 子 结构 很 复杂 ,不 同 启动 子 在 序列 上 的 变化 很 大 。 然 而 它们
都 是 由 多 个 短 的 序列 ( 称 为 元 件 ,element) 所 构成 。 这 些 元 件 都 在 起 始 位 点 的 上 游 ,通常 是 分 散
在 一 个 大 于 100 bp 的 区 域内 。 这 些 元 件 与 元 件 之 间 的 序列 本 身 是 不 重要 的 ,但 用 它们 将 元 件
与 元 件 分 隔 开 则 可 能 是 重要 的 .不 同 启动 子 所 用 的 元 件 的 种 类 ,数目 以 及 这 些 元 件 所 处 的 位 置
都 不 同 ,尽管 有 些 元 件 可 出 现在 不 同 的 启动 子 中 。RNA 聚合 酶 工 自己 不 能 识别 这 些 元 件 并 与
之 结合 (所 以 不 能 按 原核 的 定义 把 真 核 启 动 子 也 定义 为 RNA 聚合 酶 结合 区 ) ,而 是 由 多 种 转
录 因 子 分 别 特异 地 识别 这 些 元 件 并 与 之 结合 后 ,RNA 聚合 酶 工 才能 结合 上 去 启动 转录 .。 因 此，
协助 RNA 聚合 酶 工 起 作用 的 转录 因子 很 多 ,我 们 可 把 它们 分 为 3 大 类 :

(1) 基 础 因子 (basal factor) ”这 些 是 所 有 启动 子 在 启动 RNA 合成 时 所 必需 的 因子 (所 以
也 叫做 通用 因子 ) 。 它 们 与 RNA 聚合 酶 工 结合 起 来 形成 一 个 围绕 在 起 始 位 点 周围 的 复合 体 ，
它们 决定 转录 的 起 始 位 点 。

(2) 上 游 因子 Cupstream factor) “它们 识别 并 特异 地 结合 在 起 始 位 点 上 游 的 元 件 上 ,是 普
遍 存 在 的 ,其 活性 不 受 调控 ,并 且 作 用 于 任何 具有 其 识别 的 元 件 的 启动 子 。 它 们 的 作用 是 提高
启动 的 效率 ,是 那些 功能 相当 高 的 启动 子 所 必需 的 。 每 个 启动 子 在 充分 表达 时 都 需要 特定 的 一
套 这 种 因子 。

(3) 诱 导 型 因子 (inducible factor) “其 作用 与 上 游 因子 相同 ,但 它们 是 受到 调控 的 。 它 们
在 特定 的 时 间 、 条 件 或 特定 的 组 织 中 合成 或 被 活化 ,因而 有 调控 基因 在 不 同时 间 、 条 件 或 不 同
地 点 表达 的 作用 。 因 此 ,把 它们 结合 的 元 件 叫做 应 答 元 件 (response element) 。

一 个 仅 含 有 被 基础 因子 和 上 游 因子 所 识别 的 元 件 的 启动 子 能 在 任何 种 类 的 细胞 中 进行 转
录 。 可 见 这 种 启动 子 担负 着 细胞 中 那些 组 成 型 基因 (constitutive gene), 有 时 也 叫做 持家 基因
(housekeeping gene) 的 表达 。

1. 由 RNA 聚合 酶 IE 和 通用 转录 因子 组 成 基础 转录 装置 RNA 聚合 酶 工 自己 不 能 启动

著录 , 它 必须 依靠 转录 因子 的 辅助 。 酶 和 这 些 因子 一 起 组 成 基础 转录 装置 (basal transcription
apparatus) ,此 装置 是 转录 任何 启动 子 都 必需 的 。 因 此 ,在 讨论 启动 子 的 结构 时 ,首先 要 确定 一
个 通用 (generic) 启 动 子 , 即 确定 一 个 RNA 聚合 酶 工 能 在 该 处 启动 转录 的 最 短 的 序列 ,并 鉴定
出 识别 该 序列 所 需 的 转录 因子 .通用 启动 子 应 该 能 在 任何 细胞 中 启动 转录 , 它 不 依赖 于 那些 用
于 调控 组 织 特异 性 的 序列 。 这 种 启动 子 所 需 的 转录 因子 称 为 基础 的 或 者 通用 的 转录 因子 ,用
TFITXCX 代 表 各 个 因子 ) 表 示 之 。 当 然 通用 启动 子 的 转录 效率 是 很 低 的 ,通常 需要 有 另外 的
上 游 因子 才能 达到 应 有 的 转录 水 平 。

可 以 预料 ,在 通用 启动 子 中 应 该 有 保守 序列 , 它 在 所 有 或 大 多 数 启动 子 中 应 该 是 同 源 性 很
高 的 。 然 而 分 析 表 明 , 在 转录 的 起 始 处 没有 明显 的 同 源 序 列 , 但 mRNA 的 第 一 个 碱 基 通 常 为
A, 并 且 在 基因 中 A 的 两 边 为 喀 啶 ,可 用 通 式 PyxCAPys 表示 之 。 此 区 称 为 起 始 子 Cinitiator，

401

JInr)。 仅 由 Inr 组 成 的 启动 子 是 能 被 RNA 聚合 酶 工 识 别 的 最 简单 的 启动 子 。

RNA 聚合 酶 工 的 绝 大 多 数 启动 子 具 有 TATA 框 。TATA 框 的 共有 序列 为 TATAAAA，
这 是 分 析 了 100 多 个 启动 子 得 出 的 。 点 突变 TATA 框 的 个 别 碱 基 显著 损伤 启动 子 的 活性 ,使
A 和 T 碱 基 对 换 可 引起 失 活 。 可 见 TATA 框 是 有 精确 序列 的 元 件 , 而 不 只 是 富 含 A 一 T 对 。
TATA 框 位 于 一 25 处 附近 , 它 是 真 核 启 动 子 中 唯一 与 起 始 位 点 有 固定 距离 的 元 件 , 也 是 最 靠
近 起 始 位 点 的 元 件 。 少 数 没有 TATA 框 的 启动 子 称 为 无 TATA 框 启动 子 (TATA-less pro-
moter ) 。

腺 病毒 的 晚期 启动 子 是 研究 通用 启动 子 的 有 用 材料 。 它 含有 一 个 TATA 框 和 一 个 符合
Inr 序列 的 起 始 位 点 ,在 有 基础 转录 因子 时 ,RNA 聚合 酶 工 在 体外 可 在 此 启动 子 处 启动 转录 。
用 此 体系 曾 确定 了 许多 启动 转录 所 需 的 成 分 .大 多 数 基础 转录 因子 已 被 提纯 ,它们 的 基因 也 已
克隆 。

基础 因子 有 多 种 ,它们 与 RNA 聚合 酶 工 共 同 结合 在 启动 子 处 形成 起 始 复合 体 。 根据 这 些
因子 和 RNA 聚合 酶 工 结合 上 去 的 次 序 以 及 被 它们 保护 的 DNA 区 域 ,推测 复合 体形 成 的 过 程
如 图 13-14 所 示 。 首 先 结合 上 去 的 转录 因子 是 TF ID, 它 结合 在 TATA 框 及 其 上 游 的 区 域 上 。
现在 已 知 TF ID 的 一 个 亚 基 是 特异 识别 TATA 框 的 , 称 之 为 TATA 框 结合 蛋白 .TFID 的
其 余 亚 基 叫 做 TBP- 相 关 因 子 (TBP-associated factors ,TAF) 不同 的 TF ID 可 能 含有 不 同 的
TAFs ,它们 识别 不 同 的 启动 子 。 这 个 概念 还 适用 于 其 它 RNA 聚合 酶 的 启动 子 。 前 已 述 及 ，
RNA 聚合 酶 下 的 内 部 启动 子 所 用 的 因子 是 TF EB, 聚 合 酶 I 启动 子 所 用 的 是 SL1。 可 把
TFIEB 和 SLI1 看 成 是 由 TBP 与 不 同 套 的 TAFs 结合 而 成 的 。

由 于 TBP 是 第 一 个 与 DNA 结合 的 因子 而 受到 特别 重视 。 已 知 它 是 个 分 子 量 约 30KkD 的
小 蛋白 质 。 它 的 一 个 很 独特 的 性 质 是 结合 在 DNA 的 小 沟 处 (迄今 已 知 的 所 有 DNA- 结 合 蛋 白
都 是 结合 在 大 沟 ) 。TBP 与 DNA 结合 的 区 域 的 氨基 酸 序列 在 不 同 品种 间 是 保守 的 ,而 其 可 变
的 N 端 尾 巴 则 暴露 着 以 和 其 它 蛋 白质 相互 作用 。 提 纯 的 TBP 在 体外 与 DNA 结合 时 , 它 保 护
TATA 框 处 约 一 转 的 DNA 双 螺 旋 , 典型 的 是 由 一 37 到 一 25 区 .但 在 起 始 反 应 中 TFID 的 结
合 区 为 一 45 到 一 10。TBP 是 唯一 与 DNA 特异 序列 结合 的 基础 转录 因子 。

然后 是 TF IA( 酵 母 的 由 2 个 亚 基 组 成 ,哺乳 动物 的 为 3 个 亚 基 ) 的 结合 。 它 的 结合 通过
”释放 出 一 个 TAF 而 使 TBP 活化 。 再 次 是 TF IB 的 结合 , 它 保护 由 一 10 到 十 10 区 , 即 结合 在
起 始 位 点 附近 。

然后 是 TF IE 与 RNA 聚合 酶 工 形成 的 复合 体 结合 上 去 . TF IF 由 两 个 亚 基 组 成 。 较 大 的
亚 基 具 有 DNA 解 旋 酶 (helicase) 活 性 ,在 启动 时 它 可 能 参与 解 旋 作用 . 较 小 的 亚 基 能 与 RNA 聚
合 酶 工 结合 得 很 紧 。 事实 是 IE IF 与 RNA 聚合 酶 工 结 合 在 一 起 联结 到 正在 组 装 中 的 转录 复合 ”
体 上 ,所 以 TF IF 有 把 RNA 聚合 酶 工 带 到 复合 体 上 去 的 作用 。 RNA 聚合 酶 工 的 结合 保护 了 模
板 链 至 十 15, 编码 链 至 十 20。 此 时 TFIE 能 够 结合 了 , 它 使 保护 区 向 下 游 扩 至 十 30。

在 TFIE 之 后 还 有 两 个 因子 , 即 TF IH 和 TF IJ 结合 到 复合 体 上 。TF IIH 有 激酶 活
性 , 它 能 使 RNA 聚合 酶 工 的 CTD 尾巴 磷酸 化 .这 可 能 是 RNA 聚合 酶 ! 与 转录 因子 的 分 开 所

必需 的 ,分 开 后 RNA 聚合 酶 工 便 可 离开 启动 子 进行 延伸 。

无 TATA 框 启动 子 的 情况 是 怎样 的 ? 已 知 它 需 要 的 转录 因子 与 有 TATA 框 启动 子 所 需

要 的 相同 ,其 中 包括 TF ID。 然而 由 于 它 没 有 TATA 框 , 所 以 迄今 尚 不 清楚 TF ID 是 怎样 结
合 上 去 的 。 看 来 Inr 是 个 定位 成 分 ,可 能 有 另外 一 个 因子 结合 到 Inr 上 ,然后 TF ID 再 结合 上
402

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-了 ATA--

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TFIIE

13-14 RNA 聚合 酶 工 的 起 始 复合 体 在 启动 子 处 组 装 的 过 程

去 。 无 论 如 何 ,TF ID 必定 是 以 某 种 与 结合 到 TATA 框 上 去 的 不 同 的 方式 进入 复合 体 。 可 见 ，
在 无 TATA 框 启动 子 处 TBP 的 功能 更 像 它 在 RNA 聚合 酶 I 的 启动 子 和 RNA 聚合 酶 开 的
内 部 启动 子 处 的 作用 。
许多 基础 因子 都 是 由 多 亚 基 组 成 的 ,因而 参与 在 基础 转录 装置 中 的 多 肽 的 数目 很 多 , 约 有
20 多 个 ,总 分 子 量 约 为 500kD。RNA 聚合 酶 工本 身 由 约 10 个 亚 基 组 成 ,分 子 量 也 约 为
500kD。
403

比较 一 下 RNA 聚合 酶 工 启动 复合 体 的 装配 与 原核 RNA 聚合 酶 的 异同 是 有 意义 的 。 原 核
RNA 聚合 酶 的 核心 酶 不 能 识别 启动 子 , 要 靠 ec 因子 。c 因子 是 RNA 聚合 酶 的 一 个 组 成 成 分 ，
由 它 识别 启动 子 并 使 RNA 聚合 酶 结合 在 启动 子 处 。 然 而 延伸 不 需要 c 因子 ,所 以 ,结合 在 启
动 子 上 后 将 之 释 出 以 便 核 心 酶 合成 RNA.。 因此 ,c 因子 起 着 严格 规定 转录 起 始 位 点 的 作用 。 看
来 RNA 聚合 酶 工 的 基础 转录 因子 起 着 与 原核 中 c 因子 相 类 似 的 作用 。 RNA 育 合 酶 工 自己 不
能 识别 启动 子 , 要 靠 基础 因子 来 识别 ,所 以 这 些 基础 因子 起 着 严格 规定 转录 起 始 位 点 的 作用 。
但 延伸 不 需要 它们 ,所 以 在 起 始 复合 体形 成 之 后 ,RNA 聚合 酶 工 要 与 这 些 因子 分 开 , 由 它 自己
去 合成 RNA.。 不 过 进化 使 得 这 些 因 子 更 独立 了 ,它们 不 是 组 成 RNA 聚合 酶 的 成 分 ,而 是 独立
的 转录 因子 。

在 有 TATA 框 的 启动 子 中 ,由 TATA 框 调 准 RNA 聚合 酶 工 的 位 置 ,使 它 准确 地 由 起 始
位 点 开始 转录 ,这 大 概 是 TATA 框 与 起 始 位 点 有 固定 距离 的 原因 。TATA 框 的 缺失 引起 起 始
位 点 的 不 稳定 ,尽管 对 转录 的 效率 仅 有 较 小 的 影响 。 诚 然 , 某 些 无 TATA 框 的 启动 子 没有 独特
的 起 点 ,起 点 发 生 在 一 串 起 点 中 的 任何 一 个 。

2.RNA 聚合 酶 工 的 上 游 元 件 及 其 转录 因子 ”如 上 所 述 ,RNA 聚合 酶 工 和 基础 因子 结合
在 Inr 和 其 附近 的 TATA 框 上 形成 基础 起 始 复合 体 时 是 能 够 进行 转录 的 ,然而 转录 的 效率 很
低 。 一 个 启动 子 要 达到 足够 的 转录 效率 和 具有 特异 性 ,要 靠 其 上 游 更 远 处 的 短 序列 ,这 些 序列
由 上 游 因 子 或 诱导 型 因子 所 识别 ,它们 位 于 起 点 上 游 约 100 bp 范围 内 。 当 转录 因子 结合 在 这
些 序列 上 后 ,可 在 起 始 复合 体形 成 的 不 同 阶段 发 挥 效应 。

上 游 元 件 是 通过 逐个 改变 起 始 位 点 上 游 的 碱 基 , 以 观察 它 对 启动 子 转录 效率 的 影响 而 鉴
定 出 来 的 。 典 型 的 实验 是 用 8- 珠 蛋 昌 基 因 进 行 的 ,如 图 13-15 所 示 。 从 图 中 可 以 看 出 ,在 从 起
点 到 一 100 的 范围 内 ,大 部 分 碱 基 改变 不 影响 此 启动 子 在 Hela 细胞 中 启动 转录 的 效率 。 但 在

相对 转录 水 平
QL 三 正常 )

一 100 三 80 一 060 40 20 CAP
CGTAGAGCCACACCCTGGTAAGGGCCAATCTGC TCA CAC AGG ATA GAG AGGGCAGGAG CCAGGGCAGAGCATATAAGGTGA TAGGATCAGTTGCTCCTCACA
图 13-15 ”用 碱 基 突 变法 鉴定 出 在 - 珠 恒 白 基因 的 上 游 有 3 个 影响
启动 子 转录 效率 的 短 序列 ,它们 是 TATA,CAAT 和 GC 框
4014

3 个 短 的 区 域内 的 突变 使 转录 效率 下 降 , 它 们 分 别 集中 于 一 30, 一 75 和 一 90 处 。 因 而 得 出 结
论 , 这 3 个 短 的 序列 构成 了 8- 珠 蛋白 基因 的 启动 子 。

分 析 这 3 个 短 序列 的 序列 得 知 , 集 中 在 一 30 区 的 序列 为 TATA 框 。 前 已 述 及 ,TATA 框
是 规定 转录 起 始 位 点 的 ,从 图 中 可 以 看 出 改变 它 的 碱 基 比 改变 另外 两 个 序列 的 碱 基 对 转录 效率
的 影响 比较 小 。 集 中 在 一 75 区 的 序列 叫做 CAAT 框 , 因 为 它 的 共有 序列 GGCCAATCT 中 有
CAAT 而 得 名 。 集 中 在 一 90 区 的 序列 称 为 GC 框 , 因 为 其 共有 序列 为 GCGGCGG 。 需 要 注意 的 是 ，
我 们 在 写 出 这 些 元 件 的 共有 序列 时 ,都 是 按 编码 链 上 的 序列 由 5 向 3 书写 的 。 对 于 TATA 框 来
说 , 它 必 须 在 编码 链 上 , 如 果 是 在 模板 链 上 则 无 效 。 对 于 CAAT 框 和 GC 框 来 说 ,其 共有 序列 在
编码 链 上 和 模板 链 上 同样 有 效 , 即 元 件 的 方向 可 以 调换 , 但 都 是 对 其 下 游 的 基因 起 作用 。

图 13-16 中 列举 了 3 个 启动 子 作 为 例子 。 从 图 中 可 见 ,在 这 3 个 启动 子 中 总 共 出 现 了 4 种
元 件 , 即 TATA 框 .GC 框 .CAAT 框 和 八 聚 体 (octamer ,一 个 8 bp 元 件 )。 真 核 启 动 子 还 有 另
外 多 种 元 件 , 它 们 在 其 它 启 动 子 中 出 现 。 从 图 中 可 以 看 出 ,每 个 启动 子 都 是 由 特定 一 套 多 个 元
件 所 组 成 ,但 不 同 启动 子 中 这 些 元 件 的 种 类 数目 以 及 它们 所 处 的 位 置 都 是 不 同 的 ,而 且 没有
一 种 元 件 是 所 有 启动 子 都 必须 具有 的 ,尽管 有 些 元 件 可 出 现在 多 种 不 同 的 启动 子 中 。

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启动 子

-140 -120 -100 -80 -60 一 0 -20 起 点 |

1 4 入 习

八 聚 体 ”CAAT 人 TAT

图 13-16 ”含有 不 同 组 合 元 件 的 儿 个 启动 子

上 游 元 件 之 间 的 序列 对 启动 子 的 功能 是 没有 影响 的 .元 件 与 元 件 之 间 的 距离 也 是 可 变 的 ，
ji 臣 离 改变 10 一 30 bp 一 般 不 影响 启动 子 的 功能 。 元 件 散布 在 一 段 很 长 的 DNA 上 , 它 远 远大 于
JRNA 柬 合 酶 工 能 够 直接 接触 的 范围 。 这 提示 这 些 元 件 分 别 由 不 同 的 转录 因子 所 识别 ,这 些 因
子 结合 在 上 游 元 件 上 后 并 不 直接 作用 于 RNA 聚合 酶 工 ,而 是 作用 于 基础 因子 ,再 由 基础 因子
直接 作用 于 RNA 聚合 酶 工 。 这 种 情况 表明 ,在 转录 的 启动 中 ,蛋白 质 与 蛋白 质 之 间 的 相互 作
用 具有 和 蛋白 质 与 DNA 之 间 的 作用 同等 的 重要 性 。
表 13-2 中 列举 了 一 些 最 常见 的 因子 和 它们 特异 识别 的 元 件 。 这些 因子 覆盖 的 DNA 序列
通常 比 其 共有 序列 要 长 些 。 它 们 通常 覆盖 约 20 bp DNA ,而 共有 序列 都 小 于 10 bp。
这 些 转录 因子 特异 地 结合 到 它 所 识别 的 元 件 上 之 后 是 如 何 活化 转录 的 ? 其 机 制 目前 尚 不
清楚 ,然而 已 经 知道 了 这 些 因 子 的 某 些 一 般 特 性 。 这 些 因 子 一 般 都 是 转录 的 激活 物 。 典 型 的 都
有 一 个 与 特异 DNA 序列 结合 的 特殊 结构 域 , 和 一 个 或 多 个 另外 的 结构 域 , 这 些 结构 域 是 活化
转录 或 与 其 它 调控 蛋白 相互 作用 所 必需 的 。 为 了 说 明 起 活化 作用 的 结构 域 [ 称 为 活化 结构 域
(activating structural domain) ] 的 某 些 特 点 ,下 面 列举 3 种 不 同 的 转录 因子 作为 例子 ,每 个 例
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子 都 代表 着 一 大 类 蛋白质 ,它们 具有 同一 类 型 的 活化 结构 域 。
表 13-2 哺乳 动物 RNA 聚合 酶 工 常用 的 上 游 转 录 因 子 及 其 结合 的 元 件 |

元 件 名 称 共有 序列 结合 DNA 长 度 ”因子 分 子 量 (kD) ”每 细胞 所 含 分 子 数 ”存在 地 点
TATA 框 ” TATAAAA 一 10 bp TBP 27 ? 普遍 存在
CAATETIS CSGCCANTET 一 22 bp CTF/NF1 60 300 000 普遍 存在
GC 框 GGGCGG 一 20 bp SP1 105 60 000 普遍 存在
八 聚 体 ATTTGCAT 一 20 bp Oct-1 76 ? 普遍 存在
ERTTEGCAT 23 bp Oct-2 52 ? 淋巴
kB ESEACTITCE 一 10 bp NFkB 44 ? 淋巴
kB GEGAGTTTEE 一 10 bp H2-TF1 ? ? 普遍 存在
ATF GTEGACGT 一 20 bp ATF ? ? 普遍 存在

《Cl)SP1 它 是 结合 到 GC 框 上 的 转录 因子 。 最初 是 在 研究 SV40 病毒 启动 子 时 发 现 的 , 现
在 看 来 普遍 存在 于 兰 椎 动物 的 细胞 中 . 它 既 可 与 GGGCGG 结合 ,也 可 与 其 互补 序列 CCGCCC
结合 ,可 见 SP1 能 与 启动 子 的 任 一 条 链 结合 。 在 一 个 启动 子 中 常 有 多 个 SP1 的 结合 位 点 ,例如
在 SV40 的 启动 子 中 有 5 个 GC 框 。SP1 是 个 单 链 蛋 白质 ,分 子 量 约 为 105 kD。 它 与 DNA 结
合 的 结构 域 [简称 DNA 结合 域 (DNA-binding domain)] 在 C- 端 附近 ,含有 3 个 锌 指 。 在 SP1
中 另 有 两 个 活化 结构 域 。 它 们 活化 转录 的 作用 机 制 目 前 尚 不 清楚 。 然 而 值得 注意 的 是 这 些 结
构 域 中 富 含 谷 酰胺 , 谷 酰胺 约 占 其 氨基 酸 残 基 总 数 的 25% 。 而 且 已 知 在 其 它 与 SP1 很 不 相同
的 激活 物 蛋白 中 也 有 富 含 谷 酰胺 的 结构 域 。
《2) 结 合 CAATI 框 的 因子 ”识别 并 结合 在 CAAT 框 上 的 因子 有 多 种 ,其 中 的 一 类 是 CTF
家 族 ,这 一 类 因子 是 由 同一 个 基因 编码 ,但 在 转录 后 通过 不 同方 式 的 剪接 产生 的 。CTF 成 员 对
CAAT 框 的 亲 和 性 相同 ,其 中 之 一 是 CTF1.。CTF1 的 分 子 量 约 为 5.5kD, 它 的 DNA 结合 域 显
然 没 有 螺旋 -转角 -螺旋 或 锌 指 这 两 种 常见 的 蛋白 质 与 DNA 结合 的 结构 模式 ,其 结合 DNA 的
机 制 尚未 阐明 。CTF1 的 活化 结构 域 富 含有 睛 氨 酸 , 有 睛 氨 酸 占 其 氨基 酸 残 基 总 数 的 20% 以 上 。 由
大 鼠 肝 中 制备 出 来 了 两 种 结合 CAAT 框 的 蛋白 质 , 即 C/EBP 和 ACF。C/EBP 优先 结合
GCAAT 序列 ,ACEF 则 结合 清 蛋 白 基 因 启 动 子 中 的 更 为 常见 的 CCAAT 序列 。C/EBP 有 两 个
活化 结构 域 ,其 中 之 一 也 富 含 睛 所 酸 , 另 一 个 不 属于 这 里 叙述 的 类 型 .C/EBP 以 二 到 体 形式 结
合 在 DNA 上 ,二 聚 体 的 两 个 分 子 以 亮 氨 酸 拉链 的 形式 结合 在 一 起 。 另 一 类 与 CAAT 框 结合
的 因子 是 CP 家 族 , 其 成 员 与 不 同 基因 的 启动 子 中 CAAT 框 的 亲 合 力 不 同 。 例 如 ,CP1 与 w- 珠
蛋白 基因 的 CAAT 框 亲 和 为 高 ,而 CP2 与 六 血 纤维 蛋白 原 基因 中 的 CAAT 框 亲和力 高 。
结合 CAAT 框 的 因 了 于 有 多 种 的 事实 提醒 我 们 ,不 能 认为 一 种 元 件 仅 被 一 种 转录 因子 所 识
别 ,而 且 这 种 事实 必定 有 其 生物 学 意义 。 虽 然 目 前 我 们 还 不 清楚 其 意义 是 什么 ,然而 看 来 醒 上
CAAT 框 可 能 是 个 调控 基因 表达 的 划 位 点 .已 知 在 组 蛋白 H2B 的 一 个 基因 的 启动 子 中 有 两 个 二
CAAT 框 ( 见 图 13-17) ,在 海胆 中 此 基因 仅 在 精子 发 生 时 表达 。 但 由 皖 丸 和 胚胎 组 织 中 都 能 币
得 结合 CAAT 框 的 因子 ,然而 此 因子 仅 能 与 睾丸 的 CAAT 框 结合 ,而 不 能 与 胚胎 组 级 的
CAAT 框 结合 , 这 是 因为 在 胚胎 组 织 中 有 个 叫做 CAAT- 取 代 蛋 白 (CAAT-displacement 页 5-
tein,CDP) 的 蛋白 质 , 如 图 13-17 中 所 示 , 由 于 CDP 结合 在 CAAT 框 上 ,从 而 阻止 了 CAA 正
结合 因子 的 结合 ,使 转录 复合 体 不 能 形成 , 因而 就 不 能 进行 转录 了 。 可 见 CDP 的 作用 类 似 于 原
核 中 的 阻 遇 物 。 因 此 ,结合 在 一 个 给 定 启动 子 元 件 上 的 不 同 蛋白 质 的 功能 可 能 是 不 同 的 ,它们
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可 能 是 激活 物 、 阻 过 物 或 者 具有 其 它 功能 的 蛋 日 质 。

在 睾丸 中 能 组 装 成
转录 复合 体 进行 转录
《基础 因子 未 全 示 出 )

CDP 阻止 了 其 它 因子 的

结 人 台 . 因 而 不 能 转录

图 13-17 在 海胆 睾丸 中 的 H2B 启动 子 能 够 启动 转录
但 在 胚胎 中 ,由 于 CDP 结合 在 CAAT 框 上 ,阻止 了 CAAT 结合 因子 的 结合 ,也 就 阻止 了 转录 。

被 不 只 一 种 因子 识别 的 元 件 的 另 一 个 例子 是 八 聚 体 。Ocet-1 是 个 广泛 存在 的 转录 因子 , 它

和 结合 在 八 聚 体 上 活化 H2B( 大 概 还 有 其 它 ) 基 因 。 在 非 淋巴 细胞 中 Oct-1 是 唯一 的 八 聚 体 结合

因子 。 但 在 淋巴 细胞 中 有 另 一 个 不 同 的 因子 :Oct-2, 它 结合 在 八 聚 体 上 活化 免疫 球 恒 白 < 轻 链
基因 。 可 见 ,Oct-2 是 组 织 特异 性 的 激活 物 , 而 Oct-1l 是 广泛 存在 的 。 为 什么 在 非 淋巴 组 织 中 广
泛 存 在 的 Oct-l 不 能 活化 免疫 球 蛋 白 基 因 ? 看 来 八 聚 体 前 后 的 情况 必定 是 重要 的 。Oct-2 可 能
是 与 结合 在 启动 子 上 的 其 它 蛋白 质 相互 作用 而 发 挥 其 作用 ,而 Oct-l 则 不 能 。 因 此 ,我 们 不 能
简单 地 根据 启动 子 中 有 什么 元 件 就 能 预料 什么 因子 能 够 活化 它 。

通常 的 情况 是 一 个 给 定 的 共有 序列 被 相应 的 转录 因子 所 识别 。 和 但 如 上 所 述 , 在 有 些 情 况
下 ,同一 序列 可 被 不 同 的 因子 所 识别 。 而 在 另 些 情况 下 ,一 个 特定 的 蛋白 质 能 够 识别 不 只 一 种

| 滋 列 。 最 清楚 的 例子 是 CUEBP, 如 上 所 述 它 结合 于 CAAT 框 ,但 也 结合 于 一 个 与 CAAT 框 十

莽 不 同 的 序列 元 件 上 ,其 意义 为 何 , 尚 待 研究 。 而 且 我 们 必须 考虑 到 ,在 体外 观察 转录 因子 与
EDNA 结合 时 常常 用 的 是 裸露 的 DNA 。 然 而 在 细胞 中 DNA 是 与 组 蛋白 结合 成 核 小 体 的 形式
存在 的 ,这 种 形式 必定 会 对 转录 因子 与 DNA 的 结合 发 生 影响 。 因 此 ,为 了 研究 在 天 然 条 件 下
活泼 转录 复合 体 的 形成 ,必须 用 组 装 在 染色 质 中 的 DNA .总 之 ,转录 因子 与 启动 子 元 件 的 结合
是 比较 复杂 的 ,其 中 有 许多 问题 目前 尚 不 明了 。

(3)GAL4 是 酵母 中 的 一 种 激活 物 蛋 白 , 它 结合 在 一 个 叫做 UASe 的 上 游 激活 序列 Cup-
stream activating sequence,UAS) 上 (酵母 中 的 上 游 激活 序列 类 似 于 高 等 真 核 生 物 中 的 增强
子 ) ,此 序列 在 酵母 半 乳 糖 代 谢 有 关 酶 类 基因 的 附近 。GAL4 的 DNA 结合 域 中 有 几 个 锌 指 , 它
们 在 C- 末 端 附近 。 其 活化 结构 域 的 特点 是 含有 许多 酸性 氨基 酸 残 基 。 用 各 种 肽 序列 取代
GAL4 的 酸性 活化 结构 域 的 实验 结果 表明 ,此 结构 域 的 酸性 性 质 是 关键 ,而 其 具体 的 氨基 酸 序

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列 则 可 显著 改变 。
3. 转录 因子 的 DNA 结合 域 和 活化 结构 域 是 独立 的 转录 因子 需要 具有 两 种 功能 :中 能 恒 ，
够 识别 位 于 启动 子 、 增 强 子 或 其 它 调节 元 件 中 的 特异 序列 并 与 之 结合 ,这 些 序列 影响 一 个 特定
靶 基 因 的 转录 ;@@ 转 录 因 子 是 激活 物 ( 对 于 阻 遇 物 来 ,只 要 它 结合 在 DNA 上 ,就 足以 阻止 基
因 的 转录 了 ) , 它 还 必须 能 够 结合 到 转录 装置 上 以 发 挥 其 促进 转录 的 作用 。 实 验 表明 ,转录 因 了 于
的 DNA 结合 域 和 起 活化 转录 作用 的 活化 结构 域 是 分 别 独立 发 挥 作 用 的 ,其 作用 模式 如 图 13-
18 所 示 。 事 实 上 我 们 可 以 认为 ,DNA 结合 域 的 功能 只 是 把 活化 结构 域 带 到 转录 起 点 的 附近 ，
而 DNA 结合 域 和 活化 结构 域 之 间 的 联结 物 时
Cconnector) 是 足够 柔性 的 ,这 样 , 不 论 DNA
结合 域 所 结合 的 具体 位 点 在 哪里 ,都 能 使 活 国
化 结构 域 找到 其 靶 蛋 白 , 而 靶 蛋 白 很 可 能 是 尾
基础 转录 因子 。
曾 用 酵母 的 激活 物 GAL4 仔细 地 研究 |
了 此 问题 。 前 已 述 及 ,GAL4 是 结合 在 上 游 激 里
活 序列 UASc 上 而 发 挥 作 用 。GAL4 蛋白 有 昨
3 个 功能 : 即 结合 DNA、 活 化 转录 和 结合 另 芋
一 个 叫做 GAL80 的 调节 有 蛋白质 。 它 的 这 些 略
功能 是 可 以 分 开 的 ,如 图 13-19 所 示 。GAL4
的 结合 结构 域 由 其 N- 端 的 65 个 氨基 酸 残 基 QQQQQQQQQQQQQQQQQuQQQQQQ

图 13-18 ”转录 因子 作用 的 模式 图

组 成 ,单独 的 此 片段 能 够 与 它 的 共有 序列 结 14 岳

合 ,但 不 能 活化 转录 。GAL4 有 两 个 活化 转录 >

的 区 段 , 即 148 一 196 和 768 一 881。 如果 将 它 1 二

们 联结 在 DNA 结合 域 上 就 能 活化 转录 。 CO
GAL4 还 有 另外 两 个 功能 结构 域 。 一 个 :二 证 人

是 65 一 94 区 段 , 它 可 使 GAL4 形成 二 聚 体 。 作 >

它 与 DNA 结合 域 相 邻 , 形 成 二 聚 体 (与 蛋 日 ， 二 聚 化 区 GAL80 结合 域

质 结合 ) 的 结构 域 与 DNA 结合 域 相 邻 是 在

转录 因子 中 十 分 普遍 存在 的 花样 。 另 一 个 是 图 1319 CAL 合作 全国 全

851 一 881 区 段 , 它 位 于 一 个 活化 结构 域内 ,能 与 GAL80 结合 .后 面 将 要 谈 到 GAL80 的 结合 与
否 是 调节 GAL4 的 活性 的 。

将 活化 结构 域 结合 到 启动 子 附近 的 DNA 上 当然 是 它 能 活化 转录 的 先决 条 件 , 然而 这 种
外 合 是 否 必须 依赖 其 特定 的 DNA 结合 域 ? 图 13-20 示 出 的 实验 结果 明确 地 回答 了 此 问题
LexA 是 细菌 的 一 种 阻 遏 物 ,其 N- 端 有 结合 DNA 的 结构 域 , 它 特异 识别 LexA 操纵 基因 。 当
用 (通过 基因 工程 方法 )LexA 的 DNA 结合 域 取 代 GAL4 DNA 结合 域 时 ,此 册 合 蛋白 质 不 能
结合 在 UAS。 上 ,因而 不 能 活化 gal 基因 。 但 当 用 LexA 操纵 基因 序列 代替 酵母 DNA 中 的
UAS。 序列 时 , 则 此 嵌 合 蛋白 质 能 正常 活化 酵母 基因 的 转录 。 此 结果 明确 说 明 GAL4 的 活化 结
构 域 和 DNA 结合 域 是 各 自 独 立地 发 挥 作 用 的 ,并 且 互 不 影响 。 只 要 能 把 活化 结构 域 带 到 启动
子 附近 就 能 发 挥 作用 ,用 GAL4 的 DNA 结合 域 或 用 LexA 的 DNA 结合 域 将 活化 结构 域 结合
到 DNA 上 的 效果 是 一 样 的 。

408

UAS。 启动 子 LexA 攻 序 列 启动 子
ANANANNNAANANRNNNA ANNANNNAANNNNAAN

不 结合

ANANANAXNNANANANNNAN

Te

图 13-20 _ GAL4 活化 转录 不 依赖 于 其 特异 的 DNA 结合
当 用 LexA 的 DNA 结合 域 取 代 GAL4 的 DNA 结合 域 时 ,只 要 在 启动 子 附 近
加 上 LexA 的 特异 结合 序列 .此 嵌 合 蛋白 质 便 能 活化 转录 。

tat 通常 结合 到 RNA 产物 的 tar 序列 上
RNA

起 始 复合 体 正在 转录 的 来 合 栈 [3

记 将 tat 的 活化 结构 域 联结 在 一 个 DNA 结合 域 上 照样 起 作用

ANCNORNONANCRSCSCNCNCNORCNARAAOARASOSL

Sa SN RS
Se

上

图 13-21 HIV uat 履 白 的 活化 结构 域 的 作用 示意 力
用 HIV 的 tat 蛋白 所 做 的 实验 进一步 表明 了 转录 因子 的 DNA 结合 域 和 活化 结构 域 的 作
用 是 各 自 独立 的 。tat 蛋白 不 与 DNA 结合 , 而 是 结合 在 转录 产生 的 RNA 中 的 一 个 三 级 结构
409

区 ,此 区 叫做 tar 序列 。 如 图 13-21 所 示 ,'tar 序列 在 转录 起 点 的 紧 下 游 ,因此 , 当 tat 蛋 日 结合
在 tar 上 时 ,就 将 tat 蛋白 带 到 转录 起 始 复合 体 附 近 了 .这 样 tat 蛋白 就 像 其 它 上 游 转录 因子 一
样 ,其 活化 结构 域 便 可 与 起 始 复合 体 中 的 转录 因子 相互 作用 ,从 而 促进 转录 。 当 然 ,在 tat 蛋白
的 情况 下 ,必须 在 产生 第 一 个 转录 物 为 它 提供 tar 之 后 ,tat 蛋白 才能 结合 上 去 发 挥 作 用 。

图 13-21 的 下 部 分 表明 , 当 将 tat 蛋白 改造 成 其 活化 结构 域 与 一 个 结合 DNA 的 结构 域 相
联结 的 符合 蛋白 质 时 ,再 在 启动 子 中 加 上 一 个 该 DNA 结合 域 的 识别 序列 , 则 此 徐 合 蛋 自 质 照
样 能 活化 转录 。 此 实验 结果 清楚 地 表明 ,转录 因子 的 DNA 结合 域 和 活化 结构 域 是 独立 发 挥 作
用 的 ,DNA 结合 域 的 功能 只 是 把 活化 结构 域 “ 推 在 "起 始 复合 体 附 近 , 使 之 能 够 发 挥 活化 转录
的 作用 而 已 。 转 录 因 子 的 这 一 特性 表明 ,它们 的 立体 结构 是 高 度 可 塑 的 , 即 其 DNA 结合 域 和
活化 结构 域 之 间 的 联结 物 的 构象 是 可 变 的 。

八 、 增强 子 C(enhancer)

前 面 我 们 是 把 启动 子 作 为 担负 启动 转录 的 成 分 进行 讨论 的 。 然 而 在 真 核 中 启动 子 不 一 定 ，
是 单独 自己 发 挥 作用 的 ,至 少 在 某 些 情况 下 启动 子 的 活性 被 增强 子 大 大 地 提高 .增强 子 由 另外
一 组 元 件 所 组 成 。 奇 异 的 是 ,增强 子 可 在 距 起 始 位 点 很 远 ( 几 千 个 碱 基 ) 的 位 置 发 挥 作 用 ,而 且
这 种 距 离 是 可 以 改变 的 (目前 还 不 知道 距离 多 远 后 就 不 起 作用 了 ) 并且 它 们 可 在 基因 的 上 游 、
下 游 ,甚至 基因 的 内 部 发 挥 作用 。 例 如 ,SV40 病毒 的 增强 子 是 第 一 个 发 现 的 增强 子 , 将 它 移 动
至 此 环 状 病毒 基因 组 (5. 2 Kb) 的 任何 位 置 都 有 作用 。 另 外 增强 子 序列 无 论 在 编码 链 或 模板 链
上 都 有 效 。 在 酵母 中 有 一 种 与 增强 子 类 似 的 序列 , 称 为 上 游 激活 序列 (UAS) ,但 它 仅 在 启动 子
上 游 起 作用 ,不 能 在 下 游 起 作用 。

前 面 我 们 曾 将 真 核 启动 子 定义 为 转录 起 始 位 点 附近 的 一 些 序列 ,这 些 序列 是 启动 转录 所
必需 的 。 按 此 定义 ,启动 子 是 不 包括 增强 子 的 ,因为 它 可 距离 很 远 。 但 这 只 是 个 实用 的 定义 ,并
不 严格 ,因为 按 其 效应 来 说 ,把 增强 子 说 成 为 启动 子 的 一 部 分 ,也 并 非 不 可 以 。

为 了 说 明 增强 子 的 结构 特点 ,我们 可 用 SV40 病毒 的 增强 子 作为 例子 。 此 增强 子 由 两 个 相 轩
同 的 72 bp 序列 串联 重复 而 成 ,已 证 明 缺 失 此 两 个 序列 中 的 任 一 个 都 不 影响 转录 的 水 平 , 但 两 和
者 都 缺失 时 则 使 转录 效率 大 大 降低 。 图 13-22 是 用 碱 基 突 变法 扬 示 二 贡 四 时 乓 生生
的 结果 .从 图 中 可 以 看 出 ,一 个 增强 子 含有 多 个 短 的 序列 元 件 ,它们 被 特异 的 蛋白 因子 所 结合 。
这 些 元 件 中 有 许多 是 在 启动 子 中 常见 的 ,如 AP1 和 八 聚 体 。 不 过 在 增强 子 中 元 件 的 密度 要 比
启动 子 中 大 很 多 。

许多 增强 子 仅 在 某 些 细胞 中 有 效 , 而 在 其 它 细胞 中 无 效 ， 例 如 ,免疫 球 蛋 白 基因 的 增强 子 ，
仅 在 B 淋巴 细胞 中 有 效 ,从 而 使 免疫 球 蛋 白 基因 仅 在 B 淋巴 细胞 中 表达 ,这 是 因为 增强 子 需
要 有 特异 的 激活 物 蛋 白 与 之 结合 才能 促进 转录 ,而 这 种 蛋白 质 仅 在 革 些 细胞 中 才 具 有 之 故 . 在
这 方面 了 解 得 最 清楚 的 是 媒介 糖 皮质 激素 发 挥 其 激素 效应 的 增强 子 . 糖 皮质 激素 进入 细胞 后 ，
首先 与 其 胞 液 中 的 特异 受 体 相互 作用 ,这 样 形成 的 激素 - 受 体 复合 体 再 进入 细胞 核 ,并 结合 在
糖 皮质 激素 的 增强 子 上 ,从 而 引发 特定 的 二 套 基因 的 表达 ,其 结果 表现 出 糖 皮质 激素 的 生理 效
应 。 可 见 糖 皮质 激素 增强 子 仅 在 具有 糖 皮质 激素 受 体 蛋 白 的 细胞 中 才能 发 挥 作用 。 由 此 可 以
预料 ,感染 真 核 细胞 的 病毒 DNA 中 应 该 含有 被 寄主 细胞 中 特异 蛋白 质 活化 的 增强 子 。 事实 正
是 如 此 。 例 如 ,小 鼠 乳 腺 肿瘤 病毒 (MMTV) 的 DNA 中 含有 糖 皮质 激素 增强 子 ,因此 ,MMTV

仅 在 那些 正常 受 这 些 类 固 醇 刺激 的 细胞 (如 乳腺 上 皮 细 胞 ) 中 才能 大 量 繁殖 ,因为 只 有 在 这 些
410

CCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAG GCTCCCCAGCAGGCAG AAGTATGCAAAGCATGCAT CTCAATTAGTCAGCAAC
GGTCGACACCTTACACACAGTCAA TCCCA CACCTTTCAGGGGTCCGAGGGGTCGTCCGTCTTCATACGTTTCGTACGTA GAGTTAATCAGTCGTTG

AP4 AP1 AP3 AP2 八 聚 体 AP1

13-22 托 形 图 表示 出 所 有 使 增强 子 的 功能 降 至 低 于 野生 型 75 为 的 突变 ，
和 矩形 图 的 下 按 示 出 了 已 知 的 蛋白 质 结 合 位 点

细胞 中 才 有 活化 其 增强 子 的 激素 - 受 体 。 病 毒 寄 主 范围 有 局 限 性 的 原因 之 一 ,就 是 由 于 它们 含
有 组 织 特异 性 和 种 属 特异 性 的 增强 子 之 故 。 现 在 看 来 组 织 特异 性 表达 的 基因 有 的 是 由 其 启动
子 负责 的 ,这 种 基因 依靠 其 附近 的 增强 子 提高 表达 效率 。 另 一 些 基 因 的 启动 子 没 有 组 织 特异
性 ,它们 的 组 织 特异 性 表达 要 靠 增强 子 来 调控 ,可 见 增强 子 具 有 重要 的 调控 基因 表达 的 作用 。

增强 子 能 在 离 起 始 位 点 很 远 处 发 挥 作 用 ,而 且 它 在 基因 的 上 游 或 下 游 均 可 ,其 作用 机 制 为
何 , 曾 经 引起 人 们 做 了 多 种 设想 。 现 在 看 来 , 它 和 上 游 局 动 子 元 件 的 作用 一 样 ,是 与 转录 的 基础
装置 相互 作用 的 。 实 验 表明 , 当 增 强 子 未 与 启动 子 靠拢 在 一 起 时 , 它 是 不 能 发 挥 作用 的 。 只
增强 子 靠拢 在 启动 子 处 时 才能 发 挥 作用 ,这 种 靠拢 是 靠 结合 在 DNA 上 的 蛋白 质 起 桥梁 作用
的 ,并 且 在 增强 子 和 局 动 子 间 的 DNA 必定 发 生 打 圈 (loop ) 。

九 、. 转 录 的 调控

原则 上 说 , 真 核 基 因 的 表达 可 在 表达 过 程 中 的 任 一 阶段 进行 调控 .现在 看 来 至 少 有 5 个 潜
看 的 调控 点 , 即 5 种 水 平 的 调控 ,它们 是 :@ 基 因 结 构 的 活化 ;四 转录 的 启动 ;四 转录 物 的 加 工 ;
@@mRNA 的 转运 到 胞 质 及 其 稳定 性 ;@ 翻 译 的 调控 。 由 此 可 见 ,我 们 不 能 认为 ,一 个 基因 的 表
达 一 旦 开始 就 必定 要 表达 到 底 , 而 是 不 同 基因 的 表达 可 在 特定 的 环节 进行 调控 。

前 已 述 及 , 真 核 染色 体 的 结构 对 基因 的 表达 是 有 重大 影响 的 ,活泼 转录 的 基因 处 的 染色 体
结构 与 不 转录 的 基因 处 的 染色 体 结构 不 同 。 然 而 染色 体 结构 的 改变 并 不 等 于 该 处 的 基因 必定
被 转录 ， 而 只 是 为 转录 创造 了 条 件 , 即 该 处 的 基因 是 能 够 转录 的 。 因 此 ,基因 结构 的 活化 是 基
因 表达 的 第 一 步 , 它 调控 着 该 基因 的 能 否 表达 。 能 够 被 转录 的 基因 是 否 真 的 进行 转录 是 由 转录
的 启动 阶段 调控 , 这 就 是 转录 水 平 的 调控 。 对 大 多 数 基因 来 说 这 是 主要 的 调控 点 , 它 大 概 是 最
普遍 的 调控 水 平 . 当前 尚未 发 现在 真 核 细胞 中 转录 一 旦 启动 后 还 会 发 生 对 转录 的 调控 ,例如 在
转录 未 完成 前 使 之 停止

411

转录 后 的 几 个 阶段 的 调控 都 可 称 之 为 转录 后 的 调控 。 真 核 RNA 聚合 酶 工 转录 产生 的 初
始 转录 物 要 经 过 多 种 加 工 后 才 生 成 成 熟 的 mRNA, 其 中 包括 5 端的 加 帽 ,3 端的 加 尾 ` 内 含 子 ，
的 剪接 掉 和 RNA 编辑 等 。 这 些 步骤 都 可 调控 ,但 知道 最 多 的 是 在 剪接 阶段 。 成 熟 mRNA 的 转
运 人 胞 浆 也 可 进行 调控 .最 后 ,mRNA 在 胞 浆 中 的 翻译 也 是 重要 的 调控 环节 。 在 这 方面 对 成 年
的 体 细胞 了 解 得 比较 少 ,而 在 胚胎 发 育 过 程 中 的 翻译 水 平 的 调控 则 了 解 得 比较 多 。

为 什么 某 些 基因 仅 在 某 些 细胞 中 表达 , 而 在 其 它 细胞 中 不 表达 (这 是 高 等 真 核 生物 不 同 细胞
具有 不 同 表 型 的 根本 原因 ,是 细胞 分 化 的 结果 )? 为 什么 许多 基因 仅 在 一 定时 间 ( 例 如 发 育 的 一 定
阶段 ) 或 一 定 条 件 下 (包括 生理 的 、 营 养 的 、 环 境 的 条 件 等 ) 进 行 表达 ?在 转录 水 平 的 调控 中 我 们 拟
从 以 下 两 个 方面 来 讨论 这 些 问 题 , 即 :四 靶 基 因 中 的 什么 成 分 能 使 转录 因子 特异 地 认 出 从 而 使 之
表达 ? 加 转录 因 子 本 身 的 活性 是 怎样 调控 的 ,而 这 种 调控 又 怎样 反映 出 各 种 信号 的 作用 ?

一) 应 答 元 件 使 靶 基因 被 转录 因子 识 出

在 分 析 一 组 受到 共同 调控 的 基因 的 结构 时 ,发现 它们 都 有 一 个 相同 的 启动 子 元 件 , 此 元 件
被 一 个 起 调节 作用 的 转录 因子 所 识别 。 使 基因 对 这 种 因子 做 出 反应 的 元 件 叫 做 应 答 元 件 (re-
sponse element) ,例如 , 热 休 克 应 答 元 件 (heat shock response element ,HSE)、 糖 皮质 激素 应
答 元 件 (glucocorticoid response element,GRE) 和 血清 应 答 元 件 (serum response element，
SRE) 等 。 表 13-3 中 列举 了 一 些 诱 导 型 转录 因子 的 性 质 和 它们 识别 的 元 件 。

表 13-3 ”诱导 型 转录 因子 结合 到 一 组 具有 相同 应 答 元 件 的 启动 子 或 增强 子 上 使 之 协同 调控

调节 物 代号 共有 序列 结合 DNA 长 度 因子 分 子 量 (kD)
热 休克 HSE CNNGAANNTCCNNG 27 bp HSTF 93
糖 皮质 激素 GRE GTACAAATGTTCT 20 bp 受 体 94
佛 波 酯 TRE GEACTCA 22 bp AP1 39
血清 SRE CCATATTAGG 20 bp SRF 52

应 答 元 件 的 共同 特点 是 :它们 都 是 启动 子 的 上 游 元 件 或 者 增强 子 ; 都 含有 短 的 共有 序列 ，
并 且 在 不 同 基因 中 应 答 元 件 的 复制 品 (copy) 很 相似 ,但 不 一 定 完全 相同 ; 因子 结合 区 向 共有 序
列 的 任 一 侧 扩展 一 个 短 的 距离 ;元 件 与 起 点 没有 固定 的 距离 ,但 通常 在 起 点 上 游 小 于 200 bp
处 ;通常 有 一 个 元 件 即 足以 做 出 调节 应 答 , 但 有 时 有 多 拷贝 .
应 答 元 件 可 在 启动 子 中 或 增强 子 中 。HSE 通常 是 在 启动 子 中 ,而 GRE 则 在 增强 子 中 。 现
在 认为 所 有 应 答 元 件 的 作用 原理 是 相同 的 , 即 一 个 基因 由 一 个 启动 子 或 增强 子 中 的 序列 所 调
控 , 此 序列 由 一 个 特异 的 蛋 自 质 所 识别 ,此 蛋白 质 是 RNA 聚合 酶 启动 转录 所 必需 的 一 个 转录
因子 。 仅 在 此 基因 需要 表达 的 条 件 下 才 出 现 有 活性 的 此 转录 因子 ,在 没有 有 活性 的 此 转录 因子
时 意味 着 该 启动 子 不 被 此 系统 所 活化 。
热 休 克 应 答 是 多 个 基因 受 单一 因子 调控 的 例子 , 它 在 原核 和 真 核 中 都 广泛 存在 。 当 温度 逢
高 时 , 某 些 基因 关闭 了 ,而 热 休 克基 因 (heat shock genes) 则 被 转录 ,并 且 还 引起 mRNA 翻译
的 改变 。 热 休克 基因 调控 的 模式 在 原核 和 真 核 中 是 不 同 的 。 在 细菌 中 是 合成 了 一 个 新 的 5 因
子 , 它 指导 RNA 聚合 酶 的 核心 酶 识别 热 休 克基 因 所 共有 的 一 个 与 普通 启动 子 不 同 的 一 10 区
序列 。 在 真 核 中 , 热 休 克基 因 也 有 个 共同 的 共有 序列 (HSE) ,但 在 不 同 基因 中 它 与 起 点 的 距离
是 可 变 的 ,并 且 是 由 一 个 独立 的 转录 因子 HSTF 所 识别 。 此 因子 的 活化 使 得 特异 的 一 组 ( 约 20
个 ) 在 启动 子 中 含有 HSE 的 基因 启动 转录 。 果 蝇 的 所 有 热 休 克基 因 都 含有 多 拷贝 的 HSE，【]
412

En

es
且

DATE 人 了 Wai

二

HSTEF 协同 的 结合 在 相 邻 的 这 些 应 答 元 件 上 。HSE 和 HSTEF 在 进化 中 都 是 保守 的 , 果 蝇 的 热
休克 基因 可 在 哺乳 动物 或 海胆 中 被 活化 。 果 蝇 的 HSTE 与 酵母 的 HSTF 也 很 相似 。 在 热 休 克
时 酵母 的 HSTEF 磷酸 化 了 ,这 种 修饰 作用 使 HSITEF 活化 了 。

金属 硫 蛋 白 (metallothionein ,MT) 基 因 是 一 个 基因 能 够 受 多 种 不 同 途径 进行 调控 的 例
胖 。 金属 硫 蛋 白 保护 细胞 对 抗 过 浓 的 重金 属 ， 其 方式 是 与 金属 结合 并 将 其 从 细胞 中 移 去 , 在 一
般 情况 下 基因 以 一 个 基本 的 水 平 进行 表达 ,但 在 重金 属 ( 如 锅 ) 离 子 或 糖 皮质 激素 的 诱导 下 则
以 较 高 的 水 平 表达 。 如 图 13-23 所 示 , 此 基因 的 调控 区 有 多 个 调控 元 件 , 在 不 同 条 件 下 ,它们 与
各 自 的 特异 转录 因子 结合 而 进行 调控 。 二

应 答 元 件

GRE BLE NMRE MRE 。。 BLE TRE MRE GC “NMRE 。 TATA
RE 二 全 FE

结合 的 蛋白 质
图 13-23 “人 金属 硫 蛋 白 基因 的 调控 区 ,在 其 启动 子 中 含有 基础 元 件 , 并 含有 增强 子 。
启动 子 中 还 含有 金属 诱导 元 件 ,增强 子 中 有 对 糖 皮质 激素 起 反应 的 元 件
图 上 边 示 出 元 件 , 下边 示 出 与 之 结合 的 蛋白 质 。
从 图 中 可 见 , 在 起 始 位 点 附近 有 个 TATA 框 和 GC 框 , 这 是 两 个 组 成 型 的 启动 子 元 件 。 为
了 基础 水 平 的 组 成 型 表达 ,除了 TATA 框 和 :GC 框 外 ,还 需要 两 个 基础 水 平 元 件 (basal level

旺 slements,BLE) ,它们 是 增强 子 。 在 一 个 BLE 中 有 个 TRE,TRE 是 在 数 种 增强 子 中 都 有 的 共

有 序列 ,例如 ,除了 MT 的 BLE 外 , 它 还 存在 于 SV40 的 增强 子 中 。IRE 有 个 AP1 结合 位 点 。
如 前 所 述 ,AP1 是 个 上 游 因子 , 它 的 结合 是 组 成 型 表达 机 制 的 一 部 分 .然而 AP1 的 结合 还 有 第

三 个 作用 。 已 知 TRE 还 对 佛 波 醇 \phorbol) 类 ,如 下 全 (一 种 促进 肿瘤 物质 ) 发生 应 答 作用 ， 此

作用 是 由 APl 与 TRE 结合 媒介 的 。

多 个 金属 应 答 元 件 (MRE) 序 列 担负 着 对 金属 的 诱导 性 应 答 作 用 。 它 们 是 启动 子 的 元 件 。
有 二 个 MRE 即 有 对 重金 属 发 生 应 答 作用 的 能 力 ,而 更 高 水 平 的 诱导 作用 则 是 由 多 个 元 件 达
到 的 。 对 类 固 醇 激素 的 应 答 是 由 一 个 GRE 控制 的 , 它 位 于 起 点 上 游 250 bp 处 ,其 行为 是 个 增
强 子 。 缺失 此 区 域 不 影响 基础 水 平 的 表达 ,也 不 影响 金属 诱导 的 表达 水 平 , 但 它 对 类 固 醇 的 应
敌 是 绝对 必需 的 。

金属 硫 蛋 白 基因 的 表达 调控 表明 了 -个 一 般 的 原理 ， 即位 于 增强 子 或 启动 子 中 的 几 种 不
同 元 件 中 的 任 一 个 都 能 独立 地 活化 基因 。 一 种 模式 的 活化 作用 所 需 的 元 件 不 存在 时 不 影响 其
它 模 式 的 活化 作用 。 元 件 的 多 样 性 ,它们 作用 的 独立 性 ,以 及 它们 的 相对 位 置 的 安排 显然 是 没
有 限制 地 可 以 改动 ,提示 结合 到 元 件 上 的 因子 是 能 够 独立 地 提高 由 基础 转录 装置 启动 的 转录
效率 的 。 之 所 以 能 够 如 此 ,大 概 是 赁 藉 蛋 白质 -蛋白 质 的 相互 作用 ,以 稳定 或 者 辅助 起 始 复合 体
的 形成 。

(二 ) 诱 导 型 转录 因子 活性 的 调控

基因 表达 调控 的 关键 是 要 做 到 使 基因 在 特定 的 时 间 、 地 点 或 条 件 下 进行 表达 , 即 在 需要 表
达 时 表达 ,不 需要 表达 时 不 表达 。 怎 样 才 能 做 到 这 一 点 ? 前 已 述 及 ,这 些 被 调控 的 基因 的 启动

413

子 或 增强 子 中 都 有 应 答 元 件 , 当 特 异 的 诱导 型 转录 因子 (或 叫做 调节 性 转录 因子 ,regulatory
transcription factor) 绪 合 在 其 上 时 , 即 能 启动 转录 。 因此 ,调控 的 关键 是 , 当 需 要 某 一 (或 某 些 ) )
基因 表达 时 , 则 提供 有 活性 的 特异 转录 因子 , 当 不 需要 它 表 达 时 , 则 灭 活 此 因子 。 由 此 可 见 , 调
控 诱 导 型 转录 因子 的 活性 是 调控 基因 表达 的 关键 , 而 诱导 型 转录 因子 活性 的 调控 应 能 反映 客
观 的 需要 。 表 13-4 中 列举 了 几 种 目前 已 知 的 调控 方式 。 由 于 目前 对 这 种 调控 机 制 的 了 解 还 不
够 全 面 和 深入 ,因此 表 中 所 列 并 不 全 面 , 这 种 归 类 方式 也 不 能 作为 最 后 定论 。 现 将 表 中 所 列 几
种 方式 分 述 如 下 :
表 13-4 诱导 型 转录 因子 的 几 种 活化 方式

无 活性 情况 有 活性 情况 例子
合成 蛋白 质
无 蛋白 质 区 同 源 异 型 蛋白
蛋白 质 殉 酸化
研 HSTF
蛋白 质 脱 磅 酸化
AS 要 Rs
一 一 AP1 UuVFos}
配 体 结合
性 >》 类 固 醇 受 体
由 抑制 剂 释放 出 来
ANONANNNON
三 NF-<B
灭 活 蛋 白质 途 。 3
抑制 剂 所;
改换 伙伴
ANONANONNAN NONECSDNAN 直
灭 活 蛋 白质 八 。 》 人 二 weDnii
灭 活 伙伴 二-

1. 调控 转录 因子 的 合成 ”这 种 调控 方式 的 特点 是 , 当 某 一 基因 不 需要 表达 时 ,特异 启动 该
基因 转录 的 转录 因子 不 存在 ,而 需要 表达 时 则 合成 此 转录 因子 。 已 知 的 这 种 例子 很 多 ,突出 的
表现 在 个 体 发 育 的 调控 中 ( 详 见 第 三 节 ) .例如 , 果 蝇 中 许多 具有 同 源 异型 域 的 蛋白 质 是 转录 因

了 于: 不 同 的 这 种 转录 因子 分 别 特异 地 在 不 同类 型 的 细胞 中 合成 ,从 而 使 不 同 细胞 各 自 表 达 不 同
414

的 一 套 基 因 , 其 结果 使 不 同 细胞 具有 了 不 同 的 表 型 .可 见 是 由 于 不 同 细胞 中 存在 有 不 同 的 含有
同 源 异 型 域 的 蛋白 质 才 使 它们 具有 了 不 同 的 表 型 事实 上 ,不 同 的 同 源 异 型 蛋白 之 所 以 在 不 同
细胞 中 表达 ,是 由 于 在 不 同 细 胞 中 分 别 具 有 它们 各 自 的 基因 的 转录 因子 之 故 。 因 此 ,这 是 一 种
基因 级 联 的 方式 , 即 一 个 基因 的 表达 产物 是 下 一 个 基因 的 转录 因子 ,而 下 一 个 基因 的 表达 产物
又 是 再 下 一 个 基因 的 转录 因子 等 。 这 种 基因 级 联 的 方式 在 个 体 发 育 的 调控 中 看 来 很 重要 。

2. 通过 化 学 修饰 改变 转录 因子 的 活性 ”许多 转录 因子 的 活性 是 用 化 学 修饰 直接 调控 的 ，
最 常见 的 化 学 修饰 是 磷酸 化 和 脱 磷酸 化 .例如 , 热 休克 基因 的 应 答 元 件 CHSE) 是 由 热 休 克 转 录
因子 (HSITEF) 特 异 识别 的 ,HSIF 结合 在 HSE 上 启动 热 休 克基 因 的 表达 。 已 知 酵母 的 HSTF
必须 磷酸 化 后 才 有 活性 ,在 酵母 热 休克 时 ,HSTE 磷酸 化 了 ,从 而 使 得 热 休 克基 因 进 行 表达 。

， AP1 是 通过 脱 磷酸 化 而 活化 的 转录 因子 的 例子 。 AP1 是 由 Fos 和 Jun 以 亮 氨 酸 拉链 方式 结合

起 来 形成 的 异 二 聚 体 。 此 转录 因子 仅 当 其 Jun 亚 基 脱 磷酸 化 时 才 变 为 活性 型 。

3. 由 配 体 的 结合 活化 或 灭 活 转录 因子 ”对 于
这 种 调控 方式 知道 得 最 清楚 的 是 糖 皮质 激素 受 体
的 作用 (图 13-24) 。 糖 皮质 激素 类 以 简单 扩散 的
方式 穿 过 细胞 膜 而 进入 细胞 。 在 细胞 中 糖 皮质 激
素 结合 在 其 受 体 上 。 目 前 还 不 清楚 游离 的 受 体 定
位 于 何 处 ,它们 大 概 是 以 平衡 状态 位 于 核 和 胞 质
中 。 不 管 怎样 , 当 激 素 结合 在 受 体 上 时 , 受 体 便 转
变 成 一 个 有 活性 的 转录 因子 。 此 活化 的 受 体 识别 2
一 个 特异 的 共有 序列 , 即 糖 皮质 激素 应 答 元 件 ANONONOR ANNNNNANNA

(GRE)。 典 型 的 GRE 位 于 增强 子 中 ,此 增强 子 与 3

gs
类 固 醇 日

| 应 答 糖 皮质 激素 的 基因 临近 。 因 此 , 当 激 素 - 受 体 活化 < 转录
复合 体 结合 在 此 种 增强 子 上 时 ,启动 了 一 套 基 因
的 表达 , 其 结果 便 表现 出 糖 皮质 激素 的 生理 效应 。 本

已 知 上 述 糖 皮质 激素 的 作用 机 制 代表 着 一 大
类 化 合 物 (图 13-25) 作 用 的 共同 模式 。 从 图 中 可
以 看 出 ,这 些 化 合 物 的 结构 不 同 ,有 的 甚至 差异 很
夫 。 肾 上 腺 皮质 分 泌 30 多 种 类 固 醇 , 主要 的 是 糖 皮质 激素 和 盐 皮质 激素 。 另 两 类 类 固 醇 激素
《 雁 激 素 和 峻 激素 ) 主要 是 由 性 腺 分 刻 的 。 这 些 类 固 醇 激素 是 应 答 多 种 神经 内 分 刻 的 活动 而 合
成 并 分 泌 的 ,它们 对 动物 的 生长 .组织 发 育 和 体内 环境 恒定 (homeostasis? 起 者 重要 的 作用 。 维
生 素 D 则 是 骨骼 发 育 所 需要 的 。 甲状 腺 激素 不 是 类 固 醇 , 它 调控 动物 的 基础 代谢 率 。 类 固 醇 和
甲状 腺 激素 在 变态 (metamorphosis ) 中 可 能 很 重要 ,例如 ,昆虫 中 的 脱皮 类 固 醇 (ecdysteroids )
和 蛙 的 甲状 腺 激素 。 视 黄 酸 (维生素 A) 是 个 形态 发 生 素 , 它 负责 正在 发 育 的 鸡 肢 芽 体 (chick
limb bud) 的 前 -后 轴 的 发 育 。 这 些 在 结构 和 功能 上 都 不 相同 的 形形色色 的 化 合 物 ,从 调控 基因
表达 的 途径 来 说 却 是 用 着 一 个 相同 的 模式 , 即 它们 都 是 小 分 子 化 合 物 , 它们 各 自 结合 在 其 特异 “
的 受 体 上 ,此 受 体 活化 基因 的 转录 。

用 克隆 这 些 受 体 cDNA 的 方法 推出 了 它们 的 氨基 酸 序 列 。 分 析 各 种 类 固 醇 激 素 . 甲 状 腺
激素 和 视 黄 酸 的 受 体 结构 表明 ,它们 代表 着 一 个 新 的 基因 调节 物 的 超 家 族 (super-family), 即
配 体 应 答 (ligand-responsive) 转 录 因 子 家 族 。 它 们 都 有 活化 结构 域 .DNA 结合 域 和 结合 激素 的

415

图 13-24 糖 皮 质 激 素 引 起 它们 的 受 体
与 一 个 增强 子 结合 来 调控 基因 的 转录

皮质 类 固 醇

OH

ChH3
CHs
- 峻 二 委 责
发 育 和 形态 发 生
1
HC-CH;-CH CH，
= CH H3C
CH， 3
1
HC
上
CH
维生素 D; ，
H C CH3
HC
1
甲 腺 激素 CH
HC
1
C-cH
| 3
放 cooH 内
HO AN cH 元 cH，
| COoH
一 NH
| 1
三 磺 甲 腺 原 氨 酸 反 - 视 黄 酸

13-25 ”活化 转录 因子 的 几 种 小 分 子 化 合 物 。 皮 质 激素 和 性 激素 是 由 胆固醇 合成 的 。
维生素 D 是 一 种 类 固 醇 。 甲 状 腺 激素 由 酷 氨 酸 合成 。 视 黄 酸 由 维生素 A 合成

结构 域 , 而 且 这 些 结构 域 的 位 置 安排 是 相同 的 , 即 在 受 体 的 中 心 是 结合 DNA 的 结构 域 , 此 区
域 在 这 些 受 体 中 是 比较 保守 的 。 它 在 活化 转录 中 也 起 作用 , 因为 当 此 结构 域 发 生 突变 时 , 既 不
能 与 DNA 结合 ,又 丧失 了 受 体 活 化 转录 的 作用 , 即 活化 结构 域 和 DNA 结合 域 不 是 独立 的 。 受
体 的 N- 端 含有 起 活化 转录 作用 的 另 一 部 分 成 分 。C 端 是 与 激素 结合 的 结构 域 , 此 结构 域 与
DNA 结合 域 是 各 自 独立 的 。

416

， 但 不 同 受 体 的 调节 方式 并 不 完全 相同 。 例 如 , 糖 皮 质 激素 受 体 的 C- 端 结构 域 缺失 时 ,缺失
后 的 蛋白 质 是 组 成 型 的 活化 基因 的 转录 , 即 不 再 需要 类 固 醇 来 活化 它 。 这 提示 在 完整 受 体 中 ，
当 没有 类 固 醇 激素 时 ,其 结合 激素 的 结构 域 阻止 了 受 体 识 别 GRE , 即 它 起 着 内 在 的 负 调控 作
睛 用 。 糖 皮质 激素 的 结合 使 此 阻 过 作用 失 活 , 受 体能 结合 GRE 并 活化 转录 。 当 前 对 此 阻 过 作用
| 关 的 机 制 尚未 确定 。 一 种 可 能 是 受 体 自己 内 部 的 作用 ; 另 一 种 可 能 是 有 某 种 另外 的 蛋白 质 参与 ，
是 此 种 蛋白 质 与 受 体 结合 时 阻 遏 了 受 体 与 GRE 的 结合 ,而 具有 糖 皮质 激素 时 ,激素 取代 了 此 种
， 蛋白 质 而 使 受 体 活 化 。
导 在 肉 激素 受 体 中 各 结构 域 之 间 的 相互 作用 与 上 述 糖 皮质 激素 的 受 体 不 同 。 当 结合 激素 的
必 车 构 域 缺 失 时 , 雌 激素 受 体 的 剩余 部 分 仍 能 与 ERE 结合 ,但 不 能 活化 转录 。 可 见 ,在 活化 转录
中 需要 其 结合 激素 的 区 域 ,但 具体 的 机 制 尚 不 明了 。
岂 在 类 固 醇 受 体 家 族 的 成 员 中 C- 端 结构 域 的 同 源 性 在 30% 一 57%% 范 围 内 ,它们 与 甲状 腺 激
岂 素 等 的 受 体 的 同 源 性 相 比 则 小 得 多 ,表明 了 此 结构 域 与 不 同化 合 物 结合 的 特异 性 。
， 这些 受 体 以 二 聚 体形 式 与 其 DNA 上 的 应 答 元 件 相 结合 ,结合 的 方式 是 锌 指 ,例如 , 糖 皮
质 激素 受 体 和 峻 激素 受 体 都 有 两 个 锌 指 。 这 些 受 体 的 应 答 元 件 都 是 由 两 个 短 的 重复 序列 所 组
成 ,每 个 重复 序列 也 叫做 半 位 点 (half site) 。 两 个 半 位 点 之 间 以 0 一 4 bp 分 隔 开 , 它 们 或 是 回 文
形式 ,或 是 直接 重复 。 正 是 用 这 种 间隔 不 同和 重复 方式 不 同 将 不 同 受 体 的 应 答 元 件 区 别 开 的 ，
而 半 位 点 的 共有 序列 种 类 则 很 有 限 。 已 知 糖 皮质 类 固 醇 受 体 (GR)、 盐 皮质 类 固 醇 受 体 (MR)、
雄 激素 受 体 (AR) 和 孕 酮 受 体 (PR ) 都 形成 同 二 聚 体 ,它们 识别 的 应 答 元 件 半 位 点 的 共有 序列
为 TGTTCT。 两 个 半 位 点 安排 为 回 文 ,位 点 间 的 间隔 决定 着 元 件 的 类 型 。 肉 激素 受 体 (ER ) 的
作用 方式 与 上 述 相同 ,但 其 半 位 点 的 序列 为 TGACCT。
甲 状 腺 激素 受 体 (T3R) ,维生素 D 受 体 (VDR) , 视 黄 酸 受 体 (RAR) 和 9- 顺 视 黄 酸 受 体
由 CRXR) 则 以 异 二 聚 体形 式 发 挥 作用 ,它们 识别 的 半 位 点 的 序列 为 TGACCT, 但 两 个 半 位 点 的
和 安排 为 直接 重复 。 由 于 两 个 半 位 点 之 间 的 间隔 不 同 而 被 不 同 的 受 体 所 识别 ,其 中 RXR 的 应 答
性 元 件 两 个 半 位 点 间 的 间隔 为 1 bp,VDR 的 为 3bp,T3R 的 为 4bp,RAR 的 为 5 bp。
是 14. 抑制 因子 的 解除 例如 ,NFxB 在 B 淋巴 细胞 中 活化 免疫 球 蛋 白 “ 基因 的 转录 因子 ,但
医 电 有 在 于 和 种 其 它 细胞 中 。 在 其 它 细胞 中 由 于 抑制 因子 <B( 一 种 蛋白 质 ) 与 NFxB 相 结
， 合 , 使 NFxB 滞留 在 胞 浆 中 ,不 能 发 挥 作 用 。 在 B 淋巴 细胞 中 , 则 NFxB 由 LeB 的 结合 中 释放
肌 来 ， 并 移动 至 核 中 活化 转录 。
硬 另 一 个 例子 是 酵母 中 的 GAL4。.GAL4 结合 在 上 游 活化 序列 UASe 上 时 ,启动 UASce 附近
的 一 些 基因 转录 ,这 些 基因 的 表达 产物 是 半 乳 糖 代谢 的 有 关 酶 类 。 但 当 没有 半 乳 糖 时 ,蛋白 质
GAL80 与 GAL4 相 结合 ,使 GAL4 没有 启动 转录 的 活性 。 在 有 半 乳 糖 时 , 则 半 乳 糖 促使
GAL4-GAL80 复合 体 解 离 ,产生 有 活性 的 GAL4, 启动 有 关 的 酶 类 基因 的 转录 。 这 是 个 典型
的 反馈 控制 的 例子 ,实际 上 是 半 乳 糖 自己 诱导 产生 代谢 它 的 酶 类 。
5. 二 聚 体 伙伴 的 改变 “这 种 方式 的 调控 可 用 螺旋 - 环 -螺旋 CHLH) 和 蛋白 作为 例子 来 说 明 。
在 前 面 曾经 谈 到 ,HLH 蛋白 有 碱 性 的 (bHLH) 和 非 碱 性 的 两 类 。 在 一 个 二 聚 体 中 ,如 果 两 个 亚
基 都 是 bHLH 蛋白 ， 则 它 能 够 各 DNA 特异 结合 .如 果 两 个 亚 基 中 有 一 个 是 非 碱 性 HLH 和 蛋白，
则 此 三 聚 体 不 能 与 DNA 特异 结合 。 这 就 是 这 种 调控 方式 的 基本 原理 。 下面 举 两 个 具体 的 例子
〈 见 图 13-26 ) 。

417

bHLH 蛋白 质 二 聚 化 并 与 DNA 结合 | 非 碱 性 的 HLH 和 蛋 白 质 阻 止 与 DNA 结合

SB

AC-3 / ermmc

13-26 在 一 个 HLH 二 聚 体 中 ,如 果 两 个 亚 基 都 是 bHLH, 则 能 与 DNA 结合 。
如 果 二 聚 体 中 的 一 个 亚 基 没 有 碱 性 区 , 则 不 能 与 DNA 结合

在 果 蝇 中 , 基因 exzc (extramacrochaetae) 是 建立 正常 成 年 感觉 器 官 的 立体 样式 所 必需 的 ，
它 是 通过 它 的 表达 产物 抑制 几 种 基因 产物 的 功能 而 发 挥 作用 的 ,其 中 包括 基因 ae(daughter-
less) 和 achaete-scute complex(4C-S) 产 物 的 功能 。 如 不 抑制 这 些 基 因 产 物 的 功能 , 则 它们 将
引起 额外 的 细胞 形成 感觉 器 官 。4C-s 和 dea 的 表达 产物 为 bHLH 类 和 蛋白质。ezxzc 编码 的 是 没
有 碱 性 区 的 HLH 蛋白 , 它 是 个 抑制 物 。 可 以 设想 ,在 没有 ezc 功能 时 ,Da 和 AC-S 蛋白 质 形 成
二 聚 体 , 这 些 二 聚 体 活化 适当 的 靶 基 因 进 行 转录 。 但 当 产 生 Emec 蛋白 时 , 则 引起 Emec 蛋白 与
它们 形成 二 聚 体 , 此 种 二 聚 体 不 能 与 DNA 结合 ,也 就 不 能 活化 靶 基 因 的 转录 。 可 见 ,在 适当 细
胞 中 产生 Emec 蛋白 以 抑制 4C-S/aa 的 功能 ,是 使 这 些 细胞 不 形成 感觉 器 官 所 必需 的 。

肌肉 细胞 的 生成 是 由 转录 程序 的 一 个 改变 触发 的 ,此 程序 需要 数 种 bHLH 蛋白 质 , 其 中
包括 MyoD。MyoD 是 在 生 肌 细胞 myogenic cells ) 中 特异 产生 的 ,如 果 在 某 些 其 它 细 胞 中 过 度 “
表达 MyoD , 则 能 引起 这 些 细胞 开始 一 个 生 肌 程序 .肌肉 分 化 的 触发 物 大 概 是 由 MyoD-E12 或 |
MyoD-E47 形成 的 异 二 聚 体 ,而 不 是 MyoD 的 同 二 聚 体 . 在 生 肌 作用 开始 之 前 ,一 个 非 碱 性
HLH 蛋白 ,Id 蛋白 与 MyoD 和 /或 下 12,E47 相 结合 ,形成 一 种 不 能 与 DNA 结合 的 异 二 聚 体 。 |
Id 与 E12,E47 结合 的 能 力 比 与 MyoD 强 ,可 见 芭 的 作用 是 束缚 住 广泛 表达 的 E12 或 E47, 而
使 它们 不 能 发 挥 作用 。Id 的 过 度 表 达能 阻止 生 肌 作用 。 可 见 移 去 Id 是 触发 MyoD( 与 El2，
E47) 启 动 生 肌 作用 的 机 制 。

上 述 两 个 例子 表明 HLH 蛋白 类 在 细胞 分 化 中 起 着 重要 的 作用 。 两 种 bHLH 特异 结 侣 形
成 的 二 聚 体 调控 着 特定 基因 的 转录 ,从 而 使 细胞 发 生 特定 的 分 化 。 而 非 碱 性 HLH 的 存在 抑制
着 两 种 bHLH 二 聚 体 的 形成 可见, 细胞 的 分 化 与 否 依赖 于 特定 的 非 碱 性 HLH 蛋白 的 移 去 或
存在 。

418

十 ,mRNA 前 体 的 可 变 和 剪接

和 原核 不 同 , 真 核 编码 蛋白 质 的 基因 经 转录 产生 的 初始 转录 物 需 经 过 加 工 后 , 才 产生 出 成
熟 的 mRNA, 然 后 mRNA 进入 胞 浆 , 经 翻译 产生 出 特定 的 蛋白 质 。mRNA 前 体 的 这 种 加 工 包
和 括 忆 加 帽 .3' 加 尾 、 剪 接 和 编辑 等 。 现 在 已 知 许多 这 些 加 工 过 程 是 受到 调控 的 。 例 如 ,通过 不 同
上 的 剪接 可 由 一 个 基因 的 转录 物产 生出 不 同 的 成 熟 mRNA, 从 而 翻译 出 不 同 的 蛋白 质 。 又 如 , 通
过 编辑 后 mRNA 的 密码 子 有 所 改变 ,产生 出 与 基因 编码 有 所 不 同 的 蛋白 质 等 。 这 些 都 具有 重
时 要 的 生物 学 意义 。 下 面 先 介绍 mRNA 前 体 的 可 变 剪接 ,然后 再 介绍 RNA 的 编辑 。

(一 )mRNA 前 体 的 可 变 剪 接 的 概念

大 多 数 真 核 基 因 转 录 产 生 的 mRNA 前 体 是 按 一 种 方式 剪接 产生 出 一 种 mRNA, 因 而 只

屿 产生 一 种 蛋白 质 。 但 有 些 基 因 产 生 的 mRNA 前 体 可 按 不 同 的 方式 剪接 , 即 可 变 剪接 (alterna-

和 tive splicing) ,产生 出 两 种 或 更 多 种 mRNA。 在 有 些 情况 下 ,虽然 由 于 可 变 剪接 而 产生 的

和 mRNA 不 同 ,但 是 由 于 其 差异 仅 在 5 或 3' 非 翻译 区 ,因而 产生 的 蛋白 质 是 相同 的 。 这 种 可 变 前

时 接 的 意义 如 何 ,目前 尚 不 甚 明了 ,但 推测 它 可 能 对 翻译 有 调控 作用 .在 另 些 情况 下 , 则 由 于 可 变
剪接 所 产生 的 不 同 mRNA 的 编码 区 有 所 不 同 , 因 而 产生 出 不 同 的 蛋白 质 。 其 中 有 的 产生 两 种

和 蛋白质, 有 的 可 产生 更 多 种 .在 这 些 例 子 中 ,有 些 是 多 种 蛋白 质 在 同一 细胞 中 同时 产生 ;有 的 则
性 是 同一 基因 在 不 同 细胞 中 产生 出 不 同 的 蛋白 质 ,表现 出 组 织 特异 性 ;有 的 则 是 在 不 同 发 育 时 期
或 条 件 下 采取 不 同 的 剪接 方式 ,表达 出 不 同 的 蛋白 质 , 所 有 这 些 都 是 受到 调控 的 。

0

为 什么 真 核 基因 是 割裂 的 , 它 含 有 那么 多 内 含 子 ? 这 是 迄今 仍 不 甚 明 了 的 问题 。 但 可 变 剪
接 提供 了 一 种 事实 ,可 用 以 说 明 内 含 子 的 功能 之 一 , 即 由 于 内 含 子 的 存在 而 使 得 可 变 剪 接 成 为
昨 可 能 。 其 意义 在 于 可 使 一 个 基因 表达 出 多 种 蛋白 质 , 即 扩大 了 DNA 中 遗传 信息 的 含量 。 然 而
昨 念 人 不 解 的 是 ,高 等 真 核 生 物 的 基因 组 是 很 宽阔 的 , 它 完全 能 够 容纳 更 多 的 基因 ,但 不 知 为 什
女 一 方面 它 的 许多 基因 非常 分 散 , 另 方面 它 又 使 一 个 基因 产生 出 多 种 产物 。
凡 (二 ) 可 变 剪 接 的 方式
性 ”现在 已 知 许多 基因 有 两 个 或 更 多 个 启动 子 , 因 而 有 两 个 或 更 多 个 转录 起 始 位 点 。 当 用 不 同
， 的 启动 子 进行 转录 时 产生 的 初始 转录 物 是 不 同 的 。 然 而 迄今 尚未 发 现 由 于 所 用 启动 子 不同 而
产生 出 不 同 蛋白 质 的 例子 目前 尚 不 清楚 一 个 基因 有 多 个 启动 子 的 意义 如 何 , 但 估计 可 能 与 基
因 表 达 的 调控 有 关 。 现在 还 发 现 许多 基因 的 初始 转录 物 有 不 止 一 个 加 尾 位 点 (图 13-27 A) 。 与 选
用 不 同 启动 子 的 情况 不 同 ,选用 不 同 的 加 尾 位 点 可 产生 出 不 同 的 蛋白 质 ( 如 免疫 球 蛋 白 ) 。 另 一 种
可 变 前 接 方式 是 选用 不 同 的 剪接 位 点 (图 13-27 B) ,如 SV40 的 工 和 t 抗原 是 由 同一 基因 用 这 种
方式 产生 出 来 的 两 种 蛋 和 白质。 再 一 种 方式 是 上 述 二 者 兼 有 , 如 降 钙 素 基因 转录 产物 的 剪接 方式 。
(三 ) 可 变 剪接 的 举例
1. 在 大 鼠 中 , 降 钙 素 (calcitonin) 基因 的 初始 转录 物 (图 13-28) 有 6 个 外 显 子 和 2 个 加 尾
位 点 “在 甲状 腺 中 加 尾 时 采用 第 一 个 位 点 ,使 加 尾 后 的 产物 仅 含有 前 4 个 外 显 子 (其 中 第 四 个
为 降 钙 素 所 特有 ) , 它 再 经 前 接 产生 成 熟 的 mRNA ,此 mRNA 的 翻译 产物 为 降 钙 素 。 而 在 脑 中
加 尾 时 采用 了 第 二 个 加 尾 位 点 ,因而 加 尾 后 的 产物 中 含有 全 部 6 个 外 显 子 。 但 在 剪接 时 将 第 四
个 外 显 子 剪接 掉 , 使 成 熟 mRNA 由 1,2,3,5,6 等 5 个 外 显 子 组 成 ,其 翻译 产物 为 另 一 种 激素 ，
叫做 降 钙 素 基 因 相 关 肽 (calcitonin gene related peptide ,CGRP) 。 这 个 例子 说 明 , 同 一 基因 的
转录 产物 在 不 同 组 织 中 进行 了 不 同 的 前 接 ,从 而 产生 出 不 同 的 蛋白 质 , 它 必然 是 受到 调控 的 。
419

在 这 个 例子 中 还 可 看 出 , 它 既 采用 不 同 的 加 尾 位 点 ,又 进行 不 同 的 盘 接 。

加 多 聚 (A) 位 点 5 剪接 位 点 “3 剪接 位 点 加 多 聚 (A) 位 点

了 世上 汉 4
AAS

初始 转录 物 人 | 外 初始 转录 物 |

帐 子 幅 子

| 有 裂解 和 聚 腺 苷 酸化

在 Al 裂解 和 在 A2 有 裂解 和
聚 腺 苷 酸化 了

剪接
0

成 部 mRNA 成 熟 mRNA

(a) (b)

13-27 初始 转录 物 不 同 加 工 过 程 的 两 种 机 制

(a) 多 个 加 尾 位 点 (图 中 示 出 2 个 ,Al 和 Asz) 的 可 变 使 用 ; (b) 可 变 剪 接 ( 示 出 2 个 不 同 的 3 剪接 位 点 ) 。

加 尾 位 点 加 尾 位 点
1 2 3 4 5 全
初始 转录 物
邮 裂解 和 加 尾 忆
甲状 腺 脑
2 3 4 1 2 3 4 5 6
EC
| 外 共 | 剪接
224 4 人 6
成 关 mRNA 国有， 六 NEED
| 翻译 | 翻译
mw TS
本 |
A wm

降 钙 素 CGRP

图 13-28 ” 降 钙 素 基 因 转 录 产 物 在 不 同 组 织 中 进行 不 同 的 加 尾 和 剪接 ,从 而 产生 出 不 同 的 蛋白 质

420

一 er 一 prerererterrrmemrteerrreerrraaererrrereeeerreneamrnna

Ms 一

2. 在 产生 抗体 的 细胞 前 体 , 前 B 淋巴 细胞 (pre-B lymphocyte) 中 合成 的 抗体 是 定位 在 细
胞 质 膜 上 的 ,此 种 抗体 的 重 链 的 C 端 有 段 玻 水 区 ,此 下 水 区 散在 膜 中 ,从 而 把 抗体 固定 在 质 腊
上 (图 13-29) 当 用 特异 的 抗原 刺激 前 B 淋巴 细胞 时 ,抗原 被 细胞 膜 上 的 抗体 所 识别 ,引起 细
胞 的 分 化 和 增殖 。 这 种 活化 了 的 也 淋巴 细胞 产生 的 抗体 被 分 泌 到 胞 外 , 因为 它 的 重 链 的 C 端
没有 那 一 段 定位 在 质 膜 上 的 朴 水 区 。

结合 在 膜 上 的 抗体 分 子 AD 溶解 的 抗体 分 子
， RNA 的 可 变 前 接 洁 38
将 结合 在 膜 上

的 结构 域 除 掉 (7
1

分 沁 到 细胞 外
介质 中

Se
本
EPE

A 结合 在 膜 上 的 单位 8

13-29 A. 前 B 淋巴 细 胞 产生 的 抗体 定位 于 膜 上 ;B. 活化 的 B 淋巴 细胞 产生 的 抗体 被 分 泌 到 胞 外

考察 发 生 这 种 变化 的 原因 得 知 是 由 于 可 变 剪 接 引起 的 。 图 13-30 中 所 示 是 IgM 免疫 球 蛋

白 M) 的 情况 . 由 图 中 可 以 看 出 ,IgM 重 链 的 mRNA 前 体 在 恒 区 (constant region) 有 6 个 外 显

子 和 2 个 加 尾 位 点 。 在 前 B 淋巴 细胞 阶段 ,加 尾 发 生 在 外 显 子 M2 之 后 ,因而 其 恒 区 是 由 剪接
在 一 起 的 6 个 外 显 子 产生 的 。 前 4 个 外 显 子 编码 恒 区 的 4 个 结构 域 。 后 2 个 外 显 子 (M1 和
M2) 编 码 41 个 氨基 酸 残 基 的 疏水 的 C- 末 端 区 以 及 一 段 不 翻译 的 尾 序 。 M1 和 M2 编码 的 一 段
朴 水 区 就 是 使 IgM 定位 在 质 膜 上 的 序列 ,因而 此 时 产生 的 IgM 是 定位 在 质 膜 上 的 。 当 前 B 淋
巴 细胞 受到 抗原 的 刺激 而 变 为 活化 的 B 细胞 , 即 分 泌 阶 段 时 ,mRNA 前 体 的 加 尾 发 生 在 外 显
子 md 之 后 ,因而 剪接 后 的 成 熟 mRNA 中 没有 了 外 显 子 M1 和 M2, 产 生 的 IgM 便 是 分 弯 型 的
了 。 这 是 一 个 仅 因 选 用 的 加 尾 位 点 不 同 而 产生 不 同 蛋白 质 的 例子 ,蛋白 质 间 的 差异 仅 在 C 端 。

膜 结合 阶段

核 内 RNA
在 M2 后 加 尾 ，

在 mRNA 中 有
外 显 子 MI 和 M2

分 泌 阶 段

核 内 RNA 在

外 显 子 pkd 后 加 尾 ;
mRNA 中 仅 有

前 4 个 外 显 子

图 13-30 IgM 重 链 基因 转录 物 的 不 同 加 工 方式 , 仅 示 出 恒 区 部 分
421

这 个 例子 说 明 , 在 细胞 发 育 的 不 同 阶段 ,调控 机 制 可 使 同一 基因 的 转录 产物 发 生 不 同 的 剪接 ，
产生 出 不 同 的 蛋白 质 , 以 和 不 同 发 育 阶段 的 需要 相 适 应 。

3.SV40 病毒 的 早期 基因 转录 物 通过 不 同方 式 的 剪接 产生 两 种 mRNA, 它 们 的 翻译 产物
分 别 为 工 抗原 (分 子 量 约 为 100kD) 和 t 抗原 (分 子 量 约 为 18 kD), 如 图 13-31 所 示 ，SV40 早
期 基因 的 转录 物 含有 两 个 外 显 子 和 一 个 内 含 子 , 它 有 两 种 剪接 方式 。 一 种 是 剪接 掉 一 个 大 的 内
含 子 , 产 生 一 个 比较 小 的 mRNA,。 由 于 在 剪接 掉 的 内 含 子 中 有 个 终止 密码 子 也 被 除去 了 ,因而
翻译 出 来 的 是 分 子 量 比较 大 的 工 抗原 。 另 一 种 剪接 方式 是 剪接 掉 一 个 比较 小 的 内 含 子 ,产生
一 个 比较 大 的 mRNA, 但 是 由 于 在 其 中 保留 了 那个 终止 密码 子 , 所 以 翻译 产生 的 是 分 子 量 小
得 多 的 t 抗原 。 这 种 剪接 方式 是 3 剪接 位 点 固定 ,但 选用 了 不 同 的 5 剪接 位 点 。 两 种 剪接 方式
在 同一 细胞 中 同时 发 生 。

早期 基因

产生 t mRNA 时
剪接 掉 的 内 含 子 L 转录
mRNA 前 体 一 一 一 一 mcgssU

产生 T mRNA 时

前 接 掉 的 内 含 子
剪接 途径 1 > 导 剪接 途径 I
一 一 一 mu 一 一

岂 TmRNA tmiRNA
人 和 人

大 T 抗 原 小 + 抗原

100 kD 18 kD
13-31 SV40 的 早期 转录 物 通过 不 同 的 剪接 表达 出 工 抗 原 和 +t 抗原 两 种 蛋 和 白质

(四 ) 可 变 剪 接 的 调控 机 制

当前 迫切 需要 解决 的 问题 是 什么 物质 调控 着 可 变 剪接 ?” 其 调控 机 制 如 何 ? 对 于 这 些 问 题
目前 已 经 有 了 一 些 了 解 , 但 还 远 不 彻底 。 从 前 面 所 举 的 SV40 的 例子 可 以 看 出 ,在 剪接 时 是 用
相同 的 3' 剪接 位 点 与 不 同 的 5 剪接 位 点 相 联 的 ,从 而 产生 了 工 抗原 和 + 抗原 两 种 蛋白 质 。 在
产生 T 抗原 的 剪接 中 ,由 于 选用 的 5 剪接 位 点 去 掉 了 一 个 终止 密码 子 , 所 以 产生 二 个 大 的 蛋
白质 。 而 在 产生 t 抗原 的 剪接 中 采用 了 另 一 个 5 剪接 位 点 ,因而 在 其 mRNA 中 保留 了 该 终 正
密码 子 , 产 生出 一 个 较 小 的 蛋白 质 。 在 腺 病毒 科 (Adenovirus) 的 E1A 区 的 转录 产物 前 接 时 ,也
是 用 同一 3 剪接 位 点 与 不 同 的 5 剪接 位 点 联结 ,从 而 产生 出 3 种 蛋白 质 (图 13-32)。 而 在 果 电
的 tra 剪接 中 则 是 用 同一 5 剪接 位 点 与 不 同 的 3' 剪接 位 点 联结 ,结果 由 于 一 个 终止 密码 子 的
保留 与 否 而 引起 了 不 同 的 结果 ,从 而 决定 了 果 蝇 的 性 别 ( 详 见 后 ) 。

422

U ternative splicing factor,ASF) 。 后 来 发 现 它 原 来

线 位 点 时 ,提高 SF2 的 浓度 促使 它 使 用 与 3 位 损 最

国 辣 坝 楼 位 点 药 选 用 是 怎样 做 到 的 在 用 IE 从 有 下 有 ODNAE
SV40 感染 不 同类 型 的 细胞 时 发 现 它们 产生 的 工 / 一 个 3' 位 点 前 接 二 二
vt 抗原 的 比值 是 不 同 的 .用 产生 较 多 t 抗原 的 细胞 TREESRSSSE

， 抽 提 物 在 体外 进行 实验 时 , 其 剪接 方式 也 是 产生

， 较 多 的 + 抗原 mRNA。 由 这 种 类 型 的 细胞 中 提取 (amaamesaaeaal。 aaa

， 到 一 种 蛋白 质 , 当 将 此 蛋白 质 加 在 其 它 类 型 细胞 5

”的 抽 提 物 中 时 ,也 使 其 它 类 型 细胞 的 抽 提 物产 生 “

由 出 较 多 的 + 抗原 mRNA ,说明 此 蛋白 质 具有 可 变 。 腺 病毒 EIA 用 不 同 的 5 位 点 与 一 个 3 位 点 剪接
， 剪接 的 效用 ,并 曾经 把 它 叫 做 可 变 剪接 因子 (al- 让 we

是 就是 前 接 因子 SF2。SF2 是 剪接 体 组 装 的 早期 上 FE
上 又 以 及 剪接 中 第 一 个 裂解 -连接 反应 所 必需 的 因 人

字 , 它 是 个 与 RNA 结合 的 鼻 白 质 ,具有 一 个 结合 IEAA SN 2 全 时
RNA 的 富 含 精 - 丝 二 肽 序列 的 基 元 。 此 基 元 在 其 2
时 它 结合 RNA 的 蛋白 质 中 也 具有 。 当 一 个 mRNA 5% 55 氨基 酸
三 不 ,3 前 接 位 点 前 面 有 不 止 一 不 纪 剪 接 二 一 一 一 一 一 一 一
近 的 5' 位 点 进行 剪接 ,而 减少 用 其 它 5 位 点 。SF2 0
| 的 这 种 效应 能 被 另 一 个 剪接 因子 SF5 所 抵消 。 这 0
此 因子 的 确切 分 子 作用 目前 尚 不 清楚 ,但 总 的 说 gm/ aaal Upaamea
来 ,参与 在 剪接 体 组 装 中 的 蛋白 质 影响 着 5 剪接 AN 和 只 布 夫人 性 六 千 ，
位 点 的 选择 性 使 用 。 的 蛋白 质

(五 ) 可 变 剪 接 决定 果 蝇 的 性 别

在 果 蝇 的 性 别 决定 途径 中 涉及 到 一 系列 基因
间 的 相互 作用 ,在 其 中 用 可 变 剪 接 区 分 开 雄 和 肉 。
13-33 示 出 了 此 途径 ,在 其 中 X 染色 体 与 常 染
色 体 的 比值 决定 着 Sxl(Sex-lethal) 的 表达 ,并 且 表达 的 改变 逐次 地 通过 其 它 基因 到 达 Dsx
(double Sex) ,Dsx 是 此 途径 的 最 后 成 员 。

途径 是 由 Sxl 的 性 别 特异 性 剪接 开始 的 。szl 基因 的 外 显 子 3 含有 一 个 终止 密码 子 , 它 阻
下 动能 蛋白 质 的 合成 。 在 雄性 (X 染色 体 对 常 染 色 体 的 比值 低 ) 剪 接 的 mRNA 中 合 有 此 外 显
子 , 因 而 不 能 产生 出 功能 的 蛋白 质 。 在 肉 性 (X 染色 体 对 和 常 染 色 体 的 比值 高 ) 甬 接 的 mRNA 中
不 含 此 外 显 子 。 因 而 仅 在 雌性 中 产生 Sxl 蛋白 。Sxl 蛋白 具有 与 其 它 结合 RNA 的 蛋白 质 类 似
的 结构 。

Sxl 蛋白 的 存在 改变 了 transformer(tra) 基 因 的 剪接 (可 变 剪接 的 方式 与 wsz 类 似 , 参 看
图 13-32)。 一 种 前 接 方式 是 在 雄性 和 峻 性 中 都 发 生 的 ,剪接 产生 的 mRNA 中 含有 靠 前 的 终止
密码 子 , 因而 没有 功能 蛋白 质 的 产生 。 在 雌性 中 由 于 Sxl 蛋白 的 存在 , 它 阻止 了 与 5 位 点 靠近
的 3! 前 接 位 点 的 利用 ,而 是 越过 它 用 了 下 一 个 3' 剪 接 位 点 ,从 而 去 掉 了 一 个 外 显 子 ,也 就 去 掉
了 其 中 的 终止 密码 子 。 由 此 产生 了 一 个 肉 性 特异 的 mRNA , 它 编码 一 个 蛋白 质 。 因 此 zra 仅
在 雌性 中 产生 一 种 蛋白 质 ,此 蛋白 质 是 个 剪接 调节 剂 , 它 影 响 tra2 的 剪接 ,以 类 似 的 方式 使 得

423

图 13-32 ”在 剪接 时 选用 不 同 的 剪接 位 点
可 引入 终止 密码 子 (用 * 号 示 出 ) 或 改变
读 框 ,从 而 产生 出 不 同 的 蛋白 质

克 与 4 的
比值

无 产物 -和 王 严 ma

的 交 人 - 近 王 mm 。

和 近 理 = 到- 时

梭 性 特异 的 人 本 二 硬 : 本 二 加

Dsx 蛋白 质 ea 肉 性 特异 的 Dsx

封 阻 肉 性 分 化 阻 过 雄性 基因
雄性 了

13-33 ” 果 蝇 (D， zeLaz0gaste 六 性 别 决 定 的 途径
在 内 性 中 发 生 一 系列 不 同 的 剪接 ,在 每 一 步 都 封 阻 了 雄性 发 育 的 途径 。

仅 在 雌性 中 产生 出 Tra2 蛋白。Tra2 蛋白 再 影响 dsz 的 剪接 。Tra 和 Tra2 与 SF2 类 似 , 都 有
精 - 丝 样子 的 结合 RNA 的 基 元 ,它们 直接 作用 于 靶 转 录 物 。tra2 的 雌 特异 性 剪接 需要 Tra ,而
dsz 的 峻 性 特异 性 剪接 需要 Ira 和 TIra2 二 者 。

13-34 表示 出 dsz 的 可 变 剪 接 方式 。
从 图 中 可 以 看 出 , 果 蝇 的 dsz 基因 在 雌性 和 剪 掉 一 个 外 显 子
雄性 中 的 剪接 方式 不 同 。 在 峻 性 中 (有 Tra
和 Tra2) 是 内 含 子 3 的 5 剪接 位 点 与 其 3 前

接 位 点 相 接 ,从 而 保留 了 外 显 子 4。 外 显 了 4 ”AAA 人 夺

中 有 个 终止 密码 子 , 所 以 翻译 至 此 为 止 ,产生

的 是 肉 性 特异 的 Dsx 蛋白 。 在 雄性 中 (没有 AAS

Tra 和 Tra2) 内 含 子 3 的 5 剪接 位 点 直接 与 “ 潮

内 含 子 4 的 3' 剪 接 位 点 相 剪接 ,使 其 mRNA

中 没有 了 外 显 子 4, 因 而 翻译 可 继续 到 外 显 图 13-34 果 蝇 4sz 基因 转录 物 在 雌性 和 雄性 中 的

子 6, 产 生 的 是 雄性 特异 的 Dsx 蛋白 。 可见 在 不 同 剪 接 方式

此 途径 的 最 后 在 雌性 和 雄性 中 产生 出 不 同 的 注意 外 显 子 和 上 中 有 个 终止 密码 子 ( 以 * 号 示 出 )。

蛋白 质 。 雄 性 的 产物 封 阻 了 分 化 为 峻 性 ,而 雌性 的 产物 则 阻 如 了 雄性 特异 基因 的 表达 。
424

党 综 上 可 见 ,性 别 决定 起 始 于 szl 在 肉 性 中 的 特异 剪接 , 它 避 免 了 像 雄性 中 那样 的 缺陷 性 前
接 , 从 而 仅 在 雌性 中 产生 Sxl。Sxl 影响 zra 的 剪接 ,Tra 又 影响 tra2 的 剪接 ,从 而 使 得 仅 在 雌性
中 产生 Tra 和 Tra2, 它 们 再 影响 dsz 的 剪接 ,最 后 决定 了 性 别 。 已 知 Tra2 在 体外 结合 在 dz
mRNA 前 体 中 的 峻 性 特异 外 显 子 内 的 一 个 短 区 域 上 ,并 诱导 峻 性 特异 剪接, 但 仍 不 清楚 它 是
怎样 调控 3' 剪接 位 点 的 选择 的 。 由 于 没有 Tra 和 Tra2 时 能 够 发 育 为 正常 的 雄性 ,可 见 正常 前
，。 接 不 需要 它们 。 它们 作为 特异 的 调节 物 , 不 必须 参与 在 剪接 反应 的 机 制 之 中 。 在 这 一 点 上 它们
中。 与 SF2 不 同 ,SF2 是 一 般 剪 接 所 需要 的 因子 ,同时 也 影响 不 同 剪接 位 点 的 选择 。
二 (五 ) 反 式 剪接

前 面 所 讨论 的 剪接 过 程 都 是 发 生 在 一 个 RNA 分 子 内 部 , 即 通过 剪接 将 一 个 RNA 分 子 内
几 。 部 的 内 含 子 剪接 掉 , 使 外 显 子 连接 在 一 起 ,这 种 剪接 方式 称 为 顺 式 剪接 (cis-splicing)。 已 发 现 ，
在 锥 虫 . 线 虫 以 及 植物 的 叶绿体 中 发 生 两 个 RNA 分 子 之 间 的 剪接 , 即 反 式 剪接 (trans-spli-

cing)。 因 此 ,在 真 核 生 物 中 虽然 反 式 剪接 比 顺 式 前 接 少 很 多 ,但 它 确实 存在 。
在 锥 虫 (tryztpaxzosoxme) 中 发 现 有 许多 mRNA
的 纪 端 有 个 共同 的 35 碱 基 的 前 导 序列 (leader 革 0 呈 位 单个 转录 单位
国 seauenee). 然而 此 前 导 序列 并 不 被 每 个 转录 单位 “MCA 人 CNANANANCNY
一 的 上 游 所 编码 ,而 是 在 由 位 于 基因 组 其 它 区 域 的 小 由
量 。 一 个 重复 单位 转录 出 来 的 独立 的 RNA 中 此 。 ，。，s
RNA 的 3' 端 还 具有 前 导 序 列 以 外 的 一 段 序 列 。 前 导 序列 碱 基 09 序列
图 13-35 中 示 出 了 此 RNA 的 组 成 。 在 其 35 碱 基 内 含 子 左 部 ”内 含 子 右 部
前 导 序列 的 紧 后 面 是 个 有 5 剪接 位 点 的 序列 。 而
在 编码 mRNA 的 序列 中 ,在 成 熟 mRNA 的 紧 前 小
面 有 个 3' 剪接 位 点 。
如 图 13-35 中 所 示 , 如果 前 导 序列 与 mRNA en
是 由 反 式 剪接 连接 起 来 的 , 则 前 导 RNA 的 3' 区 S Y 型 分 子
和 mRNA 的 中 区 各 相当 于 一 个 内 含 子 的 一 半 。 一 A 一 ^
如 果 剪 接 是 按 通常 的 核 内 剪接 机 制 进行 的 , 则 首
先 应 在 内 含 子 引 段 的 GU 与 3' 段 AG 上 游 的 分 支 小
点 之 间 发 生 反应 ,形成 一 个 5-2' 连 接 的 磷酸 二 琵
键 。 此 时 由 于 内 含 子 的 两 个 部 分 不 是 共 价 连 接 在 35 碱 基 mRNA 序列
一 起 的 , 因而 形成 的 是 个 Y 字 型 分 子 ,而 不 是 像 ER
通常 那样 形成 个 套 索 型 分 子 。 已 证 明 此 种 剪接 确 。 图] > 仆 ^ 提 全 个 外 显 子 ，
实 是 形成 个 立 字 型 分 子 , 因而 支持 图 13-35 中 所 此 外 显 子 通过 反 式 前 接 与 一 个
示 的 剪接 模式 。 mRNA 的 第 一 个 外 显 子 相连 接

线虫 (C. eregaxs) 中 肌 动 蛋白 Cactin) 基 因 的 表达 与 上 述 情况 类 似 。3 种 肌 动 蛋白 mRNA
(以 及 某 些 其 它 RNA) 的 5 端 是 个 相同 的 22 碱 基 的 前 导 序 列 。 此 序列 不 在 肌 动 蛋白 基因 中 编
码 , 而 是 由 另外 的 基因 编码 ,此 基因 独立 地 转录 出 一 个 100 碱 基 的 RNA ,前 导 序 列 是 此 RNA
的 一 部 分 。 ，
在 反 式 剪接 中 提供 5 外 显 子 的 RNA 称 为 前 接 的 前 导 RNA (spliced leader RNA ,SL
RNA) .SLRNA 存 在 于 几 种 锥 虫 中 , 也 存在 于 线虫 中 .它们 有 一 些 共 同 的 特点 ,它们 都 折 午 成
425

一 种 相同 的 二 级 结构 ,此 结构 有 3 个 蔡 - 环 (stem-
loop) 和 一 个 单 链 区 ,是 以 snRNA 的 形式 存在 的 。
锥 虫 具 有 U2、U4 和 1U6 snRNAs ,但 没有 Ul 或
U5 snRNAs .可 用 SL RNA 的 性 质 来 解释 为 什么
没有 Ul, 因 为 SL RNA 能 够 完成 通常 是 由 Ul
snRNA 完成 的 在 5 剪接 位 点 的 功能 。 可 见 ,SL
RNA 事实 上 是 含有 一 个 具有 U1l 功能 的 snRNA
序列 ,此 序列 与 它 识 别 的 外 显 子 - 内 含 子 位 点 联结
在 一 起 。 看 来 ,SL RNA 的 反 式 剪接 反应 可 能 代表
着 向 完全 的 核 内 剪接 装置 进化 中 的 一 个 步骤 。
某 些 叶 绿 体 基因 是 反 式 剪接 的 ,图 13-36 中
指出 了 一 个 例子 。 单 胞 薄 (CALazzywoxzozas) 叶 绿
体 的 asa 基因 由 3 个 相隔 很 远 的 外 显 子 所 组 成 。
外 显 子 1 和 外 显 子 2 相距 50 kb ,外 显 子 2 和 外 显
子 3 相距 90 kb。 在 这 些 外 显 子 之 间 有 许多 其 它 的
基因 。 而 且 外 显 子 1 的 转录 方向 与 外 显 子 2 和 3
的 转录 方向 相反 。 因 此 ,无 论 如 何 它 们 也 不 可 能 是
被 转录 出 一 个 RNA 分 子 进行 表达 的 。 事 实 上 已

图 13-36 ”叶绿体 zsa 基因 的 外 显 子 分 布 情 况 。
鉴定 出 来 的 转录 物 只 是 含有 每 个 外 显 子 (和 它 两 推测 其 mRNA 是 由 两 步 反 式 前 接 形 成 的

侧 的 局 部 序列 ) 的 RNA.。 因 而 推断 其 mRNA 是 由
两 个 反 式 剪接 反应 形成 的 。 在 这 两 个 反 式 剪接 反应 中 还 需要 一 些 其 它 的 基因 ,因而 可 知 此
mRNA 的 剪接 过 程 是 很 复杂 的 。

十 一 .RNA 编辑 (RNA editing )

分 子 生物 学 的 一 个 基本 公理 是 ,一 个 mRNA 的 序列 只 能 代表 DNA 中 编码 它 的 序列 。 中
心 法 则 设想 的 是 个 线 型 关系 , 即 DNA 的 一 个 连续 的 序列 转录 为 mRNA 序列 ,mRNA 序列 再
直接 翻译 成 蛋白 质 。 割 裂 基因 的 存在 以 及 通过 RNA 的 剪接 移 去 内 含 子 , 在 基因 表达 的 过 程 中
引入 了 一 个 额外 的 步骤 , 即 DNA 中 的 编码 序列 (外 显 子 ) 必 须 在 RNA 中 再 连接 。 但 是 此 过 程
仍然 是 个 信息 传递 过 程 ,在 其 中 DNA 的 真正 编码 序列 没有 发 生 改 变 。

在 一 些 特 殊 的 条 件 下 DNA 编码 的 信息 发 生 了 改变 ,其 中 最 显著 的 是 在 哺乳 类 和 禽类 中
产生 编码 免疫 球 蛋 白 的 新 序列 。 这 些 改变 特异 地 发 生 在 合成 免疫 球 蛋 白 的 体 细胞 (B 淋巴 细
胞 ) 中 。 在 再 造 一 个 免疫 球 蛋 白 基 因 的 过 程 中 ,在 单个 细胞 的 DNA 中 产生 新 的 信息 ,并 且 在
DNA 中 编码 的 信息 由 于 体 细胞 的 突变 而 改变 了 .不 过 在 这 种 情况 下 ,DNA 中 的 信 息 仍 被 忠实
地 转录 到 RNA 中 。

与 上 述 情况 不 同 ,RNA 编辑 是 个 信息 在 mRNA 水 平 上 发 生 改 变 的 过 程 。 此 过 程 是 由 于 二
个 RNA 中 的 编码 序列 与 转录 产生 它 的 DNA 序列 有 所 不 同 而 揭示 出 来 的 . 已 知 的 RNA 编辑
有 两 种 :中 在 哺乳 动物 细胞 中 发 生 的 mRNA 个 别 碱 基 的 取代 ,从 而 引起 它 编码 的 蛋白 质 的 改
变 ; 凶 在 锥 虫 的 线粒体 中 一 些 基 因 的 转录 物 发 生 更 多 的 改变 ,产生 碱 基 的 插入 或 缺失 。

图 13-37 所 示 是 哺乳 动物 中 载 脂 蛋白 B (apo-lipoprotein B,apoB)mRNA 编辑 的 过 程 。
426

apoB 包围 在 脂 质 的 外 面 形成 脂 蛋 白 颗 粒 , 因而 在 甘油 三 酯 和 胆固醇 的 转运 中 起 着 重要 的 作
用 .apoB 有 两 种 .在 肝 中 合成 的 是 分 子 量 约 为 512 kD 的 apoB-100, 它 参 与 内 生性 脂 质 的 运输 ;
另 一 种 是 在 小 肠 中 合成 的 分 子 量 约 为 240 kD 的 apoB-48, 它 以 乳 糜 微粒 的 形式 运输 由 食物 中
吸收 的 脂肪 .apoB-100 含有 4 563 个 氨基 酸 残 基 ,apoB-48 由 apoB-100 的 N 端 2 152 个 氨基 酸
残 基 所 组 成 .由 于 apoB-48 没有 了 apoB-100 的 C 端 部 分 ,所 以 它 虽然 能 形成 脂 蛋 白 颗 粒 , 但 不
能 像 apoB-100 那样 与 细胞 表面 的 LDL( 低 密度 脂 蛋 白 ) 受 体 结 合 了 。

载 脂 蛋白 B 基因 含有 29 个 外 显 子

HI TEL ES | | 本

2153 号 密码 子 编码 谷 酰胺
CAA

编辑
一 一 一 一 研 二 一 一 一 一 一
QQQQQQQRQQR QQQQQQ
在 肝 中 剪接 形成 的 ”在 小 肠 的 mRNA
mRNA 编码 一 个 中 有 个 UAA 密码 子 ，
4563 氨基 酸 残 基 它 使 翻译 停止 在
的 蛋白 质 2153 密码 子 处

图 13-37 小肠 和 肝 中 azoB 基因 的 序列 是 相同 的 ,但 在 小 肠 中
mRNA 的 一 个 碱 基 改变 了 ,从 而 产生 了 一 个 终止 密码 子

已 知 在 基因 组 中 仅 含 有 一 个 编码 atoB 的 基因 ,并 且 在 所 有 组 织 中 都 是 相同 的 。 此 基因 的
编码 区 有 4 563 个 密码 子 , 在 肝 中 它 转录 出 一 个 mRNA ,其 编码 序列 全 部 被 翻译 而 产生 肝 中 的
apoB-100。 那 么 为 什么 在 小 肠 中 会 产生 出 一 个 短 了 约 一 半 的 蛋白 质 apoB-48? 经 查 明 ,小 肠 中
的 mRNA 与 肝 中 的 mRNA 有 所 不 同 , 有 一 个 碱 基 发 生 了 改变 , 即 在 肝 的 mRNA 中 第 2 153
号 密码 子 为 谷 酰胺 的 密码 子 CAA ,这 与 DNA 中 的 是 一 致 的 。 但 在 小 肠 中 此 密码 子 中 的 C 变
成 了 避 , 成 为 终止 密码 子 UAA ,所 以 在 小 肠 中 的 翻译 到 此 为 止 ,产生 出 一 个 比 肝 中 小 得 多 的
蛋白 质 。 此 现象 在 人 、 免 . 鼠 中 都 已 发 现 。

此 种 C 变 为 U 的 过 程 是 怎样 发 生 的 ? 在 基因 组 中 没有 编码 此 种 新 序 列 的 另外 的 基因 或 外
显 子 ,也 未 发 现在 剪接 方式 上 有 任何 改变 。 因 而 认为 这 是 一 种 新 的 机 制 在 起 作用 ,是 在 转录 产
生 RNA 的 过 程 中 或 在 转录 完成 后 发 生 C-U 的 转变 , 即 在 RNA 水 平 上 发 生 的 , 称 之 为 RNA
编辑 。 已 知 apoB mRNA 中 的 C 变 为 U 是 由 特异 的 脱 氨基 酶 催化 的 ,此 酶 仅 存 在 于 小 肠 中 , 肝
中 没有 , 它 是 受 发 育 调控 的 .有 实验 表明 ,在 apoB 的 编辑 中 编辑 位 点 下 游 5 一 15 一 段 核 苷 酸 序
列 很 重要 , 称 为 “ 系 留 (mooring) 区 ”。 如 将 此 11 个 核 苷 酸 用 其 它 核 苷 酸 蔡 换 , 则 引起 编辑 活性
丧失 ; 如 将 此 段 序列 移 到 其 它 位 置 或 其 它 mRNA 上 , 则 会 产生 新 的 编辑 位 点 。 因 而 推测 此 序列
可 能 是 蛋白 质 识 别 并 结合 的 区 域 , 特 异 的 脱 氨基 酶 以 某 种 方式 到 达 此 位 置 , 并 催化 编辑 位 点 的
胞 喀 啶 脱 去 氨基 变 成 尿 喀 啶 。

427

在 哺乳 动物 细胞 中 用 RNA 编辑 的 方式 在 RNA 水 平 上 改变 信息 的 事实 虽然 很 少 ,但
apoB 的 编辑 不 是 唯一 的 。 另 一 个 已 知 的 例子 是 小 鼠 脑 中 的 谷 氨 酸 受 体 。 谷 氨 酸 结合 在 突 触 后
(postsynaptic) 膜 上 的 受 体 上 时 开放 兰 椎 动物 中 枢 神经 系统 中 的 阳离子 特异 通道 (cation-spe-
cific channels) .RNA 编辑 将 谷 氨 酸 受 体 mRNA 中 的 一 个 谷 酰胺 密码 子 (CAG) 改 变 成 为 精 氮
酸 的 密码 子 (CGG) 。 受 体 中 的 谷 酰胺 变 为 精 氨 酸 阻止 了 Ca?+ 通 过 此 通道 ,但 Na+ 可 以 通过 。 可
见 编辑 作用 是 生理 功能 所 必需 的 。 这 种 A 变 为 G 的 编辑 机 制 目前 尚 不 甚 明了 。

已 发 现 锥 虫 线粒体 的 一 些 基因 的 序列 发 生 了 很 大 的 改变 。 第 一 个 发 现 的 是 其 细胞 色素 氧
化 酶 亚 基 工 蛋白 的 序列 与 编码 它 的 基因 coz 工 相 比 有 移 码 (frameshift) 现 象 。 图 13-38 示 出 了
其 基因 和 和 蛋白 质 的 序列 。 这 种 情况 是 怎样 发 生 的 ?从 图 中 可 以 看 出 是 由 于 在 coz IEmRNA 的 移
码 位 点 附近 插入 了 4 个 额外 的 尿 苷 酸 。 由 于 这 种 插入 才 恢复 了 该 蛋白 质 的 正确 读 框 (翻译 出 正
确 的 功能 蛋白 质 ) 。 插 入 的 结果 是 增加 了 一 个 氨基 酸 ,并 且 改 变 了 周围 的 氨基 酸 。 由 于 未 能 发
现 与 其 mRNA 序列 相同 的 另外 的 基因 ,因而 认为 这 些 额 外 的 碱 基 是 在 转录 过 程 中 或 转录 后 插
入 的 。 与 此 类 似 的 mRNA 与 基因 组 序列 之 间 的 差异 在 一 些 病毒 中 也 已 发 现 , 在 其 中 是 在
mRNA 中 插入 G。

IEESS LS 和 1 长 N LVY SG Y NM 基因 组 中 编码 的

4 E

ATATCAAGTT TAGGTATAAAAGTAGA “G A ACC TGGTAGGTGTAAT ; DNA 序列

ESIISIEERNSNNEREVD CC 1 PP 6G Rh G NE 蛋 自 质 序 列

图 13-38 锥 虫 coz 工 基因 的 mRNA 与 其 DNA 相 比 有 个 一 1 移 码
正确 的 读 框 是 经 插入 4 个 尿 苷 酸 产 生 的

类 似 的 ,RNA 序列 的 编辑 在 其 它 基因 中 也 发 生 , 并 且 包 括 有 尿 苷 酸 的 插入 和 缺失 。 图 13-
39 是 布 氏 锥 虫 (T. brucei) coz 工 基因 的 编辑 情况 .在 此 很 极端 的 例子 中 ,mRNA 中 一 半 以 上 的
尿 苷 酸 是 不 被 基因 编码 的 。 将 基因 组 DNA 与 mRNA 进行 对 比 可 以 看 出 ,没有 长 于 了 不 核 音
酸 的 一 段 序列 是 没有 改变 的 ,而 且 有 的 地 方 连续 插入 了 7 个 尿 苷 酸 之 多 。

一 一 一 一 ”一 ”一 一 一 一 一 一 一 一” ”一 一 ”一 ”一 一 一 一 一 一 一 一

UUG UGAAACCAG 要 可 UUAUUUAUUACAUUAAGUUGGUGUUUUUGG UUC

图 13-39 7 prucel co mRNA 的 部 分 序列
指出 了 许多 未 被 DNA 编码 的 U( 下 面 划 线 者 ) 和 由 RNA 移 去 的 U( 以 工 表示 出 )。

特异 插入 的 信息 是 由 什么 提供 的 ? 已 知 一 个 指导 RNA(guide RNA) 的 序列 是 与 正确
编辑 后 的 相应 mRNA 片段 互补 的 。 图 13-40 示 出 了 指导 序列 在 利 什 曼 原 虫 CEezsjzzazia) 的 细
428

胞 色素 b 基因 中 的 作用 模型 。 上 面 的 序列 是 初始 转录 物 ( 或 者 叫做 编辑 前 的 RNA ,pre-edited
RNA) 的 序列 .其 中 的 间隔 表明 在 编辑 过 程 中 将 在 该 处 插 和 人 碱 基 。 在 此 区 域 必须 插入 8 个 U 才
， 能 产生 正确 的 mRNA 序列 。 指 导 RNA 序列 与 mRNA 的 编辑 区 及 其 周围 的 相当 长 的 一 段 是
互补 的 。 典 型 的 情况 是 在 编辑 区 的 3 侧 互 补 的 长 一 些 , 而 5 侧 则 比较 短 。 在 指导 RNA 与 编辑
前 的 RNA 配对 时 出 现 间隔 ,这 些 间 隅 是 指导 RNA 中 的 A 未 能 配对 处 ,因为 在 编辑 前 的
RNA 中 该 处 没有 与 之 配对 的 U。 这 样 指导 RNA 提供 了 一 个 模板 ,使 得 在 这 些 位 置 能 够 插入
缺少 的 U.。 编辑 完成 后 ,指导 RNA 便 与 mRNA 分 开 。 编辑 的 程序 可 能 是 很 复杂 的 。 在 此 例子
中 ,在 很 长 的 一 段 转 录 物 中 要 通过 编辑 总 共 揪 人 39 个 U 残 基 ( 图 中 未 全 示 出 ) ,看 来 它 需 要 两
妆 个 指导 RNA ,它们 作用 在 相 邻 的 位 置 。 编 辑 可 能 是 同时 进行 ,也 可 能 是 先 用 一 个 指导 RNA 进
行 编辑 后 再 用 另 一 个 指导 RNA 进行 编辑 。 已 在 Zezspzanzza 的 线粒体 DNA 中 测定 出 来 了 细
， 胞 色素 b 的 基因 , 它 编 码 编辑 前 的 mRNA 序列 ; 另 有 两 个 区 域 是 编码 指导 RNA 的 。 这 两 个 编
码 指导 RNA 的 区 域 以 及 细胞 色素 b 基因 在 基因 组 中 是 由 其 它 基 因 将 它们 分 散 开 的 。 所 以 指
导 RNA 是 由 独立 的 转录 单位 编码 的 。
] 基因 组 AAAGCGGAGAGAAAAGAAA AG GCTIAACTTCAGGTTIGTTTATTACGAGTATATGG
小 转录

编辑 前 的 RNA AAAGCGGAGAGAAAAGAAA ”A G G 5 UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

小 与 指导 RNA 配对

编辑 前 的 RNA AAAGCGGAGAGAAAAGAAA ”和 A G ” G 5 UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
和 生生 六 号 外 多

:和
指导 RNA 二 本 省 远 史 站

小 插入 尿 昔 酸

哮 mRNA AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUSUU SU 到 CBARUAWANPG
六 8 交 3 2 只 了 记 中 全 人 部
的 下 涩 和 认 员 站 丝 吴 灶
指导 RNA AUADucAAUAAuAAALRNINRIULIAUAAUAGA AAAGUUCAGUAUACAEUAUAAUAaAuaAau

小 释 出 mRNA

mRNA AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGU CU UUUAACUUCAGSUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

图 13-40 编辑 前 的 RNA 中 编辑 区 的 两 侧 与 一 个 指导 RNA 配对 ,指导
RNA 作为 插入 U 的 模板 。 插 人 后 产生 的 mRNA 与 指导 RNA 互补

原则 上 说 , 突变 其 “基因 ”或 者 它 的 任何 一 个 指导 RNA 都 能 改变 mRNA 的 序列 , 因而 改
。 。 变 蛋 和 白质。 按照 基因 的 标准 ,可 把 这 些 转录 单位 的 每 一 个 都 看 成 是 “基因 ”的 组 成 部 分 。 由 于 这
。 。 些 单 位 是 独立 表 大 的 ,所 以 它们 当然 是 以 反 式 (trans) 补 充 (complement) 的 。 由 此 可 见 ,一 个 蛋
白质 的 一 级 序列 需要 由 3 个 相互 补充 的 单位 编码 。

部 分 编辑 的 中 间 产 物 的 鉴定 提示 编辑 作用 是 沿 编辑 前 的 RNA 的 3'~>5!/ 方 向 进行 的 。 指
导 RNA 不 仅 藉 助 与 编辑 前 的 RNA 配对 以 规定 U 的 特异 性 插入 ,而 且 它 还 是 插入 U 的 给 体 。
指导 RNA 转录 终止 在 一 段 3 一 5 个 U ,然后 再 加 上 一 个 3' 守 聚 U 尾巴 , 寡 聚 U 的 长 度 为 5 一
24 个 U 残 基 。 这 些 U 被 插入 到 编辑 的 RNA 中 ,其 反应 与 RNA 自我 前 接 类 似 。 指导 RNA 与

429

编辑 前 的 RNA 之 间 配 对 后 ,通过 两 个 转 酯 化 作用 。
将 U 插入 ,如 图 13-41 所 示 。 在 第 一 步 反应 中 ,和 编 “z。。 。。 光 6
辑 前 的 RNA 配对 的 指导 RNA 的 3'.-OH 攻击 编辑 。
区 ,使 编辑 前 的 RNA 裂解 为 两 部 分 。 一 部 分 是 其 5/
区 段 , 它 有 个 3 -OH; 另 一 部 分 是 其 3' 区 段 , 它 的 5 由 站 二 畏
端 与 指导 RNA 的 3' 端 共 价 连接 接 在 一 起 。 第 二 步
反应 是 第 一 步 反 应 产生 的 编辑 前 的 RNA 5' 区 段 用
其 3-OH 攻击 指导 RNA 中 两 个 U 之 间 的 磷酸 二
酯 键 ,这 样 再 产生 编辑 前 的 RNA ,但 已 在 其 中 插入
了 一 个 U。 同 时 再 生成 了 指导 RNA, 但 它 已 委 失 了
一 个 U。 重 复 此 过 程 , 便 可 在 编辑 位 点 处 插入 多 个
U。 有 实验 表明 每 次 仅 插入 一 个 U, 而 不 是 插入 一
组 。 看 来 其 过 程 可 能 是 在 每 加 上 一 个 U 后 , 便 用 指
导 RNA 的 互补 性 检查 一 下 是 否 还 需要 插入 。 如 果 t
需要 则 再 插 人 一 个 ,如 果 不 需要 就 不 进行 了 , 即 正确 “me u
的 编辑 序列 是 逐步 完成 的 。

汪汪 林 一 些 其 它 编辑 的 事 “和
实 。 例 如 ,已 发 现 植 物 线粒体 中 的 细胞 色素 氧化 酶 亚 基 、 细 胞 色素 b 和 NADH 脱氧 酶 等 的
mRNA 都 是 经 过 编辑 的 ,其 序列 与 它们 基因 组 中 的 相应 DNA 序列 有 所 不 同 .已 知 的 编辑 方式
是 用 一 个 U 代替 二 个 C。 但 与 apoB 的 情况 不 同 ,植物 线粒体 中 的 这 种 代替 不 是 引进 一 个 终止
密码 子 , 而 是 改变 一 个 氨基 酸 。 此 外 ,许多 编辑 的 机 制 目 前 还 不 清楚 。 例 如 ,有 的 编辑 是 缺失 避 ，
有 的 是 插入 G 等 ,这 些 都 需要 研究 。

和 可 变 剪 接 一 样 令 人 不 解 的 是 , 真 核 生 物 为 什么 要 采取 编辑 的 方式 !

十 二 .mRNA 稳定 性 的 调控

和 原核 的 相 比 (原核 mRNA 的 寿命 通常 为 几 分 钟 ) , 真 核 mRNA- 的 寿命 比较 长 .典型 真 核
mRNA 的 半 训 期 通常 为 8 一 10 h。 然而 有 些 真 核 mRNA 的 寿命 却 比较 短 , 例 如 ,调控 细胞 周期
的 蛋白 质 的 mRNA 的 半衰期 为 10 一 30 min ,这 是 与 这 些 蛋 白质 的 功能 相 适合 的 。 调 控 细 胞 周
期 的 蛋白 质 是 在 细胞 周期 的 特定 时 相 中 合成 的 ,此 时 相 一 过 它 的 合成 便 需 停 止 。 因 此 ,编码 这
些 蛋白 质 的 基因 (已 知 的 有 致 瘤 基因 、 细 胞 分 裂 素 基因 等 ) 是 短暂 表达 的 ,它们 的 表达 要 与 细胞
的 分 裂 过 程 同步 , 随 着 细胞 分 裂 的 过 程 而 及 时 表达 和 迅速 关闭 .这 类 蛋白 质 的 合成 能 够 迅速 停
止 的 原因 之 一 ,就 是 由 于 它们 的 mRNA 的 寿命 比较 短 。

研究 这 类 mRNA 的 寿命 比较 短 的 原因 发 现在 它们 的 3 端 非 翻 译 区 都 有 个 相似 的 序列 ，
” 其 形式 为 AUUUA.。 已 证 明 此 序列 是 mRNA 在 细胞 中 不 稳定 的 原因 之 一 。 缺失 掉 此 序列 可 使
原来 不 稳定 的 mRNA 变 为 稳定 ,而 且 在 本 来 稳定 的 mRNA 中 加 入 AUUUA 序列 后 ,可 使 之
变 为 不 稳定 。 为 什么 有 此 序列 的 mRNA 不 稳定 ? 这 当然 与 mRNA 的 降解 机 制 有 关 , 目 前 正在
积极 探讨 有 关 mRNA 降解 的 机 制 。

已 若 有 些 mRNA 的 稳定 性 是 受到 调控 的 ,并 从 而 调节 它 编码 的 蛋白 质 的 合成 。 其 中 知道
得 比较 清楚 的 是 运 铁 蛋 白 受 体 (transferrin receptor,TfR)mRNA。TfR 含量 的 多 少 调节 着 细

430

3/

本 中 大 本 本 呈 本 和
E G-c
和
| 、

胞 摄 入 的 铁 量 , 而 THR 合成 的 速度 (因而 其 含量 ) 则 由 细胞 内 铁 的 水 平 所 调控 。 当 细胞 内 铁 的
含量 下 降 时 ,THfR 的 合成 增强 ,从 而 摄 人 更 多 的 铁 ,使 细胞 内 铁 的 水 平 上 升 至 符合 需要 的 量 。
而 铁 的 含量 多 时 则 降低 TIR 的 合成 速度 。 这 种 保持 细胞 内 铁 含量 恒定 的 反馈 控制 是 怎样 做 到
的 ? 已 证 明 TIfR mRNA 稳定 性 的 调控 是 调控 TfR 合成 速度 的 重要 环节 ,而 TIR mRNA 的 稳
定性 则 是 受到 其 3' 端 非 翻 译 区 的 一 段 特 异 序列 所 调控 。 此 段 序列 可 形成 5 个 荃 - 环 (stem-
loop ) 结 构 ( 见 图 13-42)。 已 知 一 个 叫做 IRE- 结 合 蛋 白 的 蛋白 质 结合 在 此 茎 - 环 结构 上 时 ,使
TIR mRNA 稳定 ,不 结合 此 蛋白 质 的 TfR mRNA 则 易于 被 降解 , 当 细胞 内 铁 缺 乏 时 ,IRE- 结
谷 蛋白 结合 在 TIR mRNA 上 ,使 之 稳定 ,从 而 合成 出 比较 多 的 运 铁 蛋白 受 体 ,细胞 因而 摄 人
较 多 的 铁 , 当 细 胞 内 铁 丰 足 时 , 则 FE- 结合 蛋白 不 结合 在 TIR mRNA 上 ,使 TIR mRNA 易于
降解 ,合成 的 TfR 便 较 少 ,细胞 摄 入 的 铁 就 少 了 。 一 个 与 此 有 关 的 机 制 还 调控 着 铁 蛋 白 的 合
成 ,将 在 下 面 讨论 。

Ga) 铁 蛋白 mRNA 翻译 的 调控 。 (b) 运 铁 蛋 白 受 体 mRNA 《7 铁 蛋白 IRE 的 结构

IRE 稳定 性 的 调控 4
人 和

m G 3 5S
3Fe 4S CA
7 沿 可
铁 多 余

才 (d) IRE 共有 序列
翻译 IRE BP 不 稳定
0G 3? my” 运 铁 恒 和 白 有 党 体 具 3 CN

图 13-42 ”哺乳 动物 细胞 中 铁 蛋 和 白 基 因 和 和 运 铁 和 蛋白 爱 体 基因 转录 后 调控 示意 图

十 三 、 翻 译 的 调控

在 真 核 基 因 表达 的 翻译 调控 中 , 目前 知道 得 比较 清楚 的 有 3 个 例子 :@D 铁 应 答 的 mRNA-
结合 蛋白 对 铁 蛋 白 mRNA 翻译 的 抑制 作用 ;@@ 通 过 真 核 起 始 因子 -2 调节 翻译 :@@ 氨 基 酸 缺乏
对 酵母 GCN4 翻译 的 诱导 作用 。 目 前 已 知 的 真 核 翻 译 调控 的 例子 比 原核 的 少 ,但 看 来 这 不 是

二 于 翻译 的 调控 对 真 核 不 重要 ,而 是 由 于 研究 真 核 翻译 的 调控 比 原核 难得 多 .相信 在 经 过 深入
研究 之 后 ,将 揭示 出 更 多 的 真 核 翻译 调控 的 例子 和 规律 。 下 面 着 重 介绍 这 3 个 例子 ,并 提供 一

些 有 关 真 核 翻译 调控 的 已 知 线索 。

(一 ) 铁 蛋白 合成 的 调控 一 一 阻 遏 物 蛋 自 对 特异 mRNA 的 调控

哺乳 动物 细胞 中 的 铁 蛋 白 (ferritin) 是 贮存 铁 的 蛋白 质 , 它 在 细胞 中 的 含量 是 随 细胞 内 铁
含量 的 变化 而 变化 的 。 即 在 细胞 内 铁 的 含量 低 时 , 铁 蛋白 的 合成 速度 减 慢 ,使 细胞 内 铁 蛋 白 的
含量 下 降 ;而 在 细胞 内 铁 的 含量 高 时 , 则 铁 蛋 白 的 合成 速度 加 快 ,使 细胞 内 铁 蛋 白 的 含量 升 高 .
可 见 ;是 细胞 内 铁 的 水 平 调控 着 铁 蛋 白 合成 的 速度 。 这 种 调控 是 怎样 实现 的 ?

已 知 这 是 在 翻译 水 平 上 进行 的 调控 ,是 由 一 个 约 90 kD 的 蛋白 质 , 它 结合 在 铁 蛋 白 mRNA
的 5 -末端 附近 抑制 翻译 的 进行 (图 13-42 a)。 此 阻 遏 物 结合 的 靶 位 点 是 个 保守 的 茎 - 环 结构 ，

431

如 图 13-42c 和 d 所 示 , 称 之 为 铁 -应 答 元 件 (iron-response element ,IRE) ,因而 把 特异 与 之 结
合 的 阻 遇 物 蛋白 称 为 下 E- 结 合 蛋 白 (IRE-binding protein ,IRE-BP) ,但 也 有 把 它 叫 做 铁 调节
因子 (iron regulatory factor,IRF) 的 。 当 细胞 内 铁 含量 低 时 ,IRE-BP 结合 在 IE 上 ,阻止 了 铁
蛋白 mRNA 的 翻译 ; 当 铁 含量 高 时 , 则 IRE-BP 由 IRE 上 解 离 下 来 ,使 铁 蛋白 mRNA 得 以 翻
译 。 那么 铁 的 含量 是 怎样 发 挥 这 种 调节 作用 的 ? 最 近 已 克隆 了 IRE-BP 的 全 长 cDNA。 分 析 其
序列 发 现 它 与 顺 乌 头 酸 酶 有 很 高 的 同 源 性 ,而 且 此 阻 巡 物 本 身 也 具有 顺 乌 头 酸 酶 活性 。 顺 乌 头
酸 酶 含有 个 易 变 的 [Fe-Sj] 复 合体 ,这 提示 耻 E-BP 是 靠 此 复合 体 觉察 细胞 内 铁 的 含量 的 。 实 验
表明 IRE-BP 确实 是 个 含 LFe-SJ] 复 合体 的 蛋白 质 . 当 在 体外 用 铁 盐 处 理 它 时 可 激活 其 酶 活性 ，
此 激活 过 程 是 由 于 它 从 L3Fe-4 S] 型 转变 为 [4Fe-4 SJ 型 的 结果 。 而 且 类 似 的 处 理 可 使 RE-BP
丧失 其 与 了 E 结合 的 能 力 。 由 此 认为 , 当 细 胞 中 铁 含量 低 时 ,IRE-BP 以 [3Fe-4SJ 型 存在 , 它 结
合 在 IRE 上 阻止 翻译 ; 当 细胞 内 铁 含量 高 时 , 它 以 [4Fe-4Sj 型 存在 ,并 从 三 上 解 离 下 来 ,使
铁 蛋 白 mRNA 得 以 翻译 。 关 于 铁 含量 改变 RE-BP 的 作用 机 制 还 有 其 它 解 释 , 这 里 不 再 介绍 。

已 经 研究 了 IRE-BP 结合 在 IRE 上 阻止 铁 蛋 白 mRNA 翻译 的 原因 ,有 实验 支持 图 13-42
a 中 的 模式 , 即 IRE-BP 的 结合 阻止 了 核糖 体 40 S 亚 基 与 mRNA 5 -末端 的 结合 。 虽 然 荃 - 环 结
构 本 身 能 够 抑制 翻译 ， 但 构成 IRE 的 葵 - 环 结构 是 不 稳定 的 ,这 大 概 是 它 自 己 不 能 抑制 翻译 的
原因 。IRE-BP 的 结合 可 以 稳定 及 E 结构 中 的 碱 基 配 对 ,所 以 它 的 结合 阻止 了 翻译 。 在 铁 蛋 白
mRNAs 中 ,IRE 位 于 距 5 -帽子 约 30 核 苷 酸 处 ,这 种 与 5 -末端 临近 的 位 置 是 很 重要 的 。 因 为
当 将 此 IRE 移 至 距 5 -末端 67 个 核 苷 酸 的 位 置 时 , 它 就 没有 了 阻 巡 作用 。 此 实验 也 说 明 ,在 40
S 核糖 体 亚 基 一 旦 结合 在 mRNA 的 5 -末端 上 后 , 它 的 沿 mRNA 前 进 能 够 使 其 它 蛋 白质 离
去 ,并 能 使 碱 基 配 对 结构 解 开 。 由 于 40 S 核糖 体 亚 基 有 清除 其 前 进 道 路 上 的 障碍 的 能 力 , 因 而
一 个 mRNA 结合 蛋白 (或 者 一 个 发 夹 结构 ) 仅 当 与 5 -未 端 足够 近 , 能 够 阻止 核糖 体 40 S 亚 基
的 结合 时 ,才能 抑制 翻译 。 虽 然 上 述 模式 得 到 了 一 些 实验 的 支持 ,但 也 提出 了 一 些 其 它 的 模式 ，
因而 最 后 的 结论 还 有 待 实验 的 进一步 证 明 。

前 已 述 及 ,在 运 铁 蛋 白 受 体 (T 人 )mRNA 的 3' 非 翻译 区 也 有 IRE 结构 , 而且 是 用 同一 蛋
白质 一 一 下 E-BP 与 之 结合 ,以 稳定 TIR mRNA ,增加 THfR 的 合成 。 可 见 ,在 细胞 内 铁 含量 少
时 ,IRE-BP 一 方面 结合 在 铁 蛋 白 mRNA 的 5 端 IRE 上 ,阻止 其 翻译 ,降低 铁 蛋 白 的 合成 ; 同
时 IRE-BP 还 结合 在 TIR mRNA 的 3' 端 IRE 上 ,增加 TfR 的 合成 。 最 近 有 实验 提示 JRE-BP
还 调控 红细胞 中 “- 所 基 -Y 酮 成 酸 合成 酶 mRNA 的 翻译 ,此 酶 是 血红 素 生 物 合成 途径 中 的 第
一 个 酶 。 当 细胞 内 铁 含量 少时 ,IRE-BP 结合 到 此 酶 mRNA 的 5 端 IRE 上 ,阻止 其 翻译 ,降低
酶 的 合成 。 可 见 是 由 一 个 非凡 的 蛋白 质 同 时 调控 着 铁 的 含量 恒定 以 及 利用 铁 的 一 个 关键 代谢
途径 。，

铁 蛋 白 合成 的 调控 是 在 真 核 中 用 阻 遇 物 调 控 翻 译 的 例子 。 虽 然 在 原核 中 已 经 发 现 了 很 多
用 阻 遏 物 调 控 翻 译 的 例子 ,但 在 真 核 中 除了 铁 蛋 白 以 外 还 未 发 现 其 它 确切 的 例子 .而且 在 原核
中 已 发 现 有 用 激活 物 调 控 翻 译 的 例子 ,但 在 真 核 中 ,虽然 从 理论 上 说 也 应 该 有 用 激活 物 调 控 翻
译 的 现象 ,但 迄今 还 没有 有 说 服 力 的 证 据 。 看 来 ,对 于 真 核 基因 表达 的 翻译 调控 还 需要 做 很 多
的 工作 。

(二 ) 酵 母 GCN4 mRNA 翻译 的 调控 和

这 是 最 近 发 现 的 一 种 真 核 的 调控 机 制 。 啤酒 酵 母 (S. cerevzsiae) GCN4 基因 编码 一 个 转录

因子 ,此 转录 因子 活化 30 一 40 个 基因 的 表达 ,它们 的 表达 产物 都 是 参与 氨基 酸 的 生物 合成 的 。
432

， GCN4 本 身 的 表达 则 是 在 翻译 水 平 上 进行 调控 的 ,其 mRNA 是 组 成 性 存在 的 ,但 是 仅 当 细胞
。 缺乏 氨基 酸 时 它 才 被 翻译 产生 出 GCN4 蛋白 .GCN4 蛋白 则 启动 一 些 基 因 的 表达 ,使 酵母 进行
所 基 酸 的 合成 ,以 满足 其 需要 。 如 果 酵 母 中 有 足够 的 氨基 酸 , 则 GCN4 mRNA 不 被 翻译 ,酵母
， 也 就 不 进行 氨基 酸 的 合成 了 。
CCN4 mRNA 的 翻译 是 怎样 受到 氨基 酸 的 含量 调控 的 ? 由 于 发 现在 GCCN4 mRNA 中 ,在
上 其 忆 - 未 端 与 GCN4 的 起 始 密码 子 之 间 有 4 个 小 的 开放 读 框 (open reading frame，ORF) 而 受
岂 到 启发 . 已 知 在 真 核 mRNA 的 翻译 中 , 首先 是 核糖 体 的 40 S 亚 基 与 eIF-2-GTP“， Met-tRNAi
恒 形成 复合 体 ,此 复合 体 结合 在 mRNA 的 5 -帽子 处 ,然后 沿 mRNA 向 3' 移 动 寻找 起 始 密码 子 。
岂 当 过 到 离 5 -未 端 最 近 的 起 始 密码 子 AUG 时 , 则 核糖 体 的 60 S 亚 基 结 合 上 去 ,形成 完整 的 核
上 糖 体 ,并 由 该 AUG 处 开始 翻译 。 可 见 真 核 mRNA 的 翻译 总 是 由 离 5 -末端 最 近 的 AUG 开始
的 。 实 验 表明 ,如 果 人 为 地 在 一 个 主要 ORF 的 AUG 上 游 插 入 一 个 起 始 密码 子 , 则 抑制 了 此
ORF 的 正常 翻译 。 然 而 ,如 果 在 上 游 AUG 与 主要 OREF 的 起 始 密码 子 之 间 插 入 一 个 终止 密码
恒 子 , 则 能 减轻 上 游 AUG 对 主要 ORF 翻译 的 抑制 作用 。 对 此 现象 的 最 简单 的 解释 是 ,在 插入 终
时 止 密码 子 后 使 主要 ORF 的 上 游 形成 一 个 ORF , 当 80 S 核糖 体 将 上 游 ORF 翻译 完毕 后 ,60 S
几 亚 基 解 离 出 去 ,而 核糖 体 的 40 S 亚 基 仍 然 结 合 在 mRNA 上 , 它 再 沿 mRNA 向 3' 移 动 , 寻 找 下
二 个 AUG ,并 能 够 由 下 一 个 AUG 再 启动 翻译 。 就 是 说 真 核 核 糖 体 有 再 启动 翻译 (reinitiate
性 translation ) 的 能 力 。 已 发 现 , 真 核 的 再 启动 效率 (与 原核 的 不 同 ) 是 随 着 上 游 ORF 与 下 游 ORF
”之 间 的 距离 加 大 而 增高 的 。 对 于 真 核 中 这 种 基因 间 的 距离 越 大 越 容 易 再 启动 翻译 的 合理 解释
是 , 当 核 糖 体 将 第 一 个 ORF 翻译 完 ,60 S 亚 基 离 去 后 ,40 S 亚 基 再 开始 寻找 下 一 个 AUG 时 ，
最初 它 大 概 没 有 识别 AUG 的 能 力 , 因 为 此 时 的 40 S 亚 基 没有 Met-tRNAi。 两 个 ORF 之 间 的
距 离 加 长 ,可 为 40 S 亚 基 再 获得 Met-tRNAi 提供 了 足够 的 时 间 , 从 而 使 它 易 于 再 启动 翻译 。
此 概念 是 说 明 酵 母 GCN4 基因 表达 的 调控 机 制 的 基础 。
图 13-43 示 出 了 酵母 CCN4 mRNA 翻译 调控 的 概要 。 由 于 在 mRNA 的 5 -未 端 与 GCN4
的 起 始 密码 子 之 间 有 4 个 小 ORFs( 图 中 仅 示 出 了 第 1 和 第 4 两 个 ) ,因而 GCN4 的 翻译 必定
有 再 启动 机 制 的 参与 .对 此 体系 的 遗传 学 和 生物 化 学 的 研究 揭示 出 来 了 其 调控 途径 的 概要 。 在
”此 途径 中 ,细胞 内 eIF-2-GTP. Met-tRNAIi 的 浓度 调控 着 翻译 的 再 启动 ,而 细胞 内 eIF-2 ，
MetstRNAi 的 浓度 则 是 由 氨基 酸 的 含量 所 调控 。 如 图 13-43 中 所 示 , 由 核糖 体 40 S 亚 基 .Mert-
UIRNAi 和 起 始 因子 (包括 eIF-2) 组 成 的 复合 体 结 合 在 GCN4 mRNA 的 5 -未 端 , 然后 沿 mRNA
寻找 AUG。 当 遇 到 第 一 个 OREF 的 AUG 时 ,核糖 体 的 60 S 亚 基 结 合 上 去 并 开始 翻译 第 一 个
REORF . 当 第 一 个 ORF 翻译 完 后 ,60 S 亚 基 离 去 ,40 S 亚 基 继续 向 下 游 寻找 另 一 个 AUG .。 开始 时
由 于 40 S 亚 基 中 还 不 带 有 Met-tRNAi, 因而 它 没有 能 力 识别 AUG, 只 有 当 它 沿 mRNA 移动 一
| 定时 间 后 ,才能 再 结合 上 Met-tRNAi, 才 有 能 力 再 启动 翻译 。 图 13-43 a 表示 在 不 缺乏 氨基 酸 的
情况 下 ,有 活性 的 EIF-2 的 含量 较 高 。 由 于 EIF-2 的 作用 是 将 Met-tRNAi 带 到 40 S 亚 基 上 去 ，
|

因而 能 使 翻译 完 上 一 个 ORF 的 40 S 亚 基 很 快 地 结合 上 Met-tRNAi ,以 获得 再 启动 翻译 的 能
力 。 因 此 ,在 不 缺乏 氨基 酸 的 情况 下 ORF4 被 翻译 .。 ORF4 翻译 的 终止 位 点 以 某 种 尚 不 清楚 的 因
素 排除 了 再 启动 翻译 的 进行 ,因此 ,在 不 缺乏 氨基 酸 的 条 件 下 GCN4(mRNA 中 的 第 5 个 ORF)
不 被 翻译 。 而 仅 当 核 糖 体能 够 越过 ORF4( 不 翻译 ORF4) 时 才能 翻译 GCN4。 图 13-43 b 所 示 是
缺乏 氨基 酸 的 情况 。 当 氨基 酸 缺乏 时 , 由 于 未 负荷 的 (uncharged)tRNA 的 聚 存 引起 了 一个 蛋白
激酶 的 活化 。 此 激酶 使 一 部 分 eIF-2 分 子 磷酸 化 而 灭 活 ( 机 制 见 后 ), 从 而 使 40 S 亚 基 再 获得
433

Met-tRNAi 的 时 间 加 长 , 亦 即 在 翻译 完 一 个 ORF 后 能 够 再 启动 下 一 个 OREF 的 翻译 所 需 的 时 间
延长 了 .这 就 使 得 一 些 40 S 亚 基 在 到 达 ORF4 时 不 能 启动 翻译 ,从 而 越过 了 ORF4。 但 当 这 些 40
sS 亚 基 继 续 前 进 至 GCCN4 的 起 始 位 点 时 ,它们 有 了 足够 的 时 间 获 得 Met-tRNAi, 就 能 够 启动
SGCN4 的 翻译 了 。 这 就 是 在 缺乏 氨基 酸 时 能 够 表达 GCN4 的 原因 。

(a) 在 未 饥饿 条 件 下 GCN4 不 被 翻译
60S

1 GCN4
49 (人 了 7 的 站 -
起 始 ”再 开始 扫描 MettRNA “ 仅 在 此 处 发 生

和 elIF-2 进入 再 启动
(b) 氮 基 酸 饥饿 诱导 GCN4 的 翻译
AZ
ZB
3 GCN4 -汪汪
四 《CE 殉 《3

(c) 饥 饿 不 能 使 一 种 突变 型 的 mRNA 翻译 CCN 4

MA 插 人 序列 5ZBo

人 2
A MA

图 13-43 ”酵母 中 GCN4 翻译 的 调控 机 制
8 表示 带 有 Met-tRNAi 的 40 S 亚 基 ,0 表示 不 带 有 Met-tRNAi 的 40 S 亚 基 。

图 13-43 所 示 是 当 人 为 地 在 ORF1 和 ORF4 之 间 插入 一段 序 列 ,使 ORF1 和 ORF4 之 间
的 臣 离 由 原来 的 200 个 核 昔 酸 变 为 346 个 核 苷 酸 时 , 则 虽然 在 缺乏 氨基 酸 的 条 件 下 GCN4 也 -

不 能 翻译 。 对 此 实验 结果 的 解释 是 ,虽然 由 于 氨基 酸 缺 乏 而 使 40 S 亚 基 获 得 再 启动 能 力 的 时

间 延 长 了 ,但 由 于 ORF1 和 ORF4 之 间 的 距离 加 大 了 ,因而 当 40S 亚 基 到 达 ORF4 的 AUG-

时 仍 能 再 启动 翻译 。OREF4 的 翻译 抑制 了 GCN4 的 翻译 。 因 此 , 此 实验 结果 支持 上 述 关于
GCN4 翻译 调控 的 模型 。

已 在 植物 和 动物 病毒 以 及 销 椎 动物 的 mRNA 中 发 现 有 类 似 的 情况 , 即 在 主要 开放 读 框 的 “

前 面 有 小 的 开放 读 框 。 然 而 对 于 这 些 mRNA 中 的 小 的 开放 读 框 的 作用 是 什么 目前 还 不 清楚 ，
更 不 用 说 其 作用 机 制 了 。 但 已 知 远 非 所 有 的 上 游 小 的 OREF 的 作用 都 是 和 CGCN4 mRNA 的 一
样 。 例 如 ,酵母 的 另 一 个 基因 ,CP41 基因 的 mRNA 也 有 个 上 游 的 小 ORF ,但 它 的 调控 机 制 显
然 与 GCN4 的 不 同 。CP41 mRNA 的 上 游 ORF 编码 一 个 25- 氨 基 酸 的 多 肽 ,而 不 简单 地 只 是
像 GCCN4 mRNA 那样 是 个 负责 调控 翻译 的 上 游 结构 。CP41 的 上 游 多 肽 阻 台 CPA1 翻译 的 具
体 机 制 尚 不 清楚 。

引 人 注 意 的 是 ,在 背 椎 动物 中 具有 上 游 小 ORE 的 mRNA 并 非 是 随意 的 。 已 知 具 有 这 种
上 游 小 ORF 的 mRNA 的 大 多 数 是 编码 致癌 蛋白 (oncoprotein ) ,生长 因子 Cgrowth factor) , 转
录 因 子 , 受 体 和 其 它 关 键 性 调控 蛋白 的 mRNA。 目前 尚 无 证 据 表明 上 述 再 启动 的 机 制 在 这 些

mRNA 的 翻译 中 有 重要 的 作用 。 这 些 mRNA 的 上 游 ORF 的 作用 是 什么 ? 相信 经 过 研究 是 会 时

揭示 出 其 奥秘 的 ，
(三 )eIF-2 的 磷酸 化 对 翻译 的 普遍 抑制
酵母 中 GCCN4 基因 表达 的 调控 是 近来 才 知 道 的 利用 elF-2 的 磷酸 化 进行 的 翻译 调控 。 然
434

的

wp

而 多 年 来 即 已 知道 ,在 哺乳 动物 细胞 中 通过 eIF-2 的 可 逆 磷 酸化 调控 翻译 。 例如 , 早 就 知道 , 当
网 织 红 细胞 中 血红 素 缺 乏 时 ,引起 一 种 蛋白 激酶 的 活化 (血红 素 是 此 激酶 的 抑制 剂 ), 此 激酶 使
elIF-2 的 < 亚 基础 酸化 而 灭 活 ,从 而 停止 了 所 有 和 蛋白质 的 合成 [这 就 是 在 利用 网 织 红 细胞 裂解
液 Greticulocyte lysate) 进 行 体 外 翻译 试验 时 必须 向 其 中 加 入 血红 素 的 原因 ]. 目前 已 知 除了 血
红 素 缺乏 外 ,还 有 许多 因素 可 引起 eIF-2 的 磷酸 化 ,例如 ,不 供给 培养 的 细胞 血清 、 热 休克 、 氮
基 酸 饥 俄 以 及 某 些 病毒 感染 等 (图 13-44) ,而 且 对 其 生物 化 学 过 程 已 经 进行 了 仔细 地 研究 。 如
图 13-44 所 示 ,eIF-2 与 GTP 形成 一 个 复合 体 ,在 溶液 中 它 与 Met-tRNAI 结合 在 一 起 ,然后
elIF-2 将 Met-tRNAIi 带 到 核糖 体 40 S 亚 基 上 形成 一 个 43 S 的 起 始 复合 体 。 下 一 步 是 43S 复
合体 结合 在 mRNA 的 5 -末端 , 沿 mRNA 向 下 游 移 动 寻 找 起 始 密码 子 AUG ,在 那里 eIF-5 结
合 上 去 ,触发 结合 在 eIF-2 上 的 GTP 水 解 。eIF-2 是 个 典型 的 G 蛋白 ,GTP 水 解 后 使 其 变 为
GDP 型 而 发 生 构 象 的 改变 .GDP 型 eIF-2 与 40 S 亚 基 的 亲和力 比较 低 , 因 而 eIF-2-GDP 由 40
_ S 核糖 体 亚 基 上 解 离 下 来 ,而 将 Met-tRNAI 留 下 .然后 60 S 亚 基 才 能 够 结合 上 去 ,组 装 成 有 功
能 的 80 S 核糖 体 , 即 可 进行 翻译 了 。

由 于 eIF-2 对 GDP 的 亲和力 比 对 GTP 高 400 倍 , 所 以 需要 一 个 辅助 因子 推动 GTP 和
GDP 的 交换 ,以 便 由 eIF-2. GDP 再 产生 eIF-2 . GTP ,此 辅助 因子 叫做 eIF-2B, 或 者 叫做 鸟
ix” 埋 酸 交换 因子 (guanine nucleotide exchange factor ,GEF ) 。 这 些 反 应 见 图 13-44(Cb) 。 在 和 蛋白质
合成 中 ,此 eIF-2 循环 是 个 调控 点 ,因为 在 多 种 不 同 的 生理 条 件 下 见 图 13-44(c),eIF-2 的 “ 亚
基础 酸化 了 , 这样 阻 止 了 eIF-2. GTP 的 再 生成 ,从 而 也 就 阻止 了 所 有 mRNA 的 翻译 。eIF-2
磷酸 化 后 为 什么 阻止 了 eIF-2 .GTP 的 再 产生 ? 这 是 因为 细胞 中 GEF 的 含量 很 有 限 ,而且 它
与 eIF-2(cp) 的 亲和力 比 未 磷酸 化 的 eIF-2 高 约 150 倍 。 因 此 ,eIF-2 仅 有 约 25%% 磷 酸化 时 , 便
能 使 所 有 的 GEF 与 eIF-2(x p) 形 成 稳定 的 eIF-2(ap) "CDP "GEF 复合 体 。 这 样 不 但 结合
复合 体 中 的 eIF-2(c p) 不 能 再 启动 翻译 ,而 且 由 于 所 有 的 GEF 都 束缚 在 此 复合 体 中 了 ,也 就
无 法 促使 sIF-2 .GDP 再 变 为 eIF-2. GTP, 因 而 停止 了 所 有 和 蛋白质 的 合成 见 图 13-44(c) 。

(a) 核 糖 体 的 起 始 循环 ) 溶 液 中 sIF-2 (c)elIF-2 凋 节
由 此 开始 斑 <

ES
elIF-2-GTP-Met-tRNAje e 正 5
40S 核糖 体 | 一 eIF-3 CTP 牛 了 他

43S 起 始 复合 体 elIF-2-GEF

T 祝 二 二 elJF-2 (xcP) ”促进 eIF-2
48S 起 始 复合 体 eIF-2-eDE-CEF . -GDP-GEF ”磷酸 化 的 条 件 :
1. 热 休 记
”一 交换 因子 my | 2. 不 供给 血清
民 60S 核糖 体 \|<=EL elIF-2-GDP elIF-2(xP) 3. 氨基 酸 似 俄
活化 多 波 瑟 ”-GDP 《4[ 规 下 列 病毒 感染
和 合 休 人 ， 水泡 性 ，
活 竹 激酶 中
无 活性 呼 肠 孤 病毒 等

13-44 “哺乳 动物 细胞 中 的 eIF-2 循环
Ca)eIF-2. GDP 由 40 Ss 亚 基 释放 出 来 , 它 是 稳定 的 ;(b)GEF 促使 CDP 和 GTP 交换 ;(c)eIF-2 磷酸
化 为 eF-2(a p) ,使 GEF 与 之 形成 稳定 的 复合 体 , 从 而 降低 了 整体 的 翻译 能 力 。

已 鉴定 出 两 个 催化 eIF-2 磷酸 化 的 特异 激酶 。 其 中 之 一 叫做 DA1 ,或 者 叫做 p68 激酶 , 它
是 由 双 链 RNA 活化 的 ; 另 一 个 叫做 HR1, 它 的 活化 机 制 尚 不 清楚 。 但 已 知 在 网 织 红细胞 中 具
有 HR1, 它 被 血红 素 所 抑制 ,因此 , 当 缺 乏 血 红 素 时 HR1 活化 ,使 eIF-2 磷酸 化 ,从 而 封 阻 了 网

435

织 红细胞 中 的 蛋白 质 合成 。 这 两 个 激酶 的 cDNA 已 被 克隆 和 测序 。

关于 催化 已 磷酸 化 的 eIF-2 脱 去 磷酸 的 特异 磷酸 酶 目前 知道 的 很 少 ,然而 可 以 肯定 它 必
定 参与 此 调控 机 制 .另外 已 发 现 还 有 抑制 eIF-2 磷酸 化 的 因子 在 起 作用 。 已 知 通过 eIF-2/GEF
调控 翻译 的 事实 不 仅 限于 哺乳 动物 ,而 是 相当 普遍 地 存在 。 因 而 对 此 调控 系统 的 研究 还 有 待 深
入 。 除 了 elIF-2 外 ,是 否 还 有 通过 其 它 起 始 因子 以 及 延伸 因子 或 核糖 体 蛋 白质 的 磷酸 化 - 脱 磷
酸化 来 调控 翻译 的 ? 在 这 方面 也 已 做 了 不 少 工作 。 虽 然 已 经 发 现 它们 中 有 些 蛋 白 因子 确实 发
生 磷 酸化 ,但 不 能 肯定 这 种 磷酸 化 是 否 在 调控 中 真 的 发 挥 作用 ,因而 也 是 需要 研究 的 问题 。

在 前 面 的 叙述 中 ,我 们 强调 了 通用 起 始 因子 的 受到 限制 ,例如 eIF-2 的 磷酸 化 ,对 所 有 和 蛋
白质 合成 的 抑制 作用 。 然 而 这 种 抑制 作用 的 程度 是 否 对 所 有 和 蛋白质 的 合成 都 一 样 ? 会 不 会 有
些 蛋白 质 的 合成 不 受到 抑制 ? 即 这 种 抑制 作用 不 是 对 全 部 蛋白 质 的 合成 ,而 是 有 目标 的 ? 这 是 。
可 能 的 。 我 们 可 以 设想 有 3 种 可 能 的 途径 做 到 这 一 点 。

(1) 某 一 mRNA 是 通过 特殊 的 机 制 进行 翻译 的 ,此 特殊 机 制 使 得 在 活性 通用 起 始 因 子 的
量 不 足 时 (不 是 绝对 没有 ) , 它 的 情况 与 其 它 大 多 数 mRNA 不 同 。 例 如 前 面 讨论 过 的 GCN4
mRNA 就 是 如 此 。GCN4 mRNA 的 翻译 是 靠 再 启动 的 ,在 40 S 亚 基 再 开始 扫描 至 其 到 达 下 一
个 AUG 之 间 是 有 固定 时 限 的 。 在 此 期 间 ,40 S 亚 基 必 须 结 合 上 eIF-2。GTP“。 Met-tRNAi 才
能 由 下 一 个 AUG 处 再 启动 翻译 ,如 果 结 合 不 上 ,就 只 能 越过 它 而 不 翻译 。 因 此 ,在 eIF-2 部 分
失 活 时 ,使 得 所 有 和 蛋 白质 的 合成 速度 都 降低 ,但 对 GCN4 的 表达 可 以 没有 影响 。

(2) 激 酶 或 磷酸 酶 的 活化 可 发 生 在 胞 质 溶胶 (cytosol) 的 局 部 区 域内 ,从 而 仅 影响 位 于 该 区
域内 的 mRNA 的 翻译 ,而 不 影响 位 于 其 它 位 置 的 mRNA 的 翻译 。 目 前 对 于 细胞 溶胶 的 这 种 分 “
区 的 了 解 还 不 充分 ,因而 还 不 能 具体 说 明 此 问题 。 然 而 已 有 实验 证 明 ,eIEF-2 的 磷酸 化 对 有 些
mRNA 翻译 的 抑制 作用 比 其 它 mRNA 大 ,而 且 造 成 这 种 差异 的 原因 是 由 于 其 翻译 被 抑制 的
靶 mRNA 和 引起 磷酸 化 的 诱导 物 (大 概 是 双 链 RNA) 位 于 同一 局 部 ,而 它们 位 于 同一 局 部 的
原因 尚 不 明了 。

(3) 在 哺乳 动物 的 mRNA 中 ,其 前 导 序 列 (leader sequence) 形 成 二 级 和 三 级 结构 的 倾向
性 是 不 同 的 ,其 结果 使 得 它们 提供 5 -未 端的 情况 不 同 ,因而 在 43 S 起 始 复合 体 的 含量 下 降 。
时 ,有 的 mRNA 能 与 之 结合 ,有 的 则 难于 结合 ,从 而 使 它们 的 翻译 速度 有 所 不 同 。 已 有 证 据 表 是
明 ,mRNA 的 5' 非 编码 区 的 三 级 结构 的 程度 与 其 所 处 位 置 都 影响 核糖 体 与 mRNA 的 相互 作
用 。 然 而 遗憾 的 是 ,此 学 说 难以 用 天 然 的 mRNA 进行 验证 ,其 原因 是 天 然 mRNA 的 忆 前 导 序 列
可 被 设想 出 多 种 不 同 的 构象 , 而 不 是 二 种 三 级 结构 , 因而 其 在 细胞 中 的 具体 结构 情况 难以 知道 。

在 mRNA 的 结构 影响 其 翻译 效率 方面 已 经 做 了 很 多 研究 。 例 如 ,Kozak 分 析 了 已 发 表 的
620 个 冰 椎 动物 mRNA( 根 据 其 cDNA) 的 5 前 导 序列 中 GC 的 含量 ,因为 GC 含量 越 高 通常
可 以 说 明 它 能 够 形成 二 级 结构 的 量 越 大 。 在 这 些 mRNA 中 只 有 一 小 部 分 的 前 导 序 列 所 含 GC
的 量 二 50% ,设想 它们 形成 比较 少 的 二 级 结构 .具有 这 种 前 导 序列 的 是 编码 珠 蛋 白 、 栈 蛋白、 清
蛋白 、.- 胎 蛋白 (c-fetoprotein) 和 组 蛋白 等 的 mRNA, 所 有 这 些 都 是 大 量 产生 的 蛋白 质 ,它们
的 mRNA 是 被 有 效 地 翻译 的 。 与 之 相反 ,大 多 数 兰 椎 动物 mRNA 的 前 导 序列 中 含有 较 多 的
GC(50%% 一 70%%) ,提示 它们 形成 较 多 的 高 级 结构 ,因而 在 通用 的 翻译 能 力 下 降 时 ,它们 更 少 地
被 翻译 。 事 实 是 ,在 除去 细胞 培养 基 中 的 血清 、 热 休克 或 病毒 感染 时 ,大 多 数 细胞 的 mRNA 的
翻译 被 抑制 。 极端 的 情况 是 有 些 mRNA 的 引 非 编码 区 中 含有 70% 一 90%% 的 GC。 典 型 的 这 种

mRNA 是 编码 致癌 蛋白 .生长 因子 、 信 号 转 导 成 分 (signal transduction component) 和 转录 因
436

|

也 ,以 及 许多 持家 和 蛋白质 (housekeeping protein) 。 这 些 蛋 白质 的 含量 低 ,与 它们 的 mRNA 难

以 翻译 的 设想 相符 合 。 提 高 43 S 起 始 复合 体 的 含量 大 概 也 不 足以 促进 这 些 GC 含量 非常 高 的

mRNA 的 翻译 。 因 为 虽然 43 S 起 始 复合 体 一 旦 结合 在 mRNA 上 后 ,在 它 沿 mRNA 扫描 时 能
够 破坏 沿途 的 二 级 结构 而 通过 ,但 这 种 能 力也 不 是 无 限 的 。 它 可 能 通 不 过 上 述 这 些 GC 含量 非

， 常 高 的 前 导 序 列 中 强 有 力 的 碱 基 配 对 结构 。 可 见 , 要 想 提 高 生长 因子 等 的 翻译 效率 需要 加 入

RNA 解 旋 酶 (RNA helicase) ,此 酶 应 能 使 43 S 起 始 复合 体 易 于 进行 扫描 。 然 而 迄今 尚未 找到

这 样 的 酶 。 另 一 个 办 法 就 是 改变 它们 的 前 导 序 列 。

目前 已 积累 了 一 些 关 于 mRNA 的 结构 影响 其 翻译 效率 的 资料 。 除 了 上 述 5 非 编 码 区 的

委 构 对 翻译 有 影响 外 ,其 3' 非 编码 区 (例如 有 的 结构 影响 mRNA 的 稳定 性 , 见 前 ) 以 及 编码 区

，《〈 例 如 使 用 同一 氨基 酸 的 不 同 密码 子 ) 的 结构 都 对 mRNA 的 翻译 效率 有 影响 ,而 且 它们 的 影响

是 多 种 多 样 的 。 查 明 这 些 现象 不 仅 具有 理论 意义 ,而 且 还 有 实用 价值 .因为 当 我 们 用 真 核 细胞
体系 表达 某 一 基因 以 期 获得 其 产物 时 ,总 是 希望 其 表达 效率 越 高 越 好 。 很 清楚 ,要 想得到 高 效
表达 ,不 但 需要 注意 转录 中 的 问题 ,还 必须 考虑 如 何 提高 其 mRNA 的 翻译 效率 的 问题 。

第 二 节 ”细胞 周期 和 生长 的 调控

一 ` 细 胞 周期

分 裂 活动 是 从 上 一 次 细胞 分 裂 后 开始 发 生 的 一 系列 事件 的 顶点 ,两 次 细胞 分 裂 之 间 的 时
期 称 为 体 细胞 周期 (cell ycle)。 从 上 次 有 丝 分 裂 的 终止 到 下 次 分 裂 开始 之 间 的 时 期 称 为 间 期

(interphase)。 实 际 分裂 的 期 间 , 即 相当 于 可 以

外 连续 过 程 , 这 是 编码 形成 特定 细胞 表 型 的 蛋
白质 的 基因 转录 和 翻译 的 结果 ,所 以 RNA 和

看 到 有 丝 分 裂 的 期 间 称 为 M 期 (mitosis

phase) 。 一 个 细胞 周期 也 可 停止 于 减 数 分 裂 , 产 从 机
生 具 有 单 倍 体 染色 体 成 分 的 配子 。 在 有 丝 分 列
和 减 数 分 裂 的 调控 中 有 共同 的 情况 。

为 了 分 裂 ,一 个 真 核 体 细胞 必须 使 其 物质
加 倍 ,然后 将 其 组 成 成 分 等 量 地 分 配给 两 个 子
细胞 , 即 产生 两 个 相同 的 子 细胞 .体积 的 加 倍 是

蛋白 质 的 合成 是 不 断 进行 的 。 与 之 相反 ,基因 组
的 复制 则 仅仅 发 生 在 特定 的 DNA 合成 期 , 称
之 为 $ 期 ,S 是 表示 合成 期 (synthetic period )
之 意 。 所 以 DNA 的 合成 是 间断 的 。 因 此 ,根据
DNA 合成 的 时 间 又 把 间 期 分 成 为 几 个 期 ,如 图
14-45 所 示 。 在 有 丝 分 裂 完 成 后 细胞 进入 第 一
个 间隔 期 (gap phase) , 称 为 G1 期 。 此 时 RNA 图 13-45 间 期 分 为 G1,S 和 G2 期 。 一 个 细胞
和 和 蛋白 质 在 合成 ,但 不 发 生 DNA 复制 。DNA 周期 和 下 一 个 细胞 周期 之 间 用 有 丝 分 裂 划 界
复制 的 开始 意味 着 G1 期 过 渡 到 S 期 。 在 S 期 有 的 有 村 为 6 也 可 由 90 再 进入 周期，
437

已 汪 2 一 47 DNA

DNA 持续 地 合成 ,直到 完全 复制 出 来 为 止 . 由 S 期 终了 到 有 丝 分 裂 开 始 前 是 第 二 个 间隔 期 , 称
为 G2 期 ,在 此 期 间 细胞 含有 两 套 二 倍 体 的 染色 体 。

由 此 可 见 , 在 整个 间 期 细胞 的 外 表 虽 然 看 不 出 什么 变化 ,但 其 RNA 和 和 蛋白质 的 量 在 不 断
增加 ,DNA 则 在 S 期 加 倍 ( 此 时 细胞 核 的 体积 显著 增 大 ), 但 染色 质 的 状态 没有 看 得 出 的 变化 ，
最 后 各 种 物质 都 加 倍 ,就 为 有 丝 分 裂 做 好 了 准备 .需要 指出 的 是 有 些 细胞 周期 与 上 述 体 细胞 的
有 所 不 同 .例如 ,在 胚胎 形成 期 可 发 生 特异 的 细胞 分 裂 ,分 裂 出 的 细胞 是 彼此 不 同 的 ;又 如 卵 的
生成 , 它 要 聚 存 足 够 的 物质 以 维持 其 早期 分 裂 。

在 有 丝 分 裂 时 分 给 每 个 子 细胞 一 套 二 倍 体 染 色 体 .在 此 期 间 细胞 结构 发 生 深刻 的 改变 : 核
包 膜 裂解 了 ;染色 质 发 生 凝 聚 , 仅 在 此 期 间 各 个 染色 体 变 为 可 以 看 到 的 了 ;细胞 骨架 发 生 深 刻
的 再 组 建 , 细 胞 在 纺锤 体 上 再 建 等 。 在 有 丝 分 裂 期 间 所 有 的 合成 过 程 实际 上 都 暂停 了 。

一 个 正在 进行 周期 活动 的 动物 体 细胞 ,其 周期 活动 是 每 18 一 24h 重复 一 次 。 图 13-45 中

表明 G1 期 一 般 最 长 , 它 由 快速 生长 的 动物 细胞 的 约 6 h 到 较 慢 生长 细胞 的 约 12h 之 间 变动 。
细胞 周期 的 长 短 不 同 主要 是 由 于 G1 期 长 短 不 同 之 故 .S 期 的 长 短 由 复制 全 部 基因 组 所 需 的 时

间 而 定 , 典 型 的 为 6 一 8 h。G2 期 通常 是 间 期 中 最 短 的 , 它 大 概 是 有 丝 分 裂 的 准备 阶段 。M 期 通
常 不 到 1 h。

二 \ 两 个 关键 的 决定 位 点

细胞 周期 是 怎样 调控 的 ? 已 发 现在 细胞 周期 中 有 两 个 位 点 决定 着 周期 是 否 继 续 进行 ,第
一 个 位 点 是 在 G1 期 ,此 位 点 决定 着 染色 体 是 否 复制 ,只 有 条 件 成 熟 时 才 开 始 DNA 的 合成 , 即
进入 S 期 。 所 谓 条 件 成 熟 大 概 有 评估 培养 基 的 状况 以 及 细胞 物质 的 含量 是 否 足 够 等 等 。 此 决
定位 点 在 酵母 中 研究 得 最 清楚 ,把 它 称 为 起 点 (start) ,在 动物 细胞 中 称 之 为 限制 点 Crestriction
point) 。 第 二 个 位 点 在 G2 期 ,此 位 点 决定 着 是 否 进行 有 丝 分 裂 , 即 进入 M 期 。 检 验 是 否 可 以 进
和 人 M 期 的 条 件 有 :细胞 物质 的 含量 是 否 已 增加 到 足够 分 裂 : 复 制 是 否 已 经 完成 和 DNA 有 没
有 损伤 等 。 对 于 培养 的 动物 细胞 来 说 ,已 知 Gl 调控 是 主要 的 决定 位 点 ,而 G2V/M 调控 是 辅助
的 。 细 胞 在 其 周期 中 在 G1 期 花 了 最 长 的 时 间 ,而 且 调节 G1 期 的 长 短 反映 着 生长 的 条 件 , 一 有

细胞 经 过 了 G1l 期 , 则 除非 发 生 偶然 情况 , 它 将 完成 S 期 ,经 过 G2 期 ,并 进行 分 裂 。 培 养 的 细胞

不 会 停止 在 G2 期 。 现 在 看 来 ,大 多 数 二 倍 体 细胞 大 概 都 是 在 G1 期 调控 ,培养 的 和 体内 的 细胞
都 是 如 此 。

有 些 细胞 表 型 是 永 不 分 裂 的 .这 些 细 胞 被 认为 是 由 细胞 周期 中 撤 出 而 成 为 另 一 种 状态 ,此
状态 类 似 于 G1, 但 又 不 同 于 Gl, 因 为 它 不 能 进入 S 期 ,此 种 状态 称 为 GO0。 有 些 类 型 的 细胞 可
被 刺激 由 G0 再 进入 细胞 周期 。 由 细胞 周期 的 撤 出 或 再 进入 ,实际 上 是 发 生 在 G1 期 的 早期 阶
段 。 有 些 类 型 的 细胞 停止 在 G2 期 。 在 二 倍 体 细胞 中 , 这 种 类 型 的 细胞 通常 是 要 进行 分 裂 的 , 例
如 ,在 昆虫 胚胎 发 生 的 某 些 阶段 , 核 分 裂 了 ,但 停止 在 四 倍 体 状 态 ， 单 倍 体 细胞 更 常常 停止 在
G2 期 ,这 提供 了 保护 DNA 不 受 损伤 的 作用 ,因为 此 时 以 双 拷 贝 基因 组 代替 了 G1l 期 的 单 拷贝
基因 组 。 有 些 酵母 可 用 Gl 期 或 G2 期 作为 主要 调控 位 点 ,这 取决 于 营养 状况 。

三 ` 在 $ 期 和 M 期 有 起 调节 作用 的 物质

在 早期 的 实验 中 已 经 发 现在 细胞 周期 的 不 同 阶段 有 不 同 的 调控 物质 ,这 是 将 处 于 细胞 周
期 不 同 阶段 的 细胞 融合 在 一 起 发 现 的 ,如 图 13-46 所 示 。 融合 后 的 杂交 细胞 可 在 共同 的 胞 浆 中
438

”含有 两 个 或 更 多 个 核 。 从 图 中 可 以 看 出 :(1)
当 一 个 S 期 细胞 与 一 个 GL 期 细胞 融合 时 ，
”产生 的 杂交 细胞 中 的 两 个 核 都 复制 DNA .这
提示 在 S 期 细胞 的 胞 浆 中 有 一 个 DNA 复制
的 激活 物 , 叫 做 S 期 激活 物 (S phase activa-
tor);(2) 当 一 个 S 期 细胞 与 一 个 G2 期 细胞
融合 时 ,S 期 细胞 核 继续 复制 ,但 G2 期 的 核
不 复制 .这 提示 已 经 复制 了 的 DNA 变 为 对 $S 细胞 细胞 核 核
期 激活 物 不 起 反应 了 ,这 保证 了 每 个 DNA 、 让 人
Sa 、 RS :
3 G1 期 X G2 期 间 期 间 期
人 决 些 :而 .5 13-46 ”细胞 融合 后 的 杂交 细胞 的 状态

期 细胞 则 要 等 到 S 期 核 复制 完毕 后 才 进 入 有 人
丝 分 裂 。 这 可 能 意味 着 在 S 期 细胞 中 有 某 种
调节 物 抑制 着 有 丝 分 裂 的 开始 ,此 调节 物 大 概 就 是 S 期 激活 物 本 身 ;(3) 当 一 个 有 丝 分 裂 的 细
胞 与 一 个 处 于 间 期 任何 阶段 的 细胞 融合 后 , 它 引起 间 期 细胞 核 进入 一 种 假 有 丝 分 裂 (pseudo-
mitosis ) , 其 特点 是 染色 体 的 超前 凝聚 (premature condensation ) ,提示 在 正 处 于 分 裂 中 的 细胞
内 有 个 M 期 激活 物 ; (4) 当 G1 期 和 G2 期 细胞 融合 后 ,杂交 细胞 中 的 任何 核 都 不 被 诱导 进行
复制 或 有 丝 分 裂 , 可 见 在 G1 期 和 G2 期 细胞 中 不 存在 S 期 激活 物 和 M 期 激活 物 , 说 明 这 些 激
活 物 的 活性 是 暂时 存在 的 ,S 期 和 M 期 一 过 ,它们 便 分 别 被 灭 活 。

下 面 我 们 将 讨论 S 期 激活 物 和 M 期 激活 物 的 本 质 及 其 调控 机 制 。 虽然 对 于 这 些 调 控 机 制
目前 还 未 完全 清楚 ,然而 可 以 看 出 ,通过 调控 保证 了 在 细胞 周期 中 必须 是 在 上 一 个 阶段 完成 后
才 开 始 进入 下 一 阶段 .另外 ,关于 真 核 细 胞 周期 的 调控 主要 是 通过 爪 蟾 的 卵 母 细胞 的 生化 分 析
” 和 了 酵母 细胞 周期 的 遗传 分 析 进 行 的 ,然而 已 知 调节 真 核 细 胞 周期 的 主要 调控 成 分 是 高 度 保守
的 ,所 以 用 这 两 种 生物 揭示 出 来 的 调控 机 制 有 着 足够 的 代表 性 。

四 、 由 爪 蟾 卵 中 制备 出 促成 熟 因子

爪 蟾 (X. zaevis) 卵 的 早期 发 育 提供 了 一 个 分 析 细 胞 如 何 进 入 有 丝 分 裂 的 非常 有 用 的 体

系 . 爪 蟾 的 卵 母 细 胞 在 其 未 成 熟 型 时 被 抑制 在 其 第 一 次 减 数 分 裂 周期 中 ,正好 在 染色 体 凝 聚 的
开始 阶段 ,相当 于 体 细胞 的 G2 期 。 当 激素 触发 它 进 入 第 二 次 减 数 分 裂 时 发 生 排 卵 。 当 卵 排出

后 它 被 阻止 在 接近 第 二 次 减 数 分 裂 的 未 尾 , 其 状态 相当 于 体 细胞 的 M 期 。

由 于 卵 的 体积 比较 大 ( 爪 蟾 的 卵 直 径 约 为 1 mm) ,特别 是 由 于 休止 的 卵 母 细 胞 和 休止 的

卵 都 易于 获得 ,因而 提供 了 一 个 很 方便 的 研究 体系 。 实 验 表明 ,将 休止 的 卵 的 胞 浆 抽 提 物 注射
给 休止 的 卵 母 细 胞 时 ,促进 了 卵 母 细 胞 的 有 丝 分 裂 , 可 见 在 卵细胞 中 有 一 种 活性 物质 , 它 能 使
未 成 熟 的 卵 母 细 胞 由 G2 期 进入 到 M 期 , 故 将 此 物质 称 为 促成 熟 因 子 (maturation promoting
factor MPF ) 。 后 来 证 明 MPF 有 普遍 的 引起 体 细 胞 进入 M 期 的 作用 ,所 以 就 把 它 叫做 M 期 促
进 因子 (M phase promoting factor, 代 号 仍 是 MPF)。 已 证 明 MPEF 的 活性 随 着 有 丝 分 裂 的 过
程 发 生变 动 , 即 在 发 生 有 丝 分 裂 时 MPF 的 活性 升 高 ,而 在 有 丝 分 裂 已 经 完成 和 S 期 时 它 的 活

性 消失 了 。

439

已 由 爪 蟾 的 卵 中 分 离 出 来 了 MPF .。 它 是 由 两 个 亚 基 组 成 的 二 聚 体 ,具有 蛋白 激酶 活性 ,能
使 多 种 不 同 的 蛋白 质 磷 酸化 。MPF 的 两 个 亚 基 之 一 的 分 子 量 为 34 kD , 故 称 为 5p34, 它 是 起 蛋
白 激酶 作用 的 亚 基 。 另 一 个 亚 基 的 分 子 量 为 45 kD , 故 称 为 p45, 它 是 一 种 周期 素 (cyclin) 。p34
的 蛋白 激酶 活性 需要 p45, 它 必须 与 p45 结合 后 才 有 激酶 活性 。 周 期 素 的 种 类 很 多 ,将 这 类 物
质 叫做 周期 素 是 因为 它们 在 整个 细胞 周期 中 不 断 增多 ,而 在 有 丝 分 裂 过 程 中 突然 被 蛋白 酶 降
解 掉 .有丝分裂 的 周期 素 可 分 为 两 大 类 , 即 周期 素 A 和 周期 素 B。 目前 对 这 些 周 期 素 的 功能 各
是 什么 还 不 清楚 ,但 已 知 MPF 中 的 周期 素 是 B 类 周期 素 。MPF 的 更 为 合适 的 名 称 应 该 是 M
期 激酶 。

在 由 G2 期 进入 M 期 时 活化 M 期 激酶 以 及 在 M 期 中 灭 活 它 是 细胞 周期 中 的 关键 。M 期
激酶 的 活化 和 灭 活 循环 见 图 13-47。 已 知 在 大 多 数 细胞 的 整个 细胞 周期 中 p34 的 含量 是 保持
恒定 的 。 在 S 期 新 合成 的 周期 素 与 p34 结合 起 来 ,形成 M 期 激酶 ,但 这 时 它 是 没有 活性 的 。 然
后 被 不 同 的 酶 先后 在 p34 的 苏 14、 酷 15 和 苏 161 处 磷酸 化 ,此 时 它 仍 没有 活性 ,但 易于 被 触
发 。 关 键 的 一 步 是 由 一 个 磷酸 酶 将 p34 中 苏 14 和 酷 15 上 的 磷酸 基 脱 掉 , 这 样 M 期 激酶 就 有
了 活性 ,从 而 启动 了 有 丝 分 裂 。 此 磷酸 酶 是 cdc25 蛋白 (p34 也 叫 cdc2 蛋白 ,这 些 蛋白 质 的 名 称
来 源 见 后 ) , 它 是 在 DNA 合成 完成 后 才 起 作用 的 。

Thr-14/Tyr-15
脱 磷酸 化

周期 素 磷酸 化

13-47 _M 期 激酶 的 活性 是 由 磷酸 化 、 脱 磷酸 化 和 蛋白质 的 降解 作用 调控 的
磷酸 化 的 次 序 是 苏 -14, 酷 -15, 苏 -167。 各 种 事件 发 生 的 时 间 尚 未 确定 。

M 期 激酶 的 灭 活 是 细胞 离开 有 丝 分 裂 所 必需 的 ,是 完成 有 丝 分 裂 的 先决 条 件 。M 期 激酶
是 怎样 灭 活 的 ? 是 通过 其 周期 素 亚 基 的 降解 实现 的 。 周 期 素 亚 基 降解 的 机 制 尚未 完全 明了 ,但
己 知 是 M 期 激酶 自己 启动 的 , 它 使 周期 素 产生 一 个 新 的 氨基 末端 ,从 而 使 之 与 泛 素

(ubiquitin) 结 合 ,而 泛 素 的 结合 是 标志 出 被 它 结合 的 蛋白 质 要 被 降解 的 。 可 见 M 期 激酶 的 活
440

则 性 是 自我 限制 (self-limiting) 的 ,这 样 就 自动 地 在 有 丝 分 裂 持 续 时 间 的 长 短 上 安置 了 一 个 界
瞎 限 .

五 、 蛋 白质 的 磷酸 化 和 脱 磷酸 化 调控 着 细胞 周期 -

由 上 述 可 见 ,M 期 激酶 的 活化 触发 了 有 丝 分 裂 的 开始 。 在 有 丝 分 裂 时 细胞 的 结构 发 生 深
刻 地 变化 ,其 中 主要 有 :中 染色 质 凝 聚 为 可 识别 的 染色 体 ; 包 核 纤 层 (lamina) 的 溶解 和 核 包 膜

| (envelope) 的 裂解 ;@ 微 管 Cmicrotubules ) 的 解 聚 和 再 构建 成 纺锤 体 ; 四 为 了 胞 质 分 裂 (cytoki-

nesis) 而 发 生 肌 动 蛋白 丝 actin filaments ) 的 再 组 织 。 有 丝 分 裂 后 ,M 期 激酶 灭 活 , 这 些 细胞 结
梅 又 恢复 到 间 期 的 状态 。 可 见 M 期 激酶 调控 的 都 是 可 逆 的 过 程 。

对 于 M 期 激酶 调控 这 些 过 程 的 细节 虽然 还 不 清楚 ,然而 已 知 是 M 期 激酶 活化 后 ,使 得 一
些 蛋 白质 发 生 了 磷酸 化 ,从 而 诱发 出 上 述 在 有 丝 分 裂 时 发 生 的 细胞 结构 的 各 种 变化 .在 有 丝 分
裂 后 ,M 期 激酶 灭 活 了 ,被 M 期 激酶 磷酸 化 了 的 各 种 蛋白 质 又 在 磷酸 酶 的 作用 下 脱 去 磷 酸 基
而 恢复 原状 ,从 而 使 得 细胞 的 结构 恢复 为 间 期 的 状态 。 有 证 据 表 明 , 在 由 Gl 期 进入 S 期 的 调
控 机 制 也 是 通过 某 些 蛋白 质 的 磷酸 化 和 脱 磷 酸化 进行 的 ， 所 以 说 是 蛋白 质 的 磷酸 化 和 脱 磷酸

合体 外 和 体内 的 实验 表明 ,M 期 激酶 使 下 述 蛋 白质 发 生 磷酸 化 可 能 是 引起 有 丝 分 裂 时

sa :HI 组 蛋白 的 磷酸 化 可 能 是 引起 M 期 染色 体 凝 聚 的 原因 ; 包 核 纤
量 层 的 组 成 单位 是 核 纤 层 蛋白 (lamin)。M 期 激酶 可 使 核 纤 层 蛋白 磷酸 化 ,从 而 使 核 纤 层 解 聚 为
核 纤 层 蛋白 ,引起 核 的 完整 性 的 丧失 和 核 包 膜 的 破裂 。 关 于 引起 细胞 其 它 结 构 发 生 改 变 的 蛋白

质 尚 在 鉴定 之 中 ,催化 这 些 蛋 白质 于 磷酸 化 之 后 再 脱 去 磷酸 基 的 究竟 是 些 什么 磷酸 酶 也 是 需

。 要 解决 的 问题 。

入 醇 母 的 遗传 分 析 揭示 出 多 种 与 调控 细胞 周期 有 关 的 基因

为 了 确切 说 明细 胞 周期 调控 的 复杂 机 制 , 需 要 鉴定 出 那些 直接 参与 调控 细胞 周期 的 基因 。
其 法 是 找到 一 些 细胞 的 突变 体 , 由 于 突变 而 把 这 些 细胞 封 阻 在 细胞 周期 的 某 一 特定 阶段 ,从 而

二 得 知 此 突变 的 基因 是 与 该 特定 阶段 的 调控 有 关 的 基因 。 由 于 这 种 突变 对 于 动物 细胞 来 说 是 致
， 死 的 ,所 以 无 法 用 以 进行 研究 .然而 用 酵母 则 可 以 进行 ,所 以 迄今 已 用 酵母 做 了 大 量 的 工作 。 由
国手 已 知 细胞 周期 的 调控 机 制 在 进化 中 是 非常 保守 的 ,所 以 也 就 揭示 出 来 了 许多 有 关 真 核 细 胞

周期 调控 的 原理 。

于 酵母 的 有 丝 分 裂 循 环 有 两 种 方式 ,如 图 13-48 所 示 . 裂 殖 酵 母 (fission yeast，'S. pomzpe) 的

细胞 周期 和 动物 细胞 一 样 ,也 分 为 相同 的 期 。 细 胞 先 纵向 生长 ,然后 分 裂 。 其 通过 细胞 周期 的
进度 大 致 可 用 细胞 的 长 度 (由 7 一 8 pm 到 加 们 为 14 一 16 pm) 来 评估 .面包 酵母 (baker's yeast，
S. cerevisiae) 的 周期 是 不 一 般 的 。 细 胞 几乎 是 由 S 期 直接 进入 分 裂 ,G2 期 实际 上 很 短 或 没有
(图 中 标 出 了 G2 期 是 为 了 标 出 向 M 期 过 渡 的 时 相 )。 并 且 细 胞 不 是 相等 的 分 裂 ,而 是 子 细胞
以 由 母 细 胞 全 出 的 方式 生长 ,最 后 以 一 个 较 小 的 细胞 释 出 而 获得 独立 。

酵母 细胞 可 以 单 倍 体 或 二 倍 体形 式 存在 。 它 们 有 两 种 型 式 的 生命 周期 。 单 倍 体 细胞 可 经
有 丝 分 有 裂 而 加 倍 。 一 个 单 倍 体 细胞 可 以 是 交配 型 a 或 <。 相反 型 的 单 倍 体 可 进行 性 交配 途径 ，
在 此 途径 中 它们 接合 (conjugate 起 来 形成 二 倍 体 细胞 ,二 倍 体 细胞 再 通过 减 数 分 裂 形 成 单 倍
体 细胞 .

441

TAI 人

中 烈 殖 酵母 (Schizosocchaoromyces pombe ) 四 |
司
人 :so Ce ) “ |

人

面包 酵母 (Soccharomyces cereyisiae )
本

图 13-48 ”两 种 不 同 的 酵母 细胞 周期

单 倍 体 细胞 的 行为 规定 了 细胞 周期 中 的 一 个 关键 之 点 , 即 在 其 Gl 的 早期 阶段 决定 了 究
竞 是 进行 分 裂 周期 还 是 进行 交配 。 这 种 决定 是 受 环境 影响 的 ,例如 ,必须 具有 相反 交配 型 细胞 ，
时 才能 发 生 接 合作 用 。 事实 是 由 一 种 交配 型 的 细胞 分 刻 出 一 种 交配 因子 (mating factor) ,此 因
子 是 个 多 肽 激素 , 它 引 起 另 一 种 交配 型 细胞 停止 其 周期 。 但 交配 因子 仅 能 在 G1 早期 使 细胞 转
向 交配 途径 。 在 Cl 晚期 细胞 变 成 为 进入 分 裂 周期 ,不 能 再 被 刺激 进入 交配 途径 。G1l 期 中 的 这

个 决定 点 称 为 起 点 。

多
王
本
国

命

图 13-49 3. zozzpe 的 细胞 周期 需要 cdc2 基因 以 通过 特定 的 阶段 ,但 可 被 反映 细胞
大 小 的 基因 (zweeZ) 所 阻止 ,细胞 可 在 G1l 的 早期 转变 为 交配 途径

在 两 种 酵母 中 都 进行 了 广泛 的 细胞 分 裂 周期 (cell division cycle,cdc) 的 突变 体 的 筛选 工 ，
作 , 从 而 揭示 出 许多 与 调控 细胞 周期 有 关 的 基因 ,简称 为 cdc 基因 。 图 13-49 概括 了 S. poxzjzpe

442

周期 中 所 涉及 的 事件 和 基因 。S. pompe 的 各 种 Cdc 突变 体 或 在 G2 和 M 期 的 边界 上 ,或 在 Gl
中 的 起 点 处 封 阻 细胞 的 周期 。

已 确定 Cdec2 蛋白 (cdc2 基因 的 产物 ) 是 个 关键 的 调节 物 ,因为 cdc2 的 突变 体 可 被 封 阻 在
起 点 之 前 或 M 期 之 前 ,可 见 细胞 周期 的 两 个 调控 位 点 都 是 受 Cdc2 蛋白 的 调控 。 前 已 述 及
Cde2 蛋白 是 爪 蟾 p34 的 同 源 物 , 它 和 p34 一 样 都 是 蛋白 激酶 ,并 通过 它们 的 蛋白 激酶 活性 引
发 细胞 周期 的 向 前 进行 。 然 而 它们 需要 与 其 它 蛋 白质 相互 作用 后 才 具 有 激酶 活性 。 这 些 蛋白
质 都 是 cdc 基因 的 产物 。 已 知 为 了 通过 起 点 ,除了 cdc2 外 还 需要 cdc10, 此 基因 编码 一 个 转录
因子 的 亚 基 , 此 转录 因子 活化 S 期 所 需 的 基因 。 而 为 了 由 G2 期 进入 M 期 , 则 除了 cdc2 基因
外 ,还 需要 cadc13 和 cdc25 基因 ,以 及 其 它 基 因 。

关于 Cdc2 蛋白 在 调控 由 G2 期 进入 M 期 的 作用 机 制 知 道 得 比较 多 。 它 与 cdc13 的 产物
(一 种 B 类 周期 素 ) 结 合成 为 M 期 激酶 。 与 图 13-47 中 所 描述 的 哺乳 动物 的 p34 的 情况 类 似 ，
Cdc2 蛋白 的 酷 15 必须 脱 去 磷酸 基 , 而 苏 161 则 需要 磷酸 化 ,但 没有 与 哺乳 动物 p34 相似 的 苏
球 的 修饰 作用 。 关键 的 一 步 是 cdc25 的 产物 即 Cdec25 蛋白 的 作用 , 这 是 个 磷酸 酶 ,特异 地 脱 去
Cdc2 蛋白 酷 15 的 磷酸 基 , 使 M 期 激酶 活化 ,从 而 引起 有 丝 分 裂 。 在 有 丝 分 裂 时 Cdc25 蛋白 的
量 增加 了 。 看 来 Cdc25 蛋白 的 量 逐 渐 增加 , 当 它 的 量 超过 一 个 阔 值 时 才 使 M 期 激酶 活化 并 引
起 有 丝 分 裂 是 重要 的 .Cdc25 蛋白 的 活性 似乎 起 着 一 种 检查 作用 , 它 保证 了 只 有 当 S 期 完成 后
才 启 动 M 期 。. 另 一 个 能 与 Cde2 蛋白 结合 的 蛋白 质 是 基因 sxwcl 的 产物 p13, 然 而 它 的 功能 迄今
尚 不 明了 。

在 正常 情况 下 ,细胞 的 分 裂 周期 是 与 细胞 的 大 小 相关 的 。 在 不 良 的 生长 条 件 下 细胞 的 增长
较 慢 ,G1 变 得 更 长 .这 是 个 保护 作用 ,用 以 避免 在 细胞 的 物质 含量 达到 足以 支持 两 个 子 细胞 之
前 进行 危险 地 分 裂 。 已 经 鉴定 出 检验 细胞 大 小 催化 亚 基 ， 调 节 亚 基
的 物质 之 一 是 zwee/ 基因 的 产物 ,此 产物 是 个 激 S. pozazpe Cdc2 Cdcl13 (B- 类 )

酶 , 它 能 使 Cde2 蛋白 的 酷 15 磷酸 化 ,从 而 抑制 .cerewisiCe CDC28 CLB1 一 4 (B- 类 )
的 洛 害 访 元 00 的 声 物 起 着 同样 的 从 月 革 列 人 /可 站 了 4 候 周 因素 人,B1 32
用 。zweel 和 zz 让] 都 缺失 是 致死 的 。 由 此 可 见 ，

zeel 和 mil 基因 的 产物 是 检查 细胞 大 小 的
它们 保证 了 细胞 在 不 够 大 之 前 不 进行 分 裂 。

由 上 述 可 见 ,zoeel 的 产物 和 cdc25 的 产物
起 着 相互 持 抗 的 作用 。zweel 产物 的 激酶 活性 作
用 于 Cdec2 和 蛋白 的 酷 15 ,抑制 其 功能 ,而 Cdc25
蛋白 的 磷酸 酶 活性 作用 于 同一 位 点 以 活化
Cdec2 和 蛋白。Cdc25 过 度 表达 的 突变 体 与 缺乏

zeal 的 突变 体 表 型 相同 。 这 些 工作 所 建立 起 来 cd 站 于

的 基本 原理 是 :关键 的 调节 物 是 Cdc2 蛋 日 , 它 。 S.cereuisiae CDc28 CLN1~3

的 活性 受到 激酶 和 磷酸 酶 的 调控 ,而 这 些 激酶 CDK2(p33)， ”周期 素 A,C
和 磷酸 酶 的 活性 又 受到 其 它 信 号 (例如 细胞 的 随 多 动物/ 圣 计 羡 未 4 D 国 及 25D3,E 忆
大 小 是 否 足够 ,DNA 的 合成 是 否 完毕 等 ) 的 调 图 13-50 ”用 于 构建 M 期 激酶 和 Gl 期
控 。 所 有 这 些 信和 号 都 最 后 通过 Cdc2 各 和 白 的 作 所 用 激酶 的 可 能 成 分

用 决定 是 否 前 进 通过 周期 。
443

关于 调控 起 点 的 知识 比 调控 有 丝 分 裂 的 知识 要 少 些 ,这 些 知识 首先 是 分 析 酵 母 S. cere-
zisiae 的 cdc 突变 体 获得 的 ,然后 用 以 鉴定 其 它 生物 .已 知 在 $. cerevisiae 中 调控 通过 起 点 和 进
入 M 期 两 个 阶段 的 关键 物质 都 是 基因 cdc28 的 产物 (是 $. pompe 中 Cdc2 的 同系 物 )。 和 Cdec2
蛋白 一 样 ,Cdc28 蛋白 也 是 蛋白 激酶 的 催化 亚 基 ,需要 与 周期 素 结合 起 来 才 有 作用 。 但 在 调控
起 点 所 用 的 周期 素 与 调控 进入 M 期 所 用 的 周期 素 是 不 同 的 ,因而 有 时 把 它们 分 别称 为 G1 周
期 素 和 G2 周期 素 。 图 13-50 中 列举 了 两 种 酵母 和 哺乳 动物 中 的 调节 性 激酶 的 可 能 成 分 。 由 图
中 可 见 , 真 核 生物 调控 细胞 周期 的 一 致 策略 是 激酶 由 一 个 催化 亚 基 和 一 个 调节 伙伴 所 组 成 。 在
有 丝 分 裂 时 催化 亚 基 由 单个 基因 的 产物 (cdc2 和 cdc28 产生 的 蛋白 质 p34) 所 提供 ,而 调节 伙
伴 则 通常 不 是 一 种 ,而 是 由 B 型 或 者 A 型 的 周期 素 所 提供 。 在 调控 由 G1 期 进入 S 期 时 ,酵母
所 用 的 催化 亚 基 与 M 期 激酶 的 相同 ,而 在 动物 细胞 中 则 是 一 个 与 p34 有 关 的 蛋白 质 , 即
CDK2 或 CDK4。 调节 伙伴 则 是 一 大 类 G1 周期 素 中 的 一 种 。 这 类 周期 素 在 序列 上 与 有 丝 分 列
时 的 周期 素 关系 很 小 。 当 前 关于 周期 素 的 定义 已 和 原来 所 说 的 A 型 或 B 型 周期 素 的 定义 有 所
不 同 , 除 了 A 型 和 B 型 外 又 发 现 了 多 种 周期 素 , 它 们 的 性 质 也 不 都 是 像 原来 所 描述 的 在 细胞
周期 中 逐渐 粮 累 , 在 有 丝 分 裂 过 程 中 突然 被 蛋白 酶 降解 .现在 把 与 原来 类 型 的 周期 素 在 序列 上
有 二 定 相关 性 ,并 且 能 够 与 一 个 p34 或 CDK2 以 及 相关 的 催化 亚 基 结 合 起 来 形成 一 个 激酶 的
蛋白 质 ,都 叫做 周期 素 。

第 三 节 发育 的 基因 调节

发 育 是 由 单个 受精 卵 开 始 的 ,但 由 它 产 生 的 细胞 中 却 有 着 不 同 的 发 育 结局 。 早 期 发 育 需 要
了 解 的 问题 是 ,在 分 子 水 平 上 这 种 不 对 称 是 怎样 引入 的 , 即 开 始 时 的 一 个 细胞 ,仅仅 经 过 几 次
分 裂 ,是 怎样 使 得 这 些 子 细胞 的 性 质 彼此 不 同 的 ? 不 同 生 物 引入 不 对 称 的 方法 不 同 , 当前 仅 对
果 蝇 研究 得 比较 清楚 。 已 知 果 蝇 的 卵子 本 身 是 不 对 称 的 ,这 是 由 母 方 基因 引起 的 , 即 在 卵子 发
生 期 间 , 母 体 细胞 中 的 一 些 基 因 的 表达 产物 (包括 mRNA 和 和 蛋白质) 进入 卵子 ,这 些 产物 在 卵
子 中 做 不 均匀 地 分 布 ,从 而 使 卵子 成 为 不 对 称 。 同 时 在 受精 后 的 初期 仅 发 生 核 分 裂 ,产生 的 许
多 核 都 处 于 同一 胞 浆 中 ( 称 为 合 胞 体 )。 随 后 这 些 核 分 布 在 合 胞 体 的 固定 的 不 同 部 位 处 。 由 于
母 方 基因 的 产物 在 合 胞 体 胞 浆 中 的 分 布 是 不 对 称 的 ,因而 处 于 不 同位 置 的 核 的 环境 不 同 , 而 且
母 方 基因 的 表达 产物 对 基因 的 表达 有 调控 作用 ,因而 使 处 于 不 同位 置 的 核 ( 以 及 随后 由 它们 形
成 的 细胞 ) 的 基因 表达 的 情况 有 所 不 同 ,这 就 使 得 细胞 分 化 了 .经 研究 ,受精 后 开始 表达 的 基因
称 为 分 节 基 因 ， 它 们 的 种 类 很 多 。 其 中 有 些 是 在 母 方 基因 产物 的 影响 下 分 别 在 不 同 的 细胞 申 局
部 表达 , 它们 的 表达 又 调控 下 一 类 分 节 基 因 的 表达 。 分 节 基 因 共 分 为 3 类 ,在 它们 的 作用 下 使
胚胎 分 成 若干 个 节 。 它们 并 且 控 制 着 下 一 群 基因 的 表达 ,这 一 群 基因 称 为 同 源 异 型 基因 。 在 不
同 节 中 表达 不 同 的 同 源 异 型 基因 , 同 源 异 型 基因 的 产物 都 是 转录 因子 ,它们 在 不 同 节 中 分 别 启 .
动 不 同 的 一 套 基 因 进 行 表达 , 其 结果 使 不 同 的 节 产 生 不 同 的 表 型 。 个 体 发 育 的 调 探 过程 很 复
杂 , 但 上 面 的 过 于 简单 的 描述 说 明了 一 个 基本 的 原理 , 即 个 体 发 育 是 在 一 套 基 因 控 制 下 一 套 基
因 , 下 一 套 基 因 又 控制 再 下 一 套 基因 的 基因 级 联 的 方式 下 进行 的 ,这 个 原理 是 所 有 生物 都 共同
的 。 下 面 将 根据 上 述 过 程 主要 讨论 果 蝇 发 育 的 已 知 的 有 关 细 节 ,最 后 简单 说 明 其 它 生 物 也 有 与
果 蝇 发 育 相 似 之 处 。

444

一 ` 必 须 把 一 个 梯度 转变 为 分 隔 的 分 区

在 图 13-51 中 按 发 育 的 3 个 阶段 , 卵 ` 幼 虫 和 成 虫 表明 了 果 蝇 发 育 的 基本 问题 .在 发 育 开
着 帮 的 前 CanterioEposterior) 和 背 - 腹 而，
(dorso-ventral) 两 个 轴 (axis) 建立 起 梯度 (Cgradi- 。 沿 前 后 负 和 背 - 腹 轴 建立 起 极 性
ent) 。 卵 的 前 端 将 变 为 成 虫 的 头 ,后 端 将 变 为 尾 。 背 侧
背 侧 在 上 , 腹 侧 在 下 。 梯 度 是 由 分 子 \ 蛋 白质 或 和
RNAs ) 在 胞 浆 中 差别 分 布 形 成 的 。 担 负 前 -后 发
育 的 梯度 在 受精 后 立即 形成 ,而 背 - 腹 梯 度 的 建立
则 稍 晚 一 些 。 概 括 但 过 于 简单 的 说 法 是 :前 -后 体
系 调控 沿 幼虫 体 的 位 置信 息 , 而 背 - 腹 体系 则 调控 “ 翁 昌
组 织 的 分 化 , 即 规定 不 同 的 胚胎 组 织 ,其 中 包括 中 。 别 旨 更 和 玖 信 员 必 旬 具 状 带 由 度 傅 扩 出，
RE 用 展 必 Eractoderim) 有 是 十 是 二 三 二
和 背部 外 胚层 (dorsal ectoderm ) 。 7

昆虫 的 发 育 分 2 个 阶段 ,首先 是 由 卵 发 育成
幼虫 ,然后 由 幼虫 变态 Cmetamorphoses) 为 蝇 。 而 银
幼虫 (胚胎 ) 和 蝇 的 结构 是 十 分 不 同 的 。 随 着 幼虫 尾
的 发 育 , 它 形成 一 些 幼虫 所 特有 的 部 位 ,这 些 部 位

不 形成 成 虫 的 组 织 , 而 另 些 部 位 则 变态 为 成 虫 的 有志
结构 。 与 之 相反 ,哺乳 动物 的 胚胎 则 发 育 出 与 成 年 具有 3 个 胸 节 和 8 个 腹 节 的 分 节 结 构
相同 的 身体 各 部 位 。 尽 管 发 育 过 程 有 这 样 大 的 不
同 , 但 控制 昆虫 发 育 和 痛 椎 动物 发 育 的 基本 原理
看 来 是 相同 的 ,已 发 现 了 果 蝇 的 调节 因 了 于 和 哺乳
动物 的 调节 因子 之 间 的 相关 性 。

分 隔 的 区 域 是 在 胚胎 中 确定 的 ,它们 相当 于
成 虫 身 体 的 各 部 位 。 在 图 13-51 中 根据 幼虫 的 表
面 结 构 指 出 了 这 些 分隔 区 。 在 幼虫 的 表皮
(euticle) 上 有 特定 花样 的 锯齿 状 突起 (小 昔 毛 ) 的
带 。 其 特点 是 :中 沿 前 -后 轴 锯 齿 状 突起 (denticles )
形成 分 隔 的 带 , 每 个 带 相 当 于 成 年 果 蝇 的 一 个 节 。
事实 是 11 条 饥 齿 状 突起 的 带 相当 于 成 虫 的 11 个
节 ; 四 沿 背 - 腹 轴 的 情况 是 ,腹部 的 锯齿 状 突起 粗 ,而 背部 的 则 细 得 多 。 虽然 表皮 仅仅 代表 体 表 , 但
它 的 结构 是 胚胎 两 个 轴 上 整个 机 构 的 特征 。 因此 ,根据 沿 两 个 轴 的 锯齿 状 突起 花样 的 畸变 已 做 了
很 多 在 果 蝇 发 育 中 突变 体 表 型 的 分 析 。

根据 卵 的 梯度 和 成 虫 的 节 之 间 在 形式 上 的 差异 提出 了 一 些 基本 的 问题 。 卵 中 的 梯度 是 怎
样 建立 起 来 的 ?一 个 连续 的 梯度 是 怎样 转变 成 为 决定 每 个 细胞 类 型 的 不 连续 的 差异 的 ? 由 单
一 的 梯度 怎样 能 够 发 展 成 为 数目 很 多 的 分 开 的 分 区 ?

梯度 的 本 质 以 及 它们 影响 位 于 整个 胚胎 中 的 多 种 细胞 型 发 育 的 能 力 , 是 依靠 果 蝇 发 育 的
某 些 特性 的 。 图 13-52 概括 了 其 早期 阶段 。 在 受精 的 卵 中 有 两 个 亲本 的 核 , 并 且 在 其 后 端 有 个

445

图 13-51 果 蝇 发 育 的 基本 情况

受精 卵 有 两 个 核

90 min

分 裂 1 一 8 次 核 在 同一 胞 质 内 分 裂
( 合 胞 体 )

册 E 了
S 合 胞 体 囊 胚层 核 移动 至 周边 并 分
羽 裂 ,进一步 发 生 4 次 分 列

195 min

细胞 型 吉 肥 层 核 由 膜 包围 起 来 , 形
成 约 6 000 个 体 细胞 的 单 层

图 13-52 ” 果 蝇 多 的 早期 发 育 是 在 共同 的 胞
浆 中 进行 的 ,直至 细胞 型 囊 胚 层 阶 段 为 止

叫做 极 质 (polar plasm) 的 区 域 。 在 头 9 次 分 裂 时 核 是 在 共同 的 胞 浆 中 分 裂 的 。 在 此 胞 浆 中 物
质 是 能 够 扩散 的 (虽然 可 能 有 细胞 骨架 结构 的 约束 ) . 在 第 7 次 分 裂 时 有 些 核 移动 至 极 质 中 ,在
那里 这 些 核 成 为 生殖 细胞 的 前 体 。 在 第 9 次 分 裂 之 后 , 核 移动 并 分 裂 以 便 在 卵 的 表面 形成 一
层 。 然后 它们 再 分 裂 4 次 ,分 裂 后 膜 包 围 了 它们 而 形成 体 细胞 . 直到 细胞 形成 之 前 所 有 的 核 都
是 在 同一 胞 浆 中 。 在 细胞 型 圳 胚层 (cellular blastoderm ) 阶段 ,分 开 的 分 区 开始 变 为 明显 了 ,并
且 在 此 时 卵 的 特定 区 域 被 确定 为 变 成 成 虫 的 特定 型 结构 (这 种 确定 是 逐渐 的 和 顺序 变化 的 )。
然而 在 此 过 程 开始 时 , 当 核 移动 至 表面 以 形成 囊 胚 层 的 单 层 时 ,每 个 核 到 达 什 么 位 置 是 完全 随
机 的 。 由 此 可 见 , 是 核 到 达 的 位 置 决定 了 它们 的 后 代 细胞 将 变 成 什么 型 。

二 、 在 胚胎 发 生 的 早期 由 母体 基因 的 产物 建立 梯度

最 初 的 不 对 称 是 在 卵子 发 生 (oogenesis) 时 加 给 果 蝇 的 卵 母 细胞 (oocyte) 的 。 图 13-53 表
明了 果 蝇 卵巢 中 一 个 滤 泡 (follicle) 的 结构 ,这 是 一 次 减 数 分 裂 和 随后 4 次 有 丝 分 裂 以 产生 16
个 单 倍 体 细胞 的 结果 。 其 中 一 个 细胞 变 成 了 卵 母 细 胞 ,其 余 15 个 变 成 了 滋 卵 细胞 Cnurse
cell )。 卵 母 细胞 和 与 之 相 邻 的 滋 卵 细胞 之 间 用 胞 质 桥 (cytoplasmic bridge ) 或 者 叫做 环 管 的
4ring canal) 相 连通 。 细 胞 的 胞 浆 物质 ,包括 蛋白 质 和 RNA 可 进入 卵 母 细胞 ,这 些 物 质 占 卵 的

相当 大 的 一 部 分 体积 。 胞 质 桥 位 于 卵 母 细胞 的 一 端 , 此 端 将 成 为 卵 的 前 端 。
446

在 母 蝇 体内 表达 的 基因 对 早期 发 育 很 重要 , 这 些 基因 叫做 母体 基因 (maternal gene) ,可 用
具 性 不 育 (female sterile) 突变 进行 鉴定 。 由 于 这 些 基因 不 影响 母 蝇 自己 ,但 对 产生 后 代 是 必需
的 ,因而 这 种 突变 的 峻 蝇 所 产 的 卵 不 能 发 育 为 成 虫 , 它 们 在 发 育 期 间 死 亡 。

母体 基因 的 共同 特点 是 在 受精 前 表达 , 尽
管 它们 的 表达 产物 有 的 是 在 表达 之 时 起 作用 ，
有 的 则 贮备 起 来 在 后 期 使 用 。 按 其 表达 的 地 点
可 将 母体 基因 分 为 两 类 : 山 在 母体 细胞 (例如 滤
泡 细 胞 ) 中 表达 并 影响 卵 发 育 的 基因 称 为 母体
体 细 胞 基因 (maternal somatic gene) ; @) 在 种
” 系 细胞 ( 滋 卵 细胞 或 卵 母 细胞 ) 中 表达 的 叫做 母
体 种 系 基因 (maternal germline gene ) 。

用 母体 基因 突变 的 方法 鉴定 出 来 了 4 组
与 胚胎 的 特定 区 域 发 育 有 关 的 基因 。 用 常规 “图 13-53 果 晶 的 一 个 滤 泡 ,外 面 有 滤 泡 细胞 ,它们
遗传 学 测定 和 生物 化 学 分 析 得 知 , 每 组 基因 包围 着 细胞 和 与 之 紧密 接触 的 卵 母 细胞
都 可 按 其 活动 次 序 组 成 一 个 途径 ,这 些 途径 滋 卵 细胞 通过 胞 质 桥 彼此 联结 ,并 和 卵 母 细 胞 的 前
的 成 分 列 于 图 13-54。 有 时 把 途径 中 活动 较
早 的 基因 叫做 上 游 基因 ,活动 较 晚 的 叫做 下 游 基因 。 从 图 中 可 以 看 出 ,4 个 途径 运转 的 共同 原
理 是 ,每 个 途径 都 是 由 局 部 事件 开始 ,这 些 事件 有 的 发 生 在 卵 内 ,有 的 发 生 在 卵 外 ,其 结果 是 使
卵 内 的 一 个 信号 局 部 化 .此 信号 是 个 蛋白 质 , 它 以 不 对 称 的 方式 分 布 于 卵 内 , 称 为 形态 发 生 素

前 部 体系 后 部 体系 末端 体系 背 腹 体系
母体 体 细 胞 基因 torsolike pipe

母体 种 系 基因

有 转录 调节 物 “

合子 中 的 靶 基 因

13-54 4 个 母体 体系 ,每 个 都 是 由 其 产物 作用 于 凡 外 侧 的 基因 井 始 的 ,然后 途径 转 到 旬 内 ，
在 卵 内 每 个 途径 的 局 部 产物 都 是 形态 原 , 它 们 或 者 是 个 受 体 ,或 者 是 个 基因 表达 的 调节 物
途径 最 后 的 成 分 是 个 转录 因子 , 它 作 用 于 合子 的 靶 物 质 ,这 些 靶 物质 负责 下 一 阶段 的 发 育 。
447

(morphogen) 。 形 态 发 生 素 的 定义 是 , 它 是 个 蛋白 质 , 它 的 局 部 浓度 (或 活性 ) 使 其 周围 区 域 采
取 一 种 特定 的 结构 或 结局 。 形 态 发 生 素 有 的 是 转录 的 调节 因子 ,有 的 是 使 一 个 转录 因子 活化 。
4 个 体系 中 的 3 个 与 前 -后 轴 有 关 , 一 个 与 背 - 腹 轴 有 关 。 简 述 如 下 :

(1) 前 部 体系 (anterior system) “负责 头 和 胸部 的 发 育 。 此 体系 的 形态 发 生 素 是 Bicoid 蛋
白 , 它 是 个 转录 调节 因子 ,调控 基因 junchbac&( 大 概 还 有 其 它 分 节 的 和 同 源 异 型 基因 ) 的 表 “ 蜂

达 。 picoid RNA 是 在 滋 卵 细胞 中 生成 的 ,并 依靠 母体 的 生殖 系 产物 转运 至 卵 母 细胞 中 ,并 局 限
在 卵 的 前 端 。 |

(2) 后 部 体系 (posterior system) ”负责 腹部 的 分 节 。 其 最 初 过 程 的 本 质 尚 不 清楚 ,是 由 许
多 产物 的 作用 使 ranos 产物 在 卵 母 细胞 中 局 部 化 。 "anos 产物 是 形态 发 生 素 , 它 局 部 阻 过 和
jazzcpnpac& 的 表达 (通过 mRNA 翻译 的 调控 ) 。

(3) 未 端 体系 (terminal system) “负责 卵 的 不 分 节 示 端的 特异 结构 ( 头 部 的 原 头 区
(acron) 和 尾部 的 尾 节 (telson) ) 的 发 育 。 已 知 此 体系 的 最 初 事件 发 生 在 滤 泡 细胞 ,这 些 事件 导
致 orso 编码 的 跨 膜 受 体 局 部 活化 。 此 途径 的 最 终 产 物 尚 待 鉴定 。

(4) 第 4 个 体系 是 负责 背 - 腹 发 育 的 ”此 途径 是 由 来 自 滤 泡 细胞 的 -个 信号 在 卵 的 腹部 局
动 的 。 此 信号 由 Tolz 编码 的 跨 膜 受 体 转 导 ,引起 dorsal 产生 的 转录 因子 的 活性 梯度 (用 控制 它
在 细胞 中 的 定位 做 到 的 ) 。

已 鉴定 出 约 30 个 参与 格局 形成 的 母体 基因 ,而 且 看 来 也 不 会 比 这 个 数目 再 多 很 多 了 。4
条 途径 的 所 有 成 分 都 是 母体 的 , 可见 ,建立 最 初 格局 的 所 有 体系 都 取决 于 受精 前 发 生 的 事件 。
两 个 体 轴 (body axis) 是 各 自 独立 建立 的 。 影 响 极 性 的 突变 可 使 后 区 发 育成 像 前 部 的 结构 ,或
者 使 腹 区 发 育成 背 的 样子 ,但 影响 一 个 轴 的 突变 不 影响 另外 的 轴 。 在 前 -后 轴 上 ,前 部 体系 和 后
部 体系 提供 对 立 的 梯度 ,控制 着 体 节 的 发 育 . 未 端 体系 和 背 - 腹 体系 的 运转 不 依赖 于 其 它 体系 .

发 育 所 需 的 物质 浓缩 于 局 部 的 事实 是 用 营救 法 (rescue) 表 明 的 。 此 法 是 将 由 野生 型 胚胎
中 取出 的 物质 注射 给 早期 发 育 有 缺陷 的 突变 胚胎 .如 果 突 变 的 胚胎 因此 而 发 育 正常 , 则 可 知 突
变 使 它 缺 乏 了 在 野生 型 胚胎 中 存在 的 某 物质 。 例 如 用 此 技术 曾 鉴 定 了 前 部 的 决定 因素 。 已 知

zicoid 基因 的 突变 体 不 发 育 头 部 ,但 此 缺陷 可 通过 给 突变 的 卵 注射 由 野生 型 胚胎 前 端 取得 的
胞 浆 而 纠正 。 而 且 , 注 射 野生 型 前 部 胞 浆 还 可 使 突变 胚胎 的 其 它 部 位 发 育 出 前 部 结构 来 。 营救
的 程度 还 取决 于 注射 的 野生 型 胞 浆 的 量 。 注射 物 中 的 活性 成 分 可 被 提纯 和 鉴定 ,在 icoiz 的 例
子 中 此 活性 成 分 是 5icoid mRNA ,注射 提纯 的 wzcoid mRNA 可 代替 前 部 胞 浆 。

(一 ) 前 部 体系

jicoid 基因 是 在 滋 卵 细胞 中 转录 的 ,产生 的 mRNA 通过 胞 质 桥 转 运 到 卵 母 细胞 中 。 此
mRNA 定位 于 胚胎 的 前 部 末端 ,但 在 卵子 发 生 期 (oogenesis ) 它 不 被 翻译 。 翻 译 是 在 受精 后 立
即 开 始 的 ,然后 此 和 蛋白质 沿 胚胎 建立 起 一 个 梯度 ,如 图 13-55 所 示 , 此 梯度 可 能 是 由 于 Bicoid
蛋白 由 前 部 末端 的 源头 扩散 产生 的 ,此 梯度 建立 于 7 次 分 裂 之 前 ,并 保持 稳定 至 囊 胚 层 阶 段 之
后 。 已 发 现 前 部 发 育 所 需 的 其 它 基 因 ，,sxwuc 和 ezz 的 产物 也 具有 相同 方向 的 梯度 . 这 些 基因 产
物 的 功能 可 能 与 zicoid mRNA 转运 人 卵 母 细胞 有 关 , 或 者 与 使 zicoid mRNA 不 由 前 部 未 端 向
外 扩散 有 关 。zicozd mRNA 的 定位 于 前 部 未 端 依赖 于 其 3' 端 非 翻译 区 的 序列 。

Bicoid 梯度 建立 起 来 的 后 果 是 什么 ”用 改变 母体 功能 基因 的 拷贝 数 而 使 此 梯度 增高 或 降
低 的 实验 表明 ,减弱 此 梯度 引起 前 部 的 体 节 (segment) 发 育 得 更 像 后 部 的 体 节 , 而 增强 此 梯度
则 使 前 部 样 (anterior-like) 的 结构 沿 胚胎 延伸 得 更 远 。 可 见 Bicoid 蛋白 是 个 形态 发 生 素 ,依靠

攻 48

sw” 本

人

人

， 录 因 子 , 它 特异 地 启动 一 些 基 因 的 转录 ,这些 基
。 国 启 动 后 再 进一步 调节 另外 一 些 基 因 的 开关 ，

它 的 浓度 决定 着 胚胎 中 前 部 -后 部 的 位 置 。

胚胎 前 部 细胞 的 结局 是 由 它们 所 处 位 置 的

Bicoid 蛋白 的 浓度 决定 的 。Bicoid 蛋白 是 个 转

从 而 决定 着 前 部 结构 的 形成 。 由 此 可 见 , 在 前 部
发 育 中 Bicoid 起 着 指导 性 作用 。 已 知 Bicoid 直
接 启 动 的 一 个 主要 基因 是 zexzcpnpac& ,其它 基
因 尚 待 鉴定 。Bicoid 启动 zezcpnpac& 的 转录 是
剂量 依赖 型 的 , 即 在 Bicoid 蛋白 的 浓度 高 于 一
父 特定 冰 值 时 zzzcppac& 才 被 活化 ,这 就 使 得
Bicoid 蛋白 的 浓度 梯度 能 够 影响 处 于 不 同位 置
的 基因 是 否 表达 .在 胚胎 发 育 中 ,就 是 以 这 种 方
式 使 形态 发 生 素 (如 Bicoid 蛋白 ) 的 量 的 差异
转变 成 了 (细胞 结构 ) 在 质 上 不 同 的 状态 。 关 于 图 13-55 在 果 蝇 发 育 过 程 中 ,Bicoid 蛋白 形成 一 个
Bicoid 启动 zzzchzac& 的 后 果 将 在 后 面 讨论 。 “梯度 。 此 梯度 沿 500 pm 长 的 卵 延 伸 约 200 pm

(二 J 后 部 体系 由 于 蛋白 质 含量 的 测定 方法 还 不 够 精确 ,梯度

后 部 的 发 理 依赖 于 三 大 组 基因 的 表达 。 这 的 实 奈 伟 况 可 能 5 此 民有 所 不 站，
些 基 因 中 任何 一 个 发 生 突变 的 雌 蝇 产生 的 胚胎 ,其 头 和 胸 节 都 正常 发 育 , 但 缺乏 腹部 . 后 部 体
系 的 起 始 事件 与 前 部 体系 的 基本 性 质 相 似 , 即 一 个 母体 的 mRNA ,zazos mRNA 定位 于 后 部

， 的 极点 处 (posterior pole), 其 翻译 产物 Nanos 蛋白 是 个 形态 发 生 素 , 它 由 其 合成 位 点 扩散 , 沿

腹 区 形成 一 个 梯度 。 确 定 Nanos 蛋白 为 形态 发 生 素 是 因为 注射 提纯 的 zazos mRNA 能 营救 任
何 甚 它 后 部 基因 发 生 窗 变 的 胚胎 ,而 且 将 wazos mRNA 注射 给 胚胎 的 其 它 部 位 ,能 引起 该 处
形成 腹部 结构 .其它 后 部 基因 的 作用 则 可 能 与 zazros mRNA 的 转运 和 定位 有 关 。 zazos mRNA
的 定位 依赖 于 其 3' 非 翻译 区 的 序列 。 但 它 的 定位 比 gzcozd mRNA 的 定位 要 复杂 得 多 , 因为
zaz0s mRNA 是 由 滋 卵 细胞 产生 的 , 它 由 卵 母 细胞 的 前 端 进 入 ,需要 转运 通过 卵 母 细 胞 的 全
长 ,才能 达到 并 定位 于 后 部 极点 。
Zicoid 和 zazos 都 作用 于 Pencjnpac& 基因 的 表达 。Anazozchpac& 编码 一 个 转录 的 阻 遏 物 ,前 部
于 构 ( 胸 区 ) 的 形成 需要 它 的 存在 ,后 部 结构 的 发 育 则 不 需要 它 。 在 卵 母 生成 期 它 被 转录 产生
本 示 NA， 此 mRNA 均匀 地 分 布 在 卵 中 。 受 精 后 ,在 前 部 区 域 中 Bicoid 的 梯度 活化 zezcjpacR
mRNA 的 合成 ; 在 后 部 区 域 zaxros 阻止 hzwnchpauc& mRNA 的 翻译 ,其 结果 是 使 zzzchpbacK
mRNA 降解 。 因 此 ,前 部 体系 和 后 部 体系 共同 使 得 卵 的 前 半 部 pzrchpac& 水 平 升 高 ,而 在 后 半
部 则 将 它 除 掉 。 后 面 即将 讨论 jxncphzauc& 这 种 分 布 的 意义 在 于 它 调控 着 一 些 基因 .已 知 它 直 接
阻 遇 基 因 Aozrzs 和 大 概 还 有 siaxz ,这些 基 因 是 形成 腹部 结构 所 必需 的 。 可 见 hzxzchpack 的 主
要 作用 是 通过 抑制 enzrps 和 giant 在 前 部 区 域 的 表达 ,从 而 阻止 了 在 此 区 域 形 成 腹部 结构 。
后 部 体系 除了 如 上 所 述 负责 腹部 的 发 育 外 ,还 负责 极 细胞 (polar cells ) 的 形成 , 极 细 胞 将
生成 生殖 细胞 .这 两 种 事件 的 形态 发 生 素 都 存在 于 极 质 中 。 其 中 之 一 是 zazros, 如 前 所 述 它 决
定 腹部 的 发 育 ; 另 一 个 形态 发 生 素 尚 未 鉴定 出 来 , 它 调控 极 细 胞 的 形成 。 由 于 除了 zaxzos 和
pxzzazzlio 之 外 ,其 余 所 有 后 部 基因 都 是 两 个 过 程 所 必需 的 ,可 见 后 部 体系 在 开始 时 是 一 个 途径 ，
449

到 了 一 定 阶 段 发 生 分 支 。 分 支 后 由 zazos 和 zzxzzlio 确定 腹部 发 育 .Nanos 蛋白 是 形态 发 生 素 ，
zzzazzlzo 的 功能 可 能 是 其 产物 协助 Nanos 蛋白 的 扩散 ;活化 或 稳定 Nanos 和 蛋白。 而 极 细 胞 形成
”分 支 的 形态 发 生 素 则 尚 不 清楚 。

(三 ) 背 腹 体系

果 蝇 胚胎 背 - 腹 样式 的 发 育 需要 11 个 母体 基因 , 它们 的 功能 是 在 由 受精 到 细胞 型 训 胚 层 之 前

的 期 间 建 立 起 背 - 腹 轴 ( 见 图 13-54) 。 此 体系 对 腹部 结构 [其 中 包括 中 豚 层 mesoderm) 和 神经 外 胚
层 (neuroectoderm ) 的 发 育 是 必需 的 。 如 图 13-56 所 示 , 这 些 基 因 中 的 任 一 基因 的 突变 体 都 在 其 腹
侧 有 背 部 结构 。 但 将 野生 型 的 胞 质 注 射 到 突变 的 豚 胎 中 可 挽救 其 缺陷 ,使 腹部 结构 能 够 发 育 。

野生 型 胚胎

背 腹 组 基因 突变

给 突变 体 注射 含有
To!/ 基因 产物
的 胞 质

13-56 野生 型 果 蝇 胚胎 有 明显 不 同 的 背部 和 腹部 结构
背 - 腹 组 基因 的 突变 阻止 了 腹部 结构 的 出 现 , 胚 胎 的 腹 侧 背部 化 了 。 注 射 含有 To 基因 产物 的 胞 质 可 恢复 腹部 结构 。

在 此 途径 中 卵 母 细胞 和 滤 泡 细胞 之 间 发 生 着 复杂 的 相互 作用 。 卵 母 细胞 中 某 些 基 因 的 功
能 是 滤 泡 细胞 正常 发 育 所 必需 的 ,由 于 这 些 基因 的 突变 而 使 滤 泡 细胞 有 缺陷 时 , 则 背 - 腹 的 发
育 不 正常 。 此 现象 的 发 生 是 因为 在 滤 泡 细 胞 中 有 3 个 基因 (zipe,nudel 和 roindzpexteD， 它 们 的
功能 是 传送 一 个 信号 给 卵 母 细 胞 ( 卵 在 受精 前 不 接受 此 信号. ) 此 信号 的 本 质 虽 然 尚 不 清楚 ,但
已 知 它 引起 在 卵 的 表面 上 发 生 一 系列 的 蛋白 质 裂 解 作 用 :snake 的 产物 使 easter 的 产物 裂解 而
活化 ,活化 的 easter 产物 又 使 spatzle 的 产物 裂解 而 活化 ,活化 的 szpazzie 产物 则 是 Tolz 基因 编
码 的 受 体 的 配 体 (ligand) ,To 是 此 途径 在 卵 母 细胞 中 起 作用 的 第 一 个 成 分 。 营 救 实 验 表明 ，
7o 是 将 信号 转 人 卵 母 细 胞 内 的 关键 ,途径 中 的 其 它 基因 则 起 辅助 作用 。

TIoll 蛋白 的 作用 是 诱导 背 - 腹 结构 的 形成 , 它 仅 在 腹 侧 有 活性 而 在 背部 没有 ,从 而 形成 背 -

腹 梯 度 . 然而 实验 证 明 , 在 胚胎 的 所 有 部 位 都 有 Toll 蛋白 ,那么 为 什么 它 仅 在 适当 的 局 部 诱导
450

出 腹部 结构 ? 这 是 因为 它 的 功能 需要 结合 上 配 体 ， 而 此 配 体 (Spatzle 蛋白 裂解 产物 ) 仅 在 卵 周
隙 (peiivitelline space) 的 腹 侧 产生 ,此 配 体 或 是 由 于 不 能 扩散 至 远 处 ,或 是 由 于 与 Toll 结合 得
很 快 ,其 结果 是 使 Toll 仅 在 胚胎 的 腹 侧 被 活化 。
Toll 蛋白 活性 的 本 质 目前 尚 不 清楚 ,但 已 知 它 是 以 某 种 方式 经 由 tube 和 pelle 而 起 作用
_ 的， zzpe 的 功能 尚 不 清楚 。zezle 编码 一 个 激酶 ,此 激酶 的 靶子 大 概 是 cactus 的 产物 ,此 产物 调
| 控 着 dorsal 编码 的 转录 因子 。 在 胞 质 中 Cactus 蛋白 和 Dorsal 蛋白 形成 复合 体 ,使 lorsal 不 能
进入 核 。 当 Cactus 蛋白 被 Pelle 蛋白 磷酸 化 后 , 它 将 Dorsal 蛋白 释 出 ,Dorsal 蛋白 即 可 进入 核
中 。 由 此 可 见 ,Toll 活化 的 结果 是 在 胚胎 中 由 腹 侧 至 背 侧 建立 起 dorsel 在 核 中 活性 的 梯度 。 在
胚胎 的 腹部 Dorsal 蛋白 进入 核 ,在 背 侧 它 仍 停留 在 胞 质 中 。 此 梯度 是 在 合 胞 体 圳 胚层 (syncy-
Laial blastoderm) 阶 段 建立 的 ,实验 证 明 , 它 在 过 渡 到 细胞 型 圳 胚层 期 间 梯度 变 得 更 陡 。 在 此 过 程
中 ,胚胎 中 Dorsal 蛋白 的 总 量 没有 改变 ,只 是 由 于 它 在 核 和 胞 质 中 的 再 分 配 而 建立 起 了 梯度 .。
| Dorsal 蛋白 活化 基因 zwis: 和 sxail 是 腹部 结构 发 育 所 必需 的 。Dorsal 蛋白 又 阻 遏 背部 发 、
育 所 必需 的 基因 dpp 和 zen, 其 结果 是 这 些 基 因 仅 在 背部 表达 , 发育 出 背部 结构 。
四) 末端 体系
末端 体系 启动 的 方式 与 背 - 腹 体系 相似 。 受 精 后 ,通过 翻译 母体 的 tor*o mRNA 产生 一 种
跨 膜 受 体 .。 此 受 体 定位 于 整个 胚胎 中 ,但 在 极 部 它 被 局 部 产生 的 一 种 细胞 外 配 体 所 活化 。Tor-
so 蛋白 具有 激酶 活性 , 它 启 动 一 个 级 联 使 tezlless 和 Pxuc&epezz mRNA 局 部 表达 , 这 两 种
mRNA 编码 调控 转录 的 因子 。
(五 ) 小 结
现 将 每 种 体系 的 调节 物 在 发 育 的 每 个 阶段 的 分 布 情况 总 结 于 图 13-57。 最 初 的 不 对 称 是

前 部 体系 潮 后 部 体系 背 - 赂 体系

| junchpackE RNA 广 泛 存在 ; Toll 蛋白 广泛 存在 ;

1210S RNA 在 后 部 Spatzle 和 蛋白 (因而 Toll 蛋白 )
在 腹部 被 活化

picoid RNA 在 前 部

Toll 蛋白
Spatzle 配 体

在 背 侧 Dorsal 蛋白 在 胞 质 中

Core

PR
sce 辣

- @
要
忆 策
seoo [=
Ooeoeoeeoeeeee

在 腹 侧 Dorsal 蛋白 在 核 中

Cpp 和 ze RNA 在 背部

和 部 区 域 充 满 了 jncPpackRNA
于 代 良 | AGREERSRRSERRAS | FREEPROERRRT
NS 人- 臣 全 加
转录 出 合子 | 号 | 沁 六 oo
的 RNAs 人 CE 二 本 同 耳 同 e 介 个 同 辣 本 人 /7

tizuzst 和 2QzL RNA 在 腹部

图 13-57 ”在 每 个 轴 的 决定 体系 中 , 卵 中 的 局 部 产物 使 得 在 合 胞 体 宫 胚层 阶段 其 它 母 体 RNAs 或
蛋白 质 较 大 范围 的 定位 ,在 细胞 型 吉 豚 层 期 合子 的 RNA 在 不 同 带 中 生成
451

用 两 种 机 制 建立 的 。 对 于 前 -后 轴 来 说 是 将 一 种 mRNA 前 部 体系 是 wicoid ,后 部 体系 是 zaxros) 芋
定位 在 卵 的 一 端 ,定位 依赖 于 mRNA 的 3 端 序列 与 母体 蛋白 质 的 相互 作用 。 在 背 - 腹 体系 和 末 需
端 体系 中 , 则 是 一 个 受 体 蛋 白 在 特异 的 局 部 被 活化 ,这 是 因为 仅 在 此 局 部 有 其 配 体 的 结果 。 所 “ 明
有 这 些 相互 作 用 都 依赖 于 母体 基因 表达 产生 的 RNAs 和 /或 蛋白 质 。
上 述 物 质 的 定位 于 局 部 引起 一 个 形态 发 生 素 梯度 的 产生 . 有 的 是 量 的 梯度 Bicoid 和 蛋白)
有 的 是 由 于 在 核 和 胞 浆 中 的 不 同 分 配 (Dorsal 蛋白 ), 有 的 则 是 定位 于 一 个 较 宽 的 局 部 区 域内
(Nanos 蛋白 )。 每 个 体系 的 形态 发 生 素 活 动 范围 约 为 卵 的 50% 。 形 态 发 生 素 是 母体 mRNAs
翻译 产生 的 ,所 以 直到 此 阶段 发 育 是 依赖 母体 基因 的 。
建立 前 -后 和 背 - 腹 梯 度 是 确定 胚胎 的 方位 和 空间 结构 的 第 一 步 。 在 母体 基因 的 指导 下 ， 路 1
越 共同 的 胞 质 形成 梯度 , 它 影响 定位 于 其 中 的 核 的 行为 。 下 一 步 是 分 隔 的 区 域 的 发 育 , 不 同 分 是
隔 区 将 生出 身体 的 不 同 部 位 , 这 需要 合子 的 基因 组 的 表达 ,此 时 变 为 活动 的 基因 座 (loci) 称 为
合子 基因 (zygotic genes) 。 参 与 这 一 阶段 的 基因 是 用 分 节 (segmentation) 突 变 鉴 定 出 来 的 。

三 、 吉 胚层 阶段 形成 的 分 区 决定 着 细胞 的 结局

由于 如 上 所 述 ,在 母体 基因 的 作用 下 , 沿 前 -后 轴 建 立 起 来 了 梯度 ,从 而 使 不 同 基因 在 不 同时
的 区 域 表达 ,其 结果 使 胚胎 形成 许多 节 , 每 个 节 分 化 为 成 虫 的 特定 形态 .这些 节 是 怎样 形成 的 ? 避
为 了 说 明 这 个 问题 ,我 们 首先 考察 一 下 由 胚胎 到 成 虫 各 相应 部 位 之 间 的 关系 ;如 图 13-58 所 串
示 。 从 图 中 可 以 看 出 ,成 虫 是 由 一 系列 的 可 以 清楚 区 分 的 体 节 (segment) 所 组 成 ,而 幼虫 则 有 吕
一 系列 用 沟 (groove) 分 开 的 相应 的 节 。 我 们 将 主要 讨论 3 个 胸部 (T) 和 8 个 腹部 CA) 的 节 , 因
为 对 它们 的 发 理 知道 得 最 多 。 节 的 格局 是 在 训 胚 层 期 决定 的 。 在 圳 胚层 期 胚胎 的 主要 物质 被
分 开 为 一 系列 交替 的 前 部 (A) 和 后 部 (P) 分 隔 区 .。 一 个 体 节 是 由 一 个 A 分 隔 区 和 其 后 的 一 个 了
分 隔 区 所 组 成 ,例如 , 节 A3 是 由 分 隔 区 A3A 和 和 A3P 组 成 的 。 而 在 节 出 现 之 前 , 即 在 原 肠 肘
(gastrula) 期 可 看 到 副 节 (parasegment) ,在 5 一 6h 的 胚胎 表面 有 浅 沟 将 相 邻 的 副 节 分 开 。 如
图 中 所 示 , 每 个 副 节 都 是 由 一 个 P 分 隔 区 和 其 后 的 一 个 A 分 隔 区 所 组 成 ,例如 , 副 节 4 是 由 分
隔 区 T1P 和 T2A 所 组 成 。 当 发 育 至 9 h 左右 形成 节 时 , 沟 加 深 并 移动 ,因此 每 个 节 的 按 边 代表
着 一 个 副 节 的 中 心 , 即 节 的 前 半 部 来 自 一 个 副 节 , 后 半 部 则 来 自 下 一 个 副 节 。
由 上 述 可 见 , 在 果 蝇 的 发 育 过 程 中 是 在 胚胎 发 生 期 形成 分 隔 区 ,然后 再 由 这 些 分 隔 区 形成 ，
副 节 和 节 ， 那 么 这 些 分 隔 区 是 怎样 建立 的 ? 突变 的 实验 表明 ,大 约 有 30 个 基因 参与 节 的 生成 。
根据 这 些 基因 罕 变 产 生 的 后 果 可 把 它们 分 为 3 类 , 即 间隔 基因 (gap gene); 配 对 -界定 基因
(pair=rule gene) 和 节 极 性 基因 (segment polarity gene) ,如 表 13-5 中 所 列 。 这些 基因 统称 为 分
节 基 因 (segmentation genes)。 在 发 育 过 程 中 ,这 3 组 基因 逐次 地 表达 ,如 图 13-58 所 示 汪 们
规定 着 卵 的 越 来 越 狭窄 的 区 域 。 从 图 13-59 中 可 以 看 出 ,首先 是 母体 的 基因 备 前 部 未 端 和 后 部 二
未 端 建立 起 梯度 。 这 种 梯度 活化 或 阻 过 间隔 基因 。 间 隔 基因 是 受精 后 最 早 (第 十 一 次 核 分 列
后 ) 转 录 的 基因 ,它们 将 胚胎 分 为 4 个 宽 的 区 域 .间隔 基因 调节 配对 -界定 基因 ， 配 对 -界定 基因
转录 得 稍 晚 一 些 , 它 们 被 限定 在 一 对 节 的 区 域内 。 配 对 -界定 基因 再 调节 节 极 性 基因 , 节 极 性 基
因 在 第 13 次 核 分 裂 期 间 表达 ,它们 的 区 域 大 小 是 每 个 节 。
许多 母体 基因 、 间 隔 基 因 和 配对 -界定 基因 是 转录 的 调节 因子 ,它们 的 产物 活化 或 阻 遏 转
录 . 在 有 些 情况 下 ,一 种 蛋白 质 可 活化 一 些 基 因 , 阻 过 另 一 些 基 因 , 这 取决 于 它 的 含量 高 低 或 与
其 它 物质 的 关系 。 任 一 组 的 基因 既 彼 此 调节 ,又 调节 下 一 组 的 基因 。 只 有 节 极 性 基因 的 作用 方
452

|

式 不 同 , 例 如 ,一 种 蛋白 质 可 由 一 个 细胞 中 分 弯 出 来 去 影响 它 邻 近 的 细胞 .由 此 可 见 ,在 每 一 阶
有 段 都 是 用 少数 母体 的 .间隔 的 和 配对 -界定 的 蛋白 质 联 合 起 来 发 挥 作 用 的 方式 ,以 规定 在 胚胎
”的 特定 区 域 基因 表达 的 样式 。

4
-天 和 人 细胞 型 胚 层
:4 35 1041112;13114
到 号 三 每 个 区 段 的 结局 已 被 确定 ，
但 体 节 还 看 不 到
和
局
有
10h 时 的 胚胎
已 发 育 出 胸 节 和 腹 节
]
成 虫

有 3 个 胸 节 和 8 个 腹 节

图 13-58 。 果 蝇 的 发 育 由 形成 分 隔 区 开始 ,再 由 分 隔 区 形成 副 节 和 节
表 13-5 “分 节 基 因 的 分 类 及 其 表达 时 间
最 早 表 达 的 时 间

最 早 表达 的 时 间

间隔 基因 节 极 性 基因
JazzCADacA e1287QzLeC
和 大 7z 轧 户 EL roz72gless
R7at7- 态 8 > 二 有 | SEO05Eebe17y
ELIG7EE “ 核 分 烈 CtpitzLS 172te77at2t3
tatLLess patched
配对 -界定 基 Ahedgehog 13
| 7272 CishievelLeC 核 分 裂
Aaz7y COstQL2
< 11~12 Jeesed
| eUE] SRTI 力 六 ec 核 分 裂
zaireC

oda pairec
slLoppy pai7ed
odd SRipPped

453

这 种 调控 的 机 制 非常 复杂 ,其 中 的 很 多
细节 目前 还 不 清楚 。 为 了 说 明 这 种 调控 的 基
本 原理 , 现 用 图 13-59 中 间隔 基因 规定 的 4
个 区 的 产生 方式 加 以 说 明 。 已 知 最 前 端的 带
是 由 Hunchback 蛋白 组 成 的 , 它 由 PazezcA-
ac& mRNA 翻译 生成 ,而 此 mRNA 的 合成
是 由 zizceozd 活化 的 。 第 二 条 带 由 Kruppel 蛋
白 组 成 ,txzzppel 基因 的 转录 由 Hunchback
重 白 活化 。 后 两 条 带 分 别 由 Knirps 和 Giant
蛋白 所 组 成 ,它们 的 基因 的 转录 受到 Hunch-
back 蛋白 的 阻 遏 ,但 在 这 些 区 内 zazos 阻止
了 Hunchback 的 表达 , 因而 在 胚胎 的 后 部
Axzzzps 和 gzazt 表达 了 。 图 13-60 表示 出 由 间
隔 基因 的 产物 间隔 蛋白 (gap protein ) 相 互 作
用 而 形成 4 个 宽带 的 情况 (由 图 中 可 见 实际
情况 比 我 们 说 的 还 要 复杂 些 ) ,这 是 用 突变 实
验 得 出 的 结果 。 在 其 中 pzxzchpac&t 起 着 特殊
重要 的 作用 , 它 在 胚胎 前 部 一 个 宽 的 区 域 中
表达 ,到 中 部 降低 了 .。 高 水 平 的 pzerchnpac& 阻
遏 Arzppe! ,以 此 规定 tzrxzppel 表达 的 前 方 界
限 。 在 副 节 3 处 随 着 Pazezcjppac& 的 降低 zrz 户
ze! 的 表达 升 高 。 然 而 trxpzpel 的 表达 又 需要

母体 基因 由 前 端 和
后 端 建立 起 梯度

间隔 基因 在 卵 中
分 隔 在 4 条 宽带 中

配 届 -认定 基因
建立 7 个 条 纹

节 极 性 基因 建立
14 个 条 纹

图 13-59 母体 的 和 分 节 的 基因 逐次 作用

在 胚胎 的 越 来 越 小 的 区 域

一 定 水 平 的 pzizcjhpac&, 所 以 在 副 节 5 附近 , 当 zzchapack 的 水 平 进一步 降低 时 ， przppel 关闭 上
了 。jazcjhpac& 以 相同 的 方式 调控 着 giant 的 表达 。Anzrps 则 在 没有 jarcjpec 处 表达 。 已 证 明 上
间隔 重 自 同 相互 作用 以 调控 基因 表达 的 实际 情况 比 上 述 要 复杂 得 多 。 实 际 上 沿 着 久 的 前 部 到 中
后 部 的 每 个 特定 位 置 ,都 被 各 种 间隔 蛋白 的 水 平 确定 了 。

副 节 MT 27 37-4775006 人 0 全 人 二 和 汪 IO TI213714

蛋白 质 水 平

Hunchback Giant “”Kruppel Knirps Giliont Hb Toailless
多 13-60 间隔 基因 的 表达 将 胚胎 划分 成 不 同 的 区 域

曲线 示 出 各 种 蛋白 质 的 水 平 。

所 有 间隔 蛋白 都 是 转录 的 调节 物 , 它 中
们 除了 彼此 相互 调节 外 , 还 调控 着 在 下 二
阶段 起 作用 的 配对 -界定 基因 的 表达 则 由 于
在 相当 于 不 同体 节 处 各 种 间隔 蛋 自 的 流 度
有 不 同 的 搭配 ,而 对 于 某 一 配对 -界定 基因
来 说 , 这 些 间隔 蛋白 有 的 是 激活 牧 , 有 的 是
阻 遏 物 , 从 而 使 配对 -界定 基因 仅 在 某 些 副
节 中 表达 。 例如 ,使 户 > 基因 仅 在 偶数 副 节
中 表达 ,而 eve 基因 仅 在 奇数 副 节 中 表达 。

以 eve 基因 在 副 节 3 中 的 表达 为 例 可 具体 说 明 这 种 调控 的 原理 。 在 副 节 3 中 用 分 布 范围 较 广
的 Hunchback 蛋白 和 Bicoid 蛋白 活化 eve 基因 使 之 表达 ,但 其 表达 边界 用 两 个 阻 巡 物 限定 ，
其 前 边 边 界 用 Giant 蛋白 限定 , 后 边 边 界 用 Kruppel 蛋白 限定 ,如 图 13-61 所 示 . 已 知 造成 这
种 结果 的 原因 是 由 于 在 eve 的 启动 子 中 有 很 多 应 答 元 件 , 其 中 有 些 结合 上 Hunchback 或

454

Bicoid 蛋白 而 被 激活 , 有些 则 结合 上 Giant
或 Kruppel 蛋白 而 被 阻 巡 。
配对 -界定 基因 调节 节 极 性 基因 的 表达 ，
”但 其 调节 机 制 目 前 还 不 了 解 . 已 知 节 极 性 基因
在 每 个 体 节 中 表达 , 而 且 表达 的 区 域 是 非常 严
x” 格 的 这样 就 使 每 个 节 中 的 细胞 分 化 成 为 不 同
的 纲 胞 ,并 发 理 成 不 同 的 结局 。 而 且 节 极 性 基 ， 图 13 61 凋 拉 se 在 囊 3 中 雪 达 的 原 基 示 间 国
， 因 还 将 每 个 节 分 隔 成 为 前 部 (A)7 分 隔 区 和 后 图 中 曲线 示 出 在 eve 条 纹 附近 几 种 蛋白 质 的 水 平 。
部 (P) 分 隔 区 ,已 知 这 是 由 于 ezgrazled 基因
表达 的 结果 。enzgrazled 基因 仅 在 P 分 隔 区 中 表达 ,不 在 A 分 隔 区 中 表达 ,从 而 把 每 个 节 分 成 为
A 分 隔 区 和 了 分 隔 区 。 当 此 基因 发 生 突变 时 , 节 的 A 分 隔 区 和 了 分 隔 区 就 区 分 不 开 了 。
在 这 里 有 两 点 需要 加 以 说 明 : 中 在 前 面 的 叙述 中 强调 了 母体 基因 调控 间隔 基因 的 表达 , 间
隔 基因 调控 配对 -界定 基因 ,配对 -界定 基因 再 调控 节 极 性 基因 的 基因 级 联 调控 方式 ,在 总 体 上
说 这 无 疑 是 对 的 ,但 实际 上 并 不 很 严格 ,它们 有 着 复杂 的 相互 作用 。 例 如 ,wiicozd 是 母体 基因 ，
但 其 产物 直接 调控 着 配对 -界定 基因 eve 的 表达 ;外 许 多 分 节 基 因 的 产物 是 转录 因子 ,但 并 非
所 有 的 都 是 .已 知 节 极 性 基因 的 产物 中 有 分 记 蛋 白质 、 跨 膜 蛋白 质 ` 激 酶 和 细胞 骨架 蛋白 等 , 它
们 如 何 发 挥 作 用 的 机 制 目前 还 不 清楚 ,但 可 以 肯定 它们 是 以 不 同方 式 发 挥 作用 的 。

\ 同 源 异 型 基因 调控 胚胎 的 基本 形态 结构

如 上 所 述 ,分 节 基 因 调 控 着 每 个 体 节 内 的 样式 ,包括 其 极 性 。 这 样 每 个 体 节 中 的 细胞 是 不

同 的 ,它们 将 发 育 出 不 同 的 形态 结构 。 然 而 某 些 突变 可 把 身体 一 个 部 位 转化 (transform ) 为 另
一 种 部 位 ,这 种 突变 叫做 同 源 异 型 突变 (homeotic mutations) 。 例 如 ,触角 - 足 (Antenna-pedia，
4z 友 ) 突变 使 一 个 触角 变 成 了 一 条 腿 。 这 说 明正 常 的 4zttp- 基因 确定 在 正确 的 位 置 形成 腿 。 我
们 把 用 这 种 突变 方法 鉴定 出 来 的 基因 称 为 同 源 异 型 基因 (homeotic genes) 。 一 般 说 来 , 同 源 异
型 基因 负担 着 决定 每 个 节 的 独特 分 化 程序 ,它们 调控 着 胚胎 的 形态 构筑 方案 。 同 源 异 型 基因 是
在 胚胎 发 生 期 活动 的 ,它们 的 表达 依赖 于 此 前 分 节 基 因 的 表达 ,因此 可 把 同 源 异 型 基因 的 作用
看 成 是 对 分 节 基 因 建 立 起 来 的 信号 格局 的 整合 。 尽 管 同 源 异 型 基因 的 突变 可 引起 诸如 在 触角
位 置 发育 出 腿 , 或 者 在 眼睛 处 发 育 出 翅 , 然 而 它们 并 不 改变 分 节 基 因 等 基因 已 经 建立 起 来 的 信
瑟 格 局 . 同 源 异 型 基因 是 通过 开动 特定 位 置 的 一 套 基 因 来 修饰 该 位 置 细 胞 的 结局 ,而 细胞 的 结
向 是 已 经 由 节 极 性 基因 等 确定 了 的 。

在 果 蝇 中 同 源 异 型 基因 成 能 地 存在 于 两 个 主要 复合 座 (complex loci) 中。 触角 足 复 合 座
(antennapedia complex,ANT-C) 调 节 头 和 前 部 的 胸 节 ; 双 胸 复合 座 (bithorax complex，BX-
C) 调 节 后 部 的 胸 节 和 腹 节 。

13-62 示 出 了 ANT-C 的 结构 。ANT-C 中 含有 数 个 同 源 异 型 基因 ,其 中 包括 Jetbia:
(1ap) ,zroposciz5eaia (za) ,Dejormed(CDJQ) ,Sez comzps redzxced(CScr) 和 4zatezzzapedia (4ztzp) 。

这 些 同 源 异 型 基因 成 往 地 位 于 一 个 约 350 kb 的 区 域 中 ,但 其 中 散布 有 几 个 其 它 的 基因 。
果 蝇 最 前 面 的 几 个 部 位 ( 副 节 1 一 4) 的 特性 是 由 ANT-C 决定 的 ,图 中 指明 了 ANT-C 的 同 源 异
型 基因 分 别 在 豚 胎 中 表达 的 部 位 。 这 些 基 因 在 ANT-C 中 由 左 向 右 的 次 序 也 就 是 它们 在 胚胎 中
由 前 向 后 表达 的 位 次 。 例 如 ,Lawea: 在 最 前 面 , 它 影 响 头 部 ,最 后 面 的 是 4x 友 , 它 影响 节 工 2 一 3。

455

功能 缺失 时 的 表 型
ab 影响 头 部
pb “下 展 的 结构 变 为 触角 的
Dfo 缺失 上 显 的 节

5cr TI1. 转 化 为 T2
Antp T2 一 IT3 转化 为 T1

ANT-C 含有 几 个 同 源 异 型 基因 (1 灶 代 表 外 显 子 ) 和 一 些 其 它 的 基因

50 100 150 200 250 8 300 350

15- 6G 光 8

2 3 4
aobg sb 于 :5 恒 站 u 得 国 国

转录 由 两 个 启动 子 所 有 转录 物 的 “转录 终止
处 开始 编码 区 都 一 样

13-62 ANT-C 复合 座 的 同 源 异 型 基因 赋予 果 蝇 前 部 各 节 的 特性
在 同 源 异型 基因 中 间 还 散布 有 其 它 基 因 。4zzt 基因 很 大 , 它 有 不 同 的 表达 方式 。

图 13-62 中 还 示 出 了 4z 态 基因 的 结构 。 此 基因 约 103 kb 长 ,有 8 个 外 显 子 和 很 大 的 内 含 ，
子 。 实 际 编码 蛋白 质 的 部 分 仅 为 基因 DNA 的 1 为 。 它 有 两 个 启动 子 , 一 个 位 于 外 显 子 1 的 上
游 , 另 一 个 位 于 外 显 子 3 的 上 游 ,二 者 相距 约 70 kb。

转录 的 终止 位 点 也 有 了 两 个 。 然 而 无 论 转 录 从 何 处 开始 和 何 处 终止 ,编码 的 蛋白 质 是 相同
的 。

BX-C 复合 座 是 用 几 种 同 源 异 型 突变 鉴定 出 来 的 ,这些 突变 影响 了 胸部 发 育 ,引起 了 腹部
的 形态 发 育 。 当 整个 复合 座 缺失 时 ,昆虫 在 胚胎 发 育 的 后 期 死亡 。 然 而 复合 座 内 发 生 突变 时 可
以 存活 ,但 一 些 节 的 表 型 发 生 改 变 。 图 13-63 是 个 极 罕 见 的 例子 。 图 中 果 蝇 由 于 3 突变 (triple
mutation) ,使 3A[ 它 带 有 平衡 棒 (Chaltere), 截 短 了 的 翅 ] 转 变 为 T2 的 组 织 型 ( 它 带 有 起 ), 从

456

而 使 果 蝇 有 4 个 翅 ,而 不 是 通常 的 两 个 翅 。

BX-C 的 基因 调控 的 范围 由 T2 到 A8, 可 见 ,BX-C 复合 座 与 果 蝇 身体 的 大 部 分 发 育 有 关 。
与 ANT-C 一 样 ,BX-C 的 突变 与 其 影响 的 节 的 关系 也 是 基因 图 谱 的 次 序 与 节 的 次 序 相 同 , 即
洛 基 因 图 谱 由 左 向 右 依 次 突变 , 则 由 前 向 后 依次 影响 身体 各 体 节 。

同 源 异型 基因 是 怎样 影响 每 个 体 节 的 形态
的 ?如 前 所 述 , 大 多 数 同 源 异 型 基因 是 在 有 限 的
空间 表达 的 ,每 个 基因 的 表达 空间 相当 于 一 个 副
节 。 许 多 同 源 异 型 基因 编码 的 是 转录 因子 ,它们
的 表达 产物 各 自 调 控 着 其 靶 基 因 的 表达 , 而 这 些
划 基 因 的 表达 则 表现 出 每 个 节 的 表 型 。 然 而 遗 憾
的 是 对 于 这 种 间 基 因 目 前 我 们 还 一 无 所 知 。

同 源 异 型 基因 本 身 的 表达 是 受到 严格 调控
的 ,已 知 这 种 调控 是 很 复杂 的 。 它 们 的 表达 既 受
到 在 它们 发 挥 作用 之 前 的 分 节 基 因 表 达 情 况 的 图 13-63 在 BX-C 复合 座 的 abzr,pz 和
调控 ,又 受到 彼此 之 间 的 调控 。 已 知 这 些 基因 具 zpz3 处 突变 ,产生 一 支 四 翅 果 蝇
有 很 多 调控 元 件 ,这 些 元 件 分 布 在 一 个 很 长 的
区 域内 ,使 得 它们 具有 了 很 复杂 的 调控 方式 。 因 此 ,一 个 同 源 异 型 基因 的 突变 引起 的 最 后 表现
不 仅 取决 于 该 基因 功能 的 丢失 ,而 且 还 取决 于 这 种 丢失 所 引起 的 其 它 同 源 异 型 基因 如 何 改变
的 后 果 。 因 此 ,增加 了 对 同 源 异型 基因 突变 的 后 果 进 行 分 析 的 复杂 性 ,而 这 种 分 析 一 直 是 研究
有 关 问 题 的 重要 手段 。

现在 我 们 可 以 概括 一 下 果 蝇 发 育 的 过 程 . 早 期 豚 胎 是 个 合 胞 体 , 在 其 中 许多 核 处 于 同一 胞
质 中 . 此 时 由 母体 基因 的 产物 建立 起 前 -后 轴 和 背 - 腹 轴 梯度 ,从 而 能 够 按照 每 个 核 所 处 位 置 的
不 同 控制 每 个 核 的 功能 。 到 了 细胞 型 囊 胚 层 阶 段 ,合子 的 RNAs 开始 合成 ,此 时 胚胎 的 发 育 变
为 依赖 它 自己 的 基因 。 细 胞 是 在 襄 胚 层 阶 段 形成 的 ,形成 后 发 生 一 个 转录 调节 物 的 级 联 , 由 分
节 基 因 产 物 的 相互 作用 决定 每 个 体 节 中 基因 的 独特 表达 。 同 源 异 型 基因 在 每 个 体 节 中 的 独特
表达 决定 了 每 个 体 节 的 最 后 表 型 。

五 ` 同 源 异 型 框 是 同 源 异 型 基因 中 的 一 个 共同 的 编码 基 序
\

其 它 生 物 是 怎样 发 育 的 ?例如 ,在 发 育 的 早期 是 怎样 由 一 个 单一 的 细胞 经 过 次 数 不 多 的 分
裂 后 ,就 使 产生 的 子 细胞 分 化 为 性 质 不 同 的 细胞 的 ?其 它 生物 产生 这 种 分 化 的 方式 可 能 与 果 蝇
的 不 同 。 例 如 ,哺乳 动物 的 卵 可 能 是 均一 的 ,而 不 是 像 前 面 所 说 果 蝇 的 卵 在 开始 时 其 胞 质 成 分
的 分 布 就 是 不 对 称 的 。 然 而 同 源 异 型 框 (homeobox) 的 发 现 及 其 研究 得 知 ,控制 发 育 的 分 子 机
制 在 进化 中 有 着 高 度 的 保守 性 ，

同 源 异 型 框 是 David Hogness 和 Walter Gehring 在 果 蝇 的 ANT-C 和 BX-C 中 首先 发 现
的 他们 用 杂交 试验 揭示 出 在 这 些 簇 中 的 许多 基因 中 含有 一 个 共同 的 序列 ,并 证 明 此 一 再 出 现
的 是 个 180 bp 的 序列 , 称 之 为 同 源 异 型 框 。 它 编码 一 个 60 氨基 酸 残 基 的 多 肽 , 称 为 同 源 异 型
域 Ghomeodomain) , 见 图 13-64。 同 源 异 型 域 的 碱 性 氨基 酸 残 基 含量 很 高 ,提示 它 是 与 DNA 结
合 的 。 事 实 是 含有 同 源 异 型 域 的 蛋白 质 定 位 于 细胞 核 中 ,并 结合 在 特异 的 DNA 序列 上 。
诚然 ,在 由 酵母 到 人 类 的 所 有 真 核 生物 中 , 同 源 异 型 域 都 是 基因 表达 的 调节 物 。 用 核磁 共
457

振 和 X 射线 结晶 学 研究 果 蝇 和 酵母 的 同 源 异 型 域 表 明 ,它们 有 一 个 伸展 的 氨基 -末端 臂 和 3 个
“x 螺旋 (图 13-64 中 示 出 了 其 部 位 ) 。 螺 旋 1 和 2 是 彼此 反 和 平行 的 ,它们 与 螺旋 3 近 于 垂直 。 其
氨基 -末端 臂 适合 进入 DNA 的 小 沟 ,而 螺旋 3 则 适合 进入 大 沟 。 同 源 异 型 域 以 单 体 结合 在
DNA 的 特异 位 点 上 ,其 螺旋 2 和 螺旋 3 安排 为 螺旋 -转角 -螺旋 样式 与 DNA 结合 。

口 口中 和

图 13-64 同 源 异型 域 是 由 调控 发 育 的 基因 编码 的 一 再 出 现 的 基 序
哺乳 动物 、 两 栖 类 .昆虫 和 酵母 中 的 序列 是 相似 的 。 图 中 比较 的 同 源 序 列 为 :CA)7) 小 鼠
MO-10 基因 ;(B) 峙 MM3 基因 ;(C) 果 蝇 4zztz 基因 和 (D) 酵 母 M4Tea2Z 基因 。

在 进化 中 同 源 异型 域 的 保守 性 是 突出 的 。 并 椎 动物 的 同 源 异 型 框 基因 (homeo box gene)
叫做 互 oz 基因 ,它们 与 其 在 果 蝇 中 的 同系 物 (homologs) 是 相似 的 。 在 小 鼠 和 人 中 同 源 异 型 杠
基因 被 安排 在 4 个 簇 中 , 即 囊 ozl, 豆 oz2, 有 oz3 和 五 oz4, 它 们 存在 于 不 同 染 色 体 中 。 由 小 鼠
瓦 oz1. 1 基因 编码 的 同 源 异 型 域 与 果 蝇 4ztz 编码 的 仅 差 1 个 氨基 酸 残 基 。 而 且 哺 乳 动物 的 五 oz
基因 在 果 蝇 中 也 起 作用 。 更 值得 注意 的 是 ,在 果 蝇 和 哺乳 动物 二 者 中 同 源 异型 框 基 因 的 顺序 都 是
精确 的 相当 于 它们 沿 胚胎 的 前 -后 轴 发 生 作用 的 次 序 ( 图 13-65)。 规 定 头 部 发 育 的 同 源 异 型 框 基

小 鼠

/ab ”pb Dfa 5Scr Antp Ubx Aba-A Abd-B Raz29 22522726 07 靖 守信 2.3 2.4 2.5
国 寺 一 友和 一 企 和 和 9 一 攻 -一 生 -一 名 盖 本 是 桓 | 本 是 本 至 到 理 区 E 一 二 -一

图 13-65 在 进化 中 , 同 源 异 型 框 基因 的 安排 和 它们 编码 的 蛋白 质 的 序列 是 高 度 保守 的 -
左 图 是 果 蝇 的 ANT-C 和 BX-C 中 基因 的 次 序 以 及 每 个 基因 在 果 蝇 胚胎 中 表达 的
位 置 ; 右 图 是 小 鼠 鼠 oz2 基因 相应 的 基因 以 及 它们 表达 的 位 置
用 不 同 点 线 表 示 出 果 蝇 和 小 鼠 间 相应 的 基因 以 及 它们 表达 的 情况 。
引 自 王 . B. Lewis. J. Amer. Med. Assoc. 1992. 267 :1 524.

因 在 入 的 一 端 , 而 指导 后 部 结构 (在 果 蝇 为 腹部 ,在 哺乳 动物 为 腰椎 ) 形 成 的 在 另 一 端 ， 很 明
显 , 划 定 体 节 的 特异 化 这 个 发 育 的 基本 机 制 在 进化 中 已 经 保留 了 6 亿 多 年 . 现在 我 们 已 在 开始 破
译 包含 在 DNA 序列 中 的 一 维 信息 是 怎样 转变 为 多 细胞 生物 的 复杂 而 美丽 的 三 维 形式 的 。

参考 文 献

.Lehninger,A.L. ,Nelson,D.L. and Cox,M. M. 1993.
、 Principles of Biochemistry (2nd ed. ). Worth Publishers, (Chapters 25 and 27. ).

本

.Stryer ,L. Biochemistry (〈4th ed. ). W.H. Freeman and Company, (Chapters 37. )1995.
.Lewin ,B. Genes V. Oxford University Press, (Chapters 13,29,30,31,32 and 38. )1994.，

〈 齐 顺 章 )

158

第 十 四 章 “分 子 生 物 学 技术

人

分 子 生物 学 的 发 展 是 基于 我 们 对 生物 大 分 子 的 了 解 , 尤 其 是 DNA 和 RNA。 通 过 对 前 面
章节 的 学 习 , 我 们 知道 ,DNA 和 RNA 是 生命 体 中 遗传 信息 的 载体 ,生物 学 中 的 许多 秘密 就 隐
藏 于 DNA 的 核 苷 酸 序列 中 。 但 是 要 得 到 一 段 较 长 的 DNA 序列 ,在 70 年 代 初 期 以 前 似乎 还 只
是 一 个 幻想 ,更 不 用 说 现在 随处 可 见 的 任意 改变 DNA 的 序列 这 样 一 类 实验 。 然 而 ,随后 的 技
术 上 的 进步 迅速 改变 了 这 一 状况 .首先 ,能 够 用 酶 在 特定 位 点 切割 DNA ,并 将 其 断裂 成 可 重复
的 不 同 大 小 的 片段 ,这 些 现 在 称 之 为 限制 性 内 切 酶 的 应 用 ,使 两 种 非常 重要 的 技术 , 即 DNA
”克隆 和 DNA 序列 分 析 得 到 了 极 大 发 展 。

两 个 DNA 分 子 可 以 在 酶 的 催化 下 连接 起 来 。 因 此 ,任何 DNA 的 限制 性 片段 都 能 插入 到
一 个 载体 DNA 分 子 中 (通常 是 质粒 DNA 分 子 ) ,这 样 ,就 形成 了 重组 DNA 分 子 , 将 重组 DNA
分 子 引入 到 合适 的 细胞 群体 中 之 后 (常见 为 细菌 ), 带 有 特定 重组 DNA 分 子 的 细胞 可 被 挑选
出 来 。 这 一 过 程 称 之 为 目的 DNA 片段 的 克隆 。 由 此 ,我 们 可 以 制备 出 无 限量 的 特定 DNA 分
子 。 随 着 技术 的 发 展 ,现在 能 够 利用 化 学 方法 在 机 器 上 自动 合成 长 度 达 100 碱 基 的 DNA 守 聚
核 苷 酸 . 因此 ,人 们 不 仅 能 够 制造 出 含有 天 然 DNA 的 重组 DNA 分 子 , 而 且 也 能 够 将 经 过 突变
的 或 人 工 合成 的 DNA 分 子 插入 到 载体 分 子 中 。
DNA 序列 的 快速 分 析 法 是 70 年 代 末 发 展 起 来 的 .利用 限制 性 内 切 酶 ,人 们 可 以 完全 重复
地 把 从 某 一 生物 体 中 得 到 的 DNA 切割 成 大 小 不 同 的 片段 。 这些 片段 在 原来 的 DNA 分 子 中 的
排列 顺序 可 以 通过 实验 得 以 确定 .这 时 ,确定 一 个 长 度 为 500bp 的 DNA 片段 的 顺序 也 已 成 为
现实。 因此 ,要 分 析 一 个 长 达 10 kb 的 DNA 分 子 的 序列 也 已 没有 任何 困难 。 也 就 是 说 ,任何
和 DNA 分 子 都 可 进行 分 离 和 序列 分 析 。 这 为 人 们 了 解 复杂 的 真 核 生物 基因 组 结构 开辟 了 道路 。
靠 计 算 机 的 帮助 ,我 们 现在 可 以 自动 分 析 DNA 的 序列 ,并 将 序列 资料 进行 贮存 .比较 和 分
。 可 以 预见 ,人 们 还 将 在 不 远 的 将 来 了 解 整个 人 类 基因 组 的 顺序 。
现在 的 分 子 生物 学 技术 ,还 能 够 把 任何 DNA ,无 论 是 天 然 的 还 是 经 过 改造 的 , 黄 至 是 完全
人 工 合成 的 , 送 回 到 细胞 中 ,以 鉴定 其 生物 学 活性 。 如 果 一 段 编码 蛋白 质 的 基因 被 送 回 到 细菌
或 其 它 细胞 中 时 , 它 将 指导 所 编码 的 天 然 的 或 突变 的 蛋白 质 的 合成 。
| 分 子 生 物 学 的 发 展 ,已 经 产生 了 一 整套 分 子 生物 学 技术 。 几 乎 在 一 夜 之 间 , 这 一 技术 已 经
成 了 研究 许多 基本 生物 学 问题 的 重要 手段 .通过 对 DNA 或 RNA 的 提取 ,基因 的 分 离 , 核 苷 酸
序列 的 测定 ,人 们 将 了 解 到 基因 及 其 所 编码 的 蛋白 质 的 结构 ,进而 对 其 功能 也 有 所 认识 。 通 过
对 基因 的 表达 的 研究 ,我 们 能 了 解 基因 的 表达 调节 过 程 , 进 一 步 认 识 生命 活动 的 规律 。 通 过 对
“基因 进行 突变 和 改造 ,我 们 将 深入 了 解 基因 及 其 产物 的 结构 和 功能 的 关系 ,基因 在 生长 发 育 过
程 中 的 作用 等 。 总 之 分 子 生 物 学 技术 在 生命 科学 各 个 方面 的 渗透 ,使 我 们 掌握 有 效 的 手段 ,为
459

进一步 认识 生命 活动 的 本 质 ,更 好 地 利用 其 规律 为 人 类 服务 提供 了 帮助 .本章 将 简要 介绍 分 子
生物 学 技术 的 基本 原理 。

第 二 节 ”放射 性 同位 素 技术

放射 性 同位 素 作为 一 种 示 踪 物 已 经 被 广泛 用 于 分 子 生物 学 技术 中 。 放 射 性 标记 示 踪 实验
简化 了 许多 生物 化 学 的 测定 方法 ,具有 用 量 少 ,灵敏 度 高 的 优点 ,而 且 还 具备 一 定 的 特异 性 。 常
用 的 放射 性 同位 素 为 3H,MC ,sP,sP,sS ,125I 等 ,其 中 以 2?P 和 8S 应 用 最 多 。

在 被 标记 的 分 子 中 ,至 少 应 有 一 个 原子 是 放射 性 同位 素 原子 ,这 一 原子 并 不 改变 被 标记 分
子 的 化 学 性 质 。 也 就 是 说 ,如 果 被 标记 的 分 子 是 一 个 酶 , 当 它 执 行 代谢 功能 时 ,如 :催化 蛋白 质 ，
DNA,RNA 的 合成 与 未 标记 的 相同 酶 分 子 无 任何 区 别 , 但 由 于 可 以 检测 出 放射 性 同位 素 的 误
变 , 因 此 ,它们 可 以 示 踪 被 标记 的 分 子 以 及 它们 在 体内 的 代谢 或 转运 情况 。

5S 标记 的 甲 硫 氨 酸 通常 用 于 示 踪 蛋白 质 , 因为 高 比 活 性 的 甲 硫 氨 酸 易于 制备 。 比 活性 指
的 是 每 单位 质量 的 物质 中 的 放射 性 同位 素 活 性 , 它 决 定 于 放射 性 同位 素 的 原子 数 与 非 放射 性
同位 素 的 原子 数 的 比率 。 此 外 ,8S 还 可 用 于 标记 核 苷 酸 , 如 :把 dNTP 中 的 < 位 磷酸 基 上 的 氧
原子 用 sS 取代 ,ssS 标记 的 核 苷 三 磷酸 可 用 于 核 苷 酸 序列 分 析 , 也 可 做 其 它 用 途 ,如 :未 端 标记
DNA 分 子 等 。

szP 常用 于 标记 各 种 核 苷 三 磷酸 。:P 可 以 是 核 苷 三 磷酸 的 位 磷酸 ,也 可 以 是 “ 位 的 磷
酸 ,szP 标记 的 核 苷 酸 是 目前 在 分 子 生 物 学 技术 中 用 途 最 广 的 示 踪 物 之 一 。

C 和 sH 标记 的 氨基 酸 、 核 昔 酸 也 常用 于 分 子 生物 学 研究 。

一 ` 放 射 性 同位 素 的 检测 方法

检测 挫 人 的 放射 性 同位 素 的 方法 有 二 种 ;
《一 ) 放 射 自 显影
在 标记 了 放射 性 同位 素 的 细胞 .组 织 ` 切 片 或 其 它 生 物 样品 上 , 压 上 一 张 入 光 胶片 ,放射
性 同位 素 的 电离 辐射 作用 于 X 光 胶 片上 的 乳胶 ,就 像 可 见 光一 样 产 生 了 一 个 潜在 的 图 象 。 因
此 ,经 过 曝光 ,射线 与 乳胶 作用 产生 电子 ,电子 使 讽 化 银 还 原 成 金属 银 , 这 样 , 便 得 到 了 放射 性
同位 素 的 分 布 图 。 在 细胞 水 平 上 ,放射 自 显影 可 用 来 确定 生物 大 分 子 的 合成 部 位 ,以 及 随后 在
.细胞 内 的 运动 情况 。 如 :通过 摊 人 "H 标记 的 脱氧 胸腺 喀 啶 核 音 酸 ,我 们 得 知 细胞 核 是 DNA 侣 ”
成 的 主要 部 位 。 细胞 成 分 的 分 离 和 组 织 学 染色 也 证 实 , 大 部 分 DNA 在 细胞 核 中 。 与 此 相反 , 通
过 摊 和 标记 的 尿 喀 啶 到 RNA 中 ,我 们 知道 RNA 是 首先 在 细胞 核 内 合成 的 ,但 是 在 细胞 中 ,大
部 分 RNA 存在 于 细胞 质 中 。 通 过 摊 人 标记 的 氨基 酸 我 们 得 以 了 解 蛋 白质 是 在 细胞 质 中 合成
的 。 也 正 是 由 于 电子 显微镜 放射 自 显影 技术 的 应 用 ,我 们 看 到 了 和 蛋白质 分 沁 的 途径 。
(二 ) 放 射 性 同位 素 的 定量 检测
放射 性 同位 素 的 衰变 使 空气 电离 产生 电子 ,这 些 电 子 可 用 盖 革 计数 器 检测 出 来 。 因 此 ,可
以 定量 测定 标记 的 样品 中 含 放射 性 同位 素 的 种 类 和 数量 。 应 用 闪烁 计数 器 也 是 定量 测定 放射
性 同位 素 的 一 种 很 好 手段 。 闪 烁 计数 器 的 工作 原理 是 这 样 的 :放射 性 同位 素 的 误 变 产生 了 粒
子 , 荧 光 剂 吸收 了 这 些 粒子 的 能 量 后 会 发 出 荧光 .因此 ,把 放射 性 同位 素 与 荧光 剂 混 合 济 | 定 诡
光 的 闪烁 次 数 , 便 可 知道 放射 性 物质 的 含量 。
460

ae 本

检测 方法 以 及 放射 性 同位 素 的 选择 都 取决 于 实验 目的 ,标记 的 化 合 物 挫 人 细胞 组 分 后 必
须 具 有 足够 高 的 比 活性 ,如 :"H 标记 的 核 苷 酸 前 体 就 比 “C 标记 的 比 活性 要 高 。 因 而 在 挫 人 时
间 较 短 或 细胞 样品 较 少 的 情况 下 ,通常 选用 五 标记 RNA 或 DNA。

在 放射 自 显影 的 研究 中 ,放射 性 同位 素 衰 变 所 产生 的 粒子 的 能 量 对 细胞 定位 的 精确 性 有
影响 。 如 :”P 的 训 变 释放 出 高 能 量 的 硬 忆 射线 ,它们 在 久光 胶片 上 经 过 显影 留 下 长 达 1 mnm 的

痕迹 , 比 一 个 单 细胞 的 直径 还 要 长 。 因 此 ,不 适 于 用 作 细 胞 定位 。 正 相反 ,，H 所 释放 的 8 射线 在

一

X 光 胶 片上 仅 产生 0. 47 pm 的 黑 影 , 因 此 ,在 细胞 内 定位 可 达到 0. 5 一 1. 0 pm 的 精确 。
二 ,脉冲 标 记 实 验

脉冲 标记 实验 也 就 是 在 要 标记 的 样品 中 加 入 放射 性 标记 的 化 合 物 , 经 过 短 时 间 后 ,将 放射
性 标记 的 化 合 物 取 走 , 同 时 加 入 过 量 的 未 标记 的 化 合 物 。 脉 冲 标记 实验 通常 可 以 示 踪 标记 的 化
合 物 分 子 在 不 同 的 细胞 器 以 及 生物 代谢 途径 的 不 同 分 子 之 间 的 移动 情况 。

在 标记 的 化 合 物 分 子 , 如 :氨基 酸 、 核 苷 酸 或 磷酸 等 被 挫 和 人 以 前 ,它们 首先 进入 到 细胞 内 的
构件 分 子 库 中 。 这 是 一 个 由 可 以 在 细胞 质 和 细胞 核 中 自由 扩散 的 小 分 子 所 组 成 的 库 , 这 些小 分
子 中 包括 氨基 酸 、 核 苷 酸 等 ,它们 有 的 可 自由 扩散 通过 细胞 内 原生 质 膜 而 进出 不 同 的 细胞 器 ，
有 的 则 不 行 。

随 着 细胞 生长 条 件 的 不 同 ,组 成 细胞 构件 分 子 库 的 各 组 分 的 含量 也 发 生变 化 。 同 样 ,细胞
吸收 ` 利 用 、 分 泌 不 同 的 构件 分 子 的 速度 也 有 变化 。

氨基 酸 可 以 在 构件 分 子 库 和 介质 间 进 行 迅速 交换 。 如 果 把 正在 生长 的 细胞 放 入 到 一 个 含
有 放射 性 标记 的 氨基 酸 的 介质 中 ,那么 只 需 5 min, 细 胞 内 的 构件 分 子 库 的 放射 性 比 活性 达到
最 高 值 ,蛋白 质 中 的 放射 性 积累 稍 慢 些 。 因 为 ,标记 的 氨基 酸 必须 首先 挨 入 到 氨基 酸 库 中 ,但 是
如 果 把 标记 物 移 走 ,加 入 未 标记 的 氨基 酸 , 几 分 钟 内 ,标记 的 氨基 酸 就 停止 挫 入 蛋白 质 了 .这 是
因为 细胞 内 的 氨基 酸 与 介质 中 的 氨基 酸 已 迅速 达到 平衡 ,因此 能 观察 到 非常 明显 的 脉冲 标记
效果 (图 14-1 a) 。

(a) (b)

100 100
二 :
半 Q- 洋 未
卫 芯 旦 疙 与 闪 家
旦 要 左 芭 呈 丰 后
包 中 虹 50
0 同 蕉 名 生
和 和
国志 此 估 车 区 此 &
医 其 时 间 (minm) 其 节 时 间 (mim) 芝
2 站 6 8 10 12 14 10 20 30 40 50 60 80
出 从 标记 1 国 汪 和 全 区 去 标记 ， 个 各 和 标记 的 移 去 标记 ，
氨基 酸 追加 冷 氨基 酸 UTEF 追加 冷 UTP

图 14-1 氨基 酸 与 核糖 核 苷 酸 的 脉冲 标记 结果 比较

然而 ,核糖 核 苷 酸 和 脱氧 核糖 核 苷 酸 进 入 细胞 后 不 和 久 就 被 磷酸 化 ,磷酸 化 后 的 核 苷 酸 一 般

不 能 离开 细胞 ,不 能 与 细胞 外 的 标记 核 苷 酸 达 成 平衡 ,因此 ,虽然 脉冲 标记 的 尿 喀 啶 核糖 核 苷

酸 可 在 10 min 内 摊 人 到 库 中 ,但 是 当 标记 的 尿 喀 喧 核 苷 酸 移 走 后 ,追加 的 过 量 的 未 标记 尿 喀

了 喧 核 糖 核 苷 酸 不 能 有 效 地 降低 库 中 的 标记 物 的 含量 。 这 些 标 记 的 尿 喀 啶 核糖 核 苷 酸 最 终 要 被

摊 人 到 RNA 中 ,该 过 程 约 需 几 小 时 ,因此 ,我 们 看 不 到 那 种 明显 的 脉冲 标记 效果 (图 14-1b)。
461

与 此 相反 ,脱氧 核糖 核 苷 酸 的 脉冲 标记 效果 很 明显 ,这 是 因为 细胞 的 库 中 的 脱氧 核糖 核 苷 酸 含
量 在 DNA 合成 时 仅 够 几 分钟 用 。 追 加 未 标记 的 脱氧 核糖 核 苷 酸 能 有 效 地 降低 库 中 相应 的 标
记 物 的 水 平 。

因此 ,在 设计 脉冲 标记 实验 和 解释 实验 结果 时 ,应 该 充分 考虑 到 各 种 前 体 小 分 子 在 细胞 的
库 中 所 具有 的 特性 。

三 ` 放 射 性 同位 素 技术 在 分 子 生 物 学 中 的 应 用

放射 性 同位 素 除了 能 够 标记 生物 大 分 子 ， 尚 与 模板 结合 的 十 已 吉 戈 二 的
定量 测定 它们 在 细胞 器 ,细胞 和 组 织 中 的 含量 新 的 大 分 子 j
以 及 它们 在 细胞 内 的 分 布 外 , 还 能 够 用 于 研究
生物 大 分 子 的 合成 ,下 面 仅 举 一 例 予 以 说 明 。

当 放射 性 标记 的 前 体 小 分 子 进入 细胞 后 ，
它们 即 被 挫 入 到 正在 合成 的 大 分 子 中 ,如 果 把 全
放射 性 同位 素 标记 的 氨基 酸 加 到 介质 中 ,它们 | 标记
即 被 挫 人 到 正在 合成 的 多 肽 链 中 。 随 着 挨 人 时
间 的 延长 , 越 来 越 多 的 已 完成 的 多 肽 链 被 标记
上 。 在 不 同 的 时 间 间 隔 取样 , 当 完 整 的 多 肽 链 中 ，
所 含 放射 性 同位 素 的 量 与 还 连 在 模板 上 的 多 肽
链 上 的 同位 素 量 相等 时 , 所 需 的 时 间 , 就 是 合成
一 条 特异 多 肽 链 的 时 间 , 因为 当 标 记 开 始 时 , 只 AL 人
有 正 要 起 始 合成 的 多 肽 链 从 头 开 始 被 标记 , 其 余
的 正在 延伸 的 多 肽 链 中 大 小 不 一 的 部 分 被 标记
上 , 当 整 条 完整 的 多 肽 链 从 N 端 到 C 端 都 被 标
记 上 有 时, 从 开始 标记 起 到 现在 的 时 间 , 便 是 合成
多 肽 链 所 需 的 时 间 ,也 是 完成 的 与 未 完成 的 多 肽 图 14-2 ”放射 性 同位 素 技术 用 手
链 中 含有 相等 量 的 同位 素 时 的 时 间 ( 图 14-2) 。 测定 大 分 子 的 合成 时 间

<

|

第 三 节 ”核酸 的 提取 和 纯化

核酸 可 分 为 两 大 类 :脱氧 核糖 核酸 , 即 DNA; 核 糖 核酸 , 即 RNA。 真 核 细胞 的 DNA 主要 ，
存在 于 细胞 核 中 , 与 蛋白 质 相 结合 构成 大 小 不 一 的 染色 体 。 核 外 也 有 少量 DNA ,如 线粒体
DNA 和 叶绿体 DNA 等 。DNA 是 遗传 信息 的 主要 贮藏 者 和 携带 者 . RNA 主要 存在 于 细胞 质 ，
中 , 真 核 细 胞 的 RNA 分 子 的 合成 发 生 在 细胞 核 , 合 成 的 RNA 前 体 分 子 在 核 内 加 工 成 熟 ,并 穿 上
过 核 膜 运 至 细胞 质 中 用 于 指导 或 帮助 蛋白 质 的 合成 。RNA 是 遗传 信息 的 传递 者 。 因 此 ,要 进
行 分 子 生 物 学 研究 ,首要 任务 就 是 从 组 织 或 细胞 中 提取 核酸 。

一 、 核 酸 的 提取

(一 )DNA 的 提取
DNA 的 提取 其 最 根本 的 要 求 是 保持 核酸 的 完整 性 。 一 般 情况 下 , 随 着 生物 由 低级 到 高 级
462

的 进化 ,DNA 的 分 子 量 也 由 小 到 大 递增 。 如 病毒 的 DNA 分 子 量 为 几 至 几 十 千 碱 基 对 ,细菌 的
”为 几 千 千 碱 基 对 ,而 高 等 动 植物 的 则 达到 几 百 万 千 碱 基 对 。 基 因 组 文库 的 构建 或 基因 组 DNA
的 Southern 分 子 杂 交 等 都 需要 分 子 量 大 小 至 少 在 100 一 200 kb 范围 的 DNA ,而 在 提取 DNA
的 过 程 中 有 许多 因素 能 导致 DNA 降解 成 小 片段 :中 物理 因素 降解 .因为 DNA 分 子 量 较 大 ,机
| 械 张力 或 高 温 很 容易 使 DNA 分 子 发 生 断 裂 。 因 此 ,在 实际 操作 时 应 尽 可 能 轻 缓 ,尽量 避免 过
”多 的 溶液 转移 ,剧烈 的 振荡 等 ,以 减少 机 械 张力 对 DNA 的 损伤 ,同时 也 应 避免 过 高 的 温度 ;@)
”细胞 内 源 DNA 酶 的 作用 。 细 胞 内 常 存在 活性 很 高 的 DNA 酶 ,细胞 破碎 后 ,DNA 酶 便 可 与
DNA 接触 并 使 之 降解 。 为 了 避免 和 钝 化 DNA 酶 的 作用 ,在 溶液 中 常 加 入 EDTA,SDS 以 及 蛋
白 酶 等 。EDTA 具有 五 合 Ca 和 Mg 半 的 作用 ,而 Ca 和 Mg 是 DNA 酶 的 辅 因子 。SDS 和
蛋白 酶 则 分 别 具 有 使 蛋白 质变 性 和 降解 的 作用 ;:G@@ 化 学 因素 也 会 降解 DNA .如 过 酸 的 条 件 下 ，
由 于 DNA 脱 味 叭 而 导致 DNA 的 不 稳定 , 极 易 在 碱 基 脱 落 的 地 方 发 生 断 裂 , 因 此 ,在 DNA 的
提取 过 程 中 ,应 避免 使 用 过 酸 的 条 件 。

DNA 在 体内 通常 都 与 蛋白 质 相 结合 ,和 蛋白质 对 DNA 制品 的 污染 常常 影响 到 以 后 的
DNA 操作 过 程 ,因此 ,需要 把 蛋白 质 除 去 。 一 般 采 用 苯酚 -氯仿 抽 提 的 方法 。 葵 酚 、 氯 仿 对 蛋白
质 有 极 强 的 变性 作用 ,而 对 DNA 无 影响 。 经 苯酚 -氯仿 抽 提 后 ,蛋白 质变 性 而 被 离心 沉降 到 栈
相 与 水 相 的 界面 ,DNA 则 留 在 水 相 , 这 一 方法 对 于 去 除 核酸 (无 论 是 DNA 或 RNA) 中 的 大 量
的 蛋白 质 杂 质 生 之 有 效 , 因 此 也 是 一 个 基本 方法 .。 少量 的 或 与 DNA 紧密 结合 的 蛋白 质 杂 质 可
用 蛋白 酶 予以 去 除 。

DNA 制品 中 也 会 有 RNA 杂质 ,但 RNA 极 易 降解 .况且 ,少量 的 RNA 对 DNA 的 操作 无
大 影响 ,必要 时 可 加 入 无 DNA 酶 的 RNA 酶 以 去 除 RNA 的 污染 。

DNA 的 提取 没有 统一 的 方法 ,但 它们 的 第 一 歼 儿 意 将 明 量 牧 各 ;然后 去 际 生 由 质 以 及 多
糖 等 的 污染 。 细胞 器 的 DNA 提取 ,一 般 采 取 先 提纯 细胞 器 , 再 溶解 细胞 器 膜 , 待 释放 出 细胞 器
DNA 后 ,再 进一步 提取 纯化 之 。 利用 差 速 离心 通常 能 达到 纯化 细胞 器 的 目的 。 如 :线粒体 或 叶
绿 体 的 提取 。 细 菌 质 粒 DNA 的 提取 是 根据 环 状 质粒 DNA 分 子 具 有 分 子 量 小 ,易于 复 性 的 特
点 进行 的 。 在 热 或 碱 性 条 件 下 DNA 分 子 双 链 解 开 , 若 此 时 将 溶液 置 于 复 性 条 件 ,由 于 变性 的
质粒 分 子 能 在 较 短 时 间 内 复 性 而 染色 体 DNA 不 行 。 经 过 离心 ,上 清 液 是 质粒 DNA 分 子 , 而 沉
淀 是 变性 的 染色 体 DNA 和 和 蛋白 质 杂 质 , 以 此 使 质粒 DNA 与 染色 体 DNA 分 离 。 鸣 菌 体 DNA
的 提取 则 通常 先 沉 演 噬菌体 分 子 , 经 CsCl 密度 梯度 离心 后 , 鸣 菌 体 得 以 纯化 ,再 用 苯酚 -氯仿

提 去 除 叭 菌 体 蛋 白 , 即 得 到 鸣 菌 体 DNA。
(二 )mRNA 的 提取
细胞 内 主要 有 3 种 RNA. mRNA 只 占 RNA 总 量 的 5%% 左 右 。 其 分 子 量 大 小 下 一 ,由 几 百
至 几乎 个 核 苷 酸 组 成 mRNA 主要 存在 于 细胞 质 中 ,大 部 分 mRNA 均 与 蛋白 质 结合 在 一 起 形
成 核 蛋白 体 . mRNA 的 提取 对 于 进一步 研究 基因 的 结构 及 其 表达 调控 是 必要 的 。 原 核 生 物 的
mRNA 半衰期 较 短 , 提取 困 难 。 而 真 核 生物 的 mRNA 较 稳定 ,相对 来 说 比较 容易 提取 。
要 成 功 的 提取 mRNA ,关键 在 于 尽 可 能 完全 抑制 或 去 除 RNA 酶 的 活性 。RNA 酶 是 非常
稳定 的 酶 , 它 由 一 条 多 肽 链 组 成 ,变性 后 容易 复 性 ,因此 很 耐 热 ,煮沸 后 还 能 保持 大 部 分 活性 。
RNA 酶 无 需 任何 辅助 因子 ,在 较 宽 的 pH 范围 内 都 有 活性 。 操作 者 的 手 、 唾 液 等 含有 较 丰富 的
RNA 酶 .因此 ,mRNA 的 提取 方法 ,也 是 根据 尽量 减 小 mRNA 的 降解 ,把 RNA 酶 的 活性 降低
到 最 低 限 度 的 原则 而 设计 的 。
463

提取 mRNA 一 般 有 二 条 途径 。 其 一 是 先 提取 多 聚 核糖 体 ,再 将 蛋白 质 与 mRNA 分 开 。 利
用 抗原 抗体 的 反应 ,还 可 以 将 含量 极 微 的 .特异 的 mRNA 提取 出 来 .因为 没有 合成 完 的 蛋白 质
还 停留 在 多 聚 核糖 体 上 。 这 些 新 生 肽 链 能 与 完整 蛋白 质 的 抗体 发 生 抗 原 抗体 的 反应 ,因此 ,可
以 选择 性 沉淀 特异 的 mRNA。 其 二 是 提取 细胞 总 RNA ,利用 寡 聚 脱氧 胸腺 喀 啶 核 苷 酸 纤维 素
柱 层 析 [oligo(dT)-cellulose], 把 mRNA 与 其 它 的 RNA, 如 tRNA,rRNA 分 开 , 因为 几乎 所
有 的 mRNA 3' 端 都 具有 poly A 的 序列 ,而 tRNA 和 rRNA 上 都 没有 这 样 的 结构 。 进 行 oligo
(CdT)- 纤 维 素 柱 层 析 时 ,只 有 3 端 有 poly A 的 mRNA 才 与 oligo(dT) 结 合 , 从 而 达到 与 其 它 。
RNA 分 离 的 目的 。

在 所 有 RNA 的 操作 中 , 凡 接 触 RNA 的 器 严 必 须 严 格 消毒 ,溶液 中 必须 加 入 RNA 酶 的
抑制 剂 ,如 RNasin。 氧 钒 基 - 核 苷 复合 物 、. 异 硫 氰 酸 有 等 ,所 用 溶液 和 水 一 般 先 用 焦 碳酸 二 乙 酯
处 理 , 再 经 高 温 灭 菌 。 操 作者 必须 戴 塑 料 手 套 。

二 、 核 酸 的 纯化

核酸 由 4 种 不 同 的 核 苷 酸 组 成 。 它 们 之 间 在 化 学 性 质 上 差异 不 大 。 因 此 ,根据 核酸 的 长 度
大 小 的 不 同 而 进行 分 离 纯化 就 成 了 最 常用 的 方法 。

(一 ) 密 度 梯 度 离心

超速 离心 是 生物 化 学 中 常用 的 分 离 大 分 子 的 手段 .超速 离心 又 可 分 为 两 类 :一 类 是 根据 样
品 的 质量 来 进行 分 离 , 称 之 为 速度 区 带 离心 。 样 品 铺 在 梯度 介质 的 顶部 ,在 离心 过 程 中 以 不 同
的 速度 往 下 沉降 .沉降 的 速度 与 样品 的 质量 密度、 离心 力 的 大 小 .介质 的 密度 以 及 样品 与 介质
的 摩 扩 力 大 小 有 关 。 离 心 完 成 时 ,不 同 的 样品 在 离心 管 中 位 于 不 同 的 区 带 上 。 但 是 ,速度 区 带
离心 时 间 不 能 太 长 ,否则 ,样品 会 沉降 至 离心 管 底 部 。60 000 r/min 的 速度 可 沉降 分 子 量 为
10 kD 的 分 子 。 芒 糖 常 选 作 梯度 介质 ,因此 ,这 一 类 型 的 超 离 心 又 被 称 为 基 糖 密度 梯度 离心 。 另
一 类 超速 离心 则 根据 样品 的 密度 大 小 不 同 而 进行 分 离 , 称 之 为 密度 梯度 离心 ,平衡 密度 梯度 离
心 是 分 子 生 物 学 研究 中 最 常用 的 一 种 。

密度 梯度 可 在 离心 开始 以 前 做 好 ,也 可 在 离心 时 依靠 离心 力 自己 形成 密度 梯度 。 后 者 就 是
平衡 密度 梯度 离心 技术 。 在 上 面 所 说 的 两 种 情形 中 ,介质 的 密度 梯度 既 要 比 样品 的 密度 大 , 又
要 比 样品 的 密度 小 。 离 心 时 ,样品 或 往 上 或 往 下 移动 , 当 介 质 的 密度 与 样品 自身 的 密度 相等 时 ，
样品 停止 移动 ,并 停留 在 该 介质 密度 的 位 置 上 。 甚 至 在 很 大 的 离心 力作 用 下 ,样品 也 不 会 沉降
到 比 它 自身 密度 大 的 位 置 (图 14-3) 。

形成 密度 梯度 的 介质 ,最 常用 的 是 毛 化 狗 (CsCl) 的 水 溶液 . 由 于 饮 离 子 (Cs+) 的 分 子 量 较
小 ,但 其 密度 大 于 溶剂 分 子 一 一 水 的 密度 ,在 离心 场 作用 下 ,CsCl 分 子 在 溶液 中 重新 分 布 而 形
成 了 密度 梯度 ,离心 管 底 部 的 溶液 较 之 上 部 溶液 含有 更 多 的 CsCl 分 子 ,一 般 情 况 下 , 顶部 与 底
部 溶液 之 间 的 密度 差 可 以 达到 0. 02 g/ml。 因 此 ,该 技术 可 以 方便 地 分 离 密 度 差 仅 为 0. 02 g/
ml 的 分 子 。 在 CsCl 溶液 中 ,蛋白 质 ,DNA 和 RNA 的 密度 分 别 为 1. 3,1. 6 一 1.7 和 1.75~~
1. 85 g/ml, 因此 它们 能 被 容易 地 分 离开 。 这 里 所 给 出 的 密度 值 比 相应 的 大 分 子 在 活 细 胞 中 所 时
具有 的 密度 值 要 高 。 这 是 因为 CsCl 溶液 中 的 离子 可 结合 到 蛋白 质 或 核酸 上 去 。 如 果 没 有 结合
的 离子 ,那么 所 有 这 些 大 分 子 都 具有 几乎 相等 的 密度 值 , 即 1. 25 一 1. 3 g/ml, 在 CsCl 溶液 申 ，
Cs 主要 结合 在 DNA 的 磷酸 基 上 ,而 对 RNA, 除 了 结合 在 磷酸 基 上 外 ,还 结合 在 核糖 的 羟基
上 ,因而 RNA 的 密度 比 DNA 大 。 蛋 白质 的 平均 电荷 比 核酸 少 ,结合 的 Cs+ 也 少 。

464

样品 与 Cscl, 溶 液 混 合

上 一
s*H 标记 的
uC 标记 的 密度 低 的 样品
密度 高 的 样品
CsCl 溶液 带 负 电荷 的 核酸 分 子

《ii
离心 ,形成 密度 梯度
梯度 方向

样品 迁移 至 与 它们 自身
密度 相同 的 环境

二 一 一 一 一 -一

收集 不 同 组 分 ，
测定 放射 性 活性

AN
中 目 日 |

不 断 提 高 的 样品

和 窗 庆 一 图 14-4 族 胶 电泳 的 原理
(1) 混 合 物 置 于 琼脂 糖 或 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 中 ,施加 电场 ;
图 14-3 平衡 密度 梯度 离心 (2) 分 子 以 它们 的 链 长 成 反比 的 速度 通过 凝 胶 间 的 空隙 。

如 果 蛋 白质 或 核酸 中 的 :2C 或 :4N 被 :3C 或 5N 所 代替 ,那么 这 些 蛋 白质 或 核酸 就 能 从 含有
正常 分 子 的 混合 物 中 分 离 出 来 ,如 在 蛋白 质 中 ,N 的 含量 占 14 为 ，N 的 密度 比 N 大 15/14
倍 , 若 蛋 白质 中 的 ”N 完全 被 SN 所 取代 , 它 的 密度 将 比 正常 的 蛋白 质 高 1 名, 这 已 足以 使 正常
的 与 被 取代 的 蛋白 质 得 到 完全 分 离 . 因 此 , 如果 细 胞 在 含有 重 的 氨基 酸 或 核 苷 酸 前 体 的 培养 基
中 生长 ,就 有 可 能 分 离 重 同位 素 加 入 前 后 细胞 所 制造 的 大 分 子 。

DNA 的 密度 与 其 G-C 对 的 含量 成 正比 这 是 因为 G-C 对 中 有 3 个 氢 键 的 缘故 ,G-C 对 与
DNA 密度 p 的 关系 可 由 下 列 公式 表示 :

p=0.098(G%% 一 C%) 十 1. 680

双 链 DNA 中 ,G 和 A 分 别 与 C 和 工 严 格 配对 ,因此 知道 G-C 对 的 含量 后 , 便 可 推算 出
465

A-I 对 的 含量 , 故 可 利用 超速 离心 对 DNA 的 碱 基 组 成 进行 测定
CE 十 汪
电泳 能 够 分 离 混合 物 中 大 小 不 同 的 分 子 。 在 电场 作用 下 ,溶液 中 的 带电 粒子 的 移动 速度 决
定 于 它们 的 电荷 -质量 比 。
核酸 在 溶液 中 由 于 它们 有 磷酸 基 而 带 负 电荷 ,在 电场 中 核酸 向 正极 移动 。 但 是 ,由 于 每 一
个 核 苷 酸 都 具有 几乎 相同 的 电荷 -质量 比 ,长 度 不 同 的 核酸 分 子 也 具有 几乎 一 致 的 电荷 -质量
比 。 同 样 的 ,蛋白 质 分 子 的 形状 .质量 可 以 不 同 , 电 荷 -质量 比 却 是 相近 的 ,因此 ,如 果 只 在 溶液
中 进行 核酸 或 蛋白 质 的 电泳 , 那 就 不 会 使 大 小 不 同 的 分 子 得 到 分 离 。 但 是 ,如 果 把 蛋白 质 或 核
酸 的 电泳 改 在 凝 胶 中 而 不 是 在 溶液 中 进行 ,这 样 的 分 离 就 能 实现 .这 一 种 电泳 技术 称 之 为 凝 胶
电泳 (图 14-4) 。 常 用 的 凝 胶 有 聚 丙 烯 酰胺 凝 腕 和 琼脂 糖 凝 胶 , 凝 胶 的 孔径 大 小 限制 了 分 子 移
动 的 速度 。 具 有 相同 荷 质 比 但 长 度 不 同 的 分 子 移动 的 速度 不 同 , 长 的 分 子 移动 速度 慢 。 即便 是
由 10 000 一 20 000 个 核 苷 酸 组 成 的 核酸 分 子 , 相 差 几 个 百分点 也 能 分 离开 。 长 度 不 超过 500 个
核 苷 酸 的 分 子 , 如 果 相 差 仅 一 个 核 苷 酸 ,也 能 在 电泳 中 被 分 离开 , 这 也 就 是 DNA 序列 分 析 得
以 实现 的 基础 。
琼脂 糖 凝 胶 电 泳 是 DNA 电泳 的 常规 方法 。 它 可 用 来 测定 DNA 的 分 子 量 , 分 离 经 限制 性
内 切 酶 水 解 后 的 DNA 片段 ,进一步 纯化 DNA 等 。 琼 脂 糖 凝 胶 的 孔径 大 小 主要 取决 于 凝 胶 中
琼脂 糖 的 浓度 。
RNA 也 可 用 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 分 离 鉴 定 。 由 于 了 NA 分 子 容 易 形 成 二 级 结构 ,从 而 影响
RNA 分 子 的 迁移 率 。 因 此 ,RNA 的 电泳 中 常 加 入 变性 剂 , 如 : 甲 酰胺 、 尿 素 、. 甲 醛 和 乙 二 醛 等 。
聚 丙 烦 酰 胺 凝 胶 电 泳 常用 于 蛋白质 及 小 分 子 量 核酸 的 分 离 。 其 孔径 大 小 主要 取决 于 丙烯
酰胺 与 甲 又 双 丙烯 酰胺 ( 交 联 剂 ) 的 浓度 。 DNA 的 序列 分 析 就 采用 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 . 蛋白
质 的 SDS( 十 二 烷 基 硫酸 钠 , 去 污 剂 ) 聚 丙烯 酰 胺 凝 胶 电泳 可 用 于 测定 蛋白 质 的 分 子 量 , 中 性 pH
下 ,SDS 带 负 电 , 蛋白 质 的 每 个 氨基 酸 残 基 结 合 一 个 分 子 的
SDS, 相 邻 的 SDS 分 子 由 于 带 有 相同 的 负电 荷 而 相互 排斥 ，
使 结合 了 SDS 分 子 的 蛋白 质 形 成 棒状 构 型 并 且 具 有 相同 的
荷 质 比 ,此 时 的 蛋白 质 处 于 变性 状态 。 它 们 在 凝 胶 中 的 迁移
速度 决定 于 它们 的 长 度 。 相 差 1%% 的 和 蛋白质 也 能 被 分 离 。
脉冲 场 凝 胶 电泳 技术 是 近年 来 发 展 起 来 的 分 离 大 分 子
量 DNA 的 有 效 手段 。 线 状 的 双 链 DNA 分 子 超过 一 定 的 长
度 后 ,它们 在 琼脂 糖 凝 胶 电泳 中 以 相同 的 速度 泳 动 ,这 是 因
为 琼脂 糖 凝 胶 的 孔径 太 小 。 降 低 琼脂 糖 的 浓度 虽然 可 以 有
限 地 增 大 凝 胶 的 孔径 ,但 是 这 样 的 低 浓 度 (0. 1 吧 一 0.2 色 )
凝 胶 不 易 操 作 , 而 且 , 超 过 750 kb 的 DNA 分 子 不 能 得 到 有
效 分 离 。 而 脉冲 场 电泳 技术 可 用 于 分 离 分 子 量 范围 在 1 一
10 Mb 的 线 状 双 链 DNA 分 子 . 当 DNA 分 子 在 电泳 中 朝 一 人
个 者 门 移动 网 生 和 全 分 子 治 痢 电 芭 的 方向 伸展 开 ,这 时 ， 切 NA
断 电 流 ,DNA 则 开始 回复 松弛 的 无 规 卷曲 状 ,松弛 所 需 的 。 表 一 条 染色 体 ,2 4 噬菌体 DNA 的 连环 人
时 间 取 决 于 DNA 分 子 的 长 度 。 分子 越 长 ,回复 所 需 的 时 间 ”最 小 单位 分 子 量 为 48. 5 kb;3. NoxI 消化 的
也 越 长 。 短 时 间 后 ,一 个 新 的 电场 加 在 与 原来 电场 成 一 定 角 。” 瑟 co 染色 体 .
466

1

恕 人
ie
2

1 2 3

” 度 的 方向 ,长 的 DNA 分 子 因 还 未 回复 到 松弛 状态 ,需要 更 多 的 时 间 才 能 重新 开始 朝 新 的 电场

| 方向 移动 。 这 样 ,在 这 两 个 方向 上 反复 施加 电场 ,就 能 使 大 分 子 量 的 DNA 分 子 得 到 分 离 (图

14-5)。 因 此 ,这 一 技术 在 染色 体 的 分 析 中 是 不 可 替代 的 。 因 为 最 小 的 酵母 染色 体 也 有 5X105
bp ,最 大 的 动物 或 植物 的 染色 体 则 有 3X10* bp。

三 ` 限 制 性 内 切 酶 的 应 用

要 进一步 分 析 提 取 纯 化 的 DNA ,首先 必须 依赖 于 限制 性 内 切 酶 的 应 用 。 利 用 限制 性 内 切
酶 ,我 们 可 以 把 较 大 的 DNA 分 子 重复 地 切割 成 分 子 量 符合 要 求 的 大 小 片段 。 也 只 有 利用 限制
性 内 切 酶 ,我 们 才能 构建 出 DNA 的 物理 图 谱 , 了 解 限制 片段 之 间 的 排列 顺序 ,也 才能 够 进行
DNA 序列 分 析 和 目的 基因 的 克隆 .
从 第 三 章 第 七 节 里 ,我 们 认识 了 限制 性 内 切 酶 .目前 已 经 发 现 并 提纯 的 限制 性 内 切 酶 已 达
100 多 种 .正确 选择 使 用 限制 性 内 切 酶 , 主要 依赖 于 我 们 的 实验 目的 .将 要 产生 的 DNA 限制 性
片段 的 分 子 量 大 小 通常 是 首要 考虑 的 因素 。 几 百 碱 基 对 长 短 的 DNA 片段 适 于 进行 精细 的 物
理 图 谱 以 及 DNA 序列 分 析 等 . 因此 常 选用 切 点 较 多 的 识别 位 点 为 4 个 核 苷 酸 序列 的 酶 这样
的 酶 也 适 于 进行 DNA 的 部 分 酶 解 。 这 在 建立 基因 组 文库 时 是 常用 的 方法 。
识别 位 点 为 6 个 核 苷 酸 序列 的 限制 性 内 切 酶 通常 产生 1 一 10 kb 长 短 的 限制 性 片段 , 适 于
进行 较 长 的 DNA 分 子 的 物理 图 谱 分 析 和 包括 内 含 子 ` 结 构 基 因 以 及 调控 序列 在 内 的 完整 基
因 的 克隆 。
识别 序列 为 8 个 核 苷 酸 的 限制 性 内 切 酶 较 少 ,但 是 对 于 构建 更 大 的 DNA 分 子 的 物理 图
谱 非常 有 用 。 它 们 产生 的 限制 性 片段 可 以 在 脉冲 场 电泳 中 得 到 分 离 。
选择 限制 性 内 切 酶 时 另 一 个 需要 考虑 的 因素 是 产生 相同 的 末端 以 便于 连接 和 克隆 。DNA
连接 酶 能 够 将 具有 相同 粘性 末端 或 都 是 平 端的 两 个 DNA 末端 连接 起 来 。 在 DNA 克隆 时 , 需
要 把 DNA 的 限制 性 片段 与 载体 DNA 分 子 相 连接 。 因 此 , 必须 选用 产生 相同 末端 的 限制 性 内
切 酶 分 别 消 化 所 要 克隆 的 DNA 分 子 和 载体 DNA 分 子 。 在 此 我 们 看 到 , 正 是 由 于 限制 性 内 切
酶 和 DNA 连接 酶 的 应 用 ,使 人 们 能 够 在 体外 进行 DNA 的 切割 和 连接 ,为 重组 DNA 技术 的
出 现 葛 定 了 重要 基础 ,具有 划时代 的 意义 。
限制 性 内 切 酶 相对 来 说 是 比较 稳定 的 酶 ,但 是 不 正确 地 使 用 常常 也 会 出 现 问题 ,影响 酶 活
性 的 主要 因素 有 :(a2DNA 底 物 的 纯度 。 常见 的 污染 物 为 重 白质 乙醇. 酚 ` 氯 仿 `. 过 高 的 EDTA
等 ;:(b)DNA 分 子 的 结构 包括 DNA 分 子 的 超 螺旋 . 甲 基 化 等 ;(c) 反 应 条 件 . 如 :反应 温度 、 绥
冲 液 组 成 等 。

贞

第 四 节 ”核酸 的 分 子 杂 交 和 DNA 的 人 工 合成

一 、\ 核 酸 的 分 子 杂 交

核酸 的 分 子 杂交 技术 是 目前 分 子 生物 学 中 最 广泛 应 用 的 技术 之 一 。 它 可 以 鉴定 核酸 分 子
之 间 的 同 源 性 .这 一 技术 是 分 子 克 隆 技术 的 重要 组 成 部 分 ,在 基因 的 表达 调控 和 物种 的 亲缘 关
系 研究 中 也 发 挥 重 要 作用 。 从 DNA 和 RNA 的 结构 中 我 们 得 知 :DNA 为 双 链 双 螺 旋 分 子 , 其
中 一 条 链 与 另 一 条 链 的 核 苷 酸 序列 互补 ,RNA 分 子 若 其 顺序 与 DNA 分 子 有 互补 关系 ,也 能

467

与 DNA 形成 互补 的 双 链 结构 。 因 此 ,两 条 来 源 不 同 的 ,具有 核 苷 酸 互补 关系 ,也 即 :具有 一 定 ，

同 源 性 的 DNA 单 链 分 子 或 DNA 单 链 分 子 与 RNA 分 子 , 在 去 掉 变 性 条 件 后 互补 的 区 段 能 够
退火 复 性 形成 双 链 DNA 分 子 或 DNA/VRNA 异 质 双 链 分 子 。 我 们 把 这 一 过 程 称 为 核酸 的 分 子
杂交 。 核 酸 的 分 子 杂交 有 不 同 的 形式 和 方法 。 下 面 我 们 介绍 常用 的 几 种 。

(一 )Southern 分 子 杂 交 技 术

以 它 的 发 明 者 命名 的 Southern 分 子 杂 交 技 术 已 成 为 基因 分 离 和 鉴定 的 必 不 可 少 的 手段 ，

也 广泛 用 于 遗传 多 态 性 分 析 。
DNA 样品 用 一 种 或 几 种 限制 性 内 切 酶 消化 后 ,DNA 片段 按照 分 子 量 的 大 小 在 电泳 凝 胶
中 进行 分 离 。 凝 胶 经 过 变性 处 理 ( 通 常 加 入 碱 性 缓冲 液 ) ,使 其 中 的 DNA 双 链 分 子 变 性 为 单

链 , 然后 利用 毛细 管 作 用 原理 或 其 它 物理 方法 ,将 凝 胶 中 的 单 链 DNA 分 子 转移 并 固定 到 固 相

支持 物 表 面 上 (一 般 为 硝酸 纤维 素 膜 或 尼龙 膜 ) ,此 时 的 DNA 片段 还 保留 着 原来 在 凝 胶 中 的
分 布 图 式 。 如 果 用 一 段 放 射 性 标记 的 核 苷 酸 序 列 ( 称 之 为 探 针 ) 与 膜 上 的 DNA 片段 杂交 , 那
么 ,与 探 针 有 同 源 性 的 DNA 片段 在 膜 上 的 位 置 便 可 通过 放射 自 显影 而 得 以 了 解 。Southern 分
子 杂交 技术 具有 很 高 的 灵敏 度 , 可 以 检测 出 相当 于 人 的 基因 组 中 只 出 现 一 次 的 DNA 序列 ( 约
1/10")。 它 与 绘制 DNA 物理 图 谱 相 结合 ,可 以 确定 目的 基因 ( 探 针 或 同 源 序 列 ) 在 图 谱 中 的 位
置 及 其 限制 性 酶 切 位 点 的 分 布 。

硝酸 纤维 素 腊 放射 自 显影

” | 与 标记 的 DNA
或 RNA 探 针
zi

本
碱 性 溶液

毛细 作用 将 DNA 从
凝 胶 中 转移 至 硝酸 纤维 素 膜 上

14-6 Southern 分 子 杂 交 技 术 用 于 检测 特异 DNA 序列 的 存在

(二 )Northern 分 子 杂 交 技 术

Northern 分 子 杂交 技术 由 于 与 Southern 分 子 杂交 技术 类 似 而 得 名 。 它 们 所 不 同 的 是 :
Northern 分 子 杂交 技术 用 于 检测 特异 的 mRNA 分 子 的 存在 . mRNA 样品 经 过 电泳 ,转移 到 硝
酸 纤维 素 膜 上 ,与 放射 性 标记 的 DNA 探 针 进行 杂交 ,经 过 放射 自 显影 ,特异 的 mRNA 分 子 在
样品 中 的 存在 与 否 ,其 长 度 大 小 以 及 量 的 多 守 便 可 得 知 。 Northern 分 子 杂交 技术 已 广泛 用 于
研究 特异 的 mRNA 分 子 在 细胞 处 于 不 同 条件 下 发 生 的 量 和 质 的 变化 或 不 同 组 织 器 官 中 ,基因
表达 的 差异 。

另 一 项 类 似 的 技术 称 为 Western 蛋白 质 杂 交 技术 。 在 这 项 技术 中 ,经 过 单 向 或 双向 电泳
分 离 的 蛋白 质 被 转移 到 硝酸 纤维 素 滤 膜 上 ,放射 性 或 用 酶 标记 的 特异 抗体 即 可 用 来 检测 相应
抗原 (和 蛋白质) 的 存在 。

(三 ) 原 位 杂交 技术

有 两 种 意义 的 原 位 杂交 技术 :一 种 是 指 在 构建 基因 组 文库 或 cDNA 文库 时 ,长 在 培养 亚

468

|

上 的 菌落 或 只 菌 斑 经 转移 到 硝酸 纤维 素 膜 上 后 进行 分 子 杂交 。 我 们 将 在 下 一 节 继 续 讨 论 这 一
技术 .。 另 一 种 原 位 杂交 技术 则 是 指 在 细胞 .组织 切片 上 直接 进行 分 子 杂 交 。 通过 检测 细胞 内 特
异 mRNA 的 存在 与 否 , 它 能 够 告诉 我 们 ,在 哪些 细胞 中 有 特异 基因 的 表达 。 要 进行 原 位 杂交 ，
首先 要 进行 组 织 的 固定 ,以 免 在 以 后 的 操作 过 程 中 组 织 的 天 然 形态 结构 遭 到 破坏 .常用 的 有 甲

，” 醛 ` 戊 二 醛 等 交 联 固定 剂 . 以 后 依次 经 过 脱水 、 石 螨 包 埋 和 切片 ,组 织 样品 的 准备 就 算 完成 。 以
， 上 这 些 过 程 与 制备 显微镜 下 观察 所 需 的 石蜡 切片 并 无 太 大 区 别 。

原 位 杂交 所 用 的 探 针 要 短 ,这 样 才能 尽量 使 探 针 挫 人 细胞 内 。 同 时 ,在 杂交 进行 以 前 常用
蛋白 酶 消化 ,使 细胞 的 空 院 增 大 ,从 而 提高 探 针 对 划 子 mRNA 序列 的 可 接近 度 , 标 记 探 针 的 同
位 素 常 用 ”“S 和 H,P 因为 具有 过 高 的 能 量 导致 分 辩 率 降低 而 往往 成 为 落选 者 。

原 位 杂交 所 需 杂 交 液 的 用 量 很 小 ,杂交 反应 可 在 盖 玻 片 下 进行 .与 前 面 所 介绍 的 分 子 杂 交
技术 不 同 , 原 位 杂交 的 放射 自 显影 不 是 利用 光 片 而 是 将 乳胶 涂 在 切片 上 ,经 过 上 曝光、 显影 、
定 影 来 完成 。 然 后 ,进行 组 织 切 片 的 化 学 染色 , 便 可 观察 到 切片 组 织 的 形态 结构 以 及 放射 自 显
影 信号 在 组 织 ` 细 胞 中 的 位 置 。 原 位 杂交 技术 可 以 检测 出 一 个 细胞 中 只 有 一 个 分 子 的 mRNA。

二 、DNA 的 人 工 合成

在 核酸 的 分 子 杂 交 技 术 中 所 使 用 的 探 针 可 以 是 来 源 于 其 它 物 种 或 自身 的 同 源 序列 ,也 可
以 是 化 学 合成 的 寡 聚 核 昔 酸 序列 ,这 尤其 适用 于 只 知道 特定 目的 DNA 片段 的 部 分 序列 时 的
情况 ( 见 第 一 节 介绍 ) 。

化 学 合成 寡 聚 核 苷 酸 序列 今天 已 经 能 够 在 机 器 上 自动 进行 。 它 采用 的 是 固 相 磷酸 三 酯 法
和 亚 磷 酸 三 酯 法 。 由 于 亚 磷酸 三 酯 法 具有 反应 速度 快 ,合成 效率 高 和 副 反 应 极 少 的 优点 ,已 经
在 机 器 自动 合成 中 被 广泛 使 用 .其 基本 原理 (图 14-7) 是 将 所 要 合成 的 赛 聚 核 音 酸 链 的 3 -未 端
先 以 3'-OH 与 一 个 不 溶性 载体 ,如 多 孔 玻璃 珠 (CPG) 连接, 然后 依次 从 3'->~5' 的 方向 将 核 苷 酸
单 体 逐 个 加 上 去 。 所 使 用 的 核 苷 酸 单 体 的 活性 官能 团 都 是 经 过 保护 的 。 其 中 5'-OH 用 4,4- 二
对 甲 氧 基 三 葵 甲 基 (DMT) 保 护 ,3' 端 的 二 异 丙 基 亚 磷 酰 胺 上 磷酸 的 -OH 用 甲 基 或 5 氰 乙 基 保
护 , 碱 基 上 的 活泼 基 团 如 氨基 也 都 用 不 同 的 保护 基 韦 以 保护 。 合 成 的 延伸 是 这 样 开始 的 :

- 单 体 1 人
= 入 人 缩合
(弱酸 )
他 了
? 】
玻 玉 P
载体 WSIBL
DMT-0 碱 基 : PE 氧化 1 Epo 醒 复 循环 . 窒 聚 核 苷 酸
量 7 ZnBr，
脱 三 葵 甲 基 o

O

O

0
|

图 14-7 DNA 的 化 学 合成 原理
469

(一 ) 脱 三 茶 甲 基 保 护 基

加 入 ZnBr: 或 三 氯 乙酸 , 脱 去 4,4- 二 对 甲 氧 基 三 茶 甲 基 , 释 放出 与 载体 相连 的 守 聚 核 苷
酸 单 体 1 上 的 5 -OH。

(二 ) 缩 合 反 应

在 弱酸 -四 唑 的 存在 下 ,新 加 入 的 带 保 护 基 的 核 苷 酸 单 体 2 与 单 体 1 发 生 缩合 反应 ,形成
3 ,5 -磷酸 二 酯 键 ,其 中 磷 为 三 价 。

三 ) 盖帽 反应

加 入 乙酸 栈 , 使 极 少 数 尚未 参与 缩合 反应 的 核 苷 酸 单 体 1 中 的 5 -OH 乙酰 化 ,从 而 达到
使 其 封闭 ,终止 其 以 后 参与 缩合 的 资格 ,以 减少 发 生 合成 错误 序列 的 机 会 。

(四 ) 氧 化 反应

形成 的 3 ,5 -磷酸 二 酯 键 由 于 磷 为 3 价 ,也 称 为 亚 磷 酯 键 。 亚 磷 酯 键 不 稳定 ,能 被 酸 或 碱
解 离 , 故 加 入 碘 将 其 氧化 ,成 为 比较 稳定 的 3 ,5 -磷酸 二 酯 键 , 其 中 的 磷 为 5 价 。

如 此 经 过 多 次 循环 ,直到 合成 出 具有 所 需 序列 长 度 的 寡 聚 核 苷 酸 片段 后 ,将 其 从 固 相 载体
中 释放 下 来 ,再 脱 去 其 余 的 所 有 保护 基 , 就 得 到 了 所 需 的 窒 聚 核 苷 酸 。 凝 胶 电泳 法 或 高 压 液 相
色谱 法 可 用 于 它们 的 进一步 纯化 。

化 学 合成 诊 聚 核 苷 酸 现 在 已 经 在 分 子 生 物 学 研究 中 得 到 了 广泛 应 用 。 它 能 够 :四 作为 核酸
分 子 杂 交 的 探 针 ;@ 作 为 酶 促 DNA 合成 的 引物 ,用 于 DNA 序列 分 析 , 聚合 酶 链 式 反 应 (PCR )
等 ;@ 作 为 基因 合成 的 元 件 . 对 于 一 些 比 较 小 的 基因 或 天 然 来 源 不 易 得 到 完整 基因 的 或 对 天 然
基因 进行 部 分 改造 时 ,可 以 利用 人 工 合成 基因 的 办 法 获取 目的 基因 .化 学 合成 的 宴 聚 核 苷 酸 片
段 则 担当 起 人 工 基 因 合成 的 元 件 。 常 用 的 组 装 基因 的 办 法 有 两 种 , 即 :小 片段 的 互补 粘 接 法 和
大 片段 的 部 分 互补 酶 促 延 长 法 (图 14-8) 。 合成 出 的 双 链 DNA 作为 整个 基因 合成 的 三 个 段 侠 ，
与 其 它 的 段 块 连接 成 更 长 的 双 链 DNA ,最 后 组 装 成 一 个 完整 的 基因 ;四 作为 DNA 未 端 改造

(a) b)
短 的 赛 核 苷 酸 长 的 守 核 苷 酸
IO
| | 由
DNA 连接 酶 DNA 聚 合 酶
正 .coRI
II II II
合成 基因 BamaHI
下 coRI BEzxHI
人
克隆 II
+ T4DNA 连 接 酶 BamHl
泗
EcoRI EcoRI EcoRT

Se
”二 SS 着
EcoR1
人 和 |
和 Be 二 全 ， HI

AmpTetsi

图 14-8 小 片段 的 互补 粘 接 (a) 和 大 片段 的 酶 促 延长 (b)
470

中 的 接头 。 基 因 克 隆 过 程 中 ,往往 需要 在 DNA 末端 引入 新 的 限制 性 内 切 酶 位 点 。 这 些 新 的 位
点 可 以 通过 化 学 合成 的 二 条 互补 的 寡 聚 核 苷 酸 链 经 过 退火 后 形成 。 再 经 与 所 要 克隆 的 目的
DNA 片段 连接 , 便 形 成 了 具有 新 的 限制 性 内 切 酶 位 点 的 末端 。

第 五 节 目的 基因 的 分 离

目的 基因 的 分 离 无 疑 是 分 子 生物 学 的 重要 内 容 。 要 进行 基因 的 结构 和 功能 的 研究 ,首先 应
该 得 到 纯化 的 ,单一 的 目的 基因 .利用 限制 性 内 切 酶 可 以 直接 分 离 得 到 那些 定位 在 质粒 或 病毒
上 的 基因 。 但 是 ,如 果 要 分 离 得 到 人 的 基因 组 中 的 某 一 单一 的 DNA 片段 则 要 困难 得 多 。 因 为
人 的 染色 体 DNA 总 共 长 约 有 3X10 bp .假如 限制 性 内 切 酶 每 隔 3 000 bp 切割 一 次 ,将 产生 上
百 万 的 不 同 的 DNA 片段 ,可 以 设想 ,利用 电泳 及 其 它 已 经 介绍 过 的 技术 ,要 想 纯化 出 其 中 的
某 一 DNA 片段 几乎 是 不 可 能 的 ,重组 DNA 技术 却 能 够 克服 这 种 从 较 大 的 基因 组 中 分 离 纯 化
单一 的 目的 基因 的 困难 。

利用 重组 DNA 技术 分 离 目的 基因 ,我们 也 称 之 为 基因 克隆 。 这 里 的 “克隆 "一 词 是 动词 ，
是 指 从 单一 祖先 产生 同一 的 DNA 分 子 群 体 或 细胞 群体 的 过 程 。 而 克隆 "用 作 名 词 时 , 则 是 指
从 一 个 共同 祖先 无 性 繁殖 下 来 的 一 群 遗 传 上 同一 的 DNA 分 子 、 细 胞 或 个 体 所 组 成 的 特殊 的
生命 群体 。 因为 在 基因 克隆 的 过 程 中 ,含有 目的 基因 的 外 源 DNA 经 过 限制 性 内 切 酶 消化 或 其
它 手段 形成 DNA 片段 后 ,在 体外 与 能 在 细胞 中 独立 自主 复制 的 载体 分 子 连接 ,形成 的 重组
DNA 分 子 被 引入 寄主 细胞 ,每 一 个 含有 重组 DNA 分 子 的 寄主 细胞 增殖 后 成 为 一 个 克隆 , 其
中 带 有 一 段 同一 的 外 源 DNA 片段 ,经 过 筛选 , 便 可 以 从 大 量 的 克隆 中 得 到 含有 目的 基因 的
DNA 片段 的 克隆 ,同时 ,插入 的 DNA 片段 也 得 到 扩 增 。

由 大 量 的 含有 基因 组 DNA( 即 某 一 生物 的 全 部 DNA 顺序 ) 的 不 同 的 DNA 片段 的 隆 克 所
构成 的 群体 ,我 们 称 之 为 基因 文库 .一 个 完全 的 基因 文库 ,应 该 能 够 保证 从 中 筛选 到 目的 基因 。
1976 年 ,L. Clark 和 J. Carbon 提出 了 一 个 完全 的 基因 文库 所 需 克隆 数 的 计算 公式 ，

N=ln(1 一 如 )/lnG1 一 亡 )

在 上 述 公式 中 :N 是 一 个 完全 基因 文库 所 应 包含 的 重组 体 克 降 数 ;为 所 期 望 的 目的 基因
在 基因 文库 中 出 现 的 几率 ;/ 是 插入 片段 的 平均 大 小 与 基因 组 DNA 大 小 的 比值 。
从 这 一 公式 中 ,我 们 可 以 计算 出 不 同 来 源 的 基因 组 构建 基因 文库 时 需要 的 最 少 克隆 数 的
理论 值 。

若 这 些 大 量 的 重组 体 DNA 分 子 所 含 的 外 源 DNA 不 是 基因 组 DNA ,而 是 由 某 一 生物 的
特定 器 官 或 特定 发 育 时 期 细胞 内 的 mRNA 经 反 转 录 形 成 的 cDNA 分 子 , 它 们 所 构成 的 重组
DNA 克隆 群体 , 则 称 为 EDNA 基因 文库 。

在 基因 文库 和 <DNA 文库 中 所 使 用 的 寄主 遇 胞 通常 为 大 肠 杆菌 忆 col: 细胞 。 最 近 ， 酵母 的 人
工 染色 体系 统 (YACs) 技 术 已 经 出 现 。 利 用 此 技术 可 以 方便 地 克隆 非常 大 的 基因 组 DNA 片段 。

一 \ CDNA 克隆

网 织 红 细胞 中 ,含有 大 量 的 珠 蛋 白 mRNA ,细胞 内 合成 的 蛋白 质 90% 以 上 是 c 和 订 珠 蛋
白 。 下 面 , 我 们 以 珠 蛋 白 的 cDNA 克隆 为 例 ,说 明 建立 cDNA 文库 的 原理 , 见 图 14-9。
471

polyA 尾巴
一

EARL

(1)

〈4)

(5)

(c)

14-9 编码 珠 蛋白 的 cDNA 克隆
Ca) 来 自 网 织 红 细胞 的 珠 蛋 白 mRNA;'\b) 带 有 氮 休 青霉素 抗 性 基因 的 质粒 ; (c) 含 重组 质粒 的 互 .co 细胞 生长 ;
(d) 没 有 amp: 的 细胞 死亡 。(1) 用 poly 工 引物 杂交 ; (2) 反 转录 酶 从 mRNA 反 转 录 出 cDNA;(3) 限 制 性 内 切 酶 消化 ;
(4) 碱 解 RNA, 加 poly C 尾巴 到 cDNA 的 3 端 !(5) 与 poly G 引物 杂交 ;(6)DNA 多 聚 酶 ;(7) 加 同 聚 物 尾 巴 到 3' 端 (与

双 链 cDNA 尾巴 互补 );(8) 加 同 聚 物 尾巴 到 3 端 ;(9) 珠 蛋白 cDNA; (10) 转 染 无 azzp: 基因 的 . coii 细胞 ,用 氨 葵 青 霉
素 选择 amp: 细胞 。

反 转 录 酶 是 合成 cDNA 的 关键 酶 。 它 是 以 mRNA 为 模板 把 脱氧 核糖 核酸 逐个 加 到 引物
上 ,由 5 一 3 的 方向 合成 出 与 mRNA 链 互补 的 cDNA 链 。 在 反 转 录 酶 作用 前 , 必须 将 一 个 短 的
引物 杂交 到 mRNA 分 子 的 3 端 , 幸运 的 是 , 真 核 生 物 的 mRNA 分 子 在 其 3 端 通常 有 一 段 长

度 约 为 50 一 250 个 核 苷 酸 组 成 的 多 育 腺 嗓 叭 核 苷 酸 (polyA ) 结 构 。 因 此 ,多 聚 脱氧 胸腺 喀 啶 核
472

苷 酸 poly(dT) 可 以 完全 满足 作为 引物 的 要 求 。

在 cDNA 链 合成 完毕 后 ,模板 mRNA 用 碱 处 理 降解 ,DNA 链 不 受 影 响 。 双 链 的 DNA 可
以 cDNA 链 为 模板 合成 出 来 。 其 中 一 种 技术 路 线 是 首先 利用 末端 转移 酶 (一 种 无 需 模板 ,催化
下 脱氧 核 苷 三 磷酸 以 5 -3" 为 方向 ,逐个 将 脱氧 核 苷 酸 分 子 加 到 线性 DNA 分 子 的 3-OH 末
端的 酶 ) ,在 cDNA 的 3'- 未 端 加 上 同 聚 物 (poly dC) 尾 巴 。 然 后 以 一 段 多 聚 脱氧 鸟 味 叭 核 苷 酸

(poly dG) 作 为 第 二 条 链 合成 的 引物 ,在 DNA 聚合 酶 催化 下 ,合成 出 双 链 的 DNA 分 子 。

下 一 步 是 把 合成 好 的 双 链 cDNA 分 子 与 载体 分 子 相 连 ,这 里 我 们 选用 的 载体 分 子 为 质
粒 。 质 粒 是 一 种 能 在 细菌 中 独立 进行 复制 的 染色 体外 DNA 分 子 , 呈 双 链 环 状 ,经 过 人 工 改 造
的 质粒 在 其 上 通常 有 许多 限制 性 内 切 酶 的 单个 切 点 。 选 用 一 种 限制 性 内 切 酶 将 质粒 分 子 切 断 ，
注意 不 要 破坏 质粒 的 复制 起 点 。 然 后 分 别 在 双 链 cDNA 分 子 和 线性 化 了 的 质粒 DNA 分 子 的
两 个 3.- 未 端 再 一 次 用 未 端 转移 酶 加 上 同 聚 物 尾 巴 。poly(dC) 被 加 到 cDNA 分 子 的 两 端 ,而 与
它 互 补 的 poly(dG) 被 加 到 线性 化 质粒 分 子 的 两 端 。 当 cDNA 分 子 与 质粒 分 子 混合 在 一 起 时 , 它
们 可 通过 突出 末端 的 互补 作用 相连 ,在 DNA 连接 酶 的 作用 下 ,形成 环 状 的 重组 DNA 分 子 。

在 质粒 分 子 上 ,有 一 个 抗 药 性 基因 ,我 们 也 称 之 为 选择 性 标记 。 因 为 带 有 这 种 质粒 的 细菌
对 相应 的 抗生素 不 敏感 。 若 在 培养 基 中 加 入 相应 的 抗生素 ,没有 质粒 的 细菌 就 不 能 生长 ,而 带
有 相应 质粒 的 细菌 便 会 增殖 形成 菌落 。

经 过 特殊 处 理 的 细菌 细胞 具有 吸收 外 源 DNA 的 能 力 , 我 们 把 它们 称 为 感受 态 细胞 。 当 重
组 质粒 分 子 与 感受 态 细胞 混合 , 由 于 感受 态 细 胞 的 数量 远大 于 重组 质粒 分 子 的 数量 , 因此 , 在
培养 基 上 长 出 的 单 菌 落 可 以 认为 是 由 每 一 个 重组 质粒 分 子 导 入 一 个 细菌 细胞 后 经 过 增殖 而 形
成 的 。 在 我 们 现在 所 说 的 例子 中 , 应 该 有 90%% 的 重组 质粒 分 子 编码 “或 8 珠 蛋 白 , 由 于 mRNA
分 子 通常 并 不 完全 被 反 转 录 成 cDNA 分 子 。 因 此 ， 非 全 长 的 EDNA 也 会 被 克隆 ， 要 进行 鉴定 ，
必须 测定 所 克隆 的 插入 DNA 片段 的 顺序 。 含 有 目的 基因 的 cDNA 克隆 可 按照 (图 14-11) 进
行 筛选 。

二 基因 文库 的 建立

建立 基因 文库 的 技术 原理 与 cDNA 文库 是 相似 的 ,但 是 ,由 于 构建 基因 文库 的 目的 是 要

分 离 定位 于 染色 体 上 的 基因 ,而 基因 组 DNA 的 总 长 度 通常 要 比 某 一 特定 组 织 器 官 或 细胞 中

的 mRNA 分 子 的 长 度 的 总 和 大 许多 倍 。 根 据 Clarke 和 Carbon 的 公式 不 难 知 道 ,一 个 完全 的
基因 文库 所 需 的 克隆 数 要 远 远 超过 cDNA 文库 的 克隆 数 。 例 如 ,人 和 鼠 的 基因 组 DNA 的 长 度
约 为 3 一 4X 10* bp, 如 果 要 构建 它们 各 自 的 基因 文库 ,其 中 插入 片段 的 平均 分 子 量 大 小 为

于 20 kb ,那么 必须 具有 10: 以 上 的 克隆 ,才能 保证 每 一 DNA 片段 在 文库 中 出 现 的 几率 为 99%。
由 于 插入 片段 的 大 小 对 基因 文库 的 大 小 有 着 直接 影响 ,因此 ,通常 选用 4 噬菌体 DNA 作为 载
体 分 子 , 它 所 能 克隆 的 插入 片段 的 长 度 在 20 kb 左右 。\ 叹 菌 体 DNA 的 长 度 约 有 50 kb ,但 是
中 间 部 分 的 25 kb 可 以 删 去 , 代 之 以 外 源 DNA 片段 。 经 过 这 样 重组 的 噬菌体 完全 具备 对 已.

co 细胞 的 侵 染 和 在 五 . coii 细胞 内 进行 复制 的 能 力 。
构建 基因 文库 的 第 一 步 是 从 某 一 物种 的 任 一 组 织 中 提取 基因 组 DNA .动物 的 生殖 细胞 或
早期 胚 ,以 及 植物 的 叶片 等 都 是 常用 于 提取 总 DNA 的 材料 。 然 后 ,用 限制 性 内 切 酶 消化 总
DNA, 如 果 选 用 EcoRI ,经 过 消化 后 的 DNA 片段 都 具有 粘性 未 端 , 当 DNA 片段 的 平均 长 度
为 20 kb 左右 时 终止 消化 。4 喉 菌 体 DNA 也 用 相同 的 限制 性 内 切 酶 EcoRI 降解 ,EcoRI 在 1
473

喉 菌 体 DNA 上 有 两 个 识别 位 点 ,因此 消化 后 的 ADNA 产生 一 条 25 kb 长 短 的 片段 ,这 就 是 位
于 ADNA 中 部 的 非 必需 片段 ,此 外 还 有 两 条 位 于 两 端的 短 的 DNA 片段 ,也 称 臂 。ADNA 的 中
间 部 分 可 通过 电泳 而 与 两 条 臂 分 开 。 这 时 ,可 将 ADNA 的 两 臂 与 基因 组 的 DNA 片段 混合 , 混
合 的 比例 为 1 : 1, 由 于 粘性 末端 是 互补 的 ,相当 于 正常 的 噬菌体 DNA 大 小 的 MDNA 分 子 就 会 “
形成 ,其 中 包含 有 一 段 长 度 约 为 20 kb 的 鼠 的 基因 组 DNA, 在 DNA 连接 酶 的 作用 下 ,重组

DNA 分 子 连接 起 来 。 再 从 感染 的 , co 细胞 中 提取 出 噬菌体 的 外 壳 蛋 白 ,在 体外 进行 噬菌体 。

的 组 装 。 只 有 长 度 正 常 的 ADNA 分 子 才能 被 有 效 的 包装 ,形成 具有 感染 能 力 的 噬菌体 (图
14-10) 。 含 有 重组 IDNA 分 子 的 噬菌体 感染 玖 . coz 细胞 ,在 培养 基 上 形成 叹 菌 斑 。 通过 原 位 噬
菌 班 杂交 ,我 们 便 可 确定 含有 特异 基因 的 叹 菌 体 在 培养 基 上 的 位 置 . 所 用 的 探 针 可 以 是 同位 素
标记 的 特异 mRNA 或 cDNA 分 子 以 及 其 它 物种 的 同 源 基因 组 DNA( 图 14-11)。

小 鼠 DNA 噬菌体
(~4.0 x 10? bp) 一 50 Kb 一 一 一 一 一 >
ET
ER 非 必需
(1) (2》 |
本 = 下 本 站) EAI ES |
全 3 | Eee| IE

(a) (b)

(3)

全
EEC 可

区

14-10 建立 基因 组 文库 的 原理

(1) EcoRI 酶 解 成 的 2X105 片段 ; (2)
FEcoRI 酶 解 ,去 掉 中 间 部 分 ;(3) 小 鼠 DNA 与 ，
双 臂 混合 ,粘性 未 端 ;(4) 用 ^) 有 蛋白 质 进行 包装
只 有 插入 片段 为 20 kb 左右 的 噬菌体 才 复 制 。
(Ca) 带 粘性 未 端的 20 kb 片段 !(b) 带 粘性 末端
的 双 臂 ;(c) 大 小 适 于 包装 的 重组 DNA;(d)
含有 小 鼠 基因 组 DNA 的 4 叭 菌 体 ( 为 了 使 文
库 有 90%% 一 95%% 的 可 能 性 包含 整个 小 鼠 基 因
组 ,需要 有 104 这 样 的 喉 菌 体 ) 。

474

噬 菌 斑

看

图 14-11 利用 原 位 杂交 法 从 基因 组 文库
(或 cDNA 文库 ) 中 筛选 得 到 目的 基因
《1) 将 硝酸 纤维 素 膜 置 于 平板 上 , 以 吸附 噬 菌 班 ,便于 第 四
选 出 所 需 噬菌体 !(2? 碱 性 溶液 裂解 噬菌体 ,使 释放 出 的 DNA
变性 ; (3) 与 标记 的 cDNA 或 mRNA 探 针 杂交 ,放射 自 显 是
(a) 用 叭 菌 体 文库 ( 约 含 2x 105 咬 菌 体 ) 感染 细菌 ,并 铺 到 平板
上 以 产生 噬 菌 斑 ;b) 硝 酸 纤维 素 膜 ,(c) 单 链 的 哈 菌 体 DNA 结
合 到 膜 上 ;(d) 与 探 针 序列 互补 的 噬菌体 DNA 出 现 阳性 信号 。

三 、 特 异 基因 片段 的 分 离

如 何 才能 分 离 得 到 含有 目的 基因 的 重组 DNA 分 子 , 这 是 基因 克隆 的 中 心 问题 。 基因 文库
或 cDNA 文库 中 的 目的 基因 可 利用 核酸 分 子 杂交 技术 ,抗体 与 抗原 的 特异 反应 来 筛选 获得 。
不 同 的 生物 常 具有 相同 的 基因 ,这 些 基 因 的 核 苷 酸 序列 虽然 不 尽 相 同 , 却 享有 一 定 的 同 源
性 ,因此 ,如 果 另 一 种 生物 的 同一 基因 已 被 克隆 ,那么 , 它 便 可 以 用 作 探 针 , 筛选 得 到 所 需 的 目
的 基因 。
组 织 特异 性 表达 的 基因 可 以 通过 差别 筛选 法 获得 。 具 体 的 方法 是 这 样 的 :提取 A 类 细胞
的 mRNA, 构 建 cDNA 文库 :另外 ,标记 从 mRNA 反 转 录 形 成 的 单 链 cDNA 分 子 , 以 此 由 不 同
的 单 链 cDNA 分 子 组 成 的 探 针 与 所 构建 的 cDNA 文库 进行 分 子 杂 交 。 再 提取 B 类 细胞 的
mRNA ,同样 标记 反 转 录 后 形成 的 单 链 cDNA 分 子 , 也 以 B 类 细胞 的 单 链 cDNA 为 探 针 ,与 A
类 细胞 的 cDNA 文库 进行 分 子 杂 交 。 如 果 和 A 类 细胞 中 有 相对 于 B 类 细胞 来 说 是 特异 性 表达 的
基因 ,那么 ,该 基因 应 该 只 与 A 类 细胞 的 单 链 cDNA 探 针 杂交 , 而 不 与 B 类 细胞 的 探 针 杂交 。
与 两 类 单 链 cDNA 探 针 都 杂交 的 克隆 则 是 在 A 类 和 了 B 类 细胞 中 都 表达 的 基因 。 而 与 两 类 探 针
都 不 杂交 的 克隆 则 可 能 是 由 于 其 mRNA 丰 度 较 低 导 致 无 法 检测 出 其 存在 与 否 .这 一 种 筛选 目
的 基因 的 方法 也 称 为 正 负 筛 选 法 。 同 样 原 理 ,我 们 也 可 筛选 得 到 不 同 的 发 育 时 期 不同 环境 条
件 下 特异 性 表达 的 基因 。
合成 的 寡 聚 核 苷 酸 序列 也 可 作为 探 针 ,这 尤其 适用 于 只 了 解 目的 基因 的 产物 一 -蛋白质
的 部 分 序列 时 的 情况 。 因 遗传 密码 具有 简 并 性 ,从 蛋白 质 推导 出 的 核 昔 酸 序列 与 目的 基因 的 相
应 序列 可 能 并 不 一 致 ,但 这 并 不 影响 合成 的 寡 聚 核 苷 酸 探 针 成 为 一 种 有 效 的 筛选 手段 。
如 果 目 的 基因 所 编码 的 蛋白 质 易 于 提取 ,利用 抗体 对 抗原 的 特异 性 识别 进行 筛选 也 是 一
种 很 好 的 方法 。 其 中 的 抗原 就 是 提取 得 到 的 蛋白 质 ,制备 出 该 抗原 的 抗 血 清 后 ,构建 一 个 表达
的 cDNA 文库 。 由 于 选用 了 表达 载体 分 子 , 插 入 的 基因 可 融合 到 一 个 大 肠 杆 菌 基 因 的 后 面 , 因
此 ,可 在 大 肠 杆 菌 中 诱导 表达 , 当 抗体 分 子 识别 出 表达 了 相应 抗原 的 克隆 时 也 就 是 找到 了 相应
的 含有 目的 基因 的 重组 DNA 分 子 。
如 果 打 算 克 隆 一 个 未 知 的 真 核 生 物 基 因 , 也 就 是 说 , 既 没 有 目的 基因 的 核酸 探 针 ,也 没有
基因 所 编码 的 蛋白 质 ,但 是 该 基因 与 某 一 表 型 有 关 。 在 这 种 情况 下 ,通常 采用 的 方法 是 引入 一
个 示 踪 核 昔 酸 序列 到 真 核 生 物 细胞 内 ,该 序列 可 插入 到 染色 体 上 的 某 一 位 置 ,使 所 插 人 的 位 置
的 基因 结构 发 生 改 变 , 基 因 的 失 活 引起 了 可 观察 到 的 表 型 的 变化 ,选择 表 型 变化 了 的 细胞 ，
建 其 基因 文库 ,以 示 踪 核 苷 酸 序列 作为 探 针 ,筛选 出 含有 示 踪 核 苷 酸 序列 的 插 人 片段 ,在 此
有 段 中 ,位 于 示 踪 序列 两 边 的 核 苷 酸 序列 就 应 该 是 与 该 表 型 有 关 的 基因 的 序列 .常用 的 示 踪 核
酸 有 病毒 分 子 如 反 转 录 病 毒 或 转 座 子 等 ,它们 进入 真 核 细胞 后 都 具有 整合 到 染色 体 上 的 能 力 。
分 离 目 的 基因 , 离 不 开 构建 基因 文库 或 cDNA 文库 。 如 何 决定 选用 哪 一 种 文库 呢 ? 首先 ,这
取决 于 我 们 将 采用 的 筛选 方法 .例如 : 若 采用 核酸 控 针 的 筛选 方法 , 则 两 种 文库 都 适用 。 如 果 采 用
抗体 -抗原 的 特异 性 反应 作为 筛 选 的 手段 , 则 应 选用 构建 EDNA 文库 的 方法 .其 次 ,要 考虑 目的 基
因 在 这 两 种 文库 中 的 丰 度 。 一 般 说 来 ,*DNA 文库 较 小 ,一 个 完全 的 cDNA 文库 所 含 的 克隆 数 要
比 一 个 完全 的 基因 文库 所 含 的 克隆 数 少 得 多 , 它们 之 间 相 差 可 达 10~100 倍 ,如 果 能 恰当 地 选择
mRNA 的 来 源 ,从 cDNA 文库 中 筛选 得 到 目的 基因 的 机 率 就 大 些 。 但 是 有 些 基因 组 简单 的 生物
如 :酵母 . 盘 基 网 柄 菌 等 ,目的 基因 在 基因 文库 中 的 丰 度 也 与 它 在 cDNA 文库 中 的 丰 度 相当 .此
475

外 ,从 cDNA 文库 中 分 离 得 到 的 基因 可 在 大 肠 杆菌 中 表达 , 因为 mRNA 经 过 加 工 修饰 后 , 切 掉
了 内 含 子 。 而 表达 的 产物 有 时 对 于 研究 者 来 说 是 重要 的 。 从 基因 文库 中 得 到 的 目的 基因 包含 了 完
整 的 基因 结构 信息 如 :5 -上 游 区 的 调控 序列 ,外 显 子 . 内 含 子 等 。 因 此 ,要 研究 基因 的 完整 结构 ，
如 确定 内 含 子 在 基因 中 的 精确 位 置 , 则 具有 来 自 这 两 种 文库 的 目的 基因 是 必 不 可 少 的 。

\ 酵 母 人 工 染色 体 (YAC) 克 隆 系统

利用 酵母 载体 产生 的 酵母 人 工 染 色 体 .
(YAC) 克 隆 系统 可 以 克隆 和 分 离 极 大 的 DNA 片
段 ( 达 数 百 千 碱 基 对 ), 从 而 代替 》 噬菌体 载体 和
粘 粒 载体 构建 文库 。 酵 母 人 工 染 色 体 系统 中 必须
包括 下 列 序列 (图 14-12) :

一) 着 丝 粒 (CEN )

已 克隆 的 真 核 着 丝 粒 , 每 一 个 着 丝 粒 都 有 一
个 数字 , 对 应 于 原先 所 在 的 染色 体 . 着 丝 粒 使 染色
体 在 分 裂 过 程 中 能 正确 分 配 到 子 细胞 中 。

(二 ) 两 个 端 粒 CTEL)

它 是 染色 体 末 端 复制 所 必需 的 ,而 且 可 防止
染色 体 被 核酸 外 切 酶 逐步 降解 。

(三 ) 复 制 起 始点 (ARS1) BamHI

它 可 使 DNA 在 酵母 细胞 中 自主 复制 。

(四 ) 选 择 标记 14-12， 酵 母 人 工 染 色 体 系统

利用 它 可 在 酵母 细胞 中 鉴别 筛选 转化 子 ( 如 TRP1 和 URA3)。

五) 原核 序列

如 天 .col 复制 启 始 位 点 和 az 基因 。

(六 ) 限 制 酶 切 点

便于 插 和 人 外 源 DNA。

利用 YAC 系统 克隆 的 主要 过 程 是 ,用 切割 位 点 较 少 的 限制 酶 部 分 酶 切 基因 组 DNA( 如
EcoRI ) 用 脉冲 凝 胶 电泳 分 离 , 纯 化 出 大 小 为 200 一 500 kb 的 片段 。YAC4 载体 用 EcoRI 和
BaxzHI 切割 ,去 掉 两 个 BamHI 切 点 间 的 序列 , 将 产生 的 载体 两 臂 与 带 有 EcoRI 末端 的 外 源 片
段 连接 , 并 通过 原生 质 体 转化 到 酵母 细胞 中 ,筛选 Ura“ 和 Trp* 以 保证 两 臂 都 存在 .另外 ,所 使 用

的 宿主 带 有 赭 色 突变 , 当 载 体 带 有 插 和 人 顺序 时 ,菌落 成 红色 。 仿

第 六 节 “核酸 的 序列 分 析

测定 DNA 核 苷 酸 序列 的 方法 现在 有 两 种 ,一 是 化 学 法 ,又 叫 Maxam-Gilbert 法 ; 另 一 种

是 双 脱 氧 法 ,又 叫 酶 法 ,Sanger 法 或 链 终止 法 ,两 种 序列 分 析 方 法 的 原理 在 本 书 第 三 章 中 已 经
476

一 .DNA 核 背 酸 序 列 的 测定

做 过 介绍 。 这 两 种 方法 都 是 要 产生 标记 的 不 同 长 度 的 成 套 DNA 片段 ,各 个 带 有 标记 片段 的 起
点 相同 ,终点 不 同 , 使 DNA 链 中 的 每 个 核 苷 酸 处 都 有 DNA 的 断裂 或 终止 ,通过 聚 丙 烽 酰胺 电
泳 ,能 够 将 相差 一 个 核 苷 酸 的 DNA 片段 分 开 , 用 适当 的 检测 手段 读 出 核 苷 酸 序列 ,再 通过 计
算 机 分 析 得 到 一 个 完整 的 DNA 序列 。
(一 ) 双 脱氧 法 分 析 DNA 核 背 酸 序列
Sanger 发 明了 使 用 双 脱 氧 核 苷 酸 分 析 DNA 序列 的 方法 ,其 原理 是 在 体外 合成 DNA 的
同时 挫 人 使 DNA 链 合成 终止 的 抑制 剂 , 与 四 种 脱氧 核 苷 酸 按 一 定 比例 混合 ,并 以 之 为 底 物 参
与 DNA 的 体外 合成 。 通 常 模板 链 是 一 条 单 链 DNA ,通过 将 一 段 待 测 DNA 片段 克隆 到 M13
鸣 菌 体 ( 第 十 一 章 ) 或 其 衍生 载体 上 而 得 到 ,DNA 的 合成 由 一 个 通用 引物 (universal primer) 开
始 , 该 引物 与 M13 的 多 克隆 位 点 区 相 邻 的 区 域 互补 。 因此 ,无 论 被 克隆 的 DNA 片段 序列 如 何 ，
都 可 以 使 用 相同 的 DNA 合成 引物 来 进行 DNA 序列 分 析 。 双 链 DNA 的 序列 分 析 基 本 原理 也 是 相
同 的 ,只 是 在 方法 上 要 加 以 修正 , 一般 双 链 DNA 序列 分 析 每 组 反应 所 能 得 到 的 序列 长 度 不 如 单 链
DNA 序列 分 析 每 套 反应 所 能 读 出 的 核 苷 酸 序 列 长 。
通常 使 用 的 DNA 链 终止 抑制 剂 是 4 种 ,2 ,3 - 双 脱 氧 三 磷酸 核 苷 酸 (ddATP,ddCTP，
ddGTP 和 ddTITP), 这 4 种 双 脱 氧 核 背 酸 的 3 位 没有 DNA 链 延 长 所 必需 的 羟基 ,所 以 在
DNA 合成 中 当 挫 人 一 个 ddNTP 时 ,DNA 链 的 延长 就 被 终止 。DNA 序列 分 析 的 体外 合成 反
应 一 般 是 在 4 个 试管 中 分 别 进行 的 ,每 个 试管 中 含有 一 种 ddNTP, 反 应 底 物 中 还 要 含有 一 种
放射 性 标记 的 核 苷 酸 ( 常 为 [*“S]-ATP 或 ["PJ-ATP), 在 DNA 聚合 酶 作用 下 ,使 DNA 模板 的
互补 链 能 够 被 合成 ,并 随机 地 挫 人 双 脱 氧 核 苷 酸 ,使 DNA 链 的 延长 终止 。 因 此 ,每 个 反应 中 就
产生 了 一 套 长 短 不 同 的 放射 性 标记 的 单 链 DNA 片段 ,这 些 长 度 各 异 的 DNA 片段 在 5 -末端
都 是 相同 的 ,而 3' 端 是 以 一 种 ddNMP 结束 的 。 将 4 种 反应 混合 物 在 变性 条 件 下 进行 高 分 辨 率
的 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 (可 以 分 辩 长 度 相 差 一 个 核 苷 酸 的 单 链 DNA)， 经 放射 性 自 显影 ,就 可
以 读 出 被 测定 的 DNA 片 段 的 核 苷 酸 序 列 ( 图 14-13) .由 于 DNA 复 制 时 是 从 5' 到 3' 进行 的 ,所

省
2 (b)

有 的 二 三 -一 王 一 --
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一 一 一 变性 .电泳 分 离

图 14-13” 双 脱氧 法 DNA 序列 分 析 示 意图
(Ca) 用 一 段 5 -末端 标记 的 赛 聚 脱氧 核 苷 酸 引物 与 待 测 的 单 链 DNA 杂交 ,然后 分 别 进行 4 套 反应 ,在 DNA 聚合 酶 的 作
用 下 DNA 引物 被 延长 ,每 个 反应 中 都 含有 4 种 正常 的 脱氧 核 苷 酸 再 加 上 一 种 双 脱 氧 三 磷酸 核 苷 酸 。 当 DNA 合成 时 向 DNA
链 中 引入 一 个 双 脱 氧 核 苷 酸 时 ,DNA 链 的 合成 被 提前 终止 。 每 个 反应 混合 物 在 高 分 辩 率 的 聚 两 烯 酰胺 变性 电泳 胶 中 分 离 ，
经 放射 性 自 显影 可 以 读 出 核 苷 酸 序列 ! b)DNA 的 核 苷 酸 序列 测定 的 放射 性 自 显影 图 ,反应 所 用 的 酶 为 sequenase, 每 个 反
应 做 了 两 次 重复 ,以 便于 互相 证 明 测 序 的 准确 性 。
477

以 靠近 5 端的 DNA 链 较 短 , 读 序列 时 是 从 胶 的 底部 读 起 。
双 脱 氧 法 序列 分 析 需 要 一 种 酶 来 催化 DNA 的 合成 ,过 去 通常 使 用 的 是 大 肠 杆菌 DNA 到
合 酶 工 的 大 片段 (klenow fragment) ,现在 多 使 用 经 过 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 (sequenase 和
sequenase 2. 0) ,经 过 改造 的 T7 DNA 聚合 酶 可 以 更 均匀 地 使 dNTP 和 ddNTP 失信 到 新 合成
的 DNA 链 中 ,产生 放射 性 强度 较为 一 致 的 DNA 条 带 。 也 有 人 使 用 耐 热 的 Taq(TAerzars
adxaticxs) 聚 合 酶 。 这 种 酶 最 初 用 于 聚合 酶 链 式 反 应 ,而 用 于 核 苷 酸 序列 的 测定 并 不 十 分 理想 ，
它 所 生成 的 DNA 带 的 强度 均一 性 不 是 很 好 ,但 由 于 它 能 在 较 高 的 温度 下 催化 DNA 的 合成 反
应 ,用 它 对 容易 形成 二 级 结构 的 DNA 片段 进行 序列 分 析 较 为 合适 。
有 些 DNA 在 某 一 片段 中 含有 大 量 的 GC ,容易 形成 发 夹 形 二 级 结构 ,使 得 这 一 区 域 的 核
苷 酸 序列 难以 测 出 。 为 解决 这 一 问题 ,可 以 使 用 更 加 严格 的 变性 电 沪 条件, 例如 在 电泳 胶 中 加
和 人 甲 酰胺 ,或 将 电泳 时 凝 胶 的 温度 提高 ,如 果 通 过 改变 电泳 条 件 不 能 解决 问题 时 ,可 以 使 用
dGTP 的 类 似 物 代替 dGTP ,常用 的 类 似 物 有 dITP 和 7- 脱 氮 dGTP(7-deaza-dGTP)。 使 用 这
些 类 似 物 所 得 到 DNA 序列 分 析 图 谱 质 量 偏 低 , 因 此 只 有 在 改变 电泳 条 件 无 效 的 情况 下 才 使
用 dGTP 的 类 似 物 。
在 分 析 DNA 序列 分 析 的 电泳 结果 时 ,过 去 都 是 将 直接 从 放射 性 自 显影 图 谱 上 读 取 的 数
据 人 工地 输入 电子 计算 机 , 当 序 列 较 长 或 数据 较 多 时 很 容易 发 生 错误 ,现在 有 一 种 自动 化 数据
输入 设备 (graf bar) ,将 其 放 在 光源 匣 的 上 面 , 它 有 一 种 像 笔 一 样 的 装置 , 当 用 其 尖端 向 每 一 条
带 按 下 时 , 可 以 使 记录 器 记 下 各 个 电泳 道中 每 一 个 条 带 的 位 置 并 输入 到 计算 机 中 ,这 样 即 方便 是
了 序列 分 析 数 据 的 阅读 , 又 大 大 减少 了 出 错 的 机 会 。 1
双 脱 氧 法 DNA 序列 分 析 现 在 已 经 成 了 普通 实验 室 都 可 以 掌握 的 常规 手段 ,与 最 初 相 比
也 有 了 很 多 改进 ,使 得 一 次 分 析 能 够 比较 容易 地 测 出 1 000 bp 以 上 .标记 的 方法 一 般 使 用 随机
标记 法 ,即将 一 种 放射 性 标记 的 或 荧光 标记 的 三 磷酸 脱氧 核 苷 酸 按 -一定 比例 挨 人 底 物 中 ,使 之
能 随机 地 挫 人 到 新 合成 的 DNA 链 中 去 。 这 样 就 增加 了 灵敏 度 。 由 于 DNA 测序 多 为 重复 性 的
操作 ,人 们 在 不 断 地 探索 各 种 自动 化 的 途径 , 目前 已 能 将 DNA 序列 分 析 部 分 地 自动 化 ,一 些
公司 推出 了 体外 合成 反应 和 产物 分 离 数据 读 取 的 自动 化 仪器 设备 ,大 大 提高 了 测序 的 速度 和
准确 度 , 扩 大 了 其 应 用 范围 。 自 动 化 分 析 DNA 序列 的 仪器 和 药品 目前 还 很 昂贵 ,因此 一 般 实
验 室 还 是 以 手工 测序 为 主 。
(二 )DNA 核 苷 酸 序列 的 化 学 法 测定
用 特异 的 化 学 裂解 法 测定 DNA 的 核 背 酸 序列 是 由 Allan Maxam 和 Walter Gilbert 首先
研究 成 功 的 .用 这 一 方法 进行 核 音 酸 序列 测定 ,首先 要 制备 末端 标记 (通常 是 用 放射 性 2P 进行
标记 ) 的 单 链 DNA 。 可 以 用 多 核 苷 酸 激酶 将 LY-?P]-ATP 的 [LY-?P] 磷 酸 引 入 双 链 DNA 的 纪 - |
末端 ,再 用 限制 性 内 切 酶 从 一 端 切 掉 一 小 段 并 将 切 下 部 分 除去 ,就 得 到 了 放射 性 标记 的 单 链
DNA( 图 14-14)。 用 适当 的 化 学 试剂 处 理 标记 的 单 链 DNA ,使 标记 的 DNA 在 4 种 核 苷 酸 中 的
一 种 核 苷 酸 处 断 开 。 这 一 处 理 的 条 件 是 至 关 重 要 的 , 一 定 要 使 每 个 分 子 断 裂 的 次 数 平 均 少 于 或
等 于 一 次 。 这 样 就 得 到 了 从 放射 性 标记 物 到 DNA 链 中 每 个 特异 性 核 苷 酸 处 的 各 种 长 度 的 放
射 性 DNA 片段 的 群体 。

假如 DNA 的 顺序 是 5 P-ACGTACGT-3 ,那么 在 4 种 核 苷 酸 处 分 别 断 裂 后 就 产生 了 14
组 放射 性 的 群体 :

478

第 一 个 反应 ,在 A 处 断裂 *P-ACGT

第 二 个 反应 ,在 C 处 断裂 2P-A 和 3P-ACGTA

第 三 个 反应 ,在 G 处 断裂 2?P-AC 和 ??P-ACGTAC

第 四 个 反应 ,在 工 处 断裂 2?P-ACG 和 ?2P-ACGTACG
将 这 4 组 片段 进行 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 分 离 ,就 可 以 将 不
同 长 度 的 相差 为 一 个 核 苷 酸 的 DNA 片段 分 开 。

常用 的 使 DNA 特异 性 断裂 的 化 学 方法 如 下 :

磷酸 二 甲 酯 能 破坏 味 叭 , 它 使 鸟 顺 叭 在 N-7 位 和 腺 明
叭 在 N-3 位 甲 基 化 , 甲 基 化 嘎 叭 的 糖苷 键 在 中 性 pH 条 件
下 加 热 断 裂 ,使 味 叭 碱 基 脱 掉 , 再 在 碱 性 条 件 下 加 热 就 使 骨
架 断 裂 及 糖 基 消除 。 因 为 鸟 味 叭 甲 基 化 的 速度 远 比 腺 味 叭
快 ,所 以 这 样 处 理 主要 造成 DNA 在 鸟 叮 叭 处 的 断裂 (图
14-14 中 的 G 道 ); 相 反 , 甲 基 化 腺 苷 的 糖苷 键 却 不 如 甲 基
化 鸟 苷 的 糖苷 键 稳定 ,因此 甲 基 化 以 后 如 用 稀 酸 处 理 主要
放出 腺 味 叭 (图 14-14 中 的 A 道 ) 。

胞 喀 辽 和 胸腺 喀 啶 可 以 在 肝 作 用 下 分 解 , 骨 架 由 六
吡啶 断裂 。 六 氧 吡啶 可 以 从 DNA 链 上 去 掉 肝 反 应 产物 ,并
消除 磷酸 酯 。 这 些 反 应 使 DNA 在 胞 喀 啶 和 胸腺 喀 啶 处 的
断裂 (C 十 T 道 )。 为 了 区 别 胞 喀 啶 和 胸腺 喀 啶 的 断裂 位 点 。
可 以 将 肝 解 反应 在 2 mol/L NaCl 存在 的 条 件 下 进行 ,这 时
胸腺 喀 啶 的 反应 受到 抑制 ,使 得 DNA 链 断 裂 主要 发 生 在
胞 喀 啶 处 (C 道 ) 。

用 X 射线 胶片 对 电泳 胶 进行 放射 性 自 显影 ,就 可 以 从
胶片 上 读 出 所 要 分 析 的 DNA 的 序列 。 通 过 比较 凝 胶 上 G，
A,C+T 和 C 道 的 放射 性 区 带 ,就 可 以 读 出 DNA 的 顺序
(图 14-14) ,因为 最 短 的 片段 迁移 速度 最 大 ,所 以 距 放 射 性

| 标记 近 的 一 端 (5' 端 ) 从 胶 的 底部 读 起 。

化 学 断裂 法 经 常用 于 分 析 较 短 的 DNA 链 , 例如 检测
人 工 合成 的 赛 聚 核 苷 酸 和 分 析 蛋 白 结合 区 的 核 苷 酸 序列 。

| 有 时 一 些 DNA 序列 由 于 二 级 结构 的 存在 很 难 用 双 脱 氧 法
* 测 准 , 这 时 使 用 化 学 法 序列 分 析 比 较 合适 .有 一 种 改进 的 化

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六
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C
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长 6

本

14-14 _DNA 序列 的 化 学 法 测定

41) 首 先 制备 末端 标记 的 单 链 DNA 片
段 , 将 4 个 相同 的 含有 末端 标记 的 DNA 片
段 样品 做 化 学 处 理 ;(2) 使 它们 分 别 在 A，
G'C+TI 或 上 处 断裂 ,化 学 反应 的 程度 要
控制 得 使 每 个 标记 的 DNA 片段 只 断裂 一
次 ,使 被 断 开 的 标记 的 DNA 在 一 端 带 有 标
记 , 另 一 端 为 化 学 处 理 的 断 点 ;(3) 将 4 个
样品 分 别 进 行 凝 胶 电 泳 分 离 和 放射 性 自 显
影 ,可 以 使 各 个 电泳 道中 的 核 苷 酸 断 裂 点
被 读 出 来 ;(4)A 道 和 G 道中 的 带 可 以 分 别
地 直接 读 A 和 G, 同 时 出 现 于 C+T 道 和
C 道 的 放射 性 自 显影 带 读 作 C ,而 只 在 C 十
工 道中 出 现 的 带 被 读 做 了 。

学 测序 方法 ,也 可 以 用 于 很 大 的 DNA 片段 的 核 苷 酸 序列 分 析 LPNAS(1984)81:1991 一 1995]。

(三 ) 待 测 DNA 片段 的 亚 克 隆

一 般 测 序 的 DNA 片段 都 比较 长 ,不 能 通过 一 次 测定 反应 就 能 够 得 到 所 要 的 全 序列 。 因

此 ,需要 对 待 测 的 DNA 片段 进行 亚 克 隆 ,即将 一 个 完

的 DNA 片段 被 分 成 若干 个 有 一 定 程

度 重 本 的 较 小 的 DNA 片段 ,并 使 之 能 在 适当 的 载体 (如 M13) 上 得 到 扩 增 ,这 一 过 程 称 为
DNA 片段 的 亚 克 隆 过 程 , 每 一 个 较 小 的 DNA 片段 都 是 DNA 大 片段 的 一 个 亚 克 隆 。 将 测 得 的
每 一 个 亚 克 隆 的 DNA 序列 进行 计算 机 分 析 , 根据 亚 克 隆 之 间 的 重 释 序列 排出 各 个 亚 克 隆 的

前 后 次 序 , 最 后 排 定 整 个 DNA 片段 的 核 苷 酸 顺序 。

479

用 双 脱 氧 法 测定 DNA 序列 一 般 是 将 待 测定 的 DNA 片段 克隆 到 M13mp 鸣 菌 体 或 其 衍
生 载 体 上 ,用 下 面 4 种 手段 进行 全 序列 的 分 析 , 一 是 根据 测 出 的 DNA 核 苷 酸 序列 合成 DNA
片段 内 部 的 寡 聚 核 背 酸 引 物 ,逐步 完成 全 序列 的 测定 。 这 一 做 法 的 缺点 是 大 的 DNA 插 人 片段
在 载体 上 可 能 不 太 稳 定 ,而 且 合成 新 的 引物 需要 花 去 大 量 的 经 费 和 较 多 的 时 间 。 第 二 种 做 法 是
将 DNA 克隆 在 靠近 通用 引物 的 一 端 进行 不 同 程度 的 缺失 处 理 , 然 后 用 通用 的 M13 引物 进行
序列 分 析 。 这 一 方法 的 缺点 之 一 也 是 比较 大 的 亚 克 隆 可 能 不 太 稳定 ,缺点 之 二 是 可 能 需要 花 很
长 时 间 才 能 得 到 最 佳 状 态 的 亚 克 隆 。 第 三 种 方法 是 用 限制 性 内 切 酶 将 待 测定 的 DNA 切 成 较 .
小 的 片段 ,再 分 别 进行 克隆 和 序列 分 析 , 但 有 时 在 DNA 片段 的 某 些 部 分 难以 找到 很 方便 的 限
制 性 内 切 酶 位 点 。 第 四 种 方法 是 将 DNA 随机 降解 成 较 小 的 DNA 片段 (常用 超声 波 方法 ), 再
将 这 些 降解 的 片段 进行 克隆 和 测序 。 这 种 方法 在 一 开始 需要 对 实验 条 件 进 行 一 些 摸索 ,以 后 的
步骤 比较 快 。 对 一 段 DNA 进行 序列 分 析 , 往往 要 用 以 上 提 到 的 两 种 以 上 方法 的 结合 才能 完成 。

二 .RNA 的 序列 分 析

远 在 DNA 序列 分 析 方法 出 现 以 前 ,RNA 序列 分 析 就 可 以 用 碱 基 特 异性 核酸 酶 进行 了 ，
但 随 着 方便 快速 的 DNA 序列 分 析 方法 的 出 现 ,RNA 序列 分 析 就 显得 比较 慢 且 不 十 分 方便 。
尽管 现在 测定 RNA 序列 已 经 采用 了 一 些 DNA 核 苷 酸 顺 序 测定 的 技术 和 方法 ,但 要 直接 测定
一 个 RNA 分 子 的 核 苷 酸 序列 可 能 需要 使 用 几 种 不 同 的 方法 才能 完成 。

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14-15 RNA 序列 分 析

A. 双向 迁移 率 改 变法 分 析 15 个 碱 基 的 RNA 片段 的 核 苷 酸 顺 序 。 用 了 1l 核酸 酶 部 分 降解 以 后 ,用 高 压 电泳
(第 一 向 ) 和 同系 层 析 (第 二 向 ),15 个 核 苷 酸 的 排列 顺序 可 以 根据 已 知 的 迁移 速率 数据 被 分 析出 来 ,5'- 末 端 标记
的 寡 聚 核 苷 酸 是 从 胶 的 顶部 (5 ' 端 ) 向 底部 (3' 端 ) 读 起 的 。# 为 指标 剂 二 甲苯 蓝 的 位 置 ;B. 部 分 酶 解法 分 析 RNA
序列 。RNA 的 片段 在 8 mol/L 尿素 存在 的 条 件 下 被 碱 基 特 异性 的 核酸 酶 部 分 降解 后 ,用 含 8 mol/L 尿素 的
20%(W/V) 又 丙烯 酰胺 电泳 分 离 。 正 :没有 外 加 的 核酸 酶 ;TI1 : T1 核酸 酶 ; U2 : U2 核酸 酶 !H+ : 0. 1 mol/L
H2SO4;S3 : pH 3. 5 时 金黄 色 葡萄 球菌 核酸 酶 ;S7 :pH 7.5 和 10 mmol/L CaCl, 时 金黄 色 葡 萄 球菌 核酸 酶 。
5 -末端 标记 的 寡 聚 核 苷 酸 在 读 序 时 从 底部 (5') 向 顶部 (3') 读 起 。

480

NE

(一 )RNA 的 纯化

为 避免 非特 异性 的 降解 ,RNA 的 纯化 要 尽 可 能 快 地 在 变性 条 件 下 进行 ,所 有 的 材料 和 溶
液 都 要 严格 消毒 .对 于 小 分 子 的 RNA 分 子 (如 tRNA,5S rRNA,snRNA 等 ) 进 行 纯化 ,最 有 效
的 方法 是 双向 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳 或 单 向 变性 电泳 与 非 变性 电泳 结合 .而 对 分 子 量 大 的 RNA
分 子 如 病毒 的 基因 组 RNA 或 大 的 rRNA ,不 能 直接 从 细胞 中 分 离 , 从 纯化 的 病毒 粒子 或 核糖
体 中 进行 分 离 纯化 效果 要 好 得 多 .这些 分 子 量 较 大 的 RNA, 也 包括 mRNA 通常 都 经 过 反 转 录

合成 cDNA, 然 后 分 析 其 cDNA 核 苷 酸 序列 。

(二 )RNA 的 末端 标记

RNA 的 序列 分 析 中 , 对 末端 的 标记 是 必 不 可 少 的 。 要 对 RNA 的 5 端 进行 放射 性 磷酸 标
记 , 一 定 要 有 一 个 5 -羟基 ,帽子 结构 要 用 烟草 酸性 焦 磷 酸 酶 和 磷酸 酶 除去 ,5 端 磷酸 化 的
RNA 要 经 碱 性 磷酸 酯 酶 脱 磷 , 并 将 此 酶 失 活 。5' 端 脱 磷 的 RNA 可 以 用 高 比 活性 的 T4 多 核 苷
酸 激酶 (PNK) 磷 酸化 ,PNK 可 以 将 L-”P]-ATP 的 [Y-”P]- 磷 酸 转移 到 RNA 的 5 -末端 。 对
RNA 的 3'- 末 端 进行 标记 一 般 用 T4 RNA 连接 酶 将 [5'-?P]-pCp 连接 到 RNA 的 3' -末端 。

(三 )RNA 序列 测定
测定 由 15 个 以 下 核 苷 酸 组 成 的 序列
可 以 在 末端 标记 后 进行 部 分 碱 水 解 或 P1
核酸 酶 部 分 降解 ,再 通过 双向 电泳 分 离 (本
酸 纤维 素 高 压 电 泳 和 DEAE 纤维 素 板 同
系 层 析 ) 将 不 同 长 度 的 带 有 标记 的 寡 聚 核
苷 酸 分 离开 ,再 根据 已 知 的 迁移 参数 (参看
酶 学 方法 Methods in Enzymology. 59
p58 一 109. ) 确定 出 赛 聚 核 苷 酸 序 列 ( 图
14-15A) 。
末端 标记 的 RNA 分 子 也 可 以 用 碱 基
特异 性 的 RNA 酶 的 部 分 降解 来 进行 核 苷
酸 序列 的 测定 .用 这 些 酶 处 理 后 ,末端 标记
的 RNA 分 子 经 过 高 分 辩 率 的 聚 丙烯 酰胺
凝 胶 电 泳 分 离 , 就 可 以 像 DNA 序列 的 化
学 法 测定 一 样 , 读 出 RNA 的 核 苷 酸 排列
顺序 。 碱 基 特 异性 好 的 RNA 酶 有 RNA 酶
T1(G 专 一 性 ) 和 RNA 酶 U2(A 专 一 性 )，
但 目前 还 没有 找到 专 一 性 地 作用 于 C 或
U 的 RNA 酶 .PhyM RNA 酶 作用 于 WU 和
A , 蜡 状 芽 胞 杆菌 (Baczlus cerexs)RNA 酶
专 一 性 地 作用 于 C 和 U, 金 黄色 葡萄 球菌
(Sazpjylococczs azrets ) 核酸 酶 在 PH 7. 5
时 特异 性 地 作用 于 A 和 U, 但 这 一 活性 和
PhyM RNA 酶 不 同 的 是 它 作 用 于 U 和 AA
前 面 的 磷酸 酯 键 ,使 得 断裂 后 带 有 放射 性

一 30

1 6040844446 608110000 116 11168 风 | 有

全 ->

|
A JAY C CILUTIURERN 志

图 14-16 tRNA 的 序列 分 析

A. 将 tRNA 用 沸水 浴 部 分 降解 ,降解 片段 用 放射 性
酸 进行 5' -末端 标记 , 再 用 12. 5% 聚 丙烯 酰胺 电泳 (加 8
mol/L 尿素 ) 分 离 , 将 每 条 放射 性 条 带 所 对 应 的 RNA 片段
分 别 洗 脱 回收 ,再 用 P1 核酸 酶 彻底 降解 ,用 薄 层 层 析 鉴定
被 未 端 标记 的 核 苷 酸 B,C+B,C. 纤维 素 薄 层 层 析 鉴 定 5/-
末端 标记 的 核 苷 酸 。

481

标记 的 部 分 在 电泳 图 谱 中 向 前 移动 一 位 (图 14-15 B)。 在 pH 3.5, 且 没有 Ca ”存在 的 情况 下 ，
金黄 色 葡萄 球菌 RNA 酶 表现 为 喀 啶 专 一 性 ,有些 像 螨 状 芽 胞 杆菌 核酸 酶 ,但 对 喀 啶 与 腺 味 叭
之 间 的 键 有 更 强 的 专 一 性 。 部 分 酶 解法 分 析 RNA 的 核 苷 酸 序列 具有 一 定 的 优点 , 即 速度 较
快 , 反 应 不 受 RNA 分 子 二 级 结构 的 影响 ,并 且 现 在 已 经 有 商品 化 的 试剂 盒 投放 市 场 。 其 缺点
是 不 能 测定 出 RNA 分 子 中 的 稀有 碱 基 。 对 于 带 有 修饰 基 团 的 RNA, 可 以 通过 对 碱 基 特 异性
修饰 的 方法 来 测定 碱 基 顺 序 .。 其 原理 是 将 RNA 的 3' 端 用 放射 性 基 团 进 行 标记 ,再 用 碱 基 特 异
性 试剂 将 核 苷 酸 的 碱 基 去 掉 或 将 碱 基 的 芳香 环 打 开 , 使 RNA 在 受 损伤 部 位 的 肝 解 。 通 过 电泳
分 离 后 ,得 到 核 苷 酸 的 序列 。 在 用 酶 解法 测定 RNA 碱 基 序 列 时 ,一 般 需 要 一 个 碱 基 阅 读 梯 度
作为 参考 , 即 随机 地 在 每 个 碱 基 处 降解 ,可 以 通过 部 分 地 酸 水 解 或 碱 水 解 来 得 到 (图 14-15 B) 。

对 一 些 不 适合 作 5 -未 端 标记 的 RNA( 如 tRNA 或 5S rRNA), 可 以 采用 Stanley 和 Vas-
silenko 发 明 的 方法 来 完成 序列 分 析 , 这 种 方法 是 将 RNA 用 化 学 方法 随机 地 降解 ,可 以 将
RNA 溶 于 薰 馅 水中, 在 沸水 浴 中 加 热 30 s 左右 ,使 每 个 分 子平 均 断 裂 一 次 (要 靠 实验 得 到 最
佳 条 件 ) ,产生 一 系列 不 同 长 度 的 RNA 片段 , 且 又 不 受 RNA 二 级 结构 的 影响 。 然 后 用 [7-?P]
ATP 和 了 PNK 将 带 有 5 -末端 羟基 的 RNA 片段 进行 放射 性 标记 ,经 过 电泳 分 离 后 , 便 可 纯化
得 到 每 一 种 5 -末端 标记 的 RNA 片段 ,再 将 这 些 纯化 的 片段 完全 水 解 ,进一步 鉴定 其 5 -未 端
的 核 苷 酸 ,就 可 以 推算 出 整个 RNA 分 子 的 碱 基 顺 序 ( 图 14-16) 。

三 、 基 因 转 录 起 始 位 点 的 确定

有 时 确定 mRNA 转录 的 DNA 起 始 位 点 是 很 重要 的 ,有 两 种 方法 可 以 完成 这 一 工作 :S1
内 切 酶 法 或 引物 延伸 技术 。 首 先 要 根据 序列 分 析 数 据 找 到 DNA 分 子 上 含有 转录 起 始 位 点 的
区 域 ,再 用 限制 性 内 切 酶 将 这 一 片段 ( 约 100 个 核 苷 酸 ) 切 掉 并 分 离 出 来 ,将 5- 未 端 进行 放射
性 标记 , 然后 与 mRNA 进行 分 子 杂 交 , 再 用 S1 内 切 酶 将 未 杂交 部 分 的 单 链 切 掉 , 最 后 通过 变
性 电泳 得 到 标记 的 单 链 DNA 片段 ,经 过 序列 分 析 就 可 以 确定 起 始 位 点 的 确切 位 置 (图 14-17
b)。 引 物 延 伸 技 术 的 原理 与 此 相似 ,用 一 段 标记 的 与 mRNA 靠近 5' 端 互补 的 守 聚 核 苷 酸 ,使
之 与 mRNA 杂交 ,然后 用 反 转 录 酶 合成 mRNA 的 5 端 互 补 DNA, 变 性 后 电泳 分 析 mRNA 的
转录 起 始 位 点 (图 14-17 a) 。

元 5 5

| 5 | sa
| 变性 ,电泳 变性 电泳
Luuuuuuuuuuo Unuuuuuuuw

车
图 14-17 DNA 中 由 RNA 所 对 应 的 起 始 位 点 的 测定

Ca) 引物 延伸 法 :合成 一 个 与 mRNA 完全 互补 的 守 聚 核 苷 酸 并 进行 放射 性 末端 标记 , 当 与 mRNA 杂交 之 后 ,用 反 转 有 录
酶 合成 mRNA 的 cDNA。 变性 后 得 到 放射 性 的 单 链 DNA ,可 以 测 得 在 DNA 中 对 应 于 mRNA 第 一 个 核 苷 酸 的 位 置 ; (b)S1
内 切 酶 法 :制备 一 段 末 端 标记 的 单 链 DNA( 约 100 个 核 苷 酸 ), 其 序列 是 已 知 的 , 且 对 应 于 mRNA 5' -末端 及 其 上 游 区 。 当 这
段 DNA 与 mRNA 完全 杂交 之 后 ,用 S1 内 切 酶 进行 酶 切 处 理 , 去掉 没 有 杂交 的 单 链 部 分 ,经 变性 后 ,就 得 到 了 放射 性 标记 的
单 链 DNA ,可 以 由 此 得 知 mRNA 起 始 位 点 所 对 应 的 DNA 的 位 置 。

482

|

第 七 节 “聚合 酶 链 式 反 应 技术 及 其 应

自 1985 年 Kerry Mnullis 发 明 DNA 聚合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction ，PCR ) 技
术 以 来 ,这 一 技术 已 经 在 很 大 程度 上 代替 了 传统 的 DNA 克隆 方法 。 利 用 PCR 技术 能 够 从 复
杂 的 DNA 分 子 群 体 中 选择 性 地 复制 一 段 特 异 的 序列 ,使 某 一 DNA 片段 得 到 特异 性 的 扩 增 。
同时 这 一 技术 也 在 很 多 方面 得 到 了 广泛 的 应 用 。

一 ` 基 本 原理

如 图 14-18 所 示 , 将 提取 的 总 DNA 用 限制 性 内 切 酶 切 成 片段 (或 用 cDNA) ,变性 后 使 之
成 为 单 链 ,变性 后 的 DNA 将 作为 DNA 聚合 酶 链 式 反 应 的 模板 。 合 成 分 别 与 待 扩 增 的 双 链
DNA 片段 两 条 链 的 3 端 互 补 的 寡 聚 核 苷 酸 引 物 (一 般 每 个 引物 多 于 15 个 核 苷 酸 ), 然 后 在 50
一 60C 的 温度 下 将 过 量 的 引物 加 入 到 少量 的 DNA 样品 中 ,这 时 DNA 保持 单 链 状态 , 而 合成
的 特异 性 的 引物 能 够 与 其 互补 序列 杂交 , 这些 杂 交 上 的 寡 聚 核 苷 酸 将 作为 引物 ,参与 合成 模板
DNA 的 互补 链 。 加 入 三 磷酸 核 苷 酸 (dNTP) 和 机 热 的 DNA Tad 聚合 酶 后 ,DNA 合成 反应 开

循环 长 链 特异 性 链

了 0 2 0

图 14-18 ”聚合 酶 链 式 反应 示意 图
双 链 DNA 分 子 ( 细 长 箭头 ) 经 过 热 变性 后 ,用 两 个 与 待 扩 增 DNA 片段 相 邻 的 核 苷 酸 序列 互补 的 赛 聚 核 苷 酸 引 物 与 变
性 DNA 一 起 退火 ,再 用 一 种 DNA 聚合 酶 使 引物 延长 ,变性 -退火 -延长 构成 了 一 个 DNA 扩 增 反应 循环 , 像 这 样 的 循环 可 以
重复 多 达 40 次 ,使 特异 性 DNA 片段 得 到 扩 增 。

483

始 ,Taq 聚合 酶 能 在 高 达 72C 的 条 件 下 进行 反应 。 当 反应 完成 时 ,将 反应 混合 物 加 热 到 95C 使
新 合成 的 DNA 双 链 变性 , 当 温 度 下 降 以 后 ,由 于 过 量 引物 的 存在 , 另 一 轮 的 反应 又 可 以 进行
这 种 合成 -变性 -退火 -合成 的 循环 可 以 重复 多 次 ,使 所 需要 的 DNA 片段 得 到 特异 性 的 扩 增 ,在
理想 的 条 件 下 ,每 一 次 循环 使 两 个 引物 位 点 之 间 的 DNA 序列 增加 一 售 。

二 .PCR 技术 的 问题 及 改进

第 一 个 问题 当 DNA 模板 的 量 太 少 ( 如 小 于 10 个 拷贝 ) 时 ,有 时 反应 失败 ,产生 非特 异性
的 扩 增 ,其 原因 可 能 是 引物 和 模板 之 间 非 特异 性 的 结合 或 引物 之 间 相 互 作 用 引起 的 。 最 近 有 人
提出 改进 的 建议 ,一 是 高 温 PCR , 由 于 多 数 非特 异性 的 引物 延长 反应 可 能 是 在 第 一 轮 反 应 的
加 温 到 变性 过 程 中 温度 的 最 低 点 发 生 的 ,所 以 可 以 在 第 一 次 高 温 过 后 加 !DNA 聚合 酶 ,以 提高
反应 的 特异 性 ;或 者 在 第 一 循环 中 不 加 入 三 磷酸 核 苷 酸 , 也 能 起 到 相同 的 作用 。 另 一 解决 的 办
法 可 以 称 为 后 援 PCR ,在 模板 的 量 较 小 时 ,可 以 先 用 一 小 部 分 引物 进行 反应 ,经 过 约 15 个 循
环 之 后 ,再 加 入 其 余 的 寡 聚 核 苷 酸 引 物 。

这 一 技术 的 另 一 问题 是 使 用 Taq 聚合 酶 时 ,由 于 这 个 酶 没有 外 切 酶 活性 ,在 合成 中 容易
发 生 错误 。 最 近 有 报道 表明 ,可 以 通过 控制 反应 的 pH 值 和 底 物 的 浓度 将 核 苷 酸 的 错误 率 降 低
5 们 (到 1/105), 当 要 对 扩 增 的 DNA 片段 进行 基因 克隆 或 进行 功能 的 研究 时 , 这 是 很 有 用 的 ，
只 是 不 能 充分 利用 Taq 酶 的 反应 活性 。

PCR 技术 应 用 的 另 一 限制 因素 是 被 扩 增 片段 的 长 度 一 般 在 2. 0 kb 以 下 时 效果 才 最 好 , 当
要 扩 增 的 DNA 片段 长 度 较 大 时 ,会 出 现 一 些 问 题 , 阿 能 扩 增 产物 的 背影 较 强 , 或 扩 增 出 的 产
物 DNA 片段 的 电泳 带 不 整齐 ,或 没有 扩 增 发 生 。 最 近 有 报道 (Nucl. Acids Res. 20:623,1992)
说 ,使 用 pH8. 4 的 不 含 KCI 的 Tricine 缓冲 液 , 作 者 可 以 重复 性 很 好 地 用 Taq DNA 聚合 酶 来
扩 增 得 到 6. 3 kb 的 DNA 扩 增 产物 。

三 PCR 的 应 用

(一 ) 引 入 新 的 核 背 酸 序列

新 的 核 苷 酸 顺序 可 以 加 到 PCR 引物 的 5 -末端 ,或 者 通过 改变 PCR 引物 的 核 苷 酸 序列 而
获得 。 新 的 核 苷 酸 顺 序 可 以 是 一 个 新 的 酶 切 位 点 ,这 将 大 大 方便 克隆 特异 DNA 片段 的 操作 ;
也 可 以 是 特异 的 突变 , 突变 的 引入 对 于 结构 和 功能 的 关系 的 研究 是 一 种 很 好 的 手段 ;也 可 以 通
过 新 的 核 苷 酸 顺 序 的 引入 ,将 基因 表达 的 调控 序列 如 启动 子 , 或 翻译 的 起 始 位 点 等 加 到 基因 的
上 游 ,从 而 使 PCR 产物 在 体外 系统 中 得 到 表达 。

把 碱 基 加 到 引物 的 5 端 是 最 简单 的 方法 ,新 顺序 的 加 入 对 PCR 无 任何 影响 , 目前 长 达
45bp 的 5 端 加 入 顺序 已 有 报道 。 若 要 在 PCR 引物 中 引入 突变 ,也 应 尽 可 能 将 突变 位 点 设 在 引
物 的 5- 末端, 这样 才 能 最 大 限度 地 降低 突变 点 对 PCR 的 影响 。

(二 ) 重 复 序列 的 扩 增

PCR 技术 已 被 用 来 扩 增 DNA 中 的 重复 片段 ,所 使 用 的 引物 核 苷 酸 有 与 十 复 序列 相 避
序列 ,也 有 在 重复 片段 内 的 序列 。 典 型 的 例子 是 人 的 Alu 序列 家 族 的 PCR 扩 增 ,由 于 Aia 序
列 分 布 在 人 类 基因 组 中 的 不 同 区 域 , 而且 是 人 类 基因 组 所 特有 的 顺序 ,因此 ,Alu 序列 的 PCR
可 用 于 从 非 人 类 DNA 背景 中 鉴定 ` 扩 增 和 分 离 人 类 DNA 序列 。

构建 指纹 图 谱 是 重复 DNA 片段 PCR 的 另 一 用 途 。 以 重复 序列 作为 引物 进行 的 PCR ,不

184

同 的 个 体 之 间 由 于 基因 组 结构 具有 足够 的 天 然 变异 , 而 导致 扩 增 重复 序列 之 间 的 不 同 DNA
片段 对 其 效率 不 同 ,最 终结 果 是 产生 了 可 区 分 的 不 同 个 体 特有 的 指纹 图 谱 。

(三 ) 锚 定 PCR

锚 定 PCR 的 目的 在 于 分 离 与 一 段 已 知 序列 相 邻 的 未 知 序 列 ,潜在 的 应 用 前 景 有 鉴定 复杂
基因 组 的 内 含 子 外 显 子 结合 部 .重组 过 程 中 整合 位 点 ,引起 人 类 疾病 的 DNA 断 点 等 。 还 可 以
分 离 与 固定 序列 相 邻 的 DNA 片段 ,简化 克隆 和 染色 体 行走 步骤 等 。 人 们 已 经 设计 和 成 功 地 使
用 了 一 些 方法 ,其 中 包括 从 已 知 序列 到 人 工 加 上 去 的 寡 聚 核 苷 酸 的 PCR ,从 已 知 序 列 到 天 然
的 或 人 工 连 接 的 同 种 核 苷 酸 序列 的 PCR , 环 化 DNA 片段 的 PCR 和 Alu 序列 的 PCR 等 。 还 可
以 通过 一 些 辅助 措施 进行 这 些 工 作 , 如 在 寡 聚 核 苷 酸 的 5 端 用 生物 素 进行 标记 ,再 用 亲 合 素
包 被 的 磁 珠 捕捉 扩 增 的 DNA 片段 ;或 在 5 端 加 入 一 段 双 链 DNA 的 蛋白 质 结合 序列 ,用 固定
化 的 特异 性 DNA 结合 蛋白 来 纯化 扩 增 后 的 双 链 DNA。

还 有 一 种 单位 点 PCR ,从 一 个 已

知 位 点 的 碍 聚 核 苷 酸 向 一 个 人 工 连接 省
上 的 寡 聚 核 苷 酸 引 物 进行 PCR 扩 增
《图 14-19) ,连接 上 的 引物 又 是 PCR

所 用 的 一 个 引物 ,只 有 已 知 序 列 的 引
物 被 延长 并 合成 到 人 工 连接 的 引物 位
置 后 , 另 一 个 引物 才能 被 延长 ,从 而 达

册 聚合 酶 链 式 反应

到 特异 性 扩 增 的 目的 。 -
在 分 子 生物 学 研究 中 有 时 受到 所 二 的 可 cihc

和 NA 得 一 些
能 得 到 的 了 本 入 图 14-19 与 已 知 序列 相信 的 未 知 序列 的 单位 点 扩 增
很 有 用 的 技术 方法 ? (a) 用 限制 性 内 切 酶 将 DNA 降解 ,此 内 切 酶 在 已 知 序列 内 无

增 可 以 解决 这 一 问题 ,将 整个 PNA 。 切 点 ;(b) 在 连接 酶 的 作用 下 将 一 对 核 苷 酸 引 物 加 在 新 切 出 的
群体 中 各 个 片段 的 两 端 都 连接 上 窒 聚 。 DNA 片段 的 未 端 ,这 一 对 连接 上 去 的 赛 聚 核 苷 酸 并 不 完全 配对 ，

仿 昔 酸 ,再 用 同样 的 寡 聚 核 苷 酸 作为 即 较 短 的 一 条 在 其 8 端 不 能 与 较 长 的 一 条 形成 互补 氢 键 !(e) 以
引物 进行 PCR， 使 片段 混合 物 得 到 扩 连接 上 去 的 寒 珍 核 昔 酸 和 相 邻 的 已 知 序列 内 的 一 个 引物 进行
请 ,这 一 过 程 为 再 生 PCR (regenera_，，DNA 到 全 链 式 反应 ,由 于 连接 上 去 的 一 和 夺标 核酸 引 物 不

， 完全 配对 ,使 得 X 方向 进行 的 DNA 合成 ,只 有 在 立方 向 的 DNA
tiveyPCR)。 这 一 方法 已 成 功 地 应 用 。 合成 完成 以 后 才能 够 进行 ,保证 了 PCR 引物 的 特异 性 .

于 人 的 cDNA 差 减 筛选 等 工作 。 需 要
注意 的 问题 是 长 度 不 同 的 DNA 片段 可 能 不 成 比例 地 被 扩 增 。

(五 ) 定 量 PCR “

一 般 通过 PCR 进行 DNA 扩 增 的 效率 有 很 好 的 重复 性 ,因此 这 一 方法 可 以 用 来 估计 模板
DNA 的 浓度 ,但 要 有 志 个 已 知 含量 的 对 照 模板 , 与 未 知 模板 一 起 进行 扩 增 。

(六 ) 突 变 的 检测

应 用 较 广泛 的 是 检测 常见 的 遗传 病 ,用 PCR 合成 引起 病变 处 的 DNA 序列 ,再 用 病变 的
寡 聚 核 苷 酸 进 行 点 杂交 ,单个 的 核 苷 酸 变 化 能 够 被 检测 出 来 .对 于 那些 多 处 突变 引起 的 病变 可
以 合成 多 个 与 引起 病变 序列 互补 的 核 苷 酸 ,分 别 点 在 杂交 的 膜 上 ,再 用 标记 的 PCR 产物 与 腊
进行 杂交 ,根据 杂交 反应 的 阴性 或 阳性 来 确定 是 哪 处 碱 基 变 化 引起 的 遗传 病 , 这 种 方法 称 为 反

485

坷 7

向 点 杂交 。 最 近 在 这 方面 有 两 种 方法 上 的 改进 ,一 是 根据 已 知 遗 传 病 的 核 苷 酸 顺 序 的 改变 合成
正常 的 和 突变 的 PCR 引物 ,在 PCR 反应 的 底 物 中 加 入 荧光 标记 的 核 苷 酸 ,根据 反应 产物 中 有
否 获 光 出 现 ,确定 在 扩 增 所 用 的 引物 中 有 和 否 碱 基 变 化 ; 另 一 个 进展 是 利用 完全 配对 的 PCR 引
物 ,来 检测 PCR 产物 中 可 能 的 核 苷 酸 序 列 改 变 , 反 应 完成 后 将 变性 的 放射 性 标记 反应 产物 用
非 变性 的 聚 两 烯 酰胺 电泳 进行 分 析 , 单 个 的 核 苷 酸 变 化 会 使 电泳 图 谱 发 生变 化 。

(七 ) 直 接 分 析 PCR 产物 的 核 背 酸 序列

要 测定 PCR 产物 的 核 苷 酸 序 列 , 一 般 不 需要 将 PCR 产物 克隆 到 一 个 序列 分 析 载 体 上 , 可 以
直接 用 PCR 的 引物 进行 序列 分 析 。 目前 有 几 种 方法 可 以 用 来 测定 PCR 产物 的 核 苷 酸 序列 ,其 一
是 用 ”P 标记 的 引物 , 而 不 是 将 放射 性 同位 素 随 机 地 挫 人 新 合成 的 DNA 链 中 去 , 这 样 可 以 增加
放射 性 信号 强度 , 降低 背景 条 带 的 强度 ; 但 这 种 做 法 很 难 测 出 大 于 200 bp 的 序列 , 主要 是 由 于 互
补 的 两 条 模板 单 链 很 容易 形成 双 链 , 而 序列 分 析 的 引物 被 排斥 在 外 。 解 决 这 一 问题 有 两 种 办 法 ，
一 是 向 序列 分 析 反 应 中 加 入 10% (VV/V) 的 二 甲 亚 砚 , 以 阻止 互补 双 链 的 复 性 ; 另 一 方法 是 在 进
行 序列 分 析 反 应 时 , 使 用 多 次 热 循 环 , 即 在 ddNTP 存在 的 条 件 下 进行 多 个 循环 的 PCR 扩 增 。

由 于 在 DNA 序列 分 析 中 ,DNA 的 第 二 条 链 常 常 对 测序 反应 有 干扰 ,所 以 人 们 想 出 了 一
些 办 法 来 将 两 条 DNA 链 在 进行 序列 分 析 反 应 以 前 分 离开 来 ,其 一 是 将 DNA 双 链 在 变性 电泳
中 分 开 , 再 将 两 条 链 分 别 回收 ,这 一 方法 对 碱 基 含 量 较 偏 的 DNA 效果 最 好 。 一 个 最 新 出 现 的
方法 是 在 一 个 PCR 引物 的 5 -末端 引入 一 个 生物 素 基 团 ,再 用 带 有 亲 合 素 琼 脂 糖 柱 纯 化 带 有
生物 素 的 单 链 DNA , 洗 脱 后 就 得 到 了 单 链 的 DNA 产物 ,便于 DNA 的 序列 分 析 。 第 三 种 将 两
条 DNA 链 分 离 的 方法 是 用 外 切 酶 下 将 一 条 DNA 链 降 解 , 在 PCR 扩 增 以 前 , 先 将 一 个 PCR
引物 的 5 -末端 磷酸 化 ,由 于 外 切 酶 下 只 降解 5 端 带 有 磷酸 基 团 的 DNA 链 ,就 使 两 条 互补 的
扩 增 产物 DNA 链 的 一 条 被 降解 ,而 另外 一 条 链 可 以 用 来 作为 DNA 序列 分 析 的 模板 。

还 有 一 种 不 对 称 扩 增 法 可 以 用 来 制备 DNA 序列 分 析 的 模板 , 这 种 方法 在 直接 分 析 PCR
产物 核 苷 酸 序 列 中 用 的 是 最 多 的 。 其 原理 是 在 DNA 扩 增 时 加 入 的 两 种 PCR 引物 的 量 是 不 同
的 ,其 中 的 一 种 引物 在 PCR 扩 增 前 10 一 15 个 循环 中 就 被 用 完了 , 而 在 以 后 的 多 次 循环 中 ,只
有 另外 一 种 引物 被 延长 ,PCR 的 产物 的 大 部 分 为 一 条 DNA 链 ,在 以 后 的 测序 反应 中 所 受到 另
一 条 链 的 干扰 就 小 得 多 了 。

(人 八 ) 微 生物 PCR

很 多 人 正在 利用 PCR 技术 试图 发 现 某 种 微生物 的 存在 。 有 一 种 做 法 设计 得 比较 巧妙 ,将
免疫 反应 与 PCR 扩 增 结合 起 来 , 先 将 抗 甲 型 肝炎 病毒 的 抗体 固定 在 微型 滴定 板 上 ,然后 与 含
有 甲肝 病毒 颗粒 的 样品 接触 ,经 过 洗涤 后 ,得 到 甲肝 病毒 , 再 用 特异 性 的 引物 对 所 得 到 的 病毒
的 DNA 进行 PCR 扩 增 ,就 证 明了 甲肝 病毒 的 存在 。

也 有 人 将 PCR 技术 用 于 细菌 的 鉴定 和 分 类 上 ,细菌 中 与 rRNA 基因 相 邻 的 DNA 序列 因
种 而 异 , 可 以 对 这 些 因 种 而 异 的 核 苷 酸 序列 进行 PCR 扩 增 和 序列 分 析 ， ae
鉴定 的 目的 。

( 九 ) 合 成 PCR

有 人 对 人 工 合成 的 234 碱 基 的 序列 进行 了 PCR 扩 增 , 先 合成 一 条 完整 的 单 链 DNA ,再 人 台
成 两 端的 寡 聚 核 苷 酸 引物 ,最 后 用 PCR 技术 进行 扩 增 。 结 果 证 明 没有 化 学 反应 和 酶 反应 引入
的 错误 。 这 种 方法 要 比 化 学 法 合成 两 条 互补 单 链 或 先 合成 两 条 相互 部 分 重 秋 的 单 链 再 用 酶 法

补 齐 的 办 法 快 而 且 便宜 ,尤其 是 在 DNA 产物 用 量 较 大 的 情况 下 更 为 有 用 。
486

第 八 节 ”基因 的 表达 和 改造

DNA 的 同 源 重 组 是 一 个 生物 界 的 普遍 现象 ,这 一 研究 领域 除了 本 身 所 具有 的 理论 意义 之
外 ,其 应 用 前 景 对 人 类 更 具有 莫大 的 诱惑 力 。 分 子 生 物 学 技术 研究 的 直接 应 用 前 景 就 是 应 用 于
生产 实践 和 临床 医疗 ,通过 一 定 的 技术 手段 将 某 些 基因 加 以 改造 ,有 时 需要 对 基因 的 产物 的 结
构 进行 一 定 修饰 ,在 有 些 情 况 下 需要 增加 某 基 因 的 活性 ,相反 ,在 另外 一 些 情 况 下 , 却 要 降低 某
些 基 因 的 活性 ,甚至 有 时 需要 将 某 些 基因 完全 失 活 ,才能 满足 人 的 愿望 。 但 基因 改造 是 一 个 复
杂 的 过 程 ,目前 还 存在 着 一 些 难以 克服 的 障碍 ,例如 ,有 些 生物 难以 用 外 源 DNA 进行 转化 , 转
化 后 外 源 DNA 在 染色 体 上 随机 地 与 内 源 DNA 重组 ,造成 基因 组 功能 上 的 紊乱 等 等 .为 此 ,人
们 也 正在 逐步 探索 有 关 的 技术 原理 和 完善 基因 改造 的 方法 。

对 原核 细胞 进行 基因 改造 比较 简单 ,例如 大 肠 杆菌 , 可 以 筛选 出 目的 基因 的 突变 型 ,再 将
改造 过 的 基因 引入 到 突变 型 中 ;而 真 核 细 胞 的 基因 改造 就 要 复杂 得 多 ,下面 介绍 几 种 真 核 基因
改造 中 常用 的 方法 。

一 .体外 定点 突变

(一 ) 基 因 调 控 单 元 的 突变 Ca) 缺失 (b) 点 突变

当 一 个 基因 被 克隆 并 能 引入 到 它 原来 的 细 对 友 上 市 生 和
胞 中 以 后 ,就 可 以 通过 一 系列 的 突变 手段 找 出 (CD) 攻 沪
基因 的 调控 单元 ,开始 鉴定 调控 单元 靠 选 择 突
变型 ,现在 可 以 通过 一 些 方便 快捷 的 手段 来 进 下

行 。 要 确定 一 段 调控 单元 ,需要 对 基因 的 调控 区

进行 缺失 、 插 入 、 预 定位 点 的 碱 基 对 置换 等 突变

手段 。 最 容易 做 的 是 两 个 内 切 酶 位 点 之 间 的

DNA 片段 缺失 。 对 一 个 质粒 进行 部 分 酶 切 , 可 区
以 分 离 得 到 大 量 的 只 缺失 一 个 内 切 酶 片段 的 酶 1
切 产物 ,进一步 将 这 些 纯化 的 DNA 连接 成 环 ES

状 ,其 中 相当 一 部 分 还 会 有 生物 活性 .要 制造 比 是 7

较 短 的 缺失 ,可 以 将 质粒 DNA 在 一 个 内 切 酶
位 点 上 切 开 , 使 之 成 为 线 状 的 ,然后 使 用 核酸 外 |

切 酶 对 质粒 DNA 两 端 进行 缺失 处 理 , 如 图 14- 二 oPEER
20。(CaJDNA 缺失 :可 以 将 一 个 DNA 克隆 中 的

两 个 内 切 酶 位 点 之 间 的 DNA 片段 全 部 去 掉 ， 缺失 的 克 放

也 可 以 从 一 个 内 切 酶 位 点 切 开 以 后 ,用 外 切 酶 | anamam
Fa131 进行 缺失 处 理 , Bal31 可 以 从 线性 化 的 JE 二
DNA 两 端 逐 步 地 切 掉 一 到 数 个 碱 基 对 。 所 需要
的 DNA 缺失 克隆 可 以 从 一 系列 的 不 同 程度 的 SA 、A
缺失 克隆 中 筛选 出 来 ; (b) 在 要 制造 突变 的 位 区

置 设 计 一 个 化 学 合成 的 寡 聚 核 苷 酸 引物 ,使 得 -29 人 履 外 突变
487

当

培养 基 上 生长 的 细胞 都 是 由 于 LEU2+ 被 整 2 En
_ 合 到 了 酵母 的 含有 LEU2- 的 染色 体 上 , 这 是 -人 遇
通过 重组 酶 类 的 作用 ,经 过 同 源 交 换 来 实现 < 于

这 一 外 来 引物 与 变性 后 的 DNA 克隆 杂交 ,再 用 DNA 聚合 酶 将 引物 延长 ,转化 细胞 以 后 ,就 产
生 了 正常 克隆 和 带 有 人 工 引 入 的 突变 克隆 的 混合 物 , 经 过 进一步 筛选 就 可 以 得 到 所 需要 的 突

(二 ) 碱 基 特 异性 突变

单个 碱 基 对 的 改变 可 以 使 用 体外 定点 突变 ,以 代替 过 去 使 用 的 化 学 方法 。 用 一 段 15 一 20
个 碱 基 的 寡 聚 核 音 酸 链 ,可 以 在 一 条 DNA 分 子 的 任何 部 位 进行 碱 基 特 异性 的 改变 。 这 种 长 度 时
的 寡 聚 核 苷 酸 可 以 和 互补 DNA 链 形 成 非常 稳定 的 DNA-DNA 双 螺 旋 结 构 , 当 究 聚 核 苷 酸 含
有 一 到 两 个 非 互 补 碱 基 时 , 这 种 互补 的 双 螺 旋 结 构 就 不 十 分 牢固 ,但 仍然 具有 相当 的 稳定 性 。
在 DNA 聚合 酶 和 4 种 三 磷酸 脱氧 核 苷 酸 存在 的 条 件 下 ,这 种 不 完全 互补 的 守 聚 核 苷 酸 可 以
作为 DNA 链 延 长 的 引物 ,所 生长 的 双 链 DNA 除 在 引物 部 分 以 外 都 是 互补 的 。 将 这 样 的 环 状
DNA 分 子 引 入 大 肠 杆菌 后 ,就 会 产生 两 种 DNA ,一 种 是 野生 型 的 , 另 一 种 是 在 原来 的 窒 聚 核
苷 酸 引物 处 碱 基 改 变 的 DNA( 图 14-20) 。 两 种 DNA 分 子 可 以 由 它们 对 突变 部 位 的 不 同 寡 聚
核 苷 酸 的 结合 紧密 程度 通过 DNA 杂交 来 区 分 .野生 型 的 DNA 对 野生 型 齐 聚 核 背 酸 比 对 突变
型 的 朝 聚 核 苷 酸 的 结合 能 力 强 ,而 突变 型 的 DNA 却 相反 。

二 、 体 内 基因 的 改造

一) 野生 型 的 恢复
大 肠 杆菌 中 的 真 核 基因 克隆 所 能 提供 的 mLEU2:DNA 和 和
信息 是 有 限 的 ,要 研究 基因 的 调控 和 功能 ,还 加 多 和 RN， 。 国
要 将 基因 引入 到 真 核 细胞 中 去 。 酵 母 细胞 的 。 C? 相 部 并 菇 ，DN
转化 常 通过 钙 离子 (Ca2+ ) 和 聚 乙 二 醇 处 理 酵 。 二 葡 它 醇 母 来 色 体 1 日 |
母 的 原生 质 体 ,使 外 源 DNA 被 引入 到 酵母 ”酵母 染色 体
细胞 中 ,第 一 个 成 功 的 例子 是 将 克隆 在 大 肠 “2 突 裤 | 辣 吉 重 夺
杆菌 质粒 上 的 酵母 忆 EBU2+ 转 化 到 工 EU72- 的 六 换 + 个
单 倍 体 细胞 中 ,所 有 的 能 够 在 不 含 亮 氨 酸 的

的 (图 1421)。ZEU2+ 基 因 揪 入 时 最 容易 出 讽 可
现 的 情况 是 一 次 发 生 在 质粒 和 染色 体 之 间 同 一
源 序列 之 间 的 对 等 交换 ,引起 整合 转化 即 整 有 和 =aammmmmmm 三 -ss= 二
个 外 来 质粒 所 携带 的 LEU 2+ 插 和 人 到 同 源 染 i，,，_
色 体 中 ,使 得 染色 体 上 含有 两 套 基 因 , 一 是 原 双 交 换
来 细胞 中 的 工 EU2 ,还 有 一 套 是 新 引入 的 野 图 14-21 酵母 的 整合 转化
生 型 ,这 样 转 化 了 的 细胞 就 具有 了 自身 合成 ”酵母 的 重组 质粒 上 带 有 一个 野生 型 的 基因 (LEU24 天
亮 氨 酸 的 能 力 , 可 以 在 不 含 亮 氨 酸 的 培养 基 。 酵母 染色 体 上 带 有 一 个 突变 的 基因 (LEU2- ) ,3 个 并 列 商 下
上 将 其 筛选 出 来 .如 果 发 生 同 源 区 的 双 交 换 ， 的 箭头 表示 可 能 发 生 同 源 重组 的 位 置 。
就 导致 外 来 基因 的 片段 替代 原 有 序列 , 当 序列 的 替换 发 生 在 引起 LEL72 基因 突变 的 区 域 时 ，
LEU2- 就 变 成 了 LEU2+ ,细胞 也 具有 了 合成 亮 氨 酸 的 能 力 ，

488

随后 人 们 又 成 功 地 用 这 一 方法 转化 了 酵母 的 一 些 其 它 基 因 ,但 转化 效率 很 低 。. 这 一 问题 通
过 使 用 含有 酵母 DNA 复制 起 始 位 点 的 质粒 和 将 引入 的 DNA 分 子 线性 化 得 到 了 克服 。

(二 ) 酵 母 染色 体 基因 的 替代

不 仅 可 以 用 野生 型 基因 取代 突变 的 基因 ,整合 性 转化 也 可 以 用 来 以 突变 基因 代替 正常 基
因 。 这 一 基因 操作 手段 首先 应 用 于 酵母 整合 型 质粒 (YIp) 的 转化 ,YIp 中 含有 缺失 、 无 活性 的
感 TS3- 基 因 和 一 个 有 活性 的 UVR43 基因 ,并 带 有 这 些 基因 的 相 邻 序列 区 。 用 这 样 的 质粒 转化
酵母 使 得 半数 质粒 插入 到 妞 IS3 位 点 , 另 一 半 质 粒 插 入 到 位 于 另 一 个 染色 体 的 wR43 位 点
上 。 在 瓦 TS3 位 点 的 插入 使 酵母 染色 体 带 上 两 个 相 邻 近 的 五 TS 位 点 ,一 个 野生 型 的 和 一 个 突
变 无 活性 的 (图 14-22) 。 这 些 细胞 的 进一步 生长 会 导致 不 时 的 在 两 个 五 TS3 位 点 之 间 发 生 交

YIp

URA3+
Ce

体外 引入 的 突变 一 / |

HI1S3+ URA3+ HiS3-

图 14-22 整合 重组 引起 的 基因 替换

带 有 一 个 突变 的 有 TS3 基因 和 一 个 野生 型 的 ITR4 基
因 可 以 通过 在 染色 体 的 互 TS3 或 VR4 位 点 分 离 而 使 酵母
被 转化 。 \a) 转 化 发 生 在 五 TS 位 点 附近 ,根据 质粒 是 否 从 染
色 体 上 被 切除 ,产生 转化 于 的 或 野生 型 的 染色 体 ;(b) 在 染
色 体 互 TS3+ 位 点 附近 发 生 的 整合 ,使 得 两 个 瑟 TS3 基因 在
染色 体 上 串 行 排列 ,两 个 瓦 7S3 拷贝 之 间 发 生 的 重组 使 整
合 过 程 逆转 , 即 质 粒 被 前 切 下 来 (染色 体 丢 掉 VR4 选择 标
记 ) ,这 时 有 两 种 可 能 的 情况 发 生 ,- :种 是 产生 带 有 突变 型
玉 7S3 的 染色 体 , 另 一 种 是 染色 体 仍 然 带 有 已 7S3+ 基因 的
野生 型 。

YIp

人
人

1

(4)

(2)

(4 和)

14-23 利用 整合 重组 分 析 染 色 体 基因
〈 肌 动 蛋 白 基 因 ) 的 必要 性

〈1) 酵 母 肌 动 蛋白 基因 的 两 端 被 缺失 以 后 , 带 在 醇
母 的 整合 质粒 (YIp) 上 ;(2)YIp 还 带 有 一 个 wR4+ 基 因
作为 选择 标记 ;3)? 经 过 同 源 重 组 后 ,产生 两 种 突变 的 无
功能 的 肌 动 蛋白 基因 ;(4) 酵 母 在 没有 正常 肌 动 蛋白 的
情况 下 不 能 存活 ,因此 这 里 所 介绍 的 插入 失 活 实验 是 在
双 倍 体 菌 株 中 进行 的 (有 正常 的 肌 动 蛋白 存在 ) ,半数 的
减 数 分 裂 钨 子 ( 即 带 有 失 活 的 肌 动 蛋白 基因 的 孢子 ) 不
能 存活 ,因此 肌 动 蛋白 是 酵母 所 必需 的 。

换 , 交 换 的 结果 使 得 两 个 TS3 位 点 之 间 的
ZR43 序列 从 染色 体 上 被 剪 切 下 来 ,使 细胞
重新 变 为 UR43 的 突变 型 这 些 具 有
UVR43 表现 型 的 恢复 子 中 有 些 还 是 瑟 7S3
的 野生 型 ,而 有 些 已 经 变 成 了 五 TS3- 的 突变
型 (图 14-22) 。

任何 定位 于 染色 体 的 基因 只 要 有 了 野生
型 克隆 之 后 ,都 可 以 用 更 简单 的 方法 将 其 失
活 。 其 原理 是 在 体外 将 基因 的 前 后 两 端 进 行
缺失 处 理 , 用 基因 的 中 间 部 分 转化 细胞 , 当 在

489

细胞 中 发 生 交换 时 ,所 产生 的 两 种 基因 拷贝 都 是 有 缺陷 的 ,其 中 一 个 拷贝 没有 基因 的 开始 端 ，
另 一 个 拷贝 缺少 基因 的 末尾 。 这 一 操作 首先 证 明了 酵母 肌 动 蛋白 的 必要 性 。 在 这 一 实验 中 二
倍 体 的 VR43 细胞 被 转化 成 VR43” ,用 来 转化 用 的 质粒 上 含有 一 个 wR43 基因 和 一 段 肌 动
蛋白 基因 的 中 间 部 分 的 片段 , 当 在 肌 动 蛋白 基因 片段 处 发 生 交换 的 50 久 的 wR43 细胞 (相对
于 在 UR43 基因 中 发 生 交 换 的 另外 50%%) 形 成 钨 子 时 ,只 能 形成 VR43 孢子 ,因为 在 这 样 的
VR43- 单 倍 体 细胞 中 肌 动 蛋白 基因 是 没有 活性 的 (图 14-23)。

三) 酵母 基因 的 获得

酵母 的 特定 基因 可 以 用 恢复 载体 (retriever vector) 通 过 同 源 交 换 从 正常 染色 体 上 获得 。
用 途 较 广 的 恢复 载体 上 含有 能 够 在 大 肠 杆 菌 和 酵母 中 复制 的 起 始 位 点 和 能 够 在 两 种 细胞 生长
过 程 中 进行 选择 的 标记 , 同时 还 要 含有 一 段 与 目的 基因 同 源 的 序列 .这 样 的 载体 构建 完成 以

后 ,用 限制 性 内 切 酶 去 掉 中 间 的 同 源 基 因 片 段 ，
留 下 基因 两 端的 酵母 DNA 序列 ,将 这 一 线性
的 缺失 载体 引入 到 含有 目的 基因 的 细胞 中 , 当
进入 细胞 核 之 后 ,具有 高 度 同 源 性 的 两 个 3 - 末
端 会 从 酵母 染色 体 的 同 源 区 开始 进行 复制 , 结
果 使 细胞 中 的 目的 基因 被 复制 到 引入 的 恢复 载
体 上 来 (图 14-24)。 下 一 步 就 可 以 提取 质粒
DNA ,转化 大 肠 杆菌 ,进行 扩 增 , 得 到 大 量 的 目
的 基因 。

(四 ) 高 等 真 核 生物 中 的 同 源 重组

哺乳 动物 基因 转化 可 以 通过 一 些 常 规 的 基
因 转 化 手段 来 实现 ,如 磷酸 钙 /DNA 共 沉 淀 、 原
生 质 体 融 合 . 电 穿孔 直接 注射 等 。 一 些 高 等 植
物 的 基因 转化 可 以 通过 农 杆菌 的 Ti 质粒 来 实
现 , 也 可 以 使 用 电 穿 孔 或 基因 枪 来 进行 转化 。

哺乳 动物 中 最 初 进行 的 基因 改造 工作 都 是
先 向 细胞 的 染色 体 上 引入 一 个 突变 的 基因 , 再
用 另外 一 个 突变 的 同一 基因 转化 细胞 , 使 外 来
的 基因 和 已 经 定位 在 染色 体 上 的 基因 发 生 同 源
重组 ,形成 一 个 野生 型 的 基因 。 引 入 外 源 的
DNA 一 般 使 用 在 与 准备 改造 的 基因 同 源 处 线
性 化 的 ,这 样 可 以 大 大 提高 基因 改造 效率 。
Smithies 等 人 第 一 次 对 天 然 基因 位 点 (2- 球 蛋
白 ) 进行 改造 , 同 源 对 非 同 源 重 组 的 比 约 为
1 000 : 1, 经 过 改造 的 8- 球 蛋白 能 够 稳定 地 进
行 表达 。

植物 基因 转化 可 以 借助 于 农 杆 菌 天 然 的 转
基因 性 质 ,也 可 以 直接 对 植物 的 适当 组 织 和 细

490

带 有 野生 型 等 位 基因 的 质粒

缺失 的 重组 质粒

Tetx 宙 URA43- 也 572

突变 的 等 位 基因 “酵母 染色 体

图 14-24 恢复 载体 的 使 用
用 限制 性 内 切 酶 去 掉 恢 复 载体 质粒 上 的 目的 基
因 , 这 一 缺失 的 载体 被 引入 到 带 有 突变 型 目的 基因
的 细胞 中 去 ,恢复 载体 进入 细胞 以 后 ,质粒 的 末端 序
列 就 侵入 到 与 基因 相 邻 的 片段 ,并 开始 复制 与 丢掉
的 基因 同 源 的 染色 体 上 的 基因 序列 。

-JR

胞 进行 转化 。 一 个 直接 转化 成 功 的 报道 是 对 烟草 原生 质 体 的 两 次 转化 将 两 个 突变 的 新 霉 素 磷
酸 转移 酶 在 原生 质 体 中 同 源 重组 ,产生 野生 型 的 卡 那 霉 素 抗 性 基因 .首先 通过 基因 转化 构建 受
体 细 胞 系 , 使 细胞 系 中 含有 一 端 缺 失 的 基因 ,再 用 另 一 端 缺失 的 基因 转化 构建 的 受 体 细胞 系 ，
作者 筛选 到 了 同 源 重组 的 野生 型 新 霉 素 磷 酸 转移 酶 原生 质 体 , 并 且 培 养 出 再 生 植株 ,野生 型 性
状 能 够 稳定 地 遗传 给 后 代 。

农 杆 菌 进 行 基 因 转 化 的 核心 部 分 是 质粒 编码 的 TDNA( 转 化 的 机 制 尚 不 清楚 ), 因 此 人
们 试图 用 T-DNA 作为 一 个 过 湾 分 子 , 使 染色 体外 的 遗传 物质 能 够 在 细胞 核 中 进行 同 源 重组
而 达到 基因 改造 的 目的 。1990 年 有 利用 农 杆菌 IT-DNA 进行 基因 改造 成 功 的 报道 。 作 者 将 叶
肉 细胞 原生 质 体 与 两 个 分 别 带 有 缺失 选择 标记 的 T-DNA 的 农 杆 菌 共 培养 ,两 个 I-DNA 在
选择 标记 基因 的 编码 区 有 0. 55 kb 的 同 源 区 ,一 个 在 编码 区 的 5 端 缺 失 , 一 个 在 编码 区 的 3 端
缺失 , 同 源 重 组 的 原生 质 体 被 特异 性 地 选择 出 来 。 他 们 发 现 约 有 1% 一 4 党 的 转化 细胞 发 生 了
分 子 间 的 同 源 重 组 ,对 11 个 不 同 的 再 生 株 系 进行 Southern 印迹 和 了 PCR 分 析 , 证 明了 有 野生
型 标记 基因 的 存在 。 有 一 种 可 能 性 是 重组 发 生 在 农 杆菌 细胞 中 , 而 不 是 在 植物 组 织 中 , 首先 通
过 质粒 结合 使 同一 细菌 细胞 中 含有 两 种 类 型 的 TDNA ,两 个 不 同 的 缺陷 型 的 标记 基因 在 细
胞 内 发 生 重组 ,产生 野生 型 重组 ,再 将 野生 型 的 重组 基因 转 和 人 受 体 植 物 组 织 。 这 种 可 能 性 已 被
各 种 对 比 实验 所 排除 。 这 一 实验 证 明了 T-DNA 可 以 用 作 植 物 细胞 核 中 同 源 重组 的 底 物 。

三 、 反 义 RNA 技术 及 其 应 用 前 景

继 在 细菌 中 发 现 反 义 RNA 对 基因 表达 的 调控 作用 ( 见 第 十 一 章 ) 以 后 ,人 们 试图 利用 反
义 RNA 来 特异 性 地 抑制 某 些 基因 的 表达 。 美国 科学 家 用 单 式 疱疹 病毒 的 胸 苷 激酶 (TK) 基 因
蛋白 质 编码 区 反 向 连接 在 启动 子 的 下 游 ,使 之 能 够 转录 出 反 义 RNA( 即 与 mRNA 序列 互补 的
RNA) , 当 将 带 有 有 义 基 因 与 反 义 基 因 的 质粒 注射 到 TK 细胞 中 时 , 反 义 RNA 抑制 了 细胞 中
TK 酶 的 表达 。 后 来 他 们 又 将 了 天 基因 中 52 个 碱 基 的 非 编 码 区 以 相反 的 方向 连接 在 启动 子 的
下 游 ,并 使 之 在 瞬时 和 长 期 地 转录 反 义 RNA, 发 现 TK 的 这 一 反 义 RNA 对 所 抑制 的 序列 是
高 度 专 一 的 , 它 只 能 抑制 单 疱 疹 病 毒 的 TK ,而 对 与 之 没有 对 应 的 有 义 序 列 的 鸡 TK 没有 抑制
作用 。

1991 年 有 一 项 在 首 蕃 上 用 反 义 RNA 进行 应 用 研究 所 注册 的 专利 ,研究 的 目的 是 想 通过
抑制 根 组 织 特异 性 表达 的 谷 氮 酰 胺 合成 酶 亚 基 , 使 根 中谷 氨 酰胺 的 水 平 下 降 , 以 缓解 对 固氮 酶
活性 的 抑制 作用 。 作 者 们 将 谷 氢 酰 胺 合成 酶 同 工 酶 以 颠倒 的 方向 连接 在 根 特异 性 表达 启动 子
的 下 游 , 连 接 在 一 个 大 肠 杆菌 - 农 杆菌 双 起 始 位 点 质粒 上 ,质粒 上 带 有 25 bp 染色 体 上 的 相 邻
序列 (整合 区 ) ,以 氨 甲 蝶 叭 (methotrexate) 抗 性 为 选择 标记 .。 实验 结果 证 明 , 反 义 RNA 使 得 根
中 谷 氨 酰胺 合成 酶 的 活性 降低 80% , 攻 蒂 干 重 增加 50% 。

四 、 用 基因 向 除 技术 研究 基因 表达 及 功能

基因 敲 除 技 术 (gene knockout), 又 称 基因 靶 向 技术 (gene targeting) 是 80 年 代 示 发 展 起
来 的 ,通过 人 为 干预 达到 抑制 或 灭 活 目的 基因 表达 的 分 子 生 物 学 技术 .是 利用 同 源 重组 技术 建
立 基 因 定 点 灭 活 细 胞 系 或 基因 定点 灭 活动 物 。 近 年 来 ,在 生物 学 诸多 研究 领域 中 得 到 应 用 ,已
获得 了 数 百 种 基因 定点 缺陷 小 鼠 。 这 些 研 究 成 果 使 人 们 对 被 敲 除 基 因 在 生物 总 体 水 平 的 功能
有 了 更 深入 地 了 解 。
491

该 技术 的 原理 是 首先 用 基因 重组 技术 在 目的 基因 片段 中 插 人 一 外 源 基因 作为 筛选 标志 基
因 并 使 目的 基因 失 活 。 将 此 灭 活 " 基 因 转 和 人 小 鼠 胚 胎 干 细胞 (ES 细胞 ) 中 ,通过 细胞 内 的 基因
同 源 重 组 使 灭 活 的 基因 取代 染色 体 上 原 有 的 目的 基因 。 利 用 标志 基因 产物 的 特殊 药物 抗 性 进
行 筛选 和 基因 型 鉴定 ,可 以 得 到 基因 定点 灭 活 的 ES 细胞 。 将 重组 ES 细胞 注射 到 小 鼠 胚 胎 中 ，
再 将 豚 胎 植 和 人 假 孕 母体 的 子宫 内 ,使 其 发 育成 目的 基因 缺陷 的 杂 合 的 坐 合体 小 鼠 , 最 后 从 子 代
小 鼠 中 得 到 纯 合 子 的 基因 散 除 小 鼠 。 通 过 分 析 基 因 效 除 小 鼠 体 内 单 基因 缺陷 所 产生 的 表 型 异
常 来 研究 基因 调控 和 功能 ,建立 疾病 的 动物 模型 以 及 进行 基因 治疗 等 。

第 九 节 RFLP 和 RAPD 及 其 应 用

RFLP 是 限制 性 片段 长 度 多 态 性 (restriction fragment length polymorphism) 的 英文 缩
写 。RFLP 是 由 于 不 同 个 体 的 等 位 基因 之 间 碱 基 代 换 、 重 排 . 插 入 、 缺 失 等 引起 的 。 限制 性 内 切
酶 能 把 很 大 的 DNA 分 子 降 解 成 许多 长 短 不 等 的 较 小 片段 ,所 产生 的 DNA 片段 的 数目 和 各 个
片段 的 长 度 又 反映 了 限制 性 内 切 酶 的 切 点 在 DNA 分 子 上 的 分 布 。 对 于 每 一 个 DNA/ 限 制 性
内 切 酶 组 合 来 说 ,所 产生 的 片段 是 特异 性 的 , 它 能 作 1 6 2 二
为 某 一 DNA( 或 含 这 种 DNA 的 生物 ) 所 特有 的 “ 指
总 本

当 一 个 基因 组 比较 小 时 ,例如 植物 叶绿体 基因
组 ,只 有 十 几 万 碱 基 对 ,就 可 以 将 提纯 的 DNA 用 限
制 性 内 切 酶 消化 成 各 种 长 度 的 DNA 片段 ,进行 琼
脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 并 用 省 化 乙 锭 染色 以 后 ,可 以 在
紫外 光 下 直接 观察 多 态 性 (图 1 上 25)。 但 对 于 大 分
子 染色 体 DNA ,就 不 能 直接 观察 限制 性 片段 长 度 的 A Ba <
多 态 性 , 因为 各 种 长 度 的 DNA 片段 在 电泳 腕 上 相
互 交 盖 , 连 成 一 片 , 不 能 进行 分 辨 ,要 检测 限制 性 片
段 长 度 的 多 态 性 就 要 借助 于 分 子 杂 交手 段 , 用 某 一
标记 的 DNA 片段 作为 探 针 , 与 被 转 到 硝酸 纤维 素 四 2 不 元 贡生
膜 或 尼龙 膜 上 的 电泳 后 的 DNA 片段 进行 杂交 , 这 : 队 : 本 T
样 只 有 与 探 针 有 高 度 同 源 性 的 片段 能 够 被 检测 出 部 分 DNA 限制 性 内 切 酶 图 谱 , 看 侧 下 部 为
来 ,因此 提 到 限制 性 片段 长 度 的 多 态 性 一 般 都 要 通 植物 A 和 植物 B 及 植物 C 的 RELP 形式 。
过 DNA 分 子 杂 交 (Southern blotting) 来 检测 。 如 果 植 物 A 与 祖先 植物 种 相 比 变化 很 小 , 那

10 多 年 来 RFLP 作为 共 显 性 的 遗传 标记 , 被 广 各 优 杀 它 发 生 了 两 个 突变 ,一 是 在 形成 植物
泛 地 用 于 很 多 种 生物 的 分 析 中 ,这 主要 是 由 于 人
REFLP 的 普遍 性 以 及 检测 方法 的 简便 性 。 限 制 性 片 段 ; 另 一 个 突变 是 在 形成 植物 C 的 过 程 中 ，
段 长 度 多 态 性 在 植物 遗传 图 谱 的 构建 上 尤其 有 用 。 一 个 限制 性 内 切 酶 位 点 消失 ,产生 11 kb 的
过 去 跟踪 染色 体 片段 和 观察 它们 在 配子 形成 时 重组 内 切 酶 片段 ,而 5 kb 和 6 kb 两 条 带 消失 . 可
的 唯一 方法 是 观察 发 生 在 该 片段 上 的 基因 作用 所 引 以 根 据 这 些 变化 列 出 系统 发 育 图 如 本 图 左
起 的 表现 型 的 变化 。 通 过 观察 表现 型 变化 ,如 花色 、 Pi 丈 ，
株 高 、 抗 性 等 ,人 们 可 以 推测 在 减 数 分 裂 和 重组 期 间 各 个 染色 体 片段 的 行为 。 用 这 种 间接 的 方

492

A 植物 DNA 的 限制 性 内 切 酶 图

琼脂 糖 电泳 图

~

法 跟踪 染色 体 片 段 已 构建 了 几 个 植物 种 相当 详细 的 遗传 图 ,但 是 这 一 方法 非常 繁琐 , 而 且 要 花
很 长 的 时 间 。 而 RFLP 提供 了 一 个 直接 跟踪 重组 期 间 染 色 体 片段 的 方法 ,而 且 大 大 地 简化 了
遗传 图 的 构建 过 程 。 人 们 只 需 直接 看 片段 本 身 的 RFLP 标记 ,而 不 必 看 染色 体 片 段 上 基因 存
在 所 引起 的 表现 型 变化 。 因 此 ,可 以 直接 看 到 植物 的 基因 型 ,而 不 是 间接 地 通过 基因 产生 的 表
现 型 来 推测 。

由 于 在 一 个 作 图 群体 中 可 以 分 析 大 量 的 RFLP 标记 ,所 以 能 够 构建 一 个 分 离 群体 的 染色
体 片 段 图 .这 些 图 能 表示 群体 中 每 一 植株 的 整个 基因 组 中 来 自 父 . 母 本 双方 的 染色 体 片 段 的 分
布 , 这 在 遗传 育种 中 是 非常 有 用 的 ,例如 在 一 个 回 交 计 划 中 , 目标 是 导入 一 个 单 基 因 ,那么 我 们
要 选择 的 植株 应 该 是 : 含 轮回 亲本 染色 体 片段 数目 最 大 ,同时 要 保留 目的 基因 的 片段 。

Alec Jeffreys 等 从 人 的 染色 体 DNA
中 分 离 出 一 种 中 度 重复 序列 作为 探 针 , 对
人 的 妆 色 体 DNA 进行 RFLP 分 析 ( 称 为
DNA 指纹 )。 他 们 将 总 DNA 用 限制 性 内
切 酶 完全 酶 解 以 后 ,用 放射 性 的 探 针 进行
Southern 印迹 ( 见 本 章 第 三 节 ) ,每 个 人 的
DNA 所 产生 的 阳性 杂交 条 带 都 是 特异 性
的 ,而 且 子 女 的 阳性 杂交 条 带 中 ,有 一 半 与
父亲 的 DNA 阳性 杂交 带 相 同 , 另 一 半 是
与 来 自 母 亲 的 阳性 杂交 条 带 相 同 ( 图 14-
26)。 用 这 种 中 度 重复 序列 作为 探 针 , 对 不
同 的 人 的 DNA 进行 指纹 分 析 , 产生 完 全
相同 的 图 谱 的 机 会 小 于 6X10 ,因此 这
一 方法 可 用 于 法 医 鉴定 ,血缘 关系 的 识别
等 。 这 一 实验 方法 所 提供 的 证 据 已 于 1988 8 F， 9
年 得 到 英国 法 庭 的 认可 。 由 于 英国 有 着 严 图 14-26 ”人 的 指纹 分 析 示 意图
重 的 移民 问题 ,;DNA 指纹 技术 的 应 用 ,为 4 为 父亲 的 DNA 指纹 图 谱 ; ?为 母亲 的 DNA 指纹 图 谱 ;
新 移民 血缘 关系 的 鉴别 提供 了 令 人 信服 的 瑟 为 子 / 女 可 能 出 现 的 DNA 指纹 图 谱 ， 图 左 , 右 两 侧 的 箭头 表
技术 手段 。 示 子 女 DNA 指纹 图 中 分 别 与 其 父 ` 母 的 DNA 指纹 中 相对 应 的

RAPD 是 随机 扩 增 多 态 性 DNA 。 分 了 杂交 条 带 ，
(random amplified polymorphic DNA) 的 英文 缩写 。RAPD 是 1990 由 JJ G.K. Williamas 等 发
明 的 ,是 一 种 新 奇 的 遗传 标记 。 其 方法 是 用 随机 序列 的 9 一 10 个 核 苷 酸 的 引物 ,对 基因 组 的
DNA 进行 PCR 扩 增 ,再 进行 电泳 分 离 和 溴 化 乙 锭 染色 ,多 态 性 的 产生 可 以 由 TDNA 序列 中 与
互补 寡 聚 核 苷 酸 引物 中 一 个 碱 基 的 差别 形成 。

RAPD 只 产生 显 性 标记 ( 即 有 或 没有 ) ,所 以 不 能 用 来 鉴定 杂 人 合体, 但 对 自 交 系 和 回 交 群
体 来 说 这 是 不 成 问题 的 ,因为 所 有 或 大 多 数 的 基因 位 点 都 是 同 源 的 。RAPD 也 不 能 单独 地 用
来 对 没有 基因 标记 的 生物 进行 遗传 图 谱 分 析 , 因为 它 所 产生 的 多 态 性 是 随机 的 。

然而 RAPD 图 谱 比 RFLP 有 一 定 的 优点 ,人 工 合 成 的 随机 引物 可 在 实验 空间 进行 交换 ，
这 要 比 克 隆 DNA 片段 作为 探 针 要 容易 和 迅速 得 多 ,可 以 免 去 DNA 分 子 杂交 的 手续 , 对 大 的
基因 组 中 低 找 贝 数 序列 也 同样 灵敏 .RAPD 要 求 对 每 个 分 离 群体 中 的 标记 所 进行 的 PCR 扩 增

493

和 电泳 分 离 有 高 度 的 重复 性 ,所 以 操作 一 般 采 用 自动 化 。 因 此 ,RAPD 有 可 能 成 为 将 来 遗传 图
谱 构建 中 的 一 种 普遍 方法 。

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〈 王 荣 臣 。” 奢 小 松 )

495

人

阿拉 伯 糖 操纵 子 arabinose operon 282

艾滋 病毒 HIV 335

所 酰 -tRNA 合成 酶 aminoacyl-tRNA-synthetase
220 和

过 合 物 chelate 20

cx- 鹅 襄 草 碱 c-amanitin 397

Ac 元 件 Ac element 169

Alu 家 族 Alu family 77,357

B

八 聚 体 octamer 405

靶 target 60

白喉 毒素 diptheria toxin 256

斑 驭 现象 variegation 169

半 保 留 复 制 semiconservative replication 105

半 不 连续 复制 semidiscontinuous replication 108

半 乳 糖苷 透 过 酶 galactoside permease 273

半 位 点 half site 417

包 膜 envelope 294

细胞 质 cytoplasm 46

胞 液 cytosol 53

胞 吐 作 用 exocytosis 267

胞 质 桥 cytoplasmic bridge 446

保守 型 转 座 conservative transposition 162

背 - 腹 轴 dorso-ventral axis 445

葛 麻 蛋白 ricin 256

鞭毛 flagellum 44，59

鞭毛 蛋白 flagellin 45

变 偶 假说 wobble hypothesis 204

变性 denaturation 72

表 型 混合 phenotypic mixing 304

病毒 粒子 virions 290

有 - 半 乳 糖苷 酶 8-galactosidase 3,272,273
496

引

操纵 基因 operator 273

操纵 子 operon 273

操纵 子 学 说 theory of operon 273

草 履 虫 Pazraxazeczzzaz 42，59

侧 体 lateral element 146

插 和 人 -insertion 132
长 单 拷贝 序列 long single copy sequence 373
长 未 端 重 复 long terminal repeat 171

超 分 子 复合 物 supramolecular complex 37

超 螺旋 DNA supercoiled DNA 83

超越 创伤 复制 translesion replication 137

沉默 突变 silent mutation 133

衬 质 靶 向 信号 matrix targeting signal 267
成 角 重 组 angular reconstitution 22 和 4

持家 基因 housekeeping gene 352

持续 性 Processitivity 110

出 口 通道 复合 物 exit channel complex 224

出 芽 budding 296

触角 足 复合 座 antennapedia complex(ANT-C) 455
促成 熟 因子 maturation promaoting factor(MPEF) 439
错 读 misreading 211

错 配 修复 mismatch repair 134

重组 recombination 139,369

重组 体 连 接点 recombinat joint 142

重组 修复 recombinational repair 137

C- 值 C-value 350

C- 值 悖 理 ,.C-value paradox 351

CAAT- 取 代 蛋 自 CAAT-displacement protein
(CDP) 406

D

大 肠 杆 菌 下 schnerichia cozz 47
大 沟 major groove 64,238

大 量 流 动 bulk flow 266

单 链 结合 蛋白 single-strand binding protein 114

单 链 同化 single-strand assimilation 150

单亲 遗传 uniparental inheritance 367

单位 进化 周期 unit evolutionary period 344

单一 序列 unique sequence 353

蛋白 脂 proteolipid 37

蛋白 质变 性 protein denaturation 256

蛋白 质 的 柔性 flexibility of protein 259

蛋白 质 的 翻译 后 易 位 translocation for post-transla-
tion of protein 267

蛋 和 白质 二 硫 键 异 构 酶 protein disulfide lsomerase
上 IT 2257

蛋白 质 易 位 马达 protein translocation motor 268

等 位 基因 allelic gene 303

低温 电镜 cryoelectron microscopy 224,248 一 249

第 二 遗传 密码 secondary code 240

地 中 海 贫 血 症 thalassemia 376

颠 换 transversion 132

点 突变 point mutation 209
定位 因子 positioning factor 399
端 粒 telomere 96,128,355

端 粒 酶 telomerase 128 ,356
短程 力 short-range force 18

短 单 拷贝 序列 short single copy sequence 372
断裂 -复合 breakage and reunion 140

DNA 连接 酶 DNA ligase 115
DNA 指纹 图 DNA finger Printing 356
Ds 元 件 Ds element 169

也

二 分 裂 binary fission 43

二 级 结构 secondary structure 27,227
二 聚 体 dimer 237

二 硫 键 异 构 酶 disulfide isomerase 260
20 面体 icosahedron 294

二 重 对 称 性 dyad symmetry 189

下

发 夹 结构 hairpin structure 77

翻译 后 易 位 translocation for post-translation 267

翻译 水 平 translational level 271
翻译 调控 translation regulation 243
翻译 阻 过 蛋白 translational repressor 288
反 密 码 臂 anticodon arm 238
反 密 码 子 anticodon 233

反 向 重复 inverted repeat 276

反 向 重复 序列 inverted repetitive sequence 77,160

范 德 华 力 van der Waals force 18,65
非 对 称 二 聚 体 asymmetric dimer 113

多 蛋白 polyprotein 127,296,331

多 核 苷 酸 链 polynucleotide chain 62

多 核 苷 酸 磷酸 化 酶 polynucleotide phosphorylase 200
多 核糖 体 -polysome 224

多 聚 了 菌 体 polyphage 293

多 态 性 polymorphism 67

D 环 Dloop 371

DNA 聚合 酶 下 DNA polymerase 下 112
DNA- 结 合 蛋白 DNA-binding protein 81

DNA 的 变性 DNA denaturation 72

DNA 的 不 寻常 结构 unusual structtire of DNA 93
DNA 复制 DNA replication 105
DNA 的 复 性 DNA renaturation 73

DNA 的 复杂 性 DNA complexity 73

DNA 多 联 体 DNA concatemers 306

DNA 结合 域 DNA-binding domain 406

DNA 聚合 酶 DNA polymerase 49

非 复制 型 转 座 nonreplicative transposition 162
非 混 合 型 密码 子 族 unmixed codon family 203
非 孟 德尔 遗传 non-Mendelian inheritance 367
非 自 主 元 件 nonautonomous element 168

废弃 DNA junk DNA 78

分 泌 小 泡 secretory vesicles 266

分 支点 branch site 376

分 支 迁 移 branch migration 142

分 子 伴侣 molecular chaperone 34，
分 子 生 物 学 molecular biology 1

分 子 细胞 生物 学 molecular cell biology 5,6
辐射 的 环 radial loops 349

辅 阻 遇 物 corepressor 272 ,284

负 调 节 negative regulation 264

附加 体 episome 109,162

复合 转 座 子 composite transposon 160

复 性 renaturation 73

497

复制 酶 replicase 110

复制 又 replication fork 107
复制 体 replisome 121

复制 型 replicative form 117
复制 眼 replication eye 107
复制 因子 replication factor 126
复制 子 replicon 109,299

G

于 扰 作 用 interference 304

于 扰 索 二 全 362

囚 崎 片段 Okazaki fragment 108

高 度 重 复 序列 highly repetitive sequence 76,353

高 尔 基 体 Golgi body 41

共 翻 译 co-translation 263

共 合 体 cointegrate 163

共有 序列 consensus sequence 158,182,375

构象 conformation 14

构 型 configuration 15

割 ( 断 ) 裂 基因 split gene 77,360

谷 氨 酰胺 酶 glutaminase 260

光敏 裂 合 酶 photolyase 134

果 蜗 Drosobpjizla mazelazogaster 6,50

过 氧化 物体 peroxisome 53

过 氧 物 酶 体 靶 向 信号 peroxisome-targeting signal
(PTS) 269

G- 有 蛋白 Gjrotein 60

|

炊 enthalpy 21

核 酶 ribozyme 4,291,375,383

核 膜 nuclear envelope 41,51

核 内 小 RNA small nuclear RNACsnRNA) 377

核 内 小 核糖 核 蛋白 颗粒 small nuclear ribonucleo-
protein ParticlesCSnRNPs) 377 本

核 纤 层 蛋白 lamina 441

核 仁 nucleolus 41,51

核酸 酶 nuclease 197

核糖 核酸 ribonucleic acid (RNA) 174

核糖 体 ribosome 3,38,43,54

核 业 体 RNA ribosomal RNA(CrRNA) 176,223
498

核糖 体 蛋白 ribosomal protein 288
核糖 体 结合 位 点 ribosome-binding site 287
核糖 体 释 放 因 子 ribosome releasing factor 250
核 小 体 nucleosome 50

核心 蛋白 core protein 223

核心 酶 core enzyme 112,375

核心 启动 子 core promoter 397

核 衣 壳 nucleocapsid 294

猴 病 毒 40 SV40 334

后 部 体系 posterior system 448

后 随 链 lagging strand 108

互补 DNA complementary DNA (cDNA) 362
花椰菜 花 叶 病 毒 CaMV 317

滑动 序列 slippery sequence 340

环 化 的 滚 环 结构 looped rolling circle structure 119
环 卡 ( 套 圈 ) 结 构 loop structure 288

回复 reversion 132

混合 侵 染 superinfection 303

混合 型 密码 子 族 mixed codon family 203

活化 结构 域 activating structural domain 405
Holliday 连接 点 Holliday junction 143

工

IRE- 结 合 蛋白 IRE-binding protein 432

可

肌 动 蛋白 actin 37,55,59

肌 红 和 蛋白 myoglobin 1,34

肌 球 蛋白 myosin 55 ,56

肌肉 收缩 muscle contraction 59

肌 丝 滑动 模型 sliding filament model 59 烧 !
基础 水 平 元 件 basal level elements 413
基础 因子 basal factor 401

基础 转录 装置 basal transcription apparatus 401
基因 座 loci 452

基因 表达 gene expression 271

基因 答 gene cluster 357

基因 家 族 gene family 363

基因 组 构 gene organization 371

基因 间 抑 制 intergenic suppression 210

基因 内 抑制 intragenic suppression 210

基因 学 说 gene theory 5

基因 转换 gene conversion 153

基因 组 genome 48

基因 新 向 技术 gene targeting 491

校正 突变 suppressor mnutation 133

激活 蛋白 activator 273

极 细 胞 polar cells 449

莱 膜 capsule 44

假 基 因 pseudogene 78 ,358

假 结 节 pseudoknot 341

间隔 基因 gap gene 452

间 体 mesosome 46

间 质 matrix 53

减 数 分 裂 meiosis 139,140

前 接 的 前 导 RNA spliced leader RNA (CSLRNA)
425

剪接 体 spliceosome 376

简 并 性 degeneracy 204

简单 序列 DNA simple sequence DNA 355

碱 性 HLH 蛋白 basic HLH protein 392

降 钙 素 calcitonin 419

降 钙 素 基 因 相 关 肽 calcitonin gene related peptide
419

交换 crossing over 140

交 联 cross-linking 260

酵母 Saccharomzyces 50

节 极 性 基因 segment polarity gene 452

结构 基 元 structural motif 375

结构 生物 学 structural biology 6

结构 域 structural domain 32,56

解 离 酶 resolvase 162

解 螺 旋 酶 helicase 114

介 怀 mediator 262

爹 红 三 羧 酸 aurintricarboxylic acid 242

金属 硫 蛋 白 基 因 metallothionein gene 413

蔡 - 环 stem-loop 340

镜像 重复 mirror repeat 95

居间 序列 intervening sequence 195

聚合 酶 polymerase 197

聚合 酶 链 式 反 应 polymerase chain reaction (PCR )
483

菌 毛 plli 45

前 接 splicing 375

了

可 变 前 接 alternative splicing 419

可 变 前 接 因子 alternative spPlicing factor 423
克隆 clone 3

跨 膜 蛋白 transmembrane proteins 46,58
框架 frame 203

类 病毒 virolds 290

类 固 醇 受 体 sterolid receptor 389

类 核 体 nucleoid 43

类 赛 体 thylakoid 43

离子 通道 ion channel 58

力 蛋 白 dynein 57

利 链 菌 素 streptolydigin 180

联 会 synapsis 140

联 会 丝 复合 体 synaptonemal complex 140

两 亲 分 子 amphipathic molecule 10

亮 氨 酸 拉链 leucine zipper 278,393

磷酸 二 酯 酶 phosphodiesterase 61

硫 半 乳 糖苷 转 乙酰 酶 thiogalactoside transacytylase
273

卵 母 细胞 oocyte 446

卵 清 蛋白 ovalbumin 359

螺 菌 Szzrillzzrz spzrilla 44

螺旋 - 环 - 螺 旋 helix-loop-helix 392

螺旋 -转折 -螺旋 helix-turn-helix 277

螺旋 helix 292

M

马达 motor 45

模板 template 110

腾 靶 向 信号 membrane targeting signal 267
膜 小 泡 vesicle 266

魔 点 magic spot 252

末端 丰 余 terminal redundancy 306

末端 体系 terminal system 448

母体 基因 maternal gene 447

母体 种 系 基因 maternal germline gene 447

499

M 期 促进 因子 M phase promoting factor (MPF)
439

N

赛 泡 cisterna 266

内 含 体 inclusion body 317

内 含 子 intron 77,195,361

内 旺 crista 53

内 香 作 用 endocytosis 266

内 质 网 endoplasmic reticulum 51

拟 病 毒 virusoids 290

拟 南 芥 4rapiadozpsis thalianra 6,51

道 转录 病毒 retrovirus 127

道 转 录 转 座 子 retrotransposon 128

岛 苷 酸 交 换 因 子 guanine nucieotide exchange factor
(GEF) 435

鸟 蚌 叭 guanine 2

至

配对 -界定 基因 pair-rule gene 452
配 体 应 答 ligand-responsive 415

Q

启动 子 promoter 81
起 点 start 438
起 始 密码 子 initiation codon 208
起 始 子 initiator 401
前 -后 轴 anterior-posterior axis 445
前 部 体系 anterior system 448
前 导 肽 leader peptide 287
前 导 序 列 leader sequence 436
前 噬菌体 prophage 327
前 胰岛 素 原 preproinsulin 260
纤毛 cillum 44,59
纤 丝 flament 348
切口 位 移 nick translation 112
球菌 Coccrs cocci 44
趋 化 性 chemotaxis 60
趋向 性 tropism 320
全 酶 holoenzyme 112

500

全 身 性 红斑 狼疮 systemic lupus erythematosus 377
缺失 delietion 132

R

染色 单 体 chromatid 140

染色 体 chromosome 42,51

染色 质 chromatin 343

热 休 克 和 蛋白 heat shock protein 258

热 休 克基 因 heat shock gene 412

热 休 克 应 笠 元 件 heat shock response element
(HSE) 412

人 类 基因 组 human genome 5

溶菌 酶 jysozyme 44

溶 酶 体 jysosome 41,53

洲 源 复制 jysogeny replication 327

熔 球 态 melton-globule state 257

乳糖 操纵 子 lac operon 273

弱化 子 attenuator 176 ,284

RNA 编辑 RNA editing 426

RNA 聚合 酶 RNA polymerase 49,177

RNA 末端 腺 苷 酸 转移 酶 RNA terminal riboadeny-

late transferase 193

S

三 级 结构 tertiary structure 27

扫描 隧道 显微镜 scanning tunnel microscope 67

entropy 22

上 下 文 效应 context effect 212

上 游 激活 序列 upstream activating sequence(UAS)
407

上 游 调 控 元 件 upstream control element(UCE 站 98

上 游 因 子 upstream factor 401

奢侈 基因 luxury gene 352

神经 递 质 neurotransmitter 58,60

神经 生物 学 neurobiology 60

神经 元 neuron 58,60

渗 漏 突变 leaky mutation 133

生长 因子 growth factor 434

生物 分 子 biomolecujle 9

生物 固氮 biological nitrogen fixation 5

十 字形 结构 cruciform structure 77,354

识别 螺旋 recognition helix 278

识别 位 点 recognition site 82

视 紫 红 蛋 白 rhodopsin 60

释放 因子 release factor (REF) 220

受 体 receptor 60 ，

朴 水 交互 作用 hydrophobic interaction 19

朴 水 塌 hydrophobic collapse 257

数目 可 变 的 串联 重复 序列 variable number tandem
repeat Sequence 356

双 螺 旋 模 型 double helix model 1

双 胸 复合 座 bithorax complex (BX-C) 455

双 意 基因 组 ambisense genome 310

顺 式 剪接 cis-splicing 425

四 级 结构 quaternary structure 27

四 膜 虫 TetiraAhymzera 51,379

松弛 型 突变 型 relaxed mutant 252

随机 扩 增 多 态 性 DNA random amplified polymor-
phic DNA (RAPD) 493

羧基 末端 结构 域 carboxyl-terminal domain (CTD)
396 一 397

工

肽 葡 聚 糖 peptidoglycan 43

肽 脱 甲 酰基 酶 peptide deformylase 259

肽 酰 转移 酶 peptidyl-transferase 249

糖 蛋白 glycoprotein 36

糖 酵 解 glycolysis 50

糖 皮 质 激素 应 答 元 件 glucocorticoid response ele-

ment(GRE) 412

体 细 胞 分 离 somatic segregation 367

调节 性 转录 因子 regulatory transcription factor 414
铁 癌 答 元 件 iron-response element(IRE) 432

铁 蛋白 ferritin 431

停泊 蛋白 docking protein 263

同 多 糖 homopolysaccharide 10

同 二 聚 体 homodimer 392

同型 转换 transitions 302

同 源 异 型 基因 homeotic genes 455

同 源 异 型 框 homeobox 391

同 源 异 型 突变 homeotic mutations 455

同 源 异 型 域 homeodomain 391,457

突变 mutation 139,209

突 触 axon 60

突 触 运 输 axonal transport 60

脱落 蛋白 split protein 223

拓扑 异 构 酶 topoisomerase 87

TATA 框 结 合 蛋 白 TATA-binding protein (TBP)
400

TBP- 相 关 因 子 TBP-associated factors(TAF) 402

tRNA 核 苷 酰 转移 酶 tRNA nucleotidyl tEamsferase
195,233

W

外 显 子 exon 32,195,361

网 格 蛋白 clathrin 266

微 管 microtubujle 43,55,57

徽 管 蛋白 tubulin 37,57

徽 丝 microfilament 55

卫星 DNA satellite DNA 76

温度 敏感 突变 型 temperature-sensitive mutation
209

无 细胞 体系 cell-free-system 220

无 义 密 码 子 nonsense codon 208

无 义 突变 honsense mutation 209

愉

硒 代 半 胱 氨 酸 selenocysteine 217

稀 朴 堆 素 sparsomycin 242

细胞 壁 cell wall 45

细胞 分 裂 周 期 cell division cycle(cdc) 442

细胞 骨架 cytoskeleton 55

细胞 核 nucleus 51

细胞 核定 位 序列 nuclear localization sequence 268

细胞 生物 学 cell biology 6

细胞 糖 苯 glycocalyx 44

细胞 学 说 the cell theory 1,41

细胞 质 cytoplasm 46,52

细胞 质 流 动 cytoplasmic streaming 43,60

细胞 周期 cell cycle 437

限制 点 restriction point 124,438

限制 性 内 切 酶 restriction endonuclease 49

限制 性 片段 长 度 多 态 性 restriction fragment length
polymorphism (RFLP) 491

501

线虫 Caenrorhapaitis elegans 6

线粒体 mitochondria 41

腺 病毒 科 Adenovirus 422

腺 味 叭 adenine 2

小 沟 minor groove 64

小 鸣 菌 体 miniphage 293

小 卫星 序列 minisatellite sequence 356

锌 指 zinc finger 389

信和 号 转 导 signal transduction 58

信和 号 识别 颗粒 signal recognition particle 39 ,263

信和 号 序列 受 体 signal sequence receptor 264

信使 RNA messenger RNA 3,176

信使 核糖 核酸 messenger ribonucleic acid (mRNA)
220

形态 发 生 素 morphogen 447 一 448

胸腺 喀 啶 thymidine 2

序列 组 织 sequence organization 77

旋转 酶 gyrase 88

血红 蛋白 heiiogiobin 1，34

YY

亚 基 subunit 292

亚 基 因 组 mRNA subgenomic mRNA 309
延伸 因子 elongation factor 220

叶绿体 chloroplast 41,53

液 泡 vacuole 53,55

液 泡 膜 tonoplast 55

一 级 结构 Primary structure 27

衣 壳 蛋白 coat protein 294

衣 蔬 Chnaxzaydozxzozas 42,50,59

移 码 frameshift 214，,428

移 码 突变 frameshift mutation 133

遗传 密码 genetic code 199

乙 醛 酸 循环 glyoxylate cycle 55

乙酰 胆 碱 acetylcholine 58
异 乳 糖 allolactose 274

异 两 基 硫 代 半 乳糖 苷 isopropyl thiogalactoside

PTGy》 274

异 二 聚 体 heterodimer 392

异型 转换 transversions 302

引物 酶 primerase 114

应 力 丝 stress fiber 56

502

有 丝 分 裂 mitosis 43,51,59
诱导 酶 inducible enzyme 272
诱导 物 inducer 272

诱导 型 因子 inducible factor 401
预 引物 体 preprimosome 117

原 病 毒 provirus 315

原核 细胞 prokaryotic cell 41

原生 动物 protist 42,50

运输 蛋白 transporter 58

运 铁 蛋白 受 体 transferrin receptor(TfR) 430
原 位 杂交 in situ hybridization 354

乙

杂 多 糖 heteropolysaccharide 10

杂 合 现象 heterozygosis 304

杂种 不 育 hybrid dysgenesis 169

载 脂 蛋白 B apo-lipoprotein B (apo B) 426
增强 子 enhancer 410

真 核 细 胞 eukaryoteic cell 41

真菌 fungi 50

整合 integration 49,109

整合 酶 integrase 156

整合 体 intasome 158

整合 作用 integration 158

脂 双 层 lipid bilayer 58

脂 质 长 辣 醇 lipid dolichol 265

指纹 图 法 finger printing method 275

质粒 plasmid 5,109

质 体 plastid 53

质 膜 plasma membrane 41,58

致 病 性 virulence 44 人
致死 突变 lethal mnutation 114 屿
中 度 重 复 序列 moderately repetitive sequenee 353
中 间 纤 维 intermediate filament 55

终止 termination 121

终止 密码 子 termination codon 208

终止 子 terminator 284

周期 素 cyclin 440

转 导 蛋白 transducin 61

转换 transition 132

转录 transcription 174

转录 本 transcript 289

转录 活化 transcriptional activation 119

转录 水 平 transcriptional level 271
转 酯 化 作用 transesterification 196
转 座 酶 transposase 160

转 座 子 transposon 139,160

转 座 作用 transposition 160

着 丝 点 centromere 355

滋 卵 细胞 nurse cell 446
紫杉醇 taxol 57

自杀 底 物 suicide substrate 157
自我 组 装 self-assembly 232

自由 基 free radical 55
自由 能 free energy 22

自主 性 复制 序列 autonomous replication sequence

125
自主 元 件 autonomous element 168
足迹 图 法 foot-printing method 275
阻 遇 酶 repressive enzyme 272
组 成 分 泥 constitutive secretion 266
组 成 型 基因 constitutive gene 401
组 蛋白 histone 51,344
组 蛋白 八 聚 体 histone octamer 90

503

本

met 四
5[ moon
82
2
(起

封面 说 明 : DNA 三 种 形式 的 三 维 结构 ( 左 :B-DNA ,中 :TA-DNA, 右 :A-DNA.TA-DNA 为 含有 TATA
框 并 能 与 TATA 结合 蛋白 相 结合 的 DNA 片段 。 碱 基 为 蓝 色 ,脱氧 核糖 链 骨 架 的 氧 及 碳 为 红色 , 磷 原 子 为 黄
色 。

中 华农 业 科 教
基金 资助 图 书
责任 编辑 : 赵 玉 生

封面 设计 : 郑 川

Ta 员 3 晤 让 :

和

定价 :42. 00 元

9 7878