Full text of "Archiv Fur Mikrobiologie Vol-13"

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UBRARY

New Delhi

ARCHIV

FÜR

MIKROBIOLOGIE

ZEITSCHRIFT FÜR DIE ERFORSCHUNG
DER PFLANZLICHEN MIKROORGANISMEN

DREIZEHNTER BAND
Heft 1-4

BERLIN

SPRINGER-VERLAG
19 4 3

(Aus dem Institut für Mikrobiologie der Universität Gkittingen.)

Über (las Vorkommen von Mikroorganismen
in pflanzlichen Geweben
(nach Untersuchungen an Früchten und Samen) *.

Von

0. Marcus.

Mit 5 Textabbildungen.

(Eingpgangen am 2, Janwir 1942.)

Mikroorganismen ]eb?n in pflanzlichen Geweben einerseits als
Parasiten und rufen dort m^hr oder weniger starke pathologische Ver-
änderungen hervor; andererseits sind zahlreiche Fälle^ bekannt, in denen
Mikroorganismen Symbiosen mit höheren Pflanzen eingehen und in
deren Geweben leben. Die große wirtschaftliche Bedeutung, die beiden,
Parasiten sowie Symbionten, zukommt, ließ ein umfangreiches Schrift-
tum entstehen.

Wenig beachtet, weil für die Praxis bedeutungslos, wurden einige
Beobachtungen über das Vorkommen von Mikroorganismen in pflanz-
lichen Geweben, ohne daß Krankheitserscheinungen auftreten oder
irgendein ersichtlicher Nutzen für die Pflanze entsteht. Und doch sind
gerade solche Fälle biologisch besonders beachtenswert, weil sie gewisser-
maßen Übergänge zur parasitischen oder symbiontischen Lebensweise
darstellen können. Im allgemeinen galten bisher gesunde pflanzliche
Gewebe als steril. Es mehren sich aber gerade in den letzten Jahren die
(oft allerdings recht zweifelhaften) Angaben, die von dem Vorkommen
von Mikroorganismen in intakten pflanzlichen Geweben berichten. So
erheben sich die Fragen, ob intakte pflanzlic he Gewebe wirklich steril
sind, und ob gegebenenfalls Beziehungen zwischen höherer Pflanze
und ~ abgesehen v^on Symbionten und Parasiten — darin lebenden
Mikroorganismen bestehen. Wenn hier von pflanzlichem Gewebe
gesprochen wird, so soll vorerst kein Unterschied zwischen extra-
cellularem und intracellularem Vorkommen gemacht werden.

Besprechung des Schrifttums.

Die über diese Fragen in der Literatur vorliegenden Ergebnisse sind
recht verschieden. Fernbach schließt aus seinen Beobachtungen, daß
Mikroben nicht in lebendes Gewebe einzudringen vermögen, und auch
Zinaer konnte keine Bakterien in pflanzlichen Geweben nachweisen. Dern-

* D 7.

Archiv für Mikrubi(>Io(i;ie. 1hl. l i. ]

O. MarcuB :

gegenüber berichtet NeaÜer (\)^ daß sich im Fr\ichtfleisch von reifen Wa-
cholderbeeren {Juniperus communis) faßt stets Hyphen von Pilze/n in mehr
oder minder großer Zahl vorfänden. Das Stielchen solcher Beeren sei außen
von Pilzmycel überzogen, im Innern aber frei davon. Unreife, noch grüne
Beeren enthielten keine Pilzhyphen. Der Pilz wird als AspergiUus bezeichnet.
Tn einer späteren Arbeit berichtet der gleiche Autor (2) über Bakterien^ die
er aus dem Innern der Paprikafrucht (Capsicum annuum) isolieren konnte.
Es handelte sich dabei um zwei Arten, von denen eine in gelben,

die andere in roten Kolonien wächst; von beiden wird die Zugehörigkeit
zur Gruppe des Micrococcus roseus vermutet. Cauda, der die Reife einiger
Früchte wie von Pirus communis, Malus silvestris, Mespilus germanica,
Ceratonia süiqtia, Phoenix dactylifera, von Rosa und Musa sapientum
untersuchte, berichtet, daß es ihm gelungen sei, aus den meisten von ihnen
spezifische Mikroorganismen zu isolieren. Es handele sicli um BacAllus-
imd Micrococcus- Arten, die er an dem Reifevorgang der Frücljte für ))eteiligt
hält; er benennt sie jeweils nach der Fruchtart, aus der sie isoliert worden
sein sollen (Bac. Piri Gauda, Bac. Mali Cauda usf.). Ob sich derartige
Angaben bestätigen werden, muß zur Zeit noch stark bezweifelt weiden,
denn es ist nicht einzusehen, warum der Reifevorgang das Werk von rnehi’
oder weniger symbiontischen Mikroorganismen sein soll und nicht das
Ergebnis eines durch die Pflanze selbst eingeleitet-en physiologiscfieri Vor-
ganges, Im Hinblick auf Nestlers (2) Beobachtungen ist Catidas Fest-
stellung interessant, daß sich Bac. Piri Cauda gut im Innern der Capsicuni-
Frucht entwickeln soll, eine Eigenschaft, die wohl nicht auf eine Spezifität
des beschriebenen Bazillus schließen ließe.

Zu einem anderen Ergebnis gelangte Wöller. Er konnte im Innein
von Pflanzen (er untersuchte allerdings keine Früchte) niemals Bakterien
finden, „so daß das Pflanzeninnere als steril angesehen weiden muß“. Die
auf der Pflanzenoberfläche normalerweise zahlieich vorkommenden Bak-
terien dringen nur bis zum Perus der Atemöffnung vor. Auch Berthold,
der die gleiche Frage untersuchte und zu diesem Zwecke krautiges CÜewebe
sowie Holz auf das Vorkommen von Mikroorganismen prüfte, kommt zu
dem Schluß, daß normales pflanzliches Gewebe im Innern steril sei. Audi
könne man sich vorerst an die Angaben von Clauditz halten, wonacdi zu
parasiti.schem Theben in der Pflanze nicht liefähigte Bakterien niclit durch
die Wurzel in das Gewebe gelangen könnten.

Miehe dagegen berichtet, daß es ihm nie gelang, trotz Beachtung aller
aseptischer Kautele, Samen aus Kürbissen (Cucurbita Pepo) steril zu ge-
winnen. Die Kürbisfrucht müsse schon von vornherein Bakterien enthalten,
denn sie seien „in solchem Maße und so regelmäßig“ aufgetreten, ,,daß
Fehler in der Methodik nicht als Erklärung herangezogen werden konnten“.

In verschiedenen Arbeiten' teilt NiethAimmer mit, daß sie aus Früditen
und Samen die verschiedenartigsten Pilze isoliert habe. Soweit es sich um
das auch in der vorliegenden Arbeit untersuchte Pflanzenmaterial handelt,
sind die Befunde in Tabelle X, S. 38, zusanrunen mit meinen eigenen, zu-
sammengestellt. Von weiteren Angaben sei erwähnt, daß im Fru(;htfleisch
von Malus aüvestris Konidien von Fusarium solani und F. lateritium ge-
funden worden sein sollen; im Fruchtfleisch von Cucurbita melo wurden
Pilzhyphen gesehen, die sich in Kultur zu Pcnidllium expansum ent-
wickelten.

' Die in dieser Zeitschrift auf die vorliegende Veröffentlichung folgende
Arbeit von Niethammer konnte nicht mehr berücksichtigt werden.

Vorkommen von Mikroorganismon in pflanzlichen Gewolxjn.

ln (Jetreidefriichten nolien Pilze bis in die Alenronzellen vonlringen.
Hier nei auch noch auf die Angaben von Pelclo hingewienen, wonctch in
der Aleuronschicht der Granuneenf rächte regelmäßig Pilze Vorkommen
\md die Aleiironkörner Produkte des Pilzes sc^in sollen, eine Ansicht, die
indessen nicht einsthaft in Hetracht gezogen weiden kann. Weiter soll
nach Niethammer aus Samen von Soja hispida Penicillium bicolor isoliert
worden sein. An steril entnommenen Samen von Geranium sanguineum sei
Arthrobotrys arthrobotryoides festgestellt worden, an (oder in?) steril ent-
nommenen Haselnußkernen der gleiche Pilz, •ferner Cladoaporium herbarum
und Botrytis cinerea. Vielfach sollen sich die Pilze in den Zellwänden finden,
so auch in den Zellwänden des Kndosperms von Coffea arabica.

Nach Niethammer soll es sich bei den von ihr fcstgestellten Pilzen um
die nafiirliche Mikroflora des Standortes (Hodens) handeln, mit Ausnahme
allerdings von zahlreichen Hefen, rlie sich im Kerngehäuse von Pirus
communis fanden, dem Boden des Standortes al>er fehlten. Man vergleiche
hierzu noch die S. 40 der vorliegenden Arbeit gemachten Bemerkungen.

Romwalter (der ältere) und v. Kiräly glauben aus ihren Versuchen mit
Stachell)eeren schließen zu dürfen, daß wolil von vornherein in diesen
Früchten Bakterien und Hefen enthalten seien. Hierfüi’ könnten al)er die
unten S. 31 mitgeteilten Versuche eine Erklärungsmöglichkeit geben,
wonach Mikroorganismen etwa durch Insektenstiche in die Beeren gelangen
können. Es konnten also lieiden bespr(K*henen Versuchen einzelne infizierte
Beeren vorhanden gewesen sein.

Wie Cappelletti und Ceruti (9) beri(diten, findet sich auf den Blüten -
nurfien von Alpenpflanzen eine reiche Pilzflora, wälirend die Gewebe des
Griffels und der Samonanlagen dem Eindringen der Pilze beträchtlichen
Widerstand entgegensetzen. Bei gelegentlich doch erfolgt-er Infektion werde
die normale Entwicklung der Samen niclit gehemmt. Den höchst-en Anteil
an Fruchtknoteninfektionen fanden Verfasser bei Ericace^n: doch müssen
auch derartige Infektionen bei Rhododendron hirsutum beobachtest worden
sein, wie aus der Fesist-ellung hervorgeht, daß für die Fruchtknoten, ebenso
für die Narl>en eine mit der Höhenlage zunehmende Immunität beob-
achtet wurde.

Die neueste Literatur in der Frage der Sterilität pflanzlicher Gewebe
gruppiert sich irn wesentlichen um einige Arbeiten von Schanderl die
auf erheblichen Widerspruch stießen. Der Verfasser l^hauptet darin, daß
nicht allein Leguminosen Bakterien als Symbionten besäßen, sondern auch
eine erhebliche Zahl von Niclitlegurninosen, wie Hedera helix^ Tussüago
farfara, Dactylis glomtrata u. a. m. Die Symbiont-en seien nicht auf be-
stimmte Gewebepartien Ijeschränkt, sondern fänden sich über alle Organe
der Pflanze verteilt und ließen sich leicht daraus isolieren. Bedingung sei
jedoch die Verwendung eines geeigneten Nährbodens, da die Sjnmbionten
in den Geweben als Bakterioden vorlägen und in diesen Nährböden zu echten
Bakterien regeneriert werden müßten; als einen solchen gibt Verfasser
flüssige Bohnenbrübe an; jedoch teilte er auf der Berliner Biologen -Tagung
1941 mit, daß er der Bohnenbrühe nicht mehr die spezifische Eignung
zuspräche. Auch aus Früchten, wie Äpfeln, Birnen, Weinbeeren, Johannis-
beeren, Tomaten, Gurken hätten sich mittels dos genannten Nährbodens
Baikterien- Symbionten, gelegentlich auch Hefen isolieren lassen. Mit geeig-
neten Färbemitteln seien die Symbionten direkt mikroskopisch nach-
zuweisen; als dafür besonders geeignetes Objekt werden die Oalium- Arten
genannt. In einer zweiten Arbeit bringt Schanderl (3) Untersuchungen an

O. Marcus:

einer Menge weiterer Pflanzen, meist Nichtleguminosen, aus denen er eben-
falls ßakteriensymbionten isoliert haben will. Eigentümlicherweise endet
aber „der am häufigsten beobachtete Regenerationsvorgang“ mit der
Bildung von sporulierenden Zellen. Auch in der Aussprache zu dem Vortrag
von A. Jiippel anläßlich der 2. wissenschaftlichen Woche zu Frankfurt a. M.,
betont Schanderl (2) den entscheidenden Einfluß, den seiner Ansicht nach
die Verwendung eines bestimmten Nährbodens auf das Gelingen der Regene-
ration ausübt. Diese könne eben nur in einem Nährmedium stattfinden,
dessen chemisch -physikalische Konstitution der des pflanzlichen Plasmas
weitgehend ähnlich sei. Erst nach erfolgter Rückbildung zu Bakterien
könne auf feste Nährböden übergeimpft werden. Indessen überprüfte
Schciede die Angaben von Schanderl uncl befaßte sich eingehend mit dem
obenerwähnten OcUium. Durch Jodreaktion konnte er zeigen, daß es sich
bei den vermeintlichen ,, Bakterien“ um Stärkekörner handelte. Bei Galium-
Sprossen, die er bei schwacher Belichtung im Zimmer hielt, fiel nach 3 Tagen
die Jod -Stärke -Reaktion negativ aus, „und es fehlten jetzt auch die ,Bak-
tcrien‘“. Auch Bureik, der Schandcrlfi Ergebnisse prüfte, konnte zu keiner
Übereinstimmung der Befunde gelangen, obwohl er auch mit Ttissilago
farfara arbeitete und als Kulturmedium die von Schanderl empfohlene
Bohnenbrühe benutzte. K. Bippel (1) untersuelite neben den von Schanderl
untersuchten Pflanzen besonders die Verhältnisse bei Weinbeeren. Als
Nährböden verwandte er neben Bohnenbrühe u. a. helle, ungehopfte Bier-
würze, Birnensaft nach Müller -Thurgau und Süßmost, pn 5. Auch er koimte
weder in Weinbeeren noch in anderem Material Bakterien feststellen. Diese
negativen Angaben werden erweitert durch weitere, die von dem gleichen
Autor auf der Berliner Biologen -Tagung 1941 gemacht wurden. Ebenda
berichteten Bürge ff und Gessner über diesbezügliche negative Ergebnisse
bei zahlreichen Pflanzen. Nur bei Honkenya peploides fand Gessner in 98%
der Fälle Bakterien im Mesophyll. Bei gleicher Gelegenheit teilt Ullrich
mit, daß er aus den Milbenhäuschen (Acarodomatien) von Coprosma- und
Coffea-Arten Bakterien isoliert habe, niemals aber aus anderen Teilen der
Pflanzen.

Sch/inderls Befunde glauben Hennig und Villforth bestätigen zu
kömien. Sie erzielten aus verschiedenem pflanzlichen Material die mannig-
fachsten Bakterienkulturen, meist Spoienbildner. Ganz abgesehen davon,
daß Bakterien von verschiedenem physiologischen Verhalten und Kultiuen
verschiedenster Farbe — ,, einige der Kulturen gei’ieten in Gärung, bei
anderen bildeten sich verschieden gefärbte Häute, wie Kahmhefen"' — als
Bact. radicicola Bey. und Azotobacier agile })estimmt werden, leidet diese
Arbeit unter einem gewissen Mangel an Sterilisationstechnik, was auch
Borteis in seiner Kritik dieser Arbeit zum Ausdruck bringt. Nicht diskutalrel
dürften die Angaben von Elfving sein, wonach sich aus höheren Organismen
durch Beschädigungen verschiedener Art (Hitze, Gifte) „künstlich“ Bak-
terien darstellen ließen!

Endlich sei noch eine ArVreit von Stührk erwähnt, wonach sich a\is
sterilisierten Erbsen Bakterien entwickeln sollen, wenn die Erbsen zer-
({uetscht würden. Demgegenüber betont Stapp bei der l^erlimu* Biologen -
Tagung 1941, daß hierbei Bakterien zur Entwicklung kommen könnten,
die vor dem Zerquetschen aus Nahrungsmangel nicht anwuchsen. Eine
andere Möglichkeit der Erklärung ist die, daß Luftsäcke vorhanden waren,
in denen die Bakterien der Sterilisation entgingen. Durch Zerquetschen
der Samen konnten die Luftsäcko zerstört werden und damit die Benetzungs-

Vorkonunen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 5

inöglichkeit für die Bakterien und somit für ihre Entwicklung gegeben sein.
Nach beiden Erklärungsmöglichkeiten brauchen die Bakterien also nicht
in den Samen gesessen zu haben*.

Um zu sehen, ob gewisse Beziehungen hinsichtlich der Reife zwischen
Wacholderl>eeren und darin aufgefundenen Pilzhyphen bestehen, beimpfte
Nestler (\) unreife, noch keinen Pilz enthaltende Wacholderl>eeren mit
pilzhaltigem Fruchtfleisch gleicher Art. Tn der Tat seien die so infizierten
Beeren rasch blau geworden, und er habe auch Pilzwachstum darin nach-
weisen können. Dagegen sollen in gleicher Weise verletzte, aber nicht
infizierte Beeren in wiederholten Versuchen höchstens einen bläulichen
Ring um die Wunde herum gezeigt haben; oft sei auch diese Reaktion
Husgeblieben. Doch konnte daraus nicht auf eine notwendige Beteiligung
des Pilzes am Reifungsvorgang geschlossen werden, denn es hätten sich
vereinzelt auch reife Beeren gefunden, die offensichtlich keinen Pilz ent-
hielten. Nestler nimmt dagegen an, daß der Pilz die Zellen im Innern der
Beeren rasch abtötet und so die Farbänderung veranlaßt. Diese Aiuiahme
steht nicht in Widerspruch zu einer Mitteilung von Harter und Weimer,
daß Rhizopus- Arten, die Bataien befallen, erst dann von einer frischen
Schnittfläche aus in das Gewebe eindringen könnten, wenn man die eisten
Zellagen abtöte oder mit Agar bestri(;he. Der Pilz entwickle sich zunächst
m dem toten Material, Durch Enzymwirkung töte er dann einige Zell-
schichten vorher ab, um sich von den toten Zellen zu einäliren. ÄlinlicVies
berichtet Möller Thurgau auch von Botrytis. So eii-cheint es nicht aus-
geschlossen, daß durch das Einbringen des pilzhaltigen Fruchtfleisches in
die intakte Wacholderbeere eine ähnliche Infektionsbasis geschaffen wuide.
Daß aber solche Fragen nicht generell entschieden werden kömien, sondern
von F'all zu Fall neu beurteilt weiden müssen, zeigen Infektionsversiiche
von Günnewig t der sich bemühte, die Synthese voii pilzfieien X^^twm-Keim-
lingen mit dem lAÜiuin-VW/. herzustellcn. Er ging dabei in der Weise vor,
daß er ü Tage alte Z/o/twm-Keirnlinge unterhalb des Vegetationskegels mit
sterilem Skalpell verwundete, in die Wunde H>^hen des /yo/? ur/t-Pilzes
einbrachte und mit iVfcZ«cn-Agar verschloß, da dieser für den Pilz Iwsonders
gute Wachst uinsbedingungen bietet; auch brachte er Schnitte am Wuizel-

* Anmerkung hei der Korrektur Soeben erhalte ich Kenntnis von der
Veröffentlichung von Szilvdsi. Es 'wnirden 13t> verschiedene Pflanzenarten
<ler verschiedensten systematischen Stellung untersucht und in 28% der
t'älle bei Blättern, in 12% bei jungen Trieben, in 20% bei Blüten, in 31%
bei Früchten und in 9^,, bei Wurzeln verschiedene Bakterien (und vereinzelt
Hefen) gefunden. Darunter war z. B. Azotohacicr 48mal vertreten (bei
38 verschiedenen Pflanzenarten). Es läßt sich indessen nicht erkennen, mit
welcher Häufigkeit jeweils die gefundenen Mikroorganismen vertreten
waren. Jedenfalls kann es sich auch hier nicht um wirkliche Symbiosen
handeln, auch wenn die aufgefundenen Mikroorganismen wirklich aus dem
Innern der Pflanzen stammen sollten, so daß die Schlüsse des Verf. in Hin-
sicht auf allgemein verbreitete Symbio.sen abgelehnt werden mvlssen. Es
sei nochmals ausdrücklich iHJttmt, daß es weniger darauf ankommt, bei
verschiedenartigsten Pflanzen einmal Mikroorganismen zu finden als darauf,
in Iwstimmteii Einzelfällen eingehend zu zeigen, ob eine Infektion regel-
mäßiger vorhanden ist (falls es sich wirklich um eine solche handelt) und
wie sie gegelienenfalls zu deuten ist, worülier weiter auf die unten S. 36
folgenden Ausführungen verwiesen sei.

O. Mai*cii8 :

hals der jui^en Pflanzen an und beimpfte sie mit Sporen des Pilzes. Von
diesen Versuchen berichtet er, daß in keinem Falle die Infektion der Keim-
linge geglückt sei.

Nach Dold soll Honig, der ja ein Produkt aus zuckerhaltigen pflanz-
lichen Sekreten und Ausscheidungen aus der Biene darstellt, stark hemmend
auf Bakterienwachstum wirken, und zwar durch Gehalt an thermolabilen
„Inhibinen“. Auch auf Schnittflächen von rohen Kartoffeln, Mohrrüben.
Gurken und Bananen würde Bakterienwachstiun deutlich gehemmt. Von
einer keimtötenden Wirkimg der Zuckerrohrpflanzen spricht Owen, gegen
die sich Bacterium sctccharale zu .schützen verstehe. Dabei stützt er sich
auf C. A. Brown, dei berichtet, daß die Zahl der Bakterien im frischen
Zuckerrohrsaft während einiger Stunden sich vermindere, in sterilisiertem
Saft dagegen von Anfang an zunähme. Berthold faßt die Ergebnisse seiner
Untersuchungen über die Möglichkeit von Mikroorganismenleben in lel)endem
pflanzlichen Gewebe dahin zusammen, daß Bakterien in lebendem krautigen
Gewebe sowie in Holz lange am Leben blieben, daß er aber Vermehrung
von Saprophyten in gesundem Gewebe nicht beobachtet habe; auf i.soliertem
pflanzlichen Grewebe seien Bakterien nicht abgestorben, aber auch nicht
zu irgendwelcher erkennbaren Entwicklung gelangt, wofür die Acidität allein
nicht verantwortlich gemacht werden könne ; außerdem schiene es erforder-
lich, daß das Gewebe erst tot sein müsse, ehe seine Nährstoffe den Bakterien
zugänglich würden.

Zu ähnlichen Ergebnis.sen wie Oiven gelangte Söding. Er stellte fest,
daß Bact. ozaenae und Boot, prheumcmiae Friedl. in Pießsaft und auf Wund-
stellen von Blättern von Iris und Echeveria zu wachsen vermögen. Brachte
er aber diese Keime mittels Infiltratiomsmethode in intaktes Blattgewel>e
von Iris, so hätte er l)eobachten können, daß die Bakterien innerhalb
einiger Tage abgestorben seien. In Blättern von Echeveria glatica infiltriertes
Bact. ozaenae stürbe zunächst „fast restlos“ ab, breite sich aber später
wieder im Blatte aus. Für Bact. prodigiosum dagegen wird Wachstum in
Preßsäften sowie in verwundetem und intaktem Blattgewet)e von Iris tmd
Echeveria angegeben, was mit den Angaben Owens durchaus in Einklang zu
bringen ist. Nach K. Rippel (2) enthalten die Kotyledonen von Erbsen,
nicht aber die Samenschalen und Samenanlage, einen auf Hefen giftig
wirkenden Stoff, der aber bereits verschwunden ist, wenn der Keimling
eine Größe von 0,5 cm erlangt hat; dagegen werde er in reifenden Samen
wieder eingelagert.

Selbstverständlich kann auch eine reine Giftwirkiing in Frage komrneir,
wie z. B. das Anemonin nach Baas, das RanunctUus acer seine hohe rnikrobicide
Wirkung verleiht, im Gegensatz zu dem wenig wirksamen R. repens. Ähn-
liches dürfte wohl auch der Fall .sein bei der von Moriondi angegel>enen
Hemmung des Wachstums von Bakterien durch den Saft von Allium
sativum, während der Saft von A, Gepa nicht hemmt.

Das Wechselspiel zwischen Samen bzw. Früchten und daraus isolierter
Pilze wurde von Niethammer untersucht. Tn einer Versuchsreihe wurde
der Einfluß von Kulturflüssigkeit der Pilze PeniciUium expansum, Tricho-
derma Koningi — von Weizen isoliert — und Rhizopus nigricans auf die
Samenkeimung von Secale cereale untersucht. Dazu wurde Saatgut der
Jahre 1937 und 1917 verwendet. Während in der Keimfähigkeit und im
Keimungsverlauf des Materials von 1937 keine Unterschiede festzustellen
waren, soll das mit Kultur flüssigkeit der drei genannten Pilze behandelte
Saatgut des Jahres 1917 eine wesentliche Erhöhung der Keimfähigkeit

Vorkommen von MikroorganiBmen in pflanzlichen Geweben. 7

gezeigt haben. In einer zweiten Versuchsreihe wurde Kulturflüssigkeit von
Tthizopua nigricans auf ihre Wirkung gepriift. Auch hier sei der Keimungs-
verlauf des Saatgutes von Secale cerecUe der Jahre 1936/37 unbeeinflußt
geblieben, während das Saatgut von 1917 die Behandlung mit verbrauchter
Kulturflüssigkeit wieder erhebliche Steigerung der Keimfähigkeit zur Folge
hatte. Daß es sich hier um Wuchsstoff lief erung seitens des Pilzes gehandelt
haben müßte, geht aus der Bemerkung hervor, daß die gleiche Erhöhung
der Keimfähigkeit bei dem 20 Jahre alten Saatgut durch Zusatz von Wuchs-
stoff aus Roggenkörnern des Jahres 1937 erzielt worden sai.

Andererseits scheint zuweilen auch von der höheren Pflanze eine
Begünstigung des Pilzwachstums auszugehen, wie weitere Beobachtungen
von Niethammer (5) zeigen. Danach sollen einige Pilze, die aus verscliiedenen
Früchten isoliert worden seien, auf gereinigten Zuckerlösungen nur kümmer-
lich gewfUihsen sein; seien al>er kleine Stückchen aus unterscliiedlichen
Teilen der Samen oder Früchte der Nährlösung zugesetzt worden, so hätte
Mycelwachstum und Fruktifikation „bei manchen, nicht allen Arten“
gefördert werden können. Auch diese Beobachtungen weisen auf Be-
ziehungen hin, die offenbar zwischen höheren Pflanzen und in deren Geweben
lebenden Mikroorganismen })este}ien können, deren Art in großen Zügen
wohl zu erkennen, im einzelnen aber noch ungeklärt ist. Daß im übrigen
zwischen den als Syrnbionten auftretendon Mikroorganismen und der Wirts-
pflanze enge Wechsclbeziehunge'n bestehen, ist aus zahlreichen Unter-
suchungen bekannt; auf diese Frage soll hier nicht eingegangen werden
(Literatur bei A. Hippel).

Abschließend soll noch auf das Zusammenlei kui eines Pilzes mit einigen
Arten, besonders Loliufn temiihntum, hingewiesen werden. Ks
handelt sich hier wohl um einen biologisch beachtenswerten Fall, wo sich
das Zusammenleben der Partner schon stark der Grenze zwischf‘n Symbiose
und Parasitismus zu nähern scJieint. Vogl entdeckte zuerst den Pilz in
Frikihten von Lolinm temulentum, und Hiltner glaubte eine gel inge Bindung
des Luft Stickstoffs durch den Pilz feststellen zu können, so daß (lie An-
nahme einer echten Symbiose gerechtfertigt schien. Hayner stützt sich bei
ihren Angaben auf die Untersuchungen von McLennati, wonach Früchte
von Lolium te7nulentU7n aus verschiedenen Erdteilen mit dem gleichen Pilz
infiziert gefunden wurden. Der Pilz breite sich nacli dem Griffel und dem
Nucellus hin aus; er werde aber durch Absorption des Mycels in seiner
Ausbreitung gehemmt und diene allem Anschein nach dem sich entwickelnden
Embryo als Nahrungscpielle. Gewöhnlich w^erde zwischen Schale und
Eiidosperm eine Dauerrnycelschicht gebildet; überwiege aber die Absorption
des Mycels durch das (rewebe, so unterbleibe die Bildung der Dauerraycel-
schicht, und es fänden sicli nur Hyphen iin Scutellum- und Embryogowebe.
Offenbar kämen in Loliimi temal(ntu7n zwei verschiedene Pilze vor, einer
in den Wurzeln, dei- andtue in Sproß und Früchten. Wälirend Peyronel
den Pilz in den Wiu’ziün für cünou Phycmnyceten lialte, glaubt H(iy7ier den
Pilz der Sproßtoile und Früchte zu den üslilaginven stellen zu müssen.
Günnewig bestinunte den Pilz als Chaetomiu7n Ku7izea7ium Zopf . Aus seinen
Untersuchungen schluißt er, daß der Pilz nicht imstande sei, den N der
Luft zu assimilieren luid auch sonst der Pflanze keine VorUüle biete; liin-
gegen hätten sich infizierU^ Pflanzen gegenüber pilzfreien als in ihrer Kon-
stitution geschwächt erwiesen.

Es mag hier nocli erwähnt werden, daß sich in den reifen (nicht den
degenerierten) Früchten imd in der Mikrophyle der Samen der Haffhsiacec

0. MarouH :

Müroatemon Yamamotoi .stets die Chlamydosporen eines Pilzes finden
(Watannhe), Ferner sei noch hingewiesen auf den Fall von Pavetta indica
var. tomentoaa mit Bakterien in den Samen, ohne dai3 Blattknoten vorhanden
sind, weiter auf das Vorkommen von Bakterien im Samen (zwischen Schale
und Keimling) von Wasserkelchpflanzen wie SpcUhodea {v. Faber).

Überblickt man die vorliegende Literatur im ganzen, so ergibt sich
folgendes Bild: Aus Früchten und Samen werden eine Anzahl Iso-
lierungen von Mikroorganismen beschrieben; dabei handelt es sich um
Bakterien-, Hefe- und Pilz- Arien. Die Angaben über Bakterien -
Symbiosen von Nichtleguminosen und Totalinfektion der Pflanze durch
den Syinbionten stehen bisher vereinzelt und sind vorerst durchaus
zweifelhaft. Offenbar bestehen Wechselwirkungen zwischen Samen bzw.
Früchten und den aus ihnen isolierten Mikroorganismen, wobei indessen
nicht zu entscheiden ist, wieweit diese Wechselwirkungen spezifische
Vorkommen bedingen [vgl. Mykorrhiza (Freisieben)']. Das fast

regelmäßige Vorkommen von Chaetotnimn Kunzeanum im Gewebe von
Loliutn temulentum wird mehr für einen Parasitismus seitens des Pilzes
als für eine Symbiose gehalten.

Eigene Untersuchungen.

1. Das Yorkominen von Mikroorganismen in Früchten und Samen.

Entsprechend den eingangs aufgeworfenen Fragen sollten die
vorliegenden Untersuchungen in der Haiiptsache feststellen, ob sich in
dem zur Untersuchung gelangenden Material Mikroorganismen vor-
finden, und in welchem Umfange etwa mit Infektionen gerechnet
werden muß. Außerdem wurden einige ergänzende Versuche angestellt,
ob etwa wechselseitige Beziehungen zwischen höherer Pflanze und den
gegebenenfalls darin vorkommenden Mikroorganismen aufzudecken seien.

Meine Untersuchungen erstreckten sich auf Früchte und Samen
verschiedener Art- und Familienzugehörigkeit. Die sich daraus er-
gebenden außerordentlichen Schwankungen in der Größe der Versuchs-
objekte lassen es vorteilhaft erscheinen, die Versuchsmethoden den
jeweils gegebenen V^erhältnissen anzupassen. So soll hier bewußt auf
eine gesonderte Behandlung der Methodik verzichtet und bei der Be-
handlung des jeweiligen Materials näher darauf eingegangen werden.
Die Einordnung des Materials folgt nach der Reihe der systematischen
Stellung der betreffenden Arten. Dabei werden Untersuchungen an
Erdbeeren und Himbeeren weggelassen, weil hier die Infektion.sgefahr
zu groß ist.

Juniperus communis L. (Wacholder).

Die Beobachtungen von Nestler (1) über das Vorkommen von Pilz-
hyphen in Wacholderbeeren veranlaßten mich, diese Früchte in meine
Untersuchungen einzu beziehen. Wenn im folgenden die Frucht des

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 9

Wacholders als ,, Beere“ bezeichnet wird, so nur der Kürze halber in
Anlehnung an den allgemeinen Sprachgebrauch; ihr Charakter als
,, Zapfenbeere“ soll dadurch in keiner Weise berührt werden.

Das zur Untersuchung gelangende Material stammt zunächst teils aus
der Umgebung Göttingens, teils aus der Gegend um Homberg, Bez. Kassel,
aus Höhenlagen von 250 — 300 m über NN. Die Einerntung erstreckte sich
tuf die Zeit vom März bis Mitte Juli 1941. Von Wacholdersträuchern
Warden kleine Zweige, die möglichst reich mit einwandfrei aussehenden,
teils reifen, teils noch unreifen Beeren besetzt waren, abgeschnitten und
sofort in gut schließende Papierbeutel gebracht. Die Untersuchung wurde
möglichst noch am gleichen Tage, spätestens al>er am folgenden Tage vor-
genommen. Dazu wurden vollstänclig gesund aussehende Beeren von den
Zweigen abgetrennt und auch das Stielchen entfernt, olme a]>er die Frucht
selbst zu verletzen. Zur Beseitigiuig von gröberen, auf der Scliale haftenden
Verunreinigungen wurden die Beeren zuerst mit in Wasser angefeuchtetem
Wattebausch abgerieben, darauf wurden no(;h verbliebene Reste der Wachs-
schicht durch wiederholtes Abreiben mit Xylol entfernt. Anschließend
folgten ein 2 - 3 Minuten dauerndes Bad in 0,2%iger Hg Clg -Lösung, und
mit sterilem, destilliertem Wasser wurde 5—10 Minuten nachgespült.
Jetzt koimten die Beeren äußerlich als steril gelten. Von jeder so vor-
hehandelten Beere wurden zwischen sterilem Holundermark schnell vier bis
sec*hs möglichst dünne Schnitte mit in der Flamme keimfrei gemewjlitem
Rasiermesser hergestellt. Das zum Schneiden bestimmte sterile Holunder-
mark bereitet man sich zweckmäßig vorher in ausreichender Menge, indem
man einige Stangen Holundermark in etwa 2 cm lange, runde Klötzch(‘ii
zerschneidet und diese wieder der Länge nach anfspaltet. Damit füllt man
einige Keagensröhrchen \md achtet darauf, daß die Hälften der Kh’it zehen
stets gut nebeneinander bleiben; die Röhrchen werden dann in üblicher
Weise mit Wattepfropfen verschlossen und im Autoklaven bei -f 120® C
20 Minuten lang sterilisiert.

Obwohl zur mikroskopischen Untersuchung der Schnitte das Anfärben
derselben ohne Schaden hätte unterbleiben können, wurde es dennoch durch -
geführt, um etwa vorhandene Feinheiten nicht zu übersehen, ^’'on den zur
Untersuchung gelangenden Beeren wurde je ein Teil der Schnitte nach der
Methode von D. Alcom und C. C. Yeager mit Orseillin BB gefärbt. Diese
Methode besitzt den Vorzug, etwa vorhandene Pilzhyphen innerhalb kurzer
Zeit kräftig rot anzufärben, so daß sie sich von dem weniger stark bzw.
gar nicht gefärbten Gewebe abheben. Der ihr anhaftende Mangel liegt
jedoch darin, daß in so behandelten Schnitten anwesende Mikroorganismen
abgetötet werden. Da bei dem restlichen Teil der Schnitte alx»r Wert
flarauf gelegt wurde, etwa darin lebende Mikroorganismen am ]^l:>en zu
erlialten, fand eine auch von Niethammer (4) zur Färbung von Pilzhyphen
vt^rwendete wässerige Lösung von Oxaminblau 4 R Verwendung. Die günstige
Konzentration scheint nicht für alle Objekte die gleiche zu sein, und auch
Niethammer (4) sagt nichts über die Stärke der von ihr verwendeten Farb-
lösung. Zur Untersuchung von Wacholderbeeren erwies sich die 0,06 %ige
Lösung als brauchbar, doch reicht diese Färbung hinsichtlich der Differen-
zierung nicht- an die vorgenannte Methode heran. Aus diesem Gr\mde
fanden beide Methoden nebeneinander Verwendung. — Die Schnitte wurden
mit einem Tropfen im Autoklaven sterilisierter Oxaminblaulösung an ein
abgeflanruntes Deckglas geheftet und dieses auf einen ebenfalls abgeflammten

O. Marcus :

Objektträger mit Hohlschliff gelegt imd mit einem Tröpfchen abgekochten
destillierten Wassers an diesem angeheftet, sodann zur Kultur in einer
feuchten Kammer aufbewahrt.

So wurden im ganzen etwa 50 Beeren untersucht, davon 20 unreife,
der Rest ausgereifte Beeren. Das Fruchtfleisch der unreifen Beeren
war ausnahmslos pilzfrei, und auch in den Hohlschliffen konnte keinerlei
Pilzwachstum beobachtet werden. Von den untersuchten 30 reifen
Früchten (Tabelle I) waren nur 4 im Innern pilzfrei. Die urigen be-

Tabelle I. Vorkommen von Pilzen in •7wn^per^^Ä-Beeren.

Zahlen in % der untersuchten Beeren.

Herkunft der Probe aus (Anzahl der Beeren)

Pilzart

Oöttingeii,

Kroatien

Kassel

(30)

Alternaria tenuis

13,3*

10,0

5,0

_ .

Hormodendron chlor i-

num var. nigrovirens

20,0*

—

Hormodendron herharum

—

6,0**

16,7

Monilia

—

20,0

45,0**

—

Unbestimmbar

40,0

10,0

15,0

—

10,7

16,7

Pilzhyphen mikrosko-
pisch beobachtet, kein

Wachstum in Kultur

20,0

—

16,7

Steril

13,3

60,0

36,0

100,0

66,6

• In zwei Beeren waren die b<'iden Pilze vorhanden. — •• ln einer Beere waren die beiden
Pilze vorhanden.

Abb. 1. Schnitt ans reifer Wacholderbeere. Orseillin BB, ^artorysche FlflMiskeit.

Vergr. 176 mal.

saßen ein von Pilzhyphen völlig durchzogenes Fruchtfleisch (Abb. 1),
wobei sich zwischen den Proben aus Göttingen und aus Klassel kein
Unterschied ergab. Das Mycel scheint sich nur intercellular auszu breiten ;
jedenfalls konnten bei dem untersuchten Material intracellular vor-

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 11

kommende H 5 rphen nicht festgestellt werden. Oft sind die Hyphen
knorrig, dick und mehr oder weniger kurzzellig, bräunlich oder dünner,
dann aber langzelliger und farblos, teils mit körnigem Inhalt oder auch
hyalin. Die Dicke der Hyphen schwankt beträchtlich:

Gemessene Hyphendicken:

Präparat 1 : 10,9 9,9 jjl.

,, 2: 7,6, 6,3, 9,9 p.

„ 6: 10,0, 12.0, 4.6, 10,0, 5,6, 3,3 [i.

Fruktifikationsorgane, die NeMler (!) selten beobachtet zu haben
glaubt, konnten nicht festgestellt werden, des öfteren aber auch von
ihm erwähnte Hyphen mit stark gequollenen Zellwänden (Abb. 2) ; wie

Abb. 2. Pllxhyphe aus Wacholderbeere (mit gequollenen Zellwänden).
Vergr. 1100 mal.

die Abbildung zeigt, sind die Quellungsschichten in gleicher Weise
gegliedert- wie die Pilzhyphen, so daß es sich kaum um von der Pflanze
ausgeschiedene Cellulosescheiden handeln kann: auch angestellte
Reaktionen ergaben keinen Anhalt dafür.

In den Hohlschliffen entwickelte sich meist nur ein mehr oder
weniger üppiges Mycel ohne Fruchtkörper, welches nach kurzer Zeit
unter dem Deckglas hervorwuchs und so eine einwandfreie Beob-
achtung ausschloß. In fünf verschiedenen Fällen konnte mit Sicherheit
Konidienbildung festgestellt werden, die die Bestimmung und Isolierung
des Pilzes ermöglichte. Die Bestimmung wurde nach Thom^-Migula
vorgenommen, ln jedem dieser Fälle konnte der Pilz als Hormodendron
cMorinum var, nigrovirens (Fresen) Sacc. bestimmt werden; jedenfalls
handelte es sich nicht um eine Aspergillus -Art, wie Nestler (l) ohne
nähere Bestimmung annahm. Der Pilz, dessen Standort nach der
ö'^ögebenen Bestimmungstabelle auf faulenden Früchten angegeben
wird, läßt sich leicht bei Zimmertemperatur auf Würzeagar und Czapek-
Agar kultivieren, wo auch reichlich Konidien gebildet werden; doch

O. Marcus :

scheint ihm Würze-Agar mehr zuzusagen, worauf die üppigere Ent-
wicklung und das schnellere Wachstum schließen lassen.

Wenn danach auch ein häufigeres Vorkommen dieses Pilzes in
Wacholderbeeren erwartet werden konnte, so lag doch kein Grund
dafür vor, ihn allein für die Verpilzung des Pruchtinnem verantwortlich
zu machen. Im Gegenteil mußte damit gerechnet werden, daß sich noch
eine Anzahl weiterer Pilze, wie u. a. auch Altemaria, daran beteiligen
und vielleicht auch nebeneinander Vorkommen. Denn in einigen Beeren
fand ich auch bei den Kultur versuchen Ältemaria (vermutlich tenuis)
neben Hormodendron.

Es ist noch zu erwähnen, daß die Pilze nicht in die verholzten
Schalen der Samen eindringen.

Für das Eindringen der Pilze in das Fruchtfleisch erscheint es von
Bedeutung, daß die Beeren an der oberen Verwachsungsstelle der sie
bildenden Schuppen drei verzahnte Nähte besitzen, deren Schluß wohl
nicht immer ganz vollständig ist. Diese Annalime stützt sich auf die Beob-
achtung, daß bei verschiedenen weiblichen Pflanzen die Beeren oben über-
haupt nicht schließen, so daß zwischen den Schuppen die Samen noch bei
reifen Beeren deutlich zu erkennen sind. Solche Pflanzen weisen einen sehr
hohen Anteil offensichtlich kranker Früchte auf, und es fällt selbst bei sehr
starkem Behang schwer, aus noch unreifen Beeen einige gesund aussehende
herauszufinden. Da die Untersuchung solcher unreifer Beeren ergab, daß
das Fruchtfleisch noch pilzfrei war, so liegt der Schluß nahe, daß die unter-
bliebene Verwachsung der Fruchtschuppen keine durch Pilzbefall verursachte
pathologische Erscheinung darstellt, sondern sicher auf eine Eigenschaft
der betreffenden Einzelpflanze zurückgeführt werden muß.

Um den Zeitpunkt des Eindringens der Pilze in die Beeren zu er-
mitteln, wurden in Abständen von 14—21 Tagen Proben von über-
jährigen, unreifen Beeren untersucht. Da sich bis zur Mitte des Monats
Juli in keiner gesund aussehenden unreifen Beere Anzeichen von Pilz-
infektionen feststellen ließen, kann angenommen werden, daß der
Befall erst nach der zweiten Julihälfte des zweiten Jahres einsetzt.
Pilzisolierungen aus offensichtlich kranken und größtenteils zerstörten
Früchten zeigten, daß der die Erkrankung verursachende Pilz nicht
mit dem aus gesund aussehenden Beeren isolierten Hormodendron
chlorinum var. nigrovirens identisch war.

Nachträglich wurden noch weitere Wacholderbeeren sehr ver-
schiedener Herkunft 1 untersucht, die ebenfalls in Tabelle I aufgeführt
sind. Es ist zunächst auffallend, daß in der Probe aus dem Werfatal
(Südhang des von Werleshausen zum Haustein führenden Tales), von
der einige Beeren mikroskopisch Pilzhyphen zeigten, das oben erwähnte
Hormodendron fehlte, obwohl die Stelle fast genau in der Mitte zwischen

^ Für die Überlassung des Materials danke ich den Herren Dr. Stare,
Dr. Ä. Meyer und Prof. Rvppel.

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 13

der Kasseler und Göttinger Stelle liegt (südostwärts dieser Linie).
Dafür war wie dort Altemaria tenuis vorhanden, ferner war eine Monilia
stark vertreten. Der Anteil der sterilen Früchte war mit 60 % sehr hoch.

Die nächste Probe aus der Lüneburger Heide (Sülberg) zeigte
ebenfalls mikroskopisch häufig Pilzhyphen. Wiederum fand sich, wenn
auch vereinzelt, AUemaria tenuis und eine andere Hormodendron- Art,
H. herbamm (in einer Beere zusammen mit Altemaria), ferner eine
Monilia in sehr hohem Anteil. 35% der Beeren erwiesen sich als steril.

Es folgen drei Proben aus Kroatien, und zwar von Moslavacka Gora
(einem kleinen Gebirge südöstlich von Zagreb), aus Zagorje (nördlich
von Zagreb) und aus Sljeme (unmittelbar bei Zagreb). Das Bild ist
hier weniger mannigfaltig als bei den deutschen Proben. Es wurde
nur bei der zweiten Probe Hormodendron herbarum identifiziert, dazu
in dieser und der dritten Probe unbestimmbare Pilze. In der dritten Probe
zeigte eine Beere im Schnitt Pilzhyphen, die sich mit Orseillin BB außer-
ordentlich stark angefärbt hatten: der Inhalt war körnig, und die
H3nphen zeigten an einigen Stellen, in der Mitte oder endständig, kugelige
Auftreibungen. Die Querwandbildung war spärlich; im ganzen ähnelte
das Bild sehr dem von NeMler (l) beschriebenen. Leider erfolgte kein
Wachstum der Hyphen, als die Schnitte auf Würze -Schrägagar aus-
gelegt wurden.

Bei diesen kroatischen Proben war der Anteil der sterilen Beeren
sehr hoch, und in der ersten Probe konnten sogar bei 20 Beeren weder
mikroskopisch noch kulturell Pilze festgestellt werden. Da die Beeren
stärker verharzt schienen als die einheimischen, wurde eine Äther-
extraktion von dieser Probe und der Probe aus dem Werratal ausgeführt,
die folgende Werte ergab:

Mo.slavacka 11,26% der Trockensubstanz ätherlöslich

Werratal 9,55% „ „ „

Der Unterschied ist wohl zu gering, als daß er in Betracht gezogen
werden könnte. Immerhin bleibt natürlich noch die Möglichkeit be-
stehen, daß die kroatischen Proben mehr Stoffe fungicider Natur ent-
hielten als die deutschen Proben.

Trotz des wechselnden Bildes ergeben sich doch bei den Juniperus-
Beeren offenbar örtliche Unterschiede, sei es in der Stärke der Infektion
selbst, sei es im Vorkommen bestimmter Pilze, wie es geschildert wurde.
Es würde sich zweifellos lohnen, diesen Dingen auf breiterer Basis und
unter stärkerer Berücksichtigung der Standortsbedingungen nach-
zugehen.

Oratnineae,.

Zur Untersuchung gelangten die Früchte der einheimischen Getreide-
arten, sowie eine Probe der Früchte von LciUum temulentum als Vergleichs-
material. Die Ernte erfolgte in ähnlicher Weise wie die des Wacholders;

O. Marcus :

auf dem Felde wurden jeweils mehrere gesund aussehende Ähren bzw.
Rispen mit nur kurzem Halmstück abgeschnitten und in gut schließendem
Papierbeutel verpackt, darin getrocknet und aufbewahrt.

Die Untersuchung bot insofern eine Schwierigkeit, als die Früchte
äußerlich möglichst keimfrei gemacht werden sollten; andererseits aber
durften Mikroorganismen, die vielleicht in Frucht- oder Samenschale ein-
gedrungen waren, nicht abgetötet werden. Daher wurde folgendes Ver-
fahren angewendet: die Früchte wurden in destilliertem Wasser so lange
gespült, bis sie sich vollständig benetzt hatten. Danach brachte ich sie in
eine 0,2% ige Lösung von Uspulun -Universal, worin sie 3—5 Minuten ver-
blieben. Obwohl Angaben über Chlorphenolquecksilber dem wirksamen
Bestandteil von Uspulun-Universal, besagen, daß es sich gut zur Sterilisation
Von Samen bzw. Früchten eigne, und diese bei Verwendung einer 2%igen
Lösung in einer Stunde sicher keimfrei seien (Bouillonprobe), so konnte
doch aus dem oben angegebenen Grunde eine so lange Einwirkungsdauer
nicht in Frage kommen; denn bereits 10 — 15 Minuten lange Einwirkung
von Uspulun-Universal erwies sich als ungünstig. Auch erscheint bei der
hier gestellten Forderung die Entscheidung darüber, ob Mikroorganismen,
die sich in Kontrollproben entwickeln, noch von der Oberfläche staminem
also die Entkeimung nicht ganz vollständig war, oder aber ob sie aus der
Oberfläche nahegelegenen Gewebeteilen hervorgewachsen sind, nicht ohne
weiteres möglich. Nach dem Uspulun -Bad spülte ich die Früchte 10 Minuten
lang unter mehrmaligem Wasserwechsel in sterilem, destilliertem Wasser
nach. Die Schnitte zur mikroskopischen Untersuchung wurden, wie bei
Wacholder beschrieben, hergestellt.

Zur Färbung der Schnitte fanden wieder die Methoden von D. Alcorn
und G. G. Yeager ( 1 ) und von Niethammer (4) Anwendung. Da sich aber beim
Mikroskopieren die Stärkekörner als außerordentlich .störend erwiesen,
wurden sie bei den für die Färbung mit Orseillin BB bestünmten Schnitten
durch Diastase 1 ; 250 (Merck) bei 65® C herausgelöst, so daß die Schnitte
gänzlich klar erschienen. Darauf wurden die Schnitte in saulierem destil-
lierten Wasser kiu^ gespült und dann gefärbt. Bei den Schnitten, die in
Hohlschliffen kultiviert werden sollten, erschien die Herauslösung der Stärke
nicht zweckmäßig, da eine Schädigung etwa darin vorhandener Mikro-
organismen befürchtet werden mußte; außerdem ergaben Kontrollproben,
daß das verwendete Diastasepräparat nicht keimfrei war. Daher wurden
die zur Kultivierung bestimmten Schnitte in sterilem destillierten Wasser
ausgewaschen und in einem Tropfen Oxaminblau 4 R, wie bei Wacholder
beschrieben, in einen Hohlschliff gebracht. Von jedem Korn wruden wieder
eine Anzahl Schnitte hergestellt imd jeweils ein Teil davon nach einer der
beschriebenen Methoden untersucht. Die Färbung mit Orseillin BB zeigte
sich hier der anderen noch weiter überlegen, da das Oxaminblau 4 R von
den Aleuronzellen so stark gespeichert wurde, daß diese schwarzblau er-
schienen und keinerlei Strukturen mehr darin zu erkennen waren. Die
verwendete Farblösung war 0,06 %ig. Weitere Verdünnung der Farblösimg
hätte lediglich die Differenzierung beeinträchtigt, aber keine neuen Vorteile
mit sich gebracht. Im folgenden soll nun über die Untersuchungen an
Getreidefrüchten berichtet werden.

^ Arbeiten der Landwirtschaftlichen Versuchsstation Limbmgerhof.

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 15

Secale cereale L. (Roggen).

A. Sorte: v. Lochows Petkuser Normalstroh Winterroggen

(Hochzucht).

Die Probe stammte aus der Umgebung von Homberg, Bez. Kassel, imd
wurde im Juli 1940 in gelbreifem Zustande geerntet; die Keimfähigkeit
betrug 98 % nach 3 Tagen .

Im Januar 1941 untersuchte ich 20 Körner der Probe, von denen
120 Schnitte angefertigt wurden. Jeweils die Hälfte, das sind von jedem
Kom drei Schnitte, wurde nach einer der zwei genannten Methoden
behandelt. Bei den mit OrseilJin BB gefärbten Schnitten konnten fast
überall Pilzh 3 ^hen in größerer Zahl beobachtet werden ; nur vereinzelte
Schnitte mac^hten eine Ausnahme.

Die Hypben hoben sich deutlich
von dem übrigen Gewebe durch in-
tensivere Rotfärbung ab (Abb.3);
ihre Dicke schwankte zwischen 2,3
und 0,6 [x; die dickeren Hyphen
waren etwas stärker septiert als
die dünneren. Sie durchzogen das
Gewebe der Längs- und Querzellen-
schicht und schienen sich dabei
mehr intercellular zu halten, denn
innerhalb der Zellen konnten keine

Pilzhyphen beobachtet werden. Sehr
zahlreich waren Pilzhyphen in Hohl-

Abb. 3. Roggen, J^üngaschnitt aus Koni mit
Mlzhj'phe (Orseillin BB, .Sarfori/sclie Tjb»ung).
Vergr. 175 mal.

räumen vertreten, die sich durch

Loslösen der Fruchtschale von der Samenschale gebildet hatten und
vor allem zu beiden Seiten der Raphe stark ausgeprägt in Erscheinung
traten .

Entgegen den Angaben von Peklo und Niethammer (4) erwiesen
sich die Zellwände und Zellen der Aleuronschicht in allen Fällen als
pilzfrei, und auch im Mehlkörper konnten — in Übereinstimmung mit
den vorgenannten Autoren — von einer Ausnahme abgesehen, keine
Pilzhyphen festgestellt werden. Obwohl Niethammer (4) auch im Gewebe
des Keimlings Pilzhyphen gesehen zu haben glaubt, fand sich im vor-
liegenden Material keine Bestätigung dafür. Es liegt vielmehr nahe
anzunehmen, daß die Pilze die unverletzte Samenschale nicht zu durch-
dringen vermögen. Denn einmal konnte ich deutlich sehen, daß einzelne
Pilzhyphen durch eine alte Rißstelle in der Samenschale bis weit in den
Mehlkörper vorgedrungen waren. Aber auch hier konnte kein Befall
der Aleuronzellen beobachtet werden. Das Korn war gänzlich normal
entwickelt und wies auch äußerlich keine Zeichen von Pilzbefall auf.

O. Marcus :

Fruktifikationsorgane der Pilze wurden innerhalb der pflanzlichen
Gewebe nicht beobachtet.

In den übrigen mit Oxaminblau 4 R gefärbten 60 Schnitten, die in
Hohlschliffen kultiviert wurden, entwickelten sich in den meisten
Fällen innerhalb weniger Tage zahlreiche Pilzhyphen, deren Ursprung
aus den im Innern der Schale liegenden Hyphen unter dem Mikroskop
deutlich beobachtet werden konnte; aber in nur wenigen Präparaten
fand nach etwa 8 Tagen Konidienbildung statt. Dreimal wurde
Hormodendron, allem Anschein nach Hormodendron herbarum, öfter
Altemaria festgestellt (Tabelle II). Niethammer (4) bestimmte die von
ihr isolierte Altemaria als A. humicola; im vorliegenden Falle aber war
der Pilz eher als Altemaria aecalis anzusprechen. Horrnodendron und
Altemaria fanden sich hin und wieder im gleichen Kom.

Tabelle II. Isolierung von Pilzen aus Getreidefrüchten.
Anzahl der Isolierungen.

Secale

Triticum

Hordeum

Avena

rereale

aeitivum

tmlgare

iotiva

Altemaria tenuia

Altemaria aecalis

Hormodendron herbarum

Hormodendron chlorinum var, nigrovirens . .

— 1

ß (20)

3 (20)

4 (15)

1 (8)

Cephaloaporium accremonium

Fusarium graminearum

1 (15)

2 (8)

1 (8)

Unbestimmbare Pilze

9 (20)

7 (15)

2 (8)

5 (8)

ln () aus Anxah] der Früchte.

B. Sorte: Heßdorfer Johannisroggen.

Die Proben stammten vom Versuchsfeld des Instituts für Pflanzenbau
in Göttingen. Die erste der Proben wurde in grünreifem Zustand am 6. Juli
1939 geerntet, die zweite Probe war bei der Ernte am 20. Juli 1939 gelbreif.
Die Untersuchung beider Proben erfolgte im April 1941.

Die Untersuchung der grünreif geernteten Probe brachte gegenüber
A. nichts Neues. Pilzhyphen waren in ähnlichem Umfange vorhanden,
und es war auch nirgends zu beobachten, daß Pilze in die Aleuronschicht
oder den Keimling eindrangen. In HohlschliffkuJturen unterblieb
überall das Pilzwachstum, obgleich die Bedingungen gegen früher
nicht geändert worden waren; es mußte daher angenommen werden,
daß die Hyphen bereits tot waren.

Die gelbreif geerntete Probe wies Pilzh 3 phen in der gleichen Art
wie A. auf; in Kulturversuchen erfolgte aber auch hier kein Wachs-
tum mehr.

C. Sorte: Nordost.

Die Proben stammten ebenfalls vom Versuchsfeld des Instituts für
Pflanzenbau in Göttingen. Eine grünreife Probe wuide am 6. Juli 1939

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 17

genommen, während die gelbreife Probe am 20. Juli 1939 geerntet wurde.
Die Untersuchung beider Proben fand im April 1941 statt.

Neue Befunde waren nicht zu verzeichnen; die Ergebnisse der
Proben A. und B. fanden hinsichtlich des Vorkommens von Pilzhyphen
ihre Bestätigung. Wachstum der Hyphen fand weder in den Hohl-
schliffkulturen der grünreif geernteten Probe, noch in denen der gelbreif
geernteten statt. Danach muß man annehmen, daß die Pilzhyphen bei
längerer Lagerung absterben.

Triticum aestivum L. (Weizen),

Zur Untersuchung gelangte nur eine Probe eines Sommerweizens der
Ernte 1940 aus der Gegend von Homberg, Bez. Kassel, die in gelbreifem
Zustand geerntet wurde. Die Untersuchung erfolgte im Mai 1941.

Bei mikroskopischer Betrachtung der mit Orseillin BB gefärbten
Schnitt-e bot sich ein ganz ähnliches Bild wie bei Roggen: Pilzhyphen
fanden sich in der Fruchtschale intercellular wachsend, vornehmlich
aber in den Hohl räumen zwischen Frucht- und Samenschale ; in größerer
Menge waren sie wieder in den großen Höhlungen seitlich der Raphe
zu beobachten. Scptierung und Größen Verhältnisse entsprachen denen
der bei Roggen beschriebenen Pilzhyphen. Aleuronschicht und Mehl-
körper sowie das Gewebe des Keimlings erwiesen sich als pilzfrei.

Die Färbung des anderen Teiles der Schnitte mit Oxaminblau 4 R
und deren Kultur in Hohlschliffen erbrachte mehrmals das Wachstum
von Altemaria tenuis Ne.es und einmal von Cephalos'poriuin acremonium
Corda. In anderen Präparaten entwickelten sich weißliche bis graue
Pilzlager, ohne jedoch irgendwelche Fruchtkörper zu bilden (Tabelle II).
Die von Niethammer (4) erwähnten Arten, Trichoderma Koningi, Mucor
hiemalis, wurden hier nicht isoliert.

Hordeum vulgare L. (Gerate),

A. Sorte: Dr. Mausbergs Wintergerste.

Auf dem Versvichsfeld de.s In.^^Jtitut.s für Pflanzenbau in Göttingen
wurden zwei Proben, eine am 6. Juli 1939 in grünreifem Zustand, die andere
gelbreif am 20. Juli 1939 geerntet. Die Untersuchung fand im April 1941
statt.

Durch kurzes Einquellen in Leitungswasser lockerten sich die
Spelzen etwas, so daß sie leicht entfernt werden konnten; die Weiter-
behandlung der Körner erfolgte wie eingangs beschrieben. Nach den
bei den Versuchen mit Roggen gemachten Erfahrungen konnte auf eine
Färbung der Schnitte mit Oxaminblau 4 R und deren Kultur in Hohl-
schliffen verzichtet werden; vorgenommene Stichproben bestätigten
dies. — Die mikroskopische Untersuchung der mit Orseillin BB ge-
färbten Schnitte ergab wieder Pilzh 3 phen in den Geweben der Frucht -
Archiv ftlr Mikrobioloiüe* Bd. 13. o

O. Marcus :

schale, doch in weit geringerem Umfange als bei Roggen und Weizen.
Man geht wohl nicht fehl, wenn man hier das geringere Vorkommen
vdn Pilzhyphen auf einen gewissen Schutz zurückführt, den wohl die
fest anliegende Spelze dem Kom bietet. Die beobachteten Hyphen
waren ziemlich stark septiert, zwischen 2 und 4 fji dick und verliefen
intercellular; intracellulares Vorkommen von Hyphen wurde nicht
beobachtet. Die hier mehrschichtige Aleuronschicht wies in keinem
Falle Pilzh 3 ^hen in den Zellen oder Zellwänden auf ; ebenso waren der
Mehlkörper und der Keimling pilzfrei. Die grünreif geerntete Probe
unterschied sich nicht von der gelbreif geernteten.

B. Sorte: Friedrichswerther Berg- Wintergerste.

Die Proben wurden wieder in grünreifem Zustande am 6. Juli 1939 und
in gelbreifem Zustand am 20. Juli 1939 auf dem Versuchsfeld des Instituts
für Pflanzenbau in Göttingen geerntet.

Die mikroskopische Untersuchung beider Proben ergab keine
neuen Befunde. Hervorzuheben ist nur, daß auch bei diesen Proben in
der Aleuronschicht, im Mehlkörper und im Gewebe des Keimlings
keine Pilzhyphen beobachtet wurden.

C. Sorte: Peragis Wintergerste.

Wieder wurden zwei Proben — eine grünreife am 6. Juli 1939 und eine
gelbreife am 20. Juli 1939 — auf dem Versuchsfeld des Instituts für Pflanzen-
bau in Göttingen geerntet.

Beide Proben unterschieden sich hinsichtlich des Pilzbefalles nur
insoweit voneinander, als die gelbreif entnommene Probe etwas stärkeren
Befall aufwies. Neue Beobachtungen wurden gegenüber A. und B.
sonst nicht gemacht.

D. Sorte: Unbekannt; Sommergerste.

Die Probe wurde Von todreifem Material der Ernte 1940 entnonunen
und stammte aus der Gegend um Homberg, Bez. Kassel.

Die mikroskopische Untersuchung der mit Orseillin BB gefärbten
Schnitte ergab, daß Pilzhyphen hier in den Geweben der Schalen
häufiger Vorkommen als in den vorhergehenden Proben, wohl eine Aus-
wirkung der Witterungsverhältnisse. Aber auch hier blieben die H 3 rphen
auf die Gewebe der Fruchtschale beschränkt, wo sie sich intercellular
ausbreiteten. In den Aleuronzellen wurden keine Pilzh 3 rphen be-
obachtet, ebenso nicht in Geweben des Mehlkörpers und des Keimlings.

Aus Schnitten, die mit Oxaminblau 4 B gefärbt wurden und Pilz-
hyphen im Schalengewebe führten, entwickelte sich in einigen Hohl-
schliffkulturen AUemaria ienuia Neea, in anderen Kulturen gelangten
Fusarium graminearum zur Entwicklung (Tabelle I), ferner noch ein

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 19

unbestimmbarer Pilz. Dagegen fehlte in allen Kulturen Hormodendron,
Einige Hohlschliffkulturen der älteren Proben A.— C. ergaben keine
Pilzentwicklung, was mit den Erfahrungen bei Roggen übereinstimmt.

Avena aativa L. (Hafer).

Sorte: von Lochows Petkuser Gelbhafer Flämings-Gold

Zur Untersuchung gelangte nur diese eine Probe (Hochzucht aus der
Umgebung von Homberg, Bez. Kassel) aus dem Erntejahr 1940, die auf
dem Felde von gänzlich ausgereiftem Hafer entnommen wurde. Die Ver-
arbeitung des Materials erfolgte im Mai 1941.

Die Körner wurden zunächst zwei- bis dreimal gründlich in Leitungs-
wasser gewaschen. Die mikroskopische Untersuchung des Wasch-
wassers ließ zahlreiche Konidien von Fusarium und Altemaria er-
kennen. — Dann folgte ein 2—3 Minuten dauerndes Bad in 0,2%iger
HgCl2-I-<ösung; darauf wur-
den die Körner zweimal in
dest. Wasser naehgespült,
entspelzt und nochmals
2— 3 Min. lang in 0,2%iger
HgCl2-Lö8iing gebadet, als-
dann in sterilem dest. Wasser
einige Minuten nachgespült;
während der Zeit wurde das
sterile Wasser zweimal ge-
wechselt. Dann wurden die
Schnitte in der üblichen
Weise angefertigt.

Abb. 4. Hafer, Auflicht auf die Fruchtichale mit Pilz-
hyphen (OneiUin BB, .Sartory sehe Lösung).
Vergr. 350 mal.

Die mikroskopische Untersuchung der mit Orseillin BB gefärbten
Schnitte führte zu ganz entsprechenden Ergebnissen wie bei Roggen
und Weizen. Hyphen waren in allen Schnitten zu erkennen (Abb. 4).
Sie durchzogen die Fruchtschale intercellular in größerer Anzahl. Sehr
reichlich waren sie auch in Hohlräumen zu finden, die von Frucht- und
Samenschale gebildet wurden. In den Zellen der Aleuronschicht und
deren Wänden wurden niemals Pilzhyphen beobachtet, ebenso nicht
im Gewebe des Mehlkörpers und des Keimlings. — Die Hyphen waren
reich septiert, und Messungen ergaben Dicken von 2,3— 5,6 p..

In Hohlschliffkulturen der mit Oxaminblau 4 R gefärbten Schnitte
entwickelten sich Hormodendron chUmnum vor, nigrovirens (Fresen)
Sacc. und Cephdtosporium acremonium in je einem Fall. Entsprechende
Schnitte, die auf 1/2 Bierwürze- Agar ausgelegt wurden, lieferten die
gleichen Ergebnisse. In anderen Kulturen zeigte sich reiches Mycel,
ohne daß Fruchtkörper gebildet wurden (Tabelle II).

2 *

O. Marcus:

Lolium temulentum L. ( TaumeUolch) .

Das untersuchte Material stammte aus dem Botanischen Garten in
Göttingen.

In den mit Orseillin BB gefärbten Schnitten der Samen hob sich
die Dauermycelschicht des Begieitpilzes Chaetomium Kunzeanum
deutlich von den übrigen Gewebepartien ab. Der Pilz scheint aber
nicht auf das angrenzende Gewebe überzugreifen; er bleibt vielmehr
auf die Dauermycelschicht beschränkt. Nach Günnewig sollen auch
Hyphen des Pilzes im Gewebe des Embryo Vorkommen. Jedenfalls ist
die Ausbreitung des Pilzes eine ganz andere als bei den oben be-
schriebenen Fällen; gerade von diesem Gesichtspunkt aus war Lolium
als Vergleichsmaterial willkommen.

Viscum alhum L. (Mistel).

Zur Untersuchung standen 21 reife Früchte aus der Gegend von Treysa
in Hessen zur Verfügung. Die Ernte erfolgte in den ersten Tagen des Januar
1040, so daß die Früchte schon stärkeren Frost überstanden hatten.

Nachdem die Früchte gründlich in frischem Leitungswasser gewaschen
waren, wurden sie zur äußerlichen Sterilisation 2—3 Minuten lang in 0,2% ige
Lösung von HgClg gelegt und dann zweimal mit sterilem destillierten
Wasser abgespült. — Die Entnahme von Proben geschah mittels aus-
geglühter, noch heißer Nadel, mit der die Schale auf geritzt und zur Seite
geklappt wurde. So ließ sich das Fruchtfleisch mit dem darin eingebetteten
Kern leicht und schnell mit der nochmals abgeflammten Nadel heraus -
heben und in Reagensröhrchen mit Bohnenbrühe und Bohnenbrühe -Agar
einbringen .

Im ersten Versuch erschienen nach wenigen Tagen auf zwei Proben
kleine Lager von Penicillium glaucum, die aber als Fremdinfektionen
gedeutet werden mußten (vgl. S. 22); im zweiten Versuch, der in
gleicher Weise angelegt worden war, blieben sämtliche Proben steril
(Tabelle IV, S. 22). Kontrollproben mit sterilisierten Schalestücken
blieben ebenfalls steril, während in Reagensröhrchen mit ungereinigten
Sehaleteilen kräftiges Bakterien- und Pilzwachstum zu beobachten war.

Aus beiden Versuchen darf jedoch nicht ohne weiteres geschlossen
werden, daß sich keine Mikroorganismen in den Mistelfrüchten befunden
hätten. Man muß vielmehr in Betracht ziehen, daß die Früchte, bevor
sie geerntet wurden, Temperaturen bis zu — 20® C ausgesetzt waren
und der Einwand berechtigt scheint, die Mikroorganismen könnten
durch die Kälte so gelitten haben, daß sie nicht mehr zu weiterem
Wachstum befähigt gewesen wären. Für Pilzhyphen könnte dies wohl
zutreffen, kaum aber für Pilzsporen und andere Dauerzustände von
Pilzen und für Bakterien. Da aber bei mikroskopischer Untersuchung
auch keine Pilzhyphen im Fruchtfleisch zu sehen waren, so kann doch
angenommen werden, daß sich keine Mikroorganismen im Innern der
Mistelfrüchte befanden.

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 21

Ribea Uva-crispa L, (Stachelbeere),

Ans dem Garten des Instituts für Mikrobiologie in Göttingen stand
umfangreicheres Material von Früchten verschiedenen Reifegrades zur
Verfügung. Stets wurden nur durchaus gesund aussehende Früchte ein-
geemtet. Zunächst wurde der Kelchrest von den Früchten entfernt und
diese gut in Leitungswasser abgewaschen; vor ihrer Öffnung wurden die
Früchte mit einem in 70%igen Alkohol getauchten Wattebausch einige Male
gründlich abgerieben, dann kurz abgeflammt. Mit in Alkohol und Flamme
sterilisiertem Skalpell wurde die Schale zur Hälfte abgeschält, das Skalpell
wieder in Alkohol und Flamme sterilisiert und damit die Frucht gekappt.
Mit nochmals abgeflammtem Skalpell wiu-den dann schnell einige Proben
aus dem Innern der Früchte entnommen und verschiedene Reagensröhrchen
mit Nährböden damit beimpft. — Bei reifen Früchten wurde die öffnungs-
weise insofern abgeändert, als sie nicht gekappt wurden; mit dem sterilen
Skalpell wurden vielmehr vier Schnitte ziehend vom Kelchrest ziun Stiel -
ansatz geführt, so daß sich durch den Druck von innen heraus ein nach
beiden Seiten spitz zulaufendes Stück abhob und das Messer vor der Probe-
nahme gar nicht erst mit dem Fnichtinnem in Berührung kam.

Die Ergebnisse dieser Versuche* finden sich in Tabelle III zu-
sammengefaßt. Einige Bakterien und Hefen konnten aus den Früchten
isoliert werden. Bei den Bakterien handelte es sich um farblose, sporen-
bildendc Stäbchen, die Gelatine verflüssigten. Unter den isolierten
Hefen befand sich eine runde, die als Torulopsis albida bestimmt werden
konnte; die andere war länglich und bildete rötlichen Farbstoff: sie
gehört wohl der Gattung Rhodotorula (nach Lodder) an.

Tabelle III. Versuche mit Früchten von Ribea IH’^a criapa.

Ver-

such

Nr,

Datum

Material

Gesamt-

zahl

Bakterien

PUae

19. VI. 1939

unreif

22. VI. 1939

f»

23. VI. 1939

—

6. VII. 1939

halbreif

—

7. VII. 1939

»»

•f

14. VII. 1939

reif

—

-f

28. VII. 1939

>»

—

28. VII. 1939

überreif

-f

1. VIII. 1939

stark überreif

4- +

2.Vin. 1939

*» »♦

—

-f

23. VI. 1941

unreif

—

121

1.7

1.2

—

Auf die Anzahl der Früchte bezogen

3,3

2,5

Spalte 4: Fr = Früchte, Pr == Proben, -f = Fremdinfektion.

Im ganzen liegen aber die Infektionen zahlenmäßig so niedrig
(Tabelle III), daß von einem regelmäßigen Vorkommen von Mikro-
organismen in gesunden Stachelbeerfrüchten wohl keine Rede sein

O. Marcus:

kann. Dies schließt jedoch nicht aus, daß gelegentlich durch den Stich
saugender Insekten oder ähnliche Ursachen hervorgerufene Infektionen
doch Vorkommen können (vgl. dazu unten S. 31). Die Angaben von
Romwalter und von Kiräly (36), wonach Stachelbeeren regelmäßig
Hefen enthalten sollen, fanden sich nicht bestätigt.

Pyru8 communis L. (Birne),

Zwei lagerreife Früchte unbekannter Sortenzugehörigkeit aus der
Gegend von Homberg, Bez. Kassel, dienten als Versuchsmaterial. Sie
wurden zunächst mit Leitungswasser gereinigt, sodann mit 70%igem
Alkohol abgerieben und kurz in der Gasflamme abgeflammt. Mit in Alkohol
und Flamme sterilisiertem Skalpell wurden dann Fruchtfleischpartien frei-
gelegt und daraus mit nochmals sterilisiertem Skalpell je Frucht neun
Proben entnommen, die in Reagensgläser mit verschiedenen Nährböden
gebracht wurden,' je Frucht entfielen:

Zwei Proben mit je zwei Impfungen auf Bierwürze -Agar = 4 Impfungen
Zwei Proben mit je zwei Impfungen auf Bierwürze .... = 4 Impfungen
Zwei Proben mit je zwei Impfungen auf Kürbissaft -Agar = 4 Impfungen
Zwei Proben mit je zwei Impflingen auf Bohnenbrühe = 4 Impfungen
Eine Probe mit je zwei Impfungen auf Bohnenbrühe-

Gelatine = 2 Impfungen

1 8 Impfungen

Kontrollproben von ungereinigten Schalestücken wurden auf Bierwürze,
Kürbissaft-Agar imd Bohnenbrühe -Gelatine ausgelegt.

Als Ergebnis des Versuchs (Tabelle IV) konnte festgestellt werden,
daß sämtliche Proben aus dem Innern steril blieben und sich auch nach
mehreren Wochen noch keine Entwicklung von Mikroorganismen zeigte.
Dagegen wiesen die Kontrollproben (ungereinigte Schalenstücke)
beträchtliches Pilz- und Bakterienwachstum auf.

Tabelle IV. Versuche mit verschiedenen Früchten.

Datum

Früchte von

Oesamt-

sahl

Bak-

terien

Hefen

PU*e

■

28. VII. 1939

Prunvs cerasus, reif

2,6

7,6

23.

XI. 1939

Pyrus communis, reif

Viscum album, reif

—

1.1940

—

-f +

10.

1.1940

»f »»

—

18.

1.1940

Vida faha, Samen reif . .

—

— !

II. 1940

»» »» »» •

—

28.

X.1940

Crataegus oxyacantha, reif

12 i

—

Mdhis silvestris Mül, (Apfel),

Oft finden sich in äußerlich ganz gesund aussehenden Äpfeln voll-
ständig verpilzte Kerngehäuse. Bei frisch geernteten oder erst kurze

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 23

Zeit gelagerten Früchten ist dieser Pilzbefall auf die Innenseiten des
Kerngehäuses und die Kerne beschränkt, während das unmittelbar
angrenze Fruchtfleisch keine Spuren eines Pilzbefalles zeigt Bei un-
günstiger Lagerung der Äpfel soll aber der Pilz auch auf das Frucht-
fleisch übergehen können, so daß solche Äpfel von innen heraus zu
faulen beginnen.

OsteruxMer beschrieb diese Kernhausfäule und benannte den Pilz, (ler
sie verursachen sollte, Fusarium putrefaciens. Wollenweber und Reinking
machten eine Anzahl anderer Fusarium- Axt&n, wie Fus, avenaceum ( = Fus.
herbarum = Fus, putrefaciens), Fus. latericium, Fus. oxysporum, var. auran-
iiacum und Fus, Uictis für die Entstehung dieser Fäule verantwortlich. Die
Infektion soll während der Blütezeit erfolgen, und am meisten gefähidet
seien Sorten mit lange offenbleibender oder sich gar nicht schließender
Kelchröhre, wie u. a. Danzigei Kantapfel, Schöner von Boskoop. Appel
führt Fus, herbarum als Erreger an und erwähnt, daß auch die rote Berga-
mottebirne leicht befallen werde.

Bei eigenen Versuchen konnten Altemaria tenuis Nees und Phyl-
losticta tirolensis Bubdk. aus verpilzten Kerngehäusen sonst restlos
gesund aussehender Äpfel isoliert werden. Das Fruchtfleisch solcher
Früchte muß für pilzfrei gehalten werden, da Versuche, den Pilz daraus
zu isolieren, stets negativ verliefen. Weiter soll hier auf diese Frage
nicht eingegangen werden, es würde zu weit in das pathologische Gebiet
hineinführen.

Einige Bemerkungen über das Verhalten von Altemaria tenuis auf
verschiedenen künstlichen Nährböden seien hier angeschlossen. Auf
Bierwürze-Agar bildete der Pilz sehr reichlich Mycel und schritt erst
nach 8 -12 Wochen, oft auch gar nicht zur Konidienbildung. Auf
Zwiebel-Agar (100 ccm HgO -f 20 g zerquetschte Zwiebeln + 1,5 g
Agar) übertragen, blieb die Mycelbildung etwas zurück, aber die Koni-
dienbildung trat schon nach 14—21 Tagen ein; die Konidien waren auch
zahlreicher vorhanden und größer als bei den vorigen Kulturen. Wird
der Pilz aber auf Glycerin- Agar (100 ccm H 2 O + 1,2 g Pepton -f 0,8 g
Fleischextrakt -f 3,0 g Glycerin -f 1,5 g Agar) übergeimpft, so tritt
die Mycelbildung gänzlich zurück; es entsteht dann nur ein dem Substrat
fest auf liegendes farbloses Lager ohne Lufthyphen. Dagegen werden
aber schon nach 2—3 Tagen sehr zahlreiche und auffallend große
Konidien gebildet. Die folgende Gegenüberstellung soll diese Ver-
hältnisse erläutern:

Abmessungen von Konidien aus Kulturen von Zwiebel- Agar, 30 Tage alt :

Länge :

Breite:

von Qlyotrin-Agar, 30 Tage alt:

Länge:

Breite

O. Marcus :

Allem Anschein nach wurde der Pilz durch den Glycerin-Nährboden
sehr geschädigt, denn aus 14 Tage alten Kulturen auf anderen Nähr-
böden, wie Bierwürze-Agar, übertragene Mycelstücke, wuchsen ge-
wöhnlich nicht mehr an und auch die Konidien keimten dort nur noch
in seltenen Fällen aus. Ähnliches Verhalten zeigte AÜemaria auf
Dextrin- Agar (wie Glycerin- Agar, statt dessen aber 1 g Dextrin).

Crataegus oxyacaniha L. (Weißdorn).

Das zur Verfügung stehende Material bestand aus 12 reifen, gesund
aussehenden Früchten, die im Herbst 1940 am Hainberg (Göttingen) ge-
sammelt wurden. Die Verarbeitung erfolgte noch am selben Tage. Nach
äußerlicher Sterilisation der Früchte (Abwaschen mit Leitungswasser,
gründliches Abreiben mit 70%igem Alkohol und kurzem Abf lammen)
wurden mit geglühter, noch heißer Nadel Fruchtfleischproben, teils mit
Kernen, aus dem Innern der Früchte entnommen. Die Proben von .sechs
Früchten wurden auf Bierwürze -Agar, die der restlichen sechs Früchte
auf Bohnenbrühe abgeimpft.

Nach 6 Tagen trat in vier der beimpften Röhrchen Pilzwachstiim
auf (Tabelle IV, S. 22). Der Pilz konnten in allen Fällen als Clastero-
sporium obovatum bestimmt werden.

Daß sich bei der Untersuchung eines umfangreicheren Materials
ein ähnlich hoher Anteil an pilzbefallenen Früchten ergeben würde,
kann mit Sicherheit angenommen w^erden. Auch kann bei Berück-
sichtigung des Baues und der Entwicklung der Früchte ein so hoher
Prozentsatz an Infektionen nicht sonderlich überraschen. Mikroskopisch
war der Pilz allerdings nicht zu finden, so daß kaum mit einer sehr
starken Infektion gerechnet werden kann.

Prunus cerasus L. (Kirsche).

Reife Früchte (Sauerkirschen aus dem Garten des Instituts für Mikro-
biologie in Göttingen) gelangten zur Untersuchung. Nachdem die Schale
durch Abwaschen mit Leitungswasser, mehrmaliges Abreiben mit 70%igem
Alkohol und kurzes Abflammen genügend entkeimt war, wurde mit in
Alkohol und Flamme sterilisiertem Skalpell um die Mitte der Frucht ein
Schnitt gelegt und die Schale heruntergezogen. I^on dem dar unter liegenden
Fruchtfleisch wurden mit frisch in Alkohol und Flamme sterilisiertem
Skalpell je Frucht zwei Proben entnommen und damit Reagensröhrchen
mit Bohnenbrühe -Agar beimpft (Tabelle IV).

Nach einigen Tagen entwickelten sich in Proben von drei ver-
schiedenen Früchten Hefen, in einer Probe ein sporenbildendes Stäbchen
und in zwei weiteren Fällen PeniciUium glaucum. In den Kontroll-
versuchen, die mit ungereinigten Schalestücken beimpft waren, beob-
achtete man reiches Pilz- und Bakterienwachstum, während Proben
mit gereinigten und sterilisierten Schaleteilen steril blieben. — Bei den
beiden Infektionen mit PeniciUium glaucum dürfte es sich wohl um

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweihen. 25

unvermeidbare Fremdinfektionen gehandelt haben, da dieser Organismus
stets im Laboratorium als Infektion auftrat. Dagegen können das
Bakterium und die Hefen, die als Infektionen sonst nie beobachtet
wurden, als aus dem Innern der Früchte stammend betrachtet werden.
Alle drei Hefen bilden keine Sporen; eine derselben führt rötlichen
Farbstoff von carotinoidem Charakter und gehört wohl — nach
Ijodder (19) — zu Rhodotonda glutinis.

Vicia faba L. (Pferdebohne) .

Das Material zur I Untersuchung bestand aus reifen Samen der Ernb} 1939
aus der Umgebung von Homberg, Bez. Kassel. Die Soi te war unbekannt.

Vor der Verarl>eitung mußten die Samen ül)er Nacht in dest. Wasser
quellen. Am anderen Morgen wurden sie zwischen Fließpapier abgetrocknet
imd nacheinander V 2 bis 1 Minute lang in 70%igem Alkohol gelegt und
dann der noch anhaftende Alkohol abgebrannt. Mit sterilem Skalpell wurde
ein Teil der Schale entfernt. Von den so freigelegten Kotyledonen wurden
mit dem noch einmal sterilisierten Skalpell kleine Stückchen in Reagens-
röhrchen mit Bohnenbrühe bzw. Bohnenbrühe -Agar übertragen; gleich-
zeitig wurden Kont rollproben mit sterilisierten und ungereinigten Schale-
stücken angelegt.

Während in beiden Versuchen die Kontrollproben mit ungereinigten
Schalestücken Pilz- und Bakterienentwicklung aufwiesen, blieben die
Kontrollproben mit sterilisierten Schaleteilen steril. Aber auch in den
Proben der eigentlichen Versuche zeigte sich auch nach Wochen noch
keinerlei Pilz- oder Bakterien wachst um. Es kann daher angenommen
werden, daß sich in den Geweben des vorwiegenden Materials keine
lebenden Mikroorganismen befanden (Tabelle W, S. 22).

Cucurbita Pepo L. (Kürbis).

Die zur Untersuchung gelangten Früchte wurden im Garten des
Instituts für Mikrobiologie in Göttingen in den Jahren 1939 und 1940
gezogen. Es handelte sich um vollständig gesunci aus.sehende Kürbis.«e von
3— 34 kg Gewicht, die nach Abernten im Keller gelagert und nach und nach
untersucht wurden. Drei vor, in und kurz nach der Blüte geerntete Frucht-
knoten wurden sofort untersucht.

Die Entnahme der Proben gestaltete sich folgendermaßen: Zunächst
wurde die ganze Frucht unter der Wasserleitung mit Seife und Bürste
gereinigt. Nachdem die Schale et'was abgetrocknet war, wurde die Seite
der Frucht, an der die Öffnung vorgenoirunen werden sollte, mehrmals mit
70%igem Alkohol abgerieben und der Alkohol abgebrannt. Auf dieser
Seite wurde eine Stelle von etwa 20 cm Durchmesser mit der Gasflamme
solange angebraten, bis die äußere Haut aufriß und verkohlte. Tn der
Mitte dieser Stelle wurde nun mit einem geglühten, noch zischend heißen
Messer eine runde, etwa 6 cm weite Öffnung in die Frucht wand gesclinitten.
Durch dieses Loch wurden möglichst schnell mit einer langen sterilen
Pinzette einige größere Stücke von lockerem Fruchtfleisch mit Kernen
herausgerissen und in beroitstehenden sterilen Petrischalen aufbewahrt.
Daraus erfolgte anschließend die tTbertragimg der einzelnen Proben auf die

O. Marcuö :

verschiedenen Nährböden. — Um auch Proben von dem festen Frucht-
fleisch der Fruchtwand zu erhalten, wurde von einer anderen Stelle, die
nochmals mit Alkohol sterilisiert, aber nur kurz abgeflammt wurde, mit
dem abermals geglühten und noch heißen Messer ein Stück der Schale
entfernt; aus dem darunterliegenden festen Fruchtfleisch wurden einige
dicke viereckige Stücke heraiisgeschnitten und in eine bereitstehende zweite
sterile Petrischale gebracht. Aus dem Innern dieser Stücke wurden mit
sterilem Skalpell einige Proben entnommen und diese in Reagensröhrchen
mit verschiedenen Nährböden übertragen.

Die untersuchten Fruchtknoten wurden in ähnlicher Weise äußerlich
sterilisiert wie kleinere Früchte; nachdem sie mit Leitungswasser ge-
säubert waren, wurden sie für kurze Zeit in 70%igen Alkohol getaucht
und abgeflammt. Darauf wurde mit sterilem Skalpell die Schale rund-
herum abgeschält und mit frisch sterilisiertem Skalpell der Fruchtknoten
gekappt. Mit dem nochmals abgeflammten Skalpell wurden dann die
Proben aus dem Innern des Fruchtknotens entnommen und in Reagens-
röhrchen mit Nährböden übertragen.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind zahlenmäßig in Tabelle V
zusammengefaßt. Daraus geht hervor, daß in sehr großem Umfange

Tabelle V. Versuche mit Früchten von Cucurbita Pepo.

Ver-

such

Nr.

Lockeres Fruchtfleisch + Kerne

1 Festes Fruchtfleisch

Summe

aller

Proben

Bakterien

Pllac

steril

zusammen

Bakterien

steril

zusammen

—

16a

—

16b

—

-f

—

.•K)

—

— •

—

-f

—

+ +

—

1 4

1 +

1 4

186

282

—

! 70

369

31%

0,7%

66%

100%

16%

100 %

—

1 Fruo

htknote

n vor.

während

2 j

—

1 und

kurz nach der Blüte.

69%

41%

100?^

386

•f Infektionen, die selir wahrscheinlich nicht aus dem Material Btammen (Peniciüium
glaueim).

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 27

Mikroorganismen in den Früchten nachgewiesen werden konnten; nur
aus 2 von 21 Früchten ließen sich keine Mikroorganismen isolieren, d. h.
daß das untersuchte Material zu rund 91% Bakterien und Pilze im
Innern enthielt.

In der Hauptsache waren es Bakterien, die sich im Innern der
Kürbisfrüchte vorfanden, und man konnte hier fast von regelmäßigem
Vorkommen sprechen; dagegen fanden sich in nur zwei Fällen Pilze.
Betreffs der Bakterien decken sich diese Befunde mit denen von Miehe.

Aus der Zusammenstellung der Tabelle V geht aber auch hervor,
daß sich das lockere Fruchtfleisch im Innern der Frucht anders verhält
als das feste Fleisch der Fruchtwand. Während sich in 31 % der Proben
des ersteren Bakterien entwickelten, trat dies nur in 16 % der Proben
des letzteren ein. Ein entsprechendes Verhältnis zeigte auch die Um-
rechnung auf die Anzahl der untersuchten Früchte: nur bei 45% des
Materials konnten Bakterien aus dem festen Fruchtfleisch isoliert
werden; Pilze fanden sich darin überhaupt nicht. Es handelt sich
danach offenbar um ein Vorkommen in den Intercellularen, nicht im
Innern der Zellen.

Tabelle VI. Versuche mit Früchten von Cucurbita Pepo
in zeitlicher Reihenfolge,

Infektionen in % der Proben der jeweiligen Gruppe. % der gesamten
Infektionen sind auf die Gesamtzahl der Proben des Versuchs bezogen

Ver-

Datum der
Untersuchung

Fruchtfleisch

Gesamte

such

locker

fest

Infektionen

Ihnierkungcn

Nr.

23.

IX.

1939

11.

XI.

1939

16.

XI.

1939

16.

XI.

1939

16a.

XII.

1939

16b

1. XII.

1939

18. XII.

1939

18.

XII.

1939

19. XII.

1939

19. XII.

1939

18.

IX.

1940

100

Proben aus dem Innern von

1940

Fruchtknoten vor, in und nach

1940

—

der BlQte.

1940

Kurz nach der Blüte (Durch-

1040

messer 8 cm).

XI.

1940

Unreif geerntet.

14.

XI.

1940

XII.

1940

13.

1941

23.

1941

Kja

1941

O. Marous :

Wenn die Mikroorganismen erst während der Zeit der Lagerung
im Keller in die Früchte eingewandert wären, so hätte sich daraus eine
mit der 25eit sich steigernde Anzahl infizierter Proben ergeben müssen.
Ein solche Tendenz ist aber aus der in Tabelle VI gemachten Zusammen-
stellung nicht zu ersehen. Es muß daher angenommen werden, daß —
wie auch Miehe folgert — die Kürbisfrucht von vornherein Mikro-
organismen enthält.

Die Zählung der Bakterien im Fruchtfleisch liefert wegen ihrer
durchaus ungleichmäßigen Verteilung innerhalb der ganzen Frucht
Ergebnisse, die nur für die betreffenden Proben Gültigkeit besitzen
können, die aber keinesfalls auf die ganze Frucht umgerechnet werden
dürfen. Selbst durchgeführte Zählungsversuohe führten zu so wider-
sprechenden Ergebnissen, daß hier auf ihre Wiedergabe verzichtet
werden kann.

Einer der isolierten Pilze wurde als Hormodendron olivaceum ( Corda )
Bonard bestimmt. Er wächst gut auf Würze- und Kürbissaft -Agar,
wo er auch schnell fruktifiziert ; dagegen ist sein Wachstum auf CzapeJc-
Agar wesentlich langsamer. Der andere aus Kürbis isolierte Pilz komite
als Acrostcdagmus cinnabarinus (Corda) bestimmt werden. Auf Würze -
Agar wächst er gut und bildet auf der Oberfläche etwas wollige, ziegel-
rote, mit weißen Lufthyphen durchsetzte Kolonien, während die
Kulturen auf Kürbissaft -Nährboden eine samtartige und kompaktere
Oberfläche ohne Lufthyphen aufwiesen. Auf Czapek-Ag&r breitet sich
der Pilz verhältnismäßig schnell aus, indem er nur ein ganz dünnes,
lockeres, oben etwas wolliges Lager bildet.

Die meisten der isolierten Bakterien waren sporenbildende Stäbchen,
die die Eigenschaften vonBac, vulgatus (mesentericiis) (Migvla) Flügge,
besaßen; doch erweckten junge, lebende Zellen bei Betrachtung im
Dunkelfeld den Anschein, als seien sie nur mit zwei Geißeln ausgerüstet.
Solange aber die Frage der Begeißelung noch nicht endgültig geklärt
ist, kann diesem Merkmal keine entscheidende Bedeutung beigemessen
werden. — Nach Burgwitz soll dieses Bakterium der Erreger der Stempel -
faule bei weiblichen Blüten von Cucurbita Pepo sein, die auch zuweilen
auf den Fruchtknoten Übergriffe. Da aber beobachtet werden koimte,
daß in den meisten Fällen die fleischigen Stempel der Kürbisblüten
durch Fäulnis zugrunde gingen, so läßt sich wohl das häufige Vor-
kommen dieses Bakteriums im Innern der Kürbisfrucht als eine gewisser-
maßen unterdrückte Erkrankung der Frucht auffassen; dafür spricht
auch, daß Bac, vulgatus sich im Innern der Frucht nicht wesentlich zu
vermehren scheint, was auch aus Tabelle V zu entnehmen ist. In dieser
Hinsicht wären Untersuchungen über die Abhängigkeit des Vorkommens
von Bac, vulgatus in Kürbisfrüchten von dem Verlauf der Sommer-
witterung recht aufschlußreich, denn es wäre denkbar, daß in Jahren

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 29

mit trockenen Sonnnem, in denen die Stempel der weiblichen Blüten
meist eintrocknen können, auch das Vorkommen der Bakterien in den
Früchten geringer wäre.

In zwei weiteren Fällen wurden gelbe Bakterien isoliert. Sie ent-
wickelten sich gut auf Kürbissaft -Agar, gelangten aber auf Glycerin-
Agar in kurzer Zeit zu noch größerer Massenentwicklung. Die in dicker
Schicht liegenden Kulturen besaßen eine glatte und fettig glänzende
Oberfläche. Man hätte sie als Mycobacterium luteum bestimmen können,
doch fehlte ihnen die nach Haag MycohctcteHum von Oorynebacterium
unterscheidende Eigenschaft, daß ersteres Paraffin als C- Quelle ver-
werten könne. Er verschwieg aller-
dings nicht gewisse Beobachtungen,
denen zufolge Corynebacterium sich
doch auf Paraffin entwickelt haben
könnte. Er führte dies aber darauf
zurück, daß das verwendete Paraffin
möglicherweise noch andere flüchtige
Stoffe enthalten hätte. Die beiden
isolierten Bakterien wurden daher
zu Corynebacterium gestellt und als

Oorynebacterium brune.um (Schröher) Abb. 5 , Corynebacterium brvnrum ftus

Kinhalt u. Berend (Lehmann- Neu- Kürbis, 3 w<>chen alte Kultur auf

1 . Glycerlu-Agar.

II, S. 708) bestimmt. BeiFär- Carbol-Oentlana-Violett. VergT. 990 mal.

bung mit Methylenblau und Carboi -

Gentiana-Violett bemerkte man im Innern der Zellen 2—3 besonders
stark angefärbte Körnchen (Abb. 5). Nach Feulgen gefärbt zeigten die
weitaus meisten Zellen diffuse. Färbung, und nur ein verschwindend
geringer Teil der Zellen wies Körnung auf. Die Deutung der Beob-
achtung würde jedoch zu weit führen; die Feststellung möge hier
genügen.

Wirkung der einzelnen Nährböden.

Im Hinblick auf die Angaben von Schanderl (1, 2) über die besondere
Eignung von Bohnenbrühe -Nährböden (welche Meinung jetzt allerdings
aufgegeben ist, wie S. 3 gesagt wurde) wäre anschließend die Frage
zu prüfen, ob die Wahl bestimmter Nährböden die V^ersuchsergebnisse
entscheidend beeinflußt haben könnte. Wäre dies der Fall, so müßte
von dem die Entwicklung der Mikroorganismen besonders begünstigenden
Nährboden gefordert werden, daß er im Durchschnitt wesentlich mehr
Infektionen aufwiese als andere Nährböden; entsprechend müßte bei
einem ungünstigen Nährboden die Durchschnittszahl der Infektionen
bedeutend unter dem Mittel der anderen Nährböden liegen. Tabelle VII
läßt aber erkennen, daß die am meisten verwendeten Nährböden in

O. Marcus :

ihren Durchschnittswerten nicht weit auseinanderliegen. Die beiden
Bohnenbrühe-Nährböden weisen zum Teil einen geringeren Prozentsatz
an Infektionen auf als andere gleichzeitig verwendete Nährböden. Da
aber Schanderl (1) angibt, daß in Bakteroidenform in pflanzlichen
Geweben befindliche Mikroorganismen sich in flüssigem Bohnenbrühe-
Nährboden erst zu regelrechten Bakterien regenerieren müßten, ehe
sie auf festen Nährböden abgeimpft werden könnten, so blieb die Frage
offen, ob nicht vielleicht steril erscheinende Proben doch lebende Keime

Tabelle VII. Zahl der Infektionen aus verschiedenartigen
Früchten auf verschiedenen Nährböden.

Zusammenstellung aus 35 Versuchen mit zusammen 699 Proben.

Ver-

sach

Wttnse

Kürbifl«aft

KOrbiB-AgAT

BohoenbrOhe

Bohnenbrühe-

Agar

Nr.

IKl

3.1

8,3

10,0

9.4

33,0

60,0

47.2

16,7

—

4.4

—

4.2

163

16.8

12,6

8.4

16,4

16.4

11,6

6.7

20,0

13,6

—

60,0

40,0

60,0

26,0

—

26,0

8,3

26,0

4,6

7,2

2,4

4,8

16,0

. 1

6,0

10,0

18,7

—

18,7

8,0

4,0

msm

4.0

—

Mittel an 36
Versaohen

) 8.7

■

11.8

■

16,4

9,3

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. «31

enthalten könnten. Daher wurden von augenscheinlich steril gebliebenen
Proben, die in Bohnenbruhe abgeimpft waren, laufend Proben genommen,
indem jeweils einige davon mehrere Wochen hindurch aufbewahrt
wurden. Der flüssige Nährboden zeigte stets während dieser Zeit keine
Veränderungen, und Versuche, durch Überimpfung von Flüssigkeit aus
5—6 Wochen alten Proben auf festen Nährböden Bakterien Wachstum
zu erzielen, verliefen alle erfolglos. Es wäre auch merkwürdig, wenn
ein Nährmedium, welches die Regeneration von Bakteroiden zu Bakterien
ermöglicht, die doch auch nur auf Wachstumsvorgängeri beruhen kann,
dann das Wachstum bzw. die Vermehrung dieser Bakterien verhinderte.
So ist wohl doch der Schluß berechtigt, daß sich die Wahl der Nährböden
nicht entscheidend auf die Versuchsergebnisse ausgewirkt haben kann.

II. Das Verhalten der Mikroorganismen gegenüber Früchten

und Samen.

Die Isoliening von Mikroorganismen aus dem Innern von Früchten
und Samen gab Veranlassung zu Versuchen, die über ihr gegenseitiges
Verhalten Aufschluß geben sollten.

Rihes Um crispa L.

Noch unreife Früchte wurden mit einer Aufschwemmung von aus
Stachelbeeren isolierter Toruhpsis albida in Würze geimpft. Die Be-
impfung erfolgte mit einer vorher im Autoklaven sterilisierten Injektions-
.spritze, die mit ccm-Teilung versehen und der eine Hohlnadel der
Stärke 20 aufgesetzt war. Jede der Früchte bekam 0,1 ccm der Auf-
schwemmung injiziert. Nur wenige überstanden diesen Eingriff; die
meisten fielen schon am folgenden Tage ab. — Die Untersuchung erfolgte
durch Proben, die in üblicher Weise steril aus dem Fruchtinnem ent-
nommen und auf Würze bzw. Würze-Agar abgeimpft wurden. War
die Hefe noch am Leben, so mußte sie dann auf dem Nährboden wieder
zu sichtbarer Entwicklung gelangen.

So fand sich in Früchten, die 2 Tage nach der Impfung geerntet
wurden, die Hefe noch überall am Leben (Tabelle \nLII). Das erwähnte
Abfallen der Früchte verhinderte eine längere Versuchsdauer. In einem
zweiten Versuch gelangten zehn Früchte 22 Tage nach der Beimpfung
zur Untersuchung; sie hatten sich gänzlich normal weiterentwickelt
und standen vor der Reife. Aus drei der zehn geimpften Früchte ließ
sich die Hefe wieder isolieren, in den restlichen war sie allem Anschein
nach bereits abgestorben.

Prunus cemsus L,

Die Beimpfung der unreifen Früchte erfolgte in gleicher Weise wie
bei Rihe^ Um-crispa mit Torulopsis albida. Die Früchte vertrugen die

Tabelle VIII. Versuche über Lebensfähigkeit von Hefen in einigen Früchten.

O. Marcus:

Beimpfung sehr gut,
wenn sie nicht in zu
jungem Stadium davon
betroffen wurden. Die
Stichwunde vernarbte
innerhalb einiger Tage,
und die Früchte ent-
wickelten * sich ohne
stärkere Schädigung
weiter. Die Hefe schien
aber auch hier keine
günstigen Lebensbedin-
gungen gefunden zu
haben, denn wie aus
Tabelle VIII ersichtlich,
starb sie im Gewebe der
Früchte meist schon
nach kurzer Zeit ab.
In den meisten Fällen
gelang es 15 Tage nach
Beimpfung der Früchte
nicht mehr, die Hefe
daraus zu isolieren. Nur
in einem Versuch konnte
die Hefe nach 27 Tagen
noch aus einer von zehn
Früchten wieder heraus -
gezüchtet werden, doch
schien sie nach ihrer zu-
nächst langsamen und
spärlichen Entwicklung
zu urteilen, in ihrer
Lebenskraft stark ge-
schwächt zu sein. Eine
andere, aus einer Frucht
von Prunus cerasus iso-
lierte Rhodotomla war
wohl etwas empfind-
licher und konnte nach
2 Tagen nur noch aus
wenigen der damit be-
impften Früchte wieder
herausgezüchtet werden
(Tabelle VIII).

Voikonimen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 33

Solanum Lycopersicum L. (Tomate),

Aus Früchten, denen in unreifem Zustand je 0,5 ccm der Auf-
schwemmung von Toruhpsia cdbida injiziert wurden, ließ sich die Hefe
nach 40 Tagen aus 5 von 23 Proben isolieren (Tabelle VIII). Bei Öffnung
der Früchte fielen im Innern des Tomatenmarks weißliche Flocken auf,
die den Verdacht erweckten, daß sich die Hefe darin vermehrt haben
könnte; die mikroskopische Untersuchung ließ auch Hefezellen in
solcher Menge erkennen, daß auf eine starke Vermehrung der Hefe in
der Frucht geschlossen werden mußte, und auch die daraus entnommenen
Proben lieferten sehr kräftig wachsende Kulturen.

Malus silveatris MUL

Bald nach der Blüte — Anfang Juli 1940 — wurden junge Früchte
mittels Injektionsspritze (Nadelstärke 20) mit einer wässerigen Sporen-
aufsehwemmung von Phyllosticta tirolenais^ aus Kerngehäuse von Apfel
isoliert, beimpft. Die meisten der Früchte überstanden die Beimpfung
gut und reiften normal aus : der Einstich vernarbte vollständig und war
an reifen Äpfeln nur noch als ^winziger, etwas rauher Punkt erkennbar.
Im Oktober gelangten zehn dieser Früchte zur Untersuchung; vier
davon waren schon im Laufe des Juli abgefallen und solange auf-
bewahrt worden; sie waren daher stark geschrumpft, im übrigen aber
noch intakt. Bei ihrer Öffnung waren alle Kemg -häuse verpilzt, jedoch
hatte sich der Pilz nicht weiter auf das umliegende Fruchtfleisch aus-
gebreitet. Die restlichen sechs Früchte wurden Mitte Oktober geerntet;
sie waren normal entwickelt, ausgereift und sahen äußerlich vollständig
gesund aus. Die Untersuchung wurde einige Tage nach der Ernte vor-
genommen. Die Kerngehäuse von zwei Früchten waren nur schwach
verpilzt, während die der anderen starke Pilzentwicklung erkejinen
ließen. Bei allen aber blieb der Pilz auf das Kerngehäuse beschränkt.
\"ersuche, den Pilz aus dem an das Kerngehäuse angrenzenden Frucht-
fleisch zu isolieren, verliefen erfolglos. Auch aus Proben, die dem sich
von dem weißen Fruchtfleisch als dünne, bräunliche Linie abhebenden
Stichkanal entnommen wurden und in den nach der Impfung mit
zurückfließender Impfflüssigkeit Pilzsporen hineingeraten sein mußten,
ließ sich kein Pilzwachstum erzielen. Ebenfalls waren in mikroskopi-
schen Schnitten, die aus Teilen des Stiehkanals hergestellt wurden,
keine Pilzhyphen zu erkennen. Der in. den Kerngehäusen Vorgefundene
Pilz ließ sich wieder mit Phyllosticta tirolensis identifizieren.

Sechs gesunden, reifen Früchten wurde um Mitte November 1940
eine Konidienaufschwemmung in H 2 O von Phyllosticta tirolensis injiziert
und die Stichwunde mit heißem Paraffin verschlossen. Drei der Äpfel
wurden bei + 20^ C und drei im Kühlen bei wechselnden niedrigen
Temperaturen gelagert. Während die drei ersteren schon gegen Ende
Archiv fttr Mikrobiologie. Bd. 13. 3

O. Marcus :

Dezember von innen heraus zu faulen begannen, hielten sich die kühl
gelagerten Früchte bis Ende Februar und einer davon zeigte erst dann
äußerlich erkennbare Fäulniserscheinungen. Aus Proben des faulen
Fruchtfleisches ließ sich stets wieder PhyUosticta tirolenaia isolieren.
Der Pilz vermag also Fäulnis bei reifen Lagerfrüchten hervorzurufen,
während er heranreifende Früchte nicht schädigt.

Cucurbita Pepo L,

Die hier beschriebenen Versuche knüpfen ebenfalls an Beob-
achtungen an, die bei den im ersten Teil beschriebenen Versuchen
gemacht wurden.

Um das Verhalten von Fruchtfleisch gegenüber Pilzen und Bak-
terien näher kennenzulernen, wurden aus einer Kürbisfrucht Stücke
von festem und lockerem Fruchtfleisch möglichst steril herauspräpariert
und in vorher sterilisierte Erlenmeyerkölbchen gebracht. Der Versuch
wurde nach folgendem Plan angelegt:

Festes Frachtfleisch

Lockeres Fruchtfleisch

roh

bei 100® C in Dampf
abgetötet

roh

bei 100® C in Dampf
abgetötet

3 Kölbchen
mit Sporen voi
olivaceur

Waol

2 Kölbchen

1 Hormodendron
beimpft
fitum:

3 Kölbchen
mit Sporen voi
olivaoeur
Wach

4“

2 Kölbchen

1 Hormodendron
% beimpft

Btum :

4-4-

3 Kölbchen
mit Bacillus v
Wach

2 Kölbchen
ulgatus beimpft
Lstum :

+ 4-

3 Kölbchen
mit Bacillus vi
Wach
4-

2 Kölbchen
ulgatus beimpft

Btum :

4-4-

1 Kölbchen un-
beimpft

— = nicht; -f = spärlich; = gut.

Auf den Stucken von rohem, festem Fruchtfleisch konnte weder
Pilz- noch Bakterienwachstum festgestellt werden, und auch auf dem
rohen, lockeren Fruchtfleisch war die Entwicklung von Pilz und Bak-
terium nur recht spärlich, aber doch deutlich. Dagegen bestand zwischen
abgetötetem festem und lockerem Fruchtfleisch kein Unterschied mehr:
auf beiden Substraten entwickelten sich Hormodendron olivaceum und
Bac. vulgaius gut.

Am 6. Dezember 1940 erhielt eine 2,7 kg schwere Kürbisfrucht eine
Einspritzung von 2 ccm einer wässerigen Sporenaufschwemmung von
Uormodeudron olivaceum (Injektionsspritze mit Nadel von Stärke 20).

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 35

Die Stichwunde wurde mit heißem Paraffin verschlossen und die 'Frucht
weiter im Keller gelagert. Während dieser Zeit zeigten sich keine
äußeren Veränderungen an der Frucht; sie behielt nach wie vor ihr
frisches, gesundes Aussehen. Bei ihrer Öffnung konnte aber festgestellt
werden, daß der Pilz von der Impfstelle ausgehend große Teile der
Innenfläche besiedelt hatte, in das lockere Fruchtfleisch etwas ein-
gedrungen war und auch die meisten Samen mit schwärzlichem Basen
überzog. Auffallenderweise waren alle diese Samen mit langen Wurzeln
ausgekeimt, während diese Erscheinung in ungeimpften Früchten erst
viel später und auch dann nur sehr vereinzelt beobachtet wurde. Viel-
leicht ist hier im Hinblick auf die Angaben von Niethammer (2, 4) über
die Förderung der Samenkeimung durch Pilze, die Vermutung nicht
ganz unberechtigt, daß das verfrühte Auskeimen der Samen durch den
Pilz verursacht wurde. Das feste Fruchtfleisch der Wandung erwies sich
auch hier als pilzfrei.

Diese Beobachtung regte dazu an, den Einfluß von Hormodendron
olivaceum auf die BLeimung von Kürbissamen in besonderen Versuchen
zu prüfen.

Als Versuchsgefäße dienten große Petrischalen, die eine Schicht feuchten
Sandes enthielten tmd in Autoklaven bei -f 120® C sterilisiert wiu*den.
Das Samenmaterial stammte aus einer hiesigen Gärtnerei. — Um den
Einfluß etwa in der Samenschale anwesender Hemmungsstoffe auszuschalten,
mußte diese entfernt werden, zumal auch die Keimung der Samen, denen
die Samenschale belassen war, so uni egelmäßig verlief, daß keine brauchbaren
Werte zu erhalten waren. Zu diesem Zwecke mußten die Samen über Nacht
in Leitungswasser quellen; am nächsten Morgen wurden sie geschält und
in 0,25%iger Uspulun -Universallösung ^ gelegt, worin sie 1 Stunde lang
belassen wurden. Anschließend wurden die Samen in sterilem, destilliertem
Wasser in vier Stufen, jeweils 6, 15, 30 und 60 Minuten nachgespült. Hieran
schloß sich die gesonderte Behandlung der einzelnen Gruppen an. Die erste
Gruppe gelangte ohne weitere Behandlung in ihre Versuchsgefäße; die zweite
Gruppe erhielt zusätzlich ein halbstündiges Bad in unverbrauchter Nähr-
lösung (^/j Würze). Gruppe 3 wurde mit Sporen von Hormodendron olivaceum
Stamm 3 beimpft und Gruppe 4 wurde eine halbe Stimde lang (2) in ver-
brauchter Kultur flüssigkeit, auf der Hormodendron olivaceum Stamm 3
3 Monate hindurch gewachsen war, gebadet. Jede Gruppe bestand aus
25 Samen, da die Petrischalen für eine größere Anzahl nicht genügend Raum
boten. Alle Versuchsgefäße wurden in einem dunklen Raiun bei -f 20® C
aufgestellt.

Nach 7 Tagen war die Keimung der Samen so w^eit fortgeschritten,
daß eine Beurteilung möglich war. Die Entwicklung war bei Gruppe 3
am weitesten voraus ; ihr folgten der Reihe nach Gruppe 4, 2 und 1 .
Ein zweiter Versuch wurde in der gleichen Weise , aber mit einer Parallelen
angelegt. Die Auswertung des Versuchs erfolgte nach 7 Tagen durch

' Arbeiten der Landwirtschaftlichen Versuchsstation Limburgerhof.

3 *

O. 3iarcus:

Auszählen und Einireihen der Keimlinge nach deren Größe in vier ver-
schiedene Entwicklungsstadien, wobei IV das am weitesten vor-
geschrittene Stadium darstellt. Dabei ergab sich das gleiche Bild wie
im vorhergehenden Versuch. Die, wenn auch nicht sehr starke, die
Samenentwicklung fördernde Wirkung des Pilzes und der verbrauchten
Kulturflüssigkeit trat wieder hervor (Tabelle IX), insbesondere bei
Gruppe 3 und Stadium IV, also bei den mit Sporen geimpften Samen.
Im dritten, in dieser Weise durchgeführten Versuch, bei dem Sporen
von Hortnodendfon olivaceum Stamm 5 und dessen nur 14 Tage alte
Kulturflüssigkeit Verwendung fanden, konnte nach der gleichen Zeit
eine Förderung der Keimung durch den Pilz und seine verbrauchte
Kulturflüssigkeit nicht beobachtet werden, was möglicherweise auf die
Verwendung eines anderen Stammes des Pilzes zurückzuführen ist.

Tabelle IX. Beeinflussung der Keimung von Samen von Cucurbita
pepo durch Hormodendron olivaceum St. 3 und dessen verbrauchte

Nährlösung.

Je Schale 26 Kerne.

Entw icklungastadium

Schale

|■|||Q||[||^

III

Nr.

■1

> 1

—

^ 1

—

3 1

A f

* 1

Schale Nr. 1: nicht zusätzlich weiterbehandelt; Schale Nr. 2: 4- un-
verbrauchte Nährlösung (Würze); Schale Nr. 3: -f mit Sporen von Hormo-
dendron besät; Schale Nr. 4: 4- verbrauchte, 3 Monate alte Nährlösung von
Hormodendron olivaceum St. 3.

Auch mit Gelbhafer (von Lochows Flämingsgold) der Ernte 1940
und dem daraus isolierten Hormodendron chlorinum var. nigrovirens und
dessen 14 Tage alter Kulturflüssigkeit wurde ein solcher Versuch an-
gelegt. Es zeigte sich, daß der Pilz und seine Kulturflüssigkeit die
Keimung des Hafers. in keiner Richtung zu beeinflussen vermochten.

Besprechung der Ergebnisse.

Wenn sich die vorliegenden Untersuchungen auch nur auf eine
verhältnismäßig geringe Anzahl von Samen von Früchten nur weniger
Pflanzenarten beschränkten, so zeigten sie doch, daß sich daraus ver-

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 37

schiedene Mikroorganismen isolieren lassen (Tabelle X) und daß, wie
die unter jedem Pflanzennamen in ( ) beigefügten Zahlen zeigen, das
Vorkommen häufig als regelmäßige oder fast regelmäßige Erschei-
nung angesehen werden muß. Es kann wohl auch kein Zweifel darüber
bestehen, daß sich bei weiteren Untersuchungen unter Einbeziehung
noch umfangreicheren Materials noch weitere Pilz-, Hefe- und Bak-
terienarten aus Früchten und Samen isolieren lassen, worauf auch ver-
schiedene Literaturangaben hinweisen. Von den hier isolierten Mikro-
organismen fanden sich aber die jeweiligen Arten meist so unregelmäßig
und in so geringem Prozentsatz in den Früchten vor, daß sie nicht als
Symbionten angesprochen werden konnten, wie es einige Autoren tun
zu müssen glaubten; und auch dort, wo nahezu regelmäßiges Vor-
kommen beobachtet wurde, wäre eine solche Annahme durch nichts
gerechtfertigt.

Diese Ansicht kann auf mannigfache Weise begründet werden,
ohne daß hier eine eingehende Analyse der einzelnen Erscheinungen
vorgenommen werden soll.

1. Einmal finden sieh in Früchten von Pflanzen gleicher Art und
Herkunft verschiedenartige Mikroorganismen. Bei den von mir unter-
suchten Fällen fand sich nur beim Kürbis eine Art, B. mlgatus^ durchaus
vorherrschend und in 91 % der untersuchten Früchte, also auch nicht
in allen Fällen. Dieses Vorkommen ist jedoch nach den unter 4. vor-
gebrachten Gesichtspunkten zu deuten. Im übrigen zeigte sich l>ei den
aus der Gegend von Göttingen und Kassel untersuchten Wacholderbeeren
ein Pilz, Hormodendron chlorinnm var. nigroi'irens, als verhältnismäßig
vorherrschend und in 20% der untersuchten Beeren vorhanden. Aber
es fand sich auch ein anderer Pilz, und Beeren wieder anderer Herkunft
ergaben den erwähnten Pilz nicht, sondern andere Arten; eine kroatische
Probe zeigte sogar überhaupt keine Infektion. Endlich zeigt auch das
100%ige Vorhandensein von Pilzen in Getreidefrüchten ein durchaus
wechselndes Bild in der Artenzusammensetzung.

2. Zweitens handelt es sich in gewissen Fällen zweifellos um Infek-
tionen von Pflanzengewebe, die man nicht als voll lebensfähig ansehen
kann. Das trifft insbesondere für die Gmtntwfm- Früchte zu, in denen
der Pilz nur in den Geweben der Fruohtschale vorkommt, das eigentliche
Samengewebe, Aleuronzellen, Zellen des Keimlings und des Mehl-
körpers aber streng meidet. Die Infektion dürfte auf eine ähnliche Stufe
zu stellen sein wie das bekannte Auftreten von Schwärzepilzen auf
Getreide. Sie können als mehr oder weniger zufällige Ansiedlungen
aufgefaßt werden. Der Umstand, daß die Pilze, w ie oben erwähnt, bei
älterem Saatgut augenscheinlich abgestorben waren, dürfte weiterhin
darauf hinweisen, daß die Pilze in dem absterbenden Gewebe keine
zusagenden Bedingungen mehr finden, w'as zw'eifellos ebenfalls gegen
die Auffassung eines engeren symbiontischen Verhältnisses spricht.

0. Marcus:

von mir nach Angaben anderer Autoren

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 39

In ( ) unter dem Pflanzennamen <lie Häufigkeit der festgestellten Infektion.

Zeichen: — = nichts gefunden; ^ = vereinzelt gefunden; O = oft gefunden; x = fast regelmäßig gefunden;

® = regelmäßig gefunden.

O. Marcus :

3. Drittens zeigt die Tatsache, daß es möglich ist, z. B. Hefen in
Früchte künstlich einzuführen, wo sie eine gewisse Zeit am Leben
bleiben können, daß durch ähnliche Vorgänge in der Natur (Insekten-
stiche) durchaus Mikroorganismen namentlich in süße Früchte über-
tragen und hier bisweilen aufgefunden werden können. Ein festgestelltes
Vorkommen ist also ohne engeres Verhältnis verständlich.

4. Viertens aber ist ein Teil der hier beobachteten Fälle zweifellos
mehr oder weniger vom Gesichtspunkt einer parasitären Erkrankung
(Grenzfälle des Parasitismus) aus zu betrachten. Man wird hierzu —
im weiteren Sinne, falls man nicht von zufälliger Ansiedlung sprechen
will — auch das V’orkommen von Pilzen in den Früchten der Oramineen
rechnen können, auch wohl den Pilzbefall der Juniperus- und Crataegus-
Beeren. Aber noch eindeutiger werden die Verhältnisse im Falle des
Bakterienvorkommens im Kürbis, wo der Zusammenhang mit einem
Parasiten der Blütennarbe offen daliegt. Und weiterhin zeigt das
Beispiel der Phyllosticta tirolensis im Apfelkemgehäuse, daß ein Schäd-
ling reifer Lagerfrüchte in den heranreifenden Früchten als harmloser
Mitbewohner vorhanden sein kann. Es sind eben Fälle einer ver-
zögerten oder unterdrückten Erkrankung. Man hat ja auch bei extremen
Parasiten ähnliche Beispiele, W’ie beim Weizen- und Haferflugbrand
(Ustilago tritici und avenae).

Zusammengefaßt ergibt sich also aus den vorliegenden Unter-
suchungen durchaus kein Hinweis auf eine weite oder sogar allgemeine
Verbreitung endophytischer Symbionten. Dabei sei noch darauf hin-
gewiesen, daß ja gerade Bakterien, die in dieser Hinsicht besonders
beachtet wairden, in den vorliegenden Untersuchungen gegenüber Pilzen
durchaus zurüektreten.

Es fragt sich noch, warum der eingedrungene Mikroorganismus
nicht als Schädling zur Entwicklung kommt, wobei von der Wirkung
etwa vorhandener thermostabiler Gifte wie Anemonin u. dgl. (vgl. oben

S. 6) abgesehen sei. Wenn sich Mikroorganismen auf Stücken von
gesundem Fruchtfleisch, etwa von Kürbis oder Apfel, nicht recht
entwickeln, so könnte an Nahrungsmangel oder an das Vorhanden-
sein bzw. die Bildung thermolabiler mikrobicider Stoffe seitens der
Pflanze gedacht werden. In beiden Fällen würde Erhitzen des Frucht-
fleisches einen günstigen Nährboden schaffen können, wie wir es
tatsächlich beobachten können. Diese Dinge lassen sich im Augen-
blick jedoch schwer übersehen. Denn einerseits gibt Dold eine erst
durch Wundreiz entstehende Wirkung des „Wundsekretes“ an. Dann
läge also kein Grund vor, daß die in den Kürbis eingedrungenen
Bakterien sich nicht stärker entwickeln sollten, wenn also die mikro-
bicide Eigenschaft dem intakten Fruchtfleisch fehlte. Andererseits geht
aus den Angaben von Söding hervor, daß gewisse Bakterien im unver-

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 41

letzten Blatt bald absterben, an Wundstellen und im Preßsaft dagegen
wachsen. Man sieht, aUgemein Gültiges läßt sich zur Zeit über diese
Dinge noch nicht aussagen, zumal die vorliegenden Untersuchungen zu
dieser Frage keine besonderen Beiträge bringen, da der Gang der Unter-
suchungen zunächst anders gerichtet war. Es läßt sich eben nur sagen,
daß bei parasitären Erkrankungen bzw. beim Vorkommen von Mikro-
organismen im lebenden Pflanzengewebe Gleichgewichte mannigfacher
Abstufung bestehen werden, die in jedem Einzelfall zunächst einmal
einer genauen Analyse unterzogen werden müßten.

Noch auf einen Punkt sei hier aufmerksam gemacht. Bei den von
mir untersuchten Fällen handelt es sich in der Hauptsache um fleischiges
Gewebe von Früchten, dem man vielleicht keine so große Widerstands-
kraft gegen das Eindringen eines Mikroorganismus zusprechen kann wie
etwa den Zellen der Blätter oder der Samen. Soweit ich solche unter-
sucht habe (Samen von Vicia Faha, Oramineen innerhalb der Frucht -
schale) fand ich ja auch keine Mikroorganismen. Es müßte aber noch
Material über diese Frage beigebracbt werden, zumal Niethammer das
Vorkommen von Pilzen in den Aleuronzellen von Getreide -Früchten
angibt, was ich indessen niemals beobachten konnte. Auch weitere von
Niethammer erwähnte Befunde über das Vorkommen von Pilzen in
Samen (vgl. S. 2/3) wären zu überprüfen, zumal die Angaben über die
Isolierungen meist zu kurz sind.

Nun muß aber noch die entgegengesetzte Seite des Vorkommens
von Mikroorganismen in Früchten kurz erörtert werden. Wenn nämlich
die beobachteten Mikroorganismen auch keine spezifischen Begleiter im
Sinne einer wirklichen Symbiose sind, so schließt das keineswegs aus,
daß sie nicht gewisse für die Pflanze nützliche Wirkungen entfalten
können. Es würde sich dabei in erster Linie um eine Beeinflussung der
Samenkeimung handeln, wie sie das oben beschriebene Auskeimen der
Kürbissamen im Innern einer intakten, aber mit Hormodendron infi-
zierten Frucht und die Angaben von Niethammer zeigen (besonders
altes Saatgut soll in seiner Keimung durch Pilze gefördert werden).
Ebenso ist bekannt, daß manche Samen erst nach längerer ,, Rotte“ im
Boden keimen. Sie werden sich hier nicht der Einwirkung von Mikro-
organismen entziehen können, und die Annahme einer gegebenenfalls
auch nur gelegentlichen Förderung durch Mikroorganismentätigkeit
Hegt durchaus nahe, ebenso aber auch, daß es sich dabei nicht um
spezifische Wirkungen zu handeln braucht ; es kann ja auch die Keimung
von Samen von Mykorrhiza -Pflanzen durch gewöhnliche Schimmel-
pilze gefördert werden (Freisieben) ; und für eine Förderung der Samen-
keimung allgemein werden zweifellos viele der im Boden vorkommenden
Mikroorganismen in Frage kommen können. Im einzelnen kann es sich
dabei um folgende Möglichkeiten handeln:

O. Marcus :

1. Lieferung wachstumsfördemder Stoffe durch den Mikro-
Organismus, bei Mykorrhiza-Pflanzen verwirklicht.

2. Zerstörung keimungshemmender Stoffe in der Samenschale
oder anderen Teilen von Samen und Frucht (oder auch im Boden
vorkommender). Daß dieser Fall verwirklicht sein wird, kann kaum
bezweifelt werden.

3. Zerstörung derber, die Keimung hemmender Zellwandschichten,
wie z. B. von den Samen von Symphoricarjms angegeben ist (Pfeiffer).

Wenn also auch gesagt wurde, daß solche Erscheinungen wohl
kaum durch spezifische Mikroorganismen durchgeführt werden, so ist
doch darauf hinzuweisen, daß eine gewisse Begleit -Mikroflora von
Früchten und Samen regelmäßiger auftreten kann, wie Niethammer
glaubt. Danach handelt es sich um die Mikroflora des Standortes
(Bodens), da sie die gleichen Arten hier und in Früchten fand. Man
wird das für möglich halten dürfen, muß aber wohl umfangreicheres
Material und eingehendere örtlich -ökologische Untersuchungen (vgl.
oben S. 13 bei Juniperus) abwarten. Die von Niethemmer gegebenen
Listen der Mikroflora unterscheidet sich von den von mir festgestellten
Arten stark (Tabelle X). Kein einziger der von ihr angegebenen Pilze
wurde von mir gefunden, insbesondere B. keine einzige Mucorinee.
Natürlich kann nicht gesagt werden, ob die Boden-Mikroflora in beiden
Fällen so stark verschieden war; man hat fast den Eindruck, daß
die Arten von Niethammer etwas zahlreich sind und vielleicht doch
nicht alle als wirkliche Begleiter von Früchten (d. h. deren innerer
Teile) anzusprechen seien.

Bei meinen eigenen Untersuchungen ist es jedenfalls auffallend,
daß Hormodendron chlorinum var. nigrovirens bei Juniperus des Göttinger
und Kasseler Standortes vorherrschend war; diese Art erscheint aber
auch in einem Falle bei Avena vom gleichen Standort. Eine noch
häufigere Form ist AUemaria tenuis, die bei Juniperus, Triticum,
Hordeum, Malus, gefunden wurde, bei Triticum und Hordeum dazu als
häufig vertretener Pilz. Es erscheint demnach durchaus möglich, daß
sich gewisse Arten vermöge ihrer Konstitution besonders als Früchte -
Begleiter eignen; aber auch hier könnten nur ausgedehnte Unter-
suchungen völlige Klarheit schaffen. Ob dabei Wirkstoffe der Früchte
eine Rolle spielen [vgl. Nielhammer (5)], läßt sich ebenfalls nur auf
Grund ausgedehnter Untersuchungen entscheiden.

Zweifellos aber wird man das Zusammenleben von Mikroorganismen
mit höheren Pflanzen nicht zu eng nur vom Gesichtspunkt einer vollen-
deten Symbiose aus sehen dürfen, sondern man wird nach Zusammen-
hängen weiteren Ausmaßes und geringer Spezifität suchen müssen.

Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben. 43

Zusammenfassung.

Aus dem Innern gesunder Früchte konnten Pilze, Hefen und
Bakterien isoliert werden.

In Früchten von Cucurbita pepo fand sich in 91 % der Früchte
BoiciUus vulgatus, der aber als Parasit der Blütennarbe bekannt ist und
von dieser aus offenbar in die Frucht eindringt, ohne sich jedoch in
dieser stark zu vermehren.

Die Früchte der Getreidearten zeigten in allen Fällen Pilze ver-
.schiedener Artzugehörigkeit, aber nur außerhalb der Samenschale, nie
in Zellen der Aleuronschicht, des Keimlings oder des Mehlkörpers.

Sehr hohen Pilzbefall, mit verschiedenen Arten, zeigten die Beeren
von Juniperus und Crataegus ; der Grad des Befalls wechselte aber sehr
stark bis zur völligen Sterilität bei einer Herkunft.

Samen von Vicia Faha waren frei von Mikroorganismen, ebenso
Früchte von Viscum und Fruchtfleisch von Pyrus und Malus, während
im Fruchtfleisch von Prunus cemsus und Ribes Uva-crispa in geringem
Ausmaße Hefen und Bakterien gefunden wurden.

In Früchte eingeimpfte Hefen blieben eine gewisse Zeit am Leben,
insbesondere Toruhpsis albida in Solanum lycopersicum. In der Natur
können Hefen also durch Insektenstiche gelegentlich in Früchte gelangen
und dort auf gefunden werden.

Es ist möglich, aber durch umfangreichere Untersuchungen noch
streng zu beweisen, daß die aufgefundenen Mikroorganismen solche des
natürlichen Standortes (Bodens) sind. Ebenso erscheint es möglich,
daß die Begleiter von Früchten bei der Samenkeimung gewisse fördernde
Wirkungen ausüben können, w ie Niethammer annimmt, und auch hier
in einem Falle wahrscheinlich gemacht werden konnte.

Solche Erscheinungen sind aber kaum spezifischer Natur, und alle
in den vorliegenden Untersuchungen beobachteten Fälle haben mit
einer eigentlichen Symbiose nichts zu tun, sondern können als zufällige
Ansiedlungen bzw. als gehemmte oder unterdrückte Infektionserkran-
kungen (Grenzfälle des Parasitismus) angesehen werden.

Mit Rücksicht auf die Möglichkeit fördernder Wirkungen der
Mikroorganismen auf die Samenkeimung und die Häufigkeit des Vor-
kommens von Mikroorganismen in Früchten wird man die Frage des
Zusammenlebens nicht zu eng auf eine eigentliche Symbiose einstellen
dürfen, sondern nach Zusammenhängen weiteren Ausmaßes suchen
müssen.

Literatur.

Alcom, C. D., u. G. C. Yeager, Stain. Technol. 12, 157, 1987. — Am-
iong, H., Deutsch. Landw. Presse 68, 106, 1941. ~ Appd, O., Taschenatlas
d. Krankheiten des Kern- u. Steinobstes. Berlin 1988.

44 O. Marcus : Vorkommen von Mikroorganismen in pflanzlichen Geweben.

Berthold, E., Jahrb. f. wiss. Bot. 57, 387, 1917. — Boas, F., Dynamische
Botanik. München -Berlin, Lehmann, 1937; Ber. Deutsch. Botan. Ges. 62,
126, 1934. — Bortelsy H., Centralbl. f. Bakt. II, 108, 94, 1941. — Bureik, E.,
Planta 80, 683, 1940. — Burgwitz, O. K„ Ref. im Bot. Zentralbl. 11, 315, 1940.

CappelleUi, (7., u. A. Ceruti, Nov. G. Bot. Ital. 46, 339, 1939. — Cauda, A.
ebenda 82, 36, 1925.

Bold, H„ Centralbl. f. Bakt. I, 140, 265. 1937.

Elfving, F., Soc. Sc. Fenn. Biol. 7, 4, 1938; 9, 1, 1941.

Faber, F. C. v., Jahrb. f. wiss. Bot. 51, 285, 1912. — Fembach, M. A., Ann.
de rinst. Pasteur 1888, S. 567.

Freisieben, R., Ber. d. Deutsch. Bot. Ges. 51, 351, 1933; Jahrb. f.
wiss. Bot. 80, 421, 1934; 82, 413, 1935.

Günnewig, J., Beitr. z. Biol. d. Pflanzen 20, 227, 1933.

Haag, F. E., Centralbl. f. Bakt. II, 17, 1, 1927. — Harter, L. L., u.
Weimer, I. L, in Ed. Fischer u. E. Qäumann, Biol. d. pflanzenbewohnenden
parasitischen Pilze. Jena, G. Fischer, 1929. — Hennig, K., u. F. ViUforth,
Biochem. Zeitschr. 805, 299, 1940. — Hiltner, L., Centralbl. f. Bakt. II, 5,
831, 1899.

Lehmann, K. B., u. O. Neumann, Bakteriologie, Bd. II. München
1927. — Lodder, J., Die anaskosporogenen Hefen. Amsterdam 1934.

Miehe, H., diese Zeitschr. 1, 78, 1930. — Moriondi, Ch., C. R. Soc. Biol.
Paris 106, 351, 1931. — Müller -Thurgau, H., in Lafar. Handb. d. techn.
Mykologie 6, 48, Jena 1905/14.

Nestler, A., 1. Ber. d. Botan. Ges. 17, 320, 1899; 2. ebenda 89, 230,
1922. — Niethammer, A., 1. diese Zeitschr. 4, 72, 1933; 2. Die mikro-
skopischen Bodenpilze. Gravenhage 1937; 3. diese Zeitschr. 9, 23, 1938;
4. ebenda 10, 13, 1939; 5. ebenda 11, 73, 1940; 6. ebenda 12, 314, 1941.

Osterwalder, Centralbl. f. Bakt. II, 18, 207, 1904. — Owen, W. M. L..
J. ofBact. 1, 235, 1916.

Peklo, J., Ber. d. Botan. Ges. 81, 370, 1913. — Pfeiffer, N. E., Contrib.
Boyce Thompson Inst. 6, 103, 1934.

Rayner, M. C., Mycorrhiza. London 1927. — Rippel, A., Mikrobiologie
des Bodens in; Handb. d. Bodenlehre von E. Blanck, l.Erg.-Bd. Berlin,
Springer, 1939. — K. Rippel, 1. Planta 80, 689, 1940; 2. ebenda 80, 806,
1940. — Romwalter, A. (d. Ältere), u. A. v. Kiraly, diese Zeitschr. 10, 87,
1939.

Schade, R., Planta 81, 169, 1940. — Scha-nderl, H., 1. Gartenbau -
Wissenschaft 18, 406, 1939; 2. Organismus u. Umwelt 1939, S. 222; 3. Garten-
bauwissenschaft 15, 1, 1940. — Söding, H., Ber. d. Botan. Ges. 57, 465,
1939. — Stührk, A., Die Obst- und Gemüse-Verwertungs-Industrie, A,
Heft 42, 1941. — Szüvdsi, J ., Mitt.a.d. botan. Inst. Sopron 1942 (mit einem
Vorwort von D. Feher).

Thcn}iee’Migula, Kryptogamenflora III, 4, 2, Leipzig 1934.

Watanahe, K., Bot. Mag. Tokyo 47, 498, 1933. — Wollenweber, H. W.,
u. O. A. Reinking, Die Fusarien. Berlin 1935. — Wöller, H., Centralbl. f.
Bakt. II, 79, 173, 1929.

Zinsser, O., Jahro. f. wiss. Bot. 80, 423, 1897.

(Aus der Mikrobiologischen Abteilung des Instituts für Biochemie und
Nahrungsmittelchemie der deutschen Technischen Hochschule, Prag.)

Hefen sowie mikroskopische Pilze ans Blüten,
ferner von Samen und Früchten.

Von

A. Niethammer.

(Eingegangen am 28, Januar 1942.)

Begründung der Untersuchungen und Angabe des Arbeitsgangeg.

Die hier mitgeteilten Versuchsergebnisse sollen einen Beitrag dazu
liefern, welche Arten von Hefen sowie von mikroskopischen Pilzen im
Nektar, in den Blüten, ferner an Samen und Früchten heimischer
Garten-, Wiesen- und Feldpflanzen zu finden sind. Gleichzeitig wurde
auch der Frage nachgegangen, inwieweit auch im Innern von Früchten
bzw. Samen, ohne auf pathologische Erscheinungen einzugehen, pilzliche
Mikroorganismen anzutreffen sind. Ebenfalls zu prüfen ist, inwieweit
die Samen in der intakten Fnicht keimfrei sind.

Die Blüten wurden in den Monaten Mai bis Juli g^feammelt, und
zwar teils in der Umgegend Prags, teils im botanischen Garten der
Karls -Universität. Im Laboratorium wurden sie 24 Stunden unter Glas-
glocken bewahrt. Durch leichten Druck mit dem Finger ^mrde aus den
Blüten der Nektar in Form kleiner Tröpfchen gequetscht und mit
sterilen Nadeln auf die Nährsubstrate übertragen. In manchen Fällen
wurde auch mit einem sterilen Skalpell ein kleiner Teil des Blüten-
bodens auf die Nährsubstrate gegeben.

Bei den Früchten und Samen war die Auswahl des Materials sehr
wichtig. Normale Handelsware kommt im allgemeinen nicht in Frage.
Die Proben wurden teils selbst gesammelt, teils wurden sie uns von
verläßlichen Züchtern oder Gärtnern überlassen. Die Samen und
Früchte wurden mit Alkohol gereinigt, mit sterilem, destilliertem
Wasser gewaschen, um die zufällig anhaftenden Mikroorganismen zu
beseitigen. Die fleischigen Früchte wurden mit dem ausgeglühten
Messer auf geschnitten. Stücke des Fruchtfleisches aus den inneren
Partien, sowie die unter sterilen Bedingungen entnommenen Samen
dienten der Untersuchung. Harte Früchte und alle Samen müssen
1 Stunde unter sterilen Bedingungen in Wasser bei etwa 18^ quellen.
Dann wurden mit dem ausgeglühten Messer Schnitte von Schale und
Kern hergestellt, die gesondert in die Nährsubstrate gelegt wurden.

Mit dem Studium der Mikroorganismen des Nektars, insbesondere
der Hefen, haben sich früher bereits u. a. HauUnann, Zinkernagel und

A. Niethammer :

Niethammer befaßt. Hautmann beschäftigte sich nur mit einer Art,
dem ArUhmyces Jßeukaufii. Zinkemagd isolierte sehr verschiedene
Hefen, ohne aber eine systematische Einreihung vorzunehmen. „Niet-
hammer wies neben Hefen auch auf andere mikroskopische Pilze hin.

Über das Vorhandensein von Hefen sowie mikroskopischen Pilzen
an und in Samen bzw. Früchten hat Niethammer ebenfalls wiederholt
berichtet. Ihre Untersuchungen lassen vermuten, daß auch im Innern
gesunder Samen und Früchte Mikroorganismen zugegen sein können.
Sie müssen nicht immer vorhanden sein. Dafür spricht die Arbeit von
K, Rippel, die beweist, daß im Innern gesunder Weintrauben keine
Mikroorganismen anzutreffen sind. Hefen und mikroskopische Pilze,
die den aus der Natur unmittelbar entnommenen Samen bzw. Früchten
anhaften, interessieren naturgemäß auch.

Die Rohkulturen zur Heranzucht der Mikroorganismen wurden in
Bierwürze (4® Ball.), Hefewasser mit 2% Glucose (Henneberg) und auf
Bierwürze, sowie Hefewasseragar (1,5% Agar-Agar) hergestellt. Zur Rein-
kultur wurden zunächst die gleichen, zur näheren Charakteristik auch
Spezial -Nährböden benutzt. Zum Studium des Wachstumsbildes dienten
reine Zucker lösungen.

Zusammensetzung der Zuckerlösungen: 2% Saccharose oder Glucose,

0,1% (NH4)2S04, 0,01% KH2PO4, 0,01% MgS04.

Das Farbenspiel der Kultiu'en wurde in der WoeUje-ldöHung verfolgt.
Lösung nach Woeltje: 7,5% Saccharose, 1% Asparagin, 0,5% KH2PO4,
0,25% MgS04, dest. Wasser.

Penvoznansky machte aufmerksam, daß viele Hefen und auch mikro-
skopische Pilze, besonders solche mit schwacher oder fehlender Gärkraft,
Chinasäure als C- Quelle verwerten können. Dabei können interessante
Verfärbungen von Substrat und Pilz verzeichnet werden. Chinasäure-
Nährlösung nach Perwoznansky : 2 g Chinasäure, 0,1 ccm 20%iger NH,-
Lösung, 0,03 g KH2PO4, 0,15 g MgS04, 0,003 g FeClg, NagCO., bis zur
Neutralisation gegen Lackmus. Dazu 1,5% Agar-Agar.

Im Anschluß an die auf Chinasäure igar gewonnenen Erfahrungen
wurde das Gärvermögen der Hefen und anderer hier gut gedeihender Mikro-
organismen geprüft. Für diese Zwecke bedieixi^;. wir uns wieder des Hefe-
wassers, das jeweils einen 2%igen Zusatz von Glucose oder Saccharose
erhielt. Die Beobachtung erfolgte in Einhorn -Gärröhrchen. Das Sporen-
bildungsvermögen der Hefen wurde auf Gipsblöcken und Kartoffel scheiben
verfolgt (vgl. F, Wagner). In manchen Fällen bewährte sich auch Bierwürze -
oder Chinasäureagar. Perithezienbildung glückte bei manchen Ascomyceten
auf Bierwürzeagar. Unsere frühere Beobachtung bestätigte sich wieder,
daß frisch aus der Natur stammendes Material eher Perithezien bildet als
solches nach einem langen Aufenthalt im Laboratorium.

In einzelnen Fällen interessierte auch die Wachstumsmöglichkeit auf
Cellulose- bzw. ligninhaltigem Material. Zu diesen Zwecken dienten Sulfit -
Cellulose und Holzschliff, wie sie fabrikmäßig hergestellt werden. Zur
Befeuchtung diente eine nach Stopp hergestellte Nährlösung. Nährlösung
nach Stopp: Leitungswasser 1000, (NH4)2S04 0,5, KH2PO4 0,25,

Mg S O4 • 7 Hg O 0,1 -f- Hg S O4 bis zur schwach -sauren Reaktion, pn etwa 6,0.

Hefen sowie mikroskopische Pilze aus Blüten.

Die Kulturen fanden bei 26® Aufstellung in einem Brutschrank.
Gelegentlich wurden zum Vergleich niedrigere oder höhere Temperaturen
geprüft, ohne einen besseren Erfolg zu haben. Die Gänmg wurde bei 20
und 26® verfolgt.

Die festen Nährböden gelangten in Petri-Schalen und Reagenzröhrchen
zur Anwendung. Dies gilt auch für Sulfitcellulose und Holzschliff. Die
Nährlösimgen reichten wir in 100-ccm-Erlenmeyerkolben und bei den Hefen
vorwiegend in Freudenreich-Kölbchen. Die Gipsblöcke fanden in kleinen
Petrischalen Aufnahme. Als Impfmaterial dienten nach F. Wagner stets
frisch auf Bierwürze gezüchtete Stämme. Die Anfeuchtung der Blöcke
erfolgte mit Bierwürze.

Aufzahlung und Beschreibung der isolierten Formen.

Die Abhandlung der isolierten Mikroorganismen (ausschließlich
Ascomycetes bzw. Fungi imperfecti) erfolgt systematisch. Wir benutzten
die von Oäumann gegebene Einteilung, wobei aber in manchen Fällen
die Erkenntnis neuerer Literatur berücksicht werden muß.

In der Ordnung der Endomycetales wurde aus der Familie der
Sa/^cha/romycetaceae , welche die askosporogenen Hefen enthält, kein
Vertreter isoliert.

Die Ordnung der Exoascales enthält in der Familie der Candidaceae
nach den neuesten Einreihungen von Windisch Torulopsis pulcherrifna
(Lindner) Sarcardo, die nach dem zitierten Autor als Candida pulcher-
rima bezeichnet wird. Wir wollen die von Lodd,€r bei den anaskospogenen
Hefen eingereihte Form hier anschließen. Windisch beobachtete die
Bildung von Ascosporen, die wir nach unseren Kulturen bestätigen
können. Windisch isolierte sie von Kirschen und Johannisbeeren ^ wir
von dem steril entnommenen Fruchtfleisch einiger Pfirsiche.

In Bierwürze sowie auf Bierwürzeagar ist die Vielgestaltigkeit der
Zellen zu erwähnen (vgl. Windisch). Rasches Wachstum, zunächst wie
es Lindner (vgl. Lodder) beobachtet, vorherrschend längliche Zellen, die
sich später beträchtlich vergrößern und abnmden. Bildung einer großen
oder mehrerer kleiner Fettkugeln in den Zellen. Die typischen ^.pulcher^
nwa“-Zellen sind vorhanden. In älteren Kulturen findet man gelegent-
lich die Bildung von Pseudomycel. Aus den runden Zellen entwickelt
sich bei neuerlichem Überimpfen wieder eine Generation mit länglichen
Zellen. Äußerlich erscheint die Kultur auf Bierwürzeagar weißlich
glänzend, deutlich am Rande gezackt. Fast keine Farbstoff bildung.
Nach den Angaben von Lodder muß diese nicht allen Stämmen eigen
sein. In Bierwürze ist nach 48 Stunden ein deutlicher Bodensatz, später
auch Ringbildung. Glucose und Saccharose werden schwach vergoren.

Auf Chinasäureagar beginnt das Wachstum nach 24 Stunden. Es
entsteht ein weißgelber Belag. Der Nährboden ist zunächst hell, bald
erscheint er rosa. Nach etwa 1 Woche werden Belag und Substrat
dunkel, noch etwas später schw’arz. Die anfangs länglichen, später

A. Niethanuner :

runden Zellen haben sich, wie die mikroskopische Kontrolle lehrt, in
derbwandige Dauerzellen Verwandelt. Dieser Vorgang dauert etwa
10 Tage. Einige Tage später bilden diese Zellen in der von Windiach
beschriebenen Art einen Ascus, in dem 4 bald frei werdende Sporen
entstehen. Gipsblöcke zeigen nach mehreren Tagen derbe Dauerzellen
mit viel Fett, aber ohne Sporenbildung. Kartoffelscheiben werden von
einem gelbweiß-glänzenden Überzug, mit gezacktem, rosa Rand über-
zogen. Auf Zellstoff und Holzschliff unterbleibt das Wachstum voll-
kommen. Diese Versuche wurden angestellt, da Melin und Renner feld
über die starke Verbreitung von Hefen und hefenartigen Pilzen auf
Holzschliff sowie Zellstoff in Schweden berichten.

Ordnung Plectaacales,

Die Familie der Aspergillaceae ist mit verschiedenen Gattungen
vertreten.

Geltung Penicillium.

Aus der Gruppe Monoverticillium wurde P. glaher Wehnier verschiedent-
lich isoliert. 1. Aus dem steril entnommenen Kerngehäuse von verschiedenen
Früchten des MeUtts aüvestria. 2. Kern von Corylus Avellana, welcher unter
sterilen Bedingungen entnommen wurde. 3. Testa, Gurke, Ernte 1938,
Delikatas, Versuchsfeld, Pflanzenbau, Tetschen-Liebwerd. 4. Samen,
Glycine Soja, keimfrei der Hülse entnommen.

Ausgezeichnet durch sehr gutes Wachstum auf Sulfit Cellulose,
zerkleinerten Haselnußschalen, Hülsen der Sojabohne.

Die Gruppe Asymmetricum stellt mehrere Vertreter. P. notatum
WeaÜing wurde isoliert von: 1. Prunus Persica, Kern, steril der Frucht
entnommen. 2. Blüte, Forsythia suspensa. 3. Testa, Eier- und Rheinland-
bohne, Ernte 1938, 1939, Tetschen-Liebwerd, Versuchsfeld, Pflanzenbau.
Auf Bierwürzeagar blaugrüne Decken, typische Radialfalten. Woeltje-
Lösimg zeigt blaugrüne Decken, gelbe Unterseite und gelbe Nährflüssigkeit.
Auf den Glucose- oder Saccharoselösungen blaugrüne Decken. Sulfit-
cellulose läßt blaugrüne Decken entstehen, die aber nur oberflächlich im
Substrat verankert sind,

P. lanosum WesÜmg wurde auf Kernen von Vitis vinifera, die steril
der Frucht entnommen wurden, gefunden.

Verbreitet ist P. italicum W ebner. Es wurde isoliert von 1. Fruchtsaft,
steril entnommen, Citrus nohüis. 2. Fruchtsaft, ebenso, Citrus aurantiacum.
3. Testa Eierbohne 1938, 1939, Versuchsfeld, Pflanzenbau, Tetschen-
Liebwerd. 4. Testa, Zuchterbse, Haid bei Tachau. Auf Bierwürzeagar ist
der große, sehr derbe, eckige Konidienträger zu nennen; sie sind auf der
Platte zu dicken Büscheln angeordnet. Die Konidienfarbe ist stahlblau,
ln diese Konidiendecke werden kleine rosa und weiße, sterile wie fertile
Sklerotien gesetzt. Auf Sulfitcellulose entstehen grüne, körneliche Decken.
Holzschliff ermöglicht keine Entwicklung. Mit Stamm 4 dieser Art führten
wir wiederholte Impfungen einzelner Konidien durch. Der Konidienträger
ist in Größe sowie Zahl seiner einzelnen Glieder starken Schwankungen

Hefen sowie mikroskopische Pilze ans Blüten.

unterworfen. In einzelnen Fällen können Rami, Ramuli und Sterigmen
sogar regelmäßig ausgebildet sein.

Für P. expcmeum Link konnten wir bereits früher Verbreitung auf
Samen und Früchten angeben. Hier wurde es gleichfalls einige Male isoliert.
1. Kern, Corylus Aveücma, steril entnommen. 2. Malus silvestris, steril dem
Fruchtfleisch entnommen. 3. Same Glycine Sqja^ keimfrei der Hülse ent-
nommen. 4. Pyrua communis , steril dem Fruchtfleisch entnommen.
5. Rhinanthus minor, steril der Kapsel entnonunen. O.fTesta, Kern, Gurke
Delikatas, Versuchsfeld, Pflanzenbau, Tet sehen -Lieb werd. 7. Testa BohnCy
Saxen, ferner Rheinlandbohne, 1938, 1939, gleiche Herkunft. 8. Testa
Pisum sativum, Posteiberg 1929. Diese Art ist durch die Ausbildung der
typischen gestielten, oft federförmigen Koremien gekennzeichnet. Diese
Ausbildungsart ist auf Streifen von Sulfitcellulose sowie zerkleinerten
Haselnußschalen sehr deutlich. Bei den unter 7 angeführten Stämmen
verfolgten wir wieder bei unterschiedlichen über Impfungen auf Bierwürze -
agar die mikroskopische Ausbildung des Konidienträgers. Die Art der
Verzweigung sowie die Zahl der Stockwerke ist mannigfachen Schwan-
kungen unterworfen. Typisch ist nur die stets eckige Ausbildung der Teil-
stücke des Trägers.

Die Gruppe Symmetricum stellt in P. bicolor Fries einen bekannten
Vertreter. Er wurde isoliert : 1. Samen,* Lupinu« aUms, steril der Hülse
entnommen. 2. Samen, Fraxinus excelsior. Die typischen Koremien mit
gelbem Fuß und grünem Köpfchen fallen auf. Auf Sulfitcellulose sind sie
in dichten Reihen erkennbar.

P. elegans Corda, das auf Bierwürzeagar durch seinen hellgrünen,
samtigen Belag kenntlich ist, wurde einige Male isoliert. 1. Saft, steril
entnonunen von Citrus nobüis. 2. Fruchtfleisch, steril abgelöst von Vitis
vinifera. Gelegentlich auch aus Rheinweinen. 3. Testa, Kohlsamen, Ver-
suchsfeld, Tetschen-Liebwerd. 4. Testa, Eierbohne, Ernte 1938, gleiche
Herkunft. 5. Fruchtfleisch, steril entnommen, Malus silvestris. Sehr gutes
Wachstxim auf Sulfitcellulose. In den hellgrünen Decken zahlreiche gelbe,
meist sterile Sklerotien. In Wodtje-Löf^xing sind die stechend gelben Ab-
scheidungen in die Flüssigkeit typisch. Hier wie auf der gewöhnlichen
Glucose- und Saccharoselösung geschlossene Decken. Angenehmer, parfüm-
artiger Geruch,

Gattung Gliocladium,

G. deliquescens Sopp wurde von Samen isoliert, die unter sterilen Be-
dingimgen der Frucht von Ribes Uva crispa entnonunen waren. Auf Bier-
würzeagar hellgrüne Lager, die mit zunelunendem Alter in Übereinstimmung
mit den Angaben von Sopp etwas verschleimen. Der Konidienträger ist
nach dem Bau eines PenioiUium gestaltet. In Bierwürze erfolgt die Ent-
wicklung submers. Auf Chinasäureagar tritt deutliches Wachstum ein.
Das Substrat bleibt hell. Glucose \md Saccharose werden schwach vergoren.
Nach Sopp soll Bildung von Buttersäiire erfolgen.

Gattung Acaulium.

A. atbo-nigrescens Sopp wurde einmal aus dem Nektar der Blüte von
Prunus Cerasus isoliert. Auf Bierwdirzeagar sind in dem gelblichen Mycel
die dunklen Perithecien maßgebend. Entspricht den von Sopp gemachten
Angaben.

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13. 4

A. Niethammer :

Gattung Scopulariopsis.

S. brcvimule Thom-Bainier wurde ebenfalls einmal aiis der Blüte von
Prunus cerasus isoliert. Keine Abweichungen gegenüber der Beschreibung
bei Thom.

Ordnung Sphaeriales.

Die Familie M ycospha^rellaceae ist durch Sphaendina intennixta
und Mycosphaerella Tulusnei hier vertreten. Sphaerulina intermixta,
deren Konidienfomi als Danatium pullulans de Bary bekannt ist, wurde
sehr oft isolieit. In Blüten und Früchten ist es ein häufiger Begleiter
der mannigfachsten Hefen. Wir führen nachstehende Isolierungen an:

1. Blüte, Rihes rubrum, Prag, Garten. 2. Fruchtfleisch, TanuUe,
ebenda. 3. Prunus Persica, innere Partien des Fruchtfleisches, Garten,
Leitmeritz. 4. Nektar, Prunus Cerasus, Garten, Prag. 5. Nektar, Trifolium
pratense. Wiese bei Prag. 6. Nektar, Barbarea vulgaris. Wiese l^i Prag.
7. Malus silvestris, Nektar, Garten, Prag. 8. Coronilla varia, Nektar, Wald-
rand unweit Prags. 9. Salvia pratensis, Nektar, Wiese unweit Prags. 10. Epi-
lobiufn angustifolium, Nektar, Waldlichtung bei Prag. 11 . Amica moyUana,
Blüte, Botanischer Garten, Universität. 12. Testa der Samen, Eierbohne,
Rheinlandbohne, Gurke Delikatas, Versuchsfeld Pflanzenbau, Tetschen-
Liebwerd. 13. Samen steril den Früchten von Vitis innifera und Malus
silvestris entommenn, nicht ausgereift, Melnik. 14. Samen steril der Frucht
von Pyrus communis, Garten, Prag, entnommen. 15. Kern, unter sterilen
Bedingungen der unreifen Frucht von Aesculus Hippocastanum entnommen .

Dieser Pilz, der neuerdings von Bauer in physiologischer Hinsicht
beschrieben wurde, ist durch seine Vielgestaltigkeit bekannt. Auf Bier-
würze- und Hefewasseragar entsteht rasch ein gelblich -weißer, schnell
sich verbreitender, schleimiger Belag. In dieser Wachstumsphase sind
die hefeartigen Konidien, fädiges Mycel, sowie Sproßmycel zu beob-
achten. In allen Teilen Speicherung von öltropfen. Nach einiger Zeit
kann, aber muß nicht immer, ein Nachdunklen der Kultur eintreten.
Dieser Vorgang kann so weit schreiten, daß der ganze Belag in eine
glänzende, schwarze Masse verwandelt wird. Die erwähnte Erscheinung
erfolgt durch die Bildung dunkler Gemmen in Konidien und Mycel.
sie sind dickwandig und lagern einen dunklen Farbstoff und Fett ab.
überimpft man auf frisches Nährsubstrat, so entsteht wieder der er-
wähnte Schleim. Diese Gemmenbildung setzt bei den verschiedenen
Stämmen ungleich rasch ein und bleibt bei manchen auch aus.

Die Wachstumsmöglichkeit auf Chinasäureagar w^urde bereits
früher an dem Erdreich entnommenen Formen geprüft. Diese Prüfung
fiel damals negativ aus. Die nun isolierten Stämme gehen auf diesem
Substrat langsam an. Es wird in den meisten Fällen ein erst heller,
bald nachdunkelnder Belag geformt. Das Substrat bleibt zunächst hell.
Bei längerer Kiilturdauer tritt dunkle Tönung ein. Den hier isolierten
Stämmen geht Gärkraft gegenüber Glucose und Saccharose ab. In den

Hefen sowie mikros)copische Pilze aus Blüten. 51

Zuckerlösungen werden helle, schleimige Lager ge bildet. Fettabsonderung
in den Hyphen, schwache Gemmenbildung. Zunehmende Kulturdauer,
bei Eintrocknen oder Erschöpfung der Nährsubstrate, steigert die Fett-
absonderung mächtig. Einzelne Stämme schreiten rasch zur Bildung
der dunklen Perithecien. Bei Stamm 1 wird diese in Gemeinschaft mit
Fusarium hulhigenum, das der gleichen Blüte entstammt, deutlich
gefördert. Bierwürzeagar ist für diese Perithecienbildung sehr geeignet.
Die Perithecien selbst sind wollig, stecknadelkopfgroß, dunkel. Sie
enthalten die länglichen Asci. Zu erwähnen ist, daß jene Stämme, die
einen langsamen Aufgang zeigen, dann rasch zur Gemmenbildung
schreiten.

Mycosphaerella Tulasnei ist als Konidienform unter dem Namen
Cladosporium herbarum Fers, bekannt. Diese auch als Schwärzepilz
bezeichnete Art wurde verschiedentlich isoliert.

1. Nektar, Malus süvestris, Garten, Prag. 2. Mcdva pusiUat Nektar,
Botanischer Garten, Universität. 3. Samen, Glycine Soja, steril der Hülse
entnommen. 4. Kern Corylus Avellana* steril der Frucht entnommen.
5. Samen, Geranium pratenae, steril der Frucht entnommen. 6. Testa der
Samen, Eierhohne, Bohne Saxen, Gurke Delikatas, Versuchsfeld, Pflanzenbau,
Tetschen-Liebwerd, Saaterbse, Haid bei Tachau, Victoria -Fr6«e, Posteiberg.

Auf Bierwürzeagar eingesenkte dunkle H 5 rphen, darüber ein graues
Luftmycel. In Bierwürze- sowie Zuckerlösungen submerse Lager.
Chinasäureagar ermöglicht gutes Wachstum, schwarze eingesenkte
Lager. Das Substrat nimmt sehr allmählich eine dunkelgrüne Tönung
an. In den Hyphen Absonderung kleiner öltropfen. Gärkraft gegen-
über Glucose und Saccharose ist nicht vorhanden.

Cellulosehaltiges Material wird gern besiedelt und ermöglicht die
Ausbildung schwarzer Lager mit darüberstehendem Luftmycel. Wir
nennen Sulfitcellulose, Hülsen von Glycine Soja, zerkleinerte Haselnuß-
schalen. In Keimversuchen erkannten wir die Entwicklung dieser Pilze
auf den entleerten Samenschalen.

Sklerotienbildung tritt auf allen benutzten Nährböden leicht ein.
In einzelnen Fällen trat auf den entleerten Samen im Keimverlauf
{Eierbohne, Saaterbse) Perithecienbildung ein.

Ordnung Hypocreales.

In der Gruppe Didymosporeae-Dictyosporeae ist VerticiUiusn a^ri-
cium zu erwähnen, dessen höhere Fruchtform bei Hypomyces steht.
Diese Art ist an dem Samen von Rhinanthus minor, der steril der
Kapsel entnommen wurde, gefunden worden. Gelbliche Mycellager mit
hyalinen Konidien sind zu erwähnen : daselbst entstehen die dunklen,
runden Perithecien.

4 *

A. Niethammer :

Ordnung Pezizalea,

Familie Pezizaceae.

Botrfftis cinerea Kkbahn als Konidienform, ist bei Bildung von
sterilen und fertilen Sklerotien unter dem Namen SlderoHnia Liber-
tiana bekannt.

Isolierungen erfolgten aus Blüten, Fruchten und Samen. 1. Nektar,
Faraythia auapenaa, Garten, Prag. 2. Nektar, Malus süveatris, ebenda.
3. Blüte, Spiraea vulgaria, ebenda. 4. Nektar, Salvia pratensia. Wiese,
unweit Prags. 5. Nektar, Trifolium prcUense, Wiese, ebenda. 6 . Oorylua
AveUana^ Kern steril der Frucht entnommen. 7. Testa der Samen Eierbohne,
Rheihlandbohne 1938, 1939, Ourke Delikatas, Versuchsfeld, Tetschen*
Liebwerd, Pflanzenbau. 8. Samen, steril der Schale von Raphanus Rapha-
nistrum entnommen.

Auf Bierwürzeagar Bildung eines grauwolligen Mycels, in dem
zahlreiche dunkle Sklerotien eingelagert sind. In Zuckerlösungen
entwickeln sich aus diesen Sklerotien weiße bis graue submerse Lager,
mit Fetttröpfchen, in den Hyphen. Auf Chinasäureagar entstehen weiß-
graue Lager, das Substrat bleibt hell. Auf Cellulosestreifen ist das
Wachstum sehr gut; die Hyphen sind stark verbreitert und führen
deutlich Oltropfen. Gärkraft gegenüber Glucose und Saccharose ist
nicht vorhanden.

Monilia nigra Burri-Staaib wurde aus dem Nektar von Tilia
pUUyphylloa isoliert. Auf Bierwürze- sowie Chinasäureagar schwarze,
eingesenkte Lager. Glucose und Saccharose werden nicht vergoren.
Deutliche Bildung von Gemmen.

Fungi imperfecti.

Es wurden zahlreiche Vertreter isoliert. Zunächst wird die Familie
der Mucedinaceae behandelt. Im Anschluß daran ist ein längerer
Abschnitt den anaakoaporogenen Hefen gewidmet. Als Schluß sind die
Familien der Dematiaceae und Tuberculariacea^e angereiht.

Familie Mucedinaceae.

Cephalothecium roaeum wurde wiederholt isoliert.

1. Nektar, Prunus Cerasus, Garten, Prag. 2. Nektar, Malus süvestris,
ebenda. 3. Samen, sterü der Frucht entnommen, Qeranium pratene, 4. Kern,
Corylus AveUana, steril der Schale entnommen. 5. Testa der Samen Eier-
höhne, Bohne Saxen, 1938, 1939, Versuchsfeld, Pflanzenbau, Tetschen-
Ldebwerd, Zuchterbse Haid.

Auf Bierwürzeagar eine rosa, leichte Decke. Auf Chinasäureagar
gute Entwicklung ; das Substrat bleibt hell. Glucose und Saccharose
werden nicht vergoren. In Zuckerlösungen helle, submerse Lager.
Auffallend ist die sehr starke Entwicklung auf Holzschliff, welche
diejenige auf Sulfitcellulose bei weitem übertrifft.

Hefen sowie mikroskopische Pilze aus Blüten. 53

Anaskoaporogene Hefen.

Hier sind mehrere Familien abzuhandeln, wir beginnen mit den
NeciarovnyceUicecte .

Nectaromycea oder Anthomycea Reukaufii Orüaa, der von Hautmann
genau beschrieben ist, stellt eine typische Nektarhefe dai . Wir isolierten
ihn desgleichen verschiedentlich.

1. Nektar und später auch Fruchtfleisch Rihes Uva-crispa, Garten, Prag.
2. Nektar, Trifolium prcUenae, Wiese bei Prag. 3. Nektar, Tüia pkUy-
phylloa, Park, Prag. 4. Nektar, Salvia pratensis. Wiese bei Prag. ö. Nektar,
Vioia sativa. Botanischer Garten, Universität. 6. Nektar, Prunus Armeniaca,
Garten bei Prag.

Für diesen Pilz ist typisch, daß er seine hefeartigen Zellen so zu-
sammenfügt, daß sie ein Kreuz bilden. Man heißt dies nach Orüaa und
Hautmann die sogenannte Kreuzform. Diese typische Gestalt wird
allerdings nicht immer ausgebildet; man erkennt sie im Nektar und
in Nährsubstraten, welche diesem in chemisch -physiologischer Hinsicht
gleichen. In Bierwürze und Hefewasser erkannten wir bei frischen
Isolierungen ebenfalls die KUeuzform, deren Bildung aber bei fort-
schreitender Kultur in synthetischen Medien verlorenging. Auf Bier-
würzeagar sieht man langgestreckte Zellen, die sich zu Verbänden ver-
einigen. Der Belag ist glänzend weiß. Chinasäureagar ermöglicht nur
eine schwache Entwicklung. Hefe und Substrat sind braun gefärbt.
Mit zunehmender Kulturdauer sind in den alten Hefezellen die von
Hautmann erwähnten Fetteinschlüsse zu sehen. Bildung von derben
Dauerzellen ist auch möglich. Htmtmann gibt je nach den Stämmen
wechselndes Gärvermögen gegenüber Fructose, Glucose und Saccharose
an. Bei unseren Stämmen ist die Gärkraft gegenüber Glucose und
Saccharose stets schwach. Das Wachstum in diesen Lösungen ist
immer gut. Auf Gipsblöcken oder Kartoffelscheiben tritt nie Sporen-
bildung ein; Ablagerung großer Fetttropfen in den Zellen ist zu ver-
zeichnen (vgl. F. Wagner).

Die Familie der Rhodotorulaceae ist durch den Besitz eines roten
Carotinoiden Farbstoffs ausgezeichnet. Rh. glutinis var. rubescens
(Saito) Lodder wurde einige Male isoliert.

1. Nektar, Sinapis arvensis, Feld bei Prag. 2. Nektar, Ajuga reptans,
Wegrand bei l^ag. 3. Nektar, TÜia pkUyphyllos, Park, Prag. 4. Frucht-
fleisch, Pyrus communis, steril der Frucht entnommen. 5. Blüte, Labumum
anagyroides, Park, Prag. 6. Testa, Weizenkorn, Feld bei Tetschen-Liebwerd.

7. Testa, Gurke Delikatas, Versuchsfeld Pflanzenbau, Tetschen-Liebwerd.

8. Samen, steril der Frucht entnommen. 9. Epüobium angustifolium,
Waldlichtung bei Prag.

In Bierwürze rundliche bis ovale Zellen, 4 X 4,5—5 (x, einzeln
oder zu zweien. Bodensatz, später leichte Ringbildung. Beides rosa

A. Niethammer :

getönt. Auf Bierwürzeagar rötliche bis orangerote, weiche glänzende
Lager.

Chinasäureagar ermöglicht sehr starkes Wachstum, rotbraune
Lager, auch das Substrat wird leicht verfärbt. Keine Gärkraft gegen-
über Glucose und Saccharose. Das Wachstum ist stets kräftig; Aus-
bildung typischer, runder Zellen mit einem Fetttropfen, Farbstoff-
bildung. Auf Gipsblöcken und Kartoffelscheiben unterbleibt die
Bildung von Sporen ; starke Fettabsonderung in den Zellen. Schwedische
Forscher (vgl. Melin) fanden Vertreter dieser Familie auf Holzschliff.
Aus diesem Grunde interessierte es, einmal die Wachstumsmöglichkeit
dieser Art auf Holzschliff sowie Sulfitcellulose zu verfolgen. Das Wachs-
tum bei 180, 250 , 300 war stets nur schwach. In diesem Zusammenhang
erwähnen wir auch eine Isolierung von einem in Mähren hergestellten
Holzschliff. Die Entwicklung auf dem eigenen Holzschliff war auch
nicht besser.

Rh. korallina (Saito) Harrison. In Bierwürze wird ein schleimiger,
rosa Bodensatz gebildet. Die Zellen sind oval, wurstförmig, gekrümmt.
Auf Bierwürzeagar rosa bis rote, glänzende, schleimige Lager. Zell-
gestalt wie oben; Austreibungen sowie Ausbuchtungen der Zellen sind
nicht selten. Auf Chinasäureagar entstehen braunrote Lager; das
Substrat wird leicht-braun getönt. Gärkraft gegenüber Glucose und
Saccharose tritt nicht ein; das Wachstum ist kräftig. In älteren Zellen
große Fetttropfen. Sporenbildung auf Gipsblöcken oder Kartoffel -
scheiben tritt nicht ein.

Diese an sich seltene Art wurde aus dem Nektar von Salvia pratenaia.
Wiese bei Prag, isoliert.

Aus der Familie der Torulopsidaceae ist die Unter-Familie der
Torulopaoideae mit einigen Vertretern zu nennen.

a) Stämme mit Gärvermögen nach Lodder.

Torvla utilia Lodder. Bierwürze runde, ovale Zellen, Bodensatz;
vgl. Lodder. Mit zunehmendem Alter Fetttropfen in den 2iellen. Auf
Bierwürzeagar Zellgestalt ähnlich, weißgelbe, glänzende Lager. China-
säureagar zeigt braune Lager und ein ähnliches Verfärben des Substrates.
Glucose, Saccharose, Fructose werden schwach vergoren. Auf Gips-
blöcken und Kartoffelscheiben Bildung kräftiger Dauerzellen mit Fett-
tropfen; nie Sporenbildung.

Isoliert von 1. Nektar, Tropaeolum mojus, Garten, Prag. 2. Nektar,
Coronilla varia. Wiese, bei Prag. 3. Blüte von Malva veglecta. Botanischer
Garten, Prag. 4. Blüte, Arnica montana^ ebenda. 6. Fruchtfleisch, Malua
aüveatria, steril entnonunen, Garten in Prag.

T. cöllicida (Hartmann) Sacc. Bierwürzelösung runde bis ovale
Zellen, einzeln, zu zweien und zu dritt; vgl. Lodder. Durchmesser

Hefen sowie mikroskopische Pilze aus Blüten.

3,57 p.. Große Fetttropfen, Bodensatz. Auf Bierw^ürzeagar Zellgestalt
ähnlich. Lager sind glatt, feucht, glänzend; im Alter deutliche Er-
hebungen. Auf Chinasäuireagar ist das Wachstum schwach; helle,
allmählich braun werdende Lager. Substrat rosa. Glucose sowie
Saccharose gestalten gutes Wachstum und werden schwach vergoren.
Fetteinschlüsse in den Zellen. Besonders starke Absonderung von
Fettkugeln erfolgt auf Hefewasseragar. Auf Gipsblöcken und Kartoffel -
scheiben keine Sporen bildung.

Isoliert aus dem unter sterilen Bedingungen zerlegten Fruchtfleisch
von Malvs silvestris. Dieser entstammte einem Garten in Prag.

T. pulcherrima, variabilis Lodder. Diese nach Lodder umgrenzte
Form lassen wir vorläufig hier stehen. Sie wurde unter sterilen Be-
dingungen dem Ftiichtfleisch von Ruhus idaeus entnommen. Die
Früc hte stammten aus dem Brdy-Wald.

In Bierwürze runde, 4 — 5 |jl große Zellen, mit einem Fetttropfen.
Finzeln, zu zweit und zu dritt, daneben auch längliche Zellen, 1,5—3
x2--4 a Bodensatz. Dieser ist nach 3—4 Tagen rosa getönt. Auf
Bierwürzeagar ist die Zellgestalt ähnlich. Weiche, glänzende, gelbliche
bis weiße Lager, radiale Streifen. Der eingebuchtete und gelappte
Rand fällt durch die schöne himbeerfarbene Tönung auf. Estergenich.
Auf Chinasäureagar rotbraune Lager. Das Substrat bleibt hell. Gär-
kraft gegenüber Gluc*ose und Saccharose ist vorhanden. Das Wachstum
ist auch sehr kräftig. Auf den Gipsblöcken entstehen die typischen
,, pulch^rrif na' '-ZeUen (vgl. Lodder). Große Fettkugeln im Innern der
Zellen. Keine Bildung von Sporen, wie sie bei der Hauptart erkannt
wurde. Auf Hef ewasseragar entstehen derbe Zellen mit großen Fett-
tropfen. Die gelb-weißen Lager auf Kartoffelscheiben fallen durch den
breiten, roten Rand auf.

b) Stämme ohne Gärvermögen.

T. minor ( Pollar i-Naumizzi) Lodder. Bierwürze sehr kleine Zellen,
oval bis nindlich, 2,5—4 x 3,5—5 \i Sproß verbände. Bodensatz. Bier-
vvürzeagar Zellgestallt ähnlich. Weiße, weiche, mattglänzende Lager.
Wachstum auf Glucose und Saccharose. Gäning tritt aber nicht ein.
Die Entwicklung auf Chinasäureagar erfolgt langsam. Erst helle, dann
braune Lager. Das Substrat wird allmählich schwarz verfärbt. Auf
Oipsblöcken runden sich die Zellen stark ab, si>eichem kräftig Fett,
bilden aber keine Sporen. Kartoffelscheiben lassen dichte, glänzende
Lager entstehen. Auf Hefew^asseragar tritt in den Zellen sehr starke
Speicherung von Fett ein.

Verschiedene Isolierungen liegen vor. 1. Samen, die steril der Frucht
von Solanum lycopersicum entnommen wurden. 2. Fruchtfleisch von

A. Niethammer:

Prunus Cerastis, das steril entnommen wurde. Entstammt, wie Nr. 1 einem
Garten bei Prag. 3. Nektar, Ajuga reptans. Wiese bei Prag.

T.aeria (Salto) Lodder. Bierwürze sehr rasches Wachstum. Bunde
Zellen 3,3—5 X 4,5—6 (jl. Einzeln, zu zweien und auch zu dritt. Gele-
gentlich kurze Sproßverbände. Kräftiger Bodensatz. Auf Bierwürze-
agar die gleiche Zellgestalt. Glänzende, weiße, glatte Lager, Rand glatt,
Wachstum auf Glucose- und Saccharoselösungen sehr gut, aber keine
Gärung. Chinasäureagar läßt rasch glänzende, schleimige Lager ent-
stehen. Fast keine Verfärbung tritt ein. Sporenbildung auf Gips-
blöcken, Kartoffelscheiben erfolgt nicht. Stamm 2 fällt durch die
langen Sproßverbände auf. Stamm 3 zeigt auf Bierwürzeagar nach
längerer Kulturdauer einen rosa Farbenton. In älteren Zellen erfolgt
ganz allgemein Ablagerung von öltropfen.

Diese Form wurde isoliert. 1. Nektar, Trifolium repens. Wiese l)ei
Prag. 2. Nektar, Epilobium angustifolium, Waldlichtung bei Prag.

T. Candida (Saito) Lodder, Zellgestalt in Bierwürze rund bis oval;
einzeln oder zu zweien. Bodensatz. Vergleiche Lodder. Bierwürzeagar
ein weiß-gelber Schleim: die rundlichen Zellen sind 3—4 x 5—7 (x groß.
Ältere Zellen weisen Fetteinschlüsse auf. Chinasäureagar läßt lang-
sames Wachstum zu; gelber bis brauner Belag. Das Substrat wird
braun verfärbt. Gipsblöcke, Kartoffelscheiben zeigen keine Sporen -
bildung.

Diese Hefe wurde aus der Blüte und dem Nektar von Sinapis wrvensis
isoliert.

Familie Dematiaceae.

Altemaria tenuis Neer. Auf Bierwürzeagar werden die bekannten
schwarz-grünen, wolligen Lager gebildet. Die typischen, länglichen,
gekammerten Konidien treten in großen Mengen auf. Auf Chinasäure-
agar entstehen rasch scbwarzgrüne, eingesenkte Lager ; Luftmycel wird
allmählich gebildet. Das Substrat wird schwach grün getönt. Die
Hyphen des eingesenkten Mycels speichern stets öltropfen. Auf Sulfit -
Cellulose dichte, wollige Decken; starke Konidienabsonderung. Holz-
schliff wird abgelehnt. Auf Glucose- und Saccharoselösungen w'erden
dichte grüngraue Decken mit reichlicher Konidienabsonderung gebildet.
Gärung tritt nicht ein. Gäumann reiht diese Konidienform bei der
höheren Fruchtform Pkospora in der Ordnung der Myringiales ein.
Wirerzielten nie eine höhere Fruchtform ; so erfolgt die Abhandlung bei
den Fungi imperfecti.

Aus dem Nektar V9n Epüobium augustifolium, Waldlichtung bei Prag,
isoliert; ferner aus dem steril geöffneten Fruchtfleisch von Soktnrnn lyoo-
persioum, Garten l^ei Prag.

Ma^croaporium cormmine Rabenhorat. Das Wachstumsbild auf Bier-
würzeagar ist dem von Alternaria tenuia recht ähnlich. Dichtes, wolliges

Hefen sowie mikroskopische Pilze aus Blüten.

Luftmyoel und eingesenkte schwarze Lager. Die Konidien sind aber
viel derber und breiter; die mauerartige Unterteilung fällt wieder auf.
In jeder Kammer ist gewöhnlich ein Petttropfen. In Bierwürzelösung,
ebenso in Hefewasser entstehen rasch weißgraue Decken, die dann
von dem dunklen Konidienrasen überdeckt werden. Chinasäureagar
ermöglicht ein rasches Wachstum; zunächst sind schwarze, eingesenkte
Lager zu nennen, darüber wird ein grauschwarzes Luftmycel geformt.
Glucose sowie Saccharoselösungen gestatten gute Entwicklung; Gärung
tritt nicht ein. Die Hyphen des eingesenkten Mycels weisen gewöhnlich
zahlreiche öltropfen auf.

1. Nektar, Echvwm vtUgcire, Moldauufer bei Prag. 2. Nektar, Sinapia
arvensia, Feld bei Prag. 3. Nektar, Epüobium augttatifolium, Waldlichtung
bei Prag. 4. Nektar, Salvia pratenaia. Wiese bei Prag. 5. Nektar, Malva
hiapida. Botanischer Garten bei Prag. 6. Samen, steril der Frucht ent-
nommen, und zwar von Epüobium augustifolium, Ehinanthua minor, Ra-
phanua Eaphaniatrum. Alle auf Wiesen in der Umgegend von Prag ge-
sammelt.

Familie Tuberculariaceae.

Aus dieser Familie wurde die Gattung Fusarium wiederholt isoliert.

Aus dem Nektar von Vicia aativa züchteten wir F. dimerum PenZt das
auf Bierwürzeagar einen roten, schleimigen Belag und darüber ein leichtes,
wolliges Luftmycel formt. Auf Chinasäureagar rascher Aufgang; Bildung
eines rosa Schleimes, darüber wolliges Mycel. Das Substrat bleibt hell.
Gutes Wachstum auf Glucose- und Saccliaroselösimgen. Gärkraft fehlt.
Auf Sulfitcellulose gute Wachstumsmöglichkeit.

F. aainbucinvm Fuck. (Sacc.) wurde häufig von der Testa unterschied-
licher Samen, so Rheinland6o/ine, Bohne Saxen, Eierbohne, Gurke Delikatas,
Wirsingkohl, Wiener Frühe, alle Versuchsfeld, Pflanzenbau, Tetschen-Lieb-
werd, isoliert. Dieser Pilz siedelte sich auch bei dem Keimversuch auf der
entleerten Schale an. PeniciUium expansum drängt seine Entwicklung
zurück. Typisch ist (las weiße, rosa bis braune Luftmycel auf Bierwürze-
agar. Chinasäureagar gestattet rasche Entwicklung. Rote, eingesenkte
Lager, darül)er weißes Luftmycel. Das Substrat wird langsam rot getönt.
Glucose- und Saccharoselösungen gestatten gute Entwicklung; Gärung
tritt nicht ein.

F. equiaeti (Cda) Saoc. wurde aus der Blüte von Arnica morUana, Garten,
Prag, isoliert. Die von Wollenweber beschriebenen Merkmale. Auf China-
säureagar Wachstum. Roter Schleim, leichtes, helles Luftmycel. Glucose-
sowie Saccharoselösungen ermöglichen gutes Wachstum. Gärung tritt
nicht ein.

F. btUbigenurn Cke Maas, wurde an Samen von Rapfmnua Eaphania-
trum, die steril der Fiaicht entnommen, gefunden. Ferner aus dem Nektar
von Ribea rubrum, Garten, Prag. Auf Bierwürzeagar ist auf die blauen
Farbentöne im Luftmycel hinzuweisen. Chinasäureagar zeigt ein helles
Luftmycel über einem roten Schleim. Das Substrat wird grünlich getönt.
Glucose- imd Saecharoselösimgen lassen nur submerses Wachstum zu;
Gärung tritt nicht ein. Auf Sulfitcellulose rötliche Schleime.

A. Niethammer :

F, oxysporum SchiechtendM. Diese Art wurde von Samen der Olycine
Soja und Lupinua albus, die steril den Hülsen entnommen wurden, isoliert.
Beim Keimversuch entwickelt es sich auf der Testa des entleerten Samens.
Allmähliches Zurückdrängen durch PeniciUium expanaum. Auf Bierwürze -
agar ein rötlicher oder lila Schleim, darüber Luftmycel. Chinasäiureagar
gestattet gutes Wachstum; roter Schleim von einem Luftmycel überdeckt.
In Zuckerlösungen submerses Wachstum; keine Gärung.

Ergebnisse der Untersuchungen.

Im Blütennektar sind zahlreiche Pilze zu finden, die m die Ordnung
Exoascdka und die Gruppe der anasicosporogenen Hefen zu stellen sind.
Die seinerzeit von Hautmann und Zinkemagel isolierten Formen ge-
hören ebenfalls in diese Gruppen. Gewöhnlich ist Vergesellschaftung
mit einem Vertreter der sogenannten Schwärzepilze gegeben, wie
Demaiium puUulans, Cladoaporium herbarum, Altemaria tennis oder
Macroaporium commune. Gelegentlich sind auch Angehörige der
Gattungen PeniciUium und Fuaarium zu finden.

Im Innern mancher fleischiger Früchte und an Samen, die der
Frucht steril entnommen wurden, befinden sich einzelne pilzliche
Mikroben. Aus diesen Versuchsergebnissen kann nun geschlossen
werden, daß das Innere der Früchte und die darin befindlichen Samen
nicht immer keimfrei sein müssen. A. Romtoalter gibt desgleichen für
das Innere unbeschädigter Früchte Vorhandensein von Hefen und
Bakterien an. Damit ist naturgemäß nicht gesagt, daß es nicht
auch Fälle gibt, in denen Fruchtfleisch und Samen steril sind (vgl.
K. Rippel),

Frisch ihrem natürlichen Standort entnommene Samen führen an
und in der Testa verschiedene mikroskopische Pilze. Sehr verbreitet
ist die Gattung PeniciUium. Meist sind es ähnliche Fonnen, wie wir
sie auch im Erdreich erkannten. Im Kern des Samens fanden wir
diesmal keine mikroskopischen Pilze.

Das Wachstum der isolierten Pilze wurde verfolgt. Die von Per-
woznanaky zusammengesteJlte Chinasäurelösung eignet sich für die
meisten isolierten Pilze sehr gut. Die Annahme, daß vor allem Pilze,
denen das Vermögen der Alkoholbildung abgeht, hier gedeihen, kann
nicht streng aufrechterhalten bleiben. Manche Hefen, denen Gärkraft
zukommt, gedeihen hier. Richtig ist, daß mikroskopische Pilze, denen
die Fähigkeit der Alkoholbildung völlig abgeht, hier besonders rasch
und kräftig gedeihen. Die Verfärbung des Substrats nach grün oder
schwarz ist unter diesen Bedingungen deutlich. Bei Dematium pullulana
ist auf das sehr verschiedenartige Wachstumsbild hinzuweisen. Gär-
kraft geht allen isolierten Stämmen ab. In älteren Hefezellen (Dauer-
zellen) und Fäden der Schwärzepilze ist Ablagerung von öltropfen zu

Hefen sowie mikroskopische Pilze aus Blüten.

verzeichnen. Viele der von den Samen isolierten mikroskopischen Pilze
sind durch vorzügliche Wachstumsmöglichkeit auf Cellulose und Holz-
stoff ausgezeichnet. Hefen, obgleich sie von Melin und Renner feit oft
aus diesen Medien isoliert wurden, versagen hier.

Literatur.

Bauer ^ R., Centralbl. f. Bakt. II, 98, 133, 1938. — Oäumann^ E., Ver-
gleichende Morphologie der Pilze. Jena, Fischer, 1926. — Orüss, Jahrb.
f. wiss. Bot. 66, 109, 1937. — Hautmann, F., Arch. Protistenkde. 48, 213,
1924. — Henneberg, W., Handbuch der Gärungsbakteriologie. Berlin,

Parey, 1926. — Lodder, J., Die Hefesammlung des Centraal -Bureau voor
Schimmelcultiu’es. II. Teil : Die Anaskosporogenen Hefen. 1. Hälfte 1934. —
Melin, E., diese Zeitschr. 4, 508, 1930. — Niethammer, A., ebenda 10, 13,
1939; 12, 312, 1941. - Pertvoznansky, W. W., Centralbl. f. Bakt. II, 81,
372, 1930. — Rennerfeit, E., diese Zeitschr. 12, 19, 1941. ~ Rippet, K.,
Planta 30, 806, 1940. — Romwcdter, A. d. Ält., u. A. i’>on Kiräly, diese
Zeitschr. 10, 87, 1939. ~ Sopp, O. Johan Olsen, Monographie der Pilzgrupj>e
PenicilUum. Videnskapaelkapet.s, Skriften math. naturw. Kl. 1912, Nr. 11. —
Thom, C., The Penicillia London. Bailliere Tindal. Cor. 1930. — Wagner, F.,
Centralbl. f. Bakt. 75, 4, 1928. — Windiach, S., diese Zeitschr. 11, 368,
1940. — Zinkemagel, H., Centralbl. f. Bakt. 78, 191, 1929.

(Aus der Mikrobiologischen Abteilung des Instituts für Biochemie und
Nahrungsmittelchemie der deutschen Technischen Hochschule, Prag.)

Weitere Beiträge über mikroskopische Bodenpilze.

Von

A. Niethammer.

(Eingegangen am 1, April 1942.)

Zweck der Arbeit und Angabe der Methodik.

Ziel der folgenden Studie war es, ein kleines Gebiet im westlichen
Sudetenland genau durchzuarbeiten. Es interessierten folgende Punkte :
1. Regelmäßige Gemeinschaften bestimmter Pilze. 2. Bei der Anzucht
der Mikroorganismen wurden in manchen Fällen neben den üblichen
Temperaturen von 20 bis 23^ auch solche von 30 bis 32® geprüft. 3. In
einzelnen Böden wurde die Gemeinschaft von Pilzen und Bakterien
verfolgt. 4. Das Verhalten der Pilze gegenüber Cellulose wurde be-
trachtet: dies interessierte besonders dort, wo der Versuch lehrte, daß
wenig Bakterien, und vor allem keine zum Celluloseabbau befähigte,
vorhanden waren. 5. Mikroskopische Pilze aus Mooren wurden studiert :
der Abbau der Cellulose durch dieselben erscheint hier wichtig. 6. Eine
nicht mehr im Betrieb stehende, an Schwefel reiche Bergwerkhalde
wurde untersucht.

Die Methodik war die gleiche wie in den früheren Arbeiten. Die Roh-
kiiltiiren für Pilze wurden auf Bierwürzeagar und diejenigen für Bakterien
auf Fleischpeptonagar ausgeführt; im Texte gebrauchen wir die Namen
Nährboden I und 2. Die Petrischalen fanden in Brutschränken Irei 20 bis 23®
und 30 bis 32® Aufstellung. Für die Reinkultur sowie Bestimmung dienten
die ebenfalls früher erwähnten Spezial -Nährböden. Die Wachstums -
möglichkeit auf Cellulose wurde auf technischer Sulfitcellulose verfolgt;
dieselbe wurde für Pilze wieder mit einer sauren nach Stapp Irereiteten
Nährlösung befeuchtet. Für Bakterien wurde die von Viljoen und Mit-
arbeitern genutzte Nährlösung mit einem pH 1 genutzt.

Tersuchgergebnisse.

Die einzelnen Bodenarten werden aufgezählt und die isolierten
Mikroben beschrieben. Die Durcharbeitung der oben angegebenen
Punkte erfolgt in diesem Rahmen. Dort, wo in der Beschreibung auf
frühere Arbeiten hingewiesen wird, unterbleibt dieselbe. Bei den
einzelnen Bodenarten, in denen die gleichen Mikroorganismen immer
wieder auf treten, ist die erste Isolierung zu vergleichen. Auf die Bak-
teriengruppe eines engeren Gebietes im Zusammenhang mit den mikro-
skopischen Pilzen hat Janke mit seinen Mitarbeitern hingewiesen. Auf

Mikroskopische Bodenpilze.

die dort niedergelegten Ergebnisse gehen wir im Zusammenhang mit
unseren Versuchsbesprechungen ein. Untersuchungen von Moorböden
in der Po -Gegend lassen nach Verona ein starkes Zurücktreten der Pilze
gegenüber den Bakterien erkennen.

Moorböden,

Aus dem Moor Soos bei Eranzensbad wurden mehrere Proben
bezogen.

Nährboden 1.

1 Fusarium oxysp&rum Schlechtend, AspergiUvs fumigatus Thom

PeniciUium lanosum Wesiling

Cladosporium herharum Pers,

Nährboden 2.

II Bac, subtilis (Ehrenberg) Cohn, | Die gleiche Form

Nährboden 1.

2 II Fusarium orthoceras Wollenw, App, | Aspergillus glaucus Link.

Nährboden 2.

II Bac. vtUgatus Flügge^ Migula | Die gleiche Form

Nährboden 1.

3 II PeniciUium affinis Bainier-Sartory | Aspergillus fumigatus Thom
II Bhodotorula gluiinis (Fres.) Harrison |

Nährboden 2.

|1 j5ac. subtilis (Ehrenberg) Cohn \ Bete, subtilis (Ehrenberg) Cohn

|| Bact. fluorescens Lehm. Neum. |

Nährboden 1.

4 Cladosporium herbarum Pers. PeniciUium affinis B.u.S.

Fusarium dimerum Penz.

Muoor hiemalis Wehmer

Nährboden 2.

Actinomyces ruber Strain^ky-Waksman Bae. mycoides Flügge
Bojc. mesentericus (Flügge) L. N. Bae. megaierium de Bary
Bac. mycoides Flügge
Actinomyceienf nicht näher bestimmt

Nährboden 1.

6 Bhizopus nigricans Ehrenberg Trichoderma Koningi Oud.

Fusarium dimerum Penz
PeniciUium luteum Zukal

Nährboden 2.

II Bae, subtilis (Ehrehberg) Cohn | Dieselbe Form

Nährboden 1.

6 |] Fusarium oxysporum Schlechtend, | Dematium pullulans de Bary
II PeniciUium luteum Zukal | PeniciUium luteum Z,

A. Niethfunmer:

Probe

Nr.

20-280 c

30—320 C

Nährboden 2.

I Bact, pi'odigiosum (Ehrenberg) Lehm.- | Dieselbe Form, aber farblos

I Neum. I

Nährboden 1.

Fwtnrium merismoides var. chlamydo- Fusarium merismoides var. chla-
sporum Wr. mydoaporum Wr.

PenicilUum elegans Corda
Trichoderma Koningi Oud.

Mucor hiemalis Wehmer
Cladosporium herharum Pers.

Nährboden 2.

II Bac. megaterium de Bary | Dieselbe Form

Nährboden 1.

Fusarium equiseti (Cda) sacc.
Cladosporium herbarum Pers.
Trichoderma Koningi Oud.
PenicilUum luteum Zukal
„ affinis Wehmer

Aspergillus fumigatus Thom

Nährboden 2.

Bact. Zopfii Kurth, nicht näher be-
stimmte Actinomyc-eien
Bact. fluorescens Lehm.-N.

Bac. megaterium de Bary

Nährboden 1.

Mucor hiemalis Wehmer Aspergillus fumigatus Thom

PenicilUum glaber Wehmer Trichoderma Koningi Oud.

PenicilUum luteum Zukal
Fusarium oxysporum Schlechtend

Nährboden 2.

II Keine Bakterien, nur Pilze \ Das gleiche Ergebnis

Diese neun Proben können gemeinsam behandelt werden. Dem
sauren Charakter der Moorböden entsprechend sind die Pifze mannig-
facher vertreten als die Bakterien. Aerobe und anaerobe Cellulose
abbauende Bakterien wurden hier nicht isoliert, ebensowenig termophile
Bakterien. Die meisten hier genommenen Pilze, besonders Fusarium-
Arten und Trichoderma Koningi sind zu sehr gutem Wachstum auf
Cellulose befähigt. Die PenicilUum- Art^n bilden Decken, wogegen die
Fusarium- Art/&n in dem Substrat wuchern und dasselbe unter mannig-
facher Verfärbung erweichen.

Für den Aufgang bestimmter Pilzarten in der Kultur ist die Tem-
peratur maßgebend.’ Aspergillus -Arten bevorzugen meist höhere
Temperatur.

Unter physiologischen Eigentümlichkeiten ist bei diesen Proben
manches zu beachten. PenicilUum- Äxten gedeihen auch bei 30 bis 36<>;

Mikroskopische Bodenpilze.

die Konidien bildung wird stark zurückgedrängt. Die meisten aus diesem
Moorgebiet isolierten mikroskopischen Pilze weisen in ihren Hyphen
deutliche Fettspeicherung auf. Besonders beträchtlich ist dieselbe bei
P. affinis und vor allem in flüssigen Medien. Die von Pervozvxinsky
eingeführte Chinasäurelösung mit 2 % Agar-Agar wird von den meisten
Pilzen besiedelt. P. glaber fällt durch die reichliche Absonderung von
Kristallformen, welche an Calciumoxalat erinnern, auf, und zwar auf
allen Nährböden. Die isolierten Mucorineem sind durchwegs durch eine
kräftige Absonderung von öltropfen in den H 5 rphen, Gemmen, Dauer-
zellen sowie Kiigelzellen ausgezeichnet; ähnliches gilt für die Fusarinm-
Arten. Bdct. prodigiosum zeigt nur bei Temperaturen unter 26^ die
typische rote Farbstoff bildung ; bei höheren Temperaturen wächst er in
hellen Lagern. Cellulosestreifen mit Vlljoen-hörnng besiedelt er gerne,
ein deutlicher Abbau der Masse tritt aber nicht ein. Die isolierten
Stämme von Trickoderma Koningi sind durch das Vermögen eines
guten C^elluloseabbaues und angenehmen Geruch ausgezeichnet.

Ein zweiter Moorboden stand uns von Sebastiansljeig-Eizgebirge zur
Verfligung. Auf Nährbudenl und 2 entwickeln sich l>ei beiden Temperatur-
gefällen die gleichen Formen, und zwar Penicillium glaber Wehnier, MonilUi
nigra Burri-SUmby Denmtium pulhUa-ns de Barg. Nährboden 2 läßt keine
Bakterien aufkommen. Versuche mit Cellulosestreifen und \"ilj()en -Losung
bringen Cellribrio fulva Stopp, einen aeroben Cellulose -Zersetzer zur Ent
Wicklung. Der Abbau der Cellulo.se duich diesen Organismus bei 2t> und 32** ( '
ist gering. Janke be.«chreibt bei seinen Vntersuchungen in Lunz Hac,
imlgatufi, mycoides, nhcsentericu^, Bact. jluorescens als häufig.

Fddbestände .

Feldbestände bei Haid und Pfraumberg im Bezirke Tachau wurden
genau untersucht.

In den v'erschiedenen Feldl)eständen werden die t\"pischen Boden-
pilze erkannt : in den unterschiedlichen Pflanzen beständen treten immer
wieder ähnliche Formen auf. Nahezu jeder Feldbestand liefert reichlich
Actinomyceten; im Durchschnitt 100000 Kolonien auf lg Erde. Sie
sind durch sehr gutes Wachstum auf Fleisch -Peptonagar ausgezeichnet.
Temperaturen von 20 bis 22^ werden bevorzugt. Unter den Bakterien
ist wieder auf ähnliche Formen hinzuweisen, wie sie Janke als für Boden-
arten sehr t\ 7 )i 8 ch angibt. Bac, vulgatus wmrde von Werner desgleichen
aus dem Boden isoliert und für den Abbau von Buttersäure als wichtig
erkannt. Bei der niedrigeren Temperatur kommen im Durchschnitt
mehr Arten von Pilzen und Bakterien auf; die höhere Temperatur be-
günstigt meist die Entwicklung einer Art. Die Gattungen Penicillinm
und Dematimn schreiten besonders bei hoher Temperatur zur Peri-
thecienbildung. Bei den verschiedenen Arten von Penicillinm w^erden

A. Niethammer :

Flachsfeld.

Probe

Nr.

20—230 c

30— 820 c

Nährboden 1.

Fusarium meriamoidea Cda

P. luteum Z. mit vielen fertilen

VerticiUium glaucum Bon.

Sklerotien

PeniciUium bicolor Fries

PeniciUium luteum Zukal
Zygorrhynchus Moelleri V.

Rhodotorüla gluiinia Harris
Trichoderma Koningi Oud.

Mueor ailvaticus Hagem

Nährboden 2.

Nicht näher bestimmte Actinomyceten
Bac, eubtilis (Ehrenberg) Cohn
Ba>cU Zopfii Kurth
Micrococcus flavus Lehm,~N.
Micrococcus bicolor Zimmermann
Bac. vulgatus Flügge-Migula
Bad. tumescena Z<ypf.

Bac. mycddes Flügge
Ba^. megaierium de Bary
Bac. graveolens Meyer-ChUheU

Nicht näher bestimmte Adino-
myceien

Bac. mycoides Flügge

Auf Cellulose- Streifen mit Ft7;oen-Lösung tritt bei 24 bis 25® starke
Gärung ein; ebenso bei 37®.

Nährboden 1.

Zygorrhynchus Moelleri Vuill. PeniciUium luteum Zukal, viel

Penicillium luteum Zukal sterile Sklerotien

Trichoderma Koningi Oud.

Rhodotorüla glutinia (Fres.) Harrison
Fusarium meriamoides Cda.

Nährboden 2.

Nicht näher bestimmte Adinomyceten
Micrococcua flavua Lehm.-N.

Bac. meaentericua (Flügge) Lehm.-
Neum.

Bad. coli Eacherich

Bac. aubtilia (Ehrenberg) Cohn

Nicht näher bestimmte .4c^mo-
myceten

Bac. aubtilia (Ehrenberg) Cohn

Bei 26® und 37® langsam Vergärung von Cellulose- Streifen.

Roggenfeld.

Probe

Nr.

20 — 280 C

30— 32®C

Nährboden 1.

Mucor hiemalia Wehmer
PeniciUium bicolor Fries
Penicillium glaber Wehmer
Trichoderma Koningi Oud.
Dematium puUülana de Bary
Fusarium Poa^ Sacc.

AapergiUua fumigaiua Thom
Fusarium rdicuUUum Montagne
P. luteum Z.

Mikroskopische Bodenpilze.

Nr.

Probe

20—280 C

30—320 C

Nährboden 2.

Sehr viele, nicht genau bestimmte
Actinomyceten

Bac, suhtilis (Ehrenherg) Cohn
Bac. mesentericus (Flügge) Lehm.-
Neum,

Bac. sübtilia (E.) Cohn

Nährboden

1 Mucor hiemalis Wehmer

1 Penicillium luteum Zukal
j Trichoderma Koningi Oud.

1 Cladosporium herbarum Pers.

1 Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc.

P. bicolor Fries

Nährboden

Viele nicht näher bestimmte Actino-

Bac. subtilis (E.) Cohn

myceten

Bac. subiilis (Ehrenberg) Cohn

Cellvibrio fulva Stapp

Auf Cellulose -Streifen mit V Ujoen-l^enng entwickelt sich bei 27 bis 29®
Ceüvibrio ftUva. Unter diesen Bedingungen auch bei 36 bis 37® starke

Vergärung von Cellulose.

Kartoffelfeld.

■"Nr. i
Probe i

20— 230 c

\ 36—320 C

Nährboden

Mucor hiemalis Wehmer

Pen. luteum Zukal, Perithezien

Trichoderma Koningi Oud.
Cladosporium herbarum Pers.

Nährboden

Viele nicht näher bestimmte Actino-

Bac. subtilis (E.) Cohn

myceten

Bac. mycoides Flügge

Das gleiche Ergebnis wie Probe 1.

Gerstenfeld.

Probe ||

20—230 C

30— 320 c

Nährboden 1.

Penicülium ItUeum Zukal Penicillium bicolor Fries

Cladosporium herharum Pers. Dematium pMtUans de Bary^ mit

Perithecien

Nährboden 2.

II Verschiedene, nicht näher bestimmte
Actinomyceten
II Bac. aubtilis (E.) Cohn

ArohiT für Mikrobiolofcle. Bd. 13.

Bac. snbtilis (E.) Cohn

A. Niethammer

Mikroskopische Bodenpilze.

Nährboden 1.

1 Mucor hiemalis Wehmer Penicillium hicohr Fries.

Dematium pyllulana de Bary Trichodernui Koningi Oud.

Fuaarium nivale (Fr.) Ces.

Fttsarium arthoaporicides Sherp.

6 *

A. Niethammer :

Probe

Nr.

20—820 C

30—820 C

Nährboden 2.

II Nicht näher bestimmte | Bac, aubtilia (E,) Cohn

II Bac, megaierium de Bary |

Nährboden 1.

Mucor hiemalia PTeÄmer, reichlich Zy-
goten

Zygorrhynchua Moelleri VuilL
Cladoaporium herbarum Pera,
Trichoderma Koningi Ovd.

Fuaarium reti<yulatum Mont. /. L Wr.

Trichoderma Koningi Ovd.

Nährboden 2.

II Nicht näher bestimmte | Bac. aubtilia (E.) Cohn

II Bac. megaierium de Bary |

In beiden Proben tritt bei 25® und 37® Vergärung von Cellulose ein; eine
Bestimmung der Arten erfolgt nicht.

immer sehr ähnliche oder übereinstimmende Perithecien gebildet ;
dieser Umstand spricht wieder für eine nahe Verwandtschaft.

Die Mucorineen speichern durchwegs öltropfen. Bei Mucor hiemalis
ist sie im Zusammenhang mit der Zygotenbildung sehr stark (Schöpfer).
Die Fv^arium-Arten lagern in Hyphen, Chlamydosporen und rundlichen
Dauerzellen ebenfalls öltropfen ab. Die Vertreter der Gattungen
PeniciUium, Demaiium, Cladoaporium, Trichoderma und Fusarium
zeigen auf Cellulosestreifen gute Entwicklung. Die aus den Mooren
isolierten Formen arbeiteten kräftiger. Bei den meisten Proben wurde
auch auf die Anwesenheit von aeroben zum Celluloseabbau befähigten
Bakterien geprüft; diese Probe fiel stets positiv aus. Auf anaerobe
Formen wurde nur selten eingegangen, daher unterblieb auch bei der
Aufzählung ihre Erwähnung. Soweit wir Isolierungen anstellten,
arbeiteten die gewonnenen Stämme schwach.

Krautfeld.

Im November 1941 wurden in einem abgeemteten Krautfeld

unweit Prags einige Proben gezogen.

Nährboden

20—280 0

so — 820 c

Mucor hiemalia Wehmer

Aapergillua fumigatua Thom

Demaiium pullulans de Bary

Fuaarium oxyaporum SchUchtend.

Synaporium bigutattum

Bhodotorula gltUinia Harriaon

20—220 c 30—320 C

Nährboden 1.

1 Penicillium luteum Zukal, mit rosa Aspergillus fumigatus Thom

und gelben Sklerotien
Fusarium samhucinum Fuck.

Cladosporium herharum Pers,

Trichoderma Koningi Oud,
sehr angenehmer Greruch

Nährboden 2.

II Bac. megaterinum de Bary | Bac, subtilis (E.) Cohn

Nährboden 1.

2 Mucor racemosus Fres. Penicillium affinis B, u. S.

Penicillium affinis B. u. 8.

Cladosporium herharum Pers,

Fusarium nivale (Fr.) Ces.

Fusarium merismoides Cda.

Nährboden 2.

Sehr viele nicht näher bestimmte Bac. subtilis (E.) Cohn

Actinomyceten, auf diesen Lagern
entwickelt sich deutlich Cellvibrio
fulva

Nährboden 1.

3 Penicillium luteum Zukal, viele Skle> P. luteum Z., fertile Perithecien

rotien

Trichoderma Koningi Oud.

Fusarium orthoceras Wr. App.

Nährboden 2.

Sehr viele nicht näher bestimmte Ba>c. subtilis

ActinomyceUnj darüber wieder Cell-
Vibrio fidva

Bact. fluorescens (Flügge) L.-N.

Bac. anthracis F. Cohn et Koch
Bac. mycoides Flügge
Ba/c. mesentericus (Flügge) L.-N.

A. Niethammer :

Probe

20—220 C

Nr.

30—320 C

Nährboden 1.

Penicillium italicum Wehmer | PenirAllium italicum Warner

Cladosporium herharum Pera.

Fusarium dimerum Penz |

Nährboden 2.

I Bat, meseniericus (Flügge) Lehm.- 1 Bat. suhiilia (E.) Cohn
I Neum. I

Sehr viele nicht näher bestimmte j

j Actinomyceten |

Aus allen Proben wurden aerobe sowie anaerobe Cellulose ab-
bauende Bakterien zur Entwicklung gebracht. Diese Proben weisen
gegenüber den Feldbeständen keinen wesentlichen CJnterschied auf.

Wcddböden.

Weiterhin wurde Erdreich unter Laub- und Nadelwaldungen
geprüft.

Nadelwald.

Probe

20—220 C

30—320 C

Nr.

Nährboden 1.

Penicillium glaher Wehmer
Dematium jmllidans Pers.
Trichoderma Koningi Oud.

Fusarium oxysporum Schlechtend. ^
innig verbunden mit Zygorrhynchus
Moäleri Vuill.

Trichoderma Koningi Oud.

Nährboden 2.

II Bact. Zopfii Kurth

I Bac. subtilis (E.) Cohn
Nährboden 1.

Mucor racemosua Fres.
Trichoderma Koningi Oud.
Penicillium luteum Z.

Penicillium luteum Z.

Nährboden 2.

Bac. megaterium de Bary
Nicht näher bestimmte Actinomyceten
Sarcina subflava Ravenei
Bact. fluorescena (Flügge) Lehm.-
Neum.

Bac. anthracia J. fCohn u. Koch

Bac. auhtilia (E.) Cohn

Nährboden 1.

Penicillium bicolor Fries, mit sehr
vielen gelben Sklerotien
Trichoderma Koningi Oud.

Fusarium oxysporum Schlechtendahl
Fusarium dimerum Penz

Pen. bicolor Fries

Mikroskopische Bodenpilze.

A. Niethammer:

Alle aus den Waldböden isolierten Proben liefern auf Cellulose-
streifen mit Vilfoen-Löaung eine reiche Menge von aeroben und anaeroben
Cellulose vergärenden Bakterien. Bei Prüfung der verschiedenen mikro-
skopischen Pilze fiel auf, daß die hier isolierten Stamme schwach auf
Cellulose gediehen und der Abbau derselben gering war. Die gemeinsam
auftretenden Mucorineen- und Fusarium-ATten weisen in ihren Hyphen
eine sehr kräftige Absonderung von öltropfen auf. Unter den auf
Cellulose gedeihenden Bakterien wurde die von Stapp beschriebene
Cellvibrio fulva öfters isoliert.

Schwefelreiche Halde,

Die letzte abzuhandelnde Probe berichtet noch über eine abgebaute
Halde, welche reich an Schwefel ist.

20—220 c

32—340 c

Nährboden 1.

Zygorrhynckua Modleri VuiU; in dessen Dematium ptdltdans de Bary,

Hyphen findet starke Fettspeicherung statt drängt alle Pilze zurück
Mucor Ramannianus Modler, ebenfalls durch
starke Fettspeicherung ausgezeichnet
Dematium pvUfdans de Bary
PeniciUium glaber Wehmer

Nährboden 2.

Bac. meserUerictLS (Flügge) Lehm.-Neum,
die Kolonienzahl ist sehr gering

Bac, svbtilia (E,) Cohn

Zusammenfassung der Ergebnisse.

Unsere Untersuchungen zeigen wieder, daß es sich bei den im
Boden verbreiteten Pilzen um bestimmte Gemeinschaften handelt.
Die Versuche lehrten, daß bei der Anzucht in Temperaturbereichen von
20 bis 23^ zahlreichere und verschiedenartigere Mikroorganismen auf-
traten als zwischen 32 und 34^. Höhere Temperatur begünstigt meist
die Entwicklung einer oder weniger Arten, ln Übereinstimmung mit
den Arbeiten von Janke kann gezeigt werden, daß gemeinsam mit den
mikroskopischen Bodenpilzen auch bestimmte Bakterien-Axten auftreten.
Viele der isolierten mikroskopischen Bodenpilze gedeihen auf Cellulose
sehr gut ; interessant ist, daß diejenigen Pilzstämme, welche aus Böden
stammen, in denen wenige zum Abbau der Cellulose befähigte Bakterien
vorhanden sind, besonders gut arbeiten. In Moorgebieten fehlen Bak-
terien, welche zur Vergärung von Cellulose befähigt sind. Verschiedene
mikroskopische Pilze aus Mooren sind zum Abbau von Cellulose gut
befähigt. Die aus diesen Gebieten isolierten Mucorineen und Fusarium-
Arten speichern in ihren Hyphen reichlich öltropfen. Eine alte, nicht

üükroskopische BodenpiJze.

mehr im Betrieb befindjiche schwefelreiche Bei^hälde zeigt verschiedene
mikroskopische PtZze; Bakterien sind nur vereinzelt vertreten. Die aus
Wald- oder Feldboden isolierten mikroskopischen Pilze speichern
vielfach auch Oltropfen, aber nie in dem Ausmaß, wie die aus den
Moorböden. Ähnlich verhält es sich auch mit dem Abbau der Cellulose
durch diese Mikroorganismen. Die Stämme aus dem Moorboden arbeiten
meist kräftiger als diejenigen aus dem Waldboden und Ackerland, ln
Übereinstimmung mit Okada kann die weite Verbreitung von Tricho-
derma Koningi in fast allen Bodenarten erkannt werden, ln dem Zu-
sammenhang ist die Tatsache wieder interessant, daß nach den Er-
fahrungen von Wakarmn und uns dieser Pilz sehr gut auf Cellulose
gedeiht und diese nach Wakaman bis zu über 50 % abbauen kann.

Literatur.

Janke, A., u. M. Wozak, diese Zeitschr. 5, 338, 1938. Niethammer, A.,
ebenda 12, 312, 1941. — Okada, J., Sc. Repr. Tokyo Univ. Biol. 1939,
Nr. 3. — Perwozvaneky, N,, Centralbl. f. Bakt. II, 81, 372, 1930. — Schöpfer,
W. H., Extrait du buHetin de la Soci^t^ Botanique de Gen4ve, 2e s^rie,
vol. 20, fase. 1. — - Stopp, C,, u. Borteis, Cehtralbl. f. Bakt. II, 90, 28, 1934. —
VUjoen, J. A., E. B. Fred u. W. H. Peterson, J. of Agric. Sc. 16, 1, 1926. —
Verona, O., diese Zeitschr. 5, 348, 1934. — Werner, W,, Centralbl. f. Bakt. II,
87, 446, 1933. — Wakstnan, S, A., u. A. Cordon, Soil Sc. 47, 217, 1929.

(Au8 dem Institut für Mikrobiologie der Universität Göttingen.)

Der Einflttfi steigender Gaben von Magnesiumsulfat
auf den Ertrag einiger Pilze.

Von

Artur Stare.

Mit 1 Te?:tabbildung.

(Eingegangen am 15. April 1942.)

In Fortsetzung der Untersuchungen, die A. Rippel und Mitarbeiter
über das Ertragsgesetz und die Nährstoff Wirkung durchgeführt haben,
sind in der kürzlich erschienenen Arbeit von W. Lohrmann (2) einige
Fragen ungeklärt geblieben. Mit Rücksicht auf die Tatsache, daß bei
einigen Pilzen verhältnismäßig sehr hohe Mg S 04-Konzentrationen
eine fördernde Wirkung ausüben, war es wichtig festzustellen, wie die
verschiedenen, allmählich steigenden Gaben von Magnesiumsulfat auf
den Pilzertrag wirken.

Yersuehsbedinguiigen.

Die allgemeinen Versuchsbedingungen waren die gleichen wie bei
W. Lohrmann.

Als Versuchsobjekte dienten Aspergillus flavus und Mticor pusilluSf
zwei Pilze von verschiedener Resistenz gegenüber Mg S O4 . Die Pilze wurden
auf Würze -Schrägagar kultiviert; Von 3 Tage alten Kulturen wurde unter
Zusatz von etwas dest. Wasser eine dichte Sporensuspension hergestellt
und mit der großen Platinöse je 25 ccm Nährlösung in Erlenmeyerkölbchen
von 100 ccm, geimpft.

Die Stammnährlösungen, die einen Zusatz von verschiedenen steigenden
Gaben des MgS04 erhielten, waren folgende:

a) Für AspergiUvs flavus: Dest, Wasser 1000 ccm; Saccharose 100 ccm;
KH2PO4 5 g; KNO3 33,5 g; NaCl, MnS04, FeS04 und Citronensäure je
0,01 g; ZnS04 2 Tropfen l%ige Lösung; CUSO4 1 Tropfen l%ige Lösung.

b) Für Mucor pusülvs: Dest. Wasser 1000 ccm; Saccharose 200 g;
(NH4S04)2 20 g; K2HPO4 1 g; Citronensäure 0,5 g; FeS04 0,1 g; ZnS04
0,01g; CUSO4 0,005g; Asparagin 0,5g.

Die Reaktion wurde für beide Nährlösungen auf ph 6.5 eingestellt.

Beim direkten Zusatz hoher Gaben von MgS04 als feste Substanz zur
fertigen Stammnährlösung steigt das Flüssigkeitsvolumen erheblich, so daß
die Prozentzahlen nicht richtig sind. In unseren ersten zwei Versuchen, bei
denen wir die Nährlösung so herstellten wie W. Lohrmann angibt, haben
wir nachträglich die wirklichen Prozentzahlen errechnet; so z. B. beim
Zusatz von 50 g MgS04 • 7 HjO ist der prozentuale Gehalt etwa 40, von
60 g MgS04 • 7 HgO 45 und bei 70 g MgS04 • 7 HjO nur 50.

Die geimpften Kölbchen wurden jm Brutzimmer bei 30 ± 1® C ge-
halten. Obwohl das Temperaturoptimum für die beiden Pilze bei etwa

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

37® C liegt, ist das Wachstum bei 30® doch noch immer üppig. Das Mycel
wurde zu zwei bis drei verschiedenen Zeitpunkten, je nach der Wachstums-
intensität des Pilzes, geerntet, und zwar so, daß die Pilzhäutchen auf den
vorher abgewogenen Filtern quantitativ übertragen, zunächst mit schwach
angesäuertem und dann mit destilliertem Wasser mehrmals ausgewaschen
wurden. Die Mycelien wurden einige Tage bei 35 bis 40® im Brutzimmer,
dann über Nacht im Trockenschrank bei 100® getrocknet und endlich
gewogen. Die Ergebnisse beziehen sich auf die abs. Trockensubstanz und
stellen den Durchschnitt von 3 bis 4 Parallelen; die wahrscheinliche Schwan-
kung des Mittels ist hinzugefügt.

Die Zuckerbestimmung wurde nach Bertrand durchgeführt. Da größere
Mengen von MgSOi störend auf die Bestimmung wirken — es bildet sich
ein voluminöser Niederschlag von Mg(OH )2 — , wurde das MgS 04 aus den
Proben als MgNH 4 P 04 beseitigt und der Zucker im Filtrat bestimmt.
Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, wurde die Zucker bestimmimg
gleichfalls auch in den Kontrollen mit verschiedenen Mg SO4- Gaben durch-
geführt.

Der Aschegehalt ist durch Veraschung der fein zerriebenen Pilzmasse,
die Reaktion mit Lyphanstreifen in Lösungen nach der einzelnen iErnte
bestimmt.

Yersuchsergebnisse.

Versuch I.

Die Ergebnisse des Versuchs sind in den Tabellen 1 und II an-
geführt. Dazu sind noch einige Bemerkungen über das Aussehen der
Myceldecke und die mikroskopische Kontrolle zu erwähnen.

Aspergillus flavus: In der Nährlösung tritt schon am zweiten Tage
ein weißes Häutchen auf, das sich nach einiger Zeit mit gelbgrünen
Sporen bedeckt. Während der ersten Ernte (nach 4 Tagen) befindet

Tabelle I. Aspergillus flavtis.

MgSO*

Nach 4 Tagen

Nach 11 Tagen

Mycelgewicht

1 Mycelgewicht

0,00

27 ± 3

6,7

46 ±12

6,3

0,01

226 ± 7

6.9

378 ± 3

7,0

0,026

271 ± 4

7,1

681 ± 20

7,2

0,06

342 ± 9

7,2

647 ± 10

7,6

0,10

322 ± 36

7,1

663 ± 2

7.8

0,26

402 ± 20

7,1

706 ± 4

7.8

437 ± 14

7,1

766 ± 6

7,8

1,00

610 ± 11

7,1

702 ± 8

7,6

2,60

616 ± 7

7,1

664 ± 17

7,6

6,00

478 ± 16

6,8

716 ± 3

7,4

10,00

428 ± 11

6,7

761 ± 8

7,4

16,00

470 ± 4

6,6

759 ± 6

7,4

20,00

637 ± 7

6,6

753 ± 6

7,5

26,00

603 ± 19

6,6

724 ± 12

7,6

36,00

462 ± 18

6,6

720 ± 12

7,4

40,00

162 ± 17

6,8

642 ± 18

7,2

46,00

118 ±17

6,6

600 ± 6

6,8

60,00

46 ± 12

4,6

419 ±11

6,8

A. Stare:

Tabelle II. Mucor puaillus.

MgS 04

Nach 7 Tagen |

Nach IS Tagen

Myoelgewioht

* PB

Mycelgewicht

0,00

60± 11

3,3

90 ± 7

2.6

0,01

146 ± 6

2.0

146 ± 19

2,0

0,025

168 ± 2

2,0

191 ± 2

1.8

0,06

147 ± 6

2.0

201 ± 9

1,6

0,10

162 ± 3

2,0

201 ±10

1,6

0,26

144 ± 4

2.0

208 ± 6

1,6

0,60

174 ± 2

2.0

237 ± 8

1,6

1,00

169 ± 8

2.0

277 ± 2

1,6

2,60

166 ± 7

2.0

226 ± 10

1,6

6,00

132 ± 16

2.5

198 ± 33

1,8

10,00

89 ± 4

2,8

177 ± 12

2,0

16,00

79 ±14

2,8

133 ± 26

2,0

20,00

39 ± 6

3,1

89 ±11

2,3

26,00

14 ± 3

3.6

62 ± 6

2.7

36,00

9 ± 1

3.8

24 ± 6

2,9

40,00

10 ± 1

3.7

18 ± 9

3,2

46,00

ö± 1

3.7

8± 1

3,2

60,00

2± 1

4.1

7± 1

3,2

sich an der Oberfläche der Lösung eine feste und stark gefaltete Decke ;
das Wachstum ist aber in den Parallelen nicht gleichmäßig, und es sind
oft Inseln des stark entwickelten, mit dünnen Häutchen verbundenen
Mycels zu beobachten. Bei den stärkeren Mg SO 4 - Gaben (von 5%
aufwärts) ist die Farbe der Oberfläche stärker gelb. Sporenbildung
erfolgt jedoch in allen Kölbchen, sogar auch in jenen mit 50% MgS 04 .
Allein bei 0,0% MgS 04 ist das Häutchen weißlich und schleimig.
Wahrscheinlich ist auch hier das Magnesium in Spuren vorhanden, da
die gebrauchten Chemikalien, besonders der käufliche Rohrzucker, nicht
absolut rein sind. Bei der zweiten Ernte (nach 11 Tagen) war das
Häutchen noch zäher und fester, an der Oberfläche mit braungrünen
Sporen überdeckt ; nur in den Lösungen mit 40 und 50% MgS 04 ist
das Häutchen zarter, schwach entwickelt und die Decke blaß grünlich.
Im allgemeinen ist das Mycel besonders auf der Unterseite fest und mit
weißlicher Kruste von Salzen überzogen. Andererseits war in Kölbchen
ein Bodensatz festzustellen, hauptsächlich in Mg S O 4 -Konzentrationen
von 0,5 bis 5,0%.

Die mikroskopische Kontrolle zeigte keinen besonderen Einfluß
der höheren MgS 04 -Gaben auf die morphologischen Eigenschaften
dieses Pilzes. Doch sind bei den höheren MgS 04 -Konzentrationen die
Konidienträger und die Sterigmen kürzer, und als eine Anomalie haben
wir, allerdings selten, fingerähnliche, manchmal auch verzweigte
Sterigmen beobachtet. Sporenbildung erfolgt auch bei 50% MgS 04 .
Auch die vegetativen Hyphen sind mehr oder weniger normal.

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

Mucor puaiüua: Dieser Pilz zeigt eine schwächere Entwicklung, so
daß ein sichtbares Wachstum erst im dritten Versuchstag zu beobachten
ist. Die Sporenbildung ist nicht so üppig wie bei A,flavu 8 , und eine
bräunlich graue Überdecke macht sich hauptsächlich nur am Rande des
Kölbchens bemerkbar. Bei höheren MgS04-Gaben bildet sich ein
weißer Ring, während die Mitte nur von einem dünnen, zarten Häutchen
überzogen ist. Abei* auch bei diesem Pilz ist das Wachstum in den
Parallelen unregelmäßig. Nach 16 Tagen (2. Ernte) war die Haut
noch immer weich und schleimig, in Lösungen mit niedrigen MgS04-
Gaben (bis 5%) mit vielen weißen warzigen Anhäufungen auf der
Oberfläche.

Die mikroskopische Kontrolle zeigt, daß die Si)orenbildung in
größeren Mengen nur bei den Konzentrationen von 0,01 bis 0,5 % Mg S O4
auftritt und von höheren Gaben gehemmt wird; bei 15 bis 20% MgS04
waren keine Sporen mehr festzustellen. Indessen beobachteten wir auf-
geblasene, meist runde und oft an Hyphenenden liegende Zellen, ferner
stark vakuolisierte vegetative Fäden onit kleinen oder großen Blasen.
So sehen wir, daß auch die mikroskopische Durchprüfung für eine
größere Empfindlichkeit dieses Pilzes gegenüber MgS04 spricht.

Die Ertragskurven für die beiden Pilze zeigen nun, daß Ä. flavus
eine weit bessere Entwicklung und größere Resistenz gegenüber höheren
Gaben des Magnesiumsulfates besitzt.

Bei A. flavus ist zunächst (1. Ernte, nach 4 Tagen) eine Steigerung
der Ernten bis 1 bis 2,5% MgS04 festzustellen, danach ein Sinken, dem
eine nochmalige Steigerung bei 20% MgS04 folgt. Bei der zweiten
Ernte (nach 11 Tagen) wiederholt sich dieses zweite Maximum, liegt
jedoch schon bei 10%. Von einer zeitlichen Maximumverschiebung
und sonstigen Regelmäßigkeiten im Sinne des Ertragsgesetzes
[A, Rippel (5)] kann in diesem Falle kaum die Rede sein. Die Angaben
für die Reaktion zeigen, daß parallel mit stärkerem Wachstum auch eine
stärkere Alkalisierung auftritt, wenigstens für die nicht allzu hohen
Mg SO4- Gaben.

M. pusillus besitzt eine gleichmäßigere Kurve, nach 7 Tagen
(1. Ernte) wurde eine Steigerung bis 0,025% MgS04, danach wieder
eine bei 0,5 % und weiter ein Sinken der Erträge festgestellt ; bei hohen
Gaben von 50 % Mg S O4 ist der Ertrag gering. Nach 16 Tagen (2. Ernte)
läuft die Kurve ähnlich mit etwas mehr ausgeprägtem Maximum bei
1 % MgS04, während der absteigende Ast seinen Wendepunkt erst bei
etwa 20% zeigt. Die Reaktion ist hier sehr sauer [(NH4)2S04]; es ist
anzunehmen, daß sie die weitere Entwicklung hemmt. Deswegen sind
auch die Erträge, besonders in der 2. Ernte, in einem großen Bereich
ziemlich gleich. Aber schon die Tatsache, daß dem ursprünglichen

A. Stare:

Aufsteigen der Kurve bei 0,025% MgS 04 das Absteigen nicht sofort
folgt, zeigt uns, daß neben der Nährstoff Wirkung auch andere Faktoren
mitwirken.

Versuch II.

Versuch I wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß jeder Pilz in
den beiden Nährlösungen (AapergiUus- und Afticor-Lösung) gezogen wurde,
um den Einfluß verschieden zusammengesetzter Nährlösungen auszuschalten.
Die Stufen der Mg S O4- Gaben lagen weiter auseinander als im ersten Versvich.

Die Ernten sind in den Tabellen HI und IV wiedergegeben.

Tabelle III. Aspergillus flavus.

MgSO«

Nach 4 Tagen

Nach 22 Tagen

A-Löaung

M-Lösimg ,

A-Löaung

H -Lösung

Mycelgewioht

Hycelgewicht

PH 1

Hycelgewicht

0.00

6,5

2,5 i

109

6,6

116

1.5

0,06

166

6,9

267

3.6

606

8,6

370

1.4

0,10

438

7.2

269

1.6

609

8,8

347

1.4

1.00

341

6,6

250

1.6

678

8,0

414

1.4

2,50

273

6,5

237

1,6

722

7.8

472

1.4

5,00

274

6,5

255

1.6

688

8,3

496

1.6

10,00

242

6,6

237

1.6

729

8,4 !

509

1.4

20,00

264

6,6

270

1.4

964

8.6 1

711

1.4

25,00

386

7.2

268

1.0

994

8,6 1

622

1.6

35,00

339

7.0

199

1.5 j

—

Tabelle IV. Mucor pusillus.

HgS 04

Nach 4 Tagen

Nach 22 Tagen

1 A-Lösung 1

H-Lösung

A-Lösung

H-Löeung

Hycelgewicht |

1 Hycelgewicht |

PH 1

Hycelgewicht |

0,00

6,6

1.6

6,6

2,0

0,06

6,4

166 1

1.6

628

8,0

297

1,5

0,10

6,3

175 1

1,6

634

8,0

300

1.6

1,00

6,8

134

1.6

1 679

6.0

292

1.6

2,50

103

5,4

118

1.5

i 80^

7,8

322

1,4

6,00

6,4

82 1

1.5

967 1

7,8

284

1,6

10,00

6,4

; 1.9

957

7,6

368

1.6

20,00

5,4

03 1

1 3,8

626

4,3

280

1.6

26,00

5,4

! 3.9

1 410

4,0

266

; 2,0

A. flavus: In der M (Afwcor) -Lösung fängt das Wachstum etwas
früher als in der A {Aspergillus) -Jjösung an; das Häutchen ist zer-
brechlich und halbschleimig, die Oberfläche blaß gelblichgrün, die
Sporenbildung überall üppig. Die mikroskopische Durchprüfung des
Mycels in der M-Lösung zeigte (2. Ernte) den Zerfall der meisten Hyphen
in angeschwollene rundliche Zellen mit fester Zellwand und mit vielen

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

Reservestoffen. Solche Erscheinungen, obwohl im kleineren Ausmaße^
wurden auch in Lösungen mit kleinen Mg SO4- Gaben (0,05%) fest-
gestellt und sind demnach mehr eine Folge der sauren Reaktion und
des Kulturalters als des Einflusses der hohen Konzentrationen des
Magnesiumsulfats .

M, jmsillua: Das Wachstum in der A- Lösung ist in den ersten
Tagen etwas verzögert; im Laufe der Zeit entwickelt sich aber eine
schneeweiße, wasserreiche und schleimige Decke. Charakteristisch ist
für das Wachstum dieses Pilzes in der A-Lösung das hoch ausgewachsene
Mycel, während die Sporenbildung (bräunlich graue Farbe) sehr spar-
sam ist.

Wir sehen also, daß die Entwicklung schon makroskopisch, je
nach Lösungen, verschieden ist.

Was die Zahlen in den Tabellen betrifft, so können wir feststellen,
daß die Ertragskurve von A. flavua in der A-Lösung, trotz der geringeren
Wachstumsintensität, doch ähnlich der im Versuch I ist. Bemerkens-
wert ist jedoch der Kurvenanstieg bei 20 bis 25% MgS04 (2. Ernte,
nach 22 Tagen) ; die mikroskopische Kontrolle zeigte, daß zwischen der
Pilzhyphen eine sehr große Zahl von Kristallkonglomeraten eingelagert
ist, welche mit gewöhnlichem Auswaschen des Mycels nicht zu beseitigen
sind. Es ist also anzunehmen, daß diese Steigerung teilweise auf die
Salzanhäufung in älteren Kulturen (nach 22 Tagen) zurückzuführen ist.

In der M-Lösung ist die Entwicklung gleichmäßiger; wie bei Mucor
spielt auch hier die stark saure Reaktion eine große Rolle. Nach 22 Tagen
wiederholt sich auch in diesem Falle ein ausgeprägter Anstieg der
Kurve bei 20% MgS04 (Salze, Inkrustierung!?).

M.pusillus hat in der A-Lösung bei der 1. Ernte (4 Tage) eine
charakteristische Biegung im Bereich von 1 bis 5% MgS04. Während
der zweiten Ernte (22 Tage) wurde eine sehr starke Steigerung der
Erträge festgestellt mit dem Maximum bei 10%. Dagegen hat die
Ertragskurve in der M-Lösung einen ruhigeren Verlauf mit der gleichen
Tendenz wie im Versuch I; nach 22 Tagen sind die Erträge größer, die
Steigerung doch nicht so bedeutend wie in der A-Lösung (saure Reaktion,
stärkere Sporenbildung).

In diesem Versuch wurde also festgestellt, daß M. pusiUus in der
A-Lösung besser wächst; außerdem daß die Intensität der Sporen-
wirkung bei steigendem Ertrag abnimmt.

Versuch III,

In diesem Versuch verwendeten wir die gleiche, d. h. A-Lösung für
A. flavua und M, pusiUua. Um eine gleichmäßigere Entwicklung der Pilz-
decke an der Oberfläche der Nährlösung und damit auch eine gleic^3aftßl^!%

A. Stare :

Entwicklung der Paralielkulturen zu erhalten, wurde 0,1% Agar zugefügt
[A, Rippel (1)]. Ergänzend wurde auch der ökonomische Koeffizient
{verbrauchte Saccharose) und der Aschegehalt bestimmt.

Die Ergebnisse zeigen die Tabellen V und VI.

Aspergillus flavus: Der Pilz entwickelt sich schon in den ersten
Tagen stark, so daß nach 3 Tagen auch die Kölbchen mit 50% MgS04
mit einer gut gewachsenen Decke an der Oberfläche der Nährlösung
überzogen sind. Das Häutchen ist sehr fest und zäh, mit vielen Sporen,
die bei hohen Mg SO4- Gaben auch in diesem Falle eine heller gelbe
Farbe besitzen.

In den Lösungen mit 0,5 bis 10% MgS04, besonders in älteren
Kulturen, wurde ein reichlicher, schmutzigweißer und voluminöser
Niederschlag festgestellt, in dem das Magnesium größtenteils als Mg (0H)2
vorhanden ist. Außerdem ist auch die Unterseite des Häutchens bei
diesen wie auch bei höheren M^S04- Gaben *^lt einer Salzkruste
bedeckt.

Die mikroskopische Kontrolle in den Erntezeiten zeigte das gleiche
Bild wie in den ersten beiden Versuchen. Blasen und ähnliche Er-
scheinungen konnten wir nicht feststellen.

Mucor pusillus: Wählend der 1. Ernte hat sich eine schneeweiße
Decke in den Kölbchen bis 1 % MgS04 entwickelt; in höheren MgS04-
Konzentrationen ist die Entwicklung schwächer und größtenteils nur
auf die Bildung eines Randringes beschränkt. Auch die Sporenbildung
ist gering. Das Wachstum ist jedoch etwas gleichmäßiger als in den
ersten Versuchen ohne Zusatz von Agar. Nach 19 Tagen (2. Ernte)
hat sich ein dickes schleimig- wässeriges Häutchen entwickelt mit stär-
kerer Sporenbildung nur bei niederen MgS04-Gaben (von 0,01 bis
0,05%). Das Mycel wächst gut in der Nährlösung, so daß es diese fast
vollständig ausfüllt.

Die Wirkung des Agars äußert sich bei den beiden Pilzen in einer
intensiveren Entwicklung, und zwar bei A, flavus in der ersten Periode
(nach 4 Tagen) in einem stärkeren Wachstum in niederen MgS04-
Konzentrationen (0,05 bis 0,25%), in der zweiten Periode (nach 11 Tagen)
in höheren Konzentrationen — von 1 % weiter. Auch für M. pusillus
ist in der Zeit der ersten Ernte eine üppigere Entwicklung bei den
niedrigen MgS04-Gaben (bis 0,25%) festzustellen und ein allgemein
besseres Wachstum bei der 2. Ernte.

Es ist bemerkenswert, daß der Agarzusatz kein gleichmäßigeres
Wachstum der Versuchsparallelen verursacht hat (vgl. die wahrschein-
lichen Schwankungen in Versuchen mit und ohne Agar).

Die Ertragskurve zeigt in diesem Versuch bei der ersten Ernte
{nach 4 Tagen) in diesem Versuch zwei Maxima für A. flavus: das erste
bei 0,05 bis 0,1 % MgS04, das zweite bei 2,5 bzw. 20 %. Nach 11 Tagen

Tabelle V. Aspergillus flavtis.

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

König,
ö. K.

vH Ovl CM

29,6

29,9

419

601

680

oor-, 00
©>1 CO CM
t>- l> l> ^

1-=

iO CM CQ

20,6

29,1

30,3

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o 00 00 00 00 1 > o 05 oq o 05 o
odododododado5adodo5Qdodo6i>

21,9

26,6

29.1

33.2

37.3
38,0

39.4

« <L

Verbraucht

2162

2446

2451

2452

00 OO GM
kO O CD

Tt» r**

CM CM CM

Mycelgew.

m«

463 dz 9
630 dz 16
649 dz 10
707 dz 5
714 d: 16
786 dz 11
815 ± 12
829 ± 10

853 dz 17

916 dz 26
947 dz 16
972 dz 10
1063 dz 17
932 dz 6

o o o o CO lO 00 00 oq c> o o o C5
ooododoot>^T>c^t^i>ododaoi>co

O O O O GM

CO t> -H CO CO

GM CM CO CO CO

<d d i’- »d

CO CO CO eo

naSifx II

Verbrauchte

Saccharose

1617

2451

2424

2429

2347

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CO 00 »o

CM Ol Dl CM

OS CD

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36,0

37,3

27,9

26,6

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CM rt CM CO O

vH C» r» CO CM

rH rH rH tH tH rH

1265

1266

1174

874

1 »

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W tH tH rH CO kO CM rH rH

-H -H 41 -H 4^ 4^ -H 41 -4 -4 4^ 41 4i -H

C0Q 00 05 05C0CMrt<CMO’^05rHC0
»HQQ05^COT-i05kOl>l>rHCOCO
COCOcOTt<'»t'-J<lO'^'^^'^''*<GM

'S, ^

0,01

0,06

0,10

0,25

0,50

1,00

2,60

6,00

10,00

16,00

20,00

26,00

40.00

60.00

ArchlT ffir Mikrobiologie. Bd. 13.

rH p^Ot^CD

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267

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261

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332

316

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rH bO O bO P P P
O p rH CM_ bO p bö

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6 1 /

A. Stare:

läuft die Kurve jedoch gleichmäßiger und steigt allmählich bis 20 —25 % ;
nach 22 Tagen (3. Ernte) fanden keine größeren Veränderungen statt.
Hier ist sogar eine Abnahme der Ernten zu beobachten, die auf Auto-
lyse zurückzuführen ist. Das bestätigt auch die Bestimmung des in
der Nährlösung verbliebenen Zuckers.

Der ökonomische Koeffizient zeigt eine gute Parallelität mit den
Erträgen. Während der ersten Ernte erreicht er den größten Wert
im Bereich des 2. Maximums (42,6). Die Aschebestimmung führte zu
dem unerwarteten Ergebnis, daß der Aschegehalt nach 22 Tagen
außerordentlich groß ist (bis 54% der Trockensubstanz bei 50%
MgS04); der tatsächliche Ertrag ist also hier bedeutend niedriger, bzw.
die ausgeprägte Steigerung bei hohen Mg SO4- Gaben ist eigentlich
durch die Einlagerung des Salzes im Pilzmycel verursacht; weitere
Ascheanalysen zeigten, daß es sich natürlich um Mg- Salze handelt
(Mg O in der Asche). Dieser Befund ist weiter durch den histochemischen
Nachweis des Magnesiums im Pilzmycel bestätigt. Es ist selbstverständ-
lich, daß solche großen Aschenmengen nicht innerhalb, sondern größten-
teils außerhalb der Zellen liegen; mikroskopisch sieht man die Ab-
lagerungen zwischen den Hyphen.

Es wurde noch versucht, den Aschegehalt des Mycels dadurch
herunterzudrücken, daß einige Proben mit verschieden stark an-
gesäuertem Wasser ausgewaschen bzw. verschieden lange Zeit in ver-
dünnter Salzsäure liegengelassen wurden. Erst das Liegen des Pilz-
mycels 1 Stunde lang in 1:50 verd. Salzsäure genügt praktisch, um
alle Salze zu beseitigen.

Die Steigerung der Kurve bei der 2. Ernte können wir ebenfalls
auf Grund des Aussehens des Mycels und der mikroskopischen Prüfung
auf den großen Aschegehalt zurückführen, obwohl eine Asche bestimmung
hier nicht durchgeführt wurde.

Die Reaktion ist alkalisch, so daß der pu-Wert in alten Kulturen
bis 9,0 steigt; das Magnesium fällt als Mg(OH)2, besonders im Bereich
von 0,5 bis 5% M^S04 aus. Das bedeutet aber, daß der tatsächliche
Gehalt an MgS04 in diesen Kölbchen (in der Lösung) viel niedriger ist;
es ist nicht ausgeschlossen, daß das Ansteigen der Erträge in diesem
Bereich (besonders 1. Ernte) damit in Zusammenhang steht.

Im Versuch mit M, jmsillus wurde — ähnlich wie im Versuch II
mit der A-Lösung — ein Maximum bei 0,1 % MgS04 festgestellt, dann
ein zweites, viel niedrigeres bei 2,5%. Bei der 2. Ernte (nach 19 Tagen)
wiederholt sich dies, oby^obl die Biegung der Kurve nicht so stark ist.

Der Aschegehalt ist in diesem Versuch leider nicht quantitativ
bestimmt. Nach der mikroskopischen Kontrolle und dem Aussehen
des getrockneten Mycels (das sehr hart ist), kann es aber nicht zweifelhaft
sein, daß die Asche auch hier in der Trockensubstanz stark vertreten ist
und ihr die großen Erträge bei hohen Mg SO4- Gaben zuzuschreiben sind.

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

Der ökonomische Koeffizient ist hier zwar niedriger, stimmt aber
gut mit den Erträgen überein; sehr kleine ökonomische Koeffizienten
bei den hohen Mg SO4- Konzentrationen sprechen außerdem für eine
unökonomische Arbeit dieses Pilzes und indirekt für eine hemmende
Wirkung dieser hohen MgS04-Gaben.

Die Reaktion verändert sich hier weniger und ist sogar bei den
höheren Mg SO4- Gaben sauer (Einfluß des MgS04 oder der gebildeten
organischen Säuren!?).

Versuch IV.

Der Versuch mit A. flavus wurde mit der A-Nährlösung, aber bei ver-
schiedener Reaktion durchgeführt : bei Ph (wie in den früheren Versuchen )
und bei pH 4:,0, d. h. bei saurer Reaktion, um damit die Fällung von
Magnesium während des Wachstums des Pilzes zu vermeiden. Die Lösungen
mit Ph 4,0 waren bei deren Herstellung wie auch später während des Versuchs
ganz klar.

Für M. puaiUua wurde auch in diesem Versuch nur die Nährlösung mit
Ph 6,5 verwendet, da hier weder Alkalisierung noch Fällung des Nieder-
schlages entsteht.

Beim Ernten wurden die Salze praktisch vollständig entfernt (Liegen
des Mycels 1 Stimde in 1 : 50 verdünnter HCl). Der Aschegehalt und
die verbrauchte Saccharose wurden auch in diesem Versuch bestimmt.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen VTI und VIII sowie in Abb. 1
dargestellt.

Abb. 1. Aspergillas flaviu : 1. Ernte, 2. Ernte.

Mucor pusillus: — — — 1. Ernte, 2. Ernte.

A. flavus: In der sauren Nährlösung ist die Entwicklung in den
ersten Tagen etwas besser, sonst ist das Aussehen des Häutchens das
gleiche wie in neutraler Lösung.

Die mikroskopische Kontrolle der einzelnen Pilze zeigte auch hier
die Kristallglomerate an der Unterseite der Pilzdecke, und zwar besonders
im Bereich von 5 bis 25% MgS04; in höheren Konzentrationen ist
das Häutchen schwächer entwickelt, weicher, und bei 70% MgS04 ist
die Entwicklung vollständig gehemmt (keine Sporenbildung). In diesjpi

Tabelle VII. Aspergillus f

A. Stare

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

Versuch war die Sporenbildung nicht so üppig, und man konnte oft
weiße Flecken des Vegetativmycels zwischen den grünen Inseln der
Konidien beobachten.

M. puaiUus : In den ersten Tagen war die Entwicklung außer-
ordentlich schwach und auf die Bildung eines weißen Ringes beschränkt.
Die Sporenbildung war nicht nur gering, sondern auch sehr unregelmäßig ;
z. B. bildete der Pilz bei 0,5% MgS04 in zwei Fällen sehr viele Sporen,
in den anderen zwei Parallelen ein mächtiges Mycel ohne Sporen.

Ein Niederschlag in den Kölbchen wurde nur für A. flavus bei
PH 6,5 festgestellt und zwar im Bereich von 0,5 bis 15% MgS04.

Die Ertragskurve von A. flavus bei pn 6,5 unterscheidet sich von
den Ertragskurven in früheren Versuchen dadurch, daß sie keine Ertrags-
steigerungen im Bereich von 10 bis 30% MgS04 zeigt (Beseitigung
der Salze! ?). Im Versuch bei Ph 4,0 ist der Kurvenverlauf anders; das
zweite Maximum ist im großen Bereich von 5 bis 20 % MgS04 (1. Ernte)
vorhanden.

Der Aschegehalt ist niedrig, d. h^ normal (bis 7% nach 12 Tagen).
Der ökonomische Koeffizient ist praktisch der gleiche in beiden Ver-
suchsreihen. Die Reaktion zeigt auch im Versuch bei pH 4,0 eine Alkali-
sierung, die indessen gering ist; ein Niederschlag bildet sich nicht.

Wir sehen also, daß die Reaktion die Erträge von A. flav^is in
verschiedenen Mg S 04- Lösungen beeinflußt. Gerade im Bereich der
Mg SO4- Gaben, in welchem bei den ersten Versuchen ein Bodensatz
festgestellt wurde, ist der Kurvenverlauf bei Ph 4,0 anders, und zwar
läßt sich hier ein ausgeprägtes Maximum erkennen.

Für M, pusillus wurden im Verhältnis zu den ersten Versuchen
niedrigere Erträge erhalten. Ein deutliches Maximum wurde für die
beiden Ernten bei 0,05 % Mg S O4 gefunden. Der ökonomische Koeffizient
war auch hier niedrig, der Aschegehalt verhältnismäßig hoch (bis 15 %
bei 2,50% MgS04).

Auch in diesem Versuch mit M. pusillus konnten wir nur bei
niederen Mg SO4- Gaben eine gute Entwicklung feststellen; andererseits
treten solche Streuungen und Unregelmäßigkeiten bei hohen MgS04-
Konzentrationen, wie sie für A, flavus typisch sind, hier nicht auf.

Besprechung der Ergebnisse.

Es sei zunächst hervorgehoben, daß die von W. Lohrmann (2)
festgestellte Wirkung von MgS04 auf Aspergillus flavus und Mucor
pusillus wie auch die scheinbar größere Resistenz von A . flavus gegenüber
MgS04 durch diese Versuche bestätigt werden konnten (vgl. hierzu
Abb. 1). Aus allen Versuchen geht hervor, daß bei A, flavus eine Schädi-
gung erst bei sehr hohen Mg SO4- Gaben eintritt, während das Wachstum

8(5

A. Stare:

von M. 'pusillus schon bei viel niedrigeren Konzentrationen gehemmt
wird . Es ist jedoch bemerkenswert, daß auch M. pusillus sehr hohe
MgS04-Konzentrationen vertragen kann, wenn auch hier die Ent-
wicklung gering ist. Die absolute Eesistenz ist für die beiden Pilze
ungefähr die gleiche; die relative Wirkung der hohen MgS04-Gaben
ist aber für die beiden Pilze verschieden, was ohne weiteres aus dem
Kurven verlauf der Erträge zu ersehen ist. Nur in diesem Sinne können
wir von einer verschiedenen Empfindlichkeit der untersuchten Pilze
gegenüber steigenden Gaben des MgS04 sprechen.

Es ist weiter hervorzuheben, daß ein und derselbe Pilz in mehreren,
unter möglichst gleichen Bedingungen durchgeführten Versuchen, sehr
verschiedene Erträge erreicht. Obwohl die Zahl der Parallelen in unseren
Versuchen offenbar klein ist, können wir doch die auftretenden Ver-
schiedenheiten in erster Linie als die große Reaktionsfähigkeit der Pilze
gegenüber der Konstellation der Wachstumsfaktoren betrachten. Das
oft unregelmäßige Wachstum des Pilzmycels auf der Oberfläche der
Nährlösung zeigt z. B., daß trotz der ursprünglichen Homogenität der
Lösung während des Wachstums des Pilzes bald Veränderungen eintreten
(örtliche Versäuerung usw.).

Die Verschiedenheit unserer Ertragskurven für ein und den gleichen
Pilz können wir aber, wenigstens zum Teil, auf bestimmte Faktoren
zurückführen, so z. B. auf den Einfluß des Agars (in Versuch III) oder
der Reaktion (im Versuch IV). Bei M. pusillus kommt dazu noch das
Verhältnis zwischen dem vegetativen Wachstum und der Sporenbildung,
eine Tatsache, die wir leider nicht quantitativ erfassen können.

Für die Bewertung der Pilzerträge bei verschiedenen Mg SO4- Gaben
ist es wichtig, daß die schon erwähnten Unregelmäßigkeiten in größerem
Ausmaße besonders bei den höheren, noch immer fördernden Konzen-
trationen des Magnesiumsulfats eintreten, so daß dort kein scharfes
Maximum hervortritt, während bei den niedrigen, optimalen Gaben fast
regelmäßig ein Maximum in relativ engerem Bereich der MgS04-
Konzentrationen eintritt. Das bezieht sich zunächst auf die 1. Ernte,
da sich später die Erträge ziemlich ausgleichen.

Wie schon bei der Besprechung des Versuchs III (A, flavus) erwähnt
wurde, können wir den Anstieg der Erträge bei den höheren MgS04-
Konzentrationen teilweise auch auf die Salzinkrustierung zurückführen,
besonders bei den älteren Kulturen. Aus den Zahlen geht aber hervor,
daß der Kurvenanstieg doch nicht völlig durch den Aschegehalt
gedeckt wird. Außerdem konnten wir auch im Versuch IV, wo die Salze
aus den Mycelemten praktisch vollständig beseitigt wurden, ebenfalls
einen Anstieg bei hohen Mg SO4- Gaben feststellen. Wir können also
von einer Förderung durch die hohen Konzentrationen von MgS04
sprechen. Im Sinne der Erklärungen, die A, Rippel (5, 9) für das

Einfluß steigender Gaben von MagnesiumsiiKat.

Ertragsgesetz, sowie für den Begriff der Nährstoffwirkung gibt, können
wir sagen, daß in diesen Fällen in niederen (optimalen) MgS04-Konzen-
trationen das Magnesium als Elementarnährstoff wirkt, während bei
den höheren (überoptimalen) Gaben des Magnesiumsulfats die Wirkung
des Neutralsalzes MgS04 mit allen seinen Nebenwirkungen in Frage
kommt. Wenn wir indessen das Mg SO4 als ,, Nahrung“ betrachten, dann
sehen wir, daß seine fördernde Wirkung b^i A . flavus einen sehr breiten
Bereich umfaßt, etwa bis 40 % MgS04, und daß sich bei M, pusillus, der
empfindlicher ist, die Salz Wirkung weniger äußert. Für uns hat be-
sonders dieser zweite Teil des auf steigenden Astes Interesse, da sich
in diesem Bereich die komplexe Wirkung des Salzes abspielt.

Dabei gibt A. flavus wegen seiner Plastizität gegenüber MgS04
ein aufschlußreicheres Material als M. pusillus. Allgemein genommen
wurde hier ein Optimum für Magnesium im Bereich unter 1% MgS04
festgestellt (etwa bei 0,05 bis 0,1%; im Versuch IV mit pn 4,0 bei
0,25% MgS04). Schon bei den Konzentrationen über 1% MgS04
spielen offenbar noch andere Faktoren^eine Rolle, Faktoren, die fördernd
wirken und in welchen die Wirkung des Magnesiums als Elementar-
nährstoff schon überdeckt ist. Hier können wir voraussetzen, daß das
MgS04 als Salz (undissoziierte Moleküle) und auch als Mg-Kation
bzw. als SO4- Anion wirkt. Ob diese Wirkung rein chemischer Natur ist
(Reaktionen in den Lösungen) oder ob es sich mehr um physiologisch -
chemische Vorgänge handelt (Wirkung auf das Plasma), ist schwer zu
entscheiden.

Chemische Veränderungen in der Nährlösung sind möglich, es
sprechen dafür viele Erscheinungen. Schon der einfache Zusatz von
größeren Mg S04-Gaben, von 5 % aufwärts, ändert merklich die Reaktion
der Lösung und das ursprüngliche pu sinkt (bei 50% MgS04 von 6,5
auf etwa 5,0). Andererseits haben wir bei der alkalischen Reaktion,
die während des Wachstums eintritt, eine Fällung der Salze festgestellt,
und zwar besonders im Bereich von 0,5 bis 10 % Mg S O4, also im Bereich,
der durch den Wendepunkt charakterisiert ist. Endlich zeigt auch der
Versuch IV mit der sauren Lösung, daß gerade in diesem letzten Teil
des aufsteigenden Astes Veränderungen eintreten ; hier war (1 . Ernte) der
Ertrag größer, wahrscheinlich wegen der stärkeren Löslichkeit der aktiven
Stoffe.

Die Erklärung dieser Erscheinungen nur auf dem chemischen Wege
ist aber einseitig und kann uns nicht befriedigen. In Versuchen von
W. Lohrmann wurde eine antagonistische Wirkung hoher Mg SO4- Gaben
festgestellt, so daß diese Gaben die von Sublimat oder Borsäure ver-
ursachten Schädigungen beheben können ; es handelt sich also um einen
physiologisch -chemischen Antagonismus, der mit den Lebensvorgängen
des Organismus verknüpft ist. Denn die Mengen von Sublimat bzw. von

A. Stare :

Borsäure waren verhältnismäßig so gering, daß rein chemische Wir-
kungen mit den hohen MgS04-Gaben ausgeschlossen sind. Die Er-
scheinung des Antagonismus spricht auch für eine Salzwirkung, da sie
sich bei solchen Konzentrationen äußert, die weit über die Grenze des
Normalbedarfs des Pilzes an dem Nährstoff Magnesium liegen. Dies ist
nur eine Komponente der mannigfaltigen komplexen Wirkung des
MgS04; in unseren Versuchen können wir auch auf eine antagonistische
Wirkung des Magnesiumsulfats gegenüber den anderen Bestandteilen
der Nährlösung vermuten.

Bei den hohen Salzkonzentrationen müssen wir weiter auch dem
hohen osmotischen Druck eine gewisse Wirkung zuschreiben. Verschie-
dene Literaturangaben zeigen, daß besonders die kosmopolitisch ver-
breiteten Aspergillus- Alten, weniger die Mucor-Arten, sehr hohe Salz-
konzentrationen vertragen können. So fand D. Rabinovitz-Sereni (4),
daß manche Pilze und Bakterien bis 40% MgS04 vertragen können,
und daß der toxische Effekt der höheren Konzentrationen auf den
hohen osmotischen Druck zurückzuführen ist; G.Schoop(\0) erwähnt
A.flavus als einen fakultativ halophilen Organismus. Es sei doch hier
bemerkt, daß die osmotischen Werte des MgS04 im Vergleich mit Na CI
in äquimolaren Lösungen viel niedriger sind [H, Walter (12)]. In unseren
Nährlösungen mit 40% MgS04 beträgt der osmotische Wert etwa
90 atm,, bei 50 % 110 atm. und bei 70 % schon etwa 150 atm. Das sind
schon sehr hohe Werte, die zeigen, daß die Pilze ein sehr hohes osmotisches
Niveau ertragen können. Dies gilt für A,flavus besonders, während
M, pusillus empfindlicher ist. So können wir für den ersten Pilz sagen,
daß der Einfluß des osmotischen Druckes von sekundärem Charakter
ist (wenigstens bis 40% MgS04) und daß bei diesem osmotoleranten
Pilz die fördernde Wirkung von größeren MgS04-Konzentrationen auf
die spezifische Wirkung des Salzes zurückzuführen ist. Bei M. pusillus
ist jedoch wahrscheinlicher, daß diese spezifische Wirkung durch den
Einfluß der hohen osmotischen Werte überdeckt wird. Die mikro-
skopische Überprüfung gab, daß bei den hohen Mg S O4- Gaben die Hyphen
von M. pimllus verhältnismäßig dünn und vakuolisiert sind.

Bei den obligat halophilen Organismen sind die Verhältnisse relativ
einfach, da NaCl keine ausgesprochene Nährstoffwirkung besitzt; in
Versuchen mit MgS04 kommt aber die Nährstoff- wie auch die Salz-
wirkung stärker zum Ausdruck, und die Kurven sind mehr oder weniger
zweigipfelig. Wahrscheinlich besteht hier der Unterschied zwischen
NaCl und Mg S O4 , derei\ Ionen auch in lyotroper Reihe weit voneinander
liegen. Während die Halophilie mehr mit der osmotischen Resistenz
verbunden ist — die obligaten Halophyten wachsen bei niederen NaCl-
Konzentrationen überhaupt nicht — ist die festgestellte Resistenz
gegenüber MgS04 mehr eine Folge der kombinierten spezifischen

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat,

Nährstoff- und Salzwirkung. Hier spielt auch die Tatsache eine Rolle,
daß die Mg- wie auch die S04-Ionen langsamer in die Zelle permeieren
als Na CI, und daß das MgS04 eiuen verhältnismäßig geringeren osmoti-
schen Wert besitzt.

Die Literaturangaben über die physiologische Wirkung von MgS04
(lonenantagonismus, Permeabilität, lyotrope Effekte, spezifische Wir-
kung usw.) können wir nicht ohne weiteres auf unsere Betrachtungen
anwenden, da sie sich hauptsächlich auf niedere Salzkonzentrationen
beziehen. Hinsichtlich des Einflusses von Ionen im Sinne lyotroper
Reihen, die bei den höheren Konzentrationen der Salze zum Ausdruck
kommen, wissen wir, daß die Mg- und S04-Ionen verhältnismäßig
schwer auf genommen werden bzw. daß sie die Permeabilität durch ent-
quellende Wirkung auf das Plasma vermindern. Die Verhältnisse sind
jedoch nicht so einfach, da z. B. in mehreren Fällen festgestellt wurde,
daß das Mg-Ion auch als einwertiges Ion wirken kann, und daß nach der
Salzkonzentration und aus anderen Gründen eine Verschiebung oder
sogar eine Umkehrung der lyotropen lonenreihen möglich ist. Es ist
nicht ausgeschlossen, daß das Mg-Ion in höheren Konzentrationen
fördernd auf die Permeabilität wirkt, was zum Teil auch unsere Ergeb-
nisse erklären könnte.

Andererseits ist sicher, daß das SO4- Anion eine Rolle in den hohen
MgS04-Konzentrationen spielt. Die Untersuchungen von A, Rijypel
und K, Behr (8) wie die von K, Mothes ( 3 ) deuten darauf hin, daß das
S04-Ion in den Nährlösungen (für A.niger) großen Veränderungen
unterworfen ist, obwohl es an sich die physiologisch stabile, wenig aktive
Form des Schwefels darstellt. Die Wirkung von Mg SO4 -Molekülen
können wir auch voraussetzen, was aber in diesen Untersuchungen
ein ebenso wenig kontrollierbarer Faktor ist wie die wahrscheinlichen
antagonistischen Erscheinungen bei hohen Gaben von MgS04. Endlich
kompliziert sich diese Faktorenkonstellation noch dadurch, daß zwischen
Salzaufnahmen und Gesamtstoffwechsel eine enge Beziehung besteht.
Wir können nur voraussetzen, daß sich bei hohen, noch immer fördernden
Mg SO4- Konzentrationen in erster Linie die spezifische Wirkung des
Salzes MgS04 äußert, und daß die anderen Faktoren (lonenwirkung,
Antagonismen, Nährstoffwirkung) durch diese großen Mg SO4- Gaben
physiologisch verdrängt sind.

Während für den ,, Nährstoff“ im engeren Sinne des Wortes ein
primäres, unmittelbares Eingreifen in die Vorgänge, die zur Ertrags-
bildung führen, charakteristisch ist [A. JRippel ( 9 )], haben wir es also
bei der ,, Salzwirkung“ auch mit einer indirekten Wirkung zu tun. Das
ist in jenem Bereich der Ertragskurve, wo die fördernde Wirkung des
Magnesiumsulfats von der Hemmungswirkung allmählich überdeckt
wird, und wo allmählich schon Konzentrationswirkungen eintreten.

A. Stare :

Für A , flaims ist dieser Bereich breit ; deswegen finden sich auch
solche Verschiedenheiten in einzelnen Versuchen. Übrigens zeigt die
mikroskopische Kontrolle, daß die hohen Mg SO4- Gaben nur wenig
auf die morphologischen Eigenschaften des Mycels ein wirken ; die fest-
gestellten Anomalien sind mehr dem Alter der Kulturen bzw. der
Reaktion der Nährlösung zuzuschreiben. Erst bei 70% MgS 04 (ge-
sättigte Lösung) ist die Hemmung vollständig und die geimpften Sporen
keimen nicht mehr. Auch hier tritt der osmophile Charakter dieses
Pilzes hervor.

Die Bestimmung der Reaktion, der verbrauchten Saccharose sowie
des Aschegehalts erklären nur zum Teil diese Verhältnisse. Hinsichtlich
der Reaktion wurde für Ä.flavus eine allmähliche Alkalisieiung fest-
gestellt, die bei den hohen MgS 04 -Gaben gering ist; auch organische
Säuren bilden sich wahrscheinlich nicht in großem Ausmaße, worauf
wir u.a. aus dem verhältnismäßig hohen ökonomischen Koeffizienten
schließen können; er stimmt gut mit den Erträgen überein, d. h. steigt
mit zunehmendem Ertrag. Es ist hier bemerkenswert, daß der öko-
nomische Koeffizient auch bei hohen MgS 04 -Gaben hoch ist, was
wiederum die große Resistenz dieses Pilzes andeutet. D. Buromsky (1)
konnte für A. niger ebenfalls einen größeren ökonomischen Koeffizienten
bei etwas steigenden Konzentrationen von MgS 04 (von 0,0 bis 0,5%)
feststellen und schließt daraus auf die .,8timulative“ Wirkung dieses
Salzes. Andererseits sinkt der ökonomische Koeffizient mit dem Alter
der Kultur, besonders in niederen Konzentrationen. Das gleiche fand,
wenn auch unter Anwendung einer anderen Methode, auch V. 0.
Tauason (11) für A. flaws.

Eine Analyse der Ertragskurven für Ä.flavus nach dem Ertrags -
gesetz zeigt ein ziemlich unklares Bild. Die zeitliche Maximum Verschie-
bung konnten wir in unseren Versuchen nicht immer feststellen (im
Versuch IV bei pH 4,0 sogar das umgekehrte). Hier sei erwähnt, daß
auch bei den höheren Pflanzen [A. Mi'p'pel und R. Meyer durch
überoptimale Konzentrationen des Hauptfaktors Unregelmäßigkeiten
eintreten (Rückläufigkeit des Maximums usw.), und daß die Wirkung
der Nebenfaktoren um so mehr hervortritt, je mehr sich der Haupt -
faktor aus dem Bereich der Anstiegtangente entfernt.

M. pusillus zeigt größere Empfindlichkeit gegenüber MgS 04 .
optimale Gabe beträgt 0,05 bis 0,1%; höhere Gaben schädigen. Im
Versuch I wurde dieser Fall zwar nicht gefunden, und die Kurve läuft
ungefähr horizontal, aber wegen der bald eintretemden Versäuerung
bildet sich in niedrigen, optimalen MgS 04 -Konzentrationen kein aus-
geprägtes Maximum. Dieses Maximum kommt als Folge der Nähtstoff-
wirkung des Magnesiums zustande. Obwohl schon theoretisch — wegen

Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

der Empfindlichkeit — eine stärkere ,, Salzwirkung“ nicht erwartet
werden kann, können wir doch diese Wirkung bei 1 % bzw. 2,6 % Mg SO4
vermuten (Erträge im Versuch lU bzw. IV).

Wir haben schon erwähnt, daß die Intensität der Sporenbildung
die Erträge beeinflußt; ob die kleine Steigerung der Kurve im Bereich
über 1% MgS04 mit dieser Erscheinung (üppige Bildung des vege-
tativen Mycels) zu erklären ist, oder sich besser durch irgendeine andere
physiologisch -chemische Wirkung erklären läßt, ist schwer zu sagen
(im Versuch IV ist bei 0,5% MgS04 der Ertrag des Mycels in den
Kölbchen mit stärkerer Sporenbildung 14 bzw. 16 mg, in einer anderen
Parallele ohne Sporen 315 mg). Es ist natürlich nicht ausgeschlossen,
daß auch in diesem Falle komplexe Vorgänge auf treten.

Diese, wenn auch nicht so ausgeprägte Salzwirkung, äußert sich
bei M. pusillus in der Weise, daß nach dem Überschreiten der optimalen
Gaben das Absinken des Ertrages sich bald verzögert und sogar in eine
geringe Steigerung umkehrt. Wegen der größeren Empfindlichkeit
dieses Pilzes gegenüber der hohen Mg SO4- Gaben können wir hier aber
ein so ausgedehntes zweites Maximum und so große Streuungen wie
bei A,flavu8 nicht erwarten.

Die über das Ertragsgesetz und A . flavus gemachten Angaben gelten
auch für M. puailJus. Eine zeitliche Maximum Verschiebung wurde bei
diesem Pilz nicht festgestellt. Der ökonomische Koeffizient steigt in
älteren Kulturen. Der Unterschied gegenüber A. flavus ist jedoch nur
scheinbar, da M. jmsillus viel langsamer wächst. Es folgt daraus, daß
z. B. im Versuch IV für die Bewertung der Salzwirkung nicht die Er-
träge der 1., sondern die der 2. Ernte (nach 16 Tagen) maßgebender sind ;
hier ist das Wachstum intensiver, die Zuckerausnutzung größer und
auch das zweite Maximum ist hier besser ausgeprägt.

Zusammenfassung.

Die untersuchten Pilze, Aspergillus flavus und Mucor pusillus, sind
gegenüber hohen Mg SO4- Gaben resistent, so daß sie noch bei 50%
MgS04 -7H20 wachsen. Doch ist die Entwicklung der Pilze bei
steigenden Mg SO4- Konzentrationen in der Nährlösung insofern ver-
schieden, als die Entwicklung von M. pusillus schon bei niederen
Konzentrationen (über 2,5%) verzögert wird, während bei A, flavus
erst in den Lösungen mit über 40% MgS04 eine merkliche Schädigung
eintritt.

Neben einem Maximum der Erträge bei niederen, optimalen Gaben
von MgS04 (etwa 0,05 bis 1%), das der Wirkung von Magnesium als
Elementamährstoff zuzuschreiben ist, wurde eine zweite Steigerung

92 A. Stare : Einfluß steigender Gaben von Magnesiumsulfat.

bei höheren Salzkonzentrationen festgestellt. Dieses Maximum umfaßt
einen breiteren Konzentrationsbereich als das erste und ist bei A, flavua
stärker als bei M. pusiÜua ausgeprägt.

Die fördernde Wirkung der höheren MgS 04 -Konzentirationen läßt
sich durch rein chemische Vorgänge, wie auch durch osmotische Ver
hältnisse in der Nährlösung nicht erklären ; sie steht mit der spezifischen
physiologischen Wirkung des Salzes MgS 04 in engem Zusammenhang.

Zum Schluß möchte ich Herrn Prof. A. Rippel für die Anregung wie
auch für die Unterstützung und Ratschläge während der Durchführung der
vorliegenden Arbeit meinen besten Dank aussprechen.

Literatur.

1) Buromsky.D., Mikrobiologija (russ.) 5, 800, 1936. — 2) Lohrmann, W.,
diese Zeitschr. 11, 329, 1940. — 3) Mothes, K., Planta 29, 67, 1938. —

4) Rabinovitz-Sereni, D., Boll. Reg. Staz. Pat. Veg. 18, 103, 1933. —

5) Rippel, A., Das Ertragsgesetz. In Honcamp’s Handb. d. Pflanzen-
ernährung. Bd. I, S. 602. Berlin, Springer, 1931. — 6) Deraelhen. R. Meyer,
Zeitschr. f. Pflanzenernährung usw. (A) 27, 267, 1933. — 7) Rippel, A.,
diese Zeitschr. 7, 210, 1936. — 8) Rippel, A.,u,0. Behr, ebenda 7, 584, 1936.
- 9) Rippel, A,, u. W. Lohrmann, Nachr. aus d. Biologie (Ges. d. Wiss.
Göttingen) 8, 239, 1940. — 10) Schoop, O., Deutsch. Tierärztl. Wochenschr.
42, 816, 1934. — 11) Tauaaon, V.O., Mikrobiologija (russ.) 6, 542, 1937. —
12) Walter, H., Bericht, d. Deutsch. Bot. Ges. LIV, S. 328, 1936.

(Aus dem Institut für Mikrobiologie der Universität Okittingen.)

Untersttchangen zur Morphologie und Biologie
der Mycobakterien des Bodens.

Von

0. V. Plotho.

Mit 16 Textabbildungen.

(Eingegangen am 15. Jrdi 1942.)

Seit etwa 50 Jahren sind neben den pathogenen Mycobakterien eine
große Zahl säurefester saprophytischer Formen beschrieben worden. Sie
stammten aus den verschiedensten Quellen, und fast jeder dieser Organismen
wuchs nach den Angaben der Autoren schnell und üppig auf allen gebräuch-
lichen Nährböden. Keiner besaß ein© Pathogenität im eigentlichen Sinne,
wenn auch starke Impfung bei den Versuchstieren Abszesse, vereinzelt sogar
den Tod verursacht haben soll. Di© Zahl der Originalbeschreibungen dieser
säurefesten Stämme wuchs schnell, aber sie waren oft so unzureichend, daß
es unmöglich war, di© Bakterien wieder zu erkennen. Daher gab es in der
Literatur ein© erheblich© Anzahl, die unter dem Namen ihres Autors oder
ihrer Herkunft umliefen und es war wahrscheinlich, daß manche unter ver-
schiedenen Namen bekannt© in Wirklichkeit die gleichen waren.

Das zeigte sich denn auch, als im Jahr© 1896 Lehmann und Neumann
zum erst/en Male ©in© systematisch© Einordnung der Mycobakterien unter-
nalimen. Für di© aus Böden verschiedenster Herkunft stammenden Formen
stellten sie auf Orimd eingehender Studien an 13 Stämmen zwei Arten auf,
die den Namen Myc. lacticola und Myc. phlei erhielten. Später fügten sie
diesen beiden Arten zwei weitere hinzu, so daß in der 7. und bisher letzten
Auflage ihrer baktei iologischen Diagnostik Myc. eos und Myc. luteun» neben
Myc. lacticola und phlei als Arten verzeiclmet sind.

Die im folgenden mitgeteilten Untersuchungen wurden an 27 Stäm-
men dieser vier Arten durchgeführt, von denen ich 21 selbst aus Stand-
orten verschiedenster Herkunft isolierte. Zu wiederholten Malen
wurden aus einem Ansatz mehrere Stämme isoliert, doch werden
offenbar gleiche nur einmal aufgeführt.

Isolierungsmethoden, Herkunft und systematische Einordnung der
untersueJiten Stämme.

Zur Isolierung wurden zwei verschiedene Methoden verwendet. Nach
der von Keraten angegebenen sollen durch Zusatz von 10 bis 20% Anti formin
nach einstündiger Einwirkung di© Begleitorganismen weitgehend geschwächt
bzw. abgetötet, und nur die Mycobakterien entwicklungsfähig sein. Ich
behandelte das tJrsprungsmaterial 1 Stunde lang mit einer 16%ig©n Anti-
fomxinlösung und strich nach sorgfältigem Auswaschen und Zentrifugieren
auf Petrischalen mit Nähragar, dem 0,6% Dextrose zugesetzt war, aus.
Nach der von Söhngen mitgeteilten Methode wird zur Isolation der Myco-
bakterien Paraffin, Benzin, Paraffinöl oder Petroleum als einzige C-Quelle
dem Näbrmedium zugesetzt. Bei den hier ausgeführten Isolierungen kam
Archiv fär Mlkrobiologrie. Bd. 13. 7 |

O. V. Plotho:

ausschließlich flüssiger Nährboden in der von Söhngen angegebenen Zu-
sammensetzung zur Verwendung (NH 4 CI 0,06%, K 2 HPO 4 0,06%, MgS 04
0 , 02 %, CaCOs 0 , 02 %). Mit ihm wurden 600 ccm Erlenmeyerkolben bis
zu 2 cm Höhe angefüllt und 1 % Paraffin naeh Erwärmen mit einer Pipette
auf die Nährlösung getropft. Jeder Tropfen erkaltet sofort und schwimmt
in Form eines kleinen Plättchens auf der Lösung. In den bei etwa 36” C
gehaltenen Kulturen erscheint nach 14 bis 16 Tagen am Bande der Plättchen
und auf ihrer Unterseite ein kleiner weißer bis gelblicher Belag, der häufig
MifCobakterien enthält. Die Anreicherung der Rohkulturen ist ebenfalls von
Söhngen beschrieben und erfolgte nach seinen Angaben.

Die Isolierungen wurden sämtlich im Herbst 1940 vorgenommen und
zu anderen Jahreszeiten nicht wiederholt, da Haag keinen Unterschied im
Ergebnis seiner Herbst- und Frühjahrsisolieningen feststellen konnte.
Nach ihm erscheint die Verteilung der "Bilden- Mycobakterien in der Natur
durchaus regellos, sowohl geographisch als auch jahreszeitlich.

Über den Erfolg der Isolienmgsmethoden, die Herkunft und die Stellung
der Stämme im System unterrichtet die Tabelle T.

Tabelle 1 .

Stellung im System

” ' *

Herkunft

. .. „

Isüliermethode

Myc. teatudinia

Sammlung des Roh. Koch-
Instituts Berlin*

„ laeticola var, perrugoaum

Grabenwasser

nach Söhngen

♦1

Sammlung des Hygieni-
schen Instituts Göt-
tingen *

ft »» ft f

dasselbe

—

tt tt tt -«

Komposterde

nach Söhngen

** tt tt tt

Sammlung des Rob. Koch-
Instituts Berlin

—

„ „ „ planum

Gartenerde

nach Söhngen

„ phlei var, perrugoaum

Sammlung der biologischen
Reichsanstalt Berlin*

—

»» tt tt tt

dasselbe

„ „ „ planum

Komposterde

Tümpelwasser

nach Söhngen

tt tt tt tt

„ Karaten

tt tt tt tt

Grabenwasser

„ Söhngen

»• tt t^ tt

„ Karaten

„ luteum

Schlamm

„ Söhngen

„ eoa

Walderde

tt tt

Sekundärkolonie
von Stamm 15

tt tt

frisches Heu

nach Söhngen

tt tt

Ackererde

tt tt

Schlamm

tt tt

Proactinomyeea ap.

Komposterde

tt tt

tt \ tt

Gartenerde

tt tt

•f

*t tt

tt tt

Walderde

tt tt

Pfützenwasser

„ Karaten

tt tt

Tümpelwasser

Strafenstaub

Atypische Form

„ Söhngen

* Den Herren Profesaoreu Xant/«;- Berlin und Göttingen, sowie Herrn Oberregierungsrat

S<app-Berlin sage Ich auch an dieser Stelle für die liebenswürdige t^berlaasung der Stämme meinen
verbindlichsten Dank.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

Ein Blick auf die Tabelle läßt sofort die Überlegenheit der Iso-
lierungsmethode nach Söhngen erkennen. Unter 20 Proben wurden bei
ihrer Anwendung nur in drei Ansätzen keine Mycobakterien gefunden.
Das Antiformin verfahren erwies sich dagegen als weit unergiebiger.
Unter der gleichen Anzahl von Proben gelang nur viermal die Heraus-
züchtung von Mycobakterien, Wenn Kersten seinerzeit von seiner
Methode sagen konnte, daß sie als die sicherste ,,zur Züchtung der säure-
festen Saprophyten angesprochen werden könne“, so ist sie heute durch
das Söhngen^che Verfahren weit überholt.*

Die Übersicht über die Herkunft der Stämme zeigt von neuem das
ubiquitäre Vorkommen der Mycobakterien im Boden, das von vielen
Forschem festgestellt ist. Das Ursprungsmaterial besteht hier aus-
schließlich aus Bestandteilen des Bodens oder seiner unmittelbaren
Abkömmlinge; auf Proben aus Milch, Butter, Wasserleitungen u. dgl.
wurde verzichtet, da im Boden die Ursprungsstätte auch der in solchem
Material gefundenen Bakterien liegen dürfte. Aus der geringen Zahl
der Fehlansätze kann weiter auf den hohen Prozentsatz geschlossen
werden, den die Mycobakterien unter der gesamten Mikroflora des
Bodens einnehmen. Es iöt wahrscheinlich, daß eine beträchtliche Zahl
der in Bodenuntersuchungen als ,, Kokken“ angegebenen Organismen
in Wirklichkeit zur Familie der Mycobakterien gehören. Der Stamm 16
ist, wie in der Tabelle I vermerkt, aus Sekundärkolonien des Stammes 15
hervorgegangen. Etwa 4 Wochen nach seiner Isolierung entstanden auf
seiner Kultur viele runde, weiße Kolonien, die sich nach ihrer Abimpfung
korallenrot färbten. Hoog beschreibt eine Reihe solcher Abtrennungen,
bei den hier besprochenen Stämmen wurde das Phänomen nur einmal
beobachtet.

Die Tabelle I enthält, der Einteilung von Lehmann und Neumann
folgend, Vertreter der Arten Myc. lacticola phlei, eos und luteum. Die
Stellung der beiden letztgenannten ist nicht unumstritten, da die
amerikanischen Autoren sie nicht als Arten anerkennen. Amerikanische
Forscher versuchten in neuerer Zeit die saprophytischen Mycobakterie/n
durch Aufstellen von Standardmerkmalen zu klassifizieren. Dabei
wurde zuerst von Thomson das Wachstum bzw. Nichtwachstum bei
47^0 als Klassifikationsgrund angewandt. Oordon untersuchte dann
252 S+ämme auf das Überleben bzw. Absterben bei einer Erw^ärmung
auf 600 C während 1 Stunde. Sie teilte, Thomson folgend, ihre Kulturen
in drei Gruppen ein, bei denen das Verhalten der Organismen diesen
thermischen Faktoren gegenüber die Hauptbasis der Klassifikation
darstellt. In der Arbeit von Qordon und Hagan wird diese Gruppen-
einteilung beibehalten, die Unterteilung in Untergruppen aber ver-
vollständigt durch Erweiterung der Untersuchung über das Verhalten
der Bakterien in Lösungen mit verschiedenen Kohlenstoff quellen. Diese
Einteilung übernimmt Bergey in der neuesten Auflage seines diagnosti^/

O. V. Plotho :

sehen Handbuchs. Sie zeigt in der Gruppe I (Wachstum bei 47® C,
Absterben bei Erhitzen auf 60® C während 1 Stunde) eine große Ein-
heitlichkeit, da alle Stämme bis auf vier (die die Untergruppe T b bilden)
Stämme vom Typus perrugosum sind. In der Untergruppe I b
erscheinen die £ar^»cokz-Stämme vom Typus planum. Die gleiche
Einheitlichkeit weist die Gruppe III auf (Wachstum bei 47® C, Über-
leben bei Erhitzen auf 60® C während 1 Stunde). Alle Stämme in ihr
sind Stämme. Die Gruppe II dagegen (kein Wachstum bei 47® C,
Absterben bei Erhitzen auf 60® C während 1 Stunde) ist heterogener.
Sie umfaßt alle sogenannten Kaltblüterbakterien, in der Untergruppe III c
erscheint Myc, testudinis. Das Genus Mycobacterium wird also von den
amerikanischen Forschem auch heute noch begrenzt durch die streng
säurefesten Bakterien. Bei den Boden- erscheinen nur
Myc. lacticola und Myc. pMei als Arten, ebenso wie Winslow und Mit-
arbeiter nur diese beiden Arten gelten lassen wollten. Bergey reiht
in der 5. Auflage seines Handbuches (1939) Myc. eos bei den Proactino-
myceten ein unter der Bezeichnung Proactinomyces rubropertinctum,
während er es in der 1. Auflage (1923) als Serratia rubropertinctus be-
zeichnet. Auch Jensen (1934) stellt Myc. eos zu den Proactinomyceten.
Tn Einzellkulturen ähnelt aber Myc. eos in keiner Weise den Proactino-
mycelm. und nach Beobachtung der Entwicklung solcher Einzel -
Individuen ist die Zuordnung zu den ProacXirvomyceten sicher nicht zu
rechtfertigen, was aus den weiter unten folgenden Angaben über das
mikroskopische Bild klar hervorgeht. Das gleiche gilt für Myc. luteum,
das Bergey ebenfalls als wahrscheinlich zu den Proactinomyceten ge-
hörend bezeichnet. Es sei aber, so heißt es weiter, zu ungenügend be-
schrieben, um es mit Sicherheit klassifizieren zu können. Myc. luteum
weist aber in EinzePkulturen ebenfalls keinerlei Merkmale auf, die seine
Einreihung bei den Proactinomyceten rechtfertigen könnten, es er-
scheint vielmehr, wie auch Hactg feststellte, als eine gute Art der Myco-
bakterien. Vielleicht gelingt es einmal, auch auf serologischem Wege
zu einer zweifelsfreien Einordnung der umstrittenen Arten zu kommen
(Ebina).

Die Stämme 21 bis 26 stellen dagegen zweifellos Übergangsformen
zwischen Mycobakterien und Actinomyceten dar, die als Proactinomyceten
bezeichnet werden können. Sie ähneln sämtlich dem von Qray und
Thomton (1928) erstmalig als Myc. a^este beschriebenen Organismus,
der von Jensen (1931) als Proactinomyces agrestis bezeichnet wird; auch
Bergey wählt 1939 die gleiche Benennung, während er ihn in der 3. Auf-
lage seines Handbuchs 1930 als Actinomyces agrestis bei den Actino-
myceten unterbringt.

An letzter Stelle ist in dei Tabelle I als atypische Form ein
Bakterium aufgeführt, das sich in die obigen Arten nicht ohne

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

weiteres einordnen ließ. Seine Stellung wird bei der Betrachtung
seiner Morphologie diskutiert werden.

Makroskopisches Bild der Stämme unter verschiedenen
Umweltbedingungen.

Einen Überblick über die Beschaffenheit, Konsistenz und Färbung
der einzelnen Stämme, sowie ihr Verhalten unter anaeroben und sauer-
stoffarmen, aber kohJensäurereichen Bedingungen vermittelt Tabelle II.

Was die Beschaffenheit und Konsistenz der Kolonien betrifft, so
fällt in der Tabelle TI der Unterschied im Wachstumscharakter zwischen
gefalteten (perrugosum) und glatten (planum) Modifikationen der Arten
Lacticola und Phlei soforf auf. Die perrugosumartigen Formen sind
gekennzeichnet durch ein mattes, trockenes, brüchiges, mehr oder
weniger stark radiär gefaltetes Wachstum; zähe oder gallertartige
Exsudate fehlen bei ihnen. Bei einer Temperatur von 35^0 werden
am 4. bis 5. Kulturtag die jungen, durchscheinenden Kolonien dicker
und undurchsichtig, und die Faltung setzt ein. Die glatten Vertreter
bilden dagegen von vornherein meist glänzende, feuchte und ungefaltete
Kolonien, sie sondern zähe Umsetzungsprodukte in mehr oder weniger
großer Menge ab und daher sind ihre Kolonien von teigiger, wachs-
artiger bis weicher Beschaffenheit. Auch im Alter zeigen sie die gleichen
Eigenschaften. Dieser Unterschied iin Habitus ist auf den verschieden-
sten Nährböden festzustellen. Er ist vorhanden auf Fleischextrakt -
Pepton-Agar mit und ohne Zusatz einer besonderen Kohlenstoffquelle,
wie auch auf Agar von bekannter Zusammensetzung, z. B. dem Aspar-
aginagar nach Jensen (1934) i. Am wenigsten ausgeprägt erschien er
auf einem als Hefekochsaft bezeichneten Agar 2^ der an sich einen aus-
gezeichneten Nährboden darstellt, die Konsistenz der Kolonien aber
stark beeinflußt, indem er ihre Brüchigkeit weitgehend auf hebt. Ein
Unterschied zwischen gefaltetem und glattem Wachstum besteht aber
auch auf ihm.

Die mit perrugosum und planum bezeichneten Modifikationen
entsprechen den Benennungen ,,R-Form“ und ,,S-Form“ der amerikani-
schen Forscher, die sich von ,,rough Type“ und ,,smooth Type“ her-
Jeiten. Die willkürliche Aufspaltung in diese beiden T3pen soll auf
bestimmten Nährböden gelingen (Gildemeister)^ Versuche nach dieser

’ Dextrose 1%, Asparagin 0,1%, KjHP 04 9,1%, MgS 04 0,06%,
NaCl 0,06%. — * 100 g Bäckerhefe + 1 Liter Wasser 2 Stunden bei 26® C
stehenlassen, 16 Minuten bei 2 Atm. Druck sterilisieren, absetzen. Zu-
sammensetzung des Nährbodens: Hefekochsaft 10 ccm. Aqua dest. 90 ccm,
Mannit 2%, K 2 HPO 4 0,02%, KH 2 PO 4 0,03%, MgS 04 0 , 020 /^, NaCl
0 , 01 %, CaS 04 0,0006%.

4 /

O. V. Plotho:

Farbe gelb
'acbstum gut,
Farbe hellrot

Tabelle II (Fortsetzung;.

Moiphologie und Biologie der Mycobakterien. 99

100

O. V. Plotho :

Richtung wurden hier nicht angestellt. Der Stamm 7 verkörpert keinen
ausgesprochenen S-Typ, er ist, wie die Tabelle angibt, in älteren Kulturen,
in geringem Maße gefaltet, in Flüssigkeitskulturen bildet sich ein dünnes
Oberflächenhäutchen, während die ausgesprochenen S-Typen keine
Neigung zeigen, an die Oberfläche zu gehen. Die Kulturen von Stamm 7
sind jedoch weich und das Ausbleiben des Farbumschlags beim fort-
schreitenden Wachstum, worauf sofort eingegangen werden soll, ist
bezeichnend für den S-T 3 rp der Art ; der Stamm stellt also eine Zwischen-
form zwischen beiden Modifikationen dar. Bei den Eos- und Liiteum-
Stämmen fehlt die besprochene Aufteilung in die zwei Modifi-
kationen.

Die Farbstoffbildung ist bei einigen Stämmen sehr ausgesprochen,
was aus der Tabelle II deutlich hervorgeht. Von Dextrose als C- Quelle
wird sie gefördert, Glycerin ist in dieser Beziehung weniger günstig,
Asparagin unterdrückt die Farbstoff bildung, ebenso anorganische
Stickstoffquellen. Am geringsten ist die Färbung der Stämme.

Der für die gefalteten Formen in der Tabelle verzeichnete Farbumschlag
der jungen, weißlichen, bis leicht gelben Kolonien in tiefer gelb und
dunkelgelb gefärbte im Verlauf des weiteren Wachstums ist sehr charak-
teristisch. Qordon fand bei Stämmen, die außerhalb dieser Gruppen
stehen, nur ein einziges Mal den gleichen Umschlag. Bei Zimmertempe-
ratur entwickelt sich nach einer Kulturdauer von 4 bis 5 Wochen immer
ein mehr oder weniger intensives Gelb, das unter den untersuchten
Stämmen bei Stamm 6 fast zu einem Ockergelb wird. Bei dem glatten
Stamm findet dagegen, wie bereits erwähnt, dieser Umschlag
nicht statt, seine Kolonien besitzen von vornherein eine weißliche
Färbung und behalten sie während der ganzen Kulturzeit. Weitaus
kräftiger gefärbt sind alle Stämme der übrigen Gruppen. Unter ihnen
gibt es nicht wenige, die schöne, intensive Rot- und Gelbtöne besitzen.
Die von Krassilnikow (1934 und 1938) beschriebenen grünlichen bis
braunen Farbtöne fehlen allerdings bei den untersuchten Organismen,
sie scheinen verhältnismäßig selten aufzutreten. Überall finden sich
die Farbstoffe aber nur als Eigenfarbe, eine Verfärbung des Agars
fand nie statt, auch nicht bei Myc. teatvdinis, für das Hdag eine solche
angibt. Die Bildung der Eigenfarbe aber war bei allen von mir unter-
suchten Stämmen während der ganzen Untersuohungszeit auf den
gleichen Nährböden und unter sonst gleichen Bedingungen konstant.

Zur Entscheidung der Frage über den Einfluß des Faktors ,, Licht“
auf Auftreten und Intensität der Farbstoffbildung wurden eine Reihe
von Versuchen mit den kräftigsten Farsbstoffbildnem durchgeführt.
Die Kulturen wuchsen bei Zimmertemperatur auf Nähragar mit 1 %
Dextrose, das ph betrug 6,8 bis 7,0; die belichteten standen vor einem
Nordfenster, so daß sie direktem Sonnenlicht nicht ausgesetzt waren.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle III zusammengefaßt.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien. 101

Tabelle III.

stamm

3 Tage alte Kulturen

12 Tage alte Kulturen

28 Tage alte Kulturen

belichtet

unbelichtet

belichtet

unbelichtet

belichtet

unbelichtet

ziegelrot

hell

ziegelrot

blaßgelb

gelb

hellgelb

tiefgelb

gelb

blaßrot

rot

blaßrot

hochrot

schwächer

rot

schwach rot

schwach

rötlich

korallenrot

blaßrosa

korallenrot

»»

blaßrot

intensiv rot

blaßrot

hochrot

schwach rot

rot

blaßrosa

rot

Die Zusammenstellung läßt erkennen, daß die Färbung sowohl in
Tageslicht- als auch in unbelichteten Kulturen frühzeitig auftritt, daß
aber ihre Intensität bereits in jungen Kulturen abhängig ist vom Zutritt
des Lichtes (Stamm 14 und 16). Diese Abhängigkeit tritt bei den 12 Tage
alten Kulturen sehr deutlich in die Erscheinung. Alle Tageslicht -
kulturen sind bedeutend intensiver gefärbt als die unbelichteten. Auch
beim Abschluß der Versuchsreihe ist diese? Unterschied noch deutlich
wahrnehmbar, dem Licht kommt also offenbar ein starker Einfluß auf
die Farbstoff bildung zu. Dieses Ergebnis stimmt überein mit Beob-
achtungen an anderen Mikrooiganismen, die an der Luft oder in ober-
flächlichen Schichten des Bodens leben und daher den Lichtstrahlen
ausgesetzt sind und die, wenn sie bei Lichtabschluß kultiviert werden,
die Fähigkeit der Farbstoffbildung geringer entwickeln oder sogar ver-
lieren (Danilow, Ebeling). Vor kurzem veröffentlichte Barbudieri
Beobachtungen an einem, einen grau -violetten Farbstoff bildenden,
nichtpathogenen Mycobacterium, das ebenfalls den Farbstoff im diffusen
Tageslicht, nicht aber im ,, Halbdunkel“ seines ursprünglichen Standorts
entwickelte. Er schreibt den violetten und ultravioleti^en Teilen des
Sonnenlichtspektrums hierbei die größte Wirkung zu.

Über die Natur der Farbstoffe von Mycobakterien liegt eine neuere
russische Arbeit mit englischer Zusammenfassung vor (Kries und Koreniako).
Die Verfasser erreichten die Differenzierung der Pigmente durch die von
dem russischen Botaniker Tswett 1906 erstmalig veröffentlichte Ausführungs-
form der Adsorptionsanalyse, nach der sich die einzelnen Komponenten
auf Grund ihrer verschieden starken Adsorption an ein farbloses Adsorbens
als farbige Zonen „chromatographisch“ erkennen lassen. (Zusammen-
fassende Darstellung bei Zechmeister und Choknoky.) Krise und Koreniako
unterteilen die Farbstoffe der Mycobakterien vorläufig in 3 Gruppen:

1. Fa.rb8toffe, löslich in Wcusser, Alkohol und anderen organischen
Lösungsmitteln .

2. Farbstoffe, unlöslich in Wasser, löslich in Alkohol imd anderen organi«
sehen Lösungsmitteln.

3. Farbstoffe, unlöslich in Wasser, unlöslich in Alkohol und anderen

organischen Lösungsmitteln. 4 /

102

O. V. Plotho :

In die Gruppe 1 fällt ein violetter Farbstoff von Myc. cyaneum KrciSBÜ-
nikoWf zur Gruppe 2 gehören die Carotide verschiedener Stämme, das
Phytocoll des Tvberkeibctzülvs und die Pigmente von Myc. citreum Krassil-
nikoWy der Gruppe 3 entspricht ein grüner, fest an das Zellplasma gebundener
Farbstoff von Myc. viridis Tauaon.

Die Methode der chromatographischen Adsorption wurde besonders
von H. Brockmann weiterentwickelt, der in der Hauptsache Aluminium -
oxyd als Adsorbens verwendete, das sich durch ein ausgeprägtes Adsorptions-
vermögen für viele Stoffklassen auszeichnet, welches aber weitgehend ab-
hängig ist von der Art der Gewinntmg {Holmes) und dem Wassergehalt des
Oxyds. Brockmann regte daher vor einigen Jahren die Herstellung eines
Aluminiumoxyds mit standardisiertem Adsorptionsvermögen an, und ein
solches wird heute von der Firma Merck Mntev der Bezeichnung „Aluminium-
oxyd zur Adsorption nach Brockmann'^'^ in den Handel gebracht. Das
Präparat wurde zu den weiter unten mitgeteilten Versuchen benutzt. Es
besitzt den Aktivitätsgrad III, was durch Prüfung mit den entsprechenden
Farbstoffgemischen vor seiner Anwendung nachgeprüft wurde (Methode
von Brockmann imd Schoddsr).

Da bei den hier untersuchten Stämmen violette und grüne Farb-
stoffe nicht Vorkommen, so war es wahrscheinlich, daß die Farbstoffe
der pigmentierten Stämme in die von Krise und Koreniako aufgestellte
Gruppe 2 gehörten. Es zeigte sich denn auch, daß sie sämtlich in
Wasser unlöslich waren, daß aber alle leicht mit absolutem Methyl-
alkohol extrahiert werden konnten. Zur Ausführung der Versuche
wurden die Kulturen der Stämme 8, 14, 17 und 20, die die kräftigste
Färbung zeigten, vom Nährboden abgehoben. Eine Zerreibung der
Zellen mit Kieselgur, die Krise und Koreniako empfehlen, erwies sich
als unnötig, da die Farbstoffe aller Stämme auch ohne sie leicht in den
Methylalkohol gingen. Dieser färbt sich bei den Stämmen 17 und 20
dabei orangerot, bei dem Stamm 8 entsteht eine hellgelbe Farblösung,
der Farbstoff des Stammes 14 geht mit tief gelber Farbe in den Alkohol
über. Eine Adsorption an Aluminiumoxyd ist aber nur aus Lösung in
Benzin, Petroläther oder Benzol möglich, daher mußten die Farbstoffe
aus der Methanollösung in eine Lösung dieser Substanzen übergeführt
werden. Zur Überführung wurde eine Lösung von Petroläther und
Benzol im Verhältnis 4 : 1 gewählt, in die die Farbstoffe aus der Methanol -
lösung aber nur nach starker Verdünnung mit Wasser übertraten. Das
Chromatogramm des Stammes 14 besteht aus einer gelben und einer
darunterliegenden schmalen grünen Zone, der Farbstoff des Stammes 8
konnte nicht identifiziert werden, weil er wahrscheinlich zu stark
verdünnt war, die Chromatogramme der Stämme 17 und 20 zeigen
eine orangefarbene Zone, sie enthalten Carotin.

Dieses Ergebnis wurde bestätigt durch die von Moliech angegebene
Methode zum Nachweis von Carotin. Hierzu wurde Material der
Stämme 8, 14, 17, 20 und 18 in 40%igem Alkohol, der 20% Kalium-
hydroxyd enthält, gelegt und die Beagensgläschen mit Paraffin luftdicht

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

103

verschlossen, um die Absorption von atmosphärischer Kohlensäure
durch die Kalilauge zu verhindern. Die Versuchsröhrchen standen
mehrere Tage bei 22^ C im Dunkeln. Stamm 17 und 20 zeigten darauf
prächtige Carotinkristalle. Sie sind braunorange und bilden teilweise
einzelne Nadeln, teilweise große Stern- und büschelförmige Aggregate
von solchen. Nach vollständigem Auswaschen der Kalilauge mit
destilliertem Wasser und möglichst vollständigem Entzug des Wassers
im Exsikkator färbten sich die Kristalle mit konzentrierter Schwefel-
säure und konzentrierter Salpetersäure tief indigoblau. Bei Anwendung
von Salpetersäure verschwand die Farbe jedoch bald, auf Zusatz von
Wasser werden die Kristalle sofort entfärbt. Bei Stamm 18 lag der
Farbstoff nur in Form von zahlreichen gelben Tropfen vor. Diese
färbten sich nach Auswaschen der Kalilauge und Entfernen des Wassers
ebenfalls mit den genannten Reagentien tief blau. Bei den Stämmen 8
und 14 wurden keine Carotinkristal ie gefunden.

Bei der Durchsicht der 4. Vertikalreihe der Tabelle II ergibt sich,
daß keiner der untersuchten Stämme Glßlatine verflüssigt. Alle wachsen
längs dem oberen Teil der Impf rinne üppiger als an ihrem unteren Ende,
was zweifellos mit dem Sauerstoffbedürfnis der Organismen zusammen-
hängt.

Die Ergebnisse der 5, Vertikalreihe der Tabelle II gehen zurück
auf eine Atmosphäre vermehrter Kohlendiox^’d- und verminderter
Sa uerstoff Spannung .

Sie wurde hergestellt auf die kürzlich von Kunz angegebene einfache
und billige Weise, indem in einem luftdicht verschließbaren Gefäß, nach
Einstellen der beimpften Schrägagar -Reagensgläser, eine Paraffinkerze
angezündet wird. Nach kurzem Öffnen des Deckels, das ein Entweichen
eines Teiles der erwärmten und daher ausgedehnten Luft ermöglicht, wird
das Gefäß luftdicht verschlossen. Die Kerze erlöscht bald, es hat sich in
dem Gefäß Kohlendioxyd und Wasser gebildet, während der Sauerstoff
zum großen Teil verschwunden ist.

Die auf diese Weise vorgenommene Veränderung in der Zusammen-
setzung der umgebenden Luftschicht scheint jedoch für die Entwicklung
der Mycobakterien von geringer Bedeutung zu sein. Alle Lacticöla-
Stämme, bis auf den Stamm 6, der nur schlecht vorwärts kam, wuchsen
gut, Färbung und Beschaffenheit der Kolonien waren ebenfalls ziemlich
normal. Auch die PAZci-Stämme entwickelten sich gut, Stamm 8 zeigt
aber eine Unterdrückung der Faltung, außerdem ist die Farbstoff-
bildung gehemmt. Das gleiche Bild unterdrückter Farbstoff bildung
weisen auch alle übrigen Kulturen auf, während das Wachstum durch
die veränderten Umweltsbedingungen weniger beeinflußt wird.

Um das Verhalten der Bakterien unter streng anaeroben Be-
dingungen zu prüfen, wurde ein luftdicht verschlossenes Kulturgefäß,

104

O. V. Plotho :

das die beimpften Versuchsröhrchen enthielt, an der Wasserstrahl-
pumpe so weitgehend evakuiert, daß es unter Berücksichtigung eventuell
eingetretener kleiner Fehler nur noch einen Sauerstoffpartialdruck von
der Größenordnung etwa eines Millimeters enthielt. Unter diesen Be-
dingungen fand, wie die 6. Vertikalreihe der Tabelle TI zeigt, bei fast
allen Stämmen nicht die geringste Entwicklung statt. Nur bei 3 Stämmen
hatte ein sehr schwaches Wachstum eingesetzt. Der unter allen Ver-
hältnissen kräftig und schnell wachsende Stamm 8 wies eine geringe
Entfaltung auf, die bei den Stämmen 21 und 24 noch kümmerlicher
war. Zudem ließen alle drei Kulturen auch nicht die geringste Spur
einer Färbung erkennen. Trotz der schwachen und unnormaJen Ent-
wicklung der drei erwähnten Stämme dürfen aber die Mycobakterien
als streng aerobe Organismen bezeichnet werden, jedenfalls ist zu ihrer
normalen Ausbildung die volle Sauerstoffspannung der atmosphärischen
Luft notwendig.

Mikroskopische Untersuchung der Arten.

Es ist bekannt, daß die Mycobakterien im mikroskopischen Bild
einen verwirrenden Pleomorphismus auf weisen. Lange und kurze,
gebogene und gerade, ungleich dicke, parallel und winkelig gelagerte
Stäbchen, kokkoide Formen, völlig sphärisch erscheinende Individuen
sind bei entsprechender Vergrößerung bei willkürlich einer jüngeren
Agarkultur entnommenen Probe fast in jedem Gesichtsfeld erkennbar.
Dazu kommt, daß die Art und Reichhaltigkeit des Nährsubstrats und
die Häufigkeit des Überimpfens den Habitus der Stämme weitgehend
verändern können, viel stärker als das bei anderen Bakterien der Fall
zu sein pflegt. Häufig überimpfte Kulturen von guten Medien bestehen
aus verhältnismäßig langen Stäbchen, während bei seltenerer Über-
impfung und ärmeren Nährböden gleichaltrige Kulturen viel gedrungenere
Formen besitzen, die frühzeitig in die Kokkenform übergehen. Endlich
finden sich bei vielen Mycobakterien in verschiedenen Altersstadien
verzweigte Stäbchen bzw. Fäden, die das mikroskopische Bild noch
mehr verwirren.

Jenem (1934) teilte die Myoobakterim in 2 Gruppen ein und ermöglichte
dadurch auf einf eiche Weise eine erste Orientierung über die Zugehörigkeit
eines neu auf gefundenen Steunmes zu einer bestimmten Art. Die erste
Gruppe, Subgenua A, ist nach ihm gekennzeichnet durch vorwiegend parallele
Lagerung der Stäbchen, sogenanntes Pallisadenwaohstum. Es wurde zuerst
von Oraham Smith beobachtet und als „slipping growth“ beschrieben. Diese
Benennung ist sehr bezeichnend, denn nach der Teilung gleiten die Tochter-
zellen an der Ausgangszeile vorbei, wrie das die Abb. 1 recht gut erkennen
läßt. Bei Wiederholimg dieses Vorgangs entstehen dann parallele Bündel
von Zellen, die die Bezeichnung als Pallisadenwachstum rechtfertigten. Die
zweite Gruppe bezeichnete Jenem als Subgenue B. Sie zeigt zumeist winklige
Lage der Einzelstäbchen, das HiU „snapping growth** nannte. Bei diesem

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

105

Wachstumsmodus stellt sich die Tochterzelle sehr schnell (snapping!) in
einen Winkel zur Ausgangszeile und behält diese Lagerung, die sehr charak-
teristisch für die Kulturen der meisten Mycobakterien ist, bei.

Bei allen von mir untersuchten Organismen finden sich die beiden
Extreme gemischt, womit ich die Angaben von Jensen bestätigen konnte ;
jedoch herrscht bei den Z/oc^tco/a- Stämmen, wie beim humanen Tuberkel-
baziUus, Pa llisaden Wachstum vor (Gardner). Im tuberkulösen Sputum
findet sich allerdings, wie ich häufig feststeJlen konnte, meist winkelige
Lage der Stäbchen, was gut zu der Feststellung Oerskows (1935) stimmt,
daß das Wachstum des Tuberkelbazillus mit Winkelwachstum beginnt,
das jedoch in Kultur durch gleitendes Wachstum abgelöst wird. Jedenfalls
ähneln die Kulturen des humanen TuberkelbaziUus und die der Ijocticola-
Stämme einander in hohem Maße. Bei den übrigen Arten findet sich
vorwiegend der Wachstumsmodus von Jensens Subgenus B, das Winkel-
wachstum, wenn auch bei Myc. luteum in jungen Kulturen nicht selten
parallele Lagerung der Stäbchen angetroffen wird. In älteren überwiegt
aber auch bei dieser Art entschieden das Winkelwachstum. Dieses
tritt bei den Phlei- und JE'o«- Stämmen auch in jungen Kulturen stark
in den Vordergrund.

In der Literatur nehmen ohne Zweifel Erörterungen über die Ver-
zweigung der Mycobakterien die erste Stelle ein. Die Beobeichtungen iil)ei
angeblich reich verzweigte Formen stammen jedoch großenteils von alteren
Autoren (Metschnikmv, Majfuci^ Coppen Jones^ Bruns), die ihre l'nter-
suchimgen an mit Carbolfuchsin gefärbten Präparaten vorn ahmen. Wenn
zudem die mikroskopische Vergrößerung unzureichend ist, was häufig der
F'all war, so ist eine genaue Beobachtung und Beurteilung unter diesen
Verhältnis.sen kaum rnöglicti. Auf das Konto der benutzten geringen Ver-
größerung (750) sind wahrscheinlich auch die Aiigal^en Oerskmos (1932) zu
setzen, der zahlreiche Verzweigungen bei den Mycobakterien feststellte.
Jensen (1934) unterzog ebenfalls die Verzweigung einer genauen Prüfung.
Er charakterisiert in dieser Beziehung Myc. lactic^la, indem er sagt: „Wenn
ül)erhaupt, so ganz selten Verzweigung“. El:)enso fand er bei zwei Phiei-
Stämmen , »selten Verzweigung“. Wykoff und Smithbom, sowie Wykoff in
zwei weiteren Arbeiten, setzten den Film bei Untersuchungen an Myc.
phlei und mehreren Kaltblüterbakterien sowie einem nicht säurefesten
Stamm ein und fanden, daß verzweigte Stäbchen gelegentlich vorkämen
in Kulturen des glatten und häufiger in Kulturen des gefalteten Typs.
Aber die Vergrößerung, bei der sie diese Beobachtungen machten, betrug
nur 350! ln einer sorgfältigen neueren Arbeit untersuchten Carter und
Hastings mehrere saprophy tische Mycobakterien sowie einen Stamm von
Myc. gaUinctceum in Einzellkulturen, die mit dem Mikromanipulator isoliert
wurden. Bei Beobachtungen im hängenden Tropfen mit 1426facher Ver-
größerung fanden sie niemals Verzweigung. Nur bei 440facher Vergrößerung
sahen sie beim glatten Typ von saprophytischen Bakterien Formen, die als
verzweigt angesprochen werden konnten, die sie aber als pseudo verzweigt
bezeichne ten.

Ein Überblick über die Literatur ergibt also kein klares Bild
über die Morphologie der Organismen.

106

0. V. Plotho :

Um zu einem gesioherten Urteil zu gelangen, wurde zunächst
versucht, Bakterienmaterial aus Zonen gleicher Alteirsstufen zu unter-
suchen. Zu diesem Zwecke wurden Petrischalen nur in der Mitte der
Platte mit möglichst wenig Material beimpft (Piekaraki). Die glatten
Formen wuchsen dann konzentrisch um die Impfstelle herum und es
konnten Präparate aus den Zonen annähernd gleichen ^ters hergestellt
werden. Im Miljxoskop wies aber auch jedes Gesichtsfeld von ,, gleich-
altrigen“ Bakterien eine Vielfalt von Erscheinungsformen auf und bei
den gefalteten Tjrpen ließ sich die geschilderte Methode überhaupt
nicht verwenden, weil ,, gleiche“ Alteyszonen bei ihnen in der einfachen

Fig. 1.

Fig. 2.

Flg. 3.

Fig. 4.

1 2 3

Fig. 5. Flg. 6.

13 2V laib 3aSb

Abb. 1. Entwicklung einer Eiuzellkultur von Stamm 4.

Fig. 1 = Auagaugaetäbchen; Fig. 2 = Entwicklungaatadium 6 Stunden nach der Impfung;
Fig. 3 = Entwicklungaatadium 11 Stunden nach der Impfung; Flg. 4 « Kntwickliinga-
stadium 14 Stunden nach der Impfung; Fig. 5 == Entwicklungaatadium 24 Stunden imch der
Impfung; Fig. 6 » Entwicklungaatadium 31 Stunden nach der Impfung.

Weise wie bei den glatt wachsenden Bakterien nicht feststellbar sind.
Daher erschien es aussichtslos, aus Vielzellkulturen überhaupt eine
sichere Beurteilung der Entwicklung von Mycobakterien zu erreichen.
Es wurde deshalb ganz davon abgesehen, Vielzellkulturen zur Unter-
suchung der morphologischen Verhältnisse heranzuziehen.

Die im folgenden mitgeteilten Ergebnisse gründen sich ausschließlich
auf eine große Zahl von Beobachtungen an Einzellkulturen. Diese
wurden zum Teil mit dem Mikromanipulator isoliert, zum Teil wurde
zur Untersuchung einzelner Zellen die Deckglaskulturmethode nach
Fortner herangezogen, die zur fortlaufenden Kontrolle des Wachstums
einzelner Zellen auch unter Verwendung stärkster Vergrößerungs-
systeme vorzüglich geeignet ist.

Von den untersuchten Organismen lieferte Stamm 4, der als erster
besprochen sein mag, sehr charakteristische Bilder.

Abb. 1 zeigt die Entwicklung einer Einzellkultur dieses Stammes
auf dem oben erwähnten Hefekochsaftagar, der mit Na OH auf das
Ph 7 eingestellt war. Die Kulturtemperatur betrug 28^0, die Ver-
größerung 1080. Die Beobachtungen wurden während der Tages-
stunden in Abständen von 40 bis 60 Minuten wiederholt. Die Fig. 1
der Abb. 1 stellt das Ausgangsstäbchen dar, Fig. 2 das erste Ent-
wicklüngsstadium, das 6 Stunden nach der Impfung entstand. 5 Stunden
später hatte Stäbchen 2 sich von neuem geteilt (Fig. 3), nach weiteren

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

107

Abb. 2.

Einzellkultur von
bt4tmin 4: 31 Stun-
den alt, V ergrößeninK
1 : 1250.

3 Stunden bot die kleine Kolonie das Bild der Fig. 4. Stäbchen 3 hatte
sich verlängert und fast ganz unter das Stäbchen 2 geschoben. 24 Stun-
den nach der Impfung hatte Stäbchen 3 sich ebenfalls geteilt und
alle hatten sich merklich verlängert (Fig. 5). 7 Stunden später ließen
sämtliche Stäbchen Teilungsstadien erkennen (Fig. 6), die auch in
der photographischen Wiedergabe der Beobachtungsreihe deutlich zu
erkennen sind (Abb. 2). Die junge Kolonie hatte
also bis zu dem hier wiedergegebenen Stadium
31 Stunden zu ihrer Ausbildung gebraucht. Die
weitere Entwicklung vollzog sich bedeutend schneller
und die Verfolgung der Teilung der einzelnen Stäb-
chen war nicht mehr möglich. In den ersten 24 Stun-
den hatten sich die Stäbchen viermal geteilt, so daß
die durchschnittliche Teilungszeit 6 Stunden betrug.

Carter und Hartings sprechen von einer durchschnitt-
lichen Teilungszeit von ,, ungefähr 5 Stunden“, was
mit den hier beobachteten Zeiten ziemlich gut über-
einstimmt. Aber diese Zahlen besagen nicht viel,
denn die ersten wahrnehmbaren Verändeningen auf neuem Substrat
hängen ab von der Lage der Einzelstäbchen zueinander. Je isolierter
ein Stäbchen liegt, um ho länger ist die I^atenzzeit bis zum Waohstums-
beginn auf dem neuen Medium. Liegen die Stäbchen relativ dicht
nebeneinander, so beginnt die Teilung schneller
und das Teilungsintervall ist kürzer. Das gilt
für die Kulturen aller Stämme.

Wie bereits erwähnt, läßt die ßeobachtungs-
reihe sehr gut die Entstehung des Pallisaden-
waclistums erkennen. Weiter ist klar erkenn-
bar, daß in den ersten Entwicklungsstadien an
den Stäbchen keine Verzweigungen entstehen.

Auch sj)äter werden solche in jungen Kulturen
nie gebildet. Die Abb, 3 gibt ein späteres
Wachstumsstadium einer 4 Tage alten Kultur
des gleichen Stammes wieder, die auf neu-
tralem, 3%igem Glycerinagar bei einer Temperatur von 35^0 wuchs.

Die Photographie gibt in sehr charakteristischer Weise den Wachs-
tumsmodus des Stammes wieder, der sich bei allen gefalteten Stämmen
von Myc. lacticola fand. Sie bieten sämtlich in jungen Kolonien das
Bild dieser unregelmäßigen Kreise dar. Dieser gleichsam kreisförmige
Wachstumsmodus findet sich übrigens auch in der Wiedergabe der
Filmaufnahmen der Kaltblüterbakterien in der Arbeit von Wykoff
(Amer. Rev. Tub.). Verzweigungen sind auch dort nicht vorhanden.
Erst in 8 Wochen alten Kulturen des Stammes 4 auf 3%igem

Abb. 3. Kiiuclllcoloiiic von
Htaniiii 4: 4 Tage alt,
Vergrößerung 1 : 1250.

108

O. V. Plotho:

Glycerinagar fanden sich, jedoch sehr vereinzelt, an verlängerten und
daher nicht mehr voll lebensfähig erscheinenden Stäbchen kurze,
laterale Verzweigungen. Die gleichen kurzen Seitenverzweigungen
wurden in älteren Kulturen bei Stamm 2 und 3 in synthetischer
Nährlösung mit Glykokoll als N- Quelle gefunden. Bei den Stämmen 5
und 6 wurden sie nicht beobachtet. Mit fortschreitendem Alter ver-
kürzen sich bei allen Xaritcolo- Stämmen die Stäbchen, kokkoide Formen
sind aber selten.

Die Entwicklung der Kolonien des Stammes 7 verläuft in ganz
ähnlicher Weise, nur zeigt dieser Stamm in jungen Kulturen noch aus-
gesprochener die parallele Anordnung der
Stäbchen. Die in Abb. 4 wiedergegebene
Kolonie wuchs auf neutralem Hefekoch-
saftagar bei 35^0, sie ist 3 Tage alt.

Die anfangs langen und schlanken unver-
zweigten Stäbchen (0,5 -- 0,6 X 2 — 8 (jl)
werden nach 3 bis 4 Tagen kürzer, die Ver-
kürzung nimmt mit dem Alter zu, doch
sind kokkoide Formen auch in alten

Eitusellkolonie von Stamm 7:

li Tage alt, Vergrößerung 1 ; 1860. Kulturen Selten. Ein Unterschied zu den

Stämmen 2 bis 6 besteht darin, daß der
,, kreisförmige“ Wachstumsmodus bei Stamm 7 weniger ausgeprägt
ist. Verzweigungen wurden auch in alten Kulturen auf keinem Nähr-
boden beobachtet.

Das gleiche gilt von Myc. testudinis. Dieser Stamm aus der Gruppe
der säurefesten Kaltblüter hazillen (Frosch-, Fisch-, Schildkröten- und

Schlangenbaziüen) unterscheidet sich
% von den Xoc^tcoZa- Stämmen durch sein
viel langsameres Wachstum, eine Eigen-
art, die er mit den Warmblüter-
Tuberkelbazillen teilt, auch kann seine
Kultur derjenigen echter Tuberkel-
bazillen zum Verwechseln ähnlich
sehen. Sie gleicht aber auch in hohem
Maße den Wachstumsbildem der
Stämme 2 bis 7. Unter den hier ver-

Abb. 6.

Einaellkulturen von Myc. tettudinis,
Vergrößerung 1 : 1200,

wendeten Nährmedien gedieh Myc.
testudinis in befriedigender Weise nur
auf 3%igem Glycerinagar, auf dem

auch die Kultur der Abb. 5 wuchs. Aus dieser Abbildung ist ersicht-

lich, daß die ersten Wachstumsstadien denen der Lacticola-Stämme

durchaus ähneln, Verzweigungen sind auch hier nicht festzustellen, sie

wurden in älteren und alten Kulturen ebenfalls nicht beobachtet. Die

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

109

Abnahme des Längenwachstums der Stäbchen findet sich auch hier,
kokkoide sind ebenfalls selten.

Der Stamm 14 bildet auf Glycerinagar kurze, in jungen Kulturen
immer unverzweigte Stäbchen, die anfangs oft parallele Lagerung
zeigen, in älteren Kulturen herrscht Winkelwachstum vor. Auf Dextrose-
agar sind die Stäbchen länger und schlanker. In seltenen Fällen wurden
aut Glycerinnährböden in sehr alten Kulturen kurze, laterale Ver-
zweigungen beobachtet, auf Nährböden anderer Zusammensetzung
wurden sie nicht gefunden. In alten Kulturen sind die Stäbchen kürzer,
doch kommen kokkoide Zellen kaum vor. Myc. luteum zeigt also in
p]inzellkulturen nicht die geringste Ähnlichkeit mit Proactinomyceien
und es erscheint durchaus nicht zu recht -
fertigen, den Organismus diesen zuzu weisen.

In allen Altersstadien vollständig unver-
zweigt erwiesen sich stets die Stämme 15 bis
20. Sie bilden sämtlich kurze, feine Stäbchen,
die 0,4 - 0,5 X 2 — 5 fx messen, zugespitzt
sein können (Stamm 19) und meistens in
Winkelstellung auf treten. Vereinzelt kommt
daneben aber auch parallele Lagerung vor.

Oft bilden sich kleine Ketten von 5 bis
6 Stäbchen, die die Winkellage beibehalten. Die Stämme stellen in
jüngeren Kulturen die kleinsten und regelmäßigsten Formen unter allen
isolierten dar, nur ganz selten bemerkt man, und zwar in jungen Kul-
turen, nicht aber in alten, verlängerte und verdickte Individuen, die
Ansätze von Verzweigungen auf weisen (Stamm 17), zu einer wirklichen
\’'erzweigung kommt es aber nie. Im Alter bestehen die Kulturen aller
Stämme aus Kokken. Aus dem Gesagten geht hervor, daß auch Myc. eos
keinerlei Merkmale der Prodctinomyceten auf weist.

Ein ganz anderes Bild bieten dagegen die PWci- Stämme dar
(Stämme 8 bis 13). Auf frisches Nährmedium gebracht, streckt sich
die kokkoide Ausgangszeile dieser Stämme und es entsteht ein gerades
oder gebogenes Stäbchen, das ungleich lang auswachsen kann. Es
teilt sich nach wenigen Stunden, und die Tochterzelle stellt sich oft
nach einiger Zeit sehr schnell winkelförmig zur Ausgangszeile ein. Bei
der weiteren Teilung können die Stäbchen in kleinen Ketten vereinigt
bleiben, die die winkelige Lagerung beibehalten, oder auch in gerader
Linie hintereinander liegen . Schon in der dritten oder vierten Generation,
bereits 7 bis 8 Stunden nach der Impfung, treten seitliche rechtwinkelige
Verzweigungen an den Stäbchen auf, wie das die Abb. 6 des Stammes 8
gut erkennen läßt. Die Kolonie wuchs auf neutralem, 1 %igem Dextrose-
agar bei 3ß0C. Leider lagen die Stäbchen nicht alle in der gleichen
Ebene, was in der Photographie störend wirkt, doch kann über die

Archiv Ittr Mikrobiologie. Bd. 13.

Abb. A. Einzellkultur von
Stamm 8 , 9 Stunden alt,
Vergrößerung 1 :

110

O. V. Plotho :

Verzweigung kein Zweifel bestehen. Die Verzweigungen wachsen zu
ungleich langen Stäbchen oder fadenförmigen Elementen heran, die
eine Zeitlang mit den Ausgangsstäbchen verbunden bleiben. Aber
schon früh beginnt ein Zerfall der kleinen Kolonie, deren einzelne
Glieder sich spontan trennen. Abb. 7 gibt eine 18 Stunden alte Kolonie
des Stammes 9 M'ieder, die während der Beobachtung in sieben Teile
auseinanderfiel.

Abb. 7. Einzollkolonie von Stamm 0, 18 Stunden alt.

Auf diese Weise verkürzen sich Stäbchen und Verzweigungen. In
späteren Wachstumsstadien erreichen die lezteren außerdem nie mehr
die Länge der zuerst gewachsenen, 2 Tage nach der Impfung waren sie

kürzer und seltener geworden, und
nach weiteren 24 Stunden waren sie
ganz verschwunden. Die Kolonie
bestand dann aus unverzweigten,
plumpen, kurzen Stäbchen, die meist
Winkellagerung auf wiesen und zu-
weilen die charakteristisch gewinkelten
kurzen Ketten bildeten. Abb. 8 zeigt
das Bild des Stammes 27 nach drei-
tägigem Wachstum auf l %igem Dex-
troseagar, sie ist typisch für alle
untersuchten PWei- Stämme dieses
Alters. Am nächsten Tage finden sich
viele kokkoide Formen, die in alten
Kulturen fast ausnahmslos vorhanden sind. Wird eine von ihnen auf
neues Nährsubstrat übertragen, so beginnt der Zyklus von neuem.

Durch den geschilderten Wachstumsverlaul erweisen sich die
PÄfei-Stämme ungezwungen als Verbindungsglieder zu den Procuitiw-
myceten, denen sie in ihrem Wachstumszyklus durch Anfangsverzweigung
und Koloniezerfall geradezu entgegenkommen. Aus der frühzeitigen

Abb. 8. Kultur von Stamm 27,

3 Tage alt, Vergrößerung 1 : 300.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

111

Ausbildung der Verzweigungen und ihrem schnellen Zerfall, sowie aus
der geringeren Entwicklung und Häufigkeit der Verzweigungen beim
Portschreiten des Wachstums erklärt sich wahrscheinlich die Beob-
achtung von Jensen^ nach der Myc, phlei ,, selten verzweigt“ sein soll.

Der Stamm 27 bedarf einer besonderen Erwähnung. Er wurde als
atypische Form keiner der bekannten Arten zugewiesen. Seine Kulturen
sind auf Dextroseagar fleischfarben, auf Glycerinagar gelb bis schwach
rötlich, wachsartig, mattglänzend, in älteren Kulturen kommt es zu
leichter Faltung. Auf Asparaginagar nach Jensen findet schwaches,
farbloses Wachstum statt, Gelatine wird nicht verflüssigt, Milch nicht
koaguliert und nicht peptonisiert. Aus kokkoiden Zellelementen gehen
auf frischem Nährmedium Stäbchen hervor, die in Einzellkultur 8 bis
9 Stunden nach der Impfung auf Dextroseagar bei kurze Ver-

zweigungen auf wiesen. Diese sind nach wenigen Tagen nicht mehr
vorhanden, die Abb. 8 gibt, wie erwähnt, das Bild einer 3 Tage alten
Kultur des Stammes wieder. Sie zoigt die charakteristischen Winkel-
formen und kurzen Ketten, wie sie in den Kulturen der Päfet-Stämme
gleichen Alters auftreten. Später werden die Stäbchen kokkoid. Beweg-
liche Formen treten nicht auf, alle Kultiirlösungen bleiben klar. Der
Stamm überlebt das Erhitzen auf 60® C während 1 Stunde und wächst
bei 47® C, Arabinose wird als Kohlenstoff quelle ausgenutzt. Somit
könnte Stamm 27 seinen morphologischen und biologischen Eigen-
schaften nach ein PÄfet-Stamm sein, aber seine Säurefestigkeit ist auf
allen Nährböden und zu allen Altersstadien gering. Nach sechstägiger
Kultur in Milch, die die Säurefestigkeit erhöht, finden sich innerhalb
der Stäbchen säurefeste Strukturen. Meistens liegen drei bis vier,
seltener bis zu sechs runde Körperchen in den Stäbchen, die der Ent-
färbung in 5 %iger Schwefelsäure während 1 Minute wiederstehen, die
Stäbchen als Ganzes sind aber auch in den Milchkulturen nicht säurefest.

Verschiedene Autoren (Vierling, Gray und T hornton, Eichbaum)
berichteten über nicht oder inkonstant säurefeste, ihrer Morphologie
und Physiologie nach aber zu den Mycobakterien gehörende Organismen,
die namentlich der Gruppe nahestanden, so daß ihre systematische
Einordnung in ein anderes Genus nicht gerechtfertigt erschien. Daher
ist es fraglich, welche Bedeutung der im übrigen recht labilen Eigen-
schaft der Säurefestigkeit zuzusprechen ist. Die amerikanischen Forscher
verwenden sie heute nicht mehr als Einteilungsgrund, da sie in unseren
immerhin unnatürlichen Kulturbedingungen bei dem einen Stamm
ausgesprochener hervortreten könnte als bei dem anderen. Immerhin
wollte es mir nicht zulässig erscheinen, Stamm 27 ohne weiteres bei
den PAZet- Stämmen einzureihen.

Die Stämme 21 bis 26 stellen, wie bereits erwähnt, Übergangs-
formen dar, die zwischen Actinomyceten und Mycobakterien stehen.

112

O. V. Hotho :

und heute wohl allgemein als Proactinomyceten bezeichnet werden.
Über den Wandel in ihrer Bezeichnung und systematischen Einreihung
wurde auf S. 96 berichtet. Jemen stellte 1932 die Eamilie der Pro-
actinomyceten auf, Krassilnikow veröffentlichte 1938 vergleichende
Studien mit verschiedenen Proactinomyces-ATten (englische Zusammen-
fassung). In alten Kulturen finden sich fast nur kokkoide Formen, die
auf frischem Medium zu Stäbchen auskeimen. Abb. 9 gibt eine Einzell-
kultur von Stamm 21, der als Typus gelten kann,
nach löstündigem Wachstum auf Dextroseagar bei
35^ C wieder.

Abb. 10 zeigt den gleichen Stamm 25 Stunden
nach der Impfung. An den Stäbchen sind recht-
winklige Verzweigungen deutlich erkennbar, die kleine
Kolonie ist umgeben von einer Plüssigkeitszone, die
sich in der Photographie unverkennbar abhebt. Nach
weiteren 15 Stunden hat sich ein kleines, zusammen-
hängendes, verzweigtes Mycel gebildet, dessen
Hyphen Neigung zeigen in den Agar hinein-
zuwachsen, die sich aber auch als winzige Luft-
hyphen über die Agaroberfläche erheben. In
Abb. 11 ist bereits erkennbar, wie sich von einem
solchen Mycel winklig gelagerte Teilstückchen ab-
trennen. Dieser Vorgang setzt sich bei fort-
schreitendem Wachstum fort, die Teilstücke zer-
fallen weiter, und nach etwa 6 Tagen besteht die

Abb. 9.

Kinzellkultiir von
Stamm 21,
VcTfrröüening 1 : 420.

Abb. 10. Eiiizollkultur
von Stumm 21,
VersröUcrung 1 : 420,

Abb. 11. Einzellkultur von
Stamm 21, Vergrößerung 1 ; 420.

Abb. 12. Kinxellkultur von Szamm 21,
Vergrößerung 1 : 420.

Kultur nur aus un verzweigten, meist kurzen, ausschließlich winklig
gelagerten Stäbchen, die sich noch weiter durch Teilung vermehren.
Abb. 12 zeigt ein solches Wachstumsstadium. Wenn noch hier und da
an den Stäbchen eine Verzweigung auftritt, so ist sie stets kurz und
unbedeutend.

Das ursprünglich myceliale Wachstum geht also über in die Zell-
teilung nach dem ,,snapping'' Typ Jenaens, Nach etwa 8 Tagen war

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

113

in Einzellkulturen keine Vermehrung der Stäbchen mehr zu beobachten,
der Zerfall der Stäbchen in kokkoide Formen ging aber weiter, so daß
in alten Kulturen stets fast ausschließlich kokkenartige Organismen
vorhanden sind. Wird einer von ihnen auf frisches Substrat gebracht,
so setzt der beschriebene Zyklus von neuem ein. Actirvomyces-khnXiGhe
Sporen, wie Krassilnikow sie bei einem Stamm fand, wurden nie gebildet.

Im mikroskopischen Bild (Abb. 8) wurde beobachtet, daß das
jugendliche Mycel in einer Flüssigkeitsumgebung geradezu eingebettet
ist, so daß die sich ablösenden Teilst ückchen förmlich davonschwimmen.
Auf welche Weise sich der Organismus diese Flüssigkeitsumgebung
schafft, konnte im einzelnen nicht ermittelt werden, doch wurden
V^ersuche angestellt, um ihre Zusammensetzung auf das Vorhandensein
von Schleimstoffen zu prüfen. Nach dreistündiger Einwirkung einer
mäßig konzentrierten alkoholischen Met yhl Violettlösung konnte fest-
gestellt werden, daß eine die einzelnen Individuen gleichmäßig um-
gebende Schleimschicht nicht vorhanden ist (Methode von A. Meyer,
zitiert nach Schneider -Zimmermann, S. 400). Es waren oft schwäch
violett gefärbte Fäden mit unregelmäßig gelagerten, dunkler gefärbten
Jhhaltskörpem zu erkennen, die sich von einem Bakterium zum anderen
zogen. In gleicher Weise gefärbte Schleimfäden umgaben auch zu-
sammenliegende Bakterienhäufchen, so daß diese vollständig in ihnen
eingebettet waren. Um die Organismen herum ließen sich also schleim-
artige Umsetzungsprodukte nachweisen, die möglicherweise gemeinsam
mit aus dem Agar herausgezogenem wässerigem Substrat und in V^er-
bindung mit dem aus der Atmung der Bakterien stammenden Wasser
die Flüssigkeitsumgebung schaffen, die der Verbreitung der abgestoßenen
Mycelteile so förderlich ist.

Wykoff hat in Beobachtungen am Film festgestelJt, daß in einer
jungen Kultur anfangs das Wachstum die Teilung übertrifft, ,,daß aber
die Teilung lange fortdauert, nachdem die Zeit des schnellen Wachstums
vorbei ist“. Die letztere Beobachtung deckt sich mit der oben erwähnten,
daß nämlich in Einzellkulturen von Stamm 21 eine Vermehrung der
Stäbchen nicht mehr beobachtet wurde, der Zerfall in kokkoide Formen
aber anhielt. Diese Diskrepanz zwischen Teilungsintervall und Wachs-
tumsenergie ist sehr interessant. Sie ist geeignet, wenigstens zum Teil
die Vielgestaltigkeit der Formen bei den Mycobakterien zu erklären.
Bei gleichbleibendem Teilungsintervall müssen bei großer Wachstums-
energie, wie sie beim Beginn einer neuen Kolonie stets vorhanden ist,
längere Formen, also Stäbchen, entstehen, während bei verminderter
Wachstumsenergie in emer älteren Kolonie diese Stäbchen immer
kürzer werden müssen, um schließlich, sobald die Wachstumsenergie
nahezu ganz auf hört, Kokkenform anzunehmen. Dabei bleibt natürlich
ganz ungeklärt, aus welchem Grunde mit der ermattenden Wachstums-
energie nicht auch die Verlängerung des Teilungsintervalls einheigc^.

114

O. V. Plotho :

Uittersuehungen zur BOdung von Sporen und anderen Danertormen.

Ein ebenso umstrittenes Gebiet wie die Verzweigung ist das der
Bildung von umweltresistenten Dauerformen.

Endosporen wie bei Bakterien oder Sj^>oren nach Art der Actino-
myceten wurden bei den Mycobahterien allerdings niemals beschrieben,
sie traten bei den hier besprochenen Stämmen ebenfalls nie auf, obgleich
eine große Zahl von Überimpfungen auf Agar mit verschiedenen Zu-
sätzen vorgenommen wurde, von denen angenommen werden konnte,
daß sie eine Sporenbildung fördern würden. Hierzu erwiesen sich oft
sehr nänrstof farme Nährböden als gut brauchbar.

Vertreter der einzelnen Arten wurden daher geimpft auf Medien, in
denen z. B. gewöhnliche Nährbouillon auf die Hälfte, sowie auf ^/ 4 , ’/io
und ihrer normalen Konzentration verdünnt war. Weiter wurde geimpft
auf Würzenährböden in der Verdünmmg auf VlO und Vm. zu denen teilweise
0,6 bzw. 0,1% Pepton zugesetzt war. Auch ein Kartoffelagar' in Ver-
dünmmgen von '/j, und ^/lO kam zur Verwendung, ebenso Chapec-Agar.
Ferner wurden auch flüssige Nährböden, z. B. Peptonwasser in verschiedenen
Verdünnungen beimpft, sowie synthetische Nährlösungen mit verschiedenen
Stickstoffquellen und in verschiedenen Konzentrationen. Auch auf Gips-
platten wurde das Material der verschiedenen Arten geimpft.

Im allgemeinen ist über die Entwicklung auf diesen Medien zu
sagen, daß die Mycobahterien schlecht wuchsen auf stickstoffarmem
aber kohlenstoffreichem Substrat, wie z. B. dem Kartoffelnährboden,
ihr Wachstum aber besser war auf Stickstoff reichem aber kohlenstoff-
armem Medium wie Bouillon und Pepton. Alle Stämme wuchsen noch
gut bei 1/4% Dextrosegehalt, wenn der Gehalt an Stickstoff im Substrat
genügend war, sie entwickelten sich aber schlecht auf unverdünntem
Kartoffelsaft, der nur etwa 0,07% N enthält (Stapp und BorteU), Ein
Zusatz von Stickstoff erhöht auf ihm das Wachstum, ein Zusatz von
Dextrose bleibt ohne Einfluß, Schwaches Wachstum aller Stämme
fand noch statt bei Verdünnung von gewöhnlicher Nährbouillon auf 1 /20
ihrer normalen Konzentration. Auf unverdünntem Würzeagar fand
nie eine Entwicklung statt, auf seinen Verdünnungen erfolgte mehr
oder weniger gutes Wachstum, wenn Pepton zugesetzt war.

Auf keinem dieser Nährböden wurden Endosporen wie bei Bakterien
oder Luftsporen wie bei Actinomyceten gebildet.

Bei Stamm 4 gelang es aber, umweltresistente Dauerformen anderer
Art festzustellen. Von einer 10 Tage alten Kultur dieses Stammes auf
3%igem Glycerinagar wurde am 30. April 1941 überimpft auf ein
Schrägagarröhrchen mit Bouillon-Nährboden, der auf i/jq seiner normalen
Konzentration verdünnt wai. Das Agar war bereits am 25. Januar 1941

^ 400 bis 600 g geschälte, feingeschnittene Kartoffeln kochen, filtrieren.
Das Filtrat auffüllen auf 1000 ccm.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

115

Abb. 13. Stamm 2 ^
MUchkultur;

4 Wochen alt,
Verscrößemng 1 : 1850.

hergestellt und in das Röhrchen eingefüllt worden. Es war mit Watte-
stopfen verschlossen. Die Kultur wurde während 8 Wochen bei 35® C
gehalten, später stand sie bei Zimmertemperatur. 8 Wochen nach der
Impfung fanden sich in der Kultur vorwiegend am oberen Rande des
Nährbodens kleine, staubfeine Anhäufungen, die im auffallenden Licht
weiß, im durchfallenden dunkel aussahen. Sie bestanden aus winzigen
kugelförmigen Elementen von 0,2 bis 0,4 [i. Durchmesser, die bei tiefer
Tubuseinstellung dunkel erschienen, bei hoher auf leuchteten. Außer
diesen freiliegenden Granula — wie sie, gemäß der sieh mehr und mehr
einbürgemden Bezeichnung auch hier genannt seien
— fanden sich in den Anhäufungen auch Stäbchen
von 1,4 bis 1,6 jx Länge und 0,4 bis 0,5 pi Breite, in
denen häufig dunkler erscheinende kreisrunde körnige
Strukturen feststellbar waren. Zuweilen lagen diese
Einschlüsse an einem Ende des Stäbchens oder an
seinen beiden Polen, es fanden sich aber auch Stäb-
chen, die ein bis drei mittelständige Körnchen ent-
hielten und deren Mitte dann immer etwas aufgetrieben war. Bei
Färbung mit Eisenhämatoxylin und Fuchsin ist das Stäbchen, auch
wenn es in lebenden Präparaten nicht mehr erkennbar ist, als Hülle
um die Granula liegend lange mehr oder weniger deutlich nachweis-
bar. Krassilnikow (1934) beschreibt ebenfalls von einigen seiner iso-
lierten Stämme diese Innenstrukturen.

Ganz ähnliche Bilder wurden in 4 Wochen alten Milchkulturen von
Stamm 2, 4 und 5 beobachtet. Die Abb. 13 läßt deutlich ein Stäbchen
erkennen, in dem sich vier Granula befinden. Das Stäbchen selbst ist
anscheinend bereits weitgehend verändert, sei es durch autolytische
oder exogene Fermente, das erste Granulum ist schon freigeworden
und aus dem Stäbchen ausgetreten; es liegt nicht mehr in der gleichen
Ebene mit den anderen und erscheint daher in der Photographie un-
schärfer. Die drei anderen füllen die Breite des Stäbchens vollständig
aus, sie sind voll entwickelt. Das Präparat wurde mit Ziehl »ehern
Carboifuchsin gefärbt und darauf 1 Minute mit 5%iger Schwefelsäure
behandelt. Färberisoh verhalten sich die Granula wie die intakten
Stäbchen: sie sind streng säurefest. Im Gram -Präparat erscheinen sie
tief blauschwarz, mit Methylgrünessigsäure (Färbezeit 12 Stunden)
dunkel-grünblau, bei Behandlung nach Fevlgen blauviolett. Die Färbung
nach Oiemsa läßt die Granula dunkel-blaurot, die Konturen der Stäbchen
schwach bläulich erscheinen. Oft konnten Granula auch frei in der
Milch liegend nachgewießen werden.

Aus den Granula-Häufchen der soeben beschriebenen Kultur auf ver-
dünntem Bouillon- Agar wurde am 18. November 1941, also 6^/2 Monate
nach der Beimpfung des Nährbodens, eine kleine Öse Material in 1 ccm

116

O. V. Plotho ;

sterilem destilliertem Wasser aufgeschwemmt und aus der Aufschwem-
mung auf einen i’orfnef sehen Deckgiasagarblock geimpft (3%ige8
Glycerinagar). Nach 24 ständiger Bebrütung bei 35 ^ C bot sich das Bild,
das die Abb. 14 wiedergibt. Es zeigt die Granula zum Teil in ihrer
ursprünglichen Form, aber um etwa das Doppelte aufgequollen. Andere
haben sich nach einer Richtung hin verlängert und sind zu winzigen
Stäbchen ausgewachsen. 24 Stunden später haben diese Stäbchen sich
verbreitert und gestreckt und an den Polen sind deutlich Zonen ver-

Abb. 14. GranulakeimunK,
Stamm 4, 24 Stunden alt,
Vergrößerung 1 : 1250.

Abb. 15. Granulakeimung, Stamm 4,
48 Stunden alt,
Vergrößerung 1 : 1250.

dichteten Plasmas entstanden. Mit diesem Entwicklungsstand hörte in
diesem Falle das Wachstum auf (Abb. 15). Auf einer zweiten Deckglas-
kultur waren aber aus dem gleichen Material 5 Tage nach der Impfung

kleine Kolonien entstanden, die ganz das
typische Bild des Wachstumsbeginns dieses
Stammes aus vegetativem Impfmaterial
darbieten, was beim Vergleich mit der
Abb. 3 sehr deutlich wird (Abb. 16). Von
dieser Deckglaskultur wurde auf Schräg -
agarröhrchen abgeimpft, es wuchsen nor-
male Kulturen des Stammes 4.

Wir haben also in dem Ganulum ein
Dauerstadium des Bakteriums zu sehen,
das die Fähigkeit besitzt, über langan-
Idauemde Perioden ungünstiger Umwelts-
bedingungen hinaus die Art zu erhalten. Die vegetativen Formen,
nach denen die Einordnung des Mycobakteriums im System vor-
genommen wird, sind nur eine Entwicklungsstufe wie bei einem
komplexen Organismus. Dieses Dauerstadium kommt höchstwahr-
scheinlich vorwiegend zur Ausbildung in Verhältnissen, die ungünstige
Emährungsbedingungen für die vegetativen Formen bieten, in unserem
Falle auf dem sehr stark verdünnten, schon etwas eingetrookneten

Abb. 16. Granulakeimung,
Stamm 4, 5 Tage alt,
Vergrößerung 1 : 1250.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

117

Bouillonagar und in der jedenfalls wenig assimilierbaren Milch. Weitere
Untersuchungen nach dieser Richtung wären sehr zu begrüßen und
könnten im Hinblick auf die nahe Verwandtschaft von Myc, lacticola
zum humanen Tuherkdbazillus von größter Bedeutung sein.

Von verschiedenen Forschern wurden an Tuherkelbazillys-l^ultuTeri^
Typus humanus, bereits Beobachtungen gemacht, die dem oben mitgeteilten
Befund durchaus analog sind. Myc. tuhercvloais vermehrt sich gewöhnlich
durch Querteilung. Unter gewissen Umständen finden sich aber in den
Zellen körnige Strukturen, die bereits von Robert Koch als Sporen gedeutet
wurden, deren Auskeimung von ihm aber nicht beobachtet wurde. Später
beschrieb Spengler „aus dem Kettenverband herausgetretene Körner“, die
er als Splitter bezeichnete, denen er aber keine Sporenqualitäten zubilligen
wollte. Beträchtliches Aufsehen erregten die Untersuchungen von Miich,
der humane Tuberkelbazillen in Milch impfte, in der nach einiger Zeit
feine Körnchen entstanden, „die anfangs auch nach Zieht, später nur nach
Gram färbbar waren“. In gesundes Gewebe verschleppt, sollen sie sich zu
säurefesten Stäbchen entwickeln können, ln zwei Arbeiten berichtete ferner
Morten Kahn über Ergebnisse an Beobachtungen des Iiiitialwachstums
einzelner Tulierkelbazillen im hängenden Tropfen. Er kommt zu der Auf-
fassung, daß „reife“ Tul)erkelbazillen sigh in immer kleinere Kleinkokken
teilen, die schließlich ein kleines kolonieähnliches Konglomerat bilden.
Aus den Kleinkokken sprossen stälxdienförmige Elemente, die schließlich
zu den ,, reifen“ Stäbchen des Tuberkelbazillus heranwachsen, ,,der Ring
ist geschlossen“, wie er wörtlich sagt. Kahn stellte bei 240 Kulturen in
zwei Fällen den beschriebenen Entwicklungsgang fest . ForUes hält ebenfalls
das Granulum für die Dauerform des Tul^erkelbazillus, Eduard Oröh kommt
l)ei Untersuchungen an humanen und bovinen Tuberkelbazillen zu ähnlichen
Ergebnissen, Lominski bericht-et, daß er bei säurefesten Grag;nda von Myc.
tuberculoais Auskeimung beobachtet habe. Endlich sei noch die Arbeit
von Hu erwähnt, der elKuifalls die Auskeimung eines freien Granulums
beo})achtete.

Über die Benennung dieser ,, Dauerform“, wie man sie wohl nach
meinen Beobachtungen bezeichnen kann, herrscht noch keine Einheit-
lichkeit. Spengler nennt sie ,, Splitter“, Much bezeichnet sie als ,, Gra-
nulum“, Kuhn als ,,C-Form“, Play Armengol als ,, Angriffsform“. Es
hat sich bisher die Bezeichnung ,, Granulum“ eingebürgert, sie wird
auch in einer kürzlich erschienenen Arbeit von Lembke. und Ruska
angewandt. Lembke und Ruska veröffentlichten Untersuchungen an
verschiedenen TuberkelbaziUen- Arten im Übermikroskop. Bei Ver-
größerungen von 1 : 10000 sahen sie ebenfalls große und kleine Granula
und beschreiben ihre Entstehung. Zur Keimungsfähigkeit dieser
Elemente bemerken sie, daß diese ,, bisher nur von wenigen Forschem
beobachtet worden sei und nicht als sicher bewiesen gelten könne.“
Die bei den vorliegenden Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse
schließen sich denen der ,, wenigen Forscher“ an und ich hoffe, der
Klärung dieses Problems gedient zu haben dadurch, daß es mir ge-
lungen ist, auch von der Seite der nahe verwandten Roden- Mycc^akterien

8 * L'

118

O. V. Plotho :

her eine Stütze für die Stichhaltigkeit der Beobachtungen dieser Wenigen
eirbracht zu haben. Doch erscheint mir der Ausdruck „Oranulum'', eine
für die heterogensten Dinge angewandte Bezeichnung, nicht ganz
glücklich. Es beda^ noch weiterer Untersuchungen, n3it welcher bei
anderen Organismen vorkommenden Sporenform man die fraglichen
Gebilde gleichsetzen kann, bzw. ob das überhaupt möglich ist.

Die Sälirefestigkeit.

Ein für alle Stadien und Umweltsbedingungen zutreffendes Urteil
über die Entfärbungsresistenz der MycohdkUrien des Bodens läßt sich
nicht abgeben, es ist nicht einmal möglich für eine einzige Art. Die
Säurefestigkeit ist vielmehr nach unseren heutigen Kenntnissen eine
sehr labile Eigenschaft aller ,, säurefesten“ Organismen, insbesondere
der Saprophyten. Sie ist abhängig von einer großen Zahl äußerer Be-
dingungen und Voraussetzungen.

Zunächst ist die Methode, mit der sie festgestellt wird, von Wichtigkeit.
Die Ergebnisse sind verschieden, ob die Färbung durch Erhitzen oder durch
verschieden lemges Behandeln der Präparate in der Kälte durchgeführt
wird, sie sind andere bei verschieden langer Dauer der Säureeinwirkung
und unterschiedlichem Dissoziationsgrad der Säure, sie weichen voneinander
ab, je nachdem eine Nachfärbung vorgenommen wird oder nicht. Wahr-
scheinlich gehen auf diese „Labilität** der Keaktion in vielen Fällen die
abweichenden Angaben verschiedener Autoren bei den gleichen Organismen
zurück. So beschreibt z. B. Qrasaherger seinen Organismus als nicht säure-
fest, während Hefferan ihm eine „sehr gute“ Säurefestigkeit zuspricht.
Es wäre daher sehr begrüßenswert, wenn durch Übereinkunft eine einheit-
liche Handhabung der Säurefestigkeitsprüfung, die von allen TJntersuchem
einzuhalten wäre, festgelegt würde in der Art, wie ähnliche Standardi-
sierungen von amerikanischen Forschern bereits durchgesetzt sind. Jeden-
falls würde diese Maßnahme eine Beihe von Einzelangaben in den Spezial-
arbeiten überflüssig machen.

In den vorliegenden Untersuchungen wurde das Carboifuchsin kalt
auf den Objektträger gegossen und auf ihm mehrere Male bis zur Blasen-
bildung erhitzt. Die Entfärbung erfolgte durch n Schwefelsäure,
n Essigsäure, n/110 Schwefelsäure und 70%igen Alkohol mit Zusatz
von 1 % HCl. Die Entfärbungszeit betrug stets 1 Minute. Eine Nach-
färbung wurde nicht gemacht. Stärkere Säuren, wie sie einige Autoren
benutzten, wurden nicht verwendet, weil ihre Emwirkung die morpho-
logischen Strukturen der Bakterien zu sehr veränderte.

Aber nicht nur durch die Färbemethode kann das Ergebnis bei
der Säurefestigkeitsprüfung beeinflußt werden. Von großer Bedeutung
ist auch das Alter der Kulturen, wozu die Tabelle IV einen Überblick gibt .

Die Kulturen der Tabelle IV wnichsen in Nährbouillon mit Zusatz
von 1 % Dextrose bei 30^ C, das betrug 6,4, die Entfärbung wurde
mit 5%iger Schwefelsäure vorgenommen, Entfärbungszeit 1 Minute.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien. 119

Tabelle IV. Einfluß des Alters auf die Säurefestigkeit.

Stamm

Alter

der Kultur

Säurefestigkeit

stamm

Alter

der Kultur

Säurefestigkeit

3 Tage

++>

3 Tage

4“

4 Wochen

+ +

4 Wochen

etwa 90% der Stäb-

3 Tage

4 - +

chen enfärbt

4 Wochen

4 - 4 -

3 Tage

etwa 40 % der Stäb-

3 Tage

+ 4-

chen entfärbt

4 Wochen

+ *

4 Wochen

wenige Stäbchen als

3 Tage

4 -

Ganzes säurefest

4 Wochen

ein Teil der Stäb-

3 Tage j

4 :®

chen entfärbt

4 Wochen

wenige Stäbchen als

3 Tage

wenige Stäbchen

Ganzes säurefest

entfärbt

3 Tage

wenige Stäbchen

4 Wochen

viele Stäbchen ent-

säurefest

färbt

4 Wochen

nicht säurefest

1 )

3 Tage

4 "

4 Wochen

viele Stäbchen ent-

färbt

‘ -f -f — Htrenj? sÄurefest. — • + = Stäbcbrn ontfärbt. — * :± — mehr als die Hälfte

der smbchen entfärbt.

Die in der Tabv^^lle aufgeführten Stämme sind sämtlich nach 3 Tagen
bei der angegebenen Kulturtemperatur gut entwickelt, die Säure-
festigkeit ist bei fast allen zu diesem Zeitpunkt größer als nach 4 Wochen
Kulturdauer. In ganz jungen Kulturen ist die Säureresistenz bei den
meisten verhältnismäßig schwach, in ganz alten erleidet sie oft eine
noch größere Einbuße als die Tabelle ausweist. Die Säurefestigkeit von
Stamm 14 ist immer gering, ebenso sind alle Proaciinomyctten immer
nur wenig säureresistent .

Sehr deutlich tritt in der Tabelle V die Bedeutung der Zusammen-
setzung des Nährbodens für den Ausfall der Entfärbungsresistenz in
die Erscheinung.

Tabelle V. Einfluß des NährVodens auf die Säurefestigkeit.

Alter der Kulturen 14 Tage. Nährboden-pn " 7- Temperatur 35®

Stamm

Nähragar
mit 2 % Dextrose

Nähragar
mit 2 % Glycerin

Hefekochsaftagar j

Synthetisches Agar
mit NaNOa

++*

-f

4 - 4 -

4 -

- 4

—

4 "

1 dz

—

in einigen Stäb-
chen säurefeste
Inhaltskörper

* + - einige Stäbchen entfärbt. — • -f + streng säurefest. — » 4 = mehr als die Hälfte
der Stäbchen entfärbt. — * — nichts, fest.

120

O. V. Plotho :

Die Tabelle läßt erkeimei), daß auf dem Glycerinnährboden die Säuie-
festigkeit am besten, auf dem synthetischen Agar mit NaNO^ als Stickstoffe
quelle am geringsten ausgebildet war, der Dextroseagar und der Hefekoch-
saftnährboden stehen dem Glycerinagar etwas naci . Es kann also der
Grad der Säurefestigkeit durch das Nährsubstrat gesteigert bzw. ver-
ringert werden. Ältere Autoren (Btenstock, Oottatein) gingen so weit, zu
behaupten, daß nicht säurefeste Organismen säureresistenr gemacht werden
könnten durch Kultivieren auf fett- und wachsreichen Medien oder sogai'
durch Zerreiben in einem fetthaltigen Substrat. Sie fanden aber bald
Widerspruch. Rabinowitsch z. B. zeigte, daß durch fetthaltiges Medium
niemals Säurefestigkeit hervorgerufen, sondern nur bereits bestehende
erhöht werden kann. Auf den teilweisen bzw. vollständigen Verlust der
Säureresistenz auf proteinfreien und glycerinfreien Medien wies schon
B. Lange hin, den Einfluß erhöhter H-lonenkonzentration im Nährboden
n€kch der gleichen Richtxmg betonte in neuerer Zeit Kirchne .

Andere Forscher (Frei und Pockschischewsky) haben angegeben,
daß die Art der verwendeten Säure für den Ausfall der Reaktion von
Bedeutung sei. Hierzu wurden nähere Untersuchungen angestellt . Es
wurden eine Reihe von Stämmen, bei denen gleiche Voraussetzungen
Vorlagen (Alter, Art und Reaktion des Nährbodens, Kulturtemperatur
u. dgl.), auf ihre Entfärbungsresistenz geprüft gegenüber der Ein-
wirkung von n Schwefelsäure und n Essigsäure. Bei den streng säure-
festen Stämmen war ein Unterschied in der h^inwirkung beider

Säuren nicht erkennbar, allerdings erschienen die Granula immer
dunkler rot, also weniger entfärbt, nach Behandlung mit n Essigsäure.
Bei den PÄZei- Stämmen schienen aber nach Einwirkung der n Essig-
säure stets mehr Bakterien der Entfärbung widerstanden zu haben als
nach Behandlung mit n Schwefelsäure. Dieser Unterschied verstärkte
sich bei den gegen Schwefelsäure wenig resistenten Formen und wurde
bei den ProaciirvomyceteM sehr auffällig. Es wurde also der Eindruck
erweckt, als ob mit der Empfindlichkeit gegenüber der Einwirkung
normaler Schwefelsäure eine relative Widerstandsfähigkeit gegen die
det normalen Essigsäure einherginge. Die Schlußfolgerung, dem Anion
beider Säuren eine Bedeutung bei diesem Ergebnis zuzumessen, lag
nahe, vielleicht konnte auch das Molekül der Säuren als Ganzes für
das ungleiche Ergebnis verantwortlich sein. Zur Klarstellung dieser
Frage wurde mit Hilfe der BörerbsenBchen Farbindikatoren eine Schwefel-
säurelösung hergestellt, die die gleiche H-lonenkonzentration besaß
wie die n Essigsäure. Es ist dies eine Lösung, die etwa n/110 ist, beide
Säuren besitzen dann ein pH von ungefähr 2,5. Bei der Anwendung
dieser beiden Säuren waren die Entfärbungsintensitäten stets ganz
gleich, wie die Tabelle VI erkennen läßt.

Es ergibt sich aus diesen Versuchen, daß die Säureresistenz der
Bod&n.- Mycohakterieri nicht bedingt wird von der Art der einwirkenden
Säure, sondern lediglich von ihrer H-Ionenkonzentration. Es ist sehr

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

121

Tabelle VI. Einfluß des Dissoziationsgrades der Säuren
auf die Säurefestigkeit.

Alter der Kulturen 14 Tage. Nähragar mit 3% Glycerin, p« 7.

Stamm

Fititfärbnog mit
u-Schwefelsäure

Entfärbung mit
n-EsAiKsäure

Entfärbung mit
n/HO Schwefelsäure

wenige Stäbchen als
Ganzes säurefest

viele Stäbchen als
Ganzes säurefest

wie in Essigsäure

wenige Stäbchen mit
säurefesten Inhalts -
körpern

dasselbe

j» »» »>

dasselbe

>» »» »♦

einige Stäbchen mit
säurefesten Inhalts-
körpern

viele Stäbchen
säurefest

>» »» >»

dasselbe

»» »* t»

in einigen Stäbchen
säurefeste Inhalts-
körper

viele Stäbchen als
Ganzes säurefest

»» »« »*

wahrscheinlich, daß dieses Gesetz für alle Säuren gilt und daß alle
säurefesten Bakterien ihm unterstehen.

Zur Entfärbung !nit70%igem Alkohol 1% HCi braucht nur
kurz angegeben zu werden, daß ausschließlich die Lac/icoto- Stämme
eine deutliche Entfärbungsresistenz gegen dieses Mittel besaßen. Bei
den Stämmen war nach einer Einwirkungszeit von 1 Minute nur

in einer kleinen Zahl von Stäbchen die Färbung erhalten, die Vertreter
der übrigen Arten waren entfärbt.

Über die Ursache der Säurefestigkeit ist viel diskutiert worden . Schon
früh brachte man den Fett* und Wachsgehalt der säurefesten Bakterien in
Beziehung zur Säureresistenz. Hammerechlag wies als erster in quanti-
tativen Untersuchungen bei dem humanen Tvberkelbinillns besonders
reichliche Substanzen nach, die in den gewöhnliclien Fett lösungsmittein
löslich waren. Seine Befunde wurden von vielen Autoren bestätigt (Klebe,
Kresling, Bavderan u. a.). Diese Lipoidsubstanzen stellten sieh die Forscher
ganz allgemein als eine Hülle um den Bakterienleib heriimliegend vor.
Die älteren Autoren führten daher das färberische Verhalten der Säure-
festen ausschließlich zurück auf das Vorhandensein einer Fett- und Wachs-
hülle (Marmorek, BuUoch, Mo, Leod, Tamura),

Die experimentellen Befunde späterer Untersuchungen (Pfannenetiel,
Lotm) widersprachen aber dieser Vorstellung, denn die Menge der durch
fettlösende Mittel dem Bakterienleib entzogenen Substanz geht nicht parallel
dem Verlust der Säurefestigkeit des Bakterienrückstandes. Es i.st vielmehr
niemals gelungen, durch bloßes Behandeln mit lipoidlöslichen Mitteln die
Säureresistenz bei den behandelten Organismen zu beseitigen. Diese Tat-
sache fand sich auch bei den vorliegenden Untersuchungen immer wieder.
Durch diese Erfahrungen wurde die Vorstellung unhaltbar, daß lediglich
in einer Lipoidhülle die Ursache der Säurebeständigkeit za sehen sei.

Gegenwärtig besteht wohl allgemein die Auffassung, daß physikalische
oder physikalisch-chemische Eigenschaften, wie Struktur und Dichtigkeit

122

O. V. Plotho :

des Plasmas das ausschlaggebende Moment für die mehr oder weniger große
S&ureresistenz darstellen {Schloßberger, Sorddli und Arena). Beim Zu-
standekommen dieser Dispersitätsunterschiede der Plcbsmakolloide gegen-
über den nicht säurefesten Organismen dürften die Lipoidsubstanzen aber
wesentlich beteiligt sein.

Über Quantität und Zusammensetzung der Lipoidsubstanzen liegen
seit längerer Zeit für den TuberkelbaziUua zahlreiche Untersuchungen vor.
Die Versuchsergebnisse gehen weit auseinander, so daß z. B. die Angaben
über die Menge der extrahierten Lipoide zwischen 8 und 44% des Trocken-
gewichts schwanken (Rwppel fand 8 bis 26%, Baudran 36 bis 44%). Erst
beträchtlich später wurden auch Boden- Mycohakterien in den Kreis der
Untersuchungen einbezogen. Auch bei ihnen wechselt die Menge der von
den einzelnen Autoren extrahierten Substanzen. Diese Unterschiede be-
ruhen in erster Linie auf der Verschiedenheit der Methodik und der Extrak-
tionsmittel. Pfannensiiel, der neben Warm- und Kaltblüterbakterien als
erster auch verschiedene Stämme von Myc. lacticola untersuchte, extrahierte
mit einem Gemisch von Äther imd Aceton, obgleich bereits bekannt war,
daß einige Wachssubstanzen des Tuberkelbazillus sich schwer in Äther
lösen und die Phosphatide in Aceton überhaupt unlöslich sind. Seine
Prozentzahlen sind daher niedrig (für Myc. lacticola im Höchstfall 16,47%
des Trockengewichts). Lang gibt nach Extraktion mit Alkohol und Petrol-
äther etwas höhere Prozentzahlen an. In der Arbeit von Lang und Ccm/pheü
wird der Einfluß der Nährböden auf die Menge der gebildeten Lipoide
behandelt und festgestellt, daß Glycerin der Lipoidbildung förderlich ist.
Da die Autoren zur Kultur der extrahierten Bakterien dann einen Nähr-
boden benutzten, der ö% Glycerin enthielt, sind ihre Prozentzahlen hoch
(20,3 und 30,3% des Trockengewichts). Die einzige Arbeit, die sich aus-
schließlich mit den Fettsubstanzen des ffTimotheebazülus"" beschäftigt,
wurde von Coghill und Bird veröffentlicht. Nach diesen Verfassern ergab
die Ätherextraktion 1,87%, die Chloroformextraktion 0,85% des Trocken-
gewichts. Nach Behandlung der „entfetteten“ Bakterien mit heißer,
20%iger Salzsäure ergab eine nochmalige Chloroformextraktion aber noch
zusätzlich 14,93% Fett. Chargaff und Mitarbeitern standen bei der Unter-
suchung des „GrasbaziUua^^ große Mengen von Bakterienmaterial zur Ver-
fügung, das 1^/2 Jahre lang in einem Gemisch von Alkohol und Äther zu
gleichen. Teilen im Dimkeln stehengelassen und dann 3 Tage geschüttelt
wurde. Im, über einem dicken, gelblichen Niederschlag stehenden, klaren,
roten Extrakt fanden sich 8,37% Totallipoide. Die durch diese „milde“
Art entfetteten Bakterien enthielten aber noch 10,2% Fettsubstanzen, die
bei weiterer Behandlung mit Salzsäure und Kalilauge gewonnen wurden.
Weitere Arbeiten über den Lipoidgehalt der Boden- Mycobakterien sind mir
nicht bekannt.

Alle vorliegenden Arbeiten geben keinen genügenden Einblick in die
angewandten Methoden. Diese lassen sich grundsätzlich einteilen in chemi-
sche imd mechanisch-extraktive. Pfannenatid^ Long^ sowie Long und Camp-
bdl verwendeten ausschließlich extraktive Methoden, die im einzelnen aber
sehr ungenau beschrieben sind. Bei Coghill und Bird sowie Chargaff und
Mitarbeitern wurden mechanisch -extraktive und chemische Arbeitsweisen
miteinander verknüpft, doch sind die angewandten chemischen Hilfsmittel
ganz verschieden. Ein Vergleich der Ergebnisse aus Methoden beider Art
ist aber sehr unzuverlässig, sofern Art und Konzentration der chemischen
Agentien nicht die gleiche ist und die Zertrümmerung des Bakterienmaterials

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.^

123

unvollkommen bleibt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten sind also
zu einem zureichenden Vergleich nur bedingt brauchbar.

Da in neuerer Zeit wiederholt auf die Mangelhaftigkeit der chemi-
schen Methoden hingewieaen (Heide) und die Überlegenheit einer
befriedigenden Extraktionsmethode betont ist, wurde bei den im
folgenden beschriebenen Untersuchungen die Anwendung auf schließender
Methoden vermieden und die chemische Beeinflussung des Materials
erst vorgenommen, als die mechanischen Methoden nicht weiterführten.

Die Untersuchungen wurden an den Stammen 2, 3 imd 4 durchgeführt.
Deis Kulturmedium bestand in allen Fällen aus neutralem Nähragar mit
3% Glycerin, das Alter der Kulturen betrug 26 bis 28 Tage. Die Bakterien
ließen sich sämtlich vom Agar mit dem Spatel leicht ablösen, sie wurden
sofort in ein getrocknetes und quantitativ gewogenes Glasgefäß getan und
zunächst 48 Stunden bei 60® C zu ihrer Abtötimg und der Inaktivierung
der Enzyme vorgetiocknet und darauf bis zur Gewichtskonstanz bei 100®
getrocknet. Das Material war dann vollständig brüchig und ließ sich leicht
pulvern. Nach Abkühlimg im Exsikkator und quantitativer Wägung
wurde es mit Kieselgur in einer Achatschale mit Pistill aus gleichem Material
von Hand solange zerrieben, bis bei 60 facher Vergrößerung keine zu festen
Verbänden zusammengeballten Bakterienhäufchen mehr erkennbar waren.
Die fertig verriebenen Proben wurden in Extraktionsfilter „Schleicher u.
Schüll, Blauband“ eingefüllt und im Soxhlet -Apparat extrahiert.

Die Auswahl der Lösungsmittel wurde in Analogie zu den Unter-
suchungen am TuherkeJhazülvs vorgenommen. Schon Krealing stellt für
diesen eine Reihenfolge der Güte unserer gebräuchlichsten Lösungsmittel
auf, die vom Chloroform über Benzol und Äther zum absoluten Alkohol
geht. Benzol leistete als alleiniges Lösungsmittel die besten Dienste, die
Ausbeute an Fett stand jedoch der mit kombinierter Anwendung von
Chloroform, Äther und Alkohol erzielten etwas nach. Gcris u. a. zogen
ausschließlich mit Chloroform aus, nach den Erfahrungen Krealing^ schien
die oben angegebene Kombination jedoch vorteilhafter und daher wurde
für die Stämme 2 und 3 die Reihenfolge Äther, absoluter Alkohol, Chloro-
form angewendet, während bei Stamm 4 zuerst mit Chloroform, darauf mit
absolutem Alkohol und schließlich mit Äther ausgezogen wurde. Mit jedem
Lösimgsmittel wurde 2^/j Stunden extrahiert. Eine Übersicht über die bei
den drei Stämmen erzielten Ergebnisse bietet die Tabelle VIJ.

Die Summe der entzogenen Lipoide in % des Trockengewichts der
extrahierten Bakterien ist bei den drei Stämmen nicht sehr verschieden.

Tabelle VII.

Gewicht der
getrock-
neten Bak-
terien
in g

Gewicht
des
Äther-
extrakts
in g

Mit Äther
extrahierte
Lipoide
in % des
Trocken-
gewichts

Gewicht
des Al-
kohol-
extrakts
in g

Mit Alkohol
extrahierte
Lipoide
ln % des
Trocken-
gewichts

Gewicht

des

Chloro-
forin-
extrakts
in g

Mit Chloro-
form extra-
hierte
Lipoide
in % des
Trocken-
gewichts

Summe der
entzogenen
Lipoide
in % des
Trocken-
gewichts

4,0145

0.2132

6,31

0,3637

8,81

0,0643

1.6

16,72

6,224

5,42

8,89

0.1064

1,71

16,02

0,0376

1.01

0,3065

8.21

0.2482

6,67

15.89

1 /

124

O. V. Plotho ;

Für das Endergebnis ist es also bedeutungslos, mit welchem der drei
Lösungsmittel begonnen wird. Wird mit Chloroform begonnen, so
lösen sich etwa 1,3 % an Lipoiden mehr in ihm, als sich in Äther lösen,
wenn die Extraktion mit diesem angefangen wird. Chloroform ist also
an sich ein besseres Lösungsmittel als Äther. Als ein recht gutes Lösungs-
mittel erwies sich in allen drei Fällen der absolute Alkohol. Der Äther-
extrakt ist von hellgelber Farbe und angenehmem Geruch, der sich
aber bald vermindert und schließlich ganz verschwindet, der Alkohol-
extrakt ist rotbraun und von stechendem Geruch, ebenso wie der
duhkelgelbe Chloroformauszug.

Wurde der Bakterienrückstand nach diesen Extraktionen mit
Sudan III untersucht, so erschien er so gut wie völlig fettfrei. Bei der
Prüfung auf Säurefestigkeit aber ergab sich, daß die Bakterien in ihrer
morphologischen Integrität nicht verändert und in ihrer Säureresistenz
nicht wesentlich beeinflußt waren. Ein gleiches Ergebnis wurde bereits
von Ixmg nach seinen Extraktionen gefunden, und erst nach Behandlung
des Kückstandes mit Salzsäure verschwand die Säurebeständigkeit der
Bakterien. Der Rückstand der Stämme 2, 3 und 4 wurde daher eben-
falls in n Salzsäure gebracht und verblieb in ihr bis zu 60 Stunden. Eine
nach Filtrieren und Auswaschen erfolgende neuerliche Extraktion mit
Äther ergab dann für die Rückstände der Stämme 2 und 3 einen Lipoid-
gehalt von 3,6 bzw. 3,5 %, bei dem des Stammes 4 einen solchen von
3,9% des Trockengewichts. Bei der mikroskopischen Untersuchung
zeigte sich, daß die Morphologie der Organismen nicht mehr erhalten
und die Säurefestigkeit vollständig verschwunden war.

Die erst nach der Säurebehandlung gewonnenen Lipoide waren
also derartig fest im Bakterienleib verankert, daß einfache Extraktion
mit fettlösenden Mitteln sie nicht freimachen konnte, und erst durch
chemische Einwirkung ihre Extraktion gelang. Die Lipoidmoleküle
sind offenbar mit den Plasmakolloiden innig verbunden, und diese
Bindung verursacht höchstwahrscheinlich bestimmte Dispersitäts-
verhältnisse, die ihrerseits die Ursache der Säurefestigkeit darstellen.
Die mit fettlösenden Mitteln dem Bakterienleib ohne weiteres entzieh -
baren Substanzen besitzen vermutlich als Rfeservestoffe für die Bak-
terien Stoffwechsel -physiologische Bedeutung, stehen aber aller Wahr-
scheinlichkeit nach zur Säurefestigkeit in keiner direkten Beziehung,
wenn auch ihr Vorhandensein das Phänomen überhaupt erst möglich
machen dürfte.

Bei den Stämmen 2 und 3 wurde weiterhin der Prozentgehalt des
Unverseif baren gegenüber dem Betrag an Gesamtlipoiden ermittelt.
Er geht aus der nachstehenden Zusammenstellung hervor (Tabelle VIII ) .

Die Bestimmung des Unverseifbaren wurde nach der Methode von
Fahrion {Klein , Spez. Analyse I, 5, 630) vorgenommen, nach der das Un ver-
seifbare als Äthylätherextrakt quantitativ erfaßt wird.

Morphologie und Biologie der Mycobskterien.
Tabelle VIII.

125

Stamm

Qesamtlipoide in %
deB Trockengewichts

Unverseif bares in %
der Gesamtlipoide

19.32

16,37

19,62

16,45

19,79

—

Wie bereits erwähnt, stellten Long und Campbell den Prozentsatz an
unverseifbaren Substanzen für eine Reihe von Mycobakterien fest. Sie
gaben für einen „Dung-Bazillus“ (vermutlich ein LacticolaStamm) das
Unverseifbare mit 9,4% der Glesamtlipoide an. Bei allen Nicht-Pathogenen
fanden die Verfasser einen verhältnismäßig niedrigen Satz an Unverseif-
barem, die Organismen mit geringer Pathogenität (Vogel-, Frosch-, Schild-
krötenbazillvs) besaßen 35,1, 33,7 und 28,3 % unverseifbare Stoffe, während
die virulenten Formen des humanen und bovinen Tuberkelba^illus 77 und
60% von ihnen aufwiesen. Es scheint somit, als ob der Gehalt an unverseif-
baren Substanzen in einer gewissen Beziehung zur Pathogenität stände.

Untersuchungeu im Fluoreszenzmikroskop.

Nachdem die Fluoreszenzmikroskopie bereits längere Zeit zur Unter-
suchung histologischer Schnitte in Botanik und Zoologie Anwendung
gefunden hatte, wurde sie 1937 von Hagemann in die Bakteriologie ein-
geführt. Dem Wesen der Fluoreszenz entsprechend werden bestimmte
körperliche Elemente nach Vorbehandlung mit sogenannten Fluorochromen
bei Bestrahlen mit ultraviolettem Licht befähigt, Licht von größerer Wellen-
länge als der des auffallenden auszustrahlen, mit anderen Worten zum
Leuchten gebracht. Die Methode von Hagemann wurde 1938 von Herrmann
durch Verstärken der CuS 04 -Lösung und Veränderung der Färbetechnik
erweitert, doch teilte kürzlich Finke mit, daß er mit den Modifikationen
HerrmannH niemals bessere Ergebnisse erzielte und das Färbe verfahren
Hagemannit, sich als zuverlässiger gezeigt habe. Es wurde daher auch bei
den hier vorgenommenen Tmtersuchurigen verwendet. Die Fluoreszenz-
mikroskopie bewährte sich ausgezeichnet bei der Auffindung säurefester
Bakterien und w'ird heute häufig zur Diagnose auf Tuberkelbazillen ver-
wandt. An vergleichenden Untersuchungen mit ver.«chiedenen Tuberkel-
öoztZZßn- Typen und anderen Säurefesten liegt nur die Arl)eit von Finke
vor, der von Boden -M.i/coöaikterien nur den „Thimotheebazillus^'' und einen
Stamm von säurefesten MUchbakterien untersuchte.

Zu den hier angestellten Beobachtungen im Fluoreszenzmikroskop
diente als Strahlenquelle eine 5 Amp. Kohlenfadenlampe mit Siemens-
Plania-Kohlen. Die von Hagemann angegebene 2%ige CuS 04 -Lösung
wurde gegen eine kalt gesättigte ausgetauscht, womit eine Verbesserung der
Absorption der roten Strahlen erzielt wurde, wie das auch von Herrmann
angegeben wird. Um zu vermeiden, daß ultraviolette Strahlen ins Auge
drangen, wurde eine Okularsperrfilterkappe Lifa II verwendet, beobachtet
vrurde mit Trockenobjektiv Apochromat 20 und Okular 10 und 20, die
Beobachtung fand ohne Deckglas statt'. Die Präparate wurden nach
Flammenfixierung mit Auraminlösung 1 : 1000 Aqua dest. +5% Phenol

' Für die freundliche Hilfe bei dem Aufbau des Mikroskops und der
Durchsicht der Präparate bin ich Herrn Dozent Dr. R. Meyer zu großem
Dank verpflichtet.

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13.

126

O. V. Plotho :

liquefac. 15 Minuten gefärbt, mit Leitungswasser abgespült und mit salz-
saurem Brennspiritus (1000 ccm Brennspiritus, 4 ccm konz. reine HCl,
4 g Na CI) 3 Minuten differenziert, wobei nach 1^/, Minuten der Brenn-
spiritus erneuert wurde. Eine Gegenfärbung wurde nicht gemacht.

Beim Durchmuatem zeigten alle Stämme eine helle

Fluoreszenz, die aberden goldgelben Ton der Tuberkelhazillu8-V\\xQTeszera
nicht erreichte, sondern mehr grünlich leuchtete. Es fluoreszierten
aber nicht nur ,, wenige, meist sehr kurze, Stäbchen“, wie Finke schreibt ;
das Gesichtsfeld bot vielmehr das Bild ungleich langer, leuchtender
Stäbchen in großer Menge dar, Bakterienhäufchen zeigten eine beträcht-
liche Leuchtkraft, die jedoch hinter der von zusammengeballten Tuberkel-
bazillen zurückblieb und, wie erwähnt, weniger goldgelbe Farbtönung
aufwies. Ebenso fluoreszierten Myc. eos und luteum. Alle Phlei-
Stämme zeigten ebenfalls gute Fluoreszenz, die Helligkeit zusammen-
geballter Häufchen fiel aber deutlich gegenüber der von Lacticola-
Stämmen ab, und der Ton einzeln liegender Stäbchen war mehr grau-
grün, auch war die Zahl der fluoreszierenden Stäbchen geringer. Be-
merkenswerterweise war eine schwache, aber deutliche Fluoreszenz
auch bei den Proactinomyceten festzustellen. Hierauf wurde auch ein
aus Erlenknöllchen isolierter, als Stamm 10 bezeichneter (o. Plotho)
Actirumycet untersucht, der reichlich mit Fett- und Wachsstoffen
inkrustiert ist und dessen Mycel eine gewisse Säurefestigkeit besitzt.
Auch er zeigte geringe, wenn auch lichtschwache graugrünliche Flu-
oreszenz in mehr oder weniger langen Fadenstücken und einzelnen
Sporen. Die Prüfung eines anderen, in der angegebenen Arbeit mit
Stamm S bezeichneten Actinomyceten, dem jede Säurefestigkeit fehlt,
fiel jedoch negativ aus, es konnte keine Spur von Fluoreszenz fest-
gestellt werden.

Es scheint nach diesen Beobachtungen, als ob Fluoreszenz und
Säurefestigkeit auf den gleichen Voraussetzungen beruhen. Wie die
Säurefestigkeit nach den oben mitgeteilten Versuchen bedingt zu sein
scheint durch eine bestimmte von den Lipoidsubstanzen verursachte
Dispersität der Plasmakolloide, so dürfte auch die Fluoreszenz mit
dieser besonderen Struktur der Proteine Zusammenhängen. Es bilden
also wahrscheinlich auch für sie physikalisch -chemische Verhältnisse
die Grundlage.

Das Verlialten der Myeobakterien auf yerschiedenen Nährböden.

In der Literatür finden sich nur wenige Untersuchungen, die das Ver-
halten der Myeobakterien auf verschiedenen Nährmedien behandeln. Am
häufigsten wurden auch nach dieser Richtung hin die hochvirulenten
TuherkelbazUlen beobachtet und schon früh wurde festgestellt, daß das
Hinzufügen von Glycerin zum Nährmedium bei ihnen das Wachstum
erhöht. Maaßen, der zum erstenmal an 62 Bakterienarten einen Überblick

Morphologie imd Biologie der Mycobakterien.

127

über Stoffwechsel Vorgänge bei Mikroorganismen gab, zeigte, daß Myc. Tuber-
culosia in keiner der gewöhnlichen Nährlösungen mit Pepton und Salzen
organischer Säuren wächst, daß er jedoch zur Entwicklung gelangt, wenn
die Medien emen Zusatz von 9®/oo Glycerin erhielten. 10 Jahre später
demonstrierte Theobald Smith die gleiche Wirkung dieses Substrats und noch
in jüngster Zeit bezeichneten französische Forscher (Fembach u. JRuUier)
die wachstumsfördernde Wirkung des Glycerins auf den Tuberkelbazillus
als geradezu spezifisch. Es war daher interessant, festzustellen, ob sich diese
Wirkung bei den verwandten Bodenbakterien auch nachweisen ließ.

Als Nährsubstrat wurde Fleischextrakt-Pepton-Bouillon mit 3%
Glycerin gewählt. In den Vergleichslösungen befanden sich dem Glycerin-
zusatz äquivalente Mengen von Mannit und Dextrose. Beim Abbrechen
des Versuchs wurden die Kulturflüssigkeiten durch quantitativ gewogene
Filter filtriert und der Rückstand auf ihnen bei Zimmertemperatur ge-
trocknet und gewogen. Es wurden stets 2, oft 3 Parallelkulturen angelegt,
die Zahlen stellen daher die Durchschnittsergebnisse mehrerer Versuche
dar. Auch die Angaben der weiter unten aufgeführten Tabellen X bis XIV
sind immer Durchschnittswerte aus 2 oder 3 Parallel versuchen.

Die Tabelle IX läßt erkennen, daß die wachstumsfördemde Wirkung
des Glycerins auch für Myc. iestudints und die Zac/tcofo- Stämme besteht.
Der Schildkrötenhazillus wächst sehr langsam, aber auch bei ihm ist ein
deutlicher Vorsprung der Glycerinkultur unverkennbar. Die Stämme 2
und 4 hatten sich dem Mannitnährboden gegenüber um etwa 1/3 besser
entwickelt; nicht ganz so groß war der Vorsprung gegenüber dem
Dextrosemedium, doch auch hier ist er sehr beträchtlich. Die nahe
Verwandtschaft der genannten »Stämme zum Tuber kelbazih ns wird
durch dieses Ergebnis aufs neue erwiesen. Interessant ist au ah die
Wachstumsförderung, die der Stamm 14 durch das Glycerin erfährt.
Bei ihm ist sie den anderen Nährböden gegenüber noch größer. Die
übrigen Stämme, besonders der Vertreter der Proactinomyceten

Tabelle IX.

25 ccm Nährlösung. Ausgangs-pn 6,6. Alter der Kulturen 14 Tage.

Stamm

3 % Qlyoerin

2,967 % Mannit

2,92 % Dextrose

Gewicht
in mg

End-pH

Milch-
säure -
bi Idung

Gewicht
in mg

End'PH

Milch-
säure-
bi Idung

Gewicht
in mg

End-pn

Milch-

sfiure-

bildung

18,9

6,6

:fc

16,2

6,6

13,3

6,6

4 +

368,8

7.2

238.1

7.2

312,8

7.0

333,6

7,2

237,6

7.2

262,3

7.2

139,4

6,8

246,7

7,0

203,4

7,0

274,3

7.2

129,6

7,2

99,6

7,0

24,7

6,0

134,6

6,8

100,3

6,8

89,3

6,4

■f

102.3

6,2

117,4

6,4

61,9

6,6

133,0

7.0

283,9

7,0

149,1

6,6

211,3

6,9

141,9

7,0

4- -f = reichliche Bildung von Milchs&ure; 4 — Mllchsäuiebildung ; + --- schwache Milch-
Bäurebildung.

128

O. V. Plotho :

(Stamm 21), wachsen jedoch weitaus besser auf dem Zuckemährboden
oder auf Mannit, sie entfernen sich also auch in ihren kulturellen Eigen-
schaften mehr und mehr vom Mycobakteriutn-Ty'pus,

Aus der Tabelle ist weiter ersichtlich, daß die Stämme 2, 4, 8, und 14
alle drei Medien alkalischer machen, während die übrigen eine Erhöhung
der Acidität in den Substraten, oder doch nur ein geringes Absinken
der H-Ionen bewirken. Bei längerer Kulturdauer steigt zunächst bei
den genannten vier Stämmen die Alkalität noch bis auf etwa pa 8 an,
dann tritt eine langsame Erhöhung der H-Ionenkonzentration ein und
die Nährlösungen werden schließlich sauer. Bei den übrigen Stämmen
werden die Medien bei längerer Kulturzeit noch etwas saurer, dann
fällt aber die Acidität, wahrscheinlich infolge autolytischer Vorgänge,
langsam ab. Zur Erklärung dieser Unterschiede im Reaktionsverlauf
ist zu sagen, daß die Stämme 2, 4, 8 und 14 die am schnellsten wachsenden
Organismen sind, so daß eine Säurebildung bei ihnen wahrscheinlich
anfangs überdeckt wird durch eine überaus starke Bildung von alkali-
schen Abbauprodukten, die bei den langsamer wachsenden Formen in
der gleichen Zeit nicht in so großer Menge entstehen und die Säure-
bildung also hervortreten kann. Außerdem werden organische Säuren
in großem Umfang sicher nicht gebildet. Die einzige Säure, die sich
fast immer in mehr oder weniger großer Menge fand, war die Milchsäure,
die mit der Reaktion nach Denigis (Bernhauer) nachgewiesen wurde-
Diese Reaktion ist außerordentlich empfindlich, ihr Ausfall ist bereits
bei einem Bruchteil von Milligrammen Milchsäure positiv. Eine ältere
Methode zum Milchsäurenachweis mit Ätherextrakt und Risenchlorid-
lösung (Seifert und Müller) versagte häufig, wo nach Denigis noch das
Vorhandensein der Säure deutlich nachgewiesen werden konnte. Hierauf
ist wahrscheinlich die Mitteilung von Merrill der die zweite Methode
benutzte, zurückzuführen, daß Milchsäure bei Myc. lacticola und phlei
nie nachzuweisen sei. Ihre Bildung kann jedoch nicht zweifelhaft sein.

Für die späteren Untersuchungen war es notwendig, einen Nähr-
boden von genau bekannter Zusammensetzung zu benutzen. Nach
verschiedenen Versuchen mit anderen synthetischen Lösungen wurde
in der Folge immer die verhältnismäßig einfache Kombination benutzt,
die von Jemen (1934) für Mycobakterien und Corynehakterien verwendet
wurde. Sie enthält: Dextrose 1%, K2HPO4 0,1%, MgS04 0,05%,
Na CI 0,05% . über die Wirkung einiger der gebräuchlichsten Stickstoff -
quellen in Gemeinschaft mit dieser Lösung unterrichtet Tabelle X.

In der Tabelle tritt die Überlegenheit des Ammoniumphosphats
als N- Quelle deutlich hervor. Es ist erstaunlich, welchen Vorsprung
vor den anderen die Loc^tcoZa- Stämme auf diesem Medium erreichen.
Der Wachstumsertrag des Stammes 2 7. B. übertrifft auf ihm um mehr
als das Doppelte den des nächstbesten Substrats. Für die Verireter

Morpholo^^ie und Biologie der Mycobaktei ieii.

129

Tabelle X.

25 ccm Nährlösung. Alter der Kulturen 28 Tage. Ausgangs -pn 8.

0,2 %(N H 4 ) 2 HP 04

Stamm

Gewicht
in mg

End-pH

20,6

4.0

45,6

7.2

19,5

4,3

92,6

6,7

18,6

3,9

62,6

7.2

14,6

4,3

77,7

6,6

14,3

6,4

19,0

7,3

18,2

4.7

48,7

6,6

4,6

4,9

6,3

6.4

17,6

6,6

10,2

6,3

3,3

4.5

6,5

5,4

16,6

4,8

10,8

6,4

4,6

6,8

6,7

6.8

12,4

6,6

11,3

6,6

der anderen Arten ist der Unterschied gegenüber der Ammonium-
Chlorid- und der Natriumnitratlösung genau so beträchtlich, die Ammon-
sulfatlösung schneidet aber besser ab. Sie ist überhaupt für die Stämme 8,
14 und 21 nicht ungeeignet, und Ammonsulfat scheint sieh bei anderer
Zusammensetzung der Nährlösung im allgemeinen gut zu bewähren,
denn Frey und Hagan benutzten es bei ihren zahlreichen Isolierungen
aus Böden in synthetischen Lösungen als N- Quelle. In meinen Ver-
suchen blieben die Ixirticola-Siiimme jedoch immer sehr stark zurück,
was sicher zum großen Teil auf die während des Kulturv^erhiufs ein-
tretende starke Verschiebung der pn-Werte in den sauren Bereich
infolge der Aufspaltung des Ammonsulfats zurückgeführt werden muß.
Wenn auch nach anderen, hier nicht mitgeteilten Versuchen dit' S])anne
der Reaktionsgrenzen, innerhalb derer Wachstum stattfindet, bei den
betreffenden Stämmen außergewöhnlich groß ist, und etwa von 4
bis pk 10 reicht, so verlangsamt sich doch die Wachstumsgeschwindig-
keit bei Annäherung an diese Grenzen beträchtlich und eine volle Ent-
wicklung der Kulturen wird in der Nähe der Grenzwerte überhaupt
nicht erreicht. Die starke Ansäuerung dürfte auch ein Grund sein für
die besonders unbefriedigende Entwicklung in der Ammonchlorid-
lösung, außerdem macht sich aber auch in ihr die schädigende Wirkung
des Chlorions geltend. In der Nitratlösung ist das End-/>H dem Ausgangs-
stadium gegenüber nicht allzu stark verschoben, doch ist hier das
NOß-Ion wahrscheinlich der Entwicklung abträglich, so daß auch
dieses Medium in seiner Wirkung allzu weit hinter der Ammonphosphat -
löbung zurückbleibt. Für die späteren Versuche wurde daher stets
Ammonphosphat als N- Quelle in synthetischen Lösungen benutzt.

Erst verhältnismäßig spät wurde die Verwendbarkeit der Kohlen-
hydrate d\irch die "Boden-MycoM terien gesichert. Es gibt eine Reihe
älterer Arl)eiten (Keudel und Mitarbeiter, Lang und Majcr), die die Ver-
gärungsmöglichkeit dieser Verbindungen bestreiten. Durch Braun und
seine Mitarbeiter wurden dann später systematische Reihenversuche über
den Verwendimgsstoffwechsel der Bakterien unternommen und gezeigt ,
daß die saprophytischen Mycobakterien in synthetischen Nährböden mit

130

O. V. Plotho ;

viel verschiedenartigeren C- Quellen auszukommen vermögen als die
pathogenen. Dennoch berichten auf Grund von Reaktionskurven Weinzirl
und KnapUm noch 1927, daß Dextrose und Lactose in synthetischen
Lösungen nicht vergoren würden. Durch die Arbeit von Merrill (1930), der
als erster eine quantitative Bestimmung der Zucker in den Nährlösimgen
nach verschiedenen Kulturtagen vornahm, wurde endlich die Ausnutzbarkeit
der Kohlenhydrate durch Mycobakterien sichergestellt. In neuester Zeit
prüfte CtUinelli mit der manometrischen Methode nach Warburg die Ver-
wendbarkeit der Kohlenhydrate durch den Ttiberkdbazüliis und fand, daß
Mannose, Lävulose und Galaktose in absteigender Geschwindigkeit an-
gegriffen werden. Von den Disacchariden werden Maltose gut, Saccharose
mäßig ausgenutzt, Pentosen und Polysaccharide sind nicht verwendbar.

Die in der Tabelle XI aufgeführten Kulturen wuchsen in Reagens-
gläsern, die 7 ccm einer Nährlösung enthielten, die aus den oben an-
gegebenen Salzen +0,2% (NH 4 )HP 04 bestand. Dazu kam jeweils
J % der Kohlenhydrate. Die Zahlen geben die Menge der gewachsenen
lufttrockenen Bakterien in mg an.

Die Tabelle zeigt, daß von den Hexosen die Monosaccharide Glu-
cose, Lävulose und Mannose etwa gleich gut verwertet werden, etwas
geringer erscheint die Ausnutzbarkeit der Galaktose. Auffallend ist
demgegenüber die außerordentlich schlechte Verwertbarkeit der Saccha-
rose. Die beiden Stämme von Lacticola perrugosum sind auf ihr über-
haupt nicht gewachsen. Hierauf wurden die übrigen Stämme von
Lacticola perrugosum gesondert geprüft. Die Stämme 3 und 6 zeigten
nicht die geringste, Stamm 5 nur eine schlechte Entwicklung. Dagegen
konnte iMCticola planum Rohrzucker verhältnismäßig gut verwerten,
was wiederholt geprüft wurde. Bei allen anderen Stämmen ist ebenfalls
die Entwicklung in Rohrzucker äußerst mäßig. Es muß somit für die
'Boden- Mycobakterien der Abbau des Moleküls über die beiden Mono-
saccharide unmöglich sein und eine Verarbeitung des ungeteilten
Moleküls nur schwer gelingen. Dagegen wird die Maltose allgemein
besser, wenn auch nicht gut, verarbeitet und besonders auch von den
Lac/ico/d- Stämmen angegriffen.

Das Trisaccharid Raffinose ist eine so schlechte Kohlenstoff quelle,
daß es den meisten Stämmen nur ein derartig geringfügiges Wachstum
ermöglicht, daß das Gewicht der entwickelten Bakterien nicht fest-
gestellt werden konnte. Merkwürdig ist das verhältnismäßig gute
Gedeihen von Stamm 14. Die Stärke wurde als C- Quelle von keinem
der geprüften Stämme verarbeitet, niemals war das geringste Wachstum
festzustellen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cuthielli am
Tuherkelbazillus sieben die Wachstumsbefunde bei den Pentosen.
Fast alle Stämme gediehen auf ihnen gut bis sehr gut, insbesondere
wuchsen auch die beiden Vertreter von Lacticola perrugosum durchaus
befriedigend. Nur der Lacticola ptonwfn-Stamm war so kümmerlich
gewachsen, daß das Gewicht der Bakterien nicht festgestellt werden

Tabelle XI. Alter der Kulturen 21 Tage. Anfangs-pH bis 7. Kulturtemperatur 3ö®C.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

131

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Pt 00

ö ©r . « cd

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0 05

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CP^tP^lH t^

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!> cd

1»

w a

kein

Wachstum

dasselbe

>»

Gew. nicht
feststellbar
dasselbe
kein

Wachstum

■§ *
«»•

7,4

PtCOCO 00

CH iH cd cd

IH r-T

Gewicht
in mg

13,4

12,6

10,9

Gew. nicht
feststellbar
dasselbe

CH 05
cdiH

»4

•ö stj
ö öl
w ^

co"

C04OPt 40

cdcdccT cd

Pt Pt

cd cd

’S

•<

Gewicht
in mg

kein

Wachstum

dasselbe

Stamm

coGO CO

rH rH

-H CH
©3 ©3

132

O, V. Plotho :

konnte. Nach Bergey ist dieses Verhalten bei Kultur auf Arabinose
charakteristisch für die Mycobakterien, die zu seiner Untergruppe Ib
gehören, in der iMcticola planum steht. Auch das Wachstum von
Stamm 7 auf Rohrzucker spricht nach Gordon und Hagan für seine
Zugehörigkeit zu dieser Untergruppe der amerikanischen Forscher.
Kürzlich haben allerdings Rippel und Mitarbeiter darauf hingewiesen,
daß die Verarbeitung von Zuckern, organischen Säuren und sonstigen
C- Quelle so stark von der Konzentration der Stoffe und anderen
Kulturbedingungen abhängt, daß eine systematische Verwertbarkeit
äußerst problematisch erschiene. In diesem Falle dürfte das kulturelle
Verhalten aber wohl herangezogen werden, da die daraus folgende
systematische Stellung übereinstimmt mit derjenigen, die dem Stamm 7
auf Grund seiner morphologischen Eigenschaften ohnehin zugewiesen
werden müßte.

In weiteren Versuchen wurden organische Säuren als Kohlenstoffqueile
für die Mycobakterien geprüft. Ihre Wirkung wurde nach der älteren Ver-
wendungsstoifwechselmethode festgestellt durch Beobachtung wachsender
Bakterien in den Lösxmgen der betreffenden Säuren, ln neuerer Zeit ver-
wendet die biochemische Forschung zum Säureabbau durch Mikroorganismen
häufig die Methode der „ruhenden“ Bakterien (Braun und Vasarhelyi,
Franke und Peria). Erst kürzlich wies aber Rippel darauf hin, daß für die
rein biologische Betrachtung diese Methode primär weniger geeignet sei,
da es sich für den Biologen in erster Linie darum handele, „die Wirkung
des Zusammenspiels aller gegebenen Möglichkeiten im Lel)ensablauf zu er-
fassen, worüber das Herausnehmen nur eines, sozusagen stationären Vor-
ganges, noch keinen Aufschluß geben kann.“ Für andere Bakterien liegen
nach der älteren Methode auf dem Gebiet der Verwendungsmöglichkeil
organischer Säuren zahlreiche Untersuchungen vor. Für die saprophyti sehen
M'jcohakterien finden sich in der Literatur jedoch keinerlei Angaben, daher
dürften die nachfolgenden Darlegungen, zumal in ihrer quantitativen
Durchführung, gerechtfertigt erscheinen.

Die Nährlösungen der in der Tabelle XJJ zusammengestellten Kulturen
sind die gleichen wie die in der Tabelle XI, nur ist jeweils 0,1% der zu
prüfenden Säure als Kohlenstoffqueile an Stelle der Kohlenhydrate hinzu -
gefügt und der pH-Wert auf 6,8 bis 7,0 gebracht. Höhe re Säurekonzentra-
tionen erwiesen sich besonders bei der Milch- und Brenztraubensäure als
scliädigend, vielleicht wegen der großen Menge Alkali, das zur Neutralisi-
sierung dieser weitgehend dissoziierten Säuren in die Lösung hineingebracht
werden mußte.

Wie aus der Tabelle ersichtlich, ist von den beiden niederen ge-
sättigten Monocarbonsäuren nur die Essigsäure zur Synthese neuer
Zellsubstanz brauchbar. Die Ameisensäure wird zwar,, was aus der
Änderung der pn-Werte hervorgeht, angegriffen, ihre Abbauprodukte
können aber offenbar zum Aufbau der Leibessubstanz der Mycobakterien
nicht verwertet werden, bei keinem Stamm war auch nur das geringste
Wachstum eingetreten. Quastei berichtete bereits 1925 über die Un-
brauchbarkeit dieser Säure für viele Bakterien und bestätigte seine

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

133

Ergebnisse später mit Hilfe verhältnismäßig neuer Methoden, ins-
besondere der 7^ättn66r^schen Methylenblautechnik. Die Mycobakterien
verhalten sich also der Ameisensäure gegenüber nicht anders wie die
meisten Mikroorganismen. Im Gegensatz zu ihr gehört die Essigsäure
zu der Reihe zellvertrauter Substrate, die von fast allen Bakterien
leicht angegriffen werden. Sie besitzt auch für die Mycobakterien eine
recht gute Eignung als Zellbaustoff. Von den untersuchten Organismen
war nur Stamm 16 so kümmerlich auf ihr gewachsen, daß das Gewicht
der Bakterien nicht featgestellt werden konnte. Er scheint aber gegen-
über der C- Quelle besonders anspruchsvoll zu sein, denn er erreichte
in keiner Lösung der Tabelle XII eine befriedigende Entwicklung.
Unter den gesättigten zweibasischen Fettsäuren zeichnen sich die
Oxalsäure und die Weinsäure durch sehr geringe Verwertbarkeit aus.
Die letztere wird nur von dem immer kräftig wachsenden Stamm 8
ausgenutzt, aber auch bei ihm kommt es nur zu einer mäßigen Ent-
faltung. Die Bemsteinsäure wird dagegen in erheblichem Umfang
angegriffen und ihre Spaltprodukte werden als Aufbaumaterial offenbar
leicht verwendet. Die Stämme 2, 3, 8 und 14 erreichten in ihr die
höchsten Grewichtszahlen unter allen geprüften Säuren. Auch dieses
Ergebnis weicht nicht ab von den Erfahrungen mit vielen anderen
Bakterien in dem gleichen Substrat. Merkwürdig aber ist das Ergebnis
aus der Lösung der Citronensäure. Sie wird in den Untersuchungen
von Braun und Mitarbeitern sowie in neueren Literaturangaben (Sonder-
hoff und Deffner) übereinstimmend als sehr gutes Baumaterial be-
zeichnet. In den vorliegenden Versuchen zeigte sie sich aber durchaus
nicht als solches. Die beiden Ixicticola-Stämme und der Eos-Sta>mm
waren gar nicht, der Stamm 27 spärlich, auch die Stämme 8 und 14 nur
sehr mäßig entwickelt. Nur der Vertreter der Proactinomyceten
(Stamm 21) war gut gediehen. Ob hier ein für alle Mycobakterien
spezifisches Verhalten v'^orliegt, müßten weitere Versuche klären . Milch-
säure und Brenztraubensäure sind in vielen Stoffwechseluntersuchungen

Tabelle XIII.

7 ccm Nährlösung, Anfangs-pn 6,8. Alter der Kultur 18 Tage. Kultnr-

temperatur 35® C.

Stamm |

stamm

Citronensäure

Gewicht in mg

Oewicht in mg

BSnd-pif

1-G 1

nicht gewachsen

5,2

7.2

6,6

7.2

6,4

7,0

2,4

7,0

4,0

7,2

4,8

7.4

3,6

7,2

6,2

7,1

3,2

7.2

3,2

7.0

12,6

7.4

nicht gewachsen

6,6

3,9

7,4

9 *

Tabelle XIV. Alter der Kulturen 28 Tage. Anfangs-pa 7,0. Kulturtemperatur 36® C, 25 ccm Nährlösung.

134

O. V. Plotho :

0,135 % Alanin

Milchsäure

als hervorragende Kohlenstoffquelle
41 1 ; erkannt worden, sie erwiesen sich

auch in den vorliegenden als solche.

•c

Im allgemeinen erschienen also
S5SS222S5 <ii© gleichen Substrate, die generell

in mehr oder weniirer großem Um-

Gewicht
in mg

^ ^ fang von allen Bakterien ausgenutzt

1 ^ werden können, auch für die Myco-

bakterim als brauchbar. Um die Ver-

1 0,1 % Asparagin

wendbarkeit der Citronensäure für
-i_ . - 1 . die übrigen untersuchten Stämme

-Lj -U -Lj «J 4- ~ ®

+ + festzustellen, wurden diese sämtlich

in ihr kultiviert. Die Tabelle XIII

gibt die Zusammenfassung der Er-

O O CO r#< 00 CO r- , .

c^r^co coio u 3 locor^ gebnisse.

Gewicht
in mg

Alle Stämme, mit Ausnahme
«l ^ von Stamm 25, sind in der Citronen-

CO>^fHaOCOG^CO'i1<O50 , . .11

2 saure sehr mäßig entwickelt. Es ist
£ vorderhand nicht möcrlioh für diese

0,198% Leucin

Milchsäure

1 Erscheinung eine Ursache anzu-

1 1 + p geben.

_ ’> An vftrglfti oben den TJntersiinhiin-

gen über die Verwendung der Amino-
t säuren als Stickstoff quelle durch
- Mycobakterien sind mir ebenfalls keine

Gewicht
in mg

_ 1 den Mitteilungen von Jenaen (1934)

O^CQI>CMCO 0t-*«0 , , „

005000? !ood 1 über da» Wachstum einiger Stämme
O 5 coio-i^<i-t^ i- ^ synthetischem Nährboden mit

- - ü Asparagin als N * Quelle liegen über die

0,113 % Glykokoll |

^ Brauchbarkeit dieser Säuren keine
4 _ 4 _-j__|_ + _j__j_ 4 _+ | Beobachtungen vor. Die hier durch-

+ -f- > geführten Versuche sind in der

” Tabelle XIV zusammengefaßt. Die

Lösungen enthalten jeweils die 0,1%
e^c> CO u 3 »o CO 00 !>; g Asparagin äquivalente Menge an
c-t- co^co-^co oco - 1 ? g Aminosäure, 1% Dextrose undMine-
t ralsalze in der auch von Jenaen be-

Gewicht
in mg

i nutzten Kombination (K^H P O 4 0, 1 % ,

i MgSO« 0,06%, NaCl 0,05%).

CO ^ CO CO 1-H 05 0 |3^

1 Im allgemeinen wurden, wie

Stamm

" Tabelle XIV zeigt, alle Aminosäuren

^ gut ausgenutzt, das Leucin stellt
durchschnittlich wohl die beste N-

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

135

Quelle dar. Die Stämme 14 und 27 entwickelten sich am schlechtesten,
was auf die reichliche Bildung saurer Abbauprodukte zurückzuführen
sein dürfte.

Die Kultur der Mycobakterien in Milch.

Milch ist für alle hier untersuchten Stämme kein guter Nährboden.
Sämtliche Formen bilden in ihr eine schwache Oberflächenhaut und
wenig Sediment von der Farbe, wie sie sich auch in Fleischextrakt -
Pepton- Bouillon entwickelt. An den Formelementen sind häufig
involutionsartige Veränderungen nachweisbar. Die Stämme

bilden z. B. im Sediment sehr feine, dünne Fäden von ungleicher Länge,
0,8 — 1,3 X 3 — 7 [j., die in sehr feine Kokkoide zerfallen (Stamm 6).
Die Bildung säurefester Granula wurde bereits ausführlich besprochen.
Sie fanden sich im Sediment häufig außer bei den Stämmen

auch in den Stäbchen, sowie frei in der Milch bei Stamm 14. In lebenden
Präparaten leuchten sie bei hoher Tubuseinstellung auf. Wird zum
lebenden Sediment verdünnte Methylenblaulösung hinzugefügt, so
nehmen die Granula den Farbstoff nicht auf. Nur nicht mehr voll
lebensfähige Elemente lassen ihn eintreten und färben sich dunkelblau.
Das verhältnismäßig häufige Vorkommen von Granula (vgl. oben, S. 1 15)
kann, wie erwähnt, zurückgeführt werden auf das ungünstige Kultur-
medium. Auch im Oberflächenhäutchen von Stamm 14 lassen sich
viele, stark verlängerte, in der Mitte oder an den Polen aufgetriebene
Stäbchen und sonstige Involutionsformen erkennen. Bei den Eos-
Stämmen (Stämme 15 und 17) kommen in 4 Wochen alten Milchkulturen
in Oberflächenhaut und Sediment bis zu 10 \l lange, verdickte Stäbchen
vor, in denen sich nach Färbung mit Carboifuchsin und Behandlung
mit 5%iger Schwefelsäure stark säurefeste Strukturen naehweisen
lassen, die teilweise fast die ganze Länge der Stäbchen ausfüllen und in
ihrem Verlauf regelmäßige Einschnürungen zeigen, teils als kugelige
Körperchen in den Stäbchen liegen. Die PÄ/et- Stämme und Pro-
actinomyceten zeigen ebenfalls zahlreiche Involutionsformen in Ober-
flächenhaut und Sediment (Stämme 8, 22, 24). Im allgemeinen ist die
Säurefestigkeit in alten Milchkulturen größer als in gleichaltrigen
Kulturen von Nährbouillon mit Dextrosezusatz (Stamm 17), die Er-
höhung ist jedoch bei vielen Stämmen nicht beträchtlich.

Die Milch wird von allen Stämmen nicht koaguliert und nicht
peptonisiert, keiner der hier untersuchten Stämme kann also Milch
verdauen. In alten Kulturen findet als charakteristische Veränderung
eine langsame Aufhellung der Milch statt, die aber keine Koagulation
ist. Die Milch wird halb transparent, opalisierend und zäh; nach Jensen
(1934) soll sie in 3 Monate alten Kulturen sogar ganz gelatinös sein.

1 /

136

O. V. Plotho :

Jenaen hält den Vorgang für irgendeinen physikalischen Effekt auf
das Casein.

Die Reaktion der Milch wird nach wenig Kulturtagen alkalischer
und die Konzentration der H-Ionen sinkt bei längerer Kulturdauer
weiter ab, wie die Tabelle XIV zeigt.

Tabelle XV.

Staium

H-Ionen - Konzentration
nach Tagen

Beschaffenheit der Milch
nach Tagen

6.4

7.8

unverändert

halb transparent

6.7

7.4

aufgehellt

7.1

7.2

♦»

„

6,6

6,9

halb transparent

6,2

6.4

unverändert

7.2

7.6

*»

opalisierend, zäh

7.0

7.6

»>

»» ♦>

Die Kulturen wuchsen in Reagensgläsem mit

7 ccm Inhalt, das

Ausgangs-pH betrug 6,2, die Kulturtemperatur 35® C.

Die aus der Tabelle XV ersichtliche alkalische Reaktion der
Kulturen kann wenigstens anfänglich nicht auf die Bildung von Am-
moniak aus Eiweißzersetzung zurückgeführt werden, wie das bei vielen
Bakterien der Pall ist, denn auch nach 3 Wochen Kulturdauer konnte
kein Ammoniak nachgewiesen werden. Die Milch bleibt vielmehr
während der ersten 2 bis 3 Wochen der Kultur ganz unverändert und
beginnt erst dann die besprochenen Veränderungen zu zeigen. Die
alkalische Reaktion dürfte höchstwahrscheinlich hervorgerufen werden
auf Grund der Bildung von Carbonaten bzw. Bicarbonaten aus den
Salzen von in der Milch vorhandenen organischen Säuren durch Oxyda-
tion. Hier kommt vermutlich in erster Linie die Citronensäure in
Betracht und auf diese Weise erklärt sich auch das schlechte Wachstum
aller Stämme in Milch. In der Tabelle XV ist der Stand der H-Ionen-
konzentration nach 9 Tagen angegeben, die Alkalisierung macht sieb
bei den schnell wachsenden Stämmen (8, 21) aber schon früher geltend,
die langsam wachsenden (Stamm 15) zeigen sie erst nach längerer Zeit,
auch erreichen nicht alle den gleichen Grad der Alkalität. Ebenso setzt
die Veränderung der Milch nicht überall nach der gleichen Kulturzeit ein.

Zusammenfassung.

Es wurden 27 Stämme von Mycobahterien und Proactinomyceien
untersucht und ihre Zugehörigkeit zu den verschiedenen Arten und
Modifikationen festgestellt.

Die meisten Organismen sind streng aerob, drei Stämme zeigten
auch unter anaeroben Bedingungen ein sehr schwaches Wachstum, doch
war die Farbstoff bildung vollständig unterdrückt.

Morphologie imd Biologie der Mycobakterien.

137

Die Pigmentbildung trat in belichteten und unbelichteten Kulturen
auf, ihre Intensität war in Tageslichtkulturen aber größer. In einigen
Stämmen wurde Carotin nachgewiesen.

Die Untersuchungen zur Morphologie fanden ausschließlich an
Einzellkulturen statt. Die Stämme 1 bis 7 (Myc, iMcticola) zeigen in
jungen Kulturen nie Verzweigungen, bei einigen von ihnen wurde sie
in alten beobachtet. Das gleiche gilt für Stamm 14 (Myc. luteum). Die
Stämme 15 bis 20 (Myc. eos) waren nie verzweigt, im Alter sind sie
kokkoid. Die Stämme 8 bis 13 (Myc. phlei) bilden in sehr jungen
Kulturen Verzweigungen, die am dritten Kulturtag verschwunden
sind, alte Kulturen enthalten nur kokkoide Formen. Die Proactino-
myceten bilden in der Jugend ein kleines verzweigtes Mycel, das am
sechsten bis siebenten Kulturtag in Stäbchen und später in Kokken
zerfällt.

Luftsporen wurden nie gebildet. Bei einem Stamm fanden sich
Dauerformen anderer Art, deren Auskeimung beobachtet wurde.

Die Säurefestigkeit ist abhängig von verschiedenen äußeren Be-
dingungen, für ihren Grad ist nur die H-Ionenkonzentration der Säure
nicht ihre Art verantwortlich. Die durch festgebundene Lipoidsubstanzen
beeinflußte Struktur des Plasmas wurde als Ursache der Säureresistenz
wahrscheinlich gemacht.

Der Anteil der Lipoidsubstanzen in % des Trockengewichts der
Bakterien und der Prozentsatz des Unvcrseifbaren wurde für einige
Stämme bestimmt.

In ultraviolettem Licht zeigten alle Organismen mehr oder weniger
starke Fluoreszenz.

Die spezifische Wirkung des Glycerins im Nährboden wurde auch
für die Stämme nachgewiesen, die dabei gebildete Säure

wurde als Milchsäure identifiziert.

In synthetischen Nährlösungen tat (NH 4 ) 2 HP 04 als Stickstoff-
quelle die besten Dienste.

Unter den Kohlenhydraten wurde Raffinose nur von wenigen.
Stärke von keinem Stamm ausgenutzt. Von organischen Säuren erwies
sich die Citronensäure als schlechte C- Quelle, die Aminosäuren wurden
allgemein gut verwertet,

Milch ist für die Mycobakterien ein schlechter Nährboden, sie wird
nicht koaguliert und nicht peptonisiert .

Literatur.

Anderson, R. I.t J. of biol. Chem. 74, 62ö, 1927. — Auc/a r, u.
L. Paris, Arch. med. exper. et anat. 20, 737, 1908.

Barbudieri, C., Cent^albl. f. Bakt. I Orig. 146, 377, 1941. — Baudran,
O., C. r. Acad. Sei. 152, 657, 1906. ~ Bergey, D. H., Man. of derterm. ßact.,
5. Aufl. London 1939. — ßemÄat^er, K., Gärungschem. Praktikum. BerliiH/

138

O. V. Plotho :

Springer, 1936. — Bi^tock, B., Fortschr. d. Med. 4, 193, 1886. — BtUlock,
W,, u. J, J. R, Mc.Leodf J. of hyg. 4, 1, 1904. — Büttner, H,, Arch. Hyg.
17, 12, 1926. — Braun, H., H. Stamatelakiau. S. Kondo, Biochem. Zeitschr.
145, 381, 1924. — Braun, H., u. Ö. Vaaarhelyi, Centralbl. f. Baki. I. Orig.
127, 106, 1933. — Brockmann, H., Angew. Chem. 58, 384, 1940. — Brock-
mann H,, u. H.Schodder, Ber. d. Deutsch, chem. Ges. 74, 73, 1941.
Bruns, H., Centralbl. f. Bakt. I, 17, 817, 1896.

Chargaff, E,, M. Panghom u, R. J. Anderson, J. of biol. Chem. 90, 45,
1931. Carter, J. M., u. E. O. Hastings, J. Bact. 29, 503, 1936. — CoghiU,

R. D., u. 0. D. Bird, J. of biol. Chem. 81, 115, 1929. — Coppen, Jones A.,
Centralbl. f. Bakt. 1, 17, 1896. — Cutinelli,C., Boll. Ist. sier. milan. 19, 146,
1940; Ref. Centralbl. f. Bakt. I, 188, 192, 1940.

Danilow, A. N., Ber. d. Deutsch, chem. Ges. 48, 27, 1924.

Ebeiing, R., diese Zeitschr. 9, 1, 1938. — Ebina, T., Centralbl. f. Bakt.

I. Orig., 145, 289, 1940. — Eichbaum, F., Zeitschr. f. Immunforseh. 74,
31, 1932.

Fortner, J . D., Naturwiss. 28, 699, 1935. — Franke, W., u. W. Peris,
Biochem. Zeitschr. 295, 61, 1938. — Fernbach, E., u. O. RuUief, C. r. soc.
Biol. 181, 1142, 1939. - Finfce, L., Arch. Hyg. 128, 381, 1940. - Fontes, R.,
Beitr. z. Klin. d. Tub. 77, 2, 1931. — Frei, W., u. N. Pockschischewsky,
Centralbl. f. Bakt. I. Orig., 60, 161, 1911. Frey,C., u. W.A.Hagan,

J. Inf. Dis. 49, 497, 1931.

Qardner, A. D., J. Path. Bact. 82, 715, 1929. — Gildemeister, E.^
Centralbl. f. Bakt. I. Orig., 86, 513, 1921. — Qottstein, A., Fortschr. d. Med*
4, 262, 1886. - Oordon, R. E., J. Bact. 84, 617, 1937. - Oordon, R. E., u.
W. A. Hagan, ebenda 86, 39, 1938. — Goris, A., C. r. Acad. Sei. 170, 1526,
1920. — Grassberger, R., Münch, med. Wochenschr. 46, 343, 1899. — Gray,
P. H. H„ u. H. G. Thomton, Centralbl. f. Bakt. II, 78, 74, 1928. - Gröh, E„
ebenda I. Orig., 128, 353, 1933.

Haag, F. E., Centralbl. f. Bakt. II, 71, 1, 1927. — Hagemann, K. H ,
Münch, med. Wochenschr. 84, 76,1937. — Derselbe, ehenda So, 1066, 1938. —
Derselbe, Deutsch, med. Wochenschr. 68, 517, 1937. — Hammerschlag, A,,
Sitzungsber. d. kais. Acad. d. Wiss., 13. Dez. 1 888. — Hefferan, M., Centralbl.
f. Bakt. II, 11, 460, 1903. — Heide, S,, diese Zeitschr. 10, 135, 1939. -
Hermumn, A., Deutsch, med. Wochenschr. 64, 1354, 1938. - Hill,H. W.,
J. med. Res. 7, 116, 1902. — Holmes, H. N., J. of biol. Chem. 99, 417, 1933. —
Hu, K., Japan. J. of expe^’. Med. 14, 29, 69, 67, 1936.

Jensen, H. L., Proc. Lin. Soc. NSW 59, 18, 1934. — Derselbe, ebenda
56, 79 u. 345, 1931. — Derselbe, ebenda 56, 201, 1932.

Kahn, Morton, C. Am. Rev. Tub. 20, 19, 1929. — Derselbe, Ann. Inst.
Past. 44, 259, 1930. — Keudel, A.J., A. A. Day u. A. W. Walker, J. Inf.
Dis. 15, 417, 428, 1914. — Kersten, H. E., Centralbl. f. Bakt. I. Orig., 51,
494, 1909. — Kirchner, C., ebenda I. Orig., 118, 167, 1930. — Klebs, E.,
ebenda I, 20, 488, 1896. — Klein, F,, Handb. d. Pflanzenanalyse, Spez.
Anal. I, S. 630. Berlin, Springer, 1932. — Derselbe, Spez. Anal. III,

S. 426. — Koch, i2.,Mitt. d.kaiserl. Gesundheitsamtes 2, 1, 1884. — Kuhn,P.,
Zeitschr. f. Immuhitätsforsch. 74, 93, 1932. — Kunz,0., Centralbl. f. Bakt.
I. Orig., 147, 206, 1941. — Krassünikow, N . A., C. r. del’Acad. d. Sei. d.
rVRSS. 2, 580, 1934. - Derselbe, Bull. Acad. Sc. ÜRSS. S^r. biol. 1, 61,
1938 — Derselbe, Centralbl. f. Bakt. II, 90, 428, 1934. — Kresling, K,,
ebenda I, 80, 897, 1901. — Krise, A, E., u. A, Koreniako, J. Microbiol. 8,
522 u. 693, 1939.

Morphologie und Biologie der Mycobakterien.

139

Lcmge, Br.,Ber. d. Rob. Koch-Stift. 8, 134, 1921. — Lange, L.,Centralbl.
f. Bakt. I. Orig., 127, 10, 1933. — Lehmann^Neiimann, Bakteriologie,
7. Aufl. München 1927. — Lemhke, A., u. H. Ruska, Klin. Wochenschr.
19, 217, 1940. - Lom-nski, J., Centralbl. f. Bakt. I. Orig., 128, 276, 1933. ~
L<yng,E,R„ Amer. Rev. Tub. 6, 642, 1922/23. - Long, E. R., u. L, K.
Campbell^ ebenda 6, 636, 1922/23. — Long, E. R., u. Ä. L. Major, ebenda
5, 1921/22.

Maaßen, A., Arb. d. kaiserl. Gesundheitsamtes 12, 340, 1895.
Maffnci, A.y Zeitschr. £. Hyg. 2, 446, 1892. — Marmorek, K., Zeitschr. f.
Tub. 1, 144, 1901. - Merriü, H. M., J. Bact. 20, 235, 1930. - Metachni-
koff, Ä7., Virchows Arch. 16, 177, 1888. — Moeller, A., Deutsch, med. Wochen-
schrift 24, 376, 1898. — Derselbe, Therap. Monatsh. 12, 607, 1898. — Mo-
lisch, H., Mikrochem. d. Pflanzen, 2. Aufl., S. 260. Jena, O. Fischer, 1921 . —
MvciyH., Beitr. Klin. Tub. 8, 85 u. 375, 1907.

Oerskow, J., Ceniralbl. f. Bakt. I. Orig., 128, 271, 1932. - Derselbe,

C. r. Soc. Biol. 46, 1115, 1926. — Derselbe, Invest, into the morphol. ray
fungi. Copenhagen, Levin u. Mimksgaard 1923.

Pfannenstiel, W., Zeitschr. f Hyg. u. Infektionskrankh. 96, 87, 1922. —
PiekarskiyQ., diese Zeitschr. 11, 406, 1940. — Pia y Armengol, J Beitr.
Klin. Tub. 77, 47, 1931. — Plotho O. von diese Zeitschr. 11, 33, 1940.

Quaatel, J . H., u. B. J . Wooldridge, Biochem. J. 19, 652, 1925. -

Derselbe, Ergehn, d. Enzymforsoh. 1, 208, 1932.

Rabinountsch, L., Zeitschr. f. Hyg. 26, 102, 1897. — Rippel, A., K. Nabel
u. W. Köhler, diese Zeitschr. 12, 285, 1941. — Rtippel, W.G., Zeitschr. f.
phys, Chem. 26, 218, 1898.

Schloßberger, H., Beitr. Klin. Tub. 60, 216, 1921. - Schneider -Zimmer-
mann, B t. Mikrotechnik, 2. Aufl., S. 400. Jena, G. Fischer, 1922. —
Seifert, O., u. Fr, Müller, Fr. Tschb. ined. klin. Diagnost., S. 127. Wies-
baden, Bergmann, 1915. — Smith, Qraham, H. S., Parasitology 8, 17, 1910.
- Smith, T., J. med. Res. 18, 253, 1905. — Söhngen, N. L., Centralbl. f.
Bakt. II, 87, 599, 1913. ÄonderÄo//, Ä., u. H. De//ner, Liebigs Ann. 526,
132, 1936. — Sordelli, A., u. A, Arena, C. r. Soc. Biol. 67, 63, 1934. —
Spengler, C., Zeitschr. f. Hyg. u. Infektionskrankh. 49, 641, 1905. —
Stapp, C., u. H. Borteis, Zeitschr. f. Parasitenkde. 4, 15, 1931.

Tamura, S., Zeitschr. f. phyn. Chem. 87, 85, 1913. — Thomson, L. C„
Amer. Rev. Tub. 26, 162, 1932.

Vierling, K., Centralbl. f. Bakt. II, 62, 193, 1921.

Weinzirl, J., u. F. Knapton, Amer. Rev. Tub. 16, 380, 1927. — Winelow,
C. E. A., J. Broadhurst, R. E. Buchanan, C. Krumwiedel, L. A. Rogers u.
G. H. Smith, J. Bact. 6, 199, 1920, - Wyckoff, R. W.Wg., J. Exper. Med.
69, 381, 1934. — Dersdbe, Amer. Rev. Tub. 29, 389, 1934. — Wyckhoff,
R. W, Wg., u. K. C.Smithhurn, J. Inf. Dis. 62/68, 201, 1933.

Zechmeister, L., u. L, von Gholnoky, D. chromat. Absorptionsmeth.,
2. Aufl. Berlin, Springer, 1938.

(Aus dem Institut für Biochemie und Nahningsmittelchemie der Deutschen
Technischen Hochschule in Prag» Mikrobiologische Abteilung.)

Ernährungsphysiologische Untersuchungen
an Fusarien, unter Hervorhebung der Ölspeicherung.

Von

A. Niethammer.

Mit 1 Textabbildung.

(Eingegangen am 22. August 1942.)

Aus verschiedenen Erdproben sowie von cellulosehaltigem Materia
isolierten wir mannigfache Arten. Einzelne derselben dienten

zu ernährungsphysiologischen Untersuchungen. Den ersten Anlaß zu
den Untersuchungen bildeten Beobachtungen über das ganz unter-
schiedliche Wachstumsbild auf verschiedenen Nährböden. Die Konidien-
bildung, welche für die Artbestimmung unerläßlich ist, hängt sehr stark
von der Wahl des Nährmediums ab. Auf vielen Substraten gelingt sie
trotz langer Kulturdauer überhaupt nicht. Unsere Untersuchungen
sollen darüber Auskunft geben, welche Nährböden beste Entwicklung
bei deutlicher Konidienbildung gewähren und somit auch die günstige
Möglichkeit für die Bestimmung, Besonderes Augenmerk wurde auf
verschiedene cellulosehaltige Abfallstoffe als Nährsubstrat gerichtet, da
solchen Untersuchungen auch in Hinblick auf die Erzeugung fett- und
eiweißhaltiger Futtermittel Bedeutung zukommen kann. Die oft sehr
starke Speicherung von öitropfen in Hyphen, Konidien sowie Chlamydo-
sporen fiel dabei auf, sie wurde genauer verfolgt und den ihr zugrunde
liegenden Ursachen nachgegangen. Auf die Erfahrungen von Haeseler,
Fink^ Heide, Raaf, Blinc-Bojic ist hinzuweisen.

Bei der Bestimmung der Arten bin ich der Hilfe von Oberregierungsrat
Wollenweber y Berlin, teilhaftig, gewesen.

Folgende Nährsubstrate, die mit Nummern bezeichnet sind, dienten
zu den Untersuchungen: 1. Kartoffelstücke, sauber gereinigt. 2. Kartoffel-
saftagar nach WoUenweher. 1000 ccm Flüssigkeit, bestehend aus 600 ccm
Wasser und 400 ccm BLartoffelsaft (aus rohen Kartoffeln). 15 Minuten bei
1 Atm. Überdruck im Autoklaven sterilisieren. 20 g Agar-Agar, 10 g
Traubenzucker dazu, pn = 4,8 bis 5, das Ansäuern erfolgt mit Milchsäure.
3. Bierwürze-Agar. Ungehopfte Bierwürze von 4® Ball, mit 1,6% Agar-Agar
versehen. 4. Maisxnehlagar. 1000 ccm Wasser, 30 g Maismehl (vorher mit
wenig Wasser anrühren), 20 g Agar-Agar, 6 ccm Glycerin. Ncush dem
Auflösen 0,5 ccm Milchsäure zusetzen. 5. Chinasäureagar. 2 g Chinasäure,
0,1 ccm 20%iger NHj-Lösu^, 0,03g KH2PO4, 0,16 g MgSOt, 0,003 g,
FeCls. Mit NajCOj neutralisieren. 2% Agar-Agar dazu. 6. Streifen von
Sulfitcellulose mit folgender mineralischen Nährlösung angefeuchtet :

Ernährungsphysiologische Untersuchungen an Fusarien. 141

0 , 6 % (NH 4 ),S 04 , 0 , 1 % KH,P 04 , 0 , 1 % MgS 04 PH == 6,5 mit HjS 04
eingestellt. 7. Ausgelaugte Rübenschnitzel mit Leitungswasser angefeuchtet.
8 . Abfallstoffe, wie Haferspelzen, Bohnen-, Pferdebohnen- und Erbsenstroh,
Kartoffelkraut. 9. Zuckerlösungen zur Verfolgung der Bildung von öl-
tropfen in den H 5 ^hen. Ihre Zusammensetzung erfolgt nach den Er-
fahrungen von Heide. 7,5% Saccharose, 0,5% KH 2 PO 4 , 0,25% MgS 04 ,
1% Asparagin. Die Asparaginmenge wird in den Versuchen variiert, und
zwar vermindert. Eine parallele Serie wird mit (NH 4 ) 2 S 04 als N- Quelle
angesetzt. 10. Das Gärvermögen gegenüber 5%igen Lösungen von Maltose
Saccharose, Lävulose und Lactose wird studiert. Ein Zusatz von 0,05%
Pepton, je 0 , 01 % KH 2 PO 4 und MgS 04 wird gereicht.

Es folgen die Beobachtungen an den einzelnen Fusarien. Die Versuche
wurden bei 23 bis 26® im Dunkeln ausgeführt

F. sambueinum Fuek.

Herkunft: Erdreich unter einem Roggenfeld, Haid im Sudetenland.

Diese Form wurde auch von Hochapfel untersucht. Temperaturoptimum
20 bis 23®. Die meisten Zuckerarten können verwertet werden. Bei älteren
Kulturen wird auf das Stadium einer fettigen Degeneration hingewiesen.

Bericht über die einzelnen Nährmedien.

1. Sehr dichte Mycelentwicklung, weiß ; himbeerfarbene sowie gelbe
Farbentöne treten erst nach etwa 10 Tagen auf. Konidien bildung
unterbleibt, ebenso die von Chlamydosporen. In den Hyphen nach
10 bis 12 Tagen deutliche Ablagerung von hellen öltropfen. Mit Sudan III
tritt hier, wie in den später angeführten Fällen, rasch Rotfärbung ein.
Osmiurasäure bedingt Schwärzung.

2. Dichtes weißes Mycel, himbeerfarbene und gelbe Einlagerungen
erscheinen nach 8 bis 10 Tagen, Diese Verfärbungen treten verschieden
ein, einmal herrschen die roten, das andere Mal die braunen Töne vor.
Konidienbildung fehlt. Ablagerung von öltropfen wie bei 1.

,3. Entspricht 2.

4. Die roten bzw. braunen Farbentöne sind hier besonders deutlich.
Konidienbildung im Substrat mycel. Die Ablagerung von öltropfen in
den Hyphen ist schwach.

5. Weißes, einsinkendes Mycel; das Substrat erleidet eine braune
Verfärbung. In dem eingesenkten Mycel typische Konidienbildung.
Chlamydosporenbildung in Paketen. In Hyphen, Konidien sowie
Chlamydosporen deutliche Ablagerung von öltropfen.

6. Deutliche bis schwache Mycellager; typisch eingesenkt in das
Substrat. Konidienbildung; große, gelbliche Chlamydosporen. Inner-
halb von 14 Tagen deutliche Ablagerung von öl tropfen in den Hyphen.

^ In Einteilung und Wahl der Ausdrücke beziehe ich mich auf Wollen-
weher- Reinking.

Archiv für Mikroblolofirie. Bd. 13. ]0 4 /

142

A. Niethammer :

7. Dichtes weißes Mycel mit rotgelben Einlagerungen; starke Ab-
sonderung von öltropfen in den Hyphen. Die Konidienbildung ist
sehr schwach.

8. Haferspelzen weisen nach wenigen Tagen dichte weiße bis rosa
Lager auf. Konidienbildung sowie Absonderung von Chlamydosporen
reichlich. In allen Teilen sind reichlich öltropfen zu erkennen. Die
gleichen Befunde sind an Bohnen-, Pferdebohnen- und Erbsenstroh
sowie Kartoffelkraut ermittelt.

9. 0,25% Asparaginzusatz genügt zur Entwicklung einer Mycel-
decke und starkem submersem Mycel mit sehr häutiger Ablagerung von
öltropfen, vor allem in den submersen Teilen. (NH 4 ) 2 S 04 wirkt kaum
schlechter.

10. Wachstum auf allen vier Zuckerarten; deutlich vergoren
wurden nur Maltose und Saccharose (vgl. Nord). Hier wurde zusätzlich
das Wachstum auf verdünnter Sulfitablauge (Fichtenzellstoff) verfolgt.
Es erfolgt submers in großen Ballen, in den Hyphen Ablagerung großer
öltropfen. Die Sulfitablauge mit etwa 2 % Fehling reduzierenden
Stoffen wurde auf 5 Teile mit 95 Teilen Wasser verdünnt.

F« bulbigenum Cke-Mass.

Herkunft: Erdreich unter Johanni sbeersträuchein bei Prag.

Bericht über die einzelnen Nährböden,

1. Mittelmäßige, weiße Mycelentwicklung. In den Hyphen ist
nach wenigen Tagen starke Absonderung von öltropfen zu verzeichnen .
Nur Mikrokonidien.

2. Entspricht 1.

3. Weiß wollige Lager; nach 2 bis 3 Wochen langer Kulturdauer
Einmengung von lila Farbentönen. Keine Konidien. In den Hyphen
dichte Ablagerung von öltropfen.

4. Entwicklung schwach. Keine Konidienbildung. Die Ablagerung
von öltropfen in den Hyphen ist spärlich.

5. Dunkle, eingesenkte Lager, Substrat schwarz, kein Luftmycel.
In diesem eingesenkten Mycel Absonderung von derben Makrokonidien
und von großen öltropfen in den Hyphen.

6. Entwicklung oberflächlich kaum sichtbar; Hyphen in das
Substrat eingesenkt.* Die Ablagerung von öltropfen in den Hyphen
ist außerordentlich stark (Abb. 1). Bildung von großen, derben Konidien
im Substrat.

7. Starke, dichte Mycelentwicklung; zunächst weißwollig, später
deutlich eingestreute lila Farbentöne. Nur Mikrokonidienbildung. Im

Ernährungsphysiologische Untersuchungen an Fusarien.

143

Luftmycel weniger, vorwiegend im Stroma in den recht breiten Hyphen
Ablagerung von zahlreichen öltropfen.

8. Haferspelzen lassen keine sehr starke Entwicklung zu. Die
Konidienbildung ist gut^ In den stark verbreiterten Hyphen ist eine
sehr reichliche Ablagerung von öl-
tropfen. Die Tropfen sind hier be-
sonders groß. Auf Bohnen-, Pferde-
bohnen- und Erbsenstroh sowie
Kai1}offelkraut ist das Wachstums-
bild ähnlich.

9. Bei einer Asparaginmenge
von 0,25% ist Wachstum sowie
Ablagerung von öltropfen in den
Hyphen sehr gut. (NH 4 ) 2 S 04 er-
weist sich hier als beinahe ebenso
gut.

10. Die vier Zuckerarten er-
möglichen Wachstum, deutlich ver-
goren werden Saccharose und
Maltose.

F. oxyspomm Schlecbtendahl.

Herkunft ; Erbsenfeld, Erdreich, unweit Prags.

Bericht über die einzelnen Nährböden.

1. Weiß wolliges Luftmycel, Substrat braun verfärbt. Makro-
konidien mit großen Fetteinschlüssen. In den Hyphen erscheinen nach
4 Tagen große öltropfen.

2. Entspricht 1.

3. Langfaseriges Luftmycel, weiß bis rosa. Stroma braun, nach
2 bis 3 Wochen langer Kulturdauer sind lila Verfärbungen zu ver-
zeichnen. Keine Konidien. In den Hyphen viel öltropfen.

4. Entspricht 3.

5. Luftmycel, dünn, weiß. Stroma leicht braun. Substrat blaulila
verfärbt. Keine Konidienbildung. Sehr große öltropfen in den Hyphen.

6. Oberflächliches, weißes Mycel; bald treten im Substrat lila
Verfärbungen auf. Im Myeel zunächst terminale und intercalare Chla-
mydosix)ren. Nach etwa 3 Wochen erscheinen auf dem Substrat gelbrote
Sklerotien, welche zahlreiche t 3 ^ische Makiokonidien enthalten. In
den Hjrphen starke Ablagerung von öltropfen.

144

A. Niethammer :

7. Sehr mächtige Mycelentwickiung, weiße Farbentöne. Makro-
konidien von Fett erfüllt. In den Hyphen sehr reichliche Ablagerung
von öltropfen.

8. Auf Haferspelzen weißliche Decken. Makro -Mikrokonidien
sowie Chlamydosx)oren. In den Hyphen sehr viele öltropfen. Bohnen-,
Erbsen- Pferdebohnenstroh sowie Kartoffelkraut zeigen dasselbe
Ergebnis.

9. Vorwiegend submerses Wachstum, nur geringe Deckenbildung.
0,25 %iger Zusatz von Asparagin bedingt die stärkste Absonderung von
öltropfen bei gutem Wachstum.

10. Die vier Zuckerarten ermöglichen Wachstum. Saccharose und
Maltose werden vergoren.

Ein Stamm aus dem Moor Soos bei Franzensbad sowie zwei Stämme
aus dem Erdreich unter einem Flachsfeld bzw. Roggenfeld bei Haid (Sudeten -
land) zeigen das gleiche Ergebnis.

F. oxysporum Schl. var. aurantiaeum (Lke. ut sp.) Wr.

Herkunft: Kohlfeld bei Moderschan-Prag.

Bericht über die einzelnen Nährböden.

1. Weißes Luftmycel, Stroma braun. Makro- und Mikrokonidien.
Nach wenigen Tagen starke Absonderung von öltropfen in den H 3 ^hen
und Konidien.

2. Ähnliche Ausbildung.

3. Zunächst weiße, dann rosarote Mycellager. Stroma rosa. Keine
Konidien. Starke Ablagerung von Öltropfen in den Hyphen.

4. Weißes bis rosa Luftmycel. Stroma braun. Reichliche Bildung
von Makrokonidien, die viel Fett speichern. In den Hyphen ebenfalls
reiche Ablagerung von öltropfen.

5. Luftmycel weiß; eingesenktes braunes bis schwarzes Stroma,
hier in den H 3 ^hen sehr mächtige Ablagerung von öltropfen. Reichlich
Absonderung von Konidien mit Ölei risch lüssen. Bildung von Chlamydo-
sporen mit gezacktem Rande und einem großen öltropfen.

6. Weißwollige Lager, welche leicht einsinken und das Substrat
allmählich viskos machen. Konidienbildung sehr reichlich. Nach
3 Wochen entstehen auf dem Substrat gelbrote, Stecknadel köpf große
Sklerotien, weiche sehr reichlich Konidien enthalten. Nach 6 Wochen
sind die Streifen rosa verfärbt und deutlich erweicht, öltropfen in
den Hyphen.

7. Sehr dichte weiße Lager. Bildung von Mikrokonidien. Starke
Absonderung von großen, hellen öltropfen in den H 3 ^hen.

Ernährungsphysiologische Untersuchungen an Fusarien. 145

8. Auf Haferspelzen Deckenbildung; viel Makrokonidien. In den
Hyphen große, helle öltropfen. Erbsen-, Bohnen>, Pferdebohnenstroh
sowie Kartoffelkraut zeigen ebenfalls dichte Mycellager mit kräftigen
Öleinschlüssen in den Hyphen. Bei Kartoffelkraut ist die Entwicklung
ganz besonders stairk und die Ölablagerung sehr beträchtlich.

9. Ein Zusatz von 0,125% Asparagin bewährt sich für Wachstum
und Ablagerung von öltiropfen ganz besonders. Die Mycelbildung hier
ist schwammig bis submers. Höhere Gaben von Asparagin sind nicht
besser. Eine gleich starke Gabe von {NH 4 ) 2 S 04 wirkt ähnlich.

10. Wachstum ist auf allen Zuckerarten möglich, Sacchai^jse wird
stark, Maltose und Lävulose deutlich vergoren.

F. bnlbigenum Cke et Mass. var. blasticola (Rostr. ut sp.).

Herkunft: Waideide im oberen Egertal. Sudeten.

Bericht über die einzelnen Nährböden.

1. Dichte weiße Lager; Stroma ^bräunlich. Nur Mikrokonidien
In den Hyphen deutliche Ablagerung von öltropfen.

2. Wie 1 ; aber Bildung typischer Makrokonidien, ebenso Chlamydo-
sporen, daneben auch Mikrokonidien. In allen Teilen starke Ablagerung
heller Öltröpfchen.

3. Weißes, wolliges Luftmycel mit roten und lila fädigen Ein-
lagerungen. Stroma rot bis blau verfärbt. Reichliche Bi f düng von
Makrokonidien, daneben Mikrokonidien. Die Fettspeicherung ist vor
allem in den Hyphen des Stromas sehr kräftig.

4. Farbentöne und Mycel wie bei 3, aber etwas schwächer. Konidien-
bildung fehlt.

5. Eingesenktes Mycel, kein Luftmycel; deutliche Bildung beider
Arten von Konidien. Li den Hyphen sind reichlich öltropfen ab-
gelagert.

6. Die Entwicklung auf Cellulose ist auffallend gering. Keine
Konidienbildung. Die eingesenkten Hyphen sind auf getrieben und
führen sehr große, oft gelb verfärbte öltropfen.

7. Die Entwicklung ist sehr gut; weiß wollig, untermischt mit lila
Tönungen. Konidienbildung unterbleibt. Die Ablagerung von öl-
tropfen in den Hyphen ist sehr beträchtlich.

8. Das Wachstum auf Haferspelzen ist gering; die Ablagerung von
öltropfen in den Hyphen ist ungewöhnlich kräftig. Konidienbildung
unterbleibt. Die gleichen Befunde gelten für Erbsen-, Bohnen-, Pferde-
bohnenstroh und Kartoffelkraut.

146

A. Niethammer ;

9. 0,25 % Asparagin ist für Mycelbildung und Absonderung reich-
licher Oltropfen in den Hyphen gut ; Ammonsulfat bewährt sich in der
gleichen Konzentration ebenfalls.

10. Alle vier Zuckerarten lassen Wachstum zu; vergoren werden
nur Maltose und Saccharose.

P. bulbigenum Cke et Mass. var. traeheiphylum (E. F. Sm.) Wr.

Herkunft: Ackerfeld Haid im Sudetenland.

Bericht über die einzelnen Nährböden.

1. Weiß wollige Lager, Stroma braun. Makro- und Mikrokouidien
führen bei ihrer Loslösung von den H 3 ^hen starke Mengen von öl-
tropfen. Die Septen sind durch dieselben verdeckt. In den H 3 rphen
ebenfalls starke Ablagerung von Fetttropfen.

2. Wie 1, nur ist auf die kräftige Ausbildung von Chlamydosporen
mit einem großen öltropfen hinzuweisen.

3. Weißwollige Lager leicht rosa Verfärbung von Luftmycel und
Stroma. Keine Konidien. Fetttropfen in den Hyphen .

4. WeißwoJlige bis rosa Lager; blaurotes Stroma. Starke Bildung
von Konidienköpfchen. Konidien und Hyphen sehr reich an abge-
lagerten öltropfen,

5. Eingesenktes, braunes Lager, kein Luftmycel. Substrat schwarz.
Konidienbildung. In allen Teilen starke Ablagerung von öltropfen.

6. Gute Mycelent Wicklung mit starker Absonderung von Konidien
und Chlamydosporen. In allen Teilen viel öltropfen abgelagert.

7. Dichte, weiße Lager mit Mikrokonidien und endständigen
Chlamydosporen. Die Absonderung von öl tropfen ist sehr beträchtlich.

8. Haferspelzen werden von einem dicken Mycel bewachsen, das
reichlich Konidien absondert. Die Ablagerung von Fetttropfen ist hier
sehr kräftig. Kartoffelkraut ist hier desgleichen ein glänzendes Nähr-
medium, auf dem eine bedeutende Ablagerung von öltropfen in den
H 3 ^hen erfolgt. Bohnen-, Erbsen- und Pferdebohnenstroh ist etwas
schwächer. Auf allen diesen Substraten ist kräftige Konidienbildung.

9. Auf der Zuckerlösung ist die Entwicklung hier besonders gut;
0,125% Asparaginzusatz bedingt eine ganz mächtige Ablagerung von
öltropfen. Das Wachstum erfolgt submers. Ammonsulfat 0,25% ist
ebenfalls eine gute' Stickstoff quelle

10. Wachstum tritt an allen Zuckerlösungen ein; auf Saccharose
und Lactose ist dieses am besten. Vergoren werden nur Saccharose
kräftig, Lävulose schwach und die anderen gar nicht.

Brn&hrungsphysiologisohe Untersuchungen an Fusarien.

147

F. solaai (Mut.) App. et Wr.

Herkunft: Haferfeld bei Prag.

Bericht über die einzelnen Nährböden.

1. Dichte, weiße Lager, Stroma braun. Keine Konidienbildung.
In den Hyphen starke Ablagerung von öltropfen.

2. Entspricht 1.

3. Weißes Mycel mit rötlichen Einlagerungen. Stroma braun.
Keine Konidienbildung. Geringe Absonderung von öltropfen.

4. Mycel eingesenkt, weiß, rosa Verfärbungen. Chlamydosporen.
Große öltropfen in den Hyphen.

ö. Eingesenkt, Mycel gelblich, kein Luftmycel. Substrat schwarz.
Keine Konidienbildung. Starke Ablagerung von öltropfen in den
Hyphen.

6. Weißwollige Decke. Substrat wird erweicht, rosa verfärbt. In
diesem Schleim werden reichlich Makro- und Mikrokonidien abgelagert.
In den Hjrphen reichlich öltropfen.

7. Üppige, helle Mycelentwicklung ; im Laufe von einigen Wochen
tritt lila Verfärbung ein. Nur Mikrokonidien. In den Hyphen große
und zahlreiche Fetttropfen.

8. Haferspelzen weiße Decke, Konidienbildung. Reichliche Ab-
lagerung von öltropfen in den Hyphen. Ähnliche Ergebnisse liegen für
Bohnen-, Erbsenstroh sowie Kartoffelkraut vor.

9. In der Zuckerlösung submerses Wachstum und sehr starke
Ablagerung von öltropfen. 0,25 % Asparagin ist die beste Konzentra-
tion. Ammonsulfat ist hier etwas ungünstiger.

10. Wachstum auf allen Zuckerlösungen; vergoren werden Saccha-
rose und Maltose.

F. solani (Mart.) var. Martii (App. et Wr. sub. speeie) Wr.

Herkunft: Erdreich unter Johannisbeersträuchern bei Prag.
Bericht über die einzelnen Nährböden.

1. Weiße Decken, Stroma grünlich verfärbt. Derbe Konidien,
dicht von öltropfen erfüllt, keine Septen sichtbar. In den H3^hen
Ablagerung von öltropfen.

2. Entspricht 1.

3. Luftmycel schwach entwickelt, weiß, einsinkend; Stroma grün
verfärbt. Die Ablagerung von öltropfen in den Hyphen ist gering.
Keine Konidienbildung.

4. Ähnlich wie 3.

148

A. Niethammer:

5. Dunkle, eingesenkte Lager, Substrat schwarz verfärbt. Hier in
den Hyphen deutliche Ablagerung von öltropfen. Keine Konidien-
bildung.

6. Schwache Mycelausbildung, in das Substrat eindringend, dieses
erweichend. Keine Verfärbungen. Makrokonidienbildung. In den
Hyphen große öltropfen.

7. Sehr üppige Entwicklung, keine Verfärbung. Die Hyphen sind
teils verbreitert und lassen große öltropfen erkennen. Bildung sehr
derber Konidien mit kräftigen Petteinschlüssen. Die Septen sind nicht
sichtbar.

8. Haferspelzen gestatten nur geringe Entwicklung. Die Pett-
speicherung in den Hyphen ist deutlich. Zunächst keine Konidien-
bildung ; nach einigen Tagen entstehen Sklerotien mit dichten Konidien-
einschlüssen. Die Septen sind deutlich sichtbar, keine Petteinschlüsse.
Auf Bohnen- und Erbsenstroh, ferner Kartoffelkraut ist die Entwicklung
ähnlich wie bei Haferspelzeii.

9. Die Zuckerlösung bedingt submerses Wachstum ; hier ist in den
Hyphen sehr viel öl abgelagert. 0,25 % Asparagin ist die beste Kon-
zentrationsstufe. Ammonsulfat bewährt sich schlechter.

10. Wachstum auf alten Zucker lösungen ist möglich. Vergoren
werden Maltose und Saccharose.

Unsere Versuche auf zahlreichen Nährböden zeigen, daß Wachstums-
bild und Wachstumsart je nach denselben sehr verschieden sind. Gutes
Wachstum und deutliche Konidienbildung zeigen sich vorwiegend auf
natürlichen Substraten. A. B. Werner gibt bei Untersuchungen an
russischen Böden an, daß sich im Boden selbst diese Mikroorganismen
schlecht halten, sie werden meist ein Raub der Bakterien und Protozoen.
Anders liegt nach diesem Forscher die Sache, wo im Boden viele organi-
sche Reste oder Pflanzenbestandteile sind; hier ist üppige Entwicklung
der Fusarien.

Alle von uns geprüften Fusarien können auf den mannigfachen
Nährsubstraten in ihren Hyphen öltropfen abscheiden. Im submersen
Mycel oder Stroma ist diese Absonderung besonders stark. Die ver-
schiedenen Abfallstoffe sind sehr geeignet für die Abscheidung von öl
in den Hyphen dieser Pilzgattung Am stärksten ist die Speicherung
von öl in den flüssigen Medien; hier erfolgt allerdings ein geringeres
Wachstum als auf den festen Substraten. Besonders stark ist hier die
Ölbildung in den submers gedeihenden Mycelpaketen. Vielfach ist
überhaupt dort, wo das Wachstum irgendwie gehemmt erscheint, die
Ölabsonderung besonders intensiv.

Blinc-Bojic machen auf die Ölabsonderung bei Mvoor mucedo
aufmerksam. Nach unseren Erfahrungen sondern auch andere Mucor-

Ernährungsphysiologische Untersuchungen an Fusarien.

149

Arten, so beispielsweise M. silmticua, viel Fett ab. Am kräftigsten
erfolgt die Fettabscheidung im gemeinsamen Wachstum mit einem der
von uns isolierten Fusarium-Arten, die auch im Erdreich gemeinsam
beheimatet sind.

Bei der Aufzählung von sogenannten Fettpilzen (vgl. Htteseler-
Fink) sind künftig auch die FvMrium-Arten zu nennen.

Zasammenfassniig.

Verschiedene Nährsubstrate werden bezüglich ihrer Eignung für
Wachstum und Konidienbildung bei Fusarium-ATten geprüft. Natür-
liche, cellulosehaJtige Abfallstoffe sind sehr geeignet. Auf allen geprüften
Nährmedien ist auf eine starke Öltropfenablagerung in den Hyphen,
vielfach auch Konidien und Chlamydosporen, hinzu weisen.

Ausgeführt mit Unterstützung des Forschungsdienstes.

Literatur.

Blinc, M., u. M. Bojic, diese Zeitschr. 12, 41, 1941. -- Haeseler-Fink, F.,
Zeitschr. f. Spiritusind. 08, 194, 1940. Heide, S., diese Zeitschr. 10, 171,
1939. — Hochapfel, F,, Centralbl. f. Bakt. II, 64, 174, 1926. — Nord,F,,
Ergebn. d. Enzymforsch. 8, 149, 1939. — Raaf, H., diese Zeitschr. 12, 136,
1941. - Werner, A. R., C. r. de l’Ac. d. Sc. de l’URSS. 4, Nr. 1/2, 70/71, 1936.

(Aus dem BoiaDiscben Institut der Technischen Hochschule Dresden.)

Die Entwicklnng und Wandlung
des Zusammenlebens von Pilzen nnd Algen.

Von

Fri^dfidi Tobler.

Mit 10 Textabbildungen.

(Eingegangen am 25. August 1942.)

Die Schtoendener^ahe Auffassung über die Natur der Flechten habe
ich (1921) im Zusammenhang mit den heutigen Auffassungen dargestellt.
Es sind dabei drei Grundtatsachen zu unterscheiden :

1. die Ähnlichkeit bzw. Übereinstimmung der Gonidien mit den Algen-
typen (1860),

2. der Befund, daß kein genetischer Zusammenhang zwischen Pilzen
und Gonidien besteht (1868),

3. daß die Flechte, oder besser gesagt der Flechtenpilz, als Schmarotzer
auf der Alge aufzufassen ist (1869).

Es sind zu Schiuendeners Zeiten eine ganze Reihe von Ein wänden
seitens der Lichenologen erfolgt. Kremplhuher wies auf die verschieden*
artige Physiologie von Pilz und Alge hin, Kör her betonte, daß bisweilen
mehrere Algentypen in einer Flechte verkämen und Nylander bemerkte,
daß Flechten häufig dort gedeihen, wo Algen fehlen können. Diese
drei Gruppen von Einwänden sind seinerzeit wenig beachtet worden,
verdienen aber eigentlich durchaus nähere Beleuchtung und sind letzten
Endes Fingerzeige für eine mehr physiologische Auffassung der ganzen
Frage. Als die Einwände erhoben wurden, ging freilich niemand näher
darauf ein, und die nachfolgende weitere Arbeit bezog sich teils auf die
getrennte Kultur der beiden Flechtenkomponenten, teils auf die Zu-
sammenfügung zu neuer Symbiose (Möller). Man kann sagen, daß die
Anatomie und der Laboratoriumsversuch mit aller Kraft die ursprüng-
liche, allerdings etwas naive Vorstellung der alten Lichenologie von der
einheitlichen Natur der Flechte besiegen wollten und tatsächlich auch
zu Fall brachten. Und diese Sachlage ist der Qrund dafür, daß die physio-
logische Betrachtung des Gegenstandes unnatürlich lange urUerdrückt blieb.
Wie aber ist die ErUstehung der Flechten heute vorzustdlen ? Fragen
wir 8chwendener& Schriften, ja fragen wir die heutigen Lehrbücher der
Botanik, so finden wir so gut wie nichts darüber und werden mehr oder
weniger stillschweigend auf die Vorstellung verwiesen, daß zur Ent-
stehung jeder Flechte ein neues Zusammentreffen der beiden not-

Zusammenleben von Pilzen imd Algen.

151

wendigen Komponenten auf freier Bahn notwendig sei. Erst ver-
einzelt sind später Hinweise auf eine andere Richtung aufgetaucht.
Die starke reproduktive Fähigkeit des Pilzes betonte Strato (1921), die
wesentliche Bedeutung der vegetativen Vermehrungsarten und den
Zusammenhang mit halbfertigen Flechten habe ich selbst seit 1920
(vgl. Tohler, 1934) mehrfach nachgewiesen. Und so gewöhnte man sich
nach und nach daran, die verschiedenartige Entwicklung und getrennte
Entwicklungsmöglichkeit der beiden Komponenten in der Natur ins
Auge zu fassen. Jedenfalls wäre das eine erwünscht einzuschlagende
Bahn für die heutige Forschung. Mehr Beobachtung dieser Dinge in
der Natur als im Laboratorium, starke Betonung der physiologischen
Seite gegenüber der systematisch-morphologischen, wird uns zur
Klärung noch schwebender Fragen führen. Um nur einige Beispiele
bereits gesicherter Tatsachen anzuführen, sei darauf verwiesen, daß
z. B. kränkelnde Algen geringere Umspinnung erfahren, sowie daß Ab-
weichungen von der typischen Symbiose einer Flechtenart sowohl bei
der Entstehung wie auch später gar nicht selten zu beobachten sind.
Deutlich kann man immer wieder erkennen, daß sehr verschieden
gestaltete H 3 qphenformen an einem Thallus Vorkommen und nach der
Umgebung hzw. dem Vorhandensein oder Fehlen der Gonidien an der
Stelle ihres Wachstums sich zu verändern pflegen (nebenbei bemerkt
ist das auch heute wohl das wertvollste Argument gegen die bisher
noch nicht aufgegebene Behauptung Elfving», der aus langgliedrigen
Hyphen entstehende kurzgliedrige irrtümlich als Entstehung von
Gonidien an Hyphen deutete). Schließlich weiß man heute, daß große
regelmäßige Gruppen unvollkommener Flechten, die sich systematischer
Betrachtung oder Beschreibung gänzlich entziehen können, außer-
ordentlich reichlich auftreten. Sie werden voraussichtlich für immer
eine höchst unbequeme Angelegenheit für den systematischen Licheno-
logen bleiben. Man denke an die Massen der auf Blättern lebenden
tropischen Flechten, bei denen sich nicht im geringsten von einem
normalen Habitus oder etwas Ähnlichem sprechen läßt. Man muß
aber hiermit auch in Zusammenhang bringen die Erscheinungen der
Cephalodien und der sogenannten Flechtenparasiten — Gegenstände,
auf die ich in ähnlicher Weise schon wiederholt hingedeutet habe.

Bei meinen seit Jahren angestellten und unter verschiedensten
Bedingungen fortgeführten Beobachtungen über die vegetative Fcr-
rmhning bei Flechten aus der Gattung Cladonia {Tobler, 1932, und
Tobler- Mattick, 1938), habe ich mehr und mehr auch schon die Fragen
nach den besonderen Bedingungen für die oder jene Entwicklungs-
richtung beider oder der einen oder anderen Komponente beantworten
können. Die Entwicklungsbedingungen liegen zunächst stets im Rahmen
der Faktoren Feuchtigkeit und Belichtung und sind somit weitgehend

152

F. Tobler:

von der Jahreszeit abhängig. Außerdem aber sind auch die Formen
gruppenweise im Besitz einer um so stärkeren Vermehrung durch
Bruchstücke, als sie gleichzeitig hinsichtlich der Pilzfruchtbildung
steril zu werden beginnen oder schon geworden sind (Rämsch, 1939).
Hierzu sei gleich die Bemerkung angefügt, daß mit der Zunahme der
Sterilität wiederum die systematischen Schwierigkeiten beginnen und
daß auch eine vegetative Gemeinschaftsbildung nicht gleichartiger
Bruchstücke unter Umständen der Systematik unüberwindliche
Schwierigkeiten bereiten dürfte. Dies ist der Stand unserer gegen-

Abb. 1. Mauer mit Anflügen von Pilzen, Algen, Flechten, Moosen, Richtung gegen Westen
(Schillerstraße in Dresden- Losohwitz).

wärtigen Erfahrungen auf diesem Gebiete. Sie sind von Bedeutung für
die Kenntnis und allgemeine Entwicklung des Zusammenlebens von
Pilz und Alge und bringen in gewisser Weise, aber auf ganz anderem
Wege, auch eine phylogenetische Vorstellung zum Bewußtsein, wie sie
etwa Reinke in ganz anderer Art längst gegeben hatte. Auf die Unter-
schiedlichkeit der beiden Betrachtungen braucht hier nicht hingewiesen
zu werden.

Setzen wir aber nun die Erforschung der heutigen Entstehung der
Plechtenindividuen in der Natur weiter fort, so ist die Grundlage dafür
natürlich in den drei von mir wiederholt betonten Punkten zu sehen:
Die Symbiose, sofern sie zustande kommt, wirkt auf die Gestalt, auf den
Stofftvechsel und auf d|e Fortpflanzung (Tobler, 1932 u. 1934).

Ich habe nun in jüngster Zeit mich ausführlich um bestimmte
Vorkommnisse solcher Gemeinschaften, fertiger oder unfertiger oder
halbfertiger in der Natur bemüht, wie ich sie früher schon als Flechten^
anfliige bezeichnete und wie sie am besten zu verstehen, vielleicht auch

Zusammenleben von Pilzen und Algen.

153

zurückzuführen sind im Anschluß an die von Herrmann (1935) studierte
Entwicklung von CZodonia- Soredien. Ich ging dabei in den letzten
Jahren von einem ganz bestimmten Standort aus, nämlich meist aus
Sandstein bestehenden, schwach rückwärts geneigten Mauern, die an
der Schillerstraße in Loschwitz bergauf die eine Straßenseite begrenzen
(Abb. 1). In Nachahmung dieser Standorte habe ich späterhin auch
eine eigene derartige Mauer
im Botanischen Garten Dres-
den aufgebaut. Man findet
an solchen Stellen zunächst
in den Fugen zwischen den
Sandsteinen, dann aber auch
über die Sandsteinflächen,
sich oft in tränenartigen Strei-
fen herunterziehend, feine grau-
körnige bis grünliche Anflüge.

Bei näherer Untersuchung
stellte sich hier mit immer
wiederkehrender Deutlichkeit
ein jahreszeitlicher Unterschied
in der feineren Morphologie
dieser Gebilde heraus.

Zunächst findet man
nicht selten, meist in trocke-
nerer Zeit und am Beginn feuchterer Perioden, helle, etwa an Rosen-
kohl erinnernde Köpfchen kleinsten Umfangs von rosa bis weißer Farbe.
Sie stellen reine PilzregetaMon, ohne jedes Vorhandensein von Algen,

Ab!> 2. Reine Pilzentwicklnng, „Roseukohlstadiuin"
im Frühjahr. Veifl^r. 6 x .

Abb. 3.

Abb. 4.

Abb. 8. Auf und in den Pilzklümpchen treten auf der Photographie nur schwach sichtbare —
Algeupunktc auf, die Klümpchen werden etwas fester. Vergr. 6 x.

Abb. 4. Entstehung von Flechten: Läppchenbildung (Thallusschuppen von Cladoniaf), feste
Abgrenzung der Blättchen deutlich. Vergr. 6 x .

154

F. Tobler:

dar, sind unregelmäßig in ihrer Oberfläche, aber wachsen ungefähr
zentrifugal nach allen Seiten und verdichten sich damit zu rasenartigen
Gebilden (Abb. 2). Es folgen dann mit zunehmender Feuchtigkeit ge-
legentlich ähnliche köpfchenartige Massen mit ganz feinen grünen
Pünktchen, die teils oberflächlich, teils etwas eingesenkt erscheinen und
bei stärkerer Vergrößerung im Auf licht (Zeißsches Auf lichtgerät!) in
größter Deutlichkeit Einsprengungen von grünen Algenkliimpchen in den
Pilzmassen erkennen lassen (die allerdings die einfarbige Abb. 3 wenig
erkennen läßt). Hieraus entwickeln sich noch später kleine lappenartige
Gebilde, die bei etwas gekräuseltem Rand schon fast den Bau eines
Flechtenläppchens besitzen können (Abb. 4). Ich kann nicht umhin, diese

Abb. 5. Abb. 6.

Abi), r». Die Läppchen oder blattartigeii Thalli von Abb. 4 beginnen wieder am Eande aus-
ziisprosHen zu isidiösen (ko)ilkopfartigen) Hilduiigen: Zustand (im Herbst und) im WinWr.
Es erfolgt auch Einreiüen der J.Appenränder. Vergr. 6 x .

Al)b. 0. Stärkeres Aussprosser, Entstehung von wiederum rein pilzlichen, klüinpehenartigen
Massen, Zustan<i gegen das Frühjahr Iiin. Vergr. 6 x .

bereits als ,, Flechtenthalli“ zu bezeichnen. Es bleibt dahingestellt,
welcher Gattung oder Art solche Gebilde angehören. Manches, vor
allem gelegentliche weite^re Entwicklung, spricht für eine Zugehörigkeit
zur Gattung Cladonia. Dieser Zustand herrscht bei Beginn des Winters
vor und er verändert sich in der Richtung, daß der Rand dieser Lappen
durch kräftiges und unregelmäßiges Wachstum immer stärker gekräuselt
und zugleich mehr grau wird, wonach auch Einrisse entstehen (Abb. 5
und 6), aus denen wiederum Wucherungen und gelegentlich auch —
eben als Hinweis auf die genannte Gattung ~ Podetien hervorgehen
können. Das kommende Frühjahr aber verändert die Erscheinung
aufs neue: Die Ränder der Lappen beginnen reichlich und erneut mit
reifhem Pilzwachstum auszusprossen und aus den immer wieder bröckliger
werdenden und sich voneinander trennenden Klümpchen entsteht
wiederum das eingangs genannte Stadium, das ich mit Rosenkohl

Zusctimnenleben von Pilzen und Algen.

155

verglich. Die lappige oder blattähnliche Form des Ausgangs geht
wieder verloren und wir dürften es hier nach der sonst üblichen Morpho-
logie mit Isidien zu tun haben. Diesen Entvncklungsgang habe ich zu
mehreren Malen nun an den gleichen Stellen hintereinander verfolgen
können, und man erkennt daraus wohl mit hinreichender Deutlichkeit,
wie ein Wechsel des Übergeunchts der einzelnen Teile und damit also ein
Auf und Ab in dem Charakter eines flechtenartigen Organismus an-
genommen werden muß. Ursache hierfür ist in diesem Falle nicht ver-
schiedenartiger Standort, sondern lediglich der jahreszeitliche. Wechsel
in Feuchtigkeit (und vielleicht auch Lichtgenuß). Sehr selten gelangt
eine \'^egetation solcher Anflüge an den zur Beobachtung gewählten

Abb. 7. Abb. ft.

Abi). 7. Der Pilz als Bplplij't von Moosen in Form solcher Klümpchen, wie sie von den Kündern
der Lappen sich abiiteen. Vergr. 2,5 x ,

Abb. 8 wie Abb. 7, einzelne Pilzindividuen noch deutlicher. Vergr, 2,5 x .

Stellen zu einer vollen und systematische Erfassung der Art gestattenden
Entwicklung. Hier ist es also leicht, den reinen Flechtenpilz zu be-
stimmter Zeit vorzufinden und hier muß die Frage nach dem gelegent-
lichen Zustandekommen neuer Flechtenindividuen durch heute er-
folgendes Hinzutreten von Algen durchaus mit ja beantwortet werden.
Freilich ist die Flechtensymbiose nicht von Dauer und kommt oft nicht
zur bleibenden Ausgestaltung.

Wie sehr dey Flechtenpilz an solchen Stellen auch selbständig noch
seinen Weg zu gehen vermcig, beweist das gar nicht seltene Auftreten
der Pilzkliimpchen als Ansiedler auf jungen Moospflänzchen, wie sie
innerhalb der Anflüge uns gelegentlich begegnen (Tobler, 1936). Hier
sitzen die erwähnten rein pilzlichen, weißen Hyphenklümpchen un-
mittelbar den Moosblättchen oder -stämmchen auf (Abb. 7 und 8). Sie
überziehen sie bisweilen so stark, daß das Moos darunter zu leiden

156

F. Tobler:

beginnt, ja, zugrunde geht, worauf der Flechtenpilz auf der verrottenden
Unterlage offenbar um so besser weiterwächst. Doch möchte ich keineB>
Wegs einen Parasitismus des Flechtenpilzes auf den Moosen annehmen.
Die Ablösungsmöglichkeit der Klümpchen von den Blättern ist stets
sehr groß imd ein Eindringen habe ich nicht beobachten können.

Hiemeben dürfte die Frage gestellt werden, ob denn angesichts der
Zufälligkeit des Zusammentreffens solcher freien Pilze mit aus der
nächsten Nachbarschaft herangebrachten oder vom Pilz erreichten
Algen nicht auch Anlaß zu neuen Kombinationen geben könnte. Denkbar

Abb. 9. Aus Ton der Mauer eDtnommenen Pilzanflügen hervorgegangene Entwicklung von
Fl^tenthalli in einer Kultur auf Erde, natürl. Or.

ist das wohl, aber die Auswahl von Pilz- wie Algenformen scheint gering,
und im allgemeinen dürften an diesen Standorten auch beide gleichen
Ursprung, nämlich aus auf die Mauer gelangten Flechtenbruchstücken
haben und aus diesem Grunde innerhalb eines engen Bezirks wohl als
Abkömmlinge der gleichen Flechte immer wieder gleiche Kombination
eirgeben müssen. Daß Abweichungen gegenüber der erwähnten Gestalt en-
folge zu verschiedener Jahreszeit auch nach Ort, Himmelsrichtung und
Witterung Vorkommen, halte ich aber für sicher. Und aus diesem
Grunde habe ich mich eben zunächst streng an einen Standort im
Verlauf von 3 Jahren gehalten.

Natürlich darf ich die Frage nach der systematischen Zugehörigkeit
meiner Funde nicht ganz umgehen, wenn sie mir auch weniger wichtig
erscheint als die Betrachtung der Entwicklung des Zusammenlebens.
Der Flechtensystematiker gibt derartige Anflüge bisweilen mit be-
stimmten Gattungs- und Artnamen aus. Das bekannte Exsikkatenwerk
von Schade-StoUe-Biehmert ,,Lichenes Saxonici Exsiccati“, bringt unter
Nr. 411 ein ganz meinen Funden gleichendes Objekt als ,,Psoroma

Zusammenleben von Pilzen tmd Algen.

1Ö7

lanuginoaum Ach"'. Diese Bezeichnung hat nach meinem Ermessen
keine Berechtigung, da Früchte davon niemals bekannt geworden sind.
Ich habe ganz ähnliches Material auch auf Erde in Schalen weiter
kultiviert, also unter Bedingungen, die nicht mehr die der Stellen
sogenannter Anflüge sind, und habe nach mehreren Jahren, meist
bleibend, offenbar zu Gladonia gehörende Thalli erzielen können (Abb. 9).
Ich neige also durchaus dazu, auch die sogenannte Psoroma etwa als
hierin gehörig aufzufassen. Jedenfalls dürfte den Gregenbeweis zu er-
bringen unmöglich sein. Andere gestaltlich ziemlich ähnliche Objekte
mit mehr gelblicher Färbung mögen in andere Formenkreise verwiesen
werden. Sie haben mir bei der Untersuchung vorläufig noch nicht
gedient. Daß auch innerhalb anderer Gruppen Dauervorkommnisse
nur vegetativ sich entwickelnder Formen mit einer durch ihre Klumpen-
bildung an meine Beobachtungen erinnernden, hinsichtlich des Vor-
kommens bestimmter Farbstoffe aber wesentlich anderen Bildung in
andere Richtung zu verweisen wären, bezeugen die Schwefelflechten
der Sächsischen Schweiz, die ja erst dann zu einer systematischen
Klarheit gelangen, wenn sie Pilzfruchtformen erzeugen, was bekanntlich
an manchen Standorten außerordentlich selten ist (Schade, 1917;.

Die letzte Frage wäre wohl noch die, warum denn an gewissen
Standorten die Flechtenentuncklung soviel weniger vollkommen wird als
an anderen ? Die Entwicklung des Zusammenlebens von Pilz und Alge
ist, physiologisch betrachtet, unendlich verwickelt schon deshalb, weil
bekanntlich ja die Wachstums bedingungen zweier so gänzlich ver-
schiedener Organismen aufeinander abgestiinrnt oder zueinander in ein
bestimmtes Gleichgewicht gebracht werden müssen, was begreiflicher-
weise selten genug der Pall ist. Ich stehe aber auch nicht an, für das
stärkere oder geringere Ent wicklungs vermögen der Teile und besonders
des Pilzes auch noch andere Organismen, die vielleicht niemals in der
noch lockeren Gruppierung fehlen, in Anspruch zu nehmen. Eine
zufällige Beobachtung in meinen Laborkulturen auf künstlichen Nähr-
böden, bei denen ich ebenfalls die Anflüge von C7te?(mia-artiger Natur
zum Ausgang nahm, brachten mir das Ergebnis, daß bei Anwesenheit
einer roten Lufthefe (Rhodotorula glutinis) das Pilz Wachstum wesentlich
besser verlief als ohne diesen Teilhaber. Versuche über Zusatz dieses
rein gezüchteten Organismus zu sich entwickelnden halbfertigen Flechten
bewies mir das mehrfach i. Ich lege auf diese Laborbeobachtungen,
deren Anlage natürlich durchaus nicht den natürlichen Verhältnissen
entspricht, an sich keinen bedeutenden Wert. Ich glaube mich aber

' Den naheliegenden Versuch, den Einfluß eines Wuchsstoffzusatzes
zu beobachten, habe ich schon mit Erfolg vorgenommen, berichte darüber
aber erst später in einer die Symbiose als Wuchsstoffproblem behandelnden
Arbeit.

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13. 1 1

158

F. Tobler: Zusammenleben von Pilzen und Algen.

immerhin dazu berechtigt, anzunehmen, daß außer den Faktoren
Feuchtigkeit und Belichtung auch solche Momente, die selbstverständlich
in der Natur dauernd wirksam sein können, ausschlaggebend für den
Verlauf des Zusammenlebens von Pilz und Alge sein müssen.

Ich schließe mit dem Hinweis darauf, daß gerade durch diese
neuen Beobachtungen die Labilität des Gleichgewichts der Symbiose
heute entstehender und lebender Flechten erneut nachgewiesen wurde
und daß wir uns daran gewöhnen sollten, die Gruppe der FUchUn auch

Abb. 10. Ein Polyvorut {hetulinut)^ recht» von der Mitte iiacli hinten ein Answnchs, der Algen
in Pilzmasso verstrickt enthält, dort findet ein lebhaftes uini aus der Form des Pilafnichtkörpers
heransfalleudes Wachstum statt. 1/2 nat. Gr.

heute noch als zu neuem Ursprung von neuen Gemeinschaften befähigt
anzusehen. Bedürfte es eines Hinweises auf etwas ferner liegende Er-
scheinungen, so wäre es der Befund, wie man ihn an Fruchtkörpem
von Polyporus bisweilen machen kann: aus verletzten Stellen wuchert
Pilzmycel und nimmt aus der Luft oder dem Niederschlag der Um-
gebung Algen in einer gewissen Weise sichtbar in sich auf (Abb. 10).
Die Gestalt des Zusammenlebens erinnert an Umspinnung, und wir
hätten hier gleichsam den Anfang einer neuen Basidiomycetflechte vor
uns, was um so interessanter ist, als die Zahl derartiger Gemeinschaften
ja noch gering ist und ihre Form nicht allzu feste Bahnen ein-
geschlagen hat.

Literatur.

Hemnann, ßeih. Bot. Centralbl. 58 A, 661 ff., 1936. — Ramsch, diese
Zeitschr. 10, 279ff., f939. — Schade, Abhandl. d. Isis-Dresden 1916/17,
S. 21 ff. — ^ato, Hedwigia 68, 11 ff., 1921. — Tobler, Ber. d. Deutsch. Bot.
Ges. 88, Uff., 1921,* Beih. Bot. Centralbl. 49 (Erg.-Bd., Drude -Festsohr.),
482 ff., 1932; Die Flechten. Jena, G. Fischer, 1934; Ber. d. Deutsch. Bot.
Ges. 64, 401ff., 1936. — Tobler u. Mattick, Bibliotheca Bot., Heft 117,
1938.

(Aus dem Institut für Mikrobiologie der königlichen TJniversit&t Neapel. )

Der Abban der Acetessigsänre
durch Bacterium coli.

Von

L. Calitano.

Mit 1 Textabbildung.

(Eingeganget) am 18, August 1942.)

Wenn man eine Aufschwemmung von Bakterium coli bei 37® in
Gegenwart einer gesättigten monocarboxylischen Fettsäure schüttelt,
so erhöht sich der Sauerstoff verbrauch, weil die Säure durch die Bakterien-
zellen dehydriert wird. Die Zunahme ist gering für die ersten Glieder
der Reihe (mit Ausnahme der Ameisensäure und der Essigsäure) und
wächst mit der Länge der Kohlenkette, so daß bei der önanthsäure
gegenüber den Proben ohne Substrat die verbrauchte Sauerstoffmenge
mehr als doppelt so groß ist, mehr als dreifach bei der Pelargonsäure
und mehr aJs fünffach bei der Myristinsäure. Die entsprechenden Er-
gebnisse sind in Tabelle I angeführt.

Tabelle I.

Kontrolle

Ameisensäure
Essigsäure
Propionsäure .
Buttersäure . .
Valeriansäure
Capronsäure .

100 önanthsäure .

2 1 ö Caprylsäure . .

309 Pelargonsäure

128 Gaprinsäure . .

108 Undeoylsäure .

112 Laurinsäure . .

1 10 Tridecylsäure .

206

Myristinsäure.

287

Palmitinsäure

469

Margarinsäure

i 360

Stearinsäure .

3G4

Araebinsäure .

400

278

Oj.

Verbrauch

t«m

676

484

455

629

266

Die Oxydation der monocarboxylischen Fettsäuren wurde durch
Quastei nach der Thunberg sehen Methode untersucht, jedoch mit negativem
Erfolg; Mazza und Gimrmno zeigten dagegen die große Fähigkeit des Bac-
terium coli Palmitinsäure imd Stearinsäure zu dehydrieren, und Franke
und Pens bestätigten diese Tatsache und stellten außerdem die Oxydations-
fähigkeit anderer Säuren dieser Reihe fest, besonders durch Pseudomonas
sowie durch Sarcina lutea. Im allgemeinen sind die höheren Glieder der
gesättigten Fettsäurenreihe leichter oxydierbar als die mittleren und die
unteren, mit Ausnahme der Ameisensäure und der Essigsäure.

Neue durch Cutinelli ausgeführte Versuche zeigen, daß der Tuberkel-
baziUus die Fettsäuren oxydiert, während der Oonccoccus dazu nicht fähig
ist. Eine hervorragende Fähigkeit zur Dehydrierung der Fettsäuren besitzt
die Gattung Brucella (AUsmoneUi).

160

L. Califano :

Der Vorgang des oxydativen Abbaues der Fettsäuren durch die
Bakterien ist bis jetzt noch unbekannt. Da nun die durch Bacterium coli
hervorgerufene Oxydation beachtenswert schnell erfolgt, lag es nahe zu
untersuchen, ob der Fettsäurenabbau durch eine j9-Oxydation zu
Ketonkörperbildung führt. Prüft man jedoch die Flüssigkeit, in der die
Oxydation stattgefunden hat, auf das Vorhandensein von Acetessigsäure
und /9-Oxybuttersäure, so bekommt man ein negatives Ergebnis, auch
wenn man große Bakterienmassen zusammen mit großen Säuremengen
verwendet und die Prüfung nach einer genügenden Zeitspanne ausführt,
um die fast vollständige Oxydation der vorhandenen Säuren zu erzielen.
Dieses Ergebnis läßt an zwei Möglichkeiten denken:

1 . Daß der Fettsäurenabbau auf
anderem Wege als dem der /5-Oxy-
dation erfolgt.

2. Daß die gebildeten Keton-
säuren schnell verbrannt werden und
zwar sowie sie gebildet sind, derart,
daß sie sich niemals in bestimmbaren
Mengen anhäufen.

Es wurde ferner die Oxydations-
fähigkeit der /S- (Hydro-) Oxybutter-
säure und der Acetessigsäure unter-
sucht. Diese beiden Säuren werden
weitgehend durch Bdcterium coli oxy-
diert, so daß, falls sie sich während
des Abbaues der gesättigten Fett-
säuren bilden, keine Möglichkeit be-
steht, sie nachzuweisen wegen der
eintretenden schnellen Oxydation,
welche aerobisch stattfindet.

Beendet» Int^.rw«lrt.u.

Acetessigsäure-Natrium; Kurve III: die- verschiedenen Gründen der Oxy-
BeibenmitAceij^i^^^^^^ dationsverfauf der Acetessigsäure.

Diese Oxydation verläuft sehr schnell
und die Geschwindigkeit nimmt mit der Zeit zu, was wahrschein-
lich andeutet, daß beim Abbau der Ketonsäure sich Körper bilden, die
leichter als die Säure selbst verbrennen. Die Oxydationsgeschwindigkeit
wird erheblich durch Phosphatanwesenheit vermehrt, wie ersichtlich
in Abb. 1. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die Phosphate an der Reaktion
teilnehmen, und daß die Steigerung der Oxydationsgeschwindigkeit
nicht bloß eine Pufferfunktion ist, und zwar, sei es, weil die Aktivierung
durch sehr kleine praktisch keine Pufferwirkung besitzende Phosphat-

Der Abbau der Acetessigsäure.

161

mengen stattfindet, sei es, weil sie auch erfolgt, wenn auch in verschieden
hohem Maße, mit Phosphatgemischen von recht verschiedenem

Die Annahme einer Phosphorylierung der Acetessigsäure oder ihrer
Spaltprodukte wird durch die Tatsache unterstützt, daß die Aktivierung
durch Monojodessigsäure und Monobromessigsäure stark gehemmt wird.
Die Fluoride dagegen üben eine geringe hemmende Wirkung aus, die
vielleicht auch zu vernachlässigen ist.

Es ist wahrscheinlich, daß auch, wenn man der Untersuchungs-
flüssigkeit keine Phosphate hinzufügt, bei der Oxydation des Natrium-
Acetacetats Phosphat ionen beteiligt sind, die als Verunreinigungen oder
als Spaltprodukte der Autolyse der bakteriellen Zellen vorhanden sind.
Monojodessigsäure und Monobromessigsäure hemmen in der Tat die
Oxydation der Acetessigsäure auch in den Versuchen, bei denen Phos-
phate nicht hinzugefügt sind.

Ähnliche beschleunigende Wirkung der Phosphate wurde auch
bei Glucose und bei Bernsteinsäure festgesteht, was den vorhergegan-
genen Untersuchungen von Yudkin entspricht. Bei den monocarboxy
lischen Fettsäuren ist die Wirkung der Phosphationen unsicher und
jedenfalls nicht zu vergleichen mit der, die sie auf den Abbau der Acet-
essigsäure und der Bernsteinsäure ausüben.

R. Deotto hat, auf meine Anregung hin, schon seit längerer Zeit die
Versuche über die Oxydation der Acetessigsäure vertieft, und er ist auf
verschiedene interessante Schlußfolgerungen gekommen, unter anderem,
daß die Acetessigsäure eine aktivierende Wirkung auf die Atmung der
Bakterien selbst ausübt, feiner, daß nur die Keime in der Ä-Phase die
Fähigkeit haben, die Ketonsäure zu oxydieren, während die in der
Ä-Phase ganz inaktiv sind. Nach Deotto geschieht der Abbau der Acet-
essigsäure nicht auf dem Weg über /8-Oxy buttersäure bildung. Unter
den Spaltprodukten kann man weder die Gegenwart der Brenztrauben-
säure noch die der Bemsteinsäure nach weisen; es erscheinen jedoch
Körper, welche Verbindungen mit Bisulfit geben und Körper mit dop-
pelter Bindung. Unsicher ist die Methylglyoxalbildung und auszu-
schließen ist die von Acetylaldehyd und von Milchsäure.

Experimenteller Teil.

Es kamen zur Verwendung 16- bis 208tündige Kulturen von
Bacterium coli auf Agar. Die Bakterienmasse wurde abgehoben und in
physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt, im Verhältnis von
5 ccm für jede Agar Rohre. Die Aufschwemmung wurde durch Papier
filtriert, um die Bakterienklümpchen und die Agarteilchen zu entfernen,

^ Siehe Cutinelli, welcher diese Erscheinung als Funktion des pn -Wertes
untersucht hat.

Der Abbau der Acetessigs&ure.

163

daraufhin zentrifugiert und die mit einer großen Menge physiologischer
Kochsalzlösung zur Auswaschung zweimal von neuem zentrifugierten
Keime schließlich in physiologischer oder in Ringerlösung suspendiert,
so daß jeder ccm von Emulsion einer Kulturröhre entsprach. Auf
diese Art erhält man Bakterien, welche eine sehr geringe Atmungs^
größe zeigen, weil sie größtenteils ihre eigenen Donatoren verloren
haben und welche deshalb in Gegenwart eines durch sie leicht ver-
brennbaren Substrats sofort eine Zunahme an Sauerstoffverbrauch
zeigen. Keime unter solchen Bedingungen entsprechen den ruhenden
Bakterien von Quastei.

Der Sauerstoffverbrauch wurde manometrisch nach ITortwrgr gemessen.
Die birnenförmigen Gefäße enthielten im zentralen Behälter Kalilauge, um
die Kohlensäure zu binden. Nach dem Erreichen des Temperatur- und
Druckausgleichs wurde das Substrat durch den Seitenansatz eingegossen,
um so von Anfang an die Zunahme des Sauerstoff Verbrauchs zu messen.
Es gelangten Fettsäuren (pro analysi) von Schering-Kahlbaum , British Drug
House und Fraenkel d" Landau zur Verwendung. Die Fettsäuren wurden als
Na- Salze nach Zusatz einer berechneten Natronlaugemenge gebraucht.
Das ph der Lösung wurde elektrometrtsch bestimmt und wenn nötig auf 7,2
eingestellt. Meist wurde mit physiologischer Kochsalzlösimg geai beitet,
welcher Bicarbonat hinzugefügt war, manchmal auch mit Ringe'^lösung.
Die Acetessigsäure wurde aus Äthylacetacetat nach Ijjunggren dargestellt ;
der Titel der im Eisschrank gehaltenen Lösung wurde jedesmal geprüft
und es wurde festgestcllt, daß er nur langsam abnimmt. Die Bestimmung
der Acetessigsäure wurde nach der Verbesserung der manometrischen
Methode von Quastei und Whcatley nach Edson erzielt, d. h. durch De-
carboxylation der Säure mit Anilinhydrochlorat . Die Flüssigkeit wurde
durch Citronensäure angesäuert, das Anilinhydrochlorat nach Erreichen des
Temperatur- und Druckausgleichs aus dem Seitenansatz in den Hauptraum
eingekippt und der durch Kohlen -'äureentwicklung verursachte positive
Druck manometrisch gemessen.

Die ^-Oxy buttersäure wurde nach Edson bestimmt. Monobromessig-
säure und Monojodessigsäure (British Drug House) wurden als Na-Salze
hergestellt.

Literatur.

AUirnonelli, -B., Boll. Ist. Sier. Mil. 21, 238, 1942. — Cuiinelli, C.,
ebenda 19, 88, 141, 1940. - Derselbe, ebenda 20, 391, 1941; 21, 137, 1942.
— Yudldn, J., Biochem. J. 27, 1849, 1933. — Franke, W., u. W. Peris,
Biochem. Zeitschr. 296, 61, 1938. Mazza, F. P., u. Ä. Cimmino,
Rend. Acc. Lincei 20, 113, 1934. - Deotto, R., Enzyinologia 8, 289, 1940. —
Edson, N. L., Biochem. J. 29, 2082, 1936. — Ljunggren,ö., Biochem.
Zeitschr. 146, 422, 1924. — Quastei, J. H., u. A. H. M. Wheatley, Biochem.
J. 27, 1763, 1933; 29, 2773, 1936.

(Aus dem Institut für Mikrobiologie der Universität Göttingen.)

Zur Frage der Rhizosphäre nnd Bodenimpfdng
mit Azotobacter.

Von

Artur Stare.

Mit 2 Textabbildungen.

(Eingegangen am 24. September 1942.)

Unter dem Einfluß der schon von L. Hiltner (5) aufgestellten
H 3 rpothese, daß die Pflanzen in ihrer Rhizosphäre die Entwicklung
einer spezifischen und für die Pflanzenernährung nützlichen Mikroflora
fördern, wurde für manche Kulturpflanzen behauptet, daß sie in ihrem
Wurzelbereich günstige Bedingungen für Entwicklung von Azotobacter
darbieten sollen, der seinerseits ihnen den aus der Luft gebundenen
Stickstoff liefere.

So sollen sich infolge dieser Verhältnisse gewisse Kruciferen (Senf,
Raps usw.) in stickstoffarmen Böden gut entwickeln [L. Hiltner (Q); A.
Cauda (2); H. Poachenrieder (18)]. Für Tabak haben /S'. Kosticev^ A. Selou-
mova und 0. Sidjgina (9) gefunden, daß seine hohen Erträge in Beden der
Krim auf die Tätigkeit von Azotobacter zurückzu führen seien. Auch in der
Rhizosphäre der Leguminosen wurde diesem 8tickstoffbinder eine gewisse
Bedeutung beigemessen; F.Löhni8(\Z) z. B. nimmt an, daß der erhöhte
N- Gehalt in von Leguminosen bewachsenen Böden weniger den Knöllchen-
bakterien zuzuschreiben ist, als der Tätigkeit der nichtsymbioriti sehen Luft-
stickstoffbinder. Dieses Problem wurde besonders aktuell, seitdem Q. Truf-
f aut und N. Bezssonoff (30) behaupteten, daß es ihnen gelungen sei, in Stick-
stoff- und kohlenstofffreien, aber mit Stickstoffbindern geimpften Substraten
den Mais bis zur Reife zu kultivieren. Im Anschluß an diese Untersuchungen,
nach denen die Energiequelle für Azotobacter in den Atisscheidungen der
Wurzel liegen mußte, lebten die schon vorher gemachten feldmäßigen
Bodenimpfungen mit Azo^oöoc^r-Präparateii wieder auf — ungeachtet Von
den vielen in diesem Zusammenhang noch zu lösenden Fragen.

O. Naundorf (16) imd H. AmUmg (1) führten mit der neuen AZ. -Kultur
(Azo^o6ac<er-Präparat) vom Radicin-Institut Feldversuche durch und fanden
eine gute Wirkung bei Hafer, Mais und Kartoffeln, besonders unter Zugabe
von „Ravit“, das Bakterienwirkstoffe enthalten sollte (Vitamine, Säuren,
Spurenelemente). Q. Naundorf stellte beim Mais eine Ertragsstc igerimg
von 30,3% mit AZ. und 39,7% mit AZ. Ravit fest, d. h. mehr als mit der
normalen N-Düngimg (18,3%). Hier ist der Kontrollversuch mit „Ravit“
ausgeblieben, ebenso in den genauer angeführten Versuchen von H. AmUmg,
der übrigens bei Kartoffeln nicht so große Unterschiede finden konnte
(+ AZ. und 16% mit AZ. -j- Ravit). Eine eindeutige Vergleichs-

Khizosphäre und Bodenimpfung mit Azotobacter.

165

basis ist aber schon deshalb nicht vorhanden, weil die Naßbeize bei den
Kartoffeln bzw. Getreidesamen in den Kontrollen nicht ausgeführt wurde.

In Rußland hat in den letzten Jahren das Azoto&octer-Präparat „Azo-
togen“ (von Seloumova) und neuerlich „Azotobakter in“ (von Savostin) große
Verwendung gefunden. Als durchschnittliche Ertragserhöhungen der
Kulturpflanzen auf Grund von dreijähriger Anwendung dieses Präparates
in verschiedenen Gebieten führt (?. Petrenko (17) an: bei Weizen 1 bis 3 dz /ha
(10 bis 20%), bei Hafer 1,6 bis 2,5 dz/ha (10 bis 16%), bei Kartoffeln 16 bis
60 dz /ha (12 bis 16%) imd auch bei anderen Kulturpflanzen, wie Zucker-
rüben, Lein, Hanf und Ohat eine durchschnittliche Ertragssteigerung von
10 bis 30% gegenüber der Kontrolle. Jedoch muß bemerkt werden, daß
oft auch negative Ergebnisse gefunden wurden, und daß noch immer Kontro-
versen über die technische Herstellung wie auch über das aktive Prinzip
der Präparate bestehen.

Die Feldversuche sind in ihren Ergebnissen oft sehr variabel und
schwer zu vergleichen, besonders wenn die Bodenverhältnisse und die
Zusammensetzung der Mikroorganismenflora, insbesondere das Azoto-
Vorkommen nicht genauer bekannt sind. Die vielen Widersprüche
zeigen, daß man zunächst durch exakte Laboratoriums- und Gefäß-
versuche das Verhältnis von Azotobacter zu den höheren Pflanzen in
bezug auf das Rhizosphärenproblem klären muß, wobei man einerseits
die Bodenfaktoren und Pflanzenalten, andererseits die Azotobacter-
Rassen und die Konkurrenz der anderen Bodenmikroorganismen der
Rhizosphäre berücksichtigen muß. Auf diese Fragen werden wir später
zurückkommen .

II.

Um den Einfluß der Azotobacter-Xm^iung auf den Pfianzenertrag,
wie im allgemeinen das Vorkommen von Azotobacter in der Rhizosphäre
festzustellen, wurde ein Gefäßversuch mit Mais im reinen Quarzsand
durchgeführt ; Stickstoff wurde nur in minimaler Gabe zugefügt, um das
Anwachsen der Pflanzen zu ermöglichen, während die Zugabe der
C- Quelle für Azotobacter ganz ausblieb, um so den Einfluß der Wurzel-
ausscheidungen auf die Luftstickstoffbindung und also auf die Maisernte
festzustellen.

Mitscherlichgefäße wiu'don mit 7 kg Sand (Freienwalder Sand, Wasser-
fassungsvermögen 21%) angefüllt und 1 Liter Nährlösung zugefügt [A. Rip-
pet vücid R. Meyer ( 22 )]: CaHP 04 4,0 g; K 2 SO 4 3,0 g; MgS 04 1,6 g; MgCl,
0,2 g; FeS 04 0,1 g; dest. Wasser 1000 ccm; pn — 6 » 8 . Außerdem wurden
noch 0,01 g NaMo 04 und 0,2 g KNO 3 (27,7 mg N) zugesetzt.

In den Sand wurden je drei Objektträger je Gefäß in vertikaler
Richtung eingegraben (für die Rhizosphärenunter Buchung nach der Auf-
wuchsplattenmethode), die Sandoberfläche mit schwarzem Papier überdeckt
und dann im Autoklaven in zwei aufeinanderfolgenden Tagen bei 2,0 Atm.
4 Stunden sterilisiert. Die Maiskörner (Sorte Mahndorf) wrurden zunächst
oberflächlich mit 0,6% Bromwasser 20 Minuten sterilisiert, in feuchtem
sterilem Sand zum Keimen gebracht und die kleinen Keimlinge vorsichtig
in die sterilisierten Mitscherlichgefäße überpflanzt.

Von zwölf Gefäßen
wurden sechs mit je
2 ccm einer Azotobacter-
Aufschwemmung (etwa
50 Millionen) beimpft.
Hierzu wurde eine Rein-
kultur von Azotcbacter
chroococoum verwendet,
von der in einem Vor-
versuch mit Mannit-
Agar-Nährlösung nach
A. Rippel (21) festge-
stellt war, daß sie eine
gute N-Bindungsfähig-
keit besitzt (12,2 mg N
auf 1 g Mannit nach
8 Tagen). Die übrigen
sechs Gefäße dienten
als Kontrolle. Außer-
dem wurde ein unbe-
pflanztes Gefäß mit
Azotobacter geimpft und
dazu noch 10 g Mannit
zugefügt, um dadurch
die Stickstoffbindung
der Kultur im Sand mit
gut verfügbarem Ener-
giematerial zu ermitteln.

Die Gefäße wurden
die erste Woche bei
Zimmertemperatur,
später im Gewächshaus
gehalten und täglich mit
dest. sterilem Wasser
begossen. Der Versuch
wurde nach 40 Tagen
(am 16. VI.) abgebro-
chen, da die Maispflan-
zen schon deutliche
Merkmale von Stick-
stoffmangel zeigten.

Um festzustellen,
ob T Azotobacter in den
beimpften Gefäßen am
Leben blieb, wurde in
Abständen von je 10 Ta-
gen mit dem Sand der
bewachsenen Gefäße
eine Azotobacter - Im-
pfung auf Kieselsäure -
gallerte mit Ca-Lactat
ausgeführt [5. Wino-
(32)]. Noch nach

Khizofcrphäre und Bcxlenimpfung mit Azotobacter.

167

40 Tagen konnte man so die Entwicklung von AzotobcuOer fast in Rein*
kultiur feststellen; die Sandimpfungen aus den Kontrollgefäßen blieben da-
gegen steril. (Da der Versuch nicht unter ganz sterilen Bedingungen
ausgeführt werden konnte, fand eine geringe Infektion statt, die Azo-
toöooter-Zellen waren aber so reichlich vorhanden, daß sie ohne Konkurrenz
ihre Tätigkeit entfalten konnten.)

Nach 40 Tagen wurden die Maispflanzen geerntet und die Trocken-
substanz der ober- und unterirdischen Teile (die letzteren unter Abziehung
des beigemengten Sandes) wie auch der Gehalt an Stickstoff in Pflanzen
(nach KjeldaM) und im Sand (nach Kjddahl-Foerster) bestimmt.

Die Ergebnisse mit N-Bilanz am Ende des Versuchs zeigt Tabelle I.
Aus dem Vergleich zwischen den beimpften und den unbeimpften
Gefäßen ergibt sich, daß im gesamten Pflanzenertrag kein Unterschied
besteht ; auch die Erträge der ober- und unterirdischen Teile zeigen nur
geringe Unterschiede, was auch auf den von den Pflanzen assimilierten
Stickstoff zutrifft. Aus den Zahlen für den im Sand am Ende des
Versuchs gefundenen Stickstoff geht jedoch hervor, daß die geimpften
Gefäße im Durchschnitt 11,3 mg N mehr als die Kontrollen enthalten,
was sich auch in der N-Bilanz äußert. Doch sind die Schwankungen
der einzelnen Parallelen groß, so daß der Schluß über einen Gewinn
des Stickstoffs in beimpften Gefäßen kaum berechtigt ist. Im Gegensatz
dazu konnten wir im Gefäß mit Mannit einen weit größeren N- Gewinn
(gegenüber der Kontrolle 50,6 mg N) feststellen ; auf 1 g Mannit bezogen
fanden sich 5,06 mg aus der Luft gebundener Stickstoff.

Es ist anzunehmen, daß der mit KNO 3 und den M,ai 8 kömeni
zugesetzte Stickstoff fast ganz von den Pflanzen aufgenommen wurde;
nur 4,2 mg N davon sind im Substrat geblieben: es ist weniger wahr-
scheinlich, daß auch ein Teil vom Sandstickstoff (87,3 mg) absorbiert
wurde. (Mit Aufschwemmung zugesetzter N kommt hier

nicht in Frage, er beträgt weniger als 0,1 mg N.) Damit in Einklang
steht auch die Feststellung über das Aussehen der Maispflanzen am
Versuchsende.

Den kleinen festgestellten N- Gewinn in geimpften Gefäßen müssen
wir auf die Luftstic kstoffbindung von Azotobacter zurückführen. Es
spricht teilweise dafür auch die Bestimmung der Azo0bacter-Z8ih\ am
Ende des Versuchs. Direkte mikroskopische Zählung nach Winogradsky
ergab in Präparaten aus den geimpften Gefäßen 70000 Zellen, aus den
Gefäßen mit Mannit 450000 Zellen in 1 g Sand, während anfänglich
etwa 7000 Azotoöoc^er-Zellen je g Sand zugesetzt wurden. (In den
Petirischalen mit Maimit-Agar hatten sich nur winzige unregelmäßige
Kolonien entwickelt; deswegen haben wir die Zahlen nach diesem
Plattenverfahren nicht ausgewertet.) Es folgt daraus, daß eine Ver-
mehrung von Azotobacter nicht nur im Gefäß mit Mannit stattfand —
das entspricht auch der analytisch gut feststellbaren N-Bindung — ,

168

A. StCkTc:

sondern auch in den Gefäßen ohne Zusatz von Energiematerial. Da
es kaum anzunehmen ist, daß die C- Quelle von den Spuren der organi-
schen Substanz des Sandes stammt, die möglicherweise durch die
Tätigkeit des Wurzelnetzes hätten aktiviert werden können, muß man
die Vermehrung der Azotobdcter-ZeWen den Ausscheidungen der lebenden
Wurzeln bzw. den teilweise schon abgestorbenen Wurzelteilen zu-
schreiben.

Eine teilweise Aufklärung gab weiter die Untersuchung der Wurzel-
haare bzw. auch der dickeren Wurzelteile nach der AufwuchspJatten-

methode von Cholodny [s. A. Hulpoi (8);
jR. Starkey (25)]. Die ausgegrabenen
Objektträger mit darauf festgekJebten
Wurzelhaaren von Mais wurden an der
Luft getrocknet, flamme- oder alkohol-
fixiert und mit 5%igem Phenol- Ery-
throsin 30 Minuten gefärbt. Durch mikro-
skopische Kontrolle konnten wir keine
Anhäufung, sogar nicht einmal verein-
zeltes Vorkommen von Azotohacter -TtfAlen
auf oder um die Wurzelhaare herum ent-
decken. Die in einigen Fällen um die
Wurzelhaare beobachteten Stäbchen kann
man auf etwaige Infektion zurückführen.

Es ist andererseits interessant, daß sich um die Wurzeln von Mais,
die mit festgeklebtem Sand auf die Kieselsäuregallerte mit Ca-Lactat
gelegt wurden, schon nach zwei Tagen ein weißer, schleimiger Überzug
bildete, der sich als fast reine Anhäufung von Azotobacter-TtMen erwies
(Abb. 1). Hieraus folgt also, daß sich Azotobacter in der Rhizosphäre
von Mais befindet. Daß aber eine engere Beziehung mit den Wurzel -
haaren, etwa im Sinne der Bakteriorhiza, nicht besteht, zeigen auch die
Präparate, die nach einer modifizierten Methode von Razumov (20)
hergestellt wurden und nach welcher die Objektträger mit festgeklebten
Wurzelhaaren mit Mannit-Agar ohne N überdeckt, zwei Tage in feuchter
Kammer bei 30<^C bebrütet und dann getrocknet und mit Phenol-
Erythrosin gefärbt wurden; in diesem Falle entwickelten sich keine
Azo<o6ac<er-Kolonien oder Zellen um die Wurzelhaare.

Aus diesem allen folgt, daß sich Azotoba^cter in der Maisrhizosphäre
befindet, daß er sich aber nicht auf den Wurzelhaaren ansiedelt. Für
den endgültigen Effekt .der eventuellen Tätigkeit von Azotobakter in der
Rhizosphäre ist eine solche Bakteriorhiza auch nicht unbedingt nötig.

Der Einwand eines ungeeigneten Nährbodens für Mais kommt hier
nicht in Frage, denn die Pflanzen entwickelten sich mit einer größeren
N-Gabe gut, was aus der Entwicklung zweier Maispflanzen hervorging,

Abb. 1. Wurzeln von Maü, auf Ca-
Lactat- Agar ausgelegt. Entwicklung
von Azotobacter.

Bhizosphäre vuad Bodeniznpfung mit Azotobacter.

169

die unter sonst gleichen Bedingungen bei Zugabe von je 2,0 g KN 0^ gut
vorwärtskamen. Ebenso zeigt die gute N-Bindung und die Vermehrung
von Azotoba>cter im G^fä6 mit Mannit, daß auch Azotobacter, wenn eine
geeignete C- Quelle vorhanden ist, in diesem Boden günstige Ent-
wicklimgsbedingungen findet. Die Prüfung der Reaktion am Ende des
Versuchs (pH 6,3 bis 6,4) zeigte, daß auch nicht eine eventuelle Ver-
säuerung des Substrats die geringen Unterschiede zwischen geimpften
und nichtgeimpften Gefäßen erklären konnte.

III.

Um genauer das Vorkommen von Azotobacter in der Mais-Rhizo-
sphäre zu prüfen, wurde ein Versuch mit kleineren Sandmengen unter
absolut sterilen Bedingungen ausgeführt.

Der Versuch wurde insofern ausgedehnt, als zusammen mit Azoto-
bacter auch andere Mikroorganismen in die Rhizosphäre des Mais ein-
gebracht wurden, um auf diese Weise die Konkurrenzeinflüsse verschie-
dener Bodenmikroorganismen im Wurzelbereich zu prüfen. Außer
Maie (Sorte Mahnfeld) wurde auch Ackerbohne (Sorte Wadsacks) unter-
sucht.

In Rollflaschen von 760 ccm wurde je 0,5 kg Sand gefüllt und 100 ccm
der Nährlösung zugesetzt (wie im ersten Versuch, aber ohne Stickstoff).
Nach der zweimaligen Sterilisation bei 2,5 Atm. 45 Minuten wiu*den je zwei
mit Bromwasser sterilisierte Körner je Gefäß zwischen zwei eingegrabene
Objektträger eingesät. Nach der Keimung der Samen wurden je zwei
Flaschen mit Aufschwemmung von Azotobacter allein bzw. mit folgenden
Mikroorganismen zusammen beimpft:

Azotobacter chroococcum in Reinkultur;

Azotobacter -f Bact. fluorescens liquefadens;

Azotobacter aerobe Cellulosezersetzer (Rohkultur);

Azotobacter -|- Trichoderma viridis;

Azotobacter -f Fusarium sp . ;

Azotobacter -f Bodenaufschwemmung.

Alle diese Mikroorganismen wurden aus dem Boden isoliert. Als Kon-
trollen dienten bepflanzte und unbeirnpfte bzw. unbepflanzte und beimpfte
Rollflaschen.

Nach 18, bei dem Mais auch nach 5 Tagen, wurden die Wurzeln,
ähnlich wie im ersten Versuch, nach der Aufwuchsplattenmethode (nach
Cholodny) auf Objektträgern mit Mannit-Agar (nach Razumov modifiziert)
und auf der Kieselsäuregallerte untersucht.

In der Jlfais-Rhizosphäre wurde folgendes festgestellt : Die Objekt-
träger mit aufgeklebten Wurzelhaaren ergaben das gleiche Bild wie im
Versuch mit Mitscherlich^chen Gefäßen. Azotobacter konnte auch nach
18 Tagen mikroskopisch auf oder um die Wurzelhaare nicht festgestellt
Werden; eine Ausnahme bildeten jedoch die Präparate aus den Flaschen,
in die Azotobacter zusammen mit aeroben CeUulosezersetzem geimpft

170

A. Stare :

worden war. Hier findet man, wenn auch sehr selten, typische Azo/o-
6acter-DipIokokken um die Wurzeln herum. Andere Mikroorganismen
entwickeln sich dagegen um die Wurzelhaare gut, was im Palle von
Bcict. fluorescens besonders deutlich erscheint. Pilzhyphen fanden sich
wenig um die Wurzelhaare, sie entwickeln sich aber auch außerhalb
der engeren Mais-Rhizosphäre ; bei Trichoderma begegnet man z. B.
typischen, auf den Objektträgern aufgeklebten Konidienträgem.

Die nach Razumov hergestellten Präparate und insbesondere die
auf der Kieselsäuregallerte mit Ca-Lactat gelegten kleinen Wurzeln
zeigen indessen, daß sich Azotobacier unter diesen, für sein Wachstum
günstigen selektiven Bedingungen, entwickelt, wenn auch in allen
Fällen nicht gleich intensiv. Die verschiedene Entwicklung unter diesen
Bedingungen kann uns teilweise als Maßstab dienen, wieweit die ver-
schiedenen Mikroorganismen die Azo0ba>cter-Zeüen aus der Mais-
Rhizosphäre verdrängen können. So entwickeln sich z. B. auf der
dünnen Agarschicht (Präparate nach Razumov) nach Einbringen einer
Reinkultur von Azotobacter bzw. einer Mischkultur von diesem mit
Celluloaezeraetzem mehr Mikrokolonien des Stickstoffbinders, als in
Kombination mit Pilzen oder mit Mikroorganismen aus der Boden -
aufschwemmung. In Mannitpräparaten aus den Gefäßen, in die Azoto-
bacter zusammen mit Bact. fluorescens eingebracht wurde, kam Azoto-
bacter gar nicht zur Entwicklung. Auf der Kieselsäuregallerte ent-
wickelte sich der Stickstoffbinder gut um die Wurzeln herum, sogar
auch dann, wenn die Würzelchen vorher mit sterilem Wasser abgespült
waren. Doch war der weiße, später braune, schleimige t^berzug im
Falle Azotobacter + Bodenaufschwemmung wenig dick. Auch nach
dieser Methode konnte man feststellen, daß Azotobacter besonders durch
Bact. fluorescens aus der Mais-Rhizosphäre verdrängt, wird, da sich
dieser auf den meisten Platten mit Kieselsäuregallerte nicht mehr um
die Wurzeln entwickelte.

Dieser unter sterilen Bedingungen ausgeführte Versuch bestätigt
also, was das Vorkommen von Azotobacter auf der Wurzeloberfläche
betrifft, im allgemeinen die Befunde des ersten Versuchs. Er zeigt
außerdem, daß sich andere Bodenmikroorganismen auf der Wurzel -
Oberfläche leicht ansiedeln und den Stickstoffbinder aus der engeren
Rhizosphäre verdrängen können. Am deutlichsten kommt das bei
Bact. fluorescens liquefaciens, weniger bei den Pilzen vor, während die
aeroben Cellulosezersetzer nicht verdrängend zu wirken scheinen (sichere
Schlußfolgerungen sind jedoch nicht gestattet, da mit einer Anhäuf ungs-
kultur von Cytophaga gearbeitet wurde). Daß Azotobacter dennoch in
der weiteren Rhizosphäre bleibt, beweist sein Wachstum um die Wurzeln
auf der Kieselsäuregallerte mit Ca-Lactat und auf der dünnen Mannit-
Agarsohicht. Jedenfalls besteht zwischen Azo0bacter und den Mais-

Khizosphäre und Bodenimpfung mit Azotobacter.

171

wurzeln keine so enge Berührung, wie dies für andere Bodenmikro-
organismen festgestellt werden konnte.

Die Prüfung dieser Konkurrenzverhältnisse in der Khizosphäre
der Ackerbohne ergab — unter sonst gleichen Versuchsbedingungen —
ein ähnliches Bild.

Doch wurde in der Ackerbohne-Rhizosphäre im allgemeinen eine
üppigere Vermehrung festgestellt. Azotobcicter, in Reinkultur geimpft,
fanden wir nach 18 Tagen nicht nur um die Wurzeln auf der Gallerte
und auf dem Mannit-Agar, sondern, wenn auch selten, auf den im Sand
eingegrabenen Objektträgern; hier treten einzelne Azotobacter-ZeWen
neben den Wurzeln auf, wurden aber niemals den Wurzelhaaren auf-
sitzend beobachtet. Auch in dem Falle, wo Azotobacter zusammen mit
(^eJlulosezersetzem eingebracht wurde, findet man nach der Aufwuchs:
plattenmethode einige Azotobacter -Kokken um die Wurzeln. In anderen
Kombinationen konnte auf den Objektträgern Azotobacter nicht fest-
gestellt werden. Demgegenüber war die Entwdcklimg der Pilzhyphen
in der Khizosphäre der Ackerbohne reichlich und die kleinen Wützeichen
oft stark mit Hyphen von Trichoderma verfilzt. Auf der Kieselsäure
entwickelt sich jedoch der Stickstoffbinder nicht nur in Kombination
mit Pilzen, sondern, weim auch weniger intensiv, auch mit Bact. flu-
orescens, so daß auch dieses Bakterium nicht ganz Azotobacter aus der
Ackerbohne-Rhizosphäre zu verdrängen imstande ist.

Schon nach den mikroskopischen Bildern der auf den Objektträger
auf geklebten Wurzeln können wir schließen, daß die Vermehrung von
Azotobacter in der Khizosphäre der Ackerbohne intensiver vor sich geht
als in der Khizosphäre des Mais. Dasselbe gilt auch für andere Mikro-
organismen, wenn auch diese die Azotobacter-Kokken aus dem Wurzel -
bereich nicht so stark verdrängen, wie dies für den Mais festgestellt
werden konnte. Es ist höchst wahrscheinlich, daß man diese Erscheinung
auf die intensivere Wurzelausscheidung der Ackerbohne zurückführen
kann. Zahlreiche Literaturangaben beweisen, daß die Le^guminosen
eine sehr üppige Mikroflora in ihrer Khizosphäre anreichem.

IV.

Um noch deutlicher auf synthetische Weise diese Verhältnisse in
der Mais- und AcÄJcrftoÄwe- Khizosphäre zu demonstrieren, haben wir
weiter die betreffenden Pflanzen steril auf den Nähragar kultiviert und
die ausgewachsenen Keimlinge (bzw. auch die Samen) mit Azotobacter
und anderen Mikroorganismen beimpft.

Erlenmeyerkolben von 100 ccm Inhalt wurden mit 80 ccm des Nähr-
bodens folgender Zusammensetzung gefüllt: CaHP 04 0 , 05 %; K,HP 04
0 , 025 %; MgS04 0 , 025 %; KNO, 0 , 005 %; FeS04 0 , 005 %;

0 , 0005 % ; gut gewässertes Agar 0 , 2 % ; pu 6,8.

172

A. Stare:

Auf diese Weise wurde ein Substrat von halbfester Konsistenz hergestellt,
das ein gutes Wachstum des Wurzelnetzes, ebenso wie auch die nötige
Diffusion der Wurzelausschoidungen bzw. der Mikroorganismenzellen zuläßt.

In den Hals der Erlenmeyerkolben wurde ein Reagensglas mit durch-
bohrtem Boden mittels Watte befestigt und so weit eingeschoben, daß die
Röhre eben in den Nährboden eintauchte. Das Reagensglas wurde mit dem
Wattepfropfen geschlossen und das Ganze im Autoklaven sterilisiert. Dann
wurde auf dem Boden des Reagensglases je ein sterilisiertes Korn von
Mcm- bzw. Ackerhohne gelegt. In Berührung mit dem halbflüssigen Nähr-
boden erfolgte bald die Keimimg und die Wurzeln der Keimlinge wachsen
durch das Loch der Röhre in das darunter liegende Agar hinein. Die als
steril befundenen jungen Keimlinge wurden alsdann durch das Reagensglas

Abb. 2 a.

Abb. 2b.

Abb. 2. a) Äzotobaeter um die Wurzel von Afai«, in 0,2 %igem Agar kultiviert. Vergr. 250.
b) Ebenso, Vergr. 55. Zeigt die Abnahme von Azotobacter in größerer Entfernung
von der Wurzel.

mit einigen Tropfen einer dichten Aufschwemmung von Azotobeteter in
Reinkultur wie auch zusammen mit Betet, fluoreacena, cteroben CeUvloae-
zeraetzem und Trichoderma viridia beimpft.

Die Wurzeln wurden nach 10 bis 20 Tagen geprüft. Hier sei ein Beispiel
aus dem Protokoll für den Maia erwähnt :

1. Azotobacter chroococcum allein:

a) Präparate nach der Aufwuchsplattenmethode : Gute Entwicklung von
Azotobacter; ZeUen einzeln und in kleinen Anhäufimgen um die Wurzeln
und zwischen den Wurzelhaaren; in größerer Entfernimg von der
Wurzel abnehmend (Abb. 2a und 2b).

b) Präparate nach Bazumov: Große Zahl von Mikrokolonien von Azoto-
bacter um die Wurzeln henim.

c) EjeselBäuregallerte : Sehr gut entwickelter Azotobaeter-tibevzug um
die Wurzeln,

Khizosphäre und Bodenimpfung mit Azotobacter.

173

2. Azotohckcter + Bact, fltuyrescena :

a) Aufwuchsplattenmethode: Eine Menge von kleinen Stäbchen um die
Wurzelhaare; Azo^öooter-Diplokokken nur in einzelnen Fällen fest-
gestellt.

>)) Präparate nach Raaumov: Zahlreiche Mikrokolonien von Baet. flu-
oreacens, wenige von Azotobacter.

q) Kieselsäuregallerte: Schwächer gewachsener schmutziger Belag \un
die Wurzeln, bestehend aus Azotobacter und Bact. fluoreacena.

d) Bouillon-Agar: Starke Fluoreszens; nur Bact. fluoreacena.

3. Azotobacter Trichoderma viridia:

a) Aufwuchsplattenmethode : Die Wurzelzone ist gut mit Pilzhyphen

durchwachsen; Kokken sehr selten.

b) Präparate nach Razumov: Neben Pilzmycel einige Azotcbctcter-
Kolonien.

c) Kieselsäuregallerte: Mäßig entwickelter schleimiger Überzug; Azoto-
bacter,

d) Würze-Agar: Nur der Pilz um die Wurzeln.

4. Azotobacter -f- aerobe Celluloaezeraetzer :

i\) Aufwuchsplattenmethode: Azotobacter wurde nicht gefunden; Pilz-
hyphen, kleine Kokken und Kurzstätchen.

I)) Präparate nach Razumov: Pilzhyphen; nur einige Mikrokolonien von
Azotobacter.

c) Kieselsäuregallerte : Schwach entwickelter Belag um die W%irzeln
herum. Azotobacter vermengt mit anderen Mikroorganismen.

Eh folgt daraus, daß sich unter den angeführten Versuch ßbedin-
gungen Azotobacter doch im engeren Bereich der Wurzeln entwickelte.
Makroskopisch läßt sich nur feststellen, daß das Agar um die Wurzeln
etwas trüb wird; weiter entfernt von den Wurzeln findet im Agar kein
Wachstum der Mikroorganismen statt. In diesem Zusammenhang ist
die Feststellung von Bedeutung, daß andere Bodenmikroorganismen
auch unter den vorliegenden Ve^suchsverhältnissen Azotobacter im
höchsten Maße aus der Afaw- Rhizosphäre verdrängen können. Auch
die Cellulosezersetzer sind diesbezüglich den anderen Mikrooiganismen
gleichzustellen ; dies darf man wahrscheinlich der stärkeren Entwicklung
von Pilzen aus der Anhäufungskultur zuschreiben.

Bei der Ackerbohne liegen die Verhältnisse ähnlich. Wie im Sand
wurde auch im Agar ein stärkeres Wachstum der Mikroorganismen
festgestellt als in der Rhizosphäre des Mais. Dies folgt schon aus dem
makroskopischen Aussehen der Kulturen, die ein charakteristisches
Bild ergaben : das Agar um die Wurzeln ist trüb und in der oberfläch-
lichen Agarschicht entwickelt sich Azotobacter in Form eines leicht
sichtbaren Belages. Azotobacter konnte in großer Zahl zwischen den
kurzen, gut färbbaren Wurzelhaaren festgestellt werden. Auch in
Razumovpräparaten und auf der Kieselsäuregallerte ist die Entwicklung
um die Wurzeln gut.

Archiv für Mlkrobiolofpe. Bd. 13

174

A. Stare:

Die Vermehrung von Bact. fluorescens um die Wurzeln ist bei der
Ackerbohne sehr intensiv, so daß die Wurzeloberfläche eine schleimige
Beschaffenheit besitzt; aber auch das Wachstum von Azoiohacter läßt
sich bei gemeinsamem Einbringen mit Bact, fluorescens leicht, sowohl
mit den direkten als auch mit den indirekten Methoden, feststellen. In
diesem Falle ist die Entwicklung des Stickstoff binders jedenfalls
weniger gehemmt als im analogen Fall bei dem Mais. Für die Kom-
bination von Azotobacter mit Oellulosezersetzem gilt für die Ackerbohne
das gleiche wie für den Mais. Azotobacter war weiter auch durch
Trickoderma weitgehend gehemmt. Der Pilz entwickelt sich gut,
insbesondere auf der Agaroberfläche und sogar auf den Keimlingen,
so daß das normale Anwachsen der jungen Pflanzen in den meisten
Fällen verhindert war.

Es ist offensichtlich, daß die Wurzelausscheidung der Ackerbohne
unter solchen Versuchsbedingungen sehr stark ist, worauf man u. a.
auch aus dem Wachstum der Mikroorganismen in oberflächlicher Agar-
schicht schließen kann.

Wenn man endlich diese Ergebnisse mit jenen vergleicht, die in
der Synthese von Wurzeln mit Mikroorganismen im Sand erzielt wurden,
so sieht man, daß nach diesem Verfahren die Entwicklung von Azoto-
bacter in Reinkultur auch in der unmittelbaren Rhizosphäre des Mais
und nicht nur der Ackerbohne festgestellt werden kann. Aber auch hier
war das Wachstum der anderen nicht Stickstoff bindenden Mikro-
organismen intensiver, so daß sie imstande sind, Azotobacter zu ver-
drängen.

Bei der Besprechung dieser Ergebnisse können wir zunächst an-
führen, daß man gegen den angestellten Glefäßversuch einwenden
könnte, daß er nicht den natürlichen Verhältnissen der Entwicklung
von Azotobacter im Boden bzw. in der Rhizosphäre entspricht und
außerdem, daß die Versuchsdauer zu kurz war.

Es ist ohne weiteres zuzugeben, daß die Verhältnisse in Mitscherlich-
gefäßen denen in der Natur nicht gleichen. Wir konnten aber fest-
stellen, daß sich Azotobacter im Sande doch vermehrt, besonders unter
Zusatz von geeignetem Energienlaterial. Außerdem zeigte der Versuch
mit Beimischen von anderen Mikroorganismen, daß sie eher hemmend
als fördernd auf die Entwicklung von Azotoöocter in der engeren Rhizo-
sphäre wirkten.

Was die Kürze der Versuchsdauer betrifft, so muß man hier berück-
sichtigen, daß nach vielen Literaturangaben die Ausscheidung von
Wurzelexkreten in der Periode des starken Vegetativwaohstums am
intensivsten ist, einer Zeit, in der auch die Zahl der Rhizosphäre-Mikro-

Rhizosph&re und Bodenimpfung mit Azotobacter. 175

Organismen die größte ist. Nach N, Krasilnikov, A. Kris und M. Lit-
vinov (12) findet z. B. schon sehr früh ein Maximum in der Zahl der
Mikroorganismen in der Mais-Rhizosphäre statt, was mit der starken
Wurzeltätigkeit zusammenhängt. Am Anfang des Versuchs entwickelten
sich die Maispflanzen gut und erst in den letzten 10 Tagen machten sich
die N-Mangelmerkmale bemerkbar. Angesichts der Möglichkeit, daß
Azotobacter erst mittelbar die Wurzelausscheidungen und abgestorbene
Wurzelteile ausnutzt, könnte man annehmen, daß sich dieser Stickstoff <•
binder erst in dieser letzten Periode stärker entwickelte, nachdem das
Wurzelsystem des Mais wegen des N-Mangels und schwächerer Assimila-
tion zum Absterben von einzelnen Teilen neigte; den von Azotobacter
fixierten Stickstoff konnten aber die Pflanzen nicht mehr ausnutzen.
Auf diese Weise kann man eventuell den im Sande von geimpften
Gefäßen gebliebenen Stickstoff erklären. Es konnte dabei die Möglich-
keit eine Rolle spielen, daß zu Beginn des Versuchs die N-Bindungs-
fähigkeit von Azotobacter wegen des zugesetzten gebundenen Stickstoffs
(KNO3) geschwächt wurde, und erst später, nachdem der Nitrat-N
durch die Wurzeln absorbiert war, sich entfalten konnte. Gegen diese
Annahme spricht allerdings, daß dieser Azotobacter im Gefäß
mit Mannit in Gegenwart von KNO3 gut Luftstickstoff bindet; doch
liegen die Verhältnisse hier verschieden, weil im Mannit eine reichliche
C- Quelle vorhanden ist. Obwohl also wahrscheinlicher ist, daß Azo-
tobacter erst in den letzten Versuchstagen den Luftstickstoff stärker
zu binden begann, ist kaum anzunehmen, daß sich die Pflanzen bei
einer Versuchs Verlängerung wieder erholen konnten.

Die Ergebnisse dieses Versuchs stehen im Gegensatz zu den ähnlich
ausgeführten Versuchen der Autoren, die beim Mais mit Azotobacter-
Impfung gute Ergebnisse erzielten. In der schon erwähnten Arbeit von
G. Truffaut und N. Bezssonoff konnten die Autoren im Substrat ohne
Stickstoff (der Sand enthielt jedoch 105 mg N auf 1 kg) große N- Gewinne
am Ende des Versuchs feststellen; so z. B. in einem Falle 585,0 mg N
auf 40,2 g Trockensubstanz, d. h. 14,5 mg N auf 1 g. Doch fanden sie
in einem anderen Falle nur einen geringen Gewinn von 3,65 mg N auf
4,1 g Maissubstanz und auch die N-Bilanz in den Kontrollen war großen
Schwankungen unterworfen, was die Autoren auf die Infektion zurück-
führen möchten. Da mit einer Mischung von Stickstoff bindern geimpft
wurde, ist das Bild der Tätigkeit w^eniger klar. Jedenfalls

muß man annehmen, daß der Mais große Mengen von Wurzelexkreten
ausgeschieden hat. Unter der Voraussetzung, daß sie nach ihrem ener-
getischen Wert dem Mannit oder der Glucose entsprechen, wäre auf I g
Trockensubstanz etwa 1 g von Wurzelexkreten ausgeschieden . Über
die Menge und Zusammensetzung der Wurzel ausscheidunger* haben
wir bis jetzt keine genauere Vorstellung ; außerdem sind solche Unter-

12 *

176

A. Stare:

Buchungen hauptsächlich mit Wasserkulturen ausgefühit. T. Lyon und
J. Wilson (lö) fanden, daß die Menge der Wurzel ausscheidungen nicht
mehr als 1/37 bis 1/35 der organischen Pflanzensubstanz beträgt. Selbst
wenn wir noch viel größere Mengen annehmen, so s.nd doch noch immer
die Zahlen von 0. Truffaut und N. Bezssonoff über den gebundenen
Luftstickstoff auf Kosten von Würze! ausscheidungen kaum wahr-
scheinlich, sogar noch dann, wenn man einen Teil der C- Quelle den
abgestorbenen Wurzel haaren, abgelösten Epidermiszelien usw. zu-
schreiben wollte. Wie auch E. Starkey (24) anfuhrt, ist es nicht wahr-
scheinlich, daß unter diesen Bedingungen die Stickstoff binder den großen
Bedarf der Nichtleguminosen an N decken können. Übrigens haben
dieselben Autoren (31) später weniger befriedigende Ergebnisse mit
Mais erhalten.

Von anderen Versuchen seien hier insbesondere die von A . Selcmmova
erwähnt, da sie die Grundlage für die seit 1936 große Produktion des
Präparats ,,Azotogen“ (Reinkultur von Az. chroococcum im Torf) in
Rußland gaben. In Vegetations versuchen mit N-aimem Boden (Sand-
podsol) haben A. Sdoumova und 0. Protod jakonov (25) für Mais und
Tabak einen N- Gewinn in mit Azotobacter beimpften Gefäßen fest-
gestellt, während die un bepflanzten Gefäße merkliche Verluste zeigten ;
es wurde daraus gefolgert, daß die Stickstoff bindung von Azotobakter
nur in Verbindung mit Wurzelausscheidungen der Pflanzen zur Geltung
kommt. Bei der Fortsetzung der Versuche (26) konnte man dann fest-
stellen, daß sich Azotobacter in bezug auf die N-Bilanz verschieden
verhält, und zwar nicht nur als Binder des elementaren Luftstickstoffs,
sondern auch als Zersetzer des gebundenen Stickstoffs. In einer neulich
erschienenen Arbeit (24) bringt die Autorin die Ergebnisse der Gefäß-
versuche im Sand unter sterilen Bedingungen, die ebenfalls die gute
Wirkung des ,,Azotogens“ zeigen sollen. So wurde für il/ais ein N- Gewinn
von 40 mg in mit Azotobaoter geimpften Gefäßen festgestellt, der (schon
nach 20 Tagen) ganz von den Pflanzen aufgenommen war. Die Versuchs-
reihe mit 62 mg NO3/N zeigte, im Vergleich mit der Kontrolle, eine
Ertragssteigerung von 4,45 ; 3,55 g Trockensubstanz und einen N-Gewimi
von 41,9; 1,5 mg (zwei Parallelen). Größere N-Gaben (175 mg NO3/N)
wirkten hemmend auf die Luftstickstoff bindung ; doch wurde hier in
den geimpften Gefäßen ein kleinerer Ertrag als in der Kontrolle erzielt
(3,25 : 4,0 g). Es ist weiter schwer zu erklären, daß kleinere Mais-
erträge mit größeren N-Gaben erzielt wurden, als mit kleineren Mengen
aber in Kombination mit Az. chroococcum.

In unseren Versuchen haben wir ebenfalls einen N- Gewinn im
Sand gefunden, der aber viel geringer war und sich nicht im Pflanzen-
ertrag äußerte. Nach A. Seloumova (24) kann man die Mißerfolge vieler

Rhizosphäre und Bodenimpfung mit Azotobacter.

177

Autoren bei derartigen Versuchen hauptsächlich dadurch erklären, daß
sie nicht die hemmende Wirkung des vorhandenen oder zugesetzten N,
wie auch die Verschiedenheit der Azotobacter^St&mme berücksichtigten.
Diese Einwände treffen aber auf unsere Versuchsbedingungen nicht zu.
Es wurde nur 0,2 g KNOg (auf 7 kg Sand) zugesetzt, bei welcher Gabe
(und zwar auf 2,8 kg Sand) A. Sdoumova eine günstige Wirkung fand;
der verwendete Azoiofeacter- Stamm band bei Gegenwart von Mannit
gut Luftstickstoff.

Andererseits konnten schon vor vier Jahrzehnten Gerlach und
Vogel (3) in Gefäßversuchen mit natürlichen Böden keine günstige Wir-
kung der Azotohacter-lnvpfnng auf den Ertrag von Hafer^ Senf und
Möhren finden, was sie auf die allgemeine Verbreitung der Stickstoff -
binder in den Böden zurückführen. Es ist offensichtlich, daß man in
Versuchen mit natürlichen Böden sehr verschiedene Ergebnisse erzielen
kann, was nicht nur von dem Vorkommen von Azotolxicter in bezüg-
lichen Böden abhängt, sondern auch von vielen anderen Faktoren,
von der Menge und Form des gebundenen Stickstoffs \ind nicht
weniger von der Pflanzenart.

ln bezug auf die so verschiedenen Ergebnisse ist es wichtig, daß
man zunächst das Vorkommen von Azotobakter in der Rhizosphäre
näher untersucht. In der Literatur finden wir über diese Frage nur
wenige Angaben, wobei man die auseinandergehenden Ergebnisse
einzelner Autoren teilweise auf die angewandten Methoden, teilweise
auf die Auffassung des Begriffs von Rhizosphäre und Bakteriorhiza
zurückführen kann. N . Krasilnikov (IQ) fand, daß sich Azotobacter in
Wasserkultureri in der Rhizosphäre anfangs gut entwickelt, später

aber verschwindet ; mit der Verlangsamung der Entw icklung nimmt
gleichzeitig auch die Größe der Zellen ab. Wie R. Starkey (28) anführt,
ist Azotof)acter noch in keinem Falle in so großer Zahl in der Rhizosphäre
gefunden, daß man daraus auf eine größere Bedeutung des Stickstoff-
binders für das Wachstum der höheren Pflanzen schließen könnte: er
selbst fand nach Cholodny i^cher Methode sehr selten die Azotobacter-
Zellen um die Wurzelhaare. Auch bei meinen im Sand durchgeführten
Versuchen konnten nach der Aufw'uchsplattenmethode auf den Wurzeln
des Mais keine und im engeren Wurzelbereich der Ackerbohne, nur ver-
einzelt Azotobacter festgestellt werden. In Versuchen mit Agar
wurde zwar eine gute V^ermehrung von Azotobacter auch in der Mais-
Rhizosphäre beobachtet, doch hat diese Möglichkeit mehr eine theore-
tische Bedeutung, da die Verhältnisse hier weitgehend unnatürliche
waren. A-us den Angaben von H. Poschenrieder (19) können wir ebenfalls
schließen, daß dieses ,, gewöhnliches, allgemein verbreitetes Wurzel -
bakteriura“ doch öfter in der weiteren als in der engeren Rhizosphäre,

178

A. Stare:

d. h. an den Wurzeln vorkommt. Das stimmt übrigens auch mit dem
vorbespiochenen Nachweis von Azotohacter in der Bhizosphäre auf
indirektem Wege (Präparate nach Rammov, Kieselsäuregallerte) über-
ein. Die Ergebnisse von R. Starhey (27) über die Zahl der Stickstoff-
binder und von 0. Oräf (4) über die Stickstoffbindung in der Rhizo-
sphäre verschiedener Pflanzen zeigen weiter, daß gegenüber dem be-
nachbarten Boden keine wesentlichen Unterschiede bestehen.

Diese Literaturangaben stehen also im Einklang mit unserem
Befunde, wonach Äzotobacter in der jlfats-Rhizosphäre vorkommt, an
der Oberfläche «der Wurzelhaare aber nicht nachweisbar ist. Er über-
läßt diesen Platz anderen Mikroorganismen. Es folgt übrigens aus den
Untersuchungen von russischen Autoren [.^. Krasilnikov (11) ; A Ryhal-
kirya (23)], daß mit bakterisierten Samen im Boden eingeführter Azoto-
bacter schon nach 10 bis 15 Tagen aus der Rhizosphäre der Kultur-
pflanzen vollkonnnen verschwindet (Gefäß- und Feldversuche)

Im Einklang mit vielen Literaturangaben über das häufige Vor-
kommen von Bakterien aus der Bact. fluorescens-Gtuy^e (schon seit
L. Hiltner und Störmer (7)] auf den Wurzeln, ergibt sich aus unserem
Versuch, daß Bact. fluorescens die Wurzelhaare überdeckt (Präparate
nach Oholodny) und Äzotobacter aus der engeren Rhizosphäre im höchsten
Maße verdrängt (Platten mit Ca-Lactat). Nach N. Krasilnikov, A. Kris
und M. lAtvinov (12) überwiegen in der Rhizosphäre von Kultur-
pflanzen weit nichtsporenbildende Bakterien, unter welchen die Flu-
oreszenten gut vertreten sind. Weiter hat H. Poschenrieder (19) fest-
gestellt, daß am Ende der Vegetationsperiode, nachdem der Äzotobacter
aus der engeren Rhizosphäre verdrängt ist, in dieser die Bact. flnorescens-
Gruppe erscheint. Es ist weiter interessant, daß B. radiobacter — ein
anderer gewöhnlicher Begleiter von Äzotobacter in Rohkulturen — in
der Rhizosphäre bzw. auf der Wurzeloberfläche in sehr hoher Zahl
gefunden wurde (u. a. auch E. Starkey (27); G. Qräf (4)]. Die vorliegenden
Versuche mit anderen im Boden oft vorkommenden Mikroorganismen
zeigten ebenfalls, daß diese sich viel leichter um die Wurzelhaare an-
siedeln können als Äzotobacter. Auch bei der Acherbohne,, wo die Ent-
wicklung aller Mikroorganismen in Versuchen mit Sand und Agar im
allgemeinen stärker war, sind diese Mikroorganismen imstande, Azoto-
bacter weitgehend aus der Wurzeloberfläche zu verdrängen.

Diese Feststellungen, auch gestützt auf Literaturangaben, köimen
uns die Rolle von Äzotobacter im Wurzelbereich der Pflanzen teilweise
erklären. Man kai^n annehmen, daß diese Mikroorganismen der Bakterio-
rhiza auf direktem Wege die Wurzelausscheidungen als Nahrung aus-
nutzen, während Äzotobacter erst mittelbar, vielleicht durch diese
Bakterien, über diese Energiequelle verfügt. Warum sich bei Azoto-
bacter nicht eine so enge Berührung mit den Wurzelhaaren wie bei

Khizosj^are und Bodenimpfung mit Azotobacter.

179

anderen Mikroorganismen verwirklicht, ist schwer zu beantworten.
Es ist dabei nicht ausgeschlossen, daß die Wurzelausscheidungen
lösliche N-Verbindungen enthalten, die das unmittelbare Wachstum
von Azotobacter verhindern, nicht aber das von anderen konkur-
rierenden Mikroorganismen. Den Einfluß der Reaktion können wir
hier nicht abmessen; nach C.Thom und H . Humfeld (29) zeigt das
Wurzelsystem von Mais in Böden verschiedener Reaktion eine aus-
gesprochene Tendenz, die Reaktion im neutralen Bereich (pu 6,0 bis 7,5)
zu halten, so daß die Reaktion eher fördernd als hemmend wirken
dürfte. Es wäre jedenfalls von Interesse, die Beteiligung und Bedeutung
von Azotobacter in diesen Auseinandersetzungen zwischen den Pflanzen
und Mikroorganismen genauer zu untersuchen.

Das Problem der Energiequelle für Azotobacter im Boden bleibt
noch immer ungelöst. Aus diesen Betrachtungen geht hervor, daß die
Ernährung mit Ausscheidungen der lebenden Wurzelteile auf indirektem
Wege viel wahrscheinlicher als auf direktem Wege ist. Daß sich Azoto-
bacter mit Zwischenprodukten des Kohlenhydratabbaues ernähren kann,
folgt u. a. auch aus den Untersuchuitgen von S. Winogradsky (32), der
auf Grund dieser Tatsache die Ernährungsweise des Stickstoffbinders
in natürlichen Verhältnissen im Boden zu erklären versuchte. Nach
(). Loew (14) soll sich Azotobacter in humusaimen Böden hauptsächlich
auf Kosten von absteibenden Wurzelhaaren einähren. N . Krasilnikov .
A. Kris und M. Litmnov (12), die in der Rhizosphäre (auch von Mais)
eine beträchtliche Zahl von aeroben Cellvlosezersetzem in der Periode
des intensiven Vegetativwachstums fanden, meinen, daß sich die Mikro-
organismen auch im Wurzel bereich der lebenden Pflanzen mehr auf
Kosten von Abbauprcdukten der abgestorbenen Wurzelteile entwickeln
als von Wurzelausscheidungen. In diesem Falle könnte Azotobacter nur
sekundär die pflanzlichen Nährstoffe auswerten, nämlich die Zer-
setzungsprodukte der Cellulose. Im Rahmen dieser Versuche sei auf
die interessante Tatsache hingewiesen, daß man bei dem gemeinsamen
Einbringen von Azotobacter und aeroben Gellulosezersetzem das Vor-
kommen des ersten auch nach der AufwuchspJattenmethcde feststjllen
kann. Auf irgendeine Förderung des Azo^oftoc^er-Wachstums durch
Ausnutzung der durch Cellulosezersetzer angegriffenen abgestorbenen
Wurzelhaare kann nur vorsichtig geschlossen werden, da die Lösung
dieser Frage nur durch genauere Untersuchungen möglich ist.

Wir sehen also, daß manche Gründe dafür sprechen, daß Azoto-
fxicter die Produkte der lebenden bzw. abgestorbenen Wurzelteile erst
vermittelst anderer, an die Lebensbedingungen der Rhizosphäre besser
angepäßten, Mikroorganismen ausnutzt.

Das Vorkommen von Azotobaoter in der Rhizosphäre bietet also
noch viele offene Probleme. Was aber die Frage der Bodenimpfung

180

A. Stare:

mit AzotobacUr betrifft, so ist das direkte Einbringen dieses Luftstick-
stoffbinders offenbar von geringerem Wert als die Schaffung von
günstigen Bedingungen für die Entwicklung der im Boden schon vor-
handenen Azotob(iCter-lA.e\me.

Zusammenlassimg.

Im Sandversuch mit Mais war der Ertrag der Pflanzen in den mit
Azotobacier chroococcum beimpften Gefäßen gleich dem Ertrag in der
Kontrolle. Doch konnte man in beimpften Gefäßen am Ende des
Versuchs (nach 40 Tagen) einen geringen N- Gewinn im Sand feststellen.

In geimpften Gefäßen wurde eine Vermehrung der Azotohacter-
Zellen im Sande wie auch um die Wurzeln herum im geeigneten Substrat
festgestellt. Die mikroskopische Untersuchung der eingegrabenen
Objektträger zeigte jedoch, daß Azotobacier nicht auf den Wurzelhaaren
erscheint.

Durch gesondert angefitellte Versuche im Sand konnte man für
Mais und Ackerbohne zeigen, daß sich andere Bakterien und Pilze,
insbesondere Bact. fluorescens liquefaciens schnell auf den Wurzel haaren
ansiedeln und Azotobacier aus der engeren Rhizosphäre weitgehend
verdrängen.

In Versuchen mit Agar fand sich Azotobacier jedoch unmittelbar
um die Wurzeln herum, aber auch hier konnte eine gewisse Hemmung
durch andere Bodenmikroorganismen beobachtet werden.

Es ist wahrscheinlich, daß dieser Stickstoff binder die Produkte
der lebenden und abgestorbenen Wurzelteile erst vermittelst anderer
Mikroorganismen der Rhizosphäre ausnutzt.

Zum Schluß möchte ich Herrn Prof. A. Rippel, der mir die Anregung
für die vorliegende Arbeit gab und deren Ausführung in seinem Institut
ermöglichte, meinen besten Dank aussprechen.

Literatur.

1) H. Amlong, Deutsch. Landw. Preise 46, 387, 1941. — 2) A. Oauda^
Nuovo Giorn. Bot. Ital. 26, 169, 1919 (zitiert nach B. Starkey ^ Soil Sei. 82,
367, 1931, Angabe auf S. 3 -46). — 3) M, Oerlach u. J. Vogels Centralbl.
f. Bakt. II, 9, 881, 1902. - 4) O, Qräf, ebenda II, 82, 44, 1930. -
5) L, HiUner, Arb. d. Deutsch. Landw. Ges. 98, 59, 1904. — 6) Der-
sdbe^ Mitt. d. Deutsch. Landw. Ges. 14, 1915. 7) L. HÜtner u.

K, Störmer, Arb. d. biol. Abt. d. Gesundheitsamtes 8, 445, 1926. — 8) A. HwZ-
poi, diese Zeitschr. 7, 79, 1936. — 9)8. KosUcev, A.Seloumova u. O. StUjgina^
Trudy Inst. s. h. mikrobiol. 1, 5, 1926 (nach N. Kraaünikov, 12). —

10) N . Kraaünikov, Mikrobiologija 8, 343, 1934. — 11) Derselbe, ebenda

KhizoBphäre und Bodenimpfling mit Azotobacter.

181

8, 5, 523, 1939. - 12) N. Kraaünikov, A, Kris u. M. Lümnov, ebenda

6, 270, 1936. — 13) i^. Löhnia, Soil Sei. 22, 263, 1926. — 14)0. Loew, Central-

blatt f. Bakt. II, 70, 36, 1927. - 15) T. Lyon u. J. Wilaon, N. Y. (Cornell)
Agr. Exp. Sta. Mem. 40, 1921. — 16) O. Naundorf, Deutsch. Landw. Presse
47, 427, 1940. — 17) O. Petrenko, Zap. Inst. zern. hoz. necernoz. pol. 1940
(Ref. Mikrobiologija 10, 364, 1941). — 18) H. Poachenrieder, Centralbl. f.
Bakt. II, 79, 222, 1929. - 19) Deraelbe, ebenda II, 80, 369, 1930. --

20) A. Razumov, Mikrobiologija 2, 346, 1933. ~ 21) A. Äippei, diese Zeitschr.

7, 210, 1936. - 22) A. Rippelii. R. Meyer, Zeitschr. f. Bodenkde. u. Pflanzen -
ernähr. A. 27, 257, 1933. — 23) A. Rybalkina, Mikrobiologija 10, 540, 1941
(Ref.). — 24) A. Seloumova, Mikrobiologija 10, 33, 1941. — 25) A. Selou-
mova u. O. Protodjakonov, Trudy Inst. s. h. mikrobiol. 4, 41, 1930 (Ref.
Centralbl. f. Bakt. 11, 91, 306, 1934/35). — 26) A. Seloumova, E. Zaicet>a u.
V. Faerman-Nüov, Trudy Inst. s. h. mikrobiol. 5, 131, 1933 (Ref. Centralbl.
f. Bakt. II, 91, 306, 1934/35). - 27) R. Starkey, Soil Sei. 27, 319, 355, 1929.
— 2S) Deraelbe, ebenda 45, 207, 1938. — 29) C. Thom u. ü. Humfeld, Soil
Sei. B4, 29, 1932. ~ 30) Ö'. Truffautu. N. Bezaaonoff, C. r. Soe, Biol. 91, 1077,
1934. - 31) Dieselben, C. r. Acad. Science 182, 663, 1926. — 32) S. Wino-
gradaky, Ann. Inst. Pasteur 4S, 89, 1932.

(Aus dem Institut für physiologische Botanik der Universität Upsala.)

über das Vorkommen von geographischen Rassen
bei Crncibninm vulgare Tul.

Von

Nils Fries.

Mit 3 Textabbildungen.

(Eingegcmgen am 2. N<n>ember 1942.)

In einer vor einigen Jahren durchgeführten Untersuchung über den
zur Familie Nidulariaceae gehörenden Gasteromyceten Cyathus atriatus
Pers. wies ich nach (Fries, 1940), daß die der multipolaren Sexualität
zugrunde liegenden Gene bei diesem Pilz in sehr wenigen multiplen
Allelen auftreten. In der Diskussion des Untersuchungsergebnisses
wurde u. a. auf die Möglichkeit hingewiesen, daß dieser Pilz infolge seiner
aller Wahrscheinlichkeit nach zoochoren Verbreitungsweise Lokal >
rassen — im eigentlichen Sinne ,, geographische Rassen“ — bilden
könnte, von denen jede ihre bestimmte Allelenkombination der eben-
genannten Gene besäße. Die Zahl der analysierten Fruchtkörper war
jedoch damals viel zu gering, um überhaupt vermuten zu können, wie
sich der Pilz wirklich in genannter Hinsicht verhielt. Nur eine gründliche
Inventarisierung des Fruchtkörpermaterials innerhalb zweier (oder
mehrerer) ziemlich begrenzter, doch weit voneinander getrennter
(Jebiete konnte hier etwas Klarheit schaffen.

Für eine derartige Untersuchung war indessen Cyathus atriatus
auf Grund seiner relativen Seltenheit offenbar ungeeignet. Doch hatte
ich bereits früh gefunden, daß der systematisch sehr nahestehende
Crucibulum vulgare sich hinsichtlich der multipolaren Sexualität auf
die gleiche Weise wie Gyalhua atriatus zu verhalten schien. Da Cruci-
bulum vulgare die am häufigsten vorkommende aller Nidulariaceen sein
dürfte, beschloß ich statt dessen diesen Pilz zum Gegenstand einer
Untersuchung genannter Art zu machen.

Infolge verschiedener Umstände zog sich diese im Jahre 1936
begonnene Arbeit über lange Zeit hin. Es zeigte sich u. a., daß gewisse
Rassen von Crucibulum vulgare sehr schlecht in Kultur wachsen und
darum viel Zeit und beträchtliche Geduld bei dem Mikroskopieren er-
fordern. Obwohl sich die hier veröffentlichten Ergebnisse auf die
Analysen von nur 15 Fruchtköipem gründen und im Hinblick auf das
für die Untersuchung aufgestellte Ziel als präliminär anzusehen sind,
dürften sie gleichwohl mancherlei an Interesse bieten.

183

Vorkommen von geographischen Kassen.

Material und Methodik.

Die beiden Gebiete, in denen das Fruchtkörpei material der vorliegenden
Untersuchung eingesammelt wurde, liegen im südlichen Schweden mit
einem gegenseitigen Abstand von ungefähr 380 km (Abb. 1) und stimmen

der Lage und Größe nach in der Hauptsache mit den beiden Gebieten
überein, die früher bezüglich der geographischen Rassen bei Folyporus
afnetinus (Fries imd Jonasson, 1941) inventarisiert wurden. Das eine Gebiet
liegt also unmittelbar südlich der Stadt Upsala, Provinz Upplar.d, und
imifaßt eine Fläche von etwa 50 qkm (Abb. 2). Schon im Herbst 1936 be-
gann ich Fruchtkörper von Crucibulum imlgare in diesem Gebiet zu analy-
sieren. Das zweite Untersuchungsgebiet liegt südlich der Stadt Uddevalla,
Provinz Bohuslän, an der schwedischen Westküste und nimmt eine Fläche
von ungefähr 30 qkm ein (Abb. 3). Fruchtkörper aus diesem Gebiet wurden
während der Jahre 1941/42 untersucht.

184

N. Fries:

Abi». 2. I)i<* b'uii(lort<^ <lor «ntersuohton Fruclitkönn‘r im östlirlion I'i)t6r8uchui)ehgebi(‘t
(bei Upsala). Ein einfacher Kreis bezeichnet, UaU vom «-FnktoriUe Allelen Cjag, ein doppelU'r
bezeichnet, daß 0203 nachgewiesen wurden. Die Iadexbez(‘lohiiungen der beiiii 6-Fakt«ir
festgestellten Allelen werden durch die Ziffern fn den Kreisen angegeben.

Abb. 3. Die Fundorte der untersuchten Fruchtkörper iin westlichen Untersuehungsgebiet
(bei Uddevalla). Erklfining wie bei Abb. 2.

Örtlichkeit und Zeit für das Einsammeln der verschiedenen Fnioht-
körper gehen aus Tabelle T hervor.

Vorkommen von geographischen Rassen.

186

Bezüglich der Untersuchungbrnethodik sowie der im folgenden an-
gewandten Bezeichnungsweise für Fruchtköiper, Einspoimycelien usw. sei
auf meine frühere Arbeit über Cyaihua atriaVua verwiesen.

Tabelle 1. Zusammenstellung der Fundorte der analysierten
Fruchtkörper von Crucibulum vulgare.

186

N. Fries :

Sporen von Fruchtkörpem erhalten, die während dieser Zeit im Dunkeln
bei Zimmertemperatur aufbewahrt wurden. Ein derartiges Verhalten kann
bei einer Untersuchung dieser Art natürlich von großem Vorteil sein, da
man hierdurch die Möglichkeit hat, neue Einspormycelien zu erhalten,
beispielsweise als Ersatz für alte, degenerierte Testmycelien.

Kombinationsyersuche.

Im Herbst 1936 wurden vollständige Sexualitätsanalyse für die
neun Fruchtkörper aus dem Upsalagebiet durchgeführt. Bei sämtlichen
ließ sich Tetrapolarität konstatieren. Durch gegenseitige Kombinationen,
die auf die gleiche Weise wie bei Cyathus atriatus durchgeführt v/urden,
stellte ich dann fest, welche Allelen für die verschiedenen Fruchtkörper
gemeinsam waren. Ich halte es für überflüssig, innerhalb dieser Mit-
teilung die Kombinationsschemata wiederzugeben, die hierbei aufgestellt
wurden. (Es besteht die Absicht, diese in Verbindung mit einer zu-
künftigen umfassenderen und abgerundeten Darstellung zu veröffent-
lichen.) In diesen Schemata und in den im folgenden erwähnten, die
auf der Grundlage von einigen tausend analysierten Kombinations-
kulturen angefertigt worden sind, kommt keine einzige Unregelmäßig-
keit vor, weder in Form von Durchbrechungskopulationen noch aus-
gebliebener Schnallenbildung. Die Schlüsse, die aus den Ergebnissen
der Kombinationskulturen gezogen werden konnten, sind demnach
völlig eindeutig und widersprechen einander nicht in einem einzigen
Punkt.

Die Verteilung der Allelen auf die verschiedenen Fruchtkörper
geht aus Tabe'le II und Abb. 2 (S. 184) hervor. Wie ersichtlich, ver-
treten die neun untersuchten Fruchtkörper nur drei ver8chied3ne Bio-
t3^en, näm’ich aia 2 bib 2 (Nr. I, V, VII und XVI), a^a 2 bQb^ (Nr. VIII,

Tabelle II. Übersicht der fest-

gestellten Allelenkombinatio-
nen der Upsala-Frucht -
körper.

Nr. des
Frucht-

Zifferbezeichnungeu der Alleleu

körpers

Faktor a

Faktor b •

VII

XVI

VIII

2 '

XII

XIII

III

Tabelle 111. Übersicht der fest -
gestellten Allelenkombinatio -
nen der Uddevalla-Frucht -
körper.

Nr. des
Fnicht-
körpers

Zifferbezeichnungeu der Allelen

Faktor a |

1 Faktor b

LIII

LIV

LVIII

12 1

* bl und b^, die in dieu'iii Schema nicht Vorkommen, sind in einem Fruchtkörper (mit d('r
Formel «2 ^4 ^r.) von einem Fundort niißerhalb der beiden hier unfcereuchteii Gebiete nachgewiesen.

Vorkommen von geographischen Rassen.

187

XI, XU und Xtll) und (Nr. IH). Der Faktor ist in sämt-

lichen Fruchtkörpern enthalten, in allen außer in Fruohtkö’rper
Nr. III, wo er durch ersetzt ist. Vom 6-Faktor kommen fünf ver-
schiedene Allelen vor, welche allerdings nur auf drei verschiedene Arten
kombiniert auftreten, und zwar 6^62 (Nr. I, V, VII und XVI), 6^67
(Nr. VIII, XI, XII und XHI) und 6263 (Nr. III).

Während der Sommermonate 1941 und 1942 wurden an sechs ver-
schiedenen Standorten des Uddevallagebietes Fruchtkörper eingesammelt
und anschließend analysiert. Es ergab sich hierbei, daß die Anzahl
Allelen der ,, Sexualfaktoren“ auch hier sehr begrenzt war. Bevor
diese Allelen mit Bezeichnungen versehen werden konnten, mußten
jedoch die isolierten Einspormycelien mit Upsala-Testmycelien kom-
biniert werden, da ja die Möglichkeit bestehen mochte, daß eine oder
mehrere Allelen in Fruchtkörpem von beiden Gebieten vertreten sein
konnten.

Nachdem die sehr umfangreichen Arbeiten des Kombinierens von
Testmycelien aus den beiden Untersuchungsgebieten beendet worden
waren, wurde das in Tabelle III wiedergegebene Schema über die
Faktorenkombinationen der Uddevalla-Fruchtkörper als Ergebnis
erzielt (vgl. auch Abb. 3 , S. 184 ). Vergleicht man diese Fruchtkörper
(LI bis LVI und LVIII) miteinander, so findet man, daß sie vier ver-
schiedene Biotypen vertreten: aj «2 6369 (Nr. LI, LIIl und LV), aia^b^hiQ
(Nr. LIV), aia26i26i3 (Nr. LVIII) und (Nr. LII). Der

Faktor ist auch hier in sämtlichen Fruchtkörpem enthalten und
in allen außer einem (Nr. HI), wo er durch ersetzt ist . Die 6-Faktoren
kommen in vier verschiedenen Kombinationen vor : b^b^ (Nr. LI, LIIl
und LV), 69610 (Nr. LIV), 610611 (Nr. LII) und 612613 (Nr. LVIII).

Vergleicht man die Upsala- und Uddevallastämme miteinander,
ergibt sich also, daß dieselben drei Allelen des a-Faktors (und nur
diese drei !) in den beiden Gruppen vertreten sind, während der 6-Faktor
in den zwei Untersuchungsgebieten durch völlig verschiedene Allelen
(5 bzw. 6) repräsentiert ist.

Über einen gewissen Zusammenhang zwischen Habitus und
,,SexuaIgenotyp^^

Die Hunderte von isolierten Einspormycelien bilden hinsichtlich
Aussehen, Wachstumsgeschwindigkeit usw. Vertreter der verschiedensten
Typen. Bezüglich der von den Upsala-Fruehtkörpem isolierten Einspor-
mycelien habe ich einen gewissen Zusammenhang zwischen Habitus
und ,, Sexualgenotyp“ festgestellt, ein recht interessantes Verhalten,
das ich hier jedoch nur in Kürze berühren will, da es noch nicht aus-
reichend klargelegt worden ist.

Die Einspormycelien, die aus den zuerst untersuchten Frucht-
körpem (I bis V) erhalten wurden, vertraten den Myceltyp, der von

188

N. Fries :

mir früher beschrieben wuidc (Fries, 1936): rein weiß, reichlich luft-
mycelbildend sowie schnell und regelmäßig in vorwiegend radialer
Richtung wachsend. Ich fand jedoch bald, daß dieser ,, Normaltyp“
nicht durchgängig vorkam. So konnte ich aus den Fruchtkörpem VIII,
XI, XII und XIII nur Einspormycelien eines vollkommen abweichenden
Typs isolieren, das sich durch bedeutend langsameres Wachstum kenn-
zeichnete und wenig oder gar kein Luftmycel bildete. Weiterhin war
die Wachstumsweise nicht deutlich radial, sondern — wie eine mikro-
skopische Untersuchung zeigte — die äußerst reich verzweigten, dünnen
Hyphen bildeten ein vollständiges Durcheinander ohne bestimmte
Wachstumsrichtung. Die entstehenden Mycelien erhielten daher eine
mehr oder weniger unregelmäßige Form.

Nachdem die Kombinationsversuche mit den Upsalastämmen
beendet worden waren, zeigte es sich, daß der erstgenannte, ,, normale“
Myceltyp sämtliche Einspormycelien auszeichnete, die von Prucht-
körpem mit den 6-Faktoren und 63 isoliert worden waren, während
alle Einspormycelien von Frucht körpern mit den ft- Faktoren feg und 67
den letztgenannten Typ vertraten. Um einen genaueren Ausdruck des
fraglichen Typunterschieds zu erhalten, wurde eine Anzahl Messungen
der Wachstumsgeschwindigkeit bei 26 Test mycelien angestellt, von denen
15 die Faktoren , Ö2 und 63 sowie M die Faktoren und 67 repräsen-
tierten. Für die ersteren wurde der Durchschnittswert» 4,34 0,18 mm

je 24 Stunden und für die letzteren 1,50 zL ^1,31 nim je 24 Stunden
erhalten. Hierbei ist jedoch zu beachten, daß der Durchschnittswert
für die letzteren nicht als besonders repräsentativ für den langsam
wachsenden Typ als Gesamtheit zu betrachten ist, da die Testmycelien
dieses Typs aus praktischen Gründen begreiflicherweise unter den
schnei Ist wachsenden der isolierten Einspormycelien ausgewählt wurden.
Der Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit zwischen den
beiden Typen dürfte deshalb in Wirklichkeit größer sein.

Es wäre von großem Interesse gewesen einen Fruchtkörper zu
studieren, der sowohl einen der Faktoren hi, oder b^ und einen der
Faktoren b^ oder 67 besessen hätte. Einen derartigen Fluchtkörper
habe ich jedoch nicht in der Natur gefunden, und die durch Kombina-
tionsversuche erhaltenen Diploidmycelien, die genannte Faktoren
besaßen, bildeten ebensowenig wie andere Diploidmycelien in Kultur
Fruchtkörper. Die einfachen Versuche, die ich bisher zwecks Erhaltung
von Fruchtkörperbildung in Kultur unternommen habe, sind mißlungen,
doch hoffe ich bei »fortgesetzten Versuchen mehr Erfolg zu haben.

Diskussion.

Die Ergebnisse der Kombinationsversuche mit Crucibulum vulgare
können in Kürze auf folgende Weise zusammengefaßt weiden. Vom

Vorkommen von biographischen Rassen.

189

Faktor a wurden nur drei Allelen festgestellt, die sämtlich innerhalb
der beiden untersuchten Grebiete angetroffen wurden. Der Faktor b
tritt dagegen in einer größeren Anzahl Allelen auf, insgesamt 11 , und
keine der 5 hiervon, die im Upsalagebiet wahrgenommen wurden, ist
mit einer der 6 vom Uddeval lagebiet identisch.

Diese Verhältnisse stimmen in gewissem Grade mit denen überein,
die Bauch (1930, 1931) bei Usiilago longissima vorfand. In seinem
umfangreichen Material aus Europa und Asien konnte Bauch bei dem
genannten Pilz nur 8 Allelen des «-Faktors und 3 des /^-Faktors nach-
weisen. Qualitative Verschiedenheiten zwischen den be*den Faktoren
bezüglich der Wirkungsweise, w^ie sie Bauch bei Usiilago longissima
fand, scheinen bei Crucibulum vulgare doch nicht vorzuliegen. Das
Vorkommen einer identischen Allele, sei es vom «- oder 6 -Faktor, bei
zwei kombinierten Einspoimycelien von Crucibulum vulgare konnte
augenscheinlich in sämtlichen untersuchten Fällen vollkommen
Schnallenbüdung verhindern, zum mindesten unter den Bedingungen,
die angewandt wurden.

Bezüglich der geographischen Verbreitung der Allelen der a- und
6 -Faktoren verhält sich indessen Crucibulum v'ulgare auf eine völlig
andere Weise als Usiilago longissima und übrigens alle anderen in dieser
Hinsicht untersuchten Pilze. Während die dvvi Allelen des «-Faktors
offenkundig allgemeiner verbreitet sind, treten die verschiedenen
Allelen des ^-Faktors sichtlich in voneinander wenigstens teilweise
getrennten Gebieten auf. Wie groß diese Gebiete sind und wie scharf
sich die Grenzen zwischen ihnen ziehen lassen, darüber ist eine Äußerung
bisher noch unmöglich. Der Umstand, daß keine der Allelendes /^-Faktors
vom Upsalagebiet im Uddeval lagebiet angetroffen wurde oder um-
gekehrt, scheint mir darauf hinzudeuten, daß erstens die Verbreitungs-
möglichkeiten des Pilzes relativ begrenzt sind und zweitens sich die
fraglichen Allelen durch eine ungewöhnliche Stabilität auszeichnen [im
Vergleich mit z. B. Schizophyllum commune (Kniep, 1920) u.a.].

Nach allem zu schließen ist Crucibulum vulgare eine zoochore Art.
und die Peridiolen dürften die Diasporen vertreten (vgl. Gäumann ^
1926, S. 554). Ein freies Kombinieren von Einspormycelieii verschiedener
Fruchtkörper kommt bei Crucibulum vulgare sicher in bedeutend ge-
ringerer Ausdehnung vor als bei Pilzen im allgemeinen, wo die Sporen
die Verbreitungseinheiten bilden. Nimmt man bei Crucibulum vulgare
,, Selbstbefruchtung“ als das normale an, so wird das in Tabelle II zu
beobachtende Verhältnis erklärlich, nämlich daß innerhalb eines kleineren
Gebiets nur gewisse Biotypen vertreten sind, in diesem Falle u. a.
«i« 26 j 62 und «i« 25 e ^7 (doch nicht z. B. «ia 2^]^6 ®der «ia 2 ^ 2 ^ 7 )*
typische Anemochore, die hierbei als Vergleichsobjekt geeignet ist,
Archiv für Mikrobiologie. Bd. 18. 13

190 N. Fries: Vorkommen von geographischen Rassen.

bildet Polyportis abietinua (Fries und Jonasson, 1941), bei dem das
Vorkommen von geographischen Rassen in den gleichen Gebieten wie
bei Crucibulum vulgare untersucht wurde, doch mit in wesentlichen
Punkten abweichendem Ergebnis.

Zusammenfassung.

1 . 15 Fruchtkörper von Crucibulum vulgare - 9 aus einem Gebiet
bei Upsala (Ostschweden) und 6 aus einem Gebiet bei Uddevalla (West-
schweden) — wurden zum Gegenstand von Sexualitätsanalysen ge-
macht. In sämtlichen Fällen wurde tetrapolare Geschlechtsverteilung
festgestellt.

2 . Duirch umfassende Kombinat ionsversuche mit Testmycelien von
verschiedenen Fruchtkörpern wurde das Vorkommen gemeinsamer
Allelen bei den Genen konstatiert, die die Tetrapolarität bedingen.
Insgesamt wurden vom a-Faktor 3 Allelen nachgewiesen, die sämtlich
in beiden Untersuchungsgebieten angetroffen wurden, sowie vom
6 -Faktor 11 Allelen, und unter diesen war keine der 5, die im Upsala-
gebiet festgestellt wurden, identisch mit einer der 6 vom Uddevalla-
gebiet.

3. Gewisse Genot 3 rpen (z. B. aia 2 ^i ^2 ^ud aia^b^b^ von Upsala
und aia 2 b^bg von Uddevalla) wurden durch Fruchtkörper von mehreren
verschiedenen Standorten vertreten.

4. Alle Einspormycelien, die aus Fruchtkörpem des Upsalagebiets
isoliert wurden, konnten auf zwei Gruppen verteilt werden, die teils
durch verschiedene Allelen des 6 -Faktors und teils durch Unterschiede
bezüglich Habitus und Wachstumsgeschwindigkeit voneinander getreimt
sind. Die eine Gruppe umschließt Einspormycelienmit den ö-Faktoren

62 oder 63 und zeichnete sich durch schnelles und regelmäßiges Wachstum
aus, während die andere Gruppe Einspormycelien mit den ^^-Faktoren
oder 67 umfaßt und sich durch langsames und unregelmäßiges Wachstum
hervorhob.

5. Die für Crucibulum vulgare kennzeichnende, eigenartige Ge-
staltung der multipolaren Sexualität konnte möglicherweise so ge-
deutet werden, daß sie teils durch eine ungewöhnliche Stabilität bei
den Allelen der Gene bedingt ist, die der genannten Erscheinung zu-
grunde liegen, und teils durch die wahrscheinlich zoochore Verbreitungs-
weise des Pilzes.

Literatur.

R, Bauch, Arch. f. Protistenk. 70, 417, 1930. — Derselbe, ebenda 76,
101, 1931. - N, Fries, Bot. Notiser 1936, S. 567. - Derselbe, Symb. Bot.
Upsal. IV : 1, 1940. — N, Fries u. L. Jonasson, Svensk Bot. Tidskr. 86, 177,
1941. — E.Oäitmann, Vergleichende Morphologie der Pilze. Jena 1926.-
H, Kniep, Zeitschr. f. ind. Abst.- u. Vererbungsl. 81, 169, 1928.

Beobachtimgen über die Lebensdauer
von Pilzkolturen.

Von

K. H. Zobl, Wien.

(Eingegcmgen cm 21, Dezember 1942. J

Vereinzelt finden sich in der Literatur Angaben über die Lebens-
dauer bestimmter Pilze^ meist als gelegentliche Bemerkungen. Für
einige technisch wichtige Hefen gibt es genauere Hinweise, die sich
aber mehr auf die Lebensdauer von nach bestimmten Methoden be-
handelten und aufbewahrten Dauerkulturen beziehen. Nur in einer
Arbeit von C. Wehmer (1) werden über die Lebensfähigkeit einiger ein-
getrockneter Pilzkulturen nähere Angaben gemacht. Es ist daher nicht
unangebracht, langjährige Beobachtungen über die Lebensdauer von
nach keiner besonderen Methode angelegten und aufbewahrten Pilz-
kulturen mitzuteilen, da sie besonders dem, der Pilzsammlungen zu
betreuen hat, nützlich sein könnten.

Es wurde versucht, die weit in der Literatur verstreuten und oft
schwer zugänglichen Bemerkungen über die Lebensdauer von Pilzen
zu sammeln, wobei allerdings eine vollständige Erfassung aller Zitate
nicht erreicht werden konnte. Die meisten Angaben liegen Jahrzehnte
zurück und sind, soweit sie für die Zeit vor 1880 gelten, wenig sicher,
da Kulturmethoden zu dieser Zeit erst vereinzelt angewendet wurden.

Von Eidam (2) wird angegeben, daß AspergiUvs fumigatus nach
10 Jahren noch lebensfähig sei. Er hat 1873 Rasen von Aepergülvs fumigatua
getrocknet imd im Herbar aufbewahrt, 1883 keimten Sporen dieses Rasens
nach Aussaat wieder aus. Er macht diese Angaben auf S. 397 seiner Arbeit
in einer Fußnote. Diese Angabe wird auch von de Bary (3) und später
von anderen übernommen^. C. Wehmer {!&) findet die Angabe Eidams
nicht zutreffend. Nach ihm stirbt Asper^lua fumigatua wesentlich früher
völlig ab.

De Bary (3) gibt an, daß geschützt \md trocken aufbewahrte Kulturen
von PenidUium glaucum noch nach 2 Jahren, Aapergiüua niger nach über
1 Jahr, Miuyor atolonifer (Rh. nigricans) nach 1 Jahr, Botrytia Baaaii nach
1 bis 2 Jahren und Sordaria curvula noch naoh 28 Monaten lebensfähig
waren. Für Phycomycea nitens gibt de Bary an, daß er nach 10 Monaten
abstirbt, während van Tieghem (4) die Erfahrung machte, daß Phycomycea
nitena kaum länger als 3 Monate lebensfähig bleibt.

Hanaen (5, 5a) gibt an, daß Sporen von Coprinua Roatrupnanua noch
nach 2 Jahren 4 Monaten keimfähig waren, wenn sie vom Schleim des

^ Übrigens stimmt in de Barys Zitat die Seitenzahl der Arbeit Eidams
nicht, da S. 347 angegeben wird, die Bemerkung sich aber auf S. 397 in
einer Fußnote findet.

Archiv fflr Mikrobiologie. Bd. 18 .

192

K. H. Zobls

Hutes umgeben, zwischen Filtrierpapier bei Zimmertemperatur aufbewahrt
wurden.

Nach demselben Autor war Coprintta stercorariua an der Luft liegend
nach 7 Monaten abgestorben, dagegen blieb die Keimfähigkeit des gleichen
Pilzes 16, 19, ja sogar 42 Monate erhalten, wenn er in Filtrierpapier ver-
packt, bei Zimmertemperatur aufbewahrt wurde.

Anixiopsia atercoraria, den E. Chr. Hanaen 1874 auffand, war nach
seiner Angabe noch nach 21 Jahren lebensfähig, die Sporen keimten mit
Leichtigkeit auf Würzegelatine aus.

Ebenso fand Hanaen Miicor racemoauay Mucor erectua, Mucor mucedOy
AapergiUua niger noch nach 6 Jahren keimfähig, Aapergülua flaveacena
(Aapergülna flavua) nach 8 Jahren und Aapergülna glaucua noch nach
16 Jahren. Es wird allerdings nicht angegeben, wie diese Pilze kultiviert
und auf bewahrt wurden.

Brefeld (6) gibt als Grenze der Lebensfähigkeit für Goprinua atercorariua
1 Jahr, für Aapergülua flavua 6 Jahre an.

Hof f mann (1) gibt an, daß Mucor atolonifer (Rh. nigricana) nicht zu
feucht und nicht zu trocken aufbewahrt „ein bis mehrere Jahre keimfähig
bleibt“. Nach Zvmmermann (8) keimt dieser Pilz schon nach 1^/j Jahren
nur mehr sehr schwer aus. Mucor racemoaua war nach 6 Monaten nicht
mehr keimfähig, ebenso ist Mucor mucedo sehr empfindlich gegen Aus-
trocknung.

Von erstaunlicher Lebensdauer erwiesen sich, nach Angaben von
Hof f mann (1) und von v. Liebenberg {9) Sporen gewisser Roat- imd Brand-
püze. Hoffmann trocknete Sporenmaterial an der Luft imd bewahrte es
in Papier eingeschlagen auf. üredo deatruerM Schlechtendal keimte noch
nach 4 Jahren, üredo aegetum Pera. nach 2 Jahren 7 Monaten, üredo Maydia
nach 3 Jahren 6 Monaten, v. lAebenberg findet die Keimfähigkeit seines
Herbarmaterials noch wesentlich länger erhalten. So keimten Tületia cariea
nach 8^/, Jahren, üatilago carbo nach 7^/2 Jahren, üatüa^o Tulaanei und
ürocyatia occtdta nach 6^/, Jahren, üatilago Kolaczekii, ü. Crameri und
ü, deatruena nach Ö^/i Jahren und üatüago Rabenhoratiana noch nach
3^/2 Jahren.

Besondere Beachtung verdienen auch die Angaben von Aooata (\(^)
und Bereatneff (l\) über die Lebensfähigkeit von Actinomyceten. Aooata
gibt an, daß er ausgetrocknete Kulturen von Actinomycea invulnerabüia
noch netch 8 Jahren lebensfähig fand. Bereatneff brachte am 1. Juli 1896
Actinomycea violaceua auf eine befeuchtete, bei 120® sterilisierte Roggenähre,
verschloß nach Angehen dieses Pilzes das Kulturröhrchen mit einer Gummi -
kappe und bewahrte es im Dunkeln bei Zimmertemperatur auf. Am 16. Ok-
tober 1906 überimpfte er auf Bouillonagar imd erzielte üppiges Wachstum.
Der Pilz hatte damit 10 Jahre seine Lebensfähigkeit bewahrt.

F. Siebenmann (12) gibt in seiner Arbeit „Die Schimmelmycosen des
menschlichen Ohres“ an, daß 6 Jahre alte Köpfchen von Aapergülua niger
und AapergiUua flavua ausgesät, wieder keimten, Aapergülua clavatua da-
gegen nicht.

Bemerkenswert «ind ferner die Angaben über die Langlebigkeit der
für pathogen geltenden Sproßpüze, Darüber besitzen wir Angaben mehrerer
Untersucher. Buaae (13) gibt an, daß seine pathogene Hefe noch nach
2^/4 Jahren ohne Schwierigkeiten anging, obwohl die Kulturen völlig ein-
getrocknet waren. Eine am 16. August 1894 angelegte Kultur seiner Hefe-
keimte. noch am 2. April 1897. Dies findet Buaae beachtenswert, da die

Lebensdauer von Pilzkulturen.

193

lange Lebensfähigkeit bei der Abwägung der Gefährlichkeit dieser Hefen
recht erheblich ins Gewicht fällt.

Hohes Lebensalter erreichen Sproßpilze, die entweder in 10%iger
Saccharoselösung oder auf Watte angetrocknet in zugeschmolzenem JPretidcn-
retcÄ-Kölbchen aufbewahrt werden. R. Meissner (14,14a) bewahrte
12 Stämme verschiedener Weinhefen in 10%iger Saccharoselösung auf und
fand keine Schädigung. Nach 13 Jahren waren alle Stämme noch lebens-
fähig und gärkräftig. A. Klöcker (15) berichtet, daß er selbst ncuih mehr
als 30 Jahren verschiedene Hefen lebend auffand. H. Wille {I6a>,h) ver-
danken wir ausführliche Angaben über die Lebensdauer technisch wichtiger
Hefen imd über die Anlage von Dauerkulturen. A. R. Ling und D. R.
Nanij (17, 17 a) fanden sporenbildende Sproßpilze, die an Watte angetrocknet
waren und sich in zugeschmolzenen Frevdenreich-'KöXhcYiBn befanden nach
34 Jahren vermehrungsfähig. Plaut (18) teilt mit, daß Gonidien (Chlamydo-
sporen) von Monilia candida zwischen Fließpapier aufbewahrt 10 Jahre

9 Monate lang lebensfähig blieben.

C, Wehmer (1) verdanken wir mehrfach Angaben über die Liebensdauer
eingetrockneter Pilzkulturen. Er bewahrte die Pilze in Form von Reagens-
glaskulturen mit Wattever Schluß bei Zimmertemperatur auf. Als Nähr-
boden verwendete er Würze und Zuckerlösungen. Nach 2^/* Jahren keimten
ohne weiteres nach Aussaat mit der Platinöse Aspergilliis oryzae (AhUbg.),
Aspergillus flavus (Link), Aspergillus Wentii (Wehmer), Aspergillus gigan-
teus, Aspergillus minimus Wehmer, Citromyces Pfefferianus Wehmer, ebenso
Mucor Rouxii (Calm.) Wehmer und Mucor javanicus Wehmer.

Ohne Ergebnis blieb vorerst die Abimpfung von Asp. clavalusDesmaz.,
Asp. peniciUiopsis Racib., Asp. ostianus Wehmer, Asp. candidus (Linkt)
Wehm., Monascus purpureus Went, Mucor piriformis A. Fischer, M. rhizo-
podiformis Cohn, M. corymbifer Cohn, Rhizopus oryzae Went und Pr. Qeerl.,
Penicillium luteum Zukal, Mucor hiemalis Wehmer, Phycomyces nitens Ag.,>
Thamnidium elegans, Saccharomyces Marxianus Hans, und Saccharomyces
Logos Lindner.

Aspergillus niger (Cram.) van Tiegh. und Aspergillus fumigatus Fres.
waren durch paraffinierte Wattever Schlüsse vor dem Austrocknen geschützt
und wuchsen langsam zu neuem Mycel heran. Nach Wehmer sterben
Konidien von Aspergillus niger trocken aufbewahrt schon nach kaum 1 Jahr.
Wehmer steht in Gegensatz zu Siebenmann, er kann weiters auch die Angaben
von Eidam, Hansen, Brefeld nicht bestätigen. Die Sporen von Mucor
hiemalis Wehrr^r verlieren ihre Keimfähigkeit nach Wehmer (\h) unter
1 Jahr, während gleich alte submerse oder auch getrocknete Mycelien wohl
auf Grund der Chlamydosporen auskeimten.

Die anscheinend toten Kulturen übergoß Wehmer mit steriler Nähr-
lösung. Dabei konnte er neue Vegetation bei Asp. davalus, Asp. penicilli-
opsis, Mucor piriformis, M. rhizopodiformis, Rhizopus oryzae und Monascus
purpureus erzielen. Die übrigen Kulturen waren abgestorben. Lendner (19)
verdanken wir einige Beobachtungen über Mucorineae. Er fand, daß Spore n
von CunninghameUa elegans nach 2 Monaten, solche von Mucor mucedo ,
Mucor spinosus, Sporodinia grandis, Rhizopus nigricans nach 3 Monaten,
Sporen von Rhizopus arrhizus, Pirella oirdnans naeh 4 bis 6 Monaten,
Sporen von M. hiemalis, Rhizopus Cambodja, Thamnidium elegans, Chaeto-
stylum Fresenii nach 8 Monaten und Sporen von Mucor Prainii nach

10 Monaten nicht mehr keimten.

Mucor racemosus, M. Rouxianus, CircineUa ospera und Circinella
minor waren nach 10 Monaten noch keimfähig.

14 *

194

K. H. Zobl:

Eigene Beobaehtmigm.

Unsere Beobachtungen beziehen sich auf Kulturen unserer Pilz-
sammlung und damit auf eine größere Zahl von Mucorineae, Ascomy-
ceteUy einige Basidiomyceten sowie Fungi imperfecti. Die Pilze liegen in
Reinkultur vor, sind genau bestimmt und in kürzeren Zeiträumen
auf ihre Identität nachuntersucht. Sämtliche Kulturen sind in Röhrchen
meist 16/16 abgeimpft und mit Zellstoffstopfen verschlossen. Über
die Watteverschlüsse sind passende, ziemlich eng anliegende Glas-
kappen gestülpt, so daß die Austrocknung der Kulturen nur langsam
stattfindet. Auch wird dadurch eine Infektionsgefahr der Kulturen
stark herabgesetzt. Die Kulturen stehen bis zur Ausbildung einer
kräftigen Vegetation im Halbdunkel, dann werden sie in Pappschachteln
mit übergreifendem Deckel bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Da
die Kulturen, besonders der gleichen Gruppen, zum selben Termin
abgeimpft, unter denselben Bedingungen und auf den gleichen Nähr-
böden gewachsen sind, ergibt sich dadurch eine gute Vergleichsmöglich-
keit. Alle Kulturen wurden am gleichen oder folgenden Tag abgeimpft.
Die Tabelle I ergibt das Verhalten aller Mucorineae nach der am gleichen
Tage stattgefundenen Abimpfung.

Es zeigte sich, daß kaum 1/3 der Kulturen ohne Schwierigkeit aus-
keimten. Die nicht angegangenen, anscheinend toten Jlfwcor-Kulturen
wurden daraufhin mit Nährlösung (Hefeabkochung mit 3% Maltose)
so übergossen, daß sie eben mit Flüssigkeit bedeckt waren. Um eine
Verunreinigung der Kulturen zu vermeiden, wurden die Zellstoffstopfen
abgesengt und das Übersohichten mittels sterilem Abfülltrichter vor-
genommen. Infektionen lassen sich auf diese Weise bei sorgfältiger
Arbeit mit großer Sicherheit verhindern.

Diese Behandlung bewirkte bei einem Teil der anscheinend toten
Kulturen bereits nach einigen Tagen das Auswachsen eines sich rasch
entwickelnden Mycels vorwiegend aus dem Teil der Pilzkultur, der in
Adhäsion mit der Wand der Kulturröhrchen stand. Die unmittelbar
folgende Überimpfung und Identitätsprüfung ergab einwandfreie Rein-
kulturen der neubelebten Pilze mit zwei Ausnahmen, die durch Peni-
ciUium verunreinigt waren. Diese Kulturen konnten nicht mehr ge-
rettet werden.

Die Tabelle II zeigt die Ergebnisse der überschichteten Pilzkulturen.

Überblickt man die Tabellen I und II so ergibt sich, daß von den
71 geprüften Mucorineae nur 27 nach 24 bzw. 18 Monaten ohne Schwierig-
keiten keimten. Als sehr keimfreudig und keimkräftig erwiesen sich
alle geprüften Absidia-Axten. Von der Gattung Mucor fällt bereits
nach einer Lebensdauer von 18 Monaten der größte Teil aus und ist
nur mehr teilweise durch Überschichten mit Nährlösung zu neuer
Vegetation anzuregen.

Tabelle 1. Lebensdauer der Mucorineae.

Bedeutung der verwendeten Abkürzungen: + = Kultur angegangen; -- = Kultur nicht angegangen;
*f -h-f, +» sehr gutes, gut^, schwaches Auskeimen der Kulturen.

Lebensdauer von Pilzkulturen.

195

Tabelle I (Fortsetzung).

196

K. H. Zobl:

' ^ s s

llll

1 1 S 1 S 1 1 1 1 1 1 1 1 M 1 1 1 1 1 S 1 1 SS 1 1 1 1 ®

Entee frei
tichtbares
Wacbstum

28. 8. 42

30. 8. 42

28. 8. 42

30. 8. 42

29. 8. 42

Intensität

der

'Keimung

+ -L + J..I. ^

1 1 + 1 1; 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 + 1 1 1 1 1 1

Anskeimen

ohne

Schwierig-

keit

1 1 -f 1 + 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 + 1 1 -}-+ 1 1 M +

Nährboden

S : 1 : s J t : r : : : : J : : 5 : r r : : I : : : ; ; :
n

Datum
der neuen
Abimpfung

Nährboden

•s

Datum
der alten
Abimpfung

rH CM

CM CM CX)

rH tH

Pliaart

M.flavus

3f. fragtlia

M. f%8CU8

M, genevensis

M. globoaus

M. griseo — cyanus

M, heterosporus

Jf . hiemalis

Jf . Jansseni

M. javanicus

M. luUus 4-

M. luteus —

M. luUus, Zygosporen bildend

M. microsporus

Jf . mucedo -f

M. mucedo —

M. mucedOf Zygosporen bildend

M, piriformi«

M. plumbeua

M, pusillus

3f . racemosus

M. Ramannianus

M, Rouxianua

M. silvaticus

M. sphaerosporus

Jf . strictus

M. aubtilissimus

Jf . aatumimui

Phycomycea nitena +

iz;

iO O r- QO OÄ o CM CO »O CO C» 00 Oi O rH CM CO O CO I> 00 05 Q tH CM CO

CMCMOMCM<MCOCOCOCOCOCOCOCOCOCO^'^'^'«r'^'^'^’^’^‘^‘0^»0 IC

Tabelle I (Fortsetzung).

Lebensdauer von Pilzkulturen.

197

Tabelle II. Lebensdauer der Mucorineae.

198

K. H. Zob!

Tabelle II (Fortsetzung)

Lebensdauer von Pilzkulturen.

199

iilf

1 1 1 1 SSSS 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1*11 1

Intensität

der

Keimung

1 1 1 1 + + + + 1 1 1 1 1 1 1 1 +1 1 J 1 1 1

lil

6. 9. 42

4. 9.42

6. 9. 42

4. 9. 42

8. 8. 42

4. 9. 42

1 1 1 1 ++++ 1 1 1 1 1 1 1 1 -fl 1 + 1 1 1

Nährboden

!====. ========== = = ==== =

II t

4. 9. 42

2. 9. 42

4. 9. 42

3. 9. 42

6. 9. 42

3. 9. 42

||Ss

»•Säg

*as

Nährboden

€

■? 1 s

« gsp

Datum
der alten
Abimpfnng

Oi i-H(N03QdMrHCa

tH rH tH i-H iH rH tH

Piisart

M, mucedo +

M, mucedo —

M, mucedo, Zygosporenbildend

M, piriformis

M.plumbeus

M.pusillue

M, Ramannianus

M, Bouxianus

M,strictus

M.subtilissimus

if. scUurninus

Phycomyces nitens -f

Ph, nitens —

Ph, nitens, Zygosporenbildend

PA. piloboloides

PA. piloboloides —

PA. piloboloides, Z^gosporen
bildend

Gircineila Sydotvii

Sporodinia grandis

Pilaira anomala

CAaetostylum Fresenii

Coemansia pectinata

oaoTHoaco’^cot»Oi-H(Mco'^‘050t^oo cä th catoc©

200

K. H. Zobl:

Besonders empfindlich smd alle PAycomyce«-Arten, von denen
nur eine Kultur von Phycomyces piloboloides Burgeff, die Zyposporen
bildete, nach 18 . Monaten durch Überschichten mit Nährlösung zu
neuer Vegetation angeregt werden konnte. Ein ähnliches Verhalten
zeigt Mucof lutevs Linnemann. Während der Pilz auf gespalten in
+- und — Stämme schon nach 5 Monaten sehr schwer auskeimt,
gelingt es, eine Kultur, die beide Stämme Zygosporen bildend enthält,
noch nach 18 Monaten, allerdings auch erst nach gründlicher Durch -
tränkung mit Nährlösung zur Keimung zu veranlassen. Bei Mucor
mucedo Zygosporen bildend konnte auch diese Kultur nicht mehr zum
Wachstum angeregt werden. Dieser Pilz stirbt auf gespalten in seine
+- und — Stämme schon nach 6 bis 8 Monaten ab, kaum ein Jahr ist
die Zygosporen bildende Kultur keimfähig.

Sehr empfindlich gegen Austrocknung ist auch Sporodinia grandis.
6 Monate alte Brotkulturen keimen nur mehr nach Durchtränkung
und da selten, während ebenso alte Karottenagar-Kulturen noch aus-
keimten, wenn das Impfmycel von noch feuchten Stellen der Agar-
Oberfläche entnommen wird. Sehr empfindlich ist Coemansia pectinata.
Diese Art wächst sehr langsam, auf den üblichen Nährböden oft gar
nicht. Sie gedeiht aber gut auf l^%igem Karottenagar sowie auf
Haferflocken. Die Keimfähigkeit erlischt meist nach 6 Monaten, ge*
legentlich gelingt es, den Pilz nach 8 Monaten noch zu neuer Vegetation
anzuregen.

Bemerkenswert ist die Keimkraft von Circineüa umbellaia, die, wie
mehrfach festgestellt werden konnte, noch nach 31/2 Jahren keimt,
während ein — Stamm der Circinclla Sydowii nach 18 Monaten nicht
mehr zur Keimung zu bringen war.

Untersucht man diejenigen Arten, die ohne Schwierigkeiten

nach 18 Monaten keimen oder nach Durchtränkung mit Nährlösung
zu neuem Wachstum angeregt werden, so ergibt sich, daß die meisten
von ihnen Gemmen bilden. Es sind offenbar diese Dauerzustände,
welphe die vollständige Austrocknung ertragen und überstehen können.
Solche Gemmen finden sich unter anderen bei Mucor hiemalia, M. race^
moamy M, erectua^ M. Rouxianua^ M. javanicus, M. circintUoidea^
M. plumbeua.

Es mag erwähnt sein, daß Mucor globoaua Flacher und Mucor
aphaeroaporua Hagem, die in letzter Zeit als synonjmi angeführt werden,
gleich keimkräftig sind ; ebenso gilt dies für Mucor racemosnia Freaeniua
und dem angeblich synonymen Mucor chriatianiemaia Hagem, weiter
für Mucor erectua Bainier. als synonym mit Mucor hiemalia Wehmer
angegeben.

Die gute Keimfähigkeit von Mucor corymbifer Cohn braucht daher
nicht zu überraschen, da dieser Pilz synonym mit Abaidia Lichtheimi

Lebensdauer von Pilzkulturen.

201

{Lucet u. Cost.) Lendner gilt und alle Arten, wie oben erwähnt,

sehr keimkräftig sind und lang anhaltende Austrocknung vertragen.

Bemerkenswert ist auch die gute Keimfähigkeit des Mucor jmstUus
Lindt, was nicht ohne Wichtigkeit ist, da dieser Pilz mehrmals als
pathogen wirkend beschrieben wird. Überiaschend groß ist auch die
Keimkraft der ,, Konidien“ bildenden Familien der Mncorineae, sowie
der Arten der Gattung Thamnidium, soweit sie untersucht wurden.

Die Tabelle III zeigt vor allem, daß sich die beobachteten Arten
der Aacomycetes, Basidiomycetes und der Fungi imperjecti dadurch
auszeichnen, daß ihre Keimfähigkeit trotz völliger Austrocknung meist
noch nach zwei und mehr Jahren erhalten ist. Einzelne Arten der
Gattung Aspergillus sind etwas empfindlicher, alle aber keimten ohne
Schwierigkeiten noch nach 18 Monaten, die meisten auch noch nach
29 Monaten. Von Aspergillus niger standen drei Stämme zur Verfügung.
Stamm Zach keimte noch nach 29 Monaten, allerdings sehr langsam,
Stamm Zahl keimte nach 18 Monaten ohne Schwierigkeit, nach 29 Mo-
naten trotz Befeuchten mit Bierwürze nicht mehr. Ebenso verhielt
sich ein Säure bildender Stamm. Daraus ergibt sich, daß die einzelnen
Stämme verschieden widerstandsfähig gegen das Austrocknen sind.

Von Bedeutung ist die Tatsache, daß Arten der Gattungen
Scopulariopsis und Microascus, die vor kurzem als entwiekelungs-
geschiehtlich zusammengehörig erkannt wurden und die häufig bei
Erkrankungen der Haut, vor allem der Nägel isoliert wnrden, noch nach
29 bzw. 35 Monaten ihre volle Keimkraft bewahrt hatten. Die Art
Scopulariopsis oidiospora ist etwas empfindlicher und keimt nur schwierig
und sehr langsam aus.

Auch Arten der Gattungen Microsporon, Trichophyton^ Candida,
von denen eine große Zahl als Erreger von Haut- und Haarkrankheiten
bei Mensch und Tier erkannt wurden, sind sehr widerstandsfähig gegen
Austrocknung.

Die als Erreger der Blaufäule des Holzes bekannten Arten der
Gattung Ceratostomella (Endoconidiophora, Ophiostoma) keimten noch
nach 18, 27 und 29 Monaten aus, es war keine Verminderung der Keim-
kraft feststellbar.

Von besonderer Keimfähigkeit erweisen sich Arten der Gattung
Melanospora Gorda. Alle sechs geprüften Arten keimten noch nach
41 Monaten aus. Zobl (20) beobachtete, daß Sporen von Melanospora
leucotricha noch nach 6 Jahren 8 Monaten bzw. 7 Jahren 6 Monaten
ohne Schwierigkeit auskeimten und nach 16 Tagen bereits Perithecien
gebildet wurden. Sporen aus einer Kultur vom 20. März 1929 und einer
Kultur vom 4. Juni 1928 erwiesen sich nach dem Abimpfen am 10. De-
zember 1935 noch keimfähig. Sie keimten am 14. Dezember 1935 aus
und hatten am 26. Dezember 1935 die ersten Perithecien gebildet.

Tabelle III. Lebensdauer von Ascomycetes, Basidiomyoetes und Fungi imperfeoti.

Abkürzungen wie in Tabelle I.

202

K. H. Zobl

Tabelle III (Fortsetzung).

Lebensdauer von Pilzkulturen. 203

llll

8. 9. 42
17. 9. 42
6. 9. 42

4.10.42
10. 9. 42

6. 9. 42
20. 9. 42
8. 9. 42
3. 9. 42

7.9.42
12. 9. 42

steril

3. 9.42

5 Ja

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30. 8. 42

31. 8. 42
29. 8. 42

1. 9. 42
29. 8. 42

1. 9. 42

29. 8. 42

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1. 9. 42

30. 8. 42

Inteiuitit

der

Keimung

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+ t ++++U+++++++ +t+++M+'++

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Nährboden

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Abimpfung

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112.3.41

1 9.4.40
112.3.41
9. 6.40

10. 4. 40

18. 10.39

7. 3. 40
12. 4. 40

lö. 6. 40
12. 4. 40
12. 3. 41
16.6.40
12. 4. 40

12. 3. 41
12. 4. 40

20. 3. 39

Pfliart

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iHtHtHtH THrHiHiHTHTHTHtHTHiHTH

204

K.H-Zobl:

Tabelle III (Fortsetzung).

liebensdauer von Filzkulturen.

2U5

Begino der
Fmcht-
kOrperdien-
bfldang

/ leuchtet a.

125. 9. 42

3 . 9 . 42

Lebens-
er-
halten na<di
Monaten

cDaOGOaoaOcoaOQOr-r-i>r-(

rHrHrHrHiHiHr^GUWCU’^

Erstes frei
siebtbares
Wachstum

3. 9.42

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6. 9. 42
3. 9. 42
1. 9. 42
3. 9. 42
20. 9. 42
29. 8. 42

IntensiULt

der

Keimung

Auskeiraen

ohne

Schwierig-

keit

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Nährboden

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der neuen
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12. 3. 41

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20. 3. 39

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OJOQ'^kO^Or-OOOiQrHCQCO

Auch die geprüften Baai’
dumyceten (Clitocybe olearia,
Caniophora cerebeUa^ Lenlinua
aqaamoma, Schizophyüvm
commune) erwiesen sich sehr
widerstandsfähig. Alle keim-
ten noch nach 27 Monaten.
Schizophyllum commune hatte
noch nach 41 Monaten die
Keimfähigkeit nicht einge-
büßt.

Zusanunenfasgiing.

Es wurden 153 Pilzarten
auf ihre Keimfähigkeit hin
geprüft.

Die Mucorineae sind im
Vergleich zu den meisten
Ascomycetea, Basidiomycetea
und Fungi imperfecti gegen
Austrocknen sehr empfindlich
und sterben in der Mehrzahl
zwischen 6 bis 18 Monaten ab.

Bemerkenswert ist das
Vermögen der meisten als
pathogen angesehenen Pilze,
langdauemde Trockenheit zu
ertragen, ohne irgendwie die
Keimkraft einzubüßen.

Von allen untersuchten
Pilzen waren die Perithecien
bildenden Arten der Gat-
tungen CeratoatomeUa und
Melanoapora am widerstands-
fähigsten, sie keimten noch
nach 31 / 2 , 6 und 7^/2 Jahren.

Literatur.

1) C. Wehmer, Ber. d.
Deutsch, bot. Ges. 22, 476, 1904.
— la) Derselbe, Centralbl. f.
Bakt. II, 8, 149, 1897. -

Ib) Derselbe, Die Pilzgattung

206

K. H. Zobl : Lebensdauer von Pilzkulturen.

Aspergillus, S. 43, Genf 1901. — \c)Der8e]be, Ann. Mycologici 1, 38, 1903.

— 2) E. Eidam, Beitr. z. Biol. d. Pflanzen 8, 397, 1883. — ^ 3) A, de Bary,
Vergleichende Morphologie und Biologie der Pilze, S. 369. Leipzig 1884.

— 4) Ph. van Tieghem u. Q. Lemonnier, Recherches sur les Muoorin4es,

S. 30, 32. Paris, Massen, 1873. — 6) E. Chr. Hansen, Bot. Ztg. 1897,
LV. Jahrg., 1. Abt., S. 121, 126, 127. ~ 6a) Dertfe/fte, Bot. Zentralbl. 1886,
Nr. 6. - 6)0. Brefeld, Schimmelpüze, II, S. 76; III, S. 16; IV, S. 66. ~
7) Hoffmann, Jahrb. wiss. Bot. 2, 267, 302, 334, 1860. — 8) O. E, B.

Zimmermann, Dies. Jena, S. 40, Chemnitz 1871. — 9) v. Liebenherg,

Oesterr. Landw. Wochenbl. 1879, Nr. 43 u. 44. — 10) Aoosta, Centralbl. f.
Bakt. 17; 466, 1896. ~ 11) JV. Af. Berestneff, ebenda I, 40, 298, 1907. ~
12) F. Siebenmann, Die Schimmelmycosen des menschlichen Ohres, 2. Aufl.,
S. 26. Wiesbaden 1889. — 13) O. Busse, Die Hefen als Krankheitserreger,
S. 16. Berlin 1897. — 14) R. Meißener, Zeitschr. f. Weinbau u. Wein-
behandlung 2, 103, 1916. — 14a) Derselbe, Zeitschr. f. Qärungsphysiol.
1, 106, 1912. — 16) A. Klöcker, C. r. des Trav. du Labor, de Carlsberg 11,
297-311, 1917. - 16) H. WiUe, Centralbl. f. Bakt. II, 48, 36-41, 1917.

— 16a) Derselbe, ebenda II, 44, 68—76, 1916. — 16b) Derselbe, eihenda II,
81, 346—463, 1911. — 17) A. R. Ling u. D. R, Nanij, Proc. Roy. Soc. Edin-
burgh 92, 366, 1921. — 17a) Dieselben, Wochenschr. f. Brauerei 89, 64,
1922. — 18) H. G. Plaut, Neue Beiträge zur systematischen Stellung des
Soorpilzes in der Botanik, S. 23. Leipzig 1887. — 19) A. Lendner, Les
Mucorinäes de la Suisse, Bern 1908. — 20) K. H. Zobl, Untersuchungen über
den Bau und die Entwicklung des P3a«nomyceten Melanospora leucotricha
Oorda. Wien 1940.

Beobachtimgen über Mucor Jansseni Lendner.

Von

K. H. Zobl, Wien.

Mit 2 Abbildungen im Text.

(Eingegangen am 10. Januar 1943.)

Bei Untersuchungen über Standorte und Verbreitung einheimischer
Mucoraceae wurde aus mehreren Erdproben, die aus räumlich weiter
entfernten Gegenden stammten, neben zahlreichen anderen Arten Mucor
Jansseni isoliert.

Die Isolierung wurde in allen Fällen auf 2% Bierwürzeagar vor-
genommen, auf dem kleine Erdkrümelchen ausgesät wurden. Die Proben
stammten von folgenden Örtlichkeiten; Gemischter Nadelwald, vorherr-
schend Fichte, in der Gegend des Plöckenpaß (20. Juni 1937), Villacheralpe
(2. September 1938), Ullrichsberg (15. August 1937), Loiblpaß (20. Sep-
tember 1938), Tristachersee (Umgebung von Lienz, 25. September 1938),
alle Kärnten, die Höhenlage betrug zwischen 800 und 1300 m; Mischwald
aus vorwiegend Fichte, Buche und Hasel aus der Umgebung von Zöptau,
Berggeist, Altvater (September 1939), alle Sudetengau, Höhenlage zwischen
300 und 1400 m. Die Kärntner Erdproben stammen aus einer ungedüngten
Verwitterungskrume, die auf kalkigem Untergrund aufliegt, während die
Erde aus dem Sudetengau ebenfalls ungedüngt auf gneisig-schiefrigc'r Ur-^
gesteinsunterlage ruht. Der Pilz ist recht selten. Er konnte in 870 Erd-
proben aus verschiedenen Gebieten nur in 1 1 Fällen der oben angeführten
Örtlichkeiten nachgewiesen werden.

Ein Vergleich dieser aus verschiedenen Gegenden, Höhen und Boden-
unterlagen heriührenden Stämme ließ morphologisch und physio-
logisch keine Unterschiede erkennen, so daß diese Art sehr konstant ist.

Der Pilz wurde das erste Mal von A. Lendner aufgefunden und be-
schrieben, der ihn aus einer Erdprobe aus dem Mont Blanc -Gebiet (4810 m)
im Sommer 1906 gezüchtet hat(l). Ling-Young (1930) isolierte ihn aus
Erdproben, die aus der Auvergne, Frankreich, stammten (2). G. Linnemann
züchtete diesen Pilz aus einer Erdprobe, die aus einem sehr vegetationsarmen
Basalthang (Amöneburg, Umgebung Marburg, Juli 1934) stammte (3).

Die Beschreibung und Abbildungen, die Lendner gibt, lassen eine
ergänzende Untersuchung wünschenswert erscheinen, zumal auch
Ling-Young und Linnemann sich nur auf die Angaben von Lendner
berufen und keine eingehendere Unt-ersuchung durchgeführt haben, da
sie in der Hauptsache f loristisch arbeiteten. Wir möchten daher im
nachfolgenden eine Ergänzung hierzu geben und auch einiges über die
Physiologie dieses Pilzes mitteilen. Die Untersuchungen wurden auf
alle Stämme ausgedehnt und ergaben im wesentlichen übereinstimmende
Ergebnisse.

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13.

208

K. H. Zobl:

1. Makroskopisclies Aussehen der Kulturen.

Wir haben uns bei der Beschreibung der Kulturen an die von
Zycha (4) formulierten Grundsätze über Nährböden und Nährböden-
einfluß gehalten, denn nur so ist, wie Zycha ganz richtig angibt, eine
einigermaßen sichere Diagnose möglich. Wir beobachteten das Wachs-
tum des Pilzes auf verschiedenen Substraten, stets aber nach mehr-
maliger, meist fünf- bis achtmaliger Passage. Dadurch gewöhnt sich
der Pilz an den Nährboden. Während er anfangs Wachstumsvarietäten
bildet, Involutionsformen, zeigt er nach Gewöhnung sein wahres art-
eigenes Wachstum. Wir haben die Beobachtung gemacht, daß Muco-
raceae, direkt von ihrem natürlichen Standort entnommen und mikro-
skopisch untersucht, oft zu Fehldiagnosen verleiten und damit Anlaß
geben zur Beschreibung angeblich neupr Arten oder Varietäten. Denn
abgesehen von einigen schnell und kräftig wachsenden Arten sind viele
Mucoraceae (dies gilt aber auch für viele andere Pilze) gezwungen, in
der ganzen, auf natürlichen Substraten auftretenden Mikroflora und
Mikrofauna eine mehr minder beengte, oft recht kümmerliche Vege-
tation zu führen. Sie erreichen dadurch selten ihre volle Entfaltung,
die in der Regel erst in der Reinkultur und da erst naöh mehreren
Passagen auftritt. Dem großen Nachteil des Ausbleibens der Zygoten-
bildung bei heterothallischen Arten in den Einsporenkulturen kann
man gelegentlich so beikommen, daß möglichst viele Stämme der
gleichen Art vom selben Fundort isoliert werden. Durch Kombination
der Stämme erhält man dann manchmal doch die Zygotenbildung.

Mucor Janaseni zeigt auf Brot, Bierwürze-, Karottenpepton-,
Gorodkowa- und Malzagar ziemlich gleichartiges Wachstum. Auf
Kartoffel und Karotte bleibt er im Wachstum anfangs etwas zurück.
Auch bleibt die Farbe des Rasens durch stärkere Untermischung mit
Luftmycel länger weißlich und ist auch später oft nicht sehr ausgeprägt.
Bei Karotten spielt die Herkunft bzw. die Düngung eine wichtige Rolle.
Wir haben häufig bemerkt, daß Karotten aus reichlich, besonders mit
Kunstdünger gedüngten Böden schlechte Nährböden abgeben, während
solche, die aus mit Stallmist, und nicht zu reichlich gedüngten Böden
stammen, dem Pilz besser zusagten, was vor allem in der für Mucor
Janaseni charakteristischen Färbung des Rasens zum Ausdruck kommt.
Die Konzentration der Nährstoffe im Substrat spielt überhaupt eine
wesentliche Rolle. Es gibt eine maximale und optimale Konzentration,
aber auch ein Nährstof fminimum. Während das letztere meist gut
bekannt ist, wird das Optimum und Maximum nicht gebührend
berücksichtigt. Deutlich ist dies bei Bierwürze festzustellen. Wir finden
in der Literatur meist nur die Bemerkung, daß Bierwürzeagar oder
flüssige Bierwürze irgendwelcher Herkunft verwendet wurde, nähere

Miicor Jansseni Lendner.

209

Angaben fehlen. Selbst hergestöllte Würze [nach Windiach aus Janke-
Zickes, S. öO (5)] enthält, wie wir mehrfach feststellen konnten, sehr
viel mehr Nährstoffe als die von Brauereien bezogene, deren Nähr-
stoffgehalt außerordentlich wechselt. Sie stellt eine Nährlosuifg von
maximaler Konzentration (12 bis Balling) dar.

Mucor Jansseni wächst darauf anfangs unter Bildung eines stark
ölhaltigen Substratmycels, bildet reichlich Chlamydosporen (in diesem
Fall ein Zeichen ungünstiger Lebensbedingungen durch überreichliche
Ernährung), weißliches Luftmycel und erst nach Reduktion der Nähr-
stoffe des Substrats entsteht stark verspätet ein Rasen von Sporangien-
trägem. Würze von 5^ Balling läßt viel rascher das charakteristische
Wachstum von M. Ja'hsseni zu. Sie bietet dem Pilz eine optimale
Konzentration an Nährstoffen. Auch der pH-Wert beeinflußt das
Wachstum und muß entsprechend berücksichtigt werden. Über das
Zusammenwirken von Konzentration der Nährstoffe, pn-Wert und
Temperatur sind Untersuchungen im Gange. Mancher Widerspruch
über das Wachstum, z. B. auf Bierwürae, der sich in der Literatur
findet, so auch für Mucnr Jansseni fischen Lendner und Linnemann,
ließ sich unter Berücksichtigung der oben angeführten Gründe ohne
Schwierigkeit auf klären.

Mucor Jansseni bildet auf Würze- und Malzagar (Würze von
50 Balling, 3% Malzextrakt, Biomalz; 2% Agar-Agar), sowie Brot
nach 4 bis 6 Tagen einen blaugrauen, 0,6 bis 1 cm hohen Rasen, der
nach 8 bis 12 Tagen seine volle Ausbildung erreicht. Einzelpartien des
Rasens werden 1,5 selten 2 cm hoch. Das Substratmycel ist nicht
übermäßig entwickelt. Die Sporangienträger sind anfangs unverzweigt,
mit fortschreitender Höhe tritt starke Verzweigung ein (Abb. 1, Fig. 1).
Die Verzweigung ist vorherrschend sympodial. Doch geht dieses reich-
lich sympodial verzweigte Astsystem gegen die Spitze zu meist in eine
mehr minder deutliche racemöse Verzweigung über. Ältere Rasen zeigen
beide Verzweigungsarten in einem solchen Verhältnis, daß die Zu-
ordnung sowohl zur Sectio Racemomucor, als auch zur Sectio Cymomucor
erfolgen kann. Wenn auch der Verzweigungsmodus kein konstantes
Merkmal ist, so kann immerhin daraus ein erster Anhalt zur Bestimmung
der Art gewonnen werden. Die Sporangien sind innerhalb des ganzen
Rasens verteilt, irgendeine vorherrschende Schicht ist nicht zu erkennen.
Die Sporangien sind mit freiem Auge als dunkle, fast schwärzliche
Pünktchen im Rasen erkennbar. Das Mycel ist anfangs weiß, mit zu-
nehmender Ausbildung des Rasens tritt eine Verfärbung ein, die von
hellgrau über blaugrau zu einer blauschwarzen Tönung des Mycels führt,
die durch die dunkle, fast schwarze Färbung der Sporangien verstärkt
wird. Immer besitzt der Rasen auf Brot, Würze- und Malzagar diesen
eigenartigen blauen Farbton, der die Unterscheidung von anderen

15 *

210

K. H. Zobl;

Arten wesentlich erleichtert. Besonders schön tritt manchmal die Farbe
des Rasens auf Karotten hervor, wenn man gerade die dem Pilz zu-
sagende Sorte verarbeiten konnte. Meist aber bildet er hier eine mehr
schmutzigbraune Farbe aus. Auf Karottenpepton- und Gorodkowaagar
bleibt der Rasen niedriger, meist 0,5 bis 0,8 cm hoch. Das Substrat-
mycel verfärbt sich gelblich bis orange, der darüber befindliche Rasen
wird hellgrau bis bräunlich. Auf allen verwendeten festen Nährböden
entstanden im Gegensatz zu Lendner Sporangien. Die Höhe des Rasens
gibt Lendner mit 2 bis 6 mm zu niedrig an, was auch schon Linnemann
aufgefallen ist. In flüssigen Nährböden (Bierv^ürze ö^Balling, 2%
Peptonlösung mit 3% Traubenzucker) entwickelt der Pilz nur ein
farbloses, in größeren Mengen weißlich scheinendes Mycel. Solange das
Mycel die Oberfläche der Nährflüssigkeit nicht erreicht, werden keine
Sporangien ausgebildet. Erst wenn sich in der Oberfläche der Flüssigkeit
eine genügend dicke Schichte von Substratmycel entwickelt hat,
beginnen Sporangienträger herauszuwachsen. Dann tritt auch bald die
blaugraue Verfärbung des Rasens ein.

II. Mikroskopische Beobachtungen.

Die Sporen (Abb. 1, Fig. 2) sind kugelig, selten geringfügig oval,
hyalin, farblos oder mit einem schwach bläulichen Stich. Im ganzen ist
ihre Form und Größe sehr beständig, unabhängig von den Substraten.
Der Durchmesser beträgt 4 bis 6 jjl. In Würze oder einer anderen Nähr-
flüssigkeit schwellen sie rasch an, und man erkennt dann im Innern der
Spore Fettröpfchen (nachgewiesen mit Sudan III und Osmiumsäure),
und kleinere, mitunter auch größere Vakuolen. Bald erreichen sie 10 bis
17 [X im Durchmesser, verlieren ihre Kugelgestalt und keimen mit einem
oder zwei Keimschläuchen aus. Nach 20 bis 24 Stunden sind schon
reichlich verzweigte Hyphen im Substrat gebildet, die bald danach mit
freiem Auge sichtbar werden. Nach 48 bis 72 Stunden sind vereinzelt
die ersten Sporangien gebildet. Die Hyphen sind anfangs nur wenig
septiert, gleichmäßig breit. Die Breite ist wechselnd und nimmt gegen
die Wachstumsspitzen zu ab. Später tritt reichlich Querwandbildung
auf, besonders an den Verzweigungsstellen. Der Inhalt junger Hyphen
ist hyalin, von leicht bläulicher Tönung. Ältere Hyphen enthalten
reichlich Fettröpfchen und zahlreiche Vakuolen. Junge Hyphen sind
glatt, ältere sehen streifig aus. Dies kommt dadurch zustande, daß
feinste Inkrustationen an der Oberfläche der Hyphen entstehen, die
oft regelmäßig in Linien verlaufend abgeschieden werden. An den
Verzweigungsstellen und etwas unterhalb der Sporangien sind die
Hyphen manchmal geringfügig aufgetrieben. Es werden Chlamydo-
sporen gebildet (Abb. 1, Fig. 3 u. 3a), die von mannigfaltiger Gestalt
sind, doch auf festen Nährböden nicht allzu reichlich entstehen. Sie

Mucor Jansseni Lendner.

211

sind kugelig, oval, tonnenförmig oder auch ganz unregelmäßig geformt,
haben eine derbere Membran und enthalten reichlich Reservestoffe,
hauptsäclilich fettes öl. Diese Gemmen können an allen Stellen des

Abb. 1. Mucor Jansseni. 1. und 4. Verzweigung der Sporangienträger ; Vergr. 30 mal bzw.
120 mal. 2. Sporen, z. T. gequollen; Vergr. 350 mal. 3. Chlamydosporcn; Vergr. 350 mal.
5. Oberfläche des Sttorangium; Vergr. 450 mal. 6. Columella; Vergr. 450 mal. Weitere

Erklärungen im Text.

Mycels entstehen, weitaus am häufigsten jedoch am Substratmycel und
besonders reichlich an submers in Nährflüssigkeit wachsendem Mycel.
Die Sporangienträger verzweigen sich anfangs sympodial, die Zweige
schließen jeweils mit einem Sporangium ab. Die Seitenäste werden mit

212

K. H. Zobl:

zunehmender Ordnungszahl immer schwächer und auch kürzer, die
Sporangien immer kleiner (Abb. 1, Fig. 4). Während die Sporangien
der Hauptäste zahlreiche Sporen enthalten, schließen die kleinen
Sporangien oft nur 2 bis 8 Sporen ein, manchmal findet sich nur eine
einzige Spore vor.

Häufig entspringen unterhalb eines Sporangiums kleine, sogenannte
Nebensporangien, das ganze Astsystem ruft dann den Eindruck einer
racemösen Verzweigung hervor. Dies findet sich besonders in älteren
Kulturen.

Die Sporangien sind kugelig, die Größe sehr verschieden, im Mittel
etwa 45 bis 75 [x Durchmesser. Doch kommen gelegentlich auch größere
bis zu 90 fx vor. Die kleinen Sporangien, die an den Endzweigen der
Astsysteme sitzen, gehen in ihren Abmessungen bis auf 15 bis 20 [x im
Durchmesser herab. Die anfangs hellblaugraue Farbe der Köpfchen
weicht bald einer tief dunkelblauschwarzen Tönung, die durch das Nach-
dunkeln der durchscheinenden Sporen, sowie durch die reichlich ab-
gesonderten Inkrustationen noch wesentlich verstärkt wird. Die Ober-
fläche des Sporangiums sieht feinstachelig aus und, da auch hier die
Anordnung der Kriställchen, es handelt sich wahrscheinlich um Oxalate,
ziemlich regelmäßig in Linien erfolgt, auch streifig (Abb. 1, Fig. 5).
Die Sporangienwand ist nicht zerfließlich, sondern brüchig. Es bleibt
immer ein Kragen in Form mehr minder größerer Bruch res te an der
Columella zurück. Die KristäUchen sind nadel-spieß-stäbchenförmig.
Die Columella ist in ihrer Form und Größe sehr variabel (Abb. 1, Fig. 6).
Man findet alle Übergänge von rein kugeliger Gestalt bis kegelförmiger
Form. In sehr jungen Sporangien ist sie hellgrau und hyalin, später
bräunlich mit schwach bläulichem Stich ; dann enthält sie auch reichlich
Fettröpfchen und Vakuolen. Die blaue Farbe scheint hier, ähnlich wie
bei den Blaufäulepilzen des Holzes, auf das Prinzip der ,, Trüben Medien“
zurückzuführen sein. Für die Kugelform wurden 12 bis 65 [x, im Mittel
45 [X, für die Ovalform 15 bis 55 [x Längs- und 7 bis 50 jx Querdurch-
messer gemessen.

Besonderer Erwähnung bedürfen die in Nährflüssigkeit bei sub-
me^sem Wachstum auf tretenden Wuchsformen. Neben normal aus-
gebildeten Hyphen finden sich zahlreiche Übergänge bis zum typisch
hefeartigen Sproßverband. Wir sind, um jedem Einwand zu begegnen,
von Einzelsporen ausgegangen. Sporenemulsionen wurden soweit
verdünnt, bis sich in der feuchten Kammer im hängenden Tropfen
nur eine Spore befknd. Diese bildete nach dem Auskeimen alsbald
Kugelzellen, die schließlich sproßartige Verbände ergaben, deren Einzel -
elemente verschiedene Größen hatten und alle Übergänge von der
Kugelform bis zu langgestreckten Sproßzellen zeigten. Davon wurde
mit einer Kapillare angesaugt und das Impf gut durch Abbrechen der

Muoor Jansseni Lendner.

213

Kiipillarspitze in 3 % Traubenzucker- Peptonlösung gebracht. Es wurde
streng steril gearbeitet. Es wuchsen neben typischen Hyphen reichlich
Kugelzellen und Chlamydosi)oren. Die Hyphen zeigten Arthrosporen-

Abb. 2. Muftor Janstmi. 1. Arthrosporenbildung ; 2. PseudoTnycel uod Blastosporen;

3. Eicseiizcllen^ 4. KugelzcUeii; 5. Spiral wachstuin. Weitere Erklärungen ini Text.

Vergr. aller Abb. etwa 750 mal.

bildung (Abb. 2, Fig. 1), d. h. aus der primär entstandenen Hyphe
ging durch Zerfall in der Wachstumsrichtung eine Kette von Arthro-
sporen, die untereinander und mit der Hyphe im Zusammenhang
blieben, hervor. Die Kugelzellen konnten so aussproasen, daß sich

214

K. H. Zobl:

die entstandenen Langsprosse durch weitere Sprossung ganz ein-
seitig nach einer Richtung hin erstreckten und so der Eindruck eines
Pseudomycels entstand (Abb. 2, Fig. 2). Die Langsprosse erzeugten
mitunter in der Gegend ihrer Berührungsstellen Kurzsprosse, die dann
ihrer Entstehung und Anordnung nach typische Blastosporen waren
(Abb. 2, Fig. 2 a). Damit entstand durchaus der Eindruck einen Sproß -
pilz, etwa eine Art der Gattung Candida, vor sich zu haben. Daneben
finden sich zahlreiche Chlamydosporen mit derber Membran. Auch
Riesenzellen (Abb. 2, Fig. 3) von bedeutenden Abmessungen kommen vor.
Alle die verschiedenen Elemente sind voll von Reservestoffen, unter
denen glykogenartige Stoffe und fettes öl den Haiiptteil bildeö. Bringt
man ein wenig nur Kugelzellen enthaltendes Impfmaterial mit Hilfe
von Glaskapillaren auf Brotnährboden, so zeigt der Pilz in Kurze seine
alte charakteristische Wuchsform. Auf Bierwürzegelatine gebracht,
keimen die Chlamydosporen ohne weiteres zu Hyphon aus, während die
Kugelzellen ein Zwischenstadium bilden. Die Kugelzelle schwillt zu
einer Blase von doppelter Größe an, aus der dann eine kurze Hyphe
herauswächst, die aber sofort wieder Kugelzellen bildet (Abb. 2, Fig. 4
u. 4a). Erst nach einiger Zeit, offenbar nach Gewöhnung an die Ver-
hältnisse in dem neuen Nährboden, tritt die normale Wuchsform auf.
Eigenartig sind die spiraligen Wuchsformen, die gelegentlich in Trauben-
zuckerlösungen auf treten (Abb. 2, Fig. 5). Meist ist es eine kurze Hyphe
oder ein Langsproß, der ganz regelmäßig spiralig gewunden beobachtet
wird. Über das Zustandekommen dieser eigenartigen Wuchsform kann
vorläufig nichts Näheres ausgesagt werden.

Auch über das sexuelle Verhalten des Pilzes wurden Versuche an-
gestellt, die aber ohne eindeutiges Ergebnis blieben. Trotz Anwendung
verschiedener Nährböden, vor allem solcher, die mit Erfolg zum Nach-
weis der Ascosporenbildung bei den Sproßpilzen dienen, konnten keine
Zygoten erhalten werden. Die Versuche mit Gorodkowaagar, Karotte,
Gipsblöckchen sowie der Nährlösung nach Wöltje, letztere unter Zusatz
von 5, 10, 15 und 30% Saccharose und Vitaininbeigaben in Form von
Hefeextrakt blieben ohne Ergebnis. Auch die Kombination der ver-
schiedenen Stämme untereinander blieb bisher erfolglos. Es wurde auch
versucht, Bastardzygoten zu erhalten. Lendner gibt an, daß Mucor
Jansseni vielleicht in die Nähe von Mucor fragilis zu stellen ist. Mehr-
fache Kombinationen von M. Jansseni mit Mucor fragilis blieben ohne
Erfolg. Auch Kombinationen mit Mucor luteus + u. — , Ahsidia
glauca + u. — sowie Mucor mucedo + u. — ließen nichts Sicheres er-
kennen. Einmal bildete der Stamm Zöptau mit M. luteus — Gebilde
aus, die vielleicht als Anlagen von Bastardzygoten gedeutet werden
könnten. Doch kam es nie zur Ausbildung vollständiger Zygoten.
Dieser Versuch könnte dahin ausgewertet werden, daß M. Jansseni

Mucor Jansseni Lendner.

215

Stamm Zöptau die Plusf orm einer heterothallisch en oder besser diözischen
Rasse ist. Die übrigen Stämme sind, den Ergebnissen nach zu schließen,
weder homothallisch (monözisch) noch hetero thallisch (diözisch),
sondern waren Neutralformen. Eine endgültige Entscheidung wird bei
Mucor Jansseni wohl schwer herbeizuführen sein, da der Pilz doch recht
selten ist und offenbar noch sehr viel seltener in seine Plus- oder Minus-
formen getrennt in der Natur vorzu kommen scheint.

[II. Physiologisehe Merkmale.

1, Zuckervergnrung (Gas- und Säurebildung). Die Prüfimpj auf diese
Merkmale wurde im Vorversuch mit dem Einhomi^chen Gärrohr vor-
genommen. Zum Hauptversuch verwendeten wir Gärröhrchen (Glocken-
methode). Als Versuchsflüssigkeit diente folgende Nährlösung; 2% Pepton-
Witte in destilliertem Wasser, abgefüllt zu 100 ccm, sterilisiert und mit
5% des durch IJmkristallisieren gereinigten Zuckers versetzt. Je 5 ccm
der <iurch zweimaliges Erhitzen auf 100® C sterilisierten Flüssigkeit
wurden in Proberöhrchen, die mit dem Gärröhrchen versehen waren (vor-
her im Trockenschrank sterilisiert), steril abgefüllt. Die mit Glaskappen
versehenen Röhrchen werden nochmals bei 100® C sterilisiert, wodurch
gleichzeitig die Luft aus dem Gärröhrchen vertrieben wird. Nach dem
Erkalten wird 1 ccm einer sterilen Lackmuslösung nach Kubel-Thiemann
hinzugefügt. Es wird, um später die Säurebildung oder einen Umschlag
nach der alkalischen Seite hin genau feststellen zu können, mit n Na OH
oder ^/lO n Sodalösung auf den Neutralpunkt eingestellt. Die Lösung zeigt,
vermutlich durch das Pepton, manchmal eine schwach saure Reaktion.
Um vergleichbare Werte zu erhalten, wurde mit einer 1 ccm-Pipette jeweils
ein Tropfen einer Sporenemulsion vorimpft. Die Emulsion wurde durch
Uberschichten einer jüngeren Agarkultur mit physiologischer Kochsalz-
lösung und leichtes Schütteln erhalten. Es hatte sich gezeigt, daß immer
Sporen in genügender Menge durch diesen Vorgang trotz der Sprödigkeit
und Festigkeit der Sporangiumwand erhalten werden. Geprüft wurden
folgende Zucker: Glucose, Fructose, Mannose, Galaktose, Saccharose,
Maltose, Lactose und Raffinose. Auch für die Mucoraceae gelten die von
Kluyver (6) für Hefepilze gefundenen Gesetzmäßigkeiten der Zucker -
Vergärung, soweit wir bisher feststelleii konnten.

In allen Zuckerarten trat Säurebildung auf, wie der Lackmus -
Umschlag nach rot anzeigte. Gas wurde dagegen nur in Glucose,
Fructose, Mannose, Maltose und Galaktose gebildet. Die Versuche
wurden in mehreren Serien bei 18, 22 und 37^0 durchgeführt. Bei
18 und 220 Q tritt die Säuerung am 2., die Gasbildung schon am 3. Tage
ein, der Pilz wächst rasch und kräftig heran. Bei 37® C geht der Pilz
nur sehr, schwer und langsam an, zeigt nur schwaches Wachstum und
starke Beeinträchtigung aller Lebensfunktionen.

Anfangs wird ziemlich viel Säure gebildet, am stärksten in den bis
zur Gasbildung abgebauten Zuckerlösungen. Da stets mit gleichen
Mengen gearbeitet wurde, konnten durch Titration mit ^/iqU Na OH
gegen Lackmus Vergleichswerte erhalten werden. Am meisten Säure

216

K. H. Zobl:

entstand in der Maltoselösung, dann in Mannose, Glucose, Fructose.
In Galaktose entstand nur wenig Säure entsprechend der geringeren
Gasbildung. Schwächer noch war die Säurebildung in Saccharose,
Raffinose und sehr schwach in der Lactoselösung.

Merkwürdigerweise blieb aber die Säure nicht erhalten. Nach
3 bis 4 Wochen machte die Rotfärbung des Lackmus einer immer
stärker werdenden Violett- und schließlich Blaufärbung Platz. Nach
6 Wochen war auch die Maltoselösung deutlich blau. Mucor Jansseni
ist offenbar in der Lage, auch die gebildete Säure nach Aufzehren des
Zuckers weiter. zu verarbeiten oder sonst irgendwie zu binden, so daß
die Säure wieder verschwindet. Und nun zeigte sich gerade das um-
gekehrte Verhältnis. Die alkalische Reaktion war in der Lactose-,
Raffinose- und Saccharoselösung am stärksten; bei der Titration auf
den Neutralpunkt wurden 0,35 bis 0,40 ccm n HCl gebunden,
während bei den übrigen Zuckerarten nur 2 bis 6 Tropfen i/ionHCl
nötig waren. Am wenigsten wurde von der Maltoselösung gebraucht,
wo nach 2 Tropfen der Neutralpunkt gegen Lackmus erreicht war.
Gleichzeitig verschwand das Gas in allen Gärröhrchen bis auf eine kleine
Blase, ob durch Absorption durch die Flüssigkeit oder Assimilation
durch den Pilz kann nicht gesagt werden. Vielleicht entstehen bei der
Verwertung des Peptons Zwischen- oder Endprodukte alkalischer
Reaktion, die sowohl die Ändening der Reaktion bedingen, als auch
das COrt binden, womit dann vielleicht giftig wirkende Stoffe un-
schädlich gemacht würden. Weitere Untersuchungen wären sicher
wünschenswert.

2. Temperatureinfluß. M. Jansseni wächst noch bei 4 bis 6^0,
allerdings nur sehr langsam und beinahe nur Substratmycel bildend.
Bei 00 C keimten die Sporen noch aus, setzten aber das Wachstum nicht
fort. Bei 16, 18, 20, 22 und 250 C wächst er sehr gut. Hier liegt auch
sein Optimum, wenn auch schwer zu entscheiden ist, ob ein Unterschied
bei 22 und 25® C merklich in Erscheinung tritt. Bei 30® C geht die
Kultur noch rasch an, der Rasen bleibt aber niedrig, 1 bis 3 mm. Bei
370 C und bei 40® C geht M. Jansseni nur mehr sehr langsam an und
zeigt nur spärliches Wachstum als Substratmycel. über 45^ C stellt
er das Wachstum ein, wird aber nicht geschädigt, sondern wächst, auf
Zimmertemperatur gebracht, rasch heran. Die Tötungstemperatur der
Sporen liegt bei 650 C. Dieses wurde mit Sporenemulsionen im Wasserbad
festgestellt. 10 Minuten dauerndes Erhitzen, die Zeit von da an ge-
rechnet, in der ein Thermometer in der gleichen Menge Flüssigkeit diese
Temperatur anzeigte, schädigte die Sporen nicht. Nach 20 Minuten
keimten noch vereinzelte Versuchsröhrchen aus, nach 30 und 40 Minuten
nicht mehr, während die unbehandelten Kontrollröhrchen in allen
Fällen angingen. Bei 70® C genügte 10 Minuten langes Erhitzen, um

Mucor Jansseni Lendner.

217

die Sporen abzutöten. Ebenso waren Brot- und Karottenkulturen nach
dieser Zeit fast immer abgetötet, wie durch Abimpfen auf neue Nährböden
festgestellt werden konnte.

5. Einfluß des 'p^^Wertes. Der für das charakteristische Wachstum
günstigste pn-Wert lag bei pn — 5, doch zeigt der Pilz im ganzen einen
ausgedehnten Wachstumsbereich. So bildete sich in einer alkalischen
Fleischbrühe mit 1 % Traubenzucker und einem pn-Wert von 7,9 sehr
rasch ein reichliches submerses Mycel, während in derselben Brühe, aber
mit ph = 6 ein sehr viel schwächeres Mycel wuchs. Bei pn — 4,5 war
da^ Wachstum ähnlich wie bei pn ~ 7,9. Es scheint also so zu sein,
daß der Pilz sowohl im sauren als auch im basischen Bereich je einen
optimalen pH-Wert bevorzugt. Dies würde übrigens eine Bestätigung
unserer Befunde über das Verhalten bei der Gärung bedeuten.

/. Lebensdauer. Trotz der Chlamydosporenbildung verträgt
M. Jansseni keine zu langandauemde Austrocknung. In der Regel lebt
der Pilz auf Brot in Röhrchen mit Watte Verschluß 8 Monate, auf Bier-
würzcagar 12 bis 14 Monate. Nach 18 Monaten hatte er seine Keim-
fähigkeit eingebüßt und auch eine Durchtränkung des Nährbodens mit
Bierwürze brachte ihn nicht mehr zum Auskeimen. Immerhin zählt er
zu den widerstandsfähigeren Mucor ’AviQii.

5. Einfluß des Lichtes. Der Einfluß des Lichtes scheint sich dahin
auszuwirken, daß die Verzweigung dunkel gehaltener Kulturen etwas
früher und stärker einzu treten pflegt. Später sind Unterschiede im
Wachstum nicht mehr feststellbar. Immerhin sind auch hierbei gewisse
Erscheinungen bemerkenswert. Es wurden drei Versuchsreihen auf-
gestellt. Versuchsreihe I blieb bei Zimmerhelligkeit, Versuchsreihe II
und III wurden sofort nach dom Abimpfen bei völliger Dunkelheit auf-
be wahrt. Nach 3 Tagen wurde die Versuchsreihe II auf 1 Minute der
Zimmerhelligkeit ausgesetzt, nach 8 Tagen alle drei Reihen miteinander
verglichen. Reihe I hatte einen wohlausgebildeten Rasen, doch waren
die Sporangienträger nur mäßig verzweigt, im ganzen war der Rasen
hellgrau. Reihe II glich der Reihe I, doch war die Verzweigung der
Sporangienträger unserem Empfinden nach> wesentlich stärker, auch
war der Rasen etwas niedriger. Reihe III zeigte nur sehr wenige, reich-
lich verzweigte Sporangienträger, der Rasen war niedrig und stark mit
weißem Luftmycel untermischt. Daraus geht hervor, daß die kurze
Lichteinwirkung doch als Reiz in der Richtung eines besseren Wachs-
tums, vor allem aber einer reichlicheren Sporangienbildung gewirkt hat.
3 Wochen alte Kulturen der drei Versuchsreihen zeigten aber keine
Unterschiede mehr.

G. Sonstige Beobachtungen. M. Jansseni verflüssigt Gelatine, aller-
dings erst in älteren Kulturen. Vermutlich werden durch Autolyse ab-
gestorbener Hyphen Gelatine verflüssigende Fermente frei. Milch wird

218

K. H. Zobl: Mucor Jansseni Lendner.

innerhalb 8 bis 12 Tagen zum Gerinnen gebracht, was wohl auf die Säure -
bilduhg zurückzuführen ist. LackmusmiJch zeigte anfangs kräftige
Rotfärbung, die mit dem Alter der Kultur abnahm und einer schwachen
Blaufärbung Platz machte. Die Natur der Säuren konnte nicht näher
untersucht werden. Stärke wird geringfügig verzuckert, wie aus den
positiven Zuckemachweisen hervorging. Kontrollröhrchen mit der
gleichen Stärkelösung unter den gleichen Bedingungen gehalten blieben,
auf Zucker geprüft, negativ. Die Sporangien träger sind photo tropisch
positiv, sie wachsen dem Licht zu . Dabei sind manche Sporangienträger
scheinbar phototropisch negativ, indem sie von der Lichtquelle weg-
wachsen. Genaue Beobachtung zeigt aber, daß diese Träger auf Stellen
Zuwachsen, an denen das Licht stärker an der Glaswand des Kultur-
gefäßes reflektiert wird. Zu großer Wassergehalt des Nährbodens und
der Luft gibt Anlaß zur Bildung von Kümmerformen innerhalb der
Sporangienträger und läßt das Mycel mit zahllosen Tröpfchen bedeckt
erscheinen. Auch bezüglich der Feuchtigkeit ist damit ein Minimum,
Optimum und Maximum feststellbar, das übrigens mit der Züchtungs-
temperatur in Beziehung steht. Bei Temperaturen von 25^ C kann eine
vermehrte Feuchtigkeit ohne bemerkenswerte Erscheinungen ertragen
werden, während dieselbe Feuchtigkeit des Nährbodens bei Zimmer-
temperatur (16 bis 18^ C) bereits zur Ausscheidung von Tröpfchen führt.

Zusammenlassung.

Über Mucor Jansseni Lendner, von dem mehrere Stämme aus ver-
schiedenen Gegenden isoliert wurden und dessen Beschreibung in der
Literatur unvollständig ist, werden genauere Angaben über sein morpho-
logisches und physiologisches Verhalten gemacht.

Literatur.

1) Lendner, A., Bull, Herb. Boissier, 2e s6rie, t. Vli, 1907. — la) Der-
selbe, Les Mucorin^s de la Suisse. Bern 1908. — 2) Ling-Young, M., Etüde
biologique des ph^nomenes de la sexualit6 chez les Mucor in^es. Rev. g6n.
de Bot. 42, 144, 1930; 48, 30, 1931. — 3) Linnemann, O., Flora oder
Allgemeine Bot. Zeitung, N. F., 80, 176, 1936. ~ 4) Zycha, H., Mucorineae
in Kryptogamenflora der Mark Brandenburg, Band Via. Leipzig 1935. —
5) Janke, A, u. Zikes, H., Arbeitsmethoden der Mikrobiologie, S. 50.
Dresden 1928. — 6) Kluyver, A, J ., Biochemische Suikerbepalingen. Delft
1914.

(Aus dem Botanisch-Mikrobiologischen Institut der Technischen Hochschule

Karlsruhe.)

Untersnchungen über die Einwirkung
von ultraknrzen Wellen auf Mikroorganismen. II.*

Von

Sigrid Hansen und Wilhelm Schwartz.

Mit 9 Textabbildungen.

(Eingegangen am 17 . November 1942.)

Die Untersuchungen von Sanier und Schwartz (1939) haben gezeigt,
daß elektromagnetische Wechselfelder eines Funkenstreckensenders mit
hohen Spitzenspannungen und geringer mittlerer Feldstärke bei geringer
Leitfäll igkeit und nur mäßiger Erwärmung der Bakterienaufschwemmung
die Zellen so stark schädigen können, daß sie absterben. Da die Tem-
peraturen hierbei höchstens etwa um Ißo Q über die Anfangstemperatur
anstiegen, also etwa 36^ C erreichten, war die Möglichkeit einer nicht
thermischen, also spezifischen Wirkung gegeben, wenn auch nicht
bewiesen. Ferner ist aus dem Schrifttum bekannt, daß die Zellen
einer Bakterienaufschwemmung im Kondensatorfeld eines ungedämpfte
Schwingungen liefernden Röhrengerätes rascher abgetötet werden als
die im Wasserbad bei derselben Temperatur (Schlie/phake , 1935).

In der Heilkunde werden Ultra-Kurzwellen (UKW.) seit geraumer
Zeit verwendet, obwohl man sich über die Wirkungsweise nicht klar
ist. Aus der Tatsache, daß die beim Patienten auftretende Wärme-
empfindung als Dosismaß benutzt wird, darf ja nicht ohne weiteres
geschlossen werden, daß in erster Linie die Wärmewirkung ausgenutzt
wird. Die in der Praxis gebräuchlichen Apparate erzeugen teils ge-
dämpfte (Funkenstreckensender), teils ungedämpfte (Röhrensender)
Schwingungen. Arbeitet man mit ungedämpften Schwingungen, so ist
die mittlere Feldstärke groß im Verhältnis zur maximalen, während bei
gedämpften Schwingungen die mittlere Feldstärke klein, die maximale
recht beträchtlich ist. Verwendet man Bakterienaufschwemmungen,
so muß die Erwärmung der Aufschwemmung bei großen mittleren Feld-
stärken größer sein als bei kleinen. Selbstverständlich ist auch die
Leitfähigkeit der Aufschwemmung von größter Bedeutung.

Im Anschluß an die bekannten Tatsachen sollte die Wirkung unge-
dämpfter UKW. bei extrem hohen mittleren Feldstärken und sehr

* Ausgeführt mit Unterstützung des Reichsforschungsrates und der
Siemens-Schuckert-Werke, Berlin.

220

8. Hemsen u. W. Schwartz:

kurzen Behandlungszeiten untersucht werden. Es war ferner von Inter-
esse zu untersuchen, ob mit den mittels eines Röhrengerätes zu erzeu-
genden gedämpften Hochfrequenzschwingungen dieselben oder, ähnliche
Wirkungen auf Bacterien ausgelöst werden können, wie es mit einem
Funkenstreckensender in früher durchgeführten Versuchen der Fall
war. Gleichzeitig sollte festgestellt werden, inwieweit die Leitfähigkeit
der Aufschwemmung und Unterschiede des Schwingungsverlaufes beim
Einsetzen der Schwingungen einen Einfluß auf die biologische Wirksam-
keit haben.

Wir benutzten für unsere Untersuchungen folgende Stämme von Mikro-
organismen :

Von der Reichsanstalt für Land^ und Forstwirtschaft in Berlin er-
hielten wir: Micrococctia candicana, aus der EmZschen Sammlung in Wien;
Azotobacter chroococcumy Stamm XV, isoliert vom Versuchsfeld in Dahlem.
Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften der beiden Stämme
wichen von den bekannten Angaben nicht ab.

Ferner wurden aus Erde und aus Milch Bakterien- Stämme, und aus
einem Schleimfluß ein He/e- Stamm isoliert.

Die Bodenbakterien stammten aus Erdproben aus dem Botanischen
Garten aus einer Bodentiefe von 5 bis 8 cm unter einer Rasenfläche. Je eine
Spatelspitze dieser Eide wurde in einem Reagensglas in 10 ccm sterilem,
destilliertem Wasser aufgeschwemmt und im Wasserbad erwärmt. Die
Anfangstemperatur betrug 40^ C. Der Wärmegrewi des Wasser bades wurde
binnen 10 Minuten um 10° erhöht, 1 Minute bei der erreichten Temperatur
gehalten, um dann binnen weiterer 10 Minuten um weitere 10° erwärmt zu
werden usf. bis zu 100° C. Am Ende jeder 11. Minute wurde ein Glas mit
einer Probe aus dem Wasserbad heraüsgenommen und kurz geschüttelt.
Nachdem sich die festen Teilchen abgesetzt hatten, wurden */i(jCcm der
Aufschwemmung mit 10 ccm Fleischbouillongelatine in eine Petrischale
gebracht. Nach einigen Tagen zeigten sich auf den Platten Bakterien-
kolonien, die verschieden hohe Temperaturen ausgehalten hatten. Sie
wurden nach dem XocÄ sehen Plattenverfahren rein gezüchtet. Die Stämme
wurden so ausgewählt, daß sie Gelatine gar nicht oder nur sehr langsam
verflüssigen und gegen höhere Temperaturen nicht allzu empfindlich sind.

Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Stamm wurde b 90° benannt
(Tabelle I und II). Die Erdprobe, aus der er gezüchtet wurde, war in der
geschilderten Weise auf 90° erwärmt worden, wobei die Probe im ganzen
56 Minuten im Wasserbad verblieb. Die später geprüfte Hitzeresistenz
zeigte, daß bereits bei Erwärmung auf 47° C 90% der Keime abstarben,
während 42 bis 46° ohne nennenswerte Beeinflussung vertragen wurden.

Zur Gewinnung von Müchaäurebakterien ließen wir Magermilch bei
Zimmertemperatur 3 Tage stehen. Eine Impföse des gesäuerten Materials
wurde auf einen Gelatine- oder Agamährboden gebracht imd nach dem
Koch sehen Plattenverfahren in drei Folgen rein gezüchtet. Nach den
morphologischen und physiologischen Eigenschaften ließ sich der aus Milch
isolierte Bakterienstamm als Streptococcus lacticus (Kruse) einordnen (Ta-
belle I und II).

Die Hefe stammte aus dem Schleimfluß einer Uhne, Unter den ver-
schiedenen Hefeformen, die sich auf der Würzegelatine entwickelten, wurde

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 221

ein Stamm mit annähernd runden, d. h. kugelförmigen Zellen zur Reinzucht
ausgewählt.

Tabelle I. Morphologische Eigenschaften der Stämme h 90® und
Streptococcue lacticua (Kruse).

Bigenschaften

b 900

Streptococcw UuAicut (Krtue)

Form

Langstäbchen

Lanzettkokken, Streptokokken selten

Bewegung

unbeweglich

Größe

1,9 bis 3,7 fjL lang

0,6 bis 0,8^ breit

1 p lang, 0,5 bis 0,6 ß breit

Kolonieform , .

glatte runde Kolonien
und Fawerkolonien

kleine, glatte, weiße Kolonien an der
Oberfläche größer als im Substrat

Gramfärbung .

positiv

negativ

Sporenbildung

nein

Kapselbildung

nein

Tabelle II. Physiologische Eigenschaften der Stämme 6 90® und
Streptococcus lacticua (Kruse).

Nährboden

Verhalten von 6 900 bei t = 2()0

Verhalten von Stre-ptococeus
lacticus (Kruse), t = 370 C

Gelatine (Stichkultur)

nach 14 Tagen beginnt
schwache Verflüssigung

Schräg- Agar -j- Blei-

keine Schwefelwasserstoff-

acetatpapier

bildung

Fleischbouillon

Trübung; es bildet sich ein
fettiger Rand

deutliche Trübung

Trypsin bouillon

keine Indolbildung

Indol bildung

Drigalski-Agar

—

starke Gasbildung, Farb-
umschlag in rot

Neutralrottrau ben -

geringe Gasbildung, keine

starke Gas* und Fluores-

Zucker

Fluoreszenz

zenzbildung

Lackmus -Trauben -
Zuckerlösung

—

starke Gasbildung und
Farbumschlag in rötlich -
gelb

Lackmusmilch

schwache Blaufärbung,
keine Koagulation

Methylenblaumilch . .

Reduktion, keine Koagu-
lation

am 2. Tag Reduktion,
Koagulation

Endo-Agar

—

keine Fluoreszenz

Stärkebouillon

keine Hydrolyse

am 7. Tag vollständige
Hydrolyse

Nitratbouillon

Nitritbildung, keine

Am moniakbildung

Nitritbildung, keine
Ammoniakbildung

Leberbouillon

schwache Trübung

Trübung; es bildet sich ein
fettiger Rand

Blut-Agar (anaerob)

—

anaerob angewachsen

Bestimmung nach: Lehnumi%-Neunumn^ Atlas und Grundriß der
Bakteriologie. München, Lehmann Vorlag, 1912.

222

S. Hansen u. W. Schwartz:

Außer diesen Reinkulturen wurde auch eine Mischkultur verwendet,
wie wir sie in der Milch vorliegen haben

Einwirkung ungedämpiter Schwingungen.

1. Versuchsanordnung.

Die elektrischen Schwingungen wurden mit dem Ultrakurzwellengerät
„Ultra-Pandoros“ der Siemens-Reiniger -Werke erzeugt. Der Ultra-Pandoros
ist ein Röhrengenerator, in dem zwei Schwingungsröhren von Siemens
& Halske, A.-G., Type GR I, hochfrequenzmäßig im Gegentakt arbeiten
(Abb. 1).

^ Es bot sich hierbei neben guter Leitfähigkeit, die nicht nur durch
NaCl-Ionen bedingt ist, auch eine Vergleichsmöglichkeit hinsichtlich der
noch später zu erörternden Wärmeeinwirkung, die einmal durch UKW., in
den Molkereien aber in Hocherhitzern entwickelt wird.

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 22ä

Durch Veränderung der Selbstinduktion des Primärschwingungskreises
können Wellenlängen zwischen etwa 3,15 und 8 m eingestellt werden. Die
Kurzwellenleistung beträgt zwischen 3,16 und. 3,70 m über 300 Watt,
zwischen 3,70 und 8 m über 600 Watt. Die Arme der für therapeutische
Zwecke verwandten Schliephake-Elektroden wurden durch feste Kupfer-
drähte von 4 bis 4,6 mm Durchmesser und der auß der Zeichnung ersicht-
lichen Länge ersetzt, die zu den Versuchselektroden führten (Abb. 2). Die
obere Elektrode bestand aus einem Hohlzylinder von 60 mm lichter Weite,
175 mm Höhe, 5 mm Wandstärke und einer auf schraubbaren Platte, die

Abb. 2. Versuchsanordnung für VerBucho mit unged&mpften Schwingungen.

konzentrisch einen kegelförmigen Vorsprung mit einer 1 mm weiten Düse
besaß. Aus der Düse lief die zu behandelnde Bakterienaufschwemmung
zur unteren Elektrode, traf genau auf die Spitze der unteren Elektrode
und lief hier an dem Kegel ab und durch die vier Öffnungen in den Hohl-
zy linder der unteren Elektrode von 7,5 mm lichter Weite (Abb. 3).

Von der Bakterienaufschwemmung wurde eine Probe abgefüllt, RK I *,
sie ergab den Keimgehalt der unbehandelten Aufschwemmung. Die Elek-
troden sowie das ausgedämpfte Standgefäß wurden in der aus der Zeichnung
ersichtlichen Weise angeschlossen, die Klemmschraube am Zuleitungsrohr
angezogen imd die Aufschwemmung eingefüllt. Dann wurde die Kleipm-^

* Siehe die Bezeichnungen in Tabellen III bis V.

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13.

i24

S. Hansen u. W. Schwartz:

schraube etwas geöffnet und so viel Aufschwemmung in die Elektrode
gefüllt, daß die Flüssigkeit 3 bis 4 cm hoch stand, was etwa 60 bis 60 ccm
entsprach. Mittels Begulieiung an der Klemmschiaube erreichte man, daß
die zufließende Menge gleich der abfließenden war und das Volumen in der
Elektrode konstant blieb. Die im Rohr der unteren Elektrode abfließende
Aufschwemmung wmde in einem 600 -ccm -Meßzylinder von 60 mm lichter
Weite und 360 mm Höhe aufgefangen. Werm 200 ccm Aufschwemmung
darin aufgefangen waren, wtu de die erste Probe DK I genommen, die
anzeigt, ob Bakterien an der Gefäßwand hängenbleiben bzw. neue dazu

Abb. 3. Elektroden für Versuche mit ungedämpften Schwingungen.

kommen. In einem sterilen und abgefleunrnten Reagensglas wurde 1 Minute
lang die von der unteren Elektrode abfließende Aufschwemmung auf-
gefangen, Glas und Wat^ abgeflammt und das Glas wieder verschlossen.

Nun wurde der Apparat eingeschaltet imd die Heizspannung auf 20 Volt
eingestellt. Die Wellenlänge lag fest bei 6,64 m. Sie wurde am Anfang der
Versuchsreihe eingestellt und später nicht mehr verändert. Die Schwan-
kungen der Wellenlänge waren unbedeutend, sie lagen zwischen 6,64 und
6,60 m. Die Wellenlänge wurde indirekt aus der Frequenz bestimmt, die
mit einem Frequenzmesser, T 3 q>e FM 6, Meßbereich 3,0 bis 126 MHz, der
Firma Dr. Steeg & Reuter G. m. b. H., Bad Homburg, gemessen wurde.

Die Abstimmung erfolgte mittels eines Kupferdrahtringes vom Durch-
messer 126 nmi uiid 2 mm Drahtdicke» in den eine 6 Volt /0 ,04 Amp.-Xampe
eingeschaltet war. Im Hochfrequenzfeld leuchtet die Birne auf. Der Kupfer-
drahtring wurde im Abstand von etwa 30 bis 36 cm senkrecht über die
Elektrodenzuleitung in unmittelbare Apparatnähe gebracht, wobei die
Ebene der Drahtschleife parallel zur El^ne der Elektrcdenzuleitung lag.
Jetzt drehte man an dem Knopf „Abstimmung''. Bei einer reinen Welle

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 225

erhielt man, wenn man den Knopf durch die ganze Meßskala drehte, nur
an einem Punkt hellstes Aufleuchten der Birne, auf allen anderen Ab-
schnitten der Skala leuchtete die Birne nicht. Durch Verstellen der Knöpfe
„Abstimmung“ und „Sperrkreis“ erhielt man diese Einstellung. Den Knopf
„Sperrkreis“ brauchte man später nicht mehr zu bedienen, mit dem Knopf
„Abstimmung“ mußte jeweils bei Beginn des Versuchs die Einstellunig
erfolgen.

Die an den Versuchselektroden liegende Spannung w\irde mit dem
iSftorÄje-iScÄroedcr- Spannungsmeßinstrument, Type Pet 86 für 26 kV Gleich-,
Wechsel- und Hochfrequenz gemessen. Sie betrug 1400 Volt, wobei zu
beachten ist, daß die Kapazität des Meßinstruments größer war als die der
Versuchselektroden, die Spannung an den Elektroden älso wahrscheinlich
größer war. Das Meßinstrument lag, weil es die Spahmmg zu stark herab -
setzt, während der Versuche nicht an den Elektroden.

Wenn seit Beginn des Einschaltens im Meßzylinder (A) 600 ccm auf-
gefangen worden waren, wurde die erste Probe bestrahlter Auff chwemmung
genommen, anschließend die Temperatur gemessen, indem man ein Toluol -
thermometer in die aus der unteren Elektrode ablaufende Flüssigkeit hielt.
Das Thermometer in das Feld zu bringen war nicht ratsam, weil dadurch
einmal das Feld verzerrt wird, zudem auch Funkenüberschläge auf das
Thermometer auftreten können. Die. nächsten Bestrahlungsproben, mit
D II, D III, D IV usw. bezeichnet, wurden je nach weiteren 600 ccm ge-
nommen. Alle Proben wurden sofort nach Entnahme im Impf kästen so
weiterverarbeitet, daß ^/lO» ^ und 10 ccm mit sterilem Wasser auf je 100 ccm
verdünnt und davon V.0 und ^/| ccm zum Plattengießen verwendet werden.
In jede der sechs Petrischalen kamen 10 ccm 14%ige verflüssigte Fleisch-
bouillongelatine, dazu die angegebenen Aufschwemmungsmengen, die mit
dem Nährboden sorgfältig vermischt wurden. Nach 2 Tagen wurden die
Keime auf den Platten erstmalig gezählt, ebenso an den beiden folgenden
Tagen. Aus dem Keimgehalt einer Platte wurde der Keimgehalt von 1 ccm
Aufschwemmung berechnet. Die Genauigkeit dieser Bestimmung betrug
:£ 10%. Als 4. Stufe wurden, wenn weitgehende Abtötung erwartet wurde,
von der gleichen Aufschwemmung und ^/j^ccm in je eine Petrischale
gebracht und in gleicher Weise behandelt.

Der Apparat wurde ausgeschaltet, wenn die Flüssigkeit im Standgefäß
(Bodendurchmesser = 170 mm) nur noch 60 mm hoch stand. Nach Ab-
schalten des Apparats wurde eine Probe unbehandelter Aufschwemmung
aus dem Standgefäß genommen, mit RKII beaseichnet, um Änderungen
des Keimgehalts während der Versuchsdauer berücksichtigen zu können.
Der Prozentgehalt der Abtötung ist auf RK I bezogen.

Jeweils imter Konstanthaltung der übrigen Faktoren wurden folgende
Veränderliche geprüft:

Heizspannung, die an der Kathode liegt: Die Heizspannung betrug
zweckmäßig 19 bis 20 Volt; bei höherer Voltzahl sprangen an den Elektroden
Funken über, wodurch die Spitzen der Kegel abschmoren. Geringere
Heizspannung setzte die Temperatur herab.

Elektrodenabstand : Der Elektrodenabstand wurde zu 44 mm zwischen
den Kegelspitzen gewählt. Hierbei sprangen allgemein bei obiger Heiz-
spannung keine Funken über. Bei größerem Abstand g.ng die Temperatur
herunter.

Durchflußgeschwindigkeit durch die Elektrodendüse und Flüssigkeits-
höhe in der oberen Elektrode, sowie die Konstanthaltung dieser Höhe :

226

S. Hansen u. W. Schwartz:

Die Flüssigkeitshöhe in der oberen Elektrode soll konstant gehalten weiden,
da sie die Durchflußgeschwindigkeit bestimmt. Eine Höhe zwischen 3 bis
5 cm wurde als beste Bedingung herausgefunden.

Frequenz bzw. Wellenlänge: Die Frequenz wurde willkürlich zu 64,3
bis 64,6 MHz gewählt, das entspricht einer Wellenlänge von 6,62 bis 6,60 m.
Diese wurde konstant eingehalten. Nach früheren Versuchen von 8auter
und Schwartz (1939) ist die Wellenlänge innerhalb gewisser Gienzen ohne
Bedeutimg für die Bakterienabtötung.

2. Ergebnisse,

a) Versuche mit einer wässerigen Bakterienaufschwemmung.

Verwendete man abgekochtes, filtriertes, steriles Leitungswasser
zur Herstellung einer Aufschwemmung von Streptoccociis larticus
(Kruse), so ließ sich keine Abtötung feststelJen. Die Temperatur stieg
auf 30 bis 310 C maximal an. Setzte man der Aufschwemmung Kochsalz
zu, auf 1 Liter Aufschwemmung 1 g, so erwärmte sich die Aufschwem-
mung infolge der größeren Leitfähigkeit stärker. Die Temperaturen

Tabelle III. Verhalten einer Aufschwemmung von Streptococcus
lacticus (Kruse) mit 0,1% NaCl-Gehalt.

Auf den Keimgehalt geprüfte
Proben

AufechwemmnngB-
teinperatur am
Ausflaß gemessen
foc

Keimgehalt der
Proben» berechnet
auf 1 ccm

Abtötung in %

RK I

22,6

6,2 • 10*

D I

3,8 • 10«

64 • 10&

D III

6,9 • 10*

D IV

4,6 . 10«

D V

1,9.10«

D VI

2.1 . 10«

Tabelle IV. Versuche mit Magermilch.

Auf den Keimgehalt geprüfte
Proben

Milchtemperatur
am Ausfluß
gemessen
foc

Keimgehalt der
Proben, berechnet
auf 1 ccm Milch

Abtötung in %

Versuch 4.

RK I

4,8-10«

4,1 . 10*

7,6 . 10*

D III

3,6.10«

RK II

7 .10«

Versuch 6.

RK I

1 .10«

8 .10«

2 .10«

99,8

D III

2 .10*

D IV

6 .10«

RK II

1 .10«

Einwirkimg von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 227

Tabelle IV (Fortsetzung).

Auf den Keimgehalt geprüfte
Proben

Milchtemperatur
am Ausflufi j

gemessen

foc

Keimgehalt der
Proben, berechnet
auf 1 ccm Milch

Abtötung in %

VeiBuch 16.

RK I

4,3 . 10«

2,9 • 10»

2,7 • 10»

D III

3,9 • 10«

D IV

öl

3,7 • 10«

D V

1,3 • 10«

D VI

2.2 . 10« 1

D VII

4,4. 10&

D VIII

2,8 . 10«

99,9

D IX

1,9.10*

99,6

D X

1,6 . 10«

RK II

8.6 . 10«

Tabelle V. Versuche mit Vollmilch.

Auf den Keimgehalt
geprüfte Milchproben

Milchtemperatur am
Ausfluß gemessen

<0C

Keimgehalt der
Proben, berechnet
auf 1 ccm Milch

Abtötung in %

Versuch 3.

RK I

2,3 • 10'-

3.7 . 10^

63 1

6.3 . 105

D III

unterbrochen, Düse war durch Milohpfropf verstopft

D IV

1.3 W

99,9

D V

7,6 • 10»

99,6

D VI

2.8 ■ 10*

99,8

D VII

2,6 • 10»

D VIII

2,2 . 10«

Versuch 6.

RK I

9,6 . 10*

62,6

4 • 10»

96,8

61,6 1

2,4 . 10«

97,6

D III

61,6

9,1 • 102

D IV

unterbrochen, Düse war durch Mild

bpfropf verstopft

D V

5,6. 10«

Versuch 16.

RK I

1,8 • 10«

6,6 . 10*

2,2 • 10*

87,8

D III

4,4 . 10*

D IV

2,9 . 10*

83,9

D V

3 .10»

D VI

6,9 . 10«

96,7

D VII

3 .10«

D VIII

1.6 . 10*

99.8

228

S. Hansen u. W. Schwartz :

lagen zwischen 49 und 64® C (Tabelle III). Diese wie die folgenden
Versuche zeigten eindeutig (Tabelle IV und V), daß der Prozentsatz
der Abtötung mit der Erwärmung der Aufschwemmung im elektrischen
Feld steigt und fällt. Der Abtötungsgrad ist von der erreichten Tem-
peratur abhängig. Da die Aufschwemmung nicht nur im Feld, d. h.
zwischen den Elektroden, sondern auch schon in der oberen Elektrode
erwärmt wurde, da ferner die am Abfluß der unteren Elektrode ge-
messene Wärme nur annähernd den erreichten Wärmegrad angab und
zudem erst nach jeder Probeentnahme festgestellt wurde, konnten
Fehlmessungen von 1 bis 2® C Vorkommen.

b) Versuche mit Mager- und Vollmilch.

Die Ergebnisse von 17 Versuchen mit Magermilch und lö Versuchen
mit Vollmilch entsprechen den bei den Bakterienaufschwemmungen
erhaltenen (Tabelle IV und V). Eine 100%ige Abtötung wurde in
keinem Fall erzielt (Tabelle IV). Da überlegungsmäßig bei schnellem
Temperaturanstieg die Keimgehalte der ersten D- Versuche niedriger
sein müssen, wurde die Milch in einigen Versuchen auf 40® C vorgewärmt
und dann mit UKW. behandelt. Die Ergebnisse bestätigt^en die Richtig-
keit dieser Vermutung, jedoch waren die Verbesserungen unwesentlich.
Sehr geringe, an ,, Kochgeschmack“ erinnernde geschmackliche Ver-
änderungen ließen sich bei einiger Übung in der behandelten Magermilch
feststellen.

Die Ergebnisse der Vollmilchversuche entsprachen den Mager-
milchversuchen, der Fettgehalt der Milch beeinflußt die Keimschädigung
nicht (Tabelle V). In einigen Versuchen wurde sogar eine 100%ige
Abtötung erreicht. Beim Arbeiten mit Vollmilch verstopfte sich leicht
die Düse der Elektrode, so daß die Milch nur noch heraustropfte. Der
Versuch mußte dann unterbrochen und der Milchpfropf entfernt
werden. Der Geschmack der Vollmilch änderte sich durch die UKW.-
Behandlung nicht.

Vergleicht man die absoluten Keimzahlen mit den zugehörigen
Temperaturen, so zeigt sich, daß bei 55® etwa 10^, bei 57 bis 58® etwa
10^ Bakterien, bei 60® etwa 103, bei 64® lO^ bis 10® Bakterien Zurück-
bleiben, wenn man von lO^ Keimen in 1 ccm Milch ausgeht. Liegt der
Keimgehalt der Rohmilch höher, dann ändern sich die absoluten Zahlen.

Kontrollversuche, die bei entsprechenden Temperaturen im Wasser-
bad durchgeführt wurden, zeigten gleiche Abnahme des Keimgehalts.
Bei der Dauerpasteurisierung, bei der die Milchproben 30 Minuten
lang auf 64® C gehalten wurden, war die Keimschädigung sogar größer,
nämlich meist 100 %ig.

Der Milchdurchsatz war bei der l-mm-Düse gering; 500 ccm flössen
durchschnittlich binnen 20 Minuten durch. Versuche mit einer 2-mm-

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 229

Düse verdoppelten den Milchdurchsatz, zeigten aber nur 40 %ige
Abtötung, da die Temperatur nur auf etwa 40® anstieg. Damit dürfte
zur Genüge gezeigt sein, daß bei dieser Versuchsanordnung die Er-
hitzung der Milch als ausreichende Ursache für die Abtötung der Bak-
terien angesehen werden darf.

Aufrahmung. Die Aufrahmung ^ wurde in 250 ccm Meßzylindern von
3,6 cm lichter Weite bei Zimmertemperatur geprüft. Schon nach kurzer
Zeit setzte sich der Rahm ab. Mehnnals am Tage wurde, bei einer Versuchs-
dauer von 24 Stunden, die Höhe der Rahmschicht abgelesen. Zu den Auf-
rahmversuchen benutzten wir: Rohmilch eines Milchhofes (Batzenhof-
milch), also stets Milch von denselben Kühen, und Sammelmileh, d. h.
von verschiedenen Milchhöfen und Gemeinden gemischte Vollmilch.

In beiden Fällen wurde die Aufrahmfähigkeit von roher und von
dauerpasteiirisierter Milch geprüft, ferner d.ejenige der mit UKW. be-
handelten Rohmilch eines Milchhofes und, um einen Vergleich zur Auf-
rahmung der Handelsmilch zu haben, auch die der hochpasteurisierten
Sammel Vollmilch. Bei der Dauerpasteurisieiung eiwäimten wir 260 ccm
Milch im Wasserbad von etwa 70® im 300- bis 600-ccm -Erlenmeyerkolben
binnen 10 Minuten auf 63® und hielten sie unter dauerndem Schütteln
30 Minuten bei dieser Temperatur.

Tabelle VI. Aufrahmung von Vollmilch nach verschiedener
Vorbehandlung.

Datum

1940

Batzenhof,

roh

Batzenhof,

dauer-

pasteuri-

Biert

Batzenhof,

bestrahlt

Batzenhol,
auB dem
Standgefftli
unter der
Rahm-
Bcbicht

Sammel-
milch, roh

Sammel-

milch,

hoch-

paBteuzi-

Blert

Sammel-

milch,

dauer-

paateuri-

Biert

27. VII.

J2,6

29. VII.

11,6

30. VII.

2. VIII.

10,6

6. VIII.

1,6

6,5

2,6

6,6

6. VIII.

16,6

6,6

8,6

12. VIII.

9,6

8,6

1,6

6. IX.

6,5

6. IX.

12. IX.

8,6

1,6

11,6

17. IX.

8,6

7,6

0,6

26. IX.

8,5

8,6

8,5

1. X.

9,6

0,6

Mittel-

wert

10,3

6,9

6,3

6,1

10,6

6,8

^ Bekanntlich verändern sich die Eigenschaften der Milch bei jeder
Haltbarmachung, am wenigsten bei der Dauerpasteurisierung, bei der
Peroxydasen, Albumingerinnung, Labfähigkeit und Aufrahmfähigkeit weit-
gehend erhalten bleiben. In unseren Versuchen wurde außer der Ver-
änderung des Keimgehalts nur die Aufrahmfähigkeit der Vollmilch als Test
herangezogen.

230

S. Hemsen u. W. Sohwartz :

Am besten rahmte die unbehandelte Milch auf, die dauerpasteuri-
sierte Milch schon um 30 bis 50% schlechter. Die hochpasteurisierte
Milch hatte nur 1 bis 2 % Rahm, die mit UKW. behandelte Milch etwa
ö %. Sie kam der dauerpasteurisierten Milch nicht gleich und ergab nur
einen Vorteil gegenüber der hochpasteurisierten Milch (Tabelle VI).

Zusammenfassend kann also festgestellt werden, daß ungedämpfte
UKW. extrem hoher mittlerer Feldstärken auch bei kurzzeitiger Ein-
wirkung in Medien mit guter Leitfähigkeit (L 0,005 Q-i cm-i) bei der
vorliegenden Versuchsanordnung eine Erwärmung hervorrufen, die aus-
reicht, die in deJr Aufschwemmung enthaltenen Bakterien abzu toten.
Dies trifft sowohl für die Aufschwemmung von Reinkulturen als auch
von Rohkulturen, wie sie für die Milch gelten, zu. Je größer die Leit-
fähigkeit, um so größer ist die Erwärmung, um so größer ist die Ab-
tötung (Tabelle VII).

Tabelle VII. Abhängigkeit der Abtötung von der Erwärmung
bzw. von der Leitfähigkeit des Mediums.

Aufftchwemmungsmedium

Salzzusatjs

Leitfähigkeit
in Ä”* cm”'

Erwärmung
in fOC

Abtötung
in %

Abgekoohtes, filtriertes
Wasser

keiner

0,000 61

Abgekochtes, filtriertes
Leitungswasser

1 g auf 1 Liter

0,0016

41,3

Milch

keiner

0.006 7

99.9

Auch der rasche Temperaturanstieg, wie er durch das UKW. -Feld
hervorgerufen wird, hat keine stärkere Schädigung der Bakterien zur
Folge als die geringere Erwärmungsgeschwindigkeit in den Hoch-
erhitzem der Milchzentrale. Nebenbei sei bemerkt, daß eine Ent-
keimung der Milch mit UKW., deren Möglichkeit gelegentlich erörtert
wurde, gegenüber den heute üblichen Pasteurisierungsverfahren keinerlei
Vorteile bietet, zumal die Verbesserung der Aufrahmfähigkeit nur
unwesentlich ist, die UKW. -Anlage aber wesentlich teurer sein dürfte
und der Milchdurchsatz gering ist.

Wurde bisher also die Auffassung gestützt, daß der Leitungsstrom
eine Erwärmung hervomift, die so hoch sein kann, daß sie letal wirkt,
so wird im weiteren dargelegt werden können, daß bei niedrig bleibender
Temperatur der Aufschwemmung der Verschiebungsstrom als wesent-
licher Faktor für die Abtötung der Bakterien anzusehen ist.

Einwirkung gedämpfter Schwingungen.

i. Verauchsanordnung,

Die gedämpften Schwingungen wurden mit dem gleichen Röhrengerät,
dem „Ultra-Pandoros“ der Siemens-Reiniger -Werke, Berlin (Abb. 1),

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 231

erzeugt, der mit dem Induktionsstrom eines 20000 Volt Transformators (1)*
betrieben wird. Der Transformator (2) transformiert die zur Verfügung
stehende Weohselspannung von 126 Volt auf 240 Volt. Der Singer -Unter-
brecher (3) zerhackt den Strom im Rhythmus der Wechselstromfrequenz.
Die Stromstärke auf der Unterspannungsseite wird mit dem Amperemeter (4)

kontrolliert, sie beträgt. 4,6 Amp. Der hochgespannte Strom wird über ein
Glühventil (6), Type V 160/602 p, der Siemens-Reiniger-Werke geleitet.
Zur Heizung der Kathode desselben sind zwei Transformatoren (6) und (7)
erforderlich. Ein Schiebewiderstand (8) gestattet die genaue Einstellung
der erforderlichen Heizstromstärke und das Amperemeter (9) deren Kon-
trolle. Der durch das Qlühventil gleichgerichtete Strom lädt die Hescho-

* Die Ziffern beziehen sich auf Abb. 6.

16 *

232

S. Hansen u. W. Schwartz:

Kondensatoren (10) (je 5000 pF) auf, bis die Überschlagsspannung der
Funkenstrecke (11) erreicht ist. Die Funkenstrecke wird durch einen
Ventilator gekühlt. Der Stromstoß nimmt seinen Weg über den Wider-
stand (12) zu dem Röhrengerät (17). Als Verbraucherkondensator des

1. Transformator U0V/200ü()V 7. Transformator IH. A tnpi'reiiieter

2. Transformator 125V/240V 8. Schiebewiderstand 14. Ampl'rcTrictcr

3. Ätnflfef-Unterbrecher 0. Amperemeter 15. 6Amp. Sicherung

4 . Amperemeter 10. if^scAo-Kondensatorcn 16. Voltmeter

5. Glühventil 11. Funkenstreckc 7 mm Abst. 17. Röhrengerät

6. Transformator 12. Oäw scher Widerstand

Abb. 5. Schaltungsschema für Versuche mit gedämpften Schwingungen.

Abb. 6. Versuchsanlage für gedämpfte Schwingungen.

1. Trafo. 2. Glühventil. 3. Funkenstrecke. 4, HMcAo-Kondensatoren. 6. Ultra Pandoros.

Röhrengerätes war, an Stelle der ScMiephake-Mektioden, ein Versuchsgefäß
angeordnet (Abb. 4). Es bestand aus zwei ineinandergestellten, einseitig
geschlossenen Röhren, von denen die innere innen, die äußere außen mit
einem Metallbelag versehen war. Um den oberen Rand des äußeren Metall-
belags war ein 8 mm breites Messingband gelegt, das mittels einer Schraube

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. 11. 233

fest angezogen wurde und mit drei Füßen versehen war, Von denen auf der
Zeichnung, Abb. 4, zwei dargestellt sind. Der eine Zuleitungsdraht wurde
mit diesem Messingband verbunden, die leitende Verbindung zur inneren
Elektrode durch eine Messingspange erreicht, die dem inneren Metallbelag
fest auflag. Die Zuleitungen zur Elektrode bestanden aus 2 mm dicken und
735 mm und 770 mm langen Kupferdrähten (Abb. 7). Die Amperemeter (13)
und (14), die 6 -Amperesicherung (15) und ein Voltmeter (16) erleichterten
die Überwachung der Apparatur (Schaltschema 1, Abb. 5 und 6). Die ganze
Anlage stand zur Abschirmung in einem Maschendrahtkäfig. Im ültra-
Pandoroß wurden einige Veränderungen vorgenommen. Die Verbindungs-
leitung zwischen Hochspannungstransfoimator imd Ancde Fowie der
Kondensator in der Gitterableitung wurden entfernt und der Abstand
zwischen Gitter- und Schwingkreis-Induktivität vergrößert. Fimkenüber-
schläge zwischen beiden Induktivitäten ließen sich mit Hilfe einer dazwischen
gehängten Glasplatte von 10 mm Dicke, 450 mm Länge und 150 mm Breite
vermeiden. Eine Messung oder Berechmmg der maximalen Feldstärken
war bei dieser Versuchsanordmmg nicht möglich. Es ist jedoch sehr wahr-
scheinlich, daß die maximalen Feldstärken niedriger waren als in früheren
Versuchen von SatUer imd Schwartz (1939) unter Verw^endung eines Funken -
Streckensenders.

Die Entkeimung des Versuchsgefäßes (Abb. 4) erfolgte mit ultra-
violettem Licht Das äußere Elektrodengefäß wurde auf ein Becherglas
gestellt, das innere waagerecht über ein Becherglas gelegt und nach der
halben Sterilisationszeit von 5 Minuten tun 180® gedreht. Im UV-Licht
wurde das Elektrodengefäß zusammengesetzt, steriles Wasser eingefüllt
und der Deckel aufgesetzt. Mit dem eingefüllten, sterilen Wasser wurden
zwei Platten mit je und V 2 ccm des Wassers ausgegossen, um zu prüfen,
ob das Gefäß wirklich steril war.

Der jStnger-XJnter bracher, ein 20 cm hoher, mit einem Deckel ver-
schließbarer Porzellantopf von 14 cm lichter Weite, dessen Lumen durch
eine Porzellanscheidewand in zwei Kammern geteilt ist, wuide mit 5- bis
7,5%iger Schwefelsäure gefüllt, in einen Topf fest eingeklemmt und mit
mittelstarkem Wasserstrahl gekülilt.

Eine Impföse Bakterienraaterial wuide in 100 ccrn abgekochtem,
sterilem Wasser in einer Rollf lasche abgespült, die Flasche mit einem
Gummistopfen verschlossen und unter fortwähiendem Schütteln 10 Minuten
in einem Wasserbad von 40® C' erwärmt, wobei der Stopfen zweimal kurz
gelüftet werden mußte. Die Bakterien werden durcli diese Wärmeeinwirkung
und naclifolgendes 10 Minuten langes Schütteln mit der Hand weitgehend
entballt. Der Keimgehalt der Aufschwemmung lag durchschnittlich bei
10^ bis 10® Keimen im ccm. Von dieser Aufschwemmung wurden 15,5 ccm
in das sterilisierte Elektrodengefäß eingefüllt. Die Flüssigkeit stand dann
gleich hoch mit den Metallbclägen (Abb. 4). Ein Toluolthermometer wurde
mit Alkohol abgewischt, abgef lammt und duich die Bohrung des Hart-
gummideckels in die Aufschwemmung gebracht. Es stand dabei auf dem

^ Die verwendeten UV-Strahler, Type Hg NQ 1350/0,43 m, der Siemens-
Schuckert-Werke hatten eine Gesamtlänge von 43 cm, eine Leuchtlänge von
30 cm und einen Durchmesser von etwa 1,3 cm. Acht Strahler waren so
angebracht, daß der Abstand von der Mitte des einen bis zur Mitte des
nächsten etwa 4 cm betrug. Die Entfemimg von der Glasplatte, auf der
die 6,5 cm hohen Bechergläser standen, bis zu den UV- Strahlern betrug 24 cm.

234

S. Hansen u. W. Sohwartz:

zweifüßigen Glasring auf. Dieser diente dazu, die innere Elektrode in
möglichst gleichem Abstand von der äußeren zu halten, um ein annähernd
homogenes elektrisches Feld zu erzielen. Das Gefäß wurde in der bereits
geschilderten Weise (Abb. 7) an den Patientenkreis angeschlossen. In-
zwischen hatte man den Unterbrecher eingeschaltet und das Kühlwasser
angestellt. Nachdem die 16-mm-Kugeln in der Funkenstrecke eingesetzt
bzw. gedreht und ihr Abstand auf 7,6 mm eingestellt worden war, wurden
das Glühventil und die Senderöhren aufgeheizt, dann Vortransformator

Abb. 7. Anschluß des Ycrsuchskrcises für Versuche mit gedämpften Schwingungen.

1. Ultra Pandoros. 2. Vcrsuchselektrode. 3. Ventilator.

und Hochspannungstransformator eingeschaltet. Die Stromstärken und
Spannungen, die an den einzelnen Apparaten lagen, sind aus der Schalt -
Skizze 1, Abb. 5, ersichtlich. Die Heizspannung der Senderöhren betrug
20 Volt.

Die Abstimmung erfolgte in der schon im ersten Teil geschilderten
Weise mittels eines Kupferdrahtringes von 126 mm Durchmesser und 2 mm
Drahtdicke, in den eine 6 Volt /0, 04 Amp. -Lampe eingeschaltet war. Die
Birne leuchtet im Hochfrequenzfeld auf. Der Kupfei drahtring wurde auf
6 bis 10 cm Entfernung, senkrecht über die Elektrodenzuleitung in un-
mittelbare Apparatnähe gebracht, wobei die Ebene der Drahtschleife
parallel zur Ebene der Elektrodenzuleitung lag. Man drehte an dem Knopf
„Abstimmung“, bis die Stelle hellsten Aufleuchtens der Birne gefunden
war. Auf den übrigen Abschnitten der Skala ging die Birne aus. Gleich-
zeitig zeigte sich die Verstimmung des Schwingkreises auch daran, daß
zwischen den Sicherheitshömem von Gitter- und Schwingkreisinduktion
Funken übersprangen. Beim erstmaligen Abstimmen wurde auch der
Knopf „Sperrkreis“ betätigt, später war das nicht mehr notwendig. Die
Wellenlänge wurde grob mittels des Knopfes „Wellenlänge“ eingestellt;

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 235

sie wurde indirekt aus der Frequenzmessung in der bereits geschilderten
Weise bestimmt.

Die Zahl der Schwingungen je Sekunde wurde mittels eines Stroboskops
festgestellt.

Die Besendungszeit betrug 10 Stunden.

Die mittlere Feldstärke war in diesen Versuchen gegenüber derjenigen
der Milchversuche wesentlich herabgesetzt. Die Erwärmung war ent-
sprechend geringer. Um 37® C maximal nicht zu überschreiten, wurde beim
Erreichen dieser Temperatur die Versuchselektrcde mittels eines Ventilators
gekühlt, der unterhalb des Holzbrettes in 6 cm Entfernung waagerecht
angebracht war und die Luft so durch das ausgesparte Loch im Holzbrett
blies, daß die V^ersuchselektrode von allen Seiten von Zugluft umstrichen
wurde (Abb. 4 und 7). Allgemein ging die Temperatur in wenigen Minuten
mehrere Grade herimter. Bei etwa 31® wurde der Ventilator wieder ab-
gestellt, lun bei 37® wieder in Betrieb gesetzt zu weiden, damit die Tem-
peratur auf annähernd 35® C blieb.

Nach zehnstündiger Besendung wurde der Keimgehalt der Auf-
schwemmung in der üblichen Weise bestimmt. Die gleichen Ver-
dünnungen und Platten wurden vbn der Kontrol lauf sch wemmung,
die während der Besendungszeit bei Zimmertemperatur gestanden
hatte, hergestellt. Der Unterschied im Keimgehalt ergab die Abtötung.

2, Ergebnisse.

Eine Reihe von sieben Versuchen zeigte gleichläufige Ergebnisse
(Tabelle VIII).

Bei den Bafcicnew.- Stämmen schwankte die Abtötung zwischen
21 und 66%. Die ^e/e-Zellen wurden überhaupt nicht geschädigt,
der Keimgehalt stieg, ebenso wie bei den Wärmekontrollen, um 50%
an. Die Hefezellen hatten 4,37 bis 5 [jl Durchmesser. Bei Azotohacter
war die 50%ige Abtötung nicht zu werten, da der Wärmeversuch, der
bei 320 jq Stunden im Wärmeschrank stand, ebenfalls eine Keim-
verminderung um 50% aufwdes. Die maximale Versuchstemperatur

Tabelle Vlll. Versuche mit verschiedenen Bakterien unter Ver-

wendung gedämpfter Schwingungen.

stamm

Alter der
Kultur

Keimgehalt
der Kontrolle
bei Zimmer-
temperatur

Keimgehalt

der

besendeten

Auf-

schwemmung

Abtötung
ln %

Üaximale
Temperatur
ln toc

Microcoocus candicans .

6 Tage

3,2*107

1 107

Micrococcus candicans .

7 „

3,6 * 107

2,3 * 107

h 90^

2 „

8,6 * 105

6,7* 105

h9(fi

6 „

4,8 • 10®

2 *105

Hefe rund

6 „

3,6*10«

6,2 * 10«

AztOobcuter ehrooeocetim

2,2 * 10»

1,1 * 10«

38,6

b9a>

4 ..

3.1 . 10«

1,8 * 10«

236

S. Hansen u. W. Sohwartz :

von 38,0^0 war also schon zu hoch gewählt. Die ^420to6acicr-Zellen
waren 1,25 bis 1,5 [x breit und 1,85 bis 2 [jl lang.

Eine 4 Wochen später angesetzte zweite Reihe von sieben Ver-
suchen (Tabelle IX) brachte dagegen in keinem Fall eine Abtötung,
obgleich die Versuche unter den gleichen Bedingungen ausgeführt
wurden. Das Alter der Bakterienkulturen dürfte keinö Rolle spielen,
da in den drei ersten Versuchen genau wie bei der ersten Versuchsreihe,
junge Kulturen verwendet wurden. Auch die Erklärung, daß durch
lange Kultivierung der Stamm die Empfindlichkeit gegen UKW.
verliert, ist unwahrscheinlich.

Tabelle IX. Versuche mit Micrococcua candicana unter Ver-
wendung gedämpfter Schwingungen.

Alter der
Kultur

Kcimgehalt der
Kontrolle bei
Zimmertemperatur

Kcimgehalt der
besendeten
Aufschwemmung

Abtötung
in %

Maximale
Temperatur
in toc

4 Tage

7,7 • 10^

8,2 . 107

36,6

5 „

1,8 • 10’

3,2*107

6 „

1,6 • 10’

1,6*107

14 „

6 -10’

7,9 . 107

4,1 • lOf-

3.9 * 10“

26 „

1,9 • 10“

1,8 * 10&

27 „

8,6 • 10«

7,6 * 10*

Trotzdem wurde anschließend ein Versuch mit dem aus Mager-
milch am 27. Oktober 1941 isolierten Streptokokkenstamm i, Strepto-
coccus lacticus (Kruse), der weniger Streptokokken als Lanzettkokken
bildet, angesetzt. Der Keimgehalt der Kontrolle: 7,2 • lO^ ging in
der besendeten Aufschwemmung auf 2,87 • 10 7 Keime zurück, d. h.
um 60%.

Da nach den bis jetzt besprochenen Versuchen vermutet werden
mußte, daß noch unbekannte Faktoren die Keimschädigung maß-
geblich beeinflussen, wurde bei den folgenden Versuchen zunächst
geprüft, wie weit etwa auch hier die Leitfähigkeit der Aufschwemmung
das Ergebnis beeinflußte. Dies wäre denkbar, da das zur Herstellung
der Aufschwemmungen und Verdünnungen benutzte Wasser nach dem
Abfiltem des ausgeschiedenen Kalkes noch wechselnde Mengen von
Ionen enthielt. Außerdem wurden verschiedene Aufschwemmungs-
medien verwendet.

^ Die von Schliephake (1935) gemachte Beobachtung, daß Strepto-
kokkenstämme sich durch starke „Mutation serecheinungen“ auszeichnen,
d. h. sich an einem Tag vollkommen anders verhalten als am nächsten und
daher für UKW. -Versuche unbrauchbar sind, konnte bei dem aus Milch
isolierten Stamm nicht stärker beobachtet weiden als bei anderen auch.

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 237

Die Messung der Leitfähigkeit erfolgte mit Hilfe der Wheatstone-
sehen Brücke und einer Tauchelektrode (Abb. 8) für geringe Flüssigkeits-
mengen. Die Meßgenauigkeit betrug ± 0,00002 Q-i cm-i.

Während in früheren Versuchen für jeden Versuch eine neue
Kultur genommen wurde, wurden die folgenden Versuchsreihen stets
mit einem Kulturröhrchen durchgeführt, um vielleicht vorhandene
Unterschiede zwischen den einzelnen Röhrchen in bezug auf Ernährung
und Feuchtigkeitsgehalt usw., die indirekt die An-
fälligkeit der Bakterien gegen UKW. verändern
könnten, auszuschalten.

Die ersten vier Versuche zeigten Keim-
schädigungen (Tabelle X), die zwischen 34 und
49% schwankten, der 7. Versuch lag mit 27%
etwas unterhalb des Durchschnitts. Verwendete
man an Stelle von abgekochtem Wasser Leitfähig-
keitswasser, dessen Widerstand so groß ist, daß
er in der üblichen Weise mit der WheatsUme-
sehen Brücke schlecht zu messen ist, so erhielt
man keine Keimschädigung (5. und 6. Versuch),
desgleichen nicht, wenn man 0,085 %ige Koch-
salzlösung benutzte (8. Versuch)^.

Eine Versuchsreihe von zehn Versuchen,
wieder von einer Kultur genommen, sollte die
zuletzt erhaltenen Ergebnisse bestätigen (Tabelle XI). widersprach
jedoch in ihrem Ausfall durchaus den Erwartungen. V'on den zehn
Versuchen w^aren nur zwei positiv ausgefallen, einer von ihnen war
24 Stunden lang dem UKW. -Feld ausgesetzt gewesen (Tabelle XI).

Zw^ei weitere \"er8uehe einer neuen Reihe zeigten, daß eine Wärme-
vorbehandlung ohne Einfluß auf den Abtötungseffekt ist (Tabelle XII).
Im ersten Versuch wurde die Aufschwemmung am Vorabend hergestellt
und über Nacht im Brutschrank bei 36^0 belassen. Im 2. Versuch
stand die Aufschwemmung über Nacht bei Zimmertemperatur, etwa 13^.

Von den letzten drei, wieder mit jungen Kulturen durchgeführten
Versuchen fielen zwei negativ aus, der dritte zeigte 17% Abtötung
(Tabelle XIII). In diesen Versuchen wurde zusätzlich das der Auf-
schwemmung am Ende des Versuchs bestimiht, um den Einfluß der

II-.

-PlßlechfSxm.-^-

tSjm.

Abb. S. Bau der Tauch-
clektrodc zur Bostiminung
der LeitfkhiKkeit des Auf-
sehweimn-Mediums.

^ Beide Aufachwemrnungsmedien werden gut vertragen, wie Kontroll-
versuche zeigten. Nach F. W. Tanner und Houston (1940) kann der NaCI-
Gelialt bis zu 1% gesteigert werden, erst 1,5- und 2%ige Lösungen hemmen
das Wachstum, während nach Schliephake und Hause (1931) Bakterien in
physiologischer Kochsalzlösung absterben. Es wurde in den vorliegenden
Versuchen nur eine 0,085 %ige Lösung verwendet, um nicht zuviel Elektro-
lyte in die Lösung zu bekommen.

4 /

238

S. Hansen u. W. Sohwartz:

H-Ionenkonzentration !
prüfen. Das pn wuri
mit dem Folienkoloi
meter nach Wulff b
stimmt. Das pn des Wa
sers ohne Bakterien, 2
Beginn des Versuchs h
stimmt, lag bei 6,4.

Wenn wir jetzt zi
sammenfassend die E]
gebnisse überblicken, s
zeigt sich folgendes : Aue
mit der vorliegenden Ap
paratur ist trotz des lang
sameren Sohwingungsein
Satzes eine Abtötung de
Bakterien möglich. Di«
prozentuale Abtötung er
reichte nicht die Höh<
wie beim Funkenstrecken
Sender. Allerdings warer.
mit den bis jetzt behan-
delten Faktoren keine ein-
heitlichen Ergebnisse zu
erzielen. Selbst die Leit-
fähigkeit reicht zur ein-
deutigen Erklärung nicht
aus. Zwar wurde keine
Abtötung bei hoher Leit-
fähigkeit erhalten, dafür
aber wechselnde Ergeb-
nisse bei geringer Leit-
fähigkeit.

Die absolute Leit-
fähigkeit lag bei abge-
kochtem Wasser als Auf-
schwemmungsmedium
zwischen 0,00030 und
0,00049, bei Mischung mit
Na CI -Lösung bei 0,000 52,
bei Na CI - Lösung bei
0,0017 bis 0,0015 und bei
Leitfähigkeitswasser bei

Tabelle XI.

ÜinfluB der Leitfähigkeit auf die Abtötung von Streptococcus lacticus (Kruse).

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 239

* 24 Standen besendet.

Tabelle X. £influß der Leitfähigkeit auf die Abtötung von Streptococcus lacticus (KrtiseJ.

238

S. Hansen u. W. Sohwartz:

H-Ionenkonzentration zu
prüfen. Das wurde
mit dem Folienkolori-
meter nach Wulff be-
stimmt. Das pe des Was-
sers ohne Bakterien, zu
Beginn des Versuchs be-
stimmt, lag bei 6,4.

Wenn wir jetzt zu-
sammenfassend die Er-
gebnisse überblicken, so
zeigt sich folgendes ; Auch
mit der vorliegenden Ap-
paratur ist trotz des lang-
sameren Sohwingungsein-
satzes eine Abtötung der
Bakterien möglich. Die
prozentuale Abtötung er-
reichte nicht die Höhe
wie beim Funkenstrecken-
sender. Allerdings waren
mit den bis jetzt behan-
delten Faktoren keine ein-
heitlichen Ergebnisse zu
erzielen. Selbst die Leit-
fähigkeit reicht zur ein-
deutigen Erklärung nicht
aus. Zwar wurde keine
Abtötung bei hoher Leit-
fähigkeit erhalten, dafür
aber wechselnde Ergeb-
nisse bei geringer Leit-
fähigkeit.

Die absolute Leit-
fähigkeit lag bei abge-
kochtem Wasser als Auf-
schwemmungsmedium
zwischen 0,00030 und
0,00049, bei Mischung mit
NaCl-Lösung bei 0,000 52,
bei NaCl - Lösung bei
0,0017 bis 0,0015 und bei
Leitfähigkeitswasser bei

Tabelle XI.

influß der Leitfähigkeit auf die Abtötung von Streptococcus lacticus (Kruse).

Einwirkling von nltrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 239

24 Standen beaeodet.

TabeUe XII.

Wirkung einer Wärmevorbehandlung auf die Abtötung von Streptococcus lacticus (Kruse),

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. 11. 241

etwa 0,00000617. Bei Verwendung von Leitfähigkeitswasser und
Kochsalzlösung, den extremen Werten in der Leitfähigkeit, wurde
keine Abtötung erzielt. Danach scheinen zu geringe oder zu große
Leitfähigkeit die Schädigung der Bakterien zu verhindern. Innerhalb
kleiner Intervalle, von 0,00037 bis 0,00049 liegt keine Beeinflussung vor.

Besendete Proben und Kontrollaufschwemmungen zeigen Unter-
schiede in der Leitfähigkeit, dabei können einmal die S- und einmal die
K- Werte höher liegen. In den Tabellen X und XI sind die Differenzen
berechnet und mit + bezeichnet, wenn K > S, mit — , wenn S > K
ist. Die Ergebnisse scheinen darauf hinzudeuten, daß eine Schädigung
der Bakterien mit einer Änderung der Leitfähigkeit, einem Größer-
oder Kleinerwerden derselben, parallel läuft. D. h. daß entweder die
Leitfähigkeit sich ändert, weil aus den abgetöteten Bakterien Ionen
frei werden, das Absterben also der primäre Vorgang ist, oder aber
daß die Bakterien infolge der veränderten Leitfähigkeit absterben,
die durch das elektrische Feld hervorgerufene Leitfähigkeitsänderung
also primär ist. Weitere Versuche in dieser Richtung sollen noch ge-
macht werden. Eine Gresetzmäßigkeit läßt sich aus diesen Werten bisher
nicht ableiten.

Auch die Temperaturverhältnisse reichen zur Erklärung der
Ergebnisse nicht aus. In den ersten zwei Versuchen der Tabelle X
lagen die maximalen Temperaturen bei 35 und 32o C. In den nächsten
Versuchen lief die Kühlung ununterbrochen, der Wärmegrad stellte
sich auf 310 ein. In allen Fällen wurde eine Abtötung erhalten, und
Kontrollversuche zeigten, daß diese Wärmegrade gut vertragen wurden.
Mithin kann die Temjjeratur der Aufschwemmung die Schädigung
nicht heBvöTgerufen haben.

Wäre allein die Temperatur ausschlaggebend, dann müßte im
letzten Versuch dieser Reihe (Tabelle X) bei Verwendung von
0,085 %iger NaCl-Lösung ebenfalls eine Abtötung eingetreten sein, denn
hier wurden bei dauernder Kühlung 34® C erreicht. Im zweiten Versuch
in Tabelle XI ist eine rund 32 %ige Abtötung zu verzeichnen bei maximal
nur 200 0, hier wurde fortlaufend gekühlt. So ließen sich noch viele
Beispiele auf zählen. Auch der berechtigte Einwand, daß bei den Kon troll -
versuchen zwar die gleiche Temperatur erreicht wurde, jedoch ohne
Kühlung, läßt sich entkräften. Wohl wird in den S-Versuchen durch
die Kühlung ein Teil der Wärme weggenommen, es wird also eigentlich
mehr Energie hineingebracht als in die Kontrollen. Aber da in allen
Versuchen trotz Kühlung die annähernd gleiche Temperatur erreicht
wurde, hätten auch alle Versuche eine Abtötung ergeben müssen, und
dies ist nicht der Fall. Man darf daraus wohl schließen, daß in diesen
Versuchen die Temperatur die Abtötung höchstens mitbedingt, aber
nicht allein dafür verantwortlich zu machen ist. Eindeutiger wäre

17 *

242

S. Hansen u. W. Schwartz :

die Temperaturfrage zu beantworten, wenn man auf die Kühlung
ganz verzichten könnte. Dies ist wiederum bei der vorliegenden Appa-
ratur nicht möglich, weil man dazu mit der Energie zu weit herunter-
gehen müßte, andererseits aber eine untere Energiegrenze, einen
Schwellenwert erreichen muß, um eine Abtötung zu erhalten.

Die Wirkung der UKW. auf biologische Objekte hängt nicht
allein von der während der Behandlungsdauer absorbierten Energie
ab, sondern auch von der im Behandlungsabschnitt in der Zeiteinheit
absorbierten Energiemenge (RajewsM, 1938). Nach Sanier und Schwartz
(1939) ist die Bakterienzelle nicht an allen Stellen gleich empfindlich,
sondern sie besitzt drei lebenswichtige Zentren i, von denen mindestens
eines die Hochfrequenzleitfähigkeit haben muß, die es befähigt, ein
Maximum an Energie zu absorbieren. Erst dann stirbt die Zelle ab.
Sehen wir von der Möglichkeit chemischer oder physikalisch-chemischer
Umwandlungen in der Zelle ab, so ruft die Energieabsorption auf alle
Fälle im Zellinneren eine Erwärmung hervor, die nicht meßbar ist,
die sich daher auch auf die Aufschwemmung nicht auswirkt, anderer-
seits aber letal wirken kann. Groag und Tomberg (1934) sprechen daher
von ,, quasi elektrischen Wirkungen“, da diese Art der Erwärmung
auf anderem Wege als durch UKW. nicht zu erreichen ist. Wenn
daher in der vorliegenden Arbeit zwischen thermischen und spezifischen
Wirkungen unterschieden wurde, so heißt das, daß bei thermischer
Schädigung das Aufschwemmungsmedium einen für die Bakterien
tödlichen Wärmegrad erreichte, bei der spezifischen Wirkung dagegen
möglicherweise Wärme innerhalb der Zelle entsteht, ein Wärmeabfall
also von innen nach außen stattfindet. Durch die Kühlung (Ventilator)
wird die Temperatur der Aufschwemmung herabgesetzt, die Erwärmung
innerhalb der Zelle dagegen keineswegs beeinflußt. Die Möglichkeit,
daß nur der letzte Faktor die Schädigung bedingt, ist dadurch gegeben.
Damit wird die Annahme, daß der Verschiebungsstrom die wirksame
Komponente ist, weitgehend gestützt.

Aus den wenigen pn-Messungen läßt sich über den Einfluß desselben
auf die Abtötung nichts aussagen. Dagegen besteht durchaus die Möglich-
keit, daß einzelne Stämme verschieden anfällig gegen UKW. sind.
Die Hefe ist z. B. widerstandsfähiger als die geprüften Bakterien-
Stämme.

Die von Sanier und Schwartz (1939) unter anderen Versuchs-
bedingungen festgestellte Abhängigkeit der Abtötung vom Keimgehalt
der Aufschwemmung, wonach der Keimgehalt bei jungen Kulturen

^ Siehe auch die von Sauter und Schwartz angeführten Arbeiten von
Schubert (Habil. schrift, Königsberg), Hercik (1933), Möhler u. Taylor (1935)
und Lea, Haines u. Cotdson (1936).

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen II. 243

(36 Stunden) zweckmäßig 10® bis 10® Keime /ccm, bei alten Kulturen
(14 Tage) 10® bis 10^ Keime betragen soll, um annähernd eine 100 %ige
Abtötung zu erhalten, konnte nicht beobachtet werden. Es wurde einer-
seits sowohl bei 6 Monate alten Kulturen beim Keimgehalt von 10^,
als auch bei 5 Tage alten Kulturen bei 10 ^ Keimen eine Abtötung
erhalten, während in anderen Versuchen weder bei 4 Tage alten Kulturen
und 107 Keimen, noch bei 23 Tage alten Kulturen und 10^ Keimen
eine Abtötung erzielt wurde. Diese Beobachtung wurde sowohl bei
Micrococcua candicans als auch bei ö 90^ und Streptoccocua gemacht.

Es bleibt also nur noch die Annahme, daß noch weitere, bis jetzt
unbeachtet gebliebene Faktoren mitgewirkt haben können. Derartige
Faktoren sind in der Wetterlage zu suchen.

S. Einfluß der Wetterlage,

Nach den Feststellungen, die z. B. Rvdder (1938) und Borteis (1942)
gemacht haben, wäre vor allem an einen Einfluß des Wetters auf den
Zustand der Bakterienzellen und damit auf das Ergebnis der Versuche
zu denken. Borteis verwendet «als Maßstab die Änderung der Hoch-
und Tiefdruckgebiete. Er stellte z. B. fest, daß Bakterien bei einem
herannahenden Hoch eine gesteigerte Lebenskraft besitzen und dadurch
widerstandsfähiger gegen Speichel-Inhibine sind, w^ährend sie umge-
kehrt vor einem Tief leichter und stärker durch die Inhibine gehemmt
werden. Er unterscheidet dabei, ob der Versuchsort im zentralen
Bereich des Tiefs, im inneren oder äußeren Randgebiet desselben, im
indifferenten Randgebiet zwischen Hoch und Tief, im äußeren oder
inneren Randgebiet eines Hochs oder im zentralen Bereich eines Hochs
liegt. In Analogie zu den Ergebnissen von Borteis könnten also die
Bakterien auch vor einem Tief leichter durch UKW. geschädigt werden,
während sie bei einem herannahenden Hoch widerstandsfähiger sind

Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurden die Versuche zur jeweiligen
Wetterlage in Beziehung gesetzt (Tabelle XIV, Abb. 9), außerdem für
die gleichen Versuche Stromstärke und Spannung des Niederspannungs-
stromes sowie die Hochspannungsstromstärke eingetragen, um einen
Anhalt für die Leistung zu gewinnen. Als Maßstab der Wetteränderung
diente zunächst der örtliche Luftdruck, gemessen in mm Hg, wobei
das Wetter jeweils schon mindestens 2 Tage vor und nach dem Versuchs-
tag mitberücksichtigt werden muß, damit man den Verlauf der Änderung
besser verfolgen kann. Der Vergleich der Wetterkarte mit dem Ergebnis
der einzelnen Versuche läßt erkennen, daß ein Zusammenhang beider
mindestens recht wahrscheinlich ist. Die Lebensfähigkeit der Bakterien
wird durch ansteigenden Luftdruck so gesteigert, daß sie der UKW.-
Wirkung besser standhalten können. Die Versuche 6, 7, 9, 10, 13, 14

244

S. Hansen u. W. Schwartz :

Tabelle XIV. Übersicht über Versuche mit Streptococcus lacticus
unter Berücksichtigung der aufgewandten Leistung.

Lfd.

Nr.

Mllliamp.

Hoch-

Volt Unter-
spannungs-

Produkt

Aufschwemmu ngsmedium

Ab-

tötung

Spannung

des Trafos

MiUiamp. X Volt

in %

100-110

736

85- 90

860

41,9

8-10

86-110

810

> Abgekoohtes HgO

7-10

110

860

8-10

810

7 10

100-106

900

Leitfähigkeitswasser

7- 8

100

760

Leitf&higkeitBwasser

630

Abgekoebtes HgO

8- 9

100

860

0,086 %ige NaCl-Lösung

Abgekochtes HgO

6-12

80-105

810

600 ccm HgO

400 „ Leitfähigkeitswasser

9-10

95-100

960

0,085 %ige NaCl-Lösung

9-10

96-100

960

900 ccm Hj 0

100 „ 0,086 %ige NaCl-

Lösung

—

106

600 ccm HgO

400 ,, Leitfähigkeitswasser

8- 9

100

860

700 ccm HgO

300 „ Leitfähigkeitswasser

7- 9

90-100

760

7- 8

100

760

8-12

100

900

6- 7

100

660

7— 9

110

770

880

Abgekochtes H 2 O

6- 6

110

600

6- 6

110

600

106-110

630

660

1 17,7

15, 21, 22 und 24 zeigen dies eindeutig. Ebenso klar liegen unter ent-
gegengesetzten Bedingungen die Verhältnisse bei den Versuchen 1, 2,
3, 4, 8, 11, 18 und 20. Hier sind die Bakterien durch das vordringende
Tief geschwächt, so daß sie durch die UKW. -Einwirkung abgetötet
werden.

Bei Versuchen 9 und 12 wurde an Stelle von abgekochtem Wasser
0,085 %ige NaCl-Lösung zur Aufschwemmung verwendet. Obwohl die
angewandte Energie besonders in Versuch 12 über dem Durchschnitt
lag, fand trotz eines herannahenden Tiefs keine Abtötung statt. Diese
Feststellung bestätigt die Vermutung, daß bei Verwendung einer
0,085 %igen NaCl-Lösung keine Abtötung erfolgt, weil das Verhältnis
von Verschiebungsstrom zu galvanischem Strom zugunsten des galvani-
schen Stromes verschoben wird, im Zell inneren infolgedessen keine
maximal^ Absorption stattfindet.

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 245

Die Versuche 14 und 15 sind mit Leitfähigkeitswasser durchgeführt
worden und ergaben beide keine Abtötung. Das Ergebnis ist um so

unerklärlicher, als gerade hierbei das Verhältnis von Leitimgs- zu
Verschiebungsstrom weitgehend zugunsten des letzten verschoben ist

246

S. Hansen u. W. Schwartz :

Beide Versuche sind aber bei herannahendem Hoch durchgeführt
worden, so daß bei Berücksichtigung der Wetterlage eine Abtotung
nicht erwartet werden konnte. In der Zwischenzeit durchgeführte
Versuche haben gezeigt, daß unter günstigen ,, Wetterbedingungen“
eine Abtötung eintritt.

Die Versuche 16 und 23 lassen sich vielleicht damit erklären, daß
der vorhergehende Druckanstieg sehr steil war, die Bakterien dadurch
möglicherweise besonders gestärkt wurden, so daß eine Abtötung trotz
des herannahenden Tiefs ausblieb.

Bei Versuch 19 wurde auf einem absteigenden Ast der Kurve
keine Abtötung erhalten, obwohl die Bakterien geschwächt sein müßten.
Die angewendete Energie war ziemlich klein, so daß möglicherweise
der Ausfall darauf zurückgeführt werden kann (vgl. Tabelle XIV).
Unverständlich in bezug auf Veränderungen des örtlichen Luftdrucks
allein bleiben vorerst die Ergebnisse der Versuche 17 (keine Abtötung
bei absteigender Kurve), 5 und 25 (Abtötung am aufsteigenden Ast
der Wetterkurve), wobei noch besonders zu beachten ist, daß die in
Versuch 25 zugeführte Energie die kleinste aller Versuche war. Setzt
man jedoch an Stelle des örtlich gemessenen Luftdrucks die Groß-
wetterlage und beachtet die Tendei^z der Hoch- und Tiefdruckgebiete,
sich gegeneinander zu verlagern, abzuschwächen oder aufzufüllen, so
zeigt sich, daß die Versuche 5 und 25 sowie die unbefriedigend ge-
deuteten Versuche 16 und 19 erfaßt werden können. Während die
Wetterkurve der örtlich gemessenen Luftdrucke für die Versuche 16
und 19 einen Übergang vom Hoch zum Tief vermuten läßt, zeigt die
Großwetterlage, daß sich Karlsruhe am Versuchstag des 16. Versuchs
im äußeren Randgebiet eines Hochs befand. Bis zum nächsten Tag
näherte sich das Hoch wenig, während ein Tief herankam und Karls-
ruhe damit in die indifferente Zone zwischen einem Hoch und Tief zu
liegen kam.

Bei Versuch 19 zeigt die Gesamtwetterlage einen Übergang vom
indifferenten Gebiet in das äußere Randgebiet eines Hochs, während
der örtliche Luftdruck fallende Tendenz auf weist. In beiden Fällen
konnte also eine Abtötung nicht erwartet werden.

Gerade umgekehrt liegen die Verhältnisse für die Versuche 5 und 25.
Hier ist ein klarer Übergang vom äußeren Randgebiet eines Hochs
zum äußeren Randgebiet eines Tiefs in Versuch 5, und ein Übergang
von der indifferenten Zone zum äußeren Randgebiet eines Tiefs in
Versuch 25 zu erkennen, weshalb also eine Abtötung ein treten mußte.
Der örtliche Luftdruck stieg dabei in beiden Fällen an.

Die Ergebnisse der Versuche 17 und 23 lassen sich weiterhin nicht
erklären.

Es dürfte also mit ziemlicher Sicherheit erwiesen sein, daß tatsächlich
ein Zusammenhang zwischen Wetterlage und Anfälligkeit der Bpikterien

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 247

besteht. Allerdings zeigt sich bei den positiven Versuchen immer noch
eine erhebliche Schwankung im Ausmaß der Abtötung zwischen 20
und 60%, ferner bleibt ein unerklärlicher Rest von 10% der Gesamt-
zahl der Versuche zurück. Bei Verwendung des Funkenstreckensenders
{Sanier und Schwarz, 1939) kam ein Wetterfaktor überhaupt nicht zur
Beobachtung, weil wahrscheinlich höhere maximale Feldstärken auf-
traten, die selbst bei ungünstiger Wetterlage zur Abtötung der Bakterien
ausreichten. Eine weitere Bearbeitung dieser Fragen ist also erforderlich.

Über die Natur des wirksamen Faktors kann vorerst nichts aus-
gesagt werden. Die Kennzeichnung der allgemeinen Wetterlage oder
die Angabe des örtlichen Luftdrucks dienen nur als vorläufiger Anhalts-
punkt zur Darstellung der Zusammenhänge. Es wäre sogar denkbar,
daß nicht einmal das Wetter unmittelbar, sondern ein sowohl die
Wetterentwicklung wie die Anfälligkeit der Bakterien beeinflussender
Faktor das eigentlich wirksame ist.

Zusammenfassuiig.

Versuche mit ungedämpften Schwingungen.

1. Ungedämpfte Ultrakurzwellen (A = 5,5 m) hoher mittlerer Feld-
stärken rufen in Medien guter Leitfähigkeit (L ~~ 0,005 0“^ cm-i) eine
Erwärmung hervor. Die Erwärmung kann so hoch werden, daß die
in der Aufschwemmung enthaltenen Bakterien absterben.

2. Der Prozentsatz der abgestorbenen Zellen ist abhängig von der
Temperaturerhöhung, die ihrerseits wieder von der I.eitfähigkeit der
Aufschwemmung abhängt; je größer die Leitfähigkeit, um so höher
die Erwärmung, um so stärker die Abtötung.

3. Der in der Aufschwemmung fließende Leitungsstrom ruft also
die Temperaturerhöhung hervor, die letal wirken kann.

4. Die Ergebnisse wurden sowohl mit wässerigen Bakterien-
aufschwemmungen wie mit Mager- und Vollmilch erzielt. Bei ent-
sprechenden Versuchsbedingungen wurden die Keime zu über 90%
abgetötet.

5. Die Aufrahmung der UKW. -behandelten Milch wird herab-
gesetzt, sie ist jedoch besser als die der hochpasteurisierten Vollmilch.

6. Eine Entkeimung der Milch mittels hochfrequenter Wechsel -
fei der dürfte gegenüber den zur Zeit üblichen Pasteurisierungsverfahren
keinen Vorteil bieten.

Versuche mit gedämpften Schwingungen.

1. Unter Einhaltung bestimmter Bedingungen ist es möglich, mit
einem Ultrakurzwellen- Gerät in Gegentaktschaltung, das mittels eines
Hochspannungstransformators und einer Funkenstrecke stoßweise be

248

S. Hansen u. W. Schwartz:

trieben wird, Bakterien bei Temperaturen unterhalb 400C und bei
einer zehnstündigen Einwirkung des UKW. -Feldes abzutöten.

2. Die Abtötung wird nicht, oder jedenfalls nicht allein, durch die
Temperatur der Aufschwemmung erzielt.

3. Selbst bei gleichbleibenden Bedingungen sind etwa 50% der
Versuchsergebnisse widerspruchsvoll. Die Ursache kann darin liegen,
daß bis jetzt noch nicht kontrollierte Faktoren unter den gegebenen
Versuchsbedingungen das Resultat mitbestimmen.

4. Die Wetterlage, deren Einfluß auf mikrobiologische Vorgänge
aus Versuchen von Borteis und anderen bekannt geworden ist, erwies
sich auch im vorliegenden Fall als wesentlicher, die Ergebnisse beein-
flussender Faktor, wobei nicht nur der örtlich gemessene Luftdruck,
sondern die Gesamt Wetterlage als Maßstab herangezogen werden muß.

5. Die Bakterien werden bei einem herannahenden Tief geschädigt,
während sie bei einem hcrannahenden Hoch die UKW. -Behandlung,
die jeweils unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde, ver-
tragen.

6. Ob tatsächlich die Druckverhältnisse oder eine andere Kompo-
nente des Wetters die entscheidende Rolle spielen, muß dahingestellt
bleiben. Es wäre sogar denkbar, daß es sich um einen Faktor X handelt,
der sowohl die ,, Wetterlage“ wie die Bakterien beeinflußt und so eine
direkte Abhängigkeit der Bakterien vom Wetter vortäuscht. Die
,, Wetterlage“ kann also zunächst nur als Kriterium angesehen werden.

7. Die Leitfähigkeit des Aufschwemmungsmediums ist anscheinend
auch unter Berücksichtigung der Wetterlage von Einfluß auf die Ab-
tötung.

8. Selbst unter Berücksichtigung der ,, Gesamtwetterlage“ bleibt
der Ausfall von etwa 10 % der Versuche vorerst noch unerklärlich, so
daß die Beteiligung weiterer Faktoren, die übrigens auch in den schwer
zu überblickenden physikalischen Versuchsbedingungen liegen können,
nicht ausgeschlossen ist.

9. Sämtliche bisher geprüften Bakterienarten — h 90^ aus Erde,
Micrococcus candicans, Streptococcus lacticus (Kruse) — erwiesen sich
als anfällig gegen Ultrakurzwellen, jedoch scheint der Grad der
Empfindlichkeit verschieden zu sein. Es gelang bisher nicht, Hefe
abzu töten.

Literatur.

Arbeiten a. d. preuß. Versuchs- u. Forschungsanstalt f. Milchwirtschaft
in Kiel : Prüfung an Hoch- und Momenterhitzern. Berlin SW 48, Verlag
d. milchwirtsch. Zeitung, 1931 u. 1932. — - Bertels^ H., Centralbl. f. Bakt. II,
104, 189, 1942. - Oale, M. D„ u. D, MiOer, New York. N. Y. J. of Lab.
a. Clin. Med. 21, 31, 1936. — Qrasaer, H.y Med. Klin. 32, 706, 1936. —
Qroag^ V. Tomberg ^ Wien. klin. Wochenschr. 47, 267, 1934. — Haase, IT.,

Einwirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroorganismen. II. 249

u. E. ScMiephake, Strahlentherapie 40, 133, 1931. — Hauaser, I,, Sitzungs-
her. d. Heidelberger Akad. d. Wissensch. 1939, 4. Abhandlung. — Hercik, F.,
Strahlentherapie 47, 374, 1933. — Lea, D. E., R. B, Haines \x.C. A. CotUson,
Proc. Roy. Soc. London (B) 120, 47, 1936. — Lehmann u. Neumann, Atlas
und Grundriß der Bakteriologie. München, Lehmanns Verlag, 1912. —
Lentze, F., Centralbl. f. Bakt. 1, 126, 608, 1932. — Liebesny, P., L. Wertheim
u. Scholz, Klin. Wochenschr. 12, Nr. 4, 1933. — Li^esny, P., Wien,
klin. Wochenschr. 47, 65, 1934. — Derselbe, Strahlentherapie 66, 109, 1936. —
Möhler, F, L., u. L. S, Taylor, Amer. J. Röntgenol. a. Radium Therap. 84,
(1), 89, 1935. — Oettingen, K. V., Strahlentherapie 41, 261, J931. — Oster-
tag, B., Deutsch, med. Wochenschr. 68, 1240, 1932. — Paulian, M. D.,
u. J. Bistriaeano, Bullet, de TAcademie de Medicine 116, 883, 1936. —
Rajewski, B., Ergehn, d. biophysikalischen Forschg. 1, 52, 1938. — Reiter, P.,
Zeitschr. f. Neurologie u. Psychiatrie 166, 382, 1936, I., II., III. — Rudder,
B. de, Grundriß einer Meteorobiologie des Menschen. Berlin, Springer,
1938. — Sanier, E., u. W. Schwartz, diese Zeitschr. 10, 189, 1939. — Schliep-
hake,E., Kurzwellentherapie, 2. Aufl. 1935. Verlag G. Fischer, Jena. —
Derselbe, Münch, med. Wochenschr. 1941, S. 626. — Steinhäuser, A.

Strahlentherapie 68, 79 — 89, 1941. — Tanner, F. W., u. C. W . Houston,
Centralbl. f. Bakt. II, 102, 353, 1940. — Tomberg, V., Strahlentherapie 60,
373, 1937. — Weiß, H., J. Fiele, F. Tomberg, Klin. Wochenschr. 16, 750,
1937.

Eine russische Arbeit von K. F. Firsowa : Zur Frage der bakteriziden
Wirkung von ultrakurzen Wellen auf Mikroben, Akaci. d. R. A. 14, Lenin-
grad 1940, konnte nicht berücksichtigt werden.

(Aus dem Institut für Mikrobiologie der Universität Göttingen.)

Weitere Untersuchimgen über den Abbau
der Cellulose

durch Bacillus cellulosae-dissolvens Khouvine.

Von

Rudolf Meyer.

Mit 15 Textabbildungen.

(Eingegangen am 10. April 1943.)

Zur Reinzüchtung des zuerst von Omelianski ausführlich beschrie-
benen Erregers der Cellulosegärung (anoxydativen ^ nach Bemhauer)
eignet sich bisher immer noch am besten das von Khouvine (1) ein-
geführte Wasch verfahren, mit dessen Hilfe ihr erstmalig die Rein-
züchtung dieses Bakteriums gelang. Dem Wasch verfahren haften zwar
noch Bedenken an, und es wurden daher mehrfach Versuche unter-
nommen, das Reinzucht verfahren auch dieses Bakteriums nach dem
.ffocÄschen Plattengußverfahren durchzuführen; aber die besonderen
Eigentümlichkeiten dieses Organismus und die Beschaffenheit der
Kulturmedien gestatten keine strenge Einhaltung der Grundsätze,
auf denen das iTocfesche Verfahren beruht, so daß diese Versuche bisher
unbefriedigend bleiben mußten.

Nach dem iLÄow?;ineschen Verfahren gelangt man zu einem Organismus,
der im wesentlichen dem von Omelianski und den meisten späteren Forschern
beschriebenen entspricht. Vom Verfasser wurde festgestellt, daß zu Beginn
der Entwicklung, bevor die Gärung einsetzt, in der Kultur eine lebhaft bewegliche
Spindelform dieses später Stäbchen-, bei der Sporenbildung trommelschlegel-
förmigen Bakteriums vorwiegt, auf die wahrscheinlich der vor Beginn der Gärung
zu beobachtende Sauerstoffverbrauch der Kultur zurückzuführen ist^. Erst
aus dieser Form entwickelt sich dann später, mit einsetzender Gärung, nachdem
sich die Spindeln der Cellulosefaser angelegt haben, die Stäbchenform, die den
eigentlichen Abbau der Cellulosefaser durchführt. Neben diesen genannten
Formen wurden aber auch von verschiedenen Autoren faden- und zitronen-
förmige Entartungen dieses Organismus und alle Übergänge zwischen diesen
und den „normalen“ Formen auf gefunden, so daß der Zusammenhang zwischen
allen diesen Formen außer Zweifel steht

Hinsichtlich des Stoffwechsels kann festgestellt werden, daß beim Abbau
der Cellulosefaser in der künstlichen Kultur an gasförmigen Bestandteilen in
erster Linie Kohlendioxyd auftritt; es ist aber wahrscheinlich, daß dieses nur
zum Teil unmittelbar beim Abbau der Cellulosefaser entsteht, und daß ein Teil

1) Vgl. jedoch S. 266 und R. Meyer (3). — *) Von V. Meyer wird allerdinga
ein solcher Zusammenhang bestritten.

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

251

desselben erst durch die ebenfalls als Stoffwechselprodukte auftretenden organi-
schen Säuren aus dem zur Neutralisation der Nährlösung zugesetzten Calcium-
carbonat freigemacht wird. Neben dem Kohlendioxyd beobachtet man an gas-
förmigen Bestandteilen in weit geringerer Menge, und auch nicht immer, Wasser-
stoff. Das von Omelianski beobachtete Methan ist aller Wahrscheinlichkeit
nach auf die Tätigkeit von verunreinigenden Begleitorganismen zurückzuführen,
die in seinen Kulturen noch vorhanden waren. Spätere Autoren haben dieses
Gas höchstens in so geringer Menge gefunden, daß sie innerhalb der Analysen-
fehler liegen. Ebenso wird es sich mit dem Schwefelwasserstoff verhalten, den
man ziemlich regelmäßig in den Cellulosezersetzerkulturen beobachten kann.
An nicht gasförmigen Stoffwechselprodukten tritt neben den organischen Säuren
auch Äthylalkohol auf.

Fehlerquellen bei der Reinzfiehtung des Cellulosezersetzers.

Weiterhin glaubten der Verfasser [Ä. Meyer (3)] und dann auch
Khouvine^Soeters, Pochcm (1) und Imsenecki (6) festgestellt zu haben,
daß der Cellulosevergärer — gegebenenfalls nach Gewöhnung — auch
in zellulosefreien Medien (Bouillon, Glucose-Nährlösung) gedeihen kann.
Es gelang Verfasser sogar, nach vielen Bouillonpassagen den Cellulose-
zersetzer wieder in der reinen Cellulose-Mineral-Nährlösung^ zum An-
wachsen zu bringen. Die ersten Bedenken entstanden jedoch, als es
selbst in mehr als 100 Versuchen nicht gelingen wollte, Einzellkulturen
des Cellulosezersetzers in Bouillon oder auf Bouillon -Agar zum An-
wachsen zu bringen, weder bei Übertragung von Sporen noch bei
Übertragung von vegetativen Stäbchen. Auch beim Einträgen einzelner
von Stäbchen besetzter Cellulosefasern in Bouillon erfolgte in den
meisten Fällen kein Wachstum; wenn ein solches jedoch eintrat, dann
handelte es sich nicht um Cellulosezersetzer 2. Die Bedenken des Ver-
fassers wurden jedoch verstärkt, als bei den Weiterimpfungen Unregel-
mäßigkeiten bei der Farbstoffbfldung beobachtet wurden. Jedoch
war zunächst nicht einzusehen, woher die Verunreinigungen in den
Kulturen stammen sollten. Gelegentliche unbeimpfte Kontrollen mit
Cellulose-Mineral-Nährlösung hatten zu Bedenken keinen Anlaß ge-
geben; und bei Zimmertemperatur konnte diese Nährlösung im sterili-
sierten Zustande länger als ein Jahr unverändert auf bewahrt werden.

Um aber Gewißheit über die Berechtigung der erwähnten Bedenken
zu erhalten, wurden nochmals zunächst zwei unbeimpfte Kontrollen
der in üblicher Weise sterilisierten CeDulose-Mineral-Nährlösung (Dampf-
topf fraktioniert, bei anderen Versuchen auch Autoklav Stunde

^ Verfasser benutzte anfangs eine solche folgender Zusammensetzung:
Best. Wasser 1000 ccm, KgHP 04 puriss. Merck 1,0 g, (NH 4 )jHP 04 p. A. Merck
1,0 g, MgCls p. A. Merck 0,6 g, Kreide 12,0 g, Filtrierpapier 8,0 g. Vgl. auch
i?. Meyer (1) u. (3). Abänderungen siehe weiter unten. — * Zuerst glaubte
Verfasser, daß diese Verunreinigungen aus dem Abschlußwasser auf dem Hohl-
schliff stammten.

252

R. Meyer:

bei 1300 C) einige Zeit bei 37® C im Brutschrank aufgestellt. Bereits
nach 14 Tagen stellte sich das überraschende Ergebnis heraus, daß sich
in einer dieser Kulturen nicht nur gewöhnliche sporenbildende Stäbchen,
sondern auch ein Gelluloaezersetzer entwickelt hatten. Eine Wieder-
holung dieses Versuchs mit 5 Kontrollen ergab das gleiche. Es entstand
nun die Frage, mit welchem der Bestandteile der Cellulose-Mineral-
Nährlösung die Verunreinigung eingeführt worden war, die sogar die
Sterilisationsmaßnahmen überstanden hatte. Die löslichen Bestandteile
schieden ohne weiteres aus. Der Verdacht konnte sich also auf das
Calciumcarbonat, das als Kreide, und die Cellulose, die als Filtrierpapier
gegeben waren, beschränken.

Zur Klärung dieser Verhältnisse wurde folgender Versuch angesetzt:
9 Gärkolben mit je 250 ccm Inhalt wurden mit Cellulose-Mineral -Nährlösung
beschickt; jedoch wurde in 5 von ihnen das Calciumcarbonat nicht gleich hinzu-
gesetzt, sondern zunächst getrennt in 100 ccm Jenaer Erlenmeyerkolben in
etwas Nährlösung ohne die Cellulose getan. Die Gärkolben wurden zweimal
bei 130® C autoklaviert mit einer ZwischeAzeit von zwei Tagen, während welcher
sie im Brutraum bei 37® C aufgestellt waren; kurz vor dem zweiten Autoklavieren
wurden sie bis 12 mm Hg evakuiert, um etwa okkludierte Luft zu entfernen.
Die Erlenmeyerkolben mit der Kreide wurden im Dampftopf sterilisiert. Die
restlichen Gärkolben und Erlenmeyerkolben wurden gerade so behandelt, nur
waren hierbei die Rollen von Kreide und Cellulose vertauscht. Nach der Sterili-
sation wurde die Kreide bzw. Cellulose aus den Erlenmeyerkolben unter Be-
achtung der Sterilerhaltung den Gärkolben ein verleibt. Sämtliche Gefäße
wurden unbeimpft im Brutraum bei 37® C aufgestellt.

Bereits nach vier Tagen hatten sämtliche 9 Gärgefäße Unterdrück
hergestellt ^ Nach 22 Tagen zeigten vier von den fünf Gefäßen mit
autoklaviertem Kalk Andeutung von Cellulosezersetzung (Welken der
Cellulosestreifen, bei einigen beginnende Farbstoff bildung), wenn auch
in verschiedenem Maße. Dagegen war bei den Gefäßen mit auto-
klavierter Cellulose noch kaum eine Andeutung eines Celluloseabbaues
festzustellen. Diese wurde hier erst nach 40 Tagen bemerkbar und blieb
während der ganzen Versuchsdauer von 104 Tagen hinter der der ersten
5 Gärgefäße zurück. Nach diesem Ergebnis möchte man geneigt sein,
die Verunreinigung in der Cellulose zu vermuten. Dem ist aber nicht
so, wie der folgende Versuch zeigt.

Zugleich mit dem eben genannten Versuch wurde noch ein weiterer an-
gesetzt, bei dem die gleiche Cellulose verwendet wurde, wie in dem obigen, bei
dem jedoch die Kreide ersetzt wurde durch das Jfercksche Präparat „Calcium
carbonicum präcipitatum p. A.“*. Die fünf für diesen Versuch verwendeten
Gärgefäße wurden nuf im Kocäschen Dampftopf fraktioniert (dreimal) sterilisiert
mit eintägiger Unterbrechung, während welcher die Gefäße bei 37® C im Brut-
raum aufgestellt wurden.

^ Vgl. R* Meyer (3), — ■ Dieses benutzte Verfasser früher nur für gas-
stoffwechselanai3rtl8che Versuche.

TJntersuchungen über den Abbau der Cellulose. 253

Während der ganzen Versuchsdauer von 104 Tagen wurde in diesen
Gefäßen weder die Entstehung eines Unterdruckes noch die geringste
Veränderung an der Cellulose beobachtet. Auch mikroskopisch war
keinerlei Veränderung an der Cellulose noch die Anwesenheit irgend-
welcher Bakterien festzustellen. Die verunreinigenden Keime können
sich demnach nur in der Kreide befunden habend. Und nach dem ersten
Versuch sieht es merkwürdigerweise fast so aus, als ob das Autoklavieren
der Kreide das Wachstum der darin enthaltenen Keime noch gefördert
hätte. Das Verhalten dieser aus der Kreide stammenden Keime war
allerdings in den verschiedenen Gefäßen recht verschieden; manche
daraus entstandenen Kulturen zeigten Farbstoffbildung, bei anderen
verwelkten die Cellulosestreifen ohne Farbstoffbildung.

Die Versuche haben also gezeigt, daß zur Sterilisation von Nähr-
lösungen, die technisches Calciumcarbonat enthalten, die bisher ver-
wendeten Sterilisations verfahren nicht ausreichen. Für die Cellulose-
Mineral-Nährlösung ist daher die Verwendung reinsten gefällten
Calciumcarbonates unerläßlich ; aber auch dann empfiehlt sich noch die
Anwendung sorgfältigster Sterilisationsmaßnahmen.

Die Mitteilung dieser an sich negativen Ergebnisse hätte sich er-
übrigt, wenn sie nicht für spätere Versuche mit dem Cellulosevergärer
einige Bedeutung hätten und eine Überprüfung aller bisher mit dem
Cellulosevergärer ausgeführten Versuche erforderlich machten. Denn
es muß nun natürlich nachgeprüft werden, wieweit bei diesen Versuchen
den nach dem oben Gesagten zu stellenden Forderungen entsprochen
wurde. Zwar werden die (spärlichen) cytologischen Ergebnisse früherer
Untersuchungen hierdurch kaum berührt; denn in den untersuchten
Kulturen sind natürlich Cellulosezersetzer überhaupt vorhanden ge-
wesen, wenn sie in den fortlaufenden Überimpfungen auch nicht not-
wendig voneinander abstammen mußten. Ebenso werden die morpho-
logischen Ergebnisse der früheren Untersuchungen kaum korrigiert
zu werden brauchen; es wäre wohl denkbar, daß eine Form, die einer
Verunreinigung zugehört, dem Cellulosezersetzer zugeschrieben wurde;
aber die meisten Autoren haben nur die Trommelschlegelform als den
eigentlichen Cellulosezersetzer beschrieben. Demgegenüber würde aber
eine in der Kultur vorhandene Verunreinigung die stoffwechselphysio-
logischen Ergebnisse früherer Untersuchungen vielmehr beeinflussen
können (z. B. der Methangärer Ormlianskis).

Nun geben leider die Arbeiten der verschiedenen Autoren nicht
immer eine ausreichende Auskunft darüber, welchen Reinheitsgrad die
von ihnen verwendeten Chemikalien hatten und welcher Art die Sterili-
sationsmaßnahmen waren; ein Zeichen, daß dieser Frage oft ein zu

^ Vgl. auch L,E,den Dooren de Jong, diese Zeitschr. 9, 224, 1938.

254

R. Meyer:

geringes Gewicht beigelegt wurde. Zuweilen pflegt man ja absichtlich
— mit Rücksicht auf etwa erforderliche Spurenstoffe — den weniger
reinen Präparaten den Vorzug zu geben, ln der folgenden Übersicht
habe ich die in Frage stehenden Angaben zusammengestellt, soweit sie
den betreffenden Arbeiten zu entnehmen waren.

P. Clausen: Cellulose: ehern, rein (Döhn Sauer, Leipzig-Plagwitz). — Calcium-
carbonat: Kreide. Sterilisation: KocÄscher Dampftopf; fraktioniert.

C. Coolhaas: Cellulose: Filtrierpapier. -- Calciumcarbonat: keine Angaben. —
Sterilisation: Angaben fehlen.

Ph.B.Cowles u. L,F.Rettger: Cellulose: Filtrierpapierstreifen. — Calcium-
carbonat : Qualität aus den Angaben nicht zu entnehmen. — Sterilisation :
Autoklav (Temperatur?).

K. F. Kellerman u. 1,0. Mc Beth : Cellulose : chemisch rein (für die Kulturplatten).
— Calciumcarbonat: keine Angaben. — Sterilisation: genauere Angaben
fehlen.

Y , Khouvine: Cellulose: Papier Berzüius oder aus Schweitzers Reagens gefällte
Cellulose. ~ Calciumcarbonat: keine genauen Angaben. — Sterilisation:
Autoklav, 2 Stunde bei 110®C.

F. Löhnü u. O. Lochhead: Cellulose: ehern, rein (König et* Co., Leipzig-Plagwitz). --
Calciumcarbonat: keine Angaben. — Sterilisation: keine Angaben.

R. Meyer: Cellulose: Filtrierpapierstreifen. — Calciumcarbonat: Kreide. —
Sterilisation : KocAscher Dampftopf, fraktioniert, oder Autoklav, Stunde
bei 130® C.

V. Meyer: Cellulose: Filtrierpapierstreifen. — Calciumcarbonat: Kreide. —

Sterilisation: Autoklav, Stunde bei 110® C.

W, Omelianski : Cellulose : Cellulosen verschiedener Herkunft. — Calciumcarbonat :

neben anderer auch chemisch reine und gefällte Kreide. — - Sterilisation:
keine Angaben.

J. Pochen: Cellulose: Filtrierpapier. — Calciumcarbonat: als Puffer Schaum
von Zuckerfabriken; enthält 60% CaCO,. — Sterilisation: an drei auf-
einanderfolgenden Tagen Stunde auf 126® C, dazwischen im Brutraum
bei 37® C.

St. Sniesko : Macht keine Angaben.

P. A. Tetrault, Cellulose: reinstes quantitatives Filtrierpapier. Calcium-
carbonat: keine Angaben. — Sterilisation: Angaben fehlen.

E. Werner: Cellulose: Filtrierpapierstreifen. •— Calciumcarbonat: Kreide. —
Sterilisation: keine genauen Angaben.

Diese Zusammenstellung sagt uns, daß in allen Kulturen der ge-
nannten Autoren Verunreinigungen vorhanden gewesen sein können.

Für die weiter unten mitgeteilten Versuche wurden folgende Grund-
sätze eingehalten: Es wurden die reinsten erhältlichen Chemikalien
benutzt; als Calciumcarbonat ausschließlich ,, Calcium carbonicum
praecipitatum p. A. Merck''. Sterilisiert wurde ausschließlich im Auto-
klaven; und zwar jedes Gefäß bei ISO® C ^/2 Stunde, im ganzen
dreimal mit einer Zwischenzeit von zwei oder drei Tagen. In der
Zwischenzeit wurden die Gefäße im Brutraum bei etwa 35o C aufgestellt.
Vor jeder Sterilisation wurde bis 20 mm Hg zwecks Entfernung etwa
von dem Calciumcarbonat oder der Cellulose eingeschlossener Luft
evakuiert. Das Evakuieren wurde mit den noch warmen Gefäßen vor-

Untersuchungen über den. Abbau der Cellulose.

255

genommen; es trat dann in den Gefäßen ein schwaches Sieden ein,
wodurch die Luft besonders wirksam entfernt wurde. Dann wurden
die mit Wattestopfen verschlossenen Gefäße längere Zeit bei Zimmer-
temperatur aufbewahrt, so daß angenommen werden konnte, daß sich
die Nährlösung wieder mit Luft gesättigt hatte.

Mit dem so behandelten Nährsubstrat wurden neue Kulturen
angelegt. In einem unterschieden sich diese neuen Kulturen grund-
sätzlich von den früheren: Während diese mit Beginn der Gasentwick-
lung (infolge sulfatreduzierender Vorgänge) einen unangenehmen,
ekelerregenden Geruch annahmen, rochen die neuen Kulturen ausnahms-
los angenehm fruchtartig aromatisch, und jede Spur einer Sulfat-
reduktion fehlte. Verfasser hat diese Beobachtung bisher nirgends
angegeben gefunden, so daß er schon hieraus den Schluß zu ziehen
geneigt ist, daß in den ihm bekannt gew^ordenen Fällen -- wie ja auch
die oben mitgeteilten Angaben vermuten lassen — keine Reinkulturen
Vorgelegen haben werden. Bei seinen Versuchen hat Verfasser von nun
an stets den Geruch der Kultur als Reinheitskriterium mit herangezogen.

Versuche mit neu isolierten Cellulosezersetzern.

Es wurden zwei neue ,, Stämme“ isoliert, von denen der eine siis
einem Versuch zur Prüfung der Reinheit der Chemikalien auf ihre Keiin-
freiheit aus der Kreide (vgl. S. 252) erhalten worden war. Dieser Stamm,
der weiterhin als ,, Stamm C“ bezeichnet werden soll, bildete niemals
Farbstoff, der Abbau der Cellulose ging außerordentlich träge vor sich
und blieb ini allgemeinen unvollständig. In einem Zeitraum von über
drei Jahren konnten von diesem Cellulosezersetzer z. ß. nur 12 Weiter-
impfungen durchgeführt werden. Das mikroskopische Bild der Kultur
zeigte im ganzen nur wenig Organismen, typi^^che Trommelschlegel-
formen wurden nur selten gefunden; meist traten nur einige Stäbchen
und ovale Sporen auf. Stoffw^echselphysiologisch verhielt sich dieser
Stamm jedoch — abgesehen von dem langsamen Ablauf der Vorgänge —
ähnlich wie der andere Stamm, der aus dem Panseninhalt eines frisch
im Göttinger Schlachthof geschlachteten Rindes isoliert wurde, und
der als ,, Stamm P*‘ bezeichnet werden soll. Dieser Stamm bildet
intensiv gelben Farbstoff (vgl. S. 270) und zersetzt die Cellulose recht
lebhaft; im Verlaufe von 3 Jahren konnten 30 Weiterimpfungen erzielt
werden. In den Kulturen wurden in der Regel reichlich charakteristische
Trommelschlegelformen nachgewiesen, daneben aber auch Stäbchen,
ovale, seltener runde, Sporen, Fäden und gelegentlich die früher vom
Verfasser beschriebenen entarteten Formen (längere Fäden, zitronen-
artige Formen ^ und Stäbchen mit in der Mitte liegenden Anschwellungen).

^ Vgl. Meyer (]).

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13 . 18

256

R, Meyer :

Diese Stämme wurden nach dem KhouvinesQh&n Waschverfahren
in Verbindung mit ^/4 ständigem Erhitzen des Impfmaterials auf 80® C
gereinigt Bereits nach wenigen Weiterimpfungen machten die Kul-
turen mikroskopisch und dem Geruch nach vollständig den Eindruck
einer Reinkultur. Es zeigte sich jedoch sehr bald, besonders beim
Stamm P, daß die Überimpfungen immer schlechter an wuchsen, wenn
die Nährlösung in der angegebenen Zusammensetzung (vgl. S. 251,
Fußnote 1) benutzt wurdet.

Diese mußte also in geeigneter Weise abgeändert werden. Zunächst
wurden zu jedem Gärgefäß etwa 0,1 % Kaliumsulfat zugesetzt, da die
bisherige Nährlösung sulfatfrei war. Weiterhin wurden 0,01 % Ferro-
sulfat zugesetzt. Hierbei zeigte sich zum ersten Male, daß die reine
Kultur Sulfat nicht reduziert, während die früheren Kulturen dies
immer getan hatten. Durch diese Zusätze wurde das Wachstum jedoch
nur unwesentlich gefördert. Ein Zusatz von 0,0004% Kupfersulfat
hemmte das Wachstum vollständig. Es konnte sich nur noch um das
Fehlen von irgendwelchen anderen mineralischen Spurenstoffen,
Vitaminen oder weiteren organischen Spurenstoffen handeln. Um diese
festzustellen, wurden als Zusätze noch versucht: Erdextrakt, Pansen-
inhaltextrakt, Hefeextrakt, Orangenextrakt (neutralisiert), gelber
Farbstoff des Cellulosezersetzers (vgl. S. 270), Duftstoff des Cellulose-
zersetzers (vgl. S. 273), Vitamin Bj, Chlorophyll, Kulturextrakt des
Cellulosezersetzers aus alten Kulturen, Wurzelspitzenextrakt vom Mais,
Keimblätterextrakt (ergrünte Blätter) von Mais und Vitamin D. Von
allen diesen Zusätzen zeigten nur die letzten vier einen merklich för-
dernden Einfluß. Am intensivsten wirkte der Extrakt von ergrünten
Maiskeimlingen (vgl. dazu auch Tabelle I, S. 266), und zwar so, daß
damit 30 Weiterimpfungen ohne wesentliche Einbuße an Wachstums-
energie ermöglicht wurden. Wenn man bedenkt, daß der anaerobe
Cellulosezersetzer in erster Linie als Saprophyt des Wiederkäuerpansens
anzusehen ist und erst in zweiter Linie als Bodenorganismus, in den er
erst durch die Ausscheidungen hineingelangt 3, so liegt die Verwendung
des grünen Blätterextraktes nahe; denn der Organismus wird sich den
Umweltverhältnissen, besonders im Pansen der Wiederkäuer, weit-

^ Zur hier angewandten Züchtungstechnik vgl. R, Meyer (\) u. (3); in die
hier beschriebenen Versuche wurden allerdings im Gegensatz zu den früheren
ausnahmslos Gärgefäße aus Jenaer Glas 20 von Schott d* Öen., Inhalt 250 ccm,
mit engem Hals, benutzt. — * Bei Rotmistrov u. Scharojko wuchsen merk-
würdigerweise die reineren Kulturen besser als die Anreicherungskulturen;
von Imsenecki wird allerdings die Reinheit der Kultur dieser Autoren bezweifelt.
“ * Hierfür sprechen ja auch die Tatsachen, daß das Temperaturoptimum des
(mesophilen) Cellulosevergärers bei etwa 37® C liegt, und daß sich — gemäß den
obigen Versuchen -- ein Zusatz von Erdextrakt als unwirksam erwiesen hat.

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

257

gehend angepaßt haben. Merkwürdig ist allerdings die Wirkungslosigkeit
von Panseninhaltextrakt ; aber es kommt wahrscheinlich gerade auf
das frisch in den Pansen gelangende Material an. Auffallend ist die
Wirkung des Vitamins D ; es konnten mit diesem zwar nur zwei Ver-
suche durchgeführt werden, aber der fördernde Einfluß war nicht zu
übersehen.

Das Vitamin, als „Vigantol forte“ Merck gegeben, ist nur fettlöslich; es
wurde daher dem Impfmaterial im letzten Waschwasser ein kleiner Tropfen
Vigantol forte zugesetzt und kräftig geschüttelt, so daß etwas von dem Material
an den Cellulosefasern haften bleiben mußte. Obwohl in den beiden erwähnten
Versuchen die Nährlösung bereits Keimblattextrakt enthielt, war doch noch
ein fördernder Einfluß des Vitamins bemerkbar.

Die Beobachtungen mit dem Vitamin D legten es nahe, einmal
Versuche mit IT V- Bestrahlungen zu versuchen. Es wurde zu diesem
Zwecke das Impfmaterial im letzten Waschwasser in ein Kölbchen aus
Quarzglas getan und in drei verschiedenen Proben 5, 10 und 15 Minuten
lang mit einer Quarzlampe bestrahlt. In zwei weiteren Proben wurde
wieder 5 Minuten lang mit der Quarzlampe bzw. mit dem Cadmium-
funken bei 275 mfi. bestrahlt. Ein Einfluß war nicht zu bemerken. Nur
in der zweiten Quarzlampenprobe trat merkwürdigerweise Sulfat-
reduktion ein und im mikroskopischen Bilde erschien ein Teil der
Stäbchen schwarz gefärbt (Sulfatreduktion im Bakterienkörper ?).

Der Mais wurzelspitzen extrakt erwies sich nur zu Anfang wirksam;
die Wirkung klang aber bald ab. Ähnlich verhielt sich der Extrakt von
alten Cellulosezersetzerkulturen, der durch Verreiben des Bodensatzes
einer alten Kultur mit dest. Wasser und Ultrafiltrieren erhalten wurde.
Der sich als am wirksamsten erweisende Keimblätterextrakt wurde
folgendermaßen hergestellt :

Etwa 4 bis 5 g grüne Maiskeimblätter wurden in einer Reibschale zunächst
mit 10 ccm dest. Wasser zu einem gleichmäßig dünnen Brei verrieben. Dann
wurden 90 ccm dest. Wasser hinzugefügt und nochmals verrieben. Die Ver-
reibung wurde 2 Stunden stehengelassen und dann zunächst die gröberen
Bestandteile durch ein gewöhnliches Papierfilter abfiltriert. Das Filtrat wurde
dann durch ein Membranfilter gesaugt, wobei ein hellbraunes Filtrat hindurch -
läuft. Dieses wurde zu je 5 ccm in Beagensgläser gefüllt und mindestens sechsmal
bei 60® C pasteurisiert. Die Zeitabstände zwischen zwei Erhitzungen betrugen
anfangs einen, zuletzt zwei Tage. Beim Pasteurisieren wurde der braune Ton
des Extraktes tiefer. Der so erhaltene Extrakt zeigte auch nach wochenlanger
Aufbewahrung keinerlei Trübung oder Bakterienwachstum. Jedes Kulturgefäß
mit 250 ccm Cellulosemineral -Nährlösung erhielt 5 ccm Extrakt zugesetzt.
In ähnlicher Weise waren aucb die anderen oben aufgeführten Extrakte behandelt.
worden. Nur der Erdextrakt war durch Extraktion bei höherer Temperatur
erhalten worden^.

1 Vgl. R, Meyer (3).

18 *

258

R. Meyer:

Die stärkere Wirkung des grünen Keimblattextraktes gegenüber
dem Wurzelextrakt war die Veranlassung, einmal mit alkoholischem
Keimblattextrakt Versuche zu machen. Der alkoholische Extrakt
enthält im wesentlichen Chlorophyll. Dieser zeigte aber keinerlei Wir-
kung; die wirksamen Bestandteile des Blätterextraktes sind also nicht
im Chlorophyll enthalten.

Zam Abbau der Celhilosetaser.

Von den Produkten des Abbaues der Cellulose durch den anaeroben
Cellulosezersetzer kennt man mit Sicherheit nur einige Endglieder.

Was an Zwischenprodukten auf-
tritt, darüber gehen die Mei-
nungen noch auseinander. Man-
che Autoren wollen Zucker
nachgewiesen haben, entweder
ohne weiteres oder nachdem
durch bestimmte Zusätze zum
Kultursubstrat der Ablauf des
Celluloseabbaues im geeigneten

Abb. 1. Gerichtete Anordnung der Bakterien auf
der Oeiluiosefager. Vergr. 600mai. Aufnahme-
daten vgi. S. 259.

Augenblick unterbrochen wur-
de; andere haben keine Zucker
oder andere reduzierenden Sub-

stanzen nach weisen können.

Ini mikroskopischen Bild
einer in Gärung befindlichen
Kultur findet man die Cellu-
losefaser dicht mit Bakterien
bedeckt; beim flüchtigen Hin-
sehen anscheinend in regelloser
Anordnung. Meist handelt es
sich dabei um noch sporenlose
Stäbchen. Dieses Bild wird

Abb. 2. Gerichtete Anordnung der Bakterien auf
der (Cellulosefaser hei schräg zur Faserlängsrichtuug
verlaufenden Mizellarsträngen. Vergr. TCOnial.
Aufnahmedaten vgl. 8.259.

aber dadurch hervorgerufen ,
daß bei der Präparation die
Lagerung eines Teiles der Stäb-
chen gestört wird ; manche lösen

sich dabei ganz von der Faser ab. Bei vorsichtiger Präparation findet
man jedoch zuweilen, daß sich die Stäbchen vorwiegend der „fibril-

lären Struktur* ‘ der Faser parallel lagern i. Es ist dabei gleichgültig,
ob die Mizellarstränge parallel (Abb. 1) oder schräg (Abb. 2) zur Längs-

richtung der Faser verlaufen, immer ist die Richtung der Mizellar-

^ Vgl. auch F, Baker u. R. Martin (2), ferner R, Meyer (3).

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

259

stränge maßgebend für die Lagerung der Stäbchen. In besonderen
Fällen, z. B. bei den Hoftüpfeln der Koniferentracheiden, machen die
Stäbchen auch den abweichenden Verlauf der Mizellarstränge in den
Tüpfeln mit, wie das z. B. Abb. 3 andeutet. Auch an ganz dünnen
Faserenden beobachtet man Parallellagerung der Stäbchen zu den
Mizellarsträngen, wie aus Abb. 4 hervorgeht.

Zu den optischen Daten der Abbildungen sei hier folgendes bemerkt:
Zur besseren Darstellung der Verhältnisse wurde ein Teil der Aufnahmen im
Polarisationsmikroskop^, je nach Bedarf mit Polarisationsfiltern (Bemotaren
von C. Ztiss) oder Kalkspatnikols, unter gekreuzten Schwingungsebenen von

.\bh. 3. Anordnung der Bakterien
um den Hoftüpfel einer Koniferen*
trachclde. Vergr. 500mal.
Aufnahmedaten vgl. S. 269.

Abb. 4. Anordnung der Bakterien an
einem dünnen Faserende. Vergr. 500 mal.
Aufnahmedaten vgl. S. 259.

Analysator und Polarisator gemacht, wobei die Cellulosefaser in Diagonallage
gebracht wurde. Sollte das Bildfeld zur gleichzeitigen Hervorhebung der Bak-
terien etwas aufgehellt werden, so wurden die Schwingungsebenen nicht ganz
gekreuzt. Zur weiteren Hebung des Kontrastes wurde dann zuweilen noch für
die mit Gentianaviolett oder Fuchsin gefärbten Bakterien ein geeignetes Kom-
plementärfilter eingeschaltet (für Gentianaviolett: 15 mm gesättigte Auramin-
lösung; für Fuchsin : 15 mm Nilblau etwa 1 : 1000 und 15 mm gesättigte wässerige
Auraminlösung; orthochromatische Platten). Für die Aufnahmen der Abb. 9
wurde, um die verschiedene Dicke der Cellulosefaser an verschiedenen Stellen
darzustellen, als Kompensator Gips Rot I eingeschaltet und die Faser in Addi-
tionslage gebracht. In dem Beispiel erschienen die „Schuppen'' in Blau II,
während die anderen Teile der Faser Purpur waren. Photographisch wurde der
Kontrast hier erhöht durch Einschalten des Rotfilters RG 1 Schott d* Gen, 2 mm
und Verwendung einer panchromatischen Platte. Für die Aufnahmen wurden
die Zew«-Apochromate 40/0,95 und 20/0,65 in Verbindung mit Homal III benutzt.

Man könnte nun geneigt sein, diese Art der Lagerung der Stäbchen
durch Adhäsionskräfte zu erklären, indem man etwa annähme, daß sich
die Stäbchen leichter in vorgebildete „Rillen“ auf der Faser hineinlegen

^ Baker-Martin^ Baüey-Vestal und Schvhe benutzen ebenfalls polarisiertes
Licht zur Beobachtung des Abbaues der Cellulosefaser.

260

R. Meyer:

als sich quer dazu lagern.' Indessen erscheint mir diese Erklärung nicht
ausreichend. Schon die Tatsache, daß sich nur die Cellulosezersetzer,
nicht aber auch andere Bakterien, in dieser Weise an die Faser anlegen
und festhaften (vgl. Wasch verfahren), deutet darauf hin, daß hier eine
„Zweckhandlung“ vorliegen muß. Das Bakterium sucht gewissermaßen
einen möglichst großen Teil seiner Oberfläche mit den die Faser auf-
bauenden Elementen in geeigneten Kontakt zu bringen. Warum dies
geschieht, versteht man vielleicht am besten, wenn man .sich den Aufbau
der Cellulosefaser vergegenwärtigt, wie man sich ihn nach den Unter-
suchungen von Staudinger, Frey-Wissling ii. a. vorzustellen hat:

Mehrere 100 bis 1000 (nach Seifritz'^ sogar 100000) Grundmoleküle der
Glucose bilden in //-glucosidischer Bindung ein Fadenmolekül der Cellulose,
welches somit eine Länge von der Größenordnung eines y erreicht, also mit den
Dimensionen eines Bakteriums vergleichbar wird. Diese Fadenmoleküle ordnen
sich in kleinsten Bäumen zu Kettengittern, was auch durch das Röntgen-
diagramm ‘ bestätigt wird. Die native Cellulosefaser besteht nun jedoch nicht
aus einem lückenlosen und ungestörten System solcher geordneter Bereiche
(Mizelle)®, sondern sie weist eine Lockerstruktur auf, d. h. diese Kettengitter
werden solcherart miteinander verflochten, daß mehr oder weniger große Hohl-
räume zwischen ihnen verbleiben^. Dieser Aufbau ergibt sich aus dem xx)lari-
sationsoptischen Verhalten der Faser (Stäbchendoppelbrechung). Diese Hohl-
räume, die inkrustierte Substanzen (Lignin, Mineralbestandteile) enthalten
können, bilden mit dem Cellulosegerüst ein System gegenseitiger Durchdringung,
was man durch Herauslösen der Inkrusten (Celluloseskelet) oder der Cellulose
(Ligninskelet) zeigen kann*. Die Hohlräume bilden ein submikroskopisches
und mikroskopisches Kapillarsystem, in welchem die extrafaszikuläre Saft-
leitung stattfindet, wie Strugger durch fluoreszenzmikroskopische Unter-
suchungen nachweisen konnte.

Man kann nun annehnien, daß das Cellulosebakterium bestrebt ist,
sich der Längsrichtung der Fadenmoleküle anzulegen — beide sind ja
bezüglich der Längsausdehnung von der gleichen Größenordnung.
Das Bakterium wird dadurch in die I^ge versetzt, das Cellulosemolekül
durch enzymatische Einwirkung an bestimmten (zunächst wenigen)
Stellen zu sprengen. Geschieht dies an mehreren (quer-) benachbarten
Stellen, so kann man sich vorstellen, daß an dieser Stelle zugleich mit
dem chemischen Eingriff wiegen der Lockerstruktur der Faser der Ver-
band noch weiter gelockert und schließlich auch ihr mechanischer
Zusammenhalt gelöst wird Noch verständlicher wmrde dieser Vorgang,

^ Vgl. auch K, H. Meyer u. A, J, A. van der Wyk, — * Frey-Wisaling (2).

— * Wobei die Hauptvaienzketten mehrere Mizelle durchlaufen können. —
* Von Ituska elektrbnenoptisch nachgewieeen. — * Frey-Wissling (l), Bailey.

— ® Vgl. hierzu auch Baker u. Martin, Ein Verschwinden der Doppelbrechung
der Faser, wie sie diese Autoren beschreiben, konnte vom Verfasser allerdings
nicht beobachtet werden; soweit überhaupt noch feststellbar, zeigten auch die
kleinsten Trümmer Doppelbrechung. Vielleicht ist der Unterschied darauf
zurückzuführen, daß Baker u. Martin nicht mit Reinkulturen arbeiteten (Bak-
terien pseudomorph ose ? Vgl. 8. 263).

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

261

wenn man annimmt, daß das Bakterium sich diesen Aufbau der Cellulose-
faser derart zunutze machen kann, daß es kurze Plasmaausläufer etwa
in die Hohlräume der Faser hineinversenkt; zugleich würde dies auch
das feste Anhaften des Bakteriums an der Faser erklären, worauf ja
das Kh(mvinesc\ve Wasch verfahren beruht. Mit der Zeit müßte so der

Abb. 5. Trümmer mittlerer
Größe einer CelluloHcfaaer.

Vergr. 500 mal.
Aufnahmedaten vgl, S. 250.

Abb. 6. Kleine Trümmer einer Cellulosefaser.
Vergr. SOOmal. Aufnahmedateu vgl. S. 259.

ganze Verband der Faser in mehr oder weniger große Stücke auseinander-
brechen, und zwar wegen der Ix)ckerstruktur der Faser und der Faden-
form der Cellulosemoleküle unter einem relativ kleinen chemischen Auf-

Abb. 7. Scheinbare Sternbildiing
von Cellulosezcrsetzeru an sehr
kleinen Trümmern einer Celiii-
iosefaser. Vergr. 500mal.
Aufnahmedaten vgl. 8. 259.

Abb. 8. Zackige Ausbrechung und
rhombische Korrosionsflguren eines
Trünunerstückes einer Cellulo8t*fas«*r.
Vergr. 750mal.
Aufnahmedaten vgl. S. 259.

wand. Nun findet man in der Tat' in älteren Kulturen des Cellulose-
zersetzers eine Unmengq solcher Fasertrümmer der verschiedensten
Größe, teils freischwebend in der Kulturflüssigkeit, teils noch mit Faser-
resten zusammenhängend i. Die Abb. 5 und 6 zeigen solche Fasertrümmer.
Sind sehr kleine Fasertrümmer noch mit Bakterien behaftet, so erhält

^ Vgl. auch Hooper.

262

R. Meyer:

man oft den Eindruck, als seien die Bakterien verzweigt [vgl.
R, Meyer (\), Abb. 9] oder neigten sie zur „Sternbildung“ (Abb. 7).
Eigentümlich ist für diese Trümmer oft die zackige Ausbrechung an den
Enden oder das Auftreten von Korrosionsfiguren in der Faser als
charakteristische, oft rhombisch geformte Lücken, wobei die größere
Diagonale des Rhombus in die Längsrichtung der Faser fällt (Abb. 8) ;

in anderen Fällen sitzen solche

Abb. 9. Khonibigchu ,,Schupp<*ii“ auf einer
(-elluloftefasrr.

Vortn*. 75()inal. Aufnabinedaten vgl. S. 259.

Rhomben als erhabene ,, Schuppen“
oder Leisten auf den Faserresten
(Abb. 9). Diese Art der Korrosions-
figuren steht ganz im Einklang mit
der Auffassung von Frey-Wiasling
gemäß einer Verzahnung der Ketten-
gitter in der Längsrichtung der
Faserl. Die Größe der spitzen
Winkel dieser Zacken, Lücken oder
Schuppen schwankt etwas; am
häufigsten liegen die Werte aber
zwischen 30 und 50 ^ 2 ,

Diese Beobachtungen zeigen,
daß bei der Cellulosegärung kein
eigentliches Ektoenzym wirksam
sein kann, denn Korrosionsfiguren

entstehen — örtlich begrenzt —
nur an solchen Stellen der Faser,
die auch von Bakterien besetzt
sind (Abb. 10). Wäre ein Ekto-
enzym wirksam, so müßte der
Zerfall der Fasern in der ganzen
Kultur ziemlich gleichmäßig er-
folgen, und man müßte auch an
den unbesetzten Stellen der Faser
Korrosionsfiguren finden. Wei-
ter spricht dafür auch die Lang-

Abb. 10. Mit Bakterien boar-tet« Loch In einer samkeit des Vorganges. Von
Celluloaefauer. Vergr. 500 mal. Aufnahmedateii diesen KoiTOSionSStellen her

VRl. d. 259.

schreitet — unter gleichzeitiger

Vermehrung der Bakterien — der Abbau der Cellulosefaser fort, so

daß bald nur noch ein lockeres Gerüst (Abb. 11) oder bei Schrauben-

^ Ähnliche Korrosionsfiguren und Trümmer konnte Verfasser auch bei
der aeroben Cellulosezersetzung nach weisen (nicht veröffentlicht). — * Bailey
u. Veetal fanden Winkel zur Achse der Fibrillen von 20 bis 25®. Da vom Ver-
fasser die doppelten Winkel gemessen wurden, kann man die Übereinstimmung
als leidlich bezeichnen.

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

263

textur einige ,, Rippen“ (Abb. 12) stehenbleiben. In den Endstadien
findet man zuweilen nur noch an den Rändern der Faser einige
Trümmer, während die übrigen Teile der Faser (bei sorgfältiger
Präparation) als Bakterienpseudornorphose erscheinen (Abb. 13).

Abb. 11. L(K*korc8 (»erüfit <*iiier (’elluIosffaHPr. Ver^r. 750 mal. Aufiiahniedaten vgl. S. 259*.

Abb. 12. ('briuu< l)li« riiicr (Vlluloscfasor mit Schrauln'iitextur. Vergr. lOOinal.

Xiifimbmodaton vgl. S. 2.59.

Abb. l;J. Hakt«M it'lipsruliomorpboHr riiirr (’i*)luli)«vfaavr mit Trümm«‘rHtüc*kon am liaiiile.

Vcrsr. 400 mal. AiifiiulmaMlatt'ii vgl. S. 2.50,

In manchen Fällen verläuft der Abbau etwas andeis, was sich schon durch
d€wi makroskopische Bild zu erkennen gibt. In der Regel pflegt sich ja zu Beginn
der Gärung der ganze Cellulosestreifen oder doch wenigstens ein mehrere Milli*
meter großer Bezirk gelb zu färben, oder, bei farblosen Vergärern, welk zu

264

R. Meyer :

werden. Seltener kommt es vor, daß man auf den Cellulosestreifen nur steck-
nadelkopfgroße Löcher findet, wie dies Abb. 14 zeigt. Bei stärkerer Vergrößerung
kann man nun feststellen, daß in diese Löcher zugespitzte Cellulosefasern hinein-
ragen (Abb. 15). Die Fasern werden in diesem Falle also nicht von der Seite,
sondern von einem Ende her angegriffen. Warum in einigen Fällen das eine, in
anderen das andere, und zwar auch innerhalb der Überimpfungsreihe ein und
derselben Kultur, eintritt, konnte nicht ermittelt werden. Es wäre denkbar,

daß dies mit der Beweglichkeit der Jugend -
formen zusammenhängt, indem diese bei den
Löcherkulturen aus irgendeinem Grunde ge-
hemmt ist, und ein Wachstum nur da erfolgt,
wo beim Impfen eine Spore zu liegen kam. Mit
zunehmendem Alter der Kultur pflegt sich an
diese Art des Celluloseangriffs schließlich der
allgemeine Zerfall der Cellulose wie bei den
anderen Kulturen anzuschließen.

Gegen Ende der Cellulosegärung findet
man in der Kultur fast nur noch Faser-
trümmer neben Bakteriendetritus und
Sporen. Aber man kann im Bodensatz
selbst ein Jahr alter Kulturen immer noch
vereinzelte intakte Cellulosefasern nach-
weisen, auch dann, wenn der Abbau an-
fangs sehr intensiv war. Eine vorherige
Verquellung der Cellulosefaser, wie sie von
Werner angegeben wird, konnte niemals beobachtet werden, weder
in der jungen noch in der fortgeschrittenen Kultur.

Abb. 14. Filtrlerpapierstroifen, die
ln einzelnen Löchern angefO’lffen
werden. Natürliche Gröüe.

Abb. 15. Zugespitzte Cellulosefasern in einem Loch eines Cellulosestreifens. Vergr. 180 mal.
» Aufnahmedaten vgl. 8. 269.

Das mikroskopische Bild gibt uns also schon einigen Aufschluß
darüber, wie man sich den Beginn des Abbaues der Cellulosefaser
vorzustellen hat. Es entsteht nun die Frage, welches das weitere
Schicksal der Cellulosetrümmer in der Kultur ist. Daß die — auch

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose. 26^

mechanische — Zerteilung der Trümmer bis weit ins submikroskopische
Gebiet hineinreicht, darüber kann kein Zweifel bestehen ; denn auch die
kleinsten Trümmer hängen oft noch fest mit den Bakterien zusammen.
Nun liegt die Annahme nahe, daß die Aufspaltung der Cellulose durch
Hydrolyse über die niederen Polymerisationsgrade schließlich zur
Cellobiose und Glucose führt, die dann durch Gärung zu den als End-
produkten auftretenden organischen Säuren imd den weiteren noch
beobachteten Stoffwechselprodukten führt.

Bezüglich der Zwischenprodukte sind wir aber — wie bereits er-
wähnt — noch völlig im unklaren. Manche Autoren, z. B. Pring8heim{\),
V. Meyer, Tetrault, Imhtuecki (3), (5) u. a. wollen Zwischenprodukte
wie Cellobiose und Glucose oder Zucker unbestimmter Art nachgewiesen
haben. Von anderen Autoren wird jedoch das Auftreten solcher
Zwischenprodukte bestritten ^ Verfasser konnte Fehlingsc\ie Lösung
reduzierende Substanzen in der Kultur nicht nach weisen. Wenn solche
auf treten, müssen sie jedenfalls schnell weiterverarbeitet werden. Ob
Kohlenhydrate als Zwischenprodukte überhaupt zu erwarten sind,
hängt wohl in erster Linie davon aU, ob die chemischen Eingriffe des
Bakteriums vorwiegend hydrolytischer oder oxydativer Natur sind.
Verfasser möchte vorläufig zu der Ansicht neigen, daß — wenigstens
zu Anfang — die oxydativen Eingriffe überwiegen und möchte als
wichtigstes Argument dafür den Verbrauch von Sauerstoff vor Beginn
der sichtbaren Gärung anführen 2. Man muß demnach damit rechnen,
daß bereits die größeren Bruchstücke des Cellulosemoleküls sauerstoff-
reicher sein können als das Celluloseniolekül selbst ^ und daß weiterhin
z. B. Cellobiose und Glucose nicht unbedingt als Zwischenprodukte
aufzutreten brauchen.

Von den Stoffwechselprodukten treten mengenmäßig die organi-
schen Säuren in den Vordergrund, und zw^ar in erster Linie Essigsäure,
in w^eit geringerer Menge Buttersäure. Ameisensäure und Propionsäure
konnte Verfasser im Gegensatz zu den Ergebnissen einiger anderer
Autoren 4 in den Kulturen der neu isolierten Stämme nicht nach weisen.

1 Rotmistrov (2) u. (3); Verfasser konnte auf der filtrierten restlichen Nähr-
lösung keine Hefen zum Anwachsen bringen. — * Es besteht auch noch, die
Möglichkeit, daß dieser Sauerstoff oder ein Teil desselben durch das Impf-
material zur Atmung verbraucht wird; hierfür würde die Tatsache sprechen,
daß der Sauerstoff verbraucht ist, bevor eine sichtbare Veränderung der
Cellulose eintritt. Andererseits beobachtet man jedoch in cellulosefreier Mineral-
lösung eine merkliche Verzögerung im Sauerstoffverbrauch [E. Meyer (3)],
so daß eine Entscheidung auf Grund der vorliegenden Versuchsergebnisse noch
nicht möglich ist. — * Vielleicht würde eine Prüfung nach der Methode von
MiiUer hier eine Entscheidung zulassen. Methoden zur Bestimmung des Redox-
potentials in Kulturen anaerober Cellulosezersetzer gibt Bojarakaja an. —
* Vgl. Imaenecki, B, Meyer^ V, Meyer, Botmiatrov u. a. V, Meyer fand Butter-
säure nur bei Anwesenheit von B. coli.

266

R. Me5rer :

Tabelle 1.

Kultur

Wachstums-

zett

Verbr.

Cellulose

B:Ci

Tage

P 14 *

166

4,26

2,01

0,03

1.6

0,46

P 16

1,70

0,68

0,12

14,9

0,40

P 17

1,04

0,40

0,11

21,5

0,39

P 17

—

0,31

0,02

6,3

—

P 18

0,96

0,63

0,03

6,2

0.66

P 188

1,78

0,68

0,02

4,0

0,33

P 19

1,30

0,57

0,02

3,1

0,41

P 19 ®

1,71

0,48

0,02

3,6

0,28

P 20

0,80

0,29

0,01

4,0

0,36

P 20 *

144

1,60

0,60

0,01

2,4

0,40

P 20 *

144

1,26

0,36

0,01

3,0

0,29

P 20

144

1,25

0,61

0,02

2,9

0,49

P 20

144

1.14

0,41

0,01

2,2

0,36

P 20

1,36

0,66

0,02

3,9

0,41

P 21

143

1,64

0,57

0,01

2,1

0,36

P 21

0,06

0,01

13,4

( 0 , 94 ) »

P 21

—

0,46

0,01

2,4

P 22

0,66

0,02

3,5

P 22

1,08

0,46

0,01

2,8

! 0,42

P 22 *

1,46

0,63

0,02

2,9

0,37

P 23

115

1,64

0,79

0,03

3.4

0,48

P 23 *

1,74

0,48

0,02

4,6

0,28

P 25

1.48

0.60

0,01

2,9

0,34

P 26 ö

0,97

0,32

0,01

2,4

0,33

P 26

1,42

0,60

0,02

3,9

0,42

P 268

0,98

0,64

0,02

2,9

0,56

P 268

1,09

—

P 26

0,75

0,13

0,01

5,0

0,19

P 29

197

1,62

0,20

0,01

6,2

0,12

P 29

197

1,30

0,60

0,03

6,1

1 0,46

P 298

197

1,20

0,64

0,04

7,1

0,46

P 29

197

1,41

0,62

0,03

4,6

0,44

P 29 8

197

1,45

0,61

0,06

7,4

0,42

C 6

465

1,69

0,31

0,07

18,9

0,18

C 7

482

1,81

i 0,76

0,05

6,2

0,42

C 8

380

1,80

0,66

0,04

6,3

0,37

C 10

0,42

1 0,18

0,07

3,6

0,43

* Verhältnis von Essigsäure zu verbrauchter Cellulose. Die Werte der Spalten (1 und 7 wurden
aus den dreisteUigen Zahlen des Vcrsuchsprotokolls errechnet; für die Tabelle wurden diese Zahlen
auf zwei Di'Zitnalen abgerundet. — • Material von drei Gärgefäßen zusainniengetan. Die Ziffer
liinter der Bezeichnung des Stammes gibt die Stelle ln der Folge der Weiterimpfungen an. — • Diese
Kulturen erhielten im Gegensatz zu den gleichsUdligen einen Zusatz von Maiskeimblattextrakt;
die späteren erhielten diesen regelmäßig. — * Diese Kulturen erhielten anstatt Filtrierpapierstreifeii
gereinigte Cellulose. Diese war folgendermaßen hergestellt: 150 g reinstes Kohmaterial für Filtrier-
papier, welches von der Firma Schleicher <fc Schäll, Dfiren, freundlichst zur Verfügung gestellt war,
wurden in 4Liter5%ige Natronlauge eingetragen und häufig umgerührt. Nach drei Tagen mit
Leitungswasser gründlich ausgewaschen und in Salzsäure <400 ccm konz. Salzsäure auf 4 Liter
Wasser) (vgl. Farr-Kekenon u. Bonner) eingetragen. Nach zwei weiteren Tagen in fließendem
Leitungswasser 3 Stunden lang ausgewaschen und auf der Nutsche mit destllliert-em Wasser nach-
gewaschen. Dann Im Bnitraum einen Tag bei 30* C vor- und im Trockenschrank bei 105* C bis zur
Gewiclitskonstanz nachgetrocknet. Dann mit Alkohol, mit Äther und wieder mit Alkohol ge-
waschen. Schließlich wurde wieder auf der Nutsche mit destilliertem Wasser gewaschen, eine Woche
lang in destilliertem Wasser stehengelassen, nochmals abgenutscht, im Trockenschrank bei 80 bis
90* C vor- und bei 110* C bis zur Gewichtskonstanz nachgetrocknet. Da die gereinigte Cellulose
günstiger wirkte, wurde diese für die späteren Weiterimpfungen ln der Kegel verwendet. — • Diese
Gärgefäße waren bis zum Hals mit Nährlösung angefüllt, so daß den Kulturen nur wenig Sauer-
stoff zur Verfügung stand. — • Dieser Wert wurde bei der Berechnung der Mittelwerte nicht be-
rücksichtigt, da die Bestimmung der geringen Menge flüchtiger Säuren zu unsicher erschien.

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

267

Tabelle I zeigt die in verschiedenen Kulturen dieser Stämme beob-
achteten Mengen Essigsäure und Buttersäure neben der verbrauchten
Cellulose und dem Alter der einzelnen Kulturen. Die flüchtigen Säuren
wurden durch Wasserdampf destillation aus dem Eindanipfrückstand
der restlichen Nährlösungen gewonnen und dann getrennt i.

Im einzelnen streuen die Werte der Tabelle T ziemlich stark, ins-
besondere der Prozentgehalt der flüchtigen Säuren an Buttersäure.
Dieser beträgt beim Stamme P im Mittel aus sämtlichen Beob-
achtungen 5,0; das Ausmaß der Streuung (mittlere Abweichung des
Mittelwertes 0,76) wird dabei in erster Linie durch einige wenige Extrem-
werte bedingt, deren Ursache allerdings nicht ersichtlich ist. Für den
Stamm C liegt der Buttersäuregehalt bei 8,5%: aber die Sicherheit
dieses Wertes ist wegen der geringen Anzahl der Beobachtungen noch
kleiner als der für Stamm P. Besser gesichert erscheint der Anteil der
je Einheit verbrauchter Cellulose gebildeten Essigs iure; er beträgt
im Mittel der Beobachtungen für Stamm P 0,38 ± 0,02, für Stamm C
0,33*. Ein Gang dieser Werte mit den Kulturbedingungen, insbesondere
dem Alter der Kultur, geht aus der Tabelle I nicht hervor. Man kann
aber aus der Tabelle ersehen, daß Mangel an freiem Sauerstoff den
Wert der verbrauchten Cellulose herabsetzt, ohne daß dadurch jedoch
die Anteile der flüchtigen Säuren beeinflußt werden 2.

Der Gasstoffwechsel des Cellulosezersetzers wurde bereits früher
untersucht. Obwohl gegenüber den diesbezüglichen Versuchen des
Verfassers keine Überraschungen zu erwarten waren, da für diese
bereits das reinste Calciumcarbonat verwendet worden war, wurden
dennoch für den Stamm P bei den Kulturen P 20 und P 29 zwei Gasstoff-
wechselversuche mit je vier Parallelen a bis d durchgeführt, die aber
die früheren Beobachtungen — wenigstens qualitativ - nur bestätigen.
Die Ergebnisse zeigt Tabelle II.

Zu der Menge des aufgefangenen Kohlendioxyds kommt noch diejenige
hinzu, die in der restlichen Nährlösung in den Kulturgefäßen als Gas oder als
Calcium bicarbonat enthalten ist. Diese konnte für die Parallelen der Kultur P 20
durch Auffangen in Barytlauge bestimmt werden zu;

a) 49,9 ccm; b) 47,5 ccm; c) 27,0 ccm und d) 43,3 ccm.

Die geringe Menge in der Parallelen c ist wohl auf die absolut geringe Menge des
in diesem Kulturgefäß gebildeten Kohlendioxyds zurückzuführen (vgl. Tabelle II)
die zur Sättigung der Lösung nicht ausreichte.

^ O, Klein, Handbuch der Pflanzenanalyse, Band II. Wien 1932. -
* Rotmistrov (2) fand 25 bis "50% Essigsäure und 6 bis 25% Buttersäure
unter den flüchtigen Säuren, 30 bis 60% Gesamtsäure in bezug auf die ver-
brauchte Cellulose. Tschdtzowa findet das Verhältnis Essigsäure zu Butter-
säure wie 1:1, bei stärkerer Luftzuführung jedoch 3,5 ; 1 bis 4,7 ; 1. Snieszko (2)
findet etwa 50% Essigsäure der verbrauchten Cellulose. Khouvine fand
1,012 g verbrauchte Cellulose 0,275 g Essigsäure und 0,033 g Buttersäure.

268 R. Meyer:

Tabelle 11.

Kulturen P 20 a bis d

Kulturen F

20 a bis d

Wachstums-

zelt

Tage

CO 2 *

ccm

02*

ccm

Wachstums-

zeit

Tage

CO,*

ccm

H,*

ccm

0,*

ccm

24,2

0,7

24,4

0,0

2,0

144

58,3

2,2

0,9

63,3

1,1

2,0

144**

71,4

3.4

1,2

197

99,6

6,8

2,9

18,5

0.0

0,1

113

46,0

0,6

0,9

144

28,2

0,0

0,2

197

64,6

1,8

6,4(?)

144**

43,6

0,0

0,4

144

11,8

0,2

0,4

27,9

0,6

0,2

144**

20,6

1,1

0,6

197

69,6

3,7

0,6

197**

80,3

8,7

1,8 *♦*

20,6

0,0

0.2

40,1

2,8

0.0

144

33.9

1,2

0,4

197

64,0

5,7

0,1

144**

48,8

1,4

0,4

• BezoKen auf 0* 0 und 760 mni Hr. — •* Diese Angaben beziehen sich auf das über der Nähr-
flOssigkeit verbliebene Gas, welches durch abgekochtes destilliertes Wasser verdrängt und gesondert
aufgefangen wurde. Zur Technik vgl. R. Meyer (3). — ••• Während der Analyse Luft hiuzugetreten.

Die gefundene Kohlendioxydmenge muß zum größten Teile oder
ganz durch die organischen Säuren aus dem zur Neutralisation zu-
gesetzten Calciumcarbonat freigemacht worden sein. Denn wenn man
— ganz summarisch — - annimmt, daß die beobachtete Essigsäuremenge
durch Oxydation aus der Cellulose entstünde, so würden sich für die
Kulturen P 20 und P 29 im Mittel der Beobachtungswerte folgende
Verhältnisse ergeben:

Tabelle III.

P 20

P 29

l^obacbtftte T^futigHÄiirftTnengp

0,60 g

1,29 „

0,63 „

88 ccm

0,69 g

1,34 „
0,64 „

116 ccm*

VprbrAiicbt« Cpüulose, beobaphtet

Verbrauchte Celluloae, berechnet

Beobachtete Kohlendioxydmenge

Berechnete Kohlendioxydmenge

166

198

davon unmittelbar aus Cellulose

davon mittelbar aus Calciumcarbonat .

Verbrauchte Sauerstoff menge

Verbrauchte Sauerstoffmenge, berechnet .

etwa 10 „

110

etwa 10 „

* Für F 29 wurde zu dem Wert aus Tabelle 11 noch ein Wert von 41 ccm, dem Mittel aus der
für die Kulturen P 20 erhaltenen Werte des in der restlichen Nährlösung enthaltenen Kohlen-
dioxyds, hinzngefügt. Das konnte ohne allzu großen Fehler geschehen, weil Größe der Kulturgefäße,
Zusammensetzung und Menge der Nährlösung und die Temperatur ti beiden Fällen die gleichen
waren.

Tatsächlich verläuft der Vorgang natürlich nicht so, und die
Tabelle 111 zeigt, daß die von der beobachteten Essigsäuremenge aus
dem zugesetzten Calciumcarbonat freigemachte Kohlendioxydmenge
in beiden Fällen schon allein genügt, um die beobachtete Menge Kohlen-

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose. 269

dioxyd zu erklären. Die Zahlen lassen also die Vermutung zu, daß
beim Abbau aus der Cellulose unmittelbar kein Kohlendioxyd frei-
gemacht wird. In der Tabelle III ist noch die Menge Sauerstoff an-
gegeben, die erforderlich wäre, um die Cellulose gemäß der oben ge-
machten Annahme in Essigsäure überzuführen, wobei ^J^deder die beob-
achtete Essigsäuremenge zugrunde gelegt wurde (die geringe Menge
Buttersäure wurde außer acht gelassen). Da diese Sauerstoff menge
nun nicht restlos aus der über der Nährlösung in den Kulturgefäßen
belassenen Luft stammen kann — diese betrug in der Regel etwa 50 ccm,
enthielt also etwa 10 ccm Sauerstoff — , so muß das Sauerstoffdefizit
anderweitig gedeckt sein, und zwar aus der Cellulose bzw'. dem Wasser.
In der Tat ist auch die beobachtete Menge verbrauchter Cellulose weit
größer als sie sich auf Grund der obigen Annahme aus der beobachteten
Menge Essigsäure ergeben würde'. Wir müssen dann aber als End-
produkte noch weitere Sauerstoff ärmere Stoffe erwarten. Nun war von
verschiedenen Autoren, auch vom Verfasser, Äthylalkohol unter den
Endprodukten nachgewiesen 2 , und d§; andere sauerstoffarme End-
produkte in größerer Menge nicht gefunden wurden, kommt er allein
in Frage. I.»eider konnte der Äthylalkohol in den obigen Versuchen nur
qualitativ nachgewiesen werden, da die restliche Kulturflüssigkeit
für andere Untersuchungen verwendet werden sollte, so daß eine Bilanz
einstweilen noch nicht aufgestellt werden kann.

Unklar ist noch die Rolle, die der in manchen Kulturen beobachtete
Wasserstoff spielt. Mengenmäßig fällt er für die Stoffwechselbilanz
kaum ins Gewicht. Auch ist nicht ersichtlich, durch welche Neben-
umstände sein Erscheinen bedingt wird. Nur soviel geht aus den Ver-
suchen hervor, daß er erst gegen Mitte bis Ende der Gärung festgestellt
werden kann. Einstweilen erscheint noch die Annahme am meisten
plausibel, daß es unter den Cellulosevergärern Formen gibt, die Wasser-
stoff erzeugen, und andere, denen diese Fähigkeit abgeht, und daß je
nach Zufall jene mehr oder weniger in den Vordergrund treten.

Neben diesen Stoffwechselendprodukten, die für die Stoffwechsel-
bilanz mehr oder weniger ins Gewicht fallen, findet man noch andere
Stoffe, die zwar für die Stoffwechselbilanz mengenmäßig ziemlich
bedeutungslos sind, die aber in mancher Hinsicht gerade der Cellulose-
zersetzung dimch Bttcilltts ceUulosae-dissolvens eigentümlich sind. Diese
sollen im folgenden noch charakterisiert werden.

^ Ein geringer Teil der Cellulose ist für den Baustoffwechsel verbraucht.
— * Imaenecki (5); Hotmistrov (2) fand 2 bis 23% (!) der verbrauchten Cellu-
lose; Rotmistrov u. Sherbakova; Rotmistrov u. Scharojko fanden 7 bis 10% der
vergorenen Cellulose, Snieszko{l) fand 0,25%, Khouvine (l) fand 0,082 g
Äthylalkohol auf 1,012 g verbrauchter Cellulose. Bei Rotmikrov u. Sckarojko
ist die Alkoholausbeute vom ^ der Nährlösung abhängig.

270

R. Meyer;

Der gelbe Farbstotf.

Von den beiden untersuchten Stämmen war der Stamm P zur
Farbstoffbildung befähigt. Wie bereits früher vom Verfasser mit-
geteilt [Ä. Meyer (1)], ändert sich der Sättigungsgrad der Farbe mit
der Anzahl der fortlaufenden Überimpfungen. Meistens hat man zu
Begifin, wenn die Kulturen noch weniger rein sind, kaum Farbstoff-
bildung. Diese setzt im Laufe der Weiterimpfungen mit zunehmender
Reinheit der Kultur ein und erreicht dann ein Maximum. Mit dem
Abklingen der Farbstoffbildung in den späten Weiterimpfungen pflegt
dann auch die Gärkraft des Erregers zu erlöschen. In der Überimpfungs-
reihe des Stammes P kommt dies nicht so klar zum Ausdruck, weil
mit den frühen Überimpfungen dieses Stammes andere Versuche
verbunden waren und die Zusammensetzung der Nährlösung mehrfach
geändert worden war. Jedoch scheint mit der 26. bis 27. Überimpfung
der höchste Sättigungsgrad erreicht worden zu sein, wie folgende
Übersicht andeutet:

Tabelle IV.

Farbcharakter*

Kultur

Farbcharakter

Kultur

3 pa

P 26

2 ga

P 23, P 26

3 pc

P 27

2 gc

P 26, P 29

2 nc

P 29

2 ea

P 21, P 29

2 ia

P 27

1 ca

P 26, P 29

2 ic

P 27

• W.Oitwaid^ Die kleine Farbmeßtafel. Zu beziehen von der ,,Phywc“ Göttingeu.

Natürlich ändert sich der Farbcharakter auch mit dem Alter der
einzelnen Abimpfung; der höchste Sättigungsgrad wird meist kurz vor
oder zu Beginn der Gasbildung erreicht. Später wird er dann meist
wieder etwas unreiner (größerer Graugehalt) ; aber auch in ausgegorenen
Kulturen ist der Bodensatz immer noch deutlich gefärbt. Ob der Farb-
stoff für die Gärung, etwa als Sauerstoffüberträger, irgendeine Rolle
spielt, läßt sich nicht sagen. Einerseits scheint zu seiner Bildung Sauer-
stoff — wenigstens in Spuren — erforderlich zu sein ; so gelang es Ver-
fasser z. B. nicht, größere Mengen Farbstoff zu erhalten durch Ver-
wendung größerer Kulturgefäße weil dann der Sauerstoffzutritt ein-
geschränkt ist. Andererseits vermögen jedoch auch Erreger ohne Farb-
stoffbildung, wie z. B. Stamm C, die Cellulose abzübauen, wenn auch
sehr viel langsamer. In Versuchen mit dem Stamm P, bei denen der
Ammoniakstickstoff der Nährlösung durch Nitratstickstoff ersetzt war,
trat die Farbstoffbildung mit erheblicher Verzögerung erst nach Beginn
der Gärimg ein.

^ R, Meyer (\),

Untersuchimgen über den Abbau der Cellulose.

271

Der gelbe Farbstoff scheint in das kapillare Hohlraumsystem der
Cellulosefaser eingelagert oder seine Moleküle der Faser gerichtet an-
gelagert zu sein; denn die Gelbfärbimg ist dichroitisch, und sie erscheint
-- wie bei der Chlorzinkjod- oder Kongorotfaser — am intensivsten,
wenn die Schwingungsrichtung des Lichtes parallel zur Längsrichtung
der Faser liegt. Liegt sie senkrecht dazu, dann erscheint die Faser
vollkommen farblos. Im Fluoreszenzmikroskop erscheint die gefärbte
Faser ziegelrot (etwa 4 pc). Es scheint sich dabei aber nicht um eine
Eigenfluoreszenz des gelben Farbstoffs zu handeln; diese konnte z. B.
an seinen Lösungen nicht beobachtet werden (vgl. weiter unten). Viel-
mehr wird es so sein, daß der Farbstoff den kurzwelligen Anteil des
bläulich weißen Fluoreszenzlichtes absorbiert, welches bei allen Fasern
in der gärenden Kultur zu beobachten ist (vgl. weiter unten). Das
ziegelrote Licht ist polarisiert.

Verdünnte Salzsäure läßt den gelben Farbton der Cellulose für
einige Sekunden in ein Fleischrot, etwa 5 pa für Cellulose aus der intensiv
organgegelb gefärbten Kultur P 2ß; Umschlägen. Nach längerer Ein-
wirkung verschiebt sich der Farbton nach schmutziggelb bis schmutzig-
grün unter Zerstörung des Farbstoffs ; denn ein Zusatz von Lauge stellt
den ursprünglichen Farbton nicht wieder her. Schwache Laugen be-
wirken keine merkliche Veränderung des Farbtones, höchstens eine
geringe Weißverhüllung.

Von den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln löst sich der
gelbe Farbstoff leicht in Methylalkohol und Äthylalkohol; die Löslich-
keit im ersteren ist wohl noch etwas besser als im letzteren, weil mit
Methylalkohol extrahierte Cellulose völlig farblos zurückbleibt, während
sie nach der Äthylalkoholextraktion noch ein wenig gelblich bleibt.
Ganz wenig löst sich der gelbe Farbstoff noch in n -Propylalkohol ; da-
gegen ist er nicht mehr löslich in iso-Propylalkohol und den höheren
aliphatischen Alkoholen, die bis zum Hexylalkohol untersucht wurden.
Nicht löslich ist der gelbe Farbstoff ferner in Ammoniak, Petroläther,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol und BenzylalkohoD. Ganz
schwach gelblichbräunlich färbt sich Aceton, ganz schwach gelblich
40 %iges Formalin und Acetaldehyd. Bei der I.»ösung in letzterem ent-
stand in einem Falle beim Eintrocknen auf dem Filter ein rosenroter
Ring. In einem Falle, nämlich bei der intensiv gefärbten Kultur P 26,
wurde beim Waschen der Cellulose mit heißem Wasser eine ganz schwache
Gelbfärbung des letzteren beobachtet. In alten Kulturen ist auch oft
die restliche Nährlösung gelbstichig, etwa wie Weißwein. Ob es sich
hierbei um den gleichen gelben Farbstoff handelt, ist fraglich.

^ Khouvine(l) fand ihn löslich in Äthylalkohol, Schwefelkohlenstoff,
Benzol und Aceton.

Archiv für Mikroblolop^le. Bd. 13. 29

272

R. Meyer :

Der gelbe Farbstoff ist sehr lichtempfindlich; schon der gefärbte
Filtrierpapierstreifen bleicht im zerstreuten Tageslicht nach einigen
Tagen merklich. Sehr viel schneller bleichen jedoch die methyl- tmd
äthylalkoholischen Lösungen; im zerstreuten Tageslicht bleichen diese
Lösungen im Sommer in ein bis zwei Tagen vollständig. Aber auch im
Dunkeln entfärben sich diese Lösungen allmählich; nach ein bis zwei
Wochen ist vollständige Entfärbimg eingetreten. Auch im Licht ge-
wachsene Kulturen erscheinen schwächer gefärbt.

Die äthylalkoholische Lösung des gelben Farbstoffs absorbiert
im sichtbaren Teil des Spektrums, beginnend im Blauen, vorwiegend
im Violetten. Aber auch das langwellige Ultraviolett wird stark ab-
sorbiert. Für einige Wellenlängen des Cadmiumfunkens konnte die
Absorption bis zur Wellenlänge 214,5 mp beobachtet werden. Die
alkoholische Lösung des gelben Farbstoffs zeigt keine Fluoreszenz,
jedoch einen merklichen, wenn auch schwachen, Tyndallkegel. Eine
Fluoreszenz konnte auch nicht beobachtet werden, wenn die alkoholische
Lösung mit Wasser versetzt wurde.

Beim Eindunsten der äthylalkoholischen Lösung, auch in der Kälte,
verbleibt ein ockerfarbener Rest, der sich aber nur teilweise mit Alkohol
wieder aufnehmen läßt; auch zeigt der wieder gelöste Anteil nicht die
gleiche Sättigung wie die ursprüngliche Lösung. Vielleicht besteht der
Farbstoff aus mehreren Komponenten, die gar nicht oder nur locker
aneinandergebunden sind. Wegen der äußerst geringen verfügbaren
Menge dieses Farbstoffs konnte eine genauere chemische Untersuchung
noch nicht erfolgen.

Ein fluoreszierender Stoff.

Neben dem gelben Farbstoff, der bei Stamm P auftrat, wurde bei
beiden Stämmen noch ein anderer, als solcher wahrscheinlich farbloser,
Stoff gefunden, der sich durch eine schöne himmelblaue Fluoreszenz
auszeichnet, die an die des Äskulins erinnert. Dieser Stoff ist nicht
mit dem gelben Farbstoff identisch, da Lösungen des letzteren nicht
fluoreszieren, und da der fluoreszierende Stoff ja auch bei dem farblosen
Stamm G beobachtet wurde. Der fluoreszierende Stoff befindet sich
vorwiegend in der Lösung, teilt sich jedoch auch der Cellulosefaser mit.
Er ist kochbeständig. Weder die frische unbeimpfte Cellulose-Mineral-
Nährlösung zeigte die Spur einer Fluoreszenz, noch trat eine solche
nach langem Stehen in dieser Nährlösung auf, so daß der fluoreszierende
Stoff erst bei der Zersetzung der Cellulose entsteht. Allerdings beob-
achtet man eine bläuliche l^uoreszenz auch in Substraten mit Agar
und Gelatine und in Nährlösungen mit organischen Substanzen (Bouillon),
sowie in Kulturen anderer Mikroorganismen, so daß diese Fluoreszenz
nicht streng spezifisch für die Kulturen des Cellulosezersetzers ist.

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

273

ln der unbehandelten Xiösung wird man den fluoreszierenden Stoff nicht
immer deutlich beobcbchten können, da wegen der Schwebestoffe das Fluoreszenz -
licht meist durch den Tyndalleffekt verhüllt wird. Bei Stamm C genügt
jedoch Ultrafiltration durch ein Membranfilter. Bei Stamm P erhält man
unter diesen Umständen eine grünliche Färbung, da die Lösung noch Spuren
des gelben Farbstoffs enthält. Beim Kochen dieser Xiösung wird jedoch mit dem
ausfallenden Eiweiß und Calciumcarbonat (aus dem in der Lösung enthaltenen
Calciumbicarbonat stammend) der Best des gelben Farbstoffs mitgerissen,
so daß man auch hier nach erfolgter Ultrafiltration dieselbe schöne blaue
Fluoreszenz erhält wie bei Stamm C. Beste eines Tyndalleffektes kann man
durch Beobachtung des Fluoreszenzlichtes durch einen Nikol unschädlich
machen.

Die Fluoreszenz beginnt im äußersten Violett des erregenden
Lichtes, was nach dem blauen Ton des Fluoreszenzlichtes ja zu erwarten
ist, und wird noch deutlich hervorgerufen im nahen Ultraviolett bis

275 mfjL. Die stärkste Fluoreszenz ist bei etwa 360 m[x zu beobachten;
jedoch ist anzunehmen, daß auch Licht von kürzerer Wellenlänge als

276 mfjL noch Fluoreszenz erregt, nur wird dieses Licht — in zunehmendem
Maße nach den kürzeren Wellenlängen zu ~ von der Nährlösung selbst,
die noch einen Teil der Mineralbestandteile der ursprünglichen Nähr-
lösung enthält, absorbiert. Unmittelbar an der der Lichtquelle zu-
gewandten Wand des Beobachtungsgefäßes (Quarzküvette) konnte
auch bei 230 mfx noch ein ganz kurzer fluoreszierender Streifen beob-
achtet werden.

Es wurde weiterhin versucht, den fluoreszierenden Stoff aus der
Lösung mit Äther, Benzol, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff
auszuschütteln, jedoch ohne Erfolg. Nach der Behandlung war keine
merkliche Abnahme der Fluoreszenz zu verzeichnen, nur war meistens
der Tyndallkegel verstärkt.

Der Dultetotf.

Eingangs war bereits erwähnt worden, daß als Kriterium der
Beinheit einer Kultur des Cellulosezersetzers ihr Geruch mitverwertet
werden kann. Früher wurde meistens angegeben, daß die Kulturen
dieses Organismus einen unangenehmen, ekelerregenden Geruch be-
sitzen; an diesem sind Schwefelwasserstoff und wahrscheinhch auch
Skatol und ähnliche Stoffe beteiligt. Der Schwefelwasserstoff ist durch
Reduktion der zugesetzten Sulfate entstanden. Die reine Kultur verhält
sich in dieser Beziehung nun gänzlich anders. Es wurde oben bereits
bemerkt, daß in dieser eine Reduktion der Sulfate nicht erfolgt, so daß
dafür in den früher untersuchten Kulturen Begleitorganismen verant-
wortlich gemacht werden müssen, die aller Wahrscheinlichkeit aus der
zugesetzten Kreide stammten imd sich über die unzureichenden Sterili-
sationsmaßnahmen hinweg am Leben zu erhalten vermochten, ln den

reinen Kulturen wird Schwefelwasserstoff also nicht gebildet, was

19 *

274

R. Meyer :

schon äußerlich daran zu erkennen ist, daß aus dem zugesetzten Perro-
sulfat kein Schwefeleisen ausgefällt wird und eine Verfärbung der
Kultur nicht eintritt.

Die reine Kultur des anaeroben Cellulosezersetzers hat nun keines-
wegs einen unangenehmen, sondern vielmehr einen aromatischen
Geruch, der als durchaus angenehm zu bezeichnen ist. Obwohl es
schwierig ist, die Geruchsqualität einigermaßen scharf festzulegen,
möchte der Verfasser annehmen, daß der Geruch der Kultur etwa die
Mitte hält zwischen dem von Weißwein und Ananas. Am Zustande-
kommen dieses Geruches ist sicher die geringe Menge Äthylalkohol,
die bei der Cellulosezersetzting entsteht, ebenso vielleicht einige (höch-
stens in Spuren vorhandene) Ester, die aber nicht isoliert wurden, mit-
beteiligt. Das eigentliche Prinzip ist aber ein in der Kulturflüssigkeit
vorhandener besonderer Körper, der leicht nachgewiesen werden kann.
Dieser läßt sich nämlich aus der Lösung mit Äther ausschütteln. Man
erhält dann nach Eindunsten des Äthers (in der Kälte) einen dunkel-
braunen Stoff mit ganz intensivem Geruch. Verfasser möchte diesen
mit dem der Hyazinthe oder vielleicht noch besser mit dem der Blüte
von Robinia pseudacacia vergleichen.

Dieser Duftstoff ist recht flüchtig; an der Luft geht der Geruch
nach ein bis zwei Tagen verloren ; es hinterbleibt aber noch ein geruch-
loser Rückstand. Daß es sich bei dem mit Äther ausgeschüttelten Stoff
um wenigstens zwei Komponenten handelt, zeigt auch das mikroskopische
Bild; man findet neben anisotrop kristallinen auch wachsartige Anteile,
die in Äthylalkohol löslich sind. Wegen der sehr geringen zur Verfügung
stehenden Mengen war durch Geruchsprobe nicht zu entscheiden, ob
der kristalline oder der wachsartige Anteil der eigentliche Duftträger
ist. Der Duftstoff geht auch mit Wasserdanapf über.

Die aus den Kulturen der Stämme P und C gewonnenen Duftstoffe
sind einander hinsichtlich der Geruchsqualitäten so ähnlich, daß sie als
identisch bezeichnet werden müssen; vielleicht ist der Duftstoff des
Stammes P etwas süßlicher als der des Stammes C. Auch in solchen
Kulturen, die anstatt Ammonsulfat als Stickstoff quelle Asparagin,
Kalium- oder Natriumnitrat erhalten hatten, war der gleiche Duftstoff
nachzuweisen. Etwas verändert erschien der Geruch einer Kultur
des Stammes P, die einen Zusatz von Vitamin D erhalten hatte. Hier
war zwar auch ein aromatischer Geruch vorhanden wie in den anderen
Kulturen, aber mit einem Unterton des brenzlichen. Bemerkenswert
ist nun, daß sich die Kultur des Stammes P, deren Impfmaterial vorher
mit der Quarzlampe bestrahlt wurde (vgl. S. 257), ganz ähnlich verhielt.
Es ist durchaus möglich, daß auch in diesem Falle das Vitamin D für
die Geruchsveränderung verantwortlich zu machen ist; denn es wäre
denkbar, daß beim Impfmaterial durch die Bestrahlung aus etwa vor-

Untersuchungen über den Abbau der Cellulose.

275

handenem Ergosterin dieses Vitamin gebildet worden ist. Es ist aber
anzunehmen, daß auch in diesen Kulturen der Duftstoff unverändert
vorhanden ist und daß sich ihm nur eine Komponente überlagert.

Es wurde noch versucht, den Duftstoff mit anderen organischen
Lösungsmitteln auszuschütteln, z. B. mit Petroläther, Benzol und
Chloroform. In Petroläther geht der Duftstoff nicht über, in Chloroform
etwas. Das Chloroform ist aber zur Gewinnung des Duftstoffes nicht
so gut geeignet, da es stark schäumt und der Schaum sehr beständig
ist. Beim Ausschütteln mit Benzol erhält man beim Eindunsten eben-
falls eine bräunliche, aber geruchlose Masse. In schwach verunreinigten
Kulturen bekommt man neben dem Duftstoff meist Stoffe mit skatol-
artigem Geruch.

Eingehendere Untersuchungen über den Duftstoff waren wegen
der äußerst geringen zur Verfügung stehenden Mengen Bruchteil
eines Milligramms — nicht möglich. Er scheint aber für den anaeroben
Cellulosezersetzer äußerst charakteristisch zu sein.

Zusammenfassung,

Es wird auf eine Fehlerquelle aufmerksam gemacht, die die Rein-
züchtung des anaeroben Cellulosezersetzers in Frage stellen kann. Denn
in der Kreide, die der Nährlösung zum Abfangen der bei der Gärung
entstehenden Säuren zugesetzt wird, konnten neben anderen Keimen
auch solche des anaeroben Cellulosezersetzers nachgewiesen werden,
die sich über die üblichen Sterilisationsmaßnahmen hinweg am Leben
zu erhalten vermögen. Es empfiehlt sich daher die Verwendung reinster
Präparate des Calciumcarbonats und die Anwendung ausreichender
Sterilisationsmaßnahmen, am besten AutoLlavieren bei 130^ C in
mehreren Fraktionen mit eingeschalteter mehrtägiger Bebrütung und
Evakuieren kurz vor dem Autoklavieren zur Entfernung etwa in dem
Calciumcarbonat oder der Cellulose okkludierter Luft; die Anwesenheit
solcher Luft genügt, um die Wirksamkeit der Sterilisation wesentlich
herabzusetzen.

Auf Grund dieser Erfahrungen vmrden zwei neue Stämme des
anaeroben Cellulosezersetzers isoliert: ein farbloser Stamm und ein
Stamm mit intensiver Farbstoffbildung. Es zeigte sich, daß das Wachs-
tum dieser Stämme — insbesondere des gelben Stammes — in der
verwendeten Nährlösung, die Cellulose als einzigen organischen Körper
enthielt, mit der Anzahl der Weiterimpfungen naehläßt. Dieser Mangel
kann behoben werden durch Zusatz von grünem Maiskeimblätterextrakt,
der sich von den untersuchten Stoffen als am wirksamsten erwies. Auch
das Vitamin D scheint eine günstige Wirkung zu haben.

Beim Abbau der Cellulose legen sich die Bakterien gerichtet der
Cellulosefaser an, derart, daß die Längsrichtung der Stäbchen der

276

R. Meyer :

Richtung der fibrillären Struktur der Faser parallel ist. Es wird dies
in Zusammenhang gebracht mit der Art des Celluloseabbaues. Das
Fadenmolekül der Cellulose, dessen Länge von der gleichen Größen-
ordpung wie die des Bakteriums ist, wird wahrscheinlich an bestimmten
Stellen angegriffen, so daß schließhch — auch infolge der Locker-
Struktur der Cellulosefaser — der Verband der Faser gesprengt wird;
im mikroskopischen Bild findet man dann eigentümliche Korrosions-
figuren und Trümmer. Eine vorherige Verquellung der Faser findet
nicht statt. Die Art dieses Abbaues der Cellulosefaser läßt sich nur
durch die Annahme eines Endoenzyms deuten, da ein Abbau nur dort
stattfindet, wo die Faser von Bakterien besetzt ist. Der weitere Abbau
der Cellulose führt über einstweilen strittige Zwischenprodukte zu
flüchtigen Säuren und Äthylalkohol, wobei ungefähr die Hälfte der
Cellulose in diese Säuren zerfällt. Die flüchtigen Säuren bestehen in der
Hauptsache aus Essigsäure und Buttersäure (letztere im Mittel 5 % der
flüchtigen Säuren). Das weiterhin beobachtete Kohlendioxyd ent-
stammt zum größten Teile oder ganz dem zur Neutralisation zugesetzten
Calciumcarbonat, aus dem es durch die Säuren freigemacht wird.
In geringer Menge, und nicht in allen Kulturen, entsteht Wasserstoff.
Zu Beginn des Wachstums wird in der Kultur Sauerstoff Verbraucht.
Dieser wird wahrscheinlich für den ersten Eingriff in das Cellulose-
molekül verwendet. Da aber wegen der Fadengestalt der Moleküle nur
wenig Sauerstoff benötigt wird, um bereits tiefgreifende Veränderungen
zu erzielen, verläuft der Vorgang des Celluloseabbaues bei diesem
Bakterium im ganzen scheinbar anaerob.

Neben den genannten Stoffen wurden noch in beiden Stämmen
ein bläulich fluoreszierender Stoff und ein Duftstoff nachgewiesen.
Bei dem farbigen Stamm trat außerdem noch ein in Methyl- und Äthyl-
alkohol leicht löslicher Farbstoff auf, der im Lichte leicht ausbleicht.
In anderen Lösungsmitteln ist dieser Farbstoff nur wenig oder gar nicht
löslich. Der gelbe Farbstoff ist in der Hauptsache an die Faser ge-
bunden, die sich dichroitisch anfärbt, während der Duftstoff und der
fluoreszierende Stoff sich in der Lösung befinden.

Literatur.

Bailey, A. ./., The Paper Industry Year 1938, Nr. 2. — Bailey, I. W, u.
Vestal, M, i?., J. Arnold Arboretum 18, 196, 1937. — Baker, F., Nature 143, ö22,
1939. — Baker, F, u^ Martin, R., (1) Zbl. Bakt. II, 96, 18, 1937. — (2) Ebenda 97,
201, 1937. — (3) Ebenda 99, 400, 1939. — Bemhauer, K., Gärungschemisches
Praktikum. Berlin 1936. — Bonner, /., Jahrb. wiss. Bot. 82, 377, 1935. — Bo-
jarakaja, B. G., Microbiology 8, 142, 1939.

Clauaen, P,, Zbl. Bakt. II, 84, 377, 1931. ~ Coolhcuia, G., ebenda 76, 38,
1929. — Cowles, Ph. B. u. Rettger, L,F., J. Bact. 21, 167, 1931.

Untersuchimgen über den Abbau der Cellulose.

277

Farr, W, K.m. Eckerson, S. H,, Contr. Boyce Thompson Inst. 6, 309, 1934.

— Frey-Wiasling, A., (1) Protoplasma 26, 261, 1936. — (2) Ebenda 27, 372, 1937.

— (3) Naturwiss. 28, 386, 1940.

Hooper, F. E,, Contr. Boyce Thompson Inst. 10, 267, 1939.

Imhenecki, A, A., (1) C. R. de TAc. Sc. de TURSS. 21, 332, 1938. —
(2) Microbiology 8, 129, 1939. ~ (3) Ebenda 8, 363, 1939. (4) Ebenda 9, 233,

1940. - (6) Ebenda 9, 433, 1940. - (6) Ebenda 10, 385, 1941. - Imsenecki, A, A,
u. Bojarakaja, B, ö., ebenda 8, 667, 1939.

Kellerman, K, F, u. Mc Beth, 7. Ö., Zbl. Bakt. II, 34, 485, 1912. — Khou-
vine, r., (1) Ann. Inst. Pasteur 37, 711, 1923. — (2) Cellulose et Bact^ries,
D^compos. et Synthese, Paris 1934. — Khouvine, Y, u. Boeters, K., C. R. Soc.
Biol. 122, 69, 1936.

Löhnia, F, u. Lochhead, O., Zbl. Bakt. II, 37, 490, 1913.

Meyer, K. H. u. van der Wyk, A, J. A,, Zeitschr. f. Elektrochem. 47, 353,

1941. — Meyer, 72., (1) diese Zeitschr. 5, 185, 1934. — (2) Forschungsdienst 6,
197, 1938. - (3) Diese Zeitschr. 9, 80, 1938. - Meyer, V,, Zbl. Bakt. II, 92, 1,
1936. — Müller, F., Helv. chim. Acta 22, 208, 1939.

Omelianaki, W,, Zbl. Bakt. II, 8, 193, 1902.

Pfenniger, L. u. Frey-Wiaaling, A., Protoplasma 23, 371, 1939. — Pochon, J,,
(1) Ann. Inst. Pasteur 56, 676, 1935. ~ (2) C. R. Soc. Biol. 127, 999, 1938. —
Pringaheim, H,, (1) Zbl. Bakt. II, 23, 300,* 1909. ~ (2) Ebenda 38, 513, 1913.
Rotmiairov, M, N., (1) Microbiology 8, 56, 1939. — (2) Ebenda 9, 331, 1940.

— (3) Ebenda 9, 453, 1940. — Rotmiatrov, M. N. u. Scharojko, K, M., Micro-
biology 8, 806, 1939. — Rotmiatrov, M, N. u. Sherbakova, J. A., Microbiology 10,
49, 1941. — Rouachal, E, u. Strugger, S,, Ber. dtsch. bot. Ges. 68, 60, 1940. —
Ruaka, H,, Kolloid-Zeitschr. 92, 276, 1940.

Schulze, P., Zeitschr. VDI. 83, 1306, 1939. — Seifriz, W,, Ind. engin. Chem.
28, 136, 1936. - Snieazko, St., (1) Zbl. Bakt. II, 78, 376, 1929. - (2) Ebenda 88,
403, 1933. — Staudinger, H., Naturwiss. 28, 136, 1936. — Strugger, S,, (1) Flora
(Jena) 132, 263, 1938. - (2) Ebenda 133, 56, 1938. - (3) Biol. Zbl. 69, 409, 1939.

— (4) Zeitschr. f. Bot. 36, 97, 1939/40.

Tetrault, P. A,, Zbl. Bakt. II, 81, 28, 1930. — • Tacheltzoiva, Ju. S., Micro-
biology 8, 481, 1939.

Werner, E., Zbl. Bakt. II, 67, 297, 1926.

Weitere Literatur über anaerobe Cellulosezersetzung siehe bei R. Meyer,
Forschungsdienst 5, 197, 1938.

(Aus dem Botanisch-Mikrobiologischen Institut der Technischen Hochschule

Karlsruhe.)

Mikrobiologische Untersnchnngen
an See- nnd Silfiwasserflschen.

V. Mitteilung:

über die Wirkung von ultraTioIettem Licht
auf den OberllSchenkeimgehalt von Fischfilets und von Fischen

Von

Th. Zeiser und W. Schwartz.

Mit 5 Textabbildungen.

(Eingegangen am 22. Februar 1943.)

Die bakterizide Wirkung von ultraviolettem Licht bestimmter
Wellenlängen ist bekannt und schon wiederholt bei der Lebensmittel-
konservierung angewandt worden. Meist wird das UV-Licht mit einem
anderen Konservierungs- oder Prischhaltungsverfahren kombiniert,
etwa mit der Anwendung von Kälte. Die äußerst geringe Eindringungs-
tiefe beschränkt den Anwendungsbereich von vornherein auf die Fälle,
in denen bei festen Körpern, wie Fisch oder Fleisch, die Bakterien nur
die Oberfläche infiziert haben, oder in denen Flüssigkeiten, wie Milch,
in dünner Schicht an den UV-Lampen vorbeigeführt werden können.

Bei Seefischen wäre vor allem daran zu denken, Filets, die durch
Tiefgefrieren für Monate haltbar gemacht werden sollen, einer ÜV- Vor-
behandlung zu unterwerfen, um die mit dem Schlachten und Filetieren
verbundene Oberflächeninfektion möglichst wieder auszuschalten.
Voraussetzung für die Wirksamkeit dieses Verfahrens ist die Annahme,
daß die Abtötung der Bakterien mit einer Vernichtung der von ihnen
hervorgebrachten Enzyme verbunden ist, so daß die Filets in einem
biologisch günstigeren Zustand zur Gefrierbehandlung und anschließen-
den Lagerung gelangen.

Die 16 in dieser Veröffentlichung besprochenen Versuchsserien wurden
1940 mit verhältnismäßig frischen Seefischfilets ausgeführt, die uns in Eis
verpackt unmittelbar von der Küste aus zugeschickt wurden. Äußere
Gründe zwangen zu einer längeren tJnterbrechung der Arbeit. Bei der
Wiederaufnahme 1942 zeigten von 14 Versuchen mit 8 tJV-Röhren nur 2

' Ausgeführt mit Unterstützung des Reichsforschungsrates und des
Reichskuratoriums für Technik in der Landwirtschaft. Die Versuchs -
apparatur wurde mit Unterstützung der Siemens- Schuckert-Werke A.-G.
in Berlin -Siemensstadt entwickelt.

Mikrobiologische Untersuchungen an See- und Süßwasserfischen. V. 279

eine mit den früheren Ergebnissen vergleichbare starke Abtötung; im
Mittel aller Keimzahllogarithmen war die Abtötimg sogar schwächer als 1940
mit nur 2 UV-Röhren^.

Die Unvereinbarkeit der Ergebnisse ist offenbar durch Unterschiede
im Versuchsmaterial bedingt. Die Filets von 1942 waren größtenteils
Gefrierfilets, die ims teils noch leicht gefroren, teils schon aufgetaut zur
Verfügung standen, -* also ein Material, bei dem zweifellos schon eine
stärkere, der UV- Wirkung entzogene Tiefeninfektion anzimehmen war.

Da frische Füets nicht erhältlich waren, haben wir uns in der Auswertung
auf die Versuche von 1940 beschränkt, weil nur dort ein Vergleich ver-
schiedener Bestrahlungsstärken möglich war. Allerdings mußten wir dabei
in Kauf nehmen, daß wegen der geringen Versuchszahl (insgesamt 16 Reihen)
die Auswertung vorläufigen Charakter hat imd nur mit Vorbehalt einer
späteren Na^chprüfung veröffentlicht werden kann.

Für die praktische Anwendung der UV-Behandlung ergibt sich jedoch
schon jetzt die wichtige Konsequenz, daß ihr Erfolg völlig von der Be-
schaffenheit des Ausgangsmaterials abhängig ist.

In einigen Versuchen wurde auch die UV- Wirkung auf den Oberflächen-
keimgehalt ganzer Fische geprüft.

Auf die Theorie der UV- Wirkung, insbesondere auf die Frage nach
dem Nebeneinander direkter und indirekter Wirkungen, soll hier nicht
eingegangen werden. Sie wird in einem anderen Zusammenhang behandelt
werden.

I. Methode.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten der ÜV-Bestrahlung. Mit
Rücksicht auf die in der Praxis angestrebte Verwendung wählten wir
(abgesehen von einigen orientierenden Versuchen mit wiederholter
Bestrahlung ganzer Fische) die einmalige, möglichst kurzfristige Be-
strahlung von der Küste bezogener frischer Fischfilets bei möglichst
kleinem Abstand der UV- Lampen.

Die UV-Lampen* waren röhrenförmige Quecksilberdampf -Niederdruck-
lampen, Type HNS 1350/0,0 m, mit einem Durchmesser von etwa 1,4 cm
und einer Leuchtlänge von 30 cm. Von der Gesamtstrahlung entfallen
85 % auf die Linie 2537 A, der Rest größtenteils auf die Linie 1849 A. Als
Versuchsmaterial dienten Kabeljau- und Schellfischfilets, Heringe, Schleien,
Brachsen und Rotfedern,

Versuche mit Fischfilets. Die aus der Bauchseite (Innenseite) eines
großen Filetlappens herausgescbnittenen Versuchsstücke ( Größe etwa 4 : 5 cm )
lagen in einer bestimmten Anordnung in ein oder zwei Reihen auf einer
Glasplatte im Impfkasten. Die Bestrahlungsanlage war 10 cm über der
Filetoberfläche eingebaut. Sie bestand zunächst aus 2, dann aus 4 und
schließlich aus 8 UV-Lampen, deren Abstand voneinander 20, 8,3 bzw.
4 cm betrug. Die senkrecht unter den Röhren liegende bestrahlte Fläche
umfaßte 20 x 30, 25 X 30 bzw. 28 x 30 cm.

Bei den Filets wurde der Oberflächenkeimgehalt vor Versuchsbeginn
bestimmt, sowie 20 oder 30 und 40 Sekunden und 1, 2, 5, 10, 20 imd
30 Minuten nach Versuchsbeginn.

^ Eine Intensitätsmessung ergab, daß die Röhren in ihrer Wirksam-
keit nicht nachgelassen hatten.

280

Th, Zeiser u. W. Schwartz:

Versuche mü ganzen Fischen. Bei einmaliger UV-Behandlimg (nur ein
Versuch) war die Anordnimg die gleiche wie bei den Filetversuchen. Bei
mehrmaliger Bestrahlung lagen die Fische in den früher beschriebenen Glas-
wannen (Schwartz iind Zeiser ^ 1939) im Kühlschrank in 20 cm Abstand von
den beiden TJV-Lampen. Der Deckel der Glaswannen wurde während der
Behandlungsdauer von 10 bis 30 Minuten imd während der folgenden 10 bis
16 Minuten abgenommen. Die Kühlschranktemperatur war -1- 6® C.

Um bei der anschließenden Kühllagerung einen zuverlässigen Maßstab
für das Erreichen der Haltbarkeitsgrenze zu haben, wurde die Kurve der
Oberflächenkeimzahl-Logarithmen ergänzt durch die Qualitätskurve, die
auf Grimd der subjektiven Qualitätskontrolle (Zeiser imd Schwartz^ 1942)
aufgestellt war.

Die Keimzahlberechnimg erfolgte nach der fiüher beschriebenen
Methode : Entnahme von 6 oder 10 qcm Fischhaut von den ganzen Fischen
bzw, einer entsprechenden etwa 2 bis 6 mm dicken Gewebescheibe von der
Filetoberfläche; Herstellung der Aufschwemmung mit abgekochtem,
sterilem Leitimgswasser, Aussaat in Fleischbouillongelatine, Berechnung
der Keimzahl je qcm Fisch- bzw. Filet Oberfläche.

Wie bei früheren Versuchen wurde jede Fischbouillongelatineplatte
mindestens zweimal gezählt, vorläufig am zweiten Tag, endgültig am dritten
oder einem späteren Tag.

Manche Versuche ließen vermuten, daß nach einer Bestrahlungs-
dauer bis 5 Minuten der Keimzahlanstieg von der ersten zur zweiten
Z&hlung größer sei als nach einer längeren Bestrahlungsdauer. Dies
würde bedeuten, daß überlebende Keime im ersten Falle eine Ver-
zögerung ihres Wachstums aufweisen. Das Mittel der Keimzahlanstiege
war jedoch für alle Versuche von 0 Sekunden bis 30 Minuten gleich;
nicht abgetötete Keime werden also durch die vorhergegangene Be-
strahlung nicht gehemmt. Die UV-Wirkung hat also auch hiernach
den Charakter einer Trefferwirkung: entweder wird die Zelle getötet
oder sie bleibt, was die unmittelbare UV-Wirkung anbetrifft, unbeeinflußt.

n. Yersuchsergebnisse.

1. KfihUagenmg ganzer Fische bei wiederholter Uy-Behandlung.

Vier Versuchsreihen mit Heringen, Schleien, Brachsen, Rotfedern
verliefen in bezug auf die UV-Wirkung ziemlich gleich, so daß als
Beispiel nur ein Versuch mit 14 Heringen herausgegriffen werden soll
(Abb. 1), von denen 8 mit UV bestrahlt wurden und 6 als Kontrolle
dienten.

Bei Versuchsbeginn hatten zwei unbehandelte Fische je qcm
6,3 und 3,48 X 10* Keime. Das Mittel der Keimzahllogarithmen war
also 4,67. Zwei UV-bestrahlte Fische ergaben 2,1 x IC^ und 1,5 x 10*
Keime und log 3,74. Der Keimzahllogarithmus war also durch die
Bestrahlung um 0,93, die Keimzahl auf rund 12 % des Anfangswertes
gesenkt.

Mikrobiologische Untersuchungen an See- und Süßwasserfischen. V. 281

Nach 2 Tagen hatte eine Probe von den bei Versuchsbeginn be-
strahlten Fischen einen mittleren Keimzahllogarithmus von 5,83, der
durch erneute Bestrahlung auf 5,06 fiel, also um 0,77, was einer Senkung
der Keimzahl auf 17% entspricht.

Am fünften Versuchstag wurde zunächst bei unbehandelten Fischen
ein mittlerer Keimzahllogarithmus von 9,21 festgestellt. Die bereits
zweimal, am nullten und zweiten Tag bestrahlten Fische ergaben nur
7,96, also eine Senkung um 0,42 oder auf 38 %.

Abb. 1. Kühllageniiig grüner Heringe bei + 6" C mit wiederholter UV-Bestrahlung.
Abszisse: Tage, Ordinate: Obere Kurven : log der Keimzahlen je qem Oberfläche bei der Kon-
trolle und nach Bestrahlung. Untere Kurven; Qualitätskurven für KontroUreihe und UV -Reihe;
Aussehen und Geruch: @ O “= KontroUreihe, O • = UV-Reihe.

Am siebenten Tag ergaben die Kontrollfisclie 9,07, die nun schon
dreimal (am nullten, zweiten und fünften Tag) bestrahlten UV-Fische
8,79 und nach erneuter Bestrahlung 8,76, also eine Senkung um 0,12
oder auf 76 %.

Überblicken wir den Kurvenverlauf und die Prozentzahlen, so wird
deutlich, daß die UV- Wirkung im Laufe des Versuchs immer mehr
abnimmt. Es werden verhältnismäßig immer weniger Keime abgetötet.
Da keine UV- Versuche mit nichtbestrahlten Fischen höherer Anfangs-
keimzahlen vorliegen, kann nicht entschieden werden, ob dies auf
einem Übrigbleiben relativ UV-resistenter Stämme beruht.

Auf Grund der Beschreibungen des Zustandes der Fische (Geruch,
Aussehen, Schleimbildung usw.) in den Versuch sprotokollen wurde die
Qualitätskurve zur Veranschaulichung des Frischezustandes und des
allmählichen Verderbens ermittelt. Hiernach erreichten bei dieser
Serie die Kontrollfische die Haltbarkeitsgrenze (Q — 2,5) nach 2, die
bestrahlten nach 3,8 Tagen.

282

Th. 9^iser u. W. Schwartz:

Dagegen wurde bei einer Serie mit Brachsen und Rotfedern die
Haltbarkeitsgrenze von beiden Gruppen gleichzeitig, ja von den Be-
strahlten ^er etwas früher erreicht. Bei einer weiteren Serie standen
keine Kontrollfische zur Verfügung, und die vierte mußte aus äußeren
Gründen vorzeitig abgebrochen werden.

Die Behandlung mit nur zwei UV- Strahlern hat bei ganzen Fischen
keine einwandfreie, praktisch bedeutsame Verlängerung der Haltbarkeit
ergeben. Nach den Ergebnissen der Piletversuche dürfte aber Aussicht
bestehen, durch Steigerung der Strahlungsintensität bessere Erfolge
zu erzielen.

2. Versuche mit Fischfilets und ganzen Fischen
bei einmaliger UV-Behandlung.

a) Versuche mit 2, 4 und 8 UV -Röhren.

Um Zufälligkeiten der Einzelwerte auszuschalten, die wohl haupt-
sächlich auf die ungleichmäßige Keimverteilung auf der Filetoberfläche
(Zeiser, 1943) zurückzuführen sind, und einen Überblick über die Gesetz-
mäßigkeiten des Kurven verlauf 8 zu erhalten, wurde für jede der Probe-
zeiten von 0 bis 30 Minuten das Mittel aus den Keimzahllogarithmen -
Senkungen der Einzelserien gebildet, so daß sich Durchschnittskurven
ergaben (Tabelle I, Abb. 2). Wir haben das Mittel aus den Logarithmen
und nicht aus den Keimzahlen selbst gewählt, da die Verkürzung der
Haltbarkeitsdauer proportional der Zunahme des Logarithmus ist
(Schwartz und Zeiser, 1939).

Tabelle I. Keimzahlsenkung auf der Oberfläche UV-bestrahlter
Fischfilets (Durchschnittswerte).

2 ÜV-Röhren
4 UV-Röhren
8 UV-Röhren

Bestliche Keimzahl je qcm Oberfläche in % der Anfangskeimzahl
nach einer BeBtrahlungsdauer von

20 Sek. 30 Sek.

1 40 Sek.

IMin.

2 Min.

5 Min.

10 Min.

20 Min.

30 Min.

70 69

26 21

24 8,6

4.7

2.9

3.1

2,1

3.6

6.6

2.6

Bei zehn Serien mit zwei UV-Lampen zeigt sich ein deutliches Ab-
sinken des Keimzahllogarithmus vom Anfangswert bis zur zweiten
Minute und ein weiteres, schwaches Sinken bis zur fünften Minute. Bis
zur zehnten Minute bleibt dann die Keimzahl nahezu konstant, um
hierauf bis zur 20. Minute leicht zu steigen und bis zur 30 Minute wieder
konstant zu bleiben.

Bis zur 40. Sekunde ist (Tabelle II) der Keimzahllogarithmus um 0,28,
die Keimzahl also auf rund 52% des Anfangswertes gesunken, nach
5 Minuten um 0,66, das entspricht einer Abnahme auf 42 % des Wertes

Mikrobiologische Untersuchungen an See- Und Süßwasserfischen. V. 283

bei 40 Sekunden. Die Wirkung einer einzelnen Röhre erhalten wir,
indem wir den Logarithmus der Gesamtsenkung durch die Röhrenzahl
dividieren. Eine Röhre senkt also in 40 Sekunden den Logarithmus um

Abb.2. Einmalige UV-BestrahlTing von Seeflschlllete mit 2, 4, 8 UV-Köhren. Die einzelnen
VerBuchzwerte sind angegeben. AbszlBse: Dauer der Bestrahlung. Ordinate: Senkung des
KeimzahllogarlthmuB Je qcm Oberfläche A (log JT^ — log Überlebende Keime ln

% der AntangBkeimzahl.

1 log bedeutet den log der Keimzahl nach der jeweiligen Be
strahlungsdauer, \o%AK den log des Anfangskeimgehaltes.

284

Th. Zeiser u. W. Schwartz:

0,14, die Keimzahl auf 72 %, in 5 Minuten um 0,33 auf 47 %. Für eine
Verlängerung der Haltbarkeit ist eine solche Keimzahlsenkung noch
viel zu gering.

Tabellen. Anfangskeimzahllogarithmus (log AK), Senkung des Keimzahk
logarithmus, (4 log) und restliche Keimzahl in % dei* Anfangskeimzahl
auf Grund der einzelneli Versuchswerte nach einer UV-Bestrahlung von
40 Sekimden, 6 und 30 Minuten. Die Mittelwerte der % -Zahlen wurden
aus den Mittelwerten für A log berechnet (vgl. hierzu S. 282), nicht aus den
einzelnen darüberstehenden % -Werten. Schlägt man den zweiten Weg ein,
so ergeben sich Abweichungen, weil das Mittel zweier Zahlen stets größer
ist als der Numerus des Mittels der Logaritliraen.

Serie

log AK

Nach 40 Sek.

Nach 5 Min.

Nach 30 Min.

log*

%••

.^log

.«flog

2 UV-Röhren

6,38

5.20
6,78

6.20
6,62
7,06
6,76
6,26
8,84
6,18

0,41

0,11

0,49

0,23

0,19

0,28

+0,39

0,33

0,52

0,64

246

0,30

0,32

1,19

0,14

0,61

1,16

0,27

0,69

0,77

1,18

6,6

6,9

6,6

0,60

0,37

1,60

0,07

0,32

0.27

+0,17

0,61

1,00

2,6

160

Mitte] der log- und
der %-Werte ....

6,23

0,28

0,66

0,63

4 UV-Röhren

7,10

7,06

0,81

0,77

0,86

1,12

7,6

1,02

0,74

9,6

Mittel der log- und
der %-Werte ....

7,08

0,79

0,98

0,88

i 13

8 UV-Röhren

7,14

7.03
6,88

6.03

1,71

1,70

1,21

0,69

1,9

2,0

6,2

2,23

1,86

l-,98

0,68

0,6

1.4

1,0

1,69

1,43

2,28

0,93

2,0

3.7

0,6

Mittel der log- und
der %-Werte

6,77

1,33

4,7

1,69

2.1

1,68

2.6

Bei A log ist in der Tabelle daa Minusaeichen bei KeimzahlBenkungen woggelassen. Ein
GröSerwerden des log ist durch Pluszeichen bervorgehoben. — ** Werte oberhalb 10% sind auf
Ganze, Werte darunter auf Zehntel abgerundet.

Außer den Zufallsschwankungen sind auch starke Abweichungen
in den Abtötungsergebnissen im Verlauf der Einzelkurven zu verzeichnen.
So zeigt z. B. die dritte Serie eine sehr starke Abtötung in 40 Sekunden
auf 32 und in ö Minuten auf 6,ö%; die zehnte auf 23 bzw. 6,6 %. Bei
der mit dem gleichen Material ausgeführten vierten Serie dagegen ist
nach 40 Sekunden die Keimzahl nur bis 59% gesunken, steigt bis
5 Minuten wieder auf 72 %, bleibt etwa auf dieser Höhe und hat nach

Mikrobiologische Untersuchungen, an See- und Süßwasserfischen. V. 285

30 Minuten 85 % erreicht. Es handelt sich hier nicht um isolierte Zufalls-
werte, sondern um Werte, die im Verlauf der Einzelkurven liegen. Die
abweichenden Werte von 7 dagegen sind Zufallsergebnisse ; sie kommen
dadurch zustande, daß der Wert für die Anfangskeimzahl offenbar
infolge der ungleichmäßigen Keimverteilung zu tief liegt, während der
Kurvenverlauf eine gute Abtötung vermuten läßt.

Ein in gleicher Weise durchgeführter' Versuch mit ganzen Fischen
(Blaufelchen), der anhangsweise erwähnt sei, brachte ähnliche Ergeb-
nisse; die stärkste Senkung um 1,21 auf 6,2% war nach 10 Minuten
erreicht. Gegen Ende des Versuchs kam es auch hier zu einem leichten
Anstieg der Keimzahlen.

Bei Verwendung von vier UV-Röhren (zwei Serien) erhalten wir
einen ähnlichen Kurvenverlauf und als Erfolg nach 40 Sekunden eine
Senkung um 0,79 auf etwa 16% der ursprünglichen Keimzahl, nach
5 Minuten um 0,98 auf 10,4 % —* also von 40 Sekunden bis 5 Minuten
um 0,19 auf 64 % des Wertes bei 40 Sekunden. Für eine Röhre beträgt
die Senkung in 40 Sekunden 0,20 oder 63% und in 5 Minuten 0,25
oder 56% (Tabelle II).

Eine viel stärkere Keimzahlsenkung ist mit acht UV-Röhren
(vier Serien) erreichbar. Nach 40 Sekunden ist der Keimzahllogarithmus
schon um 1,33, die Keimzahl also auf nur 4,7 % gesunken, nach 5 Minuten
um 1,69 auf 2,05 %; von 40 Sekunden bis 5 Minuten demnach um 0,36,
auf 44 % des Wertes bei 40 Sekunden. Eine Röhre senkt den Logarithmus
in 40 Sekunden um 0,17 und die Keimzahl auf 68%, in 5 Minuten um
0,21 auf 62% (Tabelle II).

Die vierte Serie mit der tiefsten Anfangskeimzahl ergab eine auf-
fallend schwache Senkung (40 Sekunden 20,4 %, 5 Minuten 21 %) und
verlief sehr unregelmäßig ; die erste mit der höchsten Anfangskeimzahl
brachte in regelmäßigem Kurvenverlauf die stärksten Senkungen auf
1,9% schon nach 40 Sekunden und auf 0,59% nach 5 Minuten. Be-
merkenswert ist noch, daß die dritte Serie, die mit demselben Filet-
material und am selben Tag wie die vierte angesetzt wurde, mit viel
höherem Anfangswert beginnend, in regelmäßigem Kurvenverlauf zu
bedeutend tieferen Endwerten sank als die vierte. Vermutlich hatte die
dritte Serie eine stärkere Oberflächeninfektion, was sowohl die höhere
Anfangskeimzahl als auch die stärkere Abtötung erklären würde,
während bei der vierten Serie eine stärkere Tiefeninfektion anzu-
nehmen ist.

Bei so ausgeprägten Keiihzahlsenkungen, wie sie sich mit acht
UV-Röhren erreichen lassen und wie sie bei weiterer Steigerung der
Röhrenzahl zu erwarten sind, wäre eine günstige Nachwirkung bei der
anschließenden Lagerung rtn tiefgefrorenen Zustand möglich. Er-
fahrungen an Fischen mit künstlich gesenkter Anfangskeimzahl

286

Th. Zeiser u. W* Schwartz :

(Schwartz und Zeiser, 1939) mahnen aber auch hier zur Vorsicht ^ und
verlangen eine experimentelle Prüfung in monatelang fortgesetzten
genau kontrollierten Lagerungsversuchen.

Überblickt man die Ergebnisse (Abb. 2), so wird der überein-
stimmende Verlauf ersichtlich: stärkste Senkung in den ersten 40 bis
60 Sekunden, dann schwächeres weiteres Sinken bis zum Minimum bei
etwa 5 Minuten und schließlich ein mehr oder weniger deutlicher Wieder-
anstieg, dem bei acht UV-Röhren nochmals eine Senkung folgt.

Was den Kurven verlauf jenseits der 5-Minuten- Grenze, Anstieg
und erneutes Absinken bestimmt, ist noch unbekannt.

Zunächst sollte der Anstieg der Keimzahlen damit erklärt werden,
daß sich die Bearbeitung der Proben bei Versuchsbeginn wegen der
schnellen Aufeinanderfolge etwas verzögerte. In der längeren Pause
zwischen Bestrahlen und Einbringen in den Kolben mit Verdünnungs-
wasser hätte durch bei der Bestrahlung gebildete Giftstoffe eine zusätz-
liche Abtötung erfolgen können, deren Unterbleiben bei pausenloser
Verarbeitung den Anstieg erklärt hätte. Es zeigte sich jedoch, daß es
auch dann zum Anstieg der Keimzahlen kam, wenn stets zwischen
Bestrahlung und Verdünnung eine Pause von 5 oder 10 Minuten ein-
gelegt wurde.

Andere Erklärungsmöglichkeiten könnten darin liegen, daß bei
unserer Versuchsanordnung die letzten Probestücke etwas mehr außen
lagen und daher etwas schwächer bestrahlt wurden (daß sie eine viel
größere Gesamtstrahlung empfangen, kann, wie wir später sehen werden,
nicht als Gegenargument dienen), oder auch darin, daß die ersten
Probestücke vom vorderen, die letzten dagegen vom hinteren, dünneren
Filetende stammen, dessen Keimgehalt im Durchschnitt etwas höher
ist (Zeiser, 1943).

Der Keimzahlanstieg bei den UV- Serien scheint uns zu ausgeprägt
und zu regelmäßig zu sein, als daß er nur versuchstechnisch bedingt
sein könnte 2.

Diese und andere Fragen der UV-Wirkung bedürfen jedenfalls
einer gesonderten Bearbeitung unter vereinfachten und übersicht-
licheren Versuchsbedingungen.

h) Beziehungen zwischen Anfangskeimzahl und Keimzahlsenkung
sowie Wiederanstieg der Keimzahlen.

Verfolgt man die Beziehungen zwischen der Anfangskeimzahl
der Filetoberfläche (log AK) und der durch UV erzielten Keimzahl-
logarithmen- Senkung, so ergibt sich, daß mit steigender Anfangs-

^ So war beispielsweise bei frischen Fischen trotz Senkung der Anfangs -
keimzahl auf 0,3% die Haltbarkeit statt um die erwarteten 8 Tage kaum
merklich verlängert. — ® Für die Praxis ist der erneute Anstieg schon
deshalb bedeutungslos, weil er erst nach 6 Minuten einsetzt.

Mikrobiologische Untersuchungen an See- und Süßwasserfischen. V. 287

keimzahl auch die Senkung des Keim^hllogarithmus zunimmt. Bei
höherer Anfangskeimzahl werden nicht nur absolut, sondern auch
relativ mehr Keime abgetötet. Für die Versuche mit zwei UV- Röhren
ist diese Beziehung ziemlich klar zu erkennen; bei Verwendung von
acht UV-Röhren ist sie wahrscheinlich, aber wegen der geringen Zahl
der Versuchsserien noch nicht einwandfrei nachgewiesen (Abb. 3).

tog/t/r

Abb. 3. Senkung des Keimzahllogarithmus nach einer Bestrahlungsdauer von 5 Minuten
(Ordlnat(5) in Abliängigkeit vom log der Anfangskeimzahl (Abszisse).

Bei größerer Keimdichte steigt die Trefferwahrscheinlichkeit für
die Lichtquanten, es wären also wohl absolut, aber nicht relativ
mehr Abtötungen zu erwarten. Über die Ursachen der verstärkten
Abtötung sind vorerst nur Vermutungen möglich. Denkbar wäre ein
Zusammenhang mit den Vorgängen bei der Tiefeninfektion. Vermehren
sich, was aber bei ganzen Fischen im allgemeinen nicht der Fall zu
sein scheint {Schwartz und Zeiser, 1939), die Oberflächenkeime stärker
als die in die obersten Gfewebeschichten eingedrungenen und dort der
UV- Wirkung entzogenen Keime, dann müßte mit steigender Oesamt-
keimzahl ein immer größerer Anteil der UV- Wirkung zugänglich sein
und abgetötet werden.

Ferner könnten die bei der Abtötung entstehenden Zerfallsprodukte
eine Giftwirkung ausüben und zu einer zusätzlichen Abtötung von
Keimen führen, die durch die unmittelbare UV-Wirkung noch nicht
erfaßt wurden. Diese zusätzliche Wirkung müßte um so größer
sein, je näher die Keime beisammen liegen, je größer also die Keim-
zahl ist.

Für den Wiederanstieg der Keimzahllogarithmen in der Zeit
zwischen 5 und 30 Minuten erhält man eine ganz ähnliche Kurve wie
für die Senkung; auch er nimmt mit steigender Anfangskeim-
zahl zu.

Archiv für Mikrobiologie. Bd. 13.

288

Th. Zeiser u. W. Schwartz :

c) Beziehung zwischen RöhrenzaM, Bestrahlungsdauer und Keimzahl-
senkung. Wirkungsgrad der zur Bestrahlung aufgewendeten Energie.

An Hand der in Abschnitt 2 a mitgeteilten Ergebnisse können wir
uns die Beziehungen zwischen der Senkung des Keimzahllogarithmus
und den dabei mitwirkenden Faktoren Röhrenzahl und Bestrahlungs-
dauer in den drei Versuchsabschnitten klar machen. Hieraus lassen
sich dann Schlüsse ziehen auf das Verhältnis zwischen der aufgewendeten
Energie und dem erzielten Erfolg, also auf den Wirkungsgrad der
UV -Behandlung .

Die Werte für die Senkung des Keimzahllogarithmus durch zwei>
vier und acht UV- Röhren im ersten Versuchsabschnitt von 0 bis

Abb. 4. Senkung des Keimzahllogarithmus für eine Bestrahlungszelt von 40 Sekunden
und 6 Minuten in Abhftngigkeit von der Edhrenzahl. Ordinate: A (logK^ — log AK).

Abszisse: Böhrenzahl.

40 Sekunden liegen ziemlich genau auf einer durch den Nullpunkt
gehenden Geraden (Abb. 4)^. ln diesem Abschnitt steigt also die loga-
rithmische Gesamtabtötung proportional zur Röhrenzahl, die Ab-
tötung pro Röhre ist konstant: jede weitere Röhre senkt den Keimzahl-
logarithmus um etwa logJT =0,17, die noch vorhandene Keimzahl
auf 72%,

Die Werte für die Senkung bis 5 Minuten liegen auf einer parallelen
Geraden. Im zweiten Abschnitt von 40 Sekunden bis 5 Minuten ist
also die logarithmische Gesamtabtötung konstant und nicht mehr

^ Di© Versuch© mit vier ÜV-Röhren hatten eine höhere^ di© mit 2 UV-
Röhren eine tiefere Anfangskeimzahl als die Versuche mit acht Röhren
(vgl. Abb. 2); nach Abschnitt 2b sind also die Keimzahllogarithmen-
Senkungen zu groß bzw. zu klein. Wird dieser Umstand berücksichtigt,
so dürften sich die Punkte eher noch der Geraden nähern.

Mikrobiologische Untersuchungen an See- und Süßwasserfischen. V. 289

proportional der Röhrenzahl ; sie beträgt etwa log K = 0,64, was einer
Senkung auf 44 % der Keimzahl bei 40 Sekunden, unabhängig von der
Röhrenzahl, entspricht. Die logarithmische Abtötung je Röhre sinkt
demnach mit wachsender Röhrenzahl. Im dritten Abschnitt von
5 bis 30 Minuten schließlich tritt überhaupt keine Abtötung mehr ein,
die entsprechende Glerade für 30 Minuten würde also mit der für 5 Mi-
nuten zusammenfallen, oder sogar etwas darunterliegen (Wiederanstieg).
Dementsprechend ist in den Kurven (Abb. 2) die Senkung im ersten
Abschnitt um so steiler, je größer die Röhrenzahl ist, im zweiten bei
allen Kurven etwa gleich schwach, während der dritte Kurventeil
waagerecht oder leicht ansteigend verläuft.

Abb. 5. Senkung des Keimzahllogarlthmus und Energieverbrauchs in Röiirenminuten bei 2, 4,
S UV-Röhren. Bei den einzelnen Versuchspunkten ist die Bestrahlungsdauer angegeben.

Ordinate : A (lug — log A K). Abszisse ; Röhrenmiuuten.

Die 40-Sekunden-Linie (Abb. 4) zeigt, daß durch Vermehrung der
Röhrenzahl (bzw. der Intensität der Bestrahlung) die logarithmische
Abtötung proportional der Röhrenzahl weiter gesteigert werden kann.
Unsere Versuche haben bis jetzt also keinen Hinweis auf die Existenz
absolut UV-resistenter oder geschützter Keime ergeben. In Wirklich-
keit wird allerdings die Abtötung bei weiterer Erhöhung der Röhrenzahl
durch die geringe Eindringungstiefe des UV ihre Grenze finden.

Aus dem Kurven verlauf ergibt sich, daß es vorteilhaft sein wird,
die Röhrenzahl zu erhöhen, um die Abtötung im ersten Abschnitt zu
steigern, während eine längere Bestrahlung unzweckmäßig wäre; denn
sie bedingt einen größeren Stromverbrauch, ohne die Abtötung ent-
sprechend zu erhöhen.

Die zu einer Bestrahlung verbrauchte Energie ist proportional
der Röhrenzahl und der Bestrahlungsdauer. Für unsere Zwecke genügt
es, wenn wir als Energieeinheit die Röhrenminute verwenden, d. h. die
Energiemenge, die von einer Röhre in I Minute abgegeben wird. Je
größer der Erfolg, hier die Senkung des Keimzahllogarithmus, im
Verhältnis zum Energieverbrauch ist, desto größer ist der Wirkungsgrad
(Nutzeffekt) der Bestrahlung.

20 *

290

Th. Zeiser u. W. Schwartz:

Da die Senkung des Keimzahllogarithmus nicht proportional der
Zeit zunimmt (Abb. 4), folgt, daß bei gleicher Röhrenzahl der Nutz-
effekt mit wachsender Bestrahlungsdauer sinkt. Ferner ist die Senkung
außer für 40 Sekunden nicht proportional der Röl^renzahl ; daraus ergibt
sich, daß bei gleicher Bestrahlungsdauer oberhalb 40 Sekunden der
Nutzeffekt mit wachsender Röhrenzahl sinkt.

Weitere Aufschlüsse geben Kurven (Abb. 5), aus denen abgelesen
werden kann, welcher Erfolg mit dem gleichen Energieverbrauch
(Röhrenminuten) bei verschiedener Röhrenzahl erzielt wird. Während
der Nutzeffekt mit steigender Röhrenzahl bei gleicher Bestrahlungs-
dauer sinkt, steigt er für gleichen Energieverbrauch mit steigender
Röhrenzahl, wobei, was für die Praxis wichtig ist, die erforderliche
Bestrahlungszeit abnimmt.

Die gleiche Energiemenge, 10 Röhrenminuten, wird z. B. verbraucht
bei Bestrahlung mit zwei Röhren während 5 Minuten, mit vier während
2,5 und acht während 1,25 Minuten. Die hierdurch erzielte logarith mische
Abtötung wächst aber mit der Röhrenzahl: der Keimzahllogarithmus
wird gesenkt um etwa 0,65, 0,87, 1,53, die Keimzahl also auf 22, 13,5,
2,95 % der Anfangskeimzahl.

Alle drei Kurven biegen bei etwa 10 Röhrenminuten zur Horizon-
talen um, die weitere Bestrahlung ist fast wirkungslos, obwohl sie, wie
aus Abb. 5 hervorgeht, 5-, 11-, 23 mal soviel Energie verbraucht. Die
Maximalwirkung wird also stets mit etwa derselben wirksamen Energie-
menge erzielt, nämlich mit diesen 10 Röhrenminuten; sie ist aber um
so stärker und tritt um so früher ein, je größer die Röhrenzahl ist.

Durch Vermehrung der Röhrenzahl wird also innerhalb gewisser
Grenzen eine weitere Verstärkung und Beschleunigung der Abtötung
ohne größeren Energieaufwand möglich sein. Sollte sich die aufgestellte
Regel bestätigen, so wäre z, B. zu erwarten, daß mit 15 Röhren die
Maximalwirkung schon nach 40 Sekunden eintritt und größer ist als
mit acht Röhren in 1,25 Minuten.

Während sich bei den Versuchen von Lembke^ Rickert und Thomsen
(1940) die annähernde Gültigkeit des Bunsen-Roscoeschen Gesetzes
herausstellte, die Abtötung bei gleichem Produkt aus Intensität und
Zeit also annähernd gleich war, gilt dieses Gesetz für unsere Versuche
nicht, es steigt vielmehr mit zunehmender Intensität die Abtötung
sehr stark an.

Wenn es sich um eine Ein-Treffer-Tötung bei homogenem Zell-
material handelte, müßte nach Jordan (1939) das Bunsen-Roscoe sehe
Gesetz gelten, es dürfte kein Zeitfaktor mitwirken. Auch der nach
oben konkave Verlauf der Kurven (Abb. 2) ist offenbar auf die Inhomo-
genität des Zellmaterials zurückzuführen (Jordan, 1939), wobei zuerst
die empfindlicheren Zellen abgetötet werden und die Überlebenden im
Durchschnitt unempfindlicher oder besser abgeschirmt sind.

Mikrobiologische Untersuchungen an See- und Süßwasserfischen. V. 291

Die Annahme, daß zur Abtötung eines Keimes mehrere Treffer
in kurzem Zeitabstand nötig smd, könnte einen Anstieg der prozentualen
Abtötung mit wachsender Bestrahlungsintensität erklären. Die Wahr-
scheinlichkeit mehrerer Treffer kurz nacheinander steigt ja mit der
Bestrahlungsdichte; und auch etwas tiefergelegene Kei^e können
dann genügend Treffer erhalten.

Zusammenfassung.

1. Werden Fische während eines Lagerungsversuchs bei
wiederholt 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt (zwei UV-Röhren,
Wellenlänge in der Hauptsache 2537 Äj, so ist die Keimzahlsenkung bei
der ersten Behandlung verhältnismäßig am größten und nimmt dann
immer mehr ab. Der Keimzahllogarithmus wird bei Versuchsbeginn
am 2., 5. und 7. Versuchstag z. B. um 0,93, 0,77, 0,42 und 0,12, die
Keimzahl also auf 12, 17, 38 und 76 % der vorher vorhandenen Keime
gesenkt. Mit steigender Keimzahl werden also verhältnismäßig immer
weniger Keime abgetötet.

2. Einmalige Behandlung von Seefischfilets mit zwei, vier oder
acht UV-Röhren ergibt einen starken Keimzahllogarithmus-Abfall
etwa innerhalb der ersten 40 Sekunden, einen schwächeren bis 5 Minuten,
worauf bis 30 Minuten ein leichter Wiederanstieg erfolgt.

3. Die Senkung des Keimzahllogarithmus erfolgt um so schneller
und ist um so größer, je höher die Röhrenzahl ist.

4. Bei einer Bestrahlungsdauer von 40 Sekunden sank mit zwei,
vier und acht Röhren der Keimzahllogarithmus um 0,28, 0,79 und 1,33,
die Keimzahl also auf 52, 16 und 4,7 %. Selbst bei der stärksten Ab-
tötung blieben also von 5,89 X 10® Keimen je qcm Oberfläche immer
noch 2,75x10® übrig,

5. Bis 40 Sekunden ist die ‘logarithmische Gesamtabtötung pro-
portional der Röhrenzahl, also die Abtötung je Röhre konstant:
jede weitere Röhre senkt den Keimzahllogarithmus um 0,17, die noch
vorhandene Keimzahl auf 72 %.

6. Die weitere Gesamtabtötung von 40 Sekunden bis 5 Minuten
ist konstant, der Keimzahllogaritbmus sinkt um 0,64. Ganz unabhängig
von der Röhrenzahl wird die Keimzahl auf 44 % des Wertes bei 40 Se-
kunden gesenkt. Die logarithmische Abtötung ist also umgekehrt pro-
portional der Röhrenzahl.

7. Die bisher vorliegenden Versuche ergaben noch kein Anzeichen
für eine Grenze der Gesamtabtötung, also für die Existenz völlig resi-
stenter oder vor dem UV geschützter Keime.

8. Im Gegensatz zu den Fischlagerungs versuchen mit mehrmaliger
Bestrahlung steigt bei einmaliger Bestrahlung von Fischfilets die

ogarithmische Abtötung mit steigender Oberflächenkeimzahl, "^s

292 Th. Zeiser u. W. Schwartz : Mikrobiologische Untersuchungen usw.

werden also nicht nur absolut, sondern auch verhältnismäßig mehr
Keime abgetötet.

9. Als Maß für die absorbierte Strahlung dient die Röhrenminute,
d. h. die Strahlungsenergie, die von einer Röhre in 1 Minute geliefert
wird. Fast die gesamte Abtötung wird stets mit etwa derselben wirk-
samen Energie, nämlich mit 10 Röhrenminuten, erzielt, also bei zwei
Röhren in 5 Minuten, bei vier in 2,5 und bei acht in 1,25 Minuten. Dabei
wird der KeimzahUogarithmus um 0,65, 0,87 und 1,52, die Keimzahl
auf 22, 13,5 und 2,95% gesenkt. Die gesamte während der weiteren
Versuchsdauer zugeführte (5-, 11- und 23mal so große) Energie bleibt
fast wirkungslos.

10. Bei gleicher Röhrenzahl sinkt der Wirkungsgrad (logarith-
mische Abtötung je Röhrenminute) mit wachsender Bestrahlungsdauer.

11. Bei gleicher Bestrahlungsdauer sinkt der Wirkungsgrad mit
wachsender Röhrenzahl; nur bis 40 Sekunden bleibt er konstant.

12. Bei gleichem Energieverbrauch steigt der Wirkungsgrad mit
wachsender Röhrenzahl. Die Abtötung wird stets mit derselben wirk-
samen Energie (10 Röhrenminuten) erzielt, steigt aber mit wachsender
Röhrenzahl sehr stark an bei gleichzeitiger Abnahme der erforderlichen
Bestrahlungszeit .

13. Das Bunaen-Roacoe^che Gesetz gilt für unsere Versuche nicht,
denn nicht die zugeführte Gesamtenergie, das Produkt aus Intensität
und Zeit, ist für die Wirkung maßgebend, sondern die Intensität,
mit der ihr wirkaamer Anteil zugeführt wird.

14. Der Erfolg der UV-Behandlung hängt bei Fischfilets weit-
gehend von deren Vorbehandlung und Qualität ab.

Nachtrag.

In unserer zweiten Mitteilung (Schwartz und Zeiaer, 1939) bitten
wir, folgende Stellen zu berichtigen : Unterschrift zu Abb. 2 : statt
± 00 C muß es heißen + 6® C. — Auf S. 333, Zeile 5 von oben muß es
heißen: ,,. . . verläuft also proportional der Zunahme des Keimzahl-
logarithmus“. Der erste Satz auf S. 335 oben: ,, Hierfür spricht . .
ist an dieser Stelle einzufügen. — Auf der letzten Zeile S. 337 muß es
heißen: weniger fest statt fester und auf der zweiten Zeile von oben,
S. 338, schwächer statt stärker.

Literatur.

Jordan^ P., Protoplasma 82, 464, 1939. — Lenibke, A., O. Rickcrt
u. H. Thomaen, Vorratspflege imd Lebensmittelf orschimg 8, 534, 1940.
— Müller, R., Lehrbuch der Hygiene, Teil II. München -Berlin, 1939. —
Schwartz, W., u. Th. Zeiaet, diese Zeitschr. 10, 322, 1939. — Zeiaer, Th., u.
W. Schtvariz, Centralbl. f. Bakt., IJ. Abt., 105, 16, 1942. — Zeiaer, Th.,
ebenda, II. Abt., im Druck.

(Aus dem Versuchs- und Forschungsinstitut der Kriegsmarine
für Lebensmittelfrischhaltung. Hannover.)

Über den Verlauf des Absterbens
von Mikroorganismen bei wiederholtem Gefrieren.

Von

Bernd Stille.

Mit 2 Textabbildungen.

(Eingegangen am 1. Mai 1943,)

IJittersuchungen über die Wirkung niedriger Temperaturen auf
Mikroorganismen reichen bis in die Frühzeit der Bakteriologie zurück.
Sie führten zu zahlreichen — oft gegenteiligen — Ergebnissen und
verschiedenen, sich teils ergänzenden, teils widersprechenden Theorien
über den Verlauf des Kältetodes, die im wesentlichen in der Protoplasma-
monographie von J. Belehrddek ziisa mm engefaßt sind.

Während der Einfluß der Hitze eine restlose Abtötung aller Keime
herbeiführt, bewirken tiefe Temperaturen, selbst die der flüssigen Luft,
in der Kegel nur eine mehr oder minder stark in Erscheinung tretende
Abnahme der ursprünglich vorhandenen Keimzahl. Dabei sei jedoch
von jenen Formen — vor allem unter den pathogenen Arten ~ ab-
gesehen, deren Lebensbereich innerhalb enger Temperaturgrenzen ein-
geschlossen ist, und die bereits durch eine geringfügige Abkühlung
vernichtet werden.

Die Verringerung der Keimzahl durch das Gefrieren w^eist bei den
einzelnen Mikroorganisinenarten zum Teil erhebliche Unterschiede auf,
und auch innerhalb ein und derselben Art ergeben sich bisweilen be-
trächtliche Abweichungen, Alter der Kultur und besonders die Zu-
sammensetzung des Milieus, in dem sich die Organismen während des
Gefrierens befinden, spielen dabei eine ausschlaggebende Rolle. So
nimmt z. B. die Frostempfindlichkeit von Saccharomyces cerevisiae
nach eigenen Untersuchungen mit steigender Konzentration der Wasser-
stoffionen zu, w^ährend die Anw^esenheit bestimmter Kolloide (Gelatine,
Agar) in der Aufschwemmung die Absterbequote herabsetzt. Da
Sporen von Pilzen und Bakterien durch w'eg der Kälte widerstehen,
lassen Ermittlungen an verspürtem Material keine sicheren Rück-
schlüsse auf die Kälteresistenz der vegetativen Stadien der betreffenden
Arten zu. Außerdem w^erden die Ergebnisse mitunter auch dadurch
empfindlich gestört, daß manche Bakterienarten, die in Zellverbänden
vereinigt sind — - insbesondere Sarzinen, Streptokokken und Staphylo-
Archlv für Mlkroblologf«. Bd. 18. 21

294

B. Stille:

kokken — durch die Kristallisation auseinandergesprengt werden und
infolgedessen bei der nachfolgenden Keimzahlermittlung nach dem
Platten verfahren sogar eine Vermehrung Vortäuschen können. Für
eine zuverlässige statistische Auswertung derartiger Tötungsexperimente
kommen daher nur solche Mikroorganismen in Betracht, die sich inner-
halb einer Aufschwemmung mit Bestimmtheit in einzelne Individuen
trennen lassen.

Die Tatsache, daß durch die Dynamik des Temperatursturzes und
des anschließenden Auftauens nur ein bestimmter Prozentsatz der
anfangs vorhandenen Keimzahl vernichtet wird, legte die Frage nahe,
wie sich die Überlebenden gegenüber nochmaligem bzw. wiederholtem
Gefrieren verhalten.

Die ersten diesbezüglichen Angaben veröffentlichte Prttdden 1887. fir stellte
fest, daß Bacillus typhosus durch einmaliges Einfrieren eine zahlenmäßige
Abnahme von etwa 26% erfährt, während dreimaliges Vereisen eine Abtötung
von annähernd 90% bewirkt.

Nach Sedgwick und Winslow soll wiederholtes Gefrieren und Auf tauen für
den Typhuserreger nur wenig schädlicher sein als dauernde Kälteeinwirkung.

Smith und Swingle fanden bei wiederholter Abkühlung eine stärkere Ver-
minderung der Keimzahl als bei Dauerkälte, während Hilliard, Torossian und
Stone dem wiederholten Eineisen nur einen unwesentlichen Einfluß auf Bacterium
coli und Bacillus subtilis (letzterer Sporenbildner!) zuschreiben. Dieser Befund
wurde dann in einer späteren Mitteilung von Hiüiard und Davis berichtigt, da
sich häufiges Einfrieren und Auftauen als bedeutend schädlicher erwies als
kontinuierliche Kälte. Gleichsinnige Ergebnisse erzielte Tohyana mit Vibrio
eomma und Bact. typhi.

Wallace und Tanner schreiben dem abwechselnden Gefrieren und Auftauen
keine schädlichere Wirkung als andauerndem Kälteeinfluß zu; ihre Befunde
erstrecken sich jedoch im wesentlichen auf Sporcnbildner (Aspergillus niger,
Penicillium camenberti, B. subtilis) und scheiden daher für eine statistische
Ermittlung des Absterbe Vorganges aus.

Nach A. und S. S. Ooetz soll die Sterblichkeitsquote von Sctccharomyces
cerevisiae bei mehrfacher Abkühlung keine konstante Wahrscheinlichkeit haben,
sondern trotz völlig homogener Kultur schließlich kleiner werden. Sie folgern
daraus, daß bei den einzelnen Zellen eine verschieden starke Resistenz gegenüber
der Kristallisation besteht, so daß die empfindlichsten zuerst kristallisieren,
während die Überlebenden die folgenden Male mit größerer Wahrscheinlichkeit
überstehen. Verfasser verzichteten bei der Ermittlung der Keimzahl auf das
Platten verfahren und stützen ihren Befund auf das unterschiedliche färberische
Verhalten lebender und toter Zellen in ^/öOO wässeriger Methylenblaulösung.
Diese Methylenblaukonzentration übt jedoch schon bei kurzer Einwirkungsdauer
eine deutliche Giftwirkung auf die Hefe aus und führt somit zu unsicheren
Ergebnissen.

Sigene Untersuchungen.

Material und Methode.

Da aus den bereits dargelegten Gründen sporenbildende Formen
für die Untersuchungen ausscheiden mußten, wurden unter zahlreichen

Absterben von Mikroorganismen.

295

Nichtsporenbildnern 1 zunächst einige wenige Arten ausgewählt, die
nicht zur Bildung von Zellaggregaten neigen, sondern sich innerhalb
einer Suspension ohne weiteres in Einzelindi'idduen trennen. Außerdem
kamen für die Versuche nur solche Organismen in Betracht, die sich
ohne besondere Schwierigkeiten auf einfachen Nährböden kultivieren
lassen und auf dem Substrat gleichmäßige und klar umrissene Kolonien
bilden, so daß sie bei der Zählung leicht zu erfassen sind. Als besonders
geeignet erwiesen sich bei dieser Auswahl Saccharomyces cerevisiaCy
Pseudomonas pyocyanea, Bacterium rubidaeum und mit einer gering-
fügigen Einschränkung Bacterium tencllum.. Selbstverständlich ließe
sich dieser Kreis noch beliebig erweitern.

Die Stämme wurden auf D-Agar und auf Bouillongelatine gezüchtet und
im Brutschrank bei 30 bzw. 20® C gehalten. Da das Alter der einzelnen Zellen
auch einen gewissen Einfluß auf ihre Kälteempfindlichkeit zu haben scheint,
wurde, um Altersunterschiede innerhalb des Versuchsmaterials weitgehend aus-
zuschlicßen, stets nur mit ganz jungen, höchstens 2 Tage alten Kulturen gear-
beitet, die sich noch in deutlicher Entwicklung und somit in lebhafter Zell-
teilung befanden.

Aus den Kulturröhrchen wurde stets €?ine bestimmte Probemenge mit einer
Platinöse entnommen und in sterile physiologische Kochsalzlösung übertragen,
die darauf 10. Minuten lang kräftig geschüttelt wurde, um eine gleichmäßige
Verteilung aller Keime in der Flüssigkeit herbeizuführen.

Das Einfrieren der Aufschwemmungen erfolgte in verschiedener Weise:
entweder wurde die Suspension zu je 10 ccm auf eine Serie von Reagensgläsern
gleicher Größe übertragen, oder aber die der Bestimmung dienende Flüssigkeits-
menge direkt in sterile Petrischalen pipettiert. In letzterem Falle wurde der
durch Erwärmen verflüssigte Nährboden gelegentlich bereits vor dem Gefrieren
zugegeben, vor allem bei der gegenüber der Kälte besonders empfindlichen
Pseudomonas pyocyanea. Innerhalb jeder einzelnen Versuchsreihe herrschten
selbstverständlich stets konstante Bedingungen.

Die Gefriertemperatur betrug durchweg — 24® C, das Auftauen erfolgte
stets bei etwa -f 25® C, und zwar bei den Reagensgläsern im Wasserbad, bei den
Petrischalen durch die umgebende Luft. Um den Organismen im auf getauten
Zustande keine das Ergebnis störende Entwicklungsmöglichkeit zu lassen,
wurden sämtliche Versuchsgläser, soweit sie nicht der jeweiligen Bestimmung
dienten, im Anschluß an das Auftauen sogleich wieder eingefroren. Das Ein-
frieren und Auftauen wurde bei den einzelnen Versuchsreihen insgesamt zwischen
sechs- und zehnmal wiederholt, und diese gesamte Zwischenbehandlung ließ
sich wegen der geringen Flüssigkeitsmengen bequem innerhalb 48 Stunden
durchführen*. Die Keimzahlbestimmungen erfolgten nach dem KocÄ sehen
Plattenverfahren, dabei wurden für jede einzelne Ermittlung stets drei Parallel-
platten angelegt, um den Einfluß von Streuungen auf die Ergebnisse möglichst
einzuschränken.

^ Herrn Oberregierungsrat Dr. 8tapp, Biologische Reichsanstalt für Land-
und Forstwirtschaft, Berlin-Dahlem, danke ich bestens für die Überlassung
mehrerer Bakterienstämme. — * Die Versuche wurden mit den Kälteeinrich-
tungen der Reichsforschungsanstalt für Lebensmittelfrischhaltung Karlsruhe
durohgeführt. Herrn Professor Dr. Plank sei auch an dieser Stelle für sein
Entgegenkommen bestens gedankt.

21 *

296

fi. Stille:

Befunde.

Die folgenden Versuchsreihen veranschaulichen die zahlenmäßige
Abnahme verschiedener Organismen unter dem Einfluß wiederholten
Gefrierens und Auftauens. Dabei ist es selbstverständlich und durch
die Methodik des Plattenvei*fahrens bedingt, daß nur solche Zellen als
,, überlebend“ bezeichnet werden, die sich nach Zugabe des Nährbodens
als vermehrungsfähig erwiesen und zur Ausbildung von Kolonien
führten. Die Bezeichnung „abgetötet“ ist also nur mit einer gewissen
Einschränkung zu verstehen. Da den Mikroorganismen jedoch in
jedem Falle die gleichen Kulturbedingungen geboten wurden (abgesehen
von der wiederholten Kälteeinwirkung), hat diese Frage in diesem Zu-
sammenhang nur ein nebensächliches Interesse.

Vermche I und II : Saccharomyces cerevisiae.

Aus 24 Stunden alter Kultur, übertragen in physiologische Kochsalzlösung.
I wurde in Petrischalen, II in Reagensgl&sern eingefroren. Die Keimzahl ist
mit K bezeichnet; Kq bedeutet Anfangskeimgehalt, = Überlebende nach
t-maligem Einfrieren und Auftauen (Tabelle I).

Tabelle I.

Versuch II

Versuch I

Versuch II

■

14 660

0,000

212 000

0,000

3120

0,331 -1

28 900

0,136 - 1

11120

0,883-1

161 000

0,863-1

2800

0,284-1

17 000

0,904-2

9 080

0,796 -.1

—

2060

0,149-1

—

6 480

0,648-1

—

1470

0,004-1

8 460

0,601 -2

4 620
3 760

0,492-1

0,412-1

63 200

0.400-1

6 300

0,473-2

In Versuch I wurden beim ersten Gefrieren und Auftauen 23,6%
der ursprünglich in der Suspension vorhandenen Zellen vernichtet; bei
neunmaliger Abkühlung ergibt sich stets wieder eine gleichmäßige
Abnahme, und zwar im Mittelwert 22,5%. In Versuch II betragen die
entsprechenden Werte 28,7 bzw. 29,6% bei zehnmaligem Einfrieren.

Die durchweg stärkere Abnahme der Keimzahl in der Versuchs-
reihe II ist lediglich auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Auf-
schwemmung n in Reagensgläsern, I dagegen in Form kleinerer Tropfen
in Petrischalen eingefroren wurde. Diese Beobachtung stimmt mit den
Ergebnissen von Haines überein, der beim Gefrieren bestimmter Bak-
terienarten ebenfalls eine stärkere Abnahme der Zeilenzahl in Reagens-
gläsern als in dünner Verteilung auf Deckgläsern feststellte.

Absterben von Mikroorganismen.

297

In Abb. 1 sind die ermittelten Zahlen werte logarithmisch ein-
getragen (log KJKq). Die einzelnen Punkte streuen nur geringfügig um
eine in der Richtung zunehmender i- Werte geneigte Gerade. Im ganzen
läßt sich also klar ein exponentieller Verlauf des Absterbevorganges beim

wiederholten Gefrieren und Auftauen erkennen. Da die Übeiiebenden-

quote q — = konstant ist, ergibt sich somit die Möglichkeit.

bereits durch Berechnung die Zahl jener Zellen vorauszusagen, die
i-maliges Einfrieren mit größter Wahrscheinlichkeit überstehen werden :

if, = üTo-gh

Vermch III: ßacterium rubidaeum,

Kultur 24 Stunden alt, wurde in physiologischer Kochsalzlösung auf-
geschwemmt und anschließend in Reagensgläsern wiederholt eingefroren und
aufgetaut. Tabelle II.

Versuch IV: Pseudomonas pyocyanea.

Es wurden kleinere Mengen einer homogenen Suspension von Psetidomonas
pyocyanea, gleichfalls aus 24 Stunden alter Kultur, auf Petrischalen verteilt
und bereits vor dem Einfrieren mit Bouillongelatine übergossen (Tabelle II).

Pseudomonas pyocyanea ist gegenüber dem Kälteeinfluß außer-
ordentlich empfindlich, wie schon Haines feststellen konnte. In eigenen
Untersuchungen erfuhren Aufschwemmungen in physiologischer Koch-
salzlösung beim Einfrieren eine Abnahme der Keimzahl um 90 bis 95%.
Zusatz von Kolloiden zeigte indessen eine außerordentliche Schutz -
Wirkung und verringerte die Absterbequote erheblich, w^orüber in
einer späteren Mitteilung berichtet werden soll.

Als Schutzkolloid wurde in dieser Versuchsreihe Gelatine dem
Agar vorgezogen, weil Agar nach dem Auf tauen das ausgefrorene

298

B. Stille:

Tabelle 1

Versuch 111 {BaeUrxum mbidaeum)

Versuch IV {Pseudomonat pyocyanea)

46 000 000

0,000

2 419 000

0,000

8 000 000

0,260-1

1632 000

0,802-1

900 000

0,369 -2

949 000

0,694 - 1

280 000

0,794-3

632 000

0,417-1

40 000

0,949-4

469000

0,278 - 1

7000

0,192-4

290000

0,079 - 1

187 000

0,888-2

Wasser nur unvollkommen wieder auf-
nimmt ; es entwickeln sich dann auf
dem Nährboden verwaschene, inein-
anderfließende Kolonien, die sich nicht
auszählen lassen.

In Versuch III betrug die Keim-
zahlverminderung in der Aufschwem-
mung von Bacterium rubidaeum beim
ersten Gefrieren 82,2%. Bei fünfmal
wiederholtem Temperatursturz trat je-
desmal eine gleich starke Abnahme ein,^
und zwar im Mittelwert 82,7 %.

Den gleichen exponentiellen Ver-
lauf zeigt die Versuchsreihe IV mit
Psevdomonas pyocyanea: bei einmaligem Einfrieren gingen 36,5% zu-
grunde, bei sechsmaliger Abkühlung durchschnittlich 34,7%.

Versuch V: Bacterium tenellum.

Schließlich wurde noch ein gleichsinniger Versuch mit Bacterium tenellum,
ebenfalls 24 Stunden alt und in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt,
durchgeführt. Dabei ergab sich folgende Abnahme (Tabelle Ul):

Tabelle III.

■

Versuch V {Bacterium teneUum)

iH^I

log--

46 600 000

0,000

0,119-2

12 000 000

0,420 - 1

3 900 000

0,932-2

Absterben von Mikroorganismen.

299

Der Absterbe verlauf von Bacierium teneUum zeigt beim Vergleich
mit den übrigen untersuchten Mikroorganismenarten eine geringe
Abweichung : beim ersten Einfrieren nahm die Keimdichte um 73,7 %,
beim zweiten nur um 66,9% ab; dann erhöhte sich bei weiteren Ab-
kühlungen der Anteil der Abgetöteten auf einen ziemlich konstanten
Wert, im Mittel 84,3 %. Der Grund für die anfangs geringere Abnahme
liegt darin, daß bei Bacteriuyn teneUum die einzelnen Zellen häufig in
kleineren Ketten Zusammenhängen, die erst bei der Eisbildung ge-
sprengt w^erden. Sobald jedoch eine restlose Trennung der Einzel-
individuen erfolgt ist, ergibt sich dann mit zunehmenden «-Werten
eine exponentielle Verminderung der Keimdichte.

Schlußbetrachtung.

Die oben beschriebenen Absterbereihen lassen stets eine klare,
einfache Gesetzmäßigkeit erkennen: beim wiederholten Einfrieren und
Auftauen verringert sich innerhalb einer homogenen Suspension gleich-
artiger Zellen die Keimdichte stets um den gleichen Prozentsatz. Es
ergibt sich also ein ähnlicher, im Prinzip übereinstimmender Tötungs-
verlauf wie bei der Einwirkung bestimmter Gifte (insbesondere Phenol
und Sublimat), der Hitze, der Trockenheit und verschiedener Strahlen-
arten (vor allem Ultraviolett- und Röntgenstrahlen), die ebenfalls ein
exponentielles Absterben von Mikroorganismen herbeiführen, ln ihrer
Gesamtheit fand diese statistische Gesetzmäßigkeit durch die Jordan sehe
Treffertheorie ihre wohl begründete Deutung im Sinne der Quanten-
physik. Jordan widerlegte die früheren Auffassungen, die das ungleich-
mäßige Absterben von Einzellern auf Resistenzunterschiede zurück-
führten, und kam — insbesondere auf Grund zahlreich vorliegender
Strahlenex})eriniente — zu dem Schluß, daß bei exponentiellem Ab-
sterbeverlauf die tödliche Wirkung primär durch je einen einzelnen
„Treffer“ ausgelöst wird. Alle übrigen Veränderungen, die den getöteten
Einzeller charakterisieren, erfolgen demnach zwangsläufig erst sekundär
als Kettenreaktion im Anschluß an den Primärakt. Die Analyse des
Treffers erhärtete seinerseits die Vorstellung, daß die Bakterien ein
empfindliches Steuerungszentrum — eine Art ,, Miniaturkern“ — ent-
halten müssen, eine Auffassung, die durch den gleichzeitigen Nachweis
gesetzmäßig strukturgebundener Thymonucleinsäure innerhalb der
Bakterienzelle durch Stille und alsdann durch die Arbeiten von Pielcarski
und anderen Autoren ihre zytologische Fundierung fand.

Was nun das exponentielle Absterben der Mikroorganismen unter
der Dynamik wiederholten Gefrierens und Auftauens anbetrifft, so
ergibt sich aus diesem gesetzmäßigen Verlauf, daß jene Theorien über
den Kältetod, die eine Summierung von Einzelschäden innerhalb der
Zelle bzw. an ihrer Oberfläche voraussetzen, unwahrscheinlich sind.

208

B. Stifle:

Tabelle 11.

1 Venach III {Baäerium rubidaeum)

Veniuoh IV (Pieudomonat pyocyanea)

46 000 000

0,000

2 419 000

0,000

8 000 000

0,260-1

1 632 000

0.802-1

900 000

0,369 -2

949 000

0,694 - 1

280 000

0,794-3

632 000

0.417-1

40 000

0,949-4

469000

0,278 - 1

7000

0,192-4

290 000

0,079 - 1

—

187 000

0,888-2

Wasser nur unvollkommen wieder auf-
nimmt; es entwickeln sich dann auf
dem Nährboden verwaschene, inein-
anderfließende Kolonien, die sich nicht
auszählen lassen.

In Versuch III betrug die Keim-
zahlverminderung in der Aufschwem-
mung von Bacierium rubidaeum beim
ersten Gefrieren 82,2%. Bei fünfmal
wiederholtem Temperatursturz trat je-
desmal eine gleich starke Abnahme ein,^
und zwar im Mittelwert 82,7 %.

Den gleichen exponentiellen Ver-
lauf zeigt die Versuchsreihe IV mit
Pseudontonas pyocyanea: bei einmaligem Einfrieren gingen 36,5% zu-
grunde, bei sechsmaliger Abkühlung durchschnittlich 34,7%^.

Versuch V: Bacterium tenellurn.

Schließlich wurde noch ein gleichsinniger Versuch mit Bacierium ieneüum,
ebenfalls 24 Stunden alt und in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt,
durchgeführt. Dabei ergab sich folgende Abnahme (Tabelle III):

Tabelle III.

Versuch V (Bacterium teneüum)

Versuch V {Bacterium teneUum)

lo«-

ÄO

45 600 000

0,000

600000

0,119-2

12 000 000

0,420 - 1

100 000

0,431 -3

3 900 000

0,932 -2

18 600

0,608 -4

Absterben von Mikroorganismen.

299

Der Absterbeverlauf von Bakterium tenellum zeigt beim Vergleich
mit den übrigen untersuchten Mikroorganismenarten eine geringe
Abweichung: beim ersten Einfrieren nahm die Keimdichte um 73,7%,
beim zweiten nur um 66,9% ab; dann erhöhte sich bei weiteren Ab-
kühlungen der Anteil der Abgetöteten auf einen ziemlich konstanten
Wert, im Mittel 84,3 %. Der Grund für die anfangs geringere Abnahme
liegt darin, daß bei Bacteriurn tenellum die einzelnen Zellen häufig in
kleineren Ketten Zusammenhängen, die erst bei der Eisbildung ge-
sprengt werden. Sobald jedoch eine restlose Trennung der Einzel-
individuen erfolgt ist, ergibt sich dann mit zunehmenden i-Werten
eine exponentielle V^erminderung der Keimdichte.

Sohlußbetrachtung.

Die üben beschriebenen Absterbereihen lassen stets eine klare,
einfache Gesetzmäßigkeit erkennen: beim wiederholten Einfrieren und
Auftauen v^erringert sich innerhalb einer homogenen Suspension gleich-
artiger Zellen die Keimdichte stets um den gleichen Prozentsatz. Es
ergibt sich also ein ähnlicher, im Prinzip übereinstimmender Tötungs-
verlauf wie bei der Einwirkung bestimmter Gifte (insbesondere Phenol
und Sublimat), der Hitze, der Trockenheit und verschiedener Strahlen-
arten (vor allem Ultraviolett- und Röntgenstrahlen), die ebenfalls ein
exponentielles Absterben von Mikroorganismen herbeiführen, ln ihrer
Gesamtheit fand diese statistische Gesetzmäßigkeit durch die Jordan sehe
Treffertheorie ihre wohl begründete Deutung im Sinne der Quanten-
physik. Jordan widerlegte die früheren Auffassungen, die das ungleich-
mäßige Absterben von Einzellern auf Resistenzunterschiede zurück-
führten, untl kam - insbesondere auf Grund zahlreich vorliegender
Strahlenex])eriniente ~ zu dem Schluß, daß bei exponentiellem Ab-
sterbeverlauf die tödliche Wirkung primär durch je einen einzelnen
„Treffer** ausgelöst w ird. Alle übrigen Veränderungen, die den getöteten
Einzeller charakterisieren, erfolgen demnach zw^angsläufig erst sekundär
als Kettenreaktion im Anschluß an den Primärakt. Die Analyse des
Treffers erhärtete seinerseits die Vorstellung, daß die Bakterien ein
empfindliches Steuerungszentrum - eine Art ,, Miniaturkern“ ent-
halten müssen, eine Auffassung, die durch den gleichzeitigen Nachweis
gesetzmäßig strukturgebundener Thymonucleinsaure innerhalb der
Bakterienzelle durch Stille und alsdann durch die Arbeiten von Piekarski
und anderen Autoren ihre zytologLsche Fundierung fand.

Was nun das exponentielle Absterben der Mikroorganismen unter
der Dynamik wdederholten Gefrierens und Auftauens anbetrifft, so
ergibt sich aus diesem gesetzmäßigen Verlauf, daß jene Theorien über
den Kältetod, die eine Summierung von Einzelschäden innerhalb der
Zelle bzw. an ihrer Oberfläche voraussetzen, unw^ahrscheinlich sind.

300

B. Stille: Abeterben von Mikroorganismen.

Wenn auch die Frage nach dem Mechanismus des Kältetodes von Ein-
zellern aus zahlreichen Gründen weiterhin offen bleiben muß, so scheint
es mir doch von besonderer Bedeutung zu sein, bei derartigen Unter-
suchungen die Protistenzelle zumindest nicht als ein homogenes Gefüge,
sondern als ein wohlstrukturiertes System mit einem differenzierten
Steuerungszentrum aufzufassen. Es spricht vieles dafür, anzunehmen,
daß erst die Zerstörung dieses Zentrums — sei es nun beim Einfrieren
oder erst beim Auftauen — die Gesamtreaktion, den Zelltod, herbeiführt.

Literatur.

Belehrddekf J., Temx)erature and living mattej*. Protoplasmamonographien,
Bd. 8. Berlin, Borntraeger, 1935. — Goetz, A., u.S.S. Ooeiz, Naturwiss. 26, 427,
1938. ~ Haines, R. B,, Proc. Boy. Soc. London (B) 124, 451, 1938. — Hilliard,
C. M., C, Torossian u. R. 8tone, Science 42, 770, 1915. — Hilliard, C. M,, u.
if. A. Davis, J. of Bact. 3, 423, 1918. — Jordan, P., Radiologica 2, 16, 166,

1938. — Derselbe, Naturwiss. 26, 537, 1938. — Derselbe, Biol. Zentralbl. 59, 1,

1939. — Derselbe, Protoplasma 32, 464, 1939. — Piekarski, O., diese Zeitschr.
8, 428, 1937. — Derselbe, ebenda 11, 406, 1940. — Prudden, P. M., Med. Res.
31, 341, 1887. — Sedgwick, W, T., u. (7. E, A. Winslow, Centralbl. f. Bact. I,
27, 684, 1900. — Smith, E. F., u. D. B. Swingle, Abstr. in Sei., N. Ser. 21, 481,
1905. — Stille, B., diese Zeitschr. 8, 125, 1937. — Tohyana, Y., Jap. J. Exp.
Med. 8, 327, 1930. — Wallace, ö. /., u. P. W. Tanner, Fruit Prod. J., New York
14, 235, 1935.

(Aas dem Pflanzenphysiologischen Institut der Deutschen Karls -Universität

in Prag.)

Der Stoffwechsel heterotropher Flagellaten.

1. Mitteilung:

Kritigche Bespreckung der bisherigen Literatur.

Von

Karl Reinhardt^.

(Eingegangen am 7, Juni 1943,)

Eine Durchsicht der ernährungsphysiologischen Literatur zeigt, daß
verschiedene Fragen des Grundstoffwechsels, besonders solche chemisch -
physiologischer Natur, durch Untersuchung der Lebensvorgänge bei
Vielzellern nicht geklärt werden können. Die im Organismus der Meta-
zoen und Metaphyten vor sich gehenden Stoffwechselprozesse sind so
vielgestaltig und von so zahlreichen, von außen oft nicht zu beeinflussen-
den Faktoren bestimmt, daß die Verfolgung eines Reaktionsablaufes
bis zu seinen letzten Grunderscheinungen meist nicht bis zur restlosen
Klärung möglich ist. Es lag nahe, diese Grundfragen mit Hilfe von ein-
zelligen Organismen einer Klärung näherzubringen, deren Zellgeschehen
im allgemeinen leichter verfolgt werden kann und die vor allem der
experimentellen Untersuchung weniger Schwierigkeiten bereiten als
Vielzeller.

Die Auswahl der Versuchsobjekte war naturgemäß der Fragestellung
entsprechend verschieden, besondere Bedeutung erlangten für gewisse
Fragen u. a. Vertreter der Gruppe der Flggellaten. Anfangs wandte sich
das Interesse fast restlos Formen zu, welche durch den Besitz eines
Assimilationspigmentes zur autotrophen Kohlenstoffgewinnung be-
fähigt, meist leicht in Reinkultur gewonnen werden konnten. Die bald
erfolgte Feststellung, daß verschiedene dieser mit Assimilations-
pigmenten ausgestatteten Formen neben Kohlensäure auch gewisse
organische Verbindungen als Kohlenstoffquelle ausnützen können, sich
also ,,mixotroph" zu ernähren vermögen, legte eine Untersuchung
des ,,heterotrophen“ Anteils an der ,,mixotrophen“ Ernährungsweise,
also der Verwertung organischer Kohlenstoffquellen durch gefärbte
Arten, nahe. Nachdem die Züchtung grüner Formen mit organischen
Verbindungen im Dunkeln gelungen war, bedeuteten die ersten Züch-
tungsversuche farbloser Nebenformen grüner Organismen nur einen

•) Die früheren Arbeiten des Verfassers sind unter dem Namen Ondratsehek
erschienen.

302

IL Beinhardt:

weiteren Schritt in der Entwicklung des hier zu besprechenden Fragen-
gebietes.

Die systematische Stellung der Flagellaten ist ein häufig erörtertes
Problem. Frühzeitig unterschied man ganz allgemein zwei Haupt-
gruppen, die man nach dem Vorhandensein oder Fehlen eines Assi-
milationspigmentes dem Pflanzen- oder Tierreich zuordnete. Bezüglich
der gefärbten Formen traf man bald eine Einteilung in Arten, die aus-
schließlich der Kohlensäure als Kohlenstoffquelle bedurften und in
solche, die daneben noch Anspruch auf eine zusätzliche organische
Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle erhoben. Erstere wurden als obligat
autotroph, letztere als mixotroph bezeichnet. Farblose Arten verlangten
in jedem Fall organische Nährstoffe, sie wurden als heterotroph bezeich-
net. Chemoautotrophie, also die Fähigkeit zur Kohlensäureassimilation
ohne Assimilationspigment unter Verwertung der bei chemischen Um-
setzungen frei werdenden Energie, ist bei farblosen Flagellaten bislang
nicht bekannt. Mast und Pace (1932a, 1932b, 11934) deuten zwar für
ChilomoncLS paramaecium etwas Ähnliches an, doch haben verschiedene
Nachprüfungen (zuletzt Ondratschek 1940d) diese Befunde nicht be-
stätigen können.

Eine weitere Gliederung der Flagellaten unter Berücksichtigung der
gegenseitigen Beziehungen hat Lwoff vorgenommen. Nachdem auch er
anfänglich (1932) nur nach dem Vorhandensein oder Fehlen eines
Assimilationspigmentes CJdorophyten und Protozoen unterschieden hat,
stellte er später (1935a, 1936a) eine weitere Gruppe auf, die zwischen
den beiden erstgenannten eine Mittelstellung einnehmen soll und die er
als Leukophyten beze^chnete. Die drei Typen wurden in folgende Be-
ziehungen gebracht:

Chlorophyten ^

besitzen Assimilations-
pigmente und Plastiden. \

Leukophyten

Assimilationspigment fehlt,
Plastiden vorhanden.

Protozoen

Assimilationspigment und
Plastiden fehlen.

Das Vorhandensein von Plastiden bei farblosen Flagellaten ist
jedoch bisher mit einiger Sicherheit nur für einzelne Polytoma-Avien
nachgewiesen (Volkonsky, 1930a, b), die obige Neugruppierung bzw.
die Aufstellung des neuen Typus der Leukophyten entbehrt somit der
nötigen experimentellen und morphologischen Grundlage.

Derzeit scheint es vorteilhafter zu sein, auf eine Festlegung der
systematischen Stellung der Flagellaten zu verzichten und diese Organi-
sationsstufe, die heute allgemein als Übergang und Bindeglied zwischen
den beiden Organismen reichen gilt, als Einheit für sich zu betrachten.
Eine Festlegung der Stellung und eine Aufgliederung kann, solange

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. I. 303

genügende Einzelkenntnisse fehlen, keine weitere Förderung unserer
Erkenntnisse zur Folge haben und erscheint somit unangebracht.
Falls eine Gliederung dieser Organismengruppe sich als nötig erweisen
sollte, kann diese heute zweckmäßig nur auf ernährungsphysiologischer
Grundlage erfolgen, eine Einteilung nach biochemischen Gesichts-
punkten ist — trotz ihrer unleugbaren Yorteile — derzeit nicht möglich,
da wir über die biochemische Seite des Stoffwechsels der Flagellaten
überhaupt nicht unterrichtet sind. Ernährungsphysiologisch können wir
nachstehende Typen unterscheiden:

/. Aidotrophe FlageUaien besitzen Assimilationspigmente, können nur

COj, nicht aber organische Verbindungen
assimilieren.

II. Mixotrophe Flagellaten besitzen Assimilationspigmente, können ihren

Kohlenstoff bedarf aus anorganischen und or-
ganischen Verbindungen decken.

III. Heterotrophe Flagellaten Assimilationspigmente fehlen, organische Koh-
lenstoff quellen sind unentbehrlich.

Obige Einteilung stützt sich auf die Art des Kohlenstoffgewinnes.
Im Gegensatz zu Lwoff (1935a), der*bei einem neu vorgeschlagenen
ernährungsphysiologischen System der Flagellaten auch die Stickstoff-
quelle berücksichtigt, wird diese hier bewußt als nicht kennzeichnend
außer acht gelassen. Lwoff nahm bei der genannten Aufstellung ver-
schiedene Ansprüche der Flagellaten hinsichtlich der Zusammensetzung
der N- Quelle an, doch sind seine Ergebnisse durch die anfängliche
Vernachlässigung der Bedeutung von Wirkstoffen für die Auswertbar-
Keit von Stickstoff Verbindungen nicht stichhaltig. In früheren Arbeiten
(Ondratschek, 1940d, 1941a, b,c) konnte ich zeigen, daß alle bisher
untersuchten heterotrophen Flagellaten mit Hilfe von Aneurin ihren
Stick Stoff bedarf aus anorganischen Verbindungen decken können, für
mixo- und autotrophe Arten war diese Tatsache seit jeher bekannt.
Eine Einteilung nach der verschieden hohen Organisation der erforder-
lichen N- Quelle (Nitrat-N, Ammon-N, Aminosäure-N, Pepton-N), wie
sie Lwoff vornahm, ist Semnach nicht zutreffend.

Die in obiger Einteilung an letzter Stelle genannte Gruppe der
heterotrophen Flagellaten gehörte hinsichtlich der Ernährungsphysiologie
bis vor kurzem zu einepi der scheinbar bestuntersuchten Teilgebiete der
Mikrobiologie. Wie jedoch Provasoli 1938 zeigen konnte, lassen sich
bei genauem Vergleich der zahlreichen Arbeiten auf diesem Gebiet
bemerkenswerte Unterschiede in den Ergebnissen der einzelnen Autoren
feststellen. Durch die jüngsten Ergebnisse der Untersuchungen über
die Bedeutung von Wirkstoffen für die Ernährung heterotropher Fla-
gellaten (OndraUtchek, 1940d, 1941a, b, c) wurden manche dieser unter-
schiedlichen Ergebnisse verständlich gemacht, andere blieben nach wie

304

K. Reinhardt:

vor ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit werden weitere Faktoren
auf gezeigt, welche den C- und N- Stoffwechsel der heterotrophen Fla-
gellaten maßgeblich beeinflussen und die bisher außer acht gelassen
wurden.

Die bereits erwähnten eigenen Untersuchungen des Wirkstoff-
bedürfnisses heterotropher Flagellaten haben aber darüber hinaus ver-
schiedene grundsätzliche Bedenken an den bisherigen Ergebnissen
ernährungsphysiologischer Untersuchungen dieser Gruppe

entstehen lassen, die sich in der Folgezeit, gestützt durch neue experi-
mentelle Befunde, gesteigert haben, so daß schließlich eine grundlegende
Neubearbeitung des ganzen Ernährungsproblems notwendig erschien.

Als Voraussetzung für die experimentelle Durchführung der ge-
planten Neuuntersuchung mußte ein kritischer Vergleich der zahlreichen,
auf diesem Gebiet vorhandenen Arbeiten vorgeiiommen werden. Eine
Neubearbeitung der angedeuteten Fragen ohne entsprechende Berück-
sichtigung der bisherigen Literatur hätte einmal unnötige Mehrarbeit
zur Folge gehabt, andererseits aber jeglichen Zusammenhang mit den
bisherigen Befunden vermissen lassen. Zur Vermeidung einer isolierten
Stellung der nachfolgenden eigenen Befunde soll in der vorliegenden
Mitteilung als erstes das Ergebnis der oben genannten vergleichenden
Betrachtung der bisherigen Literatur vdcdergegeben werden. Wenn der
Rahmen weiter gesteckt wurde, als dies sonst üblich ist, so ist der Grund
für dieses Vorgehen in der Bedeutung des angeschnittenen Fragen -
gebietes zu suchen.

Der Gesamtplan der hiermit begonnenen Arbeitenreihe ist folgender: Im
Anschluß an die in der 1. Mitteilung gegebene Literaturübersicht werden die ver-
schiedenen, bisher beschriebenen Versuchsmethoden kritisch zu prüfen sein.
Nach Festlegung einer bestimmten Methodik sind jene Faktoren zu untersuchen,
deren grundsätzliche Bedeutung für den N- und C- Stoffwechsel in Vorunter-
suchungen bereits festgestellt werden konnte. Nach Abschluß der Vorarbeiten
soll die vergleichende Untersuchung verschiedenster Kohlenstoff- und Stickstoff-
quellen hinsichtlich ihrer Eignung als Nährstoffe für heierotrophe FlagdUUen
erfolgen. Der biochemischen Seite der Stoffwechbelvorgänge wird besondere
Beachtung geschenkt werden. Als Endziel wird die Aufstellung eines ernährungs-
physiologischen Systems auf Grund der neuen Ergebnisse beabsichtigt.

Ein Mangel der bisherigen Untersuchungen ist auch in der geringen Zahl
der bearbeiteten FlagellcUen-Arten gegeben. Hier wird außer einigen bereits
wiederholt untersuchten, eine größere Zahl teils nicht untersuchter, teils neu-
beschriebener Arten zur Verwendung gelangen.

Historische Übersicht

Eine Durchsicht der Literatur zeigt, daß über Fragen der Er-
nährung und des Stoffwechsels heterotropher Flagellaten zahlreiche
Untersuchungen vorliegen, daß jedoch die Zahl der Bearbeiter gering
ist. Einer kritischen Sichtung der Ergebnisse und einem Vergleich der

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. 1. 305

einzelnen Autoren stellen sich somit keine allzu großen Schwierigkeiten
entgegen.

In der nun folgenden Besprechung der Fragestellung der einzelnen
Autoren sollen besonders die Zusammenhänge der Untersuchungen
sowie die Entwicklung dieses Forschungszweiges hervorgehoben werden.
Die Ergebnisse werden hier nur soweit besprochen, als dies zum all-
gemeinen Verständnis notwendig ist, da die Befunde der einzelnen
Autoren im Hauptteil dieser Arbeit an Hand der Organismen gelegent-
lich der Darstellung der eigenen Versuche besprochen werden müssen.
Die folgenden Ausführungen sind so gehalten, daß im Hauptteil auf
die Literaturangaben nicht mehr zurückgekommen werden muß. Aus
Gründen der Raumersparnis und der Vereinfachung wird dort im Einzel-
fall nur der Autor angegeben, nähere Einzelheiten können aus dem nun
folgenden historischen Teil entnommen w^erden.

In der Geschichte der Ernährungsphysiologie heterotropJier Flagel-
laten können wir ohne Schwierigkeiten drei Hauptabschnitte unter-
scheiden, die jew'eils durch den im Vordergrund der Betrachtung stehen-
den Fragenkomplex gekennzeichnet sind.

1. Die Zeit der zoologischen Betrachtungsweise. In diesem von 1885 bis 1921
sich erstreckenden Zeitabschnitt finden wir vornehmlich Untersuchungen
zoologisch -morphologischer Richtung. In ernährungsphysiologischer Hinsicht
ist diese Zeit durch mehr oder minder planlose Versuche zur Züchtung von
Flagellaten gekennzeichnet, wobei Arbeitsmethoden der Bakteriologie mit
wechselndem Glück in Anwendung gebracht wurden. Die Züchtung war nicht
Selbstzweck, sie hatte nur die Aufgabe, eine größere und gleichartige Zellmenge
für morphologische oder cytologische Untersuchungen bcreitzustellen.

2. Der botanisch- physioU^gische. Zeitabschnitt. Et umfaßt die Jahre 1921
bis 1937. Das Jahr 1921 brachte durch die erstmalig in einwandfreier Weise
durchgeführte Züchtung eines heterotrophen Flagellaten in bakterienfreier Rein-
kultur eine entscheidende Wendung. Die neuen Züchtungsmethoden ermöglichen
eine systematische Untersuchung der Nahrstoffansprüche dieser Organismen.
Umfangreiche, meist planmäßig angestellt^ ernährungsphysiologische Versuche
kennzeichnen diesen Zeitraum.

3. Die Zeit der physiologisch-chemischen Untersuchungen. Seit 1937 trat
infolge der Entdeckung der umfassenden Bedeutung von Wirkstoffen für die
Lebensäußerungen der verschiedensten Organismengruppen auch auf dem hier
zur Erörterung stehenden Forschungsgebiet eine wesentliche Änderung ein.
Die Feststellung der Bedeutung einiger Wirkstoffe, vor allem solcher vitamin-
artiger Natur, auch für die Gruppe der heterotrophen FUtgellaten hatte zwangs-
läufig eine Entwicklung zur Folge, in deren Verlauf die gesamte Ernährungs-
physiologie dieser Formen immer mehr vom Standpunkt der Frage der Wachs-
tum sfaktoren aus gesehen werden mußte. Es ergab sich somit die Notwendigkeit,
die bisherigen Ergebnisse der Ernährungsphysiologie nach den neuen Erkennt-
nissen zu überprüfen, und endlich mußte auch der Forderung nachgekommen
werden, die biochemische Seite der ernährungsphysiologischen Prozesse zu
beachten. Die Biochemie des Flagellatenstoffwechsels war bis dahin überhaupt
nicht untersucht worden.

Nachstehend sollen die in den genannten Zeitabschnitten erschienenen, das
vorliegende Arbeitsgebiet betreffenden Veröffentlichungen behandelt werden.

306

K. Bernhardt:

1, Die Zeit der zoologischen Betrachtungsweise.

Der Hauptteil der in diesem Zeitabschnitt erschienenen Arbeiten
befaßt sich mit Fragen morphologischer Art, von einer Besprechung
kann abgesehen werden, da sie keine Ergebnisse gezeitigt haben, welche
für die weitere Entwicklung von Bedeutung gewesen wären.

Die ersten Versuche zur Züchtung eines heterotrophen FUigellaten
nahm meines Wissens Khawkine 1885 vor. Er untersuchte die Biologie
und Ökologie von Ästasia oceUata und züchtete diese mit Stärke als
Kohlenstoffquelle. Nach unseren heutigen Kenntnissen kann der Autor
nur bakterienhaltige Kulturen, vielleicht sogar nur Rohkulturen erhalten
haben, wobei die anwesenden Bakterien möglicherweise die Stärke
soweit abgebaut haben, daß die Abbauprodukte für die Flagellaten
verwertbar wurden. Khawkine schenkte der Ernährungsphysiologie
keine weitere Beachtung.

Eine Reihe von Jahren vergingen, ehe sich wieder ein Autor mit
der Züchtung eines farblosen Flagellaten beschäftigte. Es war dies
Ogata, der 1893 über die geglückte Züchtung des späteren Standard-
objektes zahlreicher Autoren Polytoma uvella in Nährlösungen, welche
vorwiegend Dekokte verschiedener Meeresalgen enthielten, berichtete.
Er gibt an, bakterienfreie Kulturen erhalten zu haben, da er jedoch
keine weiteren Angaben über das ernährungsphysiologische Verhalten
des von ihm gezüchteten Stammes machte, kann diese Angabe heute
nicht mehr nachgeprüft werden. Von den Versuchen Khawkines scheint
Ogata keine Kenntnis gehabt zu haben.

Die Versuche Ogaias veranlaßten 1910 Jacobsen zu einer Wieder-
holung, doch gelang es ihm nicht, Polytoma uvella mit Algenabkochungen
zur Vermehrung zu bringen. Er züchtete dann diese Art in Faulkulturen,
konnte aber keine verläßlich reinen Klone isolieren. Seine Folgerungen
sind dementsprechend meist nicht zutreffend und wurden in der Folgezeit
wiederholt als nicht stichhaltig nachgewiesen.

Während es sich bei den eben besprochenen Arbeiten mehr um
tastende Vorversuche auf völligem Neuland handelt, stellte sich 1900
Zumstein als erster gegen die bisherige Arbeitsweise und zeigte auf,
daß nur planvolle experimentelle Untersuchungen neue Erkenntnisse
zeitigen können, nicht aber theoretische Erwägungen, wie sie namentlich
Khawkine angestellt hat und welchen eine experimentelle Grundlage
vielfach fehlte. Zumstein selbst befaßte sich eingehend Init der Rein-
Züchtung von Euglena gracHis, Anfängliche Versuche mit chemisch
nicht definierten Dekokten und Organextrakten zeigten die Unzweck-
mäßigkeit der bisher üblichen Versuchsanstellung auf und Zumstein
gebührt hier das Verdienst, als erster synthetische Lösungen angewendet
zu haben. Er untersuchte so auch die uns hier interessierende hetero-

Stoffwechsel: heterotropher Flagellaten. I.

307

trophe Ernährungsweise von Euglena gracilis und beschäftigte sich
namentlich mit jenen Bedingungen, welche eine Rückbildung des Chloro-
phylls bei heterotropher Züchtung verursachten. Er erkannte die Be-
deutung organischer C- Quellen für dieses Problem und hat seine Be-
hauptungen durch zahlreiche Versuche gefestigt. Es sei noch erwähnt,
daß Zunistein bereits auch die Bedeutung der Reaktion für den Erfolg
eines Züchtungs Versuchs richtig erkannt hat.

Wenn auch gewisse Feststellungen Zumateins, besonders die sich
auf Citronensäure als C- Quelle beziehenden, in der Folgezeit anders ge-
deutet werden mußten, so haben seine Arbeiten trotzdem ein großes
Verdienst um die Weiterentwicklung der Ernährungsphysiologie der
FlagelUUen. Er hat nachgewiesen, daß nur genaue experimentelle
Untersuchungen unsere Erkenntnisse erweitern können, nicht aber die
bisher üblichen, mehr oder minder spekulativen Erwägungen, er hat
erstmalig auf die Notwendigkeit chemisch definierter Nährlösungen für
ernährungsphysiologische Versuche hinge wiesen, ^welcher Forderung er
als erster auch nachgekommen ist und hat so der kommenden Ent-
wicklung Weg und Richtung gezeigt.

Das Lebenswerk Zamsteins wurde dann 1912 von Ternetz ab-
geschlossen und einheitlich ausgerichtet. In manchen Punkten hat
Ternetz einen Schritt weiter getan a\s Zum^teiny so u. a. bei der Beschrei-
bung einer ,, hyalinen Lichtforin‘‘ von Euglena gracilis. Es scheint hier
wohl eine Verwechslung mit Astasia Vorgelegen zu haben.

Zur gleichen Zeit, als ZurnsUin seine klassischen Versuche mit
EugUna anstellte, versuchte Aragao (1910) einen weiteren FlagdlaUn
in Kultur zu nehmen, Polytomella agüis. Da er in die bereits von Znrn-
stein herausgestellten Fehler der vorangegangenen Zeit verfiel, nimmt
es nicht wunder, wenn seine Versuche zu keinem einwandfreien Ergebnis
geführt haben.

Die Arbeit Aragaos hat in der Folgezeit besonders Dojlein angeregt ,
der in zwei Mitteilungen (1916 u. 1918) über eigene Versuche zur Er-
nährungsph^^siologie von Polytomella agilis berichtete, wobei er be-
sonders die Bedeutung von ,, Zucker“ als Nährstoffquelle hervorhob.
Schon diese Angabe zeigt, daß Poflein über keine Reinkulturen verfügt
haben kann, denn die genannte Art ist zur Verwertung irgendeines
Zuckers“ nicht befähigt, so daß angenommen werden muß, daß an-
wesende Bakterien den ,, Zucker“ in eine von Polytomella assimilierbare
Form umgewandelt haben.

Die Ergebnislosigkeit der meisten hier besprochenen, planlos an-
gestellten Untersuchungen haben 1920 Pringsheim veranlaßt, auf dem
von Zumstein angegebenen Wege zu einer Reinkultur von Polytoma
uvella zu gelangen. Dank der von Zumstein angeführten Arbeitsweise
gelang die Isolierung und Reinzüchtung in einwandfreier Form.

308

K. Bernhardt:

2. Der botanisch-physiologische Zeitabschnitt,

Die Bedeutung farbloser Flagellaten für die Erweiterung allgemeiner
ernährungsphysiologischer Kenntnisse stand seit langem fest, syste-
matische Versuche über die Ernährungsphysiologie heterotropher Flagel-
laten setzten aber das Vorhandensein absoluter Reinkulturen voraus.
Als die Reinzüchtung einer Art (Polytoma uvella) Pringsheim 1920 ge-
lungen war, untersuchte dieser Autor (1921) in eingehender Weise die
Gewinnungsmöglichkeiten von Ausgangsmaterial, das Ansetzen von
Anhäufungskulturen sowie weitere Reinzüchtungsmöglichkeiten mittels
des * JToc Aschen Plattenguß Verfahrens. Die angestellten ernährungs-
physiologischen Versuche haben vor allem einen wesentlichen Fortschritt
gebracht, insofern sie nach wiesen, daß nicht Zuckerarten, sondern
niedere Fettsäuren, namentlich Essigsäure, die günstigsten Kohlenstof f-
quellen darstellen. Pringsheim untersuchte in ähnlicher Weise auch eine
Astasia- und eine Chilomonas- Art, konnte aber zu keinem eindeutigen
Ergebnis gelangen, da ihm die absolute Reinkultur nicht gelang.

Unter Außerachtlassung bisheriger Ergebnisse w^andte sich Oehler
(1924) der gleichen Frage zu, versuchte jedoch die Züchtung in der früher
besprochenen Weise mit Lösungen unklarer oder unbekannter chemischer
Zusammensetzung und kam dadurch auf Abw^ege.

Die Bedeutung niederer Fettsäuren für die Kohlenstoffernähning
heterotropher Flagellaten war im Gegensatz zur bisher angenommenen
Ernährungsweise mit „Zucker“ eine so gewichtige, daß eine Nachunter-
suchung dieser Verhältnisse notwendig war, die dann auch von Prings-
heim und Mainz (1926) im Anschluß an die oben besprochenen Ergebnisse
des ersteren vorgenommen wurde. Die Abhängigkeit der untersuchten
Arten von Monocarbon säuren konnte neuerdings bestätigt werden,
so daß man hier mit Recht von ,, Fettsäure-Organismen“ sprechen
durfte,. Pringsheim gebrauchte mitunter den noch engeren Ausdruck
,, Acetat-Flagellaten“, w^elcher gut die Bedeutung der Essigsäure als
vomehmUchste Kohlenstoff quelle zum Ausdruck bringt. Darüber
hinaus stellen die beiden Autoren hier erstmalig die Notwendigkeit
von ,, Wuchsstoffen“ für die Züchtung heterotropher Flagellaten fest,
welche in den ,, Humusstoffen“ der Erdabkochung wie auch in karameli-
siertem Zucker gegeben sein sollen. Ihre Anwesenheit ist zur üppigen
Vermehrung in einer einfach zusammengesetzten Nährlösung notwendig.
Ein weiterer bemerkenswerter Befund gelang bei der Untersuchung
verschiedenster organischer Stoffe hinsichtlich ihrer Eignung zur Stärke-
bildung. Es konnte festgestellt werden, daß ein Stoff, der keine Stärke-
bildung ermöglicht, auch für die Ernährung unbrauchbar ist.

Ein bisher noch unbekannter Faktor war die Stickstoffernährung
heterotropher Flagellaten. Hier setzten die Untersuchungen von Lnvoff

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. 1.

309

(1929) ein, der die Bedeutung von Peptonen als Stickstoffquellen in
Gegenwart niederer Fettsäuren als Kohlenstofflieferanten für Polytoma
uvella aufzeigen konnte. Nachdem somit einige gesicherte Ergebnisse
über die Ernährung der heUrotrophen Flagellaten Vorlagen, trat die
Frage der Mineralstoffernährimg in den Vordergrund. Ltvoff (1937) wies
auf die Notwendigkeit von Eisen für Polytoma uvella hin. Die biAer
verwendeten Nährlösungen enthielten von Mineralsalzen nur MgS 04
und K 2 HPO 4 (bzw. KH 2 PO 4 ), Lvüoff zeigte durch analytische Versuche
die Lebensnotwendigkeit von Eisen. Hier sei allerdings festgestellt,
daß die in den vorstehend besprochenen Arbeiten zur Verwendung
gelangten Nährlösungen zwangsläufig auch Eisen enthalten haben
müssen, sei es in Form von Verunreinigungen der Nährstoffe oder aus
denx, Glas der Versuchsgefäße stammend. In einer Zusammenfassung
gibt dann der gleiche Autor 1931 eine Übersicht über die bisher bekannt-
gewordenen Tatsachen bezüghch der Kohlenstof fernährung von Poly-
toma uvella.

Neben Polytoma uvella stellt Euglena gracilis auch weiterhin eine
häufig untersuchte Art vor. So hat JDangeard (1921) über eine durch
S Jahre erfolgte Züchtung im Dunkeln berichtet, womit das Vermögen
von E. gracilis zur ausschließHch heterotrophen Lebensweise netch-
gewiesen ist. Einen weiteren Beitrag kann man in einer Mitteilung von
Mainx (1927) erblicken, der unter anderem die Verwertbarkeit von
Aminosäuren als Nährstoffe für Eugleninen nach wies. Eine weitere
Untersuchung des Kohlenstoff- und Stickstoffbedarfs dieser Gruppe
nahmen Lwoff und Dusi (1929) sowie Dusi (1930a, b, c, d) vor, w^obei
der Einfluß der Reaktion auf die Vermehrung imd die Auswertbarkeit
gewisser Stickstoffquellen von chemisch bekannter Zusammensetzung
im Vordergrund der Betrachtung standen, auch wurde ein Vergleich
der autotrophen und der heterotrophen Leliensweise vorgenommen.
Im Anschluß daran erfolgte eine Feststellung über den Stickstoffbedarf
an einer Reihe weiterer Aminosäuren durch Dusi (1931).

Wir sehen um das Jahr 1930 eine Fülle von Einzelbefunden auf dem
Gebiet der Ernährungsphysiologie heterotropher Flagellaten, die teils
übereinstimmten, teils aber in Gegensatz zueinander standen. Eine
kritische Sichtung war notwendig geworden, die dann auch Lwoff (1932)
vomahm. Von den hier zur Untersuchung stehenden Flagellaten wurden
vornehmlich Polytoma uvella und Euglena gracilis behandelt, wobei
hinsichtlich der letzteren Art in diesem Rahmen nur diennit Dunkel-
kulturen erzielten Ergebnisse von Bedeutung sind. Ltooff nahm vor
allem zur VersuchsansteUung der einzelnen Autoren Stellung und zeigte
namentlich die Fehlermöglichkeiten der Methodik von Pringsheim auf,
der seine Versuche nur einmal durchgeführt haben soll. Im Gegensatz
dazu wies Lwoff darauf hin, daß seine eigenen Ergebnisse immer an
Archiv für Mikrobiologie. Bd. 18. 22

310

K. Reinhardt:

einer Reihe von Passagen nachgeprüft wurden. BezügUch der Stickstoff-
emährung stellte Lwoff eine geringe Eignung anorganischer Stickstoff-
quellen fest, die im Vergleich mit Asparagin nur sehr geringe Vermehrung
ermöghchen. Auf die Gründe dieses, wie wir heute wissen, nicht richtig
gedeuteten Verhaltens soll später im Zusammenhang mit der Wirkstoff-
frage näher eingegangen werden. Auch die Kohlenstoffernährung wurde
in der genannten Mitteilung kritisch untersucht und schließlich die Be-
hauptung aufgestellt, daß nur Essigsäure und n-Buttersäure geeig-
nete Kohlenstoffquellen darstellen. Die Auswertbarkeit einer Kohlen-
stoffquelle will Lwoff nicht von der Anzahl der C-Atome im Molekül
abhängig sehen, sondern von der Zahl der CH 2 -Grüppen. Eine wesent-
liche Feststellung war damit nicht getan

Die Besonderheiten des ernährungsphyBiologischen Verhaltens
heterotropher Flagellaten veranlaßte Lwoff, die gesamten Erscheinungen
einheitlich zusammenzufassen und mit dem Ausdruck ,,Oxytrophie“^
zu belegen, ohne allerdings eine genaue Bestimmung dieses neuen
Begriffes zu geben. Anfänglich bedeutet ,,Oxytrophie*‘ eine Ernährungs-
form, welche ganz allgemein an das Vorhandensein von Plastiden
gebunden sein soll, wobei sich Lwoff auf die Befunde von Volkonshy
(1930a, b) stützt, der feststellen konnte, daß die Reservestoffe der
Polytoma-ZeWe in Plastiden gebildet werden. Diese Angaben steheti
allerdings vereinzelt da und wurden in der Folgezeit nicht mehr be-
stätigt, so daß die Hauptstütze der Zw// sehen Oxytrophietheorie als
zumindest nicht gesichert bezeichnet werden muß.

Im Bestreben, die bisher an Polytoma uveUa und Euglena gracüis
in Dunkelkulturen gewonnenen neuen Erkenntnisse weiter zu stützen,
hatte schon Pringsheim (1921) Versuche zur Reinzüchtung von Chilo-
moncts angestellt, die allerdings nicht geglückt waren. Neuerdings
wandten sich Mast und Pace (1932a, b) dieser Fragestellung zu. Nach
erfolgter Reinzüchtung glaubten die Autoren feststellen zu können,
daß sich Chilomonas paramaecium in einer reinen Mineralsalzlösung
zu vermehren vermag, also ,,zur Synthese von Kohlenhydraten, Fetten
und Proteinen aus anorganischen Salzeu, CO 2 und H 2 O in Abwesenheit
von Chlorophyll und Licht befähigt ist“. Es müßte sich demnach um
einen Pall von Chemoautotrophie handeln, wobei dies eine erstmalige
Erscheinung bei farblosen FlagellcUen wäre.

Da die genannten Ergebnisse verschiedentlich angezweifelt wurden,
wandten sich die gleichen Autoren (1934) nochmals der Emährung von
Chilomonas paramaecium mit ausschließlich anorganischen Stoffen zu
und konnten ihre obigen Befunde im wesentlichen bestätigen, treffen
allerdings jetzt ihre Feststellungen in viel vorsichtigerer Weise. So
heißt es u. a., daß Gh. paramaecium in der bewußten anorganischen
Nährlösung „can grow and reproduce for many days“. Die Vermehrung

Stoff Wechsel heterotropher Flagellaten. 1. 311

^st hierbei sehr gering, gemessen an den Ergebnissen anderer Autoren
(siehe zuletzt Ondratachek, 1940 d). Außerdem geben die Verfasser nun
auch die Möglichkeit zu, daß mit den eingeleiteten Gasen Verunreini-
gungen verschiedener Stoffe miteingebracht worden sein können, welche
u. U. als Kohlenstoffquellen auswertbar waren, da diese Gase nicht be-
sonders gereinigt wurden.

Die eben genannten Feststellungen wurden von Loefer (1934) einer
eingehenden Nachprüfung unterzogen, wobei er die Ergebnisse der
obigen Autoren nicht bestätigen konnte. Chilomonas war nicht imstande,
seinen Kohlenstoff- und Stickstoff bedarf aus ausschließlich anorgani-
schen Quellen zu decken, von einer Chemoautotrophie katin also keine
Rede sein. Diese Angaben werden durch eine Mitteilung von Livoff
und Dusi (1934) unterstützt.

Im Anschluß an die oben besprochenen Nachprüfungen der Er-
gebnisse von Mast und Face (1933a, b, 1934) nahm J^efer (1935a)
eine neuerliche Untersuchung der Kohlenstoffernährung von Chilo-
monas unter kritischer Auswertung früherer Arbeiten vor, von welchen
er feststellen mußte, daß sie häufig nicht mit absoluten Reinkulturen
durchgeführt worden waren. Loefer richtete sein Hauptaugenmerk
auf die Verwertbarkeit von Kohlenhydraten und glaubte feststellen
zu können, daß eine gewisse Anzahl von ihnen, wie Arabin ose, Dex-
trose u. a. m. von Chilomonas assimiliert w^erden können. Loefer
scheint hier den Fehler, den er anderen Autoren vorwirft, selbst be-
gangen zu haben, nämlich nicht mit Reinkulturen gearbeitet zu haben.
Kohlenhydrate können von heierotrophen Flagellaten nicht abgebaut
werden, eine Assimilation kann allenfalls nach vorangegangener Spal-
tung durch Bakterien erfolgen. Auch den niederen Fettsäuren
schenkte Loe/er eine gewdsse Beachtung und fand namentlich Essig-
säure und n-Buttersäure für Chilomonas sehr geeignet. In Fort-
setzung dieser Arbeiten untersuchte Loefer (1935 b) auch das Stickstoff-
bedürfnis dieses Organismus. Er zeigte auf, daß gewisse Peptone die
besten Stickstoffquellen darstellen, während Aminosäuren nur geringe
Vermehrung ermöglichen und Amide überhaupt nicht auswertbar sind.
Im Anschluß daran wurde (1935 c) der Einfluß der Reaktion auf die
Vermehrung von Chilomonas untersucht und der Lebensbereich, sowie
das optimale pn festgestellt.

Die bisher besprochenen Arbeiten hatten ein ziemUch vollständiges
Bild von der Ernährung sowne von den sonstigen Lebensbedingungen
von Chilomonas paramaecium gegeben. Uber die erforderlichen Kohlen-
stoff- und Stickstoffquellen herrscht ziemliche Klarheit, weniger jedoch
über den Mineralstoffwechsel dieses Organismus. Mast und Pace (1935)
begannen mit der Untersuchung eines, wie ihnen schien, besonders
wichtigen anorganischen Nährstoffs, des Schwefels. Sie fanden Na 2 l|.

22 *

312

K. Reinhardt :

Na2S208, Na2S03, Na2S04, Cystein und Glutathion in reduzierter
wie oxydierter Form als Schwefelquellen geeignet, wobei die optimale
Konzentration sehr verschieden war. Sie betrug z. B. für Na2S rund
15,6 mg S, für Na2S04 1,28 mg S und für Glutathion in reduzierter
Form 0,81 mg S, jeweils für 100 ccm Nährlösung. In Abwesenheit von
Schwefel ging das Wachstum und die Teilung weiter, ebenso wurde
Stärke und Fett gebildet, für diese Prozesse war also Schwefel nicht not-
wendig. War umgekehrt Schwefel in optimaler Konzentration vor-
handen und Acetat fehlte, dann wurde Stärke und Fett abgebaut und
das Wachstum setzte aus, die Flagellaten blieben aber beweglich und
teilten sich weiter. Ein, wie mir scheint, wesentlicher Befund für das
Verständnis der Degenerationserscheinungen liegt in der Feststellung,
daß das in ChilomMaa-Zelien häu/ig auftretende ölige Fett aus Stärke
gebildet wird.

Ein für die Emährungsphysiologie heterotropher Flagellaten wesent-
licher Faktor, dessen Bedeutung anfänglich übersehen wurde, der
aber in der Folgezeit immer größere Beachtung fand, war die Reaktion
der Versuchslösung. Wie bereits eingangs erwähnt, hat schon Zumstein
1900 auf die Bedeutung der Reaktion aufmerksam gemacht, mangels
geeigneter Bestimmungsmethoden konnte aber eine nähere Unter-
suchung durch lange Zeit nicht erfolgen.

Pringsheim (1934) untersuchte mit neuen Methoden die Beziehungen
zwischen der Lebensfähigkeit einiger heterotropher Flagellaten und dem
Ph der Kulturlösung. Durch verschiedene Mischungen von n/lONHs
und n/lOCHsCOOH stellte er unterschiedliche Reaktionsbereiche
her und untersuchte nun, innerhalb welcher Grenzen sich bestimmte
Arten am üppigsten vermehrten. Er zeigte auf, daß Polytoma uvella
zwischen pn 7,1 und 8,5 am besten zu gedeihen vermag, für Polytomella
caeca wurde ein Optimum zwischen pn 5,3 und 6,5 angegeben, Chilo-
monas paramaecium vermehrte sich üppig zwischen pn 5,7 und 6,7.
Der Autor betont die Spezifität seiner Angaben und wies nachdrücklich
darauf hin, daß Angaben über den optimalen pn-Bereich eines Organis-
mus nur immer für eine bestimmt zusammengesetzte Lösung gemacht
werden können. Wie bereits Jahn (1932) nachgewiesen hatte, muß aber
auch der Temperaturfaktor berücksichtigt werden, da mit wechselnder
Temperatur auch Verschiebungen des pn-Optimums eintreten können.

Einer weiteren, für die Versuchsanstellung bedeutsamen Frage
schenkte (1936a, b) Beachtung. Er untersuchte (Jen Einfluß

verschiedener Nährstoffkonzentrationen auf die Entwicklung von
Polytoma, ebenso zeigte er die Bedeutung der Sauerstofftension für
die Vermehrung dieser Art auf, wobei er seine Ergebnisse in Form von
Vermehrungskurven festlegte. Wenn seine Ergebnisse auch keine
wesentlichen Neuerungen gebracht haben, besteht ein Verdienst der

Stoffwechsel heterotrophet Flagellaften. I.

313

Üntersuohungen doch darin, daß die Vermehrung mit quantitativen
Methoden untersucht wurde.

Wie wir aus den bisher besprochenen Arbeiten ersehen, war die
Frage, ob heterotrophe Flagellaten zur Assimilation von Kohlenhydraten
befähigt sind, noch immer nicht zur völligen Zufriedenheit geklärt.
In jüngster Zeit hat sich Loefer (1938) nochmals dieser Frage zugewendet
und bestimmte u. a. den Dextroseabbau durch ChiUmmias para^naecium.
Seine Untersuchungen nahmen auf die neuere Literatur überhaupt
keinen Bezug, sie erscheinen zumindest zweifelhaft, nachdem sämtliche
Autoren bisher die Unmöglichkeit einer Ausnutzung von Kohlenhydraten
durch die hier zur Behandlung stehenden Flagellaten nachgewiesen
haben . Im Gegensatz dazu sind jedoch die bereits früher veröffentlichten
Ergebnisse von Loefer und Hall (1936 a, b) über die Eignung von
Alkohol zur Züchtung bestimmter Flagellaten sowie über den Stickstoff-
bedarf der gleichen Arten in jeder Weise stichhaltig.

Die bisher besprochenen Arbeiten haben zahlreiche neue, teils
durch Nachprüfung gesicherte, teils stark bestrittene Einzelergebnisse
gezeitigt. Lwoff und sein Mitarbeiter Dusi sahen sich daher in der Folge-
zeit genötigt, die meisten der bisherigen Arbeiten nachzuprüfen, was
in einer Reihe nachstehend kurz zu besprechender Arbeiten geschah.
1934 untersuchten sie die Ernährung einiger heterotropher Flagellaten
insbesondere in bezug auf die Auswertbarkeit niederer Fettsäuren.
Nach ihren Ergebnissen ist Polytoma uvella imstande, neben Essigsäure
auch Propion-, n-Butter- und n-Valeriansäure zu assimilieren. Hervor-
gehoben wird die Eignung von löslicher Stärke als Kohlenstoffquelle,
das gleiche Verhalten wird auch für Euglena gra^cilis in Dunkelkulturen
angegeben. Im Anschluß daran untersuchte Lwoff (1935 a) in gleicher
Weise die Kohlenstoff- und Stickstoffernährung von Polytomelia,
Mit 0,4 % Pepton erhielt er in Anwesenheit von Acetat sehr üppige
Vermehrung, während diese mit Asparagin als Stickstoffquelle nur gering
war. Lwoff meint also, daß Asparagin keine geeignete Stickstoffquelle
für Polytomella darstelle.

Nach Lwoff sah sich auch Pringsheim (1035) zu einer kurzen Zu-
sammenfassung seiner bisherigen Ergebnisse veranlaßt, wobei er im
wesentlichen darauf hinwies, daß die von ihm untersuchten Flagellaten
mit Recht die Bezeichnung ,,Acetat-Flagellaten‘‘ verdienen, da sie sich
durchweg mit Essigsäure als Kohlenstoff quelle vermehren können.

Nachdem so eine gewisse Sichtung der bisherigen Befunde erfolgt
war, konnten Lwoff und Duai darangehen, diese Ergebnisse auch
theoretisch auszuwerten. Nachdem bereits 1934 neuerdings die Oxy-
trophietheorie zur Diskussion gestellt worden war, wobei die Autoren
Oxytrophie als die Fähigkeit chlorophyllfreier, plastidenführender
Mikroorganismen zur Assimilation niederer Fettsäuren definiert^j»,

314

K. Reinhardt:

besprach I^ooff (1935b) in etwas sprunghafter Weise neuerdings seine
Oxytrophielehre. Er versteht nun unter Oxytrophie „physiologische
Bedingungen, unter welchen organische Kohlenstoffquellen neben
organischen Stickstoffquellen unentbehrlich sind''. Die Oxytrophen
sind also Organismen, welche neben einer organischen G- noch eine
organische N- Quelle benötigen. Es handelt sich demnach um einfache
C- und N-Heterotrophie. Aus welchen Gründen diese bekannte er-
nährungsphysiologische Erscheinung mit einem besonderen Ausdruck
gekennzeichnet wurde, bleibt unverständlich, zumal die neue Begriffs-
bestimmung durchaus nicht fest blieb, sondern von ihrem Schöpfer
selbst wiederholt verändert wurde und darüber hinaus keinerlei Er-
weiterung unserer Kenntnisse zur Folge hatte.

In der gleichen Mitteilung wird auch die Rolle der Essigsäure im
Stoffwechsel erörtert und die Hypothese auf gestellt, Essigsäure sei
nicht nur für farblose Organismen von maßgebender Bedeutung,
sondern spiele darüber hinaus auch im Assimilationsprozeß grüner
Pflanzen eine wesentliche Rolle, eine Behauptung, die durch keinerlei
experimentelle Befunde unterbaut wird.

Verfolgen wir die gleiche Arbeit »weiter, so treffen wir neuerdings
auf eine neue Fassung des Oxytrophiebegriffes. Er bedeutet diesmal
,,die Fähigkeit zur Synthese von Reservestoffen durch Plastiden in
Abwesenheit von Chlorophyll". Für die meisten heterotrophenFlagellaien
ist jedoch das Vorhandensein von Plastiden nicht erwiesen, ferner ist
darauf hinzuweisen, daß sich auch cJdorophyUfiUirende Flagellaten bei
Züchtung im Dunkeln genau so verhalten wie Lwoffa „echte Oxytrophe"
Wiederum kann festgestellt werden, daß die Neueinführung des unklar
definierten Oxytrophiebegriffs in keiner Hinsicht die Forschung günstig
beeinflußt hat.

Während sich die ernährungsphysiologischen Untersuchungen
bisher auf eine kleine Anzahl von Arten beschränkt haben, sind von
nun ab Bestrebimgen bemerkbar, welche eine Erweiterung unserer
Kenntnisse durch das Studium neuer Arten suchen. So haben Lwoff
und Provasoli (1935) eine neue Polytoma, P. cäudatum var. a^tigmatum
eingehend untersucht und mit P, uvdla verglichen. Im Anschluß daran
stellte Lwoff und Dusi (1936) Versuche über die Ernährung einer farb-
losen Euglenine, Aataaia ChaUoni an. Ihre Ergebnisse werden später
näher zu besprechen sein.

Die verschiedenen Unstimmigkeiten zwischen den Ergebnissen von
PringsheifH und Lwoff haben schließlich Provasoli (1937 a) veranlaßt,
eine Neubearbeitung der ganzen Fragengruppe vorzunehmen. Ein
wesentlicher methodischer Fortschritt dieser Arbeit ist insofern gegeben,
als Provasoli nicht in der bisher üblichen Weise von allen Nährstoffen
gleiche Konzentrationen bot, sondern eine, die chemische Struktur

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. 1.

315

berücksichtigende Konzentrationsanpassung einführte. £r zeigte, daß
bei den höheren Gliedern der aliphatischen Reihe der Monocarbonsäuren
eine Konzentration von 0,2 %, wie sie bisher üblich war, bereits toxisch
wirkt. Für jede einzelne Verbindung wurde die geeignete Konzentration
experimentell festgestellt, welche in vielen Fällen Vermehrung ermög-
lichte, wiewohl dies von Pringshßim z. B. bestritten worden war.
Wie später gezeigt werden soll, war auch damit der Kern des Problems
noch nicht erkannt, aber seine Ergebnisse haben den Weg für die weiteren
Untersuchungen gezeigt.

Ein weiteres Problem, welches sich in der Folgezeit als überaus
bedeutsam erweisen sollte, hat Pringsheim wiederholt angeschnitten
(1935, 1936a, b, 1937a, b, c, d): Die Frage nach der Notwendigkeit ge-
wisser ,, Wuchsstoffe“ wie Erdabkochung oder Glucosekaramel für die
Vermehrung heterotropher Flagellaten. Lwoff und Lederer (1935)
beschäftigten sich mit der gleichen Frage und erhielten im Grund ein
ähnliches Ergebnis wie Pririgsheim, konnten also Polytoma, PolytomeUa
und Chilomonas bei Anwesenheit von Erdabkochung mit Ammonacetat
als alleinige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle züchten, zogen aber aus
diesen Befunden eine andere Schlußfolgerung wie Pringsheim, Da sie
nämlich in ihren Versuchen auch mit Acetat und Erdabkochung allein,
also ohne besondere Stickstoffquelle, eine gewisse, wenn auch geringe
Vermehrung erzielt hatten, behaupteten sie, die Erdabkochung stelle
lediglich eine etwas unklar zusammengesetzte Stickstoffquelle dar;
unberücksichtigt blieb die Tatsache, daß in ihren eigenen Versuchen
bei Zusatz einer weiteren Stickstoffquelle, z. B. Asparagin, eine weitaus
üppigere Vermehrung eintrat. Aus ihren eigenen Angaben ist somit
zu ersehen, daß Erdabkochung nur eine sehr gering auswertbare Stick-
stoffquelle für die genannten FlageUaten darstellt. Der Deutungs-
versuch der Ergebnisse Pringsheims ist somit nicht gelungen, die beiden
Autoren haben überdies einen wesentlichen Punkt nicht beachtet:
Pringsheim züchtet seine Flagellaten nicht etwa in einer Lösung von
Erdabkochung plus Nährstoffen, er setzt vielmehr nur 1 Vol.-% Erd-
abkochung (1:5 verdünnt) der Grundlösung bei. Die gegebenenfalls
noch vorhandene Stickstoff menge muß durch diese doppelte Ver-
dünnung so gering sein, daß sie das immerhin beträchtliche Bedürfnis
heterotropher FlageUaten nach Stickstoff auf keinen Pall stillen kann.
Nach wie vor ist die Tatsache gegeben, daß gewisse Stoffe, die nicht
Nährstoff Charakter tragen, für die genannten Flagellaten notwendig sind.

Unter Berücksichtigung der oben erwähnten günstigen Ergebnisse
mit ,, Wuchsstoffen“ hat Pringsheim (1937 a, b, c, d) die Ernährungs-
weise einiger heterotropher FlageUaten neuerdings mit geänderter Frage-
stellung untersucht. Zum Unterschied von den Arbeiten der Lwof flohen
Schule, welche durchweg in Form von kaum 2 Druckseiten umfassenden

316

K. Eeinbardt:

vorläufigen Mitteilungen erschienen sind und meist keine Angaben über
die Art der Versuchsdurchführung enthalten, gibt Pringsheim hier
nähere Einzelheiten über die Art der Versuchsanstellung wie auch über
den Verlauf der Versuche.

In der ersten Mitteilung dieser Arbeitenreihe (1937 a) verglich
Pringsheim die Emährungsphysiologie von Chlorogoninm und Hyalo-
gonium, also einer gefärbten Art und ihrer farblosen Nebenform. Be-
züglich der Kohlenstoffernährung stimmen beide Arten miteinander
überein, was jedoch die Stickstoffversorgung betrifft, erwies sich Hyalo-
gonium als bedeutend anspruchsvoller. Besonders auffallend ist auch
der relativ hohe Bedarf der letzten Art an Calcium. Da der einzige
bisher reingezüchtete Hyalogonium-^iAmm. verloren ging, war es im
Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, auf diese sonst bedeu-
tungsvolle Art einzugehen. Alle Versuche, Hyalogonium wiederzufinden,
scheiterten.

In der zweiten Mitteilung (1937 b) konnte Pringsheim die bisherigen
Kenntnisse über die Ernährung von Polytoma und PolytomeUa erweitern
und festigen.

Eine weitere Mitteilung des gleichen Autors (1937 c) beschäftigt
sich mit^em Theoriengebäude der Ltvoff sehen Schule, wobei aufgezeigt
werden konnte, wie völlig haltlos die Behauptungen Lux>ffs sind und
wie wenig sie überhaupt durch experimentelle Befunde gestützt werden.
Abschließend gab Pringsheim (1937d) eine Übersicht über seine bis-
herigen Ergebnisse in Tabellenform, wobei besonders das verschieden-
artige Verhalten unterschiedlicher Stämme der gleichen Art beachtens-
wert ist, ein Befund, der für farblose Flagellaten erstmalig aufgezeigt
wurde.

Die eben besprochenen Angaben von Pringsheim über ein ver-
schiedenartiges Verhalten von Stämmen der gleichen Art, welche sich
nur durch die Herkunft unterscheiden und ebenso die Außerachtlassung
der engen Beziehungen zwischen der optimalen Konzentration einer
Kohlenstoffquelle und ihrem strukturellen Bau veranlagten Provasoli
zu einer Nachprüfung der Pringsheimschen Ergebnisse. In einigen
Mitteilungen (1937 b, 1938a, b) konnte Provcbsoli an Hand von Original-
stämmen nachweisen, daß die Befunde von Pringsheim nicht stich-
haltig sind. Bei genauer Beachtung der Versuchsbedingungen verhielten
sich verschiedene Stämme der gleichen Art völlig gleichsinnig. Durch
die Herabsetzung der Konzentration der Kohlenstoffquellen konnte
Provasoli eine ganze Reihe von Stoffen, deren Assimilierbarkeit Prings-
heim bestritten hatte, für eine Anzahl heterotropher Flagellaten als aus-
wertbar nachweisen.

Nachdem Lwoff (1938) die Ergebnisse seiner Schule in einer ein-
gehenden Mitteilung zusammengefaßt hatte, zeigte schließlich Provasoli

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. 1.

317

(1938 o) auf Grund eigener Untersuchungen in einer umfangreichen und
sehr gründlichen Zusammenstellung den damaligen Stand der Kenntnisse
über die Kohlenstoffernährung unserer Flagellatengruppe auf.

3. Die Zeit der physiologisch-chemiachen Untersuchungen.

Wie bereits aus verschiedenen der besprochenen Arbeiten hervor-
geht, war die Züchtung heterotropher Flagellaten bisher nur mit komplexen
Stickstoffquellen neben der üblichen Kohlenstoff quelle, also mit Peptonen
oder anderen ,, Eiweißabbaustoffen“ möglich, oder aber mit Amino-
säuren, vereinzelt auch mit Ammonstickstoff, bei Zugabe von ,, Wuchs-
stoffen“ wie Erdabkochung, Hefeextrakt, Harn, Karamel oder ähnlichen
Stoffen zur Nährlösung möglich.

Während Ltuoff die Erscheinung, daß ein Pepton einer Aminosäure
als Stickstof fquejle überlegen ist, so zu deuten versucht, daß die kom-
plexe Zusammensetzung des Peptons eine bessere Auswertbarkeit
ermögliche, wies Pringsheim wiederholt auf den Wuchsstof fgehalt von
Peptonen hin, ohne diesen aber ex j:ierim enteil gesondert nachzu weisen .
Es blieb somit nach wie vor unbekannt, ob ein bestimmtes Pepton
zufolge seines Aufbaues oder wegen eines allfälligen Wuchsstoffgehalts
anderen Stickstoffquellen überlegen ist. Immerhin gaben diese Ver-
hältnisse eine Anregung, um die Bedeutung von Wirkstoffen nun auch
für heterotrophe Flagellaten zu untersuchen.

Auf anderen Gebieten der Mikrobiologie war man bereits näher über
diese Frage unterrichtet, so gelang es Nielsen und HarteliUs (1930) aus
Kulturen von Rhizopus suinus und Absidia ramosa einen Stoff — Rhi-
zopin — zu isolieren, der verniehrungsanregend auf Aspergillus niger
wirkt. Er besteht, wie 'weitere Untersuchungen gezeigt haben, aus einem
ätherlöslichen Anteil A, der auf die A^?€wa.-Koleoptile wirkt und einem
Wuchsstoff B, der wasserlöslich ist und die Vermehrung von Aspergillus
niger fördert. Wie die gleichen Autoren (1932) weiter zeigen konnten,
läßt sich dieser B-Wuchsstoff auch auf chemischem Wege durch Er-
hitzen von Zucker mit organischen Säuren oder deren Ammonium -
salzen herstellen.

Einen weiteren, seiner chemischen Zusammensetzung nach genau
bekannten Wirkstoff konnte Schöpfer (1934) für Phycomyces aufzeigen,
indem er die Bedeutung von Aneurin (Vitamin Bj) als Wachstumsfaktor
für diesen Organismus nach wies.

Auch auf dem Gebiete der eigentlichen Bakteriologie konnten neue
Befunde festgestellt werden, es sei als Beispiel nur auf Knight (1935)
verwiesen, der die Notwendigkeit von Aneurin neben Nikotinsäure
und Bios für Staphylococcus aureus nachgewiesen hat.

Das Wirkstoffbedürfnis heterotropher Flagellaten fand, wie ber^ts
erläutert, verhältnismäßig spät Beachtung. Als erster wandten sich

318

K. Reinhardt:

Lwoff und seine Mitarbeiter, nachdem sie das Wirkstoffbedürfnis ver-
schiedener anderer Mikroorganismen wie HaemophÜMs influenzae
(1937 a), H, Ducreyi (1937 b) und von Trypanosomiden (1937 c) imtersucht
hatten, den hier zur Behandlung stehenden Flageüaten zu. Zunächst
erfolgte durch Lwoff und Dusi (1937a) die Untersuchung der Notwendig-
keit von Wachstumsfaktoren für Poly0meUa caeca- Dieser Flagellat
war bisher bakterienfrei nur in Gegenwart komplexer organischer
Substanzen wie Pepton Vaillant oder in synthetischer Nährlösung mit
Erdabkochung gezüchtet worden, deren „Wuchsstoffwirkung^* Pringa-
heim (1935, 1936a) wie erwähnt auf den Gehalt an Humusstoffen
zurückführte. Wie bereits oben besprochen, haben Lwoff und Lederer
(1935) dagegen Bedenken erhoben, ohne aber eine andere annehmbare
Erklärung geben zu können. In der Erkenntnis, daß mit Erdabkochung
und ähnlichen Stoffen keine Erweiterung unserer Kenntnisse und eine
Lösung des Problems zu erzielen sein wird, versuchten Lwoff und Duäi
(1937 b) für Polytomella einen definierten Wachstumsfaktor zu finden.
Sie griffen auf die Ergebnisse von Schöpfer (1935/38) und Knight (1937)
zurück und versuchten Polytomella caeca in einer Nährlösung zu züchten,
welche neben den notwendigen Mineralsalzen nur Natriumacetat und
Asparagin enthielt. Durch einen Aneurinzusatz gelang es, die anfäng-
liche Individuendichte von 14 Zellen im cmm auf 700 zu steigern. Die
Verfasser geben zwar an, daß Aneurin noch in einer Verdünnung von
10“®% ,,wirksam‘‘ sei, unterlassen aber die Angabe der optimalen
Konzentration. Mit Ammonacetat als Kohlenstoff- und Stickstof fquelle
konnte Polytomella nicht ihr Auslangen finden. Im weiteren wurde
dann auch die Wirkung der beiden Bausteine des Aneurinmoleküls
untersucht und festgestellt, daß Polytomella caeca auch mit Thiazol
4- Pyrimidin zu gedeihen vermag, so daß sie zur Synthese des Aneurin -
moleküls aus diesen beiden Bestandteilen befähigt sein muß.

In einer weiteren Arbeit untersuchten Lwoff und Dusi (1937 b) das
Wirkstoffbedürfnis von Polytoma caudatum und Chilomonas paramaecium .
Lwoff und Provasoli (1935) hatten bereits die Vermutung ausgesprochen,
daß im Pepton ein Stoff enthalten sein muß, bei dessen Fehlen eine
optimale Vermehrung nicht zu erzielen ist, Pringsheim war, wie wir
bereits gesehen haben, zu einem ähnlichen Ergebnis gelangt. In der
letztgenannten Mitteilung wurde nnun dieser Stoff gesucht und dabei
aufgezeigt, daß Polytoma caudatum in einer Nährlösung, die neben den
notwendigen Mineralsalzen noch Natriumacetat und Asparagin enthält,
durch Zusatz von Aneurin zu üppiger Vermehrung angeregt wird.
Pjmmidin allein ist unwirksam, Thiazol allein wirkt hingegen in gleichem
Maße wie Aneurin. Ob allerdings die vermehnmgsbeeinflussende
Substanz im Pepton Vaillant mit diesen Stoffen in Beziehung steht,
konnte nicht entschieden werden. Ähnliche Verhältnisse gelten auch

Stoffweoluiel heterotropber Hagellaten. 1.

319

für Chilomonas pmamaecium. Bei Verwendung von Asparagin als
Stiokstoffquelle bewirkt Aneurin reichliche Vermehrung, es ist in seiner
Wirkimg durch Thiazol, nicht aber durch Pyrimidin zu ersetzen.

In einer dritten Mitteilung haben LAJtx)ff und Duai (1937 c) die
Bedeutung von Aneurin bzw. Thiazol als Wachstumsfaktor für Pölytoma
oceltatum untersucht. Auch hier wiederum ermöglicht der Zusatz der
genannten Wirkstoffe zu einer Nährlösung mit Asparagin und Acetai
üppige Vermehrung. Die beiden Autoren ergänzen dann ihre Ergebnisse
durch einige weitere Befunde und stellen zusammenfassend lest : Poly-
tomeUa ca,eca benötigt Thiazol und Pyrimidin, ChilamonM paramaecium,
Polytoma caudatum und P, oeeUatum finden ihr Auslangen mit Thiazol,
während P. obtusum und P, uveUa bei Züchtung in einer Nährlösung mit
Asparagin als Stickstoff quelle ohne Wachstumsfaktor zu gedeihen ver-
mögen. Für Eugleha gracilis, welche durch 9 Jahre im Dunkeln in
einer Lösung mit Pepton und Acetat gezüchtet worden war, ist die Be-
deutung von Aneurin bei Züchtung mit Asparagin nicht so leicht zu
erkennen. Erst im Laufe längerer Kulturversuche erwies sich eine
Überlegenheit der aneurinhaltigen Kulturen. Es konnte also auf gezeigt
werden, daß Aneurin auch für die Gruppe der heterotrophen Flagellaten
eine gewisse ernährungsphysiologische Bedeutung besitzt.

Die zuletzt besprochenen Versuche stießen verschiedentUch auf
Widerspruch, selbst Lwofl und Dusi scheinen Bedenken über ihre
früheren Feststellungen gekommen zu sein, denn sie untersuchten (1938)
nochmals in vergleichender Weise die Züchtungsmöglichkeit hetero-
tropher Flagellaten in synthetischer Nährlösung. Da ihre früheren
Versuche durchweg mit einem Asparaginpräparat durchgeführt worden
waren, welches einen Gehalt von Wirkstoffen nicht ausschloß, versuchten
die beiden Autoren die gleichen Untersuchungen mit einem Ammonium-
salz als Stickstoffquelle zu wiederholen. Zunächst scheiterten aUe
Versuche. Erst als der Nährlösung nach der Sterilisierung CaCl2
Fe-Citrat zugesetzt wurde, gelang es zunächst Polytoma obtuaum und
P. uveUa zur Vermehrimg zu bringen. Die Verfasser glaubten damit
einige Feststellungen von Pringaheim widerlegt zu haben, weil dieser
das Eisen bereits vor der Sterilisation zur Nährlösung zugesetzt hatte,
leider unterlassen sie die Angabe, auf welche Weise in ihren Versuchen
das Eisen und Calcium keimfrei gemacht wurde. Die Verfasser stellten
zusätzlich fest, daß in ihrem Fall Watte als Wuchstoffquelle nicht in
Betracht käme. Wurde in weiteren Versuchen zu einer synthetischen
Lösung mit Ammonacetat als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle noch
Thiazol zugesetzt, dann genügte sie auch den Ansprüchen von Polytoma
caudalnm und P. oceüatum. Ein Zusatz voil P^midin und Thiazol
ermöglichte schließlich auch PolytomMa caeca und Ohilomonaa

320

K. Reinhardt:

maecium die Vermehrung. Während in einer vorangegangenen Mit-
teilung (1937 b) hervorgehoben wurde, daß ChilonKmaa mit Thiazol
allein sein Auslangen findet, benötigt nun der gleiche Organismus
daneben noch Pyrimidin.

Ausgehend von experimentellen Untersuchungen über den Einfluß
von Wirkstoffen auf die Vermehrung mixotropher Algen (1940a)
wandte sich Ondratschek in einer Keihe näher zu besprechender Mit-
teilungen der Frage des Wirkstoffbedarfs heterotropher Flagellaten zu.
Für mixotpophe Formen konnte bereits (1940b) aufgezeigt werden, daß
der Verlauf der Ertragskurven innerhalb gewisser Grenzen nur von der
Menge des zur Verfügung stehenden Wirkstoffs bestimmt wird, falls
die notwendigen Nährstoffe in optimaler Konzentration vorhanden
sind. Das Vitaminbedürfnis konnte schließlich (1940c) als Folge eines
Verlustes des Synthesevermögens wahrscheinlich gemacht werden.
Auf Grund der an Mixotrophen gemachten Erfahrungen konnte an eine
Untersuchung des Wirkstof fbedürfnisses heterotropher Arten geschritten
werden. Zunächst (1940d) konnte aufgezeigt werden, daß Aneurin
bzw. seine Bausteine Thiazol und Pyrimidin für Chilomonas paramaecium
nicht nur eine vermehrungsfördernde Substanz, sondern einen Wachs-
tumsfaktor darstellen. Weitere Untersuchungen (1941a) zeigten die
Rolle des Aneurins als Wachstumsfaktor für vier weitere Chilomonaden
und drei Pölyblepharidineen auf. In Fortsetzung dieser Arbeiten wurde
(1941b) dann auch das Wirkstoffbedürfnis von insgesamt 14 Polytomeen
und (1941 c) von 3 Astasiaceen und 3 Euglenaceen geklärt. Es sind somit
28 heterotröphe Flagellaten untersucht worden, deren Abhängigkeit von
Aneurin bewiesen werden konnte. Im Laufe dieser Arbeiten hatte sich
gezeigt, daß neben Aneurin mitunter andere Wirkstoffe (Pseudowachs-
tumsfaktoren, Spurenelemente) lebensnotwendig sein können, ein Be-
fund, der zur näheren Untersuchung des Mineralstoffbedürfnisses hetero-
tropher Flagellaten (1941 e) Veranlassung gab.

Die eben besprochenen Ergebnisse ließen die bisherigen Befunde
über die Ernährungsweise heterotropher Flagellaten in neuem Licht
erscheinen. Manche Unklarheiten und Gegensätze können aus der*
Unkenntnis der Bedeutung von Wirkstoffen für die C- und N- Assimilation
erklärt werden, darüber hinaus aber erscheinen auch die bisher als ge-
sichert angenommenen Tatsachen als fraglich, da der Einfluß von Wirk-
stoffen, welche ii. U. als Verunreinigungen oder Beimengungen vorhanden
sein konnten, auf das einzelne Versuchsergebnis nicht abzuschätzen
ist. Es ergibt sich somit die Notwendigkeit, die wesentlichsten bisherigen
Befunde unter den neuen Gesichtspunkten nachzuprüfen, eine Aufgabe,
der die vorliegenden Untersuchungen im Rahmen des Möglichen nach-
zukommen versuchen.

StoffwechBel heterotropher Flagellaten. I.

321

Die Bedeutung der Yersuehsanstellung.

Die im vorangegangenen Abschnitt erörterten Versuchsergebnisse
der einzelnen. Autoren wurden naturgemäß mittels verschiedenartiger
Versuchsanstellung und -durchführung erzielt, eine vergleichende Be-
sprechung der wichtigsten Arbeitsweisen läßt sich auch hier nicht um-
gehen, da manche abweichenden Ergebnisse auf die angewendete
Arbeitsweise zurückgeführt werden können. Nachstehend sollen einzelne
Arbeitsverfahren, nach methodischen Gesichtspunkten geordnet, näher
besprochen und miteinander verglichen werden.

i. Das lebende Material.

Die Heranzüchtung der Organismen geschah bei allen Autoren,
die sich mit dem vorliegenden Pragengebiet beschäftigt hatten, in
ähnlicher Weise durch Anlegen von Rohkulturen. Die einzelnen Forscher
gingen dabei wohl verschiedene Wege, im Grunde kam es aber immer
darauf an, in gärenden, nährstoffreichen Flüssigkeiten, sogenannten
,, Faulkulturen“, einige wenige, mit anderem Material vom Standort
eingebrach ten Flagellatenzellen zur Vermehrung zu bringen. Die
abbaufähige Substanz war mitunter eiweißartiger Natur (Käsereste,
Peptone) oder ein Kohlenhydrat (verschiedene Stärkesorten, Dextrin,
Inulin). Durch Beigabe von Erde wurde für Anwesenheit von Bakterien
gesorgt, durch deren Stoffwechseltätigkeit die anfänglich inr ’ Flagellaten
nicht verwertbaren Kohlenstoff- und Stickstof fquellen in für sie assi-
milierbare Stoffe umgewandelt wurden.

In einer mit Fibrin angelegten Faulflüssigkeit konnte Jacobsen (1910) nach
Beimpfung mit Schlamm oder Erde Anhäufungskulturen etlicher Flagellaten
erzielen. Bei Lichtkulturen überwogen grüne Formen, ^^mrden die Versuche im
Dunkeln aufgestellt, so häuften sich besonders farblose Arten an. Buder (1914)
hat diese Methode übernommen, er ersetzte das Fibrin durch einige andere Stoffe,
wobei sich getrocknetes Eiweiß besonders bewährt hat. Pringsheim (19€1) zeigte
dann, daß^ebenso gut G^elatine und noch besser Casein zu verwenden ist. Er hat
dann die Methodik der Faulkulturen noch besonders ausgebaut und (1936 a) ein-
gehend geschildert. Er verwendet als Nährstoff Käse, Erbsen oder Getreidekömer
und überschichtet mit Erde oder Torf, womit gleichzeitig die Möglichkeit einer
gewissen Beeinflussung der Reaktion gegeben ist. ln eiweißhaltigen Faul-
fltissigkeiten nimmt die Reaktion infolge der NH 3 - Abspaltung ständig nach der
alkalischen Seite hin zu, bei Verwendung stärkehaltiger Ausgangsmaterialien
werden durch die entstehenden Säuren Verschiebungen nach der sauren Seite
hin beobachtet. Außerdem ist die Reaktion der mit Erde angesetzten Versuche
stets alkalischer als jene der mit Torf beschickten.

Mittels dieser Arbeitsweise wurden auch die in den später zu behandelnden
eigenen Versuchen verwendeten Flagellaten-StSimme angehäuft und in Roh-
kultur genommen.

Je nach den zufällig in der Faulkultur herrschenden Bedingungen gewinnt
die eine oder andere Flagellaten-Art die Vorherrschaft und erfüllt in Kürze die

322

K. Reinhardt :

Faulflüssigkeit. In günstigen Fällen herrschen nur 2 bis 3 Arten vor, mitunter
setzt sich das ganze Individuengemisch aus Angehörigen einer Art zusammen.
Zu diesem Zeitpunkt üppigster Vermehrung kann an die Reinzüchtung gegangen
werden. Abgesehen von vereinzelten Versuchen, mit Hilfe des iTooA sehen
Plattenguß Verfahrens die Isolierung vorzunehmen, wie sie z. B. Pringaheim (1921)
mit PolyUm^ gelungen ist, haben auch hier die meisten Autoren die gleiche
Methode zur R3inzüchtung verwendet, nämlich das sogenannte „Mikropipettier-
verfahren“. Mit Hilfe steriler Kapillaren wurden ein oder mehrere Zellen aus
der Faulkultur entnommen, in sterile Lösung gebracht, nach einigen Minuten
neuerdings herauspipettiert und in frische Lösung übertragen. Nach mehrmaliger
Wiederholung dieses Vorganges ergaben die bakteriologischen Reinheits-
prüfungen in der Regel Abwesenheit irgendwelcher biologischer Verunreini-
gungen. Die Arbeitsweise der einzelnen Autoren unterscheidet sich nur insofern,
als manche jeweils mehrere (z. B. 20) Zellen übertrugen (u. a. Pringaheim),
während andere (u. a. Lwoff) stets von einzelnen Zellen ausgingen.

Ich habe im allgemeinen die gleiche Methode benutzt (eine ein-
gehende Schilderung gab Pringaheim, 1937a), hier sei nur auf einige
Besonderheiten hingewiesen. Über die Art der zur Isolierung verwen-
deten Glaskapillaren finden sich in der Literatur so gut wie keine An-
gaben. Lwoff scheint nach allem mit Pyrexglas gearbeitet zu haben,
von Pringaheim ist bekannt, daß seine Pipetten meist ^aus Kavalierglas
und nur vereinzelt aus Jenaer Geräteglas bestanden. Ich konnte zu
wiederholten Malen feststellen, daß die Verwendung von alkaüabgebenden
Glassorten eine große Gefahrenquelle für das Versuchsergebnis mit sich
bringt (s. Ondratachek, 1935). Bei der Isolierung wirkt sich dieser Um-
stand noch nicht einmal so stark aus, es tritt mitunter eine Schädigung
der übertragenen Zellen ein, so daß die neu angelegten Klone nicht an-
wachsen, bei der Beimpf ung ernährungsphysiologischer Versuche kann
dieser Umstand aber zu wesentlichen Fehlurteilen führea. So kann es
Vorkommen, daß einem Nährstoff jegliche Eignung abgesprochen wird,
obwohl tatsächlich die eingetragenen Zellen durch das Alkali des Glases
irreparabel geschädigt worden waren. Wird die gleiche Lösung auf andere
Weise beimpft, dann tritt starke Vermehrung ein. Besonders bedenklich
wird dieser Umstand bei Beimpf ung mit einzelnen Zellen. Ich verwende
grundsätzlich Jenaer Glas, sowohl zur Anfertigung von Pipetten und
Kapillaren, als auch in Form von Uhrschälchen, Röhrchen und Kolben.
Selbst die Vorratsflaschen der Stammlösungen bestehen aus Jenaer
Glas.

In der vorliegenden Arbeitenreihe wird getrachtet, alle Befunde
durch möglichst zahlreiche Einzelergebnisse an den verschiedensten
Arten zu erweitern. Ein Teil der hier untersuchten heterotrophen Flagel-
laten stellt erstmalig reingezüchtete, zum Teil neubeschriebene Arten
dar, ein anderer Teil wurde bereits wiederholt untersucht. Nachstehend
wird eine systematische Übersicht über alle untersuchten Arten ge-
geben.

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. I.

323

Verzeichnis der untersuchten Arten.

A Cryptomonaden.

Chilomonaa paramaecium Ehrenberg.

Gh, longcUa Ondraiechek.

Gh. obUmga Pascher.

Gh. coniformxs OndrcUachek.

Gh. globosa Ondratschek.

B. Volvocalen.

a) Polyhlepharidineen.

Polytomella o/gilis Ara/gao.

P. caem Pringsheim.

P. globosa Panscher.

b) Ghlamydomonadineen.

Polytoma obtuswn Pascher var. Stigmata Ondratschek.

P. majus Pascher var, astxgmata Ondratschek.

P. Pascheri Moewns.

P. cavdatum Korschihoff var. astigmata Provasoli.

P. uvella ^fSensu strictu'' Ehrenberg.

P. angustum Pascher.

P. minus Pascher.

P. papillatum Pascher.

P. curvatum Ondratschek.

P. coniforme Ondratschek.

P. dorsiventrah Pascher var. asligmata Ondratschek.

P. ocellatum FrangL

P. tetraoleare Pascher var. astigmata Ondratschek.

P. cylindraceum Pascher.

C, Eug/enfnen.

a) Euglenaceen.

Euglena gracilis Klebs.

E. gracilis Klebs var. robusta Ondratschek.

E. viridis Ehrenberg.

b) Astasdaceen.

Astasia longa Pringsheim.

A. quartana Moroff nov. comb. Pringsheim.

A. Ghattoni Lwoff.

2. Die Zubereitung der Lösungen.

Es war wohl stets das Bestreben aller Autoren, möglichst mit
chemisch reinen Stoffen ernährungsphysiologische Versuche durch-
zuführen. Mit zunehmender Verfeinerung der Herstellungsmethoden
gelangten Präparate in den Handel, welche heute so ziemlich den nieisten
Anforderungen entsprechen, besonders die synthetisch bereiteten
organischen Stoffe befriedigen in dieser Hinsicht vollauf. Die Angabe
des chemischen Reinheitsgrades der Präparate berücksichtigt allerdings

324

K. Bernhardt:

fast ausschließlich Stoffe, welche dem Chemiker oder Techniker als
allfällige Verunreinigungen unerwünscht sind. Es sind dies meist
Substanzen, welche infolge ihrer nahen chemischen Verwandtschaft
(Homologe z. B.) oder welche aus technischen Gründen nur schwer aus-
zuschließen sind. Der Chemiker hat oft keinen Grund, Stoffe zu berück-
sichtigen, welche für den Mikrobiologen von größter Bedeutung sein
können. Es sei hier nur auf die verschiedenartigsten Wirkstoffe ver-
wiesen. Solche anorganischer Natur — Spurenelemente (Pseudo-
wachstumsfaktoren) — können aus dem Herstellungsprozeß nur allzu
leicht anwesend sein, ebenso aber auch, wie früher gezeigt werden
konnte {Qndratscheh, I940d, 1941a, b, c), organische Wirkstoffe. So
konnte u. a. ein bedeutender Wirkstoffgehalt in Peptonen, aber auch
in Aminosäurepräparaten (Glykokoll, Asparagin) nachgewiesen werden.
Für spezielle Arbeiten, bei denen es gerade auf diese mengenmäßig
geringfügigen Beimengungen ankommt, muß daher in jedem Einzelfall
eine eingehende Reinheitsprüfung, unter Umständen eine besondere
Reinigung erfolgen.

Auf Grund eigener Erfahrungen wurden, um Versuchsfehler zu
vermeiden und zweifelhafte Ergebnisse auszuschließen, in den folgenden
Versuchsreihen durchweg frische Präparate unmittelbar von den ein-
zelnen Werken angeschafft. Sie bieten Gewähr, daß die Möglichkeit
einer gegebenenfalls eintretenden Zersetzung oder Umlagerung durch
längeres Auf bewahren, weitgehend ausgeschaltet ist. Die chemischen
Stoffe sind Erzeugnisse der Firmen Merck, Schuchardt, Fränkel und
Landau und Kahlbaum, Jeweils wurde das Präparat mit höchstem
Reinheitsgrad, wenn möglich synthetischer Herstellung verwendet.

Die Zubereitung der Lösungen erfolgt hier stets mit doppelt destilliertem
Wasser, die Versuchsgefäße sind aus Jenaer Geräteglas. Über die Zusammen-
setzung der Versuchslösungen wird jeweils an geeigneter Stelle Näheres an-
geführt werden. Grundsätzlich erfolgt die Konzentrationsangabe in mg des
wirksamen Elementes. Die übliche Angabe in % hat den Nachteil, nichts über
die aktuelle Konzentration des Elementes auszusagen, besonders wenn, wie
üblich, die Angabe des Wassergehalts unterbleibt. Wir schreiben also z. B.
X mg Mg als MgClj und nicht x% BlgCl 2 , oder x mg C als CHjCOONa und nicht
x% Na-Acetat, bezogen jeweils auf das Versuohsvolumen. Diese Ausdrucks-
weise wurde für anorganische Salze bereits in einer Reihe von Mitteilungen
gebraucht (Ondratschek, 1940 d, 1941 a, b, c, e) imd hat sich bewährt.

S, Die Beimpfung der Vermchslömngen,

Die Art der Beimpfung einer Versuchslösung wechselte bei verschiedenen
Autoren. Loefer beimpfte, soweit aus seinen Arbeiten ersichtlich ist, mit meh-
reren Zellen. Ob imd wieviel Kulturfolgen er anlegte, wurde nicht angegeben.
Lwoff beimpfte stets mit einem Tropfen einer Zellaufsohwemmung und über-
trug bei positivem Ausfall zu wiederholten Malen in die gleiche frische Nähr-
lösimg. Trat immer wieder Vermehrung ein, dann sprach er der geprüften

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. I.

325

Substanz Eignung als Nährstoff zu. Pringaheim führte anfänglich die Be-
Impfung mit 1 Öse voll Zellen durch» wobei er gleichfalls einige Kulturfolgen
anlegte. Später ging er dazu über» jeden Versuch mit nur einer Zelle zu be-
impfen» um so anscheinend sicherere Ergebnisse zu erzielen. Wenn man aber
bedenkt» daß infolge der Nichtbeachtung des Lebenszustandes die ver-
schiedensten physiologischen Zustände zur Einsaat gelangten» und wenn
man in Betracht zieht, daß durch die Alkaliabgabe der aus Kavalierglas her-
gestellten Pipetten leicht eine zusätzliche Schädigung dieser einzelnen Zellen
eintreten konnte» dann nehmen die oft recht verschiedenartigen Ergebnisse
seiner Versuche, sowie die Gegensätze zwischen seinen Ergebnissen und denen
LwoffB nicht wunder.

Ich habe im I^aufe der Jahre eine bestimmte Beimpf ungs weise
ausgebaut, welche nachstehend kurz beschrieben werden soll. Bei
Prüfung einer Substanz auf ihre Eignung als Nährstoff werden die ersten
Versuche stets in 10 ccm Versuchslösung in Röhrchen durchgeführt, die
Beimpfung erfolgt mit einem Tropfen einer Aufschwemmung von Zellen,
welche in der vielfach erwähnten Nährlösung L 25 (enthält 0,1 % Pepton
Vaillant und 0,2% Natriumacetat) herangezogen worden waren. Die
Anzahl der Zellen in diesem Impftropfen beträgt 20 bis 30. Tritt Ver-
mehrung ein, werden wiederum 20 bis 30 Zellen in frische Nährlösung
übertragen und dies insgesamt dreimal durchgeführt. Nach dreimaligem,
positivem Ausfall steht die Eignung der Substanz als Kohlenstoff- oder
Stickstoffquelle fest und es erfolgt die quantitative Bestimmung der
maximalen Trockensubstanz, welche unter Verwertung des betreffenden
Stoffes erzielt werden kann. Zu diesem Zweck werden 250 ccm der
gleichen Versuchslösung in Koliken wiederum mit 20 bis 30 Zellen aus
der letzten Kulturfolge beimpft und nach einer gewissen, je nach der
Organismenart verschiedenen Zeitspanne das Trockengewicht bestimmt.

Gegen die oben erwähnte Art der Übertragung in nur drei Kultur-
folgen wird oft eingewendet, daß Versuchsfehler durch aus der Ausgangs-
kultur mit übertragene Nährstoffe auf treten können. Wenn man aber
bedenkt, daß sich die eingebrachten 20 bis 30 Zellen bei Polytoma
z. B. nach wenigen Tagen auf 20000000 vermehrt haben (2000 Zellen
im cmm angenommen), dann ist es kaum wahrscheinlich, daß in einem
Tropfen — etwa 0,03 ccm ~ so viele Nährstoffe mitgebracht werden
konnten, als für den Bau- und Betriebsstoffwechsel notwendig sind.
Langjährige Erfahrungen zeigen sogar, daß das Ergebnis der ersten
Kulturfolge fast obne Ausnahme bereits endgültig ist. Trotzdem werden
auch in der vorliegenden Arbeit jeweils drei Übertragungen in Röhrchen
angelegt, bevor ein quantitativer Versuch angestellt wird, um auch die
geringste Nährstoff Übertragung zu vermeiden. Zur Übertragung
werden nahezu kapillar ausgezogene Pipetten aus Jenaer Geräteglas
verwendet.

Es sei noch erwähnt, daß sämtliche Versuche bei 25^ C im Thermo-
staten durchgeführt wurden.

Archiv für Mikrobtolofcie. Bd. 13. 23

326

K. Bernhardt:

4. Bestimmung und Deutung der Ergebnisse,

Wir kommen hiermit zum schwierigsten und gleichzeitig wichtigsten
Gebiet der Methodik. Die Literatur zeigt, daß das Ergebnis ernährungs-
physiologischer Versuche mit farblosen Flagellaten meist in sehr einfacher
Weise angegeben wird.

Pringaheim und Lwoff schätzten bloß den Emte^rtrag, und zwar gaben sie
üppige Vermehrung mit -f--f an, gute Vermehrung mit +, blieb die Vermehrung
ziemlich hinter dem Durchschnitt zurück, dann wurde sie mit bezeichnet,
bei sehr spärlicher Vermehrung mit ±. Diese Schätzungen sind mit subjektiven
wie objektiven Fehlem behaftet. Es bleibt dem einzelnen Autor überlassen,
was er nqch als i oder bereits — bezeichnen will, die Angabe von + besagt
überhaupt nichts mehr, da daraus nicht entnommen werden kann, ob dem be-
treffenden Stoff noch eine gewisse Bedeutung als Kohlenstoff- oder Stickstoff -
quelle ^ukommt, oder ob etwa die geringe Vermehrung auf Kosten der Reserve-
Stoffe vor sich ging. Abgesehen von diesen subjektiven Fehlerquellen müssen
aber auch solche objektiver Natur berücksichtigt werden, so kann z. B. der
Beservestoffgehalt eine wesentliche Fehlerquelle bilden, denn bei gleicher
Individuenzahl wird eine Kultur reservestoffreicher Zellen eine viel größere
Dichte Vortäuschen als eine Solche reservestoff armer Zellen. Das gleiche gilt
für die Schätzung der Ernteerträge nackter (Polytomella) und behäuteter Zellen
(Polytoma). Aus all dem ist ersichtlich, daß die Angabe von Schätzwerten nur
eine sehr geringe Zuverlässigkeit verbürgt.

Wesentlich anders verhält sich die Angabe der Ernteerträge bei Loefer
und Provaaoli, welche die Höchstzahi der Zellen in cmm bestimmten. Diese
Methode ist an sich brauchbar und wurde auch in früheren, eigenen Arbeiten
(Ondratachek 1940 a, b, c, d, 1941 a, b, c, d, e) teilweise angewendet. Loefer
verwendet nicht unmittelbar die absoluten Zahlen als Maßstab, sondern bildet
einen Faktor F = x/x^, wobei a?o die Zahl der Zellen in cram zu Beginn und x
die am Ende des Versuchs darstellt. Wenn nun auch diese Methode durchaus
brauchbar ist, so geht Loefer in manchen Fällen bei der Deutung seiner Ergebnisse
doch zu weit, wie bei der Behandlung der Kohlenhydrate als Kohlenstoffquellen
zu zeigen sein wird. Er nimmt auch dann noch Eignung an, wenn z. B. o; 270
und Xf, == 230 ist, und kommt dadurch zu mitunter falschen Schlüssen. Provasoli
gibt die Zahl der Zeilen in cmm an, und zwar in kennzeichnender Weise. Allerdings
hielt er es für nötig, außerdem noch mit — , ± oder 4- die Eignung bestimmter
Stoffe zu bezeichnen. Seine Kontrollversuche ohne Kohlenstoffquelle haben
infolge des hohen Peptongehalts (0,4% !) eine immerhin beträchtliche Ver-
mehrung aufzuweisen und beim Vergleich der Versuchsergebnisse mit den Kon-
trollen kommt es vor, daß einmal der doppelte Ertrag als -f, ein anderes Mal
wieder als db oder gar ^ bezeichnet wird. Wiederum sehen wir die subjektiven
Fehlermöglichkeiten. Dabei hat doch das Ansteigen der Zeilenzahl auf das
Doppelte nichts zu besagen, denn es bedeutet bei Formen, welche 2 Toohter-
zellen bilden, lediglich, daß sich jede Zelle noch einmal geteilt hat, bei Arten,,
welche 4 oder 8 Tochterzellen bilden (PolyUma)^ sogar nur, daß sich jede 4. oder
8. Zelle geteilt hat.^ Zur Auswertung der Ergebnisse von ProvcLSoli soll daher im
folgenden nur die Angabe der durchschnittlichen Zahl der Zellen in cmm ver-
wendet werden, da diese Zahlen verläßlich sind und ein gutes Kennzeichen über
die Brauchbarkeit verschiedener Stoffe als Nährstoffe bieten.

Ich habe die in anderen Forschungszweigen seit langem übliche
Methode der Feststellung des Emteertrages durch Trockengewichts-
bestimmungen übernommen und für unsere besonderen Zwecke aus-

Stoffwechsel* heterotropher Flagellaten. 1.

327

gebaut. Die Methode hat sich in einer Reihe von Arbeiten sehr bewährt
(Ondratacheky 1940a, b, c, d, 1941a, b, c, d, e) und liefert gut vergleich-
bare Zahlen. Namentlich für Bilanzversuche kann nur diese Ertrags-
bestimmungsart angewendet werden, da sie allein Aufschluß gibt,
wieviel Leibessubstanz aus der gebotenen Nährstoff menge entstanden
ist. Die Durchführung der Trockengewichtsbestiramung ist verhältnis-
mäßig einfach. Die Versuchslösung wird durch Jenaer Glasfiltertiegel
bei mäßigem Unterdrück durchgesogen, die zurückbleibenden Zellen
gewaschen und der Tiegel bei K)5^^ C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Je nach der Größe der Zellen, wobei besonders der Durchmesser maß-
gebend i.st, gelangen Filtertiegel mit den Porengrößen G 3 oder G5/3
zur Verwendung. Auch die Auflagerung einer dünnen Bolusschicht hat
sich bewährt. Um eine rasche Filtration zu ermöglichen, zentrifugieren
wir bei den vorliegenden Untersuchungen das Zellgemisch zuerst ab,
nehmen es mit 5 bis 10 ccm Wasser wieder auf und gießen diese Or-
ganismenaufschwemmung erst zum Schluß auf das Filter, die Arbeits-
zeit kann so w'esentlich abgekürzt w^^erden. Durch Vorhandensein einer
großen Anzahl Filtertiegel konnten die Trockengewdchtsbestimmungen
laufend durchgeführt werden.

Von großer Bedeutung ist die Auswertung des Ergebnisses der Trok-
kengewichtsbestimmungen. In früheren Arbeiten, die sich mit der
Trockensubstanzproduktion farbloser Flagellaten in ihrer Abhängigkeit von
Wirkstoffen beschäftigten, wurde als Vergleichsmaßstab der von Nielsen
Trockengewicht der Wirkstoff haltigen Versuche
eingeführte Faktor / Trockengewicht der Wirkstoff freien Kontrollen
gebraucht. In der vorliegenden Arbeit kann eine ähnliche Berechnungs-
weise nicht angewendet werden, da die Versuche ohne Nährstof fzusatz
keine wägbaren Trockenrückstände ergaben. Der genannte Faktor hätte
zudem in diesem Fall nicht viel besagt. Es schien mangels anderer
Möglichkeiten noch am zweckmäßigsten, die mit Essigsäure und an-
organischem Stickstoff erzielten Ernten als Grundlage für Berechnungen
bzw. Auswertungen heranzuziehen. Essigsäure bietet für alle unter-
suchten Organismen eine vorteilhafte, w^enn nicht die beste Kohlenstoff-
quelle. Die zur Berechnung notwendigen Grundzahlen wurden durch
wiederholte Bestimmungen zu verschiedenen Zeitpunkten festgelegt,
wobei folgende Lösung zur Verwendung gelangte;

5 • 10“*% C als* Natriumacetat,

10 “*% N als NH 4 NO.,,

5 • 10 “»% K als KCl,

2 • 10 “»% P als Na,HP 04 • 12 H,0,

10 “»% S als Na,S 04 • 10 H,O,

6 • 10 “«% Ca als CaCl„

10 “«% Mg als MgCl, • 6 H,0,

ö • 10“»% Fe als FeCls-

328

K. Reinhardt: Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. I.

Hierzu kamen noch folgende Spurenelemente: 10~*% Zn als
ZnS 04 , 10-8% MnalsMnS 04 und As als AsgO 3, gelöst in HCl.

Diese Konzentrationen sind nach früheren Untersuchungen {Ondratachek,
1941 e) am günstigsten.

Zu dieser Grundlösung kam zur Bestimmung der oben genannten
Grundzahlen noch ein Zusatz von Aneurin in der für den betreffenden
Organismus günstigsten Konzentration. Aus zahlreichen Bestimmungen
wurde das Mittel gezogen und etwas abgerundet, um für die Berechnung
einfache Zahlen zu besitzen

Zur Berechnung der Auswertbarkeit einzelner Kohlenstoff quellen

T • 100

wurde folgende Formel zu Hilfe genommen: = — 1 ^, — , wobei F(^

den zu bestimmenden Ertragsfaktor für Kohlenstoff, T das mit einer
bestimmten Kohlenstoff quelle erzielte Trockengewicht in mg und T'
die Acetatgrundzahl bedeutet. Bestimmt wird also, welchen Hundertteil
ein mit einer bestimmten Kohlenstoffquelle zustande gekommenes
Trockengewicht von dem mit Essigsäure erzielten ausmacht.

Ein weiterer Ertragsfaktor für Stickstoff wird in der gleichen Weise
T • 100

nach der Formel: Fy^ — — berechnet, wobei diesmal T das mit

der zu untersuchenden Stickstoff quelle erzielte Trockengewicht in mg
und T' das mit NH4NO3 erreichte bedeutet.

Zusammenfassimg.

Die vorstehenden Ausführungen geben ein Bild von der Entwicklung
des vorliegenden Forschungszweiges. Dargelegt wird, daß infolge der
in letzter Zeit festgestellten Bedeutung von Wirkstoffen für das gesamte
Ernährungsproblem alle bisherigen Ergebnisse wankend geworden sind,
so daß eine Neuuntersuchung notwendig ist. Die Bedeutung der Art der
Versuchsanstellung für das Ergebnis wurde dargelegt und die eigene
Methodik geschildert.

Aufgabe der nächsten Untersuchungen ist die Feststellung der
Bedeutung einiger Faktoren für den Kohlenstoff- und Stickstoff Wechsel.
Eine Literaturübersicht wird am Schluß der Arbeitenreihe gegeben
werden.

(Aus dem Pflanzenphysiologischen Institut der Deutschen Karls -Universität

in Prag.)

Der Stoffwechsel heterotropher Flagellaten.

II. Mitteilung:

Über die Beeinflussung der C- und N-Assimilierung durch einige Faktoren^
insbesondere durch Wirkstoffe.

Von

Karl lieinhardt.’*'

(Eingegangen am 6. August 1943.)

Die Auswertung verschiedener Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
durch, heterotrophe Flagellaten, wie auch die Art des biochemischen
Abbaus ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, ohne deren genaue
Kenntnis eine Untersuchung des Stoffwechsels nicht erfolgen kann.
Aufgabe der nachstehend zu schildernden Versuche war die nähere
Analyse dieser Faktoren. Wie bereits in der I. Mitteilung hervorgehoben
wurde, mußte hier besonders der Einfluß bestimmter Wirkstoffe unter-
sucht werden.

1. Die Bedeutung des physiologischen Zustande«.

In den letzten Jahren hat sich die Forderung nach stärkerer Berück-
sichtigung des I^benszustandes eines biologischen Versuchsmaterials
(Zellgemisches) immer mehr durchgesetzt. Wie Czurda (1935b) forderte
und in einer Reihe von Untersuchungen (1933, 1935a, 1937) auch
experimentell zeigte, bietet nur die Verwendung eines physiologisch wie
morphologisch definierten Zellzustandes Gewähr für die Erzielung
wiederholbarer Ergebnisse. Nach Czurda bezeichnen wir jenen Zustand
des Zellgemisches, der durch größte Homogenität und höchste Ver-
mehrungsfähigkeit der einzelnen Zellen gekennzeichnet ist, als den
,, Normalzustand“ des Zellgemisches. Es bedarf mitunter längerer
experimenteller Untersuchungen, um durch Veränderung der Versuchs-
bedingungen jene Umstände ausfindig zu jnachen, welche es ermöglichen,
der obigen Forderung zu entsprechen. Ist jedoch eine ,, optimale“
Nährlösung gefunden, dann gelingt es durch wiederholtes Übertragen
der Zellen in frische Nährlösung meist leicht, den geforderten Normal-
zustand zu erzielen. Der Verfasser konnte an Deamidicbc^en zeigen

* Die früheren Arbeiten des Verfassers sind unter dem Namen Ondratschek
erschienen.

330

K. Beinhardt:

{Ondratschek, 1936), auf welche Weise durch Einrichtung günstiger
Vermehrungsbedingungen das Zellgemisch einer bestimmten Art nach
wiederholten Übertragungen an Gleichförmigkeit zunimmt, wobei die
Vermehrungsintensität ständig im Steigen begriffen ist. Ein Gemisch
von Zellen, welche zu fast 100% teilungsfähig sind, bietet in morpho-
logischer Hinsicht vollkommene Homogenität. Nur jene Zellgestalten,
welche. unter diesen ,, Normalbedingungen“ entstehen, sind für die be-
treffende systematische Einheit kennzeichnend.

Betrachten wir den ganzen Vermehrungsverlauf eines Zellgemisches,
so können wir nach Gzurda drei Abschnitte unterscheiden, welche durch
den jeweiligen Zellzustand gekennzeichnet sind. Der ,, Normalzustand“
findet sich nur in einem verhältnismäßig kurzen Bereich des ansteigenden
Astes der Vermehrungskurve, und zwar nur so lange, als sämtliche
Zellen noch teilungsfähig sind. Nach Überschreiten dieses Punktes
beginnt bereits die ,, Degenerationsphase“, während welcher die Ein-
heitlichkeit des Zellgemisches immer mehr abnimmt. Diu*ch die Ver-
schlechterung der Lebensbedingungen, vor allem infolge des eigenen
Stoffwechsels, nimmt die Teilungsintensität ab, die nicht mehr in
Teilung begriffenen Zellen verändern ihre Form, es kommt zur Aus-
bildung verschiedener Zellgestalten, welche oft beträchtlich vom Normal-
zustand abweichen. Soweit die morphologische Seite der Degeneration.
In physiologischer Hinsicht sind Degenerationsstadien besonders durch
einen veränderten Stoffwechsel gekennzeichnet, das äußert sich nament-
lich in einer* Anhäufung von Reservestof fpn. Darüber hinaus bildet der
Verlust der Teilungsfähigkeit ein weiteres Merkmal. Übertragen wir
ein derart verändertes Zellgemisch in neue, frische Nährlösung günstiger
Zusammensetzung, so tritt ,, Regeneration“ ein, ein physiologischer
Vorgang, welcher die Vermehrungsintensität neuerdings ansteigen
läßt und damit das bereits degenerierte Zellgemisch in den Normal-
zustand bringt, falls die Degeneration nicht bereits zu pathologischen
Veränderungen geführt hatte. Die „Regenerationsphase“ ist ebenso
wie die oben geschilderte ,, Degenerationsphase“ durch das gleichzeitige
Auftreten uneinheitlicher Zellformen gekennzeichnet.

Die von Czurda aufgestellte Forderung nach Zugrundelegung
definierter Zellzustände für biologische Arbeiten jeder Art ist von
grundlegendster Bedeutung. Die Notwendigkeit der Beachtung des
Lebenszustandes eines Organismengeinisches ist für alle Zweige der
Biologie gegeben. Auch die nachstehenden Versuche stellen einen
weiteren Beleg für diese Forderung vor. Es kann hier gezeigt werden,
daß der Lebenszustand des untersuchten Zellgemisches von so ausschlag-
gebender Bedeutung ist, daß seine Nichtbeachtung die Gewinnung
physiologisch stichhaltiger Ergebnisse experimenteller Untersuchungen
vollkommen vereiteln kann.

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II.

331

Welche Bedeutung dem Lebenszustand eines Versuchsmaterials
für den Ausfall eines physiologischen Versuchs* zukommt, hat Czurda
bereits 1933 an Hand von Untersuchungen über die kopulations-
auslösenden Bedingungen bei Conjttgaien aufgezeigt. Hier gestattet
überhaupt nur die Verwendung eines im Normalzustand befindlichen
Individuengemisches die Auffindung ursächlicher Beziehungen zwischen
Lebenszustand und Kopulation. In Degeneration befindliche Zellen
sind niemals zur Kopulation befähigt.

Den Einfluß des Zellzustandes auf das Ergebnis ernährungsphysiologischer
Untersuchungen konnte ich erstmalig an einer Reihe mixotropher FlageUaten
und Algen zeigen (Ondraischek, 1940a, b, c), bei welchen der Einfluß des Lebens-
zustandes auf das Versuchsergebnis quantitativ erfaßt wurde. In einer eigenen
Untersuchung (Ondraiachek, 1941 d) wurden dann die als Voraussetzung für die
hier anzustellenden Versuche notwendigen Kenntnisse über die Variabilität der
zu untersuchenden Flagellaten experimentell erarbeitet. Es wurden die Be>
dingungen gesucht und gefunden, unter welchen unsere Arten im Normal-
zustand vorliegen. Die morphologischen Kennzeichen der einzelnen Arten im
Normalzustand können aus der genannten Arbeit ersehen werden. Die Bedeutung
des Lebenszustandes des zur Beimpfung ^ines Versuchs verwendeten Zell-
gemisches für die Menge der unter sonst optimalen Bedingungen gebildeten
Trockensubstanz wurde in einigen zusätzlichen Versuchsreihen aufgezeigt.

Diese Versuche wmrden hier in erweitertem Rahmen ausgebaut
und ergänzt. Als erstes waren die Beziehungen zwischen einer gegebenen
Kohlenstoffquelle und dem zu erzielenden Erntehöchstertrag zu klären.
Als Kohlenstoffquellen dienten Essigsäure, n-Buttersäure und n-Capron-
säure, beimpft wurde mit Zellgemischen im Normalzustand, mit Zellen,
die sich in Regeneration befanden, und mit in Degeneration begriffenen
Individuen. Das Ergebnis sei an Hand der Tabelle I aufgezeigt.

Tabelle I. Einfluß des Lebenszustandes auf die Höhe des Ernte-
ertrages einiger Flagellaten bei Verwendung verschiedener Mono-
carbonsäuren als Kohlenstoffquellen.

(Emteerträge in mg/250 ccm/12 Tage.)

Organismen

Bssigsäure

Kohle Dstoff quellen

n-Buttersänre TT n-Capronsäure
Lebenssustand des Impfmaterials*

Polytomdla
agilis

69,3

65,8

31,2

73,4

70,8

36,5

45,8

45,5

18,6

ChiUmoncLs
oblonga ....

99,5

94.3

21,3

115,6

109,6

26,3

56,8

48,5

11,3

Polytoma
iivella

121,3

106,2

29,7

123,2 1

120,0

26,5

68,7

57,3

6,9

Aataaia

Chattoni . . .

81,2

82,4

80,7

83,5

81,9

76,3

35,3

33,6

32.1

N »= Impfmaterial Im Normalzustand. R -* Impfmaterial in Regeneration begrilif^.
D •> Impfmaterial degeneriert (bei den einzelnen Organismen in verschieden starkem Maße).

332

K. Reinhardt:

Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, hat die Beimpfung eines Versuchs
mit in Regeneration begriffenem Zellmaterial nahezu gleich hohe
Ernteerträge zur Folge wie bei Einsaat eines Zellgemisches im Normal-
zustand, vorausgesetzt, daß die zur Verwendung gelangende Nähr-
lösung bezüglich ihrer stofflichen Zusammensetzung und der Reaktion
für den untersuchten Organismus günstig ist. Die Beimpfung der
gleichen Lösungen mit degenerierten Zellen lieferte in den meisten
Fällen bedeutend niedrigere Ernteerträge, deren Größe im einzelnen
Falle vom Grad der Degeneration des Impfmaterials abhängt. Eine
Ausnahme bildet in obiger Tabelle I Ästaaia ChatUmi und in gleicher
Weise die übrigen, hier nicht angeführten EugUninen, Wie schon früher
(OndratacJiek, 1941 d) auseinandergesetzt wurde, weisen Eugleninen
hinsichtlich der äußerlich sichtbaren Degenerationsnierkmale Besonder-
heiten auf, die bei anderen untersuchten Flagellaten nicht beobachtet
werden konnten. Zellen im Normalzustand unterscheiden sich von
solchen der Degenerationsphase nur durch ihre Reservestof farmut,
morphologische Unterschiede bestehen nicht. In den oben besprochenen
Versuchen sehen wir ein diesen Befunden entsprechendes Verhalten,
und zwar derart, daß die Beimpfung einer Nährlösung mit reserve-
stoffreichen Zellen nur einen um ein geringes niedrigeren Ernteertrag
liefert als die Verwendung eines im Normalzustand befindlichen Impf-
materials.

Um die ausschlaggebende Bedeutung des Lebenszustandes für ein
Versuchsergebnis noch deutlicher zu veranschaulichen, seien hier einige
weitere Versuchsreihen kurz erwähnt. Es wurde eine buttersäurehaltige
Nährlösung mit Zellgemischen in verschiedenen Lebenszuständen
beimpft und die Ergebnisse der Trockengewichtsbestimmungen mit
solchen von essigsäurehaltigen Kulturen verglichen. Veranschaulicht
werden die auf gezeigten Verhältnisse durch die in Tabelle II zusammen -
gestellten Zahlen.

Tabelle IL Vergleich der mittels n-Buttersäure bei Verwendung ver-
schieden vor behandeltenimpfmaterials zu erzielenden Ern teert rage.
Kontrolle: Nährlösung mit Essigsäure, beimpft mit Zellen im Normalzustand.

(Emteerträge in mg/250 ccm/12 Tage.)

Organismen

Essigsäure

n-Buttersäure

l^benssnstand des Impfmaterials

im Normal-
zustand

schwach

degeneriert

stark

degeneriert

PolytomeUa agilis

42,1

0.8

Chilomonaa obUmga

70,3

1,2

Polytoma uvdla

82,3

4,7

Astasia ChaUoni

81.4

76,2

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. H.

333

Aus Tabelle II ersehen wir unmittelbar den Zusammenhang zwischen
dem Lebenszustand des Impfmaterials und der Emtemenge. Darüber
hinaus zeigen die Versuchsergebnisse eindeutig, welche Fehlschlüsse
bei der Bewertung verschiedener Kohlenstoffquellen hinsichtlich ihrer
Eignung als einzige organische Nährstoffe entstehen können, falls der
Lebenszustand des zur Einsaat gelangten Zellgemisches nicht näher
untersucht bzw. berücksichtigt wird. So gibt z. B. Chihmcmas obUmga
mit Essigsäure gezüchtet nach 12 tägiger Versuchsdauer im genannten
Versuch einen Höchstertrag von 102,6 mg Trockensubstanz/250 ccm
Nährlösung, mit n -Buttersäure gezüchtet unter den gleichen Bedingungen
einen solchen von 114 mg/250 ccm, falls ein im Normalzustand befind-
liches Impfmaterial verwendet wird. Wird die Buttersäurelösung mit
schwach degenerierten Zellen beimpft, während bei den mit Essigsäure
angesetzten Versuchen ein im Normalzustand befindliches Zellgemisch
zur Einsaat gelangte — was bei zeitlich auseinanderliegenden Versuchen,
welche den Lebenszustand nicht beachten, leicht der Fall sein kann — ,'
so würde aus den erhaltenen Trockengewichten der Ernten unfehlbar
der Schluß gezogen werden, Buttersäure sei, da sie nur 70,3 mg/250 ccm
Trockensubstanz in 12 Tagen liefere, eine um rund 30% schlechtere
Kohlenstoffquelle für Ch. obUmga als Essigsäure mit 102,6 mg/250 ccm.
Mährend tatsächlich Buttersäure unter Berücksichtigung des Lebens-
zustandes der Essigsäure deutlich überlegen ist. Wie verhängnisvoll
die Verwendung stark degenerierter Zellen zur Beimpf ung ernährungs-
physiologischer Versuche werden kann, zeigen die in der letzten Zahlen-
reihe der Tabelle II angeführten Werte. Wir erhalten hierbei nur
1 bis 4% der Trockensubstanz, welche bei Verwendung von Zell-
gemischen im Norlnal Zustand erzielt werden.

Sämtliche untersuchten EugUnintn (in Tabelle II ist nur Ästasia
Chattoni zur Veranschaulichung angeführt) verhalten sich auch hier
wiederum gänzlich anders. Selbst mit Reservestoffen dicht erfüllte,
aus mehrere Wochen alten Kulturen entnommene Zellen lieferten nur
wenig niedrigere Ernteerträge äls Zellen im Normalzustand.

Auf Grund der be^Jirochenen Ergebnisse kann somit auch hier
festgestellt werden, daß die Forderung nach Verwendung eines streng
definierten Zellgemisclies für physiologische Zw ecke nicht nur l,heoreti6ch
berechtigt ist, sondern auch praktisch als unbedingt notwendig nach-
gewiesen wurde.

Unter Berücksichtigung des ungeheuer verwdckelten Zellstoff-
wechseTgeschehens ist ja auch leicht verständlich, daß bereits geringste
Änderungen des Lebenszustandes zahlreiche biochemische Umsetzungen
beeinflussen müssen, sei es in Form einer einfachen Ablenkung, sei es
vollständige Unterbindung einzelner Reaktionsabläufe oder Steigerung

334

K, Keinhardt:

dieser über die Norm hinaus. Wenn wir die morphologische Form und
den Reservestoffgehalt als Kennzeichen für den Lebenszustand an-
sprechen, so geschieht dies nicht etwa deshalb, weil diese Merkmale
besonders bedeutsam wären. Sie sind lediglich leicht erkennbare
äul^ere Anzeichen für, im einzelnen einstweilen noch nicht faßbare,
Änderungen der empfindlichen chemischen Umsetzungen im Zellinneren.

In einer weiteren Mitteilung dieser Reihe wird an gegebener Stelle
aufgezeigt werden, zu welchen Trugschlüssen die Außerachtlassung des
Lebenszustandes eines Impfmaterials bei ernährungsphysiologischen
Untersuchungen mitunter geführt hat. Für die eigenen Versuchsreihen
wird grundsätzlich nur im Normalzustand befindhches Impfmaterial
verwendet. Durch laufende, in kurzen Zeitabständen durchgeführte
Übertragungen von Zellaufschwemmungen der Stammkulturen konnte
dieser Forderung ohne wesentliche Belastung nachgekommen werden.

?. Die Beeinflussung des Zellzustandes und des Emteertrages
durch die Reaktion.

Die Bedeutung der Reaktion für den Verlauf und Ausfall ernährungs-
physiologischer Versuche braucht hier nicht näher erläutert zu werden,
der oft erfolgsbestimmende Einfluß der H-ionenkonzentration (ch) ist
zur Genüge bekannt. Unter Beachtung dieser Tatsache wurde ihre
Rolle für die Vermehrung heterotropher Flagellaten wiederholt untersucht,
die Angaben über den Lebensbereich verschiedener Arten stimmen bei
den meisten Autoren im allgemeinen überein. Mitunter auftretende
Unterschiede sind nur von geringer Bedeutung. Weichen die Angaben
in einzelnen Punkten stärker voneinander ab, so können diese Befunde
so gedeutet werden, daß bei der übHchen Nichtbeachtung des Lebens-
zustandes Zellgemische Vorlagen, welche verschiedene Zellzustände auf-
wiesen, möglicherweise auch verschiedenen Arten angehörten, wobei
der Artunterschied einerseits wegen der geringfügigen Abweichungen,
andererseits wegen ähnlicher Degenerationszustände, die sicher viel-
fach Vorlagen, nicht immer erkannt werden konnte.

Hier stehen außer einigen bekannten Arten auch eine Reihe erst-
malig beschriebener zur Untersuchung, so daß es notwendig ist, die
Beeinflussung des Zellgeschehens durch die Reaktion neuerdings fest-
zustellen.

ln einer vorangegangenen Mitteilung (Ondratscheh, 1941 d) wurden die hier
zu untersuchenden Arten bezüglich des Einflusses verschiedener Reaktionen
einer Nährlösung auf den Zellzustand in morphologischer wie physiologischer
Hinsicht bereits behandelt. Infolge der Bedeutung der Befunde für die hier
anzustellenden Versuche sollen sie kurz aufgezeigt werden und durch weitere
Versuche über den Einfluß der Ch auf die Trockensubstanzproduktion ergänzt
werden, wobei vorläufig nur Essigsäure als Kohlenstoffquelle zur Verwendung
gelangen soll.

Die Einrichtung bestimmter pH-Bereiche geschah, nachdem bereits früher
(1041d) Versuche mit Phosphatpuffergemisohen fehlgeschlagen waren, in der

StoifweohBel heterotropher Flagellaten. II.

335

damalß angegebenen Weise durch Zusatz einer wechselnden Anzahl von ccm
n/50 HCl oder n/50 Na OH zur Nährlösung. Es ist naturgemäß unmöglich,
einen bestimmten Anfangs -pn* Wert „einzustellen“, wie dies in der Literatur
oft angegeben wird, es gelingt lediglich durch diese Zusätze einen Wert in der
Nähe des angestrebten zu erreichen. Die Unterschiede betragen aber im all-
gemeinen nicht mehr als db 0,26 pn im Durchschnitt, und infolge dieser ver-
hältnismäßig geringen Abweichungen vom angestrebten Idealwert bestehen
keine Bedenken gegen die Verwendung derart abweichender Lösungen.

Aus den recht umfangreichen Ergebnissen der obengenannten
Untersuchung {Ortdratschek, 1941 d) seien hier nur jene hervorgehoben,
welche für die im Rahmen dieser Arbeit zu untersuchenden Fragen
von Bedeutung sind. Sie werden ergänzt durch einige neue quantitative
Befunde über die Beeinflussung der Erntemenge durch den pH-Wert.

A. Cryptomonaden,

Untersucht wurden Zellgemische, deren Heranzüchtung in Acetat-
nährlösungen mit folgenden Anfangsreaktionen erfolgte: Pk 5,2, 5,8,
6,2, 6,5 und 7,2. Die laufend durchgeführte mikroskopische Über-
prüfung des Zellaussehens zeigte, daß bei allen untersuchten Arten
der Normalzustand in einer Lösung mit p^ 6,5 am 4. bis 6. Tag nach
Beimpfung erreicht wurde. Eine Lösung mit Ph 6,2 zeigte nur geringe
Verschiedenheiten, bei pH 5,8 degenerierten hingegen die eingetragenen
Zellen bereits nach einigen Teilungen, wobei die Vermehrungsgeschwin-
digkeit rasch absank. Eine Reaktion von pn 7,2 hatte schließlich sehr
starke Degenerationserscheinungen zur Folge. Die quantitativ durch-
geführten Versuche über die Beeinflussung des Ernteertrages durch
die Reaktion ergaben ein den oben aufgezeigten Befunden entsprechendes
Bild. Einige Ergebnisse meiner Bestimmungen sind in Tabelle III
zusammengestellt. Die Zahlen bedeuten Mittelwerte aus mehreren
Bestimmungen.

Tabelle III. Einfluß der Reaktion auf die Trockensubstanzbildung
einiger Chilomonaden,

(Trockengewicht in mg/250 ccm/12 Tage.)

Arten

Ph 6.5

Ph 7-*

Chilomonas fxiramaeciurn

81.2

106.9

.53,4

Ch. obUmga

90,1

101,5

40,8

Ch. conijormiH

82,7

98,8

32,5

Ch. lonpaia

64,3

97,5

26.6

Ch . alobosa

56.6

102.3

36.9

Es ergibt sich somit, daß ein Ph von 6,5 für alle fünf untersuchten
ChilomoncLS- Arien die günstigste Reaktion darstellt sowohl was die
rasche Erreichung des Normalzustandes betrifft als auch bezüglich
der maximalen Erntemenge.

336

K. Reinhardt:

B. Volvocalen.

a) Polyblepharidineiu, Die liier angest eilten Versuche ergaben in
Verbindung mit den früher durchgeführten (1941 d) im allgemeinen
ähnliche Befunde, wie sie bei den Chüomonaden besprochen wurden.
Eine Reaktion von pu 6,5 ist in allen Fällen am günstigsten, sämtliche
Zellen stehen bei dieser Reaktion in reger Vermehrung und sind durch-
wegs im Normalzustand befindlich, p« 6,2 unterscheidet sich liezüglich
seines physiologischen Einflusses nicht von Ph 6,5, pn 5,8 hingegen
verursacht bei PolytcmelJa glolosa bereits starke Degeneration, während
P. agilis und P, caeca noch annähernd im Normalzustand verbleiben.
Ph 7,2 führt in allen Fällen sehr rasch zu starken Degenerationserschei-
nungen. Dfe Ergebnisse der hier an gestellten Trockengewichtsbestim-
mungen seien auszugsweise in Tabelle JV wiedergegeben.

Tabelle IV. Einfluß der Reaktion auf die Trockensubstanzbildung
einiger Polyhlepharidineen.

(Trockengewicht in mg/250 ccm/ 12 Tage.)

Arten

pH 5.8

Ph «.s

Ph7,2

PolyUmella agilis

69.6

71,0

46,2

P. caeca

59,3

72,2

55,0.

P. alobosa

36.5

68.5

53.1

b) Chlamydomonadineen. Die Versuche zeigten bezüglich der für
das Wachstum einzelner Polytoma- Arten optimalen Reaktion ziemliche
Verschiedenheiten. Unter Berücksichtigung gewisser gemeinsamer
Merkmale können jedoch die untersuchten 14 PolyUma- Arien in
folgende Einteilung gebracht werden:

1. Optimaler pn-Bereich um pu 7,5, gute Vermehrung zwischen
Ph 6,8 und 7,8: P. uvella, P. mujtis. P. minus^ P, coniforme, P. dorsi^
ventrale, P, cylindro/ceum und P. tetraokare.

2. Optimaler pH -Bereich um Ph 7,0, gute Vermehrung zwischen
Ph 6,5 und 7,5 : P. Pascheri, P. obtusum. und P. cavdatvm.

3. Optiöialer pn-Bereich um pn 6,5, gute Vermehrung zwischen
Ph 5,8 und 6,8 : P. ocellatum, P. angu&ium, P. curvatum und P. pa-
piUatum.

Die mikroskopische Untersuchung des Lebenszustandes der unter
den verschiedenen Versuchsbedingungen erhaltenen Zellgemische zeigte,
daß bei Gruppe I (Optimum pn 7,5) der Normalzustand zwischen pn 7,0
und 7,8 nach einigen Übertragungen des Zellgemisches sicher eintrat,
auch wenn stärker degenerierte Zellen zur Beimpfung verwendet wwden.
Zwischen pa 6,5 und 6,8 fanden sich leichte Degenerationsstadien,
jenseits von pn 7,8 oft irreversibel degenerierte Zellen. Bei Gruppe II

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II. 337

(Optimum pn 7,0) liegt der Sachverhalt ganz ähnlich. Zwischen ph 6,6
und 7,5 herrscht der Normalzustand vor, jenseits des unteren Wertes
leichte Degeneration, jenseits des oberen Wertes starke Degeneration.
Gruppe III (Optimum ph 6,5) weicht davon etwas ab. Auch Reaktionen
außerhalb des optimalen Bereiches (auf der sauren Seite) können das
eingeimpfte Zellgemisch in einer dem Normalzustand ähnlichen Be-
schaffenheit erhalten, jedoch ist die Vermehrung gering. Ein ph über 7,0
erzeugt stärkere Degenerationserscheinungen. Zellen, w^elche bei pn 7,6
oder 7,8 eingesetzt wurden, degenerierten irreversibel.

Die neuerdings durchgeführten Trockengewichtsbestimmungen
ergaben ein gleichsinniges Verhalten. Auch hier können wir die drei
genannten Gruppen feststellen, innerhalb welcher die gleichen physiolo-
gischen Verhältnisse in bezug auf die optimale Reaktion herrschen. Die
wesentlichsten Befunde werden in nachstehender Tabelle V wieder-
gegeben.

Tabelle V. Einfluß der Reaktion auf die Trockensubstanzbildung

einiger Polytomeen.

(Trockengewicht in mg;250 ccm/12 Tage.)

Arten

I. Gruppe;

Ph s.3

Polytomo. uviihi

62,4

120,3

78,9

P. maju^

32.1

100,9

21,2

P. miv US

34,4

82,3

30,9

P. c^ni forme

30,2

99,3

41,7

P. (iorsiveutralr

03,4

97,8

46,4

P. cylhidracevfn

40,8

126,1

62,8

P. teiraolmrc

43,2

98,6

26,3

11. Gruppe:

1 pH 7,0

PH 7,9

P. Paficheri

10,5

103,8

56,0

P, obtusum

97,7

122,9

87,7

P. cjiudatum

18,3

105,9

47,6

III. Gruppe;

PH 7.5

P. ocellatum

117,7

150,8

123,2

P. anguatum

81,9

101,4

64,3

F. curvatum

44,4

79.7

^16,5

P. vaviüaium

11.4

117.9

53.8

C, Eugleninen.

Züchtungsversuche mit den hier zur Untersuchung stehenden
Euglena- und Astasia- Arien bei verschiedener Reaktion der Nährlösung
ergaben in allen Fällen eine geringe Beeinflußbarkeit des Lebens-
zustandes durch die Reaktion. Wie bereits oben festgestellt wmrde,
unterscheiden sich Eugleninen bezüglich ihrer Formenvariabilität
wesentlich von allen anderen bisher untersuchten Arten. Während bei

K, Bernhardt:

ööb

anderen systematischen Einheiten in der Regel Zellen im Normal-
zustand von degenerierten verhältnismäßig leicht zu unterscheiden sind,
ändert sich bei JEttgleninen die Zellform im Laufe der Degeneration
nicht, nur der Grad des Reservestoffgehalts bietet einen Hinweis auf
den physiologischen Zustand der Zelle. In Übereinstimmung damit
konnte auch bei den hier angestellten Versuchen festgestellt werden,
daß zwar eine Lösung mit ps 6,5 durchschnittlich reservestofffreie
Zellen entstehen läßt, daß jedoch mit zunehmender Alkalität lediglich
die Reservestoffe im Innern der Zellen zunehnien, ohne daß die Zellform
beeinflußt wird. Wird die Reaktion nach der sauren Seite hin ver-
schoben, dann tritt eine als ,,Hungerdegeneration‘‘ bekannte Er-
scheinung ein.

Für die Höhe des Erntetrockengewichts ist jedoch die Reaktion
der zur Züchtung verwendeten Lösung von wesentlicher Bedeutung,
wie aus der Tabelle VI zu ersehen ist. Eine Reaktion um pn 6,5 wirkt
bei allen untersuchten Arten am günstigsten. Euglend gracilis var.
robusta und Astdsia longa vermehren sich auch bei pn 6,0 sehr gut,
A. quartana ebenso bei pu 7,0. Im allgemeinen muß festgestellt werden,
daß das pn-Optimum für die hier /untersuchten Eitglena- und Astasia-
Arten ziemlich eng begrenzt ist. Wie aus Tabelle VI zu ersehen ist,
haben verhältnismäßig geringe Reaktionsverschiebungen l)ereits einen
sehr ungünstigen Einfluß auf die Trockensnbstanzbildung.

Tabelle VI. Einfluß der Beaktion auf die Trockensubstanzbildung

einiger Eugleninen.

(Trockengewicht in mg/250 ccm/12 Tage.)

Arten

Ph 5,6

PH 6,0

PH 6,6

PH 7,6

Euglena viridis

6,5

22,3

52,1

28,6

17,5

E, gracilis

18,8

36,1

63,8

37,2

22,7

E. gracilis vor. robusta . .

37,6

75 8

81,1

57,3

23,8

Astasia longa

37,9

76,6

80,9

52,7

12,0

A. quartana

16,9

45,6

68,2

66,8

21,0

A . ChatUmi

11.2

32.7

78.9

64.3

28.2

3« Das Wirkstoff bedärfnis heterotropher Flagellaten.

Die Frage nach der „Stimulierung** der Vermehrung und des Wachstums
durch die verschiedenartigsten Stoffe hat seit jeher das Augenmerk der auf
diesem Gebiet tätigen Autoren auf sich gezogen. Bis zur jüngsten Zeit wurden
vielfach Stoffe auf ihre Wirkung hin geprüft, deren chemische Zusammen-
setzung nicht bekannt war. So wurden die verschiedensten organischen Er-
zeugnisse, wie Bierwürze oder Hefeautolysat, oder Organextrakte, wie lieber -
extrakt, und Früohteabkochungen verwendet. Die mitunter erzielte positive
Beeinflussung der Vermehrung oder des Wachstums wurde mit sehr unbestimmten
Begriffen bezeichnet, wie „stimulierend**, „anregend**, „wachstumsfOrdemd**,

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. 11.

339

„vermehrungsanregend“, „ertragssteigernd“ und ähnlichen Wortbildungen. Auf
die Unzweckmäßigkeit dieses Gebrauchs wird später noch eingegangen werden .

Erst die Fortschritte der Chemie in der Synthetisierung gewisser organischer
Verbindungen haben es ermöglicht, mit reinsten, zum Teil synthetisch her-
gestellten, vor allem aber in ihrer chemischen Struktur genau bekannten Wirk-
stoffpräparaten — besonders mit Vitaminen — an die Untersuchung der Wirkung
einer Keihe von Faktoren heran treten zu können, die teils eine bedeutende
Steigerung der Trockensubstanzbildung, teils aber überhaupt erst die Aus-
wertung chemisch einfach gebauter Energie- und Baustoff quellen durch die
verschiedenen Mikroorganismen ermöglichen.

Neben zahlreichen Untersuchungen an Bakterien (Knighi, 1933 ff.) hat vor
allem Schöpfer (1932 ff.) an verschiedenen Pilzen, insbesondere an Phycomycea,
und Nielsen (1930 ff.) an Hefe und Aspergillus wichtige Feststellungen über die
Rolle der Vermehrungsfaktoren („Wuchsstoffe“) in der Ernähr ungsphysiologic
dieser Organismen getroffen. Eine sehr übersichtliche Zusammenstellung der
bisherigen Befunde auf dem Gebiet der Wirkstofforschung, welche auch Einzel-
heiten unsere Flagellaten betreffend enthält, hat Schöpfer (1939) gegeben, eine
weitere, nach anderen Gesichtspunkten zusammengestellte Übersicht ver-
öffentlichte Janke (1939). Beide Arbeiten lassen ein näheres Eingehen auf die
bisherigen Mitteilungen, soweit sie nicht unmittelbar in den engeren Bereich
unserer Fragestellung fallen, an dieser Stelle unnötig erscheinen.

Vor einer näheren Betrachtung jener Wirkstoffe, welche für die hier zur
Untersuchung stehenden Mikroorganismen lebenswichtig sind, haben wir uns
mit der Möglichkeit einer Gliederung der unter den Begriff „Wirkstoffe“ fallenden
Substanzen zu beschäftigen. Schöpfer (1939, S. 17) gab eine solche, der ich mich
voll anschließe, und derzufolge wir alle W^irkstoffe in folgendes System bringen
können :

Wirkstoffe.

Pseudouxichstumsfaktoren: Stoffe anorganischer Natur.

Wachstumsfaktoren-. Substanzen vitaminischer Natur, greifen in den Stoff-

wechsel ein, wirken u. a. auf die Assimilierbarkeit der
Nährstoffe und den Plasmaw^uchs.

Wuchsstoffe-, Stoffe hormonartiger Natur, beemflusseii letzten

Endes auf spezifische Weise die Formbildung.

Die vorliegende Anzahl der bisherigen Untersuchungen beschäftigte sich
mit zur zweiten Gruppe gehörenden Stoffen, also mit Wachstumsfaktoren im
engeren Sinn, über deren Bedeutung für das Zellgeschehen bei Algen jedoch
noch wenig bekannt ist. Der Verfasser konnte in einer Reihe von Mitteilungen
(Ondratschek, 1940a, b, c) den Einfluß einiger Wirkstoffe, w'ie Ascorbinsäure
(Vitamin C) und Aneurin (Vitamin Bj) auf die Vermehrung mixotropher Grün-
algen nachweisen. Ascorbinsäure stellt eine vermehrungsfördemde Substanz
namentlich bei Ernährung mit Kohlensäure und anorganischen Substanzen dar,
Aneurin beeinflußt hingegen die Auswertung organischer Kohlenstoff % und
Stickstoffquellen in besonderem Maße. Die optimale Konzentration liegt im
allgemeinen mit lOOy/lOOccm Nährlösung höher, als dies z. B. bei Pilzen
der Fall ist.

Es konnte ferner auf gezeigt werden, daß die Vermehrung der untersuchten
Organismen allein von dem zur Verfügung stehenden Wirkstoff beeinflußt wird,
wenn alle Nährstoffe im Optimum vorhanden sind. Ein neuerliches Ansteigen
der Vermehrungskurve ist nur durch zusätzliche Beigabe des infolge des Ver-
brauchs ins Minimum geratenen Wirkstoffs zu erzielen.

340

K. Reinhardt:

Es zeigte sich aber auch, daß verschiedene mixotrophe Algen keines der
gebotenen Vitamine bedurften, sie vermehrten sich in einer vitaminfreien Nähr-
lösung ebenso gut wie in einer wirkstoffhaltigen. Wie nun bereits Schöpfer
(1939) auf Grund von Versuchen an Pilzen ausführte, kann das Wirkstoff-
bedürfnis als Zeichen eines Verlustes der Fähigkeit zur Selbstbildimg des be-
treffenden Wachstumsfaktors aufgefaßt werden» Es gelang mir zü zeigen, daß
das Vitaminbedürfnis gewisser Hormidium-Arten tatsächlich auf den Verlust
der Synthesefähigkeit zurückgeführt werden kann. Ein Zusatz von Extrakten
Vitamin -nichtbedürftiger Arten zu Kulturen vitamin -bedürftiger Stämme hatte
die gleiche ertragssteigernde Wirkung zur Folge wie ein Zusatz synthetischer
Vitamine, während Zusätze von Extrakten vitamin -bedürftiger Stämme keinerlei
vermehrungsfördemde Wirkung haben.

In der genannten Mitteilung habe ich bereits eingehend die Not-
wendigkeit einer schärferen sprachlichen Fassung des Einflusses von
Wirkstoffen dargelegt. In den eigenen Arbeiten wird nach folgender
Regel verfahren, deren allgemeine Anwendung vorgeschlagen wurde:

1. Ist ein Wirkstoff unumgänglich für die Vermehrung notwendig,
so daß in seiner Abwesenheit in einer sonst optimalen Nährlösung keine
Vermehrung eintritt, darf nur der Begriff ,, Wachstumsfaktor“ (im
engeren Sinne) gebraucht werden.

2. Falls der zu untersuchende Stoff eine an sich zwar vorhandene,
jedoch geringe Vermehrung bedeutend steigert, also nach dem bis-
herigen Gebrauch einen Wachstumsfaktor ,,im weiteren Sinne“ dar-
stellt, wird seine Wirkung mit ,, vermehrungsanregend“ oder ,, ertrags-
steigernd“ bezeichnet. Ersteren Begriff wende ich in Fällen an, wo
der Vermehrungs verlauf durch Bestimmung der Zeilenzahl in der
Volumeneinheit erfolgt, letzteren bei Untersuchungen, welche den
Wirkstoffeinfluß quantitativ an der erzeugten Trockensubstanzmenge
feststellen.

Der Ausdruck ,, wachst umsf ordernd“ hat nur dann seine Be-
rechtigung, wenn tatsächlich eine Zunahme des Wachstums, also der
irreversiblen Volumenzunahme der einzelnen ZeWe festgestellt wird.

Wie gleichfalls bereits früher auseinandergesetzt wurde, soll mit
dieser scharfen sprachlichen Trennung keine physiologische Unter-
schiedlichkeit festgelegt werden. Nach dem vorhin Gesagten ist die
Möglichkeit zur stufenweisen Rückbildung eines Syntheseverniögens
gegeben.

Der Einfluß chemisch definierter Wirkstoffe auf die Vermehrung hetero-
tropher Algen, sowie deren Bedeutung als Wachstumsfaktoren oder nur als
„ertragssteigernde“ Stoffe wurde bereits in vorversuchsartiger Weise von
Lwoff und seinen Mitarbeitern (1935 ff.) untersucht. Leider teilen die Autoren
ihre Ergebnisse nur in Form sehr kurzer, oft nicht zwei Seiten umfassender
Mitteilungen mit, die infolge der Kürze jegliche Einzelheiten vermissen lassen.
Obwohl die Neuartigkeit und Einmaligkeit der Ergebnisse offenkundig war,
sind für die Nachprüfung wichtige Angaben, wie Zusammensetzung der Nähr-
lösungen, Reaktion, Impfweise, Aneurinkonzentration u. a. m. nur höchst

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II.

341

unvollkommen oder meist überhaupt nicht vorhanden. Ebenso fehlen jegliche
Angaben über die Größenordnung der Ertragssteigerung. Die Verfasser geben
lediglich an, daß Aneurin bzw. dessen Bestandteile Thiazol und Pyrimidin oder
auch nur einer von beiden für den bestimmten Organismus lebensnotwendig
ist und begnügen sich mit dieser Feststellung. Über die wirksame Konzentration
des Aneurins findet sich nur eine vereinzelte Angabe, daß nämlich Pdytomella
caeca noch mit 10”® N ( ?) ihr Auskommen findet. Welche Konzentration
optimal wirkt und welche Menge bei den einzelnen Versuchen zur Lösung zu-
gesetzt wurde, bleibt unbekannt.

In Anbetracht der überragenden Bedeutung des Wirkstoffproblems
für die Ernährungsphysiologie erschien es daher unbedingt notwendig,
das Wirkstoffbedürfnis heterotropher Flagellaten eingehend zu unter-
suchen. In der Hauptsache w urden die Ergebnisse dieser Untersuchungen
bereits in einer Reihe von Mitteilungen veröffentlicht (Ondratschek,
1940d, 1941a, b, c, d), so daß hier nur wenige Ergänzungen notwendig
waren. Nachstehend sollen die wesentlichsten Befunde der genannten
Arbeiten, ergänzt durch neue Befunde, kurz besprochen werden.

Anfängliche, mit Chilomonas paramaecium durchgeführte Versuche
zeigten, daß Aneurin bereits in geringen Dosen die mit organischen
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen erzielten Ernteerträge um das
80- bis 100 fache zu steigern imstande ist. Mit Hilfe dieses Wirkstoffs
kann Ch. paramaecium. aucji anorganischen Stickstoff voll ausw^erten.
Die Bestimmung der optimalen Aneurinkonzentration ergab einen
Zusatz von 1 y Aneurin auf 100 ccm Nährlösung als besonders wirksam.
Höhere Konzentrationen haben keine weitere Ertragssteigerung zur
Folge, mit fallenden Aneurinmengen nehmen die Erträge ab, .doch ist
die Wirkung noch bei einer Verdünnung von 1 : 10 ”i 2 feststellbar.

Weitere Versuche haben gezeigt, daß Aneurin durch eine Mischung
seiner beiden Komponenten Thiazol und P^Tiniidin ersetzt werden
kann, Pyrimidin allein hat keinen Einfluß, Thiazol w'ohl eine gewisse
ertragssteigernde Wirkung, doch bleibt der erzielte Ertrag hinter dem
mit Aneurin hei vorgebrachten um rund die Hälfte zurück.

Die Versuche mit Ch. paramaecium hatten die Voraussetzung für
die Untersuchung des Wirkstoffbedürfnisses weiterer Arten gegeben.
Als nächstes erfolgte die Prüfung von vier weiteren Chilomonaden
(Ch, longata, Ch. globosa, Ch. oblonga und Ch. coniformis), sowie von
drei Polyblepharidineen (Polytomella agilis, P. caeca und P. globosa).
Auch hier konnte auf Grund der Analyse des Aneurineinflusses gezeigt
werden, daß dieses einen unbedingt lebenswichtigen Wachstumsfaktor
vorstellt. Bezüglich der optimalen Konzentration zeigten sich hiei
kleine Verschiedenheiten unter den einzelnen Arten. Während Ch. para-
maecium ein ausgesprochenes Optimum bei 10”®% Aneurin aufwies,
lieferte Ch. oblonga bei Konzentrationen zwischen 10"® und 10” 7 %
nahezu die gleichen Emteerträge, Ch. longcUa nur zwischen 10”® . und
Archiv für Mikrobiolofüe. Bd. IS. 24

342

K. Reinhardt:

während Ch, globosa und besonders Ch. coniformia wiederum
ein ausgesprochenes Optimum bei 10“®% Aneurin haben. Die drei
Polytomella-Arten liefern gleichfalls mit 10“®%) Aneurin die größten
Erträge, während jedoch eine Konzentrationsverminderung bei P, caeca
ein sofortiges Absinken der Erträge herbeiführt, bleiben die Ernten von
P. globosa und P. agilis auch bei vermindertem Aneuringehalt die
gleichen.

Aneurin kann in seiner Wirkung durch ein Pyrimidin-Thiazol-
gemisch vollständig ersetzt werden, Thiazol allein genügt den An-
sprüchen der Chilomonas- Arien zu rund 50 bei den Polyblephyridiiieen
erweist es sich allein als un^Wrksam. Pyrimidin schließlich blieb in
allen Fällen unwirksam. ChiUmonas hat also mit anderen Worten die
Fähigkeit zur Bildung von Thiazol vollständig, zür Synthese von
Pyrimidin zumindest teilweise eingebüßt, während Polytomelia zu
keiner der beiden Synthesen befähigt ist.

Es erfolgte im Anschluß die Untersuchung einer Reihe von Poly-
tomeen. Insgesamt 14 Arten, von denen einige bereits in dieser Hinsicht
von anderen Autoren behandelt worden waren, wurden auf ihr Wirkstoff-
bedürfnis hin untersucht.

Pringaheim (1937) hatte bereits die Notwendigkeit von „ Glucose karaineJ“^
für P, uvella behauptet, während Ltvoff und Dust (1937) den Einfluß von Aneurin
und seiner Komponenten auf die Vermehrung einiger Pol ytoma- Arten unter-
suchten. Ihr Ergebnis ist kurz zusammengefaßt folgendes: P. uvella und P. ob-
iuaum sind in ihrer Vermehrung von Aneurin unabhängig, P, ocellatum und
P, caudatum besitzen die Fähigkeit zur Bildung von Pyrimidin, benötigen hin-
gegen THiazol. Diese Ergebnisse wurden jedoch zumindest teilweise mit Aspa-
ragin als Stickstoffquelle gewonnen, soweit dies aus den simrlichen Angaben
der Versuchsbedingungen ersichtlich ist und wie ich wiederholt (1940d, 1941a,
b, c) gezeigt habe, besitzt selbst ein als „purriBsimum*^ bezeichnetes Präparat
einen genügend großen Wirkstoffgehalt, um die Vermehrung von gewissen
FlageUcUen — allerdings nicht allen — zu ermöglichen. Die Angaben von
Lwoff und Dust waren somit einer Nachprüfung und Neubtiarbeitung zu unter-
ziehen. Ein Wirkstoffbedürfnis ist nach meiner Ansicht erst dann eindeutig
nachzuweisen, wenn mit möglichst einfach zusammengesetzten, chemisch be-
sonders gereinigten und geprüften Präparaten an die Untersuchung heran -
getreten wird. Auf den „Wuchsstoff“ Pringaheim^ (Glucosekaramel) wird aus
diesen Gründen hier nicht näher eingegangen. Untersuchungen mit Stoffen,
deren chemische Zusammensetzung nicht nur unklar, sondern infolge der Her-
stellungsweise niemals konstant ist, können keine eindeutigen Ergebnisse
hervorbringen .

Die Untersuchung des Wirkstoffbedürfnisses der Polytomeen
stieß zunächst auf große Schwierigkeiten. Bestimmte Stämme zeigten
ein sehr starkes Abweichen vom sonstigen Verhalten. Erst nach der
Feststellung des Zinkbedarfs einiger Arten konnte dann gezeigt werden,
daß Aneurin für alle untersuchten Polytoma-Arien die Bedeutung
eines Wachstumsfaktors besitzt. Die optimale Dosis schwankt be«

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II.

343

Tabelle VII. Wirkstoffgehalt organis^cher Stickstoffquellen» Ertrags
faktoren und optimale Aneurinkonzentration.
(Zusammengestellt aus den Mitteilungen: Ondratschek, 1940d» 1941a» b, c.)

Arten

Ertragsfaktoren

Aneurin-

optimum

ln %

Asparagin

Pepton- Fotftenf

Am-

mon-

nitrat

t. r. *

ch. r. •

p.*

u. b. •

m. C.*

Chilomonas •paramaecium . .

1,77

12,3

78,2

1,04

52,5

82,1

10-«

Ch. oblonga

2,3ß

15,2

95,2

1,06

85,0

115,0

10- ‘

Ch. longata

1,89

10,3

107,1

1,02

75,6

121,5

10- •

Ch. globoaa

3,05

12,9

90,8

1,04

76,1

113,1

10*-®

Vh, coniformis

1,92

13,5

94,4

1,01

50,6

137,9

10-*

Polytomelia caeca

2,65

16,9

108,7

1,02

65,8

110,4

10-«

P. agilis

2,32

18,2

90,8

1,03

64,3

118,8

10-«

P. globosa

3,12

22,1

111,3

i;oi

56,3

139,7

10- *

Polyioma uvdla

6,70

27,1

96,9

1,06

55,5

111,0

10- “

P. ncellntum

4,85

26,0

105.8

1,04

59,5

115,2

10- »

P. anquatum

6,77 •

27,2

100,9

1,02

50,5

111,2

10-s

P. curvatum

5,87

26,8

104,0

1,05

43,4

110,0

10-»

P. majus

6,73

30,5

111,0

1,04

54,7

116,2

10-*

P. Pascher i

6,8 t

30,1

92,9

1,02

64,9

93,8

10- ‘

P. minm

5,95

28,8

118,3

1,05

50,1

99,3

10-^

P. ohtumm

7,92

27,7

92,1

1,04

54,0

105.8

10-*

P. coniforme

7,80

28,9

104,0

1,03

52,8

113,9

10-»

P. caudatum

7,66

29,3

105,4

1,06

51,7

108,2

10-«

P. t€trcu)leare

8,55

28,1

91,0

1,02

54,2

95,4

IO-“

P. dorsiventrale

8,08

27,7

97,2

1,02

53,0

127,1

10- *

P. cylindracenm

8,32

29,2

102,6

1,03

53,2

100,2

10- •

P. papillatum

8,04

29,0

98,6

1,04

57,3

105,1

10-'

Euglena viridis

1,89

1 20,6

111,6

1,03

60.0

125,6

10- “

E. ararilis

1,25

16,5

97,6

1,01

59,3

119,8

10-'

E. gracilüi var. robusta

1,65

10,9

9A,7

1,00

62,3

127,8

10- •

Astasia Umga

2,53

21,3

98,1

1,04

1 66,8

133,3

10-'

A . quarUina

2,06

20,5

93,4

1,04

59,2

131,1

10-'

A. Chnttoni

2, 16

18,9

98,2

1,03

63,3

126,7

10-4

• t. r. ^ technisch rein, eh. r. — chemisch rein, p. purissimuni. 3 mal umkristallisiert;
u. h. = unbeltandelt, in. C. « mit Carboraffin aiisBeschiittelt.

träohtlich, die jeweils günstigste Konzentration kann aus der folgenden
Tabelle VI J entnommen werden.

Weitere Versuche zeigten, daß Aneurin in 13 von 14 Fällen durch
eine Mischung seiner beiden Komponenten ersetzt werden kann, lediglich
P. mintLs verlangt das vollständige Aneurinmolekül. Thiazol hat in
einigen Fällen eine zieYnliche ertragssteigernde Wirkung (P. uvella.
P. ocelUUurn, P. ohtvsum), in anderen Fällen hat es nahezu die gleiche
Wirkung wie Aneurin (P. curvatum, P. caudaium), in weiteren Fällen
weist es überhaupt keine Wirkung auf (P. majua, P. minus), Pyrimidin
ist für P. curvatum. ebenso günstig wie Aneurin, für P. obtusum halb so
gut, in den anderen Fällen ist die Wirkung mehr oder minder gering.

344

K. Reinhardt:

Wie aus der genannten Arbeit {Cndmischek, 1941b) entnommen werden
kann, ist die Fähigkeit zur Synthese von Aneurin bzw. dessen Bestand-
teilen bei den einzelnen FolyUma- Arten in ganz verschiedener Weise
und in verschiedenem. Grade vetlorengegangen.

Hier muß noch zu einigen Widersprüchen der Ergebnisse Lwoffs
zu den eigenen Stellung genommen werden. Lwoff behauptet die
Unabhängigkeit von Polytoma uvella und P. obiusum von Aneurin. Die
Versuche wurden mit 0,4 % Asparagin als Stickstoffquelle durchgeführt.
Wie ich bereits früher zeigen konnte, bieten aber bereits 0,2 % Asparagin
genügend Wirkstoffe, um diesen beiden Arten Vermehrung zu er-
möglichen (s. auch Tabelle VII). Dieser Widerspruch erklärt sich somit
aus dem Wirkstoffgehalt des von Lwoff verwendeten Asparaginpräparats.
Lwoff stellte ferner fest, daß P. ocellatum und P. caudatum mit Thiazol
allein ihr Auslangen finden können: Die eigenen 'Versuche haben' das
im allgemeinen bestätigen können, da Lwoff aber keine quantitativen
Bestimmungen durchgeführt hat, ist es ihm entgangen, daß Thiazol in
seiner Wirkung immerhin beträchtlich hinter der des vollständigen
Atieurinmoleküls zurückbleibt. Eigene Versuche mit Thiazol ergaben
Vermehrungsfaktoren von / = 52,8 für P. ocellatum und / = 86,8 für
P. caudatum , während bei Anwendung von Aneurin die gleichen Faktoren
/ = ]07,0 und / = 102,6 betragen. In beiden Fällen ist also Aneurin
dem Thiazol deutlich überlegen und muß daher mit Recht als der
Wachstumsfaktor für beide Arten bezeichnet werden.

In ähnlicher Weise wie bei Polytomeen ist auch die Vermehrung
von Eugleninen in synthetischer Nährlösung an das Vorhandensein von
Zink gebunden. In seiner Gegenwart stellt Aneurin einen Wachstiims-
faktor für alle untersuchten Arten vor. Seine optimale Konzentration
beträgt zwischen I0~^ und 10“ Näheres ist aus der Tabelle VIII
/u entnehmen.

Aneurin ist für die Euglena-Aiten sowohl durch ein Gemisch seiner
Bausteine, als auch durch Thiazol allein voll wirksam zu ersetzen,
während Pyrimidin allein wirkungslos ist. Die A^^o^m-Arten kommen
gleichfalls mit Pyrimidin 4 Thiazol ebensogut aus wie mit dem voll-
ständigen Aneurinmolekül, mit Thiazol allein liefern sie hingegen nur
rund 50% der normalen Emtemenge. Pyrimidin allein ist unwirksam.

Wie aus den besprochenen Untersuchungsergebnissen eindeutig
ersichtlich ist, besitzt Aneurin für alle geprüften heterotrophen Flagel-
laten (bis jetzt 28 Arten) maßgebliche Bedeutung. Abgesehen von
zufällig als Verunreinigung organischer Substanzen anwesenden Wirk-
stoffen ist Aneurin in jedem Falle lebensnotirendig, also nach der
Definition ein „Wachstumsfaktor'' im engeren Sinne, ohne dessen
Vorhandensein keine Vermehrung möglich ist.

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II.

345

Tabelle Vlll. Ertragsfaktoren für Aneurin und seine Komponenten.
(Zusammengestellt nach OndraUchek^ 1940/41.)

Arten

Aneurin

Thiasol
+ Pyrimidin

Thiarol

Pyrimidin

ChilnmoTias paramaecium

98,7

99,3

51,4

7,8

Ch. dblonga

101,3

99,8

46,7

3,6

Oh. longata

108,2

102,4

52,0

5,9

Ch. globoaa

100,6

98,6

39,5

4,0

Ch. coniformis

122,6

119,8

49,8

6,9

Polytomdla caeca

128,0

129,1

1.5

P. agilie

110,8

108,6

1,4

0.9

P. globosa

110,2

112,5

1,0

1.6

Pclytoma uvdla

105,1

104.1

49,4

8,8

P. ocettaium

107,0

105.2

52,8

7.0

P. angvMum

93,8

90,3

14,5

11,6

P. curvatum

89,1

83,5

77,6

79,0

P. majua

88,6

75,7

1,8

P. Pascheri

100,9

101,3

28,9

21,5

P. minus

106,2

54,1

2,8 i

3,0

P. obtusum

98,6

101.4

63,2

58,1

P. coni forme

93,2

90,7

21,4

11,1

P. caudaium

102,6

99,5

86,8

13,4

P. tetraoleare

102,8

96,6

23,9

1.4

P, dorsiventrale

96,4

90,6

35,0

6,3

P. cylindraceum

92,4

85,6

46,6

10,8

P. papillatum

100,5

72,0

17,7

3,1

Euglena viridis

100,2

97,8

91,6

5.6

E. gracilis

118,8

120,6

117,2

4,8

E. grac. mr. robusla .

117,9

116,9

112,1

4,6

Astasia longa

115,7

119,3

59,4

1,7

A. quartana

137,0

130,6

65,0

2,0

A . Chattoni

109,9

104,0

57,9

2,0

In Tabelle VII, S. 343, sind einige Zahlen uiedergegeben, welche
einerseits die Wirkung des Aneurins auf die Trocken Substanzbildung
zeigen, andererseits die optimale Aneurinkonzentration angeben. Einige
zahlenmäßige Vergleiche der Aneurinwirkung mit der eines Thiazol-
Pyrimidingemisches bzw. der beiden Stoffe für sich sollen diesen Ab-
schnitt beschließen (Tabelle VIII).

Zur Kennzeichnung der Verhältnisse werden in den nachstehenden
Tabellen nicht die Ergebnisse der Trockengewichtsbestimmungen
direkt angegeben, sondern die aus ihnen berechneten Ertrags-
faktoren :

, _ Trockengewicht der aneurinhaltigen Kultur
Trockengewicht der aneurinfreien Kultur

weil diese Zahlen eine bessere Vergleiehsmöglichkeit gewährleisten, wie
bereits früher auseinandergesetzt wurde.

346

K. Beiabavdt:

4. Das Mineralsalzbedfirbiis boterotropher Flagellaten.

In Zusammenhang mit der Untersuchung des Wirkstoffbedürfnisses
heterotropher Flagellaten (Ondratschek^ 1940d, 1941a, b,c) konnte der
Verfasser die ersten vorläufigen Feststellungen über den Mineralsalz-
bedarf der untersuchten Arten treffen. Gleichzeitig wurde auch die
für eine maximale Trockensubstanzbildung günstigste Konzentration
der notwendigen anorganischen Nährsalze bestimmt. Im J-<aufe der
Versuche ergab sich ferner die Notwendigkeit zur Beachtung des Bedürf-
nisses an Spurenelementen, so daß schließlich die Notwendigkeit zu
einer eingehenden Untersuchung des Mineralsalz bedarf es gegeben war.
Dieses Vorhaben wurde in einer eigenen Mitteilung {Ondratschek^ 1941e)
verwirklicht. Es wurde hierbei vornehmlich der Bedarf an anorganischen
Nährstoffen untersucht und der Bedeutung der Spurenelemente nur
soweit Beachtung geschenkt, als diese nicht in Form von Verunreini-
gungen bereits in der Nährlösung vorhanden waren. Letztere Frage
wird hier einer näheren Analyse unterzogen.

Solange unsere Kenntnisse über die eigentliche Wirkung der als
Spureneiemen te‘‘ bezeichneten Stoffe noch gering sind, ist es nicht
empfehlenswert, zwischen Nähr- und Spurenelementen einen grund-
sätzlichen Unterschied zu machen. Derzeit ist eine Entscheidung
darüber, ob die nur in sehr geringer Konzentration notwendigen Elemente
zur Gruppe der Wirkstoffe (Pseudowachstumsfaktoren nach Schöpfer)
zu rechnen sind, unmöglich. Es scheint zweckmäßiger, vornächst die
Konzentration eines lebensnotwendigen Elements für die Verwendung
in dieser oder jener Beziehung nicht zu sehr zu betonen. Wenn auch
weiterhin die üblichen Begriffe „Nährelemente“ und ,, Spurenelemente“
angewendet werden, so geschieht dies nur im üblichen Sprachgebrauch
und soll lediglich sagen, daß für eine reichliche Vermehrung erstere
in viel stärkerer Konzentration vorhanden sein müssen als letztere.

Den Ansprüchen heterotropher Flagellaten an anorganischen Nähr-
stoffen war man bisher stets so nachgekommen, daß in ziemlich will-
kürlicher Weise die von Kulturversuchen bei höheren Pflanzen be-
kannten Mineralstoffe zur Nährlösung zugesetzt wurden. Vielfach
scheint man sich auch auf die zufällige, in Form von Verunreinigungen
gegebene Anwesenheit gewisser anorganischer Stoffe verlassen zu haben,
was daraus hervorgeht, daß in verschiedenen älteren Arbeiten (z. B.
Pringsheim, 1921) lediglich K 2 HPO 4 und MgS 04 zugesetzt wurde.
Ca, Fe und — falls notwendig — Spurenelemente mußten dann zwangs-
läufig bei positivem Ausfall des Züchtungsversuchs aus den genannten
Verbindungen oder Nährsalzen stammen.

In der oben erwähnten Arbeit {Ondratachek, 1941 e) wurden sämt-
liche anorganischen Nährelemente auf ihre Lebensnotwendigkeit hin

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II.

347

untersucht und erstmalig festgestellt, welche Mengen die Vermehrung
und Trockensubstanzbildung am günstigsten beeinflussen.

Die Angabe der Zusammensetzung einer Nährlösung erfolgt aus
Gründen, die in der ersten Mitteilung bereits eingehend besprochen
worden sind, in einer Form, welche nur das tatsächlich notwendige
Nährelement berücksichtigt. So wird z. B. der Phosphatgehalt einer
Nährlösung nicht mehr wie bisher üblich in % Na 2 HP 04 , sondern in
% P als Na 2 HP 04 .

Es wurden nun experimentelle Untersuchungen angestellt, bei
welchen, ausgehend von einer Nährlösung in der bisher üblichen Form,
von der die Gewißheit bestand, daß sie allen zu untersuchenden Flagel-
laten günstigste Lebensbedingungen bot, schrittw^eise ein Element um
das andere in seiner Konzentration verändert woirde.

Einzelheiten über diese Untersuchungen können in der genannten
Arbeit nachgelesen werden. Ihre Ergebnisse, ermöglichten die Zu-
sammenstellung einer Nährlösung nach den neuen Gesichtspunkten,
die sich in allen Fällen als günstig erwiesen hat und auch in dieser
Arbeitenreihe grundsätzlich verwendet wird. Die genaue Zusammen-
setzung v^nirde bereits bei der Besprechung der Art cler Versuchs -
anstellung in der ersten Mitteilung dieser Reihe gegeben.

Nach der Untersuchung der übrigen als ,, Nährelemente“ bezeich-
neten Stoffe konnte dann das Bedürfnis der Flagellaten an Elementen
näher betrachtet werden, welche wegen der geringen Mengen, die
lebensnotw'endig sind, als ,, Spurenelemente“ bezeichnet werden. Auf
technische Einzelheiten braucht hier nicht eingegangen zu w’erden. Es
sei nur festgestellt, daß nach langwierigen Vorversuchen aufgezeigt
werden konnte, daß Zusätze von Zn, Mn und As eine Lösung, die wegen
der vorausgegangenen sorgfältigen Reinigung von Spurenelementen
keine Vermehrung heterotropher Flagellaten zuläßt, zur Züchtung brauch-
bar machen. Weitere Versuche zeigten die jeweils günstigste Konzen-
tration dieser Spurenelemente auf. Es sei aber ausdrücklich be-
tont, daß damit weder absolut gültige Werte gegeben sein sollen, noch
ein Anspruch auf Vollständigkeit erhoben w^erden kann. Es besteht
immerhin die Möglichkeit, daß Elemente, die in noch geringerer Ver-
dünnung wirksam sind, bei der Reinigung der Lösungen nicht erfaßt
wurden.

Nachstehend sei eine Zusammenstellung der für die Vermehrung
der hier zur Untersuchung stehenden FlagellcUen notwendigen Spuren-
elemente sowie ihre günstigste Konzentration wiedergegeben (Ta-
belle IX). Die gemachten Angaben beziehen sich nur auf die in meinen
Versuchsreihen gegebenen Bedingungen.

348

K. Reinhardt:

Tabelle IX. Zusammenstellung der für die Vermehrung heterotropher
Flagellaten notwendigen Spurenelemente, sowie ihre günstigste

Konzentration.

(Nach OndreUschek, 1941 e.)

Arten

Zink in %

Hangan In %

Anen in %

Chilomonas pafamaecium

10-»

10- •

nicht notwendig

Ch, ohlonga

10-»

10-*

»» »»

Gh. coniformih

10-»

10-«

•* »»

Ch, longata

10-^

10- *

»» »»

Ch. glcLoaa

10~‘

10-*

♦» >>

Pclytomella cbgilis

10-*

10-»

»» »»

P, caeai

10-»

10- »

»» »♦

P. globosa

10-*

»> »»

Pclytoma uvella

10“*

lO-io

tt »9

P. minus

10“*

10-»

P, obtuaum

10- •

10--'®

P. majus

10-»

10-'

»♦ 99

P. anguatum

10-*

10-’«

99 99

P. caudatum

10- •

10-»

99 99

P. paptllatum

10- •

10-'®

99 99

P. tylindraceum

10-»

10-*

99 9*

P. ocelUUum

10- •

99 99

P. tetraoleare

10-‘

10-1®

99 99

P. Paacheri

10-»

10-'®

99 99

P. cxmiforma

10-«

10-»

99 9

P. doraiventrale

10-*

10-'®

10-“

P, curvatum

10-*

10-»

10-"

Euglena viridia

10“*

10-»

10-1®

E. gracilia

10-*

10-»

10-'®

E, grcLC, mr. robuaia

10-'

10-»

nicht notwendig

Aatasia longa

10-»

10-«

10-"

A, quartana

10-»

10“*

lO-’P

A, Chationi

10-*

10- •

10-’®

5. Bedeutimg der Reaktion für die Auswertbarkeit yersehiedener Kohlen-
stoffquellen, Beeinflussung der Trockensubstanzbildung durch die
Konzentration der Kohl^stoffquelle.

Bei der Erörterung der obigen, für die weiteren Versuche besonders
bedeutsamen Fragen müssen teilweise Ergebnisse herangezogen werden,
die erst in einer folgenden Mitteilung näher besprochen werden können.
Aus Gründen der Zweckmäßigkeit, namentlich um nicht bei der Be-
sprechung jeder einzelnen Kohlenstoffquelle neuerdings auf die Be-
deutung der Reaktion und der C-Konzentration eingehen zu müssen
und auch, weil die Ergebnisse dieser Untersuchungen ein ziemlich
gleichartiges Bild darstellen, soll hier die vorliegende Frage für sämtliche
Kohlenstoff quellen behandelt werden.

Wie einleitend aufgezeigt werden konnte, hatte ich bereits früher
jene Reaktionsbereiche festgestellt, welche bei Züchtung mit Essigsäure

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. II. 349

als Kohlenstoffquelle üppige Vermehrung ermöglichen. Weitere Ver-
suche haben dann gezeigt, daß diese Werte aueh für alle übrigen näher
untersuchten Kohlenstof fqueUen als optimal zu gelten haben. Dies war
von vornherein nicht als unbedingt sicher anzunehmen. Es hätte an
sich die Möglichkeit bestanden, daß z. B. mit steigender Zahl der Kohlen -
Stoffatome im Molekül auch eine Verschiebung des Ph- O ptimums nach
der sauren oder alkalischen Seite stattfinden könnte. Die Erklärung
wäre dann so gewesen, daß die den C-Komplex angreifenden Fermente
verschiedenes Reaktionsoptima gehabt hätten. Ich konnte aber fest-
steilen, daß in allen Fällen die für Essigsäure als besonders günstig
festgestellten Reaktionen auch für andere Kohlenstoff quellen ^treffen,
was den Schluß erlaubt, daß die Art des biochemischen Abbaus der
Kohlenstoffquellen nach einer einheitlichen Richtung erfolgt.

Nachstehend soll dieses Verhalten an einigen Beispielen kurz auf-
gezeigt werden, wobei auf die Wiedergabe umfangreicher Versuchs-
ergebnisse verzichtet werden kann, da sich, wie bereits angeführt, keine
wesentlichen Unterschiede gezeigt haben. Zur Veranschaulichung seien
Vertreter aus jeder systematischen Gruppe ausgewählt, die das gleiche
PH-Optimum haben. Folgende Arten sollen zu diesem Zwecke verwendet
werden : ChilonwndS paramaecium, Polytomella caeca, Polytoma ocehaturn
und Astasia longa ^ alle mit einem optimalen pH von 6,5. An Hand einiger
Kohlenstoffquellen sei das V'erhalten aufgezeigt (Tabelle X).

In ähnlicher Weise wie hier geschildert verhielten sich sämtliche
Arten, und zwar bei Züchtung mit anderen verwertbaren Kohlenstoff-
quellen. Es ist damit festgestellt, daß die für Essigsäure als optimal
aufgezeigten Reaktionen auch für alle anderen hier geprüften Kohlen-
stof fquellen ihre Gültigkeit haben.

Tabelle X. Einfluß der Reaktion auf die Auswertbarkeit einiger

Kohlenstof fquellen.

Angabe der Ertragsfaktoren (/c).

EsBl(i:8äure

n-Butteraäiire |

n-Caprnnsäure

PH 6,8

PH 6,6

PH 7,2

PH 6,6

PH 6.5

PH 7,3

PH 5,8

PH 6,5

PH 7,5

Chilomonas

paramaecium

81,2

100,0

63,4

85,1

119,9

65,2

75,9

99,8

48,2

Polytomella
casca

87,0

100,0

57,8

89,2

132,7

62,8

42,9

68,3

24,1

Polytoma
ocellcUum . .

78,6

100,0

81,2

82,3

112,8

101,6

60,8

98,8

75,7

Astasia longa .

82,9

100,0

68,7

97,3

125,8

85,6

81,1 j

99,9

63,6

Ein weiterer Punkt, der zweckmäßig hier vorweggenommen v'erden
soll, ist die Frage nach der günstigsten Konzentration der Kohlenstoff-

350

K. Reinhardt:

quelle. Wie wir an Essigsäure näher aufzeigen werden, kommt einer
Konzentration von 50 mg C/100 ccm der günstigste Einfluß auf den
Ernteertrag zu. Ähnliche Versuche wurden auch mit anderen Kohlen-
stoff quellen angestellt, wobei ich mich besonders mit Monocarbonsäuren
befaßte. Durchwegs erwies sich ein Gehalt von 50 mg C/100 ccm Lösung
als sehr günstig. Das gleiche Verhalten konnte dann auch für Alkohole
und einige andere Stoffe, wie Milchsäure, Brenztraubensäure, Glycerin-
aldeh 5 ^d und Dioxyaceton nachgewiesen werden. Wegen der völligen
Gleichartigkeit der Ergebnisse erübrigt sich hier eine auch nur auszugs-
weise Wiedergabe. Bei der Besprechung der Essigsäure werden einige
Zusammenstellungen gegeben, welche in ähnlicher Weise für alle anderen
Kohlenstoffquellen gelten.

Eine weitere Frage, die gleichfalls hier erörtert werden soll, ist die
nach der toxischen Konzentration der Kohlenstoffquelle. Bis zu Prova-
soli (1937) wurden willkürlich Konzentrationen von meist 0,2% an-
gewendet, Provasoli hat dann aufgezeigt, daß verschiedene der bis-
herigen negativen Ergebnisse auf diese mitunter bereits giftige Kon-
zentration zurückzuführen sind. Er setzte seine Konzentrationen
wesentlich herab, ohne aber eine Regel hierbei zi^finden. Wie meine
Versuche zeigen, besteht eine gewisse Gesetzmäßigkeit zwar insofern,
als bei sämtlichen Kohlenstoffquellen eine Konzentration von 50 mg C
pro 100 ccm Lösung optimal ist, d. h. mit anderen Worten, daß mit
steigender Kohlenstoffzahl im Molekül die optimale Molekülkonzentra-
tioh der betreffenden Kohlenstoff quelle immer geringer wird.

Es erschien ferner notwendig, auch jeweils jene Konzentration zu
bestimmen, bei welcher eingetragene Zellen sich nicht mehr teilen bzw.
nach 24 Stunden absterben. Es wurden verschiedene Versuche an-
gestellt, welche wiederum ein ziemlich gleichartiges Verhalten aller
untersuchten Organismen zeigten. Das Ergebnis war folgendes: mit

Tabelle XI. Toxische Konzentrationen der Kohlenstoffquellen.

Kohlenstoffaaellen

Anzahl der

C Atome

Tozilche Konzentration
in mg C/100 ccm

nicht bestimmbar

100

Stoffe mit gerader

0’ Anzahl

Stoffe mit ungerader

C-Anzahl

Stoffe mit iso-Bindung i

Stoffwechsel heterotropher Flagellaten. 11.

351

steigender Kohlenstoffzahl nimmt die Toxizität ziemlich gesetzmäßig
zu, wobei drei physiologische Reihen unterschieden werden können,
wie Tabelle XI zeigt.

Iso- Verbindungen mit mehr als 6 Atomen C im Molekül werden
in keinem Falle verwertet, ebenso sind iso- Verbindungen mit ungerader
C- Anzahl nicht assimilierbar.

Zusammenfassung.

Die vorliegende Arbeit bringt eine Reihe von experimentellen
Untersuchungen zur Darstellung, deren Ergebnisse erst die Durch-
führung der geplanten stoffwechselphysiologischen Untersuchungen
ermöglichen.

Die Bedeutung des physiologischen Zustandes wurde klargelegt,
der ertragsbestimmende Einfluß der Reaktion aufgezeichnet. Die
bisher bekannten Tatsachen über das Wirkstoffbedürfnis heterotropher
Flagellaten wurden zusammengestellt und durch eigene Befunde ergänzt.
Die zur Ernährung nötigen anorganischen Elemente wurden in quanti-
tativen Versuchen gesucht und gefunden. Versuche über die Bedeutung
der Reaktion für die Auswertbarkeit verschiedener Nährstoff quellen
sowie über die Beeinflussung der Trockensubstanzbildung durch die
Konzentration der Kohlenstoffquellen und deren- Toxizität schlossen
die Vor versuche ab.

Auf Grund der besprochenen Ergebnisse erfolgt jetzt die Unter-
suchung der Kohlenstoffernährung der hier behandelten Flagellaten,
deren Besprechung einer weiteren Mitteilung Vorbehalten bleibt.

Eine Literaturübersicht wird in der letzten Mitteilung dieser
Arbeitsreihe gegeben.

(Aus dem Institut für Mikrobiologie Rostock.)

Die Erblichkeit der durch Eadiumhestrahlnng
hei der Hefe ansgelösten Riesenzellbildung.

Von

R. Bauch.

Mit 8 Textabbildungen.

(Eingegangen am 21, Juli 1943,)

Die (jröße der Zellen in einer Hefe-Kultm folgt den für alle Orga-
nismen geltenden Gesetzen der Variabilität. So findet man in jeder
£fe/e- Kultur kleine, mittlere und extremgroße Zellen, über die zahlen-
mäßige Verteilung dieser drei Zellsorten orientieren variationsstatistische

Abb, 1. Kurven der Voluinina verscliiedencr AuHwerhmgSBerien von Klon 1.

A. Bei Kultur auf Bierwürzeagar.

B. Bei Kultur in flüssiger Bierwürze.

Auswertungen, bei denen Umrißzeichnungen der Zellen (mit Zeichen-
apparat bei stärkster Vergrößerung entworfen) in ihren Durchmessern
ausgemessen, die Volumina der Einzelzellen rechnerisch bestimmt und
die Einzel Volumina kurvenmäßig unter Zugrundelegung einer Klassen-

Erblichkeit der bei der Hefe auBgelösten Biesenzellbildung.

353

einteilung von je 100 Volumen werten (z. B. alle Zellen mit Werten von
61 bis 150 gehören der Klasse 100 an) zusammengestellt werden. Die
Variationskurven verschiedener Ausmessungen der Zellvolumina auf
dem gleichen Bierwürzeagar zeigen einen recht übereinstimmenden
Verlauf der Gesamtkurven und identische Lagen der Kurvengipfel
(Abb. lA). Die errechneten Zahlen werte sind innerhalb der durch die
Meßmethodik gebotenen Fehlerquellen als identisch zu bezeichnen
(Tabelle I). Der Anfangspunkt dieser Kurven gibt die Größe der eben
abgeschnürten Tochterzellen an, ihre Gipfelpunkte stellen die Größe
der heran wachsen den Zellen dar und ihr Ende zeigt die von den Zellen
unter diesen Bedingungen überhaupt erreichbare Größe an. Das Ausmaß
der Größe dieser extremen Plusab weicher wechselt von Fall zu Fall
etwas.

Tabelle I. Zahlenwerte zu den Variationskurven der Abb. 1 und 2.

Mittelwert

M±m

Streuung

Anzahl der Zellen

Abb. 1. A Kurve 1

183,7 ± 6,9

117,3

386

»»

163,1 ± 6,6

87,0

244

»»

183,3 ± 7,2

103,0

206

B „

3C8.6 db 9.6

160,7

251

>»

325,0 ± 8,9

132,0

220

»♦

338,1 ± 9,1

139,6

236

Abb. 2. Stammwürze, konz.

369,6 ± 11,6

172,3

226

»>

1:3

215,3 ± 7,4

117,4

249

1:6

19G,0± 7,0

110,7

236

Voraussetzung für eine vergleichende Auswertung derartiger
Kurven ist naturgemäß die Innehaltung der gleichen Außenbedingungen.
In Flüssigkeitskulturen, z. B. in Stammwürzelösungen von 10^ Balling,
verschieben sich die Mittelwerte etwa um das Doppelte gegenüber
Agarkulturen und die Lage der extremen Plusabweicher folgt dieser
Verschiebung in etwa dem gleichen Verhältnis (Abb. IB). Dies dürfte
ein Ausdruck der in einer Flüssigkeitskultur naturgemäß gegebenen
besseren Ernährungsverhältijisse der Einzelzellen gegenüber einer
Kultur auf festem Nährboden sein, wo der Einzelzelle nur geringe
Nährstoffmengen zur Verfügung stehen. Wieweit die Menge der Nähr-
stoffe die Größe der Zellen beeinflußt, wird aus der Abb. 2 ersichtlich,
in der eine variationsstatistische Auswertung der Zellengröße in einer
verschieden verdünnten Stammwürzelösung vorgenommen wurde.
Die Gigasrassen verhalten sich entsprechend.

Bei derartigen Auswertungen stößt man gelegentlich auf die Tat-
sache, daß einzelne Zellen unvermittelt höhere Volumenwerte zeigen
und manchmal weit über das Ende der gewohnten Plusabweicher

354

B. Bauch:

hinausgreifen können. Man bezeichnet diese Extreniformen für ge-
wöhnlich als Riesenzellen und man kennt sie wohl von allen ife/e- Arten.
In den Lehrbüchern der Gäningsphysiologie finden sie eine meist nur
recht kurze Erwähnung und über die Ursachen und Bedingungen ihrer
Entstehung ist nicht allzuviel bekannt. Die Frage, ob diese Riesen-
zellen überhaupt fortpflanzungsfähig sind und dabei ihre Größe auf
die Nachkommen vererben oder ob sie wieder den Normal typus liefern,

Abb. 2. Voluraenkurven von Klon 1 bei Kultur in verschieden verdünnter Bierwürze.

1. in Stammwürze,

2. in mit Wasser 1 : 3 verdünnter Stammw ürze,

3. in mit Wasser 1 : 6 verdünnter Stammwürze.

ist 111 . W. noch kaum angeschnitten worden. In der Sprache der Genetik
würde diese Frage lauten: „Stellen die Riesenzellen nichterbliche,
phänotypische Modifikationen dar oder handelt es sich bei ihnen um
genotypische erbliche Veränderungen ?“ Aus der allgemeinen Praxis
der Hefezüchtung heraus ergeben sich aber gewisse Anhaltspunkte,
daß es sich hierbei um nichterbliche Modifikationen handelt. Denn im
anderen Falle müßte es ja möglich sein, aus jeder Riesenzellen auf-
weisenden Kultur Rassen mit größeren Volumenwerten herauszuzüchten.
Erfahrungen dieser Art liegen anscheinend in der gärungsphysiologischen
Literatur nirgends vor und auch der zu meinen Versuchen benutzte
Klon einer Brauerei-Betriebshefe hat bei laufender, vielfacher Über-
wachung innerhalb eines Zeitraumes von 2 Jahren ni^ spontan ,, Riesen-
rassen“ geliefert.

Die Frage über die genetische Struktur der Riesenzellen ist theo-
retisch besonders wichtig im Hinblick auf die Gigasrassen, die sich
durch Behandlung der Hefe mit bestimmten chemischen Stoffen ge-
winnen lassen \Bauch, 1942 (1) (2)]. Bei diesen Gigasrassen handelt es
sich um Formen, die in ihrer Zellgröße teilweise um das Doppelte und

Erblichkeit der bei der Hefe ausgelösten Riesenzellbildung. 355

Vierfache verändert sind und die diesen Riesenwuchs auf die !^ach-
kommenschaft übertragen. Man darf diese Gigasrassen mit einem
hohen Maß von Wahrscheinlichkeit als genotypische Veränderungen,
also Mutationen, auf fassen, bei denen die Größenzunahme wahrscheinlich
auf einer Vermehrung des Chromosomenbestandes beruht. Die Stoffe,
mit denen sich die Bildung derartiger Gigasrassen auslösen läßt, gehören
zu den Wirkungsgruppen der polyploidisierenden Substanzen, den
krebserregenden Stoffen und den pflanzlichen Wuchsstoffen von Hetero-
auxincharakter. Von allen drei Stoffgruppen ist bekannt, daß sie ent-
weder an der tierischen oder pflanzlichen Zelle Veränderungen der
Chromosomenzahl durch Einwirkung bei der Zellteilung auszulösen
vermögen.

Der Genetik ist es möglich, Erbänderungen in besonders reichem
Umfang durch Bestrahlung mit Röntgen- oder Radium strahlen und
mit ultraviolettem Licht auszulösen. Es treten dabei sehr verschiedene
Arten von Mutationen auf : 1. Genmutationen, bei denen nur ein einzelner
Erbfaktor verändert ist, 2. Chromosomenmutationen, bei denen Einzel-
chromosomen in ihrer Struktur verändert sind, 3. Genommutationen,
bei denen die Zahl der Chromosomen Abweichungen zeigt. Dem-
entsprechend sollte man erwarten, daß Bestrahlung von Hefe ebenfalls
zum Auftreten neuer Rassen führt.

Bekanntlich hat Nadson (zusammenfassende Darstellungen 1933 und 1937)
mit verschiedenen Mitarbeitern durch Bestrahlung von Hefe mit Radium -
emanation verschiedene neue Rassen gewinnen können und auch bei anderen
Pilzen sich konstant erhaltende Veränderungen hervorgerufen. Seine Versuche
sind in Frankreich besonders von Lacasaagne (1939) an Hefe und von Meialnikoff
mit Mitarbeitern (1939 und 1940) bei Bakterien mit positivem Erfolg weiter-
geführt worden, und es ist der Versuch unternommen worden, die Entstehung
solcher Radiumrassen auch für technische Zwecke verwertbar zu gestalten.
Rin sehr umfangreiches Material über die Entstehung von Mutationen bei
Ascomyceten der Gattung Sordaria durch Röntgenbestrahlung hat neuerdings
Greis (1941) vorgelegt.

Der Frage des Auftretens von neuen Größenvarianten der Hefe ist
dabei verhältnismäßig wenig Aufmerksamkeit geschenkt worden.

Nadson berichtet von seiner Rasse C, entstanden durch Behandlung mit
Radiumemanation, aus der Brennereihefe XII, daß sie sehr polymorph sei und
daß „Riesengroße hier eine gewöhnliche und charakteristische ErEcheinung"' sei^
ohne aber anzugeben, ob die Zellengröße allgemein erhöht sei. Nur Lacassagne,
Schoen und B6mii4 (1939) geben kurz an, durch Radium bestrahlung bei Saccharo-
myces ellipsoideus Chambertin Rassen erhalten zu haben, die sich durch ihre
Größe von der Ausgangsrasse unterscheiden und stellen eine ausführliche
Schilderung der Morphologie ihrer Radiumrassen in Aussicht. Bei Aspergillus
niger hat Wheiden (1940) durch Bestrahlung mit Kathodenstrahlen niederer
Spannung eine Rasse als „Sektormutante** gewonnen, die sich 'durch ver-
größerte Mycelzellen, vergrößerte Konidien und schnelleres Wachstum von der
Ausgangsrasse unterscheidet. Ihren Charakter als pol yploide Gigasrass^ konnte

356

R. Bauch:

er durch Zählung der Chromosomen sicherstellen. Daß gelegentlich bei den
Pilzen ebenso wie bei den Blütenpflanzen spontan pol 3 rploide Gigasrassen auf-
treten können, machen die Beobachtungen von Sörgü (1036) an AlUmycts
Kniepii höchstwahrscheinlich. Im Zusammenhang mit den reichen Erfahrungen
der Strahlengenetik an anderen Objekten müssen wir auch für die Hefe damit
rechnen, daß Bestrahlung neben Abweichungen anderer Art die Bildung von
Gigasrassen auslösen kann.

Die aufgeworfene Fragestellung nach der genetischen Natur der
Riesenzellen und der experimentellen Auslösung von Gigasrassen erhält
aber von einer ganz anders orientierten Forschungsrichtung eine wesent-
lich veränderte Beleuchtung. Die Strahlenbiologie hat seit langem die
Hefe als leicht zu handhabendes Versuchsobjekt benutzt, um die Schädi-
gung einer Zelle durch die Bestrahlung festzustellen. Bei den Versuchen,
eine Abtötung der Hefe durch Bestrahlung durchzuführen, stellte sich
heraus, daß bei mittleren Strahlendosen nie sämtliche Zellen gleich-
mäßig abgetötet werden, sondern daß immer nur eine bestimmte Zeilen-
zahl v’^on der Schädigung betroffen wird. Die dabei gewonnenen ,, Schädi-
gungskurven** verlaufen exponentiell und diese Unstetigkeit der Strahlen-
wirkung wird von der Strahlenphysik auf die korpuskulare, quanten-
hafte Natur der Strahlung zurückgeführt. Die Abtötung selbst wird
dabei als ein Effekt eines ,, Treffers** eines Strahlenquants auf ein
Steuerungszentrum, vor allem den Kern, angesehen (Jordan, 1938).

Für unsere Gedankengänge interessiert* aus diesen biophysikalischen
Untersuchungen und (ien daraus sich ergebenden, für unsere Auffassung
des belebten Organismus höchst wichtigen theoretischen Schluß-
folgerungen nur eine Beobachtung, die mehr am Rande der dort disku-
tierten Fragen liegt. Als Primärfolge einer Bestrahlung der Hefe kommt
es zu einer leichten Hypertrophie aller Zellen, bedingt durch Änderungen
der Plasmapermeabilität (Nadson, 1922 und 1925). Neuerdings schätzen
V. Euler, Ahlström und Högberg (1942) das Ausmaß dieser Vergrößerung
auf etwa 30% des Zellvolumens. Außerdem findet sich in bestrahlten
Hefekulturen immer eine mehr oder minder große Anzahl von Zellen
von ausgesprochenem Riesenwuchs.

Nadson hat wohl als erster im Jahre 1922 auf diese Riesenzellen infolge
einer Radiumbestrahlung hingewiesen und sie für Bierhefe, Nadsonia fulvescens,
Rosahefe und Endomyces vemalis beschrieben. Bei einer Nachuntersuchung
fanden Kotzareff und Chodat (1923) bei Behandlung von Bierhefe mit Radium -
emanation Riesenzellen mit einem Durchmesser von im Mittel 13,3 p gegen 8 (x
der Normalzellen. Derartige Riesenzellen sind immer wieder bei strahlenbiologi-
Bchen Untersuchungen an Hefen und anderen Pilzen auf gef allen. Sie sind
beobachtet worden >on Holweck und Laeassagne (1930) bei Sacch, elUpsoideus
Chambertin nach Röntgenbestrahlung, von Erdmann (1934) bei der Bierhefe
nach Röntgenbestrahlung, von Oster (1934) bei Bierhefe und von Schreiber
(1939) bei Sacch» turbidans nach ultravioletter Bestrahlung, von Motida und
Adati (1939) bei Sacch, ellipsoideus II nach Röntgenbestrahlung und von Beutin
(1941) bei Torula-Arten aus Bäckereihefe nach Röntgenbestrahlung. Daß es

Erblichkeit der bei der Hefe ausgelösten Biesenzellbildung.

357

sich hierbei nicht um eine besondere Beaktion der Hefen imd verwandter
Pilze, sondern um eine allgemeine zellphysiologische Beaktionsweise handelt,
zeigen entsprechende Befunde bei anderen Organismen. So berichten Lea,
Haines und Coulson (1936) über Biesenzellen bei Bakterien nach y-Bestrahlung,
und Luria (1939) nach Behandlung mit a- imd Böntgenstrahlen. Gleiche Be-
obachtungen liegen auch für Infusorien, Flagellaten (LacasscLgne, 1934) und
für Algen [Mesotcbenium (Forssberg, 1933), Zygnema (Petrovd, 1936), GhloreUa
(Pietschmann, 1937)] vor. Diese Biesenzellen sind aber in sehr verschiedenem
Maße durch die Bestrahlung geschädigt. Manche Zellen können sich trotz ihrer
physiologischen Aktivität überhaupt nicht weiter vermehren. Sie sind in ihrer
Teilungsfähigkeit irreversibel geschädigt, obgleich sie, wie ihre Wachstumsfähig-
keit erweist, nicht völlig abgetötet sind. Andere haben in mehr oder minder
großem Ausmaße ihre Teilungsfähigkeit erhalten und bilden Kleinkolonien von
sehr verschiedener Größe. Lacass<igne(\^Z^) führt diese differenten Schädigungen
der Vermehrungsfähigkeit auf Trefferereignisse an einzelnen Zellbestandteilen,
dem Teilungszentrum oder EinzelteiJen der chromatischen Substanz oder des
Cytoplasmas zurück.

Die genetische Seite dieser als Bestrahlungsfolge auftretenden
Kiesenzellen ist von der Strahlenbiologie nur andeutungsweise gestreift
worden. Im Hinblick auf die Synthese von Gigasrassen der Hefen
durch chemische Stoffe mußte die Frage nach der Erblichkeit dieser
Riesenzellbildungen besonderes Interesse erwecken. Denn wenn auch
aus den vorher geschilderten Untersuchungen über die Entstehung
von neuen Heferassen nach Radium behandlung erbliche Änderungen
mit Sicherheit anzu nehmen sind, so spielen doch in den bisher ver-
öffentlichten Beobachtungen Riesenrassen eine ganz untergeordnete
Rolle. Dies ist besonders auffällig, w^eil die Riesenzellen anscheinend
in recht erheblicher Menge nach einer Bestrahlung gebildet werden.
Um über diese Frage ein eigenes Urteil zu gewinnen, wurden deshalb
bereits im Dezember 1941 größere Versuchsserien mit Radium bestrah -
lung durchgeführt, die im Frühjahr 1942 im wesentlichen ab-
geschlossen waren. Weitere Versuchsserien, die nur einer Überprüfung
vorher erhaltener Teilergebnisse dienten, gelangten im Winter 1943
zur Ausfühning.

Zur Methodik der Bestrah iungs versuche sei kurz, folgendes gesagt: Von
jungen, in lebhafter Sprossung befindlichen Bierwürzekulturen der Hefe —
benutzt wurde vor allem der auch für die Auslösung der Gigasrassen verwendete
Klon einer Brauereibetriebshefe, ferner die obergärige Frohberghefe des Instituts
für Gärungsgewerbe, Berlin, und je ein haploider und diploider Stamm einer
von Winge, Kopenhagen, freundlichst überlassenen PreßhefekuUur — wurden
auf Deckgläschen zwei Reihen von Tröpfchenkulturen in einem Abstande von
etwa 5 mm angelegt. Auf der Oberseite des Deckglases wurden die üblichen
röhrenförmigen Badiumelemente von 10 mg möglichst zentriert zwischen beide
Tropfenreihen angeordnet und durch Vaselintropfen in ihrer läge fixiert. Die
Bestrahlungsdaucr wurden zwischen 1 und 9 Tagen variiert. Da quantitative
Auswertungen nicht beabsichtigt waren, wurde auf eine Feststellung der zeit-
lichen Grenzwerte des Strahlungseffekt^ verzichtet. Die getroffene Versuohs-
anordnung ermöglichte sowohl die direkte Beobachtung der durch die Be-
Arehiv fttr Mlkrobioloftie. Bd. 18 .

358

R. Bauoh:

Strahlung hervorgerufenen Zellverändenmgen, gestattete aber auch, Platten-
aussaaten zur Überprüfung des weiteren Verhaltens der einzelnen Zellen an-
zulegen.

Für die Überlassung der benötigten Radiummengen bin ich den Herren
Prof. Lehmann, Chirurgische Universitätsklinik, und Prof. Haaelhorst, Univer-
sitätsfrauenklinik Rostock, zu verbindlichem Dank verpflichtet.

Die Reaktion aller verwendeten Hefestänime auf die Bestrahlung
war in allen wesentlichen Punkten gleichartig. Schon nach 24stündiger
Bestrahlung findet man in den Tröpfchenkulturen eine ganze Anzahl
von toten Zellen, deren Protoplast kontrahiert ist. Etwa gleich häufig
sind Zellen, bei denen die Schädigung unter dem Bilde der Plasmo-
ptyse verläuft. Die Zelltnembran ist meist an eüier Schmalseite der

Zelle aufgeplatzt und das
Plasma anscheinend unter
Druck nach außen getreten,
wo es noch längere Zeit als
Gerinnsel erkennbar bleibt.
Über derartige Plasmoptysen
berichten auch (1934)

nach ultravioletter Bestrah-
lung von Sctcch, iurbidans und
Motida und Adati (1939)
nach Röntgenbestrahlung von
Sacch. ellipaoideTis. Bei län-
gerer Bestrahlungsdauer fallen
gelegentlich wesentlich ver-
größerte Zellen vom Riesen -
zellcharakter auf. Die Über-
impfung der bestrahlten Hefen
auf Bierwürzeagarplatten läßt
die Differenzen des Strah-
lungseinflusses auf die einzelnen Zellen wesentlich schärfer als in den
Tröpfohenkulturen hervortreten. Auf diesen Aussaaten entwickeln sich
neben Normalkolonien von gewohnter Zellgröße die von den genannten
Autoren beschriebenen Kleinkolonien mit vergrößerten Zellen. Diese
Kleinkolonien, die ja auch für die chemisch beeinflußte Hefe charakte-
ristisch sind, treten hier in überraschend großer Zahl auf. Gegenüber der
chemischen Behandlung imterscheiden sie sich aber durch ihre sehr
verschiedene Entwicklungsfähigkeit, die alle Zwischenstadien zwischen
„kleiner gebliebenen“ Kolonien bis zu solchen, die nur mikroskopisch
erkennbar sind, umfassen. Darüber hinaus läßt die mikroskopische
Durchmusterung der Platten, am besten nach etwa dreitägigem Wachs-
tum, noch eine Fülle von Übergangsstadien zwischen nicht mehr ent-

Abl). 3. Obergärige Frohb&rg-Hefe,
Kleinkolonien aus ItieseiizeUen neben Nonnal-
kolonlen nach Badlurobeatrahlung.
Leitz-Objektiv 3, Okular 6 X. (Alle Aufnahmen
sind mit Miflex-Ck)ntax-Apparatur hergestellt und
identisch vergrößert). Veigr. 180 X.

Erbliohkeit der bei der Hefe ausgelöeten Riesenisellbildung.

359

wickiungdfähigen Einzelzellen und Kolonieanfängeri, die nur au» wenigen
Zellen bestehen, erkennen (Abb. 3). Die Fülle der verschiedenen Kolonie-
und Zelltypen läßt sich etwa in folgende Gruppen einteilen :

1. Einzel- oder Doppelzelleri (Abb. 4).

Diese können zum Teil zu recht erhel)iicher Größe anschwellen
und führen meist große Fettmengen. Sie sind keiner weiteren Ent-
wicklung fähig und bleiben noch längere Zeit auf den Platten ohne
bemerkenswerte Veränderungen liegen. Bei diesen Riesenzellen ist also
die Wachst umsfähigkeit erhalten geblieben,
ihre Teilungsfähigkeit aber irreversibel ge-
schädigt. Es ist zu vermuten, daß bei den
Doppelzellen die Teilung zwar vom Plasma
eingeleitet wird, der Kern dabei aber durch
seine Schädigung unbeteiligt bleibt.

2. Kleinkolonien aus Riesenzellen mit Ihoch-

gradig gehemmter Teilungsfähigk^it.

Bei diesem Typus der Schädigung kommt AWb. 4. obergäriRe Frohberg-mfe.
es zwar zu einer Reihe von Teilungsschritten, “sw x.

die alle wieder zu Riesenzellen führen, aber

meist erlischt, nachdem 10 bis 30 Zellen gebildet sind, die Teiluiigs-
fähigkeit und die Kleinkolonie bleibt unverändert noch längere Zeit
erhalten. Bei Abimpfungen dieser sehr kleinen Kolonietypen kam es
nie zu weiterer Entwicklung. Man möchte annehmen, daß hierbei
Schädigungen des Teilungszentrums, etwa Chromosomen undagerungen,
Rtückverluste oder Ausfall ganzer Chromosomen vorliegen, die zwar
anfänglich eine Zellteilung noch gestatten, aber durch die bei jeder
Teilung erneut auftretenden Teilungsanomalien schließlich kumulativ
zum letalen Effekt führen. Eine direkte Demonstration dieser kumula-
tiven Schädigung stellt eine seltener auf tretende Abart dieses Typus
dar. Hierbei werden Sproßbäumchen aus Riesenzellen gebildet, deren
Anfangszeilen durchaus normalen Eindruck machen, deren Endzeilen
aber — mitunter auch mittlere Zellen — unter typischen Plasmoptyse-
erscheinungen zugrunde gehen (Abb. 5). Die Schädigung macht sich
also erst an den Nachkommen der bestrahlten Zellen bemerkbar. Es
liegt hier eine auffallende Parallele zu den Erfahrungen der medizinischen
Strählentherapie über Spätfolgen der Bestrahlung vor.

HdUhusen^ der 1938 das medizinische Material einer eingehenden Be-
sprechung unterzog und auch auf analoge Befunde an pflanzlichen und tierischen
Objekten hinwies, spricht hier von einer „heredocellulären Schädigung“. Be-
sonders eindrucksvoll sind die von ihm angezogenen Regenerationsversuche
von Meserve und Kinney an bestrahlten Planarien, Geköpfte Planarien, di|^.

360

R. Bauch:

24 Stunden mit einer vier- bis zwölffachen Hauter3rthemdo8i8 von Röntgen-
strahlen behandelt waren, regenerieren anfänglich das abgetrennte Vorder-
ende ganz normal wie die unbestrahlten Kontrollen. Aber etwa vom Ende
der dritten Woche an setzt bei den mit stärkeren Dosen bestrahlten Tieren
eine Zelldegeneration im Regenerat ein, die sohheßlich zu völligem Zerfall
führt.

Beobachtungen ähnlicher Art an einzelligen Organismen liegen noch in
den Arbeiten von Petrovd (1936) an Zygnema und von Beutin (1941) an Tonda-
Arten vor. So weist Beutin darauf hin, daß die Zellen der ersten Tochter-
generation häufig stärkere Schädigungserscheinungen auf weisen als die be-
strahlten Zellen selbst. Zygnema zeigt die Latenz des schädigenden Einflusses

Abb. 6. Obergärige Frohberg-Hefe.

Plasiuoptysen der Endzelleii eines Sproßbäumchens. „Hcredocelluläre Scliädigung**.

Vergr. 590 X.

der //-Strahlen besonders eindrucksvoll. Auf geringe Strahlendosen reagiert
die Alge zunächst mit einem Aussetzen der Teilungen. Dann aber kommt der
Teilungsmechanismus wieder normal in Gang. Erst 12 bis 14 Tage nach der
Bestrahlung, nachdem bereits eine ganze Reihe von Teilungen abgelaufen sind»
erscheinen in vorher ganz gesunden Algenfäden abnormale Zellen, die teilungs-
unfähig sind.

Es liegt hier also eine ansoheinend gesetzmäßige Reaktionsweise
von allgemein-zellphysiologischer Natur vor, bei der der Ansatzpunkt
der Schädigung wohl überall identisch ist.

S. Kleinkolanien von Eiesenzeüen mit Rückschlägen zum Norvmltyjms.

Bei diesem Typus entwickeln sich anfänglich meist größere Mengen
von Riesenzellen. "Die Kolonien bleiben aber in diesem Stadium für
gewöhnlich noch unter der für das unbewaffnete Auge bemerkbaren
Größe, sind also in ihrer Teilungsintensität gehemmt. Plötzlich treten
aber Zellen von normaler Größe auf (Abb. 6) und mm ist die durch die
Bestrahlung ausgelöste Teilungshemmung überwunden. Bei genügend

Erblichkeit der bei der Hefe ausgelöeten Kiesenzellbildung.

361

langer Beobachtung können sich diese Rückschlagstypen noch nach*
träglich zu der Größe von Nommlkolonien der betreffenden Hefeart
entwickeln.

Abb. ft. Diploide Preßhefe Winge.

Bdckscblag einer Kleiiikolonic aus Hiesi'nzcllen zum Normaltyp. lieelits und links Käiid<‘r
von Norinalkolonieii. Vcrpr. 690 X.

4, Kleinkohnieu von Hiesenzelkn ohnt Eüchschläge.

Sie bestehen aus einer im einzelnen sehr verschieden großen Anzahl
von Zellen und können verzögert zu makroskopisch sichtbaren Kolonien
heran wachsen (Abb. 7 und 8).

Sie bieten dann völlig das \

gleiche Bild wie die durch .

chemische Einfl ü.s.se entstehen -
den Gigasrassen.

Von den Erfahrungen , .

ausgehend, die bei der Ent- v ' ;

stehung der Gigasrassen durch
chemische Einflüsse gewonnen

waren, mußten diese aus w *

Riesenzellen bestehenden i
Kleinkolonien des Typus 4

besonderes Interesse erwecken, a ä.ä*

zumal sie im Gegensatz zu Abb. 7. Haploide Preßhefe Winge.

Klelukolonie aus Biesenzellen, darunter Rand einer
den chemischen Induktions- Normalkolonie. Vergr. 600 X.

versuchen hier in recht erheb-
licher Anzahl auftraten. Zur Prüfung der Frage, ob durch die Radiuni-
bestrahlung tatsächlich Gigasrassen gebildet waren, wurde eine große
Anzahl von ihnen — von den verschiedenen Hefearten insgesamt ©tw^

362

R. Bauch:

100 Kolonien - abgeinipft und fortlaufend auf ihre Zellforni unter-
sucht. Eine ungewöhnlich große Anzahl der Abiinpfungen ging nicht
an, ein Zeichen für eine herabgesetzte Vitalität dieser Formen. Durch
diesen Ausfall verminderte sich die Zahl der überprüften Kulturen

auf etwa 80 Stämme. Die
übergroße Mehrzahl der
angegangenen Kulturen
überraschte schon kurz
nach dem Anwachsen
durch die Ausbildung von
Zellen ganz normaler
Größe. Der Rückschlag
zur Norm, der ja teil-
weise schon auf den Aus-
saatplatten erkennbar ge-
wesen war (Typus 3), ist
hier also ebenfalls, nur
verspätet , eingetreten .
Bei dieser Art der durch
Radiumbestrahlung aus-
gelösten Riesenzellbil-
dung liegt somit keine erbliche Veränderung, kein Mutationsvorgang,
vor. Eher könnte man diese Erscheinung dem Begriff der Dauer-
modifikation einordnen, bei dem man vorwiegend an plasmatisch be-
dingte Veränderungen, die nach einer kürzeren oder längeren Teilungs-
folge reversibel sind, denkt.

Nach Ausscheidung der sofort zum Normaltypus zurückschlagenden
Stämme blieben aber noch einige Kulturen übrig, bei denen die Ver-
größerung der Zellen längere Zeit erhalten blieb. Insgesamt handelt
es sich dabei um vier Stämme. Von diesen stand der Stamm M 342,
aus dem Klon 1 der Brauereihefe gewonnen, zeitlich am längsten unter
Beobachtung. Kr war Ende Januar 1942 isoliert worden und hatte sich
im August 1942, nachdem er etwa monatliche IJmimpfungen durch-
gemacht hatte, kurven- und zahlenmäßig einwandfrei als vergrößert
erwiesen. Eine zweite variationsstatistische Auswertung erfolgte im
Februar 1943, nachdem er also über 1 Jahr in Kultur stand. Hierbei
zeigte er gegenüber dem normalen Vergleichsstamm einen Vergrößerungs-
faktor von 1,55. IMe drei anderen Stämme waren im Dezember 1941
isoliert worden und wurden im Februar bzw. März 1942, nachdem sich
ihre Konstanz erwiesen hatte, statistisch bearbeitet. Sie erreichten
dabei ebenfalls Vergrößerungs werte zwischen 1,5 und 1,6. Leider
gingen diese Stämme im Anschluß an Feindeinwirkungen im April 1942
verloren, so daß über ihre weitere Konstanz kein Beobachtungsmaterial

Abb. 8. Klon 1 der Brauerei- BeMebihsfe.
Oben: Eand einer Normalkolonie.

Unten: Hand einer Kleinkolonlc aus Riesenätelleu.
Vergr. 690 X*

Erblichkeit der bei der Hefe auBgelöeten Riesenzellbildung.

vorliegt. Trotz des spärlichen Materials ist somit nicht zu be-
zweifeln, daß es sich bei diesen durch Radiumbestrahlung gewonnenen
Stämmen um völHge Parallelen zu den chemisch ausgelösten Gigas-
rassen handelt.

Betrachtet man die Gesamtheit dieser Befunde vom Standpunkte
der Genetik aus, so läßt sich feststellen, daß die durch Radiumbestrah-
lung an der Hefe ausgelösten Veränderungen sehr verschiedener Natur
sind. Bei den Riesenzellen des Ty-pus 1, die nicht weiter vermehrungs*-
fähig sind, wird es sich um weitgehende Zerstörungen des Teilungs-
zentrums, also des Kernes, durch Trefferereignisse handeln, wobei das
Plasma nur unwesenthch geschädigt wird und seine Wachstumsfähigkeit
behält. Beim Typus 2, bei dem eine geringe Anzahl von Teilungen unter
Bildung weiterer Riesenzellen durchgeführt werden, ist die Schädigung
des Teilungszentrums nicht so weitgehend oder nur partiell. Der Tod
der Folgezellen unter Plasmoptyseerscheinungen und das Nicht-
anwaohsen bei der Überinipfung führt zu der Annahme, daß die Schädi-
gungen durch die weiteren Zellteilungen kumuliert werden. Zur Er-
klärung dieses Typus der „heredocellulären Schädigung“ der medizini-
schen Strahlenbiologie wird man an Veränderungen an Einzelchromo-
somen oder Verlust ganzer Chromosomen denken müssen. Bei den
Typen 3 und 4, die, wie die Kulturversuche ausweisen, fließend inein-
ander übergehen, liegt bei der überwiegenden Mehrzahl der Fälle ein
Analogon zu den reversiblen Dauermodifikationen vor. Nur ein sehr
geringer Teil von ihnen behält auf längere Zeit den Riesenwuchs bei.
Sie dürften in Parallele zu den chemisch induzierten Gigasrassen mit
großer Wahrscheinlichkeit [vgl. Batich (2), S. 50ff.] als Mutationen auf-
zufassen sein.

Diese Befunde über die experimentelle Auslösung der Riesenzell-
bildung bei der Hefe erlauben einige Rückschlüsse auf die Natur der
spontan auf tretenden Riesenformen, die besonders in alternden Kulturen
zu finden sind. Diese sind ja allen bisherigen Erfahrungen zufolge nicht
erblicher Natur. Ihre besonders reichliche Bildung in gealterten Kul-
turen, bei denen schon autolytische Prozesse eingeleitet sind — Hennings
(1909, S.206), weist auf entsprechende Beobachtungen hin — , wird
man auf chemisch gesetzte Schädigungen zurüokführen können, die
eine Sprengung der normalen Korrelation zwischen Zellwachstum und
Zellteilung zur Folge haben.

Die Durchführung dieser Untersuchungen wurde durch eine Unterstützung
seitens des EeiohsforBchungsrates ermöglicht. Herrn Prof. Poppe, Rostock,
danke ich für die in seinem Institut gewährte Gastfreundschaft.

Bostock, 11. Juni 1943.

ä64 B. Bauch: Erblichkeit der bei der Hefe ausgelöeten BieBenzellbildiuig.

Literatur.

Baucht R., 1. Wochenschr. f. Brauerei Nr. 1/2, 1942 ; 2. Ber. d. Deutsch,
bot. Ges. 60, 42, 1942. — Beuiin, H., Strahlentherapie 70, 322, 1941. — Erd‘
mannt K,, Pflügers Arch. f. d. ges. Physiol. 235, 470, 1934. — v. Eulert H,,
L, AhUtröm u. B. Wigherg, Hoppe- Seylers Zeitschr. f. physiol. Chem. 277, 1,
1942. “ Forsßbergt A., Acta radiol. 14, 399, 1933. — OreiSt H,t Zeitschr. f.
Bot. 37, 1, 1941. ~ HoHhusent H., Strahlentherapie 62, 228, 1938. — Hol-
weckt E,t u. A. LacaarngnCt C. r. Soc. Biol. Paris 103, 60, 1930. — Jordant P.,
Naturwiss. 26, 637, 1938. — Kotzarefft A., u. P. Ghodatt C. r. Soc. Phys. et
Hist. nat. Geneve 40, 36, 1923. — Lacassagne, A., M. Schoen u. P. Biraudt
Ann. d. Fermentations 5, 9, 1939. — Lacasrngntt A., Badiophysiol. et Radio-
th4rap. 3, 216, 1934. — //ea, i>., P. Haines u. C. Coulsant Proc. Roy. Soc.
London (B) 123, 1, 1937. — Luriat P., C. r. Aoad. Sei. Paris 209, 604, 1939. —
Metalnihoff, 8,t A. Yakimach u. O. Yadofft 1. C. r. Acad. Sei. Paris 208, 606,
1939; 2. ebenda 208, 1092, 1939. — Metalnikofft S., u- A. Yakimacht Ann. Inst.
Pasteur 64, 47, 1940. — Motidat N., u. T. Adatit Strahlentherapie 64, 468,
1939. — Nadsont A. G.t Ann. Roentgenol. et Radiol. Pötersbourg 1, 47, 1922. -
Derseihe, Bioch. Zeitschr. 165, 381, 1926. — NadaoUtG, A,, u. E, J . Rochlint
diese Zeitschr. 4, 189, 1933; Actualit^s scient. et industr. Nr. 614, Paris 1937. —
OsteTt P. H,t Joum. gen. Physiol. 18, 71, 1934. - Retrovät J,, Beihefte Bot.
Centralbl. A 54, 370, 1936. -- Pietschmannt K., Arch. f. Mikrobiol. 8, 180, 1937,
— SehreibeTt H., Strahlentherapie 49, 641, 1934. — Sorget, O., Ges. Wiss.
Göttingen. Kachi*. a. d. Biologie 2, 156, 1936. — Whelden, P. ilf., Mycologia 82,
630, 1940.

(Aus dem Institut füi* Mikrobiologie der Universit&t Göttingen.)

Über das Verhalten einiger Mikroorganismen
gegen Pyridin.

Von

A. Kippel-Baldes^ A. Stare und W. Köhler.

(Wingegangen am 19. Juni 1943.)

Der eine von uns {A. Rijfypel) hat die Ansicht ausgesprochen, daß
die starke Resistenz der Humusstoffe gegen den Angriff der Mikro-
organismen, soweit der Stickstoffgehalt in Frage kommt, darauf beruhe,
daß der Stickstoff in diesen Stoffen heterocyklisch gebunden sei. Daß
er in dieser Form, allgemein gesehen, schwerer angreifbar ist als sonstiger
Stickstoff, kann Mohl keinem Zweifel unterliegen, wenn auch der Abbau
heterocyküscher Kohlenstoff- Stickstoff Verbindungen durch Mikro-
organismen bekannt ist; es sei nur auf die letzten Veröffentlichungen
von Buckerer über den Abbau von Nicotin verwiesen.

Es schien uns von Interesse, den einfachsten Vertreter hetero-
cyklischer Stickstoff -Kohlenstoffverbindungen mit 6 er Ring, das
Pyridin, genauer zu prüfen, das nach den Angaben in der Literatur
schwerer angreifbar zu sein scheint als kompliziertere Verbindungen
dieser Art; Literatur über das Verhalten von Mikroorganismen gegen-
über Pyridin ist in der auf diese Veröffentlichung folgenden Arbeit
von V. Horv6lh(\) angegeben. Zudem sind fast alle Angaben lediglich
qualitativer Natur, so daß sich nichts Sicheres erkennen läßt.

Wir prüften zunächst bekannte Mikroorganismen in ihrem Ver-
halten dem Pyridin gegenüber, in erster Linie Azotobakter chroococcuruy
von welchem Bakterium eine gewisse Vorliebe für aromatische Ver-
bindungen bekannt ist.

Erwähnt sei, daß sich auf Kieselsäuregallerte, die mit Natrium-
benzoat und 0,25 bis 0,2 ccm Pyridin durchtränkt und mit Boden -
körnchen geimpft war, zunächst nur Azotobaoter entwickelte, auf den
Platten mit 0,1 bis 0,2 ccm Pyridin selten und viel später einige Bakterien
(kleine Stäbchen und Kurzstäbchen, wahrscheinlich Mycohakterien oder
Proactinomyceten ) .

Tabelle I zeigt das Verhalten von Azotobacier in Mannitnährlösung
mit anorganischen Salzen, ohne gebundenen Stickstoff, bei Gegenwart
steigender Mengen von Pyridin. Man erkennt eine deutliche Förderung
durch 0,01 und 0,06 ccm Pyridin (auf 60 ccm Nährlösung), bei höheren
Gaben eine Schädigung. Der pn-Wert der Nährlösung -ist dabei nicht

^ Änderung des früheren einfachen Namens des Autors.

26 *

366

A. Kippel-Baldes, A. Stare u. W. Köhier:

Tabelle I. Stickstoffbindung von Azotobacter chroococcum bei Gegen-
wart von Pyridin.

Zugabe von Pyrfdin
Je 100 cem

mg BtweiO-Stickatoff

Zugate von Pyridin

mg EiwelO-Stiokstoff

Jo Kolben

Mittel

Jo 100 ccm

Jo Kolben

Mittel

6.48

5.48

5,48

0,10 ccm

3.78

4,46

4,12

0,01 ccm

6,77

6,91

6,84

0,20 „

3,17

3,31

3,24

9,21

10,08

9,65

N&hrlöeung: 2% Mannit, 0,08% K 2 HPO 4 , 0,05‘}„ MgS 04 , 0,6 mg°/o
Na 4 Mo 04 , 10mg% PeS 04 , 0,1% CaCOg. Ohne Agar. 60 ccm Nährlösung in
260er Erlenmeyer. Temperatur 29® C. Wachstumszeit 5 Tage. Pyridin nach
dem Sterilisieren steril zugegeben.

Tabelle II. Stickstoffbindung von Azotobacter chroococcum bei
Gegenwart von Pyridin.

Zugabe von Pyridin

Je 100 ccm

ing EiweiO-Stickatolf

Je 100 oem

1 Je Kolben

Mittel

1 Je Kolben

Mittel

Wachstumszeit 4 Tage.

Wachstumszeit 10 Tage.

10,66

20,72

10,80

10,66

20,86

20,91

10,21

21,16

0,05 ccm

11,09

0,06 ccm

16,31

12,84

12,60

16,73

16,66

13,86

16,73

0,10 „

11,63

0,10 „

15,32

12,66

12,36

16,61

16,69

12,99

16,90

Wachstumszeit 7 Tage.

Wachstumszeit 16 Tage.

17,07

18.38

17,22

18.58

18,60

17,36

18,82

0,06 ccm

17,36

0,06 com

16,61

17,66

16,78

16,76

17,66

16,90

0,10 „

16,92

0,10 ,.

16,78

17,22

17,12

16,90

1639

17,22

16,06

In den 0-Kol|;>en wurden zu diesem Zeitpunkt an G^samtstickstoff ge-
funden: 21,45 - 22,32 - 22,47 = 22,08 mg im Mittel.

Der Blind wert betrug; 1,46 mg für die unbewachsene Nährlösung und
1,68 mg für die mit B, glycinophihts bewachsene, pyridinfreie Nährlösung.

Nährlösung usw. wie in Versuch der Tabelle I, aber 0,1% Agar und ohne
CJaCO,. Ferner 0,10%

Verhalten einiger Mikroorganismen gegen Pyridin.

367

entscheidend, da 0,1 ccm Pyridin ihn nicht verändert. Tabelle II zeigt
einen ähnlichen Versuch mit etwas veränderter Nähilösung, '^vie an-
gegeben, bei 0,05 und 0,1 ccm Pyridin und verschiedener Wachstunis-
zeit. Nach 4 Tagen ist die Förderung der Stickstoffassiniilation bei
beiden Pyridingaben unverkennbar, nach 7 Tagen gleich derjenigen
der Kulturen ohne Pyridin, nach 10 Tagen haben sich die Verhältnisse
umgekehrt : Ohne Pyridin ist die Stickstoffassimilation höher, und der
Stickstoffgehalt der Pyridinkulturen ist sogar zurückgegangen. Nach
15 Tagen ist bei den Pyridinkulturen keine weitere Veränderung ein-
getreten, die Kulturen ohne Pyridin zeigen einen leichten Rückgang,
liegen aber immer noch über jenen. Per Rückgang ist offenbar auf
Autolyse zurückzuführen. Denn wegen des Vorhandenseins von Pyridin
wurde eine Eiweißbestimmung nach ßamstein vorgenominen. Die
Bestimmung des Gesamtstickstoffs nach 15 Tagen in den Kulturen ohne
Pyridin ergab einen höheren Wert, nämlich 22,08 mg gegen 18,60 mg N
an Eiweißstickstoff.

Tabelle 111 zeigt endlich, daß auch in Gegenwart Aon Pyridin-
dämpfen die gleichen geschilderten Erscheinungen auftreten.

Tabelle III. Wirkung von Pyridindämpfen auf Azotohacter
chroococcum.

368

A. Rippei*Baldei, A. Stare u. W. Köhler:

niung wurde kolorimetrisch nach Barta vorgenommen, und zwar im
Filtrat -der Eiweißbestimmung. Es wurde nicht destilliert, da etwa
vorhandenes Ammoniak in schwach saurer l^sung nicht stört. Die
Brauchbarkeit der Methode wurde vorher an reinen Lösungen aus-
probiert. Tabelle IV, in der mit je zehn Patallelkulturen gearbeitet
wurde, deren Ergebnisse im einzelnen aufgeführt sind, zeigt eindeutig,
daß die Förderung der Stickstof fassimilation durch Pyridin, die bei
Zugabe von 0,06 ccm Pyridin je 50 ccm Nährlösung außerordentlich
groß ist (nach 5 Tagen untersucht), nicht auf den Verbrauch von Pyridin
zurückzuführen ist: Die Kontrollen, ungeimpfte Kölbchen mit Nähr-
lösung + Pyridin, zeigen genau den gleichen Wert, eine geringe, durch
Verdunstung bedingte Abnahme. Auch folgende Berechnung zeigt
dies : Verschwunden sind rund 21 mg Pyridin — 3,7 mg Stickstoff,
mehr assimiliert dagegen 7,2 mg Stickstoff.

Tabelle IV. Pyridin Wirkung und Pyridinbestimniungen bei
Azotohacter chroococcum.

Kolben Nr.

Mittel ± f

mg Eiweiß- Stickstoff je Kolben

Ohne y
Pyridin j

Mit )
Pyridin- 1
dämpfen |

Mit 1
0,0ö ccm >
!^ridin )

6,99

6,87

11,92

6,70

7,37

12,69

6,22

6,28

13,22

6,76

8,30

14,04

6,06

6,68

13,72

6,19

6,93

14,12

6,90

7,26

13,85

6,81

7,00

12,69

6,22

6,79

13,90

6,32

7,12

12,12

6,01 ±0,21

7,06 ±0,47

13,22 ±0,79

Darin |
Pyridin |

28,8

30,3

27,8

33,4

23,3

26,3

29,4

30,3

29,4

28,6

28,8 ±2,8

in mg )

Un-

geimpfte

Kon-

trollen

32,8

25,0

33,4

30,3

29,4

28,6

32,3

28,6

25.0

29,4

29,4 ±3,0

mg F^ri-
din

Nährlösung usw. wie in Versuch Tabelle I, aber 0,1% Agar. Wachstums -
zeit 6 Tage.

Es ergibt sich also: Pyridin wird von Azotohacter nicht angegriffen,
aber seine Gegenwart erhöht die Schnelligkeit des Wachstums bzw.
der Stickstoffbindung, die hier gemessen wurde. Es setzt jedoch gegen
Ende des Wachstums eine schnellere Autolyse in Gegenwart von Pyridin

Verhalten einiger Mikroorganismen gegen Pyridin.

360

ein, die zur Folge hat, daß sohließlioh die Pyridinkulturen etwas gegen-
über den ohne Pyridin verbliebenen Zurückbleiben. Es ist nicht
ausgeschlossen, daß Pyridin seine fördernde Tätigkeit durch Wasser-
stoff Übertragung ausübt, was jedoch genauer untersucht werden
müßte.

Weitere Versuche wurden mit Bacillus glycinophilus angestellt,
die in Tabelle V wiedergegeben sind. Bei 0,05 ccm Pyridin, ohne Zugabe
von weiterem Stickstoff, trat kein Wachstum ein. Zusatz dieser Menge
von Pyridin zu 100 bzw. 25 mg Glykokoll bewirkte, wie die Zahlen
zeigen, keine Erhöhung der Stickstoffassimilation, sondern in beiden
Fällen eine geringe Schädigung, die besonders groß in der ersten Ent-

Tabelle V. Verhalten von Bacillus glycinophilus gegen Pyridin.

Stickstoffgabe

ll mg Biweifi-Stickstoff nach Tagen

II mg Pyridin nach Tagen

0,58

10,88

17,37

100 mg Glykokoll 1

2,86

8,10

16,84

-f 0,06 ccm Pyridin |

6,72

8,26

14,80

0.36

12,12

16,11

Mittel :

2,63

9,82

15,78

23,6

Pjrridi

ngehalt der un-

} 30

geimpften Kontrollen

1,83

14,48

16,13

100 mg Glykokoll j

10,29

16,04

7,13

14,67

16,57

16,42

0,68

16,66

16,29

Mittel:

6,44

12,99

16,36

0,96

3,29

26 mg Glykokoll |

0,70

3,00

-f 0,06 com Pyridin |

3,31

2,29

3,36

2,00

Mittel:

2,06

2,66

Pyridi]

ngehalt der un-

geimpften Kontrollen

3,47

2,86

26 mg Glykokoll j

4,01

3,14

2,99

4,01

3,21

Mittel:

3,66

3,01

Nährlösung: 1,0% Glykoee, 0.4% KH,P 04 , 0,2% K*HP 04 , 0,01%
MgS 04 , 0,005% FeSO^* pn 6,3. Ohne Agar-Zusatz. öOoom in 250er Erlen-
meyerkölbohen. Temperatur 37® C . Pyridin nach dem Sterilisieren steril zu-
gegeben.

370

A. Rippel-Baldes, A. Stare u. W. Köhler:

Wicklung nach 4 Tagen ist^. Die ebenfalls aufgeführten Pyiidin-
bestimmungen zeigen auch hier keinen Unterschied zwischen den
geimpften und ungeimpften Kontrollen. Der Versuch wurde noch
so abgeändert (Tabelle VI), daß die Kolben fest mit. Gummistopfen
verschlossen wurden, uni die Verdunstung des Pyridins zu verhindern.
Man sieht, daß das Bild das gleiche geblieben ist; d^ Pyridin wurde
sowohl in den geimpften wie in den ungeimpften Kulturen quantitativ
iviedergefunden .

Tabelle VI. Verhalten von Bacillus glycinophilus gegen Pyridin.

Verhalten einiger Mikroorganismen gegen Pyridin. 371

Tabelle VII. Verhalten verschiedener Pilze gegen Pyridin.

Trichoderma viridis
imcb Tagen

1 8 I iT

mg Eiweiß-Stickstoff je Kolben.

500 mg Kalium- 1
nitrat |

21.07

29.86

13,09

2,10

11,24

18,64

8,03

47,67

i 36,45

26.00

32.47

14,96

4,40

9,49

16,37

9,10

37,87

34,43

28.04

32.41

5.02

11,24

6.22

41,25

Mittel :

24,90

31,46

14,03

3,84

10,66

17,65

7,78

42,26

36,64

500 mg Kalium- |

20.46

31,39

14,38

4,49

11,83

13,21

4,64

27,08

39,62

nitrat -f- 0,05 ccm .

24,39

36,19

13,68

3,46

18,69

16,33

6,41

29,34

42,92

Pyridin 1

19.12

39,08

3,13

16,64

—

6,63

29,61

—

Mittel :

21,32

35,22

13,96

3,69

16,72

14,72

5,83

28.68

41,17

j Pyridin je !

Kolben

[ bei Versuchsende.

500 mg Kalium- |
nitrat + 0,06 ccm 1
Pyridin; geimpfte |
Kultur ‘

36 ;

Mittel:

37 ’

Ungeimpfte Kon- 1
trolle j

j)H-Wert bei Versuchsende.

500 mg Kalium- )
nitrat |

1 ö,3

6.7

6,8

6,2

4,6

7.8

4,4

7.1

7,8

600 mg Kalium- 1
nitrat -f 0,05 ccm
Pjridin 1

I 5,7

6,8 .

6,8

6,1

4,3

7,8

4,4

5,6

8.2

In Kolben mit Pyridin ohne Kaliumnitrat kein Wachstum.

Nährlösung: 5,0% Glykose, 0,6% KH,P04, 0,06% MgSO*, 0,05% NaCl,
FeS04, ZnS04 und CUSO4 Spuren, pn 4,6. Pyridin nach dem Sterilisieren
steril zugesetzt. 60 ccm Nährlösung in 260er Erlenmeyerkölbchen. Tem-
peratur 30® C.

des Pyridins bei den geimpften im Vergleich zu den ungeimpften Kulturen
scheint auf eine gewisse Assimilation des Pyridins hinzudeuten. In-
dessen beträgt diese Abnahme im höchsten Falle 9 mg Pyridin, was
einer Stickstoff menge von rund 1,6 mg N entspricht, während die
scheinbare Zunahme des assimilierten Stickstoffs 4 bis 6,5 mg N beträgt.
Es ist daraus zu schließen, daß eine Assimilation des Pyridinstickstoffs
kaum stattgefunden hat; die beobachteten scheinbaren Förderungen
müssen auf unkontrollierbare Schwankungen zurückgeführt werden.
Eine wirkliche Ausnützung des Pyridinstickstoffs hätte einen ganz
anderen Ausschlag ergeben müssen.

Demgegenüber lag die anfängliche Förderung der Stiokstoffbindung
von Azotobacter durch Pyridin ganz anders; sie war zwar ebenfalls

Fusarium spee.

nach Tagen
3 I H I 18

372 A. Rippel-Baldes, A. Staro u. W. Köhler: Mikrooiganiemen ubw.

nicht erheblich, trat aber so völlig regelmäßig auf, daß an ihrem tat-
sächlichen Bestehen kein Zweifel sdin kann. Nach den mit den übrigen
Mikroorganismen gemachten Erfahrungen muß man danach annehmen,
daß eine Wasserstoffübertragung des Pyridins, falls dessen Wirkung
wirklich darauf zurückzuführen wäre, sich unmittelbar auf die Bindung
des elementaren Luftstickstoffs auswirkt. Pyridin als Wasserstoff-
überträger würde nach der diesbezüglichen Rolle des Pyridinkernes,
z. B. in der Cozymase, auch durchaus möglich erscheinen.

Zusammenfassung.

Die geprüften Bakterien {Azotobacter chroococcum, Bacillus glycino-
philus) und Pilze {Aspergillus niger^ Trichoderma viridis und Fusarium
spec.) vermögen Pyridin nicht als Stickstoffquelle zu verwerten, wie
die quantitative Pyridinbilanz zeigte.

Doch wird die anfängliche Enti^dcklung von Azotobacter durch
Gegenwart von Pyridin beschleunigt, es tritt jedoch eine frühere Aiito-
lyse ein. Insgesamt wird die Stickstoffbindung nicht beeinflußt. Es
wäre zu prüfen, ob Pyridin bei diesem Organismus als Wasserstoff-
überträger wirkt.

Literatur.

A. Rippd, Blanehs Handb. d. Bodenlehre 8, 658, Berlin, Springer, 1931,
1. Ergänzungsband, S. 569. — DtrseUbe, Forsobungsdienst, ^nderheft 17,

54, 1941.

Weitere Literatur ist in der nachfolgenden Arbeit von J, v. Horvdth an-
gegeben.

(Aus dem Institut für Mikrobiologie der Universität Göttingen.)

Beitrag zur Kenntnis des mikrobiellen Abbaus
von Pyridin.

Von

J. V. Horv&th (Kolozsvär).

Mit 2 Textabbildungen.

(Eingegangen am 19, Juni 1943.)

Ini Anschluß an die in der vorstehenden Arbeit geschilderten
Versuche von A. Rippel- Baldes und Mitarbeitern hatte ich mir die
Aufgabe gestellt, einen Mikroorganismus aus Boden zu isolieren, der
befähigt ist, Pyridin zu zersetzen. Ini folgenden berichte ich über
eine dabei aufgefundene Proaciinomyces- Axt.

Daß Pyridin, wie auch andere heterocyclische Koh lenstoff -Stickstoff -
Verbindungen, von Mikroorganismen abgebaut werden können, wurde wiederholt
beschrieben; jedoch wurde meist keine genauere Beschreibung der wirksamen
Mikroorganismen gegeben. Rüssel und seine Schüler prüften hauptsächlich
vom Gesichtspunkt der partiellen Sterilisation des Bodens aus eine Beihe von
Verbindungen und verwendeten außer Pyridin noch Dimethylpyridin (Lutidin)
und Trimethylpyridin (Collidin). Nach der partiellen Sterilisation des Bodens
mit diesen Stoffen erfolgte eine starke Vermehrung der Bakterien. Ähnliche
Versuche stellte Robbins an ; auch er fand nach der partiellen SteriÜsation des
Bodens mit Pyridin starke Bakterienvermehrung und züchtete auf Browii&chem
Albuminagar Bakterien, die die Fähigkeit besaßen, Pyridin abzubauen. Aller-
dings gibt er keine weitere Beschreibung dieser Organismen und verzichtet
überhaupt auf die Gewinnung absoluter Reinkulturen. Weitere Autoren (Barthelf
Ehrlich. Funckes. Jewson und Tatterfield, Meyerhof) stellten ebenfalls Abbau
von Pyridin durch Mikroorganismen fest und geben an, daß Mikroorganismen
in Gegenwart von Pyridin am Leben blieben.

Den Dooren de Jong prüfte (Tabelle XX) in einer Nährlösung mit 5%
Pyridin (Leitungswasser, dazu noch l®o MgS 04 und' 0,1® „ KCl) zahlreiche
bekannte Arten von Bodenbakterien (Pseudomonas-, Mycobacterium- und andere
Stämme) auf ihre Fähigkeit, Pyridin abbauen zu können, ohne jeden Erfolg.
In Tabelle IX wird jedoch für B. aerogenes und B. herbicola deutlicher, für
B. prodigiosum schwächerer Abbau von Pyridin angegeben, allerdings in anders
zusammengesetzter Nährlösung mit nur 0,1% Pyridin. Indessen sind die
Versuche auch nur qualitativer Natur.

So läßt sich also nichts Sicheres über pyridinab bau ende Mikro-
organismen aussagen, und weitere Versuche waren erwünscht. Es
gelang nun auf folgende Weise, pyridinabbauende Mikroorganismen zu
gewinnen :

Auf Grund der Versuche von Robbins, Buckerer , Den Dooren de Jong stellte
ich eine Nährlösung zusammen, die enthielt: 0,1% K,HP 04 , 0,04^„ MgS 04 ,
Archiv ffir Mikrobiologie. Bd. 13.

374

J. V. HorvÄth :

0,004 reS04, aufgelöst in 100 com Göttinger bzw. später in Kolozsvarer
Leitungswasser. Als einzige Stickstoff- und Kohlenstoff quelle wurde 0,2%
Pyridin gegeben. Das Göttinger Leitungswasser enthält keinen Stickstoff,
während das dest. Wasser stets Spuren enthält; das Kolozsvarer Leitungswasser
enthält die minimale Menge von 0,008% Stickstoff in Form von Kitrat. Die
so bereitete Nährlösung wurde in 250er Erlenmeyerkolben, bei 50 ccm Nähr-
lösung, im Autoklaven bei 1,5 Atm. Druck sterilisiert und mit Boden aus dem
Garten des (TÖttinger Instituts geimpft. Die Kolben wurden im Thennostaten
bei 30® C aufgestellt.

Nach .5 bis 6 Tagen konnte ein Abbau des Pyridins festgestellt
werden: die Nährlösung ergab starke Reaktion mit Nesslers Reagens
auf Ammoniak. Die Kultur wurde nun alle 6 Tage in gleiche Nühr-

Abb. 1. Proaetinomyces roseus,
jnnRes Mycel. Vergr.

•■‘V.

Abb 2. PrnactinomyceF roneutt, ;iIt<Mps,
l\okk(*i»Rtadiiini. Vrrgr. (i4().

lösung übejgeimpft, und diese Behandlung sechsmal wiederholt. Aus
der letzten t'berimpfung brachte ich 1 ccm, mit sterilem Leitungswasser
zehnfach verdünnt, in Pyridin-Agar, der aus der gleichen ei wähnten
Nährlösung -f- 2 Agar bereitet war (vgl. Buckerer).

Auf dem l^yridin-Agar entwickelte sich in der Mehrzahl der Fälle
ein Mikroorganismus, der nach dem iCocÄ sehen Plattenverfahren rein-
gezüchtet wurde und nach morphologischer und physiologischer Prüfung
unter Berücksichtigung der Arbeiten von Jensen, Krassilnikov und
V. Plotho als zu den Proactinoniycetes gehörig erwies. Von dieser neuen
Art gebe ich folgende Charakterisierung:

Proactinornyces roseus nov. S'pec.

Das mikroskopische Bild des auf Gelatine oder Agar gezüchteten
Organismus ist folgendes: In den frisch übergeimpften Kulturen zeigt
sich nach 4 bis 5 Tagen ein winziges Mycel (s. Abb. 1). Dieses zerfällt
von da ab in kleine Stäbchen und Kokken (s. Abb. 2). Das ganze Bild
unterscheidet sich nicht von den durch v. Plotho untersuchten Pro-
actinonhyce8-¥oTmen. Die Mycelien bleiben länger erhalten auf Jensen-
schem Dextrose-Phosphat-Nährboden (1 Glykose, 0,2% (NH 4 )HP 04 ,

Kenntnit} des mikrobiellen Abbaus von Pyridin.

375

0,1 K 2 hP 04 , MgS 04 , 0,05% Na CI in dest. Wasser. Wenn

noch Eisensulfat in Spuren hinzugegeben wurde, bleiben die Mycelien
10 bis 12 Tage bestehen.

Die kleinen Enden ^ haben 0,7 bis 0,8 (jl Dreite und 7 bis 14 p Länge.

Eigen beweguiig ist nicht vorhanden.

Färbbarkeit: Aiisgespiochen gram positiv. Mit den üblichen Anilin-
farben leicht färbbar, dabei sind häufig j^erlschnurartig angeordnete
,, Granula“ zu sehen. Sie stellen offenbar den lleginn der Kokken-
bildung dar. Aus je einer , .Granula“ entsteht je ein Coccus (s. Abb. 2).

Säurefestigkeit : Nach r. Ploiho mit n Schwefelsäure behandelt
wird völlig entfärbt, bei Behandlung mit n Essigsäure und n/IOO Schwefel-
säure verbleibt nur schwache diffuse Färbung.

Der Organismus ist ausgesprochen aerob.

Auf den ge\^ öhnlichen Nährböden erfolgt gutes Wachstum.

(ielatineplatte: Keine Verflüssigung. Die Kolonien wachsen bei
20<^ C langsam. Sie sind kreisrund und erhaben, ältere Kolonien zeigen
jedoch unregelmäßige Formen. Die Oberfläche ist feucht und glatt, die
Farbe der Kolonie schinutzigweiß.

(Gelatine- Stich : Keine Verflüssigung. Die Farbe der Kolonie ist
schmutzig weiß. Wachstum jedoch nur im obersten Teil des Stich-
kanals, was bei dem ausgesprochen aeroben Wachstum erklärlich ist.

Gelatine- Strich: Keine Verflüssigung. Farbe schmutzigweiß.

Glykose- Agar-Platte: Bei 30^0 reichliches Kolonie wachst um.
Kolonien kreisrund, erhaben, mit glatter Oberfläche. Bei Dunkelkultur
ist die Farbe der Kolonien gelbweiß, bei normalem Licht gezüchtet
blaßrosa. Das Substrat wird niemals gefärbt.

Glykose-Agar- Stich : ln der Stichröhre kein Wachstum, nur in der
Nähe der Stichöffnung, hier aber so üppig, daß die Öffnung sich trichter-
förmig senkt und die Kolonien bald zusammenfließen. Farbe charak-
teristisch blaßro.sa wie bei der Glykose- Agar-Platte.

Glykose- Agar- Strich: Die Kolonien sind anfangs erhaben und
kreisrund, verschmolzen aber bald. Farbe ebenfalls blaßrosa wde bei
der Glyköse- Agar-Platte.

Glycerin-Agar-Platte: Intensiver Kolonien Wachstum. Kolonie aus-
gesprochen erhaben, kreisrund, mit glatter Oberfläche. Die Farbe ist
ein wenig lebhafter rosarot als bei Glykose-Agar.

Glykose-Phosphat-Agar-Platte nach Jeiisen: Form der Kolonien
wie bei den vorhergehenden. Farbe cremeartig, w^eicht also von der auf
den vorher beschriebenen Nährböden ab. Wahrscheinlich beeinflußt
das dem Nährboden zugesetzte Eisen die Farbe.

^ Wenn Buch&re/r (2) von seinem BacUrium nicotianum sagt, daß es manch
mal „Fäden"' bilde, so wäre, falls es sich um eine Reinkultur handelt, zu prüfen,
ob nicht eine ProacHnomyees- oder Myooha-cterium- Art vorliegt.

376

J. V. Horvath:

Bouillon : Bei SO® C auf der Nährlösung deutliche Häutchenbildung,
am Grund der Nährlösung geringer, schwach fadenziehender Bodensatz.

Milch: Optimales Wachstum. Keine Pe]>t()nisierimg oder Koa-
gulation.

Lackmus-Milch: Rötliche Färbung.

Glykose, Saccharose, Mannit, Glj^cerin: Gutes Wachstum, starke
diffuse Trübung der Kulturflüssigkeit.

Säure- und Alkalibildung: Neutralem Glykose- Agar wurde Kongo-
rot, Lackmusblau und Chinablau zugesetzt. Die durch die Verfärbung
kenntliche Säurebildung war gering, die pH*Wei*te betrugen 6 bis 6,2
und blieben während mehrerer Wochen konstant.

Versuche über den Abbau des Pyiidins.

Auf Pyridin-Agar der eingangs erwähnten Zusammensetzung, der
also Pyridin als einzige Stickstoff- und Kohlenstoff quelle enthielt,,
entwickelten sich nur schwache Kolonien. Bei gleichzeitigem Zusatz
von Glykose war das Wachstum optimal. Bei Zusatz von Glykose
kann also der Stickstoff des Pyridins besser ausgenutzt werden, wie
folgender Versuch noch genauer zeigt: Werden 20 ccm Pyridin-Nähr-
lösung (ohne besondere Kohlenstoffquelle) mit ein bis zwei Platinösen
Bakterien beimpft und bei 30^ C aufgestellt, so erhält man nach 4 bis
5 Tagen eine starke Ammoniakreaktion mit Nesslers Reagens, die bei
umgeimpften Kontrollen natürlic]^ ausblieb, wie ausdrücklich fest-
gestellt sei. Die Vermehrung des Organismus bleibt aber gering, die
Nährlösung wurde lediglich opaleszierend. Noch charakteristischer war
das mikroskopische Bild : Bereits 1 Tag nach der Impfung waren Kokken-
formen festzustellen.

Ganz anders war das Bild, wenn zu dieser Nährlösung noch 1 %
Glykose zugegeben wurde (eine solche Nährlösung verwendete auch
Robbins), Unter den gleichen Kulturbedingungen wie oben entstand
nach 4 bis 6 Tagen auf der Oberfläche der Kulturflüssigkeit eine Kahm-
haut von ansehnlicher Dicke. Nach 10 Tagen war, nach Aussage der«
Fehling-Probe, alle Glykose verschwimden, und die Nessler-Probe
zeigte, daß auch kein Ammoniak mehr vorhanden war. Da der pH-Wert
5,6 betrug, so kann das Ammoniak nicht durch Verflüchtigung verloren
gegangen sein, sondern es war anzunehmen, daß es von dem Organismus
assimiliert war.

Es waren nun die Fragen zu beantworten: 1. In welchem Maße
zersetzt der Orgaiüsmus das Pyridin zu Ammoniak, wenn Pyridin als
einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquelle vorhanden ist ? 2. Verwendet
er etwas von dem Pyridin ? 3. Was geschieht mit dem Pyridin bzw.
Ammoniak bei Vorhandensein von Glykose ? Diese Fragen waren nur
durch quantitative Versuche zu lösen.

Kenntnis des mikrobiellen Abbaus von Pyridin.

377

Zu dienen Versuchen wurden ein mit drei Öffnungen versehenes
Wulf Bohes Gefäß von 1 Liter Inhalt verwendet; die Öffnungen waren
mit eingeschliffenen Glasstöpseln verschlossen. Durch den einen
Stöpsel führte eine bis auf den Grund der Kulturflüssigkeit reichende,
mit Glashahn versehene Kapillare, damit aus Kontrollversuchen mittels
der Vakuum jjumpe jederzeit ein paar Troj)fen des Versuchsmaterials
steril entnommen werden konnten. Der zweite,, mit Hahn und kurzer
Einfühningsröhre versehene Stöpsel diente zur Einführung von Luft
zur Zeit der Materialentnahme; ein Wattepfropf in der Einführungsröhre
verhinderte die Infektion. Die dritte Öffnung diente zum Eingießen der
Kulturflüssigkeit und zur Impfung.

Wieviel Pyridin wird zersetzt, wenn dieses als einzige Kohlenstoff-
und Stickst offquelle vorhanden ist ? Ein Wulf sehe» Gefäß erhielt 50 ccm
der eingangs erwähnten Pyridin -Nährlösung und wurde nach dem
Sterilisieren mit zwei Ösen von auf Glykose-Agar gezüchtetem P. roseus
beimpft. Ein zweites Kontrollgefäß blieb ungeimpft. Kultur bei 26^ C
iift Thermostaten. Nach 1 Tag bereits zeigte das Versuchsgefäß intensive
Ammoniakbildung nach Nessler, während im Kontrollgefäß keine
Ammoniak bildung festzustellen w^ar. Die quantitative Bestimmung des
Ammoniaks nach Chghoin-J endrasaik in einigen vorher bakterienfrei
filtrierten Proben ergab eine qtuiniitative Umwandlung des Pyridins in
Ammoniak. Der ^'ersuch wurde mehrmals mit dem gleichen Ergebnis
wiederholt.

Wieviel Pyridin- bzw. Ammoniak -Stickstoff verwendet nun der
Organismus, w'enn dieses als einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquelle
vorhanden ist ? Es wurden aus Gefäßen des vorstehend beschriebenen
Versuchs nach 6 Tagen Proben entnommen. Die Ammoniakbestimmung
ergab, daß kein Stickstoff verwendet war. Das Wachstum bei Pyridin
als einzige Stickstoff- und Kohlenstoffquelle ist also in der Tat ganz
minimal, so daß der Nachweis des assimilierten Stickstoffs sich offenbar
innerhalb der Fehlergrenzen hält, wenn nicht das minimale Wachstum
überhaupt aus dem Keservernaterial der Impfung erfolgt.

Die dritte Frage w^ar die nach der Verwendung des Pyridin -Stick-
stoffs in Gegenw^art von Glykose. Die Methodik w’ar die gleiche ; zu
der Pyridin-Nährlösung war 1 % Glykose zugesetzt. Die Kulturen
standen im Thermostaten bei 3(F C. Durchschnittlich war am 10, Tage
die Glykose restlos verbraucht und der Stickstoff aus der Nährlösung
verschwunden. Eine Eiweißbestimmung in der Kultur ergab, daß der
Pyridin -Stickstoff restlos in Eiweiß überführt worden w^ar. Auf 100 ccm
Nährlösung bezogen wurden 36,75 mg N im Eiweiß gefunden, gegen
35,42 mg, die in der 0,2%igen Pyridin-Nährlösung gegeben werden .
Das Mehr liegt gänzlich innerhalb der Fehlergrenzen, falls es nicht

378

J. V. Horv&th:

durch den geringen Stickstof fgehalt der Impfung (zwei Platinösen)
hervorgerufen wurde.

Immerhin Murde auch noch versucht, nachzuweisen, ob der Orga-
nismus Luftstickstoff bindet. Dabei wurde die von Eippel angegebene
Nährlösung verwendet. Die Kontrollen ergaben im Älittel 0,14 mg
Stickstoff, die zehntägigen Kulturen 0,28 mg. Bindung des elementaren
Stickstoffs konnte also innerhalb der Fehlergrenzen nicht nachgewiesen
werden.

Während also der Organismus bei Pyridin als einziger Kohleiistoff-
und Stickstoffquelle den Kohlenstoff des Pyridins kaum zum Körpei-
aufbau verwendet, das Pyridin jedoch unter Ammoniakbildiing zei-
stört, wird in Gegenwart von Glykose der Pyridin -Stickstoff restlos
zusammen mit dem Gtykose-Kohlenstoff zum Körperaufbau verwendet.

Es interessierte noch die Frage, ob der Organismus imstande ist.
Pyridin allein oder in Gegenwart von Glykose anaerob abzubauen. Xu
diesen Versuchen wurde das BurrtHche An aerobe verfahren Nerw’cndet .
Nachdem die Kulturen 7 Tage bei 30^ C im Thermostaten gestanden
hatten, ergab die Pyridin best immung nach Barta. daß anaerob Pyridin
nicht abgebaut wurde.

Schließlich prüfte ich, wieweit Pyridin in Gasform durch den
vorliegenden Organismus verwendet wird. Zu diesen Versuchen benutzte
ich Petrischalen mit Prmgsheim, scher Kieselsäuregallerte. Eine Platin Öse
wurde in sterilem Leitungswasser auf das Hundertfache verdünnt,
daraus wurde mit 0,5 ccm eine Oberflächenkultur hergestellt. Auf die
innere Seite des Deckels der Petrischale klebte ich ein Stückchen mit
Pyridin getränkter Watte und hielt die so vorbereitete Kultur bei 3(V^ ('
in einer schwach feuchten Kammer verschlossen. Trotz wäedeiholter
Versuche konnten keine, bei öOfacher Vergrößerung sichtbare Kolonien
aufgefunden werden. Es konnte aber angenommen werden, daß die
Vermehrung der Bakterien zu gering war, um erkannt zu werden, odei
daß die durch die Impfung vorhandenen Bakterien das Pyridin zu
Ammoniak abbauten. Daher wurde auf eine 8 läge alte Kultur in
dünner Schicht Neaslers Reagens gegossen und dieses in ein Gliis<-hen
abgegossen. Es w'ar jedoch keinerlei Reaktion zu beobachten. Pyridin
in Gasform scheint also nicht von dem Organismus angegiiffen zu
werden .

Zusammenfassung.

Bei der Suclre nach einem Mikroorganismus, der imstande ist,
Pyridin abzubauen, isolierte ich aus Göttinger Gartenboden Pro-
actinomyces roseus nov. spec.

Dieser Organismus baut Pyj idin in 0,2 /(»iger Nährlösung, w enn es
als einzige Kohlenstoff- und Stickstoff quelle gegeben wird, restlos zu

Kenntnis des mikrobiellen Abbaus von Pyridin.

379

Amnioniak ab. Nachweisbaie Körpermasse wird dabei nicht gebildet.
In Gegenwart von 1 Glykose wird der Pyridin- Stickstoff quantitativ
zu Organismeneiweiß verarbeitet.

Die Verarbeitung von P^Tidin allein oder in Gegenwart von Glykose
erfolgt nur auf aerobem Wege.

Pyridin in Gasform wurde nicht verarbeitet.

Die ,, gewöhnlichen“ Mikroorganismen fehlende Fähigkeit zum
Abbau des Pyridins erweist sich somit als eine Eigenschaft spezifischer
Formen von Boden mikroorganisinen.

Literatur.

L, Barta, Biochem. Zeitschr. 277, 412, 1935. — C. Barthel^ Centralanst.
försöhsv. päjord. 308, 1926. — H. Buckerer^ 1. Centralbl. f. Bakt. II, 105, 166,
1942; 2. ebenda 106, 445, 1943. - R.A.Cleghorn u. L. Jendraasik, Biochem.

Zeitschr. 274, 189, 1934. — L, E. Den Dooren de Jong, Bijdrage tot de kennis van
het mineralisatieprocess. Rotterdam 1926. — F. Ehrlich^ Biochem. Zeitschr.
79, 152, 1916. - M.J. Funckes. Ala. Agr. Exp. Stat. 191, 196. 65, 1917. -
H. L. Jensen, Proc. Linn. Soc. NSW 56, 79 u. 345, 1931 ; 59, 18, 1934. - S, T.
Jewaon u. F. TaUerfield, Aiin. appl. Biol. 9, 213, 1922. — N. A. Krassilnikov.
Bull. Acadern. Sc. USSK. CI. Sc. Math. 1, 51. 1938. - O. Meyerhof^ Pflügers
Arch. 164, 853, 1916. — O. v. P/o^Ao, diese Zeitschr. 13, 93, 1942. — A. Rippel-
Baldes, A. Stare u. W. Köhler ^ diese Zeitschr. 13, 365, 1943. — W. J, Roöbins.
Ala. Agr. P^xp.Stat. 195, 49, 1917. E.J. Rüssel ii. H, B. Hutchinson^
Agr. Sc. 3, 111, 1909; E,J. Bussel u. J.Oolding, J. Soc. Chem. Ind. 30,471,
1911; E. J, Rüssel u. F. R, Petherhridge, J. Agr. Sc. 5, 248, 1913.

Beiträge zur Kultur phytoparasitinclier Pilze
auf deflnieiiieii Nährboden.

Von

Friedrich Gerhardt, Berlin.

Mit 3 Textabbildungen.

(Eingegangen am 11. Afigust 1943.)

Ein großer l'eil der phytoparasitischen Vi\ze läßt sich nur schwierig
oder überhaupt nicht auf künstlichen Nährböden kultivieren. Bei den
gebräuchlichen künstlichen Nährböden handelt es sich zumeist um
Extrakte aus Pflanzenmaterial oder Fleisch, die mit Agar-Agar gelatiniert
werden. Geht man aber zu den physiologisch näher definierten Nähr-
böden, die nur chemisch wohldefinierte Bestandteile enthalten, über,
so engt sich die Zahl der kultivierbaren Pilze weiter ein (vgl. Monilia,
Botrytis usw.).

Zum Studium der Physiologie parasitischer Pilze ist es aber uner-
läßlich, auch die Stoffe kennenzulernen, aus denen die Pilze ihren
Organismus aufbauen und ihre Fortpflanzungsorgaiie entwickeln können.
Traubenzucker, Milchzucker usw., die von den meisten tierischen Orga
nismen assimiliert werden, eignen sich nur für wenige meist saprophyti-
scher Pilze zur Ernährung. Daher ist die Auffindung der Kohlenstoff-
quellen, die zur Ernährung der betreffenden Pilze erforderlich sind,
von größter Wichtigkeit. Neuerdings sind zahlreiche Arbeiten er-
schienen, deren Aufzählung im Bahmen dieser Darstellung aber zu weit
führen würde, in denen die Verfasser durch Wuchsstoff- oder Vitamin-
zugaben bei verschiedenen Pilzen ein besseres Wachstum erzielt haben
und daraus nun die Schlußfolgerung ableiten, daß Wuchsstoffe, Hormone
oder Vitamine zum I-«eben gewisser Pilze erforderlich sind. Diese Ergeb-
nisse, deren Itedeiitung unbestritten ist, lenken aber von der überaus
wichtigen Kernfrage nach der geeigneten Kohlenstoffquelle dei be-
treffenden Pilze ab.

Schöpfer und Blwtur (1, 2) haben mit Ustilago violacea und Vita-
min den Versuch unternommen, die Kohlenstoffquelle ausfindig zu
machen, die dieser Pilz hauptsächlich verarbeitet. Sie haben dabei
zahlreiche Kohlenhydrate und andere organische Stoffe als Kohlen-
stoffquelle für diesen Pilz geprüft, dabei aber eine in der Pflanzenwelt
weitverbreitete C-Verbindung übersehen, das Pektin^ das nach eigenen
Versuchen als die natürliche Kohlenstoffquelle für eine ganze Reihe
von Pilzen in Frage kommt.

Kultur pbytoparasitischer Pilze auf definierten Nährböden. 381

Es ist in der Phytopathologie eine wohlbekannte l'atsache, daß
die meisten phytoparasitischen Pilze intercellular wachsen. Die Mittel-
lainelle, die die einzelnen Zellen miteinander verbindet, besteht be-
kanntlich aus Pektin, und zwar dem Protopektin. Es ist in Wasser
iinlöslich und wird durch das Ferment Protopektinase zu wasser-
löslichem Pektin abgebaut. Es liegt nahe, in deraHigen parasitischen
Pilzen ein solches Ferment für den Abbau des wandständigen Pektins
und dessen Verwertung zur Ernährung zu vermuten. Für zahlreiche
phytopathogene Pilze und Bakterien, wie Botrytis, Monilia, Pythium,
Phytophthora, Fusariuw, Bacillus phytophthorus u. a. m., ist die Aus-
scheidung dieses Ferments bereits nachgewiesen worden (3, 4, 5). Das
gute Gedeihen aller eben aufgeführten Pilze auf Malzagar wird mindestens
zum Teil auf dessen Gehalt an Pektin zurtickzuführen sein, das nach
eigenen Versuchen, wie noch näher ausgeführt w’erden soll und durch
Photographien belegt werden kann, sich für verschiedene dahingehend
untersuchte Pilze als für Wachstum und Entwicklung des Pilzes über-
legene C- Quelle erwiesen hat.

Experimentelles.

Untersuchungen über Monilia und Botrytis,

Um die in der Einleitung aufgeworfene Frage der geeigneten 0- Quelle zu
klären, wurden vergleichsweise folgende Nährböden mit Monilia fi'uctigena und
Botrytis cinpreu geimpft:

1. 2 % Agar-Agar,

2. 2 % Agar-Agar,

3 . 2 ®„ Agar-Agar,

2 % Pektin,

2 "t, Glucose,

Asparagin,

0,25 Asparagin,

0,25';„ Asparagin,

0,15»„ KHjPO,,

0,15% KH 2 PO;,

0,16%, KH 2 PO 4 ,

0,05“ „ Mg 804 .

0,05«„ MgS() 4 .

0,05% MgS04.

Das Pektin Merck für wissenschaftliche Zwecke, das zu diesen Versuchen
verwandt wurde, war durch dreimaliges Ausschütteln mit 96°i)igem Alkohol
von gegebenenfalls noch anwesenden Mengen Vitamin befreit worden.

Für Botrytis wie auch für Monilia ergab sich folgendes:

Die Kulturen auf Nährboden 1 (Pektin als C- Quelle) entwickelten
sich äußerst schnell und lieferten bald die chai'akteristischen Wuchs-
formen, wde sie an der Wirtspflanze auftreteiij sowohl für Botrytis
cinerea wie auch für Monilia fructigena. Auf Nährboden 2 w'ar bei
beiden Pilzen nur ein schwaches Wachstum festzustellen, das dem von
Nährboden 3 gleichzusetzen war. Die beobachtete, wenn auch geringe
Entwicklung auf den Nährböden 2 und 3 wird wohl auf die Aus-
nutzbarkeit der Kohlenstoffquelle Asparagin zurückzuführen sein,
da auf reinem Agar-Agar kein Wachstum von Botrytis und Monilia
stattfindet.

382

F. Gerhardt:

Aus den beigefügteii Photos (Abb. la bis 1 c und Abb. 2a und 2b)^
ist deutlioh der Unterschied in der Ausnutzung de [Kohlenstoff quellen
zu ersehen.

Abb. ln. Botryti» cinerea auf Nährboden 2.

Abb. Ib. Botryti» einerea auf Nährboden 1.

Abb. 1 c. Botrytie cinerea auf Nährboden 1.
Ältere Kultur mit 3 inipfntcllen.

Abb. 2a. MnnWtt fntrtidena auf Nährboden 2. Abb. 2 b. MnniVn Iructiffena auf Nährboden 1.

Alle Abbildungen zeigen Petrischalen-Kulturen der Pilze.

Kultur phytoparasitisc'her Pilse auf definierten Nährböden. 383

Auf Nährboden 1 tritt bei Monilia frtLctigena iiii weiteren Wachs-
tuinsverlaiif Schwärzung des älteren l^zgewebes auf sowie Bildung
von Sklerotien. Die Bildung von Apothecien aus den Sklerotien konnte
l)i8her nicht lieobachtet werden, da die Arbeiten, durch Zeitunistände
bedingt, eine X^nierbrechung erfuhren. Aus dem beigefügten Photo
Abi). 1 c ist bei einer älteren Kultur von Botrytis eine prächtige Sklero-
tienbildung am Rande der drei Wachstumsstellen zu erkennen, die von
drei Überimpfungen auf die gleiche Platte herrühren.

rntersuchnngen über Brandpilze.

Diese Erfolge reizten dazu, diesen neuen Nährboden auch für
einige andere Pilze auszuj)robieren und es w urde der Versuch unter-
nommen, das Wachstum einiger schwierig zu kultivierender Brandpilze.

die ja aucli intercellulär wachsen, auf ihnen zu verfolgen. Kein äußerlich
ergab sich auf den vorher angegebenen Nährböden bei Ustikujo avenat
das gleiche Bild wie bei Botrytis und Monilia. Vstilago at^enae bildete
zusätzlich auf Nährboden 1 noch ein mächtiges l^nftmycel ans (s. Abb. 3a
und b). Nach 6 bis 7 Tagen war die Kultur rotbraun gefärbt und
roch ziemlich stark nach Ammoniak. Der pn-Wert des Nährbodens
hatte sich innerhalb dieser Zeit von pn 3,8 bis 4 auf pn 1 bis 7,5 ver-
schoben, was auf eine intensi\ e Spaltung des Asparagins durch Fermente
hinweist. Zu derselben Zeit war auch die beginnende Bildung der
typischen Brandsporen zu beobachten, bis nach 3 bis 4 Wochen die
Platte etwas eintrocknete und die fertigen Brandsporen im Substrat
eingebettet zu sehen waren, die auf neue Nährböden übergeimpft wieder
ganz typisch aiiskeimten und an den entstehenden Basidiosporen zahl-
reiche hefeartige Konidien bildeten. Die auffällige Tatsache, daß
Ustilago anenae ebenfalls ein schwaches Wachstum auf dem Nährboden
zeigte, der nur As))aragin enthielt, erforderte zu prüfen, ob dieses

384

F. Qerbftrdt:

Waohstum auf die Ausnutzung des im Asparagin enthaltenen Apfel-
säurerestes zurüokzuführen war. Deshalb wurde diesem Boden zusätzlich
einmal 0,5%ige Apfelsäure zugefügt und da ergab sich, daß Uatilago
avenae gleich ein gutes Wachstum unter Bildung eines schwach rosa
gefärbten Luftmycels entwickelte. Somit bestätigte sich die Ver-
mutung, daß der Apfelsäurerest des Asparagins als C- Quelle ausgew ertet
wurde. Nach diesem Experiment scheint es sogar, als ob die Ver-
arbeitung der Kohlenhydrate von Pilzen nicht nur eine Fiage des
C/N- Verhältnisses ist, sondern auch des Redoxpotentials, das bei
Apfelsäure und Pektinen ja ein ganz anderes als bei Zuckern usw. ist.

Eine Überprüfung der Ernährungsverhältnisse des viel virulenteren
Ustilago zeae, der nach Ranker (6) auf einem synthetischen Nährboden,
der Glucose enthielt, gedeiht, ergab ebenfalls ein üppiges Wachstum
auf dem pektinhaltigen Nährboden 1. Wurde in der Ranker achen Nähr-
lösung (0,3g K28O4, lg NH4N()3, lg CaClg, lg Mg3(P()4)2 und
10 g Glucose auf 1 Liter dest. Wasser) die Glucose durch Pektin er-
setzt, so gedieh Ustilago zeae bald noch üppiger. Am stärksten aber
war das Wachstum auf Nährböden mit Pektiti und einer organischen
N- Quelle.

Um das Pektin als Nahrungsquelle verwerten zu können, müssen
die Brandpilze in der Lage sein, das Pektin der Mittellamelle mit Hilfe
von Fermenten abzubauen. Die Auflösung der Mittellamelle durch
IJstilago avenae, Txm und Tilletia tritici konnte auf folgende Weise
anschaulich gemacht werden.

Die drei genannten Pilze wurden auf einen Agar-Nährboden übergeirnpft,
der Pektin, Asparagin und Rübenschnitzel enthielt, die nur 10 Minuten sterilisiert
waren, in denen also das Protopektin noch nicht durch Kochen in Hydrato-
pektin uingewandelt war. Nach ein paar Tagen, als das Pilzwachstum im vollen
Gange war, wurden die Rübenstücke vergleichsweise in einem ungeimpften und
in einem geimpften Boden vor dem wachsenden Mycel untersucht, in welchem
die Rübenstücke nachweislich kein Pilzwachstum aufwiesen. Mit einem Spatel
wurden diese Stücke auf ihre Festigkeit untersucht. Es waren aber lediglich
die Stücke vor dem wachsenden Mycel weich geworden. Eine Untersuchung
der mikroskopischen Schnitte der Rüb^:ischnitzel aus dem ungeimpften Boden
imd vor dem wachsenden Mycel mit Rutheniumrot zeigte die gleichen Unter-
schiede, wie sie bei der Einwirkung von Protopektinase (aus der Weinberg-
schnecke gewonnen) auf Rübenschnitze] auf treten. Die Stücke vom ungeimpften
Boden ließen durch ihre tiefrote Färbung die Mittel lamelle deutlich erkennen,
während die Stücke vor dem wachsenden Mycel keine ausgeprägte Mittellamelle
mehr aufwiesen. Somit erschoint die Absonderung einer Protopektinase durch
diese Pilze als recht wahrscheinlich.

Schöpfer und Blumer (2) hatten bei ihren umfangreichen Versuchen
mit Ustilago violacea beobachtet, daß ein gutes Wachstum auf definierten

Kultur phytoparasitisoher Pilze auf definierten Nährböden. 385

Nährböden erst bei Zugabe von Aneurin erfolgte. Pektin hatten sie
ja leider nicht bei ihren Versuchen als Kohlenstof fquelJe verwendet.
Nach den bisherigen Ergebnissen war zu erwarten, daß auch Uatilago
violacea auf Pektin besser wachsen würde. Das Pektin wurde wiederum
aneurinfrei durch dreimaliges Ausschütteln in 96 %igem Alkohol
gemacht.

So wurde folgender Versuch unternommen :

Je drei 100-ccm-]2rlenmeyerkölbchen mit je 26 ccm Nährlösung in unten-
stehender Zusammensetzung wurden nach der Sterilisation mit Konidien von
Uatilago violacea beimpft, die einer Kultur von Prof. Schöpfer entstammten,
dem hiermit nochmals für die freundliche Überlassung der Kulturen verbindlichst
gedankt sei.

Nährboden A.

1: 1*;,, Glucose, 0,15‘;„ Asparagin, 0,15"^, KH 2 PO 4 , (Mlö“,, MgS 04 ;

II: 1% Pektin, 0,16‘\, „ 0,16^„ „ 0,06*\,

Nährboden B.

I: 1% Glucose, 0%A8paragm, 0,15% KH,P 04 , 0 ^ 06 % MgS 04 ;

II: 1 % Pektin, „ 0,15% „ 0,06%

Nährboden C

I: 0<J(, Glucose, 0,15^)t, Asparagin, 0,16% KH,P 04 , 0,06 Mg 804 .

II; Pektin, 0,15 ‘»o »» 0,16 ‘*0 „ 0,06 »o

Zur N- Quelle ist zu bemerken, daß Glutamin wahrscheinlich zweckmäßiger
gewesen wäre, da die CaryophylUiceen ja Glutaminpflanzen sind.

Nach ungefähr 8 Wochen konnte im letzten noch isoUert und
ungeöffnet gebliebenen Gefäß von A II die Bildung reifer typischer
Brandsporen beobachtet werden, die sich am Boden des Erlenme^^er-
kölbchens festgesetzt hatten. In den anderen Nährlösungen konnte eine
solche Beobachtung nicht gemacht werden. 1 Stunde nach dem Auf-
bringen der neu gebildeten Brandsporen (in den Kulturen von Prof.
Schöpfer waren nur Konidien) von Uatilago violacea auf einen Objekt-
träger konnte unter dem Mikroskop das Auskeimen der Brandsporen
und im weiteren Verlauf auch die beginnende Bildung von Basidio-
sporen an den Keimschläuchen beobachtet werden.

Damit ist der Beweis der bevorzugten Eignung des Pektins als
C- Quelle für eine Anzahl phytoparasitisoher Pilze erbracht. Aber noch
fehlt die Erklärung für das physiologische Verhalten der Brandpilze,
die mit Ausnahme des Maisbrandes, der auch junge Blätter usw. be-
fallen kann, nur in keimendes Getreide einzudringen und hinter der
wachsenden Spitze dem Wachstum des Halmes folgend bis in die Blüt||

386

F. Öerhardt:

vorzudringen vermögen, während sie ältere Gewebszellen nicht infizieren
können.

Im keimenden Getreidekorn befinden sich zahlreiche Aminosäuren
neben wenig Polypeptiden und Proteinen. Es reizte daher zu prüfen,
ob nicht ein Zusammenhang zwischen der Aggressivität und der Perment-
garnitur von Ustilago avenae mit dem physiologischen Zustand des
befallenen Objekts andererseits besteht. So wurden UstiUigo avenae und
Uatüago zeae auf Nährböden übergeimpft, die als einzige C- Quelle 2 %
Pektin und als alleinige N- Quelle in einem Falle 1 % Pepton, im anderen
Falle 1 % Gelatine enthielten. Dabei zeigte Ustilago avenae durch
fehlendes Wachstum an, daß dieser Pilz nicht imstande war, die ge-
botenen N- Quellen zu verwerten, wie aus den wenigen sich entwickelnden
Hyphen ersichtlich war, die man nur mittels einer Lupe über dem
Pektin-Agar-Eiweißnährboden bemerken konnte. UstiUigo zeae dagegen
wuchs gut, und bei dem Gelatine-Pektin- Agarnährboden konnte man
vor dem wachsenden Mycel eine schmale Verflüssigungszone des Nähr-
bodens beobachten.

Es scheint nach diesen Untersuchungen bei diesen beiden Brand-
pilzen tatsächlich ein Zusammenhang zwischen Aggressivität und
Fermentgarnitur einerseits und physiologischem Zustand der Pflanze
andererseits zu bestehen.

Weitere Untersuchungen über Botrytis^ Monilia
und PeniciUium spec.

Dem Vermögen von Monilia fructigena^ verletzte Äpfel schnell zu
verderben, steht ebenfalls eine reichliche Absonderung von Proteinasen
gegenüber, wie auf einem Nährboden, enthaltend 2% Pektin und
21 / 2 % Gelatine aus der schnellen Verflüssigung der Gelatine vor den
wachsenden Zonen zu ersehen war. Botrytis cinerea („Schwäche-
parasit“) besaß diese Eigenschaft nur in vermindertem Maße. Peni-
ciüium-ATten (Saprophyten), die Ja bekanntlich nur überreife Früchte
befallen, zeigten gegenüber Monilia und Botrytis nur ein sehr geringes
Wachstum auf den Pepton- Gelatine-Pektin -Agamährböden, dagegen
ein annähernd gleich starkes auf Pektin-Asparaginnährböden.

Besprechung der Ergebnisse.

In der vorliegenden Arbeit konnte die in dei Einleitung aus-
gesprochene Vermutung, daß Pektin eine für intercellulär wachsende
parasitische Pilze natürliche Nährstoffquelle sei, bestätigt werden. Es
ist selbstverständlich, daß die betreffenden Pilze, um das Pektin als
Nahrungsquelle benutzen zu können, auch imstande sein müssen, es

Kultur phytoparasitischer Pilze auf definierten Nährböden. 387

abzubauen und in eine für den Organismus verwertbare Form ül)er-
zufübren. Die tjberlegenheit des Pektins als C- Quelle gegenüber den
Zuckern ist so auffallend, daß sie zur Annahme einer Beziehung zwischen
Eignung der C- Quelle und der Lebensweise der Pilze berechtigt. Sie
ist gleichzeitig ein wohl zu beachtender Hinweis für die Herstellung
geeigneter künstlicher Nährböden für diese Pilze.

Natürlich ist mit der Lösung der Fragender geeigneten C- Quelle
das Gesamtproblem der Nährbodenbeschaffenheit für diese Pilze
noch nicht gelöst. Schon die Frage der geeigneten und natürlichen
N- Quellen erfordert neue 1 -ntersuchungen. Wie die beschriebenen
Versuche dartun, scheint zwar eine Beziehung zwischen Pilzaggres-
sivität und Proteinasenaktivität zu bestehen, doch muß zugegeben
werden, daß die ungleiche Auswertung der Gelatine zunächst nur auf
eine verschiedene Aktivität der spezifisch auf Gelatine eingestellten
Proteinase schließen läßt. Entsprechende Versuche mit anderen
definierten Eiweißen müssen daher die Breite der Schlußfolgerungen
erst erweisen.

Auch die ^verschiedene proteolytische Aktivität genügt noch nicht
ziii* vollen Erklärung des Parasitismus, sondern es muß auch noch die
Spezifität des ^Vrhältnisses von Parasit und Wirt geklärt werden.
Da würde 1, die Frage der l^n Verträglichkeit verschiedener Eiweiße
(Fermentträger) eine Bolle .sjäelen und 2. der Gehalt der Pflanze an
Stoffen, die giftig auf den Pilz wirken. Ferner wäre für das Verhältnis
Parasit— Wirts]>flanze noch die Absonderung von toxisch wirkenden
Ausscheidungen durch den Parasiten von Bedeutung und von seiten
der Pflanze die Ausbildung von Cellulosemembranen. Das Problem der
chemisch -j)hysiologischen Erfassung des Parasitismus ist daher noch
lange nicht mit der Erfassung der natürlichen Nährstoffquellen gelöst;
es i.st lediglich ein Baustein mehr zur Erfassung der stofflichen Grund-
lagen des Parasitismus. Daß außerdem neben den Fragen des , »niedrigen
Stoffwechsels“ diejenigen der Wuchsstoff- und Honnonbedürftigkeit in
Verbindung mit den dargestellten Ergebnissen weiterhin experimentell
geprüft werden müssen, bedarf wohl keiner weiteren Begründung.

Zusaimnenlassuug.

1 . Das Pektin wurde als geeignete C- Quelle für gewisse Pilze fest-
gestellt, die sich bisher auf definierten Nährböden gar nicht oder nur
schwierig kultivieren ließen.

2. Bei üsHlago avenae und zeae, sowie bei TiUetia tritici konnte
die Absonderung einer Protopektinase wahrscheinlich gemacht
w^erden.

388 F. Gerburdt: Kultur jdiytopuraaitiBoher Pilse auf definierten N&hrböden.

3. Die Verarbeitimg der Kohlenhydrate durch Pilze scheint nicht
nui eine Frage des C/N-Verhältnisses, sondern auch des Redoxpotentials
zu sein.

4. Es konnte ein Zusammenhang zwischen Aggressivität der Pilze
und ihrer Proteinaseaktivität einerseits und dem physiologischen
Zustand der Pflanze andererseits beobachtet werden.

Literatur.

1) S. Blumer, diese Zeitschr. 8, 468, 1937. — 2) W, H, Schöpfer u. 8, Blumer,
ebenda 9, 306, 1938. - 3) K. P. N. Mmon, Annals of Botany 48, 187, 1934. -
4) X. B. Ghana, ebenda 46, 1033, 1932. — 6) P. P. Davimm u. J. J. WiUaman,
The Botanical Gazette 38, 329, 1927. — 6) P. Ranker, J. of Agric. Res. 41,
436, 1930.

(Au8 dem InBtitut für Mikrobiologie der Universität Güttingen.)

über Eiweifibildttng durch Bakterien.

VI. Mitteilung:

Die Wirkung einer Misehung von Aminosäuren auf Bacilius glycinopiiiliis.

Von

August Bippel-Baides^ und Werner Köhler.

(Eingegangen am 6. September 1943.)

In der vorhergehenden Mitteilung {A. Bippel, K. Nabel und
W. Köhler) hatten wir darauf hingewiesen, daß eine Mischung von Gly-
kokoll und Alanin bei BacHlua glycinophilus besser wirkt als die gleiche
Konzentration einer einzelnen Aminosäure; ein Gleiches wurde für die
Ammoniaksalze organischer Säuren festgestellt. Die Versuche waren
indessen insofern nicht eindeutig, als nur volle Konzentration der
Einzelkomponenten verglichen wurde mit der Mischung, nicht aber die
Wirkung der Einzelkomponenten in der der Mischung entsprechenden
geringeren Konzentration ebenfalls untersucht wurde. Der nach-
stehend beschriebene Versuch mit Glykokoli^, Alanin und Leucin sollte
diesen Mangel beseitigen. Die Zahlen finden sich in Tabelle I.

Tabelle I.

Bacillus glyeinophilus, Wirkung einer Aminosäuremisohung.

Stickstoff'Gabe

mg BiweiB'StSckstoff le Kolben
KoltunUuer in Tagen

Glykokoll 0,2%

1,66

16,09

Alanin 0,24%

0,86

14,67

Leudn 0,85 %

0,66

Mischung dieser 3 = je ^/g

4,42

16,96

Glykokoll Vs obiger Menge

2,17

4,86

Alanin Vs obiger Menge

1*30

6,66

Leucin Vs obiger Menge

0,66

1.74

Summe der ^/g-(Hben

4,12

12.24

Nährlösung: Olykose 1,0%, MgS 04 0,01%, reS 04 0,006%, KH.P 04
/K 4 HPO 4 = 0,4/0,2%, Agar 0,1 %, dest. Wasser; 60 com in 260er Erlenmeyer-
kölbohen aus Jenaer 20er Glas. Thermostat bei 37^ C. pu ö»2. Mittel aus je
zwei Parallelen.

^ Änderung des früheren einfachen Namens des Autors. ^ * Da es sich
bei dem Qlykokoll um synthetiBohes der „Kohlenteohnik**-Dortmund handelte,
scheidet ein möglicher Oehalt an Wuohsstoiffen als Erklärung für die ba-
sonders gute Wirkung des GlykbkoUs aus.

AisklT fflr Xikrobiolosis. Bd. IB.

390

A. Rippel-Baldea u. W. Köhler:

ln der oberen Hälfte der Tabelle ist die Stiokstoffgabe von 0,2 % Glykokoll
zugrunde gelegt und verglichen mit der gleichen Stiok8toffgat>e in Form von
Alanin und Leucin (0,24 bzw. 0,36%), dazu die Mischtmg dieser drei Amino-
säuren, jede in ein Drittel dieser Konzentration. Bei den Zahlen ist die Stickstoff-
menge für Leucin 0,35% nach 1 Tag als Blindwert abgezogen; dieser Wert liegt
um ein geringes unter dem in der reinen BlindbestimmHng ermittelten Wert*

Nach 1 Tag Kulturdauer hat also die Mischung erheblich besser
gewirkt als die beste der drei Einzelkomponenten in der der Mischung
entsprechenden Konzentration. Mit 4,42 mg Eiweiß-N liegt dieser Wert
sogar noch über dem der Summe dieser drei' Einzelkomponenten mit
2,52 mg N. Nach 3 Tagen Kulturdauer sind die Zahlen ausgeglichen : der
Wert der Mischung entspricht dem bei Glykokoll, der besten N- Quelle,
eidialtenen.

Während nun nach 1 Tag Kulturdauer nicht entschieden werden
kann, ob auch das Leucin in der Mischung als Stickstoff quelle stärker
herangezogen wurde als im Einzelfalle, liegt der Fall nach 3 Tagen
Kulturdauer klar: Da je Kolben 18,7 mg N gegeben waren, so können
auf Glykokoll + Alanin höchstens 12,5 mgN entfallen gegen 15,95 mg N,
die bei der Mischung gefunden wurden. Der Unterschied von 3,45 mg
kann also nur durch Assimilation des Leucin- Stickstoffs zu erklären
sein, das somit in Mischung erheblich besser verwertet wurde als bei
alleiniger Darbietung (0,65 mg).

Wir müssen jedoch weiter die untere Hälfte der Tabelle betrachten,
in der die drei Aminosäuren bei jeweils 1/3 Konzentration der oberen
Tabellenhälfte verglichen wurden. Es sei ausdrücklich bemerkt, daß
es sich um einen gleichzeitig angesetzten Versuch handelt. Bei 1/3 Kon-
zentration wirkten die einzelnen Aminosäuren besser als bei voller
Konzentration, wenn wir die Ergebnisse nach 1 Tag Kulturdauer
betrachten. Das entspricht durchaus dem, was von dem Ertragsgesetz
bekannt ist (A. Rippd). Nach 3 Tagen Kulturdauer ist natürlich die
N-Menge der i /3 Konzentration absolut geringer als die der vollen
Konzentration.

Die Summe der drei Aminosäuren ergab nach 3 T^gen Kulturdauer
12,24 mg Eiweiß-N gegen 15,96 mg bei der Mischung der oberen Hälfte
der Tabelle, die somit merklich besser wirkte. Diese bessere Wirkung
ist auch bereits nach 1 Tag zu erkennen, wenn auch die Werte (4,42 mg
Eiweiß-N der Mischung gegen 4,12 mg der Summe der Einzelamino-
säuren in jeweil 8 'i /3 Konzentration) nicht so weit auseinanderliegen, daß
man mit voller Sicherheit von einem Unterschied sprechen könnte.
Allerdings ist in der unteren Tabellenhälfte Glykokoll vom 1. zum
3. Kulturtag merkwürdigerw'eise etwas zurückgeblieben (obwohl die
Parallelen übereinstimme^). Zum Ausgleich wollen wir zu den Glykokoll-
zahlen pach 3 Tagen Kulturdauer in der unteren Tabellenhälfte noch

über Eiweißbildung durch Bakterien. VI.

391

1 mg N hinzurechnen. Als Summe ergibt sich dann 13,24 mg Eiweiß-N
bei den Konzentrationen gegen 15,95 mg bei der Mischung dieser
Konzentrationen', also ein Unterschied von 2,71 mg Eiweiß-N, der
nur durch die bessere Verarbeitung des Leucins zu erklären ist. Selbst
wenn wir annehmen, daß in Wirklichkeit Glykokoll und Alanin zu
100% verarbeitet wären, so würde die Summe dieser beiden 12,5 mg
Eiweiß-N für die Gaben ergeben. Rechnet man die 1,74 mg Ei-
weiß-N des Leucin der %-Gabe hinzu, so verbleibt mit 14,24 mg,
verglichen mit den 15,95 mg der Mischung, immer noch ein Plus von
1,71 mg Eiweiß-N für die Mischung, das nur durch bessere Ver-
arbeitung des Leucin in dieser erklärt werden kann. Für dieses er-
gibt sich demnach in der Mischung ein Wert von mindestens 1,74
-+-1,71 — 3,45 mg Eiweiß-N gegen 0,65 mg bei alleiniger Darbietung
in voller Konzentration.

Was besagen nun diese Zahlen ? ln der vorhergehenden Veröffent-
lichung hatten wir die Herabsetzung der Konzentration der einzelnen
Aminosäuren in der Mischung in Betracht gezogen, da ja jede höhere
Konzentration zunächst eine Schädigung bedingt , auch wenn im Gesamt-
ablauf der Verarbeitung die höhere Konzentration schließlich noch zu
einer Ertragssteigerung führt, wie es allgemein nach dem Ertragsgesetz
der Fall ist (A. Rippel). Wir wiesen aber schon darauf hin, daß dies
allerdings voraussetzt, daß jede einzelne Komponente einen spezifischen
Schädigungsfaktor besitzt, da in der Mischung die Konzentration

ja die gleiche ist wie bei der Einzelkomponente. Bei gleichem Stickstoff-
gehalt haben wir ja in Hinblick auf die Aminosäuren äquimolekulare
Lösungen.

Frühere Versuche zeigten weiterhin {A. Rippel und W . Lohrniann),
daß jede Giftwirkung, auch solche, die nicht von einem normalerweise
als Nahrungsfaktor in Betracht kommenden Stoff ausgeübt werden,
eine Nährstoff Wirkung entfalten können, falls dieser Stoff antagonistisch
auf die Gift Wirkung eines anderen Stoffes wirkt. So kann man die
Wirkung von Calcium durch Tannin ersetzen, wenn Magnesiumsulfat
als zweiter Schädigungsfaktor vorhanden ist, ferner durch Borsäure
und Sublimat.

Es bleibt demnach nur die Annahme übrig, daß die Schädigung
durch die einzelnen Aminosäuren sich gegenseitig antagonistisch beein-
flussen. Denn, worauf noch einmal . ausdrücklich hingewdesen sei, in
der Mischung wirkt z. B. das besonders ,, giftige“ Leucin erheblich
l)e88er als in der Einzelkonzentration, die der Konzentration in der
Mischung entspricht, wie oben angeführt wurde.

Wie die Schädigung durch die einzelnen Aminosäuren zustande
kommt, bleibt dabei vorerst unbestimmt. Bei der besonderen Vorlie^

392 4 A. Rippel-Baldes u. W. KMikr. EiweiBloldung dvioh Bakterien, vt

de^BakteriumB für Essigsäiire liegt die Annahme niahe, daü^es sich in
de^^ Hauptsache um eine Wirkung der Kohlenstofftetten der Amino-
säuren handelt. Diese Auffassung wird noch weiter durch die Tat-
sache unterstützt, daß die geprüften Aminosäuren, wie in der vor-
angehenden Mitteilung gezeigt wurde, vor der Verarbeitung des-
aminiert werden. Da der Organismus zudem Ammoniak als N- Quelle
ebensogut auszunützen vermag wie Aminosäuren, so kann es sich
also kaum um eine Wirkung der Aminosäuren als solcher handeln,
wie sie von anderen Autoren bereits beobachtet wurde. Darüber
können indessen erst weitere Versuche endgültigen Aufschluß geben.

Zusammenfassang.

Die geprüften Aminosäuren Glykokoll, Alanin und Leucin (in
dieser Reihenfolge mit abnehmender Eignung als Stickstoffquelle)
werden bei BdciUus glycinojohilus in Mischung besser verarbeitet als
bei Einzeldarbietung, auch wenn deren Konzentration derjenigen der
Mischung entspricht.

Es ist wahrscheinlich, daß jede Aminosäure ihren spezifischen
Schädigungsfaktor besitzt, der vermutlich auf die Kohlenstoffkette
zurückzuführen ist und daß sich diese Schädigungsfaktoren anta-
gonistisch beeinflussen.

Literatur.

Ä, JRippd, Das Ertragsgesetz. In Honcamps Handbuch der Pflanzen-
emähnmg, Bd. I, S. 602. Berlin, Springer, 1931. -- Vergleiche weiter die Dar-
Stellung in A, Rippd- Baldes, Grundriß der Mikrobiologie. Berlin, Springer.
Im Erscheinen. — A. Rippd u, TT. Lohrmann, Nachr. a. d. Gesellsch. d. Wiss.
Göttingen, Mathem.-Physikal. Kl., N. P., Fachgruppe VI: Nachr. a. d. Biologie
3, 239, 1940. — A. Bippd, K, Nabd u. W, Köhler, diese Zeitsohr. 12, 286, 1941

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